Книга
← К списку книгЗагрузка разделов…
активнаАктивные записи участвуют в каталоге и синках. Неактивная книга скрыта, но не удалена из базы.
Книга
молекулярная И КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ
Peter von SengbuschMolekular- und ZellbiologieSPRINGER-VERLAG BERLIN HEIDELBERG NEW YORK 1979Peter von SengbuschMolekular- und ZellbiologieSPRINGER-VERLAG BERLIN HEIDELBERG NEW YORK 1979ПЗенгбуш
Peter von Sengbusch
Molekular- und Zellbiologie
SPRINGER-VERLAG BERLIN HEIDELBERG NEW YORK 1979
Peter von Sengbusch
Molekular- und Zellbiologie
SPRINGER-VERLAG BERLIN HEIDELBERG NEW YORK 1979
МОЛЕКУЛЯРНАЯ
И КЛЕТОЧНАЯ
БИОЛОГИЯ
В ТРЕХ ТОМАХ
Том I
Перевод с немецкого Л, В. Алексеевой и канд. физ.-мат. наук Л. С. Шляхтенко под редакцией акад. В. А. Энгельгардта
Москва «Мир» 1982
БВК28.0
356
УДК 576.3+577:1.3
Зенгбуш П.
Молекулярная и клеточная биология: Пер. с нем./Под ред. и с предисл. В. А. Энгельгардта.—М.: Мир, 1982. — Т. 1.
В книге известного ученого из ФРГ на самом современном уровне обсуждены последнее достижения молекулярной биологии и цитологии. По широте охвата материала книга представляет редкое явление в мировой литературе.
В русском издании книга выходит в трех томах. В первом томе рассмотрены строение и функции нуклеиновых кислот и белков.
Для биологов всех специальностей, для преподавателей и студентов университетов, медицинских, педагогических и сельскохозяйственных институтов.
„ 21005—167 подл, мзд-е, 82, ч. 1,2001040000БЕК 28.0
041(01)—82
Редакция литературы по биологии
© Springer-Verlag Berlin Heidelberg 1979. Authorized translation from German language edition published by Springer-Ver- lag Berlin — Heidelberg — New York.
© Перевод на русский язык, «Мир*, 1982
Предлагаемая вниманию советского читателя книга в известной мере сочетает в себе черты, присущие двум разным видам научной литературы: она может служить и учебным пособием для слушателей лекционного курса по данному предмету, и богатым источником сведений, без которых невозможно формирование полноценного кругозора у молодых научных работников, занимающихся исследованиями в новых, стремительно развивающихся направлениях.
Такое своеобразие книги обусловлено тем, что автор для обоснования и иллюстрации сообщаемых им сведений, обобщений и выводов постоянно привлекает разнообразный материал из конкретных экспериментальных работ самого последнего времени. Об этом говорит хотя бы то обстоятельство, что библиографические ссылки, помещенные в конце каждой главы, охватывают, как правило, публикации последних пяти, максимум десяти лет. В то же время внутренняя связь книги с лекционным вузовским курсом отражается в том, что в ней очень кратко, лапидарным стилем изложены результаты классических исследований, составляющих фундамент современных научных представлений, т. е. таких исследований, которые послужили отправными пунктами для последующего развития наших знаний.
В силу этих особенностей книгу П. Зенгбуша отнюдь не следует рассматривать как начальное пособие, помогающее читателю войти в прочно установившийся — а потому, нередко, и остановившийся в своем развитии — круг познаний. Напротив, читая книгу, мы оказываемся в самой гуще событий, где формируются новые подходы и новые итоги. Получается, что автору приходится преодолевать соблазны —не пытаться «объять необъятное», но и не ограничиваться застывшими контурами, которые обрисовались к началу семидесятых годов, не заниматься простым пересказом. Несомненно, что автору, оказавшемуся между Сциллой и Харибдой, пришлось проделать немалый труд, чтобы избежать обеих опасностей, и в этом отношении ему, несомненно, удалось достичь успеха.
Следует подчеркнуть, что для полного усвоения изложенного здесь материала со стороны читателя потребуются определенные усилия. Это отнюдь не повествование для легкого чтения, а сжатая сводка разнообразных сведений, которые можно усвоить только при внимательной и углубленной работе над книгой. Богатый иллюстративный материал в виде графиков, хроматограмм, электронных микрофотографий и т. д., воспроизведенный по большей части из оригинальных научных работ, вводит читателя в круг визуальной документации экспериментальных данных, иногда даже приобретая черты некоего атласа научных исследований.
Явно ощущается большой педагогический дар автора. Кратко, порой сугубо схематично излагая материал, он дает читателю богатую пищу для размышлений, удовлетворяет его любознательность, способствует стремлению использовать текущую журнальную литературу для расширения кругозора.
Разумеется, одно из главных достоинств книги состоит в том, что она в полной мере отражает ведущую тенденцию в нынешнем направлении физико-химического исследования жизненных процессов—систематически возрастающую биологизацию фундаменталь- ных подходов. Идет перемещение центра тяжести от самого низшего, подлинно молекулярного уровня, когда интерес исследователей сосредоточивался на сфере структур и свойств молекул биополимеров-белков и нуклеиновых кислот,— в направлении все возрастающей степени организационной сложности. На смену молекулам приходят супрамолскулярные внутриклеточные образования — хромосомы, митохондрии, рибосомы, мембраны, тубулярные и фибриллярные структуры и т. д. Соответственно меняются по своему характеру и по уровню сложности и совершенства также и изучаемые процессы. На смену простой редупликации ДНК, функционированию генетического кода и т. п. приходят такие проблемы, как механизмы злокачественного перерождения, манипулирование генами, осуществляемое утонченными орудиями генной инженерии, вся сложнейшая область иммунитета и т. д. Именно эта сторона отражена не только в заглавии, но, что гораздо важнее, и в самом содержании книги «Молекулярная и клеточная биология».
Мы не сомневаемся, что книга будет по достоинству оценена советским читателем.
Перевод выполнен Л. С. Шляхтенко (гл. 2—23), Г. И. Лойди- ной (гл. 24—48) и Л. В. Алексеевой (предисловие, гл. 1 и гл. 49—
В. А. Энгельгардт
Автор любого учебного пособия всегда ставит перед собой задачу сделать обзор всех фактов и концепций, которые, по его мнению, необходимы для понимания данного предмета. По сути дела, он выполняет роль летописца определенной эпохи, сообщая в доступной форме о работах, проведенных в различных научно- исследовательских лабораториях. Если автор хочет идти в ногу со временем, то основное внимание он концентрирует на результатах, полученных в последние годы. Кроме того, он пытается провести границу между известным и неизвестным и указать на еще не решенные проблемы. Материал в учебнике, как правило, должен быть изложен в сжатом виде.
Книга «Молекулярная и клеточная биология» предназначена для студентов старших курсов и специалистов, интересующихся достижениями в пограничных областях, лежащих вне сферы их собственных научных интересов. Я сознательно отказался от изложения основ молекулярной биологии, во-первых, потому, что это неоднократно делалось в других книгах и, во-вторых, по той причине, что я уже останавливался на многих се проблемах в моем «Введении в общую биологию» (Springer-Verlag, 1977). Я отсылаю читателя к этой книге, чтобы избежать повторений. Наконец, как и подобает преподавателю высшей школы и автору учебника, я пытаюсь дать описание современного состояния науки, не ограничиваясь только теми чрезвычайно важными данными, которые были получены всего несколько лет назад и вызвали тогда сенсацию, но которых теперь уже недостаточно, чтобы понять сегодняшний мир с его насущными проблемами.
Молекулярная биология достигла в 50-е годы и в начале 60-х годов поразительных результатов. В середине 60-х годов волна успехов, казалось, стала спадать. В 1968 г. Г. Стент (G. Stent) в журнале «Сайенс» (Science, 160, 390) опубликовал своего рода «некролог» под заголовком «That was the molecular biology, that was». Этот «некролог» оказался преждевременным. Семидесятые годы принесли с собой целую серию удивительных открытий. Последовательная разработка новых методов (использование мутантов, генетическая инженерия, слияние клеток и др.), выбор новых объектов, многолетняя предварительная работа в хорошо финансируемых и руководимых на высоком профессиональном уровне лабораториях, а также отлично налаженный международный обмен информацией вполне оправдали себя. В конечном счете молекулярная биология, на основе которой развилась клеточная биология, стала «большой наукой», или, как было недавно сказано, «высокоинтенсивной наукой». Многие новые результаты были получены на клетках высших организмов, и в частности на клетках человека. В настоящее время нет другого высшего организма.
генетическая карта которого была бы более полной, чем генетическая карта человека. Целый ряд научно-исследовательских разработок связан с медицинскими, и прежде всего онкологическими, проблемами. Молекулярная биология и клеточная биология, как и многие другие области науки, стали в высшей степени комплексными дисциплинами, оперирующими множеством фактов. Между тем, по мере того как объем знаний постоянно увеличивается, в обществе нарастает недовольство и антипатия почти ко всем областям естественных наук, где наблюдается прогресс. Люди разочарованы тем, что развитие науки не принесло ощутимых результатов, которые бы способствовали повышению уровня жизни. Кроме того, все видят, что применение новых технологий таит в себе определенную опасность. Причиной недовольства в обществе может быть то, что от науки ожидают решения таких проблем, которые не могут быть решены в короткий срок и которые требуют колоссальных затрат. Хотя в последнее время удалось очень много узнать о свойствах, например, опухолевых клеток, все же мы еще далеки от того, чтобы понимать причины возникновения рака и предотвращать появление или по крайней мере замедлять распространение раковых клеток в организме, а это как раз такие проблемы, в решении которых заинтересовано все общество (и в том числе те, кто ведает финансами).
В последние годы увеличился поток критики в отношении экспериментов на животных. Была высказана мысль о том, что следует работать с культурами клеток и тем самым избегать уничтожения множества подопытных животных. При этом не учитывается, что эффекты различных воздействий на сложные многоклеточные системы нельзя изучать на их отдельных компонентах —клетках— и что культуры нормальных клеток должны постоянно обновляться, так как продолжительность их жизни ограниченна. Нельзя также забывать, что научная деятельность, как правило, связана с большим объемом будничной работы, а зачастую и с неудачами. Нет общепринятого рецепта, по которому можно было бы целенаправленно получать желаемые результаты. С 1973— 1974 гг. не прекращаются дебаты по поводу генетической инженерии. Высказываются опасения относительно возможности ее неправильного использования, и в связи с этим проводятся поиски максимального обеспечения безопасности экспериментов. Было бы ошибкой утверждать, что вновь разработанные методы абсолютно безобидны. Они так же опасны, как и любые другие методы, если они попадают в некомпетентные руки или используются без должного чувства ответственности. Одной из главных причин разногласий в дискуссиях, которые иногда проводятся весьма эмоционально, является страх перед тем, что при манипуляциях с наследственным материалом (ДНК) будет изменена генетическая информация, причем результаты этого вмешательства скажутся лишь
на будущих поколениях; сегодня же мы не в состоянии оценить его последствия. -С тех же позиций проводится и критика использования ядерной энергии, так как здесь тоже опасаются вредных воздействий, которые проявятся только в будущем.
Книга «Молекулярная и клеточная биология» обдумывалась нс за письменным столом. Материал для нее я собирал во время многочисленных личных бесед с коллегами, а также на конференциях и коллоквиумах. Еще одним источником информации послужили симпозиумы Европейской организации по молекулярной биологии (European Molecular Biology Organization, EMBO), проходившие в 1975—1978 гг. Обсуждавшиеся на них темы мы прорабатывали на семинарах со студентами Гейдельбергского университета. Я благодарю научную секцию по общей биологии и биологический факультет Гейдельбергского университета за то, что в 1974—1978 гг. мне была предоставлена возможность принять участие в обмене мнениями на заседаниях Гейдельбергского научного общества. Дальнейшая работа проходила в рамках подготовки к многочисленным лекциям, которые я читал в Билефельд- ском университете. И наконец, после просмотра оригинальных работ и обзорных статей, уже за письменным столом был написан и подготовлен к печати окончательный вариант рукописи. Каждая глава книги завершается списком использованных литературных источников, причем число отобранных ссылок сильно ограниченно. Упор делается на работы, вышедшие в свет в 1976—1978 гг. По этой причине далеко не каждое упоминание о результатах той или иной работы и не каждое высказывание подтверждены литературными ссылками. В книге нет такой главы, тема которой в последние годы не обсуждалась бы на одном или нескольких национальных и международных симпозиумах. Доклады, сделанные па конференциях, в большинстве случаев были изданы в виде сборников. Из этого неиссякаемого потока новых публикаций мною отобраны лишь некоторые.
Приношу свою благодарность всем, кто помог мне в работе, за предоставление необходимой информации и конструктивную критику, а также за многочисленные предложения по улучшению качества книги и просмотр отдельных глав. Среди этих лиц особо должны быть упомянуты следующие коллеги: проф., д-р К. Аль- тендорф (Бохум), проф., д-р Э. К. Ф. Баутц (Гейдельберг), д-р Н. Блин (Чепел Хилл/Берлин), д-р X. Бюнеманн (Билефельд/Дюс- сельдорф), проф., д-р X. Бужар (Гейдельберг), А. Дрезель (Гейдельберг), д-р А. фон Габайн (Гейдельберг), проф., д-р Г. Гериш (Базель), проф., д-р В. Гёбель (Вюрцбург), приват-доцент, д-р Б. М. Йокуш (Гейдельберг), проф., д-р Э. Кольш (Мюнстер), д-р X. Г. Маннхерц (Гейдельберг), проф., д-р Г. Мельхерс (Тюбинген), приват-доцент, д-р Г. Михаелис (Билефельд), проф., д-р И. Ф. Нэгл (Питтсбург), проф., д-р В. Остертаг (Геттинген/Глаз-
го), д-р Э. Пратье (Билефельд), проф., д-р X. Г. Руппель (Билефельд), проф., д-р Ц. Шольтиссек (Гисен), приват-доцент Г. Шульц (Гейдельберг), приват-доцент, д-р В. Штретлинг (Гамбург), д-р Н. Штраусфельд (Гейдельберг), проф., д-р В Шибальски (Мэдисон), проф., д-р К. Вебер (Геттинген), проф., д-р X. Г. Виттман (Берлин). Благодарю также всех, кто предоставил в мое распоряжение оригиналы рисунков и разрешил использовать их в книге.
Выражаю признательность г-же X. Крсчмер за подготовку чистового экземпляра рукописи, г-ну К. Вайгелю за подготовку большей части штриховых рисунков, д-ру К. Ф. Шпрингеру и его сотрудникам, прежде всего д-ру Д. Чешлику и г-же Грёссль за традиционное участие в сотрудничестве, а также помощь и содействие в издании данной книги.
Билефельд, июль 1979 г. Петер Зенгбуш
ВВЕДЕНИЕ
«Можно наблюдать объект годами и не заметить в нем ничего, что было бы интересно в научном отношении. Чтобы сделать важное наблюдение, необходимо прежде всего уяснить себе, что следует наблюдать, а также иметь заранее составленное представление о возможных результатах. Продвижение науки вперед часто происходит тогда, когда перед нами раскрывается неведомая доселе сторона вешей, что обусловлено не столько применением какого-то нового метода, сколько рассмотрением объектов под другим углом зрения. При этом всегда руководствуются определенной идеей о том, какова может быть так называемая реальность. Она неизбежно включает в себя некую концепцию о неизвестном, т. е. о том, что лежит за пределами логически или экспериментально доказуемого». (Jacob, Evolution and Tinkering, 1977).
Биологическая наука — так же, как и любая другая наука,— является частью истории человеческой культуры. Во все времена люди задавали себе одни и те же вопросы и надеялись найти на них ответы на протяжении жизни своего поколения:
что такое жизнь?
как и когда появилась жизнь?
как возникло многообразие живой природы?
как развивается индивидуум?
что наследуется, как реализуется наследственность? на чем основывается «особое положение* человека?
Мы можем рассматривать все явления жизни в двух аспектах, которые кратко можно охарактеризовать как регуляцию и эволюцию.
Не бывает нерегулируемого роста, и нет такой нерегулируемой структуры, которая в течение длительного времени имела бы шансы на выживание. Все формы жизни следует рассматривать как продукты непрерывной эволюции. Заслугой философов досокра- товского периода было осознание того, что наш мир можно понять и объяснить с помощью наблюдений и здравых размышлений, без привлечения «метафизических», т. е. не постижимых разумом, сил. Исходя из этого, был сделан вывод о том, что необозримое многообразие вещей восходит к единому общему корню.
Натурфилософы из Милета не делали различий между живыми и неживыми объектами. Ксенофан рассматривал ископаемые как свидетельства исчезнувшего животного мира. Это наблюдение и его трактовка были в большей степени лишенными предрассудков и более правильными, чем представления, распространенные вплоть до XVII—XVIII вв., когда окаменелости считали неудач-
ными творениями или капризами природы. Эмпедокл выдвинул ростулат о том, что живые организмы возникли постепенно — сначала растения, затем простые и высшие животные и наконец человек. Не все организмы «удаются природе» одинаково хорошо. То, что не удается, уничтожается в процессе борьбы за существование. Таким образом, он уже точно сформулировал теорию отбора, как это сделал после него только Чарлз Дарвин. Афинская школа философов (Сократ, Платон, Аристотель) продолжила идеи своих предшественников. Платон пытался ввести систематику понятий. Он различал над- и подпонятия, а также исследовал вопрос о том, как из различных подпонятий с логической последовательностью можно вывести надпонятие и какие логические требования следует предъявлять к различению подпонятий и подчинению их надпонятню. Он ясно сознавал, какое значение его систематика понятий имеет для классификации организмов.
Подобная классификация приводит к иерархической системе организации, к пирамиде понятий. Аристотель воспринял логикоонтологические мировоззрение своего учителя Платона и дополнил его таким важным для его философии понятием, как категория «идей», которые он рассматривал как некую действительность или осуществление (энтелехию), стремящееся реализоваться в мировом порядке. Он считал, что одушевленные (живые) предметы обладают энтелехией более высокого уровня, чем неживые, а кристаллические вещества — более высокого уровня, чем аморфные. Растения — (только) живые; животные — живые и способны чувствовать; человек — живой, способен чувствовать и имеет душу. Наивысшую (нематериальную) ступень энтелехии образует божественный праразум. Для современной биологии наибольший интерес представляет работа Аристотеля «История животных». В ней он рассматривает тему, к которой через 1800 лет вновь возвратился швейцарский врач Гесснер. Аристотель описал свыше 500 видов животных и расположил их в определенном порядке, создав такую обоснованную систему классификации, что многие ее части можно найти и в современных порядках и классах.
В средние века столкновение различных концепций и взаимодействие между идеями христианства и духовными ценностями античности приводили к дискуссиям, длившимся столетиями и нашедшим свое наивысшее выражение в схоластике. Труды Аристотеля получили признание, и его высказывания считались неопровержимыми. Естественные науки не должны были вступать в противоречие ни с философией Аристотеля, ни с библейской историей творения. Преподавание и научные исследования не должны были выходить за традиционные, строго ограниченные рамки, вследствие чего в науке наступил застой. Постепенные изменения в этой системе взглядов произошли (вначале в Верхней Италии) в XIV в. с наступлением эпохи Возрождения.
1. Введение 131. Введение 13\
1. Введение 13
1. Введение 13
Люди больше узнали о функциях человеческого организма, познакомились с отдельными системами органов и поняли, что причиной многих заболеваний могут быть патологические изменения в определенных органах. XVIII и XIX вв. были отмечены расцветом современных естественных паук. Наряду с наблюдением появился эксперимент. Создание микроскопа в конце XVI и в начале XVII в. англичанином Р. Гуком (1635—1705) и голландцем А. Левенгуком (1632—1723) открыло новую эпоху в развитии биологической науки. Гук первый увидел «клетки», но лишь в 1838— 1839 гг. М. Шлейден и Т. Шванн, обобщив многочисленные накопленные к тому времени наблюдения, сформулировали клеточную теорию: все живые существа состоят из клеток. В 1855 г. Р. Вирхов выдвинул тезис «omnis cellula a cellula», объясняющий непрерывную связь клеточных поколений. В начале XX в. несколько раз переиздавался «Учебник общей биологии» О. Гертвига. Книга содержит в основном цитологические и гистологические данные и свидетельствует о том, что современное представление о строении тканей и органов было уже тогда четко сформулировано. Независимо от этого научного направления развивались исследования в области генетики и эволюции, которые еще в XIX в. нашли своих самых видных представителей в лице Грегора Менделя и Чарлза Дарвина. Наиболее значительное произведение Дарвина — книга «Происхождение видов путем естественного отбора, или сохранение благоприятствуемых пород в борьбе за жизнь» вышла в 1859 г. В этой книге и в последующих трудах Дарвина содержится множество наблюдений, которые он приводит в качестве доказательств естественного отбора. Но в его работах еще не было построено филогенетическое древо живых организмов. Приведем цитату из его статьи, опубликованной в 1858 г.:
«В природе повсеместно наблюдаются какие-то незначительные отклонения во всех ее частях, и, я думаю, можно показать, что изменение условий существования служит главной причиной того, что ребенок не является точной копией своих родителей...
... Естественный отбор сохраняет лучших. Если бы это было не так, то земля через несколько столетий не смогла бы вместить потомства даже одной-единствснной пары. Только очень немногие остаются жить, чтобы воспроизводить себе подобных».
Дарвин исходил из того, что признаки наследуются, но не имел четкого представления о механизме наследственности. Он разработал гипотезу о пангенезе, согласно которой зародышевые клетки являются резервуаром для частиц (зачатков признаков), поступающих туда из всех органов. Центральным и спорным пунктом гипотезы об отборе очень скоро стал вопрос о происхождении человека и его положении в природе. В 1859 г. Дарвин еще уклонялся от ответа на этот вопрос и писал лишь следующее:
14 1. Введение14 1. Введение/
14 1. Введение
14 1. Введение
«В далеком будущем я вижу широкое поле, открывающееся для еще более значительных исследований. Психология, безусловно, будет опираться на достаточно обоснованное положение Герберта Спенсера о том, что каждое свойство и каждая способность разума приобретаются лишь постепенно. Наука еще прольет свет на происхождение человечества и его историю».
В 1863 г. появился труд Т. Гексли «О положении человека в природе», из которого взята следующая, часто цитируемая мысль: «Анатомические различия между человеком и высшими обезьянами менее значительны, чем аналогичные различия между высшими и низшими обезьянами. Едва ли какая-либо другая часть тела иллюстрирует эту истину лучше, чем рука (или нога). И все же есть орган, изучение которого совсем уж неожиданно приводит нас к тому же выводу, — это мозг. Как будто природа на ярком примере хотела показать, что между человеком и обезьяной невозможно провести резкую границу, основанную на строении мозга. Действительно, все обезьяны наделены мозгом, который по своему развитию представляет почти непрерывный ряд — от форм, лишь ненамного превышающих уровень грызуна, до форм, стоящих немного ниже уровня человека».
Эрнст Геккель, профессор анатомии и зоологии в Йене, написал изданную в 1866 г. «Естественную историю миротворения», в которой он полностью поддержал дарвиновскую гипотезу об отборе н подкрепил ее множеством новых фактов из области физиологии развития, и прежде всего сравнительной анатомии. Он был первым, кто составил хорошо обоснованные родословные организмов, включив в них и человека. В своей аргументации он опирался на две группы данных:
Факты, касающиеся онтогенетического развития человека.
Результаты сравнения органов человека с гомологичными органами животных.
Последнюю группу данных он рассматривает особенно тщательно и, обобщая результаты, формулирует биогенетический закон: «Развитие зародыша представляет собой сокращенное повторение эволюционной истории данного организма, или, другими словами, онтогения — это краткое повторение филогении, или, несколько подробнее: последовательный ряд форм, образующихся при развитии организма от яйцеклетки до зрелого состояния, — это краткое, сжатое повторение длинного ряда форм, через которые предки данного организма (или предковые формы данного вида) прошли от древнейшего периода так называемого органического творения до настоящего времени. Причинная, или каузальная, природа отношений, связывающих историю развития индивидуального организма с историей развития его предковых форм, основана на явлениях наследственности и приспособляемости».
Против «биогенетического закона» высказывается ряд возра-
жений, \ак что, как нам сегодня представляется, правильнее говорить скорее о корреляции, нежели о законе. Основными физиологическими функциями, или проявлениями жизнедеятельности, Геккель считал 1) питание, 2) приспособление, 3) рост, 4) размножение, '5) наследственность, 6) разделение труда, 7) обратное развитие и 6) регенерацию.
Перечисленные явления часто используют как критерии для определения понятия «жизнь», однако при этом следует учесть, что они не равноценны (см. у Платона), так как имеют отнюдь не одинаковое значение для разных организмов.
НАСЛЕДСТВЕННОСТЬ
Учение о наследственности, или генетика, имеет богатую традициями историю, уходящую в далекое прошлое. Мендель не был ее основателем. Многое из того, что ему обычно приписывают, было известно и раньше. Новым же было следующее:
он скрещивал между собой не различные виды, как его предшественники, а сорта (расы) одного вида;
в своей работе он оперировал точными цифрами и понял значение абстракции: именно это и позволило ему сделать важные выводы;
он установил, что признаки наследуются независимо друг от друга.
Главная работа Менделя «Опыты над растительными гибридами» появилась в 1865 г., но оставалась незамеченной до 1900 г. Лишь после того как Корреис, де Фриз и Чермак пришли к выводам. сходным с результатами Менделя, значение этой работы было понято и она получила заслуженное признание. Одним из самых выдающихся представителей генетики начала века был фрейбург- ский зоолог А. Вейсман. Ему принадлежит гипотеза о зародышевой плазме; согласно этой гипотезе, в организме имеется два типа клеток — соматические и зародышевые, причем следующему поколению передаются только признаки, локализованные в зародышевых клетках. В 1904 г. в «Лекциях по эволюционной теории», написанных на основе курса, прочитанного во Фрейбурге, Вейсман обобщил научные данные из области генетики, которые были известны к началу XX в. Он, в частности, писал:
«Если мы вправе рассматривать хроматиновую субстанцию как субстанцию наследственности, то сразу становится ясно, насколько важно ее равномерное распределение, так как оно свидетельствует о том, что так называемый процесс оплодотворения есть соединение равных количеств отцовской и материнской наследственной субстанции».
«...Если бы каждая из сливающихся половых клеток имела полный набор хромосом, то в ядре должно было бы содержаться их двойное количество, и если бы это продолжалось дальше, то
число хромосом должно было бы увеличиваться из поколения в поколение в арифметической прогрессии и вскоре долДкно было бы стать чудовищно большим». /
«... Совершенно особый интерес представляет то обстоятельство, что это число всегда составляет половину числ^ хромосом, содержащихся в клетках тела данного животного, и 4to уменьшение числа хромосом наполовину как в мужских, так и в женских половых клетках происходит на стадии последних делений, которые предшествуют их созреванию».
«...Детерминант — это для нас нс что иное, как элемент зародышевой субстанции, от присутствия которого в зародыше зависит появление и специфическое формирование определенной части тела».
«Детерминанты — это нс какие-то гипотетические элементы, а нечто вполне реальное».
«... Венский физиолог Эрнст Брюкке уже 40 лет назад обосновал положение о том, что живая субстанция не может быть просто скоплением химических молекул, но что она должна быть «организована», т. е. состоять из мельчайших невидимых живых единиц. Если предположить, что механистическая теория жизни правильна, если не существует жизненной силы в том смысле, как ее понимали натурфилософы, то положение Брюкке не подлежит сомнению, поскольку случайное скопление молекул, так же как одиночная молекула, не может вызвать никаких проявлений жизни, потому что молекулы, как известно, не живут, не растут и самостоятельно не движутся. Следовательно, жизнь может возникнуть лишь при определенном соединении различных молекул и из таких определенных групп молекул должна состоять всякая живая субстанция».
«... Обычная химическая молекула не может размножаться делением; если же она расщепляется под действием каких-то сил, то при этом она распадается на совершенно другие молекулы. Лишь живая молекула обладает удивительным свойством расти, а затем делиться на две половинки, сходные между собой и с исходной молекулой; отсюда становится ясно, что здесь тоже должны действовать силы притяжения и отталкивания, т. е. сродство. Я не знаю, почему бы нам не постулировать наличия таких сил, а также нс предположить, что сотни атомов, из которых, по современным представлениям, состоит молекула белка и которые определяют ее тип, сохраняют специфическую, чрезвычайно сложную структуру благодаря сродству. Или нам следует считать, что есть абсолютная граница между комплексом атомов в молекуле и следующими, более высокими комплексами — биофорами, детерминантами и хромосомами, предполагая, что в последних комплексах действуют совершенно иные силы? Ведь, в конце концов, биофор— это лишь группа молекул, а детерминант — группа биофоров».
Как\видно из этих высказываний, Вейсман понял, что разгадку тайны наследственности следует искать в молекулах. Но должно было пройти еще полвека, прежде чем наука приблизилась к решению данной проблемы. В своем развитии генетика прошла фазу интенсивных исследований, названную «классической генетикой», которая дала множество новых научных результатов: были детально проанализированы хромосомные структуры, открыты группы сцепления генов, построены первые генетические карты, объяснены отклонения от правил Менделя, доказано существование плейотропных эффектов, мутаций и мутагенных факторов. Все это привело к тому, что ученые начали задавать себе вопросы:
что такое ген?
как происходит накопление генетической информации?
как она реализуется?
Для фундаментальных исследований в области генетики решающее значение имеют выбор подходящего объекта и правильная постановка проблемы. Уже Мендель превосходил в этом вопросе своих предшественников. В 1911 г. в качестве нового объекта исследований впервые использовали дрозофилу. В тридцатые годы было начато изучение плесневого гриба нейроспоры и вскоре после этого —бактерий и вирусов. Главными причинами выбора этих объектов были, как всегда, их короткий жизненный цикл, возможность работать с большим числом особей, удобство использования в эксперименте.
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА: НОВАЯ БИОЛОГИЯ?
Человеческий разум, как и природа, не делает скачков в своем развитии. Начало молекулярной генетики приходится не па 1953 г., когда Уотсон и Крик представили свою модель ДНК, и не на 1944 г., когда Эвери, Мак-Лсод и Мак-Карти показали, что ДНК служит носителем генетической информации. Предпосылкой для понимания процессов наследственности на молекулярном уровне послужили данные, полученные при изучении болезней обмена. Примерно в 1908 г. английский врач Гэррод обнаружил, что алкаптонурия (болезнь, при которой моча приобретает темный цвет) передается по наследству. Тем самым было доказано, что процессы обмена веществ (биохимические реакции в живых организмах) тоже наследуются, как и все другие известные в настоящее время фенотипические признаки. В период между 1930 и 1950 гг. были выяснены главные пути обмена веществ в организмах, причем оказалось, что решающие этапы и последовательности биосинтетических реакций (гликолиз, цитратный цикл, синтез аминокислот, синтез нуклеотидов и др.) у микроорганизмов (про- и эукариот), растений и животные- приблизительно одинаковы. Отсюда можно 2—200/1 ^Ч,-^;.
сделать вывод о том, что эволюция путей обмена веществ' в значительной степени закончилась на стадии прокариот и что с тех пор (если не принимать во внимание второстепенные пути обмена) изменилось лишь немногое. С выдвижением гипотезы один ген — один фермент (Beadle, Tatum, 1941; Horowitz, 1948) была установлена взаимосвязь между генетикой и биохимией. Использование биохимических мутантов оказалось эффективным и многообещающим методом выяснения отдельных этапов обмена веществ и получения желаемых продуктов обмена.
Без данных, кратко изложенных выше, и без достижений, описанных в предыдущих разделах, не было бы и молекулярной генетики. В первой половине XX в. объектами биохимических исследований были почти исключительно малые молекулы. Молекулярная биология и современная биохимия занимаются макромолекулами, и для понимания их функций необходимо знание так называемых слабых взаимодействий (водородные связи, ионные взаимодействия, вамдерваальсовы силы и др.). Они были неизвестны Вейсману. Эти взаимодействия, благодаря которым удерживаются вместе компоненты надмолекулярных комплексов и клеток, обусловливают специфичность последних и несут ответственность за матричную функцию макромолекул. Успехи молекулярной генетики основаны не только на использовании биохимических методов. Решающее значение имело и имеет применение физических и физико-химических методов и принципов. Следует отметить, что молекулярная генетика тоже прошла несколько стадий развития и многие из научных результатов (представленных в многочисленных учебниках) могут уже считаться классическими.
В 1950-е и 1960-е гг. стала известна детальная структура генетического материала. Было получено окончательно доказательство того, что генетическая информация заключена в линейной нуклеотидной последовательности ДНК. Модель Уотсона — Крика наглядно показала, каким образом происходит репликация ДНК. Было установлено, что передача информации идет в направлении от ДНК к РНК и далее к белку и осуществляется с помощью механизмов, обозначаемых как «транскрипция» и «трансляция». Был разгадан генетический код, причем выяснилось, что генетическая информация используется организмами чрезвычайно экономно. В конце 60-х годов наступил период всеобщей успокоенности, и многие считали, что главные проблемы молекулярной генетики уже решены. Эти настроения нашли свое выражение в известной формуле: «То, что верно для Escherichia coli, верно и для слона». Однако такой прогноз оказался неправильным. Семидесятые годы принесли много неожиданностей. Большая часть того, что будет обсуждаться в следующих главах, основывается на результатах, полученных в последние годы. Было установлено, что у эукариот многие процессы происходят совсем по-другому, чем у прокариот.
Эукариоты обладают более тонкими регуляторными механизмами, имеющими гораздо более разнообразные формы, чем это представлялось ранее. В результате развития молекулярной генетики появились молекулярная биология и клеточная биология. Началось изучение эмбрионального развития на молекулярном уровне, причем было показано, что в основе дифференцировки лежит последовательное включение различных генов. В связи с этим возник вопрос, на который до сих пор еше не найдено удовлетворительного ответа: Каким образом регулируется активность генов? Мы знаем, что ДНК вирусов и бактерий получают многочисленные сигналы, определяющие интенсивность транскрипции, но нам почти ничего не известно о таких сигналах у эукариот. Транскрипция ДНК ведет к образованию РНК. Но эта РНК, в особенности у эукариот, далеко еще не готовый продукт. С концов и из середины ее молекулы вырезаются определенные участки, модифицируются многие основания и к обоим концам присоединяются добавочные группы нуклеотидов. Транскрипция находится под воздействием многочисленных регуляторов внутри- и внеклеточного происхождения. Решающее значение для регуляции транскрипции, как и для всех других регуляторных процессов, происходящих в клетке (и между клетками), имеют концентрации как самих участников реакции, так и других молекул и ионов. Только что синтезированные белки в необработанном виде редко представляют собой способные к функционированию единицы. После синтеза они претерпевают различные изменения: во многих случаях с концов или из середины их молекул удаляются определенные участки, модифицируются отдельные аминокислоты и с помощью ковалентных или нековалентных связей к белкам присоединяются кофакторы.
Сложные процессы происходят только в сложных структурах. Мембраны, рибосомы, митохондрии, сократительные элементы и другие структуры представляют собой системы, состоящие из множества макромолекул (часто различных классов), удерживаемых вместе под действием слабых, но многочисленных связей. Сейчас дебаты ведутся уже не о том, что это за молекулы, а о том. каким образом отдельные молекулы взаимодействуют между собой, как они расположены по отношению друг к другу и в каких количествах они встречаются в тех или иных структурах. Макромолекулы в олигомерных комплексах ведут себя как кооперативные системы.
Чтобы понимать процессы, происходящие внутри клетки, необходимо изучить поведение молекул в надмолекулярных структурах. Кооперативное взаимодействие молекул —одна из предпосылок осуществления таких процессов, которые невозможны при наличии разрозненных молекул (например, фотосинтез, дыхание, биосинтез белков, специфическое взаимное распознавание клеток 2*
Таблица 1.1
Примерный химические состав делящейся клетки Escherichia coli (WatSon, 1975)
Компонент
Содержание, %
Средняя молекулярная масса
Среднее число молекул на клетку
Число различных видов молекул
ню
Неорганические ноны
(Na+, К+, Mgi+, Cai+, Fe2*, С1“, РО?-, S<2- и т.д.)
Углеводы и их предшественники Аминокислоты и их предшественники Нуклеотиды и их предшественники Липиды и их предшественники Другие небольшие молекулы (гем, хиноны, продукты распада)
Белки
ДНК
РНК
165-рРНК
235-рРНК тРНК мРНК
70 1
3
0,4
0,4 2
0,2
15
1
6
18
40
150
120 300 750
150
40000 2,5-10*
500 000
1000 000
25 000 1000 000
4-Ю1» 2,5108
2-10®
3-10’
1,2-10’ 2,5-10’
1,5-10’ 10»
4
3-10*
3-10*
4-10» 108
1
20
200
100
200
50
250 2000—3000
1
1
1
60
1000
и др.). Просто устроенных клеток не существует. Даже кишечная палочка (Escherichia coli'), которая с точки зрения генетики и биохимии изучена лучше всех других организмов, имеет довольно сложное молекулярное строение. В табл. 1 приведены сведения о типах и количестве молекул, содержащихся в этой бактериальной клетке. Таблица дает лишь самое общее представление о химизме клетки, поскольку в ней не указано, как распределены молекулы, какие превращения они претерпевают, какова способность клетки к биосинтезу. Клетки Escherichia coli растут быстро. Время генерации в благоприятных условиях составляет у них около 20 мин. В табл. 1.2 представлены данные об интенсивности биосинтеза в бактериальной клетке. Из них видно, что основная часть энергии расходуется на образование белков. Позднее мы увидим, что биосинтез белков —чрезвычайно сложный процесс, регулируемый с помощью многочисленных механизмов. Главные затраты клеточных ресурсов связаны с регуляцией. Вместе с тем следует отметить, что все биосинтетические процессы в клетке зависят от точного функционирования белков (ферментов).
Биологическая наука лишь в редких случаях занимается чисто теоретическими проблемами. Как правило, она всегда тесно связана с медицинской наукой. После того как ученые в какой-то степени разобрались в том, что собой представляет клетка Escherichia coll, был поставлен вопрос об изучении клеток человека. Были разработаны методы, позволяющие культивировать in vitro клетки любого происхождения и выращивать их как микроорганизмы. Полученные с их помощью результаты в равной мере важны для онкологических и вирусологических исследований, для физиологии развития, а также для изучения проблем эволюции.
Таблица 1.2
Биосинтетическая активность бактериальной клетки1*
Компонент
Сухая масс», %
Примерная мол. масса
Число молекул на клетку
Число молекул, синтезируемых за 1 с
Число молекул АТФ, необходимых для синтеза
Доля всея энергии, затрачиваемо! на биосинтез, %
ДНК
5
2 000 000 000
1
0,00083
60 000
2,5
РНК
10
1000 000
15 000
12,5
75 000
3,1
Белок
70
60 000
1700 000
1400
2 120 000
88,0
Липиды
10
1000
15 000 000
12500
87 500
3,7
Полисахариды
5
200 000
39000
32,5
65 000
2,7
') Клетка Escherichia coll имеет размеры 1X1X3 мкм. объем 2,26 мим", сырую массу 10-10-“ г и сухую массу 2.5-КН* г. Указанные показатели биосинтеза относятся к одному поколению бактерия (время генерации —20 мин).
Сложность живых организмов
Чем сложнее организм, тем больше генетической информации он содержит. У мелких вирусов может быть всего 3 гена, а у человека их 50 000. Недавно открытые вироиды, в происхождении и функционировании которых еще много неясного (см. гл. 46), состоят из одной молекулы нуклеиновой кислоты (РНК), содержащей меньше информации, чем требуется для одного гена. Количество ДНК не следует приравнивать к количеству генетической информации. Значительная часть ДНК эукариот (организмов с истинным клеточным ядром) представлена повторяющимися последовательностями, не несущими информации. Есть ряд предположений относительно их значения, но вопрос пока остается неясным (см. гл. би 10). У эукариот носитель информации (ДНК) и исполнительные механизмы (биосинтез белков, обмен веществ) пространственно отделены друг от друга (первый находится в ядре, последние —в цитоплазме). Тот же принцип лежит в основе конструирования и использования компьютеров.
Генетическую информацию можно сравнить с рабочим чертежом, но в ДНК закодированы также «указания» о том, как, когда и с какой эффективностью следует использовать эту информацию. Чем больше объем информации, тем труднее при делении клетки распределить ее поровну между двумя дочерними клетками и использовать упорядоченным образом. Из этого следует, что для регуляции того или иного процесса необходимо множество регуляторных механизмов. Процессам регуляции свойственна специфичность, которая может быть обеспечена только при участии белков. Вопрос о том, каким образом белки взаимодействуют с нуклеотидными последовательностями ДНК (или РНК), относится к важнейшим, но далеко еще не решенным проблемам молекулярной биологии. Как было сказано выше, гены приводятся в действие в определенной последовательности. В результате этого, во-первых, включаются необратимые процессы и, во-вторых, устанавливается определенная иерархия событий.
Многоклеточные организмы используют свою генетическую информацию в различных клетках по-разному. Взаимодействие между клетками требует наличия специфических сигналов на поверхности клеток, с помощью которых одна клетка распознает другую как «свою» пли «несвою», что соответственно обеспечивает или исключает межклеточную кооперацию. Развитие многоклеточного организма основано па последовательном получении таких сигналов, а они в свою очередь обусловлены последовательным включением разных групп генов. При этом речь идет не столько о смене одной генетической программы другой, третьей и т. д., сколько о смещении равновесия в ту или иную сторону. Один ген или одна группа генов начинают проявляться сильнее, чем раньше, тогда как другой или другие снижают свою активность. Развитие (онтогенез) многоклеточного организма можно, таким образом, рассматривать как реализацию генетических программ, обнаруживающих чрезвычайно высокую степень гибкости. Лишь у очень примитивных одноклеточных и многоклеточных организмов все происходит по строго детерминированной схеме. Брюшной ганглий нематоды Caenorhabditis elegans, например, состоит из 58 нейронов. На ранней стадии ее развития закладывается первичный ганглий из 15 нейронов. На дальнейших стадиях развития последовательно вводятся остальные 43 нейрона. Судьба каждой отдельной клетки при этом предопределена заранее. В некоторых случаях запрограммирована даже гибель той или иной клетки (см. гл. 70). Кроме подтверждения уже упоминавшейся иерархии событий этот пример указывает на то, что на стадии эмбрионального развития действует несколько программ (в данном случае две), продукты которых так тесно связываются между собой, что в дальнейшем уже невозможно проследить происхождение образовавшихся клеток. Развитие «высших» многоклеточных организмов
более пластично. Одни клетки могут заменять другие. Зачаток органа начинает формироваться не из отдельной клетки, а из группы клеток (клона). Факторы окружающей среды воздействуют на развивающийся организм модифицирующим образом, причем поврежденные ткани могут восстанавливаться (в определенных пределах). Окончательно сформировавшийся организм (его фенотип) следует рассматривать как продукт генотипа и внешних факторов, действовавших в процессе онтогенеза. Следовательно, чтобы предсказать весь ход развития индивидуума, недостаточно знать его генотип — нужно еще знать, в каких условиях он будет развиваться. Внешние воздействия могут быть переработаны и «накоплены», а это опять-таки происходит на различных уровнях иерархической организации клетки или многоклеточного организма. К наиболее сложным механизмам переработки информации у многоклеточных относятся иммунная система (см. гл. 66—68) и нервная система (см. гл. 70). Накопление и использование информации, поступающей извне, называют обучением (научением). Способность к отбору усвоенной информации присуща интеллекту (Intelligenz), а образование из этой информации новых комбинаций лежит в основе мышления. Предпосылкой научения и оценки усвоенного является достаточный объем хранилища информации (достаточно большое число нейронов). Приблизительное число нейронов и способы их соединения между собой в значительной мере определяются наследственностью. Напротив, то, что «усваивается», время и способы усвоения, а также использование «усвоенного» материала заранее не определены. Здесь можно провести сравнение с игрой в шахматы. В ней имеется лишь несколько общеизвестных правил. Но одного знания этих правил далеко не достаточно, чтобы выиграть шахматную партию! Число возможных вариантов невероятно велико, и необходимо научиться предугадывать ходы противника, чтобы согласовывать собственную тактику со стратегией другого игрока.
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ И ЭВОЛЮЦИЯ
Молекулярная биология в узком смысле изучает, как мы уже говорили в предыдущем разделе, механизмы хранения и экспрессии (выражения) генетической информации. Чем проще объект исследования, тем больше можно рассчитывать па успешное разрешение поставленной проблемы.
Изучение эволюции идет в противоположном направлении. Здесь ставятся вопросы о том, как возникли генетические программы, определяющие развитие клетки Е. coll, многоклеточного растения или многоклеточного животного. Для решения вопросов эволюции необходимо накопить большой фактический материал.
Исследователь пытается свести его в упорядоченную систему; он выясняет отношения родства между организмами и строит родословное древо. Работа в этих направлениях (систематика и изучение филогенеза) привела к выводу о том, что эволюция действительно имела место, но мало прояснила в вопросе о том, каков был ее ход, почему одни линии эволюции оказались более удачными, чем другие, и по какой причине эволюция разных линий различается по скорости (иногда на 5 порядков величины).
В 1949 г. Дельбрюк указал на то, что в биологии —в противоположность физике—нет абсолютных проблем, так как все явления связаны во времени и в пространстве. Каждое животное, растение или микроорганизм не что иное, как звено в цепи изменяющихся в процессе эволюции форм, ни одна из которых не остается неизменной. Нет такой структуры или функции, которые можно было бы до конца понять без знания исторического фона.
Основой эволюции служат изменения, но не каждое изменение— это эволюция. В качестве примера неэволюционных изменений можно привести периодически (циклически) повторяющиеся события. Хотя эволюция и направленна, но направленность не всегда означает прогресс, так как нередко это путь специализации, во многих случаях заводящий в тупик. Считают, что 99,9% всех линий развития привели к вымиранию соответствующих видов. Основу эволюционных изменений составляют изменения частот аллелей в генофонде популяции. Источником возникновения фенотипического многообразия следует считать не мутации, а скорее рекомбинации генов.
Все организмы подвергаются отбору под действием окружающей среды, поэтому фенотип, как правило, представляет собой компромисс между противоречивыми требованиями окружающей среды.
Э. Майр выдвинул в 1954 г. постулат о том, что главным условием видообразования является прекращение обмена генами (например, изоляция небольшой части популяции). В этой части популяции устанавливается иное соотношение аллелей, нежели во всей популяции. Новое положение дел ведет к цепной реакции. В присутствии определенных аллелей в одном локусе в другом локусе какие-то иные аллели занимают главенствующее положение. Носители этих аллелей получают преимущество. Со временем различия между такими особями и потомством исходной «остаточной популяции» становятся настолько значительными, что члены обеих популяций уже не узнают друг друга и не спариваются между собой, так что можно говорить о двух видах.
Де Фриз и Бэтсон в начале века предполагали, что новые виды возникают в результате «больших мутаций». После того как стала известна природа генетической информации, механизм мутирования и то, что один ген определяет один белок, от этой
концепции отказались. Сегодня, вероятно, следует быть немного осторожнее. Мы уже знаем, что перегруппировка генетической информации оказывает решающее влияние на скорость эволюции систематических групп. Группы, которым эволюция благоприятствовала, такие, как птицы и млекопитающие, отличаются большим разнообразием числа хромосом у разных видов (см. гл. 6). Виды менее благоприятствуемых групп, например бесхвостые амфибии (лягушки), имеют почти одинаковое число хромосом. Эти данные свидетельствуют о том, что эволюция основана не на приобретении новых генов и новых белков, а на изменениях в регуляции генной активности, связанных с перекомбинированием имеющихся генов (см. гл. 17). Здесь также можно провести хотя бы частичное сравнение между эволюцией и эмбриональным развитием (онтогенезом). Как упоминалось в предыдущем разделе, во время эмбрионального развития главную роль играют сдвиги в относительной активности генов.
Что характерно для живой системы?
Каждая живая система, существующая сегодня (и, конечно, существовавшая в прежние времена), содержит белки, обладающие свойствами катализаторов, и нуклеиновые кислоты, играющие роль носителей информации. Эйген (Eigen, 1971) обобщил все данные молекулярной биологии и разработал гипотезу эволюции, согласно которой зарождение жизни — это не что иное, как процесс самосборки. Ни белки, ни нуклеиновые кислоты по отдельности не могут развиться в живые системы. Лишь взаимодействие между этими двумя классами молекул приводит к возникновению свойств, характерных для живой системы. Важным элементом такого взаимодействия является «инструкция» для построения новых молекул и контроль за правильностью этого процесса. Но отсюда следует также, что должны существовать рост, размножение и отбор. Чтобы противостоять давлению отбора, система должна обладать хотя бы минимумом стабильности, что невозможно при наличии лишь одного циклического процесса. Стабильность возникает только при специфическом объединении нескольких циклических процессов. Образующийся при этом «гиперцикл» (рис. 1.1 и 1.2) представляет собой ранний предшественник клетки.
Эволюция происходит лишь в том случае, если система делает «ошибки» и если эти «ошибки» в данных условиях отбора оказываются полезными. Частота ошибок не должна быть слишком велика, так как в большинстве случаев они, безусловно, приводят к появлению менее жизнеспособных форм, которые раньше или позже обречены на вымирание.
Каковы возможности простых систем? Генетическая инфор-
Рис. 1.1. Иерархия циклических, связанных между собой в сложную сеть последовательностей химических реакций (химическое превращение—►каталитическая активность). /. Катализаторы (ферменты Е) осуществляют последовательные реакции (пример: цикл лимонной кислоты). 2. Автокатализ (самовоспроизволящпяся система). Один из ферментов (Е.) катализирует образование второго фермента (Ез), который в свою очередь катализирует образование третьего и т. л. Наконец фермент Е„ катализирует образование первого фермента Еь Тем самым круг замыкается. 3. Каталитический гиперцикл. Каждый автокаталитический процесс обусловливает осуществление последующего. Сам по себе гиперцикл также является автокаталитическим (Fiegen, Schuster, 1977).
Рис. 1.2. Модель гиперцикла второго порядка. Носитель информации Ii выполняет две инструктивные функции: свою собственную репликацию и образование Е|. Еь в свою очередь катализирует образование следующего носителя информации. Реакции протекают в определенной последовательности (Eigen, Schuster, 1977).Рис. 1.2. Модель гиперцикла второго порядка. Носитель информации Ii выполняет две инструктивные функции: свою собственную репликацию и образование Е|. Еь в свою очередь катализирует образование следующего носителя информации. Реакции протекают в определенной последовательности (Eigen, Schuster, 1977).
Рис. 1.2. Модель гиперцикла второго порядка. Носитель информации Ii выполняет две инструктивные функции: свою собственную репликацию и образование Е|. Еь в свою очередь катализирует образование следующего носителя информации. Реакции протекают в определенной последовательности (Eigen, Schuster, 1977).
Рис. 1.2. Модель гиперцикла второго порядка. Носитель информации Ii выполняет две инструктивные функции: свою собственную репликацию и образование Е|. Еь в свою очередь катализирует образование следующего носителя информации. Реакции протекают в определенной последовательности (Eigen, Schuster, 1977).
нация многих мелких вирусов записана в форме одноцепочечной РНК. Она редко содержит более 5000—7000 нуклеотидов. По всей вероятности, механизмы, контролирующие репликацию у таких вирусов, недостаточно эффективны для того, чтобы обеспечить безошибочное копирование более крупной молекулы РНК. ДНК — это, как правило, двухцепочечная молекула, что само по себе обеспечивает дополнительный контроль репликации. Механизмы репликации и репарации ДНК сложнее, чем механизмы реплика-
ции РНК. Поэтому даже очень крупные молекулы ДНК могут быть удвеены более или менее безошибочно. Но и здесь существуют ограничения. Прокариоты редко содержат в своем геноме более 106 пар оснований. Они обычно гаплоидны. Эукариоты имеют обширные геномы и, как правило, диплоидны, причем у них есть дополнительные механизмы, которые сводят к минимуму процент ошибок при репликации (например, распределение информации между несколькими молекулами благодаря наличию нескольких хромосом).
Что необходимо для образования примитивной клетки? Для этого нужно, чтобы были выполнены два условия:
обособление от окружающей среды и
наличие энергетического обмена.
Энергетический обмен также развивается в сторону постоянного повышения эффективности. Энергия (химическая или световая) улавливается клеткой и накапливается в ней в форме ковалентных химических связей или конформационных изменений более крупных молекул. Уже на ранних этапах эволюции появились цепи переноса электронов и возникло взаимодействие между ионами тяжелых металлов (прежде всего Fe), нуклеотидами и фосфат- ионами:
Х^РН-Р, ^ Х-|-Р~Р,X-P+ADP ^ Х + АТР.
Фосфор отличается от других встречающихся в живых системах элементов (С, S, N) тем, что при физиологических условиях он не восстанавливается.
После того как тот или иной механизм был однажды испытан, он уже не подвергается дальнейшим изменениям и сохраняется в первоначальном состоянии. Природа чрезвычайно консервативна; в случае же необходимости изменения могут происходить на более высоких уровнях. Мы уже отмечали, что главные пути обмена веществ приблизительно одинаковы у всех организмов.
Специализированные клетки эукариотических организмов характеризуются прежде всего тем, что гены для большинства ферментов в них репрессированы (их активность подавлена) и поэтому большая часть метаболических путей не функционирует. Многоклеточный организм может существовать лишь в том случае, если входящие в него клетки взаимосвязаны и обмениваются информацией. Мы уже знаем, что в этих процессах чрезвычайно важную роль играют мембраны, идет ли речь о распознавании соседних клеток как «своих» или «несвоих» или о приеме внешних сигналов, которые затем усиливаются и передаются дальше внутрь клетки либо игнорируются. Чем сложнее организм, тем сложнее все эти взаимодействия. Благодаря результатам, полученным классической
Сине-зеленые OodopotutuSpirulina ВебирсклиВысшие ристенш ХлорошестыСине-зеленые OodopotutuSpirulina ВебирсклиВысшие ристенш Хлорошесты&MWPUU&MWPUURhodmeudomonasRhodmeudomonasPncillusPncillusДыханиеДыханиеДупликация цитохромов тина сДупликация цитохромов тина с— Дупликация ферредтсина— Дупликация ферредтсинаДназробнми фотосинтез при участии хлорофиллаДназробнми фотосинтез при участии хлорофиллаФотосинтез с бывежнисм UpФотосинтез с бывежнисм UpАэробные бактерии PseudomonasАэробные бактерии PseudomonasАэробные фотосинтезирующиеАэробные фотосинтезирующиеSuccharomycesSuccharomycesАнаэробныеClostridium '«'-'«JWHАнаэробныеClostridium '«'-'«JWHРТитохондрии Млеко- Высшие питающие рестени*РТитохондрии Млеко- Высшие питающие рестени*Факцлыпитибно-Факцлыпитибно-а.Шныеа.Шныебактериибактерииtschrrichuitschrrichuiбукариотоб Плекопитиншцие
Сине-зеленые Oodopotutu
Spirulina Вебирскли
Высшие ристенш Хлорошесты
Сине-зеленые Oodopotutu
Spirulina Вебирскли
Высшие ристенш Хлорошесты
&MWPUU
&MWPUU
Rhodmeudomonas
Rhodmeudomonas
Pncillus
Pncillus
Дыхание
Дыхание
Дупликация цитохромов тина с
Дупликация цитохромов тина с
— Дупликация ферредтсина
— Дупликация ферредтсина
Дназробнми фотосинтез при участии хлорофилла
Дназробнми фотосинтез при участии хлорофилла
Фотосинтез с бывежнисм Up
Фотосинтез с бывежнисм Up
Аэробные бактерии Pseudomonas
Аэробные бактерии Pseudomonas
Аэробные фотосинтезирующие
Аэробные фотосинтезирующие
Succharomyces
Succharomyces
Анаэробные
Clostridium '«'-'«JWH
Анаэробные
Clostridium '«'-'«JWH
РТитохондрии Млеко- Высшие питающие рестени*
РТитохондрии Млеко- Высшие питающие рестени*
Факцлыпитибно-
Факцлыпитибно-
а.Шные
а.Шные
бактерии
бактерии
tschrrichui
tschrrichui
ВысшиерастенияВысшиерастенияАнаэробные сулофитреРуциругощилбактерии'
Высшиерастения
Высшиерастения
Besaiforil’iiu
Анаэрнбные фото-
сбЬтЛОипсинтезирующие бак-
Сб13нииИин1 терии
Днаэробнее брожение
Рис. 1.3. Эволюция хлоропластов, митохондрий, аэробных и анаэробных бактерий, а также эукариотических клеток. Родословное древо составлено на основе данных молекулярной биологии (методические подробности см. в гл. 15—17). Ферредоксин — это «древний», связывающий железо белок, который встречается у всех организмов. Цитохром с представляет собой белок, участвующий в дыхательной цепи. Он обнаружен у всех организмов, живущих в аэробных условиях. 5S-pPHK — составная часть рибосом, встречающаяся у всех организмов (у эукариот 5S-pPHK находится не только в цитоплазме, но и в хлоропластах, и в митохондриях). Названные белки и 5S-pPHK являются главными компонентами живых клеток. По своей структуре они в большей или меньшей степени различаются у разных групп организмов. Различия могут быть использованы в качестве маркеров, отмечающих те изменения генетической информации, которые произошли в процессе эволюции. Путем сравнения указанных компонентов можно определить родственные отношения между организмами. В результате обобщения данных получают приведенное выше родословное древо. Высокая степень гомологии между последовательностями нуклеотидов в органеллах и в бактериях служит веским подтверждением эндосимбиотической гипотезы (см. в тексте) (Schwartz, Dayhoff, 1978).
биологией, мы имеем относительно хорошее представление об эволюционных взаимоотношениях животных и растений. Использование данных молекулярной биологии позволяет проанализировать эволюционные отношения и в тех случаях, когда это невозможна сделать с помощью обычных методов (рис. 1.3).
Между эукариотами и прокариотами, казалось бы, лежит непреодолимая пропасть. Эукариотические клетки крупнее и содержат митохондрии (а растительные клетки также и хлоропласты). Существует предположение, что эти органеллы произошли от эндосимбионтов. Многие данные подтверждают это предположение, но есть и такие, которые противоречат ему.
Органеллы, по крайней мере отчасти, генетически автономны. Их геном действует совместно с геномом ядра. В последние годы было обнаружено, что имеются «прыгающие» гены, т. е. гены, изменяющие свое положение в геноме. Это явление можно привлечь в качестве объяснения тех результатов, которые не поддаются интерпретации на основе классических представлений. Наши знания о молекулярных процессах в клетке все больше и больше расширяются. Поэтому в последующих главах мы можем рассмотреть лишь небольшую часть всех известных нам данных. Как и любой другой, наш учебник, несмотря на его объем, все же представляет собой только введение в молекулярную и клеточную биологию. Слишком многие вопросы остаются открытыми, и потому говорить о завершенности еще рано. Многие из проблем могут быть решены с помощью методов, известных нам уже сегодня, и в ряде случаев — это только вопрос времени. Но мы не знаем, какие новые неожиданности принесут нам ближайшие годы.
ЛИТЕРАТУРА
Arlstoteies. 1957. Tierkunde (dtsch. Ubersetzung), Paderborn, Schoningh.
Avery О. T., MacLeod С. M., McCarty M. (1944). Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of Pneumococcal types: Inductiton of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from Pneumococcus type 111, J. Exp. Med., 79.137.
Beadle G. M.. Tatum E. L. (1941). Genetic control of biochemical reactions io Neurospora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 27, 499.
Darwin C. 1859. The origin of species by means of natural selection or the preservation of favoured races in the struggle of life; Deutsch: 1976. Die Entstehung der Arlen, Stuttgart: Reclam 3071—3080.
Eigen M. (1971). Selforganization of matter and the evolution of biological macromolecules, Naturwissenschaften, 58, 465.
Eigen M., Schuster P. (1977). The Hypercycle, Naturwissenschaften, 64, 541.
Eigen M„ Schuster P. (1978). The Hypercycle, Naturwissenschaften, 65, 341.
Haeckel E. (1868). Natiirliche Schopfungsgeschichte, 11. Aufl. Berlin, Reimer, 1909. Horowitz N. H. (1948). The one gene—one enzyme hypothesis, Genetics, 33, 612. Jacob F. (1977). Evolution and tinkering, Science., 196, 1161.
Magdefrau K. 1973. Geschichte der Botanik, Stuttgart, Gustav Fischer.
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
Электронная микрофотография расправленной молекулы ДНК Escherichia colLМолекула ДНК образует многочисленные сходные по структуре петли (см. гл. 2).В некоторых местах видны отходящие в стороны боковые нити РНК—продуктытранскрипции. (Фото Н. Delius, 1974.)
Эта вступительная глава содержит лишь краткий обзор проблем, связанных с исследованием нуклеиновых кислот. Многие из затронутых здесь тем будут подробно обсуждаться в следующих главах.
ДНК—НОСИТЕЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ
Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) является носителем генетической информации, которая, однако, заключена нс во всех нуклеотидных последовательностях данной молекулы ДНК. Так, ДНК из клеток эукариот (клеток с истинным ядром) содержит нуклеотидные последовательности, лишенные какой-либо генетической информации, причем сегодня мы еще не можем с уверенностью сказать, какова их истинная роль. Кроме того, в ДНК есть большое число так называемых сигнальных последовательностей, предназначенных для инициации и терминации процессов репликации (см. гл. 8), транскрипции (см. гл. 9 и 10) и трансляции (см. гл. 38). Помимо этого, имеются нуклеотидные последовательности, которые служат для связывания специфических активирующих и ингибирующих регуляторных молекул (см. гл. 19), и, наконец, модифицированные области, защищающие молекулу от действия нуклеаз. Широко распространено представление о том, что один ген содержит информацию о структуре одного фермента (белка). Как мы увидим позже, это слишком упрощенное представление, так как известно, например, что у ряда вирусов на одном и том же участке генома закодировано несколько белков, а также что у эукариот некоторые гены распределены по разным участкам молекулы ДНК.
В 1953 г. Уотсон и Крик создали модель двойной спирали ДНК, и поначалу казалось, что проблема структуры ДНК разрешена. Однако это было верно лишь отчасти. Для того чтобы всесторонне охарактеризовать молекулу ДНК, следует использовать ряд параметров. Прежде всего необходимо знать ее молекулярную массу, а также нуклеотидный состав (см. гл. 3) и последовательность оснований (см. гл. 4). Наконец возникает вопрос о том, представляет ли ДНК одно- или двухцепочечную структуру и существует ли она в виде линейных или кольцевых молекул (табл. 2.1).
Геном некоторых вирусов (фаги 0X174, fd и др.) представлен одноцепочечпой ДНК- Часто встречаются кольцевые молекулы ДНК. Они обнаружены во многих вирусах и прокариотах, в органеллах (митохондриях и хлоропластах; см. гл. 43 и 44) и ядре эукариот (амплифицированная ДНК, см. гл. 42; кольцевая ДНК с диаметром 2 мкм, см. гл. И). Кольцевые молекулы, как правило, закручиваются сами на себя, образуя суперспиральные моле-
Таблица 2.1
, Размеры и конформация ДНК (Adams et aL, 1976)
ГИсточник
Мол. масса
Длина
Число нуклеотидных пар
Конформация
- Bscherichia coli
1,9-10*
1 ММ
3-10"
Кольцевая двух-
Haemophilus influ-
8-10»
300 мкм
1,2-10»
цепочечная
То же
enzae
Mycoplasma PPLO,
410"
150 мкм
6-10»
>
штамм H-39
Бактериофаг T4
1,3-10=
50 мкм
2-105
Линейная двухцепочечная
Бактериофаг X
3,3-107
13 мкм
5-10»
То же
Бактериофаг 0X174
1,6 10»
0,6 мкм
_1)
Кольцевая одноцепочечная
Вирус 110ЛИ0МЫ
3-10*
1,1 мкм
4,6-10»
Кольцевая двухцепочечная
Мнтохонцриаль-
9,5-i0«
5 мкм
1,4-10*
То же
мая ДНК (мышь)
Drosophila melano- gaster
4,3-1010
2 см
6,5-101
Линейная двухцепочечная
Коэффициенты пересчета.
молекулярная масса нары оснований равна 660:
I мкм ДНК—3000 пар оснований (мол. масса 1,9-10*>.
'* Нельзя говорить о числе нуклеотидных пар в одноцепочечной ДНК. Молекула содержит 5386 нуклеотидов.
кулы с супервигками (рис. 2.1). Такая суперспиральная молекула может перейти в открытую (релаксированную) кольцевую форму путем разрыва одной из цепей. Переход суперспиральной ДНК в открытую кольцевую молекулу является необходимым этапом процесса репликации.
Две полинуклеотидные цепи в модели двойной спирали Уотсона— Крика расположены антипараллельно, причем они обвивают друг друга, образуя правую спираль. Без раскручивания они не могут разойтись между собой (плектонемическая спираль). Цепи удерживаются вместе благодаря образованию трех водородных связей между гуанином (G) и цитозином (С) и двух водородных связей между аденином (А) и тимином (Т). Однако стабильность двойной спирали в основном определяется взаимодействием расположенных параллельно л-электроиных систем оснований, а не водородными связями. В данном случае говорят об энергии стэ- кинг-взанмодействия (Eigen, Porschke, 1970).
На поверхности молекулы ДНК имеются две четко выраженные бороздки (желобки) — большая и малая (рис. 2.2, А). Их
3—2094
образование обусловлено тем, что именно пары оснований, а не связанные с ними сахарофосфатные остатки располагаются непосредственно друг против друга. ДНК может существовать в трех различных конформациях (А, В и С). В-форма в соответствии с моделью Уотсона — Крика является наиболее часто встречающейся и стабильной конформацией в водной среде. Ее основная особенность заключается в том, что пары оснований расположены перпендикулярно длинной оси спирали. Обнаружена также А-фор- ма ДНК- Она отличается от В-формы углом наклона пар оснований к оси спирали (70°), шагом спирали и числом пар оснований на виток спирали (рис. 2.2,5). А-конформация наблюдается в двухцепочечных РНК и в гибридных молекулах ДНК —РНК, так как дополнительная гидроксильная группа у атома С2' остатка рибозы препятствует образованию В-конформации.
Рис. 2.1. ДНК, выделенная из плазмиды рМ L21 (мол. масса 7,42- 10е, 11 200 пар оснований, длина 3,6 мкм; более подробно о плазмидах см. в гл. 11). Наряду с кольцевыми и суперспиральными молекулами (три изображены полностью, а одна частично) можно видеть также и линейные молекулы. Замыкание молекулы ДНК в кольцо неизбежно приводит к закручиванию двойной спирали ДНК вокруг самой себя и образованию суперспирали. «Открытые» кольцевые молекулы возникают в результате одного одноцепочечного разрыва; Х24 900 (Stflber, Heidelberg, 1979).
—isA—
Л6
Рис. 2.2. Двойная спираль ДНК. А. В-конформация (модель Уотсона — Крика; Watson, Crick, 1953). Б. А-коиформация (Fuller et al., 1965, воспроизводится из работа Harbers et al., 1968).
Линейная ДНК в клетке не имеет форму вытянутой молекулы, как можно было бы думать на основании электронно-микроскопических исследований, а существует в виде более или менее беспорядочного клубка. Такое состояние термодинамически выгодно и предотвращает деградацию длинной молекулы. Чтобы под электронным микроскопом ДНК приобрела вид линейной молекулы, препарат ДНК должен быть соответствующим образом приготовлен. В 1959 г. Клайншмидт и др. (Kleinschmidt et al., 1959) создали метод, в котором для растягивания молекул ДНК на подложке использовали белковую пленку. В 1974 г. Делиусу и Уор- селу (Delius, Worcel, 1974) с помощью этой методики удалось увидеть интактную молекулу ДНК из Escherichia coll (см. рисунок на титульном листе к этому разделу). Эта молекула содержит суперспиральные участки. Она образует 12—80 петель и прикреплена к мембране. Помимо ДНК на электронной микрофотографии видны многочисленные молекулы РНК разной длины, образовавшиеся при транскрипции и частично еще связанные с ДНК. Эти молекулы РНК вместе с белками обусловливают укладку молекул ДНК с образованием определенного числа петель (Worcel, Burgi, 1972; см. также рис. 2.3). В течение долгого времени считалось, что
Рис. 2.3. Модель конденсированной бактериальной хромосомы. Стадии А—В наглядно поясняют процесс конденсации под действием белка и РНК. Двойная спираль (Л) находится в ненапряженной (релаксированной) форме. Это состояние предполагает существование по крайней мере одного одноцепочечного разрыва. В результате обработки ДНКазой (введение одноцепочечных разрывов) конденсированная ДНК частично релаксирует (Д). обработка же РНКазой приводит к уменьшению степени конденсации (Г; Pettijohn, Hecht, 1973). Эти данные подтверждают модель Ворсела и Буржи (Worcel, Burgi, 1972).
спираль ДНК является жесткой и неизменной структурой. Сейчас известно, что это не так и что ДНК представляет собой динамичную и легко модифицируемую структуру. При репликации и транскрипций, например, происходит нарушение водородных связей. Этот процесс называется плавлением.
Под электронным микроскопом расплавленные области в ДНК имеют форму «вилок» или «пузырей» (см. рис. 6.8). Двухцепочечная ДНК более жесткая, чем одноцепочечная. Поэтому на электронных микрофотографиях расплавленная область ДНК, где цепи разделены, выглядит как свободная, относительно гибкая структура.
В последние годы накапливается все больше данных о существовании «прыгающих генов», т. е. таких участков ДНК, которые из одних мест генома могут перемещаться в другие (см. гл. 13). Процессы встраивания и выщепления генов контролируются специфическими белками, способными узнавать определенные последовательности в ДНК. В этой связи интересны так называемые палиндромные последовательности в ДНК, представляющие собой обращенные повторы, т. е. нуклеотидные последовательности, замыкающиеся сами на себя и образующие структуры, похожие на шпильки (палиндромы; рис. 2.4). Следовательно, они обладают
Рис. 2.4. Обращенные повторы двух типов. Каждый из них состоит из 2р нуклеотидов (?)), которые должны связаться друг с другом с помощью водородных связей, чтобы образовывать палиндромную структуру (6). 1— повторы не разделены неповторяющимися последовательностями. 2 —повторы разделены нсповто- ряюшейся последовательностью (XYZ), которая имеет длину, равную / нуклеотидам (/ — от англ, turp — поворот). Видно, что в обоих случаях в вершине палиндрома остаются неспаренными несколько оснований (Hamer, Thomas, 1974).
вращательной симметрией второго порядка и поэтому в обоих направлениях читаются одинаковым образом.
Широко распространены короткие палиндромные последовательности, представляющие собой области узнавания для рестрик- таз (см. гл. 20) и большинства регуляторных белков (см. гл. 19). Длинные палиндромы, содержащие 300—1200 пар оснований, пока обнаружены лишь в ДНК эукариот (Drosophila, Xenopus, человек).
Катенаны (структуры, имеющие форму цепей). Обнаружено, что кольцевые молекулы ДНК ряда вирусов (SV40, 0X174), а также митохондрий связаны друг с другом, как звенья одной цепи. Значение таких структур не вполне ясно, и даже возможно, что во многих случаях речь идет об артефактах, возникающих в результате ошибочного процесса репликации.
Сложность молекулы ДНК. ДНК — полинуклеотид, состоящий из определенной последовательности оснований. В простейшем
случае мы имеем дело со статистическим распределением оснований, в котором на первый взгляд отсутствуют какие-либо законо-
мерности:
CTTCGATACTAG GAAGCTATGATC 2. CAGAT
GTCTA
Молекула (1) длиннее, чем молекула (2), поэтому ее сложность больше. Наряду с этими простыми случаями обнаружены повторяющиеся последовательности (повторяющиеся единицы):
CTTCGA CTTCGA CTTCGA GAAGCT GAAGCT GAAGCT
Существуют также повторяющиеся последовательности, прерываемые уникальными последовательностями:
CTTCGA ATGCA CTTCGA CTTCGA GAAGCT TACGT GAAGCT GAAGCT
Выявлены случаи, когда различные типы повторяющихся последовательностей чередуются с уникальными последовательностями: 5. CTTCGA CTTCGA AGCAT TTGCA TTGCA
GAAGCT GAAGCT TCGTA AACGT AACGA
Кроме того, встречаются последовательности, повторяющиеся в обратном порядке (обращенные повторы):
CTTCGA TCGAAG
GAAGCT AGCTTC,
а также обращенные повторы, прерываемые уникальными последовательностями:
CTTCG AAGCAG CGAAG
GAAGC TTCGTC GCTTC
GC-GC-Повторяющиеся последовательности (повторяющиеся единицы) могут быть различной длины. Сложность молекулы ДНК может быть определена с помощью экспериментов по денатурации и ре- натурацни. При нагревании (денатурации) ДНК плавится, что сопровождается разрывом водородных связей между парами оснований. Как уже говорилось, стабильность двойной спирали в основном определяется энергией стэкинг-взанмодействия, а не числом водородных связей, причем наиболее сильное стэкинг-взаимо- действие возникает между GC-парами ^9 (или QpQ ), более слабое—между 9?^ и самое слабое—между . При этом тем-
GC-
GC-
пература плавления молекулы ДНК прямо пропорциональна содержанию. Процесс плавления (превращение двухцепочечной молекулы в одноцепочечную) осуществляется в более или менее широком температурном интервале (рис. 2.5). Середина кривой плавления обозначается как Т’т.При этой температуре 50% всех
водородных связей в молекуле ДНК оказываются разорванными.
ТтТтРис. 2.5. Кривая денатурации ДПК тимуса теленка (кривая плавления). Тш — температура плавления (Marmur, Doty, 1962).Рис. 2.5. Кривая денатурации ДПК тимуса теленка (кривая плавления). Тш — температура плавления (Marmur, Doty, 1962).
Тт
Тт
Рис. 2.5. Кривая денатурации ДПК тимуса теленка (кривая плавления). Тш — температура плавления (Marmur, Doty, 1962).
Рис. 2.5. Кривая денатурации ДПК тимуса теленка (кривая плавления). Тш — температура плавления (Marmur, Doty, 1962).
Как следует из рис. 2.5, процесс плавления легко прослеживается спектрофотометрическим методом, так как пары оснований, расположенные в двухцепочечной молекуле стопкой и повернутые друг относительно друга на 36°, поглощают меньше УФ-света, чем статистически неупорядоченные основания в одноцепочечном клубке. Денатурированная ДНК может снова ренатурироваться (Doty, Marmur, Eigner, Schildkraut, 1957),
Скорость ренатурации решающим образом зависит от концентрации различных последовательностей ДНК в растворе. Например, если к денатурированной ДНК Е. coll добавить равное количество денатурированной ДНК мыши, то концентрация ДНК в растворе хотя и увеличится, но сложность смеси при этом также возрастет, так как концентрация комплементарных последовательностей ДНК Е. coll в данном случае не изменится.
Какой вид имеет кинетика процесса ренатурации? Скорость реакции (V) может быть определена из следующего соотношения:
V—T=^'
где с —концентрация одноцепочечной ДНК в растворе, а к — константа скорости ренатурации. Преобразовав это соотношение, получим следующее уравнение:
Проанализировав его
с-Чс=J Mi.с-Чс=J Mi.оо
с-Чс=J Mi.
с-Чс=J Mi.
о
о
Рис. 2.6. Кинетическая кривая идеальной реакции второго порядка, объясняющая процесс рспатурацяи ДНК (график Со/). Доля одноцепочечной ДНК в каждый произвольно выбранный момент времени описывается указанным на графике уравнением (Britten, Kohne, 1968).
при граничных условиях
(=0;с=с0;
t—i; с=С,
(с0 — концентрация одноцепочечной ДНК в момент времени / —0), получим
Умножим обе части уравнения на с0:
^- = 14-ktcQ;
обратное выражение имеет вид с ] Со 1 + Ае«< ■
Экспериментальные данные есть смысл представлять именно в такой форме (Со^-график; рис. 2.6).
Принимая, что с—-g-Co, получим
2 " 1 + йс»/ ’ откуда
^</ = 1,
и, следовательно,
Итак, зная значение t, при котором 50% одноцепочечной ДНК ренатурируется, можно определить скорость и константу скорости ренатурации (6). Для ДНК Е. coll при стандартных условиях (0,18 MNa+ 60 °C)
А=0,25М-’с-\
где М означает молярность в расчете на пару оснований (1). Для всего генома Е. coli, содержащего 3-106 пар оснований, константа скорости будет равна
6 = 0,75- Ю'М-^Л
Это значение часто используют в качестве стандарта при выяснении размера генома неизвестного образца методом ренатурации. Основное преимущество данного метода заключается в том, что его можно применить не только для интактных молекул ДНК, но и для фрагментов. В гл. 3 мы еще увидим, что выделить длинную интактную молекулу ДНК чрезвычайно трудно. При ренатурации две цепи в интактной форме вызывают процесс нуклеации. Образование спирали после нуклеации (узнавания) происходит настолько быстро, что его невозможно обнаружить с помощью анализа кинетики процесса. Во фрагментированном геноме концентрация комплементарных последовательностей остается той же и поэтому скорость реакции не изменяется. Следовательно, концентрация последовательностей определяет частоту успешных актов нуклеации. Для геномов разных размеров получаются четко отличающиеся друг от друга кинетические кривые (рис. 2.7). Ана-
Нумсотибдае m/»i
Рис. 2.7. Кинетика реассоциации расплавленной ДНК из разных источников. Рисунок наглядно демонстрирует зависимость величины Cot от сложности генома (выраженной числом пар оснований). Эукариотическая ДНК дает двухступенчатую кинетическую кривую реассоциации (более подробно об этом см. в гл. 6; Britten, Kohne, 1968).
лиз ДНК эукариот показывает, что ее можно разделить (в среднем) на две фракции: быстро ренатурирующуюся и медленно ре- натурирующуюся. Ниже (гл. 6) мы увидим, что именно геном эукариот в основном состоит, во-первых, из так называемых повторяющихся последовательностей, т. е. фрагментов, встречающихся в геноме много раз, и, во-вторых, из уникальных последовательностей, т. е. последовательностей, встречающихся только один раз.
РНК ВЫПОЛНЯЕТ МНОЖЕСТВО ФУНКЦИЙ
Рибонуклеиновая кислота (РНК) также может быть носителем генетической информаций, что имеет место, например, у ряда вирусов: вируса табачной мозаики (ВТМ), вируса гриппа, многих опухолеродных вирусов, у некоторых мелких бактериофагов, таких, как Qp, R17, fr, MS2 и др. Во всех перечисленных случаях РНК существует в виде одноцепочечной структуры, образуя короткоживущие комплементарные цепи лишь в процессе репликации. Выделенная на этой стадии РНК представляет собой двухцепочечный промежуточный продукт (подробнее об этом см. гл. 46). Геномы некоторых мелких вирусов, таких, например, как вирус раневой опухоли, представлен двухцепочечными молекулами РНК. РНК всегда находится в A-форме или других сходных формах.
Каждая клетка содержит молекулы РНК, которые по своим функциям и структуре могут быть подразделены на различные классы: а) мРНК (матричная РНК); гяРНК (гетерогенная ядер- ная РНК); б) рРНК (рибосомная РНК); с) тРНК (транспортная РНК).
Клеточная РНК всегда возникает как первичный продукт транскрипции, т. е. информация для ее образования считывается с ДНК. После транскрипции РНК подвергается процессингу, при котором молекула РНК дробится на короткие фрагменты; отдельные основания модифицируются с помощью ферментов, а к 3'- и 5'-концам могут присоединяться дополнительные нуклеотиды.
мРНК используется для биосинтеза белков. Она представляет собой копию некоторой части генетической информации, и для се функции особое значение имеет первичная структура (последовательность оснований).
Скорость синтеза РНК в ядрах эукариотических клеток чрезвычайно велика. Продукт транскрипции, сильно гетерогенный по длине, получил название гяРНК. Только небольшая часть этой фракции РНК покидает ядро и связывается в цитоплазме с поли- сомами как мРНК (см. гл. 10). Значение гяРНК полностью еще не выяснено. Существует предположение о том, что она служит исключительно в качестве резервуара нуклеотидных оснований, так как известно, что переход от мономеров к полимеру ведет к падению осмотической активности молекулы, поскольку величина осмотического давления пропорциональна молярности содержа-
1-метилитшн1-метилитшн1-мспшлы/ажоин1-мспшлы/ажоинН2-Зи*апыгубьвзинН2-Зи*апыгубьвзинРис. eg «Редкие* основания; компоненты тРНК.Рис. eg «Редкие* основания; компоненты тРНК.
1-метилитшн
1-метилитшн
1-мспшлы/ажоин
1-мспшлы/ажоин
Н2-Зи*апыгубьвзин
Н2-Зи*апыгубьвзин
Рис. eg «Редкие* основания; компоненты тРНК.
Рис. eg «Редкие* основания; компоненты тРНК.
шихся в клетке веществ. Рибосомная РНК (рРНК) является в основном структурным элементом. Она непосредственно участвует в специфическом взаимодействии с рибосомными белками. Следовательно, ее нуклеотидная последовательность не содержит информации о белках. Определенные участки рРНК связываются с мРНК, которая своим 5'-концом прикрепляется к рибосоме; более подробно об этом см. гл. 37.
Взаимодействие между рРНК и мРНК осуществляется в результате специфического спаривания оснований. Менсе ясно, каким образом взаимодействуют между собой нуклеиновые кислоты и белки. В настоящий момент едва ли существуют данные, позволяющие точно сказать, благодаря какому специфическому взаимодействию происходит их связывание и как они располагаются в пространстве относительно друг друга.
тРНК (транспортная РНК) играет роль адаптера в биосинтезе белков. Такую функцию могут выполнять лишь те молекулы, которые имеют вполне определенные вторичную и третичную структуры.
Мы уже видели, что ОН-группа в 2'-положении рибозного остатка препятствует образованию спирали Уотсона—Крика (В-фор- ма). В-форма является оптимальной, если нужная генетическая
сн3
Рис. 2.9. Различные типы водородных связей в дрожжевой тРНКРЬе. Аналогичная структура постулирована и для других видов тРНК- Черные кружки означают соответствующие С-Г остатков рибозы. Помимо пар оснований в тРНК существуют триплеты оснований. тРНКРЬе означает, что эта тРНК связывает аминокислоту фенилаланин (Phe; Kim et al., 1974).
информация считывается в виде линейной последовательности нуклеотидов. A-форма легко модифицируется с образованием различных вариантов вторичной и третичной структур. Дополнительная ОН-группа влияет на стабильность структуры, так как она обеспечивает возникновение водородных связей с соседними парами оснований. тРНК и рРНК содержат так называемые «редкие», или, точнее, «модифицированные», основания. Наиболее известные из них приведены на рис. 2.8.
Наряду со спариванием по Уотсону — Крику (A=U и G=C) в рибонуклеиновых кислотах, и прежде всего в тРНК, обнаружен ряд необычных типов спаривания, наиболее важные из которых представлены на рис. 2.9.
Для выяснения вторичной и третичной структур РНК применяются различные методы. До сих пор в кристаллическом виде получена только тРНК. Данные о структуре молекулы получают рентгенографическим методом (см. гл. 15) из так называемых фазовых диаграмм, благодаря тому что рентгеновские лучи рассеиваются не на кристалле, а на пучке молекул, уложенных в виде параллельных волокон. Точная структура пар оснований, и в первую очередь расстояния между атомами, а также длины
водородных связей, устанавливается вначале на кристаллах мононуклеотидов.
РНК может образовывать не только двойные, но и тройные спирали. Вероятность возникновения этих форм и условия, обеспечивающие их стабильность, выяснены при изучении синтетических полинуклеотидов, например poly (A), poly (С), polyU и др.
Модифицированные основания в тРНК выполняют различные функции. Льюис и Амес (Lewis, Ames, 1972) обнаружили мутант бактерии Salmonella, у которого в молекуле тРНК для аминокислоты гистидина стоит U вместо V (псевдоуридин). Такая мутация в тРНК приводит к тому, что последняя утрачивает способность принимать участие в регуляции синтеза белка, хотя адапторная функция при этом не нарушается. Ватанабе и др. (Watanabe et at, 1976) обнаружили, что термостабильность тРНК из термофильной бактерии Т. thermophilus зависит от содержания в ней 5-метил-2- тиоурацила.
Как мы уже говорили, ДНК содержит обращенные повторы, способные образовывать палиндромы. Тем не менее попытки увидеть под электронным микроскопом молекулы ДНК с подобной структурой оказались тщетными, так как они, вероятно, образуются лишь на определенных стадиях активности, на которых такие структуры стабилизируются с помощью белков. В случае РНК дело обстоит иначе. Здесь короткие палиндромы — преобладающие структурные элементы. В связи с этим возникают следующие вопросы: а) какова минимальная длина палиндрома? б) какова вероятность образования палиндромов?
Длина палиндрома зависит от его стабильности, а стабильность в свою очередь — от образования правильных водородных связей и от энергии кооперативного стэкинг-взаимодействия. Для возникновения достаточно стабильной двойной спирали необходимо существование, самое меньшее, трех, а лучше четырех расположенных рядом пар оснований.
В 1972 г. Эйген рассчитал, что для образования четырех пар оснований достаточно статистической последовательности из 16 оснований, ибо вероятность такого образования равна xUxxU- При этом полинуклеотидная цепь может замыкаться сама на себя (формирование «шпилечной» структуры), образуя петлю из 4—5 неспаренных оснований. Отсюда следует, что РНК обладает постоянной вторичной структурой при наличии участков, состоящих в среднем из 20 или более пар оснований.Так как тРНК содержит в среднем около 80 нуклеотидов (от 71 до 94 в зависимости от вида и происхождения тРНК)» такая молекула складывается наподобие «клеверного листа» с четырьмя лопастями (ветвями), в каждой из которых находится около 20 нуклеотидов (рис. 2.10). Более длинные молекулы РНК содержат большее число таких палиндромов
С,5
pG
С-петля
тАС l^GUG
я011
BJ3 •m’C.o
Акцепторам банк
ГФС - петлл
GWA С А С
В®
G
TV С-пени»и
С А С А ^.д д и U O0G С А С СЪА:
П-псяДл^ й®0
C^U
G за 63 ВЙ
АнтикДнобаяпочли
° U 6о„г-'С U А, С G CG IР
G?o
Й;
К- г и-и
С:с
Й-.
С
G
КЗ
U-S2
Git
Акцспториа банк . i
А
G
А
Ст
U
Gm
ит’С40
V
А
а35 А
Рис. 2.10. Нуклеотидная последовательность дрожжевой тРНКрь'. Основания, обведенные рамкой и заштрихованные, обнаружены также и в других типах тРНК прокариот. Водородные связи, стабилизирующие вторичную структуру, отмечены точками, а водородные связи, стабилизирующие третичную структуру, — линиями. Слева изображена «структура клеверного листа», справа показано,'что петли D и ТфС расположены рядом друг с другом (Kim et al., 1974).
или петель, структура которых по предложению Фирса и др. (Fiers et al, 1976) названа структурой «цветка» (рис. 2.11).
В 1965 г. Холли удалось впервые определить последовательность оснований в тРНК. На основе полученных данных была постулирована структура «клеверного листа». Все определенные с тех пор последовательности тРНК (около 70) подтверждают эту основную схему. Встречающиеся в некоторых случаях дополнительные основания могут складываться в короткую пятую ветвь.
Четыре ветви тРНК обозначаются следующим образом: анти- кодоновая петля, D-петля, ТЧ'С-петля, САА-ствол (САА-ветвь).
Обозначение «D-петля» указывает на то, что в тРНК имеется два дигидроуридиновых остатка; ТТС-петля всегда содержит псевдоуридин, а САА-ветвь имеет неспаренные 5'- и З'-концы.
В последнее время тРНК были закристаллизованы во многих лабораториях. Исследование третичной структуры было проведено в лабораториях Рича (Massachusetts Institute of Technology, Cambrige, USA) и Клуга (Medical Research Council, Laboratory of Molecular Biology, Cambrige, England).
Рис. 2.11. Вторичная структура (структура «цветка») одного из участков РНК фага MS2. Общая длина РНК этого фага равна 3569 основаниям (Fiera et а!., 1976).
После устранения ошибок, допущенных первоначально при интерпретации модели тРНК, ее структура может быть описана следующим образом:
Молекула по своим внешним очертаниям напоминает букву L.
Модель «клеверного листа», предложенная для объяснения вторичной структуры тРНК, сохраняется.
САА-ветвь и Т^С-петля образуют длинное колено буквы L, а D-петля и антикодоновая петля — короткое.
На одном конце буквы L находится З'-конец молекулы, а на другом — антикодон. Угол буквы L образован дигидроуридиновым остатком и ТФС-петлей.
Молекула имеет в толщину около 22 А, а длина обоих ее колен составляет от 70 до 73 А.
Из общего числа оснований, содержащихся в двух коленах молекулы, все, кроме пяти, фиксированы друг под другом благо: даря стэкинг-взаимодействию. Неспаренными остаются основа-
ния D16, D17, G20, U47, А76. (Буквы обозначают основания, а цифры — их положение в нуклеотидной последовательности.)
Все спирали имеют А-конформацию.
Существует восемь типов взаимодействий между основаниями, участвующих в формировании третичной структуры и обнаруженных во всех исследованных до сих пор тРНК: U8-A14; G15-C48; G18-4f55; G19-C56; G26-A44; Т54-А58. Кроме того, встречаются два триплета оснований: U12-A23-A9 и C13-G22- G46 (см. рис. 2.9).
ВЫДЕЛЕНИЕ
И ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Основная проблема выделения нуклеиновых кислот заключается в получении клеток и отделении нуклеиновых кислот от связанных с ними белков и других клеточных компонентов. Помимо очистки нуклеиновых кислот от нежелательных компонентов, следует обратить внимание на то, что сами нуклеиновые кислоты требуют исключительно осторожного обращения, так как они чрезвычайно чувствительны к действию нуклеаз и гидродинамических сил. Прежде всего необходимо разрушить клетки, для чего существует целый ряд методов: замораживание и оттаивание, разрушение осмотическим шоком или с помощью ферментов, воздействие лизирующими агентами, такими, как детергенты и др., а также механическое разрушение (обработка в гомогенизаторе или ультразвуковом дезинтеграторе) и т. д.
Из гомогената нуклеиновые кислоты можно выделить двумя методами. Часто их комбинируют и в процессе очистки используют последовательно друг за другом. В одном из них, возрожденном в 1956 г. Шраммом, применяется экстракция фенолом. Этот метод основан на том, что в двухфазной системе вода/фенол белки выпадают в осадок, тогда как нуклеиновые кислоты и углеводы при определенных концентрациях соли и значениях pH полностью остаются в водной фазе в неповрежденном состоянии. Во втором методе, развитом Мармуром (Marmur, 1961), используются системы хлороформ/изоамиловый спирт и хлороформ/октан. В этом случае также образуются две фазы — водный раствор и органический растворитель. Нуклеиновые кислоты остаются в водной фазе, в то время как другие денатурированные макромолекулы собираются на границе между фазами. Применение протеиназы К привело к существенному улучшению методов выделения нуклеиновых кислот. Этот фермент очень быстро разрушает белки даже в присутствии детергентов, в результате чего действие нуклеаз подавляется и выход высокомолекулярной ДНК значительно повышается.
Выделение ДНК из бактериальных клеток с помощью типичного метода происходит следующим образом.
Клетки суспендируют в буфере, содержащем NaCl и ЭДТА. ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) представляет собой хелатобразующий агент, связывающий двухвалентные катионы. Так как двухвалентные катионы активируют фермент ДНКазу, в присутствии ЭДТА его активность подавляется. Затем для разрушения клеточных стенок добавляют лизоцим, а для растворения клеточных мембран и белков — детергент додецилсульфат натрия с протеиназой К. Эту реакцию лучше всего проводить при повышенной температуре (~50°С). Добавление перхлората натрия к охлажденному лизату приводит к диссоциации продуктов распада.
Для отделения нуклеиновых кислот (и полисахаридов) от остальных компонентов смеси к ней добавляют равный объем хлороформа, смешанного с изоамиловым спиртом (24:1). Разделение фаз проводят с помощью центрифугирования, причем фазу органического растворителя отбрасывают, а водную фазу подвергают дальнейшей обработке. Нуклеиновые кислоты осаждают этанолом, а затем снова растворяют в буфере с добавлением рибонуклеазы и fi-амилазы (первой — для расщепления РНК, а второй — для расщепления поли- и олигосахаридов).
При повторной обработке фенолом удаляются все оставшиеся примеси. Нуклеиновую кислоту, переходящую при этом в водную фазу, вновь осаждают спиртом и растворяют в буфере. После диализа получают чистый препарат ДНК. Чистота препарата может быть проверена фотометрически. ДНК имеет максимум поглощения при Х=260 нм и минимум при Л = 230 нм. У белков максимум поглощения соответствует 280 нм (рис. 3.1). Только тогда, когда отношение A26o/A28o> 1.8, можно быть уверенным в том, что полученный препарат очищен от белка. По описанной методике получают ДНК с мол. массой от 10- 10е до 50- 10s.
Если к препарату ДНК предъявляют более высокие требования, то метод следует модифицировать. Блин и Стэффорд (ВНп, Stafford, 1976) разработали метод получения высокомолекулярной ДНК (мол. масса 200-10е) из тканей животных. Они замораживали небольшие кусочки ткани в жидком азоте и гомогенизировали их в замороженном состоянии. После испарения азота оставался порошок, который обрабатывали в буфере протеиназой К, медленно
I 6
22 0 240 26С 280 300 320 340 Длину балны. нм
мИпим/™Уры Уф-П°™ощеяия белка (бычий сывороточный альбумин, БСА) и днк (ДНК тимуса теленка). Концентрации: БСА —0,250 мг/мл; ДНК — 0,025 мг/мл. Толщина кюветы — 1 см.
Рис. 3.2. Бромистый этидий.
перемешивая при этом реакционную смесь. Затем добавляли фенол. Водную и фенольную фазы разделяли центрифугированием. Водную фазу собирали, но не с помощью пипетки, так как всасывание пипеткой приводит к нежелательной фрагментации ДНК. После этого препарат диализовали против буфера с ЭДТА.
У про- и эукариот практически невозможно выделить неповрежденные молекулы ДНК. При всех, лаже самых совершенных, методиках выделения получаются фрагментированные молекулы ДНК. которые в дальнейшем под действием гидродинамических сил дробятся на еще более мелкие фрагменты. Только из вирусов, органелл (митохондрий, хлоропластов) и бактерий (плазмид) можно получить неповрежденные (инфекционно-активные) молекулы ДНК в больших количествах. Кроме того, интактную ДНК легко выделить в чистом виде из источников, в которых она представлена в виде суперспиральных молекул. По сравнению с другими формами суперспиральная ДНК связывает меньшее количество такого интеркалирующего красителя, как бромистый этидий (формулу см. на рис. 3.2), поэтому при определенных условиях она образует в градиенте плотности CsCl дискретные полосы с более высокой плавучей плотностью (Radioff, Bauer, Vinograd, 1967).
ВЫДЕЛЕНИЕ РНК
В принципе методы выделения РНК и ДНК сходны между собой, но, разумеется, в каждом случае используются разные исходные материалы и условия проведения реакций соответственно изменяются. рРНК лучше всего выделять прямо из рибосом, мРНК— из полисом, а тРНК — из растворимой цитоплазматической фракции, ядер, митохондрий, рибосом и т. д. с помощью центрифугирования. Как правило, молекулы РНК, имеющие форму клубка, короче, чем молекулы ДНК, и поэтому при выделении интактной РНК возникает меньше проблем. Одним из основных препятствий служат вездесущие РНКазы, активность которых может быть снижена с помощью ингибиторов, правильно выбранных буферов и величины pH. В данном случае целесообразно добавление ДНКаз и двухвалентных ионов, так как необходимо избавиться от ДНК.
мРНК из клеток эукариот обычно содержит на З'-конце последо- пательность poly (А)' (см. гл. 10). Это позволяет отделить содержащие poly (Л) РНК от остальной РНК с помощью колоночной хроматографии. Если в качестве носителя в колонке используют poly(T), то РНК, несущие poly (А), будут специфически связываться с таким носителем.
ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Описанные методы дают возможность получать «чистые» препараты нуклеиновых кислот, однако при этом не снимается вопрос о гетерогенности внутри данного класса молекул.
Гомогенный препарат можно выделить только при использовании гомогенного исходного продукта; например, из вируса табачной мозаики (ВТМ) выделяют гомогенную ВТМ-РНК, из бактериофага fd — чистую fd-ДНК и т. д. Однако из рибосом получают < месь из трех (или четырех) типов РНК. Для дальнейшего фракционирования выделенных препаратов служит ряд дополнительных методов. Нуклеиновые кислоты отличаются друг от друга в основном размерами, вторичной структурой и нуклеотидным составом.
Различающиеся но своим размерам (молекулярным массам) нуклеиновые кислоты обычно разделяют с помощью центрифугирования. Рибосомы прокариот, например, содержат 5S-, 16S- и 235-рРНК, что указывает на возможность эффективного разделения этих молекул путем центрифугирования (рис. 3.3).
Еще один удобный метод разделения — гель-фильтрация, при- а В Г
Рис. 3.3. разделение 28S-, 18S- и 4S-PHK путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. А. Создание градиента. Б. Наслаивание смеси РНК. В. Центрифугирование. Г. Собирание фракций. Д. Идентификация фракций.
Таблица 3.1
GC-содержание ДНК (Schildkraut, Marmur, Doty, 1962; Kit, 1963)
Источник
GC. %
Dictyostelium (миксомицет)
Вирус вакцины
Psammechinus militaris (морской еж)
Bacillus cereus
Bacillus megaterium
Haemophilus influenzae
Saccharomyces cereoisiae
Печень человека
Тимус теленка
Печень крысы
Drosophila melanogasier
Зародыш пшеницы
Печень мыши, сперма лосося
Bacillus subtilis
Бактериофаг Т1
Escherichia coll
Бактериофаг Т7
Neurospora crassa
Pseudomonas aeruginosa
Sarcina lutea
Micrococcus lysodelkilcus (=M. luteus)
Вирус простого герпеса Mycobacterium phiel
22
34
36
37
38
39
39
39
40
40
42
43
44
44
46
51
51
54
68
72
72
72
73
чем обычно используют гели из полиакриламида или производных декстрана (торговые обозначения: сефадекс, биогель и т. д.), в порах которых мелкие молекулы задерживаются легче, чем крупные. В результате на кривой элюции сначала появляются пики, соответствующие крупным молекулам, а затем мелким. Естественно, что хорошее разделение получается лишь в том случае, когда молекулы резко различаются размерами.
Одно- и двухцепочечные нуклеиновые кислоты разделяют с помощью хроматографии на колонке. МАК (метилированный альбумин на кизельгуре) сильнее связывается с одноцепочечной ДНК, чем с двухцепочечной (Sueoka, Cheng, 1962). Наоборот, на гидрок- силапатите (кристаллический фосфат кальция) двухцепочечные молекулы связываются более эффективно, чем одноцепочечные (Kohne, 1968).
Двухцепочечные молекулы ДНК, которые нельзя отделить друг от друга ни по молекулярной массе, ни по конформации, можно разделить ультрацентрифугированием, если они различаются по нуклеотидному составу. Этот метод основан на работе Мезельсо- яа, Сталя и Винограда (Meselson, Stahl, Vinograd, 1957), охарак-
с»3с»3СОСОГ3СИГ3СИN-CH3ОСN-CH3ОСЯ2С-СН н2< IЯ2С-СН н2< Iоон3с с.НС-НСн3с с.НС-НСН3с «—Сн3ОСН3с «—Сн3ОС1HZH3c-N со1HZH3c-N соНС-СЯ;НС-СЯ;ооИСснИСснHNHNсосоНС—HiНС—Hiн3сн3с:.н:.н^-метилбалин^-метилбалинСаркозинСаркозинI -пролинI -пролинN-CH2N-CH2НСНС33D-балинD-балин^H Сн3^H Сн3ОСОСсн-снсн-снL-треонинL-треонинНЧ СН3НЧ СН3сосо™з™зФащкстиноСое киыуФащкстиноСое киыуооРис. 3.4. Антибиотики актиномицин D (А) и нетропсин (5).Рис. 3.4. Антибиотики актиномицин D (А) и нетропсин (5).
с»3
с»3
СО
СО
Г3
СИ
Г3
СИ
N-CH3
ОС
N-CH3
ОС
Я2С-СН н2< I
Я2С-СН н2< I
о
о
н3с с.
НС-НС
н3с с.
НС-НС
Н3с «—Сн3ОС
Н3с «—Сн3ОС
1HZ
H3c-N со
1HZ
H3c-N со
НС-СЯ;
НС-СЯ;
о
о
ИСсн
ИСсн
HN
HN
со
со
НС—Hi
НС—Hi
н3с
н3с
:.н
:.н
^-метилбалин
^-метилбалин
Саркозин
Саркозин
I -пролин
I -пролин
N-CH2
N-CH2
НС
НС
3
3
D-балин
D-балин
^H Сн3
^H Сн3
ОС
ОС
сн-сн
сн-сн
L-треонин
L-треонин
НЧ СН3
НЧ СН3
со
со
™з
™з
ФащкстиноСое киыу
ФащкстиноСое киыу
о
о
Рис. 3.4. Антибиотики актиномицин D (А) и нетропсин (5).
Рис. 3.4. Антибиотики актиномицин D (А) и нетропсин (5).
тсризовавших нуклеиновые кислоты по их плавучей плотности в градиенте CsCI, а также на работе Мармура и Доти (Marmur, Doty, 1962), установивших, что плавучая плотность двухцепочечной ДНК коррелирует с ее нуклеотидным составом. Как показывает табл. 3.1, ДНК из разных источников часто значительно различаются по ГЦ-содержанию. У млекопитающих среднее значение ГЦ-содержания колеблется между 35 и 45%, а у бактерий — между 30 и 75%.
Рис. 3.5. А. Двойная спираль ДНК. Б. Деформация двойной спирали при введении в нее интсркалирующего лиганда (например, производного акридина, актиномицина D и др.; Lerman, 1963).
Геном эукариот во многих случаях состоит из участков, обогащенных ГЦ- или АТ-парами (см. гл. 6). Популяции молекул, содержащие такие участки (того или иного типа), можно разделить с помощью центрифугирования в градиенте плотности CsCl. Однако в условиях препаративного равновесного центрифугирования в градиенте плотности CsCl разделяются лишь такие молекулы ДНК* которые различаются по ГЦ-содержанию по крайней мере на 10%. Чувствительность метода может быть существенно увеличена при введении в ДНК тяжелых металлов или их соединений, предпочтительно связывающихся с АТ- или ГЦ-парами и тем самым повышающих плотность ДНК. Например, ионы Hg2+ и бис- ацетортутьдиоксап (БАРД) связываются преимущественно с АТ- парами, тогда как ионы Ag+ (при рН<7)—с ГЦ-парами. После введения тяжелых металлов разделение следует проводить в градиенте плотности CS2SO4, так как в присутствии хлоридов образуется нерастворимый осадок. В последние годы эти методы центрифугирования получили широкое распространение. Правда, они имеют и недостатки, так как дают хорошие результаты лишь в том случае, если молекулярные массы ДНК составляют по крайней мере несколько миллионов, а, как мы видели, такие большие молекулы часто трудно и не всегда желательно получать и разделять.
Существуют задачи, для решения которых молекулы ДНК нужно специально дробить на короткие фрагменты (например, выделение специфических генов, см. гл. 7; выявление повторяющихся последовательностей, см. гл. 6). Еще одним недостатком методов центрифугирования в градиенте плотности CsCl, о котором следует упомянуть, является высокая стоимость хлористого цезия; кроме того, длительное центрифугирование обходится тоже дорого, так как центрифуги в лаборатории оказываются занятыми в течение
Рис. 3.6. А. Комплекс ДНК с профлавином (за- штрихопан) или другими производными акридина, образующийся в результате встраивания (интеркаляции) этих соединений между двумя нарами оснований двойной спирали ДНК. Ин- иркалирующие лиганды либо ГЦ-специфичны, либо лишены специфичности в отношении оснований. Б. Структура комплекса ДНК с бис- бснзимидазолом. Это соединение обладает ярко выраженной специфичностью в отношении последовательности АТ-пар и располагается н малой или большой бороздке ДНК (МйИег et al., 1975, личное сообщение).
многих (16—30) часов. Для того чтобы специфически изменить плотность нуклеиновых кислот в градиенте плотности соли, вместо (яжелых металлов можно использовать целый ряд органических лигандов (красители, лекарственные препараты, антибио1ики и Т. Д.).
Антибиотик актиномицин D (рис. 3.4, А), например, встраивается в двухцепочечную ДНК преимущественно между ГЦ-парами (рис. 3.5; Muller, Crothers, 1968), тогда как антибиотик нетриисин специфически связывается с ее АТ-иарами (рис. 3.4,5). В результате связывания с соединениями этого типа плавучая плотность их комплексов с ДНК в градиенте CsCl сильно уменьшается. При введении подобных лигандов, к которым относятся и такие красители, как нейтральный феноловый красный, метиловый зеленый и другие, становится возможным разделение молекул ДНК, различающихся по ГЦ-содержанию не более чем на 6—7% и при
Рис. 3.7. А. Лкрнлфениловый нейтральный красный. Б. Акрилмалахитовый зеленый.
этом не имеющих аномальных последовательностей, связывающихся с определенными красителями. Мюллер и его сотрудники получили ряд веществ, обладающих специфичностью к отдельным или спаренным ГЦ-парам либо к двум — четырем смежным АТ-парам. При этом были разработаны методы, позволяющие разделять с высоким разрешением небольшие молекулы ДНК, взаимодействующие с красителями. К таким методам относятся: а) адсорбционная хроматография; б) распределительное разделение в двухфазной системе: противоточное распределение и жидкость-жидкостная хроматография.
В случае ГЦ-специфических веществ речь всегда идет о плоских трициклических молекулах красителей. Их взаимодействие с ДНК, как было показано на примере актиномицина D и бромистого этидия, основано на встраивании (интеркаляции) молекулы красителя между соседними парами оснований (рис. 3.6,А).
К АТ-специфическим веществам, образующим комплексы с ДНК, принадлежат соединения различных типов. Они не встраиваются между основаниями, а располагаются, очевидно, в большой и (или) малой бороздке ДНК (рис. 3.6,Б). К ним относятся, например, тетраалкиламмониевые соли. Особый интерес представля-
Рис. 3.8. А. Хроматографиче- кое разделение пяти EcoRI- фрагментое (см. гл. 20) ДНК фага X (А—Е) на колонке с сополимером акрилмалахитовый зеленый—акриламид, присоединенным к бис-акриламндным частицам. Б. Разделение линейной и суперспиральной форм плазмидной ДНК (см. гл. 11) гем же методом (Вйпетапп, МйПег, 1978).
ют флуоресцирующие вещества, такие, как ди-/-бутилпрофлавин IV, ди-/-бутилакрифлавин V, а также производное бмс-бензнмида- зола — Hoechst 33258. Эти красители все в большем масштабе используются также и для окрашивания хромосом, в особенности при локализации АТ-богатых участков (сателлитов, см. гл. 41).
Адсорбционная хроматография. Мы уже ознакомились с двумя адсорбентами: с метилированным альбумином на кизельгуре я гидроксилапатитом. Оба применяются для фракционирования нуклеиновых кислот, однако в основном они служат для разделения препаратов ДНК с различным нуклеотидным составом. Кроме того, в последнее время широко применяются и другие адсорбенты, состоящие из носителя (полиакриламида), связанного с теми или иными лигандами, специфичными к основаниям ДНК (рис. 3,7; Вйпетапп, МйПег, 1978). Образующиеся при этом красные или зеленые адсорбенты при низких ионных силах связываются с нуклеиновыми кислотами (РНК или ДНК), которые в градиенте концентрации соли (преимущественно NaC10<) элюируются в соответ-
Рис. 3.9, Разделение ДНК из Micrococcus luteus, Е. coll я Clostridium acidi-urici с помощью распределительной хроматографии в двухфазной системе полиэтилея- гликоль—декстран в присутствии связанного с полиэтиленом 1-метилфенилового нейтрального красного (МйПег, 1978, личное сообщение).
ствии с их нуклеотидным составом. На рис. 3.8 показана разделительная способность такого материала в отношении нуклеиновых кислот.
Распределительное разделение с помощью хроматографии. Фракционирование ДНК по нуклеотидному составу можно проводить также на специфических в отношении оснований и связанных с полимерами лигандах, которые в водных двухфазных системах полимеров (например, полиэтиленгликоль — декстран) имеют сильно различающиеся коэффициенты распределения. Если, к примеру, нужно, чтобы комплексообразоватсль в вышеупомянутой системе был растворим в обогащенном декстраном пограничном слое между двумя фазами, то сополимер делают из акриламида и какого-либо акриламинопроизводного одного из уже упоминавшихся красителей: нейтрального акрил фенолового красного или акрилмалахитового зеленого. Если же, наоборот, комплексообра- зователь должен быть растворим в верхней фазе системы, то получают карбоксильное соединение красителя и в расплаве с поли- этиленгликолем производят реакцию переэтерификации.
На рис. 3.9 представлены результаты разделения в такой системе ДНК с различным нуклеотидным составом. При специальных допущениях возможно разделение фрагментов ДНК, различающихся по ГЦ-содержанию менее чем на 1%.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И РАЗДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
В ПИКО- И НАНОГРАММОВЫХ КОЛИЧЕСТВАХ
Во всех обсуждавшихся до сих пор методах для разделения ДНК или РНК использовались количества порядка микро- или миллиграммов. Однако во многих случаях в распоряжении исследователей имеются лишь пико- или нанограммовые количества
нуклеиновых кислот, которые можно идентифицировать либо пу- тем их связывания с флуоресцирующим красителем, либо путем введения в них радиоактивной метки. Выше мы уже отмечали, что гель-электрофорез принадлежит к числу наиболее чувствительных методов, применяемых для анализа нуклеиновых кислот. В присутствии формамида или мочевины, нарушающих вторичную структуру нуклеиновых кислот, этот метод может быть использован для определения молекулярной массы, а также, как мы увидим позднее, и нуклеотидной последовательности (см. гл. 4 и 14). Разделенные фрагменты при прокрашивании специфическим флуоресцирующим красителем (например, бромистым этидием, см. рис. 3.2) дают четкие полосы в ультрафиолетовом свете.
При анализе ДНК и РНК широко применяется метод гибридизации. Таким способом можно изучать промежуточные этапы репликации и в особенности транскрипции. В принципе метод подходит и для определения гомологичных последовательностей. Гибриды ДНК — РНК, как и денатурированная ДНК, связываются с нитроцеллюлозными фильтрами (мембранами), тогда как свободная одноцепочечная РНК проходит через такие фильтры (Nygaard, Hall, 1964). Для избирательного связывания специфической РНК, например какого-либо продукта транскрипции, гомологичную ДНК «сажают» на нитроцеллюлозный фильтр. Затем добавляют радиоактивно меченную РНК. С ДНК на фильтре будет связываться только специфическая (комплементарная) РНК, а остальная пройдет сквозь фильтр (Gillespie и Spicgelman, 1965). Этот метод позволяет исследовать даже следовые количества РНК, благодаря тому что прочно связанную с фильтром радиоактивную метку можно определить количественно.
ЛИТЕРАТУРА
Blin N.. Stafford D. W. (1976). A general method for isolation of high molecular weight DNA from eucaryotes, Nucl. Acid Res.. 3, 2303.
Brown D. D., Stern R. (1974). Methods of gene isolation, Annu. Rev. Biochem., 43, 667.
Вйпетапп H.. Muller W. (1978). Base specific fractionation of double stranded DNA: Affinity chromatography on a novel type of adsorbant, Nucl. Acid Res., 5. 1059.
Freifelder D. 1976. Physical biochemistry: applications to biochemistry and molecular biology, San Francisco, Freeman and Co.
Gierer A., Schramm G. (1956). Infectivity of ribonucleic acid from tobacco mosaic virus. Nature (London),'177, 702.
Jain S. J., Tsai C.-С., Sohell H. M. (1977). Visualization of drug-nucleic acid interactions at atomic resolution, J. Mol. Biol., 114, 317.
Kohne D. E. (1968). Isolation and characterization of bacterial ribosomal RNA cis- trons, Biophys. J., 8, 1104.
Marmur 1. (1961). A procedure for the isolation of DNA from microorganisms, J. Mol. Biol., 3. 208.
Marmur J., Doty P. (1962). Determination of the base composition of deoxyribonucleic acid from its thermal denaturation temperature, J. Mol. Biol, 5, 109.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ‘ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
В 1965 г. Холли с сотрудниками определили нуклеотидную последовательность аланиновой тРНК дрожжей, а в 1966 г. Цахау <• сотрудниками —последовательность сериновой тРНК*. тРНК была выбрана в качестве первого объекта для определения нуклеотидной последовательности, потому что ее молекулы имеют определенную и относительно небольшую длину (в зависимости от вида тРНК от 70 до 80 нуклеотидов). В 1967 г. Сэнгер с сотрудниками установили последовательность нуклеотидов в 5S-pPHK из Е. coll (120 нуклеотидов). Для этой цели они синтезировали in vivo меченную 32Р РНК, что резко повысило чувствительность метода анализа. Меченую РНК экстрагировали затем из клеток и расщепляли при стандартных условиях специфическими рибонуклеазами (см. гл. 20). Полученные короткие фрагменты разделяли и в них определяли нуклеотидную последовательность. Для разделения фрагментов использовали двумерный электрофорез. Положение отдельных олиго- и мононуклеотидов устанавливали радио- автографическим способом. Полученные пятна, расположенные на электрофореграмме определенным образом, называют «отпечатками пальцев». Рибонуклеаза Ть например, расщепляет РНК только между гуанозин-3'-монофосфатом и 5'-гидроксильной группой соседнего нуклеотида, а панкреатическая рибонуклеаза — между З'-фосфорилпиримидином и соседним нуклеотидом. Рибонуклеаза Нг (из плесневого гриба Ustila^o) расщепляет фосфодиэфирные связи между соседними пуринами. Путем модификации гуаниновых остатков диметилсульфатом их можно защитить от действия РНКазы Ть Если в РНК замещают только часть гуаниновых остатков, то после обработки такой модифицированной РНК РНКазой Т] получают частичный гидролизат, который используют для установления последовательности в отдельных продуктах гидролиза. Подобным же образом путем модификации урацила карбодиимидом его можно защитить от действия панкреатической РНКазы. Последующий анализ в какой-то мере напоминает решение головоломки. Определяют нуклеотидный состав сначала в коротких, а затем в более длинных олигонуклеотидах; после этого ищут перекрывающиеся последовательности, чтобы установить, в каком порядке расположены расшифрованные олигонуклеотиды.
Состав коротких олигонуклеотидов следует уже из их положения на двумерной электрофореграмме, так как известно, что даже замена одного какого-либо основания на другое существенно влияет на подвижность олигонуклеотида (см. также гл. 14, рис. 14.5). С помощью описанного метода частично или полностью установ-
В это же время в СССР А. А. Баевым с сотрудниками была установлена первичная структура валиновой тРНК дрожжей. — Прим. ред.
лены нуклеотидные последовательности 5S- и 16S-pPHK из Е. coli, 5S-pPHK из ряда эукариот, большое число тРНК разных типов, многих промоторов, /ос-оператора и РНК из фагов R17, Qp и частично MS2. Этот метод не может быть полностью перенесен на ДНК по следующим причинам:
Не известны специфические эндонуклеазы, расщепляющие ДНК по определенному основанию.
Молекулы ДНК, как правило, слишком длинные.
Трудно получить радиоактивно меченную ДНК in vivo.
Тем не менее в 1975 г. и в этой области наметился определенный перелом, что было обусловлено в основном следующими обстоятельствами:
Открытие и использование рестриктирующих эндонуклеаз (рестриктаз; см. гл. 20), применение которых позволило получать фрагменты ДНК определенной длины.
Усовершенствование метода гель-электрофореза для разделения денатурированных фрагментов ДНК в соответствии с их размерами. Именно этот момент оказался особенно важным, так как при определенных условиях (например, 12%- ный акриламид и 8 М мочевина, длина геля —40 см, напряжение—20 В/см) стало возможным разделение лаже таких олигонуклеотидов, которые по длине отличаются друг от друга лишь на одно основание. Метод достаточно чувствителен, чтобы разделить между собой, например, фрагменты длиной 98, 99 и 100 нуклеотидов.
В последние годы для определения нуклеотидной последовательности в ДНК были разработаны два метода:
Метод с использованием «минус- и плюо-систем («минус- плюо-метод; Sanger, 1975: Sanger, Coulson, 1978).
Метод с использованием диметилсульфата и гидразина (Ма- хаш, Gilbert, 1977).
Оба метода настолько превосходят первоначальный метод определения нуклеотидных последовательностей в РНК, что последний теперь имеет лишь историческое значение.
«МИНУС-ПЛЮС»-МЕТОД
Метод основан на том, что ДНК-полимераза из Е. coli обладает способностью удлинять связанную с матрицей затравку («праймер»; см. гл. 19). Поскольку молекулы полимеразы действуют несинхронно, очень скоро после начала инкубации образуется смесь синтезированных продуктов различной длины. Первой задачей Сэнгера и его сотрудников было определение последовательности одноцепочечной ДНК фага 94X174, т. е. ( + )-цепи. Для этого прежде всего была синтезирована полностью комплементарная ей цепь ДНК, (—)-цепь; затем образовавшаяся двухцепочечная ДНК
©©Рис. 4.1. Схема метода с использованием рестрикционных фрагментов в качестве праймеров (затравок) для синтеза ДНК (/^/^/^). применяемого для определения нуклеотидных последовательностей по «минус-плюс*-методу (Sanger, 1975).Рис. 4.1. Схема метода с использованием рестрикционных фрагментов в качестве праймеров (затравок) для синтеза ДНК (/^/^/^). применяемого для определения нуклеотидных последовательностей по «минус-плюс*-методу (Sanger, 1975).
©
©
Рис. 4.1. Схема метода с использованием рестрикционных фрагментов в качестве праймеров (затравок) для синтеза ДНК (/^/^/^). применяемого для определения нуклеотидных последовательностей по «минус-плюс*-методу (Sanger, 1975).
Рис. 4.1. Схема метода с использованием рестрикционных фрагментов в качестве праймеров (затравок) для синтеза ДНК (/^/^/^). применяемого для определения нуклеотидных последовательностей по «минус-плюс*-методу (Sanger, 1975).
была обработана рестриктазой (см. гл. 20); при этом было получено определенное число фрагментов, которые после разделения и денатурации были добавлены к ( + )-цепи для проведения реакции гибридизации (рис. 4.1). Фрагменты, присоединившиеся к ( + )-цепи были использованы в качестве затравки. В конечном счете этим методом была определена нуклеотидная последовательность не только соответствующего рестрикционного фрагмента, но и соседней области.
На рис. 4.2 изображена подробная схема «мииус-плюо-метода. Реакцию, катализируемую ДНК-полимеразой Е. coll, останавливают через короткий промежуток времени и из реакционной смеси удаляют свободные нуклеотиды. Чтобы впоследствии можно было идентифицировать продукты синтеза, один из четырех используемых нуклеотидов должен быть радиактивно меченным. Затем полимеризацию возобновляют в «ограниченных» условиях, для чего пробу разделяют на две части и обрабатывают их следующим образом:
«Минус-система». Для синтеза, катализируемого ДНК-полимеразой Е. coli, используют только три нуклеотида. Опыты проводят в четырех вариантах, в каждом из которых отсутствует какой-либо один нуклеотид: —С, —Т, —А. — G. Синтез цепи заканчивается на З'-конце как раз в том месте, куда должно включиться отсутствующее основание (например, при отсутствии С цепь обрывается перед С).
п опем
Патрица ЗотрябкиПатрица Зотрябки3'^AIG С Г G5'5' VAWZ 3*ДИК-пми*срсза ♦ 4 трифосфета, OfcaUl ШТ •/' .«■- StHMii3'^AIG С Г G5'5' VAWZ 3*ДИК-пми*срсза ♦ 4 трифосфета, OfcaUl ШТ •/' .«■- StHMiiПатрицаПатрицаКомплементарное 'Р-мечалк♦риолентаКомплементарное 'Р-мечалк♦риолентаА1 G С т П— VArzAт А С G А СWWA’ А С Cl АVWA' A L БWAV.САГ,WWW-т АW/.w'А1 G С т П— VArzAт А С G А СWWA’ А С Cl АVWA' A L БWAV.САГ,WWW-т АW/.w'Пинус-сиапсма. например -ЛПинус-сиапсма. например -ЛА Т О С ' GTACGACТАСБАСТАССIACG TACGА Т О С ' GTACGACТАСБАСТАССIACG TACGПлюс-система, юпримя 4 АПлюс-система, юпримя 4 АРис. 4.2. Принцип определения нуклеотидных последовательностей ДНК по «ми- нус-плюс>-методу. Подробности см. в тексте (Sanger, 1975).Рис. 4.2. Принцип определения нуклеотидных последовательностей ДНК по «ми- нус-плюс>-методу. Подробности см. в тексте (Sanger, 1975).
Патрица Зотрябки
Патрица Зотрябки
3'^AIG С Г G5'
5' VAWZ 3*
ДИК-пми*срсза ♦ 4 трифосфета, OfcaUl ШТ •/' .«■- StHMii
3'^AIG С Г G5'
5' VAWZ 3*
ДИК-пми*срсза ♦ 4 трифосфета, OfcaUl ШТ •/' .«■- StHMii
Патрица
Патрица
Комплементарное 'Р-мечалк
♦риолента
Комплементарное 'Р-мечалк
♦риолента
А1 G С т П— VArzAт А С G А С
WWA’ А С Cl А
VWA' A L Б
WAV.САГ,
WWW-т А
W/.w'
А1 G С т П— VArzAт А С G А С
WWA’ А С Cl А
VWA' A L Б
WAV.САГ,
WWW-т А
W/.w'
Пинус-сиапсма. например -Л
Пинус-сиапсма. например -Л
А Т О С ' GTACGAC
ТАСБАС
ТАСС
IACG TACG
А Т О С ' GTACGAC
ТАСБАС
ТАСС
IACG TACG
Плюс-система, юпримя 4 А
Плюс-система, юпримя 4 А
Рис. 4.2. Принцип определения нуклеотидных последовательностей ДНК по «ми- нус-плюс>-методу. Подробности см. в тексте (Sanger, 1975).
Рис. 4.2. Принцип определения нуклеотидных последовательностей ДНК по «ми- нус-плюс>-методу. Подробности см. в тексте (Sanger, 1975).
«Плюс-система». Здесь в каждую пробу добавляют какой-либо один из четырех нуклеотидов. При этом используют ДНК-полимеразу бактериофага Т4, так как она обладает экзонуклеазной активностью и отщепляет все нуклеотиды, отсутствующие в реакционной смеси. Например, если к реакционной смеси добавлен А, то С, G и Т будут отщеплены. Отщепление прекратится в том месте, где стоит А; в данном случае цепь обрывается после включения А.
По окончании реакции проводят денатурацию ДНК и синтезированные продукты освобождают от матрицы и введенной затравки (расщепление с помощью уже использованной ранее ре- стриктазы). Затем восемь (2x4) полученных проб разделяют методом гель-электрофореза. При этом синтезированные продукты располагаются на электрофореграмме в соответствии с их размерами, так как подвижность олигонуклеотидов в геле обратно пропорциональна их размерам (см. гл. 14, рис. 14.1). На радиоавтографах четко проявляются отдельные полосы.
Этим методом в ходе одного эксперимента можно определить последовательность длиной до 100 нуклеотидов, просто читая ее по электрофореграмме. Лимитирующим фактором является длина геля, ограничивающая разрешающую способность метода. В 1977 г. Браунли и Картрайт модифицировали этот метод и распространили его применение на РНК. На выделенной из дифференцированных клеток или других источников РНК как на матрице синтезируют с помощью обратной транскриптазы (см. гл. 19) комплемен- 1арную цепь ДНК (кДНК) и используют ее в качестве исходного продукта для определения последовательности. Дальнейшее упрощение этого метода было достигнуто благодаря введению в реакционную смесь дидезоксинуклеотидов, добавление которых автоматически приводит к обрыву цепи (Sanger et al., 1977).
МЕТОД С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДИМЕТИЛСУЛЬФАТА
И ГИДРАЗИНА
При определении последовательности молекул ДНК, радиоактивно меченных с 5'-конца, безразлично, являются ли они одно- или двухцепочечными. В противоположность <минус-плюс»-методу в данном случае используют гомогенную популяцию молекул. Идеальными исходными продуктами служат однородные фрагменты, полученные при расщеплении рестриктазами. Каждый такой продукт в среднем расщепляется в одном месте по А-, G-, С- или Т-остаткам, так что в результате возникают разные по размерам фрагменты. Расщепление происходит химическим путем. Как и в методе Сэнгера, продукты расщепления разделяют с помощью гель-электрофореза; для локализации полученных полос используют радиоавтографию. Всего осуществляют четыре варианта расщепления. Их проводят в таких условиях, что молекула сначала расщепляется предпочтительно по А, затем по G, по С и наконец по Т+С. Из картины распределения пятен, полученной в результате разделения фрагментов, можно непосредственно прочитать последовательность оснований.
Расщепление по гуанину и аденину. Диметилсульфат метилирует гуанин в положении N-7 и аденин в положении N-3. Метилирование вызывает ослабление гликозидной связи (основание — сахар), разрывающейся при нагревании в области нейтральных pH. Обработка щелочью приводит к расщеплению фосфодиэфир- ной связи у депуринизированного основания. Гуанин метилируется в пять раз более эффективно, чем аденин, поэтому на электрофореграмме видны как слабые, так и интенсивные полосы. Интенсивные полосы соответствуют фрагментам, расщепленным по гуанину, а слабые —фрагментам, расщепленным по аденину. Чтобы с достоверностью различать пуриновые основания, параллельно проводят метилирование в области кислых pH. В этих условиях.
I»i II»i I6 c A C Рис. 4.3. Участок нуклеотидной после- Таовательности ДНК бактериофага fl.
I»i I
I»i I
Меченную на б'-конце ”Р-ДНК под-
Авергают частичному и специфическо
му в отношении оснований расщепле-
Снию путем химической обработки [мо-
дификация метода Максама— Гнль- сберта (Maxam, Gilbert, 1977)]. Про
дукты разделяют методом гель-элек-
угрофореза. Получают радиоавтограф I
геля. Специфическое расщепление ДНК по G осуществляют с помощью Gдиметилсульфата и пиперидина, по
A+G — с помощью муравьиной кис- Тлоты и пиперидина, по С+Т — с по
мощью гидразина и пиперидина и по С — с помощью гидразина. NaCl и пиперидина (Beck, Heidelberg. 1978, личное, сообщение).
Определение нуклеотидных последовательностей 69 наоборот, предпочтительнее модифицируется и выщепляется из нуклеотидной цепи адениновый остаток. После гидролиза и разделения образовавшихся фрагментов методом гель-электрофореза получают обратную картину: фрагменты, расщепившиеся по аденину, дают интенсивные полосы, а по гуанину — слабые.
Расщепление по цитозину и тимину. Гидразин в первую очередь реагирует с тимином и цитозином. В результате их выщепле- ния образуется остаток рибозилмочевины, который вновь реагирует с гидразином, превращаясь в остаток гидразона. При добавлении пиперидина вместе с сахаром удаляется фосфатный остаток, что приводит к расщеплению полинуклсотидной цепи.
В присутствии 2 М NaCl реакция протекает только с цитозином. Анализ одноцепочечных фрагментов не представляет трудности. Двухцепочечные ДНК после введения в 5'-конец метки расщепляют рестриктазой, затем разделяют и анализируют оба фрагмента. Хотя каждый препарат содержит две цепи, анализу подвергается только одна, так как метка вводится в 5'-конец лишь одной цепи, а радиоавтографией выявляются только меченые молекулы.
Этот метод также был модифицирован и усовершенствован в различных лабораториях. Один из примеров приведен на рис. 4,3. С последними достижениями в этой области мы познакомимся в гл. 7 и 9.
ЛИТЕРАТУРА
Махат A., Gilbert 47. (1977). A new method for sequencing DNA, Proc. Nat). Acad.
Sei. USA. 74, 560.
Sanger F. (1975). Nucleotide sequences in DNA, Proc. R. Soc. Lond. B. 191, 317.
Sanger F.. Coulson A. R. (1978). The use of thin acrilamide gels for DNA sequencing. FEBS Lett., 87, 107.
Sanger F„ Brownlee G. G., Barrell B. G. (1965). A two-dimensional fractionation procedure for radioactive nucleotides, J. Mol. Biol., 13, 373.
Sanger F.. Nicklen S., Coulson A. R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463.
Simoncsits A., Brownlee G. G„ Brown R. S., Rubin J. R., Guilley H. (1977). New rapid gel sequencing method for RNA, Nature (London), 269, 833.
Wu R. (1978). DNA sequence analysis, Annu. Rev. Biochem., 47, 607.;
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ ВИРУСОВ И ПРОКАРИОТ
ДНК служит генетическим материалом у всех организмов и многих вирусов, однако у некоторых вирусов геном представлен РНК. За последние три десятилетия были проведены многочисленные исследования вирусных геномов, в результате чего мы имеем теперь относительно ясное представление об их строении и содержащейся в них информации. Значительная часть этих данных может быть перенесена на ДНК эукариот. Таким образом, вирусы являются удобными моделями для изучения общих свойств ДНК (и РНК). Однако здесь необходимо соблюдать осторожность. Сведений, полученных при изучении генома простых вирусов, недостаточно, чтобы выяснить все особенности структуры и организации геномов эукариотических клеток. В дальнейшем мы еще увидим (гл. 45), что вирусы различаются в зависимости от круга хозяев. Например, бактериофаги размножаются только в клетках бактерий, и именно они послужили объектами, на которых были проведены обширные исследования в области молекулярной биологии.
Наряду с бактериофагами существуют вирусы, одни из которых размножаются только в животных клетках, а другие — только в растительных. Геном этих вирусов обладает свойствами, отсутствующими у бактериофагов. Приведем всего лишь один характерный пример: в 1977 г. у аденовируса был обнаружен так называемый сплайсинг (от англ, gene splicing — сращивание гена), явление, которое вначале казалось необычным и маловероятным. Оно заключается в том, что некоторые гены существуют не в виде целого отрезка (), а в виде фрагментов, распределенных
вдоль генома (—...—...—...). Эти фрагменты прерываются нуклеотидными последовательностями, удаляемыми во время экспрессии генов. То, что вначале считали курьезом, вскоре оказалось широко распространенной особенностью генома эукариот (см. гл. 6, 7 и 22).
ДНК вирусов может иметь разную структуру. При этом особый интерес представляют концы линейных молекул. Как правило, в них обнаруживаются повторы того или иного типа (рис. 5.1). Это либо обращенные повторы, либо концевая избыточность как с циклическими перестановками (пермутациями), так и без них.
ДНК фага X имеет «липкие», т. е. одноцепочечные и комплементарные друг другу, концы (рис. 5.2). Эти на первый взгляд казавшиеся странными закономерности становятся понятными, если рассмотреть процесс репликации ДНК. Ни одна ДНК-полимераза не может работать на свободных концах молекулы ДНК (см. гл. 19). Поэтому требуются какие-то вспомогательные механизмы для того, чтобы репликация линейной молекулы могла бы начаться и закончиться. В случае кольцевых молекул никаких трудно-
— Йндцетдапаялинейся ДИК— Йндцетдапаялинейся ДИК2D Одноиепочетия ммцекя ДНК2D Одноиепочетия ммцекя ДНК(I I I I I I I I L(I I I I I I I I Lп-п Дктцночечки ДПК LJ_V с замкнутыми концамип-п Дктцночечки ДПК LJ_V с замкнутыми концамиДбдщрютчная замкнута! ДНК*Суперашрал»АДбдщрютчная замкнута! ДНК*Суперашрал»АПримеры
— Йндцетдапаялинейся ДИК
— Йндцетдапаялинейся ДИК
2D Одноиепочетия ммцекя ДНК
2D Одноиепочетия ммцекя ДНК
(I I I I I I I I L
(I I I I I I I I L
п-п Дктцночечки ДПК LJ_V с замкнутыми концами
п-п Дктцночечки ДПК LJ_V с замкнутыми концами
Дбдщрютчная замкнута! ДНК
*Суперашрал»
А
Дбдщрютчная замкнута! ДНК
*Суперашрал»
А
Парбскрус
фх т, fd
17
15
Vaccinia
Пят8а6«№
•ьсе Ь- Йноиепдаишя ДНКIbpfokpyc
с обращенным побтором
Дбугцепочечная ДНК с обришднны* побторомДбугцепочечная ДНК с обришднны* побтором
Дбугцепочечная ДНК с обришднны* побтором
Дбугцепочечная ДНК с обришднны* побтором
Концебая избытоожга»Концебая избытоожга»abed. 1 .vto beabed. 1 .vto be
Концебая избытоожга»
Концебая избытоожга»
abed. 1 .vto be
abed. 1 .vto be
I I I I I I 1 1 i-L-LLl Конц*» избыточноат o'E-d . f il»« c ц,имичГскими „bed.f „«».«.' перееншкибими
LLI I, I I I 1 ПШ
DfcW ejiobeOet
Абенобиру17ISАбенобиру17IS.M,n i-ггг.,. *^2
Абенобиру
17
IS
Абенобиру
17
IS
Б
Рис. 5.1. А. Различные формы ДНК, встречающиеся у вирусов. 5. Концевые нук-леотидные последовательности (а, а'—комплементарные последовательности)Luria et а!., 1978).
стей в этом отношении не возникает, хотя здесь тоже существуют специфические участки, с которых начинается репликация. Небольшие молекулы ДНК часто представляют собой кольцевые структуры. Помимо того что они имеют преимущества при репликации, они более стабильны, чем линейные молекулы, так как не подвергаются, например, деградирующему действию экзонуклеаз.
Чтобы выяснить, какую информацию несут те или иные гейм
72 L Нуклеиновые кислоты
5' GGGCGGCGACCT—
-CCCGCCCCTCGA 5'
Л"
Рис, 5.2. ДНК фага X. А. В вирионе ДНК существует в виде линейной молекулы, имеющей «липкие» одноцепочечные концы. Б. После проникновения в клетку-хозяина молекула замыкается в кольцо.
и как они распределены в геноме, широко используют соответствующие мутанты и рекомбинанты. Лишь недавно стали применять новую методику — картирование рестрикционных фрагментов. РНК-co держащие вирусы ставят перед нами некоторые дополнительные проблемы, так как у них нет рекомбинации в обычном смысле (см. гл. 12). В ходе эволюции эти вирусы приобрели два рода приспособлении, компенсирующих указанный недостаток.
Разделение генома на несколько фрагментов, способных соединяться друг с другом в разных комбинациях. При этом, однако, часто образуются неполные вирусные частицы, которые становятся инфекционными лишь в присутствии вирусных частиц, дополняющих недостающие фрагменты. Таким образом, геномы различных частиц могут дополнять друг друга (см. гл. 46).
Информация, записанная в РНК, может передаваться в ДНК. По такому пути следуют, например, РНК-содержащие опухолеродные вирусы (см. гл. 47).
В случае двухцепочечных молекул возникает вопрос о том, какая из двух цепей несет генетическую информацию (транскрибируется). Шибальский и его сотрудники (Szybalski et al., 1970) на примере бактериофага X первыми доказали, что обе цепи содержат генетическую информацию и что в одной части генома считывается одна цепь, а в другой части — другая (рис. 5.3). Этот факт в последующие годы был подтвержден как на ДНК других вирусов, так и на ДНК про- и эукариот.
Какие особенности наблюдаются у вирусов, геном которых представлен одноцепочечными ДНК или РНК? Здесь мы прежде всего сталкиваемся с проблемой репликации такой нуклеиновой кислоты. Наиболее убедительный, и вероятно, правильный ответ состоит в следующем: как только одноцепочечная молекула попадает в клетку-хозяина, на ней начинает строиться комплементарная цепь, которая служит матрицей для образования новой
Рис. 5.3. Упрощенная генетическая и молекулярная карта бактериофага X. Стрелками показано направление транскрипции. Особый интерес представляет 1) положение «липких» свободных концов, которые соответствуют началу и концу генома; 2) участок интеграции (а//) с соседними с ним локусами xis и int, продукты которых нужны для интеграции и исключения ДНК; 3) область иммунности с тепами N, rex, С1, его и сП. значение которых описано в тексте (гл. 9). pL и рк — промоторы • первый для транскрипции 1-цепи и второй для транскрипции комплементарной ей г-цепи (Szybalski, 1976, с некоторыми изменениями).
вирусной ДНК (или РНК). Цепь, несущая генетическую информацию, обычно обозначается как «плюо-цепь. В процессе репликации возникает промежуточный продукт, обозначаемый как «ми- нуо-цепь. У вирусов и организмов с двухцепочечными ДНК обе цепи с равной эффективностью используются в качестве матриц. У вирусов, содержащих одноцепочечную нуклеиновую кислоту, предпочтительно реплицируется одна из цепей. Промежуточный продукт является, как правило, на порядок более эффективной матрицей, чем цепь, включенная в вирион (вирусную частицу).
РНК-содержащие вирусы в зависимости от их типа содержат либо «плюо-цепь (например, вирус полиомиелита), либо «минуо- цепь (например, вирус гриппа). После того как «плюо-цепь попадает в клетку, она сразу же начинает играть роль мРНК. На «минуо-цепи должна сначала синтезироваться «плюо-цепь, прежде чем заключенная в ней информация может быть использована.
В последующих разделах мы познакомимся с тремя проблемами, о которых здесь будет рассказано лишь коротко. Основные исследования были проведены в 50-е и 60-е годы, и их результаты
подробно изложены во всех учебниках по молекулярной генетике. Однако для понимания дальнейшего материала необходимо знать хотя бы основные выводы, вытекающие из этих работ. Поэтому мы остановимся на следующих ключевых вопросах: мутации, генетические карты и организация генома.
МУТАЦИИ
Генетическая информация заключена в ДНК (РНК) в виде линейной последовательности нуклеотидов, которая транслируется (переводится) в линейную последовательность аминокислот в том или ином полипептиде (белке).Три расположенных друг за другом нуклеотида образуют кодон (триплет), кодирующий определенную аминокислоту. Генетический код устанавливает расположение кодонов для аминокислот. Список кодонов представлен в табл. 7.1.
Точковые мутации. Если один нуклеотид заменяется другим, то содержание информации изменяется. Известен целый ряд агентов (мутагенов), индуцирующих подобные замены оснований. Мутации, в результате которых в геноме дикого типа происходит замена отдельных оснований, называются точковыми мутациями. Они обладают способностью к обратному мутированию.
А —* G; G —► А.
В случае одноцепочечных нуклеиновых кислот любая замена основания вызывает гибель потомства. Отсюда следует, что большинство мутагенов обладает инактивирующим действием, так как замена основания лишь в редких случаях приводит к усовершенствованию кода. Однако нужно отметить, что на ранних этапах эволюции в результате отбора выработался генетический код, содержащий много избыточной информации, вследствие чего значительная часть замен отдельных оснований не приводит к каким- либо последствиям.
При наличии двухцепочечных молекул ДНК точковые мутации поражают лишь половину потомства, так как обе цепи используются как абсолютно равноценные матрицы, а точковые мутации по определению инициируются только в одной цепи. У диплоидных организмов существует широко распространенный защитный механизм. Каждая молекула ДНК представлена двумя копиями, и при каждом мейозе одна отбрасывается.
Мутации со сдвигом рамки. При таких мутациях происходит вставка или выпадение какого-либо одного нуклеотидного основания, в результате чего все последующие кодоны считываются неправильно. Подобные мутации в большинстве случаев приводят к искажению генетической информации. Так, например, при добавлении еще одного С из триплетов
ABC DEF СНГ JKL MNO
получатся триплеты
ABC CDE FGH UK LMN.
Влияние мутации зависит от ее положения. Если вставка (или выпадение) основания происходит в начале или в середине гена, то это вызывает в нем значительные изменения. Если же мутация произошла в конце гена, то в клетке может образоваться слегка модифицированный продукт, еще годный к употреблению.
POR SIU UVW.
Мутация со сдвигом рамки при определенных обстоятельствах может быть репарирована («залечена»), например, с помощью второй мутации, компенсирующей действие первой:
ABC CDE FBI JKL MNO
Повреждение, вызванное включением одного лишнего основания устраняется в результате удаления какого-либо из последующих. Ошибочная информация, возникающая между двумя мутациями, часто не оказывает существенного влияния на функции продуктов гена.
Делеции. Делецией называют утрату части гена. Мутанты, несущие делеции, не способны ревертировать. Мутации такого типа встречаются относительно часто, и к ним относится большинство так называемых спонтанных мутаций. В гл. 13 мы познакомимся с недавно обнаруженными элементами 1S и при этом обсудим механизмы, способствующие возникновению делеции.
Гены-мутаторы. Существуют гены, от которых зависит частота мутаций. Продукты этих генов представляют собой ферменты, ответственные за включение, исключение и перестройку элементов 1S и вследствие этого влияющие на частоту делений.
Описанные здесь механизмы объясняют причины мутаций. Чтобы выделить отдельные мутанты, необходимы специальные селективные среды. Мутантов выявляют и отбирают по их фенотипу. Ниже приводится несколько примеров.
Мутанты с измененным обменом веществ. Основной задачей так называемой биохимической генетики было получение и идентификация мутаций, затрагивающих обмен веществ у микроорганизмов. Изучались мутанты, которые не росли на минимальной среде, но приобретали способность к росту при добавлении к среде определенных продуктов обмена. Тщательное исследование этих мутантов, проведенное в содружестве с биохимиками, привело к установлению путей биосинтеза аминокислот, нуклеотидов, сахаров и т. д. Более подробно об этом можно прочитать в любом учебнике по биохимии. Вирусы не имеют собственного обмена веществ, и потому было бы бесполезно искать у них подобных мутантов.
Температурочувствительные мутанты (ts-мутанты). Реакции обмена веществ катализируются белками, а так как белки — это продукты генов, то проще вначале определить структуру белка, чтобы использовать ее затем как отправную точку для выяснения структуры кодирующего данный белок гена. Одним из путей решения" такой проблемы является исследование температурочувствительных мутантов. Известно, что стабильность белков зависит от температуры. При повышенных температурах белки денатурируются. Понятие «повышенная температура» имеет относительный смысл, так как чувствительность к температуре меняется от белка к белку. С помощью мутации можно изменить порог температурной чувствительности данного белка. Мутантный белок полностью сохраняет свою активность при «нормальной» температуре, но инактивируется при повышенных температурах, при которых белок дикого типа еще остается активным.
Миссенс- и нонсенс-мутанты. Замена кодона, определяющего одну аминокислоту, на кодон для другой аминокислоты называется мис- сенс-мутацней. Миссенс-мутация приводит к изменению смысла информации. Кроме 61 кодона, каждый из которых соответствует той или иной аминокислоте, существуют три кодона (UAA, UAG, UGA), означающие обрыв полипептидной цепи (терминирующие колоны). Мутация, обусловливающая замену какого-либо кодона на терминирующий, называется нонсенс-мутацией. Поскольку терминирующие кодоны не имеют определенного смысла, происходит преждевременный обрыв синтезируемой полипептидной цепи. Здесь наблюдается та же закономерность, о которой мы уже говорили при обсуждении мутаций со сдвигом рамки. Если мутация возникает в начале или середине гена, то это приводит к фатальному исходу. Если же мутация произошла недалеко от конца гена, то последствия могут быть не столь трагичными. Белок, у которого отсутствует небольшое число концевых аминокислот, часто обнаруживает по крайней мере частичную биологическую активность.
Результаты, полученные при анализе генных продуктов у мутантов, несущих миссенс-мутации, и одновременном картировании дефектных генов, позволяют сделать вывод о коллинеарности нуклеотидных и аминокислотных последовательностей. Нуклеотидная последовательность той или иной мРНК, которая считывается от 5'- к З'-концу, соответствует аминокислотной последовательности определенного белка, если ее читать от N- к С-концу.
Нонсенс-мутации поддаются исправлению путем супрессии. Супрессия может осуществляться с помощью специфической тРНК, которая принимает кодон, означающий обрыв цепи, за кодон, соответствующий определенной аминокислоте, в результате чего эта аминокислота включается в растущую полипептидную цепь. Синтезированный при этом продукт гена в полной мере обладает биологической активностью (см. гл. 19).
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КАРТЫ
Первая, правда лишь фрагментарная, генетическая карта появилась еще во времена «классической генетики». Объектом исследования служила Drosophila melanogaster (Sturtevant, 1925). Сегодня более или менее точные генетические карты составлены для многих видов. Развиваются также методы, с помощью которых можно картировать геном человека (см. гл. 41). Однако наиболее подробные генетические карты построены для вирусов, прокариот и некоторых грибов (дрожжи, нейроспора). У Е. coli, имеющей около 2000 генов, картировано приблизительно 300 (Stand, 1976; Taylor, 1976). Генетические карты публикуются в регулярно издаваемом сборнике «Handbook of Biochemistry and Molecular Biology».
В настоящее время для исследования геномов служат не только генетические методы (анализ скрещиваний). Кроме них, существует, во-первых, так называемый метод гетеродуплексного картирования, в котором используется электронная микроскопия, и, во-вторых, метод построения рестрикционных карт.
Гетеродуплексное картирование. В гл. 2 мы уже обсуждали процесс плавления и ренатурацин ДНК. Его можно пояснить с помощью модели. Рассмотрим два сходных, но не идентичных друг другу генома. Возможно, что в одном из них произошла делеция. Изобразим гены буквами:
а b с d е f a' b' с' d' е' f
а b с f a" b' с' f
(abc...— одна цепь ДНК, а а'Ь'с'... — другая, комплементарная ей цепь).
Если теперь смешать и расплавить оба образца, а затем провести ренатурацию образовавшейся одноцепочечной ДНК, то средн прочих появятся и такие структуры, в которых отдельные участки ДНК не будут связаны с комплементарными им цепями. Такие участки под электронным микроскопом имеют вид одноцепочечных петель. Их длину можно измерить непосредственно, и, кроме того, можно установить их положение по отношению к остальному геному.
Гетеродуплексное картирование проводится также при добавлении к ДНК соответствующей мРНК. При определенных условиях реакции гибрид ДНК —РНК стабильнее, чем гибрид ДНК—- ДНК. Поэтому молекула РНК вытесняет одну цепь из двухцепочечной молекулы ДНК. Образовавшаяся при этом структура легко обнаруживается с помощью электронной микроскопии, так как в
ней имеется петля (двухцепочечный гибрид ДНК — РНК и одноцепочечная ДНК; см. рис. 9.13—9.15 и рис. 37.2—37.5).
В совокупности с радиоавтографией этот метод можно использовать также для локализации генов в гигантских хромосомах двукрылых и хромосомах типа ламповых щеток амфибий (см. гл. 42).
Рестрикционное картирование. Несколько лет тому назад была обнаружена целая группа ферментов, расщепляющих ДНК в определенных (специфических) местах (рестриктирующие эндонуклеазы, ферменты рестрикции, рестриктазы; см. гл. 20). Небольшие геномы, например геномы вирусов, митохондрий, хлоропластов, или части крупных геномов могут быть, таким образом, расщеплены на определенное число рестрикционных фрагментов. Поясним это снова на примере модели. Пусть наш геном состоит из следующих генов:,_
a b с d е f g h.
Под действием рестриктазы I он расщепляется на фрагменты abc de fgh,
а под действием рестриктазы И —на фрагменты a bed efgh.
Уже из сравнения этих двух наборов фрагментов можно установить их последовательность в геноме. Легко понять, что компонент «Ь» расположен после «а», так как оба они содержатся в одном общем фрагменте «аЬс», а компонент «d» расположен после «с», так как оба они появляются в одном фрагменте «bed» и т. д. В дальнейшем эти фрагменты можно выделить, чтобы определить, каким генам и (или) регуляторным участкам они соответствуют. Их также можно использовать, чтобы синтезировать гетерологичные рекомбинантные молекулы, встроив, например, какой-либо фрагмент в плазмиду и размножив его с помощью Е. coll (о генетической инженерии см. гл. 11). Получение коротких фрагментов ДНК определенной длины необходимо и для установления последовательности оснований в более крупных фрагментах.
■ПРОСТЫЕ» ГЕНОМЫ
Геномы вирусов устроены очень просто. Мелкие РНК-содержа- шие вирусы (MS2, R17, Qp и др.) содержат только три гена, один из которых кодирует белок оболочки, второй — так называемый А-белок и третий — репликазу. У нескольких таких геномов полностью установлена последовательность оснований, а фрагмент генома MS2 представлен на рис. 2.11.
Ркс. 5.4. Генетическая карта бактериофага рХ174. Буквами обозначены гены./< расположен внутри А, а £ —внутри D. Более детальные изображения см. нарис. 5.5 и 5.6. Заштрихованные участки не транскрибируются (Sanger et al., 1977,Fiddes et al., 1977).
днк. -ф^^Г^т g a|t gJFTQlgIt g t a a a 6-
Гм ^' uiu | Gly i Vol| Met | stop |
f№£. Tt»» Г бЛГГбТ^П
r»^ ^^S55 11 Г^ЕИЕИдГЦ
Рис. 5.5. Эффективно используемый фрагмент ДНК фага *Х174. Нуклеотидная последовательность выполняет три функции. Она содержит генетическую информацию для двух продуктов, а также "область узнавания рибосом, участвующих в синтезе третьего продукта (Sanger et al„ 1977; Fiddes et al., 1977).
Как уже говорилось в предыдущей главе, в 1975 г. были разработаны методы быстрого определения последовательности оснований в нуклеиновых кислотах. Сэнгер и его сотрудники применили разработанный ими метод для определения нуклеотидной последовательности в геноме бактериофага 0X174 (одноцепочечная ДНК). Анализ этой ДНК преподнес ряд сюрпризов. Фаг 0X174 имеет очень маленький геном, однако использует его чрезвычайно эффективно.
Одна из нуклеотидных последовательностей ДНК этого фага содержит информацию не одного, а двух или трех генов (см. рис. 5.4, 5.5 и 5.6). Особый интерес представляет пограничная область между генами D, Е и L Ген Е находится внутри гена D, но считывание заключенной в них информации начинается от двух разных точек со сдвигом на один нуклеотид. Считывание с гена J начинается еще до того, как заканчивается считывание с генов D
Рис. 5.Ь. Рассчитанная с помощью ЭВМ часть нуклеотидной последовательности фага *Х!74. а также аминокислотная последовательность продуктов генов D, Е и Л (Анализ последовательности был осуществлен Sanger et а!.. 1977; 1978 — исправленный вариант). Программа: Staden, 1977, 1978).
и Е, и при этом используется третья рамка считывания. Является ли этот случай курьезом, или он имеет общебиологическое значение? Пока на этот вопрос трудно ответить, так как одни фаги (например, G4), родственные фагу 0X174. ведут себя аналогичным образом, а другие (например, fd) — нет.
Опухолевый вирус SV40, размножающийся в клетках эукариот, имеет геном, представленный двухцепочечной ДНК. Он использует, и притом неоднократно, всю информацию, содержащуюся в одной нуклеотидной последовательности (рис. 5.7). При этом реализуются практически все возможности:
Считывание информации происходит с обеих цепей с перекрыванием генов, причем используются одновременно обе комплементарные цепи.
Считывание генов, одни из которых находятся внутри других, начинается либо из одной, либо из разных точек со сдвигом на один нуклеотид.
Каковы недостатки такого экономного использования генома? При многократном считывании нуклеотидных последовательностей
Рис. 5.7. Генетическая карта и схема транскрипции вируса SV40. Внутренний круг: генетическая карта. Буквами обозначены рестрикционные фрагменты. Внешний круг: направление и продукты транскрипции. VP2 и VP3 считываются из одной и той же точки отсчета, a VP1 — из другой. Толстые стрелки соответствуют транслируемым участкам РНК. 'vv А означает присоединение poly (A) (Piers et al., 1978).
почти исключена всякая избыточность информации. Ошибка, возникшая в результате мутации, проявится одновременно в двух (трех) белках, и не известно, выдержит ли вирус такое двойное (тройное) повреждение. Выше мы уже отмечали, что генетический код должен быть вырожденным. Замена третьего нуклеотида в триплете во многих случаях не приводит к заметным фенотипическим изменениям. При использовании же одной нуклеотидной последовательности в разных рамках считывания этот защитный механизм (вырожденность кода) перестает действовать, так как третье положение в кодоне для одной аминокислоты одновременно является вторым положением в кодоне для другой, а замена второго нуклеотида в кодоне не остается без последствий.
Итак, суммируя все изложенное выше, можно сделать следующий вывод: организация генома у вирусов имеет ограниченные возможности для эволюции. Это такая система, которая сохраняется при определенных условиях и может существовать до тех пор, пока окружающая среда остается постоянной. При каких-либо изменениях внешних условий у подобной системы вряд ли есть шансы выжить. Правда, следует добавить, что вирусы используют такой аппарат клетки, который в ходе эволюции уже давно достиг чрезвычайно высокой устойчивости и, находясь на оптимальной стадии развития, имеет весьма высокую селективную ценность.
6-2094
иными словами, вирусы с их сложным геномом нашли свою экологическую нишу и будут сохраняться в ней до тех пор, пока будут существовать клетки-хозяева (Е. coll, эукариотические клетки).
Организация генома
Что такое ген? Термин «ген», введенный в 1903 г. датчанином Иогансеном, претерпел ряд изменений. Вначале он использовался для обозначения наследственных задатков, определяющих разви- ' тие тех и или иных внешних фенотипических признаков. В сороковые годы Бидл и Татум выдвинули гипотезу: один ген — один фермент. Сегодня, несколько изменив первоначальную формулировку, мы можем сказать: один ген — один белок или один ген — один полипептид (см. гл. 18). Хотя эта концепция сохраняет свое значение и по сей день, она уже недостаточно современна, так как известно, что существуют белки, которые кодируются участками, распределенными вдоль всего генома.
Мы только что познакомились с включенными один в другой генами, а также с перекрывающимися генами и, исходя из этого, должны были бы сказать: один ген — две полипептидные цепи. Однако применять эту формулу нужно с осторожностью. Ген имеет начало и конец, представленные особыми сигнальными кодонами. Именно поэтому и различаются между собой включенные один в другой гены, хотя они содержат одни и те же нуклеотидные последовательности.
Молекула ДНК выполняет различные функции. В ней имеются не только нуклеотидные последовательности, несущие генетическую информацию, но и такие, которые контролируют экспрессию (проявление) генов и репликацию.
Облает» угнабакаеполимерамОблает» угнабакаеполимерамТерминаторТерминаторI рррРи—*Ж„I рррРи—*Ж„
Облает» угнабакаеполимерам
Облает» угнабакаеполимерам
Терминатор
Терминатор
I рррРи—*Ж„
I рррРи—*Ж„
। Промотор | „Лисер"। ОператорОблаете уывкпт। Промотор | „Лисер"। ОператорОблаете уывкптСтруктурные готПесто сбезыбини»Структурные готПесто сбезыбини»фактора рфактора р(гопнбатсра(например, СЛР-сЛМР)(гопнбатсра(например, СЛР-сЛМР)
। Промотор | „Лисер"
। Оператор
Облаете уывкпт
। Промотор | „Лисер"
। Оператор
Облаете уывкпт
Структурные гот
Песто сбезыбини»
Структурные гот
Песто сбезыбини»
фактора р
фактора р
(гопнбатсра
(например, СЛР-сЛМР)
(гопнбатсра
(например, СЛР-сЛМР)
Рис. 5.8. Модель структуры опероиа (например, лактозного оперопа). Перед структурными генами расположены промотор и регуляторные участки (например, область узнавания активатора, оператор, участок связывания репрессора). Область промотора заканчивается стартовой точкой транскрипции, кодирующей 5'-концевое основание (почти всегда пурин). Терминатор — это тоже определенная область, которая может узнавать различные сигналы; более подробно см. текст и гл. 9 (Szybalski, 1977).
Так как эти функции ДНК уже хорошо известны, для отдельных участков ее нуклеотидной последовательности существуют специальные обозначения. Последовательности нуклеотидов, содержащие информацию о так называемых структурных белках (ферменты, фибриллярные белки, антитела), называют структурными генами. Они начинаются с инициирующих кодонов и заканчиваются терминирующими кодонами. К структурным генам присоединены остальные сигналы: промотор (связывает ДНК-зависнмую РНК-полимеразу), оператор (связывает регуляторные молекулы), участок связывания с рибосомами и др. Несколько структурных генов присоединяются к концу промоторно-операторной области и образуют генетическую единицу, оперон, экспрессия которого включается и выключается как единое целое (рис. 5.8). Регуляторные белки представляют собой продукты регуляторных генов. В одном опероне содержатся гены для белков, которые используются в каком-то одном биосинтетическом цикле (пример см. в гл. 9). Существование таких единиц можно было бы считать за правило, однако это опять-таки не совсем верно.
Известно много примеров, когда генные продукты используются в обмене веществ одновременно и в равных количествах, однако их гены расположены в различных местах генома. В следующих главах мы все чаще будем задавать вопрос о том, каким образом координируется экспрессия таких генов.
ЛИТЕРАТУРА
Barrell В. G., Air G. М„ Hutchison Ш С. А. (1976). Overlapping genes in bacteriophage 0X174, Nature (London), 264, 34.
Fasman G. D. (ed.). 1976. Handbook of biochemistry and molecular biology. 3. AufL Cleveland, CRC Press Inc.
Flers W., Contreras R., Haegeman G., Rogiers R., van de Voorde A., van Heuvers- wyn H„ van Heereweghe J., Volckaert G., Ysebaer M. (1978). Complete nucleotide sequence of SV40 DNA. Nature (London), 273, 113.
Garett A. (1968). Sense and nonsense in the genetic code, Science, 180, 149.
Hayward G. S., Smith M. G. (1972). The chromosome of bacteriophage T5, J. Mol.
Biol., 63, 383.
Luria S. E„ Darnell L E„ Baltimore D., Campbell A. 1978. General virology, 3. Aufl. New York, J, Wiley and Sons.
Reddu V. B., Thimmappaya B., Dhar R., Subramanian B., Zain S„ Ghosh P. K., Cel ma M. L., Weissman S. M. (1978). The genome of simian virus 40, Science, 200. 494.
Sanger F„ Air G. M„ Barrell B. G„ Brown N. L., Coulson A. R., Fiddes J. C., Hutchison III C. A., Slocombe P. M„ Smith M. (1977). Nucleotide sequence of bacteriophage 0X174 DNA Nature (London), 265, 687.
Shaw D. C., Walker J. E„ Northrop F. D., Barrell B. G„ Godson G. N„ Fiddes J. C. (1978). Gene K, a new overlapping gene in bacteriophage G4, Nature (London), 272, 510.
Simon M. N.. St tidier F. №. (1973). Physical mapping of the early region of bacteriophage T7 DNA. J. Mol. Biol., 79. 249.
Staden R. (1977). Sequence data handling by computer, Nucl. Acid Res., 4, 4037.
Staden R. (1978). Further procedures for sequence analysis by computer, Nucl. Acid Res.. 5, 1013.
6. ДНК ЭУКАРИОТ
ДНК эукариотических клеток по своей структуре похожа на Д1IK прокариотических. Различия касаются лишь количеств (в расчете на гаплоидный геном; рис. 6.1), длины молекулы (рис. 6.2 и 6.3) и расположения специфических нуклеотидных по- c. 1сдовательностей. Как правило, ДНК эукариот ассоциирована с белками и образует нуклеопротеидный комплекс, так называемый хроматин (более подробно об этом см. гл. 40). Геном Escherichia mH содержит около 2000 структурных генов, если считать, что каждый составляет в длину приблизительно 1500 пар оснований. Поэтому геном человека должен был бы содержать 3-Ю6 генов. «Фактически же в нем имеется лишь около 50 000. Это опять-таки означает, что только около 2% ДНК является носителем генетической информации. Даже если предположить, что размер гена у эукариот в десять раз больше, чем у прокариот, то и в этом случае можно было бы картировать только 20% гаплоидного генома.
Рис. 6.1. Минимальное содержание ДНК (или РНК) на гаплоидный геном у 23 обширных систематических групп. Знак 4- означает удвоение генома, которое не приводит к появлению новых видов (Sparron, Nauman, 1976).
Рис. 6.3. Электронная микрофотография ДНК из метафазной хромосомы клетки HeLa. Тот же препарат, что и на рис. 6.2, но при большем увеличении. Отчетливо видно переплетение складок, образуемых молекулой ДНК. Хотя цепь ДНК и различима, проследить ее ход не удается из-за многочисленных складок. Масштаб: 28 мм на рисунке соответствует 2 мкм. (Фото Paulson и Laemmli, Princeton University, 1977.)Рис. 6.3. Электронная микрофотография ДНК из метафазной хромосомы клетки HeLa. Тот же препарат, что и на рис. 6.2, но при большем увеличении. Отчетливо видно переплетение складок, образуемых молекулой ДНК. Хотя цепь ДНК и различима, проследить ее ход не удается из-за многочисленных складок. Масштаб: 28 мм на рисунке соответствует 2 мкм. (Фото Paulson и Laemmli, Princeton University, 1977.)
Рис. 6.3. Электронная микрофотография ДНК из метафазной хромосомы клетки HeLa. Тот же препарат, что и на рис. 6.2, но при большем увеличении. Отчетливо видно переплетение складок, образуемых молекулой ДНК. Хотя цепь ДНК и различима, проследить ее ход не удается из-за многочисленных складок. Масштаб: 28 мм на рисунке соответствует 2 мкм. (Фото Paulson и Laemmli, Princeton University, 1977.)
Рис. 6.3. Электронная микрофотография ДНК из метафазной хромосомы клетки HeLa. Тот же препарат, что и на рис. 6.2, но при большем увеличении. Отчетливо видно переплетение складок, образуемых молекулой ДНК. Хотя цепь ДНК и различима, проследить ее ход не удается из-за многочисленных складок. Масштаб: 28 мм на рисунке соответствует 2 мкм. (Фото Paulson и Laemmli, Princeton University, 1977.)
н^\6'2; ЭлектР0Ш,ая микрофотография ДНК из метафазной хромосомы клеткиHeLa после удаления гистона. Хромосома состоит из интенсивно окрашенной бел-козои сердцевины (в центре изображения) и растянутой па подложке ДНК Мас-штаб: 17 мм на рисунке соответствует 2 мкм. (Фото Paulson и Laemmli PrincetonUniversity, 1977.)
Между тем считается доказанным, что большая часть ДНК эука- биотических клеток не несет никакой генетической информации.
1аряду с уникальными (встречающимися один раз) нуклеотидными последовательностями, геном эукариот содержит множество повторов. Это участки, в которых определенная последовательность ' повторяется от 100 до 1 млн. раз. При этом различают многократно и умеренно повторяющиеся последовательности. Все они либо сконцентрированы в определенных местах генома и образуют так называемый структурный (конститутивный) хроматин (см. гл. 40), ' либо более или менее равномерно распределены вдоль всего генома. При этом обнаружено, что они встроены регулярным образом между уникальными последовательностями.
КАК ИССЛЕДУЕТСЯ СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА ЭУКАРИОТ?
В середине 1960-х гг. были проведены одновременно два исследования, посвященных структуре ДНК эукариот. Однако в некоторых из полученных при этом результатов и по сей день обнаруживаются значительные расхождения. В 1965 г. было показано, что ДНК тимуса теленка при центрифугировании в градиенте плотности CsCl дает неоднородную картину. Следует, однако, отметить, что в этих опытах не могли быть использованы интактные молекулы ДНК, поскольку выделение таких крупных молекул невозможно и в настоящее время. Удалось лишь получить радиоавтограф и электронную микрофотографию отдельной молекулы. Фрагменты ДНК тимуса теленка кроме основной полосы с плавучей плотностью 1,7 давали несколько четких полос с плавучими плотностями 1,714 и 1,711. При исследовании ДНК эукариот из других источников неизменно получали подобную же картину. Менялось лишь расположение полос с соответствующими плавучими плотностями, так называемые «сателлитные полосы». Значительное повышение разрешающей способности центрифугирования в градиенте плотности, как мы уже видели (см. гл. 3), было достигнуто путем добавления к градиенту специфических в отношении оснований лигандов. Сначала при центрифугировании в градиенте Cs2SO4 использовали ионы Hg2+ (АТ-специфические) и Ag+ (GC- специфические при рН<7 и АТ-специфические при рН>7), затем перешли к органическим комплексообразователям и наконец объединили оба метода.
Второй метод исследования структуры ДНК основан на изделии кинетики ренатурации молекул ДНК. Как уже говорилось в гл. 2, двухцепочечные молекулы ДНК в процессе нагревания (при определенных ионной силе и температуре в присутствии определенных ионов) переходят в одноцепочёчныс. Если раствор денатурированной ДНК оставить на длительное время (до нескольких
недель) при температуре на 20—25 °C ниже температуры денатурации (Тщ), то ДНК снова «ренатурируется», т. е. ее комплсмен- чарные последовательности находят друг друга и связываются между собой. Аналитически этот эффект можно прослеживать пу- юм измерения оптической плотности, вязкости или оптического крашения. Часто для тон же цели используют также гидрокснл- апатит, чтобы специфически связать двухцепочечные (реассоциированные) молекулы ДНК и отделить их от оставшихся нереассоци- прованными молекул.
Процесс реассоциации комплементарных цепей в растворе может быть описан функцией Со/, являющейся произведением концентрации ДНК и времени:
|C0/J = M.r1.
Сложность данного препарата ДНК определяется величиной С0//2 (см. гл. 2). Эта величина обратно пропорциональна концентрации комплементарных цепей и прямо пропорциональна числу различных последовательностей в молекуле ДНК (размер генома). Как следует из рис. 6.4, кинетика реассоциации эукариотической ДНК представляет собой двухступенчатый процесс. Сначала происходит реассоциация повторяющихся последовательностей, и лишь после этого, намного позже, — реассоциация уникальных последовательностей, у которых величина Со/ на порядок больше. Подобная картина, меняющаяся лишь количественно, обнаружена при исследовании ДНК всех эукариот. Ряд примеров приведен в табл. 6.1.
Рис. 6.4. Кинетика пепатурации ДНК тимуса теленка (кружки и треугольники) и Е. coll (крестики). Двухцепочечная (ренатурированная) ДНК связывается с гидроксилапатитом и таким образом может быть отделена от однопспочечной ДНК. Из представленных данных ясно, что для ДНК эукариот характерна двухступенчатая кривая ренатурации, а для прокариот—одноступенчатая (Britten.
Kohne. 1968).
90 I. Нуклеиновые кислоты
Таблица 6.1
Размеры генома и доля повторяющихся последовательностей у некоторых животных и растений
Вид
Содержание ДНК в гаплоидном геноме, пг1)
Доля повторяющихся последовательностей, %
Животные:
Drosophila melanogasier
0,12
26
Neciurus maculosus
52
77
Xenopus laevls
3,1
27
Bos taurus
3,2
45
Homo sapiens Растения:
2,9
35
Nicotiana tabacum
1,6
53
Raphanus sativus
1.5
18
Anemone blanda
16,0
57
Vicia faba
16,4
85
Allium сера
16,7
95
') 1 ПГ-1О-" г.
Как уже говорилось, различают многократно и умеренно повторяющиеся последовательности. Приведем лишь несколько примеров: доля многократно повторяющихся последовательностей в геноме Drosophila melanogasier составляет 12%, умеренно повторяющихся— также 12% и уникальных —приблизительно 70% (Manning, Schmid, Davidson, 1975). Соответствующие доли у мыши составляют 8, 15 и 76% (Ginelli et al., 1977). Многократно повторяющиеся последовательности можно разделить на множество фракций с помощью центрифугирования в градиенте плотности CsCl. К этим фракциям принадлежат так называемые сателлиты, а также некоторые структурные гены, например гены для рРНК (см. гл. 37), гистонов (см. гл. 7) и, вероятно, некоторые другие. У человека доля многократно повторяющихся последовательностей составляет 2% всего генома, тогда как у Drosophila nasutoides— 60%. Как правило, такие последовательности расположены в хромосомах в определенных местах (в теломерах, центромерах в пр.), причем это расположение является видоспецифическим (более подробно об этом см. гл. 41). ДНК Drosophila virilis имеет три сателлита. состоящие из повторяющихся гептануклсотидов и различающиеся между собой лишь отдельными основаниями.
Однако не все сателлиты состоят из таких коротких повторов (табл. 6.2). Повторяющаяся единица сателлита из ДНК тимуса теленка содержит 1460 пар оснований. В ДНК африканской зеленой мартышки обнаружен сателлит с повторяющейся единицей длиной 172 пары оснований, который повторяется в геноме несколько миллионов раз (тандемное включение). Определение нук-
Таблица 6.2
Сателлитная ДНК у некоторых эукариот
Вид
Сателлит1)
Содержание в геноме, %
Степень повторяемости
Последовательность или ее длина
Морская свинка Pi podomys ordis ('.nicer pagarus Drosophila vtrills
Drosophila nasutoldes
Drosophila melanogaster
I (1,705) HS-₽
1 (1,692) II (1,688) III (1,671)
I (1,687)
II (1.682) III (1,669) IV (1,665)
I (1,672)
Il (1,686)
III (1,688) IV (1,705)
5,5
11
20
25
8
8 20—30 10-15 5-10 5-10
5,6
3,8 4,0
4,6
107
1,2 10’
20-10”
4-10»
10
3,7-10»
1,2-10”
3,2-10»
1,8-10»
СССТАА ACACAGCGGG АТ АСАACT АТАААСТ
АСААТТ
5 ЮЗ 2,310" 46
ААТАТ UAATATAT ААТАА CATAG
3(AAG), 4(AG), 1(G)
’) В скобках указана плотность (г/мл).
леотидной последовательности этой сателлитной ДНК (Rosenberg it al., 1978) показало, что все повторяющиеся единицы в ней практически идентичны. Лишь в нескольких местах произошли замены нуклеотидов, однако их распределение все-таки не является статистическим.
В связи с этим возникают следующие вопросы:
Как возникают сателлиты? Каково давление отбора, которому они подвергаются? Как распространяются мутации?
Хотя об этом написано много, тем нс менее не всегда еще на эти вопросы даются убедительные ответы.
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
ВДОЛЬ ГЕНОМА
В отличие от тандемно расположенных, многократно повторяющихся последовательностей умеренно повторяющиеся последовательности, или промежуточные повторы (г), встраиваются между уникальными последовательностями (s) и распределяются вдоль всего генома
Г151Г1$2Г153 илн г^г^^зr1smr2s,nr3s0....
Для определения длины и порядка расположения повторяющихся единиц проводят гибридизацию радиоактивно меченных
Рис. 6.5. Я. Электронная микрофотография, свидетельствующая о существовании повторяющихся последовательностей ДНК, встроенных между уникальными. Из ДНК крысы получали фрагменты длиной 2500 пар оснований. Сначала их денатурировали. а затем ренатурировали при условиях, способствующих ренатурация лишь повторяющихся последовательностей. Показаны частичные гетеродуплексы, содержащие как одно-, так и двухцепочечные участки. В нижней части рисунка даны схемы, поясняющие фотографии. Образовавшиеся причудливые формы обусловлены тем, что уникальные и повторяющиеся последовательности чередуются друг с другом. (1 kb означает 1000 пар оснований). Б. Уникальные последовател, ностн во фрагментах длиной 20 000 пар оснований. Эти фрагменты гибридизуютс с короткими фрагментами длиной 900 пар оснований. (Фото Wilkes, Paarson, WiJ. Bonner, 1978.)Рис. 6.5. Я. Электронная микрофотография, свидетельствующая о существовании повторяющихся последовательностей ДНК, встроенных между уникальными. Из ДНК крысы получали фрагменты длиной 2500 пар оснований. Сначала их денатурировали. а затем ренатурировали при условиях, способствующих ренатурация лишь повторяющихся последовательностей. Показаны частичные гетеродуплексы, содержащие как одно-, так и двухцепочечные участки. В нижней части рисунка даны схемы, поясняющие фотографии. Образовавшиеся причудливые формы обусловлены тем, что уникальные и повторяющиеся последовательности чередуются друг с другом. (1 kb означает 1000 пар оснований). Б. Уникальные последовател, ностн во фрагментах длиной 20 000 пар оснований. Эти фрагменты гибридизуютс с короткими фрагментами длиной 900 пар оснований. (Фото Wilkes, Paarson, WiJ. Bonner, 1978.)
Рис. 6.5. Я. Электронная микрофотография, свидетельствующая о существовании повторяющихся последовательностей ДНК, встроенных между уникальными. Из ДНК крысы получали фрагменты длиной 2500 пар оснований. Сначала их денатурировали. а затем ренатурировали при условиях, способствующих ренатурация лишь повторяющихся последовательностей. Показаны частичные гетеродуплексы, содержащие как одно-, так и двухцепочечные участки. В нижней части рисунка даны схемы, поясняющие фотографии. Образовавшиеся причудливые формы обусловлены тем, что уникальные и повторяющиеся последовательности чередуются друг с другом. (1 kb означает 1000 пар оснований). Б. Уникальные последовател, ностн во фрагментах длиной 20 000 пар оснований. Эти фрагменты гибридизуютс с короткими фрагментами длиной 900 пар оснований. (Фото Wilkes, Paarson, Wi
J. Bonner, 1978.)
Рис. 6.5. Я. Электронная микрофотография, свидетельствующая о существовании повторяющихся последовательностей ДНК, встроенных между уникальными. Из ДНК крысы получали фрагменты длиной 2500 пар оснований. Сначала их денатурировали. а затем ренатурировали при условиях, способствующих ренатурация лишь повторяющихся последовательностей. Показаны частичные гетеродуплексы, содержащие как одно-, так и двухцепочечные участки. В нижней части рисунка даны схемы, поясняющие фотографии. Образовавшиеся причудливые формы обусловлены тем, что уникальные и повторяющиеся последовательности чередуются друг с другом. (1 kb означает 1000 пар оснований). Б. Уникальные последовател, ностн во фрагментах длиной 20 000 пар оснований. Эти фрагменты гибридизуютс с короткими фрагментами длиной 900 пар оснований. (Фото Wilkes, Paarson, Wi
J. Bonner, 1978.)
фрагментов ДНК различной длины со стандартными молекулам! ДНК определенной длины. Условия выбирают таким образом, что бы ренатурнровались только умеренно повторяющиеся последова тельности. Если повторяющиеся последовательности чередуютс с уникальными, то последние будут выступать в виде одноцеп!
Рис. 6.6. Связывание реассоциированной ДНК на гидроксялапатите. Одноцепочечные фрагменты различной длины гибридизуются с избытком коротких молекул ДНК. Условия выбирают таким образом, чтобы реассоциировали только повторяющиеся последовательности. По мере увеличения длины фрагментов количество комплексов, связывающихся с гидроксилапатитом, вначале увеличивается; при этом предполагают, что уникальные последовательности длиннее, чем повторяющиеся. Как только длина фрагментов начинает превосходить длину уникальных последовательностей, кривая выходит на плато (Graham et al., 1974).
чечных свободных концов из двухцепочечных областей, соответствующих умеренно повторяющимся последовательностям. Определение длины двухцепочечных участков можно проводить различными способами: 1) методом электронной микроскопии (рис. 6.5), 2) путем отщепления одноцепочечных уникальных последовательностей специфическими в отношении одноцепочечных ДНК нуклеазами и последующим электрофоретическим определением размера оставшихся гибридных молекул, 3) путем связывания продуктов реассоциации с гидроксилапатитом (рис. 6.6).
Исследования такого рода, проводившиеся на многочисленных образцах ДНК из эукариот, показали, что ДНК эукариот всегда устроена либо по типу «Xenopus», либо по типу «-Drosophila». Чаще всего у них встречается ДНК типа «Xenopus». Такая ДНК обнаружена у одноклеточных организмов, растений и животных. ДНК типа «Drosophila» до сих пор обнаружена только у Drosophila, Chironomus и медоносной пчелы Apis meUi^ica. Все три вида содержат менее 0,7 пг ДНК на гаплоидный геном, что чрезвычайно мало по сравнению с содержанием ДНК в геноме насекомых среднего размера. ДНК большинства других насекомых, включая комнатную муху Musca domestica, организована по типу «Xenopus» так же, как и многие мелкие геномы видов, относящихся к другим гигтпмятииргким rnvnnaw
Чем различаются ДНК типов «Xenopus* и «Drosophila*? Эти
различия в общих чертах заключаются в следующем:
ДНК типа «Xenopus* (Davidson et aL, 1973)
50% генома
Повторяющиеся последовательностиI Уникальные последовательности
Длина: около 300 пар оснований| 700—1000 пар оснований
25% генома
Повторяющиеся последо вательности Длина: около 300 пар основанийПовторяющиеся последо вательности Длина: около 300 пар основанийI Уникальные последовательности | >4003 пар основанийI Уникальные последовательности | >4003 пар оснований
Повторяющиеся последо вательности Длина: около 300 пар оснований
Повторяющиеся последо вательности Длина: около 300 пар оснований
I Уникальные последовательности | >4003 пар оснований
I Уникальные последовательности | >4003 пар оснований
ДНК тапа «Drosophila* (Manning et al., 1975)
25% генома
Повторяющиеся последовательностиI Уникальные последовательности
Длина: 5600 (500—13 000) пар оснований | 13 000 пар оснований
2—3% генома
Повторяющиеся последовательностиI Уникальные последовательности
Длина: <500 пар оснований] >13 000 пар оснований
Дэвидсон и Бриттен, интенсивно занимавшиеся изучением кинетики реассоциации ДНК, использовали этот метод для сравнительного исследования ДНК многочисленных видов эукариот. Они получили данные, свидетельствующие о постоянстве и эволюции исследуемых образцов. В табл. 6.3 представлены некоторые типичные результаты.
lag^tlag^tРис. 6.7. Кривая ренатурацин фрагментированной ДНК человека. Кинетика рена- турации определялась по связыванию ренатурировавшей ДНК с гидпоксилапати- том. Уже в момент времени /=0 значительная часть ДНК (0,1 = 10%) существует в виде двойной спирали, в образовании которой участвуют обращенные повторы. Анализ остальной части кинетической кривой реассоциации показывает, что ДНК человека гетерогенна и содержит несколько компонентов, ренатурирующих с различными значениями Cot- В нижней части рисунка представлены кривые отдельных фракций (пунктирные линии), входящие в состав обшей кривой (Schmid, Deininger, 1975).Рис. 6.7. Кривая ренатурацин фрагментированной ДНК человека. Кинетика рена- турации определялась по связыванию ренатурировавшей ДНК с гидпоксилапати- том. Уже в момент времени /=0 значительная часть ДНК (0,1 = 10%) существует в виде двойной спирали, в образовании которой участвуют обращенные повторы. Анализ остальной части кинетической кривой реассоциации показывает, что ДНК человека гетерогенна и содержит несколько компонентов, ренатурирующих с различными значениями Cot- В нижней части рисунка представлены кривые отдельных фракций (пунктирные линии), входящие в состав обшей кривой (Schmid, Deininger, 1975).
lag^t
lag^t
Рис. 6.7. Кривая ренатурацин фрагментированной ДНК человека. Кинетика рена- турации определялась по связыванию ренатурировавшей ДНК с гидпоксилапати- том. Уже в момент времени /=0 значительная часть ДНК (0,1 = 10%) существует в виде двойной спирали, в образовании которой участвуют обращенные повторы. Анализ остальной части кинетической кривой реассоциации показывает, что ДНК человека гетерогенна и содержит несколько компонентов, ренатурирующих с различными значениями Cot- В нижней части рисунка представлены кривые отдельных фракций (пунктирные линии), входящие в состав обшей кривой (Schmid, Deininger, 1975).
Рис. 6.7. Кривая ренатурацин фрагментированной ДНК человека. Кинетика рена- турации определялась по связыванию ренатурировавшей ДНК с гидпоксилапати- том. Уже в момент времени /=0 значительная часть ДНК (0,1 = 10%) существует в виде двойной спирали, в образовании которой участвуют обращенные повторы. Анализ остальной части кинетической кривой реассоциации показывает, что ДНК человека гетерогенна и содержит несколько компонентов, ренатурирующих с различными значениями Cot- В нижней части рисунка представлены кривые отдельных фракций (пунктирные линии), входящие в состав обшей кривой (Schmid, Deininger, 1975).
i ii I i ii i i i
-HsiMihh Sg5^3l^*5
Л АЛ AAAA 1
sssls* Ий I
5 к 4^52==
888RS8SE^2
. _ . о й Д и с-в- | S!bi^ S^smsH Si^^g-SS в ci >.5
"A 5.5 -• .L^^.gj
liHOii * 2 g 5s3-CS^|8g
38 $ S§ 8g ?g 8 8§ 8g |g 8
510
&s-§a&o§&& ci oo ^ ^ ri ri — *" co g * co 2 Ь h-‘ v CO* *" g{ o‘
9 2? Яю io io ю
hh-l|b ses^ir
СЧ <o 0000*co_ b- CM 3
— О — Cl — о О* Cl co о
5 co
g8 3s5 *§S
£й-£а<з4и££с
3
5
Доля и распределение повторяющихся и уникальных последовательностей в геноме некоторых видов животных (Davidson et al., 1975а).
Повторяющиеся последовательности, длина которых колеблется) от 300 до 400 пар оснований, различаются по своей структуре. Их можно подразделить на ряд классов, члены которых в большей или меньшей степени сходны между собой. Их положение в геноме ничего не говорит об их принадлежности к классам. У Xenopus laevis встречается до 800 классов, причем каждый из них содержит 2000 идентичных копий, что в сумме составляет 1,6-106 повторов.
Помимо обычных повторяющихся последовательностей геном содержит некоторое количество так называемых обращенных повторов:
а b с а' Ь' а'.
Их величина Со/ равна 0, так как они замыкаются сами на себя с образованием палиндромов, и, следовательно, эта реакция не зависит от концентрации. В качестве примера, иллюстрирующего частоту встречаемости всех этих последовательностей и их значение, на рис. 6.7 приведены результаты исследования генома человека (Schmid, Deininger, 1975). Повторяющиеся последовательности разбросаны более чем по 80% генома. 50% генома составляют уникальные последовательности длиной около 2000 пар оснований; обращенные повторы распределены статистически вдоль всего генома.
Какое значение имеют повторяющиеся последовательности? Самым естественным ответом было бы то, что они участвуют в регуляции транскрипции. Бриттен, Дэвидсон и их сотрудники обнаружили. что основная часть цитоплазматической мРНК (РНК, связанная с полисомами; см. гл. 38) содержит участки, непосредственно примыкающие к повторяющимся последовательностям. Выделенная из ядер РНК включает транскрипты из повторяющихся и уникальных последовательностей.
Для наглядности представим себе участок генома г abc г def г gh..., где г означает повторяющуюся единицу, a abc — уникальную последовательность. В ядерной РНК найдены rab, rde, gh и пр. В мРНК найдены только a. d и g. но в пей нет b, с, е, f, h и г. Эти данные, указывающие на то, что повторяющиеся и большая часть уникальных последовательностей не транслируются, очень важны, так как сам собой напрашивается вопрос: для чего требуется так много избыточной (?) ДНК в геноме эукариот? Таким образом, отпадает упрощенное представление о том. что основная масса генома состоит из повторяющихся последовательностей.
Равномерно ли распределены четыре нуклеотида по всему геному? На этот вопрос также следует ответить отрицательно. В геноме мыши, крупного рогатого скота и некоторых других млекопитающих 20% генома состоит из АТ-богатых участков длиной
Рис, 6.8. Две частично денатурированные молекулы ДНК из одного и того же источника (крупный рогатый скот). Одна из них ^вверху) содержит много АТ-бо- гатых участков с разделенными комплементарными цепями, образующими «пузыри*. У второй молекулы (внизу) такие пузыри отсутствуют. Масштаб соответствует 1 мкм. (Фото предоставлено Mayfield и McKenna, 1978).
1500 пар оснований, не подчиняющихся статистическому распределению. АТ-богатые участки легко идентифицировать с помощью электронной микроскопии после частичной денатурации ДНК (рис. 6.8). Неравномерное распределение этих участков служит возможной причиной появления так называемых <Q-cerMCHTOB> в метафазных хромосомах. Для их обнаружения используют флуоресцирующий краситель, образующий с АТ-богатыми участками комплексы, спектры флуоресценции которых отличаются от спектров флуоресценции комплексов с ГЦ-богатыми участками (см. рис. 41.2—41.6).
Высокое постоянство, с каким встречаются повторяющиеся последовательности, наводят на мысль о том, что их присутствие обусловливает существенное селективное преимущество для организмов. Отдельные, обсуждавшиеся до сих пор результаты позволяют сделать вывод о том, что скорость мутаций в повторяющихся последовательностях, хотя и высока, не превышает скорости мутаций быстро эволюционирующих структурных генов (Britten, Davidson, 1976).
У -2094
ЭВОЛЮЦИЯ ДНК ЭУКАРИОТ
Как развивался геном эукариот? Здесь прежде всего следовало бы выяснить вопрос о том, каким образом возник геном определенного размера. Самым простым ответом на этот вопрос был бы такой: геном возник в результате многократных, следующих друг за другом дупликаций. На рис. 6.1 показано, как это приблизительно могло бы происходить и сколько для этого потребовалось бы дупликаций. Однако из приведенных данных нельзя сделать никаких выводов ни о функциях ДНК, ни о значении специфических участков. Как мы увидим в последующих главах, у многих белков обнаружены внутренние дупликации. Прекрасный пример этому представляют антитела. В сильно упрощенном виде молекулу антитела можно изобразить следующим образом:
^цСщСщСнз.
Все четыре участка, значение которых выяснится позднее (см. гл. 22), гомологичны друг другу, и соответствующие им гены, по-видимому, произошли от одного общего предкового гена. Такая структура может возникнуть в результате последовательных дупликаций какого-то одного структурного гена. Это вновь указывает на то, что в подобных случаях происходит не только удвоение всего генома, но и избирательное умножение отдельных его участков. То, что многократное удвоение всего генома может быть даже причиной эволюции, достаточно подтверждается на примерах растений. Почти все культурные растения являются полиплоидами или амфидиплоидами. Последние представляют собой гибриды между двумя близкородственными видами, в геноме которых объединились обе родственные ветви. Число хромосом и количество ДНК в нем равно сумме соответствующих показателей в обоих первоначальных геномах. В связи с этим мы могли бы задать вопрос о том, сопровождается ли увеличение количества ДНК увеличением числа функций, и снова мы должны ответить на него отрицательно. Амфиднплоидные или полиплоидные культурные растения практически всегда превосходят свои исходные формы лишь в количественном, но не в качественном отношении прежде всего потому, что увеличение количества ДНК не сопровождается возникновением новых функций. Однако при однократном удвоении генома обе его части могут развиваться дальше и накапливать разные мутации независимо друг от друга (дивергировать). Межвидовые скрещивания и возникновение амфидиплоидов у животных наблюдаются очень редко, так как у них существует множество препятствующих этому механизмов.
Несмотря на указанные ограничения, увеличение и уменьшение количества ДНК играют в эволюции организмов заметную роль. Кроме точковых мутаций, изменение количества ДНК является
единственным и к тому же наиболее эффективным способом модификации информации и ускорения процесса эволюции. Значение ючковых мутаций в эволюции организмов обычно сильно переоценивается. Сегодня известно, что они играют всего лишь второстепенную роль. Даже при спонтанных мутациях и в ходе эволюции прокариот основными механизмами служат делеции и дупликации отдельных частей генома. Во многих случаях адаптация к новому субстрату- основана на перепрограммировании генома, причем гены, кодирующие ферменты, вырабатываемые обычно лишь в следовых количествах, избирательно активируются таким образом, что необходимые генные продукты начинают производиться в больших количествах.
Определение содержания ДНК у различных видов позволяет выявить ряд закономерностей, которые могут объяснить причину эволюции. Мы начинаем понимать, чем обусловлена различная скорость эволюции и почему успех какого-либо вида предопределяется размером генома. Сегодня содержание ДНК известно у более чем 1000 видов. Определение количества ДНК проводится колориметрическим способом: либо по флуоресценции ДНК, выделенной из определенного числа ядер, либо микроспектрофото- метрическим методом в ядрах отдельных клеток после окрашивания их по Фёльгепу. Хотя оба метода дают сходные результаты, цифровые данные при этом редко совпадают, так что приходится мириться с большим разбросом полученных величин. Количество ДНК у свободноживущих организмов варьирует между 0,007 пг (среднее значение для бактерий) и 100 пг на гаплоидный геном (у некоторых растений и саламандр). Разница между этими величинами составляет четыре порядка. В клетках млекопитающих содержится лишь 3—6 пг ДНК, что приблизительно в 500—1000 раз больше, чем у бактерий. Некоторые цифры приведены в табл. 6.4.
В этих данных можно усмотреть ряд тенденций (Mirsky, Ris, 1951).
С повышением уровня организации у беспозвоночных наблюдается увеличение количества ДНК (в расчете на гаплоидный геном).
Родственные виды, например члены одного семейства, содержат примерно одинаковое количество ДНК.
Эволюция наземных позвоночных сопровождается уменьшением количества ДНК-
Размах колебаний в содержании ДНК в пределах одной систематической группы варьирует в разных группах. Например, у птиц содержание ДНК у видов с наименьшим и наибольшим количеством ДНК различается в 1,3 раза, а у хвостатых амфибий — в 5 раз. У высших эукариот в клетках редко содержится меньше 0,4 пг ДНК. Из этого можно заключить, что в клетке должно присутствовать какое-то минимальное количество ДНК*
ВидКоличество ДНК в гаплоидном геноме, пгМикоплазмы0,0017—0,0037Бактерии0,0033—0,01Губки0,05Кишечнополостные0,35—0,73Кольчатые черви0,09—5,3Ракообразные0,09-15,8Насекомые0,1—7,5МоллюскиБрюхоногие0.43-4,4Двустворчатые0,65—5,4Иглокожие0.54—3,3Низшие хордовые0,20—1,5Акулы и скаты2,8-9,8Костистые рыбы0,39—4,4АмфибииХвостатые19100Безхвостые1,2— 7,9Рептилии1,5- 3,5Птицы1,7— 2,3Млекопитающие3,0- 5,8РастенияPsilopsida129— 313Папоротники6,0—~100Голосеменные4,2— 50Покрытосеменные1,2— 89ВидКоличество ДНК в гаплоидном геноме, пгМикоплазмы0,0017—0,0037Бактерии0,0033—0,01Губки0,05Кишечнополостные0,35—0,73Кольчатые черви0,09—5,3Ракообразные0,09-15,8Насекомые0,1—7,5МоллюскиБрюхоногие0.43-4,4Двустворчатые0,65—5,4Иглокожие0.54—3,3Низшие хордовые0,20—1,5Акулы и скаты2,8-9,8Костистые рыбы0,39—4,4АмфибииХвостатые19100Безхвостые1,2— 7,9Рептилии1,5- 3,5Птицы1,7— 2,3Млекопитающие3,0- 5,8РастенияPsilopsida129— 313Папоротники6,0—~100Голосеменные4,2— 50Покрытосеменные1,2— 89Таблица 6.4Таблица 6.4‘'Содержание ДНК в геномах некоторых про- и эукариот (Hinegardner, 1976)‘'Содержание ДНК в геномах некоторых про- и эукариот (Hinegardner, 1976)
Вид
Количество ДНК в гаплоидном геноме, пг
Микоплазмы
0,0017—0,0037
Бактерии
0,0033—0,01
Губки
0,05
Кишечнополостные
0,35—0,73
Кольчатые черви
0,09—5,3
Ракообразные
0,09-15,8
Насекомые
0,1—7,5
Моллюски
Брюхоногие
0.43-4,4
Двустворчатые
0,65—5,4
Иглокожие
0.54—3,3
Низшие хордовые
0,20—1,5
Акулы и скаты
2,8-9,8
Костистые рыбы
0,39—4,4
Амфибии
Хвостатые
19100
Безхвостые
1,2— 7,9
Рептилии
1,5- 3,5
Птицы
1,7— 2,3
Млекопитающие
3,0- 5,8
Растения
Psilopsida
129— 313
Папоротники
6,0—~100
Голосеменные
4,2— 50
Покрытосеменные
1,2— 89
Вид
Количество ДНК в гаплоидном геноме, пг
Микоплазмы
0,0017—0,0037
Бактерии
0,0033—0,01
Губки
0,05
Кишечнополостные
0,35—0,73
Кольчатые черви
0,09—5,3
Ракообразные
0,09-15,8
Насекомые
0,1—7,5
Моллюски
Брюхоногие
0.43-4,4
Двустворчатые
0,65—5,4
Иглокожие
0.54—3,3
Низшие хордовые
0,20—1,5
Акулы и скаты
2,8-9,8
Костистые рыбы
0,39—4,4
Амфибии
Хвостатые
19100
Безхвостые
1,2— 7,9
Рептилии
1,5- 3,5
Птицы
1,7— 2,3
Млекопитающие
3,0- 5,8
Растения
Psilopsida
129— 313
Папоротники
6,0—~100
Голосеменные
4,2— 50
Покрытосеменные
1,2— 89
Таблица 6.4
Таблица 6.4
‘'Содержание ДНК в геномах некоторых про- и эукариот (Hinegardner, 1976)
‘'Содержание ДНК в геномах некоторых про- и эукариот (Hinegardner, 1976)
Размеры тела (у взрослых организмов) положительно коррелируют с количеством ДНК в их клетках. Примером тому служат моллюски, многие растения и насекомые. Так, у Drosophila mela- nogaster вдвое больше ДНК, чем у Drosophila uirilis, и размеры ее тела также вдвое больше.
Как правило, количество ДНК не коррелирует с числом хромосом. Исключение составляют полиплоидные ряды у растений, близкородственные формы которых имеют разное число хромосом, кратное какому-то основному числу п. У иглокожих содержание ДНК колеблется между 0,5 и 3 пг, причем во всех случаях у исследованных животных обнаружено 21 или 22 хромосомы. Все саламандры рода Plethodon имеют 14 хромосом. Количество ДНК -в их клетках варьирует между 18 и 69 пг. У высших не установлено корреляции между количеством ДНК и числом хромосом.
Содержание ДНК и специализация клеток положительно коррелируют друг с другом. «Нормальные» формы имеют такое количество ДНК, которое соответствует его среднему значению, характерному для данной систематической группы. На рис. 6.9 это
Рис. 6.10. Подразделение всех организмов на четыре класса на основе содержания ДНК в гаплоидном геноме. Класс I — бактерии, класс II —грибы, класс III — все животные и ряд растений, класс IV — многие растения, саламандры и некоторые рыбы (кроме костистых) (Hinegardner, 1976).
поясняется на примере рыб, но та же зависимость наблюдается и у насекомых, амфибий, моллюсков, галотурий, высших и некоторых других групп растений. Специализированные и(или) нечетко выраженные формы имеют либо больше, либо меньше ДНК, чем средние «типичные» виды соответствующих групп.
Хайнгарднер (Hinegardner, 1976) разделил все организмы на четыре класса, исходя из содержания в них ДНК (рис. 6.10).
К первому классу относятся прокариоты. Они не могут вырабатывать большие количества ДНК, так как у них отсутствует механизм ее равномерного распределения в процессе клеточного деления (механизм митоза).
Второй класс составляют грибы.
К третьему классу относятся большая часть животных и многие растения. У видов внутри этого класса обнаружена наибольшая гетерогенность в отношении их среды обитания, анатомии и физиологии.
К четвертому классу принадлежит целый ряд относительно примитивных растений (в том числе голосеменные), саламандры и некоторые примитивные рыбы. Внутри вышеупомянутых групп обнаружены лишь небольшие вариации. Виды высоко специализированы.
Слишком большой избыток ДНК причиняет организму только вред. Как у животных, так и у растений существуют филогенетические линии, которые эволюционируют очень медленно. Как правило, они содержат больше ДНК, чем родственные виды быстро развивающихся групп. В качестве примеров можно привести Psilopsida (129—313 пг), двоякодышащих (80—140 пг) и кишечнополостных (7 пг). Большая часть их геномов не несет никакой
информации, и избыточное количество ДНК, очевидно, прспятст- нует эффективной Изменчивости этих организмов.
Среднее количество ДНК, характерное для той или иной таксономической группы, обратно пропорционально числу видов в • гой группе. Это справедливо прежде всего для позвоночных, у ко- юрых богатые видами группы (птицы и костистые рыбы) содержат чрезвычайно малые количества ДНК, а бедные видами группы (саламандры, двоякодышащие) очень большие.
Какие изменения произошли в ходе эволюции? Во-первых, изменилась относительная частота определенных нуклеотидных последовательностей, и, во-вторых, общее количество ДНК сначала увеличилось, а на поздних этапах уменьшилось.
Скорость утраты генетической информации, как правило, выше, чем скорость замены нуклеотидов, а это означает, что утрата информации не может компенсироваться за счет мутаций. Утрата генетической информации приводит к потере функций, а затем к специализация клеток или даже к вымиранию вида.
Ничто (ни машина, ни теоретическая концепция, ни организм) нс может быть оптимально приспособлено к выполнению какой- либо одной специфической функции и в то же время оставаться оптимальным для всех ситуаций. Через некоторое время любое развитие замирает, так как потенциальные возможности для дальнейшего развития оказываются исчерпанными. Шансы на выживание в любом случае связаны с реорганизацией генетического материала и с приобретением в результате этого новых функций.
Практически ни один вид не остается неизменным в течение длительного времени, что обусловлено изменением окружающей среды. Всегда происходит отбор тех организмов, которым легче всего добывать пищу, эффективно размножаться и избегать хищников. Но так как каждый организм служит добычей для другого, отбор действует на оба. Всякий раз, когда для добычи увеличиваются шансы на выживание, возрастает и се общая биомасса. Следовательно, это исключительно вопрос времени, приноровится ли данный хищник к новой ситуации, или появится какой-то новый хищник. Отсюда видно, что никакой подлинной эволюции нс происходит, пока система находится в равновесии.
Чем более постоянна окружающая среда, тем меньше скорость эволюции существующих в этой среде видов. Глубоководные рыбы, живущие в чрезвычайно постоянной, но в то же время и чрезвычайно специфической среде, обладают ДНК-богатым геномом по сравнению с рыбами, живущими у поверхности воды в зоне, подверженной сильным изменениям. А наземные позвоночные обычно содержат еще меньше ДНК, чем водные.
После этих наглядных примеров естественно возникают вопросы, что есть причина и чтб есть следствие. Параметры окружающей среды имеют исключительно селективное значение. Способ-
ностью к адаптации обладают виды только таких таксономических групп, у которых геном допускает адаптивные изменения. Если же такая возможность у генома отсутствует, то никакой адаптации не произойдет, даже если параметры окружающей среды изменятся. Их изменение в неблагоприятную сторону приведет к вымиранию вида. Составленный палеонтологами список вымерших видов во много раз превышает число оставшихся видов.
Уровень общей организации и сложность генома. Как организована «избыточная-» ДНК в геноме? При утрате ДНК вследствие специализации исчезают как повторяющиеся, так и уникальные последовательности. Высокая сложность генома не обусловливает автоматически более высокой ступени эволюции. Сложность генома у медузы Aurelia, например, приблизительно в шесть раз выше, чем у Drosophila, и тем не менее у Aurelia отсутствуют какие-либо органы. Хвостатые амфибии содержат больше ДНК, чем бесхвостые (лягушки, жабы). Приведем несколько примеров:
23 523 723 523 7Содержание ДНК на гаплоидный геном, пг
23 52
3 7
23 52
3 7
Triturus cristatus
Necturus maculosus Xenopus laevis Bujo bufo
Оба указанных здесь вида каждой группы содержат одинаковое число уникальных последовательностей и разное число умеренных повторов. При этом число классов повторяющихся последовательностей у них сохраняется и меняется лишь число копий в каждом классе.
По сравнению с бесхвостыми хвостатые амфибии имеют более высокую сложность не только умеренных повторов, но и уникальных последовательностей (Baldari, Amaldi, Rom, 1976).
При сравнении уникальных и повторяющихся последовательностей у Xenopus laevis и Xenopus mulleri (borealis) выяснилось, что многие повторяющиеся последовательности у Xenopus mulleri встречаются в 10—100 раз реже, чем у Xenopus laevis. Вместе с тем для других повторяющихся последовательностей наблюдается прямо противоположная закономерность. Если не все, то более 70% уникальных последовательностей у обоих видов гомологичны друг другу. Однако вследствие мутаций в обеих линиях возникло 10—15% измененных пар оснований.
Бахман и Прайс проанализировали несколько родов подсемейства Microseridinae (сходное с одуванчиком американское растение из семейства сложноцветных) и обнаружили резкое уменьшение содержания ДНК в зависимости от специализации растений. Результаты ясно показывают, что вследствие специализации утрачивается не только избыточная, но и генетическая информация.
При этом диапазон вариаций многих признаков сужается с ростом специализации. При уменьшении размера генома происходит пропорциональная утрата умеренно и многократно повторяющихся, а также уникальных последовательностей.
ЛИТЕРАТУРА
Ayala F. 1. fed.). 1976. Molecular evolution, Sunderland, Mass. Sinauer Ass. Inc.
Bachman K., Goin D. B., Goin C. J. (1974). Nuclear DNA amounts in vertebrates.
In: Evolution of genetic systems, Brookhaven Symp. Biol., 23.
Britten R. J., Kohne D. E. (1968). Repeated sequences in DNA, Science, 161, 529.
Chamberlin M. E„ Britten R. J., Davidson E. H. (1975). Sequence organization in Xenopus DNA studied by the electron microscope. J. Mol. Biol., 96, 317.
Davidson E. H. 1976. Gene activity in early development, 2. Aufl. New York, London, Academic Press.
Davidson E. H„ Hough B. R., Amenson C. S„ Britten R. J, (1973). General interspersion of the repetitive with non-repetitive sequence elements in the DNA of Xenopus, J. Mol. Biol., 77, 1.
Davidson E. IL, Galau G. A., Angerer R. C., Britten R. J. (1975a). Comparative aspects of DNA organization in metazoa, Chromosoma, 51, 253.
Davidson E. H„ Hough B. R„ Klein W. H., Britten R. J. (1975b). Structural genes adjacent to interspersed repetitive DNA sequences, Cell, 4, 217.
Deininger P. L, Schmid C. W. (1976). An electron microscope study of the DNA sequence organization of the human genome, J. Mol. Biol., 106, 773.
Galau G. A., Chamberlin M. E., Hough B. R., Britten R. J., Davidson E. H.. Evolution oi repetitive and nonrepetitive DNA. In: Molecular evolution, Ayala F. J. (ed.). (1976). Sunderland, Mass, Sinauer Ass. Inc,
Gall 1. G., Atherton D. D. (1974). Satellite DNA sequences in Drosophila virilis, J. Mol. Biol.. 85, 633.
Ginelii E., Dilernia R.. Cornea G. (1977). The organization of DNA sequences in the mouse genome. Chromosoma, 61, 215.
Graham D. E., Neufeld B. R., Davidson E. H., Britten R. J. (1974). Interspersion of repetitive and non-repetitive DNA sequences in the sea urchin genome, Cell, 1, 127.
Hinegardner R. Evolution of genome size. In: Molecular evolution, Ayala F. J. (ed.). 1976. Sunderland. Mass, Sinauer Ass, Inc.
Manning I. E., Schmid C. W„ Davidson N. (1975). Interspersion of repetitive and nonrepetitive DNA sequences in the Drosophila melanogaster genome, Cell, 4, 141.
Mayfield I. E., McKenna I. F. (1978). A-T rich sequences in vertebrate DNA, Chromosoma. 67. 157.
Mirsky A. E.. Ris H. (1951). The deoxyribonucleic acid content of animal cells and its evolutionary significance, J. Gen. Physiol., 34, 451.
Price H. L. Bachmann K. (1975). DNA content and evolution in the Microseridinae, Am. J. Bol.. 62. 262.
Schmid C. IF., Deininger P. L. (1975). Sequence organization of the human genome, Ceil, 6, 345.
Sparrow А. H., Nauman A. F. (1976). Evolution of genome size by DNA doublings. Science, 192. 524.
Waring M„ Britten R. J. (1966). Nucleotide sequence repetition: A rapidly reassociating fraction of mouse DNA. Science, 154, 791.
Wilkes M. M., Pearson W. R„ Wu L-R., Bonner J. (1978). Sequence organization of the rat genome by electron microscopy. Biochemistry, 17, 60.
Описанные в предыдущих главах методы позволяют охарактеризовать организацию и нуклеотидную последовательность генов эукариот. Основная сложность заключается в их выделении. Если в руках исследователя уже есть какой-либо фрагмент ДНК с желаемой нуклеотидной последовательностью, то получение этого фрагмента в нужных количествах связано только с затратами труда. С помощью описанных в гл. 11 опытов по клонированию генов можно получить ДНК из любого источника в больших количествах. Поэтому благодаря чрезвычайно эффективным аналитическим методам, существующим в настоящее время, число выясненных нуклеотидных последовательностей эукариотических генов постоянно возрастает. Гены эукариот кажутся более интересными, чем гены прокариот, так как нуклеотидные последовательности определены лишь для нескольких фаговых геномов, бактериальные же гены в этом отношении изучены мало. Часто для определения нуклеотидной последовательности того или иного гена анализируют соответствующую мРНК, выделенную из специализированных клеток. В качестве исходного материала используют такие клетки, в которых предпочтительно экспрессируется данный ген. Нуклеотидная последовательность, установленная таким образом, как правило, хорошо согласуется с соответствующей (известной) аминокислотной последовательностью кодируемого ею белка. Позже мы еще вернемся к тому факту, что не все кодоны равнозначны и что одни из них используются чаще, чем другие.
В 1977 г. совершенно неожиданно было установлено, что у аденовирусов первичный продукт транскрипции содержит в своей средней части последовательность, которая отсутствует в готовой мРНК. Это явление получило название «сплайсинг», а утраченный в результате процессинга участок был назван интроном (Gilbert, 1978, см. гл. 10).
То, что поначалу представлялось курьезным случаем, вскоре оказалось широко распространенным явлением в генах эукариот. Доказано, что сплайсинг имеет место в генах fl-глобинов мыши и кролика, иммуноглобулинов мыши, овальбумина и лизоцима курицы, рРНК Drosophila и тРНК дрожжей. При этом интроны могут быть разной длины: от 10 до более чем 1000 пар оснований. Возникают вопросы: почему некоторые гены разделены на фрагменты? находятся ли эти фрагменты рядом друг с другом? До сих пор еще нет ясных ответов на эти вопросы.
В последующем изложении мы приведем в качестве примеров несколько генов эукариот: гистоновый ген (чтобы обсудить организацию повторяющихся последовательностей), инсулиновый ген (чтобы показать, как происходит клонирование и экспрессия генов в бактериях), глобиновый ген, как пример первого гена эукариот.
у которого была, определена нуклеотидная последовательность, и несколько других генов с установленной последовательностью оснований. И наконец, в гл. 37 мы познакомимся со структурой и организацией генов рРНК и тРНК-
ГИСТОНОВЫЕ ГЕНЫ
Гистоны образуются в больших количествах в начале S-фазы клеточного цикла. В эмбриональных клетках морского ежа на их долю приходится 60% общего синтеза белков.
Различают пять классов гистонов: Hl, Н2А, Н2В, НЗ и Н4. Гистоны — это низкомолекулярные, консервативные в отношении последовательностей и функций белки. Гистоны НЗ и Н4 менее изменчивы, чем гистоны Н2А и Н2В, которые обнаруживают некоторую изменчивость в зависимости от стадии развития данного организма (см. рис. 40.2).
Эмбриональные клетки морского ежа на стадии I—300 клеток содержат a-форму гистона Н2В; на стадии бластулы в них обнаружены также и p-форма, а на стадии гаструлы —у-форма. В клетках мезенхимы содержатся а-, у- и 6-формы этого гистона, а в спермиях— a-форма (Cohen, Newrock, Zwcidler, 1975).
Все варианты гистонов различаются между собой заменами отдельных аминокислот в N-концевых участках полипептидных цепей. Таким образом, эти гистоны служат маркерами программы развития, указывающими па то, что на ее последовательных стадиях проявляются различные гены (см. также изоферменты, гл. 17). Наряду с генетически обусловленной изменчивостью у гистонов существует изменчивость, основанная на посттрансляционной модуляции (см. гл. 40). При этом под действием ферментов происходит метилирование, ацетилирование или фосфорилирование отдельных аминокислот. Выделение гистоновых генов представляет интерес по разным причинам. Во-первых, это гены, многократно повторяющиеся в гаплоидном геноме эукариот и потому легче поддающиеся исследованию, чем те, которые представлены в гаплоидном геноме всего одной копией. Во-вторых, речь здесь идет об участках ДНК, которые в отличие от многократно повторяющихся генов рРНК п тРНК (см. гл. 37) не только транскрибируются, но и транслируются. Кроме того, интересны не только структурные гены, но и соседние области, так как нам хотелось бы знать, существует ли и здесь такая же система контроля, какая известна у прокариот (оператор, промотор, стартовый сигнал и т. д.), и если существует, то действует ли она таким же или каким-то иным образом, или геном эукариот регулируется с помощью принципиально других механизмов. Основанием для такого предположения служит тот факт, что ДНК-зависимая РНК-по-
лимераза эукариот во многих отношениях отличается от соответствующего фермента прокариот (и вирусов; см. гл. 20).
Интересно также выяснить значение отдельных участков ДНК, при этом в первую очередь необходимо обратить внимание на вопрос о том, какие из этих участков изменяются в ходе эволюции, а какие сохраняются неизменными. Кроме того, нам хотелось бы знать, одинаковы ли гены во всех органах данного индивидуума, или из-за соматических мутаций и рекомбинаций они видоизменяются и вследствие этого по-разному экспрессируются во время развития индивидуума.
Представляет интерес и вопрос об активности выделенной ДНК. Методы генетической инженерии (см. гл. 11) дают возможность перенести любой фрагмент ДНК в ту или иную плазмиду или умеренный фаг (например, X) и размножить его в бактериях. Однако при транскрипции и трансляции чужеродных генов возникают трудности.
Мерц, Де Робертис и Гордон разработали в 1977 г. метод, позволивший вводить ДНК в ооцитные ядра амфибий, что вызывало инициацию транскрипции. Крессман и Бёрнстил модифицировали этот метод, приспособив его для «массового производства» генных продуктов. В своей системе они использовали выделенные из морского ежа гистоновые гены и показали, что в ооцитах транскрибируются по крайней мере гены гистоиов Н2А и Н2В.
Как выделяют гистоновые гены? Бернстил и др. (Birnstiel ct al., 1974) выделили гистоновые гены из Psammechinus militaris (вид морских ежей). При этом они, во-первых, использовали мРНК в качестве зонда для идентификации выделенного продукта и, во- вторых, исходили из того, что гистоновые гены многократно повторяются. В гаплоидном геноме морского ежа содержится 300— 1000 копий гистоновых генов, что составляет около 0,3% всего генома.
Вид Число гистоновых генов на гап
лоидный геном
Psammechinus500—1000
Slrongylocenlrotus300
Paracentrotus400
Xenopus laevis20—50
Мышь10—20
Человек10—20
Drosophila30—40
Первые три приведенных в списке вида относятся к морским ежам. В связи с этим возникает вопрос о том, почему они содержат избыток генов по сравнению с позвоночными и дрозофилой. Причину здесь следует искать в том, что в неоплодотворенных яйцах морских ежей вряд ли есть гистоны. Они образуются в них только после оплодотворения, тогда как ооциты и яйца амфибий
содержат достаточно гистонов, чтобы удовлетворить потребность в них на ранних стадиях развития. В эмбриональных клетках Хе- nopus laevis обнаруживается лишь небольшое количество новообразованной гистоновой мРНК.
Ооциты и яйца морских ежей богаты гистоновыми мРНК, которые связываются с полисомами преимущественно незадолго до начала и во время S-фазы. Поэтому на этой стадии полисомы служат хорошим источником для получения обогащенных фракций и выделения той или иной специфической мРНК. Гистоновые мРНК имеют константу седиментации, равную 9S, и отличаются отсутствием концевых последовательностей поли (А) (см. гл. 9). Гистоновые мРНК являются гетерогенной популяцией молекул, так как они служат матрицами для всех гистонов: Hl, Н2А, Н2В, НЗ и 114. Однако все эти типы мРНК можно разделить и точно идентифицировать.
ДНК гистоновых генов более богата GC-парами, чем остальная ДНК морского ежа, и поэтому их можно разделить путем центрифугирования в градиенте плотности. Отделение гистоновых генов от остального генома обусловлено тем, что выделенная из ядер ДНК под действием гидродинамических сил дробится на короткие фрагменты, длина которых не превышает длину гистоновых генов.
Эффективность методов разделения в градиенте плотности значительно повышается при введении актиномицина (формула представлена на рис. 3.4). Молекулы актиномицина преимущественно связываются с GC-парами ДНК, благодаря чему увеличивается различие в плотности между GC- и АТ-богатыми ДНК.
Доказательство того, что гистоновые гены морского ежа организованы в оперон, было получено после выделения из ядер предшественника мРНК, который содержал все пять видов мРНК. Это было довольно трудно доказать, так как предшественник относительно быстро распадался на отдельные компоненты.
Длина повторяющейся последовательности («гистоновый оперон») у разных видов различна.
Вид Длина повторяющейся единицы, число нуклеотидных пар
Psammechinus 5600—6000 Strongylocentrotus 6000—6700 Drosophila 4000—5000 Homo sapiens >14500
Структурные участки генов богаты GC-парами, а спейсерные области — АТ-парамн. Частичная денатурация выделенной ДНК дает возможность обнаружить АТ-богатые области электронно- микроскопическими методами. С помощью рестриктаз и последующего анализа рестрикционных фрагментов можно определить порядок расположения отдельных генов. У Psammechinus установле-
PsenimechinHs miUtaris
HlHl680680H*HZ8НЗH2A
Hl
Hl
680
680
23E23C3E33
9*0888500950 970510550700
SUoiigyloccntrgtus purpuratus
HI №HZB H3 HZA
—EZZ2f~~~~1П.' 1I 1! . '
070690 *001190520 610 970 080 520
Рис. 7.1. Расположение гистоновых генов в ДНК двух видов морских ежей. На рисунке оба гистоновых оперона (многие из них расположены в геноме последовательно друг за другом) изображены во всю длину. Цифры обозначают число пар оснований. Кодируемые последовательности отделены друг от друга спейсера- ми. Данные об опсроне Psammechinus взяты из работы Schaffner et al., 1976, а данные об опероне Strongylocenlrotus— из работы Kedes, 1976).
но следующее расположение (З'-^-б') и направление транскрипции (б'-^З7) гистоновых генов (Birnstiel et al., 1976).
Н4-* Н2В-НЗ— Н2А—Н1.
Кедес и его сотрудники (Kedes, 1976) проанализировали гистоновые гены у Strongylocenlrotus purpuratus и получили качественно те же результаты (рис. 7.1).
Соответствие между гистоновыми генами и их продуктами было установлено с помощью высокоочищенной мРНК, на которой в системе in vitro параллельно были синтезированы отдельные гистоны. До 1978 г. у обоих видов морских ежей было расшифровано свыше половины повторов. Среди расшифрованных участков были гены гистонов НЗ и Н2А, а также значительная часть остальных структурных генов. Интроны не были обнаружены. Подтвердились данные о специфической локализации области, кодирующей гистоновые гены, в одной цепи ДНК и о ее полярности. Очевидно, «гистоновый оперон» используется лишь один раз. «Считывание» с использованием двух других точек отсчета со сдвигом на один или два нуклеотида не привело к какому-либо разумному результату. До сих пор не удалось идентифицировать регуляторные участки.
Спейсерные последовательности содержат многочисленные стоп- сигналы для трансляции, и уже поэтому не может быть и речи об их использовании в качестве структурных генов для крупных полипептидов. Кроме того, в них встречаются длинные последовательности из ТТТ... и AAA... (Schaffner et al., 1976; Sures et al., 1976).
Вначале мы уже указывали на гетерогенность некоторых гистонов, в связи с чем возникает вопрос о том, как осуществляется их кодирование. Из приведенных выше данных следует, что повторяющиеся единицы у всех исследуемых видов различаются по длине
Еще одно свидетельство гетерогенности гистонов получено из анализа рестрикционных фрагментов. Таким образом, все говорит о том что гистоны у морских ежей и других видов кодируются с помощью полиморфной серии генов, что и составляет генетическую основу гетерогенности гистонов. Однако тут же встает вопрос о том, какой из оперонов активируется на той или иной стадии развития и каким образом репрессируются остальные опероны.
Клетке требуются эквимолярные количества гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4 (см. гл. 40), но лишь половина этого количества гистона Н1, причем неизвестно, на каком уровне происходит такое сокращение.
О консервативном характере гистонов свидетельствуют опыты Вильсона и Молли (Wilson, Meili, 1977), которые показали, что гистоновая мРНК из эмбрионов морского ежа гибридизуется с соответствующей ДНК из генома человека так же хорошо, как и гистоновая мРНК из клеток человека (клетки HeLa в S-фазе).
Так как у морских ежей все гистоновые гены расположены друг за другом в одной цепи ДНК и транскрибируются как единое целое, есть смысл говорить об одном опероне. Однако это утверждение’ нельзя обобщать. У Drosophila, например, все гистоновые гены, хотя и находятся в одной повторяющейся единице, распределяются в обеих цепях ДНК. При этом образуется пять единиц транскрипции:
Н1-Н2В-Н2А-Н4-НЗ.
С помощью радиоавтографии in situ установлен порядок расположения гистоновых генов (диски 39D — Е) в гигантской хромосоме 2 у Drosophila metanogaster (см. рис. 42.3). Таким же образом удалось локализовать гистоновые гены в хромосомах типа ламповых щеток из ооцитов амфибий (см. рис. 42.12).
ИНСУЛИНОВЫЙ ГЕН
Одна из возможных областей применения генетической инженерии (см. также гл. 11)—это производство важных белков в индустриальном масштабе. К наиболее интересным белкам такого рода принадлежат пептидные гормоны, такие, как инсулин или гормон роста, а также антитела. В 1977 г. в этом направлении были достигнуты первые успехи (Ullrich et al., 1977). Этим авторам удалось перенести инсулиновый ген в плазмиду, трансформировать клетки Е. coll и клонировать в них включенный ген. При этом они следовали ставшим уже классическим путем: мРНК, несущую информацию о синтезе инсулина, включая его первоначальные стадии [МН2-(препептид)-В-цеиь-(С-цепь)-А-цепь-СООН; подробнее см. гл. 18, рис. 39.2], выделяли из клеток островков Лангерганса поджелудочной железы крысы и с помощью обратной
транскриптазы (см. гл. 19) переписывали в комплементарную цепь (к ДНК). После деградации мРНК из одноцепочечной ДНК получали двухцепочечную. Образовавшиеся шпилькоподобные структуры и одноцепочечные концы удаляли, разрушая их путем обработки ДНК нуклеазой S1. Готовый продукт был полидисперсным, но основная масса фрагментов имела длину около 450 нуклеотидов.
С помощью лигазы Т4 к обоим концам ДНК пришивали последовательности
CCAAGCTTGGGGTTCGAACC
Обработка ДНК рестриктазой Hind III приводила к появлению на обоих концах молекулы одноцепочечных областей (участки расщепления рестриктаз см. в. табл. 20.3). Аналогичным образом с помощью рестриктазы Hind III можно расщепить плазмиду рМВ9 (мол. масса 3,5-106) лишь в одном определенном месте. Эта плазмида несет гены устойчивости к тетрациклину и колицину (см. гл. 11). Чтобы обеспечить связывание ДНК инсулинового гена с плазмидной ДНК, необходимо работать с избытком плазмид.
Продукт рекомбинации переносили в клетки Е. coll. Затем среди устойчивых к тетрациклину клонов отбирали клон, содержащий ДНК с инсулиновым геном. Для этого выделяли клон, плазмидная ДНК которого гибриднзовалась с инсулиновой ДНК. Для гарантии в этой ДНК определяли нуклеотидную последовательность методом Максама — Гильберта (см. гл. 4). Полученные данные убедительно показали, что инсулиновый ген крысы включался в бактериальную клетку и безошибочно в ней реплицировался. Нуклеотидная последовательность мРНК соответствует, как и ожидалось, почти полностью расшифрованной аминокислотной последовательности предшественника проинсулина. Установлено, что С-цепь инсулина соединена с В-цепыо через последовательность Arg-Arg, а с А-цспыо — через последовательность Lys-Arg, Следует еще устранить некоторые неясности в определении состава и последователь!] ости аминокислот в С-цепи (см. рис. 39.2).
Экспрессию (выражение) инсулинового гена в клетках Е. coll удалось осуществить в 1978 г. группе из Гарвардского университета (Villa-Komaroff et al., 1978). Эти исследователи также начали с мРНК для проинсулина, которую переписали в кДНК. Эту ДНК они встроили в бактериальный ген (ген пенициллиназы) так, что обе последовательности считывались от одной точки отсчета. Продукт, образовавшийся при таком слиянии двух генов, как обычно, включали в плазмиду и переносили в клетки Е. coU. Этот метод имеет то преимущество, что он позволяет использовать бактериальную систему контроля транскрипции и трансляции. Аппарат синтеза белка Е. coll принимает встроенный фрагмент за свой
собственный и обеспечивает его экспрессию. Поскольку пенициллиназа является внеклеточным белком, продукт слившихся генов пи шляется из клетки и взбегает таким образом возможности быть ра <рушенным внутриклеточными протеазами.
Однако инсулин — это не первый белок эукариот, который был сип тезирован в клетках Е. coll. Уже в 1977 г. была осуществлена эм прессия соматостатинового гена (соматостатин — гормон, см. Li 56, рис. 56.10), а вскоре это удалось сделать и в отношении гормона роста (Seeburg et al., 1978).
1ЛОБИНОВЫЙ ГЕН
1977 г. можно назвать годом расшифровки нуклеотидных по- «аедователыюстей в ДНК. Был полностью расшифрован не только нет, геном фага 0X174 (см. гл. 5), но и первые гены эукариот.
fJ-Глобиновый ген кролика — первый полностью расшифрованный ген эукариот (Efstratiadis et al., 1977). Три месяца спустя пыла установлена нуклеотидная последовательность р-глобиново- ю гена человека (Marrota et al., 1977а, b); была также выяснена последовательность мРНК для а- и р-глобинов человека (Baralle, Г»77Ь; рис. 7.2).
Указанные группы исследователей пользовались различными методами, и потому не все они достигли успехов в равной степени. Но самое важное состояло в том, что все группы в конечном счете получили согласующиеся между собой результаты и тем самым доказали надежность примененных методов.
Ген глобина не относится к повторяющимся генам. Поэтому выделение соответствующей ДНК, как это было сделано, например, и случае гистоновых генов, не могло дать хороших результатов. >ато выделение мРНК из ретикулоцитов не составляет особого i руда, так как более 90% синтезируемых в этих клетках белков относится к а- и р-глобинам. Эта мРНК была выделена всеми । руппами и использована в качестве матрицы для получения кДНК с помощью обратной транскриптазы.
Здесь пути, по которым шли исследователи, расходятся. Вейсман и его сотрудники использовали сначала устаревшие методы, а затем перешли к более быстрому методу, разработанному Сэнгером и Коулсоном (Sanger, Coulson, 1975) и модифицированному Броуили и Картрайтом (Brownlee, Cartwright, 1977) (подробнее об этом см. в гл. 4). Гарвардская группа (Efstratiadis et al., 1977) применила в своей работе метод Максама — Гильберта и добилась успеха. кДНК была перенесена в плазмиду и клонирована в клетках Е. coll (см. гл. И). Затем выделенную из Е. coli плазмндную ДНК расщепляли рестрнктазой на фрагменты определенной длины и расшифровывали в них нуклеотидную последовательность.
Глобиновая мРНК состоит из трех участков:
Рис. 7.2. Нуклеотидная последовательность р-глобиповоЛ мРНК и аминокислотная последовательность р-глобина (Baralle, 1977; расчеты с помощью ЭВМ выпотнень Sladen, 1978).
5'-концевая нскодируемая область,
кодируемая область,
З'-концевая нскодируемая область.
Значение некодируемых областей не известно, тем не менее им можно было бы приписать ряд функций: связывание с рибосомами; контроль трансляции; узнавание фермента, участвующего в процессинге (образование мРНК из гяРНК, см. гл.. 10); терминация транскрипции; узнавание расщепляющих ферментов (рибонуклеаз).
Во всех названных функциях участвуют специфические белки, которые со своей стороны могут узнавать специфические последовательности РНК.
5'-концевая нскодируемая область. Она короче, чем соответствующая З'-концевая область. Предполагается, что в ней находится участок связывания с рибосомами. На конце fl-глобиновой мРНК расположена последовательность (5')CAGAAUGGUGC(3') (Legon, 1976). Благодаря связыванию с рибосомами этот участок защищен от действия РНКаз. Рибосомная 18S-pPHK эукариот всегда содержит следующую последовательность: (5')GAUCAUUA(3') (Hunt. 1970).
В глобиновой мРНК имеется короткий (длиной три нуклеотида) участок, который может связываться с рРНК. Таким образом, связывание между мРНК и рРНК здесь менее прочно, чем соответствующее связывание у Е. coli (см. рис. 38.1).
З'-концевая некоднруемая область. Эта область различается по длине у мРНК, кодирующих разные глобины.
■-I |ибнк (кролик) 85 нуклеотидов
| | лобин (кролик) . 95 * и I ь'бин (человек) 112 » Р I ■••«пи (человек) 125 *
Ън факт, что глобиновые гены человека и кролика имеют разную длину, снова наводит на мысль о наличии встроенных участков в глобиновых генах человека. В этих встроенных участках имеются тьлеотндныс последовательности (5')CCCGG (3') и (б >CCGGG(3'), которые могут образовать внутреннюю палин- лримиую структуру.
Не говоря уже о встроенных участках (вставках), известно, чю 80% последовательностей в глобиновых генах человека и кролика гомологично. Это указывает на чрезвычайно высокое давление отбора в направлении сохранения этих нскоднрусмых последовательностей.
Обнаружено, что во всех частично или полностью проанализированных до сих пор мРНК эукариот (глобиновая, овальбумино- п. 1я, иммуноглобулиновая, мРНК SV40) на расстоянии 14—20 нук- .нотидов от З'-конца находится последовательность AAUAAA I Proudfoot, Brownlee, 1976). Область, непосредственно примыкающая к З'-концу, содержит необычно много U. З'-конец можно опре- нлпть благодаря тому, что здесь начинается последовательность poly (А) (см. гл. 10).
Кодируемая область. Она начинается с AUG (старт-сигнал) и кончается UAA (стоп-сигнал, терминатор). Расшифрованные нуклеотидные последовательности полностью соответствуют уже известным аминокислотным последовательностям. Однако существенно, что для кодирования (р-глобина) Не все возможные кодоны используются одинаково часто. Из табл. 7.1 видно, что некоторым кодонам отдастся явное предпочтение перед другими, причем наблюдается значительное отклонение от случайного распределения. Особенно это относится к кодонам аминокислот Leu, Vai, Arg, Ala и Ser. Кодоны, имеющие на конце А, встречаются реже, а кодоны, оканчивающиеся на G — чаще, чем можно было бы ожидать исходя из их случайного распределения; используются почти все кодоны, имеющие на конце U (14 из 16). Эти результаты отчетливо показывают, что мутации в третьем нуклеотиде кодона также испытывают давление отбора и не являются «нейтральными» вопреки широко распространенному мнению. Как следует далее из табл. 7.1, нуклеотидный состав кодонов отклоняется от «ожидаемой» средней статистической величины также и у бактериофагов MS2 и РХ174.
Исследование глобиновых мРНК человека позволяет выяснить причины появления аномальных глобинов. Хорошо известный глобин, содержащийся в эритроцитах больных серповидноклеточной анемией, отличается от нормального р-глобина заменой Glu-^Val
Таблица 7.1
Использование кодонов в геномах или генах с установленной нуклеотидной последовательностью11
■
b c
d
■
b
c d
■
b
c d
a
b
c
d
Hie
LUU
39
19
3
11
Ser
ucu
35
15
3
to
I»
VAU
36
9
1
3
Су»
UGU
12
6
I
5
Hie
vve
26
29
5
9
Ser
КС
9
20
3
5
Ty<
LAC
15
32
7
UGC
10
6
0
I
You
LUA
14
17
n
3
Ser
UCA
16
16
0
7
Mr
LAA
-
—
—
ler
UGA
—
—
—
Leu
UK,
26
11
0
4
Ser
uro
14
22
0
1
ter
VAG
-
-
-
-
Irp
UGG
16
23
j
3
Leu Hi У
36
15
0
8
Pro
ecu
34
17
3
6
Hu
CAU
16
6
4
4
Ar?
CGU
40
21
0
0
Leu CUC
15
26
2
6
Pro
cue
6
10
II
1
Hu
ГАС
7
9
3
Ari
CGC
29
20
0
2
Leu CUA
3
15
0
1
Fra
GA
6
9
1
7
Gtn
ГА A
27
17
0
H
Arx CGA
4
10
0
0
leu CI G
24
9
16
10
Pro
CCG
21
13
0
0
Gin
(AG
34
22
4
7
Air
CGG
H
И
0
П
Ik
AtU
45
12
1
6
Th.
AtU
40
19
2
4
A in
A At
37
17
*
10
Ser
AGU
9
8
4
6
Jie
AUG
12
25
о
16
Ihr
ACC
18
21
2
4
Ami
AAC
25
28
4
?
Sei
AGC
5
I6
0
4
Ik
Al*
2
19
0
3
Ihr
АСА
13
13
0
7
1У»
AAA
47
19
3
11
*4
AGA
6
7
0
10
Mei
AUG
42
20
I
17
Th.
ACti
19
14
n
(1
l>>
AAG
31
26
9
9
Ary
AGG
1
6
3
3
Vai
GUU
53
21
4
9
Ab
GCV
64
26
7
10
Аф
GAI
44
28
0
8
Gly
GGU
38
31
4
3
Vai
GUC
14
21
?
7
Ab
ucx
17
21
6
9
Аф
GAL
35
22
3
6
Gly
(.(X
28
16
6
8
Vai
GIA
10
16
(1
5
Ala
GCA
12
21
1
16
(>lu
GA A
16
4
18
Gly
GGA
13
12
0
6
Vai
GUG
11
19
12
10
Ala
GCG
12
23
0
0
Glu
GAG
34
28
5
15
i;i>
ggg
3
16
»
2
|> Приведены данные о: а) геноме фага ФХ 174 (Sanger et al.. 1977): Ы геноме фага MS2 (Piers et al., 1976); с) гена fl-глобина кролика (Efstratladis et al.. 1977) и d) гене овальбумина курицы (McReynolds et al., 1978).
В таблице показано, какие кодоны (UUU. DUG и т. д.) определяют те или иные аминокислоты (Phe, Leu „.). Частота кодонов дается в абсолютных Величинах. ter означает обрыв цепи,
в шестом положении. В мРНК для нормального р-глобина в этом положении находится кодон GAG, а в мРНК серповидноклеточного глобина —GUG. Это означает, что аминокислотные замены обусловлены фактически нуклеотидными заменами.
Иначе обстоит дело в случае гемоглобина Hb Bristol. В положении 67 нормального р-глобина стоит Vai (потенциальные кодоны GUG, GUC. GUU, GUA, но в мРНК обнаружен только GLG). У гемоглобина Hb Bristol в том же положении находится Asp (потенциальные кодоны: GAU или GAC). Это значит, что при такой аминокислотной замене должны произойти, самое меньшее, две нуклеотидные замены, р Глобины человека и кролика, каждый из которых состоит из 146 аминокислот, различаются между собой по 14 аминокислотам, а соответствующие мРНК (432 нуклеотида) — по 48 нуклеотидам. Чтобы закодировать 146 аминокислот, требуется не 432, а 438 нуклеотидов, но мы не будем принимать во внимание это расхождение, так как данные о последовательно-: стях недостаточно точные. Такое сравнение свидетельствует также1 о том, что в .ходе эволюции замены редко происходят в третьем. положении кодона. Таким образом, давление отбора, направлен-1 ное на сохранение структуры нуклеиновой кислоты (последова-1 телыюсти), не намного меньше, чем давление отбора на продукты! генов (белки). Большая часть нуклеотидных замен, не вызывающих аминокислотных замен, происходит в тех же участках генома, I где часто встречаются замены нуклеотидов, приводящие к амино-1 кислотным заменам в белках (Kafatos et al., 1977).
ДРУГИЕ ГЕНЫ I < 'писанные методы дают возможность охарактеризовать почти лю- бой ген эукариот при условии, что получена соответствующая мРНК. Клонирование синтезированной на ней кДНК позволяет работать с обогащенной, а не с полностью очищенной фракцией мРНК, потому что таким способом можно тестировать потомство не только отдельной бактерии, но и отдельных встроенных чужеродных молекул. Естественно, что предпосылкой для успешной ра- боты является развитие эффективных и быстрых селективных снс- шм. Так, например, выделен и охарактеризован ген фиброина шелка из Bombyx mori. В его геноме содержится только одна копия этого гена, составляющего лишь 0,002% всего генома. В нем имеется ГЦ-богатый участок (60%) с мол. массой 11,6-10® и АТ- богатый участок (35%) с мол. массой 6-Ю7 (Lizardi, Brown, 1975).
В гл. 58 мы еще увидим, что с помощью гормонов можно - симулировать специфическую транскрипцию определенных генов. Классическими примерами являются индукция экспрессии овальбуминового гена в яйцеводе кур при добавлении эстрогена (O’Mal- К у, Means, 1974), а также активация отдельных генов в личинках Drosophila под влиянием экдизона. У Xenopus под действием эстрогена активируется образование белков желтка (Tata, 1976). Эти белки необходимы для развития яиц, вследствие чего данная сис- юма представляет интерес и для решения вопросов физиологии развития. Эстроген активирует не только транскрипцию, но и |рансляцпю. а также механизмы посттрансляционного контроля. После синтеза белков происходит их фосфорилирование, а также образование липидных и углеводных оболочек. Белок желтка со- ■ гонт преимущественно из трех компонентов: фосвитина, липови- u-ллина и вителлогенина. Фосвитии и линовителлин— продукты распада вителлогенина, который образуется в печени всех яйце- । ладущих животных и с током крови транспортируется в яичник, । де происходит его расщепление на отдельные компоненты. Среди белков эукариот это первый известный случай, когда белки обра- лются в результате расщепления одного общего многокомпонентного предшественника. У прокариот и вирусов этот механизм был обнаружен неоднократно (см. гл. 9).
Установлена также нуклеотидная последовательность овальбуминовой мРНК (McReynolds ct al„ 1978) и гена иммуноглобулина (см. гл. 22). В обоих случаях синтезированная кДНК включалась и плазмиду и клонировалась в клетках Е. coli. После ее выделения и 1 клеток она была картирована с помощью ряда рестриктаз и шким образом охарактеризована. Овальбумин содержит 387 аминокислот, а его мРНК— 1859 нуклеотидов, при этом 729 нуклеотидов принадлежат к некодируемой области. Кодируемый участок состоит из восьми отрезков, разделенных интронами.
В первой части этой главы мы уже говорили, что генетическа! инженерия служит удобным методом для изучения онтогенез! (развития эмбриона). Прежде всего, яйцеклетки содержат множе ство специфических мРНК для белков, появляющихся только hi ранних стадиях развития и направляющих развитие эмбриона ш определенному пути. Геринг (Базельский университет) сосрсдото чил свое внимание на изучении белков, влияющих на экспрессии генов на ранних стадиях развития Drosophila и специфически свЯ' зывающнхея с теми или иными участками ДНК. ДНК, связаннук с такими белками, выделяли, клонировали и исследовали даль ше, поскольку из всего сказанного выше ясно, что такие специ фически активируемые участки ДНК несут генетическую инфор мацию, существенную для реализации программы развития Ого sophila.
Еще в 1953 г. Уотсон и Крик в своей первой работе по исследованию структуры ДНК указали на то, что молекула ДНК обладает способностью к самоудвоению (репликации). В 1958 г. Ме- зельсон и Сталь подтвердили это положение и продемонстрировали, что репликация происходит полуконсервативным образом. Это означает, что обе цепи разделяются и на каждой синтезируется комплементарная ей цепь.
В 1956 г. Корнберг открыл ДНК-полимеразу, которая использует одноцепочечную ДНК как матрицу, нуждается в затравке (праймере) и в присутствии всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов строит на этой цепи вторую цепь ДНК (см. гл. 19). Таким образом, в общих чертах проблема репликации была решена.
Однако настоящие трудности возникли тогда, когда было установлено, что хотя этот фермент и способен достраивать растущую полинуклеотидную цепь, он не может инициировать синтез новых цепей ДНК. Кроме того, оказалось, что фермент in vitro работает на два порядка медленнее ио сравнению с репликацией в живой клетке, и что он катализирует синтез только в направлении (5'->3'). Из этого следует, что при разделении двух цепей может реплицироваться только одна из них, репликация же второй цепи начинается лишь после завершения репликации первой. Однако такая гипотеза противоречила экспериментальным результатам. В 1969 г. Оказаки показал, что обе цепи ДНК реплицируются одновременно, причем новые цени синтезируются не непрерывно, а в виде коротких фрагментов, поэтому сразу же встал вопрос о том, как происходит сшивание этих фрагментов друг с другом. Таким образом, процесс репликации оказался нс таким уж простым, как это могло показаться вначале.
Транскрипция и трансляция также чрезвычайно сложные процессы. Однако, как мы увидим позднее, для них характерны сложности совершенно иного плана. Во всех трех процессах принимает участие множество белков, выступающих в роли регуляторов или катализаторов реакций, протекающих на разных стадиях этих процессов. Хотя система трансляции, без сомнения, является сложной, ее легко создать в экспериментальных условиях (см. гл. 38), так как отдельные этапы процесса происходят на крупных функциональных единицах — рибосомах, которые можно получить в больших количествах.
Напротив, <рспликон» со всеми нужными для репликации компонентами представляет собой гипотетическую систему, так как требуемые белки существуют в клетке в растворимой форме. К тому же возникает еще одна трудность. Клетка постоянно синтезирует и использует белки, и все необходимые для этого фактопы
I присутствуют в ней в больших количествах. Иначе обстоит дело при репликации. Во время клеточного цикла геном (как правило) реплицируется только один раз. Для выполнения этой задачи нуж- in. сивеем немного ферментных и регуляторных молекул.
За прошедшие годы репликацию изучали на ряде объектов. Пытались (и не безуспешно) создать системы in vitro, которые были бы в состоянии инициировать синтез ДНК и удачно доводить до конца. ДНК мелких фагов являются удобными объектами исследования. Правда, все фаговые системы нуждаются в белках клетки-хозяина (.Escherichia coli"), и поэтому приходится парал- лглыю исследовать также процесс репликации бактериальной клетки. Однако, как мы уже отмечали, чрезвычайно трудно выделить интактную ДНК из клеток Е. coll в больших количествах. Зато у ной системы есть важное преимущество, заключающееся в том, -но она позволяет использовать мутанты Е. coli, дефектные в отношении репликации (ts-мутанты).
Системы in vitro
Системы, проницаемые для нуклеотидов. Благодаря созданию систем in vitro были преодолены трудности, связанные с исполь- юванием в опытах клеток Е. coli. Бактериальная мембрана непроницаема для нуклеотидов и крупных молекул. Для изучения же репликации необходимо ввести в клетку радиоактивно меченные нуклеотиды. В 1970 г. Мозес и Ричардсон впервые применили <толуоловые клетки», а в 1971 г. Дюрвальд и Хофман-Борлинг использовали в своей работе «эфирные клетки». Согласно их методикам, клетки обрабатывают толуолом или эфиром, в результате чего мембраны становятся проницаемыми для таких мелких мо- лекул, как, например, нуклеотиды. После дальнейшей обработки клеток неионными детергентами через них проходят также и крупные молекулы (например, белки) (Moses. 1972).
Система с использованием целлофановой пленки. Высококон- цептрированную суспензию клеток лизируют на целлофановой пленке. После промывания препарата крупные молекулы остаются прикрепленными к ней. Пленку можно затем перевернуть и на обратную ее поверхность нанести мелкие молекулы. Эта система имеет ограниченные возможности в смысле инициации новых циклов репликации, но позволяет следить за ходом уже начавшейся репликации. Ее преимущество состоит в том, что в результате использования крупных молекул создается возможность получать и выделять соответствующие продукты генов, существенные для репликации (Schaller et al., 1972).
Фаговая система. Эта система тоже основана па лизисе клеток, но в данном случае клетки инфицированы фагом. Клеточную ДНК и мембраны удаляют путем центрифугирования. Добавляют одно-
цепочечную фаговую ДНК, которая через некоторое время при соответствующих условиях переходит в двухцепочечную. В такой системе впервые было показано, что в процессе репликации принимает участие также и РНК-полимераза.
Существует несколько типов репликации
До сих пор репликацию изучали главным образом на кольцевых молекулах, так как при использовании линейных молекул возникают дополнительные трудности. С помощью методов радмоав-: тографии и электронной микроскопии можно обнаружить несколько типов репликации.
Модель Кернса (репликация в двух направлениях). В 1963 г. Кернс с помощью радиоавтографии обнаружил, что кольцевые молекулы ДНК Е. coll реплицируются следующим образом (рис. 8.1). Репликация всегда начинается в одном определенном месте бактериальной хромосомы (как стало теперь известно, в точ- ке, соответствующей 74 мин генетической карты Е. coll) и продолжается в обе стороны. При этом образуются две репликационные вилки Двунаправленный способ репликации). Так как кольцевые молекулы ДНК закручены сами на себя (суперспирализованы), при раскручивании двойной спирали они должны непрерывно вращаться вокруг собственной оси. Точка вращения получила название «шарнир». При раскручивании возникает торсионное напряжение, которое может быть устранено только путем разрыва одной из цепей. Затем оба конца должны сразу же вновь соединиться друг с другом. Фермент, выполняющий эту функцию, называется релаксирующим ферментом. После завершения репликации появляются две двухцепочечпые кольцевые молекулы, которые вначале связаны друг с другом как звенья одной цепи. При их разделении одно из двух колец временно разрывается (рис. 8.2). Описанный здесь механизм репликации существует не только у Е. coll, но и у
1234
Рис. 8.1. Репликация кольцевой ДНК по модели Кернса (Cairns, 1963). Репликация всегда начинается в одном определенном месте молекулы (точка инициации, стартовая точка. О). На обеих цепях образуются новые комплементарные цепи (изображены пунктиром). После завершения репликации происходит разделение колец. Более подробно см. подпись к рис. 8.2.
*Б
Гис. 8.2. А, Подробное изображение процесса репликации кольцевой молекулы П1К Е. coll по модели Кернса. Модель разделения удвоившейся кольцевой моле- к лы. Структура / — ковалентно замкнутая двухцепочечная кольцевая молекула; " -стартовая точка и терминатор однонаправленной репликации; о' — термина- юр двунаправленной репликации. 1—4— следующие друг за другом стадии рсп- ,кацин. 5—13 — стадии разделения обоих колец, что может осуществляться разами путями (S — одноцепочечный разрыв; Ceftcr, 1975). Б. Репликация линейной молекулы ДНК с липкими одпоцепочечными концами (например, у бахтерио- рага Т7). В процессе репликации происходит образование длинного промежуточного продукта (конкатемера) (Watson, 1972).
некоторых вирусов, таких, как вирус SV40, фаг X, а также у мно- пх плазмид и т. д. Во всех случаях картируется определенная ।очка инициации (стартовая точка).
Модель Кернса (репликация в одном направлении). Этот механизм похож на первый, за исключением того, что репликационная вилка движется только в одном направлении. Такой механизм обнаружен, например, у некоторых плазмид.
и. Репликация с образованием D-петли. Согласно этому механизму, вначале реплицируется одна из цепей, тогда как вторая цепь смещается», образуя D-петлю (от англ, displacement loop, D-Ioop). Репликация второй цепи начинается с другой стартовой точки и юлько после того, как реплицировалось более половины первой цепи. Такой механизм обнаружен, например, у митохондриальных ДНК (см. гл. 44).
г. Модель катящегося кольца (рис. 8.3). Одна из цепей ДНК разрывается и постепенно разматывается благодаря наращиванию
Рис. 8.3. Репликация кольцевых молекул ДНК по модели катящегося кольца. Одна из двух цепей разрывается. Ее 5'-конец связывается с рецептором, расположенным на клеточной мембране. Интактная кольцевая цепь как бы «катится* и при этом «разматывается*. Одноцепочечные участки служат в качестве матриц. Таким образом, на обеих цепях образуются комплементарные им цепи. Готовое кольцо высвобождается, а следующие кольца продолжают синтезироваться, как па конвейере (Gilbert, Dressier, 1968).
се конца, связанного с иеразорванной цепью. Таким образом, разматывающаяся цепь непрерывно удлиняется. На пей синтезируется вторая цепь, разделенная на фрагменты одинаковой длины (Gilbert, Dressier, 1968). Преимущество этого механизма заключается в том, что с его помощью за короткий промежуток времени, как па конвейере, образуется большое количество ДНК. Такой механизм обнаружен у некоторых фагов, а также в ряде эукариотических клеток (см. амплификация, гл. 42).
д. Линейные молекулы ДНК. Многие линейные молекулы ДНК отличаются тем, что на их свободных концах содержатся избыточные (повторяющиеся) последовательности. Таким образом, последовательности па одном конце молекулы в точности повторяются на другом ее конце. ДНК такого типа встречаются у фагов Т5 и Т7 (см. гл. 5). В процессе их репликации образуются длинные промежуточные продукты, которые Уотсон (Watson, 1972) назвал конкатемерамн (рис. 8.2, Б). На этих стадиях геном (фага) состоит из целой серии повторяющихся последовательностей. Их ковалентное связывание осуществляется с помощью ДНК-полимеразы I и лигазы, а последующее расщепление образовавшихся продуктов на фрагменты определенной длины — с помощью рестриктаз (см. гл. 20). Репликация начинается не на концах молекулы, а где-то в ее средней части. У фага Т7 это место удалено от одного из концов молекулы ДНК на расстояние, составляющее 17% длины всей молекулы. Стартовую точку можно различить после начала
бб Г АЕбб Г АЕС ATT AT АТА АТс —-ОТ*АТЛТАТТ#С ——С ATT AT АТА АТс —-ОТ*АТЛТАТТ#С ——Рис. 8.4. Модель репликации б'-концов линейной молекулы ДНК. Предполагается. что на б'-конце молекулы ДНК находятся обращенные повторы (Л), которые складываются и образуют палнндромную структуру (Б). 3'- ОН-конец служит затравкой для ДНК-полимеразы (В). С помощью лигазы (Г) и эндонуклеазы (Д) образуется готовый продукт репликации(Е) (Cavalier-Smith, 1974).Рис. 8.4. Модель репликации б'-концов линейной молекулы ДНК. Предполагается. что на б'-конце молекулы ДНК находятся обращенные повторы (Л), которые складываются и образуют палнндромную структуру (Б). 3'- ОН-конец служит затравкой для ДНК-полимеразы (В). С помощью лигазы (Г) и эндонуклеазы (Д) образуется готовый продукт репликации(Е) (Cavalier-Smith, 1974).Рис. 8.5. Хромосомы китайского хомячка. Клетки культивировали в течение двух поколений в среде, содержащей BrdU. BrdU при репликации включается вместо Т в синтезируемую ДНК. После соответствующей обработки хромосомы прокрашивали по методу Гимза и рассматривали под микроскопом. Хроматиды, содержащие BrdU, прокрашивались очень слабо. Они выглядят па рисунке как неокрашенные. Полученные результаты показывают, что ДНК в хромосомах реплицируется полуконсерватив- ным способом. Иногда происходит обмен между дочерними хроматидами (см. гл. 41). Число обменов увеличивается под воздействием веществ, повреждающих ДНК. При этом возникают структуры с шахматным расположением отдельных частей. Частота их появления после обработки определенными веществами может служить мерой мутагенности данных веществ. (Фото Stakayama и Sakanishi, 1977.)
б
б Г А
Е
б
б Г А
Е
С ATT AT АТА АТс —-
ОТ*АТЛТАТТ#С ——
С ATT AT АТА АТс —-
ОТ*АТЛТАТТ#С ——
Рис. 8.4. Модель репликации б'-концов линейной молекулы ДНК. Предполагается. что на б'-конце молекулы ДНК находятся обращенные повторы (Л), которые складываются и образуют палнндромную структуру (Б). 3'- ОН-конец служит затравкой для ДНК-полимеразы (В). С помощью лигазы (Г) и эндонуклеазы (Д) образуется готовый продукт репликации
(Е) (Cavalier-Smith, 1974).
Рис. 8.4. Модель репликации б'-концов линейной молекулы ДНК. Предполагается. что на б'-конце молекулы ДНК находятся обращенные повторы (Л), которые складываются и образуют палнндромную структуру (Б). 3'- ОН-конец служит затравкой для ДНК-полимеразы (В). С помощью лигазы (Г) и эндонуклеазы (Д) образуется готовый продукт репликации
(Е) (Cavalier-Smith, 1974).
она представляет собой пузырь (или глаз).она представляет собой пузырь (или глаз).репликации, так как она представляет сииип и;ое.ко v.„„ ...,, который увеличивается, распространяясь в обе стороны к концам молекулы (репликация в двух направлениях). Так как этот пузырь достигает одного из концов молекулы быстрее, чем другого.
она представляет собой пузырь (или глаз).
она представляет собой пузырь (или глаз).
возникает Y-образная структура, которая буквально на глазах переходит в V-образную. Кажущийся таким сложным механизм образования конкатемеров является необходимым, так как. с одной стороны, полимеризация ДНК прекращается еще до достижения З'-конца матрицы, а с другой — ДНК-полимераза не способна начинать синтез новой цепи на свободных концах (см. также гл. 19).;
Для решения проблемы репликации линейной ДНК был предложен третий механизм (Cavalier-Smith, 1974). Он основан на том, что ДНК (в хромосоме) содержит на б'-концах обращенные повторы, которые замыкаются сами на себя и образуют палиндромы. Такие структуры могут играть роль затравок при репликации ДНК (рис. 8.4).
е. Репликация у эукариот. ДНК в хромосомах эукариот находится в линейной форме и, как было показано методом радиоавтографии, реплицируется полуконсервативным способом (Taylor ct al., 1957). В 1973 г. этот вывод был подтвержден фон Латтом. Он выращивал клетки в течение двух поколений (двух S-фаз) в присутствии бромдезоксиуридина. На следующих стадиях митоза клетки фиксировали и прокрашивали флуоресцирующим красителем («Hoechst 33258»), ДНК, в которой обе цепи включили бромдезок- сиуридин, флуоресцировала слабее, чем ДНК, содержащая только одну бромзамещснпую цепь. Поэтому в хромосоме обе дочерние хроматиды отличались друг от друга. В 1974 г. этот метод был усовершенствован благодаря введению дополнительного окрашивания по Гимза (рис. 8.5).
У фасоли Vicia faba молекула ДНК примерно в 800 раз длиннее, чем у Е. coli. Тем не менее ее репликация (во время S-фазы) при 25°C занимает всего 8 ч. Это означает, что она протекает приблизительно в 100 раз быстрее, чем в клетках Е. coli. Существуют два возможных объяснения такого увеличения скорости репликации:
В ДНК V. faba число точек инициации и репликационных вилок больше, чем в ДНК Е. coli.
Полимеризация в первом случае идет с более высокой скоростью. Вторая возможность сразу же отпадает по той простой причине, что скорость одной и той же ферментативной реакции, даже если она и протекает в клетках двух разных организмов, не может различаться на два порядка.
Указания на правильность первого предположения вытекают из результатов радиоавтографического исследования гигантских политенных хромосом, меченных 3Н-тимидином (Keyl. Polling, 1963; Felling, 1966). Кейл и Пелинг па основе полученных данных сделали вывод о том, что хромомеры (поперечные диски политенных хромосом) представляют собой единицы репликации, причем репликация происходит одновременно во всех хромомерах. Этот вывод трудно распространить на другие клетки, так как не всегда
Рис. 8.6. Тандемно расположенные единицы репликации в эукариотической ДНК. 1 Двухцепочсчиый участок ДНК. на котором показано положение стартовых точек. Б—Д. Промежуточные стадии репликации. Под изображением двойной це- пи показаны выявленные на радиоавтографах радиоактивно меченные участки (Huberman, Riggs, 1968; Callan, 1976).
можно идентифицировать хромосомы и хромомеры в интерфазных ядрах.
Хуберман и Риггс (Huberman, Riggs, 1968) на основе методики Кернса (Cairns 1963, 1966) разработали радиоавтографическнй метод для исследования отдельных молекул ДНК. Клетки инкубируют в течение очень короткого времени с радиоактивным предшественником (импульсная метка), а затем осторожно лизируют па миллипоровом фильтре, чтобы свести к минимуму число разрывов в молекулах ДНК. Освобожденная ДНК растекается по фильтру, после чего белки разрушают протеазами, препарат осторожно промывают для удаления всех ненужных компонентов, а затем высушивают и переносят на рентгеновскую пленку (для получения радиоавтографа). Появляющиеся на ней следы зерен серебра соответствуют тем участкам молекулы ДНК, в которые метка вклю-
Рис. 8.7. Радиоавтографы, показывающие репликацию ДНК в геноме эукариот. А. Ткань Triturus cristatus carnifex (25°C, метка вводилась в течение 4 ч). 5. Диссоциированная нейрула Triturus vulgaris (18°С, введение метки в течение 1 ч). В. Triturus vulgaris (18 °C, введение метки в течение 2 ч). Г. Triturus vulgaris (25°C, введение метки в течение 4 ч). (Фото Callan, 1976.)
Рис. 8.8. Радиоавтографы, показывающие репликацию в геноме эукариот. А. Ткань Xenopus laevis. Вначале вводили метку с высокой удельной активностью (23 °C, 2 ч), а затем с низкой (23°C, 2 ч). Стрелками указаны точки инициации, которые уже действовали до введения метки. Б. Ткань Xenopus laevis. Метка вводилась в течение 4 ч. Стрелка и здесь указывает точку инициации. В. Ткань Triturus cristatus carnifex метилась при 25 °C в течение 4 ч. Наверху слева и справа стрелками показано разделение дочерних цепей. Сложная структура справа возникла в результате переплетения двух реплицирующихся молекул ДНК. (Фото Callan, 1976.)
чилась в процессе репликации (рис. 8.6—8.8). Полученные результаты показали, что реплицируются тандемно расположенные участки ДНК. Репликация начинается в нескольких точках инициации, и каждая репликационная вилка движется в двух направлениях со скоростью 0,5—1,2 мкм/мин. Так как скорость этого движения на различных участках нс одинакова, расстояния между точками инициации варьируют от 15 до 120 мкм (в среднем 50 мкм). Инициация синтеза в различных точках происходит не одновременно.
Даже близкородственные виды эукариот различаются по содержанию ДНК в гаплоидном геноме. У Xenopus laevis, например, содержится 3 иг, а у Triturus cristatus— 29 пг ДНК на гаплоидный геном; тем не менее длительная репликация у Triturus только в три-четыре раза больше, чем у Xenopus. Скорость полимеризации у Triturus равна примерно 20 мкм/ч, а у Xenopus — несколько меньше, чем 10 мкм/ч. Следовательно, решающее значение имеет не только число точек инициации, но и (в известных пределах) скорость реакции полимеризации. Расстояние между точками инициации у Xenopus составляет 20—100 мкм, а у Triturus — более 100 мкм.
Длительность S-фазы на разных стадиях развития данного вида также варьирует. На ранних стадиях развития эмбриона S-фаза короче, чем в дифференцированных соматических клетках. Особенно продолжительна S-фаза в предшественниках половых клеток перед началом мейоза. У саламандры Triturus vulgaris в ранней бластуле она составляет 1 ч, в дифференцированных клетках — 48 ч. а в премейотически.х сперматоцитах — 200 ч (Callan, Taylor, 1968).
Эти различия почти полностью обусловлены различным числом точек инициации. Очевидно, в ходе развития они постепенно репрессируются. Совершенно естественно возникает вопрос, чем определяется выбор той или иной точки инициации. Существуют ли специфические нуклеотидные последовательности или структуры, которые в различной степени активируются или защищаются белками? Сегодня еще мало известно о том, каким образом полимеразы узнают определенные участки в ДНК эукариот. Поэтому вывод о наличии в ней таких специфических последовательностей можно сделать лишь по аналогии, экстраполируя данные, полученные на прокариотах и вирусах.
Молекулярные основы репликации
В табл. 8.1 приведены гены и их продукты, влияющие на репликацию генома у Е. coli.
Здесь естественно задать вопрос, каким образом регулируется синтез ферментов, необходимых для репликации. Однако на сегодня об этом известно так же мало, как и о регуляции трансля-
Таблица 8.1
Гены и их продукты, влияющие на репликацию генома Е. coli (Gelder, 1978)
Локус (обозначение)
Положение в геноме, мин
функция/дефект
dna А
73
Инициация в стартовой точке
dna В
81
Рост цепи
dna С, pol D
89
Инициация в стартовой точке
Inu E-pol С
4
ДНК-поли мераза III.
dna F-nrd А
42
Субъединица В1 рибонуклеотиддифосфат- редуктазы
Л па G
60
Рост цепи
-Ina Н
64
Инициация в стартовой точке
dna I
36
Инициация в стартовой точке
dna Р
75
Повреждение мембраны
dna S
72
Накопление коротких фрагментов ДНК
.Ina Z
11
Рост цепи
hr
46
ДНК-лигаза
nrd В
42
Субъединица В2 рибонуклеотиддифосфат редуктазы
pol A
76
ДНК-полимераза 1
pol В
2
ДНК-полимераза 11
rif
77
P-Субъединица РНК-полимеразы (чувствительность к рифампицину)
Следует отметить, что репликация находится под контролем большого числа генов и их продуктов и что эти гены не организованы в оперон, а распределены вдоль всего генома. Со свойствами ферментов, участвующих в реплекацян, мы познакомимся в гл. 19.
ции (см. гл. 38). Для репликации нужны как РНК-, так и ДНК- полимераза. Оба фермента используют в качестве матрицы одноцепочечную ДНК; однако они различаются по способности инициировать синтез новых цепей. Чтобы начать синтез РНК, РНК- полимеразам требуются промоторы, т. с. специфические нуклеотидные последовательности. При нефизиологических условиях синтез может начаться даже не на промоторе, а на каком-то другом участке. Ни одна ДНК-полимераза не способна инициировать синтез новой цепи, все они лишь удлиняют уже образовавшуюся по- линуклеотидную цепь. Обращает на себя внимание тот факт, что именно полирибонуклеотиды служат хорошими затравками и поэтому РНК-полимераза играет решающую роль в инициации репликации.
Как уже отмечалось, мелкие фаги (например, фаг 54X174) представляют удобные модели для изучения репликации. Для синтеза своей ДНК этим фагам нужны, кроме собственных, также и специфические белки клетки-хозяина. Геном фага 94X174, как мы уже говорили, состоит из одноцепочечной ДНК с известной последовательностью (см. гл. 5).
В процессе репликации фаговой ДНК прежде всего образуется комплементарная ей (—)-цепь. При этом возникает двухцепочеч- 9*
Дбитлючечпи* ДНК (KFH)Дбитлючечпи* ДНК (KFH)Рис. 8.9. Стадии репликации одиоцепочечной ДНК бактериофага 0174. / — одиночная цепь под действием АТР, белковых продуктов генов dnaB и dnaC, белка i, белка п и расплетающих белков подготавливается к репликации. ДНК покрывается молекулами расплетающего белка. 2 —образуется РНК-затравка. В этом процессе принимают участие ген dnaG, ATP, GTP, СТР и UTP. Я — происходит репликация с участием ДНК-полимеразы III, белка U, ATP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP. Образуется двухцепочечпая молекула (форма RF1I с одноцепочечным разрывом). 4 — RFII превращается в RFI. ДНК-полимераза I и лигаза сшивают место разрыва. RFI переходит в скрученную суперспиральную конформацию. 5 — под действием гер-белка Е. coll, cisA-белка фага 0X174. расплетающего белка и ДНК-полимеразы III дальнейшая репликация осуществляется по модели катящегося кольца. При этом образуется только одноцепочечная ДНК, так называемая (+)-цепь (Kornberg, 1977).Рис. 8.9. Стадии репликации одиоцепочечной ДНК бактериофага 0174. / — одиночная цепь под действием АТР, белковых продуктов генов dnaB и dnaC, белка i, белка п и расплетающих белков подготавливается к репликации. ДНК покрывается молекулами расплетающего белка. 2 —образуется РНК-затравка. В этом процессе принимают участие ген dnaG, ATP, GTP, СТР и UTP. Я — происходит репликация с участием ДНК-полимеразы III, белка U, ATP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP. Образуется двухцепочечпая молекула (форма RF1I с одноцепочечным разрывом). 4 — RFII превращается в RFI. ДНК-полимераза I и лигаза сшивают место разрыва. RFI переходит в скрученную суперспиральную конформацию. 5 — под действием гер-белка Е. coll, cisA-белка фага 0X174. расплетающего белка и ДНК-полимеразы III дальнейшая репликация осуществляется по модели катящегося кольца. При этом образуется только одноцепочечная ДНК, так называемая (+)-цепь (Kornberg, 1977).
Дбитлючечпи* ДНК (KFH)
Дбитлючечпи* ДНК (KFH)
Рис. 8.9. Стадии репликации одиоцепочечной ДНК бактериофага 0174. / — одиночная цепь под действием АТР, белковых продуктов генов dnaB и dnaC, белка i, белка п и расплетающих белков подготавливается к репликации. ДНК покрывается молекулами расплетающего белка. 2 —образуется РНК-затравка. В этом процессе принимают участие ген dnaG, ATP, GTP, СТР и UTP. Я — происходит репликация с участием ДНК-полимеразы III, белка U, ATP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP. Образуется двухцепочечпая молекула (форма RF1I с одноцепочечным разрывом). 4 — RFII превращается в RFI. ДНК-полимераза I и лигаза сшивают место разрыва. RFI переходит в скрученную суперспиральную конформацию. 5 — под действием гер-белка Е. coll, cisA-белка фага 0X174. расплетающего белка и ДНК-полимеразы III дальнейшая репликация осуществляется по модели катящегося кольца. При этом образуется только одноцепочечная ДНК, так называемая (+)-цепь (Kornberg, 1977).
Рис. 8.9. Стадии репликации одиоцепочечной ДНК бактериофага 0174. / — одиночная цепь под действием АТР, белковых продуктов генов dnaB и dnaC, белка i, белка п и расплетающих белков подготавливается к репликации. ДНК покрывается молекулами расплетающего белка. 2 —образуется РНК-затравка. В этом процессе принимают участие ген dnaG, ATP, GTP, СТР и UTP. Я — происходит репликация с участием ДНК-полимеразы III, белка U, ATP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP. Образуется двухцепочечпая молекула (форма RF1I с одноцепочечным разрывом). 4 — RFII превращается в RFI. ДНК-полимераза I и лигаза сшивают место разрыва. RFI переходит в скрученную суперспиральную конформацию. 5 — под действием гер-белка Е. coll, cisA-белка фага 0X174. расплетающего белка и ДНК-полимеразы III дальнейшая репликация осуществляется по модели катящегося кольца. При этом образуется только одноцепочечная ДНК, так называемая (+)-цепь (Kornberg, 1977).
ный промежуточный продукт, называемый репликативной формой ДНК (RF, от англ, replicative form). В основном различают два типа репликативных форм: кольцевую релаксированную форму с одноцспочсчпым разрывом (RFI1) и кольцевую замкнутую форму без разрыва (RFI). Последняя находится в суперспира.тизован- ном состоянии.
Инициация синтеза репликативной формы у фага 0X174 в отличие от фага М13 (также содержащего одноцепочечную ДНК) нечувствительна к рифампицину. Это позволяет сделать вывод о том, что РН К-поли мер аз а здесь не принимает участия в репликации. Создается впечатление, что вместо РНК-полимеразы синтез ДНК фага ФХ174 инициируют продукты генов dnaB, dnaC, dnaE и dnaG, которые образуют и удлиняют затравку. Отдельные этапы репликации представлены на рис. 8.9.
(—)-Цепь служит более эффективной матрицей, чем ( + )-цепь, так что в конечном счете образуется больше ( + )-цепей, чем (—)-цепей. (+)-Цепи, синтезируемые по механизму катящегося кольца, включаются в зрелые вирусные частицы. У Е. coll при
Рис. 8.10. Репликационная вилка. Показаны стадии репликации ДНК Е. coll и участвующие в ней белки. Комплекс инициации кроме прочих компонентов содержит также и продукт гена dnaG— так называемую «праймазу» (Kornberg, 1977).
инициации синтеза ДНК наблюдается сходная ситуация, но здесь принимает участие РНК-полимераза, и поэтому синтез начинается с образования коротких фрагментов РНК. Раскручивание двойной спирали происходит под действием «расплетающих» белков (Alberts, Sternglanz, 1977), которые избирательно связываются с одной цепью, дестабилизируют двойную спираль и препятствуют транскрипции. Все компоненты, принимающие участие в инициации, представлены на рис. 8.10. Первоначально считали, что только одна цепь ДНК синтезируется в виде коротких фрагментов (прерывистый синтез), но затем оказалось, что таким же образом синтезируется и вторая цепь. Перед соединением новосинтезированных коротких фрагментов ДНК (фрагментов Оказаки) цепи РНК (затравки) должны быть удалены, что и происходит в результате их расщепления под действием рибонуклеазы Н. Образующиеся при этом бреши заполняются соответствующими дезоксирибонуклеотидами с помощью ДНК-полимеразы I. Непосредственное соединение фрагментов осуществляется ДНК-лигазой (см. гл. 19). После удаления цепей РНК на З'-конце линейной ДНК остается брешь, которая не может быть достроена ДНК-полимеразой, поскольку здесь отсутствует затравка. Поэтому возникает необходимость либо в образовании конкатемеров (см. рис. 8.2,5), либо в каком-то другом из уже описанных механизмов.
ЛИТЕРАТУРА
Alberts В., Sternglanz R. (1977). Recent excitement in the DNA replication problem, Nature (London), 269, 655.
Bouchi J.-P., Rowen L., Kornberg A. (1978). The RNA primer synthesized by prima- se to initiate phage G4 DNA replication, J. Biol. Chem., 253, 765.
ТРАНСКРИПЦИЯ ДНК ВИРУСОВ И ПРОКАРИОТ
Генетическая информация любого организма заключена в линейной последовательности нуклеотидов, входящих в состав ДНК. Чтобы ее использовать, необходимо прежде всего полностью или по частям переписать ее в РНК. Этот процесс мы называем транскрипцией. Он осуществляется с помощью фермента — ДНК-зависи- мой РНК-полимеразы. Транскрипция — это один из важнейших механизмов, контролирующих экспрессию генов. Он включает в себя процессы регуляции и модуляции и состоит из ряда высоко- специфических этапов. При этом следует различать, с одной стороны, ферментативный процесс, осуществляющий перенос генетической информации с одной макромолекулы (ДНК-матрицы) на другую (РНК — матрицу для биосинтеза белка), и с другой — процессы узнавания, при посредстве которых аппарат транскрипции находит старт- и стоп-сигналы на ДНК-матрице. Все это обеспечивает избирательность транскрипции. При переносе информации (ДНК^РНК) существенное значение имеет как специфическое спаривание оснований, так и взаимодействие белок — нуклеиновая кислота, и от того, с какой скоростью РНК-полимераза узнает начало какого-либо гена или группы генов и приступает к синтезу РНК, зависит, будет ли определенная генетическая информация и в каком количестве переписана в РНК. Таким образом, длительность «периода узнавания» в конечном счете определяет эффективность транскрипции. Нуклеотидная последовательность, которая служит как бы «адресом» (т. е. началом) одного или нескольких генов, называется промотором. Промотор обладает высокой степенью сродства к РНК-полимеразе и определяет как направление синтеза РНК, так и (с большой вероятностью) первое основание, которое будет переписано с ДНК в РНК. Сразу же после возникновения комплекса полимераза — промотор фермент может при наличии нуклеозидтрифосфатов образовать первую фосфодиэфир- ную связь и, таким образом, начать синтез РНК. Это бимолекулярная реакция, которая состоит из нескольких частично обратимых и частично необратимых стадий. При отсутствии нуклеотидов комплекс разрушается, причем время его полураспада сильно варьирует в зависимости от промотора. За редким исключением, первым основанием в РНК всегда является пурин. Следующий этап, ведущий к росту цепи, называется элонгацией. В связи с этим возникают следующие вопросы: с какой скоростью протекает процесс элонгации? зависит ли скорость от времени и последовательности оснований? какова точность транскрипции?
При транскрипции in vivo скорость элонгации при 37 °C составляет 40—50 нуклеотидов в 1 с. В системах in vitro искомый параметр равен 15—40 нуклеотидам в 1 с. При малых концентрациях субстрата рост цепи осуществляется прерывисто с остановками
Точка инициации
Галоформам
СРямРичиет ни прси-торе
llfllllllllllll
Ш1
т
ТРрминацик
ШШН11ШП1НШИ
ДНК
РНК-полимераза(-кор")
ЛТК UTP СТР СТР
^Цепь d
Фактор р
*©
Рис. 9.1. Отдельные стадии транскрипции ДНК у прокариот (подробности см. в тексте; Watson, Molecular biology of the gene, 1975, с изменениями).
в совершенно определенных местах молекулы ДНК. Места, в которых преимущественно происходят такие остановки, представляют собой G-богатые участки с длинными последовательностями ро- 1у(А) в кодирующей (матричной) цепи. Таким образом, нуклеотидный состав ДНК существенным образом влияет на скорость элонгации цепи.
Процесс транскрипции осуществляется с большой точностью. Частота ошибок составляет 2-10~3—2-КН, иными словами, на 2000—20000 нуклеотидов встраивается одно неправильное основание. Как ни малы эти величины, все же точность транскрипции не идет ни в какое сравнению с точностью репликации, так как при репликации частота ошибок составляет лишь КН0. Одна из причин такой высокой точности этого процесса заключается в том, что здесь участвует дополнительный механизм контроля (исправление ошибок под действием ДНК-полимеразы I, см. гл. 9 и 19).
Чтобы понять, почему столь велико различие в частоте ошибок, возникающих при репликации и транскрипции, следует вспомнить, что репликация, как правило, происходит только один раз за весь клеточный цикл и что реплицируется очень длинная молекула ДНК (единица репликации). При транскрипции, наоборот, на одной единице транскрипции образуется много транскриптов, значительно более коротких по сравнению с ДНК-матрицей. Вполне достаточно, если активными окажутся лишь около 95% образовавшихся
н конечном счете белковых молекул. Ошибка же, появившаяся при репликации, будет перенесена в следующие поколения клеток, и ее уже нельзя будет исправить.
Как осуществляется терминация транскрипции? Процесс, веющий при транскрипции к обрыву (терминация) цепи мРНК, еще менее изучен, чем процесс инициации. Ясно, что в ДНК имеются специфические терминирующие последовательности, дойдя до которых РНК-полимераза прекращает свою работу. При этом син- гезированная цепь РНК и молекула фермента отделяются от ДНК- матрицы. Существуют также терминирующие сигналы, которые ^познаются лишь в присутствии терминирующего фактора (р-фак- тора). р-Фактор — это белок, обладающий АТФазной активностью и высоким сродством к определенным нуклеотидным последовательностям. И наконец, известны случаи, когда р-фактор, хотя и способствует прекращению синтеза цепи, не является абсолютно необходимым.
Терминирующие последовательности практически всегда содержат определенное число остатков А, следующих за несколькими GC-парами. Мы уже видели, что в таких местах реакция полимеризации подавляется и РНК-полимераза останавливается, причем подобные паузы, вероятно, в свою очередь служат сигналами для прекращения катализируемой этим ферментом реакции элонгации. Основные обсуждаемые здесь данные представлены на рис. 9.1.
Как действует механизм регуляции транскрипции?
РНК-полимераза только направляет транскрибирование ДНК- матрицы, регуляция же транскрипции осуществляется при участии других факторов. Во многих случаях экспрессия генов регулируется с помощью механизмов, которые влияют на процессы узнавания. Наряду со старт- и стоп-сигналами в ДНК имеются высокоспецифические области, узнаваемые регуляторными белками, которые обеспечивают либо продолжение, либо торможение транскрипции определенных участков ДНК (такие белки ответственны за активацию, репрессию, а также положительный или отрицательный контроль транскрипции). Несколько сигнальных последовательностей такого типа обнаружено в ДНК вирусов и прокариот. С некоторыми из них мы познакомимся в конце этой главы.
Активность регуляторных белков изменяется под действием многочисленных факторов (концентрация метаболитов, ионов и т. д.). Кроме того, и сама ДНК-зависимая РНК-полимераза способна изменять свою специфичность и активность. В зависимости от условий фермент может проявлять разную степень активности. Он состоит из нескольких субъединиц (см. гл. 19). Особый интерес представляет субъединица о, которая легко диссоциирует от остальных субъединиц, образующих комплекс, называемый кор-фер-
Рис. 9.2. Транскрипция ДНК бактериофага Т7 in vitro. После добавления ДНК- зависимой РНК-полимеразы Е. coll лишь на одном конце молекулы ДНК появляются ответвляющиеся от него нити (молекулы) РНК. Скорость синтеза здесь относительно высока и ясно прослеживается направление транскрипции. Остальной геном (80%) может транскрибироваться только с помощью фагоспецифической полимеразы. (Фото сделано Delius из Cold Spring Harbor Laboratory, 1973.)
ментом (от англ, core — сердцевина). Субъединица а нужна для узнавания промотора и инициации специфической транскрипции с определенной стартовой последовательности.
Вирусы, и прежде всего бактериофаги, в последние годы шм- воко используются при исследовании регуляции транскрипции и, в первую очередь таких процессов, которые направляют развитие событий в определенной временной последовательности. С ростом количества информации, как правило, возрастает сложность механизмов, контролирующих транскрипцию. В геноме мелкого бактериофага fd после заражения бактериальной клетки транскрибируются все гены одновременно. В этом случае нет никаких временных стадий и специфических механизмов регуляции.
Более крупный геном фага Т7 (а также ТЗ и др.) состоит из двух групп генов, активирующихся последовательно друг за другом. Их называют ранними и поздними генами. После заражения бактериальной клетки сначала транскрибируются только ранние гены (рис. 9.2). Необходимый фермент для этого предоставляется бактериальной клеткой. К продуктам ранних генов относится фагоспецифическая полимераза, осуществляющая транскрипцию
поздних генов (Chamberlin et al., 1970). Специфичность кодируемого фагом Т7 фермента проявляется, в частности, в том, что в по присутствии ДНК близкородственного фага ТЗ не транскрибируется. Это справедливо и в отношении фермента, кодируемого фагом ТЗ. Он также имеет чрезвычайно узкий спектр действия, причем узнает промоторы поздних генов фага ТЗ в 10 раз эффек- тивнее, чем весьма сходные по структуре промоторы фага Т7 (Dunn et al., 1971).
У фага SP01 Bacillus subtilis существует три класса генов, различающихся по времени их действия. Все они транскрибируются с помощью бактериальной полимеразы, однако геном фага направляет последовательное образование генных продуктов и тем самым видоизменяет полимеразу и ее специфичность. После заражения фагом бактериальный фермент теряет свой о-фактор (Talkinton, Рего, 1977).
Наконец, следует упомянуть фаг Т5 Escherichia coli, гены которого также организованы в виде трех временных классов. Регуляция транскрипции здесь осуществляется с помощью различающихся по эффективности промоторов.
Механизмы, контролирующие транскрипцию, могут оказывать на данную систему необратимое воздействие, как это имеет место во всех перечисленных выше примерах, а также при эмбриональном развитии и дифференцировке. Однако оно может быть и обратимым. К обратимо регулируемым транскрипционным системам принадлежат бактериальные опсроны, такие, как лактозный опе- рон, триптофановый опорой и другие. Образующиеся при этом генные продукты принимают участие в обмене веществ. Гены включаются только тогда, когда это требуется, и прекращают свою работу, если продукт гена больше не нужен.
Каковы характерные особенности промотора?
Промоторы представляют собой участки ДНК, прочно связывающиеся с ДНК-зависимой РНК-полимеразой. В последние годы были определены нуклеотидные последовательности нескольких промоторов мелких фагов, а также регуляторные области у прокариот, которые мы будем обсуждать в следующем разделе (Prib- now, 1975; Schaller et al„ 1975; Sugimoto et al., 1975). Они были выделены в виде фрагментов соответствующих ДНК, защищенных от действия нуклеаз с помощью РНК-полимеразы.
Области промоторов в большинстве своем богаты АТ-парами, причем пурины и пиримидины распределены в них ассимметрично. Известно, что такое распределение влияет на вторичную структуру ДНК и снижает ее стабильность. Предполагается, что промоторы играют важную роль как в процессе узнавания генов РНК-полимеразой, так и при последующем локальном плавлении ДНК. Про-
Последобатслыксти, защищенные от дейстбия Д№зы
*Р RM
G
I G
T
T A
G A
T
A
T
T
T
A
T c
c
С Т Т
G
С 6
G
7
G А
•
А
G
А
т 7
т
А
А
с
G Т А
Хр L
G
G I
0
T 1
0
A
c
A
T
A
A
A
T A
c
САС
т
0 G
С
о
О Т
G
д
•
А
С Г
G
А
и
с
АСД
ХР R
C
G I
G
T T
G
A
c
T
A
T
T
T
I A
c
с т с
т
G G
С
О
G T
G
А
т
А
А Т
G
G
т
I
G С А
Ьр о
G
A A
G
T T
G
A
G
T
A
T
T
I
T T
G
0 I G
т
А Т
т
Т
О I
С
А
Т
А
А 7
G
А
с
т
С С • G
SV4O
G
T I
G
T T
G
T
T
A
A
c
T
T
G T
T
ТАТ
т
G С
А
G
С т
Т
А
т
А
А Т
6
G
т
1
АСА
fd X
T
T T
G
A T
G
c
A
A
T
T
c
G
C T
T
Т G С
т
Т с т
G
А С
т
А
7
А
А Т
А
G
А
с
А 05
fd И
A
A C
G
T T
T
A
c
A
A
T
I
T
A A
A
ТАТ
т
Т G
С
т
Т А
т
А
С
А
A T
с
А
Т
с
сто
fd VIC
c
r c
C
G T
T
G
A
c
r
T
T
G T
T
ТСС
с
G С
т
т
G 0
Т
А
т
А
А Т
с
G
с
т
g 55.5
Т7АЗ
A
C G
G
T T
G
A
C A
A
C A
T
G A
A
СТА
А
А С
А
с
G G
Г
А
с
G
А Г
G
т
А
с
САСА
Т7А2
G
T A
T
T G
A
c
A A
c
A
T
G
A A
G
Т А А
с
А Г
G
с
A G
А
А
G
A T
А
с
А
А
А Т С Д
ex D
T
T G
T
T G A
c
A
T
T
T
T
A
A A
A
G A G С
G Т
G
0
А Т
т
А
с
т
А Т
С
I
G
А
0 • С С 5
ex в
A
G C
TGC
A
A
A
A
T
A
c
G T
G
G С С
т
Т А
Т
G
0 т
т
А
С А
G Т
Т
G
с
С С А
OX A
A
G G
A
T I
G
A
C
A
C
c
c
T
C C
C
А А Т
т
G Т
А
т
G Т
т
Т
т
с
А I
G
с
С
т
С С А А
tRNS fyr
T
A A
c
A C
T
T
T
A
C
A
G
c
G G
c
G С Т
с
А Т
т
т
G А
т
А
т
G
А Т
G
с
G
с
С С С 0
ora BAD
T
A C
c
T G
A
c
G
C
T
I
T
I
T A
T
С G С
А
А С
7
с
Г С
г
А
с
0 т
1
Т
С
с
С А 1 А
loc ZYA
G
G C
T
T T
A
c
A
C
T
T
T
A
T 6
c
Т т с
с
G G С
т
С 0
т
А
т
с
т т
G
т
G
т
ОСА
loc 1
A
A T
G
G C
G
C A
A
A
A
c
c
T T
T
С G С
G
G Т
А
G G
с
А
т
G
А Т
А
G
С
G
С С С G
gal ICAP)
G
T c
A
C A
C
T
T
T
T
c
G
c
A T
c
т т т
О
Т т
А
т
G С
т
А
G
G Т
Т
А
I
т
Т С А
gal1
c c
A
T G
T
c
A
c
A
c
T
T
T 1
c
С С А
т
с т
7
т
G Т
А
т
0
с т
А
Т
G
G
Т Т А
trp kali!
G
C T
G
T T
G
A
c
A
A
T
T
A
A T
c
АТС
G
А А
с
т
A G
т
Т
А
А
с т
А
G
т
А
СОСА
trp iSt.)
G
6 T
G
T T
G
A
c
A
30
T
T
A
T
т C
c
АТС
G
А А
С
т
5
A О
т т
Т
А
А Т
а с : ^А Т
А
G
G
т
А
С САД .1
пакт При5ня6а
Рис. 9.3. Промоторы с установленной нуклеотидной последовательностью (по данным, полученным к апрелю 1977 года; сопоставление сделано Majors).
анализировав расшифрованные нуклеотидные последовательности промоторов, Прибиов (Pribnow, 1975) установил, что все они содержат одинаковые или очень сходные между собой последовательности из семи нуклеотидных пар (рис. 9.3). В своей работе он заключил в рамку этот участок, получивший название «бокс Прибнова» («Pribnow box»).
5'T-A-T-Pu-A-T-G 3'
З'А-Т-А-Ру-Т-А-С 5'.
Шаллер и др. (Schaller et al., 1975) получили аналогичные результаты. Эта область промотора удалена от точки инициации синтеза РНК на 5—7 пар нуклеотидов. Последовательность самого промотора не транскрибируется.
Скорости связывания РНК-полимеразы с промотором и ее высвобождения из образовавшегося комплекса могут сильно варьировать. У восьми промоторов фага fd скорости связывания РНК- полимеразы различаются в 10 раз. Скорость связывания полимеразы определяет эффективность промотора. Следует, однако, помнить, что эффективность промотора и сродство РНК-полимеразы к ДНК —это не одно и то же. Решающее значение здесь имеет скорость оборота данного промотора, т. е. число образовавшихся цепей РНК в единицу времени. Таким образом, относительная эффективность промотора определяется частотой актов инициации, специфичных в отношении данного промотора, и зависит от относительной скорости образования и диссоциации комп-
лекса фермент —ДНК, а также инициации синтеза РНК. В принципе полимераза может связываться с любой последовательностью ДНК, но если это промотор, то скорость инициации синтеза РНК оказывается на порядок выше, чем скорость освобождения фермента (константа диссоциации).
Зебург и др. (Seeburg et al. 1977) сообщили следующие величины скоростей для образования комплекса между полимеразой и промоторами бактериофага fd:
Фермент-)-ДНК
Связывание (15 с —3 мин) Ц Диссоциация (30 с —50 ч)Фермент —ДНК(Преинициаторный комплекс)
4-4 NTPI Инициация синтеза РНК (1 с)
Фермент —ДНК —РНК
(Транскрипционный комплекс)
Самые эффективные из известных в настоящее время промоторов имеет бактериофаг Т5 (Gabain, Bujard, 1977). Некоторые из них значительно более эффективны, чем промоторы ДНК клетки- хозяина. Так как после заражения клетки фагом в ней не образуется фагоспецифической РНК-полимеразы, между фаговым промотором и промотором клетки-хозяина начинается конкуренция и в конце концов первый, как более эффективный, выигрывает. Время жизни комплексов промотор — полимераза составляет 30 мин — 48 ч, причем эти различия определяются в основном скоростью связывания полимеразы. Между скоростью связывания и скоростью высвобождения полимеразы нет никакой корреляции, тогда как между скоростью связывания фермента и эффективностью промотора наблюдается определенная зависимость. Геном фага Т5 содержит 80—120 генов, которые, как уже говорилось, принадлежат к трем временным классам — предранних, ранних и поздних генов (McCorquodale, Buchmann, 1968). Непосредственно после заражения бактериальной клетки фагом Т5 8% фаговой ДНК, содержащей предранние гены, включается в ДНК клетки-хозяина и сразу же транскрибируется. Транскрипция остальных 92% ДНК зависит от наличия белка, кодируемого одним из предранних генов. Синтез ранней мРНК начинается через 5 мин после заражения, а синтез поздней мРНК— через следующие 5 мин и продолжается вплоть до лизиса клетки-хозяина.
ДНК фага Т5 содержит около 40 промоторов. Штюбер и др. (Stuber et al., 1978) с помощью электронной микроскопии установили, что шесть из них находятся в предраннем участке, 29 — в раннем и 5 —в позднем, (рис. 9.4). Расположение транскрибируемых участков, распределение в них различающихся по эффективности промоторов, генетическая карта и структура ДНК фага Т5 приведены на рис. 9.5. Преимущество фагового генома
9. Транскоипция ДНК вирусов и прокариот 143
Проран нив-Предранние
геныРанние'геныПоздние гены 1 ген»
-*—**4*W—*
ds? mPW ds pol els i Отросток Галобка।
1 23 г3 5 8-01518 16*16 89-21I / 2J
•—i Ы- -JJi—i—il-—i:1 j IX Генетическая
i карта
РестрикционныеЧп7 1гт-11r-r-m—1 ^t®™
E A 0 F HNE В G I J LU D(Kind 13)
111111111i00.1020.3OS05050.705OS1.0
Длина генома, атноситг.тжы* единицы
Рис. 9.5. Генетическая карта, структура и транскрипция ДНК бактериофага Т5 Н. соН. 80—120 генов организованы в три временных класса (предранпие, ранние и поздние гены). Часть генов (предранние) содержит избыточную информацию. Одна из ценен ДНК интактна, а комплементарная ей цепь разорвана (сегментирована). els — гены, продукты которых, по всей вероятности, участвуют в переключении транскрипции с ранних генов на поздние: pol — ген ДНК-поли- меразы. Поздняя область содержит гены, необходимые для сборки фага и лизиса клетки-хозяина. Транскрибируемые участки и направление транскрипции (Hendrickson, Bujard, 1973) показаны стрелками, расположенными выше и ниже изображения структуры ДНК. Толщина стрелок соответствует относительной интенсивности транскрипции in vitro. Из имеющихся данных вытекает, что в ранней области промоторы значительно сильнее, чем в поздней. Внизу даны фрагменты, полученные в результате обработки ДНК рестриктазой Hind III. Эти фрагменты были использованы для определения эффективности расположенных в них промоторов. На основании полученных результатов и было сделано приведенное выше заключение об относительной эффективности промоторов (Gabain, Bujard, 1977).
состоит в наличии четко передаваемого сигнала (сильного промотора). Если уж транскрипция ДНК фага началась, то далее все осуществляется по строго запрограммированной схеме и все происходящие при этом процессы являются необратимыми.
Регуляторные участки в ДНК: оператор, оперон, аттенюатор
В ДНК находится целый ряд функциональных элементов. Принято различать структурные гены, т. е. элементы, несущие генетическую информацию для образования ферментов и структурных белков, с одной стороны, и гены-регуляторы, несущие информацию для образования регуляторных белков, — с другой. Регуляторные белки называются так потому, что они взаимодействуют со спе-
цифическими участками ДНК и либо увеличивают, либо уменьшают скорость транскрипции.
Из этого следует, что в геноме должны существовать специфические функциональные участки, осуществляющие регуляцию экспрессии генов. При этом необходимо отличать операторы, т. е. участки, узнающие регуляторные белки, от уже упоминавшихся промоторов, которые связываются с ДНК-зависимой РНК-поли- меразой и, таким образом, устанавливают место инициации (стартовую точку) транскрипции. Сюда же в некоторых случаях относятся места связывания «положительных» контролирующих элементов (например, комплекс сАМР— САР). Все эти участки образуют функциональную единицу «оперой», состоящую из структурных генов, одного промотора и одного оператора. Структурные гены оперона включаются и выключаются все вместе одновременно.
Лактозный оперся (lac-оперон) Е. coli. Это наиболее хорошо изученный оперой. В основе наших знаний о нем лежит классическая работа Жакоба и Mono (Jacob, Monod, 1959). В результате дальнейших интенсивных исследований мы имеем теперь довольно ясное представление о структуре и механизме регуляции этого оперона.
С помощью генетического анализа в /ас-опероне были выявлены отдельные участки, а также установлены их функции и расположение. Было показано, что скорость транскрипции регулируют три белка:
Репрессор (регуляторный белок)—продукт гена I (подробно об этом белке см. гл. 19).
Место связывания: оператор.
ДНК-зависимая РНК-полимераза (подробнее о ней см. гл. 19), Место связывания и стартовая точка: промотор.
CAP (CRP) —сАМР-связывающий белок. Место связывания: «левый» конец промотора.
Репрессор блокирует транскрипцию /ас-оперона. Место его связывания находится между промотором и структурными генами. Лактоза инактивирует репрессор и тем самым создает условия для начала транскрипции. Синтез трех ферментов р-галактозидазы, галактозидтрансферазы и трансацетилазы (продуктов генов г, у и я) осуществляется путем индукции. Он происходит только в том случае, если в этих ферментах возникает потребность, т. е. тогда, когда бактерии попадают в среду, содержащую лактозу. Генетические дефекты в операторе (ос) приводят к постоянному конститутивному синтезу ферментов. Транскрипция лактозного оперона контролируется «отрицательно», так как гоп в отсутствие лактозы остается выключенным. Кроме того, этот оперой находится под «положительным» контролем, осуществляемым путем изменения уровня сАМР в клетке (Beckwith, 1975). Концентрация сАМР
опять-таки «отрицательно» коррелирует с концентрацией глюкозы. При низкой концентрации глюкозы концентрация сАМР повышается. сАМР связывается с САР-белком, а образовавшийся комплекс— с промотором, в результате чего стимулируется связывание ДНК-зависимой РН К-полимеразы и возрастает скорость транскрипции. Это явление носит название «катаболитная репрессия». Глюкоза представляет для клетки более выгодный источник углерода, чем, например, лактоза (и некоторые другие углеводы). Пока глюкоза имеется в достаточном количестве, клетка не нуждается в получении и переработке никаких других сахаров. Лишь при возникновении острой потребности в углероде используются менее выгодные источники.
Чтобы лучше понять механизм действия контролирующей области /ас-оперона, необходимо определить нуклеотидную последовательность этого участка, имеющего длину 120 пар оснований. Здесь прежде всего встает вопрос о том, каким образом можно отделить данный участок от остальной части генома Е. coll. состоящей примерно из 107 пар оснований. В 1969 г. эта задача была решена. Шапиро, МакХатти, Эрон, Иппен и Беквит (Гарвардский университет) выделили лактозный оперон в чистом виде и достаточном количестве. В своей работе они использовали два умеренных фага, обладающих способностью встраиваться в геном Е. colt по соседству с /ас-опероном и захватывать его при исключении из генома (см. гл. 13). Мы не будем обсуждать здесь эту работу, упомянем лишь, что /ас-оперон встраивался в оба фага в двух разных ориентациях. Денатурация (плавление) фаговой ДНК, разделение одиночных цепей и последующая ренатурация смеси ДНК из обоих фагов приводила к правильному спариванию оснований только в области /ас-оперона. Неспаренные области (геномы фагов) разрушали с помощью экзонуклеазы. Полученный фрагмент был слишком длинен для определения в нем нуклеотидной последовательности, так как помимо контролирующей области он содержал структурные гены z, у и а. а также ген-регулятор i.
Для выделения оператора к ДНК, содержащей оператор, добавляли репрессор, защищавший его от действия нуклеаз. После расщепления остальной ДНК и диссоциации репрессора получали чистый препарат оператора, пригодный для дальнейшего анализа.
В то время, когда определяли нуклеотидную последовательность /ас-оперона (Gilbert, Maizels, Maxam, 1973), еще не были разработаны соответствующие методы, применяющиеся в настоящее время. Поэтому необходимо было прежде всего синтезировать in vitro мРНК и лишь после этого определить в ней нуклеотидную последовательность. Тем временем стала известна последовательность всей контролирующей области (рис. 9.6). Эта область отличается рядом особенностей. Оператор обладает симметрией 2-го порядка. Промотор содержит две области с высоким содержанием
ПромоторПромотор£трдшпут№_£трдшпут№_1Ш6ИШ лишгцан ^„^ дщрщонё.разгаромСтруктуре»1 Мт■1Ш6ИШ лишгцан ^„^ дщрщонё.разгаромСтруктуре»1 Мт■гея5- ’-?-** — - -OGWCCaOGOGTMгея5- ’-?-** — - -OGWCCaOGOGTMI \—-*Рт,-'еТббААТТС-ТОАССОЗАТМСААПГСАСАСАЗСАААСАбСтХтбЛССАТО-I \—-*Рт,-'еТббААТТС-ТОАССОЗАТМСААПГСАСАСАЗСАААСАбСтХтбЛССАТО-CCCCTTGCGT!«-;At*CTC*AraWnOGBArcC5:C6C<r:CGWiy.WveAaWaX^McCA»CMCACACCrCCCCTTGCGT!«-;At*CTC*AraWnOGBArcC5:C6C<r:CGWiy.WveAaWaX^McCA»CMCACACCr-io -то -ео -so -io -io ?о .-о о-io -то -ео -so -io -io ?о .-о оРис. 9.-6. Структура и нуклеотидная последовательность области промотора—оператора /ас-оперона. Промотор и оператор перекрываются друг с другом. Промотор содержит значительно больше пар оснований, чем оператор. Нетранслируе- мый б'-кониевой участок мРНК называют лидером- Дальнейшие подробности даны в тексте. Взаимодействие между промотором и оператором изображено на рис. 9.9. (Dickson et al., 1975.)Рис. 9.-6. Структура и нуклеотидная последовательность области промотора—оператора /ас-оперона. Промотор и оператор перекрываются друг с другом. Промотор содержит значительно больше пар оснований, чем оператор. Нетранслируе- мый б'-кониевой участок мРНК называют лидером- Дальнейшие подробности даны в тексте. Взаимодействие между промотором и оператором изображено на рис. 9.9. (Dickson et al., 1975.)
Промотор
Промотор
£трдшпут№_
£трдшпут№_
1Ш6ИШ лишгцан ^„^ дщрщонё.разгаром
Структуре»1 Мт■
1Ш6ИШ лишгцан ^„^ дщрщонё.разгаром
Структуре»1 Мт■
гея
5- ’-?-** — - -OGWCCaOGOGTM
гея
5- ’-?-** — - -OGWCCaOGOGTM
I \—-*Рт,-
'еТббААТТС-ТОАССОЗАТМСААПГСАСАСАЗСАААСАбСтХтбЛССАТО-
I \—-*Рт,-
'еТббААТТС-ТОАССОЗАТМСААПГСАСАСАЗСАААСАбСтХтбЛССАТО-
CCCCTTGCGT!«-;At*CTC*AraWnOGBArcC5:C6C<r:CGWiy.WveAaWaX^McCA»CMCACACCr
CCCCTTGCGT!«-;At*CTC*AraWnOGBArcC5:C6C<r:CGWiy.WveAaWaX^McCA»CMCACACCr
-io -то -ео -so -io -io ?о .-о о
-io -то -ео -so -io -io ?о .-о о
Рис. 9.-6. Структура и нуклеотидная последовательность области промотора—оператора /ас-оперона. Промотор и оператор перекрываются друг с другом. Промотор содержит значительно больше пар оснований, чем оператор. Нетранслируе- мый б'-кониевой участок мРНК называют лидером- Дальнейшие подробности даны в тексте. Взаимодействие между промотором и оператором изображено на рис. 9.9. (Dickson et al., 1975.)
Рис. 9.-6. Структура и нуклеотидная последовательность области промотора—оператора /ас-оперона. Промотор и оператор перекрываются друг с другом. Промотор содержит значительно больше пар оснований, чем оператор. Нетранслируе- мый б'-кониевой участок мРНК называют лидером- Дальнейшие подробности даны в тексте. Взаимодействие между промотором и оператором изображено на рис. 9.9. (Dickson et al., 1975.)
GC-nap и одну расположенную между ними область с высоким содержанием АТ-пар. Конец гена i и начало гена г были проанализированы. Расшифрованная нуклеотидная последовательность оказалась именно такой, какую можно было ожидать, исходя из известных аминокислотных последовательностей генных продуктов. На конце гена i не обнаружено терминирующей последовательности, и поэтому нет уверенности, что в системе in vivo транскрипция здесь действительно прекращается. Между тем законченная к тому времени расшифровка нуклеотидной последовательности гена i (Farabaugh, 1978) позволила исправить некоторые ошибки в установленной ранее аминокислотной последовательности бел к а -реп р ессор а.
Другие опероны, исследованные у прокариот. Модель лактозного оперона Жакоба и Моно быстро получила признание и вошла во многие учебники. Хотя она правильно описывает регуляцию данного оперона, было бы ошибочно думать, что и все остальные опероны регулируются подобным же образом. Регуляторные белки арабинозного, мальтозного и D-сериндезаминазного оперонов действуют как положительные элементы, т. е. являются активаторами. В других случаях, как, например, в системе, ответственной за утилизацию гистидина (йиЛопероны), регулятор не только ингибирует синтез структурных белков, ио воздействует также непосредственно на свой собственный синтез (аутогенная регуляция; рис. 9.7). Этот регуляторный белок представляет собой фермент (глутаминсинтетазу) и, следовательно, продукт структурного гена.
hut-тин IIhut-тин II44йупемипсиипкишмйупемипсиипкишмhul-тсрж I p оhul-тсрж I p оppCAP-CAMP *™CAP-CAMP *™P 0P 0Рис. 9.7. Репрессия и активация двух Ли?-оперонов Salmonella typhimurium (hut — <>т англ, histidin utilizing). 1 — AuZ-penpeccop блокирует оба hut-оперона. 2 — инак- пшация репрессора еше, не ведет к транскрипции данного оперона. 3 и 4 — транскрипция начинается после связывания с промотором САР—сАМР или глутамии- ■ интетазы. Таким образом, система содержит как отрицательные, так и положительные элементы контроля. (Smith, Magasanik, 1976.)Рис. 9.7. Репрессия и активация двух Ли?-оперонов Salmonella typhimurium (hut — <>т англ, histidin utilizing). 1 — AuZ-penpeccop блокирует оба hut-оперона. 2 — инак- пшация репрессора еше, не ведет к транскрипции данного оперона. 3 и 4 — транскрипция начинается после связывания с промотором САР—сАМР или глутамии- ■ интетазы. Таким образом, система содержит как отрицательные, так и положительные элементы контроля. (Smith, Magasanik, 1976.)hut-pcnpe™hut-pcnpe™< Индуктор(Uis)po U< Индуктор(Uis)po U
hut-тин II
hut-тин II
4
4
йупемипсиипкишм
йупемипсиипкишм
hul-тсрж I p о
hul-тсрж I p о
p
p
CAP-CAMP *™
CAP-CAMP *™
P 0
P 0
Рис. 9.7. Репрессия и активация двух Ли?-оперонов Salmonella typhimurium (hut — <>т англ, histidin utilizing). 1 — AuZ-penpeccop блокирует оба hut-оперона. 2 — инак- пшация репрессора еше, не ведет к транскрипции данного оперона. 3 и 4 — транскрипция начинается после связывания с промотором САР—сАМР или глутамии- ■ интетазы. Таким образом, система содержит как отрицательные, так и положительные элементы контроля. (Smith, Magasanik, 1976.)
Рис. 9.7. Репрессия и активация двух Ли?-оперонов Salmonella typhimurium (hut — <>т англ, histidin utilizing). 1 — AuZ-penpeccop блокирует оба hut-оперона. 2 — инак- пшация репрессора еше, не ведет к транскрипции данного оперона. 3 и 4 — транскрипция начинается после связывания с промотором САР—сАМР или глутамии- ■ интетазы. Таким образом, система содержит как отрицательные, так и положительные элементы контроля. (Smith, Magasanik, 1976.)
hut-pcnpe™
hut-pcnpe™
< Индуктор(Uis)
po U
< Индуктор(Uis)
po U
Можно попутно отметить, что указанное вначале различие между ферментами и регуляторными белками во многих случаях действительно существует, однако обе эти функции отнюдь не исключают друг друга. У триптофанового оперона Е. coll образуется неактивный репрессор, который активируется лишь под действием корепрессора (триптофана или триптофановой тРНК). Здесь мы имеем дело с особым типом ингибирования конечным продуктом. Однако при этом не только изменяется (подавляется) активность первого фермента, как при обычном ингибировании конечным продуктом (например, при синтезе треонина), но и прекращается син- гез всех ферментов данной цепи реакций. Последовательность оснований в триптофановом опероне была установлена Беннеттом и др. (Bennett et al., 1976). Репрессор и ДНК-зависимая РНК- полимераза связываются с одним и тем же участком. Таким обра- юм, участки для узнавания этих двух белков здесь также не отделены друг от друга; они богаты ЛТ-парами, и в них отсутствуют (iC-богатые последовательности (Bertrand et al., 1975; Bennett et al., 1976; рис. 9.8).
Иеич'чвьый psiprtcop * А рГп №
—р-е Тгр№
АипиМ’ j
paipccrap 7
Р.о ( l.o , trpE , frpD , trpC । frp В
L/in^^z .w Z/pf:
)^2кта№;
v,i a- -•• v- * 1VIIXMтаX’ 1ir•'
s' TTссссссссссттпттгтсаасааллттаоасаатаасалтссаалсас——
3' A ACGGGCGCCCGAAAAAAAACTTGTTTTAATCTCTrATTGTTACGT?TGTG -
СимАетцл
VUи —"GCCCGCCGKUULUU-JUU -ОН
яармекоч мРПК
Рис. 9.8. Функциональная модель триптофанового оперона. Обычно репрессор находится в неактивной форме. После связывания конечного продукта (Тгр) или Тгр-тРНК он переходит в активную форму. Нуклеотидная последовательность контролирующей области установлена. Между оператором и началом структурного гена tr'pE расположен участок длиной 160 пар оснований (лидер). (При повторной проверке данных было показано, что лидер включает в себя 166 пар оснований.) Он содержит также аттенюатор — участок, отличающийся тем, что в нем находятся две последовательности с обращенными повторами. В аттенюаторе, как правило, происходит прекращение транскрипции, если этому не препятствуют какие-либо внешние стимулы (например, недостаток триптофана). (Bertrand et al., 1975.)
Между оператором и структурным геном расположен участок длиной 166 пар оснований, так называемая лидерная последовательность, определенная часть которой представляет собой аттенюатор. В этом месте в девяти случаях из десяти транскрипция прекращается. Цепь РНК далее не удлиняется, так как полимераза отделяется от ДНК- Для преодоления этого препятствия требуется некий внешний сигнал. Положительное воздействие оказывает недостаток триптофана. В настоящее время известна также нуклеотидная последовательность регуляторной области триптофанового оперона Salmonella typhimurium. Сравнение этой последовательности с аналогичной последовательностью в триптофановом опероне Е. colt показало, что функциональные участки в них в значительной степени совпадают, т. е. что в процессе эволюции давление отбора было направлено не только на сохранение структурных генов, но и генов-регуляторов (Lee et al., 1978).
В катаболических системах прокариот часто происходит индуцируемый синтез ферментов. Это дает клетке возможность приспосабливаться к различным условиям окружающей среды и экономить энергию, прекращая синтез соответствующего фермента, если он больше не требуется. Для индукции синтеза ферментов характерно несколько отличительных особенностей:
с!
S' AGCrGCTCTTGTGTTAATGGTTTCTTTTTTGTGCrCATACGTТАААТС 3 tCGACGAGAACACAATTACCAAAGAAAAAACACGAGTATGCAATTIAG
.*• *п Ды Otn 1ы lav Pre Lye lys lyi Ты Ser-W^^^
.°r3,or2
TATCACCGCAAGGGATAAATATCTAACACCGTGCGTGITGACTATTT atagtggcgttcccta-ttatagattgtggcacgcacaactgataaa
,oR1его *
tacctctggcggtgataatggttgcatgta з"
atggagaccgccactattaccaacgtacat S'
,yr»L2
s' taaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcgg
3' attttttgtatgtctattggtagacgccaciaittaatagagaccgcc
OL1N
TGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACTGAGCACAICAG 3' acaactgtatтtatggtgaccgccactatgactcgtgtдоге s'
fl
Рис. 9.9. Область оператора—промотора у бактериофага X. А. Схематическое изображение расположения генов и их транскрипции в участке контроля (область иммунности). Правый оператор и правый промотор обозначены как ов и рв, а ле- ный оператор и левый промотор —как Оь и ръ. Транскрипция генов с/ и гех на- •шнается либо на промоторе Рг, (при фаговой инфекции нелизогенных бактерий), либо на промоторе р,т в лизогенных клетках-хозяевах. Б и В. Нуклеотидные последовательности на участках левого и правого операторов. Обе они имеют по три участка связывания репрессора: oRJ-i и Оц-з- Показаны также стартовые точки транскрипции генов N и с! (дана соответствующая X-концевая аминокислотная последовательность). В ов1 обнаружено место свя- швання рибосомы при считывании гена с! (обозначено звездочками). (Ptashne et al., 1976.)
Концентрация субстрата (в среде) должна превысить определенный уровень, прежде чем соответствующий фермент может образоваться.
Фермент синтезируется только тогда, когда соответствующий субстрат необходим для роста организма.
Система достаточно стабильна и мало чувствительна к помехам.
Индукция и репрессия могут быстро чередоваться друг с другом, что дает преимущество клетке при изменении условий окружающей среды.
Репрессор, оператор и промотор фага X;
геном, который сам себя выключает
Фаг X— это лизогенный (умеренный) фаг, который после заражения клетки Е. coll может включаться в ее геном. Вирусный геном с этого момента почти полностью выключается (т. е. переходит в состояние профага). В это время образуется только один генный продукт — Х-репрессор. Шибальский и его сотрудники уже в конце шестидесятых годов обнаружили, что у фага X на разных участках транскрибируется либо одна, либо другая цепь. Подробности представлены на упрощенной карте гена на рис. 5.3. В 1975 г. две группы исследователей во главе с Птацгне и Пиротта расшифровали нуклеотидную последовательность регуляторной области ДНК фага X. Полученные результаты приведены на рис. 9.9. X-Репрессор связывается с двумя операторами oL и or, один из которых расположен в одной, а другой —в комплементарной ей цепи ДНК.
Операторы содержат множество мест связывания с репрессором. Транскрипция генов его (=to[) и N начинается вне этой области; таким образом, оператор, как и в случае /ос-оперона, не транскрибируется. Промоторы и операторы частично перекрываются. Ген с! расположен между операторами or и oL. В лизогенных бактериях транскрипция гена с! начинается вблизи правого оператора (от промотора ргт) и распространяется «влево».
Связывание репрессора с Х-операторами препятствует связыванию с промоторами ДНК-зависимом РНК-полимеразы. В области промотора и оператора фага X, как и в /ас-опероне, наряду с АТ-богатыми участками обнаружены чередующиеся с ними GC-бо- гатые участки. Содержание в них GC-riap достигает максимально 73%, а содержание АТ-пар —92%. Промотор pR —это очень сильный промотор с высокой степенью сродства к полимеразе. Поэтому, когда репрессор отсутствует, доминирует транскрипция генов, контролируемых промотором рч. При блокировании же этого участка полимераза связывается с ртт — промотором гена с/.
Можно более подробно рассмотреть только что набросанную схему. X-Репрессор представляет собой продукт гена с/. Однако наряду с ним существует и второй репрессор (продукт гена его). Вместе они образуют пару аутогенных регуляторов противоположного действия, причем оба действуют на оператор or. Сродство продукта гена с/ к отдельным участкам оператора убывает в следующем порядке: oju>Or2>or3, а сродство продукта гена его изменяется таким образом: овз>(ощ, oR2). Продукт гена с/ в небольших концентрациях активирует свой собственный синтез, облегчая транскрипцию, начинающуюся от промотора ptm. Образовавшаяся мРНК содержит информацию генов cl и гех (—-4% всего генома). Продукт гена гех препятствует размножению фага,
-61 три гснобаний-61 три гснобанийПолимеразыПолимеразыРепрессорcl I—Репрессорcl I—СильныйСильныйСлабыйСлабыйOriOriДНКДНКСтимулами» р™Маблекие ;^*"Pr РппСтимулами» р™Маблекие ;^*"Pr Рпп—| СП?—| СП?Маблсниер™ и р.Маблсниер™ и р.
-61 три гснобаний
-61 три гснобаний
Полимеразы
Полимеразы
Репрессорcl I—
Репрессорcl I—
Сильный
Сильный
Слабый
Слабый
Ori
Ori
ДНК
ДНК
Стимулами» р™
Маблекие ;^*"Pr Рпп
Стимулами» р™
Маблекие ;^*"Pr Рпп
—| СП?
—| СП?
Маблсниер™ и р.
Маблсниер™ и р.
ПолимеризиПолимеризиВторойрепрессор
Полимеризи
Полимеризи
Рис. 9.10. Реципрокная автономная регуляция в области иммунности бактериофа- ;а X. Подробности см. текст. sc — стартовая точка транскрипции, направленной влево (иммунитет); sR — стартовая точка транскрипции, направленной вправо; oR —правый оператор. Продукт гена с/ (Х-релрессор) связывается с ои<ом< <oR1. Связывание с оператором Or, способствует транскрипции, начинающейся от промотора р,т (стимуляция собственного синтеза), и одновременно подавляет направленную вправо транскрипцию. При больших концентрациях продукт гена с! преимущественно связывается с оператором ояз, что открывает возможность для образования продукта гена его. Последний также преимущественно связывается с от, подавляя таким образом транскрипцию, начинающуюся от р,т, и стимулируя (слабо) свой собственный синтез. (Szybalski, 1977.)
благодаря чему клетка-хозяин приобретает ограниченный иммунитет против фаговой инфекции. При повышенных концентрациях /.-репрессора (продукта гена с/) его синтез прекращается. Продукт гена его даже в малых концентрациях блокирует транскрипцию гена cl, связываясь с оператором оц3 (рис. 9.10). Некоторые особые мутанты фага X (AN-, Adv) могут размножаться в бактериальных клетках как плазмиды. Для поддержания такого состояния |ребуется продукт гена его (ген с/ не участвует в этом процессе).
A-Репрессор представляет собой олигомерный белок, который инактивируется под действием ультрафиолетового света, в резуль- <ате чего профаг переходит из лизогенного в литический цикл развития. Репрессия участков oRpn и OlPl прекращается, и образуется мРНК. Однако опять-таки все это происходит совсем не просто. Транскрипция, направленная влево, далеко не распространяется (считывается только 2% длины всего генома), так как терминатор препятствует удлинению образовавшейся мРНК.
Направленная вправо транскрипция встречает аналогичное пре-
пятствие, но здесь оно возникает уже на расстоянии 0,5% длины генома. Прекращение транскрипции осуществляется при участии бактериального фактора терминации р. Короткий продукт, образующийся в результате направленной влево транскрипции, содержит информацию гена N, а продукт этого гена (белок с мол. массой 13 500) представляет собой так называемый «антитерминатор». Он модифицирует ДНК-завнсимую РНК-полимеразу так, что она начинает узнавать определенную контролирующую область в ДНК (пи/) и как бы не замечает сигнала терминации или р-фак- тора. При направленной вправо транскрипции таким же образом считывается ген Q, продукт которого тоже способствует «перепрыгиванию» РНК-полимеразы через сигнал терминации. И только теперь гены, необходимые для образования зрелой фаговой частицы, могут экспрессироваться.
Геном аденовируса; сплайсинг генов
Транскрипция у аденовируса во многом напоминает транскрипцию у бактериофагов: здесь также существуют ранние и поздние гены, одни из которых транскрибируются более эффективно, чем другие. На разных участках считывается либо одна, либо другая цепь. Аденовирус по многим причинам является удобным объектом исследования. Он размножается в животных клетках, и поэтому его можно использовать в качестве модели для изучения экспрессии генома эукариот. Аденовирус (здесь мы рассматриваем только тип Ad2; см. также гл. 45 и 47) может размножаться путем продуктивной инфекции или, подобно фагу А, интегрировать с ге-
НоскиеПалипептибыРатинНоскиеПалипептибыРатин(1Уаг1Х)НК Ша(ШЛ)рУ1ЦрУП!) NOk(1Уаг1Х)НК Ша(ШЛ)рУ1ЦрУП!) NOkФункцииФункции92-Ш,!бк 72kНачало Белок. ассоцииро- Палый Боль- Белок.ассо- терми-банный с гаиадт* кор шей циирсбаниый нации кор с гексоном92-Ш,!бк 72kНачало Белок. ассоцииро- Палый Боль- Белок.ассо- терми-банный с гаиадт* кор шей циирсбаниый нации кор с гексономТрансформация Белок, Пентон Гексон Белок, облик- Нить яссо-ный с s-ДНКцииробанный с секанемТрансформация Белок, Пентон Гексон Белок, облик- Нить яссо-ный с s-ДНКцииробанный с секанемО 10 20309050 ОО 708090№।।।।1:1111О 10 20309050 ОО 708090№।।।।1:111115-5К (19k,11k) Несу- Начало адсол- терми- бенный нации15-5К (19k,11k) Несу- Начало адсол- терми- бенный нацииЫшадцыЫшадцы
Ноские
Палипептибы
Ратин
Ноские
Палипептибы
Ратин
(1Уаг1Х)НК Ша(ШЛ)рУ1ЦрУП!) NOk
(1Уаг1Х)НК Ша(ШЛ)рУ1ЦрУП!) NOk
Функции
Функции
92-Ш,!бк 72k
Начало Белок. ассоцииро- Палый Боль- Белок.ассо- терми-банный с гаиадт* кор шей циирсбаниый нации кор с гексоном
92-Ш,!бк 72k
Начало Белок. ассоцииро- Палый Боль- Белок.ассо- терми-банный с гаиадт* кор шей циирсбаниый нации кор с гексоном
Трансформация Белок, Пентон Гексон Белок, облик- Нить яссо-ный с s-ДНК
цииробанный с секанем
Трансформация Белок, Пентон Гексон Белок, облик- Нить яссо-ный с s-ДНК
цииробанный с секанем
О 10 20309050 ОО 708090№
।।।।1:1111
О 10 20309050 ОО 708090№
।।।।1:1111
15-5К (19k,11k) Несу- Начало адсол- терми- бенный нации
15-5К (19k,11k) Несу- Начало адсол- терми- бенный нации
Ышадцы
Ышадцы
Рис. 9.11. Топография генома аденовируса: расположение генов, транскрипция яее направление, длина молекул мРНК, интенсивность синтеза, функции синтези-рованных полипептидов (Flint, 1977); ss-ДНК — одноцепочечная ДНК.
Рис. 9.12. Доказательство существования сплайсинга генов у аденовируса (Ad2). ДНК расплавлена, и каждая из цепей рассматривается отдельно. На рисунке изображена цепь, транскрипция которой направлена вправо (см. рис. 9.11). В условиях, способствующих гибридизации, к ДНК добавляют мРНК. Частичные гетеродуплексы ДНК- РНК обнаруживаются в виде хорошо различимых двухцепочеч- иых участков. Стрелка (справа") указывает на шпилькообразную структуру, в которой оба конца молекулы ковалентно связаны друг с другом. Вторая стрелка (слева) указывает направление транскрипция. В нижней части рисунка показано, каким участкам генома соответствует РНК (черные прямоугольники). Белые прямоугольники обозначают неспаренные области. Образовавшаяся на этих участках РНК удаляется во время процессинга РНК благодаря сплайсингу. Следует учесть, что в экспериментах по гибридизации используют зрелую мРНК, а не первичный продукт транскрипции. Участки, примыкающие к 3'- и о'-коицам мРНК. не нахо- 1ят себе партнеров а ДНК и выявляются на фотографии в виде свободных концов.
(Фото Kitchingman et aL, 1977.)
номом клетки-хозяина и таким образом трансформировать клетку (см. гл. 47).
Здесь мы рассмотрим только первую возможность. Репликация и транскрипция вирусного генома происходят в клеточном ядре. На ранней стадии заражения количество вирус-специфической РНК составляет только 1 % от общего количества синтезируемой в ядре РНК. На более поздней стадии эта величина достигает *10%. Цикл размножения аденовируса длится около 20 ч. Образовавшаяся в ядре РНК значительно длиннее, чем мРНК, выделяемая из цитоплазмы. Первичный продукт транскрипции подвергается процессингу, в результате чего значительная часть молекулы утрачивается. Во время процессинга к З'-концу мРНК присоединяется около 200 остатков аденина (Philipson et al., 1971). Наличие такого З'-конца с последовательностью poly (А) является типичной приметой мРНК эукариот. Кроме того, к 5'-концу мРНК
присоединяется особая группировка m7G (5')m6AmpN (см. об этом гл. 10), что также характерно для мРНК эукариот.
Промоторы в ДНК аденовируса, безусловно, должны отличаться от промоторов прокариот, так как транскрипция этой ДНК катализируется полимеразами эукариотической клетки-хозяина (см. гл. 19). Схема транскрипции генома аденовируса представлена на рис. 9.11. Результаты получены методом гибридизации с использованием рестрикционных фрагментов. Гетеродуплексы РНК — ДН1\ точно локализуются и измеряются с помощью электронной микроскопии (Westphal et al., 1976).
Геном аденовируса устроен довольно сложно (Petterson et al., 1974; Petterson et al., 1976; Philipson, 1976, 1977; Flint, 1977).
На ранних стадиях транскрипции экспрессируются лишь немногие (ранние) гены и прежде всего те, продукты которых необходимы для специфической репликации и транскрипции вирусного
генома. Позднее активируются поздние гены, содержащие информацию о структурных компонентах вириона (см. рис. 45.6). При пом транскрипция ранних генов прекращается.
50% всех транскрибируемых на ранней стадии участков находится на одной цепи (легкой, или 1-цепи), а 70%—на другой (тяжелой, или h-цепи). Это означает, что на некоторых участках 1 ранскрибируются обе цепи (20%). Лишь небольшая часть этой РНК достигает цитоплазмы. Если выделить цитоплазматическую мРНК и охарактеризовать ее, определив, с какими участками ДНК она гибридизуется, то обнаружится, что в качестве матрицы функционирует 25% 1-цепи и 15% h-цепи. Транскрипция симметрична. Следовательно, генетическая информация обеих цепей используется в равной степени. На поздних стадиях транскрибируется 85% 1-цепи и 10—15% h-цепи, т. е. транскрипция ассимметрична. Свыше 60% продуктов транскрипции появляется в цитоплазме.
Рис. 9.14. Гетеродуплексная молекула ДНК. Молекула представляет собой гибрид, состоящий из цепи Adj-ДНК и комплементарной ей цепи ДНК мутантного вируса Ad2+ND4. Видно, что перед небольшим участком (справа на рисунке) все основания в двух цепях полностью спарены; денатурированная область выявляется благодаря двум одноцепочечным участкам. Кроме того, можно различить две так называемые R-петли, т. е. участки, в которых при добавлении мРНК в условиях, способствующих гибридизации, образуется гибрид РНК—ДНК. Цепь ДНК, не комплементарная мРНК, вытесняется; эта одиночная цепь ясно видна на рисунке. Комплементарная цепь ДНК образует с мРНК двухцепочечную гетеродуплексную молекулу (при определенных экспериментальных условиях гетеродуплексы РНК— ДНК стабильнее, чем ДНК—ДНК). Масштаб: 1 мкм. Внизу схематически изображено положение R-петель и песпаренной области. (Фото Westphal, Lai, 1977.)Рис. 9.14. Гетеродуплексная молекула ДНК. Молекула представляет собой гибрид, состоящий из цепи Adj-ДНК и комплементарной ей цепи ДНК мутантного вируса Ad2+ND4. Видно, что перед небольшим участком (справа на рисунке) все основания в двух цепях полностью спарены; денатурированная область выявляется благодаря двум одноцепочечным участкам. Кроме того, можно различить две так называемые R-петли, т. е. участки, в которых при добавлении мРНК в условиях, способствующих гибридизации, образуется гибрид РНК—ДНК. Цепь ДНК, не комплементарная мРНК, вытесняется; эта одиночная цепь ясно видна на рисунке. Комплементарная цепь ДНК образует с мРНК двухцепочечную гетеродуплексную молекулу (при определенных экспериментальных условиях гетеродуплексы РНК— ДНК стабильнее, чем ДНК—ДНК). Масштаб: 1 мкм. Внизу схематически изображено положение R-петель и песпаренной области. (Фото Westphal, Lai, 1977.)
Рис. 9.14. Гетеродуплексная молекула ДНК. Молекула представляет собой гибрид, состоящий из цепи Adj-ДНК и комплементарной ей цепи ДНК мутантного вируса Ad2+ND4. Видно, что перед небольшим участком (справа на рисунке) все основания в двух цепях полностью спарены; денатурированная область выявляется благодаря двум одноцепочечным участкам. Кроме того, можно различить две так называемые R-петли, т. е. участки, в которых при добавлении мРНК в условиях, способствующих гибридизации, образуется гибрид РНК—ДНК. Цепь ДНК, не комплементарная мРНК, вытесняется; эта одиночная цепь ясно видна на рисунке. Комплементарная цепь ДНК образует с мРНК двухцепочечную гетеродуплексную молекулу (при определенных экспериментальных условиях гетеродуплексы РНК— ДНК стабильнее, чем ДНК—ДНК). Масштаб: 1 мкм. Внизу схематически изображено положение R-петель и песпаренной области. (Фото Westphal, Lai, 1977.)
Рис. 9.14. Гетеродуплексная молекула ДНК. Молекула представляет собой гибрид, состоящий из цепи Adj-ДНК и комплементарной ей цепи ДНК мутантного вируса Ad2+ND4. Видно, что перед небольшим участком (справа на рисунке) все основания в двух цепях полностью спарены; денатурированная область выявляется благодаря двум одноцепочечным участкам. Кроме того, можно различить две так называемые R-петли, т. е. участки, в которых при добавлении мРНК в условиях, способствующих гибридизации, образуется гибрид РНК—ДНК. Цепь ДНК, не комплементарная мРНК, вытесняется; эта одиночная цепь ясно видна на рисунке. Комплементарная цепь ДНК образует с мРНК двухцепочечную гетеродуплексную молекулу (при определенных экспериментальных условиях гетеродуплексы РНК— ДНК стабильнее, чем ДНК—ДНК). Масштаб: 1 мкм. Внизу схематически изображено положение R-петель и песпаренной области. (Фото Westphal, Lai, 1977.)
«О ±120 к1500±200
755±1J77,8 ±1.0/83.3 ±1.0
793+09
Рис. 9.13. Сплайсинг генов в геноме аденовируса 2. Неспаренная ДНК образуетв гибриде мРНК петлю. Цифры вверху обозначают число пар оснований, а вни-зу— положения на генетической карте Ad2 (см. рис. 9.11). (Фото Westphal, Lai,1977.)
16,6 19.625.6
1
2
3
ПрсдшггпЛтиг мРНК
Обваробитк
„кмшма" и общги м**'
ПржоеЗи* «еже к .лиЗеру* pSMUWWI ywcmwf
мРНК ZmUpppEZZl
С'!
Z •о-
, , X Y 2
■тивр?
X Г
PPP DyO-
Рис. 9.15. Модель «исключенной петли» (loop-out). Модель описывает механизм ковалентного связывания различных частей молекулы РНК, кодируемых пространственно удаленными друг от друга участками ДНК. Участок XYZ объединяется и образует вместе лидерную последовательность, которая попеременно подключается к структурным генам Gl, G2 и т. д. (Kiessig, 1977.)
В 1977 г. была выделена относительно короткая мРНК, содержавшая информацию об участках ДНК, расположенных в геноме на большом расстоянии друг от друга (Sharp et al., 1977; Kiessig, 1977; Berk, Sharp, 1978).
С помощью электронной микроскопии было установлено, что эта мРНК гибридизуется с участками, разбросанными вдоль всей молекулы ДНК, тогда как расположенные между ними последовательности образуют петли (рис. 9.12—9.14).
Таким образом, было открыто совершенно новое явление. Для его объяснения можно выдвинуть по меньшей мере три альтернативных предположения:
При транскрипции некоторые участки цепи остаются «непрочитанными».
Вначале образуется длинная молекула РНК, которая затем подвергается процессингу; при этом часть ее расщепляется, а оставшиеся фрагменты объединяются в одну молекулу мРНК-
Все фрагменты синтезируются отдельно, а затем объединяются в один общий продукт.
Второе предположение наиболее вероятно (рие. 9.15).
Описанное явление получило название «сплайсинг». При процессинге РНК происходит вырезание фрагментов (интронов) из середины молекулы и их удаление. Спустя всего несколько месяцев
после открытия этого феномена выяснилось, что сплайсинг генов часто встречается и- при транскрипции генома эукариот. Он обнаружен не только в геноме опухолеродных вирусов (например, SV40), но и в гемоглобиновом, овальбуминовом и иммуноглобулиновых генах, в генах для тРНК и рРНК, а также в некоторых других.
ЛИТЕРАТУРА
Beckwith J., Zipser D. (eds.). 1970. The lactose operon, New York, Cold Spring Harbor Laboratory.
Bennett G. N„ Schweinegruber M. E., Brown K. D., Squires C., Yanofsky C. (1976). Nucleotide sequence of region preceding trp mRNA initiation site and its role in promotor and operator function, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 2351.
Berk A. J., Sharp P. A. (1978). Spliced early mRNAs of simian virus 40, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 1274.
Bertrand K., Korn L., Lee F„ Platt T., Squires C. L., Squires C., Yanofsky C. (1975). New features of the regulation of the tryptophan operon, Science, 189, 22.
Bremer H. (1967). Chain growth rate and length of enzymatically synthesized RNA molecules, Mol. Gen. Genet., 99, 362.
Chamberlin M. J. (1974). The selectivity of transcription, Annu. Rev. Biochem., 43. 721.
Chow L. T., Gelinas R. E„ Broker T. R., Roberts R. (1977). An amazing sequence arrangement at the 5' ends of adenovirus 2 messenger RNA, Cell, 12, 1.
Delius H., Westphal H., Axelrod N. (1973). Length measurements of RNA synthesized in vitro by Escherichia coll RNA polymerase, J. Mol. Biol., 74, 677.
Dickson R. C., Abelson L, Barnes W. M., Reznikoff W. S. (1975). Genetic regulation: The lac control region. Science, 187, 27.
Dickson R. C„ Abelson J., Johnson P. (1977). Nucleotide sequence changes produced by mutations in the lac promoter of Escherichia coli, J. Mol. Biol., 111, 65.
Farabaugh P. J. (1978). Sequence of the lad gene. Nature (London), 274, 765.
Flint J. (1977). The topography and transcription of the adenovirus genome, Cell, 10, 153.
Frederick R. J., Snyder L (1977). Regulation of anti-late RNA synthesis in bacteriophage T4: A delayed early control. J. Mol. Biol., 114, 461.
Gabain A. v„ Bujard H. (1977). Interaction of E. coll RNA polymerase with promoters of colinhage T5, Mol. Gen. Genet., 157, 301.
Gabain A. v.. Hayward G. S„ Bujard H. (1976). Physical mapping of the Hind III, EcoR I. Sal and Sma restriction endonuclease cleavage fragments from bacteriophage T5 DNA, Mol. Gen. Genet., 143, 279.
Ghosh P. K-, Reddy B., Swinscoe J., Choudary P. V., Lebowltz P., Weisman S. M. (1978). The 5'-terminal leader sequence of late 16S mRNA from cells infected with simian virus 40, J. Biol. Chern., 253, 3643.
Gilbert W. 1976. Starting and stopping sequences for RNA-polymerase. In: RNA polymerase, Losick R„ Chamberlin M. (eds.). New York, Cold Spring Harbor Laboratory.
Gilbert W., Malzets N.. Maxam A. (1974). Sequences of controlling regions of the lactose operon. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 38, 845.
Greenblatt J„ Schleif R. (1971). Arabinose C protein: regulation of the arabinose operon in vitro. Nature New Biol., 223, 166.
Hahn W. E., Pettljohn D. E., Ness J„ van. (1977). One strand equivalent of the Escherichia coli genome is transcribed: complexity and abundance classes of mRNA. Science, 197, 582.
Hayward S. D., Smith M. G. (1973). The chromosome of bacteriophage T5, J. MoL Biol, 80, 345.
10. ТРАНСКРИПЦИЯ ДНК ЭУКАРИОТ; гяРНК — мРНК
Транскрипция в ядрах эукариотических клеток протекает с чрезвычайно высокой скоростью, однако лишь небольшая доля образовавшейся РНК выходит из ядра, связывается в цитоплазме с рибосомами и используется в качестве матрицы. Остальная часть молекул с коротким временем жизни (ti/a = ~ 10—30 мин) разрушается в ядре. Все эти молекулы различаются по длине и часто содержат много тысяч нуклеотидов; константа седиментации таких молекул составляет 40—50S. Эта молекулярная фракция обозначается поэтому как гяРНК (гетерогенная ядерная РНК). Сразу же возникают следующие вопросы: каково происхождение мРНК? является ли мРНК продуктом распада гяРНК, или она образуется независимо от последней?
РНК эукариотических клеток представляет собой в большинстве случаев моноцистронную матрицу, т. е. она состоит из относительно коротких молекул, содержащих информацию для образования только одной полипептидной цепи. Полицистронная матрица, широко распространенная у прокариот и вирусов, у эукариот встречается редко. Одну из возможных причин этого следует искать в том, что рибосомы связываются исключительно с 5'-концом мРНК и именно здесь инициируется трансляция. Возможно, что в средней части молекул мРНК также существуют участки связывания для рибосом, но они не используются при трансляции, так как рибосомы не «узнают» их.
Транскрипция у эукариот регулируется иначе, чем у прокариот. Это вытекает уже из того факта, что у эукариот существует три класса ДНК-зависимых РНК-полимераз (см. гл. 19). Один из них транскрибирует только мРНК, другой—18S- и 28S-pPHK и третий — 5,8S-pPHK, а также тРНК-
Как уже подробно обсуждалось в гл. 6, ДНК эукариот содержит как повторяющиеся, так и уникальные последовательности. Первые в свою очередь подразделяются на многократно и умеренно повторяющиеся последовательности. Последние, называемые также промежуточными повторами, как правило, встраиваются между уникальными последовательностями: r-a-r-b-r-c и т. д. Ниже мы увидим, что именно эти последовательности часто примыкают к структурным генам и транскрибируются вместе с ними. Эти данные позволяют предположить, что они участвуют в регуляции транскрипции.
Для многоклеточных эукариот характерны детерминированная динамика развития и наличие специфических дифференцированных клеток. Например, в эритроцитах (или их предшественниках) не образуется почти никаких других белков, кроме гемоглобина. По-
этому в них содержится также большое количество соответствующей мРНК, отсутствующей в других типах клеток. Это свидетельствует о том, что мРНК образуется только тогда, когда в ней действительно возникает потребность. Но существуют и другие белки, такие, как гистоны или актин, которые необходимы клеткам на всех стадиях развития и независимо от степени дифференцировки. Значит, соответствующая мРНК должна присутствовать в клетках любого типа.
Как явствует из предыдущей главы, чем выше сложность генетической информации, тем сложнее контролирующие механизмы транскрипции. У эукариот они во много раз сложнее, чем у прокариот. Поэтому, естественно, возникает вопрос о том, каким образом эукариотическая клетка справляется с контролирующими механизмами транскрипции в ходе своего развития и дифференцировки. У морского ежа на стадии гаструлы в ядре транскрибируется 30% ДНК. но только 2,7% синтезированной РНК достигает цитоплазмы. Это означает, что кроме контролирующего механизма транскрипции существует и другой важный и эффективный механизм посттранскрипционного контроля. Мы уже познакомились с таким механизмом у некоторых вирусов, и в связи с этим следует еще раз упомянуть о явлении сплайсинга (см. гл. 9).
Какие участки ДНК транскрибируются, какова эффективность этого процесса и что собой представляют продукты транскрипции? Чтобы определить, содержит ли РНК (мРНК) уникальные или повторяющиеся последовательности, комплементарные определенным участкам ДНК, измеряют скорость образования гибрида ДНК/РНК в смеси, содержащей небольшое количество радиоактивно меченной РНК и избыток клеточной ДНК. После завершения реакции добавляют РНКазу, чтобы удалить непрореагировавшую РНК. Кроме того, в последние годы часто используют видоизмененный вариант этого метода: вначале на мРНК, как на матрице, синтезируют кДНК (см. гл. 19), а затем уже проводят гибридизацию между кДНК и избытком клеточной ДНК. Преимущество этого метода заключается в том, что в данном случае требуются меньшие количества материала.
Совершенно ясно, что мРНК, транскрибируемая с повторяющихся последовательностей ДНК, гибридизуется быстрее, чем мРНК, образовавшаяся на уникальных последовательностях. Относительное содержание гибридов ДНК/РНК должно увеличиваться с повышением сложности (разнообразия) последовательностей РНК. Если, например, принять, что в клетке существует 102—103 различных типов мРНК, то в эксперименте отношение ДНК/РНК должно быть равно минимум 10~2—10~3. Само собой разумеется, необходимо принимать во внимание и длину исследуемых молекул, исходя из того, что молекула мРНК в среднем содержит 2000 нуклеотидов.
Величину ДНК/РНК можно получить из следующего соотношения:
ДНК Размер генома
РНК Частота повторений ХС ложность
В L-клетках мыши 80% мРНК гибридизуется с уникальными последовательностями ДНК, а 20% — с умеренно повторяющимися последовательностями, чередующимися с уникальными (Greenberg, Perry, 1971). Если вместо мРНК проанализировать гяРНК, то окажется, что в ней доля повторов возрастает до 32%. Пока точно не известно, все ли организмы содержат мРНК, образующуюся на повторяющихся последовательностях ДНК. Было показано, (Goldberg et al., 1973), что мРНК из эмбрионов морского ежа едва ли содержит такие фракции. Согласно другим авторам (McColl, Aronson, 1974), у морских ежей есть небольшое количество мРНК, которая могла бы быть транскриптом повторяющихся последовательностей ДНК.
В клетках HeLa эта мРНК составляет 6% (Klein et al., 1974). Такие отчасти противоречивые данные указывают на то, что хотя повторяющиеся последовательности транскрибируются в относительно большом количестве, лишь незначительная доля транскрибированного продукта переходит в мРНК-
У гяРНК поли нуклеотидные цепи, вероятно, в 10—20 раз длиннее, чем у мРНК, так как молекулы именно такого размера обнаруживаются в клеточном ядре через несколько минут после введения в него радиоактивных предшественников; вскоре эти молекулы распадаются на более короткие фрагменты. Цитоплазматическая мРНК накапливается в клетке очень медленно. В эритробластах, предшественниках эритроцитов, в которых происходит чрезвычайно быстрый синтез гемоглобина, только 0,1% ядеркой РНК достигает цитоплазмы. Непонятно, какое значение имеют остальные 99,9%.
Чтобы показать, что гяРНК — это предшественник мРНК (пре- мРНК), выделяют, например, глобиновую мРНК из эритробластов, синтезируют на ней, как на матрице, кДНК, а затем проводят гибридизацию между этой кДНК и гяРНК из клеточного ядра.
Куртис и Вейсман (Curtis, Weissmann, 1976) поставили такой эксперимент и доказали, что высокомолекулярная гяРНК содержит последовательности, специфические для глобиновой мРНК. Вначале была обнаружена только одна фракция молекул, длина которых была вдвое больше, чем у глобиновой мРНК (15S), позднее Бастос и Эвис (Bastos, Avis, 1977) выделили фракцию молекул с константой седиментации 27S (5000 нуклеотидов), что соответствовало семикратной длине глобиновой матрицы.
Время полураспада этой молекулы составляет 5 мин. Она распадается на уже упоминавшуюся 155-гяРНК, из которой в результате дальнейшей деградации образуется глобиновая мРНК-
Предшественник мРНК с константой седиментации 27S не содержит последовательности poly (А). В следующем параграфе мы увидим, что на З'-конце мРНК эукариотических клеток, как правило, имеется такая последовательность. Она присоединяется к продукту транскрипции во время процессинга гяРНК в ядре и цитоплазме.
Каким образом выделяют мРНК? Принципиально существуют две возможности:
Сначала получают фракцию полисом, а затем выделяют из нее фракции, нс содержащие рРНК и тРНК.
Из цитоплазмы и (или) ядра выделяют РНК, содержащую последовательность poly (А). Таким образом получают большую часть всей мРНК, хотя некоторая се доля все-таки теряется, например гистоновая мРНК. При этом предполагается также, что в рРНК, тРНК и гяРНК последовательности ро!у(А) отсутствуют.
В последнее время для тех же целей применяют и аффинную хроматографию. Сначала из дифференцированных клеток выделяют специфическую мРНК и на ней, как па матрице, синтезируют кДНК. Эту ДНК связывают с каким-либо носителем, который затем используют в качестве адсорбента со специфическим сродством к определенным нуклеотидным последовательностям. Таким путем можно установить, в каких клетках, в какое время, в каком количестве и в какой фракции (ядро, цитоплазма, гяРНК) содержатся одинаковые последовательности РНК (Curtis, Weissmann, 1976; Wood, Lingrel, 1977).
мРНК всегда находится в комплексе с белками! Она образует рибонуклеопротеидный комплекс (РНП), который седиментирует в градиенте сахарозы приблизительно с той же скоростью, что и рибосомные субчастицы. Однако в остальном РНП-частицы мало похожи на рибосомы. Их плотность в градиенте плотности CsCl ниже, так как они содержат больше белка, чем рибосомы (Спирин, 1969). Частицы со сходными свойствами были выделены из цитоплазмы L-клеток и клеток HeLa (Perry, Kelley, 1968; Spohr et al., 1970). Такие частицы часто называют информосомами. Считают, что их функция скорее всего заключается в стабилизации вторичной структуры мРНК, хотя пока не ясно, соответствует ли это действительности.
Глобиновая мРНК связана с тремя белками, их мол. массы лежат в диапазоне 50 000—130 000. Они частично фосфорилированы и не отделяются от РНК даже при высоких концентрациях соли. В L-клетках содержатся другие белки с мол. массами 78 000 и 52 000; возможно, что их больше двух, но не более пяти. _
Множество фактов свидетельствует о том, что одни и те же белки образуют комплексы с различными типами мРНК. С мРНК из L-клеток, содержащей последовательность poly (А), связывается только белок с мол. массой 78 000.
Сложность мРНК; тканевая специфичность
и специфичность на разных стадиях развития организма
Количество и сложность мРНК могут служить мерой экспрессии генома.
На разных стадиях развития организма, а также в различных дифференцированных тканях клетки должны содержать разные типы мРНК. В связи с этим особый интерес вызывают следующие вопросы:
Сколько различных молекул мРНК имеется в клетке?
Сколько существует копий молекул каждого типа?
Насколько различаются молекулы мРНК в разных клетках? Ответы на эти вопросы могут дать исследования с применением метода гибридизации.
Было обнаружено (Bishop et al., 1974), что в цитоплазме клеток HeLa существует три класса мРНК, различающихся по сложности и числу копий. Интересно отметить, что в клетках HeLa экспрессируется всего 1% уникальных последовательностей ДНК, и этого достаточно для кодирования 35 000 различных белков.
20% мРНК приходится на продукты транскрипции лишь нескольких участков (17) ДНК. Во всех клетках содержится по 104 копий мРНК каждого типа. 50% мРНК транскрибируется с очень большого числа различных генов (~ 35000). В клетке обнаружено в среднем около десяти молекул мРНК каждого из этих типов. Остальные 30% молекул —это продукты транскрипции около 350 генов, причем в одной клетке на каждом гене образуется приблизительно 450 копий мРНК. Приведенные данные основаны на реакции гибридизации между кДНК и мРНК-матрицей. Реассоциация зависит от относительной концентрации и абсолютного числа различных молекул мРНК-
Если бы все типы мРНК были представлены в одинаковом количестве, то на кривой реассоциации была бы только одна точка перегиба (7т). Если бы одни типы РНК были представлены в большем числе, чем другие, то одна из фракций ренатурировалась бы быстрее, чем остальные, и на кинетических кривых обнаруживалось бы не менее двух перегибов. Экспериментально были получены трехступенчатые кривые, что указывает на существование в клетках HeLa трех классов популяций мРНК, различающихся по частоте встречаемости.
35 000 экспрессируемых генов — очень большая величина. В линиях клеток Drosophila экспрессируется максимум 4000 генов. 11е
Рис. 10.1. Кинетика реассоциации выделенной из ткани печени мРНК, содержащей poly(A), и кДНК, синтезированной на мРНК из ткани печени (О) и ткани головного мозга (•). Величина Rat обратно пропорциональна Cat. Rot показывает, сколько добавленной к пробе РНК ги бри ди зов а лось с ДНК за определенный период времени. (Bishop et al., 1975.)Рис. 10.1. Кинетика реассоциации выделенной из ткани печени мРНК, содержащей poly(A), и кДНК, синтезированной на мРНК из ткани печени (О) и ткани головного мозга (•). Величина Rat обратно пропорциональна Cat. Rot показывает, сколько добавленной к пробе РНК ги бри ди зов а лось с ДНК за определенный период времени. (Bishop et al., 1975.)
Рис. 10.1. Кинетика реассоциации выделенной из ткани печени мРНК, содержащей poly(A), и кДНК, синтезированной на мРНК из ткани печени (О) и ткани головного мозга (•). Величина Rat обратно пропорциональна Cat. Rot показывает, сколько добавленной к пробе РНК ги бри ди зов а лось с ДНК за определенный период времени. (Bishop et al., 1975.)
Рис. 10.1. Кинетика реассоциации выделенной из ткани печени мРНК, содержащей poly(A), и кДНК, синтезированной на мРНК из ткани печени (О) и ткани головного мозга (•). Величина Rat обратно пропорциональна Cat. Rot показывает, сколько добавленной к пробе РНК ги бри ди зов а лось с ДНК за определенный период времени. (Bishop et al., 1975.)
Не исключено, что клетки HeLa не являются типичными клетками. Вполне вероятно, что в них дерепрессировано большое число таких генов, которые репрессированы в «нормальных» дифференцированных клетках. Три указанных класса мРНК обнаружены также и в других клетках (рис. 10.1).
Частота встречаемости молекул мРНК варьирует от органа к органу. Для мышей были получены следующие величины:
Классы
Печень
Почки
Головной мозг
1
9
3
6
2
750
570
660
3
12 500
(11 000
11800
(Bishop et al., 1977; см. также рис. 10.1).
Было показано (Firtel et al., 1972), что у плесневого гриба Diciyostelium 20% генома постоянно находится в активном состоянии, а 37% — только на определенных стадиях развития.
Исследуя гаструлу морского ежа, Галау и др. (Galau et al..
19741 получили следующие данные:
Приблизительное количество связанной с полнсомами мРНК в эмбрионе морского ежа на стадии гаструлы (Galau et al„ 1974)
Общее количество мРНК:
Общее число нуклеотидов7-Ю10
Число молекул мРНК5,8-107
Сложность мРНК (число различных молекул мРНК)1,7-107
Число транслируемых генов1,4-10*
Классы сложности молекул мРНК
8% всей мРНК:
Число молекул мРНК4 10*
Число молекул белка, синтезирующихся за 1 ч6,6-10*
Число копий мРНК на 1 ген340
Число образующихся молекул белка на 1 ген4,7-10*
92% всей мРНК
Число молекул мРНК5,3-107
Число молекул белка, синтезирующихся за 1 ч7,6-10®
Из обсуждения описанного здесь метода ясно, какие аспекты развития и дифференцировки можно исследовать с его помощью. Таким образом, найден экспериментальный подход к определению числа активных генов в организмах, и, естественно, теперь нам хотелось бы знать, во-первых, коррелирует ли это число со степенью продвинутости организма в эволюционном отношении и, во-вторых, какова доля генома, необходимая для реализации генетической программы. Однако для решения этих вопросов нам пока еще не хватает нужных сведений.
Какое значение имеют умеренно повторяющиеся последовательности (промежуточные повторы) в ДНК? Известно, что промежуточные повторы образуют в ДНК целый ряд различных семейств. Возникает вопрос, сохраняется ли в гяРНК такое же распределение этих последовательностей, или в ней имеют место иные соотношения. Справедливо второе предположение. Это значит, что в данный момент времени транскрибируются преимущественно лишь такие участки ДНК, которые содержат определенные семейства повторяющихся последовательностей, а в какой-то другой момент или в каких-то других тканях предпочтение оказывается другим семействам. Члены одного семейства распределены вдоль всего генома. Поскольку структурные гены примыкают непосредственно к повторяющимся участкам, в данный момент времени будут транскрибироваться главным образом те из них, которые следуют за однородными повторяющимися последовательностями. Из этого вытекает, что экспрессия генов находится под контролем повторяющихся участков и они, таким образом, являются своего рода адресами, по которым направляются соответствующие регуляторные молекулы.
Можно предположить, что эти молекулы, как и в случае прокариот (см. гл. 9), представляют собой белки, но не исключено также, что это — РНК, т. е. первичный продукт транскрипции, ко-
торый затем образует гибридную молекулу ДНК—РНК. До сих пор не ясно, какое из двух предположений правильно. Представленная здесь модель (Davidson et al., 1977) рассматривает гяРНК как продукт согласованно регулируемой транскрипции: все примыкающие к какому-либо повтору уникальные последовательности считываются все вместе и находятся под единым контролем. Образуется очень длинная молекула, которая затем последовательно расщепляется. Таким образом, модель объясняет уже обсуждавшиеся данные о том, что основная часть гяРНК состоит из уникальных, а не из повторяющихся последовательностей.
Ро1у(А) и S'-концевой «колпачок»
В клетках эукариот мРНК содержит на З'-конце последовательность poly(A) длиной около 200 нуклеотидов (Hadjivassiliou, Brawerman, 1966; Darnell et al., 1971). Эта последовательность образуется, как правило, не в процессе транскрипции, а в результате последующей ферментативной полимеризации, происходящей на З'-конце первичного продукта транскрипции (исключение составляет полиовирусная РНК, см. гл. 46). Реакция протекает в клеточном ядре и цитоплазме.
В 1977 г. было обнаружено (Sawicki et al., 1977), что последовательность poIy(A) претерпевает некоторые превращения. Адениловые остатки, присоединившиеся к РНК в ядре, в цитоплазме отщепляются и заменяются новыми. По мере «старения» мРНК эта последовательность постепенно сокращается, пока наконец не достигнет длины около 100 нуклеотидов.
Какова роль последовательности ро!у(А)? На этот вопрос пока еще нет удовлетворительного ответа, так как известно, что в эукариотических клетках существуют многочисленные виды мРНК, не содержащие poly (А). К ним относятся, например, гистоновая мРНК, небольшая часть мРНК из клеток HeLa и неоплодотворен- ных яиц морского ежа, а также РНК ВТМ в зараженных клетках растений (см. гл. 46).
Тем не менее молекулярные биологи очень ценят последовательность poly (А), так как она дает им возможность отделять мРНК от рРНК и тРНК. Для этого poIy(U) или poly(T) присоединяют к какому-либо носителю, в результате чего он приобретает способность избирательно связывать РНК, несущую poly (А).
Сиппел и др. (Sippel et al., 1974) осуществили связывание ро1у(А)-мРНК с poly (U)-носителем и обработали образовавшийся комплекс РНКазой Н — ферментом, который расщепляет только двухцепочечную РНК. Благодаря такому приему им удалось получить свободную от poly (А) мРНК и определить ее активность в системе синтеза белка in vitro. Оказалось, что отщепление poly (А) не влияет ни на активность, ни на время жизни молекулы.
Остается заключить, что если poly (А) существует, то, следовательно, она должна выполнять какие-то функции; вопрос только в том, какие именно.
«Колпачки»; проблема б'-конца. мРНК эукариотических клеток на 5'-конце содержит, как правило, олигонуклеотид типа m7G(5')pppmNpN или m7G (5') pppmNpmNp“N, где m означает метилированный остаток. На 5'-конце всегда находится 7-метилгуано- зин, за ним следует либо один из №-метилированных аденозинов (2'-О-диметиладенозин, или 2'-О-метиладенозин), либо 2'-О-метил- гуанозин. В третьем положении обнаружены
2'-О-метилуридин,
2'-О-.метилцитозин или
2' -О-метил аденозин.
Концевой гуанозиновый остаток связан с остатком молекулы мРНК с помощью трифосфатного мостика. Эта группа метилированных оснований, которую называют «колпачком», защищает РНК от 5'-экзонуклеаз. Однако известны многочисленные случаи, когда такой «колпачок» отсутствует, и пока нет отчетливых данных, что при этом мРНК транслируется менее эффективно или имеет более короткое время жизни.
ЛИТЕРАТУРА
Bishop J. О., Morton J. G., Rosbash М., Richardson М. (1974). Three abundance classes in HeLa cell messenger RNA, Nature (London), 250, 199.
Bishop J. O„ Beckmann I. S., Campo M. S., Hastie N. D„ Izquierdo M., Perlman S.
(1975). DNA—RNA hybridization, Philos. Trans. R. Soc. Lond. В 272, 147. Brawerman G. (1974). Eukaryotic messenger RNA, Annu. Rev. Biochem., 43, 621. Britten R. J., Davidson E. H. (1969). Gene regulation for higher cells: a theory, Scien
ce, 165, 349.
Brown D. D., David 1. B. (1968). Specific gene amplification in oocytes, Science, 160, 272.
Campo M. S„ Bishop J. 0. (1974). Two classes of messenger RNA in cultured rat cells: repetitive sequence transcripts and unique sequence transcripts, J. Mol. Bio!., 90, 649.
Davidson E. H., Klein W. H„ Britten R. J. (1977). Sequence organization in animal DNA and a speculation on hnRNA as a coordinate regulatory transcript, Dev. Biol., 55, 69.
Derrnan E„ Goldberg S., Darnell J. E. (1976). hnRNA in HeLa cells: Distribution of transcript sizes estimated from nascent molecule profile. Cell, fl, 465.
Galau G. A., Britten R. 1., Davidson E. H. (1974). A measurement of the sequence complexity of polysomal messenger RNA in sea urchin embryos. Cell, 2, 9.
Galau G. A., Klein W. H., Britten R. I., Davidson E. H. (1977). Significance of rare mRNA sequences in liver. Arch. Biochem. Biophys., 179, 584.
Hunter T.> Garrets 1.1. (1977). Characterization of the mRNAs for a-, B- and y-Actin, Cell, 12. 767.
Klein W. H„ Murphy W„ Attardl G„ Britten R. J., Davidson E. H. (1974). Distribution of repetitive and nonrepetitive sequence transcripts in HeLa mRNA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 1785.
11. ПЛАЗМИДЫ; КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ (ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ)
ПЛАЗМИДЫ: ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ВНЕХРОМОСОМНЫЕ МОЛЕКУЛЫ ДНК В БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКЕ
Плазмиды — это кольцевые, внехромосомные, автономно реплицирующиеся молекулы ДНК (генетические элементы), которые могут существовать в бактериальной клетке наряду с бактериальной хромосомой. Название «плазмида» ввел в 1952 г. Ледерберг. Известен целый ряд самых разнообразных плазмид. Они различаются размерами и, следовательно, содержанием генетической информации, регуляцией их репликации и отчасти ферментативной системой аппарата репликации. Их число в бактериальной клетке изменяется в зависимости от типа плазмиды. Молекулярные массы плазмид колеблются от 1,0-10® до 150-10®—170-10®. Верхняя граница установлена менее точно. Мелкие плазмиды содержат генетическую информацию в среднем для двух больших белков, тогда как крупные могут кодировать 200 и более подобных белков.
В одной бактериальной клетке часто встречается только одна какая-нибудь плазмида, представленная более чем одной копией, но могут существовать и плазмиды разных типов.
В клетке, как правило, присутствует не менее десяти копий мелких плазмид (со средней мол. массой 5-10®), что составляет около 1—10% общего количества ДНК в клетке (в случае Escherichia coli, у которой «бактериальная хромосома» имеет мол. массу 2-10®, это количество равно 10-(5-10®) =5-Ю7=2%). Крупные плазмиды чаще всего представлены одной или двумя копиями на клетку. Обнаруженные различия в числе копий плазмид указывают на существование различных механизмов, контролирующих про. цесс репликации.
Плазмиды имеют ряд общих черт с умеренными фагами (см. гл. 13). Одно из основных различий между ними состоит в отсутствии у плазмид белковой оболочки, которой, как правило, покрыта вирусная ДНК. Фаги и плазмиды, возможно, представляют собой разные формы существования одной и той же молекулы ДНК. Фаг X, например, обычно встраивает свою ДНК в геном клетки- хозяина, но он может также размножаться в бактериальной клетке автономно, как плазмида (XdV и XN~) (Hayes, Szybalski, 1973; Berg, 1974).
В последние годы плазмиды упоминались прежде всего в связи с проблемой «резистентности» и вопросами, касающимися генетической инженерии. При этом не следует забывать, что речь идет о генетических элементах, весьма распространенных в естественных популяциях бактерий; вследствие наличия у них широкого спектра функций они влияют на выживаемость бактерий в природной среде. Существуют общие функции, обнаруженные у всех типов плазмид:
репликация (rep);
функция несовместимости (tnc);
функция переноса (tra), а также специальные функции, благодаря которым отдельные типы плазмид отличаются друг от друга.
Общие функции плазмид
Репликация. Согласно полученным данным, у крупных плазмид реплицируется только ограниченный участок ДНК с мол. массой ЫОМ-Ю9 (примерно 2000—8000 пар оснований). В этом участке локализованы как стартовая точка (начало) репликации, так и, возможно, гены, необходимые для репликации плазмиды. Пока остается еще много неясного относительно совместного действия продуктов этих генов при инициации репликации.
Важным исключением из общего правила является фактор устойчивости к антибиотикам RP4, у которого функции, связанные с репликацией, занимают значительную часть генома и распределены по всей кольцевой молекуле плазмидной ДНК. Лучше всего изучена репликация мелкой плазмиды ColEl. Для ее автономной репликации необходимо присутствие ряда генных продуктов, детерминированных бактериальной хромосомой (см. гл. 8), которые прежде всего влияют на элонгацию (продукты генов dnaB, G, Е и F), но отчасти также и на инициацию (как, например, продукт гена dnaCY Из этого следует, что начало репликации плазмидной ДНК —это единственная функция, детерминируемая самой плазмидой, остальные же функции, связанные с ее репликацией, осуществляются аппаратом репликации бактериальном хромосомы. Еще одна особенность плазмиды ColEl, отличающая ее от хромосомы Е. coll, состоит в том, что для ее репликации требуется как ДНК-полимераза III, так и ДНК-полимераза I, которая в случае Е. coll служит только в качестве репарационного фермента. „
Маловероятно, что в процессе инициации синтеза ДНК С01Ы принимают участие также и плазмидоспецифические генные продукты (белки), так как ее репликация не прекращается в присутствии ингибитора белкового синтеза — хлорамфеникола. По-види- мому, более правильно предположение о том, что последовательность плазмидной ДНК длиной около 500 пар оснований используется как стартовый участок, причем репликация осуществляется либо только в одном направлении от этого участка, либо в обоих. По крайней мере в одном случае было показано, что в плазмиде ColElсуществует несколько стартовых точек.
Несовместимость. Несовместимостью называют явление, заключающееся в том, что две сходные плазмиды не могут стабильно существовать в одной и той же клетке. Это явление, молекулярный механизм которого еще не выяснен, можно объяснить либо отри*
Рис. 11.1. Упрощенная генетическая карта фактора F. Изображены не все необходимые для переноса гены (tray Подробности см. в тексте. (Sherratt, 1974.)
дательным контролем репликации, либо способом распределения плазмид между дочерними клетками. Мы рассмотрим здесь две различные модели. Старая модель репликации Жакоба, Бреннера и Кузина исходит из того, что на бактериальной мембране имеется ограниченное число мест прикрепления молекул ДНК. Это существенно для инициации репликации. Если данные точки заняты плазмидами одного типа, то к ним уже не могут прикрепиться другие плазмиды, сходные с первыми.
Согласно модели Причарда, Барта и Коллинза, несовместимость связана с отрицательным контролем репликации этой плазмиды. Присущая данной клетке плазмида вырабатывает какой-то элемент контроля (репрессор), который оказывает отрицательное воздействие на внедрившуюся сходную плазмиду, так как занимает точку инициации и препятствует репликации внедрившейся плазмиды.
Функции переноса. В то время как функции репликации и несовместимости (гер и inc1) существуют у всех плазмид, функция переноса (/га) свойственна только большим плазмидам. К числу наиболее хорошо изученных факторов переноса принадлежит фактор F Е. coli, содержащий около 20 000—24 000 пар оснований. К настоящему моменту в этом «опероне переноса» локализован 21 цистрон (рис. 11.1). Перенос плазмиды, имеющей соответствующий участок, начинается в определенной точке плазмиды, так называемой стартовой точке переноса (опТ). В процессе переноса одна из двух цепей молекулы ДНК разрывается в этой точке и переносится в клетку-акцептор, где на ней реплицируется комплементарная цепь ДНК. То же самое происходит с одноцепочечной молекулой ДНК, оставшейся в донорной клетке. <
Репликацию, имеющую место при переносе плазмид, не следует путать с репликацией, начинающейся в стартовой точке репликации и ответственной за вегетативное размножение плазмид во время клеточного деления. Фактор F имеет мол. массу 65 млн. Как и многие другие плазмиды, он может интегрировать с бактериальной хромосомой, в результате чего в клетке-хозяине возникает так называемое состояние Hfr (от англ, high frequency ot recombination). При таком состоянии фактор F с высокой частотой
1721. Нуклеиновые кислоты
осуществляет перенос всей хромосомы клетки £. coll в подходя* щий реципиентный штамм. Согласно последним данным, рекомбинация между фактором F и хромосомой клетки Е. coll происходит по типу незаконной рекомбинации, при которой в обоих геномах участвуют элементы 1S2 (см. гл. 13).
Специальные функции
Помимо названных общих функций, свойственных очень многим плазмидам, существует множество специальных функций, детерминируемых каждой данной плазмидой. Известные на сегодняшний день сведения о кодируемых плазмидами функциях представлены в табл. 11.1. Некоторые из них мы подробно рассмотрим в этом разделе.
Устойчивость к антибиотикам; факторы R, плазмиды R. Плазмиды R (от англ, resistance) имеют относительно широкое распространение. Они были обнаружены в 1959 г. в Японии. После интенсивной химиотерапии против Shigella (возбудитель дизентерии) были обнаружены штаммы, оказавшиеся одинаково устойчивыми ко всем четырем использованным лекарственным препаратам (сульфамиду, стрептомицину, хлорамфениколу и тетрациклину). Однако этим дело не ограничилось. Подобная устойчивость была вскоре выявлена и у других патогенных и непатогенных бактерий, например у Е. coll и Salmonella. Были получены данные о том, что 65% штаммов Shigella и 50% всех остальных энтеробактерий, выделенных от больных, оказались устойчивыми к перечисленным лекарственным препаратам (Watanabe, Mitsuhashi,
Таблица 11.1
Специальные функции, кодируемые плазмидами (Goebel, личное сообщение, 1978)
Плодовитость (способность переносить генетический материал путем конъюгации)
Устойчивость к антибиотикам (устойчивость к одному или нескольким антибиотикам; плазмиды R известны у более чем 50 бактериальных видов)
Устойчивость к тяжелым металлам (Cd2+, Hg2+)
Устойчивость к ультрафиолетовому излучению
Образование бактериоцинов (веществ, действующих на клетки данного вида и убивающих их)
Образование антибиотиков (метиленомицина, актинородина, хлорамфеникола и др.)
Использование необычных источников углерода (разрушение камфары, октана, октанола у Pseudomonas и пр.)
Образование токсинов и поверхностных антигенов (энтеротоксине», гемолизина, антигена К88 и др.)
Индукция опухолей (у растений образование галлов при посредстве плазмиды
• Ti из Agrobacterium, см. гл. 48)
Участие в споруляции у стрептомицетов
11, Плазмиды; клонирование генов (генетическая инженерия) 173
1965). Быстрое распространение устойчивости обусловлено в основном способностью бактерий к конъюгации; у стафилококков главным способом ее передачи является трансдукция. Плазмиды R состоят из двух функциональных частей:
фактора переноса (RTF), во многом сходного с общим фактором переноса, таким, как фактор F Е. colt, и 2) детерминанта (или детерминантов) устойчивости к антибиотикам (детерминанты R; рис. 11.2).
Обычно обе функциональные части объединены в одной молекуле, но у некоторых бактерий, таких, как Salmonella и Proteus, они находятся в разных молекулах. Однако детерминанты R могут переноситься только после того, как соединятся с RTF. В природных бактериальных популяциях штаммы, несущие RTF и R в разных плазмидах, изолированы от штаммов, содержащих оба компонента в одной плазмиде. Как только возникает подходящая комбинация RTF —R, она быстро распространяется в популяции бактерий. Однако в большинстве случаев перенос факторов устойчивости к антибиотикам репрессирован. Поэтому вскоре после включения соответствующих механизмов контроля распространен
Рис. 11.2. Предполагаемый механизм обратимой диссоциации я ассоциации плазмид R под действием элементов IS1 (см. гл. 13). Модель объясняет раздельное ж совместное существование детерминантов R и RTF, а также образование плазмид с множественными детерминантами. (Cohen, Kopecko, 1976.)
ние этих факторов замедляется. Вместе с тем существуют мутанты, у которых отсутствует подобный контроль, вследствие чего у таких мутантов частота переноса факторов R не снижается.
Устойчивость бактерий к антибиотикам обусловлена синтезом специфических ферментов, которые либо расщепляют антибиотики, либо модифицируют их (путем ацетилирования, аденилирования или фосфорилирования) таким образом, что они утрачивают свою активность. Устойчивость к тетрациклину и сульфамидным препаратам основана на изменении бактериальной мембраны.
Хотя данные, полученные японскими исследователями в конце 50-х и начале 60-х гг., привели к сокращению злоупотреблений антибиотиками, их применение еще долго не прекращалось. В последнее время (1975—1976 гг.) появилась новая пенициллиноустойчивая форма гонореи (возбудитель Neisseria gonorrhoeae), которая медленно, но неуклонно распространяется по всему миру. Устойчивый штамм (или штаммы) имеет фермент пенициллиназу, расщепляющую и таким образом инактивирующую пенициллин. По данным Визнера, до 10 февраля 1976 г. в Атланте (США) не было случаев заболевания гонореей, устойчивой к пенициллину, но с этого времени до декабря 1976 г. здесь был зарегистрирован 41 случай заболевания такой формой. Особых трудностей при этом не возникло, так как гонорея излечивалась пенициллином, правда, его дозу пришлось увеличить с 200 000 единиц до 4,8 млн. единиц. Тем временем устойчивые формы гонореи появились в Гонконге, Корее, Японии, Сингапуре, на Филиппинах, в Новой Зеландии, Австралии, Англии (?), Норвегии и Канаде. Первоначальный источник эпидемии установить не удалось, но, судя по многочисленным данным, он находился где-то в Юго-Восточной Азии. На Филиппинах у 20—40% проституток была диагностирована устойчивая форма.
Фальков (Вашингтонский университет) предсказал появление в 1975 г. новой формы гонореи, однако он не мог предположить, что она получит столь быстрое распространение. Этот тип устойчивости к пенициллину известен уже с 1974 г. и впервые был установлен у Haemophilus influenzae, вызывающего менингит. Ежегодно в США регистрируется 40 000 случаев такого менингита. В качестве «спасительного средства» используют хлорамфеникол, несмотря на возможное побочное действие — повреждение костного мозга. В настоящее время при пенициллиноустойчивой гонорее с успехом применяют спектиномицин, однако нет сомнения в том, что через некоторое время и к этому антибиотику возникнет устойчивость. Приведенные примеры касаются болезней, эпидемиологические последствия которых пока до конца не осознаны; они показывают, что до сих пор существует угроза со стороны тех инфекционных заболеваний, которые, по мнению многих медиков, являются побежденными.
Бактериоцины. Бактериоцнногенные факторы встречаются у многих видов бактерий. Основные генные продукты, вырабатываемые этими факторами, представляют собой бактериоцины — белки, обладающие антибиотическими свойствами. Они выделяются бактериями, несущими плазмиды, и действуют на других представителей того же или близкого вида, не содержащих плазмид. Спектр действия бактериоцинов, как правило, очень узок. К наиболее хорошо изученным бактериоцинам относятся колицины, продуцируемые клетками Е. coll. Они действуют также и на близкородственные виды энтеробактерий, например на Proteus и Shigella. Самыми известными являются колицины Eb Е2, Е3, D и К. Они имеют мол. массы порядка 40 000—100 000. Е| — это основный белок, ингибирующий окислительное фосфорилирование и тем самым блокирующий передачу энергии. Е2 и Е3 сходны между собой по молекулярным свойствам, но не по функциям. В то время как Е2 способствует распаду ДНК, Е3 инактивирует бактериальные рибосомы путем отщепления З'-конца 16S-pPHK. Из-за потери З'-кон- цевого фрагмента рРНК утрачивает способность узнавать мРНК (см. гл. 38). Колицин К нарушает функции мембран бактериальной клетки. Колицин-кодирующие плазмиды обозначаются как ColEl, Со1Е2 и т. д. ColEl играет важную роль в генетической инженерии, так как его используют в качестве вектора (см. ниже).
Образование антибиотиков. Основные продуценты антибиотиков— это стрептомицеты. Новые исследования показали, что у многих продуцентов антибиотиков существуют плазмиды, прямо или косвенно участвующие либо в самом процессе образования антибиотика, либо в регуляции его образования. Так, Хопвуд недавно обнаружил, что у Streptomyces coelicolor выработка антибиотика метиленомицина детерминируется плазмидой (фактором переноса). Было также показано, что и синтез антибиотиков хлорамфеникола, тетрациклина и макролита контролируется или частично детерминируется плазмидами. Прямые доказательства существования плазмид в таких сложных микроорганизмах удалось получить лишь в нескольких случаях. Часто об их присутствии свидетельствуют лишь косвенные данные, например нарушение функций под действием определенных веществ, таких, как бромистый этидий, акридин оранжевый и другие. Известно, что эти вещества вызывают удаление плазмид из клеток Е. coli и других энтеробактерий. Механизм такой реакции элиминирования до конца не выяснен.
Использование необычных источников углерода. Многие псевдомонады обладают способностью расщеплять необычные источники углерода, такие, как алифатические и ароматические углеводороды, или такие соединения, как камфора и салициловая кислота. Показано, что это их свойство также детерминируется способными к переносу плазмидами. За последнее время многие
подобные плазмиды были выделены и охарактеризованы на молекулярном уровне. Установлено, что большинство очень крупных, способных к переносу элементов наряду с реакциями разрушения выполняют какие-то важные генетические функции.
Образование токсинов. Существуют плазмиды, которые кодируют функции, влияющие на патогенность бактерий. К этой группе принадлежат плазмиды, кодирующие энтеротоксины, антигены, расположенные на поверхности клеток (К88, К99) и гемолизины. Во всех случаях обнаружено, что одних плазмид, несущих подобные функции, недостаточно, чтобы превратить непатогенные бактериальные штаммы в патогенные. Это означает, что необходимо наличие каких-то дополнительных функций, которые могут зависеть либо от плазмид, либо от хромосом. Энтеротоксиновые плазмиды Е. coli— это факторы переноса, несущие генетическую информацию для двух различных белков (так называемые термоустойчивый (ST), термолабильный (LT) энтеротоксины). В то время как термостабильный энтеротоксин вызывает только кратковременное расстройство желудка, термолабильный энтеротоксин обычно служит причиной тяжело протекающих воспалительных инфекций. Методами генетической инженерии, которые будут обсуждаться ниже, оба энтеротоксина из Е. coli были блокированы, причем было показано, что они кодируются различными генами. В клетках Е. coli вырабатывается по крайней мере три типа гемолизинов (а, р и у), гены которых также локализованы в способных к переносу плазмидах. Большинство гемолитических диких штаммов содержит до трех плазмид с различными молекулярными массами. Гемолизиновый детерминант всегда находится только на одной из этих плазмид, но она одна не может индуцировать патогенные свойства. Индукция осуществляется только в комбинации с двумя остальными плазмидами.
Гемолизиновый детерминант в отличие от энтеротоксина содержит не менее трех цисгронов, два из которых необходимы для синтеза активного гемолизина. По крайней мере один цистрон контролирует транспорт активного гемолизина во внешнюю среду через клеточную мембрану. Поверхностные антигены, например антиген К 88, участвует в патогенезе Е. coli. В то время как плазмиды уже частично охарактеризованы, о молекулярных свойствах и функциях антигенов по существу ничего не известно.
Плазмиды в качестве векторов (переносчиков)
Векторы — это специфические в отношении клетки-хозяина и способные к репликации структуры, которые могут присоединять к себе те или иные гены и переносить их в другие клетки. Мы еще вернемся к этому вопросу и рассмотрим его более подробно при обсуждении вирусов и генетической инженерии. Мы расскажем
Рецилиекп|Рецилиекп|У реизиУ реизиCyHupumpedyHiiiauiCyHupumpedyHiiiauiБелли нигутикобБелли нигутикобEschcrldiiu coltEschcrldiiu coltФерменты, «оЬидимые для исимьябиних малотипиФерменты, «оЬидимые для исимьябиних малотипиФерменты, нсо6г.а1и«бя для испалеяданих адинитиФерменты, нсо6г.а1и«бя для испалеяданих адинитиГидролиза, paauaiMwinia желатинФерменты, необходимые to иа«»ю6и«й инозитаФерменты. ныБыЛсюее дм еГраядания ицепюти и д.д-Ьуттди миФерменты, нсибгсдимыс для исполембиния идтритаБитндаярбоксилизиГидролиза, paauaiMwinia желатинФерменты, необходимые to иа«»ю6и«й инозитаФерменты. ныБыЛсюее дм еГраядания ицепюти и д.д-Ьуттди миФерменты, нсибгсдимыс для исполембиния идтритаБитндаярбоксилизиДотрДотрCdrvbecterCdrvbecterEatercbuctrrEatercbuctrrXicteuttoXicteuttoPwidaxluPwidaxluPivlcvsPivlcvsSaUnonctleSaUnonctle| . Биохимических фуккидя Фснилиланиндаиминизи| . Биохимических фуккидя Фснилиланиндаиминизи= EdwurdileUa= EdwurdileUa“tfe = Stnutia“tfe = Stnutia
Рецилиекп|
Рецилиекп|
У реизи
У реизи
CyHupumpedyHiiiaui
CyHupumpedyHiiiaui
Белли нигутикоб
Белли нигутикоб
Eschcrldiiu colt
Eschcrldiiu colt
Ферменты, «оЬидимые для исимьябиних малотипи
Ферменты, «оЬидимые для исимьябиних малотипи
Ферменты, нсо6г.а1и«бя для испалеяданих адинити
Ферменты, нсо6г.а1и«бя для испалеяданих адинити
Гидролиза, paauaiMwinia желатин
Ферменты, необходимые to иа«»ю6и«й инозита
Ферменты. ныБыЛсюее дм еГраядания ицепюти и д.д-Ьуттди ми
Ферменты, нсибгсдимыс для исполембиния идтрита
Битндаярбоксилизи
Гидролиза, paauaiMwinia желатин
Ферменты, необходимые to иа«»ю6и«й инозита
Ферменты. ныБыЛсюее дм еГраядания ицепюти и д.д-Ьуттди ми
Ферменты, нсибгсдимыс для исполембиния идтрита
Битндаярбоксилизи
Дотр
Дотр
Cdrvbecter
Cdrvbecter
Eatercbuctrr
Eatercbuctrr
Xicteutto
Xicteutto
Pwidaxlu
Pwidaxlu
Pivlcvs
Pivlcvs
SaUnonctle
SaUnonctle
| . Биохимических фуккидя Фснилиланиндаиминизи
| . Биохимических фуккидя Фснилиланиндаиминизи
= EdwurdileUa
= EdwurdileUa
“tfe = Stnutia
“tfe = Stnutia
Рис. 11.3. Гены, кодирующие ряд белков, не содержащихся в большинстве штаммов Е. coll, можно перенести в клетки Е. coll нз других видов бактерий путем трансформации (с помощью плазмид или вирусов). (Reanney, 1976.)
также и о плазмидах, играющих роль таких переносчиков. При рассмотрении факторов R мы уже познакомились с их значением и опасностью. Однако подобным образом переносятся не только факторы устойчивости. Имеется ряд признаков, которые таким же способом передаются от одной клетки к другой. На рис. 11.3 наглядно показано, как в результате переноса увеличивается геном Е. colt, что может повысить ее шансы на выживание. Отсюда следует, что подобная горизонтальная передача генов играет заметную роль в эволюции прокариот. Условия окружающей среды определяют, выгодно ли (для прокариот, занимающих соответствующее жизненное пространство) обладание теми или иными генами или нет. То, что при этом все-таки сохраняются границы видов и обмен генами не выходит за определенные рамки, обусловлено существованием специфических нуклеаз рестрикции (см. гл. 20), которые узнают чужеродную ДНК и при известных обстоятельствах ее разрушают.
Встречаются ли кяазмиды в клетках эукариот?
Вопрос о том, существуют ли плазмиды в эукариотических клетках, по-прежнему остается открытым, однако в цитоплазме клевок дрожи»*! обнаружены кодьцевые молекулы ДНК со сред-
ним диаметром 2 мкм. В клетках Drosophila присутствуют еще более мелкие кольца с диаметром 1,1 мкм. Такие молекулы широко распространены. Они встречаются у Neurospora, Eugtena, в клетках трипаносом, табака, шпорцевой лягушки, а также в культурах клеток обезьян, мышей и человека. Их происхождение не связано с митохондриями. Они охарактеризованы в физико-химическом отношении, но их биологическое значение и происхождение остается неясным.
«ЛОКИРОВАНИЕ ГЕНОВ; ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
Клонирование генов проводят с целью получения того или иного фрагмента ДНК в количестве, достаточном для его исследования. Этот фрагмент встраивают в плазмиду или умеренный фаг, которые используются в качестве средств переноса (векторов) для введения данного фрагмента в какую-нибудь бактериальную клетку (например, Е. coli), где он и размножается (клонируется). На рис. 11.4 представлена схема этого метода в том виде, в каком юн применяется в настоящее время. Очень важно, что клонируемую ДНК и плазмиду переводят в линейную форму, расщепляя их какой-либо рестриктазой, в результате чего возникает молекула определенной длины со свободными, часто одноцепочечными концами. Эти концы, как правило, удлиняют с помощью концевой трансферазы, присоединяя к ним либо А, либо Т, что дает возможность получить желаемую комбинацию обеих гетерологичных молекул. При этом оказалось, что любой фрагмент ДНК из прокариот или эукариот может быть размножен в клетках Е. coli. В качестве векторов часто используют производные плазмиды ■ColEl, так как репликон ColEl может реплицироваться в присутствии хлорамфеникола. Благодаря этому число копий плазмид на клетку достигает 1000—3000 и, следовательно, значительно увеличивается количество клонируемой ДНК. Сейчас работают с векторами, существенно отличающимися от тех, с которыми работали еще 2—3 года назад. Почти все они сконструированы in vitro из фрагментов плазмид различного происхождения. В зависимости от задач и целей экспериментов используют разные плазмиды. Существуют плазмиды с широким кругом хозяев, способные размножаться во многих бактериальных клетках, но есть и такие, которые размножаются в клетках двух или даже только одного вида. Дальнейшие исследования плазмид направлены на то, чтобы создать мелкие, быстро размножающиеся плазмиды, каждая из которых содержала бы один участок расщепления для какой-либо определенной рестриктазы (Bolivar et al., 1977; Chang, Cohen, 1978).
При получении необходимой для клонирования ДНК часто ио .пользуют РНК (в основном мРНК) того или иного происхожде-
Плазмиды; клонирование генов (генетическая инженерия) 179 ния; на ней с помощью обратной транскриптазы синтезируют in vitro комплементарную цепь ДНК (кДНК), которую соединяют с плазмидой. Обратную транскриптазу (см. гл. 19) в основном выделяют из вируса птичьего миелобластоза. Ее особенность заключается в том, что она не только синтезирует на мРНК, как на матрице, комплементарную цепь ДНК, но и образует в ней шпилькообразную структуру (см. рис. 8.4), которую ДНК-полимераза использует как затравку для синтеза второй цепи ДНК. Наконец участок, связывающий обе цепи, удаляют с помощью нуклеазы S1—фермента, выделенного из Aspergillus oryzae, способного расщеплять только одноцепочечную ДНК. Кроме того, для клонирования используют рестрикционные фрагменты (см. гл. 20) вирусного или бактериального происхождения, ДНК, фрагментированную другими способами, а также химически синтезированную ДНК. В гл. 3 были описаны применяющиеся при клонировании ДНК методы разделения и обогащения фракций.
Одно из самых важных преимуществ клонирования ДНК состоит в том, что с его помощью можно получать специфические фрагменты ДНК в больших (миллиграммовых) количествах и высокой чистоты. Эти фрагменты можно использовать, во-первых, для определения в них нуклеотидной последовательности (см. гл. 4
Рис. 11.4. Метод получения рекомбинантных молекул ДНК.
и 7) и, во-вторых, в качестве зондов для локализации комплементарных цепей (например, в хромосомах одинаковых или разных видов). При использовании фрагментов ДНК прокариотического происхождения уже давно было показано, что клонируемая ДНК не только транскрибируется, но и транслируется. Например, был сконструирован гибрид из фага Л и гена Е. coll для ДНК-лигазы. После внедрения гибридной молекулы в бактериальную клетку выход лигазы повысился в 500 раз.
Трудности возникают в первую очередь при экспрессии клонируемой ДНК эукариот в Е. coll. Причина этого кроется в том, что у про- и эукариот сигналы для транскрипции и трансляции различаются. Чтобы выйти из этого затруднения, эукариотическую ДНК встраивают в структурный ген какого-нибудь прокариота, и, таким образом, эукариотический ген получает возможность использовать прокариотический сигнал для транскрипции.
В гл. 7 мы уже познакомились с некоторыми результатами, полученными этим новым, но уже широко применяемым методом. Первые успехи были достигнуты в 1977 г., когда удалось клонировать «соматостатиновый ген» (соматостатин — пептидный гормон, см. рис. 56.10), и в 1978 г. при проведении опытов с инсулиновым геном и геном для гормона роста. Инсулиновый ген был введен в расположенный в плазмиде (R) ген, кодирующий пенициллиназу. Вместе с пенициллиназой из бактериальной клетки выделялся и комплекс пенициллиназа — инсулин. Так как инсулин извлекали непосредственно из культуральной жидкости, отпадала необходимость в трудоемкой очистке этого продукта.
Принятие мер предосторожности; перспективы
Во всех экспериментах по клонированию ДНК необходимо принимать определенные меры предосторожности. Лаборатории, в которых разрешены такие эксперименты, должны удовлетворять известным стандартам. Все меры, направленные на обеспечение безопасности работ в области генетической инженерии, разделены на четыре категории по степени их надежности. Исследователи стараются использовать и создавать только такие клетки-хозяева, которые не способны выживать за пределами лаборатории (вероятность их выживания составляет 10-8).
Проводятся работы по созданию модифицированных векторов, например таких, у которых репликация была бы чувствительной к температуре. Нс менее ценны были бы векторы, обладающие системой рестрикции — модификации, причем система модификации, представленная метилазой, была бы чувствительной к температуре, а рестриктаза, наоборот, температуроустойчивой. Такой вектор, оказавшись в клетке теплокровного организма, сам собою разрушился бы.
В молекулярной биологии методы генетической инженерии становятся обычными методами исследования. Причем речь здесь идет вовсе не о тех столь впечатляющих результатах, о которых мы уже упоминали. В конце 1978 и начале 1979 г. стало ясно, что в клетках Е. coll можно осуществить экспрессию любого эукариотического гена. Основная трудность теперь заключается главным образом в том, чтобы иметь в своем распоряжении любой желаемый ген. При использовании мРНК в качестве матрицы для синтеза кДНК следует отдавать себе отчет в том, что при этом мы получаем в сущности не сам геи, а структуру ДНК, которая может быть реализована в генный продукт. Например, в 1977—1978 гг. стало известно, что собственно ген овальбумина (яичного альбумина) состоит из восьми отдельных участков, расположенных в разных местах генома (см. гл. 7). Однако в клетке образуется «•диная, целая структура, содержащая всю информацию об овальбумине (мРНК). В результате экспрессии кДНК, полученной пу- 1см обратной транскрипции и клонированной в клетках Е. coll, •бразуется овальбумин, составляющий 1,5% всего клеточного белка. При этом значительная его часть выделяется из клетки.
Наконец, следует отметить, что без использования генетической инженерии уже нельзя думать об исследовании процессов развития и дифференцировки клеток про- и эукариот.
ЛИТЕРАТУРА
Bet tach М., Hershfield V., Chow L„ Brown W„ Goodman H. M., Boyer H. W. (1976). A restriction endonuclease analysis of the bacterial plasmid controlling the EcoR I restriction and modification of DNA, Fed. Proc., 35, 2037.
Bolivar F., Rodriguez R. L, Greene P. J., Betlach M. C., Heyneker H. L, Boyer H. W„ Crosa L H„ Falkow S. (1977). Construction and characterization of new cloning vehicles: a multipurpose cloning system, Gene, 2, 95.
Chang А. С. У., Cohen S. N. (1974). Genome construction between bacterial species in vitro: replication and expression of Staphylococcus plasmid genes in Escherichia coli, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 1030.
Chang А. С. У., Cohen S. N. (1978). Construction and characterization of amplifiab- le multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic plasmid, J. Bacterio!., 134, 1141.
Cohen S. N. (1977). Recombinant DNA: facts and fiction, Science, 195, 654.
Cohen S. N„ Chang A. C. Y„ Boyer H. IF., Helling R. B. (1973). Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70, 3240.
Cohen S. N., Chang А. С. У. (1974). A method for selective cloning of eukaryotic DNA fragments in Escherichia coll by repeated transformation, Mol. Gen. Genet., 134. 133.
Cohen S. N., Kopecko D. I. (1976). Structural evolution of bacterial plasmids: Role of translocating genetic elements and DNA sequence insertions, Fed. Proc., 35, 2031.
Collins J., Williams P., Helinski D. R. (1975). Plasmid ColE 1 DNA replication in Escherichia coli strains temperatur-sensitive for DNA replication. Mol. Gen. Genet, 136, 273.
Falkow W. 1975. Infectious multiple drug resistance, London, Pion Limited. Helinski D. R. (1976). Plasmids, Fed. Proc., 35, 2024.
ОБМЕН ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИЕЙ; РЕКОМБИНАЦИЯ
Рекомбинация — это такое явление, когда гены одной группы сцепления образуют новые комбинации с генами гомологичных групп сцепления. В 1903 г. Бовери (Вюрцбургский университет) писал: «Тот факт, что два признака в следующем поколении появляются вместе или вместе исчезают, позволяет с большой вероятностью считать, что задатки этих признаков находятся в одной хромосоме. Если скрещивание затрагивает несколько признаков, го число комбинаций отдельных признаков в следующем поколении оказывается больше, чем число возможных комбинаций имеющихся хромосом. Из этого следует, что признаки, локализованные в одной хромосоме, при редукционном делении расходятся по дочерним клеткам независимо друг от друга, что указывает на существование обмена участками между гомологичными хромосомами».
Морган и его сотрудники доказали, что такой обмен генами наблюдается у Drosophila. В нем участвуют гены (маркеры), сцепленные с полом, т. е. гены, локализованные в Х-хромосоме. Пример: серовато-коричневые длиннокрылые? Xчерные с рудиментарными крыльями (d). В Fi все особи серовато-коричневые и длиннокрылые. В Р2 наряду с первоначальными с определенной частотой встречаются также и новые комбинации (типы обменов) (табл. 12.1).
Таблица 12.1
Обмен факторами путем кроссинговера (Morgan, 1919)
Типы обмена
Частота
Без обмена
серовато-коричневые, длиннокрылые черные, с рудиментарными крыльями
41,5%
41,5%
83%
С обменом
черные, длиннокрылые
серовато-коричневые, с рудиментарными крыльями
8.5%
8,5%
17%
Из таблицы видно, что в данном случае между частотами обменов устанавливаются реципрокные отношения. Если принимается во внимание более чем две пары признаков, то получают другие результаты. Так, если самок с белыми глазами, миниатюрными крыльями и раздвоенной щетинкой скрещивают с самцами дикого типа (красные глаза, длинные крылья, простая щетинка),
то в Fi все особи имеют фенотип дикого типа. При возвратном скрещивании 9 с d (белоглазый, миниатюрные крылья, раздвоенная щетинка) получают следующие результаты (табл. 12.2):
Таблица 12.2
Простой и двойной кроссинговер (Morgan, 1919)
Типы обмена
Частоте
Без обмена
белоглазые, с миниатюрными крыльями и раздвоен-
26,8%
ными щетинками
красноглазые, длиннокрылые, с простыми щетинками
26,8%
Простой обмен
белоглазые, длиннокрылые, с простыми щетинками
53,6%
13.2%
красноглазые, с миниатюрными крыльями и раздвоен-
13,2%
ными щетинками
белоглазые, с миниатюрными крыльями и простыми
6,7%
щетинками
красноглазые, с длинными крыльями и раздвоенными
6.7%
щетинками
Двойной обмен
белоглазые, с длинными крыльями и раздвоенными
39,8%
3.3%
щетинками
красноглазые, с миниатюрными крыльями и простыми
3.3%
щетинками
6.6%
В обоих последних случаях, очевидно, имел место обмен между первыми и вторыми, а также между вторыми и третьими парами генов. Эти результаты позволяют сделать вывод о том, что в хромосоме гены расположены в линейном порядке и что при спаривании хромосом во время мейоза между ними происходит обмен участками. Связь между факторами Л и В нарушается только в том случае, если они расположены в различных участках хромосомы н место разрыва находится между ними. Чем дальше удалены друг от друга факторы в хромосоме, тем больше вероятность того, что при разрыве они разойдутся. Поэтому частота обмена может служить мерой расстояния между генами (Sturtevant).
Косвенные данные о линейном расположении генов, полученные впервые Морганом, Стёртевантом и Мюллером, в тридцатых годах были подтверждены Штерном с помощью цитологических исследований. Штерн показал, что хромосомы действительно раз-
Рис. 12.1. Схема эксперимента, доказывающего идентичность обмена факторами и обмена хромосомными участками у Drosophila melanogaster. Обозначения генов (аллелей): сг — яркокрасный цвет, +” — красный цвет. В - полосковидные глаза, +я — неполосковидные глаза (нормальные). (Stern, 1931.)
рываются и их фрагменты переносятся в гетерологичные хромосомы (транслокация). В своих экспериментах он использовал такие особи, у которых обе гомологичные Х-хромосомы различались по двум признакам. Одна из Х-хромосом несла на своем длинном плече Y-хромосому, тогда как другая была разорвана и один из фрагментов был соединен с хромосомой IV.
Выбирали таких самок, которые во фрагментированной Х-хро- мосоме содержали факторы bar (нолосковидные глаза) и сг (яркокрасный цвет), а в гомологичной Х-хромосоме (с добавкой У-хромосомы) — соответствующие аллели дикого типа (+fl, +")• Такие самки были скрещены с самцами дикого типа, у которых Х-хромосома несла аллели сг и + ®.
Если гипотеза обмена генами верна, то ожидаемые в F2 обмены должны проявляться не только в фенотипических признаках, но и в новых хромосомных комбинациях. На рис. 12.1 представлена схема, на которой слева показаны две комбинации родительских хромосом без обменов, а справа — хромосомы с обменами двух типов. Многочисленные опыты, проведенные на Drosophila, полностью подтвердили эти результаты и показали, что в основе факторного обмена действительно лежит обмен участками хромосом.
Хиазмы. Уже Морган привлек гипотезу Янссена об образовании хиазм для объяснения обмена генами. Из всех стадий мейоза для нас представляют интерес прежде всего пахинема и диплоне- ма, так как именно в это время образуются состоящие из четырех частей эквиваленты хромосом (тетрады). Четыре хроматиды каждой тетрады расходятся в четыре гаплоидные клетки в результате двух быстро следующих одно за другим делений созревания.
Тетрады чаще всего имеют особую форму — крестообразную или кольцевую (в виде одного или нескольких колец). К началу диплотенной стадии завершается как продольное разделение гомологичных хромосом, так и их продольное спаривание. При этом иногда не происходит полного их разделения, так как гомологичные хроматиды перекрещиваются и образуют хиазму. Число и положение хиазм определяют форму тетрад. На то, что такие «двойные хромосомы» (в тетрадах) возникают в результате тесного сближения гомологичных хромосом, указывают прежде всего данные о мейозе тех форм, в которых содержатся два набора хромосом разной длины. Такие формы были выявлены у Drosophila и кукурузы.
У кукурузы известный случай возникновения двойной гетеро- морфности связан со следующими структурными особенностями хромосом:
Девятая хромосома одной из рас кукурузы содержит на конце гетерохроматиновое утолщение.
Концевые участки хромосом 8 и 9 способны обмениваться (McClintock, 1930).
Если такую расу скрестить с нормальной расой, лишенной концевого утолщения, то образуются гибриды, содержащие пару рекомбинантных хромосом 8/9 и 9' с двойной гетероморфностью. В пахинеме появляются крестообразные структуры. При отсутствии обмена (рис. 12.2) во время редукционного деления опять образуются хромосомы родительского типа (5, В). Если же обмен произошел, то появляются новые хромосомы (Д), а именно одна длинная без утолщения (9//8) и одна короткая с утолщением (9).
Рекомбинация наблюдается не только у эукариотических организмов. Она обнаружена также у прокариот и вирусов, у которых отсутствует мейоз, а геном представлен только одной молекулой
Рис. 12.2. Схематическое изображение мейотических обменов у кукурузы. Объяснение см. в тексте. (McClintock, 1930.)
Рис. 12.3. Генетическая карта области гИ бактериофага Т4. Каждая независимо возникающая точковая мутация обозначена квадратом. Мутации генов, локализованных на концах карты, дают около 6% рекомбинантов, а мутации соседствующих с ними генов —0,01—0,02% (Benzer, 1961). В отдельных участках ДНК частота мутационных событий различна. Выявлены два участка, в которых мутации происходят особенно часто, и еще ряд участков, мутирующих несколько реже. Они называются «горячими точками». Чем это обусловлено? При исследовании аналогичного эффекта на гене Lac-I Е. coll было обнаружено (Coulondre et al., 1978), что мутации возникают преимущественно там, где стоит 5'-метилцитозино- вый остаток. После его удаления ни в одном участке ДНК не наблюдается какого- либо предпочтительного мутирования.
Таким образом, гомологичные цепи ДНК, очевидно, способны разделяться, разрываться и заново перегруппировываться. Описанные в гл. 5 генетические карты Е. coll и некоторых фагов построены в значительной мере на основе данных, полученных в многочисленных исследованиях по рекомбинации.
Классический пример таких исследований представляет анализ тонкой структуры области rll бактериофага Т4 (Benzer, 1961; рис. 12.3). Область rll состоит из двух цистронов, кодирующих два полипептида, от наличия которых зависит размер бляшек бактериальных штаммов. Этот вывод основан на данных по рекомбинации, полученных в работах Бензера. Однако для нас интересны два других наблюдения:
Рекомбинация может происходить в принципе между любыми, но гомологичными друг другу нуклеотидными последовательностями.
В определенных местах генома наблюдается повышенная скорость рекомбинации («горячие точки»).
Генетики использовали данные по рекомбинации преимущественно как средство для достижения определенной цели. Такой целью было (и остается и по сей день) построение генетических карт. Вначале никто не интересовался молекулярными механизмами рекомбинации. Между тем, как мы сейчас увидим, здесь тоже существует ряд проблем, из которых мы назовем лишь несколько:\ i
Как происходит узнавание и связывание гомологичных участ- «!
ков в различных молекулах ДНК?
Как образуются «горячие точки»?
Во время мейоза гомологичные хромосомы (хроматиды) спариваются своими гомологичными участками. Как осуществляется такое быстрое узнавание?
Рекомбинация (кроссинговер)—относительно частое явление у эукариот. Почему при этом практически не возникает ошибок? Кроссинговер (рекомбинация) происходит, как правило, во время мейоза и только очень редко во время митоза (митотический кроссинговер). Фенотипически митотический кроссинговер в соматических клетках обнаруживается благодаря появлению отграниченных участков в соответствующих тканях (см. рис. 63.4).
До сих пор мы исходили из того, что рекомбинация имеет место i только между гомологичными участками ДНК. Между тем существует множество примеров обмена гетерологичными участками, лежащего в основе транслокаций, делеций, вставок, дупликаций и т. д. Так как вначале причина возникновения всех этих явлений была неизвестна, они были объединены под общим названием «незаконная» (неправильная) рекомбинация (см. гл. 13).
Молекулярные механизмы «законной» рекомбинации
Как и все молекулярные механизмы, рекомбинация является сложным процессом, состоящим из нескольких этапов. К ним относятся:
Узнавание гомологичных участков.
Разрыв и реципрокное воссоединение молекул: замена одних цепей гомологичными.
Устранение ошибок, возникших в результате неправильного спаривания участков.
Так как рекомбинация — это высокоспецифический процесс, в ней должны принимать участие белки, а значит, должны существовать мутанты, дефектные в отношении рекомбинации. У Е. colt имеется по крайней мере четыре локуса, генные продукты которых принимают участие в рекомбинации: гесА, recB, recC, lex. Продукт гена гесА играет чрезвычайно важную роль. Мутации в этом локусе понижают частоту рекомбинации на пять порядков и вызывают тяжелые физиологические повреждения, при этом повышается чувствительность к ультрафиолетовому и рентгеновскому излучениям, а также к воздействию алкилирующих агентов. Мутации в гене гесА препятствуют индукции профага и снижают скорость мутаций, индуцируемых УФ-светом. Продукт гена гесА представляет собой белок с мол. массой 43 000 (McEntee et al., 1976). Он был выделен из клеток, трансформированных фагом X, в которых фаг несет ген, проявляющийся в УФ-облученных клетках-хозяевах. Это свидетельствует о том, что белок гесА влияет на репарацию ДНК и регуляцию синтеза.
Продукты генов recB, гесС и lex — это субъединицы экзо- и эндонуклеаз, которые тоже принимают участие в механизме репарации ДНК. Уже эти данные указывают на то, что рекомбинация и репарация имеют много общего и, вероятно, представляют собой две стороны одного и того же явления.
В гл. 8 мы познакомились с «белком гена 32» бактериофага Т4, который был выделен из клеток Е. coll, инфицированных фагом Т4 (Huberman et al., 1971); по своим свойствам он напоминает расплетающий белок. После добавления такого белка к раствору ДНК ее температура плавления понижается примерно на 20°C. Белок стабилизирует денатурированную ДНК, что способствует не только репликации, но и рекомбинации. За последнее время во множестве других организмов были обнаружены белки, оказывающие такое же или аналогичное действие на ДНК.
В 1964 г. Холлидей предложил модель рекомбинации, которая не утратила своего значения и сегодня (рис. 12.4 и 12.5). Согласно этой модели, рекомбинация начинается с разрыва одной из цепей ДНК. Образовавшиеся свободные концы отделяются и вытесняют гомологичную цепь в соседней двухцепочечной молекуле. В качест-
Рис. 12.4. Рекомбинация линейных молекул ДНК (Holliday, 1964; воспроизводится из работы Potter, Dressier, 1976).
Рис. 12.5. Рекомбинация кольцевых молекул ДНК по модели Холлидея. Возникающая в результате рекомбинации симметричная структура открывает возможность для двух альтернативных путей дальнейшего развития реакции. Один путь приводит к образованию двух колец, в которых гены, локализованные вне области кроссияговера, сохраняют свое первоначальное положение, а второй —к образованию кольцевых димеров. (Potter, Dressier, 1977)
ве важного промежуточного продукта возникает гетеродуплекс (гибридная молекула ДНК). В конце концов одиночные гомологичные цепи обмениваются реципрокно (крест-накрест). Существует несколько вариантов модели Холлидея, отражающих, вероятно, фактическое положение вещей. Они отличаются друг от друга прежде всего местом второго разрыва и временем встречи отрезков. Следует, однако, отметить, что во всех моделях предусмотрено действие репарационных механизмов (удаление или включение одного или нескольких оснований).
Хотя все модели можно прекрасно изобразить на бумаге, она имеют смысл только тогда, когда описываемые ими процессы могут быть реализованы действительно существующей структурой. Сигал и Албертс в 1972 г. предложили объемную модель рекомбинации ДНК с точным соблюдением всех масштабов и продемонстрировали на ней, что со стороны структуры нет каких-либо препятствий. Точка, в которой две цепи перекрещиваются между собой, не является статической структурой. Она может перемещаться вдоль всей молекулы ДНК, действуя как застежка <мол- ния».
Электронно-микроскопические исследования позволили наконец получить визуальное доказательство существования промежуточных продуктов, образующихся в процессе рекомбинации. Поттер и Дреслер (Potter, Dressier, 1976) изучили рекомбинационные свойства плазмиды ColEI и подтвердили модель Холлидея. В штаммах гесА- средн 8000 молекул не было выявлено ни одной рекомбинантной. Чтобы облегчить визуализацию промежуточных продуктов при исследовании штаммов гесА*, к препаратам добавляли
Рис. 12.6. Электронная микрофотография промежуточного продукта рекомбинации. Крестообразная структура («х-форма>) двух рекомбинантных молекул ДНК возникает в присутствии высокой концентрации формамида. При этих условиях АТ-богатые участки остаются одноцепочечными. Такая специфическая денатурация в отношении АТ-последовательностей позволяет идентифицировать в молекуле гомологичные ветви и прослеживать ковалентное связывание цепей в области синапса. В этом, так же как и в 80 других известных случаях, гомологичные ветви находятся в гранс-конФормации, что и следует ожидать, исходя из представленной на рис. 12.4 модели (стадия К). (Фото Potter и Dressier, Harvard University, 1976.)
Рис. 12.7. Схематическая диаграмма, объясняющая образование синаптической структуры, вытекающей из модели Холлидея. Она должна иметь возможность без затруднений перемещаться вдоль генома. Стрелки слева показывают направление такого перемещения. На концах молекул указано направление их вращения. Длинные стрелки в середине структуры изображают ось симметрии. (Sobell, 1973.)
формамид. АТ-богатые участки при этом расплавлялись и приобретали форму пузырей (рис. 12.6). Такие участки представляют собой идеальные маркеры для идентификации обеих гомологичных цепей. На тех же электронных микрофотографиях видно также, что во время репликации молекулы ДНК имеют одинаковую полярность.
На некоторые вопросы, касающиеся рекомбинации ДНК, уже получены ответы, однако многое по-прежнему остается неясным. Не выяснено, например, как узнают друг друга гомологичные области или как возникают «горячие точки». Конечно, можно выдвигать различные гипотезы: не исключено, что это АТ-богатые области, которые легко плавятся под действием расплетающего белка и на которых рекомбинация осуществляется более эффективно, чем на GC-богатых.
Собелл (Sobell, 1973) предложил ряд формальных молекуляр-
со ; т ° » о e ^ O« ()UO1- <U I'*<r <K-kOO *- ■< >J <^< 4 -" *-0< NOH 4001-0 <<b-e •• rn V. J 4 u^c<u<kp ,1НиЬ«ОО<ЬОЮЮ<<1>-ьи4Ьии<О1-Ь4|е»1П
.< ! LL ° С1» • < 0Н>-<0<1-00 •- о ь < < о о « >. О - О • О « « V- -и'«^Uoio *--«••• *■ 1Пе • • 0<0>-0>-<00'<0<Н,-ООКО<0<0>-1-0<<0 - «оо-о « < - ооо h
Рис. 12.8. Схема, показывающая, что при рекомбинации по модели Холлидея возможно образование двух различных про дуктов рекомбинации в зависимости от того, обмениваются ли при этом обе или только одна цепь (Sobell, 1973).
Рис. 12.9. Одновременное возникновение двух форм глобина в результате негомологичного спаривания оснований и неравного кроссипговера между соседними генами для 6- и р-глобинов (незаконная рекомбинация) (McKusick, Ruddle, 1977).
ных моделей для наглядного пояснения некоторых деталей рекомбинации. На рис. 12.7 и 12.8 представлены наиболее существенные моменты этих моделей. Все они исходят из того, что ферменты, необходимые для рекомбинации, узнают симметричные структуры, возникающие в результате специфической укладки полинуклеотид- ных цепей (например, палиндромы или «клеверный лист»). Понятно, что такие структуры не могут образовываться в любом месте цепи, и это позволяет объяснить то, что рекомбинация происходит в одних местах чаще, чем в других.
Пока еще не ясно, как узнают друг друга гомологичные участки гомологичных хромосом. Под электронным микроскопом в точке соприкосновения хромосом видно образование с регулярной структурой, обозначаемое как синаптонемальный комплекс. Отсюда следует, что если в процессе рекомбинации принимают участие белки, то это ни в коей мере нс упрощает проблему, так как мы не знаем, на чем основаны их специфичность и комплсментарность.
В геноме эукариот уникальные последовательности чередуются с повторяющимися (см. гл. 6). Повторы, как правило, не несут никакой генетической информации, и есть веские основания для предположения о том, что рекомбинация происходит преимущественно в этих участках. В пользу этого говорят следующие соображения: во-первых, именно в таких участках увеличивается вероятность того, что одна гомологичная последовательность найдет другую, и, во-вторых, здесь вполне допустимы ошибки. Однако существуют данные, свидетельствующие о том, что повторяющиеся последовательности —это не единственное место, где происходит рекомбинация. Известен по крайней мере один случай внутрицист- рониой рекомбинации. Речь идет об аномальном гемоглобине человека «Lepore» (рис. 12.9). Этот дефект связан с внутрпцистрон- ной рекомбинацией 0- и 6-глобинов. Вообще говоря, здесь происходит не только законная, но и незаконная рекомбинация, поскольку рекомбинируют как гомологичные, так и гетерологичные участки (различные гены). Однако они настолько сходны между собой, что их можно назвать «квазигомологичными» участками. Мы знаем, что оба гена имеют одинаковое происхождение и возникли в
Обмен генетической информацией; рекомбинация 195 результате дупликации одного и того же предкового гена. Поэтому чисто формально и в этом случае можно говорить о повторяющихся последовательностях.
Слишком большое содержание ДНК в геноме тоже препятствует эффективной рекомбинации. Частота рекомбинации в геномах млекопитающих несколько выше, чем в геномах бесхвостых амфибий (например, у лягушки). Последние содержат вдвое больше ДНК на гаплоидный набор хромосом, чем млекопитающие.
При сравнении частот рекомбинации у трех разных видов саранчи было показано (Miklos, Nankivell, 1976), что повторяющаяся ДНК (сателлитная ДНК; гетерохроматин), локализованная в теломере (концевой участок хромосомы), характеризовалась более низкой частотой рекомбинации, чем остальная ДНК. Три исследованных вида содержали одинаковое количество эухроматина, но разные количества суммарной ДНК (в соотношении 1,00: 1,10: 1,41).
При торможении рекомбинации наблюдается полярный эффект. Это означает, что участки хромосом, удаленные от гетерохроматина, рекомбинируют чаще, чем участки, расположенные поблизости от него (см. гл. 41).
Еще в 1932 г. аналогичное явление наблюдал Бидл на Х-хро- мосомс Drosophila melanogaster. Он обнаружил, что участки, лежащие вблизи центромеры, обмениваются реже, чем удаленные от нее. Обнаруженный нм эффект вошел в литературу под названием «эффект центромеры». В богатой гетерохроматином хромосоме IV практически не происходит кроссииговсра, и поэтому мы так мало знаем о положении локусов в этой хромосоме.
ЛИТЕРАТУРА
Coulondre С., Miller I. Н., Farabaugh Р. J., Gilbert IF. (1978). Molecular basis of base substitution hotspots in Escherichia coll, Nature (London), 274, 775.
Gudas L. J.. Mount D. IF. (1977). Identification of the recA (tif) gene product of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5280.
McEntee K., Hesse J. E., Epstein IF. (1976). Identification and radiochemical purfi- cation of the recA protein of Escherichia coli К 12. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 3979.
McKusick V. A., Ruddle F. H. (1977). The status of the gene map of the human chromosomes, Science, 196, 390.
Miklos G. L, Nankivell R. N. (1976). Telemeric satellite DNA functions in regulating recombination. Chromosoma, 56, 143.
Potter H., Dressier D. (1976). On the mechanism of genetic recombination: Electron microscopic observation of recombination intermediates, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 3000.
Potter H., Dressier D. D9TTV On the mechanism of genetic recombination: The maturation of recombination intermediates, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 4168.
Sigal N., Alberts B. (1972). Genetic recombination: The nature of a crossed strandexchange between two homologous DNA molecules, J. Mol. Biol., 71, 789.
Sobell H. M. (1973). Symmetry in protein-nucleic acid interaction and its genetic implications, Adv. Genet., 17, 411.
НЕЗАКОННАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ:
ИНТЕГРИРОВАННЫЕ СЕГМЕНТЫ, ТРАНСПОЗОНЫ, ВНЕДРЕНИЕ ЧУЖЕРОДНОГО МАТЕРИАЛА
Как уже упоминалось, в основе «незаконной» рекомбинации лежит обмен негомологичными участками ДНК, приводящий к возникновению вставок, делеций, дупликаций и транслокаций генетического материала. Такие события происходят слишком часто, чтобы их можно было считать случайными отклонениями от нормы (т. е. «законной» рекомбинации). В гл. 6 отмечалось, что перестройка генетического материала оказывает решающее влияние на эволюцию организмов. Мы уже коротко говорили о фаге X и опухолеродных вирусах, геном которых внедряется в клетку-хозяина. Более подробно речь об этом пойдет в последнем разделе этой главы. И наконец, было бы интересно рассмотреть механизм действия рестриктаз (см. гл. 20), а также вопрос об участии этих ферментов в создании рекомбинированных молекул ДНК (см. гл. 11).
Интегрированные сегменты,
(IS-элементы, или IS-последовательности) —новый тип генетических элементов
Обнаружена группа необычных мутантов, у которых затронуты галактозный и лактозный опероны, причем их свойства невозможно объяснить, исходя из точковых мутаций, делеций или нонсенс- мутаций (Malamy, 1966; Jordan, Saedler, Starlinger, 1967). Скорость спонтанных обратных мутаций (реверсий) у таких мутантов ничтожна и не может быть изменена с помощью мутагенов.
В качестве последней возможности остается предположить, что речь здесь идет о мутантах, у которых в лактозном или галактозном оперонах содержатся дополнительные фрагменты ДНК (вставки). Это предположение объясняет также и их полярное действие. Их называют элементами или последовательностями /5. Во многих отношениях они представляют собой новый вид последовательностей: они оказывают влияние на экспрессию соседних генов, могут индуцировать делеции и при этом обладают своеобразным свойством— способностью встраиваться и исключаться из бактериального генома в разных местах. Процессы встраивания и исключения не зависят от гена гесА. В последние годы элементы 1S интенсивно исследовались, и к настоящему времени выделено пять отличающихся друг от друга единиц (/£/—IS5). Они встречаются у Escherichia coll, Salmonella lyphimurium, Citrobacter freundii, в некоторых плазмидах (факторы F и R) и умеренных фагах (X) (ссылки см. в работе Szybalski, 1977).
Хромосома Е. coll содержит восемь копий IS1 и пять копий IS2 (Saedler, Heiss, 1973). В отличие от вирусов и плазмид элементы IS не способны реплицироваться автономно. Их можно выявить после переноса галактозного или лактозного оперона фагом X. Мы уже знаем, что трансдуцирующий фаг X может встроить в свой собственный геном часть генома клетки-хозяина. При этом образуется, например, X-gal, содержащий галактозный оперон, или Х-lac, содержащий лактозный оперон.
Если такой оперон включает какой-нибудь дополнительный фрагмент ДНК, то он также будет перенесен фагом. Плотность фага (измеренная методом равновесного центрифугирования в градиенте плотности CsCl) прямо зависит от количества встроенной ДНК. Поэтому фаг X-gal имеет более высокую плотность, чем фаг X. Включение последовательности IS еще несколько повышает плотность; это увеличение хотя и незначительно, но вполне измеримо (Jordan, Saedler, Starlinger, 1967).
Михаэлис и др. (Michaelis et al., 1969) осуществили транскрипцию ДНК фага X-gal, содержащего элемент IS. Продукт транскрипции гибридизовали затем с ДНК фага X-gal, не содержащей элемента IS. Одна из фракций оставалась нереассоциированной и гибридизовалась только с ДНК X-gal, содержащей сегмент IS.
Третье доказательство существования дополнительного участка
Рис. 13.1. Схематическое изображение способа выделения гена (ABCDV Этот ген Ж«н в два бактериофага (или две плазмиды) в разных ориентациях (/ и 2). обоих фагов (плазмид) после их размножения денатурируют. При реципрокной ренатурации последовательность ABCD гибридизуется с комплементарной ей последовательностью А'В'С'ЕУ, тогда как остальные области остаются одноцепочечными и могут быть разрушены ДНКазами.
А1Д^А1Д^A Y 2 ОРA Y 2 ОРАА• -*—■ ] К , Т , Е ^ОР Галактозный опсрон• -*—■ ] К , Т , Е ^ОР Галактозный опсрон, A Y .Z ^.^ОР Лактозный оперся, A Y .Z ^.^ОР Лактозный оперся
А1Д^
А1Д^
A Y 2 ОР
A Y 2 ОР
А
А
• -*—■ ] К , Т , Е ^ОР Галактозный опсрон
• -*—■ ] К , Т , Е ^ОР Галактозный опсрон
, A Y .Z ^.^ОР Лактозный оперся
, A Y .Z ^.^ОР Лактозный оперся
оис 13 2 Встраивание элементов /5/ в галактозный и лактозный опероны. Структурные гены /С Т, Е и А, У, Z не транскрибируются, так как они отделены от промотора элементом IS1.
ДНК было получено с помощью гетсродуплексного анализа. Известны умеренные фаги, у которых фрагменты генома клетки- хозяина включаются в различных ориентациях. Если выделить ДНК двух таких фагов, денатурировать ее и провести гибридизацию гетерологичных фракций, то окажется, что реассоциировали с образованием двухцепочечной структуры только участки со встроенными фрагментами ДНК клетки-хозяина (рис. 13.1).
В 1969 г. было показано (Shapiro et al., 1969), что этот метод можно использовать для выделения специфических генов. В свое время указанные авторы таким способом выделили /ас-оперон. Теперь "этот прием применяется для доказательства, выделения и идентификации элементов IS (Hirsh, Starlinger, Brachet, 1972; Fiandt et al., 1972; Malamy, Fiandt, Szybalski, 1972).
Длина элементов IS составляет около 700—1400 пар оснований. Их выделение осуществляется в три этапа:
Разделение комплементарных цепей ДНК (у обоих фагов).
Ренатурация (отжиг) комплементарных цепей, одна из которых содержит элементы 18 в ориентации I, а другая — в ориентации II.
Расщепление свободных одноцепочечных концов (Schmidt et al., 1976).
Какими свойствами обладают элементы IS? К настоящему времени лучше всего изучены элементы 181 и 182. Действие 181 схематично представлено на рис. 13.2. При включении этого элемента в тот или иной оперой резко снижается скорость транскрипции тех генов, которые оказались отделенными от своего промотора. Аналогичный эффект обнаружен также и после включения 182, если он встраивается в определенной ориентации (ориентация I).
Чем обусловлено торможение транскрипции? Было обнаружено (Crombrugghe et al., 1973), что элемент 182 содержит терминирующие последовательности, связывающиеся с фактором р (см. гл. 9). Именно это п является причиной прекращения транскрипции.
182 может включаться в оперой и в противоположной ориентации (ориентация II). Тогда он действует не как терминатор, а как промотор. В этом случае скорость транскрипции всех генов, рас-
положенных от него «справа» (по направлению транскрипции), повышается втрое. При этом они теряют свою способность к индукции и становятся конститутивными (рис. 13.3), так как новыЙк промотор теперь располагается между оператором и структурными • генами и не связан, как обычно, с каким-либо оператором. Поэтому IS2 как переносимый контролирующий элемент действует по механизму «флип-флоп» и может включать и выключать активность • соседних генов (Saedler et al., 1974).
Когда 1S2 встраивается в оперой в ориентации I, он сам может" претерпевать некоторые изменения, что в свою очередь может привести к изменению экспрессии соседних генов. Чтобы исследовать это явление, галактозный оперон Е, coll с включенным в пего элементом IS2 был перенесен в плазмиду. Затем были отобраны мутанты, индуцированные, несмотря на присутствие в них IS2. Некоторые из них были выделены. Особый интерес представляли неустойчивые мутанты, так как было показано, что включенные в них элементы 1S2 были длиннее обычных на 108 или 54 пары оснований. Такие мини-вставки первоначально обозначались как IS6 и 1S7. Теперь же, в соответствии с принятой номенклатурой (Campbell et al., 1977), они обозначаются как IS2-6 и IS2-7. В 1978 г. Гозал и Сэдлер (Ghosal, Saedler. 1978) определили их нуклеотидные последовательности и при этом обнаружили еще один неизвестный до тех пор механизм репликации. Отдельные части последовательностей IS2 и IS2-6 высокосимметричны. К ним относятся длинный обращенный повтор, состоящий из 62 пар оснований, полностью двуспиральный участок длиной 46 пар оснований и несколько более коротких и менее совершенных двуспиральных участков. Все они содержат чрезвычайно большое число АТ-пар.
Струн тук дс1-спар«еСтрун тук дс1-спар«еgal-фснотилgal-фснотил, К Т Е OP1 1111F, К Т Е OP1 1111FИндуцируемыйИндуцируемый
Струн тук дс1-спар«е
Струн тук дс1-спар«е
gal-фснотил
gal-фснотил
, К Т Е OP
1 1111F
, К Т Е OP
1 1111F
Индуцируемый
Индуцируемый
„ К Т ЕДЗ^ОР
2 —i—I—•—Е323—•-
К Т Е IS2OP ,, .
3 —^—к—,—^^1н КвнститупкИныи
Рис. 13.3. Встраивание элемента IS2 в gal-оперон в двух ориентациях. В ориен-тации I оп подавляет транскрипцию генов К, Т и Е. При ориентации II транскрип-ция этих структурных генов становится конститутивной, так как IS2, ориентиро-ванный в направлении транскрипции, выполняет функцию промотора. (Nevers,Saedler, 1977.)
Рис. 13.4. Модель «скользящей» репликации. Изображена часть последовательности IS2 (Л). Обращенные повторы обозначены толстыми стрелками, АТ-богатые участки — условными знаками нуклеотидов. Во время репликации одной из цепей новообразованная цепь может отделиться от матрицы (Б) и начать замыкаться сама на себя (В). Таким образом, она сама будет служить матрицей (Г). Наконец полимераза снова переместится ла первоначально реплицировавшуюся цепь, в которой тоже образовался палиндром (Д). В результате новосинтезировапная цепь будет длиннее, чем старая. Во время следующего цикла репликации (без скольжения) образуется более короткая цепь. В конечном итоге получатся два продукта: IS2 (Е) и IS2-6 (Ж). (Chosal, Saedler, 1978.)
Такая высокая доля АТ-пар в определенных участках IS2 может во время репликации приводить к отделению новообразованной цепи от матрицы. Поскольку эта отделившаяся, частично синтезированная цепь содержит обращенный повтор, она может замкнуться сама на себя и на ней, как на матрице, будет продолжаться синтез ДНК (скользящая репликация; рис. 13.4). Репликация такого типа неизбежно приводит к образованию вставки во вновь образовавшейся цепи. После следующего цикла репликации (без скольжения) появятся два неодинаковых по длине продукта: IS2 и IS2-6 (или IS2-7). Длина вставки может быть кратной основному
числу включенных пар оснований. Оказалось, что описанная здесь последовательность (/32-7) содержит 54 пары оснований и представляет собой основную единицу, которая в IS2-6 повторяется дважды.
Почему 1S2-6 и IS2-7 не стабильны? Это можно объяснить следующим образом. Если исходить из того, что при репликации одна из цепей IS2-6 служит матрицей, то мы должны допустить, что в процессе синтеза ДНК в ней образуются палиндромы, так как она содержит обращенные повторы. Если во время репликации эти палиндромы не считываются, то мы получим укороченный продукт IS2.
Элементы IS могут встраиваться в различные места генома Е. colt, однако некоторые из них оказываются более предпочтительными, чем другие. Как правило, встраивание и исключение этих фрагментов происходит с высокой точностью, что свидетельствует об участии в этих процессах белков, узнающих концы элементов IS. При определении нуклеотидных последовательностей концевых участков элемента IS1 (Grindley et al., 1977) в них была обнаружена частичная гомология. 18 пар оснований из 23 в обоих концевых участках оказались одинаковыми. Самая длинная гомологичная последовательность содержит восемь пар оснований.
Транспозоны: прыгающие, или блуждающие, гены
Давно известно, что некоторые плазмиды способны целиком или частично встраиваться в геном клетки-хозяина. К таким плазмидам относятся факторы F (от англ, fertility — плодовитость) и гены устойчивости к лекарственным препаратам в плазмидах R (см. гл. 11). Интеграция факторов F, так же как и вирусов, как правило, происходит в определенных, генетически картируемых местах генома. Наряду с этим было обнаружено также, что иногда гены устойчивости, локализованные вначале в плазмидах (факторах R), затем оказываются в бактериальной хромосоме. Очевидно также, что каждый из этих генов может встраиваться во многие места хромосомы. Если такое встраивание произошло в середине структурного гена, то это приводит к его инактивации. Как мы видим, по своему поведению эти гены напоминают элементы /3. Каким образом можно объяснить такое явление? Описанные гены устойчивости расположены в участках ДНК, к которым с обеих сторон примыкают элементы IS, ориентированные в противоположных направлениях. Такая единица, состоящая из гена (генов> устойчивости и двух элементов IS, называется транспозоном (Tn; табл. 13.1).
Противоположно ориентированные элементы IS можно увидеть с помощью электронной микроскопии (Davidson et al., 1975). Если плазмиду, содержащую транспозон, денатурировать путем нагре-
202 I. Нуклеиновые кислоты
Таблица 13.1
Транспозоны и плазмиды, из которых они были первоначально выделены, а также локализованные в них маркеры устойчивости (Campbell et al., 1971)
Транспозон
Плазмида
Маркер устойчивости1)
Тп1
RP4
Лр
Тп2
RSF1030
Лр
ТпЗ
R1
Ар
Тп4
R1
ApSmSu
Тп5
JR67
Km
Тпб
JR72
Km
Тп7
R483
TpSm
Тп9^
pSM14
Sm
ТпЮ
R100
Tc
') Лр — ампициллин. Km — канамицин, Sm — стрептомицин, Su — сульфонамид, Тр- триметоприм, Тс — тетрациклин.
!) Обозначение Тп8 до сих пор не присвоено. К транспозону Тл9 с обеих сторон при мыкают элементы ISL
вания, а затем провести ренатурацию разделившихся цепей, то образуются гантелеобразные структуры, каждая из которых состоит из одного двухцепочечного ствола и двух отходящих от него кольцевых одиночных цепей (рис. 13.5 и 13.6). Двухцепочечный участок в факторе F содержит около 1400—1500 пар оснований ( ^ IS2). В других плазмидах обнаруживаются также участки, имеющие в длину 800 пар оснований US1). Интеграция факторов F осуществляется в результате рекомбинации этих участков с гомологичными последовательностями бактериальной хромосомы. Их положением в геноме объясняется то, что распределение мест интеграции фактора F носит неслучайный характер. Ориентация этих последовательностей по отношению к остальному геному Е. coli определяет, какие гены будут перенесены — расположенные справа или слева от встроенной плазмиды.
Широкое распространение элементов IS позволяет сделать вывод о том, что они выполняют какую-то чрезвычайно важную функцию, связанную с подвижностью генов, обусловливают высокую частоту обмена генетической информацией (прыгающие, или блуждающие, гены). Эти элементы способствуют быстрому распространению генов в популяциях бактерий, ускоряют эволюцию про- и эукариот и управляют процессами дифференцировки. Если гены так легко изменяют свое положение, то не ясно, почему все- таки существуют вполне определенные генетические карты и отграниченные один от другого виды.
Элементы IS благодаря их специфической функции располагают огромными возможностями. Однако эти возможности реализу-
Рис. 13.5. Повторяющаяся нуклеотидная последовательность Тс-транспозона плазмид R6-5 и R6. Последовательности AiBjCj и С'В'А' образуют ствол палиндрома. Встраивание последовательности А2В2С2 (комплементарно»! AjBiCi) приводит к прекращению экспрессии гена устойчивости к тетрациклину (Тс), который обычно несет эта плазмида. (Cohen, Kopecko, 1976.)
Рис. 13.6. Генетическая структура плазмид F (внутренняя окружность) и родственных плазмид R, несущих факторы устойчивости к лекарственным препаратам. У плазмид R и F одна половина каждой молекулы проявляет высокую степень гомологии (образование гетеродуплексных молекул, обозначенных на диаграмме штриховкой). Остальные части молекул не гомологичны друг другу. В одном из участков плазмиды F находятся многочисленные элементы IS. Они ответственны за интеграцию плазмид с бактериальной хромосомой. Гены tra (в плазмидах F) и участок RTF (в плазмидах R) необходимы соответственно для конъюгации и переноса детерминанта (или детерминантов) R (см. гл. 11). Плазмиды R могут нести некоторое число транспозонов в негомологпчпых участках. Область детерминантов R, к которой с двух сторон примыкают элементы IS, способна размножаться. (.Shapiro, 1977.)
ются только при наличии необходимого набора соответствующих ферментов, а клетки снабжены ими, очевидно, очень экономно. Мы практически ничего не знаем ни о функциях, ни о синтезе этих ферментов, ни о регуляции их синтеза. Необходимы эффективные механизмы, препятствующие их образованию в больших количествах.
Умеренные фаги X и ц
В предыдущих разделах мы уже говорили, что для осуществления незаконной рекомбинации оба партнера, участвующие в реакции, также должны иметь специфические и одинаковые нуклеотидные последовательности, которые, однако, не охватывают целую группу сцепленных между собой генов, а ограничиваются короткими участками. Такая рекомбинация происходит не в любом месте, а лишь в одной или нескольких точках (сайт-специфи- ческая рекомбинация, т. е. рекомбинация, специфическая в отношении определенного участка). Интеграция транспозонов, плазмид и умеренных фагов представляет собой классический пример рекомбинации подобного типа. Становится все более очевидным, что этот механизм существует также и в эукариотических клетках.
В 1977 г. Шапиро ввел термин «интеграционная рекомбинация», подчеркнув тем самым, что продукт «незаконной рекомбинации» длиннее (или короче), чем исходная молекула. При «законной рекомбинации» исходная молекула и продукт рекомбинации одинаковы по длине.
Фаг X. ДНК фага имеет линейную форму и содержит одноцепочечные комплементарные друг другу концы («липкие» концы). После внедрения в клетку-хозяина молекула ДНК замыкается в кольцо.
Интеграция фага X с геномом £. colt происходит в специфических местах прикрепления (а//). Наиболее эффективное место прикрепления расположено между генами gal и bio на 17 мин стандартной генетической карты Е. coll. При отсутствии такого места прикрепления используются другие, более слабые места. Для интеграции необходим продукт фагового гена int, а также один или более белков клетки-хозяина. Для исключения профага кроме гена int требуется также и ген xis (также фагоспецифический). Оба локуса расположены в фаговом геноме справа от att (см. рис. 5.3).
Оперон att-int-xis содержит 1400 пар оснований и находится под контролем генов сП и сШ, продукты которых активируют экспрессию гена Int (Pilacinski et al., 1977). Место прикрепления фага обозначают attP(POP'), а соответствующее ему место в бактериальном геноме — attB(BOB'), В состоянии профага (встроенный фаг) обнаружены ВОР' (attL— левое место прикрепления)
Рис. 13.7. Интеграция Х-ДНК с бактериальным геном. Место интеграции фага обозначено POP'. Опп расположено между генами I и inl-Vxis (см. генетическую карту на рис. 5.3). ВОВ' — место интеграции фага в бактериальной хромосоме — находится между генами gal п bio. Механизм интеграции фага аналогичен механизму встраивания и исключения транспозона. При исключении профага к нему может присоединиться один из бактериальных генов — bio или gal. Соответственно изменится и структура участков интеграции РОВ' и ВОР'. Дальнейшие подробности см. в тексте. (Landy, Ross, 1977.)
и РОВ' (attR — правое место прикрепления) (рис. 13.7). Исключение профага основано на рекомбинации между ВОР' и РОВ', причем после этого вновь восстанавливается первоначальное состояние (ВОВ' и POP’).
Трансдуцирующие фаги образуются в результате редкой, int- независимой рекомбинации, при которой часть фаговой ДНК утрачивается, а вместо нее включается бактериальная ДНК, например X-gal, несущий attL, и X-bio, несущий attR. Фаг X с бактериальным местом прикрепления ВОВ' представляет собой продукт ^/-зависимой рекомбинации между X-gal (ВОР') и X-bio (РОВ'). Этот продукт рекомбинации трансдуцирует оба гена — gal и bio. Исследование /п/-зависимой рекомбинации с участием различных мест прикрепления приводит к выводу о том, что Р, Р', В и В' различаются своими нуклеотидными последовательностями. Для подтверждения этого вывода Лэнди и Росс (Landy, Ross, 1977) опре-
а 6 f г Зеа 6 f г ЗеPOPPOPto— г -д —-to— г -д —-з-жз -гз-жз -г
а 6 f г Зе
а 6 f г Зе
POP
POP
to— г -д —-
to— г -д —-
з-ж
з -г
з-ж
з -г
б-г —
d-e —
a-б — —
Рис. 13.3. Логическая схема идентификации и выделения рестрикционных Фрагментов ДНК фага X, содержащих четыре места интеграции: POP', РОВ', ВОР', и ВОВ'. Слева — структура ДНК, в которой стрелками указаны места ее расщепления рестриктазами; справа — разделение образовавшихся фрагментов с помощью гель-электрофореза и их идентификация на основании соответствующих нм полос е геле. Подробности см. в тексте. (Landy, Ross, 1977.)
делили эти нуклеотидные последовательности. В качестве исходного материала они использовали рестрикционные фрагменты, содержащие места прикрепления POP', РОВ', ВОР' и ВОВ.
На рис. 13.8 представлена схема их эксперимента. ДНК из четырех различных фагов, каждый из которых содержал какое-нибудь одно из указанных мест прикрепления, фрагментировалась с помощью рестриктаз. Места расщепления обозначены на рисунке буквами а — з.
Разделенные с помощью гель-электрофореза фрагменты распределили по классам:
Фрагменты, которые присутствовали во всех четырех случаях. Опи расположены вне областей прикрепления (а —б и д — е).
Фрагменты, которые обнаруживались в двух из четырех случаев. Сюда относятся фрагменты бактериального происхождения, комбинации фаговых и бактериальных ДНК (кроме а(/) и фрагменты, содержащие фаговую ДНК, утрачиваемую при образовании трансдуцируюших фагов, например б — в, г — д, б — з и ж — д.
Фрагменты, встречающиеся только один раз. Они содержат участки прикрепления, например в —г, в —ж, з — г и з — ж.
Эти фрагменты использовались для определения в них нуклеотидных последовательностей.
POP' имеет длину 317 пар оснований, а ВОВ' — 259. Все четыре участка содержат одинаковую (расположенную в середине) последовательность (О) длиной 15 пар оснований. Она представляет собой точку кроссинговера. Остается выяснить, какое значение имеют ветви Р и Р', В и В', расположенные справа и слева от общей последовательности О. По-видимому, для фагоспецифических последовательностей характерна более высокая регулярность (например, обращенные повторы), чем для бактериальных последовательностей.
Фаг р. Этому фагу также свойственны некоторые особенности:
ДНК фага р постоянно связана с бактериальной ДНК- К геному фага р (не только в состоянии профага, но и в вирионе) с обеих сторон примыкает бактериальная ДНК.
Интеграция имеет существенное значение для репликации. Не выделено ни одного жизнеспособного мутанта с утраченной способностью к интеграции.
Место интеграции определяется концами ДНК фага р, т. е. ви- русоспецнфнческими участками. По статистическим данным, фаг р может встроиться в любое место бактериального генома.
ДНК фага р способна связывать друг с другом две кольцевые молекулы ДНК и благодаря этому переносить любой фрагмент бактериальной ДНК в ту или иную плазмиду. Таким образом, фаг р обладает свойством, присущим транспозону.
Интеграция фага р, перенос бактериальных генов и экспрессия фаговых генов происходят также и в клетках гесА-.
Хотя фаг р обладает свойствами вируса, по существу он является крупным элементом /S (длиной 38 000 пар оснований), который связывает между собой последовательности ДНК путем интеграционной рекомбинации. Встраивание в оперов фага р (так же как и фага X), подобно встраиванию элементов /S, вызывает полярные эффекты, тогда как его исключение индуцирует делецни.
Участки бактериальной ДНК, примыкающие к обоим концам р-ДНК, идентифицировали с помощью гетеродуплексного анализа (Daniell ct al., 1973). Если ДНК фага р денатурировать, а затем ренатурировать, то при этом обычно возникают продукты гибридизации с расплетенными концами (рис. 13.9). Только участок, расположенный в середине, ренатурируется, образуя двойную спираль. Концы остаются одноцепочечными и свободными, так как нет совершенно сходных между собой молекул. Однако удивительно то, что все они имеют почти одинаковую длину. Фрагмент бактериальной ДНК на одном конце молекулы — относительно короткий (С-конец), а на другом — длинный (S-конец).
Было обнаружено (Bukhari, Taylor, 1975), что при упаковке в фаговую частицу молекулы ДНК она целиком заполняет головку
Рис. 13.9. Электронная микрофотография ренатурированной р-ДНК- Обнаруживаются се характерные особенности: расплетенные концы и «пузырь G>. Объяснения см. в подписи к рис. 13.10; X 23 000. (Фото Delius, Heidelberg, 1978.)
фага, т. е. при созревании фаговой частицы в головке фага укладывается столько ДНК, сколько в ней может уместиться. В таком случае размер головки фага определяет максимально возможную длину молекулы ДНК. Фаг ц — единственный известный до сих пор вирус, который способен в процессе своей репликации приобретать новые последовательности бактериальной ДНК. Так как эти последовательности, расположенные на обоих концах фаговой ДНК, различны, последняя не может замкнуться в кольцо (и поэтому не может реплицироваться самостоятельно?).
Сегмент G. На электронных микрофотографиях денатурированную ДНК фага р можно узнать не только по расплетенным,концам, но и по характерному вздутию («пузырю») в спаренной области молекулы. Это и есть сегмент G. Он представляет собой обращенный повтор, который может находиться то в одной («flip»), то в другой («Пор») ориентации (рис. 13.10). В зависимости от стадии развития фага преобладает какая-нибудь одна из этих двух конформаций. Следовательно, этот сегмент может иметь два значения и выполняет роль переключателя, регулирующего активность генов фага р. Возможно, что обе его цепи содержат генетическую информацию. Йх экспрессия определяется тем, какая из них окажется непосредственно рядом с промотором (который сам не яв-
iiiiiunimr,
ж-Сегмютж-СегмютБариибмнше
ж-Сегмют
ж-Сегмют
Б-Саинсит p-Ccuwotm липцы
у'у X
Пумф'йПумф'йPuyuiMKuw ненцы(Билка)PuyuiMKuw ненцы(Билка)
Пумф'й
Пумф'й
PuyuiMKuw ненцы(Билка)
PuyuiMKuw ненцы(Билка)
I ис. 13.10. Структура ц-ДНК. Показаны наблюдаемые в электронный микроскоп 1 труктуры денатурированной, а затем ренатурированной ДНК; xyy'z комплементарны хУуг'. После ренатурации гетерологичных цепей «сегмент G» образует «пузырь», а расплетенные концы молекулы — «вилки». (Howe, Bade, 1975.)
ляется обращенной последовательностью). В качестве другой аль- гернативы можно предположить, что в зависимости от ориентации сегмент G, так же как элемент IS2, служит либо инициирующим, либо терминирующим сигналом. Сегмент G состоит из 3000 пар оснований. С обоих концов к нему примыкают обращенные повто- ры (каждый по 50 пар нуклеотидов длиной) (Hsu, Davidson, 1974).
Контролирующие элементы.
Элементы-переключатели у эукариот
До сих пор еще не выделены ни элементы IS, ни транспозоны из эукариотических клеток. Тем не менее генетические эксперименты приводят к выводу о том, что они должны в них присутствовать. Известны по меньшей мере три системы, в которых постулировано существование блуждающих контролирующих элементов: а) контролирующие элементы у кукурузы (McClintock, 1950, 1961); б) мутации, вызывающие изменения цвета глаз у Drosophila (Green, 1967);
с) слияние вариабельных и константных участков в молекулах иммуноглобулинов (Tonegawa, 1976).
Контролирующие элементы. Они различаются по своему воздействию на структурные гены. Без сомнения, некоторые из них
принимают участие в экспрессии того или иного структурного гена. Известны контролирующие элементы, состоящие из двух различных функциональных единиц. Одна из этих единиц всегда связана со структурным геном и влияет на его экспрессию (рецепторная единица); другая (регуляторная единица) может находиться в каком-то ином месте хромосомы. Ес действие обусловлено тем, что она продуцирует один или несколько продуктов, которые направляют экспрессию структурных генов. Сравнение этой системы с моделью /ас-опсрона Жакоба и Моно вполне уместно. Указанные элементы соответствуют оператору и гену-регулятору. Однако они отличаются от элементов /ас-оперона своей подвижностью.
Встраивание контролирующего элемента непосредственно в какой-либо ген или рядом с ним влияет па экспрессию этого гена. После исключения контролирующего элемента из генома восстанавливается первоначальное состояние. Способность к мутациям лучше всего выявляется у таких локусов, генные продукты которых влияют на окраску зерен кукурузы и узор, образуемый пятнами на их поверхности. При этом изменяется либо интенсивность окраски, либо распределение пятен в окрашенных и неокрашенных частях поверхности зерен.
По-видимому, регуляторные элементы у кукурузы кодируют ферменты, катализирующие их встраивание в геном и исключение из него. Перемещение (транспозиция) регуляторных элементов, влияющих также и па перенос рецепторных элементов, осуществляется автономно. У кукурузы выявлено еще несколько систем, состоящих из двух элементов (регулятор — рецептор), которые функционируют совершенно независимо друг от друга. Лучше других изучен элемент Spm (супрессор — мутатор). Этот элемент может внедряться в локус хромосомы 3.
Расположенный здесь геи управляет синтезом антоциана. В зависимости от места интеграции Spm возникают различные мутанты, у которых либо совсем прекращен синтез антоциана, либо образуется продукт какого-то другого гена. Удаление этих элементов из некоторых клеток во время развития зерна приводит к появлению сегментированной на вид поверхности. Внедрение рецепторного элемента практически не влияет на экспрессию локуса Ль Исключение рецепторного элемента из генома находится под контролем одного из компонентов Spin (мутатора).
Супрессорная функция (подавление образования антоциана) и мутационная функция не зависят друг от друга. Изменения рецепторного элемента проявляются в различной интенсивности окрашивания зерна антицианом.
Продукт гена-мутатора контролирует перенос элемента Spm. Механизм его действия схематически изображен на рис. 13.11 (Nevers, Saedler, 1977). На одном конце элемента Spm находятся два промотора pv и р2, а на другом — терминирующая последова-
I
-Пути mop
Рис. 13.11. Гипотетическая схема структуры и функции активного элемента Spm. ЛЮлель показывает молекулярную структуру интегрированного регуляторного элемента ^рт. На одном его конце расположены последовательно два промотора и р2). Направление транскрипции указано стрелками. Элемент заканчивается терминирующей последовательностью (0. Он содержит три структурных гена: А (ак- шнатор), S (супрессор) и М (мутатор). Места, на которые направлено их действие, обозначены стрелками. Когда супрессор связывается с последовательностью t, 'ранскрипция прекращается. Активатор — положительный элемент, способствующий транскрипции путем активации промотора Р1. Продукт гена-мутатора действует на концы элемента и способствует его исключению из хромосомы. Заштри- ховапные квадраты представляют последовательности, в которых могут происходить те или иные акты рекомбинации (инверсии, делении, дупликации). (Nevers
Saedler, 1977.)'
Рис. 13.12. Интеграция Spm с локусом Л, хромосомы 3 Zea mays, в результате чего возникают мутанты с аллелями av”-\ а,” и а,”-2. Фенотип этих мутантов изображен на рис. 13.13. Делеция приводит к образованию еще одного генетического элемента (а^-1). (Nevers, Saedler, 1977.)
Фенотип зерна
Локус
Состоите
Актибност» Spm
Положите Spm ।
не рядам с
А,
* и -
af51
Ai
11
Ai
отМ)
IW?M
+
Ai
<
1
нет
не ржкмс A!
|V£3l
<*
1
+
ш&
2
нет
но рядом c
"Г
2
+
Ai
।1
«г2
1
—
Ai
IIMI
а™"г
1
+
A,
Рис. 13.13. Состояния локуса Л, Zea mags и влияние элемента Spm на экспрессию генов. У зерен дикого типа, у которых нет элементов контроля (.первый ряд}, об разование антоциана и пигментация — максимальны и не зависят от того, встраивается ли Spm в какое-то другое место в геноме или нет. Степепь пигментации фона у всех других зерен указывает на то, что экспрессия локуса Л, зависит от активности Spm. Черные пятна соответствуют клонам, у которых элементы контроля утрачены (исключены под действием мутатора), белые пятна (самый нижний ряд} — результат инактивации Spm в отдельных клетках и их потомстве.
(Nevers, Saedler, 1977.)
8Нсектибжи8НсектибжиИнберы»Инберы»Рис. 13.14. Циклические изменения активности элемента Spm. Инверсия одного или обоих промоторов (р, и pt) приводит к образованию трех различных неактивных структур (а, 6, в). Структура в может активизироваться, если активный аллель Spm обеспечит образование активного продукта. (Nevers, Saedler, 1977.)Рис. 13.14. Циклические изменения активности элемента Spm. Инверсия одного или обоих промоторов (р, и pt) приводит к образованию трех различных неактивных структур (а, 6, в). Структура в может активизироваться, если активный аллель Spm обеспечит образование активного продукта. (Nevers, Saedler, 1977.)
8
Нсектибжи
8
Нсектибжи
Инберы»
Инберы»
Рис. 13.14. Циклические изменения активности элемента Spm. Инверсия одного или обоих промоторов (р, и pt) приводит к образованию трех различных неактивных структур (а, 6, в). Структура в может активизироваться, если активный аллель Spm обеспечит образование активного продукта. (Nevers, Saedler, 1977.)
Рис. 13.14. Циклические изменения активности элемента Spm. Инверсия одного или обоих промоторов (р, и pt) приводит к образованию трех различных неактивных структур (а, 6, в). Структура в может активизироваться, если активный аллель Spm обеспечит образование активного продукта. (Nevers, Saedler, 1977.)
ГЯтПт ь X^s у^п ^Т^
тельность (Л. Между ними расположены три структурных гена: активатор (Л), супрессор (S) и мутатор (М).
Встраивание элемента Spm в хромосому и его последствия представлены на рис. 13.12 и 13.13. Возникающие при этом мутанты (aim~6, aim и а]т~2) отличаются по своему фенотипу как друг от друга, так и от растений дикого типа. Отличительная особенность элемента Spm заключается в его способности инактивировать самого себя. Поэтому активные фазы его существования сменяются неактивными (рис. 13.14). Инверсия одного или обоих промоторов обычно приводит к возникновению различных неактивных конформаций, причем частота и время изменения активности определяются элементами, которые локализованы в последовательностях «black box» (на диаграмме заштрихованы).
Мутации «white—■crimson» у Drosophila melanogaster. В локусе white, расположенном в Х-хромосоме Drosophila, встречаются нестабильные мутации. Вероятно, они обусловлены встраиванием сегмента ДНК, обладающего свойством транспозона и вызывающего делеции в соседних генах. Локус white ревертирует с высокой частотой (1:10-3—1: 1СН) к дикому типу (+); так же часты мутации в обратном направлении. Уже эти данные свидетельствуют о существовании некоего переключателя. Ген-мутатор, по-ви-
димому, широко распространен у Drosophila.
Интеграция генов, кодирующих V- и С-области иммуноглобулинов. Этот вопрос мы подробно обсудим в гл. 22.
БЕЛКИ
Дифракционные картины (справа), получаемые при прохождении лазерного луча через различные образцы (слева). Расстояния между рефлексами обратно пропорциональны соответствующим расстояниям в образце. Такие дифракционные картины помогают интерпретировать рентгенограммы нуклеиновых кислот и белков. Подробнее об этом см. в гл. 15.
БЕЛКИ: ФУНКЦИИ, ВЫДЕЛЕНИЕ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
В предыдущих главах мы познакомились с молекулами, которые служат носителями генетической информации, и увидели, что информация имеет значение только тогда, когда она вызывает протекание физических процессов. Сами по себе нуклеиновые кислоты либо совсем не в состоянии выполнять эту функцию, либо выполняют ее лишь в ограниченной степени. Для этой цели больше подходят белки. Они определяют всю координированную во времени и пространстве программу синтеза в живой клетке. Белки — это макромолекулы, состоящие, как правило, из 20 различных видов аминокислот, расположенных в определенном порядке.
Почему существует именно 20, а не 4 или 50 аминокислот? Общеизвестно, что каждый класс макромолекул содержит минимально возможное число различных структурных элементов. Многие полисахариды, например крахмал и целлюлоза, содержат лишь один основной строительный блок —глюкозный остаток. Хотя их строение однотипно, тем не менее они полностью удовлетворяют предъявляемым к ним требованиям (как к запасным или структурным материалам). Известны и белки, выполняющие функции только защитных и структурных элементов (такие, как коллаген, кератин, белки шелка) и, как мы увидим ниже, также отличающиеся относительно монотонным строением. I
Из небольшого числа строительных блоков нельзя построить сложные структуры, а сложные структуры — это предпосылка специфичности. Нуклеиновые кислоты состоят из четырех элементов, которые попарно комплементарны. В спаривании оснований заложена их способность к созданию новых копий. Однако это структурное правило (А-Т, G-С) ограничивает разнообразие возможных пространственных структур молекулы.
Лишь один особый вид РНК —тРНК —имеет специфическую третичную структуру, которая в этой форме существенна для белкового синтеза. Очевидно, однако, что для нуклеиновых кислот это максимум структурной специфичности. Этой специфичности недостаточно для удовлетворения потребностей клетки, возникающих в процессе эволюции. Синтез нуклеиновых кислот в энергетическом отношении «дешев», тогда как синтез белков очень сложен и «дорог» (см. гл. 38). Клетка вкладывает значительную часть своей энергии в синтез белка, но следует учитывать, что без белков эффективное преобразование энергии в клетке было бы вообще невозможным.
Существует 20 различных аминокислот; число довольно большое, и теоретически оно могло бы при сохранении триплетных кодонов быть еще больше — около 60 (64 минус несколько старт-
и стоп-сигналов). Однако при этом код уже не был бы вырожденным, что увеличило бы чувствительность системы к помехам.
Функциональные особенности аминокислот обусловлены различием в их боковых цепях. Известны нейтральные, полярные и неполярные остатки, остатки различной величины, с SH-группой и без нее и т. п. Относительное количество тех или других аминокислот в белке придает ему специфические свойства. Очень многие белки водорастворимы. Их гидрофильные свойства обусловлены относительно высоким содержанием аминокислот с ОН-, СОО--, NH3+- и SH-группами. К этой категории относится большинство растворимых белков плазмы и внеклеточной жидкости, и многие из них действуют как катализаторы (ферменты). В противоположность им гидрофобные белки содержат большое количество СН3-, СН2-групп и фенильных остатков. Сюда относятся белки, связанные с мембранами.
Не существует другого такого класса природных макромолекул, в котором одни представители были бы гидрофобными, а другие— гидрофильными. Нуклеиновые кислоты и полисахариды гидрофильны. Липиды либо гидрофобии, либо биполярны, т. е. у одной молекулы могут быть одновременно и гидрофобные, и гидрофильные остатки. Вследствие этого такие молекулы на поверхности раздела определенным образом ориентируются и образуют мономолекуляр- ную пленку. Хотя практически все белки содержат как гидрофильные, так и гидрофобные группы, из-за крупных размеров молекулы большинство функциональных групп насыщаются внутри молекулы и становятся недоступными для реакций с другими веществами.
Свойства каждого белка однозначно определяются его аминокислотной последовательностью. Каждый белок уникален, но не в смысле его неповторимости, а скорее в смысле оптимальной приспособленности для выполнения определенной функции. По имеющимся оценкам, клетки Е. coll содержат около 2000, а клетки многоклеточных эукариотических организмов — около 3000 различных белков. У Е. coll уже идентифицировано 1100 различных белков.
Существует небольшое число специализированных клеток, содержащих или синтезирующих в основном один или несколько белков. Таковы, например, эритроциты и клетки, образующие антитела. В первых гемоглобин составляет 90% всех клеточных белков, а вторые выделяют только один специфический вид антител (иммуноглобулинов). Следует также упомянуть клетки, инфицированные вирусом, которые по инструкции вирусного генома синтезируют лишь несколько вирус-специфических белков.
Регуляторные белки и ферменты действуют в чрезвычайно малых концентрациях. Здесь мы только вскользь коснемся их эф-
фективности. Каждый учебник биохимии содержит подробную гла* ву на эту тему. Сейчас для нас важно лишь то, что именно эта белки из-за своей высокой активности представлены в клетке лишь в очень небольших количествах. Часто они составляют менее 0,1% сухой массы клеток. Кроме того, в клетках встречается много очень сходных белков — по крайней мере по химическому составу и физико-химическим параметрам (молекулярная масса, форма и т. д.). С этим связана большая трудность получения очищенных белков в достаточных количествах для аналитических целей. Проблемы химии и биофизики белков весьма разносторонни. Некоторые задачи могут быть разрешены только при наличии высокоочишен- ных препаратов (например, задача анализа аминокислотных последовательностей). Для определения третичной структуры нужно идти еще дальше: необходимо закристаллизовать белок и получить его соединения с тяжелыми металлами. Белки современных организмов — это «потомки» примитивных предшественников, и нередко от одного такого предшественника происходит несколько белков, что и обусловливает сходство их первичной и третичной структуры (см. гл. 17).
Определенные белки близко или отдаленно родственных видов обнаруживают различия, более или менее пропорциональные степени расхождения этих видов в процессе эволюции. Мы получаем, таким образом, «маркер», чрезвычайно полезный при установлении эволюционных родословных.
РАЗДЕЛЕНИЕ, ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ
Большинство методов выделения белков пригодно в основном для гидрофильных молекул. Лишь в последние годы были разработаны методы выделения гидрофобных белков и изучения их свойств. При этом в качестве растворителей используются ионные и неионные детергенты, такие как додецилсульфат натрия, холат натрия, соли желчных кислот и др. Одна из предпосылок успеха — выбор подходящего исходного материала.
Ткани и клетки, богатые данным белком, более пригодны, чем те, в которых этот белок содержится лишь в следовых количествах. Поэтому регуляторные белки из эукариотических клеток до сих пор вообще почти не охарактеризованы. Классическим примером легко доступного белка служит гемоглобин, который без особого труда получают из эритроцитов. Однако изучение даже весьма обычных белков часто бывает связано со значительными трудностями. Актин и миозин, например, содержатся в мышечных клетках в больших количествах, и тем не менее лишь недавно удалось выяснить их структуру, так как эти белки по сравнению с другими имеют относительно большую молекулярную массу, и исследователи шли по пути наименьшего сопротивления — изу-
яали в первую очередь некрупные белки. Трудности анализа аминокислотной последовательности не компенсировались легкостью выделения белков.
Процедура очистки белка, как правило, состоит из ряда этапов обогащения. При этом приходится проверять эффективность отдельных этапов — выяснять, обогащается ли фактически исследуемый белок, или же, может быть, он частично или полностью теряется.
Здесь нужен метод измерения концентраций белка на единицу объема, чтобы можно было сопоставить эту величину со специфической активностью исследуемого белка. Метод обогащения считают эффективным только в том случае, если 1) специфическая активность на единицу веса всего белка увеличивается (например, возрастает каталитическая активность фермента на 1 мг белка в пробе) и 2) общая активность после данного этапа обогащения существенно не уменьшается.
Последовательные этапы обогащения, как правило, проводят до тех пор, пока специфическая активность на единицу веса белка не перестанет увеличиваться, т. е. не будет оставаться постоянной.
Чистоту белкового препарата определить не просто. Однако существует несколько критериев, которые можно использовать для ее оценки:
кристаллизуемость;
кинетика растворимости;
гомогенность при ультрацентрифугировании и/или электрофорезе;
однозначность данных при определении аминокислотной последовательности;
однотипность каталитической активности (отсутствие побочных активностей);
гомогенность при изучении хроматографическими методами (при использовании различных систем растворителей).
Всегда нужно иметь как можно больше различных независимых критериев чистоты: какого-то одного недостаточно, чтобы сделать определенный вывод. Некоторые белки образуют кристаллы в комплексе с другими компонентами, у других одной полипептнд- ной цепи свойственны две ферментативные активности (см. гл. 18), третьи полностью активны только после добавления кофакторов (кофермента, эффектора, какого-либо иона и т. п.).
Термин «чистота препарата» с самого начала не следует путать с максимальной ферментативной активностью. Чтобы получить химически чистый продукт, нужно устранить кофакторы (а тем самым и активность). Белковая часть гемоглобина, например, неактивна— активность появляется лишь после образования комплекса с порфириновым кольцом; однако для анализа аминокислотной последовательности порфирин был бы большой помехой.
Значительные трудности возникают при изучении белков, связанных с мембранами (см. гл. 24), так как здесь часто бывает не ясно, где кончается белок и где начинается мембрана. Нередко встречаются взаимодействия между белками, и они чрезвычайно важны для понимания многих биологических явлений (в том числе построения надмолекулярных комплексов и органелл). Способность избирательно связывать определенные небольшие ионы служит важной предпосылкой для выполнения белком функции переносчика ионов (см. гл. 28).
Методы
При выделении белка из тканей или клеток сначала нужно разрушить клеточную структуру (методы: растирание, фрагментация, воздействие ультразвуком, химическими и/или ферментативными агентами); при этом следует обращать особое внимание на то, чтобы не повреждалась структура изучаемого белка. Эта проблема особенно остра при выделении белков из растительных клеток, так как при разрушении клетки белки цитоплазмы смешиваются с содержимым вакуоли, кислая реакция которого вызывает повреждение многих белков. Для устранения этой трудности здесь, а также при работе с другими объектами в качестве экстрагирующих веществ и растворителей используют буферы. Далее, важными параметрами являются температура и ионная сила. Так как химические реакции при пониженных температурах протекают медленнее, чем при высоких, рекомендуется работать при температуре около 4 °C. Нс вполне очищенные белковые препараты не следует оставлять надолго, так как возможно расщепление белка. Следует также отметить, что многие белки денатурируются, если они находятся в очень разбавленном растворе или в среде с неподходящей концентрацией солей. Растворимость белка зависит от концентрации соли и величины pH. Эти величины различны для разных белков, чем можно иногда воспользоваться для их идентификации и очистки. Выпадение белка из раствора при добавлении соли (эффект высаливания), как правило, обратимо. Высаливание часто используют как первый шаг при очистке белка. С помощью высаливания возможно концентрирование белка, так как осажденный белок может быть снова растворен в гораздо меньшем объеме жидкости. Одним из лучших высаливающих агентов служит (NH4)zSO4, так как эта соль растворима в больших концентрациях. Большинство органических растворителей тоже годится для высаливания гидрофильных белков, причем часто это не влияет на их активность. Одним из таких агентов является ацетон. Гидрофобные компоненты (липиды и др.) остаются в растворе, тогда как белки выпадают в осадок и могут быть отделены центрифугированием и высушены. Таким образом получают
так называемый ацетоновый порошок, который пригоден для длительного хранения. Из такого порошка ряд белков можно вновь жстрагировать с помощью водных растворителей, причем в ак- швном состоянии.
Некоторые другие органические растворители, прежде всего с высокой диэлектрической постоянной (диметилсульфоксид, формамид, уксусная кислота, дихлоруксусная кислота), тоже служат хорошими растворителями для белков.
Для дальнейшей очистки и обогащения белков используют различия в следующих свойствах: 1) в молекулярной массе, 2) в рас- 1воримости; 3) в электрическом заряде; 4) в адсорбируемости определенными веществами; 5) в сродстве к другим молекулам.
Существуют по меньшей мере три основных способа (со множеством вариантов) разделения белков на основе их молекулярной массы:
Разделение в поле тяготения (центрифугирование).
Метод молекулярного сита. Он основан на том, что поры в мембране или между частицами проницаемы для молекул только в том случае, если диаметр молекул меньше диаметра пор.
Можно изготовлять материалы с заранее заданными размерами пор и с их помощью определять величину молекул и отделять друг от друга молекулы разных размеров. На принципе молекулярного сита основаны два метода — диализ и гель-фильтрация.
Гель-электрофорез с додецилсульфатом натрия (ДСН). ДСН обладает амфипатическими свойствами и своей гидрофобной частью связывается с молекулой белка, которая при этом денатурируется. Как показывает опыт, на единицу длины полипептид- ной цепи связывается примерно одинаковое большое число молекул ДСН. Молекула ДСН песет отрицательный заряд и, таким образом, комплекс белок — ДСН становится сильно электроотрицательным. Собственный заряд белка почти не изменяется с молекулярной массой, так что общий заряд комплекса прямо пропорционален величине белковой молекулы. Поскольку подвижность в электрическом иоле зависит не только от общего заряда молекулы, а в первую очередь от распределения этого заряда (от величины заряда на единицу объема), обычный электрофорез нс позволяет разделять одинаково заряженные частицы. При гель-элек- трофорезе с ДСН дополнительно используется диффузионный эффект при прохождении через гель. Небольшие молекулы проходят быстрее, чем крупные. Скорость прохождения пропорциональна их величине (рис. 14.1). Этот метод относительно прост и в последнее время стал стандартным методом определения молекулярной массы. При этом, однако, следует учитывать, что здесь получаются лишь относительные величины и в каждом эксперименте должны использоваться подходящие молекулы в качестве стандарта.
Рис. 14.1. Определение молекулярных масс при помощи гель-электрофореза с ДСН (калибровочная кривая). Скорость движения макромолекул в геле пропорциональна логарифму молекулярной массы. Метод дает лишь относительные величины. Поэтому в каждом эксперименте нужен стандарт с известной молекулярной массой. БСА —бычий сывороточный альбумин. (По данным Goodenough et al., 1972.)
Метод разделения на основе различной растворимости мы уже коротко рассмотрели. Особый случай представляет собой использование растворимости в сочетании с электрофорезом — метод изоэлектрического фокусирования. Этот метод основан на одновременном создании градиента pH и электрического поля. Молекулы белка движутся в электрическом поле до тех пор, пока не попадут в область своей изоэлектрической точки (ИЭТ). ИЭТ — это такая величина pH, при которой в белке ионизировано наименьшее число боковых групп аминокислот и он выпадает в осадок. Так как ИЭТ у каждого белка своя, можно отделить определенный белок от остального раствора и вновь растворить его в подходящем растворителе.
Изоэлектрическое фокусирование, так же как и другие электрофоретические методы, на которых мы здесь не можем останавливаться подробнее, применяются в первую очередь для аналитических целей; однако существуют и модификации, пригодные для препаративных целей.
Точность и разрешающая способность этих методов в последние годы непрерывно улучшались. В 1975 г. О’Фаррелл и его сотруд-
пики (Калифорнийский университет в Сан-Франциско) создали двумерный метол, при котором смесь белков разделяется в одном направлении по принципу гсль-электрофореза с ДСН, а в другом — по принципу изоэлектрического фокусирования. Таким образом, с помощью этого метода белки отделяются друг от друга как по молекулярным массам, так и по изоэлектрическим точкам (рис. 14.2). Этот метод позволяет в одном геле разделить 7000 различных белков. В одном лизате Е. coli таким способом были разделены 1100 белков в аналитических количествах. Число их лимитируется не разрешающей способностью метода, а величиной бактериальной хромосомы. Само собой понятно, что подлежащие разделению белки имеются здесь лишь в следовых количествах и что химические методы для их выявления здесь не годятся. Чтобы выявить и локализовать белки в геле, их предварительно метят 35S и определяют радиоактивность в геле методом радиоавтографии. Этот метод в дальнейшем дает возможность полуколичест- венной оценки. Сравнивая степень почернения с каким-либо внутренним стандартом, можно определить относительные количества всех разделенных белков. Правда, невозможно установить активность отдельных белков, так как в результате обработки ДСН белки денатурируются и их активные центры разрушаются.
При использовании гелъ-электрофореза без ДСН некоторые виды активности можно выявлять и в геле. Это представляет особый интерес потому, что таким образом можно выявлять ферментативные активности после электрофоретического разделения неочищенного лизата и локализовать их в геле. Применяют также гель с производным субстрата соответствующего фермента; это производное подбирают с таким расчетом, чтобы после воздействия фермента образовывался водорастворимый краситель, который можно непосредственно видеть как цветную полоску, что позволяет определить локализацию специфического фермента в геле. Этот метод очень удобен для идентификации изо- и аллоферментов (см. гл. 17).
Различия в заряде используются также для разделения белков с помощью ионообменников. Этот метод — ионообменная хроматография— применяется главным образом в препаративной работе, так как система обладает большой емкостью при высокой степени разрешения. В то время как в ионообменной хроматографии разделяемый материал (белки, пептиды и т. п.) образует с ионооб- менником обратимые связи, причем сродство зависит от числа надлежащих зарядов (+ или —) на молекулу, то при аффинной хроматографии используется специфическое взаимодействие между белком и каким-либо фиксированным лигандом.
Этот краткий обзор методов разделения должен дать представление о многочисленности используемых подходов и их комбинаций. Детали можно найти в методических работах, например в
Рис. 14.2. Разделение суммарного белка эукариотической клетки (иэ почки обезьяны) (электрофорез с неравновесным градиентом pH). Разделение основано на различиях в молекулярной массе (электрофорез) и различиях в изоэлектрической точке (изоэлектрическое фокусирование) отдельных белков. Белки метились in vivo м5-мстионшюм. Их идентификация в геле осуществлялась с помощью радиавтографии. Кислые белки разделяются хуже, чем основные. (O'Fappell et al., 1977.)
«Methods of Enzymology» (к 1979 г. вышло уже 62 тома), или в справочниках вроде «Handbook of Chemistry and Physics». Однако более важен собственный многолетний опыт, приобретаемый в лаборатории. В самом деле, иногда решающее значение имеет использование 0,1-моляриого буфера вместо 0,12-мол ярного. Не всегда все параметры разработаны до последних деталей; поэтому имеет смысл пользоваться прежде всего теми методами, которые уже приводили к удовлетворительным результатам. При этом, естественно, следует быть настороже, чтобы не внести артефактов. Разумеется, сказанное относится и ко всем другим описанным здесь методам. Нужно учитывать, что можно отлично использовать, например, определенный метод для работы с одним белком, однако этот же метод для другого белка может оказаться совершенно непригодным или же потребовать значительной модификации.
АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
Первичная структура белка — это последовательность аминокислот в его пептидной цепи. Чтобы определить ее в каком-то белке, необходимо, чтобы этот белок был очищен до гомогенного состояния.
Прежде чем приступать к определению первичной структуры белка, нужно знать, какие из 20 аминокислот имеются в этом белке, причем интерес представляет как качественный, так и количественный состав. Белок гидролизуют сильной кислотой до свободных аминокислот. В основном все аминокислоты переносят такую обработку, хотя некоторый процент потерь все же есть; однако известно, какие аминокислоты особенно чувствительны и каковы соответствующие цифры потерь. Гидролизат (смесь аминокислот) разделяют. Для этого обычно используют хроматографию на бумаге и тонкослойную хроматографию в органических растворителях. Для улучшения разрешения применяют так называемую двумерную хроматографию, при которой смесь аминокислот наносится в одной точке в углу листа бумаги или тонкой стеклянной пластинки. Смесь движется в одной системе растворителей, а затем хроматограмму поворачивают на 90° и уже разделившуюся в основном смесь подвергают действию другой системы растворителей. Подвижность аминокислот в этих двух системах растворителей должна быть различной. В конце эксперимента получают распределение аминокислот на бумаге или тонкослойной хроматограмме. Так как аминокислоты бесцветны, требуется специальное
Рис. 14.3. Разделение смеси аминокислот с помощью двумерной хроматографии на бумаге. Для разных направлений выбирается разные растворителя (liaurowitz,
Рис. 14.4. Кривая элюции, полученная при автоматическом анализе аминокислот. Ионообменная смола (на основе полистирола с замешенными сульфогруппами) (Spackmann et al., 1958).
окрашивание для проявления их на бумаге. Для этого можно использовать нингидрин. Там, где есть аминокислоты, появляется красно-фиолетовая окраска. Все аминокислоты характеризуются вполне определенными величинами Rf (рис. 14.3).
Количественное определение. Здесь в основном применяется ионообменная хроматография. Если эксперимент проводят при стандартных условиях с использованием автоматического анализатора аминокислот, то аминокислоты появляются в элюате в совершенно определенной последовательности. Пример получаемых результатов представлен на рис. 14.4. Здесь, как и при бумажной хроматографии, применяются главным образом органические растворители (буферные системы). Площадь под кривыми для отдельных аминокислот отражает содержание этих аминокислот в смеси; но здесь следует вносить определенные поправки, так как коэффициенты экстинкции разных аминокислот отличаются друг от друга.
Определение аминокислотного состава. Белок обычно содержит около 100—300 аминокислот. Практически невозможно анализировать такую молекулу целиком, поэтому ее расщепляют на фрагменты; при этом важно, чтобы молекула распадалась на определенное число фрагментов определенной длины и чтобы полипеп- тидная цепь разрывалась в определенных местах. Это осуществляют с помощью протеолитических ферментов, таких как трипсин, химотрипсин, пепсин, папаин и др. Их специфичность указана ниже.
Фермент
Аминокислотные остатки, позади которых происходит расщепление
Трипсин Химотрипсин Пепсин
Карбокенпептидаза
Arg, Lys
Trp, Phe, Туг" »«fliiai'
Trp, Phe, Туг, Met, Leu
Отщепляет по одной аминокислоте от карбоксильного конца
Папаин Субтилизин Термолизин Эластаза
.Arg, Lys, Gly
Ароматические и алифатические остатки Гидрофобные остатки (Leu, Не, Phe и др.) Нейтральные остатки
Наибольшей специфичностью обладает, несомненно, трипсин, который поэтому чаше всего и применяют. Примерно через каждые 5—15 аминокислот в белке встречаются остатки Arg или Lys; поэтому после обработки пептида трипсином образуются фрагменты длиной 5—15 аминокислот. Эти фрагменты отделяют друг от друга хроматографически (на бумаге, с помощью ионообменной хроматографии или по принципу молекулярного сита) и/или элек- трофоретически. После этого каждый фрагмент анализируют отдельно: сначала устанавливают его аминокислотный состав, а затем последовательность аминокислот.
При сравнении двух близко родственных белков нет надобности проводить всю процедуру определения аминокислотной последовательности у второго белка, если предполагаются различия лишь в одном или нескольких пептидах триптического гидролиза-
Гсмоглобин ЛПмто&т 3
Электрофорез
Рис. 14.5. «Отпечатки пальцев* (пептидные карты). Двумерное разделение смеси пептидов с помощью хроматографии и электрофореза. Картина для гемоглобина Л и гемоглобина S (из серповидных клеток) получается в целом сходной. Различие указано штриховкой. Этот метод позволяет получить предварительную информацию о том, сходны или различны две пробы и каково различие, если оно есть.
Рис. 14.6. Диагональный метод для идентификации пептидов, содержащих определенные аминокислоты. Пептиды разделяются методом хроматографии на бумаге в определенной смеси растворителей. Разделение во втором направлении осуществляется в той же смеси растворителей. Пептиды, разделенные в одном направлении, обрабатывают окислителями, которые, например, специфически реагируют с цистеином. Все пептиды, содержащие эту аминокислоту, изменяют свою подвижность. После обработки и бумажной хроматографии во втором направлении на диагонали оказываются только те пептиды, которые остались неизмененными.
та. Пользуются комбинированным методом, при котором пептиды отделяют друг от друга хроматографически (на бумаге) и элек- трофорстически; в результате после окрашивания нингидрином на бумаге получается характерный рисунок из пятен (fingerprint, «отпечатки пальцев», или пептидная карта). На рис. 14.5 приведены пептидные карты для нормального гемоглобина и —с целью сравнения — для гемоглобина серповидных клеток. Штриховкой отмечены различия между ними. Здесь остается лишь проанализировать состав несовпадающих пептидов, чтобы выяснить, чем отличается нормальный гемоглобин от серповидноклеточного. Часто достаточно бывает лишь узнать, содержится ли в пептиде определенная аминокислота, например Суз или Lys, Тгр, Туг и т. п. Для этого можно использовать специфические реактивы, которыми опрыскивают хроматограмму; при этом окрашиваются только те пептиды, которые содержат определенную аминокислоту. Другой метод, так называемый диагональный, пригоден, например, для выявления остатков цистеина или лизина. Смесь пептидов разделяют с помощью электрофореза на бумаге и затем бумагу обрабатывают реактивом, специфичным, скажем, для цистеина или лизина (окисляющим SH-группу или воздействующим на группу —МН3+). Затем пробу вновь подвергают электрофорезу, но на этот раз под прямым углом к первоначальному направлению движения. Пептиды, не прореагировавшие с реактивами, будут располагать-
ноR'нII।।Н2Н—С-С—N—С—С—NR Н Н ОноR'нII।।Н2Н—С-С—N—С—С—NR Н Н ОN !СНэ!г6N !СНэ!г6Рпс. 14.7. Введение метки в N-концевые аминокислоты. Деградация полипептид- ной цепи по Элману. А. Классический метод. Полипептид модифицируется фенил- изотиоциаиатом. После освобождения N-концевые аминокислоты появляются в виде феиилтиогидаптоицовых производных. Б. Метод дансилнрования с расщеплением по Эдману. Вместо фенилизотиоцианата применяется дансилхлорид. Метод чувствительнее на два порядка. Продукт реакции флуоресцирует.
ноR'н
II।।
Н2Н—С-С—N—С—С—N
R Н Н О
ноR'н
II।।
Н2Н—С-С—N—С—С—N
R Н Н О
N !СНэ!г
6
N !СНэ!г
6
ся на диагонали, а те, которые прореагировали, будут двигаться медленнее (рис. 14.6).
Определение С-концевого остатка в пептидах. С-концевые аминокислотные остатки идентифицируются по их отщеплению карбоксипептидазой. От пептида с последовательностью
А1а-РЬе-Пг-5ег-О1у
после кратковременной обработки ферментом будет отщепляться только Gly, после несколько более длительной — Ser и Gly, а после еще более продолжительной — Thr, Ser и Gly. Такая зависимость от времени говорит о том, что аминокислоты освобождаются последовательно. Так как отщепление происходит нс от всех пептидов смеси одновременно, этот метод пригоден для идентификации лишь четырех или пяти С-концсвых аминокислот. Около некоторых аминокислот, например Pro, карбоксипептидаза связи вообще не расщепляет.
Определение N-концевого остатка в пептидах. Существует также и аминопептидаза, но опа работает менее надежно, и ее сравнительно редко применяют в химии пептидов. Существует более
надежный метод — «расщепление по Эдману» (рис. 14.7). При этом методе к пептиду добавляют фенилизотиоцианат, что ведет к освобождению фенилтиогидантоинового производного N-концевой аминокислоты. Это производное относительно легко отделить от остального пептида и идентифицировать.
Оставшийся пептид можно вновь подвергнуть той же обработке. Эдман и Быт (1967) стандартизовали этот метод. У некоторых белков таким способом были определены в результате 20—40 последовательных циклов 20—40 N-концевых аминокислот. При этом оказалось, что чем длиннее пептид (или белок), тем лучше работает метод. Он мало эффективен для коротких пептидов триптического гидролизата и не работает в случае остатков цистеина. Лаурсен модифицировал этот метод, связав пептид с твердым носителем (твердофазный метод), и таким образом распространил применимость этого метода на область коротких пептидов.
Порядок расположения пептидов: перекрывающиеся последовательности. После того как пептиды триптического гидролизата проанализированы и установлены их аминокислотные последовательности, тот же белок обрабатывают химотрипсином и снова повторяют всю процедуру. Чтобы расположить пептидные фрагменты в правильном порядке, в них ищут перекрывающиеся последовательности.
Приведем простой пример. Имеется два триптических пептида;
Ala-Ser-Tyr-Ser-Lys;
Thr-Val-Ile-Ala-Arg.
Вопрос: как они расположены в белке — первый перед вторым или второй перед первым?
После обработки химотрипсином получаются следующие фрагменты:
Cys-Arg-Ala-Ser-Tyr;
Ser-Lys-Thr-Val-lle-Ala-Arg-Trp.
Из этого можно заключить, что первый расположен перед вторым, так как второй фрагмент, полученный с помощью химотрипсина, содержит конец первого и начало второго пептидов из триптического гидролизата.
При очень большой длине исходных полипептидных цепей (200—500 аминокислотных остатков) прежде всего разрывают цепь на несколько относительно длинных фрагментов, так как было бы очень трудно сразу с уверенностью разделить, скажем, 50 пептидов, которые получатся при обработке белка трипсином. Здесь можно было бы воспользоваться реакцией с бромцианом — химическим методом, при котором происходит расщепление пептидных связей только рядом с остатками метионина. Поскольку метионин, как правило, в белках встречается редко, образуется небольшое число длинных фрагментов, которые можно разделить и исследовать по отдельности.
Сэнгер в 1953 г/впервые определил аминокислотную последо- нательность белка. Этим белком был инсулин (см. рис. 39.2).
Анализ последовательностей аминокислот представляет собой । оловоломку. Здесь не существует прямых методов вроде тех, < которыми мы познакомились в разделе об определении последовательностей нуклеотидов (гл. 4). Приходится использовать ре- «ультаты, получаемые при расщеплении пептидных цепей многими способами и из образующихся фрагментов воссоздавать непротиворечивую общую картину. На рис. 14.8 представлена часть выясненной последовательности рибосомного белка LIO (Heiland, Brauer, Wittmann-Liebold, 1976). В настоящее время известны полные или частичные последовательности более чем 700 различных белков.
Химические методы пригодны лишь тогда, когда имеется достаточное количество исходного материала. Теперь, после того как расшифрованы аминокислотные последовательности наиболее час- 10 встречающихся белков, встает задача определения последовательностей в белках, которые можно получать лишь в мнкрограм- мовых количествах. Выход состоит в том, чтобы использовать радиоизотопы в сочетании с классическими методами разделения и идентификации. Метод Эдмана модифицирован и усовершенствован. Сейчас одного микрограмма лизоцима (7-10-11 моль) уже оказалось достаточно для определения последовательности двадцати N-коицевых аминокислот.
При анализе антигенов гистосовместимости (см. гл. 23) пользовались еще более усовершенствованным методом. В самом благоприятном случае в распоряжении экспериментатора было всего
5ЮН»»
Ai«i leu Ainieu Gin Asp ly$ Gin Ala |!« Vcl Ala Giu Vol S«r Ghj Va! Ala Lyi Gly Alo lev 5e# Alo Vol
Секбеншнир*e****e***»e**#n*»**»***#
Трипсин'—u—..^_^=iuu,uj>11 , -i.it
Пропсам St.uur —it^.^ _^i
Химотрипсин Терматиин—,,
ЭСК tn isS3
Vol Ala A*» Ser Arq&Ty Vol The Vo’ Atplr-^el Thr C*> lev Affr lyt Mo Gb ArgOv AloG»y Vol lye
Гепбспитор., , . • ,„♦»♦♦♦♦«... . (.) ♦ .,(.)♦•
Трипсин-_-____i i____>_^l ^-^^Яi—• fi.—_r 1____-_ь
Upemeaie SI. gar. оft Химотрипсин,
Тсрмомлип——
Рис. 14.8. Пример определения аминокислотной последовательности белка (N-ko»- невого участка белка L10 из рибосом Е. colly Указанные ферменты — трипсин, протеаза из Staphylococcus aureus (St. аиг.), химотрипсин, термолизин — расщепляют полипептид в указанных местах. Знаками —►, + н • отмечены аминокислоты, природа и положения которых установлены с помощью секвенатора (Heiland et al., 1976).
лишь 10~8 моль белка, и это уже позволило определить аминокислоты в N-концевом участке. Белок синтезировался клетками в культуре, к которой в это время добавляли радиоактивные аминокислоты— в каждом опыте какую-то одну из двадцати. При этом радиоактивность появлялась в белке только в тех местах, где находятся соответствующие аминокислоты. После разрушения клеток белок осаждали с помощью специфических антител, затем вызывали диссоциацию комплекса антиген —антитело и очищали белок от оставшихся примесей методом гель-электрофорсза. Положение включившихся меченых аминокислот определяли стандартным методом Эдмана.
ЛИТЕРАТУРА
Darnall D. W„ Klotz I. М. (1975). Subunit constitution of proteins: a table, Arch. Biochem. Biophys., 166, 651.
Dayhoif M. O. (ed.). 1972. Atlas of protein sequence and structure, Washingon, National Biomedical Research Foundation. Suppl. 1, 1973; Suppl. 2, 1976; Suppl. 3, 1979.
Goodenough D. A., Stoeckenius IF. (1972). The isolation of mouse hepatocyte gap junctions, J. Cell Biol., 54, 646.
Haurowitz F. 1963. The chemistry and function of proteins, 2. Aufl., New York, London, Academic Press.
Hetland L, Brauer D., Wittmann-Ltebold B. (1976). Primary structure of protein LIO from the large subunit of Escherichia coll ribosomes, Hoppe-Scyler's Z. Physiol. Chern., 357, 1751.
Laursen R. A. (1971). Solid-phase Edman-degradation. An automatic peptide sequencer, Eur. J. Biochem., 20, 89.
O'Farrell P. H. (1975). High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins, J. Biol. Chern., 250, 4007.
O'Farrell P. Z., Goodman H. M., D'Farrell P. H. (1977). High resolution two-dimensional electrophoresis of basic as well as acidic proteins, Cell, 12, 1133.
Wittmann-Ltebold B„ Marzinzig E. (1977). Primary structure of protein L28 from the large subunit of Escherichia coli robosomes, FEBS Lett, 81, 214.
КАК ОПРЕДЕЛЯЮТ ТРЕТИЧНУЮ СТРУКТУРУ? РЕНТГЕНОСТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ
Каждая полипептидная цепь складывается в специфическую фехмерную конфигурацию — третичную структуру. Лишь в этом шергетически выгодном состоянии белок проявляет свою фермен- штивиую активность. Таким образом, столь трудоемкое выяснение первичной структуры белка (см. предыдущую главу) еще мало что дает для понимания его функций. Для выяснения третичной структуры белка используют рентгеноструктурный анализ, однако <>н применим только в том случае, если в распоряжении исследователя имеются кристаллы соответствующего белка.
В результате рассеяния рентгеновских лучей на кристалле получается дифракционная картина, которая состоит из ряда рефлексов, отличающихся друг от друга положением и интенсивностью. Собирающих линз для рентгеновских лучей не существует, и поэтому невозможно по дифракционной картине воссоздать реальную картину структуры. Видимый свет при известных условиях (в том случае, когда все кванты испускаемого атомами света имеют одинаковую фазу) тоже может давать дифракционную картину. Такая синхронность испускания света достигается с помощью лазера. Если на пути лазерного луча поставить диафрагму, то на ней будет происходить дифракция. Дифракционная картина, которая математически описывается преобразованием Фурье, может быть отображена на экране. На стр. 217 приведены такого рода картины, получаемые в результате дифракции на разных диафрагмах. Преимущество использования лазера состоит в том, что он позволяет легко продемонстрировать часто кажущиеся абстрактными дифракционные картины. Рефлексы на периферии дифракционной картины менее интенсивны, чем в центре; таким образом, наглядно видны ограничения метода: разрешающая способность определяется возможностью оценки параметров периферических рефлексов. Кристалл состоит из мельчайших повторяющихся структурных единиц —элементарных ячеек. Существует только семь различных кристаллических систем, которые отличаются друг от друга симметрией элементарной ячейки (рис. 15.1):
Типы кристаллов: система
Параметры элементарной ячейки как выражение симметрия
Триклинная
Моноклинная
Орторомбическая
Тетрагональная
Гексагональная
Тригональная, или ромбоэдрическая
Кубическая
а^Ьч^с а^р^у^ОО" а^Ьч^с а=у=90°, В^ЭО* ат^Ь^с а = р=у=90° 8=6^0 а=р=у=90* a = b^c а = р=90°, у=120* a=b—с а=р=у<120ечМ» a = b=c а=р=у=90*
Для определения структуры белка прежде всего важно знать, какую симметрию имеет элементарная ячейка, к какому типу она принадлежит и сколько содержит белковых молекул, Часто их очень много, что чрезвычайно затрудняет анализ структуры белка (см. о структуре вирусов в гл. 46).
Если расстояние между точками решетки в некоторой структуре равно d, то получается картина дифракции, состоящая из линий, расстояние между которыми равно d*, причем d* = \(d. Это означает, что размеры в дифракционной картине будут обратными по отношению к картине первоначальной структуры. При двумерной решетке с расстояниями точек а и b картина дифракции представляет собой систему перекрещивающихся линий. Преобразование Фурье, таким образом, сводится к умножению двух серий линий. Линии расположены не перпендикулярно друг другу, а образуют угол, зависящий от угла в исходной структуре.
a* = l/(asina)
6* = 1/(6 sin а).
Обратная решетка характеризуется векторами а* и Ь* (рис. 15.2).
Рентгеновские лучи испытывают дифракцию на образце (например, кристалле) в результате взаимодействия с электронными оболочками атомов в молекулах. Так как получаемая картина — результат дифракции на многочисленных атомах, интенсивность рефлексов в дифракционной картине отражает распределение электронной плотности вокруг атомных ядер. Вклад отдельных функциональных групп в молекуле различен. Например, ион железа, расположенный в центре порфиринового кольца, имеет существенно более высокую электронную плотность, чем боковая цепь аминокислоты глицина. Связь между интенсивностью рефлекса и распределением электронной плотности описывается с помощью так называемого структурного фактора. В кристалле (и в молекуле) определенные расстояния всегда повторяются так, что получающиеся характерные рефлексы подчиняются условию Брегга
O=2dsin6=nX
(см. также рис. 15.3).
Одних лишь оценок расстояний между рефлексами и их интенсивности не достаточно для того, чтобы делать выводы о молекулярной структуре кристалла, так как при дифракции рентгеновских лучей возникает фазовый сдвиг. Эту проблему разрешил Перутц: он предложил вводить в молекулу белка атомы тяжелого металла и получать изоморфные производные белка. Он исходил из того, что можно легко учесть вклад тяжелого металла, а таким образом и фазовый угол рассеяния на белке. Однако измерение все же сопряжено с ошибками. Для дальнейшего уточнения и
л
• • •• • ! • * • • t. *_/ ./_/..
кристаллических решеток, а, Ь, с и углами о, р, у. элементарных ячеек (Wil-кристаллических решеток, а, Ь, с и углами о, р, у. элементарных ячеек (Wil-Б
кристаллических решеток, а, Ь, с и углами о, р, у. элементарных ячеек (Wil-
кристаллических решеток, а, Ь, с и углами о, р, у. элементарных ячеек (Wil-
Рис. 15.1. А. Пространственное изображение одной из Элементарные ячейки характеризуются длинами ребер Б. Решетка может быть построена из различных типов son, 1966).
Рис. 1БЛ. Построение обратной решетки (А—►В): а—►а*. Ь—►Ь*.
Рис. 15.3. Соотношения Брегга: угол падения равен углу отражения. Луч отражается от центров рассеяния, расположенных на параллельных плоскостях решетки, расстояния между которыми d. 2</sine=nX.
прежде всего для установления знака (установление того, происходит ли усиление или ослабление) требуется введение второго или даже третьего и четвертого сортов тяжелых атомов и измерение рефлексов от соответствующих производных. Полипептидные цепи в белках и полинуклеотидные цепи в нуклеиновых кислотах часто принимают форму спирали. В связи с этим важно знать, что рентгеновская картина от спирали всегда имеет вид креста и описывается функцией Бесселя (рис. 15.4).
6 5 13 2 1 0 1 2 3 4 5 6I—L J I L I | I I 1 I | | Фц«х*и« Паям (noftedm)6 5 13 2 1 0 1 2 3 4 5 6I—L J I L I | I I 1 I | | Фц«х*и« Паям (noftedm)
6 5 13 2 1 0 1 2 3 4 5 6
I—L J I L I | I I 1 I | | Фц«х*и« Паям (noftedm)
6 5 13 2 1 0 1 2 3 4 5 6
I—L J I L I | I I 1 I | | Фц«х*и« Паям (noftedm)
Рис. 15.4. Схематическое рали с пятью единицамиРис. 15.4. Схематическое рали с пятью единицами
Рис. 15.4. Схематическое рали с пятью единицами
Рис. 15.4. Схематическое рали с пятью единицами
представление функций Бесселя для непрерывной спи- _ „на витрк (Р шаг витка). Рефлексы располагаются на
слоевых линиях с расстоянием 1/р. Повторяющаяся единица рефлексов (т) со-ставляет 1/л, где Л —расстояние единиц друг от друга (Wilson. 1966).
Технические проблемы рентгеноструктурного анализа
Для выяснения структуры белков требуется длина волны порядка 1 А. так как нужно разрешать структуры, находящиеся Друг от друга именно на таких расстояниях. а-Компонента К-излучения меди имеет длину волны 1,54 А, и ее относительно легко получать.
Ка-излучсние меди обычно получают, бомбардируя электронами медный анод, охлаждаемый водой. На рис. 15.5 представлена схема установки для получения картины рентгеновской дифракции на кристаллах. При использовании дифрактометра с детектором сразу же получаются численные величины интенсивностей рефлексов. При использовании пленки нужно перевести в численные значения степень почернения пленки путем измерения оптической плотности. Однако важно использовать пленку, так как это позволяет получать одновременно множество численных значений для интенсивностей рефлексов. При этом кристалл будет облучен в меньшей дозе, что особенно существенно при исследовании рентгеночувствительных белковых кристаллов.
Число рефлексов, необходимое для выяснения структуры белка, составляет около 10 000. Поэтому из чисто экономических соображений следует автоматизировать по возможности все этапы анализа. Дифрактометр подключается к ЭВМ, производящей рас-
Рис. 15.5. Схема устройства рентгеновского дифрактометра.
Рис. 15.6. Блок-схема аппаратуры в рентгеноструктурной лаборатории Института медицинских исследований им. Макса Планка в Гейдельберге. (Schulz, личное сообщение).
четы. Рентгеновская пленка анализируется с помощью автоматизированного микроденситометра (рис. 15.6), который вводит измеряемую величину в компьютер с надлежащей программой, выполняющий дальнейшие операции. Уже проведен анализ свыше 150 кристаллических форм 70 различных белков. Первое число больше второго, так как, прежде чем начинать структурный анализ, нужно еще найти подходящую кристаллическую структуру. Путем изменения концентрации солей, величины pH и других параметров удается получать различные формы кристаллов. Обычно белковые кристаллы содержат 30—60% воды, что делает их очень чувствительными к высыханию. Поэтому при рентгеноструктурном анализе их всегда вместе с остатком маточного раствора помещают в кварцевый капилляр. Однако наличие воды и раствора создает нежелательный фон рассеяния.
После измерения всех рефлексов рассчитывают распределение электронной плотности в элементарной ячейке. Для удобства расчета все рефлексы «разлагают» на ряд колец. Для каждого кольца находят электронную плотность и по полученным величинам строят изолинии на плексигласовых дисках. Затем эти диски накладывают
• топкой друг на друга и рассматривают на просвет. Таким образом создается трехмерная картина электронной плотности в элементарной ячейке.
Построение модели, правила и экстраполяции
Само по себе распределение электронной плотности не представляет интереса для молекулярной биологии. Нужна правильная интерпретация, и она основывается на попытках найти соответствие между некоторой моделью полипептидной цепи и электронной плотностью. Построение модели было существенно облегчено в 1967 г. Ричардсом, создавшим устройство, получившее название «камера Ричардса». Благодаря полупрозрачному зеркалу модель и построенная карта электронной плотности отображаются друг в друге (рис. 15.7).
Как правило, для такого построения модели требуется знание первичной структуры, так как карты электронной плотности, особенно при разрешении 3 А, еще сохраняют много степеней свободы. Однако в некоторых случаях распределение электронной плотности может указать на ошибки в анализе последовательности (рис. 15.8). При оптимальном разрешении иногда возможна даже полная расшифровка первичной структуры. Перед началом построения модели должен быть сделан ряд допущений. Требуется верный масштаб строительного блока, нужно кое-что знать о его природе, например знать расстояния между атомами. На рис. 15.9 представлены некоторые из важнейших параметров. Эти величины тоже определены по рентгеноструктурным данным; правда, они получены не для таких сложных структур, как белки, а для аминокислот и дипептидов.
В 1912 г. Лауэ в Берлине впервые показал, что рентгеновские лучи испытывают дифракцию на кристаллах и дают при этом характерную дифракционную картину, из которой он мог делать выводы о расположении атомов в кристаллах. Таким путем он прежде всего выяснил структуру кристалла NaCl. Позже он, а также и исследователи в других институтах Германии занялись выяснением структуры других малых молекул. Никто, однако, не рискнул взяться за изучение крупных молекул. После того как Самнере закристаллизовал уреазу (1926), можно было думать, что и белковые кристаллы годятся для такого исследования.
Этими проблемами заинтересовались также исследователи в Англии, в том числе Астбюри, Бернал и У. Брэгг. Средн сотрудников Брэгга в Кавендишской лаборатории в Кэмбридже были Перутц и Кендрью, а позднее и Крик. Перутц занимался выяснением структуры гемоглобина, Кендрью —миоглобина.
В Пасадене, в Калифорнийском технологическом институте, уже в 1936 г. Полинг выдвинул гипотезу о том, что в образовании и
ОсбыцгиигОсбыцгиигРис. 15.8. Стереофотография участка карты электронной плотности для цитохрома Ьь- Участок соответствует положениям аминокислот 9, 12 и 13. На карту наложена модель с аминокислотами Ile-Glu в положениях 12 и 13. В первоначально опубликованной последовательности были остатки Gly(12) и Не(13). Эти данные ее согласовались с распределением электронной плотности, и их пришлось пересмотреть (Mathews et al., 1971).Рис. 15.8. Стереофотография участка карты электронной плотности для цитохрома Ьь- Участок соответствует положениям аминокислот 9, 12 и 13. На карту наложена модель с аминокислотами Ile-Glu в положениях 12 и 13. В первоначально опубликованной последовательности были остатки Gly(12) и Не(13). Эти данные ее согласовались с распределением электронной плотности, и их пришлось пересмотреть (Mathews et al., 1971).
Осбыцгииг
Осбыцгииг
Рис. 15.8. Стереофотография участка карты электронной плотности для цитохрома Ьь- Участок соответствует положениям аминокислот 9, 12 и 13. На карту наложена модель с аминокислотами Ile-Glu в положениях 12 и 13. В первоначально опубликованной последовательности были остатки Gly(12) и Не(13). Эти данные ее согласовались с распределением электронной плотности, и их пришлось пересмотреть (Mathews et al., 1971).
Рис. 15.8. Стереофотография участка карты электронной плотности для цитохрома Ьь- Участок соответствует положениям аминокислот 9, 12 и 13. На карту наложена модель с аминокислотами Ile-Glu в положениях 12 и 13. В первоначально опубликованной последовательности были остатки Gly(12) и Не(13). Эти данные ее согласовались с распределением электронной плотности, и их пришлось пересмотреть (Mathews et al., 1971).
Кирти WAIпроймой плотниаш
^рти электродной плотномш (накски'псль)
Рис. 15.7. Схема устройства для построения структурных моделей (камера Ри-чардса). Карты электронной плотности вставляются в раму и просвечиваются на-сквозь с обратной стороны (на схеме справа). Модель вставляется в раму (насхеме внизу) таким образом, чтобы структурные элементы накладывались на от-раженное распределение электронных плотностей. Величина рамы порядка 2—3 м(длина ребра) (Richards, 1968).
15. Как определяют третичную структуру? 243
Рис. 15,9, Л. Размеры элементов пептидной связи. Б. Эта связь частично двойная: атомы, обведенные на верхней схеме рамкой, всегда лежат в одной плоскости.
стабилизации сложных белковых структур участвуют водородные связи. К такому выводу его привела интерпретация рентгеноструктурных данных по кератину и миозину, полученных Лстбюри. Полинг указал на то, что все атомы, участвующие в пептидной связи, должны лежать в одной плоскости, так как между С и N образуется частичная двойная связь. Далее он постулировал, что термодинамически выгодными конформациями полипептидных цепей должны быть спиральные структуры. Однако лишь в 1950 г. удалось построить модель а-спирали с точно установленными размерами. Полинг на основании данных, полученных английской группой исследователей, построил около 120 различных моделей, прежде чем полностью удостоверился в своем выводе и согласовал предложенную им структуру со всеми имевшимися рентгеноструктурными данными. В 1953 г. работы по выяснению структуры молекул путем построения моделей достигли новой кульминаций: Уотсон и Крик создали свою модель двойной спирали ДНК. Спиральные конформации полипептидных цепей относятся к категории вторичных структур. Известны типы спиралей, отличающиеся от а-спирали числом аминокислотных остатков на виток и шагом витка.
а-Спираль встречается наиболее часто и предпочтительнее других конформаций, так как она, как правило, термодинамически наиболее выгодна. Ко вторичным структурам принадлежат также р-складчатые структуры, в которых две (или большее число) расположенные параллельно или антипараллельно полипептидные цепи соединены между собой водородными связями.
Рис. 15.10. Третичная структура миоглобина. Изображен остов полипептидной цепи (атомы С белые, атомы N черные). Аминный конец обозначен N, карбоксильный конец—С. Представлены также все водородные связи (пунктирные линии), стабилизирующие вторичную структуру (а-спирали); остальные водородные связи, участвующие в стабилизации третичной структуры, не изображены. (По Kend- rew, 1961, сильно упрощено).
Полипептидные цепи в белке могут образовывать какие-то вторичные структуры, но этого может и не быть. Например, гемоглобин, миоглобин и цитохром с богаты а-спиралямн (рис. 15.10), тогда как конканавалин Л (рис. 15.11) и иммуноглобулины содержат много складчатых структур, а в лизоциме мало участков с упорядоченной вторичной структурой (рис. 15.12).
После того как стали известны первые третичные структуры (гемоглобина, миоглобина и лизоцима), начались поиски общих закономерностей, которые помогли бы предсказывать укладку полипептидной цепи. Модели, представленные на рис. 15.10—15.12, хотя и дают правильные расстояния между центрами атомов, но
не отражают того факта, что каждый атом окружен электронной оболочкой определенной величины. Поэтому модель может привести к ложному представлению о том, что молекула белка — образование чрезвычайно рыхлое. На самом же деле как раз наоборот: если построить аналогичную модель из шариков, размеры которых пропорциональны атомным радиусам, то получится очень компактная структура, внутренние части которой плохо просматриваются.
Остовом полипептидной цепи (см. рис. 15.9) служит последовательность атомов
Рис. 15.11. Укладке полипептидной цепи одной из идентичных субъединиц конка- навалина А. Изображены только Са-атомы. Видно, что очень большую долю составляют Р-складчатые структуры. Са-атомы, выделенные черным цветом, находятся в контакте с атомами P-структуры, которая расположена под прямым углом к p-структурам, изображенным на схеме, и принадлежит соседней субъединице (Becker et at, 1975).
Рис. 15.12. Третичная структура лизоцима. Изображен остов полипептидной цепи (атомы С белые, атомы N черные). Как и на рис. 15.10, показаны только те водородные связи, которые участвуют в стабилизации вторичных структур (о-спи- ралей, 0-структур). Дисульфидные мостики представлены волнистыми' линиями. (По Phillips, 1966, сильно упрощено.)
Связь С—N (пептидная связь)—планарная. Поэтому два а-атома соседних аминокислот расположены относительно друг друга по диагонали в одной плоскости и вращение атомов или боковых групп молекулы вокруг оси С—N невозможно. Однако возможно вращение вокруг связи N—С (соответствующий двугранный угол обозначают" 0) и вокруг связи Са—С (двугранный угол ф) (рис. 15.13),
Теперь можно поставить вопрос о том, реализуются ли все мыслимые значения углов 6 и ф между 0 и 360°. Если построить пространственную модель из шариков, тотчас же выяснится, что это невозможно, так как иначе во многих случаях перекрывались бы электронные облака атомов в боковых цепях аминокислот. Подобного же типа запреты имеют место, если атомы Н и О соседних пептидных связей слишком сильно сближаются.
Рамачандран и его сотрудники в Индии (1956—1961 гг.) определили в гемоглобине и миоглобине углы 0 и ф и расположили их по двум координатным осям. Эта так называемая диаграмма Рамачандрана (рис. 15.14) позволила сделать ряд важных выводов. Из определенных комбинаций углов можно предсказать конформацию. Диаграмму разделяет диагональ. Если углы оказываются на диаграмме «вверху справа», то получаются левые спирали, а ес-
Рис. 15.13. Углы вращения ф, ф и ю. На схеме изображена конформация, в которой ф=ф=0. Так обстоит дело в полностью растянутой молекуле (Edsall et al., 1966).
Рис. 15.14. Диаграмма Рамачандрана. Штриховкой выделены области предпочитаемых комбинаций углов. Символами с», Р, (Dr и т. д. обозначены специфические вторичные структуры (спирали, ленты, (j-структуры). С —структура коллагена; р _ спираль полипролина. Пунктирные изолинии соответствуют областям с левыми спиралями, сплошные —с правыми спиралями. Изолинии указывают число аминокислотных остатков в повторяющейся единице (витке, складке) (Ramachandran, Sasisekharan, 1968).
Рис. 15.15. Пример левов и правой спиралей: рога антилопы куду (из Дарвина).
ли «внизу слева», то правые спирали. Оба типа структур не перекрываются (рис. 15.15). Прямо на диагонали расположены значения углов, приводящие к образованию складчатых структур, в которых 0 = ф. Предпочтительными оказываются две области — область $й = ф = 240° и область Ф от 20 до 140°, в которых группы С —О пептидной связи максимально удалены от боковых цепей соответствующих аминокислот. Остальные области, которые на диаграмме не заштрихованы, соответствуют «запрещенным» комбинациям углов.
Можно ли предсказать существование вторичных структур?
Дж. Уотсон, Кендрью и Перутц пытались на основе полученных ими данных найти закономерности, определяющие образование а-спирали. Они, в частности, установили, что в а-спиральных областях через каждые 3,6 аминокислотного остатка располагаются гидрофобные остатки, обращенные внутрь молекулы. Такая периодичность как раз точно соответствует виткам спирали. Эти исследователи далее нашли, что существуют комбинации аминокислот, которые обязательно приводят к нарушению спиральной структуры. Такова, например, последовательность Asp-Pro. Эти данные схематически суммированы на рис. 15.16. За последнее время в поисках определенных закономерностей были изучены все белки с известной первичной, вторичной и третичной структурой. Многие исследователи пытались выявить дальнейшие закономерности. При этом они часто использовали весьма тонкий подход: выясняли с помощью ЭВМ вероятности появления определенных
Рис. 15.16. Вторичные структуры в глобинах. Области а-спиралей изображены волнообразными линиями, неспиральные — прямыми. Спирали обозначаются Л, В, С и т. а.; области, расположенные между ними, — АВ. ВС... Положения, в которых могут находиться только гидрофобные аминокислоты, указаны черными кружками. Крестики — положения, в которых стоят остатки пролина и соседние с ними остатки Ser, Thr, Asp, Asn. Все другие аминокислоты обозначены белыми кружками. Аминокислотные остатки, выделенные прописными буквами, инвариантны (Perutz et al, 1965).
последовательностей и сравнивали частоту всевозможных групп из двух, трех и более аминокислот в спиральных и нсспиральных областях.
В 1974 г. Шульц из Института медицинских исследований в Гейдельберге осуществил тест для проверки подобных методов. К тому времени в этом институте была выяснена одновременно первичная и третичная структура аденилаткиназы (Schirmer, Schulz и др.). Еще до опубликования результатов Шульц передал сведения о первичной структуре всем исследовательским группам, ранее предложившим правила для предсказания вторичной структуры. Перед ними была поставлена задача предсказать спиральные области, области складчатой структуры и места изломов. Результаты оказались поразительными. Правда, некоторые предсказания были не особенно точными, но в целом получилось весьма хорошее согласие между предсказанными структурами и структу-
..Шпилей"□ а □ □□..Шпилей"□ а □ □□О □СП□ □О □СП□ □Рис. 15.17. Вторичные структуры, предсказанные для аденилаткиназы (см. текст). Всем методам придан равный вес. Для сравнения указаны вторичные структуры, найденные экспериментальным путем (Schulz et al., 1974).Рис. 15.17. Вторичные структуры, предсказанные для аденилаткиназы (см. текст). Всем методам придан равный вес. Для сравнения указаны вторичные структуры, найденные экспериментальным путем (Schulz et al., 1974).
..Шпилей"
□ а □ □□
..Шпилей"
□ а □ □□
О □СП□ □
О □СП□ □
Рис. 15.17. Вторичные структуры, предсказанные для аденилаткиназы (см. текст). Всем методам придан равный вес. Для сравнения указаны вторичные структуры, найденные экспериментальным путем (Schulz et al., 1974).
Рис. 15.17. Вторичные структуры, предсказанные для аденилаткиназы (см. текст). Всем методам придан равный вес. Для сравнения указаны вторичные структуры, найденные экспериментальным путем (Schulz et al., 1974).
рами, определенными экспериментально. Удалось идентифицировать практически все а-спиральные области, распознать в пятицепочечной fl-складчатой структуре три центральные цепи и верно локализовать почти все изломы (рис. 15.17). Тем самым эффективность таких предсказаний была подтверждена. Теперь этим методом уже пользуются при интерпретации неоднозначных рент- геноструктурных данных.
Другие методы исследования третичной структуры
В настоящее время примерно для 50 белков известна структура с атомарным разрешением и еще для десяти белков — приблизительная укладка полипептидных цепей. Это в большинстве случаев глобулярные белки, многие из них —ферменты. Таким образом, еще нет представительной выборки возможных и действительно существующих третичных структур. Большие трудности для рентгеноструктурного анализа представляют фибриллярные и гидрофобные белки, белки, связанные с мембранами, а также те, которые в клетке ассоциированы с другими белками и нуклеиновыми кислотами и образуют крупные комплексы, как, например, белки рибосом.
В паше время структуру крупных белков, связанных с мембраной, изучают иным методом — путем анализа электронно-оптической картины с помощью преобразования Фурье. Правда, разре-
шение этого метода, меньше — 5 А вместо 1 А, однако этого пока достаточно, чтобы получить грубую картину формы белковом молекулы и некоторых ее структурных элементов. В гл. 29 мы обсудим результат одного такого анализа, а сейчас лишь коротко опишем методику. Разрешение в электронном микроскопе зависит от техники приготовления препарата. Зернистость или же нерегулярность, возникающая в результате контрастирования тяжелыми атомами, создает помехи, которые наслаиваются на биологическую структуру. В технике связи это явление называют шумом, и существуют способы его устранения с помощью фильтров. Лучше всего помогают фильтры в случае информации, имеющей периодический характер. Пусть имеется множество одинаковых элементов изображения, расположенных, например, друг за другом. На каждый отдельный элемент изображения накладывается какая-то помеха. После суммирования такого рода искаженных сигналов получают больше информации об отдельном элементе изображения. Чтобы достичь желаемого результата, создают множество копий изображения и накладывают друг на друга сходные элементы изображения. При этом все периодические составляющие усиливаются, тогда как непериодические составляющие (помехи) уничтожаются (см. рис. 34.4). Этот метод был разработан в 1963 г. Мархэмом и его сотрудниками в Кембридже (Англия). Аналогичный пример — предсказание вторичных структур (рис. 15.17). Клуг и сотр. (1964) улучшили этот метод и предложили создавать с помощью лазерного луча картину рассеяния света фотографическим изображением, а затем производить преобразование Фурье и путем обратной трансформации воссоздавать исходную картину. При этом можно накладывать друг на друга ряд изображений и использовать их в совокупности. Применение подходящих масок позволяет усиливать одни элементы изображения и устранять другие. Такого рода оптическая фильтрация тоже связана с определенными трудностями. Она применима в том случае, когда можно считать некоторые параметры известными, что позволяет производить экстраполяцию. Таким образом, практически речь идет о методе приближения с помощью оптимизирующих шагов.
ЛИТЕРАТУРА
Becher I. №.. Reeke G. N., Wang J. L., Cunningham B. A., Edelman G. M. (1975). The covalent and three-dimensional structure of concanavalin A, J. Biol. Chern., 250. 1513.
Edsall J. T„ Flory P. J„ Kendrew J. C„ Llquori A. M., Nemethy G., Ramachandran G. N. (1966). A proposal of standard conventions and nomenclature for the description of polypeptide conformations, J. Mol. Biol., 15, 399.
Holmes К. C., Blow D. M. 1965. The use of X-ray diffraction in the study of protein and nucleic acid structure. New York, London, Sydney, J. Wiley and Sons Inc Hoppe W., Lohmann 117.. Marhl H„ Ziegler H. 1977. Biophysik: Ein Lehrbuch, Berlin, Heidelberg. New York, Springer.
РОДСТВЕННЫЕ СВЯЗИ, гомологии
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ТОПОЛОГИЧЕСКОЕ РОДСТВО
Для чего нужно знать структуру белка? В предыдущей главе указывалось на то, что знания одной лишь первичной структуры какого-то белка недостаточно для понимания его функции. В гл. 18 мы увидим, что точное пространственное положение всех аминокислотных остатков—необходимая предпосылка осуществления специфической функции, и это расположение можно определить только тогда, когда известна и первичная, и третичная структура. Мы узнаем также, что имеются физико-химические методы, которые полезны при выяснении структуры и могут указать на значение отдельных аминокислотных остатков.
Белки — первичные продукты генов. Последовательность аминокислот в них отражает последовательность нуклеотидов в нуклеиновых кислотах. Поэтому белки — важнейшие маркеры для изучения процессов эволюции и экспрессии генов. При использовании их с этой целью основываются на ряде предположений. Прежде всего, можно исходить из того, что определенные функции в ходе эволюции оказались чрезвычайно консервативными. Например, во всех эукариотических клетках ядро содержит гистоны, в цитоплазме имеются актин, миозин и тубулин, в митохондриях— все необходимые ферменты дыхательной цепи и т. л. Эти белки у всех организмов играют одинаково существенную роль, и это означает, что они подвергаются сильному давлению отбора, направленному на сохранение их структуры и функции. С другой стороны, известно, что существуют белки, которые встречаются лишь в немногих типах дифференцированных клеток и появились в процессе эволюции относительно поздно. Их функция необходима для всего организма, ио часто она менее важна, чем функции белков, упомянутых выше. Следует также отметить особые, чрезвычайно полиморфные белки, функция которых состоит в том, чтобы существовать во множестве различных вариантов. Типичными белками этой группы являются антитела (см. гл. 22) и антигены гистосовместимости (см. гл. 23).
КАК МОЖНО ВЫЯВИТЬ РОДСТВО?
Введем вначале три определения. Мы будем называть белки
гомологичными, если они одинаковы или сходны по строению и выполняют у разных организмов одинаковые функции;
паралогичными, если они различны по своему строению, но выполняют одинаковые функции;
ортологичными, если они существуют у одних и тех же особей, но выполняют различные функции.
с тс т30to vol Ser leu Gin AspGin Vo' Ser leu Asn30to vol Ser leu Gin AspGin Vo' Ser leu Asn”0”0ITS ser Ser to Tn- s„ITS ser Ser to Tn- s„lys C,S Leu lys AM Prelys C,S Leu lys AM PreVol HryVol HryPhe Asp Gl- Gly Ser Ser Ser Giv Lys lie Gm Lys .eu Lys Asn lie Asn Vai vol Olu Gly Asp O u Gm Phe lie Ser AMPhe Asp Gl- Gly Ser Ser Ser Giv Lys lie Gm Lys .eu Lys Asn lie Asn Vai vol Olu Gly Asp O u Gm Phe lie Ser AM90Ac lys Vai Phe lys90Ac lys Vai Phe lysSer Gly vor Serleu Qu Gry Gr, lyiSer Gly vor Serleu Qu Gry Gr, lyi?00se- Cy-Jwlto Asps., a, to РЯ.^рГсЯ;„ ^ ^„^ Uo?00se- Cy-Jwlto Asps., a, to РЯ.^рГсЯ;„ ^ ^„^ Uo^p Thf^p Thfvc | Vai :.s|se- av iys lev O'vc | Vai :.s|se- av iys lev O'
с т
с т
30
to vol Ser leu Gin Asp
Gin Vo' Ser leu Asn
30
to vol Ser leu Gin Asp
Gin Vo' Ser leu Asn
”0
”0
ITS ser Ser to Tn- s„
ITS ser Ser to Tn- s„
lys C,S Leu lys AM Pre
lys C,S Leu lys AM Pre
Vol Hry
Vol Hry
Phe Asp Gl- Gly Ser Ser Ser Giv Lys lie Gm Lys .eu Lys Asn lie Asn Vai vol Olu Gly Asp O u Gm Phe lie Ser AM
Phe Asp Gl- Gly Ser Ser Ser Giv Lys lie Gm Lys .eu Lys Asn lie Asn Vai vol Olu Gly Asp O u Gm Phe lie Ser AM
90
Ac lys Vai Phe lys
90
Ac lys Vai Phe lys
Ser Gly vor Ser
leu Qu Gry Gr, lyi
Ser Gly vor Ser
leu Qu Gry Gr, lyi
?00
se- Cy-Jwlto Asps., a, to РЯ.^рГсЯ;„ ^ ^„^ Uo
?00
se- Cy-Jwlto Asps., a, to РЯ.^рГсЯ;„ ^ ^„^ Uo
^p Thf
^p Thf
vc | Vai :.s|se- av iys lev O'
vc | Vai :.s|se- av iys lev O'
’10"50
С?» to vol pro Alo Ле Gin p-0 Vai Юи St- Gly leu St' Ar; he *a to AspGA. G*. Ata <o. Pro to Ser
Vo Asp Asp Asp Asp Lys lie Vol Gly Gly Туг Те. Q,s Cl, Alo Asn Thr
AU 50 6C70
lye Thrloiyl PeejerisP-teCvsto3-ySe-levlieAsrlouAs-Jr-oу оvol *пг|диAlohis Cyslciyto Ginfh'Ser Av Jva J ■» volA,aGlyGo
Seri to] Tyr l^sone Lys to»fSerlevl-eAvn|se-Gm|'-pVo.«|ser|AlaAcA r,s|t(,,.,s SerGlylie a- [vaj Arg I eutoGoAsp
Рис. 16.1. Аминокислотные последовательности химотрипсина (С) и трипсина (Т). Чтобы можно было сравнивать гомологииные (собственно, ортологичные) области друг с другом, кое-где приходится располагать цепь с разрывами (в основном iТ). Возникли ли эти различия в результате делений в гене, кодирующем Т. или вставок в гене, кодирующем С, на основаннн приведенных данных сказать нельзя. Аминокислоты, заключенные в рамку, инвариантны. Нумерация положений относит-ся только к последовательности С (Walsh, Neurath, 1964).
X и
X
X
3 Е х х» го X
о
2
о
to X
о» го го я
8 g
2
£ X
2 го
О 2,ч ох Е ^
2, <и —,
X
а о
2
р\ ох о to ГО ч 2^0
2 to
2 X
ы S о X о S
X to to to X о
to to
ч
с хэ
га
X
£
£
га
о
g
to
о
о
to
2
о
13
£
о
О to о
2 г
X о
ш to
X
X
W о
2
о
2
£ 2
го
-о X
2
to 2
О -1 я to
to to
го
2
to о
2
16. Родственные связи, гомологии последовательностей
taw; 35
X
to 2
51
Е я
to в X
Е о
2 л X
to: to —
_то со
Е Ох
О
34
о о я ох-о
х
СО
□
to я
л to
-о о
го ш О
3 X
о го
to to
О
о W
0*9
£ 2 х
- to X о D Ш
о Q-E 20
X о ° t
О =
to
8 S
га ч О
О
я
5
ь
X о
2 ^Ь ю о
о
х и
2: X о ч О
о р
У Е го
^ s
го у го Е
х X
Е
О
о
to го
5
а
5
to
2 to го X о а х ч to 3 Е х х
to X X to 2 о со
и =
й ■а
X го х
Ох
го
О
го
и>
ох го
X to
х г я о
to у X Е X
о to
2
* X
to
го
X to го го X о 2 Е X
С о to ч 2
л
гоо
G to
о
X
Е
СП
^5~ 3
X to го ГО X о 2 £
Ей
X
to 2 X
с
X
*
о
о
г
ЗЕ
о
К
==
to
5
»
го
СО
О
2 О
X X to с
о
ш х л X с
о
о а
К
X
о X о
аз а о
2 р О
а
la
Л X
Е го
го X Е
О
СП х а
х X
го ■о
ох ас £ е СО го to
2
О
Е
-§
Ох _ 2g
СТ1 у
СО to
ГО я х ° 9
о ° Е Р Е Е
* = 5
х = to го
С*
2
го to О
Е □ х
вопросов и неясных филогенетических отношений, чем в относительно хорошо исследованной группе млекопитающих. Так как анализ последовательностей в белках насекомых чрезвычайно труден, здесь нужны иные методы. В последние годы в этой области все шире применяется гель-электрофорез (без добавления додецилсульфата натрия). Гель-электрофорез ничего не говорит о последовательностях аминокислот и об их заменах, не изменяющих электрический заряд, а может выявить только различие в заряде между двумя сравниваемыми белками. Однако практика показывает, что именно различие в заряде является чрезвычайно чувствительным показателем структурных различий между близко родственными белковыми молекулами (см. гл. 17).
Широко используется также метод серологического сравнения родственных белков. При этом выявляются только изменения поверхности белковой молекулы.
ГОМОЛОГИИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
О гомологиях последовательностей в последние годы много писали и высказывали немало гипотез. Классический пример, который все снова и снова привлекают при рассмотрении этой проблемы,— цитохром с. Этот белок встречается у всех эукариот и многих прокариот, и поэтому он служит превосходным объектом для сравнительного анализа. Его аминокислотная последовательность определена у большого числа видов (микроорганизмов, растений, животных). Если сравнивать цитохром с позвоночных с цитохромом с дрожжей, то обнаруживается различие более чем в 70% аминокислот. Однако определенные аминокислоты у всех исследованных видов все-таки идентичны. Несмотря на такое различие в аминокислотах, третичная структура цитохрома с у позвоночных и дрожжей почти одинакова. Из этого можно заключить, что общая структура является весьма консервативным элементом, так же как и положение определенных аминокислот. Допускается, правда, ряд замен, но следует учесть, что в большинстве случаев они тоже по природе своей консервативны, т. е. гидрофобная аминокислота может быть заменена какой-то другой, но тоже гидрофобной, а гидрофильная —другой гидрофильной. Радикальные замены (гидрофобная->тидрофильная или наоборот) относительно редки.
На основе знания генетического кода можно оценить, какова ожидаемая частота различных типов аминокислотных замен. Существует 61 кодон (64 за вычетом трех стоп-сигнальных кодонов) для аминокислот и, таким образом, 61X9 = 549 различных одноэтапных изменений, так как каждый кодон может в результате
замены одного нуклеотида перейти в 9 различных новых кодонов, например
UUU —► CUU, GUU, AUU
UCU, UGU, UAUUUC, UUG, UUA
Из 549 существующих возможностей 23 приводят к кодонам, означающим'обрыв цепи, 134 —к мутациям, при которых замена нуклеотида не сказывается на структуре белка, например
UUU —► UUG
Phe —* Phc.
132 ведут к консервативным заменам аминокислот, 100 — к нейтральным заменам и 160 —к радикальным заменам.
Если выразить эти величины в процентах и сравнить расчетные вероятности замен с их фактическими частотами, то окажется, что консервативных замен гораздо больше, чем следовало ожидать. Различие между наблюдаемыми и ожидаемыми частотами обусловлено давлением отбора, которое влияет на белок и допускает лишь структуры, способные функционировать. Особь, у которой образуется дефектный цитохром с, не имеет шансов выжить, и в результате ее генотип теряется.
По скорости эволюции отдельные белки очень заметно отличаются друг от друга. Чрезвычайно консервативны, например, гистон IV и актин. Гистон IV состоит из 102 аминокислот. При сравнении этого белка у гороха и коровы обнаружены всего лишь две замены: Ile->Val и Lys+->Arg+.
Можно сказать, что, за исключением особых случаев, белковые молекулы меньшей величины могут изменяться легче и быстрее, чем более крупные. Большие молекулы отличаются от малых не только числом аминокислот в полипептидной цепи, но и отношением объема к поверхности. Аминокислотные остатки внутри молекулы плотно упакованы, и там остается мало места для изменений.
Рентгеноструктурный анализ крупных белков показал, однако, что полипептидная цепь у них складывается не в один большой клубок, а в несколько доменов, соединенных между собой гибкими- полипептндными отрезками. Домен содержит сложенный фрагмент цепи длиной около 150 аминокислот. При рассмотрении дегидрогеназ (в одном из последующих разделов этой главы) и иммуноглобулинов (гл. 22) мы еще раз вернемся к значению доменов и их возникновению. В течение длительного времени скорость эволюции определенного белка постоянна, но это не должно вводить в заблуждение: эта скорость, подобно всем эволюционным параметрам, проходит различные фазы.
«Фаза поиска», в которой белок не выполняет никакой необходимой функции. Частота замен велика: никакая существенная информация от этого не страдает. Вероятность того, что нефунк- цнонируюший или плохо функционирующий белок будет вследствие мутации улучшен, относительно высока, и чем больше частота мутаций, тем больше вероятность того, что возникнет какая-то полезная функция.
Фаза возникновения определенной функции. Теперь уже допускаются только вполне определенные типы замен. Отбор противодействует всем изменениям необходимых структурных частей, и эволюция замедляется.
Оптимальная фаза. Здесь допустимы лишь очень немногие замены, которые влияют на функцию лишь минимальным (но существенным) образом. Вероятность того, что в результате замен получится оптимальный белок, относительно мала. Большая часть изменений приведет к отрицательным последствиям и будет элиминирована отбором. Эволюция идет теперь очень медленно.
Как любую функцию в эволюции, скорость аминокислотных замен в белках следует описывать не прямой, а S-образной кривой. Поэтому в эволюции не существует фазы, в которой улучшения (небольшие) были бы невозможны. Считается, например, что цитохром с в момент появления млекопитающих уже был оптимальным белком. Однако требования к его функциональной эффективности в разных группах млекопитающих в связи с различиями в образе жизни не одинаковы. Например, дыхание крота количественно (но не качественно!) весьма заметно отличается от дыхания газели.
Большая часть «разрешенных» замен происходит на поверхности или около поверхности молекулы. Так как цитохром с — мономер, частота замен в нем относительно высока. Нужно, однако, учитывать, что цитохром с выполняет в клеточном метаболизме вполне определенную функцию, и поэтому любое изменение его структуры может нарушить точно установленные равновесия. В цепи дыхания цитохром с принимает электрон от цитохрома b и сразу же передаст его цитохрому а-а3. К тому же он должен — в той или иной форме — всегда вступать в специфическое взаимодействие с другими цитохромами, за что, несомненно, ответственны участки полипептидной цепи, лежащие на поверхности молекулы.
Многие ферменты и структурные белки существуют в виде агрегатов, которые состоят из нескольких одинаковых или разных полипептидных цепей (субъединиц), образующих специфическую четвертичную структуру. При этом между субъединицами, расположенными рядом, возникает взаимодействие. После того как эти взаимодействия оптимально «отработаны», на соприкасающихся поверхностях субъединиц уже не должно происходить никаких изменений.
Рассмотрим это на примере эволюции гемоглобина. Гемоглобин насекомых — мономер. На уровне рыб после стадии димера возникает тетрамер, который остается и у наземных позвоночных. Эволюция гемоглобина у рыб шла примерно в шесть раз быстрее, чем у наземных позвоночных, так как у них испытывалось нечто новое (образование олигомерных форм). У примитивных наземных позвоночных функция тетрамера была уже оптимизирована и частота замен значительно снизилась. Образование тетрамера агра— это результат по меньшей мере одной дупликации гена. Два генных продукта известны как а- и р-цепи. Ради полноты следует упомянуть и дальнейшие дупликации, приведшие к появлению у-, 6- и е-цепей, однако здесь они нс будут нас интересовать.
Цепи аир эволюционировали независимо друг от друга, причем вначале а-цепи изменялись быстрее, чем p-цепи. Впоследствии р-цепь стала изменяться с той же скоростью. Причиной этого могло быть то, что p-цепи низших позвоночных образуют гомополимеры (тетрамеры), в то время как a-цепи их не образуют. Поэтому a-цепи могли свободно мутировать до тех пор, пока не наступил такой этап, когда они образовали с p-цепями кооперативно работающий гетсрополимер. С этого момента стало выгодным, чтобы и p-цепь приспосабливалась к новой ситуации, оптимизируя взаимодействие между цепями. После того как было достигнуто оптимальное состояние, начало действовать сильное давление отбора, направленное против дальнейших изменений. Наименее подвержен изменениям участок, где присоединяется гем; эволюция соответствующего «кармана» должна была закончиться 600—700 миллионов лет назад. Во время образования гетерополимеров замены аминокислот в контактных зонах накапливались во много раз быстрее, чем в других участках молекулы.
У всех олигомерных белков (белки, состоящие из нескольких субъединиц) изменяться могут лишь небольшие участки молекулы. В гл. 22 мы рассмотрим этот вопрос подробно на примере иммуноглобулинов, а в гл. 46—на примере белка оболочки вируса табачной мозаики.
Сериновые протеазы. До сих пор мы концентрировали свое внимание главным образом на гомологичных белках. Структурные гены (см. гл. 9) могут в ходе эволюции изменяться в результате событий, к которым, например, относятся
точечные мутации (о них уже говорилось); в результате таких мутаций в белках могут происходить замены аминокислот;
вставки — встраивание отрезков пептидной цепи в белок;
делении — выпадание отрезков цепи;
слияние генов: две нуклеотидные последовательности (два гена) сливаются в одну последовательность, управляющую образованием одной полипептидной цепи;
дупликация гена: информация, содержащаяся в гене, удваивается. Оба гена — старый и новый — могут слиться, а могут а остаться обособленными и эволюционировать независимо.
В дальнейшем мы в основном займемся последним случаем. Полное удвоение структурного гена ведет к появлению двух идентичных копий, кодирующих синтез одинаковых белков. Так как после дупликации в обоих генах независимо друг от друга могут накапливаться мутации, продукты этих генов через некоторое время тоже будут отличаться друг от друга, хотя функции их вначале будут оставаться одинаковыми (или по крайней мере сходными).
Мы еще вернемся к этому при рассмотрении изоферментов (см. гл. 17). В результате накопления аминокислотных замен могут появиться и функциональные различия между двумя белками. Так как исходный ген скорее всего содержит информацию для синтеза какого-то важного белка, то у одного из двух продуктов дупликации прежняя функция должна сохраняться, в то время как функция другого продукта сможет видоизменяться до тех пор, пока у него не появится сколько-нибудь важная новая функция. Существование двух генов, содержащих сходную информацию, не всегда является преимуществом для организма, так как в случае отсутствия регуляторного механизма будет синтезироваться двойное количество продукта данного гена, что может привести к значительному нарушению метаболизма. Давление отбора воздействует на число генов точно так же, как на структуру и функции генных продуктов.
Превосходным примером дифференциации функций служат сериновые протеазы. Речь идет о группе ортологичных белков (протеаз): эластине, тромбине, трипсине, химотрипсине и др. Все они
Рис. 16.3. Сериновые протеазы: сходства и различия. Цифры означают число общих аминокислотных остатков в гомологичных положениях полипептидных цепей (de Наел et al., 1975).
Фактор
ХихминаХИ
? Серинобия протеаза, икти- биррмил nepiai при псбрелакниа
Тромбопластин л плиз мы "
Xi
Фи^тар Крисмэса
IX
АнсНисгмофыичсский фиктпЦ
VHf
Фишпор Стюирпш
X
Проанщ-лдын V
протромбинК
Си2*, фосфолипиды
фосфалипибы
©0
ФибриногенФибрин
/Фибринов I :-П16
Сгууник
Тромбин
Рис. 16.4. Образование кровяного сгустка. Активация фибрнна в результате по-следовательного воздействия сериновых протеаз (каскадный механизм).
содержат серин как существенную часть активного центра. Аминокислотные последовательности большинства белков этой группы известны; часть данных представлена на рис. 16.1, дополнительные сведения —на рис. 16.3. Эти данные иллюстрируют трудность сопоставления аминокислотных последовательностей; выяснение родственных отношений возможно лишь тогда, когда выписывают последовательности друг под другом с учетом многочисленных вставок или делеций так, чтобы различия можно было объяснить минимальным числом мутаций. Опорными точками для правильной «подгонки» могут служить дисульфидные мостики и делении одинаковой длины, так как весьма маловероятно, чтобы такие особенности возникали многократно и независимо друг от друга.
Результаты анализа последовательностей указывают на то, что менее специализированные белки древнее высокоспециализированных, которые возникли в результате ряда последовательных дупликаций исходного гена. При этом присущее белку ферментатив-
ное действие сохраняется, а специфичность по отношению к субстрату изменяется. Имеющиеся данные о третичной структуре хорошо согласуются с этими выводами.
Серин в активном центре действует как донор протонов. В химотрипсине это аминокислотный остаток Ser 195, а в трипсине — Ser 183. Столь же важную роль играет остаток гистидина в положении 57. Все сериновые протеазы первоначально синтезируются в неактивной форме. В результате отщепления пептида неактивная форма переходит в активную, причем у химотрипсина процесс активации состоит из нескольких последовательных этапов.
Тромбин (высокоспецифическая протеаза) является одним из факторов свертывания крови; это компонент сложной, хорошо регулируемой системы, организованной по принципу каскада (рис. 16.4). Система приходит в действие только при необходимости. Ее существенные функциональные свойства перечислены ниже:
Система обычно неактивна, но в любой момент готова к действию.
На каждом этапе имеется контроль, осуществляемый тормозящими белками, который ограничивает действие системы во времени и в пространстве.
На каждом этапе особые сигналы служат для координации с другими системами надежности.
Только последний белок в цепи (тромбин) биологически активен.
Наивысшая по рангу сериновая протеаза активирует не только систему свертывания крови, но и сериновые протеазы других систем; например, ею активируются предшественники плазмина и калликреина.
Как видно из сказанного выше, сериновые протеазы могут приводиться в действие различными способами; однако их неуместная активация была бы чрезвычайно опасна, и поэтому существуют многочисленные защитные приспособления, которые предотвращают эту опасность. Действие активных ферментов в неподходящих местах подавляется ингибиторами (например, ингибитором трипсина). Ингибитор трипсина — тоже белок с известной структурой, который блокирует активный центр трипсина и таким образом инактивирует его. Структура ингибитора комплементарна структуре активного центра. Можно упомянуть еще одну высокоспецифическую сериновую протеазу — акрозин, который в неактивном состоянии содержится в головке спермия. Только при соприкосновении с zona pellucida яйцеклетки он активируется и разрушает этот слой, что позволяет спермию проникнуть в яйцеклетку. Семенные клетки, не содержащие акрозина, не способны оплодотворять яйцо. Отсутствие этого фермента — частая причина мужского бесплодия.
ТОПОЛОГИЧЕСКОЕ РОДСТВО - '
Дегидрогеназы и аденилаткиназы. В предыдущем разделе мы познакомились с трудностями выяснения гомологий в аминокислотных последовательностях. И все же, несмотря на многочисленные ограничения, удавалось выявлять гомологичные отрезки и оценивать степень родства белков. Даже при относительно больших различиях в последовательностях аминокислот вероятность того, что они возникли независимо друг от друга, ничтожна. Лишь в крайнем случае приходилось обращаться к третичной структуре ц убеждаться в том, что она весьма сходна.
Как мы уже упоминали, специфическая третичная структура — чрезвычайно консервативный элемент. Почти не важно, какие аминокислоты находятся в тех или иных местах, пока общая структура остается неизменной. Это особенно хорошо видно на примере дегидрогеназ и некоторых других ферментов. Они отличаются способностью связывать нуклеотиды, которые используют в качестве коферментов; например, дегидрогеназы используют таким образом флавин и NAD+, а аденилаткиназы расщепляют связанный АТР или фосфорилируют связанный ADP:
АТР4-АМР ч=± 2ADP,
Первичная и третичная структура некоторых дегидрогеназ и аденилаткиназ известна. Сравнивая аминокислотные последовательности, здесь не находят никаких доказательств гомологии. Но если сосредоточить внимание на третичной структуре, то окажется, что все дегидрогеназы содержат одни и те же два домена с различными функциями. Один связывает кофермент, а другой — субстрат, и это уже определяет специфичность фермента.
Поэтому говорят о домене, связывающем NAD+ (или соответственно флавин), и о домене, связывающем субстрат. Аминокислоты, образующие первый из этих доменов, у разных дегидрогеназ расположены в разных участках молекулы — иногда около М-кон- ца, как у глицеральдегидфосфат-дегидрогеназы или растворимой малатдегидрогеназы, иногда в середине, как у лактатдегидроге- вазы, или же на конце, как у алкогольдегидрогеназы из печени (рис. 16.5).
Третичные структуры NAD+-cBH3HBaromHx доменов сходны между собой. Основной тип представлен на рис. 16.6. Структура состоит из шести складчатых слоев (рА —pF), связанных между собой а-спиралями. Спирали аВ и аС связывают рА с рС и рВ с PC и расположены на той же стороне, что и слои. Эта часть молекулы связывает АМР-компонеит кофермента, а другая часть домена (С-концевая область) — никотинамидный компонент. Кофермент находится в изогнутой конформации (рис. 16.7). Аденин располагается в неспсцифическом гидрофобном кармане. В таких кар-
264 II. Балки
Л Л, Д:С
DD22165525АУ339^'У^^^_-122165525АУ339^'У^^^_-1196316 ^ 376196316 ^ 376199 L 307199 L 307&мл «••№*>м- ■■■^■^■■е&мл «••№*>м- ■■■^■^■■елдгГАФДГАДГПДГлдгГАФДГАДГПДГРис. 16.5. Положение NAD+-связывающего домена в полипептидной цепи различ- ■ш дегидрогеназ. Различные домены, связывающие субстрат, обозначены В, С, D... Домены С лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и малатдегидрогеназы (МДГ) (растворимые формы) имеют одинаковую структуру. Домены, связывающие нуклеотид, а свою очередь состоят из двух однотипных отрезков (Аь Aj), возникших в процессе эволюции от общего предшественника. ГАФДГ-глнцеральдегидфосфат- дегидрогеназа; АДГ — алкогольдегидрогеназа из печени (Evenstoff, Rossmann, 1976).Рис. 16.5. Положение NAD+-связывающего домена в полипептидной цепи различ- ■ш дегидрогеназ. Различные домены, связывающие субстрат, обозначены В, С, D... Домены С лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и малатдегидрогеназы (МДГ) (растворимые формы) имеют одинаковую структуру. Домены, связывающие нуклеотид, а свою очередь состоят из двух однотипных отрезков (Аь Aj), возникших в процессе эволюции от общего предшественника. ГАФДГ-глнцеральдегидфосфат- дегидрогеназа; АДГ — алкогольдегидрогеназа из печени (Evenstoff, Rossmann, 1976).
D
D
22165525
АУ339
^'У^^^_-1
22165525
АУ339
^'У^^^_-1
196316 ^ 376
196316 ^ 376
199 L 307
199 L 307
&мл «••№*>м- ■■■^■^■■е
&мл «••№*>м- ■■■^■^■■е
лдг
ГАФДГ
АДГ
ПДГ
лдг
ГАФДГ
АДГ
ПДГ
Рис. 16.5. Положение NAD+-связывающего домена в полипептидной цепи различ- ■ш дегидрогеназ. Различные домены, связывающие субстрат, обозначены В, С, D... Домены С лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и малатдегидрогеназы (МДГ) (растворимые формы) имеют одинаковую структуру. Домены, связывающие нуклеотид, а свою очередь состоят из двух однотипных отрезков (Аь Aj), возникших в процессе эволюции от общего предшественника. ГАФДГ-глнцеральдегидфосфат- дегидрогеназа; АДГ — алкогольдегидрогеназа из печени (Evenstoff, Rossmann, 1976).
Рис. 16.5. Положение NAD+-связывающего домена в полипептидной цепи различ- ■ш дегидрогеназ. Различные домены, связывающие субстрат, обозначены В, С, D... Домены С лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и малатдегидрогеназы (МДГ) (растворимые формы) имеют одинаковую структуру. Домены, связывающие нуклеотид, а свою очередь состоят из двух однотипных отрезков (Аь Aj), возникших в процессе эволюции от общего предшественника. ГАФДГ-глнцеральдегидфосфат- дегидрогеназа; АДГ — алкогольдегидрогеназа из печени (Evenstoff, Rossmann, 1976).
Рис. 16.6. Схема относительного расположения а-спира лей и 0-структур в доме-нах дегидрогеназы, связывающих кофермент (NAD+). Буквами A—F обозначенысоответствующие вторичные структуры (Ohlsson et al., 1974).
манах или щелях субстрат, как правило, точно подходит к поверхности фермента. При связывании гидратная оболочка разрушается, так как в углублении не остается места для молекул воды. Это одна из главных причин высокой реакционной способности молекулы субстрата, связанной с ферментом. Никотинамидный компонент, за исключением его реактивного участка, тоже находится в гидрофобном окружении.
Так же как и упомянутые выше дегидрогеназы, связывающие NAD+ (алкоголь-, лактат- и малатдегидрогеназы), флаводоксин (флавин-связывающая дегидрогеназа), аденилаткинаэа, субтили-
16. Родственные связи, гомологии последовательностей 265
Рис. 16.7. Схематическое изображение активного центра лактатдегидрогеназы. NAD+ (NADH), представленный на рисунке жирными линиями, находится в гидрофобной полости в изогнутой конформации. При подходе кофермента вначале возникает взаимодействие между аденином и гидрофобными участками белка, а затем положение Arg 101 изменяется таким образом, что этот остаток может теперь вступить во взаимодействие с фосфатами. Субстрат связывается с Arg 171. Асимметрия этой области исключает связывание с D-лактатом (Holbrook et al., 1975).
зин (протеаза) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа содержат сходные между собой (ортологичные) домены (рис. 16.8 и 16.9). Таким образом, мы имеем отправную точку для построения «родословной» этих белков (рис. 16.10).
Малатдегидрогеназа отличается от лактатдегидрогеназы прежде всего отсутствием одного фрагмента у N-конца. Эта область
Рис. 16.8. Схема укладки одной субъединицы D-глицеральдегид-З-фосфатдегидро- геназы Bacillus stearothermophilus. Нижний домен связывает NAD* (представленный жирными линиями). Второй домен (вверху) содержит большую долю Р-струк- тур и связывает субстрат. (Biesecker et al., 1977).
Рис. 16.9. Связывание NAD* и двух фосфатных групп (Рь Р5) в полости NAD- связываюшего домена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Отметим, что связывание и конформация NAD* сходны здесь с тем, что мы видели в случае лактатдегидрогеназы (см. рис. 16.7) (Biesecker et al., 1977).
Hij№)mu№m<kmwii быж
Рис. 16.10. Эволюционные отношения дегидрогеназ и флаводоксина. Сокращенные обозначения те же, что на рис. 16.5 (Buehner ci al, 1973).
Рис. 16.11. Возможности расположения группы «р-тяж — а-спираль — ₽-тяж> ■ параллельных складках. а-Спираль изображена в виде плоской ленты. Тяжи P-структуры не обязательно должны быть непосредственными соседями. Из-за перекручивания складок в группе справа соотношение соседства значительно лучше, чем слева. А и Б —вид спереди, В и Г —сбоку. (Schulz, 1977).
Б
Рис. 16.12. Симметрия и форма цепей. А. Двойной нуклеотидсвязыаающий доменлактатдегндрогеназы и других белков. Здесь существует вертикальная ось вто-рого порядка. Б. Симметричная структура триозофосфатизомеразы, состоящая изскладчатого цилиндра и восьми окружающих его а-спиралей (Schulz, 1977).
существенна для образования тетрамера (у лактатдегидрогеназы). Алкогольдегидрогеназа из печени имеет ряд гомологичных последовательностей с дрожжевой алкогольдегидрогеназой; последняя образует тетрамер, а фермент из печени — димер. Таким образом, сравнение третичных структур позволяет распознавать гомологии даже тогда, когда последовательности аминокислот не рассматриваются. Это —структурно-топологическое родство интересующих нас молекул.
Шульц (Schulz, 1974) выдвинул эту концепцию топологического родства, исходя из того, что складчатые структуры (и спирали) в белке, во-первых, могут быть ориентированы различным образом и, во-вторых, могут быть по-разному соединены друг с другом, так что даже при небольшом числе структурных элементов получается большое число способов расположения и соединения: М=2„-*.л!/2 (рис. 16.11 и 16.13).
Алкогольдегидрогеназа и лактатдегидрогеназа имеют по шесть параллельно расположенных 0-слоев с одинаковой ориентацией (топология). Так как существует М=2в~1-61= 11 520 различных то-
Е D А С 8
Ряс. 16.13. Топологическое родство аденилаткиназы (А), субтилизина (Б), флаяо- доксина (В) и КАВ*-связывающего домена дегидрогеназы (Г). ГП —гидрофобная полость, предположительное место связывания аденина; ГА — гидрофобная полость, место связывания ароматических боковых цепей; КН —каталитический центр; Фа — место связывания FMN; N—Ad— место связывания NAD*. А, В, С, D, Е, F — спирали. Стрелками указано направление полипептидных цепе* (N—ьС). (Schulz, Schirmer, 1974).
Таблица 16.1
Топологическое родство между структурами белка (Schulz, Schirmer, 1974)
Бела
Число общих структур
Вероятность общего происхождении
Вероятность общего происхождения с учетом положения участка, связывающего субстрат
Аденилаткиназа — субтилизин
5
240:1
2400:1
Аденилаткиназа — флаводоксии
4
24:1
240:1
Аденилаткиназа — дегидрогеназы
4
16:1
160:)
Субтилизин—• флаводоксии
5
480:1
4800:1
Субтилизин — дегидрогеназы
5
240:1
2400:1
Флаводоксии — дегидрогеназы
5
480:1
4800:1
Дегидрогеназа (А)—дегидрогеназа (В)
6
11520:1
15200:1
пологических изомеров, то вероятность того, что эти два белка не родственны, равна 1/М= 1:11520. Поэтому крайне маловероятно, что обе структуры развивались независимо друг от друга. Данные для других пар белков представлены в табл. 16.1 и на рис. 16.13.
Таким образом, существует путь выявления филогенетических связей и в том случае, когда сходство между аминокислотными последовательностями слишком мало. Поскольку общая форма цепи часто бывает весьма консервативной, сходство этой формы говорит о возможной связи на очень ранних этанах эволюции. Россман в 1967 г. указал на наличие такого сходства между ЫАП+-связывающими белками, цитохромом Ь& и глобинами. Таким образом, открывается подход к выяснению эволюции путей метаболизма.
По-видимому, прежде всего создалась какая-то исходная структура, а затем соответствующий ген подвергался ряду последовательных дупликаций и каждая его копия далее эволюционировала независимо от других копий; при этом наряду с аминокислотным» заменами возникали вставки и делении, а также в результате слияния генов появлялись новые (субстрат-специфические) участки молекулы.
В связи с этим возникает интересный вопрос о том, могут л» субстрат-специфические домены разных ферментов, действующих на один и тот же субстрат, происходить от одного и того же эволюционного предшественника.
ЛИТЕРАТУРА
Biesecher О., Harris I. L, Thierry J. С., Walker I. E., Worm colt A. J. (1977). Sequence and structure of D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Bacillus stearother mophilus. Nature (London), 266, 328.
БЕЛКИ В ЭВОЛЮЦИИ И ОНТОГЕНЕЗЕ:
ПОЛИМОРФИЗМ, АЛЛОФЕРМЕНТЫ И ИЗОФЕРМЕНТЫ
Белки — идеальные маркеры для выяснения вопроса о том, происходят ли данные организмы друг от друга или от общего предка, и установления степени их родства. Рассмотренные в предыдущих главах возможности сравнения гомологичных и ортологичных белков дают твердую основу для далеко идущих выводов. Плохо лишь то, что проанализировано очень мало последовательностей, с помощью которых можно было бы выяснять спорные вопросы таксономии. Важнейшие из полученных до сих пор результатов можно резюмировать в следующих пунктах:
Наблюдаемая частота замен аминокислот у разных (пара- логичных) белков различна.
Частота замен у гомологичных белков варьирует на разных этапах эволюции.
Число замен в общем обратно пропорционально степени родства видов, у которых выделены белки.
Для выяснения дальнейших проблем эволюции требуется больше данных, и эти данные можно получить с помощью гель-электро- фореза и иммунологических методов. Преимущества этих методов состоят в следующем: 1) не требуется полной очистки исследуемых белков; 2) можно обойтись малым количеством белка; 3) за короткое время можно провести большое число исследований.
Было бы интересно выяснить следующие вопросы:
L Адаптивны или нейтральны встречающиеся в белках замены аминокислот?
Какое значение имеет полиморфизм, что такое аллофермек- ты и изоферменты?
Протекает ли эволюция белков параллельно с эволюцией организмов?
Возможно ли моделирование эволюции белков?
Адаптивны или нейтральны встречающиеся в белках замены аминокислот?
В 1969 г. Кинг и Джукс выдвинули гипотезу о недарвинской эволюции. Этот термин выбран неудачно, так как имеется в виду накопление нейтральных замен в белках, т. е. «шум», не дающий селективного преимущества, но и не составляющий невыгоды. Далее в 1971 г. эту гипотезу развили Кимура и Ота (гипотеза нейтральности); они сформулировали ее в математической форме и, таким образом, создали предпосылку для экспериментальной проверки. Такая проверка осуществлялась в ряде работ группы Айяла (Ayala, 1974). Объектом исследования были четыре вида Drosophila, а методом служил гель-электрофорез. Изучался полиморфизм
Таблица 17.1
Генетическая изменчивость 36 локусов в природных популяциях четырех близких видов Drosophila (Ayala, 1974). Локус считается полиморфным тогда, когда 1) частота второго по встречаемости аллеля составляет не менее 1% или 2) частота наиболее обычного аллеля не превышает 95%
Вид
Число исследованных геномов Hl I локус
Число полиморфных локусов в популяции, %
Число гетерозиготных локусов на 1 особь
по критерию (1)
по критерию (2)
D. willistoni
4983±63 6
73,8±6,4
49,1±7,2
17,9±3,7
D. tropicalis
173l±229
64,7±б,7
47,4±7,6
15,2±3,1
D. equlnoxialis
2556±2 38
79,2±6,1
54,0±7,5
16,5±3,0
D. nebulosa
412±43
69,2±7,1
53,0±6,9
19,5±3,5
Среднее
2370±960
71.7=4:3.1
50,9±1,6
17,3±0,9
по 36 ферментам, активность которых можно было выявлять в геле. Ферменты, кодируемые различными аллелями одного локуса, называют аллоферментами или аллотипами. Аллотипы служат маркерами: различия в электрофореграмме отражают различия в геноме. В табл. 17.1 приведены полученные данные о степени полиморфизма и степени гетерозиготности. Эти результаты говорят о том, что от 30 до 80% всех изученных локусов являются полиморфными и представлены двумя или большим числом аллелей, причем отдельные особи гетерозиготны в среднем по 15—20% всех своих локусов.
Термин «полиморфизм» означает существование нескольких аллелей одного и того же локуса в популяции, а «гетерозиготность»— наличие разных аллелей (одного локуса) у одной особи. У диплоидных форм особь может иметь не более двух различных аллелей в одном локусе.
В теории нейтральности предполагается, что число нейтральных замен на один генный локус в популяции, находящейся в равновесии, составляет
«=4^4-1,
где N — число потомков и ц— частота мутаций на один локус в одном поколении.
С помощью гель-электрофореза выявляются лишь такие замены, которые ведут к изменению заряда белковой молекулы. Вероятная доля таких замен может быть вычислена, и если мы подставим ее в формулу (1), то получим
ле=К8Л№,
где пе — число замен, выявляемых при электрофорезе. В природной популяции организмов, размножающихся половым способом, число
аллелей оказывается величиной, обратной частоте гомозиготных особей:
ле=1/(1—Д),
где И — средняя частота гетерозиготных особей по одному локусу.
Средняя величина для всех четырех видов Drosophila составляет 0,173±0,009 (вероятности, как правило, выражают не в процентах, а в долях единицы). Поэтому число аллелей, выявляемых путем электрофореза, в популяции каждого из четырех видов было бы
пе = 1/(1-0,173) = 1,209.
Подставляя величину пе в уравнение (2), получим
^[4=0,058 (или округленно 0,06).
Чтобы решить уравнение (1), используют грубую оценку размеров популяций различных видов Drosophila, а также оценку частоты мутаций на одно поколение и один локус.
Можно с уверенностью принять, что размер популяции каждого вида >109, а частота мутаций на один локус в одном поколении — по меньшей мере 10-7, и тогда ^p,a^l00. Если мы примем эти минимальные оценки для N и ц, то теоретически для числа обна- ружимых аллелей получим
ле=У80Г=28,
Таким образом, частота электрофоретически выявляемых аллелей равнялась бы 1/28=0,035. Однако фактически была найдена величина 0,822, что в 23 раза больше, чем можно было ожидать, исходя из теории; таким образом, полученные результаты противоречат гипотезе нейтральности.
Степень полиморфизма и гетерозиготности для различных локусов Drosophila и грызунов представлена на рис. 17.1. На частоту определенных аллелей могут влиять условия среды, и для разных видов могут быть выгодны разные аллели одного и того же локуса. Это указывает на то, что все локальные популяции находятся в равновесии. Достоверность этой гипотезы можно также проверить экспериментальным путем. Айяла и его сотрудники провели множество популяционногенетических экспериментов, причем они брали определенные исходные популяции и изучали изменение частот определенных аллелей с течением времени. Были исследованы аллели малатдегидрогеназы. Уже после десяти поколений установилось новое стабильное равновесие (рис. 17.2).
У одних видов держал верх один аллель, у других — другой. Таким образом, было четко продемонстрировано, что генные продукты обоих аллелей явно дают какое-то селективное преимущество.
100100Ф!ПФ!П8080•l:.U•l:.U• АмAVI ФГИ .АП • «Зек,• АмAVI ФГИ .АП • «Зек,°. 60I| 40°. 60I| 402020• ГФД е,1№ фуме ^ #•ГК ИЦД•ПДГ• ГФД е,1№ фуме ^ #•ГК ИЦД•ПДГ6-ФГД• «НВ.•ПИ" 'год6-ФГД• «НВ.•ПИ" 'годчадчад0,10,1АХАХКФКФМГМГДрозофилаДрозофила0.20.2ПА •6-ФГД еФГП3cmПА •6-ФГД еФГП3cm- ИИД-I • «АДГЛФГИ"•тф■п *Hh^Пеп ецр е *№Д •пдг>»(ШНВАл- ИИД-I • «АДГЛФГИ"•тф■п *Hh^Пеп ецр е *№Д •пдг>»(ШНВАлГрызуныГрызуны0,30.1Гиперми<1Н1н«>1:п№0,30.1Гиперми<1Н1н«>1:п№0,20,20,30,3
100
100
Ф!П
Ф!П
80
80
•l:.U
•l:.U
• Ам
AVI ФГИ .АП • «Зек,
• Ам
AVI ФГИ .АП • «Зек,
°. 60
I
| 40
°. 60
I
| 40
20
20
• ГФД е,1№ фуме ^ #
•ГК ИЦД
•ПДГ
• ГФД е,1№ фуме ^ #
•ГК ИЦД
•ПДГ
6-ФГД
• «НВ
.•ПИ" 'год
6-ФГД
• «НВ
.•ПИ" 'год
чад
чад
0,1
0,1
АХ
АХ
КФ
КФ
МГ
МГ
Дрозофила
Дрозофила
0.2
0.2
ПА •6-ФГД еФГП
3cm
ПА •6-ФГД еФГП
3cm
- ИИД
-I • «АДГ
ЛФГИ
"•тф
■п *Hh
^Пеп ецр е *№Д •пдг
>»(Ш
НВ
Ал
- ИИД
-I • «АДГ
ЛФГИ
"•тф
■п *Hh
^Пеп ецр е *№Д •пдг
>»(Ш
НВ
Ал
Грызуны
Грызуны
0,30.1
Гиперми<1Н1н«>1:п№
0,30.1
Гиперми<1Н1н«>1:п№
0,2
0,2
0,3
0,3
Рис. 17.1. Степень полиморфизма и гетерознготности отдельных локусов у Drosophila и грызунов. А— альбумин: АДГ—алкогольдегидрогеназа; АК—аденилат-’ киназа; Ал— альдолаза; Ам— амилаза; АО— альдегидоксидаза; ГК — гексоки- наза; ГОТ — глутамат-оксалацетаттрансаминаза; (а)-ГФД— (а)-глюкозо-б-фос- фатдегидрогеназа; ИЦД— изоцитратдегидрогепаза; КДГ — ксантиндегвдрогена- за; КФ— кислая фосфатаза; ЛАП — лейцинамипопептидаза; МДГ—малатдегид- рогеназа; НБ—неферментный белок; ОДГ —октанолдегидрогеназа; ПА—пре- альбумин; Пеп — пептидаза; СДГ — сорбитолдсгидрогеназа; СОД — супероксид- дисмутаза; ТФ— трансферрин; 6-ФГД— 6-фосфоглюконатдегидрогсназа; ФГИ — фосфоглюкозоизомераза; ФГМ—фосфоглюкомутаза; Фум— фумараза; ЩФ — щелочная фосфатаза; ЯФ — «яблочный» фермент.
Однако один вопрос в связи с этими экспериментами остается неясным. В основе электрофоретического различия всегда лежат так называемые радикальные замены аминокислот. Такие замены происходят реже, чем замены, называемые консервативными. Последние при электрофорезе не выявляются, и поэтому ничего нельзя сказать об их значении. Сомнительно, чтобы какой-либо организм можно было считать совершенной системой. Без избыточности и тем самым без возможности исправления ошибок наверняка не было бы никаких шансов па выживание. Без возможности «играть» нет шансов испробовать что-либо новое. С другой стороны, однако, возникает вопрос о стоимости. Сколько энергии организм может потратить на «игру»?
Рис. 17.2. Экспериментальное доказательство изменения частот аллелей в локусе Mdh-2 (малатдегидрогеназа) в замкнутой популяции Drosophila equinoxiatis н Ei) и Drosophila troplcalls (T, и Т»), Изменения являются направленными и указывают на селективное преимущество аллелей. В начале эксперимента в популяциях были аллели 86 и 94 (в локусе Mdh-2). В популяциях Е возрастает частота аллеля 94, в популяциях Т—аллеля 96 (Ayala, Anderson, 1973).
Полиморфизм на молекулярном уровне обнаружен во всех систематических группах. Для популяций человека были получены следующие данные (Nei, Roychoudhury, 1974):
Расе
Число исследо- ванных локусов
Полиморфизм, %
Степень гетеро- знготностк ип- дизидуумов, %
Кавказская
74
31
9,9
Негроидная
62
40
9,2
Монголоидная
35
40
9,8
В поисках редких аллелей 43 локусов Харрис и его сотрудники изучали ферменты в пробах крови 250 000 европейцев методом гель-электрофореза и обнаружили, что каждый из изученных локусов может быть гетерозиготным. Средняя частота гетерозиготности составляет 1—2%.
В 1973 г. Зеландер и Кауфман установили, что степень полиморфизма у позвоночных меньше, чем у беспозвоночных (рис. 17.3).
Причиной уменьшения полиморфизма и степени гетерозиготности могут быть, во-первых, малые размеры популяции и, во-вторых, более медленная смена поколений. При редкой смене поколений реже представляется возможность испробовать новую комбинацию генов, и поэтому высокая степень полиморфизма теряет селективное преимущество. Таким образом, для видов, использующих в эволюции г-стратегию, выгодно производить многочис-
Рис. 17.3. Генетическая изменчивость в некоторых основных группах животных и у растений (Selander, 1976).
Гаперпиытяост*Гаперпиытяост*ленное потомство, если в популяции сохраняется изменчивость. Для видов, использующих К-стратегию, у которых размеры популяций приближаются к оптимальным, такие эксперименты мало полезны. У растений имеется множество самоопыляющихся видов. Степень полиморфизма у них не меньше, чем у перекрестноопыля- ющихся. Внутри вида там образуется множество «линий», которые остаются изолированными друг от друга в процессе размножения.
Гаперпиытяост*
Гаперпиытяост*
Какое значение имеет полиморфизм?
Аллоферменты и изоферменты
Для разных ферментов, как мы уже видели, степень полиморфизма различна. Поэтому в 1968 г. Иллеспай и Кохима предложили оценивать ее в связи с функцией ферментов и разделить последние на две группы:
Ферменты, которые воздействуют на вещества, свойственные самому организму.
Ферменты, которые воздействуют на чужеродные вещества, получаемые с пищей.
Гены для ферментов второй группы должны быть более полиморфными, чем для первой, так как здесь требуется приспособление к большему разнообразию субстратов. Исходя из этого, Джонсон в 1973 г. рассмотрел соответствующие величины у Drosophila и в значительной мере подтвердил сделанное предположение, хотя обнаружил и исключения из правила.
Наиболее консервативны гидролазы. В большинстве случаев гены их представлены мономорфно, хотя субстратная специфич-
ность этих ферментов не очень узка и функция их in vivo в большинстве случаев неизвестна. Примечательны особенности фосфоглюкомутазы. Она чрезвычайно полиморфна, однако степень гетерозиготности в данном случае незначительна. Чем это обусловлено? Возможно, что это связано с супрессией аллотипов (гл. 22).
У Drosophila известны два аллотипа алкогольдегидрогеназы (два аллофермента). Они различаются по специфичности к субстрату. Форма А может намного лучше перерабатывать этанол, изопропанол, н-бутанол и циклогексанол, чем форма В. При повышенных температурах, напротив, В-форма стабильнее и активнее, чем А, и приобретает некоторое селективное преимущество.
Молодые личинки Drosophila живут в гнилых фруктах, в которых много спирта. В популяциях на юге США чаще встречается ген формы В, а на севере, наоборот, ген формы А. Как показывают прямые данные, распределение аллелей зависит от средней температуры дня летом.
Приведенные примеры должны были проиллюстрировать адаптивные преимущества аллоферментов. Большая популяция с обширным генофондом и высокой изменчивостью имеет шансы заселить разнообразные местообитания, в которых затем будут отобраны оптимальные в каждом данном случае генотипы. Это говорит в пользу гипотезы «выравненного преимущества*, согласно которой полиморфизм — это выражение некоего динамического равновесия.
К ферментам предъявляются различные требования не только у разных особей, но и в пределах одной особи. Условия меняются от органа к органу, от органеллы к органелле и от одной стадии развития к другой. В отличие от большинства внешних условий внутренние условия в клетке и организме меняются вполне определенным образом, ибо внутренние процессы—развитие организма, образование определенных органов и органелл и создание определенной внутренней среды — генетически детерминированы. Количественные и качественные изменения в синтезе белков осуществляются в ходе онтогенеза как четко запрограммированная последовательность отдельных этапов.
Стратегия полиморфизма может дать здесь не очень много, так как у диплоидной особи возможно образование не более чем двух аллоферментов.
Изоферменты как маркеры дифференциальной экспрессии генов. Мы уже говорили о дупликации генов и вкратце коснулись изоферментов. Это ферменты с одинаковой или по крайней мере очень сходной активностью, которые кодируются разными локусами одного и того же хромосомного (гаплоидного) набора. Такие локусы возникли в результате дупликации гена и последующих изменений. Таким образом, у одной особи может синтезироваться несколько вариантов одного фермента. На выбор этих вариантов влияет дав-
ление отбора. Изоферменты были открыты в 1959 г. Маркертом и Мёллером, причем уже в первой их работе было показано, что в разных органах и на разных стадиях развития активны различные формы фермента. Классическим методом исследования здесь служит гель-электрофорез, а классическим объектом — лактатдегидрогеназа (ЛДГ). Ее выявляют в геле путем добавления лактата, NAD+ и соли тетразолия, которая в присутствии фермента окисляется и переходит в окрашенное нерастворимое в воде соединение (формазан).
На рис. 17.4 показано распределение различных форм в тканях крысы, а на рис. 17.5 — изменение изоферментного состава ЛДГ в сердце мыши на разных стадиях эмбрионального и постнатального развития. На обеих электрофореграммах видны пять полос. Молекула ЛДГ представляет собой тетрамер, в состав которого могут входить субъединицы двух типов —А и В. Таким образом, в нативных тетрамерах может быть пять различных комбинаций субъединиц:
At, А3Во AjBj, А,В3, Bj.
Рис. 17.4. Электрофореграмма (зимограмма) лактатдегидрогеназы из различных тканей крысы (Markert, Ursprung, 1971).
Рис. 17.5. Изменения картины изоферментов лактатдегидрогеназы в тканях сердца мыши на разных стадиях развития. Возраст отложен по абсциссе: - 9, —5, —1 — дни до рождения; + 12, +21 — дни после рождения (Markert, Ursprung, 1971),
В ЛДГ-1 содержится только форма В, в ЛДГ-5 —только форма А. В сердечной мышце преобладает активность гена, кодирующего форму В, в скелетных мышцах активен ген формы А.
Во время оогенеза у мыши активен ген В, однако в период развития яйца он супрессирован и вместо него действует ген А. Еще до рождения и в постнатальном периоде во многих тканях последовательно реактивируется ген В, так что соотношение сдвигается в направлении изофермента ЛДГ-1. В спермиях действует третий ген — С. Изофермент С< обладает меньшей субстратной специфичностью, чем остальные формы. Ген С активен только в течение нескольких часов в фазе сперматогенеза; в других тканях и в другое время он репрессирован. Активация генов ЛДГ осуществляется цитоплазматическими факторами. У некоторых мутантов мыши синтез формы В в отдельных органах заторможен. Очевидно, здесь действует ген-регулятор, который ведет себя как простой аллель.
У рыб синтезируется еще ряд вариантов лактатдегидрогеназы; например, ген Е активен в клетках сетчатки глаза и в нейронах. Продукт этого гена самопроизвольно образует сополимеры с субъединицами А и В даже у таких видов, у которых отсутствует кооперация между А и В.
В следующей главе мы увидим, что функционирование опреде-
^■•«•=■•«=5 щ» ш •»в»3® *»walшш*:'&^:ф&^1*е»а»*аае*'л^—^^■•«•=■•«=5 щ» ш •»в»3® *»walшш*:'&^:ф&^1*е»а»*аае*'л^—^
^■•«•=■•«=5 щ» ш •»в»3® *»wal
шш*:'&^:ф&^
1*е»а»*аае*
'л^—^
^■•«•=■•«=5 щ» ш •»в»3® *»wal
шш*:'&^:ф&^
1*е»а»*аае*
'л^—^
Рис. 17.6. А. Картина аллоферментов лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в экстракте почки грызуна Peromyscus polionotus. ЛДГ — тетрамер. Полипептидные цепи кодируются двумя локусами (Ldh-1 я Ldh-2). У особей, гомозиготных по обоим локусам, полипептидные цепи могут комбинироваться так, что в геле появляются пять полос (см. рис. 17.4). У гетерозиготных особей появляются 15 полос, однако они не четко отделены друг от друга. В данном примере показаны изоферментные профили 12 особей. По локусу Ldh-1 наблюдается сильно выраженный полиморфизм, о чем свидетельствуют большие различия в картине полос у разных особей. Локус Ldh-2 (нижние широкие полосы) мопоморфея. Б. Изменение двух изоферментов лейципамипопептидазы (ЛАП) у улитки Helix aspersa. Один фермент характеризуют верхние, другой — нижние полоски. ЛАП — мономер, у гомозиготных особей получается одна полоса, у гетерозиготных — две полосы равной интенсивности: два изофермента отделяются друг от друга. По-видимому, оба локуса одновременно не бывают гомозиготными. Другие мыслимые комбинации локусов — гетерозиготный/гетерозиготный, гетерозиготный/гомозиготный и гомозиготнын/ге- тероэиготный— встречаются (Rochester, 1976).
ленного фермента в клетке определяется не только специфичностью его каталитического действия; не меньшее значение имеет то, чтобы его активность могла регулироваться «эффекторами» и другими молекулами, устанавливающими ее уровень «по потребности». Например, как мы уже видели на других примерах, изменение суммарного заряда изменяет способность фермента вступать в реакцию с другими молекулами в клетке, даже если само по себе не влияет на его каталитическую активность. Способность взаимодействовать с другими молекулами — это опять-таки результат длительного отбора.
В то время как аллофсрменты служат маркерами процесса эволюции и стратегий приспособления, изоферменты образуют группу белковых маркеров, позволяющих изучать онтогенез. Они пригодны для выяснения деталей регуляции метаболизма. При дифференцировке какой-либо линии клеток появляются новые виды изоферментов, так же как и при трансформации нормальных клеток в опухолевые. Такие неопластические изменения часто приводят к образованию нового сочетания изоферментов, сходного с тем, которое свойственно эмбриональным клеткам, хотя опухолевые клетки не являются эмбриональными (см. гл. 51).
Сейчас известно более 100 различных ферментов, имеющих изоформы. После всего сказанного их значение кажется очевидным. Однако следует отметить, что существуют, например, виды рыб, синтезирующих только один изофермент лактат дегидроген азы и тем не менее жизнеспособных. Этот факт порождает множество предположений относительно функций различных изоферментов, и его следует учитывать при истолковании получаемых данных.
На рис. 17.6 представлены результаты экспериментов, в которых изучались различия в картине алло- и изоформ двух ферментов у двух различных видов. Для уверенности в том, что мы действительно имеем дело с аллоферментами, распределение которых в популяции мы хотим исследовать, нужно всегда брать пробы у особей одинакового возраста и из одного и того же органа (насколько это возможно; у насекомых, например, это трудно осуществить). По одпой только электрофореграмме невозможно установить, являются ли две полосы продуктами двух аллелей или двух разных локусов.
Протекает или эволюция белков параллельно с эволюцией организмов?
Предыдущие разделы, касавшиеся изменчивости белков, могли создать впечатление, будто все изменения происходят медленно и частота аминокислотных замен должна описываться линейными функциями. Этому противоречит то, что эволюция организмов, по- видимому, происходит скачкообразно. Например, млекопитающие и птицы так четко отличаются друг от друга и от других классов позвоночных, что ни один систематик не усомнится в обособленности этих групп животных. Таких четких различий, однако, трудно было бы ожидать, исходя из частоты замен в некоторых исследованных белках, хотя сравнение белков ведет в качественном отношении к тем же выводам относительно родственных связей, что и изучение других признаков. Молекулы и организмы часто эволюционируют с разной скоростью.
Различия между близко родственными видами определяются не столько изменениями в самих генных продуктах, сколько раз-
линиями во времени, активации генов и в относительных количествах их продуктов. Таким образом, эволюция не ^является процессом, в котором одна функция заменяется другой, а представляет собой сложный поток сдвигов динамических равновесии. _
Клозе в 1976 г. сравнил четыре инбредные линии мышеи, ин разделил методами гель-электрофореза и изоэлектрического фокусирования белки головного мозга, печени и других органов. Картина разделенных белков оказалась воспроизводимом и притом специфичной как для ткани, так и для линии. Интенсивности пятен на электрофореграмме пропорциональны количеству соответствующих белков в исходном материале (рис. 17.7). Линии различались между собой, во-первых, по положению отдельных пятен и во-вторых, по их интенсивностям. Из этого можно было заключить, что регуляция синтеза каждого белка у мышей сравниваемых’линий различна. В экстрактах печени различия больше, чем в экстрактах из мышц. При этом можно дифференцировать орга- носпецифические белки и белки, не специфичные для органов. Различия между линиями определялись в основном различиями в органоспецифических белках.
Эволюция белков и вопросы филогении. А. Уилсон и его сотрудники нашли, что скорость эволюции альбумина у лягушек и млекопитающих одинакова, хотя внешние признаки у млекопитающих значительно более изменчивы, чем у лягушек. Различия между китом, летучей мышью и человеком огромны, тогда как все лягушки выглядят почти одинаково.
В качестве маркера эволюции белков различные группы исследователей выбрали альбумин, так как он может быть легко получен в больших количествах из крови всех позвоночных и легко очищен (с помощью электрофореза). Альбумин действует на кроликов как сильный антиген, так что можно получать антитела к альбуминам различного происхождения. Серологические различия между альбуминами обычно достаточно легко выявлять с помощью иммунодиффузии и оценивать количественно микрометодом •связывания комплемента. В качестве количественной меры различия Прагер и Уилсон (1971) и Мэксон и Уилсон (1974) ввели понятие «иммунологического расстояния». Для альбумина единичное расстояние соответствует замене одной аминокислоты. Альбумин изменяется со средней скоростью 1,7 иммунологической еди- гницы в 10е лет.
Гудмен и его сотрудники и А. Уилсон с сотрудниками, используя эти методы, рассмотрели родственные связи современных приматов. По этому критерию человек оказался ближе к горилле и шимпанзе, чем все эти три вида — к орангутану и остальным приматам. Обезьяны Старого Света и обезьяны Нового Света образуют две родственные группы, причем представители каждой из них ближе друг к другу, чем к представителям другой группы. Тупайи
Рис. 17.7. Растворимые белки из печени взрослой мыши, разделенные методами Ф°кУсиРования (ИЭФ) и электрофореза в полиакриламидном геле (ЭИ Г). Белок окрашивают в геле красителем кумасси ярко-синим. Этот метод менее чувствителен, чем радиоавтография (см. рис. 14.2). Поэтому число пятен значительно меньше. А. Экстракт из мозга мышей линии DBA/2J. Б. То же от мышей Bl/bJ. В. То же от гибрида между обеими линиями. Между линиями имеются многочисленные качественные и количественные различия. Пример качественного различия указан буквами А и В. У гибрида появляются оба пятна соответственно вдвое меньшей интенсивности. Некоторые другие различия указаны цифрами. У одной из линий отсутствуют пятна 1, 2 и 3; есть различия в интенсивности пятен 4 и 5; различно положение пятна 6. Представленная здесь система пригодна для быстрой проверки веществ на мутагенность. Если обычные методы выявляют изменение лишь одного определенного белка в продукте гена то здесь можно видеть все изменения во всех белках данной особи (Klose 1976 1978).
Рис. 17.8. Филогенетические отношения древесных лягушек рода Hyla по данным сравнения альбуминов. Буквы обозначают виды (С — Hyla clnerea, G — Hyla gra- tiosa и т. д.). Подчеркнутые буквы означают виды, относимые систематиками к другим родам (А — Acris crepitans; Р — Pseudacris triseriata; L — Litorla aurea). Цифрами указана степень родства альбуминов: чем меньше цифры, тем выше степень родства. Справа дана классическая схема, основанная на сравнении ряд» других (морфологических) признаков (Maxson, Wilson A. G., 1975).
и лемуры далеко отстоят друг от друга, но они ближе к высшим приматам, чем к остальным группам млекопитающих. Эти данные служат хорошим контролем, подтверждающим, что такой экспериментальный подход правомерен и может быть также привлечен в случаях сомнительных филогенетических отношений.
Если мы будем строить филогенетическое дерево, основываясь на гомологиях аминокислотных последовательностей, мы придем почти к тем же результатам. Помимо упомянутой выше проблемы А. Уилсон и его сотрудники занимались также выяснением родственных связей североамериканских и южноамериканских лягушек и при этом основное внимание уделяли роду Hyla. Полученные результаты привели к схеме, представленной на рис. 17.8. Из нее ясно видно, что австралийский вид стоит вне группы голарктических видов. Род Ards, напротив, находится внутри группы Hyla, т. е. он возник как побочная ветвь рода Hyla и стоит ближе к некоторым видам Hyla, чем эти последние к другим видам того же рода.
Еще один пример: судя по структуре белка, ластоногие (тюлени, моржи и др.) ближе к собачьим, чем собачьи — к кошачьим, и все же две последние группы систематики объединяют в один отряд хищных, а ластоногих выделяют в особый отряд.
Так как эволюция белков независима от эволюции организмов, мы находим здесь прямые маркеры для установления относительной степени родства между видами, родами, семействами, отрядами и т. д. Систематик часто сталкивается е вопросом, каковы
1Рис. 17.9. Скорость эволюции в предковых линиях шимпанзе и человека. Л. Эволюция организма в целом. Изменения в линии человека на единицу времени значительно больше, чем в линии шимпанзе. Б. Эволюция белков у обоих видов. Скорость эволюция у обоих видов одинакова (King, Wilson А. С., 1975).
родственные отношения трех видов Л, В и С — какой из трех схем они лучше соответствуют:
(А+В)4-С,
(А+С)+В
или (B+Q+A?
Преимущество классификации по белковым маркерам состоит в относительной биологической незначимое™ признаков, тогда как морфологические признаки, с которыми мы обычно имеем дело, ■чрезвычайно адаптивны, что, однако, тоже приводит к затрудне- •нию: невозможно различать тенденции к дивергентной и к конвер- -гентпой эволюции.
Нужно ожидать, что будет очень трудно привести к одному знаменателю выводы, основанные, с одной стороны, на данных о молекулярных изменениях, а с другой стороны — па морфологических сравнениях (рис. 17.9). Эту проблему обсуждали в 1974 г. Майр и Крэкрафт, причем они не предложили никакого возможного решения.
/Ложно ли изучать эволюцию белка на моделях?
«Эволюция в действии»
Ферменты бактерий являются продуктами эволюции, длившей- •ся миллионы лет. Однако нет никаких оснований считать их эволюционный потенциал исчерпанным. Бактерии живут в почве и в
воде, и им приходится там иметь дело с множеством органических веществ. В последние годы во все возрастающем количестве к ним присоединяются индустриальные продукты, что создает давление отбора, направленное на выработку способности расщеплять эти вещества. У бактерий появились, в частности, метаболические пути растепления камфары, нафталина, фенола, катехола, крезола, алканов, бензилсульфоиата и 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты.
Бенц и его сотрудники на Pseudomonas aeruginosa показали, что бактерии довольно быстро изменяют субстратную специфичность своих амидаз. При этом в первичной структуре происходят лишь небольшие изменения. Р. aeruginosa и родственные виды могут использовать амиды в качестве единственных источников азота. У дикого типа амидазы являются иидуцибельными ферментами. Сравнительно легко удавалось выделять мутантов с конститутивными ферментами. Обычные субстраты для амидаз дикого типа —формамид, ацетамид и пропионамид. Мутантные амидазы действуют также на бутирамид, валерамид, фенилацетамид и N-фенилацетамид. Некоторые ферменты при этом теряют способность распознавать первоначальные субстраты. Мутанты, расщепляющие валерамид, образуют гетерогенную группу. Амидазы их отличаются от амидаз дикого типа по своей субстратной специфичности и по тер.мостабнльности. Их активность гораздо ниже.
На примере этой группы мутантных ферментов видно, с какими малыми затратами может быть связана эволюция у бактерий- (даже без дупликации генов) и как быстро и эффективно открываются для них новые экологические пиши.
ЛИТЕРАТУРА
Ayala F. I. (1974). Biological evolution: Natural selection or random walk? Amr Set, 62, 692.
Ayala F. I. (ed.). 1976. Molecular evolution. Sunderland (Mass.). Sinauer Assoc. Inc.
Barker W. C.. Ketcham L. K.. Dayhoff M. 0. (1978). A comprehensive examination of protein sequences for evidence of internal gene duplication, J. Mol. Evol., 10, 265.
Betz I. L., Brown P- R„ Smyth M. J., Clarke P. H. (1974). Evolution in action, Nature (London), 247. 261.
Coates M. L. (1975). Hemoglobin function in vertebrates: An evolutionary model, J. Mol. Evol., 6, 285.
Dayhoff M. 0., McLaughlin P. L, Barker W. C., Hunt L. T. (1975). Evolution of sequences within protein superfamilies, Naturwissenschaften, 62, 154.
Goodman M„ Moore G. W., Matsuda G. (1975). Darwinian evolution in the genealogy of hemoglobin. Nature (London), 253, 603.
King M. C., Wilson A. C. (1975). Evolution at two levels in humans and chimpanzees. Science. 188, 107.
Koshland D. E. (1976). The evolution and function in enzymes. Fed. Proc., 35; 2104.
Markert C. L. (ed.), 1975a. Isozymes, New York, San Francisco, London, Academic- Press.
18. ФЕРМЕНТЫ: КАТАЛИЗАТОРЫ И РЕГУЛЯТОРЫ. ОДИН ГЕН — ОДИН ФЕРМЕНТ?
В предыдущей главе мы уже обсудили строение и эволюцию белков, а также вопросы, связанные с их использованием в качестве зондов для выяснения родственных связей между организмами. В этой и последующих главах на передний план выдвинуты их функциональные свойства. По своим функциям белки подразделяются на несколько групп:
ферменты (белки с каталитическими функциями);
регуляторные белки (белки, взаимодействующие с ДНК и управляющие экспрессией генов);
фибриллярные белки (коллаген, кератин, белок шелка и другие), выполняющие опорную и защитную функции;
белки оболочек вирусов;
антитела.
Белки часто образуют агрегаты, в которых они действуют кооперативно. В последующих главах мы опять вернемся к рассмотрению крупных белковых комплексов и увидим, что они лежат в основе таких клеточных структур, как мембраны, рибосомы и т. д.
ФЕРМЕНТЫ (ЭНЗИМЫ)
Термин «энзим» был введен в 1876 г. Кюном. Он очень быстро вошел в англо-американскую литературу, тогда как в Германии вплоть до 30-х гг. нашего столетия использовали термин «фермент». Первым выделенным ферментом был трипсин (Kiihne, 1876). В конце столетия были очищены и охарактеризованы и некоторые другие ферменты. Тем не менее виталисты продолжали выдвигать возражения против гипотезы о том, что ферменты являются катализаторами, так как вначале были выделены только такие ферменты, которые принимают участие в процессах распада. Как мы теперь знаем, ферменты лишь снижают энергию активации реакции, но никак не влияют на изменение свободной энергии ДО (рис. 18.1). Поэтому без источника энергии не может протекать ни одна реакция синтеза. Возражения, выдвинутые виталистами, отпали после того, как были открыты так называемые богатые энергией соединения — креатинфосфат (Eggleton, Eggleton, 1927) и ATP (Lohmann, 1928).
Рис. 18.1. Д. Реакция, протекающая без участия фермента. Б. Реакция, катализируемая ферментом.Рис. 18.1. Д. Реакция, протекающая без участия фермента. Б. Реакция, катализируемая ферментом.
Рис. 18.1. Д. Реакция, протекающая без участия фермента. Б. Реакция, катализируемая ферментом.
Рис. 18.1. Д. Реакция, протекающая без участия фермента. Б. Реакция, катализируемая ферментом.
Существуют простые ферменты, у которых полипептиднял цепь уложена в виде одного домена и которые обладают только одним активным центром. Классические примеры таких ферментов представляют рибонуклеаза и лизоцим. В обоих случаях полипептид- ная цепь уложена так, что ее складки образуют два выступа, окаймляющих щель, в которой находится активный центр. Подобные структуры обнаружены и у ряда других ферментов.
Как известно, принцип организации активного центра ферментов основан на том, что па поверхности фермента существует специфическая структура (щель, полость, изгиб), в которую субстрат входит настолько плотно, что в ней не остается места более чем для одной молекулы воды. Таким образом, создаются особые условия, при которых резко снижается энергия активации химического превращения субстрата. Взаимодействие реакционных групп фермента можно пояснить на двух примерах.
Рибонуклеаза (РНКаза). Этот фермент расщепляет фосфоди- эфирные связи в РНК. Его полипептидная цепь состоит из 124 аминокислот. С помощью субтилизипа от N-конца цепи можно отщепить 20 аминокислот (так называемый S-пептид); при этом активность фермента не снижается, если отщепленный фрагмент остается в реакционной смеси. Если же его удаляют, то ферментативная активность исчезает. Этот факт послужил отправной точкой для выяснения вопроса о том, необходим ли для проявления феоментативной активности целый S-пептид или только его часть.
В середине 60-х гг. Гоффманн, Финн, Уэллс и их сотрудники показали, что синтетический пептид, состоящий только из 5 аминокислотных остатков, занимающих в РНКазе положения 8—12, способен полностью восстановить активность фермента с отщепленным S-пептидом (так называемый S-белок, аминокислоты 21—124). Более короткие фрагменты не эффективны. Остаток гистидина (His 12) пространственно расположен вблизи другого остатка гистидина (His 119), причем оба они принимают непосредственное участие в каталитической реакции. Аминокислотные остатки 8—11 служат для фиксации His 12 в правильном стерическом положении. В отличие от многих других ферментов рибонуклеаза и лизоцим не нуждаются ни в каких кофакторах для проявления каталитической активности.
Карбоксипептидаза А. В реакции, катализируемой карбоксипептидазой А, принимает участие ион Zn2+ (рис. 18.2). Координационная сфера этого иона имеет тетраэдрическую структуру. Его лигандами служат атомы азота и кислорода аминокислот His 69, Glu 72 и His 196. Четвертый лиганд поставляет молекула субстра-
Рас. 18.2. Механизм действия карбоксипептидазы. Реакционные группы аминокислот Туг 248, Arg 145 и Glu 270, а также ион 2п лежат в активном центре и пре протеолитическом расщеплении последовательно вступают во взаимодействие с субстратом. Боковая цепь С-концевой аминокислоты субстрата погружена в полость, образованную гидрофобными аминокислотами молекулы карбоксипептидазы (Quiocho, Lipscomb, 1971).
та (кислород карбонильной группы пептидной связи). Три аминокислоты (Arg 145, Туг 248 и Glu 270), расположенные по краям активного центра фермента, взаимодействуют с молекулой субстрата, изменяя при этом ее конформацию. У всех ферментов гидролитического действия (гидролаз) аминокислоты, образующие их активные центры, содержат нуклеофильные группы, способные переносить электроны на электрофильные группы.
Наряду с катионами в активном центре многих ферментов обнаружены специфические кофакторы (коферменты), такие, например, как NAD+, порфириновое кольцо, биотин и другие. Так как многие животные нс способны синтезировать подобные коферменты, играющие роль витаминов, они должны получать их (или их предшественники) с пищей.
Мономерные ферменты с несколькими доменами
Мы уже познакомились с концепцией доменов и знаем теперь, что гены, кодирующие крупные и сложные молекулы белков, возникают в ходе эволюции в результате слияния двух или более отрезков ДНК- Наличие доменов позволяет распространить надежный принцип «строительных блоков», лежащий в основе организации белков, также и на их функции. Любой, самый примитивный фермент должен выполнять по крайней мере две функции: 1) специфически связываться с субстратом и 2) катализировать его превращения. Эти функции локализованы у содержащих домены ферментов в основном в отдельных единицах. Недавно стала известна структура фермента глутатионредуктазы с тремя доменами (I, II, III) (Zappe, Krohne-Ehrich, Schulz, 1977). Этот фермент связывается с двумя субстратами — глутатионом и NADP+. Оба субстрата образуют кристаллические комплексы с ферментом, что даст возможность локализовать в нем места их связывания.
Глутатион и NADP+ связываются с противоположными концами одного и того же домена в полости, образовавшейся между этим доменом и одним из двух других. Кратчайшее расстояние между субстратами составляет 10 А и проходит через середину субъединицы. Это расстояние перекрывается изоаллоксазиновым кольцом молекулы FAD — кофермента глутатионредуктазы.
Белки, состоящие из нескольких субъединиц
Каким образом можно увеличить размеры белка? Какие это дает преимущества? Как уже ясно из предыдущего раздела, клубок, образуемый полипептидной цепью, имеет ограниченные размеры. Белки с длинными полиисптидными цепями (200—1000 аминокислотных остатков) содержат не один, а несколько таких клуб-
ков (доменов). Другая возможность получить выигрыш в размере—это образование четвертичной структуры в результате определенного пространственного расположения нескольких полипеп- тидных цепей. Такой механизм лежит в основе формирования многих внутриклеточных и мембранных белков, а большинство вне-- клеточных ферментов представляет собой мелкие мономерные молекулы, содержащие большое число дисульфидных мостиков.
Белки, состоящие из нескольких полипептидных целей (субъединиц), называются также олигомерными белками. При этом субъединицы могут быть 1) одинаковыми, 2) разными, но выполняющими одинаковые функции и 3) разными и выполняющими разные функции. *1
Уже говорилось не только о том, что ферменты выполняют каталитические функции, но и о том, что эти функции могут сильно различаться по своей эффективности. Многие белки принадлежат к так называемым регуляторным белкам, и, как мы увидим в следующем разделе, существует целый ряд различных механизмов, влияющих на активность белка.
В эукариотической клетке содержится до 3000 различных ферментов, которые часто конкурируют за один и тот же субстрат (например, ЛТР). Преимущество получают только такие ферменты, которые соответствуют потребностям клетки. Внутри клетки находится множество активирующих и ингибирующих молекул, протеаз, мембран, органелл и других макромолекулярных агрегатов. Фермент должен проявлять свою активность при нормальных и изменившихся условиях обмена и при необходимости выстоять даже в катастрофических ситуациях.
Во многих случаях белки с четвертичной структурой содержат от двух до четырех чрезвычайно сходных, ио нс одинаковых субъединиц. Мы уже обсудили это явление на примере изоферментов лактатдегидрогеназы и увидели, что это открывает возможность для эффективного функционирования данного фермента в различных типах клеток, тканях и на разных этапах развития.
Подобное явление обнаружено и у гемоглобина. В ходе эволюции возникла олигомерная структура, проявляющая способность: а) изменять свое сродство к кислороду при различных парциальных давлениях О2 и б) связываться с малыми регуляторными молекулами, такими, как ЛТР и DPG (2,3-дифосфоглице- рат), снижающих сродство гемоглобина к О2.
При низком парциальном давлении О2 сродство гемоглобина позвоночных к кислороду меньше, чем сродство мономерного гемоглобина беспозвоночных; при высоких парциальных давлениях О2. напротив, сродство значительно выше. Такое изменение сродства основано на кооперативном поведении субъединиц (аллостерический эффект). Кооперативное поведение обнаруживают только олигомерные белки, что обусловлено взаимодействием соседних
субъединиц. При этом активность ферментов либо повышается, либо снижается. При повышении активности зависимость скорости реакции (о) от концентрации субстрата (S) выражается сигмоидной кривой. При ингибировании получают гиперболическую кривую, которая в зависимости от степени отрицательной кооперативности более или менее резко перегибается, так как каждая связанная молекула субстрата затрудняет связывание следующей молекулы. Примером может служить глицсральдегид-3-фосфатдегидро- геназа. Вследствие отрицательной кооперативности фермент утрачивает чувствительность при высоких концентрациях субстрата, но очень быстро реагирует на изменения при низких его концентрациях. Этот механизм регуляции обнаружен преимущественно у ферментов, функционирующих в местах переключения метаболических путей (точки ветвления).
Чем больше субъединиц содержит ферментативный комплекс, тем сильнее кооперативные эффекты, причем это справедливо как для положительной, так и для отрицательной кооперативности. Правда, имеется лишь небольшое число ферментативных комплексов, состоящих более чем из 10—12 субъединиц. При образовании более крупных агрегатов возникли бы новые осложнения: например, было бы трудно соблюдать эквивалентность связывания. В таком комплексе одна или более субъединиц, изолированных от внешней среды, должны были бы располагаться внутри глобулы в окружении гидрофобных групп; вероятно, весь комплекс имел бы форму полого шара. Примеры подобных структур можно найти в вирусологии (см. гл. 46). Кроме того, существует еще одна возможность — расположение субъединиц в одной плоскости, и клетка широко использует эту возможность (мембраны). Дальше мы увидим, что преимущество мембранной структуры заключается именно в кооперативном действии локализованных на поверхности клетки белков.
В 1965 г. Моно, Уайман и Шанжё сформулировали положения относительно условий, необходимых для возникновения кооперативного поведения белков (аллостерия):
Аллостерические белки представляют собой олигомеры, состоящие из идентичных (или очень сходных) мономеров. Некоторые аллостерические ферменты содержат и каталитические, и регуляторные субъединицы (например, аспартаттранскарбамилаза).
В каждом белковом мономере имеется только один активный центр (для одного лиганда).
Конформация мономера изменяется в результате взаимодействия с другими мономерами.
По крайней мере две стадии являются обратимыми. Они различаются между собой распределением энергии межпротомерных связей. Выявлены различные структурные конформации молекулы белка.
1 1 •1 Q
Рис. 18.3. Конформационные изменения тетрамерного аллостерического фермента. Каждая субъединица может существовать либо в одной (О), либо в другой (О) конформации. Конформация О обладает более высоким сродством к субстрату, чем конформация □. Связывание субстрата S способствует переходу формы □ в форму О. Поэтому при недостатке субстрата преимущественно встречаются либо полностью незамещенные (вверху слева), либо полностью замещенные субстратом (снизу справа) тетрамеры. Комплекс ведет себя по принципу «все или ничего» (Eigen, 1967).
Изменение конформации приводит к изменению сродства одного (или более) стереоспецифического участка.
Когда белок переходит из одного состояния в другое, его симметрия сохраняется (рис. 18.3).
Регуляторные молекулы. Многие промежуточные и конечные продукты обмена веществ, например АТР, AMP, DPG (дифосфоглицерат) и другие молекулы, тормозят или активируют действие ферментов. Таким образом, их концентрация регулирует альтернативные пути обмена веществ. В качестве примеров можно привести гемоглобин и гликогенфосфорилазу.
Гемоглобин. У низших позвоночных АТР связывается с тетрамером гемоглобина, что приводит к уменьшению сродства гемоглобина к кислороду. В гемоглобине человека имеется общее место связывания для ATP, DPG и других молекул. Если АТР свяжется с гемоглобином, то он уже нс будет оказывать ретроингибирующего действия на другие ферменты. В результате синтез АТР будет продолжаться. У низших позвоночных (например, костистых рыб) АТР образуется главным образом в результате окислительного фосфорилирования в митохондриях эритроцитов, причем количество синтезируемого АТР зависит от количества О2, высвобождаемого из гемоглобина. Таким образом, АТР стимулирует процесс окислительного фосфорилирования, а тем самым
и свой собственный синтез (положительная обратная связь). В эритроцитах млекопитающих не происходит окислительного фосфорилирования, и содержание АТР в них невелико. Вместо него в качестве эффектора используется DPG — вторичный продукт гликолиза, концентрация которого в сыворотке и клетках крови при уменьшении концентрации Ог повышается, а^ при увеличении концентрации О2 — снижается. Для его дальнейшего превращения в цитратном цикле и дыхательной цепи требуется Ог. Связывание DPG гемоглобином приводит к тому, что его ингибирующее действие на ферменты гликолиза (например, гсксокиназу) прекращается (Coates, 1975).
Гликогенфосфорилаза. Гликогенфосфорилаза может существовать как в активном, так и в неактивном состоянии. Переход из одного состояния в другое происходит под влиянием ряда контролирующих факторов. Фосфорилирование аминокислотного остатка Ser 14, катализируемое киназой фосфорилазы, приводит к появлению активной (фосфорилированной) формы фермента (фосфорилазы а). Инактивация (дефосфорилирование) фермента катализируется фосфатазой фосфорилазы и приводит к образованию фосфорилазы Ь. В основе такого механизма контроля лежит процесс образования и разрушения ковалентных связей. Кроме того, имеется ряд небольших лигандов, связывающихся с ферментом нековалентно: глюкоза, глюкозо-б-фосфат и АТР, действующие как антагонисты. В результате фосфорилирования серина в положении 14 фермент утрачивает способность к аллостерическому торможению под действием АТР, но сохраняет такую способность в отношении глюкозы. Однако при физиологических условиях в большинстве клеток торможения за счет глюкозы не происходит, так как лишь небольшое число клеток содержит глюкозу в свободной нефосфорилированной форме; исключение составляют лишь клетки печени.
Третичная структура фермента была установлена с разрешением 3 A (Fletterick et al., 1975; Johnson et al., 1975). Гликогенфосфорилаза представляет собой димер. Каждая субъединица содержит около 800 аминокислот, причем структура состоит на 40% из а-спиральных участков и примерно па 25%—из складчатых p-слоев. Область вблизи С-конца обнаруживает поразительную стерическую гомологию с NAD+-cвязывaющим доменом дегидрогеназы (см. гл. 15). Все упомянутые здесь регуляторные молекулы могут быть закристаллизованы в комплексе с ферментом, что дает возможность установить их положение на поверхности фермента.
Отличительная особенность структуры этого фермента заключается в том, что места связывания отдельных эффекторов пространственно разобщены между собой. Поэтому эффекторы могут влиять на форму активного центра только благодаря тому, что они вызывают значительные конформационные изменения всей
структуры молекулы. Таким образом, совершенно ясно, что для активности фермента важны не только аминокислоты в области активного центра, но и многие, если не все, аминокислоты, расположенные на поверхности молекулы. Это необходимо для оптимального (с точки зрения потребностей клетки) функционирования фермента.
ОБМЕН ВЕЩЕСТВ: ФЕРМЕНТЫ
В КАЧЕСТВЕ КОНТРОЛИРУЮЩИХ АГЕНТОВ
Об обмене веществ и отдельных его реакциях, а также о промежуточных и конечных продуктах подробно рассказывается во всех учебниках биохимии. Здесь мы не будем останавливаться на этом, а сразу же перейдем к обсуждению проблем регуляции и выбора того или иного метаболического пути. Эти пути образуют целую сеть, и именно регуляторные ферменты «решают», какой из них будет избран в каждый данный момент времени. Уровень ферментативной активности зависит от числа имеющихся в наличии молекул фермента, их состояния, а также от концентрации субстрата и молекул эффекторов.
По-видимому, в эукариотических клетках содержится значительно больше молекул ферментов, чем требуется клетке при «нормальных условиях». Это, безусловно, не относится к прокариотическим клеткам. У прокариот существуют индуцируемые и конститутивные ферменты. К индуцируемым принадлежит в числе прочих р-галактозидаза, которая синтезируется только в том случае, если в ней возникает потребность. В отличие от индуцируемых конститутивные ферменты образуются в клетке постоянно. Механизм контроля, лежащий в основе синтеза индуцируемых ферментов, описан в гл. 9. Его преимущество заключается в том, что он позволяет экономить энергию, а его недостаток —в том. что он лишен необходимой гибкости. Для клеток, время генерации которых колеблется в широких пределах, на первый план выступает преимущество этого механизма. В эукариотических клетках, у которых время генерации точно запрограммировано и зависит от многих параметров, перевес получает недостаток. Тем не менее и у эукариот существуют обширные клеточные системы, вступающие в действие только после индукции, вызванной внешними стимулами, как, например, иммунная система (см. гл. 66—68). Однако в таких системах время изменения активности измеряется не минутами, а днями и неделями.
При контролировании обмена веществ преобладающее значение приобретают механизмы, обеспечивающие изменение ферментативной активности. При этом реализуются три принципиально различные возможности:
Фермент синтезируется в неактивном состоянии, а затем в результате ограниченного протеолиза, осуществляемого каким-то
другим ферментом, переходит в активную форму. В процессе • активации расщепляется одна пептидная связь. Разрыв пептид- ■ ной связи — это экзергоническая и, следовательно, необратимая реакция.
Фермент синтезируется в неактивном состоянии. Путем связывания с активируемой группой (например, с фосфатным остатком) он переходит в активное состояние. Реакция катализируется киназой. С помощью другого фермента (какой-либо фосфатазы) фосфатный остаток может отщепиться, вследствие чего фермент опять перейдет в неактивное состояние. Такой механизм контроля хотя и обратим, но требует притока энергии.
Фермент синтезируется в неактивном (или частично активном) •■•состоянии. Его активность зависит от субстрата или эффекторов, которые вследствие слабого взаимодействия с ферментом -связываются с ним обратимо. Такой контроль быстр, эффекти- ! в*?и и не требует затраты энергии.
'■ Преимущества этих механизмов возрастают в порядке их перечисления. Это указывает на то, что чаще всего реализуется третий-механизм, а реже всего —первый. Все три механизма приводят к разным последствиям и выполняют в клетке существенно разные задачи.
ИСЧ ".
Э^ничённый протеолиз
залМъгуже обсуждали принцип ограниченного протеолиза на при- И^ре свертываемости крови (см. рис. 16.4) и видели, что ферменты, ушетвующие в этом процессе, включаются в определенной после- доввтельности и действуют наподобие каскада. При этом наблю- дтотся следующие явления: а) эффект усиления, б) регуляция е помощью ряда эффекторов, в) переключение альтернативных путей.
Такие системы функционируют, как правило, в течение короткого времени и носят локальный характер, поэтому они используются преимущественно в катастрофических ситуациях. Еще один пример подобного механизма — это система комплемента, связанная с иммунной системой. Общеизвестно, что антитела специфически реагируют с чужеродными телами (антигенами), в результате чего образуются комплексы антиген — антитело. Если в качестве антигена выступает белок или какая-то другая молекула сходных размеров, то возникает труднорастворимый осадок, благодаря чему антиген обезвреживается. Если же речь идет об антигенах, расположенных па поверхности клетки, такой, как проникшая в организм бактерия, то, хотя эти антигены и связываются с антителами, из-за небольших размеров образовавшихся комплексов (по сравнению с клеткой) результат будет незначителен. Только совместные действия антител с компонентами системы комплемента
Таблица 18.1
Компоненты системы комплемента
Компоненты
Молекулярная масса
Концентрация в сыворотке, мг/л
C'iq
400 000
100-200
Jr
(160 000)
—
Is
180 000
22
С'2
115 000
10
С'З
240 000
1200
С'4
230 000
430
С'5
(210 000)
75
С'6
(210 000)
75
С'7
(120 000)
С'8
(190 000)
С'9
79 000
1—2
выводят клетку из строя, вызывая ее лизис. Система комплемента состоит из девяти компонентов (табл. 18.1).
Все эти компоненты представляют собой белки (эстеразы), имеющие, как показывает таблица, относительно большие размеры; некоторые из них присутствуют в сыворотке в значительных количествах.
При образовании специфического комплекса антиген — антитело на поверхности клетки конформация молекулы антитела изменяется таким образом, что молекула становится способной связаться с компонентом С'1 системы комплемента. С'1—это комплекс, состоящий из lq. 1г, 1s и Са2+. C'ls после образования комплекса с антителом активируется и воздействует на компонент С'4, в результате чего последний приобретает способность узнавать поверхность клетки. Одновременно С'1 расщепляет компонент С'2, часть которого связывается с С'4 (С'4,2).
Этот комплекс (на поверхности клетки) активирует множество молекул С'З (эффект усиления), которые при этом распадаются на С'За и С'ЗЬ. С'За остается связанным с поверхностью клетки. Это опять-таки действует как сигнал для связывания клеткой комплекса из С'5, С'6 и С'7. Кроме компонента С'ЗЬ при этом нужен также и компонент С'4,2. На С'7 действует С'8, в результате чего происходит первое повреждение мембраны. В конце концов с С'8 связывается последний компонент С'9, что приводит к полному лизису мембраны. Для большей наглядности на рис. 18.4 представлены отдельные этапы этого процесса. Кроме описанного пути существует еще и альтернативный путь связывания комплемента, Считается, что сама по себе система комплемента неспецифична. Специфичность появляется вследствие ее взаимодействия с комплексом антиген — антитело. Вся эта сложная система дает
Рис. 18.4. Механизм действия системы комплемента. На диаграмме наглядно представлены последовательные этапы этого процесса. Первоначальные реакции (верхний ряд) зависят от образования комплекса антиген—антитело, а последующие (нижний ряд) не зависят.
огромный эффект. Поэтому с биологической точки зрения вполне понятно, что система, предназначенная для такого грубого вмешательства, как уничтожение чужеродной клетки, должна находиться под контролем многочисленных механизмов.
Обратимые модификации; фосфорилирование
В следующем разделе мы обсудим регуляцию постоянно происходящего в клетке так называемого основного обмена веществ. Теперь же рассмотрим факторы, которые периодически повышают или снижают скорость обмена. Эти регуляторные механизмы как бы главенствуют над основным обменом веществ. Внешние стимулы, такие, например как гормоны, оказывают на него модулирующее действие. Гормоны на основе их функций можно подразделить на два класса:
Гормоны, влияющие на рост и дифференцировку. Как правило, они действуют с помощью специфических рецепторов непосредственно на ДНК в ядре и таким образом влияют на скорость специфической транскрипции определенных генов.
Гормоны, оказывающие обратимое влияние на обмен в клетке. Они взаимодействуют с вторичными медиаторами, такими, как сАМР, cGMP или Са2+, которые со своей стороны инициируют в клетке каскад реакций фосфорилирования (см. гл. 59).
Таблица 18.2
Повышение (+) иля понижение (—) активности ферментов
Фермент
Фосфорилирует
Дефосфорн- «рует
Катаболические ферменты (катализируют процессы
Киназа фосфорилазы
+
Фосфорилаза
+
Гормонозависимая липаза
+
Анаболические ферменты (катализируют процессы
синтеза)
Гликогенсинтета за
+
Синтетаза жирных кислот
4-
Ацетил-СоА—карбоксилаза
—
+
Существует большое число ферментов, активность которых регулируется путем фосфорилирования. Несколько примеров приведено в табл. 18.2.
Кроме того, к белкам подобного типа относятся гистон I (см. гл. 40), тубулин, транспортные системы, такие, как Na+/K+-Hacoc и Са2+-насос (см. гл. 28), а также глнкозилтрансферазы (см. гл. 29).
Преимущества регуляции такого рода заключаются в следующем: эффекты усиления в случае необходимости возникают в результате слабых специфических раздражений;
интеграция различных регулируемых сигналов;
клетка может быстро и эффективно приспособиться к изменениям окружающей среды.
Ферментативные каскады изменяют чувствительность всего обмена веществ в клетке. Последние ферменты, о которых мы говорили, состоят из нескольких субъединиц, что обусловливает дальнейший эффект усиления.
Регуляция основного обмена веществ
Основной обмен (гликолиз, цитратный цикл, дыхательная цепь, синтез аминокислот, жирных кислот, нуклеотидов и пр.) регулируется механизмами, которые должны функционировать с очень большой скоростью (в пределах миллисекунд). Мы уже указывали, что в данном случае действуют АТР, АМР, такие продукты обмена, как цитрат, пируват и другие, а также конечные продукты, концентрация которых в клетке сильно колеблется. АТР как источник энергии почти для всех процессов синтеза всегда является лимитирующим фактором. Только ферменты, обладающие высокой степенью сродства к АТР, имеют шансы вступить с ним в контакт.
Ингибирование (торможение) конечным продуктом. Конечный продукт той или иной последовательности биосинтетических реакций ингибирует фермент, катализирующий первый этап синтеза. Вследствие этого вся последовательность реакций выключается и накопление промежуточных продуктов прекращается. Конечный продукт может использоваться и для других целей (альтернативные пути обмена).
Как правило, в последовательностях биосинтетических реакций регулируются лишь некоторые ферменты, и прежде всего те, которые катализируют начальные этапы путей обмена или этапы в точках разветвления этих путей. На промежуточных стадиях успешное протекание реакций определяется только наличием субстратов и своевременным оттоком продуктов. Все ферменты, катализирующие реакции в точках переключения путей обмена, представляют собой олигомерные белки. Эти реакции являются экзергоническими и, следовательно, необратимыми. В точках разветвления двух путей обмена за субстрат конкурируют два фермента. Поскольку их сродство к субстрату, как правило, различно, преимущество получает один из этих путей, и только при очень больших концентрациях субстрата открывается также и второй путь.
В качестве примера можно привести пируватдегидрогеназу (дыхательная цепь), функционирующую при низких концентрациях субстрата, и пируватдекарбоксилазу (брожение), которая начинает действовать только тогда, когда концентрация того же субстрата повысится в десять раз. До тех пор пока существуют условия для превращения пирувата в цитратном цикле и дыхательной цепи, весь субстрат движется только в этом направлении. Если этот путь преграждается, то происходит накопление пирувата, в результате чего открывается путь в направлении брожения. Клетка использует здесь механизм обратной связи, который
Glu+NH3 + АТР
Gig, Ala♦•Ir—*
Кароамоил- фоарат
Глюкозами-6- - фосфат
СТР ■* «-АПР
Рис. 18.5. Мультивалентное аллостерическое торможение глутаминсинтетазы. Фермент катализирует этап превращения Glu в Gin (Meister, 1969).
Простое торможение конечным продуктам:
А~р8 С D Е Лспи^мт-карбамвикзршсфсраэа
Фермент с нескамкими центрами cbisukiHui
Пдльтибяжнтк.'.- гарможемие конечным продуктам:
Лспартаткитса (Bacillus polyeiirи)Лспартаткитса (Bacillus polyeiirи)
Лспартаткитса (Bacillus polyeiirи)
Лспартаткитса (Bacillus polyeiirи)
Ковпсрип;и8.чве wvoxtemif конечным продутом:
ПерВый фермата пути бжеинтпа пуринаПерВый фермата пути бжеинтпа пуринаКумулятабгое терможежг конечным продуктам: 1Кумулятабгое терможежг конечным продуктам: 1
ПерВый фермата пути бжеинтпа пурина
ПерВый фермата пути бжеинтпа пурина
Кумулятабгое терможежг конечным продуктам: 1
Кумулятабгое терможежг конечным продуктам: 1
а'чгй tniiMCdotamubiee торжжение):а'чгй tniiMCdotamubiee торжжение):Синтез ирамитичгоиа имимокиметСинтез ирамитичгоиа имимокимет
а'чгй tniiMCdotamubiee торжжение):
а'чгй tniiMCdotamubiee торжжение):
Синтез ирамитичгоиа имимокимет
Синтез ирамитичгоиа имимокимет
Компенсаторнее оЬращрни: торможепан конечным продуктом:
Тоеониндезаминази:, Торзятсение га) действием lie. Индукции пев дейстдием Vol (В. suBtilis)Тоеониндезаминази:, Торзятсение га) действием lie. Индукции пев дейстдием Vol (В. suBtilis)
Тоеониндезаминази:, Торзятсение га) действием lie. Индукции пев дейстдием Vol (В. suBtilis)
Тоеониндезаминази:, Торзятсение га) действием lie. Индукции пев дейстдием Vol (В. suBtilis)
Торможение посреЭстбом промежуточных пройрстаб 6 точках раАвВ- jkhuh битантстичяких кучей tnbcHCdotamubiee торможение):
Многие ферменты со спеуфичсашми peeyMmopwiMu центрами:
Пребрииукис иагартита 6 р-ацетилфосфиптос производное (Е.соШПребрииукис иагартита 6 р-ацетилфосфиптос производное (Е.соШ
Пребрииукис иагартита 6 р-ацетилфосфиптос производное (Е.соШ
Пребрииукис иагартита 6 р-ацетилфосфиптос производное (Е.соШ
Рис. 18.6. Некоторые контролирующие механизмы обмена веществ у микооопга-низмов, осуществляемые посредством конечных продуктов цепей биосинтетическихреакций. Приведенные примеры должны дать представление о том. каким обоазомвозникает сложная сеть регулируемых и связанных между собой путей обменавеществ (Datta, 1969).
обеспечивает удовлетворение ее потребностей без потери субстрата.
На рисунках 18.5 и 18.6 схематически изображены различные случаи ингибирования биосинтетических реакций конечными продуктами обмена. Эти примеры иллюстрируют всю сложность взаимосвязей между отдельными этапами обмена веществ и показывают, что регуляция осуществляется на разных уровнях. Чем выше уровень, тем больше способов регуляции используется и тем более глубоким оказывается такое вмешательство.
ГЕНЕТИКА И ЭВОЛЮЦИЯ
Теперь, когда выяснена структура ряда белков и изучены их функции, мы должны несколько видоизменить формулировку известной концепции «один ген — один фермент». Существуют следующие варианты такой видоизмененной концепции:
Олигомерные белки, состоящие из двух или из п одинаковых полипептидных цепей (например, гликогенфосфорилаза):
один ген—-одна полипептидная цепь;
две или п полипептидных цепей—-один фермент.
Олигомер, состоящий из различных полипептидных цепей (изоферменты, например лактатдегидрогеназа, гемоглобин и некоторые другие ферменты):
два гена—>-две полипептидные цепи;
п (две) полипептидных цепей—>-один фермент.
Полипептидная цепь, обладающая несколькими видами ферментативной активности. Примером может служить аспартаткина- за — L-гомосериндегидратаза. Ее молекула состоит из четырех идентичных субъединиц (мол. масса 86 000): один ген—-один полипептид—>-два фермента. Другой пример — синтетаза жирных кислот у эукариот: один ген—-один полипептид—>->четы- ре ферментативные активности.
Антитела (см. гл. 22):
два гена—*-одна полипептидная цепь.
Бактериофаг 0X174 и другие:
«один ген»->-две полипептидные цепи (см. гл. 5).
Взаимодействие между молекулами и то, что они занимают вполне определенное положение в обмене веществ, сильно ограничивает возможность их независимой эволюции. Тем не менее мы видели, что в процессе эволюции белки у высокоразвитых видов изменяются. Если же модифицируются отдельные компоненты всей системы, то при этом неизбежно затрагиваются и другие ее компоненты, которые также начинают испытывать давление отбора. Они тоже должны приспособиться к новой обстановке. Из этого следует, что взаимодействие молекул приводит к эволюции всех участвующих в данной системе компонентов. Таким образом, с течением времени все свойства ферментов становятся
оптимальными; это касается не только их каталитической активности, но и специфичности, регуляторных возможностей и способности к кооперативным взаимодействиям с другими молекулами.
Как возникла регуляторная способность ферментов? Происходило ли эволюционное развитие участков ферментов, связывающих субстраты и эффекторы, независимо друг от друга? Если проследить эволюцию испей биосинтетических реакций, то мы придем к выводу, что эта гипотеза маловероятна. Биосинтетические пути (например, А—*-В—*С —*D—>-Е) развивались не в том направлении, в каком здесь указано, а в обратном. Реакция А—>-В, взятая отдельно, не имеет никакого смысла, так как в конце концов система могла бы начинаться и с конечного продукта Е. Нет никаких причин для того, чтобы многочленная цепь развивалась в указанном направлении. Если теперь мы будем исходить из того, что реакция D—^Е является первой, то, следовательно, и необходимый для нее фермент должен был образоваться первым. Одно из его свойств заключается в том, что он способен связывать продукт Е. Фермент, катализирующий реакцию А—*-В, возникает последним; как мы уже видели, большинство ферментов, катализирующих первую реакцию биосинтетической цепи, представляют собой олигомерные белки и многие из них ингибируются конечным продуктом этой цепи. Поэтому можно предположить, что одна из субъединиц (или доменов), а именно регуляторная субъединица, происходит из фермента, катализирующего последний этап цепи. Причина этого заключается в дупликации гена. Продукт присоединенного сегмента ДНК может развиваться совершенно независимо и накапливать мутационные изменения, но при этом сохранять свойство связываться с Е. Со сходным явлением мы уже познакомились при сравнении дегидрогеназы и адепилаткиназы (см. гл. 15). Оба фермента связывают ди- и трифосфатнуклеозиды соответственно. Первые используют NAD+ в качестве кофермента (они не изменились), а второй использует ATP/z\DP в качестве субстрата (в нем произошли изменения).
ЛИТЕРАТУРА
Datta Р. (1969). Regulation of branched biosynthetic pathways in bacteria, Science, 165. 556.
Eigen M. (1967). Kinetics of reaction control and information transfer in enzymes and nucleic acids, Nobe! Symp., 5. 341.
Meister A. (1968). Specificity of glutamine synthetase. Adv. Enzymol., 31, 183.
Porter R. R. (1977). The biochemistry of complement, Biochem. Soc. Trans. London,
1659.
Quiocho F. A., Lipscomb W. N. (1971). Carboxypeptidase A: a protein and an enzyme, Adv. Protein Chern., 25, 1.
Schulz G. E., Schirmer R. H., Sachsenheimer V., Pal E. F. (1978). The structure of the flavoenzyme glutathione reductase, Nature (London), 273, 120.
Zappe H. A., Krohne-Ehrich G., Schulz G. E. (1977). Low resolution structure of human erythrocyte glutathione reductase, J. Mol. Biol., 113, 141.
БЕЛКИ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИЕ С НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ
РЕГУЛЯТОРНЫЕ БЕЛКИ
Регуляторные белки связываются с ДНК и влияют на специфическую экспрессию генов (скорость транскрипции). При этом они оказывают либо отрицательное, либо положительное влияние. Белки, отрицательно влияющие на скорость транскрипции, называют репрессорами. Репрессор лактозного оперона Е. coll Uac- репрессор) — наиболее хорошо известный пример таких белков. К активирующим белкам принадлежит САР (белок, связывающий циклический АМР), который также влияет на Zac-оператор (см. гл. 9). У прокариот подробно изучен и ряд других оперонов, однако об их ДНК мы знаем значительно больше, чем о связанных с ними белках, хотя последние также играют важную роль.
Еще меньше известно о регуляции экспрессии генов у эукариот. Их ДНК существует в виде комплекса с белками (хроматин, см. гл. 40). Белки хроматина подразделяются на основные гистоны и большей частью кислые негистоновые белки. За последние годы выяснилось, что гистоны представляют собой относительно однородную популяцию молекул, лишь незначительно различающихся в зависимости от вида организма или ткани. Выдвинутая ранее гипотеза о том, что гистоны играют определенную роль в регуляции транскрипции, все более оттесняется на задний план, вместе с тем все более важное значение начинают придавать негнетоно- вым белкам.
В 1975 г. Штейн и его сотрудники обнаружили, что гистоновые гены в клетках HeLa проявляют активность только в S-фазе при одновременном синтезе ДНК. Они выделили из хроматина в S-фазе негистоновый белок, который специфически повышал скорость транскрипции гистоновых генов; в хроматине, находящемся в Gi-фазе, он не был обнаружен.
В экспериментах по реконструкции хроматина было показано, что этот белок вместе с гистоном и ДНК, выделенными из Gr хроматина, стимулирует транскрипцию гистоновых генов; при его отсутствии в реакционной среде наблюдалось торможение транскрипции. Белок не влияет на очищенную ДНК, т. е. действует только совместно с гистонами. В этой сложной области остается еще много неясных вопросов. Выделенный белок подробно не охарактеризован. Неясно, реагирует ли он с ДНК, ассоциированной с нуклеосомами, или с межнуклеосомной ДНК. Не известно также, появляется ли этот белок только в определенный момент времени непосредственно перед началом S-фазы, или он всегда присутствует в клетке, но проявляет свою активность лишь под влиянием каких-то активирующих факторов (фосфорилирование?).
Из хроматина клеток асцитной опухоли Эрлиха был выделен негистоновый белок (Wang, Kostraba, Newman, 1976), который подавлял транскрипцию ДНК. Ингибирование может наблюдаться либо на стадии инициации транскрипции, либо на стадии элонгации растущей цепи мРНК- В данном случае ингибирование происходило на стадии инициации. Ингибирующий белок из хроматина эритроцитов цыпленка электрофоретически отличался от аналогичного белка, выделенного из тимуса теленка. Ингибирующий эффект обнаруживался только при использовании гомологичной ДНК, Т. е. наблюдалось специфическое торможение. Белок предпочтительно связывался с повторяющимися последовательностями ДНК. Наряду с ингибирующим негистоновым белком из хроматина клеток асцитной опухоли Эрлиха можно выделить также и активирующую белковую фракцию, которая стимулирует синтез РНК in vitro. Активация также специфична и не наблюдается при использовании ДНК тимуса теленка, печени крысы или эритроцитов цыпленка. По-видимому, при активации происходит узнавание специфических нуклеотидных последовательностей ДНК. В отличие от ингибирующего белка активирующий белок связывается только с уникальными последовательностями.
Зависимость специфической транскрипции хроматина от негистоновых белков, высокая скорость их обновления, синтез специфических нетистоновых белков в определенные фазы клеточного цикла, а также наличие тканевой специфичности у этих белков — все эти данные указывают па то, что негистоновые белки играют ключевую роль в контроле экспрессии генов. Тем не менее решающие эксперименты пока не поставлены. Так, например, в описанной выше работе (Wang, Kostraba, Newman, 1976) не было получено убедительных доказательств того, что выделенные белки избирательно влияют на транскрипцию определенных участков генов.
/ас-Репрессор
Гас-Репрессор в настоящее время является наиболее хорошо изученным бактериальным белком. Он специфически узнает /ас- оператор и связывается с этим участком ДНК с константой диссоциации 10-11—10~|3М. Такие высокие значения константы диссоциации довольно типичны для бактерий. Многие другие репрессоры и активаторы связываются с ДПК так же прочно. Обычно /ас-репрессор составляет лишь 0,005% растворимого белка Е. coli, и этого недостаточно для проведения биохимических анализов. Однако получены мутанты, содержащие до 7% этого белка (Мй1- ler-Hill, Kania, 1974). Для этой цели применяют следующие приемы:
ПЛ*
Отбирают мутанты с измененным промотором для гена i (кодирующего /ас-репрессор), которые синтезируют в 100 раз больше репрессорного белка, чем штамм дикого типа.
Используют трансдуцирующие фаги, несущие ген I и включающиеся в бактериальные клетки. Благодаря этому значительно повышается доза гена.
/ас-Репрессор содержит по крайнем мере четыре различные функциональные области: 1) место связывания с оператором,
место связывания с индуктором;
«передаточную» область, т. е. область, которая передает сигнал от места связывания индуктора к месту связывания оператора;
область, участвующую в сборке субъединиц в тетрамер. Связывание индуктора, например лактозы или еще лучше IPTG (изопропил-р-О-тиогалактозида) с интактным репрессором, приводит к уменьшению величины константы связывания на несколько порядков.
Область связывания оператора состоит по крайней мере из двух частей: а) области специфического узнавания и связывания с ДНК и б) области неспецифического связывания с ДНК.
Изучение репрессора значительно облегчается благодаря использованию мутантов. Был разработан специальный метод, позволивший получать совершенно определенные мутации в гене, кодирующем /ас-репрессор (Miller et al., 1975). Для этого были использованы два простых приема. Выделяли мутанты с нонсенс- кодонами (UAG, UAA. UGA), т. е. кодонами, вызывающими обрыв полипептидной цепи. Для каждого такого ионсенс-кодона существуют супрессорные мутанты штаммов Е. coll, в каждом из которых нонсенс-кодон контролирует включение какой-то определенной аминокислоты. Например, в то место, где стоит UAG, могут включаться аминокислоты Gin, Leu, Lys, Ser и Туг. Следовательно, образование мутантных продуктов происходит в две стадии:
исходная аминокислота—►стоп-сигнал,
стоп-сигнал—►желаемая аминокислота.
Таким образом, были получены мутанты, у которых в гене, кодирующем /ас-репрессор, нонсенс-кодоны встречаются более чем в 90 различных положениях. Наконец, мутантный ген был включен в плазмиду (см. гл. 11), которую перенесли в соответствующий супрессорный штамм, в результате чего в нем начался синтез полных молекул измененного белка. Таким способом можно было установить, какие аминокислоты существенны для функции 1ас- репрессора, а какие можно заменить на другие аминокислоты (и какие именно).
К сожалению, этот изящный метод годится не для всех белков, так как его можно использовать только в том случае, если, во- первых, известна аминокислотная последовательность данного
Мутации 0е* ’°”* с т
’т * с* * I G А
I till! I I
01№ПТ№ ТО 10'GCA At 1 GТGAG С GOA 1 А А С ААТ11 С А САСА Л С А С А С С Т Т А Л С А С т С С С С 1 А Т Т G 1 I A A A G t G ' СТ
Мгаччигабмге tпма«с iс а
и^ч.-а^и цтрсахри „[С,С6 с от
tgtgtggaaTTg'gagcggataacaaTTTcacaca
асасассТТаасасТсс-ссТлТТоТТааасгсют
Ряс. 19.1. Последовательность /ас-оператора. В центральной части участка длиной 35 пар оснований находятся две области, обладающие высокой симметрией. Показаны положения мутаций ос. В нижней части рисунка отмечены положения, которые после связывания с репрессором либо совсем не метилируются (—), либо предпочтительно метилируются (+). Остатки тимина, связывающиеся с репрессором, обозначены, большими буквами (Ogota, Gilbert, 1977).
белка и, во-вторых, достаточно хорошо изучен ген, кодирующий этот белок. Ясно, что у бактерий найдется немного белков, удовлетворяющих обоим этим условиям.
Как узнает /ас-репрессор ДНК (оператор)? Оператор характеризуется специфической нуклеотидной последовательностью (см. рис. 9.5). Замены в этой области ведут к возникновению так называемых мутантов ос, у которых сродство к репрессору на несколько порядков меньше, чем у бактерий дикого типа. Гильберт и его сотрудники исследовали взаимодействие между репрессором и оператором, в котором отдельные основания были специфически модифицированы. С этой целью они, например, связывали репрессор с выделенным бромурацил (БУ) -замещенным оператором (бромурацил может включаться во время синтеза ДНК вместо тимина). УФ-облучение таких фрагментов приводило к образованию одпоцепочечных разрывов во всех положениях, в которые включился БУ; исключение составляли участки, связанные с репрессором и, таким образом, защищенные от действия УФ-облучения. Это исследование позволило установить в операторе положения оснований (тимина), участвующих в связывании репрессора. Все места контактов находятся в середине участка длиной 26 пар оснований (рис. 19.1). Оператор имеет симметричную структуру, однако связывание с репрессором происходит лишь на одной стороне этой структуры. Дальнейшие исследования показали, что репрессор защищает от метилирования с помощью диметилсульфата четыре гуанина и три аденина (в двухцепочечной ДНК диметилсульфат метилирует N7 гуанина и N3 аденина) и что для его связывания требуется семь фосфатных групп (расположенных на одной стороне молекулы ДНК). На основании полученных данных
Рис. 19.2. Модель взаимодействия между (ас-репрессором и оператором. В верхней части рисунка представлена модель ДНК, построенная из шариков. Репрессор изображен в виде линии. Места, в которых происходит его связывание с ДНК, указаны стрелками. Установлено, что ось молекулы репрессора не параллельна оси ДНК. На модели ясно видны большая и малая бороздки (желобки) в молекуле ДНК. В нуклеотидной последовательности /ас-оператора (нижняя часть рисунка) отсутствует участок(ср. с рис. 19.1, справаУ Хотя этот участок
и Ki Hi 1
к входит в состав оператора, он не принимает непосредственного участия во взаимодействии с репрессором (Goeddel et al., 1978).
был сделан вывод, что репрессор располагается с одной стороны ДНК, а не обвивается вокруг нее и не встраивается между цепями, как предсказывали некоторые старые модели (рис. 19.2).
ПОЛИМЕРАЗЫ
ДНК-полимеразы
Репликация ДНК — это сложный процесс, в котором принимает участие ряд ферментов (см. гл. 8). В 1956 г. А. Корнберг открыл ДНК-полимеразу, которая теперь обозначается как ДНК-полимераза I. Это очень большая молекула, состоящая только из одной полипептиднон цепи (мол. масса 110 000). Наряду с полимеризующей способностью фермент обладает двумя экзонуклеазными активностями, одна из которых вызывает деградацию ДНК с З'-конца (3'—►Б'-экзонуклеаза), а другая — с 5'-конца (5'—- —►З'-экзонуклеаза). Обе активности локализованы в различных местах молекулы. Здесь мы вновь сталкиваемся с полипептиднон цепью, обладающей несколькими ферментативными активностями (см. гл. 18). Полимеризация происходит от 5'-конца к З'-концу. Фермент работает при наличии всех четырех трифосфатнуклеози-
ионов Мг2+, матрицы и затравки, т. е. фермент только удли- ^ет полинуклеотидную цепь, во никогда не инициирует образования новой цепи (рис. 19.3). С помощью матрицы устанавливается нуклеотидная последовательность новых полимеризующихся участ- К°ВВ 1969 г Де Люция и Кернс выделили мутант Е. colt, содержавший ДНК полимеразу 1 лишь в следовых количествах но несмотря па это, нормально размножавшийся. Позднее было по казано, что полимераза I функционирует в клетке «основном как репаративный и корректирующий фермент. Она °тшепляет не правильно спарившиеся основания и подготавливает МВ^У У для действия лигаз. При этом удаляется также и РНК, которая синтезируется с помощью ДНК-зависимой РНК-поликгр используется в качестве затравки при инициации каждого цикла репликации. Отщепление рибонуклеотидов от вновь образовав- шейся цепи и замена их дезоксирибонуклеотидами перед завершением репликации ДНК тоже входит в задачу ДНК-полимеразы 1. Обнаружение «мутанта Кернса» послужило поводом для поисков штаммов Е. coll, содержащих полимеразу, основной функцией которой была бы полимеризация дезоксирибонуклеотидов. Были открыты ДНК-полимераза 11 и ДНК-полимераза III. Обе они могут быть выявлены лишь в мутантах, лишенных полимеразы 1, так
3- 5-
/
/
Рис. 19.3. Механизм действия ДНК-полимеразы. Удлинение затравки (праймера). Рост полипуклеотидной цепи в направлении от Б'-конца к З'-концу.
Рис. 19.4. Модель структурной организации субъединиц в ДНК-полимеразе III (голофермент). Комплекс, в котором нет фактора Copol III* обозначен как Pol III*. Каталитическая субъединица Pol III сама по себе неактивна (Kornberg, 1977).
как в отличие от этого фермента они содержатся в клетках лишь в следовых количествах, поэтому в присутствии полимеразы I их активность трудно обнаружить.
Полимераза III — это фермент, играющий ключевую роль в клетке. Не известны мутанты, у которых бы он отсутствовал. Тем- пературочувствитсльные мутанты, содержащие термолабильную полимеразу III, не могут размножаться при непермиссивных (рестриктивных) температурах.
В 1971 г. Т. Корнберг и Гефтср охарактеризовали полимеразу III. В бактериальной клетке содержится десять молекул этого фермента, скорость полимеризации составляет 250—1000 нуклеотидов на молекулу в 1 с. В то же время скорость полимеризации у полимеразы I составляет лишь 16—20 нуклеотидов на молекулу в 1 с, притом что в клетке содержится 400 молекул этого фермента. Полимеризация, осуществляемая полимеразой II, идет со скоростью от двух до пяти нуклеотидов на молекулу в 1 с. Наилучшей матрицей для полимеразы III служит двухцепочечпая молекула ДНК с большим числом коротких пробелов и свободными З'-ОН- концами. Этот фермент также обладает 3'—>5'- п 5'—*-3'-экзонук- леазнымн активностями. Полимеризация, как и у всех полимераз, осуществляется только в 5'—►З'-направлении. Молекула представляет собой димер и состоит из двух различных субъединиц с мол. массами 140 000 и 40 000.
С полимеразой III могут связываться два других белка. При этом получается комплекс полимеразы III*, который в присутствии
Белки, взаимодействующие с нуклеиновыми кислотами 313 еще одного кофактора работает только на длинной затравке, в отличие от полимеразы III, удлиняющей предпочтительно короткие затравки (структуру фермента см. на рис. 19.4).
ДНК-полимеразы эукариот
Из цитоплазмы и ядра эукариот выделены три полимеразы (а, р и у); из митохондрий был выделен четвертый фермент, который, однако, теперь охарактеризован как у-полимераза. Подобно бактериальным полимеразам, эти ферменты также нуждаются в матрице и затравке, но у них отсутствуют нуклеазные активности, и потому они не могут служить корректирующими ферментами. Они различаются размерами, структурой и специфичностью по отношению к затравкам и матрицам. Серологически эти ферменты не родственны друг другу. (Обзор по ДНК-полимеразам см. Sarn- gadharan et al., 1978).
ДНК-лолимераза а имеет константу седиментации 6—8 S. Молекулы обнаруживают определенную гетерогенность в отношении их состава. Фермент представляет собой олигомер, состоящий из мономеров с мол. массой 80 000—90 000. Для активности фермента существенное значение имеют SH-группы. ДНК-полимераза a широко распространена в клетках эукариот; особенно часто она встречается, и притом в очень активном состоянии, в быстро растущих клетках.
Не обнаружено никакой корреляции между активностью ДНК- полимеразы р и пролиферацией клеток. Для ее оптимального функционирования требуется нативная ДНК с одноцепочечными разрывами и короткими пробелами, содержащими свободные З'-ОН-группы. Денатурированная ДНК годится в качестве матрицы в меньшей степени. Агенты, ингибирующие SH-группы, не оказывают никакого влияния на фермент. ДНК-полимераза р не встречается у низших эукариот (дрожжи, низшие растения, про- тисты). Дрожжи содержат полимеразу А, сходную с полимеразой а, а также полимеразу В, отличающуюся от всех других форм. ДНК-полимераза у первоначально была выделена из клеток HeLa, однако она обнаруживается также и во многих животных клетках, а также у дрожжей (Wintersberger, 1977). В отличие от о- и р-по- лимераз она содержится в клетке (в цитоплазме и ядре) лишь в следовых количествах. Так как выделить этот фермент трудно, до сих пор нс удалось получить его в чистом виде. Фермент копирует синтетический полимер poly (гА) dT|0—is значительно эффективнее, чем дезоксирибополимеры. SH-группы имеют существенное значение. Активность изменяется на различных стадиях клеточного цикла.
Митохондриальная ДНК-полнмераза (у-полимераза) была выделена из клеток HeLa (Radsak et al., 1976) и из дрожжей
(Wintersberger, 1977). Ферменты из обоих источников различаются по своим молекулярным массам. Фермент из клеток HeLa инактивируется под действием агентов, блокирующих SH-группы, тогда как фермент дрожжей сохраняет при этом свою активность. Есть данные о том, что эти митохондриальные белки синтезируются на цитоплазматических рибосомах.
ДНК-зависимые РНК-полимеразы
В предыдущем разделе мы познакомились с ДНК-полимеразами, которые служат преимущественно для репликации ДНК. Здесь речь пойдет о группе ферментов, катализирующих в первую очередь транскрипцию. Они используют в качестве матрицы одноцепочечную или денатурированную ДНК, синтезируя на ней РНК. Затравки при этом не требуется. Особенно хорошо изучены полимеразы Е. coll и некоторых бактериофагов. Эти ферменты нуждаются в наличии всех четырех 5'-трифосфатрибонуклсозидов, которые используются как субстраты. Методом гибридизации показано, что считывается только одна цепь двухцепочечной ДНК и что при этом образуется специфический продукт транскрипции (см. также гл. 9).
Фермент из Е. coll выделен в чистом виде. Он имеет мол. массу 480 000—500 000, содержит ионы Zn2+ и состоит из следующих субъединиц:
2а-иепи (мол. масса одной цепи 39000)
1 0-цепь (мол. масса 155 000)
1 0'-цепь (мол. масса 165 000)
1 ю-иепь (мол. масса 10 000)
1 cr-фактор (мол. масса 95 000)
Комплекс 0200'6) получил название «кор-фермент» (от англ, core — сердцевина); комплекс азрр'ыо представляет собой голофермент.
Кор-фермент катализирует неспецифический синтез РНК, который может начаться в любом месте ДНК-матрицы. Он способен также транскрибировать чужеродную ДНК (например, ДНК тимуса теленка). В экспериментах по конкурентной транскрипции, где в качестве матриц используют ДНК Е. coli и ДНК тимуса теленка, предпочтительно транскрибируется ДНК Е. coli.
Добавление о-фактора приводит к избирательной инициации транскрипции. Она начинается только в области промотора; при этом используется соответствующая рамка считывания, т. е. голо- фермент узнает специфическую последовательность оснований в ДНК. С промотором фермент связывается на несколько порядков прочнее, чем с другими участками ДНК. Под действием фермента конформация ДНК изменяется и происходит локальное плавление двойной спирали.
Хотя р'-субъединица, по-видимому, участвует в связывании субстрата и ответственна за специфичность этого связывания, а-фак- тор совместно с р-субъедипицей действует как аллостерический эффектор на белок, состоящий из нескольких субъединиц.
а-Фактор высвобождается сразу же после образования первой фосфодиэфирной связи (в этой реакции принимает участие АТР или GTP). Для элонгации (удлинения) образовавшейся цепи РНК он не нужен. Инициация в отличие от элонгации может блокироваться антибиотиком рифампицином (рис. 19.5). Генетические данные свидетельствую! о связывании антибиотика с р-субъедини- цей, вследствие чего затрудняется узнавание субстратов GTP и АТР.
На рис. 40.9 представлена одна из стадий транскрипции, которую можно увидеть с помощью электронного микроскопа. РНК строится как на конвейере. Как только одна молекула полимеразы закончит считывание какого-либо участка ДНК, сразу же может начинать работу следующая молекула. Транскрипция осуществляется в направлении 5'—►З', т. е. в том же направлении, что и репликация. Механизм синтеза (элонгации) в общих чертах сходен с механизмом полимеризации с помощью ДНК-полимеразы, но здесь, конечно, вместо дезоксирибонуклеотидов встраиваются рибонуклеотиды.
ДНК-зависимая РНК-полимераза служит не только для транскрипции, но играет также заметную роль в качестве фермента, инициирующего репликацию. Она синтезирует олигорибонуклеотид, который служит в качестве затравки, необходимой для действия ДНК-полимеразы. Этот олигорибонуклеотид затем удаляется с помощью ДНК-полимсразы I и заменяется соответствующим олигодезоксирибонуклеотидом. Элонгация цепи прекращается при связывании актиномицина D. Этот антибиотик (см. рис. 3.4) встраивается между GC-парами в ДНК и таким образом блокирует путь для всех полимераз. Терминация транскрипции изучена менее полно. Известно, что при этом происходят следующие события: 1) цепь РНК перестает удлиняться; 2) новообразованная
Рис. 19.5. Рифамицин В. Рифампицин является производным этого соединения.
РНК отделяется от матрицы; 3) ДНК-зависимая РНК-полимераза высвобождается.
Все три реакции происходят, как только полимераза встретит «терминатор». Было установлено, что всегда в качестве терминатора действует последовательность ТТТТТТА (Lebowitz, Weissmann, Padding, 1971). Кроме того, был выделен так называемый фактор р, который, по крайней мере in vitro, вызывает преждевременную терминацию транскрипции (Roberts, 1969). При этом незаконченная цепь РНК отделяется от матрицы, но полимераза остается связанной с ДНК (см. гл. 9 и 10).
ДНК-зависимые РНК-полимеразы эукариот
Ядра клеток млекопитающих содержат три класса РНК-полимераз. Они различаются по размерам, серологическим свойствам, специфичности и чувствительности к о-аманитину (яд, содержащийся в грибе Amanita phalloides) (рис. 19.6).
Ферменты класса II ингибируются уже при небольших дозах а-аманитина, а ферменты класса III — только при очень больших дозах; в то же время яд совсем не влияет на ферменты класса I. а-Аманитип связывается с белком, а не с ДНК. При этом синтез РНК блокируется не на стадии инициации, как в случае применения рифампицина, а только па стадии элонгации.
Ферменты класса I ответственны главным образом за транскрипцию рРНК; ферменты класса III синтезируют предшественники тРНК и 5S-pPHK, тогда как ферменты класса II образуют преимущественно мРНК (и гяРНК). Все три полимеразы представ-
Рис. 19.6. а-Аманитин.
ляют собой сложно .устроенные белки, состоящие из нескольких, в основном высокомолекулярных, субъединиц. Некоторые из них входят в состав всех трех ферментов. Это представляет интерес, поскольку они, по крайней мере отчасти, выполняют сходные функции. Как и полимераза Е. coli, полимеразы I и II нуждаются в ионах Zn2+, играющих роль кофакторов.
Репликазы
Репликазы — это ферменты, использующие РНК в качестве матрицы и синтезирующие на ней РНК из рибонуклеотидов. Естественно, что они кодируются почти исключительно вирусными геномами. Репликазы образуются сразу же после внедрения вируса в клетку (см. гл. 46). Так как геном РНК-содержащих вирусов часто представлен одноцепочечной РНК, во многих случаях вначале синтезируется копия этой цепи (<минус»-цепь). Сродство ферментов к «минуо-цепи значительно выше, чем к «плюо-цепн, поэтому после образования «минуо-цепи возникает много новых «плюо- иепей, которые как генетический материал вируса транслируются либо встраиваются в новообразованные вирусные частицы.
Особый интерес представляет репликаза фага Qp. Она состоит из четырех полипептидных цепей с молекулярными массами 65000, 70 000, 35 000 и 45 000. Генетической информации, содержащейся в геноме фага QP, недостаточно для кодирования всех этих цепей. Установлено, что только субъединица с мол. массой 65 000 кодируется вирусным геномом, тогда как образование других трех субъединиц контролируется геномом клетки-хозяина. В пеинфици- рованных клетках они используются для других целей. Субъединица с мол. массой 35000 —это фактор Ти, а субъединица с мол. массой 45 000—это фактор Т5 биосинтеза белка (см. гл. 38); функция третьей субъединицы неизвестна. На З'-концах «плюс»- и «ми- нуо-цепей Qp-PHK находится последовательность ССА, которая, возможно, служит сигналом узнавания для компонентов «Т», участвующих в узнавании клеточных тРНК, несущих на З'-конце- ту же последовательность.
Обратная транскриптаза
До 1970 г. среди молекулярных биологов было распространен» мнение о том, что генетическая информация может передаваться только в одном направлении:
ДНК —* РНК —- белок.
Крик даже назвал такой принцип передачи информации центральным постулатом молекулярной биологии. Однако он был поставле»
под сомнение, когда Темин и Балтимор открыли полимеразу, использующую в качестве матрицы РНК, на которой сначала строится одна" цепь ДНК, а затем комплементарная ей цепь, так что в результате образуется двухцепочечная ДНК. В 1970 г. это открытие уже носилось в воздухе. Еще раньше было известно, что ДНК-содержащие опухолеродные вирусы встраивают свой геном в геном клетки-хозяина и таким путем трансформируют клетки. В это представление не укладывается лишь ряд РНК-содержащих вирусов (более подробно об этом см. гл. 47). Заслуживает внимания также и то, что после заражения эти вирусы не выявляются в инфицированных клетках, хотя последние и остаются в трансфор миров а нном состоянии. Проблема была решена после открытия указанного фермента — обратной транскриптазы. Между про- чим, название «обратная транскриптаза» было предложено одним анонимным корреспондентом журнала «Nature» (Nature, 228, 609, 1970) и с тех пор укоренилось. Следует подчеркнуть, что существование потока информации в направлении
РНК —- ДНК
не вызывает удивления, так как термодинамически он едва ли отличается от наиболее часто встречающегося потока ДНК—-*■ —*РНК. Иначе обстоит дело в отношении второй реакции:
РНК —** белок.
Здесь перенос информации в обратном направлении невозможен по чисто термодинамическим соображениям, а также из-за сложности самого процесса (см. гл. 38).
Обратная транскриптаза кодируется геномом РНК-содержащих опухолеродных вирусов. Шпигельман вскоре после открытия этого фермента пришел к мысли о том, что необходимо проанализировать клетки опухолей человека с целью выявления в них обратной транскриптазы, так как он считал, что присутствие в клетках этого •фермента свидетельствует о существовании в них опухолеродных вирусов. Фермент был идентифицирован в ряде опухолевых клеток человека (например, в клетках грудной карциномы), а также в молоке женщин, больных раком (Schlom, Spiegelman, 1971). Однако вскоре он был обнаружен также и в нормальных клетках мыши и человека, и, следовательно, его связь с опухолеродными вирусами опять была поставлена под сомнение (Scolnik et al., 1971).
В качестве побочных активностей у фермента выявлены активности, свойственные РНКазе Н (см. следующую главу) и ДНК- зависимой ДМК-полимсразе. Фермент работает также на синтетических гетерополимерах, таких, например, как poly (С)- poIy(rG). Как и любая ДНК-образующая полимераза, обратная
траскриптаза нуждается в затравке. Для этого используется та или иная тРНК, нуклеотидная последовательность которой комплементарна 5'-концу данной вирусной РНК. Для фермента, содержащегося в вирусах лейкоза и саркомы птиц, такой затравкой служит тРНК1гр, а для фермента из мышиного вируса лейкоза Молони— тРНКРг0.
Была описана еще одна обратная транскриптаза (Bauer, Hof- schneider, 1976), которую авторы выделили из аллантоисной жидкости куриных яиц, не зараженных лейкозным вирусом. Она четко отличается по своей специфичности и серологическим свойствам от всех известных до сих пор форм. Так как фермент был выделен из яиц, взятых от кур разных пород, это свидетельствует о том, что он кодируется вс вирусом, а клеткой, где он выполняет какую-то нормальную функцию.
Обратная транскриптаза в настоящее время широко используется для исследования специфических генов. Для этого из дифференцированных клеток выделяют мРНК, очищают нужную фракцию, и на ней с помощью фермента синтезируют комплементарную ДНК (кДНК), которую затем клонируют и подвергают дальнейшим исследованиям (см. гл. 11).
ЛИГАЗЫ . . 1
Лигазы соединяют друг с другом цепи ДНК. Они используются при репарации, репликации (см. гл. 8) и рекомбинации ДНК. Их открытие косвенным образом связано с двумя наблюдениями. В 1961 г. Мезсльсон я Вейгл обнаружили, что рекомбинация включает в себя разрыв и последующее воссоединение разорванных цепей ДНК, а в 1964 г. Янг и Синсхаймер установили, что линейная молекула ДНК фага X после внедрения в бактериальную клетку замыкается в кольцо.
В 1967 г. лигазы были выделены из клеток Е. coll, не зараженных и зараженных фагом Т4. Внрус-индуцируемая лигаза четко отличается от лигазы, специфической в отношении клетки- хозяина (Gellert, Olivera. Lehman. 1967; Gefter et al.. 1967; Coz- zarelli et al.. 1967). Обе катализируют синтез фосфодиэфирных связей между соседними З'-гидроксильным и 5'-фосфатным концами двухцепочечной ДНК. В качестве источника энергии фермент из Е. coll использует NAD+, а фермент из фага Т4 — АТР. Механизм действия лигазы схематически изображен на рис. 19.7. Он представляет собой трехстадийный процесс, в котором комплекс ДНК— аденилат выступает в роли промежуточного продукта. С помощью фермента Е. coll олигорибонуклеотиды могут включаться в гибридный дуплекс РНК — ДНК; фермент фага не обладает такой способностью. Фермент Е. coli состоит из одной поли-
Е -Uysl-NHj
Е -(Lys)-NH2Е -(Lys)-NH2Н ОE-lLysl- N-^-0-R-A н о"Н ОE-lLysl- N-^-0-R-A н о"+ Покинуклеитий или РР,+ Покинуклеитий или РР,Рис. 19.7. Механизм действия лигазы. Фермент (E-(Lys)-NHa+ или E-(Lys)-NHi) использует в качестве кофактора NAD* или ATP (Lehman, 1974).Рис. 19.7. Механизм действия лигазы. Фермент (E-(Lys)-NHa+ или E-(Lys)-NHi) использует в качестве кофактора NAD* или ATP (Lehman, 1974).
Е -(Lys)-NH2
Е -(Lys)-NH2
Н О
E-lLysl- N-^-0-R-A н о"
Н О
E-lLysl- N-^-0-R-A н о"
+ Покинуклеитий или РР,
+ Покинуклеитий или РР,
Рис. 19.7. Механизм действия лигазы. Фермент (E-(Lys)-NHa+ или E-(Lys)-NHi) использует в качестве кофактора NAD* или ATP (Lehman, 1974).
Рис. 19.7. Механизм действия лигазы. Фермент (E-(Lys)-NHa+ или E-(Lys)-NHi) использует в качестве кофактора NAD* или ATP (Lehman, 1974).
пептидной цепи и имеет мол. массу около 75000. В клетке наряду с мономерной формой, по-видимому, существует еще и димерная форма, мол. масса которой в два раза больше. Константа седиментации мономера равна 3,9 5; из этого можно заключить, что молекула имеет асимметричную форму, так как соответствующая величина для сферической молекулы того же размера должна <5ыть больше.
Лигаза из Е. coll может также катализировать и обратную реакцию, внося одноцепочечные разрывы в суперспиральную ДНК и вызывая тем самым ее релаксацию. Однако эффективность этой реакции, зависящей от АМР, значительно меньше, чем эффективность сходной реакции, катализируемой релаксирующим ферментом (см. следующий раздел).
В клетке Е. coll содержится около 200—400 молекул лигазы. Мутанты, содержащие в 100 раз меньше фермента, тем не менее жизнеспособны; из этого следует, что в клетках дикого типа имеется избыточное количество фермента. Температурочувствительные мутанты, которые при рестриктивных (непермиссивных) температурах утрачивают ферментативную активность, нежизнеспособны при этой повышенной температуре.
ДНК-лигазы выделены также из клеток эукариот, хотя они еще полностью не охарактеризованы. Для действия всех эукариотических лигаз требуется АТР. В клетках млекопитающих встречаются два типа лигаз, серологически отличающихся друг от друга. Ли-
газа I локализована- преимущественно в цитоплазме, а лигаза II — в ядре и в митохондриях. Лигаза I — это относительно крупный белок, молекулярная масса которого в зависимости от его происхождения колеблется между 175 000 и 220 000. Молекулярная масса лигазы II составляет 85000. Так же как и фермент Е. coli, она имеет асимметричную форму (см. обзор Soderhall, Lindahl, 1976).
РАСПЛЕТАЮЩИЕ И РЕЛАКСИРУЮЩИЕ БЕЛКИ
(ГЕЛИКАЗЫ)
Расплетающие белки — это группа белков, кооперативно и прочно связывающихся с одноцепочечной молекулой ДНК. Они играют решающую роль при расплетании двойной спирали ДНК. В репли- кационной вилке (см. рис. 8.10) можно обнаружить до 200 молекул расплетающих белков, причем каждая молекула образует комплекс с 8—10 нуклеотидами. Связывание носит неспецифический характер по отношению к основаниям. При добавлении белка к двухцепочечной ДНК ее точка плавления снижается. Расплетающие белки были выделены из фагов и бактерий, например из фага fd (белок гена 5; Alberts et ak, 1972), фага Т4 (белок гена 32; Alberts, Frey, 1970) и неинфицированных клеток Е. coll (Molineux, Gefter, 1974).
В клетке Е. coli обнаружено до 100000 таких молекул, что указывает на их стехиометрическое, а не каталитическое действие. Белок гена 32 имеет существенное значение как для репликации, так и для рекомбинации генома фага Т4.
Белок Е. coli стимулирует полимеразную активность ДНК-полимераз II и III* и не оказывает никакого влияния на полимеразы I и III. Он ингибирует 3'—>5'-экзонуклеазное действие всех трех полимераз. При низких концентрациях соли белок образует комплекс с полимеразой II.
Кроме описанного белка из клеток Е. coli был выделен еще один расплетающий белок (Hoffmann-Berling et ak, 1976), который после связывания с ДНК приобретает способность к расщеплению АТР. Он представляет собой фибриллярный белок. Под действием этого белка при одновременном расщеплении АТР происходит плавление двойной спирали ДНК и гибридных дуплексов ДНК—РНК. Это указывает на активный процесс плавления, который напоминает расстегивание застежки «молнии». При этом молекулы белка проявляют кооперативное поведение. Фермент с аналогичным действием был выделен из мейотических клеток лилии и крысы (Hotta, Stern, 1978). Таким образом, получено свидетельство в пользу того, что этот белок играет существенную роль также и у эукариот. Показано, что количество этого фермента увеличивается параллельно с повышением уровня кроссинговера. Поэтому можно
предположить, что он, вероятно, принимает непосредственное участие в процессе рекомбинации. Механизм действия расплетающего белка еще не выяснен во всех подробностях.
При расплетании двойной спирали ДНК она должна вращаться вокруг собственной оси. У кольцевых молекул при этом происходит дополнительное скручивание. Возникающее при этом напряжение может быть устранено лишь путем разрыва одной из двух цепей ДНК, после чего оба свободных конца вновь соединяются друг с другом. Необходимые для этого ферменты называют релаксирующими. Релаксирующие ферменты выделены как из эукариотических, так и прокариотических клеток.
МЕТИЛАЗЫ
Как уже указывалось выше, некоторые нуклеиновые кислоты модифицируются специфическим образом. Определенные основания метилируются, фосфорилируются или глюкозилируются. Особенно хорошо это можно проиллюстрировать на примере тРНК. Специфическая третичная структура (см. гл. 2), лежащая, как предполагают, в основе адапторной функции тРНК, обусловлена наличием в ней так называемых «редких» (модифицированных) оснований. Однако и в других нуклеиновых кислотах основания тоже могут модифицироваться. Метилированные основания обнаружены в рибосомной РНК, мРНК и в ДНК- В ДНК метилирование специфических участков служит для защиты их от разрушения рестрикционными эндонуклеазами (см. гл. 20), а также для узнавания их специфическими регуляторными белками. В ДНК всех многоклеточных организмов обнаружено два класса метилированных оснований. Одна группа возникает вследствие непосредственного метилирования dTTP во время синтеза ДНК, а другая — уже после образования молекулы ДНК- Во втором случае цитозин превращается в 5-мстилцитозин, а аденин — в 6-метиладенин. 5-метилцитозин широко распространен у представителей разных таксономических групп, тогда как 6-метиладенин встречается только у низших организмов. У млекопитающих метилированная ДНК составляет около 1—1,5%, а у растений — 5—6%. Часто метилирование носит органоспецифический характер. Так, у Xenopus основания в хромосомных генах рРНК метилированы, а в амплифн- цированных генах (см. гл. 37) не метилированы (David, Brown, Reader, 1970). ДНК многих фагов также модифицирована. Фаги Т2, Т4, Т7 и Р1 содержат 6-метиладенин, тогда как фаги ТЗ и Т5 — метилированный тимин. У вирусов полиомы, Herpes simplex (тип 1) и Pseudorabies ДНК не метилирована. Метилирование катализируется метилазами (метилтрансферазами). Источником метильных групп служит метионин, который сначала переходит в богатую энергией форму З-аденозил-Ь-метионин.
НУКЛЕАЗЫ
Под действием нуклеаз нуклеиновые кислоты разрушаются в результате расщепления их фосфодиэфир вых связей. Различают рибо- и дезоксирибонуклеазы, эндо- и экзонуклеазы. Расщепление может осуществляться двумя способами. В первом случае возникает продукт, фосфорилированный на 5'-конце, а во втором — фосфорилированный на З'-конце.
Рибонуклеазы. Известные в настоящее время рибонуклеазы приведены в табл. 20.1.
Рибонуклеазы выполняют в клетке различные функции. Такие ферменты, как РНКаза 1, встречаются во всех клетках и служат для разрушения излишней РНК разных типов до мононуклеотидов, которые затем используются для нового синтеза РНК. Таким образом, фермент катализирует один из этапов в том или ином циклическом процессе. В печени крысы содержится ингибитор этой РНКазы, представляющий собой белок. Иначе действуют РНКазы II, III, IV, Р и Н. Они участвуют в посттранскрипционном контроле различных типов РНК (см. гл. 11). мРНК, рРНК и тРНК образуются, как правило, в виде крупных молекул предшественников, которые после завершения транскрипции превращаются в результате их расщепления нуклеазами в функциональные формы. РНКаза Н содержится в частицах опухолсродвых вирусов и является неотъемлемой составной частью обратной транскриптазы (Grandgenett, Gerad, Green, 1973); наряду с этим существует форма РНКазы Н, встречающаяся в тимусе, печени, эмбриональных клетках цыпленка и Е. coll.
Многие РНКазы способны узнавать строго определенные нуклеотидные последовательности и расщеплять субстрат только в этих местах. В связи с этим возникает вопрос: каким образом они узнают эти последовательности? Рибонуклеаза Р содержит РНК в качестве важного кофактора, и это позволяет сделать вывод о том, что узнавание субстрата в данном случае осуществляется путем образования пар оснований. Поэтому расщепляются только такие участки РНК, которые комплементарны связанному кофактору. Заменяя кофактор, можно изменить специфичность фермента (Stark et al., 1978). С другой стороны, РНК-аза III расщепляет только двухцепочечную РНК. Мы знаем, что 16S-pPHK из Е. colt (см. гл. 36 и 37) образуется в результате деградации длинной молекулы— предшественника. РНКаза III участвует в его расщеплении. Была определена часть нуклеотидной последовательности этого предшественника (Young, Argetsinger Steitz, 1978), причем было обнаружено, что к участку, соответствующему 16S-pPHK, с обеих сторон примыкают комплементарные друг другу сегменты (каждый длиной 40 нуклеотидов). Эти сегменты могут образовать
Обозначение
Тип
Субстрат
Кофакторы
Продукты расщепления
РНКаза I
Эндонуклеаза
Одпоцепочечная РНК
Одноцепочечная
РНК
—
З'-мононуклеотиды
РНКаза II
Экзонуклеаза
К+, Mg2+
5'-мононуклеотиды и олигонуклеотиды
РНКаза III
Эндонуклеаза
Двухцепочечпая РНК
К+, Alg«+
3-фосфорилиро- ванные олигонуклеотиды (длиной 10—25 пар оснований)
Два специфических фрагмента
РНКаза IV
Эндонуклеаза
R17-PHK
—
РНКаза Р
Эндонуклеаза (специфическая)
П редшественник тРНК
Mg‘+.
Mn2+. К+ nh+4
тРНК и фрагменты
РНКаза Н
Эндонуклеаза
Цепь РНК в гиб- ряде ДНК- РНК
К+, Mg8+
э'-фосфорилиро- ванные олигонуклеотиды
Олиго-РНКаза
Экзонуклеаза (3'->5')
Короткие олигори- бонуклеотиды
Mn2+
5'-мононуклеотиды
Полинуклеотид- фосфорил- аза
Экзонуклеаза
О'-*5')
Одноцепочечная РНК
Mg2+
5-нуклеозиддифос- фаты
Таблица 20.1
Рибонуклеазы (Adams et al, Davidson, 1976).Рибонуклеазы (Adams et al, Davidson, 1976).двойные спирали и таким образом стать субстратом для РНКазы III.
Рибонуклеазы (Adams et al, Davidson, 1976).
Рибонуклеазы (Adams et al, Davidson, 1976).
Эндодезоксирибонуклеазы. Различают ферменты, расщепляющие любые фосфодиэфирные связи и ферменты, узнающие определенные участки в ДНК и расщепляющие фосфодиэфирные связи только в этих участках (рестрикционные ферменты, см. следующий раздел). К первой группе относятся ДНКаза I и ДНКаза II. Они обладают следующими свойствами:
ДНКаза 1
ДНКаза И
Субстрат Оптимум pH Активаторы Ингибиторы
Продукт
Двухцепочечная ) 7-8
Mg=+, Мпа+, Со’+
Цитрат, ЭДТА
5'-фосфорилолигонуклеотиды
1НК
4-5
О.ЗМ Na+
Mg**
З'-фосфорилолигонуклео- тиды
ДНКазу I, как правило, выделяют из поджелудочной железы (pankreas), и поэтому ее называют также панкреатической
ДНКазой. ДНКаза II содержится преимущественно в селезенке и тимусе. ДНКаза I расщепляет нативную ДНК более эффективно, чем денатурированную. Промежуточные продукты деградации ДНК служат для нее менее хорошими субстратами, чем исходная ДНК, вследствие чего в конечном итоге образуются олигонуклеотиды, а не мононуклеотиды. Под действием фермента в двухцепочечных ДНК возникают многочисленные одноцепочечные разрывы. ДНКаза I преимущественно расщепляет связи типа пурин-Р-пири- мидин. Актин (см. гл. 32) представляет собой естественный и специфический ингибитор ДНКазы. В результате исследований в системе in vitro было показано, что актин, выделенный из скелетных мышц, полностью угнетает ферментативную активность ДНКазы I (Lazarides, Lindberg, 1974). Кроме этих двух эндонуклеаз эукариотических клеток несколько эндонуклеаз выделено из нормальных и инфицированных фагом бактерий:
Стрептококковая дезоксирибонуклеаза.
Эндонуклеаза 1 из Е. coll. Oija вносит одноцепочечные разрывы в двойную спираль ДНК. На участке, где образовался такой разрыв, экзонуклеаза отщепляет примерно 400 нуклеотидов. В результате возникают так называемые бреши (пробелы). Нативная ДНК является более хорошим субстратом для этого фермента, чем денатурированная.
Эндонуклеаза II из Е. coll. Она расщепляет преимущественно алкилированную ДНК. а также вызывает одноцепочечные разрывы в нативной ДНК. Фермент выполняет функцию репаративного фермента.
АТР-зависнмая эндонуклеаза. Обнаружена у нескольких организмов. При расщеплении одной фосфодиэфирной связи расщепляются три молекулы АТР (очень неэкономное расходование энергии).
Эндонуклеазы, индуцируемые фагами. Фермент, индуцируемый фагом Т4, атакует обычную и глюкозилированную ДНК (см. гл. 4).
Существуют также неспецифическис эндо- и экзонуклеазы. Эти ферменты расщепляют как ДНК, так и РНК.
Микрококковая нуклеаза из .Staphylococcus, Атакует как РНК, так и ДНК (предпочтительно расщепляет ДНК, денатурированную путем нагревания). Ионы Са2+ служат в качестве необходимых кофакторов.
Ряд эндонуклеаз, выделенных из змеиного яда.
Нуклеаза из Aspergillus oryzae. Oira гидролизует фосфоди- эфирные связи в одноцепочечной ДНК и РНК- Нуждается в ионах 7п2+.
Экзонуклеазы. Наиболее часто встречающиеся экзонуклеазы представлены в табл. 20.2. Среди них особенно известны два фермента.
Таблица 20.2
Наиболее часто встречающиеся экзодезокснрибонуклеазы.
Экзонуклеазы называются также фосфодиэстеразами. В полном расщепления нуклеиновых кислот часто участвует несколько нуклеаз (Adams et at, Davidson. The biochemistry of nucleic acids, 1976).
Фермент
Субстрат
Место атаки (концевая группа)
Продукты
Экзонуклеаза I
Одноцепочечная
ДНК
З'-ОН
Моно- и дн нуклеозиды, 5'-моно- фосфаты
11уклеозиды, 5'-монофос- фаты
Экзонуклеаза II (3'—е-З'-ЭКЗО- нуклсазная ак-
Преимущественно одноценочеч- ная ДНК
3’—он
тивность, ассоциированная с ДНК-полимера- ЗОЙ I)
Экзонуклеаза III
Двухцепочечная ДНК
З'-ОН илиЗ'—Ot (сначала, если нужно, удаляется Pi)
Нуклеозиды, длинные одноцепочечные олигонуклеотиды
Экзонуклеаза IV
Преимущественно олигонуклеотиды
З'-ОН
Нуклеозиды, 5'- монофосфаты
Экзонуклеаза V
Одно- и двухпепо- чечные ДНК
3'—ОН или
5'—ОН
Олигонуклеотиды
Экзонуклеаза VI
Двухцепочечная
5'—ОН или
Отщепляет непра-
(5'—>-3'-актив- ность, ассоциированная с ДНК-
ДНК
З'-ОР
вильно спаренные основания
полимеразой I)
Экзонуклеаза VII
Одноцепочечная ДНК
З'-ОН или
5'—ОН
Олигонуклеотиды
Фосфодиэстераза змеиного яда. Содержится в змеином яде; используется для лабораторного и производственного получения нуклеозид-б'-монофосфатов. Фермент начинает отщеплять мононуклеотиды с З'-гидроксильного конца молекулы РНК (или ДНК).
Фосфодиэстераза селезенки. Фермент гидролизует РНК до нуклеозид-З'-монофосфатов. Начинает расщепление с б'-гндрок- сильного конца молекулы РНК (или ДНК). На рис. 20.1 схематически изображен способ действия обоих ферментов.
Многие из названных здесь ферментов применяются как аналитические инструменты для исследования ДНК и РНК. В лабораториях специфические ферменты, расщепляющие молекулы нуклеиновых кислот в совершенно определенных местах, используются для получения больших количеств однородных фрагментов, с кото-
''^МММ^| ДНКаза П''^МММ^| ДНКаза П-М'МММ'^| ДНКаза /-М'МММ'^| ДНКаза /(Дихтерам семянка(Дихтерам семянкаДихтсрам змеином кбаДихтсрам змеином кбанг.нг.II, а также соответст- совместного действияII, а также соответст- совместного действияРис 20.1. Расщепление ДНК дезоксирибонуклеазами I и вен но диэстеразами змеиного яда и селезенки. После ДНКазы I и эстеразы змеиного яда образуются 5'-моно±осфаты, а после действия ДНКазы II и дизстеразы из селезенки — З'-монофосфаты.Рис 20.1. Расщепление ДНК дезоксирибонуклеазами I и вен но диэстеразами змеиного яда и селезенки. После ДНКазы I и эстеразы змеиного яда образуются 5'-моно±осфаты, а после действия ДНКазы II и дизстеразы из селезенки — З'-монофосфаты.
''^МММ^
| ДНКаза П
''^МММ^
| ДНКаза П
-М'МММ'^
| ДНКаза /
-М'МММ'^
| ДНКаза /
(Дихтерам семянка
(Дихтерам семянка
Дихтсрам змеином кба
Дихтсрам змеином кба
нг.
нг.
II, а также соответст- совместного действия
II, а также соответст- совместного действия
Рис 20.1. Расщепление ДНК дезоксирибонуклеазами I и вен но диэстеразами змеиного яда и селезенки. После ДНКазы I и эстеразы змеиного яда образуются 5'-моно±осфаты, а после действия ДНКазы II и дизстеразы из селезенки — З'-монофосфаты.
Рис 20.1. Расщепление ДНК дезоксирибонуклеазами I и вен но диэстеразами змеиного яда и селезенки. После ДНКазы I и эстеразы змеиного яда образуются 5'-моно±осфаты, а после действия ДНКазы II и дизстеразы из селезенки — З'-монофосфаты.
рыми можно проводить дальнейшую работу (гибридизацию, определение нуклеотидной последовательности, выделение генов и т. д.).
Рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы)
Рестрикционные эндонуклеазы относятся к подгруппе эндодезоксирибонуклеаз, отличающихся высокой специфичностью узнавания субстрата. Еще в 50-х гг. Лурна и его сотрудники обнаружили, что некоторые фаги растут не на всех штаммах одной и той же бактерии одинаково хорошо. Генетический анализ позволил сделать вывод о том, что это явление обусловлено особым свойством клетки-хозяина. В 1962 г. было обнаружено, что бактериальные штаммы Е. coli В и К содержат целую систему рестриктирую- щих и модифицирующих ферментов, причем собственная клеточная ДНК путем метилирования определенных оснований оказывается защищенной от действия эндонуклеаз, тогда как чужеродная ДНК расщепляется ими и вследствие этого инактивируется (Arber et al., 1962). Таким образом, здесь идет речь об эффективной защитной функции бактериальной клетки от внедрившейся в нее чужеродной ДНК. В 1968 г. был идентифицирован первый рестриктирующий фермент (Meselson, Yuan, 1968). При этом, однако, выяснилось, что этот фермент, отнесенный позднее к рест- риктазам класса I, не обладает высокой специфичностью. Он имеет мол. массу около 300 000—450 000 и характеризуется наличием
Таблица 20.3
Рестриктазы (Roberts, Murray, 1976)
Обозначение
Источник
Специфичность
EcoR I
Е. coll
gUattc
EcoR I
»
^Cc(t)gG
Нае 1
Haemophilus 'aegypticus
(t')gg^ccI)
Нае Н
»»
PuGCGC^Py
Нае III
>»
Gg+cc
Hha I
Haemophilus haemolyticus
Gcck
Hind III
Haemophilus influenzae
A<AGCTT
Нра I
Haemophilus parainfluenzae
GTT^AAC
Нра И
>»
HcGG
Mbo I
Moraxella bouis
*GATC
Мло I
Moraxella nonliquefaciens
C^CGG
Sma I
Serratia marascens
CCC^GGG
BSVR I
Bacillus subtilis
GG^CC
неидентичных субъединиц, а также потребностью в АТР, ионах Mg2+ и S-аденозилметионинс в качестве кофакторов.
В 1970 г. из Haemophilus influenzae был выделен и охарактеризован фермент, обладающий высокой специфичностью по отношению к субстрату (Smith, Wilcox, 1970). Этот фермент принадлежит к рестриктазам класса II, и в последующих разделах мы будем говорить о рестриктазах только этого класса. Как правило, они имеют небольшую мол. массу (20 000—100 000), в качестве кофакторов используют только ионы Mg2+ и расщепляют ДНК в специфических, узнаваемых ферментом последовательностях на фрагменты определенной длины со специфическими последовательностями на концах. Узнаваемые ферментом последовательности обычно характеризуются зеркальной симметрией и имеют длину от четырех до шести нуклеотидов.
Узнавание ферментом той или иной последовательности еще не означает, однако, что фермент при этом и расщепляет ДНК именно по этой последовательности. Но если расщепление происходит, то в обеих цепях одинаково. Многие рестриктазы расщепляют обе цепи в смещенных относительно друг друга местах. Таким образом, возникают фрагменты с короткими одноцепочечными участками на концах. Лишь немногие ферменты расщепляют обе
цепи в одном и том же месте —в точках, расположенных напротив друг друга. Образующиеся при этом фрагменты не содержат одноцепочечных участков. К настоящему времени выделено свыше 100 рестриктаз из многих видов бактерий. Их названия составлены из сокращенных названий бактерий и штаммов (римские цифры обозначают, что из данного источника выделено несколько ферментов); например, Bam Н —это фермент, выделенный из Bacillus amyloliquejaciens, штамм Н. В табл. 20.3 перечислены некоторые рестриктазы, а также указаны их происхождение и специфичность.
Сразу же после открытия рестриктаз выяснились многочисленные возможности их применения. В 1971 г. Натансу впервые удалось с помощью фермента, выделенного Смитом из Haemophilus influenzae, специфически фрагментировать вирусный геном (вирус SV 40, см. рис. 5,7). Вскоре одна за другой были выделены новые рестриктазы с различной субстратной специфичностью и уже в 1974 г. впервые была построена рестрикционная карта вирусного генома (вирус SV 40; Nathans et al., 1974). Для получения фрагментов было использовано шесть различных рестриктаз, которые расщепляли геном в шести различных местах. Путем сравнения фрагментов с перекрывающимися участками была определена единственно возможная и потому правильная последовательность оснований в геноме.
Благодаря способности рестриктаз расщеплять крупные молекулы ДНК на мелкие специфические фрагменты они сыграли (и продолжают играть) решающую роль в выяснении геномов вирусов, про- и эукариот. Без них было бы невозможно развитие исследований по генетической инженерии (см. гл. 5, 7, 11, 22 и др.). Для применения описанных в гл. 4 методов определения нуклеотидных последовательностей требуется гомогенный исходный материал, и теперь его можно получать почти в неограниченном количестве, клонировать, а затем проводить анализ нуклеотид-, ных последовательностей.
Рестрикционные фрагменты можно разделять с помощью гель- электрофореза. После прокрашивания гелей бромистым этидием в УФ-свсте четко видны флуоресцирующие полосы.
Так как интересы молекулярных биологов в основном были сосредоточены на исследованиях, в которых рестриктазы служили в качестве аналитических инструментов, выяснению структуры этих ферментов уделяли мало внимания, так что наши знания о ней чрезвычайно скудны. Поскольку из многих бактерий были выделены ферменты с одинаковой специфичностью, это наводит на мысль о том, что они представляют собой идентичные или по меньшей мерс очень сходные белки.
Почему рестриктазы не расщепляют собственную ДНК клетки- хозяина? Существуют три возможных объяснения этого феномена:
В этой ДНК отсутствуют специфические последовательности, узнаваемые рестриктазами.
Такие последовательности имеются, но они замаскированы (например, содержат метилированные или глюкозилированные основания).
Клетка располагает антагонистами, угнетающими действие рестриктаз.
Третий механизм реализуется в бактериальных клетках, инфицированных фагом 7. Геном фага несет информацию о выключении активности бактериальной рестриктазы (класс I). В остальных случаях в качестве преобладающего механизма для защиты ДНК используется вторая из перечисленных возможностей. Пока рестриктазы выделены только из прокариот, однако нет никаких аргументов против их существования у эукариот.
21. ФИБРИЛЛЯРНЫЕ БЕЛКИ
Структурными и опорными элементами клетки или многоклеточного организма обычно служат полисахариды. Они отличаются крайней однотипностью молекулярной структуры. Их синтез не составляет проблемы и осуществляется без больших затрат. Иногда для этого может быть нужен лишь один фермент, синтезирующий полисахарид из мономерных субъединиц.
Иначе обстоит дело с белками. Биосинтез белков — чрезвычайно сложный процесс, требующий затраты энергии (см. гл. 38). Все рассмотренные до сих пор белки обладали специфической первичной структурой, которая на первый взгляд представляла собой статистическую последовательность аминокислот. Такая структура, по-видимому, не годится для построения крупных периодических образований. С немногими исключениями мы познакомимся в гл. 45 при обсуждении структуры вирусов.
К фибриллярным (структурным) белкам обычно относят, как мы уже отмечали, такие белки, как коллаген, кератин, серицин и т. п. Они содержат участки из повторяющихся коротких аминокислотных последовательностей.
Коллаген
Молекулы коллагена образуют агрегаты, обладающие большой прочностью на разрыв, из которых, например, состоят сухожилия, передающие механическое усилие. Коллаген образует поддерживающую сеть в коже и откладывается в качестве заполняющего материала во многих участках тела.
Молекула коллагена имеет толщину 15 А, длину 2800 А и молекулярную массу 300 000. Она состоит на одну треть из глицина и на одну четверть из пролина (Pro) или гидроксипролина (Ну Pro). Ну Pro образуется в результате ферментативной модификации Pro. В первичной структуре (кроме концевых участков) строго повторяется единица
-(Gly-X-Y)„,
где Y —часто Pro или Ну Pro. Полипептидные цепи скручены в левую суперспираль из трех тяжей. На один виток полнпептидной цепи приходится три аминокислотных остатка (рис. 21.1). Так как водородные связи не расположены здесь, как в о-спирали, параллельно оси, то возникают соединения между соседними полипеп- тидными цепями, в результате чего создается характерная надмолекулярная спиральная структура (суперспираль). Мы еще будем встречаться с такими регулярными структурами, например при рассмотрении структурных элементов цитоскелета — миозина, тропомиозина и др. (см. гл. 32 и 33).
Рис. 21.1. Тронная спираль коллагена. В одной из трех обвивающих друг друга полипептидных цепей плоскости остатков пролина или гидрокышролина заштрихованы.
Рис. 21.2. Электронные микрофотографии коллагеновых волокон. Пеерху— гистологический срез: внизу — препарат, полученный методом замораживания—травления. Х62 000. Поперечные полосы — результат того, что молекулы коллагена (тройные спирали) сдвинуты относительно друг друга на определенное расстояние (25% длины молекулы). Между молекулами, расположенными друг за другом на одной продольной линии, остаются одинаковые свободные промежутки („-*.- , ) (Stolinski, Breathnach, 1977.)
/
Тройная спираль в белках с очень высоким содержанием пролина является термодинамически выгодной конформацией. .Высокая прочность обусловлена большим числом поперечных взаимодействий. При этом цепи располагаются так плотно друг к другу, что в каждом третьем положении последовательности не остается места для боковой цепи аминокислоты; поэтому существует очень сильное давление отбора, направленное на сохранение в этих местах глицина.
Интересно, что компонент C'lq системы комплемента (см. гл. 18) содержит коллагеноподобные последовательности (Reid. 1974). На электронных микрофотографиях коллагеновых фибрилл можно видеть отчетливые поперечные полосы, обусловленные регулярным, периодическим расположением молекул коллагена с продольным сдвигом относительно друг друга (рис. 21.2). Тройные спирали соединены между собой ковалентными межмолекулярными связями, что обеспечивает высокую прочность коллагеновых волокон (рис. 21.3).
Кератины
Кератин — составная часть кожи, волос и шерсти, а также ногтей, копыт и когтей. В первичной структуре здесь имеется повторяющаяся единица:
—(Cys-Cys-Glu-Pro-Ser)n.
Волосы и шерсть состоят главным образом из а-кератипа, основной структурой которого является а-спираль. Две такие спирали, ' обвивающие друг друга, образуют протофибриллу. Таким образом, мы и здесь имеем суперспираль; толщина ее составляет 20 А. Протофибриллы соединены в одиннадцатижильный «кабель» — микрофибриллу (поперечник 80 А). Микрофибриллы погружены в аморфный белковый матрикс, отличающийся высоким содержанием серусодержащих соединений. Несколько сотен микрофибрилл образуют пучок, который под микроскопом виден как макрофнб- i рилла. Волос шерсти имеет толщину 20 мкм и состоит из отмер- I ших клеток величиной около 2 мкм. Макрофибриллы расположены , в них параллельно осн волоса.
Растяжимость волоса обусловлена, во-первых, растяжимостью «■спиральной белковой структуры и, во-вторых, растяжимостью надмолекулярных структур. Волос можно растянуть до двойной длины. Спирали соединены между собой не только водородными связями: эти связи слишком слабы для того, чтобы после растяжения волоса они могли вновь вернуть его в исходное состояние. Дополнительное соединение обеспечивают дисульфидные мостики.
Рис. 21.3. Поперечные связи между тремя тройными спиралями коллагена. • связи с участием альдегидных групп; 0 другие связи. (Tanzer, 1973.)
Они сопротивляются растягивающей силе и после снятия нагрузки возвращают структуре первоначальную форму.
Кератины с небольшим содержанием серы гибки и легко растяжимы. Такне формы имеются в коже и в роговице. Твердые кератины с высоким содержанием серы характерны для рогов, когтей и копыт.
Перманент делают следующим образом: 1) разрушают дисульфидные мостики и придают волосам желаемую форму; 2) вновь создают дисульфидные мостики, что закрепляет приданную форму.
Человеческий волос растет со скоростью 15 см в год. Из этого можно вычислить, что за 1 с образуется 9,5 витка а-спирали.
В коже, перьях, когтях и клювах и в гомологичных образованиях у рептилий содержится значительная доля р-кератина— деривата а-кератина. У амфибий имеется а-кератин. По-видимому, p-кератин появляется в той ветви рептилий, от которой произошли птицы, но не в той, от которой произошли млекопитающие.
Серицин (белок шелка)
Серицин состоит из полипептидных цепей, вытянутых параллельно оси волокна, которые образуют расположенные антипараллельно складчатые структуры. Водородные связи препятезвуют
|^L^
Рис. 21.4. р-Складчатая структура в молекуле серицина. Боковые цепи, принадлежащие антипараллельным полипептидным цепям,— цепи аланина и серина (заштрихованы) и глицина (светлые) — расположены чередующимися рядами.
(Marsh, 1955.)
полному растяжению молекулы. Здесь мы тоже находим повторяющиеся аминокислотные последовательности
—(Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala)n.
Чередование остатков Gly с остатками Ser или Ala означает, что первые (Gly) всегда направлены в одну сторону, а вторые (Ser или Ala)—в противоположную (рис. 21.4). В результате образуются прочные волокна, так как действию растягивающих сил противостоят ковалентные связи. Серицин мало растяжим, так как его цепи уже растянуты до пределов возможного. Гибкость его обусловлена тем, что расположенные друг подле друга волокна удерживаются вместе только вандерваальсовыми силами. В подобной структуре нет места для громоздких боковых цепей таких аминокислот, как аргинин, тирозин или даже триптофан. Однако в молекуле серицина имеются особые участки, обусловливающие некоторую растяжимость, так как они в «нормальном» состоянии находятся не в максимально растянутой форме. Гусеницы различных шелкопрядов вырабатывают серицин с различным содержанием упорядоченных структур. У Bombyx mori доля их составляет 60%, а доля неупорядоченных областей — 13%.
Белок, понижающий точку замерзания
У полярных рыб Trematomus borchgrevinckl и Boreogadus saida имеется гликопротеид, который понижает точку замерзания плазмы крови. Этот белок обладает почти совершенной периоди-
ческой структурой и наряду с. несколькими остатками пролина содержит повторяющуюся единицу
(Ala-Ala-Thr)n,
причем треонин соединен а-гликозидной связью с £1—►3-галакто- зил-N-aцeтилгaлaктoзaминoвым остатком. Пептиды у двух упомянутых видов рыб различаются числом повторяющихся единиц (Osuga, Feeney, 1978).
Протамины
Это основные белки клеточного ядра с высоким содержанием аргинина. Они содержат повторяющуюся единицу
—(Arg-Arg-Arg-X-X)n, где X — алифатический остаток.
Гистоны
Это тоже основные белки клеточного ядра (подробнее см. гл. 40). Здесь на первый взгляд не видно никакой периодичности. Однако изучение известных последовательностей и оптимизация с помощью ЭВМ позволили выявить повторяющуюся последовательность
Arg^H Lys)-X-X-(X),
где X—алифатический остаток. Чтобы выявить повторяемость на протяжении длинного отрезка полипептидной цепи, приходится постулировать некоторое число пробелов. Таким образом, создается впечатление, что гистоны — это сильно видоизмененные «потомки» более простых эволюционных предшественников.
Что можно сказать об эволюции таких белков?
Все белки образуются в результате обычного биосинтеза, т. е. здесь требуется соответствующая генетическая информация.
У серицинов различных видов обнаружены периоды, которые не гомологичны друг другу, как если бы они возникли независимо друг от друга.
Эволюция периодических белков, по-видимому, происходит в направлении от регулярной к менее регулярной структуре.
Если попытаться «перевести» аминокислотные последовательности некоторых белков (коллагена, кератина, белка Тгета- tomus) обратно в соответствующие нуклеотидные последовательности, оказывается, что матрица ДНК в высокой степени само- комплементарна, т. е. образует палиндромные структуры (см.
гл. 2). Такая симметрия, вероятно, не имеет функционального значения, а просто отражает эволюционную историю белка.
Все это можно легко объяснить, предположив, что соответствующие гены возникли в результате повторных дупликаций первоначальных, более коротких отрезков ДНК.
АНТИТЕЛА: СТРУКТУРА, ФУНКЦИЯ И ЭВОЛЮЦИЯ. СУПРЕССИЯ АЛЛОТИПОВ.
МНОГО ГЕНОВ — ОДИН БЕЛОК (ПОЛИПЕПТИД)
Антитела представляют собой иммуноглобулины, которые входят в состав сыворотки, экскреторных жидкостей (молоко, слезная жидкость, слюна), а также поверхности некоторых типов клеток лимфатической системы (лимфоциты, плазматические клетки, см. гл. 66).*
В противоположность обсуждавшимся до сих пор белкам молекулы иммуноглобулинов образуют гетерогенную популяцию. Различают:
разные классы (изотипы): продукты различных генов;
разные аллотипы: продукты различных аллелей одного генного локуса (см. гл. 17);
разные идиотипы: продукты, различающиеся структурой «вариабельной области» молекулы, каждый из которых синтезируется в клетках определенного клона. Специфичность антитела обусловлена вариабельной областью его молекулы. Идиотипы специфичны по отношению к определенным антигенным детерминантам.
Каждый тип антител характеризуется наличием определенных аминокислот в определенных положениях первичной структуры. Эти аминокислоты служат маркерами и используются для идентификации молекул антител.
Антитела — олигомерные белки, содержащие два типа поли- пептидных цепей — легкие (light — L) и тяжелые (heavy — Н). Мол. масса легкой цепи — 25 000, тяжелой, как правило, 50 000; у некоторых иммуноглобулинов обнаружены и более высокие значения. Существует два типа легких (х и X) и пять типов тяжелых (а, у, 6, е, р) цепей. Тяжелые цепи определяют классы (изотипы) антител: IgA, IgG и т. д. (табл. 22.1). Каждая тяжелая цепь может вступать в ассоциацию с любой из легких цепей — с X или с х-
Таблица 22.1
Сопоставление нзотипов
Изотнп (жласс)
Тяжелая цепь
Примерная мол. масса
Доля в сыворотке в норме, %
Доля углеводов, %
IgM
p
900 000
5—10
10-12
IgA
а
170 000—500 000
10—20
10-12
IgG
V
150 000
70-80
2—3
IgD
о
180 000
<1
IgE
8
180 000
<1
Рис. 22.1. Схема строения молекулы антитела (IgGi). Легкие цепи подразделяются на домены Vl и Cl, тяжелые цели —на Ул, Chi, Chi, Сиз- Между Chi и Снз расположен гибкий шарнир. Дисульфидные связи обозначены S—S. Расщепление молекулы папаином приводит к образованию двух Fab-фрагментов и одного Fc-фрагмента. Расщепление пепсином приводит к появлению одного (РаЬ)/-фраг- медта и одного Fc-фрагмевта (Poljak, 1875).
Основу молекулы антитела составляет комплекс из двух легких и двух тяжелых цепей (рис. 22.1), которые удерживаются вместе дисульфидными связями и могут быть отделены друг от друга воздействием различных восстанавливающих агентов, например меркаптоэтанола (Edelman et al., 1959). Под действием папаина молекулы антител распадаются на три типа фрагментов: два Fab и один Fc (Porter et al., 1959). Fab-фрагменты содержат антиген- связывающие центры.
Некоторые особенности отдельных классов антител
Почему существуют различные классы антител? Иммунная система выполняет в организме множество самых различных функций (см. также гл. 66—68). Соответственно этому к молекулам антител предъявляются различные требования, и не существует такого типа молекул, который отвечал бы всем этим требованиям. Молекула любого антитела должна выполнять две задачи:
узнавать антиген;
посылать определенный сигнал сразу же после связывания с антигеном.
Организму присуща широкая вариабельность возможных эффекторных функций (реакций).
IgG. Наиболее распространенный класс антител в сыворотке млекопитающих (7S). У человека и мыши существует по крайней мере четыре подкласса у-цепей: уь уг, уз, у<- Соответствующие иммуноглобулины называются IgGi, IgG2, IgG3 и IgGv Молекулы отличаются положением и числом дисульфидных мостиков, которые связывают между собой тяжелые цепи.
IgM. Эта молекула (19S) состоит из пяти основных единиц (7S), которые также связацы между собой дисульфидными мостиками: (хгЦгЬ или (ХгЦгН- Кроме этих частей молекулы, существует еще J-цепь, так что правильнее обозначать структуру (Х2Ц2Ы и (ХгЦгЫ- J-цепь имеет мол. массу 20000. В мембране В-лимфоцитов (гл. 66) она существует в виде мономера и служит для узнавания антигена при индукции иммунного ответа (см. также IgD).
IgD. Первоначально был идентифицирован как редкий миеломный белок. Он не дает перекрестных реакций с IgA, IgG, IgM. Это постоянно присутствующий в мембранах иммуноглобулин, функции которого еще не полностью выяснены. Возможно, что он играет важную роль в индукции иммунного ответа. При появлении IgD клетки приобретают устойчивость к индукции толерантности.
IgE. Встречается в исключительно малых количествах: 1/25000 количества IgG. IgE часто бывает ответствен за развитие острой тяжелой аллергии (лихорадка, астма). в-Цепи на 100 аминокислотных остатков длиннее, чем у- и a-цепи. Тучные клетки обладают рецепторами для Fc-фрагмента IgE, однако связывают его только в том случае, если IgE находится в комплексе с антигеном. В результате связывания выделяется гистамин. (Тучные клетки встречаются в рыхлой соединительной ткани всех млекопитающих; в этих клетках содержатся многочисленные гранулы, на которые в 1877 г. Эрлих указывал как на форму накопления питательных веществ. Он же дал клеткам их название.)
IgA. Может существовать в виде мономера (7S), димера (9S), тримера (11S) или мультимера (17S). Его содержание в сыворотке составляет 20% от количества IgG. Кроме того, IgA обнаружен в молоке, слезной жидкости, слюне и т. д. Он образуется в экзокринных железах субэпителиальных тканей. IgA-антитела направлены главным образом против локальных инфекций (вирусов, бактерий и пр.).
Вариабельная (V) и константная (С) области молекулы
Как легкие, так и тяжелые цепи содержат так называемые вариабельные (V) и константные (С) области. Вариабельная область содержит антигенсвязывающий центр. Определение аминокислот-
ной последовательности возможно только при гомогенной популяции молекул. Так как иммуноглобулины обычно образуют гетерогенные популяции, такой анализ представлялся па первый взгляд делом безнадежным. Решить эту проблему помогло открытие миеломных белков. Это гомогенная популяция иммуноглобулинов, образующихся в организме больных с множественной миеломой (опухоль лимфатической системы). После того как были определены аминокислотные последовательности ряда миеломных белков, выяснилось, что молекулы антител (одного класса) различаются по аминокислотным остаткам N-концевого участка по- липептидной цепи (вариабельная область: V).
У легких цепей обе области — С и V — примерно одинаковой длины, а у тяжелых цепей (например, в IgG) С-область приблизительно втрое длиннее V-области. V- и С-области легких и тяжелых цепей обладают рядом общих черт, что наводит на мысль о гомологичных (ортологичных) отрезках.
В 1968 г. Эдельман определил первую аминокислотную последовательность тяжелой цепи. Он показал, что и в пределах С-области существует гомология. Вся молекула делится на четыре гомологичных (ортологичных) отрезка (домена): один вариабельный и три константных. Возникновение гомологии легче всего объяснить дупликацией генетического материала в ходе эволюции (см. об этом в гл. 6). Для обозначения отдельных доменов используют символы:
для легких цепей IgG
VL и Си
для тяжелых цепей
^Н- Oil, С1а, Суд.
В IgM имеется еще Сщ.
Доказательство существования гомологии доменов С-области в первую очередь основано на положении остатков цистеина и дисульфидных мостиков в молекуле. Как мы увидим ниже, дальнейшие сведения дает рентгеноструктурный анализ. Недавно стала известна аминокислотная последовательность так называемого рг-микроглобулнна, компонента антигена тканевой совместимости (гл. 23). Сравнение с иммуноглобулинами свидетельствует о том, что Рг-микроглобулии соответствует одному домену С-области. Гидрофобные аминокислотные остатки расположены здесь в тех же положениях, что и в цепях иммуноглобулинов. В некоторых областях отмечается чередование остатков:
гидрофобный—X—гидрофобный—X и т. д.
Такое чередование указывает на складчатую структуру.
В 1975 г. Ричардсон (Richardson) и его сотрудники обнаружи- 1и, что Cu-Zn-суперпероксид-дисмутазы из мембран эритроцитов но своей третичной структуре аналогичны доменам Ig-молекул. Это может служить доказательством того, что синтез иммуноглобулинов регулируется старыми широко распространенными генами, продукты которых исходно не имели никакого отношения к распознаванию «своего» и «нс-своего».
Подклассы в вариабельной (V) области. Путем сравнения последовательностей V-областей легкой и тяжелой цепей установлены основные признаки, позволяющие сгруппировать последовательности в подклассы, различающиеся по положению определенных аминокислотных остатков.
У человека в х-иепи выделено три, а в Х-цепи пять подклассов. Члены одного подкласса различаются по 10—15 аминокислотным остаткам из ПО. Члены других групп — по 25—35 остаткам.
Другой признак, по которому различаются подклассы, — это наличие вставок или делений. Число подгрупп у различных би'оло- гических видов различно (Hood et al., 1967; Milstein, 1976; Niall, Edman, 1967).
Насколько «вариабельна» вариабельная область?
Кабат и By (Kabat, Wu, 1971, 1976) проанализировали все известные аминокислотные последовательности вариабельной области молекулы антител и поставили вопрос о том, распределяются ли различия статистически по всей области или концентрируются в определенных местах. В вариабельной области следует различать, во-первых, аминокислоты, определяющие третичную структуру молекулы и обеспечивающие ее сохранность, и, во-вторых, такие, которые вступают во взаимодействие с антигеном. Антитела могут образовываться почти против любой молекулярной конформации величиной примерно от 5 до 34 А. Кабат и By показали, что в вариабельной области существуют «гипервариабельные участки», выделяющиеся на фоне обычного мутационного шума. Доводы этих авторов основаны на следующем предположении:
Вариабельность=
Числа различных аминокислот в произвольном положения Частота наиболее часто встречающихся аминокислот в этом положении"
Как уже указывалось в гл. 16, для сравнения следует выписать друг под другом аминокислотные последовательности, причем обратить внимание на оптимальный порядок расположения.
Если в определенных положениях аминокислотной последовательности стоит только один тип аминокислот, то по уравнению, написанному выше, 1/1 = 1 (наименее вероятная величина). Если в положении все 20 аминокислот встречаются с одинаковой частотой,
то 1/20 = 0,05. Поэтому вариабельность равнялась бы 20/0,05 = 400 (наиболее вероятная величина).
В положении 91 легкой цепи обнаружено восемь (или девять) различных аминокислот. Из 21 исследованной аминокислотной последовательности у восьми последовательностей в этом положении стоит аминокислота Ser (а.8/21 = 0,38), откуда вариабельность
0=8/0,38=21,1, или 9/0,38 = 23,6.
Если вариабельность накладывается на порядок чередования аминокислот, то в вариабельной области легкой цепи выявляются три гипервариабельных участка (рис. 22.2, А).
Капра и Кихоу (Capra, Kehoe, 1974) позднее обнаружили, что вариабельная область тяжелой цепи также содержит четыре гипервариабельных участка (рис. 22,2, Б).
Эти данные наводят на мысль о том, что гипервариабельпые участки выполняют функцию антигеисвязывающего центра. Первым доказательством этого было исследование Сингера (Singer), который уже в конце шестидесятых годов с помощью аффинной метки показал, что антиген связывается с совершенно определенными аминокислотами в V-области молекулы антитела. Сейчас мы знаем, что эти аминокислоты расположены в гиперварнабсль- ных участках.
Какое значение имеют отдельные аминокислоты в гипервариабельном участке? Можно посчитать частоту появления пары аминокислот в одной последовательности и сравнить рассчитанную величину с экспериментально найденной в миеломных белках. Обнаружено:
семь раз Phe (32) рядом с Туг (33),восемь раз Phe (32) рядом с Glu (35) ишесть раз Туг (33) рядом с Glu (35).
Все миеломные белки, несущие эти признаки, связывают фосфо- холин. Как показали кристаллографические анализы, в миеломном белке МОРС 603 Туг (33) стерически находится рядом с Glu (35). Роль Phe (32) не ясна. Все белки, связывающие фосфохолин, содержат в положении 34 Met. Туг (33) и Glu (35) принимают участие в связывании антигена, тогда как Met (34) представляет собой структурный компонент. Таким образом, в гипервариабельном участке можно различать структурные и антиген- связывающие аминокислоты.
Ризсн (Riesen) и его сотрудники в 1975 г. обнаружили миеломный белок человека, связывающий фосфохолин, и провели его анализ. Аминокислотная последовательность в положениях 32—34 такова: Phe-Tyr-Met. В положепи 35 стоит Asp, тогда как в других
S>0 es № 75 70 65
А
20
15
Рис. 22.2. Гппервариабельпые участки в вариабельной области легких (А) и тяжелых (5) цепей иммуноглобулина человека (Kabat et al., 1976).
известных миеломных белках, связывающих фосфохолин, в этом положении, как указывалось выше, находится Glu. При этом проявлялось более высокое сродство к этому антигену, чем у белка, описанного Ризеном.
Независимо от этого Киндт и Капра (Kindt, Capra, 1у/°) вы‘ явили и противоположный случай: идентичные гипервариабельпые участки внутри различно структурированных структурных компонентов. Идентичность вариабельных участков различных антигел указывает на относительно небольшой генный пул. Следовательно, специфические антитела существуют не только для каждой мыслимой антигенной детерминанты; антитела варьируют в широких пределах по степени сродства к антигенам. Молекула антитела, обладающая высоким сродством к определенному антигену, • предусмотрена в природе не только для этих антигенов, но также для множества других, даже если она обладает к ним значительно меньшей степенью сродства.J
Третичная структура молекул антител
Первые работы по рентгеноструктурному анализу иммуноглобулинов появились в 1971 г. (Sanna, Silverton, Davies, Terry; Edmundson A. B. et al.,). Объектом исследования были миеломные IgG человека. Разрешение составляло 6А. Затем появилась работа группы Поляка (Poljak, 1972), где объектом исследования был Fab-фрагмент миеломного белка человека — IgG-New. Дэвис (Davies) и его сотрудники провели анализ мышиного IgA МОРС 603. В результате полученных в этих работах данных было установлено, что каждая из гомологичных областей образует один собственный домен. Домены соединяются друг с другом посредством гибких мостиков. Основными структурными элементами внутри домена являются два антипараллельных складчатых слоя, один из которых содержит три нити, а другой — четыре (рис. 22.3). V-домен отличается наличием дополнительной петли между двумя параллельными нитями. Таким образом, в Vh и Vl содержатся сегменты, отсутствующие в Сш и Cl- Обсуждаемые здесь структурные элементы одинаковы у антител классов IgA и IgG.
В обоих складчатых слоях находится свыше 50% аминокислот.! Они окружают плотно упакованный кор (core), содержащий ами-1 нокислоты с гидрофобными боковыми цепями.
Уже при рассмотрении первичной структуры было ясно, что- существует гомология между Vh и Vl, а также между Chi и Cl.1 Обнаружена также гомология между V и С, однако не столь оче-. видная. Она выявляется отчетливее при сравнении третичных, структур (топологическое родство, см. гл. 16).
Различия в первичной структуре находят отражение в изменениях более далеких участков цепи. Все гипервариабельные, участки расположены близко друг к другу и оказываются на той
Рис. 22,3. Схема укладки полипептидной цепи (третичная структура) доменов иммуноглобулина (Снгобласть. Снгдомены). Полипептидпая цепь вариабельной области (V-домены) укладывается аналогичным образом. Отличие в укладке Спг-доменов показано на рисунке пунктиром (Poljak, 1975).
стороне молекулы, которая обращена к растворителю. Там они образуют полость размерами 15x6 Ан глубиной 6А (у Fab-New). В миеломном белке IgA МОРС 603 глубина равна 12А." Определенная структура антигенсвязывающего центра характеризует специфичность антитела (каждый идиотип).
IgG-New и IgA —МОРС 315 обладают одинаковой авидностью к витамину К1, однако каждый из этих иммуноглобулинов связывает еще ряд других лигандов. Структура антигенсвязывающего центра представлена на рис. 22.4. IgG-New и IgA —МОРС 315 отличаются высокой степенью гомологичности в первом и третьем гипервариабельных участках.
Взаимодействие между VL и VH. Молекулу антитела можно расщепить на легкие и тяжелые цепи, разделить эти цепи и реконструировать интактные молекулы из гетерологичных цепей, например:
(L1H1),—-2L14-2H1,
(L2H2),► 2L2+2H2,
2L1+2H2 —* (L1H2)Z,
2L24-2H1 —* (L2H1)Z.
Рис. 22.4. Аминокислотные остатки антигенсвязывающего центра в IgG-New (Poljak et al., 1976).
Эксперимент свидетельствует о том, что гетерологичные легкие и тяжелые цепи узнают друг друга. Для этого необходимо, чтобы области последовательностей в молекуле были общими у всех легких (и соответственно тяжелых) цепей и либо вовсе не варьировали, либо варьировали незначительно. Последнее ограничение основано на том, что не все произвольные комбинации одинаково хорошо реассоциируют. Во взаимодействиях принимают участие аминокислотные остатки, находящиеся в следующих положениях:
VL: 35, 37, 42, 43, 86, 99
VH: 37, 39, 43, 45, 47, 94, 107.
У человека и других видов они очень постоянны, и лишь в редких случаях обнаруживаются консервативные замены. %- и Х-цепи сходны друг с другом по этим положениям. У человека все L-цепн содержат Туг(35), Gin(37), А1а(42), Рго(43), Туг(86), Phe(99).
Рис. 22.5. Взаимодействие между легкими и тяжелыми цепями. В V-домеиах друг против друга расположены иные области молекулы, чем в С-доменах (Capra, Edmundson, 1977, с изменениями).
Можно установить связь х- и Х-цепей с функциональной специфичностью. Так как они отличаются друг от друга главным образом вставками и/или делециями, в гипервариабельном участке создаются разнообразные конформации активного центра. Х-Цепь менее вариабельна, чем х. и, таким образом, вносит меньший вклад в разнообразие антител, чем последняя.
Связывание доменов друг с другом. Домены Сщ и Сиг связываются гибкими участками полипептидиой цепи (с высоким содержанием пролина). Эти области принято называть шарнирными. Гибкость позволяет молекуле антитела приспосабливаться к различным конфигурациям антигенных детерминант. Домены по-разному повернуты относительно друг друга. В вариабельной области друг против друга оказываются иные поверхности, нежели в константной (рис. 22.5). В 1976 г. была выяснена структура миеломного белка человека — IgG-Kol (при разрешении 5А). Одновременно были исследованы раздельно Fab- и Fc-фрагменты (при разрешении 3,5А). Fc-фрагмент состоит из двух доменов: Сц$иСн« которые по своей структуре сходны с доменами Fab-фрагментов. В молекуле IgG оба Сиг и оба СН2-ДОмена не вступают в контакт друг с другом, тогда как между обоими Снз-доменами существует взаимодействие.
Аллотипы; супрессия аллотипов
С аллотипами на примере ферментов (с аллоферментами) и со значением полиморфизма мы познакомились в гл. 17. При этом исходили из молчаливого допущения, что у гетерозиготного инди-
видуума оба аллеля одинаково активны и каждый участвует в синтезе 50% продуктов гена (равные дозы гена). Однако это не общее правило. Например, в крови гетерозиготных носителей гена серповидноклеточное™ содержится 65% нормального гемоглобина и 35% аномального (HbS); благодаря этому жизнеспособность носителя существенно повышена. Молекулярный механизм, лежащий в основе установления такого равновесия, до сих пор неясен.
Наличие разных аллотипов серологически доказано для популяций иммуноглобулинов кролика, человека, мыши и других видов. Различия между аллотипами нс имеют отношения к специфичности антител и определяются менделнрующими аллелями, поэтому напрашивается мысль, что аллотипы относятся к различным классам или подклассам иммуноглобулинов.
Лучше других изучены аллотипы иммуноглобулинов кролика, открытые в 1960 г. Уделом (Oudin). На основе анализа серологических и генетических различий проведена классификация структурных генов молекул антител (табл. 22.2 и 22.3).
Таблица 22.2
Аллотипы у кроликов (Mage, 1975)
Аллотип (обозначение)
Классы и области антител
Особенности
а!
Ряд аминокислотных замен в вариабельных облас-
а2
Ун
тях, которые вступают в ассоциацию с различными константными областями (Су, Са, Сц, Се)
а3
64
Ряд аминокислотных замен в константных областях
65
Х-цепн
66
Ос
69
с7
Сх
Химически не анализированы
с21
dll
Met (225)■
d!2 е14
Су
Thr (225)
Thr (309)
е15
Ala (309)
Проще всего истолковать аллотипы Ь4, Ь5, Ь6 и Ь9. В основе их различий лежит ряд аминокислотных замен в константных областях %-цепей. Столь же ясна ситуация в случае dll и d!2, а также е14 и е!5, которые различаются по константной области у-цепи.
Сложнее объяснить аллотипы al. а2 и аЗ. Тодд (Todd, 1963) обнаружил, что они одновременно связаны с различиями в вариа-
Таблица 22.3
Аллотипы у человека (Porter, 1976)
Аллотип (обозначение)
Классы н область антител
Особенности
Inv(l) Inv(2) lnv(3)
С
Val(153) Lcu(19i)
А1а(153) Leu(l91)
Ala(153) Val(191)
Gm(l) Gm(— 1) Gm (4) Gm(17)
с
Asp(356) Glu(357) Leu (358)
Glu(35G) Glu(357) Met (358)
Arg(214)
Lys(214)
Gm (21) Gm(—21) Gm(ll) Gm (—11)
с
Tyr(296)
Phe(296)
Phe(436)
Туг (436)
Gm (49)
с
Vai — Leu — His
VaiHis
бельной области у- и ц-цепей. Позднее была также обнаружена связь сане. Этот результат создал определенные трудности для иммунологов, и вначале это явление называли «феноменом Тодда». Оно свидетельствует, в частности, что различные структурные гены имеют какую-то общую часть, которая ведет себя как простой менделирующий ген. Это опять-таки наводит на мысль, что в случае иммуноглобулинов справедлива не гипотеза «один ген — один полипептид», а гипотеза «два гена — одни полипептид».
В крови гетерозиготных кроликов иммуноглобулины с аллоти- пическими маркерами обнаружены не в соотношении 1:1, а в по-
Генотип
Процентное соотношение аллотипов
в сыворотке
Ь4Ь5 Ь4Ь6 Ь4Ь9 Ь5Ь6
Ь5Ь9 Ь6Ь9 а1а2 а1аЗ а2аЗ
60:40 60:40
80:20 50:50
75:25 80:20 80:20 60:40
40:60
Таблица 22.4
Аллотипы ■ сыворотке гетерозиготных кроликов (Mage, 1967)
Рис. 22.6. Супрессия аллотипа: в организме гетерозиготных подопытных животных (64, 65), которым при рождении вводили антитела против 64 (anti-64) (7), образуются только антитела аллотипа 65. У контрольных животных (//) 60% антител принадлежат к аллотипу Ь4, а 40%—к аллотипу 65 (Mage, 1967).
UHmu-tA при Контроль рижЗснии
Рис. 22.7. Два вида опытов для доказательства супрессии аллотипа у гетерозигот (64, 65). Л. Введение антител в организм матери. Б. Введение антител новорожденным (Mage, 1967).
стоянно и существенно отклоняющихся от этого соотношениях. Эти относительные величины сохраняются при изменении титра иммуноглобулинов в сыворотке (табл. 22.4).
В первые дни после рождения в организме кролика присутствуют антитела только материнского аллотипа. Отцовский аллотип появляется впервые на 8—10-й день жизни (рис. 22.6).
Мейдж (Mage) вводил новорожденным гетерозиготным крольчатам кроличьи антитела, специфичные в отношении одного из аллотипов, и при этом наблюдал подавление данного аллотипа (супрессия аллотипа; рис. 22.7). При использовании антител дру-
того происхождения (например, бараньих) супрессии не происходило.
У гомозигот (например, Ь5Ь5) можно полностью блокировать образование х-цепей введением кроличьих анти-М. При этом титр иммуноглобулинов в сыворотке достигает нормальных величин, но в составе всех молекул легкие цепи представлены 7.-цепью.
Молекулярные аспекты этой проблемы еще не ясны. Приведенные данные, однако, указывают на сложность механизмов, регулирующих экспрессию генов, и отчетливо свидетельствуют о том, что (генетические) дефекты в одном аллеле или генном локусе способны компенсироваться более высокой активностью какого- либо другого аллеля или даже другого генного локуса.
Эволюция и генетика антител
В предыдущих разделах мы ознакомились с классами, подклассами, специфичностями (идиотипами), легкими и тяжелыми цепями, вариабельными и константными областями и аллотипами антител. Все их группы четко идентифицируются и ясно отличаются друг от друга. Для каждого типа антител нужен отдельный структурный ген, и, так как типы во многих отношениях сходны, отсюда неизбежно следует вывод, что все структурные гены принадлежат к одному семейству генов. Это продукты многократных дупликации и модификации одного предкового гена (рис. 22.8).
Иммуноглобулины существуют только у позвоночных. Несмотря на интенсивные поиски, у беспозвоночных ничего аналогичного найдено нс было, хотя у них тоже есть механизмы узнавания «свое-
Иммуноглибу. ww;Иммуноглибу. ww;тяжелые ценитяжелые цениРис. 22.8. Гипотетическая схема происхожденияРис. 22.8. Гипотетическая схема происхождениябСлш^^'п™^™3” СХема пР°исхожДепия от общего «предка» 6,-микрогло- дящих в с°став антигенов гистосовместимости, а также легкой и тя- ' лелени/пп Av0^406^™?108' ^ 2 ” 5-точки ветвления, где происходит разделение по функциям (ортологическое родство) (Dayhoff et al„ 1975). *
Иммуноглибу. ww;
Иммуноглибу. ww;
тяжелые цени
тяжелые цени
Рис. 22.8. Гипотетическая схема происхождения
Рис. 22.8. Гипотетическая схема происхождения
23—2094
го и «несвоего» и отторжения чужеродных клеток и тканей (см. гл. 66).
Бесчелюстные (или круглоротые, куда относятся миноги и миксины) обладают иммуноглобулинами с ц-подобными тяжелыми цепями. Уже самый примитивный иммуноглобулин состоит из нескольких (однотипных) полипептидных цепей. Однако субъединицы здесь еще не соединены дисульфидными мостиками. У миксин имеется мультимер из низкомолекулярных полипептидных цепей. IgM— один из древнейших классов иммуноглобулинов. Он существует у всех костных и хрящевых рыб, причем степень полимеризации у разных видов различна. Даже у амфибий, например у Xenopus, IgM — гексамер. У саркоптсригий — предков двоякодышащих— существует IgN. Тяжелые цепи (v) имеют мол. массу 38 000.
У некоторых бесхвостых амфибий найден другой класс (не имеющий названия), у которого тяжелая цепь .сходна с а- или 6-цепью. Только у рептилий впервые появляются у- и Х-цепи. а-Цепи существуют у птиц и млекопитающих, а у-цепи — только у млекопитающих. У последних мы находим также разнообразные формы а-, у-, 6- и е-цепен и экспрессию более чем одного класса в одной клетке (Du Pasquier, 1976).
Что лежит в основе вариабельности антител? По имеющимся оценкам, иммунная система способна отличить друг от друга что- нибудь около 105—107 различных детерминант. Поскольку (с известными ограничениями) любая легкая цепь может образовать комплекс с любой тяжелой, требуется примерно 103 вариантов цепей каждого типа, так как 103-103 = 106.
В прошедшие десять лет для объяснения вариабельности и наследования антител привлекались две гипотезы:
Гипотеза зародышевого пути. Она гласит, что для специфичности (каждого идиотина) существует особый гаметический ген (V). Все эти гены передаются" от одного поколения другому через гаметы.
Гипотеза соматических мутаций и рекомбинаций. Она гласит, что через гаметы передаются лишь несколько У-генов, которые в ходе онтогенеза мутируют, так что в разных клетках иммунной системы (лимфоцитах) появляются различные У-гены.
Результаты экспериментов по гибридизации привели к спорным выводам. Некоторые группы исследователей постулировали, что в гаплоидном геноме имеется лишь несколько У-генов — примерно столько, сколько существует подклассов, или лишь ненамного больше. Это число гораздо меньше, чем можно было ожидать, исходя из установленных различий в аминокислотных последовательностях У-областей [Tonegawa: Mach: Milstein и др. (1974— 1976)]. Результаты исследований группы Ледера, напротив, ука-
Лалвувтгое мкт«ГО 5
РИС Тм^Йк МОРС 32? иТ'^ ФР3™™ ВатШ ДНК мыши с Х-це- РНК морс 321 и ее фрагментами (Tonegawa, Hozumi, 1976). *
зывают на то, что существует до 1000 различных вариантов У-гена (Seidman et al., 1978).
Два гена — один полипептид. Сходство вариабельной области всех тяжелых цепей можно объяснить тем, что для каждой тяжелой цепи имеется два гена: один для вариабельной, а другой для константной областей.
Тонсгава (1976) получил прямое подтверждение этого. Он выделил из клеток мышиной миеломы мРНК для легкой х-иепи и пометил ее иодом |251. З'-конец мРНК содержит информацию для С-концсвого участка полипсптидиой цепи. Очень высокая степень иодирования часто приводит к разрыву молекулы мРНК. Получаемые при этом фрагменты можно отделять от интактных молекул с помощью хроматографии на сефадексе (по принципу молекулярного сита). Фрагменты, содержащие З'-конец, легко идентифицировать и выделить благодаря наличию последовательности poly (А) на этом конце (см. гл. 10). Таким образом, получают: 1) интактные молекулы мРНК. содержащие информацию для V- и С-областей, и 2) фрагменты мРНК с информацией для С-области.
Независимо от этого была выделена, во-первых, ДНК из эмбриональных клеток мыши и, во-вторых, ДНК из опухолевых клеток (МОРС 321). Затем эти ДНК расщепляли с помощью рестрик- тазы Bam Н1 и добавляли при условиях, благоприятных для гибридизации (избыток ДНК), к только что описанным мРНК. Комплексы РНК/ДНК отделяли от свободной ДНК и разделяли по величине с помощью гель-электрофореза. Результат разделения показан на рис. 22.9. Два компонента эмбриональной ДНК (мол. 23е
массы 6-Ю6 и 3,9-106) гнбридизовались с интактной мРНК, однако с З'-концом гибридизовалась только одна фракция этой мРНК; это означало, что теистическая информация для константной области содержится в одном компоненте (мол. масса 6-108), а информация для вариабельной части — в другом (мол. масса 3,9-106). Таким образом, поскольку оба гена расположены в отдельных фрагментах эмбриональной ДНК, то и в геноме эмбриона они должны быть отделены друг от друга.
Совершенно иная картина получается для ДНК из опухолевых клеток: обе фракции мРНК гибрндизуются только с фракцией, имеющей мол. массу 2,4 млн. В опытах с полной молекулой мРНК с ДНК может связываться вдвое больше радиоактивности, чем в опытах с З'-м РНК-фрагментам и. Из этого был сделан вывод, что Vx и Сх непосредственно сцеплены друг с другом. Так как в опухолевых клетках, кроме продукта слияния, не обнаружено больше никаких разделенных генных локусов, это значит, что в обоих наборах хромосом (отцовском и материнском) произошло слияние. Этот вывод представляет интерес в связи с супрессией аллотипов, так как он свидетельствует о том, что супрессия происходит прежде всего на одной ориентированной плоскости. В гл. 13 мы уже обсуждали, каким образом такой процесс можно объяснить механизмами перестройки расположения генов в геноме.
Для выяснения структуры генов, кодирующих иммуноглобулины, успешно используются также методы генетической инженерии, т. с. клонирования генов. Брали ДНК из эмбриональных клеток мыши и фракционировали ее. Фрагменты, кодирующие иммуногло-
1234
51, J
Рис. 22.10. Расположение и организация генных участков, необходимых для образования легкой цепи. Л — расположение в ДНК мышиного эмбриона; Б — расположение в зрелых клетках, продуцирующих антитела. V — вариабельная область;, С—константная область; / — соединительная цепь; S — сигнальная последовательность; эта последовательность необходима для выведения вновь образованных молекул белка из клетки (см. гл. 38, рис. 38.6). Между участком гена для сигнальной последовательности и участком для вариабельной области расположен отрезок длиной в 93 нуклеотида- интрон 1Ь а между J и С — интрон 12 (длиной в 1250 нуклеотидов). /—4 — места расщепления рсстрнктазой BamHl (Tonegawa,
булины, выявляли путем гибридизации с иммуноглобулиновой мРНК (из клеток миеломы); эти фрагменты связывали с ДНК фага /. н клонировали в Е. coli. Такие эксперименты тоже привели к выводу, что У-гепы и С-гсны расположены в разных фрагментах ДНК. Используя ДНК из клеток миеломы, их находят в одном цельном фрагменте ДНК. При более тщательном анализе, однако, было установлено, что между V- и С-генами включен длинный отрезок (1250 пар оснований). Он транскрибируется, но не транслируется. Таким образом, мы здесь опять встречаемся с явлением сплайсинга (Brack, Tonegawa, 1977).
В совместной работе с группой А. Мэксама и У. Гилберта из Гарвардского университета была установлена нуклеотидная последовательность клонированного фрагмента ДНК, несущего информацию для вариабельной области /.-цепи. Анализ последовательности показал, что даже сам этот ген прерывается некодирующим отрезком длиной 93 пары оснований. Расположение и перестройка гена, необходимого для образования легкой цепи, показаны на рис. 22.10.
ГИСТОСОВМЕСТИМОСТЬ (ТКАНЕВАЯ СОВМЕСТИМОСТЬ): ОБЛАСТЬ HLA У ЧЕЛОВЕКА, ОБЛАСТЬ Н-2 У МЫШИ
Явление отторжения пересаженной ткани наблюдается у птиц и млекопитающих. Оно обусловлено наличием антигенов гистосовместимости на поверхности практически всех клеток [исключение составляют эмбриональные клетки (см. гл. 64) и эритроциты]. Эти антигены детально изучены у человека и мыши. Это в сильной степени гидрофобные белки, которые кодируются рядом различных генных локусов (подобно изоферментам). Часто эти гены лежат в хромосоме поблизости друг от друга, так что можно говорить о генных «областях». Для каждого генного локуса существует множество аллелей (или псевдоаллелой), что означает высокую степень полиморфизма. Вариабельность аллотипов можно уменьшить путем инбридинга. Самые сильные антигены гистосовместимости кодируются генами, расположенными в ограниченной области хромосомы — МНС (major histocompatibility complex). У человека эту область называют областью HLA, у мыши — областью Н-2.
Часто очень трудно провести четкую границу между аллелями и псевдоаллелями. О псевдоаллелях говорят, когда «гомологичные» продукты кодируются генами, расположенными очень близко друг к другу (рис. 23.1). Выяснить, идет ли речь об одном или о нескольких локусах, можно лишь путем экспериментов по рекомбинации и комплементации.
Степень полиморфизма здесь во много раз выше, чем в случае ферментов (см. гл. 17). В отличие от антител антигены гистосовместимости не обнаруживают никакого полиморфизма в пределах клеточной популяции, так как эти антигены кодируются исключительно гаметическимн генами, и очевидно, что для соматических мутаций (или рекомбинаций) не существует никакого селективного преимущества. Поэтому здесь нет ничего аналогичного идиотипам.
/'вf—©h
Рекомбинация
1•а—@~©—h
d
kc. 23.1. Аллели и псевдоаллели. Гены b и g являются псевдоаллелями: при рекомбинации эти локусы отделяются друг от друга (или соответственно объединяются); а и в — аллели: они не отделяются друг от друга при рекомбинации.
Функции антигенов гистосовместимости еще сравнительно мало изучены, однако многое указывает на то, что они участвуют в регуляции иммунной системы и системы комплемента, а также во взаимодействиях между клетками: они могли бы играть роль в «сортировке» специфических клеток при клеточных миграциях, например в процессе онтогенеза лимфоцитов. Далее, они выполняют функцию поверхностных клеточных рецепторов для многих вирусов (например, для вируса леса Семлики). Лимфоидные стволовые клетки при миграции через эпителий тимуса «обучаются» распознавать «свои» антигены гистосовместимости.
Область HLA у человека
Самая важная система антигенов гистосовместимости у человека— это система HLA. Она гомологична системе Н-2 мыши. Соответствующие гены находятся у человека в 6-й хромосоме; существует по меньшей мере четыре таких локуса, лежащих обособленно друг от друга:
HLA-A; HLA-B; HLA-C; HLA-D.
Для каждого из этих локусов существуют многочисленные аллели, обозначаемые следующим образом:
HLA-AlHLA-B1
HLAA2HLA-B2
HLA-A3HLA-B3и т. д.
Для доказательства существования антигенов гистосовместимости существуют две возможности:
Серологический метод (с применением аллоантисывороток). Специфические сыворотки получают а) от больных, которым многократно производилось переливание крови, или б) от женщин, которые в результате беременности были иммунизированы (сенсибилизированы) к лейкоцитам плода. Иммунитет направлен против антигенных детерминант, унаследованных ребенком от отца. (При этом остается неясным, почему не происходит отторжения растущего в матке плода.)
Использование смешанных культур лимфоцитов (СКЛ). Если в клеточной культуре сосуществуют две популяции Т-лимфоцитов (см. гл. 66), различающиеся антигенными детерминантами, то они взаимно сенсибилизируются:
А-)-В: А —► анти-В; В —► анти-А.
Антигены HLA в последнее время были выделены во многих лабораториях и тщательно очищены. Легче всего их получать из культур лимфобластов. Клетка содержит около 5- 10s молекул, чт»
приблизительно соответствует 1—2% белков мембраны или <0,1% всего клеточного белка.
Откуда берут материал для исследования? Инбридинга у человека, как правило, не бывает. Одно из исключений составляют члены общины Amish — одной религиозной секты в Индиане (США). Поэтому лимфобласты (предшественники лимфоцитов) от членов этой общины служат идеальным исходным материалом для изучения антигенов HLA. Можно выделять и культивировать линии клеток, которые являются двойными гомозиготами (например, содержат только аллели HLA-A2 и HLA-B7 (Strominger et at. 1976/1977). В 1976 г. Лейрисс и его сотрудники сообщили о сходных исследованиях, касавшихся индейского племени варао (Венесуэла), которые образуют замкнутые популяции с высокой степенью инбридинга.
Антигены HLA могут в достаточных количествах синтезироваться в клеточных культурах. Молекулы их состоят из нековалентно связанных друг с другом полипептидных цепей. Одна цепь — легкая — имеет мол. массу 12 000, а другая — тяжелая — 45000. Легкая цепь представляет собой гликопротеид с различным содержанием сиаловой кислоты. Как и в случае иммуноглобулинов, это обусловливает гетерогенность препаратов антигена, выявляемую при электрофорезе, которая исчезает после отделения углеводных остатков.
По аминокислотному составу исследованные антигены HLA-A2, HLA-B7 и HLA-B12 очень сходны между собой; это означает, что соответствующие гены, находящиеся в разных местах (отстоящие друг от друга более чем на 1000 генных эквивалентов), возникли в результате дупликации одного гена-предшественника. Многое говорит за то, что и гены HLA-С и HLA-D принадлежат к тому же семейству генов. Существует также более отдаленная родственная связь с антигенами гистосовместимости Н-2 мыши.
Легкая цепь содержит один дисульфидный мостик. Молекула представляет собой Рг-микроглобулин. Тяжелая цепь содержит два дисульфидных мостка. N-концевая часть молекулы в высокой степени гидрофильна, средняя часть гидрофобна' а С-конце- вая —опять весьма гидрофильна (рис. 23.2). р2-Микроглобулин — гомолог одного из доменов иммуноглобулина.
Биологическое значение HLA-антигенов. Носители определенных антигенов гистосовместимости особенно подвержены ряду заболеваний, таких как ревматический артрит, множественный склероз, юношеский диабет и другие. В возникновении этих болезней решающую роль играют аутоиммунные реакции, причем во всех исследованных до сих пор случаях к этому имеет отношение локус HLA-В. По-видимому, он эквивалентен области 1г мыши (см. следующий раздел). Заболевания, контролируемые системой HLA, часто встречаются в определенных семьях. Подверженность забо-
Легкая цепь S(^^МиКрОМобуЛШ^ ^Легкая цепь S(^^МиКрОМобуЛШ^ ^Тяжелая цепь nh2Gly-5-S— CHG—s-sТяжелая цепь nh2Gly-5-S— CHG—s-sСнаружи.Снаружи.Гидрофильная облаете (аллиинтиинпая часть «акулы)Гидрофильная облаете (аллиинтиинпая часть «акулы)tona раацешк^ .нал iwmuhimПосле обдакпга — детергентомtona раацешк^ .нал iwmuhimПосле обдакпга — детергентом* • i*1' । I'l'IM' ill Тидрофобтяv I S I ИЛОСЛВ* • i*1' । I'l'IM' ill Тидрофобтяv I S I ИЛОСЛВSH?SH?SHSHГидрофильная областьГидрофильная областьсоонсоонВнутриВнутри
Легкая цепь S
(^^МиКрОМобуЛШ^ ^
Легкая цепь S
(^^МиКрОМобуЛШ^ ^
Тяжелая цепь nh2
Gly
-5
-S
— CHG
—s
-s
Тяжелая цепь nh2
Gly
-5
-S
— CHG
—s
-s
Снаружи.
Снаружи.
Гидрофильная облаете (аллиинтиинпая часть «акулы)
Гидрофильная облаете (аллиинтиинпая часть «акулы)
tona раацешк^ .
нал iwmuhim
После обдакпга — детергентом
tona раацешк^ .
нал iwmuhim
После обдакпга — детергентом
* • i*1' । I'l'IM' ill Тидрофобтяv I S I ИЛОСЛВ
* • i*1' । I'l'IM' ill Тидрофобтяv I S I ИЛОСЛВ
SH?
SH?
SH
SH
Гидрофильная область
Гидрофильная область
соон
соон
Внутри
Внутри
Рис. 23.2. Модель антигена HLA-A, В и его закрепления в мембране (Strominger,1967).
леванию ведет себя как рецессивный признак. Таким образом, знание типов HLA может стать составной частью превентивной медицины. Если известно, что при данном типе гистосовместимости существует предрасположение к определенному заболеванию, то могут быть приняты профилактические меры.
В популяциях с малой частотой родственных браков наблюдается большая изменчивость, в частности уже потому, что за много поколений даже бывшие тесно сцепленными локусы вследствие рекомбинации отделились друг от друга и возникли новые сочетания. Из этого следует, что в популяциях должны встречаться если нс все, то, во всяком случае, большинство теоретически мыслимых комбинаций в quc-положении (гаплотипов). Например, вместо
a) HLA-A1—HLA-B3—HLA-C5
a') HLA-A3—HLA-B2—HLA-C4
могут получиться следующие комбинации:
a) HLA-AI—HLA-B2—HLA-C5
a') HLA-A3—HLA-B3—HLA-C4
ИЛИ
a) HLA-A1-HLA-B2—HLA-C4
a') HLA-A3—HLA-B3—HLA-C5 или
a) HLA-A1-HLA-B3—HLA-C5
a') HLA-A3-HLA-B2—HLA-C4 и т. д.
Индивидуальной изменчивости в пределах одного вида противостоит необычайно высокая стабильность типов гистосовместимости в ходе эволюции. Однако это еще ничего нс говорит о расположении генных локусов в геноме. Даже при различных положениях возможны сходные функции (ср. HLA у человека и Н-2 у мыши, см. следующий раздел).
Комплекс Н-2 у мыши
Комплекс Н-2 («комплекс» следует понимать как группу областей) локализуется у мыши в 17-й хромосоме. Отдельные участки расположения генов сравнительно хорошо изучены (рис. 23.3). Каждый такой участок содержит много генов, однако он не охватывает всю хромосому. Собственно комплекс Н-2 расположен между областями Н-2К и H-2D. Между ними есть место примерно для 2000 генных локусов, однако до сих пор здесь выявлено только семь генных функций.
Многие области генетически чрезвычайно сложны, так что приходится их подразделять на субобласти. Внутри комплекса Н-2 расположены области К, 1, S и D. Область S содержит локусы Ss-Slp. Один из продуктов — фактор С/ системы комплемента (см. гл. 18). Sip сцеплен с полом и существует только у самцов. Экспрессия генов Ss-Slp регулируется гормонами. С/ оказывает влияние на компоненты С/—Сз' системы комплемента, причем не ясно, управляет ли он их синтезом или активностью.
Продукты генов областей К и D. Они были обнаружены около 40 лет назад и идентифицированы как антигены, ответст-
Рис. 23.3. Структура и положение генного комплекса Н-2 в хромосоме 17 мышя.
Упрощенное представление (более подробно см. Klein el al., 1978).
венные за отторжение пересаженных тканей (например, кусочков кожи). Полиморфизм этих генов чрезвычайно высок. Эти гены и их продукты изучались главным образом на инбредных линиях. Сейчас известно свыше 70 различных антигенов Н-2, однако полагают, что в действительности их намного больше 100.
В последние годы Клейн (Klein, 1975, 1978) начал исследовать и природные популяции мышей; при этом он обнаружил, что мыши из одной местности принадлежат к более или менее одинаковому типу гистосовместимости, но сильно отличаются в этом отношении от мышей из других мест. Этот факт указывает на относительно высокий коэффициент близкородственного скрещивания в природных популяциях мышей. Гетерогенность внутри местных популяций меньше, чем у гибридов Fi от скрещивания мышей из двух произвольно взятых инбредных линий.
Как и у человека, антигены гистосовместимости у мыши имеют мол. массы около 45 000 и 12 000. Остов их тоже состоит из одной тяжелой и одной легкой цепи гликопротеида, причем легкая цепь и здесь может быть охарактеризована как Рз-микроглобулин. До сих пор известны лишь частичные последовательности N-концевых областей антигенов гистосовместимости человека и мыши (рис. 23.4). Уже эти немногочисленные данные позволяют сделать вывод о высокой степени гомологии. Они указывают на то, что гены К и D происходят от общего предшественника, но эволюционировали обособленно, после того как пути развития мыши и человека разошлись. У мышей в последовательностях К и D обнаружены специфические для них общие черты, которых нет в антигенах человека. Как «классы» продукты генного локуса К могут не отличаться от продуктов локуса D. В связи с этим возникает вопрос, каким образом в ходе эволюции возникла высокая степень полиморфизма и как в то же время поддерживается относительно высокое постоянство определенных частей молекулы. Очевидно, естественный отбор благоприятствует высокой вариабельности одних частей молекул и постоянству других.
Продукты генов области I. Эта область содержит гены, регулирующие иммунный ответ в отношении ряда антигенов (см. гл. 68). Они влияют на реакцию в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ) и принимают участие в кооперации между В- и Т-клетками. К наиболее изученным принадлежат гены /г (гены иммунного ответа), а также гены 1а; последние кодируют гликопротеиды с мол. массой 58 000. Продукты тех и других генов —компоненты поверхности лимфоцитов.
Между комплексом Н-2 и центромерой расположен еще один комплекс — T/t. Кодируемые его генами продукты мы находим главным образом на поверхности спермиев и эмбриональных клеток. Очевидно, они служат антигенами гистосовместимости на ранних стадиях развития. Эти продукты влияют на сперматогенез и
4 к"4 к"D“D“Рис. 23.4. Частичные N-концевые аминокислотные последовательности антигенов гистосовместимости (трансплантационных антигенов) мыши и человека. (Hood, Silver, 1976.)Рис. 23.4. Частичные N-концевые аминокислотные последовательности антигенов гистосовместимости (трансплантационных антигенов) мыши и человека. (Hood, Silver, 1976.)
4 к"
4 к"
D“
D“
Рис. 23.4. Частичные N-концевые аминокислотные последовательности антигенов гистосовместимости (трансплантационных антигенов) мыши и человека. (Hood, Silver, 1976.)
Рис. 23.4. Частичные N-концевые аминокислотные последовательности антигенов гистосовместимости (трансплантационных антигенов) мыши и человека. (Hood, Silver, 1976.)
свойства спермиев; они контролируют стадии развития эмбриона и взаимодействуют с другими аллелями комплекса T/t (см. гл. 64). Если определенные аллели представлены в рецессивной форме, появляются бесхвостые фенотипы, другие комбинации приводят к летальным и (или) сублетальным формам. Продукты этих генов чрезвычайно полиморфны и сходны с продуктами генов комплекса Н-2, и это наводит на мысль, что комплексы T/t и Н-2 родственны между собой и первый, возможно, представляет собой раннюю стадию эволюции второго. Похоже на то, что обе системы происходят от общего предшественника (Artzt, Bennett, 1975).
Комплекс Н-2 расположен также по соседству с областью Т1а. Есть указания на то, что гены этой области также несут информацию для построения поверхностных антигенов клетки. Антигены гистосовместимости влияют на вирусную инфекцию. Реакции иммунной системы направлены против чужеродных веществ. Вирус, который внедряется внутрь клетки, тем самым, по-видимому, избегает воздействия этого защитного механизма. Если поверхность клетки все-таки модифицируется, то теперь клетка сама распознается как «чужая» и вызывает клеточный иммунный ответ (с участием Т-лимфоцитов). Если цитотоксические Т-лимфоциты будут сенсибилизированы против зараженных вирусом клеток любого другого типа гистосовместимости, то эти клетки не будут лизироваться. Другие зараженные вирусом клетки будут лизироваться не в большей степени, чем незаряженные клетки, принадлежащие к тому же типу гистосовместимости, что и сенсибилизированные Т-лимфоциты. Эти наблюдения можно объяснить с помощью теории «двойного узнавания», согласно которой для эффективного лизиса необходимо одновременное узнавание антигена гистосовместимости («собственного») и антигена, кодируемого вирусом (Zinkernagel, Oldstone, 1976).
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие редактора перерода S
Предисловие . *.7
ВведениеИ
I. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ3!
Структура нуклеиновых кислот32
Выделение и фракционирование нуклеиновых кислот . . . .50
Определение нуклеотидных последовательностей нуклеиновых кислот 63
Генетический материал вирусов и прокариот70
ДНК эукариот 85
Выделение и характеристика генов эукариот106
Репликация ДНК120
Транскрипция ДНК вирусов и прокариот135
Транскрипция ДНК эукариот; гяРНК— мРНК159
Плазмиды; клонирование генов (генетическая инженерия) ...169
Обмен генетической информацией; рекомбинация.183
Незаконная рекомбинация: интегрированные сегменты, транспозоны, внедрение чужеродного материала .... •196
И. БЕЛКИ217
Белки: функции, выделение, идентификация и анализ аминокислотных последовательностей218
Как определяют третичную структуру? Рентгеноструктурный анализ 235
Родственные связи, гомологии последовательностей, топологическое родство253
Белки в эволюции и онтогенезе: полиморфизм, аллоферменты и изоферменты 272
Ферменты: катализаторы ирегуляторы.Один ген—одинфермент 289
Белки, взаимодействующиес нуклеиновыми кислотами..306
Ферменты, расщепляющие нуклеиновыекислоты324
Фибриллярные белки332
Антитела: структура, функция и эволюция. Супрессия аллотипов.
Много генов - один белок (полипептид)339
Гистосовместимость (тканевая совместимость): область HLA у человека, область Н-2 у мыши359
Петер Зенгбуш
МОЛЕКУЛЯРНАЯ и КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ Том 1
Научный» редактор Н. М. Амельянчик
Мл. научный редактор Р. Ф. Куликова
Художник И. П. Козлов
Художественный редактор А. Проценко Технический редактор И. М. Крендмева Корректор В. И. Постнова
И Б № 2757
Сдано в табор 27.10.81.
Подписано к печати 23.02.82. Формат 60X90',■«.
Бумага типографская Л? 2. Гарнитура латинская.
Печать высокая. Объем 11.50 бум. л.
Усл. печ л. 23.00. Усл. кр. отт. 23.00.
Уч.-изд. л. 22.85. Изд. № 4/1398. Тираж 23 000 экз.
Зак. 2094. Цена 1 р. 80 к.
ИЗДАТЕЛЬСТВО «МИР»
Москва. 1-й Рижский пер., 2.
Московская типография № И Союзполиграфпрома при Государственном комитете СССР по делам издательств, полиграфии в книжной торговли.
Москва. 113105. Нагатинская ул., д. 1.