РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУКИНСТИТУТ ГЕОХИМИИ И АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИим. В. И. ВЕРНАДСКОГО

5. А. Руденко 「. И. Руденко

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫЕ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ

Том 2

МОСКВА «НАУКА» 2003

УДК 543

ББК 244

Р83

Ответственный редактордоктор технических наук &К Зуев

Рецензенты:

доктор химических наук Е£. Спиваков,доктор химических наук СС Юфит

Руденко ЕА*

Высокоэффективные хроматографические процессы: В 2 т* / RA. Руденко, Г,И. Руденко; Отв. ред. Е*К* Зуев. - М.: Наука, 2003. - ISBN 5-02-006479-3

Т*2: Процессы с конденсированными подвижными фазами.- 2003.- 287 с.: нп. - ISBN 5-О2-ОО2882-7 (в пер.)

Второй том монографии включает описание высокоэффе ктивн ы х хроматографических процессов с конденсированными подвижными фазами - жидкостями и сверхкритн чески ми флюидами. В этом же томе рассмотрены хроматографические процессы с близкими к насыщению парами жидкостей н сильно сжатыми газами в качестве подвижных фаз. Рассмотрены так*е высокопроизводителъные процессы планарной хроматографии, непревзойденные при выполнении массовых анализов- В последней главе книги рассмотрены методы капиллярного электрофореза и эле ктрок и нетической хроматографнн, не имеющие себе равных по ражля* ющей способжкти. Основываясь на теоретические положениях, изложенных в т+ 】,материал тома 2 раскрывает пер«д читателем огромные разделительные воз* можности хроматографии в анализе и разделении нелетучих и высокомолекулярных веществ.

Для спеидал истов химико-аналитического и мед и ко*биологм ческого профиля, а также для студентов и аспирантов соответствующих высших учебных заведений.

ISBN 5-02-002882-7 (в пер.) © Российская академия наук, 2003 © Издательство “Наука、

(художественное оформление), 2003

ПРЕДИСЛОВИЕ

Высокоэффективные хроматографические процессы, описанные в т. 1 настоящей книги и осуществляемые с использованием газообразных подвижных фаз, имеют естественное физическое ограничение 亠 они применимы лишь для разделения веществ, которые могут без разложения переходить в парообразное состояние. Немногочисленные примеры химико-аналитического определения не переходящих в пар веществ с помощью газохроматографического разделения и регистрации летучих продуктов их разложения (химического или термического) не меняют эту ситуацию по существу* В то же время, огромное количество разнообразных веществ либо совсем не способны переходить в парообразное состояние без разложения, либо требуют для этого чрезмерно высоких температур. Вследствие этого для их анализа и разделения методы газовой хроматографии не применимы. К числу таких веществ принадлежат химические соединения, имеющие важное значение для жизни человека - амино* кислоты, пептиды, белки, нуклеотиды и другие высокомолекулярные соединения^ сложные лекарственные препараты и многие продукты природного происхождения. К этим соединениям принадлежат в своем большинстве и неорганические соединения -простые ионные и комплексные соли металлов. Все эти многообразные химические соединения являются объектами хроматографических методов, использующих в качестве подвижных фаз конденсированные средн - пары, близкие к насыщению, сверхкритические флюиды, органические жидкости, воду и водные растворы различных веществ, В целом, область применения таких процессов во много раз шире, чем у процессов газовой хроматографии, поэтому их значимость для научной и хозяйственной деятельности человека исключительно высока* Именно эти обстоятельства и определили целесообразность подробного рассмотрения в данной книге высокоэффективных процессов хроматографии с конденсированными подвижными фазами.

Может показаться не вполне оправданным включение н настоящий том хроматографических процессов с парообразными подвижными фазами, традиционно рассматриваемых как вариан- ть【газовой хроматографии. Однако глубокое родство таких про-

цессов с сверхкритической хроматографией оправдывает, по нашему мнению, включение их именно в группу процессов с конденсированными подвижными фазами.

Последняя глава книги посвящена методу капиллярного электрофореза, который в своей классической форме хроматографией не является* Но с другой стороны, многочисленные варианты электрокинетических хроматографических процессов, бурно развивающихся в настоящее время, невозможно рассмат- рмвать без изложения данных о ключевой технике электрофоретического разделения веществ в капиллярах с использованием электроосмотического потока. Кроме того, не может не восхи- щать гигантская разделяющая способность этого метода и поразительное сходство результирующих электроферограмм с хро- матограммами, регистрируемыми в высокоэффективных хроматографических процессах*

В 2003「научный мир будет отмечать столетие открытия хроматографии* Первые процессы, осуществленные нашим соотечественником М.С. Цветом и названные им хроматографическими, как раз и были ничем иным, как высокоэффективными хроматографическими процессами с конденсированной (жидкой) подвижной фазой. Авторы данной книги хотели бы, чтобы ее чи- тателн* как и сами авторы, рассматривали ее как малую дань памяти тех многих иссл едовател ей, которые посвятили свою жизнь и свои таланты развитию мощного и в то же время изящного и бесконечно многообразного хроматографического метода.

Глава 1

ХРОМАТОГРАФИЯ С ПАРООБРАЗНЫМИПОДВИЖНЫМИ ФАЗАМИ

ВВЕДЕНИЕ

Применение газовой хроматографии для разделения многих групп веществ ограничивается низкой летучестью изучаемых соединений, Значительные усилия, затраченные на преодоление этого принципиального ограничения, привели к включению в сферу газохроматографического метода многих групп, веществ, обладающих крайне низкой упругостью пара даже при температурах 250-300℃ (стероиды, алкалоиды, пептиды и др). Тем не менее, стремление распространить методические приемы газовой хроматографии на вещества с молекулярной массой, превышающей 10s а.е*м* (полимерные продукты, неустойчивые биологически активные соединения и др.), побуждает исследователей к поиску новых возможностей ускорения хроматографического процесса и осуществления его в возможно более мягких температурных условиях (ниже 200℃).

Существенный прогресс в технике жидкостной хроматогра- фии высокого разрешения позволил устранить большую часть упомянутых выше затруднений. Однако это не снижает актуальность развития тех вариантов хроматографического метода, которые позволили бы использовать более привычное аппаратурное методическое оформление газовой хроматографии и в то же время были бы в той или иной мере свободны от ее недостатков. Такие варианты существуют в рамках метода хроматографии с парообразной подвижной фазой, основными среди которых являются следующие:

L Хроматография с подвижной фазой, представляющей собой пары органических и неорганических веществ при температурах более низких, чем критические, и при относительно небольших давлениях (до 10-20 кг/см1)»

2. Сверхкритическая хроматография в легко конденсирующихся парах при температурах и давлениях, немного превышающих критические параметры.

3* Хроматография с использованием в качестве подвижных фаз постоянных и некоторых конденсирующихся газов при относительно низких температурах и очень высоком давлении (до W Па и более)*

Применение хроматографического метода для разделения той или иной группы соединений возможно только при достаточно высокой скорости перемещения разделяемых веществ в колонке. Эта скорость будет тем выше, чем большая часть элюируемого вещества находится в каждый момент времени в подвижной фазе. В случае газожидкостной хроматографии долю полного количества вещества, перемещающуюся с потоком подвижной фазы в каждый момент времени, определяет отношение распределения 依

k = G』G奋(1 J)

где Gst и G毗一количество вещества в неподвижной и движущейся фазах соответственно. При изучении процессов экстракции величину, обратную отношению распределения, называют коэффициентом извлечения.

Доля вещества, находящегося в каждый момент времени в подвижной фазе, составляет

D =组=-—,(1-2)

G« G^Gsi 1 + 左

где G《6 - полное количество вещества в колонке. Отсюда время удерживания вещества в колонке t равно:

- т = т0(1 + Л).(1*3)

где “ 亠 время продвижения подвижной фазы через хроматографическую колонку* Следовательно, для уменьшения длительности хроматоп)афического процесса желательно иметь возможно меньшие значения 化 Выражая количества сорбата в неподвижной и подвижной фазах через его концентрации в этих фазах Сст. и Cmh и через объемы фаз Vsi и % можно записать следующее выражение:

где

К = 2(1-5)

СтЬ

-термодинамический коэффициент распределения, ге* отно-

щснис равновесных концентраций в неподвижной и подвиж- ной фазах;

-отношение объемов неподвижной и подаижной фаз в колонке.

Снижение отношения распределения Л может быть достигну- т0 или за счет уменьшения термодинамического коэффициента распределения или снижения соотношения объемов фаз 0. В газохроматографическом методе используются обе эти возможно сти. Часто снижение коэффициента распределения достигается подбором жидкой фазы с малой растворяющей способностью по отношению к разделяемым веществам (например, полярной в случае разделения неполярных веществ, и наоборот). Коэффициент распределения быстро снижается при повышении температу- рн* Эта зависимость используется при высокотемпературной газовой хроматографии и осуществлении разделений с программированием температуры. Однако возможность повышения температуры ограничена термической устойчивостью неподвижной фазы и самих разделяемых веществ.

Близок к исчерпанию и другой путь снижения отношения распределения: уменьшение соотношения объемов неподвижной и подвижной фаз в колонке* При хроматографии труднолетучих веществ применяют колонки, сорбенты в которых содержат десятые или даже сотые доли процента жидкой фазы* Весьма невелико может быть количество жидкой фазы и при использовании капиллярных колонок. Ограничениями на этом пути являются н еже лател ьны е адсорбционные явления на межфазных поверхностях, неоднородность слоя подвижной фазы при малом ее содержании и резкое снижение эффективности колонок при приближении коэффициента извлечения к единице для обычно применяемых подвижных фаз*

Дополнительные возможности повышения скорости движения разделяемых веществ в колонке могут быть созданы путем замены инертного газа-носителя парообразной подвижной фазой, Применение паров в качестве подвижной фазы в газовой хроматографии представляет несомненный практический и теоретический интерес. Замена инертного газа паром может существенно влиэть на величину коэффициента распределения хроматографируемых веществ между подвижной и неподвижной (твердой и жидкой) фазами, а отсюда -и на абсолютный и отно сительный объемы удерживания, коэффициент разделения^ селективность колонки, эффективность и ъд* При этом может

иметь место вытеснение сорбата активно сорбирующейся парообразной подвижной фазой. Существенное ускорение хроматографического процесса обеспечивает также применение в качестве подвижной фазы сверхкритических сред, имеющих значительно большую плотность н, как следствие, более высокую растворяющую способность, чем обычные газы. Такими дедами являются пары при температуре и давлении, несколько более высоких, чем критические параметры, а также чрезвычайно сильно сжатые газы (до 1000-2000 кг/см?)*

Перечисленные процессы разделения целесообразно объединить в рамках отдельного варианта хроматографического метода, который можно обозначить специальным термином - прояви- тельная хроматография с парообразной подвижной фазой* Вообще говоря, этот термин применим ко всем видам хроматографии, в которых используется подвижная фаза повышенной плотности, вступающая в неспецифические или специфические взаимодействия с сорбатом*

Методы хроматографии с парообразными подвижными фазами обладают пре имуще ствам и при разделении высокополярных и малолетучих веществ. Кроме того, они открывают новые пути для изучения взаимодействия молекул и определения физико-химических характеристик веществ.

Литературные данные по различным хроматографическим процессам с парообразными подвижными фазами обобщены в ряде обзоров [1-10].

ВЛИЯНИЕ ПРИРОДЫ ПОДВИЖНОЙ ФАЗЫНА ВЕЛИЧИНУ ОБЪЕМА УДЕРЖИВАНИЯ

В обычных вариантах газовой хроматографии предполагалось, что межмолекулярное взаимодействие газа-носителя с неподвижной жидкой фазой (НЖФ) и разделяемыми веществами является пренебрежимо малым.

Однако уже в 1962 г* было отмечено значительное влияние природы газа-носителя на время удерживания некоторых углеводородов и достигаемое их разделение [11], Эти наблюдения, а также аналогичные данные других работ [12-14] объясняли влиянием различий в величине смешанных вторых вириальных коэффициентов В〕力 описывающих межмолекулярные взаимодействия газа-носителя и вещества, подвергаемого хроматографиче- скому исследованию.

Несколько позже Круикшенк, Виндзор и Юнг (15, 16] учли влияние неидеального поведения газа-носителя, выражаемое третьим вириальным коэффициентом, а также описали эффек- ты, связанные с растворимостью газа-носителя в неподвижной 巾а!已* Результаты этих исследований позволяют найти значения объемов удерживания при повышенных давлениях газа-носителя (〉2 кг/см2), когда можно ожидать проявления эффектов, связан- ннх с его индивидуальной природой. Наиболее полно учитывался отмеченные эффекты в следующей формуле:

In У = In V° + 5p0Jj +自(PqJ4)23,(1-7)

где V-исправленный объем удерживания при входном давлении, равном pit^ Vo - исправленный объем удерживания при входном давлении, равном 10 Па (1 кг/см?) и исчезающе малом перепаде давления; р& - выходное давление, Ви,- члены, учитывающие вириал ьные коэффициенты, a J^- поправка на перепад давления. При этом

lnVo=lnMI_(S11^i (1-8)

где "旧-число молей неподвижной фазы в колонке, R - универсальная газовая постоянная, Т - температура, у； - коэффициент активности сорбата, растворенного в жидкой фазе при бесконечном разбавлении, р； - упругость пара чистого сорбата при температуре эксперимента, Вн - второй вириальный коэффициент сорбата, а и； — его мольный объем. Другие величины, входящие в уравнение (1-7), равны

(1-9)(1-10)(1-H)(1-9)(1-10)(1-H)5=2厢旺+ 也宣]RT [[如丿

(1-9)

(1-10)

(1-H)

(1-9)

(1-10)

(1-H)

卫—ЗС]22 -4В|2% :0 — ~2(RT)2~

бата при бесконечном разбавлении, X — мольная растворимость подвижной фазы в стационарной их2- мольная доля подвижной фазы в стационарной.

Экспериментальные исследования показали, однако, что поправки, связанные с влиянием третьего вириального коэффициента и растворимости газа-носителя, для обычных газов незначительны, по крайней мере до давления 20-30 кг/см2.

Пренебрежение этими поправками приводит к упрощенному выражению для объема удерживания;

lnv = lnd +通 J；, (1-12) хорошо описывающему экспериментальные данные, полученные при использовании перманентных газов (водорода, гелия, азота и аргона) при давлении ло 5-10 ТО5 Па.

С другой стороны, Пексок и сотр. отмечали заметное влияние растворимости газа-носителя в неподвижной фазе при но пользовании азота [18], метана или этана [19]*

Изменение соотношения объемов удерживания разных по своей природе сорбатов при изменении давления подвижной фазы наблюдали также Вигдергауз и Семкин [20], использовавшие изменение индексов удерживания для оценки смешанных вторых вириальных коэффициентов ароматических углеводородов. В той же работе сделана попытка оценить влияние растворимости газа-носителя в подвижной фазе на величину коэффициента активности сорбатов.

Данные, касающиеся влияния неидеальности подвижной фазы на удерживание сорбатов, в связи с газохроматографиче- ским определением вириальных коэффициентов рассмотрены в обзоре [21]. Отмечено, в частности, что эффекты влияния природы газа-носителя и его растворения в неподвижной фазе при использовании органических подвижных фаз и сверхкритических сред могут создать новые широкие возможности для направленного изменения разделяющей способности хроматографических колонок.

Весьма обстоятельная терм одинамич еская трактовка влияния подвижной фазы на удерживание веществ в хроматографических колонках с жидкой фазой проведена в работе [22], подкрепленной далее подробным экспериментальным исследованием [23].

Исходным пунктом этого положения является условие равновесия Гиббса, т*е* равенство фугитивностей сорбата в подвижной и стационарных фазах. При этом стационарная

газа-носителя в неподвижгаза-носителя в неподвиж巾аза представляет собой раствор НОЙ жидкости:

газа-носителя в неподвиж

газа-носителя в неподвиж

6 (Т,瓦亦1戸=Y； (Т,戸,x)Xlf^,P\(1-13)

(1-14)(1-14)『де (р1 - коэффициент фугитивности сорбата в смеси с газом-носи- тепем при температуре Т и среднем давлении в колонке Р, у；…коэффициент активности сорбата в тройной смеси с жидкой фазой, насыщенной газом-носителем при Т и Р; 丫； 一 фугитивность чисто- г0 сорбата в жидком состоянии при Т^Р,^ух- мольная доля сор* бата в подвижной фазе. Из соотношения (1-13) следует

(1-14)

(1-14)

у^~ Р~<Р/°

Зависящее от давления произведение у：力 + может быть выражено через коэффициент активности, определенный при некотором стандартном давлении:

¥；#=%)尸叫訣р j(y^!RT)dt ,(М5)

где (У；)р=& — коэффициент активности сорбата при стандартном давлении Р黜 температуре Г и при составе неподвижной фазы, соответствующем давлению Р. Фугитивность чистого сорбата (f^)p^pst также отнесена к стандартному давлению и температуре, а С - парциальный мольный объем сорбата, растворенного в жидкой фазе, состав которой соответствует давлению Р.

Важнейшим условием соблюдения соотношения (1-15) является сохранение постоянства состава неподвижной фазы при переходе от давления Р к стандартному давлению Р7Г В связи с тем, что растворимость подвижной фазы в неподвижной жидкости зависит от давления, это условие не выполняется. Тем не менее отсутствуют другие пути хотя бы приближенной оценки влияния изменений давления на коэффициент распределения сорбата при наличии заметной растворимости газа-носителя в жидкой фазе* С учетом выражения (1-15) уравнение (1-14) принимает вид：

4=4=ФФ- j (V^/RT)dP- j (V^/RT)dP(1-16)(1-16)

4=

4=

Ф

Ф

- j (V^/RT)dP

- j (V^/RT)dP

(1-16)

(1-16)

Записывая аналогичные выражения для процесса растворения газа-носителя в неподвижной фазе» можно представить следующее выражение для удельного объема удерживания сорбата в рассматриваемых условиях:

(pi exp - J (V^/RT)dP

，F My7

係「2)抬戸-<P2exp -J (V^/RT)dP

x

В этом выражении ф, и ф2 _ фугитивности сорбата и чистого газа-носителя при температуре Т и давлении Р, z2 - коэффициент ежи* маемости газа при тех же условиях, Л/3 - молекулярная масса непод* вижной жидкой фазы, 了; - коэффициент активности газа-носителя, растворенного в жидкой фазе,『之-константа Генри для растворения чистого газа-носителя в чистой жидкости при температуре Т и стандартном давлении Р5Г Показатели экспонент являются изо- термически-изобарными интегралами уравнения Гиббса-Дюгема,

Произведение 了：力° можно выразить через коэффициент Генри и поправочные коэффициенты а и 0* учитывающие растворение подвижной фазы в неподвижной [22]:

(1-18)(1-18)Y；# =X“i =1\ехрКа-В')Х2+В'.

(1-18)

(1-18)

Коэффициент фугитивности 吶 выражается через смешанные вириальные коэффициенты:

(М9)(М9)1пф, = —- В，2 Н—у f 111q

(М9)

(М9)

1 畛 2(喔)2

Используя выражения (1-18) и (1-19), и считая, что 戶》巴" можно выполнить интегрированне в формуле (1-17) и получить уравнение, допускающее экспериментальную проверку:

饴Хр込卧吟•息时*饴Хр込卧吟•息时*XX1 + ^21 + ^2ехр[(У - а)л2 - [У君]ехр[(У - а)л2 - [У君](1-20)(1-20)

饴Хр込卧吟•息时*

饴Хр込卧吟•息时*

X

X

1 + ^2

1 + ^2

ехр[(У - а)л2 - [У君]

ехр[(У - а)л2 - [У君]

(1-20)

(1-20)

В зтом уравнении последний экспоненциальный член учитыва- ет эффект растворения газа-носителя в неподвижной фазе. Ряд расчетов и экспериментов, выполненных разными авторами [23, 24], привели к несколько неожиданному выводу о том, что даже при таких больших значениях 工包 как 0/9,2, этот член маЛо отличается от единицы. Можно также полагать [21], что влияние третьего вириального коэффициента также не будет заметным образом проявляться до давлений порядка (ЗМ)・ 106 Па. При этих допущениях уравнение (20) упрощается и принимает вид:

InIn(z2) 丁叫(z2) 丁叫处戸=1n旦一里戸z2RT M^ RT ・处戸=1n旦一里戸z2RT M^ RT ・(1-21)(1-21)

In

In

(z2) 丁叫

(z2) 丁叫

处戸=1n旦一里戸

z2RT M^ RT ・

处戸=1n旦一里戸

z2RT M^ RT ・

(1-21)

(1-21)

В таком виде данное уравнение было подвергнута экспериментальной проверке [23] в интервале давлений до 107 Па для водорода и азота и до 5 х 106 Па для углекислого газа. По найденным значениям Vjp = ДР) вычисляли левую часть уравнения (1-21) и строили графики зависимости получаемой величины от давле* ния*

Согласно классическому определению, удельный объем удерживания равен:

产管爭，黄亲I。）'产管爭，黄亲I。）'(Ь22)(Ь22)

产管爭，黄亲I。）'

产管爭，黄亲I。）'

(Ь22)

(Ь22)

где t；0 - объемная скорость газа-носителя, на выходе из колонки; 修-масса жидкой фазы в колонке; 啰 _ коэффициент сжимае* мости газа-носителя при стандартной температуре и среднем давлении в колонке А ,或宀 коэффициент сжимаемости газа-носителя при температуре колонки 丁。и давлении Р> Величины т и т0 равны времени удерживания в колонке сорбата и несорбирующе- гося компонента, соответственно. Такое определение объема удерживания предполагает, что газ-носитель совершенно не растворяется в неподвижной фазе и не оказывает влияния на процесс растворения сорбата в ней* Кроме того, упругость пара жидкой фазы предполагается исчезающе малой. При этом и газовую, н хидкую фазы можно рассматривать как бинарные системы, а величина объема удерживания должна уменьшаться с ростом да- ^ления одинаково, вне зависимости от природы газа-носителя.

Однако экспериментальные данные, полученные в работе [23], показывают отчетливое влияние свойств газа-носителя на характер изменения объема удерживания с увеличением давле- HH5L Как показывает рис. 1, при использовании водорода, азота и

P, atmP, atmРис. L Зависимость логарифма удельного объема удерживания изооктана на колонке с Апиезо ном К от среднего давления в системе при использовании в качестве газа-носителя:

P, atm

P, atm

/ - водорода, 2 - азота н 3 - диоксида углерода

углекислого газа наблюдают^ ся три различные зависимости объема удерживания от давле

ния. Аналогичные группы кривых наблюдаются для толуола, че- тыреххлористого углерода и других веществ. Это убедительно доказывает, что при хроматографии в потоке конденсирующих^ ся паров или газов при высоких давлениях следует учитывать эффекты растворения подвижной фазы с образованием тройных систем, которые могут существенно отличаться по свойствам от бинарных систем? рассматриваемых в обычной газо-жидкостной хроматографии. В то же время модифицирующее влияние растворяющейся подвижной фазы может во многих случаях способствовать хроматографическому разделению близких по свойствам соединений. Кроме того^ модификация поверхности твердого носителя адсорбированными молекулами подвижной фазы может уменьшать коэффициент распределения разделяемых соединений между неподвижной жидкой фазой и этой поверхностью. Использование добавок полярных веществ к инертному газу-носителю мотивировалось ранее именно этим модифицирующим действием адсорбированных молекул добавляемого вещества [25-27]* Естественно, что дальнейшее увеличение концентра* ции полярного вещества в подвижной фазе может только усилить этот эффект и привести к еще большему спрямлению изотермы сорбции.

Еще более резко влияние изменения природы газа-носителя на величины удерживания должно сказываться в случае адсорбционной хроматографии, когда в качестве неподБижной фазы используются активные твердые тела. В этом случае происходит модификация поверхности твердого тела адсорбированными молекулами подвижной фазы, что приводит обычно к резкому изменению величины константы распределения. В ряде случаев на поверхности твердых тел может образовываться моно- и поли- молекулярная пленка.

Для газоадсорбционной хроматографии столь строгое и последовательное рассмотрение влияния подвижной фазы пока не

оведено- Однако принято считать, что газы при повышенном давлении и пары вблизи точки конденсации способны образовывать на поверхности адсорбента полимолекулярные слои, выполняющие роль жидкой фазы. При повышении температу- Ь1 толщина такого адсорбированного слоя уменьшается, воз- настает роль адсорбционного взаимодействия между молекула- ^瓜 сорбата и адсорбентом, что приводит к увеличению времени удерживания* Такую необычную для газожидкостной хромато- графии зависимость параметров удерживания от температуры колонки отмечает Нонака [28] в случае хроматографии в пото- ке водяного пара на колонках с Хромосорбом и другими сорбентами (см. ниже).

Основные случаи газоадсорбционной хроматографии с реальными газами в качестве подвижной фазы рассмотрены Локке [29] Проведенный теоретический анализ показал^ что в том случае, когда подвижная фаза является реальным газом, изотерма адсорбции которого соответствует закону Ленгмюра, а поведе- ние сорбата можно описать линейной изотермой, коэффициент распределения сорбата (Ка) выражается следующим уравнением:

ln£=ln卜f 也r7/例1 + 4戸)]+ (戸/RT)(2Bi2-BQ, (1-23)

где /f - универсальная газовая постоянная, Г - температура колонки, а Р - средн* давление в ней; Ь1иЬ2- общие константы адсорбции подвижной фазы и сорбата, равные отношению соответствующих констант скоростей, сорбции и десорбции;也;-количество молей сорбата, требующееся для образования мономоле- кулярного слоя на поверхности адсорбента; ВГ1 - второй вириалъ- ный коэффициент подвижной фазы, а Вп - смешанный второй вириальный коэффициент сорбата и подвижной фазы, характеризующий их межмолекулярное взаимодействие* В том случае, когда можно считать линейными изотермы сорбции и подвижной фазы и сорбата, уравнение (1-23) упрощается:

.In Ка = 1п(п^Ь2КТ/^а) + (Р / RT)(2B]2 - Вн). (1-24)

В первом из названных случаев коэффициенты распределения Должны уменьшаться с ростом среднего давления в колонке и с увеличением адсорбционной способности подвижной фазы (с ро- стом постоянной 仇).этот вывод хорошо согласуется с экспериментальными данными [30].

В тех случаях, когда можно ожидать наличие высоких концентраций сорбатов, например, в случае препаративной хромато- ^афии в потоке докритического или сверхкритического пар%

поведение сорбата и подвижной фазы должно описываться изотермами Ленгмюра* Соответствующее этому случаю выражение выведено в предпсложении о том, что оба газа ведут себя как идеальные* Решение для реальных газов наталкивается на весьма значительные математические трудности* В рассмотренном случае коэффициент распределения равен

储=^mblRT/ % Q + 4Р2 + 匕2P2)， (13)

где Pt н Pa — парциальные давления подвижной фазы и сорбата в условиях опыта.

Хотя полученное выражение носит весьма приближенный характер, т*к. не учитывает особенностей сжимаемости рассматриваемых паров и газов, оно все же позволяет сделать важный вывод о том, что при хроматографии в парах каждый газ или пар может снижать величину адсорбции другого компонента в соответствии с величиной произведения 仇 р,.

Таким образом, б реальных условиях хроматографии с парообразной подвижной фазой происходит сложное взаимодействие процессов, характерных для газожидкостной и газоадсорбционной хроматографии. При этом в зависимости от химической природы подвижной фазы, давления в колонке и степени приближения ее температуры к точке конденсации применяемого пара возможно изменение относительной значимости каждого из этих процессов в довольно широких пределах.

Процесс газовой хроматографии, при котором вклады адсорбционных и абсорбционных процессов сопоставимы, рассматривался в работах [31, 32], где показано, что в общем случае зависимость объема удерживания от количества жидкой фазы и от характеристик сорбента имеет следующий вид:

匕=2为齿+£赛号=£ "，+£ 04， (1-26)

где Ui 宀 количество каждой из имеющихся на сорбенте форм жидкой фазы (жидкая фаза в микропорах, жидкая фаза в полимоле- ку лярных слоях, жидкая фаза в капельной форме и т.п) & - соответствующие коэффициенты распределения; Sj - количество каждого из имеющихся типов адсорбирующей поверхности (по верхность твердого носителя (адсорбента), непокрытая жидкой фазой, поверхность раздела твердый носитель - жидкая фаза, поверхность газ - жидкость, поверхность, покрытая мономолеку- лярным слоем жидкой фазы и т.п); К)- соответствующие ад・

сорбционные коэффициенты. Более общей была бы дифферент циальная зависимость

叫=2巫面,+玄常閩,叫=2巫面,+玄常閩,(1-27)(1-27)

叫=2巫面,+玄常閩,

叫=2巫面,+玄常閩,

(1-27)

(1-27)

Однако характер распределения поверхности хроматографического сорбента по энергиям сорбционных центров или типам присутствующих модификаций обычно неизвестен и, более того, может меняться с изменением условий опыта. Поэтому практическая ценность уравнений (1-26) и (1-27) ограничена. В тех же работах выве* дено упрощенное выражение для объема удерживания:

匕=/% + //, + К/& (1-28)

Это уравнение, выведенное на основании предположения о линейном характере изотерм сорбции и подвижной фазы и сорбатов, учитывает лишь процесс сорбции веществ в капельно-жидкой неподвижной фазе (первый член), адсорбции на поверхности газ-жидкость (второй член) и адсорбции на поверхности твердого носителя, покрытого жидкой фазой (третий член)* Соответственно, %歹 Kgt и 必鼠 一 соответствующие коэффициенты распределения, 口国-объем жидкой фазы, 5卸 и 5讨一 величины поверхности жидкой фазы и твердого носителя* Допущения, сделанные при выводе этого уравнения, ограничивают его применение уже в обычных случаях газовой хроматографии. Еще меньше оно применимо в случае хроматографических процессов с парообразной подвижной фазой. Тем не менее ясно, что изменение природы подвижной фазы может привести не только к изменению всех коэффициентов распределения, но и изменению объема жидкой фазьь что приведет к существенным изменениям как абсолютных, так и относительных величин удерживания.

Теоретические представления [21, 22$ 29, 31, 33] указывают на то, что применение в качестве подвижной фазы в хроматографии активно сорбирующихся паров при температурах, близких к точке конденсации, должно весьма существенно изменять абсолютные и относительные параметры удерживания разделяемых веществ, способствуя спрямлению их изотерм сорбции. Это может во многих случаях улучшать разделение анализируемых веществ, в первую очередь, труднолетучих и высокополярных. Однако б настоящее время пока не представляется возможным предсказать изменения в удерживании конкретных соединений при переходе от газовой хроматографии к процессу, протекающему в потоке парообразной подвижной фазы. Решение этой задачи требует накопления большого количества экспериментальных данных.

ХРОМАТОГРАФИЯ

С ПАРООБРАЗНОЙ ПОДВИЖНОЙ ФАЗОЙВ ДОКРИТИЧЕСКОМ состоянии

Первыми примерами использования хроматографии с докри- тической парообразной подвижной фазой следует считать работы Янака по разделению газов в токе СО? при комнатной температуре [29]. Объектами анализа служили инертные газы и легкие углеводороды, давление на входе в колонку не превышало (1-2) х 105 Па. Поэтому специфическое вытесняющее действие СО2 не отмечалось^ и применение этого газа в основном было обусловлено особенностями детектирования* Хотя с применением СОг было выполнено большое число работ, улучшение формы пиков и ускорение процесса разделения отмечалось лишь в редких из них [11Ф 12, 23, 34-36]. Тем не менее, в дальнейшем было показано, что при повышении давления СО2 до 5 х 105 Па эффекты неидеальности приводят к снижению энтальпии сорбции углеводородов почти в два раза. Во столько же раз снижаются и удельные объемы удерживания сорбатов [37]. На основе использования таких эффектов были предприняты попытки добиться улучшения разделения многокомпонентных смесей путем применения комбинации колонок, работающих при различных давлениях [38, 39]* Хотя в этих работах в полной мере используются эффекты неидеальности подвижной фазы, характерное для паров, модифицирующее влияние на сорбент проявляется в меньшей степени. Более показательными в этом отношении являются работы Дюмазера и Шильона, которые еще в 1959 г описали хроматографическое разделение свободных органических кислот С2-С6 в парах этилового спирта [40] на колонке с шамотом, пропитанным смесью вазелинового масла со стеариновой кислотой при температуре 110℃ (рис. 2). В этом исследовании вполне определенно указано на повышение симметрии пиков низших кислот и улучшение их разделения при хроматографии в потоке паров этанола* В тот же период была осуществлена циркуляционная хроматография в парах фурана и метилформиата [41], а при определении молекулярной массы органических соединений был использован фреон [42]. Описано применение метана* зтана и паров м-пентана при разделении компонентов нефтепродуктов [43]* В упоминавшейся выше работе [30] в качестве газа-носителя был использован ацетилен*

Систематическое исследование поведения сорбатов разной природы при хроматографии в парах бензола, четыреххлори^ сто го углерода, хлористого метилена, хлороформа, метанола и

этанола было проведено в работах Тсуда^ Ишии и сотр. (44-49]. При газожидкостной хроматографии н-октана, н-декана, толуола, этилбензола и низших спиртов на колонках с неподвижными фазами различной природы (полиэтиленгликоль^ динонилфталат, силиконовые масла) показано наличие значительных изменений объема удерживания при замене азота парами органических соединений (изменения колебались от 10 до 100% и более). В работе [44] наблюдаемые изменения объяснялись образованием адсорбированных слоев молекул подвижной фазы и изменением удерживающих свойств неподвижных фаз вследст^ вне растворения пара. Полученные данные, приведенные в табл* 1, показывают, что в случае адсорбционной хроматогра^ фии влияние природы подвижной фазы проявляется значительно энергичнее, поэтому при переходе от азота к парам этилового спирта объем удерживания бензола может уменьшиться на два порядка.

Показано также, что относительное изменение объема удерживания при переходе к пару оказывается тем больше, чем менее различаются по полярности неподвижная фаза и парообразующее вещество. Применение полярных подвижных фаз, например паров метанола и этанола, вызывает снижение объема удерживания веществ в полтора-два раза* В этом случае авторы объясняли снижение параметров удерживания н-пропанола наличием межмолекулярного взаимодействия спиртов в паровой 中азе, а н-октана и толуола изменением сорбционной способности неподвижной фазы при растворении в ней паров спирта. При небольших давлениях в колонке объемы удерживания компонентов растут с увеличением давления. Например, в парах СС14 при повышении давления увеличиваются объемы удерживания толуола и н-октана в колонке с силиконовым маслом* Это объясняется повышением растворимости пара в неподвижной фазе с давлением, что увеличивает ее общий объем*

В случае газоадсорбционной хроматографии на полимерных сорбентах Порапак Q и Порапак S замена азота или гелия парами СС14 приводит к снижению объема удерживания бензола в 2,5-5 раз. При использовании более полярных паров и минеральных адсорбентов снижение объемов удерживания оказывается еще большим, что в ряде случаев позволяет осуществить хроматографическое разделение веществ, невыполнимое в обычных условиях не только с помощью газоадсорбционной, но и газожидкостной хроматографии.

Примером может служить описанное в работе [48] разделение а- и р-нафтолов при 190℃ на колонке длиной 50 см с силикагелем К923 в парах этанола или метанола (рис. 3).

123456 час

Рис 2. Хроматограмма смеси летучих жирных кислот в потоке паров С2Н5ОН (колонка размером 3 м х 8 мм с огнеупорным кирпичом {О,鳥*6 мм)т содержащим 15% парафинового масла и 1,5% стеариновой кислоты; температура колонки 96℃; подача С2Н5ОН на испарение 1,7 мл/час):

7 - уксусная кислота; 2 - пропионовая кислота; 3 - к-масляная кислота, 4 - смесь изомерных валериановых кислот

Рис* 3* Хроматограмма смеси а-нафтола (/) и р-нафтола (2) при 190℃ на колонке длиной 50 см с силикагелем в потоке паров этанола. Детектирование по поглощению УФ-света с длиноё волны 280 нм

Аналогично было осуществлено разделение смесей нафталина, дифенила и антрацена [47], нитрофенола и алкилфенолов [48], антрацена и фенантрена, изомеров динитробензола [49]. Ускорение хроматографического процесса наблюдали также при добавлении 1% этанола к йзо-октану и переходе от бензола к смеси 10% бензола и 90% этанола*

Было показано* что разделение перечисленных смесей улучшается при добавлении к этанолу 10% воды. За исключением нитрофенола для всех изученных соединений найдена линейная зависимость логарифма объема удерживания от температуры км- пения. Замена паров гексана парами этанола приводит к снижению примерно вдвое (или более) объемов удерживания алкил- бензолов, галогенобензолов и других соединений на колонке, заполненной стеклянными шариками и Хромосорбом W-AW (без жидкой фазы). При хроматографии на оксиде алюминия подобная замена вызывает снижение объема удерживания в 3-15 раз. Оценка энтальпии сорбции алкил бензолов и галогенобензолов на оксиде алюминия показала, что в парах н-гексана найденные

Таблица 1

Относительное изменение объемов удержания при переходе от постоянных газовжосителей к парообразной гюдвижной фазе [41-461

Подвижные фазы

Разделяемые соединения

Колонка

Отношение объемов удерживания

СС14 и Не

Этилбензол и w-де-

20% диоктилфтала-

кан

та на Хромосорбе

ССЦ н №

Толуол, м-октан.

25% силиконового

0,9-12

м-пропанол

масла на Хромо-

сорбе

CiH^OH н n2

65-0*7

q№ и №

СС14 и Не

Бензол» н-гексан.

Порапак

0,15-0,18

циклогексан

CCU и N?

Бензол

Порзпак

口冉

QHQHhN工

Бфнэол

Оксид алюминия

0 m

значения Д77 на 1-2 ккал/моль менее теплот испарения сорбатов и на 8 ккал/моль меньше теплот десорбции с оксида алюминия* В парах спирта АН не превышает 30-50% теплоты испарения. Это показывает, что в изученных условиях имеет место сорбция раз- деляемых соединений на слое молекул подвижной фазы, адсорбированных на поверхности окиси алюминия.

Процессы, происходящие в колонке при использовании в качестве подвижной фазы паров летучих растворителей - гептана и этилового спирта, изучали также Кязимов, Березкин и Агаева [50]* Показано, что анализ ускоряется за счет модификации сорбента парами органических растворителей. Так, например, отно* сительный объем удерживания гексаметилбензола по отношению к тридекану при 150° С на колонке с 6% Апиезона L на Хро- матоне N при использовании в качестве подвижной фазы азота составляет 3,12» гексана-ЗЛ4 и спирта 一 2,74. Таким образом, относительное удерживание для гексаметилбензола и тридекана при использовании азота и гексана в качестве подвижных фаз приблизительно одинаково* Применение же полярного спирта приводит к заметному уменьшению объема удерживания* Аналогичные результаты получены и для относительного объема удерживания мезитилена по отношению к тридекану: 0,18 и 0,19 при использовании азота и гексана и 0,16 * при использовании паров спирта. Исправление формы пиков и улучшение разделения было достигнуто при использовании аммиака в качестве газа-носи- теля при хроматографии стереоизомерных пиперидиновых спиртов на стеклянных капиллярных колонках с полисилоксанами СКТВ и НСКТ [50]. Некоторые данные, касающиеся хроматографии в

Put* 4* Хроматограмма смеси ами^ нов в парах муравьиной кислоты. Колонка длиной 2 м с 10% СКТВ-1 на хроматоне N, температура 150℃ давление пара 3 * 104 Па:

7 - ди-«зб>-бутил амин; 2 - анилин; 3 - бензиламин; 4 - диметиланилин

токе аммиака^ приведены в работе [51]* Известны примеры использования паров метанола в сочетании с электронно-захватным детектором [52, 53] для хроматографического разделения хлористых и бромистых алкилов*

Пары сероуглерода применяли в качестве подвижной фазы для низкотемпературных разделений; напротив, формамид был использован при температуре 220-230° С при хроматографии некоторых пластификаторов [54-56]* Пары чистой муравьиной кислоты использовали при хроматографии аминов и свобод

ных органических кислот [52, 53, 57J. На колонке длиной 2 м с 10% полиэтиленгликоля 4000 при 180° С смесь пропионовой, ка* проновой я каприновой кислот разделяется за 11 мин. Еще быстрее происходит разделение алифатических и ароматических аминов (рис. 4) При этом интересно, что амины могут вводиться в колонку как в виде свободных оснований, так и в виде солей. В по

следнем случае параметры удерживания пиков соответствуют данным чистых оснований. Хроматографическое разделение некоторых комплексных соединений металлов в токе газа-носите

ля, содержащего пары одного из лигандов, описано в работах [58-61]. Помимо исправления формы пиков и улучшения разделения, метод имеет перспективы применения для оценки констант устойчивости комплексов* В число изученных хелатных комплексов входили три-н-бутилфосфаттетракистрифтор, аце- тилацетонат тория и трифторацетялацетонат кобальта (II)*

Особенно перспективно использование в качестве подвижной фазы паров воды. Будучи высокополярным энергичным вытеснителем, вода резко увеличивает летучесть веществ в условиях адсорбционной хроматографии. В газо-жидкостной хромато-

графин применение водяного пара приводит к значительному спрямлению изотермы сорбции и к практически полной ликвидации размытых задних фронтов» ^хвостов'* пиков. Это наблюдается даже в случае разделения аминов, спиртов и свободных кислот на неполярных жидких фазах, нанесенных на силикатный носитель без специальной обработки. Весьма привлекательна возможность проводить прямой анализ водных растворов и дисперсий органических веществ. Хроматографическое разделение фенола, крезола, ксиленола н других фенолов в парах воды впервые описано Дюмазером и Шильоном в 1960 г. [62]. Однако патент на процесс хроматографии в потоке водяного пара в этом же году получили Масада и Хасимото [63]. В 1962 г* опубликовано описание выпущенного в продажу парогенератора для питания хроматографа водяным паром [64], Возможности прибора иллюстрировались хроматограммой разделения смеси аминов.

Обширный цикл работ по использованию водяного пара в качестве подвижной фазы при адсорбционной хроматографии со^ единений различных классов выполнил Нонака в 1967-1976 гг* [28* 65-68]. Применяя в качестве адсорбента огнеупорный кирпич или Хромосорб, модифицированные HF и KF, автор показал возможность анализа высокополярных соединений. Одноатом- ные спирты, альдегиды^ кетоны, сложные эфиры при 110-120° С разделяли на колонках размером (2,0-4,5) м х (2,0-2,5) мм, заполненных огнеупорным кирпичом (50% SiO2, 45% А1:О3> зернение 30-40 меш), модифицированным HF* Скорость водяного пара составляла 30-60 мл/мин* Многоатомные спирты, жирные кислоты, фенолы, амины разделяли при 100-270° С на колонке размером 3,0 мх 2,2 мм, заполненной прокаленным огнеупорным кир- пичом того же состава. Для разделения фенолов адсорбент так^ же модифицировали KF, а при хроматографии глицерина добавь ляли небольшое количество Н3РО4. Показано, что жирные кис* лоты и фенолы лучше разделяются при 225° С на колонке, заполненной промытым кислотой Хромосорбом Р (30-60 мет), содержащим 3% Н3РО4 и предварительно выдержанным при 500° С. Для разделения аминов в качестве адсорбента применяли оксид магния [65].

Жирные кислоты (C2-Cls), бензойную, салициловую, молочную и некоторые дикарбоновые кислоты оказалось возможным анализировать при 135-230° С на колонках размером (2,6-4,0) м х (1,8-3,7) мм* заполненных Хромосорбом Р (30-60 меш) с 3% Н3РО4 при скорости водяного пара 6,5-110,0 мл/мин (66] (рис, 5)* Смеси фенолов и алкилфенолов при 135-205° С разделяли на ко- лонках размером (2,6-3,0) м х (1,8-3*7) мм, заполненных выдержанным в течение 5 мин при 500℃ Хромосорбом РА

(3X60 меш)т обработанным 3% Н^РО小 при скорости водяного пара 3-70 мл/мин [65]. В этих условиях можно анализировать и неполярные вещества,

Алканы С5-С9 нормального строения, ароматические углеводороды (бензол, толуол, изомеры ксилола) и нефтяные фракции с пределами температур кипения 130-145° С (лигроин) разделяли при 110-260° С на колонках размером 3,0 м х 2,0 мм, заполненных активным оксидом алюминия (40-60 меш) при скорости водяного пара 5-20 мл/мин [65]. Наконец, полициклические ароматические углеводороды (нафталин, смесь а- и р-изомеров метилнафталина, антрацен, хризен, трифенилен) и полифенилы (ди-, три- и тетрамеры) анализировали при 130-160° С на колонках размером 2Q м х 4,0 мм, заполненных Хромосорбом Р (30-60 меш), при скорости водяного пара 30-80 мл/мин [67], Анализы проводили на Хроматографе с пламенно-ионизационным детектором и металлическим парогенератором вместимостью 120 мл. Давление пара изменялось от 2,5 х 13 до 3,5 х 105 Па в зависимости от скорости потока и температуры пара* Почти все анализируемые смеси готовили в виде разбавленных водных эмульсий и суспензий (1О1-1(Н%) с использованием небольших количеств поверхностно-активных веществ,

В отличие от обычной хроматографии, при газоадсорбцион' ной хроматографии в парах воды величины удерживаемых объемов растут с повышением температуры колонки до 180° С, а затем уменьшаются. При понижении температуры ниже 120℃ удерживаемые объемы уменьшаются так резко, что разделение становится неБозможным. Такое явление можно объяснить тем, что взаимодействие органических молекул с адсорбентом осуществляется через слой воды, физически адсорбированной на нем* С повышением температуры толщина слоя на адсорбенте уменьшается, ито* в свою очередь, приводит к усилению взаимодействия молекул образца с поверхностью и увеличению теплоты адсорбции [68]. Значительные преимущества предоставляет метод хроматографии в потоке водяного пара и в том случае, когда неподвижной фазой является жидкость. Основным отличием этого процесса является то, что существенно ускоряется разделение и улучшается форма пиков высокополярных соединений. Так, при хроматографии жирных кислот, алифатических аминов и спир* тов в потоке водяного пара на колонках с 10% полиэтиленгликоля 4000 или полидиметилсилоксана СКВТ-1 при 15 0° С [69, 70] получены полностью симметричные пики компонентов смеси без специальной дезактивации носителя (рис. 6).

Неблаголряятное влияние силикатных твердых носителей можно устранить при использовании пористых полимерных сор-

Рис 5. Хроматограмма 0,1%-ного водного раствора дикарбоновых кислот в потоке водяного пара. Колонка из стекла длиной 4 м, диаметром 2,5 мм, заполненная огнеупорным кирпичом^ обработанным 3% Н3РО4 н прокаленным при 500°С. Температура колонки 210℃:

/ - малоновая кислота; 2 - янтарная кислота; 3 - адипиновая кислота

Рис. 6. Хроматограммы смесей полярных веществ в токе водяного пара: а - смесь аминов: колонка длиной 2 м с 10% силиконового полимера на Хроматоне N; температура 150℃; давление пара 5 * 104 Па: / - эфир; 2 - диизопропиламнн; 3 - диизобутиламин; 4 - анилин; 5 - бензиламин; 6 - пн- метиланмлин; 7 - этил анилин； 8 - дизтиланилин； б - смесь свободных кислот; колонка длиной 1 м с 10% пол иэтил енгл икол я на хроматоне N: / - уксусная кислота; 2 - пропионовая кислота; 3 - масляная кислота; 4 - валернэновая кислота： 5 - капроновая кислота; в - смесь спиртов нормального строения; колонка длиной 2м:/- гексанол; 2 - гептанол; 3 - октанол; 4 - нонанол;5 - деканолРис. 6. Хроматограммы смесей полярных веществ в токе водяного пара: а - смесь аминов: колонка длиной 2 м с 10% силиконового полимера на Хроматоне N; температура 150℃; давление пара 5 * 104 Па: / - эфир; 2 - диизопропиламнн; 3 - диизобутиламин; 4 - анилин; 5 - бензиламин; 6 - пн- метиланмлин; 7 - этил анилин； 8 - дизтиланилин； б - смесь свободных кислот; колонка длиной 1 м с 10% пол иэтил енгл икол я на хроматоне N: / - уксусная кислота; 2 - пропионовая кислота; 3 - масляная кислота; 4 - валернэновая кислота： 5 - капроновая кислота; в - смесь спиртов нормального строения; колонка длиной 2м:/- гексанол; 2 - гептанол; 3 - октанол; 4 - нонанол;5 - деканол

Рис. 6. Хроматограммы смесей полярных веществ в токе водяного пара: а - смесь аминов: колонка длиной 2 м с 10% силиконового полимера на Хроматоне N; температура 150℃; давление пара 5 * 104 Па: / - эфир; 2 - диизопропиламнн; 3 - диизобутиламин; 4 - анилин; 5 - бензиламин; 6 - пн- метиланмлин; 7 - этил анилин； 8 - дизтиланилин； б - смесь свободных кислот; колонка длиной 1 м с 10% пол иэтил енгл икол я на хроматоне N: / - уксусная кислота; 2 - пропионовая кислота; 3 - масляная кислота; 4 - валернэновая кислота： 5 - капроновая кислота; в - смесь спиртов нормального строения; колонка длиной 2м:/- гексанол; 2 - гептанол; 3 - октанол; 4 - нонанол;

5 - деканол

Рис. 6. Хроматограммы смесей полярных веществ в токе водяного пара: а - смесь аминов: колонка длиной 2 м с 10% силиконового полимера на Хроматоне N; температура 150℃; давление пара 5 * 104 Па: / - эфир; 2 - диизопропиламнн; 3 - диизобутиламин; 4 - анилин; 5 - бензиламин; 6 - пн- метиланмлин; 7 - этил анилин； 8 - дизтиланилин； б - смесь свободных кислот; колонка длиной 1 м с 10% пол иэтил енгл икол я на хроматоне N: / - уксусная кислота; 2 - пропионовая кислота; 3 - масляная кислота; 4 - валернэновая кислота： 5 - капроновая кислота; в - смесь спиртов нормального строения; колонка длиной 2м:/- гексанол; 2 - гептанол; 3 - октанол; 4 - нонанол;

5 - деканол

бентов. При этом отпадают также трудности, связанные с недостаточной устойчивостью многих жидких раз в парах воды.

Возможность использования пористых полимерных сорбентов Хромосорба 102 и Полисорба 1 при работе в парах воды была изучена на хроматографах 1ХМ-72 и Цвет-106» модифицированных для работы с газообразными подвижными фазами. В термостат детекторов приборов устанавливали парогенераторы из нержавеющей стали вместимостью 150 мл, рассчитанные на давление до 5 МПа* При температуре 105-140 ℃ такие парогенераторы создают поток водяного пара от 10 до 80 мл/мин. Такая производительность соответствует расходу воды от 0,6 до 6 мл/час. При этом одна загрузка парогенератора обеспечивает работу хроматографа в течение одной-двух недель в зависимости от расхода пара.

Проведенные эксперименты показали, что индексы удерживания алифатических спиртов и предельных органических кислот на пористых полимерных сорбентах, измеренные в потоке азота и потоке водяного пара, различаются весьма незначительно (1-5 ед. инп), что сопоставимо с погрешностями измерения.

Соотношение параметров удерживания кислот и спиртов с одинаковым числом атомов углерода в потоке азота на колонках с исследованными сорбентами оказалось равным 1,61 для Полисорба 1 н 1*55 f для Хромосорба 102. При переходе к водяному пару это соотношение стало lt64 и 1,48, соответственно. Таким образом, в отличие от колонок с неподвижными жидкими фазами на пористых полистирольных сорбентах вытесняющее действие водяного пара проявляется в заметно меньшей степени*

Показано, что индексы удерживания полярных веществ могут изменяться весьма значительно при переходе от инертного газа-носителя к водяному пару* Однако такое изменение происходит не всегда. Так. индексы удерживания алифатических спиртов сохраняются практически неизменными. Для свободных органических кислот, наоборот, характерно сильное увеличение: на 60-80 ед. для первых членов ряда и примерно 50 ед, для более высокомолекулярных последующих гомологов* Это указывает на менее активное вытеснение таких соединений по сравнению с угле водорода ми, Несмотря на увеличение индексов, время удерживания кислот в токе водяного пара оказалось намного ниже, чем при хроматографии в азоте. При хроматографии аминов в токе водяного пара наблюдается увеличение индексов Ковача на 8-10 ед., что превышает возможную ошибку эксперимента. Порядок элюирования аминов при переходе от азота к водяному пару не изменяется* Остаются без измене-

ння и различия в величине индексов удерживания отдельных со- единений, Это означает, что все закономерности хроматографического поведения веществ, накопленные в экспериментах с газовой хроматографией в инертных газах-носителях^ по-види- миму, полностью сохраняются в пределах данного класса соединений при газовой хроматографии в парах воды. Таким образом, сохраняются возможности идентификации веществ по их параметрам удерживания, по крайней мере в пределах соединений одного химического класса.

Описанные особенности процесса хроматографии в потоке водяного пара оказываются полезными при решении довольно сложных аналитических задач. Этот вариант хроматографии применен [51, 69-72] для разделения свободных стеринов, алкалоидов и фармацевтических препаратов, при этом использовался цельностеклянный хроматограф с колонкой длиной 2 м с 5% полярного полисилоксана ХЕ-60, содержащего цианогруппьь В диапазоне температур 175-260°С осуществлено разделение стероидных спиртов, генинов, алкалоидов тропанового, пирроли- зидинового и фенантренизохинолинового рядов? таких как пла- тифиллин, гоматропин, скополамин и другие* Кроме того, анализировались фармацевтические препараты: производные пиразола (амидопирин, бутадиен), эфиры аминокислот ароматического ряда (анестезин, новокаин), аминопроизводные ароматического ряда (фенацетин) [72].

Одна из полученных хроматограмм смеси стероидных соединений показана на рис. 7, а в табл. 2 представлены индексы удерживания некоторых групп изученных веществ и проведено сопоставление их величин при хроматографии в азоте и токе водяного пара.

При хроматографическом разделении в потоке паров воды алкалоидов групп атропина и морфина, а также производных пирролизидина в большинстве случаев получены полностью симметричные пики, причем процесс хроматографического разделения завершается за 5—15 мин при умеренной температуре колонки. Не составило трудностей и газохроматографическое определение в этих условиях ряда фармацевтических препаратов (рис. 8). При этом наблюдались четкие хроматограммы названных сложных азотистых соединений, вводимых в хроматограф в виде свободных оснований или их солей*

Приведенные хроматограммы показывают, что в токе водяного пара резко облегчается проведение анализа эфиров аминокислот, алкалоидов и других фармацевтических препаратов. В большинстве случаев концентрация определяемых веществ составляла 0,1-1%.

Рис. 7* Хроматограм м а смеси стероидов в парах воды. Колонка длиной 2 м с 5% полисилоксана ХЕ-60 на Хрома- тоне N; температура 220y давление пара 13 • 105 Па:

J - эргостерин; 2 - холестерин;

3 - стигмастерин; 4 - диосгенин

При вводе таких водных растворов или суспензий нарушений режима работы хроматографа не наблюдалось*

Следовательно, такой вариант хроматографического анализа имеет значительные перспективы при непосредственном определе

нии лекарственных препаратов в водных растворах и биологических жидкостях. Кроме того, возможность анализа сильно разбавленных водных растворов может быть использована для определения загрязнений в природных водах и промышленных стоках [73], а также при гео лого-разведо ч ных работах [74]+

Изменение давления в колонке при адсорбционной хроматографии в потоке водяного пара оказывает весьма сильное влияние на параметры удерживания разделяемых соединений [75], Так, при изменении среднего давления в колонке с 1,6 до 7,2Х1(Й Па удельные объемы удерживания углеводородов уменьшаются почти на один порядок величины, тогда как параметры удержиБания полярных веществ 亠 пиридина, ацетона, этилового спирта - остаются почти постоянными. Изменение температуры колонки при повышенном давлении водяного пара, как и при низком давлении, влияет на объем удерживания сложным

Рве* 8* Хроматограмма смеси фармацевтических препаратов* Стеклянная колонка длиной 13 м, диаметром 4 мм, жидкая фаза ХЕ-60, температура 180y давление пара на входе 5 ■ 104 Па:

/ - анестезин; 2 - новокаин; 3 - амидопирин; 4 宀 бутадиен

Таблица 2

В парах водыВ парах воды3 6 3 6 92 9 2 132 2 5 6 62 2 2 2 23 6 3 6 92 9 2 132 2 5 6 62 2 2 2 2Индексы удерживания органических соединенийпри хроматографии в ларах воды

В парах воды

В парах воды

3 6 3 6 9

2 9 2 13

2 2 5 6 6

2 2 2 2 2

3 6 3 6 9

2 9 2 13

2 2 5 6 6

2 2 2 2 2

Спирты (СКТВ, 140° С)

Гексиловый

867

869

Гептиловый

969

965

Октиловый

1065

!066

Нониловый

Н66

1166

Дециловый

1267

1269

Кислоты (CKTBt 150*0

У ксусная

1592

1694

Пропионовая

1649

1719

Масляная

1730

1796

Валериановая

1834

1889

Капроновая

1934

1986

Амины (СКТВ, 150°С)

Динзопропиламин

854

865

Ди-изобутнламин

945

964

Анилин

1012

1019

Бензилам fih

1053

1061

Диметнл анилин

1103

НЮ

ЭтилаНИЛИН

1129

Н37

Диэтиланилин

1274

1224

Соединение

В азоте

Стероидные соединения и алкалоиды (ХЕ-60т 220° С)

Холестерин

3100

3024

Диосгенин

3150

314$

Сгигмастерин

2990

3163

Морфин

—

3061

Этилмормфин

2943

2761

(хлоргидрат)

Кодеин

2939

2743

Эфедрин

1941

Кофеин

2575

Платифиллин

—

2895

Фармацевтические препараты (ХЕ-60.170° С)

Димедрол Анестезин Фенацетия Амидопирин Новокаин

образом [76]. Общий ход температурных зависимостей аналоги- чен наблюдавшемуся ранее в работе [67], однако в работе [76] от* мечено, что при любой температуре сохраняется линейная зависимость логарифма объема удерживания от числа атомов углерода в молекулах гомологов. Характер температурных зависимостей является специфичным для различных гомологических рядов, что открывает дополнительную возможность идентификации компонентов сложных смесей. При хроматографии в потоке водяного пара на колонке с полиэфирной неподвижной жидкой фазой [77] отмечена малая зависимость индексов удерживания углеводородов от температуры, однако малый диапазон ее изменения не позволяет сделать заключения об истинном характере этой зависимости. С другой стороны, в той же работе показана линейная зависимость параметров удерживания от объемного соотношения компонентов при использовании в качестве подвижной фазы смеси азота и водяного пара*

Весьма перспективно и плодотворно применение парообразных подвижных фаз и конденсирующихся газов в препаративной хроматографии. Описано разделение углеводородов на молекулярных ситах типа X и Y в потоке таких газов, как этан, этилен или СО2 [78], Исследования, описанные в работах [79, 80]* показали большие преимущества метода препаративной газожидкостной хроматографии в потоке конденсирующихся газов NH3, SO2, фреона-12.

Опыты проводили с использованием специального препаративного хроматографа, допускающего применение колонок большой длины [81]. Все изучавшиеся пары и газы подавали из баллонов без предварительной очистки* Применяли колонки размером 15 м х 1 см с Хромосорбом А @3-0*5 мм), содержащим 10% полиэтиленгликоля, или с Хроматоном N, содержащим 10% полисилоксана СКТВ* Детектирование осуществляли пламенноионизационным детектором, в который подавали от 1 до 3% от общего количество газа-носителя. При использовании фреона- 12, кроме того, применяли детектор по плотности газа.

При разделении смеси углеводородов Cj-C^ в токе NH3 выходящий из колонки газ полностью конденсировался в ловушках. Компоненты разделяемой смеси выделены количественно. Полученная хроматограмма состояла из полностью симметричных пиков. Эффекты в но сть колонки при объеме пробы 2 мл составляла 800 т.т* по н-декану. Время разделения составляло 11 мин при температуре колонки 130℃ и скорости газа-носителя 200 мл/мин.

Разделение углеводородов в токе СО2 было проведено для оценки степени улавливания. При расходе газа-носителя

1200 мл/мин и объеме пробы 1*5 мл эффективность разделения составила 700 т.т* Выходящий из колонки СО2 не конденсировал- с月 полностью: даже при охлаждении ловушек жидким азотом на выходе из ловушки наблюдался небольшой остаточный ток газа. Степень улавливания составила для углеводородов 90% и для смеси цис- и /прсгкс-гераниевых эфиров >85%* При хроматогра^ фин смеси алканов в токе SO2 существенного изменения времени удерживания не наблюдалось. При объеме пробы до 1,5 мл искажения пиков отсутствовали. При охлаждении жидким азотом или сухим льдом SO2 конден сиров ал ся в ловушках полностью? и разделенные фракции улавливались количественно. Было достигнуто полное разделение изомерных метиловых эфиров гераниевых кислот при количественном выходе фракций* Относительно низкая агрессивность сухого SO2, его доступность, высокая способность адсорбироваться и достаточно высокая молекулярная масса делают его применение перспективным не только для препаративной, но и для аналитической газовой хроматографии. Фре- он-12 и фреон-22 ранее не применяли для препаративной хроматографии* Эксперименты показали» что использование их в качестве газов-носителей при хроматографии с пламенно-ионизационным детектором не вызывает затруднений* Например, успешно проведено разделение модельных смесей углеводородов и изомерных эфиров гераниевой кислоты при 130° С. В ловушках фреон конденсировался полностью, что позволяло выделять компоненты смесей количественно. Надежность работы препаративного хроматографа с фреоном позволила применить этот прием для препаративного разделения цис- и /прлне-изомеров эфиров дейтерированных гераниевых кислот (рис. 9) [82]. Из 3 г смеси было выделено 1,8 г цис-изомера, 0,8 г транс-изомера и 0,4 г промежуточной фракции» т*е. улавливание всех компонентов было количественным. Аналогичные результаты получены и при использовании в качестве газа-носителя фреона-22.

Таким образом, использование в препаративной хроматографии легко конденсирующихся паров и газов позволяет существенно повысить эффективность разделения и полноту сбора фракций, вплоть до их количественного улавливания. Применение таких подвижных фаз способствует сохранению симметричности пиков даже при пробах объемом 1,5-2 мл*

Ряд особенностей отличает процесс препаративного хроматографического разделения в потоке паров воды* Как и в аналитической хроматографии, здесь также сокращаются времена удерживания, и тем больше^ чем выше полярность разделяемых соединений, Даже при весьма значительных загрузках колонки столь ^неудобные'* для хроматографии вещества, как алифатиче-

Рис* 9. Препаративное разделение смеси дейтерированных изомеров гераниевого эфира в потоке фреона-12. Колонка длиной 15 м, диаметром Юмм; неподвижная фаза 10% полиэтиленгликоля-3000 на Хроматоне N (40-60 меш), температура 180y объем пробы 0,5 мп* выход > 95%:

j - мнснзпмер; 2 - транс^зомер

ские и ароматические амины, жирные кислоты, фенолы, гликоли и т,п., элюируются в виде вполне симметричных пиков. Помимо этого, значительно облегчается улавливание разделенных фракций и даже простые ловушки при комнатной температуре обеспечивают полную конденсацию выходящего из колонки пара* Хотя при этом вещества выделяются не в чистом виде, а в форме растворов или эмульсий, легкость их улавливания и удобство работы с водяным паром вполне компенсируют работу по окончательному выделению и ндивиду а льн ы х продуктов. Отпадает нужда в сжатых газах в баллонах (азот, аргон, гелий и т.п*), расход которых в случае препаративного разделения бывает весьма велик*

По-видимому, первым примером использования водяного пара в препаративной хроматографии является работа [83]. В этой работе был использован цельностеклянный хроматограф [81] с парогенератором, имевшим производительность 200-300 мл/мин. Дете ктиро ва н ие осуществлял ось пламенно-ионизационным детектором, для чего использовали 0,5-】% пара, выходящего из колонки. Сбор разделенных фракций проводили с полной конденсацией паров воды при комнатной температуре без специального охлаждения ловушек. Колонки из стекла, длиной от 3 до 15 м, диаметром 10 мм заполняли Хромосорбом W или Хроматоном N, содержащим 10^15% полидиметил силоксана СКТВ-1 или поли- этиленгликольадипината.

Препаративное разделение смеси нормальных алканов С-С проведено при 180° С на колонке длиной 15 м с 12% СКТВ-1 на Хроматоне N. Пики углеводородов оставались симметричными до объема пробы не менее 0,5 мл. Эффективное число пиков для

пары С14Н^)и СГ5НЭ2 составило 1,7. Общий выход разделенных продуктов составил 96%* На аналитических хроматограммах разделенных фракций пики примесей отсутствовали* В тех же уело- виях при объеме пробы 0,5 мл хроматограмма смеси углеводородов СуС]н* синтезированных из СО и Н2 [84], показала полное разделение пиков н-алканов и изомерных углеводородов. Это показывает большие возможности и перспективы препаративной хроматоп?афии в водяном паре для выделения компонентов сложных смесей природного и искусственного происхождения.

При 130℃и объеме пробы 0,3 мл проведено разделение нормальных спиртов С«]> Хроматограмма имела полностью симметричные пики, а выход разделенных фракций превысил 95%. Препаративное разделение смеси алифатических и ароматических аминов проводили при 160℃ и объеме пробы до 6/НХ5 мл. Элюируемые пики были полностью симметричны.

Смесь уксусной, пропионовой, масляной и каприловой кислот разделяли на колонке длиной 15 м с 10% полиэтиленгликольади- пината на Хромосорбе А при 200° С и объеме пробы 0,5 мл* Как и при препаративном разделении спиртов и аминов, хроматограмма состояла из полностью симметричных пиков* Попытка разделения тех же смесей в токе азота не увенчалась успехом.

Примером разделения веществ с очень низкой летучестью является хроматография смеси изомерных терфенилов и трифе- нилена» проведенная на колонке длиной Эмс 10% СКТВ-1 на хроматоне N при температуре 210° С* Наблюдалось практически полное разделение всех компонентов, элюируемых в виде симметричных инков. Время удерживания последнего компонента - «-терфенила составило 1 час 40 мин (рис* 10),

Препаративное разделение углеводородов в токе водяного пара проведено в работе [85] Метод препаративной хроматографии многокомпонентых нефтяных фракций в потоке водяного пара с программированием температуры колонки описан R работе [86]. Скорость водяного пара соответствовала расходу жидкой воды 8-13 г/ч. Колонка размером 2,8 м х 12 мм была заполнена Рисорбом С, содержащим 21% Апиезона L* Применяемый хроматограф не имел детектора* После полной конденсации пара поток направляли в коллектор, отбиравший фракции объемом 0,2-1 мл через каждые 5-15 мин. Вследствие этого прибор не нуждался в детектирующих устройствах.

Опыт разработки препаративной хроматографии в токе водяного пара позволяет считать этот метод перспективным для но пользования в промышленности. Это подтверждает работа [87], в котором описана хроматографияеская установка большого масштаба для разделения бензола и тиофена. В дальнейшем уставов*

^^ 10, Препаративное разделение смеси изомерных терфенилов и трифенилена в потоке водяного пара* Колонка длиной 15 м, диаметром 10 мм, неподвижная фаза 12% полисилоксана СКТВ на Хроматоне N (40-60 меш), температура 210 ℃t объем пробы 0>4 мл:

/ 一 о-терфенил; 2 ~ трифенилен; 3 亠 л(-терфенил; 4 - м-терфенил

лено, что применение водяного пара вместо инертного газа б промышленной хроматографии может на 30-50% сократить капитальные затраты и срок окупаемости установок. На 10% и более уменьшается себестоимость продукции и существенно облегчаются условия труда обслуживающего персонала [88]* Разработаны методы приготовления сорбентов для промьппленной хроматографии, обеспечивающие получение 200-300 кг готовых сорбентов за 1 час [89], исследованы нагрузочные характеристики сорбентов и длительность их работы в токе водяного пара [90]* Была также изучена возможность применения промышленной хроматографии в потоке водяного пара для выделения «-ксилола [91],

В настоящее время установки для промышленной хроматографии, в том числе и осуществляемой б потоке водяного пара, имеют колонки диаметром 0,5-1 >2 м и обеспечивают производительность до 1300 т очищенных продуктов в год [92].

Влияние парообразной подвижной фазы на ВЭТТ* Изменение природы подвижного носителя оказывает влияние на эффективность хроматографического процесса. Это, с одной стороны, связано с изменением физико-химических характеристик подвижной фазы, таких как коэффициент диффузии, динамическая вязкость, плотность, С другой стороны^ это вызвано влиянием парообразной подвижной фазы на процесс сорбции разделяемых веществ.

Связь межу ВЭТТ (//) и параметрами хроматографического опыта выражается уравнением Ван-Деемтера-Джонса:

в

8 = А + — + С屮 + С产,(1 -29)

где и 亠 скорость подвижного носителя в колонке; В - коэффици-

ент, учитывающий размывание хроматографической полосы вследствие наличия молекулярной диффузии в потоке подвижной фазы; С& и С^ - коэффициенты, учитывающие размывание полосы вследствие наличия сопротивления массопередачи в пленке неподвижной жидкости и в подвижном носителе [93].

Первый член этого уравнения от свойств подвижной фазы не зависит. Второй член

в = 2% , (1-30) м и ‘

где у 亠 коэффициент, учитывающий наличие в колонке извилистых каналов, пропорционален коэффициенту диффузии в подвижном носителе Ds и поэтому непосредственно зависит от природы подвижного носителя. При переходе от перманентных газов к парам соединений с большой молекулярной массой коэффициент диффузии уменьшается обратно пропорционально квадратному корню из величины молекулярной массы. Это уменьшение может быть весьма значительным. Так, при перехо* де от водорода к фреону-12 коэффициент диффузии бензола изменяется от 0,371 до 0,038 [94]. Таким образом, при использовании тяжелых паров можно ожидать снижения размывания зон под действием молекулярной диффузии.

Действительно^ согласно данным Тсуда и Ишии [451, коэффициенты взаимодиффузии углеводородов в парах хлористого метилена, хлороформа и четыреххлористого углерода оказываются в 5-10 раз меньшими, чем в токе гелия (табл, 3).

Это приводит к тому, что кривые Ван-Деемтера для перечисленных паров в области скоростей, превышающих 1 см/сек, сходны с кривыми, полученными в токе гелия, а при меньших скоростях существенно различаются. Высота, эквивалентная теоретической тарелке, в гелии быстро увеличивается при дальнейшем снижении скорости газа, тогда как в парах перечисленных соединений ВЭТТ остается почти постоянной до скорости 0,2 см/сек. Минимальное значение ВЭТТ, близкое к ОД см, достигается при линейной скорости 3 см/с в токе гелия; 1,3-1,5 см/сек в азоте, метане и этане и 0,5 см/сек в парах четыреххлористого углерода.

Влияние второго члена уравнения Ван-Деемтера-Джонса проявляется лишь при относительно малых скоростях, близких к оптимальным для данной колонки. Поэтому при использовании паров с высокой молекулярной массой наблюдается увеличение предельной эффективности колонок, соответствующей опти^ мальному значению скорости подвижной фазы.

Третий член уравнения Ван-Деемтера-Джонса, учитываю- цщй сопротивление массообмену в неподвижной жидкой фазе, не

Таблица 3

Коэффициенты взаимодиффузик при давлении 1,013х 1胪 Па（44,45]

Вещество

СН3С12

СНС13

Темпера-

О, см2/сек

Темпера

тура, 七

0 см2/сек

Этан

117J

0，⑵ +0,002

Н7Т8

0Д07±0,004

1842

0Л63 + 0т002

184,7

0J4I +0.003

Бутан

Л7,7

0,075 + 0,002

118,0

0,069 + 000 5

3*4

0Л 04+0,001

】84/

0,087±0Ь001

СС14

Не

Вещества

Темпера- тура№

D, см%?к

Температура, Т

D* ем%ек

Этан

I17J

&О95

117

0,809*

187」

GJ31

Бутан

115*6

0,057

11?

GS36*

185」

0,074

Бензол

Г 30

0,048*

Рассчитано по [95].

содержит параметров, непосредственно связанных со свойствами подвижной фазы. Однако он зависит от коэффициента распределения сорбата и толщины пленки подвижной фазы, которые м。* гут изменяться в зависимости от природы подвижного носителя. Коэффициент。川 выражается следующим образом:

где к - отношение распределения компонента; @§ - толщина пленки жидкой фазы; О^ - коэффициент диффузии в жидкости* Модифицирующее действие парообразной подвижной фазы на поверхность твердого носителя приводит к уменьшению адсорбции разделяемых веществ и спрямлению их изотерм сорбции. Вытесняющее действие парообразного носителя приводит к определенному снижению коэффициента к* При использовании наполненных колонок в большинстве случаев к имеет величину порядка 10* В этом случае изменение к на 20-30% влечет за собой примерно такое же по величине, но противоположное по знаку изменение множителя

（1-32）Q +幻2

С другой стороны» возможное растворение подвижного парообразного носителя в неподвижной жидкой фазе может замет- HbiM образом увеличить толщину жидкой пленки (d用)и коэффициент диффузии в жидкости (£＞；Д Таким образом, парообразный носитель оказывает на коэффициент С^ довольно сложное влияние. В конечном итоге это влияние приводит к увеличению рассматриваемого коэффициента* Для капиллярных колонок, где к имеет величину порядка единицы, переход к парообразной подвижной фазе может вызывать как увеличение, так и уменьшение величины

Коэффициент С^ четвертого члена уравнения (1-8) по Гиддингсу [Об, 97], выражается для наполненных колонок следующим образом:

(1-33)(1-33)

(1-33)

(1-33)

где d - средний размер частиц насадки. Это выражение мало зависит от 幺 но обратно пропорционально коэффициенту диффузии в подвижной фазе* Поэтому при переходе от перманентного газа к парообразной подвижной фазе следует ожидать заметного увеличения члена С『Для капиллярных колонок Голей [98] дает следующее выражение для Q:

(1-34)(1-34)(1+6r+1叫户24(1+ ^)2^

(1-34)

(1-34)

где г - радиус капилляра. Как и в случае наполненных колонок, это выражение обратно пропорционально коэффициенту диффузии и относительно мало меняется с изменением 攵*

Влияние коэффициентов CItJ и С& проявляется в области скоростей, в несколько раз превышающих оптимальные. Поэтому можно сделать вывод, что при переходе от газообразной к парообразной подвижной фазе будет наблюдаться увеличение эффективности колонки при малых скоростях, близких к оптимальным. Наоборот, при увеличении скорости можно ожидать более быстрого падения эффективности.

Экспериментальные данные не противоречат этому выводу. Так, найдено [99], что при оптимальной скорости подвижной фазы ВЭТТ колонки с 6% Апиезона L на Хроматоне N для бензола составляет 2,9; 2,5 и 1т3 мм - для подвижных фаз азота, паров спирта и «гексан% соответственно* В случае гексаметилбензола на той же колонке ВЭТТ составляет 0,8 мм при использовании азота и 0,7 мм - при использовании паров спирта.

Рис* 1L Капиллярная хроматограмма смеси углеводородов СМ", полученная с применением в качестве подвижной фазы водяного пара- Стеклянная капиллярная колонка с полисилоксаиом СКТВ длиной 30 м и диаметром 0,3 мм* Программирование температуры от 100 до 250^С со скоростью 5 град/мин

Возможность достижения высокой эффективности разделения при использовании тяжелых газов и паров показана также в работах [80] и [83]* Авторы осуществляли препаративное разделение углеводородов при 130° С на колонке диаметром 10 мм и длиной 15 м, заполненной Хромосорбом А (0,3-0,5 мм), содержащим 10% полиэтиленгликоля, при скорости подвижной фазы 200 мл/мин 珏 объеме пробы 1,5-2 мл. При этом для СО2 эффективность составила 700 т.т., а для SO3 - 800 т.т. Зависимость ВЭТТ применяемой колонки от скорости газа при малых пробах показывает, что при малых скоростях СО2 ВЭТТ оказывается

mA

Рис* 12. Фрагменты хроматограммы циркуляционного газохроматографического разделения р- и у-пиколинов в токе азота 3) и в парах воды (б) [Чижков В*П, Юшина ГА” Ферапонтов В.А** Заводск. лаборат., 1977, т. 43, с, 943]

менее 5 мм* Таким образом, общая эффективность колонки превосходит 3000 т.т* для СО2 и 3500 т*т. для SO2- Зависимость ВЭТТ от скорости потока для фреона-12 показывает, что минимальное значение ВЭТТ в этом случае достигается при скоростях, превышающих оптимальные для СО2 и SO3 и равных 300-400 мл/мин. Максимальная эффективность колонки для фреона-12 составила около 4200 т*т. При проведении препаративной хроматографии аминов в токе водяного пара [85] на колонке длиной 12,5 м и диаметром 10 мм, заполненной Хромосорбом А, содержащим 10% полиэтиленгликольадипината, ВЭТТ при объеме проб 0,441,5 мл составляла 5 мм. Это соответствовало полной эффективности

колонки около 2500 т.т* Максимальная эффективность, достиг^

нутая в этих опытах, составила 4800 т.т.

Высокая эффективность была достигнута при разделении углеводородов в первой работе по капиллярной хроматографии в

парах воды (рис. 11) [100]» а также при циркуляционном газохроматографическом разделении изомерных пиколинов (рис. 12),

Рма 13, Зависимость ВЭТТ от давления водяного пара на входе в колонку длиной 1Ф5 м с SE-30 на хроматоне № 口- 120℃:

/- 4声铝；2 - СГЗН36; 3 - G |Н〃； 5 - 200°С: / - новокаин; 2 - димедрол

Эффективность колонок при хроматографии в токе водяного пара специально изучали в работе [101]. На колонках диа- метром 4 мм и длиной 1,5 м с Хроматоном N зернением 75-9。меш, содержащим 5% полисилоксана SE-30, была достигнута эффективность около 1600 т.т. по тридекану и 1700-1800 т*т* при разделении фармацевтических препаратов новокаина и димедрола. Наилучшие результаты были получены при скорости пара 15 мл/мин (давление на входе в колонку 5 х I(>t Па (рис* 13).

Важный вопрос об устойчивости неподвижных жидких фаз при хроматографии в токе водяного пара был исследован в работе [102] термогравиметрическим методом* Было установлено, что распространенные полисилоксановые жидкие фазы СКТВ, SE-30, СКТФТ-50, НФС-100 устойчивы в токе водяного пара до температур 250-300° С. Несколько менее устойчив нитрильной полисилоксан ХЕ-бО. Пол иэтил енгл икол и с молекулярной массой 4000 и 20000 выносятся из колонки почти полностью уже при температуре 200° С$ однако, по-видимому, остающаяся незначительная часть полимера модифицирует твердый носитель，функ* ционирующий далее как сорбент с довольно высокой разделяю* Щ^й способностью, Полинеопентилгпикольсукцинат по своей устойчивости занимает промежуточное положение между описанными выше группами жидких фаз. Эти первые результаты пока-

зевают, что вопрос об устойчивости жидких фаз в парообразных подвижных фазах требует дальнейших исследований.

Приведенные данные свидетел ьствуют о том, что применение парообразных подвижных фаз не вызывает ограничений удельной эффективности колонки и не препятствует достижению высокой полной разделяющей способности.

Таким образом, можно считать, что перспективной областью применения хроматографии с парообразной подвижной фазой в докритическом состоянии является анализ и препаративное разделение высокополярных малолетучих веществ при умеренной температуре колонки. Преимущество хроматографии в парах для этих веществ - это снижение требований к дезактивации носителя, сокращение времени анализа и повышение эффективности разделения*

Широкое применение метод может найти также в анализе водных растворов и дисперсий. При этом объектами анализа могут быть промышленные стоки, природные воды, биологические жидкости, пищевые продукты и т.п.

Метод препаративной хроматографии с парообразной подвижной фазой, в особенности с водяным паром, имеет значительные перспективы применения в промышленности. В этом случае возможна организация новых или усовершенствование существующих технологических процессов. Отсутствие необходимости в баллонах со сжатыми газами приведет к созданию компактных и легких анализаторов для работы в полевых или цеховых условиях.

ХРОМАТОГРАФИЯВ СВЕРХКРИТИЧЕСКИХ СРЕДАХ

Для хроматографии наилучшей является подвижная фаза, обладающая растворяющей способностью! близкой к способности жидкого растворителя, и динамической вязкостью, сходной с вязкостью газа* Такой комбинацией свойств обладают вещества при температуре и давлении^ незначительно превышающими критические параметры* В отличие от обычных газов и паров такие среды называются *фсверхкритическими,\ Этот термин подразумевает, что температура не превосходит (1,2-13) 丁坤加 а давление составляет (1,1-1тЗ) РКрит- Плотность веществ в этом состоянии оказывается лишь незначительно меньше плотности жидкостей при обычных условиях (0,3-1 г/см3). Вязкость сверхкритических сред имеет тот же порядок величины, что и вязкость газов

(10-^Ю-6 Пуаз). Коэффициент диффузии имеет величину, промежуточную между значениями для газа и для жидкости, однако превышает последнюю в 100-1000 раз* Этот факт значительно снижает отрицательное влияние сопротивления массопередаче в пленке подвижной фазы, резко ограничивающее скорость процесса разделения в жидкостной хроматографии.

Таким образом, с точки зрения оптимизации хроматографического процесса сверхкритическая ^еда как подвижная фаза обладает более выгодными транспортными свойствами, чем газ в обычном состоянии и жидкость. Поэтому можно ожидать достижения больших скоростей и большей эффективности разделения, Имеются примеры разделения веществ с исчезающе малой летучестью методом хроматографии в сверхкритических средах, которые значительно превосходят по результатам обычные варианты газовой хроматографии. Растворимость веществ в сверхкритических средах может в тысячи раз превосходить равновесную концентрацию малолетучего сорбата в газе, что резко увеличивает скорость элюирования. Давно известно, что в сверхкритических средах растворяются вещества даже ионного характера [103-108]. Это делает применимым указанный метод к полимерам, фосфолипидам» углеводам, нуклеотидам» нуклеозидам и подобным веществам,

В ряде случаев хроматография в сверхкритических средах оказывается более предпочтительной, чем жидкостная хроматография в своих наиболее современных модификациях.

Свойства сверх>фитическ>1х подвижных фаз« Подвижной фазой со сверхкритическими параметрами может быть любое вещество, не разлагающееся при температуре, несколько превышающей критическую. Выбор подвижной фазы связан также с устойчивостью разделяемых веществ в данных условиях* Кроме того, важными факторами являются растворяющая способность подвижной фазы и ее селективность. Физические свойства некоторых веществ, которые могут быть использованы в качестве сверхкритических подвижных фаз, приведены в табл. 4.

Низкая критическая температура обеспечивает мягкие условия, необходимые для разделения лабильных соединений, С другой стороны» с увеличением давления в системе возрастают трудности а ппаратурно- мето диче ского характера. Поэтому оптимальным для сверхкритической подвижной фазы является сочетание низкой критической температуры с невысоким критическим давлением при максимальной плотности вещества в критической точке. Из веществ, перечиеленных в табл* 4* уже использованы в качестве сверхкритических сред фреоны, аммиак, этилен, пентан» гексан, изопропиловый спирт, эфир и

Таблица 4

Свойства некоторых подвижных фаз, применяемых для хроматографии асверхкритических условиях

『Крит» ℃

Ркрнт/УПа

Вещество

8, кал/см3

N2O 出S so； SF6 COS co2 NH』 H2O 硏

с3нв GW c4h10 c5h12 备A4 c7H % QH6 c2h3f C^HiCl

CF3Cl 5“ CHFCli ccy 匸 HCIF? C^FjCl

о 7

■8Jзз^ак^^з 3 3 J л '8

9<*{оа 必 &t^lo^^x^o^oa^ 毋- ^-T^^l^^^^-^-3^98 10^-^-&2^^-^^

自出马 5C%

chf

CH3OH64,7

0HQH78,4

Иэо-С3Н7ОН®J

CH3OCH3-23,7

C2H 50GHs35,6

СНзОСэНд7,g

CH3NH2《5

(CH3)2NH6,9

CiH5NH21&6

CHUCHO21

(CH3}2CO56,2

(CH3)3N29

4 5 о 3 4 0 0 2 4 9 2 2 7 5 6 о I w&7-6工 3249'43-82047&2*-8l86'46jj6 6550137s226593 石о88179маоз4 3 114 13 13 9 3 9 9 112 2 2 1 1 2 1 1 1 9 I 3 7 ^^

■4'9'8J-9b36'8'5'2Q'0J'3'6'03QQQ'4aJ

L & 工 7^ I z 12 a & 土 X 7M X оГ 7 8 仇 X Q^ 9 11 7 & 736712544433224453354

7 9 4 857730382452 24s 7 4 2 5425 4^22Da323 务 30 3852*25138 о о о о .000000000000.0000000000

246$%,90,272

243,463,00,276

235 347,00,279

136,052t00,242

19 3.835,50,264

164T74M0,272

156973,6-

164 力52,4-

183,255,5-

188,0--

235,546,60,273

I60J40,90,233

(Ь35)(Ь35)диоксид углерода* Абсолютная температура кипения вещества Ткнп связана с его критической температурой (Ткрит) эмпирическим соотн о шение м:

(Ь35)

(Ь35)

ткнп и 2/3元呷.

Оно показывает, что температура кипения вещества оказывается ниже комнатной, если критическая температура ниже 190℃ В этом случае подвижная фаза превращается в газообразную при снятии давления. Поэтому сверх к ритич еская хроматография делает необходимым де те кти ровани е при повышенном давлении.

Повышение скорости перемещения вещества в колонке^ По Гильдебранту [109] в системах, подчиняющихся закону Рауля или отклоняющихся от него в положительную сторону, с увеличением давления растворимость понижается, С другой стороны, с повышением давления растет плотность парообразной подвижной фазы и увеличивается ее растворяющая способность [110, 111]. Оба эти фактора способствуют увеличению скорости миграции разделяемых веществ в колонке с повышением давления в ней. Комбинируя выражение для параметра растворимости

ОС”？

6 = (1-36)

с уравнением Ван-дер-Ваальса, Гиддингс и сотр. [112] вывели соотношение:

5 = 1,25 喘/PJPQ,(1-37)

связывающее критическое давление вещества (Ркрнт), его плотность в жидком состоянии (pg) и его плотность в условиях эксперимента р^, где 5 - параметр растворимости; % - мольный объем вещества. Мольная энергия испарения а в сверх к ритическ и х условиях приобретает смысл когезионной энергии данной среды.

Исходя из соотношений (1-36) и (1-37), можно найти выражение для относительного ускорения миграции в колонке (『i?), равного отношению коэффициентов распределения при изменении плотности подвижной фазы:

М /] 2 = In К[ / Kg = ° ⑷(& — Д] )(2 —— А[),(1-38)

RT

где А = 32/6| - отношение определяемых соотношением (1-37) параметров растворимости при изменении плотности.

В обычных условиях газохроматографического разделения подвижной фазой служит газ, имеющий плотность, крайне малую по сравнению с плотностью жидкости. т*е. pjp收=0* Полагая такие условия исходным состоянием, из соотношения (1-37) получим для этого случая 5 = 0» поэтому △ = S/5Jj? = 0. Тогда уравнение (1-38) примет вид [ИЗ]:

n/*'2 = l ~rF г2-Л'n/*'2 = l ~rF г2-Л'(1-39)(1-39)

n/*'2 = l ~rF г2-Л'

n/*'2 = l ~rF г2-Л'

(1-39)

(1-39)

Отсюда получим

in人2in人2拉執f)=拉執f)=

in人2

in人2

拉執f)=

拉執f)=

= 2^1.£sl 2 —= %31g.(1-40)

RT P『* Pw 丿 RT P/Д P(J

Легко видеть, что это выражение имеет максимум при р/р,, = 1, когда ускорение миграции составляет

e42 =逃.(1-41)

1.2 RT

Порядок величин: % = 102 см3; dB = 10 ккалш см^т； R = =2 ккал/моль ■ К и Т = 5 * 102 Кт так что

= 0042)

и 5-10г，2

Отсюда относительное ускорение миграции Zu = exp 10 = 105*

Таким образом, при одинаковой линейной скорости подвижной фазы увеличение плотности среды может ускорять движение хроматографической зоны в колонке в 105 раз* Однако достичь такие скорости миграции можно, лишь применяя давления, в 1*5-2 раза превышающие критические, т.е. составляющие для большинства веществ 106*5-107 Па,

Из формулы (1-41) также следует, что относительное ускорение хроматографического процесса при переходе от обычного газа к плотным сверхкритическим средам будет тем больше, чем больше величина мольного объема (%). Так как плотности всех органических веществ довольно близки между собой, a Vo = М/р, процесс их разделения будет ускоряться с увеличением молеку-

Рис. 14. Сравнение хроматографического удерживания полициклических ароматических углеводородов：

J f в газожидкостной и 2 - в сверхкритической хроматографии

лярной массы. Экспериментальные данные [114] подтверждают этот вывод. Так, фенантрен при использовании сверхкритической подвижной фазы элюируется быстрее в 120 раз* а нафтацен уже в 750 раз (рис, 14).

Такое ускорение процесса обусловило значительные успехи сверхкритической хроматографии в применении к веществам большой молекулярной массы, сложного строения и малой устойчивости. Например, был разделен ряд порфиринов в потоке фреона при температуре 150-170℃ и давлении до 136 кг/см3 [115, 116]. Описа* но разделение хелатных комплексов металлов с этиопорфирином, ацетонилацетоном и другими лигандами (117-119]. В этих работах применялись колонки с 10% эпоксидной смолы Эпон-1001 на Хромосорбе W при температуре 115-145℃ и давлении 5,5-11,5 МПа.

На колонках с полиэтиленгликолем-6000 или алкатеном, нанесенным на силоцель, проведено разделение ряда труднолету-

Рис 15, Разделение изомерных полициклических углеводородов в потоке паров «'Пентана* Температура 200℃, давление 3,98 МПа:

/ - бензол; 2 - пирен; 3 - 3,4-бензпирен; 4 - 1х2-бензпйрен

Рис, 16* Разделение изомерных бинафтилов на колонке с оксидом алю- миниЯр Подвижная фаза …изопропанол, температура 245℃, давление 4,5 МПа:

J ・ бензол; 2 - нафталин; 3 - 1,Г-бинафтил; 4 - 2,2Р -бинафтил

Рис. 17, Разделение хинонов в парах диэтилового эфира. Колонка с По- рапаком Q, температура 20cpe давление 5,0 МПа:

7 - ацетон: 2 - антрахинон; 3 - бенэоантрахинон; 4 - пентаценхинон

Рнс* 18* Разделение алкалоидов. Ус* ловия те же, что и на рис. 17:

/ 亠 ацетон; 2 - цинхонин; 3 - бруцин

чих веществ в потоке сверхкритических паров пентана, изопро

панола и диметилового эфира [114, 120-124]* Достигнуто эффективное разделение полицикли

Рис. 19, Разделение олигомеров стирола (средняя молекулярная масса смеси 600) общей формулы QHN^H2cHzc6也)尸；на хроматограмме указана величина п* Колонка с Порасилом С с химически связанными на поверхности «-октильными группами; подвижная фаза 一 смесь паров н- пентана и метанола (20 : I); температура 205℃, давление 4,0 МПа в первые 8 мин, а затем повышение до 6,0 МПа со скоростью 4 104 Па/минРис. 19, Разделение олигомеров стирола (средняя молекулярная масса смеси 600) общей формулы QHN^H2cHzc6也)尸；на хроматограмме указана величина п* Колонка с Порасилом С с химически связанными на поверхности «-октильными группами; подвижная фаза 一 смесь паров н- пентана и метанола (20 : I); температура 205℃, давление 4,0 МПа в первые 8 мин, а затем повышение до 6,0 МПа со скоростью 4 104 Па/минческих ароматических углеводов (рис* 15), полифенилов до С^, вы сок окипя щих пластификаторов ~ эфиров фталевой кислоты. Метод успешно применен к веществам, малолетучим в обычных условиях (рис. 16)* Плодотворно использование сверхкритиче^ скнх подвижных фаз в сочетании с молекулярно-пористыми полимерами типа Поропака Q* Такое сочетание оказалось эффективным для разделения ализариновых красителей, хинонов (рис. 17), алкалоидов (рис* 18), олигомерных эпоксидов [120].

Рис. 19, Разделение олигомеров стирола (средняя молекулярная масса смеси 600) общей формулы QHN^H2cHzc6也)尸；на хроматограмме указана величина п* Колонка с Порасилом С с химически связанными на поверхности «-октильными группами; подвижная фаза 一 смесь паров н- пентана и метанола (20 : I); температура 205℃, давление 4,0 МПа в первые 8 мин, а затем повышение до 6,0 МПа со скоростью 4 104 Па/мин

Рис. 19, Разделение олигомеров стирола (средняя молекулярная масса смеси 600) общей формулы QHN^H2cHzc6也)尸；на хроматограмме указана величина п* Колонка с Порасилом С с химически связанными на поверхности «-октильными группами; подвижная фаза 一 смесь паров н- пентана и метанола (20 : I); температура 205℃, давление 4,0 МПа в первые 8 мин, а затем повышение до 6,0 МПа со скоростью 4 104 Па/мин

Рис, 20. Разделение металлоценов при 40 ℃ в токе СО2 при программировании давления от 7,5 МПа (начиная с 22-й минуты) со скоростью 0,8 МПа/мин:

J - дициклопентадиенил железа: 2 - цикло пентадиен ил марганец трикарбонил (цимангрен); 3 - циклопеита* диенил титан ди хлорид

В ряде работ [125-127] на колонке с порасилом, имеющим на поверхности химически связанные октильные группы, в потоке сверхкритического пара смеси пентана и метанола (20:1) при 205℃ осуществлено разделение олигомеров стирола с молеку* лярной массой до 1800. Давление в колонке составляло 4 МПа в первые 8 мин разделения, а затем поднималось до 6 МПа со скоростью 4 * 104 Па/мин (рис, 19)* Резкое снижение времени удерживания веществ в сверхкритических средах создает возможность разделения химически неустойчивых веществ, труднолетучих при низких температурах. На рис. 20 приведена хроматограмма смеси металлоценов железа, марганца и титана, полученная при 40 ℃ в потоке сжатого СО? при программировании давления от 7,5 МПа, начиная с 22-й минуты со скоростью 0,8 МПа/мин [28]・ Сверхкритическая хроматография на колонке с Порасилом С в токе пентана [129] с успехом была использована также и для препарата в но го выделения отдельных олигомеров, входящих в состав известной неподвижной жидкой фазы DC-710 (рис, 21)*

Рис* 2L Препаративное разделение компонентов по л им етил фенил си л о- ксановой жидкости DC710. Колонка с Порасилом С, 100-150 меш. Величина пробы 50 мкл. Подвижная фаза - н-пентан. Температура 222℃, начальное давление 2*8 МПа в ходе опыта увеличивали со скоростью 4,4 ■ 104 Па/мин до точки а, где эта скорость была увеличина вдвое:

/ - бензол; 2, 3 - неидентифицированные низкомолекулярные продукты; 4 一 циклический тетрамер; 5 亠 линейный тетрамер; 6 - (щклкческий пентамер; 7 - линейный пента мер; G - линейный гептамер. Прочие пики не идентифицированы

Выделенные индивидуальные линейные и циклические олигомеры были использованы для оценки их разделяющей способности в качестве газохроматографических неподвижных фаз, нанесенных на стенки капиллярных колонок. Некоторые примеры применения сверхкритической хроматографии описаны также в работах [130,131].

Влияние давления. Как отмечалось выше, при использовании сверхкритических подвижных фаз давление оказывает решающее влияние на скорость элюирования. Это связано с тем, что вблизи критической точки плотность вещества, определяющая скорость миграции в соответствии с уравнением (1-41), с увеличением давления изменяется очень резко (рис, 22). При давлениях, в 2-3 раза превосходящих критическое, эта зависимость несколько ослабляется* В то же время крайне малая вязкость сверхкритической подвижной фазы обусловливает относительно малый перепад давления в колонке, необходимый для создания достаточной скорости потока подвижной фазы. Для колонки длиной 4 м при скорости подвижной фазы 3,5 см/сек и диаметре частиц ОД мм перепад давления составляет около 3 ■ 104 Па [126]. Поэтому в сверхкритической хроматографии обычно применяют давление порядка 2-20 МПа* Это близко к диапазону давлений, используемому в высокоскоростной жидкостной хроматографии. Современный технический уровень научно-исследовательских лабораторий позволяет при соблюдении необходимой осторожности безопасно использовать такие давления.

Увеличение давления оказывает значительное влияние на эффективность хроматографического разделения. При давлениях, превышающих критические, сжимаемость плотной сверхкритической среды становится сравнимой со сжимаемостью жидкости. При этом расход подвижной фазы на входе в колонку становится линейной функцией входного давления* Выведено уравнение зависимости ВЭТТ (Н) от входного давления [132-137]:

占= 4 + ^■ + 砒+C+G)%, (1-43)

где А - член, описывающий вихревую диффузию; В - коэффициент, описывающий молекулярную диффузию вещества в колонке; Cj и С2 - коэффициенты* учитывающие сопротивление мае- сопередаче в процессе внешней и внутренней диффузии; Е — член, учитывающий стеночные эффекты в динамическую диф- фузию; - давление на входе в колонку.

Из этого уравнения следует, что при больших давлениях ВЭТТ растет с увеличением давления. Действительно, хромато-

рис 22* Зависимость плотности пропилена от давл&ния к температуры в критической области: А 一 точка начала кипения; В - критическая точка (г = 91,39 ℃; р = 4,54 МПа； d = 0*2306 г/мл); С - точка росы* Кривые соответствуют следующим значениям температуры (℃):

? - 37,8; 2 - 71」；3 - 104Ф4; # - 1373:5^ 171Л

граммы, полученные в сверх- критических условиях, демонстрируют относительно невы-

а, г/мла, г/млсокую эффективность коло-

а, г/мл

а, г/мл

нок* Тем не менее, значительное расширение круга возможных объектов анализа, а также увеличение различий в удерживании веществ при повышении давления с избытком компенсируют указанное снижение эффективности* Весьма перспективно использование хроматографии в турбулентном режиме [133].

Рис, 23* Влияние температуры на величину коэффициента извлечения в условиях сверхкритической хроматографии:а - неподвижная фаза - по лиэтиленглм кол ь-6000 (23%) на силоцеле; подвижная фаза - w-пентан; давление 3*5 МПа; / ~ диоктилфталат； 2 - дигексилфталат; * - дибутил фтал ат; 4 - диэтил фтал ат; 3 - адсорбент At^Oj： подвижная фаза - «-пентан; давление 4,0 МПа; ? - 10-феяилантрацен; 2 - пирен; 3 - 1,Г- бинафтил; 4 - 2-фен нлнафта л ин; 5 - антрацен; 6 - фенантренРис, 23* Влияние температуры на величину коэффициента извлечения в условиях сверхкритической хроматографии:а - неподвижная фаза - по лиэтиленглм кол ь-6000 (23%) на силоцеле; подвижная фаза - w-пентан; давление 3*5 МПа; / ~ диоктилфталат； 2 - дигексилфталат; * - дибутил фтал ат; 4 - диэтил фтал ат; 3 - адсорбент At^Oj： подвижная фаза - «-пентан; давление 4,0 МПа; ? - 10-феяилантрацен; 2 - пирен; 3 - 1,Г- бинафтил; 4 - 2-фен нлнафта л ин; 5 - антрацен; 6 - фенантренВлияние температуры. Влияние температуры при хроматографии в сверхкритических средах не является столь однозначным и простым, как в обычной газовой хроматографии. Вблизи

Рис, 23* Влияние температуры на величину коэффициента извлечения в условиях сверхкритической хроматографии:

а - неподвижная фаза - по лиэтиленглм кол ь-6000 (23%) на силоцеле; подвижная фаза - w-пентан; давление 3*5 МПа; / ~ диоктилфталат； 2 - дигексилфталат; * - дибутил фтал ат; 4 - диэтил фтал ат; 3 - адсорбент At^Oj： подвижная фаза - «-пентан; давление 4,0 МПа; ? - 10-феяилантрацен; 2 - пирен; 3 - 1,Г- бинафтил; 4 - 2-фен нлнафта л ин; 5 - антрацен; 6 - фенантрен

Рис, 23* Влияние температуры на величину коэффициента извлечения в условиях сверхкритической хроматографии:

а - неподвижная фаза - по лиэтиленглм кол ь-6000 (23%) на силоцеле; подвижная фаза - w-пентан; давление 3*5 МПа; / ~ диоктилфталат； 2 - дигексилфталат; * - дибутил фтал ат; 4 - диэтил фтал ат; 3 - адсорбент At^Oj： подвижная фаза - «-пентан; давление 4,0 МПа; ? - 10-феяилантрацен; 2 - пирен; 3 - 1,Г- бинафтил; 4 - 2-фен нлнафта л ин; 5 - антрацен; 6 - фенантрен

критической точки даже относительно малое повышение температуры вызывает весьма значительное изменение плотности среды. В результате наблюдается резкое снижение ьtpacтвopимocти*^ сорбата в подвижной фазе, т.е. значительное возрастание коэффициентов распределения и, как следствие^ увеличение параметров удерживания* Примеры такого влияния температуры [122, 123] приведены на рис. 23. При дальнейшем повышении темпера* туры ее влияние, однако, становится противоположным: как и в обычной хроматографии, наблюдается снижение объема удерживания. Это согласуется с ходом кривых плотности вблизи критической точки (см* рис. 22)* В сверхкритической хроматографии зависимости коэффициентов распределения от температуры могут пересекаться.

Поэтому изменение температуры может приводить как к улучшению, так и ухудшению разделения* Возможность и целесообразность программирования температуры должна устанавливаться экспериментально в каждом отдельном случае.

Влияние природы неподвижной фазы. Изменение природы неподвижной фазы при хроматографии в сверхкритических условиях оказывает весьма значительное влияние на характеристики удерживания разделяемых соединений. Увеличение полярности неподвижной фазы способствует разделению за счет различий в природе разделяемых веществ* При этом легко осуществить групповое разделение. Применение неполярной неподвижной фазы дает возможность разделять соединения в соответствии с их молекулярной массой [122, 123]*

Ассортимент неподвижных фаз для сверхкритической хроматографии выявлен пока недостаточно. Высокая растворяющая способность сверхкритических сред сильно ограничивает число возможных неподвижных жидких фаз* Из них пригодны лишь наиболее высокомолекулярные и труднорастворимые. В целом, жидкая фаза должна удовлетворять требованиям, предъявляемым жидкостной х ромато графи ей, Показано [116], что а потоке сверхкритического пара дихлордифторметана в течение нескольких минут из колонки вымываются Апиезон М и полипропилен- гликоль Юкон 50 НВ 2000* Силиконовый эластомер SE-5 2 выносится постепенно, а жидкая фаза Харфлекс-370 претерпевает химическую деструкцию. Пригодными для длительной работы под давлением вплоть 口口 21 МПа оказались политрифторхлорэтилен Kel-F и полярные жидкие фазы Эпон 1001, Версамид 900 и полисилоксан ХЕ*60, содержащий нитрильные группы. В потоке сверхкритических паров пентана и изопропанола с успехом применяли полиэтиленгликоль 6000 (23% на Силоцеле, 120-140 меш) и низкомолекулярный полиэтилен [122]. Для хроматографии в

потоке сверхкритического аммиака использовали силиконовые эластомеры, полистирол, полисульфон, апиезоновые вакуумные смазки и др* [112,113, 134]. Весьма устойчивыми в сверхкритических условиях оказались наполнители, имеющие на поверхности химически связанные молекулы жидкой фазы, так называемые "щеточные" сорбенты, такие как н-октан/порасил С и карбо- вакс/порасил С

Молекулы сверхкритической подвижной фазы энергично связываются с активными центрами твердой неподвижной фазы. Это приводит к модификации поверхности сорбента, способствующей снижению времен удерживания. При этом исправляются изотермы сорбции, что ведет к симметризации хроматографических зон [114]. Плодотворно применение в сверхкритической хроматографии молекулярно^пористых сорбентов - порапаков [124] (см. рис. 16* 17), Предполагается, что в этом случае разделение протекает по механизму эксклюзионной хроматографии, однако нельзя исключить и возможность модификации сорбента подвижной фазой. Пока еще данные о влиянии природы молекулярно-пористого сорбента на величину удерживания веществ в процессе их разделения в условиях сверхкритической хромато графим недостаточны. По-видимому, возможна хроматография в парах, когда в результате адсорбции, растворения или капиллярной конденсации образуется неподвижная фаза той же природы, что и подвижная. В этом случае удерживание вещества будет зависеть лишь от различия его растворимости в двух фазах одного и того же вещества, определяющегося отношением плотности фаз. При этом количество и природа ранее нанесенной жидкой фазы будут иметь подчиненное значение*

Влияние природы подвижной фазы. В обычной газовой хроматографии вещества, отличающиеся по молекулярной массе, обычно имеют различные параметры удерживания* В жидкост- ной хроматографии главную роль играет характер взаимодействия молекул разделяемого вещества, неподвижной фазы и элюента. Сверхкритическая хроматография занимает промежуточное положение и позволяет, варьируя неподвижную и подвижную фазы, переходить от одного типа разделения к другому. Здесь важнейшим фактором оказывается полярность подвижной фазы, что мало проявляется в обычной газовой хроматографин. При использовании неполярной подвижной фазы разделение происходит в соответствии с типом полярности веществ. Величина молекулярной массы сорбата имеет второстепенное значение. Так, при хроматографии на оксиде алюминия с пентаном в качестве подвижной фазы фенилнафталин и гексакозилнафталин имеют близкие параметры удерживания, несмотря на разницу в

20 атомов углерода. Более того, ди-и-триаконтилфталат элюируется гораздо раньше, чем более полярный дифенилфталат, хотя последний имеет в молекуле на 48 атомов углерода меньше [122]* В случае полярной подвижной фазы, напротив, основным фактором оказывается размер молекул сорбата [121,122], Способность молекул подвижной фазы к взаимодействию с разделяемыми соединениями обусловливает принципиальную возможность их элюирования. Так, при хроматографии порфиринов [115] достаточная скорость процесса достигалась лишь при использовании потока паров дихлордифторметана при 6,8 МПа или монохлор- дифторметана при 9,5 МПа+ Фреоны, содержащие меньше фтора, не обеспечивали разделение даже при значительно больших давлениях. Изучение свойств сверхкритических паров и газов, сжатых до плотности, сопоставимой с плотностью жидкости, по* казало, что растворяющая способность указанных сред не усту* пает способности обычных органических растворителей. Значе* ния параметра растворимости» приведенные к одной и той же плотности» представлены на рис. 24. Повышенная растворяющая способность достижима и для газов, температура которых намного превосходит критическую, если их давление составляет 100-200 МПа* Этот вариант, названный "плотногазовой^ хроматографией [112, 113], с физической точки зрения мало отличается от обычной сверхкритической хроматографии» однако экспериментально реализуется значительно труднее.

Показано, что аммиак, легко образующий водородные связи, в сильно сжатом состоянии легко растворяет амины и гидроксилсодержащие вещества (спирты, аминокислоты, нуклеотиды). Сильно сжатый диоксид углерода охотно растворяет вещества, вступающие в дисперсионные и донорно-акцепторные взаимо^ действия (углеводороды, терпеноиды, эфиры и т.п) [112, 138]. Тесная взаимосвязь сверхкритической и ^плотно-газовой** хроматографии иллюстрируется диаграммой зависимости плотности среды от приведенных температуры и давления (рис. 25) [113]. На ней обозначены области параметров, использованные различными авторами. Возможности хроматографии в сверхкритических средах и в сильно сжатых газах для анализа сложных смесей органических соединений демонстрируются в табл. 5 [112], где приведены величины давления NH3 и ©О?* обестечивающие скорость миграции сорбатов, достаточную для их хроматографического разделения. Дополнительные данные о зависимости сорбционной емкости колонок от давления при сверхкритической хроматографии б токе СО2 приведены в работе [139]*

Влиявие параметров хроматотфафической колонки. Наибольшая эффективность хроматографической колонки достига-

Жидкости

6, кал/см3

Газы при платности жидкостей

СНЭОН

NOj

С2Н5ОН —

И30-СЗН7ОН

□ириднн

H2S

—НВг

на

so；

С12

со；

N2O;CH1SH

Диоксан

АцетонЭтилацетат

Толуол

СС】4

Циклигексин

Пентан

Рис. 24* Элеотропные ряды жидких растворителей н газов, сжатых до плотности жидкостей

од

5

о

1,0

2,0

Приведенная плотность

3,0

Рмс. 25* Диаграмма состояния сверхкритических сред и сильно сжатых газов

ется при оптимальной скорости подвижной фазы, которая соответствует выражению [140]:

%lD/D户 (1-44)

где D^ - коэффициент диффузии молекул сорбата в данной подвижной фазе> а % ~ диаметр зерен сорбента. При dpy равном 0,1 мм и Рдв> равном 1ф см2/сек, оптимальная скорость составляет около 0,1 см/сек» Эта величина примерно в 100 раз выше скорости, оптимальной для жидкостной хроматографии, и примерно в 100 раз ниже оптимальной скорости газа-носителя в обычной газовой хроматографии.

Вязкость сверхкритической подвижной фазы имеет тот же порядок величины, что и для газа. Поэтому при скорости, отличающейся от оптимальной в одинаковое число раз* перепад давления на колонке в случае сверхкритической подвижной фазы будет примерно на два порядка ниже, чем в жидкостной хроматографии. Это создает возможность применения более высоких скоростей. Некоторое снижение эффективности можно компенсировать при этом соответствующим удлинением колонки. Таким образом дос-

Таблица 8

Миграция веществ в среде сжатых гаэов NH3 (при 140 ℃ и 200 кг/см2) и СО2 (при 40 Хм различных давлениях)

ВеществоМН$СО^

давление СО2. кг/см2

Пурины

АД^нин-十

「уаннн--

Кофеин++-

Нумеозиды и нуклеотиды

Аденозин+++

Гуанозин+++

Уридин+++

Адениловая кислота++-

Кортикостероиды

Кортизон++

Гидрокортизон++

Стерины

Холестерйн++1

Эргостерин++1

Ланостерин++++

Углеводы

Рибоза+^н

Арабиноза++卄

Ксилоза++++

Глюкоза++++

Фруктоза++++

Маннозан++

Сорбоза++卄

Галактоза十-

Мальтаза++++

Лактоза++-

Терпеноиды

а-КаротинРаз叮+++

卜 Каротин”

Лнконнн”++

Сквален++++

Аминокислоты, пептиды и протеины

Глицин+++

Лейцинн-

Триптофан++-

Тирозин++г

Аргинин++亠

Л» зни++-

Глицил-глицин++-

Глицнл-Е-лейцнл-Ь-тирозикт

Цитохром С

1300

1300

1300

1350

1350

1350

1350

1300

1300

510

510

510

1350

1350

1350

1350

1350

1350

1350

1350

1350

1350

170

170

170

510

1350

1350

1350

1350

1350

1350

Таблица в (окончание)

Вещество

NH$

СО2

давление СО小 кг/см2

Силиконовые масла н каучуки

DC-200

Разд*

++

70

OV-17

++

SE-30

-1

Углеводороды

770*

Октадекан

卅

136

Докозан

卅

136

Октакозан

++

136

Сквалан

т++

Полиэтиленгликоли

90*

ПЭГ400

卅

68*

ПЭГ-1000

卄

115*

ПЭГ-4000

++

190*

ПЭГ-20 000

+++

Другие вещества

Кверцитин

-н-

Пентаацетат глюкозы

Поливинилхлорцд

*

1700

Полиэтилен

1500

Днноннлфталат

++

165*

Апиезон L

++

820*

Примечание: ++ - сильная миграция (сигнал)； +- слабая миграция; - и едете м- тируемая миграции или данные отсутствуют; * - пороговое давление^

тигается заметный выигрыш в скорости разделения, В сверхкритической хроматографии обычны скорости 0,2-10 см/сек* Это соответствует для колонки диаметром 3 мм объемным расходам 0,5-20 мл/мин* В этих условиях эффективность в основном снижается за счет неравномерности заполнения колонки и диффузионного сопротивления массопередаче в порах частиц наполнителя и в пленке жидкой стационарной фазы [121], В соответствии с этим наибольший вклад в величину ВЭТТ в сверхкритической хроматографии вносит первый член (Л) уравнения Ван-Деемтера, описывающий вихревую диффузию* При диаметре колонки 6 мм, диаметре частиц 0t25 мм и давлении около 5,0 МПа этот вклад достигает приблизительно 2 мм. Снижение этой величины достигается уменьшен нием диаметра колонки н величины частиц наполнителя. Вклад сопротивления массопередаче при межчастичной диффузии в величину ВЭТТ становится весьма значительным при высоких скоростях подвижной фазы. Этот вклад пропорционален 当(уравнение (10-29)). Поэтому для получения высокой эффективности в этих

условиях следует применять частицы минимального диаметра. Это подтверждается характером зависимости ВЭТТ для пентана от линейной скорости сжатого СО； [121]. Уменьшение размера частиц не только снижает ВЗТТ, но и делает ее менее зависимой от скорости подвижной фазы. Однако снижение размеров зерна сорбента лимитируется быстрым ростом перепада давлений, пропорционального //d2. Так как вблизи критической точки влияние давления на плотность и растворяющую способность подвижной фазы про* является очень резко, то значительный перепад давлений в колонке оказывается совершенно недопустимым. Работа при температуре, близкой к критической, но при давлениях, в два-три раза больших. чем критическое» позволяет вести процесс в такой области диаграммы состояний (см, рис* 1-21), где влияние давления на плотность среды проявляется в значительно меньшей степени. Как и в высокоэффективной жидкостной хроматографии, важность равномерной упаковки частиц в колонке, работающей в потоке сверхкритической подвижной фазы, диктует необходимость применения очень узких по величине зерен фракций носителя, тщательно освобожденных от мелких частиц* Эффективны поверхностнослойные (пелликулярные) сорбенты» состоящие из сферических монолитных частиц одинакового размера, покрытых тонким пористым слоем [141-144], Целесообразно также применение наполнителей с химически связанными неподвижными фазами [145-146], в которых эффективная толщина сорбционного слоя составляет 0,03-03 диа- метра зерна. Это позволяет резко снизить сопротивление массопе- редаче в пленке неподвижной фазы без сильного уменьшения размера частиц. Поэтому не происходит значительного увеличения перепада давлений на входе и выходе колонки, что позволяет намного повысить скорость потока в колонке и, таким образом, интенсифицировать разделение.

АППАРАТУРА

Основные элементы аппаратуры для хроматографии в докри* тических газах и парах не отличаются от соответствующих узлов обычного хроматографа. Изменения необходимы только в системе подачи подвижной фазы, а также в устройствах для регулирования давления и скорости потока. Аппаратура для хроматографии в сверхкритических средах очень похожа на современные приборы для высокоэффективной жидкостной хроматографии (см* гл. 3). Общая схема такого прибора изображена на рис. 26* Требования к таким приборам рассмотрены в литературе [147-149].

В данной книге будут отмечены лишь специфические особенности приборов для хроматографии с парообразной подвижной фазой.

Системы подачи элюента. Применяются две системы подачи парообразной подвижной фазы. В одной из них жидкая фаза испаряется в специальной емкости - парогенераторе и подается в хроматографическую колонку в виде пара (рис* 25) [52, 65]* Пар в этой системе находится под давлением, превышающим рабочее давление в начальной части колонки, и его поток регулируется вентилем. Во избежание конденсации пара в коммуникациях их поддерживают при температуре выше температуры кипения рас- творителя. В то же время стабилизация электронагрева пароген нератора позволяет получить постоянный поток пара определенных параметров* В лабораторной модели достигнуто постоянст^ во давления выходящего пара с точностью до ±133 Па при расходе от 15 до 60 л/ч, что требует поддержания температуры с точностью до 0,02° [150]. Этот генератор предназначен для излучения горения паров жидкости, однако может с успехом быть использован для хроматографии.

Схема цельностеклянного хроматографа [151], использованного в работах [52, 69, 71-73, 80], представлена на рис. 2 7. Высокая степень стабилизации электропитания парогенератора осу- ществляется прецизионным электронным ста б ил изатором t При этом отпадает необходимость в запорных или регулирующих уст- ройствах на пути пара. Использование стандартных блоков про- граммирования температуры для регулирования интенсивности нагрева парогенераторов (рис, 27) позволяет осуществить хроматографию с программированием скорости потока. Такие системы не требуют особой чистоты парообразующей жидкости, т.к* летучие примеси довольно быстро отгоняются и элюируются, а нелетучие остаются в парогенераторе. Однако подобные системы выходят на стабильный рабочий режим лишь через 1-2 ч, Кроме того, небезопасно наличие растворителя, нагретого выше нормальной температуры кипения при повышенном давлении* Вместимость паро генератор а соответствует 50^300 мл растворителя, а производительность колеблется от 10 до 1000 мл/мин. Одна загрузка достаточна для работы аналитического кроматогра- фа в течение 1-2 недель, а препаративного в течение 1-2 дней,

В других системах генерация пара осуществляется путем подачи потока жидкого растворителя в испаритель хроматографа или специальный подогреваемый испаритель, находящийся при повышенной температуре. Растворитель поступает под давлением сжатого газа с помощью поршня или насоса [40, 65]. Такие системы безопасны, быстро выходят на рабочий режим и достаточно компактны* Кроме того, они позволяют применять смеси растворите-

Рис. 26* Схема прибора для хроматографии в потоке сверхкритического пара:，一 насос для подачи растворителя; 2 ~ устройство для программирования дав* ления с помощью сжатого азота; 3 - предварительный подогреватель; 4 - нагревательный змеевик; 5 - испаритель для ввода пробы; 6 - колонка; 7 - термостат колонки; 8 - холодильник; 9 - игольчатый вентиль; 10- детектор к самописецРис. 26* Схема прибора для хроматографии в потоке сверхкритического пара:，一 насос для подачи растворителя; 2 ~ устройство для программирования дав* ления с помощью сжатого азота; 3 - предварительный подогреватель; 4 - нагревательный змеевик; 5 - испаритель для ввода пробы; 6 - колонка; 7 - термостат колонки; 8 - холодильник; 9 - игольчатый вентиль; 10- детектор к самописецлей с сохранением постоянного состава пара. Применяя несколько подающих устройств, можно изменять состав подвижной фазы в процессе анализа скачкообразно или плавно, аналогично градиентному элюированию в жидкостной хроматографии. В ряде случаев парообразующая жидкость подается в испаритель за счет давления сжатого газа, регулируемого соответствующими устройствами [75, 77, 152]. В большинстве работ по хроматографии в сверхкритических средах подвижная фаза пода^

Рис. 26* Схема прибора для хроматографии в потоке сверхкритического пара:

，一 насос для подачи растворителя; 2 ~ устройство для программирования дав* ления с помощью сжатого азота; 3 - предварительный подогреватель; 4 - нагревательный змеевик; 5 - испаритель для ввода пробы; 6 - колонка; 7 - термостат колонки; 8 - холодильник; 9 - игольчатый вентиль; 10- детектор к самописец

Рис. 26* Схема прибора для хроматографии в потоке сверхкритического пара:

，一 насос для подачи растворителя; 2 ~ устройство для программирования дав* ления с помощью сжатого азота; 3 - предварительный подогреватель; 4 - нагревательный змеевик; 5 - испаритель для ввода пробы; 6 - колонка; 7 - термостат колонки; 8 - холодильник; 9 - игольчатый вентиль; 10- детектор к самописец

ется в колонку с помощью жидкостного насоса. В сверхкритической хроматографии очень важно программирование давления, ко・ то рое о существл яется специальными устройствами [1, 128, 153]. При использовании для этих целей поршневых или плунжерных насосов с многократным ходом поршня необходимо специальное сглаживание пульсаций давления [126]*

Рис. 27, Схема цел ьносте к л ян него хроматографа с парогенераторе м: / - парогенератор; 2 - нагреватель;

3 - газовый манометр; 4 - термостат; 5 - колонка； 6 - детектор

Устройства для вводы пробы* Конструкция испарителя для работы с докритичеикими парами специальных особенностей не имеет. Материал испарителя должен быть стойким к коррозии, а прокалываемая мембрана не должна набухать под действием применяемого пара. Стекло, нержавеющая сталь, кварц полностью применимы для работы с большинством паров. При работе с аммиаком нельзя использовать медь, медные сплавы и никель Прокладки из тефлона и мембраны из силиконовой резины вполне устойчивы к действию большинства применяемых паров при давлениях до 10 кг/см2. В случае сверхкритической хроматографии ввод пробы затрудняется высоким давлением 瓜 высокой температурой в системе. Весьма жесткие требования диктуются также повышенной растворяющей способностью сверхкритической подвижной фазы [122* 153]* Если давление не превышает 5 МПа* могут применяться усиленные микротприцы объемом 1-10 мкл, клапанные системы [121, 122, 153] и шлюзовые камеры на основе вентилей высокого давления [1]*

Термостаты^ Хроматография в парах осуществляется обычно при температурах, превышающих температуру кипения парообразующей жидкости, а сверхкритическая хроматотрафия - при температуре, превышающей критическую для применяемой подвижной фазы* Это определяет диапазон рабочих температур термостата до 300-350℃ Таким требованиям удовлетворяют термостаты обычных газовых хроматографов* Для перевода применяемой подвижной фазы в сверхкритическое состояние часто используется испаритель и специальный змеевиковый перегреватель, которые устанавливаются в термостате колонок или снабжаются отдельным нагревателем. При работе с докри- тическим паром целесообразно программирование температуры термостата; для сверхкритической хроматографии это требование менее обязательно.

Колонки^ При хроматографии в докритических парах материал колонок должен быть устойчивым к коррозии под действием применяемого пара* Для этой цели универсальны стекло, кварц и нержавеющая сталь, а при работе с водяным паром - обычная сталь. Применяемые в обычной хромато^афии металлические трубки выдерживают давления, используемые и в сверхкритической хроматографии. Стеклянные колонки должны и зготавл ив аться из толстостенных трубок повышенной прочности, как и в жидкостной хроматографии высокого давления [147-149].

Детекторы* Детекторы, применяемые в обычной газовой хроматографии^ могут использоваться и с парообразными жид* кими фазами. Например, катарометр был применен при рабо-

те в ацетилене, этане, четыреххлористом углероде, хлористом метилене спирте и в других органических парах [43-50, 154]. Чувствительность детектирования при этом достигает чувствительности катарометра в азоте* Повышение чувствительности за счет увеличения температуры нитей огр а ничива ется пиролизом применяемых паров. Имеются данные об успешном применении катарометра и при работе в парах воды [68]. Для повышения чувствител ьносги детектирования между колонкой и детектором была установлена кварцевая трубка длиной 150 мм и диаметром 3 мм, нагретая до 1000℃, Элюируемые продукты превращаются в этой трубке в водород и метан, что повышает чувствительность детектирования более чем в 10 раз. Высокую чувствительность обеспечивает пламенно-ионизационный детектор при работе в парах, к которым он н ечуветвите ле н t Этот детектор был использован при работе в парах воды [10, 28, 52, 65-77+ 80,83,85], муравьиной кислоты [27,52,53,57, 155], сероуглерода и формамида [54—56]* Показано, что вещества, способные сгорать в атмосфере воздуха или чистого кислорода и не дающие сигнала пламенно-ионизационного детектора, могут быть использованы в нем вместо водорода в качестве пламеобразующего агента в сочетании с другим газом-носителем или с другой парообразной подвижной фазой. В качестве пламеобразующих агентов такого типа были изучены муравьиная кислоты [57, 156, 157], сероуглерод [54, 15 8]? формамид [55, 159]* Для той же цели применяли также аммиак [51, 160], однако он способен гореть только в чистом кислороде, что представляет некоторое неудобство. Возможно, что пламенно-ионизационный детектор, в котором водород заменен другими пламеобразующими агентами, может обладать специфической селективной чувствительностью к отдельным группам органических соединений, однако этот вопрос требует дополнительного изучения*

Чувствительность и линейность обычного пламенно-иониза- ционного детектора при работе в парах воды была подробно нзу・ чена в работе [101], где был использован детектор с платиновыми электродами в сочетании с усилителем хроматографа ЛХМ-8МД, Показано, что в этих условиях чувствительность детектирования углеводородов и фармацевтических препаратов (уротропина, новокаина, пирамидона, димедрола и др*) не снижается, а линейность остается весьма высокой (рис 28). В целом, при хроматографическом анализе фармацевтических препаратов в токе водяного пара с пламенно-ионизационным детектором легко достижима точность определения, превосходящая требования Госу дар ственной фармакопеи СССР.

с* 10е

Рлс* 28* Графики абсолютной калибровки пламенно-ионизационного детектора для: а -гексаметилентетрамина и 6-амидопирина:

/ - по высоте пика; 2 - по площади пика

При хроматографии в парах воды особое значение имеет электрокондуктометрический детектор [161-164], позволяющий существенно упростить аппаратуру, отказаться от вспомогательных газов и в то же время сохранить высокую чувствительность детектирования. При анализе органических загрязнений в воде методом хроматографии в потоке водяного пара на приборе с таким детектором при непосредственном вводе проб оказалось возможным регистрировать присутствие в анализируемых водных средах 5 мг/л толуола, 10 мг/л низших спиртов. 0,5 мг/л хлороформа, 0,3 мл/л акрилонитрила* Хроматограф с электрокондук- тометрическим детектором, работающий в потоке водяного пара, может быть оформлен в виде легкого, компактного прибора, позволяющего осуществлять контроль загрязнений водной среды, в том числе природных и сточных над. Для регистрации гало- геноалканов, элюируемых потоком паров метилового спирта, применялся электронно-захватный детектор [53]. Детектор по

плотности газа был использован при работе в потоке фреона [42]* Детектирование в сверхкритической хроматографии достаточно сложно, так как обычные детекторы не могут быть использованы в условиях больших давлений. Если сверхкритическая среда является жидкостью при обычной температуре» то элюированные вещества будут находиться в растворе и могут детектироваться, как в жидкостной хроматографии. Если же применяемая подвижная фаза при комнатной температуре газообразна, то при снижении давления элюированные вещества образуют аэрозоли или осадки на стенках аппаратуры. При этом прямое детектирование невозможно [112]. Во избежание этого принципиально возможно проводить пиролиз или деструкцию элюируемых компонентов до детектирования [1], При работе в потоке жидкости могут применяться пламенные [165] или аргоновые [166] ионизационные детекторы с подвижным транспортирующим элементом, проточные рефрактометры [149], микро- адсорбционные детекторы [167], а также детекторы, измеряющие теплоту испарения [168]. Нередко производят измерение поглощения ультрафиолетового излучения [149], для этого используют спектрофотометр [169]. Ячейка ультрафиолетового детектора имеет объем около 10-20 мкл с оптической длиной порядка 10 мм. Описаны подобные устройства, работающие при давлении выше 30 МПа [153]* Ведется разработка новых возможностей детектирования примесей органических соединений в потоке жидкостей* Продолжается развитие метода хроматографии в парах воды [170,171]* Весьма обстоятельное изложение принципов, особенностей и возможностей сверхкритической флюидной хроматографии содержится в книге [172]*

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6565Хроматография в потоке паров органических и неорганических веществ открыта около 40 лет тому назад, но значительное развитие получила лишь в последние годы. Одновременно появился и другой эффективный метод разделения веществ - хроматография в сверхкритических средах. Эти модификации хроматографии находят применение в анализе смесей сильнополярных соединений с более высокой молекулярной массой, чем допускает обычная газовая хроматография. Сверхкритическая хроматография требует работы при высоких давлениях, аналогичных применяемым в высокоэффективной жидкостной хроматографии (до 30 МПа и более). Универсальность указанных новых ме・

65

65

Руденко В.А.

тодов будет способствовать внедрению их в практику научных лабораторий наряду с газовой и жидкостной хроматографией* Особенностью хроматографии в парах и сверхкритической хроматографии является легкость количественного препаративного выделения фракций. Полная конденсация элюата на выходе из колонки гарантирует отсутствие потерь разделенных компонентов, что успешно использовано в промышленном масштабе* Указанные методы открывают возможности неаналитического применения для изучения взаимодействия молекул веществ. С их помощью могут быть получены новые данные о вторых вириаль- ных коэффициентах, коэффициентах активности и фугитивно- сти, об энергиях взаимодействия молекул и о других термодинамических величинах*

ЛИТЕРАТУРА

L Myers ММ, Giddings JC // Progress in separation and purification / Ed. ES Perry, E. van Oss. N.Y.: Wiley, 1970. Vol- 3. PJ33.

Рийндерс Дк*, Елем^р Дж+, Ван-Кровелен М. // Успехи хроматографии, М*: Наука, 1972. С 65.

3* Вигдергауз Л/. С, Семкин В*" 〃 Успехи химии, 197L Т. 40* С. 1073.

4+ Gouw TH, Jentc^t RE // L Chromatogr* 1972, Vol 68. P. 303+

Doran 工〃 Gas chromatography, 1972. №Y・： Biarking, 1973, P. 133.

Przyjazny A, Staszewxki R 〃 Chum* Anal* (PRL). 1974. VqL 19. P. 3.

Huang J. // Chemistry. 1964. Vol* 68. R 800,

Вигдергауз M.C,t Рахманкулов Ш.М. // Успехи химии. 1975. Vol 44. P. 377.

Руденко EA.t Байдаровцева MA, Агаева MH H Журн* аналит. химии. 1975* Т. 30* С 1191.

Rudenko 乱4, Baydarovtseva MA,t Kuzovkin VA, // L Chromatogr, 1975. VoL 111 P. 373.

IL Goldup4, Luckhurst G*R“ Swanton WT. //Nature* 1962. VoL 19 3. P, 333.

Desty DR* Goldup 4, Luckhurst GR” Swanton W.T. // Gas Chromatography, 1962 / Ed. M. van Swaay. L: Butterworths, 1962. P* 67*

13* Everett D.H. // Trans. Faraday Soc. 1965* VoL 6L P 1637*

Martire D^.t Pollard LZ^ I I Adv. Chromatogr. 1965. VoL 1, chap. 10.

Cruikshank AJ.B.t Windsor ML, Young CL 〃 Proc, Roy. Soc. London A. 1966. VoL 295. P. 259.

16* Windsor M.L^ Young C.L. // J* Chromatogr. 1967* VoL 27. P* 355+

Buckingham A.D. The laws and applications of thermodynamics. Oxford: Pergamon press, 1964*

J 8. Gainey B.W.t Pecsok RL 〃 J* Phys. Chern. 1970. VoL 74* R 2548, 19. Pecsok RL, Windsor ML. // AnaL Chem. 1968. VoL 40, P. 92, 1238. 20* Vigdergauz M,t Semkin V. // J, Chromatogr. 1971. VoL 58. P. 195. 2L Laub R.Lf Pecsok /?.£,//Ibid- 1974, VoL 98. P. 51L

Wear S・,Novak 丄 〃 Ibid. Vol. 95. P. L

WicarS,r Novak J.//Ibid. P.13.

Sie 7\, Van Beersum W., Rijnders G*屮，A. // Separ, SciT 1966- Vol- L R 459.

К喩htHSE AnaL Chem. 1958. VoL 30. P. 2030.

Колесникова Л.П., Гуревич ГВ, Старобинец МЛ』Нефтехимия, 1964, Г 4. С. 340.

Ackman К/ 〃工 Chromatogr* Sci* 1962. VoL 10* P. 560.

Nonaka 4* 〃 Anal, lnstrumt 1973* Vol. IL R 23 6.

Locke D<. // J. Phys. Chem. 1965. VoL 69. P 37 68.

Greene SA.f Roy HEU Anal. Chum .1957* VoL 29. P 569*

Berezkin EG, // J, Chromatogr. 1974, VoL 98* P. 477.

Березкин BT.f Пахомов BJL『 Сакодынский К.И. //Твердые носите- ли в газовой хроматографии, М” Химия. 1975. 200 с

B/以 G. Etude de la chromatographie en phase gazense dans la pression €lev6. Diss. Docc, Sci* (PhysJ. Paris, 1972* 117 p*

4. Janak Л// Chem Listy. 1953. VoL 47. P. 837,1348.

Сакодынский K.H” Волков СЛ. // Препаративная газовая хроматография, М*, Химия, 1972. С* 44.

Karmen 4, McCaffrey J+f Bowman RL 〃 Nature^ 1962. VoL 193. P* 575,815.

Езрец BA.t Вигдергауз Л/.С 〃 Успехи газовой хроматографии. Ка・ занв, 1973* Вып. 3. С. 73*

Вигдергауз МС Н Тех докл. VI Всесоюз. науч.-техн+ конф. ^Состояние и перспективы развития газовой хроматографии". Баку; М” 1973. С &

Езрец В.А., Вигдергауз МС // *урн. аналнт* химии. 1976* Т* 31. С 2013.

40* Dumazert Ст Chiglione С+ // Bull* Soc. chin France. 1959. P* 615*

4L Porter RS.t Johnson J,F. 11 Nature. 1959. VoL 183. R 391*

Ревельский ИЛ., Бородулина ЛЯ„ Совакова ТМ // Нефтехимия* 1966. Т. 6 С 319.

+ Smith FG” Wagaman KL. 〃工 Chromatogr* Sci* 197L VoL 9* P* 24L

44* Tsuda 『,Tokoro N.t Ishii D, //J. Chromatogr* 1970. VoL 4 6* P* 241.

Tsuda Г, Ishii D. // Ibid. 1972* VoL 87. P. 554.

Tsuda 工，Ishii D. // Bunseki Kagaku. 1973* VoL 22.E 528*

Tsuda 工，Ito K.t Ishii D, // Ibid. P J554

48* Tsuda T.t Yunagih奸a H.t Ishii D 〃工 Chromatogn 1974, YoL 10L P* 95.

Tsuda Г Js K/shii D. 〃 Bunseki K^gaku. 1974. Vol 23. P 7.

6 Ilkova EL, Mistryukov £4 〃 J* Chromatogr. 1971* VoL 54. P. 422*

5L Berezkin V,G.r Shkolina L.A. // Ibid* 1976. VoL 119. P* 33*

Руденко E.A.t Байдаровцева ЛЛА+, Кузовкин B*M*, Кучеров В+Ф. // Тез, докл. IV Всесоюз, науч」техн* конф* ^Состояние и перспективы развития газовой хроматографии". Баку; М*, 1973/С. 7.

Rudenko ВХ” Baydarovtseva МА,Т Kuzovkin УА, Kucherov KF 〃 J* ChTomatogr, 1975. VoL 104, P. 27L

Березкин В.Г., Руденко Б.А.Г Попова Т.П. и др* А, с. 542139 СССР. Заявл. 1976; Опубл* 1977Ф Бюл. № 1*

Березкин ВГ* Руденко БА., Попова Т.П* и др- А. с. 532813 СССР- Заявл. 1976; Опубл, 1976, Бюл. № 39.

Berezkin 匕G, Rudenko BA., Zabokritsky MR et al, // J* Chromatogr. 1977t Vol. 130. P. 318.

* Кучеров В.Ф., РуЗекк^ Б.А., Байдаровцева М.Н” Забокриц- кий М+П. // Изв. АН СССР. Сер. хим. 1976.亜 10. С 2408.

Fujinaga Т., Kuwamoto 7\ Murai S 〃 Mem* Fac. Sci. Kyoto Univ* Ser, Phys*，Astrophys^ Geophys, and Chem* 1974. VoL 34. P* 301*

Fujinaga T., Kuwamoto 7\ Murai S・，Sugiura K. // Ibid. P+ 309*

60* Fujinaga T.r Kuwamoto 7\ Murai £ et at // Ibid. P. 32 L

6L Fujinaga 7\ Kuwamoto T+J Murai S.t Yamada Г // Ibid. P. 327.

Dumazert C, Chiglione U 〃 Bull. Soc. chin France .I960. P, 1770.

Масада Й.г Хасимото Й. Пат* 18087* Япония. Заявл. 1960.

64t Апоп // Chem. Eng. News. 1962. VoL 40. P. 50.

65* Nonaka A. // AnaL Chem. 1973, VoL 45. P* 483.

Nonaka A. 〃 Jap. AnaL 1967, VoL 16+ R 1166,

Nonaka 4. // AnaL Chem* 1972. VoL 44. P* 2 71.

Nonaka A+ // Ibid, 1976. Vol. 48. P. 383.

69* FyOexKG БЛ.Г Байдаровцева MA.t Кучеров В+Ф, // Изв* АН СССР Сер. хим. 1972, № 1L С* 2634,

70* Baydarovtseva MA.t Rudenko 丛4r Kucherov ME, Kuleshova MJ. // J. Chromatogr. 1975, VoL 104. P. 277.

Руденко EA, Байдаровцева МЛ„ Кучеров В、Ф. // Язв* АН СССР. Сер* хим. 1973. № 8. С 1773.

7Z Вайдар白8цева М4, Руденко £4, Кулешова М", Кучеров В.Ф. // Химия природ, соединений. 1975, № 6. С. 739*

Руденко Б.А., Байдаровцева M,A.t Кулешова М+И*. Кучеров В*⑦.〃 Тез. докл. Всесоюз. совещ. по хим. и инструмент, методам анализа природ* и сто% вод, Mj ГЕОХИ АН СССР, 1973,

Сазонов MJL* Жуховицкий А.А.Т Ракита Н.И.Г Наумова 8В // Газовая хроматография н ее применение в геохимических исследованиях. М 二 ВНИГНИ, 1973. С J L

Рахманкулов Ш.М.Т Вигдергауз КС // Изв. АН СССР, Сер+ хим+ 1975. №3. С 587.

Рахманкулов Ш.М. // Там же. № 10. С, 2309.

Маръяхин P.X.t Батыршина В.С. // Там же. 1976. № 3* С* 653.

Pearce B.t Tooke 尸.В., Thomas W.L. Пат* 1350580. Великобритания. За・ явл. 1105,71; Опубл. 18.04.74.

Кузовкин 8.4, Руденко Е.4, Кучеров В,Ф. // Изв. АН СССР. Сер. хим. 1973. № 8, С 1910.

80* Кучеров В。- Руденко 54, Байдаровцева М.4, Кузов- кин В.А* Н Тез. докл. Всесоюз. совещ. по состоянию и перспективам использования газовой хроматографии в нефтехимии, Москва, январь 1973+ М「НТО приборостроения нм. С.И. Вавилова, 1973. С 4L

Рубрик。БЛ.Г Кузовкин ВЛ.Т Пауков В.Н「Кучеров В,Ф+ // Изв. АН СССР. Сер. кнм. 197L № 工 С. 1384.

Мустафаева М.Т., Смит ВК+, Семеновский А.В. и др. // Там же+ 1973. №4. С 884.

Кузовкин ВА„ Руденко ЕХ., Кучерое В+Ф. //Там же. № 10. С 2354.

Буланова Т.内，Лапибус AJI.t Сергеева И,С., Эйдус Я.Т+ // Там же, 197L№g. С 1910.

Марьяхин Р.Х., Вигдергауг Л/, С // Тех докл. VI Всесок>з+ науч」 техн. конф. **Состояние и перспективы развития газовой хромато- графйи*\ Баку; М.，1973+ С 106+

8 6. Klesment /. // J. Chromatogr, 1973. VoL 87. Р. 401.

SakodynskiК” Kovanko V., Rozhenko 人 e【aL// 10th Intern, symp, on chromatography: Summaries of the contributions. Barselona, 1974. P* 73*

Султанович Ю.А., Кованько ЮЛ,, Волков СА+, Иващенко В*А』 Тез* докл. конф, по физ.-хим. н препаратив. применению хроматографии. Рига: Зинатне, 1976+ С. 85.

Асланова Л,Н„ Кованько ЮЛ., Султанович Ю.А.Г Клопотое- ский Е+Э, // Там же* С 88.

Султанович ЮЛ., Волков СК” Сакодынский К.И., Кованъ- ко 勿.4 и др. // Там же. С 89.

Леонтьева СЛ.^Лулова Н.И” Квасова ВА. к др. // Там же, С 93.

Ко&анъко Ю,А. //Там же. С. 18.

93+ Ногаре СП* Джувет PC // Газожидкостная хроматография. Л,: Недра, 1966. CJ10, 29工

Chen №Н” Othmer D.F. // J+ Chem. Eng* Data. 1962. VoL 7+ P. 37.

Hirschfelder 上。，Curtiss C.F.r Bird 凡B. 〃 Molecular theory of gases and liquids. №Y.: Wiley, 1967* Chap. 8.

Stewart G乩 Seager S.L.f Giddings ЛС. // AnaL Chern. 1959. VoL 3L PJ738.

Giddings J.C.. Seager S*L, Stocky L.R.f Stewart G.^//Ibid. 1960, Vot 32. P. 867.

Golay MJ£. // Gas chromatography: Proc* of the 2nd symp+ in Amsterdam, 1958 / Ed. D.H. De客ty. L+； Butterworths, 195g. P 36* Рус. ттер. в кн+: Газо* вая хроматография. М・：Изд*во иностр, лит^ 196L С+ 39,

Березкин В.Г,, Кязимов Э.Л., Агаева М//. // Азерб. хим. жури. 1973.№ LC69.

Березкин ВГ, Руденко £4, Кязимое 3.4 и др+ // Изв. АН СССР. Сер. хим. 1975. № 10. С 2352.

Руденко £4, Байдаровцева ЛЛ4〃*ур* аналит. химии. 1976+ Т. 3L № 12. С 2430.

Вайдаровцева К4, Руденко Б.А. //Там же+ CJ739*

Smits А. // Verh. Коп. nederL akad. wetensch. 1903. Vol. 12+ E 335.

Villard МГ JU，Phys. 1894. VoL 3. P. 44L

Diepen GA.M.f Scheffer EEC. 〃 J* Amer. Chem. Soc* 1948+ VoL 70. R 4081,408 5.

Карапетъянц MX、Химическая термодинамика* M「Госхимиздат, 1953.

Olander A.f Uander 从 〃 Acta chim. scand, 1950. VoL 4. P, 1437.

Cashaw JL, Segura /?., Zlatkis 4 // L Chromatogr. Sci. 1970. VoL 8. PJ363.

Гильдебранд 「 Растворимость неэлектролитов. M.: ГОНТИ, 1938.

F0go J., Sidney W,f Benson 工，Copeland C // J. Chern. Phys. 1954. VoL 22. P. 212.

HL Стырикович M+4 // Термодинамика и строение растворов. М.: Изд-во АН СССР, 195^ С 158.

Giddings JC_ Myers M.M, McLaren L” Keller PC 〃 Science. 1968. VoL 162.N3849. P. 67.

Giddings JC, Myers MN., King LW. // J+ Chromatogr. 1968* Vol, 7* R 276,

&Z S.Trf Rijnders G^A. I I AnaL chim. acta. 1968. VoL 38. P* 3L

Klesper E, Corwin 4/Л Turner DA 〃 J. Org* Chem. 1962. VoL 2工 R 700.

Karayannis МЛ/“ Corwin A.H., Baker ЕИЛ et aL // Anal- Chem. 1968, VoL 40. P. 1736,

Karayannis NM, Corwin A、H* H Anal Biochem. 1968. VoL 26. P* 34.

118* Karayannis NM、Corwin A.H. //J* Chromatogr. 1970* VoL 47. P. 247.

Karayannis ^,^^^ Corwin A .H. // J, Chromatogr. Sci* 1970. VoL 8* P. 251.

Sie ST., Van Beersum Ж+ Rijnders G.W.A. // Separ* Sci. 1966* VoL L R 459.

12L Sie Sf, Renders GWA " Ibid.1967 Vol 2. P 699.

Sie ST, Rijnders G.W』."Ibid. P 729.

&Z ST, Rijnders G.W.A. // Ibid. R 755.

4* Sie £7\ BUumer J*P.A, Rijnders G.WA. I I Proc, of the 7 th Intent.嘗 ymp. on gas chromatography and its exploatation, Copenhagen, 25-28 June, 1968* L: Inst. Petrok, 1968. P* 235*

JentofiR£, Gouw ТЛ.//1 Polym- Sci. В.1969. VoL 7 R 82L

Jentofi RE, Gouw Т.Н. // J* Chromatogr. Sci. 1970, VoL 8* P. 128.

Jentofi RE” Gouw ТТЛ 〃 Polym+ Lett* 1969. VoL 7t P. 81L

Jentoft RE, Gouw Т.Н. // AnaL Chem*1966+ VoL 2 8. P. 949+

129* Van Lenten 尸工，Conawav JE, Rogers LB 〃 Supai Sei. 1977. Vol. 12.

R'

Bartmann D* 〃 Ben Bunsenges. phys. Chem. 1972. Bd. 76. S. 3 3 6*

13L Barfmazin D+, Schneider GM. // Ibid+ 1973. Bd. 7 7. S* 220.

132 Giddings J.CJ/AnaL Chem. 1964, VoL 36. R 74L

\3 3. Mayers M.N., Giddings J.Cdl^A. 1965. VoL 37. P 1453.

Mayers M№, Giddings JC 〃 Ibid J 966. Vol, 3 8, P. 294.

Mayers MN” Giddings J.C. // Separ. Sci. 1966. VoL L R 761*

Giddings J.C.f Manwaring WA. t Mayers M.N, // Science. 1966. Vol J 54* PJ46.

137+ Nieman JA.f Rogers LB 〃 Separ. Sci, 1976* VoL 10. R 517.

13Z. McLaren L.t Myers M.N.f Giddings J.CJI Sci^c^. 1968. Vol 159. P. 197.

Van Wasen U” Schneider СЛ/.//Chromatographia, 1975. VoL 8. P, 274.

Giddings JC* Dynamics of chromatography. N.Y.: Marcel Dekker, 1965, 14L Bombaugh KJ.t King RN” Coh 电株 A J. //1 Chromatogr, 1969. VoL 43.

P 332.

142* Majors KE // 工 Chromatogr. Set 1970* VoL 8. P. 3 3 8*

Kirkland JJJ/lbi^ 1969. Vol. 7, P. 36L

Horvath & Lipsky £P 〃 Ibid* R 109.

5* Karger BL, Conroe K., Engelgardi H+ // Ibid* 1970. VoL & P. 242.

146+ Kirkland JL De Stefano J J, // Ibid. P. 309.

Perry S.G., Amos R., Brewer P.7. Practical liquid chromatography, N.Y,: Plenum press, 1972. Рус* пер.: Практическое руководство по жидко- стной хроматографии. М「Мир, 1974+

Modern practice of liquid chromatography // Ed. JJ* Kirkland, N.Y.: Wiley, 197L Рус* пер.: Современное состояние жидкостной хроматографии* Мл Мир, 1974.

Основы жидкостной хроматографии 〃 Ред. А+А. Жуховицкий. М,: Мир, 1973+ d 9L

0+ Guerin К, Foulaiier 凡〃 Bull. Soc diim. France* 1973. N 5* P. 905.

15L Руденко B.A.t Байдаровцева M4* Кучеров В.Ф. //Завод. лаб+ 1974, Т. 40. С 931.

Боярина "3, Лягин ЮМ., Руденко Е4, Чижков В.П. // Там же. 1975. T.4LC 84.

3. Jentoft RE, Gouw Т.Н. // Anal, Chern. 1972. VoL 44* P. 68L

Schmauch LJ“ Dinerstein RA // Preprints Div* Petrol. Chem* Soc. 1959. VoL 4.PJ19.

15 5, Ackman RJ. // Chromatogr, ScL 1972. VoL 10. P. 560.

Кучеров В,Ф„ Руденко 5.工” Байдаровце&а М,А. А* с. 493964 СССР. Заявл. 1974; Опубл* 1975, Бюл. №44*

7, Руденко БА.} Байдаровцева М.4, Кучеров В@+ Пат* 3954413 США. Заявл. 1976*

8* Руденко Б.А., Березкин B.F” Попова Т.П. и др. А* с. 548807 СССР. Заявл* 1975; Опубл* 1977, Еюл. № &

Березкин ВГ, Руденко БЛ„ Попова Т.П, и др. А* с. 548805 СССР. Заявл. 1975; Опубл. 1977, Бюл* № 8.

Березкин ВТ., Школина ЛЛ. А. с. 494674 СССР. Заявл. 1973; Опубл. 1975, Б юл* № 45.

16L Piling段 О, Pascalau М. Н 工 Chromatogn 1962* VoL 8, Е 410*

Piringer О, Taiaru Е, Pascalau Af // J* Gas Chromatogr, 1964* Vol> 2, R 104.

Coulson DM. 〃 Ibid 1965. Vol 3. PJ34.

Coulson DM. // Ibid. 1966* VoL 4+ P 285.

Magg R J. 〃 Chromatographia. 1968. VoL L P. 43*

James 4工,Ravenhill J.R.t Scott RPW. H Gas chromatography, 1964: Proc* of 5th Symp. on gas chromatography in Brighton, Sept. £10,1964. L.: Inst Petrol, 1965* P* 197

Schomburg G. // Ben Bunsenges* phys. Chem. 1973* Bd. 77. S. 219*

168* Sternberg ZC.t Carson LJH. 〃 J* Chromatogr. 1959. VoL 2. R 53.

169* Horvath C.G., Lipsky SR 〃 Nature. 1966. VoL 211. R 748.

Султанович Ю.Л., Волков CA, Сакодынский К.И. // *урн. физ. хямии. 1977. Т. 5L С 271L

Федченко Г.С, Шумкова ВС, Прокопенко HA.t Ковров Г.Л // Методы повышения эффективности хроматографических колонок М「НИИТЭхим, 1977. С. 3L

Supercritical fluid chromatography / Ed* RS Smith. L.: RSC, 1988. Pye. nep」Сверхкритическая флюидная хроматография* Мл Мнр, 1991.

Глава 2

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

ПРИНЦИПЫ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

В предшествующих разделах были подробно рассмотрены высокоэффективные хроматографические процессы с газообразной, парообразной и сверхкритической флюидной подвижной фазой. В большинстве хроматографических методов в качестве подвижной фазы используются жидкости. Применение жидкостей имеет ряд преимуществ. Жидкие подвижные фазы обладают высокой растворяющей способностью в широком диапазоне температур между температурой их затвердевания и точкой кипения, кроме того они способны растворять и переносить через хроматографическую колонку при комнатной температуре такие вещества, которые не могут быть объектами газохроматографического разделения вследствие их высокой молекулярной массы, очень малой упругости пара или недостаточной устойчивости при повышенных температурах.

Первые эксперименты в области жидкостной хроматографии были проведены первооткрывателем хроматографического метода М*С* Цветом уже в 1903 rt [1], В этих опытах были использованы в качестве подвижных фаз различные органические растворители, а неподвижными фазами служили разнообразные органические и неорганические адсорбенты, в том числе мел, оксид магния, крахмал, инулин и др* Были показаны возможности разделения в этих системах таких веществ, как окрашенные в разные цвета соединения, входящие в состав хлоро пластов растений, за счет различий в энергиях их адсорбционного взаимодействия с применяемыми адсорбентами. Это и определило наименование использованного Цветом варианта хроматографии как жидкост-

ной адсорбционной хроматографии* До 1950 г. были разработаны и другие варианты хроматографического метода, использующие жидкие подвижные фазы. Среди них следует отметить распределительную хроматографию, в которой неподвижной фазой служит жидкость, несмешивающаяся с подвижной жидкой фазой [2]； ионообменную хроматографию, в которой стационарной фазой является твердый адсорбент, способный к обмену ионами с веществами, подлежащими разделению [3]; эксклюзионную или ситовую хроматографию, в которой разделение осуществляется за счет различий в скоростях диффузии молекул разделяемых веществ в микропоры твердого адсорбента [4] и аффинную хроматографию, использующую специфические взаимодействия фермента и соответствующего субстрата или антигена с антителом [5].

В течение довольно долгого времени жидкостную хроматографию использовали пре имуще ствен но для препар ати в но го разделения разнообразных веществ. При этом применяли колонки диаметром 10-50 мм и длиной 5-100 см* Используемые адсорбенты имели частицы неправильной формы и достаточно широкие диапазоны размеров от 20-35 до 200-300 мкм [6-8]. Столь значительные различия в размерах частиц неподвижной фазы, а также наличие в адсорбентах существенной примеси очень мелких пылевидных фракций определяли достаточно высокое гидравлическое сопротивление применявшихся колонок. Как правило, подачу подвижной фазы осуществляли под гидравлическим давлением самого применяемого растворителя, обычно не превышавшим 0,5-1 м водяного столба (0,05-1,0 кг/см2), В таких условиях скорость подвижной фазы была весьма незначительной, так что длительность хроматографического опыта измерялась многими часами, а часто даже днями и неделями. Эффективность таких процессов также была весьма умеренной, что не позволяло разделять близкие по своим свойствам компоненты или многокомпонентные смеси веществ. Тем не менее, жидкостная хроматография даже в этих несов ершенных формах во многих случаях превосходила по своей разделяющей способности другие известные в то время методы разделения веществ, такие как дистилляция, ректификация, экстракция, дробная кристаллизация и др*

Период времени с 1950 до 1965 г* после открытия газовой хроматографии [9-12] характеризовался интенсивными исследованиями закономерностей хроматографических процессов и поисками путей достижения их максимально возможной разделяющей способности [13-16]. Эти исследования были направлены прежде всего на повышение эффективности процессов газовой хроматографии, и найденные в этих исследованиях закономерности были вкратце рассмотрены в гл* 2 I-го тома. С самого начала

было очевидно, что выявленные в этих исследованиях закономерности и условия достижения высокой разделяющей способности должны быть в равной мере применимы не только к газовой хроматографии, но и процессам жидкостной хроматографии при надлежащем учете различий в свойствах применяемых подвижных фаз* Эти различия в первую очередь связаны с различиями б вязкости подвижных фаз н, как следствие, с различиями в их коэффициентах диффузии- Вязкость газов составляет Kh^-lO-5 сПз. В то же время, вязкость жидкостей в большинстве случаев нахо- дится в пределах 0,2-2 сПз, а для таких веществ как этиленгликоль достигает 16,5 сПз* Таким образом, вязкость жидких подвижных фаз превосходит вязкость газов в 100-1000 раз. С другой стороны, жидкости отличаются от газообразных сред своей исключительно малой сжимаемостью. Поэтому жидкости практически не изменяют своего объема при повышении давления по крайней мере до 100 кг/см2, поэтому распределение давлений в колонке, заполненной мелкодисперсным адсорбентом, подчиняется линейному закону. Вследствие малой сжимаемости жидкости объем элюента, покидающего хроматографическую колонку равен объему подвижной жидкой фазы, поступающего в нее.

Возвращаясь к соотношениям, рассмотренным в гл. 2 Ьго тома, можно отметить, что в соответствии с уравнением Ван-Деем- тер虱 минимальное значение высоты, эквивалентной теоретической тарелке* может быть выражено следующим соотношением:

Н^=А + 24вС,(2-1)

где величина А = 2統「 не зависит от свойств подвижной фазы. В соответствии с уравнениями (1-63) и (1-64), член В равен сумме:

2

В= Hdm +Нх = -HeQe(2-2)

Коэффициент диффузии D用 в газообразной подвижной фазе в газовой хроматографии в 100-1000 раз превышает коэффициент диффузии в жидкой стационарной фазе D^ Таким образом, второй член в скобках может считаться пренебрежимо малым даже, если принять во внимание величину отношения распределения 尤 в большинстве случаев не превышающую 10* Множители 了炉 и 7n близки друг к другу по порядку величины и равны примерно 0,4—0,6- Коэффициенты диффузии разделяемых веществ в жидкостной хроматографии как б подвижной, так и в неподвижной фазах соответствуют по порядку величины коэффициентам диффузий в жидкостях. Таким образом, эти величины близки

друг к другу по порядку величины, примерно в 1000 раз меньшей, чем коэффициенты диффузии в газах* Таким образом, весь член В в жидкостной хроматографии оказывается примерно в 1000 меньшим, чем в газовой хроматографии и примерно пропорциональным коэффициенту диффузии в жидкости:

B~D夕 (2-3)

В знаменателях выражений для вкладов в ВЭТТ Н„, Hsm и Н„ представлены коэффициенты диффузии разделяемых веществ в подвижной и в стационарной фазах. В то же время эти выражения пропорциональны скорости подвижной фазы в колонке. Предполагая, что эти коэффициенты в жидкостной хроматогра^ фии близки по величине, можно считать, что в первом приближении множитель С в уравнении Ван-Деемтера обратно пропорционален коэффициенту диффузии в жидкости:

С~и% (2-4)

где коэффициенты диффузии снова примерно в 1000 раз меньше, чем в газовой хроматографииt а множитель С оказывается в 1000 раз большим. Отсюда легко заключить, что величина 2(ВС)т в выражении (2^1) оказывается примерно одинаковой и в газовой и жидкостной хроматографии. Однако величина оптимальной скорости подвижной фазы

и^{В!С)^ (2-5)

в жидкостной хроматографии будет примерно в 1000 раз меньшей, чем в газовой хромато^афии, что не удивительно, учитывая более медленный характер всех процессов диффузии в жидкой фазе. Более того, вклады в ВЭТТ, связанные с неравновесно- стью процессов в подвижной и в неподвижной фазах и отражаемые в величине множителя С в уравнении Ван-Деемтера, в жидкостной хроматографии должны быть в 1000 раз большими* Это означает, что при одном и том же размере частиц сорбента в колонке кривая Ван-Деемтера для жидкостной хроматографии будет проходить через точку минимума с той же ординатой Н^^ как и в газовой хроматографии. Однако в этом случае оптимальная скорость подвижной фазы wopl будет значительно меньшей, а наклон восходящей ветви кривой будет значительно более крутым.

В то же время, фактически достижимая величина ВЭТТ возрастает с увеличением скорости подвижной фазы в жидкостной хроматографии заметно быстрее, чем в газовой хроматографии вследствие относительно более высокого значения параметра С

в уравнении Ван-Деемтера. Это определяет необходимость работать в жидкостной хроматографии при скоростях подвижной фазы, как можно более близких к оптимальным или очень немного их превышающих. В этом случае минимальное значение ВЭТТ в жидкостной хроматографии будет определяться, в основном, размерами частиц адсорбента dp и качеством заполнения колонки, отражающемся в величине множителя I

Понимание этих простых соотношений и их распространение на процессы жидкостной хроматографии произошло в 1962-1965 гт\ благодаря усилиям большой группы исследователей, многие из которых уже имели в то время солидный опыт работы в газовой хроматографии [17-24].

Обратив внимание вновь на выражения для вкладов в ВЭТТ в уравнении Ван^Деемтера Н„т 儿即 Яш [уравнения (1-65), (1-69) и (Ь70), 1-й том] для наполненных колонок или НГЛ [уравнение (1-68), 1-й том] для капиллярных колонок, легко понять, что эти вклады прямо пропорциональн ы первой или второй степени геометрического параметра, отражающего влияние пути диффузии в подвижной и неподвижной фазах хроматографической системы. Вклады 乩仃 и Н『м пропорциональны квадрату величины частицы адсорбента для наполненных колонок [уравнения (1-69) и (1-70), 1-й том] или квадрату диаметра капиллярной колонки [уравнение (1-68), I-й том]. Влияние сопротивления массообмену в неподвижной фазе [уравнение (1-65), I-й том] пр опор ционально второй степени пути диффузии в этой фазе, В качестве этой величины наиболее часто применяют толщину мономолекулярной пленки на поверхности применяемого адсорбента либо некоторую часть размера его зерен (обычно весьма небольшую). Это касается адсорбционной хроматографии, которая является наиболее часто применяемым вариантом жидкостной хроматографии* В обоих случаях величина этих вкладов оказывается в не* сколько десятков или сотен раз меньшей, чем в газовой хромато- графин [18-24]+ Отсюда становится ясным, что для снижения влияния неравновесных процессов в жидкостной хроматографии необходимо значительно уменьшить размеры зерна адсорбентов, что приведет к соответствующему уменьшению пути диффузии молекул разделяемых веществ из потока подвижной фазы к поверхности адсорбента и обратно.

Первые шаги в направлении значительного улучшения кинетических характеристик на всех стадиях жидкостно-хроматографического процесса были осуществлены именно на основе вышеизложенных принципов* Сначала для этой цели были использованы адсорбенты, в каждом зерне которых твердое непористое ядро было покрыто тонким адсорбирующим слоем толщиной

1-2 мкм. Такими пелликул яр н ыми или поверхностно-пор и сты ми адсорбентами были, например, стеклянные шарики диаметром 50-100 мкм со сформированным на поверхности пористым адсорбирующим слоем толщиной 1-2 мкм* Эти слои могут быть сформированы путем прилипания к поверхности непористых стеклянных сфер (очень малых адсорбирующих микрочастиц) размером 1-2 мкм или травлением поверхности стекла подходящими кислыми или щелочными агентами [25-29].

Ясно, что значение геометрического фактора, определяющего вклад сопротивления массопередаче в ВЭТТ будет тем меньше, чем меньше фактическая величина зерна применяемого адсорбента. Можно ожидать, что эта величина будет близка к толщине адсорбционкого слоя на поверхности частицы пелликуляр- ного адсорбента [30, 31]. Однако таким адсорбентам присущи определенные недостатки сугубо хроматографического характера, хотя они позволяют существенно улучшить кинетические характеристики процесса, В частности, эти адсорбенты обладают очень малой адсорбционной емкостью, что представляется вполне естественным, т.к. в колонке активно работает всего лишь 2-10% от полного объема слоя адсорбента. Поэтому разделяются лишь очень малые пробы во избежание перегрузки и значительной потери эффективности колонки* Это обстоятельство предъявляет повышенные требования к чувствительности детектирующей системы и обусловливает необходимость обеспечения малых объемов устройств для ввода проб, соединительных коммуникаций и других элементов хроматографической системы [32-35]. По этой причине более распространенным в жидкостной хроматографии стало применение адсорбентов, в которых активно работающий адсорбционный материал охватывает весь объем частиц, но сами частицы имеют малые размеры (10, 5 или даже 3 мкм) [36-38]. Помимо малых размеров частиц, эти адсорбенты обладают еще двумя специфическими особенностями: дисперсия размеров частиц невелика, а сами частицы имеют строго сферическую форму [38—41]. Более того, на основании результатов многочисленных экспериментов была разработана особая техника заполнения колонок, обеспечивающая строго равномерную структуру слоя адсорбента без каких-либо пустот, областей пониженной плотности и других н ер авно мер костей [42-47]*

Все эти меры в целом привели к тому, что члены t^ и %, характеризующие сопротивление массопередаче в подвижной и стационарной фазах оказались в ВЭЖХ близкими между собой и примерно в 20-30 раз меньшими, чем в газовой хроматографии. Так как эти величины входят в выражения для соответствующих вкладов в ВЭТТ во второй степени, то соответствующие вклады

оказываются в5 х 10^-Ю3 раз меньше, чем в разовой хроматографии. Это в значительной степени компенсирует увеличение соответствующих членов уравнения Ван-Деемтера, связанное с меньшей величиной коэффициентов диффузии в жидкой фазе по сравнению с газовой фазой.

Многочисленными исследованиями [48, 49] установлено, что различные процессы, вызывающие расширение хроматографических зон в современной жидкостной хроматографии, вносят вклады в В9ТТ, имеющие следующий порядок величины:

Вихревая диффузия, 2%10-3см;

Молекулярная диффузия

в подвижной фазе1 g см;

Молекулярная диффузия

в неподвижной фазе1 * см;

Сопротивление массопередаче 1(Н см.

На этих величин следует, что наибольший вклад в расширение полосы в жидкостной хроматографии на слоях адсорбентов с частицами величиной 5 мкм вносит вихревая диффузия и сопротивление массопередаче в подвижной и неподвижной фазах, причем последний фактор оказывается наименее существенным из трех.

В соответствии с уравнением (2-1), величина ВЭТТ вблизи оптимальной скорости подвижной фазы составляет:

Яор1 = А + 2(ВС)】т = 1(Н + 2(1(Н х 1(Н)^ =

=10-3 + 2 х 10-5 三 10-3 см.(2-6)

Таким образом, величина ВЭТТ определяется в первую очередь размерами частиц применяемого адсорбента.

Проведенный анализ носит упрощенный характер* Однако он достаточно ясно показывает, что наибольшие вклады в процесс расширения хроматографической полосы в жидкостной хроматографии вносят процессы вихревой и молекулярной диффузии. Эти вклады пропорциональны первой или второй степени диаметра частиц применяемого адсорбента. Именно эти зависимости определяют необходимость использовать в жидкостной хроматографии значительно более мелкозернистые адсорбенты, чем в газовой хроматографии. В настоящее время адсорбенты, используемые в современных вариантах жидкостной хроматографии, имеют размеры частиц, равные 10, 5 и даже 3 мкм. Это позволяет достигать эффективноетей разделения до 3-5 тыс+ т*т* при длине колонок 3-5 см (ВЭТТ около 10 мкм) или 105 т.т/м*

АДСОРБЦИОННАЯ ЖИДКОСТНАЯХРОМАТОГРАФИЯ

Разделение веществ методом адсорбционной жидкостной х р оматографии осуще ствл я ется в результате их взаимодействия с адсорбентами, такими как силикагель или оксид алюминия, имеющими на поверхности активные центры* Различие в способности к взаимодействию с адсорбционными центрами разных компонентов анализируемой пробы приводит к их разделению на отдельные зоны в процессе движения по колонке с подвижной фазой* Достигаемое разделение зон компонентов зависит от взаимодействия как с адсорбентом, так и растворителем*

В основе сорбции иа поверхности адсорбента, имеющего гидроксильные группы, лежит специфическое взаимодействие между полярной поверхностью адсорбента и полярными (или способных поляризоваться) группами или участками молекул* К таким взаимодействиям относят диполь-дипольное взаимодействие ме^ жду постоянными или индуцированными диполями, образование водородной связи вплоть до образования комплексов или комплексов с переносом заряда. Возможным и достаточно частым в практической работе является проявление хемосорбции, которая может привести к значительному повышению времени удерживания, резкому снижению эффективности, к разложению или к необратимой сорбции вещества.

Изотермы адсорбции веществ имеют линейную» выпуклую или вогнутую форму* При линейной изотерме пик вещества симметричен и время удерживания не зависит от размера пробы. Чаще всего изотермы адсорбции веществ нелинейны и имеют выпуклую форму, что приводит к некоторой асимметрии пика с образованием размытого заднего фронта, ^хвоста"*

Чаще в ВЭЖХ применяются адсорбенты из силикагеля с разным диаметром зерна и различными объемом пор и поверхностью. Значительно реже используются оксид алюминия и очень редко - другие адсорбенты, широко применяющиеся в классической колоночной и тонкослойной хроматографии. Основная причина этого 一 недостаточная механическая прочность большинства адсорбентов, не позволяющая заполнять колонки и использовать их при повышенных давлениях, характерных для ВЭЖХ.

Полярные группы, обусл о влив ающие адсорбцию и находящиеся на поверхности силикагеля и оксида алюминия, по свойствам близки. Поэтому обычно порядок элюирования смесей веществ и элюотропный ряд растворителей для них одинаковы* Од* нако различие химического строения силикагеля и оксида алю-

мннмк может приводить к появлению различий в селективности - тогда предпочтение отдают тому или другому адсорбенту, более подходящему для данной конкретной задачи. Например, оксид алюминия обеспечивает большую избирательность при разделении полици к л ических ароматических углеводородов*

Предпочтение, отдаваемое силикагелю по равнению с оксидом алюминия, объясняется более широким выбором силикагелей по пористости, поверхности и диаметру пор, а также значительно более высокой каталитической активностью оксида алюминия, нередко приводящей к искажению результатов анализа вследствие разложения компонентов пробы либо из-за их необратимой хемосорбции.

Адсорбционная хроматограф и я на силикагеле+ Адсорбционную хроматографию с использованием в качестве наполнителя колонок силикагеля широко применяют в классическом вариант те жидкостной хроматографииt Адсорбционная активность силикагеля легко воспроизводится путем определенных операций гидроксилирования, сушки и активации. Большой опыт примене* ния силикагеля в тонкослойной хроматографии и колоночной хроматографии, естественно, стимулировал его широкое использование на ранних стадиях развития ВЭЖХ*

Было обнаружено, что при многократном использовании труд・ но поддерживать колонку с силикагелем в таких условиях рабо- ты, при которых времена удерживания и получаемое разделение оставались бы стабильными. Это связано с тем, что алканы, но пользуемые в качестве основных растворителей (н-гексан, н^геп^ тан, изооктая) обычно содержат в состоянии насыщения очень не^ большое количество воды (десятки частей на миллион или меньше). Силикагель в колонке, не имеющий на поверхности адсорбированной воды, является эффективным осушителем и отнимает воду от растворителя» меняя при этом свою активность как адсорбент. Хроматографические характеристики его при этом, естесг- веннс, также изменяются. Это продолжается до тех пор, пока не установится равновесие между количеством воды, поглощаемой и отдаваемой силикагелем. Если при смене растворителя новая партия его будет иметь иную степень насыщенности водой, чем пре- дьЕдущий растворитель, снова будет происходить процесс установ- ления нового динамического равновесия, и хроматографические характеристики снова изменятся. Аналогичный процесс может ид- ти и в обратном направлении, когда растворитель хорошо высу- шен, а силикагель содержит много ад со рби ро ванн ой воды.

Основная проблема состоит в том, чтобы иметь растворитель, например гексан, с постоянной влажностью, составляющей 50% от максимальной. Обычно этого добиваются, смешивая не*

посредственно перед использованием равные объемы гексана, находящегося в равновесии с водой, и абсолютно безводного. Если увлажнение и осушку проводят идентично и воспроизводимо, то влажность получается одна и та *е, силикагель работает в состоянии динамического равновесия, и хроматографические характеристики колонки сохраняются постоянными* Правда, процесс достижения равновесия занимает много времени, т.к. для установления первоначального равновесия требуется пропустить через колонку растворитель в количестве более 200 е€ объемов. Так же длительно протекает и уравновешивание с растворителем новой колонки, обычно заполняемой в присутствии полярных растворителей. Для ускорения процесса рекомендуется последовательная промывка колонки рядом растворителей, например, метанолом, метиленхлоридом и гексаном.

Существуют методы, которые позволяют получить воспро- изводимые хроматографические характеристики колонки с силикагелем* Один из них заключается в использовании безводного гексана, модифицированного для получения нужной селективности метиленхлоридом или ацетонитрилом. Так как их содержа- ние в гексане существенно выше, чем воды (при равной элюирующей силе), равновесие устанавливается существенно быстрее, и его легче поддерживать* Тем не менее, задача получения безводного гексана сохраняется*

В другом методе с использованием гексана при его модификации водой применяют так называемую систему контрол и руе мой влажности (СКВ). Метод основан на создании замкнутого цикла растворителя, который после детектора возвращается в систему через большую колонку с обогреваемой термостатом рубашкой. Большая колонка содержит силикагель или оксид алюминия (увлажненные) и служит для удерживания компонентов разделенных проб и поддержания требуемой влажности гексана. Увеличивая или понижая температуру в рубашке, можно изменять количество воды в цирк ул и рующем гексане и, следовательно, менять параметры удерживания аналитической колонки. Подробно устройство и работа системы СКВ описаны в литературе [50].

При анализе веществ, достаточно сильно взаимодействующих с силикагелем, например, фенолов или спиртов, алифатические углеводороды часто модифицируют спиртами, например изопропанолом* На рис, 29 представлена хроматограмма, демонстрирующая высокую селективность при разделении сложной смеси метилфенолов и фенола: разделены изомеры, трудно разделяемые методом газовой хроматографии и обладающие очень близкими свойствами, такие, как мета- и пара- крезолы и 2,4* и 2,5-ксиленолы.

Наибольшее влияние на удерживание фенолов оказывает, как видно из хроматограммы, экранирование гидроксильной группы даже такой малообъемной и слабо экранирующей группой, как метильная. За счет этого происходит четкое разделение на три группы: орто-,叩加и-замещеннне; орто-замещенные с неэкранированной гидроксильной группой и не имеющие орто- заместителей.

В общем виде можно сф ормул и ровать следующее положение: удерживание в адсорбционной хроматографии на силикагеле определяется химической природой функциональных групп или групп, способных к взаимодействию с центрами адсорбции на поверхности силикагеля, а также степенью пространственного затруднения при их сближении до наступления такого взаимодействия. В ряду функциональных групп эмпирический ряд увеличения удерживания выглядит следующим образом:

фтор - хлор - бром - иод - простой эфир - третичный амин - нитрил - нитрогруппа - сложный эфир - кетон - альдегид - первичный амин - амид - спирт - фенолкарбоновая кислота - сульфокислота*

Пример разделения аминов сложного строения приведен на рис. 30. лмрпнс-Изомеры удерживаются слабее» чем цис-изомеры, изомеры с аксиально расположенными группами - слабее, чем с расположенными экваториально. Если групповое разделение (ио типу и количеству функциональных групп) методом адсорбционной хроматографии на силикагеле провести легко, то разделение членов гомологического ряда внутри таких групп, как правило, достигается только для первых членов и быстро ухудшается с ростом числа метиленовых групп. Популярность силикагеля в качестве адсорбента для ВЭЖХ начала падать с появлением и ростом применения полярных сорбентов с привитыми на поверхности функциональными группами, такими, как аминные, нитрильные и диольные. Такие сорбенты более удобны в работе и позволяют легче подбирать селективность, меняя подвижную фазу. Тем не менее, есть качества силикагеля, которые обеспечивают ему достаточно надежное будущее в ВЭЖХ, Это прежде всего относительная дешевизна силикагеля, дающая ему большие преимущества при препаративных разделениях, особенно в том случае, когда масштаб их приближается к промышленному. Это хорошая механическая прочность, возможность в широких пределах регулировать размер и объем пор, возможность отмыть кислотой от ионов металлов переменной валентности, прокалить при внсо кой температуре и

Адсорбционная хроматография на оксиде алюминия. Оксид алюминия, так же как и силикагель, широко используется в ко-

ббРис. 29. Хроматограмма смеси фенола, крезолов и ксиленолов, полученная на колонке размером 250 х 4,6 мм с Зорбаксом Сил (6 мкм); подвижная фаза - смесь гексана, метиленхлорида и изопропанола (100 : 10 : 1 по объему), скорость подачи подвижной фазы - 1 мл/минт УФ-детектор (254 нм), величина пробы 10 мкл:/ - 2.4,б-тря мети лфе нол; 2 - 2 т6-ксиленол; 3 — 2^-ксиленол; 4 - 2Ф3-ксиле- нол; 5 - 2т4-ксиленол; 6 - о-крезол; 7 - 3Ф5-ксиленол; 8 — ЗД^ксиленол; 9 - л<-кре- зол; 10 - и-крезол; / / - фенолРис. 29. Хроматограмма смеси фенола, крезолов и ксиленолов, полученная на колонке размером 250 х 4,6 мм с Зорбаксом Сил (6 мкм); подвижная фаза - смесь гексана, метиленхлорида и изопропанола (100 : 10 : 1 по объему), скорость подачи подвижной фазы - 1 мл/минт УФ-детектор (254 нм), величина пробы 10 мкл:/ - 2.4,б-тря мети лфе нол; 2 - 2 т6-ксиленол; 3 — 2^-ксиленол; 4 - 2Ф3-ксиле- нол; 5 - 2т4-ксиленол; 6 - о-крезол; 7 - 3Ф5-ксиленол; 8 — ЗД^ксиленол; 9 - л<-кре- зол; 10 - и-крезол; / / - феноллоночной хроматографии низкого давления и тонкослойной хроматографии. Для ВЭЖХ его применение уменьшилось, и в настоящее время есть лишь единичные работы, связанные с этим адсорбентом. Это связано с тем, что разделения, которые проводят

б

б

Рис. 29. Хроматограмма смеси фенола, крезолов и ксиленолов, полученная на колонке размером 250 х 4,6 мм с Зорбаксом Сил (6 мкм); подвижная фаза - смесь гексана, метиленхлорида и изопропанола (100 : 10 : 1 по объему), скорость подачи подвижной фазы - 1 мл/минт УФ-детектор (254 нм), величина пробы 10 мкл:

/ - 2.4,б-тря мети лфе нол; 2 - 2 т6-ксиленол; 3 — 2^-ксиленол; 4 - 2Ф3-ксиле- нол; 5 - 2т4-ксиленол; 6 - о-крезол; 7 - 3Ф5-ксиленол; 8 — ЗД^ксиленол; 9 - л<-кре- зол; 10 - и-крезол; / / - фенол

Рис. 29. Хроматограмма смеси фенола, крезолов и ксиленолов, полученная на колонке размером 250 х 4,6 мм с Зорбаксом Сил (6 мкм); подвижная фаза - смесь гексана, метиленхлорида и изопропанола (100 : 10 : 1 по объему), скорость подачи подвижной фазы - 1 мл/минт УФ-детектор (254 нм), величина пробы 10 мкл:

/ - 2.4,б-тря мети лфе нол; 2 - 2 т6-ксиленол; 3 — 2^-ксиленол; 4 - 2Ф3-ксиле- нол; 5 - 2т4-ксиленол; 6 - о-крезол; 7 - 3Ф5-ксиленол; 8 — ЗД^ксиленол; 9 - л<-кре- зол; 10 - и-крезол; / / - фенол

на оксиде алюминия, легко могут быть перенесены на силикагель или полярные сорбенты с

Рис- 30. Хроматограмма смеси аминных стабилизаторов полимеров, полученная на колонке размером 250 х 4,1 мм с Силасорбом-600 (5 мкм); подвижная фаза - смесь ге- ксан-метиленхлорид-изопропа- мол-диэтиламин (100: 10: 1 : 0,01 по объему), расход 1 мл/минФ УФ-детектор (254 нм)* проба 2 мкл:

/ - фенил-Р-нафтиламин; 2 - Mcg нил-Л/'-изопропил-л-фенилекдиамин; 3 - ^1,3- диметил бути л-W *фени л-п-фе- нилендиамни; 4 - ^Л'-бис-С 1,4-диметил- пентил*м-фенилендиамин)

привитыми неподвижными фазами на его основе. Химическая однородность поверхности силикагеля существенно выше, а ка- талитическая активность значительно ниже. Оксид алюминия гораздо чаще вызывает разложение компонентов пробы или их необратимую адсорбцию. При одинаковой цене за 1 г адсорбента оксида алюминия требуется в два раза больше по массе, чем силикагеля, что оказывается вдвое дороже.

Можно считать, что в настоящее время использование оксида алюминия в качестве адсорбента в какой-то мере стимулируется тем, что многие исследователи уже имеют этот материал и используют его, когда пытаются перейти от тонкослойной хроматографии к разделениям с помощью ВЭЖХ. Используют его и в тех случаях, когда воспроизводят опубликованные ранее работы.

Однако следует признать, что, за исключением некоторых особых случаев, когда сорбенты на основе оксида алюминия показали повышенную селективность по сравнению с силикагелем (например, в разделении полициклических ароматических угле- водородов и некоторых аминов), применение силикагеля более целесообразно*

Недостатки адсорбционной хроматографии^ ограничивающие ее использование. Популярность адсорбционной хроматографии по мере развития метода ВЭЖХ постепенно падала. Этот вариант метода все больше заменяли на другие варианты, такие, как обращенно-фазовая и нормалъно^фазовая ВЭЖХ на сорбентах с привитыми неподвижными фазами. Это явилось следствием ряда недостатков, присущих адсорбционной хроматографии. К таким недостаткам прежде всего следует отнести большую дли* тельность процессов уравновешивания адсорбентов с растворителями, содержащими воду в микроколичествах, и трудность приготовления таких растворителей с определенной и воспроизводимой влажностью. Это приводит к плохой воспроизводимости параметров удерживания, разрешения, селективности. По этой же причине невозможно, использовать градиентное элюирование, т.е. разделение с постепенным увеличением содержания полярного компонента в применяемом элюенте, т.к. возврат к исходному состоянию настолько длителен, что значительно превосходит выигрыш времени за счет использования градиента.

Существенные недостатки адсорбентов, особенно оксида алюминия, связанные с частными случаями перегруппировок и разложения чувствительных к катализу соединений, необрати^ мой сорбции, также широко известны и неоднократно отмечались в литературе. Необратимо сорбирующиеся вещества, накапливаясь на начальном участке колонки, меняют природу сор-

бент®, могут привести к повышению сопротивления колонки или даже полной ее забивке* Последний недостаток может быть устранен путем использования предколонки, которая по мере повышения сопротивления вследствие засорения заменяется на новую или перезаполняется новым сорбентом* Однако необратимая сорбция, имеющая место в этом случае, приводит к получению хроматограмм, на которых полностью или частично отсутствуют пики чувствительных к адсорбции или каталитическому разложению компонентов пробы, либо существенно искажаются их количественные соотношения.

РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Распределительная хроматография - это вариант метода ВЭЖХ, в котором разделение смеси на составляющие ее компоненты осуществляется за счет различия их коэффициентов распределения между двумя несмешивающимися жидкими фразами: растворителем (подвижная фаза) и жидкой фазой на сорбенте (неподвижная фаза). Исторически первыми были абсорбенты, которые получали нанесением жидких фаз (оксидипропионитрила, парафинового масла и др.) на пористые твердые носители, аналогично тому, как готовятся сорбенты для газожидкостной хроматографии. Однако недостатком таких сорбентов было относительно быстрое смывание неподвижной фазы с твердого носителя. За счет этого количество фазы в колонке постепенно уменьшалось, время удерживания также уменьшалось, а на начальном участке колонки появлялись непокрытые центры адсорбции, вызывавшие искажение формы пиков* С этим недостатком боролись, насыщая растворитель нанесенной неподвижной фазой еще до его поступления б колонку. Вымывание неподвижной фазы также уменьшалось, когда использовали более вязкие и менее растворимые полимерные неподвижные фазы, однако в этом случае из-за затруднения диффузии в толстых полимерных пленках заметно снижалась эффективность колонок.

Логическим решением этой проблемы оказалась прививка химическими связями молекул жидкой фазы к поверхности твер* дого носителя таким образом, чтобы ее вымывание стало физически невозможным, т上* превратить твердый носитель и жидкую фазу в одно целое - в так называемый привито-фазный сорбент. Первые привито-фазные сорбенты были получены замещением силанольных групп, находящихся на поверхности силикагеля, в результате их реакции со спиртами или аминами. При этом отще-

плялась вода, а остатки спиртов или аминов химически связывались с поверхностью силикагеля. Эти, так называемые 44щеточ- ные?, сорбенты, позволяли получить высокую эффективность разделения и стабильность времен удерживания при отсутствии вымывания неподвижной фазы из колонки. Однако устойчивость таких сорбентов в условиях применения водных растворителей и даже слабоосновных или кислых сред была низкой: при- витая неподвижная фаза отщеплялась химически за счет реакции гидролиза. В дальнейшем усилия исследователей были направлены на поиск реагентов, прививка которых протекала бы достаточно быстро и полно, а образовавшиеся связи были бы максимально устойчивыми. Такими реагентами стали алкилхлорсила^ ны и их производные, позволившие по сходной технологии получать привито-фазные сорбенты разного типа и с разными, как полярными, так и неполярными группами на поверхности.

Успешное применение сорбентов последнего типа для ВЭЖХ способствовало росту их производства самыми разными производителями* Каждая фирма производила такие сорбенты, как правило, на основе своего вида силикагеля и по своей технологии, которая обычно составляет “ноу-хау” производства. В результате большое число сорбентов, называющихся химически совершенно одинаково (например, силикагель с привитым октадецил- силаном), имеют очень сильно различающиеся хроматографические характеристики. Это связано с тем, что силикагель может иметь поры разной ширины, разную поверхность и пористость. Его поверхность до прививки может гидроксилироваться. Прививаться могут моно-, ди- или трихлорсиланы; условия прививки могут давать мономерный, полимерный или смешанный слой ор- ганической фазы. Методы удаления остатков реагентов могут быть различными; например» может проводиться дополнительная дезактивация силанольных и других активных групп*

Сложность технологии прививки реагентов и подготовки сырья и материалов, многостадийность этого процесса приводят к тому, что разные партии сорбентов, даже полученные по одной технологии и на одной фирме, могут иметь несколько различные хроматографические характеристики. Особенно это касается тех случаев, когда такие сорбенты используются для анализа много компонентных смесей, содержащих вещества, заметно различающиеся по числу, положению и характеру функционал ьн ых групп [51, 52].

Учитывая вышесказанное, следует стремиться к тому, чтобы при использовании описанной в литературе методики анализа применять именно один и тот же сорбент и одинаковые условия работы* В этом случае вероятность того, что работу не удастся

воспроизвести, является минимальной. Если же такой возможности нет, а берется сорбент другой фирмы с аналогичной привитой фазой, нужно быть готовым к тому, что потребуется длительная работа по уточнению и модификации методики. При этом существует вероятность (и ее следует учитывать), что на этом сорбенте даже после длительной разработки можно не добиться требуемого разделения. Наличие в литературе многих описанных методик разделения на более старых сорбентах стимулирует их дальнейшее производство и применение. Однако в тех случаях, когда приходится переходить к разработке оригинальных методик, особенно применительно к веществам, склонным к разложению, хемосорбции, перегруппировкам, целесообразно начинать работу на сорбентах, разработанных в последнее время и выпускаемых по новым, улучшенным вариантам технологии. Новые сорбенты имеют более однородный фракционный состав, более однородное и полное покрытие поверхности привитой фазой, более совершенные окончательные стадии обработки сорбентов. Ниже будут рассмотрены привито-фазные сорбенты» являющиеся в настоящее время основными в ВЭЖХ, а также и сорбенты с нанесенными неподвижными фазами для распределительной хроматографии*

Распределительная хроматография с нанесенными неподвиж* ными фазами. Этот вариант распределительной жидкостной хроматографии был одним из наиболее важных в области разделения и анализа многих групп органических веществ. Он был предложен в 1941 г. Мартином и Синджем ⑵ и в течение длительного времени представлял собой один из наиболее предпочтительных методов

х ром атографическогох ром атографическогоанализа биологически активных соедине-

х ром атографического

х ром атографического

вариантах. В последвариантах. В последний, как б колоночном, так и в плоскостном

вариантах. В послед

вариантах. В послед

нем случае этот метод использовался в форме плоскостного хроматографического процесса - хроматографии на бумаге [53]. Однако в области высокоэффективной жидкостной хроматографии этот метод был вытеснен хроматографическими процессами, использующими адсорбенты с привитыми на их поверхности органическими неподвижными фазами. Тем не менее, в некоторых случаях применение этого метода вполне оправдано.

Неподвижную фазу и растворитель обычно подбирают таким образом, чтобы они были практически взаимно нерастворимы, в противном случае нанесенная неподвижная фаза будет быстро вымываться из колонки растворителем* Такими комбинациями неподвижной фазы и растворителя являются, например, трис-(цианоэтокси)пропан и н-гексан, парафиновое масло и вода. Однако при работе с этими системами компоненты разделяемой пробы, как правило, обладают коэффициентами распределения,

близкими или к нулю, или к бесконечности, т*е, либо элюируются с фронтом растворителя без разделения, либо задерживаются в колонке чрезмерно долго.

Методы нанесения неподвижной фазы могут быть разными. Материал может быть растворен в подходящем растворителе с низкой температурой кипения и нанесен на твердый носитель методом испарения, как это делают в газожидкостной хроматографии; можно нанести неподвижную фазу непосредственно в виде жидкости или пара. В обоих случаях заполнение колонок затрудняется, если частицы сорбента меньше 40 мкм, поэтому заполнение колонки не может быть выполнено сухим способом.

Более популярным является динамический метод нанесения неподвижной фазы, за к л ючающи й ся в том, что твердый носитель, например, силикагель с размером частиц от 5 до 10 мкм, вносят в колонку обычным суспензионным способом. На колонку подают заданный объем раствора неподвижной фазы, а потом прокачивают растворитель, насыщенный неподвижной фазой, до установления равновесия. Твердый носитель в колонке равномерно покрывается неподвижной фазой, которая находится в равновесии с насыщенным ею растворителем. Такая система достаточно стабильна и не нуждается в восстановлении из-за вымывания неподвижной фазы. Насыщение подвижного растворителя неподвижной фазой может проводиться в предколонке с той же неподвижной фазой, устанавливаемой между насосом и устройством для ввода проб и периодически заменяемой.

Распределительной хроматографии с нанесенными неподвижными фазами присущи следующие недостатки: невозможно использовать градиентную хроматографию из-за вымывания неподвижной фазы; трудно работать в препаративном режиме, так как собранные фракции, естественно, содержат заметное коли- чество нанесенной неподвижной фазы, остающейся в выделен^ ных фракциях после удаления растворителя; затруднительно менять состав растворителя, так как при этом колонка длительное время приходит в новое равновесное состояние с новым растворителем. Кроме того, затруднено использование повышенных температур для анализа，так как растворимость неподвижной фазы при повышении температуры обычно заметно возрастает. Растворитель, в которой вводится проба, должен по составу быть максимально близким к подвижной фазе, иначе возможно частичное смывание неподвижной фазы, что приводит к появлению ложных пиков и к другим нарушениям процесса хроматографии.

Твердый носитель для распределительной хроматографии с нанесенными неподвижными фазами должен иметь большой объем крупных пор, большую поверхность и быть при этом дос-

таточно прочным механически, чтобы допустить суспензионное заполнение колонок* Наносимая неподвижная фаза не должна иметь большую вязкость, чтобы не вызвать снижения эффективности разделения вследствие затруднений массообмена.

Нормально>фазовая распределительная х роматограф и я с привитыми неподвижными фазами. Недостатки, присущие адсорбционной хроматографии, а также стремление исследователей преодолеть недостатки, характерные для распределительной хроматографии с нанесенными полярными жидкими неподвижными фазами сп особствов а л и широкому применению сорбентов с привитыми полярными фазами. Такие сорбенты в настоящее время выпускаются большинством производителей материалов для хроматографии. Основными привитыми фазами для нормально-фазовой распределительной хроматографии в настоящее время являются нитрильная и аминная. Каждая из них прививается с использованием соответствующего силана (диметиламинопропилхлорсилана или диметилцианопропил- хлорсилана). Нитрильная и аминная привитые неподвижные фазы могут быть поэтому использованы в двух вариантах: для нормально-фазовой (с неполярными элюентами) и обращенно- фазовой (с полярными элюентами) распределительной ВЭЖХ.

В качестве нормально-фазовых сорбентов такие сорбенты работают, подобно силикагелю или оксиду алюминия, с теми же элюотропными рядами растворителей и сходными (но не идентичными) порядками элюирования соединений разных классов. За счет разной химической природы силанольных, аминных и нитрильных групп нередко возникают различия в селективности разделения^ позволяющие отдать предпочтение тому или иному сорбенту.

Основными преимуществами сорбентов с привитыми нитриль- ными или аминогруппами по сравнению с исходными адсорбентами являются следующие: (1) вследствие отсутствия силанольных групп вероятность необратимой адсорбции веществ заметно уменьшается; (2) заметно снижается влияние следов воды в подвижной фазе на хроматографическое разделение, отпадает необходимость строго контролировать содержание воды в растворителях; (3) быстро достигается равновесие с новым составом растворителя, что позволяет быстро переходить от одной методики к другой, а также успешно использовать градиентное элюирование; (4) возможно использовать растворители в широком диапазоне их полярностей, облегчается регенерация колонок; (5) сорбенты с привитыми аминогруппами проявляют свойства слабых анионообменников+

Следует учитывать и некоторые особенности применения сорбентов с привитыми аминными неподвижными фазами.

Рнс* 31* Хроматограмма витаминов в пищевых продуктах, полученная на колонке размером 250 х 4 мм с нуклеосилом N% (10 мкм), подвижная фаза: смесь гептан - хлороформ (80 : 20 по объему), расход 3,5 мл/мин, УФ-детектор (254 нм), проба 5 мкл:

/ - уксусный эфир витамина А; 2- витамин Е; 3 - витамин D§

Не рекомендуется использовать в качестве растворителей вещества с альдегидными или кетонными группами, тк в этом случае возможно разрушение структуры привитой фазы с образованием оснований Шиффа* Наличие последних соединений в составе исследуемых проб может привести к исчезновению из них некоторых компонентов* Аминные неподвижные фазы легко окисляются* Поэтому следует исключить действие на сорбент сильных окислителей. Аналогично, при использовании нитрильной привитой неподвижной фазы рекомендуется учитывать возможность реакций с нитрильными группами выбранного растворителя или компонентов, входящих в состав анализируемых проб*

Нитрильные и аминные неподвижные фазы применяют в биологии, медицине, биохимии, фармации и др+ (рис 31-33)* Эти неподвижные фазы нашли наиболее широкое признание и выпу* скаются почти всеми производителями сорбентов. Некоторые фирмы выпускают варианты аминных неподвижных фаз, содержащие, например, диэтиламиноэтильные или диметиламинопро- пильные группы*

Достаточно широко применяют еще одну привитую поляр* ную фазу г так называемую, диольную, которая содержит в со* ставе привитой группы два гидроксильных радикала. Ее селективность несколько отличается от других неподвижных фаз вследствие другой химической природы полярных групп и значительно отличается от немодифицированного силикагеля. Этот адсорбент представляет собой силикагель, к поверхности которого привиты группы -ССН2)зОСН2СН(ОН)СН2ОН,

Сорбенты с другими привитыми полярными группами (за исключением ионообменников) выпускаются лишь малым числом фирм. Причиной этого является то обстоятельство, что

Рис* 32* Хроматограмма смеси моносахаридов, полученная на колонке размером 250 х 4,6 мм с полигосилом 60 NH2 (5 мкм% подвижная фаза - смесь ацетонитрил-вода (75 : 25 по объему), расход 2 мл/мин, УФ-детектор (190 нм):

/ - рамноза; 2 - ксилоза; 3 - арабиноза; 4 - фруктоза; 5 - манноза, 6 - глю- козаФ 7 - галактоза

Рис* 33. Хроматограмма смеси цитохромов С разного происхождения, полученная на колонке размером 250 х 4 мм с Нуклеосилом CN (5 мкм), подвижная фаза: смесь 0,05 М раствора сульфата натрия в 0,1 М фосфатном буферном растворе (pH 2,0) с ацетонитрилом (77*5 : 22,5 по объему), расход 1 мл/мин; УФ* детектор (400 нм):

/ - цитохром лошади; 2 - быка; 3 - собаки; 4 - тунца

какая-то особая селективность, оправдывающая применение таких сорбентов, отмечается довольно редко.

Были разработаны и получили известное распространение сорбенты, имеющие привитые ал кил сил ил ьн ы е группы разной длины (от С2 до С22 с прямой алкильной цепью, фенильной и дифенильной группами)* Растворители, используемые для зтого метода

(ацетонитрил, метонол, вода, в меньшей мере - тетра гид рофура н), позволяют работать в широком УФ-диапазоне, т.к. они прозрачны в УФ-свете, начиная с коротких длин волн порядка 190-210 нм (тетрагидрофуран -с 220 нм). Это позволяет применять наиболее популярный детектор - УФ-спектрофотометр как при 190-210 нм, где он работает как неселективный универсальный детектор, позволяющий проводить анализ сахаров, жиров, сложных эфиров, спиртов, олефинов, так и при любой другой длине волны, обеспечивающей селективное детектирование (например, витамина А при 325 нм). Растворители, используемые в обращенно-фазовой хроматографии, относительно легко растворяют все важнейшие группы веществ, входящих в состав живых организмов, биологических объектов, лекарственных препаратов, пестицидов, гербицидов, широко используемых в органической химии, нефтехимии, биоорганической химии и др. (рнс 34-37).

Сорбенты в обращенно-фазовой ВЭЖХ быстро приходят в равновесие при изменении состава растворителя, что позволяет, достаточно легко переходить от одной методики к другой с использованием одной и той же колонки, а также применять градиентное элюирование с быстрым восстановлением равновесия сорбента с исходным растворителем. Эти сорбенты дают возможность использовать растворители в широком диапазоне изменения их свойств, а также добавки разных типов (соли, кислоты и основания, ион-парные реагенты, органические модификаторы и т.п*). Регенерация растворителей высокой чистоты может быть осуществлена с использованием ректификации, а загрязненный сорбент в колонке может быть промыт и снова приведен в рабочее состояние при прокачивании через колонку растворителей, удаляющих загрязнения.

Однако в обращенно-фазовой хроматографии существуют и некоторые проблемы, которые затрудняют использование этого метода* Прежде всего, характеристики удерживания и селективности для обр ащен но-ф азовых сорбентов меняются не только при переходе от сорбента одного производителя к сорбенту другого (например, от Сферисорба ОДС к Партисилу ОДС), формально определяемых как идентичные (силикагель с привитыми окта деци леи ли л ьны ми группами). Эти х ара кте ристики меняются более или менее значительно даже при переходе от одной партии сорбента к другой партии того же производителя* Проблема эта была отмечена еще в самом начале применения обращенно-фазовых сорбентов, однако в полном объеме она не решена и до настоящего времени. Причины этого связаны прежде всего с тем, что исходные силикагели, используемые разными фирмами, заметно различаются по поверхности, объему и размеру пор*

рис 34, Хроматограмма смеси полициклических ароматических углево^ дородов на колонке размером 150 х 4Б6 мм с Нуклеосилом NH2 (5 мкм)* Подвижная фаза - мзо-ок- тан, 1,4 мл/мин; УФ-детектор (254 нм); объем пробы 20 мкл:

/ - бензол; 2 - нафталин; 3 - фенантрен; 4 - флуорен; 5 - пирен; 6 - 1,3,5- трифенихбензол: 7 - хризен

Рис, 35* Хроматограмма смеси ароматических углеводородов, получен^ ная на колонке размером 250 х 4,6 мм с Зорбаксом ОДС (6 мкм)* подвижная фаза - смесь метанол-вода (90 : 10 по объему), расход 15 мл/мин, УФ'Детектор (254 нм), объем пробы 20 мкл:

/ - толуол; 2 - о-ксилол: 3 - трет .-бутклбензол: 4 - м-трет^бутилтолуол; 5 - «- mpew- пе нтилтол у о л; 6 亠宀 трет.-гекснлтолу^л; 7 - 315-ди-/ире^п,-бути л толуол; 8 - трет.-гексил-о-ксилол

22Рис 36* Хроматограмма смеси бромсодержащих антипиренов, полученная на колонке размером 250 х 4,6 мм с Зорбаксом ОДС, подвижная фаза -метанол, расход 1 мл/мин, УФ-детектор (254 нм):

2

2

/ - гексабромбутен-2; 2 - гексабромбензол; 3,4 - примеси, 5 - декабромди- фенилоксид

Для прививки неподвижных фаз, которые далее называют одинаково, применяют разные агенты. При этом чистота технических сортов реагентов, используемых для производства, также различна. Например, для получения привитой неподвижной фазы ОДС (октадецилсилан) используют октадецилтрихлорсилан, ме- тилоктадецилдихлорсилан и диметилоктадецилхлорсилан. Если используют ди- или трифункциональные силаны, то в зависимо

сти от содержания следов воды в растворителях и силикагеле на его поверхности может полу- читься мономерная пленка неподвижной фазы (монослой) или

Рис* 37* Хроматограмма снотвор- ных лекарств полученная на колонке размером 250 х4ммс Нуклеоси- лом Cls (10 мкм), подвижная фаза - смесь метанол-вод а (55 ; 45 по объему), расход 3,5 мл/мин, давление 14 МПа; УФ^детектор (254 нм); объем пробы 5 мкл:

/ - примесь; 2 - веронал; 3 - люминал; 4 - проминал; 5 - ревонал; 6 - при- месь; 7 - тиогенал

же полимерная (чем больше воды, тем выше степень полимеризации), Свойства мономерной и полимерных пленок с разной степе* нью полимеризации различаются весьма заметно. Силанольные группы, находящиеся на поверхности исходного силикагеля, к которым прививается неподвижная фаза, не могут из-за пространственных затруднений быть полностью замещены, например, диметил окта де ци л силил ьными группами даже при самых жестких условиях прививки. Удается заместить примерно половину силанольных групп* Остающиеся силанольные группы не удается полностью устранить даже в процессе так называемого окончательного покрытия поверхности силикагеля (иэнд кэппинга1'), когда используют молекулы более активного низкомолекулярного силана (обычно триметилхлорсилана)* Силанольные группы на поверхности такого привитого сорбента могут взаимодействовать с некоторыми компонентами пробы и в ряде случаев быть основным фактором, отвечающим за удерживание веществ, подвергаемых хроматографическому разделению* Нередко они действуют не непосредственно, а через посредство малых поляризуемых молекул растворителя (метанола, воды), сольватирующих силанольные труппы. В некоторых случаях, когда в удержиБании вещества участвуют как привитые, так и силанольные группы, это приводит к образованию хвостов пиков. Так, например, фирма "Ват- мая” первоначально выпускала только один сорбент вида ОДС - Партисил ОДС, который был одним из первых появившихся в про даже обращенно-фазовых сорбентов и применялся достаточно широко, хотя содержание углерода в нем составляло только 5%, а степень покрытия поверхности не превышала 50% от возможной* В дальнейшем был выпущен Партисил ОДС-2, который содержал уже 15% углерода, степень покрытия поверхности увеличилась только до 75%* Однако покрытие стали получать более плотное, пленка органической неподвижной фазы стала полимерной* Последним был разработан Партисил ОД С-3, содержащий 10% углерода, степень покрытия поверхности стала составлять 95%* Это было достигнуто за счет того, что привитая органическая фаза стала мономерной, однако проводилось еще дополнительное окончательное покрытие. Аналогично Партисилам ОДС выпущены Сферисорбы ОДС и ОДС-2, Партисилы С18 двух типов ("высокой прививки^ и “низкой прививки”). Те же производители сорбентов, которые появились на рынке позже и использовали технологию, учитывающую недостатки старых сорбентов и технологий их получения, как правило, сразу начинали выпускать сорбенты с максимальным покрытием поверхности мономерным слоем неподвижной фазы. Для устранения остаточных силанольных групп применяли дополнительное покрытие.

Из этого обсуждения следует важный вывод: ни один сорбент, как бы хорош он ни был по химии поверхности и технологии получения, не может быть использован для воспроизведения любых методик или решения любых аналитических зада% Ис* следователь всегда должен располагать возможностью использовать достаточно широкую группу сорбентов для решения возникающих перед ним аналитических задач. Поэтому на вопрос, который обычно задают начинающие хроматографисты, - какой обращенно-фазовый сорбент является наилучшим? - ответить однозначно не удается ни одному исследователю, даже имеющему большой опыт работы.

Одна из причин, способствовавших быстрому росту использования обращенно-фазовых сорбентов в ВЭЖХ, - это их способность четко разделять серии гомологов в порядке возрастания их молекулярной массы, делающая их в этом сходными с популярными в газовой хроматографии полиметил силоксановыми неподвижными фазами. При этом гомологи могут, в отличие от разделяемых методами адсорбционной или нормально-фазовой хроматографии, не иметь в своем составе полярных функциональных групп. Обращенно-фазовые сорбенты позволяют четко разделить гексан и гептан, бензол и толуол, фенол и ^-крезол, ?лре/п.-бутилтолуол и /пре/п.-пентилтолуол* Это вовлекает в область анализа методом ВЭЖХ такие важные объекты, как углеводороды нефти, продукты нефтепереработки (бензины, керосины, газойли, смазочные масла, ароматические углеводороды), продукты переработки сланцев и углей - очень важные многотоннажные продукты в промышленности, Если нужно разделить вещества неполярные или малополярные, практически любой обращенно-фазовый сорбент может при относительно простом подборе растворителя обеспечить хорошее разделение.

В настоящее время фирмы-производители выпускают более 100 разных обращенно-фазовых сорбентов. Примеры некоторых из них приведены в табл. 6* Практически все производители выпускают их с привитыми неподвижными фазами С8 и C1S (последние нередко в нескольких вариантах), многие - С^з, (что нередко обозначает одно и то же - прививку триметилхлорсилана или диметилдихлорсилана), некоторые - фенил, С4 или С& Если плотность прививки неподвижной фазы одинакова, то сорбент с привитой неподвижной фазой С4 будет содержать в два раза меньше, а для фа?ы С)8 более чем в два раза больше привитого углерода, чем неподвижная фаза С8. На практике эта плотность несколько падает в ряду С4 > Са > С1£, поэтому содержание углерода для С4 несколько больше, а для С]8 - меньше, чем можно было бы ожидать. Так как удерживание соединений в обращенно-фазовой

Таблица 6

Наименование

Производи- тельФ фирма

Форма частиц*

Величина частиц, мкм

Диаметр, нм

Удельная поверхность, м2/г

Приме* чания

Лнхросорб РП"8

Мерк

Н

10

300

22% С

Лнкрозрб РП-&

Мерк

н •

5,7,】0

10

300

14% С

Партиснл одс-з

Ватман

н

5, 10

5

400

10铀С

Нуклеосил C1S

МашераЙ- Н аге ль

Сф

Х5Л. 10

10

300

Нуклеосил Q

МатерзИ- Нагель

Сф

5.工 10

10

300

-Бондапак С]8

Уотерс

н

10

300

10% С

-Бондапак Фенил

Уотерс

н

10

300

16% С

Зорбакс ОДС

Дюпон

Сф

g

7

350

22% С

Зорбакс С&

Дюпон

Сф

8

7

350

15^С

Сферисорб ОДС

Фэйз

Сепарейшн

Сф

5, 10

8

220

6% С

Сферясорб

ОДС-2

Сепарейшн

Сф

5, 10

8

220

12 稀 С .

Примечание: *Форма частиц: Н - неправильная, Сф - сферическая.

хроматофафии пропорционально содержанию привитого углерода (точнее, той части привитого углерода, которая доступна для взаимодействия с молекулами разделяемых веществ), то для сорбентов одной торговой марки удерживание увеличивается в ряду С2 < С4 < Сй <

Однако, если взять сорбенты разных производителей, то нередко сорбент с неподвижной фазой Cs может удерживать разделяемые вещества не слабее, а сильнее, чем сорбент с неподвижной фазой C]g, выпускаемый другой фирмой.

Наряду с неполярными привитыми фазами, выпускаемыми специально для обращенно^фазовой хроматографии, в обращенно-фазовом варианте часто используют нитрильную и аминную привитые фазы, а иногда и диольную, В этом случае они работают и разделяют вещества в основном по обращенно-фазовому механизму, как имеющие короткий (С3) привитый алкил силан, а полярные группы или вообще не участвуют в разделении, или играют второстепенную роль, несколько меняя селективность для ряда веществ определенной химической структуры. В качестве растворителей для обращенно-фазовой ВЭЖХ используют

9797Руденко В.А.

97

97

преимущественно метанол и ацетонитрил* Другие спирты, кроме метанола, используют редко, т*е* их вязкость значительно выше и при работе с ними требуется слишком большое давление, тогда как эффективность разделения падает вследствие затрудненной диффузии в подвижной фазе. Тетрагидрофуран также еспользуют значительно реже, во-первых, из-за его нестабильности при хранении (он быстро окисляется, накапливая гидропероксиды, которые уменьшают УФ-диапазон пропускания, кроме того, они способны окислять привитую неподвижную фазу и взрывоопасны), во-вторых, из-за трудности очистки перегонкой (необходимо разрушать пероксиды до перегонки во избежание взрыва)* Ацетонитрил имеет ряд преимуществ перед метанолом, При хорошей очистке он лучше пропускает в ультрафиолетовом диапазоне (ниже 210 нм) и позволяет работать в смеси вода-ацетонитрил при 200 и даже при 190 нм* Он обычно обладает лучшими растворяющими свойствами для проб, чем метанол* При использовании смесей метанол-вода и ацетонит- рил-вода вязкость смесей не является аддитивной величиной и при 25℃ меняется от 0*89 и 0,57 МРа ■ сек (для чистой воды и метанола, соответственно) до 1,4 (для смеси ацетонитрил 亠 вода, соответствующие величины равны 0т89, 0,43 и 0*98 МРа * с). Бблылая вязкость смесей метанол-вода по сравнению со смесями ацетонитрил-вода (почти в 1,5 раза) затрудняет использование колонок, заполненных частицами сорбентов размером 3 и 5 мкм. Точно так же при градиентном элюировании колонки, работающие с системой метанол-вода, подвергаются при равном расходе действию больших давлений и быстрее входят из строя. Наконец, важную роль играет и то обстоятельство, что метанол относится к группе особо опасных ядов, находящихся на строгом контроле и учете, тогда как ацетонитрил к этой группе веществ не относится* К недостаткам ацетонитрила, несколько ограничивающим его использование^ относятся его довольно высокая стоимость (особенно высокочистых сортов, предназначенных для ВЭЖХ и У Ф-спектроскопии)» некоторая токсичность, требующая предосторожностей при работе, а также то, что его труднее, чем метанол, освобождать от воды, так как он образует с ней азеотропную смесь* Это затрудняет его регенерацию из отработанного растворителя, что особенно важно при большом масштабе работы, например, при препаративной работе.

Особо следует сказать о качестве воды и требованиях к ней. Вода, являющаяся в настоящее время одним из важнейших растворителей для ВЗЖХ, является как самым доступным, так и очень трудным для тщательной очистки растворите л ем. Если для изократических разделений, особенно при использовании не

очень чувствительных детекторов или при работе не в ближай^ шем УФ-диапазоне удается обойтись бидистиллятом (не деионизированной водой!), то для градиентных разделений и работы с высокочувствительными детекторами такого качества воды уже недостаточно. Деионизированная вода, как правило» не подходит для использования в ВЭЖХ: органические иониты, используемые для извлечения из воды неорганических ионов, дают воду с очень низкой проводимостью, однако содержащую заметные количества органических зап?язнений по сравнению с водой до деионизации* Удалить все органические соединения из воды очень трудно, особенно микроколичества - никакая перегонка или ректификация не помогают вследствие образования азеотропных смесей.

Существуют системы высокой очистки воды, осуществляющие деионизацию с последующим извлечением органических соединений адсорбентами, однако они достаточно дороги* Разработаны системы, позволяющие резко уменьшить содержание органических соединений в воде путем обработки ее мощным УФ*об- лучением, иногда с последующей обработкой адсорбентами* Эти системы дешевле, но не так универсальны. Наконец, существуют патроны, заполненные адсорбентом, рассчитанным на извлечение органических соединений из определенного объема воды (обычно из 15 л)- они достаточно недороги и удобны, позволяют получить ровно столько очищенной воды, сколько нужно для ближайшей работы. Высокочистая вода нестабильна при хранении, поэтому лучше ее использовать достаточно быстро и свежеприготовленную.

В том случае, если таких систем или патронов в распоряжении исследователя нет, следует взять наиболее чистую воду, имеющуюся в лаборатории и пропустить ее через колонку, заполненную чистым обращенно-фазовым сорбентом с привитой неподвижной фазой С18. Все органические примеси из воды будут сорбироваться в начале колонки, а на выходе колонки будет получаться чистая вода без примесей. После пропускания определенного объема воды, зависящего от количества органических загрязнений в ней, эту колонку промывают чистым метанолом илн ацетонитрилом, смывая загрязнения, после чего она снова будет готова к работе.

Возможны разные варианты такой очистки. Можно просто при использовании градиента высокого давления установить колонку с привито-фазным сорбентом С18, желательно не обладающую большим гидравлическим сопротивлением (с зернением 20 или 15 мкм), после насоса, подающего чистую воду, до смесителя, В этом случае колонка будет очищать ровно столько воды,

сколько нужно для работы, и вода будет свежеочищенная. Можно использовать колонку, заполненную более крупным сорбентом (например, 40^63 мкм), и подавать воду под гидростатическим давлением, получая столько воды, сколько нужно на день работы. Можно, наконец, использовать по луп репарати в ну ю или препаративную колонку для ВЭЖХ и качать воду насосом хроматографа, используя для очистки воды ночное время, когда аналитическая работа не проводится. Какой вариант удобнее должен решать сам исследователь.

Работая в граднентном режиме с водно-метанольными и вод- но-ацетонитрильными растворами, следует ежедневно дегазировать растворители наилучшим из возможных способов, особенно, если используется градиент на стороне низкого давления. Не будет лишним иметь на выходе из детектора клапан или гидрав* лическое сопротивление, поддерживающее в кювете детектора избыточное давление около 0,05-0,3 МПа* Это простое приспособление позволяет добиться того, что возможные пузырьки воздуха образуются уже после клапана, за кюветой детектора и не мешают работе.

24 ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

В ионообменной хроматографни разделение компонентов смеси достигается за счет обратимого взаимодействия ионизирующихся веществ с ионными группами сорбента. Сохранение электронейтральности сорбента обеспечивается наличием способных к ионному обмену противоионов, расположенных в непо- бедственной близости к поверхности. Ион введенного образца, взаимодействуя с фиксированным зарядом сорбента, заменяет противоион. Вещества, имеющие разное сродство к фиксирован* ным зарядам, разделяются на анионитах или на катионитах. Аниониты имеют на поверхности положительно заряженные группы и сорбируют из подвижной фазы анионы. Катиониты, соответственно, содержат группы с отрицательным зарядом, взаимодействующие с катионами,

В качестве подвижной фазы используются водные растворы солей, кислот, оснований и растворители типа жидкого аммиака, 「с* системы растворителей, имеющих высокое значение диэлектрической проницаемости £ и большую способность к ионизации растворенных соединений* Обычно работают с буферными растворами, позволяющими регулировать величину pH, При хроматографическом разделении ионы анализируемого вещества кон-

курируют с ионами, содержащимися в элюенте, стремясь вступить во взаимодействне с противоположно заряженными группами сорбента. Отсюда следует, что ионообменную хроматогра* фию можно применять для разделения любых соединений, которые могут быть каким-либо образом ионизированы. Например, можно провести разделение даже нейтральных молекул сахаров в виде их комплексов с борат*ионами. Ионообменная хроматография незаменима при разделении высокополярных веществ, которые без перевода в производные не могут быть проанализированы методом газовой хроматографии. К таким соединениям относятся аминокислоты» пептиды, сахара.

Ионообменную хроматографию широко применяют в меди- цине, биологии, биохимии [54—58], для контроля окружающей среды, при анализе содержания лекарств и их метаболитов в крови и моче, ядохимикатов в пищевом сырье, а также для раз^ деления неорганических соединений, в том числе радиоизото- пов, лантанидов, актинидов и др. Анализ биополимеров (бел- ков, нуклеиновых кислот и др,), на который обычно затрачивали часы или дни, с помощью ионообменной кроматографон проводят за 20—40 мин с лучшим разделением. Применение ионообменной хроматографии в биологии позволило анализиро- вать образцы непосредственно в биосредах, уменьшая возможность их перегруппировки или изомеризации, что может привести к неправильной интерпретации конечных результатов. Интересно использование данного метода для контроля изменений, происходящих с биологическими жидкостями {54]. Использование пористых слабых анионообменников на силикагелевой основе позволило разделять аминокислоты и пептиды (рис. 38) [55]. Механизм ионного обмена можно представить в виде следующих уравнений:

для анионного обмена X" + R+Y" т Y" + R*X ;

для катионного обмена X* + R亠Y+ т + R X*.

В первом случае ион образца X" конкурирует с ионом подвижной фазы Y" за ионные центры R+ ионообменника, а во втором в конкуренцию с ионами подвижной фазы Y* за ионные центры R- вступают катионы образца Х+.

Естественно, что ионы образца, слабо взаимодействующие с ионообменником, будут слабо удерживаться на колонке и первыми вымываются из нее* Наоборот, более сильно удерживаемые ионы будут элюироваться из колонки последними* Обычно возникают вторичные взаимодействия неионной природы за счет адсорбции или водородных связей образца с неионной частью матрицы или за счет ограниченной растворимости образца в подвиж-

Рис* 38* Ионообменное хроматографическое разделение смеси аминокислот белкового гидролизата, полученное на анализаторе Дюррум D- 599 с колонкой из нержавеющей стали диаметром 1,75 мм с ионитом Дюррум DC-A4 (размер частиц 8 мкм), работающей при входном давлении 8,35 МПа со скоростью подачи элюента (цитратного буферного раствора) 6-10 мл/час:

/ - аспарагиновая кислота; 2 ■ треонин; 3 - серин; 4 - глутаминовая кислота; 5- пролин; 6 - глицин; 7 - аланин; 8 - цистин; 9 - валин; 10 - метионин;"- далей^нн;『2 - лейцин; 13 - тирозин; /# - фенилаланин; /5 - гистидин; /6 - лн- зин; /7-аммоний; /8 - аспарагин [Benson JR, Amer. Labor** 1972, рт 53]

ной фазе. Трудно выделить "классическую” ионообменную хроматографию в ^чистом** виде. Поэтому некоторые авторы исходят при ионообменной хроматографии из эмпирических, а не теоретических закономерностей.

Разделение конкретных веществ зависит в первую очередь от выбора наиболее подходящего сорбента и подвижной фазы. В качестве неподвижных фаз в ионообменной хроматографии применяют ионообменные смолы и силикагели с привитыми ио* ногенными группами.

Полистирольные ионообменные смолы для ВЭЖХ с величиной зерна 10 мкм и менее обладают достаточно высокой селективностью и стабильностью, однако их сетчатая структура характеризуется расстоянием между узлами сетки порядка 1,5 нм. Это значительно меньше размера пор применяемого для адсорбционной хроматографии силикагеля (10 нм), что замедляет массооб- мен и, следовательно, снижает эффективность. Поэтому для обеспечения высокоэффективного разделения с помощью ионо-

обменной хроматографии приходится применять целый комплекс специальных мер. Их совокупность дает основания считать ионообменную хроматографию, выполняемую с их использованием, особым вариантом хроматографического метода, названным ионной кроматографней и подробно рассмотренным в следующем разделе настоящей книги.

Применяемые в ВЭЖХ ионообменные смолы представляют собой в основном сополимеры стирола и диви н ил бе изола * Обычно содержание последнего составляет 8-12%. Чем больше содержание дивинилбензола, тем больше жесткость и прочность поли- мера, выше его емкость и, как правило, селективность и тем меньше набухаемость*

Катиониты получают сульфированием полистирольной матрицы. Протон, ионно связанный с сульфогруппой, может перемещаться и даже уходить за пределы смолы в раствор. При этом, чтобы молекула была в целом электронейтральной, место протона занимает положительно заряженный ион, который из раствора переходит в смолу* Например, при действии Na+Cl- на катионо-обменную смолу в Н+-форме происходит реакция обмена:

Смола 亠 SO?H*+Na* -> Смола - SO^ Na++H+ *

Если реакция протекает до конца, то смола переходит в натриевую (ионную) форму.

Анионообменные смолы получают хлорированием полимерной матрицы и последующим ал килирова ние м алифатическим амином. Наиболее распространены аниониты, имеющие четвертичные аммонийные группы, получаемые при реакции с триме- тиламином:

Смола-С6Н5+ С1СН2ОСН3Смола-С6Н4СН2С1

ZnCl3N(CH3)3

Смола^С6Н4СН^(СН3)； С「

В этих смолах подвижен анион хлора, который может заменяться другим анионом, например ОН". Катиониты обычно поставляются в Н*-форме или Ка*-форме, а аниониты - в ОН'-фор- ме или СГ-форме. Таким образом указывается противоион ноно・ обменника. Полученные материалы» содержащие сульфатные или триалкиламмонийные группы, являются сильными катион- нообменниками и сильными анионообменниками и называются, соответственно, SCX и SAX. Слабые катионообменники и анио- нообменники содержат карбоксильные, СОО-, или аминные группы NHj, соответственно. Существуют также жидкие орга-

нические ионообменники - несмешивающиеся с водой жидкости, физически нанесенные на пористые или поверхностно-пористые материалы и способные к ионизации в растворах. Жидкие анионообменники - это высокомолекулярные амины или их соли, а катионообменники - эфиры фосфорной или фосфиновых кислот*

Для улучшения условий разделения в ионообменной хроматографии иногда получают лигандные комплексы ионов, изменяя при этом их полярность. Например, проводят реакцию

Fe3+ + 4Cr^FeCl4-

и делят на анионообменном сорбенте комплексные анионы железа. Так как селективность смолы зависит от характера противоиона, часто для успешного разделения необходимо изменить форму смолы* Противоионы связаны кулоновскими силами взаимного притяжения с ионообменными группами и экранируют их заряд. Это притяжение зависит от физической природы противоиона, размеров, формы и плотности электронных оболочек. Одни противоионы при равенстве концентраций могут вытеснять другие из связей с ионными группами ионообменника. Ниже приведены ряды противоионов в порядке убывающей активности и уменьшения сродства к ионообменной смоле:

для анионов

HSCO； > ClOj > NO； > Br' > CN" > HCO^ > OAc" > ОН' > F二

для катионов

Ва2+ > Pb2+ > Са2+ > Ni2+ > Cd2+ > Со2+ > Zn2+ > Mg" > Ag+ > Cs+

> Rb+ >K+> NH： > Na* >H+> Li+.

Знать эти ряды полезно для выбора системы элюирования. Наиболее быстрый метод превращения анионита в форму, которая в ряду селективности стоит выше исходной, состоит в промывании ее четырехкратным объемом 1 М раствора соответствующей соли, Если для работы необходима форма слабее исходной, то ее сначала переводят в гидроксильную форму, промывая 20-кратным количеством 1 М раствора NaOH, а затем уже превращают в нужную форму* Катиониты переводят в требуемую форму промыванием 1 М раствором нитрата соответствующего металла.

При изменении ионной формы смолы или в присутствии органических растворителей, таких, как ацетонитрил, тетрагидрофуран, может изменяться и объем смолы. Если смола уменъша-

ется в объеме, то слой сорбента в колонке оседает и образуется мертвый объем наверху колонки, что приводит к потере эффективности. Если смола набухает и ее объем в колонке увеличивается, то возрастает гидравлическое сопротивление колонки, что значительно уменьшает скорость потока и может даже привести к разрушению сорбента. Невысокая стабильность ионообменных материалов является одним из недостатков ионообменной хроматографии, причем анионообменники менее стабильны, чем катионообменники* Для увеличения q)OKa службы колонок используют предколонки, а также регенерацию колонок сильным растворителем. Катиониты, например, регенерируют, обрабатьь вая 1 М азотной кислотой и про дол жите л ьн о промывая той подвижной фазой, которая будет далее использована.

Ионообменники характеризуются степенью набухания и ионо- обменной емкостью* Степенью набухания называют объем помещенного в колонку обменника (в мл), приходящийся на 1 г его в сухом виде. Эта величина имеет размерность мл/г. Максимальное количество ионов, которое может связать ионообменник, определяет его емкость, которая совпадает с концентрацией ионогенных групп. Емкость выражается числом ммоль эквивалентов обмениваемого иона на 1 г сухого обменника (ммоль экв/г) или на 1 мл помещенного в колонку набухшего ионообменника (ммоль экв/мл) при значениях pH, соответствующих его полной ионизации. Для высокомолекулярных ионов или амфолитов, например белков, вводят понятие ^эффективная" емкость, которая зависит от размера молекулы амфолита, расстояния между ионогенными группами и степени доступности всего объема пористой матрицы обменника для этих молекул. Величины емкости и эффективной емкости могут не совпадать. Иногда приходится снижать полезную емкость сорбента за счет изменения pH, увеличивая при этом его эффективную емкость* Катионообменные смолы имеют емкость около 4,4 ммоль экв/г, а анионообменные 一 3,5-4 ммоль экв/г для гелеобразной структуры и 2J ммоль экв/г для пористой. Обменная емкость изменяется при изменении pH* При низких pH происходит нейтрализация катионита при реакции с протонами:

R^ + H+ ^RH+,

а при высоких pH подобным образом при действии щелочи нейт- рализуются аниониты:

R+ + OITTR+OH，

Этот эффект зависимости обменной емкости от pH для сильных и слабых ионообменников показан на рис* 39* Ионообменная ем-

Рис 39. Зависимость емкости ионообменных смол от pH:

/ - сильный кетионообмсюшк; 2 - сильный анионообменник; 3 - слабый катионообменник； 4 - слабый анионообменник

кость сильных катионитов падает до нуля при низких pH, их нельзя использовать при рН< L Сильные аниониты должны применяться при pH < 11, слабые катиониты при pH > 6, а слабые аниониты при pH < 8. Из рисунка видно, что сильные ионообмен- ники могут быть использованы в более широком диапазоне pH* чем слабые. Этим объясняется их широкое применение, причем с их использованием может быть разделено большое число веществ разных классов одновременно, особенно если используется градиентное изменение pH. Сильно удерживаемые вещества, нестойкие при крайних значения pH, могут разделяться на слабых ионитах. Сильные иониты полностью ионизированы в диапазоне pH = 2-11. Слабые иониты полностью ионизированы в ограниченной области pH, и их ионизацию можно изменять, меняя pH элюента в пределах диапазона рабочих значений pH. Таким образом, к категории слабых могут быть отнесены ионообмен^ ники, значительно отличающиеся друг от друга* Для них харак^ терно не только сужение рабочего диапазоне pH* но и уменьшение прочности сорбции вещества внутри этого диапазона. Слабым ионообменникам, в частности анионитам с диэтиламино- этильными замещающими группами (ДЕАЕ), отдают предпочтение в тех случаях, когда необходимо элюирование в мягких условиях, например, при разделении белков и пептидов.

Наибольший интерес в качестве сорбентов для ионообменной хроматографии представляет химически модифицированный силикагель получаемый прививкой к силикагелю ионогенных групп. Применение этих материалов значительно увеличивает стабильность работы колонок, в которых не происходит изменения эффектов ности * Однако сильнокислые или сильное снов н ые срезы (2 > pH > 7,5) могут воздействовать на силикагель, выводя из строя колонку. Привитые к силикагелю ионообменники могут

Таблица 7

Характеристика (модифицированных силикагелей и ионообменных смол

Характеристика

Силикагель

Смола (сополчмеры полистирола с дивинилбеюолом)

Типичный диаметр частицы, мкм

5-10

7-10

Типичная ионообменная емкость» ммоль зкв/「

0>2

3-5

Сгойк(хть к деформации 口№ лением

Очень хорошая

От удовлетворите л ьной до плохой (в завнсяносги от степени сшивкн)

Форма

Сферическая или неправильная

Сферическая

Перепад давления на колонке

Высокий

Очень высокий

Эффективность

Высокая

Низкая

Метод набивки

Суспензионный

Суспензионный

Диапазон pH

2-7,3

0-(2 (анионообменны е) 0-14

(катионообменные)

Скорость регенерации

Умеренная

Медленная

быть нестабильны при действии органических растворителей, концентрированных буферных растворов и высоких температур. Ионообменные силикагели с величиной зерна 10 или 5 мкм не набухают, не сжимаются, как смолы, и отличаются от них большим размером и доступностью внутренних пор как для ионов разделяемых веществ, так и для противоионов* Благодаря этому быстрее происходит массоперенос даже без повышения температуры и значительно возрастает эффективность колонок.

Слабых катионитов на основе силикагеля не существует, так как при pH < 8 материал не ионизирован, а при pH > 8 разрушается подложка твердого носителя.

Сравнительные характеристики модифицированных силикагелей и ионообменных смил, применяемых в ионообменной хроматографии, приведены в табл. 7.

Выбор подвижной фазы и условий разделения в ионообмен- ной хроматографии* Подвижная фаза в ионообменной хроматографии должна обеспечить растворимость различных солей для образования буферных растворов, необходимых для обеспечения ионного обмена и необходимой селективности разделения путем изменения удерживания компонентов анализируемой пробы за счет использования элюентов нужной силы.

Ионообменное разделение обычно выполняют при использо-

вании водных растворов солей, которым обычно придают буферные свойства. Иногда добавляют в подвижную фазу небольшое количество смешивающихся с водой органических растворителей (метанола^ этанола, ацетонитрила, тетрагидрофурана)* Сила и селективность подвижной фазы зависят от типа и концентрации буферных ионов и других солей, от величины pH и концентрации добавленных органических растворителей*

Удерживание в ионообменной хроматографии зависит от двух процессов: распределения компонентов пробы между водной подвижной фазой и органической неподвижной и образования ионных пар (т.е. от анионного или катионного обмена, причем этот последний процесс является преобладающим)*

Распределение вещества между фазами зависит от силы элек- тростатического взаимодействия заряженных ионизированных групп вещества с заряженными группами ионообменника* Некоторые гидрофобные соединения или вещества, способные образовывать водородные св 注 зи, могут вза и мод ей ствовать с материалом матрицы ионообменника по неспецифическому адсорбционному механизму*

Степень удерживания компонента пробы снижается с увеличением ионной силы подвижной фазы и увеличивается с повышением ионообменной емкости сорбента* Ионная сила подвижной фазы возрастает при увеличении концентрации буфера при неизменной величине pH или добаБлении солей* Важна также концентрация буферных растворов, тк в растворе наблюдается конкуренция между ионами образца и буфера* Уменьшение концентрации буферного раствора увеличивает сродство смолы к компонентам анализируемой пробы, что приводит к увеличе- нию времени удерживания* Концентрация буферного раствора колеблется от 0,001 до 6 моль/л, причем верхняя граница определяется растворимостью соли, используемой в качестве буфера, а нижняя - силой самого буферного раствора, т*к. в слабом буферном растворе нельзя контролировать величину pH* Сильных буферных растворов также следует избегать, т*к* возможно выпадение осадков и забивание колонок* Сила растворителя зависит от типа противоиона, причем степень удерживания образца увеличивается в ряду, обратном ряду активности ионов, приведенному выше.

При анализе веществ pH раствора выбирают таким образом, чтобы молекулы компонентов пробы были полностью ионизированы. Обычно для кислот выбирают pH 二 рК^ + 1,5, а для оснований pH = р《в- 1$. Изменение pH подвижной фазы влияет на удерживание компонентов пробы, которое с повышением pH увеличивается при анионообменном разделении и уменьшается

при катионообменном т*е* происходит уменьшение силы растворителя при анионном и увеличение при катионном обмене* Особенно сильно влияет изменение pH раствора, происходящее вблизи значений рКа компонента разделяемой пробы,

В ионообменной хроматографии применяют следующие буферные растворы: ацетатный, фосфатный, цитратный, формиатный, аммиачный, боратный. Селективность разделения в ионообменной хроматографии зависит от концентрации и вида буферных ионов и органических растворителей, а также от pH среды. Ионообменное разделение проходит в пределах температур от комнатной до 60℃* Чем выше температура, тем меньше вязкость подвижной фазы и тем выше эффективность разделения. Однако при высокой температуре может оказаться недостаточной стабильность колонки или компонентов пробы. Многие ио- нообменники выдерживают температуру до 60℃, а некоторые полимерные катионообменники - даже до 80℃* Биохимические пробы принято разделять при низких температурах, часто при 4℃, хотя в современной ВЭЖХ при довольно быстрых процессах разделения вероятность разрушения компонентов пробы при 20-30℃ резко снижается. Повышение температуры может привести к снижению 月 для всех компонентов пробы, а снижение ионной силы подвижной фазы может приводить к увеличению этих параметров.

Вводимые количества пробы не должны превышать 5% сум* марной ионообменной емкости* Так, для соединений с молекулярной массой 200-500 предполагается введение около 5 0 мг пробы на 1 г полимерного сорбента. Желательно, чтобы вводимый объем образца не превышал 1/3 объема удерживания первого интересующего пика,

В подвижную фазу иногда добавляют органические растворители (метанол, этанол, ацетонитрил, диоксан), действие которых аналогично добавлению растворителей в обращенно-фазовой хроматографии: при увеличении их количества удерживание образца уменьшается, причем этот эффект более силен для менее полярных растворителей. Добавлением органических растворителей можно добиться также изменения селективности системы. Таким образом, в ионообменной хроматографии снижают время удерживания следующие факторы: повышение температуры; повышение концентрации буферного раствора; снижение степени ионизации вещества за счет изменения pH.

Практические рекомендиции+ Ионообменная хроматография в экспериментальном отношении - один из самых трудных видов ВЭЖХ, т.к* имеется много параметров, которые необходимо учитывать и контролировать [59-62].

Если анализ необходимо вести при pH ниже 2 или выше 7,5, то должна быть применена соответствующая анионная или катионная смола, а в остальных случаях - силикагель с привитой ионообменной фазой. Для анализа веществ с молекулярной массой до 2000 применяют ионообменники с неподвижной фазой, химически привитой к силикагелю с размером частиц 5-10 мкм, а при препаративном разделении можно применять полимерные пористые сорбенты, например, типа Даррум DA-X8. При разделении крупных молекул с молекулярной массой 2000 и более применяют слабоосновной ионит, привитый на крупнопористый силикагель, Подробные сведения о ионообменных материалах для хроматографии приведены в разд. 2-6.

Скорость элюента обычно устанавливают равную 1 мл/мнн, температуру 50℃ или комнатную, если контроль температуры неудобен, а pH подбирают так, чтобы компоненты были ионизированы. Так как в ионообменной хроматографии изотермы не параллельны, необходимо найти оптимальную для каждого частного разделения температуру, изменяя ее с инкрементом 10℃. Обычно придерживаются середины найденного интервала оптимальных температур, контролируя ее с точностью ±ГС

Для создания определенной величины pH и поддержания ее на необходимом уровне готовят соответствующий буферный раствор. Если это возможно, то буферный раствор подбирают таким образом, чтобы его функциональная группа была похожа на функциональную группу образца. Так, ацетатный буферный раствор приемлем для анализа карбоновых кислот, фосфатный 亠 для элюирования нуклеотидов* Большое значение имеет чистота буферного раствора, тчк* он не должен давать сигналов применяемого детектора, что особенно важно при работе в режиме градиентного элюирования* Чистота буферного раствора зависит от фирм-производителей, и даже разные партии одной фирмы могут различаться по составу* Каждая новая партия буферного раствора перед использованием должна проверяться в двух холостых хроматографических опытах. Второй опыт показывает, существуют ли вещества, задержавшиеся в колонке в процессе регенерации или в течение последних стадий предыдущего градиентного разделения. Хотя большинство ионообменных разделе- ний проводят в водных буферных растворах, иногда к ним добавляют органический растворитель (метанол, этанол) в количестве 3-10% для повышения селективности и улучшения растворимости проб* При этом концентрация растворителя не должна быть велика, чтобы не вызвать осаждения буферной соли, о чем может свидетельствовать появление течей в системе и увеличение сопротивления колонки.

При работе в градиентном режиме желательно, чтобы к концу разделения ионная сила буферного раствора повышалась* Начинают работать с концентрации буферного раствора ОД М, так как оптимизация разделения при работе с низкими концентрациями (0,001 М) отнимает много времени. Если при этих условиях вещества не удается удовлетв орите л ьн о разде- лить» то дальнейшее улучшение разделения происходит за счет снижения концентрации буферного раствора, изменения pH или температуры шаговым методом, что должно приводить к повышению значений 犬 и увеличению времен удерживания.

Часто в буферный раствор для регулирования ионной силы подвижной фазы добавляют нейтральные соли* Особой популярностью пользуется нитрат натрия, т*к. он не вызывает коррозии аппаратуры* Галогенид-ионы оказывают вредное влияние на нержавеющую сталь, и поэтому их лучше не применять*

Сравнивая сорбенты, предназначенные для ионообменной хроматографии, с сорбентами, применяемыми в других вариантах ВЭЖХ, можно отметить ряд недостатков у первых. Эти сор^ бенты менее эффективны и менее стабильны, а также хуже воспроизводимы, Улучшить эффективность разделения ионогенных соединений можно, повышая температуру до 60℃, изменяя pH, добавляя органический растворитель или переходя от ионооб' менной хроматографии к работе в режиме ион-парной или обращенно-фазовой хроматографии с использованием метода подавления ионов.

Повышение стабильности достигают за счет очистки образца, уменьшения температуры и pH, снижения количества органн* ческих растворителей.

Для повседневного анализа и лучшей воспроизводимости желательно использовать колонки, наполненные в лаборатории. Примеры разделения некоторых веществ на катионообменнике и анионообменнике приведены на рис* 40-41*

Ионная хромато^афия. Особым видом ионообменной хро* матографии^ применяемым для анализа органических и неорга* нических ионов, не поглощающих в УФ-области, является ионная хроматография [64], В этом методе ионообменное разделение ионов сочетают с их кондуктометрическим или спектрофотометрическим определением* Так как высокочувствительное ко аду ктометрическое определение возможно только при невысокой фоновой электропроводности потока жидкости, поступающей в детектор, фоновый электролит подвижной фазы предварительно удаляют пропусканием его через ионообменные смолы.

33

3

3

Рис* 40, Хроматограмма катехоламинов плазмы крови, полученная на колонке размером 250 х 4,6 мм с Нуклеосилом 5SA, подвижная фаза - ацетатцитратный буферный раствор (pH 二 5,2), содержащий 10% метанола; детектор - электрохимический (потенциал +0,7 В);

J - норадреналин; 2 - адреналин; 3 - допамин; 4 一 а-метнлдопамин

Рис* 4L Хроматограмма смеси солей, содержащих неорганические анионы, полученная на колонке размером 250 х 4,6 мм с Нуклеосилом I0SB; подвижная фаза - 0,03 М раствор салицилата натрия (pH = 4*0)* скорость потока 0,5 мл/мин; детектор - рефрактометр； объем пробы 20 мкл:

/ - фосфат; 2 一 хлорид; 3 - нитрат; 4 - сульфат

Предложены два основных метода ионной хроматографии:

Двухколоночная ионная хроматография, основанная на компенсации (подавлении) электролита, содержащегося в элюенте для разделения смеси ионов, с помощью второй ионообменной колонки, расположенной между детектором и разделительной колонкой, Этот метод и был изначально назван ионной хроматографией.

Принципиальная схема установки для ионно-хроматографического анализа катионов показана на рис. 42+

Вещества разделяются на катинообменной колонке 4 по катинообменному механизму и попадают в так называемую подави^ тельную колонку 5 со смолой в ОН"-форме, где происходит нейтрализация подвижной фазы и удаление электролита из элюента. Анализируемые вещества выходят из колонки 5 в деионизированной

Рис. 42, Схема двухколоночной ионно-хроматографической системы:

/ - источник элюента; 2 - насос; 3 - устройство ввода пробы; 4 - разделяющая колонка; 5 - подавительная колонка; 6 - элект- рокондуктометрический детектор

воде и детектируются электрокондуктометрическим детектором 6* Сигнал кондуктометра 6 поступает на самописец или интегратор. Аналогично анализируются анионы, однако в подавительную колонку помещают ионообменяик большой емкости б Н+-форме. Подавительную колонку приходится часто регенерировать, поэтому отношение объемов, пропущенных через колонку 5, к объемам, пропущенным через колонку 4* должно быть меньше 10, Предложены различные схемы разделения для ионной хроматографии и разные варианты заполнения разделительной и подавительной колонок.

Существуют два способа детектирования - прямой и косвенный, В прямом способе элюент перевод дят в соединение с низкой электропроводностью, а определяемый ион - в высокопроводящее соединение» и детектирование проводят по положительным пикам. В косвенном способе, наоборот, элюент пере

водят в высокопроводящее соединение, а определяемый ион 亠 вводят в высокопроводящее соединение, а определяемый ион 亠 внизкопроводящее и детектируют по отрицательным пикам.

водят в высокопроводящее соединение, а определяемый ион 亠 в

водят в высокопроводящее соединение, а определяемый ион 亠 в

Принцип двухколоночного определения ионов можно рассмотреть на примерах определениях неорганических анионов （СЬ, NOj） и катионов щелочных металлов （Na+T К） Наиболее распространенными элюентами для определения анионов являются разбавленные растворы солей угольной кислоты, например NaHCO^ Анионит в разделяющей колонке находится в HCOJ -форме. По давляющей системой служит колонка, заполненная катионообмен- ником высокой емкости в Н+-форме. В этом случае в разделяющей и подавительной колонках имеют место следующие процессы

Разделяющая колонка:

RHCO3+Na++（Cr, NO；）^ R-Na+H2CO3 +

Подавительная колонка:

R-H+Na' + HCO； ->R-Na+H2coз，

R-H+Na* + （C「，N0；）TR-Na+H+ + （C「，NO；）.

Определяемые анионы попадают в кондуктометрический детек-

тор в виде сильных кислот (НС1, HNQ^), имеющих высокую электропроводность на фоне слабой угольной кислоты Н2СО3, Эквивалентная электропроводность Н+ выше эл ектр опроводности катионов, поэтому такая система детектирования обеспечивает максимальную чувствительность определения*

При определении катионов щелочных металлов в качестве элюента используют разбавленный раствор азотной кислоты. Разделяющая колонка заполнена катионообменником в Н+-форме* Подавительная колонка заполнена анионообменни- ком высокой емкости в ОН~-форме, В колонках протекают следующие процессы.

Разделяющая колонка;

R-H+NO； + (Na\K+)->R-(Na.K) + NO3 + H\

Подавительная колонка:

R-ОН+ Н++ NO； тR-NO3+ HQ

R」0H+(№+K) + N5TR-N(V0H- + (Na+K).

В этих уравнениях R означает матрицу ионообменного адсорбента с ионогенными группами.

Катионы щелочных металлов детектируют в виде гидроокси- дов, имеющих высокую электропроводность на фоне деионизованной воды, что обеспечивает максимальную чувствительность определения. Типичные хроматограммы смесей неорганических анионов и катионов щелочных металлов приведены на рис. 43, 44.

Емкость ионообменников, которыми заполняют разделяющие колонки для двухколоночной ионной хроматографии, колеблется от 0,02 до 0,1 мэкв/г+ Для определения катионов могут быть использованы поверхностно-модифицированные катионообмен- ники как на полимерной основе, так и ва основе силикагеля с функциональными сульфогруппами. Однако для определения анионов адсорбенты на основе силикагеля непригодны* Это связано с тем, что растворы солей слабых кислот, которые используют как элюенты в двухколоночной ионной хроматографии анионов, имеют pH выше 8. Силикагель в этих условиях разрушается, поэтому предпочтение отдается сорбентам на основе сополимеров стирола и дивинил бензола или полиметакрилата,

О дя около но чная ионная хроматография основана на использовании электролита с невысокой эл ектропров одн остью * В этом случае подавительная колонка отсутствует [63]. Одноколо-

Рис* 43* Хроматограмма смеси солей, содержащих неорганические ани* оны, полученная с карбонатным элюентом:

；_ фторид; 2 - хлорид; 3 - нитрит; 4 - фосфат; 5 — бромид; 6 - нитрат; 了 - сульфат

Рис. 44* Хроматограмма смеси солей, содержащих неорганические катионы, полученная с карбонатным элюентом:

/ - литий; 2 - натрий; 3 - аммоний; 4 - калий; 5 - рубидий; б - цезий

ночный вариант ионной хроматографии предложили в 1979 п Гьерде, Фритц и Ш муки ер [64] для определения анионов* В предложенном варианте (рис. 45) кондуктометрический детектор был непосредственно соединен с разделяющей колонкой.

Для сохранения высокой чу ветвите л ьн ости определения, которая в двухколоночном варианте достигается благодаря исполь- зованию системы подавления, в одноколоночном варианте используют элюенты с очень низкой электропроводностью. Это чаще всего анионы ароматических кислот, имеющих низкую эквивалентную электропроводность, но в то же время обладающих

высоким сродством к анионообменнику, что позволяет достичь быстрого и селективного разделения определяемых анионов* В качестве элюентов применяют либо растворы солей ароматических кислот с концентрацией (1-5) * 10-3 М, либо растворы самих кислот с такой же концентрацией* Величина pH элюентов изменяется от 3 до 8, Первоначально одноколоночный вариант был предложен для к ондуктометр и ческ ого дете ктирова ния, позднее его стали широко использовать с косвенным УФ [65^67] и электрохимическим [68] детектированием,

К преимуществам одноколоночной ионной хроматографии по сравнению с двухколоночной следует отнести следующие особенности:

более высокую эффективность разделения, которая достигается за счет уменьшения мертвого объема системы, а также благодаря возможности использовать сорбенты на основе сили^ кагеля;

простоту аппаратуры;

отсутствие необходимости периодически регенерировать подавляющую систему;

возможность использовать различные детекторы;

менее жесткие требования к химической устойчивости сорбентов и коррозионной стойкости хроматографической системы;

более широкий выбор элюентов.

Однако пределы обнаружения ионов в одноколоночной ионной хроматографии обычно выше, чем в двухколоночной. Поэтому при определении очень малых концентраций (менее 0,1 мг/л) предпочтение в большинстве случаев отдается двух кол о ночному варианту. Использование электрохимического детектора позволяет снизить пределы обнаружения некоторых ионов по сравнению с двухколоночным вариантом, но при этом теряется универсальность определения. Кроме того, недостатком одноколоночного варианта является более узкий по сравнению с двухколоночным диапазон линейности градуировочных характеристик детекторов. Сравнительно узкий интервал pH (3-8) элюентов для одноколоночного определения позволяет проводить разделение на ионообменниках как на полимерной основе, так и на основе силикагеля.

Первые сорбенты на полимерной основе для ионной хроматографии были синтезированы Фритцем с сотрудниками [63]* Основой сорбентов был макропористый сополимер стирола и дивинилбензола, на поверхность которого прививали функциональные аммонийные группы. Емкость таких анионообменни- ков составляла 0,007-0,07 ммоль экв/г* Такая низкая емкость сорбентов необходима для достаточно быстрого (до 20 мин) раз-

Рис- 45. Схема одноколоночной ионно-хроматографической системы: ，一источник элюента; 2 - насос; 5 - устройство ввода пробы; 4 - разделяющая колонка; 5 - детектор

Рис* 46. Разделение смеси солей, содержащих неорганические анионы, на анионообменном адсорбенте TSK GEL 620. Элюент 1,3 мМ Ма^В^О? с 5,8 мМ Н3ВС5 и 1,4 мМ глюконата калия (pH 8,5) в смеси воды и ацетонитрила (88 : 12). Скорость потока 1,2 мл/мин; концентрация анионов 5To мкг/мл. Детектирование кондуктометрическое:

- фторид; 2 - хлорид; 3 - нитрит; 4 - бромид; 5 - нитрат; 6 - фосфат; 7 一 сульфат

деления смесей анионов элюентами с очень низкой концентрацией. Однако эффективность разделения на этих сорбентах низка (1000-2000 теоретических тарелок на метр) [69], Гораздо более высокая эффективность разделения (до 20000 т.т./м) была получена на сорбенте TSKGel 620 японской фирмы Тоуо Soda, синтезированном на основе полимерного макропористого геля. Размер частиц этого адсорбента около 10 мкм, а его обменная емкость 0,03 ммоль экв/г. На этом сорбенте в течение 15 мин полностью разделяются семь неорганических анионов (рис, 4б)+ Для разделения катионов используют поверхностно сульфированные катионообменники на основе сополимера стирола и дивинил бензола с размером частиц 20 мкм и емкостью 0,02-0,03 ммоль экв/г [70].

Большее распространение в одноколоночной ионной хроматографии анионов получили адсорбенты на основе силикагеля с размером частиц 6-10 мкм и обменной емкостью 0,1-0,3 ммоль экв/г+ Элюирование на этих адсорбентах проводят, как правило» растворами фталевой, бензойной, салициловой кислот или их солей, Анионообменники на основе силикагеля характеризуются высокой для ионной хроматографии эффективностью разделения, Так, для адсорбентов фирм Vydac и Wescan (США) эффективность составляет 16 000 т*т/м, а для адсорбента Toyo Soda (Япония) 2500 т*т./м.

Синтез сорбентов для ионной хроматографии достаточно затруднителен, т*к* к ним предъявляются довольно жесткие требования:

L Сорбент должен иметь очень низкую ионообменную емкость (0Ф001Ч),1 мэкв/г). Это связано с использованием кондуктометрического детектирования, при котором необходимы элюенты с концентрацией менее 0,01 М. Для эффективного хроматографического разделения с такими разбавленными элюентами требуются ионообменные сорбенты, с очень низкой обменной емкостью.

Диаметр зерен сорбента не должен превышать 50 мкм, и чаще составляет всего 5-10 мкм* Кроме того, дисперсия размеров зерен сорбента должна быть невелика (разброс размеров зерна не более 1—5%)* Только в этом случае можно достичь высокой эффективности разделения*

Зерна сорбента должны обладать высокой механиче^ ской прочностью и устойчивостью к давлению, которое при- ходится применять при работе с мелкодисперсной неподвижной фазой*

Сорбент должен обладать высокой химической устойчивостью по отношению к элюирующему раствору* Он должен сохранять стабильность в широком интервале pH*

Этим требованиям удовлетворяют поверхностно-пористые (пелликулярные) ионообменники, которые состоят из твердого инертного ядра, покрытого тонким слоем ионита. На таких сор* бентах быстро устанавливается равновесие, так как диффузия в тонкую ионообменную пленку протекает достаточно быстро, В результате хроматографический процесс может быть сущест- венно ускорен* Кроме того, эти сорбенты обладают очень низкой ионообменной емкостью. Работы по синтезу и использованию поверхностно-пористых ионообмеиников появились за несколько лет до опубликования первых статей по ионной хроматогра- фии. Однако именно в ионной хроматографии эти сорбенты нашли самое широкое применение (рис. 47).

Рис. 47. Схематическое изображение частиц ионообменных адсорбентов с малой обменной емкостью: а - поверхностно-слойный (пеллику- лярный) адсорбент: / - сорбционный слой; 2 - неактивное и непроницаемое ядро; б - центрально-лок ал изованный сорбент: / - активное ядро； 2 - проницаемая для жидкости инертная оболочка

Анионообменники. Продажные анионообменники, используемые в качестве неподвижной фазы в ионной хроматографии, приведены в табл* 8* Наиболее распространенными анионооб- менниками на полимерной основе являются сорбенты фирмы Дайонекс (США). Ядро этих сорбентов представляет собой сополимер стирола и дивинилбензола. Его поверхность вначале сульфируют, а затем полученный поверхностно сульфированный ка- нионит обрабатывают очень мелкими частицами (0J-0,5 мкм) анионообменного латекса. Под действием электростатических сил частицы латекса притягиваются к поверхности смолы и образуют тонкую оболочку вокруг ядра* Таким образом, получающийся сорбент состоит из трех различных слоев: внутреннего ядра, сульфированного слоя и слоя анионообменных частиц. Преимущество поверхностно-пористых анионообмеиников перед обычными состоит в резком снижении диффузионного сопротивления, что приводит к ускорению обмена ионов элюента и образца и к значительному увеличению эффективности разделения. Анионообменники на полимерной основе стабильны при высоких значениях pH (более 9).

Анионообменный слой на поверхности зерна сорбента может быть закреплен также путем химического взаимодействия соответствующих ионогенных групп с инертным ядром. Такой способ синтеза анионообмеиников также используется достаточно широко [71-73]. Инертную основу анионообмеиников со ставляют смолы XAD*l, XAD-2 и XAD-4 фирмы Ром энд Хаас (Германия). Эти смолы представляют собой сополимеры стиро-

Таблица 8

Анионообменники для ионной хроматографии

Наименование

Основа

Обменная емкость. Ммоль экв./г

Размер частиц, мкм

Изготовитель

Bioironik BTIAN

Стирол-дивн нил бен ^>л

0a

101

Biotronik BTIIAN

Тоже

0т02

10

1

Dionex Anion

■03

25

2

Dionex HWGAS

15

2

ХИКС

Оксиал кил мета крнлат

ОТО2-ОРОЗ

2g5

3

Interactton Ton-100

Гидрофильный полимер

0J

10

4

Nudeosil 10-SB

Силикагель

1#

5

Partisil 10-SAX

То же

ОХИ

10

6

PRP^XIOO

Стирол -днвинллбенэол

0,20

(О

7

CAB-120

То же

ом

20-25

8

TSK-GellC AnionPW

Полимета крилат

0,03

10

д

TSK-GdIC AnionSW

Силикагель

0,4

5-8

9

TSK-Gel 620

Поливиниловы й

0,03

9

9

Vydac 302 SC

полимер Силикагель

0J

ЗСМ4

]0

Vydac 302 IC

То же

0」

10^20

10

Vydac 301 SB

То же

0J

3(М0

(0

Waters IC-РАК Anion

Полиметакрилат

(ДО

10

11

Wescan Anion

Силикагель

12

Wescan Anion/HS

Тоже

12

Wescan Anion/R

То же

12

Wescan Anion/R-HS

То же

12

Zipax SAX

Силикагель, покрытый

0,01

25-30

13

полиметакрилатом

Изготовитель: 1 -Biotronik Wissen$chaii]iche Cerate GmbH., Maintal, Germany; Dionex Corpotation, Synnyvale, CA, USA: 3 - Институт химии Акяц- наук Эстонии» Таллинн; 4 - Interaction Chemicals, Mountain View, CAT USA; 5 - Marcherey-Nagel, Dliren, Germany; 6 - Whatman, Jnc.T 7 - Hanrtikont Renot NVT USA; 8 - Институт геохимии н аналитической химии РАН* Москва* Россия; 9 - Toyo Soda Manufacturing Cd* Tokyo, Japan; 10 - Separation Group, Hesperia, CA, USA; 11 - Walers, Division of Millipore, Milford. MA, USA; t2 - Wescan (nstruments Inc., Santa Clara, CA. USA; 13 - Du Pont de Nemours and Co, 1псгъ Wilmington^ Delaware, USA,

ла и дивинилбензола с высокой плотностью поперечных связей. Они имеют макросетчатую структуру и сохраняют ее даже пос* ле дегидратации. Наиболее эффективные сорбенты для ионной хроматографии получены на основе смолы XAD」* Ее превра* щают в анионообменник путем хлорметилирования и последующего аминирования третичными аминами. В мягких условиях при небольшой продол жите л ьн ости хлорметилирования получают анионообменники с различной, но всегда малой обменной

емкостью. Синтез проводят по следующей методике* Частицы смолы XAD-1 размалывают и просеивают через сито. Пыль удаляют, а фракцию 40-60 мкм сушат при 60℃ в течение ночи. В закрывающийся сосуд помещают 2」f безводного хлорида цинка, 12,0 мл метиленхлорида, 9,6 мл хлорангидрида уксусной кислоты и 6,0 мл метилаля и встряхивают сосуд до полного растворения хлорида цинка. При проведении реакции хлорметили- рования 1,5 мл этого раствора шприцем переносят в колбу, в которую помещены 5 г смолы XAD" и 60 мл метиленхлорида. Содержимое колбы выдерживают при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 15-120 мин (степень хлорметилиро- вания зависит от времени). Останавливают реакцию добавлением воды Затем частицы отфильтровывают, промывают водой и метанолом и сушат на воздухе. Ддтя проведения аминирования к частицам полимера, подвергнутым хлорметилированию, добавляют большой избыток 25%-ного раствора триметиламина в метаноле или в воде и оставляют на ночь. Полученный сорбент промывают 1 М водным раствором изопропанола, после чего сушат в течение ночи при 60℃. Установлено, что при проведении хлорметилирования в течение 15; 30; 60 и 120 мин получаются анионообменники с емкостью 0,009, 0^012, 0,017 и 0^021 ммоль экв/гт соответственно.

Кроме того, в качестве анионообменников для ионной хрома* тографии предложено использовать так называемые центрально-локализованные сорбенты, которые получают путем удаления большей части ионогенных аминогрупп из зерна высокоосновного полистирольного анионообменника АВ・17, имеющего высокую обменную емкость (3,5 ммоль экв+/г) [74, 75]. Снижение емкости сорбента до 0,05 ммоль экв7г достигается в результате его обработки концентрированной серной кислотой в течение 2 ч при температуре 150℃ (рис* 470.

Анионообменники на основе силикагеля выпускают фирмы Веская (США), Тойо Сода (Япония) и др* Эти сорбенты представляют собой органические вещества с четвертичными аммониевыми ионогенными группами, химически связанные с поверхно* стью пористого силикагеля* Такие сорбенты обладают высокой эффективностью разделения* К их недостаткам можно отнести меньшую по сравнению с полимерными сорбентами химическую устойчивость. Силикагель может разрушаться при использовз' нии элюентов с pH более 8 и менее 2* Поэтому такие анионообменники используются Б основном в одноколоночной ионной хроматографии*

Катиоаооменники для ионной хроматографии (табл* 9) представляют собой сорбенты поверхностно-пористого типа. Как и

Таблица 9

Катионообмен ники для ионной хроматографии

Наименование

Основа

Обменная емкость, ммоль зкв,/г

Размер частиц, мкм

Изгото* витель

Biouonik ВТ IV КА

Стирол-дивинилбе нзол

0Q16

10

1

Dionex Cation

Стйрол-дивинилбензол

0咫

20-30

2

Dionex HPIC-CS

Полимер

13

2

Nucleosil SA-10

Силикагель

1,0

10

5

Partisil 10 SCX

Тоже

0,01

10

6

TSK-Gd IC-Cation

Поливиниловый

0Ф0В

11

9

полимер

Vydac401 TP

Силикагель

10

10

Vydac IC 400

Тоже

—

—

10

VydacCX

То же

0J

20-44

10

Waters 1C-PAK

Стярол-дивниплбензол

—

10

11

Wescan Cation

То же

—

12

Wescan Cation/HS

То же

—

12

Zipax SCX

Силикагель

0,005

I5T7

13

Примечание: *См, табл. &

анионообменники, их получают на основе полимерной матрицы или силикагеля*

Катионообменники на основе полимерной матрицы готовят обработкой полимерных частиц концентрированной серной кислотой. В результате на поверхности частиц образуется тонкий слой сульфогрупп. Обменная емкость катионообменника связана с толщиной этого слоя и зависит от типа смолы, диаметра частиц, температуры и времени нагревания с серной кислотой. Методика получения таких сорбентов описана в первой статье по ионной хроматографии [66]* Длина диффузионного пути в поверхностнопористом катионообменнике низкой емкости меньше, чем в обычной катионообменной смоле, так как инертное гидрофобное ядро сорбента ограничивают доступ катионов в его объем. Это приводит к ускорению массообмена катионов и, следовательно, к повышению эффективности разделения. Кроме того, благодаря жесткости ядра частицы сорбента обладают меньшей сжимаемостью* Поэтому с такими катионообменниками можно работать при больших давлениях, и, соответственно, при больших скоростях потока, чем с обычными смолами. Катионообменники низкой емкости на основе полимерной матрицы устойчивы при pH = 1-14 и практически не набухают* Катионообменники на основе силикагеля получают сульфированием в мягких условиях поверхностно-пористых силикагелей. Эти сорбен-

Таблица 10

Комплексообразующие ссфбенты для ионной хроматографии

Хелатообразующая группа

Основа

Разделяемые ионы

Литература

Иминоднуксусная кислота

Старолдиви* нилбензол

Cug U(V])tlb(IVXZf<lV)

口句

Тиогликолевая кислота

То же

AMUlh Ag(l), HgdD, Bidll), Cd(Il). Cu(U)

[77]

Амиды

То же

Au([][)T платиновые металлы

[78]

Дитизон н дегид^ ротизан

Тоже

Bi(lIl)T Cd(ll)p SbtlllX S 風 ID* ZnQD* CKVIK FedllX Pb(ll>,Cu(l!X Audll),

Ag(l). платиновые металлы

口 9]

8-Оксихп ноли»

Силикагель

Mn(IlhCd(ll)rZn(ri)t Co(IJ)h РКП), Ni(U)

[80]

Крэун-эфиры

То же

Катионы щелочные металлов, неорганические анионы

⑻.附

4-(Пирйдил-2- аэо>резорцнн

Целлюлоза

尺⑴工Cug. U(V1)

居3, S4J

Бие(салицилалъ- дегид)-этш1ен- диамнн

Тоже

RaULCMH)

[83,84]

ты обладают всеми достоинствами, свойственными катионооб- менникам на основе полимерной матрицы. Однако они устойчивы только при pH 2-8, что ограничивает область их применения.

Комп лексообраэую щи е сорбенты. Селективность разделения ионов многих металлов на катионооб мен никах невысока вследствие малого различия их коэффициентов распределения. Этот недостаток можно устранить введением в сорбент подходящих комплексообразующих групп* В этом случае селективность определяется не различием констант ионного обмена, как для катионообменников, а различной прочностью связи определяемых ионов с комплексообразующими группами. Наиболее широко комплексообразующие сорбенты используют для разделения ионов переходных и тяжелых металлов [76-84]. Используемые в ионной хроматографии хелатообразующие сорбенты представлены в табл. 10, а на рис* 48 приведен пример разделения ионов переходных металлов на колонке с хелатообразующим асорбентом.

Разделение на комплексообразующих сорбентах может осуществляться и по ионообменному механизму. Таким образом разделяются анионные хлоридные комплексы платиновых металлов на сорбентах с амидными или дитизоновьгми функциональными группами, которые благодаря наличию протонированного азота обладают анионообменными свойствами [78, 79]*

Рис 48. Хроматограммы смесей солей, содержащих щелочноземельные, переходные к тяжелые металлы, на колонках с комплексообразующим сорбентом: а - колонка размером 250 х 3 мм, заполненная сорбентом с иминодиацетатными группами; элюент - 7 мМ HNO3, расход 1 мл/мин; косвенное кондуктометрическое детектирование: / - магний； 2 - кальций; 3 - марганец; 4 - барий; 5 - бериллий; 6 - кобальт; 7 - кадмий; 8 - цинк: 6 - колонка размером 50 х 3 мм, заполненная комплексообразующим сорбентом амидоксим; элюент - 5 мМ щавелевая кислота (pH 2,2), расход 1 мл/мин; фотометрическое детектирование с послеко- лоночной реакцией с мпра-амннорезоринн0M (PAR): / - кадмий; 2 - свинец; 3 - кобальт; 4 - цинк; 5 - никель; 6 - медь [VoJoshchik L№* Litvina M+L+, Rudenko BA, £ Chromatogr. A* 1994, vol. 671, pp 51-54$ 1995, vol 706, pp, 315-319]

На сорбентах с привитыми краун-эфирами катионы щелоч^ ных металлов разделяются по механизму комплексообразования. В связи с тем, что комплексы щелочных металлов с краун-эфи- рами заряжены положительно, сорбент может разделять неорга* нические анионы по ионообменному механизму [81, 82].

В ионной хроматографии предпочтение отдается ионообменным сорбентам. Однако высокая селективность и эффективность разделения тяжелых и переходных металлов на хелатообразующих сорбентах позволяют надеяться на их более широкое использование, особенно для определения катионов.

Ряд вопросов, связанных с применением различных вариантов ионообменной и ионной хроматографии для анализа и препаративного разделения веществ, способных к ионизации в растворах, весьма подробно рассмотрен в монографиях и обзорах [85 亠94].

25 ПОДВИЖНЫЕ ФАЗЫВ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Процессы жидкостной хроматографии отличаются от газовой хроматографии прежде всего в том отношении, что в них имеет место активное взаимодействие подвижной жидкой фазы как с неподвижной фазой (адсорбентом), так к веществами, подвергаемыми хроматографическому разделению.

Подвижная фаза в жидкостных хроматографических системах выполняет двоякую функцию* С одной стороны, она подобно подвижной фазе в газовой хроматографии служит для транспорта десор б и рованн ых молекул по колонке. С этой точки зрения представляются наиболее важными такие физические свойства подвижной фазы, как ее вязкость или летучесть и др. С другой стороны, в отличие от газохроматографических систем, подвижная фаза в жидкостной хроматографии играет активную, химическую по существу роль. Молекулы подвижной фазы взаимодействуют с другими компонентами системы: молекулами разделяемых веществ и молекулами неподвижной фазы. Фактически константы сорбционного равновесия в системе определяются характером подвижной фазы ничуть не менее, чем характером сорбента* Более того, во многих случаях компоненты подвижной фазы способны к прочной сорбции, что приводит к образованию на поверхности сорбента слоя адсорбированных молекул, суще-

ственно изменяющего свойства неподвижной фазы. Поэтому вторая, и более важная> функция подвижной фазы - это регулирование констант равновесия и величин удерживания. Возможности регулирования удерживания с помощью подвижной фазы необычайно широки. Нередко заменой одного растворителя другим можно изменить коэффициент емкости в 1000-10000 раз! Однако для практической хроматографии пригоден лишь довольно узкий диапазон величин к - примерно между 1 и 20. Слишком малые значения к непригодны, так как в этой области резко возрастает вероятность взаимного перекрывания пиков. Наоборот. при слишком больших константах сорбции к разделение требует значительного времени, к тому же увеличивается риск не обнаружить более прочно сорбирующиеся компоненты смеси. Таким образом, для решения каждой конкретной задачи состав неподвижной фазы должен быть тщательно подобран с точки зрения физических и химических свойств ее компонентов.

Современный хроматограф представляет собой весьма чув- ствительный комплекс механических, оптических, электрических и химических систем, и его надежная работа во многом зависит от свойств и качества используемых растворителей. Наличие в подвижной фа^е механических примесей в первую очередь отрицательно сказывается на работе насоса, вызывая нечеткую работу клапанов и способствуя износу плунжеров и уплотнений, Твердые частицы, накапливаясь на фильтре у входа в колонку, приводят к постепенному увеличению ее сопротивления, невоспроизводимости рабочего давления либо времени удерживания, особенно при использовании насосов постоянного давления. Поэтому перед использованием подвижная фаза должна быть профильтрована через керамические фильтры с размером пор около 0*5 мкм. Как правило, повторная фильтрация осуществляется уже в хроматографе при отборе растворителя из резервуара. Надежная работа насоса также сильно зависит от летучести используемых растворителей* При резком понижении давления в цилиндре насоса при всасывании даже предварительно дегазированные растворители иногда образуют паровые пузыри, нарушающие надежную работу клапанов* Этот эффект наиболее выражен у таких легколетучих растворителей, как пентан, ацетон, метиленхлорид и диэтиловый эфир. Кроме того, подвижные фазы, содержащие эти вещества, могут изменять свой состав в процессе их использования из-за испарения, что приводит к невоспроизводимости величин удерживания. В связи с этим в практической работе следует избе- гать растворителей, кипящих при температуре ниже 60℃* С другой стороны, для менее летучих растворителей характер-

на более высокая вязкость, что отрицательно отражается из эффективности разделения и вынуждает использовать большие давления для достижения желаемой скорости разделения, Пре・ дельно допустимая вязкость подвижной фазы зависит от размера частиц сорбента и качества заполнения колонки. В качестве ориентира можно указать величину 1,5 сП* При такой вязкости и линейной скорости подвижной фазы около 0,4 см/сек давление на входе хорошо заполненной колонки не должно превышать 200 кг/см2. Если все же обстоятельства вынуждают использовать более вязкие подвижные фазы, колонку следует термостатировать при повышенной температуре (например, при 60°С)・ Определенные требования к растворителям предъявляет и используемый метод детектирования. При применении детекторов, основанных на поглощении света, подвижная фаза должна быть прозрачной в избранной спектральной области. Набор растворителей» прозрачных для УФ-излучения вплоть до 190-220 нм. довольно велик. Однако в каждом конкретном случае этот показатель определяется не столько физическими свойствами основного вещества, сколько содержанием приме- сей, поглощающих свет в УФ-диапазоне. Так как содержание таких примесей часто не нормируется даже для растворителей квалификации ^химически чистый^, рекомендуется применять растворители специальных квалификаций '*для жидкостной хроматографии** или адля спектроскопии^* При отсутствии готовых растворителей необходимого качества их можно очистить в лаборатории с помощью методов, изложенных, например, в [95,96]. Чувствительность рефрактометрического детектора зависит от разности коэффициентов преломления подвижной фазы и анализируемых соединений. На этом основании для большинства случаев можно рекомендовать подвижные фазы с минимальными величинами коэффициентов преломления. Характеристики растворителей, наиболее важные с хроматографической точки зрения, приведены в табл. 1L

Растворители, применяемые в ВЭЖХ, различаются по прочности сорбции и силе взаимодействия с разделяемыми веществами. Одни из них способны смыть с колонки лишь слабосвязанные сорбаты, другие - вызывают десорбцию почти любых молекул. Ясно, что состояние равновесия в системе в конечном итоге определяется балансом межмолекулярных взаимодействий. В частности. молекулы подвижной фазы могут взаимодействовать с молекулами разделяемых веществ( Образующиеся ассоциаты, даже и очень нестойкие, почти неизбежно имеют сродство к сорбенту, отличающееся от сродства неассоциированных молекул. В результате ассоциации сорбция может стать менее или более

Таблица 11

Свойства некоторых раствормт^лейдля высокоэффективной жидкостной хроматографии

Растворитель

Температу* Плотность Вязкость, 哈 кнпем 11PH 20 笛 сП, 25 К

Коэффициент преломления

Предел прозрачности для УФ-светат нм

Ацетон

56

Ацетонитрил

82

Бензол

80

Вода

100

Гексан

69

Гептан

98

Дибутиловый

142

эфир

Диметилформамид

153

Диоксан

ЮТ

Дихлорэтан

83

Диэтпловый эфир

35

Иэооктан

99

Изопропиловый

68

эфир

Метанол

Метиленхлорид

Метилэтялкетан

Метил целлозоль

125

Пентан

Проланол-1

Пропанол-2

Тетрагидрофуран

Толуол

110

Триэтиламин

Уксусная кислота

118

Хлороформ

Циклогексан

Ч етьгрех хлорис*

тый углерод

Этанол

78

Этилацетат

77

Этиленгликоль

182

а а а 1 a Q а

о 1 1 о о о

93673099735980

--君 9Q---5 力 Q*-'

9 0 0

7 9 1

L

储歌0,30鼠

^ ^ ^ ^ ^ ^ Lo о

4 18 0 2 65603 切 о

*43&29953159 5 о о о loll о о о it о о о

w ^ ^

28202 0 9 5

'■4^

05545480337 & 588odK97425

43334433444

о о о о € 5 о 8 5 в 8 7 о 53906-0^025 -о^ою-0 0 6 0 з8992 612192 &321ООО18 ^3406 — 51

312Z112 222212 223222222 2222 222

прочной. С другой стороны, молекулы подвижной фазы могут конкурировать на поверхности сорбента с молекулами разделяе* мых соединений, вытесняя последние с активных центров и способствуя смещению равновесия в сторону десорбции.

В жидкостной хроматографии наиболее важны дисперсионное и дипол ь-дипол ьн ое межмолекулярные вз а и модействия, образование водородных связей, электростатическое взаимодейст-

вме между разноименно заряженными ионами. Для определения общего характера влияния того или иного растворителя на удерживание используется понятие элюирующей силы* Элюирующая сила подвижной фазы 一 это ее способность вступать в такие межмолекулярные взаимодействия с компонентами хроматографической системы, которые способствуют десорбции разделяемых, соединений и более быстрому перемещению хроматографических зон* Конкретные физико-химические механизмы влияния растворителя на сорбционное равновесие, различные в различных режимах ВЭЖХ, рассмотрены ниже.

Для выполнения транспортной функции в подвижной фазе пригодны любые жидкости, достаточно хорошо растворяющие компоненты пробы* Выбор таких жидкостей довольно широк. Однако поиск растворителей подходящей элюирующей силы может осуществляться только методом проб и ошибок. Многократного увеличения гибкости метода ВЭЖХ, обогащения его возможностей достигают за счет применения в качестве подвижных фаз смесей растворителей. Принцип составления таких смесей прост. Необходимо взять два индивиду ал ьных растворителя: один с заведомо недостаточной элюирующей силой, другой - с заведомо избыточной. Из этих двух основных растворителей можно приготовить смеси, которые будут обладать подходящей элюирующей силой*

В соответствии со сложившейся практикой при описании со* става подвижных фаз концентрация более полярного растворителя Б выражается в объемных долях и далее обозначается как с (%). Символом С в необходимых случаях обозначается мольная концентрация растворителя Б,

Элюирующая сила растворителя является экспериментально определяемым интегральным параметром, отражающим некоторую усредненную способность данного вещества к межмолекулярным взаимодействиям различной природы. Выражение ^подходящая сила pacтвopйтeля,^ означает, что на данном сорбенте данному сорбату соответствует приемлемое значение 匕 В то же время ясно, что для разделения двух соединений подойдет не каждая из подвижных фаз, обладающих необходимой элюирующей силой. Часто на хроматограммах отдельные пары пиков имеют недостаточное разделение* В таких случаях говорят, что селективность системы недостаточна. Селективность системы, в которой используется данная неподвижная фаза, в первую очередь определяется селективностью используемой подвижной фазы, ее способностью к специфическим взаимодействиям с сорбатами, обладающими определенными особенностями молекулярного строения. Характер элюирующей силы данного растворителя

5+ Руденко Е.А. [ 29

или смеси растворителей по отношению к сорбатам различного строения может быть различным. Селективность, как и элюиру* ющая сила бинарной подвижной фазы, определяется прежде всего природой ее более полярного компонента.

Описанный подход к подбору состава подвижных фаз для ВЭЖХ в настоящее время общепринят* В состав почти любой подвижной фазы входит компонент, сорбционно менее активный, выполняющий преимущественно транспортную функцию, и компонент, сорбционно активный, служащий для регулирования равновесия. В соответствии со сложившейся практикой растворители первого рода обозначают буквой А, а растворители второго рода -Б. Естественно, роль одного и того же компонента в различных подвижных фазах и в зависимости от характера неподвижной фазы различна. Например, в подвижной фазе гексан - хлороформ последнее соединение выступает в качестве растворителя Б, а в системе хлороформ 亠 метанол - как растворитель А*

С целью повышения селективности разделения часто используют подвижные фазь( более сложного состава^ чем бинарные смеси А + Б: например А + Б1 + Б2 или даже А + Б1 + Б2 + ВЗ. Во многих случаях это приводит к улучшению разделения, хотя, судя по опубликованным в литературе методикам разделения, применение трех- или четырехкомпонентных подвижных фаз редко бывает оправдано, особенно, если разделяемая смесь не слитком сложна* Необходимость использования, например, трехкомпонентного элюента может возникнуть лишь при анализе трехкомпонентных и более сложных смесей.

Приведенная общая тактика выбора состава подвижной фазы непосредственно применима лишь в простейших случаях, в отсутствие затруднений, связанных с особым химическим характером разделяемых веществ, При изучении высокополярных и ионогенных соединений зачастую не удается найти удовлетворительного решения этим простейшим способом, т*к・ для них характерна тенденция образовывать асимметричные, аномально уширенные хроматографические зоны. Устранить ряд нежелательных явлений, а также изменить в нужном направлении свойства применяем мого сорбента можно с помощью специфических модификаторов 一 добавок, вводимых в подвижную фазу в небольших количествах (0,01-2%) с целью изменения термодинамических характеристик процесса. Действие модификаторов может быть связано с различными физико-химическими процессами* Они могут блокировать наиболее сорбционно-активные центры неподвижной фа^ зы, повышая тем самым ее химическую однородность. В других случаях модификатор может использоваться для подавления ионизации сорбата, что обычно приводит к улучшению формы пика*

Таблица 12

Элюирую1цая сила растворителей [98]

Адсорбент

РастворительРастворительСиликагельСиликагельОксид алюминияОксид алюминияСажа [99]Сажа [99]ГексанБензолХлористый бутилХлороформМетил хлорид Изопропиловый эфвр ЭтилацетатТетрагндрофурзн Ацетонитрил МетанолГексанБензолХлористый бутилХлороформМетил хлорид Изопропиловый эфвр ЭтилацетатТетрагндрофурзн Ацетонитрил Метанол1 06248400о■22333457& аоо 也 & аа1 06248400о■22333457& аоо 也 & аа1260288755Л^ЗТ^ЛДД5 5691260288755Л^ЗТ^ЛДД5 56900383 34HQ00383 34HQ

Растворитель

Растворитель

Силикагель

Силикагель

Оксид алюминия

Оксид алюминия

Сажа [99]

Сажа [99]

Гексан

Бензол

Хлористый бутил

Хлороформ

Метил хлорид Изопропиловый эфвр Этилацетат

Тетрагндрофурзн Ацетонитрил Метанол

Гексан

Бензол

Хлористый бутил

Хлороформ

Метил хлорид Изопропиловый эфвр Этилацетат

Тетрагндрофурзн Ацетонитрил Метанол

1 06248400о■22333457

& аоо 也 & аа

1 06248400о■22333457

& аоо 也 & аа

1260288755

Л^ЗТ^ЛДД5 569

1260288755

Л^ЗТ^ЛДД5 569

00383 34HQ

00383 34HQ

Введение специфического модификатора направляет сорбцию по наиболее выгодному в данном конкретном случае механизму* Наиболее распространенные модификаторы водных и водно-органических подвижных фаз - солщ кислоты, основания, придающие элюенту желаемую ионную силу и pH* Подвижные фазы на основе органических растворителей модифицируют добавками органических кислот и оснований.

Классификация растворителей с точки зрения их хроматографических свойств заключается в создании стройной системы, позволяющей проводить оценку их элюирующей силы и селектив- ности, чтобы осуществлять целенаправленный выбор состава подвижных фаз.

Простейшей формой оценки элюирующей силы индивидуальных растворителей являются элюотропные ряды, дающие ко* личественную оценку адсорбционной способности растворителей в тех или иных режимах хроматографического разделения.

Параметр адсорбционной силы растворителя е° [97] с физической точки зрения представляет собой относительную энергию взаимодействия молекул подвижной фазы с поверхностью адсорбента* Он предложен для адсорбционной хроматографии и его численные значения для разных неподвижных фаз различны. В табл. 12 приведены значения £<> для различных растворителей на колонках с силикагелем, оксидом алюминия и сажей в качестве неподвижных фаз. Обычно на всех полярных неподвижных фазах сила растворителя увеличивается по мере роста его полярности, а для неполярных неподвижных фаз характерна обратная последовательность.

Таблица 13

Элюирующая сила (параметры S« РЭ растваритешей, используемых в обращвнно-фазовой хроматографии

Растворитель

§

产1

Растворитель

5

Р

Вода

0,0

10,2

Ацетон

3 $

5J

Метанол

3田

5J

Дмоксан

3.5

4,8

Ацетонитрил

3,1

5,8

Изопропанол

4*2

39

Этанол

3.6

43

Тетрагидрофуран

4,4

4,0

Это подтверждает табл* 13, в которой сопоставлены параметры элюирующей силы ряда растворителей, достаточно широко применяемых в жидкостной хроматографии. Некоторые из этих растворителей отличаются специфическим характером элюционной способности*

Так, изопропиловый эфир проявляет сравнительно слабую элюирующую силу на оксиде алюминия» а хлороформ на этом сорбенте относительно сильный элюент. Гексан, который менее поля- рен, чем хлороформ^ вопреки простейшей логике, является более слабым растворителем по отношению к модифи циро ван но й саже. Параметр е° - первая отправная точка при выборе состава подвижной фазы для адсорбционной хроматографии* Однако фактическое поведение сложных полифункциональных сорбатов может отличаться от ожидаемого на основании величин 百.Параметр Е° зависит от выбора соединений, по которым он экспериментально определен, и поэтому всегда несет на себе печать селективности. В частности, по данным работы [99], сила растворителя зависит от тапа сорбатов, по которым она определена. Так, например, небольшой разницы в химической природе между метилбензолами и конденсированными ароматическими соединениями оказывается достаточно, чтобы изменить элюотропную поел едов ател ьность,

На основании данных Роршнайдера [100] о растворимости паров Снайдер [101, 102] предложил параметр Р[ который также может служить мерой элюирующей силы в распределительной хроматографии. Этот параметр рассчитывается как сумма логарифмов коэффициентов распределения ряда стандартных веществ (этанол, диоксан, нитрометан) между паровой фазой и испытуемым растворителем. Параметр растворимости Хильдебранда Sir [103,104] также может быть использован для оценки полярности и элюирующей силы растворителя. Его числовые значения отчетливо коррелируют с величинами 戶'(рис 49). В то же время между двумя шкалами имеются существенные различия и в каждой нз этих систем имеются растворители, отклоняющиеся от общих закономерностей. Так, например, по параметру & оди-

25 -

20 -

Рис* 49. Зависимость между параметром полярности 产'и параметром растворимости 5Т:

/ - ацетон; 2 - ацетонитрил; 3 - бензол; 4 - бутанол-1; 5 - четыреххлористый углерод; 6 - хлороформ; 7 - дихлорэтан; 8 - метилен хлорид; 9 - диэтил о- вый эфир; 10 - диоксан; / / - этанол; /2 - этил ацетат; /3 - пентан; /4 - метанол; /5 - нитрометан; /6 - тетра гидрофуран: /7- вода

наковой элюирующей силой должны обладать гептан и эфир, а по параметру「' - ацетон, диоксан и метанол*

Несколько иная шкала элюирующей силы для обращенно- фазовой хроматотрафии предложена в работе [105]. Основываясь на том, что для этого режима характерна зависимость,

lg^ = lg<-^B, (2-7)

где 无[-коэффициент емкости при использовании воды в качестве подвижной фазы; Фй - объемная доля органического растворителя в подвижной фазе, авторы этой работы в качестве критерия элюирующей силы выдвинули значение коэффициента S* Лучший по мнению авторов работы [105] набор значений S для растворителей, применяемых в обращенно-фазовой хроматографии, приведен в табл.13*

Эти данные в целом отражают сравнительное влияние растворителей на скорость перемещения зон в обращенно-фазовой хроматографии* Следует, однако, с осторожностью относиться к абсолютным величинам 5, тк, вопреки первоначальному мнению, они неодинаковы для различных сорбатов и, кроме того, могут зависеть от концентрации органического растворителя.

Мерой элюирующей силы для об р ащенн о -фазовой хроматографии может служить параметр 戶二 В этом случае самому слабому растворителю - воде - соответствует максимальное значение этого параметра. Сравнение величин 5 и 产，проведенное в табл. 13, показывает, что они отражают лишь общую картину. В отношении же конкретных растворителей нетрудно заметить противоречия. В частности, по параметру Р‘ ацетонитрил оказывается более ела* бым растворителем, чем метанол, что совершенно не согласуется со всем опытом обращенно-фазовой хроматографии.

Завершая обсуждение различных элюотропных рядов, можно констатировать, что все они являются приближенными последовательностями, отражающими реальную элюирующую силу растворителей лишь в самых общих чертах.

Правильный выбор элюирующей силы подвижной фазы - необходимое, но не всегда достаточное условие успешного разделения.

Для целенаправленного выбора или изменения состава подвижной фазы следует ввести рациональную классификацию растворителей по их селективности, как это сделано в отношении элюирующей силы* Основой такой классификации является различная способность растворителей вступать в межмолекулярные взаимодействия различных типов. Например, хлороформ, эфир и октиловый спирт имеют значения е° 0,40; 038 и 0,50, соответственно. Следовательно, используя эти растворители в качестве компонентов Бн Б2 и Б3 в бинарных смесях АБЬ АБ2, АЕ3, можно получить в среднем у до в летворител ьн ы е величины удерживания для некоторой группы сорбатов сходной химической природы. Однако при рассмотрении протоно-донорных и протоно-ак* цепторных свойств этих трех растворителей ясно, что хлороформ, октанол и эфир должны по-разному взаимодействовать с различными сорбатами. Так, хлороформ, будучи донором протонов, особенно сильно должен, способствовать элюированию акцепторов, например аминов. Наоборот, эфир, являющийся акцептором, будет сильнее ассоциироваться с донорами и ускорять именно их элюирование*

Параметр 产[106, 107], характеризующий общую полярность растворителя, может быть представлен как сумма составляющих, соответствующих способности данного растворителя выступать в качестве акцептора протонов, донора протонов и вступать в диполь-дипольные взаимодействия* В соответствии с относительной величиной этих парциальных характеристик полярные растворители подразделяются по селективности на восемь групп (табл. 14)*

Пользуясь приведенной классификацией подвижных фаз, можно выбрать кратчайший путь к достижению желаемого раз-

Таблица 14

Характерисшка различных групп селективности по данным работы [107]

Группа

Класс веществ

I

II

Алифатические простые эфиры, амины

Алифатические спирты

III

Пнрнднн, тетрагидрофуран, амиды (кроме формамида), эфиры гликолейф сульфоксиды

IV V VI VII VIII

Гликоли, уксусная кислота, формамид

Метнленхлорид, этиле нхлорид

Алифатические кетоны и сложные эфиры ли оксан

Ароматические углеводороды, нитросоединення

Фторированные спирты, вода, хлороформ

деления. Так, если при использовании в качестве растворителя метанола необходимое разделение не достигнуто, нет смысла испытывать другие растворители этой же группы. Значительно более вероятно, что к успеху приведет переход к растворителю, взятому из другой группы селективности (например, к эфиру). Другая система классификации растворителей для жидкостной хроматографии предложена в работах Хары {108, 109]*

Разбавители, те слабые компоненты подвижных фаз, по этой системе относятся к следующим классам:

класс О - растворители, не способные образовывать воден родные связи ни с сорбатом, ни с сорбентом* В этот класс включены алканы;

класс Р - растворители^ в молекулах которых имеются я-электроны (ароматические углеводороды);

класс N - растворители, молекулы которых содержат непо- деленные электронные пары (галогеноалканы).

Полярные растворители подразделяются на:

-класс В - электроно-донорные (простые и сложные эфиры, кетоны);

-класс АВ-обладающие одновременно электроно-донорными и электроно-акцепторными свойствами.

Концепция параметра растворимости с целью оценки селективности подвижных фаз развита далее в работе Тийссена с со- авт. [НО] и Каргера с соавт. [111]. Согласно [ПО], параметр растворимости 8Т слагается из парциальных индексов полярности:

5^ = 5^+5^+2805ь.(2-8)

где 6比 一 парциальная полярность, соответствующая способности растворителя к дисперсионным взаимодействиям; 80-ориентаци-

онная со став ляющая; 5О - составляющая, описывающая кислотные свойства; 8Ь - составляющая, описывающая основные свойства. Согласно [111], следует учитывать также способность к нн* дукционным взаимодействиям 5財

学=5； +说+23 冉+23乱.(2-9)

Анализ величин парциальной полярности, взятых из работы [110]Ф вскрывает причины противоречий, отмеченных выше. Значения 院 ряда растворителей близки, что совершенно не согласуется с их экспериментально наблюдаемой элюирующей силой. Так, в диапазоне 9,7-10,0 находятся величины 6T тетрагидрофурана, метил этил кетона, хлороформа, бензола. Столь близкие значения 0 объясняются фактически лишь тем, что основной вклад в этот параметр вносит дисперсионная составляющая &小 которая в общем лишь незначительно меняется при переходе от одного соединения к другому. Однако при сопоставлении значений параметра 60 данные четыре растворителя можно выстроить в uopиeнтaциoнный^, элюотропный ряд: бензол 飞 хлороформ < тетрагидрофуран < метил эти л кетон,

что уже вполне согласуется с обычно наблюдаемым на практике поведением этих веществ в отношении полярных сорбатов.

При использовании современных высокоэффе ктивн ых колонок для анализа смесей не слишком сложного состава обычно требуется только один органический модификатор* Выбор его определяется в первую очередь физическими свойствами, стоимостью, доступностью, а иногда я личным вкусом экспериментатора* При этом выбор состава подвижной фазы сводится (если решен вопрос о необходимости специфических модификаторов) к выбору оптимальной концентрации органического растворителя. Однако по мере усложнения анализируемой смеси нарастает вероятность того, что коэффициенты емкости некоторых компонентов будут слишком близки и разделить их не удастся даже при очень высокой эффективности применяемых колонок. В то же время разделение других компонентов может быть настолько хорошим, что между ними на хроматограмме можно было бы разместить еще несколько пиков. В таких случаях встает вопрос об оптимизации селективности системы за счет применения других комбинаций растворителей. Выбор органических растворителей, отвечающих основным требованиям обращенно-фазовой ВЗЖХ, невелик. Практически только три растворителя, пригодные для обращенно-фазовых разделений, обладают существенно различающейся селективностью: метанол, ацетонитрил и тетр аги дрофура н, Изредка применяемый этанол в смысле селективности дублирует метанол, а диоксан незначительно отличается от тетрагидрофу рана, К тому же наиболее сильные взаимодей-

Рис. 50, Треугольник селективности*

Вершинам соответствуют гипотетические растворители, способные толь* ко к протоно-донорным (ПД), протоно-акцепторным (ПА) и диполь>дипольным (ДД) взаимодействиямПунктиром обозначена область селективности доступная в обращенно-фазовом режиме. Точки『23 отражают селективность мета- нопа, тетрагидрофура на и ацетонитрила, соответстве н но. Группы селективности (табл. 13) обозначены римскими цифрами

Рис* 51* Планирование эксперимента по оптимизации состава подвижной фазы. В таблице показаны соотношения бинарных растворителей, соответствующие точкам на рисунке.

№№

АБ1

АБ2

АБЗ

№№

АБ1

АБ2

АБЗ

1

1

0

0

6

0,5

0,5

0

2

0

1

0

7

0*33

0*33

033

3

0

0

1

g

0,67

0,16

0,16

4

0,5

0

0,5

9

0,16

"16

от

5

0

0,5

0,5

10

0Л6

0,67

0J6

сгвия в обращенно-фазовой хроматографии имеют место в подвижной фазе между молекулами воды, так что роль этих растворителей в обеспечении селективности вообще не столь велика, как при хроматографии на силикагеле. Обзоры работ, посвященных оптимизации селективности [112,113], позволяют заинтересованным читателям ознакомиться с проблемой во всей ее полноте* Здесь же мы ос・ тановимся только на одном из популярных и наглядных приемов оптимизации, основанном на использовании так называемого ^треугольника селективности" [107,114 J15] (рис* 50)* Принцип оптимизации заключается в следующем:

выбирают три бинарные подвижные фазы (вода—метанол, вод а-а цетон итрил, в од a-те трагидрофуран) с примерно одинаковой элюирующей силой по отнощению к разделяемой смеси;

приготавливают по определенной схеме (рис. 51) десять подвижных фаз и для каждой из них измеряют коэффициент емкости.

Полученные результаты позволяют даже визуально оценить, где на треугольнике состава находится тот одиннадцатый режим, который следует считать оптимальным*

В химии лекарственных веществ и неорганическом синтезе высокоэффективную жидкостную хроматографию чаще всего применяют для анализа и разделения относительно простых смесей, содержащих не более 5*10 компонентов. Если компо* ненты не слишком различаются по своим свойствам, обычно удается подобрать такую подвижную фазу, которая обеспечивает приемлемую скорость анализа и достаточное разделение этих веществ. Однако в отдельных случаях смесь может содержать вещества, сильно различающиеся по сорбционным свойствам, для разделения которой требуются подвижные фазы различной элюирующей силы. В этом случае применяют такой способ проведения хроматографического процесса, когда в ходе анализа концентрация более сильного компонента подвижной фазы повышается по заданному закону (рис 52). Этот способ хроматографии называют градиентным элюированием* Вопросы теории и методики применения градиентного элюирования детально рассмотрены в монографиях [116-118]. Здесь воспроизведены только самые основные соотношения из этих работ.

Расчет объемов удерживания при градиентном элюировании может быть выполнен на основе следующих простых соотношений, Предположим, что бесконечно малому количеству подвижной фазы (JV), прошедшему через колонку, отвечает смещение максимума х ромато графи ческой зоны, про п орцион ал ьн ое величине объема подвижной фазы в колонке (壮旷巾).В этой бесконечно малой ступени элюирования коэффициент емкости можно считать постоянной величиной. Поэтому:

dliZV”(2-10)

Это уравнение может быть записано в интегральной форме:

I号1

j м = ?= J 々dR(2-11)

где /г- длина колонки, а 匕 *- удельный объем удерживания в режиме градиентного элюирования< Это же соотношение может быть представлено в единицах времени:

j d% = % = j 厂力，(2-12)

ао л

где f£ - время удерживания в режиме градиентного элюирования.

Рис* 52. Хроматограммы сложной смеси

а - изократическое элюирование, подвижная фаза сильная, из колонки вьь ходят все компоненты пробы, однако рано выходящие вещества разделяются плохо; б - изократическое элюирование, сила подвижной фазы недостаточна, компоненты 8~11 ю колонки не выходят; 8 - градиентное элюирование； происходит удовлетворительное разделение всех компонентов анализируемой смеси* Пунктиром показано содержание компонента Б в подвижной фазе в ходе элюирования

Для решения этих уравнений необходимо выразить зависимость коэффициентов емкости от объема элюента (или от времени с начала градиента) в виде двух функций. Одна из них описывает связь между удерживанием и концентрацией более сильного растворителя, вторая - связь между этой концентрацией и объемом элюента (временем элюирования). Уравнение (2-11) тогда можно записать в виде:

% 小 ну

J d% = % = J , (2-13) b o ДФ(^)]

где Ф(Г)亠 функция градиента, В простейшем случае ①(V) - линейная функция, так что концентрация более сильного компонента подвижной фазы может быть выражена следующим образом:

с = Ф(Ю = 4 + 8匕 (2-14) где А 一 исходная концентрация более сильного растворителя; В - крутизна градиента*

С другой стороны, зависимость К от с может быть выражена уравнением (2-14)

(2-15)(2-15)IgK = а-тс,

(2-15)

(2-15)

где а = 丫tv - коэффициент емкости при нулевом содержании менее полярного компонента в подвижной фазе. Объединяя уравнения (2-15), (2-14) и (2-13), можно получить после интегрирования

К.= J ^XlN + B%” оК.= J ^XlN + B%” о(2-16)(2-16)

К.= J ^XlN + B%” о

К.= J ^XlN + B%” о

(2-16)

(2-16)

и после интегрирования найти удельный объем удерживания:

К = — lg(2,3 W< l<„ X10™4 +1).(2-17)

Приведенный подход позволяет с достаточной точностью предсказать поведение различных соединений в градиентном режиме хроматографии, если известны параметры уравнения (2*15)* Величины g, рассчитанные по уравнению (2-17), хорошо согласуются с экспериментально найденными значениями для большого числа разнообразных веществ. Относительные объемы удерживания в градиентном режиме элюирования могут быть рассчитаны по аналогии с изократическими параметрами из формально вычисляемых “кажущихся” коэффициентов емкости:

з 灯/%(2-18)

Наконец, величина степени разделения двух пиков Rs определяется для линейного градиента выражением:

r%71限,31吗8%%.：105+1)-1(2.19)

g 4 左 Т^\} + ^ (2'3 ^В^^ + W，HZA Г ]'

где значения символов те же, что и в уравнениях (2-11)-(2-17)> а индексы “2” отвечают параметрам второго пика разделяемой пары соединений*

При общей оценке применимости изложенного метода для разделения многокомпонентных смесей может быть использован параметр Р - емкость хроматограммы:

(2-20)

где VRZ и Укл - объемы удерживания, отвечающие начальной и конечной точкам рассматриваемого участка хроматограммы в изо- кратическом режиме; VsZ и V^ - аналогичные величины для режима градиентного элюирования* На рис* 53 сравниваются величины Р「Pff для различной продолжительности хроматограмм в предположении, что % = Vffl и /0 = 1 мин* В изократическом режиме емкость хроматограммы возрастает незначительно с увеличением продолжительности разделения свыше 15 мин, в то время как градиентное элюирование обеспечивает линейное увеличение числа пиков со временем хроматографического эксперимента.

Как ясно из предыдущего изложения, чисто расчетный выбор оптимальных условий градиентного элюирования требует знания параметров 匕 и1 и m уравнения

IgF — (X — mu (2*22)

Эти величины можно определить, проведя необходимые предварительные измерения в изократическом режиме. Однако не всегда компоненты смеси доступны в индивидуальном виде. В связи с этим чаще условия градиентного элюирования, близкие к оптимальным, выбирают опытным путем на основании следующих правил.

Выбрав подходящую колонку, проводят градиентное элюирование в таком режиме, чтобы концентрация сильного растворителя изменялась линейно от 0 до 100%, а объем растворителя в 10-15 раз превышал У* Если все компоненты разделяемой смеси элюируются из колонки в течение не более чем 25% продолжительности градиента, вполне вероятно, что для данной смеси можно подобрать условия изократического элюирования, В противном случае градиентное элюирование необходимо, и дальнейшее улучшение режима производят на основании анализа распределения пиков по хроматограмме:

если пики располагаются равномерно, причем первые из них отстоят далеко от『白 и разделение недостаточное, следует уменьшить крутизну градиента В;

если при равномерном распределении пиков первые из них удерживаются слабо, должна быть уменьшена начальная концентрация сильного растворителя А;

если при равномерном распределении пиков они слишком далеки друг от друга и продолжите л ьн ость анализа велика, рекомендуется увеличить Л и (или) В;

Рис. 53. Зависимость емкости хроматограммы 尸 от предельного времени удерживания для градиентного и изократического элюирования при различной эффективности колонок; время удерживания несорбирующегося веще ст* ва - 1 мин* Элюирование (теоре- тич. тарелки):

7 - градиентное, 1000; 2 - нзокра* тнческсе, 1000; 3 - градиентное, 10000; 4 - нзократическое, 10000

-если разделение пиков удовлетв орите л ьно, но первое соединение имеет слишком большое удерживание, требуется увеличить содержание растворителя А;

-если компоненты исследуемой смеси элюируются слишком рано и плохо отделены друг от друга, то параметры Л и В должны быть уменьшены;

-если некоторые соединения элюируются после завершения градиента, но разделение компонентов удовлетворительно и продолжительность анализа невелика, нет необходимости изменять профиль градиента. Однако если в этом случае удерживание последнего компонента слишком п род о л жите лън о, то органический растворитель должен быть заменен на другой^ обладающий большей элюирующей силой;

-если последние компоненты смеси слишком далеки друг от друга, а соединения, элюирующиеся рано, плохо отделены друг от друга, следует изменить профиль градиента; крутизна его должна возрастать по ходу анализа, либо в начале его должен быть участок изократического элюирования;

-если пики соединений, элюирующихся рано, далеки друг от друга, а последующие компоненты разделены недостаточно, то крутизна градиента должна постоянно уменьшаться в ходе хроматографического эксперимента? либо в конце градиента должен быть участок изократического элюирования;

-если разделение и местоположение большинства пиков на хроматограмме удовлетворительно, но имеется одна или несколько пар плохо разделенных пиков в различных частях хроматограммы, то рекомендуется оптимизировать селективность разделения этих пар, изменяя В либо заменяя сильный растворитель другим, отличающимся по селективности.

ЛИТЕРАТУРА

L TswettMSJ/Proct Warsaw Soc. Natur- Sci, BioL Div, 1903. Vol. 14, P. 2s Z Marlin AJ.P.f Synge 凡/М 〃 Biochem. J. 194L VoL 35. R 1358.

Dorfner K. lonenaustauscbchromatographie, В二 Akad.-VerL, 1963.

Porath 人 Flodin R 〃 Nature* 1959. Vol, 183. PJ65工

Lowe СЯ., Dean 尸QG Affinity chromatography. N*Y,: Wiley, 1974,

Liquid column chromatography / Ed. Z. Deyl et aL Amsterdam: Elsevier, 1975.

Modern practice of liquid chromatography / Ed. J J. Kirkland. N.Y.: Wiley, 197L

Snyder L.R. Principles of adsorption chromatography. N.Y.: Marcel Dekker, 1968.

Phillips CSG Gas chromatography. Lz Butterworths, 1956.

Cremer E.t RosdiaE 厶 〃 Angew. Chem.1958. Bd. 70, N 1 S. 42-50* W.JanakJdlChem. Listy. 1953. VoL 47, N 6* R 817-827.

James Л.Г, Martin Д.ЛР, // Biochem J.195 3. VoL 5 0, N 5. P 679-690*

GlueckaufE. //Trans. Faraday Soc. 1955, VoL 56 P, 984,

Lapidus L, Amudsen MR 〃 L Phys. Chem* 1952* VoL 56. P* 984.

15* Van Deemter 7J+J Zidderwgg 尸丄 KUwenberg 儿〃 Chem. Eng, Scl 1956* VoL 5, N 6. P. 271-289,

16* Giddings J.C.r Eyring H. // J. Phys. Chum. 1955. VoL 59. P* 416.

17* Giddings JC // Nature. 1960. Vol. 188, N 4753. P. 847-848.

18・ Giddings J.C. Dynamics of chromatography- N.Y」Marcel Dekker, 1965.

19* Knox J.N. Gas chromatography. L.: Methuen; N.Y” Wiley, 1962.

Kirkland J J. 〃 Anal. Chem .1969. VoL 41, N L P. 218-220.

2L Klinkenberg A., Sjenitzer Г, // Chem. Eng. ScL 1956. VoL 5. P. 258,

Halasz 丄,Heine E* 〃 AnaL Chem. 1965* VoL 37, N L P 495*

KnoxJ.H.t Laird D,R. 〃工 Chromatogr. 1985. Vol. 3 21, N 2 R 353-362.

24* Giddings J+C. // Adv. AnaL Chem. and Instrum. 1964. VoL 3* P. 315-367.

Golay M.GE // Gas chromatography, 1960 / Ed* REW” Scott L: Butterworths, I960* Рус. пер, в кн.: Газовая хроматография, М*: Мнр* 1964. С ⑻.

Bohemen Л, Purnell J,H. //1 Chem* Soc. 196L NLP, 360.

Knox ЛЯ., McLaren L // Anal Chem. 1963. VoL 3 5, N 3. R 449*

Halasz 几 Horath C.// Ibid. 1964. VoL 3 6. P+ 117 8, 2226.

Kirkland /J. 〃丄 Chromatogr. Sci. 1969. VoL 7, P. 1

0* Horvath Cr Lipski S.R. // AnaL Chem. 1969. VoL 41. R 1227.

3L S『£ S7\ Van den Hoed M 〃 Advances in chromatography, 1961 / Ed. A* Zlatkis. Evanston: Preston, 1969. R 318,

32* Hurrell RA, Amos 艮〃 Gas chromatography, 1962 / Ed. M* van Sway. ЦФ Butterworths, 1963. PJ62*

Scott RFWr Blackburn DWJ, Wilkins Г // J, Gas Chromatogr, 1967- VoL 5,N4. P. 1967.

34+ Stewart 从MMS, Amos S*, Perry S、G 〃 J. Chromatogr, 1968. VoL 38* E209.

. Kirkland J J. // AnaL Chem. 1968, VoL 40, P. 3 9L

Scott CP+P Atiril，E., Anderson N.G+ 〃 Proc- Soc. ExpL BioL and Med* 1967. VoL 125. P. 18L

Hamilton 尸 A 〃 Adv. Chromatogr. 1966, VoL 2+

Piel £.K // AnaL Chem. 1966. Vo], 38+ P. 670.

39* Kirkland J J. 〃 Ibid J 969. VoL 4L R 218.

Van Niekerk FA.t Pretorius V+ 〃 Advances in chromatography, 1967 / Ed+ A. Zlatkis. Evanston: Preston* 1967* P. 167.

41+ Snyder L.R. // J. Chromatogr. Sci. 1969. VoL 7* N 6. P* 352.

Snyder LP "Ibid. N 10. P. 595.

43* Ohmacht R, Halasz 丄〃 Chromatographic 198L VoL 14. R 155-161.

Kuwata 斤.，Uebori M.f Yamazaki К 〃 J* Chromatogr, 1981. VoL 2H. P. 378-382.

Snyder LRH Modern practice of liquid chromatography / Ed. J J+ Kirkland* N.Y*: Wiley, 197LP. 187.

Bombaugh KJ. // Amer* Lab, 1969. Vol, 7. P 43.

Purnell JЛ J/ Nature. 1959, VoL 184. P. 2009,

Perry §6*, Amos R., Brewer PJ. Practical liquid chromatography. NY; L「 Plenum press, 1972. Рус. nep.: Практическое руководство по жидкостной хроматографии* М」Мир, 1984.

Киселев 4В「Яшин Я.И. Адсорбционная газовая м жидкостная хроматография* М.: Химия, 1979.

Engelhardt Н. High pressure liquid chromatography. В.: Springer, 1975. Рус* пер.: Жидкостная хроматография при высоких давлениях. М二 Мир, 1980.

5L B€F€ndsen GE, De Galan R. // J, Chromatogr. 1980. Vol. 196, N 1. P. 21-37.

Cooke N.H.C^t 0 Mm К 〃J* Chromatogr. Set 1980. VoL 18. P. 1-12.

Hais LM“ Ma^ek ^t Paper chromatography. Amsterdam: Elsevier, I960.

Scott C.D^ Lee N.E. //J. Chromatogr, 1973. VoL 8 3* P. 373-393+

Kabra PM、Marton LJ* Liquid chromatography in clinical analysis. Clifford: Humana press, 1981.

Edelson RH.t Lawless J.G*, Wehr CT., et aL // J* Chromatogr 1979. VoL 174* P 409-419.

Krstulovic A.M.t Brown PR Re versed-phase liquid chromatography: Theory, practice and biomedical applications. NY: Wiley, 1982+

Marhol M. Ion-exchangers in Analytical chemistry: Properties and applications- Prague: Academia 1982. Рус. пер. в кн. Ионообменники в аналитической химии. Свойства и применение в неорганической химии. М+： Мнр* 1985, 545 с

Сенявин ММ. Ионный обмен в технологии и анализе неорганических материалов. М「Химия* 1980.

МЫ好出 CL Sesta К., Starnberg 几 Hejtmanec M. // Chromatographic and allied methods. N.Y」 Wiley, 1980. Рус* пер. в кн. Лабораторное руководство по хроматографии и смежным методам; Микеш 6“ ред^ М*: Мнр. 1982* р. 222.

6L Samwe/son О. Ion exchange separations in analytical chemisry. 1964.

Blackburn £ Amino acid determination: Methods and techniques, N+K: MarceL Dekker, 1968.

63+ Fritz J.5,P GJerde DT,, PolandKt Ion chromatography* Heidelberg: Hiithig, 1982+ Рус. пер.: Ионная хроматография. М「Химия, 1984+

64* Gjerde D7\ Fritz /I, Schmuckler G, // J. Chromatogr. 1979. VoL 186. R 509-519.

Small H, Stevens TS, Bauman 阳S // AnaL Chem*1975. VoL 47, N IS P. 1801-1809*

Small 扭.，Miller ГЕ+ // Ibid, 1982. VoL 54, N 2+ P. 462-466.

67* Cochrane RA.t Hillman D.£ 〃Г Chromatogr. 1982- VoL 24L P* 392-394*

Bond AM.t Heritage LD_ Wallace G.G. // AnaL Chem. 1982* Vol. 54, N 3+ P 582-585,

Haddad P R., Heckenberg 4L // J* Chromatogr. 1984. Vol. 300, N 3. p. 357-394.

Fritz JS, Gjerde Of, Becker RM. // AnaL Chem. 1980< VoL 52, N 9. P. 1519-1522.

7 L Shpigm O.4, Zolotov Yu A. // Zavod. Lab. 1982. VoL 48, N 9. P. 4.

72. Horvath C.r Priss B.t Lipsky S.K 〃 AnaL Chem. 1967. Vol 39, N 12. P. 1422-1428,

73. Haldna UrtPalvadreR„ PentshukJ. et at // J. Chromatogr. 1985. Vol. 350. P. 296-298.

74. Долгоносое AM 〃 А. св. 1161513. СССР. Опубл. 1985,

7 5. Долгоносое AM, // Ж. физ* химии, 1984, Т. 48. № 8. С 1989-199L

7 6. Mayers 広城，Fritz J.S^ // AnaL Chem* 1977, VoL 49, N 3. P* 418-423+

7 7. Phillips /?Л, Fritz Л5. // Ibid. 1978. VoL 5 0, N 1LR 150^1508.

7 8. Pohlandt C, FrUz J C. // J. Chromatogr. 1979+ Vol. 170, N 2. P. 189-197+ 79* Grothe M.. Kettrup A. 11 AnaL ehem. acta. 1985. VoL 172+ P. 223-239.

JezorekJ,R.t Freiser H. // Anal. chem. 1979. VoL 51, N 3. P 366-373*

Biasins E, Janzen K・R, Adrian W. et al // Fresenius Ztschr, anal chem. 1977. Bd. 284, N 5+ P. 337-360,

Blasius E.f Janzen К.-P., Simem Я. // Ibid. 1985. Bd・ 3 20* S* 435-438*

3* Burba A Gleitsmann B.r Lieser K.H. //Ibid* 1978. Bd. 289, N ILS* 2 8^34.

Burba P- Lieser KJ7* // Ibid* Bd. 281, N 3, S* 205-209*

Ion exchange. Marinsky J A Ed. N.Y.: Marcel Dekker, 1969.

Rieman Wti Gallon H.F. Ion exchange chromatography in analytical chemistry* N.Y+ Pergamon, 1970.

Walton HF. Ion exchange chromatography. Stroudburg: Dowden, Hutchinson, Rosst 1976.

Smith EC, Chang RC The practice of ion chromatography, N.Y.： Wiley, 1983.

Ion chromatographic analysis of cnvironmenc pollutants / Ed. E* Sawincki et al. Idem / Ed. Ann Arbor: Ann Arbor Sci+ press, 1978* JD Mulik, E. Sawincki. Ann. Arbor: Ann Arbor Scl press, 1979.

Стыскин ЕЛ, ИциксонЛ.Б,, Брауде Е В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М+： Химия, 1986+

9L Pohl С,Д+. Johnson EL // J. Chromatogr. ScL 198cL VoL 18, N 9. P. 442T52.

Долгоносое A.M., Сеняеин M.M., Волощик КН Ионный обмен и ионная хроматография. М.: Наука, 1993.

Snyder L.R, // J. Chromatogn 1983. Voh 255, NLP. 3-2S

Snyder LR, Kirkland J J. Introduction to modem liquid chromatography. MY.： Wiley, 1979+

Dimov M, Agarova 坦一 Levy Sh.f Yanachkov /v. // J. Chromatogr 1984+ VoL 285, N 3. P 565-567.

96* Wester!ttnd D,f Theodorssen 4+ // [bid* 1977. VoL 144* N 1. P* 27-3 7+

97+ Shyder LR Principles of adsorption chromatography. MY」Marcel Dekker, 1968.

Chromatography, Fundamentals and Applications of Chromatographic and Electrophoretic Methods, Heftmann F* Ed” Amsterdam, Elsevier, 1983. Рус. nep. в кн* Хроматофафия: Практическое приложение метода, % 1, 2, М「Мир, 1986.

Colin Н.> Еоп С- Guiochon G. // J. Chromatogr. 1976. VoL 122, N 1. P. 223-242.

Rohrschneider LJI AnaL Chem. 1973. VoL 4 5, N 7. R 1241-1247.

10L Shyder L.R. // J. Chromatogn 1974* VoL 92, N Z R 223f2 3S

Snyder L.R. // J. Chromatogr. Sei* 1978* Vol. 16, N 6. P. 223-234*

Hildebland ЛЯ., Prausnitz J、M*, Scott R+L* Regular and related solutions. MY*: Van Nostrand-Reinhold, 1970,

Hildebrand J77“ Scott RL The solubility of non-electrolytes. N.Y.: Dover, 1964.

Snyder L.Rtt DolonJ.W.t Gant J.R. // J, Chromatogr- 1979. Vol. 165t N 1. P. 3-30.

Snyder L.R.//Ibid. 1974 VoL 92, N 2. P. 223-230.

Snyder L.RJU, Chromatogr. Sci. 1978. Vol. 16, N 6. P 223-234.

Hara S・〃工 Chromatogr- 1977, VoL 137, N L P. 41-5 2.

Hara S” Fujii E, Hirasawa S,t Migamoto M. //Ibid. 1978. VoL 149, N L К 143-159.

Tijssen R” BilUet HA„ Shoenmakers PJ. // Ibid. 1976, VoL 122, N L Pi 85-203.

Ш. Karger BL, Snyder 乙凡,Eon C. "Ibid. VoL 125, N L P 71-8&

Debets H.J.G. // J. Liguid Chromatogr, 1985+ VoL & N 15* P. 2725-27 80*

H3+ Glajch JL, Kirkland J J // AnaL Chum. 1983. Vol. 55，N 2. P 319A-336A.

Glajch JL.T Kirkland J J. T Squire K.M., Minor J.M. // J. Chromatogr. 1980. VoL 199,NLR 57-59.

Seculic S” Haddad P.R.t Lamberton C. "Ibid* 1986. VoL 363, N L PJ25-138.

W血$ 丄 Handbuch der lonenchromatographie, Weinheim: VCH^ 1985*

Jandera 尸.，Churasek J* Gradient elution in liquid chromatography- Amsterdam: Elsevier, 19S5.

Шатц Ba*, Сахартова O.B. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Рига: Зйнатнет 1988.

Глава 3

ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

ПРИГОТОВЛЕНИЕ УЗКИХФРАКЦИЙ СОРБЕНТОВДЛЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Сорбенты для ВЭЖХ представляют собой, как правило, очень узко фракционированные силикагели разного типа с химически привитыми фазами. Хотя исходный кусковой силикагель или размолотый и грубо сепарированный силикагель для тонкослойной хроматографии стоят недорого, цены на сорбенты для ВЭЖХ довольно высоки. Это связано с высокой стоимостью и малой производительностью установок для получения узких фракций силикагеля, с высокими ценами на реактивы для получения привитых неподвижных фаз и сложностью процедуры прививки. Следует также отметить, что технология прививки конкретной неподвижной фазы к определенному виду силикагеля может сильно различаться и давать при тех же исходных компонентах совершенно разный конечный сорбент. Поэтому технология получения сорбентов каждого вида обычно составляет иноу- мау” ф и р м-производител ей и держится в строгом секрете.

Даже один и тот же сорбент, полученный от одного произво* дителя, может в определенных пределах иметь несколько различные свойства и хроматографические качества в зависимости от партии, времени выпуска и т*д* Часто фирмы, выпускающие сорбенты и заполненные ими готовые колонки, используют для заполнения колонок сорбенты улучшенного фракционного состава или просто более мелкозернистые с целью убедить хрома-

тографистсв в невозможности получения 44caмoдeльныx^^ коло^ нок со столь же высокими параметрами эффективности, симметричности пиков, проницаемости и т.д.

К сожалению, даже хорошо оснащенные лаборатории редко имеют широкий выбор сорбентов и колонок для ВЭЖХ ввиду их высокой стоимости и очень обширного ассортимента. Кроме то- го> часто в научной практике возникает необходимость иметь, например, силикагель с определенными размером и объемом пор илн силикагель со специфическими привитыми фазами, которые могут обеспечить требуемое разделение, В этом случае наиболее быстрым и рациональным решением проблемы является приготовление сорбента и заполнение колонок своими силами, что требует, конечно, определенной КБалификации. Ниже описаны некоторые наиболее доступные способы получения узких фрак< ций сорбентов для ВЭЖХ и заполнения ими высокоэффективных колонок [1-5]*

Оборудование^ необходимое для получения узких фракций силикагеля в количествах, достаточных для ВЭЖХ, может быть о”ень несложным: несколько одинаковых термостойких химических стаканов, стеклянные палочки с резиновыми наконечниками, секундомер или часы, сушильный шкаф, дистиллятор для получения чистой воды в достаточных для работы количествах. Желательно иметь систему для ультразвуковой обработки суспензий. Если исходный силикагель кусковой, нужно иметь для его размола мельницу достаточной производительности и не загрязняющую силикагель (например, фарфоровую шаровую мельницу с фарфоровыми шарами).

Если исходный порошкообразный силикагель имеется б готовом виде, то процесс его размола отпадает. Перед тем, как начинать процесс приготовления узких фракций молотого силикагеля, желательно рассмотреть под микроскопом каплю его водяной суспензии при увеличении б 100-500 раз с мерной шкалой с целью установить присутствуют ли в достаточном количестве частицы размером от 3 до 12 мкм* Если такие частицы отсутствуй ют, значит необходим дополнительный размол.

Узкие фракции сорбента получают следующим образом. В стакан вместимостью около 1 л засыпают исходный силикагель слоем толщиной около 3 см, заливают его водой, тщательно перемешивают и доводят высоту слоя суспензии точно до 12 см+ Тщательно перемешав суспензию, оставляют ее стоять 15 мин, выпавший осадок отбрасывают, а суспензию переливают в другой стакан. Добавив воду снова до высоты слоя суспензии 12 см, оставляют ее стоять 1 ч. Выпавший осадок оставляют в стакане, суспензию переливают в другой стакан и добавляют воду до вы-

соты слоя 12 см* Тщательно перемешав, оставляют суспензию стоять еще 2 ч* Выпавший осадок оставляют в стакане, суспензию переливают в новый стакан и добавляют воду до высоты слоя суспензии 12 см. П ереме ш ива ют, оставляют на 4 ч, выпавший осадок оставляют в стакане, а суспензию выливают. В результате проделанных операций получают одна-, двух- и четырехчасовые осадки*

Одночасовой осадок суспендируют, осторожно перемешивая стеклянной палочкой с резиновым наконечником в воде, доливают воду до высоты слоя 12 см и оставляют на 20 мин. Осадок отбрасывают, суспензию переливают в другой стакан, доливают воду до высоты 12 см, перемешивают и оставляют на 1 ч* Выпавший второй одночасовой осадок оставляют в стакане, суспензию переливают в другой стакан, вновь доливают воду до высоты слоя 12 см, перемешивают и оставляют на 2 % Выпавший осадок оставляют, а суспензию выливают* Выпавшие за 20 мин и за 2 ч осадки, которые уже имеют заметно суженный фракционный состав, собирают отдельно и б дальнейшем, по мере их накопления, сужают дальше или же используют для тонкослойной или препаративной жидкостной хроматографии.

Второй одночасовой осадок обрабатывают как и первый одночасовой, получая конечный сорбент - третий одночасовой осадок, который имеет средни曲 размер частиц около 14 мкм и узкий фракционный состав, что хорошо видно при рассмотрев нии под микроскопом капли его суспензии при увеличении в 100-200 раз.

Аналогичная обработка двухчасового осадка (интервалы времени соответственно меняются на 40 минт 2 и 4 ч) позволяет получить конечный сорбент - третий двухчасовой осадок, который имеет средний размер частиц около 9 мкм и узкий фракционный состав. При такой же обработке четырехчасового осадка (интервалы времени 80 мин, 4 и 8 ч) получают третий четырехчасовой осадок, представляющий собой узко фракционированный конечный сорбент с частицами размером около 5 мкм.

Полученные сорбенты сушат в стаканах при температурах около 150 ℃ в сушильном шкафу 6 ч до постоянной массы, после чего охлаждают в эксикаторе и аккуратно пересыпают в ши- рокогорлые плотно закрывающиеся склянки* Пересыпать сорбенты следует под вытяжным шкафом, т.к. они образуют пыль, вредную для органов дыхания. Из 1 кг исходного силикагеля по лучается по 20-40 г каждого иг сорбентов, т.е. всего около 70-80 г* При дальнейшем сужении промежуточных фракций тем же способом выход их можно еще несколько повысить* Промежуточные фракции можно использовать для других видов хрома-

тографии, в том числе для других вариантов жидкостной хроматографии (по л упрепаративных или препаративных разделений, очистки образцов и т.п*)*

Описание получения сорбентов для ВЭЖХ, приведенное выше, показывает, что этот процесс несложен и достаточно производителен* Полученные сорбенты по качеству не уступают имеющимся в продаже, а иногда и превосходят их.

Однако при получении узких фракций сорбентов этим способом следует тщательно соблюдать ряд условий. Прежде всего все операции необходимо проводить с одной партией исходного силикагеля. Нужно строго соблюдать постоянство высоты слоя суспензии в стаканах и интервалы времени осаждения. В случае ошибки всегда лучше снова взмутить суспензию и повторить седиментацию правильно. Не следует применять больших усилий при взмучивании осадка^ тк это может привести к раздроблению частиц и ухудшению фракционного состава осадка- Наконец, при возможности нужно проводить ультразвуковую обработку каждой суспензии, т*к. это способствует разрушению слипшихся частиц (комочков) и отделению от частиц силикагеля прилипших к ним субмикронных пылевидных фрагментов, наличие которых ухудшает проницаемость и эффективность колонок с приготовленным сорбентом.

Химическое облагораживание полученных сорбентов может быть проведено кипячением с хлороводородной или азотной кислотами или их смесью* При этом удаляются соединения металлов переменной валентности, присутствовавшие в исходном силикагеле (в первую очередь железа, окрашивающего силикагель в цвета от светло-желтого до коричневого) или внесенные в процессе размола. Такую деминерализацию силикагеля часто проводят фирмы, производящие сорбенты. При этом цвет сорбента становится белым, его каталитическая активность сильно уменьшается и одновременно гидроксилируется его поверхность, что необходимо для успеха дальнейшей химической прививки органической неподвижной фазы. Для получения сорбентов для ВЭЖХ можно применять далеко не всякий силикагель. Очень важной характеристикой исходного силикагеля являются его стабильность в водных суспензиях и механическая прочность, т.к. если силикагель непрочен вследствие особенностей технологии его получения или теряет прочность в процессе размола и приготовления суспензии, то он для ВЭЖХ непригоден* Прежде всего это относится к силикагелям, нашедшим широкое применение в газовой хроматографи и в качестве адсорбентов, получаемых из частиц аэросила и имеющих марки силохром С-80, С-120 и др* Исследователям, приступающим к работе с но*

вым видом силикагеля, следует обратить особое внимание на размер и объем пор и технологию получения силикагеля данного вида. Чем больше объем и размер пор, тем, как правило, менее прочен силикагель, но тем больший интерес он представляет для хроматографии больших молекул в ионообменном и обращенно-фазовом вариантах ВЭЖХ (белки, полипептиды и др). Иногда сорбенты с одинаковыми или близкими характеристиками по размеру и объему пор, но полученные по разной технологии (или при нарушениях технологии), могут различаться по прочности в 2-10 раз. Особенно это относится к сорбентам, получаемым из тетраэтоксисилана путем формирования микросфер с последующим отверждением, как, например, сорбенты типа Лихросфер фирмы Мерк (Германия).

Поэтому, начиная работу по получению сорбентов для ВЭЖХ из силикагелей новых видов или партий, не следует готовить сразу большую порцию сорбента. Лучше получить сначала 4-6 г сорбента, заполнить несколько колонок при разных давлениях и испытать их. Если, например, уже при давлении заполнения около 20 МПа колонка имеет резко увеличенное (по сравнению с другим сорбентом из механически прочного силикагеля той же фракции) сопротивление потоку растворителя, то трудно рассчитывать, что удастся получить высокоэффективные колонки, заполненные сорбентом этого вида с частицами размером около 5 мкм. Если же колонки, заполненные при 2& 40 и 60 МПа, имеют близкую проницаемость, можно делать большую партию сорбента и быть уверенным в его удовлетворительном качестве,

ПРИГОТОВЛЕНИЕ КОЛОНОК ДЛЯ ВЭЖХ

Приготовление колонок для ВЭЖХ с частицами сорбента размером от 3 до 12 мкм долгое время считалось достаточно трудным процессом. Так как при измельчении любых твердых тел резко возрастает их поверхность, мелкие частицы приобретают способность заряжаться электрически и слипаться в трудно разрушаемые комочки либо отталкиваться друг от друга с образованием неравномерно распределенных пустот.

Как правило, в колонке для ВЭЖХ, заполненной традиционным методом засыпки в сухом виде и уплотнения постукиванием, после того, как через нее пропускали растворитель, адсорбент уплотнялся с образованием пустот в начале колонки. При этом форма пиков получалась неправильной, а эффективность колонки I низкой.

i^, /Рнс* 54* Схема устройства для суспензионного заполнения

У^колонок:

]2/ - капилляр для подачи растворителя от насоса; 2 - верхний

十фитинг резурвуара: 3 - резервуар для суспензии; 4 - ннжнв 弟 фи-

」；I ~тинг резервуара; 5 - форколонка; 6 - фитинг, рассверленный

'|r гпод наружные диаметры колонки и фор колонки; 7 - колонка;

I I—''& — фнтинг колонки; 9 - слив растворителя в мерный цилиндр

if

Т р

I ] ] Разработка суспензионных методов приготовлен ^^5 ния колонок позволила резко увеличить эффектив^ 宣/ ность колонок и использовать сорбенты с размером II j^частиц 10 мкм и меньше. Однако суспензионный ме-

节тод до сих пор отработан еще не до конца, существу-

^^7ет множество его вариантов, каждый из которых

имеет свои особенности,

粗18В общем процесс суспензионного заполнения

11Т^ колонки осуществляется следующим образом. Взве- 1н^ 'шивают требуемое для колонки данного размера ко-

I личество сорбента, заливают его растворителем, пригота вл и вают суспензию, тщательно перемешивая смесь, желательно с использованием ультразвука* После этого суспензию помещают в резервуар, соединенный с колонкой, на конце которой установлен фитинг с фильтром (рис. 54), и продавливают суспензию через колонку под давлением 20^0 МПа, подавая растворитель в резервуар насосом*

Суспению пропускают через фильтр колонки, формируя упорядоченный слой сорбента, обеспечивающий эффективное разделение* Останавливают поток растворителя, дают давлению упасть до нуля и снимают колонку. Аккуратно удаляют избыток сорбента на конце колонки, который соединен с резервуаром, присоединяют второй фитинг с фильтром. Полученную таким образом колонку устанавливают в хроматограф и прокачивают через нее рабочий растворитель до установления равновесия, после чего она готова к работе.

При всей кажущейся несложности процесса суспензионного заполнения колонок всегда возникает ряд вопросов* Какой растворитель взять для приготовления суспензии? Какую концентрацию суспензии использовать? Как лучше диспергировать сорбент? Какой формы и объема применить резервуар для суспензии? Какой насос лучше для подачи растворителя? Какое направление потока растворителя выбрать и какой взять растворитель? Какое давление использовать и сколько растворителя подавать? Сколько времени снижать давление? Как выравнивать слой сорбента и устанавливать фитинг и фильтр? На каждый из

этих вопросов существует ряд ответов, а выбор удачной комби* нации из всех вариантов всегда обусловлен не только собственным опытом экспериментатора, но и определенными общими представлениями, литературными данными, и, наконец, имею* щимся в наличии оборудованием [1-3].

Начать целесообразно с сорбента, которым заполняют колонку. Прежде всего желательно под микроскопом при увеличении в 200-600 раз рассмотреть каплю суспензии сорбента в подходящем растворителе. Этот простейший тест покажет, есть ли в составе сорбента пылъ из-за недостаточно четкого разделения фракций на фирме-производителе или вследствие измельчения сорбента в процессе транспортировки или прививки неподвижной органической фазы и какова форма частиц. Если имеется много пылевидных или крупных частиц, целесообразно провести седиментацию сорбента с целью сужения его фракционного состава.

Растворитель для приготовления суспензии часто является о пределяющим фактором для качества заполнения колонки* Так как суспензия должна сохранять стабильность в течение всего времени от переноса ее в резервуар и до окончания процесса заполнения, необходимо замедлить седиментацию или исключить ее полностью. Для этого существует ряд способов. Один из них, называемый "методом сбалансированной плотно- cти^^ и широко используемый в хроматографической практике, заключается в использовании растворителя с той же плотностью, что имеет силикагель. Такой растворитель включает смесь полигалогенозамещенных углеводородов (обычно смесь тетрабромэтана и четыреххлористого углерода). Так как плотность такого растворителя равна плотности силикагеля, седиментации не происходит сколь угодно долго* Недостатком этого способа является высокая токсичность, дороговизна и трудность удаления из колонки полигалогенированных растворителей. Другой способ, называемый *4методом высокой вязкости”, состоит в выборе растворителя с высокой вязкостью, в котором седиментация сорбента происходит достаточно долго. Обычно это растворители, содержащие глицерин, этиленгликоль или циклогексанол* Недостатком этого способа является длительность процесса заполнения, занимающего несколько часов. Третий способ, называемый “динамическим* состоит в использовании растворителей малой вязкости. Процесс заполнения колонок при этом проводится достаточно быстро. Для улучшения стабильности суспензии и уменьшения седиментации иногда при этом используют перемешивание суспензии магнитной мешалкой в течение всего процесса заполнения колонки.

Существует множество комбинированных методов, в которых используются элементы всех трех указанных способов в разном сочетании, а также применяются добавки поверхностно-активных веществ, кислых и щелочных агентов, солей и др. При выборе растворителя следует иметь в виду, что он может давать с разными сорбентами истинные суспензии, осаждающиеся в соответствии с законом Стокса (в них частицы сорбента распределены в виде индивидуальных частиц), и агрегированные, ^склеен- ные** суспензии, содержащие комочки из нескольких частиц сорбента и потому осаждающиеся много быстрее*

Истинные суспензии осаждаются в виде плотного, трудно диспергируемого осадка. “Склеенные” суспензии осаждаются в виде рыхлых, легко диспергируемых осадков. Предпочтение следует отдавать растворителям^ дающим с данным сорбентом истинную суспензию* Растворитель не должен химически взаимодействовать с привитой органической фазой и менять ее природу* Так, например, привитая аминопропильная фаза легко вступает в реакцию с альдегидными и кетонными группами, давая основания Шиффа. Применяя кислые или щелочные агенты, следует учитывать возможность гидролиза привитой органической фазы или растворения силикагелевой матрицы. Полибромированные й полихлорсодержащие соединения могут в присутствии влаги подвергаться разложению или гидролизу (особенно при воздействии света и тепла) с выделением токсичных и реакционноспособных веществ. Образующиеся при разложении полигалогенированных углеводородов агрессивные химические продукты вызывают коррозию даже вы со кок ачественной нержавеющей стали и других коррозионно-стойких материалов* Особенно осторожно следует применять полигалогенопроизводные в комбинации со спиртами, кетонами и другими гигроскопич ними и полярными добавками. Химическое взаимодействие полигалогенированных углеводородов с привитыми сильными анионообменниками разрушает эти адсорбенты*

Выбирая растворитель для приготовления суспензии, необходимо учитывать условия работы колонки. Так, силикагель образует устойчивые суспензии в воде, особенно при добавлении к ней для стабилизации аммиака до концентрации раствора 0,001 М. Однако после заполнения колонки силикагель будет полностью дезактивирован водой и для применения в качестве адсорбента потребуется его длительная активация с использованием больших объемов абсолютного метанола или других растворителей.

Мнения о концентрации суспензии, оптимальной для заполнения колонок^ расходятся: некоторые авторы получают наилуч-

шие результаты с очень разбавленными суспензиями (1-5%), другие -с концентрированными (10-30%). Возможно, что для каждой системы растворитель-сорбент существует диапазон концентраций суспензии, дающий наилучшие результаты при формировании слоя сорбента.

Для диспергирования сорбента в суспензии успешно применяют энергичное встряхивание или перемешивание^ которое, однако, не должно приводить к измельчению сорбента. Для лучшего диспергирования применяют ультразвуковые ванны, при этом указывают, что их дополнительным преимуществом является проходящая одновременно дегазация суспензии. Однако длительное использование ультразвукового излучателя боль- шой мощности, погруженного в суспензию для диспергирования. нежелательно ввиду возможного измельчения частиц сор- бента при их соударениях и ухудшения при этом фракционного состава сорбента. Резервуар, в который заливают суспензию для последующей подачи ее в колонку, должен быть достаточно прочным, чтобы выдержать давление не менее, чем на 20 МПа превышающее давление при заполнении колонки. Его изготовляют обычно из трубки диаметром б два-четыре раза большего, чем у колонки, и стандартных соединительных деталей для трубок разного диаметра с применением обжимных конических уплотнительных втулок.

Зная количество сорбента в колонке и концентрацию суспензии, рассчитывают требуемый объем резервуара и отрезают трубку нужной длины. Целесообразно иметь несколько резервуаров разной длины, но одного диаметра, к которым подходят одинаковые соединительные детали. Переставляя соединительные детали, можно использовать резервуар нужного для данной колонки объема*

Широко распространены резервуары для суспензии, выточенные из нержавеющей стали в виде стакана с крышкой, к которой приварены или присоединены на конической резьбе соеди- нительные детали для присоединения колонки и подвода растворителя. Крышка соединяется с корпусом и герметизируется затяжкой болтов или же с помощью резьбы с уплотнением прокладками из инертных пластмасс или мягких металлов. Такие резервуары иногда выполняют по типу автоклавов с магнитными или механическими мешалками* Мешалку используют для приготовления суспензии б резервуаре и для поддержания ее в стабильном состоянии в процессе заполнения колонки* Это позволяет избежать осаждения сорбента из маловязких растворителей в процессе заполнения, что повышает однородность слоя сорбента и упрощает выбор растворителя.

Важно правильно выбрать насос для наполнения колонки. Можно использовать для этой цели насосы постоянного расхода или насосы постоянного давления* Однако любой тип насоса должен обеспечивать необходимые расходы и давления растворителя, Для заполнения колонок можно использовать тот насос, который уже имеется в хроматографе. На современных жидкостных хроматографах обычно устанавливают насосы, способные подавать растворитель при давлении 30-50 МПа и расходе 5-10 мл/мин. С помощью такого насоса можно заполнять современную высокоэффективную аналитическую колонку и предколонку. Однако придется на время заполнения отказаться от аналитической работы* Насос в процессе заполнения будет работать на предельных режимах по давлению, а полученные колонки будут стабильно работать при давлениях, примерно на 10-15 МПа ниже максимально возможных для имеющегося насоса. Поэтому более целесообразно иметь отдельную специальную систему, рассчитанную на работу в форсированном режиме, специально для заполнения колонок. Такая система включает насос постоянного расхода, рассчитанный на подачу растворителя под давлением 20-150 МПа и с расходом 200-300 мл/мин. Такой насос работает по принципу пневмогидравлического усиления давления. В качестве источника энергии используют сжатый воздух под давлением 0,6-1,2 МПа при коэффициенте усиления давления от 30 до 150. Он позволяет заполнять колонки любого вида (аналитические, препаративные, по л упрепаративные и микроколонки).

В настоящее время имеющиеся литературные данные не позволяют сделать определенное заключение о предпочтительном направлении потока при заполнении колонок суспензионным способом (сверху вниз или снизу вверх)* Точно так же отсутствуют однозначные заключения о том, какой растворитель следует применять при заполнении колонок. Имеются многочисленные примеры приготовления высококачественных колонок при различных направлениях потока и при использовании разных рао творителей, значительно различающихся по своей плотности, вязкости и полярности* Ниже рассмотрены три описанных в литературе способа заполнения колонок, дающих согласно опубликованным данным достаточно хорошие результаты.

Аналогично, достаточно неопределенным является ответ на вопрос о выборе давления при заполнении колонок* В ряде публикаций сообщается о получении высокоэффективных колонок при давлении 3 МПа, в то время как другие авторы настаивают на необходимости применять давления порядка 100-200 МПа. Тем не менее, при выборе рабочих параметров процесса заполне-

ния целесообразно исходить из следующих критериев, рассмотренных ниже.

Конусные уплотнения на современных аналитических колонках достаточно надежно работают при правильной затяжке до давления 40-60 МПа. Некоторые силикагели разрушаются при давлениях 20-30 МПа. Органические гели, как правило, могут работать при давлениях, не превышающих 5-10 МПа. Исходя из этого, следует принять для заполнения колонок при использовании сорбента с силикагелевой матрицей давление порядка 20-60 МПа.

При работе с новым видом сорбента или его новой партией следует сначала заполнить короткую колонку (10-12 см) при относительно невысоком давлении (20-25 МПа). При хорошем результате можно попытаться заполнить более длинную (200-250 мм) колонку при высоком давлении (4(К60 МПа). Если эффективность увеличится примерно вдвое одновременно с уве* л имением сопротивления потоку в два раза, значит сорбент достаточно прочен и его можно использовать при таких параметрах процесса заполнения. Если сопротивление потоку возрастет в 2,5-6 раз, то это означает, что сорбент непрочен и разрушается* Образующаяся пыль резко увеличивает сопротивление колонки* Особую осторожность следует проявлять при выборе давления для заполнения колонки сорбентами на основе силикагелей с широкими порами (более 10 нм) и большим объемом пор, которые находят широкое применение в эксклюзионной хроматографии полимеров, в том числе в анализе объектов биологического происхождения (белков, полипептидов, нуклеотидов и др*).

При заполнении колонки можно считать оптимальным объем поданного растворителя, в четыре-шесть раз превышающий объем резервуара для суспензии. После того как нужный объем растворителя будет пропущен через колонку, следует перекрыть соответствующий кран. Поток растворителя останавливается тем медленнее, чем мельче зернение сорбента, длиннее колонка, более вязкий растворитель и больше объем резервуара для суспензии. До полной остановки потока из колонки, что отнимает обычно 1-6 мин, ни в коем случае не следует отсоединять колонку, т.к. слой сорбента в колонке может быть разрыхлен при резком снижении давления. После остановки потока растворителя следует отсоединить колонку от системы набивки, осторожно лезвием бритвы срезать выступающий слой сорбента заподлицо с концом колонки, снять излишки сорбента с трубки и конуса, положить на сорбент фильтр, аккуратно установить соединительные детали и затянуть гайки, сначала от руки, а затем с помощью гаечных ключей- Затем устанавливают две заглушки, предотвра-

щающие высыхание сорбента, после чего колонку можно считать готовой к испытаниям или к хранению*

При переходе к новому растворителю или новой смеси рас* творителей следует помнить, что новый элюент должен смешиваться с предыдущей системой без разделения на две несмешива- ющиеся фазы. Если это может произойти (например, при переходе от системы метанол-вода к системе гексан-изопропавол или от фосфатного буферного раствора к системе метанол-вода или ацетонитрил-вода), надо промыть колонку промежуточным растворителем, полностью смешивающимся с обеими системами растворителей. В противном случае выделившаяся гетерофаза (в приведенных примерах - это вода и соль) вызовет нестабильность характеристик удерживания; дрейф и нестабильность нулевой линии детектора; повышение давления на входе в колонку; искажение формы пиков; забнвку капилляров и устройства для ввода проб; **зaлипaниe^^ клапанов и т.д. Выбирая промежуточный растворитель, следует принимать во внимание его вязкость, поглощение в УФ-области и другие характеристики. Иногда приходится проводить промывку даже двумя промежуточными растворителями, чтобы избежать разделения старой и новой систем растворителей на гетерогенные фазы.

При заполнении колонки часто прибегают к установке перед ней (т.е. между резервуаром для суспензии и заполняемой колонкой) короткой предколонки, которая служит продолжением колон^ ки н, имея тот же самый диаметр и соединение с колонкой “вплот- ную”，позволяет избежать нарушений однородности слоя набивки в начале колонки, вмещает излишек сорбента, предотвращает (частично) возможность выпадения сорбента из колонки обратно в резервуар и удерживает все примеси растворителя при его прокачке* Хотя заметной разницы в качестве колонок, заполненных с такой предколонкой и без нее, не отмечалось, однако в некоторых случаях применение такой предколонки, заполняемой одновременно с рабочей колонкой, определенно целесообразно. Если при длительной работе такой системы верхний слой сорбента загрязняется или проседает, почти всегда можно заменить предколонку или вообще ее отсоединить и таким образом восстановить работоспособность системы без замены сорбента в основной колонке.

Укажем три примерно одинаково эффективных метода заполнения колонок силикагелем:

L Заполнение колонки при направлении потока снизу вверх с использованием маловязких растворителей:

взвесить в конической колбе вместимостью 50 мл 2,6-3,0 г (для колонки размером 4,6 мм х 25 см) силикагеля зернением 5, 7 или 10 мкм, добавить 20 мл метанола и закрыть пробкой;

тщательно промыть и высушить колонку, резервуар для суспензии и все сое дините л ьн ы е детали, пометить эти детали и концы колонки "к детектору” и "к устройству для ввода проб”；

присоединить к колонке соединительную деталь, помеченную “к детектору^ и соединить ее фторопластовым капилляром с мерным цилиндром вместимостью 100 мл;

собрать резервуар, присоединить его снизу к насосу капилляром и закрепить в тисках за верхнюю соединительную деталь;

тщательно перемешать силикагель и метанол, встряхивая сосуд, в котором они находятся и обрабатывая его в ультразвуковой ванне в течение ЗТ мин;

проверить, все ли гаечные ключи, колонка и воронка для заливки суспензии находятся в удобном и хорошо доступном положении;

выключить ультразвуковую ванну, тщательно перемешать суспензию и через воронку залить ее в резервуар;

немедленно присоединить колонку вверху резервуара, затянуть гайку ключом и подать метанол при давлении 20-50 МПа, Если течи нет> продолжать подачу растворителя до тех пор, пока в мерном цилиндре не соберется 80 мл метанола;

выключить насос, подождать 1-4 мин до полной остановки потока^ отсоединить верхний тефлоновый капилляр;

отвернуть нижнюю гайку колонки, осторожно отсоединить колонку от резервуара, снять излишки силикагеля с торца колонки бритвой (если при разъеме на торце колонки образовал- ся “кратер” - заполнить его шпателем из слоя уплотненного силикагеля с верха резервуара и излишек срезать бритвой);

установить соединительную деталь с пометкой “к устрой- ству для ввода проб”；

поставить заглушки на соединительные детали колонки и закрепить на колонке табличку с указанием направления потока сорбента, номера колонки, даты заполнения и других параметров*

В таком виде колонку хранят до испытания или до работы с выбранным растворителем.

Заполнение колонки при направлении потока “сверху вннз” с использованием растворителя с повышенной вязкостью:

взвесить в конической колбе вместимостью 100 мл 4-4,2 г силикагеля, добавить 50 мл 20%-ного раствора глицерина в метаноле;

к колонке присоединить соединительную деталь с помет- кой "к детектору” и заглушку, присоединить к резервуару колонку и предколонку и закрепить в тисках для подачи растворителя сверху вниз;

заполнить колонку раствором глицерина в метаноле;

приготовить суспензию, тщательно перемешав силикагель и растворитель и поместив колбу со смесью на 5 мин в ультразвуковую ванну;

залить суспензию в резервуар, долить до верха раствором глицерина в метаноле, чтобы не оставалось воздушного пузыря, и присоединить к резервуару капилляр от насоса;

снять заглушку колонки и сразу подать воду насосом под давлением 70 МПа；

через 4-5 мин вся суспензия сорбента с частицами 10 мкм будет продавлена через колонку. Прекратить подачу воды, дать давлению снизиться до атмосферного и отсоединить колонку и предколонку;

отсоединить предколонку, выровнять сорбент на торце колонки шпателем и присоединить колонку входным концом к насосу;

пропустить через колонку 200 мл абсолютного метанола для удаления воды и глицерина;

закрыть колонку заглушками и закрепить на ней таблич^ ку с ее данными,

Заполнение колонки при направлении потока сверху вниз с использованием растворителей сбалансированной плотности:

взвесить в конической колбе вместимостью 100 мл 4—4,2 г силикагеля, добавить 50 мл растворителя (60% тетрабромэтана и 40% тетрахлорэтилена);

на выходе колонки установить заглушку, присоединить предколонку, заполнить колонку и предколонку тем же растворителем, присоединить к резервуару и закрепить в тисках для подачи растворителя сверху вниз;

приготовить суспензию, тщательно перемешав силикагель и растворитель и поместив колбу на 5 мин в ультразвуковую ванну;

залить суспензию в резервуар, осторожно долить до верха гептаном, не оставляя воздуха;

присоединить к резервуару капилляр от насоса, снять заглушку колонки и немедленно подать гептан насосом под давлением 50 МПа;

прекратить подачу растворителя и дать давлению упасть до атмосферного как только вся суспензия будет продавлена через колонку и на выходе колонки появится гептан;

отсоединить колонку с предколонкой, отсоединить предков л он ку, выровнять слой силикагеля на торце колонки и соединить вход колонки с насосом;

пропустить через колонку 200 мл абсолютного метанола;

закрыть колонку заглушками и закрепить на ней табличку с ее данными*

Все три метода дают возможность получить колонки с силикагелем, заполненные достаточно однородно и обеспечивающие высокую эффективность разделения. С сорбентом зернением 10 мкм удается получить колонки длиной 25 см, имеющие эффективность от 4 до 8 тыс*т*Тг т.е. имеющих приведенную высоту теоретической тарелки от 3 до 6. При использовании имеющихся в продаже не очень узко сепарированных сорбентов это является хорошим результатом. Если использовать очень узкне фракции силикагеля и тщательно освободить их от пыли седиментацией, то удается получить колонки с эффективностью до 12 тыс.т.т” т.е* имеющих приведенную высоту теоретической тарелки, приближающуюся к 2.

Значительно сложнее набивка колонок сорбентами с химиче* ски привитыми фазами. Выбор методики заполнения колонок такими сорбентами основывается на использовании данных фирмы-производителя или оригинальных методик^ описанных в литературе, Последние являются наиболее надежными, но зачастую не содержат подробностей, и поэтому во многих случаях дают неудовлетворительные результаты при попытке их воспроизвести* Попытка применить описанный в литературе или использовавшийся иными исследователями метод заполнения колонки другим сорбентом с той же химически привитой фазой на той же матрице (например, окт а децилхл орсил ан, привитый к силикагелю), как правило, приводит к неудаче и дает хороший результат только как исключение.

Даже для новых партий одного сорбента той же фирмы может потребоваться серьезная корректировка методики заполнения колонок, так как химия их поверхности может заметно различаться от партии к партии. Надо также учитывать тот факт, что фирмы, производящие сорбенты и заполненные ими колонки, не заинтересованы в разглашении своих секретов приготовления сорбентов и заполнения колонок. Следует с осторожностью относиться к "чудодейственным^ жидкостям для приготовления суспензий обращенно-фазовых и некоторых других сорбентов, составы которых не раскрываются фирмами-изготовителями. Утверждения об ^универсальности^ этих жидкостей для любого обращенно-фазового сорбента и о получении якобы гарантированно высокоэффективных колонок являются не более, чем рекламой, нередко весьма далекой от реальных результатов, которые удается получить. Воспроизвести такие результаты обычно бывает достаточно затруднительно.

ЗАПОЛНЕНИЕ КОЛОНОК СУХИМ СПОСОБОМ

Сухим способом можно заполнить колонку только поверхностно-пористыми (пелликулярными) сорбентами с размерами час* тиц 35-60 мкм или пористыми сорбентами на основе силикагеля с размером частиц 25-40 мкм и больше* Колонки, заполненные сорбентами первого типа, имеют невысокую эффективность по сравнению с колонками, заполненными более современными сорбентами с размером частиц 5-10 мкм, и имеют малую емкость по величине пробы. Колонки с сорбентами второго типа также имеют невысокую эффективность, но допускают значительно большую нагрузку по величине проб и поэтому применяются для препаративной работы. Вследствие действия поверхностных сил эффективно заполнить колонку сухим способом микрочастицами размером 3-20 мкм не удается. Заполнение колонок сухим способом проводят следующим образом:

колонку тщательно промывают растворителями и высушивают;

к свободному концу колонки присоединяют небольшую воронку;

засыпают сорбент в колонку через воронку небольшими порциями, достаточными для заполнения колонки на 2-4 мм по высоте; колонку при этом держат вертикально;

уплотняют сорбент5 осторожно постукивая колонкой по деревянной поверхности, медленно вращая ее и постукивая деревянной палочкой по стенке колонки примерно на верхнем уровне слоя сорбента* Постукивают несколько раз нижним концом колонки по деревянной поверхности без постукивания по стенке;

добавляют следующую порцию сорбента и повторяют все операции, до тех пор, пока колонка не заполнится доверху;

несколько минут осторожно постукивают заполненной колонкой по деревянной поверхности;

7)отсоединяют воронку, выравнивают слой сорбента и присоединяют колонку к устройству для ввода проб хроматографа.

Некоторые авторь! рекомендуют использовать механические вибраторы в комбинации с ручным вращением и постукиванием по стенке колонки*

ОЦЕНКА КАЧЕСТВАПРИГОТОВЛЕННЫХ КОЛОНОК

Приготовленные колонки испытывают с целью оценки их качества на модельных смесях веществ и стандартных растворителях. Для испытания колонок с силикагелем с привитыми фазами “нитрил” и *(диол,т рекомендуется применять б качестве подвижной фазы смесь растворителей гексан-изопропаяол (100 : 2 по объему), вводя пробы 0,5%-ного раствора о-крезола и фенола в подходящем растворителе.

Для испытания колонок с обращенно-фазовыми сорбентами (G，С& и Clg) рекомендуется применять смеси метанол-вода или аце- тонитрил-вода (70; 30 по объему) в качестве растворителей и пробы 0,5%-ного раствора толуола и «-ксилола в метаноле или в ацетонитриле в качестве тестовых веществ* Если коштоненты пробы элюируются из колонки слишком быстро (для обращенно-фазовых сорбентов с малым содержанием привитой неподвижной фазы), следует применять элюент с соотношением компонентов 50 : 50.

Новая колонка, как правило, содержит растворитель, исполь* зованный при ее заполнении и отличающийся по составу от растворителя, который применяется при испытании колонки. Поэтому новую колонку устанавливают в хроматограф и подают подвижную фазу со скоростью 1 мл/мин для колонок диаметром 4*6 мм. Время, в течение которого устанавливается равновесие колонки с новым растворителем, определяется по стабильности нулевой линии и постоянной величине параметров удерживания хроматографических веществ. Это время обычно составляет 1-2 ч. После установления равновесия вводят несколько раз испытательную смесь и регистрируют ее хроматограммы.

При рассмотрении полученных хроматограмм обращают внимание на форму полученных пиков. Пики должны быть достаточно симметричными без размытых передних или задних фронтов 0<хвостов,?). Недопустимо раздвоение пиков - это свидетельство наличия каналов или пустот в колонке. Коэффици^ ент асимметрии пиков на 1/10 их высоты должен составлять для колонок хорошего качества О,8-1Ф3- Далее проверяют постоянство времени удерживания веществ на хроматограммах: постоянство этих величин свидетельствует об установлении равновесия в колонке. Расчет параметров эффективности колонки (числа теоретических тарелок и приведенной высоты, эквивалентной теоретической тарелке) проводят по обычным1 формулам. Для имеющихся в продаже сорбентов среднего качества при хорошо подобранной методике заполнения коло-

нок удается получить значения приведенной высоты, эквивалентной теоретической тарелке, от 3 до 6, что соответствует числу теоретических тарелок для стандартной колонки длиной 25 см от 4 до 8 тыс при величине зерна сорбента 10 мкм, от 5,5 до И тыс. при величине зерна 7,5 мкм и от 8 до 16 тыс. для сорбента с величиной зерна 5 мкм [6-8].

АППАРАТУРА ДЛЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Высокоэффективная жидкостная хроматография осуществи ляется с применением специальных хроматографических систем и приборов, включающих все необходимые для этого процесса элементы* В их число входят устройства для приготовления и подачи подвижной фазы (растворителей и их смесей). Эти устрой- ства также обеспечивают возможность осуществления градиент^ ного элюирования посредством изменения по заданной програм- ме состава подаваемой в хроматографическую колонку элюента в процессе хроматографического эксперимента. Далее» системы для вы сокоэффе ктивной жидкостной хроматогр а ф и и включают жидкостные насосы различной конструкции и разных принципов действия, высокоэффективные хроматографические колонки и разнообразные детектирующие системы, включающие также устройства для регистрации и обработки получаемых хромато* грамм. Ниже коротко описаны принципы действия этих систем и их наиболее часто применяемые конструкции.

Системы подготовки растворителей и создания градиентов состава подвижной фазы. Надежное функционирование современного жидкостного хроматографа возможно лишь в том случае, если применяемый растворитель отвечает определенным требованиям. Все растворители должны обладать достаточной чистотой, В настоящее время выпускаются растворители особого качества, имеющие квалификацию '*для жидкостной хромато- графии'\ Тем не менее растворители должны подвергаться предварительной обработке, включающей тщательное освобождение от взвешенных твердых частиц фи льтрованнем, удаление растворенных газов (дегазацию) и формирование градиента состава подвижной фазы*

Тщательное фильтрование растворителей перед их подачей в хроматографическую систему является абсолютно необходимым* Возможные механические примеси могут нарушать работу

клапанов насоса, что приведет к непостоянству скорости подвижной фазы. Твердые частицы могут повредить уплотнения насоса и устройства для ввода проб. Кроме того, твердые частицы могут накапливаться на входном фильтре колонки, что приводит к постепенному повышению ее гидравлического сопротивления* Поэтому фильтры являются неотъемлемым элементом в системе подачи элюента жидкостного хроматографа. Они делаются из пористой нержавеющей стали и по своей конструкции могут быть погружены в резервуар с растворителем на приемной трубке насоса либо могут быть установлены в ином месте на линии подачи растворителя. Размер пор фильтра обычно составляет 2-5 мкм* Растворитель, предназначенный для использования в высокоэффективной жидкостной хроматографии, должен быть предварительно профильтрован через обычный стеклянный фильтр для удаления более крупных механических примесей.

Применяемый растворитель не является единственным источником механических примесей в хроматографической системе. Мелкие механические частицы могут образовываться в результате износа уплотнений насоса и устройств для ввода проб. Поэтому, чтобы избежать их накопления на входном фильтре колонки между насосом и устройством для ввода проб и между этим устройством и колонкой устанавливают дополнительные фильтрующие элементы. Такие элементы одновременно предохраняют хроматофафическую систему от проникновения механических примесей, вносимых с вводимыми пробами, подлежащими анализу.

Растворенный в подвижной фазе воздух нарушает работу насосов и детекторов. Вакуум, возникающий в цилиндре насоса возвратно-поступательного действия в период всасывания, может приводить к образованию воздушных пузырей, нарушающих нормальную работу клапанов насоса, поэтому фактическая скорость подачи элюента оказывается меньше первоначально установленного значения* Более того, в этом случае усиливается пульсация давления подвижной фазы на выходе насоса. При поступлении подвижной жидкой фазы из колонки, где давление высоко, в детектор, где давление близко к атмосферному, также могут возникать пузырьки газа. Постепенное накопление газовых пузырей в детекторе и их удаление оттуда с потоком подвижной фазы приводит к резкому усилению шумов детектора и значительным искажениям нулевой линии прибора.

Дегазацию растворителя можно осуществить путем резкого понижения давления в системе подачи элюэнта как в приборе Дюпон 830 или путем выдерживания растворителя под вакуумом водоструйного насоса в отдельном сосуде с магнитной мешалкой.

При этом иногда бывает затруднительно понять, когда заканчивается дегазация и начинается кипение растворителя. Обычно в конце процесса дегазации увеличивается размер образующихся пузырей и уменьшается их число* В ряде источников для дегазации растворителей рекомендуется нагревать их до температуры, близкой к точке кипения, обрабатывать их ультразвуком или продувать гелием. Кроме того, полного удаления из растворителя растворенных газов можно достичь путем отгонки примерно 1/3 объема подготавливаемого растворителя при атмосферном давлении или под вакуумом.

Многие растворители способны после дегазации вновь поглощать газы воздуха из атмосферы* Поэтому рекомендуется проводить дегазацию в том же сосуде, из которого будет подаваться подвижная фаза в хроматограф* Кроме того, рекомендуется проводить дегазацию чистых растворителей до составления их смесей, так как при дегазации возможно изменение их состава.

Для изменения состава подвижной фазы в ходе хроматографического опыта применяются различного типа устройства для создания градиента. При этом используются три основных подхода: градиент состава подвижной фазы можно создавать на стороне низкого давления (до поступления подвижной фазы в насос), на стороне высокого давления (после насоса) или при использовании шприцевого насоса. В первом случае формирование градиента осуществляется с помощью специальных клапанных устройств, управляемых особой электронной схемой либо микропроцессором и обеспечивающей подачу двух или нескольких растворителей в форме импульсов с заданным соотношением их частот или объемов. Каждый растворитель при этом подается из отдельного сосуда, а относительная длительность импульсов соответствует желаемому соотношению скоростей подачи каждого из компонентов. Потоки разных растворителей смешиваются в специальной смесительной камере с магнитной мешалкой. После смешения подготовленная подвижная фаза поступает к насосу высокого давления. При этом рекомендуется заполнять резервуары для растворителей элюентами, состав которых соответствует начальному и конечному составу элюента в предпол а гае мом хроматографическом опыте. Так. например, если предполагается использовать градиентное элюирование с изменением концентрации вод- но-метанольной смеси от 20 до 70% метанола, то более предпоч^ тительно заполнить резервуары хроматографа водно-метаноль- ными смесями с 20 и 70% метанола и проводить градиентное элюирование от 0 до 100% содержания второго компонента.

Если градиент формируется на стороне высокого давления, то хроматограф должен иметь два или более насоса высокого да-

вления по числу растворителей^ используемых в составе подвижной фазы. Каждый компонент смешанной подвижной фазы подается отдельным насосом с самостоятельным электронным или микропроцессорным управлением. Программа управления всеми насосами обеспечивает постоянную суммарную скорость подачи элюента в течение всего хроматографического эксперимента, В то же время скорость подачи каждого из компонентов смешанной подвижной фазы должна изменяться в соответствии с заданной программой* Поток растворителя от каждого насоса направляется в смесительную камеру и далее в устройство для ввода проб и в хроматографическую колонку.

Самый простой, но, по-видимому, наименее точный способ создания градиента состава подвижной фазы заключается в формировании градиента в цилиндре шприцевого насоса. Этот способ позволяет создавать ступенчатый градиент. Порции подвижной фазы с последовательно изменяющимся составом помещают в цилиндр шприцевого насоса при его зарядке. При тщательной работе можно избежать значительного перемешивания отдельных порций подвижной фазы. В рабочем цикле насоса порции подвижной фазы со ступенчато изменяющимся составом вытесняются в колонку в обратной последовательности. Некоторые особенности различных систем создания градиента сопоставлены в табл* 15*

На первый взгляд может показаться^ что системы создания градиента на стороне низкого давления проще по устройству и более предпочтительны, чем системы высокого давления, так как клапанные системы, как правило, менее дорогие, чем до полнительные насосы. Однако клапанные системы, в которых растворители обычно находятся при неболыпем вакууме, обычно не способны предотвратить наличие в растворителях некоторого количества растворенных газов* Это приводит к частым неполадкам в работе таких систем. Газовые пузыри нарушают работу клапанов и поршней насосов и прерывают поток растворителя, особенно в тех случаях, когда применяются буферные растворы и водно-органические подвижные фазы, часто используемые в высокоэффективной жидкостной хроматографии* Таким образом, при использовании систем создания градиента на стороне низкого давления необходимо проводить тщательное освобождение применяемых подвижных фаз от растворенных газов и далее предохранять освобожденные от газов растворители от контакта с воздухом.

Высокая стоимость сложных систем дегазации растворителей совместно с клапанными устройствами делает примерно одинаковой стоимость приборов с формированием градиента на сто-

Таблица 15

Сравнительные характеристики систем для создания градиента состава подвижной фазы

Тип системы для формиро - ванн冃 градиента

Точность поддержания градиента в начале и в конце xpowaroqja- фического опыта

Возможность работы с микро' колонкам

Стоимость

Точность поддержания скорости подвижной фазы

Система низкого давл^мия

Высокая

Низкая

Умеренная

Высокая

Система высокого давления

Высокая при работе со шприцевыми насосами; низкая при работе с поршневыми и плунжерными насосами

Умеренная

Высокая

Умеренная

Формирование градиента в цилиндре шттрнцевого насоса

Низкая

Высокая

Низкая

Высокая

роне низкого и высокого давление Однако в тех случаях, когда требуется проводить градиентное элюирование со смесями трех или четырех растворителей, системы формирования градиента на стороне низкого давления становятся менее дорогими*

Таким образом, сопоставляя по лежите л ь и ы е и отрицательные стороны системы создания градиента на стороне высокого и низкого давления, можно сделать следующие заключения. Системы высокого давления довольно просты и устойчивы в работе. Они не требуют очень тщательного освобождения применяемых растворителей от растворенных газов и позволяют довольно легко переходить от работы с микроколонками к работам полупре- паративного и препаративиого масштаба.

Такие системы могут работать с относительно простыми и недорогими насосами. Манометры, демпфирующие устройства, линии подачи подвижной фазы могут иметь достаточно большие объемы, что не нарушает нормальную работу таких систем и не вносит заметных погрешностей в точность и воспроизводимость получающихся градиентов.

Для системы формирования градиента на стороне низкого давления весьма существенно наличие надежного устройства дегазации растворителей. Это является необходимым условием для стабильной работы такой системы. Имеются системы с постоян* ной продувкой гелия через растворитель, требующие довольно

большого расхода этого газа. Более экономичны системы с полупроницаемыми фторопластовыми трубками, заключенными в вакуумированный сосуд. Эти системы довольно дороги, но позволяют избежать расходования гелия и обеспечивают удаление более 99% газов, растворенных в применяемой подвижной фазе* В современных приборах для высокоэффективной жидкостной хроматографии устройства для создания градиента управляются микропроцессорами или персональными компьютерами.

Устройства для смешения компонентов обычно представляют собой сосуды относительно небольшого объема, снабженные магнитной мешалкой. Иногда эти устройства дублируются. При недостаточно эффективной работе смесительного устройства в колонку поступает подвижная фаза с неконтролируемым, неопределенным составом, что влечет за собой невоспроизводимость времен удерживания и значительное увеличение шумов детектора* Менее эффективны так называемые статические смешивающие устройства, представляющие собой особой формы каналы, обеспечивающие смешивание двух растворителей при их течении, При проведении препаративных работ, требующих повышенных расходов подвижной фазы, необходимо применять сме- сители большего объема. Напротив, при работе с микроколонками приходится применять смесители с объемом около 0,1 мл. Попытки применять в этом случае смесители с объемом около L0-1J мл приводят к значительным искажениям профиля получаемого градиента* Это легко объяснимо, если учесть, что для нормальной работы колонки диаметром 1 мм нужно обеспечить расход подвижной фазы около 30 мкл/мин. В этом случае растворитель в смесителе объемом 1,5 мл будет полностью заменен только через 30-50 мин.

Системы для создания давления подвижной фазы. В большинстве современных приборов для высокоэффективной жидкостной хроматографии скорости подвижной фазы составляют 0,1-10 мл/мин, а рабочие давления на входе в колонку достигают 1000 кг/см1 и более* В первый период развития высокоэффективной жидкостной хроматографии в 6Ох гт* XX столетия для подачи подвижной фазы в колонку использовали герметичные сосуды, соединенные с источником сжатого газа (с баллоном или с компрессором). Непосредственное соприкосновение подвижной фазы со сжатым газом приводило к растворению газа в жидкости. При снижении давления в процессе течения подвижной фазы через колонку растворенные газы выделялись, что приводило к нарушению работы и колонок, и детектирующих систем. Для того, чтобы снизить отрицательное влияние этих нежелательных явлений на работу хроматографических систем, в этих системах

использовали газы с низкой растворимостью в органических и в водных подвижных фазах (например, гелий). Кроме того, принимали меры к тому, чтобы по возможности уменьшить площадь соприкосновения газа с применяемым элюентом. Для этой цели сосуды для подвижной фазы выполняли в форме свернутых в спираль трубок диаметром 10-20 мм и длиной от 1 до 10 м. Эти устройства назывались ^змеевиковыми насосами,\ В лаборатории автора успешно работала система для высокоэффективной жидкостной хроматографии, в которой резервуар для растворения представлял собой свернутую в спираль медную трубку диаметром 1 мм и длиной 100 м* Предпринимались попытки уменьшить растворение газов в подвижной фазе путем применения поршней и диафрагм различной конструкции, а также путем использования масляных или ртутных промежуточных жидкостей, предотвращающих непосредственный контакт сжатых газов с элюентом^ подаваемым в колонку. Все эти устройства страдали серьезными недостатками и были весьма ненадежны в работе, что привело к их постепенной замене более совершенными устройствами для подачи элюента* В результате стали общеупотребительными шприцевые нагнетающие устройства, системы с пневматическим усилением давления и поршневые и плунжерные насосы возвратно-поступательного действия.

Принцип действия шприцевых насосов ясен из их наименования. Цилиндр шприцевого насоса мог иметь объем от 2,0-2,5 мл до 0,5 л и более. Его поршень продвигается с помощью винтового привода с синхронным или шаговым эл е ктродвигател ем, управляемым компьютером. Наиболее совершенные шприцевые насосы обеспечивают подачу растворителя со строго постоянной скоростью от ОД до 10 мл/мин* Давление на входе в колонку при этом зависит от ее гидравлического сопротивления и может изменяться в диапазоне 200-300 кг/м2. Общее количество растворителя соответствует объему цилиндра и обычно является достаточным для проведения от одного до десяти хроматографических опытов* После каждой такой серии экспериментов необходимо вновь заполнять шприц новой порцией растворителя. В большинстве случаев это не вызывало серьезных затруднений в повседневной работе, за исключением тех случаев, когда оказываются недопусти мы м и значительные потери времени и затраты растворителей, неизбежные при частых переходах от одной подвижной фазы к другой.

Сходными по принципу действия являются появившиеся несколько позже системы подачи подвижной фазы с пневматическим умножением давления. В таких системах вытесняющий жидкую фазы поршень малого диаметра продвигается с помо-

шью поршня значительно большего диаметра, приводимого в движение давлением газа, сжатого до 3-6 кг/см2 (азота, воздуха и т.п.)* В связи с тем, что сечение газового поршня много больше, чем сечение жидкостного поршня, можно обеспечить давление подвижной фазы на входе в колонку до нескольких сотен кг/см2 при относительно низком давлении газа над газовым поршнем*

Рабочее давление подвижной фазы, Р^ обеспечиваемое насосом с пневматическим умножением давления можно вычислить по следующей формуле:

…(3-1)

где Ps - давление сжатого газа; S^ и S, — площади поперечного сечения газового и жидкостного поршней, а % н 勺 их радиусы, соответственно, Насосы такого типа позволяют обеспечить на входе в колонку давления до 1000 кг/см2 при довольно больших объемных скоростях растворителя* По этой причине они применяются для заполнения колонок для высокоэффективной жидкостной хроматографии. Давление, развиваемое таким насосом, оказывается строго постоянным при любых изменениях гидравлического сопротивления колонки. Однако воспроизводимость давления относительно невысока* Для того, чтобы при работе с таким насосом добиться воспроизводимых значений параметров удер^ живания, необходимо обеспечить строго постоянное гидравличе^ ское сопротивление применяемой колонки и поддерживать строго постоянными температуру колонки и вязкость подвижной фазы на всем протяжении хроматографического эксперимента. Эти особенности системы подачи подвижной фазы с пневматическим умножением давления затрудняют проведение экспериментов с градиентным элюированием и к тому же, как и их шприцевые аналоги, требуют большого количества растворителя для промывки насоса при замене подвижной фазы. Однако такие насосы проще в изготовлении и менее дороги, чем шприцевые насосы такой же вместимости. Кроме того, дополнительными достоинствами таких насосов являются отсутствие каких-либо флуктуаций давления и скорости подаваемой подвижной фазы, относительно простая конструкция и высокая надежность в работе.

Тем не менее, наиболее совершенными и чаще всего применяемыми в настоящее время в жидкостной хроматографии являются поршневые или плунжерные насосы возвратно-поступательного действия. Уже в 1980-е гг. такими насосами снабжались более 85% всех приборов для высокоэффективной жидкостной

хроматографии, выпускавшихся ведущими приборостроитель- ными фирмами во всем мире. В этих насосах нагнетаемая жидкость заполняет цилиндр насоса в такте всасывания и вытесняется поршнем или плунжером в линию подачи подвижной фазы б такте нагнетания. Возвратно-поступательное движение поршня обеспечивается с помощью электродвигателя и кулачкового или кривошипно-шатунного механизма. Теория таких насосов хорошо разработана в течение многих столетий их использования в технике и детально описана в курсах теоретической механики и гидравлики. В соответствии с этой теорией величина объемной скорости подаваемой насосом жидкости определяется тремя факторами: диаметром поршня, амплитудой возвратно-поступательного движения и частотой движения поршня.

Насосы возвратно-поступательного действия обеспечивают постоянную скорость потока подвижной фазы вне зависимости от изменений гидравлического сопротивления колонки. Наибольшее давление, которое могут развивать такие насосы, составляет 500^800 и даже 1000 кг/см2. Эта величина ограничивается только качеством уплотнений поршня. Такие величины давления вполне достаточны для подавляющего большинства областей применения высокоэффективной жидкостной хроматографии. Воспроизводимость объемной скорости нагнетаемой жидкости в общем также оказывается достаточно удовлетворительной. Однако принципиальным недостатком насосов возвратно-поступательного действия является то обстоятельство> что жидкость ими подается не непрерывным потоком, а в форме последовательных импульсов. Перемещение поршня насоса возвратно-поступательного действия с кулачковым или кривошипно-шатунным приводом пропорционально синусу угла поворота приводного вала. Отсюда при первом полуобороте приводного вала подача растворителя сначала растет от нуля до некоторого максимального значения и вновь падает до нуля. Во время второй половины оборота, когда новая порция жидкости засасывается в цилиндр насоса, подвижная фаза в хроматографическую систему не поступает.

Таким образом, одноцилиндровый возвратно-поступательный насос подает жидкость в форме синусоидальных импульсов с перерывами между ними длительностью в половину каждого оборота приводного вала.

Для того, чтобы уменьшить это нежелательное явление, применяют двухцилиндровые насосы, в которых каждый цилиндр работает со сдвигом фаз движения на 180°. Это позволяет избежать полного прерывания подачи жидкой фазы в тактах всасы- ваннх, но не исключает периодического уменьшения потока от максимальной величины до нуля и нового его возрастания от ну-

ля до максимального значения. Однако такие нерегулярности потока подвижной жидкой фазы могут быть устранены с помощью специальных демпферных устройств различного типа. Некоторые из таких устройств описаны далее,

В то же время почти полное устранение неравномерности по- 口аин и импульсов скорости подвижной фазы может быть достигнуто при использовании насосов с тремя цилиндрами, работающими со сдвигом по фазе на 120°. Теория работы возвратно-поступательных насосов утверждает, что в этом случае неравномерности скорости подачи жидкой фазы в продолжении одного оборота приводного вала насоса не превышает 13% от ее максимального значения. Кроме того, частота импульсов становится в три раза выше числа оборотов привода насоса* Это существенно облегчает задачу подавления таких импульсов и сглаживания скорости подаваемой насосом жидкости*

В принципе было бы возможно обеспечить еще большее подавление неравномерностей подачи жидкости, если использовать насос с шестью цилиндрами, работающими со сдвигом по фазе на 60°. Теория предсказывает, что в этом случае неравномерность подачи подвижной фазы не превысила бы 0,8% от максимальной скорости подачи, а частота импульсов была бы в шесть раз 6оль・ те, чем число оборотов привода насоса. Однако уже трехцилиндровые насосы оказываются значительно дороже, чем одноцилиндровые и двухцил индровы е модели. В этом заключается причина того, что в настоящее время трехцилиндровые насосы для вы со коэффе ктивно й жидкостной хроматографии производятся лишь очень небольшим числом произ во дителей *

Тем не менее многочисленные усовершенствования в конструкции насосов воавратно-поступательного действия позволили существенно уменьшить флуктуации скорости подачи нагнетаемой жидкой фазы, свойственные одноцилиндровым й двухцилин- дровым насосам этого типа. Так, например, применение кулачков со специально рассчитанным профилем позволяет снизить уровень флуктуаций скорости подачи до 9% в случае одноцилиндрового насоса, до 3% для двухцилиндрового и до примерно 0,2% для трехцилиндрового* В то же время насосы с двумя или тремя цилиндрами более сложны в ремонте и обслуживании и более чувствительны к загрязнениям клапанов* Поэтому столь сложные и дорогие насосы можно рекомендовать использовать только в тех случаях, когда необходима особая точность подачи подвижной фазы. Типичным примером таких приложений метода жидкостной хроматографии является применение зксклюзнон- ной хроматографии для определения молекулярно-массового распределения полимеров.

Одним из вариантов плунжерных насосов являются мембранные насосы, в которых плунжер движется в полости, заполненной жидким маслом и отделенной от рабочего объема насоса тонкой диафрагмой из инертного пластика, устойчиво работающего в контакте как с маслом, заполняющим плунжерную камеру, так и с растворителями, находящимися в рабочем объеме насоса (например* из фторопласта), В этих насосах подаваемый элюент не соприкасается с уплотнениями плунжера, что существенно облегчает выбор материала для изготовления этих деталей прибора.

В современных приборах для жидкостной хроматографии обычно применяют сапфировые плунжеры и сапфировые шаровые клапаны, опирающиеся на тщательно обработанные сапфировые седла. Этот материал вполне устойчив по отношению ко всем органическим жидкостям и разбавленным водным раство^ рам, используемым в качестве элюентов б жидкостной хромато^ графии. В некоторых моделях аппаратуры используют миниатюрные пластинчатые клапаны, несколько более устойчивые по отношению к не значите л ьным механическим загрязнениям.

В общем, в большинстве случаев вполне достаточно использовать для высокоэффективной жидкостной хроматографии двухцилиндровый возврати о- поступ ательны й плунжерный насос с оптимизированной формой кулачков привода и с регулированием про из во дительности путем изменения частоты движения плунжера- Такие насосы вполне достаточны для получения надежных и хорошо воспроизводимых результатов хроматографических экспериментов.

Демпфирующие устройства. Для того, чтобы уменьшить колебания давления и нарушения равномерности подачи подвижной фазы при использовании возвратно-поступательных насосов, применяют демпфирующие устройства различного типа. Простейшими из них являются свернутые в спираль упругие трубки из нержавеющей стали или жесткой бронзы наподобие трубок Бурдона, применяемых в манометрах. Такие трубки прямоугольного (щелевидного) сечения включают параллельно или последовательно в линию подачи растворителя непосредственно после насоса и перед устройством для ввода проб хроматографа- Часто бывает достаточно для этой цели установить сразу после насоса манометр с упругой трубкой достаточно большого объема, однако следует принять специальные меры для полного заполнения трубки манометра жидкой фазой. Часто в системах подачи подвижной жидкой фазы используют упругие элементы сильфонного типа, помещенные в сосуды высокого давления, заполненные подвижной фазой* Сами эти упругие элементы заполняют отно-

сительно легко сжимаемой жидкостью (керосином, машинным маслом и др). Кроме того, в современных приборах применяют достаточно сложные и эффективные системы электронного контроля давления и скорости подачи, управляемые микропроцессорами или компьюте рами,

Устройства для ввода проб. В принципе ввод проб в жидкостной хроматографии может осуществляться также как я в газовой путем прокалывания эластичной мембраны иглой специального микрошприца. Такой способ ввода проб достаточно удобен до давлений порядка 100 кг/см2. Однако во многих случаях этот способ ввода проб оказывается недостаточным. При более высоких давлениях часто используется способ ввода пробы с прерыванием потока подвижной фазы. В этом случае подачу подвижной фазы пр и останавливают на время ввода пробы путем остановки насоса или путем перекрывания специального клапана. При этом избыточное давление на входе в колонку падает до нуля всего за несколько секунд* после чего открывают колонку и вводят пробу прямо на входной фильтр колонки с помощью микрошприца или микропипетки. Затем вновь закрывают колонку и возобновляют подачу подвижной фазы. Такой способ ввода проб можно применять до давлений порядка 800-1000 кг/см3 без каких-либо особых осложнений» Однако потери времени, связанные с отвинчиванием входных фитингов колонки, причиняют известные неудобства. Кроме того, при частом повторении этих операций довольно быстро наступает износ соответствующих деталей. Дополнительным недостатком такого способа ввода проб является расширение хроматографических пиков, особенно заметное для компонентов, слабо удерживаемых в колонке и быстро элюируемых из нее*

Поэтому в современных приборах для ВЭЖХ для ввода проб используют специальные крановые или клапанные устройства. Обычно эти устройства снабжаются петлеобразными трубками известного объема* Поток подвижной фазы направляется в колонку через эту пробоотборную трубку или минуя ее с помощью тщательно выполненных шестиходовых кранов очень малого объема (рис, 55).

Крановые системы обеспечивают очень высокую воспроизводимость объема вводимых проб. Этот объем можно изменять от 10 мкл до 10 мл путем простой замены дозирующих трубок* Крановые системы хорошего качества могут устойчиво работать до давления порядка 800 кг/см3+ Эти устройства не требуют ремонта даже после ввода нескольких тысяч проб, В том случае, если сжатие трущихся деталей крановых устройств будет таким, чтобы обеспечить их устойчивую работу только до

Рис* 55* Дозировочный кран для ввода проб:

/ - корпус крана; 2 - пробка крана; 3 - дозировочная емкость (петля)

350-400 кг/см2, то их срок службы значительно увеличивается* В то же время такое давление вполне достаточно для большинства хроматографических анализов.

Разработаны устройства с пневматическим или электромеханическим приводом, позволяю

щие осуществлять автоматический ввод более 100 проб в соответствии с заранее заданной программой. Обычно эти устройства способны полностью выполнить все необходимые при вводе проб операции: промывку дозирующей трубки, заполнение ее подлежащей анализу жидкой пробой и ввод этой пробы в хрома- тографическую колонку. Такие системы довольно дороги и тре^ буют к в а л ифицированного обслуживания, поэтому их использо

вание оправдано только в тех случаях, когда необходимо анализировать большое число проб, сходных по своему составу*

В некоторых наиболее современных хроматографах для ввода проб используется дополнительный насос, управляемый компьютером и обеспечивающий ввод проб по его командам. Более подробное описание этих систем выходит за пределы задан данной книги.

Колонки. Наиболее важным элементом любой системы для ВЭЖХ являются разделяющие колонки. Их размеры и конструкции весьма разнообразны в зависимости от конкретной модификации метода и особенностей решаемой аналитической задачи. Типичные характеристики колонок, широко применяемых в настоящее время и имеющих перспективы применения в ближайшем будущем, приведены в табл. 16* В последнем столбце этой таблицы приведены также данные колонок для жидкостной хроматографии, которые были использованы до развития концепции ВЭЖХ.

В большинстве случаев колонки для высокоэффективной жидкостной хроматографии представляют собой прямые толстостенные трубки из нержавеющей стали, стекла или подходящих пластмасс с винтовыми соединительными деталями на концах* Применяются стеклянные и кварцевые капиллярные колонки

Таблица 16

Характеристика основных типов колонок для высокоэффективной жидкостной хроматографии

Параметр

Аналитическая колонка

Высоко^ скоростная аналитическая ко* ломка

Мнкро- колонка

Капиллярная колонка

Препаративная колонка

Колонка для обычной жидкостной хроматографии

Длина ко дюнкм мм

50-250

50 :

150

От 100 мм до 60 и

100-300

100-500

Внутренний диаметр» мм

3-6

3-6

1Q

0,03-0,05

10-60

10-60

Скорость потока подвижной фазы, мл/мин

15

2,5

0J

0,01

30

0т0!-1т0

Давление на входе, кг/см^

50-500

10СМ00

50-200

50^200

1(М00

0.01^0 J

Полная эффективность колонки^ ТЫС. Т€<Ф+ тар+

3-20

3-5

7

5^100

27口

0J-L0

В9ТТ, мм

0,015

0т01

0g 5

0,01

0т015

Размер частиц адсорбента, мкм

3-10

3-7,5

3-7,5

Диаметр капилляра &03- 0*05 мм

5-10

30-100

диаметром 0,03-0,05 мм и длиной от 100 мм до 40-60 м и более. Колонки заполняются подходящими адсорбентами как описано выше. Внутренняя поверхность трубок из нержавеющей стали довольно шероховата, причем размеры неровностей, обусловленных технологией изготовления трубок, обычно соизмеримы с размерами зерна адсорбентов. Поэтому внутреннюю поверхность трубок, предназначаемых для изготовления колонок, подвергают специальной полировке.

Слой адсорбента удерживается в колонке с помощью специальных фильтрующих элементов, выполненных из пористой нержавеющей стали или керамики с размерами пор 0,45-2,0 мкм. Эти фильтры закрепляются в колонке с помощью винтовых фитингов для удержания слоя адсорбента в колонке при больших перепадах давления и предотвращения засорения адсорбента механическими примесями. Концевые соединительные детали ко* лонок выполняются таким образом, чтобы воспрепятствовать дополнительному расширению хроматографических зон при входе в колонку и выходе из нее.

Время эксплуатации колонок в жидкостной хром ат огр а фии заметно меньше, чем в газовой и редко превышает 1 мес.

Отработанные металлические колонки иногда наполняют адсорбентом повторно, но чаще предпочитают просто выбрасывать, Это, естественно, увеличивает расходы на проведение хроматографических работ и стоимость обслуживания хроматографических приборов. В связи с этим, часто применяют колонки с заменяемыми вкладышами, заполненными адсорбентом. Эти детали, изготовленные из стекла или подходящей пластмассы, при необходимости могут быть легко заменены, поэтому основные металлические колонки могут работать значительно более длительное время. Во избежание загрязнения основного адсорбционного слоя нежелательными примесями, присутствующими во вводимых пробах или в подаваемой подвижной фазе, перед основной колонкой уста навли в а ют добавочную короткую трубку с адсорбентом (форколонку), надежно защищающую основной адсорбент от возможных загрязнений.

Фирма Уотерс (США) выпускает высокоэффективные колонки для жидкостной хроматографии оригинальной конструкции. Эти колонки изготовляются из довольно мягких полимерных трубок, заполненных мелкозернистым адсорбентом сухим способом, как в газовой хроматографии. Далее эти колонки помещают в сосуд высокого давления и подвергают радиальному сжатию под действием входного давления подвижной фазы Такое сжатие обеспечивает достаточную равномерность слоя ад- сорбента^ что позволяет достичь высокой эффективности колонки. Диаметр таких колонок составляет 8-10 мм для аналити* ческих определений и до 40 мм для препаративных разделений* Важно отметить, что эффективность таких колонок большого диаметра при разделении малых проб оказывается не только не ниже эффективности колонок меньшего диаметра, но часто и превосходит ее.

Сходная процедура аксиального сжатая используется в системах для препаративной жидкостной хроматографии, разработанных французской фирмой Жобен Ибон [9-12]. В этих системах слой адсорбента с величиной частиц 1СМ0 мкм подвергается осевому сжатию под давлением 10-15 кг/см2 с помощью поршня, передвигающегося непосредственно в стальной колонке под действием гидравлического домкрата* При этом оказалось возможным получить величину ВЭТТ в пределах ОД 7-0,22 мм на колонке длиной 20 см, содержащей 500 г адсорбента с величиной частиц 10"40 мкм. Пробы содержали фенол и ряд загрязняющих примесей. В колонку вводили пробы (объемом до 2 мл) раствора фенола и его примесей в смеси хлористого метилена и диэтило-

вого эфира (85 : 15) с концентрацией разделяемых веществ 4 мг/мл.

В другой серии экспериментов по разделению проб дибензила и содержащихся в нем примесей была достигнута величина ВЭТТ около 0,07 мм при вводе в колонку диаметром 80 мм проб массой 20 мг. Колонка была заполнена силикагелем с величиной частиц 4-10 мкм [6]*

В ВЭЖХ используются также и капиллярные колонки* Главным фактором, определяющим расширение хроматографических зон, б этом случае является сопротивление массопередаче в подвижной фазе, т.к* коэффициенты диффузии в жидкости значительно меньше, чем в газовой 巾азе. Это обстоятельство не позволяет получить высокую эффективность при использовании капиллярных колонок с такими же диаметрами, как в газовой хроматографии [13-19]. Было показано теоретически, что для получения высоких значений эффективности в жидкостной хроматографии необходимо использовать капиллярные колонки диаметром меньше, чем 50 мкм. Поэтому в настоящее время для этой цели используют колонки диаметром 30^65 мкм и длиной от 20-100 см до 50-60 м* В процессе развития ВЭЖХ на капиллярных колонках были затрачены значительные усилия для снижения сопротивления массопередаче в подвижной фазе* Для этого применяли колонки очень малого диаметра [20-24], использовали разного рода турбулизаторы потока [25], колонки, свернутые в спирали малого диаметра (5-8 мм) [26] Ф и колонки некруглого или периодически меняющегося сечения [27]. Накопленные данные с большой обстоятельностью рассмотрены в монографиях [18, 19].

Как и в газовой хроматографии ВЭТТ в жидкостной хроматографии на капиллярных колонках описывается известным уравнением Голея:

(3-2)(3-3)(3-2)(3-3)" 2D ⑴严+6女+ 1)胃

(3-2)

(3-3)

(3-2)

(3-3)

u 96(l + k)2&,30+ 幻2 R

или2D

Н = ^ + (СШ + С5)и.

Это уравнение чаще рассматривается в приведенной форме:

(3-4)(3-4),2 11&?+6归+ 1 , 2Jt f df

(3-4)

(3-4)

Й = —I方 H7

u 96(1 +Л)23(1 + 外2(4

где h - это приведенная высота, эквивалентная теоретической та-

релкерелкеНН(3-5)(3-5)

релке

релке

Н

Н

(3-5)

(3-5)

⑶6)⑶6)口 - приведенная скорость подвижной фазы:

⑶6)

⑶6)

4

Уравнение (3-2) демонстрирует, что именно второй его член, описывающий сопротивление массопередаче в подвижной фазе, вносит наибольший вклад в ВЭТТ при наименьшей приемлемой скорости подвижной фазы и при значениях 女，превышающих еди・ ницу. Расчеты показывают, что капиллярные колонки большой длины и малого диаметра могут обеспечить и в жидкостной хроматографии полную эффективность разделения в несколько сотен тысяч теоретических тарелок, что намного превышает возможности наполненных колонок*

В настоящее время в жидкостной хроматографии применяются стеклянные капилляры малого диаметра и гибкие кварцевые капилляры с наружным полиимидным покрытием. Стеклянные капилляры обычно вытягиваются в лаборатории как описано в гл. 5 1-го тома и имеют длину до 20-60 м и внутренний диаметр 20-60 мкм.

Обработку внутренней поверхности, ее дезактивацию и нанесение неподвижной фазы проводят в общем так же как и в капиллярной газовой хроматографии. Обычно б жидкостной хромато** графин используют капиллярные колонки с иммобилизованньь ми неподвижными фазами на стенках или со слоями адсорбентов, нанесенными на стенки или сформированными из материала самого капилляра с помощью тех или иных те х но л огич еск их прие^ мов. Во многих случаях такие слои готовят из инертных твердых носителей с нанесенными на них подходящими неподвижными фазами. Процедуры, используемые для нанесения таких сорбционных слоев в общем аналогичны тем* которые применяются для приготовления капиллярных колонок для газовой хроматографии [13-15, 28-35].

Достаточно часто в жидкостной хроматографии применяются и колонки малого диаметра (0,02",5 мм), заполненные подходящими адсорбентами. Стеклянные капиллярные колонки такого типа с подходящими адсорбентами могут быть без особого труда получены путем вытягивания нз стеклянных заготовок диаметром 0,8-2 мм, заполненных подходящими термически устойчивыми адсорбентами или твердыми носителями, такими как силика-

гели, оксид алюминия, графитированные сажи и др. Далее может быть проведена дезактивация таких сорбентов и нанесение неподвижной фазы путем продавливания через изготовленный капилляр растворов силанизирующих агентов или неподвижных жидких фаз с последующей иммобил и зацией последних [36]* Колонки, выполненные из металлов или пластмасс (например, из фторопласта [37-39]), могут быть заполнены адсорбентами с помощью суспензионного метода как описано выше в этой главе*

Важной характеристикой таких колонок является отношение их диаметра к величине частиц применяемого сорбента. Нежелательно, чтобы это отношение было больше 10, т*к. в этом случае становится возможным вымывание частиц сорбента потоком подвижной фазы. Эффективность колонок с внутренним диамет* ром 50-70 мкм и длиной 10-65 м может достигать 70 тыс* т.т. и более.

Применение капиллярных колонок позволяет резко сокра* тить расход подвижной фазы: объемная скорость подвижной фазы обычно не превышает 10-30 мкл/мин. Однако становятся существенно более жесткими требования к устройствам для ввода проб и детектирующим системам. Объем вводимых жидких проб не должен превышать 1-3 мкл, и примерно таким же должен быть объем рабочих ячеек детектора. Некоторые детекторы такого типа описаны ниже. Кроме того, повышаются требования ко всем линиям подачи подвижной фазы и конструкции соединительных узлов хроматографа с тем, чтобы в максимальной степени исключить возможность внеколоночного размывания хроматографических зон и соответствующего снижения эффективности разделения*

При соединении нескольких хорошо заполненных мелкозернистым адсорбентом колонок относительно небольшой длины в жидкостной хроматографии была достигнута очень высокая эффективность разделения. В этом случае приобретает особое значение рациональная конструкция соединительных узлов во всей хроматографической системе. Были разработаны весьма совершенные конструкции соединительных узлов колонок и линий подачи подвижной фазы, применение которых позволило достигать эффективности разделения до 10* т.т. и более. Так, например, при анализе смесей обычного бензола и пердейтеробензола и смесей диазепамов была достигнута эффективность до 7 х 106 т.т. при использовании десяти последовательно соединенных колонок длиной 50 см каждая, заполненных силикагелем с величиной зерна 5 мкм [40. 41].

Было показано, что при использовании капиллярных колонок диаметром 10-50 мкм можно достичь эффективности разде-

ления от 1,25 х 106 до 5 х 106 т.т. [42, 43]. Капиллярные колонки диаметром 10 мкм позволяют достигать эффективность более 50 000 т.т. при длине колонки менее 1 м [44], Время удерживания разделяемых соединений в таких колонках составляет всего лишь 8-10 сек и даже менее*

Таким образом, рассмотренные примеры демонстриру ют возможности достижения очень высокой эффективности разделения в жидкостной хроматографии. Однако получение высокой эффективности требует очень высокого качества всей хроматографической системы и большого опыта э к оперим е нтатора, По- видимому, именно этим фактом можно объяснить то обстоятельство, что в настоящее время подавляющее большинство анализов с помощью метода жидкостной хроматографии выполняется с использованием коммерчески доступных приборов, в которых применяются колонки длиной 3-25 см и диаметром 2-6 мм. Такие колонки позволяют получить эффективность разделения до 3-20 тыс* т.т., что во многих случаях, как, например, в работе [45], оказывается вполне достаточным.

Детекторы для высокоэффективной жидкостной хромято- графин^ Применяемые в современной жидкостной хроматогра* фии детекторы должны обеспечить регистрацию изменений не- которых свойств подвижной фазы, покидающей хроматографическую колонку, связанных с элюированием из колонки разделенных компонентов анализируемой пробы. Такими свойствами могут быть оптические характеристики в УФ-. ИК- или видимом спектральном диапазоне, показатель преломления, флуоресцентные свойства, электропроводность, диэлектрическая проницаемость, способность к окислению или восстановлению и др.

Как и в газовой хроматографии, детекторы для жидкостной хроматографии могут быть разделены на две категории: универсальные и селективные. Детекторы первой категории могут регистрировать наличие в элюате любых веществ, кроме ком* понентов подвижной фазы, безотносительно к наличию или отсутствию у них каких-либо специфических индивидуальных свойств. Такие детекторы находят широкое применение в син* тетической органической химии, нефтехимии, биохимии, фар** мащш, медицине и др.

Селективные детекторы способны регистрировать элюирование из колонки веществ, интересующих экспериментатора и обладающих какими-либо специфическими свойствами по сравнению с другими компонентами, присутствующими в элюате. К этой категории относятся, например, фл уоре сцентн ы е и электрохимические детекторы. Эти детекторы широко используются при анализе следовых компонентов фармацевтических пре пара-

товФ наркотиков или биогенных аминов в биологических пробах и объектах окружающей среды*

Идеальный детектор для жидкостной хроматографии не дол^ жен вызывать дополнительного расширения хроматографической зоны компонентов» элюируемых из колонки. Чувствительность детектора должна быть достаточно высока. Весьма желательно, чтобы величина отклика детектора на конкретное соединение могла бы быть рассчитана a priori из структуры определяемого соединения или из его физических или химических свойств. Детектор может быть деструктивным или недеструктивным, причем последнее более предпочтительно* Сигнал детекто^ ра не должен существенно изменяться при небольших изменениях температуры, скорости подвижной фазы и ее состава. Зависимость сигнала детектора от концентрации вещества в элюате или от его количества должна быть линейной в достаточно широком динамическом диапазоне. Весьма желательно, чтобы детектор давал бы какую-нибудь информацию о качественном составе и молекулярной структуре определяемых веществ. Детектор должен обладать достаточным быстродействием (т*е. малой постоянной времени) и, по возможности, не должен зависеть от соста* ва подвижной фазы.

Детекторы, применяемые в настоящее время в жидкостной хроматографии, конечно, не обладают всеми характеристиками идеального детектора. Универсальных детекторов для жидкост- ной хроматографии, например, таких как пламенно-ионизационный детектор в газовой хроматограф и и, до настоящего времени пока не существует. Тем не менее, имеющийся набор детекторов дает возможность выполнять много интересных и важных опре* делений* Ассортимент доступных детекторов непрерывно пополняется по мере появления новых разработок.

Каждый детектор характеризуется уровнем собственных шумов, который может различаться по крайней мере на один порядок величины для детекторов^ работающих на основе одних и тех же принципов, но произведенных разными производителями* Второй очень важной характеристикой любого детектора является величина дрейфа его сигнала (то есть дрейф нулевой линии). Этот параметр определяют как смещение нулевой линии за определенный промежуток времени при отсутствии каких-либо элюируемых из колонки веществ (за 1 час или 1 сутки и т.п,)^ Этот параметр также может различаться на один порядок величины и более у детекторов одного типа, но выпущенных разными про извод ите л ями,

Для успешного использования того или иного детектора весьма важен такой показатель, как собственный объем рабочей

ячейки детектора. Этот объем не должен превышать 0,1 объема элюента, в котором элюируется из колонки первый пик, представляющий интерес с точки зрения выполняемого анализа. Это весьма существенно б случае быстропротекающих анализов, выполняемых на колонках длиной 3-5 смт заполненных адсорбентом с величиной зерна 3-5 мкм* Кроме того, этот показатель весьма важен при работе с колонками малого диаметра (1 мм и менее) и с капиллярными колонками. Во многих случаях^ когда хроматографическое разделение выполняется на капиллярной колонке или на наполненной колонке малого диаметра порядка 25-50 мкм, ячейкой детектора служит участок кварцевого или стеклянного капилляра. При этом кварцевые капилляры на длине 3-5 мм освобождают от лакового внешнего покрытия, предо- храняющего капилляр от атмосферных влияний. Часто первые пики в высокоэффективной жидкостной хроматографии элюируются в очень малом объеме подвижной фазы порядка 30-50 мкл. Это определяет желательный объем ячейки детектора не более 3-5 мкл*

Линейный диапазон сигнала детектора должен быть достаточно широким, для того чтобы обеспечить возможность регистрации как гтреоблад ающих компонентов пробы, так и следовых загрязнений в анализируемом объекте* Приемлемая ширина линейного динамического диапазона детектора должна быть порядка 1(Р Наконец, весьма важной характеристикой детектора является малая чу ветвите л ьн ость к небольшим изменениям температуры, флуктуациям скорости подвижной фазы и изменениям в составе подвижной фазы. Последнее качество особенно важно при проведении хроматографических анализов в условиях градиентного элюирования.

Наиболее важные типы детекторов, применяемых в настоящее время в высокоэффективной жидкостной хроматографии, кратко охарактеризованы ниже*

Фотометрический детектор, работающий в УФ- м видимом спектральном диапазоне+ Проточные фотометры, работающие в УФ-диапазоне, по-видимому, являются в настоящее время наиболее распространенными детектирующими устройствами^ применяемыми в жидкостной хроматографии. Это связано с их относительно небольшой стоимостью в сочетании с высокой чувствительностью и надежностью в работе. Эти детекторы могут проработать более 6000 часов. С другой стороны, этим детекторам присуща относительно малая чу ветвите л ь ноет ь к флуктуациям температуры, скорости подвижной фазы и изменениям ее состава. Принципиальная схема простейшего фотометрического детектора представлена на рис+ 56. Поток элюента протекает через

Рис, 56* Принципиальная схема УФ-фотометра:『-фотоприемники; 2 - рабочая кювета; 3 - оптические фильтры; 4 - ртутная лампа; 5 亠 сравнительная кюветаРис, 56* Принципиальная схема УФ-фотометра:『-фотоприемники; 2 - рабочая кювета; 3 - оптические фильтры; 4 - ртутная лампа; 5 亠 сравнительная кювета

Рис, 56* Принципиальная схема УФ-фотометра:

『-фотоприемники; 2 - рабочая кювета; 3 - оптические фильтры; 4 - ртутная лампа; 5 亠 сравнительная кювета

Рис, 56* Принципиальная схема УФ-фотометра:

『-фотоприемники; 2 - рабочая кювета; 3 - оптические фильтры; 4 - ртутная лампа; 5 亠 сравнительная кювета

рабочую ячейку, а через сравнительную ячейку направляется поток чистой подвижной фазы. Источником УФ-света служит ртутная лампа высокого или среднего давления, дающая интенсивное УФ-излучение в спектральных лиииях линейчатого спектра. Свет с нужной длиной волны выделяется с помощью подходящих оптических фильтров. Ртутные лампы низкого давления излучают более 90% световой энергии в спектральной линии с длиной волны 254 нм, что позволяет отказаться от использования оптических фильтров. В ряде случаев в фотометрическом детекторе используют излучение с длиной волны 280 нм* возбуждаемое с помощью подходящих люминесцентных экранов, В ряде конструкций фотометрических детекторов такое излучение используют во вспомогательном канале детектирования, что облегчает идентификацию неизвестных соединений. Имеются и другие лампьь в сочетании с подходящими оптическими фильтрами излучающие УФ-свет с другими длинами волн (206, 214, 229, 280, 313, 334 и 365 нм* Такие лампы могут бесперебойно работать от 500-600 до 60 000 ч.

Многие органические вещества интенсивно поглощают УФ'Излучение сдлиной волны 254 нм* К ним относятся все ароматические и многие гетероциклические соединения, карбонильные соединения и многие другие. Для детектирования таких соединений применение простых, недорогих и надежных фотометрических детекторов вполне оправдано. Чувствительность этих детекторов достаточно высока и позволяет регистрировать изменения оптической плотности в диапазоне порядка 0,001-0,002 единицы. Шумы и дрейф таких детекторов также незначительны* Ячейки этих детекторов могут иметь собственный объем от 0,2-2 мкл для работы с микроколонками до 10 мкл и более для проведения более крупномасштабных препаративных разделений. Все эти обстоятельства сделали фотометрические детекторы одними из наиболее часто применяемых в ВЭЖХ в настоящее время.

Наиболее совершенные УФ-детекторы содержат набор подходящих фотодиодов, образующих так называемую диодную матрицу или диодную линейку. УФ*излучение с непрерывным спектром (например, излучение дейтериевой лампы) после выхода из рабочей ячейки детектора разделяется на отдельные лучи с той или иной длиной волны, каждый из которых направляется на свой отдельный фотодиод* Таким образом, по существу, фиксируется УФ-спектр каждого вещества, элюируемого из хроматографической колонки. В наиболее совершенных современных хроматоп?афах используются диодные линейки, содержащие 32, 64, 128 и более (до 500-600) диодов*

В сочетании с многоканальными усилителями или компьютерами такие детекторы позволяют одновременно регистрировать целый набор хроматограмм, зафиксированных в разных длинах волн, УФ-детектор с диодной матрицей представляет собой наибольшее из известных приближение к универсальному детекто- ру, позволяющему получить очень большой объем информации о качественном и количественном составе анализируемой смеси в результате всего лишь одного хроматографического эксперимента* Такие детекторы довольно дороги, однако они оказываются исключительно полезными при анализе смесей, сложных по своему составу. Можно ожидать, что в ближайшем будущем сфера их использования в жидкостной хроматографии будет все более и более расширяться [46].

Спектрофотометрические детекторы. Эти детекторы более сложны по устройству, чем фотометрические. Их детальное описание можно найти в специальных руководствах по спектральному анализу или жидкостной хроматографии. Эти детекторы могут регистрировать изменения интенсивности поглощения УФ- излучения б диапазоне длин волн от 190 до 360 нм и видимого света в спектральной области выше 360 нм* Этот диапазон охватывает почти все органические соединения, являющиеся объектами хроматографического анализа и разделения.

Спектрофотометрические детекторы разной конструкции различаются по их спектральному диапазону, уровню шумов и скорости дрейфа. Время работы ультрафиолетовых ламп» являющихся наиболее важными компонентами таких детекторов, к сожалению, относительно невелико и составляет 300-600 ч и лишь в редких случаях достигает 700 ч,

В зависимости от выбранной длины волны спектрофотометр может работать как универсальный или селективный детектор. Так, при работе на длине волны 190 нм этот детектор позволяет регистрировать сахара, жиры, простые и сложные эфиры, синтетические поверхностно-активные вещества, полиэтиленгликоли

и др* Все эти соединения почти не поглощают УФ-излучение с длиной волны более 210 нм. Таким образом, при работе в данном спектральном диапазоне детектор функционирует как универсальное детектирующее устройство. В диапазоне больших длин волн тот же детектор работает как селективный, позволяя регистрировать вещества, поглощающие УФ-излучение в определенных спектральных диапазонах^ характеристичных для соединений с теми или иными особенностями молекулярной структуры.

Многие спектрофотометрические детекторы позволяют записывать полный спектр раствора элюируемого из колонки вещества в подвижной фазе при прерывании ее потока на время снятия спектра или даже в процессе ее движения* Полученные спектры во многих случаях позволяют идентифицировать многие неизвестные компоненты анализируемых смесей, хотя в целом идентификационные возможности спектрофотометрического детектора детектора считаются не слишком высокими. Тем не менее, полученная таким путем информация позволяет вывести определенные заключения о числе компонентов в составе зарегистрированного пика, выявить присутствие тех или иных примесей, оценить чистоту изучаемых соединений, установить длину волны, соответствующую максимуму поглощения света для данного конкретного вещества и, наконец» идентифицировать пики на хроматограмме*

Наиболее совершенные спектрофотометрические детекторы, управляемые компьютером, позволяют автоматически изменять по заданной программе рабочую длину волны в процес* се хроматографического опыта по мере выхода из колонки различных компонентов изучаемой пробы. Таким образом обеспечивается максимально возможная чувствительность детектирования каждого из компонентов изучаемой пробы, представляющего интерес*

Следует отметить, что использование спектрофотометра, работающего на длине волны 190 нм в качестве универсального де- тектора затрудняется очень ограниченным выбором растворителей, прозрачных в этом спектральном диапазоне, В обращенно- фазовой хроматографии при длине волны менее 200 нм можно применять только воду и ацетонитрил после их тщательной очистки. Такие особо чистые растворители довольно дороги, а очистка растворителей в лабораторных условиях достаточно затруднительна* Таким образом, чаще спектрофотометрические детекторы используются в жидкостной хроматографии как селективные регистрирующие устройства.

Как фотометрическое, так и спектрофотометрическое дете- ктирование, может осуществляться как прямое и косвенное. Ве-

щество, элюируемое из колонки, в первом случае регистрируется по увеличению поглощения света с повышением его концентрации в элюате, а во втором случае - по уменьшению светопо- глощения, когда в результате выхода из колонки вещества, не поглощающего в данном спектральном диапазоне, в элюате уменьшается содержание поглощающего свет компонента под- вижной фазы. Такой компонент может присутствовать в подвижной фазе изначально, либо может быть введен в подвижную фазу после колонки и перед ее поступлением в ячейку детектора,

ИК-Фурье спектрометры в качестве детекторов для высокоэффективной жидкостной хроматографии. Этот способ детектирования является одним из самых совершенных как в газовой, так и в жидкостной хроматографии. К сожалению, его использование в жидкостной хроматографии ограничивается его несовместимостью с большинством растворителей, применяемых в качестве неподвижных фаз. Тем не менее, этот способ детектирования может быть применен для регистрации элюируемых из хроматографической колонки соединений по полосам поглощения с наибольшей мольной экстинкцией. При этом такой способ детектирования осуществляется при использовании некоторых специфических растворителей (преимущественно хлорированных углеводородов). Однако, если для детектирования используются полосы поглощения карбонильных групп или непредельных связей, оказывается возможным применять довольно широкий круг растворителей различной полярности (от гексана до ацетонитрила). Этот детектор имеет ряд существенных преимуществ перед другими детектирующими системами. Если детектирование проводится по полосам поглощения связи С-Н, то детектор работает как универсальный, позволяя регистр и ровать почти все органические соединения. С другой стороны, этот детектор может использоваться как высокоселективный, позволяющий выявлять соединения, содержащие группы атомов, обеспечив а ющие сильное поглощение излучения в ИК-спектральном диапазоне (группы ОН, С=О, С=С и пр). Сигнал этого детектора почти не зависит от молекулярной массы детектируемого соединения, что существенно облегчает количественную интерпретацию хроматограмм. Чувствительность этого детектора достигает 10~7-10^ г/мл. Большая часть описанных в литературе современных ИК-детекторов основана на применении диодных матриц как и в УФ-детекторах и работает в сочетании с электронно-вычислительными машинами.

Рефрактометрические детекторы. Непрерывная регистра* ция изменений показателя преломления подвижной фазы на выходе хроматографической колонки может быть осуществле-

на с помощью проточных рефра ктоме тро в * Это устройство, по существу, представляет собой один из наиболее универсальных детекторов для жидкостной хроматографии, известных в насто' ящее время. Современные проточные рефрактометры способны зарегистрировать наличие в подвижной фазе любого вещества, в самой малой степени отличающегося от подвижной фазы по величине показателя преломления. Рефрактометрический детектор может работать в сочетании с любой подвижной фазой в очень широком диапазоне скоростей. Этот детектор, достаточно надежный в работе, предъявляет не слишком высо* кие требования к чистоте применяемых растворителей. Он обладает достаточно широким линейным динамическим диапазоном, однако его чувствительность относительно невысока, так что он является, по существу, универсальным детектирующим устройством умеренной ч у ветвите л ьн ости. При рациональном выборе растворителя предельно детектируемая концентрация вещества может составлять 5 х 10~7 г/мл, что близко к чувствительности ИК'Фурье детектора.

К сожалению, этот детектор не может применяться при проведении градиентного элюирования. Кроме того, при его использовании для обеспечения высокой чувствительности необходимо с высокой точностью поддерживать постоянную температуру. Для снижения шума и дрейфа детектора необходимо также поддерживать постоянную температуру ячеек детектора и элюента с точностью Ig-H Гр3д Рефрактометрический детектор чувствителен к флуктуациям скорости потока подвижной фазы, поэтому при его использовании применение эффективных демпфирующих устройств в системе подачи растворителей является совершенно необходимым*

Имеется три разных подхода к конструкции рефрактометрического детектора. Простейший из них - детектор оптического отклонения. Его действие основано на том, что луч света, проходящий через оптическую ячейку с двумя жидкостями, имеющими разные показатели преломления, отклоняется на угол, прямо пропорциональный разности показателей преломления этих жидкостей. В этом детекторе свет электролампы проходит через сдвоенную ячейку, выполненную в форме двух призмт одна из которых заполнена чистым растворителем, а через другую протекает элюат из колонки. Отклонение светового луча фиксируется с помощью фотосопротивлений и результирующий сигнал усиливается соответствующей электронной схемой*

Такие рефрактометрические детекторы могут работать с любыми растворителя ми и имеют достаточно широкий линейный динамический диапазон. Однако объем ячеек такого детек-

тора не может быть сделан очень малым и обычно бывает не менее 10 мкл, К такому типу устройств принадлежит хорошо известный детектор R401 фирмы Уотерс (США). В то же время описан работающий по тому же принципу лазерный рефрактометрический детектор LP-1 с объемом ячеек всего 0,1 мкл [47].

В качестве удобного детектора для жидкостной хроматографии достаточно широко применяется проточный рефрактометр Френеля. Действие этого детектора основано на законе Френеля: количество световой энергии, отраженное от поверхности раздела жидкости со стеклом пропорционально разности показателей преломления этих материалов. Два оптических луча фокусируются на поверхности раздела стекла и растворителя в двух ячейках детектора. В одной ячейке находится чистый растворитель, а через другую ячейку протекает элюат из колонки. Сами ячейки образованы вырезами в тонкой фторопластовой пленке, сжатой между стеклянной призмой особой формы н полированной поверхностью стального основания. Интенсивность двух отраженных лучей измеряется с помощью двух фотосопротивлений, и их разность регистрируется после усиления.

Рефрактометр Френеля может работать с очень малыми ячейками объемом всего б 2-3 мкл, что является его важным преимуществом. Однако недостатком этого детектора являются очень жесткие требования к чистоте ячеек и постоянству скорости потока подвижной фазы. Линейный диапазон этого детектора несколько меньше, чем у рефрактометров, описанных выше, а предельно детектируемая с его помощью концентрация веществ соответствует разности показателей преломления порядка IO-7 единиц показателя преломления.

Кроме двух типов рефрактометрических детекторов, кратко рассмотренных выше, существуют детекторы, использующие явление интерференции, которые отличаются очень высокой чувств ительностью и широким линейным динамическим диапазоном. Однако такие детекторы требуют тщательного термостатирования всей хроматографической системы* Возможно, именно этим обстоятельством объясняется довольно редкое использование таких детекторов в настоящее время.

Как рефрактометрические, так и инфракрасные детекторы в настоящее время наиболее часто применяются при исследовании полимеров методом эксклюзионной хроматографии, Этот метод не рассматривается в настоящей книге, так как в нем редко ис* пользуют высокоэффективные хроматографические системы. Тем не менее, исследования такого рода составляют в настоящее время одну из наиболее широких сфер применения жидкостной хро матографии.

Флуоресцентные (флуориметри ч еские) детекторы. Эти детекторы используют способность многих органических и неоргани- ческих соединений флуоресцировать под действием различных излучений. Флуоресцентные свойства, т.е* способность испускать свет под действием УФ-излучения или видимого света, присущи многим соединениям, имеющим важное значение в медицине, фармации, анализе пищевых продуктов и контроле загрязнений окружающей среды. Многие лекарственные препараты, включая стероиды, витамины, красители, полициклические ароматические соединения и другие важные соединения могут определяться с очень высокой чувствительностью путем измерения их флу* оресцентных свойств.

Интенсивность флуоресценции веществ зависит от интенсивности излучения вызывающего флуоресценцию и квантового выхода процесса возбуждения молекул. Для обеспечения высокой чувствительности флуоресцентных детекторов применяются достаточно мощные источники воз бу ждающе го излучения (газоразрядные лампы и лазеры)* Чувствительность флуоресцентны х детекторов с лазерным возбуждением позволяет регистрировать присутствие некоторых флуоресцирующих соединений на уровне IO4* г и менее. Такая чувствительность на несколько порядков величины превышает чувствительность детекторов по светопо- глощению. Некоторые современные флуоресцентные детекто^ ры позволяют по усмотрению экспериментатора выбирать длину волны возбуждающего и испускаемого излучений, что предоставляет дополнительные возможности идентификации пиков на хроматограммах.

Обычно фл уоре сце нтный детектор имеет проточную ячейку с двумя взаимно перпендикулярными оптическими каналами. Один из них случит для подвода возбуждающего излучения, а другой позволяет измерять интенсивность флуоресценции.

Чувствительность флуоресцентных детекторов может уменьшаться при увеличении концентрации изучаемого раствора вследствие явления внутреннего тушения фл уоресце нции, Поэтому, в основном, флуоресцентные детекторы применяются для определения следовых концентраций способных к флуоресценции соединений. Линейный диапазон этих детекторов достаточно широк (около 104), однако для некоторых соединений он может быть ограничен довольно узким диапазоном концентраций. Поэтому при использовании такого детектора требуется тщательное предкарительное изучение его характеристик до проведения с его помощью количественных определений. При этом необходимо проверить отсутствие фоновой люминесценции и эффектов тушения излучения и, кроме того, провести градуировку детекто-

ра в области реальных концентраций для конкретных соединений, подлежащих количественному определению*

Кислородсодержащие растворители обладают способностью к тушения флуоресценции и поэтому не могут применяться в сочетании с этим детектором* Аналогично, не могут быть использованы растворители с недостаточной прозрачностью для излучений возбуждения или флуоресценции, При использовании галогеносодержащих растворителей также необходимо соблюдать известную осторожность, тк они склонны к подавлению флуоресценции.

Сигнал флуоресцентных детекторов лишь в малой степени зависит от изменений температуры и давления. Эти детекторы могут быть использованы в условиях градиентного элюирования при условии, что применяемые растворители не флуоресцируют сами и не содержат флуоресцирующих примесей*

Некоторые вещества, не обладающие сами по себе способностью к флуоресценции, могут быть зарегистрированы этим детектором после перевода в флуоресцирующие производные, которые могут быть получены до проведения хроматографического разделения или после него с помощью реакций с подходящим флуоро генным реагентом [48, 49]. Так, например, амины и фенолы образуют флуоресцирующие производные с 5-диметиламино- 1-нафтилсульфохлоридом, а аминокислоты после хроматографического разделения переводят в флуоресцирующие производные реакцией с флуорескамином [50]* Такие приемы позволяют существенно расширить возможности этого очень чувствительного и во многих случаях специфичного метода детектирования на многие важные группы соединений, не обладающих собственной способностью к фл уоресценции. Таким образом^ флуоресцентный детектор является одним из наиболее важных детектирующих систем в области медико-биологических исследований и контроля загрязнений окружающей среды.

Электрохимический детектор. Вещества, обладающие элек- трохимической активностью, т*е способные к электрохимическому окислению или восстановлению, могут быть с успехом заре гистрированы с помощью электрохимического детектора. Потенциал электрохимического окисления или восстановления варьирует от -0,8 В до +1,2 В. Вещества, содержащие фенольные, индольные или альдегидные группировки, способны окисляться при более низких потенциалах порядка 0,4-0Л В. Имеющие важное значение для биохимии катехоламины и 5-оксииндолы также могут окисляться в тех же условиях, тогда как кетоны и соединения, содержащие нитро группы, в этих условиях восстанавливаются.

Рис. 57* Электродная ячейка электрохимического детектора:

7 - вход элюата из колонки; 2 - выход элюата к электроду сравнения; 3 — фторопластовая прокладка; 4 - рабочая камера ячейки; 5 - рабочий электрод: 6 - основание ячейки

Процессы окисления и восстановления веществ связаны с потерей или приобретением электронов» что приводит к появлению малых электрических токов, которые далее усиливаются и регистрируются с помощью соответствующих электронных уст* ройств* Ячейки большинства широко используемых электрохимических детекторов представляют собой миниатюрные камеры с расположенным в их центре единственным рабочим электродом, выполненным из стеклоуглерода* Второй сравнительный электрод помещается вне рабочей ячейки на ее выходе (рис, 57)* Рабочая площадь электрода составляет всего лишь 2-4 мм2.

Этот детектор работает в потоке водных или водно-органических подвижных фаз, обладающих достаточной электропроводностью (буферные растворы, водно-спиртовые смеси с растворенными солями и т*п*)* Эл ектрохим и чески й детектор проявляет высокую селективность при низких электронных потенциалах. Так, для детектирования 5^оксииндолов наилучшее значение потенциала равно 0,5-0,55 В, для катехоламинов -65-0,7 В, а для пептидов - 0,9-1,2 В* По отношению к электрохимически активным соединениям чу ветвите льность электрохимических детекторов очень высока: предельно обнаруживаемая концентрация катехол амин ов и 5-оксииндолов не превышает (5-20) х 10-】？ г вещества в пробе* Помимо двух упомянутых групп соединений, электрохимический детектор применяют при определении серотонина, ацетилхолина, их производных и метаболитов, нейропептидовт многих других биологически активных и ле к арственньгх веществ. Он также может быть использован при анализе фенолов, ароматических аминов, тиоспиртов, аскорбиновой кислоты, мочевой кислоты и многих других соединений в условиях электрохимического окисления* Возможно применение детекторов этого типа для детектирования хинонов, нитросоединений, металлорганиче' ских соединений и многих других веществ.

Электрохимический детектор очень чувствителен к чистоте подвижных фаз. Для приготовления буферных растворов необходимо применять только очень чистые соли и высокочистую воду, специально предназначенную для высокоэффективной жидкостной хроматографии. Рабочие электроды необходимо периодически подвергать очистке и промывать смесью воды и спирта (1 : 1)*

В конструкциях электрохимических детекторов применяются также рабочие ячейки других типов. В их числе можно упомянуть многоэлектродные, с трубчатыми электродами» ртутно-капельные и др* Описанные электрохимические детекторы по своей конструкции, рабочим характеристикам и условиям работы сходны с кулонометрическими детекторами, хотя такие детекти- рующие системы применяются в жидкостной хроматографии в настоящее время много реже.

Электрокондуктометрический детектор. Этот детектор, используемый, в основном, в области ионообменной и ионной жидкостной хроматографии, представляет собой кондуктометрическую ячейку, т.е. камеру небольшого объема (менее 10 мкл), снабженную двумя электродами, изготовленными из платины, золота, нержавеющей стали, титана или иного кор- розионно устойчивого материала с хорошей электропроводностью, Часто электроды представляют собой отрезки проволоки диаметром 0^3-1,0 мм и длиной 1-3 мм. Эта ячейка включена в одну из ветвей моста Уитстона» что позволяет осуществлять измерение ее эл е ктрического сопротивле н и я. Применяемые в настоящее время детекторы содержат соответствующие системы усиления и автоматической записи сигналов, а также компенсации фонового тока^ который может в десятки и сотни раз превышать величину полезного сигнала. С целью исключить влияние электролиза и образования двойного электрического слоя на показания детектора применяют системы электрического питания детектора переменным током. Современные конструкции электрокондуктометрических детекторов обеспечивают их довольно высокую чувствительность порядка I^-ICT9 г/мл и достаточно широкий линейный динамический диапазон (до 106). Устойчивость в работе, простота обслуживания и относительно невысокая стоимость обеспечили электрокондуктометрическому детектору широкое распространение как при проведении хроматографических анализов, так и при выполнении препаративных разделений. Следует отметить, что в области ионной хроматографии этот детектор выполняет функции достаточно универсал ьного средства ре- ги страции хроматогра мм.

* * *

Кроме детекторов, вкратце рассмотренных выше, в жидкостной хроматографии в разное время применялись и многочисленные иные детектирующие системы* Были затрачены значительные усилия для того, чтобы использовать в жидкостной хроматографии детекторы, хорошо зарекомендовавшие себя в газовой хроматографии, например^ такие как пламенно-ионизагщонный или электронно-захватный детектор* Эти работы дали начало, так называемым, транспортным детекторам, в которых нелету* чие вещества» элюируемые из колонки, подвергались пиролизу, и газообразные продукты пиролиза детектировались в газовой фазе, как и б газовой хроматографии. В жидкостной хроматографии применялись также детекторы, измеряющие диэлектрическую проницаемость покидающего колонку элюата. Однако эти детекторы не получили широкого распространения вследствие сложности конструкции, высокой стоимости и относительно низкой чу вствител ьн ости. Более успешным оказалось применение метода масс-спектрометрии для детектирования и идентифика^ ции разделенных в хроматографической колонке компонентов* Этот прогрессивный метод, кратко рассмотренный в гл, 8 Ьго тома применительно к капиллярной газовой хроматографии, вполне успешно применяется и в жидкостной хроматографии, продолжая активно развиваться. С его помощью в жидкостной хроматографии уже получены многие интересные и важные результаты, поэтому нет сомнений в том, что сфера его применения будет и далее непрерывно расширяться. Однако детальное рассмотрение всех названных методов детектирования определенно выходит за пределы возможностей настоящей книги.

ЛИТЕРАТУРА

Стыскин 巨力.，Ициксон Л.Б., Брауде ЕВ Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография, М「Химия, 1986.

Андерсон А.А. Жидкостная хроматография аминосоединений. Рига: Зинатне, 1984.

山口m耳 BR, Сахарто&а ОВ Высокоэффективная жидкостная хрома- тография* Рига: Зинатне, 1988.

Шпигун ОЛ„ Золотов ВА. Ионная хроматография и ее применение в анализе вод. М*: Изд-во Моск, ун-та* 1990.

Shpigun О A., Zolotov YuA, Ion chromatography in water analysts. Chichester: Ellis Horwood, 1988*

Kuwata H” Uebori M„ Yamazaki 匕〃工 Chromatogn 1981. Vol- 21L P 378. Z Daldrup T+, Kardel B. // Chromatographia. 1984. VoL 1& № Z P* 81-83.

Engelhardt"., Miller H., Dreuer R//Ibid. VoL 19, № 5. P 240^245.

Godville E., Devaux P. // J, Chromat口rg* Sci.1974. Vol* 12. P* 564.

10* Karasek FWJ Res Develop. 1977, Vol. 2& N 7. P 32.

Kuras M., Kriz 几 Triska J.t Vodicka L. 〃 J. Chromatogr, 1980* VoL 19L P. 319.

Dugois A.f Charles L” Montas tier 丄 Preparative high-performance liquid chromatography, Longjumeau Cedex: Jobin Yvon, 1978+

Руденко Б.й, Капиллярная хроматография. M.: Наука, 1978+

Jennings W. Gas chromatography with glass capillary columns. N+Y+: Acad, press, 1978. Рус. пер. Газовая хроматография на стеклянных капиллярных колонках. М.: Мкр, 1980.

Tesarik К., Komarek К* Kapilami kolony v plynove chromatografii. Praha: SNTL 1984* Pyc, nepj Капиллярные колонки в газовой хроматографии. М*: Мир, 1987,

High performance liquid chromatorgaphy in biochemistry / Ed+ A. Hensctien et aL Weinheim: VCH, 1985*

Yost R.W.t Ettre £S, Conlon K.D Practical liquid chromatography. Norwalk； Perkin-Elmer, 1980*

Беленький &「，Ганкина 3+C., Мальцев В.Г. Капиллярная жидкостная хроматография. Л.: Наука, 1987*

Introduction to microscale high-perfomance liquid chromatography / Ed* D. Ishii. N,Y/ VCH, 1988. Pyc+ nep+: Введение в микромасштабную высокоэффективную жидкостную хроматографию + М.: Мир, 199L

Tljssen R, Blumer JFA, Smit A.L.C,t van Kreveld ME // J. Chromatogr. 198L Vol. 218.PJ67.

Krejci M., Tesa^ik K, Rusek M” Pajrek M. // Ibid. P 167,

Tsuda 工，Tsuoboi K., Nakagawa G //Ibid, Vol 214. R 283.

Jorgenson J.W., Guthrie EJ. // Ibid. 1983. VoL 255+ R 3 35.

Knox G.H., Gilbert MX 〃 Ibid.1979. VoL 186+ P. 405.

25* Bristow /<4, Knox б,Я, // Chromatographia, 1977. VoL 10. E 279,

26+ Hibi K., Tsuda T.t Takeuchi Г et aL // J. Chromatogr 1979, VoL 175, PJ05+

Ishii D.t Takeuchi 厂 // Adv. Chromatogr, 1991, Vol 21.

Schomburg G., Husmann H. // Chromatographia. 1975. VoL 8* P517.

German 4L, Pfqffenberger CD, Thenot J.P. et aL // Anat Chunk 1973. VoL 45. P. 930.

30* Grob K, Grob G. // 工 Chromatogr. 1976. VoL 125, № 3* R 47L

31* Welsch T.T Engevald W,f Klaucke C, // Chromatographia. 1977, VoL 10. P 22.

2. Bujten G+J Blomberg L, Hoffmann S. et al. //J. Chromatogr. 1984. Vol. 28 3. P. 341-346.

3. Grob Kr Grob Gr Blum W.f Walther W+//IbidH982. Vol. 244. PJ97-208.

+ Grob K.t Grob G. // J. High Resolut, Cbromatogr* Chromatogr. Commun. 1982. VoL5.N3+ К 119-123.

Ellre L5+ Introduction to open tubular columns. Norwalk (Conn.): Perkin-Elmer, 1978.

Hirata 匕 Novotny M.t Tsuda T., Ishii D 〃 AnaL Chem. 1971. VoL 51, N 10+ P. 1807.

Ishii D, Asai K, Hibi K. et aL // 工 Chromatogr, 1977. Vol. 151, N 2+ К 157-168,

Ishii Dt( Hibi K, Asai K, Yanokuchi T. // Ibid. 1978. Vol, 151T N 2. pt 147-154.

Ishii D, Hibi K, Asai K, Nagaya M. 〃 Ibid. Vol, 15 2, N 2. E 341-348+

Di Cesare J.L., Dmg M.W., Atwood J.G+ // Ibid. 198L VoL 217. P* 369+

4L Takeuchi T” Kitamura H” Spitzer T,T Ishii D. // J+ High Resolut. Chromatogn Chromatogn Commun+ 1983, VoL 6* P. 666.

Clark CR, Chan J.-LJ/ Anat Chem. 1978, Vol. 5 0, N 4. P 635-637.

43+ Нире КrP.f Jonker R J., Rozing G. 〃 J. Chrom&togr. 19 84. Vol. 285, P. 253.

44* Wright MA, Villalanti DC, Burke M.F. // Anal. Chem. 1982. VoL 54, P* 1735.

5. Kolla P.//J. Chromatogn 1994. VoL 674, N 1/2. P. 3 09-318.

Бражников BB Детекторы для хроматографии. M+: Машиностроение, 1992*

Aleksandrov ML, Belenkii R.G, Gankina ES. et al. // J+ High Resolut, Chromatogr. Chromatogr. Commun. 198 3. VoL 6, N IL P. 629-631 *

Lawrence JF., ГreiR.W, Chemical derivatisation in liquid chromatography. Amsterdam: Elsevier, 1976.

Liquid chromatography detectors / Ed. T*M* Vickrey. N.Y.: Marcel Dekker, 1983.

Lawrence J+F. Organic trace Analysis by liquid chromatography. N+Y+: Acad, press, 1981.

Глава 4

ПЛАНАРНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

БУМАЖНАЯ И ТОНКОСЛОЙНАЯХРОМАТОГРАФИЯ

В отличие от газов, жидкости могут течь в открытых каналах (каналы, лотки, желоба и т.п) Кроме того, в пористых или во локнистых средах жидкости могут достаточно энергично распространяться за счет капиллярного всасывания (впитывания) без применения каких-либо побудителей потока (насосов, нагнетательных сосудов и т.п.). Эти две отличительные особенности жидких сред сделали возможным возникновение и развитие планарной (плоскостной) хроматографии, осуществляемой в открытых слоях целлюлозы (бумажная хроматография) или в тонких слоях минеральных либо порошкообразных органических адсорбентов (тонкослойная хроматография).

Преимуществами этих методов являются высокая производительность по числу одновременно анализируемых проб, простота исполнения, достаточная для многих случаев применения разделяющая способность, и, наконец, возможность визуализации хроматографических зон (полос или пятен) бесцветных разделенных веществ путем обработки бумажного листа или тонкослойной пластинки разнообразными жидкими или газообразными реагентами (серная кислота, азотная кислота, растворы хлоридов сурьмы, пары брома и иода, аммиак, хлор и др)

Техника обычной планарной хроматографии на бумаге и тонкослойных пластинах, включая выполнение самих разделений компонентов анализируемых веществ, проявление хроматограмм и их последующую обработку (визуализацию), достаточно подробно описана в большом числе монографий [1-22] и оригинальных статей [см., например, 23-3

Поэтому здесь будут специально рассмотрены лишь такие модификации планарной хроматографии, которые обеспечива-

ют эффективность разделения, существенно превышающую результаты, достигаемые в обычных достаточно простых повсеместно используемых вариантах этих методов*

В своей простейшей форме планарная хроматография легко осуществляется при использовании промокательной (фильтровальной) бумаги для удаления чернильной кляксы. На бумаге при этом возникает чернильное пятно, окруженное светлым водным кольцом* Это явление представляет собой простейший случай хроматографического разделения с использованием бумаги (целлюлозы) в качестве неподвижной фазьь

Для анализа или разделения смеси веществ обычно используют бумажную полосу достаточной длины. Вблизи одного из концов этой полосы помещают анализируемую пробу в виде пятна или полоски по возможности небольших размеров и этот конец бумажной полосы опускают в жидкую подвижную фазу, так чтобы уровень жидкости был ниже исходного пятна нанесенной пробы. Под действием капиллярных сил жидкая подвижная фаза начинает подниматься по бумажной полоске, захватывая при этом компоненты разделяемой пробы, которые продвигаются по полоске каждый со своей скоростью в соответствии с их адсорбционной способностью.

Процесс прекращают, когда верхняя граница смоченной подвижной фазой части бумажной полоски немного не достигает ее верхнего края. Далее бумажную полоску высушивают и изучают расположение на ней пятен разделенных компонентов* Такой процесс называется бумажной хроматографией в ''восходящем варианте*', В тех случаях, когда в качестве подвижной фазы применяют водные растворы легколетучих органических растворителей, для того чтобы предотвратить изменение ее состава вследствие испарения этих компонентов процесс хроматографии проводят в замкнутом сосуде - в так называемых ф*насыщенных ка・ мерах" (рнс* 584).

Если в качестве подвижной фазы применяют легколетучие органические растворители или их водные растворы, для того, чтобы предотвратить изменение их состава вследствие испарения этих компонентов, процесс хроматографии проводят в закрытом сосуде, называемом хроматографической камерой (рис. 58). При эпизодических анализах или, наоборот, при необходимости выполнять очень большое число анализов весьма удобным является экономичный вариант восходящей хроматографии на узких полосках бумаги с использованием пробирки в качестве миниа- тюрной хроматографической камеры (рис. 584).

В направлении сверху вниз под действием силы тяжести жидкости просачиваются значительно быстрее, чем поднимают-

Рис. 58* Бумажная хроматография:

Л — восходящая: 7Р 2 - в цилиндрических сосудах; 3 - R конической колбе; 4 - в пробирке: Б - нисходящая: / 亠 стойка с лотком для подачи подвижной фазы; 2, 3 - хроматографические камеры с лотком; В (см* стр* 201) - горизонтальная: 7 - хроматографическая камера; 2 - полиэтиленовые или фторопластовые стержни, поддерживающие бумагу; 3 - подвижная фаза; 4 - хроматографическая бумага; 5 - линия старта;匕-граница фронта подвижной фазы в конце хроматографического опыта; Г — круговая: 1,3- хроматографическая камера (две чашки Петри подходящего размера); 2 - хроматографическая бумага (бумажный фильтр круглой формы); 4 - подвижная фаза; 5 - фитиль для подачи подвижной фазы; б - стартовая окружность; 7 - граница фронта подвижной фазы в конце хроматографического опыта; Д - на свернутой в рулон полоске бумаги:，- хромате графическая камера; 2 - полоска хроматографической бумаги; 3 - рифленая полоса мз полиэтилена или фторопласта; 4 - прижимной валик (отрезок стеклянной палочки); 5 - подвижная фаза; 6 - линия старта; 7 - граница фронта подвижной фазы в конце хроматографнческого опыта

ся вверх под действием только капиллярных сил* Поэтому нисходящий вариант (рис, 585) бумажной хроматографии оказывается существенно более быстрым, чем восходящий. Известны также горизонтальный и круговой варианты бумажной хроматографии (рис* 58 ВЛ Г). Очень компактным является способ бумажной

201

хроматографии на свернутой в рулон бумажной полосе* Чтобы избежать слипания витков з того рулона, бумажную полосу сворачивают вместе с полоской рифленого полиэтилена или фторопласта, не смачивающегося подвижной фазой* Такой вариант бумажной хроматографии применяли чехословацкие исследователи Хайс и Мацек при изучении состава алкалоидов растения Rauwlphia reserpina (рис, 58Д). Каждый из этих способов бумажной хроматографин имеет специфическую область применения, свои достоинства и недостатки.

Пятна окрашенных веществ можно наблюдать невооруженным глазом. Пятна бесцветных соединений становятся видимыми при опрыскивании или смачивании полученной хроматограммы различными реактивами (при обработке хроматограмм аммиаком, сероводородом, парами иода, брома и др. веществ) или при облучении ультрафиолетовым светом* При этом достигается исключительно высокая чувствительность определения: уверенно регистрируются пятна, содержащие 1^12*-10'15 г вещества.

Важным преимуществом планарной хроматографии вообще и бумажной хроматографии, в частности, является легкость осуществления двумерного процесса. Пятно исходной смеси наносят вблизи одного из углов квадратного листа бумаги и получают первичную хроматограмму. Затем поворачивают лист на 90° и проводят хроматографический процесс в перпендикулярном направлении (часто с другим составом подвижной фазы)* При этом каждое пятно первичной хроматограммы разделяется на несколько пятен составляющих его компонентов. Это позволяет детально исследовать весьма сложные по составу смеси, например, такие как гидролизаты белков, культуральные жидкости микроорганизмов, растительные экстракты сложного состава ит,п. (рис. 59)*

История, область применения, техника и методика, достоинства и недостатки метода бумажной хроматографии подробно ос^ вещены в целом ряде оригинальных работ, монографий и биб- лиографических сборников [I, 2t 11, 23-25]. К сожалению» ограниченная адсорбционная способность бумаги и специфические особенности ее волокнистой структуры, затрудняющие массооб- мен между сорбирующей поверхностью и потоком подвижной фазы, не позволяют достичь достаточно высокой эффективности хроматографического разделения. Даже при использовании полос и листов бумаги длиной до 1 м экспериментаторам удалось добиться реальной эффективности разделения, не превышающей 1-1,5 тыс* теор, тарелок. Хотя теория тарелок не в полной мере применима к обычным процессам планарной хроматографии вследствие сложного характера движения подвижной фазы под действием только капиллярных сил, величины чисел теоре*

Фронт растворилеляФронт растворилеляФроит раство* рителяФроит раство* рителяОм

Фронт растворилеля

Фронт растворилеля

Фроит раство* рителя

Фроит раство* рителя

ъ屮300

60。5

Второе измерение

Рис* 59・ Двумерные бумажные хроматограммы смесей аминокислот:

口 - искусственная смесь незаменимых аминокислот; 6 - гидролизат желатина; / - лейцин; 2 — изолейцин; 3 - фенилаланин； 4 - валин; 5 - метионин; 6 * триптофан; 7 - 2-аминомасляная кислота; £ - тирозин; 9 - а-аланин; 10 - пролин; // - глутаминовая кислота; /2 + аспарагиновая кислота; 13 - оксипролин; /4 - треонин; /5 - глицин; 76 - серин; /7 - глутамин; 18 - аргинин; 19 - таурин; 20 - лизин; 2/ - орнитин; 22 - гистидин; 23 - цистеиновая кислота; 24 - цистеин; 25 - метионин; 26 - оксилизин. Подвижные фазы： в первом направлении - нзо- гтропанол-муравьиная кислота-вода (40 : 2 : 10); во втором направлении - ^ре/млбутанол-метилэтилкетон-0,88%-ный аммиак-вода (50: 30 : 10: 10)

тических тарелок, рассчитанные по обычным формулам, будут использоваться в этой главе для ориентировочной характеристики возможностей разделения веществ с помощью методов планарной хроматографии.

Несмотря на ограниченную эффективность достигаемого разделения, метод бумажной хроматографии оказался исключительно плодотворным в биохимии, фармации, медицине, криминалистике и целом ряде других смежных областей науки и технологии*

Однако более универсальным и эффективным оказался метод тонкослойной хроматографии, осуществляемый в тонких слоях неорганических и органических адсорбентов (диоксида кремния» силикагеля, оксида алюминия, талька, крахмала, полиамидного порошка и др.), нанесенных на стеклянные, металлические или пластиковые пластинььподложки в виде свободного незакрепленного слоя порошка с частицами размером 25-50 мкм или закрепленного в форму монолитного слоя, частицы которого прочно скреплены между собой и применяемой подложкой с помощью подходящего связующего (гипса, крахмала, жидкого стекла и др*)*

Как и бумажная хроматография, процесс тонкослойной хро-

Рис. 60* Тонкослойная хроматография на незакрепленных слоях сорбента:

а 亠 восходящая; 6 - нисходящая; / - хроматографическая камера (кристаллизатор подходящего размера); 2 - подвижная фаза; 3 - хроматографическая тонкослойная пластинка; 4 - слой адсорбента; 5 - уровень погружения пластинки в подвижную фазу; 6 - линия старта: 7 - фронт подвижной фазы в конце хроматографического опыта; 5 - опора с пористым слоем для подачи подвижной фазы

матографии может осуществляться в восходящем, нисходящем или плоскостном вариантах. Однако при работе с пластинками с незакрепленными слоями нисходящий и восходящий варианты осуществляются только при небольших углах наклона пластинок к горизонтали (рис. 60)*

Тонкослойная хроматография впервые была применена в 1938 г, в работе Измайлова и Шрайбер [12, 13] для изучения состава фармацевтических препаратов 一 экстрактов растений и микстур. Дальнейшее развитие этого метода было задержано в годы Второй мировой войны, однако интенсивно этот метод стал развиваться после публикации обстоятельных работ Шталя [3, 14] и Кирхнера [4].

Теория, методика, техника и области применения тонкослойной хроматографии подробно рассмотрены во многих оригинальных работах и монографиях, нз которых здесь упомянуты лишь немногие [5-9,16—21]. Но в течение достаточно длительного времени эффективность разделения, достигаемого с помощью этого метода, оказывалась относительно небольшой, не превышающей 2-3 тыс. теор, тарелок. Однако доступность методов планарной хроматографии, широкий круг решаемых с ее помощью аналитических задач, и, главное, возможность одновременкого анализа от 10 до 50 проб на одном листе хроматографической бумаги или одной тонкослойной хроматографической пластинке обеспечили этой группе методов широкое распространение.

В то же время, в 1970-1980-е годы был разработан комплекс целого ряда приемов, позволивших значительно увеличить эффективность тонкослойной хроматографий* Оказалось возможным обеспечить разделение за один цикл анализа до ЗЮ компонентов анализируемых смесей за время порядка 10 мин. При этом величины анализируемых проб составляют нанограммовые количества (1-10 н「), а предельно определяемые количества отдельных компонентов - фемтограммовые величины (1О15 г),

В целом, эффективность усовершенствованных модификаций тонкослойной хроматографии более чем на один порядок величины превысила значения, характерные для ее классических вариантов* Это дало возможность говорить о формировании, по существу, нового аналитического метода - высокоэффективной тонкослойной хроматографии [26]. Создание этого метода явилось результатом ряда усовершенствований, логиче- ски вытекающих из общих положений теории высокоэффективной хроматографии.

Наиболее важными из этих усовершенствований явились следующие:

применение адсорбентов с оптимальными характеристиками, аналогичными требованиям высокоэффективной колоночной жидкостной хроматографии (малый размер зерна порядка 3-5 мкм; однородность размеров зерен (разброс размеров не более 10% отн., низкое сопротивление массопередаче, тщательное к он дицион иров а ние адсорбентов и др);

улучшенный способ нанесения проб, обеспечивающий очень малые значения начальной ширины хроматографических зон (пятен);

усовершенствованный способ подвода элюента, исключающий неравномерности его продвижения в слое сорбента;

применение усовершенствованного оборудования для получения хроматограмм и их количественной обработки.

В целом, все усовершенствования были с достаточной полнотой обоснованы теоретическим анализом процессов тонкослойной хроматографии, подробно рассмотренными в книге Гейтса [10], основные выводы которого в основном соответствуют положениям, подробно рассмотренным в предшествующих главах настоящей книги. Новые тонкослойные пластинки для высокоэффективной хроматографии были разработаны Эйзенбейсом и Халпаапом [27, 28]. Блом одним из первых применил действенный вариант круговой тонкослойной хроматографии [29]. Ион- хен и Хезел существенно усовершенствовали системы нанесения проб и подачи подвижной фазы [30, 31], что обеспечило значительное улучшение воспроизводимости обсуждаемого метода*

Основные особенности метода высокоэффективной тонкослойной хроматографии будут рассмотрены ниже более подробно*

ПОДГОТОВКА СОРБЕНТОВИ ПРИГОТОВЛЕНИЕ тонкослойныхХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ ПЛАСТИНОК

В 1960™1970-е гг+ благодаря интенсивным усилиям теоретиков и экспериментаторов сформировались обоснованные представления о том, каким должен быть адсорбент или твердый носитель для достижения высокой эффективности хроматографического разделения за практически приемлемое время* Боль- шой вклад в это внесли исследователи, первоначально работавшие в области газовой хроматографии, однако в дальнейшем направившие свои усилия на развитие ВЭЖХ, Ван-Деемтерт Цудер- вег, Клинкенберг, Киркланд, Гиддингс, Нокс и Гийошон могут быть заслуженно упомянуты среди этих и селедовател ей [32-38].

Полученные результаты в работах этих и ряда других исследователей показали, что эффективность хроматографической системы, выражаемая высотой теоретической тарелки, оказывается тем выше, чем меньше размер зерна адсорбента или твердого носителя. При этом было установлено, что для жидкостной хроматографии необходимо применять значительно более мелкозернистые сорбенты, чем для газовой хроматографии. Такие сорбенты, естественно, образуют в колонке систему существенно более узких капилляров. Это требование связано со значительно меньшими скоростями диффузии в жидкостях по сравнению с га- зообразными подвижными фазами. При этом значительное время диффузии молекул разделяемых веществ в заполненных жидкостью широких каналах неизбежно приводит к неравновесному размыванию хроматографических зон и, как следствие к падению эффективности хроматоп)афического процесса.

Таким образом, в жидкостной колоночной хроматографии произошел переход от использования сорбентов с величиной зерна 200-300 мкм и более к применению адсорбентов с величиной зерна порядка 40 мкм. а позже - 10.7,5 и даже 3 мкм.

Однако только одного уменьшения среднего диаметра зерна оказалось недостаточно. Важное значение имеет однородность размеров зерен адсорбентов, поэтому сорбционные материалы, используемые в ВЭЖХ имеют разброс размеров зерен, не превышающий 10% отн. Это означает, что при номинальном размере зерна сорбента 5 мкм, фактически размеры его зерен находятся в интервале ±0,5 мкм.

Наконец, было показано, что для достижения высокой эффективности разделения в жидкостной колоночной хроматографии важное значение имеет форма частиц адсорбента и характер заполнения ими хроматографической колонки. Так, в практику жидкостной колоночной хроматографии были внедрены мелкозернистые адсорбенты со сферическими зернами, а операции заполнения колонок стали проводить, подавая б колонку суспензию адсорбента в подходящей жидкости (растворителе) под высоким давлением порядка 500-1000 кг/см2, как описано в предыдущей главе. Таким путем оказалось возможным добиться значений высоты, эквивалентной теоретической тарелке, близких к теоретическому пределу, определяемому уравнением Ван-Деем- тера(4)[3%41]・

Такие же подходы были в той или иной степени использованы и в тонкослойной хроматографии. Целый ряд фирм приступил к производству пластинок для высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВТСХ), отличающихся следующими особенностями:

-применение мелкозернистых адсорбентов со средним диаметром зерна 5-10 мкм вместо 40^100 мкм;

-использование фракций мелкозернистых адсорбентов с узким распределением размеров частиц (не более 10% отн. вместо 100% отн. и более) и часто с частицами сферической формы (рис. 61);

亠 применение более равномерных слоев с меньшей толщиной (0Д-Ю,2 мм вместо 0,5-0,7 мм и более), закрепленных на подложке с помощью разнообразных закрепляющих агентов (гипса, крахмала н др*) [42-44].

Следует отметить, что большая равномерность сорбционных слоев, имеющая место на тонкослойных пластинках, производимых различными фирмами, достигается с помощью специальных технологических приемов, являющихся коммерческими произ* водственными секретами про изводителей, детально не описан^

650 s650 s650 M650 MРис. 61* Микрофотография типичного адсорбента для высокоэффективной тонкослойной хроматографии (Toyopearl 650, фирма Тоуо Япония)Рис. 61* Микрофотография типичного адсорбента для высокоэффективной тонкослойной хроматографии (Toyopearl 650, фирма Тоуо Япония)

650 s

650 s

650 M

650 M

Рис. 61* Микрофотография типичного адсорбента для высокоэффективной тонкослойной хроматографии (Toyopearl 650, фирма Тоуо Япония)

Рис. 61* Микрофотография типичного адсорбента для высокоэффективной тонкослойной хроматографии (Toyopearl 650, фирма Тоуо Япония)

ными в доступной научной литературе. В то же время, способы приготовления фракций порошкообразных адсорбентов с малой величиной частиц и узким распределением их размеров не отли* чаются от способов, описанных в гл* 3.

Более высокая стоимость пластинок для ВТСХ и несколько большая длительность процессов разделения на них определили переход от пластинок размером 20 х 20 см к пластинкам размером 10 х 10 см и менее, что сделало метод тонкослойной хроматографии более компактным и экономичным* Все это привело к тому, что формально оцениваемые величины высоты, эквивалентной теоретической тарелке, уменьшились от 100 мкм и бо^ лее до значений 15-20 мкм. Таким образом, уже при длине пробега фронта подвижной фазы всего 40-50 мм общая эффектов- ность разделения достигает 2500-3000 т.т. и более [45^8].

Кроме улучшения качества сорбционных слоев, большую роль в достижении столь высокой эффективности сыграли усо* вершенствования техники нанесения проб, обеспечивающие малую ширину начальных хроматографических зон (менее 1 мм вместо обычных ранее 3-6 мм). Существенным усовершенствованиям подверглись также и методы подвода подвижной фазы, которые обусловили строго равномерное ее распределение по всей ширине фронта. Эти усовершенствования описаны ниже.

ТЕХНИКА НАНЕСЕНИЯ ПРОБ

В обычных вариантах тонкослойной хроматографии пробы наносят вблизи одного из краев пластинки на линии старта в форме пятен округлой формы или полос, не особенно заботясь об обеспечении минимальной ширины этих начальных зон. При нанесении проб пользуются стеклянными капиллярами подходящего размера (длина 50-80 мм, диаметр 0,3-1,0 мм), стеклянными пипетками и микрошприцами различных конструкций. Это позволяет наносить пробы величиной от нескольких десятых долей микролитра до ~16 мкл в форме пятен диаметром 2-6 мм. Столь значительная начальная ширина пятен определенно затрудняет разделение близких по свойствам соединений и не позволяет обеспечить высокую эффективность хроматографической системы. Для обеспечения высокой эффективности разделения в тонкослойной хроматографии требуются значительно более точные и воспроизводимые методы и устройства для дозирования проб и их нанесения на сорбционные слои*

Простейшим из таких устройств является отрезок тонкого металлического капилляра, длина которого меньше высоты капиллярного поднятия жидкости в нем при диаметре порядка ОЛ^З мм. Обычно для этой цели используется отрезок тонкой трубки из пла- тино-иридиевого сплава, нержавеющей стали или иного металла, достаточно стойкого к коррозии, прикрепленного в его средней части к какому-либо держателю (рис. 62)* В качестве таких дозировочных капилляров могут быть использованы тонкие шприцевые иглы. Ряд фирм, специализирующихся на изготовлении химикоаналитического оборудования, выпускает наборы таких дозировочных капилляров различного объема (например, 0т05, 0/00, 0,200, 0,500 мкл). Разработаны прецизионные механические устройства, обеспечивающие строго воспроизводимое заполнение капилляров анализируемой жидкой пробой и их опорожнение при касании слоя адсорбента за счет капиллярного всасывания при его увлажнении, При использовании таких устройств относительное стандартное отклонение в количестве нанесенных проб анализируемых веществ оказывается меньше, чем 0.025*

Несколько более сложными в эксплуатации, но более уни- нереальными устройствами для нанесения проб, являются микрошприцы, широко используемые как в газовой хроматографии, так и в высокоэффективной колоночной жидкостной хроматографии. Для того, чтобы избежать повреждения слоя адсорбента тонкослойных пластинок, микрошприцы объемом 1-10 мкл снабжают иглами, имеющими плоский срез их свободного конца. Такие микрошприцы применяются как для ручного ввода проб,

Рис. 62* Дозирующие устройства для нанесения проб в высокоэффективной тонкослойной хроматографии:口г 6 - платина-иридиевые капилляры, впаянные в стеклянные пипетки; в 亠 платнно-иридиевый капилляр с припаянным металлическим держателемРис. 62* Дозирующие устройства для нанесения проб в высокоэффективной тонкослойной хроматографии:口г 6 - платина-иридиевые капилляры, впаянные в стеклянные пипетки; в 亠 платнно-иридиевый капилляр с припаянным металлическим держателем

Рис. 62* Дозирующие устройства для нанесения проб в высокоэффективной тонкослойной хроматографии:

口г 6 - платина-иридиевые капилляры, впаянные в стеклянные пипетки; в 亠 платнно-иридиевый капилляр с припаянным металлическим держателем

Рис. 62* Дозирующие устройства для нанесения проб в высокоэффективной тонкослойной хроматографии:

口г 6 - платина-иридиевые капилляры, впаянные в стеклянные пипетки; в 亠 платнно-иридиевый капилляр с припаянным металлическим держателем

так и в сочетании с достаточно сложными механическими устройствами (аппликаторами), обеспечивающими автоматизированное нанесение большого числа проб (до 40-50 проб и более) на одну пластинку с высокой воспроизводимостью (рис. 63).

При нанесении проб вначале на пластинке намечают линию старта, на которую и наносят пробы. Обычно такую линию намечают в 10-20 мм от одного из краев пластинки; отмечают также и линию, которой при хроматографии должен достичь фронт подвижной фазы. Как правило, такую линию проводят в 10-15 мм от края пластинки, противоположного по отношению к краю, вблизи которого наносят исходные пробы анализируемых веществ. Эти операции несколько затрудните л ьн о выполнить без повреждения слоя адсорбента на пластинках с незакрепленным слоем* На пластинках с достаточно прочными закрепленными слоями такие линии можно без особого труда провести мягким графитовым карандашом. Обычно пробы наносят в виде разбавленных растворов в подходящем растворителе возможно меньшей полярности, что предотвращает чрезмерное расплывание стартового пятна* Этот растворитель должен быть возможно более летучим, чтобы после нанесения пробы он мог бы быстро испариться* При необходимости процесс нанесения пробы повторяют несколько раз, внося раствор анализируемого вещества небольшими порциями, причем каждое следующее нанесение выполняют после полного испарения растворителя от предыдущей

Рис 63. Микрошприцы для нанесения проб (проспект фирмы Agilent technology)

операции* Таким путем удается получить начальное пятно пробы диаметром менее 0,5 мм*

При медленном нанесении проб сорбционные свойства пластинки могут изменяться вследствие воздействия диоксида углерода и влаги воздуха [49]* Поэтому рекомендуется при нанесении проб на тонкослойные пластинки прикрывать основную часть сорбционного слоя стеклянной, металлической или пластиковой пластинкой. Часто такая пластинка может одновременно служить шаблоном для нанесения большого числа проб [4]+ Опубликованы описания полностью или частично автоматизированных устройств для нанесения большого числа проб, выпускаемых раз* личными приборостроительными фирмами.

В ряде случаев перед выполнением хроматографического разделения проводят специальные операции, направленные на дополнительное сжатие зон уже нанесенных проб* Так, например, проведя линию старта в 25 мм от края пластинки с силикагелем, авторы работы [50] наносили пробы на другую линию, отстоящую от края пластинки только на 10 мм. После испарения растворителя, в котором были растворены исходные пробы,

Рис. 64* Пластинка для высокоэффективной тонкослойной хроматографии с концентрирующим слоем:

/ - пластика с основным слоем адсорбента; 2 - концентрирующий слой; 3 - линия первоначального нанесения проб; 4 一 линия погружения пластинки в подвижную фазу; 5 - граница основного и концентрирующего адсорбционных слоев - фактическая линия старта; 6 - фронт подвижной фазы в конце хроматографического опыта

край пластинки погружали на глубину 5 мм в полярный растворитель -вспомогательную под^ вижную фазу* При этом все компоненты анализируемых проб передвигались вместе с фронтом этой подвижной фазы. В результате этой операции первоначально нанесенные зоны проб, имевшие круглую форму, сжимались в очень узкие полоски шириной около ОД мм. Когда эти полоски вместе с фронтом вспомогательной подвижной фазы достигали линии старта, процесс прерывали, пластинку высушивали и помещали в камеру с основной подвижной фазой, обеспечивающей достаточное разделение компонентов анализируемых смесей.

Сходным образом, в работе [51] для сжатия первоначальных зон использовали процесс испарения подвижного растворителя, что приводило к концентрированию первоначально нанесенных пятен и превращению нх в узкие полоски* Кроме того, для получения сильно сжатых начальных зон применяли специальные пластинки, имеющие, кроме основного разделяющего сорбционного слоя силикагеля, дополнительную полосу из более инертного адсорбента (кизельгура) вблизи стартового края (рис. 64). В процессе хроматографии исходные округлые пятна нанесенных проб претерпевали сильное сжатие при достижении ими границы слоя более активного адсорбента, после чего продвигались далее в форме узких концентрированных зон [52]* Сходные приемы были использованы и позже в работе [53].

Таким образом, для обеспечения высокой эффективности тонкослойной хроматографии можно указать следующие рекомендации, касающиеся техники нанесения проб [25]:

1* Концентрация раствора ан ализируемого материала при нанесении проб на тонкослойную хроматографическую пластинку должна быть по возможности более высокой.

Растворитель, используемый при вводе проб, должен быть таким, в котором величины % для всех компонентов исследуемых проб были бы по возможности близки к нулю (学 с 0,1, если этот растворитель использовать в качестве подвижной фазы).

3* Капилляры или иглы микрошприцев, с помощью которых проводится дозирование и нанесение проб на пластинки, должны иметь возможно меньший диаметр (менее 0,5 мм)+

4* Давление дозирующего капилляра или иглы микрошприца на слой адсорбента должно быть достаточно малым, чтобы не нарушать структуру этого слоя* При существующей в настоящее время технологии приготовления пластинок для высокоэффективной жидкостной хроматографии закрепленные слои адсорр бентов выдерживают без разрушения давление порядка 100 г/мм2. Это соответствует нагрузке в 5 г при внешнем диаметре капилляра или иглы 0,3 мм и внутреннем диаметре 0，15 мм.

При использовании для нанесения проб металлических капилляров постоянного объема воспроизводимость количества нанесенных проб весьма высока и соответствует величине относительного стандартного отклонения примерно 0,007. Использо- вание описанных приемов позволяет обеспечить достаточно ма* лую ширину начальных зон для того, чтобы добиться эффектив* ности хроматографического разделения компонентов пробы с 0,2 < Rf < 0,8 порядка 104 тн и более.

УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЕ СПОСОБЫПОДВОДА ЭЛЮЕНТА

Для обеспечения высокоэффективного разделения в тонкослойной хроматогр а фи и элюент должен равномерно поступать по всей ширине тонкослойной пластинки. Как правило, это достигается путем погружения края пластинки, вблизи которого на* несены пробы, в элюент на глубину 3-5 мм или путем приведения этого края пластинки в соприкосновение с пористым материалом, пропитанным элюентом, как показано на рис* 60.

Подвижная фаза, смачивающая сорбционный слой, вначале заполняет более узкие поры и лишь несколько позже - более широкие поры. С другой стороны, по мере продвижения фронта растворителя по слою увеличивается сопротивление потоку. Расстояние, пройденное фронтом подвижной фазы, связано с временем, прошедшим с начала процесса проявления хроматограммы, квадратичной зависимостью:

z2 = /г, (4・1)

где 2 - расстояние пройденной фронтом подвижной фазы за вре-

мя г, x - константа для данных условий течения [54,55]. Скорость движения фронта при этом равна:

包=上(4-2)

8f 2/

Следовательно, скорость подвижной фазы в тонкослойной хроматографии в отличие от колоночной хроматографии убывает обратно пропорционально расстоянию» пройденному фронтом, поэтому для продвижения фронта на удвоенное расстояние потребуется вчетверо больше времени*

Вследствие этих законе мерно стей скорость подвижной фазы в тонкослойной хроматографии очень мала по сравнению с высокоэффективной жидкостной хроматографией в колонках. Тем не менее, эта скорость в большинстве случаев превышает величину, соответствующую минимуму на кривых Ван-Деемтера, поэтому роль продольной молекулярной диффузии в расширении хроматографических зон остается подчиненной.

Константа 义 для единичного тонкого капилляра равна [55, 56]:

%==行上，(4.3)

П

где к - проницаемость капилляра; г — его радиус; у — поверхностное натяжение жидкости, т| - ее вязкость.

Применительно к процессу тонкослойной хроматографии, когда сорбционный слой можно рассматривать как совокупность большого числа извилистых капиллярных каналов, пронизывающих слой плотных частиц, это уравнение может быть записано в следующей форме [55-57]:

无=2% 丄(4-4)

где kr - параметр, характеризующий проницаемость слоя и зависящий от его структуры, плотности и шероховатости слагающих его частиц, их формы и диаметра ®* Показано [41], что это уравнение достаточно хорошо выполняется для плотных частиц сферической формы.

Таким образом, с точки зрения гадрсдинамики потока для тонкослойной хроматографии с подачей подвижной фазы за счет капиллярных сил более выгодно применять растворители с высоким поверхностным натяжением и по возможности с малой вязкостью* Эти параметры сопоставлены в табл. 17 для некоторых

Таблица 17

Физические свойства некоторых растеорителей] применяемых в тонкослойной хроматографии

Наименование растворителя

Вязкость

4 db

Поверхностное натяжение к дин/см

Отношение у/П(103)

1

2

3

4

Диэтиловый эфир

623

17,0

7/

н*П©нтан

023

16,0

7,0

н-Гексан

032

18,4

5》

н *Гептаи

0*40

20,4

5」

Ацетон

032

23,7

工4

Ацетонитрил

037

29,3

7君

Вода

1,00

73,05

7,3

Дихлорметан

0,43

26,5

6,2

Тетрагидрофуран

0,47

2&4

5,6

Этилацетат

0,45

239

5,3

Хлороформ

0,57

27」

*8

Толуол

0,58

28,3

48

Бензол

0,64

2&9

4,5

Метанол

0,56

22,6

4,1

Этанол

1,17

22,7

20

Циклогексан

1,23

34,5

2,8

Четыреххлористый углерод

0,95

269

2,8

Трифтортрмхлорэтан-1 *1*2 (фреон

0т69

173

2,5

Уксусная кислота (96%)

1,26

27,8

2,2

Циоксан

0,95

26,0

2,7

Пиридин

0,95

38,0

4,0

ра створите л ей, применяемых в тонкослойной хроматографии наиболее часто. Из данных таблицы видно, что с точки зрения скорости продвижения за счет капиллярных сил вдоль слоя мелкозернистого адсорбента, наилучшими растворителями оказываются ацетонитрил, вода, ацетон и диэтиловый эфир. Именно эти растворители в настоящее время используются наиболее часто.

При обычных способах подачи подвижной фазы на сорбционный слой посредством погружения в растворитель нижнего края пластинки или путем тесного соприкосновения слоя адсорбента с пористым материалом, через который поступает подвижная фаза, возможно неравномерное смачивание слоя по ширине пластинки. Это приводит к искажению линии фронта подвижной фазы и нарушениям формы пятен или начальных линейных зон разделяемых компонентов, что, естественно, приводит к снижению эффективности хроматографического разделения. Для уст-

Рис* 65* Разделение кортикостероидов на тонком слое полиамидного порошка в системе хлороформ-этанол (97,5 : 2,5) с нанесением проб на тонкие перемычки отдельных дорожек. Разделены следующие компоненты:

дорожка / - тетрагидрокортизол н тетра- гидрокортизон; дорожка 2 - кортизол, кортизон и альдостерон; дорожка 3 - тетрагкдрокор- тнзол, тетрагидрокортизон, кортизол, кортизон и альдостерон; дорожка 4 - альдостерон; дорожка 5 - альдостерон и 11-дегидрокортикостерон [Freimuth U., Keibel D., Buchner M_ Acia biol+ med+ Germ,, 1966, vol. 17T p. 241]

ранения этого нежелательного явления всю плоскость адсорбционного слоя на пластинке разделяют на узкие полоски, причем в начале каждой полоски оставляют лишь тонкие перемычки, на которые наносят исходные зоны анализируемых проб. Через эти же перемычки далее подается подвижная фаза (рис. 65). Обычно при этом по окончании проявления хроматограммы образуются узкие слегка изогнутые зоны, обращенные выпуклой стороной в направлении движения подвижной фазы.

Высокую равномерность подачи подвижной фазы удается обеспечить при использовании метода круговой тонкослойной хроматографии [26, 59-61]. В простейшем варианте этот способ осуществляют, как показанр на рис. 66. Растворитель помещают в чашку Петри слоем глубиной ЗТ мм. В центре чашки с помо* щью проволочного держателя устанавливают вертикально фи* тиль из хлопчатобумажного или стеклянного волокна (рис* 66d)* Чашку Петри, которая в данном случае выполняет функцию хроматографической камеры, накрывают сверху тонкослойной пластинкой с нанесенными вблизи ее центра пятнами подлежащих разделению проб. Высота фитиля, подающего подвижную фазу, должна быть на 0,5-1,0 мм больше, чем глубина применяемой чашки Петри, так чтобы при установке пластинки ее сорбционный слой сразу же пришел в соприкосновение с ним.

Благодаря тому, что подвижная фаза поступает в одной точке, равномерность движения ее фронта полностью определяется степенью однородности сорбционного слоя, которая в современных пластинках промышленного изготовления весьма высока.

Более совершенный вариант круговой тонкослойной хроматографии осуществляется в так называемых U-камерах, различные образцы которых выпускаются несколькими приборостроительными фирмами. Схема одной из ранних конструкций та*

Рис. 66. Круговая тонкослойная хроматография:

а - простая камера для круговой тонкослойной хроматографии: / - плз' стинка; 2 - слой адсорбента; 3 - хроматографическая камера (чашка Петри); 4 - подвижная фаза; 5 - фитиль с проволочным держателем для подвода подвижной фазы в центр пластинки (показан отдельно); 5 - U-камера фирмы Cam&g (Швейцария): 1 - ввод продувочного газа (сухого или насыщенного парами подвижной фазы); 2 - подвижная фаза; 3 - насос; 4 一 устройство для ввода проб; 5 - нагревательное кольцо для испарения избытка подвижной фазы

кой камеры приведена на рис. 666. Хроматографическую пластинку помещают сорбционным слоем вниз на верх камеры, а подвижную фазу подают снизу в центр пластинки с желаемой скоростью с помощью микро насоса. Анализируемые пробы либо вносят в центр пластинки с помощью того же микронасоса или микро шприца, либо предварительно до начала опыта наносят в форме пятен по окружности, недалеко отстоящей от центра пластинки. В этом случае, используя пластинки размером 100 х 100 мм, можно одновременно анализировать до 40-50 проб^ что является серьезным преимуществом этого варианта хроматогра фи и перед всеми другими. Типичные примеры круговых хроматограмм приведены на рис, 67.

Рис. 67* Высокоэффективные круговые тонкослойные хроматограммы, полученные в 0-камере при нанесении одной пробы смеси липофильных красителей в центр пластинки (占)и при нанесении 40 отдельных проб той же смеси на стартовой окружности вблизи центра пла- стинки (б\ Подвижная фаза - смесь гексан-хлороформ (70 : 30)

Предполагая, что размер зерна адсорбента составляет 5-10 мкм, можно вычислить по формулам, приведенным в предыдущей главе, оптимальные скорости подвижной фазы, приняв некоторые средние значения коэффициентов диффузии в жидкости. Такие расчеты показывают, что оптимальными при указанных размерах частиц адсорбента оказываются скорости подвижной фазы, равные 0,060,15 мм/сек. Эти величины хорошо согласуются с результатами работы [67], в которой указаны величины оптимальной скорости, равные 0,10-0Ф28 мм/сек. В то же время скорость перемещения фронта подвижной фазы под действием только сил капиллярного всасывания уже через 5-7 мин после начала процесса падает ниже ОД мм/сек [10]* Для обеспечения оптимальных условий разделения было бы желательно поддерживать скорость движения подвижной фазы постоянной в пределах, близких к оптимуму, т.е* равной 0,18-0,22 мм/сек. Это обес^ лечило бы высокую эффективность хроматографического разделения при хорошей воспроизводимости получаемых результатов. Понятно, что такой процесс неизбежно требует применения закрытой хроматографической системы* Это, по существу, устраняет одно из важных преимуществ планарной хроматографии. Тем не менее, несомненный выигрыш во времени проведения анализа, в достигаемой эффективности разделения, воспроизводимости получаемых результатов и производительности по числу одновременно выполняемых анализов обеспечили варианту тонкослойной хроматографии с подачей подвижной фазы под давлением известное распространение. Одна из первых установок для осуществления этого процесса была предложена в 1977 г* (рис. 68) [62]. В этой установке обычную тонкослойную пластинку 1 подходящего размера плотно прижимают к основанию установки под действием гибкой полимерной мембраны 2. Эта мембрана прижимается к адсорбционному слою хроматографической пластинки давлением вспомогательной жидкости (например, во^ ды) или газа 3. Ввод подвижной фазы осуществляется через сле・ циальный подающий патрубок, соединенный с распределительным каналом 4, обеспечивающим равномерное распределение подвижной фазы по всей ширине адсорбционного слоя. Функцию такого распределительного канала может выполнять узкая поперечная полоска пластинки шириной 1,0-1,5 мм, с которой предварительно удален адсорбент [66]. Исходные пробы могут наноситься на стартовую линию на пластинке до начала эксперимента, как в обычных вариантах тонкослойной хроматографии, либо могут вводиться на смоченный подбижной фазой слой уже после начала подачи растворителя [63, 64]. На боковые края пластинки и ее задний край по направлению дБИжения подвижной

Рис. 6& Схема устройства для высокоэффективной тонкослойной хроматографии под давлением:『е манометр; 2 - линия ввода проб; 3 - ввод газа нлм жидкости в уплотняющую подушку; 4 - замки, удерживающие верхнюю крышку; 5 - герметизирующая прокладка; 6 - слой адсорбента; 7 - стеклянная или пластиковая пластинка; 8 к гибкая полимерная мембрана; 9 - прозрачная крышка; 10 - линия подачи подвижной фазы; // - канал для пропускания термостатикующей жидкостиРис. 6& Схема устройства для высокоэффективной тонкослойной хроматографии под давлением:『е манометр; 2 - линия ввода проб; 3 - ввод газа нлм жидкости в уплотняющую подушку; 4 - замки, удерживающие верхнюю крышку; 5 - герметизирующая прокладка; 6 - слой адсорбента; 7 - стеклянная или пластиковая пластинка; 8 к гибкая полимерная мембрана; 9 - прозрачная крышка; 10 - линия подачи подвижной фазы; // - канал для пропускания термостатикующей жидкостифазы наносят узкие полоски непроницаемого для подвижной фазы герметизирующего материала (например, коллодия, эпоксидной смолы или парафина в случае водных подвижных фаз) (рис. 69) [65].

Рис. 6& Схема устройства для высокоэффективной тонкослойной хроматографии под давлением:

『е манометр; 2 - линия ввода проб; 3 - ввод газа нлм жидкости в уплотняющую подушку; 4 - замки, удерживающие верхнюю крышку; 5 - герметизирующая прокладка; 6 - слой адсорбента; 7 - стеклянная или пластиковая пластинка; 8 к гибкая полимерная мембрана; 9 - прозрачная крышка; 10 - линия подачи подвижной фазы; // - канал для пропускания термостатикующей жидкости

Рис. 6& Схема устройства для высокоэффективной тонкослойной хроматографии под давлением:

『е манометр; 2 - линия ввода проб; 3 - ввод газа нлм жидкости в уплотняющую подушку; 4 - замки, удерживающие верхнюю крышку; 5 - герметизирующая прокладка; 6 - слой адсорбента; 7 - стеклянная или пластиковая пластинка; 8 к гибкая полимерная мембрана; 9 - прозрачная крышка; 10 - линия подачи подвижной фазы; // - канал для пропускания термостатикующей жидкости

Применение гибкой герметизирующей мембраны, прижимаемой к адсорбци он ному слою за счет давления вспомогательного газа или жидкости является, несомненно, остроумным методическим решением, обеспечивающим достаточно полную герметизацию как всей плоскости адсорбционного слоя, так и его задней

Рис. 69. Тонкослойная пластинка для высокоэффективной хроматографии под давлением:

/ - основной слой адсорбента; 2 - непроницаемые для подвижной фаэь] полоски на боковых м одной из торцевых сторон пластинки, образованные путем пропитки слоя адсорбента пара- фином, коллодием или эпоксидной смолой: 3 - линия старта; 4 亠 фронт подвижной фазы в конце хроматографического опыта

ВЭТТ, мкмВЭТТ, мкмВЭТТ, мкмВЭТТ, мкмРис. 70. Зависимости ВЭТТ: (л) от линейной скорости подвижной фазы и для пластинки размером 200 х 200 мм с адсорбентом Фиксион 5 0 х 8 при разделении смеси аминокислот в подвижной фазе - буферном растворе с лимоннокислым натрием (pH 4,2): / - аргинин； 2 - лизин； 3 —「нети- нин; (6) от расстояния, пройденного фронтом подвижной фазы х в условиях обычной ТСХ (?-3) и высокоэффективной ТСХ (4)： J - ненасыщенная камера; 2 亠 ультрамикрокамера; 3 - насыщенная камера; 4 - высокоэффективная ТСХ под давлением.Адсорбент - силикагель 60 с размером зерна 5 мкм; подвижная фаза - ме- тиленхлорид; хроматографируемое вещество - краситель масляный желтыйРис. 70. Зависимости ВЭТТ: (л) от линейной скорости подвижной фазы и для пластинки размером 200 х 200 мм с адсорбентом Фиксион 5 0 х 8 при разделении смеси аминокислот в подвижной фазе - буферном растворе с лимоннокислым натрием (pH 4,2): / - аргинин； 2 - лизин； 3 —「нети- нин; (6) от расстояния, пройденного фронтом подвижной фазы х в условиях обычной ТСХ (?-3) и высокоэффективной ТСХ (4)： J - ненасыщенная камера; 2 亠 ультрамикрокамера; 3 - насыщенная камера; 4 - высокоэффективная ТСХ под давлением.Адсорбент - силикагель 60 с размером зерна 5 мкм; подвижная фаза - ме- тиленхлорид; хроматографируемое вещество - краситель масляный желтый

ВЭТТ, мкм

ВЭТТ, мкм

ВЭТТ, мкм

ВЭТТ, мкм

Рис. 70. Зависимости ВЭТТ: (л) от линейной скорости подвижной фазы и для пластинки размером 200 х 200 мм с адсорбентом Фиксион 5 0 х 8 при разделении смеси аминокислот в подвижной фазе - буферном растворе с лимоннокислым натрием (pH 4,2): / - аргинин； 2 - лизин； 3 —「нети- нин; (6) от расстояния, пройденного фронтом подвижной фазы х в условиях обычной ТСХ (?-3) и высокоэффективной ТСХ (4)： J - ненасыщенная камера; 2 亠 ультрамикрокамера; 3 - насыщенная камера; 4 - высокоэффективная ТСХ под давлением.

Адсорбент - силикагель 60 с размером зерна 5 мкм; подвижная фаза - ме- тиленхлорид; хроматографируемое вещество - краситель масляный желтый

Рис. 70. Зависимости ВЭТТ: (л) от линейной скорости подвижной фазы и для пластинки размером 200 х 200 мм с адсорбентом Фиксион 5 0 х 8 при разделении смеси аминокислот в подвижной фазе - буферном растворе с лимоннокислым натрием (pH 4,2): / - аргинин； 2 - лизин； 3 —「нети- нин; (6) от расстояния, пройденного фронтом подвижной фазы х в условиях обычной ТСХ (?-3) и высокоэффективной ТСХ (4)： J - ненасыщенная камера; 2 亠 ультрамикрокамера; 3 - насыщенная камера; 4 - высокоэффективная ТСХ под давлением.

Адсорбент - силикагель 60 с размером зерна 5 мкм; подвижная фаза - ме- тиленхлорид; хроматографируемое вещество - краситель масляный желтый

и боковых кромок даже и без нанесения герметизирующих полосок* Это делает метод тонкослойной хроматографии под давлением достаточно простым и удобным для практического применения.

(4-5)(4-5)Если подвижная фаза подается с объемной скоростью F на пластинку шириной b с адсорбционным слоем толщиной d, имеющим долю свободного объема В，то расстояние z, на которое продвинется фронт подвижной фазы за время『будет равно [66]:

(4-5)

(4-5)

——

мр

Рис, 71* Зависимости числа теоретических тарелок от длины разделяющего участка тонкослойной пластинки с силикагелем. Средний размер частиц адсорбента указан на рисунке у теоретических прямых. Реальные экспериментальные кривые ограничены значениями эффективности порядка 3-5 тыс. теор+ тарелок* Хроматографируемое вещество - желтый жирорастворимый краситель, подвижная фаза - метилен* хлорид

После того, как фронт подвижной фазы достигнет переднего края пластинки, линейная скорость движения подвижной фазы будет равна:

汉=女=上一. (4-6)

df Ьф

Эта скорость, естественно, будет определяться, как и в обычной хроматографической колонке, начальным давлением, которое в описанных в литературе примерах применения тонкослойной хроматографии под давлением достигало 25 кг/см3* Эта величина должна быть меньше даБления в прижимной подушке хотя бы на 3-5 кг/см3. Понятно, что максимальное давление в прижимной подушке ограничивается ее механической прочностью.

Линейная скорость движения подвижной фазы в тонкослойной хроматографии под давлением определяется величиной объемной скорости, которая при использовании жидкостных насосов с постоянной скоростью подачи растворителя остается одной и той же на всем протяжении хроматографического экспе^ римента. Входное давление при этом постепенно повышается до тех пор, пока фронт подвижной фазы не достигнет дальнего края пластинки, и далее остается постоянным. Как видно из уравнения (4-6), линейная скорость подвижной фазы в этом ва-

Рис* 72* Сопоставление эффективности обычной тонкослойной хроматографии (а) и разделения под давлением (б) стандартной смеси красителей в камере Хромопресс фирмы Камаг, Швейцария на высокоэффективных тонкослойных пластинках на алюминиевой фольге с силикагелем 60 (фирма Мерк* Германия),

Подвижная фаза - бензол; скорость движения подвижной фазы 2,3 см/мин (оптимальная скорость 1*3 см/мин). Продолжительность элюирования: а- 8 мин; 6 е 6,5 мин. Относительная влажность: а - 55%; б - 40% (оценочная); 5г - старт.

9

Рис 73. Хроматограмма лекарственных веществ? полученная мето- дом высокоэффективной тонкослойной хроматографии под давлением (а) и при использовании обычной тонкослойной хроматографии ⑹：

/ - стрихнин; 2 - эфедрин; 3 - метамфетамин; 4 亠 фенметразин; 5 - метил- фенцдат; 6 - амфетамин; 7 - дезопинон; & - корамин; 9 - кофеин; S - старт. Адсорбент -силикагель 60 (фирма Мерк, Германия); подвижная фаза - смесь «-бу- танол-хл ороформ-м етил этил кето н-уксусная кислота (25 : 17:8:6).

рианте хроматографии остается постоянной, в отличие от тонкослойной хроматографии с подачей подвижной фазы за счет капиллярных сил (где эта скорость убывает пропорционально пройденному фронтом расстоянию)* Это обусловливает существенное сокращение времени элюирования, С другой стороны, эффективность хроматографического разделения также остается постоянной (рис. 70) [64, 68].

Эксперименты показали, что оптимальная скорость потока подвижной фазе в тонкослойной хроматографии под давлением

Рис, 74, Хроматограммы, иллюстрирующие повышение разделяющей способности метода тонкослойной хроматографии на примере разделения смеси красителей в потоке бензола:

а - обычная тонкослойная хроматография (1963-1971 гг,); 6 - круговая высокоэффективная тонкослойная хроматография (1979「.)； в высокоэ中фектмн* ная жидкостная колоночная хроматография (хроматорамма приведена для сравнения) на колонке длиной 250 мм с адсорбентом Hibar Si 60 с размером частиц 5 мкм. Тонкослойные хроматограммы получены при относэтельной влажности 40%

составляет О Л 5-0,25 мм/сек. Эти величины заметно превышают скорости движения подвижной фазы в слоях адсорбентов под действием капиллярных сил, но оказываются довольно легко достижимыми в тонкослойной хроматографии под давлением. В сочетании с высококачественнымй пластинками это обеспечивает возможность достижения полной эффективности разделения до 10-15 тыс, т.т. что, несомненно, позволяет отнести описанный процесс к категории высокоэффективных (рис. 72) [65]. Улучшение качества достигаемого разделения при использовании тонкослойной хроматографии под цавлением можно видеть также на рис. 73, 74.

Помимо улучшения качества разделения, метод тонкослойной хроматографии под давлением устраняет ряд затруднений, связанных с осуществлением обращенно-фазовых процессов раз* деления. Затрудненная смачиваемость обращенно-фазовых сор* бентов водными подвижными фазами в ряде случаев сильно ограничивает применение обычной тонкослойной хроматографии с подачей подвижной фазы за счет капиллярных сил. Эти трудности успешно п реодо ле ваются при использовании тонкослойной хроматографии под давлением.

Все рассмотренные выше особенности обусловливают перспективность и определенное распространение этого варианта планарной хроматографинt Метод тонкослойной хроматографии под давлением был успешно применен при анализе смесей орга-

Рис. 75* Высокоэффективные тонкослойные хроматограммы моносахаридов (口) и олигосахаридов (К на пластинках KG 600F.

Подвижная 中аза - смесь пропанола-Jf нитрометана, воды и уксусной кис- лоты (50 : 30 : 20 : 1) в ненасыщенной камере. Визуализация путем перевода в производные, флюоресцирующие в УФ-свете: / - линия старта; 2 - фронт подвижной фазы; 3 - глицерин; 4 - сорбоза; 5 - фруктоза; 6 « глюкоза; 7 - маннит; 8 - сорбит; 9 - мальтоза; /0- мальтит: / / - рамноза; /2 - фукоза; /3 - сахароза; /4 - трегалоза; 75 - мальтотриоза; 16- раффиноза; / 7- тетраоза; /8 亠 гептао- за [Klaus R_ Ripphahn L J. Chromatogr. 1982t vol 244, no. 1, p. 99-124]

нических кислот и их производных [69]. аминокислот [70-72], афлатоксинов [73], алкалоидов и фармацевтических препаратов [74], красителей [75], продуктов растительного происхождения [76] и многих других соединений [77-93]. При выполнении анализов были использованы различные варианты хроматографического метода* Так, кроме нормально^фазовых разделений, в работах [81-83] были использованы обращенно-фазовые системы, а в работе [87] применяли ионообменную хроматографию. На рис. 73-75 приведены примеры хроматограмм, полученных при использовании метода высокоэффективной тонкослойной хроматографии под давлением.

Разнообразные варианты метода тонкослойной хроматографии с принудительной подачей подвижной фазы, их преимущества, недостатки и области применения достаточно подробно рассмотрены в обзоре [94]. Устройства, необходимые для осуществления высокоэффективной тонкослойной хроматографии с подачей подвижной фазы под давлением в настоящее время выпускаются целым рядом при б оростроител ьн ы х фирм и организаций.

2. СПОСОБЫ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОБРАБОТКИТОНКОСЛОЙНЫХ ХРОМАТОГРАММ

В течение длительного времени обработка планарных хроматограмм (бумажных и тонкослойных) включала операции их высушивания, визуализации зон (пятен или полос) разделенных компонентов (путем обработки хроматограмм подходящим химическим реактивом или путем облучения УФ-светом) и оценку величины зон путем прямого измерения их площадей простейшими средствами (линейкой, планиметром и т.н) В ряде случаев зоны разделенных веществ извлекали из адсорбента и измеряли количество полученного вещества различными химико-аналитическими методами* В монографиях и обзорах, посвященных бумажному и тонкослойному вариантам хроматографии, детально описа- ны многочисленные способы обнаружения зон бесцветных со- единений на планарных хроматограммах и оценки количества вещества, образующего данное пятно или линейную полосу [L 4-9]* Большие усилия были затрачены и для разработки спосо- бов документирования и сохранения результатов планарной хроматографии* Эти методы включают обработку полученных хроматограмм химическими реагентами путем выдерживания их в атмосфере химически активных газов или паров (аммиака, хлора, брома, иода? сероводорода, оксидов азота, формальдегида) или путем смачивания или опрыскивания хроматограмм жидкими визуализующими реагентами (концентрированными серной или азотной кислотами, растворами гидроксидов натрия или калия, хлорида олова, нитрата серебра, хлорида железа (Ш)* перманганата калия, нитропруссида натрия, различных красителей и др.)- Часто для указанных целей используют облучение полученных хроматограмм УФ-светом с длинами волн 254 или 360 нм*

В 60-х гг- XX столетия на смену простым способам оценки количества вещества чисто визуально или с помощью простейших измерительных средств пришли устройства, способные осуществлять

сканирование хроматографических зон по величине оптической плотности или интенсивности отраженного света. Одним из наиболее известных устройств такого рода были фотоденситометры, выпускавшиеся швейцарской фирмой “Camag”. Применение этих устройств позволило существенно повысить чувствительность, точность и воспроизводимость количественного анализа с помощью тонкослойной хроматографии* В сочетании с методиками высокоэффективного разделения использование таких устройств позволило получать количественные результаты, не уступающие по точности и воспроизводимости другим передовым хроматографическим методам, включая газовую хроматографию и высокоэффективную жидкостную колоночную хроматографию. Именно с помощью таких систем зарегистрированы хроматограммы, приведенные в качестве примеров на рис. 73-75. Развитие вычислительной техники в конце XX в. и, в частности, широкое распространение персональных компьютеров дало нОБые импульсы разработке техники количественного анализа б планарной хроматографии* В качестве считывающих информацию средств вместо достаточно дорогих сканирующих денситометров стали применяться малогабаритные телевизионные камеры Для анализа даваемых ими изображений используются методы, хорошо отработанные в микроскопии и анализе аэрофотоснимков [99-102]. Применение компьютерной техники позволило осуществить полную автоматизацию всех операций в методах пла- нарной хроматографии (нанесение проб, проявление хроматограмм, визуализация и получение качественных характеристик изучаемых веществ и количественной информации). Эти достижения сделали возможным осуществление большого числа анализов (до 100 и более) в течение ограниченного времени (например, за 1 день) с предельно обнаруживаемыми количествами отдельных компонентов порядка 1О12-10-15 г (рис, 76) при воспроизводимости параметров удерживания^ и количественных результатов не хуже I % отн* Полученные результаты характеризуют достигнутые в настоящее время возможности современных вариантов метода высокоэффективной тонкослойной хроматографии [103-105]. В то же время методы бумажной и тонкослойной хроматографии остаются примерами изящной и эффективной химико-аналитической техники, позволяющей получить достаточные для многих случаев практического использования результаты с помощью самых простых и доступных средств,

* * *

Ограниченный объем настоящей главы не позволяет детально рассмотреть ряд вопросов, имеющих важное значение для успешного осуществления процесса вы со коэффе ктивной тонкослойной хроматографии. В частности, здесь не были рассмотрены вопросы ак+

Рис* 76. Линейные хроматограммы смеси липофильных красителей на высокоэффективных тонкослойных пластинках

Подвижная фаза - толуол:理-одновременное разделение 10 проб; 6 - разделение линейных зон, достаточное для препаративного выделения отдельных компонентов

тивносги адсорбентов и зависимости этого параметра от характера их молекулярной структуры и влажности адсорбента. Вне рассмотрения остались также вопросы, связанные с насыщением адсорбентов парами подвижных фаз, свойствами растворителей, в частности с их элюционной способностью. Вне обсуждения остались варианты метода тонкослойной хроматоп)афии с применением градиентного элюирования с постепенным увеличением элюирующей способности подвижной фазы в процессе хроматографического опыта. В известной мере эти проблемы были рассмотрены в предыдущей главе. Лишь в малой степени здесь были затронуты вопросы техники двумерной хроматографии и многократного элюирования.

Все эти проблемы, весьма важные для успешного проведения не только тонкослойной, но и жидкостной колоночной хроматографии, детально рассматриваются в многочисленных книгах, посвященных обсуждаемым здесь методам [107-110]* К этим весьма обстоятельным источникам мы отсылаем заинтересованного читателя.

ЛИТЕРАТУРА

L Масек К., Hais ГМ* Paper chromatography. Amsterdam: Elsevier, 1962.

Stationary phase in paper and thin-layer chromatography / Ed. K. Macek, T.M. Hais. Amsterdam: Elsevier, 1965.

Thin-layer chromatography / Ed. G.B. Marini*Bettali, Amsterdam: Elsevier, 1964.

Kirchner ZG. Thin-layer chromatography, N.Y*: Wiley, 1978* Pyc+ nep.: Тонкослойная хроматография. M.: Мир, 1981*

Тюкавкина H.A.t Литвиненко В.//^ Шостаковский М.Ф. Хроматография на полиамидных сорбентах в органической химии. Новосибирск: Наука, 1973,

Лхрем А+А.т Кузнецова А.И. Тонкослойная хроматография. М「Химия, 1964.

Волынец МЛ. Тонкослойная хроматография в неорганическом анализе, М.: Наука, 1974,

Кибардин CA.t Макаров КА. Тонкослойная хроматография в органической химии. М*: Химия, 1978.

Geiss F. Fundamentals of thin-layer chromatography: (Planar chromaiogra- phy). Heidelberg: Huthig, 1987. Рус, nep」Основы тонкослойной хро* матографии. Г 1, 2* М」ИФХ РАН, 1999.

Geiss F. Die Parameter der Dunnschicbtchromatographie, eine modeme Einfuhrung in Grundlagen und Praxis* Wisbaden: Vieweg, 1972,

Consden Rt Gordon AE- Martin A J. // Biochem J, 3 944. Vol. 3 8* P* 225*

Измайлов 工4, Шрайбер Л/С 〃 Фармация. 1938. № 3* С L

Izmailov MA+j Schraiber 必S 〃 Farmatsiya (Sofia)* 1938, R 1.

14*StahlE.,SchroeierG・，KraftG.,Renz凡力Pharmazie, 1956. Bd. ILS. 633* 15* Kirchner J ,G.t Keller GJ. // Jt Amun Chcm. Soc, 1950. VoL 7 2. P, 1867.

Thin4ayer chromatography / Ed* E. Stahl. MY.: Acad, press, 1965* Pyc пер.: Тонкослойная хроматография* M「Мир, 1966*

Thin-layer chromatography / Ed. S上* Touchstone, D. Rogers, N.Y,: Wiley, 198L

Sapunova M., Schwarz V.P Michalec C. Cbromatografia na tonkich vrsMch vo farm^cii a v klinickej biocMmii* Vol. 1, Z Prague: Osveta, 1977+ Pyc. пер.: Тонкослойная хромато^афия в фармации и клинической биохимии* Ч. 1* 2* М.: МирФ 1980.

Pataki G. Dunnchichtchromatographie in der Aminosaure* und Peptidchemie* B.: De Gniyter, 1966.

Волынец AfTL Количественная тонкослойная хроматография в неорганическом анализе, М」Наука, 1993*

Ranny М. Thin-layer chromatography with flame ionization detection. Prague: Academia, 1987.

Hofmann A+£* // New biochemical separations / Ed. A.T. James, L.J. Morris. N,Y.: Van Nostrand, 1964.

Bibliography of paper and (hin-layer chromatography, 1961-1965 / Ed* K. Macek et aL Amsterdam: Elsevier, 196&

Bibliography of paper and thin-layer chromatograhy, 1966-1969 / Ed. K+ Macek et al. Amsterdam： Elsevier, 1972+

Bibliography of paper and thin-layer chromatography, 1970-1973 / Ed+ K, Mask et aL Amsterdam: Elsevier, 1976.

High performance thin-layer chromatography / Ed+ A. Zlatkis, R. Kaiser. Amsterdam: Elsevier, 1977+ Рус* пер.: Высокоэффективная тонкослой* ная хроматография. М「Мир, 1979*

Eisenbeiss F, // Bibliography of paper and thin4ayer chromatography. Amsterdam, 1976+ P. 15.

28+ Halpaap H, // J. Cbromatogr, 1973. Vol. 78. N L R 7 7.

Biome J. // Bibliography of paper and thin-layer chromatography. Amsterdam, 1976* P. 47,

30+ Janchen D. // J+ Chromatogn 1964. Vol. 14, P. 261.

3L Hesel (Л 〃 Angew. Chem. 197 3. Bd, 85* S. 334*

32* Van Deemler JJ.f Zuiderweg FJ., Klinlenberg A. // Chem, Eng* Sci. 1956. Vol 5. R 27L

Snyder LA, Kirkland J J. Introduction to modern liquid chromatography, NX: Wiley, 1979.

Giddings J.K, Dynamics of chromatography* N.Y.: Marcel Dekker, 1965-

Glueckauf £+ //Trans. Faraday Soc* 1955+ VoL 5L P. 34.

Liquid column chromatography / Ed* Z. Deyl et al+ VoL 1-3+ Amsterdam: Elsevier, 1975. Рус. пер.: Жидкостная колоночная хроматография. T. 1-3. М+: Мир. 1978.

3 7* Guiochon G.t SiouffiA. //J. Chromatogr. 1982, VoL 245. P+ L

Knox JM Practical high performance liquid chromatography / Ed. CF* Simpson* L.: Heyden, 1976* P. 19*

Modern practice of liquid chromatography / Ed* J J Kirkland* NY: Wiley, 1971. Рус. пер*: Современное состояние жидкостной хроматографии, Mj Мир, 1974.

Belenkii 66*, Nesterov HK, Gankina ES., Smirnov M.M. 〃 J* Chromatogr. 1967. VoL3LR 360.

4L Introduction to microscale high-performance liquid chromatography / Ed* D. Ishi* №£: VCH, 1988. Рус* nep*: Введение в микромасштабную высокоэффективную жидкостную хроматографию. М*: Мир, 1991*

42* Kirchner J,G.t Miller J.M., KellerGJ^ //Anal, Chem. 195 L VoL 23. P.420.

milerJM., Kirchner J.G JI WA± 1954. Vot 26. P 2002.

44+ Obreiter Zfi+, Stowe BB // Chromatogr. 1964* Vol. 16* P. 226.

45 + Okumura T., Kadono T+ 〃 Ibid.1973* Vol. g& P. 57*

4s Анбр呢e JLB- Татариунас 工,Карнаухов BH U Биофизика живой клетки. 1971. № 2. С,

RipphnbiJ- Halpaap Я. // High performance (hin-layer chromatography / Ed. A+ Zlatkis, R+ Kmser. Amsterdam: Elsevier, 1977. gc* пер. в кн*: Высокоэффективная тонкослойная хроматография. М.: Мир, 1979* С. 217.

Не^е! У【bid. С. 173.

Klaus R.t Ripphahn J* 〃 丄 Chromatogr. 1982+ Vol, 244. E 99-124,

0* Fessler J.N., Galley H. // Nature. 1964. VoL 20 L P. 1056.

5L Truter £K 〃L Chromatogr. 1964. VoL 14. P. 57.

5 2. Musgrave A J/Ibid. 1969. VoL 4L P 470.

53* Berezkin V,G.T Markov A.B. // J. Planar Chromatogr. 1999. Vol. 12- P. 279-283.

. Darcy H. Les Fontaines publique de la Ville de Dijon. P「Dalmont, 1856.

5. Belt JM, Cameron EK 〃 J. Phys, Chem. 1906. Vo】 JO. P. 658.

56+ Reid RC, Sherwood TK Properties of gases and liquids. NY: McGraw- Hill, 1958.

5工 Rn礎AL, Giddings JC. 〃 工 Chromatogr 1960. VoL 3. P. 438.

5 8. Guiochon G„ Siouffi A 〃 工 Chmmatogr. Sci. 1978, VoL 16. R 598.

59+ Bryant LH. // Nature. 1955. VoL 175. P. 556

66 Litt G J., Johl R G. J. Chromatogr. 1965. Vol. 20. P. 605.

6L КнырЛЛ^ Соколов M.C.t Перфилс^а HR, Андреев Л.В // Поведение, превращение и анализ пестицидов и их метаболитов в почве, Пущино, 1973. С 152

Tyihak Е” Kalasz Н・* Mincsovics £, Nagy J. // Proc, XVII Hyng. Annu. Meet, Biochem. Keskemet, 1977. VoL 17* P. 183.

63* Tyihak E.f Mincsovics E,f Kalasz H. //J. Chromatogr. 1979* VoL 174* P. 75.

Mincsovics E*, Kalasz Я.Л Tyihak E. 〃 Ibid. 1980. VoL 19L P. 293.

65* Chrompress-10: Overpressurized thin-layer chromatography. Budapest: Lab5rMiM, 1982.

Lengyel Z+, Tyihak E” Mincsovics E 〃 J. Liquid Chromatogr. 1982* VoL 5, PJ54L

Kalasz H** Nagy 丄〃 Proc. V Danube Symp. on Chromatography, Yalta, 1985* Moscow: Nauka, 1985. P. 18 7.

Tyihak £, Mincsovics 風 Kalasz H. //Jt Chromatogr. 1981. VoL 21L P 45.

Dudas K, Szepesi G/apA* et aL // Anal. Chem, Symp. Ser. 1982. VoL IS РЛ17.

Ngo-Tuan-Ccngf Tyihak E.f Vaida M, Mincsovics £ 〃 J. High ResoluL Chromatogr* Chromatogr* Commun* 1982, VoL 5. R 511.

71* Fata Z- Kemeny G*, Mincsovics E // Develop. Food Sci. 1983. VcL 5A* P. 483.

Abralam M.t Polyak & , Szajani £, Boross 厶〃 J, Liquid Chromatogr. 1983. VoL 6. P. 2635.

Gulyas H. // J. Chromatogr. 1985. VoL 319. P* 105*

Gulyas /Л Kemeny G, Hollosi 人 Pucsok J." Ibid. 1984. VoL 29L E 47L

Mincsovics 以 Tyihak £, Kalasz 次 〃 Ibid J9gs Vol. 19L Г 293*

Tyihak E, Mincsovics E*, Те紀瓶gi 戶+ et aL // Herba Hung. 1980. Vol. 19, N 1. Pl 13.

7 工 Hauck H.F.Jost W. 〃丄 Chromatogr 1983. VoL 262+ PJ13.

Tyihak E.T Mincsovics E_ Kaldsz H., Nagy J J Chromatogr 198L VoL 2IL P 45.

Brenner M.t Niederwieser A+ Experientia, 1961. B. 17. S. 237.

Лейстнер Л., Салма 3., Кузьмин H.M. // Журн, аналит, химии, 1982, Т. 37. С 1384.

Szepesi G.t Vegh Z, GyulayZ., Gazdag M. 〃工 Chromatogr. 1984. Voi. 290. PJ27.

Gazdag №., Szepesi G., Hernyes M.. Vegh Z.// Ibid. PJ35+

Janos Er Cserhaii T., Tyihdd £. // J. High Resolut. Chromatogr. Chromatogr. Commun. 1982+ VoL 15. P* 634

Nurok D AnaL Chem. 1981. VM 53, N 4. P. 714.

Newman ЛМ//Intern. Lab, 1985, VoL 15, N 5. E 22,

86+ Newman J.M. // Amer. Lab. 1985+ VoL 17, N 4. P. 52.

8工 Kalds 斤一 N^gy J•〃丄 Liquid Chromatogr 198L VoL 4+ P. 985.

8 8+ Newmann J.M. // Lab* PracL 1985* VoL 34, N L P. 65.

Vajda 人 Leisiner L, Pick 人 Ann-Tuan N. // Chromatographia. 1986 VoL2LR 152+

Bardosz S「Kursai Г. Elodi P J/Ibid. 1985. VoL 20, R 23.

Varadi M“ Harsahyi G. // Hung. Sci. Instrum. 1985+ VoL 59. EL

Kery 4r Turiak G., Verzas-Petri G, // Proc. V Danube Symp. on Chromatography, Yalta, 1985* Moscow； Nauka, 1985. P, 188,

Tyihdk E. 〃 Ibid. P. 5.

Березкин Н.Г., Бузаев BR H Успехи химии, 1987. Т* 61* вып. 4* С 656.

Tausch W. 〃 Messtechnik. 1972. Bd. 2* £ 3&

Mazzola 鼠 Hezel У 〃 Bull Chem. Farm. 1974. VoL 113+ P. 379.

Treiber L, Nordbery 凡，Linolstedt S* 〃工 Chromatogr. 1971. Vol, 63. P. 21L

Hamamoto H„ Kurita Г, Suzuki J. etaL //Ibid. 1976. VoL 116. N L P. 2L

产*"上，Geger 凡，Eppert G. // Ibid. 1973. VoL 78. P 21-23.

0* Emons H.H, Кейпе /Л Seyfarth H.H Chemische Microskopie: Eine Einfuhrung in chemische microskopischer Untersuchungsmethoden. Leipzig: Dts+ Verl. Grundstoffindustrie, 1973+

L Цыганов НН Основы цветной фотографии и аэрофотографии. М.: Геодезиздат, 1956+ 176 с,

Корчагин В.П., Нефедов 8+/L, Островский Э.Я, и др. Аэрофизиче- ские методы поисков месторождений редких элементов* М・：Госге- олтехиздат, 1963.

Yu-Chie Chent Jentaie Shieat Jan Sunner 〃工 Chromatogr. A. 1998* VoL 826. P 77-86.

104t Опйак A.t OrittakovdR.T TurCaniova L 〃 Ibid* VoL 825, N 2. P J89-194.

W5. Sdrbu С” Todor 3. 〃 Ibid. VoL 822. P. 263—269.

От Prakash Sharma, Tej Krishan Bhat, Bhupinder Singh // Ibid N L R 167-171.

Modem practice of liquid chromatography / Ed+ JJ. Kirkland* N*Y「 Wiley, 197L Рус. пер.: Современное состояние жидкостной хроматографии. М.: Мир, 1974.

Perry 3+G, Amos R., Brewer 尸丄 Practical liquid chromatography. N.Yz Plenum press, 1972* Рус* пер.: Практическое руководство по жидкостной хроматографии* М」Мир, 1974.

Шатц ВЛ、Сахартова О.В. Высокоэффективная жидкостная хрО' матография. Рига： Зинатне, 1988.

Schoenmakers FJ* Optimization of chromatographic selectivity. Amsterdam: Elsevier, 1986. Pyc. nep二 Оптимизация селективности в хроматографии. М.: Мир, 1$89*

11L Yost R.W., Енге LS, Conlon RD Practical liquid chromatography. Norwalk (Conn+)： Perkin-Elmer, 1980.

112. Стыскин EJL, Ициксон Л.Б., Брауде £B. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М「Химия, 1986.

Глава 5

КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

Последний метод, который должен быть рассмотрен при обсуждении высокоэффективных процессов разделения веществ, базирующихся на различных скоростях их миграции в разделяющей системе - это капиллярный электрофорез.

Этот вариант техники разделения веществ вошел в практику физико-химических исследований всего лишь 20-25 лет тому назад, однако уже завоевал себе прочную позицию среди других методов разделения близких по свойствам соединений благодаря своей исключительно высокой разделяющей способности в сочетании с простотой инструментального оформления и широчайшему кругу возможных объектов*

Действительно, с помощью этого метода возможно осуществить разделение как ионов малых молекул, так и крупных полимерных и мицеллярных образований и даже бактерий и вирусов. С помощью капиллярного электрофореза можно разделить ве* щества, обладающие ничтожными различиями по своим физико- химическим свойствам, например，атомы и ионы изотопов, изотопно-замещенные и изомерные молекулы органических соединений. Ниже будут приведены такие примеры.

Несмотря на огромный объем накопленной к настоящему моменту информации, метод капиллярного электрофореза находится пока еще в начале своего развития и, несомненно, в будущем позволит достичь новых выдающихся научных результатов, выходящих за пределы самых необузданных фантазий.

Электрофорезом называется перемещение заряженных частиц (ионов, молекул, мицелл) в растворах под действием электрического поля* В том случае, когда частицы, переносящие электрические заряды, достигают электродов, создающих в растворе электрическое поле, и претерпевают на электродах химические превращения, процесс называют электролизом. Таким образом, электролиз всегда сопровождает процесс электрофореза, но не наоборот. Частицы, несущие электрические заряды, перемеща-

ются в растворе с неодинаковой скоростью. Это может быть связано, с одной стороны, с различиями в величине электрического заряда частиц, а с другой стороны, с различным сопротивлению их движению в жидкости за счет разной величины и формы частиц, а также с различным характером их сольватации растворителем* Различия в скорости движения частиц в электрическом поле определяют возможности использования этого явления для разделения различных веществ, в первую очередь таких, которые способны ионизироваться в растворе, образуя положительные или отрицательные ионы. Эти возможности были, в известной ме- ре, реализованы уже в 1930-1950-е тт* в форме методов электрофоретического разделения ряда биологически активных веществ, в первую очередь белков и фрагментов ДНК - нуклеотидов путем электрофореза на пропитанных электролитом листах или полосках бумаги, либо на стержнях или плоских слоях полиакриламидного геля, Такой метод гель-электрофореза оказался достаточно плодотворным для анализа сложных смесей биологически активных молекул. С его помощью был получен огромный объем информации, касающейся молекулярно-массового распределения многочисленных белков, нуклеотидов и нуклеиновых кислот.

Однако эти варианты электрофоретического метода имели относительно невысокую разделяющую способность вследствие ограниченной длины разделяющих слоев и неравномерного разогрева их джоулевым теплом. Последний фактор ограничивал также напряженность приложенного электрического поля, что определяло невысокую скорость процесса. Так, разделение белков в заполненных полиакриламидным гелем трубках длиной 50-100 мм занимало несколько часов* Наиболее существенные недостатки электрофоретического метода удалось преодолеть в капиллярном варианте - методе капиллярного зонного электрофореза, в котором разделение веществ по подвижности частиц осуществляется в тонких капиллярных трубках диаметром 50-150 мкм и длиной 10-100 см, выполненных из стекла, фторопласта или плавленого кварца* Этот аналитический метод был впервые предложен Миккерсом и Эверертсом [1] в конце 70-х гг, XX в., Йоргенсом и Лукасом [2] в начале 80-х гг. XX в. Использование тонких капилляров обеспечило интенсивный отвод джоулева тепла, выделяющегося вследствие прохождения электрического тока через электролит. Таким образом, была устранена одна из главных в электрофорезе причин расширения и искажения дискретных зон разделяемых веществ.

Ряд методических приемов, рассмотренных подробно далее, позволил обеспечить формирование весьма узких зон частиц, что в значительной степени способствовало повышению качества раз-

деления. Однако, в большой мере широкое распространение метода капиллярного электрофореза связано с разработкой удобных и высокочувствительных методов детектирования разделенных фракций, в 70^х гг. уже использоБавшихся в методе ВЭЖХ.

Формирование узких зон разделяемых компонентов в капиллярном зонном электрофорезе происходит не посредстве н но в среде несущего электролита без каких-либо взаимодействий с внутренней поверхностью капилляра, которую следует рассмат^ ривать как неподвижную стационарную фазу. Поэтому, можно с уверенностью констатировать, что капиллярный зонный элект^ рофорез определенно не является хроматографическим методом. Это утверждение может вызвать два вопроса: первый - вопрос о правомерности рассмотрения этого метода в книге о высокоэффективных хроматографических процессах; второй - о правомерности и обосно в анности использования для характери сти к и достигаемого в капиллярном электрофорезе разделения тех же единиц, что и в хроматографин, т*& теоретических тарелок^ концепция которых определенно подразумевает наличие массообме- на между подвижной и неподвижной фазами разделяющей хроматографической системы. Ответом на первый вопрос является то обстоятельство, что между процессами высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза имеется значительное сходство в двух аспектах - аппаратурном оформлении и выражении полученного результата в форме хроматограммы или электроферограммы, включающей набор пиков, описываемых гауссовыми функциями и отвечающих отдельным разделенным компонентам анализируемой смеси. Наконец, большое сходство существует и в проведении самой процедуры разделения: в капилляр для электрофореза вводится дискретная проба анализируемой смеси, а результат процесса разделения наблюдается некоторое время спустя в форме показаний детектора. Ответ на второй вопрос не столь очевиден. Конечно, концепция теоретических тарелок мало применима для описания процессов классического капиллярного зонного электрофореза* Во^ прос о правомерности оценки получаемых в этом методе результатов числом теоретических тарелок рассматривался рядом авторитетных авторов [3-5]* Для обоснованных суждений в этом воп* росе важно отметить, что существуют и достаточно широко используются такие варианты метода капиллярного электрофореза, в которых массообмен между подвижной и неподвижной фа^ вами играет достаточно важную роль* Это в первую очередь электрофорез в капиллярах, заполненных полиакриламидным гелем. Этот метод является полным аналогом метода эксклюзивной хроматографии, отличаясь от нее лишь не в пример более

высокой разделяющей способностью. Весьма плодотворны также варианты мицеллярного электрофореза и электрофоретического разделения малых молекул б присутствии высокомолекулярных модификаторов, когда крупные и малоподвижные в электрическом поле мицеллы поверхности о- а ктивны х веществ или полимерные молекулы выполняют функцию неподвижной фазы по отношению к молекулам и ионам меньшего размера, и соответственно, более высокой подвижности. Эти процессы, электрофоретические по своему существу, часто по справедливости называют эл ектроки нетической хр оматографией+

В целом, резюмируя изложенное выше, можно рассматривать рассчитываемое по электроферограмме число теоретических тарелок как формальную величину, показывающую какое число теоретических тарелок имела бы хроматографическая система, обеспечивающая такое же разделение как и электрофоретическая, Такой подход будет вполне достаточным для целей настоящей книги, позволяя читателю сопоставить системы, описываемые в настоящей главе, с другими системами, рассмотренными в предшествующих разделах этой книги.

Теория капиллярного электрофореза, техника и методика этого метода и получаемые результаты подобно рассмотрены в целом ряде монографий и обзоров [6-15], к которым следует обратиться читателю, заинтересовавшемуся этим исключительно мощным методом анализа и разделения веществ. Здесь мы ограничимся кратким изложением наиболее важных моментов, достаточным для того, чтобы ясно определить позицию капиллярного электрофореза среди других высокоэффективных методов разделения 目 показать большие возможности этого метода в настоящем и перспективы их развития в будущем.

ПРИНЦИПЫ КАПИЛЛЯРНОГОЭЛЕКТРОФОРЕЗА

В своей простейшей форме капиллярный электрофорез осу* ществляется в экспериментальной установке, п ре дета вл е иной схематически на рис* 77, Концы заполненного электролитом (буферным раствором) тонкого кварцевого капилляра диаметром 50-150 мкм погружают в два сосуда с таким же буферным рас* твором. В один из этих сосудов опускают поло жите л ьн ы й злект- род, а в другой отрицательный электрод, соединенные с источником постоянного напряжения от 5 до 30 кВ* В погруженный

Рис. 77* Схема установки для капиллярного электрофореза:

/ - кварцевый капилляр диаметром 10-150 мкм; 2 - входной сосуд с буферным раствором; 3 - выходной сосуд с буферным раствором; 4 - источник высокого напряжения (10-25 кВ); 5 - детектор; 6 - сосуд с пробой подлежащей анализу [8]

в сосуд с положительным электродом конец капилляра, вводят небольшое количество анализируемой пробы (несколько нанолитров)* (Способы ввода проб рассмотрены в последующих разделах этой главы.) После этого к электродам прикладывают электрическое напряжение, которое вызывает электрофоретическую миграцию компонентов пробы. Различие в ионной подвижности отдельных частиц, входящих в состав пробы, вызывает их разделение на дискретные более или менее резко разграниченные зоны, поочередно проходящие через детектирующее уст- ройство, регистрирующее электроферограмму - график зависимости сигнала детектора от времени.

Процесс электрофореза, т.е, перемещение в капилляре несущих электрический заряд частиц под действием электрического поля* обычно сопровождается более или менее интенсивным течением буферного раствора (переносящего электро-

лита) от анода к катоду. Этот, так называемый, электроосмотический поток может совпадать по направлению с электрофоретическим перемещением разделяемых частиц или может иметь противоположное направление. При этом он может ускорять или замедлять электрофоретическое перемещение и таким образом активно влиять на форму результирующей эле ктроферограмм ы.

Скорость электрофоретического перемещения ионов определяется их электрофоретической подвижностью ц и напряженностью электрического поля в капилляре Е:

y = UE = 4ff〃， (5-1)

где г - время электрофоретического перемещения вещества

причем Leff 一 это длина капилляра от его входа до места расположения детектора, ^金疗 -приложенное на этом участке напряжение:

5沁 8)

где 。- полная величина напряжения, приложенного к электродам электрофоретической системы, L 一 полная длина капилляра.

Ускоряющая сила электрического поля F$# действующая на отдельный ион или иную заряженную частицу, может быть вьь ражена следующим образом

где z - эффективный заряд частицы^ - число Авогадро,戶-константа Фарадея, равная 96500 Кл/моль.

При установившемся режиме движения частиц эта сила равна силе торможения за счет внутреннего трения в жидкости» 忌,которая может быть описана формулой закона Стокса:

/у = бтгтр 广 U = 6g • г^^,(5*5)

где г - стоксовский радиус, Т| - динамическая вязкость жидкости. Отсюда можно определить время электрофоретического перемещения (время миграции) данного иона или иной заряженной

частицы tm (без блияния электроосмотического потока):

= ₽-，(5-6)

где В 出 константа для данной электрофоретической системы.

Из этой формулы видно, что время миграции различных заряженных частиц в электрофоретической системе, определяющееся отношением их эффективного радиуса к заряду, будет разным при минимальных различиях этих параметров, что и определяет возможность их разделения в электрическом поле. Эти соотношения оказываются действительными в том случае, если в электрофоретической системе отсутствует течение электропроводящего буферного раствора, как, например, в капилляре, заполненном полиакриламидным гелем (см. ниже). Однако в полых капиллярах при наложении электрического поля всегда возникает движение электролита - электроосмотический поток, связанный с наличием поверхностных электрических зарядов* Так, в водных средах, как правило, поверхность кварцевых и стеклянных капилляров несет отрицательные заряды, связанные с диссоциацией поверхностных силанольных групп в водно-солевых растворах. Поэтому в жидкости возника- ет распределенный электрический заряд, связанный с локализацией вблизи поверхности противоионов с противоположным знаком электрического заряда* В результате у поверхности капилляра возникает двойной электрический слой, включающий неподвижные ионы, несущие положительные заряды и связанные кулоновскими силами с отрицательными зарядами поверхности, и подвижные ионы, распре де л яющие ся между малоподвижным слоем ионов и прилегающим к нему диффузионным слоем. При этом между слоем неподвижных зарядов у поверхности и основной массой раствора возникает определенная разность электрических потенциалов, обыкновенно обозначаемая как & - потенциал* Данные о ^-потенциалах большого числа веществ опубликованы в целом ряде источников [16-18]* Электрическое поле, приложенное по оси капилляра, вызывает миграцию противоионов подвижного слоя, что приводит к движению электролита в капилляре, которое и называется электроосмотическим потоком.

В связи с тем, что электродинамические силы, определяющие электроосмотический поток, приложены вблизи стенок капилляра, в нем формируется плоский профиль скоростей жидкости, существенно отличающийся от параболического профиля скоростей, характерного для пуазейлевского течения вязкой

жидкости. При этом практически полностью исключается явление расширения дисюретных зон разделяемых соединений под влиянием неоднородгого поля скоростей в капилляре. Это является одной из наиболее важных факторов, определяющих высокую эффективность разделения, характерную для капиллярного электрофореза*

Скорость электроосмотического потока может быть оценена с помощью уравнения Гельмгольца:

U = u「E = ^^. (5-7) 47nl

Эта величина прямо пропорциональна диэлектрической проницаемости е, напряженности электрического поля Е и величине & - потенциала (связанной с плотностью поверхностных зарядов на внутренней поверхности в капилляре) и обратно пропорциональна вязкости электролита.

В связи с тем, что в кварцевых капиллярах диффузионный электрический слой образован, в основном, положительно заряженными нонами, в них электроосмотический поток направлен от анода к катоду и увеличивается при увеличении pH и уменьшении концентрации и ионной силы раствора электролита. Кроме того, электроосмотический поток уменьшается при добавлении к электролиту органических компонентов. С другой стороны, направление я интенсивность электроосмотического потока можно изменять путем добавления к электролиту поверхностно-активных веществ. Так, например, если к разделительному электролиту добавить катионное поверхностно-активное вещество, то на поверхности капилляра формируется слой положительно заряженных частиц с отрицател ьны ми противоионами в диффузионном электрическом слое. Это приводит к изменению направления электроосмотического потока, который в этом случае переносит жидкость от катода к аноду.

На рис* 78 представлены графики зависимости скорости электроосмотического потока от pH электролита при постоянной ионной силе для трех наиболее часто применяемых материалов капилляра - стекла, кварца и фторопласта. Легко видеть, что скорость электроосмотического потока можно регулировать в довольно широких пределах, изменяя величину pH электролита или материал капилляров.

В большинстве практически важных случаев для индикации скорости электроосмотического потока в состав анализи* руемой пробы вводят вещество, не ионизирующееся в электролите, но хорошо регистрируемое детектором. При исполь-

pHpHРис* 78* Зависимость скорости электроосмотического потока в капиллярах из разных материалов от величины pH переносящего электролита [16] зовании метода детектирования веществом такого рода является бензиловый спирт*

pH

pH

Как и в хроматографии качественной характеристикой веществ, подвергаемых электрофоретическому разделению, является время удерживания при ми- П>ации вещества от входа

капилляра до детектора,『汕旷 Соответственно, для сопоставления результатов, получаемых при использовании капилляров разной длины удобной величиной

является скорость миграции:

%Ь& 二 % "obs*

(5-8)(5-8)где 丄金任-длина капилляра от его входа до точки детектирования.

(5-8)

(5-8)

Для сопоставления данных о характере электрофоретической миграции веществ не только в капиллярах разной длины, но и при разных напряжениях, можно рассчитать величину наблюдаемой электрофоретической подвижности ц^：

也=督=行今(5-9)

где L『-полная длина капилляра, V - приложенное напряжение*

Как было указано ранее, в полых капиллярах при наложении электрического поля всегда возникает электроосмотический поток. Направление этого потока может совпадать с направлением электрофоретической миграции частицы, несущей электрический заряд, и может быть противоположным ему. В первом случае необходимая скорость миграции превышает скорость собственной миграции иона, во втором - оказывается меньшей на величину скорости электроосмотического потока. Если при этом последний параметр окажется меньшим^ чем собственная скорость электрофоретической миграции иона, то зона данного ио-

на вообще не сможет достичь детектора и не будет зарегистрирована на электроферограмме*

Таким образом, наблюдаемая скорость миграции ионов в капиллярном электрофорезе представляет собой алгебраическую сумму его собственной скорости электрофоретической подвижности и скорости электроосмотического потока.

Таким образом, 心=%+%，(5-10)

отсюда

^=^~ Neof-丄。f •(5-И)

Ориентировочные значения собственной электрофоретической подвижности)iion можно рассчитать из величин предельных ионных эквивалентных проводимостей, причем 召-валентное число электрона, е - заряд электрона (1,602 + 10-崎 Кул)т а Т| - динамическая вязкость электролита.

Электрофоретическая миграция ионов или иных частиц, не* сущих электрический заряд, происходит всегда при наличии электрического поля в среде жидкого электролита.

Макроскопическим проявлением электрофоретической миграции в электролите является возникновение электрического тока, J, связанного с приложенным напряжением V законом Ома:

V = RA(5-12)

где R - электрическое сопротивление электролита.

В электрохимических исследованиях чаще используют величину электрической проводимости, S, обратную омическому сопротивлению:

S= \R(5-13)

Значения проводимости в каждом конкретном случае могут быть измерены с помощью кондуктометров. Единицей измерения проводимости служит обратный Ом (Ом-1) или Сименс (Sm = Ом").

Измеряемая величина проводимости зависит от геометрии измерительной ячейки, природы ионов, участвующих в переносе электрических зарядов, и от концентрации электролита. Из измеренных величин проводимостей можно вычислить значение удельной проводимости S* путем деления измеренных величин на постоянную ячейки %:

S『SX(5-14)

Влияние концентрации электролита учитывают, вычисляя эквивалентную или мольную проводимость X путем деления удельной проводимости на величину эквивалентной или мольной концентрации электролита [С^]:

% = SJ“(5-15)

Эквивалентные концентрации используют в случае многозарядных ионов,

В соответствии с первым законом Кольрауша анионы и катионы диссоциирующего электролита вносят независимые вклады в величину его эквивалентной проводимости. При этом для полностью диссоциированного электролита с мольным соотношением катионов и анионов 1:1 эквивалентная проводимость равна сумме ионных эквивалентных проводимостей катионов и анио^ нов V и Таким образом эквивалентная проводимость полностью диссоции ров ан н ого электролита, в состав которого входят однозарядные катионы и анионы, равна

儿g = Ь + 九二(5-16)

В соответствии с уравнением (5-15) эквивалентная проводи- мость не должна зависеть от концентрации. Однако это положе* ние оправдывается только при бесконечно малых концентрациях (при бесконечном разбавлении). При более значительных концентрациях эмпирически установлено, что эквивалентная проводимость линейно зависит от квадратного корня из концентрации С (второй закон Кольрауша)

%=入厂k氏(5-17)

где % - предельное значение эквивалентной проводимости, х - константа.

Величины предельных эквивалентных проводимостей определены для многих ионов и достаточно широко представлены в многочисленных справочниках. Величины этого параметра для некоторых одновалентных ионов приведены в табл. 18* Для слабых электролитов величина эквивалентной проводимости зависит от степени диссоциации:

а = —t(5-18)

где а - степень диссоциации электролита, как обычно равная отношению концентрации диссоциировавших молекул к общей концентрации электролита в растворе*

+i+a++b+s+H L N к R с+i+a++b+s+H L N к R с4 8 0 3 7 73 3 5 7 7 74 8 0 3 7 73 3 5 7 7 7^pamr N^pamr NnhJ73.6N(CH3)；44,9n(c,h5｝；32,7nhJ73.6N(CH3)；44,9n(c,h5｝；32,7НСОзНСОзCHjCOO-CHjCOO-19&655,476478Л76*871,544,54&919&655,476478Л76*871,544,54&9

+i+a++b+s+

H L N к R с

+i+a++b+s+

H L N к R с

4 8 0 3 7 7

3 3 5 7 7 7

4 8 0 3 7 7

3 3 5 7 7 7

^pamr N

^pamr N

nhJ

73.6

N(CH3)；

44,9

n(c,h5｝；

32,7

nhJ

73.6

N(CH3)；

44,9

n(c,h5｝；

32,7

НСОз

НСОз

CHjCOO-

CHjCOO-

19&6

55,4

764

78Л

76*8

71,5

44,5

4&9

19&6

55,4

764

78Л

76*8

71,5

44,5

4&9

Для более точного учета всех факторов, определяющих ионную проводимость (в частности электростатическое взаимодействие разнозарядных ионов в растворе) используют эмпириче- ский коэффициент проводимости/^.:

а =竺力 (5-19)

Связь эквивалентной ионной проводимости с константой диссоциации и концентрацией электролита в растворе описывается законом Оствальда:

风一儿)九

или согласно уравнению (5-17)

К^^--4С(5-21)

К九

Если не принимать во внимание ионные взаимодействия (т+е* рассматривать условия бесконечного разбавления), то в гомогенном электрическом поле на заряженную частицу действует электродин ами ч еская сила Fj

叱=乙・气E(5-22)

где Z( - заряд частицы;已口 - заряд электрона (1,602 1О19 Кл); Е - напряженность электрического поля (豆/皿).

В вязкой среде при уста но вившейся скорости движения частицы электродинамическая сила уравновешивается действием тормозящей силы /у:

号二忆中Н，(5-23)

где к - константа, т] - ньютоновская вязкость среды, а 匕° - скорость движения частицы.

Согласно закону Стокса, для частиц сферической формы

& = бгс •匚(5-24)

откуда скорость движения частицы, т*е. скорость ее электрофоретической миграции, равна

V^ = ^-E = ^-E(5-25)

Коэффициент гтропорциональности в этом уравнении носит название абсолютной или предельной электрофоретической подвижности* Эта величина по своему физическому смыслу представляет собой скорость перемещения данной заряженной частицы при бесконечно малой концентрации и единичной напряженности электрического поля. При этом, скорость миграции и электрофоретическая подвижность могут иметь положительное или отрицательное значение по отношению к ориентации электрического поля в зависимости от знака заряда частицы Z* Таким образом, абсолютная электрофоретическая подвижность является векторной величиной и 氏 представляет собой характеристическую константу для данной частицы (иона) при постоянной температуре* Эта величина пропорциональна эквивалентной проводимости при бесконечном разбавлении.

Для бинарного электролита эквивалентная проводимость при бесконечном разбавлении 从,равна сумме эквивалентных проводимостей и пропорциональна сумме абсолютных электрофоретических подвижностей (взятых по их абсолютной величине) слагающих ионов, причем коэффициент пропорциональности равен константе Фарадея (F = 96500 Кл/моль).

В реальных условиях электрофорез осуществляется при конечных концентрациях электролита в растворе и в присутствии других ионов, активно взаимодействующих с ионами разделяемых соединений. Эти обстоятельства активно влияют на наблюдаемые экспериментально электрофоретические подвижности ионов. Такт например, фактически действующий заряд ионов слабых электролитов оказывается меньше расчетного теоретического значения вследствие неполной диссоциации* Кроме того, каждый

ион в растворе электролита окружен противоионами, несущими электрические заряды противоположного знака. Эти противоионы, образующие так называемую ионную атмосферу，в некоторой степени замедляют движение иона в электрическом поле. Согласно теории Дебая, Хюккеля и Онзазера такое замедление является следствием проявления силы электрофоретического замедления и релаксационного эффекта, связанных с тем, что движение заряженной частицы в электрическом поле вызывает деформацию окружающего поля противоионов (ионной атмосферы), так что плотность зарядов впереди движущегося иона оказьь вается всегда несколько меньшей, чем позади его* Эта деформация возникает и уничтожается действием сил кулоновского взаимодействия, однако вызывая некоторый тормозящий эффект по отношению к электрофоретической миграции данного иона. Такие межионные взаимодействия оказываются тем более интенсивными, чем выше концентрация применяемого электролита.

Входящий в уравнение (5-25) гидродинамический или сто- ксовский радиус иона г( представляет собой радиус сольватированного или б водных растворах гидратированного иона. Эта величина заметно отличается от значений кристаллографического радиуса, получаемых из данных рентгеноструктурного анализа. Учет влияния ионной силы и атмосферы противоионов делает необходимым использование еще больших величин - эффективных ионных радиусов R. С другой стороны, влияние ионной атмосферы может быть уточнено путем замены теоретического заряда иона 马€ значением его эффективной величины, 0«小 которая, конечно, всегда будет меньше теоретической величины* В результате эффективная электрофоретическая подвижность иона будет выражаться следующим уравнением:

3名 ⑶26)

ОТО]/?

Понятно, что полученная величина 卩『всегда будет меньше предельного значения абсолютной электрофоретической под- вижности. С другой стороны, в большинстве случаев ионы, несущие одинаковый электрический заряд, отличаются друг от друга как по величине эффективного заряда, связанного с окружающей ионной атмосферой, так и по величине эффективного радиуса, связанного с плотностью зарядов иона. Теория и практика электрофоретических методов анализа показывает, что эти различия достаточно специфичны для очень близких по химической структуре и строению ионов, что обеспечивает возможность их электрофоретического разделе няя^ включая изомерные и изо-

то иные соединения с минимальными различиями их физических и химических свойств.

В тех случаях, когда подлежащее электрофоретическому анализу вещество существует в растворе в нескольких формах, находящихся в динамическом равновесии друг с другом и имеющих различные абсолютные подвижности, эффективная подвижность 江」этого соединения может быть выражена следующим образом:

①=e斗屮"(5-27)

J=l

где 看-мольная доля каждой из присутствующих в растворе форм данного вещества. Это соотношение применимо в случае многоосновных кислот, многоатомных аминов, а также в случае соединений имеющих таутомерные формы*

На практике величины эффективных подвижностей отдельных ионов обычно определяют из зарегистрированных электроферограмм следующим образом.

При наличии в анализируемой смеси компонентов, образующих ионы с положительным и отрицательным знаком заряда, типичная электроферограмма может иметь вид, такой как на рис* 79.

Электрически нейтральное соединение (бензиловый спирт, пик 2) движется со скоростью электроосмотического потока (ЭОП)+ Катионное соединение - хлорид бензилтриметиламмония движется в электрическом поле быстрее электроосмотического потока и образует пик /, Карбоксил ат- ион ы 3-5 движутся в противоположную сторону, но со скоростями» меньшими скорости электроосмотического потока, и поэтому образуют пики 3-5, регистрируемые позже маркера ЭОП- Каждый из зарегистрированных компонентов может бь1ть ох арактери зов а н своим временем миграции г『Деление эффективной длины капилляра L口 от его входа до детектора на время мн- гр^ции компонента дает полную скорость миграции. Если из этой величины вычесть скорость электроосмотического потока, то можно получить скорость электрофоретической миграции 廿汕喲.Понятно, что скорость электроосмотического потока % можно рассчитать по времени регистрации нейтрального маркера (пик 2 на рис, 79).

Таким образом

Ц = ^^полн) _ рео = ~= Ld I.(5.28)

Е *ео14 県丿

Понятно, что при 厶 > feo величины q будут иметь отрицательные значения, что указывает на направление миграции соответствующих ионов по отношению к направлению электроосмоти-

44Рис, 79* Типичная электроферограмма смеси веществ образующих ионы с разным знаком заряда:/ — бе нзилтриметил аммоний хлорид; 2 - бензиловый спирт; 3 亠 ацетилатса- лицилат; 4 - 4*октнлбензоат; 5 - бензоат.Условия: прибор Бекман Р/ФСУ 2000 (фирма "Е^км&н'% кварцевый капилляр размером 50 см х 7 5 мкм, напряженность поля 263 В/《м, температура 25℃ уФ-детектнрование при длине волны 200 км, электролит-фосфатный буфер с концентрацией 50 ммоль/л* pH 7Д Ввод пробы гидродинамическим способом (см, ниже) в течение 1 с [8]Рис, 79* Типичная электроферограмма смеси веществ образующих ионы с разным знаком заряда:/ — бе нзилтриметил аммоний хлорид; 2 - бензиловый спирт; 3 亠 ацетилатса- лицилат; 4 - 4*октнлбензоат; 5 - бензоат.Условия: прибор Бекман Р/ФСУ 2000 (фирма "Е^км&н'% кварцевый капилляр размером 50 см х 7 5 мкм, напряженность поля 263 В/《м, температура 25℃ уФ-детектнрование при длине волны 200 км, электролит-фосфатный буфер с концентрацией 50 ммоль/л* pH 7Д Ввод пробы гидродинамическим способом (см, ниже) в течение 1 с [8]

4

4

Рис, 79* Типичная электроферограмма смеси веществ образующих ионы с разным знаком заряда:

/ — бе нзилтриметил аммоний хлорид; 2 - бензиловый спирт; 3 亠 ацетилатса- лицилат; 4 - 4*октнлбензоат; 5 - бензоат.

Условия: прибор Бекман Р/ФСУ 2000 (фирма "Е^км&н'% кварцевый капилляр размером 50 см х 7 5 мкм, напряженность поля 263 В/《м, температура 25℃ уФ-детектнрование при длине волны 200 км, электролит-фосфатный буфер с концентрацией 50 ммоль/л* pH 7Д Ввод пробы гидродинамическим способом (см, ниже) в течение 1 с [8]

Рис, 79* Типичная электроферограмма смеси веществ образующих ионы с разным знаком заряда:

/ — бе нзилтриметил аммоний хлорид; 2 - бензиловый спирт; 3 亠 ацетилатса- лицилат; 4 - 4*октнлбензоат; 5 - бензоат.

Условия: прибор Бекман Р/ФСУ 2000 (фирма "Е^км&н'% кварцевый капилляр размером 50 см х 7 5 мкм, напряженность поля 263 В/《м, температура 25℃ уФ-детектнрование при длине волны 200 км, электролит-фосфатный буфер с концентрацией 50 ммоль/л* pH 7Д Ввод пробы гидродинамическим способом (см, ниже) в течение 1 с [8]

ческого потока. Из полученных величин легко определить значение электрофоретической подвижности компонента i:

禹禹q =匕•厶E~ Vq =匕•厶E~ V(5-29)(5-29)

禹

禹

q =匕•厶

E~ V

q =匕•厶

E~ V

(5-29)

(5-29)

где LT - полная длина капилляра (расстояние между электродами), V - приложенное напряжение.

В том случае, когда капиллярный электрофорез осуществляется в отсутствие эл е ктроосмотическ о го потока как，например, при электрофорезе в капиллярах, заполненных электропроводящим гелем, уравнение (5-29) принимает вид:

(5-30)

Из изложенного следует, что в капиллярном электрофорезе каждое вещество, способное к ионизации в растворе，имеет специфическую, только ему присущую скорость миграции. Именно это обстоятельство является первым условием, определяющим возможность разделения различающихся по строению и свойствам соединений даже при очень малых различиях этих свойств.

ЭФФЕКТИВНОСТЬ РАЗДЕЛЕНИЯВ КАПИЛЛЯРНОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗЕ

Как и в хроматографии, эффективность электрофорети че - ского процесса может быть оценена числом теоретических таре- лок, рассчиты ваемым из величин времени миграции и ширины электрофоретических пиков, зарегистрированных, как и в хроматографии, в форме, близкой к кривым Гаусса. Правомерность такой оценки для электромиграционных методов была обоснована Гиддингсом в 1969 г. [3, 21 j.

Основными факторами, вызывающими расширение дискретных зон в капиллярном электрофорезе, являются продольная диффузия вещества из центральной области зоны вперед и назад по направлению ее движения, начальная ширина зоны вводимой в капилляр пробы, и термические эффекты, связанные с выделением джоулева тепла при протекании электрического тока через заполненный электролитом капилляр. Ниже зтн эффекты будут рассмотрены более подробно. В капиллярном зонном электрофорезе, в отличие от хроматографии в тонких капиллярах, практически незначимы эффекты расширения хроматографических зон вследствие параболического распределения скоростей по сечению капиллярной трубки и вследствие конечной скорости массообмена и установления сорбционного равновесия. Однако два последних фактора могут оказьл- вать серьезное влияние в некоторых вариантах элсктрокинети- ческой хроматографии, когда разделение веществ осуществляется не только за счет разной скорости миграции анализируемых компонентов в электрическом пиле, но и вследствие разли* чий в интенсивности их взаимодействия с неподвижной фазой, т启，со стенками капилляра или с заполняющей его ^едой. Процесс расширения дискретной зоны вещества в капилляре может быть описан уравнением Эйнштейна:

02=2" (5-31)

где о2 - пространственная дисперсия хроматографической зоны, ^ - коэффициент диффузии вещества в электролите, г - время миграции.

(5・32)(5・32)Так как высота, эквивалентная теоретической тарелке, Н равна О?/Х, где X - длина пути движения хроматографической зоны, то

(5・32)

(5・32)

где v I скорость движения зоны, равная цЕ, Отсюда:

Н =Н =2D证'2D证'(5-33)(5-33)

Н =

Н =

2D

证'

2D

证'

(5-33)

(5-33)

Тогда число теоретических тарелок можно выразить как

也=W=江.(5.34)

Н 2D

Для всей длины разделительного капилляра можно заменить

£ =£ =УУ(5-35)(5-35)

£ =

£ =

У

У

(5-35)

(5-35)

что дает после подстановки

л=*^.(5-36)

2办

Учитывая наличие электроосмотического потока, обеспечивающего общую скорость миграции ц = ц； + gp/, получим

"=(5-37) 2D '

Это простое рассмотрение, выполненное в работе [2], приводит к выводу о том, что в капиллярном электрофорезе число теоретических тарелок не зависит от длины применяемого капилляра и прямо связано с используемым напряжением. Однако это заключение не вполне корректно, т.к. при данном напряжении на электродах t> скорость электроосмотического потока 飓/ будет зависеть как от полной, так и от эффективной длины применяемого капилляра. Достигаемая степень разделения двух близких пиков в капиллярном электрофорезе, так и в хроматографии, определяется как отношение расстояние между максимумами пиков к их средней ширине:

/? = -=——?——^-，(5-38)

a v +а

в предположении, что % > %*

Расстояние между максимумами пиков АХ пропорционально разнице скоростей миграции (卄之 > 山)，так что

丝=竺 и ДХ = Х.е.(5-39)

(5-40)(5-40)Тогда степень разделения можно выразить следующим образом:

(5-40)

(5-40)

Учитывая, что

а2Н Н а2Н Н л =—, Нл =—, Н(5-41)(5-41)

а2

Н Н

а2

Н Н

л =—, Н

л =—, Н

(5-41)

(5-41)

можно выразить зависимость достигаемой степени разделения от числа теоретических тарелок, характеризующего данный процесс:

4爲，4爲，(5-42)(5-42)

4爲，

4爲，

(5-42)

(5-42)

Гогда соотношение -=- будет равно:

2АУ =2(%-山)匕+ 4一3+n2)•2АУ =2(%-山)匕+ 4一3+n2)•(5-43)(5-43)

2АУ =2(%-山)匕+ 4一3+n2)•

2АУ =2(%-山)匕+ 4一3+n2)•

(5-43)

(5-43)

При наличии электроосмотического потока уравнение (14*43) принимает форму:

2AV _ (%-内)К-?»，2AV _ (%-内)К-?»，(5-44)(5-44)

2AV _ (%-内)

К-?»，

2AV _ (%-内)

К-?»，

(5-44)

(5-44)

Подставляя уравнение (5-40) и (5-41) в уравнение (5*42), можно получить выражение:

,V

n2 一山

(5-45)

4 Y

2D

号+ %

или после преобразований

R=｝（n「卩1），R=｝（n「卩1），

R=｝（n「卩1），

R=｝（n「卩1），

Рис. 80* Зависимости достигаемой в капиллярном электрофорезе степени разделения двух компонентов от разницы в их электрофоретической подвижности, рассчитанные по уравне* нию (5-45). Числа у кривых показывают величину осмотической подвижности. Электрофоретическая подвижность первого компонента принята равной 5 ' 10-5 см^В-^'

Из этого Быражения следует, что достигаемое разделение двух близких пиков в капиллярном электрофорезе, с одной стороны, увеличивается при увеличении разницы в величинах электрофоретической подвижности двух веществ и с ростом приложенного напряжения, а, с другой стороны, уменьшается с возрастанием электроосмотического потока. Можно показать, что максимальная степень разделения будет достигнута при равенстве:

%产口-^4" (5-47)

Результаты расчетов величин достигаемой степени разделения по уравнению (5-46) представлены на рис. 80 [8]. При этих расчетах пред по л а га л ось^ что электрофоретическая подвижность одного нз компонентов постоянна и равна 5 х 10-5 см2/В，с, а подвижность второго компонента варьирует в пределах 30% от этой величины. Расчеты проводились для капилляра длиной 50 см при приложенном напряжении 300 В/см. Коэффициенты диффузии D были приняты равными 10-5 см^/с.

Полученные графики показывают, что наилучшее разделение достигается при движении электроосмотического потока в противопо л ожном направлении по отношению к разделяемым веществам*

Из формулы (5-46) видно, что величины R не определены для случаев, когда ц^ <|-Ц|.

Как и в хроматографии, в капиллярном электрофорезе используют величину коэффициента разделения а выражаемого как отношение времен миграции двух компонентов:

а =『2〃], (5-48)

причем 弓 当，так что всегда a >L

В отличие от хроматографии в капиллярном электрофорезе отсутствуют поправки на мертвое время, так что 为 и 力一это значения полного времени миграции от момента приложения электрического поля, до момента регистрации максимума пика детектора.

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕНА ДОСТИГАЕМОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ

ДИФФУЗИЯ

Наличие узких зон разделяемых соединений в капиллярном электрофорезе неизбежно приводит к диффузии вещества из области более высокой концентрации в центральной части зоны вперед и назад по ходу ее движения, где концентрация вещества меньше* Как уже было указано выше, вклад диффузии в общую дисперсию зоны можно описать как о2 = 2£＞厶 где £ - время миграции, D - коэффициент диффузии. Согласно закону Фика

О = Г-,(5・49)

где к - постоянная Больцмана*

Коэффициент диффузии пропорционален температуре и зависит от вязкости среды и гидравлического радиуса мигрирующей частицы. Понятно, что эта последняя величина будет зависеть от величины молекулы, т.е* от молекулярной массы вещества. Эту зави- симость иллюстрирует табл. 19 [22] Из этой таблицы видно, с одной стороны, что коэффициент диффузии веществ уменьшается с ростом молекулярной массы, а с другой стороны, что это уменьшение относительно медленное. Так, при переходе от этанола к вирусу табачной мозаики увеличение молекулярной массы в миллион раз ведет к уменьшению коэффициента диффузии всего лишь в -200 раз. Тем не менее, в капиллярном электрофорезе расширение зон вследствие продольной диффузии менее выражено для веществ с высокой молекулярной массой, что делает этот метод особенно пригодным для разделения и анализа именно таких компонентов.

Коэффициент диффузии любого соединения легко определить с помощью капиллярного электрофореза методом ^остановленного потока”. При этом, определив б отдельном опыте время миграции вещества через применяемый капилляр，в другом опыте осуществляют электрофорез, в процессе которого вы-

Таблица 19

Молекулярные массы и коэффициенты диффузии некоторых веществ при 20 или 25йС

Вещество

Молекулярная масса, а+е+м+

Коэффициент диффузии. 105 ем%

Na+

23

1*25

Этанол

46

1隅

В^лин

117,2

0t74

Триптофан

204Р2

0®

Глюкоза

180

0,56

Сахароза

342

0t42

Цитохром С

13370

OJI

Альбумин плазмы крови человека

68000

0,069

Фибриноген человеку

339700

0Q19

Вирус табачной мозаики

40590000

0,0046

ключают электрическое поле на период времени, достаточный для заметного расширения зоны под действием продольной диффузии. Это время может изменяться от нескольких минут до нескольких часов. После этого вновь включают электрическое поле и регистрируют профиль зоны данного вещества с помощью детектирующей системы* Различие ширины зон, наблюдаемых без прерывания процесса и с таким перерывом, позволяет оценить скорость продольной диффузии*

Далее, из наблюдаемых величин дисперсии пика можно вьь числить коэффициент диффузии по формуле

Р = <^/2л (5-50)

Строго ламинарный характер течения жидкости в узких кн・ пиллярах исключает наличие вихревой диффузии, С другой сто- рони, плоский профиль скоростей по течению капилляра, характерный для капиллярного электрофореза, практически полностью исключает вклад в диффузионное размывание электрофо' ретической зоны, связанный с параболическим профилем скоро^ стей, характерным для пуазейлевскаго течения подвижной фазы, как это имеет место в хроматографии.

В капиллярном электрофорезе в большинстве случаев стремятся свести к минимуму адсорбционные взаимодействия разделяемых веществ со стенками капилляра, что позволяет свести к минимуму размывание зоны, связанное с сопротивлением массообмену.

Таким образом, продольная молекулярная диффузия, оказывается, по-существу, единственным диффузионным процессом, вызывающим размывание дискретных зон веществ в капиллярном электрофорезе*

АДСОРБЦИЯ

Адсорбцион н ое вз аи модействие анализ ируе м ы х соединений со стенками применяемых капилляров в большинстве случаев вызывает дополнительное расширение пиков. Потому, в большинстве вариантов капиллярного электрофореза стремятся по-возможности уменьшить такие взаимодействия, хотя полностью их устранить обычно не удается. Из опыта жидкостной хроматографии известно, что поверхность кварцевого капилляра обладает достаточно высокой адсорбционной способностью, особенно по отношению к высокомолекулярным полярным соединениям типа белков и полипептидов. Вследствие нелинейности изотерм адсорбции наличие таких явлений неизбежно приводит к искажению формы пиков, снижению эффективности разделения и к существенным нарушениям результатов количественных определений. Значительная необратимая адсорбция может приводить к невозможности регистрации определяемого компонента детектором, С другой стороны, в ряде вариантов электро кинетической хроматографии адсорбционные явления с успехом используются для разделения достаточно сложных смесей определяемых компонентов.

В литературе описаны многочисленные приемы для подавле* ния или, по крайней мере, существенного снижения адсорбции веществ на стенках стеклянных и кварцевых капилляров. Простейшим из этих способов является подбор буферного раствора с такой величиной pH, при которой анализируемое вещество и стенки кварцевого капилляра имеют одинаковый знак электрического заряда. В этом случае адсорбционные взаимодействия активно подавляются кулоновским отталкиванием* Так, например, при электрофоретическом разделении белков устанавливают pH буферного раствора выше их изоэлектрической точки, так что и анализируемые вещества и стенки капилляра несут отрицательные заряды [23]*

С другой стороны, при низких значениях pH буферных растворов подавляется диссоциация кислотных силанольных групп на поверхности кварцевых капилляров, что также существенно уменьшает адсорбционные взаимодействия [24]. Для уменьшения адсорбционных явлений широко используется также динамическое покрытие капилляров за счет различных добавок, вводимых в применяемые буферные растворы* Так, например, показано, что сульфат калия в концентрациях до 0,25 М превосходит другие галогениды щелочных металлов в отношении подавления адсорбционных явлений и, в то же время, не мешает работе УФ-детекто- ров [25]. Для этой цели использовали высококонцентрированные

фосфатные буферные растворы (до 0$5 М) в комбинации с кварцевыми капиллярами малого диаметра (25 мкм)* Описано применение для подавления адсорбции цвиттер-ионов, таких как, например, гидросульфонат триметиламмония или бетаин, которые, не изменяя существенно электропроводность переносящих электролитов, энергично взаимодействуют с активными абсорбционными центрами на поверхности кварца [26]. Для этой же цели могут быть использованы диамины, например^ такие как 1,3-диамино- пропан, 1,4-диаминобутан и 1,5-диаминопентан. Кроме того, активно подавляют адсорбционные взаимодействия также и морфолин. катионные и неионные поверхностно-активные вещества (например, цетилтриэтиламмоний бромид или неионные поверхностно-активные вещества типа Твина различных марок).

Более сложные способы подавления адсорбционных явлений включают формирование пленки полимеров различной природы на внутренней поверхности кварцевых капилляров [27]. Для этой цели применяют бифункциональные соединения различной природы, которые одной из своих функциональных групп химически связываются с поверхностью кварца, в то время как вторая группа вступает в процесс полимеризации, ведущий к образованию иммобилизованной полимерной пленки*

К числу таких бифункциональных соединений относятся, например, у-метакрилоксипропилтриметилсилоксан или ви- нилтрихлорсилан. Метил силоксановые группы или хлорные заместители реагируют с силанольными группами на поверхности кварца» а метакрилатные или винильные группы вступают в полимеризационный процесс с такими мономерами как ви- нилпирролидон и др+ с образованием полимерной пленки» прочно экранирующей адсорбционные центры на поверхности кварца. Описаны также способы ковалентного связывания белков с поверхностью кварцевых капилляров с применением таких связывающих агентов как 3-аминопропилтриэтокси силан и глутаровый диальдегид [28].

Вклад адсорбции в общее расширение зоны может быть оценен по графику зависимости ВЭТТ (o2/L) от обратной величины напряженности электрического поля 1/Е [29]* В отсутствие адсорбции такой график представляет собой прямую линию, соответствующую уравнению

НЗ +也丄,12% 卩,eНЗ +也丄,12% 卩,e(5-51)(5-51)

НЗ +也丄,

12% 卩,e

НЗ +也丄,

12% 卩,e

(5-51)

(5-51)

где А/ - начальная ширина хроматографической зоны* Линейный характер этого графика указывает на практически полное

отсутствие адсорбционных явлений, тогда как его искривление показывает заметное влияние адсорбции*

Прямые измерения адсорбции в капилляре могут быть выполнены следующим простым способом: пробу вводят б тот конец капилляра» где расположен детектор и накладывают электрическое поле, обеспечивающее движение электрофоретической зоны к противоположному концу капилляра. При этом детектор регистрирует начальную ширину и общую площадь полосы. В момент времени, когда эта полоса прошла 2/3-3/4 полной длины капилляра, полярность электрического поля меняют на ：противоположную. Зона вещества начинает продвигаться к дете^ ктору, который второй раз регистрирует соответствующий элек^ трофоретический пик. Наличие искажений его формы и увеличение его ширины по равнению с начальными параметрами указывает на влияние адсорбционных явлений, а сопоставление площадей двух зарегистрированных пиков позволяет выявить наличие необратимой сорбции вещества,

ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКАЯ ДИСПЕРСИЯ

В капиллярном электрофорезе обычно анализируемую пробу вводят в капилляр, заполненный фоновым переносящим электролитом. При этом в капилляре формируются три четко разграниченные зоны с различным распред еле ние м концентраций: зона, заполненная пробой, зона, заполненная фоновым электролитом впереди пробы и замыкающая зона фонового электролита. Первая нз этих зон имеет две четкие границы - передний фронт и замыкающая граница. Фоновый электролит содержит коионы В+ с тем же зарядом, как и у определяемого компонента анализируемой пробы и противоионы О', а проба содержит ионы определяемого компонента S+ и те же противоионы.

При наложении электрического поля компоненты анализируемой пробы начинают двигаться в капилляре, сохраняя при этом конфигурацию компактных зон. В том случае, если элект- рофоретиче ска я подвижность ионов пробы S* меньше, чем подвижность коионов В+, т.е* u$ V Nr，электрическая проводимость зоны пробы будет меньше, чем проводимость зоны фонового электролита. Соответственно, в зоне пробы будет выше напряженность электрического поля. При этом скорость миграции ионов S+, проникающих в зону фонового электролита через переднюю границу зоны пробы (те опережающих эту зону), будет уменьшена, и зона пробы в своем движении нагонит эти ионы. Это означает, что передний фронт пробы будет оставаться достаточно резким во все время миграции. Напротив, ионы S+, вышед-

шие за заднюю границу зоны пробы в замыкающую зону фонового электролита, будут двигаться с меньшей скоростью, чем зона пробы, н* следовательно, будут все более и более отставать от нее. Это приведет к размыванию заднего фронта и к формированию асимметричного пика на электроферограмме.

Обратная ситуация будет иметь место, если электрофоретическая подвижность определяемого компонента пробы ц£ превышает подвижность коиона 卩日,т*е.卩$ > цв,

В этом случае электрическая проводимость в зоне пробы будет выше, чем в зоне фонового электролита, и, следовательно, напряженность поля в ней будет ниже. Тогда скорость миграции ионов S+, диффундирующих через передний фронт зоны пробы, будет увеличиваться. Эти ионы будут все более и более опере* жать зону пробы, что, естественно приведет к размыванию ее пе- реднего фронта,

В то же время, ионы S+, диффундирующие через заднюю границу зоны пробы, будут ускоряться более сильным полем в замыкающей зоне фонового электролита, и вследствие этого будут нагонять зону пробы. Вследствие этого задний фронт зоны будет оставаться достаточно резким*

Только при равенстве электрофоретических подвижностей Ns = "в напряженность электрического поля будет одинаковой в зоне пробы и зоне фонового электролита, и зона пробы будет оставаться симметричной, расширяясь с одновременным снижением максимальной концентрации ее компонентов под действием только диффузионных факторов.

Нарушение симметрии зоны пробы с ее одновременным расширением в процессе миграции по капилляру носит название электрофоретической дисперсии^

Показано, что эффекты расширения зоны пробы под влиянием диффузии и электрофоретической дисперсии близки по порядку величины, если

D = 0,l / (5-52)

где Cs и Св - концентрации ионов пробы и коиона фонового электролита, / - начальная длина зоны пробы в капилляре и 口§ ■ скорость ее миграции (см/сек).

Приняв типичные значения D = 10~5 см2/сек, us = 1 мм/сек и / = 1 мм, можно рассчитать, что диффузионное и электромигра- ционное расширение зоны примерно одинаковы при CS/CB »1О2. Если отношение CS/CB выше этой величины, т*е* при более высокой концентрации компонентов пробы, электрофоретическая

дисперсия становится пре обл а да ю щим фактором, определяющим расширение электрофоретической зоны и нарушение симметричности ее концентрационного профиля.

В приведенном анализе электрофоретической дисперсии предполагалось, что противоионы во вводимой пробе имеют одинаковые подвижности* На практике это соблюдается далеко не всегда, и подвижности коионов пробы и фонового электролита могут различаться весьма значительно* Однако установлено, что в том случае, когда CS/CB< 10~2, подвижность и концентрация противоионов не оказывают заметного влияния на достигаемое разделение.

Более детальное рассмотрение электрофоретической дисперсии проведено в работах [29—32].

ВЛИЯНИЕ НАЧАЛЬНОЙ ШИРИНЫЗОНЫ ВВОДИМОЙ ПРОБЫ

В том случае, когда раствор анализируемой пробы вводится в капилляр в форме четко ограниченной зоны с прямоугольным распределением концентраций, дисперсия распределения может быть рассчитана по уравнению:

as =》 (5-53)

где Z - начальная ширина зоны (см).

При движении по капилляру распределение концентраций пробы постепенно приобретает форму гауссовой функции под действием диффузии* В типичных случаях, при использовании капилляров диаметром 75 мкм, обычно длина зоны вводимой пробы составляет 1-2 мм.

Показано [33], что вклад диффузии в расширение зоны пробы при ее движении по капилляру может быть описан следующим соотношением:

А网= 2"Ёк (5-54)

Можно подсчитать, что при типичных значениях времени мигра- ции порядка 10 мин и обычных величинах коэффициентов диф* фузии диффузионное расширение зоны пробы составит 0,2-22 мм, что вполне сопоставимо с начальной шириной зоны вводимой пробы. В этих условиях достигаемое число теоретических тарелок равно

(5-54)

где 厶口 一 эффективная длина капилляра от его начала до точки детектирования.

Экспериментально установлено, что в отсутствие каких-либо специальных мер начальная ширина зоны пробы составляет всего 1 % от общей дисперсии пиков при времени ввода пробы 0,2 сек и достигает 98% при времени ввода пробы 15 сек [34], Для уменьшения влияния начальной ширины зоны прибегают к приему сжатия начальных зон анализируемых компонентов, которое осуществляется следующим образом.

В разделительный капилляр, заполненный переносящим буферным раствором (/), имеющим электропроводность &, вводят относительно длинную пробку анализируемого раствора, представляющего собой буферный раствор (2) с существенно меньшей концентрацией ионов и, соответственно, с меньшей электропроводностью ". Если первоначально введенная проба занимает часть длины капилляра х, то напряженности электрического поля в отрезках капилляра с пробой и с переносящим буфером могут быть выражены следующим образом:

Е = 77^К' ⑶ 56)

где 7 = —, т,е* отношение удельных проводимостей перенося- щего буфера и раствора пробы, а Ео - первоначальное значение напряжены(кти электрического поля в капилляре (до ввода пробы),

В связи с тем, что по условию эксперимента k} > к^ у> 1, следует, что электрическое поле в секции капилляра, заполненной переносящим буфером, будет ослаблено в 1 /ух+ (1 -х) раз, а поле в секции капилляра* заполненной раствором пробы, будет усилено в [у/ух + (1 - л)] раз*

Можно подсчитать, что, например, в том случае, если удель* ная электропроводность раствора пробы в 100 раз меньше, чем удельная электропроводноеть переносящего буферного раствора, напряженность электрического поля в секции капилляра, заполненной раствором пробы, будет усилена в 9 раз, а в секции капилляра, заполненной переносящим буфером - ослаблена в

11 раз. Если вводимая проба представляет собой низкоконцент- рированньтй водный раствор, то величина у может достигать нескольких сотен.

Вследствие более высокой напряженности поля в секции капилляра, занятой раствором пробы, ионы анализируемых веществ движутся более быстро по направлению к границе раздела пробы и переносящего буферного раствора* Как только ионы пробы пересекут эту границу, они попадают в зону действия 6о лее слабой напряженности электрического поля. Здесь скорость их движения снижается и происходит электрофоретическое разделение в соответствии с соотношением значений электрофоретической подвижности разделяемых компонентов*

В связи с тем, что поток ионов, пересекающих границу раздела двух растворов» должен оставаться постоянным, а абсолютные скорости миграции ионов пропорциональны напряженности электрического поля, в непосредственной близости от этой границы раздела концентрация ионов пробы будет повышена в у раз. При этом вследствие того, что общее количество ионов оо тается постоянным, ширина зоны, в которой распределены ионы пробы, должна во столько же раз уменьшиться, то есть должно произойти сжатие первоначально введенной пробы* Далее сформировавшиеся узкие зоны будут подвергаться электрофоретическому разделению* В обычных условиях капиллярного электрофореза, когда исходная проба вводится в конец капилляра, соединяемый с анодом, а детектор располагается вблизи его катодного конца, сжатию подвергаются зоны положительно заряженных ионов у передней границы введенной пробы и зоны отрицательных ионов у задней границы [35, 36].

Понятно, что неионные соединения, переносимые по капилляру действием электроосмотического потока, таким образом сжиматься^ и концентрироваться не будут, так что исходная ширина зоны будет вносить существенный вклад в конечную ширину наблюдаемых электрофоретических пиков.

Для того чтобы добиться существенного сжатия зон положительных и отрицательных ионов, подлежащие анализу вещества растворяют в том же буферном растворе» который используется в качестве переносящей средн, однако разбавленном примерно в 10-15 раз* Конечно, пробу можно вводить и в любом другом растворе, однако его электропроводность должна быть в 10-15 раз меньше, чем у переносящего буфера*

Раствор пробы вводят гидродинамическим способом в капилляр через его анодный конец т.& так, чтобы образовать зону, примерно в 10 раз превышающую величину уширения ее под действием диффузии. При наложении электрического поля возника-

ет электроосмотический поток» скорость которого заметно превышает скорость электрофоретической миграции разделяемых ионов в зоне переносящего электролита. Поэтому и положительные и отрицательные ионы после сжатия зон выносятся к катодному концу капилляра и регистрируются детектором*

Следует заметить, что в той зоне капилляра, которая занята раствором пробы с низкой электропроводностью, напряженность электрического поля оказывается существенно выше, чем в остальной части капилляра. Поэтому, покинув зону раствора пробы, сжатые зоны компонентов пробы движутся значительно медленнее, чем в зоне пробы В то же время, именно в этой части капилляра, заполненной переносящим буферным раствором, должно осуществиться их электрофоретическое разделение. Поэтому, когда электропроводимость исходного раствора пробы очень низка (например» в 100 раз ниже электропроводности переносящего буферного раствора), возможна си- туаци% когда моим анализируемой смеси не успеют в достаточной степени разделиться до того момента, когда будут вынесены электроосмотическим потоком к детектирующему устройству. Из этого следует необходимость выбора оптимального соотношения электропроводностей раствора, пробы и переносящего буфера, которое обеспечивало бы интенсивное сжатие зон, с одной стороны, и их достаточное электрофоретическое разделение, с другой стороны [37]*

Для того чтобы увеличить в возможно большей степени размер вводимой в капилляр пробы, прибегают к приему вытеснения буферного раствора пробы из капилляра электроосмотическим потоком после того, как уже произошел процесс сжатия зон ионов, подлежащих разделению [38, 39] Для этого через несколько секунд после ввода пробы и наложения электрического поля меняют полярность электродов на время достаточное для вытеснения 90-95% буфера пробы из капилляра. При этом, конечно, из капилляра будут удалены также и ионы, сконцентрированные у задней границы зоны первоначально введенной пробы*

Так, например, если проба введена гидродинамическим способом в анодный конец капилляра, то при сжатии зон катионы будут продвигаться к переднему фронту зоны пробы, а анионы к заднему фронту* При перемене полярности электрического поля электроосмотический поток будет направлен к аноду, т*и* к тому концу капилляра, через который была введена проба* При этом вначале сконцентрированные у задней границы зоны пробы положительные ионы, а затем и электролит, в котором были рас* творены подлежащие анализу компоненты пробы, будут вынесе^ ны из капилляра. Момент, когда электролит пробы будет почти

полностью вынесен из капилляра определяют, по изменению протекающего через капилляр тока. По мере вытеснения электролита пробы, обладающего низкой электропроводностью ток, протекающий через капилляр, возрастает. Когда его значение достигает 93-95% той величины, которая наблюдалась до ввода пробы, снова меняют полярность, и проводят разделение оставшихся в капилляре отрицательных ионов.

Для того, чтобы аналогичным способом проан ал из ировать смесь положительных ионов, необходимо изменить направление электроосмотического потока, т*е. изменить знак поверхностного заряда стенок капилляра. В случае кварцевых капилляров это можно сделать путем динамического покрытия их катионными поверхностно-активными веществами (например, такими как бромид цетилтриметиламмония или бромид ТТА в концентрации около 1 мМ)* В этом случае при перемене по- лярности электрического тока из капилляра будут удалены вначале отрицательные ионы, а затем большая часть электролита пробы.

Такой прием позволяет увеличить величину анализируемой пробы в несколько сотен раз, заполняя ею до 2/3 длины применяемого капилляра, В общем, максимально возможная при данных условиях длина капилляра, занятая зоной пробы отвечает соотношению электрофоретической подвижности определяемого иона и скорости электроосмотического потока.

Описан ряд модификаций рассмотренного процесса сжатия начальных зон анализируемой пробы. Эти приемы направлены на достижение возможно более полного разделения компонентов наряду со значительным увеличением чувствительности опреде- лення, т*е* снижения предельно детектируемых количеств определяемых компонентов [40, 41]. Так предложено до ввода пробы вводить в капилляр небольшую зону чистой воды или слабо про* водящего электролита [40]. Рекомендуется вводить пробу элект- рокинетическим методом в течение 30 с при напряжении 5 кВ или 5 с при напряжении 30 кВ* Показана возможность применения переносящего электролита с более высокой подвижностью, чем анализируемые ионы* При очень низких концентрациях ионов пробы (порядка IO-9 М) и при концентрациях переносящего электролита порядка 5-20 мМ при этом достигается значительное обогащение пробы и сжатие соответствующих зон по механизму изотахофореза [41], Более детальное описание механизма и технических приемов сжатия проб можно найти в руководствах [6^10].

Важно отметить, что именно возможность значительного сжатия начальных зон ионов пробы при отсутствии свойствен-

ных хроматографии факторов диффузионного расширения зон определяют исключительно высокую разделяющую способность метода капиллярного электрофореза, обеспечившую этому методу широчайшую область применения.

Однако суицеетвует весьма важный фактор, который оказывает крайне отрицательное влияние на процесс электрофоретического разделения. Этот фактор представляет собой джоулево тепло, выделяющееся при прохождении эле ктричес ко го тока через заполненный электролитом капилляр и нагревающее электролит, Роль и значение этого фактора и пути устранения его не- гативного влияния будут рассмотрены в следующем разделе.

ДЖОУЛЕВО ТЕПЛО

Как бсякий проводник, через который протекает электрический ток, капилляр, заполненный токопроводящим электролитом, при наложении электрического поля подвергается нагреву* При этом повышается температура внутри капилляра, что, в свою очередь, вызывает соответствующие изменения вязкости электролита и искажение плоского профиля скорости электроосмотического потока. Как в любом проводнике электрического тока, мощность 屮，выделяющаяся в капилляре при прохождении электрического тока, равна

W = UJ = RJ2=U2/R, (5-58)

где J - сила тока, U - приложенное напряжение, R - электрическое сопротивление проводника.

С другой стороны, тепловая мощность W, выделяющаяся в капилляре на единицу объема при приложении электрического поля, может быть выражена следующим уравнением:

W = E^^^c^y (5-59)

где Е - напряженность поля (В/см), Д - эквивалентная проводи^ мость раствора переносящего электролита (см2/Ом • моль), с - концентрация электролита (моль/л)Ф а ф - параметр пористости среды в капилляре, равный для полого капилляра единице.

При типичных значениях параметров капиллярного электрофореза (Е = 300 В/см; Д = 150 см2/Ом + моль; <? = 50 мМ) можно видеть, что W = 675 Вт/см3. При длине капилляра -60 см и его внутреннем диаметре 75 мкм количество джоулева тепла, выделяющееся б нем, составит 1,7 Вт.

Было установлено» что при выделяемой в капилляре мощности менее 3 Вт абсолютная температура электролита может быть подсчитана по эмпирической формуле:

r=Il,5tV + 298. (5-60)

Пря этом можно полагать, что при величине рассматриваемой в капилляре мощности 0,1 Вт температура электролита повышается на 1Д К при воздушном охлаждении капилляра путем естественной конвекции и на 0,6 К при принудительном воздушном охлаждении. При токе порядка 50 мкА увеличение температуры в капилляре составит около 11 К [8]. Джоулево тепло отводится из центральных зон капилляра через периферийные слои электролита, через стенки капилляра и через окружающую капилляр среду* Разница температур электролита в центре капилляра и у его стенки пропорцион ал ь^ на квадрату его внутреннего диаметра, ^л:

^•416K^•416K(5-61)(5-61)

^•4

16K

^•4

16K

(5-61)

(5-61)

где К - теплопроводность электролита (Вт/см ” °C)* Для воды теплопроводность равна 6 * IF Вт/см ・ ℃* Большинство органических растворителей имеет в несколько раз меньшую те пл опровод ность т например, для метанола К = 1(Н Вт/см • °С> тогда как стекло и кварц> из которых чаще всего изготавливают капилляры, имеют теплопроводность в 1,5-2 раза большую [(1-1,5) 10-2 Вт/см * ℃].

С другой стороны, теплопроводность воздуха равна 2,5 ТСН Вт/см • ℃, т：е. более чем в 20 раз меньше, чем у водного раствора. Именно это и создает наибольшее термическое сопротивление отводу тепла из капилляра. Скорость теплоотвода увеличивается при увеличении скорости воздушного потока, что иллюстрирует рис, 81* Применение жидкостного (водяного) охлаждения капилляра позволяет еще уменьшить различия температуры между центральными и периферийными областями капилляра* Неравномерность температурного поля внутри капилляра приводит к целому ряду нарушений нормального электрофоретического процесса, наиболее важными из которых являются следующие.

Ранее было указано, что величина электроосмотического потока % обратно пропорциональна вязкости жидкости, которая в свою очередь зависит от температуры экспоненциально:

旦

П = О 仃， (5-62)

где С - константа; Ел - энергия активации вязкого течения; R — универсальная газовая постоянная (8,314 Дж/моль ” ℃).

Рис* 81・ Разница температур в центре и у стенки капилляров разных диаметров при естественной и принудительной конвекции воздуха [37]:

? - естественная конвекция; 2-4 - принудительная конвекция при скорости обдува: / -0J м/с; 3 - 1 м/с; 4 - 10 м/с

Отсюда следует, что с ростом температуры вязкость жидкости уменьшается примерно на 2% на 1 градус. Соответственно меняется и скорость электроосмотического потока:

Нв = С 电仃，(5-63)

где С' - константа пропорциональности*

Как следствие^ наличие разницы температур в центральной и периферической областях капилляра приводит к искажениям плоского фронта скоростей электроосмотического * потока, что неизбежно влечет за собой расширение электрофоретических зон, т.в* снижение эффективности разделения* Кроме того, изменения температуры влекут за собой и изме* нения ионной силы и подвижности самих разделяемых ве- ществ^ что также увеличивает электрофоретическую дисперсию. При наличии адсорбционных явлений в капилляре с изменением температуры меняются также коэффициенты распределения между 兩азами и кинетические параметры сорбционных процессов.

Таким образом, наличие значительных неоднородностей температурных полей в капилляре приводит к резкому ухудшению разделяющей способности системы Поэтому одно из главных условий достижения высокой эффективности процесса электрофоретического разделения веществ заключается в обеспечении как можно меньших различий в температурах центральной и периферической зон применяемого капилляра* Допустимыми границами можно считать различия температур, не превышающие 5-7 градусов.

Показано [42]t что вклад термических эффектов в высоту, эквивалентную теоретической тарелке, не превышает 0」от вклада продольной диффузии при условии

^£С>3,3-10, (5-64)

где i/加-внутренний диаметр капилляра (мкм), Е - напряженность электрического поля (В/мм) и С - мольная концентрация электролита в капилляре.

Это условие выполняется при концентрации переносящего электролита 0,01 М и напряженности поля 30-50 В/мм для капилляров диаметром 250-140 мкм, что обычно и считается их верхней границей.

Одновременно выделение джоулева тепла ограничивает и применяемые величины напряженности поля* т.к. при слишком большом напряжении возможен сильный разогрев и даже вскипание переносящего электролита, особенно в тех случаях, когда анализируемую пробу вводят б виде очень сильно разбавленного раствора.

Таким образом, необходимость интенсивного отвода тепла определяет необходимость применения в капиллярном электрофорезе капилляров малого диаметра, что, естественно, ограничивает достигаемую чувствителъность метода и препятствует его применению для препаративного разделения сколько-нибудь значительных количеств веществ. Тем не менее, достигаемые с его помощью аналитические результаты столь многообразны и эффективны, что этот метод уже занял важную позицию средн других аналитических методов, и его значимость будет, несомненно» все более и более возрастать в будущем.

55 КАПИЛЛЯРЫ

деленных фракций. Из плавленого кварца могут быть изготовлены капилляры диаметром от нескольких микрометров до 0,5 мм и более* В капиллярном электрофорезе наиболее часто применяются кварцевые капилляры длиной от 0т5 до 1 м с внутренним диаметром 10-15 0 мкм при внешнем диаметре от 200 до 360 мкм. Наличие внешнего полиимидного покрытия значительно увеличивает прочность кварцевых капилляров, что существенно облегчает работу с ними*

Внутренняя поверхность кварцевого капилляра, заполненное го буферным раствором (переносящим электролитом)s обычно несет группы =SiOH, имеющие слабо кислотный характер. В условиях капиллярного электрофореза это определяет направление электроосмотического потока от анода к катоду* Описаны многочисленные процедуры модификации внутренней поверхности кварцевых и стеклянных капилляров, позволяющие изменить знак поверхностных зарядов на противоположный и таким обра^ зом поменять направление электроосмотического потока* Эти процедуры детально описаны в ряде руководств по капиллярному электрофорезу и во многих оригинальных публикациях [6-10]. Внешнее полиимидное покрытие кварцевых капилляров практически непрозрачно для УФ-излучения, Поэтому для осуществления детектировани я разделенных фракций полиимидное покрытие удаляют на длине 1-3 мм вблизи конца капилляра, ближайшего к катоду* Эту операцию проводят либо механически, соскабливая полиимидное покрытие, либо нагревая небольшой участок капилляра б небольшом газовом пламени. Эта операция также подробно описана в многочисленных руководствах. Некоторые фирмы поставляют специально для капиллярного электрофореза кварцевые капилляры с полимерным покрытием, прозрачным для УФ-излучения [43]. Имеются также сообщения о применении стеклянных капилляров прямоугольного сечения с размерами 20 х 200,30 х 300,50 м 50,50 х 500 и 100х 100 мкм [44], Такие капилляры облегчают применение УФ-детектирования, на оказываются весьма непрочными и требующими очень осторожного обращения. Их преимуществом, помимо легкости УФ- детектирования, является повышенная способность к рассеиванию выделяющегося джоулева тепла, что позволяет работать с повышенными напряженностями поля и с увеличенными объе* мами пробы. Это, со ответственно, позволяет заметно увеличить чувствительность определения, особенно в области малых концентраций анализируемых компонентов.

Рекомендуется использовать отдельные капилляры для работы б узком интервале pH, не превышающем 2 единиц (например, один капилляр - б диапазоне pH 2Т, второй - в диапазоне 4—6 и

тл.)・ Для повышения в осп роизводимости времен миграции рекомендуется следующая последовательность операций:

-промывка 0,1 М раствором гидроксида натрия в течение 5 мин;

+ промывка бидистил лир ова н ной водой в течение 2 мин;

-промывка переносящим буферным раствором в течение 10 мин.

Хранить подготовленные капилляры предпочтительно в сухом виде,

В ряде случаев оказывается необходимой модификация внутренней поверхности кварцевых и стеклянных капилляров путем нанесения на нее различных покрытий* Чаще всего целью такой модификации оказывается уменьшение интенсивности взаимодействия разделяемых веществ с силанольными группами на по* верхности кварца. В других случаях, напротив, покрытие выполняет функцию хроматографической неподвижной фазы, поэтому разделение происходит в основном за счет различий в характере сорбционных взаимодействий разделяемых веществ и нанесенной неподвижной фазы. Такие процессы, обычно относимые к электрокинетической хроматографии, кратко рассмотрены в следующем разделе.

Модификация поверхности кварцевых и стеклянных ка* пилляров может быть проведена динамическим способом. Для этой цели к переносящему буферному раствору добавляют соответствующий модификатор (поверхностно-активные вещества, цвиттер-ионные соединения или гидрофильные полимеры), активно адсорбирующийся на поверхности капилляра. Этот способ модификации отличается простотой выполнения, однако далеко не всегда позволяет получить в оспроизв о дим ы е результаты*

Более надежной оказывается модификация путем химической привязки модификатора к силанольным группам на поверхности стекла или кварца. Химическая пришивка модифицирующих агентов может быть осуществлена с применением полиакриламидного геля [45-47]t диметилоктадецилхлорсилана [48], эпоксидного полимера (49], полиэтиленимина [50], полиэтиленгликоля [51, 52]. Описаны способы модификации поверхности калил- ляров путем обработки их водными растворами протеинов (58) и углеводов [59] >

Как правило, модификация поверхности капилляров приводит к уменьшению электроосмотического потока, а в ряде случа- ев и к его обращению. Это создает весьма широкие возможности для варьирования условий капиллярного электрофореза применительно к решаемой аналитической задаче*

Для удобства размещения в приборах для электрофореза кварцевые и тонкие стеклянные капилляры часто сворачивают в кольцо или спиральную бухту. Эта операция может приводить к существенному снижению эффективности разделения* Так, по данным работы [60], эффективность заполненных гелем капилляров диаметром 75 мкм, равная для прямого капилляра 107 т.т/м, при свертывании в спираль снижалась б три раза, тогда как эффективность полого капилляра того же диаметра (2 * 106 т.т/м) при свертывании в спираль заметно не менялась

Совокупность имеющихся в настоящее время данных позволяет предположить, что в будущем значение фторопластовых и стеклянных капилляров может существенно возрасти.

МЕТОДЫ ЭЛЕКТРОХРОМАТОГРАФИИ

В ряде вариантов метода капиллярного электрофореза для разделения веществ используют межмолекулярные взаимодействия, аналогичные применяемым в хроматографической технике (адсорбция, абсорбция, гель-фильтрация в капиллярах малого диаметра). При этом сорбционный материал (неподвижная фаза) может быть закреплен на стенках капилляра, либо может заполнять весь его объем, или присутствовать в переносящем электролите в форме достаточно крупных молекулярных образований (мицелл или агрегатов полимерных молекул).

Важным преимуществом методов электрохроматографии является возможность разделения неионных соединений, как и в высокоэффективной жидкостной хроматографии* При этом в полной мере используются такие преимущества метода капиллярного электрофореза, как плоский фронт скоростей подвижной фазы, простота применяемой аппаратуры, малый расход подвижной фазы и очень высокая эффективность достигаемого разделения.

ЭЛЕКТРОХРОМАТОГРАФИЯ

Этот процесс в значительной степени аналогичен высокоэффективной хроматографии, рассмотренной в гл. 2, с тем отличием, что движение подвижной фазы осуществляется под действием электроосмоса, а не благодаря работе жидкостного насоса. Вследствие выделения джоулева тепла диаметр хроматографического капилляра в этом методе ограничен величиной -200 мкм. Разделение может осуществляться благодаря адсорбции на стенках капил-

Рми 82* Разделение ароматических соединений методом обращенно^фа- зовой электрохроматографии на кварцевой колонке размером 285 мм х 50 мкм* заполненной адсорбентом Гиперсил ODS с размером зерна 3 мкм

Электрокинетический ввод пробы (2,5 кв, 5 с), напряжение 45 кВ. ток 2 мкА. Подвижная фаза смесь 0,002 М раствора Na2B4O7 и ацетонитрила (1:4, pH 8,7*『- тиомочевина; 2 - бензиловый спирт; 3 - бензальдегид; 4 - бензол; 5 亠 1,2-дихлорбензол; 6- 1 Т2ъ3-трихлорбензол; 7- 1,23,4-тетрахлорбензол; 8 - пентахлорбензол; 9 - гексахлорбензол

ляра, активированных путем соответствующей химической обра* ботки, либо вследствии сорбции на заполняющем капилляр подходящем сорбционном материале. В опубл и ков анны х до настоящего времени работах по электрохроматографии для этой цели в основном используется силикагель с частицами размером 1-1,5 мкм и менее [61]* При этом интересно отаетить, что даже силикагель с химически привитыми октадецильными группами содержит на поверхности достаточное количество силанольных групп для создания электроосмотического потока. В капиллярах, заполненных мелкозернистым силикагелем, скорость электроосмотического потока при прочих равных условиях оказывается меньше, чем в полых, несмотря на то, что ^-потенциал на поверхности силикаге* ля имеет ту же величину, что и на поверхности кварца. Однако меньший размер каналов и беспорядочное, хаотичное их направление в слое адсорбента приводят к снижению скорости электроосмотического потока в 1,5-2 раза [62]т

Приготовление капиллярных колонок для электрохромато- графин, подробно описанное в работах [62, 63] в основном вклю^ чает те же операции, что и процесс заполнения колонок для высокоэффективной жидкостной хроматографии (см. гл. 3).

Результаты процесса электрохроматографии зависят от целого ряда факторов, среди которых наиболее важны pH и ионная сила раствора (переносящего электролита), приложенное напряжение. наличие органических модификаторов в составе электролита* В диапазоне концентраций электролита от 4 1>5 д口 0,2 М наблюдается довольно незначительное влияние этого параметра на величину электроосмотического потока, В то же время, при повышенных концентрациях переносящего электролита существенно повышается эффективность разделения. Для боратного буферного раствора считается оптимальным диапазон концентраций 2-4 тМ* Показательный пример применения электрохроматографии для разделения неионных соединений приведен на рис, 82 血

Детальное обсуждение вопросов расширения зон, влияния термических эффектов и величины зерна применяемого сорбента на эффективность разделения в электрохроматографии представлено в работах [37,61,62*

МИЦЕЛЛЯРНАЯ ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКАЯХРОМАТОГРАФИЯ

Мицеллярная электрокинетическая хрома тограф и я представляет собой такую модификацию метода капиллярного электрофореза, которая позволяет осуществить высокоэффективное разделение неионизирующихся электрически нейтраль* ных молекул.

Принцип этого метода разделения достаточно прост* Мицеллы представляют собой достаточно крупные молекулярные образования, образующиеся в водном растворе при некоторой концентрации поверхностно-активного вещества (ПАВ). Наименьшая концентрация его, при которой начинается образование мицелл, называется критической концентрацией м и цел л ообра зевания. Для разных ПАВ эта концентрация составляет от 10-5 до 1,4 х 1О2 М, Наименьшие значения критической концентрации мицеллообразования характерны для неионных поверхностноактивных веществ типа полиэтиленгликольсорбитан моноолеата (Твина 80),

Отдельная мицелла разных поверхностно-активных веществ может состоять из разного числа отдельных молекул. Это число для разных ПАВ изменяется от ЗТ до 130 и более, В зависимо*

сти от типа ПАВ мицеллы несут поверхностный положительный (для катионных ПАВ) или отицателъный (для анионных ПАВ) заряд, либо электрически нейтральны. Однако скорость электрофоретической миграции столь крупных молекулярных образований весьма невелика» оказываясь намного меньшей, чем скорость электроосмотического потока.

Поэтому, если электроосмотический поток направлен от катода к аноду, то в том же направлении перемещаются и мицеллы. Если в раствор, содержащий ПАВ в мицелл5грной форме, ввести смесь подлежащих разделению веществ, то они распределяются между гидрофобной мицеллярной средой и водной фазой в соответствии с индивидуальными коэффициентами распределения к При этом медленно движущиеся в электрическом поле крупные мицеллярные образования играют роль хроматографической неподвижной фазы по отношению к молекулам разделяемых веществ, продвигающихся в водной фазе с существенно большей скоростью электроосмотического потока. По существу при этом реализуется процесс обращенно-фазовой хроматографии, в которой мицеллы ПАВ выполняют роль псевдостационарной фазы, При этом чрезвычайно малые размеры мицелл определяют высокую скорость установления равновесия. Отсутствие других размывающих факторов и малая величина продольной диффузии определяют высокую эффективность хроматографического процесса. Пример разделения неионизирующихся соединений с помощью этого метода приведен на рис+ 83. Понятно, что наименьшее время удерживания в таком хроматографическом процессе 力=fg будет иметь такой компонент, который совершенно не взаимодействует с мицеллами и, следовательно, продвигается в капилляре со скоростью электроосмотического потока, С другой стороны, наибольшее возможное время удерживания равно времени электрофоретической миграции мицелл, %* Все прочие вещества будут иметь времена удерживания в интервале 〃 - Коэффициент емкости компонента / в данной системе 自 может быть рассчитан из времен миграции электроосмотинеского потока % по следующей формуле [59]:

Можно видеть, что при бесконечно большом времени миграции мицелл, tm т «\ эта формула преобразуется в обычное для жидкостной хроматографии выражения для коэффициента емкости.

Рис* S3. Разделение неионизирующихся веществ методом мицеллярной электрокинетической хроматографии:

/ - метанол, не взаимодействующий с мицеллами и выполняющий функцию несорбирующего компонента; 2 - фенол; 3 - бензиловый спирт; 4 - бензол; 5 - нитробензол; 6 - толуол; 7 - краситель Судан П1, перемещающийся в капилляре вместе с мицеллами. Прибор Бекман Р/АСЕ 2о6о, кварцевый капилляр размером 57 см х 75 мкм, гидродинамический ввод пробы в течение I с; напря* жениость поля 263 В/см; температура 25 ℃; УФ ■ детектирование при длине волны 214 нм; состав электролита: 29 мМ фосфатный буфер с доОавкой 50 мМ додецилсульфоната натрия» pH 8

в котором величина 喝 играет роль времени удерживания несор* бирующего компонента. В том случае, когда разделению подвергаются вещества, способные к ионизации, на хроматографический механизм накладывается электрофоретическое разделение [60]* При этом результирующая подвижность иона разделяемого соединения определяется как средневзвешенная величина подвижности мицелл и собственной подвижности определяемого соединения.

Коэффициент емкости разделяемого вещества связан с концентрацией мицелл линейной зависимостью:

k^K^V([S]-C^(5-66)

где К - коэффициент распределения в растворе, V - мольный объем ПАВ, [5] - мольная концентрация ПАВ в растворе, Скр - критическая концентрация мицеллообразования (моль/n)* Это уравнение выполняется при низких концентрациях как ионизирующихся, так и неионизирующихся веществ.

Степень разделения двух близких пиков в мицеллярной хроматографии можно оценить, подставив уравнение (5-66) в обычное хроматографическое выражение для этого параметра:

(5^67)(5^67)

(5^67)

(5^67)

Из этого уравнения следует, что для увеличения степени разделения весьма желательно по возможности уменьшить соотношение Q白 /f陋.Это может быть достигнуто путем уменьшения или даже полного подавления электроосмотического потока с помощью введения в переносящий электролит органических модификато* ров или путем соответствующего покрытия стенок капилляра. Вопросы оптимизации концентрации ПАВ в условиях кинетической мицеллярной хроматографии рассмотрены в работе [61].

В качестве мицеллообразутощих ПАВ в мицеллярной хроматографии применяют катионные, анионные и неионные соединения. Каждая из этих групп ПАВ имеет свои особенности и свою область применения* Так, ПАВ типа додецил сульфоната натрия образуют осадки с солями щелочноземельных металлов. Поэтому такие соли не должны входить в состав переносящих буферных растворов. Хлорид цетилтриметиламмония способен адсор- бироваться на стенках кварцевых и стеклянных капилляров, что приводит к изменению поверхностного заряда и, как следствие, к обращению направления электроосмотического потока. Последний в этом случае направляется от катода к аноду, тогда как мицеллы мигрируют от анода к катоду [8],

Ряд преимуществ имеет применение неионных и цвиттерионных ПАВ [62]* Так, введение в переносимый электролит ок- тилгликозида и 3*(3-холамидопропил)-диметиламмонио-3-про- пансульфоната оказывает лишь малое влияние на скорость электроосмотического потока и не влияет на электропроводность раствора и, следовательно, не изменяет величину протекающего через электролит тока и количество вьiделяющегося джоулева тепла.

Весьма плодотворным оказалось применение в качестве ПАВ желчных кислот и их производных [63]. Эти природные со единения образуют стабильные мицеллы в присутствии многих органических растворителей, что позволяет существенно расширить область применения метода капиллярного электрофореза на ряд гидрофобных соединений, плохо растворимых в воде.

Желчные кислоты оптически активны, что позволяет использовать их для разделения энантиомеров. Некоторые примеры таких разделений приведены нижи. Влияние ионной силы и pH переносящего буфера, температуры, различных модифицирующих добавок на результаты мицеллярной электроконетической хроматографии подробно рассмотрено в ряде монографий по капиллярному электрофорезу.

Несмотря на известную ограниченность возможностей электро- кинетической мицеллярной хроматографии, связанной с ограниченным интервалом времен удерживания между q и %, с помощью этого метода удается достигать весьма высокие значения эффективности разделения, превышающие 500000 гг，при использовании капилляров длиной всего 40-50 см. Эти возможности делают метод электро кинетической мицеллярной хроматографии одним из самых высокоэффективных методов в настоящее время и открывают весьма широкие и привлекательные перспективы в будущем.

КАПИЛЛЯРНЫЙ ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

В том случае, когда подлежащие разделению вещества ионного характера имеют близкие значения плотности заряда, те сходные величины отношения заряда к массе, их разделение с помощью зонного электрофореза в полых капиллярах становится весьма затруднительным или вообще невозможным. Однако в этих случаях можно добиться разделения таких веществ на основе различий в величине их молекул. При этом используются молекулярно-ситовые свойства заполняющего капилляр геля с контролируемыми размерами пор гелевой сетчатой структуры.

Наиболее развитой областью применения такого методического варианта капиллярного электрофореза является разделение нуклеиновых кислот, синтетических олигонуклеотидов, фрагментов ДНК с различной длиной цепи, включая высокомолекулярные фракции, а также способных к ионизации олигосахаридов и полисахаридов. Соединения этих групп имеют очень близкие значения плотности заряда и не поддаются электрофоретическому разделению в полых капиллярах.

Теоретическая трактовка процесса разделения в заполненных гелем капиллярах предполагает его молекулярно-ситовый механизм. При этом структура геля рассматривается как молекулярное сито с порами разного размера, а разделяемые молекулы 一 как недеформируемые сферические частицы разного раз- мера [64]. Очевидно, что молекулы меньшей величины могут мигрировать б структуре геля быстрее, т.к* для перемещения доступно большее число каналов,

Альтернативная модель такого процесса предполагает» что молекулярная цепь разделяемых макромолекул намного больше, чем размер пор молекулярно*ситовой структуры геля» поэтому макромолекулы мигрируют через узкие поры гелевой структуры подобно змее, проползающей в узкую нору [65].

Гелевые структуры в капиллярах формируются путем полимеризации акриламида в присутствии сшивающих агентов, таких как N, W'-метиленбисакриламид* При этом формируется гель со средним размером пор от 2 до 8 нм [66]. Кроме того, достаточно широко используют гели агарозы в ее нативной форме и виде различных модификаций*

Одной из быстро развивающихся модификаций техники капиллярного гель^электрофореза является разделение макромолекул в растворах различных водорастворимых полимеров, выполняющих функцию ^жидкого молекулярного сита”* В качестве таких полимеров используют гидроксиметилцеллюлозу, гидро- ксипропилметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, декстраны с молекулярной массой порядка 100 тыс, а^е.м, [67-69].

Результаты, получаемые с помощью метода капиллярного гель-электрофореза, в принципе сходны с результатами гель- проиикающей (ситовой) жидкостной хроматографии. Однако по^ следний метод вследствие ряда причин фундаментального характера не позволяет добиться достаточно высокой эффективности разделения и поэтому не причисляется к высокоэффективным хроматографическим процессам. Напротив, метод капиллярного гель-электрофореза обеспечивает эффективность разделения до 1 млн теор, тарелок и более даже при длине капилляра порядка 0,5 м. При этом оказывается возможным, например, провести полное разделение более 400 полимер-гомологов поли-(урвдин- 5#-фосфата) с числом мономерных звеньев от 1 до 431 [70]. Такие результаты по справедливости обеспечивают данной модификации капиллярного электрофореза прочное место среди высокоэффективных методов разделения веществ.

ПРИМЕРЫ ПРИМЕНЕНИЯКАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

Ниже приведено несколько достаточно показательных примеров, иллюстрирующих исключительно богатые возможности метода капиллярного электрофореза при разделении близких по свойствам веществ и многокомпонентных смесей* Получаемые

NaNa30 c30 c

Na

Na

30 c

30 c

Рис» 84. Разделение смеси веществ, содержащей катионыs за время менее 30 с. Переносящий электролит: раствор имидазола с концентрацией 4 тМ” pH 4,0. Кварцевый капилляр размером 75 мкм х 23 см х 15 см; напряжение 30 кВ* Косвенное УФ-детектирование при длине волны 214 нм* Гидростатический ввод пробы в течение 30 с при разнице уровней 9,8 см. Концентрация всех компонентов 1 млн^1 [70]

Рнс* S5* Разделение лантанидов с использованием комплексообразования. Переносящий электролит содержал креатинин и уксусную кислоту в концентрации 0,03 М и оксиизомасляную кислоту в концентрации 4 мМ; pH 4,8; капилляр размером 25 мкм х 20 см; напряжение 15 кВ; ток 3*6 мкА [71]

Рис. 86* Капиллярный зонный электрофорез оптически активных комплексов кобальта:

/ - [Co(o-phen)^]3+; 2 - A[Co(en)2Gly]>; 3 - 4[Co(en)2Giy|2+; 4 - Д[Co(en) jL-Pro]2+; 5 - A[Co(en)2L* Pro产+; 6 - A(Co(en)2L-Phe]2+： 7 - A[O(un)2D-Phe]2+; S - A(Co(en)3D- P(ieF+; 6 - A[Co(en)2L-Phe]2+. УФ-детектирование при длине волны 240 нм [72]

1 т5 мин 89 сек 3,1 мин

Рис, 87* Электроферограмма смеси 30 анионов. Переносящий электролит 5 мМ хромат и 0,5 мМ модификатора электроосмотического потока (Waters OFM Anion-BT)t pH 8,0; кварцевый капилляр диаметром 50 мкм; напряжение 30 кВ; электромиграционный ввод пробы в течение 15 с при напряжении 1 кВ; косвенное Уф-детектирование при длине волны 254 нм:

/ - тиосульфат; 2 - бромид; 3 — хлорид (2 млн-】)；4 - сульфат; 5 - нитрит; 6 - нитрат; 7 - молибдат (10 млн-')； 8 - азид; 9 - вольфрамат (Ю млн~');『0 - монофторфосфат; // - хлорат; /2 - цитрат (2 млн-1)；『3 - фторид (1 млн"); /4 - формиат (2 млн」)；/5 - фосфат; 76 - фосфит; /7 - хлорит; 18 - галакта- рат (5 млн-1); 79-карбонат; 20 -этансульфонат; 2/ - ацетат; 22 - пропионат (5 млн-1}; 23 - пропансульфонат; 24 - бутират (5 млн-1); 25 - бутансульфо- нат; 26 - валерат (5 млн-1); 27 - бензоат; 28 - L-глутарат (5 млн-1); 29 - пен・ тансульфонат; 30 一 D-глюконат (5 млн^1)* Концентрация прочих анионов 4 млн-1 [73]

о 481216202428323640 мин

Рис. 88* Разделение смеси наркотических веществ методом мицеллярной электрокинетической хроматографии. Капилляр размером 50 мкм х 25 см； напряжение 15 кВ; температура 40℃; переносящий электролит содержит 85 мМ додецилсульфата натрия, 8,5 мМ бората и 15% ацетонитрила; pH 8,5; УФ-детектирование при длине волны 210 нм. Содержание каждого компонента 250 мкг/мл;

/ - псилоцибин; 2 - морфин; 3 - фенобарбитал; 4 - псилоцин; 5 - кодеин; 6「метаквалон; 7 一 ЛСД; 8 - героин; 9 - амфетамин; 10 - лоразепам; II -фентанил; /2 - РСР; 13 - каннабиол; /4 - Д^-ТНС [74J

Рнс. 89. Мицеллярная электрокине- тическая хроматография смеси цефалоспориновых антибиотиков:

7 - цетилтриметил аммоний; 2 - и©# лаэидин； 3 - цефотаксим; 4 - цефопира- хон; 5 - цефменоксим: 6 - цефпирамид; 7 一 цефтриазон; 8 - цефтриаксон; 9 -цеф- пимизол; 10 - цефминокс, УФ-детектирование при 220 нм [75]

Рис. 90. Мицеллярная электрокинетиче- ская хроматография смеси изотопосодержащих метиламинов. Хроматограмма зарегистрирована с помощью флюоресцентного детектора:

/ - DNS-JY; 2 - DNS^NHCD3; 3 - DNS- NHCH3 [76]

2020минмин

20

20

мин

мин

Рис* 91. Разделение пуриновых оснований с концентрациями от 2 до 9 мкг/мл методом капиллярного электрофореза. Переносящий электролит-карбонатный буфер с концентрацией 50 мМирН 10; напряжение 15 кВ, гидродинамический ввод пробы в течение 20 с:

/ - кофеин; 2 - теобромин; 3 - аденин; 4 - гуанин; 5 - теофиллин; 6 - гипоксантин; 7 - ксантин: 8 - мочевая кислота [77]

при этом электроферограммы, приведены на рис* 8Ф-91 в порядке усложнения аналитических задач. Понятно* что эти примеры не исчерпывают всего многообразия задач разделения, решае^ мых с помощью метода капиллярного электрофореза, однако они имеют целью дать читателю представление о весьма широких возможностях этой изящной и исключительно эффективной техники разделения веществ.

ЛИТЕРАТУРА

L Mikkers F.E.Ptt Everaerts ЛМм Verheggen RE+M. // JT Chromatogr, 1979. VoL 169. PJL

2* Jorgenson ZJWm Lukacs KD 〃 AnaL Chem, 1981, VoL 53+ P, 1298*

Giddinds J<+ // Separ. Sci+ 1969, VoL 4. PJ8L

Knox J.H. // Chromatographia. 1988. Vol, 26. P. 329.

Grushka £, McCormick 凡好〃丄 Chromatogr. 1989. VoL 471* P. 42L

Энгельгардт X. Руководство по капиллярному электрофорезу. М,: Науч, совет по хроматографии АН СССР, 1996, 231 и

Jandik F” Bonn G. Capillary electrophoresis of small molecules and ions, Weinheim: VCN, 1993. 303 p.

Kuhn R” Hoffsteter*Kuhn S. Capillary electrophoresis: Principles and practice* NY; Вj Springer, 1993. 375 p*

Foret R, Kfivdnkovd L, Bo^ek P Capillary zone electrophoresis. N.Y*: VCH, 1993. 346 P.

Heiger D.N. High performance capillary electrophoresis. Waldbronn: Hewlett-Packard, 1992, 280 p.

IL Kuhr 附G 〃 AnaL Chem. 1990. VoL 63. P. 403RM14R； 1992. VoL 64. P. 389RT07R.

EngelhardtH.t Berk 附Kohr J,y Schmitt ТЛ Angew. Chem, 1993. Bd* 105+ S. 659-680.

13* LiSFYJ工 Chromatogr. Libr, 1992. VoL 52,

Vindevogel G, Sandra P. // Chromatographic methods. Heidelberg: Huthig, 1992.

15* Capillary electrophoresis technology. NY: Marcel Dekker, 1993. (Chromatogr. Sci* Sen; Vol, 64)*

Hunter Я J, Zeta-potentiol in colloid science. N.Y.: Acad* press, 198L

17* Adamson AW, The textbook of physical chemistry. N.Y*; Acad, press, 1973, 18. Snaw DJ, Electrophoresis* N.Y.: Acad, press, 1969+

Lukacs K.D., Jorgenson J.W, // 工 High Resolut. Chromatogr. Chromatogr. Commum. 1985. VoL & P・ 407.

20* Handbook of chemistry and physics, 66ih ed・ Boca Raton (HaJ: CRC press, 1985.

2L Giddings JC 〃 Chromatogr. 1989* Vol. 480. P 21-3 3*

Biochemie / Ed. AL Lehningen Weinheim; N.Y.: Verb Chem., 1979+ 140 &

3. Lower H.H.t McManigill D+ // AnaLChem. 19 86* VoL 5 8, N L P, 166-170. 24. McCormick R " Ibid, 1988. VoL 60, N & P 2322-2338.

Green J.S., Jorgenson J.屮.// J. Chromatogr. 1989. VoL 47 8+ P. 63-70.

Bushey M.M.t Jorgenson J.W. // Ibid. Vol. 480. P* 301-310.

Hierten SJ, // Ibid, 1985. Vol. 347. PJ 8 9-19&

Maa У.-Л, Hyver KJ、, Sw^dberg S.A. // 工 High Resoluu Chromatogr. Chromatogr* Commum, 199L Vol, 14, N L P* 65™67+

Hjerten SJ. // Electrophoresis. 1990. VoL 1L P. 665-690.

Mikkers EEP, Everaem FJH「Verheggen Th.P,EM. 〃工 Chromatogr. 1979. VoL 169, N L PJ-10.

3L Mosher RM” Saville D.A., Thormann W. // Electrophoresis library. Weinheim； VerL Chem., 1982+

Kleparniak K, Bocek P+ // 丄 Chromatogn 199L VoL 480. P. 3^2,

H以*打g X., Coleman W.F., Zare /?/ 〃 Ibid J9S9+ Vol. 489. P. 95-110.

Vinth^rA., S^eberg HJ, // Ibid. 199L VoL 559, P 3-26.

Coring SE, Colburn JC, Grossman RD, Lauer ЯЛ, // LC-GC Intern.

1990. VoL 3+ P 46-52.

6 Chien R「L, Burgi DX // Anal* Chem. 1992. Vol, 64. P. 489A-496A*

3 7. 6反侬 D6, Chien R-L //Ibid. 199L Vol. 63. E 2042^2047.

3& Chien R「L, Burgi DS 〃 Ibid/992. VoL 64. P. 1046-1050.

39* Bur^i D.S.f Chien R.-L // AnaL Biochem. 1992, VoL 202. P+ 306- 309.

Chien 凡L, Burgi DS. // J, Chromatogr. 199L VoL 559* R 141-151 4\.Jandik P+J Jones W.R. // Ibid. Vol. 546. P 431-443.

Kurosu 匕 Hibi K, S&$口依工，Saito M, // 丄 High Resolut Chromatogr. Chromatogr* Commum. 199L VoL 14, P. 200-203.

Supelco Biotext 199 k N 4, P. 12-14.

Tsuda T” Siweedler JY_ Zare RM " AnaL Chem. 1990* Vol. 62+ R 2149-2152.

Hjerten £ 〃L Chromatogr* 1985. VoL 347. PJ98-198.

Novotny MR, Cobb K.A., Liu J. 〃 Electrophoresis. 1990+ VoL 11 + P. 715-749.

Cobb £4, Dolnik К Novotny MK 〃 Anal. Chem. 1990* VoL 62* P. 2478^2483,

4 8. Towns J.K., Regnier F./f.//Ibid. 1991. VoL 63. E 1126-1132.

49* Towns J,K.t Bao J.f Regnier F.R. 〃 J, Chromatogr. 1992. Vok 599* P. 227-237.

50+ Towns J.K, Regnier F.R. // Ibid. 1990. VoL 516 P. 69-78.

5 L Herren BJ.f Shafer 5.G+> Van AktineJ. et al. //J. Colloid and Interface Sci.

1987. VolJ15.P.好55.

52. Bruin GJM- Chang JR, Kuhlman RM et aL // J* ChromatogE 1989. VoL 417+ P 42943 6

53+ Maa Y.-F., Hyver KJ., Swedberg SA. // J. High Resolut. Chromatogr, Chromatogr, Commum. 199L Vol. 14+ R 65-67.

Bruin GJM., Huisden R- Kraak，+C, Poppe H. // 丄 Chromatogn 1989. Vol. 480, P 339-349.

55+ Wicar S.P Vilenchik M・，Bele/ikii A. et aL // J. Microcolumn Separ. 1992. VoL 4. P 339-34&

5 6. Knox J.H., Grant LN. // Chromatographia. 1987* VoL 24. P.135-14 3.

57+ KnoxJ.H.t Gram LN J/Ibid. 199L VoL 32. P. 317-328.

58* Yamamoto Я,, Baumann 几 Erni F, // J. Chromatogr. 1992. VoL 593* P 313—319

Terabe S+, Otsuka K, Ando T. 〃 Anal. Chem. 19 85. VoL 5 7. P- 8 34—84 L

Khaledi MG, Smith S.C., Strasters 丄К 〃 Ibid. 199L VoL 63. p 1320—1830

6\. Foley J.PJ/^ 1990. VoL 62. R 1302-1308.

Swedberg S-A. //J. Chromatogn 1990. VoL 503. P 449T52*

63* Cole R。，Sepaniak MJ. // LC-GC* 1991* VoL 10. P. 380-3B5.

64+ Grossman pb“ Soane DS 〃 L Chromaiogr. 1991. VoL 559. P. 257-266+

Noolandi J. // Adv. Electrophoresis. 1982. Vol. 5.

Righetti PG, Cagiio S.t Saracchi ЛЛ Quaroni S. 〃 Electrophoresis. 1992, VoL 13. P 587-595.

Zhu M, Hansen DL, Burd 工，Gannon £ 〃 J+ Cbromatogr. 19 89. Vol. 480. P. 311-319+

Ganzler K, Greve KS, Cohen 4S, Karger BL // AnatChem. 1992. Vol 64. P. 2665-2671,

Yin 斤「儿 Lux JA, Schomburg G 〃 J. High ResoluL Cbromatogr. Cbromatogr. Commum. 1990, VoL 13. P. 624-627+

Foret F., Deme ЛЛ В必左 Л Electrophoresis. 1986+ VoL 7 R 45L

7L Otsufca K„ Terabe £, Ando Г " Nippon Kagaku KaishL 1986+ VoL 7. P, 950-955.

72+ Fanali £, 0$就Hni L., Forel 几 Bo^ek F. // J. Microcolumn. Sep. 1989. Vol. 1. P+ 190794.

3. Huang X廿 Gordon MJ,,勿ге RW. // 丄 Chromafogr 19 89. Vol. 480+ К 285.

Weinberger R., Lurie LS. // Anal Chern. 1991+ VoL 63. P, 823,

5. Nishi H.t Tsumaragi M, Kakimoto T+t Terabe S. // J. Chromatogr. 1989+ VoL 477. P 259—270

6, Bushey MAT, Jorgenson JW. // J* Microcolumn. Sep. 19 89. VoL 1. P. 125-130.

Geidan £, Brown FR // J. Chromatogr. AJ999+ Vol, 8 31. P. 123-129.

ОГЛАВЛЕНИЕОГЛАВЛЕНИЕ470458183355667722222222470458183355667722222222

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ

47045818

33556677

22222222

47045818

33556677

22222222

Глава 5

Капиллярный электрофорез

5.L Принципы капиллярного электрофореза

* Эффективность разделения в капиллярном электрофорезе

Факторы, влияющие на достигаемое разделение

5А Джоулево тепло

* Капилляры

Методы электрохроматографии

. Примеры применения капиллярного электрофореза

Предисловие 3

Глава 1

Хроматография с парообразными подвижными фазами 5

L1* Введение 5

L2* Влияние природы подвижной фазы на величину объема удерживания 8

L3* Хроматография с парообразной подвижной фазой в докрити* ческом состоянии 18

1+4* Хроматография в свер к к ритич еских средах 41

15 Аппаратура 59

1.6. Заключение 65

Глава 2

Высокоэффективная жидкостная хроматография 72

2.L Принципы высокоэффективной жидкостной хроматографии 72

2+2+ Адсорбционная жидкостная хром&тогра^ня 79

2.3* Распределительная хроматография 85

2+4* Ионообменная хроматография 100

Z5. Подвижные фазы в высокоэффективной жидкостной хроматографии125

Глава 3

Практические аспекты высокоэффективной жидаостной хрома* тографни 147

3」.Приготовление узких фракций сорбентов для высокоэффек^ тивной жидкостной хроматографии 147

3.2* Приготовление колонок для ВЭЖХ 151

3*3* Заполнение колонок сухим способом 162

34 Оценка качества приготовленных колонок 163

3.5. Аппаратура для высокозффективной жидкостной хроматографии 164

Глава 4

Планарная хроматография 198

4.L Бумажная и тонкослойная хроматография 198

4二* Способы количественной обработки тонкослойных хромато грамм227

Научное издание

Руденко Борис АнтоновичРуденко Галина Ивановна

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫЕХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕПРОЦЕССЫ

Том 2

Процессыс кон денем рованн ым иподвижными фазами

Утверждено к печатиУченым советам Институт геохимиии анолита ческой химииим. В." ВернадскогоРоссийской академии наук

Зав. редакцией Н.А. СтепановаРедактор Н.М. АлександроваДизайн оформления ЕЕ РуденкоХудожественный редактор В.Ю^ ЯковлевТехнический редактор ОВ АредоваКорректоры Р.В. Молоканова, ТМ* 出ево^сио日口

Подписано к печати 13QL2003

Формат 60x90 片& Гарнитура ТаймсПечать офсетная

Усл.печ.л. 18,0. Услжр.-огг. 13t5. Уч,-издл. ]^7Тип. зак, 3978

Издательство “Наука”

117 9 97 ГСП-7, Москва В-485, Профсоюзная ул.т 90

E-mail： secrei@ паи karan. г иInternet: www.naukaran.ru

Санкт-Петербургская типография "Наука”J990 3 4, Санкт-Петербург В-34» 9-я линия, 12

34 (p,3pj_]，

где Вп-смешанный второй вириальный коэффициент, описыва-

В настоящее время наиболее часто в качестве материала для