■ A I ■ .' z i : , . a)

ОГЛАВЛЕНИЕ

Manual of Methodsfor General Bacteriology

PHILIPP GERHARDT, Editor-in-ChiefDepartment of Microbiology and Public Health,Michigan State University, East Lansing, MI 48824

R. G. E. MURRAY, Editor, I. MorphologyDepartment of Microbiology and Immunology,University of Western Ontario, London, Ont., Canada NGA 5C1

RALPH N. COSTILOW, Editor, II. Growth

Department of Microbiology and Public Health,Michigan State University, East Lansing, MI 48824

EUGENE W. NESTER, Editor, III. GeneticsDepartment of Microbiology,University of Washington, Seattle, WA 98195

WILLIS A. WOOD, Editor, IV. Metabolism

Department of Biochemistry, Michigan State University,East Lansing, MI 48824

NOEL R. KRIEG, Editor, V. SystematicsBiology Department, Virginia Polytechnic Institute,Blacksburg, VA 24061

G. BRIGGS PHILLIPS, Editor, VI. Laboratory Safety

Health Industry Manufacturers Association, 1030 15th Street, N. W.,Washington, DC 20005

American Society for Microbiology Washington, DC 20006 1981

МЕТОДЫОБЩЕЙБАКТЕРИОЛОГИИ

В ТРЕХ ТОМАХ

1

Под редакциейФ. ГЕРХАРДТА и др.

Перевод с английского под редакциейчл.-корр. АН СССР Е. Н. КОНДРАТЬЕВОЙи проф. Л. В. КАЛАКУЦКОГО

МОСКВА «МИР» 1983

ББК 28.4 М 59

УДК 576.80.85

М 69 Методы общей бактериологии: Пер. с англ./Под ред. Ф. Герхардта и др. — М.: Мир, 1983. — 536 с., ил.

Фундаментальное руководство, написанное учеными США н Канады, по методам, широко используемым в современной бактериологии. На русском языке книга выходит в трех томах. В первый том вошли методы световой н электронной микроскопии, фракционирования бактериальных клеток, приготовления сред для выращивания микроорганизмов, измерения роста микроорганизмов.

Предназначена для специалистов, работающих во всех областях микробиологии.

ББК 57 АББК 57 Ам 2003000000—447

ББК 57 А

ББК 57 А

”041(0)—83 П°ДП- "ЗД-®-83> ч- 1

Редакция литературы по биологии

МЕТОДЫ ОБЩЕЙ БАКТЕРИОЛОГИИ

том 1

Научный редактор Т. И. Пономарева. Мл научи, редактор Р. Ф Куликова. Художник А. В. Шипов. Художественный редактор А. В. Лиси-цын. Технический редактор Т. Д. Паиасюк. Корректор И. А. Дерико-ленко

ИБ № 3305

Сдано в набор 29.04.83. Подписано к печати 21.08.83. Формат 84X108V„. Бумага типографская Nt I. Гарнитура литературная. Печать высокая. Объем 8,38 бум. л. Усл. печ. л. 28,14. Усл. кр.-отт. 28,14. Уч.-изд. л. 31,01. Изд. № 4/2551. Тираж 11 300 экз. Зак. 1260. Цена 2 р. 60 к.

ИЗДАТЕЛЬСТВО «МИР», 129820, Москва, И-110, ГСП, 1-й Рижский пер., 2.

Московская типография № 11 Союзполиграфпрома при Государственном комитете СССР по делам издательств, полиграфии и книжной торговли. Месква, 113105, Нагатинская ул., д. 1.

© 1981 American Society for Microbiology © Перевод иа русский язык, «Мир», 1983

ПРЕДИСЛОВИЕ

РЕДАКТОРОВ ПЕРЕВОДА

История микробиологии тесным образом связана с развитием и совершенствованием методов изучения и использования микроорганизмов. Богатый и разнообразный арсенал методов современной микробиологии продолжает непрерывно пополняться. Усилия в этой области находят отражение на страницах многих специальных журналов (Journal of Microbiological Methods, Elsevier Biomedical Press, Amsterdam, публикуется c 1983 г.), продолжающихся изданий (Methods in Microbiology, eds. J. R. Norris, D. W. Ribbons, Academic Press, Inc., London, N. Y., вышло из печати 14 томов), трудов тематических симпозиумов (Tilton R. С., ed. 1982. Rapid methods and automation in microbiology, ASM Publication, Washington, D. С.), коллективных монографий (The Prokaryotes, A. Handbook on Habits, Isolation and Identification of Bacteria, eds. M. P. Starr et al., Springer Verlag, Berlin, N. Y., 1981) и т. д. Наряду с совершенствованием классических методов (приемов выделения микроорганизмов, их культивирования, идентификации, микроскопии и др.) происходит интенсивное расширение арсенала микробиологии методами, заимствованными у смежных дисциплин (генетики, молекулярной биологии, биохимии и биофизики). И если даже специалист в наши дни нередко вынужден затрачивать довольно много времени и усилий на поиск описаний подходящих методов, их апробацию и совершенствование, то решение подобной задачи для начинающих исследователей, практических работников и учащихся высших учебных заведений сопряжено с еще большими трудностями.

Коллективная монография «Методы общей бактериологии», с русским переводом которой имеет теперь возможность ознакомиться советский читатель, адресована прежде всего начинающим исследователям, практичес-

ким работникам и учащимся. Составители, авторы и редакторы сборника предприняли значительные усилия к тому, чтобы из широкого круга методов, представляющих реальный или потенциальный интерес для микробиологов и других исследователей, работающих с микроорганизмами, выбрать те, которые используются особенно часто, и дать их описание в доступной для воспроизведения форме. В сборник включены преимущественно не просто «новейшие» методы, но реально «действующие», т. е. те, которые успешно прошли апробацию в различных лабораториях, в том числе в лабораториях авторов отдельных глав. Таким образом, по своему характеру книга приближается к «Большому практикуму» по микробиологии и может претендовать на место не столько на полке библиотеки, сколько на лабораторном столе.

Текст глав сборника и списки цитированной литературы отражают усилия многих специалистов по созданию и совершенствованию микробиологических методов. Результаты этой работы представляют несомненный интерес для советских читателей. Некоторые трудности в смысле применения отдельных методов связаны с тем, что авторы рекомендуют использовать в работе конкретные приборы и реактивы зарубежного производства. Во многих случаях, однако, суть методов, цель применения и требования, предъявляемые к оценке полученных результатов, изложены столь детально, что воспроизведение метода в оригинальном или модифицированном виде вполне возможно. Книга будет полезна очень широкому кругу читателей — микробиологам, биохимикам и генетикам, занятым не только исследовательской и преподавательской работой, но и работающим на предприятиях микробиологической и медицинской промышленности, в сельском хозяйстве, здравоохранении, ветеринарии и т. п. — одним словом, всюду, где возникает необходимость в ежедневной грамотной работе с разнообразными микроорганизмами.

Е. Н. Кондратьева Л. В. Калакуцкий

ПРЕДИСЛОВИЕ

Книга «Методы общей бактериологии» была задумана как краткое и доступное по цене руководство по наиболее важным и надежным методам, применяемым в бактериологической практике.

Книга охватывает все таксоны бактерий и посвящена проблемам теоретической и прикладной бактериологии. Поскольку в природе преобладают сапрофитные формы, паразитические и патогенные бактерии отдельно не рассматриваются. Не обсуждаются также специальные методы прикладных областей микробиологии, равно как и не делается попытка охватить всю микробиологию. Вирусы упоминаются только в связи с бактериофагами, используемыми в качестве векторов в процессе переноса генов, водоросли — только в связи с цианобактериями (сине-зелеными водорослями); дрожжи, плесневые грибы и простейшие упоминаются лишь вскользь.

Книга написана для тех, кто серьезно изучает предмет и нуждается в приобретении навыков, необходимых для проведения исследовательских и прикладных работ в области бактериологии. Пособие рассчитано главным образом на студентов старших курсов и начинающих научных работников, стремящихся получить более глубокие знания. Оно будет полезным для преподавателей при составлении заданий по лабораторной практике, а также для научных сотрудников в их экспериментальной работе. Книга содержит немало полезной информации для сотрудников отраслевых лабораторий и всех, кого по роду деятельности интересует затрагиваемый круг проблем.

По своему характеру и стилю эта книга о том, как надо работать. В ней освещено достаточно методологических принципов для того, чтобы понять, с какой целью и каким образом следует применять тот или иной метод. Прописи приведены в логической последовательности и

достаточно подробно, для того чтобы их можно было использовать без привлечения дополнительной литературы. Указаны наиболее типичные ошибки, затруднения и неожиданности, встречающиеся при использовании описываемых методик. В книге широко использованы примеры, рисунки, таблицы и схемы. При отборе методов учитывались частота их использования и надежность. Менее важные методы упомянуты в ссылках на оригинальную литературу, где дано их подробное описание. Авторы стремились по возможности обобщить методы таким образом, чтобы их можно было применить к любой вновь выделенной бактерии. Многие из них описаны на примере конкретных бактерий — хорошо известных авторам или часто используемых в бактериологической практике.

Методы, приведенные в этой книге, нужно рассматривать как проверенные на практике рекомендации компетентных исследователей, а не как «стандартные» или «наилучшие» методы. Тот факт, что Американское микробиологическое общество субсидировало и организовало издание этой книги, не следует рассматривать как рекомендацию, а описанные в ней методы — как «официально принятые» или «одобренные». Указание коммерческих источников оборудования и материалов не следует воспринимать как предпочтение одних и исключение других; если какие-то источники не названы вовсе, это сделано непреднамеренно.

Книга состоит из шести разделов, соответствующих основным разделам общей бактериологии, а главы, входящие в эти разделы, посвящены соответствующим областям методологии. Каждая глава — это самостоятельная и законченная часть книги. Десятичная система обозначения отдельных частей глав удобна для поиска необходимого материала, ссылок на другие разделы книги, а также для пользования предметным указателем. Все названия кратки и отражают существо вопроса, что также облегчает поиск. В конце каждой главы дается список литературы: вначале приводятся полные ссылки на литературу общего характера и краткие аннотации к ним, затем — сокращенные ссылки на специальную литературу. Некоторые главы дополнены списками фирм, поставляющих нужные приборы и материалы.

Тексты всех глав подвергались многостороннему и строгому рецензированию. После рецензирования и переработки все рукописи обсуждались на трех известных факультетах общей микробиологии разных университетов. И наконец, вся рукопись была внимательно проработана главным редактором с точки зрения ее содержания и соответствия замыслу. Такой процесс рецензирования и редактирования был не всегда легким, но чрезвычайно полезным. Мы просим читателей присылать свои замечания, благодаря которым мы сможем внести необходимые дополнения, сокращения и изменения в следующее издание.

История данного пособия восходит к 1923 г., когда X. Дж. Кон впервые написал и опубликовал для Американского микробиологического общества несколько руководств по методам микробиологических исследований в виде отдельных листков. Позже Кон был членом редколлегии и председателем Комиссии по бактериологическим методам, которая издала сборник под названием «Методы изучения чистых культур бактерий» в виде папки с отрывными листами. Авторы сборника отказались от гонорара, и доход от продажи пособия поступил в пользу Общества. В 1957 г. по инициативе Комиссии под руководством М. Дж. Пелчара-младшего переработанное пособие было издано в виде книги под названием «Руководство по микробиологическим методам».

Выход в свет настоящего руководства был вызван растущим спросом на издание 1957 г., а также необходимостью радикального обновления его содержания. С самого начала было запланировано такое количество страниц для каждого автора, которое позволило бы выпустить книгу в одном томе при минимальном объеме и максимальной лаконичности. Мы стремились к тому, чтобы цена книги была доступна для студентов. Это стало возможным, так как Общество, которое непрерывно растет (в 1980 г. оно состояло из 30 000 членов), имеет теперь собственное издательство и поэтому может издавать книги большим тиражом при низкой стоимости. Более того, Общество является освобожденной от налогов неприбыльной организацией, а редакторы и авторы не получают зарплаты или гонораров.

Я выражаю искреннюю благодарность всем, кто представил материал для книги; всем авторам и редакторам за прекрасное сотрудничество и работу по созданию книги; многочисленным рецензентам-—за скрупулезные и конструктивные критические замечания; Эрвину Ф. Лесселу и его сотрудникам, которые вызвались переделать иллюстрации и графики в едином стиле; университетам и другим учреждениям, предоставившим помощь в лице сотрудников, а часто и в виде прямой финансовой поддержки для подготовки и редактирования рукописей; Цинтии Лоунсбери — автору обложки; а также издательскому отделу Американского микробиологического общества, в частности Эстелле Б. Брэдли — за окончательную редакцию книги и составление предметного указателя; руководителю отдела книг Черилу Кроссу и исполняющей обязанности главного редактора Джизелле Поллок. Каждый из нас с удовольствием внес свою лепту в дальнейшее развитие бактериологии.

Филипп Герхардт

МЕТОДЫ ОБЩЕЙ БАКТЕРИОЛОГИИ

Ф. Герхардт

Подобно общей части любой другой науки общая бактериология рассматривает не конкретные вопросы (скажем, отдельные виды бактерий), а проблемы в целом; ее методология охватывает основные процедуры, которые находят широкое применение в самых разнообразных лабораторных исследованиях. Данное руководство охватывает весь круг бактерий, описанных в «Кратком определителе бактерий Берги» без особого выделения каких-либо групп. Методы, приведенные в книге, могут быть полезными в любой области, где приходится иметь дело с бактериями, и могут применяться для решения всех практических задач, включающих использование бактерий.

Бактериология стала наукой только после того, как были разработаны уникальные методы, благодаря которым она продолжает оказывать влияние и проникать в такие появившиеся позднее области науки, как вирусология, иммунология и молекулярная биология. Разработанная Кохом техника использования чистых культур и впервые примененные Пастером иммунологические реакции и химический анализ и сейчас не утратили своего значения.

Методология общей бактериологии отражена в нашей книге с помощью такого построения изложения, которое типично для классических учебных пособий по этой дисциплине. Так, в книгу включены разделы по морфологии, росту, генетике, метаболизму и систематике, а также лабораторной технике безопасности. Эти разделы состоят из глав, соответствующих основным группам методов общей бактериологии. Часто подразделение материала несколько произвольно, поэтому некоторые методы упоминаются несколько раз; при этом указываются глава и раздел, где дано описание метода, а в конце книги имеется предметный указатель. К каждой главе прила-

МЕТОДЫ ОБЩЕЙ БАКТЕРИОЛОГИИ

гается список общей литературы и специальных статей, где содержится описание обсуждаемых методов.

Основным литературным источником для читателя, который интересуется описанием метода, не включенного в эту книгу, может служить многотомный труд нескольких авторов «Методы микробиологии» [5]. Прекрасным собранием методик является книга Мейнеллов «Теория и практика в экспериментальной бактериологии» [4]. Не теряет своего значения и предшествовавшее нашей книге «Руководство по микробиологическим методам» Американского бактериологического общества [8]. Методы медицинской микробиологии и иммунологии, многие из которых применимы в общей бактериологии, изложены в ряде работ, включая такие справочные пособия, как «Руководство по клинической микробиологии» [3] и «Руководство по клинической иммунологии» [6]. «Учебник микробиологии» [2] и «Микробиологический словарь» [7] относятся к общемикробиологической литературе. Дополнительная информация об имеющихся в продаже оборудовании и материалах содержится в ежегодном издании «Yellow Pages of Instrumentation, Equipment and Supplies» [1] и ежегодных специальных приложениях к журналам «American Laboratory», «Chemical Engineering» и «Science».

ЛИТЕРАТУРА

Industrial Research/Development. Yellow pages of instrumentation, equipment and supplies. Industrial Research/Development Publishers, Barrington, III, 1979.

Laskin A. I., Lechevalier H. CRC handbook of microbiology, 2nd ed, CRC Press Inc., Cleveland, 1978—1980.

T. 1. Бактерии. Первые 120 страниц посвящены вводному описанию бактерий, следующие 340 страниц — описанию основных групп бактерий, последние 220 страниц содержат обычную учебную информацию, включая список коллекций культур.

Т. 2. Грибы, водоросли, простейшие и вирусы.

Т. 3. Аминокислоты и белки.

Т. 4. Углеводы, липиды и минеральные вещества.

Lennette Е. Н„ Balows A., Hausler W. Н. Jr., Truant J. Р. (ed.). Manual of clinical microbiology, 3rd ed. American Society for Microbiology, Washington, D. C., 1980.

MeyneU. G. G., MeyneU E. Theory and practice in experimental bacteriology, 2nd ed. University Press, Cambridge, England, 1970.

Прекрасное компактное (347 с.) справочное руководство, содержащее обсуждение и описание многих методов общей бактериологии.

Включает разделы, посвященные росту, культуральным средам, кислороду, двуокиси углерода и анаэробиозу, стерилизации, световой микроскопии, количественному определению, генетическим методам.

Norris J. R„ Ribbons D. W. (ей.). Methods in microbiology, vol. 1— 13, Academic Press, Inc., New York, 1969—1979.

1,2, ЗА, 5A, 5Б, 6A, 6Б, 7А, 7Б, 8 и 9 посвящены методам общей бактериологии, т. 4— микологии, т. 10—13 — методам типнрования в эпидемиологии патогенных бактерий. В каждом томе даио содержание предыдущих томов. Стиль изложения у разных авторов различен, но чаще всего это подробный обзор с многочисленными ссылками иа оригинальные статьи.

Rose N. R., Friedman Н. (ed.). Manual of clinical immunology, 2nd ed, American Society for Microbiology, Washington, D. C., 1980.

Singleton P., Sainsbury D. Dictionary of microbiology, John Wilson & Sons, Inc., New York, 1978.

Полезная энциклопедия терминов, тестов, методов, таксонов, теоретических взглядов и т. д. Объем — 481 с. Статьи энциклопедии — от кратких определений до сжатых обзоров — охватывают широкую область теоретической и прикладной микробиологии, включая биохимию и генетику.

Society of American Bacteriologists, Committee on Bacteriological Technique. Manual of microbiological methods, McGraw-Hill Book Co., Inc., New York, 1957.

Эта книга объемом в 315 с. по-прежнему остается полезной, особенно ценны главы, посвященные методам окрашивания, приготовления сред и рутинным тестам, используемым при идентификации бактерий.

Часть I

МОРФОЛОГИЯ

ВВЕДЕНИЕ

Р. Мюррэй

Микроскопы и использование эффективных методов микроскопии определяют основы микробиологии как одного из разделов биологической науки. Бактериология, в частности описательная, вобрала все достигнутое в области совершенствования микроскопических методов как простых, так и сложных, потому что вездесущие прокариотические организмы, с которыми она имеет дело, представляют собой действительно маленькие клетки. В настоящее время, когда клеточные компоненты можно изучать на уровне макромолекул и отдельных функциональных элементов, а некоторые процессы, происходящие в клетке, могут быть исследованы в клеточных фракциях, значительно возросли роль и частота применения методов анализа с высоким разрешением, в частности электронной микроскопии. Однако микроскопия, на каком бы уровне она ни осуществлялась, естественно, не исчерпывает всех возможностей исследования бактерий (или их компонентов) в природных местообитаниях или лабораторных культурах.

В первой части описаны подходы, которые, мы надеемся, читатель оценит как наиболее полезные и гарантирующие успех. Нам хотелось бы познакомить читателя с опытом многих исследователей, работающих в области бактериологии, и тем самым пополнить имеющиеся у него знания о бактериях. Главная же наша цель заключалась в том, чтобы показать, как сделать микроскоп, световой или электронный, более полезным, эффективным и ценным в работе. В иллюстративном материале особой нужды нет, так как основные параметры и устройство микроскопов подробно разбираются в учебниках и в цитируемой литературе, имеющейся в каждой главе. Поэтому мы приведем по возможности ясное описание пригодных, на наш взгляд, методик и акцентируем

ВВЕДЕНИЕ

внимание на возможных ошибках и трудностях. Одновременно мы пытаемся подчеркнуть, что многое можно сделать на очень простом оборудовании, причем умение приходит с опытом, который ничем не заменишь.

Световой микроскоп доступен и необходим всем микробиологам, но, поскольку его эффективное использование достигается не так уж часто, мы приводим в гл. 1 подробные рекомендации, знание которых необходимо каждому. В гл. 2 и 3 описывается использование светового микроскопа для получения информации о детальной структуре и для идентификации бактерий. Электронный микроскоп устроен значительно сложнее, чем световой. Как правило, его обслуживанием и регулировкой занимаются специалисты-профессионалы, которые инструктируют, помогают и дают советы. Поэтому в гл. 4 большое внимание уделяется методическим аспектам подготовки препаратов для микроскопии. Для успешного продолжения работы, начинающейся с разрушения бактериальных клеток и их фракционирования, описываемых в гл. 5, нужна как световая, так и электронная микроскопия. При этом в качестве главного средства контроля чистоты субклеточных фракций и установления связи между структурой и функцией применяется электронный микроскоп.

Глава 1

СВЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ

Р. Мюррэй, К. Робиноу

Микроскопические исследования проводить легко и интересно, а их результаты отличаются четкостью, когда под рукой имеются микроскопы по крайней мере четырех различных типов. Лучше всего, если они постоянно готовы к работе и содержатся в порядке. Речь идет о 1) обычном, хорошо, но без излишеств оснащенном микроскопе, нужном для оценки в самом первом приближении, 2) фазово-контрастном микроскопе, 3) оптимально оборудованном микроскопе, настроенном на высокое разрешение деталей и приспособленном для фотографирования, и 4) люминесцентном микроскопе. Конечно, возможны различные сочетания, а иногда нужды исследователей удовлетворяются и при более ограниченном выборе.

В продаже имеются самые разнообразные микроскопы. Те из них, что производятся на лучших заводах, примерно одинаковы по качеству, а количество предлагаемых для них дополнительных приспособлений более чем достаточно. Они различаются главным образом конструкцией опорной части, и их выбирают исходя скорее всего из соображений удобства и личных симпатий. По-настоящему хорошие микроскопы дороги. Приложив усилия, можно делать хорошие работы на микроскопе общего назначения или даже на студенческом микроскопе, если оборудовать их первоклассной оптикой. Однако при этом трудно состязаться с работами, выполненными на приборах, которые поставляются лучшими фирмами- изготовителями, Выбор может зависеть также от технических требований. Всегда рекомендуется проводить прямые сравнения разных микроскопов и приспособлений на собственном материале при используемых в работе условиях. Поэтому нет необходимости обращать внимание на то, кем сделан инструмент. Главное — чтобы работа на хорошем микроскопе (независимо от времени

его изготовления) доставляла удовольствие, а широкий выбор приспособлений и умение пользоваться ими способствовали экономии времени и точности результатов. Применение плохо настроенных микроскопов с плохим освещением настолько широко распространено, что лишь немногие биологи представляют себе возможности микроскопа. Иногда исследователи приходят в изумление, когда им удается получить очень большое разрешение даже на студенческом микроскопе. Это возможно в том случае, если использовать принципы, изложенные в разд. 1.1 или 1.3 и 1.3.1.

ОБЫЧНАЯ МИКРОСКОПИЯ

Микроскопы, которые используют в общих целях в учебной комнате, в исследовательской лаборатории или в клинической лаборатории, могут иметь разные марки, обладать разным качеством и предназначаться для разных условий. В бактериологии вопросы, на которые можно ответить с помощью микроскопа, формулируются следующим образом. Обладают ли изучаемые объекты размером бактерий и окрашиваются ли они так же, как бактерии? Однородны ли они по форме и размеру? Какие это бактерии — грамположительные или грамотрица- тельные? Организмы или клетки одного или более чем одного типа присутствуют в препарате? и т. д. Для выяснения этих вопросов самые первые наблюдения можно, как правило, проводить, не достигая высшей степени разрешения. Сначала исследователя может удовлетворить и упрощенная процедура, поскольку хорошо известно, что для получения более высокого разрешения улучшения можно добиться почти на каждом этапе исследования.

Микроскоп (рис. 1.1) должен иметь:

Окуляры по крайней мере 10-кратного увеличения. Вместе с тем для детальных исследований бактериальных структур нужны компенсационные окуляры с большим увеличением (12Х или 15х). Они закрепляются в тубусе микроскопа, который имеет фиксированную или регулируемую длину (до 180 мм или до величин, рекомендуемых заводом-изготовителем).

Рис. 1.1. Обычный оптический микроскоп, используемый для повседневной работы. 1 — тубус; 2 — револьвер со сменными объективами; 3— иммерсионный объектив 40Х; 4— безыммерсиоиный объектив 40Х; 5 — безыммерсиоиный объектив ЮХ; 6— предметный столик; 7— предметное стекло (объект); 8— окуляр; 9— макровинт; 10 — микровиит; 11— препаратоводитель; 12— штатив; 13 — конденсор; 14 — регулятор ирисовой диафрагмы; 15 — конденсорный винт; 16 — зеркало (плоская сторона); 17— лампа; 18— основание.

Слабые безыммерсионные объективы (10Х и 40Х), которые необходимы для микроскопирования растущей культуры и для нахождения потенциально интересных полей зрения в препарате.

Ахроматический иммерсионный объектив (от 90X до 100Х), для которого иммерсией служит масло.

Предметный столик с механическим препаратово- дителем или простыми пружинными зажимами. Если микроскоп снабжен препаратоводителем, последний должен легко сниматься, чтобы можно было просматривать под малым увеличением чашки Петри или окрашиваемые на предметных стеклах препараты.

Находящийся под столиком высококачественный конденсор (апланатический конденсор с тремя линзами

с предпочтительной числовой апертурой от 1,3 до 1,4). Конденсор этого типа необходим для объективов, с которыми работают при масляной иммерсии, поскольку он обеспечивает требуемое для них количество и качество света. Конденсор должен иметь ирисовую (апертурную) диафрагму, находящуюся под нижней линзой.

Источник света, либо смонтированный внутри микроскопа и имеющий ограниченную регулировку, либо (что предпочтительнее) внешний и перемещаемый. В последнем случае под конденсором монтируется зеркало (плоское с одной стороны и вогнутое с другой), положение которого можно менять; свет направляется вверх по оптической оси микроскопа за счет наклонного положения зеркала. Из множества различных ламп для большинства работ подходит круглая матовая лампа, над которой располагается линза типа «бычий глаз». Однако при исследовании окрашенных препаратов, особенно при освещении по Кёлеру (разд. 1.3.1), изображение значительно улучшается, если использовать лампу, которая дает четкое изображение источника света, снабжена держателем для светофильтра и ирисовой полевой диафрагмой. Проекционные лампы со спиральной нитью (дающие неравномерное изображение) нужно фокусировать на матовое стекло, служащее рассеивающей перегородкой и расположенное в держателе для светофильтра лампы; затем путем регулировки отражателя, находящегося в корпусе лампы, следует сместить одно из двух изображений нити так, чтобы витки одного приходились на промежутки между витками другого, и путем небольшой расфокусировки добиться возможно более однородного и яркого освещения поверхности, служащей источником света.

При работе с микроскопом выполняются следующие операции:

В положении, когда окуляр и объектив 10Х занимают свои места, конденсор почти полностью поднят до уровня предметного столика, а апертурная диафрагма в конденсоре полностью открыта, зеркало поворачивают таким образом, чтобы направить свет вверх по оптической оси. Макровинтом устанавливают объектив в положение, при котором источник света находится в фокусе, после чего выводят его в центр с помощью зеркала.

При микроскопировании, как правило, используют плоское зеркало.

Помещают предметное стекло с препаратом на предметный столик и фокусируют объектив до получения резкого (не обязательно хорошо освещенного) изображения объекта, которое следует максимально улучшить регулировкой апертурной диафрагмы и положения конденсора.

По нашему опыту лучший способ определить оптимальное положение конденсора состоит в следующем. Снимают окуляр и смотрят через тубус на заднюю поверхность линзы объектива. В это же время регулируют положение конденсора таким образом, чтобы освещение объектива было самым полным и равномерным. Любое нарушение центрировки можно выявить и исправить поворотом зеркала. Затем уменьшают блики, закрывая диафрагму конденсора (если она есть) как раз настолько, чтобы освещенный участок задней линзы объектива только-только начал уменьшаться. Эту операцию выполняют для каждого объектива при первоначальной фокусировке на данный объект.

Возвращают окуляр на место и производят окончательную регулировку, добиваясь наилучшего освещения.

Поворотом револьвера с объективами устанавливают любой другой объектив. Многие фирмы, производящие микроскопы, поставляют парафокальные объективы (т. е. объективы, у которых фокальные плоскости почти совпадают). При установке остается достаточный зазор для безыммерсионных объективов. Если же объективы не парафокальны, перед фокусированием иммерсионных объективов, имеющих малые фокальные расстояния, нужно слегка приподнять тубус микроскопа. Зазор становится еще меньше, если препарат накрыт покровным стеклом.

Если смотрят препарат с иммерсией, то наносят каплю масла на стекло с препаратом (в центр препарата) перед тем, как поместить его на предметный столик. Если же предварительно требуется отыскать нужное поле зрения при малом увеличении, то каплю масла удобно нанести, когда револьвер находится в промежуточном положении при переходе с одного объектива на

другой, перед тем как иммерсионный объектив окажется над каплей с маслом.

Чтобы научиться обращаться с иммерсионным объективом и фокусировать его, нужен некоторый практический навык и осторожное обращение с микроскопом (разд. 1.5 и 1.6), даже если передняя часть объектива способна вжиматься в целях защиты как линзы, так и предметного стекла от микроскописта с плохими руками. Глядя сбоку на предметное стекло, опускают объектив до поверхности масляной капли, а затем еще немного. Объектив опускают осторожно при помощи макровинта и следят за появлением изображения препарата, глядя в окуляр. После того как оно появляется, пользуются микровинтом. Настраивают освещение, как описано ранее, и подбирают оптимальное на свой глаз.

Если изображение неясное, плывет или только тусклое и нерезкое, значит, что-то сделано неправильно. Может быть, нуждается в очистке фронтальная линза объектива (для этого используют бумагу для линз). С иммерсионными объективами часто получается плохая картина из-за пузырьков воздуха в масле (пузырьки легко выявляются, если снять окуляр и посмотреть вниз через тубус). В этом случае поднимают объектив или поворачивают револьвер, чтобы вытереть с объектива масло (обычно пузырьки переходят на объектив) и вновь фокусируют изображение. Причиной плохого изображения может также служить случайно закрытая диафрагма, сдвинутая лампа или зеркало. Устранение других возможных неполадок см. в разд. 1.7.

Помните и выполняйте следующие простые правила работы с микроскопом.

Правило 1. Сфокусированное изображение должно быть хорошо освещено.

Правило 2. Если света слишком много, применяют нейтральный светофильтр или отодвигают подальше источник света. Для иммерсионных объективов, имеющих большую апертуру, важно избежать уменьшения освещаемой области опусканием конденсора или прикрыванием апертурной диафрагмы конденсора более чем на 10%, хотя это может оказаться полезным при использовании безыммерсионных объективов с маленькой апер-

турой и при просматривании живых неокрашенных клеток.

Правило 3. Если для объектива, который хотят использовать, света не хватает, то причина кроется либо в том, что свет чем-то заслонен, либо в том, что не подходит данная система освещения. В последнем случае следует заменить лампу или конденсор.

Правило 4. Исследуемый препарат должен быть частью (почти) однородной оптической системы и залит маслом, водой или соответствующей средой. Никаких деталей нельзя различить в высушенных окрашенных пленках бактерий, рассматриваемых с помощью безым- мерсионного объектива.

Правило 5. Линзы должны быть всегда чистыми и не- запыленными, без следов пальцев, носа и туши с накрашенных ресниц.

Отдельные живые бактерии, дрожжевые клетки или грибные гифы хорошо видны даже при просмотре через дно чашки Петри с объективом 10Х. При этом природа и состояние исследуемого материала устанавливаются без каких-либо дополнительных манипуляций. Здесь стоит сделать два следующих замечания, существенных при работе с чашками Петри: 1) лучшее освещение при обследовании чашки через дно обеспечивается использованием вогнутого зеркала и 2) искажение изображения за счет царапин на стекле или неровностей дна чашки в области, находящейся под микроскопом, можно устранить с помощью капли иммерсионного масла; каплю накрывают покровным стеклом, благодаря чему обеспечивается однородный световой путь и скрываются дефекты поверхности.

ФАЗОВО-КОНТРАСТНАЯ МИКРОСКОПИЯ

Микроскоп, который собран и постоянно используется для фазово-контрастной микроскопии, следует предпочесть тому, который работает и как фазово-контрастный и как обычный (после соответствующей замены оптики) на том же штативе. Для фазово-контрастной микроскопии требуется много света и гораздо большая оснащенность по сравнению с обычной микроскопией окрашен-

ных препаратов. Для уменьшения неизбежных хроматических аберраций пользуются зеленым светофильтром.

Существенным является центрирование фазовой пластинки, находящейся в конденсоре, по отношению к пластинке в задней фокальной плоскости объектива. Центрирование достигается проецированием их обеих при помощи фокусирующего окуляра («телескопа»), и приведением к центру создаваемой ими системы колец, для чего пользуются двумя регулировочными ручками по бокам конденсора.

Одно из преимуществ фазово-контрастной микроскопии перед темнопольной, которая применяется в настоящее время реже, заключается в полном использовании апертуры объектива, что влечет за собой необходимость применения самых высококачественных фазово-контрастных объективов. Это в свою очередь предполагает использование конденсора с достаточно большой апертурой и, так же как и раньше, применение компенсационных окуляров с увеличением 15х или даже 20X, способных реализовать то высокое разрешение, которое дают объективы. Вполне доступны фазово-контрастные иммерсионные объективы средней силы (40Х—60Х), которые дают хорошо очерченные полноценные изображения при работе с мицелием грибов и другими большими клетками. Наилучшие результаты получают, применяя объективы с увеличением 90Х и 100Х и числовой апертурой больше 1,0, используя иммерсию. Однако удовлетворительные результаты фазово-контрастная микроскопия дает и без применения иммерсии, например при подсчете бактерий, простейших и спор, проверке подвижности или при определении размера и формы. В том случае, когда хотят увидеть детальную внутриклеточную организацию живых организмов, следует обратить внимание на преломляющие свойства среды, в которой рассматриваются клетки; наилучших результатов достигают при добавлении в среду желатины до 15—30%. При этом показатели преломления среды и внутриклеточного содержимого становятся одинаковыми или почти одинаковыми, а фазовая задержка пропорциональна показателю преломления, умноженному на световой путь. В этих условиях уменьшаются также ореолы.

МИКРОСКОПИЯС ВЫСОКИМ РАЗРЕШЕНИЕМ

Под «исследовательским микроскопом» имеют в виду микроскоп, позволяющий выявлять тонкую детальную структуру при большом увеличении. Он не предназначен для оценки результатов окраски по Граму, зато он помогает разрешать вопросы, которые касаются жгутиков и другого материала, требующего выявления тонких деталей. В этих целях самое пристальное внимание следует уделить качеству оптики. Чтобы достичь высокого разрешения, а также устранить хроматические и сферические аберрации, нужно с вниманием отнестись к основополагающим принципам.

Разрешение (R) есть наименьшее расстояние между точками детали в препарате, которые еще не сливаются в изображении, видимом в микроскоп или на фотографии. R = V2-(ч. а.), где % — длина волны применяемого света, а ч. а. — числовая апертура — мера светособирающей способности объектива. Для получения наименьших значений R следует применять коротковолновый свет, хотя, к сожалению, свет наиболее эффективной части спектра (а именно ультрафиолет в области 365 нм) не воспринимается глазом и не проходит через стекло. Чтобы использовать преимущества ультрафиолетового света, например в случае люминесцентной микроскопии, нужна оптика из кварца или плавикового шпата (флюорита) и необходимы непрямые методы наблюдения. Наилучшие результаты с видимым светом получают в желто-зеленой области спектра, поскольку аберрации объективов минимизируются именно для этой области длин волн. С точки зрения разрешения эта область, однако, является сравнительно длинноволновой.

Числовая апертура иммерсионного объектива обычно составляет 1,30 или 1,32, у наилучших объективов она достигает 1,4. Она представляет собой произведение синуса половины угла между крайними лучами пучка света, входящего в объектив, на показатель преломления среды, через которую свет проходит к объективу. Максимальное значение, которое может принимать функция синуса, не превышает 1,0, но показатель преломления среды, через которую свет проходит к объективу, можно

увеличить до значения показателя преломления оптического стекла (т. е. до 1,5150) применением иммерсионного масла. Именно это позволяет нам поднять числовую апертуру до значений выше 1,0 и, создав определенные условия, полностью использовать разрешающую силу дорогостоящих объективов со значениями апертур 1,30 или 1,32, выбитыми на их сверкающих оправах. Ахроматические и апохроматические объективы с большой числовой апертурой исправлены на сферическую аберрацию и на хроматическую аберрацию для двух или трех цветов в центре поля зрения (где в основном проводится работа при большом увеличении). Объективы обоих типов работают почти одинаково хорошо, оправдывая свою цену, особенно когда применяются узкополосные (интерференционные) светофильтры.

Объективы, наиболее подходящие для выполнения поставленной задачи, важно дополнить окулярами соответствующего качества. Для этого нужны компенсационные окуляры, названные так потому, что «они рассчитаны на исправление боковой хроматической ошибки, возникающей при увеличении в линзах объективов с большой апертурой и хорошей коррекцией аберраций» [3]. Имеющийся опыт подтверждает правильность совета Шилабера [9], согласно которому «компенсационные окуляры должны иметь большую силу, желательно 15х или 20X. Возможности применения апохроматических объективов в сочетании с высокоразрешающими окулярами должны использоваться полностью; в противном случае тонкие детали, которые с их помощью могут быть выявлены на микрофотографиях, останутся невыясненными». Для тех, кто носит очки с сильными линзами, удобно и полезно приобрести специальные окуляры, с которыми можно работать в очках.

Оптимальная работа высокоразрешающих объективов зависит от оптимального освещения. Поле зрения должно быть освещено равномерно, яркости должно хватать для фотографирования. Свет от спиральных нитей ламп распределяется по их поверхности и, следовательно, по их изображению неравномерно, если он не рассеивается специальным матовым стеклом. Самыми лучшими бесструктурными источниками света стандартной яркости являются небольшие ртутные или цирконие-

вые дуговые лампы и менее дорогие удобные проекционные лампы с вольфрамовой бусинкой или ленточной нитью, изображение которых может целиком заполнить конденсор. Для широко применяемой системы освещения по Кёлеру (разд. 1.3.1) требуется оснастить лампу микроскопа двумя дополнительными устройствами: системой линз, способной проецировать резкое изображение источника света на входную плоскость конденсора, и находящейся перед этими линзами ирисовой полевой диафрагмой (см. ниже методику Кёлера). Нейтральные светофильтры (оптические пластины с алюминиевым покрытием) позволяют регулировать яркость до удобного для глаза уровня, а цветные светофильтры сужают спектр используемых для освещения длин волн. Имеются два вида цветных светофильтров: дорогие интерференционные светофильтры, пропускающие узкую область спектра и состоящие из двух полупосеребренных пластин со строго определенным зазором между ними, и рэтен-фильтры (Kodak), состоящие из двух квадратных стеклянных пластин (сторона квадрата 5 см) с полировкой оптического качества, между которыми заключен слой окрашенной желатины. Со временем эти светофильтры подсыхают из-за проникновения воздуха с ребер, однако они выпускаются в широком ассортименте цветов и плоскостей и являются ценными принадлежностями микроскопа. Красный светофильтр (рэтен № 29) или оранжевый светофильтр (рэтен № 22) делают плотные структуры прозрачными, а структуры, окрашенными голубыми красителями, более контрастными. Зеленый светофильтр (рэтен № 58В) применяется чаще других в связи с тем, что именно к зеленому цвету наиболее чувствительна наша сетчатка, а также потому, что обычно используемые в гистологических исследованиях красители имеют красный цвет и при наблюдении через зеленый светофильтр контраст изображения сильно возрастает.

Зеркала с задней отражающей поверхностью (т. е. имеющие зеркальную поверхность за слоем стекла) хороши в повседневной работе и долговечны. Однако они не дают оптимального освещения, поскольку отражения источника света с передней поверхности стекла и с задней, где находится отражающий слой металла, не совпадают и перекрываются. То же происходит с изображе-

нием отверстия полевой диафрагмы, когда к окончательно получаемому изображению добавляется нежелательный рассеянный свет (методика Кёлера). Зеркала же с передней отражающей поверхностью не имеют защитного покрытия и дают лишь единственное отражение.

Самый важный элемент на пути света от лампы к объективу и к глазу — это конденсор, находящийся под предметным столиком. Апертуры объективов со значениями от 1,30 до 1,32 будут полностью эффективны только в том случае, если числовая апертура конденсора равна им по величине или больше. Такие конденсоры также обычно бывают ахроматическими или апланати- ческими, соответствуя в этом отношении описанным выше объективам. Здесь следует вспомнить о роли показателя преломления в выражении для числовой апертуры: разрешающая способность объективов с большой числовой апертурой реализуется только тогда, когда среда, через которую проходит свет после его поступления в конденсор и прохождения через объект и систему линз объектива, является однородной и стеклоподобной на всем пути. Иными словами, высокое разрешение получают тогда, когда иммерсионное масло находится между конденсором и предметным стеклом, а не только между покровным стеклом и линзой объектива.

Если в исследовательском микроскопе все налажено: окуляр, объективы, конденсор соответствующего качества, зеркало с передней отражающей поверхностью, на которое от яркого однородного источника поступает свет, прошедший через зеленый светофильтр, — он готов к работе. Чтобы проявились все его достоинства, необходима только хорошая подготовка препарата.

Освещение по Кёлеру

Для иммерсионного объектива освещение по Кёлеру (почти оптимальное освещение) достигается следующим образом:

Фокусирование изображения нити лампы осуществляют с помощью белого листка, помещаемого на зеркале под конденсором. При этом лампу располагают так, чтобы изображение нити (предпочтительно ленточной) целиком заполняло отверстие конденсора; это можно увидеть, убрав листок с зеркала.

Для визуальных наблюдений на пути света устанавливают соответствующие светофильтры. Полностью открывают все диафрагмы. Если используется лампа со спиральной нитью, то вблизи конденсора (разд. 1.1) помещают матовое стекло.

На конденсор наносят масло (одну каплю масла с высокой вязкостью) и поднимают его до соприкосновения с такой же каплей, нанесенной на предметное стекло (разд. 1.5).

При снятом окуляре приблизительно центрируют освещение глядя на заднюю линзу объектива с маленьким увеличением, в фокусе которого находится препарат. При этом регулируют положение зеркала и конденсора на максимальное центрирование и равномерное освещение. Пузырьки воздуха в масле и другие помехи общего характера легко выявляются в этих условиях и должны быть по возможности устранены (разд. 1.1).

Вставляют окуляр и просматривают препарат в целом, чтобы найти интересующие области.

На покровное стекло наносят масло (разд. 1.5), меняют объектив на иммерсионный и устанавливают фокус.

Делают отверстие диафрагмы лампы минимальным и фокусируют его край конденсором в плоскости препарата (при этом в фокусе находятся и объектив, и конденсор). Вновь регулируют отверстие диафрагмы лампы так, чтобы ее край совпадал с краем поля зрения.

Замечание. Если по краям диафрагмы лампы образуется неравномерная цветная бахрома, то конденсор требует центровки. Для этого поворотом двух его регулировочных ручек следует смещать конденсор в ту сторону, где бахрома окрашена в красный цвет, центрируя апертуру зеркалом по мере движения. Смещение прекращают, когда цвета бахромы распределятся симметрично.

Удалив окуляр (увеличение которого должно быть не меньше 12Х или 15Х) и глядя вниз через тубус, уменьшают апертурную диафрагму конденсора, чтобы устранить блики и отражения. Уменьшение не должно составлять больше Vio диаметра задней линзы объектива; чрезмерное уменьшение снижает разрешающую способность.

Вставляют окуляр и устанавливают соответствующие светофильтры для визуальных наблюдений или фотографирования.

Те же принципы применяются и к безыммерсион- ным объективам, но в этом случае нет необходимости наносить иммерсионное масло на конденсор, если качество последнего удовлетворительное.

ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ

В люминесцентном микроскопе к оптике предъявляются те же требования, которые были описаны выше в случае обычного исследовательского микроскопа. Различия в эксплуатации и конструкции относятся к генерированию и передаче света с длинами волн, пригодными для возбуждения флуоресцирующих красителей (флуорохромов) или естественной флуоресценции в объекте, а также к детектированию света для тех длин волн, которые возникли в объекте в результате флуоресценции. Поскольку для возбуждения нужны, как правило, малые длины волн в области, близкой к ультрафиолетовой, лампа (обычно ртутная дуговая лампа высокого давления), линзы конденсора и любые другие линзы на пути от лампы к объекту должны быть изготовлены из материала (обычно флюорит), хорошо пропускающего свет таких длин волн. Существенным моментом является использование зеркала с передней отражающей поверхностью (без стеклянного слоя). Иммерсионное масло для объектива и конденсора не должно флуоресцировать (например, специальное синтетическое масло или масло сандалового дерева).

Самое главное для микроскописта — правильно расположить светофильтры на пути света. В приборах разных фирм-изготовителей светофильтры расположены по-разному, однако для них существуют следующие общие принципы:

Между объективом и окуляром должен находиться запирающий светофильтр, отсекающий ультрафиолет. Этот светофильтр защищает глаза от вредного воздействия ультрафиолета.

Между лампой и объектом должны располагаться возбуждающие и задерживающий светофильтры. Воз-

буждающие светофильтры представляют собой интерференционные фильтры с узкой областью пропускания (например, 365 нм), соответствующей используемому флуорохрому. Они непрозрачны для большей части видимого света, и поэтому фон, видимый глазом при просмотре препарата, получается черным или темно-синим. Задерживающий светофильтр отсекает ультрафиолет, ио пропускает видимый свет, что необходимо для выбора поля зрения и предварительной фокусировки при обычном освещении.

Системы освещения могут быть разных типов: 1) с передачей света через конденсор, находящийся под предметным столиком, 2) темнопольное освещение с использованием специального конденсора и 3) верхнее освещение через объектив. Системы второго и третьего типа обладают преимуществами эффективной темнопольной системы, поскольку возбуждающий пучок не дает избыточного постороннего света для глаза и не мешает выявлению более слабого флуоресцентного света от образца. В системе третьего типа конденсором служит объектив, вследствие чего отпадает проблема центрирования. Одновременно при этом сводятся к минимуму потери слабого излучения флуоресценции, обусловленные поглощением в толще образца. Возбуждающий пучок отражается вниз по направлению к объективу с помощью светоделительного зеркала, которое находится в боковом окне тубуса микроскопа. Это зеркало отражает свет с возбуждающими длинами волн, но пропускает видимый свет, функционируя, таким образом, в качестве барьерного светофильтра.

Клетки или другой исследуемый материал реагируют с флуорохромами (например, с ксантиновыми, акридиновыми, хинолиновыми производными и т. д.) как с красителями, а также с веществами, которые высвобождают флуорохромы (например, флуоресцеин). Это позволяет проводить локализацию и распознавание антигена. О том, как обращаться с микроскопом и светофильтрами, а также о необходимых предосторожностях лучше всего узнать у человека, имеющего опыт работы с микроскопом, или прочитать в руководствах, выпускаемых изготовителями. Получаемые результаты можно фиксировать на пленке, цветной или черно-белой.

В связи с тем, что: 1) выход флуоресценции мал (меньше 1 : 100), 2) флуоресцирующая часть образца незначительна (в большинстве случаев) и 3) для большинства флуорохромов характерна тенденция флуоресценции к затуханию со временем, интенсивность флуоресценции, как правило, низка и поэтому мы рекомендуем следующее:

Работать в темноте или в хорошо зашторенной комнате.

Не применять линз и светофильтров, в которых нет необходимости (не нужно и матовое стекло у осветителя), и укорачивать световые пути настолько, насколько позволяет система.

В случае вспомогательных линз проверять, в каком положении они дают наибольшее количество света. Полностью открывать конденсорную (апертурную) диафрагму.

Использовать окуляры малого увеличения (8Х), поскольку интенсивность воспринимаемого флуоресцентного света находится в обратной экспоненциальной зависимости от общего увеличения.

Для фотографирования использовать высокочувствительные пленки.

Если имеется возможность, пользоваться верхним, а не нижним освещением.

ИММЕРСИОННЫЕ МАСЛА

Иммерсионные масла предназначены для использования с иммерсионными объективами, благодаря чему передней линзе объектива обеспечивается среда с необходимыми преломляющими свойствами. Их показатель преломления близок к показателю преломления стекла, поэтому масло и стекло составляют однородную систему. Иммерсионные масла «проясняют» также высушенный на стекле бактериологический препарат благодаря тому, что они проникают в окрашенные клетки и покрывают их.

Имеющиеся в продаже масла, рекомендованные изготовителями микроскопов, проверены и с гарантией не оказывают кислотного или растворяющего воздействия на линзы или их крепления; заменители не рекомен-

дуются, их использование может привести к ложной экономии. Выбор масла зависит от конкретных требований. Может, например, потребоваться особо вязкое масло, если нужно, чтобы оно заполняло очень широкие промежутки или не вытекало при работе с горизонтальным или обращенным микроскопом, а для люминесцентной микроскопии особенно важно, чтобы масло возможно меньше флуоресцировало. Для общих целей предпочитают масло с высокой вязкостью (мы используем масло типа В с вязкостью 1250 сП фирмы Cargille Laboratories Inc., Cedar Grove, NJ 07009), которое почти не стекает и не растекается. Единственная трудность, порождаемая высокой вязкостью, заключается в более длительном удержании маслом пузырьков воздуха, но этого можно избежать.

Иммерсионные объективы следует всегда протирать после использования или по крайней мере в конце рабочего дня. Современные неокисляющиеся масла доставляют меньше забот, чем традиционное кедровое масло (которое затвердевает и оставляет неприятные следы), но и они все же претерпевают медленные изменения; к тому же они могут затечь куда не следует.

Предупреждение. Масла безопасны в работе, но до 1972 г. в их состав часто входили производные полихлорированного дифенила, которые в настоящее время признаны канцерогенными и токсичными; поэтому просмотрите старые пузырьки!

Никогда не берите масла больше, чем нужно (обычно хватает одной капли). Хороший пузырек для масла помогает уменьшить беспорядок в работе. Используйте либо сжимаемый пузырек, либо стеклянный пузырек с широким основанием и приспособлением для нанесения масла (стеклянная палочка или проволочная петля), которое прикреплено к крышке пузырька. Среди лучших вариантов укажем двухкамерный пузырек, в котором крышка превращена в емкость для масла, а внизу содержится ксилол для протирки.

Приведение в контакт конденсора с нанесенным на него маслом и предметного стекла может быть самой трудной операцией для тех, у кого не очень хорошие руки. Масло должно обладать высокой вязкостью, и при работе с ним необходимо соблюдать некоторые предо-

Сторожности как при установке, так и при удалении препарата. Лучше всего действовать так:

Нанести каплю масла на верхнюю линзу конденсора, после чего опустить конденсор ниже уровня предметного столика. При нанесении капли следить за тем, чтобы в масло не попадали пузырьки воздуха.

Нанести каплю масла на нижнюю сторону предметного стекла под тем местом, которое вы хотите просмотреть.

Опустить предметное стекло на предметный столик микроскопа так, чтобы капля оказалась в центре отверстия, и придерживать предметное стекло, подгоняя препаратоводитель или зажимы, которые должны его фиксировать.

Поднять конденсор так, чтобы обе капли встретились и чтобы его верхняя линза была полностью покрыта маслом.

Установив нужный объектив на фокус, настроить конденсор, чтобы получить освещение по Кёлеру (разд. 1.3.1).

При разборке системы, прежде чем убрать предметное стекло с образцом, следует опустить конденсор. В результате активных боковых перемещений масло может затечь под предметный столик. Об этом нужно помнить и каждый раз проверять, протирая после работы специальной бумагой верхнюю линзу.

Для нанесения иммерсии годятся только конденсоры с несъемной или навинчивающейся верхней частью. Наносить масло на подвижную верхнюю часть некоторых «универсальных» конденсоров (т. е. часть, которую с помощью рычажка отводят в сторону при работе с низким увеличением) нужно в высшей степени осторожно или не наносить его совсем.

УХОД ЗА микроскопом

Микроскопы отличаются прочностью и долговечностью. При надлежащем уходе и некоторой защите (особенно от неблагоприятного воздействия содержащего кислоты воздуха некоторых лабораторий) они прослужат положенный им срок или даже больше. Однако

для этого необходимо выполнять следующие правила по уходу за микроскопом.

Защищать микроскоп от попадания песка и пыли. Следует зачехлять микроскоп, когда он не используется; лучше всего использовать жесткий прозрачный стеклянный или пластмассовый колпак, вмещающий в себя микроскоп и его принадлежности. Не допускать скопления пыли, которая может проникнуть в линзы и механические части микроскопа.

Чистить и смазывать движущиеся части, особенно реечный механизм и шестерни (подойдет смазка для шестерен игрушечных поездов, имеющихся в соответствующих магазинах) следует по возможности реже. Не следует использовать для несущих поверхностей и зубчатых колес в качестве смазки жидкое масло, так как в этом случае тубус или конденсор могут опускаться под собственным весом.

Регулярно чистить предметный столик, вытирать любой пролитый на него материал.

Держать линзы чистыми, особенно тщательно очищать их после работы с иммерсионным маслом. Никогда не пускать в ход пальцы вместо специальной протирочной ткани для линз (см. ниже).

Не пытаться ремонтировать линзы объективов или сложные механизмы с точной настройкой. Лучше предоставить делать это специалистам. Хорошему микроскопу профессиональная чистка и настройка нужна раз в 20 лет или около этого. Те, кто имеет дело с микроскопами, обычно связаны с ремонтными мастерскими или могут порекомендовать их.

Тубус все время должен быть закрыт окуляром, а в объективные гнезда должны быть вставлены объективы или заглушки, чтобы по возможности не допускать попадания пыли в тубус.

Старые, заслуженные микроскопы можно почистить, отремонтировать, если в этом есть необходимость, и снова дать им возможность хорошо служить. Старые латунные корпуса (как они элегантны!) можно протереть сначала тряпочкой, слегка смоченной в масле, а затем сухой. Современную отделку достаточно протирать влажной тряпочкой.

Оптические поверхности требуют специального ухода. В связи с этим должны выполняться некоторые общие правила.

Необходимо иметь достаточный запас ткани для линз («линзовой бумаги»), мягкую щетку (кисточка размером 0,6 см, для акварельных красок), резиновую грушу (с прикрепленной к ней короткой тонкой резиновой трубкой). Все эти предметы должны находиться вблизи того места, где вы занимаетесь микроскопией. Следует содержать эти предметы в чистоте, лучше всего в коробке с крышкой.

Неприставшую пыль легко удалить, смахнув ее кисточкой, сдувая резиновой грушей или протирая тканью оптическую поверхность, на которую лучше предварительно подышать.

Следы от пальцев или другой приставший маслянистый материал и грязь можно вытереть тканью для линз, обернув ее вокруг пальца и слегка увлажнив ксилолом или бензолом. Нельзя заливать линзы растворителями и использовать спирт, эфир или ацетон. Это опасно тем, что последние могут проникнуть в клей между линзами. Если у линзы есть выступающая оправа, края линзы можно очистить линзовой бумагой, навернутой на палочку.

Если ксилол не удаляет грязь, стоит попробовать смочить бумагу дистиллированной водой.

Масло, жидкое и застывшее, эффективно удаляется только что отломленным кусочком пенопласта (распространенный упаковочный материал), если прижать его к передней линзе объектива и производить вращательные движения (способ Пабста, цитируемый Джеймсом [7]). Такая легкость удаления масла обусловлена липофильными свойствами пенопласта. Поскольку ксилол растворяет пенопласт, их нельзя использовать совместно.

Обычно масло с линз объектива и конденсора удаляют линзовой бумагой (большую его часть), а остатки его окончательно снимают бумагой, увлажненной ксилолом.

Никогда не следует разбирать объектив, чтобы почистить составляющие его элементы, так как расстояния между линзами играют очень существенную роль.

Пыль с задней линзы выдувают или снимают очень чистой кисточкой.

Постоянно существующая проблема — это пыль на окулярах, которая дает темные пятна, движущиеся по кругу, когда вы вращаете окуляр. Окуляры устроены довольно просто (верхняя и нижняя линзы с распорной вставкой и диафрагмой между ними), и обе их линзы легко вывинтить. Если при очистке наружных верхней и нижней поверхностей пятна не исчезают, по-видимому, их дают частицы на внутренних поверхностях. Следует обратить особое внимание на поверхности просветленных линз (имеющие антиотражательное покрытие, переливающееся цветами радуги) и с осторожностью применять щеточку или ткань при их очистке.

Нельзя касаться пальцами оптических поверхностей!

Чистые линзы значительно улучшают качество изображения.

НЕИСПРАВНОСТИ

Перечень неисправностей, их причин и способов устранения, приведенный в табл. 1.1, взят из превосходной книги Джеймса [7]. Если все это не подходит к тому, с чем вы столкнулись, нужно обратиться к книгам или к опытному микроскописту (или лаборанту), обслуживающему микроскопы, и выяснить природу неполадки— механической, оптической или кроющейся в исследуемом образце. Если дело в оптике, проверьте ее по порядку вдоль светового пути, начав с лампы и затем переходя к конденсору, образцу, объективу и окуляру. Регулировкой на каждом из этих этапов определите ее влияние на исправность; в этом вам поможет табл. 1.1.

ОПТИМАЛЬНЫЕ УСЛОВИЯ РАБОТЫ

Долгие часы сидения перед микроскопом сильно утомляют исследователя, если он не нашел для работы удобную и прямую позу. Если стол и стул не соответствуют друг другу по высоте, то работающий или сутулится, или слишком вытягивается. При такой ситуации не помогут никакие наклонные тубусы с окулярами. Си-

Таблица 1.1. Распространенные неисправности, встречающиеся в световой микроскопии, их причины и способы устранения [7]

Неисправность

Возможные причины

Способы устранения

Макровинтходит

Неправильная регули-

Для многих видов

слишком тяжело

ровна хода

Загрязнение реечного механизма

штативов регулировка осуществляется легко (обычно перемещением двух регулировочных головок в противоположных направлениях)

Почистить н нанести новую смазку

Тубус или предметный столик самопроизвольно опускаются под собственным весом (изо-

Неправильно отрегулирована зубчатая передача и (или) слишком жидкая смазка

То же

бражение расфоку-

Неисправная система

Действовать, как в

сируется)

наводки на фокус

случае первой неисправности

Микровинт не дви-

Микровипт находится

Установить при помо-

жется в одну из

в крайнем положе-

щн револьверной

сторон

НИН

насадки объектив ЮХ; поместить микровинт в среднее положение и вновь вывести объект в фокус с помощью макровинта

Расфокусировка в ре-

Объективыплохо

Способ устранения

зультате незначи

тельного движения

ввинчены в револьверную насадку

очевиден

микровинта (осо-

К объективу пристало

Применять менее вяз-

бенно при работе

липкое из-за нане-

кое иммерсионное

с иммерсионными

сенного на него

масло; прочнее при-

объективами)

масла покровное стекло

жимать образец

Неисправность

Возможные причины

Способы устранения

Неясное пятнистоеизображение

Четко сфокусированные пятна или точки, смещающиеся и исчезающие при перемещении конденсора вверх и вниз

Неясное изображение, которое нельзя хорошо сфокусировать

Грязь или смазка на окуляре (пятна движутся при вращении окуляра в тубусе) или объективе; загрязнение покровного стекла (пятна движутся при смещении образца) или любой поверхности в системе освещения

Загрязнение источника света или рассеивающего экрана перед ннм, если условия освещения критические, загрязнение крышки встроенного осветителя или прилежащего к нему светофильтра при освещении по Кёлеру

Не та среда перед объективом (масло вместо воздуха, воздух вместо масла, пузырьки воздуха в масле); загрязнение передней линзы объектива, через которую проходит свет

Слишком толстое покровное стекло, чрезмерно толстый слой среды, в которую заключен препарат

Очистить соответствующие поверхности

См. выше; при невозможности достичь загрязненной поверхности с целью ее очистки слегка изменить фокусировку конденсора

Заменить среду; уда-лить загрязнение

Применить объектив с корректирующей втулкой или (что лучше) иммерсионный объектив

Неисправность

Возможные причины

Способы устранения

Поле

зрения

освеще-

Неравномерно расположенные остатки иммерсионного масла на покровном стекле, если используется безым- мерсионный объектив с большим увеличением

Предметное стекло на предметном столике перевернуто препаратом вниз (только в случае объективов с большим увеличением)

Световой путь ча-

Очиститьсухой

тканью или бумагой; избегать ксилола, так как ои может размягчить или растворить среду, в которую заключен препарат

Перевернуть предметное стекло; убедиться в том, что метка с обозначением препарата не наклеена на противоположную сторону

Способ устранения

ИО

не полностью

стичнозаслонен

очевиден

Поле но

зрения освеще- неравномерно

держателем светофильтра

Объектив не зафиксирован в нужном положении

Конденсор (или регулируемые линзы) не находится на оптической оси

Неправильно расположено зеркало

Неотцентрирован

конденсор (при критических условиях освещения)

Неоднородность источника света и (или) рассеивающего экрана при критических условиях освещения

Слегка подвигать конденсор вверх и вниз; поставить перед источником света матовое стекло

Неисправность

Возможные причины

Способы устранения

Через поле зрения проплывает мутное пятно; после этого пропадает фокус изображения (при работе с масляной иммерсией)Четко очерченные яркие пятна в изображенииЧерез поле зрения проплывает мутное пятно; после этого пропадает фокус изображения (при работе с масляной иммерсией)Четко очерченные яркие пятна в изображенииНерезкие яркие пятнав изображенииНерезкие яркие пятнав изображенииПузырек воздуха в иммерсионном масле; масло в плоскости изображения при работе с безым- мерсионным объективомПоперечные отражения внутри микроскопа (часто серповидные или кольцевидные)Продольные отражения в тубусе, приводящие к появлению пятен света более округлой формыЗагрязнение поверхности линз, расположенных выше или ниже объекта, нли воздух в иммерсионном масле на конденсоре (различайте эти случаи, пользуясь приведенными выше разъяснениями)Пузырек воздуха в иммерсионном масле; масло в плоскости изображения при работе с безым- мерсионным объективомПоперечные отражения внутри микроскопа (часто серповидные или кольцевидные)Продольные отражения в тубусе, приводящие к появлению пятен света более округлой формыЗагрязнение поверхности линз, расположенных выше или ниже объекта, нли воздух в иммерсионном масле на конденсоре (различайте эти случаи, пользуясь приведенными выше разъяснениями)Убрать масло с образца и нанести новое. тщательно очистить препарат и объективУбрать масло с образца и нанести новое. тщательно очистить препарат и объективПопробовать другой окуляр, правильно установить освещение по КёлеруПрименить просветленные линзы, сменить пару объектив — окулярПопробовать другой окуляр, правильно установить освещение по КёлеруПрименить просветленные линзы, сменить пару объектив — окулярЕсли не удается установить, где находится загрязнение, нежелательный эффект можно сгладить, открыв побольше диафрагму конденсораЕсли не удается установить, где находится загрязнение, нежелательный эффект можно сгладить, открыв побольше диафрагму конденсораденья должны регулироваться по высоте (включая табуреты в учебных лабораториях). Если работающий отличается высоким ростом, то можно выпилить деревянный брусок определенной высоты и подложить его под микроскоп на стол; в этих условиях его тело будет иметь прямое положение. Главная цель этих подгонок состоит в том, чтобы тот, кто работает с микроскопом, мог смотреть в тубус, минимально изгибая шею или спину. При удобном положении напряжение и неприятные физические ощущения, которые могут возникнуть, сведены к минимуму.

Через поле зрения проплывает мутное пятно; после этого пропадает фокус изображения (при работе с масляной иммерсией)

Четко очерченные яркие пятна в изображении

Через поле зрения проплывает мутное пятно; после этого пропадает фокус изображения (при работе с масляной иммерсией)

Четко очерченные яркие пятна в изображении

Нерезкие яркие пятнав изображении

Нерезкие яркие пятнав изображении

Пузырек воздуха в иммерсионном масле; масло в плоскости изображения при работе с безым- мерсионным объективом

Поперечные отражения внутри микроскопа (часто серповидные или кольцевидные)

Продольные отражения в тубусе, приводящие к появлению пятен света более округлой формы

Загрязнение поверхности линз, расположенных выше или ниже объекта, нли воздух в иммерсионном масле на конденсоре (различайте эти случаи, пользуясь приведенными выше разъяснениями)

Пузырек воздуха в иммерсионном масле; масло в плоскости изображения при работе с безым- мерсионным объективом

Поперечные отражения внутри микроскопа (часто серповидные или кольцевидные)

Продольные отражения в тубусе, приводящие к появлению пятен света более округлой формы

Загрязнение поверхности линз, расположенных выше или ниже объекта, нли воздух в иммерсионном масле на конденсоре (различайте эти случаи, пользуясь приведенными выше разъяснениями)

Убрать масло с образца и нанести новое. тщательно очистить препарат и объектив

Убрать масло с образца и нанести новое. тщательно очистить препарат и объектив

Попробовать другой окуляр, правильно установить освещение по Кёлеру

Применить просветленные линзы, сменить пару объектив — окуляр

Попробовать другой окуляр, правильно установить освещение по Кёлеру

Применить просветленные линзы, сменить пару объектив — окуляр

Если не удается установить, где находится загрязнение, нежелательный эффект можно сгладить, открыв побольше диафрагму конденсора

Если не удается установить, где находится загрязнение, нежелательный эффект можно сгладить, открыв побольше диафрагму конденсора

ФОТОГРАФИРОВАНИЕС ПОМОЩЬЮ МИКРОСКОПА

Возможность точного фиксирования результатов на пленку имеется при всех видах микроскопии независимо от длины волны используемого света. Прежде всего важно выполнять технические требования, благодаря чему возможна наиболее точная регистрация изображений. В целях контроля можно рассмотреть каждую деталь снимаемого изображения, за исключением случая, когда используются совершенно необычные длины волн. Имеются превосходные книги, в которых подробно описываются и разъясняются эти требования [3, 5, 7, 9].

К наиболее общеупотребительным относятся три типа аппаратов:

Насадочная окулярная фотокамера с рулоном пленки (обычно 35 мм). Над окуляром в такой камере обычно располагается светоделительное устройство, позволяющее видеть изображение, чтобы его можно было сфокусировать, через боковой окуляр. Все дополнительные детали помещаются на тубусе микроскопа.

Встроенные фотокамеры, разработанные рядом фирм, изготавливающих микроскопы. Эти фотокамеры имеют экспонометры и устройства для задания выдержки. Обычно они отвечают поставленным целям; к ним прилагаются описания с правилами пользования.

Аппараты старого типа с гофрированными светонепроницаемыми мехами (используются редко). Такой аппарат помещают на подставке рядом с микроскопом и подсоединяют основание мехов к световыводящему патрубку, в свою очередь соединяемому с верхней частью тубуса микроскопа. В верхней части аппарата устанавливается рамка, которая изготавливается либо под обычную пленку, либо под пленку типа Polaroid.

Успех при фотографировании с помощью микроскопа и получении в результате фотоотпечатков во всех случаях зависит от следующих факторов:

Качества препарата, надлежащим образом закрепленного и помещенного точно в фокусе.

Качества оптики, правильно настроенной и освещаемой (метод Кёлера следует предпочесть другим),

позволяющей получать наилучшее из возможных изображений, а также от подбора цветных светофильтров.

Соединения фотокамеры и микроскопа, при котором не должно быть вибраций.

Правильно подобранной пленки и фотобумаги, а также от их обработки, обеспечивающей оптимальный размер зерна при правильном контрасте и диапазоне плотности.

Правильно выбранного общего увеличения.

Как 1-й, так и 2-й пункты уже подробно обсуждались. В 3-м пункте существуют некоторые проблемы, поскольку при сочленении фотографических устройств с тубусами микроскопов образуются и передаются вибрации. Отчасти они возникают оттого, что нажим на спуск затвора сдвигает светоделитель, а затем приводит в действие сам затвор; эти движения порождают сохраняющиеся во времени вибрации. Затвор, задающий время экспозиции, лучше всего расположить между лампой и микроскопом. Вибрация не имеет значения при использовании фотокамер, снабженных мехами, которые создают своего рода световой манжет вокруг окуляра, позволяющий камере и микроскопу быть независимыми и не касаться друг друга. Все же вибрации следует сводить к минимуму, чему помогает прочный, массивный, не касающийся стены стол.

Пленка должна быть панхроматической с чувствительностью 60—100 ед. ASA (чтобы экспозиции находились в хорошо контролируемых пределах), но при фазово-контрастной микроскопии гораздо лучше использовать пленку с большей чувствительностью (300—400 ед. ASA), поскольку уровень освещенности здесь значительно ниже. Экспонометр позволяет воспроизводить выдержки, установленные в контрольном опыте.

Если в вашем отделе или лаборатории собрались выкинуть старый фотоаппарат с мехами, приберегите его, потому что это самый лучший аппарат, позволяющий проводить работы высочайшего качества, пусть и не самый удобный.

Прежде чем печатать микрофотографии, вы должны подумать об общем увеличении и о том, какую деталь вы хотите показать. При обработке пленки следует при-

держиваться инструкций изготовителя, это гарантирует получение хорошего контраста. Зерно на проявленной пленке не позволяет печатать снимки с увеличением больше чем в 2—2,5 раза. В благоприятных условиях при микроскопии обычных бактерий, как правило, получают общее увеличение 1500, что необходимо для выявления тонкой детальной структуры. Поэтому изображения большего размера, получаемые на куске пленки в камере старого образца, для которой при печати обычно достаточно увеличение в 1,25—1,5 раза, лучше, чем значительно более мелкие изображения на 35-миллиметровой пленке. Если полученные микрофотографии по резкости и качеству изображения уступают картине, наблюдаемой в микроскоп, попытайтесь все повторить. Независимо от используемой камеры важна точность фокусировки. При использовании аппарата с мехами удобен такой прием: помещают на место фотопленки (или фотопластинки) плоскую стеклянную пластинку с меткой, нанесенной на ее нижнюю сторону; на эту метку наводят зрительную трубу, глядя в которую, затем регулируют фокусировку всей системы. При желании можно использовать также традиционные матовое стекло и черную накидку.

Фотографии следует увеличивать до формата, позволяющего легко различать важные детали; объект при этом должен занимать большую часть фотографии.

. ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

Книги по световой микроскопии и фотографии в микроскопии легко доступны — от энциклопедий до брошюр в бумажной обложке. Однако в книгах можно найти лишь основные принципы микроскопирования. Научиться удовлетворительно работать с микроскопом можно только под чьим-то непосредственным руководством, приобретая практический навык, немалую часть которого составляет искусство приготовления хороших препаратов. Микроскопии бактерий посвящено множество различных книг, но ее принципы универсальны. В приводимом ниже перечне (1 —10) представлены различные типы опубликованных по данному вопросу работ.

ЛИТЕРАТУРА

Anonimous. Photography through the microscope. Eastman Kodak Co., Rochester, N. Y.

Это пример брошюр, которые выпускаются фирмами-изготовителями, связанными какими-то сторонами своей деятельности с микроскопией. Последние их варианты можно получить у подобных этой фирм или их агентов. По большей части это превосходные издания.

Barer R. Lecture notes on the use of the microscope. Blackwell Scientific Publications, Oxford (1968).

Советы опытного микроскописта.

Bradbury S. The optical microscope in biology. Edward Arnold, London (1976).

Эго маленькая брошюра, в которой ясно изложен материал по разрешающей способности микроскопов и современным видам микроскопии.

Cargille I. 1. Immersion oil and the microscope. Technical Reprint 10—1051. R. P. Cargille Laboratories, Cedar Grove, N. J. (1975). Другая брошюра, выпущенная фирмой-изготовителем. Комментарии см. выше [1].

Culling С. F. Л. Modern microscopy — elementary theory and practice. Butterworths and Co., London (1974).

Комментарии см. выше [3].

Engle С. E. (ed.). Photography for the scientist. Academic Press, Inc., New York (1968).

Общие вопросы научной фотографии, включая микрофотографию.

James J. Light microscopic techniques in biology and medicine. Martinus Nijhoff Medical Division, Amsterdam (1976).

Прекрасная современная книга, в которой освещена теория н практика с упором на последнюю. В ней даются советы по специальным и усовершенствованным методикам и их применению, включая фазово-контрастную, интерференционную, темнопольную, поляризационную и люминесцентную микроскопию.

Mollring F. К. Microscopy from the very beginning. Carl Zeiss, Oberkochen, Federal Republic of Germany.

Еще одна брошюра, выпущенная фирмой-изготовителем. Комментарии см. выше [ 1].

Shillaber С. Р. Photomicrography in theory and practice. John Wiley and Sons, Inc., New York (1944).

Ничто, ио-видимому, не заменит этого классического произведения, в котором досконально и в то же время доступным языком разбираются свойства линз в объективах, свойства окуляров и конденсоров. В нем подробно изложены приемы хорошего освещения, взвешены преимущества различных иммерсионных сред, разбираются практические и теоретические вопросы микроскопии.

Slayter Е. М. Optical methods in biology. John Wiley and Sons, Inc., New York (1970).

Эта книга — источник теоретических основ большинства видов микроскопии и введение в аналитические процессы, включая дифракцию, спектроскопию и сопряженные оптические методы. В ней освещаются принципы, но нет практических рекомендаций.

Глава 2

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВДЛЯ СВЕТОВОЙ микроскопии

Р. Мюррэй, К. Робиноу

Развитие методов электронной микроскопии ослабило стремление исследователей получить как можно больше информации цитологического характера методами световой микроскопии. Тем не менее эти методы еще очень полезны для общего изучения бактерий и заполнения пробелов на уровне распознавания клеточных компонентов между живой клеткой, с одной стороны, и изображением, которое дает электронный микроскоп, — с другой. Приготовить образцы для световой микроскопии нетрудно, а получаемые с ее помощью результаты очень ценны как с эстетической, так и с научной точки зрения.

В ряде мест этой главы упоминаются или подразумеваются следующие полезные предметы.

Пинцет с плоскими незазубренными захватывающими поверхностями, изогнутыми под углом 30°, удобный для вынимания покровных стекол; изогнутый заостренный ювелирный пинцет с незазубренными кончиками также хорош для этой цели.

Нож для нарезания агаровых блоков. Для этой цели годны все виды инструментов, но обычные ножи или скальпели портятся при стерилизации в пламени. Поэтому лучше всего пользоваться нихромовой проволокой, конец которой, обработанный на наковальне, имеет узкую листовидную форму. Отрезанный довольно короткий кусок этой проволоки закрепляют в держателе петли и стерилизуют в пламени.

Колумбийские кюветы для окрашивания. Они облегчают работу с препаратами, нанесенными на покровные стекла, при их хранении, отмывке и окрашивании. Кюветы сделаны с таким расчетом, чтобы вмещать квадратные покровные стекла со стороной 22 мм (А. Н. Thomas Со., Philadelphia, Ра.).

ЖИВЫЕ КУЛЬТУРЫ

При микроскопии препаратов живых культур используют очень полезный информативный метод типа «висячая капля». Так называется препарат, когда капля с культурой свисает с покровного стекла в лунку, сделанную в толстой пластинке из прозрачной пластмассы (разд. 3.2.3). При этом бактерии находятся в ростовой среде, располагаясь в плоскости, прилежащей к покровному стеклу. Поскольку обычно их берут из колонии в виде отдельных клеток, естественное взаиморасположение клеток не сохраняется, а из-за толщины подвешенного материала и возникающих оптических трудностей разрешение невелико. Несмотря на эти ограничения, данный метод можно использовать для прослеживания действия токсичных химических агентов и антибиотиков на рост клеток и их форму. Если необходимы длительные наблюдения в более оптимальных для микроскопии условиях, исследуют культуры, находящиеся на предметном стекле, а не препараты типа «висячая капля»; при этом их можно сделать достаточно тонкими и эффективно изучать, используя соответствующую оптику. Лучше всего применять фазово-контрастную микроскопию, но в большинстве случаев анализ можно проводить и с помощью обычной оптики.

Агаровая пластинка

Для приготовления агаровых пластинок рекомендуется следующая методика. Чистые стерильные предметные стекла дважды (или большее число раз) погружают в расплавленный агар соответствующего состава, который находится в чашке Петри. С нижней стороны стекол агар вытирают увлажненной тканью. Используя бинокулярную лупу, бактерии вносят в выбранную на верхней стороне стекла область с помощью вытянутого из пастеровской пипетки стеклянного волокна или стеклянной палочки. Кончик волокна смачивают в водном растворе пептона, слегка прикасаются им к колонии или культуре нужной бактерии, переносят приставшие к кончику бактерии в каплю водного раствора пептона на свежей поверхности агара и распределяют каплю по по-

препараты для световой микроскопии

верхности. Обрезают агар вокруг выбранной области, кладут сверху покровное стекло и по его краям заливают воск. Если участок питательного агара меньше покровного стекла, то будет поступать воздух при минимальном высыхании. Соответствующие модификации и методические детали можно продумать и для анаэробов с целью получения информации о форме и размере их клеток, а также способе роста.

Желатино-агаровая пластинка

Изменения в деталях внутреннего строения становятся видимыми при фазово-контрастной микроскопии, если использовать твердую питательную агаровую среду с большим коэффициентом преломления [1]. Такую среду получают добавлением желатины до 14—18% [9]. Высокие концентрации подходят для грамположительных бактерий, в то время как для грамотрицательных бактерий могут понадобиться более низкие концентрации. Вместо желатины применяют также [11] поливинилпир- ролидон (до 30%). Этот методический прием позволил Мэйзону и Поуэлсону [3] проследить за процессом деления нуклеоидов в растущих бактериях и сделать фотографии на разных стадиях этого процесса.

При необходимости культуры на пластинках можно фиксировать для окрашивания и даже подготовить для электронной микроскопии; однако образцы с таким мало погруженным в среду материалом [2, 7], находящимся в одной плоскости, требуют значительного мастерства в обращении и получении срезов. Покровное стекло с приставшей к нему неповрежденной культурой и средой следует удалить с пластинки для фиксации и заливки в пластмассу. Легче всего удалить стекло с помощью полоски ленты Mylar или какой-нибудь липкой этикетки.

. ФИКСИРОВАННЫЕ ПРЕПАРАТЫ

Фиксация по Боуэну

Препараты, в которых клетки по виду больше всего соответствуют живым, получают фиксацией in situ; при описании формы клеток и способов их роста наиболее полезны именно такие препараты. Их готовят следую-

щим образом. Бактерии выращивают на твердой среде в чашке Петри, внося в нее столько материала, чтобы через несколько клеточных делений образовался или сплошной монослой клеток, или еще не слившиеся микроколонии, в которых клетки не нагромождены друг на друга. В процессе роста состояние клеток контролируют с помощью микроскопа при низком увеличении (с десятикратным объективом). Если для приготовления препаратов клетки нужно брать из жидкой среды, то переносят соответствующее количество суспензии на пластинку с хорошо подсушенной агаровой средой и дают жидкости впитаться в слой агара. Кусочки агара вырезают из той области, где наблюдается правильное распределение клеток. Лучше всего вырезать квадратный слой агара со стороной около 1 см и перевернуть его стороной с микроорганизмами вниз на покровное стекло размером 22X22 мм, не придавливая агар к стеклу и предотвращая скольжение. В этом случае клетки прилежат к стеклу, сохраняя свое взаимное расположение. Покровное стекло с лежащим на нем слоем агара осторожно опускают в чашку Петри, содержащую достаточное для покрывания агарового слоя количество фиксатора Боуэна.

Водоиасыщенная пикриновая кислота75мл

Формалин25 м

Ледяная уксусная кислота5 м

Эти компоненты смешивают и хранят в закупоренном пузырьке.

Растворимость пикриновой кислоты—1,4 г/100 мл при 20 °C; в качестве исходного следует хранить водонасыщенный раствор и по мере надобности использовать его для приготовления фиксатора.

В одной чашке можно фиксировать несколько кусочков агара. Их оставляют на некоторое время в покое для полного проникновения фиксатора (минимум на 45 мин и максимум на 4 ч) и фиксации клеток на покровном стекле. Агар может отойти от стекла сам по себе или можно помочь ему отделиться, удерживая внизу покровное стекло пинцетом и приподнимая агар кончиком ножа резким движением; при этом следует избегать бокового смещения слоя вдоль стекла. Затем покровное стекло отмывают водой и кладут в 70%-ный этанол, где оно лежит до момента окрашивания.

Фиксированные по Боуэну препараты лучше всего окрашиваются разведенными растворами основных красителей. Подходят для этого 0,01 % -ные растворы кристаллического фиолетового, тионина или метиленового синего, которыми прокрашивают в течение 1—5 мин. Точное время окрашивания определяют в предварительных экспериментах. Для окрашивания цитоплазматических включений могут применяться другие красители (разд. 3.3.11). Основные красители прокрашивают богатую рибосомами цитоплазму преимущественно в хорошо сохранившихся, фиксированных по Боуэну клетках; нуклеоплазма не окрашивается, она негативно выявляется точно так же, как и при фазово-контрастной микроскопии живых клеток. Описанный способ фиксации не годится для окраски нуклеоплазмы по Гимзе, даже после обработки рибонуклеазой или кислотного гидролиза.

Клеточные стенки не прокрашиваются (наиболее убедительно это продемонстрировано на образующих нити представителях рода Bacillus'), но их можно эффективно выявить обработкой фиксированных по Боуэну клеток 5 %-ной (вес/объем, в воде) дубильной кислотой в течение 20 мин с последующей промывкой и окраской 0,01 %-ным кристаллическим фиолетовым, достаточной по времени для интенсивного прокрашивания стенок. Предварительная обработка насыщенным раствором хлористой ртути в течение 5 мин также позволяет окрасить клеточную стенку основными красителями, такими, как кристаллический фиолетовый, тионин, виктория синяя [10]. Однако абсолютно надежного метода нет, причем наибольшие трудности возникают с грамотрицатель- ными бактериями.

Заключают препарат в воду или разбавленный краситель (последний полезен, если интенсивность окрашивания недостаточна для фотографирования), аккуратно промокают его, чтобы удалить избыток воды сверху и по краям покровного стекла, и заливают по краю покровного стекла воск, васпар или лак для ногтей. Из препарата можно удалить воду и сделать его постоянным, применив заливку смолой, но результат при этом не всегда удовлетворяет исследователя. Лучший способ сделать препарат вечным — сфотографировать его, а для этого описанный прием идеален.

Некоторые клетки не пристают хорошо к стеклу после фиксации через слой агара или применения метода пленочного прилипания (см. ниже). Эту трудность можно частично преодолеть, если предварительно покрыть поверхность покровного стекла тонкой пленкой сывороточного или яичного альбумина и дать ей высохнуть. Образующаяся пленка может дать в готовом препарате слабоокрашенный фон, но в целом результат получается очень неплохой. Положительно заряженная пленка из полилизина может оказаться еще более эффективной, чем две вышеупомянутые [4].

Фиксация парами

Клетки, распределенные по поверхности агаровых слоев, независимо от того, были они там выращены или перенесены из другой среды, удобно фиксировать для световой микроскопии парами четырехокиси осмия или альдегидов, таких, как формальдегид или глутаральдегид. Правда, при этом способе не подавляются все ферменты, и поэтому он не всегда годится для фиксации в цитохимических исследованиях. Ниже мы подробно опишем метод фиксации OsO4, поскольку это один из самых распространенных и полезных методов. Для него характерны следующие этапы.

Приготавливают 1%-ный или 2%-ный раствор четырехокиси осмия (вес/объем) в дистиллированной воде. Кристаллический реактив OsO4 определенного веса поставляется в запаянной ампуле. Ампулу разбивают и вносят ее содержимое в соответствующий объем воды. Кристаллы растворяются медленно, поэтому приготовление нужно начинать за 1 или 2 дня до использования.

Предупреждение. OsO4— раздражающий агент, его пары опасны для глаз и слизистых оболочек, поэтому с ним необходимо работать под тягой. Хранят реактив в холодном темном месте и желательно в темных склянках, чтобы предотвратить образование черного неактивного продукта.

Кусочки агара на предметном стекле с клетками наверху помещают в закрытую кювету с несколькими миллилитрами раствора OsO4. В качестве опоры для стекол используют стеклянные шарики, лежащие па дне

кюветы. Благодаря этому предметные стекла с агаром находятся над раствором фиксатора.

В течение 1,5—2 мин парам дают возможность адсорбироваться.

Предметные стекла вынимают и накрывают слой агара покровным стеклом. Покровное стекло захватывают специально предназначенным для этого пинцетом и быстрым резким движением поднимают его вверх, отделяя от агара. Иногда поступают иначе: переворачивают кусочек агара на покровное стекло и резко сбрасывают его кончиком ножа, так чтобы некоторые клетки остались на стекле.

Немедленно опускают покровное стекло в колумбийскую кювету с 70%-ным этанолом, где его можно держать, пока все не будет готово для последующей окраски.

Методы окрашивания могут быть теми же, что и для препаратов, фиксированных по Боуэну. Как и в том случае, цитоплазма окрашивается основными красителями, такими, как тионин, а нуклеоплазма не окрашивается. Однако нуклеоплазма имеет вид более узких пятен, чем при фазово-контрастной микроскопии живых клеток. Фиксированные OsO4 препараты пригодны для окрашивания нуклеоплазмы по Гимзе либо после гидролиза рибонуклеазой (100 мкг/мл в 1 мМ MgSO4 в течение 30 мин), либо после гидролиза кислотой. Последний метод состоит из следующих стадий.

Покровное стекло с фиксированными клетками помещают на 6—8 мин в 1 н. НС1 при 60 °C.

Отмывают его в воде.

Окрашивают раствором Гимзы (10 капель краски на 10 мл 0,067 М фосфатного буфера, pH 6,6) в течение 10 мин (или более) в случае почти всех грамотрицатель- ных бактерий.

Промывают буфером и смотрят в микроскоп, проверяя, нормальная ли получилась окраска. (На этом этапе хорошо помогает водоиммерсионный объектив, но он не обязателен.)

Заключают препарат в воду или разведенный краситель. Последний вариант хорош для грамотрицатель- ных бактерий, поскольку их цитоплазма может быть еле видна.

Нуклеоплазма окрашивается в сине-фиолетовый цвет, а цитоплазма — в розоватый. Первая стадия этого метода, безусловно, представляет собой основу для окраски по Фёльгену, и нуклеоплазма, содержащая ДНК, после гидролиза окрашивается в красный цвет реактивом Шиффа [8].

Пленочные препараты, фиксированные таким способом, могут быть очень полезны при изучении изменений в клетках, подвергшихся множественной обработке в агаре или в жидкой культуре, например, во время фаговой инфекции [5]. Следует обратить внимание на то, что во время фиксации нуклеоплазма реагирует на наличие в среде катионов, избыток которых приводит к конденсации хроматина [6].

ЛИТЕРАТУРА

Barer R., Ross R. F. A., Tkczk S. Refractometry of living cells. Nature (London), 171, 720—724 (1953).

Основные положения, касающиеся показателя преломления в средах при фазово-контрастной микроскопии.

Girbardt М. Eine Zielschnittmethode fiir Pilzzellen. Microscopie, 20, 254—264 (1965).

Полезные советы no пленочному прилипанию культур на предметных стеклах.

Mason D. 3., Powelson D. М. Nuclear division as observed in live bacteria by a new technique. J. Bacteriol., 71, 474—479 (1956).

Описаны наблюдения последовательных этапов деления нуклеоидов бактерий, которые иллюстрируются фазово-контрастными микрофотографиями.

Mazia D., Schatten G., Sale W. Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine. J. Cell Biol., 66, 198—200 (1975).

Murray R. G. E., Whitfield J. F. Cytological effects of infection with T5 and some related phages. J. Bacteriol., 65, 715—726 (1953).

Применение световой микроскопии в цитологии при изучении фаговых инфекций.

Murray R. G. Е., Whitfield J. F. The effects of the ionic environment on the chromatin structures of bacteria. Can. J. Microbiol., 2, 245—260 (1956).

Наблюдения, в которых уделено особое внямание действию катионов на нуклеоидную структуру.

Patton А. М., Marchant R. An ultrastructural study of septal development in hyphae of Polyporus biennis. Arch. Microbiol., 118, 271 — 277 (1978).

Другой пример методики пленочного прилипания.

Piekarski G. Zytologische Untersuchungen an Bakterien mit Hilfe der Feulgenschen Nuclealreaktion. Arch. Microbiol., 8, 428—439 (1937).

Применение реакции Фёльгеиа для четкого выявления очертаний бактериальных нуклеоидов.

Robinow С. F. The preparation of yeasts for light microscopy. Methods Cell Biol., 11, 1—22 (1975).

Практическая рекомендация no применению желатино-агаровых культур на стеклах.

Robinow С. F., Murray R. G. Е. The differentiation of cell wall, cytoplasmic membrane and cytoplasm of gram-positive bacteria by selective staining. Exp. Cell Res., 4. 390—407 (1953).

Выявление клеточных стенок методами окраски.

Schaechter М., Williamson J. Р„ Hood. J. R., Koch Л. L. Growth, cell and nuclear divisions in some bacteria. J. Gen. Microbiol., 29, 421—434 (1962).

Описан способ увеличения показателя преломления среды для фазово-контрастной микроскопии.

Глава 3

МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИВ СВЕТОВОЙ микроскопии

Р. Дойч

Чтобы охарактеризовать ту или иную бактерию, обычно специфические морфологические детали выявляют с помощью световой микроскопии. Некоторые используемые при этом методы, возникшие еще на заре микробиологической науки, с честью выдержали испытание временем.

Эти классические методы дают самую ценную информацию. Однако важно понимать методологические ограничения, касающиеся деталей формы или структуры, поскольку при любой лабораторной процедуре препарат может подвергаться некоторым изменениям, правда в большинстве случаев незначительным. Как бы то ни было, данные, полученные при микроскопировании бактерий, необходимы, но обычно недостаточны для идентификации последних (гл. 20). Часто, однако, ошибки в идентификации происходят из-за неверных суждений о форме, результатах окраски по Граму или подвижности вновь выделенных форм.

ВЗЯТИЕ ПРОБ

Наблюдать живые бактерии непосредственно в их естественной среде обитания довольно трудно. К тому же получаемая при этом информация может быть очень неполной. Для этого имеется ряд причин:

Не в каждой среде обитания на единицу массы приходится большое количество бактерий. Например, чтобы получить достаточное для изучения количество морских или озерных микроорганизмов, их нужно, как правило, концентрировать пропусканием через целлюлозные или поликарбонатные фильтры или центрифугированием.

В некоторых средах содержится слишком много бактерий на единицу массы. Поразительное множество бактерий и других микроорганизмов вперемежку с раз-

личными частицами обнаружено в отстое сточных вод или в фекалиях. В данном случае материал нужно разводить одним из многих имеющихся буферов с биполярными ионными свойствами. Некоторые почвы и морские отложения содержат очень мало бактерий, причем эти бактерии смешаны с большим количеством непрозрачного коллоидного вещества, которое с трудом можно отличить от бактерий.

Большинство бактерий, составляющих природную флору какой-либо среды, не имеют особых отличительных морфологических признаков. Исключения составляют, например, звездообразный Prosthecomicrobium, снабженный капсулой Sphaerotilus или трихомы рода Caryophanon.

Поскольку бактерии в водной суспензии имеют оптические свойства, сходные со свойствами воды, и их трудно наблюдать с помощью обычного микроскопа в проходящем свете, пробы лучше исследовать с использованием позитивного или негативного фазового контраста или с помощью темнопольной микроскопии. Если последние варианты недоступны, нужно опустить конденсор и уменьшить освещение, чтобы повысить контраст, даваемый обычным микроскопом.

При непосредственной работе с пробами, бактериологическими петлями, предметными стеклами с нанесенными на них капельками и покровными стеклами, а также во время приготовления препаратов в процессе работы с ними существует масса возможностей для бактериального загрязнения пальцев, рабочих поверхностей, одежды и оборудования. Важно соблюдать необходимые предосторожности, уделять внимание мелочам в работе и не забывать об источниках опасности, особенно работая с патогенными микроорганизмами. Помните, что даже фиксированные препараты организмов, содержащих эндоспоры, могут сохранить какой-то уровень жизнеспособности.

К инструментам для взятия бактериальных проб относятся большая петля (диаметром 3 мм), маленькая петля (диаметром 1 мм) и прямая игла для внесения. Они бывают разных типов — платиновые, нихромовые и т. п. (иглы предпочтительно иметь нихромовые); длина их должна быть такой, чтобы после насадки на стек-

лянную или алюминиевую ручку, ими можно было легко манипулировать при посеве в чашки, отборе материала колоний и внесении в пробирки со средами.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВДЛЯ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ

Для исследования живых бактериальных клеток разработан ряд методов. При микроскопировании можно использовать культуры, выращенные в жидких средах, однако для получения нужного числа бактерий они нуждаются, как правило, в разведении стерильной средой. Культуры, выращенные на твердых средах, можно суспендировать с помощью стерильной петли или иглы в капле стерильной жидкой среды или какого-нибудь раствора, но не водопроводной воды, до слабого помутнения (разд. 2.5.1). Следует помнить, что возраст культуры и физико-химические параметры среды могут быть причиной ненаследуемых (фенотипических) модификаций как внепротоплазматических компонентов (жгутики и капсулы), так и компонентов, находящихся внутри собственно клетки (различные включения); все эти компоненты являются важными признаками, по которым ведется идентификация. Вместе с тем специальные операции или пересевы, производимые в лаборатории, могут благоприятствовать развитию мутантов, имеющих наследственно измененные по сравнению с диким типом черты строения. Изменения могут быть стабильными и нестабильными, но очевидно, что при описании формы и структуры бактерий условия содержания культуры должны быть строго определенными, так как старение культуры и изменения состава среды могут быть причиной ряда морфологических изменений.

Специальные методы исследования растущих культур бактерий были описаны в гл. 2. Ниже мы приводим три метода, которые часто используются при исследовании живых клеток в целях идентификации.

Влажные препараты живых клеток

Для приготовления влажных препаратов одну каплю пробы (около 0,05—0,1 мл) помещают на чистую обезжиренную (предварительным нагревом в течение 20 мин

при 400 °C) поверхность предметного стекла (толщиной 0,8—1,0 мм) и накрывают ее покровным стеклом. Последнее имеет квадратную форму со стороной 22 мм, а толщина его составляет от 0,13 до 0,16 мм (номер 1 или Р/г). Чтобы предотвратить конвекционные токи, смещение или высыхание, зазор между покровным и предметным стеклами герметично заливают васпаром (смесь равных объемов петролатума и парафинового воска), петролатумом, свечным воском (используя фитиль свечи в качестве кисточки для нанесения расплавленного воска в пламени вспомогательной горелки, но не самой свечи) или прозрачного лака для ногтей.

В течение короткого промежутка времени в этих препаратах можно наблюдать подвижность облигатных аэробных бактерий, однако, как только кислород истощится, бактерии прекращают движение. Если ввести в среду небольшие пузырьки воздуха, то их активность продлевается.

Для рассматривания влажных препаратов рекомендуется фазово-контрастная микроскопия, причем для получения наилучших результатов следует использовать как можно более тонкую водную пленку. Кусочек промокательной бумаги, положенный поверх покровного стекла до герметизации, способствует выводу излишнего количества жидкости (так что в препарате остается лишь необходимая для просмотра тонкая пленка) и подсушиванию поверхности потенциальных полей зрения.

Тепло от источника света может нарушить оптимальные движения бактерий. Если наблюдения ведутся в течение длительного периода времени, рекомендуется вставлять тепловой фильтр. Поскольку белый свет может вызывать нарушение подвижности, применяют зеленый светофильтр, лучше других реализующий коррекции, даваемые линзами, и хорошо воспринимаемый глазом наблюдателя. Нагревание пробы предотвращают также с помощью задерживающей оптической вставки, заполненной 5-сантиметровым слоем раствора Мора [50 г сульфата железа и аммония, 1,3 мл 33%-ной (объ- ем/объем) серной кислоты и 250 мл дистиллированной воды].

Метод висячей капли

Этот метод заключается в следующем. Каплю пробы помещают в центре чистого покровного стекла, которое затем переворачивают и устанавливают над углублением в специальном предметном стекле так, чтобы капля висела на покровном стекле. Капля должна быть достаточно маленькой, чтобы она не касалась дна углубления. Для герметизации и фиксирования стекла на месте рекомендуется капнуть маленькую каплю воды на край покровного стекла.

Препараты типа «висячая капля» имеют некоторые недостатки, связанные с вогнутостью углубления предметного стекла, кривизной капли и увеличенной толщиной предметного стекла, которая порождает оптические аберрации. Различная глубина фокусировки, требуемая для просмотра пробы от края к центру, затрудняет наведение фокуса на отдельную клетку, особенно если она подвижна; лучше всего фокусировка удается на краю капли. Некоторых трудностей избегают, если используют предметные стекла с лунками, имеющими плоское дно. Тогда их можно заполнить образцом и накрыть покровным стеклом, как описано выше.

Метод висячего агарового слоя

Для приготовления препаратов живых клеток типа «висячая капля» существует хорошее приспособление — пластина из прозрачной пластмассы с высверленным в центре отверстием, имеющим диаметр около 1 см. Покровное стекло с висящей на нем каплей помещают над отверстием, а для того, чтобы стекло удерживалось на месте, на его край наносят каплю иммерсионного масла или воды. Подобным образом к стеклу можно прикрепить тонкий слой агара с растущей культурой или островками колоний, размазанных по стерильной находящейся рядом с ними поверхности. Образуемую отверстием камеру можно закрыть, прикрепив снизу покровное стекло.

Негативное окрашивание

Этот вид окрашивания дает возможность самыми простыми, а зачастую и самыми быстрыми способами получить информацию о преломляющих свет включениях, таких, как сера или гранулы поли-р-оксимасляной кислоты, и о спорах [12]. При его осуществлении взятый петлей 7%-ный (вес/объем) водный нигрозин (или тушь, или конго красный) тщательно перемешивают с бактериальной суспензией на покровном стекле, размазывают смесь до образования тонкой пленки и высушивают на воздухе. Затем кладут покровное стекло на предметное пленкой вниз и фиксируют его положение одной-двумя каплями свечного воска.

В приготовленных подобным образом препаратах, содержащих вместо заливки воздушный слой, бактерии не прокрашиваются и выделяются на темно-синем фоне ярким свечением. В дальнейшем они даже могут быть использованы в работах по изучению характера и степени разрушения клеток (гл. 5). Негативно окрашенные препараты не следует применять для измерения длины и ширины клеток (см. ниже), так как вокруг клеточной стенки может находиться капсула или слой слизи. Более того, отрицательно заряженные частицы коллоидного нигрозина не реагируют с клеточной поверхностью, поскольку при физиологических значениях pH последняя также заряжена отрицательно. При высыхании коллоидной пленки благодаря одинаковому заряду коллоидных частиц и бактерий черный край высыхающей пленки находится на относительно значительном, хотя и маленьком абсолютно расстоянии от истинной границы клетки. В результате видимый размер бактерии оказывается больше, чем действительный, даже если нет капсулы.

В растворах нигрозина могут завестись посторонние микроорганизмы; предотвратить это помогает небольшая добавка формальдегида, не ухудшающая свойств раствора.

Простое окрашивание

Морфологические исследования бактерий, как правило, проводятся на фиксированных и окрашенных препаратах. При использовании только одной краски процесс

называют простым окрашиванием. Исследуемую пробу распределяют по предметному стеклу на площади 1 см2. Для этого достаточно одной петли культуры, выращенной в жидкой среде, или одной капли стерильной дистиллированной воды, в которой суспендировано небольшое количество культуры, взятой с твердой среды с помощью иглы или петли. (Бульонные культуры не всегда подходят из-за образующегося при фиксации белкового преципитата; поэтому во многих случаях можно улучшить качество препарата фиксацией в формалине с последующими центрифугированием и отмывкой.) Когда препарат высыхает, производят тепловую фиксацию (фламбирование), проводя несколько раз предметное стекло материалом вверх над пламенем горелки Бунзена, чтобы убить выжившие организмы и обеспечить прикрепление бактериальной пленки к стеклу. Высушивание и нагревание вызывают сжатие и деформацию бактерий и могут нарушить структуру связей между клетками; не забывайте об этом при интерпретации морфологических данных.

Более четко, хотя и с большими затратами времени, фиксацию осуществляют с помощью химических агентов. Проста и часто вполне удовлетворительна фиксация 5%-ным формалином (объем/объем) в течение нескольких минут, особенно для окраски по Граму (разд. 3.3.5). Подробное описание фиксации четырехокисью осмия (разд. 2.2.2) и по Боуэну (разд. 2.2.1) см. в гл. 2. В последнем случае берут бактерии, выросшие за несколько часов в микроколонии или распределенные до монослоя на твердой среде в чашке Петри. Кусочек агара с бактериями вырезают, фиксируют и переносят на покровное стекло, а затем окрашивают соответствующим образом одним из основных красителей или специально обрабатывают для получения цитохимической информации. Эту методику применяют к молодым культурам всего через несколько часов после посева на агар, когда формируется сплошной слой из микроколоний. Лучше всего заливать агар соответствующей суспензией и отсасывать избыток пастеровской пипеткой, наклоняя чашку. После этого чашку подсушивают и инкубируют. Влажные пленки бактерий на покровных стеклах фиксируют и до высушивания, выдерживая их в парах 2%-но-

го (вес/объем) водного OsO4 в течение 2—3 мин. Но намного лучше фиксировать клетки, подготавливая их к окраске, после того как клеточная суспензия была распределена по поверхности стерильного агара и жидкость впиталась в агар.

В описанных выше методах бактерии находятся на покровном стекле, а предметное стекло служит основанием. С цитологической точки зрения лучше, если фиксированные химическим путем и слегка окрашенные бактерии при монтировании препарата будут в воде и если их высыхание предотвращено на всех этапах обработки. Препараты, фиксированные OsO4, не прокрашиваются достаточно хорошо при простом окрашивании, если они не прошли вторую фиксацию, например фиксатором Шаудина [6,6 мл насыщенной HgCl2, 33,3 мл абсолютного этанола и 2%-ная (объем/объем) ледяная уксусная кислота, добавленная перед использованием; 6,9 г HgCl2 в 100 мл воды при 20°C дает насыщенный раствор].

Клетки, интенсивно окрашенные для общеморфологического изучения, получают погружением на короткий срок препаратов, фиксированных нагреванием или химическими агентами, в растворы основных красителей, таких, как кристаллический фиолетовый (на 10 с) и метиленовый синий (на 30 с), после чего их промывают водопроводной или дистиллированной водой и подсушивают впитывающим воду материалом. Готовят красители следующим образом:

Кристаллический фиолетовый (по Хукеру)

Кристаллический фиолетовый2 г

Этанол 95%-ный (объем/объем)20мл

Щавелевокислый аммоний 1%-ный(вес/объем)80 мл

водный

Кристаллический фиолетовый растворяют в этаноле, затем добавляют раствор щавелевокислого аммония и выдерживают перед использованием 48 ч.

Метиленовый синий (по Лефлеру)

Метиленовый синий солянокислый1,6 г

Этанол 95%-ный (объем/объем)100 мл

КОН 0,01%-ный (вес/объем) водный100 мл

Готовят насыщенный спиртовой раствор метиленового синего, добавляя краситель к спирту. Затем вливают 30 мл этого раствора в раствор КОН.

Если клетки окрашиваются слабо или совсем не окрашиваются одним из этих красителей, то их можно окрасить карболфуксином; при этом не исключено, что они окажутся кислотоустойчивыми в отношении красителя (разд. 3.3.6). Для большинства бактерий достаточно выдержать в этом красителе несколько секунд; это очень мощный краситель, и часто он дает чрезмерную окраску. Однако в случае микобактерий необходимо нагревание или добавление поверхностно-активных веществ, причем, для того чтобы карболфуксин проник через клеточную стенку, содержащую воскоподобные компоненты, требуется какое-то время.

Постоянные препараты

Окрашенные бактериальные пленки на покровных стеклах можно смонтировать в препарат, заключив их в воду на предметном стекле и запечатав края покровного стекла петролатумом, прозрачным лаком для ногтей или свечным воском. Такие препараты временны, их можно использовать лишь в течение нескольких дней, они представляют собой превосходный материал для микрофотографирования. Чтобы увеличить срок хранения, окрашенные и высушенные на покровном стекле пленки бактерий нужно осветлить в ксилоле и положить на каплю канадского бальзама на предметное стекло; следует избегать применения избыточного количества бальзама, а в крайнем случае вытирать его тканью, смоченной в ксилоле. Имеются в продаже и нейтральные среды для заключения препаратов, такие, как, например, флотекс, DPX и пермаунт. Эти среды состоят из пластмассы (полистирол) с пластификатором (трикрезилфосфат), растворенной в органических растворителях (толуол, ксилол). Флотекс можно наносить прямо на окрашенную бактериальную пленку, находящуюся на предметном стекле, без применения покровного стекла. Пермаунт является нейтральной средой, которая не закисляется и не обесцвечивается при хранении; при заключении в пермаунт удается избежать накопления пузырьков воздуха под покровным стеклом.

ОБНАРУЖЕНИЕ ПРИЗНАКОВ

Как было показано, описываемые ниже методы удовлетворительны для выявления характерных признаков бактерий, необходимых для их идентификации. Вместе с тем их можно улучшить или модифицировать; литература изобилует описаниями незначительных изменений, которые, как выяснилось, были необходимы для получения оптимальных результатов в специфических условиях. В особой заботе при фиксации, окраске и микроскопировании нуждаются цитологические препараты. Меры предосторожности, которые необходимы при работе с ними, приводятся здесь, а также в гл. 1 и 2. Методы, которые описаны ниже, считаются рутинными, но это самые эффективные методы (особенно если дело касается цитоплазматических включений) применительно к химически фиксированным препаратам, при обработке которых на всех этапах избегают высушивания.

Размер

К сожалению, измерения длины и ширины бактерий далеко не всегда проводятся с необходимой точностью из-за неизбежных технических трудностей. Границы клеток живых бактерий, исследуемых в фазово-контрастном или темнопольном микроскопе, видны не четко. При фазово-контрастной микроскопии границы клеток плохо видны из-за ореолов, которые ухудшают также видимость деталей внутреннего строения. Улучшения можно достичь, поместив микроорганизмы в среду с большим показателем преломления, что нетрудно сделать, если добавить желатину до концентрации 15—30% (вес/объ- ем) [9]. Точную концентрацию, при которой получают наилучшие результаты, нужно определять экспериментально для каждого типа микроорганизмов и их компонентов.

Менее точный метод заключается в быстром высушивании на предметных стеклах тонкой пленки 15—20%- ного (вес/объем) раствора желатины. Пленки применяют для монтирования препаратов в жидкой среде; желатина при этом набухает, иммобилизуя погруженные в нее

клетки, и благодаря ее присутствию улучшаются фазовые соотношения между микроорганизмом и средой.

В фиксированных и окрашенных препаратах микроорганизмы в некоторой степени деформируются, причем степень деформации зависит от примененной методики; понятно, что при этом получают лишь приблизительные размеры. В высушенных окрашенных пленках, даже если они приготовлены из фиксированного формалином материала, не выявляется клеточная стенка. Обработка клеток дубильной кислотой и окраска кристаллическим фиолетовым делают клеточную стенку видимой, но при этом ширина бактерий больше по сравнению с той, которая характерна для живых клеток в жидкой среде или в окрашенных препаратах после высушивания на стекле. Эта методика не очень хороша для грамотрица- тельных бактерий.

Микроскопические измерения производятся с помощью либо калиброванного окуляра-микрометра, либо филярного микрометрического окуляра. Окуляр-микрометр, состоящий из стеклянного диска, на котором имеется ряд регулярно расположенных условно обозначенных отметок, устанавливается поверх полевой диафрагмы окуляра после отвинчивания верхней части. Об-ъект- микрометр — это стеклянная пластинка, специально размеченная линиями, отстоящими друг от друга ровно на 10 мкм; при наведении на фокус линии окуляра-микрометра накладываются на линии объекта-микрометра. Если, к примеру, между двумя соседними линиями последнего помещается 10 линий окуляра-микрометра, то каждый просвет между ними равен 1,0 мкм. После калибровки объект-микрометр больше не нужен, но для каждого применяемого объекта калибровку следует проводить заново.

Филярный микрометрический окуляр имеет измерительную нить, положение которой регулируется вращающейся микрометрической ручкой. Каждому полному обороту ручки соответствует номинальное значение 10 мкм, нить при этом смещается на 1,0 мм. Переместив нить на известное по объекту-микрометру расстояние и подсчитав число делений на барабане ручки, пройденных при этом, можно прикинуть, сколько микрометров приходится на одно деление барабана.

Форма

Для идентификации и в описательных целях (гл. 20) форму бактерий принято обозначать следующим образом: прямая, изогнутая, спиральная, коккобациллярная, ветвящаяся, плеоморфная, с квадратным концом, с округлым концом, лентовидная и веретеновидная. К этим классическим терминам можно, пожалуй, добавить звездчатую, стебельчатую и дольчатую формы. Взаимное расположение отдельных бактерий описывается такими терминами, как одиночные пары, короткие цепи (менее пяти бактерий), длинные цепи (более пяти бактерий), скопления, тетрады, октеты, комки и нити.

Когда в учебнике бактерии описываются с помощью этих терминов, подразумевается, что природные ансамбли не нарушены. Вместе с тем при чрезмерном встряхивании, например, длинные цепи клеток могут разбиваться, а из одиночных клеток могут образовываться комки. Разрушение длинных цепей или других непрочных группировок клеток сводят к минимуму добавлением к культуре формальдегида до 1—2% (объем/объем); культуру инкубируют с формальдегидом 15 мин, затем ее центрифугируют и ресуспендируют в воде для приготовления пленок или негативного окрашивания. Эта процедура особенно рекомендуется для стрептококков. Следует также принимать во внимание последствия, связанные с возрастом культуры и составом среды.

Способ деления клеток

Способ деления данной бактерии обычно не выявляется при первом поверхностном осмотре препарата; для этого требуются продолжительные наблюдения живых клеток в подходящей среде [5, 10]. Методики простого окрашивания не позволяют с достаточной точностью определить, к какому типу относится деление — делению на две или на три клетки, делению почкованием или фрагментацией. Для этой цели может оказаться необходимым окрашивание клеточной стенки или даже электронная микроскопия.

Подвижность

Поступательное перемещение бактерий за счет жгутиков можно наблюдать во влажных препаратах, применяя в большинстве случаев слабый или безыммерсион- ный сильный объектив. Скорость перемещения бактерий варьирует, и медленно движущиеся организмы следует отличать от тех, которым свойственно лишь броуновское движение. Описаны некоторые неподвижные мутанты, обладающие жгутиками (тип fla+ mot-). Чтобы убедиться в том, что жгутики действительно присущи данной бактерии, а также чтобы определить их расположение (полярное, перитрихиальное, латеральное), требуются методы с применением окрашивания (разд. 3.3.10).

Если используется обычный конденсор и масляноиммерсионный объектив, для улучшения контраста количество света нужно уменьшить апертурной диафрагмой, а конденсор опустить. Наиболее эффективный (и наиболее демонстративный) способ наблюдения за подвижными микроорганизмами при малом увеличении — это темнопольная микроскопия. Необходимые для нее специальные конденсоры доступны далеко не всем, однако вполне удовлетворительное темное поле можно получить, применив для освещения иммерсионный конденсор от фазово-контрастного микроскопа и расположенную на нужном месте фазовую пластинку; наблюдения при этом ведут с помощью обычных (не фазово-контрастных) объективов с увеличением 10 X или 45 X. Иммерсионная жидкость на конденсор не наносится, а его положение, для которого характерно самое хорошее темное поле, находится экспериментальным путем. С помощью этого ухищрения оказывается возможным видеть под малым увеличением даже спирохет!

Некоторым бактериям присущ особый тип поступательного движения при контакте с твердой поверхностью, известный как «скольжение». Это относительно медленное, моментами прекращающееся, а затем возобновляющееся продвижение в направлении, параллельном продольной оси организма. Для скольжения характерна частая смена направлений движения и отсутствие наружных локомоторных органелл [8]. Такого типа подвижность можно предположить, если при микроскопиче-

ском обследовании (с безиммерсионными объективами большого увеличения) краев колоний обнаруживают отделенные от самого края одиночные клетки или группы клеток. Часто в первичной среде выделения скольжение не выявляется; обычно его легче обнаружить на твердых средах с небольшим количеством питательных веществ, соответствующих их содержанию в естественной для данной группы среде обитания.

Скольжение следует отличать от роения, которое выражается в движении за счет жгутиков в особых условиях. Роение — это распространение микроорганизмов по относительно сухим поверхностям, например агара, где они движутся в виде больших протяженных островков или микроколоний [6]. У наблюдаемых при этом скоплений постоянно меняются очертания — от коротких языковидных выступов и изолированных групп до переплетающихся полос, чередующихся с пустотами. В местах этих пустот видны следы движения, часто рассматриваемые в качестве признака скольжения и хорошо сохраняющиеся фиксацией по Боуэну in situ (разд. 2.2.1). Молодые активные культуры нитевидных организмов, передвигающихся скольжением, оставляют волнообразные, завитые или спиралевидные рисунки. Поступательное перемещение путем скольжения происходит со скоростью 10—15 мкм/с.

Окраска по Граму

Окраска по Граму представляет собой самый важный метод идентификации бактерий. Теоретически возможно разделение бактерий на две группы: гоамположитель- ные и грамотрицательные; реально же имеются случаи, когда одни и те же бактерии характеризуются как «грамвариабельные». С тех пор как метод был впервые разработан Кристианом Грамом в 1884 г., опубликованы многочисленные модификации окраски по Граму.

Пленка бактерий для окрашивания на предметном стекле может быть получена прямым методом из культуры в жидкой или твердой среде [случай простого окрашивания (разд. 3.2.5)], но лучше всего приготовить ее из фиксированной формалином отмытой пробы. Несколько дополнительных минут, потраченных на суспендирование бактерий в 5 %-ном (объем/объем) формали-

не, сбор и промывка их центрифугированием, окупаются тем, что при этом размер и форма клеток хорошо сохраняются, клетки прокрашиваются равномерно, а беспорядочно разбросанные преципитаты из жидких культуральных сред отсутствуют. В любом случае рекомендуется высушивать пленку на воздухе и фиксировать ее нагреванием, как для простого окрашивания. Важно стандартизировать методику окраски по Граму [4]. Одинаковые результаты дают два способа окраски — в модификации Хукера и в модификации Бёрка.

Окраска по Граму в модификации Хукера

Раствор А для приготовления красящего реактива:

Кристаллический фиолетовый (с гарантированным 2,0 г 90%-ным содержанием сухого вещества)

Этанол 95%-ный (объем/объем)20 мл

Раствор В для приготовления красящего реактива:

Щавелевокислый аммоний0,8 г

Дистиллированная вода80 мл

Растворы А и В смешивают для получения красящего реактива кристаллического фиолетового. Оставляют на 24 ч и перед использованием фильтруют через фильтровальную бумагу.

Протрава:

Йод1,0 г

Йодистый калий2,0 г

Дистиллированная вода300мл

Йод и иоднстый калий размельчают в ступке и медленно добавляют воду при постоянно продолжающемся размельчении, пока иод не растворится. Хранят в темной склянке.

Растворитель для обесцвечивания:

Этанол 95%-ный (объем/объем)

Дополнительный краситель:

Сафранин О [2,5% (вес/объем) в 95 %-ном (объ- 10 мл ем/объем) этаноле]

Дистиллированная вода100 мл

Методика:

Высушенную на воздухе фиксированную нагреванием бактериальную пленку погружают на 1 мин в красящий раствор кристаллического фиолетового.

Пленку промывают в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды в течение 2 с.

Пленку помещают в иодную протраву на 1 мин.

Промывают пленку в слабой, идущей под углом

струе водопроводной воды в течение 2 с, после чего ее подсушивают промокательной бумагой.

Погружают пленку на 30 с в 95%-ный (объем/объ- ем) этанол, взбалтывая последний, после чего пленку подсушивают промокательной бумагой.

Погружают пленку на 10 с в дополнительный краситель.

Промывают пленку в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке, после чего пленку подсушивают промокательной бумагой.

Окраска по Граму в модификации Бёрка

Раствор А:

Кристаллический фиолетовый (с гарантированным 1,0 г 90%-ным содержанием сухого вещества)

Дистиллированная вода100 мл

Раствор В:

Двууглекислый натрий1,0 г

Дистиллированная вода100 мл

Иодная протрава:

Иод1,0 г

Йодистый калий2,0 г

Дистиллированная вода100 мл

Протраву готовят так же, как при модификации Хукера.

Растворитель для обесцвечивания (Предупреждение: осторожно, легко воспламеняется!):

Этиловый эфир1 объем

Ацетон3 объема

Дополнительный краситель:

Сафранин О (с 85%-ным содержанием сухого ве- 2,0 г щества)

Дистиллированная вода100 мл

Методика:

Высушенную на воздухе фиксированную нагреванием бактериальную пленку погружают в раствор А, добавляют 2—3 капли раствора В и выдерживают в течение 2 мин.

Отмывают пленку иодной протравой, после чего покрывают ее на 2 мин свежей протравой.

Пленку промывают в слабой, идущей под углом струе воды из-под крана в течение 2 с; поверхность во*

круг пленки подсушивают промокательной бумагой, но саму пленку предохраняют от высыхания.

На пленку при наклонном положении предметного стекла по каплям наносят обесцвечивающий растворитель до тех пор, пока в скапывающем со стекла растворителе не исчезнет окраска. После этого пленку подсушивают на воздухе.

На 5—10 с пленку погружают в дополнительный краситель.

Пленку промывают в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке и подсушивают ее промокательной бумагой.

При использовании любой из методик грамположительные бактерии окрашиваются в голубой или фиолетовый цвет, а грамотрицательные — в красный.

Грамотрицательные бактерии могут выглядеть как грамположительные, если бактериальная пленка слишком толста, а обесцвечивание не проведено до конца. В то же время грамположительные микроорганизмы могут выглядеть, как грамотрицательные, если пленка чересчур обесцвечена; особенно это характерно для культур, очень долго находившихся в стационарной фазе роста. Некоторые виды Bacillus грамположительны лишь в течение нескольких делений после прорастания спор. Грамположительные организмы могут окраситься как грамотрицательные, если нарушена механически целостность их клеточных стенок в результате гибели клеток, автолиза, действия ферментов (например, лизоцима), высушивания на стекле и последующего увлажнения. Для получения хороших результатов лучше всего готовить относительно прозрачные пленки (со слабой замутненностью) из молодых активно растущих культур, так как более старые культуры имеют тенденцию давать неустойчивые реакции. Целесообразно в качестве контроля использовать известные грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы.

Окрашивание на кислотоустойчивость

Второе важное тинкториальное свойство бактерий заключается в том, что некоторые из них плохо обесцвечиваются смесью кислота — спирт после окрашивания го-

рячими растворами карболфуксина. В эту маленькую группу, известную под названием «кислотоустойчивая», входят некоторые актиномицеты, микобактерии, отдельные родственные им бактерии и покоящиеся эндоспоры.

Метод окрашивания на кислотоустойчивость по Цилю — Нильсену

Растворитель для обесцвечивания:

Этанол 95%-ный (объем/объем) Соляная кислота (концентрированная)

97 мл

3 мл

Дополнительный краситель:

Метиленовый синий, солянокислая соль

0,3 г

Дистиллированная вода

100 мл

Карболфуксиновый краситель:

Основной фуксин0,3 г

Этанол 95%-ный (объем/объем)10 мл

Фенол (кристаллы, расплавленные при нагревании) 5 мл

Дистиллированная вода95 мл

Основной фуксин растворяют в этаноле и затем добавляют растворенный в воде фенол. Раствор перемешивают и оставляют стоять несколько дней. Перед использованием его фильтруют.

Методика:

Предметное стекло с высушенной на воздухе и фиксированной прогреванием бактериальной пленкой помещают на держатель для предметных стекол, находящийся над кюветой. Погружают пленку в карболфуксиновый краситель. Предметное стекло осторожно подогревают снизу на горелке Бунзена или на горячей пластине до отхождения паров (не допускать кипения!). В этих условиях препарат держат 5 мин, периодически подогревая его по мере надобности (перегрев вызывает разбрызгивание краски и растрескивание стекла). Пленку промывают слабой, идущей под углом струей водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке.

Пленку погружают в обесцвечивающий раствор и сразу же отмывают водой из-под крана, как описано выше. Обесцвечивание и отмывку повторяют до тех пор, пока пленка на вид не станет бледно-розовой.

Погружают пленку на 20—30 с в дополнительный краситель, отмывают водопроводной водой, как описано выше, подсушивают промокательной бумагой и смотрят в микроскоп.

Кислотоустойчивые бактерии выглядят красными, а все остальные — синими.

Кислотоустойчивость того или иного организма можно также определить флуоресцентным методом. У этого метода есть одно преимущество, заключающееся в том, что стекла с образцами, в которых подозревается присутствие, например, микобактерий, можно просматривать под объективом с увеличением 60 X, а не ЮОХ; следовательно, все стекло целиком можно просмотреть за короткое время.

Метод Труанта окрашивания на кислотоустойчивость

[13]

Реактив для флуоресцентной окраски:

1,50 г 0,75 г75 мл 10 мл 50 мл1,50 г 0,75 г75 мл 10 мл 50 млАурамин О, CI 41000

1,50 г 0,75 г

75 мл 10 мл 50 мл

1,50 г 0,75 г

75 мл 10 мл 50 мл

Родамин В, CI 749

Глицерин

Фенол (кристаллы, расплавленные при нагревании)

Дистиллированная вода

Оба красителя тщательно перемешивают с 25 мл воды и фенолом. Затем добавляют оставшуюся воду и глицерин и снова перемешивают. Получившийся реактив для флуоресцентной окраски фильтруют через стекловату и хранят при 4 °C или при комнатной температуре.

Растворитель для обесцвечивания:

Этанол 70%-ный (объем/объем)99,5 мл

Соляная кислота (концентрированная)0,5 мл

Дополнительный краситель:

Марганцовокислый калий0,5 г

Дистиллированная вода99,5 мл

Методика:

Погружают слегка фиксированную нагреванием бактериальную пленку на 15 мин в реактив для флуоресцентной окраски при 20—37 °C.

Промывают пленку под слабой, падающей под углом струей дистиллированной воды, пока сток не станет бесцветным.

На 2—3 мин погружают пленку в обесцвечивающий растворитель, затем промывают дистиллированной водой, как описано выше.

Погружают пленку в дополнительный краситель на 2—4 мин.

Отмывают дистиллированной водой, как описано выше, и подсушивают промокательной бумагой.

Просматривают образцы в люминесцентный микроскоп с использованием возбуждающего светофильтра BG-12 и запирающего светофильтра OG-1. Клетки кислотоустойчивых бактерий флуоресцируют желто-оранжевым светом на темном фоне.

Эндоспоры

Неокрашенные эндоспоры живых бактерий имеют при наблюдении в обычный микроскоп черное обрамление и ярко светятся в плоскости, находящейся немного выше положения истинного фокуса. Не следует считать, однако, что любая сильно преломляющая свет структура внутри бактерии — это эндоспора, особенно если отсутствует информация о теплоустойчивости (разд. 20.1.52). Прямой тест на присутствие эндоспор возможен благодаря явлению, которое наблюдается [12] во многих эндоспорах после погружения в окислитель в кислой среде (например, 0,1%-ный КМпО4 в 0,3 н. HNO3 или 0,3 н. НС1). При этом оболочка споры теряет целостность, а часть ее протоплазмы, теперь легко окрашиваемая основными красителями, выпячивается наружу через образовавшуюся брешь. Из-за поразительной скооо- течности происходящего события (менее 20 мин пребывания в растворе окислителя) этот тест заслуживает названия «проверки на лопанье» (popping test). Его удобно проводить, помещая высушенную на покровном стекле пленку спор на 10—20 мин в раствор окислителя; «лопнувшие» споры видны без окраски, хотя последняя делает их более легко различимыми.

Имеется несколько удовлетворительных методов для окрашивания эндоспор в бактериях. При использовании простейшего из них — негативного окрашивания — получают нефиксированные препараты, материал которых имеет негативный вид. Для осуществления метода взятый петлей 7%-ный (вес/объем) водный нигрозин смешивают на покровном стекле с набранной петлей культурой, смесь распределяют в виде тонкой пленки и высушивают на воздухе. Покровное стекло переворачивают пленкой вниз, помещают на предметное стекло и

закрепляют в нескольких местах свечным воском. Эндоспоры выглядят, как сильно преломляющие свет сферические или эллипсоидальные образования, находящиеся как внутри, так и за пределами клеток бактерий [12].

Эндоспоры очень устойчивы к простому окрашиванию, но, будучи однажды окрашенными, они довольно устойчивы и к обесцвечиванию. Полезным методом позитивного окрашивания бактериальных эндоспор является метод Дорнера.

Метод окрашивания эндоспор по Дорнеру

Образец, фиксированный нагреванием на предметном стекле, высушивают на воздухе и покрывают его квадратным кусочком промокательной бумаги или салфетки, подогнанным по размеру стекла.

Насыщают бумагу раствором карболфуксина (разд. 3.3.6) и выпаривают его 5—10 мин, как описано выше, поддерживая влажное состояние добавлением красителя по мере надобности. Выпаривать можно и по-другому, помещая стекла на штатив, находящийся над емкостью с кипящей водой.

Удаляют промокательную бумагу и обесцвечивают пленку смесью кислота — спирт в течение 1 мин; промывают водопроводной водой и подсушивают промокательной бумагой.

Высушивают тонкий, нанесенный на предметное стекло слой водного насыщенного раствора нигрозина и просматривают стекло в микроскоп (раствор нигрозина готовят следующим образом: смесь 10 г нигрозина и 100 мл дистиллированной воды погружают на 30 мин в кипящую воду, охлаждают и для лучшего хранения добавляют 0,5 мл формалина; перед использованием смесь фильтруют).

Вегетативные клетки бесцветны, эндоспоры окрашены в красный цвет, а фон — в черный.

В модифицированном методе Дорнера в пробирке смешивают водную суспензию бактерий с равным объемом карболфуксина. Пробирки опускают на 10 мин в кипящую водяную баню. Затем набранный петлей 7%-ный водный нигрозин смешивают на покровном стекле с небольшим количеством (одна петля) подвергшейся нагреванию суспензии бактерий; после подсуши-

вания на воздухе образуется тонкая пленка. Результаты получают те же, что указаны выше, но методика менее трудоемкая.

Метод окраски эндоспор по Шеферу — Фултону

В этом методе вместо карболфуксина применяется 0,5%-ный (вес/объем) водный малахитовый зеленый. Образец высушивают на воздухе на предметном стекле, фиксируют нагреванием, покрывают промокательной бумагой или бумажной салфеткой, пропитанной до насыщения красителем, и помещают на 5 мин над кипящей водой. Стекло промывают водопроводной водой и бактериальную пленку дополнительно окрашивают 30с сафранином, как в случае окраски по Граму. Затем вновь промывают и подсушивают пленку промокательной бумагой. Эндоспоры окрашиваются в ярко-зеленый цвет, а вегетативные клетки — в красно-коричневый.

Цисты

Бактериальные цисты, имеющиеся у видов Azotobac- ter например, при простом окрашивании прокрашиваются слабо; обычно они выглядят, как сферические тела, окруженные толстыми, но плохо прокрашенными стенками. Описанный ниже метод [14] пригоден для выявления цист азотобактера, в том числе форм, образующихся до созревания цист.

Окрашивание цист

Реактив:

Ледяная уксусная кислота8,5мл

Сульфат натрия (безводный)3,25 г

Нейтральный красный200мг

Светло-зеленый S.F. желтоватый200мг

Этанол 95%-ный (объем/объем)50мл

Дистиллированная вода100мл

Все химические реагенты и красители добавляют в воду при постоянном перемешивании в течение 15 мин и затем смесь фильтруют через мембранный фильтр (с диаметром пор 0,5 мкм).

Методика:

Реактив наносят на образец и просматривают влажный препарат под микроскопом. Вегетативные клетки азотобактера окрашиваются в желтовато-зеленый цвет;

на ранних стадиях формирования цист темно-зеленая цитоплазма несколько отстоит от наружной клеточной стенки, их разделяет красно-коричневый слой. В зрелых цистах центральная часть выглядит темно-зеленой и отделяется неокрашенной интиной от расположенной снаружи красно-коричневой экзины.

Капсулы и слои слизи

Капсулы и слои слизи образуются некоторыми бактериями в специфических культуральных условиях. Лучше всего они видны во влажных препаратах, поскольку составляющие их сильно гидратированные коллоидные полимеры легко разрушаются и сокращаются в размерах при высушивании и фиксации.

Самым простым и наиболее эффективным из трех методов окраски капсул, описанных ниже, является метод Дюгида.

Метод окраски капсул по Дюгиду

На чистое предметное стекло петлей наносят тушь и смешивают ее с культурой. Покровное стекло помещают таким образом, чтобы была накрыта лишь часть смеси.

Сложенной много раз промокательной бумагой сильно прижимают покровное стекло к предметному стеклу до появления тонкого коричневатого слоя жидкости между ними. Препарат смотрят под большим увеличением, применяя безыммерсионные и иммерсионные объективы.

Капсулы выглядят прозрачными зонами вокруг преломляющих свет микроорганизмов на коричневато-черном фоне.

Метод окраски капсул по Гиссу

Взятую петлей бактериальную суспензию смешивают с каплей нормальной лошадиной сыворотки или снятого молока на предметном стекле.

Высушивают пленку на воздухе и мягко фиксируют ее нагреванием.

Покрывают пленку красящим реактивом кристаллического фиолетового (кристаллический фиолетовый

0,1 г, дистиллированная вода 100 мл) и нагревают до появления пара.

Отмывают кристаллический фиолетовый 20%-ным (вес/объем) водным раствором сульфата меди (CuSO4-5H2O). Подсушивают впитывающим воду материалом и смотрят в микроскоп.

Капсулы выглядят бледно-голубыми, а сами микроорганизмы — темно-фиолетовыми.

Метод окраски капсул по Антони

Высушенную на воздухе пленку окрашивают в течение 2 мин 1%-ным (вес/объем) водным раствором кристаллического фиолетового.

Краситель отмывают 20%-ным (вес/объем) водным раствором сульфата меди (CuSO4-5H2O), удаляют избыток последнего и подсушивают впитывающим влагу материалом.

Капсулы выглядят светло-голубыми, а микроорганизмы — темно-фиолетовыми.

Жгутики

Хотя Кох разработал способ окраски жгутиков более чем столетие назад, существующие в настоящее время соответствующие методики не отличаются легкостью и надежностью. Поскольку толщина бактериальных жгутиков лежит за пределами разрешения светового микроскопа (жгутики имеют диаметр около 10—30 нм), для того чтобы их увидеть, необходимо, так сказать, «вымазать их дегтем и обвалять в перьях». Неподвижные бактерии лишены жгутиков, однако известны организмы, жгутики которых «парализованы» (fla+moh).

Метод окраски жгутиков по Грэю

Раствор А:

Дубильная кислота [20%-ная (вес/объем) водная] 2 мл

Калийные квасцы [KA1(SO4)2- 12Н2О), насыщенные5 мл

водные]

Хлористая ртуть, насыщенный водный раствор2 мл

Основной фуксин 3%-ный (вес/объем) в 95%-ном0,4 мл

(объем/объем) этаноле

Краситель желательно добавлять к остальным ингредиентам непосредственно перед использованием и конечный раствор отфильтровывать.

Раствор В:

Карболфуксин, приготовленный по Цилю (разд. 3.3.6)

Методика:

Обычные бактерии удобно выращивать на косячках агара с соответствующим содержанием питательных веществ. За 0,5 ч до взятия пробы в пробирку с косячком добавляют водный раствор пептона, в который переходят микроорганизмы, так как жидкая среда является наиболее подходящей в подобных экспериментах. Затем пробу центрифугируют, чтобы освободиться от составных элементов среды, промывают и вновь центрифугируют. Осадок осторожно (чтобы предотвратить потерю жгутиков) ресуспендируют в 10%-ном (объем/объем) водном формалине до получения слегка мутной суспензии.

Суспензию петлей наносят на предметное стекло, наклоняют его под углом 45° и подсушивают препарат на воздухе.

Фильтруют прямо на пленку раствор А и оставляют его на ней приблизительно на 6 мин. Точное время следует определить экспериментально.

Раствор А смывают с предметного стекла дистиллированной водой.

На пленку кладут кусочек промокательной бумаги и заливают на 3 мин раствором В.

Удаляют промокательную бумагу, промывают предметное стекло дистиллированной водой, осторожно подсушивают впитывающим влагу материалом и смотрят в микроскоп.

Жгутики и клетки бактерий окрашиваются в красный цвет. Значительная доля успеха в осуществлении метода зависит от использования абсолютно чистых обезжиренных предметных стекол. Чтобы обеспечить чистоту стекол, их нагревают либо в пламени горелки Бунзена, до тех пор пока пламя по краям стекла не становится желтым (после чего стеклам дают остыть), либо в муфельной печи в течение 20 мин при 400 °C (предметные стекла в печи располагают так, чтобы они не соприкасались). После охлаждения стекла используют немедленно или хранят в емкости, не содержащей пыли. Стекла также становятся очень чистыми, если их сначала протереть жидким очистителем Bon Ami, а затем

бумажной тканью Kleenex. Не рекомендуется применять для очистки стекол, на которых красят жгутики, такие очищающие агенты, как хромовая кислота или 50%-ный (объем/объем) спирт.

Метод окраски жгутиков по Ляйфсону

Раствор 1:

Хлористый натрий' ,5 г

Дистиллированная вода19 мл

Раствор 2"

Дубильная кислота3,0 i

Дистиллированная вода100 мл

Раствор 3:

Уксуснокислый п-розанилин0,9

Солянокислый п-розанилин0,3

Этанол 95%-ный (объем/объем)100 мл

Смешивают равные объемы растворов 1 и 2; затем два объема получившейся смеси приливают к одному объему раствора 3. В охлажденном виде полученная смесь хранится 1—2 мес.

Методика:

Высушенный на воздухе образец готовят в соответствии с 1-м и 2-м этапами метода Грэя.

Восковым стеклографом очерчивают вокруг бактериальной пленки прямоугольник.

Наносят на предметное стекло 1 мл раствора красителя, так чтобы нисколько не вытекло за пределы восковой линии. Оставляют краситель приблизительно на 7—15 мин; оптимальное время реакции следует определить экспериментально.

Как только на поверхности красителя образуется золотистая пленка и при освещении снизу будет видно, что вся пленка сплошь покрыта осадком, краситель удаляют, заставляя «плыть» эту пленку по поверхности пущенной из-под крана струи воды. Пленку высушивают на воздухе и смотрят в микроскоп.

Тела и жгутики бактерий окрашиваются в красный цвет.

Цитоплазматические включения

У многих бактерий, выращиваемых в определенных условиях, в результате обменных процессов в цитоплазме образуются отложения, которые называют включе-

ниями. Среди них — отложения жира, поли-р-оксимасля- ной кислоты, полифосфата, крахмалоподобных полисахаридов, серы и различных кристаллов. Некоторые из них представляют собой полимеризованные ненужные продукты, а другие можно отнести к запасам питательных веществ. Для выявления этих включений, которые к тому же преломляют свет, применяется несколько методик окраски.

Окрашивание поли-р-оксимасляной кислоты

Для выявления цитоплазматических включений в бактериях используют следующий метод:

Фиксированную нагреванием бактериальную пленку образца на предметном стекле погружают в раствор 0,3%-ного (вес/объем) Судана черного В, приготовленного на этиленгликоле. Фильтруют и окрашивают в течение 5—15 мин (время определяют экспериментально).

Краситель сливают и препарат высушивают на воздухе, положив предметное стекло на промокательную бумагу.

Несколько раз погружают и промывают предметное стекло в ксилоле, а затем подсушивают впитывающим ксилол материалом.

Дополнительно окрашивают препарат в течение 5—10 с 0,5%-ным (вес/объем) водным сафранином.

Промывают предметное стекло водопроводной водой, подсушивают и смотрят в микроскоп.

Включения поли-р-оксимасляной кислоты выглядят как черно-синие капельки, в то время как цитоплазма окрашивается в розовый цвет.

Окрашивание полифосфата

Включения, состоящие из неразветвленных структур с элементным составом Мп+гРлОзт-!, выявляют следующим образом.

Бактериальную пленку образца на предметном стекле фиксируют нагреванием.

Окрашивают пленку в течение 10—30 с в растворе метиленового синего по Лефлеру или в 1%-ном (вес/объем) толуидиновом синем.

Отмывают краситель водопроводной водой, подсушивают и смотрят в микроскоп.

При окраске метиленовым синим гранулы полифосфата выглядят шариками, имеющими цвет от синего до фиолетового, а вся остальная цитоплазма окрашивается в светло-голубой цвет. Толуидиновый синий окрашивает метахроматически, и гранулы имеют красный цвет на фоне голубой цитоплазмы.

Окрашивание полисахаридов с использованием реактива Шиффа

Этим методом выявляют гликогеноподобные вещества.

Пленку суспензии на предметном стекле фиксируют нагреванием.

На 5 мин на стекло наносят раствор перйодата [20 мл 4 %-ной (вес/объем) иодной кислоты в воде, 10 мл 0,2 М водного ацетата натрия и 70 мл 95%-ного этанола; защищать раствор от света!].

Отмывают стекло 70%-ным (объем/объем) этанолом.

На 5 мин наносят на предметное стекло восстанавливающий раствор, содержащий 300 мл этанола, 5 мл 2 н. соляной кислоты, 10 г йодистого калия, 5 г тиосульфата натрия (пятиводного), 200 мл дистиллированной воды. Восстанавливающий раствор готовят следующим образом: к раствору йодистого калия и тиосульфата натрия в дистиллированной воде сначала приливают этанол, а затем соляную кислоту. Смесь перемешивают и оставляют на некоторое время для выпадения в осадок серы, после чего собирают надосадочную жидкость.

Отмывают стекло 70%-ным (вес/объем) этанолом.

Окрашивают препарат реактивом Шиффа в течение 15—45 мин (точное время следует определить экспериментально). Реактив Шиффа готовят следующим образом: 2 г основного фуксина растворяют в 400 мл кипящей дистиллированной воды, охлаждают до 50°C и фильтруют через фильтровальную бумагу. Добавляют к фильтрату 10 мл 2 н. соляной кислоты и 4 г метабисульфита калия. Сосуд плотно закупоривают и оставляют на 12 ч в холодном темном месте. Добавляют такое количество 2 н. соляной кислоты (~10 мл), чтобы при высы-

хании на предметном стекле реактив не давал розового налета. Реактив Шиффа хранят в темноте.

Несколько раз отмывают стекло раствором, состоящим из 2 г метабисульфита калия и 5 мл концентрированной соляной кислоты, в 500 мл дистиллированной воды.

Отмывают препарат водопроводной водой и дополнительно окрашивают 0,002%-ным (вес/объем) водным раствором малахитового зеленого в течение 2—5 с.

Отмывают препарат водопроводной водой, подсушивают и смотрят в микроскоп.

Полисахариды окрашиваются в красный цвет, все остальные компоненты цитоплазмы — в зеленый.

Метод окраски полисахаридов алциановым синим

Для выявления полисахаридов можно также использовать алциановый синий. Обычно применяют 1%-ный (вес/объем) раствор алцианового синего в 95%-ном (объем/объем) этаноле, а в качестве дополнительного красителя используют карболфуксин. Последовательность операций такова:

Пленку препарата на предметном стекле фиксируют нагреванием.

Окрашивают пленку в течение 1 мин разведенным в 9 раз (в воде) алциановым синим, приготовленным, как описано выше.

Отмывают препарат водопроводной водой и высушивают.

Дополнительно очень быстро окрашивают (не следует допускать перекрашивания!) препарат карболфуксином (разд. 3.3.6) и сразу же отмывают водопроводной водой. Высушивают пленку на воздухе и смотрят в микроскоп.

Полисахариды окрашиваются в голубой цвет, а другие составляющие цитоплазму компоненты — в красный.

СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ

В этот раздел включен ряд методов, которые не являются столь обычными, чтобы их применять при первом ознакомлении с пробами.

Спирохеты

Спирохеты не прокрашиваются удовлетворительно «обычными» красителями, хотя свободноживущие спирохеты хорошо видны в нигрозиновых пленках. Размеры (толщина) многих из них находятся на пределе разрешения светового микроскопа. Обычно эти бактерии наблюдают живыми с помощью прямой темнопольной или фазово-контрастной микроскопии. Полезно знать, что в пленках, окрашенных по Гимзе, спирохеты флуоресцируют ярким золотисто-желтым светом при просмотре с темнопольным освещением.

Хорошие результаты обычно получают при использовании метода Фонтаны.

Метод окрашивания спирохет по Фонтане

Раствор А (фиксатор):

Уксусная кислота1мл

Формалин2мл

Дистиллированная вода100мл

Раствор В (протрава):

Фенол1 г

Дубильная кислота5 г

Дистиллированная вода100 мл

Раствор С:

К. 0,5%-ному (вес/объем) водному раствору нитрата серебра приливают 10%-ный (вес/объем) раствор водной гидроокиси аммония (по каплям) до тех пор, пока образовавшийся вначале осадок только-только начинает растворяться.

Раствор D:

Этанол абсолютный

Методика:

Высушивают на воздухе пленку на предметных стеклах, очищенных тем способом, который применяют при окрашивании жгутиков.

Фиксируют пленку в растворе А в течение 1 — 2 мин.

Отмывают пленку в растворе D в течение 3 мин.

Наносят на пленку раствор В и нагревают в течение 30 с, пока не начинает подниматься пар.

Отмывают пленку дистиллированной водой и высушивают препарат.

Наносят на пленку раствор С и нагревают, пока

не начинает подниматься пар, а сама пленка не становится коричневой. Пленку отмывают, высушивают и смотрят в микроскоп.

Спирохеты выглядят коричневато-черными.

Микоплазмы

Микоплазмы, вероятно, представляют собой самые маленькие бактерии, которые можно наблюдать в световой микроскоп и которые с трудом поддаются индивидуальному распознаванию из-за сильно выраженного плеоморфизма. Характерные колонии микоплазм, имеющие вид яичницы-глазуньи, наблюдают при прямой микроскопии чашек с агаром. Для анализа колоний полезен подход, разработанный Динесом и заключающийся в том, что препараты смотрят после того, как на место роста бактерий наносят каплю метиленового синего и накрывают ее покровным стеклом. В случае объектов, близких по размерам к пределам разрешения, оптические измерения при фазово-контрастной микроскопии затруднены по двум причинам. Первая — это ореольные артефакты и вторая — присущие фазовому контрасту особенности формирования изображения, благодаря которым круглые объекты выглядят меньше, чем они есть на самом деле. В морфологических исследованиях и при изучении подвижности микоплазм применяются влажные препараты. Что же касается типа микроскопирования, то рекомендуются методы фазового контраста и темнопольного освещения. Если нужны окрашенные препараты микоплазм, то предпочтительнее использовать несколько модифицированную методику окраски по Гимзе (см. ниже), которую следует применять к предварительно фиксированным организмам. Фиксировать микоплазмы лучше раствором Боуэна (разд. 2.2.1) непосредственно в слое агара, лежащем на покровном стекле.

Риккетсии

Риккетсии являются облигатными внутриклеточными паразитами (за исключением Rickettsia quintana), которые, как правило, имеют палочковидную форму, встречаются парами и обладают выраженным плеоморфиз-

мом. Их можно видеть в пленках инфицированной ткани при прямом микроскопическом анализе, если окрасить препараты по Гимзе или по Гименецу. Большинство риккетсий при этом имеют вид фиолетовых коккобациллярных микроорганизмов с различной длиной — от 0,25 до 2 мкм. Чаще всего наблюдаются пары и короткие цепи. Самая маленькая риккетсия — Coxiella burnetii (размер— 0,25X1 мкм)—выглядит, как окрашенная с двух полюсов палочка, находящаяся в цитоплазме инфицированных клеток. Риккетсии тифа и пятнистой лихорадки в целом крупнее (ширина — 3—0,6 мкм, длина — 1,2 мкм). Риккетсии пятнистой лихорадки обнаружены как в ядрах, так и в цитоплазме инфицированных клеток и часто окружены ореолом, иногда ошибочно принимаемым за капсулу.

Инфицированные ткани можно прямо анализировать в флуоресцентном микроскопе, используя специфические антисыворотки, меченные изотиоцианатом флуоресцеина. При окраске по Граму риккетсии красятся как грамот- рицательные.

Метод окраски риккетсий по Гимзе

Исходный концентрированный раствор:

Порошок красителя Гимзы0,5 г

Глицерин33 мл

Абсолютный метанол (свободный от ацетона)33 мл

Порошок красителя Гимзы растворяют в глицерине при 55— 60 °C в течение 1,5—2 ч. Добавляют метанол, тщательно перемешивают и оставляют стоять на некоторое время. Хранят реактив, в котором нет осадка, при комнатной температуре.

Для использования одну часть исходного концентрированного раствора разводят в 40—50 раз нейтральной дистиллированной водой или забуференной водой, pH 6,8.

Методика:

Образец на предметном стекле высушивают на воздухе, фиксируют 5 мин в абсолютном метаноле и вновь высушивают на воздухе.

Наносят на образец свежеприготовленный раствор Гимзы на 1 ч.

Отмывают 95%-ным (объем/объем) этанолом для удаления избытка красителя, высушивают на воздухе и

Часть i. морфология

смотрят в микроскоп с целью выявления базофильно окрашенных организмов, находящихся внутри цитоплазмы.

Метод окраски риккетсий по Гименецу

Исходный концентрированный раствор:

Основной фуксин10 г

Этанол 95%-ный (объем/объем)100мл

Фенол 4%-ный (вес/объем), водный250мл

Дистиллированная вода650мл

Сначала краситель растворяют в этаноле, а затем добавляют другие ингредиенты. Перед использованием красящий раствор выдерживают в течение 48 ч при 37 °C.

При использовании красителя исходный концентрированный раствор разводят в отношении 1:2,5 фосфатным буфером, pH 7,45, приготовленным смешиванием 3,5 мл 0,2 М Na2HPO4, 15,5 мл 0,2 М Na2HPO4 и 19 мл дистиллированной воды. Затем краситель фильтруют. Он может храниться 3—4 дня, но каждый раз перед использованием должен фильтроваться. При окраске этим методом требуется также 0,8%-ный (вес/объем) водный раствор щавелевокислого малахитового зеленого.

Методика:

Образец фиксируют нагреванием и наносят на него на 1—2 мин красящий раствор.

Отмывают водопроводной водой и окрашивают в течение 5—10 с малахитовым зеленым.

Вновь отмывают образец водопроводной водой и второй раз окрашивают малахитовым зеленым.

Тщательно отмывают предметное стекло водопроводной водой, подсушивают промокательной бумагой и смотрят в микроскоп.

Риккетсии выглядят как окрашенные в красноватый цвет бактерии на зеленом фоне.

Водные бактерии

При прямом микроскопировании проб морской воды, как правило, выявляется лишь немного бактерий. Для концентрирования микроорганизмов с целью определения их общего числа в единице объема, а также с целью выявления различных морфологических типов приме-

няется фильтрация. Один из способов фильтрации [7] заключается в следующем.

Фильтры из поликарбоната диаметром 25 мм (с диаметром пор 0,2 мкм) предварительно окрашивают в течение 5 мин в 0,2 %-ном (вес/объем) растворе иргале- нового черного (цветовой индекс среди кислых черных красителей № 107, Union Carbide Corp., New York, N. Y) в 2%-ной (объем/объем) уксусной кислоте, отмывают дистиллированной водой и помещают в увлажненном виде в стеклянный аппарат для фильтрования (Millipore Corp., Bedford, Mass.). Заготовленные фильтры, высушенные после предварительной окраски и промывки, перед использованием увлажняют дистиллированной водой, лишенной бактериальных клеток, на специальном держателе для фильтра. Пробу морской воды, фиксированную нейтрализованным (с помощью ВаСО3) глутаральдегидом [доведенным до концентрации 0,1% (объем/объем)], выливают в воронку над фильтром. Затем к пробе добавляют 0,1%-ный (вес/объем) раствор акридинового оранжевого (с 40%-ным содержанием красителя в исходном реактиве) в 0,02 М трисе, pH 7,2 (при 20 °C) с таким расчетом, чтобы конечная концентрация красителя составила 0,01% (вес/объем). После прокрашивания в течение 3 мин проба с акридиновым оранжевым просасывается (под действием приложенного отрицательного давления 125 мм рт. ст.) через мембранный фильтр. Затем фильтр вынимают из аппарата и кладут на каплю иммерсионного масла (типа I, F или A; Cargil- le Laboratories, Inc., Cedar Grove, N. J.), находящуюся на предметном стекле. Другую каплю наносят сверху и накрывают покровным стеклом. Эти операции следует проводить быстро, чтобы фильтр на высох. Препарат просматривают в стандартном микроскопе, оснащенном системой возбуждения люминесценции падающим светом, включающей в себя 100-ваттную галогеновую лампу, возбуждающий светофильтр BG-12, запирающий светофильтр LP-510 и светоделитель FT-510. Бактерии, находящиеся на фильтре, люминесцируют зеленым светом; при этом можно наблюдать отдельные морфологические типы.

Другой, занимающий много времени способ пропагандирует Хенрици. Он рекомендует подвешивать пред-

метные или покровные стекла в исследуемой воде на несколько часов или дней, а затем окрашивать и микро- скопировать их. В этом случае происходит отбор микроорганизмов, обладающих свойством прикрепляться к поверхностям, характерным для многих обитателей пресных и соленых вод.

Почвенные бактерии

Известны неселективные методы прямого микроскопического изучения почвенных бактерий [3, И]. В качестве миниатюрных предметных стекол используют специальные стеклянные капилляры разной ширины с прямоугольным сечением (Carlson Scientific Inc., Matteson, IL 60443). Существуют капилляры, у которых одна стенка очень тонкая (0,17 мм). Устройство для взятия проб, так называемый пелоскоп, состоит из набора четырех или пяти пучков прямоугольных в сечении капилляров длиной 1—2 см, по пять капилляров в пучке. Пелоскоп заполнен стерильной дистиллированной водой и прикреплен к держателю (с маркированной миллиметровой шкалой) посредством резиновой полоски. Его вертикально опускают в исследуемый образец почвы. По истечении определенного срока пелоскоп извлекают и исследуют под микроскопом, чтобы увидеть «микробные ландшафты» в капиллярах. Рекомендуется тщательно отмыть пелоскоп водой и удалить из держателя захваченные клетки. Каждый капилляр снаружи протирают дочиста бумагой для линз и затем просматривают тонкой стенкой вверх. При помощи специальных методик капилляры можно превратить в вечные препараты [11].

Другой простой способ, позволяющий произвести отбор (конечно же, неполный) почвенных микроорганизмов для микроскопического изучения, заключается в следующем. Пробу почвы помещают на дно часового стекла или маленькой чашки. При помощи пастеровской пипетки снизу к ней добавляют воду до тех пор, пока над пробой не появится водная поверхность. На эту поверхность кладут покровные стекла или электронно-микроскопические сетки, к которым прикрепляются микроорганизмы, находящиеся в поверхностной пленке.

ЛИТЕРАТУРА

Общая литература

Norris J. R., Ribbons D. W. (ed.). Methods in microbiology, vol. 5A, Academic Press, Inc., New York, 1973.

Материал, представленный в первой части этого тома, особенно полезен как дополнение к тому, что излагалось в данной главе. В частности, укажем следующие главы:

Microscopy and micrometry, by L. В. Quesnel, p. 1—103.

Staining bacteria, by J. R. Norris and H. Swain, p. 105—144. III. Techniques involving optical brightening agents, by A. M. Paton and S. M. Jones, p. 135—144.

Motility, by T. Iino and M. Enomoto, p. 145—163.

Paik G., Suggs M. T. Reagents, stains, and miscellaneous test procedures, p. 930—950. In E. H. Lennette, E. H. Spaulding, and J. P. Truant (ed.), Manual of clinical microbiology, 2nd ed. American Society for Microbiology, Washington, D. C., 1974.

Приведены некоторые дополнительные методики и соответствующая библиография по медицинской микробиологии.

Специальная литература

Aristovskaya Т. V. The use of capillary techniques in ecological studies in microorganisms, p. 47—52. In T. Rosswall (ed.), Modern methods in the study of microbial ecology. Swedish National Science Research Council, Stockholm (1973).

Bartholomew J. W. Variables influencing results, and the precise definition of steps in gram staining as a means of standardizing the results obtained. Stain Technol., 37, 139—155 (1962).

Casida L. Interval scanning photomicrography of microbial cell populations, Appl. Microbiol., 23, 190—193 (1972).

Henrichsen J. Bacterial surface translocation: a survey and classification, Bacteriol. Rev., 36, 478—503 (1972).

Hobbie J. E., Daley R. L, Jasper S. Use of Nucleopore filter for counting bacteria by fluorescence microscopy, Appl. Environ. Microbiol., 33, 1225—1228 (1977).

MacRae T. H., McCurdy H. D. The isolation and characterization of gliding motility mutants of Myxococcus xanthus. Can. J. Microbiol., 22, 1282—1292 (1976).

Mason D. J., Powelson D. M. Nuclear division as observed in live bacteria by a new technique, J. Bacteriol., 71, 474—479 (1956).

Noiler E. C., Durham N. N. Sealed aerobic slide culture for photomicrography, Appl. Microbiol., 16, 439—440 (1968).

Perfil’ev В. V„ Gabe D. R. Capillary methods of investigating micro-organisms, Oliver and Boyd, Edinburg, 1969.

Robinow C. F. Morphology of bacterial spores, their development and germination, p. 207—248. In: I. C. Gunsalus and R. Y. Stanier (ed.), The bacteria, vol. 1, Academic Press, Inc., New York (1960).

Truant J. P. Brett IF. A., Thomas IF. Fluorescence microscopy of tubercle bacilli stained with auramine and rhodamine. Henry Ford Hospital Med. Bull., 10, 287—296 (1962).

Vela G. R., Wyss O. Improved stain for visualization of Azotobac- ter encystment, J. Bacteriol., 87, 476—477 (1964).

Глава 4

ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯР. Коул, Т. Попкин

Исследователь, собирающийся работать на электронном микроскопе и никогда не сталкивавшийся с ним ранее, должен перенять опыт от специалистов, работая вместе с ними, причем желательно на такой же модели, на которой он планирует проводить эксперименты. Предварительно он должен запастись руководствами и справочниками и, возможно, пройти подготовку на специальных курсах. Методы электронной микроскопии, предлагаемые нами в данной главе, предназначены для тех, кто имеет доступ к микроскопу и должен проводить бактериологические исследования. Исследователи могут почерпнуть для себя много полезного, не только занимаясь на курсах, но и осваивая необходимые манипуляции с помощью квалифицированного оператора, а также привлекая необходимые сведения, изложенные в руководствах и литературе по общим вопросам [1 —14]. Мы не будем здесь дублировать все эти источники инструкций, так как для каждого микроскопа существуют собственные правила работы.

В отличие от светового микроскопа, в отношении которого предполагается, что каждый, кто на нем работает, способен использовать его наилучшим образом, электронный микроскоп — специализированный прибор, который настраивается и обслуживается специалистами. Это связано с расходами на запасные части и производством ремонтных работ, осуществляемых по контракту с обслуживающим предприятием-изготовителем. Для того чтобы оправдать капитальные вложения и затраты, связанные с организационными трудностями, в большинстве случаев на одном электронном микроскопе работает много людей. Часто к электронным микроскопам прилагаются устройства для производства срезов, получения реплик методами напыления сколов и травления замороженных образцов и, возможно, для других видов

микроскопии, в том числе — сканирующей электронной микроскопии. Те, кто отвечает за бесперебойную работу микроскопов, устанавливают правила и нормы обращения с ними, обеспечивающие сохранность оборудования и непрерывность работы, и строго следят за соблюдением этих правил. Работающему с микроскопом следует с вниманием и заботой отнестись к прибору (некоторые его части устроены очень тонко, и имеет большое значение, какие ручки крутят при его настройке), а также к тому, кто будет работать после него («золотое правило»). Работающий на электронном микроскопе должен быть также предельно честным в отношении действий, которые он предпринимает (или не предпринимает), чтобы можно было быстро преодолеть затруднения, возникающие при эксплуатации и устранении неполадок.

Необходимо придерживаться следующих правил.

На любом приборе и при выполнении любой манипуляции вас должны контролировать не только для того, чтобы вы лучше его освоили, но и для того, чтобы вы сами и отвечающий за микроскоп оператор знали слабые места в вашей подготовке.

Если микроскоп не работает, ведет себя странно или требует приложения необычных для нормальной работы усилий, остановите эксперимент на безопасной стадии, обдумайте все и обратитесь за помощью к специалистам.

Не поддавайтесь соблазну произвести самостоятельный ремонт, лучше честно признаться в совершенных ошибках и обратиться за помощью к специалистам.

Ведите записи, даже если на данном электронном микроскопе не заведен такой порядок, обязательно отмечайте время своей работы и регистрируйте все случаи отклонения от нормы.

Делайте собственные записи последовательных процедур и имейте их с собой во время работы. Используйте контрольный список, который должен включать, например, следующие пункты.

Положения ручек и выключателей при включении и налаживании прибора (а также при выключении)

Пусковые манипуляции

Требования по готовности прибора к работе Процедуры по настройке, выполняемые повседневно

Центрировка диафрагмы объективной линзы Настройка конденсора

Компенсация астигматизма

Действия по переходу на широкопольное сканирование

Рабочие операции и обращение с фотокамерой Предупредительные сигналы и реакция на них Действия по ликвидации аварийной обстановки и обеспечению безопасности

Действия по выключению прибора с последующим приведением его в исходное состояние.

Усилия, связанные с качественным приготовлением образцов и тщательным выполнением методических требований, а также настойчивость и экспериментальное искусство в работе с электронным микроскопом будут вознаграждены хорошими микрофотографиями и должны быть по достоинству оценены как научным руководителем, так и самим микроскопом.

Ценность электронного микроскопа заключается в его способности разрешать объекты, которые не разрешаются оптическим микроскопом в видимом или ультрафиолетовом свете. Короткая длина волны электронов, которая уменьшается в прямой зависимости от подаваемого ускоряющего напряжения, позволяет разрешать, т. е. различать как отдельные объекты, отстоящие друг от друга всего на 2А (0,2 нм или 0,0002 мкм) или даже меньше, в то время как предел разрешения световой оптики лежит вблизи 0,2 мкм (он зависит от длины волны используемого света). На практике самые лучшие современные электронные микроскопы просвечивающего типа в самых оптимальных условиях работы (т. е. при при соответствующих вакууме, центрировке линз, ускоряющем напряжении, чистоте прибора, физической стабильности и качестве приготовленного образца) дают разрешение в диапазоне 0,5—1,0 нм. Но биологические образцы имеют вполне определенную толщину; реально предел разрешения для срезов достигает около 2,5 нм, а для негативно контрастированных препаратов — около 1,0 нм. Чтобы улучшить разрешение, нужны мастерство и хорошо налаженный прибор. Образцы и поддерживающие пленки-подложки с большой толщиной увели-

чивают рассеивание электронов, что ведет к заметному ухудшению разрешения.

Полезно перечислить некоторые ограничения электронной микроскопии. В связи с тем что образцы исследуются в условиях высокого вакуума, необходимого для получения пучка электронов, они, очевидно, должны быть неживыми и высушенными. Природа проникновения пучка электронов в биологический образец и прохождения через него такова, что степень контраста на фотографии или при непосредственном наблюдении мала и в противоположность разрешению падает с увеличением ускоряющего напряжения. Следовательно, образец должен иметь минимальную толщину и его необходимо селективно окрашивать или контрастировать солями тяжелых электроноплотных металлов.

Поскольку электронный микроскоп обладает повышенным разрешением по сравнению со световым, оказалось возможным получить на нем значительно большее полезное увеличение. В современных электронных микроскопах достигается огромное прямое увеличение изображения на смотровом экране или фотопленке, но для большинства образцов, если не ставить целью разрешить отдельные макромолекулы, вполне удовлетворительны увеличения на экране или пленке 5000—15 000Х (последующего увеличения в 5—10 раз при фотопечати негативов более чем достаточно); при этом обычно получают стабильные изображения. Качество результатов зависит не только от уже упомянутых условий работы, но также от способа приготовления образцов, мастерства в управлении прибором и от фотографической техники.

Благодаря высокому разрешению, наличию различных препаративных методов и большому выбору соответствующей техники микроскопирования удается выявлять детали бактериальных структур. Например, с помощью солей тяжелых металлов, окружающих бактерию и проникающих в поверхностные неровности, получают контрастирование за счет дифференциальной задержки электронов. Этот эффект, известный как негативное контрастирование, аналогичен эффекту применения нигрозина в световой микроскопии. Однако, если в клеточной стенке или мембране нет разрывов, позволяющих

проникать контрастирующему красителю, с помощью этого метода нельзя увидеть никаких структур внутри цитоплазмы. В этом случае клеточные компоненты изучают после специального разрушения клеток, фракционирования структур и последующего негативного контрастирования.

Детали внутреннего строения in situ выявляют на срезах бактерий, залитых в полимерный материал; предварительно бактерии фиксируют химически и обрабатывают солями тяжелых металлов для получения необходимого контраста. Часть электронов проходит через образец, а другие рассеиваются компонентами структуры, в результате чего формируется изображение на люми- несцирующем смотровом экране или пленке. Электронный микроскоп, в котором изображение получают благодаря прохождению (просвечиванию) электронов (по крайней мере части из них) через образец, называют просвечивающим (или трансмиссионным). Такие микроскопы обладают самыми широкими возможностями применения в микробиологии [53—63].

Благодаря техническому прогрессу недавно появился также сканирующий (растровый) электронный микроскоп. Некоторые современные модели электронных микроскопов устроены так, что сочетают в себе возможности как просвечивающего, так и сканирующего микроскопов, и их можно переоборудовать с одного типа на другой.

При сканирующей электронной микроскопии, как следует из названия, пучок электронов быстро сканирует поверхность образца, вызывая излучение, которое посредством катодно-лучевой трубки формирует изображение на светящемся экране; этот процесс сходен с формированием телевизионного изображения. Образец прежде всего фиксируют химическим путем, высушивают в критической точке, чтобы избежать деформации и напыляют в вакууме золотом или другим тяжелым металлом. Разрешение, достигаемое с помощью сканирующего электронного микроскопа, заметно улучшилось со времени его появления, но оно до сих пор меньше (в лучших выпускаемых промышленностью образцах около 3,0 нм), чем в обычных просвечивающих электронных микроскопах. Сканирующий электронный микроскоп дает только картину поверхностей, но позволяет полу-

чать сразу трехмерное изображение, поэтому отпадает необходимость трудоемких процедур приготовления реплик интактных, фрагментированных или полученных замораживанием— скалыванием клеток бактерий, обязательных в случае трансмиссионной электронной микроскопии. В бактериологии [64—75] сканирование наиболее эффективно с целью выявления отростков и других поверхностных структур, для определения формы и топографических отношений как в колониях, так и на поверхностях инфицированных тканей.

В этой главе описывается небольшое число методов, которые мы в соответствии с собственным опытом считаем полезными для исследователя, изучающего анатомию бактерий. Мы делаем акцент на применении негативно контрастированных препаратов и тонких срезов образцов для анализа в просвечивающем электронном микроскопе. Здесь нет описания операций по управлению и эксплуатации электронного микроскопа [15—19], но есть краткая информация о необходимых для работы материалах и их поставщиках (разд. 4.6 и 4.7). Предполагается, что доступны вспомогательные приборы и что помощь в работе могут оказать опытные операторы. Мы поставили своей целью снабдить обучающегося сведениями о методах приготовления образцов и способах интерпретации результатов. Хотя помимо методов и оборудования, на которых делается акцент, будут упоминаться и другие, детальную информацию о них можно найти, лишь обратившись к специальной литературе, другим руководствам и журнальным статьям. В конце главы мы приводим литературу по общим вопросам [1-14] и перечень источников специальной информации.

ПРОСВЕЧИВАЮЩАЯ

электронная микроскопия

Негативное контрастирование [20—33]

Микроскопические сетки [20—23]

Для электронной микроскопии промышленностью выпускаются стандартные сетки диаметром 2,3 или 3,0 мм. Они изготовляются из различных металлов и

имеют разную частоту ячеек; наиболее распространен вариант медных сеток с частотой ячеек 200 меш (частота в мешах обозначает число рядов в сетке на расстоянии в один дюйм). Одна сторона у сеток матовая, а другая — блестящая. Перед нанесением поддерживающих пленок-подложек сетки следует очистить, обработав их для этого ацетоном или какими-либо другими растворителями. Однако некоторые предприятия-изготовители выпускают уже достаточно очищенные сетки, которые можно дополнительно не обрабатывать.

Пленки-подложки 1^20—23]

Хотя для поддержания объектов, залитых в эпоксидные смолы (см. ниже), можно использовать сетки без пленок-подложек, жидкие образцы для негативного контрастирования нужно помещать на пленки-подложки, покрывающие сетки. Обычно это нитроцеллюлозные или коллоидные (парлодиевые), поливинилформоловые (формваровые) или углеродные пленки. Пленки из первых двух веществ, относящихся к пластмассам, часто стабилизируют дополнительным тонким углеродным слоем. Формвар — наиболее удовлетворительный материал для пленок-подложек, и мы рекомендуем следующий способ его применения.

Приобрести материалы, перечисленные в разд. 4.6.1.

Приготовить рабочий 0,2%-ный раствор формвара в дихлорэтане, используя исходный концентрированный 0,5%-ный раствор и указанный растворитель.

Отмыть предметные стекла мыльным раствором (или раствором детергента) и водой и тщательно промыть их дистиллированной или деионизованной водой. Высушить стекла, пользуясь как промокашкой неволокнистым протирочным материалом, ни в коем случае не прибегая к протиранию, чтобы избежать наведение заряда статического электричества. Чистые стекла можно хранить по отдельности, проложив между ними кусочки неволокнистого протирочного материала.

Наполнить одну кювету Коплина (Coplin jar) рабочим раствором 0,2%-ного формвара, а в другую внести 4—5 капель дихлорэтана и накрыть ее. В последней

создается атмосфера растворителя, что способствует равномерному высыханию предметных стекол, покрытых формваром.

Поместить два или три предметных стекла в кювету с раствором формвара и оставить их там на 3—5 мин. Вынуть стекла по одному и перенести во вторую кювету для «высушивания». После высушивания вынуть и положить стекла на неволокнистый протирочный материал. Очищенной спиртом бритвой по периметру надрезать слой формвара с обеих сторон.

Наполнить закрывающуюся стеклянную чашку (дно которой с наружной стороны покрыто черной липкой лентой) деионизованной водой до образования выпуклого мениска у самого верха. Провести чистой стеклянной палочкой, находящейся в контакте с верхними краями чашки, по поверхности воды от края до края чашки, чтобы выровнять мениск и собрать с поверхности всю пыль. (Для перетекающей при этом через край воды под чашку можно подставить поднос.)

Осторожно, держа вертикально над подносом покрытое пленкой стекло, капнуть из пастеровской пипетки по бритвенным надрезам формваровой пленки 10%- ную плавиковую кислоту. (Пипетку каждый раз после использования выбрасывать.) Сразу же, но не спеша погрузить находящееся в вертикальном положении стекло в воду. Пленки формвара будут медленно сходить с обеих сторон стекла на водную поверхность, плавая на ней. Визуально проверить пленки (желательно под светом люминесцентной лампы), чтобы оценить их однородность и толщину. Они должны иметь цвет от серого до серебристо-серого и в соответствии с картиной интерференционных полос могут иметь разброс в толщине ±60 нм. Теоретически идеальные значения толщины 10—20 нм достигаются очень редко.

Если однородность или толщина пленки неудовлетворительны, следует повторить описанные выше этапы с некоторыми модификациями. Если пленки неоднородны, стекла, покрытые формваром, нужно сушить дольше и погружать в воду более медленно. Если пленка слишком толста, следует развести раствор формвара дихлорэтаном; если слишком тонка — добавить в раствор немного исходного концентрированного 0,5%-ного формвара и

Часть i. морфологйя

повторить все сначала. При использовании плавиковой кислоты, отделяющей при протравливании формвар от стекла, получают более воспроизводимые результаты, чем при обычном способе, когда на стекло просто дышат.

Если плавающие по поверхности воды пленки удовлетворяют всем требованиям, следует аккуратно поместить на них сетки (матовой стороной вниз). Участков пленки с заведомыми нарушениями лучше избегать, чтобы все сетки находились почти в одинаковых условиях.

Разрезать пополам кружок фильтровальной бумаги (Whatman № 1) и, держа половинку над полосой формваровой пленки с сетками, медленно опускать ее на поверхность до тех пор, пока она не пропитается равномерно водой. Затем погрузить бумагу в воду, перевернуть ее и вынуть из воды вместе с пленкой и сетками, которые оказываются при этом между фильтровальной бумагой и пленкой формвара.

Поместить бумажный полукруг с сетками в чашку Петри на другой кусок фильтровальной бумаги и неплотно закрыть чашку крышкой на время сушки.

Замечание: не применяйте слишком волокнистую фильтровальную бумагу, так как волокна могут повредить пленку.

После высушивания сетки поднимают за край специальным тонкозаостренным пинцетом. При этом пленка должна разорваться точно по периметру сетки, оставшись на ее поверхности. Если это не происходит или если пленки разрываются не точно по периметру сетки, значит, они слишком толсты; однако чрезмерная толщина может быть лишь на некоторых участках пленки, в то время как другие могут быть вполне удовлетворительными. Пленки, имеющие большие дырки (чего удается обычно избежать, применяя плавиковую кислоту, вместо того чтобы дышать на пленку при ее отделении от стекла), не способны хорошо удерживать жидкость, причем дырки бросаются в глаза при микроскопировании. Большие дырки в подложке получаются также в результате того, что при высушивании окружающая пленку среда обладает слишком высокой влажностью. Чересчур тонкие пленки легко разрываются под действием пучка электронов.

Из-за ионизации и последующих изменений электростатического заряда пленки расширяются и сжимаются, вызывая смещение образца при увеличении и уменьшении интенсивности электронного пучка. Любое возникающее движение приводит к смазыванию фотографического изображения тем больше, чем больше используемое увеличение. Часто регулировка интенсивности пучка и короткое выжидание приводят к стабилизации. Мы считаем, что формваровые пленки, приготовленные описанным способом, вполне удовлетворительны для обычных целей при увеличении, не превышающем 50 000, если тот, кто управляет микроскопом, внимательно следит за условиями микроскопирования и длительностью фотоэкспозиции. Однако для выявления тонких деталей и для работы при большом увеличении используют более стабильные пленки, которые получают путем напыления тонкого (2,0—3,0 нм) слоя углерода. Тонкие пленки чистого углерода предотвращают смещение образцов и улучшают разрешение, поскольку они более равномерны и имеют более тонкую структуру. Их готовят почти полным растворением и удалением большей части пластмассового компонента из покрытых углеродом пленок или отделением на воду углеродных пленок со стеклянных или свежерасщепленных слюдяных поверхностей точно так же, как это делается в случае обычных подложек. Сетки, покрытые углеродными пленками, имеются в продаже. Хотя у этих пленок есть большие преимущества, позволяющие проводить тонкие эксперименты с субклеточными частицами и вирусами, работать с ними нелегко, так как эти нежные и хрупкие пленки требуют осторожного обращения с ними. Пленки можно приготовить также напылением частиц углерода очень малых размеров при испарении углерода с угольных электродов в вакууме [10~s—10-6 мм рт. ст. (1,33—0,13 нПа)]. Эту процедуру осуществляют в напылительной установке — устройстве, для которого существует несколько выпускаемых промышленностью моделей. В современных напылительных установках, включающих либо просто устроенные, либо автоматические управляющие системы, процесс напыления сеток почти автоматизирован; они представляют собой неотъемлемую часть каждой электронно-микроскопической лаборатории. Подробно с

использованием напылительных установок (сюда входят также контрастирование образцов и получение их реплик при обработке тяжелыми металлами) читатель может ознакомиться в специальных источниках информации [44, 45].

Окрашивание

Негативное «окрашивание» (контрастирование) — это процесс заключения бактерий или других частиц в тонкую пленку разбавленного раствора соли тяжелого металла, которая затем высыхает на стекле. В отношении используемых красителей и методов их применения (см. ниже) существует множество вариантов. Стандартная методика, применяемая в нашей лаборатории, включает два этапа — сначала нанесение образца, а затем окрашивание 2%-ным молибдатом аммония, как описано ниже.

Край сетки с пленкой наверху помещают на край трижды сложенной полоски липкой ленты (и внизу и вверху липкой стороной наружу), прижатой к покровному стеклу.

Пастеровской пипеткой на сетку наносят каплю бактериальной или другой суспензии, подлежащей исследованию. Площадь, которую занимает капля, должна совпадать с поверхностью сетки. (Капля удерживается поверхностным натяжением мениска; неводные суспензии или суспензии, содержащие поверхностно-активные вещества, не удерживаются на сетке.)

Каплю оставляют на сетке на 1 мин или больше, чтобы бактерии или другие частицы пристали к поверхности пленки. Оптимальное время выдерживания, которое зависит от природы пленки и ее заряда (гидрофильности), а также размера и природы частиц, определяют методом проб и ошибок. Для улучшения адгезии и распределения частиц можно усилить гидрофильные свойства подложки, применяя покрытые пленкой сетки, выдержанные в холодильнике или недавно облученные ультрафиолетовым светом; для сведения к минимуму электростатического заряда сетки помещают в камеру с высоким вакуумом, где происходит тлеющий разряд или разряд при помощи катушки Теслы. Эффективно также

непосредственно перед нанесением капли образца на сетку использовать пушку зеростата.

Вершиной маленького треугольника из фильтровальной бумаги ватман № 1, прикасаются к капле и забирают большую ее часть. Затем тут же краем бумаги прикасаются к краю сетки и быстро забирают остатки жидкости.

Пока поверхность сетки не просохла, на нее наносят каплю 2%-ного молибдата аммония.

Через 30—60 с удаляют каплю красителя, как описано выше. Время обработки определяют экспериментально.

Сеткам дают возможность высохнуть и затем исследуют их с помощью электронного микроскопа.

Для негативного окрашивания суспензий существует несколько взаимозаменяемых методов. В одном из них смешивают равные объемы (можно использовать и другие отношения) красителя и суспензии, наносят одну каплю на сетку, а затем либо сразу, либо по прошествии определенного времени (например, 30 с) удаляют избыток жидкости. Обычно каплю лучше всего наносить сразу после смешивания, поскольку происходящее со временем взаимодействие частиц и красителя может приводить к нестабильным результатам. Иногда выгодно захватить тонкую пленку смеси платино-иридиевой петлей размером чуть больше площади сетки (например, диаметром 3,2 мм) и нанести ею смесь на сетку, лежащую на промокательной бумаге; этим обеспечивается более равномерное распределение частиц. Сетку высушивают и просматривают. Если нанесенного материала больше, чем должно быть в тонкой пленке, то избыток следует удалить фильтровальной бумагой.

Другой метод негативного окрашивания заключается в том, что сетке дают возможность плавать последовательно по поверхности капли суспензии, капли фиксатора или другого агента, капли промывочной воды (несколько раз; см. ниже «Отмывка») и капли с красителем, вслед за чем, как и обычно, сетку подсушивают фильтровальной бумагой (см. выше этап 6-й). Капли удобно наносить на пластинку зубного воска, сполоснутого дистиллированной или деионизованной водой для удаления пыли и растворимых солей.

Иногда смеси красителя и суспензии распыляют на сетки, но для этого нужен специальный аппарат; этот метод наиболее полезен для количественной оценки вирусов и других маленьких частиц [26].

При изучении бактерий особенно полезен способ нанесения сеток, покрытых пленкой, на бактериальный газон или колонии. Сразу же после снятия сеток удаляют лишнюю жидкость и проводят окрашивание. Этим способом можно исследовать природное состояние бактерий и их пространственные взаимосвязи, не нарушенные набиранием в пипетку или другими процедурами, для которых характерны сдвиговые усилия. Подобные процедуры могут вызвать отрыв жгутиков, ворсинок или других хрупких структур. Описанный способ полезен также для быстрого определения морфологического типа фага, вызвавшего образование стерильного пятна на газоне индикаторной культуры бактерий.

Отмывка

Отмывка сетки — полезная дополнительная процедура, следующая за нанесением суспензии, но предшествующая негативному контрастированию (в двухэтапном методе). Ее проводят для того, чтобы удалить остатки клеток, а также излишки солей и белка, выпадающие в осадок под действием некоторых красителей и ухудшающие изображение исследуемых компонентов. Отмывку проводят, быстро прикасаясь поверхностью сетки к капле воды, причем эту операцию повторяют несколько раз с новыми каплями дистиллированной воды или еще какой-либо жидкости. Другой способ отмывки заключается в том, что сетку препаратом вниз помещают на влажную поверхность полоски тонкой согнутой фильтровальной бумаги ватман № 1, которая через край впитывает отмывающую жидкость из маленького стаканчика или чашки Петри. В любом из этих случаев сетку окрашивают сразу же после удаления избытка жидкости фильтровальной бумагой.

Помимо воды, для отмывки могут быть испробованы различные растворы; при их выборе следует учитывать свойства исследуемых частиц, а также то, что соли и другие вещества, мешающие окрашиванию, должны

быть обязательно удалены. Во многих случаях для отмывки лучше всего применять 1%-ный водный ацетат аммония, поскольку он не реагирует с бактериями, микоплазмами, мембранами, вирусами и большинством внутриклеточных компонентов, а также потому, что его избыток улетучивается в условиях вакуума электронного микроскопа. При первом знакомстве с микроорганизмами из жидких культур в большинстве случаев образующийся после центрифугирования осадок суспендируют в небольшом количестве ацетата аммония и суспензию наносят на сетку. Центрифугирование бактерий в любых целях, в том числе на этапе фиксации и отмывки препаратов, готовящихся методом заливки (разд. 4.1.2), удобнее и быстрее всего проводить в настольных центрифугах, таких, как центрифуги фирм Brinkmann или Eppendorf. Объем конической пластмассовой пробирки в них не должен превышать 1,5 мл.)

Красители

В качестве красителей для негативного окрашивания используются различные соли тяжелых металлов. Наш опыт свидетельствует о том, что самой подходящей солью является молибдат аммония, так как он хорошо распределяется, не реагирует с белками и большинством других компонентов суспензии и его концентрацию легко регулировать для создания требуемой степени контраста [32]. Пожалуй, чаще других используются растворы фосфорновольфрамового натрия и калия, в целом удовлетворительные при нейтральных значениях pH. Широко применяются соли урана, поскольку их молекулы, обладающие небольшими размерами, хорошо проникают в поверхностные неровности и тем самым улучшают разрешение тонких деталей. Уранилацетат, который, как правило, имеется в электронно-микроскопических лабораториях, потому что его используют также при окрашивании срезов, дает хорошие результаты при концентрации ~ 1 % или меньше. Но его растворы имеют очень низкий pH (около 2,5), и, даже будучи частично нейтрализованным непосредственно перед использованием, он начинает выпадать в осадок при pH выше 4,5. Некоторые структуры ура-

нилацетат окрашивает позитивно, и на одной и той же сетке могут быть видны участки как позитивно, так и негативно окрашенные. Ко всему прочему, он действует как фиксатор на белки и нуклеиновые кислоты, вызывает сжатие и округление ограниченных мембранами клеток (например, микоплазм), разрушает некоторые белковые структуры при pH 4,5 и должен применяться только для чистых и хорошо отмытых препаратов. В связи с этим особую ценность приобретает уранилоксалат, так как его можно использовать при нейтральных значениях pH. Иногда также используют уранилформиат, кремневольфрамовокислый натрий и другие соли. Соли урана обладают незначительной радиоактивностью и токсичностью, поэтому во время работы с ними необходимо быть осмотрительными.

Некоторые исследователи советуют добавлять к ряду красителей (например, к фосфорновольфрамату, но не к солям урана) с целью улучшения их распределения незначительные количества удерживающих воду агентов, таких, как сывороточный альбумин, крахмал или сахароза [22]. Не все находят это полезным или необходимым, особенно в тех случаях, когда требуются большие увеличения или хороший фон.

Фиксация

Иногда перед негативным контрастированием оказывается полезной химическая фиксация микроорганизмов. Ее применяют для того, чтобы избежать структурных изменений и искажений из-за действия растворов с разными pH и осмотическими свойствами, из-за действия самих красителей или из-за высушивания в красителе. Фиксацию проводят в растворах глутаральдегида низкой концентрации, а иногда суспензию на сетке подвергают действию паров глутаральдегида в закрытом сосуде. Перед окраской фиксированные бактерии нуждаются в отмывке либо прямым способом, либо путем отмывки сеток методами, упомянутыми выше. В итоге часто наблюдается в какой-то степени позитивное окрашивание, а задержка красителя вокруг фиксированного микроорганизма такова, что для окрашивания можно применять значительно менее концентрированные растворы красителя.

«Подводные камни», трудности, предосторожности

Много указаний на трудности, встречающиеся в электронной микроскопии, уже было сделано в предшествующих разделах. Когда говорят о доступности электронного микроскопа, подразумевают наличие по крайней мере одного опытного оператора, хорошо знакомого с обслуживанием и эксплуатацией напылительных установок, ультрамикротомов и самого микроскопа. При наблюдении негативно контрастированных образцов особенно важно добиться нужной степени контраста и разрешения, применяя соответствующее ускоряющее напряжение (обычно 60—80 кВ). Заостренные катодные нити электронной пушки желательны, но не обязательны. Загрязнение колонны микроскопа, апертур и образца сводится к минимуму, если заботиться о надлежащем использовании охлаждаемого жидким азотом противозагрязнительного устройства и самоочищающихся золотых апертур объектива. Чтобы устранить дрейф образца, нужно терпеливо провести предварительные эксперименты с электронными пучками разной интенсивности и использовать углеродно-пластмассовые или чисто углеродные пленки-подложки. Повреждение или изменение тонкой структуры под действием пучка электронов, а также образование пятен красителя вокруг образца и на самом образце можно свести к минимуму, если научиться быстро наводить фокус при наименьшей допустимой интенсивности пучка. Для фотографирования при этом следует использовать как можно более короткие выдержки, которые, если учесть применяемую систему проявления фотопленки, соответствуют достижению желаемого контраста. Наилучшие результаты обычно получают с короткими выдержками при относительно низком увеличении; каждый микроскопист методом проб и ошибок определяет для используемого им микроскопа и изучаемого объекта те увеличения, при которых легче всего производится фокусирование и получаются наиболее четкие результаты.

В красителях и в отмывающих растворах (ацетат аммония) или даже в деионизованной и дистиллированной воде при долгом хранении иногда появляются бактерии. Если есть подозрение на присутствие в растворах

бактерий, их проверяют в электронном микроскопе. Рабочие растворы красителей (обычно 2%-ные растворы молибдата аммония, фосфорно-вольфрамового калия и уранилацетата) хранят в небольших пузырьках, наполняемых по мере надобности из бутылей (с соблюдением стерильности). Загрязненные растворы можно отфильтровать, но лучше всего сделать их заново, чтобы избежать неприятностей, вызываемых маленькими частичками, которые способны проходить через большинство фильтров. Растворы уранилацетата нужно защищать от света, обертывая соответствующую емкость фольгой; их необходимо фильтровать (диаметр пор фильтра 0,2 мкм), если образовался осадок. Удобно разливать растворы пластмассовым шприцем с насаженным на него фильтром типа Swinney.

Распределение по подложке красителя и исследуемых частиц, даже если применяются уже упомянутые методы, может быть неудовлетворительным; поэтому для экономии времени и пользы дела следует готовить две или большее число сеток с одним и тем же материалом.

Сетки просматривают в микроскоп при малых увеличениях. Подходящая для эксперимента сетка, приготовленная путем промокания капли, характеризуется градиентным распределением частиц и красителя от одного края до другого, в пределах которого можно найти область с удовлетворительной плотностью частиц. Если в исходной суспензии концентрация частиц низка или промокание капли дает плохие результаты, то частицы и краситель могут быть найдены лишь на очень маленькой области сетки.

При обработке молибдатом аммония на фокусирующем экране получают менее контрастное изображение по сравнению с обработкой фосфорновольфрамовыми солями и уранилацетатом, и поэтому для работы с ним требуется некоторый опыт. Однако на негативах, проявленных надлежащим образом, получают очень контрастное изображение с большим набором оттенков, воспроизводимых при печати. Молибдат аммония имеет тенденцию плотно окружать большинство бактерий почти непроницаемым слоем. Поэтому для получения хороших результатов на таких крупных объектах, как клет-

ки бактерий, часто требуется окрашивание в течение коротких интервалов времени растворами небольшой концентрации (0,1—0,5%).

Ожидаемые результаты

Какого рода информацию об основных чертах структуры бактерий можно получить методом негативного контрастирования? Это самый простой и самый быстрый метод, который только можно применить (исключая прямой просмотр, который почти бесполезен из-за отсутствия контраста), и поэтому его следует использовать первым. Можно быстро определить размер и форму микроорганизмов, подтвердить наличие жгутиков (вероятно, уже предполагавшееся при изучении подвижности) и выявить их расположение и тонкую структуру. Можно детализировать другие поверхностные отростки, такие, как ворсинки и фимбрии, или убедиться в присутствии слоя слизи или вещества капсулы. Выявляются также различия между прокариотами, окруженными мембраной, но лишенными клеточной стенки (микоплазмы или L-формы бактерий), и прокариотами, имеющими клеточную стенку.

Природу клеточной оболочки определяют путем разрушения клеток и фракционирования клеточных структур, благодаря чему появляется возможность ясно различить упорядоченную тонкую структуру слоев клеточной стенки. Этот прием позволяет разделить и сделать видимыми такие компоненты, как мембраны, мезосомы, другие цитоплазматические мембранные системы, газовые вакуоли, метаболические гранулы, рибосомы, жгутики, ворсинки и т. д. (Гидродинамические силы, возникающие при отборе раствора шприцем или при чрезмерно интенсивном пропускании его через пипетку, могут привести к отрыву жгутиков и ворсинок от клеточной поверхности.) Краситель проникает в периплазма- тическое пространство между мембраной и клеточной стенкой, и, благодаря тому что он заполняет все образуемые мембраной углубления, выявляются очертания мезосом. Это в свою очередь позволяет быстро (и обычно точно) определить, какую бактерию изучают — грам- отрицательную или грамположительную.

Негативное контрастирование представляет собой также удобный способ наблюдения за деградацией клеток при их постепенном разрушении и за изменениями, вызываемыми обработкой такими агентами, как ферменты, антибиотики, поверхностно-активные вещества и т. д.

Используемый непосредственно, а лучше после индукции, метод негативного контрастирования незаменим при быстром обнаружении лизогенного состояния путем нахождения бактериофагов или еще не собранных их компонентов, что имеет большое значение при изучении ультраструктуры и стадий развития вирусов, а также взаимодействий вируса с клеткой-хозяином.

Результаты негативного контрастирования и других способов анализа с помощью трансмиссионной электронной микроскопии можно найти в работах, список которых приведен в конце главы [53—63].

Приготовление срезов [34—43]

Прокариотические клетки, которые собираются анализировать с помощью срезов, должны быть химически фиксированы, промыты и обезвожены для заливки в материал, способный прочно затвердевать. После заливки можно нарезать очень тонкие срезы, затем обработать препарат растворами солей тяжелых металлов и исследовать в электронном микроскопе. Хотя применяются многие различные комбинации, мы считаем, что в целом достаточно использовать фиксацию в глутаральдегиде и четырехокиси осмия или только в четы- рехокиси осмия с последующей заливкой в среду Спарра [43]. Имеется целый набор пластических материалов для заливки, но для обычных целей вполне подходит среда Спарра.

Осмий-глутаральдегидная фиксация

К клеточной суспензии или жидкой культуре добавляют равный объем 5%-ного глутаральдегида в 0,2 М Na-какодилатном буфере, pH 7,4 (конечная концентрация глутаральдегида 2,5%). В другом варианте клетки центрифугируют и суспендируют осадок в 2,5 %-ном глу-

таральдегиде в какодилате. (Какодилат токсичен; поставщики и прописи для этих и других веществ приводятся в разд. 4.6 и 4.7.) Перед этим этапом проводят отмывку в свежей среде или соответствующем буфере. Для некоторых прокариот, особенно некоторых микоплазм, лучше отказаться от какодилата и готовить глутаральдегид в разных концентрациях на свежей культуральной среде, чтобы сбалансировать осмотические свойства и (или) pH.

Пробы фиксируют 2—3 ч при комнатной температуре. В действительности время можно варьировать: обычно достаточно любого интервала больше 20 мин. (Мы с успехом подвергали обработке бактерии, путешествовавшие через всю страну в глутаральдегиде в течение нескольких дней.)

Осадок дважды промывают в веронал-ацетатном буфере Келенбергера с помощью центрифугирования.

Промытый осадок суспендируют в 1%-ной четы- рехокиси осмия и оставляют на 6—16 ч при комнатной температуре. (Фиксированный глутаральдегидом осадок перед проведением этого этапа можно заключить в агар: см. этапы 6—8.) Предупреждение; работать с летучими и токсичными фиксаторами и другими веществами следует под тягой или по крайней мере надев очки и респиратор, чтобы защитить эпителий роговицы и дыхательных путей. Если чувствуется запах четырехокиси осмия, глаза могут подвергнуться опасному воздействию паров. Для того чтобы исключить возможность повреждений, в лаборатории в определенном месте должен находиться комплект для промывки глаз [Nalge Со], используемый в случае необходимости.

Центрифугируют и промывают почерневший осадок, вновь суспендируют его в веронал-ацетатном буфере и еще раз центрифугируют.

Готовят 2%-ный агар марки «Noble» на веронал- ацетатном буфере и охлаждают его до 45 °C. Добавляют к осадку 2—3 капли этого агара и быстро перемешивают при помощи теплой пастеровской пипетки.

Этой же пипеткой суспензию быстро разливают по очищенному спиртом предметному стеклу и дают агару застыть. Бактерии должны находиться в достаточной концентрации и быть равномерно распределенными. Чи-

стым бритвенным лезвием из застывшего агара нарезают кубики с ребром 1 мм.

Кубики суспендируют в 0,5%-ном водном уранилацетате и оставляют при 4 °C на 16 ч. [Раствор уранилацетата нужно профильтровать (фильтры с диаметром пор 0,2 мкм, Millipore Corp.), чтобы предотвратить кристаллизацию при этой температуре.]

Осмиевая фиксация

Центрифугируют клеточную суспензию или культуру.

Осадок промывают, суспендируют его в свежей культуральной среде или веронал-ацетатном буфере, центрифугируют и суспендируют в среде с триптоном или в триптическом соевом бульоне. (Применять эти растворы не обязательно, но обычно они улучшают выявление рибосом и нуклеоидов [58, 59, 62].)

Взвесь центрифугируют и суспендируют осадок в 0,1%-ной четырехокиси осмия, приготовленной на веронал-ацетатном буфере. Фиксацию проводят в течение 2—4 ч при комнатной температуре.

Дальше поступают так же, как на описанных выше этапах, с 3-го по 8-й.

Обезвоживание и заливка средой Спарра

Обработанные уранилацетатом агаровые кубики дважды помещают для промывки в 70%-ный этанол, каждый раз на 15 мин. Делают это в кювете на 4,5 мл (одна аптекарская драхма), используя 2—3 мл этанола.

Последовательно промывают пробы в 80 %-ном и 95 %-ном этаноле, по 15 мин в каждом.

Пробы помещают в 100%-ный этанол на 30 мин.

Этанол сливают и к пробам вновь добавляют 1 мл свежего 100%-ного этанола. Затем вносят 1 мл полной среды Спарра и смесь тщательно, но осторожно перемешивают. В этих условиях пробы оставляют на 30 мин, время от времени перемешивая, или до тех пор, пока кубики не осядут на дно кюветы (среду легче всего удалять, применяя разовые пластмассовые шприцы.)

Добавляют 1 мл среды Спарра и повторяют операцию.

Заменяют среду на новую (2,0 мл) и оставляют на 1—2 ч, пока кубики не осядут на дно.

В капсулы Бима размером 00 вкладывают типовые метки (в соответствующем держателе) и заливают в каждую один и тот же объем полной среды Спарра. (Мы заливаем 0,55 мл, чтобы окончательно получающийся блок точно входил в зажим микротома фирмы LKB.)

При помощи заостренной деревянной палочки в каждую заполненную капсулу помещают по одному пропитанному кубику (6-й этап) . Кубик должен опуститься на дно капсулы через 1 мин.

Капсулы со снятыми крышками (чтобы обеспечить улетучивание остатков любого растворителя) помещают в сушильный шкаф при 70 °C на 16 ч для полимеризации. Сразу после вынимания из шкафа блоки, образовавшиеся в капсулах, могут показаться слегка мягкими, но они приобретут оптимальную для резки твердость через 2—4 ч при комнатной температуре.

Другие фиксаторы и среды для заливки

Для специальных целей разработано много разных фиксаторов, применяемых в различных комбинациях и разной последовательности. К ним относятся перманганаты и различные альдегиды, принципы использования которых, включая эффекты, зависящие от pH, буферов, ионной силы, концентрации, температуры и длительно- си фиксации, обсуждаются в многочисленных книгах [34—39]. Для заливки применяют очень много сред [34—39] по отдельности или в смесях, причем выбор среды отчасти зависит от того, какая из них доступна. Чаще всего, вероятно, применяется эпон 812 (хотя есть сведения, что он вскоре не будет поставляться производящей его фирмой, а будет заменен подобными средами, выпускаемыми другими фирмами). Для заливки используются также дуркупан, аралдит, мараглас, весто- пал, для специальных целей различные метакрилаты и множество эпоксидных смол. Подробное описание свойств этих сред и советы по их применению читатель

найдет в соответствующей литературе. Мы остановились здесь на детальном описании единственной методики, которая является наиболее удовлетворительной.

Подготовка блоков

Перед тем как делать срезы, застывшие блоки, находящиеся в капсулах Бима или в капсулах других типов, следует вынуть и довести до подходящих размеров и формы. Заливать можно в плоские желатиновые капсулы или в специальные плоские формы, и в соответствии с этим существуют различные методы подготовки блоков [42]. Новейшие модели микротомов часто содержат устройства для подготовки блоков; такие устройства выпускаются также отдельно. Методика подготовки блоков заключается в следующем.

Капсулу обжимают со всех сторон плоскогубцами, чтобы блок не очень плотно прилегал к ее стенкам. Затем сжимают вершину пирамиды капсулы и продвигают блок до полного высвобождения. (Блоки можно также высвобождать с помощью продольных бритвенных разрезов капсулы с двух сторон.) Блок закрепляют в держателе вершиной пирамиды вверх и помещают держатель в зажим микротома.

Глядя в бинокулярный микроскоп, подрезают очищенной этанолом бритвой верхушку пирамиды блока (по которой будет проходить срез после установки в ультрамикротоме), чтобы он смог войти в ячейку. Обрезают блок со всех четырех сторон под углом 30° (угол пирамиды у блока, находящегося в капсуле, равен 60°), продвигаясь по направлению вниз от образовавшейся площадки; в результате остается маленькая усеченная пирамида (верхняя поверхность — квадрат со стороной ~1 мм), из которой готовят срезы. Тщательно работающий исследователь, обладающий определенным навыком, быстро выучивается получать хорошие блоки, срезаемая поверхность которых имеет трапециевидную форму. Однако лезвие бритвы обязательно оставляет после себя относительно крупные бороздки, которые идут под прямым углом к верхней площадке усеченной пирамиды; в связи с этим при прохождении среза на поверхность может выступать вода, мешающая получению хо-

роших результатов. Мы предпочитаем делать дальнейшую тонкую доводку поверхности, по которой пойдет срез, и боковых граней пирамиды микротомом; при этом любые неровности на гранях располагаются параллельно краям верхней поверхности блока. Тонкая доводка при помощи микротома описана в литературе {42].

Приготовление срезов

Поскольку в каждой лаборатории существуют свои методики и свои способы работы на микротомах, мы не будем описывать здесь сам процесс нарезания. Описание методов, приемов работы на микротомах и скрытых трудностей, с которыми при этом сталкиваются, подробно изложено во многих работах и руководствах по электронной микроскопии, а также в проспектах и инструкциях, выпускаемых изготовителями микроскопов [39, 40, 42]. Помимо этого, некоторые фирмы (например, LKB Instruments) проводят семинары или организуют в соответствии с поступившими запросами краткие курсы обучения по работе на ультрамикротомах. Мы полагаем, что исследователь, изучающий анатомию бактерий, имеет возможность обратиться за помощью к специалисту по ультрамикротомии, который способен проинструктировать его или в крайнем случае довести до нужного качества срезы, уже заключенные на сетках и готовые к окраске.

Ножи

Для приготовления ультратонких срезов применяются как стеклянные, так и алмазные ножи. Стеклянные ножи, которые, безусловно, дешевле, готовятся вручную или (с большей точностью и в больших количествах) при помощи аппарата, делающего ножи, такого, например, как LKB 7800 Knife Maker. Производство стеклянных ножей описано в литературе [34—40, 42] и в сопроводительных руководствах к соответствующим аппаратам. Стеклянные ножи используются лишь для подготовки верхней и боковых поверхностей блоков. Выбор ножа для приготовления срезов зависит от финансовых возможностей, вкусов и опыта исследователя, а также

от применяемого для заливки полимера. В некоторых случаях предпочитают стеклянные ножи, использование которых дает прекрасные результаты. Использование алмазного ножа дает более воспроизводимые результаты, по мере того как оператор привыкает к его режущим и другим свойствам при постоянном применении стандартной заливки. Требования к углу лезвия могут различаться в зависимости от типа заливки, так что необходимая величина угла должна оговариваться при закупке алмазных ножей. В случае самых общепринятых сред для заливки бактериальных препаратов (эпон, мараглас, аралдит), а также для несколько более мягкой среды Спарра, которую мы используем чаще всего, вполне подходит величина угла от 42 до 45°. При заливке этими средами, тщательном исполнении всех операций и соблюдении предосторожностей в работе можно использовать один алмазный нож хорошего качества в течение 5 лет и более. Естественно, срок службы ножа зависит также от количества производимых с его помощью срезов.

Окраска уранилацетатом.

Поскольку по описанной методике материал, находящийся в блоке, окрашивается еще до заливки, окраска срезов уранилацетатом обычно не требуется. Если хотят дополнительно усилить контраст или если находящийся в блоке материал не окрашен, то поступают следующим образом.

Наполняют соответствующее количество крышек от капсул Бима размером 00 1%-ным уранилацетатом, приготовленным либо на воде, либо на 70 %-ном этаноле, до появления положительного мениска. (Если растворы водные, то капли можно наносить на пластинку чистого зубного воска.)

Каждую сетку со срезом, обращенным вниз, опускают на поверхность красителя, так чтобы она держалась на плаву. Пастеровской пипеткой осторожно отсасывают небольшое количество жидкости, добиваясь центрального расположения сеток в крышке.

Сетки накрывают крышкой от чашки Петри и пробы оставляют окрашиваться на 30 мин,

электронная Микроскопия

Крышки поднимают, сетки берут пинцетом, погружают для промывки три раза в дистиллированную воду и высушивают на фильтровальной бумаге.

Окрашивание цитратом свинца

Некоторые экспериментаторы в своих целях используют окраску только уранилацетатом, но иногда получаемый при этом контраст бывает относительно слабым, а увеличение длительности окрашивания приводит к нежелательной зернистости. Для придания дополнительного контраста и для окрашивания некоторых компонентов, слабо проявляющихся за счет одного лишь урана, применяют обычно цитрат свинца (разд. 4.6.4). Его удобно хранить, а при разливке пластмассовым шприцем легко исключить контакт этого реактива с воздухом. В нашей лаборатории принята следующая схема его использования.

Окрашивание проводят в стеклянной чашке Петри, дно которой покрыто застывшим зубным воском. Пластмассовым чашкам восковое покрытие не требуется, так как единственная преследуемая при этом цель — получить выпуклые, изолированные друг от друга капли красителя.

Три маленькие склянки для взвешивания наполняют бидистиллированной или деионизованной водой и в дальнейшем используют их для промывки.

В камеру для окрашивания ставят пластмассовую чашку для культур тканей с размерами 35X100 мм на диске из фильтровальной бумаги, имеющем немного большие размеры. Чашку наполняют гранулами NaOH, а бумагу смачивают 0,02 н. NaOH.

Наносят несколько капель раствора цитрата свинца на восковую или пластмассовую поверхность. Немедленно накрывают все крышкой от чашки Петри, чтобы избежать образования нерастворимого карбоната свинца за счет взаимодествия с СО2 воздуха. Присутствие в чашке NaOH также предотвращает появление нерастворимого карбоната свинца, так как щелочь поглощает СО2 с образованием углекислого натрия.

Когда все готово, поднимают крышку и на каждую округлую каплю кладут в перевернутом виде сетки

Часть i. Морфология

поверхностью среза вниз. Камеру быстро закрывают крышкой и оставляют для прокрашивания на 3—5 мин (оптимальное время определяют экспериментально).

Сетку вынимают пинцетом и быстро погружают по пять раз подряд в каждую промывную склянку с водой. Для удаления воды прикасаются краем сетки к фильтровальной бумаге и оставляют на ней сетки для просушивания.

Замечание: по неизвестным причинам кратковременная обработка уранилацетатом, за которой следует обработка цитратом свинца, приводит к более интенсивному включению свинца.

Прямая микроскопия

Бактериальные препараты можно прямо исследовать с помощью трансмиссионного электронного микроскопа; при этом, однако, экспериментатор лишается тех преимуществ по усилению контраста, которые дают негативные красители. Исследуемые микроорганизмы можно вырастить на формваровой или коллодиевой подложке или поместить их на эти подложки и просматривать на любой стадии роста. Однако и в этом случае исследователь получит очень ограниченную информацию, за исключением опытов, когда интересуются электроноплотным материалом, присущим самому образцу. Вместе с тем негативно контрастированные образцы позволяют получать гораздо большую информацию о структуре, тогда как время, затрачиваемое на негативное контрастирование, совершенно незначительно.

К другим методам прямого исследования относятся имеющие высокое разрешение темнопольная электронная микроскопия и электронно-оптическая фазовая микроскопия. Эти методы не имеют большого значения для исследователей, начинающих изучать структуру бактерий, так как, чтобы их применять, нужны специальные микроскопы и особая обработка образцов. Специальным методом является также высоковольтная электронная микроскопия, которая, помимо того, что она дает высокое разрешение, позволяет исследовать образцы с большой толщиной без излишнего повреждения электронным

пучком. (Интересующихся отсылаем к цитируемой литературе, в особенности к многотомнику [7], т. 3, гл. 3 и 4.)

Оттенение металлами [44, 45]

Из-за растущей популярности и доступности сканирующих электронных микроскопов использование оттенения металлами сокращается. Однако, подобно сканирующему микроскопу, этот метод позволяет получать детальные изображения поверхностных структур и определять размеры бактерий, что может оказаться полезным ввиду большей разрешающей способности трансмиссионного электронного микроскопа; им можно легко воспользоваться в отсутствие сканирующего электронного микроскопа.

Тень формируется в результате отложения под определенным углом электроноплотного материала на образце во время пребывания в вакуумном испарителе. Те области, которые расположены под углом к направлению напыления металла, остаются не покрытыми им и, будучи менее электроноплотными, пропускают электроны. В результате электроны как бы очерчивают эти области, которые на обработанном негативе видны в виде черных теней. Поскольку выглядит это, как позитивное изображение, обычно (хотя и не всегда) негативы обращают контактным способом и для воспроизведения позитивного изображения окончательные фотографические отпечатки получают с обращенных негативов. (Техника оттенения хорошо описана в гл. 5 [И] и в гл. 4 и 5 т. 2 многотомника [7].) Прямое оттенение испаряющимися металлами применяется по отношению к целым клеткам или их компонентам, бактериофагам или различным суспензиям; этот метод используется также для анализа реплик, приготовленных из интактных препаратов или при замораживании—скалывании и замораживании—травлении (см. ниже). Помимо очерчивания поверхностных неровностей и периодически повторяющихся структур, техника оттенения может применяться для измерения высоты образца по вертикали посредством нахождения длины тени и геометрических расчетов, опирающихся на известный угол оттенения. Измерению

помогает нанесение на сетку в целях калибровки стандартного объекта, такого, например, как латексные шарики известного размера. Оттенение проводится следующим образом.

Исследуемый образец, не содержащий внешних загрязнений, предварительно фиксируют, но это не обязательно.

Образец помещают на покрытую формваром сетку и подсушивают. Сетку прикрепляют к липкой с обеих сторон ленте, находящейся на предметном стекле, вместе с маленьким кусочком тонкой фильтровальной бумаги, служащим визуальным индикатором количества напыленного при испарении металла. (На части кусочка бумаги делают складки, чтобы иметь для сравнения напыленные и ненапыленные стороны.)

Предметное стекло помещают в напылительную установку на столик для образцов. (Мы применяем вращающийся столик Fullam № 1205 в испарителе модели Varion VE 10, снабженном охлаждаемой жидким азотом ловушкой для увеличения вакуумного разрежения. В каждой лаборатории имеются свои приборы и приемы изменения угла оттенения между сеткой с образцом и нитью металла.)

Платино-палладиевую проволоку закручивают вокруг удерживаемой между электродами вольфрамовой нити (Fullam № 1623), сделанной из стандартной вольфрамовой проволоки диаметром 0,7 мм. Платино-палла- диевая проволока длиной 1 мм содержит 80% платины и 20% палладия (Fullam № 1221). Перед ее закручиванием сначала разогревают в вакууме вольфрамовую нить до белого каления и только после этого открывают испаритель и укрепляют платино-палладиевую проволоку. (При этом происходит дегазация вольфрамовой нити, что улучшает вакуум во время последующего испарения металла и снижает напряжения, возникающие в проволоке при ее изгибе; это способствует увеличению срока службы нити.)

Источник металла — обмотанную вокруг вершины V-образной вольфрамовой нити платино-палладиевую проволоку — располагают примерно в 12 см над сетками под желаемым углом. После того как в испарителе устанавливается хороший вакуум (KF5 мм рт. ст.), вклю-

чают быстрый нагрев металла до точки плавления. В таком состоянии система находится до тех пор, пока не испарится весь металл или пока напыление на видимой глазом индикаторной фильтровальной бумаге не покажется достаточным. Чтобы судить об этом, требуются некоторый навык и опыт.

Иногда, чтобы получить минимальный фон и меньшую по сравнению с платинопалладиевым сплавом зернистость, полезно применять напыление окисью вольфрама. Для этого V-образную вольфрамовую нить нагревают на воздухе, пока она не покроется желтой окисью вольфрама (WO2). Кристаллы окиси вольфрама счищают скальпелем, оставляя их лишь на вершине V-образной нити; нить помещают в испаритель между электродами и далее проводят оттенение, как описано выше.

Получение реплик [44, 45]

Реплики представляют собой слепки (отпечатки), которые ввиду их непрочности и прозрачности для электронов не подходят для прямого микроскопирования и должны напыляться металлом. Тонкие пленки материалов, прозрачных по отношению к электронам (обычно коллодия, формвара или поливинилового спирта), находясь в контакте с изучаемыми поверхностями и структурами, образуют слепок, тем самым как бы очерчивая их. Реплики, в которых в процессе отслаивания от поверхности-оригинала и перехода пленки в плавающее состояние оказались захваченными некоторые частицы, считают ложными.

Получение реплик существенно для анализа поверхностей методом замораживания — скалывания и замораживания— травления. Обычно реплики готовят (с применением платино-углеродного напыления) на сколотых образцах, содержащихся при—100 °C. Техника замораживания—скалывания играет важную роль при исследовании внутренней структуры клеточной мембраны, а также образцов, которые не фиксировались и не изменялись путем химических воздействий. Однако для ее применения необходимо специальное оборудование и соответствующий опыт в работе. Описание конкретных методов получения реплик выходит за рамки настоящего руководства [46—48].

Нуклеиновые кислоты

С тех пор как вышла работа Кляйншмидта и Цана [74], нанесение отдельных молекул нуклеиновых кислот на белковый или другой монослой с последующим контрастированием ураном и оттенением вращающегося образца с целью микроскопирования стало широко распространенным приемом, претерпевшим некоторые модификации. Метод Кляйншмидта и Цана, чрезвычайно важный в молекулярной микробиологии и генетике микроорганизмов, хорошо описан в соответствующих работах /[71—73, 75] и во многих специальных публикациях. Определение гомологии молекул плазмидных ДНК можно найти в разд. 15.3.5.

СКАНИРУЮЩАЯЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

Характерные черты и преимущества сканирующей электронной микроскопии отмечались выше, в вводном разделе. Для бактериолога ценность микроскопии этого вида заключается в том, что с ее помощью можно получать трехмерное изображение микроорганизмов, различать детали строения поверхностей (в пределах разрешения) и выявлять пространственные взаимосвязи бактерий, растущих в виде разнообразных ансамблей. Приготовление образцов включает в себя фиксацию находящегося на поверхности (например, на покровном стекле) материала, закрепление в держателе (этого этапа может не быть), иногда промывку и другие обработки, высушивание до критической точки или другими способами и обычно — напыление золотом или еще каким-либо тяжелым металлом в вакууме перед микроскопированием. На эти процедуры уходит довольно много времени, и для их выполнения нужны специальные навыки. Если учесть также недоступность сканирующего электронного микроскопа для многих лабораторий, то станет ясно, что исследователю, изучающему бактериальные структуры, по-видимому, не стоит начинать микроскопический анализ со сканирования — легче и быстрее достаточно детальную информацию можно получить с помощью негативного контрастирования. Для

тех, кто имеет все необходимое и интересуется применением сканирующей электронной микроскопии для решения отдельных проблем, предлагаются многочисленные литературные источники [49—52, 64—70].

ФОТОГРАФИЯ

Электронные микрофотографии являются итогом, отражающим деятельность микроскописта, поэтому правильная съемка и обработка фотографий представляют собой существенные этапы исследования. Большинство микроскопов приспособлены для съемок на фотопластины, рулонную пленку или и на то, и на другое. Рулонная пленка (35 мм) дешева и ее легко хранить. Стеклянные фотопластины легко бьются, тяжелы и требуют множества дорогих приспособлений для хранения. В настоящее время стеклянные пластины в основном заменены на покрытые эмульсией пленки, сделанные на основе эстара, которые устойчивы к изменению размеров и удобны для хранения.

Основная трудность, связанная с работой с фотопленками, заключается в том, что как эмульсия, так и основа поглощают водяные пары. Поэтому предусмотрительный микроскопист хранит их покрытыми светонепроницаемыми пластинами вместе с набором алюмоосушителей. Пластины делают из листа алюминия, идущего на изготовление заслонки перед игольчатым вакуумным клапаном. Пленку, отрезанную на нужную длину, или отстоящие друг от друга стопки нарезанной пленки помещают для высушивания на подложку в виде сетки. На дно сосуда, находящегося в темной комнате, ставят поддон с пятиокисью фосфора, которую перемешивают при каждом его открывании и в случае необходимости заменяют. Умеренное разрежение и химический осушитель способствуют хранению пленки в сухом виде. Благодаря наличию предварительного вакуума устраняется необходимость продолжительной работы вакуумного насоса в электронном микроскопе. В некоторых микроскопах осушители встроены, но они редко удовлетворяют рекомендованным выше условиям хранения.

По нашему опыту для обычных целей лучше всего подходит мелкозернистая позитивная пленка (Kodak;

35 мм), если только микроскоп приспособлен для работы с ней. Для камер с фотопластинами мы применяем Kodak Electron Image film № 4489 —пленку в виде листов, сделанную на основе эстара, которая имеет превосходную стабильность размеров и устойчива к разрыву. Она заменяет стеклянные пластины и сходную по свойствам пленку (№ 4463), не поступающую больше в продажу. За более подробными инструкциями следует обратиться к проспекту Kodak Data Release, с. 198, выпущенному вновь в феврале 1980 г., в котором описаны характеристики этой пленки и способы ее проявления. Это вполне естественно, что в любом случае прежде всего необходимо познакомиться с данными и рекомендациями, предоставляемыми фирмой-изготовителем. Затем с опытом придет уменение устанавливать выдержку, проявлять и добиваться на негативе желаемого контраста.

Умение фокусировать и получать резкие негативы приходит с опытом, но полезно напомнить, что при больших увеличениях точно установленный фокус не обязательно является лучшим для печатания негатива. Поэтому неплохо иметь привычку делать 3—5 «околофо- кусных» снимков для каждого нужного поля зрения, пытаясь получить истинный фокус в положении, немного отклоняющемся от среднего. Смещение при каждом шаге меняется от 0,05 мкм (при увеличении на пленке 30 000Х) ДО 0,4 мкм (при увеличении на пленке 4000Х)-

При печатании электронных микрофотографий требуется особое внимание к мельчайшим деталям. Очень важно пользоваться высококачественным увеличителем. Имейте в виду, что увеличители с конденсорами, работающими от точечного источника, передадут каждую царапину, имеющуюся на неэмульсионной стороне пленки. Для воспроизводимости полезны автоматические экспонометры, калибруемые для каждого типа применяемой фотобумаги один раз (например, Lectra РТМ-4А Densi- timer). Следует иметь широкий выбор фотобумаги, поскольку неизбежна некоторая разница в негативах. Этому удовлетворяет система множественной градации фотобумаги с применением соответствующих светофильтров или набора бронированных типов бумаги с номерами контрастности от 2 до 6. В последнее время участилась

практика поставки бумаги с эмульсией, покрытой специальной смолой (обозначается RC— от англ, resin-coated). Такая бумага быстро обрабатывается и быстро высыхает, а главное ее достоинство состоит в том, что она не нуждается в глянцевании. В больших лабораториях применяют аппараты для автоматизированной обработки, стабилизированную фотобумагу, увеличители с автоматическим контролем контраста и т. п.

Поскольку в разных лабораториях электронные микроскопы, условия съемки, качество пленок и обычные процедуры обработки несколько различаются, мы не будем здесь приводить детальные описания методик Исследователю, осваивающему все это, следует проконсультироваться с опытными исследователями и ознакомиться с приведенными в списке литературы статьями по этому предмету [76—82].

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Микроскопист должен уметь соотносить увиденное им в электронном микроскопе или на электронных микрофотографиях с тем, что уже известно (или не известно) об анатомии бактерий, т. е. уметь интерпретировать свои результаты. Для этого необходимо иметь некоторые знания в исследуемой области; предполагается, что исследователь, собирающийся изучать бактерии с помощью электронного микроскопа, прослушал курс лекций или читал соответствующую литературу и в общих чертах знаком с ультраструктурой микробов. К сожалению, иллюстрированные атласы, по которым можно легко и быстро сравнивать различные роды и типы микроорганизмов, редки и их трудно найти. К полезным источникам, если только они доступны, относятся атлас, который составили Авакян и др. [53] (текст написан по- русски, а названия бактерий — по-английски), статьи в книге под редакцией Фулера и Ловелока [54, 56, 57, 60, 63], работы Гринхала и Эванса по грибам [55], Лик- фелда по бактериям [61], а также Корменди [66] и Ешии с соавторами [70] по сканирующей электронной микроскопии в микробиологии. В дополнение или взамен этого обучаемый может положиться на советы на-

ставника в подборе изобилующей ныне литературы по электронной микроскопии бактерий.

В точном смысле слова «интерпретация» может толковаться как извлечение наибольшего количества информации из электронной микрофотографии. Обычно это относится к деталям тонко организованной, периодически повторяющейся структуры, которая присутствует, например, в жгутиках или дополнительных белковых слоях клеточной оболочки. Для квалифицированной работы получение удовлетворительной микрофотографии — только первый этап; она включает также методы увеличения изображения и реконструкции, в том числе обработку с помощью вычислительной техники. Для этих методов требуется сложное оптическое и другое оборудование, доступное не для каждой электронномикроскопической лаборатории, описание которого выходит за пределы поставленных перед данным руководством целей. Интересующиеся могут обратиться за советом к специалистам или ознакомиться с соответствующей литературой {76—82].

ИДЕНТИФИКАЦИЯ

Предметом специальных исследований является определение сходства или различий бактериальных антигенов, а также их локализации независимо от того, где находятся антигены — внутри или на поверхности клетки. Большое значение имеет также изучение клеточной локализации ферментов и других клеточных компонентов. Для реализации этого полезны методы с применением метки, благодаря которым появляется возможность микроскопически идентифицировать добавленные вещества, выявить их специфическое связывание с другими компонентами или химические взаимодействия. Существует несколько подобных методов, но большинство из них требует слишком много времени, некоторые технически сложны, а некоторые редко дают удовлетворительные результаты. Имея все это в виду, мы не будем здесь подробно останавливаться на этих сложных методах, а ограничимся лишь замечаниями относительно их принципов и ссылками.

Антигены

В наиболее широко используемых методах выявления бактериальных антигенов in situ применяются фракции антисывороток или антител, меченных флуоресцирующими красителями, такими, как флуоресцеин или родамин (разд. 1.4.). Связывание, которое происходит исключительно с поверхностными антигенами интактных бактерий, выявляется с помощью оптической темнопольной микроскопии с ультрафиолетовым светом, прошедшим через соответствующие светофильтры, чтобы вызвать характеристическую эмиссию флуорохрома в видимой области. Этот метод очень важен в диагностических и таксономических исследованиях, и поэтому промышленностью выпускается множество меченых антисывороток. По теории и практике этого вопроса опубликовано много трудов [83—85].

Принцип использования флуоресцирующих антител был приспособлен и для электронной микроскопии: антитела или гаптены соединяются с электроноплотными веществами (например, с железосодержащим белком ферритином) или такими, которые могут быть сделаны электроноплотными уже после реакции антиген — антитело (например, с антителом связывается пероксидаза из хрена, которой после связывания дают возможность реагировать с диаминобензидином). На практике используется множество комбинаций, включающих антисыворотки с различными специфичностями, фрагменты антител, гаптены, а также такие маркеры для визуализации, как небольшие вирусы и т. п. Эти методы, применимые к целым бактериям, позволяют локализовать поверхностные антигены точнее, чем это делают с помощью оптического микроскопа. Преимущества электронной микроскопии становятся еще более очевидными, когда меченые антитела применяют еще до фиксации, заливки и приготовления срезов, так что метка видна в тонких срезах. В некоторых случаях аналогичным образом метят не антитела, а другие вещества с известной специфичностью: чаще всего применяются лектины растений, такие, как конканавалин А, которые специфично связываются с сахарными остатками [88].

Выявление внутриклеточных антигенов [89] в интактных бактериях представляет собой более сложную задачу, чем локализация поверхностных антигенов, так как антитела не способны проходить через интактную клеточную оболочку. Поэтому методы решения задач такого рода опираются прежде всего на приготовление тонких срезов бактерий, переносимых затем на поверхность растворов с мечеными антителами, после чего следует промывка, иногда окрашивание и затем исследование с помощью электронного микроскопа. Главная трудность заключается в выборе среды для заливки, которая должна давать доступ для связывания антителам в водном растворе. В этих целях испробовано много различных веществ (метакрилаты, сшитый альбумин, различные протравленные пластмассы и эпоксидные смолы), но ни одно из них не может считаться удовлетворительным во всех отношениях; в этой области необходимы дальнейшие исследования. Интересующиеся могут получить общее представление о методах и проблемах иммуноцитохимии или иммуноэлектронной микроскопии, изучив предлагаемую литературу [87—91].

Ферменты

Проблема точной локализации ферментативных активностей в той форме, в какой они реализуются в клетке, давно стоит на повестке дня в гистохимии, а ныне — в цитохимии на уровне электронной микроскопии. Для ферментов разных типов используются различные методы. Это зависит от того, насколько возможно применение искусственных или меченых субстратов, которые в нормальных условиях транспортируются в клетку и вступают в реакцию, образуя продукт, видимый либо в световой, либо в электронный микроскоп. Изучению ферментативных активностей посвящена обширная литература, на которой мы не можем останавливаться из- за ограниченного объема настоящего руководства. Необходимую информацию читатель найдет в многочисленных работах, которые публикуются в журналах, посвященных исключительно гистохимии и цитохимии [86].

Радиоавтография

Другая большая область знаний, исследования в которой, подобно использованию меченых антител в гистохимии, перешли с оптического на электронно-микроскопический уровень, посвящена изучению поведения внутри клетки веществ, меченных радиоактивными атомами, их распределению и локализации. Радиоактивная техника применима к широкому кругу проблем, но в случае бактерий (из-за их малого размера) необходимо особое внимание к условиям опыта и качеству эмульсии, которая должна обеспечивать минимальную зернистость. Принципы и методы техники с применением радиоактивных веществ достаточно полно описаны в ряде книг [92—95].

МАТЕРИАЛЫ

Поставщики перечисленных ниже материалов обозначены буквами (в скобках) в соответствии со списком, представленным в разд. 4.7.

Материалы для приготовления пленок-подложек

Формвар, порошок (и, к, о, т)

Растворы формвара (и, к, т)

Дихлорэтан (з, и, к, о, п, т)

Чистые микроскопические стекла

Неволокнистый протирочный материал (и, к, о, р,)

Большие металлические (или пластмассовые) лотки или кюветы

Большая стеклянная чашка с вертикальными стенками. Оптимальные размеры 200X80 мм (культуральная чашка Vitro; о, у). Крышка должна быть ровной и гладкой. Дно и стенки постоянно покрыты черной изолентой, чтобы легче было видеть плавающие пленки на черном фоне

Черная изоляционная лента

Стеклянная палочка, длина которой больше диаметра чашки

Стеклянные кюветы Коплина для окрашивания (а, з, о, у)

Пастеровские пипетки и резиновые груши

10 %-пая плавиковая кислота в тефлоновом контейнере (з)

Бритвенные лезвия, отмытые спиртом

Фильтровальная бумага (Whatman № 1), кружки диаметром 9,0 см (а, з)

Стандартные чашки Петри диаметром 9,0 см

Ножницы

Пинцет для сеток Dumont № 5 или эквивалентный ему (и, к, о, п, с, т). (Вокруг основания пинцета можно сделать одну-две петельки из нихромовой проволоки, которые продвигаются вперед для смыкания кончиков пинцета на сетке, что помогает предотвратить случайное выпадение сеток. Если такие петельки сделаны, нет необходимости покупать дорогостоящий пинцет, имеющий специальную конструкцию для захвата сеток.)

Медные сетки, предварительно очищенные (е, и, к, л, о, и, с, т)

Люминесцентная лампа

Материалы для приготовления углеродных пленок

Высоковакуумные испарители и дополнительные принадлежности (б, и, к)

Материалы для негативного контрастирования

Сетки с подложкой, приготовленные, как описано, или купленные (и, к, т)

Липкая лента (Time Таре) (а, з, о)

Предметные стекла

Зеростат (г, о)

Пастеровские пипетки

Ацетат аммония (з, п)

Молибдат аммония (з, н, т)

Фосфорно-вольфрамовый калий (е, и, к, о, п, т)

Уранилацетат (е, з, и, к, п, с,т)

Материалы для фиксации, заливки,приготовления срезов и окраски срезов

Глутаральдегид (е, з, и, к, о, п, т)

Na-какодилатный буфер

Может быть куплен как буфер или как набор заранее отмеренных ингредиентов (т). В другом варианте концентрацию какодилата натрия (е, з, и, к, о, и, т) доводят в воде до 0,2 М, а pH — до 7,2, добавляя НС1. (Предупреждение какодилат токсичен; необходимо избегать контакта с ним и вдыхания содержащих мышьяк паров )

Веронал-ацетатный буфер

Может быть куплен как буфер (к, п) или приготовлен из веронала натрия (п) по следующей прописи для исходного концентрированного раствора:

Веронал натрия (барбитал натрия)2,94г

Ацетат натрия, водный1,94г

Хлористый натрий3,4г

Дистиллированная вода100мл

Из этого раствора готовят каждый день рабочий буфер: Исходный концентрированный раствор25,0мл

Дистиллированная вода96,5мл

н. НС13,5мл

н. СаСЬ (110,98 г/л)1,25мл

В колбу на 125 мл вливают 25 мл концентрированного раствора. К 90 мл воды в мерном цилиндре на 100 мл добавляют 3,5 мл 1 н. НС1 и доливают до 100 мл водой. Этот раствор вливают в колбу с концентрированным раствором, добавляют туда 1,25 мл 1 н. СаС12 и перемешивают. (Замечание: если клетки, которые должны промываться в этом буфере, до этого подвергались действию фосфатов или в культуральных средах, или в фосфатном буфере, необходимо иметь для начальных промывок рабочий буфер, приготовленный без СаС12, чтобы избежать выпадения осадка фосфата кальция. После такой предварительной промывки можно пользоваться полным буфером.)

Защитные очки

Четырехокись осмия (е, з, и, к, о, п, т)

Агар марки Noble (в)

Уранилацетат (е, з, и, к, о, п, т)

Триптон (в)

Триптический соевый бульон (в)

Стеклянные кюветы с завинчивающейся крышкой объемом в одну аптекарскую драхму (о, п)

Респиратор, Gasfoe (м)

Разовые пластмассовые контейнеры объемом в 4,5 унции (около 130 мл) (а, ж, з)

Среда Спарра:

Поставляется в виде набора (и, к, п) или в виде ингредиентов (т), которые должны использоваться для приготовления исходной смеси, как описано ниже.

Исходная смесь:

30 г или24 г или78 г или30 г или24 г или78 г или27,0 мл22,8 мл76,5 мл27,0 мл22,8 мл76,5 млERL-4206 (двуокись винилциклогексана)

30 г или

24 г или

78 г или

30 г или

24 г или

78 г или

27,0 мл

22,8 мл

76,5 мл

27,0 мл

22,8 мл

76,5 мл

DER-736 (диглицидиловый эфир пропилен-

гликоля, эпоксидная смола) NSA (нонеиилянтарный ангидрид)

Под тягой или надев специальную маску, добавляют все три компонента в указанном выше порядке в разовый контейнер Falcon № 4013 с перемешиванием на магнитной мешалке. В течение 5 мии перемешивают при комнатной температуре. Эту концентрированную смесь без затвердителя можно хранить в плотно закрытом сосуде при —4 °C 3—5 мес. При таком хранении перед открыванием сосу

да и после взятия смеси оставшуюся смесь следует выдерживать в

течение времени, достаточного для повышения ее температуры до комнатной, чтобы избежать конденсации воды, способной ее испор

тить.

Полная смесь:

Чтобы приготовить полную смесь, 22 мл концентрированной смеси помещают в разовый контейнер, добавляют 0,24 мл затвердителя S-1 (диметиламиноэтанола) и перемешивают на магнитной мешалке в течение нескольких минут при комнатной температуре. (Для каждого бактериального осадка или другого образца, который должен быть залит, но не для каждого агарового кубика, в который заключен объект, следует использовать по крайней мере 6 мл полной смеси. Этого объема хватит для приготовления нужного количества смесей, применяемых на этапах с 4-го по 6-й при проведении обезвоживания и заливки, а также для заполнения трех капсул Бима. Ясно, что если из каждого образца хотят получить больше чем три блока, нужно взять больше смеси. Аналогичным образом, если работа одновременно ведется более чем с тремя осадками или образцами, начальный объем полной смеси должен быть больше чем 22 мл; последнюю готовят в тех же пропорциях.) Время, в течение которого хранящаяся в контейнере полная смесь может использоваться, составляет всего 2 дня.

Капсулы Бима (каталоговый номер 23200, размер 00) (и, к, о, п, т)

Сушильный шкаф

Центрифуга Brinkmann 3200 (Eppendorf).

Плоскогубцы

Бритвенные лезвия с одним режущим краем

Ультрамикротом

Стеклянные пластинки

Аппарат для изготовления стеклянных ножей

Алмазный нож (д)

Зубной воск

Склянки для взвешивания

Пластмассовая чашка для культур тканей, 35Х ХЮ0 мм

Гранулы NaOH

Чашки Петри, стеклянные или пластмассовые

Цитрат свинца:

Выпускается готовый к применению препарат (и, к, о, п, т).

Может быть также приготовлен по методу Рейнольдса (J. Cell Biol., 17, 208—212, 1963), как описано ниже.

В 50-миллилитровую мерную колбу добавляют:

Нитрат свинца1,33г

Цитрат натрия1,76г

Дистиллированную воду30,0г

Встряхивают в течение 1 мин и выдерживают при комнатной температуре 30 мин. Добавляют 8 мл свежеприготовленного 1 н. NaOH и разводят водой до 50 мл

ФИРМЫ-ИЗГОТОВИТЕЛИ

Curtin-Matheson Scientific, Inc., 10727 Tucker St., Beltsville, MD 20705

Denton Vacuum Inc., Cherry Hill Industrial Center, Cherry Hill, NJ 08003

Difco Laboratories, P. O. Box 1958A, Detroit MI 48232

r. Discwasher, Inc., 1407 N. Providence Rd. Columbia, MO 65201 (or local photo stores)

Д. Dupont Instruments, Biomedical Division, Newtown, CT 06470

Electron Microscopy Sciences, P. O. Box 251, Fort Washington, PA 19034

ж. Falcon Labware Division, 1950 Williams Dr., Oxnard CA 93030

Fisher Scientific Co., 1 Reagent Lane, P. O. Box 375, Fairlawn, NJ 07410

Ernest F. Fullam, Inc., P. O. Box 444, Schenectady, NY 12301

Ladd Research Industries, Inc., P. O. Box 901, Burlington, VT 05401

л. LKB Instruments, Inc., 12221 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852

Mine Safety Appliances Co., Pittsburgh, PA 15208

h. Nalge Co., Division of Sybion Corp., Rochester, NY 14602

o. Ted Pella Co., P. O. Box 510, Tustin, CA 92680

Polysciences, Inc., Paul Valley Industrial Park, Warrington, PA 18976

p. Sorg Paper Co., Middletown, Ohio 45042

c. SPI Supplies, P. O. Box 342, West Chester, PA 19380

t. Tousimis Research Corp., P. O. Box 2189, Rockville. MD 20852

y. Wheaton Scientific (Vitro), 1000 North 10th St., Millville, NJ 08332

4.8. ЛИТЕРАТУРА

Общая литература

Benedetti Ё. L, Fauard P. (ed.). Freeze-etching: techniques and applications. Socifete Fran^aise de Microscopie Electronique, Paris. 1973.

Достаточно полный источник информации по замораживанию — травлению.

Dawes С. J. Biological techniques in electron microscopy. Barnes and Noble, Inc., New York, 1971.

Очень полезная брошюра, в которой содержатся методы, прописи, приложения и литература по общим вопросам.

Fuller R„ Lovelock D. W. (ed.). Microbial ultrastructure. The use of the electron microscope. Academic Press, Inc., New York, 1976. Включены хорошие примеры результатов применения к микроорганизмам различных методов.

Glauert А. М. (ed.). Practical methods in electron microscooy, vol. 1—6. American Elsevier Publishing Co., Inc., New York, 1972. Под этим названием до 1977 г. вышло шесть томов. Каждый из них разделен на части (например, Ультрамикротомия, Методы окрашивания срезов, Радиоавтография и иммуноцитохимия и т. д.). Некоторые из частей выпущены отдельно в бумажных обложках и служат в лабораториях подручным справочным материалом.

Goldstein J. I., Yakowitz Н. (ed.). Practical scanning electron microscopy. Plenum Press, New York, 1975.

Помимо этого заголовка у сборника есть и подзаголовок — «Электронный и ионный анализ микропроб»; он посвящен в основном физическим и теоретическим вопросам и приложениям к небиологическим объектам.

Harris R. I. С. (ed.). The interpretation of ultrastructure. Academic Press, Inc., New York, 1962.

Содержит некоторые ценные ранние методы.

Hayat М. A. Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications, vol. 1—9. Van Nostrand Reinhold Co., New York, 1970.

Под одним и тем же названием до 1978 г. вышло девять томов, посвященных главным образом трансмиссионной электронной микроскопии. В последние восемь, изданные под редакцией Хэйята, включены главы, написанные другими авторами; они перечислены по отдельности, часть из них полезна для микробиологов.

Hayat М. A. Basic electron microscopy techniques. Van Nostrand Reinhold Co., New York, 1972.

Хорошее описание методов, необходимых для начинающих заниматься электронной микроскопией.

Hayat М. A. Positive staining for electron microscopy. Van Nostrand Reinhold Co., New York, 1975.

Hayat M. A. (ed.). Principles and techniques of scanning electron microscopy. Biological applications, vol. 1—6. Van Nostrand Reinhold Co, New York, 1974.

До 1978 г. вышло шесть томов с этим заголовком. Так же как и в предыдущей серии томов по трансмиссионной электронной микроскопии, в главах, составляющих эти тома, рассматриваются частные и узкие области; некоторые из них имеют для микробиолога непосредственное прикладное значение, а все в совокупности ценны для тех, кто пытается расширить свой кругозор в электронной микроскопии. Относящиеся к микробиологии главы отдельно перечисляются в других разделах литературы к данной главе.

Kay D. (ed.). Techniques for electron microscopy, 2nd ed. F. A. Davis Co., Philadelphia, 1965.

Книга с тщательным описанием методов, в которой ценно все.

Koehler I. К (ed.). Advanced techniques in biological electron microscopy. Springer-Verlag, New York, 1973.

Детально разбирается несколько методов; имеет немалую ценность для того, кто только начинает приобретать опыт.

Meek G. A. Practical electron microscopy for biologist, 2nd ed. John Wiley and Sons, Inc., New York, 1976.

Довольно полно охватывает большинство методов.

Wells О. С. Scanning electron microscopy. McGraw-Hill Book Co., New York, 1974.

В основном изложена теория вопроса. Только в гл. 12 («Гистологические и цитологические методы работы со сканирующим электронным микроскопом в биологии и медицине», автор А. Бойд) затрагиваются соответствующие методы, но без акцента на микроорганизмы.

Литература по частным вопросам,скомпонованная по предметному принципу

Теория и практика электронной микроскопии

Agar A. W. In: D. Kay (ed.), Techniques for electron microscopy, 2nd ed., p. 1—42. F. A. Davis Co., Philadelphia, 1965.

Agar A. W„ Alderson R. H., Chescoe D. In: A. M. Glauert (ed.), Practical methods in electron microscopy, vol. 2, p. 1—190. American Elsevier Publishing Co.. New York, 1974.

Dawes C. J. Biological techniques in electron microscopy, p. 1—15. Barnes and Noble, Inc., New York, 1971.

Siegel В. M. In: В. M. Siegel (ed.), Modern developments in electron microscopy, p. 1—79. Academic Press, Inc., New York, 1964

Wischnitzer S. In: M. A. Hayat (ed.), Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications, vol. 3, p. 3—50. Van Nostrand Reinhold Co., New York, 1973.

Сетки и подложки

Baumeister W., Hahn M. In: M. A. Hayat (ed.), Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications, vol. 8, p. 1 — 112. Van Nostrand Reinhold Co., New York, 1978.

Bradley D. E. In: D. Kay (ed.). Techniques for electron microscopy, 2nd ed., p. 58—74. F. A. Davis Co., Philadelphia, 1965.

Dawes C. J. Biological techniques in electron microscopy, p. 107—- 114. Barnes and Noble, Inc., New York, 1971.

Hayat M. A. Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications, vol. 1, p. 323—333. Van Nostrand Reinhold Co., New York, 1970.

Негативное контрастирование

Anderson T. F. In: R. J. C. Harris (ed.), The interpretation of ultrastructure. p. 251—262. Academic Press, Inc.. New York, 1962

Bradley D. E. In: D. Kay (ed.), Techniques for electron microscopy, 2nd ed., p. 75—83, 87—89. F. A. Davis Co., Philadelphia, 1965.

Brenner S., Horne R. IF. Biochim. Biophys. Acta, 34, 103—110 (1959).

Dawes L. J. Biological techniques in electron microscopy, p. 146— 148. Barnes and Noble, Inc., New York, 1971.

Haschemeyer R. H., Myers R. J. In: M. A. Hayat (ed.), Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications, vol. 2, p. 101—147. Van Nostrand Reinhold Co., New York (1972).

Horne R. W. In: D. Kay (ed.), Techniques for electron microscopy, 2nd ed., p. 328—355. F. A. Davis Co., Philadelphia, 1965.

Huxley H. E„ Zubay G. J. Mol. Biol., 2, 10—18 (1960)

Kay D. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (ed.), Methods in microbiology, vol. 9, p. 177—214. Academic Press, Inc., New York (1976).

Muscatello U., Horne R. W. J. Ultrastruct. Res., 25, 73—83 (1968).

Valentine R. C., Horne R. IF. In: R. J. C. Harris (ed.), The interpretation of ultrastructure, p. 263—277. Academic Press, Inc., New York, 1962.

Препараты в виде срезов (фиксация, обезвоживание, заливка, приготовление срезов, окрашивание)

Dawes С. J. Biological techniques in electron microscopy, p. 17— 105. Barnes and Noble, Inc., New York, 1971.

Glauert A. M. In: D. Kay (ed.), Techniques for electron microscopy, 2nd ed., p. 166—212. F. A. Davis Co., Philadelphia, 1965.

Glauert A. M. In: D. Kay (ed.), Techniques for electron microscopy, 2nd ed., p. 254—282. P. A. Davis Co., Philadelphia, 1965.

Glauert A. M. In: A. M. Glauert (ed.). Practical methods in electron microscopy, vol. 1, p. 1—216. American Elsevier Publishing Co., New York (1975).

Glauert A. M., Phillips R. In: D. Kay (ed.), Techniques for electron microscopy, 2nd ed., p. 213—253. F. A. Davis Co., Philadelphia, 1965.

Hayat M. A. Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications, vol. 1, p. 3—51. Van Nostrand Reinhold Co., New York (1970).

Knobler R. L., Stempak J. G., Laurencin M. In: M. A. Hayat (ed.), Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications. vol. 8, p. 113—155. Van Nostrand Reinhold Co., New York (1978).

Luft J. H. In: J. K. Koehler (ed.), Advanced techniques in biological electron microscopy, p. 1—34. Springer-Verlag, New York, 1973.

Reid N. In: A. M. Glauert (ed.), Practical methods in electron microscopy, vol. 3, p. 217—353. American Elsevier Publishing Co., New York (1975).

Spurr A. R. J. Ultrastruct. Res., 26, 31—43 (1969).

Реплики, напыление металлом

Bradley D. E, In: D. Kay (ed.), Techniques for electron microscopy, 2nd ed., p. 96—152. F. A. Davis Co., Philadelphia, 1965.

Henderson IF. L, Griffiths K. In: M. A. Hayat (ed.). Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications, vol. 2, p. 151—217. Van Nostrand Reinhold Co., New York (1972).

Замораживание—травление, замораживание—скалывание

Benedetti Е. L., Favard Р. (ed.). Freeze-etching: techniques and applications. Societe Fran^aise de Microscopie Electronique, Paris, 1973.

Bullivant S. In: J. K. Koehler (ed.). Advanced techniques in biological electron microscopy, p. 67—112. Springer-Verlag, New York, 1973.

Koehler J. K. In: M. A. Hayat (ed.), Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications, vol. 2, p. 53—98. Van Nostrand Reinhold Co., New York (1972).

Сканирующая электронная микроскопия

Black J. T. In: M. A. Hayat (ed.), Principles and techniques of scanning electron microscopy. Biological applications, vol. 1, p. 1—43. Van Nostrand Reinhold Co., New York (1974).

Cohen A.o L. In: M. A. Hayat (ed.), Principles and techniques of scanning electron microscopy. Biological applications, vol. 1, p. 44— 112. Van Nostrand Reinhold Co., New York (1974).

Hayat M. A., Zirkin B. R. In: M. A. Hayat (ed.), Princilpes and techniques of electron microscopy. Biological applications, vol. 3, p. 311—319. Van Nostrand Reinhold Co., New York (1973).

Hayes T. L. In: J. K- Koehler (ed.), Advanced techniques in biological electron microscopy, p. 153—214. Springer-Verlag, New York, 1973.

Tрансмиссионная электронная микроскопия в микробиологии

Авакян А. А., Кац П. Н., Павлова Н. Б., Атлас патогенных бактерий человека и животных, Медицина, М., 1972.

Glauert А. М., Thornley М. I., Thorne К- I. Е, Sleyter U. В. In: R. Fuller and D. W. Lovelock (ed.), Microbial ultrastructure. The use of the electron microscope, p. 31—47. Academic Press, Inc., New York, 1976.

Greenhalgh G. N., Evans L. V. In: C. Booth (ed.), Methods in microbiology, vol. 4, p. 518—565. Academic Press, Inc., New York (1971).

Highton P. I. In: R. Fuller and D. W. Lovelock (ed.), Microbial ultrastructure. The use of the electron microscope, p. 161—173. Academic Press, Inc., New York (1976).

Hodgkiss IF., Short J. A., Walker P. D. In: R. Fuller and D. W. Lovelock (ed.), Microbial ultrastructure. The use of the electron microscope, p. 51—71. Academic Press, Inc., New York (1976).

Kellenberger E. In: R. J. C. Harris (ed.). The interpretation of ultrastructure, p. 233—246. Academic Press, Inc., New York, 1962.

Kellenberger E., Ryter A., Sechaud J. J. Biophys. Biochem. CytoL, 4, 671—678 (1958).

Lawn A. M. In: R. Fuller and D. W. Lovelock (ed.), Microbial ultrastructure. The use of the electron microscope, p. 73—86. Academic Press, Inc., New York (1976).

Lickfeld K. G. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (ed.), Methods in microbiology, vol. 9, p. 127—176. Academic Press, Inc., New York (1976).

Ryter A., Kellenberger Е. Z. Naturforsch. Teil В, 13, 597—605 (1958).

Walker P. D., Short J. A., Roper G. In: R. Fuller and D. W. Lovelock (ed.), Microbial ultrastructure. The use of the electron microscope, p. 118—146. Academic Press, Inc., New York, 1976.

Сканирующая электронная микроскопия в микробиологии

Bulla L. A., Jr., Julian G. St., Hesseltine C. W. Baker F. L. In: J. R. Norris and D. W. Ribbson (ed.), Methods in microbiology, vol. 8, p. 2—33. Academic Press, Inc., New York (1973).

Kondo I. In: M. A. Hayat (ed.), Principles and techniques of scanning electron microscopy. Biological applications, vol. 6, p. 309-— 316. Van Nostrand Reinhold Co., New York (1978).

Kormendy A. C. In: M. A. Hayat (ed.), Principles and techniques of scanning electron microscopy. Biological applications, vol. 3, p. 82—108. Van Nostrand Reinhold Co., New York (1975).

Nanninga N. In: E. L. Benedetti and P. Favara (ed.), Freezeetching: techniques and applications, p. 151—179. Societe Fran^aise de Microscopie Electronique, Paris, 1973.

Nickerson R. W., Bulla L. A., Jr., Kurtzman С. P. In: M. A. Hayat (ed.), Principles and techniques of scanning electron microscopy. Biological applications, vol. 1, p. 159—180. Van Nostrand Reinhold Co., New York (1974).

Passmore S. M., Bole B. In: R. Fuller and D. W. Lovelock (ed.), Microbial ultrastructure. The use of the electron microscope, p. 19—- 29. Academic Press, Inc., New York, 1976.

Yoshii Z., Tokumaga J., Tawara J. Atlas of scanning electron microscopy in microbiology. Igaku Shoin, Ltd., Tokyo (The Williams and Wilkins Lo., Baltimore), 1975.

Электронная микроскопия нуклеиновых кислот

Bradley D. E. In: D. Kay (ed.), Techniques for electron microscopy, 2nd ed., F. A. Davis Co., Philadelphia, 1965.

Davis R. W., Simon NL, Davidson M. Methods Enzymol., 21, 413— 428 (1971).

Kay D. In: R. Norris and D. W. Ribbons (ed.), Methods in microbiology, vol. 9, p. 177—214. Academic Press, Inc., New York (1976).

Kleinschmidt A. K., Zahn R. K. Z. Naturforsch. Teil B, 14, 770—779 (1959).

Thomas J. O. In: M. A. Hyat (ed.), Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications, vol. 9, p. 64—83. Van Nostrand Reinhold Co., New York (1978).

Электронные микрофотографии, интерпретация и увеличение изображения

Agar A. W., Alderson R. И., Chescoe D. In: А. М. Glauert (ed.), Practical methods in electron microscopy, vol. 2, p. 191—276. American Elsevier Publishing Co., New York (1974).

Farnell G. C„ Flint R. B. In: M. A. Hayat (ed.), Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications, vol. 5, p. 19— 61. Van Nostrand Reinhold Co., New York (1975).

Frank J. In: J. K. Koehler (ed.), Advanced techniques in biological electron microscopy, p. 217—274. Springer-Verlag, New York, 1973.

Hawkes Р. W. In: М. A. Hayat (ed.), Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications, vol. 8, p. 262—306. Van Nostrand Reinhold Co., New York (1978).

Horne R. IF., Markham R. In: A. M. Glauert (ed.), Practical methods in electron microscopy, vol. 1, p. 327—435. American Elsevier Publishing Co., New York (1972).

Markham R„ Frey S„ Hills G. J. Virology, 20, 88—102 (1963).

Peters K-R. In: M. A. Hayat (ed.), Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications, vol. 7, p. 118—143. Van Nostrand Reinhold Co., New York (1977).

Флуоресцирующие антитела

Goldman M. Fluorescent antibody methods. Academic Press, Inc , New York, 1968.

Kawamura A., Jr. Fluorescent antibody techniques and their applications. University Park Press, Baltimore, 1977.

Walker P. D„ Batty I., Thomson R. O. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (ed.), Methods in microbiology, vol. 5A, p 219— 254. Academic Press, Inc., New York (1971).

Цитохимия

Glauert A. M. In: D. Kay (ed.), Techniques for electron microscopy, 2nd ed., p. 274—282. F. A. Davis Co., Philadelphia, 1965.

Иммуноцитохимия

Glauert A. M. In: D. Kay (ed.), Techniques for electron microscopy, 2nd ed, p. 292—303. F. A. Davis Lo., Philadelphia, 1965.

88 Hayat M. A. Positive staining for electron microscopy, p. 194—209 Van Nostrand Reinhold Co., New York, 1975.

Kraehenbuhl J. P., Jamieson J. D. Int. Rev. Exp. Pathol., 13, 1—53 (1974).

Walker P. D., Batty I., Thomas R. O. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (ed.), Methods in microbiology, vol. 5A, p. 219—254 Academic Press, Inc., New York (1971).

Williams M. A. In: A. M. Glauert (ed.), Practical methods in electron microscopy, vol. 6, p. 1—217. Elsevier/North Holland, Inc., New York (1977).

Радиоавтография

Glauert A. M. In: D. Kay (ed), Techniques for electron microscopy, 2nd ed., p. 282—292. F. A. Davis Co., Philadelphia, 1965.

Salpeter M. M, Bachmann L. In: M. A. Hayat (ed.), Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications, vol. 2, p. 221—279. Van Nostrand Reinhold Co., New York (1972).

Salpeter M. M, McHenry F. A. In: J. K. Koehler (ed.), Advanced techniques in biological electron microscopy, p. 113—152. SpringerVerlag, New York (1972).

Williams M. A. In: A. M. Glauert (ed.). Practical methods in electron microscopy, vol. 6, p. 1—217. Elsevier/North Holland, Inc., New York (1977).

Глава 5

ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИЙК. Шнайтман

Схемы фракционирования на субклеточном уровне не могут быть универсальными, они обязательно должны быть индивидуальными. В них необходимо учитывать не только особенности отдельных организмов, но и тип органелл, которые выделяют, а также характер информации, которую требуется получить. Мы не будем здесь рассматривать все многочисленные схемы фракционирования, применяемые для бактерий и других микроорганизмов, а опишем лишь некоторые общепринятые методы разрушения клеток и фракционирования их содержимого, используемые для бактерий, и приведем несколько примеров применения этих методов к фракционированию кишечной палочки (Escherichia coli).

МЕТОДЫ РАЗРУШЕНИЯ КЛЕТОК

Выбор метода разрушения клеток является важнейшим моментом при построении схемы клеточного фракционирования. При выборе такого метода необходимо иметь в виду следующее.

Соответствует ли метод разрушения клеток типу исследуемого организма? Единой методики, которая давала бы хорошие результаты для всех типов бактерий, не существует. Например, один из возможных методов разрушения большинства грамотрицательных бактерий— продавливание клеток в прессе Френча — не очень эффективен по отношению к грамположительным коккам. Во встряхивающем гомогенизаторе Брауна полностью разрушаются клетки грамположительных кокков (Braun MSK shaker) и значительно повреждаются клетки грамотрицательных бактерий.

Не повреждаются ли при использовании избранного метода субклеточные органеллы? Такая проблема существует, например, при работе с ультразвуком. Пу-

тем обработки ультразвуком эффективно разрушаются самые различные бактериальные клетки, однако часто при этом повреждаются внутриклеточные органеллы.

Имеется ли необходимое оборудование? Многие механические устройства, с помощью которых бактериальные клетки эффективно разрушаются, очень дороги и поэтому малодоступны в обычных условиях или не подходят для обработки требуемого количества материала.

Какая методика является самой простой? Методики, в соответствии с которыми необходима длительная инкубация, или методики, включающие много сложных этапов, нередко дают плохой выход или приводят к потере ферментативной активности.

При разрушении клеток любым способом должна контролироваться степень разрушения. Часто с этой целью подсчитывают относительное число выживших клеток, но, видимо, это не лучший способ контроля, так как клетки могут утратить жизнеспособность и без потери внутриклеточного содержимого. Хорошим способом контроля является световая микроскопия влажных препаратов, но только в том случае, если она осуществляется количественно путем подсчета относительного числа оставшихся интактными клеток в счетной камере какого-либо типа. Это необходимо потому, что иногда при разрушении клеток образуются субклеточные фрагменты, которые слишком малы, чтобы их можно было различить в световом микроскопе. Чтобы отличать интактные клетки от лишенных содержимого «теней» или больших фрагментов клеточной оболочки, применяют фазово-контрастную микроскопию, а также негативную окраску нигрозином или тушью. Если клетки разрушают по методике, в соответствии с которой они переходят в сферопласты или протопласты в осмотически стабилизированной среде, важно определить процент такого перехода; при этом лучше воспользоваться счетной камерой, чем просто просматривать влажные препараты. Лизированные протопласты или сферопласты часто плохо видны в световой микроскоп, и одного лишь качественного сравнения числа этих структур, оставшихся интактными, с числом нормальных клеток недостаточно.

Другой эффективный метод контроля заключается в отборе проб по ходу разрушения и их центрифугировании в таком временном и скоростном режиме, который достаточен для осаждения интактных клеток. Надосадочную жидкость проверяют затем на содержание белка и других поглощающих в ультрафиолете веществ (т. е. нуклеиновых кислот) или специфических цитоплазматических ферментов; таким образом определяют степень выхода этих компонентов из подвергаемых разрушению клеток.

Ниже мы остановимся на нескольких конкретных методиках, которые применяют для разрушения клеток. См. также разд. 18.1.3 и 22.1.

Продавливание с помощью пресса

Продавливание с помощью пресса представляет собой, вероятно, самый распространенный и самый полезный метод разрушения клеток. Некоторое количество бактериальной суспензии (объемом 5—40 мл с содержанием клеток до 30 об. %) помещают в стальной цилиндр с плотно пригнанным поршнем, имеющим маленький выпускной клапан с узким отверстием; с клапаном соединена выводящая трубка. Цилиндр с поршнем ставят под 10-тонный гидравлический пресс. По мере того как поршень опускается, клетки разрушаются большими гидродинамическими силами, возникающими при прохождении клеточной суспензии через отверстие выпускного клапана. У этого метода есть ряд преимуществ. Во- первых, нет проблемы с охлаждением, так как цилиндр и поршень пресса охлаждают заранее, а нагрев происходит только при прохождении клеток через отверстие клапана. Температура вытекающей жидкости повышается на 5—10 °C, но эту жидкость можно быстро охлаждать, если собирать в металлическую пробирку или стакан, помещенные в ледяную баню. Во-вторых, разрушение происходит практически мгновенно, и суспензия разрушенных клеток не подвергается дополнительным гидродинамическим воздействиям, которые могли бы повредить субклеточные частицы. В-третьих, при использовании гидравлического пресса удовлетворительного качества можно проводить эксперименты в хорошо вос-

производимых условиях. К тому же на степень разрушения не влияет плотность клеточной суспензии, фаза роста, в которой были собраны клетки, или среда, в которой клетки суспендированы.

Установка типа пресса Френча состоит из цилиндра, поршня, выпускного клапана и подающей нагрузку станины (American Instrument Со. [Aminco], Rockville, MD.). В старых моделях этого пресса использовали быстро изнашивающийся клапан со стальной иглой, который часто повреждался во время работы. Вместо него можно использовать выпускаемый сейчас клапан с подогнанным по размеру нейлоновым шариком (Aminco). Он позволяет поршню доходить до дна цилиндра, не вызывая повреждений, и обеспечивает более однородное разрушение. Удобен также гидравлический пресс с приводом от мотора; пресс можно устанавливать на постоянное усилие в диапазоне скоростей движения поршня (Aminco; или Enerpac, Inc., Butler, Wis.).

Клеточную суспензию загружают в цилиндрическую ячейку и помещают под гидравлический пресс. Поршень пресса опускается на поршень ячейки, пока не разовьется максимальное усилие. До этого момента выпускной клапан закрыт, а затем его медленно открывают до тех пор, пока поршень не пойдет медленно вниз.

Перед разрушением Е. coli клетки собирают, отмывают один раз и суспендируют в объеме буфера [0,01 м HEPES (М-2-гидроксиэтилпиперазин-М'-2-этансульфоно- вая кислота), pH 7,4 при 0°С], составляющем 0,1 объема взятой культуры. Добавляют немного панкреатической рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы (0,1 мг/мл) и разрушают суспензию на прессе Френча под давлением 14-107 Па. После разрушения добавляют MgCU до конечной концентрации 1 мМ и удаляют неразру- шившиеся клетки центрифугированием при 5000 g в течение 5 мин. Mg2+ нужен для того, чтобы функционировала дезоксирибонуклеаза; его добавляют после разрушения, чтобы предотвратить стабилизацию рибосом. Рибонуклеаза действует в отсутствие Mg2+. Можно использовать и другие буферы, например фосфатный, но трис-буфера или хелатирующих агентов следует избегать, чтобы предотвратить повреждение наружной клеточной мембраны.

Пресс Френча эффективен при разрушении грамотри- цательных и некоторых грамположительных бактерий (особенно бацилл). Эндоспоры и грамположительные кокки в нем не разрушаются, для этих устойчивых клеток более действенно баллистическое разрушение или обработка лизоцимом.

Пресс Риби сходен по принципу действия с прессом Френча; различия между ними состоят в том, что пресс Риби развивает большее давление (в нем можно разрушать эндоспоры и некоторые наиболее устойчивые клетки) и имеет систему охлаждения. Его конструкция обеспечивает безопасную работу с патогенными микроорганизмами, однако, к сожалению, этот пресс больше не выпускается.

Разрушение ультразвуком

Для разрушения клеток применяют разнообразные ультразвуковые генераторы с вибрирующим пестиком. Высокочастотная вибрация наконечника пестика вызывает кавитацию, т. е. образование микроскопических пузырьков газа, движущихся с большой скоростью вблизи наконечника. Порождаемые этими быстро движущимися пузырьками большие гидродинамические силы приводят к разрушению клеток. Такой метод разрушения заманчив, так как подобные дезинтеграторы недороги и эффективны. Однако методу ультразвукового разрушения присущи недостатки, ограничивающие его применение в исследованиях, связанных с фракционированием клеточного содержимого.

Основной недостаток заключается в том, что разрушение происходит не мгновенно; для того чтобы разрушилась достаточная доля клеток, клеточную суспензию нужно обрабатывать в течение периода времени от 30 с до нескольких минут. В этот период высвобожденные субклеточные частицы подвергаются тем же самым большим гидродинамическим воздействием, что и неразрушенные клетки. Мембранные пузырьки деградируют до маленьких липопротеидных фрагментов, не осаждающихся при ультрацентрифугировании, а мембранные белки заметно перераспределяются между различными мембранами (например, между внутренней и наружной мембранами у грамотрицательных бактерий).

Во время разрушения клеток ультразвуком довольно трудно поддерживать низкую температуру образца. При этом может происходить вспенивание, вызывающее денатурацию белка, а кроме того, из-за кавитации может ускоряться окисление чувствительных к кислороду ферментов и ненасыщенных липидов. Трудности, связанные с образованием пены и поддержанием нужной температуры, сводятся к минимуму, если пробу подвергать не одной продолжительной, а нескольким кратковременным обработкам и охлаждать в перерывах между обработками. С проблемой окисления можно справиться, если проводить обработку пробы в атмосфере аргона. Нельзя сказать, что рассматриваемый метод отличается хорошей воспроизводимостью, так как эффективность обработки ультразвуком зависит от вязкости пробы, а также от размера, формы и химического состава сосуда, в котором находится проба (например, в стеклянном стакане разрушение клеток проходит гораздо более эффективно, чем в пластмассовом, который поглощает часть энергии ультразвука). Предупреждение: работающие с ультразвуком должны надевать на уши защитные приспособления, если только обработку не проводят в звукопоглощающем боксе.

Ультразвуковая обработка не очень хороша для первичного разрушения клеток, однако она эффективна для лизирования сферопластов (что осуществляется в методике разделения наружной и внутренней мембран грам- отрицательных бактерий по Осборну и Мунсону {8]) как способ разбивания комков из внутриклеточных органелл и для суспендирования отцентрифугированных осадков. Для этих целей достаточны очень короткие ультразвуковые обработки, в процессе которых внутриклеточные органеллы не повреждаются.

Баллистическое разрушение

Термином «баллистическое разрушение» обозначают разнообразный набор методов, в которых бактерии разрушаются силами сдвига, развивающимися, когда суспензия клеток очень сильно встряхивается или перемешивается вместе с маленькими стеклянными или пластмассовыми шариками. Для этого промышленностью

выпускается множество устройств, которые очень детально описаны в обзорах Сэлтона [10] и Хьюджеса с соавторами [4].

В ранних работах широко применялись два устройства— аппарат Микля для встряхивания и аппарат для встряхивания, насаживаемый на ось центрифуги типа International [14]. Ни в одном из них не обеспечивалось поддержание низкой температуры во время встряхивания, и поэтому приходилось часто прерывать процесс для охлаждения пробы. Эти устройства больше не выпускаются промышленностью, они заменены тканевым дезинтегратором Брауна (Braun MSK; В. Braun Melsungen Apparatebau, Melsungen, Federal Republic of Germany), который поставляется в США многими фирмами, специализирующимися на выпуске лабораторного оборудования. Дезинтегратор Брауна имеет контейнер для пробы объемом 65 мл, который качается в горизонтальной плоскости с частотой 2000—4000колебаний/мин. Охлаждение обеспечивается струей жидкого СО2, направляемой к контейнеру с пробой. В большинстве случаев клетки разрушаются за 3—'5 мин при температуре ниже 4 °C.

Дезинтегратор Брауна применяют, если требуется выделить клеточные стенки и отдельные ферменты из грамположительных бактерий. Как правило, при этом пользуются методикой Ворка [14].

Суспензию клеток (30 мл с содержанием сухого вещества 20—50 мг/мл) в подходящем буфере смешивают с 20 мл шариков Ballotini № 12 в соответствующем контейнере (для воздуха важно оставить не меньше 20% объема емкости) и в течение 0,5 мин для охлаждения контейнера через аппарат пропускают СО2. Затем в течение 3,5—5 мин в зависимости от типа клеток пробу встряхивают с частотой 3000 движений в минуту. Шарики удаляют низкоскоростным центрифугированием или пропусканием смеси через грубый стеклянный фильтр. Некоторые исследователи предпочитают использовать вместо стеклянных шариков пластмассовые, как описано Россом [9], чтобы свести к минимуму денатурацию ферментов. Если описанную выше методику применяют для выделения клеточных стенок, то пробу после встряхивания немедленно подвергают обработке, обеспечи-

вающей инактивацию автолитических ферментов [14].

Эндоспоры бактерий разрушают в дезинтеграторе Брауна при встряхивании сухих спор с сухими шариками (5 г сухих спор плюс 15 г шариков), как описано выше, и затем суспендируют их в буфере, как описано Стейнбергом [12].

Измельчение в твердом состоянии

Клетки можно разрушить размалыванием концентрированной биомассы или лиофилизованных клеток абразивами, такими, как корунд, или измельчением в твердом состоянии, которое достигается при продавливании замороженной суспензии или биомассы через маленькое отверстие или щель. Хьюджес с соавторами [4] дали полное описание этих методов. Промышленностью выпускается аппарат для измельчения замороженной клеточной массы икс-пресс (LKB-Produkter АВ, Bromma, Sweden), в котором эффективно разрушаются как грамположительные, так и грамотрицательные клетки. Однако этот аппарат имеет ограниченную емкость, относительно дорог и сложен в работе. К тому же у него нет особых преимуществ перед прессом Френча или дезинтегратором Брауна.

Обработка мурамидазами

Для приготовления протопластов грамположитель- ных бактерий используют яичный лизоцим. Обычно гидролиз этим ферментом проводят в растворе сахарозы (0,3—0,5 М) при нейтральном или слабощелочном значении pH. Обработка лизоцимом в концентрациях от 0,1 до 1,0 мг/мл в течение 30 мин должна приводить к 100 %-ному образованию протопластов. Для контроля этого процесса применяется фазово-контрастная микроскопия. Протопласты стабильны при малых концентрациях Mg2+ и Са2+ (в диапазоне 0,5—5 мМ). Реакцию гидролиза проводят как на холоду, так и при комнатной температуре.

В продаже имеются препараты мурамидаз, имеющих более широкую субстратную специфичность, чем яичный лизоцим; они могут быть очень эффективными

при гидролизе клеточной стенки грамположительных бактерий, устойчивых к яичному лизоциму. К этим препаратам относятся лизостафин, мурамидаза из Staphylococcus staphylolyticus (Sigma Chemical Co., St. Louise, МО) и мурамидаза из Chalaropsis sp. (Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind.). Работать с этими ферментами следует осмотрительно, поскольку они не так хорошо очищены, как яичный лизоцим, и часто содержат примеси протеаз, липаз или нуклеаз.

В отличие от грамположительных бактерий фактически все грамотрицательные бактерии имеют в своем составе муреин, который чувствителен к лизоциму. Однако наружная мембрана грамотрицательных бактерий непроницаема для лизоцима, и для того чтобы лизоцим подействовал, ее целостность должна быть нарушена. Этого добиваются замораживанием — оттаиванием, предварительной обработкой ЭДТА или в некоторых случаях обработкой антибиотиками, действующими на мембраны, такими, как полимиксин В. Гидролиз муреина в грамотрицательных бактериях не приводит к удалению наружной клеточной мембраны, поэтому образующиеся чувствительные к изменению осмотического давления структуры называют не протопластами, а сферо- пластами.

Сферопласты кишечных бактерий можно приготовить, как описано ниже, по методике Осборна и Мунсо- на '[8]. Культуры центрифугируют и суспендируют в 0,1 первоначального объема охлажденного 0,75 М раствора сахарозы в 10 мМ трис-ацетатном буфере, pH 7,8. К пробе добавляют лизоцим до конечной концентрации 0,1 мг/мл и инкубируют суспензию на льду в течение 2 мин. Перевод клеток в сферопласты осуществляется в ходе медленного разведения суспензии в течение 8— 10 мин двумя объемами холодного раствора 1,5 мМ ЭДТА, добавляемого посредством перистальтического насоса. Во время разведения суспензию слегка помешивают, а переход в сферопласты контролируют с помощью фазово-контрастной микроскопии.

На образование протопластов и сферопластов отчетливо влияет ряд факторов, включая фазу роста, на которой собраны микроорганизмы, способы промывания клеток после отбора и тип культуральной среды. В свя-

зи с описанной выше методикой Осборн и Мунсон [8] отмечают, что клетки, выращенные на комплексной среде, лучше образуют сферопласты, а предварительная инкубация клеток в холодном буфере до перенесения их в раствор сахарозы сказывается отрицательно на образовании сферопластов. В целом для приготовления сфе- ропластов или протопластов лучше всего использовать клетки, находящиеся в середине логарифмической фазы роста.

Осмотическое лизирование

Сферопласты или протопласты эффективно лизируются при быстром 10—20-кратном разведении разбавленным буфером или дистиллированной водой. Размер образующихся при этом везикул в определенной степени зависит от быстроты и кратности разведения. Часто применяют методику осаждения протопластов или сферопластов центрифугированием с последующим суспендированием их в лизирующем буфере. Такие осадки можно быстро и равномерно суспендировать при помощи шприца (в частности, пружинного шприца, снабженного оксфордовским [Oxford Laboratories] шприцевым пипеттором с иглой большого диаметра или канюлей. Несколько энергичных движений поршнем шприца позволяет быстро и равномерно суспендировать смесь.

В интактных клетках бактерий дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) включена в структуру нуклеоида. Эта структура стабилизируется рибонуклеиновой кислотой (РНК), и поэтому присутствие следов рибонуклеазы приводит к разворачиванию нуклеоида во время лизиса и образованию очень вязкого раствора высвободившейся ДНК- Трудности, связанные с высокой вязкостью, можно преодолеть несколькими путями. Цепи молекул ДНК можно разрезать короткой обработкой ультразвуком или гомогенизацией суспензии лизированных клеток в ножевом микроизмельчителе. Можно также добавить в раствор дезоксирибонуклеазу, но для функционирования этого фермента необходим Mg2+ в концентрации не менее 0,1 мМ. Если сферопласты лизируются в присутствии ЭДТА, то требуется избыток Mg2+ по сравнению с содержанием ЭДТА.

Замораживание—оттаивание

Замораживание — оттаивание используют для того, чтобы сделать грамотрицательные клетки чувствительными к лизоциму или детергентам. Этот метод можно применять при выделении мембран или внутриклеточных органелл в больших количествах.

Для выделения больших количеств мембран из Е. colt полезна следующая методика. Густую суспензию отмытых клеток (клетки составляют около 30% объема суспензии) в 0,02 М трис-буфере, pH 7,8, содержащем 5 мМ ЭДТА, 0,25 М сахарозы и 0,5 мг/мл лизоцима, помещают в колбу и замораживают в виде тонкого слоя, вращая колбу в ацетоновой бане с сухим льдом. Затем суспензию размораживают, погружая колбу в теплую воду, и, как только все растает, выливают содержимое в 20 объемов холодного буфера, имеющего состав: 0,02 М трис, 0,5 мМ MgCl2, 0,1 мг/мл дезоксирибонуклеазы, pH 7,8. Смесь немедленно обрабатывают около 20 с в ножевом микроизмельчителе, чтобы измельчить ДНК и разрушить клетки. Неразрушившиеся клетки удаляют центрифугированием в течение 5 мин при 5000 g. Если осадка много, его вновь суспендируют в указанном выше растворе трис-ЭДТА-сахарозы и повторяют цикл замораживания — оттаивания с последующим разведением. Клеточные оболочки, состоящие из наружной и внутренней мембран, получают центрифугированием при 27 000 g в течение 20 мин.

МЕТОДЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ

Дифференциальное центрифугирование

Для получения клеточных фракций широко применяются различные виды центрифугирования: дифференциальное центрифугирование, зональное центрифугирование и равновесное центрифугирование в градиенте плотности. Теоретические и практические вопросы, связанные с центрифугированием, всесторонне разобраны в обзоре Сайкса [13].

В случае дифференциального центрифугирования образцы центрифугируют определенное время при задан

ной скорости, после чего удаляют надосадочную жидкость. Этот метод полезен для разделения частиц, сильно различающихся по скорости седиментации. Например, центрифугирование в течение 5—10 мин при 3000— 5000 g приводит к осаждению интактных бактериальных клеток, тогда как большинство клеточных фрагментов при этом остается в надосадочной жидкости. Фрагменты клеточной стенки и большие мембранные структуры можно осадить центрифугированием при 20 000—50 000 g в течение 20 мин, в то время как маленькие мембранные везикулы и рибосомы требуют для осаждения центрифугирования при 200 000 g в течение 1 ч.

Зональное центрифугирование

Зональное центрифугирование представляет собой эффективный способ разделения структур, имеющих сходную плавучую плотность, но различающихся по форме и массе частиц. В качестве примеров можно привести разделение субъединиц рибосом, различных классов полисом, а также молекул ДНК, имеющих различную форму. Центрифугирование осуществляют либо в бакет-роторах, либо в специально устроенных зональных роторах; для предотвращения конвекции при центрифугировании в стаканах бакет-ротора или в камере зонального ротора создают слабый градиент (обычно сахарозы). Пробу наносят в виде зоны или узкой полосы в самом верху градиентного столбика. Для субклеточных частиц обычно используется градиент сахарозы от 15 до 40% (вес/объем); большинство этих частиц в достаточной степени разделяется центрифугированием при 100000 g в течение 1—4 ч.

Равновесное центрифугированиев градиенте плотности

При этом виде центрифугирования частицы разделяются по плавучей плотности, а не по скорости седиментации. Метод широко применяется для разделения различных фракций мембран, так как фрагменты мембран, относящиеся к одному и тому же типу, могут сильно

различаться по размеру (и, следовательно, скорости седиментации), но должны иметь одинаковую плавучую плотность. Исследуемые компоненты движутся при центрифугировании в градиенте плотности растворенного вещества (для мембран и органелл с плотностью ниже 1,3 г/мл обычно используются сахарозные градиенты, а для более плотных структур, таких, как вирусы, применяют соли винной кислоты и хлористый цезий) до тех пор, пока не будет достигнуто равновесное положение, при котором плотность каждой частицы равна плотности окружающего раствора. Поскольку растворы сахарозы относительно вязкие, градиенты, как правило, формируют заранее. У растворов хлористого цезия вязкость низкая, так что трудно заранее приготовить его градиентный раствор; в этом случае применяют технику изопикнического центрифугирования в градиенте плотности. Пробу смешивают с хлористым цезием в количестве, достаточном для создания плотности, равной средней плотности субклеточных частиц. Эту гомогенную смесь помещают в сосуд для центрифугирования, и в результате седиментации хлористого цезия в поле центробежных сил при центрифугировании формируется его градиент.

Поскольку скорость седиментации частицы постепенно снижается по мере достижения ею той области градиента, где она имеет плотность одинаковую с плотностью раствора, для достижения равновесия центрифугировать требуется очень долго. Это особенно важно для маленьких мембранных везикул, таких, как хрома- тофоры, или для фрагментов цитоплазматических мембран клеток, разрушенных на прессе Френча, так как скорость седиментации этих частиц низка даже в отсутствие градиента. Если применять центробежные ускорения порядка 100 000—200 000 g, для более или менее хорошего разделения требуется не меньше 24 ч, а для полного — 72 ч.

Градиенты сахарозы

Концентрация сахарозы в растворах для приготовления градиентов указывается в литературе по-разному: в единицах плотности, в молях сахарозы, в весовых про-

центах сахарозы (вес/вес), в процентах на единицу объема (вес/объем или г/100 мл). В стандартных химических справочниках есть таблицы для перевода концентраций водных растворов сахарозы из одних единиц в другие. Чаще всего используются весовые проценты сахарозы. При приготовлении сахарозных растворов плотность воды или разбавленных буферов принимают равной 1 г/мл. Следовательно, чтобы приготовить, например, раствор 54 %-ной (вес/вес) сахарозы, нужно растворить 54 г сахарозы в 46 мл воды. При этом образуется 100 г раствора, а поскольку плотность 54%-ного (вес/вес) раствора сахарозы равна 1,2451, конечный объем будет 80,3 мл. Приготовление растворов таким путем устраняет необходимость доведения вязких растворов до фиксированных величин объема.

Для создания градиентов промышленностью выпускаются разнообразные устройства, но их применение не обязательно, так как удовлетворительные по качеству градиенты можно приготовить, наслоив друг на друга в центрифужном стакане ряд сахарозных растворов и выдержав в течение ночи, чтобы за счет диффузии образовался непрерывный градиент. Нет необходимости выдерживать градиенты, которые будут центрифугироваться 24 ч и больше, так как за время центрифугирования благодаря диффузии сформируется непрерывный градиент. Мы обычно готовим градиенты из пяти-семи слоев. Когда используются смачиваемые центрифужные стаканы, например, из нитроцеллюлозы или поликарбоната, слои можно наносить, давая им стекать вниз по стенке стакана из пипетки, которую держат под углом к стенке. Если берут несмачиваемые стаканы, такие, как полиалломерные или полипропиленовые, то кончик пипетки при добавлении раствора должен находиться в контакте с мениском, чтобы не происходило перемешивания.

Самый простой метод отбора фракций из сахарозных градиентов заключается в их выкачивании с помощью перистальтического насоса. Центрифужный стакан зажимают в круглых лапках (мы применяем кусок прозрачного плекса с просверленным по диаметру стакана отверстием, который зажимаем в лапках), а над ним в круглых лапках закрепляют трубочку небольшого

диаметра из нержавеющей стали. Трубочку подсоединяют к насосу и опускают в стакан до соприкосновения с дном. Затем градиентный столбик с помощью насоса раскапывают по находящимся в коллекторе фракций мерным пробиркам.

Детергенты

Детергенты применяются при фракционировании клеток в трех случаях. Когда хотят получить немембранные органеллы, такие, как рибосомы, нуклеоиды и т. д., детергенты обеспечивают мягкое лизирование клеток после нарушения целостности муреина (грамположи- тельные бактерии) или наружной мембраны (грамотри- цательные бактерии). Детергенты применяют также для того, чтобы избирательно перевести в раствор цитоплазматическую мембрану грамотрицательных бактерий, сохранив интактной наружную мембрану, или удалить мембранные загрязнения с рибосом, полисом и стенок грамположительных клеток.

Детергенты представляют собой амфипатические молекулы, т. е. молекулы, имеющие как гидрофильную, так и гидрофобную области; они умеренно растворяются в воде. В очень низких концентрациях детергенты образуют в воде истинный раствор. По мере возрастания концентрации молекулы детергента агрегируют с образованием мицелл, в каждой из которых гидрофильные области обращены к воде, а гидрофобные скрыты от воды внутри мицеллы. Концентрацию, при которой по мере добавления детергента к воде начинают образовываться мицеллы, называют критической концентрацией мицеллообразования (ККМ). Каждый детергент характеризуется своими ККМ, размерами и формой мицелл. Превосходный обзор Хелениуса и Симонса [3] суммирует свойства многих детергентов, применяемых для получения клеточных фракций.

Детергенты можно подразделить на три класса, различающиеся по свойствам мицелл, способности связываться с белками и способности взаимодействовать с другими растворенными веществами. К этим классам относятся ионные детергенты, неионные детергенты и со-

ли желчных кислот. С каждым детергентом связаны свои трудности и свои преимущества при фракционировании клеток.

Ионные детергенты

К самым распространенным ионным детергентам относятся додецилсульфат натрия (лаурилсульфат натрия, ДСН), N-лаурилсаркозинат натрия (саркозил), алкилбензосульфонаты (обычные, применяемые в домашнем хозяйстве детергенты) и соли четвертичных аминов, такие, как бромид цетилтриметиламмония (цетавлон). Ионные детергенты склонны образовывать небольшие мицеллы (с мол. массой ~ 10 000) и имеют относительно высокую ККМ (для ДСН ККМ при комнатной температуре в разведенных буферах составляет примерно 0,2%). На ККМ и растворимость ионных детергентов сильно влияют ионная сила раствора и природа присутствующих в нем противоионов. К примеру, 10%-ный раствор ДСН теряет стабильность при температуре около 17 °C, в то время как сходный раствор додецилсульфата в трисе стабилен при 0°С. Додецилсульфат калия растворим только при повышенных температурах, и поэтому при использовании этого детергента К+ следует исключать из всех буферов.

Такие детергенты, как ДСН, которые имеют сильно ионизированную гидрофильную группу, не подвержены влиянию изменения реакции среды в широком диапазоне pH и не осаждаются 5 %-ной трихлоруксусной кислотой. Ионные детергенты сильно связываются с белками, и в случае ДСН обычно происходит разворачивание и необратимая денатурация белковых молекул. Хотя ионные детергенты можно удалить диализом, как правило, этого не делают из-за значительного связывания их с белками.

Неионные детергенты

К неионным детергентам относятся тритон Х-100, нонидет Р-40 (NP-40), твин 80 и октилглюкозид. Обычно мицеллы этих детергентов обладают большой молекулярной массой (50 000 и больше) и низкой ККМ

(0,1% и ниже), что ограничивает их применимость при гель-фильтрации или гель-электрофорезе. На свойства этих детергентов в растворе почти не влияют реакция среды и ионная сила, хотя они могут осаждаться 5 %-ной трихлоруксусной кислотой. Неионные детергенты связываются только с гидрофобными белками и, как правило, не вызывают денатурации или потери биологической активности.

Соли желчных кислот

Соли желчных кислот представляют собой соли сте- риновых производных, например холат, дезоксихолат или таурохолат натрия. Из-за того что массивные стери- новые ядра плохо упаковываются, эти детергенты образуют небольшие мицеллы (часто всего из нескольких молекул), а молекулярная масса последних в отличие от других детергентов является функцией концентрации детергента. Поскольку эти детергенты — соли очень плохо растворимых кислот со значениями рКа в области 6,5—7,5, их следует использовать в щелочных диапазонах значений pH. Чтобы избежать трудностей с растворением, применяют концентрированные исходные растворы, которые готовят, растворяя в избытке NaOH соответствующую свободную кислоту. При работе с этими детергентами ионный состав, значение pH и общая концентрация детергента должны поддерживаться на постоянном уровне.

Проблемы,возникающие при использовании детергентов

Поскольку большинство детергентов используется в концентрациях, довольно сильно превосходящих ККМ, и поскольку действие детергентов обусловлено образованием смешанных мицелл с липидами или связыванием с белками, отношения детергент: белок или детергент: липид значительно важнее истинной концентрации детергента. Как правило, достаточный избыток детергента обеспечивается при соотношении 2—4 мг детергента к 1 мг белка. Например, если для солюбилизации мембран используется 2%-ный тритон Х-100, концентрация белка в пробе должна быть не больше 5—10 мг/мл.

Тритон Х-100, один из самых ценных неионных детергентов, создает трудности при измерениях количества белка, поскольку он содержит ароматический остаток, препятствующий измерению поглощения при 280 нм, а в пробах с участием химических реагентов образует мутный осадок. Мы обычно преодолеваем эту трудность с помощью мечения культуры небольшим количеством 3Н-лейцина. Если метка вводится в минимальную или синтетическую солевую среду, следует позаботиться о том, чтобы добавить туда достаточное количество немеченого лейцина, обеспечив тем самым постоянное в течение всего периода роста включение изотопа из расчета на 1 мг белка. Для Е. coll достаточно добавить в качестве носителя 20—40 мкг немеченого лейцина, чтобы достичь равномерного включения метки. Когда ввести метку по каким-либо соображениям невозможно, содержание белка измеряют и в присутствии тритона Х-100 модифицированным методом Лоури, описанным в работе [11], в соответствии с которым к пробе добавляют избыток ДСН. Последний образует стабильные смешанные мицеллы с тритоном, не мешающие измерениям.

Тритон Х-100 и другие сходные с ним неионные детергенты растворяются в водно-спиртовых смесях, а белки из таких смесей можно выделить осаждением в этаноле. Пробу помещают на лед и к ней добавляют при перемешивании 2 объема охлажденного на льду абсолютного этанола. Смесь выдерживают в течение ночи в морозильнике и собирают осадок белка центрифугированием. Для эффективного осаждения требуется концентрация белка не меньше 0,2 мг/мл. Разбавленные растворы белка концентрируют в аппарате для ультрафильтрации фирмы Amicon с помощью фильтра РМ-30. Правда, следует иметь в виду, что при этом концентрируются также и мицеллы детергента.

ДСН удаляют из проб ацетоновым осаждением. Шесть объемов безводного ацетона добавляют к пробе при комнатной температуре, а выпавший осадок отделяют центрифугированием. Осадок промывают несколько раз водно-ацетоновой смесью (6'1). Так как осадок часто оказывается воскообразным и с ним трудно работать, мы обычно диспергируем его в воде гомогенизатором Поттера, а затем лиофилизуем.

Электрофорез в полиакриламидном геле

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДСН представляет собой самый простой и самый эффективный способ выявления набора полипептидов, присутствующих в субклеточных фракциях. Этот метод сейчас во многих случаях заменяет ферментативный и химический анализ при установлении чистоты и гомогенности субклеточных фракций.

Для электрофореза в полиакриламидном геле используются разнообразные выпускаемые промышленностью и самодельные приборы. Мы предпочитаем те приборы, которые позволяют проводить разделение в тонких пластинах геля, что обеспечивает оптимальное разрешение. Лучшее разрешение на пластинах обусловлено тем, что возникающее во время электрофореза тепло здесь легко рассеивается, а также тем, что гель после электрофореза можно быстро фиксировать. Последнее важно для того, чтобы свести к минимуму диффузию белка в полосах. Пластины позволяют одновременно сравнивать много проб, и их легко сохранять после высушивания на листах фильтровальной бумаги. Радиоактивность в пробах выявляют радиоавтографией и фотофлюорографией, а высушенные на фильтровальной бумаге гели можно легко нарезать ножницами или резаком и после повторного насыщения водой вырезанных сухих полосок просчитывать на сцинтилляционном счетчике. Если не требуется большая разгонка в геле, электрофорез, фиксацию, окраску и высушивание успевают проводить за один день.

Для гель-электрофореза в присутствии ДСН имеется большой набор буферных систем. Лучшее разрешение дают концентрированные буферные системы, у которых верхний (электродный) буфер содержит ионы, обладающие большой подвижностью и движущиеся через гель в виде передней зоны, или фронта. К моменту вхождения в разделяющий гель белки сжимаются этим движущимся фронтом в узкую полосу, а войдя в него, задерживаются за счет того, что гель обладает свойствами «сита». Описанная ниже система представляет собой модификацию концентрирующей буферной системы, предложенной Лэмли [5]. См. также разд. 26.5.1.

Разделяющий, или разгоняющий, гель содержит 11,5% акриламида, 0,2% бисакриламида и 0,1% ДСП в 0,375 М трис-буфере, доведенном НС1 до pH 8.8. Полимеризация инициируется удалением воздуха из раствора и добавлением тетраметилэтилендиамина (до 0,8%) и персульфата аммония (до 0,015%). Пока не произойдет полимеризация, разделяющий гель держат под слоем воды. Воду выливают и наслаивают концентрирующий гель, или гель для нанесения, содержащий 4,5% акриламида, 0,12% бисакриламида и 0,1 % ДСН в 0,125 М трис-буфере, доведенном НС1 до pH 6,8. Этот гель полимеризуется добавлением тетраметилэтилендиамина (до 0,125%) и персульфата аммония (до 0,05%). Перед полимеризацией, чтобы сформировать лунки для проб, в концентрирующий гель вставляют тефлоновую (фторопластовую) гребенку. После полимеризации образовавшиеся лунки промывают несколько раз электродным буфером, содержащим небольшое количество бромфенолового синего. При этом удаляется непрореагировавший персульфат, а границы лунок слегка окрашиваются, так что их можно видеть при нанесении проб. Верхний электродный буфер содержит 0,182 М глицин, 0,0255 М трис (конечное значение pH 8,3) и 0,1% ДСН. Нижний электродный буфер содержит те же компоненты, за исключением ДСН.

Пробы растворяют в буфере для концентрирующего геля, к которому добавлены 12,5% глицерина, 1,25% ДСН и 1,25% 2-меркаптоэтанола. До электрофореза их прогревают в течение 5 мин в кипящей водяной бане для того, чтобы прошла полная диссоциация и денатурация всех белков. В качестве красящей метки к пробам можно добавить бромфеноловый синий или феноловый красный. Окончательно приготовленные пробы должны содержать 1—5 мг/мл белка, причем в маленькие лунки (3X0,75 мм) достаточно вносить 5—25 мкг белка. Так как проводимость геля меняется по мере прохождения через него концентрирующего буфера, следует поддерживать постоянными напряжение или мощность, а не ток.

Пока исследуемая смесь не вошла в разделяющий гель, устанавливается начальное напряжение, равное 50 В; затем напряжение повышают до 145 В на весь

остаток пути. Для наилучшего разрешения температура геля должна быть 25 °C.

Самый распространенный недостаток электрофореза в полиакриламиде состоит в искривлении полос вследствие неправильно проведенной полимеризации. Чтобы этого не было, гелевые растворы нужно тщательно дегазировать перед заливкой, а верхнюю кромку разделяющего геля после полимеризации несколько раз промывать, чтобы удалить все остатки незаполимеризовавше- гося геля. Реактивы для электрофореза бывают разными по чистоте, и для того, чтобы время полимеризации было всегда постоянным, необходимо увеличивать или уменьшать количество персульфата аммония. Для разделяющего геля оптимальное время полимеризации составляет ~30 мин. При большей длительности гель становится мягким или не полностью полимеризуется, а при меньшей — полимеризация может пройти неравномерно, что приведет к появлению волнистых белковых полос. Персульфат аммония очень гигроскопичен и не отличается стабильностью. Рекомендуется готовить исходный концентрированный раствор персульфата аммония (50 мг/мл), который хранят в замороженном состоянии порциями по 1 мл. Такой раствор стабилен в морозильной камере в течение нескольких месяцев.

Полосы могут быть также размазанными из-за присутствующих в пробе липидов и гликолипидов (распространенный случай — присутствие липополисахаридов). Липиды связывают значительную часть ДСП, и фактически их присутствие может привести к истощению ДСП, доступного для связывания с белками, мигрирующими в геле. Эту трудность преодолевают, увеличивая количество ДСП в верхнем электродном буфере до 1 % и выше.

Гели окрашивают по методу Фейербенкса и др. [2]. При слабом покачивании гели вымачивают по 1 ч в каждом из следующих растворов: 1) 525 мл 95%-ного изопропанола, 200 мл ледяной уксусной кислоты, 1,0 г кумасси ярко-синего и 1275 мл воды; 2) 210 мл 95%-ного изопропанола, 200 мл ледяной уксусной кислоты, 0,1 г кумасси ярко-синего и 1590 мл воды; 3) 200 мл ледяной уксусной кислоты, 0,05 г кумасси ярко-синего и 1800 мл воды и 4) 10%-ная уксусная кислота. После

получение клеточных фракций

полного обесцвечивания геля его вымачивают перед высушиванием в 10%-ной уксусной кислоте, содержащей 1 % глицерина.

ПРИМЕР ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ: Е. coli

Полное фракционирование

Схему, показанную на рис. 5.1, можно использовать для определения внутриклеточной локализации какого- либо фермента или белка, принадлежащего Е. coll или другим кишечным бактериям. Преимущество этой схемы заключается в том, что при низких концентрациях Mg2+ (в данном случае источником Mg2+ служат как сами клетки, так и буфер для разрушения) наружная мембрана нерастворима в тритоне Х-100, в то время как цитоплазматическая мембрана полностью растворима.

При разрушении клеток силами сдвига некоторые цитоплазматические мембраны сильно дробятся (вероятно, до небольших, «открытых» мембранных фрагментов) и их нельзя уже осаждать ультрацентрифугированием. Поэтому первую надосадочную цитоплазматическую фракцию (надосадочная жидкость I на рис. 5.1) инкубируют при 21 °C. При температуре выше температуры фазового перехода мембранных липидов крошечные фрагменты агрегируют, т. е. сливаются в мембранные фрагменты больших размеров, которые можно затем осадить '[6]. В некоторых случаях неосаждаемая фракция мембран может составлять до 20—30% цитоплазматических мембран. Она образуется при разрушении клеток не только с помощью пресса Френча, но и при обработке их ультразвуком или даже при быстром лизисе протопластов или сферопластов.

При такой схеме фракционирования невозможно выяснить, откуда происходят растворимые белки — из цитоплазмы или из периплазмы. Для этого требуется отдельный эксперимент, в котором клетки подвергают осмотическому шоку по методике Неу и Хеппла [7] с высвобождением белков периплазмы.

Если окончательно получаемую фракцию цитоплазматических мембран (надосадочная жидкость III на рис. 5.1.) собираются анализировать гель-электрофоре-

РАЗРУШЕННЫЕ КЛЕТКИ

IНАДОСАДОЧНДЯ ЖИДКОСТЬ IИнкубация ЗОмин при 21йС Центрифугирование 1 ч при 200000gНАДОСАДОЧНДЯ ЖИДКОСТЬП (ЦИТОПЛАЗМА и периплазма)IНАДОСАДОЧНДЯ ЖИДКОСТЬ IИнкубация ЗОмин при 21йС Центрифугирование 1 ч при 200000gНАДОСАДОЧНДЯ ЖИДКОСТЬП (ЦИТОПЛАЗМА и периплазма)Центрифугирование 1ч прч 200000g пОСАДОК II объединение с осадком ИЦентрифугирование 1ч прч 200000g пОСАДОК II объединение с осадком ИIНАДОСАДОЧНАЯ ЖИДКОСТЬ ш (ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ)IНАДОСАДОЧНАЯ ЖИДКОСТЬ ш (ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ)пОСАДОК ПСуспендирование объединен ~ нои осадков до концентрации Юмг/мл белка в том же буфере, который использовался при разрушении клетокДобавление тритона Л-100 до конечной концентрации Ммг^мпЦентрифугирование 1ч при 30000gОСАДОК Ш (НАРУЖНЫЕ МЕМБРАНЫ)пОСАДОК ПСуспендирование объединен ~ нои осадков до концентрации Юмг/мл белка в том же буфере, который использовался при разрушении клетокДобавление тритона Л-100 до конечной концентрации Ммг^мпЦентрифугирование 1ч при 30000gОСАДОК Ш (НАРУЖНЫЕ МЕМБРАНЫ)

I

НАДОСАДОЧНДЯ ЖИДКОСТЬ I

Инкубация ЗОмин при 21йС Центрифугирование 1 ч при 200000g

НАДОСАДОЧНДЯ ЖИДКОСТЬП (ЦИТОПЛАЗМА и периплазма)

I

НАДОСАДОЧНДЯ ЖИДКОСТЬ I

Инкубация ЗОмин при 21йС Центрифугирование 1 ч при 200000g

НАДОСАДОЧНДЯ ЖИДКОСТЬП (ЦИТОПЛАЗМА и периплазма)

Центрифугирование 1ч прч 200000g п

ОСАДОК I

I объединение с осадком И

Центрифугирование 1ч прч 200000g п

ОСАДОК I

I объединение с осадком И

I

НАДОСАДОЧНАЯ ЖИДКОСТЬ ш (ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ)

I

НАДОСАДОЧНАЯ ЖИДКОСТЬ ш (ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ)

п

ОСАДОК П

Суспендирование объединен ~ нои осадков до концентрации Юмг/мл белка в том же буфере, который использовался при разрушении клеток

Добавление тритона Л-100 до конечной концентрации Ммг^мп

Центрифугирование 1ч при 30000g

ОСАДОК Ш (НАРУЖНЫЕ МЕМБРАНЫ)

п

ОСАДОК П

Суспендирование объединен ~ нои осадков до концентрации Юмг/мл белка в том же буфере, который использовался при разрушении клеток

Добавление тритона Л-100 до конечной концентрации Ммг^мп

Центрифугирование 1ч при 30000g

ОСАДОК Ш (НАРУЖНЫЕ МЕМБРАНЫ)

Рис. 5.1. Схема фракционирования клеток Е. coll, используемая для обнаружения локализации какого-либо фермента или белка внутри клетки. Клетки разрушают на прессе Френча в HEPES-буфере; интактные клетки удаляются осаждением в течение 5 мин при 5000 g.

зом в присутствии ДСН, белки нужно отделить от тритона Х-100 осаждением в этаноле, как описано ранее. В пробу и в верхний электродный буфер необходимо добавить большой избыток ДСН, в противном случае тритон Х-100 будет образовывать с ДСН смешанные мицеллы и мешать разделению белков в гелях.

Внутренняя и наружная мембраны

Клетки разрушают на прессе Френча и отделяют клеточный экстракт от целых клеток центрифугированием при 5000 g в течение 5 мин, как описано ранее. Фракцию клеточных оболочек осаждают центрифугированием при 200 000 g в течение 1 ч, а осадок ресуспендируют в

0,01 М HEPES-буфере, pH 7,4, так чтобы получить концентрацию белка ~20 мг/мл.

Градиенты сахарозы готовят на этом же буфере. Для ротора Beckman SW 27 (объем стакана 37 мл) мы используем 5 слоев по 7 мл каждый, содержащих следующие количества сахарозы (вес/вес): 35, 40, 45, 50 и 55 %. 2 мл суспензии с оболочками наслаивают поверх градиента и центрифугируют при максимальной скорости (131000 g) 36—48 ч. Небольшое количество осадка на дне стакана удаляют. Наружные мембраны содержатся либо в одиночной мутной полосе, либо в паре сходных полос в положении, соответствующем концентрации сахарозы примерно 52% (вес/вес). Фракция цитоплазматических мембран представляет собой прозрачную желтоватую полосу в том месте, где сахароза имеет концентрацию около 36% (вес/вес). Градиенты разливают с помощью насоса и измеряют поглощение фракций при 280 нм. Затем собирают и объединяют фракции, содержащие мембраны, объединенные фракции разводят в соотношении 1 :3 тем же HEPES- буфером, который в данном случае содержит 1 мМ MgCl2, и центрифугируют при 200 000 g в течение 2 ч для осаждения частиц мембран. Для выявления перекрестного загрязнения можно воспользоваться различными биохимическими маркерами. Цитохромы и Сукцинатдегидрогеназа представляют собой подходящие маркеры для фракции цитоплазматических мембран. Белки наружной мембраны, называемые «главными» [1] и выявляемые в ДСН-полиакриламидных гелях, — полезные маркеры для наружной мембраны, так же как и специфические липополисахариды или фосфолипазы [8]. Наилучшие результаты мы получили на культурах, выращенных на минимальных средах с временем генерации ~1 ч и более. Мембраны клеток, выращенных на комплексных средах, по-видимому, труднее разделить, возможно, вследствие увеличения числа зон адгезии между наружной и цитоплазматической мембранами в быстрорастущих клетках.

ЛИТЕРАТУРА

Bassford Р. L, Jr., Diedrich. D. L., Schnaitman С. Л., Reeves P. Outer membrane proteins of Escherichia coll. VI. Protein alteration in bacteriophage-resistant mutants. J. Bacteriol., 131, 608—622 (1977).

Fairbanks G„ Steck T. L., Wallach D. F. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry, 10, 2606—2617 (1971).

Helenius A., Simons K. Solubilization of membranes by detergents. Biochim. Biophys. Acta, 415, 29—79 (1975).

Hughes D. E., Wimpenny J. W. T„ Lloyd D. The disintegration of microorganisms, p. 1—54. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (ed.), Methods in microbiology, vol. 5B. Academic Press, Inc., New York, 1971.

Laemmli U. Cleavage of structural proteins during assembly of bacteriophage T4. Nature (London), 222, 293—298 (1970).

MacGregor С. H., Schnaitman C. Reconstitution of nitrate reductase activity and formation of membrane particles from cytoplasmic extracts of cholate-resistant mutants of Escherichia coll. J. Bacterial., 114, 1164—1176 (1973).

Neu H. C., Heppel L. A. The release of enzymes from Escherichia coll by osmotic shock and during the formation of spheroplasts. J. Biol. Chern., 240, 3685—3692 (1965).

Osborn M J., Munson R. Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of gram negative bacteria. Methods Enzymol, 31 A, 642—653 (1974).

Ross J. W. Continuous-flow mechanical cell disintegrator. Appl. Microbiol., 11, 33—35 (1963).

Salton M. R. Isolation of cell walls from gram positive bacteria Methods Enzymol., 31A, 653—667 (1974).

Schaechterle G. E., Pollack R. L. A simplified method for quantified assay of small amounts of protein in biological material. Anal. Bio- chem., 51, 654—655 (1973).

Steinberg W. Properties and developmental roles of the lysyl- and tryptophanyl-transfer ribonucleic acid synthetases of Bacillus subti- lis: common genetic origin of the corresponding spore and vegetative enzymes. J. Bacteriol ,118, 70—82 (1974).

Sykes J. Centrifugal techniques for the isolation and characterization of sub-cellular components from bacteria, p. 55—207. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (ed.), Methods in microbiology, vol. 5B. Academic Press, Inc., New York, 1971.

Work E. Cell walls, p. 361—418. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (ed.), Methods in microbiology, vol. 5A. Academic Press, Inc., New York, 1971.

Часть II

РОСТ

ВВЕДЕНИЕ

Р. Костилоу

Начиная с изящной работы Роберта Коха, сделанной еще в середине XIX столетия, методы выращивания бактерий стали основной заботой бактериологов. Для выращивания различных видов и штаммов микроорганизмов в самых различных целях были предложены буквально тысячи методик и сред. Однако все эти методики базируются на определенных общих принципах.

Для размножения любой бактерии (независимо от целей) необходимо обеспечить подходящее биофизическое окружение и биохимические питательные компоненты. В гл. 6 приведены методы контроля таких биофизических факторов, как pH, температура, подача и удаление кислорода, и другие. В гл. 7 рассмотрены потребности в питательных веществах, состав синтетических и комплексных сред и количественные определения роста бактерий. Умелое обращение с биофизическими, биохимическими и биологическими факторами приобретает особую важность в получении накопительных культур и последующего выделения бактерий в виде чистой культуры (гл. 8).

Способы культивирования бактерий значительно различаются, причем это зависит не только от потребностей организма, но и от того, для чего будет использоваться культура. Для выделения чистых культур, определения числа жизнеспособных клеток в популяциях и для многих других целей широко используются твердые среды. Гелеобразующие вещества и специальные методы приготовления твердых и полужидких сред рассматриваются в гл. 9. В гл. 10 описываются различные системы для жидких культур: стационарная, или периодическая, проточная, диализная — и другие специальные системы, а также методы сбора, отмывки и учета урожая бактерий.

Ростом обычно называют постепенное увеличение всех биохимических компонентов индивидуума. Для бактерий наиболее характерным результатом роста является увеличение числа клеток, т. е. их размножение. В гл. 11 описаны различные методы измерения количества клеток и математические приемы, используемые при учете и статистической обработке результатов.

Современные методы хранения чистых культур обсуждаются в гл. 12. Можно было бы составить целый «Журнал невоспроизводимых результатов», в котором были бы собраны данные, свидетельствующие о неумении исследователей сохранять необходимые бактериальные штаммы. В некоторых журналах существует требование, согласно которому каждая использованная в опубликованной работе культура должна быть помещена в какую-либо известную коллекцию. К сожалению, это не всегда позволяет избежать неудач, поскольку при хранении бактерии мутируют и при частых пересевах культура обогащается мутантными формами.

Из многих методов выращивания бактерий авторы выбрали только те, которые, по их мнению, являются наиболее приемлемыми. Там, где это возможно, приведены очень ценные обобщения, главным образом в виде таблиц, включающих составы сред (гл. 7). В некоторых случаях авторы ограничиваются изложением общих принципов и примерами использования методов. Это относится, в частности, и к тем распространенным методам, описания которых в литературе страдают многословием и противоречивостью трактовок. Во всех главах, входящих в данную часть, рассмотрены также наиболее общие причины ошибок.

Глава 6

БИОФИЗИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Р. Костилоу

Выбор основных компонентов среды культивирования определяет в известной мере значения таких важных биофизических параметров, как pH, активность воды, осмотическое давление. Температура, аэрация и давление определяются условиями культивирования. Другой важный параметр — окислительно-восстановительный потенциал зависит как от состава ростовой среды, так и от условий культивирования. Все эти факторы влияют на скорость роста, выход биомассы, метаболизм и химический состав бактерий. Контроль щелочно-кислотных условий, температуры и аэрации является критическим для любой бактериальной культуры; контроль окислительно-восстановительного потенциала особенно важен при культивировании облигатно-анаэробных бактерий.

pH

pH служит показателем активности ионов водорода (Н+). В разбавленных растворах коэффициент активности очень близок к 1, и поэтому активность Н+ практически равна концентрации. В таком случае рН^—lg[H+] Шкала pH начинается от 0([Н+] = 1 М) и заканчивается 14-ю ([Н+] = 10-14 М). Хотя некоторые бактерии растут при pH 1,0, а другие при pH 11, многие виды растут в относительно узком интервале pH, а большинство из них — при значениях pH, близких к 7,0.

Измерение

Для точного определения pH пользуются рН-метром со стеклянным электродом. В разд 16 2.1 приведено описание водородного электрода, методов, используемых для калибровки pH-метров, и способов обращения с Электродами. В работе Манро [9] можно найти детальное описание измерения и контроля pH. Когда необхо-

димо точное измерение pH, следует придерживаться следующих правил.

Доводить температуру буфера, используемого для калибровки pH-метра, до температуры измеряемой пробы, поскольку pH буфера зависит от температуры. Так, pH стандартного фосфатного буфера равен 6,98 при О °C, 6,88 при 20 °C и 6,84 при 37 °C. Значения pH стандартных буферов при различных температурах приведены в «Справочнике по химии и физике» [16].

Если проба во время измерения перемешивается на магнитной мешалке, то таким же путем нужно перемешивать стандартный буфер.

Определять pH сред после стерилизации. Автоклавирование сред часто приводит к заметным сдвигам pH. Значительный сдвиг pH может происходить даже после стерилизации фильтрованием.

Проверять pH среды перед использованием.

Поскольку некоторые pH-электроды дают неточные результаты при работе с трис-буфером, необходимо прежде всего убедиться в том, что электроды пригодны для работы с этим буфером.

В тех случаях, когда нет необходимости в высокой точности измерений, например при работе с обычными средами, pH определяют с помощью раствора индикаторного красителя или индикаторной бумаги. При пра-

Таблица 6.1. pH-индикаторы и диапазоны pH, в которых они используются

Индикатор

Диапазон РН

Цвет

кислая среда

щелочная среда

Тимоловый голубой

8,0—9,6

Желтый

Голубой

Феноловый красный

6,8—8,4

»

Красный

Бромтимоловый синий

6,0—7,6

»

Голубой

Бромкрезоловый фиоле-

товый

5,2—6,8

»

Фиолетовый

Метиловый красный

4,4—6,0

Красный

Бромкрезоловый зеленый

3,8—5,4

»

Голубой

Бромфеноловый синий

3,0—4,6

»

Используют 0,04%-ный раствор, для этого 0,1 г индикатора растворяют в минимальном (10—30 мл) объеме 0,01 и NaOH и добавляют воды до 250 мл

аильном их подборе pH можно измерить с точностью до 0,2 единицы. Индикаторные растворы и бумаги, а также их соответствующие стандартные образцы определенного цвета для различных интервалов pH поставляются большинством фирм, производящих реактивы и научное оборудование. В табл. 6.1 приведены наиболее часто употребляемые pH-индикаторы и диапазоны pH, в которых они используются.

Некоторые pH-индикаторы часто добавляют к среде культивирования с целью выявить изменение pH в процессе роста бактерий. Для этого нужно подобрать соответствующий задаче pH-индикатор и убедиться, что он не подавляет рост микроорганизма. Все рН-индикаторы плохо растворимы в воде и используются в средах в очень низких концентрациях (менее 0,01%).

Буферы

Многие бактерии используют или приводят к накоплению в растворах значительных количеств кислых или щелочных ионов. Хотя образование кислоты и ее потребление сбалансированы, в процессе роста могут происходить значительные изменения pH среды. Грубо pH культуры поддерживают с помощью добавляемых к среде буферов, т. е. веществ, препятствующих сдвигам значений pH. Тонкий контроль за щелочно-кислотными условиями достигается при автоматической подаче в среду культивирования кислоты или щелочи.

Буферы обычно представляют собой смеси слабых кислот и оснований. В комплексных средах буферным действием обладают кислые и основные группы таких органических молекул, как белки, пептиды и аминокислоты. Из-за присутствия различных веществ среды могут обладать буферным действием в широком интервале pH. Однако буферная емкость при любом заданном значении pH широко варьирует в зависимости от типа присутствующих в растворе органических молекул и их концентрации.

Для культивирования многих бактерий необходимо применять забуференные среды. При выборе соответствующего буфера исходят из: 1) подходящего значения pH буфера, 2) возможного ингибирующего или токси-

ческого действия буфера, 3) возможной утилизации компонентов буфера бактериальной культурой, 4) возможного связывания буфером двух- и трехвалентных металлов.

Буферы со слабыми кислотными и основными свойствами наиболее эффективны вблизи значений pH, при которых они диссоциируют на 50%. Эта величина pH соответствует p/G (отрицательный логарифм константы диссоциации) кислоты или основания. Эффективный диапазон буфера отличается от величины рКа не более чем на одну единицу pH. В табл. 6.2 приведен ряд соединений, которые используются в качестве буферов в ростовой среде, а также их наиболее пригодные значения рКа при 25°C. Обратите внимание, что соли лимонной, фталевой и янтарной кислот обладают буферной емкостью в широком интервале значений pH, поскольку соответствующие им кислоты содержат более одного диссоциируемого иона водорода. Буферы, содержащие перечисленные в таблице вещества, обычно готовят согласно одной из следующих методик.

Сначала готовят раствор кислоты или основания в концентрации, вдвое превышающей необходимую, титруют его NaOH или НС1 на pH-метре до необходимого значения pH и затем доводят раствор до конечного объема. Например, для приготовления 1 л 0,1 М трис- HCl-буфера с pH 7,6 титруют 500 мл 0,2 М раствора триса с помощью НС1 до pH 7,6 и затем доводят раствор до 1 л. Разведение почти не влияет на конечную Таблица 6.2. Значения рКа соединений, используемых в буферах

Соединение

Пригодные значения рК0 при 25 °C

Лимонная кислота

3,134,766,39

Фталевая кислота

2,895,51

Барбитуровая кислота

4,01

Щавелевая кислота

4,19

Янтарная кислота

4,165,61

Уксусная кислота

4,75

Одноосновный фосфат

7,21

Трнс

8,08

Борная кислота

9,24

Глицин

9,87

величину pH. Если же это влияние, хотя и очень незначительное, все-таки существует, проводят окончательную коррекцию pH перед добавлением последних нескольких миллилитров воды во время разведения раствора.

Готовят эквимолярные концентрации кислых и основных компонентов системы и смешивают два раствора в соответствующих пропорциях, так чтобы установился необходимый pH. Один раствор титруют другим на pH-метре, используя магнитную мешалку. Если требуемое значение pH близко к рК, то соотношение между кислым и основным растворами равно примерно 1 : 1. Если pH на одну единицу выше р/С, то это отношение составляет 1 : 10; при величине pH ниже рК на одну единицу оно равно 10: 1. Например, для приготовления 100 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера, pH 7,0, смешивают примерно в равных пропорциях растворы 0,1 М NaH2PO4 (одноосновного) и 0,1 М Na2HPO4 (двухосновного), а затем добавляют избыток одного из этих растворов и, контролируя процесс с помощью рН-мет- ра, доводят pH до 7,0. Для приготовления приблизительно 100 мл фосфатного буфера, pH 6,0, титруют 95 мл одноосновного раствора двухосновным.

Для бактериальных ростовых сред наиболее широко используются фосфатный, трис-солянокислый, цитратный и ацетатный буферы. Эти четыре буферные системы охватывают практически весь интервал значений pH, в котором могут расти бактерии. В табл. 6,3 приведены смеси, используемые для приготовления буферов, а также соотношения компонентов для получения данного pH смеси. Как упоминалось выше, pH любого буфера зависит от температуры. Таблицы для приготовления других смесей, обладающих буферным действием при различных температурах, приведены во многих руководствах [2, 3, 9, 16].

При инкубации культур в атмосфере, обогащенной СО2, как правило, используют буфер, содержащий угольную кислоту и бикарбонат. Концентрация в среде угольной кислоты (Н2СО3) прямо зависит от парциального давления СО2 в атмосфере. Согласно уравнению Гендерсона—Хассельбаха для этой системы

нсо.-

pH = pK'+lg -со2 •

Таблица 6.3. Приготовление буферов, часто используемых в бактериологических средах"

pH

Величина х, используемая в прописях буферов

ацетатный буфер

цитрат-фосфатный буфер

фосфатный буфер

трис-НО- буфер °

4,0

41,0

30,7

4,2

36,8

29,4

—

4,4

30,5

27,8

-—

4,6

25,5

26,7

4,8

20,0

25,2

—

5,0

14,8

24,3

5,2

10,5

23,3

-—

5,4

8,8

22,2

5,6

4,8

21,0

5,8

—.

19,7

46,0

6,0

—.

17,9

43,85

6,2

—.

16,9

40,75

—

6,4

—

15,4

36,75

6,6

13,6

31,25

6,8

—

9,1

25,5

7,0

——

6,5

19,5

7,2

—

—

14,0

44,2

7,4

—

9,5

41,4

7,6

6,5

38,4

7,8

—

—

4,25

32,5

8,0

2,65

26,8

8,2

—

—

21,9

8,4

—

—

—.

16,5

8,6

—

—

12,2

8,8

—

—

—.

8,1

9,0

—

—

—•

5,1

“ Данные из работы [3]

х мл 0,2 М уксусной кислоты+(50—х) мл 0,2 М ацетата натрия, довести водой до 100 мл.

8 х мл 0,1 М лимонной кислоты+(50—х) мл 0,2 М Ыа2НРО4, довести водой до 100 мл

г х мл 0,2 М NaH2PO4+(50—х) мл 0,2 М Na2HPO4, довести водой до 100 мл.

"50 мл 0,2 М триса гХ мл 0,2 М HCI, довести водой до 100 мл.

величина рК' при 20 °C составляет около 6,4. Отсюда молярное соотношение между СО2 и бикарбонатом (НСО3-) равно ~1 :1 при этом значении pH, а СО2-би- карбонатный буфер эффективен в диапазоне pH 5,4—8,0. Если pH среды ниже 5,0, то в ней практически отсутст-

Таблица 6.4. Растворимость СО2 в воде и величины рД' угольной кислоты при разных температурах11

Температура, °C

Раствори-^ мость СО2 и

РК'

Температура, °C

Растворимость СО2

РК’

20

0,876

6,392

35

0,592

6,328

25

0,759

6,365

40

0,530

6,312

30

0,665

6,348

° Данные Умбрейта и др. [35].

Миллилитры СОг на 1 мл воды при давлении 1 атм.

вует бикарбонат, и увеличение концентрации СО2 в атмосфере будет приводить к снижению pH за счет образования угольной кислоты. При концентрации СО2 в атмосфере от 50 до 100% среда должна быть очень щелочной для поддержания уровня pH, близкого к нейтральному. Однако следует помнить, что присутствие в среде солей в высоких концентрациях может оказаться токсичным для бактерий.

После соответствующего преобразования уравнение Гендерсона — Хассельбаха можно использовать для определения количества бикарбоната, добавляемого в среду в качестве буфера при данном значении pH и различном содержании СО2 в атмосфере. Для расчетов используют уравнение

lg (HCOS-) = pH - р^ + 1g Р (a) (%COg) (5,87-10-’),

где Р— атмосферное давление в мм рт. ст., а — растворимость СО2 (в мл) в 1 мл воды, а %СО2— процентное содержание СО2 в атмосфере. Если атмосферное давление равно 720—760 мм рт. ст. (примерно 96,0— 101,3 кПа), то его колебания оказывают незначительное влияние. Поэтому в большинстве случаев можно использовать следующее упрощенное уравнение:

lg (НСО3-) = pH - рК' + 1g а (%со2) (4,35-10-»).

Величины а и рК' для различных температур приведены в табл. 6.4. Подробности использования карбонатных буферов можно найти в работе Умбрейта и др. [35].

Обычные буферы не могут стабилизировать значения pH сред, используемых для выращивания бактерий, об-

Часть и. рост

разующих большое количество кислоты (например, молочнокислых). В этом случае кислоту следует максимально быстро нейтрализовывать, добавляя к среде тщательно измельченный мел (СаСО3). При добавлении порошкообразного мела (0,3%) к агару в чашках удобно наблюдать за образованием кислоты растущими колониями. Однако в этом случае необходимо убедиться, что мел был хорошо суспендирован в агаре при его разливе по чашкам. Колонии, образующие кислоту, формируют вокруг себя зоны просветления. Кислоту можно также удалить в системе культивирования с диализом (разд. 10.3.4).

Постоянный контроль

В тех случаях, когда pH культуры необходимо поддерживать в узком интервале, используют систему автоматического поддержания значений pH. Такая система должна включать pH-метр, стерилизуемые паром рН- электроды, устройство для поддержания заданного pH и насосы для добавления кислоты или щелочи. Большинство систем обычно оснащено самописцем, обеспечивающим постоянную регистрацию pH. Автоматические системы выпускает ряд фирм: New Brunswick Scientific Со., New Brunswick, N. J.; The Vir Tis Co., Inc., Gardiner, N. Y.; Cole-Palmer Instrument Co., Chicago, Ill.). Имеются в продаже также стерилизуемые паром рН-электро- ды в различных наборах (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, Calif.; Ingold Electrodes, Lexington, Mass.; Leeds and Northrup, North Wales, Pa.).

Точность системы pH-контроля следует достаточно регулярно проверять с помощью отдельного рН-метра. При этом могут возникнуть следующие проблемы: 1) неправильное или недостаточное заземление системы; 2) старение стеклянных pH-электродов при их стерилизации паром; 3) загрязнение мембраны электрода сравнения компонентами среды и продуктами бактериального метаболизма в процессе длительной работы. Наиболее часто мембрана загрязняется белками и сульфидом серебра, который образуется в результате реакции хлористого серебра в электроде сравнения с содержащими серу компонентами среды. Белки удаляют выдержива-

нием электродов в растворе протеазы (например, проназы), а сульфид серебра — обработкой электродов кислым раствором тиомочевины.

АКТИВНОСТЬ ВОДЫИ ОСМОТИЧЕСКОЕ ДАВЛЕНИЕ

Вода необходима клеткам для их метаболизма и роста. Однако просто присутствие воды еще не означает, что она доступна для клетки. Доступность воды определяется ее активностью в среде (аш). Величина aw отражает лишь доступную часть всех молекул воды и численно равна отношению давления водяных паров над раствором к давлению паров над чистой водой (р/ро). Это отношение, выраженное в долях единицы, численно равно относительной влажности атмосферы над средой в состоянии равновесия (выражаемой обычно в процентах) [10—12, 14]. Колебания температуры в пределах, обеспечивающих рост бактерий, влияют на величину aw незначительно.

Величина aw и истинная осмоляльность среды связаны соотношением

аш= 55,51 /(um^-f- 55,51), где у— число ионов, образуемых на одну молекулу раствора, m — моляльность жидкости и Ф — моляльный осмотический коэффициент. Один килограмм воды содержит 55,51 молей.

Осмотическое давление раствора (л), выраженное в атмосферах, зависит от концентрации раствора:

от ф RT

где п — число молей, присутствующих в растворе, R— газовая постоянная (0,0821 л-атм-моль-1 -град1-), Т— абсолютная температура (°С + 273°С), V' — объем растворителя.

Соотношение между л и а™ имеет вид RT , л=—=—lnaw,

где V— объем 1 моля воды. Подробности, касающиеся приведенных уравнений, можно найти в работах [10, 12, 14].

Минимальное значение aw, при котором бактерии способны расти, значительно варьирует, однако для большинства видов оно превышает 0,99. Некоторые га- лофильные бактерии нуждаются в ионах натрия и лучше всего растут в присутствии высоких концентраций хлористого натрия (аш«0,80). Колебания величины аш могут оказывать влияние на скорость роста бактерий, их состав и метаболическую активность. Многие растворенные вещества оказывают выраженное специфическое действие при концентрациях, ниже необходимых для лимитирования доступности воды. Поэтому определение лимитирующих значений aw следует проводить в средах, содержащих по возможности различные связывающие воду вещества. Обзоры работ по влиянию aw на рост бактерий можно найти в литературе [12, 14, 32].

Предложен ряд методов измерения активности воды с помощью специальных приборов: вибратора Брэди (Thunder Scientific Со., Albuquerque, N. М.), индикатора относительной влажности, модель 400 (General Easter Corp., Watertown, Mass.), гигрометра (Hygrodyna- mics, Silver Spring, Md.) и синаскопа (Sina Ltd., Zurich, Switzerland). В США эти приборы продает фирма Beckman Instruments, Inc., Cedar Grove, N, J. Достоинства и недостатки приборов обсуждаются в работах [И, 14].

Данные сравнительного изучения [27] методов определения aw свидетельствуют о значительной вариабельности результатов, получаемых с помощью различных методов, причем достоверность цифр после второго десятичного знака весьма сомнительна. Статистический анализ измерений, проведенных на электронном синас- копе (в пределах aw 0,755—0,967), показал разброс меньше ±0,01 [34].

Наиболее широко используемые приборы для определения осмотического давления основаны на измерении снижения давления пара (Wescan Instruments, Santa Clara, Calif.) или точки замерзания (Advanced Instruments, Needham Height, Mass.). На других приборах измеряют осмотическое давление, возникающее по обе стороны от полупроницаемой мембраны (Schleicher and Schuell Со., Keene, N. H.). Несмотря на то что часть приборов уже откалибрована для прямой регистрации, следует одновременно с пробами использовать стандартные

растворы. Имеются приборы для измерения различных интервалов осмотического давления в пределах 0—4 осмолей (моляльность идеального раствора, характеризуемого теми же величинами aw и осмотического давления, что и исследуемая проба).

Лучший способ стандартизации аш и осмотического давления бактериологических сред заключается в добавлении таких компонентов, как хлористый натрий, хлористый калий, сульфат натрия или смесей этих солей. Скотт [32] подробно описывает методы расчета aw питательных сред и концентраций солей, необходимых для получения заданных значений 0^.

Связь между осмотическим давлением, проницаемостью и транспортными системами бактерий обсуждается в гл. 19.

ТЕМПЕРАТУРА

Температура инкубации значительно влияет на интенсивность роста бактерий, поскольку она воздействует на скорость всех клеточных реакций. Кроме того, температура может влиять на характер метаболизма клеток, их потребности в питательных веществах и состав.

У большинства бактерий зависимость скорости роста от температуры сходна с зависимостью, представленной на рис. 6.1, А Полезная область температуры, близкая к оптимальной, обычно довольно узка, а максимальная температура роста нередко лишь на несколько градусов (от 3 до 5 °C) выше оптимальной. Вместе с тем минимальная температура роста может быть на 20— 40°C ниже оптимальной. Чтобы рост бактерий был заметен при минимальной температуре, их следует инкубировать довольно долго. Например, по данным Ингрэма [26], чтобы добиться удвоения клеток Е. coll при температуре 8 °C, эти бактерии необходимо выращивать 41 ч, а при оптимальной температуре для этого достаточно 21 мин.

Ниже оптимума изменения скорости роста бактерий сравнимы с температурной зависимостью химических реакций только в небольшом интервале температур. Так, если мы отложим на графике (рис. 6.1,5) логарифм скорости роста против обратных величин абсолют-

Рис. 6.1. Влияние температуры на скорость роста Е. colt при линейной (Л) и логарифмической (5) шкале ординат (кривая Аррениуса) [26].

ной температуры (зависимость Аррениуса), то линейная зависимость наблюдается лишь в ограниченном интервале температур [10, 26, 31]. У большинства бактерий температурный коэффициент Q10 скорости роста в этом интервале близок к 2; иными словами, при увеличении температуры на 10 °C скорость роста удваивается. В границах оптимальной температуры роста кривая Аррениуса для скорости роста почти горизонтальна, но при температурах, близких к максимальной и минимальной, она приобретает почти вертикальный наклон.

В целом при температурах роста несколько выше максимальных бактерии не только замедляют свой рост, но и быстро гибнут. Поэтому инкубация бактериальной культуры при температурах выше оптимальной требует точного температурного контроля. Для большей безопасности культуру лучше инкубировать ниже ее температурного оптимума, в пределах колебаний заданной температуры термостата.

В обычных воздушных термостатах конвекционного типа колебания температуры достигают нескольких градусов Цельсия и даже больше при частом открывании дверцы. Даже у термостатов с водяной рубашкой и, следовательно, с более постоянной температурой колебания

в 1 °C не столь уж редки. Для точного температурного контроля пользуются перемешиванием воды в банях; в этом случае температурные колебания составляют сотые доли градуса. Для точного измерения влияния температуры на скорость роста бактерий необходима инкубация в таких банях.

При осуществлении температурного контроля на практике придерживаются следующих правил.

Во время инкубации измеряют температуру в различных частях термостата термометрами, помещенными в колбы или пробирки с водой.

Поскольку температура и влажность воздушных термостатов значительно варьируют, для усиления воздушных конвекционных токов пользуются феном. Культуру в термостате располагают таким образом, чтобы она ни в коем случае не попала в «мертвое» воздушное пространство. Термостат открывают только в случае крайней необходимости.

В ответственных экспериментах при изучении температурной зависимости следят за охлаждением поверхности среды при ее испарении и поэтому там, где это возможно, пользуются посудой с хорошо пригнанными пробками. Если необходима постоянная циркуляция воздуха, например для аэробных бактерий, пользуются термостатами, которые обеспечивают высокую относительную влажность. Это особенно важно при высоких температурах инкубации.

Для высокотемпературных термостатов пользуются в качестве рабочей жидкости 50%-ным полиэтиленгликолем или легким силиконовым маслом.

Для получения температурной зависимости роста бактерий измеряют скорости роста при нескольких тщательно контролируемых температурах и располагают данные, как показано на рис. 6.1. Если в целом форма кривой значительно отличается от нормального распределения, еще раз более тщательно проверяют экспериментальные точки.

Ряд термостатов с температурными градиентами описан в обзоре Пэтчинга и Роуза [31]. Эти термостаты позволяют контролировать рост бактерий в более широких температурных интервалах и содержат устройства для аэрации культур микроорганизмов с различными

потребностями в кислороде. Такие термостаты с температурными градиентами нужны при измерении некоторых параметров роста. Пока этих термостатов нет в продаже, но их можно легко изготовить в мастерских.

ДАВЛЕНИЕ

Высокое гидростатическое давление оказывает неблагоприятное влияние на рост и выживание бактерий. Хотя в интервале давлений 1—100 атм большинство видов бактерий малочувствительно к нему, при этом давлении не удается выделить чистую культуру обли- гатно-барофильных бактерий [8]. Исследования культур в условиях высоких давлений весьма ограничены, и мы не будем здесь останавливаться на соответствующих методах. Маркиз {8] предложил некоторые методические приемы выращивания культуры при высоком давлении. Тэйлор и Янах [33] разрешили одну из основных проблем в данной области: они сконструировали аппарат, который позволяет в условиях высокого давления вносить в культуру добавки и отбирать пробы, не вызывая при этом перепадов давления.

КИСЛОРОД

Аэробные и факультативно-анаэробные бактерии утилизируют растворенный кислород, и поэтому их рост и метаболизм зависят от концентрации кислорода в растворе. Растворенный кислород является таким же питательным компонентом, как глюкоза или аммоний, однако в отличие от большинства подобных компонентов он довольно плохо растворим (<10 мг/л). Поэтому для бактерий, выращиваемых в жидких средах, кислород может быстро стать лимитирующим фактором, если не принимаются специальные меры, обеспечивающие его постоянную подачу и растворение в среде во время роста бактерий.

Отметим следующие основные факторы, на которые следует обратить внимание при аэрации жидкой культуры.

Доступность кислорода на границе раздела фаз питательная среда — газ. Сосуд с культурой следует за-

крывать пробкой или крышкой из пористого материала, так чтобы обеспечивался максимальный газообмен.

Поддержание большого отношения площади контакта газа с жидкой средой к объему последней. Со стационарными культурами это удается при использовании очень плоских сосудов. Благодаря встряхиванию колб на качалках площадь поверхности среды значительно увеличивается, причем этот эффект еще больше усиливается при создании турбулентных потоков среды за счет углублений в боковой части колб или при помещении в них изогнутой стальной пружины. С увеличением объема перемешиваемой культуры происходит быстрое падение ее насыщения кислородом.

При работе с большими объемами среды (0,5—1 л) обычно продувают через жидкость воздух. В таких культурах эффективность растворения кислорода зависит от числа и минимального размера воздушных пузырьков, а также от длительности контакта между пузырьками и жидкостью. При использовании газовых барботеров с малыми размерами пор получают мелкие пузырьки, однако при этом возникают условия, способствующие образованию пены. Длительность контакта между пузырьками и жидкостью можно увеличить, используя сосуды с большим отношением высоты к диаметру; этот же эффект достигается путем перемешивания культуры или с помощью перегородок в сосудах.

Системы аэрации при культивировании бактерий подробно обсуждаются в гл. 10, а также в работах Пирта [10] и Уэнга и др [15].

Растворенный кислород

Для измерения растворенного кислорода наиболее подходящим способом является полярография с помощью кислородного электрода, принципы и методические приемы которой описаны ниже (разд. 16.2.3). Подробности методов с использованием полярографа для измерения скоростей растворения кислорода в культурах можно найти у Пирта [10], Уэнга и др. '[15] и Хитчмэ- на [4].

Скорость поглощения кислорода

Скорость поглощения кислорода (СПК) выражается в миллимолях на литр в минуту и легко определяется химически по скорости окисления сульфита в сульфат растворенным кислородом в присутствии медного катализатора. Этот метод дает информацию об эффективности системы аэрации, однако истинная СПК в бульонных культурах может значительно отличаться от СПК в водных растворах сульфита натрия. Существует ряд способов измерения СПК в средах как в присутствии биомассы, так и в ее отсутствие [1, 10, 15]. Ниже приводится простой метод измерения СПК по окислению сульфита [23].

Вместо ростовой среды используют соответствующий объем раствора сульфита натрия, содержащего 0,001 М сульфата меди, с той же степенью аэрации и при той же температуре, которые характерны для изучаемой среды. Концентрация сульфита натрия в каждом случае зависит от условий аэрации (см. ниже).

В различные интервалы времени после начала аэрации вносят дважды по 5 мл раствора сульфита в пробирки размером 2,5X25 см, содержащие небольшие кусочки сухого льда. Выделяющийся СО2 перемешивает образец во время титрования и, покрывая его, препятствует дальнейшему окислению. Если образец замерзает, подогрейте его перед окончанием титрования.

Добавляют несколько капель крахмального раствора и титруют раствор сульфита до постоянного голубого окрашивания свежеприготовленным раствором иода, который калиброван по стандартному раствору тиосульфата натрия. Нормальность раствора иода должна составлять около Vs нормальности раствора сульфита.

СПК рассчитывают следующим образом:

Разность по результатам титрования (мл) хXНормальность раствора иода

ющие данной эффективности аэрации. Например, если СПК составляет около 3, то использование 0,15 н. раствора иода приводит к разности по результатам титрования около 4 мл за 10 мин. Начальная концентрация сульфита натрия должна быть в пять раз больше концентрации иода, т. е. 0,75 н.

АНАЭРОБИОЗ

Иногда трудно провести четкую границу между аэробными и анаэробными условиями. Существуют бактерии, растущие как в присутствии кислорода, так и в его отсутствие (факультативные формы) или предпочитающие среды с низким напряжением кислорода (микро- аэрофилы). Spirillum volutans являются облигатными микроаэрофилами, поскольку для инициации роста они требуют присутствия кислорода в низких концентрациях (~от 3 до 9% Os). Методы культивирования микроаэ- рофильных бактерий приведены в разд. 9.3.1.

Хотя облигатными анаэробами обычно считают бактерии, рост которых невозможен в присутствии растворенного кислорода, на практике к анаэробным относят те бактерии, которые не растут на поверхности (или около нее) твердой или полужидкой среды на воздухе при атмосферном давлении. Аэротолерантные анаэробные бактерии хорошо растут на поверхности агара в чашках при низком, но ощутимом уровне кислорода в атмосфере [24], тогда как более строгие анаэробные бактерии почти немедленно гибнут в такой атмосфере. При удалении кислорода предварительным кипячением среды или его замещении инертным газом условия, необходимые для роста строгих анаэробов, не достигаются.

Окислительно-восстановительный (или редокс) потенциал (Eh) позволяет наиболее удобно измерять степень анаэробиоза [6]. Иными словами, Eh — это мера способности раствора отдавать или принимать электроны, т. е. окисляться или восстанавливаться. Eh выражают в единицах разности электрического потенциала, т. е. в вольтах: чем более положительна эта величина, тем выше концентрация окислителя по отношению к восстановителю в растворе, и наоборот. Способность

среды противодействовать изменениям Eh аналогична буферным свойствам растворов.

Обычно в средах, используемых в лаборатории, за увеличение Eh в основном ответствен кислород; при высоких положительных значениях Eh, обусловленных присутствием растворенного кислорода, подавляется рост всех анаэробных бактерий. В то же время положительные значения Eh, обусловленные присутствием в среде других веществ, могут не препятствовать росту даже строгих анаэробов [30, 36]. Устойчивость к Eh разных анаэробных бактерий различна. Однако в стандартной среде рост большинства анаэробных бактерий подавляется при величинах Eh выше —100 мВ. Некоторые из них не растут при потенциале выше —330 мВ; теоретическая концентрация кислорода при этом значении Eh составляет 1,48-10~56 молекул на 1 л {6]. Даже при потенциале —140 мВ концентрация кислорода составляет только 1,5-10й молекул на 1 л [10], т. е. менее 1 молекулы кислорода на клетку для многих бактериальных культур. Это показывает, что для выращивания строгих анаэробов важно создание более восстановительных условий, чем те, которые обеспечиваются простым удалением кислорода из культуральной среды.

Измерение Eh

Eh раствора наиболее точно можно измерить электрометрически. Подробно способы измерения и необходимые при этом предосторожности описаны в обзоре Джекоба [7]. Рассмотренные в нем методики приемлемы для бактериологов общего профиля.

Чтобы найти Eh сред и культур, особенно для анаэробных бактерий, широко используют окислительно-восстановительные красители. Эти красители обратимо окисляются и восстанавливаются, причем в окисленном состоянии они окрашены, а в восстановленном — бесцветны. Разные красители восстанавливаются при различных значениях Eh. Величина Eh, при которой краситель окислен или восстановлен на 50% при pH 7,0, называется стандартным окислительно-восстановительным потенциалом (Ео').

Таблица 6.5. Стандартные окислительно-восстановительные потенциалы красителей при pH 7,0 и 30°С“

Краситель

Е'о, мВ

Краситель

Е'о, мВ

Метиленовый синий

11

Индигодисульфонат

—125

Толуидиновый синий Индиготетрасульфо-

—11

Индигомоносульфонат

1,5-антрахинонсуль-

—160

нат

—46

фат

—200

Резоруфин6

—51

Феносафранин

—252

Индиготрисульфонат

-81

Бензилвиологен

—359

° Данные из работы Джекоба [7], где можно найти более полный не- речень красителем.

б ГТ

Продукт первого этапа восстановления ресазурнна.

В табл. 6.5 перечислены некоторые наиболее распространенные красители и их стандартные окислительновосстановительные потенциалы. Весь диапазон Eh от полного окисления до полного восстановления, который охватывается окислительно-восстановительным красителем, составляет около 120 мВ при постоянном значении pH. К примеру, метиленовый синий (Ео'=11 мВ при pH 7,0) почти полностью окислен (окрашенный) при Eh = 71 мВ и почти полностью восстановлен (бесцветный) при Eh =—49 мВ [7].

Окислительно-восстановительный потенциал красителей зависит от pH. Например, метиленовый синий при значениях pH 5,0, 7,0 и 9,0 восстановлен на 50% при Eh, равном соответственно 101,11 и —50 мВ [8]. Точная зависимость Ео' от величины pH связана с видом красителя. Для большинства красителей Ео' увеличивается от 30 до 60 мВ при падении pH на единицу, и наоборот.

Для определенных бактерий некоторые окислительно-восстановительные красители токсичны даже в очень низких концентрациях. За исключением случаев, когда известно, что данный краситель нетоксичен, при использовании красителей ставят соответствующие контроли. При этом краситель вносят в максимально низкой концентрации, так как он может изменить Eh той среды, в которой окислительно-восстановительный потенциал слабо забуферен [7]

Многие анаэробные бактерии могут быстро снижать Eh среды; их способность к росту в среде зависит от физиологического состояния и количества инокулята. Задержка роста после инокуляции наблюдается до тех пор, пока клетки не снизят потенциал до уровня, при котором они могут расти. За снижением потенциалу лучше всего следить, включив в среду нетоксичный индикатор Eh. Для этой цели широко используется ресазу- рин в концентрации от 0,1 до 0,2 мг на 100 мл. Индикатор вначале подвергается необратимому восстановлению в резоруфин, который окрашивается в розовый цвет при нейтральных значениях pH. Ео' резоруфина равен —51 мВ при pH 7,0; при Eh около —110 мВ резоруфин обесцвечивается [7].

Когда необходимы очень строгие анаэробные условия, в среду можно добавить феносафранин (Ео' = = 252 мВ) после предварительной проверки его токсичности. Цитрат титана(III) является как восстановителем (Ео' =—450 мВ), так и индикатором Eh [37]. При полном окислении он обесцвечивается. Его использование будет описано ниже вместе с другими восстанавливающими агентами.

Восстанавливающие агенты

Восстанавливающие агенты добавляют в большинство сред, предназначенных для культивирования анаэробов, чтобы снизить окислительно-восстановительный потенциал и сбалансировать его на оптимальном уровне. Помимо того что эти вещества должны быть нетоксичными в используемых концентрациях, они должны приводить к такому снижению потенциала, которое было бы приемлемым для исследуемых организмов. Восстанавливающие агенты, особенно широко используемые при культивировании анаэробов, перечислены в табл. 6.6. Все приведенные в ней соединения имеют Ео' достаточно низкий, чтобы полностью восстановить ресазурин, однако для выращивания строгих анаэробов следует использовать только те агенты, для которых Ео'< < —300 мВ.

Восстанавливающий агент сохраняет максимальную эффективность, если основной раствор, лишенный кис-

Таблица 6.6. Восстанавливающие агенты, применяемые при культивировании анаэробов

Соединения

Ей, мВ

Концентрация в ереде

Тиогликолат натрия

<—100

0,05%

Цистеин -НС1О

—210 [22]

0,025%

Дитиотрейтол"

На+Хлористый палладий [18]

—330 [22]

—420

0,05%

Титан(III)-цитрат6 [37]

—480

0,5—2 мМ

Na2S-9H2O° (или H2S)

Цистеин • НС1 + Na2S • ЭНгО”

—571 [6]

0,025% 0,025%+0,025%

° Основные растворы автоклавируют и хранят в атмосфере, лишенной кислорода.

К 50 мл 0,2 М цитрата натрия добавляют 5 мл 15%-ного раствора трихлорида титана и нейтрализуют насыщенным раствором бикарбоната натрия. После стерилизации фильтрованием добавляют 30 мл этой смеси к 1 л стерильной среды, не содержащей кислорода. Комплекс титаи(П1)-цитрат при восстаиовлеиии окрашивается в светло-фиолетовый цвет, а при окислении обесцвечивается.

лорода, стерилизуют и хранят в атмосфере инертного газа (методы приготовления восстановленных сред приведены ниже). К среде восстанавливающий агент добавляют в необходимой концентрации непосредственно перед опытом.

Для снижения Eh среды при последующем культивировании анаэробных бактерий можно использовать также факультативно-аэробные бактерии. Так, выращивание в среде клеток Е. coll перед инокуляцией анаэроба приводит к удалению всего остаточного кислорода и снижению Eh до уровня, который наблюдается в условиях полной защиты культуры от кислорода. Перед инокуляцией анаэроба клетки Е. colt можно убить нагреванием. Это необходимо для того, чтобы была уверенность, что используемые факультативные микроорганизмы не влияют на рост анаэробов ни в результате конкуренции за питательные вещества, ни путем выделения токсичных продуктов.

Методы культивирования нестрогих анаэробов

Методы приготовления сред для культивирования и пересева нестрогих анаэробных бактерий, включая

большинство клостридиев, довольно просты [13]. Все операции можно проводить в обычной атмосфере при условии соблюдения некоторых предосторожностей для того, чтобы избежать длительного контакта бактерий и среды с кислородом. Для выращивания нестрогих анаэробов существуют следующие приемы.

Среду готовят в сосудах, где отношение поверхности среды к ее объему достаточно мало.

Для длительной инкубации анаэробов, не образующих газы, например фотосинтезирующих бактерий, наиболее подходящими являются бутыли и сосуды, доверху заполненные свежепрокипяченной средой и закрытые завинчивающимися крышками.

Готовят полужидкую среду, добавляя к жидкой среде 0,05—0,1% агара. Полужидкая среда способствует уменьшению конвекционных потоков.

На поверхность инокулированной среды наслаивают толстый слой васпара (50% вазелина — 50% парафина).

Среду автоклавируют сразу же после смешивания компонентов с восстанавливающим агентом.

Среды долго не хранят. Их нельзя хранить в холодильнике, поскольку по мере понижения температуры растворимость кислорода растет.

Для контроля за степенью окисленности среды к ней добавляют ресазурин (0,1 мг на 100 мл). Если верхняя треть среды окрашивается непосредственно перед употреблением, ее кипятят и охлаждают перед инокуляцией.

Используют по возможности большие объемы инокулята.

Культуры разводят в пробирках с ростовой средой или в свежеавтоклавированном растворе, содержащем восстанавливающий агент.

Некоторые аэротолерантные анаэробы (например, Clostridium, perfringens) можно развести в чашке Петри, нанести на поверхность свежей агаровой среды, содержащей восстанавливающий агент, и поместить чашку в камеру, лишенную кислорода. Однако клетки ряда других анаэробов чувствительны даже к кратковременному контакту с воздухом.

И. Чашки Петри со свежеприготовленными средами, инокулированными аэротолерантными анаэробами или спорами анаэробов, инкубируют в анаэробных условиях. Для этого можно использовать одну из следующих систем.

Вакуумный эксикатор. Его используют только для аэротолерантных анаэробов. Трижды откачивают воздух, пока давление не упадет до 500 мм рт. ст., и заполняют эксикатор инертным газом, например азотом, водородом или их смесью с примесью 5—10% СО2 (некоторые анаэробы нуждаются в СО2).

Сосуды для анаэробов (анаэростаты) с катализатором. Наиболее часто используют сосуд системы Torbal, модель А-3 (The Torsion Balance Со, Clayton, N. J.). Из него откачивают воздух, как описано выше, и трижды заполняют водородом или газовой смесью с большим содержанием водорода. Чтобы проверить, активен ли катализатор, его подставляют под струю Н2: активный катализатор сильно разогревается уже через 1 мин. Реактивируют катализатор нагреванием до 160 °C в течение 1 ч.

Пакеты или сосуды с генераторами Н2 + СО2. Наиболее часто используют систему Gas Рак (BBL Microbiology Systems, Cockeysville, Md.), не требующую откачки воздуха. После активации газогенераторного элемента водой пакет быстро закрывают и следят в течение 30 мин за конденсацией воды. В прозрачные пакеты или сосуды можно поместить полоски индикатора (метиленовый синий) и наблюдать за их обесцвечиванием. Катализатор проверяют и реактивируют, как описано выше.

Метод Хангейтакультивирования строгих анаэробов

Многие анаэробы, находящиеся в кишечнике, рубце или в других природных анаэробных условиях, растут только при очень низком окислительно-восстановительном потенциале. Поэтому необходимо защищать среды и клетки даже от кратковременного контакта с кислородом. Как это делают на практике, мы рассмотрим в данном и следующем разделах книги на двух примерах.

Для выделения и сохранения чистых культур строгих

анаэробов Хангейт [25] предложил метод вращающихся пробирок. Вскоре появилось много модификаций его метода. Основным преимуществом этого метода является то, что для работы требуется минимум специальной аппаратуры, а для культивирования специфических групп, например метанобразующих бактерий [17], может быть создана любая атмосфера. Подробное описание различных модификаций метода можно найти в ряде статей [6, 17, 28, 29]. В книге «Anaerobe laboratory manual» [15], опубликованной Виргинским политехническим институтом совместно с Университетом штата Виргиния, приведены модификации методов ускоренной работы с большим числом анаэробных культур. Практически все препараты и оборудование, необходимое для работы с анаэробной системой модели V. Р. I., поставляет фирма Bellco Glass, Inc., Vineland, N. J.

Несмотря на очень подробное описание некоторых модификаций метода Хангейта, им довольно трудно овладеть. Лучше всего посетить для этого лабораторию, где этот метод применяется. Ниже приводятся только основные этапы и наиболее простые приемы, используемые в методе Хангейта.

Удаление кислорода из газов

Из газов, используемых для замещения воздуха, следует удалить кислород с помощью одного из следующих приемов.

Пропускают газ через колонку или сушильную печь, нагретую до 350 °C и содержащую медь [6]. Медь чернеет после ее полного окисления. Для регенерации меди в восстановленную форму ее выдерживают в атмосфере, содержащей не меиее 3% Нг- (Предупреждение: пока в колонке остается примесь О2, не пользуйтесь чистым Н2, так как не исключена опасность взрыва.)

Газ с 3%-ным содержанием Н2 пропускают через очиститель модели Deoxo (Matheson Scientific, Inc., Rutherford, N. J.).

Газ пропускают через специальную склянку с раствором титана (III)-цитрата (см. табл. 6.6). Когда раствор полностью окисляется, т. е. становится бесцветным, его заменяют.

Рис. 6.2. Газовый зонд (канюля), применяемый по методике Хайгейта. В эксперименте используют не менее двух зондов. После сборки зонды автоклавируют, чтобы простерилизовать вату, а затем в пламени горелки стерилизуют иглу. Скорость потока СО2 или другого не содержащего кислород газа (не более 3% Н2) регулируют, направляя его на пламя бунзеновской горелки. Струя газа должна вызывать видимое отклонение пламени. Открытые пробирки или колбы необходимо постоянно продувать газом 1 — заполненный ватой цилиндр шприца типа Luer-Loc емкостью 2 см3; 2 — резиновая трубка с внутренним диаметром 0,63 см; 3 — газ без примесей О2, поступающий из коллектора; 4— 6-дюймовая игла № 18; 5 — спиленный острый конец иглы; 6 — фланец цилиндра шприца.

Приготовлениепредварительно восстановленных сред

В круглодонную колбу помещают устойчивые к нагреванию компоненты среды (за исключением восстанавливающего агента), добавляют предварительно про- стерилизованные кипячением кусочки стекла и осторожно кипятят раствор, пропуская над его поверхностью струю газа, лишенного кислорода. Газ продолжают пропускать и во время остывания среды, и при ее разливе. В зависимости от вида среды и культивируемого анаэроба используют двуокись углерода или аргон с добавленным к ним Нг (3%). Применяют газовый зонд, показанный на рис. 6.2. Когда среду необходимо использовать вскоре после автоклавирования, к ней сразу же добавляют восстанавливающий агент, если он устойчив к нагреванию. Если же восстанавливающий

агент не обладает этим качеством, то его вносят в среду непосредственно перед инокуляцией. Среду разливают по пробиркам или флаконам, снабженным пробками из черной резины (лучше всего бутиловой), соблюдая следующие предосторожности.

Во время разлива среды над ее поверхностью постоянно пропускают струю бескислородного газа, причем пробирки или флаконы, в которые разливают среду, также следует предварительно продувать газом.

Предварительно заполняют газом пипетку, используемую для внесения среды. Эту пипетку оснащают грушей или резиновой выходной трубкой. Не следует набирать газ или жидкость в пипетку быстрее, чем газ поступает в сосуд.

После разлива среды пробирку или флакон закрывают пробкой таким образом, чтобы в них не попал воздух. Эта крайне важная операция требует определенного навыка. Для этого пробку держат у входного отверстия пробирки, продолжая пропускать газ еще в течение нескольких секунд, а затем быстро вынимают из пробирки газовый зонд и одновременно закрывают пробкой, фиксируя ее вращательными движениями.

Согласно другому способу, флакон со средой, лишенной кислорода, можно закрыть пробкой из бутиловой резины, как описано выше. Пробку закрепляют зажимом или проволокой, затем среду автоклавируют [21] и разливают по пробиркам с соблюдением правил асептики. Однако при использовании этого способа увеличивается опасность загрязнения стерильной среды и не исключается попадание в нее следов кислорода.

Для стерилизации пробки в пробирках или флаконах должны быть закреплены с помощью зажимов. Существует специальный пресс для удерживания в фиксированном положении целого набора культуральных пробирок с пробками, поставляемый фирмой Bellco Glass, Inc. Зажимы для отдельных пробирок можно изготовить самим из вешалки для одежды [17]. В специальных пробирках Хангейта, снабженных завинчивающимися крышками с отверстием диаметром 9 мм (Bellco Glass, Inc., № 2047), резиновые пробки с бортиками не нуждаются в зажимах. Используют также пробирки или сосуды с горлышком, как у флаконов для сывороток, осна-

щенные перегородчатыми пробками из бутиловой резины [29]. Пробки можно закреплять с помощью алюминиевых крышек (Wheaton Scientific, Millville, N. J.).

Инокуляция и пересев

При использовании пробирок Хангейта [6] или пробирок и бутылей с горлышком, как у флаконов для сывороток [29], инокуляцию культуры и ее пересев можно производить с помощью обычных шприцов для подкожных инъекций. Предварительно через шприц несколько раз пропускают газ, не содержащий кислорода. Среды в пробирках, оснащенных хорошо подогнанными резиновыми пробками, инокулируют следующим образом: быстрым движением немного вынимают пробку и в образовавшееся отверстие вставляют стерильную газовую канюлю, добавляют инокулят, вынимают канюлю и затем пробирку вновь закрывают пробкой. Образцы или культура, из которой отбирают инокулят, должны также обдуваться струей газа и находиться рядом с пробиркой, в которую переносят инокулят. Серологическую или пастеровскую пипетку, используемую для пересева, предварительно заполняют стерильным газом. Пересев производят также с помощью стальной или платиновой петли. Для быстрой инокуляции различных сред одной культурой очень удобна система для выращивания анаэробных культур V. Р. I. (Bellco Glass, Inc.).

Вращающиеся пробирки

Для выделения отдельных колоний строгих анаэробов и для подсчета жизнеспособных клеток используют вращающиеся пробирки, которые удобнее, чем чашки Петри. Готовят агаровую среду, как описано выше, и разливают ее по пробиркам. Охлаждают расплавленный агар до 45 °C в пробирках с пробками и зажимами. Если пробирки со средой приготовлены заранее, перед кипячением необходимо убедиться в том, что они снабжены зажимами. Неразведенные пробы и пробы, разведенные предварительно восстановленной средой (или раствором), переносят в пробирки, как описано выше, смешивают со средой (при этом следят за тем,

чтобы не образовалась пена) и затем вращают пробирку под струей холодной воды, пока агар не застынет. Стараются, чтобы агар равномерно покрыл стенки пробирки. Механическое устройство, облегчающее эту процедуру [5], поставляется фирмой Bellco Glass, Inc.

Вращающиеся пробирки можно засевать штрихом с помощью специальной петли или шпателя, начиная со дна пробирки и затем постепенно продвигая петлю вверх, одновременно вращая пробирку и продувая ее газом с помощью газовой канюли (разд. 8.4.1). Фирма Bellco Glass, Inc. производит устройство для вращения пробирок во время посева культуры штрихом.

Анаэробные камеры для строгих анаэробов(анаэростаты)

Аранка и др. [19] и Аранка и Фритер [18] описали изготовленную из гибкой пластмассы камеру, оснащенную специальным устройством с перчатками, в которой выращивают анаэробные бактерии столь же эффективно, как и во вращающихся пробирках. Эта камера, известная как «анаэробная камера Фритера», была испытана и используется во многих лабораториях. Она пригодна для работы даже с очень чувствительными мета- нобразующими бактериями [20]. Ряд подобных камер поставляется различными фирмами (например, Coy Laboratory Products, Inc., Ann Arbor, Mich.).

Среди главных преимуществ таких камер следует отметить то, что они позволяют использовать стандартные бактериологические методы, включая посев культуры в чашках, перенос колоний с помощью реплик и определение чувствительности к антибиотикам. Кроме того, они позволяют приготовить любую необходимую среду, а для работы с ними не требуется особого навыка. Однако для этих дорогостоящих камер нужно специальное помещение; кроме того, возникает ряд неудобств при работе в перчатках и с предварительно приготовленными средами.

Совместное использование метода Хангейта и хорошо функционирующей анаэробной камеры позволяет проводить практически все виды экспериментов с большинством строгих анаэробов. Ниже мы остановимся на

условиях работы с анаэробными камерами и укажем на основные предосторожности, о которых необходимо помнить.

Существуют камеры, которые можно использовать так же, как термостаты. При температуре в камере от 30 до 37 °C руки нагреваются и потеют, и бывает трудно снять с них перчатки. Поэтому при работе в камере даже при комнатной температуре в течение долгого времени лучше надеть вначале нейлоновые перчатки, а сверху резиновые. Во многих случаях предпочтительнее иметь небольшой термостат внутри камеры. Можно также чашки Петри с засеянной средой или другие емкости поместить в специальные сосуды, закрыть их и удалить из камеры для последующей инкубации.

Используемая в камере газовая смесь должна содержать 10% водорода. Наиболее часто используемые смеси содержат азот с 5% СО2—10% Н2 или азот с 10% Н2. Если в процессе работы с бактериями необходим СО2, то следует обеспечить его бесперебойную подачу. Газовые смеси поставляются фирмой Matheson Scientific, но они довольно дороги. Эта же фирма производит газосмеситель, который очень полезен в работе.

Запрещается работать в камере с открытым пламенем. Лучше установить в ней электрический нагреватель, например типа Bacticinerator фирмы Scientific Products.

Рекомендуется установить в камере фильтр для газовых смесей типа фильтра, используемого для без- микробных камер (Standard Safety Equipment Со., Palatine, III.). Это поможет избежать загрязнения.

Следует часто менять палладиевый катализатор. Обычно это делают один или два раза в неделю. Вышедший из строя из-за токсического действия H2S или высокой влажности катализатор можно регенерировать нагреванием при 160 °C в течение 2 ч. Сразу после регенерации катализатор помещают в камеру и периодически проверяют его активность в струе Н2: при этом катализатор должен быстро нагреваться. (Предупреждение: никогда не подставляйте под струю Н2 горячий катализатор, так как он может воспламениться.)

Поскольку H2S необратимо выводит из строя катализатор, стараются по возможности выращивать

культуры, образующие H2S, в закрытых емкостях и открывать их вне камеры. Для удаления H2S из атмосферы камеры в ней устанавливают поднос с активированным углем (8—12 меш), нанесенным на слой марли и помещают его под палладиевым катализатором. Такая обработка в течение 30 мин уменьшает уровень H2S в камере со 100 до 1 мкл/л [20].

В камеру, где присутствует индикатор относительной влажности, ставят большой поднос с силикагелем. Когда влажность превысит 50%, силикагель необходимо заменить. Его регенерируют нагреванием до 160 °C в течение 1 ч.

Для уменьшения испарения агаровые чашки хранят в полиэтиленовых мешках, а среду — в пузырьках или бутылях с завинчивающимися крышками.

В анаэробной камере поддерживают постоянное давление. Обычные пластмассы пропускают небольшое количество газа; более того, газ проходит даже через поликарбонатпые пластмассы и резину. Если камера используется часто, то концентрация Н2 в ней остается относительно высокой в результате открывания вентиля для продувания газа. Для поддержания достаточно постоянного давления необходимо добавлять смесь газов два раза в месяц. Снижение давления довольно быстро происходит в эластичных пластмассовых камерах.

Постоянно следят за утечкой газа. Слишком быстрое падение давления и сохранение высокой влажности свидетельствуют об утечке. На это указывает и то, что такие индикаторы Eh, как ресазурин и феносафранин, начинают переходить в окрашенную окисленную форму. Чаще всего утечка происходит через резиновые перчатки. Это можно проверить, поместив в камеру большой стакан с водой и погрузив в него каждую перчатку. Если надутая перчатка не теряет своей формы, это означает, что сколько-нибудь заметной потери газа не происходит. Если утечка в пластмассе происходит через швы, то ее практически невозможно обнаружить визуальным осмотром. Для обнаружения утечки полезен электронный детектор утечки (Coy Laboratory Products, Inc.).

Среду, приготовленную стандартным способом вне камеры, необходимо сразу же после охлаждения по-

местить в камеру. Если не обеспечена строгая герметичность сосудов, горячая среда может испаряться из пробирок и флаконов из-за наличия вакуума в шлюзе.

Перед использованием приготовленную стандартным способом среду выдерживают в камере в течение 1—2 дней или до восстановления индикатора Eh. За день до работы стеклянную и пластмассовую посуду помещают в атмосферу инертного газа.

Предварительно восстановленную среду, приготовленную методом Хангейта, можно использовать сразу же после ее помещения в камеру. Она может оказаться необходимой для некоторых организмов, например ме- танобразующих бактерий.

После стерилизации следят за тем, чтобы горлышки пробирок и флаконов с культурой оставались чистыми, так как их нельзя обжигать на открытом пламени в камере.

ЛИТЕРАТУРА

Общая литература

Brown D. Е. Aeration in the submerged culture of micro-organisms, p. 127—174. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (ed.), Methods in microbiology, vol. 2, Academic Press, Inc., New York, 1970.

Datta S. P„ Grzybowski A. K. pH and acid-base equilibria, p. 19— 58. In: C. Long, K. J. King and W. M. Speery (eds.), Biochemists’ handbook, D. Van Nostrand Co., Inc., New York, 1961. Отличный обзор по pH, буферам, ионной силе н буферной емкости. Приведены обширные таблицы по составам буферов, константам диссоциации слабых кислот и оснований, а также рН-индикаторам.

Gomori G. Preparation of buffers for use in enzyme studies, Methods Enzymol., 1, 138—146 (1955). Содержит таблицы различных буферных систем.

Hitchman М. L. Measurement of dissolved oxygen. (Chemical analysis, vol. 49), John Wiley and Sons, Inc., New York, 1978.

Holdeman L. V., Cato E. P„ Moore W. E. C. Anaerobe laboratory manual, 4th ed., Virginia Polytechnic Institute and State University, Blacksburg, 1977. Отличное описание н иллюстрации анаэробных методов.

Hungate R. Е. A roll tube method for cultivation of strict anaerobes, p. 117—132. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (eds.), Methods in microbiology, vol. 3B, Academic Press, Inc., New York, 1969. Хорошее описание метода Хангейта.

Jacob Н.-Е. Redox potential, p. 92—123. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (eds.), Methods in microbiology, vol. 2, Academic Press, Inc., New York, 1970. Описано электрометрическое измере-

ние окислительно-восстановительного потенциала и влияние иа него микроорганизмов.

Marquis R. Е. High-pressure microbial physiology, Adv. Microb. Physiol., 14, 159—241 (1976). Хороший обзор данных о влиянии высоких давлений на микроограннзмы н нх жизнедеятельность.

Munro A. L. S. Measurement and control of pH values, p. 39—89. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (eds.), Methods in microbiology, vol. 2, Academic Press, Inc., New York, 1970. Содержит несколько полезных таблиц по приготовлению буферов с различной ионной силой.

Pirt S. J. Principles of microbe and cell cultivation, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1975. [Имеется перевод: Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов н клеток. — М.: Мир, 1978.] Содержит главы, посвященные потребностям микроорганизмов в кислороде, способам его подачи, а также влиянию температуры, концентрации ионов водорода и активности воды.

Prior В. A. Measurement of water activity in foods: a review, J. Food Protect, 42, 668—674 (1979). Обзор и оценка методов измерения активности воды.

Scott IF. J. Water relations of food spoilage microorganisms, Adv. Food Res., 3, 84—123 (1957). Основные представления об активности воды, ее отношении к осмоляльности, методах контроля а™ и ее влиянии на бактерии.

Sutter V. L., Citron D. М., Finegold S. M. Wadsworth anaerobic bacteriology manual, 3rd ed., С. V. Mosby Lo., St. Louis, 1980. Отличное переработанное практическое руководство, предназначенное главным образом для клинических лабораторий. В полезном приложении содержится список возможных ошибок прн работе с анаэробами.

Trotter L A., Christian J. Н. В. Water activity and food, Academic Press, Inc., New York, 1978. Отличная, авторитетная н хорошо написанная новая монография с главами, посвященными основным концепциям, методам, ферментативным реакциям, росту и выживанию микроорганизмов.

Wang D. I. С., Cooney С. L, Demain A. L., Dunnill Р., Humphrey А. Е., Lilly М. D. Fermentation and enzyme technology, p. 157—193, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1979. Освещены принципы и методы измерения переноса кислорода.

Weast R. С. (ed.). Handbook of chemistry and physics, 57th ed., p. D-133— D-137; D-147— D-152, CRC Press, Cleveland, Ohio, 1976. Таблицы буферов, pH-стандартных буферов при различных температурах, кислотно-основных индикаторов н констант диссоциации кислот и оснований.

Wolfe R. S. Microbial formation of methane, Adv. Microb. Physiol., 6, 107—146 (1971). Иллюстрированное описание метода Хан- гейта.

Специальная литература

Aranka A., Prefer R. Am. J. Clin. Nutr., 25, 1329—1334 (1972).

Aranka A., Syed S. A., Kenney E. B., Freter R. Appl. Microbiol., 17, 568—576 (1969).

Balch. W. Е., Wolfe R. S. Appl. Environ. Microbiol.. 32, 781—791 (1976).'

Bryant AL P., Brukey L. A. J. Dairy Sci., 36, 205—217 (1953).

Cleland W. W. Biochemistry, 3, 480—482 (1964).

Corman J., Tsuchiya H. M., Koepsell H. J., Benedict R. G., Kelley S. E., Feger V. H., Dworschak R. G„ Jackson R. W. Appl. Microbiol., 5, 313—318 (1957).

Gordon J., Holman R. A., McLeod J. W. J. Pathol. Bacteriol., 66, 527—537 (1953).

Hungate R. E. Bacteriol. Rev., 14, 1—49 (1950).

Ingraham J. L. J. Bacteriol., 76, 75—80 (1958).

Labuza T. P„ Acott K-, Tatini S. R., Lee R. Y., Flink J., McCall W. J. Food Sci., 41, 910—917 (1976).

Macy J. M., Snellen J. E„ Hungate R. E. Am. J. Clin. Nutr., 25, 1318—1323 (1972).

Miller T. L., Wolin W. J. Appl. Microbiol., 27, 985—987 (1974).

Onderdonk A. B„ Johnston J., Mayhew J. W., Gorbach S. L. Appl. Environ. Microbiol., 31, 168—172 (1976).

Patching J. W., Rose A. H. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (eds.), Methods in microbiology, vol. 2, p. 23—38, Academic Press, Inc, New York, 1970.

Scott W. J. Aust. J. Biol. Sci., 6, 549—564 (1953).

Taylor C. D., Jannasch H. W. Appl. Environ. Microbiol., 32, 355— 359 (1976).

Trailer J. A. J. Food Sci., 42, 85—90 (1977).

Umbreit W. W., Burris R. H., Stauffer J. F. Manometric techniques, 4th ed., Burgess Publishing Co., Minneapolis, 1964.

Walden W. C„ Hentges D. J. Appl. Microbiol., 30, 781—785 (1975).

Zehnder A. J. B., Wuhrmann K. Science, 194, 1165—1166 (1976).

Глава 7

БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Б. Гирард, Э. Снелл

Подобно другим организмам, все бактерии для своего роста нуждаются в экзогенных источниках энергии и доступных веществах, поставляющих углерод, азот, серу и неорганические ионы в такой форме, в которой они могут быть использованы для синтеза клеточных компонентов. Однако отдельные виды бактерий сильно различаются по тому, какие вещества необходимы для их роста. Для автотрофных бактерий потребности в питательных веществах довольно просты: вода, двуокись углерода и соответствующие неорганические соли. Они используют энергию света либо получают энергию в результате окисления (одного или нескольких) неорганических соединений. В качестве примера можно привести бактерии рода Nitrobacter, которые ассимилируют СО2 и получают энергию путем окисления нитритов в нитраты. Гетеротрофные бактерии получают энергию в результате окисления (диссимиляции) восстановленных углеродных соединений. При их выращивании к средам чаще всего добавляют глюкозу, однако некоторые гетеротрофные бактерии в качестве источника энергии используют практически все естественные и многие искусственные соединения углерода.

Гетеротрофные бактерии используют органические соединения в двух целях: 1) в качестве источника энергии; при этом органическое вещество окисляется или расщепляется с высвобождением энергии и образованием ряда конечных продуктов (СО2, иногда органических кислот и др.); 2) в качестве субстратов, ассимилируемых непосредственно с образованием клеточных компо-

нентов или для их синтеза в реакциях, требующих затраты энергии. Некоторые вещества, например глюкоза, могут выполнять обе указанные функции. Так, Е. coll может расти на простой среде, содержащей только глюкозу и неорганические соли. Другие бактерии, например молочнокислые, растут только на более сложных средах. Кроме неорганических солей и источника энергии (обычно глюкозы) к их ростовой среде добавляют ряд органических соединений (витамины, аминокислоты и др.), которые клетки не в состоянии синтезировать. Такие соединения называют факторами роста. Организмы, которые нуждаются в их добавлении к ростовой среде, называются ауксотрофными по соответствующим соединениям. Известны бактерии с разными градациями сложности в их потребности к определенным питательным веществам. У некоторых бактерий потребности в питательных веществах, необходимых для роста, еще не идентифицированы, и поэтому к средам приходится добавлять сложные природные вещества — дрожжевой экстракт, пептон, рубцовую жидкость и сыворотку крови. Существуют сапрофитные бактерии, способные расти самостоятельно, и облигатно паразитические формы, которые растут только в присутствии живых клеток: животных, растительных или других бактериальных, обеспечивающих паразитические формы неидентифици- рованными питательными веществами или недостающими метаболитами.

Количественно потребности гетеротрофных бактерий в специфических факторах роста в значительной мере зависят от состава среды. Так, потребность Streptococcus faecalis в витамине В6 варьирует от 10 мкг/л (в отсутствие одной или нескольких аминокислот) до нуля (при полном наборе аминокислот в среде). Важную информацию о функциях факторов роста можно получить при изучении влияния взаимодействия компонентов среды на рост клеток.

Прежде чем привести список общих и специфических сред, используемых для культивирования различных бактерий, коротко обсудим их потребности в тех веществах, которые используются для синтеза клеточных компонентов, а также дадим некоторые практические рекомендации по использованию этих соединений для

приготовления ростовых сред [70, 191]. Дополнительную информацию о питании бактерий можно найти в книге Коузера [114] о потребности бактерий и дрожжей в витаминах, в руководстве «Методы микробиологии» [122] и в книге [172]. В «Каталоге штаммов Американской коллекции типовых культур» приведены прописи сред для выращивания различных штаммов [4].

ПОТРЕБНОСТИ

В ПИТАТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВАХ

Углерод, азот, сера

Выше уже обсуждались потребности бактерий в соединениях углерода. Большинство известных бактерий используют для синтеза азотсодержащих компонентов клетки аммиак. Однако некоторые бактерии нуждаются в азотсодержащих факторах роста, которые необходимо добавлять в среду. Многие бактерии образуют аммиак путем восстановления нитратов и нитритов или путем деградации органических азотистых соединений. Ряд бактерий (например, Azotobacter, Rhizobium, пурпурные серные бактерии) способны восстанавливать молекулярный азот в аммиак. Большинство бактерий могут синтезировать необходимые серосодержащие компоненты из сульфатов; в случае же бактерий, которые не способны это делать, необходимо добавлять в среду серу в виде H2S, цистина или метионина.

Неорганические ионы

Потребность бактерий в неорганических ионах изучалась весьма подробно. Однако подобные исследования затруднены рядом факторов, к которым относятся: 1) постоянное присутствие в средах ионов металлов; 2) присутствие небольших количеств других элементов, необходимых для роста; 3) трудность удаления этих ионов из среды с целью продемонстрировать их необходимость для роста бактерий; 4) взаимозаменяемость ионов одного металла ионами другого; 5) антагонистические эффекты между некоторыми близкими ионами металлов; 6) присутствие ионов металлов во многих

биологических продуктах в виде хелатных комплексов с различной стабильностью, что влияет на их доступность для бактерий. Детально эти проблемы, а также необходимые в работе предосторожности и методические приемы рассматриваются в обзорах Хатнера и др. [91], Найта [112] и Снелла [205].

Потребности бактерий в неорганических ионах, как правило, удовлетворяются добавлением к синтетическим средам К+, Mg2+,Мп2*-,Fe2+ или Fe3+, РО43~ и SO42 . Часто бывает необходимо присутствие следовых количеств некоторых других ионов (Zn2+, Cu2+, Со2+, Са2+, С1“, молибдата и др.), но обычно они присутствуют в достаточном количестве в качестве примесей в других компонентах среды или содержатся в водопроводной воде, используемой для приготовления сред. Сложные питательные среды, в которые входят пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт (infusion) или сходные компоненты, содержат достаточное количество ионов металлов.

Приготовленные концентрированные (основные) растворы неорганических солей, добавляемые к синтетическим средам, следует хранить при низких значениях pH или в присутствии минимальных количеств нетоксичных хелатирующих агентов (например, этилендиаминте- трауксусной или нитрилотриуксусной кислоты), препятствующих выпадению солей в осадок. Присутствие хелатирующих веществ в готовой среде является важным фактором, определяющим доступность ионов металлов; поэтому, если необходимо добиться интенсивного роста бактерий, концентрация этих агентов должна быть тщательно сбалансирована с количеством микроэлементов [91]. Хелатирующими свойствами обладают также такие компоненты ростовых сред, как аминокислоты, цитрат, малат и др.

Функция необходимых бактериям ионов металлов заключается в том, что они служат активаторами или кофакторами многих ферментов [145]. Кроме того, неорганические ионы (в основном Na+ и К+) участвуют в транспорте веществ через клеточные мембраны [155] и в регуляции синтеза белка [131]. Они являются также компонентами белковых комплексов, играющих важную роль в метаболизме бактерий, например, железо входит

р гемовую простетическую группу цитохромов — элект- ронпереносящих белков.

Витамины

Витамины осуществляют свои каталитические функции в клетке обычно в качестве компонентов коферментов или как простетические группы ферментов. Готовые витамины необходимы для ряда бактерий; их взаимодействие с другими компонентами ростовых сред кратко обсуждается ниже.

п-Аминобензойная кислота

n-Аминобензойная кислота служит предшественником в биосинтезе фолиевой кислоты и поэтому оказывает воздействие на метаболизм тимина, метионина, серина, пуриновых оснований и витамина Bi2. В свою очередь, присутствие этих компонентов в среде может оказывать влияние на увеличение или снижение потребности бактерий (вплоть до нулевой) в я-аминобензойной кислоте.

Группа фолиевой кислоты

Некоторые формы фолиевой кислоты, встречающиеся в природе, отличаются по своей усвояемости отдельными бактериями. Птероил-Ь-глутаминовая кислота и ее №°-формильное производное полностью усваиваются Lactobacillus easel и S. faecalis', птероилтриглутаминовая кислота обеспечивает хороший рост L. easel, но мало активна в случае 3. faecalis, птероилгептаглутаминовая кислота вообще не стимулирует рост бактерий. №-формилтетрагидроптероилглутаминовая кислота (лейковорин) активна в случае L. easel, S. faecalis и Pediococcus cerevislae. Фолиевая кислота участвует как кофактор в синтезе тимина, пуринов, серина, метионина и пантотеновой кислоты. Если эти компоненты добавлены в среду, то потребность бактерий в фолиевой кислоте часто отпадает. Фолиевая кислота слабо растворима в воде, но ее аммонийная соль растворяется хорошо; она устойчива к автоклавированию.

Биотин

Биотин участвует в различных реакциях биосинтеза, требующих фиксации СО2, в том числе в синтезе ок- салоацетата и жирных кислот. Биоцитин (\6-биотинил- лизин) является природным соединением; он так же, как и биотин, активен в случае L. easel, но не в случае Lactobacillus arabinosus. Биотин слабо растворим в воде, но его соли растворяются легко. Биотин можно автоклавировать, он устойчив к кислотам, но быстро окисляется до сульфоксида и сульфона. Эти продукты окисления также стимулируют рост некоторых бактерий при условии, если бактерии способны снова превратить их в биотин. Окисление биотина происходит только в очень разбавленном (<1 мкг/мл биотина) растворе и в отсутствие других восстанавливающих агентов.

Никотиновая кислота и ее производные

Большинство ауксотрофов по никотиновой кислоте взаимозаменяемо используют эту кислоту и ее амид. Коферментные формы витамина — никотинамидаденин- динуклеотид (NAD) и никотинамидадениндинуклеотид- фосфат (NADP)—участвуют в окислительно-восстановительных реакциях клеточного метаболизма. Некоторые организмы, например Haemophilus influenzae, не способны синтезировать NAD из никотиновой кислоты и поэтому нуждаются в готовом коферменте. Кофермент разрушается кислотами, щелочами и при автоклавировании. Поэтому его стерилизуют фильтрованием через бактериальные фильтры и затем добавляют к автоклавированной среде. Никотиновая кислота и ее амид устойчивы к автоклавированию при pH 7,0, характерном для большинства ростовых сред.

Пантотеновая кислотаи родственные ей соединения

Пантотеновая кислота является компонентом кофермента А (СоА) и ацилпереносящего белка (АПБ), которые служат переносчиками ацильной группы в про-

цессах метаболизма. Некоторые бактерии используют интактный кофермент как фактор роста, но для роста значительно большего числа бактерий необходимы пантотеновая кислота или пантетеин. Взаимоотношения между этими компонентами схематически можно изобразить следующим образом.

Пантоевая кислота -}- Р-Аланин ► Пантотенат *-

► 4'-Фосфопантотенат ► 4'-Фосфопантотенилцистеин » >- 4'-Фосфопантетеин > ДефосфоСоА >- СоА► АПБ

tI

ПантетеинАпобелок

Потребность отдельных видов бактерий в том или другом из этих родственных соединений обусловлена способностью к их синтезу и транспорту.

Свободная пантотеновая кислота и многие из ее солей очень гигроскопичны; известна только одна малогигроскопичная соль — кальциевая, которая легко растворяется в воде и устойчива к автоклавированию. Подобно своим более сложным производным, пантотеновая кислота легко гидролизуется; поэтому ее стимулирующая рост активность подавляется (для всех бактерий, использующих интактный витамин) при кислотном или щелочном гидролизе.

Рибофлавин и его производные

Относительно немногие виды бактерий требуют готовый рибофлавин. Почти все бактерии, очевидно, содержат этот витамин, а некоторые виды синтезируют его в достаточно большом количестве, т. е. могут служить источником выделения рибофлавина в виде препарата.

Рибофлавин-5'-фосфат (флавинмононуклеотид, или ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД) являются главными коферментными формами рибофлавина, участвующими в окислительно-восстановительных реакциях. Все эти три вещества одинаково активно поддерживают рост рибофлавинового ауксотрофа L easel.

Рибофлавин плохо растворим в холодной воде, но становится легкорастворимым при нагревании в кон-

7. биохимические факторы

центрации, рекомендованной для приготовления основного раствора витамина (разд. 7.3.1). Он разрушается видимым светом, особенно при нейтральных и щелочных условиях (рН^7), поэтому водные растворы рибофлавина следует защищать от света. Разбавленный раствор (-^100 мкг/мл) рибофлавина в 0,02 М уксусной кислоте можно использовать как основной раствор. Рибофлавин устойчив к автоклавированию.

Тиамин

Большое число бактерий являются ауксотрофными по тиамину, его предшественникам или коферментной форме — тиаминпирофосфату (ТПФ). ТПФ участвует в декарбоксилировании а-кетокислот и в транскетолазной реакции.

Поскольку во время автоклавирования в водных растворах при pH 5 и выше тиамин расщепляется на составные части, его следует стерилизовать фильтрованием или автоклавировать при pH <5.

Витамин В6

В группу витамина В6 входят пиридоксин, пиридоксаль, пиридоксамин и их фосфорилированные производные. Различные виды ауксотрофных по витамину В6 бактерий по-разному реагируют на его производные. Пиридоксаль, наиболее широко используемый как фактор роста, образуется в довольно большом количестве в процессе автоклавирования сред, содержащих пиридоксин. Для роста некоторых бактерий необходим пири- доксамин-5'-фосфат; однако для большинства ауксотро- фов фосфорилированные формы витамина В6 неактивны, так как клетки не имеют для них соответствующих транспортных систем. Пиридоксаль-5'-фосфат и пири- доксамин-5'-фосфат участвуют во многих реакциях синтеза и деградации природных а-аминокислот.

Все три формы витамина устойчивы к нагреванию, но пиридоксаль и пиридоксамин взаимодействуют со многими природными веществами. Поэтому, если требуются интактные формы витамина, их следует стерилизовать отдельно от других компонентов среды. Все

формы витамина В6 чувствительны к свету, особенно при высоких значениях pH.

Витамин В12 (кобаламин)

Витамин В12 синтезируется в природе исключительно микроорганизмами, которые вместе с их побочными продуктами являются источником выделения витамина в виде препарата. Коферментная форма витамина В12 (кобаламин, связанный с адениннуклеозидом) так же активно, как и витамин, стимулирует рост бактерий. Кофермент участвует во многих метаболических реакциях изомеризации, а также (прямо или косвенно) в биосинтезе дезоксирибонуклеозидов, метионина и, вероятно, других веществ.

Кофермент витамина В12 неустойчив к свету; его следует стерилизовать фильтрованием. Напротив, сам витамин В12 довольно устойчив и к свету, и к автоклавированию.

Липоевая кислота (тиоктовая кислота)

Липоевая кислота — необходимый фактор роста для различных молочнокислых бактерий и Butyribacterium rettgeri. Участие этой кислоты в окислении пирувата и а-кетоглутарата подтверждается тем, что многим липо- атным ауксотрофам не нужен такой фактор роста, если в среде содержится ацетат. Липоевая и дигидролипое- вая кислоты, а также различные смешанные дисульфиды примерно одинаково стимулируют рост S. faecatis. Липоевая кислота устойчива к кислотам и к автоклавированию, но повреждается окисляющими агентами. Однако ее чувствительность к окислению не является проблемой при приготовлении питательных сред из-за присутствия в них более активных восстанавливающих агентов, например глюкозы.

Железопорфирины

Железопорфирины, феррихром и сходные Fe-содер- жащие соединения обнаружены у всех исследованных аэробных бактерий и являются компонентами электрон-

транспортных систем. Некоторые бактерии (например, Н. influenzae), вероятно, не способны синтезировать порфирины и поэтому нуждаются в них.

Группа хелатирующих агентов, образующих комплекс с железом, известна под общим названием сидерохромы; некоторые из них, например феррихром и terregens-фактор, необходимы для роста ряда бактериальных видов. Их можно заменить в среде значительно большим количеством гемина. Предполагается, что сидерохромы выполняют каталитическую роль, являясь переносчиками железа.

Витамин К

Витамин К или родственные ему соединения необходимы для роста некоторых видов Mycobacterium и Fusi- formis. Функция витамина К до конца не выяснена. Это жирорастворимое соединение разрушается светом, щелочами и восстанавливающими агентами. Его лучше всего добавлять в среду в форме менадиона (2-метил- 1,4-нафтохинон; спиртовой раствор), который устойчив к автоклавированию, но чувствителен к свету и щелочам.

Холин

Показано, что холин используется только некоторыми пневмококками, по-видимому, как предшественник определенных клеточных липидов.

Аминокислоты, пептиды и белки

Очень часто бактерии нуждаются в одной, нескольких или многих природных а-аминокислотах. Хотя такая потребность объясняется неспособностью к синтезу этих аминокислот, она все же не абсолютная, а, скорее, условная. Так, аминокислота, необходимая бактериям в отсутствие витамина В6, может быть синтезирована в его присутствии. Или аминокислота, необходимая в случае избытка другой аминокислоты, становится необязательной в ее отсутствие.

Даже у безусловных ауксотрофов добавление избытка одной аминокислоты может привести к возрастанию потребности в другой, что, вероятно, связано с их конкуренцией за общую транспортную систему. Таких антагонистических взаимоотношений можно избежать, добавив в среду соответствующий пептид лимитирующей аминокислоты, поскольку он транспортируется с помощью независимой транспортной системы. Это явление описано в нескольких работах, где сделан вывод о существовании специфических пептидных факторов роста. Однако вряд ли такие, уже сформированные пептиды являются обязательными для роста бактерий, хотя они обычно быстро используются и служат легко доступным источником необходимых аминокислот.

Отмеченная в ряде работ потребность некоторых бактерий в специфических белках требует дальнейшего изучения. Белки могут служить источником аминокислот или агентов, подавляющих токсическое действие некоторых веществ (эти агенты можно назвать детоксикантами); они способны выполнять также и другие функции.

Кроме глутамина, который стерилизуют фильтрованием, все аминокислоты и пептиды устойчивы к автоклавированию. Кроме триптофана, глутамина и аспарагина, все аминокислоты устойчивы в условиях кислотного гидролиза белков, однако цистеин при этом часто разрушается. Все естественные а-аминокислоты (кроме цистина) достаточно хорошо растворимы в теплой воде. Цистин можно растворить нагреванием в небольшом количестве соляной кислоты. Растворимость тирозина улучшается в присутствии других аминокислот.

Пурины и пиримидины

Многие бактерии не способны синтезировать пуриновые и пиримидиновые основания и поэтому нуждаются в них. О взаимосвязях метаболизма этих соединений с фолиевой кислотой и витамином В12 уже упоминалось. Гуанин и ксантин растворяют нагреванием в минимальном количестве соляной кислоты. Другие основания растворимы в горячей воде.

Жирные кислоты и родственные им соединения

Необходимые жирные кислоты, особенно ненасыщенные, могут иногда проявлять токсическое действие даже в низких концентрациях, поддерживающих рост бактерий. Их часто добавляют в среду вместе с детоксикантами типа сывороточного альбумина, белков, твинов, лецитина и др. Потребность в жирных кислотах характеризуется не абсолютной, а скорее групповой специфичностью, т. е. любая из нескольких активных жирных кислот часто включается в неизменном виде в липидные вещества клеток.

Мевалоновая кислота, необходимая для роста некоторых видов Lactobacillus, выступает в роли предшественника изопреноидных соединений — каротиноидов, стероидов, убихинона и др. В отличие от большинства бактерий, которые содержат мало стероидов или вообще их не содержат, микоплазмы нуждаются в них для своего роста (например, в холестерине).

Жирные кислоты и другие липиды в принципе устойчивы к автоклавированию, однако при их добавлении к водным средам возникают некоторые сложности. Эти вещества необходимо растворять в минимальных количествах этанола или эмульгировать в растворе твина.

Другие вещества

Существуют еще некоторые вещества, необходимые для роста ряда бактерий, которые могут быть или необходимыми, или стимулирующими факторами. К ним относятся полиамины (путресцин, спермин, спермидин), карнитин, а также вещества, образуемые при автоклавировании глюкозы с фосфатом или в присутствии аминокислот. Несколько факторов еще не идентифицировано в дрожжевом экстракте и сыворотке.

Определение потребностей питания

При использовании бактерий в качестве тест-орга- низмов в микробиологических и других биологических исследованиях необходимо знать их потребности в питательных веществах, а также влияние на эти потребности других компонентов среды

При подборе условий выращивания новой выделенной бактерии вначале используют так называемую комплексную среду, состав которой точно определить невозможно, так как она содержит неочищенные компоненты. Обычно в нее входит ферментативный гидролизат белка, обеспечивающий потребность в таких источниках азота, как аминокислоты, сахар (обычно глюкоза) как источник энергии и углерода, различные соли для удовлетворения потребности бактерии в неорганических ионах и дрожжевой экстракт для обеспечения всех потребностей в витаминах. Когда потребности в питательных веществах бактерий приблизительно выявлены, можно использовать полусинтетическую среду. В такую среду вносят известные соединения как явно необходимые; в нее добавляют также небольшое количество дрожжевого экстракта для обеспечения пока еще неизвестных потребностей. В конце концов находят состав синтетической среды, т. е. среды определенного состава, которая полностью удовлетворяет всем потребностям в питательных веществах. Выбор нужной среды зависит от целей эксперимента. Сложные синтетические среды довольно дороги, поэтому чаще используются комплексные среды неопределенного состава.

Основные этапы определения потребностей гетеротрофных бактерий в питательных веществах заключаются в следующем.

Бактерии следует выращивать на такой среде (комплексной или синтетической), о которой известно, что она поддерживает их рост.

Если начинают выращивать бактерии на комплексной среде, то варьируют концентрации всех компонентов (от нуля до самой большой, при которой они находились в исходной среде), чтобы определить их оптимальные концентрации и необходимость для роста или его стимуляции.

Определив оптимальные концентрации, сначала заменяют основной сложный компонент среды, поставляющий азот (например, казеин), на полную смесь аминокислот в тех же концентрациях, которые использовали в средах для аналитического (assay medium) определения веществ (см. табл. 7.14).

Если эта смесь обеспечивает рост бактерий, поочередно варьируют концентрацию каждой аминокислоты от нуля до концентрации, превышающей ту, которая установлена в среде для аналитического определения. Таким образом определяют оптимальную концентрацию каждой аминокислоты в присутствии других. Если же наблюдается ингибирующий эффект, то соответствующую аминокислоту исключают из среды.

Заменяют сложный фактор роста, например дрожжевой экстракт, полным набором известных витаминов и затем варьируют отдельно уровень каждого компонента смеси, как и в случае аминокислот. Если в исходной среде в качестве источника аминокислот и витаминов используют дрожжевой экстракт, то стараются заменить его полной смесью аминокислот с полным набором известных витаминов и затем варьируют в среде уровень каждого компонента отдельно.

Если бактерии не растут на полученной таким путем среде, то это можно объяснить тем, что они нуждаются в неидентифицированном факторе, или тем, что нарушено соотношение известных факторов роста. Можно также предполагать потребность бактерий в известных факторах роста (пептидах, производных витаминов, жирных кислотах, нуклеотидах, неорганических ионах и др.), которые содержатся в неочищенных компонентах комплексной среды, но отсутствуют в смесях испытываемых синтетических веществ. В этом случае необходимо детально выяснить потребности бактерий в питательных веществах [70].

Если работу начинают с использования синтетической среды и не наблюдают хорошего роста бактерий на втором этапе (см. выше), то заменяют источник азота на 10%-ный гидролизат казеина. Если это способствует росту, поступают, как указано на этапе 4; если же интенсивность роста все еще недостаточна, добавляют к среде 1%-ный дрожжевой экстракт. В случае стимуляции роста поступают, как указано на этапе 5.

СОСТАВЛЕНИЕ СРЕД

Все среды, используемые для культивирования бактерий, перечислить невозможно, поэтому в приведенных ниже таблицах даны ссылки на среды, в которых выращивают чистые культуры большинства известных родов.

Ключ к средам, используемымдля выращивания бактерий различных групп

В табл. 7.1 перечислены 192 вида бактерий, представляющих каждую из 19 групп, приведенных в 8-м издании «Определителя бактерий Берги» (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology). В ней даны также оптимальная температура роста каждого микроорганизма и буквенно-цифровой ключ, помогающий найти состав одной или нескольких известных в литературе сред, поддерживающих рост каждого вида. Строчные латинские буквы в верхних индексах названий бактерий указывают на сноски, в которых приведены подробности культивирования этих бактерий. В колонке буквенно-цифровых ключей приведены номера таблиц (с. 7.2 по 7.13), где даны составы сред. Ключевая буква А обозначает в табл. 7.2—7.7 богатую комплексную среду, буква В в табл. 7.2—7.7 — полусинтетическую среду (несколько сред с кодом В приведено в табл. 7.12 и 7.13), а буква С — синтетическую среду в табл. 7.8— 7.13.

В табл. 7.1 перечислены только те бактерии, которые были выращены in vitro в чистой культуре. Большинство приведенных сред не являются минимальными, т. е. они часто содержат вещества, в которых нет специфической потребности, или вещества, содержание которых значительно выше минимальных потребностей бактерий. То, что данную бактерию культивируют именно на указанной среде, еще не означает, что эта среда оптимальна для нее, поскольку детальное изучение потребностей в питательных веществах было проведено далеко не у всех штаммов.

Таблица 7.1. Ключ к средам и условия культивирования различных бактерий

Группа, род и виды °

Оптимальная температура роста, °C

Буквенно-цифровой b ключ к среде

Источник дай-

I. Фототрофные бактерии:

Amoebobacter roseusc

25—30

1С (табл. 7.8)

[158, 224]

Chlorobium Hmicolac'd

25—30

1 В, 2С (табл. 7.2, 7.8)

[123, 124]

Chlorobium thiosulfa- tophilumc- d

25—30

IB, 2С (табл. 7.2,

7.8)

[123, 124]

Chromatium okenii**’d

25—30

ЗС (табл. 7.8)

[59]

Rhodomicrobium yan- nieliF

30

2А, 4С (табл. 7.2,

7.8)

[17, 52, 154]

Rhodopseudomonas sphaeroidesc- h

25—30

2А, 4С (табл. 7.2, 7,8)

[17, 35, 154]

Rhodespirillumrub-

rumc’ i- а

25

2А, 4С (табл. 7.2, 7.8)

[17, 154]

II. Скользящие бактерии:

Archangium gephyra* Beggiatoa alba*

18-32

ЗА (табл. 7.2)

[80, 141]

20

4А, 5С (табл. 7.2,

7.8)

[115, 189]

Chondromyces croca- tuS*' I

28—30

ЗА (табл. 7.2)

[140]

Cystobacter fuscus1

Flexibacter flexilis1

30

ЗА (табл. 7.2)

[142]

20—35

5А, 5В (табл. 7.2)

[130]

Flexithrix dorotheae*

35

5А, 6С (табл. 7.2,

7.8)

[129]

Myxococcus xanthus1

30

6В, 7С (табл. 7.2,

7.8)

[53, 80]

Nannocystis exedens*

30

6В (табл. 7.2)

[174]

Saprospira grandis1

30—37

5А, 5В (табл. 7.2)

[128, 130]

Sporocytophaga myxo- coccoides*

30

8С (табл. 7.8)

[194, 212]

Stigmatella aurantiaca

30

7В (табл. 7.2)

[175]

III. Хламидобактерии:

Leptothrix ochracea1

20—25

8А, 9С (табл. 7.2,

7.8)

[150, 229]

Sphaerotilus natans‘

30

9А, ЮС (табл. 7.2,

7.8)

[50, 219, 229]

Streptothrix hyalina1' k

25—27

8А (табл. 7.2)

[151]

Группа, род и виды °

Оптимальная температура роста, °C

Буквенно-цифровой b ключ к среде

Источник данных

IV. Почкующиеся и (или) стебельковые бактерии:

Ancalomicrobium ade-

30

10А, 11С (табл. 7.2,

[211]

turn1

Asticcacaulis excentri-

25—30

7.8)

НА, 12С (табл. 7.2,

[162]

cus

Caulobacter henricii1*1

30

7.8)

ИА, 12С (табл. 7.2,

[162]

Caulobacter halobacte-

25

7.8)

ИА, 12С (табл. 7.2,

[162]

roides* ■ m Caulobacter vibrio-

30

7.8)

ИА, 12С (табл. 7.2,

[162]

ides*’"

Gallionella ferrugi-

25

7.8)

13С (табл. 7.8)

[74, 150]

nea°’»

Hyphomicrobium vul-

25—30

13С (табл. 7.8)

[86]

gare!i ’ Hyphomonas poly mor-

37

12С (табл. 7.2)

[86, 183]

pha* Pedomicrobium ferru-

12С (табл. 7.8)

[5]

gineum° Prosthecomicrobium

30

10А, ПС (табл. 7.2,

[211]

pneumaticum*’r

V. Спирохеты: Leptospira canicola*

29

7.8)

13В, 14С (табл. 7.3,

[97, 127, 192]

Leptospira pomona*

29

7.8)

13В, 14С (табл. 7.3,

[97, 127, 192]

Leptospira grippoty-

29

7.8)

13В, 14С (табл. 7.3,

[97, 127, 192]

phosa*

Трепонема Рейтера6's

37

7.8)

14А, 15С (табл. 7.3,

[27, 218]

Spirochaeta steno-

30—37

7.9)

15А (табл. 7.3)

[85]

strepta0’ *

VI. Спиральные и изогнутые бактерии:

Campylobacter fetus0

37

16А (табл. 7.3)

[1?7, 190]

Spirillum volutans0- u

30

17А (табл. 7.3)

[29, 117]

а

[руппа, род н виды

Оптимальная температура роста, °C

Буквенно-цифровой b ключ к среде

Источник данных

VII. Грамотрицатель- ные аэробные палочки и кокки:

Acetobacter aceti

30

18А (табл. 7.3)

[46, 93)

Agrobacterium rhizo- genes”

25—28

18А, 16С (табл. 7.3,

7.9)

[46, 215]

Azomonas agilis™

20—30

17С (табл. 7.91

[223]

Azotobacter chroococ-

20—30

17С (табл. 7.9)

[12, 58]

cum™

Beijerinckia indica™- x

30

18С (табл. 7.9)

[12, 13]

Bordetella pertussis»

35—37

19А (табл. 7.3)

[127, 185]

Brucella melitensis2

34—37

16А, 19С (табл. 7.3,

7.9)

[65, 127, 178, 186]

Derxia gummosa

25

20С (табл. 7.9)

[96]

Francisella tularen-

37

20А (табл. 7.3)

[127]

slsaa

Gluconobacter oxy-

25—30

18А (табл. 7.3)

[45]

dans

Halobacterium salina-

37

21А (табл. 7.3)

[ЮЗ]

rium

Melhylomonas metha-

30

22В (табл. 7.3)

[54]

nica66

Pseudomonas aeruginosa

37

23А, 21С (табл. 7.3,

7.9)

[213]

Pseudomonas fluores- cens

25—30

23А, 21С (табл 7.3,

7.9)

[213]

Pseudomonas lemoig- nelcc

30

23А, 21С (табл. 7.3,

7.9)

[213]

Pseudomonas malto- philiadd

35

23А, 21С (табл. 7.3,

7.9)

[213]

Pseudomonas putida

25—30

23А, 21С (табл. 7.3,

7.9)

[213]

Pseudomonas testo- steronies

30

23А, 21С (табл. 7.3,

7.9)

[213]

Rhizobium legumino- sarum

20

24А, 22С (табл. 7.3,

7.9)

[153]

Xanthomonas cam- pestrisif

28

18А, 16С (табл. 7.3,

7.9)

[214]

VIII. Грамотрицатель- ные факультативноанаэробные палочки:

Aclinobaclllus ligniere-

37

25А (табл. 7.4)

[127, 159]

SU

Группа, род и виды °

Оптимальная температура роста, °C

Буквенно цифровой b ключ к среде

Источник данных

Aeromonas hydr ophila

30

26А, 23С (табл. 7.4,

7.9)

[119, 188]

Cardiobacterium homi- nis^s

30—37

12А, 24С (табл. 7.2,

7.9)

[127, 144, 198, 199]

Chromobacterium vio- laceumhh

30—35

12А, 25С (табл. 7.2, 7.9)

[48, 127, 203]

Citrobacter freundii

30—37

26С (табл. 7.9)

[242]

Edwardsiella tarda

30—37

12А (табл. 7 2)

[Ю9]

Erwinia amyiovora"

27—30

26А (табл. 7.4)

[234]

Escherichia coli

37

26А, 27С (табл. 7.4,

7.9)

[133, 230]

Flavobacterlum aqua-

20—25

27А (табл. 7.4)

[147, 239]

tile

Haemophilus influen-

30

27А (табл, 7.4)

[243, 247]

zae

Haemophilus parain- fluenzae

37

27А, 28С (табл. 7.4,

7.10)

[84, 247]

Klebsiella pneumoniae

35—37

28А, 27С (табл. 7.4,

7.9)

[Ю4]

Lucibacterium harveyi

25—30

29А (табл. 7.4)

[82]

Pasteurella multocida

37

12А, 29С (табл. 7.2, 7.10)

[ЮО]

Proteus vulgaris

34—37

28А, ЗОС (табл. 7.4,

7.10)

[98]

Salmonella typhimu- rlum

37

ЗОА, 27С (табл. 7.4,

7.9)

[187, 228]

Serratla marcescensii

30—37

ЗОА, 27С (табл 7.4,

7.9)

[44]

Shigella dysenteriae

37

31А (табл. 7.4)

[156, 244]

Streptobacillus monili-

37

12А (табл. 7.2)

[79]

formis1^

Vibrio cholerae11

18—37

32А, 31С (табл. 7.4, 7.10)

[9, 26]

Yersinia pestis

30—37

ЗЗА, 32С (табл. 7.4, 7.10)

[56, 177]

Zymomonas mobilismm

30

34А, ЗЗС (табл. 7.4,

7.10)

[14]

IX. Грамотрицатель- ные анаэробные бактерии:

Bacteroides fragilis

37

35А (табл. 7.4)

[15]

Bacteroides ruminico- lann

30

36А, 34С (табл. 7.4,

7.10)

[161]

Butyrivibrio fibrisol- vensnn

30—37

36А, 34С (табл 7.4,

7.Ю)

[20, 22]

Группа, род и виды °

Оптимальная температура роста, °C

Буквенно цифровой b ключ к среде

Источник дан-

Desulfovlbrio desulf и- ricans

25—30

37А, 35С (табл. 7.4,

7.10)

[78, 163]

Fusobacterium nuclea- tum

37

38А (табл. 7.5)

[6, 7]

Lachnospira multipa- rus

30—45

38А, 34С (табл. 7.5,

7.10)

[20, 23]

Leptotrichia buccalis

Selenomonas sputige- na

25—30

35—40

39А (табл. 7.5)

12А (табл. 7.2)

[19, 92]

Succinimonas amyloly- tica

30—37

40А, 34С (табл. 7.5,

7.10)

[20, 24]

Succinivibrio dextrino- solvens

X. Грамотрицатель- ные кокки и кокко- бациллы:

30—37

40А (табл. 7.5)

[23]

Acinetobacter calco- aceticus1- °°

30—32

24А, 21С (табл. 7.3,

7.9)

[Н]

Branhamella catarrha-

Us1' pp

37

ЗОА, 21С (табл. 7.4,

7.9)

[176]

Lampropedia hyalina1

30

ЗОА, 36С (табл. 7.4,

7.10)

[167]

Moraxella lacunata*

30

41А (табл. 7.5)

[Ю|

Neisseria gonor- rhoeae1' чч

32—37

27А, 37С (табл. 7.4, 7.10)

[30, 49, 67, 68, 106, 120, 121]

Neisseria meningitidis1

XI. Грамотрицатель- ные анаэробные кокки:

37

42А, 38С (табл. 7.5,

7.10)

[31, 32]

Acidaminococcus fer- mentans

30—37

43В, 39С (табл. 7.5, 7.10)

[181]

Megasphaera elsdenii

35—38

44А (табл. 7.5)

[72, 182]

Veillonella parvula

XII. Грамотрицатель- ные хемолитотроф- ные бактерии:

37

45А, 40С (табл. 7.5,

7.10)

[179, 180]

Nitrobacter winograd- skyi1

25—30

41С (табл. 7.11)

[246]

Nitrococcus mobilis1

25—30

42С (табл. 7.11)

[238]

Nitrosococcus nitrosus‘- 8

20—25

41С (табл. 7.11)

[245]

Группа, род и виды °

Оптимальная температура роста, °C

Буквенно-цифровой b ключ к среде

Источник данных

Nitrosolobus multifor-

25—30

43С (табл. 7.11)

[237]

mis1'rr

Nitrosomonas euro-

25—30

43С (табл. 7.11)

[236]

paea1-rr

[235]

Nitrosospira brien-

SiS1' rr

25—30

43С (табл. 7.11)

[238]

Nitrospina gracilis1'ss

25—30

42С (табл. 7.11)

Sulfolobus acidocalda-

70

44С (табл. 7.11)

[193]

rias1' u

[231]

Thiobacillus thiooxi-

28—30

44С (табл. 7.11)

dans*

Thiobacillus thioparus*

28

46С (табл. 7.11)

[75]

XIII. Метанобразую- щие бактерии:

Methanobacterium ru-

39

46А (табл. 7.5)

[202]

minantiuni

[99, 210]

Methanococcus vannie-

37-42

47С (табл. 7.11)

lii=, *>«

[209]

Methanosarcina me-

30—37

47С (табл. 7.11)

thanica**' uu

XIV. Грамположи- тельные кокки:

Aerococcus viri- dans°' ww

30

ЗОА, 48С (табл. 7.4,

7.11)

[146]

Leuconostoc mesente- roidesxx

30

47А, 49С (табл. 7.5,

7.11)

[62]

Micrococcus luteus*

35

ЗОА, 50С (табл. 7.4,

7.11)

[1, 157]

Pediococcus cereui- siae°

30

48А, 51С (табл. 7.5,

7.11)

[94, 134]

Ruminococcus flavefa- ciensc

35—45

49А, 52С (табл. 7.5,

7.11)

[2, 3]

Sarcina ventriculi

30—37

50А, 53С (табл. 7.5,

7.11)

[28]

Staphylococcus aure-

US^

30—37

51В, 54С (табл. 7.6,

7.12)

[61, 136]

Streptococcus equinus^ zz

37

48А, 55С (табл. 7.5,

7.12)

[216]

Streptococcus faeca- lisxx

37

48А, 56С (табл. 7.5,

7.12)

[168]

Streptococcus pyoge- nesxx

34

52А, 57С (табл. 7.6,

7.12)

[143]

Продолжение табл. 7.1

Буквенно-цифровой

ная тем-

Источник дан-

Группа, род и виды °

пература роста, °C

ключ к среде

ных

XV. Палочки и кокки, образующие споры: Bacillus cereusxx

30—37

ЗОА, 58С (табл. 7.4,

[111]

7.12)

Bacillus subtilis1

37

ЗОА, 59С (табл. 7.4,

[111]

7.12)

Clostridium barken6

30

12А, 53А (табл. 7.2,

[208]

7.6)

Clostridium botuli-

30—40

ЗОА, 60С (табл. 7.4,

[108, 135]

num1

7.12)

Clostridium tetani0

37

12А, 61С (табл. 7.5,

[Ю5]

7.12)

Desulfotomaculum

55

54А (табл. 7.6)

[27, 164]

nigrificans6 Sporolactobacillus

35

55А, 62С (табл. 7.6,

[ПО, 110а]

inulinus0

7.12)

Sporosarcina ureae*

30

56А (табл. 7.6)

[227]

XVI. Грамположи-

тельиые палочко-

видные бактерии, не образующие спор:

ааа

Caryophanon latum*

26

63С (табл. 7.12)

Erysipelothrix rhusio- pathiae*

35

57А (табл. 7.6)

[90]

[40, 51, 81]

Lactobacillus acidophi-

37

58А, 64В (табл. 7.6,

lusxx‘bbb

7.12)

[40]

Lactobacillus bulgari-

37

58А, 64В (табл. 7.6,

cusxx-bbb

7.12)

Lactobacillus caseixx

37

58А, 65С (табл. 7.6,

[Ю7]

7.12)

[40, 168]

Lactobacillus delbrue-

37

58А, 64В (табл. 7.6,

с^цхх,ccc

7.12)

[40, 168]

Lactobacillus fermen-

37

58А, 64В (табл. 7.6,

tumxx’ ddd

7.12)

[195, 221, 222]

Lactobacillus hetero-

37

58А, 64В (табл. 7.6,

hiochiixx'bbb’еег

7.12)

Lactobacillus letch-

37

58А, 64В (табл. 7.6,

[40]

manniixx-bbb

7.12)

Lactobacillus planta-

37

58А, 64В (табл. 7.6,

[40]

rumXXi ddd

7.12)

Lactobacillus 30axx

40

59А, 66С (табл. 7.6,

[33 71]

7.12)

Listeria monocytoge-

37

12А, 67С (табл. 7.2,

[57, 241[

nes1

7.13)

Продолжение табл. 7.1

Оптималь-

Буквенно-цифровой

мая тем-

Источник

дан-

Группа, род н виды °

пература роста, °C

b ключ к среде

ных

XVII. Актиномицеты и

родственные им бактерии:

Actinobifida dichoto-

50—58

ЗОА (табл. 7.4)

[41, 116]

mica1

Actinomyces bovisc

37

60А (табл. 7.6)

[64, 89,

1601

Actinoplanes philippi-

24—26

61А (табл. 7.6)

[37, 220]

nensis1

Amorphosporangium auranticolor1

25—27

18—35

61А (табл. 7.6)

[42

Ampullariella regulars1

Arachnia propionicaxx

61А (табл. 7.6)

[42, 184]

37

60А (табл. 7.6)

[89, 160]

Arthrobacterter re-

20

62А, 68С (табл. 7.6,

[25, 173]

gens1

Bacterionema matru-

37

7.13)

63А, 56С (табл. 7.6,

[Ю2]

chotilxx' f4

36—38

7.12)

Bifidobacterium bifi-

ЗОА (табл. 7.4)

[197]

dumc- egg

Cellulomonas flavige-

30

64А (табл. 7.7)

[73

na‘

Corynebacterium bo-

37

ЗОА, 69С (табл. 7.4,

[196]

vis1- hhh

7.13)

Corynebacterium diph-

37

12А, 70С (табл. 7.2,

[149]

teriae1

7.13)

Dactylosporangium aurantiacum1

37

ЗОА, 71С (табл. 7.4,

[226]

7.13)

Dermatophilus congo- lensis1- xx

37

65А (табл. 7.7)

[66]

Eubacterium sabur-

37

12А (табл. 7.2)

[87]

reumc-111

Geodermatophilus

24—18

66А (табл. 7.7)

[132]

obscurus1

Kitasatoa purpurea1

27

61А, 72С (табл. 7.6,

[138,

66]

7.13)

Kurthia zopfii1

25

32А (табл. 7.4)

[60

Microbispora rosea1

67А (табл. 7.7)

[42

Microellobosporia ci-

26

69А, 73С (табл. 7.7,

[125

nerea*

7.13)

Micromonospora chai-

24—26

68А (табл. 7.7)

[95]

cea1

Micropolyspora brevi-

28—37

69А, 73С (табл. 7.7,

[125]

catena1

7.13)

Mycobacterium phlei1

28—45

70А, 74С (табл. 7.7,

[155]

7.13)

Продолжение табл. 7,1

Оптимальная тем-

Буквенно-цифровой

Источник дан-

Группа, род и виды °

пература

b ключ к среде

ных

роста, °C

Mycobacterium tuberculosis НЗ?'1 !ii

37

75В (табл. 7.13)

[118, 137]

ЗОА, 76С (табл. 7.4,

Nocardia asteroides*

37

[34]

7.13)

Pilimelia terevasa*

30

61А (табл. 7.6)

[10Ц

Ptanobispora longispo-

28—37

ЗОА, 72С (табл. 7.4,

[225]

ra*

7.13)

Propionibacterium

35

12А, 71А (табл. 7.2,

[147а, 148]

acnesc- kkk

7.7)

Propionibacterium freudenreichiic

30—37

ЗОА, 77С (табл. 7.4,

7.13)

Pseudonocardia ther-

40—50

ЗОА. 72А (табл. 7.4,

83]

mophila*

7.7)

[63]

Rothia dentocariosa*

35—37

52А (табл. 7.6)

Spirillospora albida*

25

61А (табл. 7.6)

[39]

Sporichthya polymor-

28—37

70А (табл. 7.7)

[

26]

phaxx Streptomyces albolon-

25—35

70А, 72С (табл. 7.7,

[228]

gus=

Streptomyces aureofa- ciens*- “‘

7.13)

61А, ЗОА (табл. 7.4,

[232]

7.6)

Streptomyces erythra- eus1' “‘

25

61А (табл. 7.6)

[232]

Streptomyces griseus*

25

ЗОА (табл. 7.4)

[232 [

Streptomyces nive- US*' “‘

Streptomyces noursei*

61А (табл. 7.6)

[232]

61А (табл. 7.6)

|232]

Streptomyces venezue- lae*

25-28

ЗОА, 72С (табл. 7.4,

[55, 232, 234[

7.13)

Streptosporangium ro- seum'

18-35

61А (табл. 7.6)

[38]

Streptoverticillium

27

ЗОА (табл. 7.4)

8)

baldaccii*

Thermoactinomyces

57

ЗОА (табл. 7.4)

[233]

vulgaris

Thermomonospora

50

67А (табл. 7.7)

[83]

curvata

XVIII. Риккетсии:ттт

Bartonella bacillifor-

28

12А (табл. 7.2)

[240]

mis*' nnn

Rickettsia quinta-

37

12А (табл. 7.2)

[152]

nal> 000

Группа, род и виды0

Оптимальная температура роста, °C

Буквенно-цифровой ключ к среде

Источник данных

XIX. Микоплазмы:ррр

Acholeplasma laidla-

37

ЗЗА, 78В (табл. 7.4,

[170, 171]

Wllxx* ggg Mycoplasma mycol-

33—37

7.13)

73А, 79В (табл. 7.7,

[77, 200]

des”.rrr

Spiroptasma citrixx

32

7.13)

74А (табл. 7.7)

[36]

Thermoplasma acidophilum1

59

75А (табл. 7.7)

[43, 201]

а Бактерии сгруппированы согласно 8-му изданию «Определителя бактерий Берги».

Состав сред, обозначенных с помощью буквенно-цифрового ключа, приведен в табл. 7.2—7.13. Комплексные, или неочищенные, среды обозначены буквой А, полусннтетические — буквой В и синтетические — буквой С.

с Анаэробы. Анаэробные условия создаются с помощью одного нз методов, приведенных в гл. 6.

Некоторым штаммам необходим витамин Bja (2 мкг на 1 л среды).

е Для этих видов используют модифицированную среду 41С (табл. 7.11), заменяя в ней интрнты на соли аммония; энергия поставляется при окислении NH3 до NO3~. Источником углерода является СОг, содержащаяся в атмосфере.

Если вместо малата используются другие источники углерода (например, этанол или бутират), то может понадобиться СО2.

^ R. molischianum и R. tenue растут также на среде 4С (Gibson, Tabita, Whitman, личное сообщение). Ни одни из этих штаммов не нуждается в биотине.

Нуждаются также в тиамине и никотиновой кислоте (1 мг каждого витамина на 1 л среды). На этой среде растет также R. capsulata (чья потребность в витаминах удовлетворяется только за счет тиамина) и R. рп- lustris. Последняя наряду с биотином нуждается в н-аминобензойиой кислоте (0,1 мг/л среды) (Whitman, Gibson, Tabita, личное сообщение).

Аэробы.

Для стимуляции и инициации роста необходим экстракт из бактериальных клеток.

S. hyalina [151] можно выращивать на синтетической среде с глюкозой, лактозой или сахарозой в качестве источника углерода, нитратами или солями аммония в качестве источника азота и в присутствии витаминов Bi н Bj2. Лучший рост достигается при использовании в качестве источника азота органических соединений, например глутамата нлн пептона.

Вместо биотина необходим витамин В12 (40 мкг/л).

^ Ко всем средам для С. halobacteroides необходимо добавлять NaCl до концентрации 2%.

п Потребность С. vtbrloides в витаминах удовлетворяется рибофлавином (100 мкг/л).

0 Микроа профили.

^ Источником углерода служит СО2 Перед разливом стерильного водного раствора агара, содержащего свежеосажденное FeS, среду аэрируют с помощью СО2 в течение 10—15 с FeS готовят, смешивая в кипящей дистиллированной воде эквимолярные количества сульфата аммония и железа(П) и сульфида натрия. Осадок несколько раз промывают стерильной дистиллиро-

Продолжение табл. 7.1

ванной водой, декантируя ее. FeS можно вносить не в агар, а на дно культуральной пробирки.

Необходима СО^; рост стимулируется гумусом или почвенным экстрактом.

Потребности в витаминах: кроме биотина необходимы тиамин (5 мг/л) и витамин В|2 (ОД мг/л).

Непатогенная форма вирулентной Treponema pallidum; вирулентную форму Т. pallidum не удалось культивировать in vitro.

£ Наибольший урожай клеток получают при забуфернванин среды 0,033 М К-2-гндрокснэтнлпнразнн-К'-2-этаисульфоновой кислотой (HEPES), пипера- зии-N, N'-бис (2-этанолсульфоновой кислотой) (PIPES) или И-трис(гидрокси- метнл)метнл-2-амнноэтансульфоновой кислотой (TES) или периодическим добавлением NaHCOa. Попытки вырастить микроорганизм на полностью синтетической среде не увенчались успехом. Концентрацию дрожжевого экстракта можно уменьшить до 0,05%, но исключать его совсем нельзя. Потребности в витаминах (биотине, рибофлавине и витамине Вр), вероятно, больше, чем было показано ранее, так как в используемой среде содержится 0,5%-ный дрожжевой экстракт — богатый источник витаминов. (HEPES и другие реактивы получены от фирмы Sigma или Calbiochem.)

и Известна также синтетическая среда, поддерживающая рост этого микроорганизма в микроаэробных условиях [18].

Для Agrobacterium rubi необходимы также пантотенат (100 мкг/л) и никотиновая кислота (100 мкг/л). A. tumefaciens хорошо растет без этих добавок на синтетической среде с NH4CI и глюкозой.

w В дефицитной по азоту среде эти микроорганизмы фиксируют молекулярный азот, для чего необходимы следы молибдата. A. chrococcum в качестве источника азота использует также аммиак, нитрат и аминокислоты.

х Крайне устойчив к изменению pH (растет в диапазоне pH от 4 до 10).

Картофельную кожуру (125 г) кипятят в смеси глицерина с водой до того момента, когда она станет мягкой. Смесь фильтруют через марлю, выдерживают до тех пор, пока прошедший раствор не Станет прозрачным н декантируют его. Затем добавляют соль и доливают водой до 1 л. Добавляют 15 г агара н нагревают до его полного растворения. Стерилизуют в 250-мнллнтровых колбах; к каждым 250 мл основного агара добавляют с соблюдением правил асептики 50 мл дефибринированиой овечьей крови и перемешивают. Для получения жидкой среды агар не добавляют.

z Эта среда поддерживает также умеренный нли слабый рост штаммов В. suis и В. abortus. Для культивирования этих видов подходит бульон для бруцелл [127].

аа К автоклавированной н охлажденной среде добавляют с соблюдением правил асептики 25 мл эритроцитарной массы из крови человека нли 50 мл дефнбриннроваиной кроличьей крови.

Клетки растут в атмосфере, состоящей на 40% из метана и на 60% из воздуха; вторым известным источником углерода является метанол.

^Только 6 из 146 испытанных соединений служат источниками углерода. Это Р-окснбутнрат, ацетат, бутират, валерат, пируват и сукцинат.

^^ Для роста требуется лишь несколько углеводов как источников углерода. Необходимая аминокислота — метионин.

ее Углеводы (в том числе глюкоза) не используются в качестве источника углерода; однако таким источником служат многие органические вещества (например, насыщенные днкарбоновые кислоты, гликолат и тестостерон).

Рост некоторых штаммов стимулируется метионином (0,02%) н глутаминовой кислотой (0,1%) (нли они нуждаются в инх), другим необходима никотиновая кислота (100 мкг/л). Потребность в биотине не обнаружена. Все Другие потребности в питательных веществах сходны с потребностями Agrobacterium rhizogenes [46].

^ Рост зависит от повышенной влажности атмосферы [198, 199]. Аденин, аденозин, рибофлавин и флавинаденннмононуклеотнд обладают выраженным ннгнбнрующнм действием.

^^ Из аминокислот необходим только метионин, однако другие аминокислоты стимулируют рост. Потребность в метионине удовлетворяется его D- илн

Продолжение табл. 7.1

L-изомерами или частично витамином В12. Рост на полностью синтетической среде хуже, чем на среде с дрожжевым экстрактом.

и В питательный агар добавляют сахарозу (5%).

^ Клетки растут на цитратной среде Козера, которая содержит те же компоненты, что н синтетическая среда. Среда Козера производится фирмой Difco.

К питательному бульону, используемому для приготовления жидкой среды, добавляют 10%-ную сыворотку. Рост иа твердой среде улучшается при повышенной влажности.

Аэроб, но некоторые штаммы растут и в анаэробных условиях.

тпг Анаэробные условия достигаются пропусканием аргона. Выход биомассы и скорость роста на синтетической среде вдвое меньше, чем на комплексной. Добавление витаминов н других факторов не способствует улучшению роста иа синтетической среде.

пп Основные культуры сохраняют на среде с агаром, содержащей 40% рубцовой жидкости, глюкозу, целлобиозу и крахмал.

оо Синтетическая среда отличается от вышеупомянутой тем, что в пей используют 0,02 М фосфатный буфер и иные, чем D-глюкоза, источники углерода. Источниками углерода служат ацетат, бутират, спирты, аминокислоты, пентозные сахара, углеводороды н соединения ароматического ряда.

РР Среда отличается от вышеупомянутой присутствием аминокислот (см. сноску w в табл. 7.10). Лактат н сукцинат являются основными источниками углерода и энергии для В. catarrhalis.

^ В отношении потребностей питания N. gonorrhoeae существуют самые различные данные. Известно много природных вариантов; кроме того, у этих бактерий легко возникают мутации. Частые пересевы в лабораторных условиях приводят к появлению менее требовательных к среде штаммов, которые отличаются генетически от исходных нзолятов (Lankford, личное сообщение).

гг Окисляет аммиак до нитрита и фиксирует COj; не растет в морской воде.

55 Значительно ингибируется большинством органических веществ в концентрациях 10—3 М.

^ S. acidocaldarius является факультативным автотрофом; он растет быстрее на среде, содержащей минеральные соединения н 0,1%-ный дрожжевой экстракт, чем на среде, содержащей серу.

ии Исследования проводились иа слегка загрязненной культуре; попытки дальнейшей очистки не предпринимались нз-за очень низкой скорости развития Methanosarcina. [В настоящее время чистые культуры Methanosarcina получены в работе Balch et al, Microbiol. Rev., 4 3, 260, 1979). — Прим, ped.] Вероятно, авторы считали, что загрязнение не влияло на результаты экспериментов.

На 1 л основной среды добавляют 15 г формиата натрия и (после автоклавирования) стерильный раствор, содержащий 0,5 г пирувата калия. Джоунс и Стэдмэн [99] рекомендуют добавлять к среде селенит (1 мкМ) и вольфрамат (100 мкМ).

Добавляют глюкозу до концентрации 0,5%.

^Факультативный анаэроб,

УУ Штаммы варьируют от факультативных анаэробов до аэробов.

^Согласно неправильной классификации [139], ранее известен как Leu conostoc mesenteroides Р-60.

йааКе1е, McCoy, Bacteriol. Proc., p. 66, 1970

^^^ Для лучшего роста на 1 л среды 58А добавляют следующие компоненты* 300 мг аскорбиновой кислоты и 5 мл твнна 80.

ссс По крайней мере для одного штамма L. delbrueckii (а имеиио для L. delbrueckii 730) нужны также пиридоксаминфосфат (0,002 мг/л) и тимидни (4 мг/л).

^^ Вместо пантетеина добавляют 20 мкг пантотената кальция.

Продолжение табл. 7.1

^^В отсутствие ацетата этот микроорганизм нуждается в факторе роста, названном мевалоновой кнслотон (поставляется в форме лактона фирмой Sigma Chemical Со.). Его добавляют к среде в концентрации I мкг/л.

•^ Гемин (0,2 мг/л), а также СО2 стимулируют рост в анаэробных условиях.

^^^ Для роста необходима СО2.

Бее штаммы С. bouts нуждаются в ненасыщенных жирных кислотах с длинной цепью, пальмитоолеиновой, рицииолевой илн олеиновой. Эта по* требиость эффективно восполняется 0,1%-ным твииом 80.

111 Для продолжительного поддержания культуры нужен кровяной агар. В качестве жидкой среды рекомендуется питательный бульон, обогащенный 0,3%-ным дрожжевым экстрактом, 0,1%-ным солянокислым цистеином, 1%-иой глюкозой и 5%-иой асцитической жидкостью человека. В случае другого штамма Eubacterium при добавлении субстратных количеств аргинина к основной среде с пептоном рост значительно стимулируется [207].

^Род включает в себя паразитов, сапрофитов и промежуточные формы. Сапрофитные штаммы растут на простых средах, а остальные — иа более сложных нли требуют добавок, например микобактина. Некоторые штаммы культивируются только иа живых клетках. Все штаммы на любой среде растут медленно.

ккк

Все жидкие среды кипятят в течение 10 мин и перед инокуляцией быстро охлаждают. Все культуры инкубируют в анаэробных условиях в атмосфере, состоящей нз 80% N2, 10% Н2 и 10% СО2.

Бактерии растут на среде Чапека без пептона.

тптпт 5актерИИ (Кроме отдельных, которые отмечены) являются облигатными паразитами н жизнеспособны только в животных клетках. Их можно выращивать в эмбриональных желточных мешках цыпленка н в культурах тканей позвоночных.

ппп Культивируются in vitro на искусственных средах. Для роста необходима сыворотка и желателен гемоглобин. В некоторых случаях стимулирующий эффект оказывают глутатион и аскорбиновая кислота. Чаще всего их выращивают на полужидких средах с 1%-ным агаром, ио онн могут также расти на твердой среде типа кровяного агара. В. bacilliformis растет в культуре тканн первичных эксплантатов легких, костного мозга илн селезенки крыс и морских свинок, а также на хорноаллантоисной и желточной жидкостях зародыша цыпленка. Оптимальное значение pH культуральной среды 7.8.

000 К основному кровяному агару добавляют гемин (40 мкг/л) или гемоглобин (1 мг/л) и инкубируют в атмосфере, содержащей 95% воздуха н 5% СО2. Необходимо также присутствие детокенкаитов типа бычьего альбумина (2 г/л), крахмала (2 г/л) или активированного угля (0,2 г/л).

РРР Более полная информация о питании этой группы бактерий дана в обзоре [169].

^^ Бульон нз экстракта сердечной мышцы обогащен 20%-пой стерильной (нагретой до 56 °C в течение 30 мин) лошадиной сывороткой и 10%-ным свежим раствором дрожжевого экстракта (25 г дрожжевых клеток на 100 мл раствора).

ттт Для роста всех штаммов необходимы стероиды и жирные кислоты с длинной цепью.

Компоненты

Количество (в единицах, указанных в колонке 1) иа 1л среды

1Ва

2А

ЗА

..Ь 4А

5АС

5B<Z

6В

7В

8А

9А

10Ае

ПА6

12А

Глюкоза? (г)

Глицерин (г)

1,0

1,0

5,4

1,0

10

1,0

(NH4)2SO4 (г)

KNO3 (г)

1.0

0,5

0,1

0,5

Na2HPO4 (г)

5,24

1,74

КН2РО4 (г)

1,13

1,4

0,04

2,77

1,06

КгНРО4 (г)

1,0

0,48

0,5

0,25

0,04

MgSO4-7H2O

0,5

1,0

0,5

0,1

1,0

3,0

0,075

0,1

NaCl (г) СаС12-2Н2О (г)

0-30

0,2

0,1

1,0

0,05

FeSO4-7H2O (мг) Микроэлементы

0,5

Даб

Да®

Витамины

Мясной экстракт (г)

1,0

Дал

Да-

0,05

Дрожжевой экстракт

3,0

1,0

5,0

1,0

(г)

Кислотный гидроли-

1,0

зат казеина (каза- миновые кислоты; г)

Ферментативный гид-

20

0,5

10

5,0

ролизат казеина

(казитои; г)

Пептон (г)

3,0

1,0

0,5

1,0

0,05

Таблица 7.2. Состав комплексных (А) и полусинтетических (В) сред №1—12 для бактерий, перечисленных в табл. 7.1

ЧАСТЬ И. РОСТ

Триптон (г)

Специальная

pH

среда

6,8

7,0 7,0

5,0

7,0

°ЫаНСОз (2 г/л) служит источником СОз, a N2S-9H2O (1 г/л) используется как восстанавливающий агент н источник серы. Для обеспечения микроэлементами вместо дистиллированной воды пользуются водопроводной.

^Вместо дистиллироваионй воды следует пользоваться водопроводной.

^Для морских штаммов используют профильтрованную морскую воду; вместо нее можно применять имеющийся в продаже заменитель морской воды или смесь следующих солей (на 1 л): 25 г NaCl, 5 г MgSO4-7H2O, 1 г СаС12-2Н2О и 0,1 г КС1. Добавляют также глицерофосфат натрия (0,1 г/л) и трис-буфер (Sigma; 1 г/л).

Среду используют для пресноводных штаммов. К среде добавляют глицерофосфат натрия 60,1 г/л) и трис-буфер (Sigma; 1 г/л).

20 мл основного раствора Хатнера, не содержащего витаминов. Этот раствор, модифицированный Коэи-Базаер и др. [35], содержит следующие компоненты: 10 г ннтрилотриук- сусиой кислоты (растворенной и нейтрализованной с помощью КОН); 14,45 г MgSO4-7H2O; 3,33 г CaCh-2H2O; 9,25 мг (NH4)eMozO24'24H2O; 99 мг FeSO4-7H2O; 50 мл смеси металлов № 44 (см. ниже). Объем доводят дистиллированной водой до 1 л, pH среды устанавливают 6,6—6,8. Смесь № 44 содержит в 100 мл: 250 мг этнленднамнитетрауксусной кнс- *оты; 1,095 мг ZnSO4-7H2O; 500 мг FeSO4-7H2O; 154 мг MnSOrH2O; 39,2 мг CuSO4-5H2O; 24,8 мг Со(МОз)2-6Н2О

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

и 17,7 мг NaaBtOylOHiO. Чтобы не выпадал осадок, добавляют несколько капель 6 н. H2SO«.

•^Для большинства сред рекомендуется глюкозу стерилизовать отдельно автоклавированием или фильтрованием через соответствующие мембраны и затем добавлять ее с соблюдением правил асептики к другим стерильным компонентам среды.

^На 1 л среды добавляют 1 мл раствора, содержащего следующие микроэлементы: растворимые соли В, Fe, Мп (каждого элемента по 0,5 мг/л) и растворимые соли Со, Си, Mo. Zn (каждого элемента по 0,01 мг/л).

* Добавляют солянокислый тиамин (1 мг/л) и витамин Би (1 мкг/л).

Добавляют витамин Б12 (500 мкг/л).

Суспендируют 40 г кровяного агара (имеется в продаже) в 1 л дистиллированной воды, доводят до кипения, автоклавируют, охлаждают и к еще не застывшей смеси добавляют с соблюдением правил асептики 5%-ную стерильную дефнбриннрованиую кровь. Состав основного кровяного агара: 500 г экстракта сердечной мышцы крупного рогатого скота, 10 г триптозы (Difco), 5 г хлористого натрия и 15 г агара (Difco). К 1 л среды добавляют 10 г янтарной кислоты.

В процессе инкубации Leptothrix ochracea величину pH поддерживают около 7, добавляя к среде стерильный раствор 0,5 и. NaOH.

Компоненты

Количество (в единицах, указанных в колонке 1) на 1 л среды

13В*

UA6

15АС

WA*-^

17А^

ISA^

19А*’Р

20 А*,Л

21 а'

22В

2зд7

24А

Глюкоза4 (г)

Глицерин (г)

0,1

5,0

5,0

1,0

100

20

25

1—3,0

10

(NH4)2SO4 (г) KNOs (г)

0,25

1,0

0,1

2,5

1,0

0,6

0,45

Na2HPO4 (г)

1.0

0,21

5,24

КН2РО4 (г)

0,3

0,05

0,09

2'77

К2НРО4 (г)

0,05

MgSO4-7H2O (г)

1,0

20

0,2

0,1

MnSO4-H2O (г)

NaCI (г)

1,0

2,5

5,0

0,002

5,6

5,0

0,005 120

СаС122Н2О (г)

0,2

10

FeSO4-7H2O (мг)

2,0

5,0

1,0

Микроэлементы

Да2

Дат

Витамины

Да"

Па0

Дрожжевой экстракт (г)

Кислотный гидролизат

5,0

2,0

2,0

2,0

5,0

15

5,0

1,0

3,0

казеина (казаминовые кислоты; г)

Ферментативный гидролизат казеина (кази- тон; г)

Пептон (г)

15

2,0

10

pH

7,4

7,4

7,6

7,0

5,4—6,3

7,0

6,8

6,8—7,0

7,0

6,8

7,5

228

Таблица 7.3. Состав комплексных (А) и полусинтетических (В) сред № 13—24 для бактерий, перечисленных в табл. 7.1“

ЧАСТЬ И. РОСТ

ю ю <ою ю <о•ч•ч. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ю ю <о

ю ю <о

•ч

•ч

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

а Готовые среды, имеющиеся в продаже, отмечены звездочкой.

Среда содержит также 0,75 г солянокислого цистеина « 0,5 г тногликолата натрия. К 9 мл стерильной основной среды добавляют 1 мл кроличьей сыворотки, простерилизо- ваииой фильтрованием.

На 1 л среды добавляют 0,5 г тногликолата натрия. Бактерии лучше всего растут прн забуфериваиии среды 0,033 М М-2-гидрооксиэтилпиперазин-М'-этаиолсульфоновой кислотой (HEPES), N-тpнc(гидpoкcнмeтнл)•мeтил-l2-aмииocyльфoиoвoй кислотой (TES), пнперазин-Н,М-бис(2-этанолсульфоновой кислотой) (PIPES) илн прн периодическом добавлении ЫаНСОз. Буферы производят фирмы Calbiochem и Sigma.

^Дополнительные компоненты: 0,1 г NaHSOs, 10 г пептического гидролизата животной ткани (USP*), 10 г панкреатического гидролизата казеина (USP*). Среда продается под названием «бульон для бруцелл».

5Для выращивания Campylobacter к «бульону для бру- целл»* добавляют 0,16% агара для создания частично анаэробных условий.

■^Добавляют янтарную кислоту (10 г/л).

^Добавляют СаСОз (30 г/л).

Объединяют перечисленные компоненты со следующими: солянокислым цистеином (I г); панкреатическим гидролизатом сердечной мышцы* (3 г); папаиновым гидролизатом соевой муки* (10 г); солянокислым тнамнном (0,05 мг). Объем доводят до I л.

На 1 л среды добавляют 2 г сукцината натрия и 0,5 г цитрата натрия.

■^20 мл безвитамннной минеральной среды Хатнера. Для модификации этой среды, согласно пропнсн Коэн-Базир н др. [35], добавляют следующие компоненты: 10 г ннтрилотриук- сусной кислоты (растворенной н нейтрализованной КОН); 14,45 г MgSO4-7H2O; 3,33 г СаС12-2Н2О; 9,25 мг (МН4)бМо?О24-24 Н2О; 99 мг FeSO4-7H2O; 50 мл смеси метал

лов № 44 (см. ниже). Дистиллированной водой объем доводят до 1 л и устанавливают pH 6,6—6,8. Смесь металлов № 44 содержит (иа 100 мл); 250 мг этилендиаминтетрауксус- ной кислоты; 1,095 мг ZnSO4-7H2O; 500 мг FeSO4-7H2O; 154 мг MnSO4 H2O; 39,2 мг CuSO4-5H2O; 24,8 мг Со(МОз)2-6Н2О;

17,7 мг Na2B4O;*10H2O. Чтобы предотвратить выпадение осадка, добавляют несколько капель 6 я. H2SO4.

Для большинства сред рекомендуется стерилизовать глюкозу отдельно от других компонентов среды и затем добавлять ее с соблюдением правил асептики. Глюкозу стерилизуют автоклавированием или фильтрованием через соответствующие мембраны.

^На 1 л среды добавляют: 0,05 мг CoSO4-7H2O; 0,2 мг Na2MoO4-2H2O; 0,2 мг ZnSO4; 0,01 мг CuSO4-5H2O.

mHa 1 л среды добавляют: 50 мкг Си (в виде CuSO4-5H2O); 10 мкг В (в виде Н3ВОз); 10 мкг Мп (в виде MnSO4-4H2O); 70 мкг Zn (в виде ZnSO4-7H2O); 10 мкг Мо (в виде МоОз).

л Добавляют 5 мг солянокислого тиамина. К 9 частям стерильной основной среды добавляют одну часть стерилизованной ультрафильтроваиием смеси альбумина с жирными кислотами* следующего состава: 20 г фракции V бычьего альбумина, 0,01 г СаС12-2Н2О, 0,01 г MgCl2-6H2O, 8 мг ZnSOi-7H2O 0,6 мг CuSO4-5H2O, 0,1 г FeSO4-7H2O, 0,4 мг витамина В12, 2,5 мл твнна 80. Дистиллированной водой объем доводят до 200 мл.

^Добавляют кальциевую соль пантотеновой кислоты (0,2 г/л). Для роста необходимо также иеидентнфицнрован- ное вещество, экстрагированное из агара (3 мл/л, 90 мг твердого субстрата). Витамин не нужен. На комплексных средах бактернн не растут.

^Добавляют картофельный экстракт, приготовленный следующим образом. Картофель очищают от кожуры н нарезают ломтями. Добавляют к нему глнцернн с водой н варят до состояния мягкости; затем фильтруют, оставляют стоять на некоторое время и надосадочную жидкость декантируют.

Компоненты

Количество (в единицах, указанных в колонке 1)

на 1 J

среды

25 А 6

26А

27 А

28А

iSkc-d

ЗОА

31 А*

32А

ЗЗА*

34Ае

35а'

36 А^

37АЙ

Глюкоза1’ (г)

1,0

2,0

1,0

2,0

3,0

3,0

(NH4)2SO4 (г)

Na2HPO4 (г)

2,5

0,45

4,0

КН2РО4 (г)

0,9

2,7

ю

MgSO4-7H2O (г)

0,02

0,2

8

MnSO4 H2O (г)

0,01

NaCl (г)

5,0

5,0

10

30

5,0

5,0

5,0

5,0

1,0

0,9

СаС12-2Н2О (г)

0,02

Дрожжевой экстракт (Г)

5,0

3,0

3,0

2,0

5,0

Пептон (г)

Триптон (г)

17

8,0

10

20

10

10

2

5,0

Питательный бульон* (г)

8,0

16

Специальные среды

Да'

Дай

pH

7,1

7,0

7,0

6—9

7,0

7,3

7,0-8,0

7,4

6,8

7,0

6,7

6,6—6,9

Таблица 7.4. Состав комплексных сред (А) № 25—37 для бактерий, перечисленных в табл. 7.1“

ЧАСТЬ И. РОСТ

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

^Готовые среды, имеющиеся в продаже, отмечены звездочкой.

На 1 л среды добавляют 10 г лактозы, 3 г протеозопеп- тоиа, 1,5 г желчных солей.

^Для морских штаммов пользуются профильтрованной морской водой или ее заменителем (имеется в продаже) или же смесью следующих солей (г/л): NaCl (25); MgSOrTHaO (5); СаС12-2Н2О (1) и КС1 (1). Добавляют также глицерофосфат натрия (0,1 г/л) и трис-буфер (Sigma, 1 г/л).

Протеозопептои (5 г/л).

е Растворяют 6,05 г триса и 5,8 г яблочной кислоты в воде и доводят pH до 6,8 с помощью NaOH.

Непосредственно перед экспериментом к другим компонентам среды добавляют отдельно стерилизованные растворы L-аскорбиновой кислоты (0,1 г) и L-цнстииа (0,1 г). L-аскор- бииовую кислоту стерилизуют фильтрованием, а L-цистии фильтрованием или автоклавированием.

ьэ ^ К другим компонентам среды добавляют 200 мл освет- £5 ленной рубцовой жидкости (см. ниже), 2 г триптиказы (BBL) и 1 мг гемииа. Устанавливают pH 6,7, объем доводят водой до 1 л и автоклавируют. Непосредственно перед экспериментом к автоклавированной среде добавляют стерильные растворы Ь-цистеина-НСЬНгО (0,5 г) н Ыа2СОз (4 г).

Культуры инкубируют в атмосфере, содержащей СО2. Осветленную рубцовую жидкость готовят из свежесобраииой рубцовой жидкости коровы, содержащейся на рационе из сена. Жидкость фильтруют через марлю и дают ей отстояться, после чего прозрачную надосадочиую жидкость центрифугируют 20 мии при 14 000 об/мин [21].

К среде добавляют 17,8 г Na2SO4.

I rr X

Для большинства сред рекомендуется стерилизовать глюкозу отдельно (автоклавированием или фильтрованием через соответствующие мембранные фильтры), а затем с соблюдением правил асептики добавлять ее к другим компонентам среды.

3 Для приготовления шоколадного агара к триптиказово- му соевому бульону* добавляют 3% (вес/объем) дрожжевого экстракта и 1% агара. После стерилизации в бульон вносят дефибринированную овечью кровь (конечная концентрация 4%), инкубируют среду около 15 мин при 70 °C, охлаждают ее до 50 °C и добавляют IsoVitaleX* (5 мл/среды) и СаС12 (конечная концентрация 0,5 мМ).

к л

Агар готовят иа экстракте из сердца крупного рогатого скота: 450 г сердечной мышцы, лишенной жира, измельчают и выдерживают в воде в течение ночи при 4—6 °C, добавляют пептон и NaCl, как указано выше, кипятят 30 мии, фильтруют, объединяют с растворенным агаром (2% в готовой среде), доводят pH до 7,4 и автоклавируют.

Количество

(в единицах.

указанных в

колонке 1) на 1 л среды

Компоненты

38Аа

39А*

40АС

41А^

42 А^

43В/

44А^

45АЛ

46А1

47А^

48А*

49А

50А

Глюкоза' (г) (NH4)2SO4 (г) КМО3 (г) Na2HPO4 (г) КН2РО4 (г) К2НРО4 (г) MgSO4-7H2O (г) g MnSO4-H2O (г)

NaCl (г) СаС12-2Н2О (г) FeSO4-7H2O (мг) Микроэлементы Аминокислоты Витамины

Мясной экстракт (г) Дрожжевой экстракт

Кислотный гидролизат казеина (каза- миновые кислоты; г)

Ферментативный гидролизат казеина (казитон; г)

Пептон (г)

5,0

1,0 5,0

3,0

1,0

10

5,0

15

1,0

5,0

10

2,0

5,0

0,074

3,0

5,0

2,25 0,75

0,096 0,001

0,002 2,0 Да™ Да" Да°

20

0,5

0,5

0,3

4,0

5,0

2,89

1,0 1,0 0,1

2,0 0,1

10

0,2 0,05

10 5,0

10

10

2,5

10

10

20

2,0

Таблица 7.5. Состав комплексных (А) и полусинтетических (В) сред № 38—50 для бактерий, перечисленных в табл. 7.1

ЧАСТЬ II. РОСТ

Триптон (г) Специальные среды pH

° Добавляют следующие компоненты: 0,5 г цистеи- на-НСЬН2О, 2г растворимого крахмала, 10 г протеозопепто- на, 50 мл стерильной сыворотки. Инкубируют в атмосфере, содержащей 90% N2 — 10% СО2.

К перечисленным компонентам добавляют следующие: 0,05 г цистеина-НСЬН2О, 2 г тиогликолата натрия, 1 г натриевого формальдегидсульфоксилата, 10 г протеозопептоиа и 0,02 г гемина. Для первичного выделения этих бактерий необходима 5%-ная концентрация СО2.

с На 1 л среды добавляют 0,5 г цистеина-НС1-Н2О и 10 г триптиказы (BBL). Смесь инкубируют в атмосфере 95% М2 — 5% СО2.

^Требуются комплексные среды. Кроме вышеупомянутых компонентов среда содержит 1—3 г бутирата, 30 мг олеино- 8 вой кислоты, экстракт из сердечной мышцы крупного рога- со того скота (25 г) и овечьей сыворотки (100 мл).

^Глутамат натрия (10 мг/л) и рибонуклеиновая кислота (250 мг/л).

•^На 1 л среды добавляют пурины и пиримидины: по 10 мг гуанина, урацила и гипоксаитнна. Культуры на твердых средах инкубируют в анаэробных сосудах, через которые продувается смесь 95% N2 — 5% СО2.

£ На 1 л среды добавляют 0,3 г тиогликолевой кислоты, 20 г растворимого крахмала, 13 г DL-лактата натрия. Инкубируют в атмосфере с 5% (или больше) СО2; остальной газ может быть Н2.

^ На 1 л среды добавляют 10 г 85%-ной молочной кислоты, 0,75 г тиогликолата натрия, 0,1 г твнна 80 и 10 г триптиказы. pH среды доводят с помощью твердого К2СО3.

Добавляют 6 г NaHCOa и рубцовую жидкость до концентрации 30%. Инкубируют в атмосфере, содержащей 80% Н2 и 20% СО2. В качестве источника углерода можно ис-

№7,4№7,47,07,07,4 6,6 6—8 6,77,4 6,6 6—8 6,75,55,5Да»7,0Да»7,0пользовать ацетат. Для некоторых штаммов необходимы 2-метил-н-бутират, несколько аминокислот и неидентифициро- ваиный витаминоподобиый фактор роста, содержащийся в рубцовой жидкости.

№

7,4

№

7,4

7,0

7,0

7,4 6,6 6—8 6,7

7,4 6,6 6—8 6,7

5,5

5,5

Да»7,0

Да»7,0

На 1 л среды добавляют 5 г цитрата аммония, 2 г ацетата натрия и 1 г твина 80.

Добавляют ацетат калия до концентрации 0,25%.

^Для большинства сред рекомендуется стерилизовать глюкозу (автоклавированием или фильтрованием через соответствующие мембранные фильтры) отдельно от других компонентов, а затем объединять их с соблюдением правил асептики.

На 1 л среды добавляют по 1 мг СоС1г6Н2О, УЗОгУНгО, ZnSO< и NaMoO^HaO, 0,5 мг CuSO4-5H2O и 20 мг иитрилотриуксусной кислоты.

^ОЬ-триптофан (100 мг/л), солянокислый L-цистеин (350 мг/л).

0 На 1 л среды добавляют по 1 г солянокислого пиридоксаля и кальциевой соли пантотеновой кислоты, по 50 мкг солянокислого тиамнна, ниацина и рибофлавина, 10 мкг n-аминобеизойной кислоты, 2 мкг биотина и по 1 мкг фолиевой кислоты и витамина Вп-

^Экстракт из сердца и мозга (37 г/л; имеется в продаже).

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫОчень хорошо растут на бульоне или агаре, приготовленном на осветленной рубцовой жидкости с целлюлозой. Осветленную рубцовую жидкость готовят из свежесобраниой рубцовой жидкости коровы, рацион которой состоит из сеиа люцерны. Раствор фильтруют через марлю и оставляют стоять на некоторое время, после чего прозрачную надосадочную жидкость центрифугируют 20 мин при 14 000 об/мин [2Ц.

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Компоненты

Количество (в единицах, указанных в колонке 1) на 1 л среды

51ВЙ

52А

53А*

54Ас

55А»

56А

57 А^

58а/

59А^

60АЛ

61А‘

62А^

63А

Глюкоза* (г) (NH4)2SO4 (г) KNO3 (г) Na2HPO4 (г) КН2РО4 (г) К2НРО4 (г) MgSO4-7H2O (г) го MnSO4-H2O (г) “ NaCl (г)

СаС12-2Н2О (г) FeSO4-7H2O (мг) Микроэлементы Аминокислоты Витамины

Мясной экстракт (г) Дрожжевой экстракт

10

7,0 0,5

5,5 0,1

2,0

Да* да™ Дар

18

8,7

8,7

0,04

0,04

0,008 0,08

0,008

Да"

10

10

1,5

10

10

12,7

4,5

0,4

5,0

12

30

1,0

0,2 0,002

Да»

3,0

2,5

10

3,3

3,3 0,4

0,02 0,2

20

Да0 Даг

10

5,0 1,0

15

0,2 0,0015

0,02 40

Да*

1,0

3,0

1,0 0,5

0,5

10

1,0

2,0 0,2

10

1,0

1,0—2,0

Кислотный гидролизат казеина (каза- мииовые кислоты; г) Ферментативный гидролизатказеина

(казитон; г)

Пептон (г)

3,0

20

5,0

10

5,0

4,0

7,5

4,0

20

2,0

Таблица 7.6. Состав комплексных (А) и полусинтетических (В) сред № 51—63 для бактерий, перечисленных в табл. 7.1

ЧАСТЬ II. РОСТ

Специальные среды pHСпециальные среды pH7,47,4Да'7,4Да'7,47,27,2

Специальные среды pH

Специальные среды pH

7,4

7,4

Да'

7,4

Да'

7,4

7,2

7,2

° Другие компоненты, которые являются необходимыми или оказывают стимулирующее действие (мг/л): ацетат натрия (820); урацил (112); ксантин (152) н аденин ((35).

6 На 1 л среды добавляют 400 мг ЫаНСОз.

с На 1 л среды добавляют 1,5 г Na2SO4. Воду берут ие дистиллированную, а водопроводную. Глюкозу можно заменить лактатом натрия (3,5 г). Если в среде присутствует пируват (в качестве субстрата), то сульфат добавлять не нужно.

*^На 1 л среды добавляют 10 г ацетата натрия.

е На 1 л среды добавляют 1 г цитрата натрия, 0,3 г тио- гликолата натрия, 0,06 г олеата натрия и 3 г сапонина.

7" Большинство молочнокислых бактерий можно поддержи- ьф вать путем ежемесячных пересевов в столбиках с 2%-ным агаром, приготовленным на данной среде. Все компоненты автоклавируются вместе. К жидкой культуре следует добавить неорганические соли, перечисленные в табл. 7.14. Обратите внимание, что количество солей приводится на 1 л среды с двойной концентрацией.

^На 1 л среды добавляют следующие компоненты: 10 г сахарозы, 1,5 г ацетата калия и 0,5 г аскорбиновой кислоты. Среду используют для получения как посевного материала (инокулята), так и биомассы. Добавив к среде 1,5—2% агара, ее используют для поддержания роста микроорганизмов, пересевая каждые 2 нед в столбики. Все компоненты автоклавируют вместе.

ЛНа 1 л среды добавляют также 1 г цистеииа-НС1, 1 г рас- гворимого очищенного крахмала, 1,5 мг NaMoOr2H2O, по 20 мг адениисульфата урацила, ксантина и тимииа, 100 мкг СоА и 1 мг олеиновой кислоты. На этой среде хорошо растут штаммы Actinomyces israelii, A. bovis и некоторые виды Corynebacterium, Lactobacillus bifidus и Leptotrichia bucca- lis. Крахмал суспендируют в небольшом количестве холодной воды, вносят суспензию в кипящую воду и затем добав-

8,8 7,8—8,1 7,08,8 7,8—8,1 7,07,27,26,86,8Да“Да“ляют остальные компоненты среды, кроме глюкозы, которую автоклавируют отдельно. Эта среда пригодна также для поддержания культуры. Для столбиков используют 0,7%-ный агар.

8,8 7,8—8,1 7,0

8,8 7,8—8,1 7,0

7,2

7,2

6,8

6,8

Да“

Да“

1 Добавляют 30 г сахарозы.

•^На 1 л среды добавляют также 1 г кислого цитрата аммония и 100 мкг terregens-фактора.

* Для большинства сред рекомендуется стерилизовать глюкозу отдельно от других компонентов среды (автоклавированием или фильтрованием через соответствующие мембранные фильтры), а затем добавлять ее с соблюдением правил асептики.

На 1 л среды добавляют 1 мг цитрата железа.

m На 1л среды добавляют 100 мг Ь-цистеина-НС! и 50 мг DL-триптофана.

л На 1 л среды добавляют 0,5 г цистеина *НС1.

° На 1 л среды добавляют 1 г гистидина -HCbHtO.

Р На 1 л среды добавляют 1 мг никотиновой кислоты, 1 мг солянокислого тиамина и 1 мкг биотииа.

^ На 1 л среды добавляют 0,5 мг рибофлавина, 1 мг тиамина и 1 мг пантотената кальция.

г На 1 л среды добавляют 16,5 мкг солянокислого пирид- оксамина.

5 На 1 л среды добавляют: 2 мг тиамниа-НС1, 1 мг пи- ридоксинаНС!, 0,5 мг пиридоксамина-2НС1, 0,5 мг пиридокса- ля-НС1, 2 мг пантотената кальция, 2 мг рибофлавина, 1 мг никотиновой кислоты, 1 мг никотинамида, 100 мкг п-амино- бензойиой кислоты, 50 мкг биотина и 50 мкг фолиевой кислоты.

^Концентрат бульона из мозга и сердца, 37 г/л.

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫп Концентрат бульона из мозга и сердца (18,5 г/л) (имеется в продаже) и гемин (250 мкг/л).

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Компоненты

Количество (в единицах, указанных в колонке 1) иа 1 л среды

64А

65А°

66 А*

67А

68АС

69А^

70А

71А*

72А7

73А

74А

2 75А J

Глюкоза8 (г)

Глицерин (г)

2,0—10

0,3

10

1,0

88

10

6,0

10

1,0

10

(NH4)2SO4 (г)

0,2

Na2HPO4 (г)

5,0

КН2РО4 (г)

К2НРО4 (г)

1,0

0,2

3,0

MgSO4-7H2O (г)

0,1

5,0

0,3

0,5

NaCI (г)

4,0

2,5

to

СаС12-2Н2О (г)

0,1

0,25

о

FeSO4-7H2O (мг) Аминокислоты Мясной экстракт (г)

3,0

1,0

1,0

Дай

5,0

1,0г

Дрожжевой экстракт

0,1—1,0

5,0

3,0

1,0

1,0

0,1

10

(г)

Кислотный гидроли-

0,1

зат казеина (каза- миновые кислоты; г)

Ферментативный гид-

5,0

5,0

2,0

ролизат казеина

(казитон; г)

Пептон (г)

Триптон (г)

10

Да/

10

Специальные среды

Да*

Даг

рн

7,0

7,0—7,2

7,4—7,5

6,8

6,5—7,0

7,3

7,4

7,0

7,6—7,8

7,8

1,0—

2,0

Таблица 7.7. Состав комплексных (А) сред № 64—75 для бактерий, перечисленных в табл. 7.1

ЧАСТЬ II. РОСТ

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

^Смешивают с 3 л лошадиной сыворотки, филыруюг и стерилизуют фильтрованием.

^Добавляют растворимый крахмал (2%) и СаСОз (0,Ио)

с Цобавляют растворимый крахмал (0,1%), СаСОз (0,1%) и агар (1,5%).

^Вместо дистиллированной воды используют водопроводную.

На 1 л среды добавляют 0,1 г Na2SOs, 0,5 г тиогликола- та натрия, 3 г фитона (BBL) и 17 г триптиказы (BBL).

Добавляют 0,2 г СаСОз на 1 л среды.

^Для большинства сред рекомендуется стерилизовать глюкозу отдельно от других компонентов среды (автоклавированием или фильтрованием через соответствующие мембранные фильтры) и затем добавлять ее с соблюдением правил ьэ асептики.

Добавляют 0,25 г L-цистииа иа 1 л среды.

Активный компонент дрожжевого экстракта был выделен и охарактеризован как один или несколько пептидов с мол. массой~1000 [201].

•^На водяной бане готовят овсяную кашицу нз 25—65 г плющеного овса и 1 л водопроводной воды. Смесь фильтруют через марлю н, пока она еще не остыла, доводят ее объем до 1 л. Затем добавляют 18—20 г агара и доводят pH до 7,2 с помощью NaOH [232].

Среда Хайфлика и Чэиока [77]: PPLO-бульон (Difco) — дегидратированная среда, которая содержит экстракт из сердца крупного рогатого скота с пептоном и NaCl (34 г/л); лошадиная сыворотка (200 мл); 25%-иый экстракт свежих пекарских дрожжей (100 мл); 1%-иый агар (предпочтительнее полумягкий). Желательна влажная атмосфера.

На 1 л среды добавляют: 21 г PPLC-бульона (Difco), 70 г сорбита, 1 г фруктозы, 10 г сахарозы и 200 мл лошадиной сыворотки. СОа (5%) в атмосфере Ы2 стимулирует рост бактерий на твердых средах.

Компоненты

Количество (в единицах, указанных в колонке 1) на 1 л среды

1С°

2С*

ЗСс

4Cd

5Се

бС^

7С

8С

9С^

ICC

псй

12СЛ

13С

14CZ

Глюкоза/ (г)

2,0

1,0

1,0

1,0

0,2

2,0]

Глицерин (г)

0,2

NH4CI (г)

1.0

1,0

2,0

0,5—

—2,0

0,08

1,0

0,25

0,5

1,0

NaNO3 или КМОз (г)

0,5

Na2HPO4-2H2O (г)

0,04

5,24

1,74

0,53

К2НРО4 (г)

0,9

0,01

0,48

1,0

0,027

0,08й

0,5

0,07

КН2РО4 (г)

0,33

1,0

1,0

0,6

1,13

0,04

0,08й

2,77

1,06

Трис-буфер (г)

2,0

NaCl (г)

10

10

24

КС1 (г)

0,33

0,7

0,5

МпС12-4Н2О (мг)

0,03

0,005

0,005

22

0,01

2,0

5,0

100

MgSO4-7H2O (г)

0,62

1,29

2,6

0,25

0,01

8,0

1,0

0,5

0,075

0,2

0,2

0,15

СаС!2-2Н2О (г)

0,33

0,1

0,2

0,094

0,05

0,5

0,2

0,05

0,05

0,1

0,1

0,004

Таблица 7.8. Состав синтетических сред (С) № 1—14 для бактерий, перечисленных в табл. 7.1

ЧАСТЬ И. РОСТ

FeSO4-7H2O (мг)

2,0

0,5

0,5

15

3,5

Микроэлементы

Дат

Да"

Да"

Да0

Да"

Аминокислоты

Витамины

Дау

Да™

Твии 60 (мг)

Твии 80 (мг)

?н

6,5—

7.3

6,5—

6,8

7,0

—7,5

-7,6

° Дополнительные компоненты: 0,2 г яблочной кислоты ^ и 0,005 г ЭДТА, pH 6,8. Растворы, содержащие 1,5 г NaHCOa <О и 1 г ЫагЗ-ЭНзО, стерилизуют фильтрованием отдельно.

Отдельно фильтрованием стерилизуют растворы, содержащие 20 г NaHCOa и 1 г Na2S-9H2O, и добавляют их к стерильной среде.

с Добавляют к другим компонентам среды 0,2 г ЭДТА и простерилизованные фильтрованием растворы, содержащие 12,76 г Na2COa и 0,1 г Na2S-9H2O.

^ Добавляют 0,025 г ЭДТА, а также 2—6 г яблочной кислоты в качестве источника углерода.

Урожай клеток увеличивается при добавлении иа 1 л среды 0,5 г ацетата натрия, 2 г NaHCOa, 42 г CaSO* и 0,001 г ЭДТА.

■^Для Flexithrix dorotheae глюкозу как источник углерода можно заменить галактозой или сахарозой (1 г/л), а хлористый аммоний в качестве источника азота — глутаматом натрия или NaNOa (10 г/л). На 1 л среды добавляют 0,1 г глицерофосфата натрия.

Да-?Да'2010гДа'ДахДа"ДаУДагДа""Да°Да66200507—97,2--7,87,26,0—-7,56—77,07,06,3-—6,67,4--7,6Да-?Да'2010гДа'ДахДа"ДаУДагДа""Да°Да66200507—97,2--7,87,26,0—-7,56—77,07,06,3-—6,67,4--7,6® Источниками азота служат глутамат иатрня (0,5 г/л) и аспарагиновая кислота (0,5 г/л).

Да-?

Да'

20

10г

Да'

Дах

Да"

ДаУ

Даг

Да""

Да°

Да66

200

50

7—9

7,2-

-7,8

7,2

6,0—

-7,5

6—7

7,0

7,0

6,3-

—6,6

7,4-

-7,6

Да-?

Да'

20

10г

Да'

Дах

Да"

ДаУ

Даг

Да""

Да°

Да66

200

50

7—9

7,2-

-7,8

7,2

6,0—

-7,5

6—7

7,0

7,0

6,3-

—6,6

7,4-

-7,6

1 л среды содержит 20 мл безвитаминиого минерального основного раствора Хатиера. В модификации Коэи- Базир и др. [351 этот раствор содержит следующие компоненты: 10 г нитрилотриуксусной кислоты (растворенной и нейтрализованной с помощью КОН); 14,45 г MgSO4*7H2O, 3,33 г СаС12-2Н2О, 9,25 мг (NH4)eMo7O24-24H2O, 99 мг FeSO4-7H2O, 50 мл смеси металлов № 44 (см. ниже) и дистиллированную воду — до 1 л. pH доводят до 6,6—6,8. Смесь металлов № 44 содержит в 100 мл 250 мг ЭДТА, 1,095 мг ZnSO4-7H2O, 500 мг FeSO4-7H2O, 154 мг MnSO4«H2O, 39,2 мг CuSO4-5H2O, 24,8 мг Со(МО3)2-6Н2О и 17,7 мг Ыа2В4Ог-ЮН2О. Чтобы предотвратить выпадение осадка, следует добавить несколько капель 6 и. H2SO4.

* На 1 л среды добавляют 0,5 г аспарагина и 0,01 г ЭДТА.

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫДля большинства этих сред глюкозу стерилизуют отдельно (обычно автоклавированием) и затем с соблюдением правил асептики добавляют ее к стерильным растворам других компонентов

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Продолжение табл. 7.8

ЧАСТЬ П. РОСТЧАСТЬ П. РОСТ

ЧАСТЬ П. РОСТ

ЧАСТЬ П. РОСТ

Автоклавируют отдельно н затем с соблюдением правил асептики добавляют к другим компонентам.

Стерилизуют фильтрованием отдельно.

m На 1 л среды добавляют: 0,1 мг ZnSO4-7H2O; 0,3 мг Н3ВОЭ; 0,2 мг СоС12-6Н2О; 0,01 мг СиС12-2Н2О; 0,02 мг NiC12-6H2O; 0,03 мг Na2MoO4-2H2O.

п На 1 л среды добавляют: 0,1 мг ZnSO4*7H2O; 0,1 мг НзВОз; 0,05 мг СоС12-6Н2О и 0,005 мг СиС1г2Н2О.

0 На 1 л среды добавляют: 2,4 мг ZnSO4*7H2O; 28 мг НзВОз; 0,4 мг СиС12-6Н2О и 7,5 мг Na2MoO4*2H2O.

р На 1 л среды добавляют 0,05 мг ZnSO4-7H2O; 0,05 мг НзВОз; 0,005 мг СоС12-6Н2О; 0,025 мкг СиС12-2Н2О и 0,005 мг Na2MoO4-2H2O.

5?^ На 1 л среды добавляют 1 мл смеси следующих микро-

° элементов: растворимых солей В, Fe и Мп (по 0,5 мг/л) и Со, Си, Мо и Zn (по 0,01 мг/л).

г На 1 л среды добавляют: 0,1 мг ZnSO4-7H2O, 0,1 мг НзВОз, 0,1 мг СиС12-2Н2О, 0,05 мг Na2MoO4-2H2O.

5 На 1 л среды добавляют: 6 мг (NH4)2Fe(SO4)2 н 4 мг СаСОз.

* Необходимы аминокислоты (г/л): фенилаланин (1); лейцин (1); изолейцин (0,5); валин (0,1) и метионин (0,05). Добавляют также аминокислоты, стимулирующие рост бактерий (г/л): глиции (0,05); пролин (0,5); аспарагин (0,44); аланин (1,0); лизин (0,25), треонии (0,1) и триптофан (1,0). Независимо от способности стимулировать рост бактерий к среде добавляют (г/л) гистидин (0,05), аргинин (0,1) и серин (0,1).

Источником азота служат (в концентрации 1 г/л) лейцин, пролин, аспарагин, алаиин, триптофан, аргииии, аспарагиновая кислота и цистин. Смесь аминокислот в виде ка- замииовых кислот способствует более быстрому и интенсивному росту культур. При замене глюкозы на сахарозу, глицерин или сукцинат в качестве источника углерода, микроорганизм может использовать неорганические источники азота.

v Необходимый для роста витамин Bi2 (кобаламин) добавляют в концентрации 0,005 мг/л.

w Необходим биотии (15 мкг/л).

х Необходим витамин Bi2 (0,005 мг/л); для некоторых штаммов нужен биотин (0,005 мг) и солянокислый тиамин (0.1 мг/л).

У У некоторых штаммов Sphaerotilus natans обнаружена потребность в биотине (0,005 мг/л).

Ни один из выделенных штаммов не растет на среде без витаминов; для поддержания или стимуляции роста большинства штаммов необходимы биотин, тиамии и витамин В12. Готовят раствор, в 1 л которого содержатся следующие витамины: 2 мг биотина, 2 мг фолиевой кислоты, 10 мг солянокислого пиридоксина, 5 мг рибофлавина, 5 мг солянокислого тиамина, 5 мг никотинамида, 5 мг пантотената кальция, 0,1 мг витамина Bi2 и 0,1 мг л-амииобензойиой кислоты. 10 мл этого раствора, простерилизоваиного автоклавированием или ультрафильтрованием, добавляют на 1 л среды.

аа Добавляют биотин (0,2 мкг/л).

88 На 1 л стерильной среды добавляют 1 мг солянокислого тиамина и 0,003 мг витамина Bi2, причем каждый из них стерилизуют отдельно ультрафильтроваиием.

Компоненты

Количество (в единицах, указанных в колонке 1) на 1 л среды

15С"

16С

17С

18С

19С

20С

21С

2?С

23С

24С

25С6

26 С

27С*

Глюкоза* (г)

10

5,0

15

20

25

20

1—3

10

10

5

3,0*

4,0

Глицерин (г)

11,7

NH4C1 (г)

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

3,0

NaNOs или KNO3 (г)

0,6

Na2HPO4-2H2O (г)

1,о

3,49

0,45

♦о КгНРО4 (г)

1,0

0,8

1,74

1,0

7,0

З.о

500

- КН2РО4 (г)

0,25

2,0

0,2

2,77

2,0

3,0

NaCI (г)

5

МпС12-4Н2О (мг)

10

0,005

16,9

MgSO4-7H2O (г)

0,01

0,2

0,5

0,5

0,62

0,2

0,1

5,0

0,01

0,09

10

СаС12-2Н2О (г)

0,2

FeSO4-7H2O (мг)

10

50

50

13,9

5,0

10

Микроэлементы

Да/

Да^

да»

да'

Да/

Да6

0,45

Аминокислоты

Да'

Дат

Да"

Да"

Кислотный гидроли-

ДаР

зат казеина (г)

Таблица 7.9. Состав синтетических сред (С) № 15—27 для бактерий, перечисленных в табл. 7.1

'. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Продолжение табл. 7.9

КомпонентыКоличество (в единицах, указанных в колонке 1) на 1 л среды15С°16С17С18С19С20С21С22С23С24С25СЬ26С27СсПурины н пиримидиныДа»ВитаминыТвин 80 (мг)ДагДа5Да'Да"Да"Да™6,00pH7,46,87,26,96,6——7,45,5—9,06,87,2——7,56,87,0——7,27,27,07,0КомпонентыКоличество (в единицах, указанных в колонке 1) на 1 л среды15С°16С17С18С19С20С21С22С23С24С25СЬ26С27СсПурины н пиримидиныДа»ВитаминыТвин 80 (мг)ДагДа5Да'Да"Да"Да™6,00pH7,46,87,26,96,6——7,45,5—9,06,87,2——7,56,87,0——7,27,27,07,0е Хорошо и лимоннаяе Хорошо и лимоннаяЧАСТЬ II. РОСТЧАСТЬ II. РОСТ

Компоненты

Количество (в единицах, указанных в колонке 1) на 1 л среды

15С°

16С

17С

18С

19С

20С

21С

22С

23С

24С

25СЬ

26С

27Сс

Пурины н пиримидины

Да»

Витамины

Твин 80 (мг)

Даг

Да5

Да'

Да"

Да"

Да™

6,00

pH

7,4

6,8

7,2

6,9

6,6—

—7,4

5,5

—9,0

6,8

7,2—

—7,5

6,8

7,0—

—7,2

7,2

7,0

7,0

Компоненты

Количество (в единицах, указанных в колонке 1) на 1 л среды

15С°

16С

17С

18С

19С

20С

21С

22С

23С

24С

25СЬ

26С

27Сс

Пурины н пиримидины

Да»

Витамины

Твин 80 (мг)

Даг

Да5

Да'

Да"

Да"

Да™

6,00

pH

7,4

6,8

7,2

6,9

6,6—

—7,4

5,5

—9,0

6,8

7,2—

—7,5

6,8

7,0—

—7,2

7,2

7,0

7,0

е Хорошо и лимонная

е Хорошо и лимонная

ЧАСТЬ II. РОСТ

ЧАСТЬ II. РОСТ

а В качестве детоксиканта добавляют кристаллический сывороточный альбумин (1%).

6 На 1 л среды добавляют 45 мг K2SO4.

с В 670 мл теплой (45 °C) дистиллированной воды растворяют указанные в таблице компоненты, а затем добавляют к ним 100 г лимонной кислоты-Н2О и 175 г NaHNH4PO4-4H2O. Отдельно простерилизоваиную глюкозу добавляют с соблюдением правил асептики к стерильной среде непосредственно перед посевом и затем разбавляют среду в 50 раз. Если добавить к среде 5 мл хлороформа, то ее можно хранить в закрытых сосудах при комнатной температуре.

Для большинства сред отдельно простерилизоваиную автоклавированием глюкозу добавляют с соблюдением правил асептики к стерильному раствору, содержащему другие компоненты.

усваиваются также другие углеводы, глицерин кислота.

лизуют фильтрованием и добавляют к стерильной среде перед ее использованием.

т На 1 л среды добавляют аминокислоты, необходимые для оптимального роста: 1,2 мг D-аланииа, 0,77 мг L-аргини- иа-НС1, 0,1 мг L-цистеина, 3,9 мг L-глутамииовой кислоты, 0,77 мг L-лизина-НС! и 0,94 мг DL-метиоинна.

п Добавляют следующие аминокислоты (мг/л): треонин (276); пролин (100); лейцин (426); гистидин (126); глицин (176); аргинин (160); глутаминовая кислота (200); валин (185) и тирозин (35). Первые шесть аминокислот являются необходимыми, остальные стимулируют рост.

° На 1 л среды добавляют: 1,4 г DL-алаиииа, 216 мг DL-триптофаиа и по 60 мг DL-треоиииа, L-лизииа, DL-ме- тноиина, DL-гистидина, DL-фенилаланина, L-лейцина, DL-изо. лейцииз, DL-валина и L-аргинниа.

^ Рост стимулируется гидролизатом казеина (0,5%) или глутаминовой кислотой (0,1%).

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

■^Микроэлементы (мкг/л): В (Н3ВОз) (5); Са (СаСОз) (100); Си (CuSO4-5H2O) (10); Fe [FeSO4(NH4)2SO4-6H2O] (100-500); I (KI) (1); Mn (MnSO4-H2O) (10-20); Mo (MoO3) (10); Zn (ZnSO4-7H3O) (50).

^Для фиксации молекулярного азота необходимы следы молибдата (0,005 г Na3MoO4-2H2O иа 1 л).

Beijerinckia indica молибдат необходим для фиксации молекулярного азота (см. выше сноску g), и его нельзя заменить ванадатом. Для некоторых штаммов, нуждающихся в Си и Zn, к среде добавляют ZnSO4*7H2O (0,005 г/л) и CuSO4-5H3O (0,004 г/л).

Са2+ добавляют в виде CaSO4 (0,2 г/л). На 1 л среды добавляют также 0,5 мг Na3MoO4-2H3O.

■^Безвитамииный минеральный основной раствор Хатнера, 20 мл/л (см. сноску h в табл. 7.8).

ь

Все виды Aeromonas растут на минимальной среде, содержащей смесь L-аргинина, аспарагина, лейцина и ме- ю тионина.

054 Для роста нужны аргинин, аспарагиновая кислота, ци

стеин, глутаминовая кислота, гистидин, лейцни, лизни, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан и валин. Сернн и тнрозии оказывают стимулирующее действие, а аланин, оксипролин и глицин не влияют иа рост. Все аминокислоты добавляют к среде в концентрации 0,001 М. Пролин может заменить глутаминовую кислоту. Глутамин (1,02 г/л) стери-

^ Для роста необходимы цитозин или урацил в концентрации 10 мг/л. Аденин (10 мг/л) оказывает стимулирующее действие.

т Потребность в витаминах не определена. Витамины добавляют в следующих концентрациях (на 1 л среды): 1 мг пантотената кальция, 10 мг л-амииобеизойной кислоты, 10 мкг биотина, 50 мг холина, 100 мкг фолиевой кислоты, 5 мг инозита, 1 мг никотиновой кислоты, 5 мг пиридоксаля, 5 мг пиридоксамина, 5 мг пиридоксина, 1 мг рибофлавина, 1 мг тиамина и 1,23 г аскорбиновой кислоты.

5 Добавляют биотин (1 мкг/л).

Добавляют никотиновую кислоту (2 мг/л) и тиамин-НС1 (0,15 мг/л). Биотин необходим для Brucella abortus, П СО3 в воздухе достаточно для роста большинства штаммов В. abortus.

и На 1 л среды добавляют следующие витамины: 0,01 мг биотина, 1 мг никотиновой кислоты и 0,5 мг солянокислого тиамина.

Р Добавляют биотин (0,5 мкг/л) и солянокислый тиамин (100 мкг/л).

На 1 л среды добавляют: 10 мкг пантотената кальция, 1 мкг бнотина, 10 мкг никотинамида, 10 мкг солянокислого гиамина н 20 мкг солянокислого пиридоксина. Пантотенат, никотинамид и тиамин необходимы для роста, а биотин и пиридоксин оказывают стимулирующее действие.

Компоненты

Количество (в единицах, указанных в колонке 1) на 1 л среды

28С°

29СЬ

30Сс

SIC^

3zC»

ЗЗс/

34С^

35С^

36CZ

3?с/

38С6

39С

40CZ

- <4

Глюкоза”1 (г)

1.0

12,5

2,5

3,0

2,0

5,0

5,0

5,0

5,0"

Глицерин (г)

0,25

6,3

Ацетат натрия (г)

6,0

3,4

NH4C1 (г)

0,5

1,0

0,9

4,0

3,0

2,2

0,4

Na2HPO4-2H2O (г)

1,3

2,25

0,6

К2НРО4 (г)

1,56

8,7

0,65

3,48

КН2РО4 (г)

0,14

5,0

6,8

0,01

0,9

2,7

0,35

2,72

0,17

0,75

0,2

Трис-буфер (г)

6,05

NaCl (г)

5,3

2,5

0,02

0,05

0,9

О

5,8

5,8

0,1

КС1 (г)

0,05

0,19

МпС12-4Н2О (мг)

0,36

20

4,2

1,0

25

1,5

1,0

7,6

MgSO4-7H2O (г)

0,01

1,6

0,04

0,04

0,238

0,02

0,2

0,02

0,41

0,62

0,096

0,1

СаС12-2Н2О (г)

0,006

0,001

0,02

0,01

0,01

0,37

0,074

0,002

FeSO4-7H2O (мг)

0,1

20

5,0

10

1,0

20

4,0

2,8

2,0

12,5

Микроэлементы

ДаР

Да»

Да”

Да9

Да<

Да"

Да”

Аминокислоты

Да™

Да*

ДаУ

Даг

Да""

Да66

Дасс

Radd

Да”»

Да//

Кислотный гидроли-

5,0^

зат казеина (г)

244

Таблица 7.10. Состав синтетических сред (С) № 28—40 для бактерий, перечисленных в табл. 7.1

ЧАСТЬ П. РОСТ

Пурины и пирими

Далл

дины

Витамины

Дан

датт

Твин 80 (мл) pH

7.8.^

7,5

Дап«

Да00

Да^

7,6

7,5

6,6-

-6,9

6,8

6,7

6,8—

—6,9

Да“

Да"

Да66

Да”

Дагг 5

Да"

Да"

7,0

7,45

7,4±

±0,1

7,0

6,8““

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

а После стерилизации к среде добавляют, соблюдая правила асептики, 500 мкг путресцина и 100 мкг стерилизованного фильтрованием NAD.

50 мкг гематина и 10 мкг олеиновой кислоты растворяют в 0,001 н. NaOH и автоклавируют. Гематии можно заменить любым веществом, разлагающим Н2О2. Гематин не нужен для роста бактерий в анаэробных условиях. В раствор добавляют 10 г молочной кислоты (85%). Одна глюкоза по- ю давляет рост бактерий в аэробных условиях, ио в сочетании ^ с другим источником углерода, например с молочной кислотой или сахарозой, она обеспечивает удовлетворительный рост.

с На 1 л среды добавляют 4,4 г лактата натрия (70%).

Среду стерилизуют фильтрованием.

е Добавление гематина и крови и инкубация при пониженном атмосферном давлении необходимы в том случае, когда пользуются твердой средой.

Добавляют 5,8 г яблочной кислоты и с помощью NaOH доводят pH среды до 6,8.

^ На 1 л среды добавляют 1 мг гемина и летучие жирные кислоты до конечной концентрации: 2,8-10-2 М уксусной кислоты, 9-Ю-8 М пропионовой кислоты, 4,5*10-3 М н-мас- ляной кислоты, 9-ИМ М изомасляной кислоты, 9*10-4 М н-валериановой кислоты, 9-1О~4 М изовалериаиовой кислоты и 9*10~4 М DL-метилмасляной кислоты. Перед использованием добавляют 4 г Na2CO3 и 0,25 г цистеина-НС1 (оба компо

нента раздельно стерилизуют фильтрованием). Культуры Bacteroides ruminicola инкубируют в бескислородной атмосфере, содержащей СО2.

В качестве источника углерода в этой среде используется солянокислый холин (5 г/л). Другие источники углерода: лактат, малат и пируват. На 1 л среды добавляют 2,6 г Na2SO4 и 1 мг Na3MoO4. Для удаления кислорода из культуральной среды используется Na2S*9HaO (0,005%) или бисульфит натрия (0,0035%). СО2 (включен в среду в виде 0,3—0,5% NaHCOa) и дрожжевой экстракт (0,1—0,2%) являются стимуляторами роста.

Источником углерода служит пируват натрия (3 г/л). Источниками углерода могут быть только компоненты цикла Кребса, а также их близкие производные.

На 1 л среды добавляют 250 мг лактата натрия, 200 мг щавелевоуксусной кислоты, 5 мг поливинилового спирта, 87 мг тетрагидрохлоридспермииа, 1 мг гемина, 4% (объ- ем/объем) 2,2',2"-нитрилотриэтанола, 2 мг NAD, 0,46 мг ти- аминпирофосфатхлорида, 42 мг NaHCOa и 1 г K2SO4. Перед добавлением к среде щавелевоуксусной кислоты, NAD и ти- амннпирофосфатхлорида их следует по отдельности просте- рилизовать фильтрованием.

ь

На 1 л среды добавляют 5 г молочной кислоты, 0,42 г лимонной кислоты*Н2О и 0,004 г ЭДТА.

На 1 л среды добавляют 10 мл 85%-ной молочной кислоты, 0,75 г гликолата натрия и 4,5 мг путресцина. Используется только свежеприготовленная среда. Посевы делают немедленно после охлаждения среды.

Для большинства этих сред глюкозу стерилизуют отдельно (обычно автоклавированием) и добавляют с соблюдением правил асептики к стерильному раствору, содержащему другие вещества.

п В этом случае глюкозу автоклавируют вместе с другими компонентами среды; производные глюкозы, автоклавируемой вместе со средой (но ие сама глюкоза), являются стимуляторами или необходимы для роста.

° Для морских штаммов в среду добавляют 2,5% NaCL

р На 1 л среды добавляют 0,44 мг ZnSO4-7H2O, 0,4 мг СоС12-6Н2О и 0,27 мг СиС12*2Н2О.

2462465 Растворяют MgSO4-7H2O (количество указано в таблице) и 80 мг FeSO4(NH4)2SO4*6H2O в 8,7-10—6 М лимонной кислоте и автоклавируют.

246

246

г Растворяют 29 мг Fe(NH4)2(SO4)2-6H2O в 0,02 М НС1 и стерилизуют фильтрованием.

5 На 1 л среды добавляют 1 мл раствора, содержащего 5% MgSO4, 0,5% МпС12-4Н2О, 0,5% FeCh и 0,4% иитрилотри- уксусной кислоты.

На 1 л среды добавляют 7,2 мг ZnSO4-7H2O, 1,4 мг CuSO4-H2O и 1.4 мг CoSO4-5H2O.

ы На 1 л среды добавляют 1 мг СоС12-6Н2О.

На 1 л среды добавляют по 1 мг СоС12-6Н2О, VSO4-7H2O, ZnSO4 и NaMoO4-2H2O, 0,5 мг CuSO4-5H2O и 20 мг нитрило- триуксусной кислоты.

^ На 1 л среды добавляют по 1000 мг DL-аланина, DL-ac- парагиновой кислоты и L-глутаминовой кислоты; по 200 мг L-аргиинна-НС! и Ь-лизииа-НСЬН2О и по 100 мг L-гистиди- на, L-лейцина, L-изолейцина, L-метионина, L-фенилаланина, L-пролина, L-треонина, L-тирозина, L-валина, L-триптофана, L-цистеина, L-серина и L-глицииа.

Продолжение табл. 7.10

сс

На 1 л среды добавляют 500 мг аспарагиновой кислоты, 1300 мг L-глутаминовой кислоты, 150 мг Ь-аргинииа-НС1, 25 мг глицина, 50 мг L-серина, 90 мг L-лейцина, 30 мг L-изо- лейцина, 60 мг L-валииа, 70 мг тирозина, 100 мг L-алаиина, 50 мг L-лизина-НС!, 50 мг L-пролииа, 80 мг L-триптофана, 50 мг L-треонина, 25 мг L-феиилаланииа, 25 мг L-аспараги- на, 61,25 мг цистеина-НСЬНзО (стерилизуют отдельно фильтрованием), 36 мг цистина, 50 мг L-глутамииа (стерилизуют отдельно фильтрованием), 14,9 мг L-метиоиииа, 46 мг глутатиона (восстановленного) и 16,5 мг гистидина.

^ На 1 л среды добавляют 0,1 г L-аргииииа-НС!, 10 мг L-цистеина-НСЬНзО, 150 мг глицина, 1,18 г глутаминовой кислоты и 21 мг серина.

ЧАСТЬ II. РОСТЧАСТЬ II. РОСТее На 1 л среды добавляют 120 мг DL-триптофана, 5000 мг глутамата натрия, 150 мг L-тирозина, 250 мг DL-фенилала- нина, 400 мг L-аргииина-НС!, 300 мг Ь-гистидина-НСЬН2О, 200 мг глицина, 400 мг DL-валина, 2000 мг DL-серииа, 125 мг DL-изолейцина, 350 мг L-цистеина-НС!.

ЧАСТЬ II. РОСТ

ЧАСТЬ II. РОСТ

^ На 1 л среды добавляют 12,5 мг L-цистеина-НС!, 50 мг DL-триптофана, 20 мг L-тирозииа, 10 мг L-пролииа, 20 мг DL-фенилалаиииа и 10 мг DL-гистидина.

Хотя кислотный гидролизат казеина кроме аминокислот содержит несколько минорных компонентов и, следовательно, среда не является «синтетической» в строгом смысле, ее обозначают буквой «С», так как казеин очищают адсорбцией на активированном угле Norit А при двух различных концентрациях ионов Н+ и в среду добавляют некоторые известные связанные с казеином компоненты, например полиамины и витамины.

^ На 1 л среды добавляют по 10 мг гуаиииа, аденина и урацила.

“ На 1 л среды добавляют 3,2 мг гипоксантина и 8 мг урацила.

^ На 1 л среды добавляют по 10 мг гуанииа, урацила и гипоксантина.

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

На 1 л среды добавляют 0,1 г глицина, 0,1 г DL-алани- на, 0,15 г DL-валина, 0,15 г DL-лейцина, 0,1 г DL-изолейци- иа, 0,2 г DL-аспарагнновой кислоты, 0,2 г DL-глутамииовой кислоты, 0,2 г L-пролина, 0,1 г DL-феиилалаиииа, 0,1 г DL-тирозина, 0,04 г L-аргииииа, 0,03 г DL-гистидина, 0,2 г DL-серина, 0,2 г DL-треонииа, 0,2 г DL-метнонина и 0,4 г L-цистнна. Первые 12 аминокислот растворяют в 0,033 М фосфатном буфере н стерилизуют автоклавированием; серии, треонин и метионин растворяют в воде и стерилизуют фильтрованием; L-цистин растворяют в НС1 и стерилизуют фильтрованием.

Любая из следующих аминокислот в концентрации 0,62 или 0,36 М может служить источником углерода, азота или энергии: глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, серин, пролин, а-аланин, аспарагин, глутамин и треонии. Однако рост улучшается после добавления смеси аминокислот илн равного количества казаминовых кислот. Источниками углерода могут служить также глюкоза, мальтоза и сахароза.

Ю 2

На 1 л среды добавляют 2,5 г L-аспарагина.

аа На 1 л среды добавляют 37 мг DL-аланина. 120 мг DL-аспарагиновой кислоты, 90 мг Ь-аргинииа*НС1, 13 МГ L-цистеина-НС! (цистеин автоклавируют отдельно, и затем его добавляют с соблюдением правил асептики к стерильному раствору остальных компонентов), 642 мг L-глутаминовой кислоты, 10 мг глицина, 68 мг Ь-гистидина-НСЬНгО, 94 мг DL-изолейцина, 100 мг DL-лейцина, 155 мг L-лизина-НС!, 65 мг DL-метионина, 78 мг DL-фенилалаиииа, 175 мг L-пролина, 100 мг DL-серииа, 70 мг DL-треоиина, 31 мг DL-трип- тофана, 110 мг L-тирозииа и 160 мг DL-валииа.

На 1 л среды добавляют по 60 мг каждой из следующих аминокислот: алаиина, аргииииа, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутаминовой кислоты, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, орнитина, оксипро- лииа, фенилаланина, пролииа, серина, треонина, триптофана, тирозина н валина. Замена этих кислот гидролизатом казеина не изменяет скорость роста и его интенсивность. Если не добавлять эти аминокислоты в среду, то концентрацию NH<CI следует увеличить до 2 г/л среды.

ъъ

На 1 л среды добавляют 30 мг гипоксантина и 2 мг урацила.

На 1 л среды добавляют 20 мг инозита, 10 мкг фолиевой кислоты, 1 мкг л-аминобензойиой кислоты, 100 мкг рибофлавина, 1 мг пантотената кальция, 1 мкг бнотина, 100 мкг солянокислого тиамииа, 500 мкг никотиновой кислоты, 500 мкг никотинамида и 2 мг солянокислого пиридоксина.

На 1 л среды добавляют 9,5 мг пантотената кальция, 2,4 мг никотинамида и 3,3 мг солянокислого тиамииа (все -^ эти компоненты стерилизуют фильтрованием).

ппНа1лсреды добавляют 2,4 мг никотиновой кислоты.

00На1лсреды добавляют 50 мкг пантотената кальция.

РРНа1лсреды добавляют 2 мг рибофлавина, 2 мг пантотенатакальция, 0,05 мг биотина, 2 мг никотиновой кисло

ты, 2 мг солянокислого тиамииа, 0,02 мг витамина Ви, 0,05 мг DL-липоевой кислоты, 2,0 мг пиридоксаля, 0,1 мг n-амииобензойиой кислоты и 0,05 мг фолиевой кислоты.

^ На 1 л среды добавляют 1 мкг биотина и 1 мг солянокислого тиамина. Пантотенат значительно стимулирует рост.

тг На 1 л среды добавляют 2 мг солянокислого тиамииа, 2 мг пантотената кальция, 1,4 мг солянокислого холина, 3,6 мг миоинозита и 0,7 мг биотина.

w На 1 л среды добавляют по 1 мг солянокислого пиридоксаля и пантотената кальция, по 50 мкг солянокислого тиамииа, ииацииа и рибофлавина, 10 мкг л-амииобеизойиой кислоты, 2 мкг биотина и по 1 мкг фолиевой кислоты и витамина Bis.

^ На 1 л среды добавляют по 2 мг солянокислого пиридоксаля н солянокислого тиамина, по 200 мкг пантотената кальция и ииацииа, 50 мкг рибофлавина, по 1 мкг п-амино- бензойной и фолиевой кислот и 10 мкг биотииа.

""pH доводят до 6,8 с помощью твердого К2СО3.

Компоненты

Количество (в единицах, указанных в колонке 1) на 1 л среды

41 Са

42С6

43С

44Сс

45С

46Cd

47С*

48С

49^

50С^

51С

52СЛ

53С(

Глюкоза' (г)

10

10

10

20

Ацетат натрия (г)

2,0

20

1,6

МН4С1

0,8

0,52

0,3

0,5

1,0

0,5

2,0

0,4

Na2HPO4-2H2O (г)

1,0

2,5

♦О

КгНРО4 (г)

0,002

0,016

0,28

0,6

3,48

4,о

2,0

4,0

со

КН2РО4 (г)

0,15

3,0

2,7

2,0

0,9

2,5

NaCl (г)

0,04

0,9

МпС12 4Н2О (мг)

0,066

0,2

1,0

10

0,05

8,0

0,03

10

20

MgSO4-7H2O (г)

0,15

0,1

0,2

0,25

0,5

0,01

0,2

0,2

2,0

0,16

0,01

0,4

СаС12-2Н2О (г)

0,006

0,02

0,07

0,25

0,01

0,01

0,01

FeSO4-7H2O (мг)

30

10

2,0

10

50

4,0

8,0

10

Микроэлементы

Да6

Даг

Да”

Дат

Да"

Да0

Дар

Аминокислоты

Да»

Даг

Да»

Да<

Таблица 7.11. Состав синтетических сред (С) № 41—53 для бактерий, перечисленных в табл. 7.1

ЧАСТЬ II. РОСТ

Кислотный гидролизат казеина (г)

Пурины и пиримидины

Витамины

Твин 80 (мл)

рн

7,5-

7,5-

7,5-

2,5-

4,8-

—8,0

-8,0

-7,8

-3.2

-5,0

а Источником углерода служит СОз атмосферы. Клетки снабжаются энергией благодаря окислению нитрита в нитрат. Кроме перечисленных солей 1 л среды содержит 2 г NaNOa и 0,5 г СаСОз. Вместо дистиллированной используют водопроводную или морскую воду.

249249В пресной воде клетки не растут, даже при добавлении NaCl; оптимальный рост наблюдается в среде, содержащей от 70 до 100% морской воды, 1 мМ NaNOj и перечисленные неорганические соли. Источником углерода служит атмосферная СОз.

249

249

с Среду периодически аэрируют воздухом, содержащим 5% СОз.

Источником энергии, азота и углерода служит тиоцианат калия (0,2 г/л). Thiobacillus thioparus ие растет иа таких сложных средах, как среды, содержащие питательный бульон, пептон, дрожжевой экстракт или гидролизат казеина.

е После стерилизации к среде добавляют с соблюдением правил асептики 200—400 мг Na2S-9H2O, 168 мг NaHCO3 и 410 мг ацетата натрия или 320 мг метилового спирта (общий объем 1 л).

^На 1 л среды добавляют 2 г цитрата аммония.

^ На 1 л среды добавляют 1 г глицерофосфата калия н 0,5 г ЭДТА. В качестве источников углерода используются L-глутамат, пировиноградная кислота, ацетат и лактат, но

5,0“2,0рДаюДахДаУДагДассДа66Да"Да^Да^17,0—-7,26,8—-7,47,0—-7,26,77,05,56,51— —9,85,0“2,0рДаюДахДаУДагДассДа66Да"Да^Да^17,0—-7,26,8—-7,47,0—-7,26,77,05,56,51— —9,8ианлучший рост наблюдается в присутствии смеси 5 г L-глутаминовой кислоты и 10 г DL-лактата (на 1 л среды).

5,0“

2,0р

Даю

Дах

ДаУ

Даг

Дасс

Да66

Да"

Да^

Да^

1

7,0—

-7,2

6,8—

-7,4

7,0—

-7,2

6,7

7,0

5,5

6,5

1— —9,8

5,0“

2,0р

Даю

Дах

ДаУ

Даг

Дасс

Да66

Да"

Да^

Да^

1

7,0—

-7,2

6,8—

-7,4

7,0—

-7,2

6,7

7,0

5,5

6,5

1— —9,8

Л На 1 л среды добавляют 3 г целлобиозы, 20 ммоль ацетата, 1 ммоль изовалериата и 1 ммоль изобутирата. Отдельно в атмосфере N2 автоклавируют растворы, содержащие 0,5 г Na2S*9H2O и 4 г На2СОз, и затем добавляют их к среде непосредственно перед посевом.

1 Для роста на этой среде необходимо довольно большое количество активного инокулята.

^Для большинства этих сред глюкозу стерилизуют отдельно (обычно автоклавированием) и добавляют с соблюдением правил асептики к стерильному раствору других компонентов.

На 1 л среды добавляют 1 мг хелатированного железа, 30 мкг Na2MoO4-2H2O; 0,6 мкг СоС12-6Н2О, 6 мкг CuSO4-5H2O и 30 мкг ZnSO4-7H2O.

На 1 л среды добавляют 1 мг хелатированного железа, 100 мкг Na2MoO4-2H2O, 2 мкг СоС12-6Н2О, 100 мкг ZnSO4-7HaO и 20 мкг CuSO4*5H2O.

m На 1 л среды добавляют 1,56 г элементной серы, про- стерилизованной отдельно автоклавированием.

. БЙОХИМЙЧЁСКЙЁ ФАКТОРЫ. БЙОХИМЙЧЁСКЙЁ ФАКТОРЫп На 1 л среды добавляют 1 мг Na2MoO4*2H2O.

. БЙОХИМЙЧЁСКЙЁ ФАКТОРЫ

. БЙОХИМЙЧЁСКЙЁ ФАКТОРЫ

Продолжение табл. 7.11

ЧАСТЬ И. РОСТЧАСТЬ И. РОСТ

ЧАСТЬ И. РОСТ

ЧАСТЬ И. РОСТ

° На 1 л среды добавляют 0,8 мкг Мо (в виде молибдата аммония) 10 мг Zn (в виде ZnSO4-7H2O), 4 мг В (в виде Н3ВО3), 1 мг Си (в виде CuSO4-5H2O) и 1 мг Со (в виде CoSO4-7H2O).

^ На 1 л среды добавляют 4 мг СоС12-6Н2О.

4 На 1 л среды добавляют по 100 мг L-цистина и L-триптофаиа.

г На 1 л среды добавляют 300 мг L-алаиина, 400 мг L-ap- гинииа, 750 мг L-аспарагииовой кислоты, 200 мг L-цистеина, 750 мг L-глутамииовой кислоты, 200 мг глицииа, 500 мг L-гистидина, 200 мг DL-нзолейцииа, 200 мг L-лейцина, 800 мг L-лизииа, 150 мг DL-метиоиииа, 200 мг DL-феиилаланина, 500 мг L-пролииа, 400 мг DL-серина, 200 мг DL-треоиииа, 200 мг L-триптофаиа, 100 мг L-тирозииа и 300 мг L-валина.

5 На 1 л среды добавляют по 200 мг каждой из следую- щих аминокислот: L-триптофаиа, L-цистеина, DL-треоиина, о DL-метиоиииа, DL-валииа, DL-лейцииа, DL-изолейцииа, DL-лизииа, DL-фенилаланина, L-тирозииа, L-пролина, глицииа, DL-аланина, D-аргинина, DL-серина, L-глутаминовой кислоты и L-аспарагииовой кислоты.

На 1 л среды добавляют по 0,2 г каждой из следующих аминокислот: DL-аргииииа, DL-валииа, L-глутамииовой кислоты, DL-серина, DL-гнстидииа, DL-изолейцииа, DL-лейци- на, L-тирозина, DL-метионина, DL-триптофана и DL-фенил- алаиииа.

и Замена гидролизата казеина восемнадцатью аминокислотами не влияет на интенсивность и скорость роста.

Исключение из среды гидролизата казеина не влияет иа рост. Это доказывает, что соли аммония могут служить единственным источником азота.

w На 1 л среды добавляют по 5 мг аденина, гуанина, ура

цила и ксантина. Гуанин или ксантин удовлетворяют потребности бактерий в пуринах. Для некоторых штаммов достаточно добавить аденин.

х На 1 л среды добавляют по 5 мг гуанина, аденина, урацила и ксантина.

У На 1 л среды добавляют по 5 мг ксантина, гуанина, аденина, тимина и урацила.

Z На 1 л среды добавляют 100 мкг биотииа, 10 мкг фолиевой кислоты, 2 мг никотиновой кислоты, 1 мг пантотената кальция, 2 мг солянокислого пиридоксина, 1 мг рибофлавина и 1 мг солянокислого тиамина. Пантотенат, никотиновая кислота и биотин, необходимы для роста всех штаммов или значительно стимулируют его.

На 1 л среды добавляют 5 мг пиридоксаля, 1 мг никотиновой кислоты, 1 мг пантотената кальция, 1 мг рибофлавина, 1 мг тиамина, 1 мкг витамина Bi2, 10 мкг биотииа, 5 мкг л-аминобензойной кислоты и 10 мкг фолиевой кислоты. ^ На 1 л среды добавляют 10 мкг биотина. Потребность в биотине можно удовлетворить за счет биоцитина или детиобиотина, а также 1000-кратного избытка твииа 80 или олеата натрия.

сс На 1 л среды добавляют 5 мг никотиновой кислоты, 1 мг пантотената кальция, 1 мг пиридоксина, 100 мкг биотина и 0,01 мг лейковорина. Некоторым штаммам Pediococcus необходимы мевалоновая кислота и рибофлавин.

^На 1л среды добавляют 2 мг тиамииа-НС1, 2 мг пантотената кальция, 2 мг рибофлавина, 2 мг никотинамида, 1 мг пирндоксамииа-2НС1, 1 мг пиридоксаля-НС1, 1 мг пиридокси- иа-НС1, 0,1 мг л-аминобензойиой кислоты, 0,05 мг биотииа, 0,05 мг фолиевой кислоты и 0,005 мг кобаламина.

ее

На 1 л среды добавляют 2 мг никотиновой кислоты и 0,5 мг биотина.

Компоненты

Количество (в единицах, указанных в колонке 1) на 1 л среды

54С°

55С6

56Се

57Cd

58€^

59с7

60Сг

61С"

62С

бзс'

64В7

65С^

66CZ

Глюкоза™ (г)

10

25

10

10

30

30

2,5"

10,4

2,0

10

10

10

Ацетат натрия (г)

20

10

10

5,0

10

6,о

1,67

NH4C1 (г)

0,5

3,0

1,0

Na2HPO4-2H2O (г)

3,3

1,75

К2НРО4 (г)

0,6

3,0

8,7

5,0

7,0°

0,5

8,3

0,5

1,0

0,5

16,7

КН2РО4 (г)

1,0

0,6

3,0

8,7

1,5

0,5

1,6

0,5

0,5

16,7

NaCl (г)

1,0

0,01

0,01

0,01

1,0

0,001

0,01

0,01

0,01

0,01

КС1 (г)

3,0

МпС12-4Н2О (мг)

20

1и

10

40

40

1,0

10

10

13

10

MgSO4-7H2O (г)

0,7

0,2

0,2

0,2

0,5

0,5

0,02

0,02

0,2

0,3

0,2

0,2

0,5

СаС12-2Н2О (г)

0,3

0,3

0,01

FeSO4-7H2O (мг)

10

10

10

10

2,5

2,5

1,0

10

10

10

10

10

10

Таблица 7.12. Состав синтетических (С) и полусинтетических (В) сред № 54—66 для бактерий, перечисленных в табл. 7.1

БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Компоненты

Количество (в единицах, указанных в колонке 1) на 1 л среды

54Са

55С6

56Сс

57Cd

58Сг

БЭс/

60Сг

61 с”

62С

63^

64ВУ

65С*

66С1

Микроэлементы

ДаР

Да?

Да»

Даг

Аминокислоты

Да5

Да'

Да“

Да”

Да®

Да*

ДаУ

Да2

Дааа

Да66

Дасс

Да"

Кислотныйгидро

лизат казенна (г)

5,Уе

5,0/7

5,0S?

♦О сп to

Пурины и пиримидины

Витамины

Да00

дай/г

Да^

Да»»

Да‘г

Дагг

Да"

Да»

Да"

Да““

дайй

Да””

Да™™

Дан

Да**

датт

ДаУУ

Да”"

Да**

рн

7,1

6,8

—7,0

6,8

7,0

7,0

7.6

7,0—

—7,4

7,4

6,8

7,8

6,5

7,0

6,0

Урожай клеток на синтетической н комплексной средах одинаков, но в первом случае количество образуемого энтеротоксина в 7 раз ниже, чем во втором. Для роста в анаэробных условиях необходимо добавлять к среде пурины и урацил нли ацетат (10 мМ) нлн пируват. Ацетат можно заменить мевалонатом, взяв его в 10 раз меньше, чем ацетата.

Глюкозу автоклавируют с другими компонентами среды. В присутствии фолнновой кислоты (цитроворнна) эта среда поддерживает хороший рост некоторых штаммов Pediococcus.

с Глюкозу автоклавируют с другими компонентами среды. На 1 л среды добавляют 20 г цитрата натрия.

1 Глюкозу автоклавируют вместе с другими компонентами среды. На 1 л среды добавляют 0,01 г олеиновой кислоты, 1 г твнна 40 (детокснкант олеиновой кислоты) и 25 мг ферментативного гидролизата казенна. Этот гидролизат можно частично заменить 10 мг глутамина, который отдельно стерилизуют фильтрованием.

Глюкозу автоклавируют вместе с другими компонентами среды. На 1 л среды добавляют 500 мг L-аскорбнновой кислоты, 300 мг L-глутамнна (отдельно стерилизуют фильтрованием) и 1 мг спермина-HCL

Глюкозу автоклавируют вместе с другими компонентами

ЧАСТЬ и. РОСТ

^Добавляют 0,1 г L-аспарагнна. Добавление к 1 л среды 0,1 г ацетата аммония и 1 г NaHCO3 улучшает рост.

е

Для Bacillus cereus и В. brevis необходимы некоторые кислоты, перечисленные в среде 58С, но витамины для них не требуются. В. alvei нуждаются в аминокислотах и тиамине, В. circulans н В. coagulans — в аминокислотах и обычно тиамине и биотине, В. sphaericus — в аминокислотах, тиамине и биотине, В. pasteurii — в аминокислотах, тиамине, биотине, никотиновой кислоте и аммонии (1% NH4C1). Оптимальный рост В. pasteurii наблюдается при pH 8,5 и температуре 28 °C. В. anthracis также растет на среде с аминокислотами. Для некоторых штаммов нужен тиамин, их рост стимулируется аденозином и (или) адениловой кислотой. Большинство видов этого рода являются аэробными, однако некоторые штаммы, например В. cereus, могут также расти в анаэробных условиях.

Bacillus subtilis, В. licheniformis и В. megaterium ие нуждаются в витаминах. В. pumilus и В. polymyxa в качестве источника азота используют соли NH4+; они нуждаются также в биотине. В. macerans растут иа среде 59С при добавлении в нее биотина и тнамниа.

^ В качестве восстанавливающих агентов к среде добавляют меркаптоацетат (0,05%) н цистеин (0,025%). Для быстрого и равномерного роста необходима СО2. Некоторые штаммы Clostridium botulinum растут на синтетической среде только после добавления ферментативного гидролизата казенна (5 г/л) или заменяющих его факторов: NaHCOs (200 мг/л), дрожжевого экстракта (5 г/л) или оксалацетата (5 г/л). Клетки С. parabotulinum (тип А и В) и С. sporoge- nes хорошо растут на среде 60С, однако при этом титр токсина в 7 раз ниже, чем при росте на бульоне из экстракта сердца и мозга.

На I л среды добавляют 5 г тиоглнколата натрия. На среде 61С клетки растут хуже, чем на бульоне из экстракта сердца и мозга.

На 1 л среды добавляют 0,15 г нитрилотрнуксусной кислоты и 0,01 г Na2S-9H2O. Нужное значение pH среды устанавливают с помощью трнса.

среды. На 1 л среды добавляют 500 мг аскорбиновой кислоты, 1,67 г ацетата калия и 10 мл раствора твин-олеата, содержащего 2 г твииа 40, 20 мг олеата натрия и воду до 20 мл.

т Если нет специальных указаний, глюкозу стерилизуют отдельно автоклавированием, а затем добавляют ее с соблюдением правил асептики к стерильному раствору других компонентов.

п Стерилизуют отдельно фильтрованием.

° Вместо К2НРО4 используют (NH4)2HPO4.

^ На 1 л среды добавляют 2 мг молибдата аммония.

^На 1л среды добавляют 8 мг ZnSO4-7H2O, 4,5 мг CuSO4-5H2O, 9 мг СоС12, 6 мг СаС12-2Н2О, 14 мг Na2B4O;-10H2O и 2,5 мг (NH4)2MoO4.

ГНа 1 л среды добавляют 0,114 мг Н3ВО3, 0,31 мг CuSO4-5H2O, 2,8 мг Fe(NH2) (SO4)2-6H2O, 0,01 мг CoSO4-7H2O, 0,12 мг MnSO4-H2O, 0,07 мг (NH4)eMo7O24-4H2O и 1,6 мг ZnSO4-7H2O.

5 На 1 л среды добавляют по 25 мг глицина, валина, лейцина, треоиииа, феннлаланниа, тирозина, цистеина, метионина, пролина, аргинина, гистидина и триптофана.

На 1 л среды добавляют 200 мг DL-0-аланииа, 242 мг L-аргннина-НС], 400 мг L-аспарагина, 100 мг аспарагиновой кислоты, 50 мг L-цистенна, 300 мг глутаминовой кислоты, 100 мг глицина, 62 мг Ь-гистнднна-НС1, 250 мг DL-нзолейци- на, 250 мг DL-лейцина, 250 мг Ь-лизина-НС1, 100 мг DL-метионнна, 100 мг DL-феннлаланнна, 100 мг L-пролина, 50 мг DL-серина, 200 мг DL-треоннна, 40 мг DL-трнптофана, 100 мг L-тирознна и 250 мг DL-валнна.

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ“ На 1 л среды добавляют 100 мг L-аспарагина, 400 мг L-цистенна, 50 мг L-трнптофана и 200 мг глицина.

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ЧАСТЬ II. РОСТЧАСТЬ II. РОСТ

ЧАСТЬ II. РОСТ

ЧАСТЬ II. РОСТ

На 1 л среды добавляют по 0,1 г L-аланниа, L-аргнни- на, L-аспарагиновой кислоты, L-аспарагина, L-оксипролина, L-нзолейцииа, L-лейцниа, Ь-лнзнна*НС1, L-метноннна, L-иор- лейцииа, L-фенилалаинна, L-пролина, L-сернна, L-треонина, L-трнптофана, L-тнрозииа, L-валнна, а также 0,05 г L-цистеи- на-НС1, 0,05 г L-цистина, 0,5 г L-глутаминовой кислоты, 0,2 г глицина, 0,2 г Ь-гистндина*НС1 и 0,02 г L-глутамииа (стерилизуют отдельно фильтрованием).

w На 1 л среды добавляют 80 мг DL-алаиина, 100 мг DL-аспарагиновой кислоты, 160 мг L-аргинина, 500 мг L-глут- амнновой кислоты, 80 мг глицина, 160 мг L-гистидииа, 100 мг L-лейцииа, 160 мг DL-метноиииа, 200 мг DL-фенилаланина, 80 мг DL-сернна, 200 мг DL-триптофана, 140 мг L-тирозниа, 250 мг L-цистенна и 320 мг DL-валина.

х На 1 л среды добавляют 3 г L-аргинина, 2 г DL-фенил- алаиииа, 0,25 г L-тирозниа, 2 г DL-валина, 1,5 г DL-лейцн- на, 0,5 г DL-нзолейцина, 0,05 г L-триптофаиа, 1 г DL-треоии- иа, 0,6 г DL-метнонина, 0,45 г L-пролнна, 0,1 г L-оксипроли- Ю иа, 0,2 г L-гистидина, 1 г DL-глутаминовой кислоты, 0,9 г У DL-аспарагнновой кислоты, 1,2 г DL-лизина, 0,42 г DL-алани- иа, 1 г DL-серина, 0,25 г L-цистеина и 0,1 г глицина.

У На 1 л среды добавляют 100 мг L-триптофана, 325 мг глицина, 1,9 г DL-валина, 1 г L-лейцнна, 1,45 г DL-изолей- цииа, 1 г DL-фенилаланина, 13 мг L-тнрозина, 200 мг DL-серина, 1 г DL-треонина, 3,15 г L-глутамииовой кислоты, 540 мг DL-метионнна, 475 мг L-аргнинна, 350 мг L-гистиднна, 2,2 г DL-лизнна и 2 г DL-аспарагииовой кислоты.

Z На 1 л среды добавляют 1 г DL-аланина, 1 г DL-аспарагиновой кислоты, 500 мг L-глутаминовой кислоты, 200 мг Ь-аргинниа-НС1, 200 мг L-лнзнна-НС!, 200 мг L-гистиди- на-НС1, 400 мг DL-изолейцина, 200 мг L-лейцина, 400 мг DL-метиоиина, 200 мг L-фенилаланина, 200 мг L-пролииа. 400 мг DL-треонина, 200 мг L-тирозина, 400 мг DL-валина, 400 мг DL-триптофана, 400 мг DL-серина, 200 мг глицина и 200 мг L-цнстеина.

На 1 л среды добавляют по 10 мг аденннсульфата, солянокислого гуанина, урацнла н ксаитнна.

На 1 л среды добавляют по 0,01 г аденина н гуаннна и 0,06 г урацила.

На 1 л среды добавляют по 5 мг аденина, гуанина *НС1 и ксантина, а также 50 мг гуаниловой кислоты и 15 мг урацила.

пп На 1 л среды добавляют 33 мг гипоксантина, 16,7 мг урацнла, 5 мг гуаннна н 83,5 мг аденина.

00 На 1 л среды добавляют 0,033 мг солянокислого тнамн- на, 1,2 мг никотиновой кислоты и 0,003 мг биотина.

^ На 1 л среды добавляют 0,5 мг тиамина *НС1, 1 мг пи

ридоксина-НС1, 0,3 мг пиридоксамииа-НС1, 0,3 мг пиридоксаля-НС1, 0,5 мг пантотената кальция, 0,5 мг рибофлавина, 1 мг никотиновой кислоты, 0,1 мг л-амннобеизойной кислоты, 0,001 мг биотина и 0,01 мг фолиевой кислоты.

^ На 1 л среды добавляют 200 мкг n-аминобензойной кислоты, 2 мкг биотина, 400 мкг пантотената кальция, 10 мкг фолиевой кислоты, по 400 мкг никотиновой кислоты и рибофлавина, 200 мкг солянокислого тиамина и по 10 мкг солянокислых пиридоксаля и пнридоксамнна.

тт На 1 л среды добавляют 5 мкг фолиевой кислоты, 2,5 мкг биотина, 100 мкг л-амииобеизойной кислоты, 500 мкг тиамина, 500 мкг рибофлавина, 1 мг пиридоксаля НС1, 1 мг пнридоксамина, 500 мкг пантотената кальция и 1 мг никотиновой кислоты.

^ На 1 л среды добавляют 1 мкг биотина, 2 мкг фолиевой кислоты, 100 мкг рибофлавина и по 500 мкг тиамина, никотиновой кислоты, солянокислого пиридоксина и пантотената кальция.

1. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ1. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

1. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

1. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

На 1 л среды добавляют 1 г одиозамещениого глутамата натрия.

^ На 1 л среды добавляют 0,1 г L-аспарагнна, 0,05 г L-триптофана, 0,1 г L-цистииа и 0,1 г L-цистеина.

сс На 1 л среды добавляют 0.1 г L-цистииа, 0,1 г L-трип- тофаиа, 0,4 г L-цистеина (стерилизуют отдельно фильтрованием), 0,1 г L-серина и 0,25 г L-аспарагина.

^ На 1 л среды добавляют 167 мг DL-алаиииа, 167 мг L-аргинина, 84 мг L-аспарагииа, 83,5 мг L-цистеииа-НС!, 167 мг L-глутаминовой кислоты, 167 мг глицина, 500 мг L-гистидина*НС1, по 167 мг DL-нзолейцииа, DL-лейцина, L-лизииа-НС!, DL-метионииа, DL-феиилаланина, L-пролина, DL-серина, DL-валина и DL-треонииа а также 33 мг DL-триптофаиа и 83,5 мг D-тирознна.

ее

Можно заменить без снижения урожая клеток смесью У аминокислот в концентрациях, соответствующих их коицеит- 81 рациям в казеиие [16].

^ Обычно используют гидролизат, приготовленный по Снеллу и Райту [206], или имеющийся в продаже (кислотный гидролизат казеина NBC с низким содержанием солей и без витаминов). Гидролизат можно заменить смесью аминокислот [69].

^ Можно заменить отдельными аминокислотами [69].

^ На 1 л среды добавляют по 10 мг аденинсульфата-НдО, гуанина-НСЬ2Н3О, урацила и ксантина.

На 1 л среды добавляют по 0,01 г аденина, гуанина и урацила.

^ На 1 л среды добавляют по 10 мг урацнла н аденина.

И На 1 л среды добавляют 0,0005 мг биотина, 0,5 мг тиамина, 0,01 мг фолиевой кислоты, 2,5 мг холина, 1,0 мг пантотената кальция, 0,5 мг пиридоксина, 0,5 мг пиридоксамнна, 0,5 мг пиридоксаля-НС1, 0,5 мг пнридоксаль-5'-фосфата, 1 мг никотиновой кислоты, 1 мг никотинамида, 0,5 мг рибофлавина, 40 мг инозита, 0,01 мг фолииовой кислоты, 0,01 мг л-аминобензойной кислоты н 0,05 мг витамина Big.

иа На 1 л среды добавляют 10 мкг биотина, 1 мг тиамина, 2 мг пиридоксамина, 2 мг никотиновой кислоты, 1 мг пантотената кальция, 1 мг инозита и 6 мкг фолиевой кислоты.

^ На 1 л среды добавляют 1 мг тиамина, 1 мг рибофлавина, 10 мкг фолиевой кислоты, 2,5 мг никотиновой кислоты, 2,5 мг л-аминобензойной кислоты, 1 мг пантотената кальция, 250 мкг фолииовой кислоты и 5 мг пиридоксаля.

^ На 1 л среды добавляют 50 мкг биотина и 200 мкг тиамина-НС1.

^ На 1 л среды добавляют по 0,4 мг пиридоксаля-НС1, солянокислого тиамина и л-амииобензойиой кислоты, по 0,8 мг рибофлавина и никотиновой кислоты, 0,016 мг фолиевой кислоты, 0,002 мг биотина, 0,005 мг витамина Вц, 300 мг аскорбиновой кислоты и 0,03 мг пантетеина.

УУ На 1 л среды добавляют по 400 мкг рибофлавина, яи- котииовой кислоты и пантотената кальция, по 200 мкг тиами- на*НС1 и л-аминобензойной кислоты, 10 мкг фолиевой кислоты и пиридоксаля «НС1 и 2 мкг биотина.

2Z На 1л среды добавляют 200 мкг л-амииобеизойной кислоты, 2 мкг биотина, 16,7 мкг фолиевой кислоты, 1670 мкг никотиновой кислоты, 400 мкг рибофлавина, 200 мкг тиамииа, 800 мкг пантотената кальция и 16,7 мкг пнрндлкс- амина-2НС1.

Компоненты

Количество (в единицах, указанных в колонке 1) на

1 л среды

67С

68С°

69С*

70Сс

71С

72С

73С

74Cd

75В

76С6

77С^

78Вг

79ВЙ

Глюкоза' (г)

10

1,0

5,0

5,0

10

20

1,0

10

10

7,5

Глицерин (г)

88

Ацетат натрия (г)

0,3

8,0

0,05

NH4C1 (г)

10

0,4

1,4

1,06

1,0

1,0

1,0

2,8

ю

с? NaNOs или KNO3 (г)

0,5

Na2HPO4-2H2O (г)

8,2

30

6,5

0,1

0,14

К2НРО4 (г)

3,28

1,0

0,1

5,65

1,0

5,0

4,0

КН2РО4 (г)

1,0

2,38

1,0

15

Трис-буфер (г)

1,0

6,0

NaCI (г)

0,1

0,1

4,0

6,8

6,6

КС1 (г)

0,5

0,4

0,4

0,4

МпС12-4Н2О (мг)

2,5

0,4

7,9

0,3

0,15

3,0

MgSO4-7H2O (г)

0,2

0,2

1,0

1,0

0,5

1,0

0,1

0,05

0,02

0,2

0,16

0,2

0,2

Таблица 7.13. Состав синтетических (С) и полусинтетических (В) сред М 67—79 для бактерий, перечисленных в табл. 7.1

ЧАСТЬ II. РОСТ

СаС12-2Н2О (г)

0,1

о,п

0,2

0,1

0,01

0,005

0,02

0,2

FeSO4-7H2O (мг)

10

5,0

0,4

1,1

10

5,0

0,5

4,0

8,0

0,50

Микроэлементы

Да/

Да"

Даг

Дат

Да"

Да»

Да"

Да»

Аминокислоты

Да'

Да5

Да'

Да"

Дау

Да™

Да*

Да>

Да*

Да””

Да66

Кислотный гидролизат казеина (г)

5,0сс

Пурины и пиримидины

Да'"'

Даго

Да'"'

Да//

Да^

Витамины

ДаАЙ

Да"

Да»

Да66

Да"

датт

Да””

Да00

Твин 80 (мг)

500

5000

200

pH

7,2

6,8

6,0—

—7,0

6,0

—7,0

6,8—

—7,0

6,5—

—7,0

7,2

6,4—

—7,0 |

7,0—

—7,2

6,8—

—7,0

8,3

7,6—

—7,8

° На 1 л среды добавляют 100 мкг terregens-фактора.

^ На 1 л среды добавляют 200 мг ннтрнлотрнуксусной кислоты н 4 г ^-глицерофосфата натрия.

с На 1 л среды добавляют 0,15 мг пнмелнновой кислоты, 7 мл этилового спирта и 17,5 г D-молочной кислоты. Для Corynebacterium diphteriae потребности в пнмелнновой кислоте и Р-аланнне могут удовлетворяться соответственно биотином и пантотенатом кальция.

В процессе роста следует тщательно контролировать pH среды добавлением NaOH или молочной или фумаровой кислоты в концентрации 5 г/л.

На 1 л среды добавляют 0,2 мг гемина, 0,1 мг пимели- новой кислоты, 1 мг олеиновой кислоты и 500 мг глутатиона.

^На 1 л среды добавляют 0,1 г тногликолата натрия.

^ На 1 л среды добавляют 10 г фракции V бычьего сывороточного альбумина (имеется в продаже). Все проверенные виды микоплазм, за исключением М. laidlawil, М. granula- гит и Mycoplasma sp., штамм S-743, для роста нуждаются в холестерине [171]. Холестерин обычно добавляют в среду в концентрации от 1 до 20 мкг/л, разведя его в этаноле или твине 80.

'. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

5Н2О),НзВОз)5Н2О),НзВОз)6 На ZnCl26 На ZnCl2гогоСПСПООООНа 1 л среды добавляют 500CuSO4 5Н2О, 100 мкг KL 200 (NH4)6Mo7O24 4Н2ОНа 1 л среды добавляют 500CuSO4 5Н2О, 100 мкг KL 200 (NH4)6Mo7O24 4Н2Омкг борной кислоты 40 мкг мкг FeCl3 6Н2О и 200 мкгмкг борной кислоты 40 мкг мкг FeCl3 6Н2О и 200 мкг

5Н2О),НзВОз)

5Н2О),НзВОз)

6 На ZnCl2

6 На ZnCl2

го

го

СП

СП

ОО

ОО

На 1 л среды добавляют 500

CuSO4 5Н2О, 100 мкг KL 200 (NH4)6Mo7O24 4Н2О

На 1 л среды добавляют 500

CuSO4 5Н2О, 100 мкг KL 200 (NH4)6Mo7O24 4Н2О

мкг борной кислоты 40 мкг мкг FeCl3 6Н2О и 200 мкг

мкг борной кислоты 40 мкг мкг FeCl3 6Н2О и 200 мкг

На 1 л среды добавляют 500 мг липопротеидного фактора, 10 мг холестериллаурата и 5 мг лецитина

1 Для большинства этих сред глюкозу стерилизуют отдельно (обычно автоклавироваинем) и добавляют ее с соблюдением правил асептики к стерильному раствору других компонентов

На 1 л среды добавляют 200 мг Fe [в виде FeSO4(NH4)2SO4 6Н2О], 100 мг Zn (в виде ZnSO4-7H2O), 120 мг Мп (в виде MnSO4 4Н2О), 8 мг Си (в виде CuSO4 10 мг Со (в виде CoSO4 7Н2О), 200 мг В (в виде и 5 мг Мо [в виде (НН4)бМо7О24 4Н2О)

1 л среды добавляют 5 мг CuSO4 5Н2О и 2 5 мг

н 1 5 мгн 1 5 мг-7 с^а7т’т среды добавляют 6,4 мг CuSO4 5Н2О z*nSO4 /Н2О

н 1 5 мг

н 1 5 мг

" На 1 л среды добавляют 10 мг ZnSO4

0 На 1 л среды добавляют 1 мг CuSO4 5Н2О н 0 8 мг ZnSO4

На 1 л среды добавляют 0,15 мг NaMoO4 2Н2О

Добавляют золу в количестве, эквивалентном 5 г пептона Золу может частично заменить Sn

г На 1 л среды добавляют по 100 мг L цистеина НС1 и L-лейцнна, по 200 мг DL-нзолейцнна и DL валина, 600 мг L глутамина (стерилизуют отдельно фильтрованием), по

Продолжение табл. 7.13

У На 1 л среды добавляют по 100 мг глицина, L-аланина, DL-сернна, L-треонина, L-лейцина, L-нзолейцииа, DL-валина, L аспарагиновой кислоты, L аспарагина, L-лизина, L-гисти- дина, L-аргнинна, L-пролнна, L оксипролина, L-феннлалаин- на L тирозина, DL метионина, L-цистеииа НС1, а также 40 мг L триптофана н 500 мг L-глутамииовой кислоты. Гидролизат казенна (4 г/л) можно заменить смесью аминокислот

Z На 1 л среды добавляют по 0,1 г L-цистина и L триптофана

ЧАСТЬ П РОСТЧАСТЬ П РОСТаа Добавляют (мг/л) L цистина (30), DL нзолейцнна (600), L-глутамина (100), L-аспарагина (200), глицина (100), DL аланина (200), DL фенилаланина (400), L-тирозина (50), L гистидина НС1 (150) DL лейцина (800), L аргинина (200), DL метионина (200) и DL треонина (400)

ЧАСТЬ П РОСТ

ЧАСТЬ П РОСТ

^ Добавляют (мг/л) L аргинина (70) L аспарагиновой кислоты (60), L цистеина (1) L глутаминовой кислоты (75), L глутамина (100) DL изолейцина (40) L метионина (15), DL фенилаланина (50) и DL триптофана (20)

Гидролизат казеина можно заменить аминокислотами Хотя на среде с аминокислотами можно производить серий ный пересев культур интенсивность роста некоторых штам мов при этом все же значительно ниже чем в присутствии гидролизата казенна

^ Добавляют к среде аденин гуаиин, урацил и ксангш до конечной концентрации 0 5 мг/100 мл

На 1 л среды добавляют по 20 мг сернокислого аденн на, гуаннна НС1, урацила, ксантина и тимина

На 1 л среды добавляют по 100 мг аденозина, гуанози на н цнтндина

На 1 л среды добавляют 1 мг адеиозинтрнфосфата, по

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

. БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

200 мг DL-метионина, L-гистндина-НС!, L-аргннина-НС! н DL-трнптофана.

Добавляют смесь аминокислот, исходя из процентного соотношения аминокислот в казение [76].

Добавляют (г/л): DL-аланнна (4); DL-аспарагнновой кислоты (1,6); L-глутамнновой кислоты (2); L-аргинина-НС! н L-лнзина-НС! (по 0,8); L-гнстидина (0,4); DL-изолейцина (0,8); L-лейцнна (0,4); DL-метионнна и DL-фенилалаинна (по 0,8); L-пролина (0,4); DL-треонииа (0,8); L-тнрозина (0,4); DL-валииа и DL-триптофаиа (по 0,8); L-цистииа (0,4); DL-серниа (0,8) и глнцниа (0,4). Вместо смеси аминокислот можно использовать кислотный гидролизат казеина. 10%-ный раствор казамнновых кислот обрабатывают активированным углем и добавляют к нему следующие аминокислоты (мг/л): L-трнптофан (2000); L-феннлалании и L-тирознн (по 400); L-пролнн и DL-гистидин-НС! (по 200) н L-цнстенн (1000). Для конечной среды используют концентрацию 5 мг/100 мл.

СЛ ц

<О На 1 л среды добавляют 0,7 г L-цистенна, 2 г DL-вали- на, 0,6 г L-метионнна, 0,5 г L-тнрозина, 0,75 г L-пролина, 5 г L-аспарагнновой кислоты, 7,5 г L-глутамииовой кислоты и 2.3 мг р-аланина.

v На 1 л среды добавляют 1,5 г L-глутаминовой кислоты н 1 г L-аргннниа.

На 1 л среды добавляют по 0,5 г L-глутаминовой кислоты, L-аргнннна, L-пролина н L-гистидина.

х Рост культур стимулируется смесью следующих амино- кйелот (каждая в концентрации 0,7 г/л): L-глутаминовая кислота, L-аспарагин, DL-a-аланин, L-глутамнн, L-гистиднн ,н DL-аспарагнновая кислота. Раствор фракции V бычьего альбумина после стерилизации фильтрованием инактивируют нагреванием до 56 °C и затем добавляют к стерильной среде -до конечной концентрации 0,01%.

0,3 мг гуанина и гипоксантина и по 5 мг РНК и ДНК.

^ Добавляют (мкг/л): рибофлавина (1000); биотина (100); тиамниа-НС1 (1000) и DL-липоевой кислоты (1).

Добавляют (мкг/л)- тиамина (80); пиридоксаля (40); пиридоксамииа (4); пиридоксина (4); л-аминобензойной кислоты (40); фолиевой кислоты (4); холина (80); инозита (2000); биотина (0,1); витамина В» (0,4) и пантотената кальция (80).

^ Добавляют (мкг/л): тиамнна-НС1 (1000); л-аминобензойной кислоты (500); никотиновой кислоты (1000); холнн- хлорида и инозита (по 10 000); пиридоксина (500); пиридокса- ля-НС1 н пантотената кальция (по 1000); биотина (20); фолиевой кислоты и витамина В12 (по 10) и рибофлавина (500). Витамины ие являются необходимыми для всех видов, кроме одного штамма, который в отсутствие аминокислот нуждается в никотиновой кислоте.

^ На 1 л среды добавляют 2,3 мг никотиновой кислоты.

^ На 1 л среды добавляют 1 мкг витамина Bis, 0,5 мг фолиевой кислоты, по 2 мг л-амииобензойиой кислоты, тн амнна-HCl и рибофлавина, по 1 мг никотиновой кислоты, никотинамида, пнридоксаля*НС1 н пнрндоксамина-2НС1, по 2 мг пантотената кальция и инозита и по 0,1 мг DL-липоевой кислоты и биотина. Бнотнн, инозит, никотиновая кислота, пиридоксаль и рибофлавин необходимы для роста бак терий.

ттп На 1 л среды добавляют 1 мкг биотина н по 1 мг пантотената кальция, тиамина и n-аминобензойной кислоты.

пп Добавляют (мг/л)1 никотиновой кислоты, рибофлавина, пиридоксина-НС1, пнрндоксаля-HCl н тиамина (по 2,5); фо- лнновой кислоты (1,0).

00 Добавляют (мг/л): холина (0,5); биотина, фолиевой кислоты, тиамина н пантотената кальция (по 0,01); пиридоксина (0,05).

Комплексные и полусинтетические среды

В табл. 7.2—7.7 приведен состав комплексных (кодовая буква А) и полусинтетических (кодовая буква В) сред для бактерий, перечисленных в табл. 7.1. Имеющиеся в продаже готовые среды помечены звездочкой. Для получения твердой среды к бульонной среде добавляют 1,5—2% агара. Дополнительные компоненты сред и детальные пояснения даны в сносках, обозначенных строчными латинскими буквами.

Синтетические среды

В табл. 7.8—7.13 приведен состав синтетических сред (кодовая буква С) и несколько полусинтетических сред (кодовая буква В) для бактерий, перечисленных в табл. 7.1. Дополнительные компоненты сред и детальные пояснения даны в сносках, обозначенных строчными латинскими буквами.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЕЩЕСТВ ПО РОСТУ КУЛЬТУР

Бактерии широко используются для количественного анализа большого числа веществ, которые способствуют их росту или ингибируют его: витаминов, аминокислот, микроэлементов, пиримидиновых оснований, полиаминов, дезоксирибонуклеозидов, дезоксирибонуклеотидов, лекарственных препаратов, антибиотиков и других химиотерапевтических агентов [70, 105а]. Хотя инструментальные методы (например, анализ аминокислот с помощью аминокислотного анализатора) частично заменили некоторые из бактериологических методов, последние еще используются довольно часто. В некоторых случаях (например, при определении витамина В6) наблюдается различная чувствительность к разным формам витамина, поэтому такой анализ нелегко заменить другими методами. До тех пор пока не удастся выделить и охарактеризовать фактор роста, его влияние на рост соответствующего организма часто служит единственным показателем при последующем выделении этого фактора из природного материала.

Бактериологические анализы в принципе основаны на линейной зависимости интенсивности (но не скорости) роста микроорганизмов при увеличении количества лимитирующего питательного вещества в ограниченном диапазоне.

Разброс результатов при бактериологическом анализе обычно составляет ±10%, однако в тщательно контролируемых условиях он может уменьшаться до ±3%. В целом количественный анализ необходимого питательного вещества можно провести с более высокой степенью точности, чем количественный анализ стимулирующего фактора.

Для количественного анализа витаминов и аминокислот наиболее пригодны штаммы родов Lactobacillus, Streptococcus и Pediococcus, поскольку для их роста требуются сложные питательные смеси, т. е. в их ростовую среду необходимо добавлять большое число компонентов. Эти микроорганизмы можно использовать для количественного анализа нескольких витаминов и аминокислот. Например, метод анализа с использованием Streptococcus equinus АТСС 8042 (ранее известного как Leuconostoc mesenteroides Р-60) позволяет определить все аминокислоты, кроме аланина [216]. Аланин можно определить с помощью этой же среды, если к ней добавить фолиновую кислоту (см. сноску b в табл. 7.12) и в качестве тест-бактерии использовать Р. cereuisiae 8081.

Детали метода бактериологического анализа можно проиллюстрировать на примере работы Стила и др. [216], в которой для определения аргинина используется S. equinus.

Аминокислоты (аргинин)

Аргинин — одна из семнадцати аминокислот, определяемых с помощью S. equinus. Для других аминокислот и витаминов приемы определения сходны. Ссылки на специфические методы, используемые для определения других факторов роста, даны в обзоре Гирарда и Снелла [70]. Для изучения путей синтеза и распада витаминов и аминокислот успешно используют мутанты бактерий — ауксотрофы по одному или нескольким веществам.

Организм

S. equinus АТСС 8042 получен из Американской коллекции типовых культур (12301 Parklawn Drive Rockville, MD 20852). Основную культуру бактерий поддерживают в столбиках со средой, состоящей из 1,5% агара, 1 % глюкозы и 1 % дрожжевого экстракта. Один раз в месяц культуру пересевают на свежую среду. Столбики инкубируют 24 ч при 37 °C. Посев делают в 2 пробирки. Одну из них оставляют на хранение и используют только при последующем пересеве через месяц. Другую используют для приготовления инокулята, применяемого при анализах.

Полная основная среда

Состав основной среды приведен в табл. 7.14. Поскольку это сложная среда, ее можно приготовить несколькими способами, причем каждый исследователь может выбрать любой из предложенных здесь вариантов. Удобнее всего смешать различные вещества (например, аминокислоты, минеральные соли, пуриновые и пиримидиновые основания, витамины), которые можно хранить либо в твердой форме, либо в виде основных растворов. Затем к этой смеси добавляют необходимые компоненты в нужном количестве и готовят соответствующее количество среды, концентрация которой вдвое выше требуемой (так называемая среда с двойной концентрацией). В аналитических целях отдельные вещества, подлежащие определению, следует исключить из таких смесей. Смеси готовят следующим образом.

Аминокислоты. Делают навески аминокислот в количествах, указанных в табл. 7.14. Аминокислоты, предназначенные для определения, исключают из смеси. Приготовленные навески смешивают, растирают в ступке и хранят в хорошо закупоренной банке в темном месте. Смеси всех аминокислот, предназначенных для аналитических целей, готовят и хранят таким же способом.

Известно, что активны только L-изомеры аминокислот. Из соображений удобства иногда используют DL-

Таблица 7.14. Состав полной синтетической среды для

Streptococcus equinus

Компонент

Количество на 1 л среды с двойной концентрацией

Аминокислоты:

DL-a-Алаиин

400 мг

Ь-Аргииин-НС1

484 мг

L-Аспарагин

800 мг

L-Аспарагиновая кислота

200 мг

L-Цистеин

100 мг

L-Глутаминовая кислота

600 мг

Глицин

200 мг

L-Гистидин-НС!

124 мг

DL-Изолейцин

500 мг

DL-Лейцин

500 мг

DL-Лизин-НС!

500 мг

DL-Метионин

200 мг

DL-Фенилаланин

200 мг

L-Пролин

200 мг

DL-Серин

100 мг

DL-Треонин

400 мг

DL-Триптофан

80 мг

L-Тирозин

200 мг

DL-Валин

500 мг

Глюкоза

50 г

Ацетат натрия

40 г

Хлористый аммоний

6 г

Неорганические соли: КН2РО4

1,2 г

К2НРО4

1,2 г

MgSO4-7H2O

400 мг

FeSO4-7H2O

20 мг

MnSO4-4H2O

40 мг

NaCl

20 мг

Пуриновые и пиримидиновые основания: Аденинсульфат • Н2О

20 мг

Гуанин НСЬН2О

20 мг

Урацил

20 мг

Ксантин

20 мг

Витамины:

Тиамин-НС1

1 мг

Пиридоксин • НС1

2 мг

Пиридоксамин • НС1

0,6 мг

Пиридоксаль - НС1

0,6 мг

Продолжение табл. 7 14

Компонент

Количество на I л среды с двойной концентрацией

DL-Пантотенат кальция

1 мг

Рибофлавин

1 мг

Никотиновая кислота

2 мг

n-Аминобензойиая кислота

0,2 мг

Биотин

0,002 мг

Фолиевая кислота

0,02 мг

Дистиллированная вода

До 1000 мл

изомеры. Если, например, L-изомер отсутствует, а есть DL-изомер, то последнего берут в 2 раза больше.

Минеральные соли. Солевой раствор А получают следующим образом: 25 г КН2РО4 и 25 г К2НРО4 растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 250 мл. Остальные соли объединяют в следующих количествах: 10 г MgSO4-7H2O, 0,5 г FeSO4-7H2O, 0,8 г MnSO4-4H2O и 0,5 г NaCl. Смесь растворяют в дистиллированной воде, доводят объем до 250 мл и добавляют 1 каплю концентрированной НС1, чтобы предотвратить образование осадка (солевой раствор В). Оба раствора устойчивы при комнатной температуре, но лучше хранить их в холодильнике, чтобы предупредить рост плесени в растворе А и окисление Fe2+ в растворе В.

Пуриновые и пиримидиновые основания. Ксантин и гуанин растворяют при нагревании в разбавленной НО; аденин и урацил растворяют в теплой воде. Смешивают эти растворы и добавляют к ним столько воды, чтобы концентрация каждого основания в смеси была 1 мг/мл. Раствор устойчив при хранении в холодильнике.

Витамины. Смешивают все витамины, за исключением биотина и фолиевой кислоты, причем количество каждого из них должно быть в 10 раз больше, чем указано в табл. 7.14. Исходные растворы биотина и фолиевой кислоты каждый с концентрацией 1 мг/мл готовят отдельно. Биотин солюбилизируется при нагревании; для лучшего растворения фолиевой кислоты добавляют небольшое количество NH4OH. После того как в смесь

витаминов внесли 0,02 мл раствора биотина и 0,2 мл раствора фолиевой кислоты, объем доводят дистиллированной водой до 60 мл и смесь нагревают до растворения всех компонентов. Хранят этот раствор при 5 °C и меняют каждые две недели.

Глюкоза, ацетат натрия и хлористый аммоний. Сначала делают навески глюкозы, ацетата натрия и хлористого аммония. Для приготовления 500 мл основной среды с двойной концентрацией взвешивают 3,1 г смеси аминокислот (не учитывая вес исключенных из нее аминокислот) и растворяют ее нагреванием примерно в 400 мл воды. Добавляют последовательно 25 г глюкозы, 20 г ацетата натрия, 3 г NH4C1, 6 мл солевого раствора А, 5 мл солевого раствора В, 10 мл основного раствора пуриновых и пиримидиновых оснований и 3 мл раствора витаминов. Объем доводят дистиллированной водой до 500 мл, а pH среды устанавливают 6,8. (Описанная и сходные с ней среды продаются, например фирмой Difco Laboratories )

Приготовление образцов

Для получения правильных результатов в анализируемых пробах необходимо, чтобы факторы роста в них были в той же химической форме, что и вещество, используемое в качестве стандарта. Так, белки следует тщательно высушить перед взвешиванием и полностью гидролизовать (Многие пептиды могут поступать в клетки и гидролизоваться, поставляя тем самым лимитирующие аминокислоты; однако количественный ответ на входящую в состав пептида аминокислоту может не соответствовать ответу на свободную аминокислоту.) Можно пользоваться любой методикой для полного гидролиза, гарантирующей незначительное разрушение аминокислот.

Для определения аргинина образцы белка высушивают нагреванием в течение 3 ч при температуре 60 °C под давлением 20 мм рт. ст. (2,7 кПа). Тщательно взвешивают около 200 мг образца, помещают его в пробирку из пирексового стекла размером 25X200 мм, добавляют 10 мл 4 н. HCI. Пробирку закрывают и автоклавируют 8 ч под давлением 103 421 Па. После охлаж-

дения пробирку открывают, нейтрализуют ее содержимое (pH 6,8) и доводят его до нужного объема. Некоторые аминокислоты (частично триптофан и тирозин и в меньшей степени некоторые другие аминокислоты) разрушаются при кислотном гидролизе. В этом случае следует использовать другие методы.

Аминокислоты, которые используются в качестве стандартов (в данном случае аргинин), также высушивают в течение 2 ч при 60 °C при давлении 20 мм рт. ст., тщательно взвешивают и растворяют в воде.

Методика определения

Инокулят готовят следующим образом. В пробирки вносят полную среду С с двойной концентрацией (табл. 7.14), содержащую 0,2% дрожжевого экстракта, разбавляют равным объемом дистиллированной воды, отбирают аликвоты объемом по 10 мл в культуральные пробирки, закрывают пробками и стерилизуют автоклавированием. Некоторые пробирки с инокулятом можно приготовить заранее и хранить при 5 °C. За день до определения с помощью инокулирующей иглы переносят часть бактерий с соблюдением правил асептики с агарового косячка в другую пробирку со средой и инкубируют ее при 37 °C в течение 15—18 ч. Непосредственно перед экспериментом клетки собирают центрифугированием. Надосадочную жидкость декантируют, а клетки суспендируют в 10 мл стерильной воды. Вновь центрифугируют и суспендируют клеточный осадок в 10 мл стерильной воды, получая таким образом отмытую суспензию бактерий для последующей инокуляции.

Определение проводят в пробирках размером 18Х Х150 мм без бортиков, помещенных в металлический штатив. Если о росте судят по образованию кислот, то, как рекомендуют Стил и др. [216], общий объем среды должен быть не менее 2 и не более 10 мл. Для турбидиметрических измерений общий объем должен составлять 10 мл, что и выполняется в описываемом ниже эксперименте.

Стандартную кривую получают путем разведения 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 160 и 200 мкг L-аргинина • НС1 в 10 мл общего объема. В пробирки вносят пробы в ко-

личествах, соответствующих концентрациям аргинина от 10 до 100 мкг на 10 мл. Дистиллированной водой доводят объем в каждой пробирке до 5 мл и затем добавляют по 5 мл среды с двойной концентрацией. Пробирки закрывают, стерилизуют автоклавированием в течение 10 мин под давлением 103 421 Па, охлаждают и инокулируют отмытой клеточной суспензией, полученной, как описано выше. Количество инокулята не является важным фактором при определении аминокислот, если в каждой пробирке оно одно и то же (достаточно одной капли).

При турбидиметрических измерениях роста бактерий пробирки с культурой инкубируют в течение 20 ч при 37 °C. За ростом клеток следя! фотометрически при длине волны >600 нм, где снижена до минимума интерференция, вызываемая окраской среды (можно использовать, например, колориметр Bausch and Lomb, модель 20). При использовании образцов объемом 2 мл время инкубации удлиняется до 72 ч, а рост культуры измеряют с помощью титрования образуемой кислоты 0,2 н. NaOH.

Строят стандартную кривую для аргинина на графике, по одной оси которого откладывают интенсивность роста (плотность клеток после 20 ч роста) или данные титрования, а по другой — количество добавленного стандартного раствора аргинина. Для каждого результата, полученного с известным количеством образца, по стандартной кривой находят то количество аргинина, которое вызывает соответствующую стимуляцию роста. Используют начальную (восходящую) часть кривой, где наблюдается линейная зависимость между интенсивностью роста бактерий и концентрацией аргинина. В этот отрезок кривой должно уложиться несколько точек из разных разведений исследуемой пробы, причем расхождения должны быть незначительными. Полученные результаты выражают в миллиграммах аргинина на 1 г пробы или в других удобных величинах.

Витамины

Витамины определяют методами, сходными с методами, используемыми для аминокислот. Вместо смеси ами-

нокислот в ростовую среду можно вносить лишенный витаминов гидролизат казеина с добавками аминокислот, которые были разрушены при кислотном гидролизе или присутствуют в казеине в субоптимальных концентрациях. Обычно витамины нужны в значительно более низких концентрациях, чем аминокислоты. Так, для типичной тест-бактерии Lactobacillus plantarum, оптимальная потребность в биотине составляет 1 нг/10 мл культуры. В связи с этим необходимо всегда работать с очень тщательно вымытой стеклянной посудой, особенно пробирками. Для мытья посуды нельзя использовать растворы кислоты, содержащие хроматы, поскольку несмываемые с помощью многократного споласкивания хроматы даже в минимальных (следовых) количествах подавляют рост бактерий. Вполне пригодна следующая обработка: культуральные пробирки заполняют дистиллированной водой, автоклавируют 10 мин, воду сливают и пробирки высушивают. Поскольку пробки также могут служить источником химического загрязнения, их следует перед каждым опытом промывать.

Так как витамины весьма различаются между собою по устойчивости и по химическому строению, не существует универсальной процедуры высвобождения связанных витаминов. Как правило, широко используют следующие способы обработки проб [204]: 1) гидролиз разбавленной кислотой, нейтрализация, доведение водой до нужного объема и фильтрование или 2) обработка смесью ферментов, автоклавирование для остановки действия ферментов, доведение до нужного объема и фильтрование.

ЛИТЕРАТУРА

Aaronson S. J. Bacterio!., 69, 67—69 (1955).

Allison М. J., Bryant M. P„ Doetsch R. N. Science, 128, 474—475 (1958).

Allison M. J., Bryant M. P., Doetsch R. N. J. Bacteriol., 83, 523— 532 (1962).

American Type Culture Collection. Catologue of strains I, 13th ed., American Type Culture Collection, Rockville, Md., 1978.

Аристовская T. В. ДАН СССР, 136, 954—957 (1961).

Baird-Parker A. C. Nature (London), 180, 1056—1057 (1957).

Baird-Parker A. C. J. Gen. Microbiol., 22, 458—469 (1960).

Baldacci Е., Locci R. In: R. E. Buchanan and N. E. Gibbons (eds.), Bergey’s manual of determinative bacteriology, Sth ed., p. 829— 831, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974.

Baron L. S., Carey W. F., Spilman W. M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 45, 976—984 (1959).

Baumann P., Doudoroff M„ Stanier R. Y. J. Bacteriol., 95, 58—73 (1968).

Baumann P., Doudoroff M., Stanier R. Y. J. Bacteriol., 95, 1520— 1541 (1968).

Becking H. I. Plant Soil, 14, 49—81; 297—322 (1961).

Becking H. I. In: R. E. Buchanan and N. E. Gibbons (eds.), Bergey’s manual of determinative bacteriology, 8th ed., p. 258—259, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974.

Belaich J. P., Senez J. P. J. Bacteriol., 89, 1195—1200 (1965).

Bergan T., Hovig B. Acta Pathol. Microbiol. Scand., 74, 421—430 (1968).

Block R. J., Bolling D. The amino acid composition of proteins and foods, p. 485—492, Charles C. Thomas, Publisher, Springfield, III., 1945.

Bose S. K. In: H. Gest, A. San Pietro and L. P. Vernon (eds.), Bacterial photosynthesis, p. 501—510, The Antioch Press, Yellow Springs, Ohio, 1963.

Bowdre J. H., Krieg N. B., Noffman P. S. Smibert R. M. Appl. Environ. Microbiol., 31, 127—133 (1976).

Brewer J. H. Science, 95, 587 (1942).

Bryant M. P., Robinson 1. M. J. Bacteriol., 84, 605—614 (1962).

Bryant M. P., Robinson I. M., Chu H. J. Dairy Sci., 42, 1831 — 1847 (1959).

BryantM.P.,SmallN. J. Bacteriol., 72, 16—21 (1956).

BryantM.P„SmallN. J. Bacteriol., 72, 22—26 (1956).

BryantM.P.,SmallN., Bouma C., Chu H. J. Bacteriol.,76,15—

23 (1958).

Burton M. O., Lockhead A. G. Can. J. Bot., 31, 145—151 (1953).

Caltaham L. T., HI, Richardson S. H. Infect. Imun., 7, 567—572 (1973).

Campbell L. L„ Jr., Frank H. A., Hall E. R. J. Bacteriol., 73, 516— 521 (1957).

Canale-Parola E., Wolfe R. S. J. Bacteriol., 79, 857—859; 860— 862 (1969).

Caraway В. H., Krieg N. R. Can. J. Microbiol., 18, 1749—1759 (1972).

Catlin B. W. J. Infect. Dis., 128, 178—194 (1973).

Catlin W. J. Bacteriol., 79, 579—590 (1960).

Catlin W. J. Bacteriol., 83, 470—474 (1962).

Chang G. W., Snell E. E. Biochemistry, 7, 2005—2012 (1968).

Christie A. O., Porteous J. W. J. Gen. Microbiol., 28, 443—460.

Cohen-Bazire G., Sistrom W. R., Stanier R. Y. J. Cell Comp. Physiol., 49, 25—68 (1957).

Cole R. M., Tully J. G., Popkin T. J., Bove J. M. J. Bacteriol., 115, 367—386 (1973).

Couch J. N. J. Elisha Mitchell Sci. Soc., 66, 87—92 (1950).

Couch J. N. J. Elisha Mitchell Sci. Soc., 71, 148—155 (1955).

Часть п. рост

Couch J. N. J. Elisha Mitchell Sci. Soc., 79, 53—70 (1963).

Craig J. A., Snell E. E. J. Bacteriol., 61, 283—291 (1951).

Cross T. J. Appl. Bacteriol., 31, 36—53 (1968).

Cross T. In: R. E. Buchanan and N. E. Gibbons (eds.), Bergey’s manual of determinative bacteriology, Sth ed., p. 859, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974.

Darland G., Brock T. D., Samsonoff W., Conti S. F. Science, 170, 1416—1418 (1970).

Davis B. R., Woodward J. M. Can. J. Microbiol., 3, 591—597 (1957).

DeLey J. J. Gen. Microbiol., 24, 31—50 (1961).

DeLey J., Frateur J. In: R. E. Buchanan and N. E. Gibbons (eds.), Bergey’s manual of determinative bacteriology, Sth ed., p. 277, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974.

Delwiche E. A. J. Bacteriol., 58, 395—398 (1949).

DeMoss R. O., Happel M. E. J. Bacteriol., 77, 137—141 (1959).

Difco. Difco manual, 9th ed., p. 116, 121, 271, 276, Difco Laboratories, Detroit, 1962.

Dondero N. C., Phillips R. A., Heukelekian H. Appl. Microbiol., 9, 219—227 (1961).

Dreizen S„ Mosny J. J., Gilley E. J., Spies T. D. J. Dent. Res., 33, 339—345 (1954).

Duchow E., Douglas H. C. J. Bacteriol., 58, 409—416 (1949).

Dworkin M. J. Bacteriol., 84, 250—257 (1962).

Dworkin M., Foster J. W. J. Bacteriol., 72, 646—659 (1956).

Ehrlich J., Gottlieb D., Burkholder P. R., Anderson L. E., Prid- ham T. G. J. Bacteriol., 56, 467—477 (1948).

Englesberg E., Levy J. B. J. Bacteriol., 67, 438—449 (1954).

Friedman M. E., Roessler W. G. J. Bacteriol., 83, 528—533 (1961).

Frobisher M. Fundamentals of microbiology, p. 538, The W. B. Saunders Co., Philadelphia, 1968.

Fuller R. C. In: H. Gest, A. San Pietro and L. P. Vernon (eds.). Bacterial photosynthesis, p. 507—509, The Antioch Press, Yellow Springs, Ohio, 1963.

Gardner G. A. J. Appl. Bacteriol., 32, 371—380 (1969).

Gardnerg J. F„ Lascelles J. J. Gen. Microbiol., 29, 157—164 (1962).

Garvie E. T. J. Gen. Microbiol., 48, 439—447 (1967).

Georg L. K., Brown J. M. Int. J. Syst. Bacteriol., 17, 79—88 (1967).

Georg L. K., Roberstad G. W., Brinkman S. A. J. Bacteriol., 88, 477—490 (1964).

Gerhardt P. Bacteriol. Rev., 22, 81—98 (1958).

Gordon M. A., Edwards M. R. J. Bacteriol., 86, 1101—1115 (1963).

Gould R. G. J. Biol. Chern., 153, 143—150 (1944).

Griffin P. I., Racker E. J. Bacteriol., 71, 717—721 (1956).

Guirard В. M. In: G. D. Fasman (ed.), Handbook of biochemistry and molecular biology, 3rd ed., vol. 2, p. 629, CRC Press, Cleveland, 1976.

Guirard В. M., Snell E. E. In: I. C. Gunsalus and R. Y. Stanier

(eds.), The bacteria, vol. 4, p. 33—93, Academic Press, Inc., New York, 1962.

Guirard В. M., Snell E. E. J. Bacteriol., 87, 370—376 (1964).

Gutierrez J., Davis R. E., Lindahl I. L, Warwick E. J. Appl. Microbiol., 7, 16—21 (1959).

Hammerstrom R. A., Claus K. D., Coghlan I. W., McBee R. H. Arch. Biochem. Biophys., 56, 123—129 (1955).

Hanert H. Arch. Mikrobiol., 60, 348—376 (1968).

Happold F. C., Johnstone К. I., Rogers H. J., Yovatt J. B. J. Gen. Microbiol., 10, 261—266 (1954).

Hawk P. B., Oser B. L., Summerson W. H. Practical physiological chemistry, 12th ed„ p. 109, The Blakiston Co., New York, 1951.

Hayflick L., Chanock R. M. Bacteriol. Rev., 29, 185—221 (1965).

Haywood H. R., Stadtman T. C. J. Bacteriol., 78, 567—561 (1959).

Heilman F. R. J. Infect. Dis., 69, 32—51 (1941).

Hemphill H. E„ Zahler S. A. J. Bacteriol., 95, 1011—1017 (1968).

Henderson L. M., Snell E. E. J. Biol. Chern., 172, 15—29 (1948).

Hendrie M. S., Hodgkiss W., Shewan J. W. J. Gen. Microbiol., 64, 151—169 (1970).

Henssen A. Arch. Mikrobiol., 26, 373—414 (1957).

Herbst E. J., Snell E. E. J. Biol. Chern., 176, 989—990 (1948).

Hespell R. B., Canale-Parola E. J. Bacteriol., 103, 216—226 (1970).

Hirsch P. In: R. E. Buchanan and N. E. Gibbons (eds.), Bergey’s manual of determinative bacteriology, Sth ed., p. 149—151, The * Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974.

Hofstad T. Acta. Pathol. Microbiol. Scand., 69, 543—548 (1967).

Holt S. C., Conti S. F., Fuller R. C. J. Bacteriol., 91, 311—323 (1966).

Howell A., Pine L. J. Bacteriol., 71, 47—53 (1956).

Hutner S. H. J. Bacteriol., 43, 629—640 (1942).

Hutner S. H., Provasoli L., Schatz A., Haskins С. P. Proc. Am. Philos. Soc., 94, 152—170 (1950).

Jackins H. C„ Barker H. A. J. Bacteriol., 61, 101—114 (1951).

Janke A. Arch. Microbiol., 15, 116—118 (1950).

Jensen E. M„ Seeley H. №. J. Bacteriol., 67, 484—488 (1954).

Jensen H. L. Proc. Linn. Soc. N. S. W„ 57, 173—180 (1932).

Jensen H. L., Peterson E. J., De P. K-, Bhattacharya R. Arch. Mikrobiol., 36, 182—195 (1960).

Johnson R. C., Wilson J. B. J. Bacteriol., 80, 406—411 (1960).

Jones H. E., Park R. W. A. J. Gen. Microbiol., 47, 369—378 (1967).

Jones J. B., Stadtman T. C. J. Bacteriol., 130, 1404—1406 (1977).

Jordan R. M. M. Br. J. Exp. Pathol., 33, 27—54 (1952).

Kane №. D. J. Elisha Mitchell Sci. Soc., 82, 220—230 (1966).

Kasai G. J. J. Dent. Res., 44, 1015—1022 (1965).

Katznelson H., Lockhead A. G, J. Bacteriol., 64, 97—103 (1952).

Kauffmann F. The bacteriology of Enterobacteriaceae, p. 311 — 332, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1966.

Kaufman L., Humphries J. C. Appl. Microbiol., 6, 311—315 (1958).

105а. Kavanaugh. F. Analytical microbiology, vol. 1 and 2, Academic Press, Inc., New York, 1963, 1972.

Kellogg D. S., Peacock W. L., Jr., Deacon W. E„ Brown L., Pirkle С. I. J. Bacterio!., 85, 1274—1279 (1963).

Kihara H., Snell E. E. J. Biol. Chern., 235, 1409—1414 (1960).

Kindler S. H., Mager J., Grossowicz N. J. Gen. Microbiol., 15, 386—393 (1956).

King В. M„ Alder D. L. Am. J. Clin. Pathol., 41, 230—232 (1964).

Kitahara K, Lai C. L. J. Gen. Appl. Microbiol., 13, 197—203 (1967).

110a. Kitahara K, Suzuki J. J. Gen. Appl. Microbiol., 9, 59—71 (1963).

Knight В. C. J. G., Proom H. J. Gen. Microbiol., 4, 508—538 (1950).

Knight S. G. In: С. H. Werkman and P. W. Wilson (eds.), Bacterial metabolism, p. 500—516, Academic Press, Inc., New York, 1951.

Кондратьева E. H., Красильникова E. H„ Новикова Л. M. Микробиология, 37, 417—427 (1968).

Koser S. Vitamin requirements of yeast and bacteria, Charles C. Thomas, Publisher, Springfield, Ill., 1968.

Kowallik U., Pringsheim E. G. Am. J. BoL 53, 801—806 (1966).

Красильников H. А., Агре H. С. Микробиология, 33, 829—835 (1964).

Krieg N. R. In: R. E. Buchanan and N. E. Gibbons (eds.), Bergey’s manual of determinative bacteriology, Sth ed., p. 198—200, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974.

Kubica G.-P., Kim T. H., Dunbar F. P. Int. J. Syst. Bacterio!., 22, 99—106 (1972).

Kulp W. L., Borden D. G. J. Bacterio!., 44, 673—685 (1942).

Lankford С. E., Skaggs P. K. Arch. Biochem., 9, 265—283 (1946).

Lankford С. E„ Snell E. E. J. Bacterio!., 45, 410—411 (1943).

La Page S. P., Shelton J. E., Mitchell T. G. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (eds.), Methods in microbiology, vol. ЗА, p. 1 —133, Academic Press, Inc., New York, 1970.

Larsen H. J. Bacteriol., 64, 187—196 (1952).

Larsen H. In: H. Gest, A. San Pietro and L. P. Vernon (eds.), Bacterial photosynthesis, p. 509, The Antioch Press, Yellow Springs, Ohio, 1963.

Lechevalier H. A., Solotorovsky M., McDurmont С. I. J. Gen. Microbiol., 26, 11 — 18 (1961).

Lechevalier M. P., Lechevalier H. H., Holbert P. E. Ann. Inst. Pasteur Paris, 114, 277—285 (1968).

Lennette E. H., Balows A., Hausler W. J., Jr., Truant J. P. (eds.). Manual of clinical microbiology, 3rd ed., p. 965—999, American Society for Microbiology, Washington, D. C., 1980.

Lewin R. A. Can. J. Microbiol., 8, 555—563 (1962).

Lewin R. A. Can. J. Microbiol., 16, 511—515 (1970).

Lewin R. A., Lounsberry D. M. J. Gen. Microbiol., 58, 145—157 (1969).

Lubin M. In: J. H. Hoffman (ed.). The cellular function of

membrane transport, р. 193—209, Prentice-Hall, Inc., Englewood Cliffs, N. J., 1964.

Luedemann G. M. J. Bacteriol., 96, 1848—1858 (1968).

Luria S. E., Burrows J. Ц7. J. Bacteriol., 74, 461 (1957).

MacLeod R. A., Snell E. E. J. Bacteriol., 59, 783—792 (1950).

Mager J., Kindler S. H., Grossowicz N. J. Gen. Microbiol., 10, 130—141 (1954).

Mah R. A., Fung D. Y. C., Morse S. A. Appl. Microbiol., 15, 866— 870 (1967).

Marshak A. J. Bacteriol., 61, 1—16 (1951).

Matsumae A. M., Obtani M., Takeshima H., Hata T. J. Antibiot., 21, 616—625 (1968).

McCleskey C. S. J. Bacteriol., 64, 140—141 (1952).

McCurdy H. D. Can. J. Microbiol., 10, 935—936 (1964).

McCurdy H. D. Can. J. Microbiol., 15, 1453—1461 (1969).

McCurdy H. D. In: R. E. Buchanan and N. E. Gibbons (eds.), Bergey’s manual of determinative bacteriology, Sth ed., p. 87—88, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974.

Mickelson M. N. J. Bacteriol., 88, 158—164 (1964).

Midgley J., Lapage S. P., Jenkins B. A. G., Barrow G. L, Roberts M. E„ Buck A. G. J. Med. Microbiol.. 3, 91—98 (1970).

Mildvan A. S. In: P. D. Boyer (ed.), The enzymes, student edition, vol. 2, p. 445—536, Academic Press, Inc., New York, 1970.

Miller T. L., Evans J. B. J. Gen. Microbiol., 61, 131—135 (1970).

Mitchell T. G., Hendrie M. S., Shewan J. M. J. Appl. Bacteriol., 32, 40—50 (1969).

147a. Moss C. W., Dowell V. R., Jr., Farshtchi D., Ranier L. J., Cherry W. B. J. Bacteriol., 97, 561—570 (1969).

Moss C. W., Dowell V. R. Jr., Lewis W. J., Schekter M. A. J. Bacteriol., 94, 1300—1305 (1967).

Mueller J. H. J. Bacteriol., 36, 499—515 (1938).

Mulder E. G. J. Appl. Bacteriol., 27, 151—173 (1964).

Mulder E. G., van Leen W. L. In: R. E. Buchanan and N. E. Gibbons (eds.), Bergey’s manual of determinative bacteriology, Sth ed., p. 133, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974.

Myers W. F., Cutler L. D., Wisseman C. L., J. Bacteriol., 97, 663— 666 (1969).

Norris D. O. Nature (London), 182, 734—735 (1958).

Ormerod J. G., Ormerod K- S., Gest H. Arch. Biochem. Biophys., 94, 449—463 (1961).

Oxender D. L. Annu. Rev. Biochem., 41, 777—814 (1972).

Pan S. F„ Yee R„ Gezon H. M. J. Bacteriol., 73, 402—409 (1957).

Perry J. J., Evans J. B. J. Bacteriol., 91, 33—38 (1966).

Pfennig N., Lippert K. D. Arch. Mikrobiol., 55, 245—256 (1966).

Phillips J. E. In: R. E. Buchanan and N. E. Gibbons (eds.), Bergey’s manual of determinative bacteriology, Sth ed., p. 373—374, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974.

Pine L., Watson S. J. J. Lab. Clin. Med., 54, 107—114 (1959).

Pittman K. A., Bryant M. P. J. Bacteriol., 88, 401—410 (1964).

Poindexter J. S. Bacteriol. Rev., 28, 231—295 (1964).

Post gate J. R. J. Gen. Microbiol., 14, 545—572 (1956).

Postgate I. R., Campbell L. L. J. Bacterio!., 86, 274—279 (1963).

Pratt D. J. Bacterio!., 64, 651—665 (1952).

Pridham T. G., Gottlieb D. J. Bacterio!., 56, 107—114 (1948).

Puttlitz D. H„ Seeley H. W., Jr. J. Bacteriol., 96, 931—938 (1968).

Rabinowitz J. C., Snell E. E. J. Biol. Chern., 169, 631—642 (1947).

Razin S. Microbiol. Rev., 42, 414—470 (1978).

Razin S., Cohen A. J. Gen. Microbiol., 30, 141—154 (1963).

Razin S„ Tully J. G. J. Bacteriol., 102, 306—310 (1970).

Rechcigl M., Jr. (ed.). CRC handbook series in nutrition and food, sect. G, vol. 3, p. 83—281, CRC Press, Cleveland, 1978.

Reich С. V., Hanks J. H. J. Bacteriol., 87, 1317—1320 (1964).

Reichenbach H. Arch. Mikrobiol., 70, 119—138 (1970).

Reichenback H., Dworkin M. J. Gen. Microbiol., 58, 3—14 (1969).

Reyn A. In: R. E. Buchanan and N. E. Gibbons (eds.), Bergey’s manual of determinative bacteriology, Sth ed., p. 432—433, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974.

Rockenmacker M„ James H. A., Elberg S. S. J. Bacteriol., 63, 785—794 (1952).

Rode L. J., Ogelsby G., Schuhardt V. T. J. Bacteriol., 60, 661 — 668 (1950).

Rogosa M. J. Bacteriol., 87, 162—170 (1964).

Rogosa M. J. Bacteriol., 87, 574—587 (1964).

Rogosa M. J. Bacteriol., 98, 756—766 (1969).

Rogosa M. Int. Syst. Bacteriol., 21, 187—189; 231—233 (1971).

Roth J. R. Methods EnzymoL, 17A, 6 (1970).

Rothwell F. M. Mycologia, 49, 68—72 (1957).

Rowatt E. J. Gen. Microbiol., 17, 297—326 (1957).

Sanders T. H., Higuchi K-, Brewer C. R. J. Bacteriol., 66, 294— 299 (1953).

Sanderson К. E. Bacteriol. Rev., 31, 354—372 (1967).

Schubert R. H. W. In: R. E. Buchanan and N. E. Gibbons (eds.), Bergey’s manual of determinative bacteriology, Sth ed., p. 345— 346, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974.

Scotten H. L., Stokes J. L. Arch. Microbiol., 42, 353—368 (1962).

Sebald M„ Vernon M. Ann. Inst. Pasteur Paris, 105, 897—910 (1963).

Sebrell W. H., Harris R. S. (eds.). The vitamins, 2nd ed., vol. 2, 4, 5, 7, Academic Press, Inc., New York, 1954—1972.

Shenberg E. J. Bacteriol., 93, 1598—1606 (1967).

Shiuuers D. W„ Brock T. D. J. Bacteriol., 114, 706—710 (1973).

Sijpesteijn A. K., Fahraeus G. J. Gen. Microbiol., 3, 224—234 (1949).

Skeggs H. R., Wright L. D., Gresson E. L., NacRae G. D. E., Hoffman С. H., Wolf D. E., Folkers K. J. Bacteriol., 72, 519—524 (1956).

Skerman T. M., Jayne-Williams D. J. J. J. Appl. Bacteriol., 29, 167—178 (1966).

Slack J. M. In: R. E. Buchanan and N. E. Gibbons (eds.), Bergey’s manual of determinative bacteriology. Sth ed., p. 671—673, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974.

1. Биохимические Факторы

Slotnick I. L, Dougherty M. Antonie van Leeuwenhoek J. Microbiol. SeroL, 30, 261—272 (1964).

Slotnick I. J., Dougherty M. Antonie van Leeuwenhoek J. Microbiol. SeroL, 31, 355—360 (1965).

Smith C. F. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 88, 628—631 (1955).

Smith P. F„ Langworthy T. A., Smith M. R. J. Bacteriol., 124, 884—892 (1975).

Smith P. H„ Hungate R. E. J. Bacteriol., 75, 713—718 (1958).

Sneath P. H. A. Iowa State J. Sci., 34, 243—500 (1960).

Snell E. E. In: P. Gyorgy (ed.), Vitamin methods, vol. 1, p. 327—

Academic Press, Inc., New York, 1950.

Snell E. E. In: J. H. Yoe and H. J. Koch, Jr. (eds.), Trace analysis, p. 547—574, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1957.

Snell E. E., Wright L. D. J. Biol. Chern., 139, 675—686 (1941).

Sperry J.F„Wilkins T. D.J. Bacteriol., 127, 780—784 (1976).

StadtmanE.R.,StadtmanT. C., Pastan I., Smith L. D. S. J. Ba

cteriol., 110, 758—760 (1972).

StadtmanT.C.,Barker H.A. J. Bacteriol., 61, 67—80 (1951).

StadtmanT.C.,Barker H.A. J. Bacteriol., 62, 269—280 (1951).

Staley J. T. J. Bacteriol., 95, 1921—1942 (1968).

Stonier R. Y. Bacteriol. Rev., 6, 143—196 (1942).

Stanier R. Y„ Palleroni N. L, Doudoroff M. J. Gen. Microbiol., 43, 159—271 (1966).

Starr M. P. J. Bacteriol., 51, 131 — 143 (1946).

Starr M. P. J. Bacteriol., 52, 187—194 (1946).

Steele B. F., Sauberlich H. E., Reynolds M. S., Baumann C. A. J. Biol. Chern., 177, 533—551 (1949).

Steinman H. G., Eagle FL, Oyama V. I. J. Bacteriol., 64, 265—269 (1952).

Steinman H. G., Eagle H., Oyama V. I. J. Biol. Chern., 200, 775— 785 (1953).

Stekes L L. J. Bacteriol., 67, 278—291 (1954).

Szaniszlo P. J. J. Elisha Mitchell Sci. Soc., 84, 24—26 (1968).

Tamura G. J. Gen. Appl. Microbiol., 2, 431—434 (1956).

Tamura G. Bull. Agric. Chern. Soc. Jpn., 21, 202 (1957).

Tehan Y. T. Proc. Linn. Soc., N. S. W., 78, 85—89 (1953).

Thiele H. H. Arch. MikrobioL, 60, 124—138 (1968).

Thiemann J. E., Beretta G. Arch. MikrobioL, 62, 157—166 (1968).

Thiemann J. E., Pagani H., Beretta G. Arch. MikrobioL, 58, 42— 52 (1967).

Thompson R. S., Leadbetter E. R. Arch. MikrobioL, 45, 27—39 (1963).

Tsukiura H„ Okanishi M., Koshiyama H., Ohmori T., Miyaki T., Kawaguchi H, J. Antibiot. Ser. A, 17, 223—229 (1964).

Van Veen W. L., Mulder E. G., Deinema M. H. Microbiol. Rev., 42, 329—356 (1978).

Vogel H. L, Bonner D. M. J. Biol. Chern., 218, 97 (1956).

Vogler K. G„ Umbreit W. W. Soil Sci., 51, 331—337 (1941).

Waksman S. A. The Actinomycetes, vol. 2, p. 328—334, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1961.

Waksman S. A., Umbreit W. W., Cordon T. C. Soil Sci., 47, 37— 61 (1939).

Waldie Е. L. Iowa State Coll. J. Sci., 19, 435—484 (1945).

Watson S. W. Arch. MikrobioL, 75, 179—188 (1971).

Watson S. W. Int. J. Syst. Bacteriol., 21, 254—270 (1971).

Watson S. W„ Graham. L. B., Remsen С. C., Valois F. W. Arch. MikrobioL, 76, 183—203 (1971).

Watson S. W„ Waterbury J. B. Arch. MikrobioL, 77, 203—230 (1971).

Weeks О. B. J. Appl. Bacteriol., 32, 13—18 (1969).

Weinman D. In: D. Weinman and M. Ristic (eds.), Infectious blood diseases of man and animals, vol. 2, p. 3—24, Academic Press, Inc., New York, 1968.

Welshimer H. J. J. Bacteriol., 85, 1156—1159 (1963).

Werkman С. H„ Gillen G. F. J. Bacteriol., 23, 167—182 (1932).

White D. C., Leidy G., Jamison J. D., Shope R. E. J. Exp. Med., 120, 1 — 12 (1964).

Wilson G. S., Miles A. A. Topley and Wilson’s principles of bacteriology and immunology, Sth ed., vol. 1, p. 849—865, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1964.

Winogradsky H. In: R. E. Buchanan and N. E. Gibbons (eds.), Bergey’s manual of determinative bacteriology, Sth ed., p. 454— 455, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974.

Zauarzin G., Legunkoua R. J. Gen. Microbiol., 21, 186—190 (1959).

Zimmerman R., Rogers К- B., Frazer J., Boyce J. M. J. Pathol. Bacteriol., 96, 413—419 (1968).*

Глава 8

ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНЫХИ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР

Н. Криг

В условиях естественного обитания чистые бактериальные культуры встречаются довольно редко. Тем не менее основная часть современных представлений о свойствах бактерий, а также их взаимоотношениях получена при изучении чистых культур. Поэтому часто возникает необходимость выделить в виде чистых культур различные виды бактерий, которые сосуществуют в естественных условиях. Накопление представляет собой основной этап процесса, который позволяет получить чистые культуры. Оно также дает возможность оценить различные воздействия факторов окружающей среды на смешанную микробную популяцию, благодаря которым может происходить отбор микроорганизмов, способных взаимодействовать со специфическими субстратами (или расщеплять их) или способных хорошо расти в необычных условиях.

Выделение чистой культуры данного микроорганизма будет успешным, если он присутствует в смешанной популяции в достаточно высокой пропорции. Микроорганизм легко выделить, если он количественно преобладает в смешанной популяции. Разработанные методы накопления имеют целью добиться увеличения относительного количества данного организма благодаря созданию лучших условий для его роста и выживания по сравнению с другими или путем пространственного отделения его от других членов популяции. К физическим методам, которые могут быть использованы в данном случае, следует отнести регуляцию роста температурой, тепловую обработку, ультразвуковую обработку и ультрафиолетовое облучение, приводящие к гибели или подавлению роста других организмов, присутствующих в популяции. Можно также использовать преимущества в некоторых физических свойствах изучаемого микроорганизма, таких, как его размеры и подвижность; это

позволяет в значительной мере отделить данный организм от других в популяции. В химических методах используют токсичные вещества, которые убивают или подавляют рост оставшейся части популяции, не влияя на выделяемый микроорганизм. Кроме того, эти вещества могут быть источниками питания, используемыми преимущественно отдельными бактериями в смешанной популяции. Биологические методы включают использование специфических хозяев для выделяемого организма, а также преимуществ некоторых патогенных свойств микроорганизма (например, его инвазивность), которыми не обладают другие представители популяции. Во многих случаях для получения максимального эффекта накопления сочетают физические, химические и биологические методы.

Как правило, накопительные культуры получают в закрытых системах, т. е. микроорганизмы выращивают в обычных периодических (стационарных) условиях в колбах или пробирках, где концентрация питательных веществ и продуктов метаболизма постоянно изменяется в процессе их роста. Для получения накопительных культур используются также открытые системы. Например, с помощью хемостата можно обеспечить постоянство окружающей среды для бактерий, непрерывно подавая питательные вещества в концентрации, лимитирующей рост, и удаляя продукты метаболизма. Изменяя скорость разбавления среды в хемостате, можно контролировать концентрацию питательных веществ, лимитирующих рост. В свою очередь это может избирательно влиять на скорость роста различных организмов в смешанной бактериальной культуре, в результате чего один или другой организм смешанной популяции начинает количественно преобладать.

Из накопительных культур бактерии обычно выделяют путем их пространственного отделения от других форм на твердой среде, где они растут в виде колоний. Для микроорганизмов, не растущих на твердых средах, можно использовать метод предельного разведения, последовательно перенося клетки в отдельные пробирки с жидкой средой. Поскольку обычные методы выделения не дают абсолютной гарантии чистоты получаемых культур, некоторые исследователи применяют более

сложные приемы, с помощью которых отдельную бактериальную клетку выделяют из смешанной популяции, используя для получения клона микроскопический контроль.

В этой главе мы приведем специфические примеры огромного многообразия и нередко изощренности методов накопления, используемых в бактериологии. Во многих случаях для получения накопительной культуры определенной бактерии используют несколько различных подходов. Основное внимание в этой главе будет уделено практическим аспектам получения накопительных культур и выделения бактерий, однако в конце главы приведены ссылки на общие обзоры [1—4], в которых можно найти подробную информацию об используемых при этом принципах. Получение накопительных культур и выделение мутантных штаммов рассматриваются в разд. 13.4—13.6.

БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Инкубация при низкой температуредля получения культурпсихрофилов и психротрофов [52]

Поскольку низкая температура способствует задержке роста многих бактерий, но не влияет на рост психрофилов и психротрофов, прежде чем начать выделение бактерий, культуры инкубируют при температуре О— 5 °C. Так, Ину [31] удалось изолировать психрофиль- ные бактерии из почвы Антарктиды, внеся разведенную суспензию бактерий в чашки с агаром, содержащим глюкозу, дрожжевой экстракт и пептон. Чашки инкубировали при температуре ниже 5 °C в течение 14— 24 дней. Таким методом были получены девять штаммов бактерий с оптимальной температурой для роста около 20 °C, т. е. это были облигатные психрофилы [32].

Инкубация при низкой температуредля получения культур

Listeria monocytogenes [39]

Клетки Listeria с трудом поддаются выделению из клинического материала, содержащего большое кодиче-

ство других бактерий (это материал из шейки матки, влагалища, мекония, фекалиев, носоглотки или тканей). Весьма полезной для получения накопительной культуры этой бактерии оказалась предлагаемая ниже процедура. Мазки помещают в пробирки с 5 мл бульона для листерий (разд. 8.2.25) и закрывают их завинчивающимися крышками. В случае проб из фекалий и тканей готовят 10%-ную (объем/объем) суспензию в бульоне для листерий. Бульон можно хранить при 4 °C до 3 мес. Поэтому целесообразно проводить выделение в первые 4 нед с недельными интервалами и затем делать месячный перерыв. При хранении на холоду бульон обогащается Listeria. Это обусловлено лучшим по сравнению с другими бактериями выживанием листерий при 4 °C [84]1, их способностью размножаться при 4 °C [67] и выходом микроорганизма из клеток ткани [15]. После такого обогащения на холоду 0,2 мл суспензии переносят в пробирку с 5 мл бульона для листерий, содержащего KCNS (до стерилизации бульона к нему добавляют 3,75% тиоцианата калия), и инкубируют 48 ч при 25 °C. Для получения отдельных колоний петлю вводят непосредственно под поверхность среды и переносят ее на поверхность чашек с агаром Мак-Брайда для листерий (разд. 8.5.29).

Инкубация при высокой температуредля получения культур термофилов [6]

В отличие от термофилов рост остальных микроорганизмов при высокой температуре подавляется. Поэтому для обогащения термофилами смешанную культуру инкубируют при достаточно высокой температуре. Например, в случае молочнокислых термофилов серийные разведения молока пересевают в чашки со стандартной агаровой средой (разд. 8.5.48) и инкубируют их при 55 °C.

Инкубация при высокой температуре для получения культур Thermus aquaticus [11]

Т. aquaticus имеет оптимальную температуру роста 70—72 °C; эта бактерия не растет при температуре ниже 40 °C и выше 79 °C. Ее можно выделить из горячей

получение накопительных и чистых культур

водопроводной воды, микробных матов, из горячих источников или рек, загрязненных горячими сточными водами. С этой целью исследуемые пробы добавляют к 10 мл основной солевой среды (разд. 8.5.7), содержащей 0,1% панкреатического гидролизата казеина и 0,1% дрожжевого экстракта. Инкубируют без встряхивания при 70—75 °C и следят за изменением мутности в течение 1—2 дней. Если мутность увеличивается, микробная масса обычно приобретает желтый или оранжевый цвет. Суспензию исследуют под микроскопом с целью обнаружения коротких и длинных нитей или сфе- ропластов. Чистую культуру выделяют путем посева на чашки с той же средой, содержащей 3% агара. На чашках ищут компактные разрастающиеся желтые колонии, состоящие из нитевидных микроорганизмов.

Нагревание для получения культуртермоустойчивых микроорганизмов [6]

Пробы сырого молока пастеризуют нагреванием до 62,8 °C и выдерживают их при этой температуре в течение 30 мин, затем их охлаждают, разводят, переносят на стандартную агаровую среду (разд. 8.5.48) и инкубируют чашки при 32 °C.

Нагревание для получения культур мезофильных спорообразующих бактерий

Пробы воды или взвеси почвы нагревают до 80 °C, выдерживают 10 мин и затем наносят штрихом на поверхность твердой среды в чашках. Для штаммов Bacillus обычно используют питательный агар; штаммы Clostridium рассевают по стенке вращающейся пробирки с восстановленным мясным агаром (разд. 20.3.10) или на поверхности свежеприготовленной агаровой среды и инкубируют в анаэростате.

Если в пробах есть небольшое количество спор, то их число можно увеличить, внеся пробы в подходящую для споруляции среду и инкубируя культуру в течение 2—21 дней перед тепловой обработкой. Для большинства видов Bacillus средой, на которой происходит образование спор, является питательный бульон (разд.

Масть и. рост"

20.3.25), содержащий 0,5% дрожжевого экстракта, 7- •Ю"4 М СаС12, 1-Ю"3 М MgCl2 и 5-10"5 М МпС12. Для большинства видов Clostridium не существует оптимальной среды для образования спор, однако известно, что их споруляцию можно вызвать инкубацией в мясной среде (разд. 20.3.10) как в присутствии глюкозы, так и в ее отсутствие [27].

Еще один способ получения накопительных культур заключается в добавлении проб, содержащих споры, к соответствующей среде, которую затем прогревают 10 мин при 80 °C и инкубируют около 1 сут. Выросшую культуру высевают на твердые среды. Для видов Bacillus наиболее подходящей средой является питательный бульон с 0,5% дрожжевого экстракта, а для Clostridium— восстановленный крахмальный бульон (бульон PY+1% растворимого крахмала; разд. 20.3.28).

Для некоторых спорообразующих бактерий иногда приходится изменять режим тепловой обработки, поскольку эндоспоры разных штаммов могут различаться по термоустойчивости. Поэтому, если не удается получить удовлетворительных результатов при стандартной температуре 80 °C, ее следует снизить до 75 или 70 °C.

Нагревание для получения культуртермофильных спорообразующих бактерий [6]

Термофильные спорообразующие бактерии встречаются в различных сладких веществах, используемых при изготовлении мороженого. Обычно готовят 20%-ную пробу исследуемого объекта (свекловичный или тростниковый сахар, лактоза, церелоза, искусственный, кукурузный или кленовый сироп, кукурузный или жидкий сахар, мед), выдерживают ее 5 мин при 100°C и затем доводят стерильной водой до конечной концентрации 13,3%.

Получение культур термофильных аэробныхслабоацидофильных микроорганизмов

2 мл прокипяченного раствора сахара наносят на поверхность глюкозо-триптонового агара в чашках Петри (разд. 8.5.20) и инкубируют 48 ч во влажной камере

при 55 °C. Характерные колонии круглой формы (2— 5 мм в диаметре) с темной центральной частью, окруженные желтым ореолом, растут на поверхности агара. Колонии, растущие под поверхностью агара, более компактны и имеют размеры булавочной головки. Их следует пересеять на глюкозо-триптоновый агар.

Получение культур термофильных анаэробов,образующих сероводород

Пробы прокипяченного раствора сахара вносят в глубокие пробирки, содержащие сульфитный агар (1% триптона или триптиказы, 0,1% сульфита натрия и 2% агара). Перед инокуляцией агар в пробирках должен быть расплавлен и охлажден до 55 °C. Содержимому пробирок даюг застыть и затем инкубируют при 55°C в течение 72 ч. Бактерии, выделяющие сероводород, образуют в среде темные сферические зоны.

Нагревание для получения культур

Bacillus fastidiosus [41]

0,2 г почвы добавляют к 50 мл среды, содержащей 1% мочевой кислоты и 0,1% К2НРО4 в дистиллированной воде. Пробу инкубируют с встряхиванием в течение 48 ч, нагревают до 80 °C и выдерживают 15 мин при этой температуре, а затем переносят в чашку с агаром, приготовленным на этой же среде. В этом методе учитывается не только термоустойчивость В. fastidiosus, но также и то, что данная бактерия способна использовать источники углерода и энергии, недоступные другим микроорганизмам.

Нагревание для получения культур

Bacillus pasteurii [82]

Споры разлагающей мочевину бактерии В. pasteurii обладают высокой термоустойчивостью и способны расти на средах с таким значением pH, при котором большинство других видов не растет. Последнее свойство используется в описываемом ниже методе. Для роста В. pasteurii значение pH должно быть выше 8. После

нагревания суспензии почвы (для сохранения исключительно спор) пробы инкубируют при 30 °C в щелочной накопительной среде (1% дрожжевого экстракта и 5% мочевины), простерилизованной фильтрованием. После завершения роста культуру пересевают на твердую щелочную среду Уилли и Стокса (разд. 8.5.58) для получения отдельных колоний.

Использование роения клетокClostridium tetani для получения их культур [71]

Пробы из почвы, испражнений животных и клинического материала инокулируют в небольшой участок свежеприготовленного кровяного агара (разд. 20.3.7). Чашки инкубируют при 37 °C в анаэростате в течение 1 дня и затем внимательно исследуют поверхность агара на наличие так называемой зоны роящихся клеток (швармеров), которые в виде тонкой пленки распространяются за пределы зоны инокуляции. Для того чтобы убедиться в существовании процесса роения, иногда полезно поскрести иглой поверхность агара. Отбирают пробы с края зоны роения и переносят их в бульон, а затем рассевают по поверхности твердой среды (5% агара) для получения отдельных колоний.

Использование подвижности трепонемдля получения их культур [24—26, 61—63]

В центре соответствующей агаровой среды (разд. 8.5.42), находящейся в чашке Петри или в мензурке, вырезают углубление не менее 7 мм глубиною и 2—10 мм в диаметре (углубление не должно достигать дна). В это углубление вносят пробы, полученные из ротовой полости, кишечного содержимого или каловых масс. Крупные углубления (диаметр 10 мм) инокулируют 0,2 мл образца, а в небольшие углубления (диаметр 2 мм) пробу вносят косым уколом в их стенку. Важно не допускать попадания проб на поверхность агара. Сразу же после внесения проб чашки помещают в ана- эростат (разд. 6.6.3) и инкубируют их от 4 до 7 дней при 37 °C. В отличие от большинства других бактерий трепонемы могут мигрировать через агаровую среду.

Там, где они растут, на некотором расстоянии от углублений наблюдается помутнение среды. Из периферической зоны помутневшей области отбирают часть выросшей культуры и переносят ее в соответствующую предварительно восстановленную полужидкую среду (например, бульон, содержащий 0,15% агара). Поскольку можно ожидать присутствия нескольких видов трепонем, субкультуру рассевают по стенке вращающейся пробирки с предварительно восстановленной средой для получения отдельных колоний. Колонии образуют в среде мутные белесые плотные зоны.

Использование подвижности клетокSpirillum volutans для получения их культур [30, 60]

Для получения накопительной культуры гигантских микроаэрофильных бактерий S. volutans готовят настой сена на стоячей прудовой воде. После появления на поверхности настоя пены из-под нее отбирают пробы и исследуют их. Ищут очень крупные спириллы (1,4— 1,7 мкм в диаметре и до 60 мкм в длину) с биполярно расположенными пучками жгутиков, которые хорошо видны при микроскопии в темном поле. Для получения накопительной культуры немного сенного настоя вносят в почвенную среду Прингсхейма (разд. 8.5.41) и инкубируют при комнатной температуре. Однако даже при такой процедуре накопления другие бактерии явно количественно превосходят S. volutans. S. volutans выделяют также с помощью метода капиллярной трубки, впервые предложенного Гезбергером [60]. Размягчают на огне центральную часть стерильной стеклянной трубки (диаметр 5 мм), заткнутой ватными пробками. На размягченном участке трубку зажимают пинцетом с квадратными концами так, чтобы она почти полностью была пережата. Вновь нагревают уплощенную часть трубки и быстро вытягивают ее, чтобы образовался длинный (15—30 см) капилляр шириной 0,1—0,3 мм, имеющий овальное поперечное сечение. Концы капилляра запаивают на огне, а затем с помощью стерильного пинцета ломают капилляр у одного конца и втягивают в него на длину от 10 до 20 см стерильную почвенную среду Прингсхейма (супернатант). После этого капил-

ляр погружают в накопительную культуру и набирают в него еще 2—4 см этой культуры, убедившись, что между стерильной средой и культурой нет воздушного пространства. Кончик капилляра запаивают, оставляя небольшое воздушное пространство, и помещают капилляр на предметный столик микроскопа (100Х)- В накопительной культуре S. volutans часто способны двигаться быстрее, чем другие бактерии, и, следовательно, они быстрее достигают отдаленного конца капилляра. Как только спириллы достигнут этого конца, капилляр за ними ломают, переносят их в пробирку с полужидкой средой CHSS (разд. 8.5.15) и инкубируют при 30 °C. Чистоту выделенной культуры проверяют с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Использование скользящей подвижности Cytophaga и Flexibacter для получения их культур Разведенные пробы (из почвы, воды или помета животных, контактировавшего с почвой) рассевают на поверхности агаровой среды с низкой концентрацией питательных веществ, например с 0,1% тритона или триптиказы, либо с разведенным в 10 раз питательным агаром. В другом варианте пробы, представляющие собой измельченные листья наземных растений, водорослей или морских растений, размазывают по поверхности обедненного агара. Cytophaga и Flexibacter обладают способностью мигрировать по поверхности твердой среды. Их можно обнаружить по появлению тонких и часто почти полупрозрачных колоний с пальцевидными выступами, которые разрастаются далеко за зону нанесения исходного материала. Из этих колоний получают субкультуру. Для подавления роста других бактерий часто оказывается полезным включение в агаровую среду пенициллина G (15 ед/мл) и хлорамфеникола (5 мкг/мл) [79].

Использование скользящей подвижности Beggiatoa для получения их культур [19, 64]

Beggiatoa образует нити, состоящие из бесцветных клеток. Такие нити способны скользить по поверхности. Beggiatoa встречается в аэробных условиях в пресной

или морской воде, богатой H2S, причем она способна окислять сульфид в элементную серу, которая накапливается в клетках.

Для получения накопительных культур сначала готовят экстрагированное сено. Для этого сено измельчают и кипятят в больших объемах воды. В процессе экстракции воду трижды меняют. Вода в последней порции должна быть янтарного цвета. Сено подсушивают и помещают на подносе в термостат (37 °C) для окончательного высушивания.

Среду для получения накопительных культур, состоящую из 0,8 %-ной суспензии высушенного экстрагированного сена в 70 мл водопроводной воды, вносят в 125-миллилитровые колбы Эрленмейера и закрывают ватными пробками. Затем ее стерилизуют автоклавированием, добавляют к ней 5 мл суспензии ила из пруда, озера или ручья, содержащей гниющий растительный материал, и инкубируют при 25 ’С в течение 10 дней.

О процессе накопления бактерий свидетельствует появление резкого запаха H2S и образование белой пленки на поверхности среды и на стенках колб. Пленку исследуют на наличие характерных нитей Beggiatoa. Часть пленки смывают несколькими порциями стерильной водопроводной воды и затем наносят смывы на поверхность стерильной агаровой среды, содержащей 1 % агара и 0,2% мясного экстракта. Пробы инкубируют при температуре 28 °C до тех пор, пока ниги Beggiatoa не начнут мигрировать к периферии агара на достаточное расстояние от других микроорганизмов. Агаровые блоки, содержащие единичные изолированные нити, вырезают и помещают на поверхность свежей агаровой среды. После инкубации вновь выделяют отдельные нити. Процедуру селекции повторяют до тех пор, пока культура не станет свободной от других бактерий. Проверка чистоты культур проводится путем посева в различные среды

Использование фильтруемости трепонемдля получения их культур [27, 70]

На поверхность агара в чашке Петри с соответствующей средой (разд. 8.5.42) помещают мембранный ультрафильтр с размером пор 0,15 мкм. На фильтр кладут

кольцо диаметром 25—30 мм, слегка смазанное вакуумной смазкой. Затем на центральную часть мембранного фильтра наносят несколько капель разведенной пробы и инкубируют чашку в анаэростате при 37 °C в течение 1—2 нед. Трепонемы достаточно малы; они способны мигрировать через поры фильтра и проникать в расположенный под ним агар, где вызывают помутнение. Кольцо и мембранный фильтр снимают с поверхности агара, с помощью пастеровской пипетки удаляют поверхностный слой агара в области помутнения и микро- скопируют его в темном поле для выявления трепонем и контаминирующих форм. Методы субкультивирования и очистки культуры описаны в разд. 8.1.11. Подавлению роста сопутствующих бактерий часто способствует добавление в агаровую среду полимиксина В (800 ед./мл) и налидиксовой кислоты (800 ед./мл).

Использование фильтруемости

Campylobacter fetus для получения их культур [68, 69]

5 г фекальных масс или содержимого из кишечника крупного рогатого скота, овец, свиней или птиц разводят в 50 мл питательного бульона и фильтруют через несколько слоев марли, чтобы удалить крупные частицы. Используя в качестве предварительного фильтра рыхлую стеклянную вату, пропускают фильтрат через мембранный ультрафильтр с размером пор 0,65 мкм. Обмакивают стерильный ватный тампон в фильтрат и густо рассевают его в чашках с агаром для бруцелл (разд. 8.5.14). Чашки инкубируют при 37 °C в течение 4—5 дней в микроаэробных условиях (5% О2, 10% СО2 и 85% N2). Подавлению роста других микроорганизмов способствует добавление в среду антибиотиков бацитрацина (2 ед./мл) и новобиоцина (2 мкг/мл).

Использование фильтруемости

Aquaspirillum gracile для получения их культур [12]

На поверхность агара со средой для выделения (разд. 8.5.1) помещают мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм и наносят в центр этого фильтра 0,05 мл болотной или речной воды. Чашки инкубируют 1,5— 2 ч при комнатной температуре, затем снимают фильтр

и продолжают инкубировать не менее 3 дней. Клетки Л. gracile имеют диаметр 0,2—0,3 мкм, т. е. они достаточно малы и способны проникать через поры ультрафильтра в агар. В агаре находят полупрозрачные области роста и делают из них пересев. Другие бактерии, имеющие малые размеры (мелкие вибрионы, кокки или короткие палочки), также способны проходить через ультрафильтры и образовывать колонии на поверхности среды, но их легко отличить от находящихся под поверхностью агара типичных полупрозрачных колоний A. gracile.

Освещение при получении культуродноклеточных цианобактерий [59, 73]

Для выделения пресноводных цианобактерий (синезеленых водорослей) пробы из прудов, ручьев или водных резервуаров вносят в пробирки со средой BG-11 (разд. 8.5.8). Для выделения морских цианобактерий используют среду MN (разд. 8.5.32); если некоторые из них плохо растут на этой среде, то предпочтительнее пользоваться средой ASN-III (разд. 8.5.2). Всю стеклянную посуду следует вручную и хорошо прополаскивать водопроводной водой, концентрированной азотной кислотой и затем деионизованной водой. Накопительную культуру инкубируют в водяной бане на свету при 35 °C; при этой температуре подавляется рост большинства водорослей. Пользуются флуоресцентной лампой или лампой накаливания с освещенностью 2000 — 3000 лк. Для некоторых цианобактерий освещенность следует снизить до 500 лк или ниже. Накопление культуры периодически контролируют до тех пор, пока не убеждаются, что начался рост цианобактерий. Тогда их высевают на поверхность среды, содержащей 2% агара бактериологической степени очистки. Чашки инкубируют в условиях постоянной освещенности (<500 лк) при 25 °C на воздухе или в атмосфере, слегка обогащенной СОг; для предотвращения испарения в качестве камер следует использовать прозрачные пластмассовые коробки, например из-под овощей. С помощью препаровальной лупы выявляют компактные, сильно пигментированные колонии неподвижных циано

ЦдСть п. рост

бактерий. Для того чтобы избежать контаминации другими бактериями, может быть необходим многократный рассев культуры. При работе с подвижными цианобактериями небольшую порцию культуры помещают на одну сторону чашки Петри с агаровой средой. Если освещать чашку с противоположной стороны, то цианобактерии начнут перемещаться по поверхности агара в область с большей интенсивностью света. После того как часть микроорганизмов достигнет противоположной стороны чашки Петри, делают пересев в новые чашки столько раз, сколько это необходимо для того, чтобы избавиться от посторонних бактерий. Этот метод был также успешно использован для выделения некоторых нитчатых цианобактерий [73].

Для медленнорастущих цианобактерий, таких, как некоторые штаммы Pleurocapsales, исходную культуру можно получить прямым выращиванием колоний на твердой среде, что предпочтительнее, чем предварительное культивирование в жидкой среде [80]. Во время транспортировки обломков камней, раковин, моллюсков или обрывков крупных водорослей из зоны прилива в лабораторию образцы сохраняют в закрытых бутылях или пробирках, содержащих кусочек влажной фильтровальной бумаги. Образцы не следует погружать в морскую воду, так как это способствует развитию посторонних микроорганизмов. В лабораторных условиях делают соскобы с природных субстратов и суспендируют их в стерильной жидкой среде, а также рассевают в несколько чашек. Если в суспензии содержится много посторонних микроорганизмов, необходимо снизить их количество, прежде чем рассевать по чашкам. Для этого суспензию промывают несколько раз стерильной средой путем центрифугирования с низкой скоростью.

Для проверки чистоты культур цианобактерий пользуются микроскопом, а также инкубируют культуры на комплексных средах в темноте при 30 °C.

Освещение при получении культурRhodospirillaceae [76]

Несмотря на то что представителей сем. Rhodospirillaceae относят к пурпурным несерным бактериям, ряд видов этого семейства может использовать в качестве

донора электронов сульфид. Однако это происходит лишь в том случае, когда концентрация сульфида поддерживается на низком, нетоксичном уровне. Поэтому данные микроорганизмы обычно выращивают на средах с органическими донорами электронов. Используя различные источники углерода и витаминов, можно получить культуры тех или иных видов пурпурных бактерий. Как правило, в среду добавляют такие субстраты, которые не могут сбраживаться нефототрофными микроорганизмами.

Виды Rhodospirillaceae довольно легко выделяют из пресной воды и морских осадков; труднее изолировать их из почвы полей, газонов и садов. Для получения накопительных культур используют основную среду (разд. 8.5.4) с добавками, указанными в табл. 8.1. 0,1 г образца вносят в пробирку с завинчивающейся крышкой и полностью заполняют ее средой, так чтобы между средой и крышкой не было воздушного пространства. Инкубируют при 25 °C и при постоянном освещении лампой накаливания (50—75 Вт) с расстояния 40—60 см. Необходимо убедиться, что пробирка при этом не нагревается. В течение 3—7 дней наблюдают за увеличением мутности культуры, имеющей коричневую, желтую или розовую окраску. Затем переносят каплю культуры в другую пробирку со средой (табл. 8.1) для вторичного накопления. Для очистки культуры используют твердую среду, содержащую 1 % дрожжевого экстракта или пептона, 0,2% малата натрия и 1,5% агара. Засеянную среду разливают по чашкам Петри или в пробирки (разд. 8.4.2). Инкубацию проводят в анаэростате с постоянным освещением. Многие виды Rhodospirillaceae способны также расти в темноте в атмосфере воздуха или в микроаэробных условиях, однако в этих случаях колонии менее пигментированы, чем при их росте на свету в анаэробных условиях.

Освещение при получении культурChromatiaceae и Chlorobiaceae

Фототрофные серобактерии, принадлежащие к сем. Chromatiaceae и Chlorobiaceae, культивировать значительно труднее, чем пурпурные несерные бактерии, хотя

Виды

Субстрат

Витамины

первичная накопительная культура

вторичная накопительная культура

Rhodospirillum rubrum

Этанол или ацетат (2 г/л)

L-Аланин (3 г/л)

Биотин (20 мкг/л)

Rhodopseudomonas capsula- ta

Пропионат (2 г/л)

Пропионат (2 г/л)

Тиамин (1 мг/л); для некоторых штаммов нужны также биотин и ниацин

Rhodopseudomonas gelati- nosa

Изопропанол (2 г/л)

Изопропанол (2 г/л)

Биотин (20 мгк/л); тиамин (1 мг/л); для некоторых штаммов нужен также пантотенат

Rhodopseudomonas spheroi- des

Этанол или ацетат (2 г/л)

Тартрат (3 г/л)

Биотин (20 мкг/л); тиамин (1 мг/л); ниацин (1 мг/л)

Rhodopseudomonas palustris

Бензоат (0,5 г/л)

Тиосульфат (2 г/л)

га-Аминобензойная кислота (200 мкг/л); для некоторых штаммов нужен также биотин

Rhodospirillum fulvum

Го же

Пеларгонат (0,3 г/л)

га-Аминобензойная кислота (200 мкг/л)

Rhodopseudomonas acidophila

Rhodospirillum tenue

1 Состав основной среды для

Сукцинат (2 г/л); pH среды довести до 5,1

Пеларгонат (0,3 г/л)

накопления см в разд. 8 5 4

Сукцинат (2 г/л); pH среды довести до 5,1

Пеларгонат (0,3 г/л)

Не нужны

Таблица 8.1. Субстраты и витамины, добавляемые к основной среде1 для получения накопительных культур Rhodospirillaceae [76]

ЧАСТЬ II. РОСТ

их массовое развитие («цветение») дольно часто можно наблюдать невооруженным глазом, особенно в морской или солоноватой воде. Однако, если «цветения» не наблюдается, полезно для получения накопительных культур использовать колонку Виноградского. При этом обеспечиваются анаэробные условия и длительное снабжение H2S, что приводит к обильному росту фото- трофных серобактерий, впрочем как и многих других микроорганизмов.

Для приготовления колонки Виноградского используют ил из пресных, солоноватых или морских водоемов, например из береговой части прудов, ручьев, озер или соленых болот. Смешивают 3 части этого ила с одной частью CaSO4-H2O и добавляют немного нерастворимых органических веществ в виде фильтровальной бумаги или корней водных растений. Если используют фильтровальную бумагу, то добавляют также небольшое количество NH4MgPO4. Смесь переливают в высокий стеклянный цилиндр диаметром не менее 5 см и высотой не менее 15 см и перемешивают ее так, чтобы не образовывались воздушные полости. Заполняют цилиндр водой (для выделения морских микроорганизмов используют морскую воду) и проводят инкубацию в темноте в течение 2—3 дней, чтобы свести к минимуму развитие фототрофных микроорганизмов, выделяющих кислород. Цилиндр оставляют при 18—25 °C под лампой накаливания или при естественном освещении в течение всего периода инкубации. Анаэробный распад органического материала в колонке, сопровождающийся образованием СО2, спиртов, жирных кислот, оксикислот и других органических кислот и аминов, а также образованием H2S из CaSO4, обеспечивает рост многих микроорганизмов. При этом фототрофные серобактерии образуют характерные пурпурные, красные или зеленые пятна на стенках цилиндра либо слой или полосы в колонке над границей раздела фаз осадка и воды. При сборе бактерий со стеклянной поверхности или из отдельных слоев для микроскопирования, выделения или дальнейшего накопления в жидких культурах пользуются пастеровскими пипетками. Можно также последовательно снимать порции осадка ложечкой или шпателем.

Накопительные культуры можно также получать, ис-

пользуя синтетические жидкие среды. Среды для отдельных видов фототрофных серобактерий подбирают, варьируя условия их культивирования, длину волны света, его интенсивность, температуру инкубации, а также донор электронов и его концентрацию. Более детальное обсуждение возникающих при этом проблем можно найти в очень полезной работе ван Нила [76].

Ультрафиолетовое облучениепри получении культур цианобактерий

Очень часто трудно получить культуры цианобактерий, свободные от посторонних микроорганизмов, которые нередко проникают в слизистые чехлы, окружающие клетки и нити цианобактерий. Герлоффу и др. [22] удалось очистить культуры цианобактерий от сопутствующих форм следующим способом. Разведенную суспензию цианобактерий помещали в кварцевую камеру и облучали ультрафиолетовым светом (275 нм), излучаемым покрытой кварцевой рубашкой ртутной лампой. Во время облучения суспензию постоянно перемешивали. При правильно выбранном времени экспозиции сопутствующие микроорганизмы погибали, тогда как цианобактерии оставались жизнеспособными. В процессе облучения периодически отбирали пробы и готовили из них большое количество разведений. Разведенные культуры, в которых выявлялся рост цианобактерий, проверяли на присутствие посторонних форм, микроскопируя пробы, а также высевая их в разные среды.

Одним из недостатков этого метода является то, что в чистой культуре могут содержаться цианобактерии, у которых в результате ультрафиолетового облучения возникли мутации.

Ультразвуковая обработка

при получении культур Sporocytophaga myxococcoides

Накопительные культуры образующей микроцисты и целлюлолитической бактерии S. myxococcoides можно получить, исходя из наличия в жизненном цикле этого организма форм, устойчивых к ультразвуку (Leadbetter, Bacteriol. Proc., р. 42, 1963). 100 мл среды для Spo-

8. Получение накопительных и чистых культур

rocytophaga (разд. 8.5.47) помещают в 500-миллилит- ровую колбу Эрленмейера и вносят в нее примерно 0,1 г почвы, ила или растительного материала. После инкубации в течение 7—10 дней при 30 °C с периодическим перемешиванием отбирают 5 мл культуры, обрабатывают ее ультразвуком в течение 15—30 с и затем высевают в другую колбу с такой же средой. Через 5— 7 дней среда приобретает характерный желтый оттенок. С помощью фазово-контрастной микроскопии находят микроцисты и вегетативные клетки на волокнах целлюлозы и вокруг них. Часть этой культуры вновь обрабатывают ультразвуком и затем для получения отдельных колоний используют метод посева разливом в чашки, как описано в разд. 8.2.25.

Использование антисывороточной агглютинации при получении культур бактерий

Использование антисыворотки может обогатить минорную фракцию в популяции, состоящей из двух видов микроорганизмов. При исследовании смешанной культуры, в которой присутствуют два вида морской спириллы — крупные и мелкие, Линн и Криг [45] обнаружили, что мелких спирилл значительно больше. Это делало невозможным получение отдельных колоний крупных спирилл методом посева в чашки. Более того, для этих целей не подходил ни один из многочисленных методов селекции. Для получения накопительных культур крупной спириллы авторы выделили мелкую спириллу и использовали ее для иммунизации кролика. Когда полученную антисыворотку добавили к смешанной культуре, мелкие спириллы агглютинировали и осели на дно пробирки. Для получения отдельных колоний методом посева в чашки использовали надосадочную жидкость, содержащую теперь много крупных спирилл.

БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Щелочные условия инкубации

при получении культур Mycobacterium tuberculosis [20]

В центрифужную стерильную пробирку (емкостью 50 мл) с завинчивающейся крышкой, содержащую 10 мл

раствора N-ацетил-Ь-цистеина в NaOH (разд. 8.5.36), добавляют 10 мл исследуемой мокроты. Крышку завинчивают, хорошо перемешивают содержимое в миксере Vortex в течение 5—20 с и оставляют пробирку на 15 мин при комнатной температуре. М-ацетил-Г-цистеин является муколитическим веществом, превращающим вязкую мокроту в жидкую, водянистую массу. Гидроксид натрия разрушает многие примеси, присутствующие в мокроте, тогда как клетки М. tuberculosis относительно устойчивы к воздействию щелочи. Для нейтрализации гидроксида натрия в пробирку добавляют стерильный 0,067 М фосфатный буфер, не доливая до края 1,3 см, а затем центрифугируют 15 мин при 1800— 2400 g, чтобы сконцентрировать микобактерии, и удаляют надосадочную жидкость. К осадку добавляют 1 мл стерильного 0,2%-ного бычьего сывороточного альбумина и осторожно перемешивают. Эту суспензию используют для инокуляции соответствующих культуральных сред (разд. 8.5.26).

Щелочные условия инкубациидля получения культур вибрионов [37]

Для получения накопительных культур Vibrio cholerae и V. parahaemolyticus клинический материал (жидкий стул или соскобы из прямой кишки) сеют легким штрихом на поверхность неселективной агаровой среды, например питательного агара (разд. 20.3.25), и густо рассевают по селективной среде типа агара TCBS (разд. 8.5.50). Материал, полученный из мазков жидкого кала, инокулируют также в питательный бульон (1% пептона, pH 8,4—8,5). В случае выделения V. parahaemolyticus к этому пептонному бульону добавляют 3% NaCl. При высоких значениях pH агара TCBS и питательного бульона рост большинства посторонних бактерий подавляется. В случае V. cholerae инкубация в бульоне продолжается от 6 до 8 ч при 35 °C, после чего делают пересев штрихом на неселективную и селективную агаровые среды. Для V. parahaemolyticus инкубация в бульоне продолжается ночь, после чего делают пересев на агар TGBS. Колонии V. cholerae в чашках имеют желтый цвет (сбраживают сахарозу) и

оксидазоположительны. Колонии V. parahaemolyticus имеют голубовато-зеленый цвет и также оксидазопопо- жительны.

Кислые условия инкубациидля получения культур лактобацилл [46]

Для выделения лактобацилл из сыров типа Чеддер делают посев штрихом из разведений на модифицированную среду Рогозы (разд. 8.5.33). Эта среда за счет ацетатной буферной системы имеет pH 5,35. При этих значениях pH такие лактобациллы, как L. casei и L. plantarum, способны образовывать колонии, тогда как обычная молочнокислая бактерия Streptococcus lac- tis не растет.

Кислые условия инкубации

для получения культур Thiobacillus thiooxidans [78]

Пробы почвы, ила или воды (лучший источник — морской ил) вносят в среду для Т. thiooxidans (разд. 8.5.53). После 3—4 дней инкубации pH должен снизиться до 2,0, при котором растут преимущественно эти кислотоустойчивые микроорганизмы. Очистку культур производят путем посева штрихом на твердую среДУ-

Ингибирование теллуритомдля получения культур коринебактерийи некоторых стрептококков

В соответствующих концентрациях теллурит калия подавляет рост грамотрицательных бактерий и большинства грамположительных бактерий. Для селекции таких коринебактерий как С. diphtheriae, к кровяному агару с цистином добавляют калиевую соль теллурита в концентрации 0,0375% (разд. 8.5.16). В результате восстановления теллурита колонии коринебактерий при обретают серый или черный цвет. Для селекции некоторых стрептококков (S. mitis, S. salivarius и энтерококков) используют калиевую соль теллурита в концентрации 0,001%, которую добавляют к специальной среде с агаром (разд. 8.5.31). S. mitis образуют очень мелкие синие колонии, S. salivarius — более крупные синие ко-

лонии типа «приклеенной капли», а энтерококки — небольшие черно-синие колонии.

Ингибирование таллиемдля получения культур микоплазми энтерококков [10, 38]

Для выделения микоплазм из дыхательных путей к Е-агару (разд. 8.5.17) и Е-бульону (разд. 8.5.18) добавляют ацетат таллия в концентрации 0,032%. Экстракты проб тампоном переносят в жидкую среду (2 мл), содержащую соевую муку и гидролизат казеина (разд. 8.5.45) и 0,5% бычьего сывороточного альбумина. 0,1 мл суспензии инокулируют в двухфазную среду Е (разд. 8.5.17), а также в чашки с агаром, приготовленным на среде Е. Культуру выращивают в аэробных условиях при 37 °C, поместив чашки в закрытые контейнеры. В течение 30 дней с помощью препаровальной лупы (Х20—60) следят за появлением мелких колоний (10— 100 мкм в диаметре), напоминающих яичницу-глазунью. В случае двухфазной культуры наблюдают в микроскоп через боковую стенку пробирки, стараясь обнаружить так называемые «сферулы», т. е. колонии в жидкой среде. Контролируют также подкисление среды, сопровождающееся пожелтением индикаторного красителя фенолового красного. Для получения отдельных колоний содержимое двухфазной среды инокулируют в чашки с агаром Е.

Энтерококки выделяют на агаровой среде (разд. 8.5.51) с добавлением ацетата таллия (0,1%).

Ингибирование селенитомдля получения культур салмонелл

К F-бульону (разд. 8.5.44) добавляют кислый селенит натрия в концентрации 0,4%. В этих условиях временно прекращается рост колиподобных бактерий, но салмонеллы продолжают расти. Пробы из кала рассева- ют штрихом на селективные и неселективные агаровые среды, а также вносят большое количество пробы в F- бульон (1 г или 1 мл на 8—10 мл бульона). Инкубацию проводят при 35—37 °C в течение 12—16 ч, а затем делают пересев в чашки с агаром.

Ингибирование фенилэтаноломдля получения культурстрептококков и стафилококков

При добавлении в агаровую среду (разд. 8.5.40) фе- нилэтанола в концентрации 0,25% подавляется рост грамотрицательных бактерий, главным образом Proteus, тогда как на грамположительные кокки фенилэтанол не действует. Эта среда пригодна, например, для выделения из проб кала коагулазоположительных стафилококков.

Ингибирование трифенилметановым красителемдля получения культурграмотрицательных бактерий и микобактерий

Обычно для подавления роста грамположительных бактерий достаточно добавления трифенилметановых красителей (кристаллический фиолетовый, основной фуксин, бриллиантовая зелень и малахитовый зеленый) в более низкой концентрации, чем для подавления роста грамотрицательных. Например, при концентрации в среде 1:4000000 малахитовый зеленый подавляет рост Bacillus subtilis, а в концентрации 1:1 000 000 — рост стафилококков. Однако для подавления роста Escherichia coll или Salmonella typhi необходима концентрация этого красителя ~ 1 . 30 000—1 : 40 000 [21]. Бриллиантовая зелень используется для выявления колипо- добных бактерий [в составе бульона с желчью и лактозой (разд. 8.5.13)] и в нескольких селективных средах для Enterobacteriaceae, таких, как агар для салмонелл и шигелл (разд. 8.5.43) и агар с бриллиантовой зеленью (разд. 8.5.12). Кристаллический фиолетовый также используют для селекции Enterobacteriaceae, например в составе агара с желчью и фиолетовым красным (разд. 8.5.56) и агара Мак-Конки (разд. 8.5.27). Микобактерии очень устойчивы к этим красителям. Поэтому малахитовый зеленый часто включают в среды, используемые для выделения Mycobacterium tuberculosis (например, в среду Лёвенштейна— Йенсена; разд. 8.5.26), в целях подавления роста других бактерий.

Часть ii. рост

Ингибирование солямидля получения культур стафилококков

Для выделения стафилококков в среду добавляют 7,5% NaCI (см. солевой агар с маннитом; разд. 8.5.28). При этой концентрации NaCI рост других бактерий подавляется.

Ингибирование солямидля получения культур галобактерий [23]

Красные галофильные палочковидные бактерии Halobacterium и кокки Halococcus можно обнаружить в очень соленых белковых продуктах, например на соленой рыбе. Они обитают в солеварнях, в морской воде (Мертвого моря) и в водоемах с очень высоким содержанием солей. Для оптимального роста этих экстремальных галофилов необходима концентрация NaCI ~25%. Они обычно не растут при концентрации NaCI ниже 15% и даже после кратковременной экспозиции в таких растворах гибнут. Поскольку при концентрации NaCI 20% и выше растут только галофилы, их селекция из природного материала осуществляется довольно просто. Подходящая среда для получения накопительных культур таких бактерий приведена в разд. 8.5.21. После внесения проб колбы инкубируют при 37 °C на качалке- и затем получают отдельные колонии путем посева культуры в чашки с этой же средой, содержащей 2% агара. Чашки инкубируют при 37 °C в течение 3— 14 дней в пластмассовых коробках или мешках, предохраняющих среду от высыхания.

Ингибирование желчьюдля получения культур энтеробактерий

Желчь или ее соли часто добавляют в культуральные среды для селекции энтеробактерий. Однако на средах с такими добавками способны расти не только кишечные бактерии, например, на чистой желчи может расти Yersinia pestis [53]. Тем не менее до сих пор желчь используют в качестве важного селектирующего фактора при выделении грамотрицательных палочковид-

ных энтеробактерий и энтерококков. Для селекции представителей сем. Enterobacteriaceae желчь или ее соли добавляют к таким средам, как агар Мак-Конки (разд. 8.5.27), агар для салмонелл и шигелл (разд. 8.5.43), агар с желчью и фиолетовым красным (разд. 8.5.56) и многим другим. Для получения накопительных культур энтерококков [20] хорошей селективной средой оказался питательный агар с желчью (разд. 8.5.9).

Ингибирование пенициллиномдля получения культур микоплазм

Поскольку микоплазмы лишены клеточной стенки, они устойчивы к высоким концентрациям пенициллина, который подавляет рост многих бактерий, имеющих кле- 1 очную стенку. Антибиотик используют в концентрации 194 ед./мл, добавляя его, например, к таким средам, как агар Е (разд. 8.5.17).

Ингибирование пенициллиномдля получения культур Bordetella pertussis

Полученные с помощью тампонов пробы из носоглотки суспендируют в бульоне и затем рассевают в чашки с агаром Борде — Жангу (разд. 8.5.11), содержащим пенициллин (0,5 ед/мл). Пенициллин способствует подавлению роста обычно содержащихся в таких пробах микроорганизмов, но на мешает В. pertussis образовывать (в течение 4 дней) характерные жемчужно-серые (типа «ртутной капли») колонии.

Набор антибиотиков

для получения культур Campylobacter fetus [68, 69]

Добавление бацитрацина (2 ед./мл) и новобиоцина (2 мкг/мл) к среде с агаром для бруцелл (разд. 8.5.14) позволяет выделять С. fetus из испражнений и кишечного содержимого крупного рогатого скота, овец, свиней и птиц. Этот метод можно использовать вместе с методом фильтрации, описанным ранее для получения накопительных культур С. fetus (разд. 8.1.16).

Набор антибиотиковдля получения культур Neisseriae

Добавление к агару Тэйера — Мартина (разд. 8.5.52) ванкомицина, колистина и нистатина позволяет выделить Neisseria meningitidis из слизи носоглотки или N.gonorrhoeae из отделяемого уретры и шейки матки, так как эти антибиотики способствуют подавлению роста остальной микрофлоры.

Обработка формальдегидомдля получения культур Gallionella ferruginea [54]

Микроаэрофильный хемолитотроф G. ferruginea встречается в холодных железистых водах, где он образует характерные изогнутые стебельки, покрытые окисью железа. В прямоугольную молочную бутылочку с завинчивающейся крышкой емкостью 150 мл, содержащую 10 мл агара с сульфидом железа и 100 мл жидкой среды, например модифицированной среды Вольфа (разд. 8.5.34), вносят 0,5 мл формалина (40%-ный раствор). Пробы, содержащие Gallionella из природных источников, центрифугируют 3 мин при 3000 g. 1—5 мл осадка вносят в сосуд со средой и инкубируют 1—2 дня при 25 °C. Формалин убивает сопутствующие бактерии, но не влияет на рост Gallionella. 1 мл обработанной формалином культуры переносят в сосуд со свежей средой, но без формалина и инкубируют при 25 °C, пересевая каждые 2—3 нед. Выделяемые бактерии образуют пушистые участки на поверхности агара, содержащего сульфид железа. Пробы из этих участков используют для получения субкультур. Чистоту культуры проверяют с помощью микроскопии и п>тем ее высева на другие среды, на которых Gallionella не растет.

Разбавленная средадля получения культур каулобактеров [57]

Каулобактеры представляют собой стебельковые бактерии, способные расти на средах с таким малым содержанием питательных веществ, которые не обеспечивают рост большинства других микроорганизмов. Про-

бы воды из прудов, ручьев, озер или даже водопроводной воды вносят в колбы или бутыли и добавляют к ним 0,01% пептона. Культуральные сосуды неплотно закрывают бумагой или алюминиевой фольгой и инкубируют при 20—25 °C. Ежедневно с помощью фазовоконтрастной микроскопии рассматривают поверхностную пленку. После появления (обычно на 4-й день) стебельковых бактерий (1 на 10—20 клеток) делают посев из поверхностной пленки в чашки с агаровой средой, приготовленной на водопроводной воде с 0,05% пептона, и затем инкубируют их при 30 °C. В условиях низкого содержания пептона обеспечивается рост мелких колоний каулобактеров, но ингибируется рост других бактерий. Примерно через 4 дня (или более) исследованные с помощью препаровальной лупы кусочки среды с микроколониями каулобактера переносят в чашки со средой, содержащей 0,2% пептона, 0,1% дрожжевого экстракта, 0,02% MgSO4-7H2O и 1% агара. После двухдневной инкубации готовят на стеклах влажные препараты каулобактеров. Отдельные колонии пересевают с агара в чашки со свежей средой.

В случае морских каулобактеров к пробам морской воды добавляют 0,01% пептона и инкубируют их около 7 дней при 13 °C. Когда с помощью микроскопа обнаруживают достаточно большое число стебельковых бактерий, делают пересев из поверхностной пленки в чашки с агаром, приготовленным на морской воде с 0,05% пептона, и инкубируют их при 25 °C. Часть выросших микроколоний переносят в чашки со свежей средой и очищают их путем пересева.

Разбавленная средадля получения культур водных спирилл [83]

При росте в разбавленных средах аэробные хемоге- теротрофные спириллы (родов Aquaspirillum и Осеапо- spirillum) часто успешно конкурируют с другими бактериями за необходимые питательные вещества. Для выделения спирилл из пресных вод к пробам воды (например, из стоячих водоемов) добавляют 1 % пептона или дрожжевого автолизата и инкубируют их при комнатной температуре около 7 дней или до появления зна-

чительного количества спирилл. Часть исходной культуры добавляют к равному объему воды из того же водоема и смесь стерилизуют автоклавированием. В эту смесь вносят пробу из нестерилизованной порции исходной культуры. После инкубации и появления колоний спирилл часть вторичной культуры разводят водой из того же источника, смесь стерилизуют и инокулируют ее культурой из нестерилизованной порции. Продолжают такое разведение питательных веществ в среде до тех пор, пока в культуре не будут преобладать спириллы. Отдельные колонии спирилл получают путем посева культур в чашки с агаром MPSS (разд. 8.5.35).

Другой подход к выделению спирилл основан на использовании низкого содержания в среде источников азота [83]. При его применении к пробам воды добавляют малат или лактат кальция (1%) и инкубируют их при комнатной температуре около 1 нед. Затем производят серию пересевов в стерильную воду, содержащую 1 % источника азота, и снова инкубируют смесь. Процедуру пересева повторяют 3—4 раза до тех пор, пока в культуре не будут преобладать спириллы. Важно не добавлять в среду такие источники азота, как NH4C1, чтобы не допустить преимущественного роста сопутствующих бактерий.

В случае морских спирилл пробы морской воды смешивают с равными объемами основной среды Гизбер- гера (разд. 8.5.19), содержащей 1 % лактата кальция [83]. После инкубации отбирают часть культуры и смешивают ее с равным объемом среды Гизбергера, содержащей лактат, но лишенной NH4C1. Стерилизуют эту смесь автоклавированием, вносят в нее нестерильную исходную культуру и инкубируют Истощение среды по азоту проводят до тех пор, пока в культуре не будут преобладать спириллы. Отдельные колонии получают путем посева на агар MPSS (разд. 8.5.35).

Для получения накопительных культур спирилл используется также проточное (непрерывное) культивирование, при котором обеспечивается низкий уровень питательных веществ. Яннах [34] показал, что в условиях хемостата скорость роста морских спирилл выше скорости роста псевдомонад в смеси этих бактерий, если скорость разведения снижается до такой величины,

при которой содержание лимитирующего источника углерода и энергии (лактата) становится ниже 10 мг/л. В других экспериментах скорость роста спирилл превышала скорость роста Escherichia colt, если концентрация лактата падала ниже 5 мг/л [35]. В подобных экспериментах с пресноводными спириллами и псевдомонадами Мэтин и Велдкамп [49] обнаружили, что при концентрации лактата ниже 0,09 мг/л псевдомонады исчезают из хемостата, так как они не растут. Эффективное использование спириллами лактата из среды может быть связано с более низким Км и более высокой Утах их транспортной системы для данного субстрата по сравнению с другими микроорганизмами, а также с более высоким отношением у клеток этих бактерий поверхности к объему [49].

Оказалось, что в условиях голодания спириллы выживают лучше [48]. Вероятно, это связано с их способностью накапливать в клетках в качестве запасного вещества поли-р-оксибутират, если их предварительно выращивать на среде при лимитировании источниками углерода и энергии. Значение запаса поли-р-оксибутира- та для выживания клеток показано и для других бактерий [16]. Поэтому истощение среды можно рассматривать как путь для выделения бактерий, образующих этот полимер.

Разбавленная средадля получения культур Sphaerotilus [8]

Бактерии рода Sphaerotilus, образующие чехлы, встречаются в ручьях, загрязненных сточными водами или органическими веществами; они формируют слизистые «пряди», прикрепленные к погруженным в воду предметам. Эти микроорганизмы можно также выделить из рек, открытых водостоков или канав, в которых нет явных признаков их присутствия. Процедура получения накопительных культур Sphaerotilus основана на их способности расти при низком содержании питательных веществ. К 50 мл среды для Sphaerotilus (разд. 8.5.46), налитой в квадратные бугыли Френча добавляют 25 мл пробы воды или по 1, 5 и 10 мл отстоя сточных вод или отстоя жидкостей, полученных на раз-

личных стадиях обработки сточных вод. Смесь инкубируют 5 дней при 22—25 °C. Через 2 дня после начала инкубации ежедневно с помощью микроскопа следят за появлением нитей. Для получения чистой культуры собирают нити из накопительной культуры и рассевают их штрихом в чашках с твердой средой (0,05% мясного экстракта и 1,5% агара). Инкубируют чашки 24 ч при 25 °C и с помощью препаровальной лупы находят типичные извитые нити Sphaerotilus. Переносят их в трип- тиказо-глицериновый бульон [5 г триптиказы (BBL Microbiology Systems, Cockeysville, Md.), 5 г глицерина и 1000 мл дистиллированной воды, pH 7,0—7,2] и инкубируют в нем до 2 нед. Через 2—3 дня Sphaerotilus образуют толстую поверхностную пленку, бульон же под ней остается прозрачным. Если в бульоне появляется помутнение, следовательно, он содержит другие микроорганизмы, но, даже если помутнения среды не происходит, для гарантирования чистоты следует вновь выделить Sphaerotilus из поверхностной пленки путем рассева штрихом на агар, приготовленный на мясном экстракте.

Если хотят убедиться в том, что выделенные микроорганизмы имеют чехлы, помещают небольшой кусочек образующейся слизи на предметное стекло в каплю воды, накрывают покровным стеклом и прижимают покровное стекло промокательной бумагой. На край покровного стекла помещают маленькую каплю 1%-ного кристаллического фиолетового, чтобы он просачивался в препарат по капиллярному принципу. Через 30 с промокают препарат бумагой, чтобы удалить избыток краски, и рассматривают его в микроскоп, используя иммерсионный объектив. Клетки и чехлы должны быть хорошо видны.

Триптофан как субстратдля псевдомонад [44]

Для получения накопительных культур псевдомонад, способных использовать триптофан как единственный источник углерода и азота, в 250-миллилитровую колбу Эрленмейера, содержащую 40 мл триптофановой среды (разд. 8.5.54), вносят около 0,1 г почвы, Смесь инкуби-

руют на качалке в течение 5—7 дней при 25 °C. 0,1 мл культуры переносят в другую колбу со средой и инкубируют 2—3 дня. После следующего серийного пересева полученную чистую культуру рассевают штрихом на триптофановую среду с агаром (15 г/л). После 1— 3 дней инкубации делают посев из отдельных колоний на агаровые косяки.

N2 как субстратдля Azospirillum и Azotobacter

Azospirillum — это микроаэрофильный азотфиксатор, ассоциированный с корнями различных растений; его находят также в почве [17, 18]. Отмытые кусочки корней длиною 5—8 мм, размягченные с помощью пинцета, помещают в безазотную полужидкую среду (среда Nfb; разд. 8.5.37). Среду можно также инокулировать почвой. Не перемешивая, инкубируют 40 ч при 32 °C и затем проверяют способность накопительной культуры восстанавливать ацетилен (тест на способность к азот- фиксации; разд. 20 2.7). Стараются не повредить плотную пленку под поверхностью среды, поскольку это может снизить активность нитрогеназы. Если культура восстанавливает ацетилен, то продолжают проводить ее накопление с помощью пересевов на свежую среду Nfb С помощью микроскопа находят толстые, извитые, подвижные палочки шириной около 1 мкм, заполненные гранулами поли-р-оксибутирата, и рассевают их штрихом в чашки со средой Nfb, содержащей 1,5% агара и 20 мг дрожжевого экстракта на 1 л. Через неделю находят маленькие, белые, плотные колонии и переносят их на полужидкую среду Nfb. Для окончательной очистки культуру из среды Nfb наносят штрихом на агар BMS (разд. 8.5.10), где следят за образованием типичных розовых, часто складчатых колоний

В отличие от Azospirtllum, который в условиях фиксации азота является облигатным аэрофилом, у Azotobacter имеются механизмы защиты кислородочувствительной нитрогеназы от кислорода. Поэтому Azotobacter может фиксировать молекулярный азот в аэробных условиях. 0,1 г почвы вносят в однолитровую колбу со 100 мл лишенной азота среды для Azotobacter (разд.

часть и. рост

и инкубируют с перемешиванием при 30 °C. Периодически культуру микроскопируют, чтобы выявить большие яйцеобразные клетки диаметром 2 мкм или более. Получают вторичную накопительную культуру и очищают ее, делая пересев отдельных колоний на агаровую среду, лишенную соединений азота (среда для Azotobacter с 1,5% агара).

Метанол как субстратдля гифомикробов [9]

Представители рода Hyphomicrobium способны использовать в качестве единственного источника углерода и энергии такие одноуглеродные соединения, как метанол и метиламин. К 5 мл воды из пруда или канавы либо 0,3 г ила или почвы (предпочтительно с низким содержанием органических веществ) в закрывающихся сосудах емкостью 75—125 мл добавляют нестерильную среду для Hyphomicrobium (разд. 8.5.22), через которую продувается молекулярный азот для создания анаэробных условий. Сосуды доливают средой доверху и инкубируют в темноте при 30 °C. Следят, чтобы сосуды оставались заполненными, добавляя в случае необходимости свежую среду. Обычно развитие гифомикробов происходит примерно в течение 8 дней. С помощью фазово-контрастной микроскопии находят палочкообразные клетки с заостренными концами овальной, яйцевидной или бобовидной формы, которые образуют нитчатые выросты (гифы) различной длины, способные ветвиться. Для вторичной накопительной культуры используют свежую стерильную среду. Чтобы выделить отдельные колонии, клетки штрихом высевают на твердую среду (разд. 8.5.22) и инкубируют в аэробных условиях.

Н2 как субстрат

для Aquaspirillum autotrophicum [7]

Воду из эвтрофного озера фильтруют через мембранные фильтры, которые помещают на минеральную агаровую среду (разд. 8.5.30) в чашках, и инкубируют ее при 30°C в атмосфере следующего состава: 60% Нг, 30% воздуха и 10% СО2. Чистые культуры получают

Получение накопительных и чистых культур

повторным рассевом штрихом культур в чашки с минеральной агаровой средой. Находят спириллы шириной 0,6—0,8 мкм со жгутиками на обоих концах клетки. Автотрофность в отношении водорода подтверждается тем, что в отсутствие органических веществ для роста культуры необходимо присутствие Н2 и СО2.

Целлюлоза как субстрат для цитофаг

Для получения накопительных культур цитофаг, разлагающих целлюлозу, на поверхность основного минерального агара (разд. 8.5.6) помещают кусочки фильтровальной бумаги Ватман № 1. На фильтровальную бумагу кладут частицы почвы или растительного материала и инкубируют чашки при комнатной температуре. Следят за образованием вокруг частиц желтой, оранжевой или розовой окраски, а также за процессом лизиса целлюлозы (бумаги). С помощью фазово-контрастной микроскопии можно обнаружить небольшие подвижные клетки цитофаг. Для выделения цитофаг, которые разлагают не только целлюлозу, культуру рассевают штрихом на агар с триптоном. Отдельные колонии цитофаг, разлагающих только целлюлозу, получают в чашках, заполненных минеральной агаровой средой, содержащей густую суспензию тщательно измельченной целлюлозы (разд. 20.1.13). Для предотвращения движения бактерий, имеющих жгутики, следует использовать достаточно твердую среду (0,85—1% агара), но не настолько, чтобы в ней нарушалась характерная для цитофаг скользящая подвижность. Иногда полезно тонким слоем агара с целлюлозой покрывать основную минеральную среду в чашках; при этом лучше видны зоны просветления, образующиеся в результате лизиса целлюлозы.

Агар как субстрат

для Cytophaga fermentans и С. salmonicolor [77]

Морские микроорганизмы С. fermentans и С. salmonicolor, являющиеся факультативными анаэробами, способны гидролизовать и сбраживать агар. Эту особенность используют для получения их накопительных

культур. Бутыли со стеклянными пробками или пробирки с завинчивающимися крышками наполняют доверху нестерильной средой Велдкампа (разд. 8.5.55). Среду инокулируют илом, взятым на морском берегу в местах, где гниют водоросли, бутыли закрывают и инкубируют их в темноте при 30 °C. В течение 3—7 дней следят за появлением мутности, образованием газа и падением pH. Отдельные колонии получают с помощью встряхивания пробирок со стерильной средой Велдкампа, содержащей 2% агара. Следят за образованием колоний, в которых при микроскопировании обнаруживаются подвижные изогнутые формы, что характерно для цитофаг. Способность бактерий из этих колоний размягчать или разжижать агар проверяют пересевом их на среды, содержащие 1 % агара и 1 % дрожжевого экстракта.

Лактат как субстратдля пропионовокислых бактерий

Основой для селекции пропионовокислых бактерий является их способность сбраживать лактат. Пробирку с завинчивающейся крышкой (вместимостью 25 мл) заполняют свежепрокипяченной и охлажденной средой, содержащей 4% лактата натрия и 1% дрожжевого экстракта. Добавляют около 0,2 г СаСОз и среду инокулируют маленьким кусочком швейцарского сыра. Завинчивают крышку пробирки и инкубируют ее при 30 °C. Следят за образованием красно-коричневого помутнения, которое появляется примерно через 5—7 дней. Отдельные колонии получают рассевом культуры штрихом на стерильный агар с лактатом и дрожжевым экстрактом с последующей инкубацией в анаэробных условиях в атмосфере, обогащенной СО2, которая создается с помощью GasPak (BBL).

Аммоний или нитрит как субстратыдля нитрифицирующих бактерий [50, 58)

Используют основную среду, описанную в разд. 8.5.38. Для бактерий, окисляющих аммоний до нитрита, в среду добавляют (NH4)2SO4 (0,5 г/л); для бактерий, окис-

ляющих нитрит в нитрат, используют среду, содержащую NaNO2 (0,5 г/л). Готовят разведения почвы 1 : 10 и в каждую колбу со средой вносят по 1 мл разведенной суспензии. Инкубацию проводят при 28 °C и каждую неделю отбирают пробы из накопительных культур в специальные чашки, наблюдая за исчезновением из среды аммония или нитрита. Для выявления аммония в чашки добавляют 3 капли раствора Несслера (разд. 20.4.10). Если среда окрашивается в оранжевый или желтый цвет, это указывает на наличие в ней аммония. Для выявления нитрита к пробам (0,5 мл) добавляют по 3 капли растворов А и В (разд. 20.4.12). В этом случае красный цвет указывает на присутствие нитрита. Сравнивают интенсивности полученной окраски и окраски разведенных стандартных растворов аммония или нитрита и восполняют использованный в накопительной культуре субстрат добавлением в нее свежего стерильного основного раствора. Если в накопительной культуре совсем нет нитрита, то нитрат выявляют, добавляя к пробе небольшое количество цинкового порошка. Это следует делать после внесения реактивов для определения нитритов. Цинк восстанавливает присутствующий в среде нитрат до нитрита, который затем окрашивается в красный цвет. Продолжают инкубировать накопительную культуру и еженедельно вносят в нее аммоний или нитрит, до тех пор пока популяция нитрифицирующих бактерий не будет выявляться при микроскопировании.

Выделить чистую культуру нитрифицирующих бактерий чрезвычайно трудно. Для этого необходимо использовать среды, полностью лишенные органических веществ, причем колонии, образуемые этими бактериями, крайне малы (примерно 100 мкм в диаметре). Более того, нитрифицирующие бактерии растут очень медленно, и поэтому их культуры часто загрязняются другими микроорганизмами. Используя в качестве разбавляющего раствора стерильную среду для накопительных культур, готовят серию десятикратных разведений. По 1 мл из каждого разведения вносят в чашки Петри и затем добавляют силикагель, приготовленный на среде для накопительных культур в двойной концентрации, как описано в разд. 9.1.3. Быстро смешивают

разведенные культуры со средой и дают ей застыть Чашки инкубируют во влажной атмосфере при 28 °C, периодически проверяя с помощью микроскопа образование крошечных колоний. Хорошо заметные колонии отбирают пастеровской пипеткой с вытянутым на пламени тонким кончиком и переносят их в стерильную среду. Способность субкультур использовать аммоний или нитрит, а также наличие посторонних микроорганизмов определяют, делая посев штрихом на такие органические среды, как питательный агар (при этом роста не должно быть). Любые, даже кажущиеся чистыми культуры проводят через силикагелевую среду несколько раз, отбирая хорошо видимые под микроскопом колонии и проверяя способность субкультур использовать аммоний или нитрит, а также наличие посторонних микроорганизмов.

Нитрат и органические кислотыкак субстраты для псевдомонад

Некоторые виды Pseudomonas, относящиеся к аэробам, можно получить в виде накопительных и чистых культур, используя их способность расти на среде с нитратом как источником азота, а также с солями различных органических кислот в качестве источников углерода и энергии [74). Для этого к 3 мл сукцинат-солевой среды (разд. 8 5 49) добавляют 0,1 г почвы или ила либо 0,1 мл прудовой или речной воды. Для получения накопительных культур псевдомонад, способных к флуоресценции, таких, как Р. putida, Р. fluorescens или Р. aeruginosa, среду инкубируют при 30 °C. Для выделения Р. aeruginosa инкубацию проводят при 41 °C (Р. putida и Р. fluorescens не растут при этой температуре). Накопительные культуры Р. acidovorans получают, заменяя в среде гликолат, муконат или норлейцин на сукцинат и инкубируя ее при 30 °C.

Некоторые псевдомонады используют в качестве терминального акцептора электронов не только кислород, но и нитрат. Поэтому их выделение проводят, увеличивая в среде концентрацию нитрата до 1% и заполняя доверху средой пробирки с завинчивающимися

крышками, поскольку лимитирование по кислороду способствует нитратному дыханию.

После получения вторичных накопительных культур псевдомонад делают посев штрихом в чашки с агаром (используют соответствующую среду с содержанием агара 15 г/л), где вырастают отдельные колонии. Чашки инкубируют в аэробных условиях при 30 °C.

Сульфат и органические кислотыкак субстраты для сульфатредуцирующих бактерий

Представители анаэробного рода Desulfovibrio и большая часть видов Desulfotomaculum окисляют лактат в присутствии сульфата, который при этом восстанавливается до H2S. Пробы почвы, ила, воды или фекального материала вносят в пробирки с завинчивающимися крышками или в сосуды с закрывающимися пробками, наливают в них доверху лактагную среду (разд. 8.5.24) и инкубируют при 30 °C. Почернение среды указывает на восстановление сульфата. Перед высевом на твердую среду проводят вторичное накопление. Спорообразующие бактерии, относящиеся к роду Desulfotomaculum, можно выделить, нагревая накопительную культуру перед высевом на твердые среды до 70 °C в течение 10 мин. Для получения отдельных колоний сульфатредуцирующих бактерий делают посев штрихом в чашки со средой Иверсона (разд. 8.5.23) и выдерживают их 7—10 дней в атмосфере водорода при 30°C.

Для получения накопительных культур Desulfotomaculum acetoxiclans [81], которая использует не лактат, а ацетат, применяют среду Виддла и Пфеннига (разд. 8.5.57), содержащую ацетат С помощью фазово-контрастной микроскопии слецят за появлением подвижных прямых или слегка изогнутых палочек толщиной 1 —1,5 мкм и длиной 3,5—9 мкм, которые имеют споры, а также яркие преломляющие участки. Для получения отдельных колоний используют метод встряхивания пробирок. После 3 нед инкубации колонии отбирают и нагревают 10 мин при 70 °C; такая тепловая обработка помогает выделению D acetoxidans, который является спорообразующим микроорганизмом.

Сера как субстратдля Desulfuromonas acetoxidans [56]

D. acetoxidans получает энергию для своего роста в результате анаэробного дыхания, используя в качестве источников углерода и энергии ацетат, этанол или пропанол, а как акцептор электронов — серу. Пробы анаэробных вод, содержащих сульфид, или ила из пресного или морского водоема вносят в стерильные сосуды с завинчивающимися крышками, которые заполняют средой Пфеннига и Библа (разд. 8.5.39), оставляя небольшое воздушное пространство. После завинчивания крышек сосуды инкубируют 1 нед при 28 °C с перемешиванием (например, на круговых качалках со скоростью 150 об/мин). Наличие стеклянных бусинок в среде обеспечивает постепенное размельчение серы в очень тонкую суспензию. Рост бактерий определяют по сильному запаху H2S. После двух пересевов на среду Пфеннига и Библа с добавлением раствора витаминов (разд. 8.5.57) сере дают осесть и проверяют, действительно ли наличием клеток объясняется легкая мутность надосадочной жидкости. В микроскоп должны быть видны небольшие палочки размером 0,4—0,7X1—4 мкм, причем некоторые из них могут двигаться. Отдельные колонии получают методом глубинного посева в пробирки с последующим встряхиванием. Для хорошего гомогенного распределения серы в пробирках с агаром к 50 мл агаровой среды добавляют 3 капли автоклавированного раствора полисульфида (10 г Na2S-9H2O и 3 г порошка серы, растворенного в 15 мл дистиллированной воды). В процессе роста бактерий следят за изменением окраски колоний от розового до цвета охры.

Поскольку сульфид, образуемый D. acetoxidans, ингибирует рост данной бактерии (предельная концентрация H2S, которую она выдерживает, составляет 0,1 %), был предложен альтернативный метод получения ее накопительной культуры, при котором среду, содержащую серу, инокулируют не только пробами ила и воды, но также чистой культурой зеленых серных бактерий из сем. Chlorobiaceae. Эти бактерии постоянно потребляют выделяемый в процессе роста D. acetoxidans H2S и окисляют его с образованием элементной серы, которая

используется быстро растущей накопительной культурой D. acetoxidans. Такой метод можно применять и для выделения чистых культур D. acetoxidans [56].

Толуол как субстратдля окисляющих его бактерий [14]

Для получения накопительных культур бактерий, окисляющих толуол, используют основную неорганическую среду А или В (разд. 8.5.5) в закрытых ватными пробками колбах. Среду инокулируют небольшим количеством влажной почвы, предварительно обработанной в течение нескольких дней парами толуола, или свежей почвой. Колбы инкубируют 1—3 нед при 25—30 °C в закрытой камере, содержащей стакан с водой, насыщенной толуолом. Отдельные колонии получают, делая посев выросшей культуры штрихом на твердую среду и инкубируя чашки при 25—30 °C в атмосфере, содержащей толуол.

Бактериальные клетки как субстратдля миксококков

Виды Myxococcus способны с помощью литических ферментов лизировать клетки других бактерий и использовать высвобождающиеся при этом вещества для своего роста. Можно воспользоваться этой особенностью при выделении миксококков из проб почвы, воды или растительного материала [47, 55, 66}. Бактериальные клетки, используемые в качестве субстрата (пригодны Entero- bacter aerogenes), получают, либо снимая целую колонию диаметром 4 мм с поверхности агаровой среды, либо центрифугируя бактерии, выросшие в жидкой среде и отмывая их несколько раз. На поверхность водноагаровой среды (1,5% агара в дистиллированной воде) миксококки высевают полоской или мазком около I см шириной и 4 см длиной. Мазок должен быть достаточно толстым, чтобы его можно было видеть невооруженным глазом. На один конец мазка помещают две или три частицы почвы или кусочки растительного материала, например коры или листьев. Через 2—3 дня и затем с однодневными интервалами исследуют чашки с помощью препаровальной лупы, чтобы убедиться в рас-

творении бактериального мазка вокруг добавленных частиц. Следит также за появлением на мазке и по его краям плодовых тел обычно желтого, оранжевого или розового цвета. Плодовые тела, обнаруженные на наибольшем расстоянии от мазка, переносят на агаровую среду, содержащую 0,2% триптона или казитона (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) и 1,5% агара. Перед посевом для высвобождения миксоспор каждое плодовое тело раздавливают в капле стерильной воды между двумя предметными стеклами.

Добавление циклогексимида (25 мкг/мл) в непитательную агаровую среду и в последующие среды задерживает рост грибов, способствуя таким образом выделению миксококков [55].

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Бактериальный паразитизмбделловибрионов [75]

Крошечные вибрионы, названные бделловибрионами, способны прикрепляться к различным грамотрицатель- ным бактериям, проникать через их клеточную стенку и размножаться в периплазматическом пространстве с последующим лизисом бактерии-хозяина. Метод выделения бделловибрионов во многих отношениях напоминает метод, используемый для бактериофагов.

500 г почвы суспендируют в 500 мл водопроводной воды и энергично встряхивают в течение 1 ч. Суспен зию центрифугируют 5 мин при 500 g для осаждения больших частиц. Надосадочную жидкость пропускают через мембранные ультрафильтры, постепенно уменьшая размер пор в следующем порядке: 3; 1,2; 0,8; 0,65 и 0,45 мкм. 0,5 мл полученного фильтрата смешивают с 0,5 мл суспензии (~5-1О10 клеток в 1 мл) бактерий- хозяев (Enterobacter aerogenes или Pseudomonas fluo- rescensY Эту смесь добавляют к 4 мл расплавленной полужидкой среды YP (разд. 8.5.60), перемешивают и наливают на поверхность твердой YP-среды в чашки. После инкубирования в течение ночи проверяют появление на среде бляшек (областей лизиса). Если они образуются в течение 24 ч, то это более характерно для

бактериофагов, чем для бделловибрионов, которые обнаруживаются не ранее чем через 2 сут. Бляшки, в которых предполагают присутствие бделловибрионов, срезают и суспендируют в YP-среде. Затем готовят серию разведений для наслаивания на газоны бактерий-хозяев с целью получения изолированных бляшек. Одну из бляшек исследуют фазово-контрастной микроскопией с целью найти очень подвижные крошечные вибрионы шириной около 0,3 мкм. Материал, полученный из бляшек, суспендируют в YP-бульоне, суспензию пропускают через ультрафильтр с диаметром пор 0,45 мкм, фильтрат разводят и наносят его на газоны бактерий-хозяев. После трех последовательных выделений из бляшек можно считать, что полученные штаммы бделловибриона вырастают из одной клетки.

Симбиоз растений с ризобиями [5]

Клубеньки, образуемые на корнях бобовых растений, представляют собой природную накопительную систему симбиотических азотфиксирующих бактерий рода Rhi- zobium. Корни люцерны или красного клевера, содержащие клубеньки, отмывают от земли. Отделяют клубеньки от корня так, чтобы небольшая часть корня оставалась с клубеньком. С помощью волосяной щетки промывают клубеньки водопроводной водой, удаляя остатки земли, и погружают их в раствор HgCU (1 : 1000) на 3—6 мин, время от времени переворачивая стерильным пинцетом. Переносят клубеньки в 75%-ный этанол и несколько минут встряхивают. Затем помещают их в стерильную воду и взбалтывают смесь еще несколько минут. Наливают по 1 мл стерильной воды в шесть стерильных чашек Петри. В первую чашку кладут клубенек, раздавливают его стерильным пинцетом и добавляют к нему воду. Переносят 1—2 петли полученной суспензии во вторую чашку со стерильной водой и перемешивают. Проводят суспензию таким же образом через оставшиеся чашки. К каждому разведению добавляют расплавленный и остуженный до 45 °C агар с дрожжевым экстрактом и маннитом (разд. 8.5.59). Инкубируют чашки с затвердевшей средой при комнатной температуре и получают затем субкультуры из отдельных колоний.

Заражение животных

для получения культур Streptococcus pneumoniae [20]

Патогенный микроорганизм можно выделить, инокулируя животное-хозяина смешанной культурой, в которой он находится. В инфицированном животном патогенный микроб преобладает и часто обнаруживается в виде чистой культуры в крови и тканях. При этом в результате действия защитных механизмов животного рост непатогенных сопутствующих микроорганизмов ингибируется или они гибнут.

Например, чистую культуру пневмококков можно получить через 4—6 ч после внутрибрюшинного введения мыши 1 мл эмульгированной мокроты, содержащей S. pneumoniae и другие бактерии. Пробы перитонеальной жидкости берут из брюшинной полости животного с помощью стерильной остроконечной капиллярной пипетки.

Инфицирование

животного возбудителем чумы Yersinia pestis

Выделение из разлагающихся трупов животных Yersinia pestis затруднено из-за присутствия большого количества бактерий, вызывающих гниение. Для получения накопительных культур Y pestis разлагающийся материал втирают в выбритую кожу живота морской свинки. Благодаря малым размерам клетки Y. pestis быстро проникают через микроскопические царапины на бритой коже и инфицируют животное, тогда как большинство сопутствующих бактерий имеют размеры, не позволяющие им проникать через кожу. Чистые культуры Y. pestis можно получить, вырастив материал, полученный из бубонов и селезенки животных.

ПОЛУЧЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР

Для выделения бактерий в виде чистых культур известно сравнительно мало методов. Чаще всего это делают путем изолирования отдельных клеток на твердой питательной среде, используя метод посева штрихом или разлива по чашкам небольшого количества жидкой культуры. Однако получение отдельной колонии не всегда гарантирует чистоту культуры, поскольку колонии

могут вырасти не только из отдельных клеток, но из их скоплений. Если микроорганизмы образуют слизь, то к ней часто прикрепляются посторонние формы. В случае выделения штаммов Bacillus или актиномицетов контаминирующие микроорганизмы могут быть опутаны цепочками клеток или соответственно гифами этих бактерий. Для очистки предпочтительнее использовать неселективную среду, поскольку на ней лучше растут контаминирующие микроорганизмы и их легче обнаружить. Но даже на неселективной среде не следует очень быстро отбирать колонии, поскольку за данный отрезок времени могут еще не вырасти медленно растущие контаминирующие бактерии.

Из чистой культуры обычно вырастают одинаковые колонии и при микроскопировании выявляются похожие клетки, в частности по размеру и окраске по Граму. Однако возможны исключения, например, колонии, вырастающие из чистой культуры, могут быть гладкие (S) и шероховатые (R). Кроме того, в чистых культурах различных микроорганизмов могут появиться кокковидные клетки, цисты и споры. Наконец, некоторые микроорганизмы проявляют грамвариабельность. Тем не менее указанные критерии широко используются при определении чистоты культур.

Посев штрихом или разливомна твердую среду

Существует много методов посева штрихом в чашки с твердыми средами («штрихованные чашки»), но лишь один из них (рис. 8.1) почти всегда дает хорошо изолированные колонии даже при отсутствии навыков у экспериментатора. Кроме того, можно наливать разведенные растворы смешанной культуры на поверхность твердых сред в чашках (подробности метода приведены в разд. 11.2.1). При работе с анаэробами «штрихованные чашки» или чашки с внесенной в них жидкой культурой в атмосфере воздуха инкубируют затем в анаэростате. Для анаэробов необходимы свежеприготовленные среды, и посев штрихом следует проводить в течение первых 4 ч после их автоклавирования, чтобы избежать накопления растворенного кислорода.

//Рис. 8.1. Удобный метод посева штрихом в чашки для получения отдельных колоний. Л. Для маркировки на обратной стороне чашки Петри карандашом наносят букву Т, разделяющую дно иа 3 сектора. В. Петлей с культурой зигзагом износят штрихи на поверхности агара в секторе 1, как показано на рисунке. Для этого крышку чашки сначала приподнимают, а после нанесения штриха сразу закрывают. Петлю стерилизуют в пламени и дают ей остыть (15 с). В. Проводят петлей по поверхности среды в секторе 1, как показано на рисунке, и затем немедленно наносят ею зигзагом штрихи на поверхности среды в секторе 2. Прогревают петлю в пламени и дают ей остыть. Г. Проводят петлей по поверхности среды в секторе 2, как показано, и затем наносят ею зигзагом штрихи на поверхности среды в секторе 3. Д. Инкубируют опрокинутые вверх диом чашки, как показано на рисунке, для того чтобы конденсирующаяся вода с крышки не попала иа поверхность агара. В секторе 1 вырастает большое число колоний, тогда как в секторах 2 и 3 появляются отдельные хорошо изолированные колонии.

/

/

Даже в таком случае необходимо какое-то время, чтобы удалить из сосуда кислород и создать там анаэробные условия. Однако если применяют метод вращающихся пробирок, содержащих предварительно восстановленные среды, то это не требуется [27—29]. Пробирки с предварительно восстановленной расплавленной средой вращают таким образом, что агар затвердевает

тонким слоем на их стенках. Метод посева штрихом во вращающуюся пробирку иллюстрирует рис. 8.2. Среду в такой пробирке инокулируют разведенной суспензией клеток и затем вращают пробирку для распределения клеток по поверхности агара (см. также разд. 6.6.4).

Последовательные разведенияв твердой среде

Самый простой способ посева с помощью разлива по чашкам заключается в том, что после инокуляции испытуемой пробы в пробирку со стерильным расплавленным агаром (охлажденным до 45—50°C) среду перемешивают, выливают в чашку Петри и дают ей застыть. Однако, чтобы получить хорошо изолированные колонии, часто возникает необходимость разведения проб. Наилучшие результаты получают при использовании последовательных десятикратных разведений исходных проб. По 1 мл каждого разведения вносят в чашки Петри, добавляют 15—20 мл расплавленной агаровой среды, смешивают, покачивая чашки несколько раз, и дают среде затвердеть. При выделении анаэробов разведения смешивают с расплавленной, охлажденной и предварительно восстановленной средой во вращающихся пробирках непосредственно перед покрытием ею стенок пробирок.

Недостатком разведения в расплавленной агаровой среде является то, что отдельные колонии оказываются погруженными в агар и поэтому извлечь их можно только механически — стерильным инструментом или отсасыванием с помощью пастеровской пипетки. Плохо также то, что бактерии некоторое время находятся в среде при температуре расплавленного агара (45—50°C).

Для выделения анаэробов, особенно фототрофов и сульфатредуцирующих бактерий, часто используют метод глубинного посева со встряхиванием пробирок [76]. Для этого готовят серию стерильных пробирок, помещают их в водяную баню при 45 °C и наполняют до половины расплавленной агаровой средой той же температуры. Инокулируют первую из пробирок несколькими каплями смешанной культуры и осторожно размешивают со средой. Затем 1/10 объема среды переносят во вторую пробирку. В это время нижнюю часть первой

Часть ii рост

Рис. 8.2. Посев во вращающиеся пробирки в анаэробных условиях [27]. 1 — проволочная петля из платины или нержавеющей стали (нихром может вызывать окисление среды); 2 — газовая канюля для постоянного продувания через пробирку газа, не содержащего кислород, 3 — предварительно восстановленная агаровая среда, покрывающая внутреннюю поверхность пробирки; 4 — соединяющийся с мотором держатель для вращения пробирки во время нанесения штриха. Петлю с инокулятом опускают на дно пробирки, прижимают плоскость петли к поверхности агара и поднимают ее вверх. После нанесения на агар штриха таким образом в нижней четверти пробирки плоскость петли ставят перпендикулярно поверхности агара (как показано на рисунке) и продолжают наносить штрих до верхней части пробирки. Удаляют газовую канюлю, закрывают пробирку резиновой пробкой и инкубируют в вертикальном положении.

пробирки погружают в вертикальном положении в холодную воду для затвердения агара. Размешивают содержимое второй пробирки и переносят 1/10 объема ее среды в третью пробирку, а вторую пробирку охлаждают. Таким же образом поступают с оставшимися пробирками. После этого в каждую пробирку с затвердевшим агаром наносят сантиметровый слой расплавленной стерильной смеси (1:1) парафина и вазелинового масла, благодаря чему среда предохраняется от контакта с воздухом. В процессе затвердения парафиновый

слой может сжиматься, и тогда он перестает выполнять свою защитную функцию. В этом случае следует применить слабое локальное нагревание, а также проколом удалить воздушные пузырьки из-под парафинового покрытия. Когда бактерии вырастают, выбирают пробирку с хорошо изолированными колониями и удаляют из нее столбик агара. Для этого вначале расплавляют и снимают парафиновый слой, а затем вводят между стенкой пробирки и агаром стерильную капиллярную пипетку. Кончик пипетки опускают до дна пробирки и вдуванием воздуха выталкивают агаровый столбик из пробирки в стерильную чашку. Чтобы получить колонии, агар разрезают на кусочки.

Последовательное разведениев жидкой среде

Этот метод применяют в том случае, если выделяемый микроорганизм не растет на твердой среде. При этом данный микроорганизм должен количественно преобладать в смешанной популяции. Готовят раствор смешанной культуры таким образом, чтобы при добавлении аликвот в большое число пробирок с питательной средой среднее число инокулированных бактерий было бы менее 0,05 на пробирку. Это достигается, например, при инокуляции 1-миллилитровых аликвот в 100 пробирок из 100 мл раствора, содержащего всего 5 бактерий. При инкубации в большинстве пробирок роста бактерий не происходит, но в те несколько пробирок, где наблюдается рост, вероятно, попала лишь одна бактерия (Р = 0,975). Чем меньше среднее число бактерий, инокулированных в пробирку, тем больше вероятность того, что культура выросла из единственной бактериальной клетки. Следовательно, в большинстве инокулированных пробирок роста быть не должно, тогда в тех нескольких пробирках, где рост наблюдается, вероятность инокулирования среды единственной клеткой очень высока. Обсуждение теоретических аспектов этого метода приводится в работе [51].

Выделение отдельных клеток

Обзор различных методов выделения отдельных клеток можно найти в работе [36]. При необходимости ре-

гулярного многократного выделения рекомендуется применять микроманипулятор. Для эпизодических выделений используют следующий метод, описанный Ледербер- гом [42].

На нижней стороне чистого предметного стекла тушью чертят сетку квадратов со стороной 5 мм. Верхнюю сторону стекла стерилизуют над пламенем горелки. После охлаждения стекла его покрывают слоем вазелинового масла толщиной 0,5 мм (стерилизовать масло нет необходимости). Нагревают стеклянную трубку диаметром 4 мм в пламени и вытягивают один ее конец так, чтобы получился капилляр диаметром около 0,1 мм. На другой ее конец надевают резиновую трубку. Разводят культуру до плотности 106—107 клеток бактерий в 1 мл среды и, сжимая резиновую трубку, насасывают суспензию в капилляр. Помещают в центр каждого квадрата каплю суспензии из капилляра под масло. Капли прилипают к стеклу и расплющиваются до диаметра 0,1—0,2 мм. Сканируют стекло с помощью фазово-контрастной или темнопольной микроскопии и определяют, в какой из капель содержится только одна клетка выделяемого микроорганизма. Часто такую единичную клетку извлекают путем многоразового набирания и выпускания капли капиллярной пипеткой, содержащей стерильную среду.

По другой методике к капле добавляют примерно 10 мкл стерильной среды и инкубируют на предметном стекле в закрытой камере до появления клона бактерий, а затем извлекают несколько клеток капиллярной пипеткой. Поскольку рост клона происходит в полуана- эробных условиях, эта методика неприменима для строгих аэробов.

СРЕДЫ И РЕАКТИВЫ

Среда для выделения

Aquaspirillum gracile [12]

Пептон5гДрожжевой экст- 0,5 г рактТвин 800,02гПептон5гДрожжевой экст- 0,5 г рактТвин 800,02гК2НРО40,1 гАгар10 гДистиллированная 1000 мл водаК2НРО40,1 гАгар10 гДистиллированная 1000 мл вода

Пептон5г

Дрожжевой экст- 0,5 г ракт

Твин 800,02г

Пептон5г

Дрожжевой экст- 0,5 г ракт

Твин 800,02г

К2НРО40,1 г

Агар10 г

Дистиллированная 1000 мл вода

К2НРО40,1 г

Агар10 г

Дистиллированная 1000 мл вода

Доводят pH до 7,2. Нагревают среду до кипения для растворения агара. Стерилизуют 15 мин при 121 °C.

Среда ASN-III [59]

NaCl25г

MgCl2-6H2O2г

КС10,5г

NaNO30,75г

К2НРО2-ЗН2О0,02г

MgSOt-7H2O3,5г

СаС12-2Н2О0,5г

Лимонная кислота0,003г

Железоаммонийцитрат0,003г

ЭДТА, двунатриевая магниевая соль0,0005г

Na2CO30,02г

Смесь микроэлементов А5 (см. среду BG-11, разд. 8.5.8)1 мл

Деионизованная вода1000 мл

После автоклавирования и охлаждения pH среды должен быть 7,5.

Среда для Azotobacter

Маннит2 г FeSO4-7H2O0,1 г

К2НРО40,5 г Дистиллированная 1000 мл

MgSO4-7H2O 0,2 г вода

Доводят pH до 7,3—7,6. Стерилизуют 15 мин при 121 °C.

Основная среда для получениянакопительных культур Rhodospirillaceae [76]

Раствор А:

NaHCO32 г

Дистиллированная вода25 мл

Стерилизуют фильтрованием (положительное давление).

Раствор В:

NH4C11г

КН2РО40,5г

MgCl20,5г

NaCl (для организмов из солоноватой или морской (20—30 г) воды)

Раствор микроэлементов (см. ниже)1 мл

Дистиллированная вода975 мл

Стерилизуют в течение 15 мин при 121 °C.

Раствор С:

3 г200 мл3 г200 млNa2S-9H2O

3 г

200 мл

3 г

200 мл

Дистиллированная вода

Стерилизуют в колбе с магнитной мешалкой в течение 15 мин при 121 °C. После охлаждения добавляют, помешивая, 1,5 мл стерильной 2 М H2SO4.

Для приготовления среды растворы А и В объединяют. Доводят pH до 7 с помощью стерильных растворов Na2CO3 и Н3РО4. При инокуляции первичных накопительных культур на 100 мл среды добавляют 1 мл раствора С. При последующих пересевах начавшей расти культуры Rhodospirillaceae исключают из среды Na2S и заменяют MgSO4 на MgCI2.

Раствор микроэлементов:

ЭДТА, двунатриевая 500 мг

СоС12-6Н2О

20 мг

соль

СиС12-2Н2О

1 мг

FeSO4-7H2O200 мг

NiCl2-6H2O

2 мг

ZnSO4-7H2O10 мг

Na2MoO4.2H2O

3 мг

МпС12.4Н2О3 мг

НзВОл30 мг

Деионизованная вода

1000 мл

ЭДТА растворяют в порции воды. Отдельно растворяют в воде другие ингредиенты и добавляют их к раствору ЭДТА. Доводят pH раствора приблизительно до 3, а объем до 1 л.

Основные неорганические среды А и В [14]

Среда АРаствор 1:Среда АРаствор 1:(NH4)2SO41,2гСаС12-2Н2О0,1гMgSO4-7H2O0,1гЦитрат железа0,002гДистиллиро- 1000 мл ванная водаСтерилизуют 15 мин при 121 °C(NH4)2SO41,2гСаС12-2Н2О0,1гMgSO4-7H2O0,1гЦитрат железа0,002гДистиллиро- 1000 мл ванная водаСтерилизуют 15 мин при 121 °CРаствор 2:К2НРО40,2 гКН2РО40,1 гДистиллиро- 200 мл ванная водаРаствор 2:К2НРО40,2 гКН2РО40,1 гДистиллиро- 200 мл ванная водаСтерилизуют 15 мин при 121 °CСтерилизуют 15 мин при 121 °C

Среда А

Раствор 1:

Среда А

Раствор 1:

(NH4)2SO41,2г

СаС12-2Н2О0,1г

MgSO4-7H2O0,1г

Цитрат железа0,002г

Дистиллиро- 1000 мл ванная вода

Стерилизуют 15 мин при 121 °C

(NH4)2SO41,2г

СаС12-2Н2О0,1г

MgSO4-7H2O0,1г

Цитрат железа0,002г

Дистиллиро- 1000 мл ванная вода

Стерилизуют 15 мин при 121 °C

Раствор 2:

К2НРО40,2 г

КН2РО40,1 г

Дистиллиро- 200 мл ванная вода

Раствор 2:

К2НРО40,2 г

КН2РО40,1 г

Дистиллиро- 200 мл ванная вода

Стерилизуют 15 мин при 121 °C

Стерилизуют 15 мин при 121 °C

Для приготовления среды растворы 1 и 2 объединяют с соблюдением правил асептики. Для получения твердой среды добавляют 20 г агара на 1 л.

Среда ВК2НРО40,8гКН2РО40,2гCaSO4-2H2O0,05гMgSO4-7H2O[0,5гСреда ВК2НРО40,8гКН2РО40,2гCaSO4-2H2O0,05гMgSO4-7H2O[0,5гFeSO4-7H2O0,01 г(NHihSOi1 гДистиллиро- 1000 мл ванная водаFeSO4-7H2O0,01 г(NHihSOi1 гДистиллиро- 1000 мл ванная вода

Среда В

К2НРО40,8г

КН2РО40,2г

CaSO4-2H2O0,05г

MgSO4-7H2O[0,5г

Среда В

К2НРО40,8г

КН2РО40,2г

CaSO4-2H2O0,05г

MgSO4-7H2O[0,5г

FeSO4-7H2O0,01 г

(NHihSOi1 г

Дистиллиро- 1000 мл ванная вода

FeSO4-7H2O0,01 г

(NHihSOi1 г

Дистиллиро- 1000 мл ванная вода

Стерилизуют 15 мин при 121 °C. Для получения твердой среды добавляют 20 г агара на 1 л.

Основная минеральная агаровая средадля целлюлолитических цитофаг (72]

(NH4)2SO4 или 1 гСаС120,1 г

KNO3FeCl30,02 г

К2НРО41 гАгар10 г

MgSO40,2 гВодопроводная вода 1000 мл

Доводят pH до 7,0—7,5, кипятят до растворения агара и стерилизуют 15 мин при 121 °C.

Основная солевая среда для Thermus [11]

Нитрилотриук-

100 мкг

FeCl3

2800 нг

сусная кис

MnSO4H2O

22 мкг

лота

ZnSO4-7H2O

5 мкг

CaSOt-2H2O

60 мкг

Н3ВО3

5 мкг

MgSOt-7H2O

100 мкг

C11SO4

160 нг

NaCl

8 мкг

Na2MoO4-2H2O

250 нг

KNO,

103 мкг

СоС12.6Н2О

460 нг

NaNO3

689 мкг

Деионизован

1000 мл

Na2HPOt

111 мкг

ная вода

Доводят pH до

8,2 с помощью NaOH.

8.5.8. Среда BG-11 [59]

NaNOj

1,5 г

ЭДТА, двунатриевая

0,001 г

K2HPO4.3H2O

0,04 г

магниевая соль

MgSOt-7H2O

0,075 г

Na2COj

0,02 г

CaCl2-2H2O

0,036 г

Смесь микроэлемен

1,0 мл

Лимонная кис

0,006 г

тов А5 (см. ниже)

лота

Железоаммо- нийцитрат

0,006 г

Деионизованная вода

1000 мл

После автоклавирования жен быть 7,4.

и охлаждения pH среды дол-

Смесь микроэлементов А5:Н3ВО32,86мг/млМпС12-4Н2О1,81мг/млZnSO4-7H2O0,222мг/млСмесь микроэлементов А5:Н3ВО32,86мг/млМпС12-4Н2О1,81мг/млZnSO4-7H2O0,222мг/млNa2MoO4-2H2O0,39мг/млCuSO4-5H2O0,079мг/млСо(МО3)2.6Н2О0,0494мг/млNa2MoO4-2H2O0,39мг/млCuSO4-5H2O0,079мг/млСо(МО3)2.6Н2О0,0494мг/мл

Смесь микроэлементов А5:

Н3ВО32,86мг/мл

МпС12-4Н2О1,81мг/мл

ZnSO4-7H2O0,222мг/мл

Смесь микроэлементов А5:

Н3ВО32,86мг/мл

МпС12-4Н2О1,81мг/мл

ZnSO4-7H2O0,222мг/мл

Na2MoO4-2H2O0,39мг/мл

CuSO4-5H2O0,079мг/мл

Со(МО3)2.6Н2О0,0494мг/мл

Na2MoO4-2H2O0,39мг/мл

CuSO4-5H2O0,079мг/мл

Со(МО3)2.6Н2О0,0494мг/мл

Желчно-эскулиновый агар (BBL или Difco)

Раствор А:

Мясной экстракт3г

Пептон5г

Агар15г

Дистиллированная вода 400 мл

Раствор В:Раствор С:

Бычья желчь40 г Цитрат железа0,5 г

Дистиллированная 400 мл Дистиллированная 100 мл водавода

Смешивают три раствора и смесь нагревают 10 мин при 100°С. Стерилизуют 15 мин при 121 °C и охлаждают до 50 °C. С соблюдением правил асептики добавляют 100 мл 1%-ного раствора эскулина, стерилизованного фильтрованием, и смесь разливают в стерильные пробирки для получения косяков.

Агар BMS, или картофельный агар [17]

Отмытый, очищенный картофель,нарезанный ломтиками200г

L-яблочная кислота2,5г

КОН2г

Нерафинированный тростниковыйсахар2,5г

Раствор витаминов (разд. 8.5.37)1,0 мл

Бромтимоловый синий (0,5%-ный спиртовой раствор)2 капли

Агар15г

Дистиллированная вода1000 мл

Картофель в марлевом мешке кипятят 30 мин в 1 л воды. Полученный экстракт фильтруют через вату и фильтрат сохраняют. Яблочную кислоту растворяют в 50 мл воды и добавляют 2 капли бромтимолового синего и КОН, пока раствор яблочной кислоты не станет зеленым (pH 7,0). Этот раствор, а также тростниковый сахар, витамины и агар добавляют к картофельному фильтрату. Дистиллированной водой доводят объем раствора до 1 л, кипятят до растворения агара и стерилизуют 15 мин при 121 °C.

Модифицированный агар Борде —Жангу [3]

125 г отмытого, очищенного и нарезанного ломтиками картофеля в марлевом мешке погружают в смесь, состоящую из 10 мл глицерина и 500 мл воды. Варят картофель до мягкости и затем выжимают его через марлю в смесь воды с глицерином. Дают жидкости отстояться в высоком цилиндре до относительного просветления. Надосадочную жидкость декантируют и доводят ее объем до 1 л дистиллированной водой. Добавляют 5,6 г NaCl с нагреванием, а затем 22,5 г агара, который растворяют кипячением с постоянным перемешиванием. Смесь стерилизуют 15 мин при 121 °C и охлаждают до 45 °C. С соблюдением правил асептики добавляют 200 мл дефибринированной овечьей крови (разд. 20.3.7), перемешивают и разливают в чашки Петри. Основной агар Борде-Жангу производится фирмами BBL и Difco.

Агар с бриллиантовой зеленью (BBL или Difco)

Панкреатический гидролизатказеинаUSP5г

Пептический гидролизат животныхтканей USP5г

Дрожжевой экстракт3г

NaCl5г

Лактоза10г

Сахароза10г

Феноловый красный0,08г

Бриллиантовая зелень0,0125г

Агар20г

Дистиллированная вода1000 мл

Доводят pH до 6,9. Кипятят до растворения агара и стерилизуют 15 мин при 121 °C.

Бульон с желчью, лактозой

и бриллиантовой зеленью

Раствор А: Лактоза Пептон Дистиллированная водаРаствор А: Лактоза Пептон Дистиллированная вода10 г10 г500 мл10 г10 г500 млРаствор В:Бычья желчьДистиллированная водаРаствор В:Бычья желчьДистиллированная вода20 г200 мл20 г200 мл

Раствор А: Лактоза Пептон Дистиллированная вода

Раствор А: Лактоза Пептон Дистиллированная вода

10 г

10 г

500 мл

10 г

10 г

500 мл

Раствор В:

Бычья желчь

Дистиллированная вода

Раствор В:

Бычья желчь

Дистиллированная вода

20 г

200 мл

20 г

200 мл

Смешивают растворы А и В и доводят дистиллированной водой до 975 мл. Устанавливают pH 7,4, добавля-

ют 13,3 мл 0,1%-ного водного раствора бриллиантовой зелени и дистиллированной водой доводят объем до 1 л. Смесь разливают в пробирки, содержащие перевернутые поплавки, и стерилизуют 15 мин при 121 °C.

Агар для бруцелл (BBL или Difco)

Панкреатический гидролизат казеина10г

Пептический гидролизат животныхтканей10г

Глюкоза1г

Дрожжевой автолизат2г

NaCl5г

Бисульфит натрия0,1г

Агар15г

Дистиллированная вода1000 мл

Доводят pH до 7,0, кипятят до растворения агара и стерилизуют 15 мин при 121 °C.

Среда CHSS для Spirillum volutans

Кислотный гидролизат казеина, без витаминов и солей2,5г

(ICN Nutritional Biochem Cleveland, Ohio)

Янтарная кислота1г

(NHt)2SO41г

MgSOt-7H2O1г

NaCl0,1г

FeCls-6Н2О0,002г

MnSO4-H2O0,002г

Дистиллированная вода1000 мл

Доводят pH до 7,0 с помощью 2 н. КОН. Для получения полужидких сред добавляют 1,5 г агара и кипятят до его растворения. Стерилизуют 20 мин при 121 °C.

Кровяной агар с цистиноми теллуритом [3]

Агар с экстрактом сердечной мышцы (основной кровя- 500 мл ной агар, разд. 20.3.31)

Агар2,5 г

Доводят pH до 7,4, кипятят до растворения агара, стерилизуют 15 мин при 121 °C и охлаждают до 56°С.

С соблюдением правил асептики добавляют следующие ингредиенты:

Дефибрииированная кроличья или овечья кровь25 мл

(разд. 20.3.7)

0,3%-ный раствор теллурита калия, стерилизованный75 мл

22 мг22 мгавтоклавированием L-Цистин

22 мг

22 мг

Во время разлива в чашки Петри смесь помешивают, чтобы цистин оставался в суспендированном состоянии.

Агар Е [3]

Папаиновый гидролизатсоевой муки USP20г

NaCl5г

Агар10г

Деионизованная вода1000 мл

Смесь нагревают до растворения ингредиентов, охлаждают и с помощью NaOH доводят pH до 7,4. Разливают и стерилизуют 15 мин при 121 °C, а затем охлаждают до 50 °C. К 65 мл раствора добавляют с соблюдением правил асептики 10 мл дрожжевого диализата (см. ниже), 25 мл лошадиной сыворотки, 2 мл пенициллина (10 000 ед./мл) и 1 мл 3,3%-ного ацетата таллия (стерилизованного фильтрованием). Среду разливают по 5 мл в чашки Петри (10X35 мм) и перед использованием инкубируют в течение ночи при комнатной температуре.

Дрожжевой диализат:

450 г активных сухих дрожжей суспендируют в 1250 мл дистиллированной воды при 40 °C. Нагревают 5 мин при 121 °C и диализуют против 1 л дистиллированной воды в течение 2 дней при 4 °C. Диализный мешок вместе с содержимым удаляют, а диализат стерилизуют 15 мин при 121 °C и хранят в морозильной камере.

Двухфазная среда

Для получения двухфазной среды в стерильные пробирки (16X25 мм) с завинчивающимися крышками с соблюдением правил асептики разливают по 3 мл Е-ага- ра. После затвердения на среду наслаивают 3 мл Е-бульона (разд. 8.5.18) и хранят пробирки при комнатной температуре.

Е-бульон [3]

Папаиновый гидролизатсоевой муки USP20г

NaCl5г

Глюкоза10г

Феноловый красный, 2%-ный водный раствор2 мл

Деионизованная вода1000 мл

Доводят pH до 7,6, разливают и стерилизуют 15 мин при 121 °C. После охлаждения к бульону добавляют те же компоненты, что и в случае Е-агара (разд. 8.5.17).

Основная среда Гизбергера [83]

NH4C11г

К2НРО40,5г

MgSO40,5г

Дистиллированная вода (см. примечание)1000 мл

Доводят pH до 7 и стерилизуют 15 мин при 121 °C. (Примечание: для морских микроорганизмов вместо дистиллированной воды используют морскую.)

Глюкозо-триптоновый агар [6]

Триптон (Difco)или триптиказа10г

Глюкоза5г

Агар15г

Бромкрезоловыйфиолетовый0,04г

Дистиллированная вода1000 мл

Доводят pH до 6,7, кипятят до растворения агара и стерилизуют 15 мин при 121 °C.

Среда для галофилов [65]

Казаминовые7,5 г

кислоты

Дрожжевой10 г

экстракт

Тринатрий-3 г

цитрат

КС12г

MgSO4-7H2O20г

РеС120,023г

NaCl250г

Дистиллиро-1000 мл

ванная вода

Получение накопительных и чистых культур

Перечисленные ингредиенты растворяют в 800 мл дистиллированной воды и доводят pH до 7,5—7,8 с помощью 1 н. КОН. Автоклавируют среду 5 мин при 120 °C и затем фильтруют для удаления осадка. Доводят pH до 7,4 с помощью 1 н. НС1, а объем среды — до 1000 мл и стерилизуют автоклавированием. Если необходима твердая среда, то добавляют 20 г агара на 1 л, кипятят до его растворения, а затем автоклавируют. Среду разливают в чашки Петри при 60—70 °C, чтобы предотвратить ее преждевременное отвердение.

Среда для Hyphomicrobium [9]

К2НРО41,74г

NaH2PO4-H2O1,38г

(NH4)aSO40,5г

MgSO4-7H2O0,2г

СаС12,2Н2О0,025мг

FeCl2-4H2O3,5мг

Метанол5мл

KNO35г

Раствор микроэлементов (см. ниже)0,5мл

Деионизованная вода1000мл

Доводят pH до 7,0 с помощью NaOH. Среду, используемую для получения накопительных культур, не стерилизуют. Среду, используемую для выделения чистых культур, стерилизуют 15 мин при 121 °C перед добавлением метанола. Для приготовления твердой среды, используемой при выделении бактерий, добавляют 15 г агара на 1 л и исключают из смеси KNO3. Перед добавлением метанола среду стерилизуют 15 мин при 121 °C. Для удаления кислорода из всех жидких сред перед использованием через них продувают азот. В анаэробных условиях KNO3 в этих средах служит акцептором электронов.

Раствор микроэлементов:

ZnSO4-7H2O

50 мг

MgCl2-4H2O

400 мг

СоС12-6Н2О

1 мг

CuSO4-5H2O

0,4 мг

Н3ВОз

2000 мг

Na2MoO4-2H2O

500 мг

Деионизованная вода

1000 мл

Среда Иверсона [33]

Триптиказо-соевый агар (обезвожен-40г

ный, BBL)

Агар5г

Лактат натрия, 0,4%-ный раствор 600 мл

MgSO4-7H2O2г

Железоаммонийсульфат0,5г

Дистиллированная вода400 мл

Доводят pH до 7,2—7,4, кипятят до растворения агара и стерилизуют 15 мин при 121 °C.

Лактатная среда

Дрожжевой экстрактIг

Лактат натрия4г

NH4C10,5г

К2НРО41г

MgSO4-7H2O0,2г

СаС12-2Н2О0,1 г

FeSO4-7H2O0,1г

Na2SO40,5г

NaCI (для морских организмов)(20—30 г)

Стерилизуют 15 мин при 121 °C.

Бульон для листерий [3]

Пептон, триптоза(Difco) или20г

биосейт (BBL)

Глюкоза (декстроза)2г

NaCI5г

Na2HPO42,5г

Дистиллированная вода1000 мл

Доводят pH до 7,3 и стерилизуют 15 мин при 121 °C.

Среда Лёвенштейна—Йенсена (BBL или Difco)

КН2РО42,4г

MgSO4-7H2O0,24г

Цитрат магния0,60г

Аспарагин3,6г

Картофельная мука30г

Глицерин12мл

Дистиллированная вода600мл

Гомогенизированные яйца1000мл

Малахитовый зеленый 2-% ный200мл

водный раствор

Соли и аспарагин растворяют в воде, добавляют к ним глицерин и картофельную муку и автоклавируют 30 мин при 121 °C. Скорлупу свежих (хранящихся не более недели) яиц тщательно моют в 5%-ном мыльном растворе. Оставляют яйца в этом растворе на 30 мин, а затем скорлупу вновь тщательно моют в проточной холодной воде. На 15 мин погружают яйца в 70%-ный этанол, затем вынимают их и разбивают в стерильную колбу. Гомогенизируют яйца встряхиванием со стеклянными бусами, гомогенат фильтруют через четыре слоя стерильной марли и 1 л отфильтрованного яичного гомогената вливают в колбу с охлажденной картофельно-солевой смесью. Добавляют малахитовый зеленый, хорошо перемешивают и разливают по 6—8 мл в стерильные пробирки (20X150 мм) с завинчивающимися крышками. Наклоняют пробирки и выдерживают их в течение 50 мин при 85 °C для сгущения содержимого. Стерильность пробирок проверяют инкубацией в течение 48 ч при 37 °C. Хранят пробирки с плотно завинченными крышками в холодильнике.

Агар Мак-Конки (BBL или Difco)

Пептон (Difco) или джелизат17 г

(BBL)

Протеозопептон (Difco) илипо-3г

липептон (BBL)

Лактоза10г

Смесь желчных солей1,5г

NaCl5г

Нейтральный красный0,03г

Кристаллический фиолетовый0,001г

Агар13,5г

Дистиллированная вода1000 мл

Доводят pH до 7,1, кипятят до растворения агара и стерилизуют 15 мин при 121 °C.

Солевой агар с маннитом (BBL или Difco)

Мясной экстракт1г

Пептон (Difco) или полипептон10г

(BBL)

NaCl75г

МаннитЮг

Феноловый красный0,025г

Агар15г

Дистиллированная вода1000 мл

Доводят pH до 7,4, кипятят до растворения агара, стерилизуют 15 мин при 121 °C, охлаждают до 55 °C и разливают по чашкам Петри.

8.5.29. Среда Мак-Брайда для листерий [3] (Difco)

Пептон, триптоза (Difco) или

10 г

биосейт (BBL)

Мясной экстракт

3 г

NaCl

5 г

Ангидрид глицина

10 г

LiCl

0,5 г

Фенилэтанол

2,5 г

Агар

15 г

Дистиллированная вода

1000 мл

Доводят pH до 7,3, кипятят до растворения агара и стерилизуют 15 мин при 121 °C. Среду охлаждают до 45—50 °C и добавляют к ней стерильную дефибриниро- ванную овечью кровь до конечной концентрации 5%.

8.5.30. Минеральный агар [7]

Na2PO4-12H2O

9 г

КН2РО4

1,5 г

MgSO4-7H2O

0,2 г

NH4C1

1 г

Железоаммонийцитрат

0,005 г

СаС12-2Н2О

0,010 г

Раствор микроэлементов ниже)

(см.3 мл

Бидистиллированная вода

1000 мл

Доводят pH до 7,1 и стерилизуют 15 мин при 121 °C. Для получения твердой среды добавляют 17 г агара на 1 л, смесь кипятят до его растворения и стерилизуют автоклавированием. После охлаждения среды до 45— 50 °C добавляют нужное количество раствора ЫаНСОз (стерилизованного фильтрованием) до конечной концентрации 0,5 г/л.

Раствор микроэлементов:

ZnSO4.7H2O10мг

МпС12-4Н2О3мг

Н3ВОз30мг

СоС12-6Н2О20мг

СиС12-6Н2О0,79мг

NiCl2-6H2O2мг

Na2MoOi-2H2O3мг

Бидистиллированная1000мл

вода

Агар для Streptococcus mittsи S. salivarius [13] (Difco)

Триптон (Difco)

10

Протеозопептон № 3 (Difco)

5

Протеозопептон (Difco)

5

Глюкоза

1

Сахароза

50

К2НРО4

4

Трипановый синий

0,075

Кристаллический фиолетовый

0,0008

Агар

15

Дистиллированная вода

1000 ^

Доводят pH, кипятят до растворения агара, стерилизуют 15 мин при 121 °C и затем охлаждают до 50—55 °C. Добавляют 1 мл 0,1%-ного теллурита калия (стерилизованного фильтрованием), перемешивают и разливают в чашки Петри.

Среда MN [59]

NaNO30,75г

К2НРО4 ЗН2О0,02г

MgSO4-7H2O0,038г

СаС12-2Н2О0,018г

Лимонная кислота0,003г

Железоаммонийцитрат0,003г

ЭДТА, двунатриевая магниевая соль0,0005г

Na2CO30,02г

Смесь микроэлементов А5(см. среду BG-111мл

в разд 8 5 8)

Морская вода750мл

Деионизованная вода250мл

После автоклавирования и охлаждения pH среды должен быть 8,3.

Модифицированная среда Рогозы [46]

Раствор А:

MgSO4-7H2O

11,5 г

MnSO4-4H2O

2,8 г

FeSO4-7H2O

0,08 г

Дистиллированная вода

100 мл

Раствор В:

Дрожжевой экстракт

6 "г

Кислый аммонийцитрат

2,4Д

КН2РО4

7,2 *г

Глюкоза

124 г

Твин 80

1,2 г

Дистиллированная вода

100 мл

Раствор С:

К 100 мл раствора В добавляют 6 мл раствора А. Слабо нагревают до растворения ингредиентов, а затем добавляют 60 мл 4М ацетатного буфера, pH 5,37, и доводят дистиллированной водой объем раствора до 200 мл. Конечный pH среды равен 5,0.

Раствор D:

Снятое сырое молоко (pH доведен до 8,5)1000 мл

Трипсин5 г

Хлороформ10 мл

Инкубируют 24 ч при 37 °C, стерилизуют паром 20 мин, фильтруют горячий раствор и доводят pH до 6,65 ледяной уксусной кислотой (около 0,5 мл на 1 л).

Для приготовления полной среды добавляют к 700 мл раствора D 19 г агара, который растворяется во время автоклавирования при 121 °C в течение 20 мин. К этому горячему раствору добавляют 185 мл раствора С, предварительно нагретого до 50 °C, и доводят объем до 1 л горячим раствором D. Проба из полученной среды, разведенная в 3 раза теплой водой, должна при 30 °C иметь pH 5,35+0,05. Среду разливают по 10 мл в пробирки и без стерилизации хранят в холодильнике. При разливе среды по чашкам ее расплавляют слабым нагреванием, стараясь избежать потемнения среды и образования осадка.

Модифицированная среда Вольфа [40, 54]

Приготовление железосульфидного агара

Равные количества железоаммонийсульфата и сульфида натрия вливают в кипящую дистиллированную воду, заполняют этой смесью мерную колбу и закрывают ее. Осадку дают возможность осесть, а надосадочную жидкость сливают. К осадку вновь добавляют кипящей дистиллированной воды и несколько раз переворачивают колбу, ресуспендируя осадок. Дают осадку осесть, надосадочную жидкость сливают, а к осадку опять добавляют кипящую дистиллированную воду и т. д. Таким способом отмывают сульфид железа четыре раза. Осадок хранят в мерной колбе, наполненной водой и закрытой пробкой. Сульфид железа достают со дна колбы пипеткой.

К ЮО мл осадка сульфида железа добавляют 15 г очищенного агара, кипятят среду до расплавления агара и стерилизуют 20 мин при 121 °C. Смесь разливают пипеткой по 10 мл в стерильные прямоугольные 150-мил- лилитровые молочные бутылки с завинчивающимися крышками и дают агару застыть.

Приготовление жидкого поверхностного слоя

В каждой бутылке на агар наносят 50 мл (100 мл в случае получения накопительной культуры с формалином) среды следующего состава:

NH4C11г

К2НРО40,5г

MgSO4-7H2O0,2г

СаС120,1г

Бромтимоловый синий0,016г

Бромкрезоловыйфиолето-0,004г

вый

Дистиллированная вода1000 мл

Стерилизуют 20 мин при 121 °C. После охлаждения среду вносят с соблюдением правил асептики в сосуды с железосульфидным агаром. Через жидкий слой в течение 15 с или до снижения pH до 6,0 продувают СО2.

Агар MPSS

Пептон (Difco)5г

Янтарная кислота1г

(NH4)2SO41г

MgSO4-7H2O1г

FeCls-6Н2О0,002г

MnSO4-H2O0,002г

Агар15г

Дистиллированная вода (см. примечание) 1000 мл

Доводят pH до 7,0 с помощью КОН, кипятят до растворения агара и стерилизуют 15 мин при 121 °C. {Примечание: для морских микроорганизмов вместо дистиллированной воды используют морскую.)

Реактив, содержащийМ-ацетил-Ь-цистеин и гидроксид натрия [20]

Объединяют равные объемы 4%-ного NaOH и 2,94%- ного цитрата натрия-2Н2О и разводят в этом растворе

Часть и гост

порошок N-aцeтил-L-циcтeинa (0,5%). Приготовленный раствор годен в течение суток.

Среда Nfb [17]

L-Яблочная кислота

5 г

К2НРО4

0,5 г

MgSO4-7H2O

0,2 г

NaCl

0,1 г

СаС12

0,02 г

Раствор микроэлементов (см. ниже)

2 мл

Бромтимоловый синий (5%-ный спиртовой

2 мл

раствор)

Fe-ЭДТА (1,64%-ный раствор)

4 мл

Раствор витаминов (см. ниже)

1 мл

кон

4 г

Агар

1,75 г

Дистиллированная вода

1000 мл

Доводят pH до 6,8, кипятят до растворения агара и стерилизуют 15 мин при 121 °C. Среду охлаждают до 40—50 °C и разливают по 4 мл в 6-миллилитровые сывороточные пузырьки с резиновыми прокладками.

Раствор микроэлементов:

Na2MoO4-2H2O0,2 г

MnSO4-H2O0,235 г

Н3ВОз0,28т

CuSO4-5H2O0,008'г

ZnSO4.7H2O0,024 г

Дистиллированнаявода200 мл

Раствор витаминов:

Биотин10мг

Пиридоксин20мг

Дистиллированнаявода100 мл

Среда для нитрификаторов [58]

Na2HPO413,5г

КН2РО40,7г

MgSO4-7H2O0,1г

NaHCOa0,5г

РеС13-6Н2О0,014г

СаС12-2Н2О0,18г

Дистиллированная вода 1000 мл

Разливают среду по 75 мл в 250-миллилитровые колбы Эрленмейера и стерилизуют 15 мин при 121 °C. В случае бактерий, окисляющих нитрит, перед стерилизацией

в среду добавляют 0,5 г NaNO2 на 1 л. Для бактерий, окисляющих аммоний, стерилизуют отдельно раствор (NH4)2SO4 и добавляют его с соблюдением правил асептики до конечной концентрации 0,5 г/л.

Среда Пфеннига и Библадля серуокисляющих бактерий [56]

КН2РО41г

NH4CI0,3г

MgSO4-7H2O1г

MgCl2-6H2O2г

NaCl (для морских организмов)(20г)

СаС12-2Н2О0,1г

Раствор микроэлементов(см.ниже)10мл

Раствор 2 М H2SO42мл

Дистиллированная вода1000мл

0,5 г4 г0,3 г20 мкг0,5 г4 г0,3 г20 мкгСтерилизуют автоклавированием и после охлаждения добавляют следующие компоненты основного раствора:

0,5 г

4 г

0,3 г

20 мкг

0,5 г

4 г

0,3 г

20 мкг

Ацетат натрия

NaHCO3 (простерилизован фильтрованием при положительном давлении)

Na2S-9H2O

Биотин

Доводят pH до 7,8. Растирают высокоочищенный серный цвет с дистиллированной водой в ступке и стерилизуют его 30 мин при 112—115 °C; избыток воды декантируют. К каждой порции среды (50 мл) добавляют кусочек серы размером с горошину. Кроме того, в каждую бутыль со средой добавляют стерильные стеклянные бусы.

Раствор микроэлементов:

ЭДТА,двунатриевая

500 мг

соль

FeSO4-7H2O

200 мг

ZnSO4-7H2O

10 мг

МпС12-4Н2О

3 мг

Н3ВОз

30 мг

СоС12-6Н2О

20 мг

СиС12-2Н2О

1 мг

NiCl2-6H2O

2 мг

Na2MoO4-2H2O

3 мг

Деионизованная вода

1000 мл

Фенилэтаноловый агар (BBL или Difco)

ПанкреатическийгидролизатказеинаUSP15г

Папаиновый гидролизатсоевоймукиUSP5г

NaCl5г

Фенилэтаиол2,5г

Агар15г

Дистиллированная вода1000 мл

Доводят pH до 7,3, кипятят до растворения агара и стерилизуют 15 мин при 118 °C.

Почвенная среда Прингсхейма [60]

Зерно пшеницы или ячменя вносят в большую пробирку и покрывают его садовой почвой толщиной 3— 4 см. Пробирку заполняют водопроводной водой почти доверху. Стерилизуют среду 30 мин при 121 °C.

Среда RGCA-SC [27]

Глюкоза0,0248г

Целлобиоза0,0248г

Растворимый крахмал0,05г

(NH4)2SO40,1г

Раствор ресазурина (0,025%)0,4 мл

Дистиллированная вода20мл

Раствор солей (разд. 20.3.28)50мл

Рубцовая жидкость (Randolph Biologicals,30мл

Houston, Тех.)

Солянокислый цистеин0,05г

Раствор гемина (разд. 20.3.28)1мл

Раствор витамина Ki (разд. 20.3.28)0,02 мл

Среду готовят способом, описанным для бульона PY (разд. 20.3.28), разливают по 10 мл в пробирки, содержащие 0,2 г агара, и автоклавируют. Для приготовления конечной среды в двух пробирках агар расплавляют и охлаждают до 50 °C. В каждую пробирку добавляют с соблюдением правил асептики:

Стерильную инактивированную сыворотку кроли- 1,5 мл ка, нагревавшуюся в течение 4 ч при 60 °C

Раствор кокарбоксилазы (тиаминпирофосфата;0,2 мл

0,025%), стерилизованный фильтрованием

Стерильный предварительно восстановленный2,0 мл

бульон PY (разд. 20.3.28)

Смешивают и переливают содержимое двух пробирок в чашку Петри, где среда застывает. Среду либо используют немедленно, либо хранят в анаэростате.

Агар для салмонелл и шигелл (BBL или Difco)

Мясной экстракт 5 г Пептон 5 г Лактоза 10 г Смесь желчных солей 8,5 г Цитрат натрия 8,5 г Тиосульфат натрия 8,5 г Цитрат железа 1 г Бриллиантовая зелень 0,33 г Нейтральный красный 0,025 г Агар 13,5 г Дистиллированная вода 1000 мл

Доводят pH до 7,0 и нагревают до кипения, чтобы растворить агар. Автоклавирования не проводят. Охлаждают до 42—45°C и разливают в чашки Петри.

Бульон с селенитом F [43] (BBL или Difco)

Полипептои(BBL)или триптон (Difco)5г

Лактоза4г

Na2HPO410г

Кислый селенит натрия4г

Дистиллированная вода1000 мл

Доводят pH до 7,0. Среду используют сразу же без стерилизации или хранят пробирки после их стерилизации с текучим паром в течение 30 мин.

Бульон гидролизата казеина и соевой муки [известен также, как триптиказо-соевый бульон

(BBL) или триптический соевый бульон (Difco)]

Панкреатический гидролизат казеина17 г

USP

Папаиновый гидролизат соевой муки3 г

USP

NaCl5 г

К2НРО42,5 г

Глюкоза2,5 г

Дистиллированная вода1000 мл

Доводят pH до 7,3 и стерилизуют 15 мин при 118— 121 °C.

Среда для Sphaerotilus [8]

Лактат натрия

100

мг

NH4C1

1,7

мг

КН2РО4

8,5

мг

К2НРО4

21,5

мг

Na2HPO4-7H2O

34,4

мг

MgSO4-7H2O

22,5

мг

СаС12

27,5

мг

FeCls -6Н2О

0,25

мг

Дистиллированная вода

1000

мл

При необходимости доводят pH до 7,1—7,2. Разливают порции по 50 мл в квадратные бутыли Френча и стерилизуют 15 мин при 116 °C.

Среда для Sporocytophaga

Бумага Whatman Chro-10г

media 11

KNO30,5г

MgSO4-7H2O0,2г

СаС12-2Н2О0,1г

FeCl30,02г

Дистиллироваииая вода 1000 мл

Агар для стандартных методов [6J(BBL или Difco)

Панкреатическийгидролизат казеина USP5г

Дрожжевой экстракт2,5г

Глюкоза1г

Агар15г

Дистиллированная вода1000 мл

Доводят pH до 7,0, кипятят до растворения агара и стерилизуют 15 мин при 121 °C.

Среда с сукцинатом и солями

Сукцинат натрия4гMgSO4-7H2O0,2

KNO30,5гСаС12-2Н2О0,1

К2НРО40,5гFeSO4-7H2O0,2

Доводят pH до 7,0 и стерилизуют 15 мин при 121 °C.

Агар TCBS [3] (BBL)

Тиосульфат натрия 10 г Цитрат натрия 10 г Бычья желчь 5 г Холат натрия 3 г Сахароза 20 г Панкреатический гидролизат казеина USP 5 г Пептический гидролизат животных тканей USP 5 г Дрожжевой экстракт 5 г NaCI 10 г Цитрат железа 1 г Тимоловый синий 0,04 г Бромтимоловый синий 0,04 г Агар 14 г Дистиллированная вода 1000 мл

Нагревают, помешивая, и кипятят 1 мин. Среду охлаждают до 45—50 °C и разливают в чашки. Автоклавирования не проводят. Конечный pH должен быть 8,6.

Агар с ацетатом таллия

Ацетат таллия1г

Пептон10г

Дрожжевой экстракт10г

ГлюкозаЮг

Агар13г

Дистиллированная вода 1000 мл

Доводят pH до 6,0, кипятят до растворения агара и стерилизуют 15 мин при 118 °C. Смесь охлаждают до 45—50 °C, добавляют к ней с соблюдением правил асептики 10 мл солянокислого трифенилтетразолия (1%-ный водный раствор, стерилизованный фильтрованием) и разливают в чашки Петри.

Агар Тейера и Мартина

Эту среду чаще всего готовят из имеющихся в продаже концентратов и растворов или используют готовую (BBL или Difco).

Раствор А (основной агар GC двойной концентрации):

Панкреатический гидролизат ка-15 г

зеина USP

Пептический гидролизат живот-15 г

ной ткани USP

Кукурузныйкрахмал2г

К2НРО48г

КН2РО42г

NaCl10г

Агар (см. примечание)20г

Дистиллированная вода1000 мл

Кипятят до растворения агара и стерилизуют 15 мин при 121 °C, после чего охлаждают до 50 °C. (Примечание: Файнголд и др. [20] рекомендуют увеличить количество агара до 30 г.)

Раствор В:

20 г 1000 мл20 г 1000 млГемоглобин

20 г 1000 мл

20 г 1000 мл

Дистиллированная вода

К небольшому количеству воды постепенно добавляют порошок гемоглобина, чтобы получить однородную пасту; затем постепенно добавляют остальную воду. Стерилизуют 15 мии при 121 °C.

Раствор С:

Витамин Bn

0,010

Г

L-Глутамин

10

г

Аденин

1

г

Солянокислый гуанин

0,03

г

n-Аминобензойная кислота

0,013

г

L-Цистин

1,1

г

Глюкоза

100

г

Никотииамидадениндинуклеотид

0,25

г

Тиамиипирофосфат (кокарбокси-

0,1

г

лаза)

Нитрат железа

0,02

г

Солянокислый тиамии

0,003

г

Солянокислый цистеин

25,9

г

Дистиллированная вода

1000 мл

Стерилизуют фильтрованием.

Раствор D:

30 мг75 мг125 000 ед.100 мл30 мг75 мг125 000 ед.100 млВанкомицин

30 мг

75 мг

125 000 ед.

100 мл

30 мг

75 мг

125 000 ед.

100 мл

Колистин

Нистатин

Дистиллированная вода

Стерилизуют фильтрованием.

С соблюдением правил асептики объединяют по 1000 мл растворов А и В и по 20 мл растворов С и D. Среду разливают в чашки Петри.

Среда для Thiobacillus thiooxidans [78]

Na2S2O3-5H2O

10 г

КН2РО4

4 г

К2НРО4

4 г

MgSO4-7H2O

0,8 г

NH4CI

0,4 г

Раствор микроэлементов (см. ниже)

10 мл

Деионизованная вода

1000 мл

Стерилизуют 15 мин при 121 °C. Доводят pH до 3,5—4,0 стерильной H2SO4. Для получения твердой среды перед доведением pH добавляют 15 г агара на 1 л. Кипятят до растворения агара, стерилизуют автоклавированием и охлаждают до 45—50 °C. Доводят pH до 3,5—4,0 стерильной H2SO.i.

Раствор микроэлементов: ЭДТА

50 г

ZnSO4-7H2O

22 г

СаС12

5,54 г

МпС12-4Н2О

5,06 г

FeSO4-7H2O

4,99 г

(NH4)6Mo7O24-4H2O

1,1 г

CuSO4-5H2O

1,57 г

СоС12-6Н2О

1,61 г

Дистиллированная вода

1000 мл

Доводят pH до 6,0 с помощью КОН.

Среда с триптофаном [44]

MgSO4-7H2O

0,2 г

К2НРО4

1 г

МпС12-4Н2О

0,002 г

FeSO4-7H2O

0,05 г

СаС12

0,02 г

NaMoO4-2H2O

0,001 г

L-Триптофаи

1 г

Дистиллированная вода

1000 мл

Доводят pH до 6,8—7,0 и стерилизуют автоклавированием.

Среда Велдкампа [77]

NaCl30г

КН2РО41г

NH4C11г

MgCl2-6H2O0,5г

0,04 г5 г 0,1 г 5 мл 2 мл5 г 0,3 г 1000 мл0,04 г5 г 0,1 г 5 мл 2 мл5 г 0,3 г 1000 млСаС12

0,04 г

5 г 0,1 г 5 мл 2 мл

5 г 0,3 г 1000 мл

0,04 г

5 г 0,1 г 5 мл 2 мл

5 г 0,3 г 1000 мл

NaHCO3

Na2S-9H2O

Цитрат железа, 0,004 М раствор

Раствор микроэлементов (см. ниже)

Агар, порошок

Дрожжевой экстракт

Дистиллированная вода

Доводят pH до 7,0. Для получения первичной накопительной культуры среду используют без стерилизации. Чтобы получить среду, используемую для посева разливом в чашки, готовят среду двойной концентрации, но без агара, доводят ее pH до указанного значения и стерилизуют фильтрованием (положительное давление). Отдельно готовят 4%-ный раствор агара в свежедистиллированной прокипяченной воде и стерилизуют его кратковременным автоклавированием. Температуру среды двойной концентрации и расплавленного агара доводят до 45—50°C и с соблюдением правил асептики смешивают их в равных объемах.

Раствор микроэлементов:

НзВОз2,8г

MnSO4-H2O2,1г

Cu(NO3)2-3H2O0,2г

Na2MoO4-2H2O0,75 г.

СоС12-6Н2О0,2г

Zn(MO3)2-6H2O0,25г

Деионизованная вода1000 мл

Агар с желчью и фиолетовым красным [6]

Дрожжевой экстракт3г

Пептон (Difco) или джелизат (BBL)7г

Смесь желчных солей1,5г

Лактоза10г

NaCI5г

Нейтральный красный0,03г

Кристаллический фиолетовый0,002г

Агар15г

Дистиллированная вода1000 мл

Доводят pH до 7,4, кипятят до растворения агара, охлаждают примерно до 45 °C и используют для заполнения чашек. После застывания среды ее покрывают дополнительным слоем среды, чтобы предотвратить поверхностный рост и распространение колоний.

Среда Виддла и Пфеннига [81]

Ацетат натрия

1,23 г

Na2SOi

2,84 г

КН2РО4

0,68 г

MgCU

0,19 г

NH4CI

0,32 г

СаС12

0,07 г

Раствор микроэлементов (см. ниже)

10 мл

Дистиллированная вода

1000 мл

Стерилизуют 15 мин при 121 °C. Затем добавляют следующие ингредиенты из стерильных основных растворов:

FeCh (из подкисленного основного раствора) 0,00025 г

NaHCO3 (стерилизован фильтрованием при поло- 1,68 г жительном давлении)

NaaS (стерилизован фильтрованием)0,117 г

Раствор витаминов (стерилизован фильтровани- 5 мл ем, см. ниже)

Витамин Ви (стерилизован фильтрованием)20 мкг

Доводят pH среды до 7,1 стерильным раствором Н3РО4. После инокуляции к среде добавляют 0,0315 г Na2S2O4- •2Н2О на 1 л (из свежеприготовленного основного раствора, стерилизованного фильтрованием). Для морских микроорганизмов добавляют 20 г NaCI и l,14rMgCl2Ha 1 л среды.

Раствор микроэлементов:

ZnSO4-7H,O

10

мг

МпС12-4Н2О

3

мг

НзВОз

30

мг

СоС12-6Н2О

20

мг

СиС12-2Н2О

1

мг

№С12-6Н2О

2

мг

Na2MoO4-2H2O

3

мг

Деионизованная вода

1000

мл

Раствор витаминов:

Биотин

0,2

мг

Ниацин

2

мг

Тиамин

1

мг

ц-Аминобензойная кислота

1

мг

Пантотеновая кислота

0,5

мг

Пиридоксамии • НС1

5

мг

Дистиллированная вода

100

мл

Растворяют ингредиенты, стерилизуют их фильтрованием и хранят при 4 °C.

Щелочная среда Вили и Стокса [82]

Дрожжевой экстракт20г

(NH4)2SO410г

Трис15,7г

Дистиллированная вода 1000 мл

Основные растворы каждого ингредиента готовят отдельно и стерилизуют их автоклавированием (рН-трис- буфера должен быть 9,0). Смешивают ингредиенты с соблюдением правил асептики и проверяют конечный pH, который должен быть 8,7. Для получения твердой среды добавляют 15 г агара на 1 л среды.

8.5.59. Агар с дрожжевым экстрактом и маннитом

Маннит

10 г

К2НРО4

0,5 г

MgSO4-7H2O

0,2 г

NaCl

0,1 г

СаСОз

3 г

Дрожжевой экстракт

0,2 г

Агар

15 г

Дистиллированная вода

1000 мл

Кипятят до растворения агара и стерилизуют 15 мин при 121 °C.

8.5.60 Среда YP [75]

Дрожжевой экстракт3 г

Пептон0,6 г

Дистиллированная вода 1000 мл

Доводят pH до 7,2 и стерилизуют 15 мин при 121 °C. Для полужидкой среды YP, используемой как покрытие, добавляют 6 г агара на 1 л; для получения твердой среды добавляют 19 г агара на 1 л. Кипятят до растворения агара и стерилизуют автоклавированием.

8.6. ЛИТЕРАТУРА

Общая литература

Aaronson. S. Experimental microbial ecology, Academic Press, Inc., New York, 1970. Содержит очень много подробных методов получения накопительных культур и выделения большого числа бактерий.

Collins V. G. Isolation, cultivation and maintenance of autotrophs, p. 1—52. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (eds.), Methods in microbiology, vol. 3B, Academic Press, Inc., New York (1969). Обстоятельный обзор принципов и методов получения накопительных культур и выделения фото- и хемоавтотрофов.

Lennette Е. Н., В alows A., Hausler W. L, Jr., Truant J. P. (eds.). Manual of clinical microbiology, 3rd ed., American Society for Microbiology, Washington, D. C., 1980. Принципы и методология получения накопительных культур и выделения патогенных бактерий, риккетсий, вирусов и грибов.

Veldkamp Н. Enrichment cultures of prokaryotic organisms, p. 305—361. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (eds.), Methods in microbiology, vol. ЗА, Academic Press, Inc., New York, 1970. Основное внимание уделено теоретическим аспектам получения накопительных культур; описаны методы накопления специфических микроорганизмов.

Специальная литература

Allen О. A. Experiments in soil bacteriology, 3rd ed., Burgess Publishing Co., Minneapolis, 1957.

American Public Health Association. Standard methods for the examination of dairy products, 11th ed., American Public Health Association, New York, 1960.

Aragno M., Schlegel H. G. Aquaspirillum, autotrophicum, a new species of hydrogen-oxidizing, facultatively autotrophic bacteria, Int. J. Syst. Bacteriol., 28, 112—116 (1978).

Armbruster E. H. Improved technique for isolation and identification of Sphaerotilus, Appl. Microbiol., 17, 320—321 (1969).

Attwood M. M., Harder W. A rapid and specific enrichment procedure for Hyphomicrobium spp. Antonie van Leeuwenhoek, J. Microbiol. Serol., 38, 369—378 (1962).

Barnes E. M. Methods for the isolation of faecal streptococci (Lancefield Group D) from bacon factories, J. Appl. Bacteriol., 19, 193—203 (1956).

Brock T. D., Freeze H. Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., non- sporulating extreme thermophile, J. Bacteriol., 98, 289—297 (1969).

Canale-Parola E., Rosenthal S. L., Kupfer D. G. Morphological and physiological characteristics of Spirillum gracile sp. n. Antonie van Leeuwenhoek, J. Microbiol. Serol., 32, 113—124 (1966).

Chapman G. H. The isolation of streptococci from mixed cultures, J. Bacteriol., 48, 113—114 (1944).

Claus D., Walker N. The decomposition of toluene by soil bacteria, J. Gen. Microbiol., 36, 107—122 (1964).

Davis B. D., Dulbecco R„ Eisen H. N., Ginsberg H. S, Wood W. B., McCarty M. Microbiology, 2nd ed., Harper and Row, Hagerstown, Md., 1973.

Dawes E. A., Senior P. J. The role and regulation of energy reserve polymers in micro-organisms, Adv. Microb. Physiol., 10, 135— 266 (1973).

Dobereiner J., Baldani V. L. D. Selective infection of maize roots

by streptomycin-resistant Azospirillum lipoferum and other bacteria, Can. J. Microbiol., 25, 1264—1269 (1979).

Dobereiner I., Marriel I. E., Nery M. Ecological distribution of Spirillum lipoferum Beijerinck, Can. J. Microbiol., 22, 1464—1473 (1976).

Faust L„ Wolfe R. S. Enrichment and cultivation of Beggiatoa alba, J. Bacteriol., 81, 99—106 (1961).

Finegold S. M„ Martin W. J., Scott E. 0. Bailey and Scott’s diagnostic microbiology, 5th ed., С. V. Mosby Co., St. Louis, 1978.

Freeman B. A. Burrow’s textbook of microbiology, 21st ed., The W. B. Saunders Co., Philadelphia, 1977.

Gerloff G. C., Fitzgerald G. P., Skoog F. The isolation, purification and culture of blue-green algae, Am. J. Bot., 37, 216—218 (1950).

Gibbons N. E, Isolation, growth and requirements of halophilic bacteria, p. 169—183. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (eds.), Methods in microbiology, vol. 3B, Academic Press, Inc., New York, 1969.

Hampp E. G. Isolation and identification of spirochaetes obtained from unexposed canals of pulp-involved teeth, Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol., 10, 1100—1104 (1957).

Hanson A. W. Isolation of spirochaetes from primates and other mammalian species, Br. J. Vener. Dis., 46, 303—306 (1970).

Hanson A. W., Cannefax G. R. Isolation of Borrelia refringens in pure culture from patients with condylomata acuminata, J. Bacteriol., 88, 111—113 (1964).

Haldeman L. V., Cato E. P., Moore W. E. C. (eds.). Anaerobe laboratory manual, 4th ed., Virginia Polytechnic Institute and State University, Blacksburg, 1977.

Hungate R. E. The anaerobic cellulolytic bacteria, Bacteriol. Rev., 14, 1—49 (1950).

Hungate R. E. A roll tube method for cultivation of strict anaerobes, p. 117—132. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (eds.), Methods in microbiology, vol. 3B, Academic Press, Inc., New York, 1969.

Hylemon P. B., Wells J. S., Jr., Bowdre J. H., MacAdoo T. O., Krieg N. R. Designation of Spirillum volutans Ehrenberg 1832 as type species of the genus Spirillum Ehrenberg 1832 and designation of the neotype strain of S. volutans, Int. J. Syst. Bacteriol., 23, 20—27 (1973).

Inoue K. Quantitative ecology of microorganisms of Syowa Station in Antarctica and isolation of psychrophiles, J. Gen. Appl. Microbiol., 22, 153—160 (1976).

Inoue K., Komagata K. Taxonomic study on obligately psychrophi- lic bacteria isolated from Antarctica, J. Gen. Appl. Microbiol., 22, 165—176 (1976).

Iverson W. P. Growth of Desulfovibrio on the surface of agar media, Appl. Microbiol., 14, 529—534 (1966).

Jannasch H. Enrichments of aquatic spirilla in continuous culture, Arch. Mikrobiol., 59, 165—173 (1967).

Jannasch H. Competitive elimination of Enterobacteriaceae from seawater, Appl. Microbiol., 16, 1616—1618 (1968).

Johnstone К. 1. The isolation and cultivation of single organisms, p. 455—471. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (eds.). Methods in microbiology, vol. 1, Academic Press, Inc., New York, 1969.

Joklik IF. G., Willett H. P. Zinsser microbiology, 16th ed., Appleton-Century Crofts, New York, 1976.

Kenny G. E., Mycoplasma, p. 333—337. In: E. H. Lennette, E. H. Spaulding and J. P. Truant (eds.), Manual of clinical microbiology, 2nd ed., American Society for Microbiology, Washington, D. C„ 1974.

Killinger A. H. Listeria monocytogenes, p. 135—139. In: E. H. Lennette, E. H. Spaulding and J. P. Truant (eds.), Manual of clinical microbiology, 2nd ed., American Society for Microbiology, Washington, D. C„ 1974.

Kucera S., Wolfe R. S. A selective enrichment medium for Gal- lionella ferruginea, J. Bacteriol., 74, 344—349 (1957).

Leadbetter E. R., Holt S. C. The fine structure of Bacillus fasti- diosus, J. Gen. Microbiol., 52, 299—307 (1968).

Lederberg J. A simple method for isolating individual microbes, J. Bacteriol., 68, 258—259 (1954).

Leifson E, New selenite enrichment media for the isolation of typhoid and paratyphoid (Salmonella) bacilli, Am. J. Hyg., 24, 423—432 (1936).

Lichstein H. C., Oginsky E. L. Experimental microbial physiology, W. H. Freeman and Co., San Francisco, 1965.

Linn D. M., Krieg N. R. Occurrence of two organisms in the type strain of Spirillum lunatum: rejection of the name Spirillum luna- tum and characterization of Oceanospirillum marts subsp. wil- liamsiae and an unclassified vibrioid bacterium, Int. J. Syst. Bacteriol., 28, 132—138 (1978).

Mabbitt L. A., Zielinska M. The use of a selective medium for the enumeration of lactobacilli in cheddar cheese, J. Appl. Bacteriol., 19, 95—101 (1956).

McCurdy H. J., Jr. A method for the isolation of myxobacteria in pure culture, Can. J. Microbiol., 9, 282—285 (1963).

Matin A., Veldhuis C., Stegeman V., Veenhuis M, Selective advantage of a Spirillum sp. in a carbon-limited environment. Accumulation of poly-|3-hydroxybutyric acid and its role in starvation, J. Gen. Microbiol., 112, 349—355 (1979).

Matin A., Veldkamp H. Physiological basis of the selective advantage of a Spirillum sp. in a carbon-limited environment, J. Gen. Microbiol., 105, 187—197 (1978).

Meiklejohn J. The isolation of Nitrosomonas europaea in pure culture, J. Gen. Microbiol., 4, 185—191 (1950).

Meynell G. G., Meynell E. Theory and practice in experimental bacteriology, Cambridge University Press, London, 1965. [Имеется перевод: Мейнелл Дж., Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология (Теория и практика). — М.: Мир, 1967.]

Morita R. Y. Psychrophilic bacteria, Bacteriol. Rev., 39, 144—167 (1975).

Myrvik Q. N., Pearsall N. N., Weiser R. S. Fundamentals of medical bacteriology and mycology, Lea and Febiger, Philadelphia, 1974.

Nunley J. IV., Krieg N. R. Isolation of Gallionella ferruginea by use of formalin, Can. J. Microbiol., 14, 385—389 (1968).

Peterson I. E. Isolation, cultivation and maintenance of the myxo- bacteria, p. 185—210. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (eds.), Methods in microbiology, vol. 3B, Academic Press, Inc., New York, 1969.

Pfennig N., Biebl H. Desutfuromonas acetoxidans gen. nov .and sp. nov., a new anaerobic, sulfur-reducing, scetate-oxidizing bacterium, Arch. Microbiol., 110, 3—12 (1976).

Poindexter J. S. Biological properties and classification of the Caulobacter group, Bacteriol. Rev., 28, 231—295 (1964).

Pramer D. A., Schmidt E. L. Experimental soil microbiology, Burgess Publishing Co., Minneapolis, 1964.

Rippka R., Deruelles J., Waterbury J. B., Herdman M., Stonier R. Y. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria, J. Gen. Microbiol., Ill, 1—61 (1979).

Rittenberg В. T., Rittenberg S. C. The growth of Spirillum volu- tans in mixed and pure cultures, Arch. Mikrobiol., 42, 138—153 (1962).

Roseburg T. Microorganisms indigenous to man, McGraw-Hill Book Co., New York, 1962.

Roseburg T., Foleg G. Isolation and pure cultivation of the smaller mouth spirochaetes by an improved method, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 47, 368—374 (1942).

Roseburg T., McDonald J. B., Ellison S. A., Engel S. G. Media and methods for separation and cultivation of oral spirochaetes, Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol., 4, 68—85 (1951).

Scotten H. L., Stokes J. L. Isolation and properties of Beggiatoa, Arch. Mikrobiol., 42, 353—368 (1962).

Sehgal S. N., Gibbons N. E. Effect of some metal ions on the growth of Halobacterium cutrirubrum, Can. J. Microbiol., 6, 165— 169 (1960).

Singh B. Myxobacteria in soils and composts: their distribution, number and lytic action on bacteria, J. Gen. Microbiol., 1, 1—10 (1947).

Slack J. M., Snyder I. S. Bacteria and human disease. Year Book Medical Publishers, Chicago, 1978.

Smibert R. M. Vibrio fetus var. intestinalis isolated from fecal and intestinal contents of clinically normal sheep: isolation of microaerophilic vibrios, Am. J. Vet. Res., 26, 315—319 (1965).

Smibert R. M, Vibrio fetus var. intestinalis isolated from the intestinal contents of birds, Am. J. Vet. Res., 30, 1437—1442 (1969).

Smibert R. M., Claterbaugh R. L., Jr. A chemically-defined medium for Treponema strain PR-7 isolated from the intestine of a pig with swine dysentery, Can. J. Microbiol., 18, 1073—1078 (1972).

Smith L. D„ Dowell V. R. Clostridium, p. 376—380. In: E. H. Len- nette, E. H. Spaulding and J. P. Truant (eds.), Manual of clinical microbiology, 2nd ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1974.

Stanier R. Y. The Cytophaga group: a contribution to the biology of myxobacteria, Bacteriol. Rev., 6, 143—196 (1942).

Startler R. Y„ Kunisawa R., Mandel M., Cohen-Bazire G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococ- cales), Bacteriol. Rev., 35, 171—205 (1971).

Stanler R. Y., Palleroni N. L, Doudoroff M. The aerobic pseudomonads: a taxonomic study, J. Gen. Microbiol., 43, 159—271 (1966).

Stolp H., Starr M. P. Bdellovibrio bacteriovorus gen. et sp. n., a predatory, ectoparasitic and bacteriolytic microorganism. Antonie van Leeuwenhoek, J. Microbiol. Serol., 29, 217—248 (1963).

Van Kiel С. B. Techniques for the enrichment, isolation and maintenance of the photosynthetic bacteria, Methods Enzymol., 23, 3—28 (1971).

Veldkamp H. A study of two marine agardecomposing, facultatively anaerobic myxobacteria, J. Gen. Microbiol., 26, 331—342 (1961).

Vishniac W., Santer M. The thiobacilli, Bacteriol. Rev., 21, 195—■ 213 (1957).

Warke G. M., Dhala S. A. Use of inhibitors for selective isolation and enumeration of Cytophagas from natural substrates, J. Gen. Microbiol., 51, 43—48 (1968).

Waterbury J. B., Stanler R. Y. Patterns of growth and development in pleurocapsalean cyanobacteria, Microbiol. Rev., 42, 2—44 (1978).

Widdel F., Pfennig N. A new naerobic, sporing, acetate-oxidizing sulfate-reducing bacterium, Desulfotomaculum (emend.) acetoxi- dans. Arch. Microbiol., 112, 119—122 (1977).

Wiley W. R., Stokes J. L. Requirement of an alkaline pH and ammonia for substrate oxidation by Bacillus pasteurii, J. Bacteriol., 84, 730—734 (1962).

Williams M. A., Rittenberg S. C. A taxonomic study of the genus Spirillum Ehrenberg, Int. Bull. Bacteriol. Nomenci. Taxon., 7, 49— 111 (1957).

Wilson G. S„ Miles A. A. Topley and Wilson’s principles of bacteriology and immunity, 5th ed., The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1964.

Глава 9

ТВЕРДАЯ КУЛЬТУРАН. Криг, Ф. Герхардт

Среды в твердом состоянии в форме плотных гелей используются в бактериологии с времен Роберта Коха. Наиболее важным преимуществом использования твердых сред является то, что на них можно выращивать микроорганизмы в виде колоний, образующихся из отдельных клеток популяции. Поэтому посев штрихом представляет собой простой и эффективный метод выделения чистых культур бактерий (разд. 8.4.1). Методы посева нанесением жидкой культуры на поверхность твердой среды, глубинного посева и послойного посева также пригодны для подсчета жизнеспособных бактерий (разд. 11.2). Другими методами, основанными на использовании твердых сред, являются посев с помощью бархатных репликаторов (разд. 13.6.2 и 20.2.5), а также ауксанографический метод (разд. 20.2.6).

В этой главе мы достаточно подробно рассмотрим основные отвердители, используемые для получения твердых сред, и их применение в бактериологии, поскольку эти вещества в других разделах данного руководства не рассматриваются. Общие подходы к существу данного вопроса отражены в обзоре Коднера [6].

ОТВЕРДИТЕЛИ

Агар

Агар получают путем экстракции из некоторых видов красных морских водорослей; это самый распространенный из отвердителей бактериологических сред. Он состоит из двух полисахаридов — агарозы и агаропектина, причем первый из них составляет около 70% всей смеси. После первой экстракции агар бывает загрязнен остатками водорослей и другими примесями. Чтобы агар был пригодным для бактериологических целей, большинство

этих примесей необходимо удалить. Опубликован обзор методов экстрагирования и очистки агара в производственных масштабах [4]. Подробные сведения о химическом составе и структуре агара можно найти в работах [4, 17].

Для бактериологических исследований наиболее важны следующие свойства агара: он не разрушается ферментами большинства видов бактерий, агаровые гели устойчивы к температурам до 65 °C или выше, расплавленный агар не превращается в гель, пока не охладится почти до 40 °C, и, наконец, агаровые гели имеют высокую степень прозрачности.

В продаже имеются различные сорта агара, причем в большинстве случаев наиболее пригодным является «бактериологический» агар. «Специальный» и «очищенный» сорта агара с пониженным уровнем примесей в основном используются для электрофореза и серологических исследований, но иногда их применяют также при изучении потребностей микроорганизмов в питании. Для очистки бактериологического сорта агара от примесей существует следующая лабораторная процедура [12]. Гранулированный агар замачивают в 10 объемах дистиллированной воды на несколько часов и затем фильтруют; эту операцию повторяют 10 раз в течение 2 дней. Полученный агар погружают в равный объем 95%-ного этанола, оставляют на 12 ч при комнатной температуре и фильтруют. Затем вновь погружают агар на 4 ч в свежий раствор этанола и фильтруют еще раз. Добавляют агар к кипящему 95%-ному этанолу, доводят до кипения и фильтруют. Отмытый агар сушат при комнатной температуре.

Для приготовления твердой агаровой среды вначале доводят pH основной жидкой среды до желаемой величины и затем добавляют гранулированный агар. Бактериологический агар или агар более высоких сортов незначительно изменяет pH среды. Для получения твердой среды используют 15—20 г агара на 1 л, а полужидкой— 1,5—4 г/л в зависимости от требуемой концентрации. Для получения среды определенной степени твердости требуются разные концентрации различных марок и сортов агара, поэтому необходимо всегда руководствоваться инструкциями фирмы-изготовителя.

После добавления агара к основной жидкой среде смесь нагревают до кипения, чтобы полностью растворить агар. Если нагрев производится над пламенем или на горячей плите, среду постоянно мешают в течение нагревания, чтобы не допускать осаждения агара на дно, где он может карамелизоваться и обуглиться. Дают среде покипеть приблизительно 1 мин; при этом следят, чтобы агар не вспенивался и не выплескивался через край. Агар можно также растворить на пару или в микроволновой печи в течение определенного времени. После того как агар растворится, его размешивают для получения равномерной концентрации во всей среде. Расплавленную среду разливают в пробирки, колбы или бутыли и стерилизуют в автоклаве.

Примечание. Если требуется агаровая среда со значением pH 6,0 или ниже, сначала готовят и стерилизуют среду с величиной pH выше этого значения, иначе агар в процессе нагревания будет гидролизоваться и потеряет способность затвердевать при последующем охлаждении среды. Сразу же после стерилизации среды и охлаждения ее до 45—50 °C к ней добавляют с соблюдением правил асептики достаточное для получения необходимого значения pH количество стерильной кислоты. Для того чтобы экспериментально определить точное количество кислоты, которое необходимо добавить к основному раствору, полезно приготовить дополнительную порцию среды.

Если требуются пробирки со скошенной средой, то сразу же после автоклавирования их ставят в наклонное положение и дают среде остыть и затвердеть. При приготовлении среды в чашках Петри вначале расплавленную среду охлаждают до 45—50 °C в водяной бане в течение 10 мин, а затем с соблюдением правил асептики разливают в стерильные чашки (обычно 15—20 мл на чашку). Чашки с агаром накрывают сразу не стеклянными крышками (на них конденсируется влага), а бумагой или другим изолирующим материалом. После затвердения агара на его поверхности могут образоваться капли влаги. Перед инокуляцией дают возможность этой влаге испариться. Хранение чашек в перевернутом положении при комнатной температуре обычно обеспечивает достаточное высыхание агара. Чтобы ускорить ис-

парение влаги, перевернутые чашки помещают на полку воздушного термостата при температуре 45 °C, где устанавливают их в наклонном положении. Инкубируют чашки в таком положении до тех пор, пока не исчезнут капли воды. Для некоторых методов посева, таких, как методы с использованием бархатных репликаторов, необходимы чашки с агаром, высушенным более основательно.

Для предохранения чашек с агаром от чрезмерного высыхания их помещают в закрытые полиэтиленовые мешки (для этой цели пригодны мешки, в которые обычно запаковывают пластмассовые чашки Петри). Чашки со средой хранят в таких условиях при комнатной температуре в течение 4—5 нед.

Все жидкие и твердые среды следует хранить в темной комнате или шкафу. Хранение чашек со средами на свету, особенно солнечном, например возле окна, может привести к фотохимическому образованию перекиси водорода или других токсичных форм соединений кислорода, что способствует иногда ингибированию роста бактерий [16, 20]. Особенно чувствительными в этом отношении оказались микроаэрофилы [3, 10].

Каррагенан

Каррагенан, давно используемый в пищевой и молочной промышленности, только в последнее время стал употребляться как отвердитель для биологических сред. Он известен также под названием «ирландский мох» или «растительная желатина»; его добывают путем экстракции из определенных видов красных морских водорослей. Существует несколько типов каррагена- на: каппа, лямбда, мю и йота [17]. Калиевые соли кар- рагенана типа каппа способны образовывать плотные прозрачные гели, которые могут быть эффективными заменителями агара во многих бактериологических средах [И, 21].

Каррагенан значительно дешевле агара. Подобно агаровым гелям, гели каррагенана можно использовать при посеве штрихом или разливом жидкой культуры. Каррагенан не разрушается большинством видов бактерий. Из него можно готовить гели, устойчивые к тем-

Часть и. рост

пературам до 60 °C. Однако каррагенан имеет некоторые недостатки. Высокая температура, при которой следует разливать жидкую среду с каррагенаном по чашкам Петри (от 55 до 60°C), может препятствовать его использованию для выращивания бактерий, когда разведения суспензии клеток вносят в расплавленную среду перед ее затвердением.

Разные каррагенаны заметно отличаются друг от друга [21]. Некоторые исследователи обнаружили, что каррагенан не пригоден для полужидких сред, в то время как другие считают, что его можно использовать для этой цели [И]. В отличие от агара каррагенан может вызывать изменения pH некоторых сред в процессе их приготовления и стерилизации. Поэтому для каждой среды следует определять, меняется ли и в какой степени значение ее pH при добавлении каррагенана. Для предупреждения таких изменений следует готовить среды с разными исходными значениями pH или увеличивать их буферную емкость. Особенно сильно снижается pH при добавлении каррагенана к средам, содержащим фосфатный буфер [11].

Среды с каррагенаном готовят так же, как и среды с агаром. Каррагенан, классифицируемый при продаже как тип I (Sigma Chemical Со., St. Louis, Мо.) и содержащий в основном мох типа каппа и в меньшей степени типа лямбда, оказался пригодным почти для всех целей. Для гелей, устойчивых при 45 °C, добавляют 2% каррагенана; а для гелей, устойчивых при 60 °C — 2,4% [11]. После добавления каррагенана к основной жидкой среде ее кипятят, чтобы полностью растворить его, а затем стерилизуют автоклавированием. Стерильную среду охлаждают до 55—60 °C, разливают в чашки Петри и дают застыть. Поскольку среду с каррагенаном разливать с помощью пипетки довольно трудно, ее следует разливать непосредственно из бутылей и колб. Конденсирующуюся на геле воду удаляют таким же путем, как в случае применения агара.

Силикагель

Отвердение сред с помощью минерального вещества силикагеля применяют для получения культур автотроф-

ных бактерий, так как при этом в среде отсутствуют органические вещества. Кроме того, при добавлении в такие минеральные среды различных органических веществ можно исследовать способность гетеротрофных бактерий использовать их в качестве единственных источников углерода. С помощью силикагелевых сред можно также определять потребность бактерий в витаминах.

Для приготовления силикагелевых сред существует много различных методов [4]. Метод Функа и Кралвича [7] прост, надежен и обеспечивает получение прозрачных и достаточно прочных гелей, на которые без затруднений можно высевать бактерии штрихом инокуляционной иглой или размыванием инокулята с помощью стеклянного шпателя. При их использовании готовят следующие растворы.

Жидкая питательная среда двойной концентрации. Ее готовят, как обычно, и стерилизуют автоклавированием.

Раствор силиката калия. К 100 мл 7%-ного (вес/ /объем) КОН добавляют 10 г порошкообразного силикагеля (N 923, 100—200 меш, Fisher Scientific Со., Pittsburg, Ра.) или кремневой кислоты (reagent grade, J. Т. Baker Chemical Co., Phillipsburg, N.J.) и смесь нагревают до растворения ингредиентов. Разливают в колбы порции по 20 мл и стерилизуют их в автоклаве.

Раствор фосфорной кислоты. Готовят 20%-ный раствор о-фосфорной кислоты из 85%-ной кислоты (certified grade; Fisher Scientific Co.).

20 мл стерильной среды двойной концентрации добавляют к 20 мл стерильного раствора силиката калия. В этот раствор быстро вносят известное количество фосфорной кислоты, достаточное для доведения pH до 7,0 (согласно предварительным экспериментам, около 4 мл). Растворы перемешивают и немедленно разливают в две чашки Петри. Среда начинает затвердевать через 1 мин и становится твердой через 15 мин. Чтобы испарилась конденсированная вода, чашки ставят на некоторое время в термостат. После инокуляции среды для предупреждения высыхания и растрескивания геля чашки инкубируют во влажной атмосфере.

МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯНА ТВЕРДЫХ СРЕДАХ

Массовая культура на твердой поверхности

Выращиванием колоний на твердой поверхности получают максимальную плотность бактериальных клеток, поскольку в данном случае жидкость находится только в промежуточном (межклеточном) пространстве и составляет от 20 до 30% общего объема (27% от плотно упакованных сфер, независимо от их размера). Если инокулят сильно разбавлен, каждая клетка в результате деления дает начало отдельной колонии. Это может быть полезным для массовой культуры, если отбор колонии ведут по какому-то одному признаку (например, если необходимо вырастить вариант, который образует только «гладкие» колонии). Чаще инокулят бывает не разбавлен, и его равномерно разливают по всей поверхности среды: в этом случае бактерии растут в виде сплошного газона. Твердую поверхность обычно получают после добавления в среду агара или другого отвердителя. Известно также несколько методов, при которых колонии растут на мембране, помещенной на поверхности жидкой среды в сосуде [14].

Массовая культура бактерий на твердой среде имеет ряд преимуществ по сравнению с культурой в жидкой среде (гл. 10).

В случае культур, выращенных на твердой среде, нет необходимости использовать центрифугу или другие средства для сбора клеток, поскольку в этих культурах клетки находятся уже в сконцентрированном состоянии. Вместо этого на поверхность агара пипеткой наливают небольшое количество стерильного солевого раствора или буфера и суспендируют в нем выросшие колонии с помощью стерильного стеклянного шпателя. Таким способом можно получить большое количество клеток с поверхности агаровых сред в чашках Петри, в больших плоских культуральных матрасах (бутылях типа PY) и в больших плоских чашках (покрытых крышками из пирекса). Особенно следует избегать центрифугирования при получении большого количества патогенных или

других вредных бактерий, поскольку при этом образуются аэрозоли.

Твердые культуры относительно свободны от макромолекулярных компонентов и полностью свободны от частиц питательной среды, так как последние обычно находятся внутри агарового геля. Более того, твердые культуры относительно свободны от низкомолекулярных питательных веществ и продуктов метаболизма микроорганизмов, поскольку для их растворения необходимы значительно большие объемы среды. Следовательно, культуры, выращенные на твердой среде, особенно полезны для приготовления антигенов или для других целей, когда важна чистота клеточной суспензии.

На твердых культурах можно получать результаты, которые невозможно достичь другим путем. Например, плодовые тела миксобактерий и эндоспоры определенных видов Bacillus образуются только при росте культур на твердой среде. Это объясняется тем, что лишь здесь бактерии сохраняют между собой физические связи, а также тем, что в данном случае обеспечивается максимальное снабжение кислородом из атмосферы и вымывание продуктов метаболизма (например, кислот) из клеточного окружения. Если этого не происходит, рост культуры подавляется.

Вместе с тем выращивание бактерий на твердых средах по сравнению с культивированием в жидкой среде имеет определенные недостатки.

Твердая культура имеет ограничения при выращивании больших количеств биомассы. Она дает возможность легко получать граммы клеток; десятки граммов выращивать уже затруднительно, а сотни граммов или килограммы клеток на твердой среде в лаборатории вырастить невозможно.

Твердые культуры не обеспечивают однородность популяции клеток в физиологическом отношении. Например, клетки в верхней части твердой аэробной среды (слой глубиной до 1000 клеток) могут находиться в условиях низкого содержания питательных веществ, но высокого содержания кислорода, в то время как в нижних слоях среды условия могут быть противоположными.

Твердые культуры характеризуются небольшим числом клеток в пересчете на данное количество среды.

Двухфазная массовая культура

Преимущества культуры, выращиваемой на твердой среде, сохраняются, а недостатки устраняются при использовании методов выращивания так называемой жид- кой/твердой культуры, или двухфазной. Она по существу представляет собой форму диализной или диффузионной культуры, где вместо обычной мембраны имеется поверхность раздела фаз, которая как диффузионный барьер отделяет культуру от резервуара с питательной средой и продуктами обмена. Основные положения и история развития двухфазной диализной культуры как частного случая мембранной диализной культуры даны в обзоре Шульца и Герхардта [14], а методы культивирования с диализом описаны в следующей главе (разд. 10.3.4). Двухфазная система для концентрированной бактериальной культуры систематически изучалась Тиррелом и др. [19].

Двухфазная система в принципе состоит из толстого слоя затвердевшей питательной среды, покрытого тонким слоем питательного бульона (рис. 9.1). Чтобы приготовить такую систему, частично заполняют сосуд горячей средой, содержащей 2—3% агара. После затвердения агарового слоя на него наливают с соблюдением правил асептики небольшое количество питательной среды, засевают ее и инкубируют. Для выращивания аэробов культуральный сосуд помещают на качалку, что обеспечивает хорошее снабжение кислородом и перемешивание среды во время инкубации. Культура развивается в жидкой части среды, но постепенно клетки диффундируют в твердую питательную среду и значительно концентрируются. Таким способом можно получить популяции с плотностью более 10” клеток/мл, причем данный метод пригоден для выращивания бактерий любого типа.

Подходящим сосудом для такого способа культивирования бактерий является колба Эрленмейера; имеющиеся у ее основания выступы удерживают агар при встряхивании колбы на качалке. Для этих же целей пригодны прямоугольные сосуды. Если во время инкубации на качалке агар раскалывается, то следует использовать среду с более высоким содержанием отвер-

Рис, 9.1. Двухфазная система для концентрированной культуры. 1 — пробка из ваты и марли, обеспечивающая достаточный доступ воздуха (разд. 11.1.2); 2— жидкий верхний слой среды (бульона) или водного диффузата; 3 — твердый слой агаровой среды; 4 — выемки у дна колбы, удерживающие агаровую основу и предохраняющие колбу от разбивания при встряхивании на качалке.

Рис. 9.2. Двухфазная система для культуры из крови на твердых и жидких средах 1— пробка, через которую вводится проба крови; 2— воздух с 10%-ным содержанием углекислого газа; 3— твердая агаровая среда; 4 — жидкая среда.

дителя. Поскольку перемещение питательных веществ зависит от диффузии, глубина агарового слоя должна быть не более 5 см. Отношение твердой фазы к жидкой должно быть не менее 4:1 и не более 10: 1 в зависимости от того, что наиболее важно — выход биомассы или концентрация клеток.

Если все компоненты среды присутствуют в агаровом слое, то на него можно нанести слой дистиллированной воды и после уравновешивания в течение ночи инокулировать бактериями. В таком верхнем слое можно вырастить относительно чистую и плотную популяцию не-

которых бактерий, например гонококков, которые обычно культивируют в мутной среде, обогащенной кровью и крахмалом, и для которых характерно образование неплотных популяций [8].

Другим примером двухфазной культуральной системы является система, созданная Кастанедой [5] для выделения Brucella из крови (рис. 9.2). Правда, принцип диализа используется в этой системе весьма ограниченно. Для приготовления системы сначала стерилизуют 3%-ную агаровую среду в прямоугольной бутыли с ватной пробкой, а затем бутыль кладут на бок, чтобы расплавленная среда образовала твердый слой на ее боковой стенке. После этого бутыль ставят в вертикальное положение, добавляют с соблюдением правил асептики стерильную жидкую среду и закрывают бутыль резиновой пробкой с мембраной. Для некоторых бактерий, таких, как Brucella abortus, иногда необходимо заменить обычный воздух в бутыли на воздух, содержащий 10% двуокиси углерода. Пробу крови вводят шприцем через резиновую пробку и инкубируют бутыль в вертикальном положении. Через каждые 2 дня наклоняют бутыль так, чтобы жидкая среда смочила всю поверхность агара, а затем вновь ставят ее вертикально, чтобы среда стекала к дну бутыли. При этом бактерии, находящиеся в жидкой среде, инокулируют поверхность агара и образуют видимые колонии. Описанный метод имеет ряд преимуществ перед выращиванием бактерий в жидкой среде. Во-первых, нет необходимости многократно открывать бутыль, чтобы получать пробы для микроскопирования или для субкультивирования при определении интенсивности роста. Это уменьшает возможность лабораторного заражения такими высоковирулентными бактериями, как Brucella, а также снижает возможность загрязнения самой культуры. Во-вторых, организмы, плохо растущие в жидкой среде, могут лучше расти на поверхности агара. И в-третьих, рост бактерий в присутствии окрашивающих и придающих мутность веществ, который трудно наблюдать в жидкой среде, легко обнаружить по развитию колоний на поверхности агара. Последние исследования Холла и др. [9] показали пригодность такой культуральной системы для обнаружения роста многих патогенных бактерий.

Биоавтография

Биоавтография является вариантом бумажной хроматографии, когда рост бактерий используется как высокочувствительный индикатор для выявления положения определенных веществ на хроматограмме. Метод имеет преимущества специфического определения веществ с биологической активностью, чего лишены химическая и радиоизотопная системы их обнаружения. Он применим при определении положения на хроматограммах факторов роста из супернатантов культур или клеточных экстрактов, когда концентрация этих факторов настолько низка, что их нельзя обнаружить другими обычными методами. Например, с помощью биоавтографии можно определить на хроматограмме 5—10 нг фолиевой кислоты. Примеры использования биоавтографии для определения факторов роста в клеточных экстрактах приведены в работе [15]. Биоавтографию широко используют также в фармацевтической промышленности для обнаружения антибиотиков на бумажных хроматограммах [22].

Для определения факторов роста готовят агаровую среду, содержащую все питательные компоненты, необходимые для обеспечения роста определенного штамма, кроме того фактора, который хотят определить. Стерильную расплавленную среду инокулируют при 45— 50 °C отмытой суспензией определенного штамма бактерий. Наливают эту питательную агаровую среду в стерильную чашку, достаточно большую для помещения в нее бумажной хроматограммы (чашку можно прикрыть крышкой из пирекса). После затвердения среды на поверхность агара помещают высушенную бумажную хроматограмму лицевой стороной вниз. При этом обращают внимание на то, чтобы между агаром и бумагой не оставалось воздушного пространства. После инкубации хроматограмму вынимают и находят на агаре зоны наиболее сильного роста бактерий, которые соответствуют местоположениям фактора роста. Внесение слоя воды на поверхность агара часто помогает сделать эти области лучше видимыми.

Для успешного проведения биоавтографии выращивание бактерий, используемых в качестве инокулята, обычно проводят в жидкой среде, содержащей мини-

мальную концентрацию определяемого фактора роста. Таким путем удается избежать избыточного накопления его в клетках бактерий, которое может приводить к неспецифическому росту бактерий на питательной агаровой среде. Для достижения максимальной чувствительности рассматриваемого метода определения факторов роста следует использовать высокую концентрацию клеток, высеваемых на агар, чтобы в местах расположения исследуемого фактора на хроматограмме появились хорошо видимые области скопления выросших бактерий. Наиболее подходящую концентрацию инокулята определяют в предварительных экспериментах. Контаминирующие бактерии, которые могут присутствовать на бумажной хроматограмме, обычно не мешают определению, поскольку они растут в виде отдельных колоний и их трудно спутать с более плотным диффузным ростом в агаре индикаторных микроорганизмов. Тем не менее количество контаминирующих бактерий следует свести к минимуму. Поэтому высушенные хроматограммы хранят в стерильных конвертах вплоть до использования, а накладывают хроматограммы на питательный агар в помещении, где нет воздушных потоков, переносящих пыль.

При биоавтографии антибиотиков агаровая среда должна содержать полный набор питательных субстратов. Это дает возможность микроорганизму расти по всей поверхности среды кроме тех зон, где на хроматограмме находятся антибиотики. Из-за высокой активности некоторых антибиотиков иногда полезно помещать бумажную хроматограмму на поверхность агара только на короткое время (около 10 мин), а затем снимать ее перед инкубацией чашки. Если надолго оставить хроматограмму на поверхности агара, то зоны ингибирования роста бактерий могут быть слишком большими, и тогда их трудно отчетливо различать.

МЕТОДЫ ВЫРАЩИВАНИЯ БАКТЕРИИНА ПОЛУЖИДКИХ СРЕДАХ

Полужидкая среда содержит гелеобразующее вещество в низкой концентрации и имеет мягкую желеподоб- ную консистенцию. Такая среда пригодна для культиви-

рования микроаэрофильных бактерий, а также для изучения подвижности клеток и хемотаксиса.

Микроаэрофилы

Микроаэрофильным бактериям присуще аэробное дыхание, т. е. в качестве конечного акцептора электронов они используют кислород. Но они не растут в атмосфере с таким содержанием кислорода, как в воздухе (21%). Например, Campylobacter fetus лучше всего растет в атмосфере, содержащей 6% кислорода. Некоторые азотфиксирующие бактерии могут расти в аэробных условиях при наличии соединений азота (например, сульфата аммония), но в безазотистых средах ведут себя как микроаэрофилы. Например, Azospirillum в условиях фиксации N2 лучше всего растет в атмосфере, содержащей 1 % кислорода. Это происходит из-за инактивации избытком кислорода нитрогеназного комплекса, катализирующего процесс азотфиксации.

При условии низкого содержания кислорода микроаэрофилы можно выращивать и в жидких, и на твердых средах, но в этом условии нет необходимости при использовании полужидкой среды с 0,1—0,4% агара. Гелеобразующие вещества расслаивают среду таким образом, что конвекционные потоки не способны смешивать богатые кислородом верхние слои среды с нижними. Единственным путем для проникновения кислорода в более глубокие слои пробирки с полужидкой средой является диффузия. Таким образом, в пробирках с полужидкой средой создается градиент кислорода, где поверхность среды является местом наиболее высокого содержания кислорода. При инокуляции среды путем укола петлей микроаэрофилы начинают расти несколько ниже поверхности, где концентрация кислорода для них наиболее благоприятна. Рост начинается в форме тонких дисков, которые заметны на расстоянии нескольких миллиметров или сантиметров от поверхности. По мере роста диски становятся более плотными и перемещаются ближе к поверхности. В конце концов клетки образуют очень плотный диффузный слой непосредственно под поверхностью среды. Анаэробы, напротив, начинают расти в нижней части полужидкой среды, но впоследст-

вии могут также расти по всей среде, если создаются анаэробные условия.

Микроаэрофил Campylobacter fetus легко культивировать в пробирках с полужидкой средой для бруцелл (бульон для бруцелл, содержащий 0,15—0,3% агара; разд. 8.5.14). Азотфиксирующие клетки Azospirillum хорошо растут в полужидкой среде с малатом, дефицитной по азоту (разд. 8.5.37 или 20.3.4). В литровых бутылях PY, содержащих слой полужидкой среды, можно получать большие биомассы этой бактерии для физиологических исследований [13].

Если пробирки с полужидкой средой хранятся долгое время, кислород может диффундировать в глубь среды. Градиент кислорода удается восстановить после того, как такие пробирки помещают на несколько минут в кипящую водяную баню, а затем дают возможность пробиркам остыть, а среде затвердеть.

Определение подвижности бактерий

Полужидкие среды можно также использовать для определения подвижности бактерий. Для этого пробирку со средой для определения подвижности (бульон, содержащий 0,4% агара) инокулируют уколом прямой иглой до середины агарового слоя. В процессе роста подвижные бактерии мигрируют от линии инокуляции, образуя диффузную мутную зону в окружающей среде, тогда как неподвижные бактерии растут только по уколу (линии инокуляции).

Этот метод можно модифицировать следующим образом. В полужидкую среду помещают открытую с обоих концов и предварительно простерилизованную стеклянную трубочку (рис. 9.3), в которую вносят инокулят. Подвижные микроорганизмы мигрируют вниз, выходят из нижнего конца трубочки и затем начинают двигаться вверх к поверхности среды, где усиленно растут. Этот метод пригоден также для селекции высокоподвижных организмов, используемых для приготовления Н-антиге- нов при иммунизации.

Хемотаксис

Полужидкую среду используют, кроме того, при изучении хемотаксиса. Например, Адлер [1] использовал

полужидкую среду, содержащую окисляемое соединение углерода как источник энергии, для исследования положительного хемотаксиса Escherichia coli. При внесении большого инокулята в центр чашек Петри со средой клетки Е. coll мигрируют к периферии в форме расходящегося круга и по мере продвижения используют весь окисляемый субстрат. При добавлении к среде двух окисляемых соединений углерода образуются два кольца из клеток, мигрирующих с различными скоростями. В отличие от методов изучения хемотаксиса в капиллярных трубках в данном случае запас кислорода в чашках с агаризо- ванной средой никогда не истощается; поэтому мигрирующие кольца клеток появляются только в ответ на сформированный этими клетками градиент субстрата, а не на самопроизвольный градиент кислорода.

С помощью полужидкой

Рис. 9.3. Полужидкая среда (/), в которую перед автоклавированием помещен кусочек стеклянной трубки (2). Инокулят вносят внутрь стеклянной трубки. Подвижные бактерии мигрируют по трубке вниз к дну пробирки, а затем поднимаются к поверхности среды, где начинают интенсивно расти.Рис. 9.3. Полужидкая среда (/), в которую перед автоклавированием помещен кусочек стеклянной трубки (2). Инокулят вносят внутрь стеклянной трубки. Подвижные бактерии мигрируют по трубке вниз к дну пробирки, а затем поднимаются к поверхности среды, где начинают интенсивно расти.среды можно изучать также отрицательный хемотаксис {18]. В этом случае клетки Е. coli суспендируют в среде в концентрации, достаточной для того, чтобы появилось заметное помутнение. Затем инокулированную среду разливают в чашки Петри. После того как среда приобретает гелеобразную консистенцию, в нее вносят кусочек твердого 2%-ного агара, содержащего предполагаемое репеллентное вещество. Если вещество действительно является репеллентом, то окружающие его бактерии мигрируют в стороны от кусочка агара и оставляют за

Рис. 9.3. Полужидкая среда (/), в которую перед автоклавированием помещен кусочек стеклянной трубки (2). Инокулят вносят внутрь стеклянной трубки. Подвижные бактерии мигрируют по трубке вниз к дну пробирки, а затем поднимаются к поверхности среды, где начинают интенсивно расти.

Рис. 9.3. Полужидкая среда (/), в которую перед автоклавированием помещен кусочек стеклянной трубки (2). Инокулят вносят внутрь стеклянной трубки. Подвижные бактерии мигрируют по трубке вниз к дну пробирки, а затем поднимаются к поверхности среды, где начинают интенсивно расти.

собой прозрачный след, который становится видимым примерно через 30 мин.

Использование полужидкой среды позволяет также осуществлять селекцию мутантов, не способных к хемотаксису [2, 18]. В случае положительного хемотаксиса эти мутанты (а также неподвижные мутанты) не реагируют на сформированный клетками градиент субстрата и остаются в центре чашки Петри, откуда их можно извлечь для субкультивирования и очистки. В случае отрицательного хемотаксиса мутанты, не способные к хемотаксису, можно выделить из прозрачной зоны, окружающей кусочек твердого агара.

ЛИТЕРАТУРА

Adler J. Chemotaxis in bacteria, Science, 153, 708—716 (1966).

Armstrong J. B., Adler J., Dahl M. M. Non-chemotactic mutants of Escherichia coll, J. Bacteriol., 93, 390—398 (1967).

Bowdre J. H., Krieg N. R. Water quality monitoring: bacteria as indicators. Va. Polytech. Inst. State Univ. Water Resour. Cent. Bull., 69, 1974.

Bridson E. Y., Brecker A. Design and formulation of culture media, p. 229—295. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (eds.), Methods in microbiology, vol. ЗА, Academic Press, Inc., New York, 1970.

Castaneda M. R. A practical method for routine blood cultures in brucellosis, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 64, 114—115 (1947).

Codner R. C. Solid and solidified growth media in microbiology, p. 427—454. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (eds.), Methods in microbiology, vol. 1, Academic Press, Inc., New York, 1969.

Funk H. B., Krulwich T. A. Preparation of clear silica gels that can be streaked, J. Bacteriol., 88, 1200—1201 (1964).

Gerhardt P., Heden C. G. Concentrated culture of gonococci in clear liquid medium, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 105, 49—51 (1960).

Hall M. M„ Mueske C. A., ilstrup D. M„ Washington J. A., II. Evaluation of a biphasic medium for blood cultures, J. Clin. Microbiol., 10, 673—676 (1979).

Hoffman P. H., George H. A., Krieg N. R., Smibert R. M. Studies of the microaerophilic nature of Campylobacter fetus subspecies jejuni, II. Role of exogenous superoxide anions and hydrogen peroxide, Can. J. Microbiol., 25, 8—16 (1979).

Lines A. D. Value of the K+ salt of carrageenan as an agar substitute in routine bacteriological media, Appl. Environ, Microbiol., 34, 637—639 (1977).

Meynell G. G., Meynell E. Theory and practice in experimental bacteriology, Cambridge University Press, London, 1965. [Имеется перевод: Мейнел Дж., Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология (Теория и практика). — М.: Мир, 1967.]

Okon У., Albrecht S. L., Burris R. Н. Carbon and ammonia metabolism of Spirillum lipoferum, J. Bacteriol., 128, 592—597 (1976).

Schultz J. S., Gerhardt P. Dialysis culture of microorganisms: design, theory and results. Bacteriol. Rev., 33, 1—47 (1969).

Slrotnak F. M„ Donati G. J., Hutchison D. J. Folic acid derivatives synthesized during growth of Diplococcus pneumoniae, J. Bacteriol., 85, 658—665 (1963).

Sneath P. H. A. Failure of Chromobacterium violaceum to grow on nutrient agar, attributed to hydrogen peroxide, J. Gen. Microbiol., 13, 1 (1955).

Towle G. A., Whistler R. L. Hemicellulose and gums, p. 198—248. In: L. P. Miller (ed.), Phytochemistry, vol. 1, Van Nostrand Reinhold Co., New York, 1973.

Tso W„ Adler J. Negative chemotaxis in Escherichia coll, J. Bacteriol., 118, 560—576 (1974).

Tyrrell E. A., MacDonald R. E„ Gerhardt P. Biphasic system for growing bactteria in concentrated culture, J. Bacteriol., 75, 1—4 (1958).

Waterworth P. M. The action of light on culture media, J. Clin. Pathol., 22, 273—277 (1969).

Watson N., Apiron D. Substitute for agar in solid media for common usages in microbiology, Appl. Environ. Microbiol., 31, 509— 513 (1976).

Weinstein M. J., Wagman G. H. (eds.). Antibiotics: isolation, separation and purification, Elsevier Scientific Publishing Co., New York, 1978.

Глава 10

ЖИДКАЯ КУЛЬТУРА

С. Дрю

Культивирование бактерий представляет собой процесс увеличения концентрации некоторых или всех компонентов популяции. Обычно характеристики этого процесса устанавливаются путем измерений тех или иных его показателей. Чаще всего измеряют увеличение числа клеток или клеточной массы (биомассы). Реже рост оценивают по синтезу макромолекул, когда увеличение количества белка, рибонуклеиновых кислот, липидов или других макромолекул отражает увеличение биомассы и числа клеток (сбалансированный рост). Однако один или несколько из этих показателей могут не зависеть от других (несбалансированный рост). Например, на ранней и поздней стадиях роста периодической культуры увеличение биомассы непропорционально числу клеток. В гл. 11 обсуждаются основные аспекты роста бактерий, методы его измерения и допущения, необходимые при использовании каждого метода.

В этой главе рассматриваются методы культивирования бактерий в жидких средах объемом от 10 мл до 100 л. Они пригодны для выращивания чистых культур бактерий в водной среде с различной степенью контроля за физическими условиями. После небольшой модификации методы можно использовать для смешанного культивирования двух или большего числа видов бактерий. Однако в задачи данной книги не входит обсуждение этого интересного раздела роста бактериальных культур.

Измерения роста микроорганизмов осложняются тем, что бактериальные культуры в значительной степени ге- терогенны. Поэтому получаемые при измерении средние величины отражают скорее рост всей популяции, чем индивидуальных клеток. Хотя все члены каждой популяции могут быть генетически идентичными, нередко они различаются по таким параметрам, как время удвоения клеток, их возраст, состав, метаболические характеристи-

ки и размер. Размах этих колебаний зависит от среды; его можно свести к минимуму путем тщательного подбора условий культивирования. Большинство описываемых здесь систем культивирования построено именно так, чтобы максимально уменьшить гетерогенностць популяции чистой культуры.

В таких системах рост популяции бактерий описывается простым соотношением

-^=^,(10.1)

где dx — прирост биомассы за интервал времени dt, х — концентрация биомассы и ц — удельная скорость роста, представляющая собой скорость роста в пересчете на единицу количества биомассы и имеющая размерность обратного времени (1/0-

Если величина ц постоянная, то, проинтегрировав уравнение (10.1), можно видеть, что величина х увеличивается со временем:

1п^ = ^,(10.2)

где In — натуральный логарифм (логарифм с основанием е = 2,303), а х0 — концентрация биомассы при /=0.

После преобразования уравнения (10.2) получаем выражение для конечной концентрации биомассы:

х=х^*.(10.3)

Рост бактерий, подчиняющийся этому соотношению, называют логарифмическим или экспоненциальным.

Соотношение между временем удвоения биомассы (/</) и удельной скоростью роста можно рассчитать, допустив, что в уравнении (10.2) х = 2хо и t=ta. Отсюда

/d= —(10.4)

Уравнения (10.1) — (10.4) описывают рост бактерий в простых системах, где факторы, влияющие на него, постоянны. Но эти уравнения нельзя использовать в случае отклонения от постоянных (равновесных) условий роста. Рассматриваемые ниже методы непрерывного

(проточного) культивирования теоретически предназначены для поддержания равновесных условий роста бактерий бесконечно долго, тогда как при периодическом культивировании в процессе роста культуры происходят значительные изменения условий среды. Для периодического культивирования уравнения (10.1) — (Ю.4) применимы без пересчета величины ц только в той части кривой роста, где изменения условий не влияют на рост популяции, т. е. во время экспоненциальной фазы роста.

ПЕРИОДИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ

Периодической называют систему, в которой после инокуляции клетками среды соответствующего состава не происходит ни добавления, ни удаления каких-либо компонентов, кроме газовой фазы (закрытая система). Отсюда следует, что периодическая система может поддерживать размножение клеток только в течение ограниченного времени, на протяжении которого меняется состав исходной среды и окружающие условия.

Типичная кривая роста

На рис. 10.1 представлена типичная кривая роста простой гомогенной периодической культуры бактерий. Рост проходит через лаг-фазу, в течение которой число клеток не увеличивается. Затем начинается фаза роста, которая обычно характеризуется экспоненциальным увеличением количества клеток и подчиняется уравнениям (10.1) — (10.4). В конечном счете изменения химического и физического состава среды приводят к переходу культуры в стационарную фазу, в которой увеличения количества клеток не происходит, но клетки еще нуждаются в источниках энергии для поддержания своей жизнедеятельности. Поскольку в периодической культуре питательные вещества ограниченны, наступает фаза отмирания (автолиза), которая часто характеризуется экспоненциальным уменьшением количества жизнеспособных клеток.

Лаг-фазу можно вызвать путем быстрого изменения состава среды культивирования. В свежей среде длительность лаг-фазы зависит от количества и возраста

Рис. 10.1. Идеализированная нормальная кривая роста популяции бактерий в периодической системе культивирования.

посевного материала, а также от изменений состава и концентрации питательных компонентов при внесении инокулята. Внесение небольшого инокулята в большой объем свежей среды может привести к диффузии из клеток витаминов, кофакторов и ионов, которые необходимы для поддержания активности многих внутриклеточных ферментов. Если клетки инокулируют из богатой среды в минимальную, то продолжительность лаг-фазы очень сильно зависит от объема инокулята, поскольку он содержит микроэлементы, попадающие при инокуляции в ростовую среду.

Длительность лаг-фазы зависит и от возраста инокулята. Это связано с тем, что в клетках накапливаются токсичные вещества, но в них недостаточно питательных веществ, необходимых для первоначального роста. Таким образом, наблюдается как положительный, так и отрицательный эффект возраста инокулята на продолжительность лаг-фазы в свежей среде. Как правило, при переносе клеток из бедной среды в богатую с увеличением возраста инокулята лаг-фаза удлиняется. На кривой зависимости продолжительности лаг-фазы от возраста инокулята при пересеве культуры с богатой среды на более бедную можно обнаружить определенный «мини-

мальный» участок, отражающий обмен между питательными веществами и внутриклеточными токсичными соединениями.

Наконец, изменения состава питательных компонентов, а также их концентраций при переносе инокулята на свежую среду могут действовать как триггер при регуляции активности ферментов и морфологической дифференцировке клеток, например при прорастании спор. Если клетки переносят с бедной среды на богатую, то питательные компоненты и время расходуются на повышение активности ферментов, необходимых для осуществления метаболизма в целом. Если же клетки переносят с богатой среды на среду с более низким уровнем питательных веществ, то они способны немедленно, хотя и с низкой скоростью, вступить в экспоненциальную фазу роста.

Возможность постоянного экспоненциального роста в периодической культуре, хотя и в течение ограниченного времени, свидетельствует о том, что его скорость фактически не зависит от изменений концентрации субстратов в довольно широких пределах. В этом случае можно говорить о сбалансированном росте культуры (см. выше), который описывается только величиной ц. Со временем рост культуры начинает отклоняться от экспоненциального, и его уже нельзя описывать только с помощью одной величины ц, даже если можно рассчитать эту величину для случая лимитирования субстратом [уравнение (10.5)]. Моно [44] следующим образом описал соотношение между концентрацией субстрата и ростом бактерий в простой системе, находящейся в экспоненциальной фазе:

<10-5) (as + j

где ц— удельная скорость роста, цтах— максимальное значение ц, полученное при S^>Ks, Ks — константа насыщения, эквивалентная константе Михаэлиса — Ментен, a S — концентрация субстрата во время экспоненциальной фазы роста.

Для описания зависимости роста культур от концентрации субстрата существует несколько альтернативных моделей [44]. Уравнение (10.5) можно использовать

для описания роста при лимитировании субстратом только в экспоненциальной фазе довольно простых бактериальных систем. Когда рост культуры замедляется в результате лимитирования субстратом, условия, которые в ней устанавливаются (концентрация биомассы и субстратов), резко отличаются от условий, существовавших во время экспоненциальной фазы. В этом случае для описания реакции культуры на уменьшение концентрации субстрата можно успешно использовать уравнение (10.1) наряду с уравнениями (10.5) и (10.6). Совместное решение уравнений (10.1), (10.5) и (10.6) приводит к обобщенной модели периодического роста, которая лучше других позволяет оценить процессы, происходящие в очень простых системах [44].

В периодической культуре максимальную биомассу определяют из экспериментальных данных, исходя из отношения прироста массы клеток к соответствующему снижению концентрации субстрата:

——У (10 6)

где х и S— соответственно концентрации клеток и субстрата в момент времени t, хо и So — концентрации клеток и субстрата в более раннее время (о, а У— коэффициент общего выхода (экономический коэффициент). Уравнение (10.6) точно описывает соотношение между концентрациями клеток и субстрата во время экспоненциальной фазы роста. Если экспоненциальный рост продолжается с постоянной скоростью вплоть до достижения стационарной фазы, а субстрат полностью исчерпывается во время экспоненциального роста, то с помощью уравнения (10.6) можно рассчитать максимальное число клеток или их концентрацию. Этот расчет верен при условии, что экономический коэффициент остается на постоянном уровне в течение всего цикла роста и потреблением субстрата в течение лаг-фазы можно пренебречь. На самом деле экономический коэффициент остается постоянным лишь при условии постоянного экспоненциального роста с одной удельной скоростью. Отсюда следует, что предсказанная с помощью уравнения (10.6) величина максимальной биомассы явно завышена. Более под-

робно понятие экономического коэффициента обсуждается ниже в этой же главе (разд. 10.5). Чтобы предсказать время достижения максимальной плотности биомассы в периодической культуре, необходимо сделать ряд упрощающих допущений [2, 4].

Атипичные кривые роста

Представленная на рис. 10.1 кривая роста идеализирована и отвечает условиям постоянной морфологии клеток при их асинхронном бинарном делении. При этом одновременно с ростом биомассы происходит увеличение числа клеток и постоянная утилизация субстратов. Вариации в кривой роста — обычное явление. Морфологические изменения культуры, такие, как увеличение мутности, коэффициента преломления, размера отдельных клеток или их агрегации, могут приводить к кажущимся изменениям кривой роста, если скорость роста определять с помощью оптических измерений. Так, бактериальные клетки из культур в стационарной фазе часто более прозрачны, чем клетки из культур в экспоненциальной фазе. В результате кривая роста, построенная в виде зависимости логарифма оптической плотности от времени, отражает кажущееся снижение концентрации клеток в стационарной фазе по сравнению с концентрацией, достигнутой к концу экспоненциальной фазы. В этом случае измененная (аберрантная) кривая роста отражает скорее изменение морфологических характеристик клеток, чем изменение их количества.

Кривые роста, представленные в виде зависимости логарифма числа клеток от времени, иногда показывают необычно быстрое увеличение числа клеток сразу после лаг-фазы, вслед за чем скорость накопления клеток понижается. Это необычное значительное ускорение роста указывает на частичную или полную синхронизацию деления клеток в культуре. Не исключено, что такой синхронизованный рост обусловлен приспособлением культуры к новому питательному компоненту или прорастанием спор. Затем синхронность культуры быстро нарушается, и через две генерации преобладает асинхронный рост. Однако разработаны специальные методы, с помощью которых можно синхронизировать деление кле-

ток в растущей популяции, так что рост популяции соответствует росту отдельных клеток (разд. 10.3.3).

Большинство микроорганизмов размножаются путем бинарного деления отдельных клеток, но у некоторых, например у актиномицетов, размножение связано с ростом гиф. Если первичный рост культуры происходит за счет вытягивания концов гиф, то зависимость увеличения клеточной массы от времени будет линейной.

Линейный рост наблюдается и в том случае, когда добавление к среде критического питательного компонента регулируется линейным процессом (например, с помощью дробных добавок или диффузии) и этот процесс становится лимитирующим. Например, ограниченная диффузия воздуха в пробирку через ватную пробку или питательных компонентов через мембрану в диализную культуру [51] может перевести экспоненциальный рост в линейный.

В жидкой культуре нитчатые микроорганизмы часто образуют шарообразные скопления. В этом случае увеличение биомассы происходит медленнее, чем при экспоненциальном росте и пропорционально времени в третьей степени. Рост микроорганизмов в шарообразных скоплениях может зависеть от диффузии питательных компонентов внутрь этих скоплений и выхода наружу продуктов метаболизма, что не предусматривается в уравнении (10.5).

В комплексной среде бактериальные клетки часто используют имеющиеся субстраты последовательно. Присутствие определенных субстратов может привести к подавлению синтеза ферментов, участвующих в метаболизме других питательных веществ. В этом случае ферменты, катализирующие метаболизм некоторых веществ, начинают действовать лишь после того, как концентрация субстратов, репрессирующих их синтез, уменьшится в результате использования клетками. Регуляция физиологии бактерий приводит к изменениям кривой роста и появлению одной или нескольких переходных (т. е. временных) стационарных фаз. Такой ответ культуры на изменение состава среды называют диауксией. Классическим примером диауксии может служить рост Escherichia coli в присутствии глюкозы и лактозы (рис. 10.2). Сначала происходит рост культуры за счет использова-

Рис. 10.2. Идеализированная диауксия роста бактерий в периодической системе культивирования с двумя субстратами (глюкоза и лактоза).

ния глюкозы. После исчерпания этого субстрата кривая роста резко меняет свой наклон, так что биомасса может даже уменьшиться. Во время этой лаг-фазы индуцируется синтез новой ферментной системы, участвующей в метаболизме лактозы, и накопление биомассы продолжается за счет потребления этого сахара.

Культуральные пробирки

Лишенные бортиков пробирки из стекла пирекс (обычно размером 16X150 мм) очень удобны для выращивания периодической жидкой культуры бактерий и широко используются для этой цели. Однако при культивировании аэробов в пробирках обычно удовлетворяется лишь минимальная их потребность в кислороде. Многие бактерии являются факультативными анаэробами, поэтому в преобладающем большинстве случаев при культивировании в пробирках они растут хорошо.

Для того чтобы улучшить аэрацию жидкой культуры в пробирке, увеличивают отношение поверхности среды к объему, например уменьшая объем среды или наклоняя пробирку. Еще лучше поместить пробирки на качалку, благодаря чему получают активное перемешивание среды. Снабжение воздухом улучшается, если для закрывания пробирок используют неплотные ватные пробки, колпачки типа Morton (Scientific Products) или проницаемые для газов мембранные пробки. Хотя мембранные пробки используют довольно редко, они очень эффективны, поскольку хорошо проницаемы для обменивающихся газов и в то же время почти непроницаемы

для водных паров, т. е. среда при этом не испаряется. Мембранные пробки производятся в виде колпачков типа Morton с тонкой поликарбонатной мембраной, встроенной в верхнюю часть колпачка (Kimble Р. М. Сар Closure Scientific Products).

Более подробно условия оптимизации аэрирования в лабораторных культуральных сосудах описываются в разд. 10.1.2. Условия обеспечения строгого анаэробиоза для культур в пробирках приведены в разд. 6.6.

Качалочные колбы

В качестве сосудов для получения биомассы в лабораторных условиях или на первом этапе в промышленных процессах, включающих периодическое культивирование бактерий! в жидкой среде, широко используются колбы Эрленмейера объемом от 100 до 2000 мл. При этом для облигатных или факультативных аэробов подбираются максимально эффективные условия подачи воздуха (кислорода), а для анаэробов — такие же условия удаления воздуха.

Аэробная культура

Аэробное культивирование в колбах должно происходить при постоянном их встряхивании для того, чтобы облегчить массопередачу кислорода (а также других газов и питательных компонентов) на двух уровнях: из газовой фазы через поверхность раздела газ — жидкость в жидкую фазу, а также из жидкой фазы через поверхность раздела жидкость — клеточная поверхность внутрь клеток. На способность системы культивирования в колбах удовлетворить потребность бактерий в кислороде влияют два основных фактора: газообмен через пробку колбы и площадь поверхности жидкости, доступная для транспорта кислорода из газовой фазы.

Пробки (крышки) в культуральных колбах должны обеспечивать адекватный обмен газами между наружной средой и содержимым колбы в стерильных условиях. Негигроскопические ватные пробки, обернутые марлей, пригодны для культивирования аэробных бактерий до невысокого уровня плотности. Однако, если эти пробки

слишком велики для колб или если они очень плотные, они затрудняют доступ кислорода в бактериальные культуры высокой плотности [58]. В таком случае следует использовать ватно-марлевые пробки (рис. 10.10), обеспечивающие лучший доступ кислорода. Их делают следующим образом.

Один слой негигроскопической ваты кладут между двумя слоями хирургической марли.

Разрезают эту ватно-марлевую подушку на квадраты такого размера, чтобы ею можно было обернуть горлышко колбы.

Помещают квадратную подушку на горлышко колбы и фиксируют ее с помощью металлической пружины или двух (для большей надежности) резинок. Металлическую пружину можно изготовить из толстой рояльной струны, изогнув ее соответствующим образом.

Колпачки типа Morton также обеспечивают достаточно стерильное закрывание колб и хороший газообмен, однако при высоких скоростях вращения они могут отвинчиваться. Для закрывания колб при культивировании на качалке пригодны также пробки из пенопласта. Их надо подбирать так, чтобы они плотно входили в горлышко колбы без дополнительных усилий. Но следует помнить о том, что пробки могут содержать пластификаторы или другие токсичные вещества; поэтому перед использованием их следует тщательно промывать. Колпачки и пробки производятся различными фирмами (например, Arthur Н. Thomas, Scientific Products, Bellco Glass, Inc.).

Поглощение растворенного кислорода жидкой бактериальной культурой зависит от плотности клеток и скорости их роста. Потребность в растворенном кислороде определяется его использованием клетками и удовлетворяется за счет постоянной диффузии кислорода из газовой фазы в жидкую. Область поверхностного контакта между газом и жидкостью часто регулирует поглощение кислорода или объемную скорость его переноса. Если эта область велика, то скорость переноса больших объемов кислорода также значительна, что позволяет культуре с высокой плотностью быстро расти без лимитирования по О2. Область поверхностного контакта увеличивается при снижении отношения объема жидкости

к объему колбы или при встряхивании колбы. Дефицит кислорода, вызванный его ограниченной диффузией, можно свести к минимуму, если заполнять жидкой средой не более 20% объема колбы и встряхивать колбы со скоростью 200—350 об/мин на круговой качалке с величиной хода 2,5 см или со скоростью 150—250 качаний в 1 мин на качалке с поступательным ходом.

Во время инкубации культур в колбах при соответствующей температуре в процессе кругового встряхивания жидкость должна подниматься примерно на 2/3 высоты колбы. Это условие обычно достигается при заполнении 250-миллилитровой колбы Эрленмейера с отбойниками 50 мл среды и вращением ее на качалке со скоростью около 220 об/мин и величиной хода 2,5 см. Встряхивание на качалке с возвратно-поступательным движением должно быть настолько эффективным, чтобы вызывать значительную турбулизацию жидкости при ее движении от одного края колбы к другому [23].

В используемых при этом колбах с отбойниками происходит разбивание образующихся потоков жидкости при вращении колб на круговой качалке. Такие колбы производятся фирмой Bellco Glass Со. и другими.

Ниже приведена методика культивирования аэробных бактерий на качалке в колбах с марлевыми пробками.

В 250-миллилитровую колбу Эрленмейера вносят 50 мл соответствующей среды.

Делают, как описано выше, марлевую пробку.

Пробку кладут на горлышко колбы, надежно закрепляют ее резинкой или пружиной и покрывают сверху алюминиевой фольгой.

Фольгу обжимают вокруг пробки и горлышка колбы, чтобы предотвратить конденсацию жидкости во время автоклавирования.

Повторяют эту процедуру со всеми колбами и затем стерилизуют их автоклавированием, как описано в гл. 23 (т. 3).

Непосредственно перед инокуляцией удаляют алюминиевую фольгу.

Осторожно снимают резинки или поддерживающие пружины, стараясь не сдвинуть пробку. Пробка подходящего размера приобретает после автоклавирования

форму колпачка (крышки), прикрывающего входное отверстие колбы и ее горлышко.

Марлевую пробку приподнимают и держат ее так, чтобы не допустить загрязнения стерильного содержимого колбы.

Горлышко колбы быстро вносят в пламя горелки и вращают его, чтобы выпарить конденсат на его внутренней стороне.

В колбу добавляют инокулят с соблюдением правил асептики и быстро закрывают ее пробкой.

И. Пробку закрепляют резинкой или металлической пружиной.

Описанная процедура предполагает использование таких пробок, которые не препятствуют быстрому газообмену и сохраняют стерильность. Если необходима очень быстрая инокуляция, можно не обжигать горлышко колбы; при соответствующем навыке удается сохранять стерильность и в этом случае.

Анаэробная культура

Для культивирования анаэробных бактерий можно использовать колбы Эрленмейера, а также любые другие колбы подходящих размеров. При этом необходимо соблюдать два основных условия: 1) питательная среда должна быть восстановлена до величины Eh =—150 мВ или ниже; 2) воздух из колб следует удалять. Специальные методики, используемые при работе с анаэробными бактериями, приведены в разд. 6.6.

При массовом культивировании анаэробов придерживаются следующих основных правил. Культуральные сосуды заполняют почти доверху, чтобы уменьшить влияние находящейся сверху газовой фазы. Вносят как можно больше инокулята на дно сосуда с восстановленной средой, стараясь держать пипетку вертикально. Воздух в сосуде заменяют очищенным от кислорода азотом или аргоном с 5—10% СО2. Сначала среду инкубируют без перемешивания, но после того как начинается активный рост, ее перемешивают либо с помощью магнитной мешалки, либо пропусканием азота или другого природного газа через трубку, опущенную на дно сосуда. Используют гидрозатвор, который затрудняет выход газов в

воздух. Предостережение: некоторые анаэробные бактерии образуют водород или метан, которые могут загораться или даже взрываться. Большинство анаэробов образуют СОг и другие газы, повышающие давление в сосудах до опасного уровня, если им не обеспечить своевременный выход.

Бутыли

Бутыли довольно часто используются для выращивания многолитровых культур бактерий в жидких средах, но существует несколько факторов, ограничивающих их применение. Так, при работе с большими стеклянными бутылями приготовление сред, их стерилизация и инокуляция сильно усложняются. Кроме того, встряхивание заполненных средой бутылей при аэробном культивировании микроорганизмов небезопасно. (Правда, при работе с пластмассовыми бутылями опасность значительно меньше.) В больших бутылях очень трудно перемешивать среду даже с помощью мешалок, поэтому создать в них достаточно высокую концентрацию кислорода — задача не из легких. Хотя при крупномасштабных работах часто приходится готовить среды в больших бутылях, культивирования бактерий в них следует по возможности избегать.

Ферментеры

Описанные ниже ферментеры и соответствующие методы культивирования в них в основном используются для выращивания аэробных бактерий, но они вполне пригодны (после небольших модификаций) и для выращивания анаэробов. Обсуждаемые здесь конструкции ферментеров предназначены для максимального снижения гетерогенности микробной популяции. Другие же ферментеры [например, колонные (plug-flow), с замкнутым контуром (closed-loop) и трубчатые], хотя и предоставляют интересные возможности для управления гетерогенностью популяции, не обсуждаются в данном руководстве. Основная литература, касающаяся конструкции ферментеров и характера работы с ними, приведена в табл. 10.1.

Таблица 10.1. Литературные источники данных по конструкции ферментеров и работе с ними

Предмет

Источник данных

Проектирование ферментеров

[2, 4, 9, 18, 22, 27, 29, 45]

Общая конструкция

Способ действия:

[32, 36]

периодический

периодический с добавлением субстрата

[16, 32]

(с подпиткой)

[18,43]

непрерывный (проточный)

диализный

[51]

Управление работой ферментера:

[2, 3, 17, 33, 35, 43, 47, 51—53]

теория и логика управления

Физиологические эффекты:

[2, 3, 5, 16, 24, 32,

периодическая культура и периодическая

культура с добавлением субстрата

38, 40]

(с подпиткой)

[1,2, 23—25, 37, 41, 54]

непрерывная (проточная) культура

диализ

[14, 51]

иммобилизованные клетки

[6, 7, 13]

Ферментеры, или реакторы с мешалкой для культивирования бактерий, устроены таким образом, что обеспечивают постоянство среды. Рабочий объем ферментеров колеблется от 500 мл до тысяч литров. Обычные лабораторные ферментеры имеют рабочие объемы от 1 до 20 л. Поскольку они предназначены для того, чтобы максимально уменьшить температурный и химический концентрационный градиент в культуре, среда в них должна перемешиваться таким способом, чтобы достигалось быстрое и полное смешение всех компонентов жидкой фазы. В случае недостаточного перемешивания возникают застойные зоны, что приводит к появлению неконтролируемых локальных градиентов концентраций. Если перемешивание слабое, то популяция клеток будет сильно гетерогенной. Например, при слабом перемешивании аэробных культур контакт между кислородом воздуха и жидкой средой недостаточен, поэтому в некоторых участках ферментера могут создаваться почти анаэробные условия, что лимитирует рост культур. Если куль-

тивируют факультативно-аэробные микроорганизмы, то дыхательные характеристики разных клеток популяции могут сильно различаться, в результате чего снижается выход биомассы.

Ферментер можно сделать кустарным способом в мастерской, причем особое внимание следует уделить устройствам для перемешивания, аэрации и стерилизации, имеющимся в продаже. Необходимо также иметь гарантии асептики покупаемых блоков [12, 20, 31, 39]. Имеющиеся в продаже ферментеры (табл. 10.2) способны обеспечить хорошую аэрацию и перемешивание довольно густых культур. Ферментеры обычно оборудованы крышкой с рядом отверстий, через которые вводят датчики pH и растворенного кислорода, а также трубки для отбора проб и введения необходимых питательных веществ.

Аэрация и перемешивание

Минимальная скорость перемешивания, необходимая для достаточной подачи кислорода, подвержена изменениям, поскольку изменяются такие параметры, как плотность культуры (концентрация клеток) и условия культивирования (скорость и объем подачи воздуха, температура и объем жидкости в ферментере). В связи с тем «то эта скорость зависит от факторов окружающей среды, управлять процессом культивирования с ее помощью весьма неудобно. Предпочтительнее скорость перемешивания доводить до такой величины, при которой концентрация растворенного кислорода никогда не падала бы ниже 10—15% начальной насыщающей его концентрации. Поддержание концентрации растворенного в среде кислорода на уровне выше 10% насыщения при соответствующей температуре позволяет выращивать большинство бактериальных культур в таких условиях, когда кислород не является субстратом, лимитирующим их рост. Теория перемешивания в барботируемых системах основана на классической кинетике Моно для роста микроорганизмов, чувствительного к лимитирующим его субстратам [1].

Требования перемешивания для соответствующего снабжения культур кислородом почти всегда превышают

Таблица 10.2. Фирмы — изготовители приборов и оборудования для ферментеров, используемых в лаборатории"

Наименование прибора

Фирма

Фильтры для стерилизации воздуха

Dollinger Corp.

Michigan Dynamics Millipore Corp.

Датчики и регуляторы растворенного кислорода

Sensorlabs, Division of Instrumentations Laboratories Inc.

Beckman Instruments, Inc.

Chemapec, Inc.

New Brunswick Scientific Co.

Анализаторы выходящих газов

Beckman, Instruments, Inc. Infrared Industries, Inc. Leeds and Northrup Co. Mine Safety Appliances Co. Perkin — Elmer Corp.

Устройство для дожигания выхлопного воздуха

Air Resources, Inc.

Trane Thermal Co.

Ферментационные установки

B. Braun Melsungen AG Chemapec, Inc.

LKB Inc.

L. E Marubashi Co., Ltd.

New Brunswick Scientific Co.

The Vir Tis Co.

Устройство для регуляции пеногашения

Chemapec, Inc.

Chemineer, Inc.

Mixing Equipment Co., Inc.

New Brunswick Scientific Co.

Дозирующие насосы и регуляторы

Cole — Palmer Instrument Co. Manostat Corp.

Системы контроля и регулирования pH

Beckman Instruments, Inc. Leeds and Northrup Co. The London Co.

Регуляторы температуры

Beckman Instruments, Inc Leeds and Northrup Co. Taylor Instrument Co.

а Адреса фирм приведены в разд

10 6

те, которые необходимы для хорошей гомогенизации высокорастворимых питательных компонентов. Это правило применимо также к условиям перемешивания в случае плохо растворимых субстратов, например углеводородов и стероидов. Для установления в культуральной среде требуемой концентрации кислорода можно изменять как скорость ее перемешивания, так и скорость подачи воздуха. Для управления культивированием аэробных микроорганизмов полезны приборы, контролирующие содержание растворенного кислорода и скорость подачи воздуха. Они позволяют оператору управлять концентрацией растворенного кислорода как независимым параметром культивирования [20].

Регулирование температуры

Большинство используемых в лабораториях ферментеров оборудовано встроенными теплообменниками. Температура циркулирующей воды (или другой охлаждающей жидкости) регулируется с помощью особого устройства, которое поддерживает постоянную температуру в ферментере. Ферментеры, имеющиеся в продаже, оснащены стандартными устройствами, регулирующими температуру, или имеют эти устройства в качестве вспомогательного оборудования. Иногда ферментер погружают в термостат с постоянной регулируемой температурой. Этот способ применяют в тех случаях, когда необходимо точное регулирование температуры.

Стерилизация воздуха

Воздух или другой газ, поступающий в ферментер, должен предварительно стерилизоваться. Наиболее простой способ стерилизации заключается в физическом удалении микроорганизмов фильтрацией воздуха через волокнистые фильтры. В большинстве лабораторных ферментеров используются заполненные стеклотканью трубчатые фильтры, но иногда применяют мембранные фильтры. В любом случае фильтры следует регулярно менять, чтобы обеспечить стерильные условия. Поскольку при длительном культивировании микроорганизмов существует опасность загрязнения фильтров, возникает

Необходимость в дополнительном (или предохраняющем) фильтре для стерилизации воздуха.

Фильтр для стерилизации воздуха можно изготовить из стальной трубки длиной 20 см и внутренним диаметром 2,5 см, оба конца которой подгоняют под соответствующие крышки или редукторы. В крышках трубки просверливают отверстия и укрепляют в них ниппели, с помощью которых она соединяется с резиновой трубкой. Тщательно очищенную стальную трубку неплотно набивают стеклянной ватой (90—150 кг/м3), после чего на каждом конце трубки укрепляют чистые крышки с соединительными ниппелями. Для предотвращения утечки газа перед укреплением крышек трубки обматывают специальной тефлоновой изоляционной лентой.

Фильтр для стерилизации воздуха перед первым использованием следует простерилизовать в течение 2 ч при 170—190 °C, завернув его в алюминиевую фольгу. После стерилизации и охлаждения фильтра проверяют, надежно ли укреплены крышки, и затем подсоединяют фильтр к трубке, через которую подается воздух. Выходное отверстие фильтра соединяют с ферментером резиновой трубкой. Фильтр для стерилизации воздуха обычно используют 2—3 раза, после чего его содержимое заменяют. Фильтры такого типа можно применять также для стерилизации не содержащей кислород смеси газов при культивировании анаэробов. Детальное описание устройства волокнистых фильтров для стерилизации воздуха приведено в работе [32].

Автоматическое пеногашение

Большинство перемешиваемых и аэрируемых культур во время роста образует довольно много пены. Если не препятствовать этому, пена смачивает воздушные фильтры, что приводит к заражению культуры, а также выходу пены наружу. Пеногашение осуществляют или с помощью механического пеногасителя, или путем добавления к среде химических пеногасителей. Большинство ферментеров имеет пеногасящие устройства, которые можно применять почти при любых условиях культивирования.

Химические пеногасители более дешевы; их исполь-

зуют время от времени при необходимости подавления пенообразования [11]. Однако при добавлении этих веществ меняется состав среды. Пеногасящие вещества растительного (кукурузное масло и масло из семян хлопчатника) и животного (свиное сало) происхождения могут использоваться микроорганизмами и тем самым вносить свой вклад в углеродный пул клеток [28]. Вместе с тем такие неметаболизируемые пеногасители, как силиконы (поставляются фирмами Dow Corning Со., Genegal Electric Corp, и Union Carbide), в высокой концентрации токсичны. Поэтому пеногасители, являющиеся поверхностно-активными веществами, следует использовать только в очень низких концентрациях и только после проверки на токсичность в каждом конкретном случае. Пеногасители добавляют непосредственно в среду перед ее стерилизацией или в ферментер через шланг в его крышке. Перед использованием пеногаситель вместе с емкостью, в которой он находится, и подающим шлангом должны быть простерилизованы. Имеются в продаже системы, обеспечивающие автоматический контроль подачи пеногасителей (New Brunswick Scientific Со., The Vir Tis Co., Chemapec Inc.).

Отбор проб и внесение инокулята

При подготовке ферментера к работе и в процессе его эксплуатации необходимо, чтобы при внесении компонентов среды и отбора проб не нарушалась стерильность и не происходило заражения ферментера микроорганизмами из внешней среды. Большинство лабораторных ферментеров оснащено трубкой для отбора проб, которая проходит через крышку ферментера и немного не доходит до его дна. При отборе проб и внесении инокулята требуется тщательное соблюдение инструкций фирмы-изготовителя. Нельзя забывать о том, что при работе ферментера должно поддерживаться положительное давление.

Культивирование в анаэробных условиях

Главным условием анаэробного культивирования в ферментерах является удаление из системы кислорода.

Прежде всего ферментер заполняют средой, насколько это максимально возможно, и в первые часы культивирования через среду продувают газ, не содержащий кислорода, поддерживая тем самым небольшое положительное давление. Использование больших объемов инокулята (10—20% объема среды) обеспечивает быстрое начало роста культуры и способствует уменьшению ее чувствительности к кислороду, попадающему из внешней среды. В случае контроля pH или добавления в среду питательных компонентов в процессе роста культуры использую! максимально короткую гибкую трубку, соединяющую сосуды с ферментером, поскольку кислород способен проникать через большинство резиновых шлангов. Мало проницаемыми для кислорода считаются трубки из тайгона, но они размягчаются после автоклавирования, и поэтому их можно использовать, только если предварительно укрепить с помощью проволоки. Наконец, шланг для выхода газа из ферментера следует оборудовать водной ловушкой (гидрозатвором), чтобы предотвратить обратную диффузию газа в его верхнюю часть.

Простой гидрозатвор можно изготовить самим, поместив заполненный водой мерный цилиндр или какой-нибудь другой стеклянный сосуд в перевернутом положении в водяную баню. Трубку для выхода газа из ферментера подводят под перевернутый сосуд таким образом, чтобы выходящий газ собирался в этом сосуде. Трубка должна быть кислородонепроницаемой или максимально короткой, чтобы предельно уменьшить диффузию кислорода. По мере накопления газа в сосуде вода начинает вытесняться. Для того чтобы вытесняемая вода не выливалась, сосуд с водяной баней должен быть достаточно большим. После заполнения воздухом одного сосуда его заменяют другим, заполненным водой. Объем выделяемого газа легко определить, если сосудом с трубкой для выхода газа является мерный цилиндр. При активном пропускании бескислородного газа через ферментер потребность в гидрозатворе невелика. После начала роста анаэробной культуры уже нет необходимости в интенсивном продувании газа через среду в ферментере. Однако если его подача прекращается, то необходимо немедленно установить гидрозатвор.

Рекомендуется использовать предварительно восстановленную среду; ее либо получают нагреванием в ферментере, либо вводят в ферментер, через который предварительно пропускали газ, не содержащий кислорода, уже восстановленную среду. Кислоты, основания и растворы питательных компонентов, добавляемые в ферментер в процессе культивирования, готовят и хранят в отсутствие кислорода. Полностью удалять кислород из растворов, добавляемых в ферментер в небольших количествах, необязательно, поскольку восстанавливающая способность активной анаэробной культуры достаточно велика для удаления его из таких систем.

ПРОТОЧНЫЕ СИСТЕМЫ

Для непрерывного (проточного) культивирования в отличие от периодической культуры характерна постоянная подача свежих питательных компонентов со скоростью, равной скорости удаления среды из культуры (открытая система). Если культура хорошо перемешивается, то пробы, взятые из любой части ферментера, будут одинаковы по биомассе и концентрации субстрата. По составу они идентичны также культуральной жидкости, вытекающей из ферментера. При непрерывном культивировании теоретически бактерии растут экспоненциально в условиях постоянной подачи свежей среды и удаления части клеток вместе со старой средой, так что объем культуры со временем не меняется. Вообще говоря, постоянная концентрация клеток (равновесное состояние, англ, steady-state) для непрерывного культивирования не обязательна. Однако в большинстве работ по изучению количественных аспектов непрерывного культивирования описываются системы с постоянной концентрацией биомассы. Рассмотренные ниже принципы относятся только к непрерывному культивированию в равновесном состоянии.

Термин «равновесное состояние» часто употребляют в литературе в связи с непрерывным культивированием; буквально он означает, что во время исследования не происходит изменения состояния культуры. На самом деле это определение слишком широко, поскольку на практике при непрерывном культивировании некоторые

параметры могут меняться, тогда как другие при этом остаются постоянными. Поэтому непрерывную культуру в равновесном состоянии определяют как культуру с постояной концентрацией биомассы в определенный период наблюдения. В противоположность этому в периодической культуре постоянная концентрация растворенного кислорода поддерживается происходящими в среде изменениями, но содержание в ней биомассы меняется.

Непрерывное культивирование в равновесном состоянии возможно только в том случае, когда все поступающие потоки, необходимые для накопления биомассы, точно сбалансированы с потоками, участвующими в выводе биомассы из системы. Это видно при рассмотрении общего материального баланса веществ в бактериальных клетках:

Клетки, добавляемые к системе — Клетки, удаляемые из системы + + Клетки, образующиеся в процессе роста культуры — Клетки

которые погибают = Клетки, накапливающиеся в системе

следующим(Ю.7)следующим(Ю.7)Математически это уравнение выражается образом

следующим

(Ю.7)

следующим

(Ю.7)

где F — скорость подачи среды в ферментер и ее выхода из него (л/ч), V — объем жидкости в ферментере (л), Хо и X— биомасса (г/л) соответственно в поступающем потоке среды и в самом ферментере, ц— удельная скорость роста, ю — удельная скорость гибели клеток (ч '), dX/dt— скорость изменения биомассы (г/л-ч).

В состоянии равновесия dX[dt = 0. Теоретически объем чисто непрерывной культуры не меняется (на практике он подвержен незначительным колебаниям). Следовательно, скорости подачи среды в ферментер и выхода культуры из него должны быть одинаковыми. Наконец, поскольку удельная скорость гибели клеток почти всегда значительно меньше удельной скорости их роста, величину а можно не принимать во внимание. Исключения из этого правила наблюдаются только при очень низких скоростях роста микроорганизмов, в присутствии токсичных веществ или в случае культивирования в экстремальных биофизических условиях. При добавлении в

ферментер стерильных питательных веществ Хо = О, и если не принимать во внимание удельную скорость гибели клеток (аХ = 0), то в равновесном состоянии

^=4 = D. (10.8)

Иными словами, удельная скорость роста популяции в ферментере определяется скоростью разбавления D, которая равна F]V.

Существует много типов непрерывного культивирования; некоторые из них подробно описаны в работах [2, 4]. В последующем обсуждении мы ограничимся двумя основными типами непрерывного культивирования: 1) «хемостатом», в котором состояние равновесия достигается путем регулирования поступления лимитирующих рост субстратов, и 2) «турбидостатом», в котором состояние равновесия достигается путем удаления биомассы и замещения ее свежей средой со скоростью, соответствующей росту культуры. В табл. 10.3 сравниваются различные стационарные параметры турбидостата и хемостата. Хемостат в отличие от турбидостата позволяет с высокой точностью регулировать условия лимитирования роста (субстратное лимитирование), тогда как турбидостат предпочтителен для изучения микроорганизмов в условиях роста, близких к максимальной удельной скорости.

Людекинг [38] опубликовал очень полезный обзор теории и практики непрерывного культивирования. В его статье приведены графический расчет и анализ систем непрерывных культур, которые позволяют обойтись без точной модели реакции скорости роста на изменение свойств окружающей среды (например, модели Моно). Эмпирический подход к непрерывному культивированию, основанный на данных по периодической культуре, имеет свои подводные камни, которые обсуждаются в работах Людекинга [38] и других авторов [6—8]. Тем не менее этот подход полезен для получения расчетных критериев.

Существует много отклонений от теории простого хемостата. Большинство из них является результатом: 1) образования вещества, для которого может понадобиться усложненная модель выхода продукта как функции ц; 2) недостаточного перемешивания среды в ферментере, из-за чего устойчивая скорость разбавления

Таблица 10.3. Сравнение хемостата и турбидостата

Рабочие параметры

Хемостат

Турбидостат

Культивирование при скорости, близкой кмаксимальной

удельной скорости роста

Неустойчивое

Устойчивое,очень

близкое к стационарному состоянию

Культивирование при низкойудельной

скорости роста

Устойчивое стационарное состояние

Неустойчивое с пульсацией

Скорость разбавления равна удельной скорости роста

Только в стационарном состоянии

Во всех случаях

Концентрация клеток припостоянной

удельной скорости роста зависит от

концентрациисуб

страта в поступающей питательной среде

концентрации субстрата в поступающей питательной среде

Скорость разбавления

Заранее определена

Регулируетсякак

функция биомассы

Концентрация субстрата при культивировании в состоянии равновесия

Лимитирующая

Все субстраты могут присутствовать в избытке

может превысить критическую; 3) пристеночного роста, который вызывает такой же эффект, как недостаточное перемешивание, но еще более выраженный; 4) необычной физиологической реакции микроорганизмов. Первые три причины отклонений обсуждаются в работе Перта [4], некоторые аспекты четвертой причины в работе Уонга и Сински [59]. Другие аспекты физиологической реакции микроорганизмов на поступление питательных веществ и их удаление рассматриваются в разд. 10.5 этой главы.

Хемостат

Теория

Культивирование в хемостате основано на том, что в простейшей форме рост бактерий можно описать как совокупность реакций, в которых скорость роста культуры

определяется самой медленной реакцией метаболизма. Хотя в растущей культуре осуществляется метаболизм многих питательных веществ, скорость роста идеальной культуры в любой момент времени определяется скоростью метаболизма лишь одного питательного субстрата. Моно [45, 46] установил, что зависимость скорости роста от концентрации субстрата можно предсказать с помощью уравнения, весьма напоминающего уравнение Михаэлиса — Ментен:

|*=|*max(S/[/Ce+S]),(10.9)

где ц— удельная скорость роста культуры, которая для бактериальных культур в экспоненциальной фазе равна (1п2)Д<ь ртах — максимальная удельная скорость роста в изучаемой среде, S— концентрация изучаемого субстрата в среде, Ks — константа насыщения для субстрата, численно равная концентрации лимитирующего вещества при ц = -уЦтах. Уравнение Моно лучше всего удовлетворяет состоянию равновесия. Для наших задач можно считать, что состояние равновесия существует в том случае, когда концентрация субстрата не изменяется, и конечная микробная популяция в системе непрерывного культивирования постоянна во времени. Когда хемостат заполняют стерильной питательной средой (Хо = О) без возврата части потока культуральной жидкости, удельная скорость роста культуры численно равна скорости разбавления [уравнение (10.8)]. Это равенство обеспечивается путем управления потребления лимитирующего субстрата за счет добавления свежей питательной среды. Для хемостата баланс лимитирующего питательного компонента можно представить схемой:

Поступление — Выход — Потребление = Накопление.

Математическое выражение, сходное с уравнением (10.7) для биомассы, выглядит так:

(Ю.Ю)

°VX]8х '

где D — скорость (или коэффициент) разбавления (D=FfV'), So и S — концентрации лимитирующего субстрата соответственно в поступающей среде и в фермец-

тере, ц— удельная скорость роста культуры в ферментере, X— сухая масса клеток в ферментере, Уж/$— коэффициент общего выхода клеток (экономический коэффициент), т. е. отношение образовавшихся клеток к количеству использованного субстрата, и dS/dt— скорость изменения концентрации субстрата в ферментере. Понятие общего выхода включает в себя рост культуры и ее поддержание (разд. 10.5). При этом предполагается, что происходит образование только клеток. Если образуется еще какой-нибудь продукт, то следует ввести в уравнение член, соответствующий дополнительному потреблению. В состоянии равновесия уравнение (10.10) выглядит так:

D(S0-S) = ^.(10.11)

1 xjs

Подставив в уравнение (10.11) уравнение (10.8), получим:

^ = ^/s(S0-S).(10.12)

Отметим, что уравнение (10.12) было представлено выше без вывода для использования его в периодических системах [уравнение (10.6)]. Допускается, что общий выход биомассы зависит только от лимитирующего питательного компонента, но не от удельной скорости роста культуры. Исключения из этого допущения обсуждаются в разд. 10.5. Уравнения (10.8) и (10.12) пригодны для описания равновесия при непрерывном культивировании. Прежде чем с помощью концентрации биомассы и субстратов, а также удельной скорости роста определить условия культивирования, полезно рассмотреть удельную скорость роста как функцию концентрации субстрата. Многим ситуациям удовлетворяет уравнение (10.5). Подставив в уравнение (10.5) уравнение (10.8), получим:

0 = ^3-,<10.13)

где Dc ■— критическая скорость разбавления (коэффициент разбавления), соответствующая максимальной удельной скорости роста (цтах). Работа хемостата при скоростях разбавления выше Dc приводит к полному вымыванию культуры.

После преобразования уравнение (10.13) выглядит следующим образом:

SSDKSDc—D 1DKSDc—D 1(10.14)(10.14)

S

S

DKS

Dc—D 1

DKS

Dc—D 1

(10.14)

(10.14)

Подставив уравнение (10.14) в уравнение (10.12), получим:

(10.15)(10.15)_SD ).

(10.15)

(10.15)

Уравнение (10.15) связывает концентрацию биомассы с коэффициентом разбавления в условиях равновесия. На рис. 10.3 представлена обобщенная реакция системы на скорость разбавления, предсказываемая уравнениями (10.14) и (10.15).

Модель Моно [уравнение (10.5)] — одна из нескольких моделей, описывающих зависимость скорости роста от концентрации субстрата. Допущения, принимаемые в ней, упрощают ситуацию, однако они приемлемы далеко не для всех систем. Фундаментальная теория проточного культивирования детально обсуждается в работах [2, 32, 56].

Оборудование

Большинство из описанного выше оборудования для периодического культивирования микроорганизмов с перемешиванием среды можно использовать непосредственно для непрерывного культивирования. Иногда для непрерывного удаления культуральной среды необходимо модифицировать ферментер. Так, для непрерывного культивирования требуется система двойного насоса (для добавления свежей среды и для удаления культуральной жидкости), используемая вместе с регулятором уровня среды; при этом культуральная жидкость удаляется через отверстие для отбора проб. Такие насосы и регуляторы уровня среды поставляют многие фирмы, производящие ферментеры (New Brunswick Scientific Со., The VirTis Co., and Chemapec Inc.).

Двойной насос и система регулирования уровня среды, используемые для внесения среды и удаления культуры, обладают рядом преимуществ при проточном

Рис. 10.3. Влияние изменений скорости разбавления на характеристики культуры в хемостат- нон системе проточного культивирования, где при вымывании культуры скорость разбавления приближается к цШах.Рис. 10.3. Влияние изменений скорости разбавления на характеристики культуры в хемостат- нон системе проточного культивирования, где при вымывании культуры скорость разбавления приближается к цШах.сти. Стеклянные сосуды, изсти. Стеклянные сосуды, из

Рис. 10.3. Влияние изменений скорости разбавления на характеристики культуры в хемостат- нон системе проточного культивирования, где при вымывании культуры скорость разбавления приближается к цШах.

Рис. 10.3. Влияние изменений скорости разбавления на характеристики культуры в хемостат- нон системе проточного культивирования, где при вымывании культуры скорость разбавления приближается к цШах.

сти. Стеклянные сосуды, из

сти. Стеклянные сосуды, из

культивировании в ферментерах больших емкостей, однако в малых ферментерах удаление переливающейся через край культуральной среды происходит просто под действием силы тяжести. Специальные культиваторы с боковым отводом для удаления жидкости можно изготовить из стандартных стеклянных или стальных сосудов. Особое внимание следует уделять поверхностному перемешиванию на уровне отверстия для отбора проб. Хорошее поверхно-

стное перемешивание получают, если трубку для отбора жидкости [21] или турбинную лопасть

помещают на уровне отверстия для отбора проб под углом 5° к поверхно которых жидкость удаляет

ся под действием силы тяжести, производит фирма Ве1- Ico Glass, Inc. (номер каталога 1970). Эти сосуды под

ходят для культивирования литровых объемов сред с небольшой плотностью бактерий. Компании, перечисленные в табл. 10.2, производят более универсальные сосуды для непрерывного культивирования, в которых обес

печивается перемешивание и аэрация даже очень плотных бактериальных культур. Однако эти сосуды необходимо дополнительно оборудовать для удаления культуральной жидкости.

Определение скорости потока среды

Тщательное регулирование скорости поступления среды в ферментер и выхода из него при постоянстве объе-

ма абсолютно необходимо для установления равновесных условий роста культуры. При проточном культивировании в хемостате скорость поступления свежей среды в ферментер определяет плотность культуры и удельную скорость ее роста. Скорость поступления среды в процессе ферментации следует тщательно отрегулировать и периодически проверять. На рис. 10.4 изображено простое устройство для измерения скорости поступления среды. Прокалиброванную пипетку (или бюретку) заполняют измеряемым объемом жидкости из резервуара, закрутив зажим 5; затем до начала измерений зажим А также закручивают. Для определения скорости поступления жидкости зажим А откручивают и одновременно зажим В закручивают. Измеряют время, необходимое для удаления измеренного объема жидкости из пипетки. Для возобновления нормальной работы системы откручивают зажим В и закручивают зажим А. Скорость разбавления (или удельная скорость роста в одном культуральном сосуде без рециклизации среды) можно высчитать, разделив скорость поступления среды на объем жидкости в ферментере.

Предотвращение заражения свежей средыв резервуаре (сборнике)

В результате аэрации и перемешивания проточной культуры образуется аэрозоль, содержащий большое число культивируемых микроорганизмов. Поэтому соединительный канал, через который поступает в ферментер свежая среда, может подвергнуться заражению. Отсюда возникает необходимость оснащения этого канала специальным «прерывателем», который действует по типу асептического затвора между ферментером и резервуаром со свежей средой. Рис. 10.5 иллюстрирует основной принцип такого прерывателя [21]. Его нижняя часть обеспечивает медленную, но постоянную подачу стерильного воздуха, предотвращая тем самым аэрозольное заражение канала, через который поступает среда. Верхняя камера устройства обеспечивает дополнительное прерывание потока поступающей жидкости. Этот прерыватель может быть использован как для периодического культивирования с добавлением субстрата, так и для непрерывного культивирования.

Рис. 10.4. Прибор для определения скорости подачи среды.

Рис. 10.5. Прибор для предотвращения заражения среды в сборнике при непрерывном или периодическом ( с подпиткой) культивировании.

Сборники и приемники

Непрерывное культивирование требует довольно больших объемов среды и приводит к образованию соответствующих больших объемов культуральной жидкости с конечным продуктом. В табл. 10.4 представлены объемы свежей среды, необходимые для 20-часового непрерывного культивирования при различных скоростях разбавления. Для удобства там же приведено соответствующее время удвоения биомассы. Чтобы иметь возможность варьировать скорость подачи среды в случае 20-часового культивирования, рекомендуется готовить достаточное количество среды. Поскольку в большинстве лабораторных операций стерилизацию проводят путем автоклавирования, предпочтительнее готовить требуемые объемы среды в бутылях соответствующего размера.

Таблица 10.4. Количество среды, необходимое для непрерывного культивирования при различных скоростях разбавления0

Скорость^раз бавления , ч-1

Соответствующее время удвоения биомассы

Отношение объема среды к объему ферментера, необходимое для 20 часового непрерывного культи вирования, мл/мл

ч

МИИ

2,77

0,25

15

55,4

1,39

0,50

30

27,8

0,92

0,75

45

18,4

0,69

1,00

60

13,8

0,46

1,50

90

9,2

0,35

2,00

120

7,0

0,17

4,00

240

3,4

0,09

8,00

480

1,8

^Бактериальная культура в 500 мл рабочего объема жидкости при скорости удвоения биомассы 30 мин (0 = 1,39 ч-1) требует 13,9 л свежей среды в течение 20 ч культивирования

скорость разбавления, высчитанная для одного сосуда без рециклизацчи среды

(С большими объемами горячих жидкостей нужно обращаться с предельной осторожностью. Вместо стеклянных лучше использовать пластмассовые бутыли, которые можно автоклавировать.) Например, для культивирования в течение 20 ч в 14-литровом ферментере с 10-литровым рабочим объемом, в котором клетки бактерий удваиваются каждый час (скорость разбавления 0,69 ч-1), необходимо 138 л свежей среды. При тех же условиях культивирования для рабочего объема жидкости 1 л необходимо 13,8 л среды.

Небольшие объемы среды можно легко автоклавировать и хранить в стандартных 20-литровых бутылях. При приготовлении небольших объемов среды (10—14 л) ее удается стерилизовать без избыточного нагревания. Для хранения стерильной среды годятся полипропиленовые или поликарбонатные бутыли, имеющиеся в продаже. На рис. 10.6 схематически изображен типичный резервуар со средой, который стерилизуют в вертикальном положении путем автоклавирования. Объем среды не должен превышать 75% объема резервуара, иначе возможно выплескивание среды во время ее автоклавирования. Кроме того, во время автоклавирования необходимо вы-

Рис. 10.6. Резервуар со свежей средой, стерилизуемый в автоклаве. Трубки 1 и 2 снабжены прижимными колпачками для стерильного закрывания. Трубки 1 и 3 снабжены зажимами, а трубка 3 содержит также фильтр для воздуха. Во время работы трубка 1 соединяется с ферментером специальной муфтой (рис. 10.7).

пустить газ из сосуда. После стерилизации несколько бутылей можно объединить вместе, увеличив тем самым общий объем резервуара. Для этого трубку 1 первого сосуда соединяют с трубкой 2 второго и т. д. (рис. 10.6).

Стерильные соединения сосудов

Для соединения сосудов между собой и с ферментером используют специальное устройство, изображенное на рис. 10.7. Оно состоит из двух секций стальных трубок, подобранных таким образом, что одна трубка легко входит в другую. На наружные концы этих трубок плотно надеваются резиновые шланги. Каждую трубку устройства перед автоклавированием заворачивают в алюминиевую фольгу. Чтобы стерильно соединить их, следует осторожно снять алюминиевую фольгу, обжечь на огне каждую трубку и плотно вставить трубку меньшего диаметра в трубку большего диаметра. Более тонкая трубка должна быть несколько длиннее, чтобы она проходила через всю большую трубку и соединялась с насаженным на нее резиновым шлангом. Для большей надежности место соединения стальной трубки с резиновым шлангом скрепляют проволокой или небольшим стягивающим зажимом. Устройство для быстрого соединения следует располагать таким образом, чтобы более широкая трубка своим открытым концом была направлена вертикально вниз. Для надежности все устройство заворачивают в стерильный защитный материал, чтобы

Резиновая трубка

Металлическая

трубка

Е^УУх^ХхЧУ^УхМуМЛЯТ

Рис. 10.7. Муфта для быстрого и стерильного соединения трубок и сосудов в системе непрерывного культивирования. Вверху, муфта в разобранном виде. Внизу: собранная муфта.

предотвратить попадание в трубки пыли и содержащихся в воздухе микроорганизмов. Эти предосторожности позволяют разъединять трубки и после стерилизации на огне вновь их соединять. Когда меняют сосуд, соединительное устройство освобождают от защитного материала; для надежности перед соединением со следующей стерильной линией более тонкую трубку следует об жечь на огне.

Стерилизация среды

Стандартные приемы стерилизации жидких сред описываются в гл. 23 этого руководства. Для предотвращения распада термолабильных компонентов среды используют стерилизацию фильтрованием. Небольшие объемы простых сред, используемых для культивирования бактерий, автоклавируют непосредственно перед их использованием, но для автоклавирования больших объемов

среды необходимо довольно длительное время. Так, в зависимости от состава среды сосуды, содержащие около 10 л жидкости, следует автоклавировать от 30 до 90 мин при 121 °C. Для полной стерилизации 10-литровых объемов среды, содержащей такие компоненты, как кукурузная или соевая мука, требуется до 90 мин, тогда как среды, содержащие только растворимые компоненты, можно стерилизовать в течение 30 мин при 121 °C. Во время автоклавирования все сосуды следует соединить друг с другом для уравновешивания давления.

При автоклавировании больших объемов предварительно восстановленных сред для анаэробных бактерий необходимо особо тщательно установить, а затем и поддерживать химически восстановленное состояние этих сред. Сосуды, содержащие предварительно восстановленные среды, немедленно после автоклавирования подсоединяют к источнику с газом, не содержащим кислород. Как только в верхнем пространстве сосуда начинает конденсироваться пар, там создается частичный вакуум. Продувание газа без О2 позволяет ослабить вакуум, образованный во время охлаждения сосуда, и предотвратить попадание в среду кислорода из воздуха.

Запуск

Непрерывному культивированию всегда предшествует непродолжительное периодическое культивирование, в процессе которого за счет избытка субстрата происходит накопление биомассы. Непрерывное культивирование следует начинать в тот момент, когда в периодическом режиме культура достигнет экспоненциальной фазы роста. При этом уменьшаются колебания, вызываемые подачей среды, и исключается непредусмотренное вымывание культуры, связанное с наличием лаг-фазы. Разбавление начинают со скоростью, меньшей, чем это требуется, и затем постепенно увеличивают ее до нужной величины. Такой прием позволяет уменьшить колебания роста, вызываемые токсичными субстратами, например фенолом. Реакция культуры в хемостате на токсичные субстраты более подробно обсуждается в работе Перта Г4]-

ю. Жидкая культура

Отбор проб

Лучше всего производить отбор проб культуры через специальный отвод в ферментере. Иногда их отбирают также из выводной трубки ферментера, но это не рекомендуется делать при отборе малых объемов, поскольку на стенках выводной трубки могут находиться бактерии; при их попадании в пробу могут быть получены искаженные результаты. При отборе проб в процессе непрерывного культивирования необходимо следовать инструкции фирмы — изготовителя ферментера. Если пробы отбирают не из выводной трубки, а через специальный отвод, их объем должен составлять менее 10% рабочего объема ферментера, так чтобы равновесие системы нарушалось не сильно. Трубку для отбора проб следует предварительно тщательно очищать. Некоторые ферментеры оборудованы воздушной системой очистки, которая обеспечивает сброс в ферментер содержимого трубки после отбора проб. При использовании этой системы нет необходимости в ее предварительной очистке.

Турбидостат

Турбидостат представляет собой самую простую из всех хорошо перемешиваемых систем непрерывного культивирования [61]. Концентрация клеток в ней регулируется постоянной подстройкой определенной скорости поступления питательных компонентов. В отличие от случая хемостата концентрацию биомассы в турбидоста- те выбирает оператор, а скорость разбавления и соответственно концентрация субстратов поддерживается таким образом, чтобы сохранялся заданный уровень биомассы. Отсюда следует, что если нет необходимости в лимитирующих количествах субстрата, то он добавляется в избытке. Поэтому работа системы (для используемой среды) наиболее стабильна при удельной скорости роста культуры, близкой к максимальной цтах. Пока концентрация всех компонентов среды избыточна, система работает в широких интервалах концентраций биомассы при скорости разбавления, близкой к критической. Именно в этих условиях хемостат наименее стаби-

часть и. рост

лен. В отличие от того, что мы имеем в случае хемостата, скорость разбавления в турбидостате при тщательном регулировании биомассы всегда равна удельной скорости роста, независимо от того, находится система в состоянии равновесия или нет.

Наиболее уязвимым местом культивирования в турбидостате является точность регулирования биомассы. Большинство старых методов регулирования плотности популяции основано на оптическом измерении (в рассеянном или проходящем свете) с помощью фотоэлектрического датчика. Недостатком этих методов являются помехи, вызываемые пеной и пузырьками, которые образуются при аэрации, а также ростом клеток на стенках ферментера и, что более важно, на оптическом измерительном устройстве. Если от помех, вызываемых пузырьками, можно избавиться, используя внешнюю проточную кювету, то пена создает серьезные проблемы. Зарастание бактериями оптических поверхностей можно частично преодолеть их протиранием, однако это малоэффективный прием. Возлагаются надежды на новые методы волоконной оптики, однако они еще не апробированы.

Термин «турбидостат» относится к любому методу, при котором плотность клеток поддерживается на постоянном уровне. Он включает в себя методы, основанные на изменениях метаболизма, измеряемых с помощью «рН-стата» [48] и «СОг-стата». Поскольку основные метаболические функции (такие, как поглощение бактери ями кислорода, выделение двуокиси углерода и в некоторых случаях изменение pH) тесно связаны со скоростью роста клеток и в конечном счете с удельной скоростью роста культуры, их можно использовать как показательные переменные при регулировке потока среды.

Теоретически в качестве регулируемого параметра при культивировании в турбидостате может быть использован любой параметр, который поддается измерению. На практике же в этом качестве используют только те параметры, которые тесно связаны с ростом клеток. Введение сложных комплексов ферментер — ЭВМ обеспечит более высокий уровень использования турбй-' достатиой теории, но эти комплексы требуют дальнейших разработок.

СПЕЦИАЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ

Управляемая периодическая культура (pH)

Управляемые периодические культуры нуждаются в специальных приборах, с помощью которых следят за параметрами среды и запуском подачи среды в ферментер таким образом, чтобы регулируемый параметр поддерживался на постоянном уровне. Примером регулируемого параметра среды в ферментере служит величина pH, поддерживаемая на постоянном уровне путем автоматического добавления кислоты или щелочи. Основными компонентами системы контроля pH являются рН- электроды с защитным покрытием, pH-метр, блок автоматического титрования, сосуды с кислотой и щелочью вместе с гибкими шлангами, соединяющими их с ферментером, а также простой перистальтический насос или соленоидный клапан. Хотя можно использовать отдельно pH-электрод и электрод сравнения, чаще применяют стерилизуемый паром объединенный электрод, который занимает меньше места и в без того ограниченном объеме небольшого лабораторного ферментера. Все компоненты системы ферментера, включая рН-электро- ды и электроды для определения растворенного кислорода, должны быть устойчивы к стерилизации паром или другими средствами, например парами окиси этилена или формальдегида.

Особенно надежными считаются электроды фирмы Ingold, которые могут быть автоклавированы многократно. pH-метр и блок автоматического титрования должны подходить друг к другу, поэтому их желательно покупать у одной и той же фирмы. Перистальтический насос надежно обеспечивает подачу кислоты или щелочи против довольно высокого отрицательного давления в ферментере, но при работе с лабораторными ферментерами вполне достаточно использовать простой соленоидный клапан (вентиль), регулирующий по принципу силы тяжести подачу в ферментер щелочи или кислоты. Фирма Radiometer (Копенгаген, Дания) выпускает очень надежные системы для измерения pH и титрования, которые легко приспособить к ферментеру. Системы регулирования pH этой фирмы и электроды фирмы Ingold

поставляются их лондонскими отделениями (The London Со.). Системы регулирования содержания растворенного кислорода поставляются всеми основными фирмами, производящими ферментеры; эти системы позволяют контролировать скорость перемешивания среды и скорость подачи кислорода. Особенно надежны электроды для измерения растворенного кислорода, поставляемые фирмой Instrumentation Laboratories, Inc., поскольку они без замены мембраны устойчивы к многократной стерилизации паром.

Регулирование pH описано также в разд. 6.1 и 16.2.1.

Периодическая культурас добавлением субстрата (подпиткой)

В периодической культуре переход от экспоненциальной фазы роста к стационарной может вызываться многими причинами, в том числе нехваткой важного питательного компонента или образованием токсичного метаболита. Если такой переход вызван нехваткой питательного компонента, то при добавлении свежей среды рост культуры будет продолжаться. Чтобы поддерживать экспоненциальный рост культуры с постоянной скоростью, скорость добавления среды и объем культуры в закрытой системе следует увеличивать экспоненциально. Такой способ поддержания роста называют периодическим культивированием с подпиткой [19]. Способ с периодическим удалением культуральной среды, позволяющим добавлять свежую среду, называют длительным периодическим культивированием или отъемно-доливным культивированием. Непрерывное культивирование отличается от периодического, периодического с подпиткой и отъемно-доливного тем, что при нем скорость подачи среды и скорость удаления культуры одинаковы.

Метод периодического культивирования с подпиткой можно использовать в случае потенциально токсичного субстрата, так как при этом его конце|нтрация в среде будет поддерживаться на низком уровне. Культивирование в периодическом режиме с подпиткой является средним между обычным периодическим культивированием' и непрерывным культивированием. Иногда при периодическом культивировании с подпиткой происходит более

значительное увеличение биомассы или выхода продукта, чем при обычном периодическом или непрерывном культивировании. Культивирование в лабораторных условиях по типу периодической культуры с подпиткой легко осуществляется простым добавлением в ферментер самотеком первичных или вторичных субстратов.

Настоящее периодическое культивирование с подпиткой требует, чтобы объем жидкой среды в ферментере увеличивался. Это требование обусловливает верхний предел времени культивирования, определяемый скоростью подпитки, а также изменение условий аэрации и эффективности перемешивания. Кроме того, при этом не исключена возможность обратного заражения свежей среды в сборнике из ферментера; поэтому желательно использовать прерыватель подачи среды (рис. 10.5).

Одним из преимуществ периодического культивирования с подпиткой и длительного периодического культивирования является возможность регулирования скоростей роста. Этот аспект изучен еще недостаточно [4], хотя он может стать ключевым при разработке улучшения процессов промышленного культивирования, например для биосинтеза антибиотиков.

Синхронная периодическая культура

Биохимические процессы, связанные с определенными этапами цикла развития индивидуальных клеток, можно изучать в синхронизированной периодической культуре. Синхронизация культуры наступает в том случае, когда все клетки начинают делиться с почти одинаковой скоростью. При этом зависимость логарифма числа клеток от длительности культивирования приобретает ступенчатый характер в отличие от линейного при обычном росте в периодическом режиме культивирования. Несмотря на то что развитие синхронизованной культуры происходит довольно равномерно, сохранить синхронность в течение длительного времени трудно, поскольку требуется точный контроль.

Синхронизация культуры может быть достигнута путем периодического изменения критических факторов среды. К числу технических приемов, вызывающих синхронизацию деления клеток, относятся подавление, уско-

рение или задержка их метаболических функций циклическим способом. Популяция постепенно синхронизирует свой ответ на периодические колебания метаболической активности, а затем и показатели роста. Однако этот метод требует значительных отклонений от нормального метаболизма, поэтому его использование ограничено. Единственным исключением является прорастание бактериальных спор как показатель начинающейся синхронизации культуры. Ступенчатые или резкие изменения состава среды могут привести к прорастанию спор и тем самым смоделировать процессы, близкие к естественным. Однако для получения гомогенной популяции (достичь 100%-ного образования спор или их прорастания практически невозможно) требуется применение некоторых физических способов предварительной селекции.

Общепринятый метод синхронизации культур основан на физическом выделении гомогенной фракции из гетерогенной популяции. Такой подход, часто называемый синхронизацией путем селекции, позволяет избежать проблем, связанных с нарушением метаболизма.

Согласно данным Кубитчека [34] и Пула (49], в процессе клеточного цикла объем клеток Е. coll возрастает линейно и количество биомассы — экспоненциально. Тот факт, что после деления клетки имеют наименьший объем, наталкивает на предположение, что с помощью центрифугирования (особенно в градиенте плотности) можно получить популяцию новых дочерних клеток из асинхронной культуры. Данные о линейном увеличении объема клеток на фоне экспоненциального роста их массы свидетельствуют о том, что те клетки, которые готовы к делению, или те, которые уже разделились, имеют самую высокую плотность, несмотря на различия в их размерах. С помощью центрифугирования в градиенте плотности можно получить несколько фракций клеток, причем фракция с наибольшей плотностью будет содержать и молодые (дочерние), и зрелые (готовые к делению) клетки, а фракция с наименьшей плавучей плотностью будет содержать гомогенную популяцию клеток, которые находятся в одинаковой стадии роста.

При синхронизации путем селекции в результате центрифугирования в градиенте плотности нет возможности получить новые дочерние клетки для непосредственного

изучения физиологии их роста, поскольку во фракциях, содержащих эти клетки, всегда присутствуют зрелые клетки, готовые к делению. Однако с помощью центрифугирования в градиенте плотности можно получить инокулят для роста синхронизованной культуры. Затем путем прямого отбора проб из нее можно изучать физиологию бактерий, связанную с их клеточным циклом. Ниже описан главный метод получения синхронизованных культур, в основе которого лежит метод Митчисона и Винсента [43]. Этот метод можно использовать в качестве начального этапа синхронного культивирования, имеющего свои характерные особенности в случае каждого изучаемого микроорганизма [37].

Метод синхронизации путем селекции

К экспериментам по синхронизации приступают только тогда, когда определены основные условия периодического культивирования, в том числе кинетика асинхронной культуры. После этого устанавливают режим периодического культивирования таким образом, чтобы в течение экспоненциального роста клеточная масса удваивалась от двух до пяти раз.

Готовят 500 мл стерильной среды в нескольких колбах (например, в 250-миллилитровых колбах Эрлен- мейера). Инокулируют половину этих колб и инкубируют в соответствующих условиях, а остальные стерильные колбы хранят в тех же условиях.

Выращивают клетки в системе периодического культивирования до середины экспоненциальной фазы. Быстро охлаждают культуру до 0—4 °C, погружая колбы в ледяную баню. Клетки собирают 10-минутным центрифугированием на холоду при 10 000 g.

Осадок клеток ресуспендируют в 2 мл соответствующего ледяного буфера (например, 0,1 М калий-фосфатного буфера, pH 7,0), используя гомогенизатор типа Vortex. Если клетки склонны к агрегации, то для получения суспензии отдельных клеток используют мягкую обработку их ультразвуком или мягкую гомогенизацию (в гомогенизаторе или размельчителе тканей). Для культур, которые особенно плохо поддаются ресуспендированию, можно вначале добавить к буферу 0,01% (вес/

/объем) твина 80, а затем применить ультразвуковую или механическую обработку.

Быстро, но осторожно наносят суспендированные клетки на стерильный охлажденный градиент плотности фикола. В зависимости от вида клеток градиент плотности готовят также из сахарозы, коллоидного си- ликазоля или других веществ. В случае градиента сахарозы ее стерильный охлажденный раствор наслаивают в увеличивающихся

Рис. 10.8. Типичная кривая син- концентрациях в простери- хронизованной популяции бак- лизованные и охлажденные терий.до 0 °C центрифужные про

бирки. Например, вносят в стерильную центрифужную пробирку 10 мл 35%-ной (вес/объем) сахарозы в фосфатном буфере, а затем на этот слой последовательно наслаивают по 10 мл раствора сахарозы разной концентрации (26,5; 25,5; 24,5; 22,0; 19,0 и 15,0%), приготовленного на том же буфере. Все буферные растворы готовят из основного 35%-кого раствора сахарозы. Растворы сахарозы перед использованием следует стерилизовать фильтрованием, хранить на холоду и подвергать предварительной аэрации (в случае аэробных бактерий).

Закрытые крышками центрифужные пробирки с

клетками аккуратно помещают в охлажденную центрифугу и центрифугируют 15—20 мин при 2500 g на холоду (0°С). Для более точного разделения клеток подбирают скорость и время центрифугирования таким образом, чтобы видимая полоса бактерий передвигалась не более чем на 2/з длины пробирки. И время, и скорость центрифугирования зависят от культуры.

0,5 мл самой легкой фракции клеток из центрифужной пробирки вносят в колбу с нагретой ростовой средой.

Тщательно измеряют оптическую плотность инокулированной среды, чтобы затем определять ее ступенчатое увеличение, свидетельствующее о синхронном росте культуры.

Синхронность культуры поддерживается в течение двух или трех циклов деления клеток; в случае более длительного периода синхронность приходится устанавливать заново с помощью описанного выше метода. Проточное зональное центрифугирование в градиенте плотности позволяет получать большие количества инокулята для синхронизованного культивирования микроорганизмов. Оно представляется перспективным в обеспечении «непрерывной» синхронизации с помощью рассчитанной во времени инокуляции турбидиметрически регулируемой проточной культуры (турбидостат). На рис. 10.8 показана типичная кривая роста синхронизованной популяции бактерий; видно, что после двух циклов кривая начинает выравниваться.

Периодическоеи непрерывное культивирование с диализом

(Ф. Герхардт)

Диализ представляет собой движимый концентрационным градиентом процесс разделения растворенных молекул за счет их различной диффузии через полупроницаемую мембрану. Этот процесс, применимый для роста и поддержания живых клеток, лежит в основе диффузионного метода культивирования.

Существуют и другие процессы, в которых используются мембраны, например электродиализ, ультрафильтрация, микрофильтрация и обратный осмос. Однако для получения клеток и их метаболитов лучше всего использовать именно диализ, поскольку в отличие от других методов при диализе происходит наименьшее засорение мембраны. При культивировании с диализом между культуральной камерой и сосудом с жидкостью помещают мембрану. Для повышения эффективности такого способа культивирования объем диализной жидкости должен быть значительно больше объема диализуемой культуры, или же диализную жидкость следует менять.

Часть и. рост

Кроме того, мембраны должны иметь достаточную площадь, чтобы обеспечивалась удовлетворительная скорость диффузии. Такая система культивирования с диализом может действовать in vivo или in vitro в периодическом и непрерывном режимах или при их сочетании.

Для культивирования с диализом используются мембраны трех типов, отличающиеся размером пор. Диализные мембраны имеют номинальный размер пор ~10 нм. Они задерживают клетки и макромолекулы, но проницаемы для таких мелких молекул, как основные питательные компоненты, требующиеся бактериям для их роста. Фильтрующие мембраны (или мембранные фильтры) имеют номинальный размер пор ~100 нм; они тоже задерживают клетки, но пропускают макромолекулы со сравнительно низкомолекулярной массой. Диализные мембранные трубки различного размера получают из регенерированной целлюлозы путем вискозного процесса (Union Carbide Corp.). Имеются в продаже листы диализной мембраны с большим диапазоном пор, сделанные из различных материалов (Gelman Sciences, Inc., Milli- роге Corp., Nuclepore Corp.). Для бактериологических целей следует принимать во внимание такие факторы, как автоклавируемость мембран, размер их пор, химическая инертность и проницаемость (которая в свою очередь определяется пористостью, емкостью и толщиной мембраны). Мембраны третьего типа, через которые проходят растворенные вещества, не имеют пор и проницаемы для газов, поскольку газы растворимы в мембранном материале, например в резине или поликарбонате.

Для разделения культуры и диализата может использоваться также поверхность раздела двух физически различных фаз (интерфазная диализная культура), например в твердо-жидкой двухфазной системе (разд. 9.2.2).

К специфическим преимуществам использования диализа при культивировании бактерий относятся: 1) удлинение экспоненциальной фазы роста в периодической культуре, что позволяет получать высокие плотности живых клеток; 2) увеличение стационарной фазы роста культур, что позволяет увеличить выход метаболитов, связанных с этой фазой; 3) ослабление контроля путем ингибирования продуктом за счет удаления или

разведения продуктов метаболизма, что увеличивает их образование в периодической или непрерывной культуре; 4) установление состояния равновесия с высоким уровнем метаболизма, что позволяет иммобилизовать клетки для длительного образования определенных продуктов; 5) получение метаболитов, свободных от клеток, и, наоборот, клеток, свободных от макромолекул среды; 6) возможность изучения клеточной популяции in situ или при создании in vivo искусственной среды, например в природной экологической обстановке или в организме животного; 7) возможность изучения взаимодействия между популяциями клеток.

История диализной культуры восходит к 1896 г., когда Мечников провел свои опыты с холерными вибрионами. Чтобы изучить способность вибрионов продуцировать растворимый токсин, он помещал их в коллодиевом мешочке в брюшную полость живой морской свинки. История вопроса, общие принципы, математическая теория и практическое применение диализной культуры приведены в исчерпывающем обзоре Шульца и Герхардта [51]. Опубликован [7] обзор использования принципа диализной культуры иммобилизованных клеток, применяемых в качестве ферментных препаратов (разд. 10.3.5), а в докторской диссертации Стайбера (Университет штата Мичиган, Ист Лансинг, 1979) собраны последние данные по рассматриваемому вопросу.

Системы in vivo

Термин «диффузионная камера» часто используют для описания небольшой диализной культуральной системы, которую имплантируют подопытному животному (например, в брюшину, рубец или под кожу). Она представляет собой пластмассовый цилиндр, закрытый с обоих концов мембранными фильтрами. Из такого цилиндра (типа барабана) можно отбирать пробы. Введенные в жидкую среду внутри цилиндра бактерии растут исключительно за счет диффузии питательных компонентов хозяина. Такие системы используют в бактериологии для изучения иммунных реакций и роста плохо культивируемых патогенов типа Mycobacterium leprae. Treponema pallidum и Neisseria gonorrhoeae.

Системы ex vivo

К системам ex vivo относится, например, следующая. У крупных подопытных животных (допустим, коз) хирургически обнажают сосудистый пучок на шее, выводят наружу и обеспечивают его контакт с диализным мешком, внутри которого содержится бактериальная культура. Такая культуральная диализная система ех vivo позволяет бактериям расти исключительно за счет питательных компонентов крови, причем в культуре отсутствуют макромолекулярные и клеточные защитные механизмы (если используются соответствующие диализные мембраны). В одной из таких систем бактерии находятся в обычном лабораторном ферментере и культура постоянно циркулирует, например через рубашку (с волокнами) для искусственного почечного гемодиализа, которая соединяется трубкой с артерией экспериментального животного [50]. В другой системе бактерии помещают в небольшую (3 мл) камеру из прозрачной пластмассы (поликарбоната), закрытую мембраной, по другую сторону от которой может протекать кровь. Все устройство укрепляют на шее свободно передвигающегося животного. Такая система неприменима для облигатных анаэробов, но она успешно используется для многих факультативных анаэробов, и ее можно применить для изучения реакций между паразитом (специфическим патогеном) и хозяином [26].

Системы in vitro

При культивировании с диализом в лабораторных условиях мембранную диализную трубку с культурой помещают в пробирку, колбу или бутыль со средой, причем ее сгибают таким образом, что она образует полость с двойными стенками, между которыми находится культура (рис. 10.9).

В устройстве, основную часть которого составляет стеклянная трубка из пирекса с загнутыми краями (рис. 10.10), сочетаются преимущества встряхиваемых колб (разд. 10.1.2) и диализной культуры. В подобных устройствах [51] можно использовать любые типы листовых мембран.

Рис. 10.9. Система для культивирования бактерий в диализном мешке. Трубка диализной мембраны свернута таким образом, что образует мешок с двойными стенками (3), в наружных полостях которого содержится культура (2). Среда (/) помещена в оплетенную бутыль. Имеются также трубка для инокуляции и внесения проб (5) и сифон для отбора культуры (4) [53].

Рис. 10.10. Сосуд для диализной культуры, оборудованный удерживающим устройством для крепления на круговой качалке. Нижняя часть сосуда заполнена стерильной средой, которая перемешивается вращающимся шариком. В верхней части находится культура, которая турбулентно аэрируется за счет перемешивания в присутствии отбойника [25].

При осуществлении культивирования с диализом в лабораторных или производственных масштабах целесообразно выращивать бактерии в отдельной замкнутой системе, которая соединялась бы с диализной замкнутой системой промежуточным диализатором [22]. Такое устройство «диализатор—диализная культура», схематически представленное на рис. 10.11, может работать в периодическом режиме в обеих замкнутых системах

Рис. 10.11. Схемы четырех моделей диализного культивирования. Принципы изображенной системы диализатор—диализная культура пригодны для многих целей. Обозначения- F — скорость потока, 5 — концентрация субстрата, V — объем, X — концентрация клеток, поступающих в резервуар и ферментер, а также их концентрация в этих сосудах и в вытекающей из них среде. Воспроизводится с некоторыми изменениями из работы [51] А. Резервуар и ферментер для периодического культивирования. Б. Резервуар и ферментер для непрерывного культивирования. В. Резервуар для периодического культивирования и ферментер для непрерывного культивирования. Г. Резервуар для непрерывного культивирования и ферментер для периодического культивирования.

(рис. 10.11, Л), в непрерывном режиме в обеих системах (рис. 10.11,5) или в двух комбинациях этих режимов (рис. 10.11, В, Г).

Основным условием эффективной работы таких систем является подходящее устройство для диализа. Такое устройство, напоминающее рамный фильтр-пресс, содержит сепараторы из силиконовой резины, которые способствуют созданию турбулентных потоков культуры и диализата по разные стороны от мембран [51J. Для этих целей используют также различные типы гемодцализа- торов.

Рис. 10.12. Схема системы диализного проточного культивирования в ферментере с подпиткой. Для максимального удаления токсичных продуктов метаболизма в диализной системе используется поток воды [15]

Система ферментераСистема ферментераСистема с диализомСистема с диализомГотовую систему можно приспособить к используемой культуре. Так, при лимитировании роста бактерий токсичными метаболитами (например, молочной кислотой) наиболее эффективно работает полностью проточная система (рис. 10.12). Непосредственно в ферментер субстрат (S°f) подают в довольно высокой концентрации, и поэтому потребность в обычном сосуде для диализата отпадает. Диализная система в данном случае состоит только из шлангов, насоса и диализной части диализатора и имеет относительно небольшой объем (ГД. В систему поступает только вода с довольно высокой скоростью (Fd). Такая система обеспечивает максимально возможный для диализа концентрационный градиент. Стайбер и др. [54] применили ее в своей работе и показали максимальное превращение концентрированной (25%) лактозы в молочную кислоту.

Система ферментера

Система ферментера

Система с диализом

Система с диализом

Математическое моделирование и применение ЭВМ

На примере описанных выше систем и практического использования проточного культивирования с диализом мы обсудим значение математического моделирования и расчетов на ЭВМ для предсказания результатов, которые можно получить при культивировании бактерий. Для подтверждения теоретических предсказаний прово-

Рис. 10.13. Влияние времени задержки клеток (Г;) на остаточное содержание лактозы в ферментере Sf и диализной системе Sa в процессе проточного диализного культивирования. Кривые получены путем расчетов математической модели на ЭВМ; точки взяты из экспериментальных данных с целью продемонстрировать хорошее соответствие между результатами и теоретическими предсказаниями [55].

дят лабораторные опыты, изменяя лишь некоторые экспериментальные условия в заранее выбранных критических точках. В свою очередь экспериментальные результаты используются для установления констант роста и для того, чтобы подтвердить необходимость в дополнительных членах в уравнениях. Основываясь на успешных теоретических предсказаниях и экспериментальных подтверждениях, модель становится значительно более точной и может быть полезна при управлении процессом культивирования.

Примером такого сочетания теоретического и экспериментального подхода к бактериальному процессу могут служить данные Стайбера и др. [15, 54, 55], полученные при культивировании бактерий в среде с лактатом и аммонием. Для субстрата, продукта и биомассы в ферментере и диализной замкнутой системе были выведены уравнения материального баланса и скоростей соотношения реакций. Эти уравнения объединили, опреде-

лили в них переменные в безразмерной форме, а производные по времени приравняли к нулю, чтобы получить общее решение для состояния равновесия, которое описывается пятью квадратными уравнениями. Реальные величины для варьируемых членов были введены в программу для вычислительной машины. При сравнении смоделированных предсказаний с экспериментальными данными (рис. 10.13) была получена хорошая корреляция.

Такая методология, сочетающая теоретические предсказания и экспериментальные подтверждения, широко используется в промышленных микробиологических процессах, но в других областях бактериологии она почти не применяется. Этот важный метод следует значительно более широко применять в научных исследованиях, например для предсказания исхода инфекционных заболеваний.

Ферментеры

с иммобилизованными клетками (Ф. Герхардт)

Большинство методов бактериальных культур предназначено для максимального размножения клеток, и основная масса питательных компонентов идет на поддержание их роста. Однако в промышленных ферментационных процессах часто необходимо получать максимальные количества определенных метаболитов, и поэтому желательно, чтобы питательные компоненты среды расходовались не для роста бактерий, а для образования ими требуемого продукта. В последнее десятилетие огромное количество исследований направлено на использование бактериальных ферментов или целых клеток, «иммобилизованных» в ферментере, с целью максимально возможного превращения субстрата в необходимый продукт.

Аббот [6] рассматривает иммобилизацию клеток как «физическую локализацию микроорганизмов, позволяющую повторно и экономно их использовать». Можно также определить ферментер с иммобилизованными клетками как устройство, обеспечивающее условия, в которых метаболизм поддержания достигает своего максимума, а рост сводится к минимуму.

Проиллюстрируем этот принцип на примере давно

известного «скорого способа образования уксуса», при котором колонии уксуснокислых бактерий в виде пленки находятся в иммобилизованном состоянии на деревянных стружках, заполняющих колонку. Сверху в такую колонку подают этанол, а снизу вверх — воздух, обеспечивающий синтез уксусной кислоты. После образования бактериальной пленки в дальнейшем она почти не растет, тогда как жизнеспособность бактерий поддерживается за счет окисления этанола в ацетат. Такой процесс может продолжаться непрерывно в течение недель или месяцев.

Одним из главных методов иммобилизации клеток остается их физическое прикрепление или химическое связывание с твердым носителем, в то время как для образования скоплений клеток используются другие методы.

Детальное описание методов иммобилизации клеток в ферментерах не входит в задачи этой книги; по этому вопросу существует несколько обзоров [6, 7, 13].

10.4. СБОР И ОЧИСТКА

Выбор способа отделения бактериальных клеток от среды культивирования определяется тем, как в дальнейшем будут использоваться фракции. Так, если собираются изучать клетки, то их отделение путем фильтрования нежелательно, поскольку при этом клетки могут загрязниться материалом, имеющимся в фильтре. Если же будут исследовать культуральную жидкость, то после центрифугирования культуры рекомендуется отбрасывать часть надосадочной жидкости, чтобы избежать ресуспендирования клеточного осадка при ее удалении.

Фильтрация

Осадочная фильтрация

Для получения бактериальных клеток из культуральной среды существуют два типа фильтрации: осадочная и мембранная. Для осадочной фильтрации используют высокопористые материалы. Обычно фильтрующая система состоит из подложки фильтра (фильтровальной бу-

ю Жидкая культура

маги или ткани с довольно большим диаметром пор) и толстого нанесенного сверху слоя фильтрующего материала (целлюлозы, диатомовой земли, кизельгура и др.), который легко суспендируется в водных средах с образованием пористого осадка, задерживающего бактерии [57]. При использовании фильтрующего материала увеличивается эффективная поверхностная зона фильтра и соответственно количество бактерий, задерживаемых одним фильтром. Фильтрующий материал можно добавлять непосредственно в культуральную среду или предварительно наслаивать на подложку фильтра. На практике добавление фильтрующего материала, такого, как целлюлоза, в культуральную среду позволяет профильтровать в 10 раз больше жидкости, чем при предварительном нанесении того же количества целлюлозы на подложку фильтра. Однако при таком добавлении значительно возрастают трудности, связанные с извлечением клеток для последующих исследований.

Осадочное фильтрование проводят на воронке Бюхнера. Ее укрепляют в вакуумной колбе и выстилают высокопористой фильтровальной бумагой (например, ватман № 1). Включают вакуумный насос и на бумагу осторожно и равномерно наливают предварительно приготовленную суспензию кальцифицированной диатомовой земли, так чтобы образовался слой толщиной 2— 5 мм. Поскольку через такой слой фильтрация происходит равномерно, бактерии можно удалять по мере накопления, соскабливая их с поверхности фильтра. Это позволяет проводить довольно длительное фильтрование без замены фильтра.

При осадочной фильтрации из культуральной среды удаляется большинство микроорганизмов, в результате чего получают хорошо просветленный фильтрат. Однако для стерилизации жидких сред этот метод неприменим. Клетки, полученные осадочной фильтрацией, обычно загрязнены большим количеством фильтрующего материала, который может помешать их дальнейшему изучению.

Мембранная фильтрация

В отличие от осадочной мембранная фильтрация основана не на использовании глубоких или извилистых пор фильтрующего материала, а на задержке бактерий

на его поверхности. Бактерии не способны проходить через поры мембраны, диаметр которых изменяется в очень узких пределах. На практике при мембранной фильтрации требуется дополнительное давление на фильтр. Аппараты для мембранной фильтрации и мембранные фильтры с различными размерами пор имеются в продаже (Millipore Corp., Nucleopore Corp., Gelman Sciences, Inc.).

Выбор мембраны зависит от характеристик культуры и от того, что необходимо получить — клетки или фильтрат. Поскольку средний размер клеток бактерий равен приблизительно 0,5—1,5 мкм, для их полного удаления в случае стерилизации фильтрованием требуется микропористый мембранный фильтр с размером пор менее 0,5 мкм. Для стерилизации фильтрованием часто используют мембраны с диаметром пор 0,22 + 0,02 мкм. Такие мембраны подходят для большинства методов стерилизации, но из-за того, что бактерии обладают достаточной гибкостью, теоретически можно допустить, что они способны проходить через них. Поэтому растворы, стерилизованные фильтрованием через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, следует периодически проверять на стерильность.

Использование мелкопористых мембранных фильтров со средним размером пор 0,45 ±0,04 мкм в принципе позволяет быстро и эффективно фильтровать бактериальные культуры, но не обеспечивает стерильности фильтрата. Сами мембранные фильтры и аппарат для стерилизации фильтрованием должны стерилизоваться автоклавированием или каким-либо другим способом. Собирать бактериальные клетки и готовить стерильные растворы путем фильтрования лучше всего под давлением азота. Такая фильтрация значительно снижает или полностью препятствует окислению фильтруемого вещества благодаря положительному давлению инертного газа в фильтрующем устройстве. Если необходимо собирать клетки в стерильных условиях, то азот следует предварительно простерилизовать фильтрованием. Все консультации по вопросам рабочего давления и размера используемого оборудования следует получить у фирмы-изготовителя.

Дополнительные сведения по осадочной и мембранной фильтрации можно найти в работах [47, 58, 60].

Центрифугирование

Сбор бактериальных клеток путем центрифугирования обычно приводит к менее полному их отделению от культуральной среды, чем с помощью фильтрации. Однако этот метод позволяет получить культуральную среду и клетки, свободные от загрязнения посторонними веществами, например фильтрующим материалом; поэтому он широко используется для получения биомассы в лабораторных условиях. Но для приготовления стерильных растворов центрифугирование не пригодно.

Скорость осаждения клеток в процессе центрифугирования зависит от таких факторов, как вязкость среды, размер (диаметр) частиц и разница в плотности между клетками и суспендирующей средой. Все эти факторы определяют время и скорость центрифугирования в каждом конкретном случае. Для осаждения большинства бактерий из относительно невязких сред (таких, как питательный бульон) вполне достаточно центрифугирования при 10 000 g в течение 10—15 мин. Поскольку упаковка бактерий в осадке зависит от их размера и условий культивирования, при подборе скорости или времени центрифугирования необходимо руководствоваться тем, чтобы осадок при сливании надосадочной жидкости как можно меньше подвергался ресуспендированию.

Оборудование для центрифугирования

Лабораторные центрифуги работают как в периодическом, так и в проточном режиме, причем иногда оба вида операций можно выполнять в одной центрифуге. Существуют роторы самых разных типов, но все они работают по одному общему принципу — регулируемого приложения центробежной силы во вращающемся роторе. Поскольку средний диаметр частиц в бактериальной культуре довольно мал, для разделения клеток и среды с помощью центрифугирования обычно необходимы высокие скорости вращения. При высокоскоростном центрифугировании образуется большое количество тепла, поэтому центрифуги должны быть оснащены собственной охлаждающей системой. Если такой системы нет,

то работу необходимо проводить в холодной комнате. Кроме того, поскольку центрифужные роторы выпускаются различных размеров, при работе с ними следует исходить не из скорости и времени центрифугирования, а из величины центробежной силы (обычно выражаемой в единицах g) и времени центрифугирования. Фирмы — изготовители центрифуг — DuPont Instruments, Ivan Sor- val, Inc., International Equipment Co., Beckman Instruments, Inc. — публикуют табличные данные о скоростях вращения роторов и эквивалентных им величинах центробежных сил.

При работе с большими объемами культуральной среды используют проточное центрифугирование (сепараторные центрифуги). Центрифуги с охлаждением фирмы DuPont — Sorval оборудованы специальным ротором и системой подачи среды для работы в проточном режиме. Этот метод пригоден для выделения большинства бактерий, кроме хлопьеобразующих видов и грибов, обычно забивающих пути подачи среды.

Центрифуги типа Sharples оборудованы длинными и узкими роторами, через которые культура подается снизу вверх. При высокой скорости вращения таких роторов клетки оседают на их стенках. Данный способ центрифугирования дает возможность очень быстро получать большие количества клеток, а также проводить дифференциальное центрифугирование частиц различного размера или плотности. Существуют модели цент рифуг как с ограниченной емкостью для биомассы, так и с непрерывным удалением осадка клеток.

Методика центрифугирования

Ниже описана методика центрифугирования, позволяющая получать отмытые клетки в стерильных условиях. Если стерильность не требуется, то метод можно упростить.

Прежде всего готовят соответствующее количество раствора для промывания клеток, получаемых после центрифугирования (разд. 25.1). Объем раствора должен быть в 4—6 раз больше объема культуры, а значения ионной силы и pH промывающего раствора и росто-

вой среды должны быть очень близки. Перед использованием раствор стерилизуют и охлаждают до 0—4 °C.

Используемый в работе центрифужный ротор охлаждают в холодильнике. Предостережение: нельзя помещать ротор, имеющий комнатную температуру, на ось центрифуги, а затем охлаждать его с помощью центрифужной системы охлаждения. При этом ротор может сжаться и настолько плотно закрепиться на оси, что впоследствии возникнут сложности при его снятии.

Стерилизуют несколько центрифужных пробирок с крышками (полипропиленовые и поликарбонатные пробирки можно автоклавировать) и дают им остыть. Для сохранения стерильности пробирки при ее последующем использовании перед автоклавированием крышку и верхнюю часть пробирки обертывают алюминиевой фольгой.

Определяют объем центрифужных пробирок и с соблюдением правил асептики заполняют их на 2/з бактериальной культурой. Пробирки попарно уравновешивают. Если окажется непарная пробирка, ее уравновешивают с пробиркой, заполненной дистиллированной водой. Все пробирки надежно закрывают стерильными крышками.

Помещают попарно уравновешенные пробирки в ротор друг против друга.

Проводят центрифугирование в соответствующих условиях согласно инструкции фирмы-изготовителя. Большинство бактерий осаждаются при центрифугировании в течение 10—15 мин при 10 000 g. Некоторые центрифужные системы имеют специальное приспособление, ограничивающее вибрацию ротора при его вращении с малыми скоростями (при остановке). Если такое приспособление отсутствует, не исключена опасность взбалтывания осадка.

Пробирки вынимают осторожно из ротора и отмечают положение бактериального осадка. Надосадочную жидкость в стерильных условиях декантируют или переносят пипеткой в стерильный сосуд. При этом практически невозможно не вызвать частичного ресуспендирования бактериального осадка. Чтобы бактерии не попадали в сос^д, приходится оставлять часть надосадочной жидкости в пробирке.

Каждую пробирку с бактериальным осадком с соблюдением правил асептики заполняют на 2/з объема стерильным холодным раствором для промывания. Осадок бактерий суспендируют в этом растворе с помощью миксера типа Vortex. Этапы 4—6 повторяют не менее 4 раз, меняя раствор для промывания.

После завершения промывки надосадочную жидкость удаляют с соблюдением правил асептики и осадок суспендируют в небольшом количестве стерильной среды. Полученную суспензию используют в дальнейших исследованиях.

Число отмывок при фильтрации или центрифугировании зависит от условий культивирования, объема раствора для промывания и объема сырой биомассы. Если сырая биомасса занимает около 1/10 объема всей культуральной суспензии, то 4-кратной промывкой объемами раствора, равными исходному объему культуры, удаляется до 99,99% всех растворимых примесей. Несколько промывок нельзя заменить одной, объем которой равнялся бы суммарному объему всех промывок, поскольку каждая последующая промывка снижает уровень примесей почти в 10 раз.

РАСЧЕТЫ ВЫХОДА БИОМАССЫ

При расчете выхода биомассы исходят из материального баланса устойчивой системы культивирования. Моно определил константу выхода, или экономический коэффициент (У), следующим образом:

у Образованные клетки, г Использованный субстрат, г

Выход биомассы в расчете на использованный субстрат часто обозначают как Yx/S, где в индексе указано отношение соответствующих концентраций. Широко принято использование соотношения масс для выражения выхода клеток на основании потребления углеродного субстрата [10, 42]. Выход можно довольно легко рассчитать, определив продукцию сухой биомассы за определенный период культивирования по отношению к массе использованного в этот же период углеродного субстрата.

Если выход биомассы хотят отнести к потреблению

кислорода или образованию АТР, синтезируемого в процессе роста, то его определяют следующим образом:

У Сухой вес клеток, г х/АТР Образованный АТР, моль ’

у Сухой вес клеток, г х/Ог Поглощенный кислород, моль

При различных условиях и для многих микроорганизмов выход клеток, рассчитанный по отношению к образовавшемуся АТР или поглощенному кислороду, отличается постоянством. Например, в условиях лимитирования энергетическим субстратом и довольно быстрой скорости роста выход клеток составляет примерно 10±2 г сухой биомассы на 1 моль синтезируемого АТР.

Однако выход биомассы в пересчете на 1 моль АТР довольно широко варьирует для разных бактерий, если рост не лимитируется энергетическим субстратом, а скорость роста культуры значительно ниже максимальной. Источники углерода и энергии могут использоваться не только для роста клеток, но и для образования продукта. Кроме того, энергетические субстраты расходуются на поддержание жизнеспособности клеток. Поскольку клетки могут использовать энергетические субстраты для дыхания в отсутствие роста, энергетические затраты на поддержание жизнеспособности бактерий будут вносить свой вклад в потребление этих субстратов без сопутствующего увеличения биомассы. Эндогенный метаболизм практически не оказывает влияния на расчеты выхода клеток, если скорость роста культуры близка к максимальной и энергетический субстрат является лимитирующим питательным компонентом. Однако потребление энергетических субстратов для поддержания жизнеспособности клеток может значительно возрасти при скоростях роста ниже максимальной или в экстремальных биофизических условиях среды. Поскольку надежные расчеты выхода биомассы требуют осторожного и тщательного контроля условий культивирования, лучше всего их проводить для хемостатных систем. Именно в этих условиях лимитирующий рост субстрат и удельная скорость роста ц могут регулироваться.

Расчет общего выхода биомассы на основании данных, полученных в проточной культуре, предполагает,

что концентрации субстрата и клеток находятся в состоянии равновесия. Поэтому легче всего такой расчет провести для культуры, выращиваемой в хемостате. В хемостатной среде скорость роста бактерий лимитируется только одним питательным компонентом. Все остальные питательные компоненты добавляются в избытке. Для составления такой среды следует провести элементный анализ бактерий, которые будут культивироваться в хемостате. В среду добавляют все компоненты клетки, обнаруженные при таком анализе. В конечном счете рост определяется концентрацией лимитирующего питательного компонента. Поскольку концентрация клеток в хемостате регулируется автоматически в соответствии со скоростью добавления к среде лимитирующего питательного компонента, более важно отношение компонентов среды, а не их абсолютные количества. Поэтому для определения общего выхода биомассы среду следует составлять так, чтобы отношение элементов, поставляемых в среду, к элементам, являющимся лимитирующими, было значительно выше, чем отношение, вычисленное на основании данных элементного анализа.

Приводимые ниже расчеты основаны на том, что в отношении концентрации клеток и концентрации субстрата система находится в состоянии равновесия. За этим следят в течение периода времени, достаточного для замены одного объема среды в ферментере. Если условия культивирования начинают изменяться (увеличивается или уменьшается скорость подачи среды в хемостат), то оператор должен иметь достаточно времени для возвращения культуры в состояние равновесия. Этого достигают путем смены не менее четырех объемов жидкости в ферментере. Поскольку проточный ферментер работает по принципу разбавления, ступенчатое или импульсное изменение условий работы ферментера может вызвать отклонения от существующего состояния равновесия. В результате система будет стремиться к новому состоянию равновесия со скоростью, определяемой скоростью разбавления культуры. Иными словами, для завершения перехода культуры к новому равновесному состоянию необходимы четыре цикла. Например, 2-литровый хемостат, в котором скорость поступления и удаления среды равна 0,5 л/ч, работает со скоростью раз-

бавления F[V= /) = 0,25 ч-1. Время, необходимое для четырех обновлений объема среды, рассчитывается путем деления 4 на скорость разбавления. В данном случае объем среды в ферментере будет полностью обновлен 4 раза за 16 ч (4/0,25 ч-1), т. е. после изменения условий роста проточной культуры и до установления нового равновесия должно пройти не менее 16 ч.

В действительности время, необходимое для достижения нового состояния равновесия, может зависеть от способа изменений условий культивирования. Если такие изменения заключаются, например, в ступенчатом снижении поступления питательных компонентов, то достаточно четырех циклов. Если же эти изменения включают в себя увеличение поступления питательных компонентов в условиях быстрого роста культуры, то для достижения нового равновесия будет необходимо более четырех циклов. В этом случае для быстрорастущих клеток могут понадобиться новые ферменты, осуществляющие метаболизм добавляемых питательных компонентов.

После достижения состояния равновесия при проточном культивировании общий выход биомассы можно определить следующим образом:

у (X — Хо) Сухой вес клеток, г

x,s (So — S) Поглощенный субстрат, г ’

где X — сухой вес клеток (в граммах) на 1 л вытекае- мой из ферментера среды, Хо — сухой вес клеток (в граммах) на 1 л среды, подаваемой в ферментер (обычно нуль), S— вес субстрата (в граммах) на 1 л вытекаемой среды и So — вес субстрата (в граммах) на 1 л среды, подаваемой в ферментер. Если в ферментер подается стерильная среда, то величина Хо равна нулю и выход становится равным Yx/S = ХЦ50—S).

Для определения сухого веса клеток путем количественного фильтрования через предварительно взвешенный мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм пропускают тщательно отмеренный объем культуры из ферментера. Клеточный осадок на фильтре отмывают буфером или дистиллированной водой, чтобы удалить остатки среды. Мембранный фильтр высушивают до достоянного веса в термостате с температурой не выше 105 °C.

Чтобы избежать излишнего подсушивания клеток, которое приводит к потере веса, температуру термостата можно снизить. Предостережение: многие фильтры после отмывки и высушивания теряют свой вес. Поэтому следует всегда фильтровать и взвешивать несколько проб, а также промывать и взвешивать несколько фильтров в качестве контроля. Более точный метод заключается в центрифугировании и отмывке клеток, как описано выше (разд. 10.4.2). При этом отбирают большие объемы среды, ресуспендируют клетки в небольшом объеме воды, высушивают и взвешивают (разд. 25.2.2).

Общий выход биомассы связан с потребностями в лимитирующих субстратах для поддержания жизнеспособности клеток и их роста, причем субстраты выступают в роли источника энергии согласно следующему уравнению:

1 m , 1

где ц— удельная скорость роста (ч™1), m— удельная скорость потребления субстрата для поддержания жизнеспособности клеток (ч-1), Уж/з — общий выход клеток и Ус— удельный выход роста. Величины m и Уо можно определить, построив на миллиметровой бумаге график зависимости 1/Ужд от 1/ц (напомним, что для простой проточной культуры без рециклизации клеток p = D). Если данная зависимость имеет вид прямой линии, то эта линия пересекает ось ординат в точке 1/Ус, а ее наклон соответствует величине т.

Хотя выход биомассы удобно выражать в виде биомассы в пересчете на массу или количество молей использованного субстрата, при этом иногда возможна путаница. Херберт [30] предложил выражать выход биомассы в грамм-атомах углерода выросших клеток в пересчете на грамм-атомы элемента, поглощенного из лимитирующего субстрата. Принятие этого определения поможет стандартизировать приводимые в литературе методы и устранить большую часть неясностей при интерпретации полученных данных. При выражении интенсивности роста в грамм-атомах углерода образованных клеток нет необходимости определять их полный эле-

ю жидкая культур/

Таблица 10.5. Термины, используемые при расчетахвыхода биомассы

Обозначениеа

Определение

Yx;s, Ys, Y

Yx/S(M\X), Умах

Ya

Ух,о2, Уо,

Ух/ATP, УATP

Yp/s, Yp

Yp/s

Yp/s^KX)y Ур(МАХ)

Коэффициент общего выхода биомассы (общий экономический коэффициент), Yxis равен отношению веса образованных клеток (в граммах) к весу потребленного питательного субстрата (в граммах)

Молярный коэффициент выхода; Yx/m равен отношению веса образованных клеток (в граммах) к весу потребленного питательного субстрата (в молях)

Теоретический или максимальный коэффициент выхода; Умах равен отношению веса образованных клеток (в граммах) к весу потребленного питательного субстрата (в граммах)

Удельный коэффициент выхода; Ус равен отношению веса образованных клеток (в граммах) к весу питательного субстрата (в граммах), потребленного для образования клеток

Коэффициент общего выхода биомассы Ух/о2 равен отношению веса образованных клеток (в граммах) к весу потребленного кислорода (в молях)

Коэффициент общего выхода биомассы, Ух/атр равен отношению веса образованного химического продукта (в граммах) к весу образованного АТР (в молях)

Коэффициент общего выхода продукта; Ypjs равен отношению веса образованного химического продукта (в граммах) к весу потребленного субстрата (в граммах)

Удельный коэффициент выхода продукта; Yp/s равен отношению веса синтезированного продукта (в граммах) к весу образованных клеток (в граммах)

Теоретический или максимальный коэффициент выхода продукта; Ур/х<маХ) равен отношению веса продукта (в граммах) к весу субстрата, превращенного в продукт (в граммах)

Продолжение табл. 10.5

Обозначение*2

Определение

Удельная скорость роста [отношение веса образованных за 1 ч клеток (в граммах) к общему весу клеток (в граммах)]

tn

Коэффициент поддержания [отношение веса потребленного за 1 ч субстрата (в граммах) к общему весу клеток (в граммах)]

а Символ, обозначенный первым, используется чаще.

ментный состав; достаточно только определить содержание углерода. В табл. 10.5 суммированы термины, используемые при расчетах выхода биомассы.

ФИРМЫ-ИЗГОТОВИТЕЛИ

Aaron Equipment Со., Div. Areco Inc., 9301 W. Bernice St., Schiller Park, IL 60176

Air Resources, Inc., 800 E. Northwest Highway, Palatine, IL 60067

Alloy Crafts Co., Subsidiary of Lox Equipment Co., RR Box 2C-A, Delphi, IN 46923

Artisan Industries, Inc., 73 Pond St., Waltham, MA 02154

B. Braun Melsungen AG, P.O.B. 346, D-3508 Melsungen, West Germany

Beckman Instruments, Inc., 2500 Harbor Blvd., Fullerton, CA 92634

Bellco Glass, Inc., 340 Edrudo Rd., Vineland, NJ 08360

Brighton Corp., 11861 Mosteller Rd., Cincinnati, OH 45241

Chemapec, Inc., 230-C Crossway Park Dr., Woodbury, NY 11797

Chemineer Agitators, P. O. Box 1123, Dayton, OH 45401

Cole-Palmer Instrument Co., 7425 N, Oak Park Ave., Chicago, IL 60648

Crepaco, Inc., 8303 W. Higgins Rd., Chicago, IL 60631

Dollinger Corp., P. O. Box 23200, Rochester, NY 14692

Dow Corning Corp., P. O. Box 1767, Midland, MI 48640

DuPont Co., Instrument Products, Scientific and Process Div., Concord Plaza, Quillen Bldg., Wilmington, DE 19898

Fisher Scientific Co., 711 Forbes Ave., Pittsburgh, PA 15219

Gelman Sciences, Inc., 600 S. Wagner Rd., Ann Arbor, MI 48106

General Electric Co. (Silicone Products Dept.), Waterford, NY 12188

Glitsch Inc., 4900 Singleton Blvd., P. O. Box 226227, Dallas, TX 75266

Infrared Industries, Inc., Box 989, Santa Barbara, CA 93102

Koch Engineering Co., Inc., 4111 S. 37 St. N, Wichita, KS 6/220

Leeds and Northrup Co., Sumneytown Pike, North Wales, PA 19454

LKB Instruments, Inc., 1221 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852

The London Co., 811 Sharon Dr., Cleveland, OH 44145

Manostat Corp., 519 Eighth Ave., New York, NY 10018

L. E. Marubushi, Co., Ltd., Koki Bldg., 8—7 2-Chome, Kaji-cho, Chiyoda, Tokyo, Japan

Michigan Dynamics, Division of AMBAC Industries Inc., 32400 Ford Rd., Garden City, MI 48135

Millipore Corp., Ashby Rd., Bedford, MA 01730

Mine Safety Appliances Co., 600 Penn Center Blvd., Pittsburgh, PA 15235

Mixing Equipment Co., Inc., Unit of General Signal, 177 Mt. Read Blvd., Rochester, NY 14603

New Brunswick Scientific Co., Inc., 44 Talmadge Rd., P. O. Box 986, Edison, NJ 08811

Nuclepore Corp., 7035 Commerce Circle, Pleasanton, CA 94566

Perkin-Elmer Corp., Maine Ave., Norwalk, CT 06856

Perry Products Corp., Mount Laurel Rd., Hanesport, NJ 08036

The Pfaudler Co., The Sybron Corp., 1000 West Ave., Rochester, NY 14603

Scientific Products, Division of American Hospital Supply, 1430 Waukegan Rd., McGraw Park, IL 60085

Sensorlabs, Division of Instrumentation Laboratories, Inc., 113 Hartwell, Lexington, MA 03173

Sharples-Stokes, Division of Pennwalt Corp., 955 Mearens Rd., Warminster, PA 18974

Taylor Instrument Co., 95 Ames St., Rochester, NY 14601

Trane Thermal Co., 250 Brook Rd., Conshohocken, PA 19428

Union Carbide Corp., 270 Park Ave., New York, NY 10017

The VirTis Co., Route 208, Gardiner, NY 12525

ЛИТЕРАТУРА

Общая литература

Aiba S., Humphrey A. E., Millis N. F. Biochemical engineering, 2nd ed., Academic Press, Inc., New York, 1973. В этой работе даны фундаментальные основы многих представленных в данной главе способов культивирования и сбора клеток.

Bailey J. Е., Ollis D. F. Biochemical engineering fundamentals McGraw-Hill Book Co., New York, 1977. Работа, в которой приведена интересная дискуссия по вопросу кинетики микробного роста. Она доступна микробиологам с незначительной инженерной подготовкой или не имеющим ее вообще.

Haldeman L. V., Cato Е. Р., Moore W. Е. С. Anaerobe laboratory manual, 4th ed., Virginia Polytechnic Institute and State University, Blacksburg, 1977. Это очень подробное руководство для лабораторного изучения анаэробных бактерий. Многие считают его основным источником лабораторных методик выращивания анаэробов.

Pirt S. I. Principles of microbe and cell cultivation, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1975 [Имеется перевод: Перт С. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. — М- Мир, 1978.]

Seeley Н. II7., Van Demark Р 1 Microbes in action, 2nd ed, W H Freeman and Co, San Francisco, 1972

Специальная литература

Abbott В. J. Annu. Rep. Ferm. Proc., 1, 205—233 (1977).

Abbott В. J. Annu. Rep. Ferm. Proc., 2, 91—124 (1978).

Abbott В. J., Lashin A. I., McCoy С. I. Appl. Microbiol., 28, 58— 63 (1974).

Borkowski J. D., Johnson M. J. Biotechnol. Bioeng., 9, 635—639 (1967).

Boyles D. T. Biotechnol. Bioeng., 20, 1101—1104 (1978).

Bryant I. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (eds.), Methods in microbiology, vol. 2, p. 187—203, Academic Press, Inc., New York, 1970.

Cameron J., Godfrey E. I. Biotechnol., Bioeng., 11, 967—985 (1969).

Chibata I. Adv. Appl. Microbiol., 22, 1—27 (1977).

Collins E. B„ Tillion A. IF. J. Dairy Sci., 60, 387—393 (1976).

Coalman G. A., Stieber R. IF., Gerhardt P. Appl. Environ. Microbiol., 34, 725—732 (1977).

Dietrich G. G., Watson R. J., Silverman G. J. Appl. Microbiol., 24, 561—566 (1972).

Difco. Difco manual of dehydrated culture media and reagents for microbiological and clinical laboratory procedures, 9th ed., Difco Laboratories, Detroit, Mich., 1953.

Dowell V. R., Hawkins T. M. Laboratory methods in anaerobic bacteriology. Center for Disease Control Laboratory Manual, US Government Printing Office, Washington, D. C., 1974.

Dunn I. J., Mor M. R. Biotechnol. Bioeng., 18, 1805—1822 (1975).

Elsworth R. Chem. Eng. (London), 258, 63—71 (1972).

Evans C. G. T., Hervert D„ Tempest D. W. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (eds.), Methods in microbiology, vol. 2, p. 277—327, Academic Press, Inc., New York, 1970.

Evans J. B. J. Gen. Microbiol., 91, 188—190 (1975).

Freedman D. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (eds.), Methods in microbiology, vol. 2, p. 175—185, Academic Press, Inc., New York, 1970.

Gallup D. M„ Gerhardt P Appl. Microbiol.. 11. 506—512 (1963).

Gerhardt P., Gallup D. M. J. Bacterio!., 86, 919—929 (1963).

Gerhardt P., Quarles J. M„ Beaman T. C„ Belding R C. J. Infect. Dis., 135, 42—50 (1977).

Grant G. A., Han Y. W., Anderson A. W. Appl. Environ. Microbiol., 35, 549—553 (1978).

Hall M. I, Ratledge C. Appl. Environ. Microbiol., 33, 577—584 (1977).

Harrison D. E. F. J. Appl Chem. Biotechnol.. 22, 417—420 (1972).

Herbert D. In: A. C. R Dean, D C. Ellwood, C. G. T. Evans and J. Melling (eds.), Continuous culture 6: applications and new fields, p. 1—30, Ellis Horwood Ltd., Chichester. 1976.

Hishinuma K., Iida Y., Kobayashi K.. Ikeda S. In: G. Terui (ed), Proceedings of the 4th International Fermentation Symposium, Fermentation Technology Todav n 155—161 1972.

Humphrey A. E In: J. J. McKetta and W. A. Cunningham (eds.). Encyclopedia of chemical process design, vol 4, p 359—394, Marcel Dekker, Inc., New York, 1977.

Khaergaard L. Biotechnol. Bioeng., 20, 1691—1694 (1978).

Kubitschek H. E. Biophys. J., 8, 792—804 (1968).

Lien H. C., Chem B. L, Creagan С. C. Biotechnol. Bioeng., 19, 425—433 (1977).

Linek, Sobotka V. M., Prokop A. Biotechnol. Bioeng. Symp. 4, 429— 453 (1973).

Lloyd D. L., Edwards J. C., Chagla A. H. J. Gen. Microbiol., 88, 153—158 (1975).

Luedeking R. In: N. Blackebrough (ed.), Biochemical and biological engineering science, vol. 1, p. 181—243, Academic Press, Inc., New York, 1976.

Margaritis A., Zajic J. Biotechnol. Bioeng., 20, 939—1001 (1978).

Martin D. F., Katt E. C., Kim Y. S. Environ. Lett., 7, 39—46 (1974).

Melling J. In: A. Wiseman (ed.), Topics in enzyme and fermentation biotechnology, p. 10—39, Ellis Horwood Ltd. (John Wiley and Sons, Inc., distributors), Chichester, 1976.

Mickelson M. N. J. Bacteriol., 190, 96—105 (1971).

Mitchison J. M., Vincent W. S. Nature (London), 205, 987—989 (1965).

Monod J. Recherches sur le croissance des cultures bacteriennes, 2nd ed., Hermann, Paris, 1942.

Monod J. Annu. Rev. Microbiol., 3, 371—394 (1949).

Monod J. Ann. Inst. Pasteur Paris, 79, 390—410 (1950).

Mulvany J. G. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (eds.), Methods in microbiology, vol. 1, p. 205—253, Academic Press, Inc., New York, 1969

Oltmann L. F., Schoenmaker G. S., Reunders W. N. M., Stautha- mer A. H. Biotechnol. Bioeng., 20, 921—925 (1978).

Poole R. K. J. Gen. Microbiol., 98, 177—186 (1977).

Quarles J. M., Belding R. C., Beaman T. C., Gerhardt P. Infect. Immun., 9, 550—558 (1974).

Schultz I. S., Gerhardt P. Bacteriol. Rev., 33, 1—47 (1969).

Scott D. C., Hancher C. W. Biotechnol. Bioeng., 18, 1393—1403 (1976).

Sterne M., Wentzel L M. J. Immunol., 65, 175—183 (1950).

Stieber R. W., Coalman G. A., Gerhardt P. Appl. Environ. Microbiol., 34, 733—739 (1977).

Stieber R. W., Gerhardt P. Appl. Environ. Microbiol., 37, 487—495 (1979).

Tempest D. W. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (eds.), Methods in microbiology, vol. 2, p. 259—276, Academic Press, Inc., New York, 1970.

Thomson R. O., Foster W. H. In: J. R. Norris and D. W. Ribbons (eds.), Methods in microbiology, vol. 2, p. 377—405, Academic Press, Inc., New York, 1970.

Van Suijdam J. C„ Kossen N. W. F., Joha A. C. Biotechnol. Bioeng., 20, 1695—1709 (1978).

Wang D. I. C., Sinskey A. J. Adv. Appl. Microbiol., 12, 121—152 (1970).‘

Watson T. G. J Gen. Microbiol., 59, 83—89 (1969).

Watson T. G. J. Appl. Chem. Biotechnol., 22, 229—243 (1972).

Глава 11

ИЗМЕРЕНИЕ РОСТА

А. Кох

В работе по измерению бактериального роста необходимо пользоваться четким определением роста. Один из главных подходов к определению роста основан на способности микроорганизмов размножаться, т. е. начинать и завершать клеточное деление. Такой подход предполагает возможность контроля увеличивающегося числа дискретных бактериальных частиц. При этом используются два основных типа контроля: микроскопический подсчет частиц в определенном объеме и электронный подсчет частиц, проходящих через соответствующий канал (жиклер).

Поскольку некоторые клетки могут быть мертвыми, вышеуказанное определение роста отличается от определения, основанного на подсчете живых микроорганизмов. Особенно существенно увеличение числа организмов, способных к неограниченному росту. Именно поэтому так важны подсчет колоний и методы наиболее вероятного числа.

Методы подсчета живых клеток применимы только к культурам, разбавленным до такой степени, что в них не происходит взаимодействий между клетками. Например, эти методы в принципе не пригодны для микроорганизмов, которые размножаются половым путем, требующим взаимодействия между мужской и женской особями. Даже при работе с прокариотами для них существует довольно много ограничений.

Обычно бактериологи, биохимики и молекулярные биологи измеряют рост бактерий по синтезу макромолекул и компонентов бактериальной клетки. С их точки зрения, клеточное деление представляет собой существенный, но второстепенный процесс, редко лимитирующий рост, который обычно ограничивается способностью ферментных систем быстро использовать источники питания, необходимые для образования биомассы.

Сбалансированный рост

Несколько подходов к определению роста совпадают лишь в одном случае — при сбалансированном росте [13]. Асинхронная культура достигает сбалансированного роста лишь тогда, когда каждое «экстенсивное свойство» культуры экспоненциально растет во времени. Понятие «экстенсивное свойство» происходит из физической химии и относится к таким свойствам системы, которые увеличиваются тем значительнее, чем их больше в системе. Например, масса и количество клеток в определенном объеме культуры являются ее экстенсивными свойствами, а температура или количество ДНК на клетку таковыми не являются. Приложимость этого физикохимического принципа к бактериологии связана с идеей о том, что если культура растет достаточно долго и при этом незначительно изменяет окружающую среду, то рано или поздно бактерии достигают одинакового сбалансированного со средой состояния независимо от начальных условий их роста. При достижении сбалансированного роста и при условии постоянства среды культура будет оставаться в этом состоянии бесконечно долго (если не изменится в результате мутаций или селекции) . Однако это только теория. Практически невозможно измерить все параметры культуры, даже если она поддерживается в состоянии непрерывного разведения. Однако если использовать менее жесткие критерии, то культуры, находящиеся в состоянии сбалансированного роста, изучать довольно просто.

Рассмотрим культуру в состоянии сбалансированного роста. Обозначим какое-нибудь экстенсивное свойство, например биомассу, ДНК, РНК или площадь поверхности клеток в пересчете на миллилитр культуры, буквой X. Скорость увеличения X пропорциональна количеству биомассы, и, следовательно,

at

где X— коэффициент пропорциональности. После интегрирования и подстановки граничных условий (A=A0, когда / = 0) получаем

Х=Х^.

Иными словами, для каждого вещества увеличение X происходит экспоненциально во времени. Если соотношение между двумя веществами остается постоянным, тот же самый коэффициент пропорциональности следует использовать при любом выборе параметра X. Коэффициент % называют удельной скоростью роста. Экспоненциальное увеличение в соответствии с одной и той же удельной скоростью роста характерно не только для любого вещества, обозначенного X, но и для любой комбинации веществ или скорости обмена любого вещества. Это позволяет использовать в качестве показателя роста потребление кислорода или образование метаболита.

Такие интенсивные свойства, как X и отношение концентраций различных субстратов в условиях сбалансированного роста, остаются постоянными. Кроме того, остается постоянным распределение клеток по размерам. При этом в нормальной клетке все внутриклеточные процессы идут с постоянными скоростями, остается также постоянной способность каждой вновь образованной дочерней клетки к образованию колонии (т. е. не изменяется доля нежизнеспособных клеток). Поэтому в данных специфических условиях независимо от способа измере ния роста (подсчет частиц, образование колоний или хи мическое определение клеточных компонентов) получают одинаковую удельную скорость роста, которая не меняется со временем.

В принципе такие «идеальные» условия можно создать лишь при непрерывном культивировании в проточном режиме. Сбалансированный рост достигается за счет роста, ограниченного скоростью добавления питательных компонентов в условиях хемостата, а также за счет неограниченного роста в условиях турбидостата, где культура механически разбавляется для сохранения постоянного количества биомассы в единице объема среды. Сбалансированный рост бактерий получают также при повторяющемся разбавлении периодической культуры [39, 49].

Изменения в клеткахпри различных скоростях роста

Организмы отвечают на изменения химических и физических условий среды изменением собственного соста-

ва. Эти изменения четко продемонстрированы для некоторых энтеробактерий [31, 39], но они характерны вообще для всех прокариот. В принципе благоприятные условия способствуют быстрому росту, который требует более высоких концентраций рибосом и связанных с ними белков. В терминах состава клеток это означает более высокое содержание РНК. Кроме того, при благоприятных условиях роста клетки могут накапливать резервный материал, например гликоген и поли-р-оксимас- ляную кислоту, а также увеличиваться в размерах. Как предполагают, последнее связано с тем, что клетки в таких условиях не нуждаются в увеличении относительной поверхности, облегчающем использование субстратов в разбавленных средах. Из-за изменений в составе клеток при измерении роста по содержанию клеточных компонентов возможны ошибки. Строго говоря, подобные измерения можно проводить лишь при росте в одной и той же среде и при условии, что сами бактерии не изменяют ее состав.

Несбалансированный рост

В ходе развития стационарных культур, в особенности при разведении таких культур свежей средой, происходят значительные изменения свойств микроорганизмов. Как уже упоминалось, это было продемонстрировано для некоторых энтеробактерий [1, И], но, вероятно, относится и ко всем прокариотам. В некотором смысле стадии развития стационарной культуры являются артефактом, зависящим от состава среды, а также возраста и состояния клеток инокулята; однако во всех случаях эти стадии существенны при измерениях роста. Феномены, проявляющиеся на различных стадиях развития стационарной культуры, важны в экологических исследованиях, где особую роль играют условия окружающей среды, которые в значительной степени неконтролируемы. Ответ культуры на колебания естественных условий включает в себя также изменения клеточных характеристик [31, 34]. Так, например, при разведении стационарной культуры, растущей в богатой среде, происходит ускорение макромолекулярного синтеза. Вначале синтезируются компоненты системы биосинтеза белка — рибо-

сомные белки и рибосомная РНК. И только после завершения синтеза ряда макромолекул происходит клеточное деление. В этой фазе значительно возрастает средний размер клеток. Когда среда уже не способна поддерживать быстрый рост бактерий, интенсивность клеточных процессов замедляется, что приводит к образованию мелких клеток с недостаточным содержанием РНК. Наконец, часть бактерий гибнет, т. е. происходит уменьшение числа колониеобразующих единиц [16]

Вероятно, большинство исследователей, предполагающих применять приведенные в этом руководстве методы, будут вызывать изменения роста преднамеренно. Такие изменения можно вызвать колебаниями в содержании или недостатком питательных компонентов в среде, добавлением ингибиторов роста (особенно антибиотиков), ионизирующим излучением и другими экстремальными физическими факторами, например высокой или низкой температурой и осмотическим давлением. Поскольку влияние перечисленных факторов на рост может быть довольно сложным, при интерпретации результатов нужно быть очень осторожными.

Источники ошибок

Существуют четыре вида источников ошибок. Первый и наиболее опасный из них заключается в том, что бактерии, которые обычно делятся регулярно, в условиях слабой токсичности способны расти с образованием скоплений и нитей. Второй опасный момент связан с различной степенью жизнеспособности поврежденных бактерий при различных условиях культивирования. Восстановлению жизнеспособности бактерий способствуют процессы репарации, но они протекают лишь в определенных условиях [8]. Третий источник ошибок связан с возможным образованием резистентных форм. Учет бактерий, способных к образованию спор, не составляет проблемы, поскольку известны методы контроля и измерения, позволяющие вносить соответствующие поправки. В том случае, когда споры в растущих спорообразующих культурах не появляются, возможны ошибки при измерении роста. Четвертый источник ошибок имеет отношение к процедурам, с помощью которых

инокулят вводят в новую среду. Результаты зависят от того, как увеличивается при введении концентрация инокулята — постепенно или ступенчато, насколько долго инокулят присутствует в высокой концентрации и как она потом изменяется. Во время угрожающих популяциям изменений среды клеточная концентрация может быть критической. Для защиты от токсического действия факторов среды бактерии имеют индуцибельные или какие-либо другие, пока неизвестные системы. Эффективность защиты зависит от численности микроорганизмов, осуществляющих детоксикацию в результате совместной деятельности. Защиту против медленно проникающих токсичных веществ способен обеспечивать сам по себе быстрый рост клеток.

Все вышеперечисленные взаимоотношения можно проиллюстрировать на примере взаимодействия рифампина с клетками Е. colt [36]. В достаточной концентрации клетки способны инактивировать рифампин в определенных дозах; после их обработки антибиотиком в постепенно нарастающих концентрациях культуры становятся толерантными к повышенным дозам препарата. Независимо от этого быстро растущие бактерии более устойчивы к антибиотику, чем медленно растущие. Возможно, это объясняется тем, что препарат не успевает эффективно проникать в быстро растущие клетки. Например, если антибиотик добавляется в относительно высокой концентрации, а затем разводится до низкой, то происходит подавление роста в условиях, при которых обычно низкие концентрации не оказывают ингибирующего действия. После того как в результате кратковременной обработки культуры высокими дозами антибиотика рост замедляется, ингибирование остается постоянным, поскольку препарат успевает проникать в клетку и в этих условиях процесс ингибирования вызывается и низкими дозами антибиотика.

Мицелиальный тип роста

Изучать рост микроорганизмов, имеющих мицелий, сложнее, чем рост более «удобных» микроорганизмов, клетки которых бинарно делятся и затем немедленно расходятся. Проблемы и методы изучения роста колоний

уже обсуждались Кэлэмом [12] и Кохом [33], поэтому мы рассмотрим их здесь очень кратко. Фильтровать и взвешивать высушенный или влажный мицелий удобнее, нежели мелкие немицелиальные клетки. Кроме того, довольно легко регистрировать увеличение размеров мицелиальной колонии. Например, для измерения роста можно использовать очень длинную стеклянную трубку, содержащую слой питательного агара. После инокуляции на одном конце трубки мицелий начинает расти вдоль трубки, и если ее соединить еще с одной, то он может «перерасти» в следующую и т. д. [47] При этом колонии растут в одном измерении, тогда как на поверхности агара они растут в двух измерениях, а во встряхиваемых культурах — в трех.

Скорость увеличения размера колонии в одном, двух или трех измерениях зависит от скорости удлинения концевых гиф, которые иногда растут перпендикулярно поверхности колонии, тогда как использование растущей массой мицелия питательных компонентов зависит от площади поверхности колонии. В случае встряхиваемой культуры на характер роста накладывает отпечаток природа и величина фрагментов инокулята; для крупных фрагментов рост ограничивается уже на ранней стадии за счет медленной диффузии питательных компонентов в мицелиальную массу. Следовательно, основная сложность заключается в том, что мицелиальный тип роста, вероятно, отклоняется от экспоненциального и зависит от геометрии роста и природы инокулята. Во встряхиваемых культурах рост зависит от скорости встряхивания, которая влияет на склонность мицелия распадаться на более мелкие фрагменты.

Клеточная дифференцировка

Процесс превращения клеток энтеробактерий из крупных и богатых РНК форм в мелкие и бедные РНК клетки по достижении стационарной фазы характеризуется рядом свойств, присущих клеточной дифференцировке. Правда, в бактериологии существует много более четких примеров дифференцировки, например превращение палочек в кокки, вегетативных клеток бацилл в эндоспоры, а также образование микроорганизмами экзо-

спор, цист и почек. При определенных обстоятельствах формирование нитевидных клеток можно также рассматривать как процесс дифференцировки. Рассмотренные выше изменения клеток и их возможная обратимость создают потенциальные причины ошибок при измерениях роста микроорганизмов.

Адсорбция на поверхности

Многие бактерии в результате адаптации или мутации могут приобретать высокое сродство к поверхностям, в частности к стеклу (эффект обрастания). Прикрепление микроорганизмов к стенкам сосуда явилось причиной неудач некоторых экспериментов с хемостатными культурами. Именно поэтому при длительных контактах микроорганизмов со стенками сосудов для культивирования следует использовать пластмассу или тефлон [31]. Другие способы уменьшения способности клеток расти на стенках сосудов заключаются в использовании фторуглеродных покрытий или больших объемов культуры в крупных емкостях, а также интенсивного перемешивания и частых пересевов бактерий в новые стеклянные сосуды. Кроме того, эффект обрастания может быть снижен в результате использования детергентов, силиконового покрытия стенок и сред с высокой ионной силой.

В частности, с этой проблемой приходится сталкиваться при разведении культуры для измерений высокочувствительными методами, например для микроскопии или подсчета колоний в чашках. Эта проблема обсуждается также в разделах, посвященных соответствующим методам (разд. 11.1.1, 11.2.1 и 25.1).

Гетерогенное окружение

Измерение роста микроорганизмов в естественных условиях связано с большими трудностями [9]. Как правило, в природных условиях встречаются смешанные культуры, в которых бактерии прикрепляются друг к другу, к частичкам почвы и листьям. В этих случаях рост измеряют четырьмя основными методами. Первый из них заключается в определении фиксации 14С-двуоки- си углерода растущей биомассой [53]. Второй предус-

матривает идентификацию клеток с реплицирующейся ДНК, меченной 3Н-тимидином, по радиоавтографии [10]. В третьем методе для идентификации микроорганизмов в образцах почвы применяют флуоресцирующие антитела [48]. Наконец, информацию о росте микроорганизмов можно получить с помощью усовершенствованной масс- спектрометрии газов, выделяемых образцами почвы [41]. Подробное обсуждение этих вопросов не входит в задачи настоящего руководства.

Рост бактерий рассматривается также в гл. 10 и в работах [1—7].

прямой подсчет

Подсчет в микроскопе

Подсчет в микроскопе представляет собой широко распространенный быстрый и дешевый метод, оборудование для которого имеется в каждой бактериологической лаборатории. Однако его применение иногда может привести к ошибочным результатам. Возникающие при этом проблемы в значительной степени решены в работе Норриса и Поуэлла [42], но широкое использование подхода этих авторов ограничено требованием специальной техники и оборудования.

Основная трудность прямого микроскопического подсчета связана с воспроизводимостью процессазаполне- ния камеры жидкостью [42]. В предлагаемом ниже методе толщину жидкости в камере измеряют с помощью хорошего микроскопа, фокусируя объектив на бактериях, находящихся на верхней и нижней поверхностях жидкости. Расстояние между ними измеряют с помощью микрометрической шкалы микроскопа. Горизонтальные размеры между двумя отметками в имеющихся в продаже камерах довольно точны [42], и поэтому здесь не возникает проблем.

Второй трудностью является адсорбция бактерий на поверхности стекла, в частности пипеток. Эту адсорбцию можно снизить, если для разведений вместо воды использовать раствор с высокой ионной силой. Другой способ заключается в использовании раствора формальдегида (нейтрализованного К2НРО4) со следами анион-

ного детергента [42]. Преимуществом формальдегида является его способность подавлять рост и подвижность бактерий, а смеси К2НРО4 с детергентом — ее способность препятствовать агрегации. Однако детергент даже в очень низких концентрациях может лизировать некоторые микроорганизмы. Адсорбцию клеток можно уменьшить, если использовать пластмассовые сосуды и пластмассовые наконечники пипеток. В описываемой ниже процедуре отбираемые пробы разводят 0,1 н. НС1. Пипеткой с пластмассовым наконечником их быстро переносят в стеклянную счетную камеру, где клетки прикрепляются к поверхностям камеры.

Счетная камера Хауксли (А 70 Helber; Hawksley, Ltd., Lancing, England) лучше камеры Петрова-Хаузера (Arthur Н. Thomas Со., Philadelphia, Ра.), поскольку ее оптическая толщина с обычным покровным стеклом достаточно мала, чтобы ее можно было просматривать с масляной иммерсией. Хотя большинство подсчетов проводят в безыммерсионных системах, иногда из-за большого числа клеток или из-за их способности образовывать скопления необходимо использовать масляную иммерсию. Камера Хауксли представляет собой пластинку, имеющую круглую выемку глубиной 20 мкм, на дне которой нанесены метки, ограничивающие зону 50Х 50 мкм.

Основным преимуществом микроскопического метода подсчета является возможность получить дополнительную информацию о размерах и морфологии изучаемого объекта. Наблюдение с масляной иммерсией делает подсчет более утомительным, однако в этом случае лучше различаются индивидуальные клетки. Другие рекомендации можно найти в инструкциях фирм — изготовителей счетных камер, а также в лабораторных пособиях для микробиологов. Обсуждение методов разведения и статистической обработки результатов приведено в разд. 11.5 и в ряде работ [5, 46].

Методика

Камеру и покровное стекло промывают водой с небольшим количеством анионного детергента, а затем споласкивают водой и спиртом, промокают и сушат на воздухе.

Предварительно определяют концентрацию клеток. Если эта концентрация ниже 3-108 клеток в 1 мл, то приступают к следующему этапу. Если она выше, то предварительно разводят клеточную суспензию раствором Норриса— Пауэлла, приготовленным следующим образом. К 1 л воды добавляют 5 мл формалина (40%-ного формальдегида) и доводят pH (можно по индикаторной бумаге) до 7,2—7,4 с помощью твердого Na2HPO4. Количество добавляемого фосфата зависит от содержания в формалине муравьиной кислоты. На кончике шпателя добавляют столько додецил сульфата натрия, сколько необходимо для прекращения быстрого лопания пузырьков, образующихся при продувании воздуха через раствор с помощью пастеровской пипетки.

К пробе добавляют равное количество 0,1 н. НС1. Это приводит к гибели бактерий и появлению на их поверхности положительного заряда, благодаря чему они перестают агрегировать, но начинают адсорбироваться на стекле.

Немедленно с помощью автоматической пипетки с пластмассовым наконечником (Pipetteman, Eppendorf, Centaur) в камеру Хауксли вносят около 5 мкл суспензии, переворачивают камеру на 1—2 мин, затем возвращают ее в нормальное положение и оставляют на 3— 5 мин.

Рассматривают содержимое камеры в микроскоп, используя фазово-контрастный объектив (лучше с масляной иммерсией). Большинство клеток прикрепляется к нижней поверхности камеры, часть •— к верхней, а остальные свободно движутся в камере (броуновское движение).

Фокусируют объектив на клетки, прикрепленные к дну камеры, и отмечают показания на микровинте (у хороших микроскопов шкала микровинта откалибрована в микрометрах). Затем фокусируют объектив на клетки, прикрепленные к верхней поверхности камеры, снимают показания и прибавляют величину диаметра бактерий. Таким способом можно определить толщину камеры, которая обычно равна 20 мкм. В целях освоения метода тщательно измеряют толщину камеры в различных ее участках, чтобы убедиться в том, что она заполнена равномерно.

Подсчитывают число клеток в каждом малом квадрате. В оптимальном случае оно должно составлять 5—15. Клетки, расположенные по краям квадрата, учитывают лишь в том случае, если они находятся на верхней или правой стороне. Для подсчета клеток внутри квадрата используют один регистр механического счетчика; второй регистр используют для подсчета количества квадратов. Некоторые исследователи пользуются счетчиком только для подсчета десятков, в уме подсчитывая однозначные числа. Для точного определения подсчитывают не менее 600 клеток, причем это необходимо делать при нескольких заполнениях камеры. Ряд авторов рекомендует вести подсчет при многократном заполнении камеры, с тем чтобы усреднять получаемые при этом результаты. При использовании описываемого здесь метода в этом нет необходимости, поскольку каждый раз измеряется толщина заполненного пространства камеры. Лучше подсчитывать количество клеток в определенных квадратах, например в четырех угловых, и в квадратах, расположенных по диагонали. Это позволяет избежать подсчета одного квадрата дважды, а также усреднить возможный геометрический градиент клеток в камере.

Число клеток определяют по следующей формуле: Общее число подсчитанных клеток-Фактор разведения-4-108 Число подсчитанных малых квадратов-Толщина камеры (мкм)"

Если точно расположить покровное стекло, то объем раствора над малым квадратом равен 50-50-20 мкм3= = 5-104 мкм3 = 5-10-8 мл. Обратная этому числу цифра 2- 107/мл представляет собой обычный фактор в формуле, предлагаемой в инструкциях фирм — изготовителей камер. Приводимая выше формула уменьшается до этой величины, если толщина камеры равна 20 мкм. Чтобы процедура оказалась успешной, необходимо, чтобы при измерении толщины камеры к каждой поверхности было прикреплено по крайней мере несколько клеток. Удобнее, однако, производить подсчет, когда основная масса клеток прикреплена к одной поверхности. Для завершения счета в малом квадрате следует сфокусировать объектив на свободных клетках, а затем на поверхности раздела, где расположено меньшее число клеток. Подсчитав об-

щее число клеток в квадрате, заново фокусируют объектив на исходной поверхности и затем передвигают камеру.

Электронный подсчет

Счетчик клеток типа Coulter Counter (Coulter Electronics, Hialeah, Fla.), его аналоги, производимые другими фирмами, а также аналогичные приборы, создаваемые в лабораториях, в последние 25 лет оказали значительное влияние на развитие бактериологии. Такие приборы давно и широко используются в клинической гематологии. Они весьма удобны для подсчета клеток простейших и немицелиальных дрожжей, но непригодны для мицелиальных организмов. Хотя применение таких счетчиков привело к созданию новых концепций в бактериологии, их использование в случае мелких палочкообразных бактерий крайне затруднительно. При участии физиков и инженеров проводятся исследовательские работы с целью улучшения электронного метода подсчета и повышения его надежности. О реальных трудностях, с которыми столкнулись при использовании метода, свидетельствует, например, тот факт, что исследователи, принимавшие участие в его разработке, больше не пользуются им. В настоящем руководстве мы обсудим лишь принципы метода, основные трудности при работе^е-ним и пути их преодоления. По остальным вопросам мы отсылаем читателя к опубликованным работам. После этого читатель сам сможет сделать вывод о применимости метода электронного подсчета для решения различных задач в бактериологии.

Принцип электронного подсчета заключается в следующем. Разбавленная бактериальная суспензия подается через очень маленькое отверстие (жиклер), соединяющее две камеры с жидкостью. В каждой камере с помощью электродов измеряется электрическое сопротивление. Несмотря на то что электропроводность среды достаточно велика, размер жиклера настолько мал, что электрическое сопротивление в нем несоизмеримо выше, чем в остальном объеме. Когда частица переносится с жидкостью через жиклер, сопротивление возрастает еще сильнее, поскольку электропроводность бактерий ниже,

чем среды. Эти изменения сопротивления улавливаются с помощью измерительной цепи и превращаются в импульс напряжения или силы тока. Подсчет импульсов в электронной цепи подобен подсчету радиоактивности, причем очень слабые импульсы элиминируются (отсекаются) с помощью дискриминатора. Слишком сильные импульсы могут быть отсечены с помощью второго дискриминатора («верхнего уровня»), если предполагают, что они имеют своим источником частички грязи или другие примеси. В усовершенствованных счетчиках импульсы анализируются по их величине и запоминаются в многоканальном анализаторе. При необходимости эти данные извлекаются из памяти и переносятся на гистограмму, где можно определить число частиц, их среднюю величину и среднеквадратичное отклонение. Все данные рассматриваются в совокупности, и в ходе анализа дискриминируются очень сильные или очень слабые импульсы. Подобные приборы требуют в процессе подсчета принудительной подачи точно измеренных объемов жидкости через жиклер. Обычно это достигается за счет вытеснения жидкости, находящейся в контакте с ртутным столбиком; при этом ток эффективно проходит через ртуть, но не через поступающую среду.

При использовании электронного метода подсчета сталкиваются с тремя важными проблемами. Первая из них заключается в том, что, поскольку некоторые бактерии очень малы (меньше 0,4 мкм3), импульсы сопротивления, возникающие при их прохождении через жиклер, сравнимы с величиной «шума» (фона), образующегося из-за турбулентности проходящей через жиклер жидкости. Можно установить дискриминирующее устройство, «срезающее» турбулентные шумы, однако при этом не исключена потеря некоторой информации об истинном числе клеток, особенно в случае присутствия только что разделившихся клеток. Другой способ учета турбулентных шумов состоит в измерении «шумов» контрольных (не содержащих клеток) проб и вычитании их из измеряемых импульсов. Однако хорошо известно, что пробы, не содержащие клеток, значительно отличаются друг от друга по импульсам сопротивления. К тому же турбулентность в потоке жидкости устанавливается сама по себе, сохраняется некоторое время, а затем меняется.

Наконец, вероятность общей ошибки возрастает, если контрольные пробы обладают статистически значимыми различиями (разд. 11.5.5). Не возникает проблем лишь при работе с определенными бактериями, растущими на богатой среде, где даже вновь образованная клетка дает импульс больший, чем турбулентный шум, или при работе с крупными бактериями типа Azotobacter agilis, клетки которых в несколько раз крупнее клеток Е. coll.

Вторая проблема заключается в том, что после деления дочерние клетки не всегда в достаточной степени отделяются друг от друга. Эту проблему, а также проблему, связанную с тенденцией к образованию нитевидных клеток, можно исключить, если правильно подобрать микроорганизм и условия его роста. Совершенно очевидно, что выбор Е. coll для физиологических и генетических исследований в значительной мере был обусловлен низкой способностью клеток этого организма к агрегации, сцеплению дочерних клеток между собой, образованию цепочек и нитей. Для диспергирования агрегатов, отделения разделившихся дочерних клеток и фрагментирования нитей используют интенсивное перемешивание в миксере типа Vortex или мягкую ультразвуковую обработку. Следует, однако, отметить следующее: для доказательства того, что все частицы представляют собой отдельные клетки, а разрушение клеток незначительно, счетчик типа Coulter Counter отнюдь не лучше, чем микроскопия с масляной иммерсией.

Существует также связанная с предыдущей проблема (разд. 11.5.5) совместного прохождения через жиклер более чем одной частицы в течение короткого времени, достаточного для того, чтобы электронное устройство зарегистрировало прохождение более чем одной крупной частицы. Ее можно решить, используя различные разведения суспензии, поскольку, чем больше разведение, тем меньше вероятность совместного прохождения (см. ниже). Особенно важно эту проблему учитывать при изучении распределения клеток по размерам.

Третьей важной проблемой, возникающей при работе с электронными счетчиками, является засорение жиклера. Если увеличить его диаметр, то изменение сопротивления при прохождении частицы составит лишь незначительную часть общего сопротивления. Поэтому для под-

счета мелких палочковидных бактерий типа Е. coll диаметр жиклера должен быть не больше 12—30 мкм. Видимо, за выбор подходящего жиклера, который позволяет достаточно сильно увеличивать сигнал, приходится расплачиваться повышенным шумом и мириться с возможностью засорения жиклера. Одним из способов борьбы с засорениями является ультрафильтрация всех растворов. Можно также дать отстояться растворам в течение долгого времени в бутылях с сифоном и затем слить растворы, лишенные частиц. Важную роль играет выбор растворителя, не способствующего образованию частиц, например, Кубичек [38] рекомендует использовать 0,1 н. НС1. НС1 обладает хорошей летучестью и не выщелачивает из стекла вещества, которые в дальнейшем могут образовывать осадки. Однако на практике проблема засорения решается далеко не просто, причем при использовании модификаций методов, разработанных для точного определения размеров клеток, она усугубляется.

Введение в практику электронного счетчика системы Coulter Counter оказало влияние на изучение роста бактерий, причем главным образом благодаря принципиальной возможности измерять распределение клеток по размерам и в меньшей степени возможности подсчета клеток. На практике крайне сложно точно измерить размер клетки из-за импульсной природы сопротивления, генерируемого проходящей через жиклер частицей. Были предприняты попытки преодолеть эту трудность, используя сравнительно длинные (100 мкм) поры [37]. Хотя при этом снимаются некоторые физические ограничения, с замедлением потока жидкости в длинной поре увеличивается возможность засорения. В другом подходе используется специальное гидродинамическое фокусирование растворов, обеспечивающее движение бактериальных клеток очень близко к центральной оси поры и окружение их жидкостью, не содержащей частиц [50, 52, 55].

Дополнительную информацию об этом методе можно найти в работах [2, 17, 38], а также в инструкциях, прилагаемых к приборам фирмами-изготовителями.

ПОДСЧЕТ КОЛОНИЙ

По существу бактериология превратилась в экспериментальную науку начиная с того момедта, когда Роберт Кох по совету Фанни Хессе впервые в лабораторной практике использовал чашки с агаровой средой. Это позволило не только осуществлять клонирование чистых культур, но также подсчитывать количество колоний, образующихся из отдельных «жизнеспособных клеток». Существует много вариантов этого метода. 1. Метод посева в агар: пробу вносят пипеткой в пустую стерильную чашку Петри, в которую затем вливают расплавленный, но остуженный до температуры 45°C агар; содержимое осторожно перемешивают и дают агару застыть. 2. Метод посева на поверхность агара: небольшие (0,1 мл) объемы разбавленной культуры вносят пипеткой непосредственно на поверхность затвердевшего агара в чашке Петри и затем клетки распределяют по поверхности с помощью стеклянного или тефлонового шпателя. 3. Метод посева в тонком слое: разбавленную культуру вносят в пробирки с небольшим объемом (2,5— 3,5 мл) расплавленного агара (0,6—0,75%), затем разливают по стерильным чашкам, уже содержащим один слой застывшего агара, и дают застыть верхнему слою. 4. Метод посева в многослойный агар напоминает предыдущий. Он отличается лишь тем, что на верхний слой засеянного застывшего агара наливают или наносят пипеткой дополнительный слой стерильного агара. Поэтому все колонии развиваются под поверхностным слоем агара. 5. Метод мембранных фильтров: разбавленную культуру фильтруют через соответствующий предварительно тщательно промытый мембранный фильтр, который затем переносят на питательный агар в чашке или на фильтровальную бумагу, пропитанную концентрированной питательной средой.

Вариантом метода посева в агар является посев на агар (или в агар) во вращающиеся пробирки и микротрубки [44]; при этом мелкие колонии можно рассматривать в микроскоп [45]. Имеются и другие варианты перечисленных выше методов. Использование автоматического подсчета колоний создает дополнительные специфические ограничения при работе этими методами,

однако оно позволяет быстро и без ошибок, свойственных исследователю, просчитывать колонии в чашках Петри.

Ниже описываются два метода. Один из них — это метод посева в чашки на поверхность агара, при котором все выросшие колонии являются поверхностными. Именно на поверхностных колониях изучают характерные изменения в индикаторных агаровых средах. Подповерхностные колонии часто отличаются по цвету от поверхностных, так как они развиваются в других условиях аэрации и, следовательно, характеризуются другой способностью к кислотообразованию и другим окислительно-восстановительным потенциалом. Второй метод — посев в многослойный агар — обладает своими преимуществами: поскольку здесь все колонии развиваются под слоем агара, они невелики, компактны и могут интенсивно окрашиваться. В чашке в данном случае может вырастать значительно больше колоний по сравнению с другими методами, причем вероятность их слияния невелика. Можно просчитать несколько тысяч колоний на чашке и получить достоверные результаты. Поскольку при использовании других методов основная сложность заключается в подсчете нарастающего числа колоний на чашку, совершенно очевидно, что в этом плане данный метод явно следует предпочесть другим. Существует правило, согласно которому оптимальное для подсчета число колоний на чашку лежит в пределах от 30 до 300. Нижний предел устанавливается из соображений статистической достоверности, а верхний — из-за опасности слияния индивидуальных колоний. Указанный 10-кратный диапазон неудобен для многих экспериментов, поскольку в ряде случаев при разведении трудно заранее определить, будет ли число колоний входить в указанный сравнительно узкий диапазон. Дополнительные усилия по приготовлению чашек с многослойным агаром окупаются тем, что вырастающие в этом случае колонии можно считать в широком диапазоне (от 30 до 2000). Вторым важным преимуществом метода является возможность дополнительных манипуляций с составом питательной среды. Первым слоем в чашки Петри можно разлить минимальную среду с агаром и в таком виде хранить их неопределенно долго. Может храниться так-

же подготовленная для посева и разлитая по пробиркам минимальная полужидкая среда с агаром. В агар, используемый для верхнего слоя, можно добавлять необходимые питательные вещества в 10—50-кратном избытке. При необходимости к полужидкому агару добавляют красители или хромогенные субстраты, облегчающие обнаружение колоний.

Попыткам ускорить и автоматизировать измерения роста посвящен ряд статей и книг [2, 23]. Однако эта область только начинает развиваться, и мы ее здесь обсуждать не будем.

Некоторые микроорганизмы обладают высокой чувствительностью к ряду веществ, присутствующих в агаре. По этому вопросу опубликовали прекрасный обзор Мейнелл и Мейнелл [5]. Если под действием этих веществ микроорганизм повреждается, то не исключено, что он нуждается в специальных питательных добавках. Этой проблеме посвящен 26-й симпозиум Общества общей микробиологии [19]. Обычно при проведении эксперимента исследователь должен решать, какие условия культивирования ему использовать — те ли, при которых наблюдается высокое выживание, или те, при которых оно низкое. Появление генетически дефектных организмов порождает свои проблемы, например проблему способности мутантов с поврежденной системой репарации образовывать колонии, поддающиеся счету [14].

Проблемы подсчета клеток в культурах строгих анаэробов обсуждаются в работах [15, 24, 25].

Посев в чашки на поверхность агара

Подходящую агаровую среду разливают в стеклянные или пластмассовые чашки Петри (диаметром 9 см). Из ряда методик заполнения и подсушивания чашек можно рекомендовать следующую.

После автоклавирования и добавления термола- бйльных субстратов (сахаров, красителей, антибиотиков, хромогенных субстратов) закрытую емкость с расплавленным агаром помещают в лоток с горячей (45—50 °C) водопроводной водой. Агар быстро и равномерно охлаждается, достигает температурного плато выше точки застывания агара (обычно для 1 л агара достаточно ин-

кубации в течение 30 мин). При этом образования геля возле стенок емкости не происходит. Такой достаточно охлажденный агар при разливе дает лишь немного конденсата на внутренней поверхности крышек чашек Петри.

Агар в чашки Петри заливают возле зажженной бунзеновской горелки. Если на поверхности агара появляются пузыри, пламя горелки немедленно направляют на эти участки, пока пузыри не лопаются. Обычно для чашки с диаметром 9 см достаточно 15—20 мл агара, что соответствует высоте слоя 0,24—0,32 см. Чем толще слой, тем менее контрастно выглядят колонии на агаровом фоне. В тонких слоях агара из-за ограничения некоторых питательных субстратов или локального подсыхания агара могут вырастать мелкие колонии и может уменьшаться их число, особенно в истонченных участках агарового слоя.

В зависимости от влажности чашки подсушивают при комнатной температуре 12—24 ч.

Чашки хранят при 4 °C в закрытых пластмассовых контейнерах неограниченное время.

Посев производят следующим образом.

На основании имеющейся информации готовят разведения культуры таким образом, чтобы получить после инкубации 100—200 колоний на чашку. Для подсчетов, однако, можно использовать и чашки в более широком диапазоне числа колоний (30—300). Если колонии мелкие, удается просчитать до 500 колоний в одной чашке. При работе со стеклянными чашками и пипетками для разведения суспензий бактерий используют растворы, препятствующие адсорбции клеток на стекле, например растворы с высокой ионной силой, с низким pH (4—5) или содержащие немного нетоксичного анионного детергента. Можно также использовать пластмассовые чашки Петри и пластмассовые наконечники на пипетки.

Разведения проводят несколькими способами. Традиционно к 1 мл пробы добавляли большие (99 мл) объемы соответствующего стерильного раствора; однако с усовершенствованием техники все чаще стали использовать небольшие объемы, экономя реактивы и время, необходимое для перемешивания. Современные полуав-

Рис. 11.1. Шпатели Слева: изогнутая скрепка для бумаги, нижняя часть которой помещена в тефлоновую трубку. Справа пастеровская пипетка с оплавленным концом, изогнутая в двух местах. Ручки обоих устройств изгибают, исходя из соображений удобства. Оба шпателя обладают низкой теплоемкостью; левый шпатель благодаря присутствию тефлоновой трубки сорбирует меньше бактерий

тематические пипетки с пластмассовыми наконечниками позволяют работать с очень малыми объемами, однако такие пипетки трудно стерилизовать. Для многих целей можно использовать 0,1-миллилитровую серологическую пипетку и добавлять 0,1 мл культуры к 0,9 или 4,9 мл раствора, которым разводят пробы (в пробирках 13Х Х100 мм), или к 9,9 мл этого раствора (в пробирках 16X150 мм). При оптимальном разведении облегчается перемешивание.

0,1 мл разведенной культуры наносят на поверхность агара в чашке Пе1три. Для этого 2—3 капли капают на поверхность, а оставшуюся в пипетке жидкость выдувают (в автоматической пипетке нажимают поршень до упора). Это делают быстро, поскольку клетки имеют тенденцию немедленно прикрепляться к твердому субстрату.

Шпатели (рис. 11.1) стерилизуют погружением в спирт, удаляют избыток последнего и обжигают в пламени горелки. Шпатель можно изготовить из большой скрепки для бумаг (Giant Gem. Nestling). Скрепку изгибают, как показано на рисунке, надевают на ее конец специальную тефлоновую трубку (№ 16, Small Parts, Inc., Miami, Fla.) и слегка нагревают на огне, чтобы трубка плотно охватила проволоку. Часть скрепки, используемую в качестве ручки, можно изогнуть наиболее удобным образом. По сравнению с толстыми стеклянными палочками такой шпатель обладает низкой теплоемкостью, быстро остывает и значительно более инертен по отношению к бактериальным клеткам. Подобный шпа-

тель можно так же быстро изготовить из пастеровской пипетки.

Культуру равномерно распределяют по агару в чашке, стараясь покрыть всю его поверхность вплоть до периферии. Равномерный посев требует определенного опыта. После инкубации проверяют распределение колоний на всех чашках, чтобы убедиться в равномерности посева. Лучшими для оценки равномерности посева являются чашки с наибольшим числом выросших колоний, хотя подсчет колоний в этом случае затруднителен. Если количество колоний, выросших вокруг наносимых на агар капель суспензии, выше, чем на остальной поверхности, то технику распределения следует улучшить. Капли влаги на крышках чашек Петри удаляют интенсивным встряхиванием крышек. Чашки с разлитым в них агаром следует подсушивать до тех пор, пока капля жидкости (0,1 мл), наносимая пипеткой, не поглотится агаром в течение 15—20 с.

Перевернутые чашки инкубируют при постоянной температуре в хорошо термостатируемой комнате или камере (разд. 6.3). Лучше использовать закрытые контейнеры, однако их не следует перегружать чашками. Если тем не менее без этого не обойтись, увеличивают время для выравнивания температуры чашек и камеры, что особенно важно при работе с температурочувствительными мутантами. Инкубация в закрытых контейнерах позволяет также избежать токсического воздействия вредных газов, которые могут присутствовать в атмосфере термостатируемых помещений общего назначения (например, паров уксусной кислоты, используемой для обесцвечивания гелей). Непрозрачные контейнеры защищают светочувствительные компоненты сред и красители от инактивации светом. Наконец, в контейнерах среда в чашках не высыхает, и поэтому такие чашки пригодны для наблюдения за медленно развивающимися или поздно появляющимися колониями. Еще одной проблемой является поддержание необходимой концентрации СО2, поскольку в СО2 могут нуждаться даже организмы, выделяемые обычно в отсутствие высоких концентраций этого газа. Эта зависимость особенно наглядно выявляется в случае нанесения на агар отдельных редких клеток из разбавленных суспензий и при инкубации в обыч-

ной лабораторной атмосфере. Хотя эти проблемы возникают далеко не всегда, о них надо помнить.

Наблюдение за чашками начинают до того, как колонии разовьются в полной мере. Часто вырастает слишком много колоний. Тогда прибегают к дополнительным разведениям и посевам либо к подсчетам (с помощью лупы) мелких недоразвившихся колоний, опасность слияния которых меньше, нежели в случае крупных развитых колоний.

Подсчет колоний следует вести при хорошем освещении, однако соответствующее оборудование далеко не всегда придается к обычным счетчикам колоний. Иногда увеличительные линзы укрепляют в оправе очков ил» используют лампы с линзами. Счет ведут либо «вручную», отмечая чернилами колонии на дне чашки Петри, либо с помощью электронного счетчика или телевизионного сканирующего устройства. Отдельные колонии на поверхности агара можно отмечать прикосновением к ним специального красящего карандаша. Далеко не все виды таких карандашей способны окрашивать колонии на агаре. Лучше всего использовать окрашивающие карандаши фирмы Eberhard Faber Mongol, причем одни красители (например, French Green № 898) окрашивают колонии лучше, чем другие. Для дифференциального подсчета можно использовать несколько красителей. Некоторые исследователи предпочитают считать единичные колонии в уме, а десятки откладывают на клавишном счетчике. При работе с электронными сканирущими счетчиками особое внимание уделяют тому, чтобы избежать ошибок, источником которых могут служить частички грязи или не видимые невооруженным глазом дефекты в стеклянных или пластмассовых чашках. Для повышения контрастности колоний и уменьшения числа ложнопозитивных случаев в агар вводят красители.

Посев в многослойный агар

Готовят чашки Петри с первым слоем агаризован- ной среды (1,5% агара, толщина слоя около 0,4 см). Как первую, так и последующие среды наливают в чашки, установленные на строго горизонтальной поверхности (с помощью уровня).

Заполняют небольшие (13X100 мм) пробирки 2,5— 3 мл 0,7%-ного расплавленного агара. Удобно иметь приготовленные заранее бутыли с агаровой средой, содержащей основные компоненты. Агар в бутылях расплавляют (это можно сделать в микроволновой печи при наличии определенного навыка, следя за тем, чтобы агар бурно не вскипал) и добавляют к нему необходимые питательные компоненты, красители и ингибиторы. Аликвоты готовой горячей среды переносят пипеткой в предварительно прогретые до 45 °C серологические пробирки (13ХЮ0 мм). Работа с горячей средой снижает вероятность заражения посторонними бактериями. При 45 °C агар остается жидким в течение нескольких часов. При 50 °C это время еще больше, однако при этой температуре гибнут многие бактерии.

Пробы с культурой разводят, как описано выше {разд. 11.2.1).

Переносят чашки Петри в комнату с температурой 25—30 °C.

Делают отметку на наружной стороне серологической пробирки и наносят на внутреннюю поверхность пипеткой 0,1 мл разведенной пробы.

Расплавленный агар немедленно выливают из пробирки в чашку Петри таким образом, чтобы, вытекая, он смыл приставшие к стеклу клетки на месте внесения пробы. Это позволяет не только перенести все клетки в чашку, но и равномерно перемешать их с агаризованной средой; кроме того, при этом уменьшается адсорбция клеток на стекле.

Чашку наклоняют и покачивают, чтобы расплавленный агар, содержащий клетки, равномерно покрыл всю поверхность первого слоя.

Чашку помещают на установленный по уровню столик и дают агару застыть.

Эту процедуру проводят и с другими чашками, необходимыми в опыте.

Добавляют пипеткой или выливают из пробирки 2,5—3 мл 0,7%-ного расплавленного агара на застывшую поверхность и покачиванием равномерно распределяют его. Чашки помещают на установленный по уровню столик и дают застыть третьему слою агара.

Чашки можно инкубировать в любом положении,

поскольку при использовании этого метода возможность заражения и высыхания значительно ниже, чем при методе посева в чашках на поверхность агара.

И. Следят за ростом колоний и просчитывают их. Колонии, растущие под поверхностью, более компактны, имеют четко очерченные края и меньший размер по сравнению с обычными поверхностными колониями. Их труднее считать, однако увеличительные стекла или специальные насадки на очки помогают снизить напряжение глаз в процессе счета.

Дополнительные затраты труда, необходимые при посеве в многослойный агар, оправдываются, когда вырастает очень много колоний. Равномерность распределения колоний по чашке определяют визуально. Если распределение действительно равномерно, просчитывают колонии в какой-либо части чашки и затем получают общее их число на чашках перемножением. Использование бинокулярной лупы позволяет избежать трудностей, связанных с подсчетом мелких и близко расположенных колоний, и в ряде случаев «спасти» эксперимент, узким местом которого оказался именно этап подсчета колоний.

НАИБОЛЕЕ ВЕРОЯТНЫЕ ЧИСЛА

Концентрация живых клеток может быть определена методом наиболее вероятных чисел (НВЧ), заключающимся в математической оценке вероятности присутствия жизнеспособных клеток в серийных разведениях, в которых рост уже не регистрируется.

Готовят несколько параллельных разведений клеток в ростовой среде и после инкубации учитывают пробирки с выраженным бактериальным ростом. Полагают, что в пробирки, в которых отсутствует рост, не было внесено даже одной клетки, способной расти. Поскольку распределение частиц должно подчиняться формуле Пуассона (см. ниже), среднее число клеток в таком разведении можно вычислить по формуле Р0 = е~т, где т — среднее, а Ро — отношение количества пробирок, где отсутствует рост, к общему числу пробирок. Затем среднее умножают на фактор разбавления и на объем инокулята, который дает заметный рост исходной культуры. Метод НВЧ статистически весьма неэффективен, поскольку каждая

пробирка соответствует только небольшой части поверхности чашки Петри. В связи с этим приходится либо использовать много пробирок, либо удовлетвориться весьма приблизительным результатом.

Одним из преимуществ метода НВЧ является возможность его использования в отсутствие способа культивирования бактерий на твердой среде. Второе преимущество заключается в том, что он удобен в случае высокой вариабельности кинетики роста. Предположим, что некоторые клетки из смешанной культуры растут быстро, образуя на агаре крупные колонии, которые, распространяясь по поверхности, маскируют появляющиеся позже мелкие колонии интересующего нас микроорганизма. Хотя количество таких мелких колоний может быть больше, их невозможно учесть на чашках из-за присутствия колоний более подвижных или быстрее растущих бактерий. Третье преимущество метода НВЧ состоит в том, что в присутствии не представляющих интереса организмов и в отсутствие подходящего метода селекции его можно использовать для выявления легко обнаруживаемых продуктов (например, пигментов или антибиотиков), продуцируемых изучаемыми микроорганизмами. В этом случае, несмотря на более выраженный рост контаминирующих микроорганизмов, количество исследуемых батерий определяют по числу пробирок, где образование характерных продуктов отсутствует. И наконец, метод НВЧ используют в случае, если агар или другие отвердители содержат некоторые факторы (например, тяжелые металлы), которые изменяют достоверность подсчета или взаимодействуют с изучаемыми бактериями.

Подсчет по методу НВЧ помогает ускорить современная лабораторная техника. Существуют, например, специальные устройства для заполнения лунок в пластмассовых пластинах, имеющих до 144 лунок. Для подсчета лунок, в которых рост отсутствует, используют сканирующие устройства, а для заполнения небольших пробирок широко применяются автоматические и полуавтоматические пипетки. Благодаря этому появляется возможность проверять значительно больше культур, чем с помощью классических методов, в которых используют фиксированное число разведений и фиксированное число

Рис. 11.2. Ошибки (коэффициент вариаций), возникающие при использовании метода наиболее вероятных чисел (НВЧ), как функции относительного числа сохранивших стерильность пробирок (нижняя абсцисса) и среднего числа клеток иа одну пробирку (верхняя абсцисса). Соответствующие оптимумы имеют место при числе стерильных пробирок 20,8 и среднем числе клеток 1,59. Пробирки (п) готовят при одном разведении.

пробирок. Все это заставляет отказаться от старых таблиц и приемов вычислений и искать новые подходы к проблеме и новые методы расчета.

Несмотря на статистическую неэффективность, при работе с одним разведением метод НВЧ наиболее точен в том случае, когда среднее число способных неопределенно долго расти бактериальных клеток составляет 1,59 на пробирку [18]. Это соответствует положению, когда 20,8% пробирок остаются стерильными (рис. 11.2). Если предполагаемое число клеток в исходной суспензии известно довольно точно, то все имеющиеся пробирки следует засеять из разведения культуры, соответствующего величине 1,59. Точность быстро падает при отклонении от оптимальной величины, особенно при выходе за пределы интервала 1—2,5 клетки на пробирку. Так,

работа с 10-кратным (по сравнению с оптимальным) разведением не дает никакой информации о среднем числе клеток. Соответственно если предполагаемое число жизнеспособных клеток находится в пределах 5-кратного разведения, то целесообразно использовать все пробирки для получения разведения, предположительно соответствующего 1,59 клетки на пробирку, и исходить при этом из предположения, что истинное число жизнеспособных клеток находится в середине возможного интервала.

Обычно, однако, ориентировочная информация отсутствует, и необходимо готовить ряд разведений, например в 10-кратном или каком-либо ином интервале. В этом случае можно отбросить данные по разведениям, где процент сохранившихся стерильными пробирок лежит вне интервала 8—36 или (если допустим более широкий интервал ошибок) вне интервала 5—50. Ошибку для разведений в пределах интервала можно найти или интерполировать по данным рис. 11.2. Этот метод прост, но требует много времени. Поэтому были предложены статистические приемы, позволяющие объединять данные, полученные с использованием различных разведений и определенным числом пробирок для каждого разведения.

В табл. 11.1 приведены результаты расчетов для определения НВЧ. Они применимы при интерпретации данных, полученных при учете посевов в 10 параллельных пробирок из трех последовательных 10-кратных разведений. Рассмотрев 1000 возможных результатов таких тестов, Халворсон и Зиглер [21] отмечают 210 случаев, когда величины Р превышают 0,01% (объяснения и определения терминов см. в сносках к табл. 11.1). Финни [18] подробно рассмотрел статистические аспекты и подходы к определению НВЧ для параллелей в каждом разведении. Он указывает, что в вычислении, связанном с подсчетом ошибок, существуют определенные преимущества, если серия разведений составляет такой интервал, что по крайней мере в одном разведении в каждой пробирке обнаруживается рост, а в следующем разведении в каждой пробирке роста нет. Но даже и в таком случае точные статистические расчеты весьма громоздки.

Таблица 11.1. Вероятности для метода наиболее вероятных чисел [21]°

Вероятность

Вероятность

Код

X