Книга
← К списку книгЗагрузка разделов…
активнаАктивные записи участвуют в каталоге и синках. Неактивная книга скрыта, но не удалена из базы.
Книга
ПРЕДИСЛОВИЕ К РУССКОМУ ИЗДАНИЮ
Виднейшие французские энологи профессора Ж. Риберо-Гайон, Э. Пейно, П. Риберо-Гайон и П. Сюдро создали четырехтомную монографию «Теория и практика виноделия». Том 1 «Анализ и контроль вин» вышел в 1972 г., том 2 «Характеристика вин. Созревание винограда. Дрожжи и бактерии» — в 1975 г., том 3 — «Виноделие. Превращения в винах» — в 1976 г. и том 4 «Осветление и стабилизация вин. Материалы и установки» — в 1977 г.
В этом фундаментальном труде обобщены результаты длительных исследований Научного центра при университете в Бордо, а также последние данные по виноделию ученых Франции и других стран.
Советский читатель уже знаком с трудами французских энологов. В 1956 г. в «Пищепромиздате» вышла книга (на русском языке) Ж. Ри- беро-Гайона «Виноделие. Преобразование вина и способы его обработки», выпущенная во Франции в 1947 г. В 1971 г. издательством «Пищевая промышленность» был издан сокращенный перевод книги Ж. Ри- беро-Гайона и Э. Пейно «Виноделие. Возбудители брожения. Приготовление вин», выпущенной во Франции в 1960 г. Эти книги пополнили знания специалистов винодельческой промышленности СССР по вопросам механизмов процессов виноделия; в настоящее время эти книги стали библиографической редкостью.
В новой четырехтомной работе крупнейших ученых-виноделов Франции изложены последние данные о методах анализа вин, превращениях в винах, об уходе за ними и обработке, а также о материалах и оборудовании, применяемых в виноделии. Особое внимание обращено на процессы созревания винограда и их влияние на качество вин.
Четырехтомная монография французских энологов наравне с восьмитомной «Энциклопедией виноградарства и виноделия мира» проф. П. Гаролио (Италия, 1973 г.) является фундаментальным сводом знаний по всем основным вопросам теории и практики виноградарства и виноделия.
Издательство «Пищевая промышленность» предполагает дальнейшее издание на русском языке томов 3 и 4 «Теории и практики виноделия».
Том 1 монографии, посвященный методам анализа вин, применяемым во Франции, для наших специалистов имеет чисто познавательный характер, так как в СССР используются другие методы анализа. В связи с этим том 1 не будет переведен на русский язык.
Первая часть настоящего тома 2 посвящена понятиям качества и типа вин, вкусовой характеристики их, поскольку вопросы повышения качества продукции в настоящее время особенно актуальны.
Во второй части книги описываются процессы созревания винограда, третья часть посвящена дрожжам — возбудителям спиртового брожения и четвертая — болезнетворным и полезным бактериям вина. Впервые приводится современная классификация дрожжей и бактерий.
Каждая глава книги сопровождается подробной библиографией. К сожалению, работы советских авторов использованы крайне слабо.
Следует отметить, что все исследования, описанные в данной книге, (проводились в условиях классического виноделия Франции, поэтому при- ®еденные рекомендации необходимо применять, учитывая современное крупномасштабное поточное производство.
В книге в некоторых случаях даны другие обозначения по сравнению с принятыми в СССР. Так, титруемая и летучая кислотности приведены в пересчете на серную кислоту, а в СССР — на винную.
В целом книга является весьма полезной для наших специалистов.
Проф. Г. Г. ВАЛУЙКО
Часть первая
ТИПЫ И ХАРАКТЕРИСТИКА ВИН
Глава!. ПОНЯТИЯ КАЧЕСТВА И ТИПА ВИН
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЧЕСТВА
Качество вина есть совокупность свойств, делающих его приемлемым или желательным для потребителя, на которого производят впечатление особенности вина, вызывающие приятные ощущения. Поэтому проблема качества должна решаться с помощью технологии производства вина, которая направлена прежде всего на сохранение и развитие этих особенностей (Ларреа, 1956). Качество является совокупностью приятных вкусовых ощущений, непосредственно связанных с химическим составом вина. Но хорошо известно, насколько неточными и субъективными являются определение и оценка вкусовых свойств вина, с одной стороны, и трудность связать их с химическим составом вина — с другой. По существу, невозможно полностью решить эту проблему. Также хорошо известно, что качество вина является понятием относительным, что вкус потребителя резко изменялся с течением времени и изменяется сейчас в зависимости от района.
Основная трудность заключается в том, чтобы определить и перевести на точный и ясный язык достоинства и недостатки определенного вина. Трудность немалая, поскольку для того чтобы знать влияние на качество вина того или иного способа приготовления, той или иной обработки, того или иного
материала или чтобы достаточно точно судить о факторах, обеспечивающих лучшее качество, нужно прежде всего иметь надежный и удобный метод для определения и выражения типов, норм, пределов, сравнительных величин. Эти трудности хорошо описал Вилфорт (1959). Они тем больше, чем выше качество исследуемых вин.
Понятно, что дегустация должна играть основную роль в определении качества, но необходимо, чтобы она проводилась в определенных условиях, так как ее оценки часто значительно расходятся: мнение потребителя или дегустатора может изменяться в зависимости от важности, которую он приписывает тому или иному недостатку -или тому или другому качеству в момент определения качества вина.
Кроме того, необходимо параллельно с дегустацией проводить по возможности химический анализ в тех случаях, когда он позволяет объективно и надежно установить некоторые достоинства или недостатки и выразить их определенными показателями. Это касается различных форм кислотности, характера и степени созревания вина. Однако состав вина представляет собой сложный комплекс, и основные элементы вкуса и аромата все еще не могут быть идентифицированы нашими методами анализа. Поэтому следует считать нормальным, когда для эффективного
изучения научных и технических проблем, связанных с качеством вина, одной из задач энологии является: сделать понятие качества объективным, конкретным и возможно более точным, установить критерии качества, умеш.- шая до минимума неизбежную часы условностей и случайностей, которые свойственны таким определениям.
НАУЧНЫЕ И ТЕХНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРОБЛЕМЫ КАЧЕСТВА
Цель энологии как науки заключается в том, чтобы помочь производителю получить возможно лучшее вино, полностью используя все качества винограда. С научно-технической точки зрения проблема сводится к выяснению и реализации тех условий, в которых должны находиться виноград и вино, чтобы природные качества конечного продукта всегда развивались в полной мере. Эта задача будет решена тем лучше, чем полнее будет изучено вино, его составные части, превращения, которым они подвергаются, т. е. чем дальше продвинется наука о вине и чем лучше будут использоваться ее данные в практике виноделия.
Эта проблема становится тем более неотложной потому, что довольно часто проявляется тенденция оспаривать ее реальность, считать, что качество не имеет отношения к энологии. Последняя, как известно, указывает пути предотвращения нарушений во время бро жения и меры по предупреждению ухудшения качества вина при хранении и, таким образом, оказывает неоспоримую помощь практикам. Определение же тонких качеств вин лучших марок, реализация условий их производства, связанная с трудно уловимыми обстоятельствами, а также определение качеств вин массового потребления не входит в задачи энологии.
Достижение наилучшего качества является пос паянной заботой энолога, практической цеп^ю его деятельности, хотя совершенно очевидно, что он может получить фактические данные и делать выводы только на основе результатов возможно более точной органолептической оценки, т. е. дегустации, к которой следует постоянно прибегать как лично, в меру своих способностей, так и при помощи высококвалифицированных дегустаторов. Правда, на практике не так просто обеспечить надежное получение из данной партии винограда наилучшего вина или получить именно такой тип вина, который соответствует вкусам потребителя. Нередко бывает, что вино, даже обработанное, казалось бы, самым надлежащим образом, подвергается частичной порче или неблагоприятным превращениям, в результате чего оно перестает обладать теми качествами, которые имело вначале.
Напиткам, в частности вину, присущ один недостаток, которого нет у продуктов ь других отраслях производства. Если в промышленности дефектная деталь считается браком, то ее выбрасывают. Не может быть и речи о том, чтобы ее использовать, смешивая с другими. Совсем другая картина наблюдается в виноделии. Здесь допускается смешивание, что ведет к снижению качества вина в целом. Купажирование позволяет на разных стадиях производства избавиться от плохого вина, увеличивая количество посредственного вина.
Необходимо также отметить, что в энологии известны две противоположные концепции: одна предусматривает недопущение снижения качества вина путем создания возможно лучших условий производства, другая же на первый план выдвигает лечение болезней вина (иногда ее называют терапевтической энологией). Последняя была бы ненуж-
ной, если бы правильно осуществлялась первая.
Технический аспект проблемы качества рассматривался на VIII Международном конгрессе по виноградарству и виноделию в 1956 г., где один из докладчиков привел следующий пример, относящийся к действию мик|роорганиз- мов.
Несомненно, что вино с высокой летучей кислотностью является очагом бактериальной болезни. Но все здоровые вина также содержат уксусную кислоту, имеют определенную летучую кислотность, и лишь тогда, когда она выходит за определенные пределы, состояние вина ухудшается вплоть до уксусного скисания, за исключением выси- коспиртуозных и экстрактивных вин. Количество летучих кислот влияет на качество вин да/ке пн да, когда процентное содержание их еще значительно ниже допущенных законом норм. Одно и то же вино будет выше по качеству, более мягким, более бархатистым, когда оно содержит летучих кислот 0,5 г/л или еще лучше 0,4 г/л, чем, например, при содержании их 0,8 г/л. Когда дело касается высококачественных вин, одной заботы о том, чтобы не превзойти установленный предел, недостаточно. Нужно стараться, чтобы получаемые вина имели низкую летучую кислотность. Впрочем, вопрос еще осложняется влиянием этилацетата.
По мере возрастания летучей кислотности чаще всего повышается, иногда очень значительно, содержание нелетучих кислот, т. е. увеличение общей кислотности более или менее превышает отдельно взятое повышение летучей кислотности. Общая кислотность может подняться на 0,5 или 1 г/л и более в результате образования молочной кислоты, которая не придает вину плохого привкуса, как уксусная, и к тому же обычно содержится во всех винах. Но если содержание молочной кислоты
превышает норму, то само повышение общей кислотности, которое получается' в результате этого, оказывает на вино неблагоприятное воздействие и в конечном счете ухудшает его, уменьшая бархатистость, мягкость, маслянистость.
Действительно, именно вследствие повышения общей кислотности, или содержания летучих кислот, или же процентного содержания этилацетата хорошие красные вина часто теряют свою бархатистость. Серьезные изменения, ведущие к полной порче продукта, в наши дни происходят относительно редка. С другой стороны, гораздо чаще бывают изменения, которые можно было бы назвать частичной порчей, проявляющейся в том, что вина становятся менее бархатистыми, менее свежими, менее гармоничными, чем они должны быть. В некоторых районах и в отдельные годы это наблюдается. Проблема усложняется еще и тем, что превращения, осуществляемые бактериями, не только портят вино, но и могут действовать положительно.
СЛУЧАЙНЫЙ ХАРАКТЕР КАЧЕСТВА
Не только плохие погодные условия, плохие условия созревания или сбора урожая, которые не зависят от воли человека, могут быть причиной получения посредственного вина, но также и плохие условия, в которых изготовлялось или хранилось вино.
В частности, всякое вино, в особенности большинство высококачественных вин, эволюционирует с момента' окончания спиртового брожения до розлива в бутылки и вплоть до момента! потребления. Оно претерпевает многочисленные и сложные превращения биологического, химического или физикохимического характера, которые полностью изменяют его вкусовые характеристики. Эта эволюция может быть, благоприятной или неблагоприятной.
Эти элементы случайности, значение которых практики часто пытаются приуменьшить или же склонны рассматривать как неизбежные, ослабляются по мере обращения к научной энологии, современной технике и технологии. Для того чтобы всегда получать в том или ином районе из данного сорта винограда возможно лучшие вина, необходимы определенные условия, которые, прежде всего, следует хорошо знать (это задача разнообразных исследований,тесно переплетающихся между собой и с традиционными эмпирическими данными) и в последующем реализовать на производстве (это задача техники, подготовки соответствующих кадров, практического использования).
Кроме того, нужно иметь в виду способности, каждого отдельного работника, его умение достигнуть поставленной цели, личный опыт, интуицию и осмотрительность, чутье к тому, что является эффективным. Необходимо предвидеть ошибки и опасности, знать и применять на практике то, что является наиболее подходящим в данном конкретном случае приготовления или хранения вин.
В энологии, как и во многих других отраслях знаний, существуют правила, но, с одной стороны, еще не все факторы достаточно изучены для того, чтобы можно было сформулировать правила одновременно точные и всеобщие, с другой стороны, как только эти правила становятся слишком точными, они перестают быть универсальными, и появляются условия, в которых они оказываются неприменимыми. Несмотря на достигнутые успехи, выражающиеся в разработке возможно более общих правил, которые предусматривают особые случаи и средства их распознавания, энология еще не может абсолютно уверенно сказать, что следует делать в каждом конкретном случае и в определенной обстановке, что представляют
собой данный виноград или данные вина, что желательно делать, что можно делать, какие для этого нужны действия человека и какое требуется оборудование.
В конечном счете вино является продуктом труда и мастерства человека. Продукт высокого качества нельзя получить без постоянных и разумных усилий, которые начинаются на винограднике, продолжаются в бродильном отделении и заканчиваются в винном подвале.
Существует другое важное понятие о противоречии между качеством и его постоянством: можно предпочесть пониженное качество, но гарантированное, качеству более высокому, но не постоянному и, тем более, не стабильному. Действительно, очень часто факторы, обеспечивающие наилучшее качество, противостоят тем, которые дают надежность. Так, вина с низким содержанием кислот являются самыми лучшими, самыми бархатистыми, самыми полными, но именно такие вина являются наиболее трудными для приготовления и хранения и наиболее чувствительными к бактериальным изменениям, снижающим качество. Поэтому можно соблазниться хорошей сохранностью вин за счет повышенной кислотности. Точно так же сульфитация винограда, мезги или вина является необходимой мерой предосторожности, но она также может в большей или меньшей степени понизить качество, чего можно было бы избежать при высоком санитарно-техническом уровне производства.
Таким образом, усиленная сульфитация белых сладких вин является особенно неблагоприятной.
Правильным решением, очевидно, будет такое, при котором достижение высокого качества сочетается с принятием необходимых технических мер для его сохранения.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Понятие качества трудно определить, когда хотят установить его контроль, например, для подтверждения того, что вина с контролируемыми названиями по месту происхождения действительно происходят из указанных мест или обладают характеристиками таких вин.
В то время как количество вина и его цена являются понятиями точными и конкретными, качество представляет собой понятие в высшей степени неточное, субъективное, трудное для определения. Следовательно, суть проблемы контроля качества сводится к тому, чтобы попытаться сделать его, насколько это возможно, объективным показателем. Но никогда нельзя будет избежать некоторой неуверенности в окончательных выводах.
НАТУРАЛЬНОЕ ВИНО
И ВМЕШАТЕЛЬСТВО ЧЕЛОВЕКА '
Вино является натуральным продуктом и должно оставаться таковым. Оно не должно изменяться при внесении добавок и обработках, необходимых для стабилизации его.
Человек думает, что самое натуральное вино является самым вкусным и полезным для здоровья. Ясно, что так бывает далеко не всегда. Вмешательство человека может быть хорошим или плохим; поэтому оно должно быть очень осторожным.
Во все времена человек вносил ингредиенты в вино в целях его сохранения. Еще в античной древности в вино добавляли смолу или канифоль, в более позднее время — пряности; в средние века, по-видимому, были широко распространены вина, приправленные перцем. Внесение перца имело цель лучше сохранить вино, а также замаскировать его недостатки. Сернистая кислота в
виде серных фитилей действительно обеспечивает значительное улучшение сох’ а внести вина. Ее применяют для стерилизации бочек и, кроме того, небольшие количества сернистой кислоты, введенные в вино во время снятия с дрожжевого осадка, парализуют активность бактерий. Без серных фитилей было бы невозможно надежно обеспечить созревание высококачественных красных вин и реализацию белых вин лучших марок, которые в противном случае подверглись бы покоричневению или скисанию.
В наши дни технический прогресс обусловил новые возможности воздействия человека на способы производства продукции. Нельзя беспричинно отказываться от всяких нововведений и модификаций: прогресс нельзя остановить, новое заставит признать себя. И в то же время необоснованное применение нового может быстро привести к упадку традиционного производства и нанести вред здоровью человека. Нельзя ничего применять без предварительного серьезного исследования последствий предлагаемого способа.
Наилучшего качества можно добиваться регулярно и уверенно только на основе научной энологии и правильной техники виноделия. Современная техника в большой степени способствует неуклонному повышению качества ви- ■ номатериалов.
При выборе технических средств и способов виноделия необходимо руководствоваться следующим правилом: при введении новой технологии важно прежде всего убедиться, и самым строгим образом, что она не является попыткой фальсификации продукта. Затем, если перечисленные выше услсвия соблюдены, ее следует подвергнуть длительному практическому испытанию, которое только и сможет дать основания для окончательного решения о возможности ее применения.
СТАДИИ ПРОИЗВОДСТВА ВИНА
Энология не может не интересоваться различными аспектами проблем, которые выдвигает практика виноделия. Ее задачами является изучение вина, его состава и превращений, разработка и практическое применение средств и способов, с помощью которых человек уверенно получает из винограда лучшее вино.
Производство вина включает две основные стадии: первая — производство винограда (виноградарство), вторая — приготовление вина из винограда. Производство вина включает и третью стадию, которая является не менее важной, так как без нее оно не могло бы существовать, а именно: сбыт продукции, методы которого еще более различны. Поэтому сначала необходимо уточнить, какие отношения существуют между этими тремя стадиями: виноградарством как отраслью сельского хозяйства, виноделием как отраслью промышленности и сбытом, т. е. отраслью торговли. '
РАЗЛИЧНЫЕ.ТИПЫ ВИНОГРАДНИКОВ И ВИН
' Известно, что Роже Дион провел Важные исследования происхождения и Истории крупнейших виноградников Франции (1948, 1952, 1959), Анжальбер (1953) описал, как возникли лучшие вина районов Бордо, Коньяк, Порто.
Во Франции различают три зоны виноградарства:
на побережье Средиземного моря самое древнее, в наиболее благоприятных климатических условиях, что обеспечивает хорошие результаты с минимумом усилий;
в районах, расположенных у северной границы культуры винограда, где даже наиболее ранние сорта вызревают не всегда и высококачественное
вино получают лишь в благоприятные годы;
в районах, находящихся между этими двумя зонами, где культура винограда появилась позднее, чем в первой, требовала большего труда при ее создании и поддержании; в этих районах Франции (Шампань, Эльзас, Бургундия, Анжу, Бордо, Шаранта), не слишком благоприятных для виноградарства из-за недостаточного количества тепла или из-за чрезмерной влажности, закладка виноградников и уход за ними потребовали здесь больших усилий человека.
Причина создания этих виноградников вне пределов зоны Средиземноморья — расположение их вдоль больших путей, ведущих к рынкам Северной Европы, тогда как доставка винограда и вин по грунтовым дорогам из южных районов была очень трудной и дорогостоящей. Таким образом, появление этих виноградников было ответом на требование рынка, но вина, которые здесь производили, не всегда были самыми лучшими. Несомненно, что сегодня из урожая этих виноградников получают ,тонкие вина, например бургундское, и бордоское (красные вина), тогда как средиземноморское виноградарство, находящееся в лучших климатических условиях, производит, за исключением особых случаев, вина текущего потребления или, по меньшей мере, на один класс ниже по качеству.
Для приготовления тонкого вина требуется зрелый виноград, но в то же время не должно быть слишком быстрого и полного созревания. В слишком жарких районах вина даже из тонких сортов винограда, которые в других местах могут быть приятными, часто бывают в различной степени плоскими, негармоничными.
Кроме того, чтобы получать вина высокого качества, лоза должна быть малопродуктивной. Условия, обеспечива»
ющие хорошее качество вина, совсем не те, которые являются наиболее благоприятными для роста растения, обильного урожая и успешного созревания винограда.
По мнению Диона, «производство высококачественных вин связано прежде всего с длительностью времени, в течение которого культивирован виноград. Наши знаменитые виноградники насчитывают более 1500 лет. Бесчисленное количество наблюдений, тщательный уход, длительная адаптация, доводимая до совершенства, привели к тому, что продукты виноградного растения в тех частях Франции, где климат, казалось бы, должен исключить это, приобрели неподражаемые качества». Продукция этих близких к северным странам виноградников находила там хороший сбыт по повышенным ценам, что позволяло покрывать большие расходы на акклиматизацию культуры винограда и одновременно стимулировало и окупало усилия, затрачиваемые на повышение качества.
До начала XVIII в. вина района Бордо все еще были обычными ординарными. Согласно формуле той эпохи, требовалось вино «ходовое, хорошее, чистое и молодое». «Все, что мы знаем о торговле бордоскими винами в период до конца XVII в., относится к низкосортным винам без всякой выдержки и какой-либо бархатистости, букета и тела, которые мы находим в наших старых винах, выдержанных в течение пяти, десяти или пятнадцати лет» (Ан- жальбер, 1953). Создание красных вин лучших марок, которые мы потребляем сегодня, датировано XVIII столетием, тогда как виноградарство в этих районах существует более 1500 лет. В средние века вина должны были потребляться сразу же после их приготовления и, во всяком случае, не позднее начала следующего лета, так как в противном случае они портились и их при
ходилось выбрасывать. Именно поэтому начинали собирать виноград в июле и производили значительные количества высококислотного вина для того, чтобы купажировать вина. «Эксплуатация виноградника в средние века была предметом культуры, которая приближалась к современным приемам, тогда как тогдашнее виноделие было очень далеко от современных методов... Вина скисали... Молодое вино было дороже, чем старое. Муниципальные правила запрещали их смешивание и особенно продажу продукта такого купажа в качестве молодого вина. Все старались быстрее избавиться от вина нового урожая... С октября первые же суда увозили его в страны «Севера» (Бутрюш, 1947).
В течение XVII столетия конкуренция крепких вин, часто с добавлением спирта, конкуренция со стороны водки, пива, кофе, какао, а также общее перепроизводство дешевых вин низкого качества быстро обесценили ординарные вина французских экспортеров. Нужно было повышать их качество путем улучшения сортового состава, методов приготовления и хранения вин. Потребовались большие усилия, прежде чем человеку удалось улучшить качество вина, и, если создание современных типов было реализовано в относительно короткий период времени, примерно в первые 50 лет XVIII в. (Анжальбер, 1953), то это потому, что оно опиралось на большое прошлое виноградарства, виноделия и торговли вином, на вековой и обширный опыт, на основе которого могла произойти такая глубокая эволюция техники.
ТРАДИЦИОННЫЕ ВИНА ТЕКУЩЕГО ПОТРЕБЛЕНИЯ И ГИБРИДНЫЕ ВИНА
Вино по традиции является продуктом брожения ягод определенного вида: Vitis vinifera (от vinum — вино и
ferre— нести). Гибридное вино является новым продуктом, образующимся в результате брожения ягод виноградных растений, полученных от скрещивания Vitis vinifera с другими видами, которые сами по себе не могут дать продукта, называемого вином. В виноградарстве они обозначаются термином «гибриды».
Таким образом, гибридное вино представляет собой новый продукт из гибридных сортов, насчитывающий лишь несколько десятков лет своего существования и получивший широкое распространение лишь в последнее время благодаря более низкой себестоимости культуры (очень высокая продуктивность, устойчивость к болезням).
По внешнему виду этот продукт похож на вино как по цвету, так иногда и по некоторым сходным вкусовым характеристикам, но нет уверенности, что этот новый продукт, который не прошел многовековых испытаний, обладает тем же химическим составом и такими же биологическими свойствами.
Гибридное вино следовало бы прода- вать другим порядком, чем традиционное вино из Vitis vinifera, даже когда оно такое же хорошее по качеству, что случается редко.
Можно понять возражения сторонников гибридов: препятствовать продаже гибридного вина подтем же названием, как вино традиционное, значит загубить его производство, а ведь прогресс требует, чтобы исчезло традиционное вино, так как его себестоимость выше. На этом основании выдвинут принцип, что гибридное вино во всех отношениях похоже на традиционное вино и отличается от него лишь более низкой себестоимостью. Посадки гибридных сортов могут пойти на пользу и уже оказались полезными благодаря тому, что очень большое число французских сортов (группа Пино) имеют низкую продуктивность.
Таким образом, цена высококачественного вина все более приближается к цене вина массового потребления, а цена последнего, в свою очередь, выравнивается с ценой гибридного вина. Французское традиционное вино обычно продается по более высокой цене, чем гибридное.
В районах, где производят вина лучших марок, присутствие даже небольшого количества гибридов, хотя бы только для местного потребления, может привести к смешению вин, что нежелательно. Научные исследования дали основу для объективной дифференциации между винами vitis vinifera и гибридными.
КУПАЖИРОВАНИЕ ВИН
Иногда купажные вина противопоставляют сортовым, и, по мнению некоторых, смешивание вин является коммерческой практикой, которую следует считать порочной. В действительности, нужно различать следующие операции смешивания: эгализацию, или смешивание вин из разных емкостей одного урожая в одном и том же хозяйстве или винзаводе; ассамбляж, или составление определенного типа вина путем смешивания вин одного и того же происхождения и одного и того же названия; кю- ве, которое представляет собой смешивание в рамках одного родового названия вин различных винодельческих общин; (в качестве примера можно привести Шампань, где в кюве могут смешиваться вина из белого и красного винограда, вина из урожаев разных лет, которые имели особо высокое качество); наконец, «купажирование» — термин, который чаще всего обозначает смешивание вин различных районов и годов урожая.
Согласно определению, данному в законе от 1 января 1930 г. (дополненному изменениями от 19 апреля 1930 г. и
8 июля 1933 г.), купажные винадз действительности представляют собой смесь, производимую коммерсантом, из «вин, различающихся между собой происхождением». Купаж подразумевает присоединение к определенному вину вина другого происхождения в пропорции достаточной, чтобы в ощутимой степени изменить состав первого.
В некоторых определениях выделятся лишь корректирующий характер операции. Так, купажирование проводят с целью составить нейтральное вино массового потребления, а также скорректировать некоторые недостатки или исправить дефекты. К сожалению, иногда действительно пользуются возможностями, которые дает купаж, чтобы избавиться от того или иного испорченного вина. Впрочем, нет уверенности, что такая операция рентабельна в коммерческом плане, так как требуется много хорошего вина для того, чтобы заметно улучшить плохое, причем это Л'лучшение временное.
И в то же время купажирование, проводимое добросовестно, является -операцией естественной, логичной, необходимой. имеющей исторические традиции. Понятно, что это действительно тонкая энологическая операция, требующая опыта, техники, знаний, которые приобретаются только в процессе длительной практики и в каждом случае после углубленного дегустационного исследования. '
ЗАКЛЮЧЕНИЕ \
Авторы хотели бы на этом закончить главу. Качество вин не всегда такое, каким оно могло бы быть, а типы вин не всегда правильно разграничены. Возможности, которые в этом отношении предоставляет энология, используются еще далеко не полностью.
ЛИТЕРАТУРА
Barailhe Р. (1952), L’entente interproffessi- onnelle et le marche du Vin de Bordeaux.
These doctoral en droit, Bordeaux.
Branas J. (1955), Progr. agric, vitic., 143, 167.
Boutruche R. (1947), Seigneurs et paysan^ du Bordelais pendant la guerre de .Cent ans, Paris.
Dion R. (1948—1949), Grands traits d’uie Geographie viticole de la France. Public. Soc. Geographie, Lille.
Dion R. (1952), La creation du Vignoble bordelais, Editions de i’Ouest. Angers.
Dion R. (1952), Les origines du Vignoble bo- urguignon, Annales (Economies, Societes, Civilisations).-
Dion R. (1952), Querelle des anciens et des modernes sur les facteurs de la qualite des vins. Ann. Geographie.
Dion R. (1959), Histoire de la vigne et du vin en France des origines au XIXе siecle, Paris.
D u b a q u i ё J. (1927), Ann. Union anc. Eleves Ec. Chimie, Bordeaux.
Enj albert H. (1953), Comment naissent les grands crus: Bordeaux, Porto, Cognac. Annales (Economies, Societes, Civilisations).
Ferre L. (1958), Traite d’Oenologie bourguig- nonne. Inst. nat. Appell. Origine, Paris.
Fl an z у M. (1954), Ind. agric, alim., 71, 309.
Flanzy M. (1954), Bull. Soc. scient. Hygiene alim., 42, 77.
Lafforgue G. (1954), Bull, techn. Inform. Minist. Agric.■
Larrea Redondo A. (1956), Aspect technique du probleme de la qualite, VIIIе Congr. intern. Vigne et Vin, Santiago du Chili, publie dans Bull, intern. Vin, 1959, 32 (343), 26.
Levadoux L. (1953), Progr. agric, vitic., 139, 118 et 295.
Marteau G. (1961), Progr. agric, vitic., 156, 17.
Mi chard P. (1944), Plantation et culture de la vigne. Encyclopedic paysanne, Flammarion, Paris.
R i b ё r e a u-G а у о n J. (1950), La degustation. Conf Ec. de Brasserie, Bruxelles. '
R i b ё r e a u-G а у о n J. (1955), Vignoble de la Gironde et Vin de Bordeaux. Conference a la Faculte de droit de Bordeaux, 16 fdvrier, pub- liee dans Ann. Fac. de Droit (Serie Economi- que), Bordeaux. Кёёбйёе dans Journ. vinic., 1966.
Ribereau-Gayon J. (1956—1957), La longue histoire des grands Vins de France. Con- 1ёгепсе a 1’Institut frangais de Buenos-Aires, 16 avril 1956; publiee dans Bull. Inst. nat. Appell. Origine, 60, 39 гёёбйёе par Journ. vinic., 1966.
R i b ё r e a u-G а у о n J. (1959), Bull, intern. Vin, 343, 40.’
V i 11 f о r t h F. (1959), Bull, intern. Vin, 343, 20
Глава 2. ДЕГУСТАЦИЯ.
ВКУСОВАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИН
Дегустировать — это значит пробовать на вкус продукт, качество которого хотят оценить, т. е. ощутить его с помощью органов вкуса и обоняния, попытаться познать его, исследуя различные недостатки и достоинства, выражая их в установленной системе.
У термина «дегустация» много синонимов: исследование с помощью органов чувств, органолептическая или физиологическая оценка, качественный анализ органолептических ощущений, метод оценки органолептических характеристик и т. п.
Дегустация вина вызывает более или менее приятные реакции слизистых оболочек полости рта и носа. Цель ее —■ определить различные ощущения, которые вызывает вино, общее ощущение от него и таким образом составить себе представление о впечатлении, которое оно вызовет у потребителя. Следовательно, это одновременно способ анализа и коммерческой оценки. Дегустатор выражает ощущения, которые он воспринимает, в определенных терминах, означающих органолептические характеристики вина, он делает выводы из этих заключений и выносит суждение.
Если рассматривать вино как приятное дополнение к нашему питанию, то ясно, что оценка его качества зависит, прежде всего, от того, в какой степени оно удовлетворяет наш вкус. Поэтому в технике виноделия и в торговле винами роль дегустации для оценки качества является решающей.
Существует много способов дегустации. При этом можно ставить себя при опробовании вина в положение людей с различными точками зрения: потребителя, любителя вина и дегустатора- профессионала. Первые ищут в дегустации, прежде всего, удовольствие и ста-
вят себя в условия, когда качества вина могут проявиться полностью, при оптимальных температурах, обычно вовремя еды. Профессионал дегустирует как критик; в первую очередь он ищет возможные недостатки и выбирает такие условия, в которых эти недостатки могут проявиться. Он старается понять, объяснить, предвидеть. Его опыт позволяет ему пойти в своей оценке дальше, чем это может сделать неспециалист. Обучение дегустации, безусловно, во многом помогает правильной оценке хорошего вина.
В профессиональной дегустации существуют различные приемы оценки на вкус. Так, коммерческая дегустация заключается в том, чтобы дать оценку товарного качества вина или распознать его происхождение. Она отвечает на такие вопросы: имеет ли вино характеристики и качество, соответствующие его названию? Какова его ценность? В этом случае можно говорить об оценивающей дегустации.
Технической дегустацией! называют, прежде всего, дегустацию в энологических целях. Она объясняет тот или иной вкус составом вина; делает анализ; разлагает его на более простые вкусовые тона, которым можно дать название; пытается связать определенный привкус с определенным веществом, разобраться в условиях приготовления вина, его хранения; пытается предвидеть последующее состояние вина, ход его созревания. Такая дегустация идет в своих суждениях дальше, чем первая. Авторы называют ее дегустацией аналитической, и именно ей уделяется здесь основное внимание.
Существует много работ и статей, посвященных технике дегустации и трудному искусству опробования вин (Ле Маньан, 1949, 1951; Америк, 1948; Аме-
19701970ГО^Жаямучная 6-лйа.-.4:7. км■м. С. М. Кир'м^Ине. Мг. Орджоникидзе СО AC^rГО^Жаямучная 6-лйа.-.4:7. км■м. С. М. Кир'м^Ине. Мг. Орджоникидзе СО AC^rг., по вопросг., по вопрос
1970
1970
ГО^Жаямучная 6-лйа.-.4:7. км■м. С. М. Кир'м^
Ине. М
г. Орджоникидзе СО AC^r
ГО^Жаямучная 6-лйа.-.4:7. км■м. С. М. Кир'м^
Ине. М
г. Орджоникидзе СО AC^r
г., по вопрос
г., по вопрос
рян и Ресслер, 1952; Америн и сотрудники, 1959; Шове, 1950, 1951, 1955, 1956; Кленк, 1950; Марто; 1953; Гот, 1958^.
В книгах Ле Маньана дегустаторы, нашли сведения по анатомии и физио-
логин органов чувств, понятия о стимулировании чувств, которые лежат в основе вкусового ощущения. Можно сказать, что эти работы стали отправным пунктом для создания дегустации.
Америну и его сотрудникам принадлежит заслуга проведения опытов по унификации тестов, повышению их точности, применению статистических методов к оценке качества.
Шове описал обонятельные ощущения при аналитическом исследовании запаха. Другие авторы представили обобщенное изложение вопроса.
В этой главе проводится различие между дегустацией теоретической, которая интересуется физиологией и чувствительностью ощущений, дегустацией аналитической, стремящейся связать вкус вина с его составом, и дегустацией прикладной (описание вкусовых ощущений), использующей специальную терминологию и содержащей обстоятельно изложенное суждение.
В последние годы было опубликовано много фундаментальных трудов, в частности работа португальского автора Лопеса Виера (1971).
Национальный центр по изучению и исследованию питания и пищевых продуктов издал в 1966 г. отчет о научном семинаре, проведенном в ноябре 1964 г. на тему «Субъективные и объективные методы оценки органолептических характеристик продуктов питания». В первой части отчета говорится об общих проблемах дегустационных испытаний и приводятся основные данные, которые необходимо знать дегустаторам.
Главы о рациональных основах анализа органолептических качеств (Ле Маньан) и об общих принципах субъективного анализа вкусовых оттенков,
или методологии вкусовых испытаний (Деплядт), можно рассматривать как основы науки и искусства дегустации. К этому нужно еще добавить технический словарь терминов, выражающих
органолептические характеристики продуктов питания вообще (Ле Маньан, 1962). Словарь для обозначения вин содержит около 140 терминов.
Книга «Принципы сенсорной оценки пищи» (Америн и сотрудники, 1965) представляет собой хорошо документированную монографию, излагающую механизм чувственного восприятия при дегустации, которое обусловливает суждение, дифференциацию и оценку качества. В этой книге приведены также статистические методы обработки и использования результатов. Особого внимания заслуживают главы, в которых детально.рассматриваются вкус и обоняние.
XI Коллоквиум по энологии в Техническом институте вина (Франция) (1966), на котором обсуждался вопрос о дегустации, подвел итог исследованиям, проводившимся в этой области. В отчетах о заседаниях собрано большое количество очень важных сведений о физиологических основах дегустации, применении различных способов оценки, статистической интерпретации результатов, внешних факторов, воздействующих на ощущения, о терминоло
гии и др.
В «Кратком очерке введения в дегустацию» (Пюизэ и сотр., 1969) в доступной форме изложены некоторые технические и научные доклады, сде
ланные в последнее время, достаточно освещены также техника работы, орга
низация сеансов дегустации и запись
условных обозначений вин.
В книге «Опробование на вкус и обоняние» (Олофф и Томас, 1971) объеди
нен ряд монографий Международного симпозиума, проходившего в Женеве в
совых и обонятельных ощущений, где особо тщательному обсуждению были подвергнуты связи между структурой молекул, их вкусом и запахом.
Наконец, «Опыт дегустации вин» (Ведель и сотрудники, 1972) представляет собой суммарное изложение наших современных познаний в этом вопросе, разделенное на ряд глав: ощущения, продукт, сенсорный анализ, дегустаторы, словарь специальных терминов.
В целом можно сказать, что в течение последнего десятилетия развитие дегустации как науки было направлено на изучение механизмов ощущений. Основную роль в этом сыграли работы Ле Маньана и разработка более полного и более точного словаря, осуществленная под руководством Веделя. Медленнее развивалась экспериментальная часть: влияние внешних факторов, пороги восприятия вкусовых тонов и запахов и помехи. Лучше развивалась практическая часть: стандартизирован дегустационный бокал, в районах виноделия созданы постоянно действующие дегустационные залы, организовано специальное обучение дегустированию.
МЕХАНИЗМ ДЕГУСТАЦИИ
При дегустации используют ряд физиологических возбудителей органов чувств, которыми являются компоненты вина, вызывающие вкусовые и обонятельные ощущения. Терминология этого процесса требует некоторых пояснений.
Стимул, или возбудитель, является физическим или химическим агентом, вызывающим стимулирование, возбуждение, реакцию специфических сенсорных рецепторов.
Ощущен.ие представляет собой субъективное явление, рефлекс, являющийся результатом стимулирования ргранолептическорр аппарата.
Восприятие — это чувственное осознание, истолкование ощущения, именно опыт, приобретенный дегустатором, позволяет ему интерпретировать ощущения. Отсюда вытекает необходимость специального обучения дегустатора, чтобы он всегда держал в памяти большое число воспоминаний о различных чувственных ощущениях. Именно это является причиной того, что острота ощущения вкуса опытными дегустаторами кажется в настоящее время незаменимой в виноделии. Более подробное освещение вопроса об ощущениях дано в работах (Маньан, 1965; Ведель и сотрудники, 1972).
Другие определения, представляющие интерес для дегустатора, — это пороги ощущения и идентификации. Порогом ощущения, или обнаружения, называют наименьшее значение стимула, возбуждающего ощущение. Оно соответствует минимальному количеству продукта, вызывающему ощущение, хотя может быть и неидентифицирован- ным. Например, 18% людей ощущают 0,5 г сахарозы на 1 л воды, но могут точно идентифицировать ее только при концентрации от 1 до 2 г на 1 л воды.
Порог идентификации, или распознавания, точно соответствует минимальному количеству распознанного и идентифицированного продукта.
Указанные пороги зависят от остроты вкусовых ощущений людей, именно это и является одним из важных качеств при подборе дегустаторов.
Дегустация вина является выражением суммы ощущений, воспринимаемых одновременно или последовательно. При употреблении вина без достаточного внимания эти ощущения сливаются в одно целое. Аналитическая дегустация имеет целью разделять, располагать в определенном порядке и, наконец, идентифицировать различные ощущения.
В дегустации участвуют многие из
наших органов чувств, воспринятые ощущения поступают от различных типов стимулирования наших чувственных восприятий: визуального, обонятельного, вкусового, к которым нужно еще прибавить тактильные (осязательные) и термические рецепторы полости рта, а также общую химическую восприимчивость, вызывающую ощущения раздражающего характера или, как крайний случай, боли.
Когда пробуют вино, берут его в рот, надо учитывать, что воспринимаемые ощущения поступают не только от органа вкуса, но и от органа обоняния. Нос участвует в создании этих ощущений даже больше, чем язык, и поэтому под словом «вкус» того или иного вещества принято понимать то ощущение, которое в действительности воспринимается, в первую очередь, обонянием. При дегустации тепло полости рта, движение щек, языка, легкое вдыхание воздуха, которое производят некоторые дегустаторы, даже их нормальное дыхание направляют в нос летучие вещества, которые составляют аромат и букет вина. Движение глотания, которое трудно не сделать, когда дегустируешь, вызывающее легкое сжатие полости рта, точно также посылает пары вещества в носоглотку и способствует восприятию запаха. Часть полости носа все еще воспринимает ощущение от вина, когда после дегустации, выпустив изо рта или проглотив жидкость, выдыхают через нос. В этот момент и в течение многих последующих выдохов воспринимают запах, который пропитал слизистые оболочки рта.
Во время дегустации нетрудно избавиться от обонятельных ощущений, чтобы остались только ощущения вкусовые в полном смысле слова; если при дегустировании зажимать ноздри, то приходится удивляться, как слабо воспринимается вкус; в этих условиях нельзя даже утверждать, что ощуща
ешь вкус вина. Подобное возникает при насморке.
Таким образом, при полном отсутствии обоняния восприятие пропадает. Обычно в таких случаях говорят, что «потерян вкус», тогда как в действительности речь идет об обонянии.
Как уже было сказано, вкус в общепринятом смысле слова включает также и обонятельные ощущения, госпри- нимаемые внутренними путями, тогда как вкус как таковой является лишь той частью вкусового ощущения, которое воспринимается языком. Под термином «букет» понимают совокупность ощущений, воспринятых носом или полостью рта во время дегустации.
В табл. 2.1 приводится перечень органов чувств и ощущений, связанных с дегустацией, которые группируются в соответствии с рациональной терминологией.
Зрительные ощущения
Зрение является первым из органов чувств, с помощью которых производится дегустация. Зрительные ощущения дают представление о цвете (интенсивность, оттенок) и прозрачности (помутнение, блеск) вина. Но внешний вид вина говорит, кроме того, и о других качествах: его текучести, выделении углекислого газа, влиянии явлений капиллярности на стенки стакана в зависимости от процентного содержания спирта. Это элементарные данные, которые подготавливают и во многом облегчают суждение о вине с помощью других органов чувств. Мутное вино часто получает плохую оценку по вкусу. Цвет говорит о возрасте, состоянии вина. Дегустировать вино, не видя его очень трудно и поэтому можно перепутать при дегустации вслепую сухое белое малокислотное вино с розовым или красным вином, содержащим мало танина. Освещенность может оказывать
ОрганыОрганы чувств и ощущения, вызываемые имиВоспринимаемые характеристикиГлазаЗрение — визуальные ощущенияЦвет, прозрачность, текучесть, бурное выделение газавнешний видНосОбоняние(передние носовые пути) — обонятельные ощущенияАроматЗапахБукетРотОбоняние(задние носовые пути) — обонятельные ощущения ■Аромат во рту Вкус• ВкусОщущение вкусаВкусовые ощущенияВкус в собственном смысле словаРеакция слизистых оболочек. Химическая чувствительностьТерпкость, вяжущий вкус, едкостьПокалываниеТактильные ощущенияКонсистенция, текучесть, маслянистость• ОсязаниеТепловые ощущенияТемператураОрганыОрганы чувств и ощущения, вызываемые имиВоспринимаемые характеристикиГлазаЗрение — визуальные ощущенияЦвет, прозрачность, текучесть, бурное выделение газавнешний видНосОбоняние(передние носовые пути) — обонятельные ощущенияАроматЗапахБукетРотОбоняние(задние носовые пути) — обонятельные ощущения ■Аромат во рту Вкус• ВкусОщущение вкусаВкусовые ощущенияВкус в собственном смысле словаРеакция слизистых оболочек. Химическая чувствительностьТерпкость, вяжущий вкус, едкостьПокалываниеТактильные ощущенияКонсистенция, текучесть, маслянистость• ОсязаниеТепловые ощущенияТемператураТаблица 2.1Таблица 2.1Органы чувств, связанные с дегустациейОрганы чувств, связанные с дегустациейкосвенное влияние даже на остроту обоняния: при достаточном освещении запахи воспринимаются лучше.
Органы
Органы чувств и ощущения, вызываемые ими
Воспринимаемые характеристики
Глаза
Зрение — визуальные ощущения
Цвет, прозрачность, текучесть, бурное выделение газа
внешний вид
Нос
Обоняние
(передние носовые пути) — обонятельные ощущения
Аромат
Запах
Букет
Рот
Обоняние
(задние носовые пути) — обонятельные ощущения ■
Аромат во рту Вкус
• Вкус
Ощущение вкуса
Вкусовые ощущения
Вкус в собственном смысле слова
Реакция слизистых оболочек. Химическая чувствительность
Терпкость, вяжущий вкус, едкость
Покалывание
Тактильные ощущения
Консистенция, текучесть, маслянистость
• Осязание
Тепловые ощущения
Температура
Органы
Органы чувств и ощущения, вызываемые ими
Воспринимаемые характеристики
Глаза
Зрение — визуальные ощущения
Цвет, прозрачность, текучесть, бурное выделение газа
внешний вид
Нос
Обоняние
(передние носовые пути) — обонятельные ощущения
Аромат
Запах
Букет
Рот
Обоняние
(задние носовые пути) — обонятельные ощущения ■
Аромат во рту Вкус
• Вкус
Ощущение вкуса
Вкусовые ощущения
Вкус в собственном смысле слова
Реакция слизистых оболочек. Химическая чувствительность
Терпкость, вяжущий вкус, едкость
Покалывание
Тактильные ощущения
Консистенция, текучесть, маслянистость
• Осязание
Тепловые ощущения
Температура
Таблица 2.1
Таблица 2.1
Органы чувств, связанные с дегустацией
Органы чувств, связанные с дегустацией
Обонятельные ощущения
Эти ощущения имеют наибольшее значение для дегустации. Орган обоняния находится в верхней части носа (рис. 2.1). Собственно нос не является
органом обоняния в точном значении этого слова, он всего лишь канал для доступа вдыхаемого воздуха к слизистой обонятельной оболочке. В носовой полости находятся три раковины, расположенные одна над другой. Слизистая обонятельная оболочка находится на уровне средней раковины по другую сторону от узкой щели с отверстием 1 — 2 мм, называемой обонятельной щелью.
Чувствительная слизистая оболочка, тонкая и гладкая, пигментирована в желтый цвет. Это желтое пятно очень небольшое по размерам (приблизительно 2,5 см2). На его поверхности находятся тонкие удлинения нейронов, или обонятельных ресничек, которые омываются слизистой жидкостью.
Рис. 2.1. Локализация органа обоняния:
1 — нижняя раковина; 2 — средняя раковина, 3 — верхняя раковина; 4 — обонятельная слизистая оболочка.
Форма органа обоняния позволяет понять, что слизистая оболочка нахо- дптся несколько в стороне от пути прохождения вдыхаемого воздуха, и, так как доступ к ней возможен только через узкую щель, при нормальном дыхании к ней может поступать лишь малая часть газов, имеющих запах. Количество поступающих к этой оболочке запахов увеличивают и тем самым усиливают ощущение, производя последовательные вдохи через нос, «обнюхивая» дегустируемый напиток и втягивая носом его запах.
Потеря обоняния, вызываемая насморком, является следствием закрытия обонятельной щели при воспалении тканей и возникновении опухлости тканей.
Вкусовое ощущение неизбежно сопровождается, хотя это на первых порах и трудно различить, ощущением обонятельным. Большинство наших продуктов питания выделяют насыщенные запахами пары, которые входят в носовую полость с вдыхаемым воздухом, играют решающую роль в создании ощущения вкуса. Запах вызывается контактом сенсорного поля с материальными частицами, находящимися в ничтожно малых количествах. Это явление носит периодический характер, как и дыхание. Оно чувствуется во время жевательных движений ртом и проявляется в полном объеме к концу глотания, так как стенки глотки в это время представляют обширную площадь для испарения вина.
Обоняние человека отличается исключительной тонкостью. По своей чувствительности оно намного превосходит химические реактивы. Обоняние является намного многограннее и чувствительнее, чем вкус, а запах намного сложнее, чем вкусовые ощущения в полном смысле слова. Если их можно свести всего лишь к четырем элементарным ощущениям вкуса, то запахи являются результатом значительного числа элементарных ощущений. Из многих систем классификации запахи можно свести к девяти основным группам: животные, бальзамические, лесные, химические, пряные, эмпиреомати- ческие, цветочные, фруктовые, растительные. Все они присутствуют в запахах вин, но вина лучших марок имеют сложный аромат или букет, которые с трудом поддаются анализу. Опытный дегустатор при внимательном исследовании распознает в них смешение и последовательность приятных запахов, напоминающих запах какого-то цветка, того или иного плода, различает в них маслянистые, кислые, ароматические и другие тона. Чаще всего в букете вина преобладает тот или иной аромат. Но
смесь многих, взаимно дополняющих друг друга запахов образует одно целое, новый аромат, в котором трудно выделить составляющие его элементы.
При смешивании различные запахи маскируются, взаимно уничтожаются. Например, эксперименты показывают, что порог идентификации пахучего вещества посредством обоняния сильно смещается при его смешивании с другими продуктами, издающими запах.
Следующие наблюдения, относящиеся к этилацетату — веществу, которое придает винам, пораженным уксусным скисанием, специфический характер, представляют собой пример обонятельных интерференций. В водном растворе этилацетата его запах легко улавливается уже при концентрациях от 25 до 30 мг/л. В 10%-ном спиртовом растворе порог ощущения сдвигается, запах обнаруживается только при концентрации 40 мг/л, следовательно, собственный запах этилового спирта маскирует другие запаян. На этом примере видно, почему слишком высокая спиртуозность может понижать букет вина. Если к раствору этилацетата прибавить сложный эфир какой-либо другой жирной кислоты (например, этилэнантат, который к тому же не существует в винах), то только содержание 150 мг этилацетата в 1 л позволяет его идентифицировать. Наконец, в винах запах этилацетата проявляется только тогда, когда его содержание достигает 180—200 мг на 1 л. Чем сложнее смесь запахов и чем они интенсивнее, тем более заглушается специфичный аромат этилацетата.
Гармоническое слияние нормальных ароматов вина объясняет невозможность усиления букета искусственными запахами. Подобная попытка является незаконной и заслуживает осуждения. Кроме того, она не заканчивается успехом, так как при добавлении искус
ственных веществ в малых коиичествах их запах тонет в совокупности запахои вина без какого-либо результата; если же превзойти определенный порог, этот запах становится преобладающим и дает искусственный гон, который сразу же определяется натренированным дегустатором.
Выше было показано, что в дегустации обоняние участвует в создании впечатления о вкусе. Такие ощущения называют вкусо-обонятельными. Безусловно, что пахучие вещества участвуют также в образовании вкусовых ощущений, ощущений тела, маслянистости. Если вино лишить всех ароматических веществ, обрабатывая его, например,, угольным порошком, оно сразу лишится тела, хотя при этом фундаментальное равновесие вина почти не изменится.
Вкусовые ощущения
Рецепторные органы вкусовых ощущений расположены в сосочках языка.. Клетки, восприимчивые к вкусу и сгруппированные во вкусовые сосочки, распределены иа его поверхности очень неравномерно. Однако из четырех типов; сосочков в восприятии участвуют только желобовидные, расположенные на- задней части языка, и грибовидные, находящиеся в основном на кончике и обладающие сосочками, чувствительными. К специфическому вкусу (рис. 2.2).. Нервные волокна, обеспечивающие передачу мозгу сигналов возбужденных: вкусовых клеток, образуют три черепных нерва (язычно-глоточный, язычный, тройничный). Центр восприятия вкуса в мозгу находится около моторных центров жевания и глотания. Восприятие вкуса тесно связано с этими функциями.
Допускают, что существует всего лишь четыре элементарных вкуса, ощущаемых языком: сладкий, кислый, со-
левый и горький. Все вкусы, ощущаемые человеком, обязательно относятся к этим четырем категориям. Одно и то же вещество может иметь только один вкус, или же представлять одновременно, а иногда и последовательно несколько элементарных вкусов.
Рис. 2.2. Распределение на поверхности языка грибовидных, нитевидных, слоистых и желобовидных сосочков и сосочков восприятия четырех элементарных вкусов:
1 — сладкий. 2 —соленый; 3 — кислый; 4— п-чжин; а—желобовидные сосочки; 6—листо- Бндные сосочки; 7—нитевидные; 8—грибовидные.
Когда пробуют сложную смесь, состоящую из веществ, которые имеют четыре элементарных вкуса, то она воспринимается как одно целое. В зависимости от вкуса продолжительность возбуждения от вина может быть различной. Вкус сладкого чувствуется сразу, горького — развивается постепенно: он нарастает и воспринимается медленно, после того, как Жидкость удаляется изо рта. Эти факты важно знать, потому что они объясняют послевкусие, которое воспринимается во время дегу
стации. Первые полученные впечатления вкуса очень отличаются от последних, и это различие необходимо тщательно отмечать по времени. Первые вкусовые впечатления могут давать ощущение сладости, быть приятными, но потом постепенно уступают место излишней горечи, неприятному привкусу.
Различия в скорости восприятия связаны, по крайней мере, частично с тем, что разные вкусы воспринимаются разными частями языка. Вкус сладкого ощущается только кончиком языка, кислый — боковыми и частью нижней поверхностями языка, соленый — краями, но отнюдь не серединой языка, горький — только задней частью языка и только во время глотания. Большая часть поверхности языка нечувствительна. С другой стороны, необходимо отметить, что во рту вкус в собственном смысле слова воспринимается только через язык. Губы, щеки, нёбо, не имеющие вкусовых сосочков, дают лишь осязательные или тепловые ощущения.
В вине сосредоточены четыре элементарных вкуса, из них главные — кислый и сладкий. Кроме того, нельзя не учитывать концентрацию минеральных солей в вине: солоноватый вкус, который они придают, ощущается отчетливо, хотя в вине он маскируется другими привкусами. Однако несомненно, что минеральные соли, содержащиеся в вине, придают ему привкус свежести. С другой стороны, небольшая горьковатость, сопровождаемая умеренной терпкостью, — необходимое качество хороших красных вин. Эти привкусы обязаны своим происхождением некоторым полифенолам. Другие нормальные составные части вина могут быть слегка горькими (например, бутандиол-2,3). Кроме того, могут быть вина, в которых горький вкус преобладает в результате дефектов или микробиальных болезней вина.
Стойкость
Послевкусием называют конечный привкус, который сохраняется в течение некоторого времени после того, как жидкость была проглочена или удалена изо рта. Ощущения такого рода, продолжающиеся в течение более или менее длительного времени, принято называть стойкостью или последействием. Они могут быть вкусовыми, обонятельными или общего химического порядка и представляют большой интерес с точки зрения определения класса и качества вина. Послевкусием называют также конечное ощущение, отличное от предыдущих. Оно бывает обычно плохим.
Ведель и сотрудники (1972) дают следующее определение интенсивной стойкости аромата: «В совокупности, из которой складывается ощущение стойкости, внимательное наблюдение обонятельных ощущений показывает, что после периода некоторой одинаковой интенсивности, она резко уменьшается». Поэтому условились обозначать термином «интенсивной устойчивости аромата» именно этот первый период. Дегустатор может измерять его продолжительность в секундах. За единицу измерения принимают кодалию (от французского caudal — хвостовой); она соответствует 1 с стойкости. Авторы предлагают использовать эту единицу измерения при классификации очень различных вин. Они предусматривают пять классов, соответствующих следующему числу кодалий: до 3, от 4 до 6, от 7 до 9, от 10 до 12, более 12. Метод испытывается и требует подтверждения.
Другие ощущения
К этим ощущениям относятся химические, осязательные, тепловые и реже — болезненные ощущения. Перечисленные ощущения воспринимаются
большим числом соответствующих рецепторов, разбросанных по всей полости рта. Вкус довольно концентрированного алкоголя, едкий и обжигающий, больше относится к реакции слизистых оболочек, чем к вкусу в собственном смысле слова. То же можно сказать и о терпком или вяжущем привкусе некоторых полифенолов, вызывающих ощущение неприятного металлического вкуса. Фактически эти впечатления передаются в мозг не теми нервами, которые передают ощущения вкуса в собственном смысле, кроме того, язык и щеки представляют собой крайне чувствительные органы осязания. Они создают впечатления температуры, консистенции, объема, вязкости, маслянистости.
ТРУДНОСТИ ДЕГУСТАЦИИ
Эти трудности можно рассматривать в трех направлениях: управляемое восприятие, т. е. волевое усилие, направляемое в нужный момент на ту или иную характеристику; описание ощущений, которые всегда трудно выразить словами; наконец, оценка, предполагающая наличие опыта, компетентность, т. е. большое число элементов сравнения, удерживаемых в памяти.
Первая трудность связана с субъективным характером дегустации, основанной на внутренних личных впечатлениях. Здесь основное значение имеют личные качества дегустатора. Явлением объективного характера является то, что в противоположность дегустации можно выразить числами, оно не зависит от оператора. Когда взвешивают или, например, измеряют длину, результат всегда один и тот же независимо от того, кто и когда взвешивал или измерял. Но нельзя измерить вкус и запах. Все попытки, которые делались в этом направлении, оказались безуспешными. Дегустация в силу сво-
ей высокой чувствительности является анализом, скорее даже, микроанализом, носящим неопределенный характер. Обоняние, безусловно, является '-одним из наших наиболее деликатных и тонких чувств в том смысле, что оно позволяет обнаруживать исключительно малые количества тех или иных веществ. В то же время это одно из наиболее грубых и ненадежных чувств в смысле того, что оно меньше всего поддается численной оценке и математическому обоснованию. Вкус или обоняние здесь невозможно измерить никак, ни прямо, ни косвенно. Количественно интенсивность того или иного запаха или вкуса можно определить, лишь сопоставляя их с одинаковыми или разными возбуждениями, сравнивая их между собой. Можно утверждать, что данный вкус выражен сильнее, чем другой, но нельзя сказать, во сколько раз одно ощущение сильнее другого.
Иными словами, не существует четкой зависимости между ощущениями и концентрациями веществ, обладающих вкусовыми свойствами и запахами. Вебер определил, что отношение между изменением концентрации стимулятора, необходимым для изменения ощущения, и общей концентрацией является величиной постоянной. Можно сказать, что малое количество, прибавленное к другому малому количеству, производит ощутимое изменение, тогда как прибавленное к большому количеству юно незаметно. Фехьер считает, что ощущения пропорциональны логарифмам концентраций стимуляторов.
Причины возможных ошибок
При дегустации впечатление может сильно изменяться в зависимости от личных особенностей дегустатора, с одной стороны, а также от условий и момента дегустации — с другой. Однако, не всегда можно избежать ошибок, вы
зываемых усталостью, привыканием, эффектом контраста и, особенно, внушением.
Результаты пробы на вкус подвергаются компетентной оценке хорошо знающего свое дело дегустатора благодаря его опыту, знаниям соответствующей терминологии, умению точно подобрать нужный термин и определить значение, которое он придает тому или иному качеству, тому или иному недостатку дегустируемого вина. У одного и того же дегустатора эти факты могут изменяться в зависимости от условий или времени дегустации. Если дегустатор привык к данной обстановке, например, к дегустационному залу, даже к форме бокала для дегустирования, в других условиях он может допускать ошибки. По этой причине дегустация на месте, в подвалах, не дает желаемой точности суждений. Точно также, в зависимости от времени дня, от того, когда проводят дегустацию — до, во время или после принятия пищи, одно и то же вино может получить различные оценки, так как острота восприятия дегустатора изменяется в течение дня. Известно, что максимум чувствительности у дегустатора наступает тогда, когда он ощущает аппетит. Наконец, следует учитывать такие факторы, как усталость нёба, явления привыкания в такой степени, что они изменяют характер ощущений. Например, когда регулярно пьют неправильно сложенное вино, то в конце концов перестают замечать его недостатки.
Иногда утверждают, что некоторые характеристики вина быстро изменяются во время дегустации, что бывают нестойкие, изменяющиеся букеты. Когда пробуют такое вино, то иногда находят его неприятным, иногда сносным, но если приходится его пробовать дальше, в нем больше не находят ранее отмечавшегося недостатка. Это не значит, что данный признак, как говорят,
усиливается или ослабевает. Дело просто в том, что в зависимости от состояния дегустатора в данный момент и особенно по мере привыкания чувство обоняния насыщается и становится неспособным к нормальной оценке.
Точно так же констатируют, что некоторые неприятные вкусы кислоты, горечи, терпкости быстро утомляют нёбо. Они как бы накапливаются во время ряда следующих одна за другой дегустаций. Когда сравнивают между собой вина, богатые танинами, впечатление грубости усиливается с каждой дегустацией, и вина кажутся все более и более грубыми и негармоничными.
Некоторый эффект усталости возникает также вследствие длительных сеансов дегустации в результате прохождения спирта через слизистые оболочки рта и носа. Эффекты контраста, из-за которых белое сладкое вино может после сухого вина показаться еще слаще или когда красное вино с большим содержанием дубильных веществ, дегустируемое после мягкого, бархатистого вина, кажется более грубым, могут также изменить окончательную оценку.
Кроме того, когда рассматривают силу внушения, которая может заставить воспринять или усилить некоторые характеристики, то учитывают, что зачастую очень трудно прийти к единой оценке абсолютного признака и утверждения различных дегустаторов, даже очень искусных или даже одного и того же дегустатора, но в разное время, бывают иногда несколько различными.
Относительно влияния внушения и воображения Пастер привел показательный пример, наблюдавшийся им лично во время дегустации, проводимой компетентной комиссией. Подогретые вина должны были сравниваться с такими же винами, но без подогрева. Пастер представил комиссии два бокала, наполненных из одной и той же бутылки. Каждый из членов комиссии
был убежден, что эти образцы взяты от различных вин, в том смысле, что в одном бокале содержится вино, прошедшее термическую обработку, а в другом — вино, которое не подвергалось такой обработке.
Таким же образом, если дают пробовать фильтрованное вино для сравнения с контрольным вином, не подвергавшимся фильтрации, и, если дегустатор находится под влиянием предвзятого мнения, что фильтрование обедняет вино, он действительно найдет, к тому же вполне добросовестно, что одно из представленных вин более прозрачно", менее маслянисто, имеет большую «рубашку» (осадок, образующийся на стенках бутылок в процессе старения), чем другое. Внушение и самовнушение играют большую роль в дегустации. Дегустатор легко поддается их влиянию, и его нетрудно ввести в заблуждение. Эта неуверенность является слабым местом дегустации.
техника дегустации
Наши чувства при дегустации вина можно применять различными способами. Акт опробования вина на вкус легко описать в общих чертах, но он может сильно изменяться в процессе своего выполнения.
Вино помещают в бокал определенной формы и объема и при определенной температуре. Далее его рассматривают и нюхают после взбалтывания, которое можно производить различными способами. Затем вино пробуют. При этом можно больше или меньше продлить контакт с различными частями языка или полости рта, одновременно можно делать движения щеками и языком, вдыхание воздуха, а также- один или несколько глотков. Наконец, вино выпускают изо рта. В течение этой операции все внимание сосредоточивают на различных ощущениях, их эволю-
ции, стойкости. Остается записать полученные впечатления, истолковать их и сформулировать оценку. Понятно, что все это можно делать различными способами.
Практические правила дегустации
Существуют определенные правила, которых следует придерживаться при проведении дегустации. Если требуется дегустировать серию вин, начинают с самых легких, а если речь идет о белых винах, то с самых сухих. Красные вина дегустируют раньше, чем белые: в противном случае усиливается таниновая жесткость красных вин. Старые вина дегустируют после молодых вин. Напомним общий закон, согласно которому одно ощущение, следующее после другого, воспринимается в своем истинном значении только тогда, когда оно вызывается другим, более интенсивным возбуждением. Поэтому вина нужно располагать по классам в порядке возрастания интенсивности возбуждения, т. е. от более слабых к более спиртуозным, от более легких к более мужественным.
Образцы, подлежащие оценке, должны быть не слишком теплыми, не слишком холодными, иметь одинаковую температуру, чтобы можно было лучше сравнивать. Правильно будет выдерживать их перед дегустацией в течение нескольких часов в помещении с желаемой температурой. Обычно чуть теплое красное вино кажется лучшим на вк}с, более полным, маслянистым, менее кислым, более мягким, производит впечатление более крепкого. Например, при 10° С вино кажется жестким, в нем чувствуются танины и особенно кислотность; при 15° С — приятнее, мягче; при 18° С вино кажется более старым;
при 20° С — обжигает. Недостатки лучше всего воспринимаются при 18° С.
Чтобы избежать ошибки при дегуста- цм вин, более или менее пэтвержен- ных действию кислорода, их следует опробовать сразу же после взятия образца или открытия бутылки. Если же дегустация задерживается, образцы можно хранить в течение нескольких дней, защищая их от доступа воздуха в плотно закупоренных бутылках.
Когда речь идет о старых винах, находящихся в бутылках, необходимо, прежде всего, не допустить перемешивания осадка с жидкостью, в тоже время не декантировать их. Если же предпочитают провести декантацию, то делать это надо в самый последний момент и, насколько возможно, без доступа воздуха, например посредством сифона. Явно ошибочно было бы декантировать старые вина за много часов до их потребления, так как их букет — результат длительного процесса восстановления без доступа воздуха — исчезает или ослабевает более или менее быстро в зависимости от типа вина, вследствие даже легкой аэрации. Предварительная аэрация допускается только в том случае, когда вина в бутылках содержат избыточное количество углекислоты и обнаруживают следы брожения. Случается, что после этой аэрации их букет, денатурированный и приглушенный этим дефектом, снова делается тонким и продолжает развиваться. Бывают также вина, восстановленные немного больше нормы, которые могут улучшиться после аэрации.
При тщательной дегустации не следует пробовать больше нескольких образцов, в противном случае восприятие быстро теряет свою четкость. Бесполезно пытаться сравнивать вина, сильно различающиеся по своей природе, например вина совершенно различного происхождения или молодые вина с более старыми винами. С другой стороны,
сравнение очень схожих вин также представляет большие трудности и требует многократного повторения испытаний на вкус.
Дегустация вина начинается с того, что его нюхают сразу же после взбалтывания с целью увеличить площадь контакта с воздухом и соответственно повысить испарение пахучих веществ.
Вращательное движение, которое дегустатор придает бокалу, образует воронку на поверхности вина, вызывает его поднятие вдоль стенок бокала, которые остаются смоченными, и наполняет пустую часть бокала душистыми парами. Интенсивность аромата и букета зависит от силы взбалтывания. -Можно также с силой втягивать в себя запах вина в бокале, находящемся в состоянии покоя, что позволяет легко сравнивать различные образцы, помещенные в бокалах, расставленных один возле другого. Ощущение при этом получается менее сильное, но сравнение бывает более точным. Необходимо вдыхать всегда одинаковое количество воздуха, с одинаковой скоростью, производить выдох между каждым восприятием, делать быстрые, короткие вдохи.
Изучение аромата или букета требует большого внимания и многочисленных повторений вдыханий. В принципе этому упражнению нужно уделять столько же времени, сколько и анализу вкусовых ощущений в собственном смысле слова. Некоторые дегустаторы уменьшают или вообще исключают фазу оценки обонянием, несмотря на ее результативность, и судят только по вкусу. Между тем ничто не дает такого богатства данных о тонкости, классе, возрасте вин лучших марок, как обоняние. В частности, дегустацию некоторых высококачественных вин, например типа Порто, проводят почти исключительно на основе обоняния.
В начале дегустации опробование первых двух-трех вин обычно не требу-
ет большого внимания, важно сначала «войти во вкус», начать с известных вин. Первые впечатления могут оказаться ошибочными, пока полость рта недостаточно освоилась с напитком.
Хотя у каждого есть свои особые привычки, рекомендуется брать в рот лишь небольшое количество жидкости (6— 7 см3). Слишком большой объем требует большего времени на согревание и разбавляет слюну, в то же время слишком малый объем не смачивает всю поверхность нёба. Жидкость во рту слегка перемещают таким образом, чтобы возобновить ее контакт с различными участками поверхности языка и нёба, которые имеют различную чувствительность, и выдерживают во рту 10 с, прежде чем выпустить, Длительность первого контакта можно изменять в за- висимости от того, что интересует — первые или последующие впечатления. Трудно избежать движения проглатывания, которое увлекает небольшое количество жидкости и к тому же усиливает обонятельные ощущения.
Прежде чем приступить к опробованию другого образца, нужно подождать некоторое время, чтобы лучше оценить первое вино и чтобы полностью исчезло всякое ощущение от него. Бесполезно пробовать много раз подряд одни и те же образцы, так как повторные оценки ведут к потере всякого ощущения. Именно первые впечатления, если они восприняты с надлежащим вниманием, являются наилучшими.
Когда нёбо устанет от дегустаций, следует хорошо прополоскать его водой, можно также съесть кусочек хлеба, но нужно воздержаться от некоторых видов пищи, например сыра или орехов, которые, улучшая оценку вина, искажают результаты дегустации.
Дегустационные бокалы
Бокал представляет собой орудие труда дегустатора, и в этом отношении
часто подчеркивают значение его формы и его объема. Действительно, сосуды, применяемые для дегустации, очень разнообразны. Дегустаторы каждого винодельческого района имеют свои собственные привычки. В Бургундии, в районе Божоле, широко распространены серебряные дегустационные чашки, но они плохо подходят для обонятель-
Рис. 2.3. Некоторые образцы дегустационных бокалов. Бокал справа является международным бокалом (АФНОР) для дегустации вин.
Рис. 2.4. Размеры нормализованного бокала (АФНОР) для дегустации вин.
кого анализа. Им следует предпочесть бокалы, специально предназначенные для точной дегустации. Дегустационные бокалы могут быть различной формы в зависимости от типов вин. Обычно применяют бокалы на ножке, разного размера и суживающиеся в верхней части для того, чтобы избежать слишком быстрой диффузии элементов запаха. На рис. 2.3 показаны образцы дегустационных бокалов.
Форма и размер бокала, изменяя отношение поверхности к объему вина, оказывают влияние на концентрацию элементов запаха в незаполненной части сосуда, этот запах неодинаков по интенсивности и по качеству. Поверхность вина после взбалтывания следует рассматривать как бы покрытую тонким туманом, состав которого зависит от физико-химических явлений испарения, поверхностного натяжения, капиллярности.
Исходя из этих данных, группа экспертов создала дегустационный бокал, который был принят за образец Французской ассоциацией по стандартам (АФНОР) под индексом N. F. V. 09.110. Бокал имеет овальную удлиненную форму (рис. 2.4) и изготовляется из хрустального стекла (пропорция свинца примерно 9%). При вместимости 210—220 см3 он позволяет оперировать с 60—70 см3 вина. Такой бокал очень рекомендуется при изучении ароматических свойств вина. Можно считать, что общий переход к использованию таких бокалов должен улучшить условия воспроизводимости результатов дегустации.
Помещения для дегустации
Ведель и сотрудники (1972) осветили этот вопрос очень детально, и поэтому здесь даются лишь краткие выводы из их работы.
Для получения возможно большей
точности оценок необходимо, чтобы дегустаторы находились в наиболее благоприятных условиях — в надлежащих и соответствующим образом оборудованных помещениях.
Не добиваясь абсолютной тишины, нужно исключить всякий шум или звуки, способные отвлечь внимание дегустаторов. Помещение должно иметь такую вентиляцию, чтобы не ощущалось никаких запахов. На практике оно нередко примыкает к лаборатории или к
Рис. 2.5. Вид зала для дегустации вин (Межпрофессиональный Совет вин района Бержерак). На первом плане кабина дегустации, состоящая из рабочего стола, разделительных перегородок и полоскательницы (слева).
конторе подвала. Наиболее рекомендуемая температура в помещении (но не обязательно температура дегустируемых вин) около 20° С. Освещение должно быть достаточным, следует предпочитать дневной свет.
Для повседневных занятий по дегустации с небольшим числом дегустаторов. которые обычно работают стоя, обстановка дегустационного зала может быть очень простой: достаточно иметь стол с легко моющимся покрытием из опалового или простого стекла или из керамики, чтобы ставить образцы вин и дегустационные бокалы, небольшую раковину для выпуска жидкости, шкаф
с дверцами и полками для размещения бокалов после мойки и просушивания.
Для более точных дегустаций (экспериментальные или контрольные дегустации, конкурсы вин или состязания дегустаторов) лучше иметь более приспособленный зал (рис. 2.5). Ведель и сотрудники (1972) описывают оборудование залов дегустации следующим образом:
«Каждый дегустатор должен иметь рабочее место, изолированное от его соседей. Оно ограничивается боковыми ц передней перегородками и образует открытую сверху и сзади кабину. Высота перегородок должна быть несколько выше головы сидящего дегустатора. Их делают из легкого материала: фанеры, древесно-волокнистой плиты и других материалов с таким расчетом, г’тобы их можно было легко ставить и снимать. Это делает кабины удобными для использования, особенно при обучении.
Ширина каждой кабины от 80 до 90 см. Внутри на высоте около 75 см находится рабочая полка, длина которой соответствует ширине кабины, ширина же самой полки равна 40 см. Полка также делается из материала, полированная поверхность которого легко чистится. На этой полке слева ставят раковину-полоскательницу шириной примерно 30 см предпочтительно темного цвета.
Вода, необходимая для мойки бокалов и раковины, поступает из водопроводного крана высотой 30 см. У некоторых типов раковин имеются устройства для подачи воды вращающейся струей».
Помимо рабочей полки желательно устанавливать у передней перегородки на высоте 1,10 м столик размерами от 10 до 20 см, на который дегустатор кладет предметы для пользования во время дегустации. В кромке столика можно сделать вырезы для подвешивания
бокалов за ножку. Столик делают из такого же материала, как и рабочую полку. Цвета этого оборудования должны быть нейтральных тонов, так же как и окраска стен зала: светло-желтый, светло-бежевый, светло-серый и т. п. В каждой кабине сиденье должно быть, по возможности, регулируемым по высоте.
Кроме общего освещения зала целесообразно устанавливать для каждого дегустатора индивидуальные светильники. Источник света, который можно направлять в нужном направлении узким, параллельным лучом, размещают на правой перегородке. Он позволяет определять степень прозрачности вина.
Различные темы дегустации
Каждое упражнение в дегустации связано с определенной задачей и проводится в зависимости от того, на какой вопрос необходимо ответить. Поэтому важно заранее определить эту задачу и четко сформулировать ее де- пстаторам.
Любое упражнение в пробе на вкус основано на сравнениях. Можно утверждать, что дегустация только тогда имеет ценность, когда она является сравнительной. Эти сравнения делаются в отношении одного или многих контрольных образцов, дегустируемых параллельно, а также в отношении образцов, которые сохранились лишь в памяти дегустаторов и которые для каждого из них представляют воображаемые нормы. В первом случае, когда сопоставляемые объекты налицо, результаты будут более объективными. Во втором случае точность зависит от квалификации дегустатора, так как очевидно, что каждый в зависимости от своего образования и профессионального опыта хранит в памяти сумму различных представлений.
Именно из-за этих причин следует
предостеречь против утверждения, что дегустацию как таковую можно рассматривать как простой психофизиологический тест, который может проводить группа лиц без какой-либо специальной подготовки. Элемент случайности в ответе вследствие отсутствия опыта у дегустаторов якобы корректируется применением законов статистического анализа. Такая концепция не имеет ничего общего с профессиональной дегустацией вин в районах традиционного высококачественного виноделия, проводимой компетентными и опытными дегустаторами. Качество дегустации могут гарантировать только квалифицированные дегустаторы-специалисты.
Темы дегустации, которые предлагаются чаще всего, можно свести к трем группам:
Дифференциация и идентификация образцов — предмет повседневной работы профессионалов. Такие опыты позволяют сравнивать вина между собой, определять их преимущества одних перед другими, контролировать влияние экспериментальных условий их выработки и хранения, видеть эффект от добавления тех или иных веществ, от той или иной обработки, устанавливать ассамбляж, купажирование и т. д.
Оценка и классификация, заключающиеся в том, чтобы сравнивать и относить к тем или иным классам соответственно достоинства и недостатки вина. Такова, например, тема дегустаций по контролю качества, целью которого является удаление из серии образцов вин с недостаточно хорошим качеством.
Аналитическая дегустация, которую можно также назвать описательным вкусовым анализом, заключается в изучении и составлении перечня всех сенсорных реакций, вызываемых вином, в описании их и, насколько возможно, в объяснении их аналитическо-
ГО COCT;-:»a В этих опытах используют детали:гриваиную и точную терминологию, лоюрпи требует модификации и системаiизаваи, чтобы быть понятной для всел. На иснове описания выносят суждение, оценку, которые можно выразить гакже отметкой или надписью.
В зависимости от предлагаемой темы метод дегусмции может изменяться как в отношении представления образцов, так и нс самому способу дегустации. По поводу того, как нужно представлять вина и проводить дегустацию вообше, написан ряд специальных трудов (/'итл, 1958; Америн и сотрудники, 19н5), содержание которых нашло отражение в последних французских работах. Авторы считают, что было бы проще классифицировать упражнения в опробовании на вкус соответственно числу используемых бокалов. В этом случае можно было бы различать:
Опыты дегустации, применяемые к одному вину в одном бокале. Это испытание является трудным, так как дегустатор должен оценивать вино только на основе информации, которую ему дают, и руководствоваться при сравнении лишь соответствующими впечатлениями от других вин, которые сохранились в его памяти. Это случай дегустации на месте, в подвале. От такой дегустации не следует ожидать таких данных, которые имели бы определяющее значение. Исключением является дегустация вин, обладающих ярко выраженными положительными или отрицательными характеристиками. При таких обстоятельствах дегустатор должен быть очень осторожным.
Дегустация попарно, в которой сравнивают два бокала вина А и Б, представленных вместе и дегустируемых одно за другим. Одно из них в этом случае играет роль контрольного образца. Дегустатор, которому не известен порядок представления бокалов, должен указать на идентичность или
различие этих образцов или на преимущество одного из них. Впрочем, в дегустации избегают говорить об идентичности двух вин. Если их нельзя различить, то правильнее будет сказать, что они не поддаются дифференциации. Такой опыт сравнения является наиболее точным и наиболее чувствительным. Были высказаны предложения о видоизменении этого способа: например, начинать опробование, зная заранее различие между винами, затем снова найти каждое из них при повторной дегустации «вслепую».
Различные опыты по дегустации с использованием трех бокалов можно резюмировать следующим образом:
два разных бокала вина представляют одновременно с третьим, содержащим одно из этих вин. У дегустатора спрашивают, какое из двух первых вин идентично третьему;
один из трех бокалов принимают за контрольный и спрашивают у дегустатора, какой из двух других идентичен ему;
выставляют три бокала, в двух из которых находится одно и то же вино. Дегустатор должен распознать одно вино, отличное от двух других. Такое упражнение называется трехсторонней дегустацией. Оно будет рассмотрено в дальнейшем;
представляют три бокала, и дегустатор должен дать один из трех ответов: три бокала идентичны, идентичны два из трех, во всех бокалах разное вино.
4. Порядок дегустации с использованием большего числа бокалов и вин позволяет проводить весьма различные упражнения. Можно представить столько же вин, сколько и бокалов, при этом вина могут идентифицироваться или нет, или же только некоторые из них, с целью их классификации. В противоположность этому можно представить только два вида вина во многих бока-
лах и предложить дифференцировать их. Можно провести очень много различных испытаний, промежуточных между этими двумя испытаниями.
Трехсторонняя дегустация
В одном из описанных выше случаев дегустатору предлагают три бокала, два из которых содержат идентичное вино. Например, если хотят видеть, какой эффект производит на вкус вина добавление небольшого количества лимонной кислоты, дегустатору предлагают без его ведома два бокала без добавления кислоты и один бокал с подкисленным вином или же два бокала с подкисленным и один контрольный бокал. Если в этих условиях дегустатор распознает бокал или бокалы с добавлением лимонной кислоты, можно быть уверенным, что разница во вкусовых качествах существует и обработка видоизменяет вкус вина. Результат такой дегустации является наиболее очевидным. Действительно, могут быть следующие варианты расположения бокалов контрольных (Т) и подкисленных (А): АТТ, АТА, ТАА, ТАТ, ТТА. Следовательно, таким путем дегустация ста- нсгеится максимально объективной.
Как отмечают Ведель и сотрудники (1972), такой метод исследования в настоящее время широко применяют как для проверки дегустаторов, так и для проверки вин, хотя общеизвестно, что он менее чувствителен по сравнению с другими- подобными способами (табл. 2.2).
Авторы констатируют, что большинство квалифицированных дегустаторов хорошо обнаруживают разницу тогда, когда им предлагают для пробы только два бокала.
При дегустации с тремя бокалами проводится больше сравнений, быстрее утомляется чувство вкуса. Кроме того, легче найти или подтвердить различие
Таблица 2.2
Сравнение чувствительности к горьким и сладким вкусам в опытах по дегустации с двумя или тремя бокалами (по данным Байера и Грея,1962)
Опенка вкуса
Правильные результаты дегустации (в %)
парной
трехсторонней
Разница между определением
-
0,5 и 0,75 мг/л сернокислого хинина
89
50
11,9 и 14 г/л глюкозы
73
47
Верные оценки вследствие случайности
50
33,3
между двумя образцами, чем идентичность. Когда пробуют два первых бокала, всегда чувствуют какую-то разницу, реальную или воображаемую. Причиной ошибки является трудность дифференцировать третий бокал по отношению к первым двум и подобрать ему пару из двух первых. Далее при определении порога восприятия элементарных вкусов будет показано, что чувствительность трехстороннего испытания повышается в том случае, когда дегустатору предлагают один бокал с измененным вином и два контрольных бокала, а не наоборот.
Попытки повысить требовательность к оценке при дегустации обычно ведут к снижению чувствительности, потому что умонастроение дегустатора играет первостепенную роль в его заключениях. При дегустации нужно умело сформулировать разницу при оценке того или иного впечатления, иначе ее можно не уловить. Опыты по закрытой дегустации (когда отсутствуют какие-либо данные относительно дегустируемых образцов) полезны, но было бы неправильным выносить при этом окончательное суждение, особенно если оно
негативное. Исследование следует завершать дегустацией, которая производится со знанием того, что пробуют. Это позволяет изучать различия, исходить из них. Упражнение заканчивают опробованием снова, не имея каких-либо данных об образце, и с учетом предшествовавшего исследования устанавливают искомую разницу.
Коллективная дегустация
Другой способ получения большей надежности заключается в том, что испытание проводит достаточно большая группа дегустаторов. Метод, при котором вино оценивается одним экспертом, несмотря на его компетентность, может приводить к ошибочным заключениям. Совпадение мнений многих дегустаторов делает оценку более надежной. При однородности группы, высокой квалификации каждого ее члена, при условии, что каждый дегустатор производит опробование и делает отметки изолированно от других, можно положиться на результаты, полученные таким образом. Дегустация с обменом мнениями членов группы может дать хорошие результаты в виде общей согласованной оценки лишь при работе группы их трех-четырех человек, хорошо знающих друг друга и привыкших работать вместе. Как правило, дегустаторы не должны обмениваться мнениями до конца дегустации.
При групповой дегустации большого количества образцов дегустаторы зача стую очень спешат, между тем дегустация является весьма кропотливой работой, которая требует времени и внимания. Наконец, от дегустаторов важно требовать письменного изложения их мнения, четкости формулировок заключения и описания характеристик вина — все это способствует повышению точности оценок.
Классификация от восьми до десяти
образцов вин, находящихся в таком же количестве бокалов, производится дегустатором путем последовательных сравнений. Окончательное определение качества каждого образца получается посредством согласования оценки с каждым дегустатором. При более значительном числе образцов оценка вин становится физически трудновыполнимой, так как дегустаторы пробуют в определенной последовательности вина и дают им оценки. В этом случае точность дегустации несколько снижается. Например, партию из восемнадцати вин распределяют, как придется, в трех сериях. В каждой серии дегустаторы, располагающие шестью стаканами, устанавливают путем сравнения классы вин и оставляют лучшие, которые затем сопоставляют между собой для окончательной классификации. Дегустатор должен уметь допускать равенство классов, так как многие вина, обладающие различными характеристиками, приходится приравнивать к одному и тому же уровню качества. Дегустатор должен быть в таких случаях принципиальным и способным признать, что он не находит разницы, которую у него просят найти.
Дегустационные листки
Чтобы помочь дегустатору правильно оформить результаты своих наблюдений, ему часто предлагают заполнить листок дегустации, в котором он должен записать свои вкусовые ощущения в виде баллов или просто отметить клеточки на соответствующей шкале классности. Ценность таких листков в том, что они помогают начинающему дегустатору в точной и достаточно полной работе, побуждают опытного дегустатора давать более полную оценку и согласовывать результаты при дегустации в группе, кроме того, листок позволяет
судить после определенного числа испытаний о квалификации дегустатора.
Предлагалось большое число форм дегустационного листка. Из наиболее распространенных можно назвать листок Кастелля (1967), озаглавленный «Анализ и словарь дегустации», работы Сернаджотто (1971) по методике оценок на конкурсах вин, листки Веделя и сотрудников (1972), Дюрана и Фу- лоно (1972), Кабесудо и Дьягуно
(1972) и, наконец, дегустационные листки французской и итальянской торговых палат (1973), форма одного из таких листков приведена ниже. •
Оформление этих листков очень разнообразно. Некоторые, слишком упрощенные, не позволяют достаточно подробно записывать и анализировать характеристики вин, тогда как другие слишком усложнены, они требуют проведения нескольких последовательных
Форма 1
ДЕГУСТАЦИОННЫЙ ЛИСТОК
№ образца .
Порядок пользования
№ дегустации
Дегустатор: №
Фамилия, имя, отчество
Точно записать общие данные-
После дегустации отметить знаком «X» соот-
Проверяемое вино:
Тип ,
Категория '
Название
Сорт .
Прочие сведения
ветствующую клетку бланка по каждой позиции
Подсчет баллов и итопи заполняет комиссия
Данные анализов Отлич- Очень Хоро-
Удов- Дефек- Исход- Коэф- Част- Заме-
винаноехоро-шее
—4 б.шее2 б.
_3 6.
Спиртуозность Общая кислотность.
Летучие кислоты so;■
Визуальная оценка (цвет—прозрачность)
Опенкаобонянием •
(качество — тонкость — интенсивность) Вкусовая и вкусо-обонятельная оценка (ка честно — тонкость — интенсивность)'
Общая гармоничность и типичность’
гетво- тноенаяфици- ныечание
ригель- или не- сумма ентбаллы .
чоеклю-баллов
1 б. ченное'
0 ХЗРеше
ние или . оценка 'Хб
ХЮ
Х6Подпись
тегу-стато
ра
Общий балл
дегустаций. Еслг
нельзя предусмотреть ло бы целесообразно
систем атизиро-
единой формы листка, который мог бы вать их в зависимости от характера ис- служить при органолептической оценке пользования. Авторами принята форма как тонких, так и ординарных вин для 1
дегустаций местного масштаба, на ме- дегустационного листка описательного ждународных конкурсах, то все же бы- T™a> форма которого приведена ниже.
ОПИСАТЕЛЬНЫЙ ЛИСТОК ДЕГУСТАЦИИ
Форма 2
Фамилия дегустатора Дата
Идентификация вина
Вид
Цвет (интенсивность, оттенок)
Прозрачность
Другие замечания
Аромат
Чистота
Качество Интенсивность Онисание
Возможные дефекты
з
Первое ощущение
Описание
Развитие
Послевкусие
Вкус
Уравновешенность и общий состав
Аромат вкуса ;
Устойчивость аромата
Другие замечания
Оценка
Заключение
Балл
-
Оценка вин в баллах
Выражение качественных и количественных уровней запахов и вкусов в баллах является очень деликатным вопросом. Первая трудность заключается в разработке таблицы, шкалы досто-
инства, на которую можно было бы ссылаться. Другую трудность представляет сравнение образца с терминами этой шкалы, которая большей частью не материализована и остается субъективной.
Ведель и сотрудники (1972) произве-
ли очень полную разработку проблем, поставленных системой оценки в баллах. Они различают «шкалы кардинальные», которые представляют математические значения баллов от 0 до 10 или от 0 до 20, и «шкалы порядковые», уровни которых связаны между собой только отношениями более низкого и более высокого качества. Ниже даны примеры 3-, 5- и 7-балльных шкал.
1.
Слабый
1.
Очень
1.
Очень
2.
Средний
слабый
слабый
3.
Сильный
2.
Довольно
2.
Слабый
слабый
3.
Довольно
3.
Средний
слабый
4.
Довольно
4.
Средний
сильный
5.
Довольно
5.
Очень
сильный
сильный
6.
Сильный
7.
Очень
СИЛЬНЫЙ
Прилагательные «слабый», «сильный» часто заменяются на «хороший», «плохой»; применяют также выражения «мне нравится» или «мне очень не нравится», «мне понравилось» или «мне немного не понравилось» и т. п.
Существует много систем балльной оценки: глобальная, или сумма индивидуальных баллов, относящихся к многим характеристикам, причем эти баллы могут применяться с различными коэффициентами. В этом случае оценивают в баллах отдельно внешний вид (цвет, прозрачность), запах (интенсивность, качество), вкус (мягкость, тело, вкусовой аромат), стойкость, гармоничность. Основным недостатком такой системы, при которой для различных вин выставляют очень близкие баллы, является то, что качество вина определяется не суммой характеристик окраски, запаха и вкуса; например, прозрачное, обладающее тонким ароматом вино может быть непригодным для употребления из-за избытка кислотности.
Обычно оценки дегустаторов в этой
системе не уходят далеко от среднего значения, инстинктивно дегустатор суживает крайние баллы. Желательно применять ,к баллам, полученным в результате дегустации серии образцов, методы статистического анализа; это дает возможность лучше судить о группировке вин по классам, чем при простом вычислении средней величины.
Чтобы помочь в применении балльной шкалы, например от 0 до 20, так чтобы все дегустаторы исходили из одной и той же исходной базы, можно условиться, что баллы 19 и 20 означают* высшую степень, 16, 17, 18—высокое* качество, при 13, 14, 15 вина считают- хорошими, с очень небольшими недостатками, при 10, 11, 12 вина являются ординарными, баллы 7, 8, 9 означают, что данные продукты ниже среднего допустимого уровня, при 4, 5, 6 они плохие и при 1, 2, 3 — непригодны для употребления.
Значение дегустационной экспертизы
Дегустация приобретает все большее и большее значение как для контроля качества вин с контролируемыми названиями по месту происхождения или вин местного производства, так и для получения дополнительных доказательств в случае судебного преследования.
Что касается вин с контролируемым названием по месту происхождения, то в целом ряде декретов, определяющих эти названия, уточняется, что такие вина не могут быть направлены для реализации без сертификата, выдаваемого Дегустационной комиссией, которую назначает Национальный институт вин контролируемых названий по месту происхождения.
Помимо этого контроля качества продукции в некоторых районах при экспорте вин с контролируемыми названиями по месту происхождения тре-
буются специальные сертификаты соответствия (декреты от 30 марта и 21 апреля 1955 г.). Например, в районе Бордо эти документы заинтересованные экспортеры получают от Межпрофессионального Совета по виноделию того района, который выдает их на основании заключения дегустационной комиссии, аттестующей соответствие органолептических качеств представленных вин установленным стандартам. Точно так же декрет от 31 августа 1964 г. уточняет, что вина, перечисленные в параграфе 26, должны отвечать определенным органолептическим характеристикам, что проверяется дегустацией; такой же порядок предусмотрен для вин местного производства (декрет от 13 сентября 1968 г.) и вин высшего качества лимитированных районов виноделия.
Наконец, необходимо отметить, что Правила Европейского экономического сообщества № 817/70 от 28 апреля 1970 г., устанавливающие нормативы высококачественных вин, производимых в определенных районах, уточняют (параграф II), что производители этих вин обязаны представлять их для проверки органолептических характеристик. Точно так же в параграфе I Правил ЕЭС № 1697/70 от 25 августа 1970 г. уточняется, что для перевода вина в низший класс по просьбе торговых фирм или в результате проверки качества, или при оптовой торговле требуется участие экспертов-дегустаторов, назначаемых Министерством сельского хозяйства (декрет от 11 января 1973 г.).
В случае судебного преследования необходимо подчеркнуть значение, которое придается дегустации декретом от 23 ноября 1967 г.
«Не могут рассматриваться как вина, пригодные для употребления, и могут использоваться только при производстве уксуса или перегонке на спирт
вина, изъятые из розничной торговли и которые, хотя и не имеют заметных изменений своих компонентов и сохраняют свой нормальный внешний вид, показывают при дегустации явные признаки скисших вин». Кроме того, необходимо указать, что из-за отсутствия установленного законом предела содержания этилацетата, характеризующего уксусное скисание, запрет на продажу вин накладывают только на основании дегустации; этот же декрет предусматривает запрещение сбыта вин с привкусом углекислоты, плесени, гнили или любым другим неприятным вкусом. Здесь еще раз видно значение дегустации.
ЗАВИСИМОСТЬ МЕЖДУ СОСТАВОМ вин И ИХ ВКУСОВЫМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ
Характеристики вина, положительные его качества или недостатки, безусловно, связаны с его химическим составом. В вине находятся кислоты, сахара, соли, полифенолы и т.. д., которые имеют свои особые вкусовые свойства. Эти вкусовые оттенки сливаются, усиливают друг друга или, наоборот, противостоят один другому, маскируются, взаимно нейтрализуются. Вкус того или иного вина представляет собой как бы сумму этих различных привкусов. Кроме того, как будет показано дальше, большинство качеств не образуется из какого-то одного элемента, присутствующего в определенной дозе, а из гармоничного сочетания составных частей вина при определенном соотношении их концентрации.
При современном уровне наших знаний проще и надежнее определять качества вина скорее .путем дегустации, чем методом химического анализа. Это отнюдь не принижает роли химического анализа, который по-прежнему сохраняет свое значение, так как он дает возможность предвидеть будущее вина
и возможно лучше определять, какие обработки надлежит проводить для того, чтобы его естественные качества достигли максимального развития. Дегустация, улавливающая только качества вина в данный момент, сделать этого не может.
Равновесие между компонентами вкусовых свойств
Слово «равновесие» здесь подразумевает благоприятное сочетание элементов, гармоничность. Вкус вина в основном является результатом равновесия между привкусами сладким, кислым и горьким.
Опыт показывает, что в первый ряд среди веществ со сладким привкусом следует поставить спирт. В малых дозах этиловый спирт почти несладкий, но в количествах, в которых он находится в вине, сладкий привкус спирта весьма ощутим. Нетрудно убедиться в том, что уже при 4° (32 г/л) водно-спиртовой раствор обладает определенно сладким вкусом, хотя при этом почти невозможно распознать специфический привкус спирта. Кроме того, хорошо известно, что присутствие спирта усиливает сладкий вкус, например, у раствора сахарозы.
14звестпо также, что сладкие и кислые вкусы взаимно маскируются. То же самое происходит со сладкими и горькими вкусами. Если сильно подкислить сладкий раствор, впечатление сладости, которое он дает, намного снижается. С другой стороны, если в кислый раствор вносить сахар, впечатление кислотности смягчается. Это довольно широко известные факты. Два этих вкуса в некотором роде взаимно нейтрализуются, однако при этом одновременно различают и сладкий, и кислый вкусы. При некотором соотноше- jj нии этих концентраций можно сказать,
что сладкии вкус имеет такую же интенсивность, как и кислый. Если увеличить количество кислоты, преобладает кислый привкус, если же повысить концентрацию сахара, происходит обратное явление.
В винах интенсивность сладких вкусов должна уравновешивать сумму интенсивностей привкусов кислых, горьких и вяжущих. Систему, определяющую такое равновесие, можно записать в виде.
Сладкий вкус ч* кислый вкус + горький вкус..
Для иллюстрации этого равновесия: между противоположными привкусами,, чтобы показать важную роль, которую- играет спирт в сладком вкусе, можно, произвести следующую манипуляцию.
Дистиллируют некоторый объем сухого красного вина. Летучая фракция, конденсирующаяся в холодильнике, содержит в себе весь спирт вина и летучие вещества букета, остаток соответствует концентрированному вину, лишенному спирта. Эти два раствора после охлаждения приводят к первоначальному объему. В конце опыта имеют две жидкости: одна — остаток, содержащий кислоты и танины вина, но не имеющая спирта, другая — дистиллят, в котором содержится весь спирт, но нет нелетучих кислот. При опробовании этих двух жидкостей вызывает удивление тот факт, что они обладают совершенно противоположными вкусами, отличными от вкуса самого вина. Дистиллят имеет мягкий, сладкий, бархатистый привкус, с большей теплотой, с винными свойствами алкоголя, смешанными с некоторыми пресными тонами. Для остатка, наоборот, характерны кислотность, зеленость, необыкновенная грубость, очень неприятный вкус. Путем простой перегонки отделяют вещества с кислыми и горькими привкусами вина от вещества со сладкими привкусами.
Вкус белых десертных и сладких натуральных вин выдвигает более сложную проблему равновесия. Здесь равновесие имеет трехсторонний характер: к описанному выше равновесию добавляется равновесие между сахаром и спиртом. Чем слаще вино, тем выше должна быть его спиртуозность, сладковатый вкус сахара следует компенсировать большим количеством теплоты, .винных качеств. Таким образом объясняются нарушения равновесия в пикетных винах, которые кажутся слишком •сладкими для своей крепости.
Другие последствия этого равновесия: белые десертные вина выдержива- -Ют довольно высокие уровни кислотности. Вина Сотерн обычно имеют от 4,5 до 5,0 г/л общей кислотности , дозы, которые делают красное вино неприятным. Недостаток кислотности, избыток сахара делают эти вина плоскими и невыразительными. Нужно отметить, что вино, безусловно, является одним из наиболее кислых напитков. Из предшествующих объяснений понятно, что вино можно пить, и оно может быть приятным при своей кислотности только тогда, когда его спиртуозность выше по сравнению с другими напитками, получаемыми путем брожения. Пиво имеет значительно меньшую кислотность, чем вино. Но горький привкус хмеля уравновешивается сладким при-
Показатель бархатистости = спиртуозность —
Общую кислотность выражают в граммах серной кислоты на 1 л, фенольные соединения выражают в танинах и вычисляют приближенно по показателю перманганата (пользуются следующим отношением: 1 г/л танина соответствует показателю перманганата 20) или по показателю Фолина. Например, вино спиртуозностью 12% об., имеющее
вкусом спирта. Аналогичным образом виноградный сок является приятным напитком потому, что повышенное содержание сахара маскирует его кислый вкус. Эти примеры показывают, что такие принципы равновесия являются общими для всех напитков.
Необходимо также подчеркнуть, что в этом равновесии привкусов вина участвуют обонятельные ощущения, в действительности можно говорить о равновесии вкусовых комплексов. Схематически можно рассматривать в дегустации две сенсорные части: «основа», которая выражает равновесие ранее определенных привкусов, и «пахучая часть», аромат и букет, которые влияют на характеристики основы и могут доминировать над ними. Интенсивный аромат, очень тонкий букет маскируют возможные недостатки основы, которые бывают заметны в винах, бедных ароматом и букетом.
Показатель бархатистости
Различными способами пытались установить отношение между показателями бархатистости и маслянистости, которое могло бы выражать эти качества числовым значением. Для красных вин можно пользоваться выражением:
(общая кислотность + процентное содержащие , полифенолов).
общую кислотность 3,8 г/л и танинов 2 г/л, дает показатель бархатистости, равный 12—(3,8 + 2,0) =6,2.
Однако нельзя упускать из виду, что в свойствах бархатистости и маслянистости выступают помимо этого другие факторы, и в частности летучая кислотность, этилацетат, другие элементы, придающие вину грубость, а также, по всей видимости, летучие вещества, составляющие вкусовой аромат. Наконец,
показатель перманганата охватывает соединения, лишенные горечи, во время выдержки некоторые полифенолы теряют свою терпкость, это так называемое смягчение старых вин. Расчет показателя бархатистости применяют только к относительно молодым красным винам.
Хотя и не существует четкого предела, похоже, что вино действительно заслуживает определения бархатистого, если его показатель явно превышает 5; он должен быть еще выше, чтобы вино помимо этого могло получить определение маслянистого.
ТЕРМИНОЛОГИЯ ДЕГУСТАЦИИ
Качество работы дегустатора зависит не только от его чувствительности, его способности определять вкус, оно зависит также от его умения выразить получаемые им впечатления. Недостаточно, чтобы он имел натренированное нёбо, точное чувство вкуса, нужно, чтобы он мог ясно выразить то, что он чувствует. Натренированность и навыки создают более тесную связь между впечатлениями и принятой терминологией. Важно, чтобы применяемые термины, которые неизбежно являются воображаемыми, означали для всех дегустаторов одни и те же значения. Эти термины уточняются по мере приобретения дегустатором опыта от своих старших коллег, владеющих словарем дегустатора. Несмотря ни на что, следует признать, что терминология дегустации часто еще неточна и носит местный характер, одни и те же слова не всегда одинаково понимаются в разных районах. Однако еще важнее, чтобы дегустаторы понимали друг друга, и пользовались одними и теми же терминами для одних и тех же вкусов. Кроме того, словарь должен быть достаточно богатым и давать достаточные возможности для выражения.
Можно объединить многие сотни терминов, используемые дегустаторами. Ле Маньан (1962) свел их к 150, Ведель с сотрудниками (1972), перечислив более 900 определений и исключи? все названия химических веществ и обТ- щих терминов, оставили около 250 слов и выражений, относящихся непосредственно к обозначению вкусовых характеристик вина. '
Авторы составили две схемы (1,2) качественных определений, предназначенные для практического использования.
Термины изменяются в зависимости от содержания спирта. В этом разделе будет сделана попытка дать определение признаков, встречающихся в винах. Оговоримся заранее, что это не более как предварительный анализ, цель которого вывести хотя бы частично более или менее точные определения по такому трудному и иногда противоречивому комплексу вопросов.
Мягкие вина
Термин «Мягкий» означает «гибкий», «податливый». Мягкое вино не раздражает нёбо, оно действительно мягкое, нежное, бархатистое, текучее и благодаря этому приятное на вкус, хорошо пьющееся, будь то легкое вино или, наоборот, вино крепкое, мужественное. Это качество связано прежде всего со слабой кислотностью и не слишком высоким содержанием фенольных соединений (показатель полифенолов ниже 40). Вино, богатое танинами, имеет терпкий, вяжущий грубый вкус, и эти его характеристики выражены тем более, чем выше кислотность; она повышает грубость танина, и, наоборот, если кислотность очень мала (в винах иногда отмечают pH 3,8 или 3,9), вино может казаться разбитым и плоским, сла- боокрашенным, как бы больным кассом. .
СХЕМА 1. Опыт рационального словаря дегустации, построенного на равновесии: сладкий вкус я кислый вкус + горький вкус
Возрастание сладкого вкуса
Возрастание кислого вкуса
Гармоничное равновесиеГармоничное равновесие
Гармоничное равновесие
Гармоничное равновесие
Разбитое — тяжелое — глицериновое — бархатистое — нейтральное — плоское — сладко ватое
Пустое — короткое — бестель- ное — сухое — жгучее — острое — сырое — грубое — резкое — жесткое — кислое — подкисленное — зеленое
Богатое, мужественное, полное, солидное, сильноеБогатое, мужественное, полное, солидное, сильноеЛегкое Элегантное Бархатистое Шелковистое Деликатное Нежное Мягкое Круглое Зрелое Полное Тельное Маслянистое
Богатое, мужественное, полное, солидное, сильное
Богатое, мужественное, полное, солидное, сильное
Грубое — танинное — жесткое
терпкое — вяжущее — горькое
Возрастание горького (терпкого, вяжущего) вкуса
СХЕМА 2. Пример рационального изображения словаря дегустации, построенного на равновесии; сладкий Вкус вислый вкус + горький вкус
Возрастание сладкого вкуса
Возрастание кислого вкуса
водянистое — жидкое — плос Кре
Пикет Бедное Слабое
Легкое
Свежее — живое — худое — пустое
Возрастание крепости
Возрастание сладкого вкуса
Винное Горячее Крепкое Спиртуозное Крепленое
Жгучее
Энергичное — яркое
Возрастание кислого вкуса
Термин «бархатистое» больше всего применяется в отношении белых вин и означает тип промежуточный между белыми ликерными и белыми сухими винами. Бархатистость является результатом присутствия специфических сахаристых веществ (глюкозы, фруктозы) , сладкий вкус которых проявляется особенно сильно при малой кислотности. Красное вино, хотя и лишенное сахаров, может быть бархатистым, если оно имеет пониженную кислотность и в нем преобладают сладковатые привкусы спирта и глицерина. В этом случае термин является синонимом мягкого.
Белые или красные вина с очень слабой кислотностью в действительности кажутся сладкими, как если бы они. содержали несколько граммов сахара на 1 л, даже тогда, когда он в них совершенно отсутствует: впрочем возможно, что в этих малокислотных винах действительно проявляется сладковатый привкус глицерина и пентоз. Несколько граммов сахара на 1 л создают у красного вина первое впечатление бархатистости, которое необязательно маскирует конечную терпкость, но, если в вине слишком мало кислоты, сахар придает ему избыточную сладость и маскирует его тонкость. Понятно, что при дегустации было бы трудно распознать в молодом малокислотном вине присутствие нескольких граммов остаточных сахаров. Дегустаторы часто говорят о малокислотном вине с достаточной спиртуозностью, что оно имеет «сахар», разумеется, это не означает, что его можно обнаружить при химическом анализе. О таком вине также говорят, что в нем есть «глицерин», однако в действительности невозможно найти связи этого признака с повышенным содержанием глицерина.
Несколько повышенное содержание углекислого газа может значительно изменить результаты дегустации вин в благоприятном или неблагоприятном
смысле в зависимости от их возраста и типа. Некоторые белые сухие вина, свежие и высококислотные приобретают явно лучшие качества в присутствии 500—600 мг/л углекислого газа. При более высоких концентрациях его вино становится покалывающим (выделяет пузырьки газа, ощутимые на вкус) и с более агрессивной кислотностью, при более низких уровнях ослабевает аромат, белое вино кажется более нейтральным, плоским, невыразительным. С другой стороны, белое бархатистое или ликерное вино не выдерживает таких сильных концентраций; углекислый газ- как бы понижает сахаристость и маслянистость. Молодые красные вина первого типа могут содержать с пользой от 400 до 500 мг/л углекислого газа, но красное вино, предназначенное для выдержки в бутылках, должно иметь менее 100 мг/л, углекислый газ снижает маслянистость и усиливает танинную жесткость таких вин.
Привкус углекислого газа во многом зависит от температуры: определенная доза может хорошо подходить для вина, употребляемого в прохладном состоянии, и делает вино совершенно непригодным для питья, если его довести до комнатной температуры. С другой стороны, углекислый газ сильно искажает результаты дегустации молодых или еще бродящих вин. От него легко избавиться, создавая вакуум в бутыле с вином с помощью водоструйного насоса и мешалки, еще проще удалить избыточный и ненужный углекислый газ путем пяти-шестикратной переливки вина из одного сосуда в другой.
Иногда для обозначения грубого, жесткого вина применяют термин «танинное», но это слово применяется также и к белым винам, которые долгое? время хранились в дубовых бочках, приобрели вкус дубильных веществ-, бочки, но не стали терпкими в собственном смысле слова.
Красное вино с недостаточным содержанием танина не оставляет во рту ощущения полноты, оно кажется пустым, негармоничным.
Повышенные дозы сернистой кислоты (например, 30 или 40 мг/л) делают красные вина более сухими и более жесткими. Как было показано выше, несколько повышенное содержание летучих кислот, так же как и большое содержание этилацетата, часто делают вина грубыми, придают им резкий вкус. Наконец, вкус плоского вина, привкус альдегида также делают вино грубым.
Вино терпкое так же, как и вино без характера, с малоприятным вкусом называют «ординарным» в противоположность «тонкому», такие вина обычно получают из ординарных сортов винограда или винограда, выращенного на плохих почвах.
«Мужественные», полные вина
Полными винами называют такие, которые имеют тело, консистенцию. Полное вино, которое имеет полный вкус, крепость, называют также мужественным. Противоположностью полному вину является легкое, слабое, малоэкстрактивное вино, которое, однако, может быть очень приятным. Тель- ность вина связана с содержанием полифенолов, спирта, сухого экстракта, с рбщим составом, а здесь рассматриваются также вина с содержанием некоторых элементов вкуса, трудно поддающихся определению.
Вкус вина не является точным понятием, в нем сочетаются тело, крепость и одновременно свойства сорта и почвы. Что такое тело, можно до известной степени представить, сравнивая хорошее вино с таким же, но разбавленным водой, например на 5—10%.
Под винными свойствами понимают тот теплый привкус, который вызывает присутствие спирта, он присоединяется
к основному вкусу вина и обычно сливается с другими качествами — мягкостью и маслянистостью. Влияние спирта становится еще больше, если повышать температуру вина. Вероятно, что в образовании винных свойств участвует янтарная кислота, во всяком случае, она оказывает большое влияние, на вкус вина.
Вино считается пустым, когда у него нет тела, винных свойств вкуса. Этот термин прежде всего характеризует малокислотное вино. Можно сказать, что пустое вино — это такое вино, в котором ничто не выделяется, нельзя ничего различить. Белое ликерное вино со слабой кислотностью и с недостаточной спиртуозностыо, например менее 12% об., легко отнести к пустому, в нем преобладает сладковатый привкус.
Энергичное вино — это такое, которое сильно воздействует на нёбо, будучи одновременно достаточно и спиртуозным, и кислым, и в то же время не имея ни алкогольного, ни кислого привкусов, которые можно было бы назвать характерными. Оно может иметь тело, крепость. Это качество является следствием не только состава вина, оно также результат пахучих веществ.
Плоское вино имеет почти такие же характеристики, как и вино пустое, у которого кислотность ниже/но оно более водянистое.
Маслянистые вина
Маслянистым вином называют такое, которое хорошо заполняет рот, имеет объем, одновременно является и мужественным, и мягким, еще говорят, что оно тельное, полное. Несомненно, что это качество ценится выше всех других и необходимо для вин лучших марок. Оно получается в основном за счет хорошей зрелости винограда, которая придает вину выразительность; вино зрелое — это вино маслянистое. Проти-
воположностью маслянистому вину является вино пустое, бестельное, которое, впрочем, может в начале дегустации иметь определенную мягкость: мягкое вино не всегда маслянистое, тогда как маслянистое вино в своей основе мягкое. Маслянистость связана главным образом со следующими элементами:
с достаточно высокой спиртуоз- ностью. Точнее, существует оптимальная спиртуозность, которая зависит от состава вина: красное вино при спирту- озности 10% об. не может быть действительно маслянистым, но, если спиртуозность слишком высока, вино кажется более сухим и менее маслянистым. Спирт представляет собой основной элемент качества, и даже слабые колебания в его концентрации ощутимы, возможно, в большей степени, чем других компонентов. Но в действительности его воздействие очень сложно и кажется иногда противоречивым. Схематически добавление спирта к пустому, сухому вину делает его еще более бедным и сухим. С другой стороны, маслянистое вино кажется тем более бархатистым, чем выше его спиртуозность. Другими словами, спирт должен быть замаскирован, как бы покрыт элементами маслянистости и слабой кислотностью. Если сравнивают белые и красные вина одного и того же происхождения, лучшими обычно оказываются те, которые содержат больше спирта не только из-за прямого эффекта этого элемента, но также потому, что повышенная спиртуозность является плодом большой зрелости винограда, которая надежно обеспечивает создание благоприятных условий, и в частности низкой кислотности;
со слабой кислотностью (разумеется, до определенного предела, так как, если она очень низкая, вино делается плоским), прежде всего выражающейся в слабой общей кислотно
сти: ниже, например, 3,5 г/л (в серной кислоте). Небольшое повышение содержания летучих кислот, превышающее 0,50 г/л, способствует обеднению вина и делает его более сухим;
с присутствием сахара и глицерина, которые смягчают влияние кислотности, а также с содержанием танина, не превышающим определенного уровня. Небольшая терпкость необязательно мешает вину казаться маслянистым;
с присутствием летучих веществ, составляющих аромат вкуса, который является плодом хорошей зрелости винограда и обогащенности натуральными веществами, создающими в вине его запах, букет и вкус, делают его более маслянистым.
Можно сделать одно общее замечание. Когда вино посредственное, ему зачастую можно приписать почти все недостатки: недостаток маслянистости, бархатистости, энергичности, характера, тонкости, и, наоборот, хорошее вино имеет все положительные качества. Таким образом, многие характеристики более или менее совокупны. Говорят, что, если вино хорошо сложено, «остальное приложится».
Зеленые вина
Зеленая кислотность для тонкого вина является большим недостатком, недостаточная зрелость винограда проявляется в терпкости, и этот вкус в точности напоминает вкус недозрелых ягод.
О таком вине говорят еще, что оно «сырое». Отсутствие яблочно-молочно- го брожения или микробиальное изменение с повышением кислотности могут также быть причиной такого явления.
Зеленоватость является результатом чрезмерно высокого содержания свободных кислот.
Несомненно, что зеленая кислотность является серьезным недостатком, осо-
бенно для красных тонких или белых сладких вин. С другой стороны, для некоторых типов вин зеленоватость не всегда является недостатком, иногда это ординарные вина текущего потребления, вина (пикеты) местн^-э производства или же хорошие белые сухие вина, которым кислотность придает свежесть и приятный вкус.
Восстанавливающие сахара маскируют летучую кислотность так же, как и летучая кислотность маскирует сахар. Красное вино с 0,75 г/л летучих кислот и 5 г, л сахаров может казаться приемлемым, с другой стороны, более слабая летучая кислотность может совершенно испортить сухие вина. Кроме того, летучая кислотность часто сопровождается другими веществами, образующимися одновременно с ней, и в частности этилацетатом, который изменяет чистоту, открытый характер айна более выразительно, чем летучие кислоты. Наконец, вина лучше выдерживают несколько повышенную летучую кислотность, когда они имеют большую спиртуозность.
Кислый вкус
Известно, что в вине содержатся шесть основных органических кислот, играющих роль в кислом вкусе. Три из них переходят из винограда и дают чисто кислый вкус: это винная, яблочная и лимонная кислоты. Три другие образуются в результате спиртового брожения и бактериальной активности. Это кислоты янтарная, молочная и уксусная. Каждая кислота имеет очень сложный вкус. Молочная кислота имеет слегка кислый, скорее кисловатый вкус, напоминающий привкус щавеля, уксусная кислота обладает резко кислым вкусом, похожим на вкус недозрелого винограда, вкус янтарной кислоты интенсивный, горький и соленый одновременно, вызывает выделение слю
ны. Эта кислота, которая входит в вино и во все спиртные напитки, обладает наиболее выраженным вкусом, и совершенно ясно, что кислота играет важную роль в образовании вкуса вина.
Делалось много попыток уточнить, не обязан ли кислый вкус своим возникновением ионам Н+, как думали вначале, или анионам, или же недис- социированным молекулам. Однако ответ на этот вопрос далеко не простой.
Когда пробуют на вкус 0,02 н. растворы основных кислот вина (сернистой, винной, яблочной, молочной, уксусной, янтарной) после их нейтрализации ед-' ким натром при pH 7, обнаруживают, что сернистая и уксусная кислоты больше не имеют никакого вкуса, янтарная кислота сохранила свое отчетливо выраженное послевкусие, а другие органические кислоты дают лишь очень легкие вкусовые ощущения.
Таким образом, можно сказать, что вкус уксусной кислоты обязан ее недис- социирующимся молекулам, тогда как вкус янтарной кислоты вызывается анионом сукцината, анион сульфата не имеет никакого вкуса, во всяком случае, при этой концентрации, другие органические анионы имеют слабо ощутимые привкусы.
Другие очень простые опыты показывают, что недиссоциированные молекулы органических кислот имеют сами по себе кислый вкус. Раствор соляной кислоты при pH 3,0 (0,001 н.), который является полностью диссоциированным, может показаться на вкус малокислотным. С другой стороны, раствор винной или уксусной кислот с такой же концентрацией водородных ионов, но с более высокой общей концентрацией (например, 0,1 н.) имеет совершенно кислый вкус. Этот кислый вкус усиливается, когда увеличивают концентрацию недиссоциированных ионов винной
или уксусной кислоты. Однако ионы IH участвуют в кислом вкусе вина, и при наличии винной или уксусной кислоты раствор ощущается нёбом тем кислее, чем ниже его pH.
В действительности интерпретация этих наблюдений не такая легкая, как кажется. Фактически слюна, которая обмывает слизистые оболочки языка и рецепторные клетки, представляет собой буферную среду с уровнем pH, близким к нейтральному. Отсюда понятно, почему собственный вкус очень разбавленного раствора соляной кислоты, не являющегося буферным, всегда намного сильнее изменяется при разведении слюной, чем растворы винной или уксусной кислоты, сильно за- буференные при pH 3.
В заключение исследования кислого вкуса можно сказать, что факторы ощущений не являются чисто химическими и зависят не только от молекулярной структуры и явления диссоциации. При сравнении кислых вкусов основных кислот вина при эквивалентных количествах, с одной стороны, и при том же pH —с другой, было получено следующее распределение по классам: в первом случае при равной титруемой кислотности порядок кислотности вкуса: яблочная>винная> >лимонная>молочная, во втором случае, при равном pH: яблочная>молоч- ная>лимонная> винная. Следовательно, яблочная кислота выступает в отношении вкуса как наиболее «кислая» из всех кислот вина.
Было проверено, что в кислой характеристике вина общая кислотность участвует в большей степени, чем pH. Некоторые вина имеют особо низкие или высокие значения pH в противоположность их общей кислотности и при дегустации они обычно классифицируются с точки зрения маслянистости соответственно их общей кислотности, а не по их pH. К тому же при
бавление воды к суслу или вину ослабляет кислый привкус без изменения pH.
Белые вина
Впечатление маслянистости, которое дают некоторые белые вина, связано, прежде всего, со слабой кислотностью, а также с некоторыми веществами, которые создают вкус, элегантность и характер, с сахаристыми веществами в случае бархатистых и ликерных вин и в меньшей степени со спиртом.
Как правило, белое маслянистое вино имеет спиртуозность 12—14% об., в зависимости от чего оно является более или менее сладким. Но это правило нельзя считать абсолютным, встречаются очень хорошие ликерные вина, маслянистые, но не мягкие, имеющие спиртуозность 12% об., тогда как другим спиртуозностью 14% об. не хватает маслянистости. У этих вин спиртуозность не производит такого же эффекта, какой оказывает спиртуозность, полученная естественным путем. Спиртуозность незначительно снижает кислотность и соответственно мало повышает впечатление маслянистости, намного меньше того, какое дает легкое обогащение сахаром. Оно ведет к тому, что вина становятся более мужественными, ничуть не более бархатистыми, но более энергичными.
В почти сухих винах присутствие нескольких граммов восстанавливающих сахаров часто маскирует кислотность, которая в этом случае может быть несколько повышенной. Тем не менее вино, которое в начале опробования кажется сладким, а в конце его воспринимается как кислое, редко бывает хорошим. Между тем белое вино оценивают именно по послевкусию, по впечатлению, которое оно оставляет после де!устации.
Известна роль глицерина. Сусла,полученные из винограда, пораженного
Botrytis cinerea, дают ликерные вина лучших марок и содержат значительные дозы глицерина, образуемые плесенью на винограде и дрожжами в процессе спиртового брожения.
Фруктоза явно -более сладкая на вкус, чем глюкоза. При одинаковом содержании восстанавливающих сахаров впечатление сладости определяется соотношением этих двух сахаров.
ХАРАКТЕРИСТИКА АРОМАТА И БУКЕТА
Определения
Аромат и букет представляют собой приятный запах, издаваемый вином, который зависит от его происхождения, возраста, состояния сохранности и является одной из наиболее ценных отличительных характеристик тонких вин лучших марок. Повседневно применяемые термины часто путают. Прежде всего необходимо провести различие между ароматом и букетом.
По мнению некоторых, ароматом обладают только белые вина, а красные вина — букетом. Это справедливо для белых молодых вин и красных старых, но не для всех вин.
Для других вин букет-—это запах, воспринимаемый непосредственно обонянием, а аромат является ощущением, воспринимаемым задненосовыми путями, когда вино находится во рту. В этом случае аромат будет всегда ароматом вкуса. Однако такое определение не соответствует обычному смыслу, в котором употребляют слово «аромат»: «пахучее вещество, которое исходит от различных тел растительного, или животного происхождения» (и которое, следовательно, можно вдыхать).
Фактически аромат вина должен обозначать совокупность пахучих веществ молодого вина, букет же приобретается в период старения и развивается в течение длительного времени.
Так, некоторые белые сухие вина обязаны своими приятными качествами больше своему аромату, чем своему букету, тогда как в старых красных винах после нескольких лет выдержки в бутылках остается только букет.
Различают два вида аромата. Аромат первичный, или первоначальный, который еще раньше существует в винограде, в сусле и особенно в кожице ягод некоторых сортов красного винограда. Это аромат плодов, свежего винограда, характеризующий данный сорт и способный изменяться по своей интенсивности и тонкости в зависимости от района и состояния зрелости ягод. Некоторые тонкие сорта: Каберне, Пино, Совиньон, Рислинг, Мускат — выделяются по своей природе и интенсивности их первичного аромата. Вторичный аромат появляется во время брожения. Это именно тот интенсивный винный запах, который развивается под воздействием дрожжей. Такое явление было названо некоторыми авторами «ароматическим брожением». Этот аромат утончается и облагораживается после окончания брожения, затем ослабевает и через несколько лет выдержки исчезает, уступая место букету.
Букет — смесь сложных тонких запахов, которые выделяет старое вино, й названное так, несомненно, по аналогии со сложным благоуханием смеси цветов. Развивается букет во время выдержки вина, скорее всего, за счет элементов первичных и вторичных ароматов. Маловероятно, чтобы медленная химическая этерификация кислот вина содержащимися в нем спиртами могла образовать пахучие вещества, объединяющиеся в букет, так как сложные эфиры, которые получаются в результате этерификации, сами обладают лишь очень слабой способностью издавать запах. Вполне вероятно, что букет в своей большей части образуется в
результате медленного гидролиза гете- розидов без запаха, в которых агликон обладает интенсивной одорирующей способностью. Нужно также проводить различие между букетом старения в бочках и букетом старения в бутылке, так как известно, что развитие букета при выдержке в бочках всегда ограничено и максимум интенсивности букета достигается после нескольких лет выдержки в бутылке. Эти вопросы освещены в главах, относящихся к явлениям окисления-восстановления и выдержки.
Когда вино очень старое, букет часто напоминает запах трюфеля или некоторых грибов при хранении вина без доступа воздуха в восстанавливающей среде, когда бочки установлены шпунтом на бок, т. е. закрыты герметически. После розлива в бутылки особенно начинают развиваться тонкие, очень приятные запахи, букет, главным образом, в летний период. Эти признаки воспринимаются обонянием как при вдыхании испарений вина, так и тогда, когда его берут в рот.
Под термином «тонкость» понимают совокупность качеств, которые характеризуют высококачественное вино с регламентируемым названием по месту происхождения. Тонкое вино — это «такое, которое отличается деликатностью своего аромата, приятностью букета, чистотой вкуса и цвета, совершенством «ансамбля».
Термин «тонкое» в районе Бордо означает также полную прозрачность, чистоту. Слово «ординарное» означает вино без характера и обычно терпкое или кислое, бестельное. Тонкость выражается запахом цветов, фруктов. Ординарное вино характеризуется запахом травы, зелени.
Вино «фруктовое», напоминающее по вкусу свежий виноград, и в частности белое вино, — это вино душистое, аромат которого напоминает фрукты, час
то даже цветы. О белом вине с хорошим ароматом во рту говорят также, что оно «с виноградной ягодкой».
«Чистым» вином называют такое, у которого нет никаких посторонних привкусов и которое после дегустации оставляет приятное ощущение без каких- либо недостатков. Термин «окисленное вино» означает вино, обогащенное свободным ацетальдегидом или хинонами, вследствие аэрации, например при снятии с дрожжей или при розливе в бутылки. По вкусу оно немного напоминает пережеванный фрукт, иногда оно пахнет бумагой. Такое ощущение исчезает при отдыхе без доступа воздуха, но может быть и устойчивым, если вино содержит слишком мало сернистой кислоты для того, чтобы связать ацетальдегид.
Аромат молодых несульфитирован- ных вин, особенно когда они приготовлены из винограда, более или менее пораженного гнилью, крайне чувствителен к контакту с воздухом. Ферментативное окисление полифенолов развивает в этих винах запах «хинона», напоминающий иногда запах выдохшегося пива. Эти признаки не всегда исчезают полностью даже и тогда, когда вшю помещают в восстанавливающую среду.
Часто отмечалось, что кислотность вин тесно связана с запахом, она придает вину зеленый тон, если оно молодое, оттенок «пригорелости», если оно выдерживалось в бутылках. Точно так же подкисление изменяет аромат, что можно заметить при внимательном дегустировании. Эти наблюдения остаются труднообъяснимыми.
Часто описывают вкусы, присущие больным винам. Различают плохие привкусы, которые исчезают более или менее быстро при аэрации (сероводород, меркаптаны), привкусы, усиливающиеся аэрацией (плесени, гнили, стоячей воды, сухого дерева, ацетамидов),
и привкусы, безразличные к воздуху (металла, нефти, керосина, креозота, гудрона).
Некоторые вина имеют интенсивный и очень тонкий аромат диацетила, он идентичен запаху сливочного масла, лесного ореха, приятной прогорклости, Впрочем, диацетил присутствует во всех винах в дозах от 0,1 до 2 мг/л; большие дозы встречаются как исключение.
Присутствие первичного аромата в кожице ягод винограда
Уже более столетия известно, что в кожице ягод винограда имеются специфические ароматические вещества, присущие данному сорту и составляющие первичный аромат вин. Нетрудно реализовать опыт, который показывает существование этих веществ: у некоторого количества зрелых виноградных ягод отделяют кожицу, быстро промывают ее в воде для удаления остатков мякоти и вымачивают в таком объеме разведенного спирта, который достаточен, чтобы их покрыть. В сравнительных опытах кожицу от 200 ягод различных сортов винограда из района Бордо помещают в раствор (200 см3) 20%-кого спирта, подкисленного винной кислотой до pH 3,0, и выдерживают несколько недель. Затем содержимое декантируют и сохраняют в небольших флаконах с притертыми.пробками в течение нескольких месяцев, чтобы оценить эволюцию запахов, вызываемую старением. Выдержку можно также производить при различных pH, различных температурах, с добавлением сернистой кислоты, чтобы выяснить влияние этих факторов на эволюцию первичных ароматов.
При этом кожица белых сортов винограда испускает типичный аромат, ко-
торый напоминает одновременно запах спирта из виноградных выжимок, точнее, водки с привкусом свежего винограда и настоя сухих листьев. Аромат сорта Коломбар грубоват, аромат сорта Мерло белый более нейтрален. Аромат тонких сортов не производит приятного -впечатления, напоминая скорее запах увядших цветов и отчасти виноградной выжимки. Извлеченный таким образом аромат сорта Совиньон является более утонченным, чем у сорта Семильон, который в свою очередь более тонкий, чем аромат сорта Муска- дель. В присутствии сернистой кислоты запах этот сильно меняется, становится неузнаваемым, напоминая запах черной смородины, смешанный с пресным тоном сульфитированного сусла, однако у хороших сортов аромат утончается, например сорт Совиньон дает очень сильный цветочный запах, напоминающий благоухание винограда в цвету, мощный и тонкий.
Обработанные таким образом красные сорта имеют общий запах фруктов, вишни, косточки плода, точнее «черешни». Сорт Мерло издает более тонкий аромат, чем сорт Мальбек, Каберне, еще более утонченный, более винный.
Таким путем можно также сравнивать качество различных виноградников. Аромат винограда из. какого-то знаменитого района (крю) отличается большей полнотой, силой, тонкостью и количественно, и качественно одновременно. pH также оказывает влияние на аромат. При оптимальном pH вина запах наиболее приятен, хранение рри низком pH вызывает запах пригорело- сти, при высоких же pH интенсивность запаха ослабевает.
Наконец, нужно отметить, что при более глубоких экстракциях мезги более концентрированным спиртом или другими растворителями выделяются неприятные запахи зелени, листьев.
Летучие вещества и характеристика запахов
В главе X «Летучие соединения и одоранты» первого тома дана библиография по этому вопросу и приведены таблицы летучих соединений, идентифицированных в винах до настоящего времени.
Исследование связей между характеристиками аромата и букета, с одной стороны, и химическим составом — с другой, не могло быть начато до тех пор, пока не появилась возможность использования газовой хроматографии, если не считать особых случаев, как, например, выявление роли этилацетата.
К началу 60 -х годов многие надеялись на то, что применение газовой хроматографии станет основным методом исследования. Она позволила получить выдающиеся результаты. Однако нужно признать, что, даже отбирая такие типичные сорта, как Каберне Совиньон или Совиньон, все еще невозможно установить точные отношения между тем или иным химическим компонентом и тем или иным запахом. Характерные признаки сортов скорее были представлены концентрациями определенных веществ.
В винограде сорта Каберне Совиньон было идентифицировано более пятидесяти различных соединений. По сравнению с сортом Мерло было найдено больше н-гексанола, изобутиллактата, этилкаприлата, изоамилкапроата, у-бу- тиролактона и этилкапрата. Среди веществ, обладающих очень высокой летучестью, было также обнаружено намного больше изобутилацетата, этилбу- тпрата, изоамилацетата, н-бутандиола в вине Каберне Совиньон, чем в вине Мерло. Отношения концентраций этих
соединений в Каберне Совиньон и в Мерло равны как 3 : 1 или 5 : 1 (Буад- рон, 1966). Следовательно, напрашивается первый вывод, что различные ароматы вина получаются в первую очередь за счет различных пропорций одних и тех же веществ и возможно, что специфических ароматических веществ нет совсем, по крайней мере, в количествах, которые можно было бы обнаружить методами, применявшимися до сих пор.
Приводимые различными авторами сводные таблицы летучих веществ в винограде, в винах и в водках содержат 30 спиртов, 15 альдегидов, 8 кетонов, 15 жирных кислот, около 90 сложных эфиров, 9 терпенов и еще около двадцати различных соединений (Риберо- Гайон, 1971).
Более глубоко исследована природа аромата у сорта Мускат, он образуется терпеновыми соединениями, в особенности линалоолом, сопровождаемым окисями фурана и окисями пирана, которые являются производными линалоола, но менее пахучие, чем он; этим объясняется оттенок запаха и его смягчение в некоторых условиях. Линалоол сопровождается а-терпинеолом, неролом и гераниолом. Линалоол, которому сначала приписывали доминирующую роль, взятый отдельно, не оказывает влияние на органолептические характеристики Муската; он дает более цветочный аромат. Смесь различных производных терпена обладает органолептическими характеристиками, очень близкими к характеристикам Муската.
Производные терпена также присутствуют в малых дозах в некоторых сортах -винограда: Рислинг, Сильванер, Гевурцтраминер. В соке винограда этих сортов содержание терпенов составляет от 0,1 до 0,3 мг/л вместо от 1 до 3 мг/л у Мускатов. В готовых винах терпены исчезают полностью, хотя эти
вина и обладают выраженным ароматом (Терье, 1972).
ОБУЧЕНИЕ ДЕГУСТАЦИИ
В этом разделе приводится серия упражнений по дегустации, рассчитанных на то, чтобы помочь дегустаторам уяснить основные положения этой практики.
Обучение начинается с советов, как проводить дегустацию. Они являются темой первых упражнений, которые могут сопровождаться комментариями, почерпнутыми в разделах по физиологии органов вкуса и обоняния. Вот некоторые из них:
сосредоточить свое внимание.. Несколькими последовательными вдохами через нос ощутить запах вина. Отметить разницу в интенсивности и качестве запаха, воспринимаемого при взбалтывании вина в бокале или без него;
встряхнуть вино более или менее энергично (уксусное скисание лучше ощущается при резком вращении бокала). Взять в рот немного вина. Сделать отметку о первом впечатлении и его эволюции, выдерживая вино во рту в течение 15 с. Отметить конечное впечатление, которое развивается в течение 15 с после того, как вино будет выплюнуто в чашку .
Следующие упражнения имеют целью дать представление об учете пои дегустации ощущений обоняния и вкуса в собственном смысле слова.
После опробования вина выпустить воздух через нос. Пробовать снова, барботируя воздух во рту легким при-, дыханием. Эти операции усиливают впечатление «вкуса» и локализуют основное восприятие органов обоняния. Прекратить обонятельные ощущения,
зажав нос, в этом упражнении важно зажать ноздри до введения вина в рот, держать их зажатыми в течение всего времени дегустации, выплюнуть вино и только тогда, когда ноздри снова будут открыты, можно очень отчетливо ощутить «вкус» вина, который абсолютно не воспринимался до этого момента. Отметить во время этого упражнения, что движения глотания при зажатых ноздрях вызывают неприятное давление во внутреннем ухе. Обычно, когда глотают, это давление гонит через нос пахучие испарения, которые пропитывают полость рта и таким образом усиливают ощущение.
Другие упражнения в дегустации разделены на три категории соответственно трем разным темам:
Изучение механизмов вкусовых ощущений, определение порогов ощущения четырех элементарных вкусов, дегустация различных компонентов вина в водном растворе, понятие о равновесии между вкусами этих составных частей. Такие упражнения, позволяющие определить физиологические основы дегустации, можно назвать упражнениями по теории дегустации.
Изучение влияния на вкус вариаций основных компонентов вина: спирт, кислоты, полифенолы, сахара, многоатомные спирты, этилацетат, углекислый газ и др. Это упражнения по аналитической дегустации.
Упражнения по применению терминологии, которые можно назвать прикладной дегустацией, состоящей щз точного и обстоятельного описания вкусовых впечатлений, вызываемых различными винами, связывая эти впечатления с их составом.
Упражнения по теоретической дегустации
Четыре элементарных вкуса: дегустация водных растворов веществ, об-
задающих элементарными вкусами. Попытаться локализовать район языка, чувствительный к различным ощущениям. Сладкий вкус (раствор сахарозы 20 г/л), ощущаемый кончиком языка; кислый вкус (раствор винной кислоты 1 г/л), воспринимаемый средней частью боковых и прилегающей к ним нижней поверхности языка; соленый вкус (раствор хлористого натрия 5 г/л)., ощущаемый большей поверхностью, за исключением центральной части; горький вкус (раствор сернокислого хинина 2 мг/л), воспринимаемый только задней частью языка. Терпкий вкус (раствор танина 1 г/л) является скорее тактильным ощущением, реакцией слизистых оболочек, чем вкусом в собственном смысле слова.
Сладкий вкус этилового спирта: спирт в растворе спиртуозностью 4% об. (32 г/л) имеет слащавый привкус. Он снова встречается вместе с ощущением едкости, теплоты в растворе спиртуозностью 10% об. (80 г/л).
При подготовке сладких растворов с 20 г/л сахарозы при разной спиртуоз- ности (0, 4, 8, 12% об.) констатируют, что спирт значительно повышает интенсивность сладкого вкуса в растворе сахара, с другой стороны, при этой дозе сахар не смягчает теплый привкус спирта.
Сладкий вкус изменяет впечатление кислого. Сравнить вкус раствора, который одновременно является и кислым, и сладким (20 г сахарозы и 1 г кислоты винной.на 1 л), с просто сладким или просто кислым раствором. Интенсивность обоих привкусов уменьшается. Обычно при этих дозах кислый вкус больше смягчает вкус сладкий, чем последний снижает интенсивность кислого вкуса. Сравнить вкус кислого раствора при различной спир- туозности (например, 0, 4, 8, 12% об.). Кислотность уменьшает сладкий привкус спирта, а он в свою очередь ис
правляет кислый вкус, оба привкуса ощущаются в одинаковой степени, как бы рядом, только с меньшей интенсивностью. Отметить усиление жгучего привкуса спирта, вызываемое кислотностью.
Вкус вина отражает своеобразное равновесие между сладким вкусом, с одной стороны, и кислым и горьким вкусами — с другой. Демонстрируют опыт, в котором производят перегонку красного вина для разделения веществ, имеющих кислый и горький вкус (органические кислоты, полифенолы). Сладкий вкус спирта уравновешивает в вине вкус кислых и горьких веществ.
В качестве примера произвести дегустацию совершенно уравновешенного (мягкого) вина, затем вина с преобладанием кислых привкусов (грубого) и красного вина, где доминируют сладкие привкусы (плоского, разбитого).
Дегустация веществ, входящих в состав вина, которые обладают сладким вкусом. Сравнивают следующие растворы: этиловый спирт спиртуозностью 4% об. (32 г/л), глицерин, глюкозу, фруктозу (20 г/л). Три первых раствора довольно близки между собой по интенсивности сладкого вкуса, хотя и имеют качественные оттенки сладости. Фруктоза в два раза слаще глюкозы (как следствие: белые вина богатые фруктозой, кажутся намного более сладкими при одинаковом содержании восстанавливающих сахаров).
Дегустация различных кислот вина. Сравнивают растворы винной, яблочной, лимонной, молочной, уксусной (1 г/л) и янтарной (0,5 г/л) кислот. Три первые кислоты, происходящие из винограда, имеют отчетливо выраженный чистый кислый вкус, вкус плода. Винная кислота дает более жесткий, яблочная — более зеленый и лимонная —более свежий вкус. Другие кислоты, являющиеся кислотами броже-
ния, имеют менее интенсивные по кислотности, но более сложные вкусы. Молочная кислота имеет кислый вкус с тонами свежести, вкус уксусной кислоты неприятно кислый, янтарная кислота не кажется явно кислой, но при такой пониженной дозе она представляется смесью интенсивных привкусов одновременно и горьких, и соленых. Кислоты придают наибольший вкус. Они, безусловно, дают напиткам, получаемым путем брожения, тот привкус, который является общим для всех. Янтарная кислота придает вину вкусовые и винные свойства, иногда и горечь.
Эти растворы имеют вкус свободных кислот. У них различные pH, расположенные в порядке выше приведенного перечисления кислот, и выражаются значениями: 2,9; 3,2; 3,3; 3,5; 3,85; 4,3. Можно сравнить эти кислоты при одинаковом pH, приводя более концентрированные растворы к pH 3 добавлением соответствующего количества едкого натра. Получающаяся в результате смесь кислоты с солью имеет менее чистый кислый вкус;
' 7. Чувствительность к элементарным вкусам. Очень поучительно исследование, проводимое большой группой дегустаторов, порогов восприимчивости к различным элементарным вкусам.
Проводят опробование растворов кислых, сладких, соленых или горьких веществ в порядке убывания концентрации и отмечают для каждого дегустатора минимальную дозу, которую он способен ощутить.
Дегустаторам предлагают три бокала, из них два с водой и один с раствором, подлежащим опознанию в любом порядке. Упражнение начинают при самых высоких дозах. Например, можно дать на дегустацию следующие растворы: сахароза — 4; 2; 1 и 0,5 г/л, винная кислота — 6,2; 0,1; 0,05 г/л, хлористый натрий— 1,0; 0,5; 0,25; 0,10 г/л, сернокислый хинин — 2; 1, 0,5 мг/л.
В табл. 2.3 приведены средние результаты большого числа опытов по определению восприимчивости.
Чтобы эти данные можно было истолковать, их следует систематизировать. Результаты будут лучше, если начать дегустацию с образцов, имеющих наиболее слабые концентрации.
Понятно, что в зависимости от индивидуальных особенностей лиц, производящих дегустацию, острота восприятия сладкого или кислого вкусов может сильно изменяться. Отмечены случаи, когда одни дегустаторы были способны обнаружить 0,5 г сахарозы или 50 мг/л винной кислоты, тогда как другие не
'Таблица 2.3
Восприимчивость группы дегустаторов к различным элементарным вкусам
820 лиц — определение сладкого вкуса (сахароза)
495 лиц — определение кислого вкуса (вииная кислота)
100 лиц — определение соленого вкуса (хлористый натрий)
374 лица — определение горького вкуса (сернокислый хинин)
порог, г/л
КОЛИЧ2СТВО лиц, %
порог, г/л
количество лиц, %
порог, г/л
Количество лиц, %
порог, мг/л
количество лиц, %
' >4
4,5
>0,2
11,8
>1,00
6
23,8
4
12,3
0,2
38,8
0,50
. 33
2
27,4
2
34,6
0,1
21,2
0,25
40
1
24,5
1
30,6
0,05
28,2
0,10
21
0,5
24,3
0,5
18,0
—
—
—
—
—-
—
ощущали присутствия сахара при концентрации 10 г/л или кислоты при 0,8 г/л. Практика в дегустации обостряет восприимчивость, и наиболее натренированные дегустаторы обычно способны ощущать очень слабые концентрации. Поэтому естественно, что лица, обладающие пониженной чувствительностью к тому или иному вкусу, могут иметь искаженную основу для оценки по сравнению с лицами, имеющими нормальную чувствительность. Хороший дегустатор не может иметь слишком выраженной слабости восприятия какого-либо отдельного вкуса.
Мнения о соленом вкусе обычно мало расходятся, тогда как способности обнаружения горького вкуса колеблются в больших пределах.
Упражнения по аналитической дегустации
Перечисленные ниже упражнения, целью которых является изучение изменений вкуса, вызываемых изменениями в составе вина, представляют собой серию примеров. Перечень их не является чем-то законченным, и его можно дополнить другими упражнениями такого характера.
Влияние спиртуозности. Сравнить образцы одних и тех же вин, белых и красных, доведенных искусственно до различной спиртуозности. Используют абсолютно чистый этиловый спирт, не имеющий посторонних запахов, спирт среднего погона при перегонке. В этом упражнении можно начать с расхождения в 0,7% об. между образцами, доводя, например, одно и то же вино до 10,3; 11,0; 11,7 и 12,4% об. Пробуют классифицировать образцы в первой слепой дегустации. В случае неуспеха их опробуют, зная их спиртуозность, что позволяет уточнить истинное влияние спиртуозности на вкус вина. В третий раз снова дегустируют вслепую.
Опытный дегустатор может постепенно определить расхождение в 0,5% об. или даже в 0,3% об. Определение крепости вина всегда является трудным упражнением, так как действие спирта на вкус очень сложно, он влияет в большей степени косвенным образом, нейтрализуя или усиливая некоторые привкусы, чем за счет собственного вкуса.
Аналогичный опыт проводят с целью расположения серии различных вин, но принадлежащих к одному и тому же типу, в порядке возрастания или убывания их спиртуозности. В действительности при таких упражнениях оценка основывается, скорее, на других характеристиках, на оценке тела и полноты состава, часто развивающихся параллельно спиртуозности.
Влияние глицерина. Сравнить образцы одних и тех же вин, белых и красных, с добавлением от 3 до 6 г глицерина на 1 л. Улучшение вкуса больше всего проявляется в сладости, чем маслянистости: при 3 г/л в некоторых довольно богатых винах оно ощущается относительно слабо.
Влияние восстанавливающих сахаров. Приготовляют образцы красных и белых сухих вин, предпочтительно молодых, путем добавления фруктозы из расчета 2; 3; 4 и 5 г/л восстанавливающих сахаров. Пробуют определить их путем дегустации. Такие упражнения подготовляют к выявлению вин, сохранивших при выработке небольшое количество восстанавливающих сахаров.
Расположить серию белых сладких и ликерных вин в порядке содержания в них восстанавливающих сахаров.
Влияние кислотности. Расположить по классам образцы этих же вин в порядке значений общей кислотности, измененной раскислением или подкислением, например, винной кислотой. Пробуют красное вино, доведенное до 3,2; 4,0 и 4,8 г общей кислотности. Эти
расхождения постепенно сокращаются по мере того, как дегустатор повышает свою способность распознавать их. Это упражнение можно модифицировать путем добавления в различных дозах лимонной, молочной или янтарной кислот.
В рамках влияния кислотности можно также сравнивать вина до и после яблочно-молочного брожения.
Наконец, расположить по классам серию различных вин в порядке их общей кислотности. Точная классификация после простой дегустации не всегда удается, так как на кислый вкус воздействуют другие элементы, особенно в белых более или менее сладких винах.
Влияние уксусной кислоты. Сравнить вина, доведенные добавлением уксусной кислоты до различных содержаний летучих кислот, например 0,60; 0,75; 0,90 г/л. Внимание дегустатора должно быть сосредоточено на конечном вкусе, кисловатом, кислом и грубом, а не на различиях в запахе, которые значительны. Отметить также, что грубость уксусного привкуса отличается от грубости кислого вкуса и более неприятна.
Влияние полифенолов. Сравнить красные вина, имеющие различные концентрации фенольных соединений (их можно приготовить купажированием с терпкими прессовыми винами). Отмечают, что перманганатный показатель 3') соответствует мягкому вину, 40 — мужественному вину, 50 и выше — грубому вину. Констатировать, что дубильная грубость, которая сопровождается терпкостью, отлична от грубости кислой и грубости уксусной.
Сравнить два образца белого вина,
имеющие различные концентрации танинов, образовавшиеся естественным путем. Такие концентрации, усиленные в результате бочечной выдержки, обычно колеблются от нескольких миллиграммов до 300 мг/л. Танин в белых винах придает им грубость. Можно сравнить еще несколько образцов этого же вина с добавлением энотанина.
Влияние этилацетата. Сравнить вина, к которым добавлены различные дозы этилацетата таким образом, чтобы получить образцы с концентрациями 100, 150, 200 мг/л. В первом случае содержание является нормальным и не отражается на вкусе, 150 мг/л дают грубость, жесткость, 200 мг/л ощущаются уже обонянием и сообщают вину признаки уксусного скисания.
Сравнить специально отобранные красные вина, грубость которых объясняется сильной кислотностью или высоким содержанием фенольных соединений или же повышенным содержанием летучих веществ, или, наконец, высоким процентным содержанием этилацетата.
Влияние сернистого ангидрида. Сравнить образцы одних и тех же красных вин или одних и тех же белых сухих вин при различных концентрациях свободной сернистой кислоты: 0, 10, 20, 30 и 50 мг/л. Точно так же сравнить ликерные вина при 30, 60 и 90 мг/л свободной сернистой кислоты. При сильных дозах, даже если не принимать во внимание неприятный резкий запах, который дает сернистая кислота, она нейтрализует большую часть аромата свежего винограда, уничтожает тонкость и индивидуальные особенности.
Эти упражнения можно дополнить в аналогичном порядке изучением влияния различных солей (1 г/л хлористого натрия или сернокислого калия) или добавления различных солей, бутандиола-2,3, диацетила или любого другого компонента вина.
Упражнения по прикладной дегустации
Эти упражнения можно проводить двумя различными способами. Сначала дегустаторам предлагают образцы четырех или пяти вин с сильно различающимися характеристиками, известными только по номерам, и одновременно им дают перечень детально описанных характеристик этих же вин, составленный опытными дегустаторами, но без указаний, к какому вину относится каждая из них. Дегустатор должен опознать вина по этим признакам. В другой серии упражнений дегустаторам предлагают также группу вин, просят их дегустировать и дать их точное описание, используя возможно большее число эпитетов. При этом характеристики следует излагать каж-- дый раз в следующем порядке: сначала определение ароматов или букета, затем описание вкусовых ощущений (первое впечатление, эволюция, послевкусие. стойкость) и, наконец, заключение о всей совокупности качеств. При этом обучают дегустатора заполнению дегустационного листка и выставлению оценок.
ЛИТЕРАТУРА
Amerine М. А. (1948), The Wine Review, 16, 10.
Amerine M. A. (1948), Bull. О. I. V., 209, 75. A m e r i n e M. A. e t О ugh C. S. (1964), The sensory evaluation of California wines. Laboratory Practice, p. 172.
Amerine M. A.," Pangborn R. M., et Roessler E. B. (1965), Principles of sensory evaluation of food. Academic Press, New York.
Amerine M. A. et Roessler E. B. (1952), Proc. Amer. Soc. Enol., 3, 97.
Amerine M. A. et Roessler E. B. (1964), Sensory evaluation of wines. Wine Institute, San Francisco.
Amerine M. A.. Roessler E. B. et Filipe ilo F. (1959), Hilgardia, 28, 477.
Amerine M. A., Roessler E. B. et О ugh C. S. (1965), Amer. J. Enol. Vitic., 16, 29.
Andre P., C h a r n а у P. et V i о t R. (1963), Bull. I.N.A.O., 86, 1.
Baker G. A., Ough C. S. et Amerine M.A.
(1965), J. Food ScL, 1055.
Baker G. A., Ough C. S. et AmerineM. A.
(1966), Amer. J. Enol. Vitic., 17, 255.
Boidron J. N. (1966), Essais d’identification des constituants de l’arome des vins de V. vi- nifera. These 3 Cycle, Bordeaux.
В о u b a 1 s D., G a 1 z у P. et Marie R. (1959), Progr. agric., 80, 143.
В у e r A. J. et G г а у P. P. (1962), Wallersteih Labor. Comm., 25, 209.
Cabezudo D. et Llaguno C. (1972), Rev.' Agron. Technol. Alim., 12, 636.
Chama у P. (1966), Bull. O.I.V., 100, 1. ' Chauvet J. (1950), L’ardme des vins fins.
Macon.
Chauvet J. (1951), La degustation des vins/ Son mecanisme et ses lois. Macon.
Chauvet J. (1955), Bull. 1. N. A. O„ 54, 21. ' Chauvet J. (1956), La physico-chimie des surfaces et l’arome des vins fins. Cahiers techniques I. N. A. O.
Durand R. et Foulonneau C. (1972), Rapport a ITnstitut technique du Vin.
Got N. (1958), La degustation des vins. So- diep, 3е edition, Beziers.
Grav P. P. (1962), Wallerstein Labor. Comm., 25, "228.
I ns ti tut technique Du Vin. (1967), XIе col- loque sur la degustation. Vignes et Vins, ne special fevrier.
Kienk E. (1950), Die Weinbeurteilung. Ulmer ed., Stuttgart.
Lamb ion R. (1966), В. I. F. Bruxelles, 6, 38. Le Magnen J. (1949), Odeurs et parfums.
Presses Univers. France, Paris.
Le M a g n e n J. (1951), Les gouts et les sa- veurs. Presses Univers. France, Paris.
Le M a g n e n J. et al. (1962), Vocabulaire technique des caracteres organoleptiques et de la degustation des produits alimentaires. CNERMA—C.N.R.S., Paris.
Le Magnen J. (1965), Ann. Nutr. Alim., 19, 11.
L i 111 e A. D. (1958), Flavor research and food acceptance. Reinhold Pub., New York.
Lopes Vieira A. (1971), Prova de vinhos. Ed. Noticias, Lisbonne.
Marteau G. (1953), Progr. agric, vitic., 140, 281.
Methodes subjectives et objectives d’appreciation des caracteres organoleptiques des den- rees alimentaires, Journees scientifiques du Centre National de Coordination des etudes et recherches sur la nutrition et 1’alimenta- tion (nov. 1964). C.N.R.S., Paris, 1966.
Ohloff G. et Thomas A. F. (1971).Gustation and olfaction. Academic Press. Londres, New York.
О ugh C. S. (1963), J. Food. Sci„ 28, 101.
О u g h C. S. et Amer in e M. A. (1959), Amer. J. Enol. Vitic, 10, 17.
О u g h C. S. et Baker G. A. (1961), Hilgar- dia, 30, 587.
Paul F. (1964), Mitteilungen, 14, 197.
Paul F. (1970), Mitteilungen, 20, 112.
PeynaudE. (1965), Bull. Soc. Sci. Hyg. alim., 53, 249.
Poupon P. (1957), Pensees d’un dfegustateur. Beaune.
Poupon P. (1965), Le vocabulaire de la d6gu- station professionnelle (essais de rationalisation). Rev. Vin. intern., 122, 73.
Pul sals M. (1971), Rev. Fr. OEnologie, 43, 19.
Puisais J., Chabanon R. L., Guii-
e r A. et Lacoste J. (1969), Precis d’initiation a la degustation. Institut technique du Vin, Paris.
R i b e r e a u-G а у о n J. (1973), Conn. Vigne et Vin, n° 2.
R i b e r e a u-G а у о n P. (1971), Bull. 0.1.V.^ 483, 428.
Rives M. (1959). Ann. technol. agric., 10, 101. Sernagiotto E. (1971), Atti Accad. ital. Vite
Vino, 23, 123.
Terrier A. (1972), Les composes terpeniques dans l’ardme des raisins et des vins de certai- nes varietes de V. vinifera. These Doct. Ing., Bordeaux.
Vedel A. (1969), Concours internationaux des vins. Projet de notation. Document O.I.V.
V e d e 1 A., Ch a r 1 e G., CharnayP. e t To- urmeau J. (1972), Essai sur la ddgustatioti des vins. Soc. Ed. Inform, viti-vinicoles, Мй- con.
Часть вторая
СЫРЬЕ: ВИНОГРАД И ЕГО СОЗРЕВАНИЕ
Глава 3. ОПИСАНИЕ И СОСТАВ ВИНОГРАДА
ЭТАПЫ РАЗВИТИЯ ВИНОГРАДА
Виноград — это ягода. Она состоит из эпикарпия — кожицы, представляющей собой тонкую и эластичную пленку, мясистого и пронизанного волокнами мезокарпия, мякоти и эндокарпия, ткани, которая выстилает изнутри полости, содержащие семена, но не отличается от остальной мякоти.
На рис. 3.1 дано схематическое изображение строения зрелой ягоды винограда.
Для более удобного рассмотрения эволюции виноградной грозди целесообразно разделить ее на четыре доволь-
Рис. 3.1. Строение виноградной ягоды в состоянии физиологической зрелости:
/ — периферийные сосудистые пучки; 2— центральные сосудистые пучки; 3 — кисточка; 4 — плодоножка ягоды; 5 — подушечка; 6 — мякоть; 7 — кожица; 8 — семена.
но различных периода: рост зеленых’ частей, начало созревания ягод, созревание, перезревание.
Период зеленого роста длится от завязывания ягод до начала их созревания. Завязывание ягод происходит в результате оплодотворения цветков. Обычно не все цветки оплодотворяются и становятся ягодами. На хорошей грозди может быть несколько сот цветков, но число ягод будет менее ста. Такие потери неизбежны, поскольку поток растительных соков, вырабатываемых растением, недостаточен, чтобы обеспечить нормальное развитие всех ягод. Это явление происходит постоянно, и его не надо смешивать с осыпанием цветов и завязей.
Когда цветы не превращаются в ягоды, происходит их осыпание; причины его могут быть различными. Физиологическое осыпание является следствием плохого питания грозди. Плохое опыление чаще всего является результатом неблагоприятных условий погоды: обильные дожди в период цветения, которые мешают перелетам насекомых с одного цветка на другой; этот вид осыпания называют климатическим. В этом случае не происходит ни оплодотворения, ни завязывания ягод. Некоторые сорта больше подвержены осыпанию, чем другие, например сорт Мёрло в районе Бордо.
Когда цветок оплодотворен, рыльце его засыхает и на этом месте остается небольшой рубец, который у зрелой ягоды более или менее заметен на полюсе, противоположном подушечке, так называемый пупок. В то же время завязь начинает утолщаться и принимает сферическую, несколько удлиненную форму, внутри которой находится ягода.
Гроздь в этом случае является зеленым органом, содержащим хлорофилл. Гребень достигает своих окончательных размеров в то время, когда ягоды увеличиваются в объеме; однако они продолжают оставаться зелеными и твердой консистенции. Сахаристость еще мала: самое большее 20 г на 1 кг винограда. Происходит накопление кислот, которое достигает максимального значения тогда, когда начинается созревание ягод.
С началом созревания внешний вид и состав ягод резко изменяются. Эти изменения происходят сперва у одних, затем у других ягод и продолжаются обычно около двух недель, иногда больше, пока не охватят все грозди. Созревание как бы эшелонируется по времени в соответствии с таким же эшелонированием цветёния и оплодотворения. В годы, когда цветение и оплодотворение из-за неблагоприятных метеорологических условий запаздывают и происходят неравномерно, начало созревания, как впрочем и последующее наступление полной зрелости, затягивается на более длительный период. При созревании ягода, объем которой намного возрастает, приобретает некоторую полупрозрачность, становится более мягкой и эластичной, так как видоизменяются стенки клеток. Она теряет хлорофилл и окрашивается соответственно образованию пигментов. У белых сортов винограда ягоды желтеют, красные же сорта эволюционируют от светло-красных к более темным оттен-
кам. Мякоть быстро накапливает сахар, в то время как кислотность значительно понижается.
Под зрелостью понимают такое состояние ягод винограда, в котором его можно собирать; слово «созревание» означает весь комплекс явлений, приводящих виноград в состояние зрелости. В течение этого периода морфологические изменения ограничиваются постепенным одревеснением тканей гребня, тогда как ягода удваивает свой объем в результате роста вакуолей. Одновременно происходит полное изменение химического состава ягоды, с одной стороны, вследствие накопления веществ, поступающих из других органов растения и в результате превращения составных частей, которые там уже находятся. В винограде не происходит или происходит в очень малых масштабах явление фотосинтеза, несмотря на присутствие небольшого количества хлорофилла, который можно извлечь из кожицы посредством эфира.
Развитие ягод происходит быстро я продолжается до вступления в состояние зрелости. Оно протекает неравномерно и зависит главным образом от метеорологических условий и режима дождей. Возрастание массы ягод с середины периода созревания до зрелости может колебаться от 25 до 80% в зависимости от года и от виноградника. Резкое увеличение объема зрелых ягод наблюдается тогда, когда после сухого периода Начинают выпадать обильные дожди; с приближением зрелости чрезмерный тургор часто может вызвать разрывы кожицы и растрескивание ягод; это одна из основных причин развития гнили в дождливое время.
Увеличение объема ягод сопровождается возрастанием их . массы; при этом, разумеется, надо учитывать тог факт, что в последний период созревания плотность ягоды повышается
вследствие накопления сахаров. Точные наблюдения, сделанные на одних и тех же кустах одних и тех же виноградников, показывают, что средняя масса ягоды может сильно колебаться в зависимости от года; возможны отклонения в ту или иную сторону на
Форма, размеры и окраска ягоды являются характеристиками данного сорта, но они могут изменяться в зависимости от многих факторов, и в частности климата, характера почвы, состояния растения, числа семян и др. У сортов для тонких вин обычно мелкие ягоды, и их масса не превышает 1 г на одну ягоду (2 г для сорта Мальбек).
У винных сортов форма ягод чаще всего сферическая, иногда чуть удлиненная. По цвету виноград делят на три категории: белый, красный и черный. В действительности гамма окраски имеет постепенные переходы, и поэтому переход от одной категории к другой происходит незаметно. Окраска начинает проявляться с началом созревания, но максимальной интенсивности она достигает лишь при полной зрелости . Содержание антоцианов колеблется в зависимости от года в значительных пределах, вследствие этого вина могут быть более или менее окрашенными. Синтез антоцианов труден и требует довольно большого количества теплых и солнечных дней. И не случайно, что в северных винодельческих районах в основном культивируют белые сорта.
Нужно различать физиологическую зрелость семян, которая соответствует их способности к. прорастанию, и зрелость мякоти, или техническую зрелость, которую можно определить как наиболее подходящий момент для сбо-
ра винограда, когда содержание сахара в нем более не возрастает. Оба типа зрелости не всегда совпадают. Для поздних сортов зрелые семена получаются задолго до сбора урожая, и семена даже начинают отдавать вещества в мякоть, которая их окружает. И наоборот, у столовых сортов очень раннего созревания мякоть созревает быстрее и семена утрачивают способность к прорастанию, так как с наступлением зрелости плода прекращается приток веществ, необходимых для их полного развития.
В некоторых случаях следует также рассматривать и четвертую фазу — перезревание, когда виноград оставляют на кусте после достижения физиологической зрелости. Полагают, что в течение этого периода ягода практически не получает больше ничего от растения. Особенно интенсивно в это время увеличение концентрации сухих веществ в результате испарения воды, тогда как одновременно протекают процессы дыхательного горения. Во- многих районах тонких вин, расположенных у границы культуры винограда, вина лучших марок можно получать только благодаря определенной выдержке уже созревшего винограда на кустах. Состояние перезрелости можно также получить искусственно, после сбора винограда, применяя способ увяливания винограда. Наконец, надо- иметь в виду случай благородной гнили, когда превращения, происходящие в состоянии зрелости, дополняются путем сложных процессов под воздействием Botrytis cinerea.
Время зрелости сорта является одной из его характеристик; на него оказывают влияние многие факторы: климат района, погодные условия года, освещенность, природа почв и плодородие участка, система ведения кустов, сорт подвоя, возраст лоз и др.
В районе Бордо средняя дата сере-
дины цветения (момент, когда распустились 50% цветков), по данным за последние двадцать лет, определяется для красных сортов Каберне и Мерло 10 июня. Середина периода созревания (момент, когда 50% ягод стали мягкими и изменили окраску) относится к 18 августа, т. е. на 69 дней позднее. Наконец, полная зрелость, также в среднем, наступает 4 октября, т. е. через 47 дней после середины созревания и 116 дней после середины периода цветения.
СОСТАВ И ФОРМА ГРОЗДИ
Виноградная гроздь состоит из двух совершенно различных частей: гребня, который представляет ее остов, и плода в собственном смысле слова, т. е. виноградной ягоды. Гребень также называют в некоторых районах теркой или древесиной грозди или просто «кистью», в результате чего появились термины эрафляж, дерапаж, эграпаж, обозначающие процесс отделения ягод от гребней механическим путем.
Гребень развивается из соцветия в узле побега; эта часть называется плодоножкой грозди. Ножкой ягоды называют маленькие плодоножки ягод. Длина плодоножки, как и строение грозди, могут сильно различаться в зависимости от сорта. Форма, характерная для грозди данного сорта, зависит от формы вторичных разветвлений, заканчивающихся плодоножками ягод; например, гроздь имеет коническую форму, когда ветви все более укорачиваются и все менее и менее разветвлены по мере их удаления от основания грозди к ее оконечности; если же ответвления грозди одинаковой длины, ее называют цилиндрической.
■ Гребень достигает своих окончательных размеров в период созревания. Хотя он и теряет хлорофилл, но остается зеленым и тогда, когда виноград
становится зрелым. Однако у некоторых сортов (Мальбек) гребень окрашивается. Плодоножка вызревает одновременно с побегом; она огрубевает, и это затрудняет отделение грозди от побега.
Ягоды соединяются с ножкой. В месте соединения находится утолщение, или подушечка. Строение грозди зависит от длины плодоножек. Если они длинные и тонкие, ягоды удалены одна от другой; такие грозди называют рыхлыми. У других сортов, наоборот, птодоножки остаются короткими; в этом случае грозди делаются плотными, ягбды плотно прижимаются одна к другой, сплющиваются. Рыхлые грозди хорошо подходят для столовых сортов; у винных сортов чаще всего встречаются грозди с плотно сжатыми ягодами.
Когда нет осыпания или горошения ягод, масса гребня составляет от 3 до 7% от массы зрелой грозди, мякоть — от 75 до 85% от массы ягод, кожица — от 15 до 20%, семена — от 3 до 6%.
Таблица 3.1
Состав виноградной ягоды
Сорт винограда
Средняя масса,
Содержание, %
мякоти
КОЖИЦЫ
семян
Каберне Совиньон
1,32
74,4
19,8
5,8
Мерло
1,62
78,8
16,4
4,8
Совиньон
1,60
82,9
14,2
2,9
Семильон
1,83
76,0
21,0
3,0
В табл. 3.1 приведены некоторые сведения относительно состава виноградной ягоды. При подготовке этих данных кожицу отделяли путем прессования с последующей промывкой.
СОСТАВ ГРЕБНЯ
Химический состав гребня сходен с составом листьев и усиков. В нем мало
Сорт виноградаI55 i «5g о “Содержание кислот (в мг-экв на 1000 г массы гребня)ОS SиСодержание кислот (в мг-э.кв на 1000 г массы гребня)ЯSS •иh"о s■ооО1Совиньон6,84,0888102190948061805,4Семнльон5,94,3058104162868051716,8Каберне Совиньон8,14,526713820562981017012,0Мерло5,34,457311018329150418315,2Сорт виноградаI55 i «5g о “Содержание кислот (в мг-экв на 1000 г массы гребня)ОS SиСодержание кислот (в мг-э.кв на 1000 г массы гребня)ЯSS •иh"о s■ооО1Совиньон6,84,0888102190948061805,4Семнльон5,94,3058104162868051716,8Каберне Совиньон8,14,526713820562981017012,0Мерло5,34,457311018329150418315,2Химический состав гребняХимический состав гребня
Сорт винограда
I55 i «
5g о “
Содержание кислот (в мг-экв на 1000 г массы гребня)
О
S S
и
Содержание кислот (в мг-э.кв на 1000 г массы гребня)
Я
S
S •
и
h"
о s
■о
о
О
1
Совиньон
6,8
4,08
88
102
190
94
80
6
180
5,4
Семнльон
5,9
4,30
58
104
162
86
80
5
171
6,8
Каберне Совиньон
8,1
4,52
67
138
205
62
98
10
170
12,0
Мерло
5,3
4,45
73
110
183
29
150
4
183
15,2
Сорт винограда
I55 i «
5g о “
Содержание кислот (в мг-экв на 1000 г массы гребня)
О
S S
и
Содержание кислот (в мг-э.кв на 1000 г массы гребня)
Я
S
S •
и
h"
о s
■о
о
О
1
Совиньон
6,8
4,08
88
102
190
94
80
6
180
5,4
Семнльон
5,9
4,30
58
104
162
86
80
5
171
6,8
Каберне Совиньон
8,1
4,52
67
138
205
62
98
10
170
12,0
Мерло
5,3
4,45
73
110
183
29
150
4
183
15,2
Химический состав гребня
Химический состав гребня
сахаров, кислоты содержатся в виде солей, поскольку в нем в изобилии находятся минеральные вещества; клеточный сок гребня имеет pH больше 4; в гребне содержится много полифенолов. Вопреки широко распространенному мнению, мацерация гребней при переработке винограда красных сортов без гребнеотделения не влечет за собой повышения кислотности вина, а понижает ее при одновременном значительном повышении pH. В табл. 3.2 приведены данные о химическом составе гребней для четырех бордоских сортов, культивируемых в одной и той же зоне.
Содержание сахара в гребне не превышает 10 г/кг. Зольный остаток составляет от 5 до 6% от сухой массы гребней; он состоит наполовину из солей калия. ,
Гребни, особенно у красных сортов, богаты фенольными соединениями; добавление гребней в виноград значительно повышает показатель полифенолов у красных вин. Маскелье извлек из гребней белых сортов винограда лейкоцианидин, который является их главным полифенольным компонентом. Присутствие лейкоцианидина в красных винах было доказано П. Риберо- Гайоном (1959), который констатировал, что внесение гребней в мезгу по
вышает общее содержание лейкоцианидина в вине примерно на одну треть.
Известно, что лейкоантоцианы являются наиболее частыми компонентами конденсированных танинов. Они составляют, во всяком случае, самую большую часть того вещества, которое называют энотанином. Поскольку антоцианы представляют собой более или менее полимеризованные молекулы, и их терпкий вкус связан с этим состоянием полимеризации, можно видеть важную роль, которую они могут играть в образовании вкуса вина.
Для ряда сортов района Юг-Ланге- док Бурзэкс и сотрудники (1972) дали следующее среднее распределение фенольных соединений в гребнях: при массе, составляющей 4,5 % от общей массы грозди, гребни содержат 20% фенольных соединений, 15% танидных веществ, 26% лейкоантоцианов, 15% катехинов, 16% галловой кислоты, 9% кофейной кислоты, содержащихся в винограде.
СОСТАВ СЕМЯН
Виноградная ягода нормально должна иметь четыре семени, развившиеся из яйцеклеток, которые существуют- в семяпочке, но почти всегда их бывает меньше: три, два или чаще всего
Сорт винограда3о 8Масса 100 ягод, гВосстанавливающие сахара, г на 1 л сокаКислотность, мг-экв на 1 кг ягод123412341234Мальбек1,59188245296296188178175166909090115Мерло2,011071381681872051891831771171069191Каберне Совиньон1,4294120155—216,211212868468-—Каберне фран1,9810414416418720218918318076767470Мюскадель1,54159204250—202196188707068Семильон2,1412516119423416817217217565615158Совиньон .1,42145176■201—2182082019699121Мерло белый2,48121157194226180#17517016169656260Сорт винограда3о 8Масса 100 ягод, гВосстанавливающие сахара, г на 1 л сокаКислотность, мг-экв на 1 кг ягод123412341234Мальбек1,59188245296296188178175166909090115Мерло2,011071381681872051891831771171069191Каберне Совиньон1,4294120155—216,211212868468-—Каберне фран1,9810414416418720218918318076767470Мюскадель1,54159204250—202196188707068Семильон2,1412516119423416817217217565615158Совиньон .1,42145176■201—2182082019699121Мерло белый2,48121157194226180#17517016169656260Связь между числом семян и составом винограда (урожай 1970 г.)Связь между числом семян и составом винограда (урожай 1970 г.)Примечание. Цифры 1, 2, 3, 4 означают число семян.Примечание. Цифры 1, 2, 3, 4 означают число семян.25—45 34—36 13—20 4—6 4—6,52—4125—45 34—36 13—20 4—6 4—6,52—41
Сорт винограда
3
о 8
Масса 100 ягод, г
Восстанавливающие сахара, г на 1 л сока
Кислотность, мг-экв на 1 кг ягод
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
Мальбек
1,59
188
245
296
296
188
178
175
166
90
90
90
115
Мерло
2,01
107
138
168
187
205
189
183
177
117
106
91
91
Каберне Совиньон
1,42
94
120
155
—
216,
211
212
86
84
68
-—
Каберне фран
1,98
104
144
164
187
202
189
183
180
76
76
74
70
Мюскадель
1,54
159
204
250
—
202
196
188
70
70
68
Семильон
2,14
125
161
194
234
168
172
172
175
65
61
51
58
Совиньон .
1,42
145
176
■201
—
218
208
201
96
99
121
Мерло белый
2,48
121
157
194
226
180
#
175
170
161
69
65
62
60
Сорт винограда
3
о 8
Масса 100 ягод, г
Восстанавливающие сахара, г на 1 л сока
Кислотность, мг-экв на 1 кг ягод
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
Мальбек
1,59
188
245
296
296
188
178
175
166
90
90
90
115
Мерло
2,01
107
138
168
187
205
189
183
177
117
106
91
91
Каберне Совиньон
1,42
94
120
155
—
216,
211
212
86
84
68
-—
Каберне фран
1,98
104
144
164
187
202
189
183
180
76
76
74
70
Мюскадель
1,54
159
204
250
—
202
196
188
70
70
68
Семильон
2,14
125
161
194
234
168
172
172
175
65
61
51
58
Совиньон .
1,42
145
176
■201
—
218
208
201
96
99
121
Мерло белый
2,48
121
157
194
226
180
#
175
170
161
69
65
62
60
Связь между числом семян и составом винограда (урожай 1970 г.)
Связь между числом семян и составом винограда (урожай 1970 г.)
Примечание. Цифры 1, 2, 3, 4 означают число семян.
Примечание. Цифры 1, 2, 3, 4 означают число семян.
25—45 34—36 13—20 4—6 4—6,5
2—4
1
25—45 34—36 13—20 4—6 4—6,5
2—4
1
одно из-за отсутствия или неоплодотво- .рения одной,или нескольких зародышевых клеток.
Кроме того, иногда происходит неправильное оплодотворение, в ягодах не образуется семян или они бывают недоразвитыми, с пустотой внутри. В этом случае ягоды не увеличиваются в размерах и остаются очень мелкими, хотя они и сохраняют способность созревать и в конечном счете имеют более высокое содержание сахара. Это горошение ягод, которое при распространении в широких масштабах вызывает большое снижение урожая; такие атрофированные ягоды называют пар- тенокарпическими. Бессемянность, т. е. ютсутствие семян может, с другой стороны, быть положительным признаком у столовых сортов винограда или у сортов, предназначенных для сушки.
Развитие семян оказывает воздействие на величину и состав плода. Масса ягоды, содержание сахара, иногда состав в ней кислот находятся в определенной связи с числом семян (Пей- но и сотрудники, 1970 ). Табл. 3.3 показывает связь между числом семян и 64
составом ягод для некоторых сортов района Бордо.
Выше было показано, что масса семян составляет от 3 до 6% массы виноградной ягоды. Их состав (в %) выражается следующим образом:
Вода
Углеводы
Масла
Танин
Вещества, содержащие азот
Минеральные вещества
Жирные кислоты
Каждое семя состоит из жировой косточки (эндосперм), которую окружает деревянистый кокон, покрытый тонкой таниновой кутикулой. Хорошо известно, что семена содержат много танина и лейкоантоцианов (П. Риберо- Гайон, 1959).
Бурзэйкс и сотрудники (1972) дали оценку фенольных соединений семян. В зависимости от сорта семена содержат от 22 до 56% общих полифенолов винограда, от 28 до 56% лейкоантоцианов, от 67 до 86% катехинов и значительную часть талловой и кофейной
кислот, содержащихся в виноградной грозди.
Некоторые из веществ, содержащихся в кутикуле семени, — фенольные соединения, вещества, содержащие азот, фосфаты, частично подвергаются растворению в процессе виноделия по красному. И наоборот, другие вещества, находящиеся внутри семени, в частности масла, оказывали бы вредное влияние на качество вина, если бы они проникали в сусло. По этой причине следует тщательно следить за тем, чтобы во время дробления и прессования не происходило раздавливание семян. Семя богато маслом; его можно извлекать из семян, измельченных в порошок с помощью растворителей (0,5 л мас- лг1 на 1 гл вина).
Установлено, что когда семя достигает физиологической зрелости, оно начинает отдавать азот в мякоть внутри самой ягоды. Оно может, таким образом, терять в виде катионов аммония до одной пятой своего азота и все же оставаться наиболее богатым по содержанию азота, чем другие твердые части грозди. Л
СОСТАВ кожицы
Кожица состоит из эпидермиса и нескольких слоев нижележащих клеток. Это та часть, которая остается при раздавливании виноградной ягоды. Она не имеет точной границы; у нее нет морфологического определения.
Масса кожицы составляет от 6 до 9% массы ягоды. Разрезали ягоду винограда и с помощью пинцета удаляли из каждой доли ее содержимое, затем внутреннюю поверхность кожицы очищали, пока не показывалось окрашенное вещество. Тем самым они удаляли камбиальный слой, который остается - . кожице при экстрагировании мяко- ■ зо время прессования, как это, на" имер, делается при производстве ви
на по белому способу. Данные табл. 3.1, полученные при прессовании и промывании кожицы, хорошо согласуются с данными практики. Кожица играет важную роль в энологии. Состав красного вина зависит не только от мякоти, в его образовании участвуют различные части винограда и особенно кожица ягод. Тип вина точно определяется способом использования различных частей винограда при приготовлении вина.
В кожице насчитывают от шести до десяти слоев камбиальных клеток. Чем ближе они к поверхности ягоды, тем мельче клетки и тем толще их стенки; они имеют вытянутую форму и развиваются, плотно зажатые между мякотью набухающей изнутри и растягивающимся под ее давлением эпидермисом. В глубине клетки больше по размерам, их стенки тоньше.
В результате разреза виноградной ягоды установлено, что нельзя провести четкой границы между кожицей и мякотью; переход от одной к другой происходит постепенно. От толщины стенок клеток, из которых состоят кожица и мякоть, зависит консистенция виноградной ягоды. Обычно у сортов столового винограда ягоды с тонкой кожей, хрустящие и мясистые, у ягод винных сортов, наоборот, кожица жесткая, мякоть сочная (рис. 3.2).
Эпидермис состоит из одного слоя клеток правильной формы. Бем (1972) наблюдал с помощью электронного микроскопа присутствие устьиц в количестве от 25 до 40 на одну ягоду; вокруг каждого устьица образуется ореол из отмершей или отмирающей ткани, ограниченный трещиной, которую Botry- tis cinerea может использовать для проникновения внутрь ягоды.
Толщина эпидермиса изменяется в зависимости от сорта; у сортов Витис винифера она составляет от 1,5 до 3,8 мкм и от 4 до 10 мкм у американ-
слева — сорт с мясистой мякотью и нежной кожицей; справа — сорт с сочной мякотью и жесткой кожицей.слева — сорт с мясистой мякотью и нежной кожицей; справа — сорт с сочной мякотью и жесткой кожицей.Рис. 3.3. Внешний вит пруина винограда Султана под электронным микроскопом (увеличение около 4500), по Радлеру (1965).Рис. 3.3. Внешний вит пруина винограда Султана под электронным микроскопом (увеличение около 4500), по Радлеру (1965).
слева — сорт с мясистой мякотью и нежной кожицей; справа — сорт с сочной мякотью и жесткой кожицей.
слева — сорт с мясистой мякотью и нежной кожицей; справа — сорт с сочной мякотью и жесткой кожицей.
Рис. 3.3. Внешний вит пруина винограда Султана под электронным микроскопом (увеличение около 4500), по Радлеру (1965).
Рис. 3.3. Внешний вит пруина винограда Султана под электронным микроскопом (увеличение около 4500), по Радлеру (1965).
ских сортов. Эпидермис покрыт пленкой особой ткани, кутикулой, напоминающей очень тонкий лак, который можно отделить, обрабатывая ягоду едким кали. Кроме того, снаружи ягода всегда покрыта налетом пруина, веществом, в состав которого входит воск, придающий ягоде бархатистый вид и особую окраску. Под электронным микроскопом пруин представляется в виде мелких чешуек, перекрывающих
Рис. 3.2. Схематический разрез кожицы виноградной ягоды:
друг друга (рис. 3.3). По данным Рад- лера (1970), пруин состоит из 2/з олеа- ноловой кислоты и '/з различных соединений (спирты, сложные эфиры, жирные кислоты, альдегиды). Кутикулярный воск делает кожицу несмачиваё- мой; он предотвращает испарение воды. Проницаемость эпидермиса для водяных паров можно измерить электрическими приборами (Мург и сотрудники, 1971); она возрастает в период созревания.
Воск кутикулы может играть известную роль при приготовлении вина; Брешо и сотрудники (1971) доказали,, что рост дрожжей в анаэробиозе ускоряется экстрактами виноградного воска и олеаноловой кислотой.
Если эпидермис поврежден болезнями (например, оидиумом), клетки становятся неэластичными, нерастяжимы- ми, ягода, увеличиваясь в объеме, рвет ею и кожица растрескивается.
В табл. 3.4 приведен химический состав кожицы зрелой ягоды для четырех сортов винограда.
Кожица содержит небольшое количество сахаров, которое может сильно' изменяться; в кожице, взятой от 1000 ягод, обнаружили от 0,7 до 3,0 г сахаров, тогда как в мякоти их было' от 140 до 175 г. Кожица богата целлюлозой (*/t или Vs часть массы сухого' вещества), нерастворимыми пектинами, белками (от 10 до 15%).
Яблочная кислота находится в кожице зеленых ягод; она исчезает во время созревания. В то же время в кожице мало винной кислоты, но преобладает лимонная кислота.
В зрелой мякоти кислоты в виде солей составляют */з или VU и, наоборот, в гребне и в кожице всегда намного1 больше кислот в виде солей, чем в свободном состоянии, что выражается в. явно более высоких pH экстрагированных из них соков, чем у сусла.
Кожица, так же как и гребень, бога-
Сорт винограда
5^
0 о К
X
Содержание кислот (в мг-экв. на 1000 г кожицы)
о
Содержание кислот (в мг-экв на 1000 г кожицы)
3
5
О
С
о о
£ ®
i«
О S
S
Совиньон
14,0
4,15
9/
148
242
99
132
9
240
2,6
Семнльон
21,0
4,30
67
116
183
64
ПО
3
177
3,4
Каберне Совиньон
19,6
4,05
8(
90
170
79
75
4
158
6.8
Мерло
16,2
3,79
5^
65
120
80
40
3
123
6,4
та полифенолами; красные сорта винограда в 2 раза богаче ими, чем белые сорта. Наиболее характерны для кожицы желтые и красные пигменты и ароматические вещества. Другие пигменты (хлорофилл, ксантофилл, каротиноиды), которые содержатся в значительных количествах в зеленых ягодах, к наступлению зрелости почти полностью исчезают.
Окраска начинает появляться в период созревания и достигает максимума в состоянии полной зрелости. Антоцианы локализованы в кожице; обычно они занимают 3 или 4 слоя клеток под эпидермисом, иногда больше (в го ды сильной окраски); если раздавить ягоду пальцем, то последние капли бывают окрашены. Мякоть целиком так-^ же может иметь, как исключение, окрашенный сок (сорта-красители, некоторые американские сорта и некоторые гибриды —■ прямые производители). У сорта Аликант-Буше 22% антоцианов находятся в мякоти.
Основным флавоновым компонентом является изокверцитрин (Маскелье и Пуэн, 1954) или глюкозид кверцетина, находящийся в эпидермисе как белых, так и красных сортов. Несомненно, имеются и другие флавоновые производные, но в меньших количествах и еще неидентифицированные.
Распределение антоцианов было исследовано П. Риберо-Гайоном (1959), который выделил и идентифицировал различные пигменты основных видов Vitis (табл. 3.5 дает пример для двух видов). В результате этой работы установлено, что в винограде существует большое число антоцианов (17 в случае Vitis lincecumii) и с этой точки зрения все виды различны. Цвет винограда и природа антоцианов, которые его образуют, подчиняются при скрещивании сортов обычным законам наследственности. Так как характеристики американских видов являются доминирующими, скрещивание Vitis vini- fera с Vitis riparia (или Vitis rupestris) дает популяцию гибридов (Н), которые все имеют то же красящее вещество, как и Vitis riparia (или Vitisrupestris). Но если произвести повторное скрещивание одного из этих гибридов с Vitis vinifera, характеристика этого вида, являющегося рецессивным, может появиться снова и тогда получают новую популяцию (Н2), в которой 50% сортов относится к типу Vitis vinifera и 50% —к типу Vitis riparia (или Vitis rupestris).
На этом принципе основан метод дифференциации вин (винифера и гибридных) по природе их антоцианов (П. Риберо-Гайон, 1959). В кожице
Состав антоцианов в кожице виноградных ягод, % (по данным П, Риберо-Гайона и
Сюдро, 1957)
Компоненты
Сорта винограда
Vltls riparia
Vltis vinlfera
Глюкозиды цианндина Мойо-
2
3
Чи-
5
0
Глюкозиды леонидина Моно-
0
15
Ди-
2
0.
Глюкозиды дельфинидина
Моно-
14
12
Ди-
12
0
Глюкозиды петунидина Моно-
10
12
Ди-
17
0
Глюкозиды мальвидина Моно-
6
35
Ди-
21
0
Общее количество анто-
14
9
цианов
ягод были найдены и другие фенольные вещества — это коричные кислоты (кофейная, феруловая) в свободной или связанной форме.
Бурзэйкс и сотрудники (1972) считают, что в кожице содержится от 12 до 61% общих полифенолов ягоды в зависимости от сортов, от 14 до 50% дубильных веществ, от 17 до 47% лейко- антоцианов и почти все количество антоцианов, находящихся в красных сортах винограда.
СТРУКТУРА И СОСТАВ мякоти
Мякоть представляет собой наиболее важную часть ягоды. Она образуется из больших клеток, имеющих типичную структуру взрослых растительных клеток. Вдоль тонкой целлюлозо-пек- тиновой перегородки лежит тонкий слой цитоплазмы с ядром. Все внутреннее пространство клетки занято вакуо- лярным соком, который образует сусло. Целлюлозо-пектиновые мембраны
смежных клеток не прилегают одна к другой на всем протяжении; на гранях клеток остаются небольшие, межклеточные пространства (меаты), через которые происходит газообмен с внешней средой.
В мякоти различают несколько зон, отличающихся строением клеток. Клетки, находящиеся ближе к кожице, имеют удлиненную форму; они расположены в радиальном направлении и имеют тонкие перегородки, которые подвергаются застудневанию во время созревания, тогда как внутренние клетки, удлиненные в том же направлений, имеют неправильную форму и обладают более толстыми, незастудневающими мембранами. Клетки эндокарпия, который охватывает семена, расположенные также радиально, сливаются с мякотью.
Число слоев клеток, образующих ягоду, включая эпидермис и эндокарпий, равно 25—30, так же как и в завязи. Ягоды растут в результате увеличения объема клеток, а не путем их деления.
Плод питается посредством сосудисто-волокнистых пучков, которые идут через стебель, плодоножку грозди, плодоножку ягоды, кисточку. Через них виноградные ягоды получают углеводы из листьев и минеральные вещества из корней.
Система питания ягоды схематически остается такой же, как и у завязи. От центра подушечки в ягоду входят 10—12 сосудистых пучков, расходящихся в мякоти ягоды. Это те пучки, которые при срывании ягоды остаются в центре подушечки и образуют кисточку. Два из них, которые называют ак- сильными или осевыми пучками, имеют наибольшую толщину и проходят через всю ягоду до конца; от них ответвляются четыре сосуда, которые охватывают и питают семена. От восьми до десяти сосудов ответвляются в первой зоне при входе в мякоть наподобие мериди-
Сорт виноградаСодержание мякоти, %pHСодержание (в мг-экв на 1000 г мякоти)Сумма катионовСодержание кислот (в мг-экв на Ю00 г мякоти)Сумма анионовсахаровсвобод- кислоткислот в соляхвиннойяб юч -лимоннойСорт виноградаСодержание мякоти, %pHСодержание (в мг-экв на 1000 г мякоти)Сумма катионовСодержание кислот (в мг-экв на Ю00 г мякоти)Сумма анионовсахаровсвобод- кислоткислот в соляхвиннойяб юч -лимоннойСовиньон82,33,3021912343,816790792,5171Семиаьон76,03,3817910949,315869842,3156Каберне Совиньон74,63,2021210743,615154912,9148Мерле79,03,222209858,615757721,8131Совиньон82,33,3021912343,816790792,5171Семиаьон76,03,3817910949,315869842,3156Каберне Совиньон74,63,2021210743,615154912,9148Мерле79,03,222209858,615757721,8131
Сорт винограда
Содержание мякоти, %
pH
Содержание (в мг-экв на 1000 г мякоти)
Сумма катионов
Содержание кислот (в мг-экв на Ю00 г мякоти)
Сумма анионов
сахаров
свобод- кислот
кислот в солях
винной
яб юч -
лимонной
Сорт винограда
Содержание мякоти, %
pH
Содержание (в мг-экв на 1000 г мякоти)
Сумма катионов
Содержание кислот (в мг-экв на Ю00 г мякоти)
Сумма анионов
сахаров
свобод- кислот
кислот в солях
винной
яб юч -
лимонной
Совиньон
82,3
3,30
219
123
43,8
167
90
79
2,5
171
Семиаьон
76,0
3,38
179
109
49,3
158
69
84
2,3
156
Каберне Совиньон
74,6
3,20
212
107
43,6
151
54
91
2,9
148
Мерле
79,0
3,22
220
98
58,6
157
57
72
1,8
131
Совиньон
82,3
3,30
219
123
43,8
167
90
79
2,5
171
Семиаьон
76,0
3,38
179
109
49,3
158
69
84
2,3
156
Каберне Совиньон
74,6
3,20
212
107
43,6
151
54
91
2,9
148
Мерле
79,0
3,22
220
98
58,6
157
57
72
1,8
131
анов; это периферийные пучки; они в свою очередь также разветвляются и делятся; в поперечном разрезе можно различить от 30 до 40 таких сосудов. Они снова соединяются и образуют осевые пучки под зонтиком. У некоторых белых сортов в состоянии зрелости сеть периферийных проводящих пучков можно видеть через прозрачную кожицу, она слегка окрашена в зеленый цвет.
По достижении полной зрелости мякоть составляет от 75 до 85% общей массы ягоды. Она состоит почти исключительно из вакуолярного сока своих больших клеток, т. е. сусла. Твердые частицы, состоящие из остатков очень тонких целлюлозных перегородок и очень тонких сосудисто-волокнистых пучков и образующие мутный осадок, едва достигают 0,5% массы мякоти, вследствие чего на практике не делают различия между составом мякоти и составом сусла.
Сусло представляет собой мутную жидкость, обычно слабо окрашенную; цвет от темно-зеленоватого до желтозолотистого для белых сортов, часто слегка подкрашенный в более темные тона для красных сортов. Его плотность колеблется в зависимости от содержания сахаров, например от 1065 до 1110 или больше для перезревшего винограда.
В табл. 3.6 приведены данные о химическом составе мякоти для четырех сортов.
Сахара
Виноградный сахар состоит из глюкозы и фруктозы. С началом созревания в ягоде содержится в два раза больше глюкозы, чем фруктозы; в состоянии зрелости оба эти сахара находятся в примерно равных количествах, но уже всегда с преобладанием фруктозы; среднее значение отношения глю- коза/фруктоза равно 0,92. Крахмал находится только в зеленых виноградных ягодах.
Сахароза, обнаруживаемая путем хроматографии на бумаге, присутствует в зеленом или зрелом винограде только в виде следов (от 1 до 3 г/л). Она гидролизуется в восстанавливающие сахара во время миграции из листа в ягоду.
Содержание восстанавливающих сахаров в винограде нормальной зрелости обычно колеблется от 150 до 250 г/л. В некоторых исключительных случаях при особо хорошей освещенности в сус- лах специальных сортов (Мускат, Гренаш) оно доходит до 300 г/л. Сусла из' винограда, пораженного благородной гнилью, могут иметь еще более высо-
10,653 ’10,653 ’
1
0,653 ’
1
0,653 ’
кое содержание восстанавливающих сахаров.
Выше было показано, что ягоды одной и той же грозди имеют неодинаковую сахаристость. Это легко обнаружить с помощью ручного рефрактометра, который обеспечивает измерения в одной капле жидкости и позволяет оперировать на одной ягоде. Если таким путем проверить сахаристость различных ягод большой грозди, то видно, что чем ближе ягоды к побегу, тем больше в них сахара; они первыми получают питательные соки.
Было также показано, что сахара распределены в ягоде неравномерно. Если ягоду разрезать пополам, полусфера, противоположная плодоножке, будет богаче сахарами, чем другая. С другой стороны, если мякоть зрелой ягоды разделить на три концентрические части, одну — около кожицы, другую — вокруг семян и третью — промежуточную, то эта, последняя, оказывается наиболее сахаристой; в ней было найдено 187 г сахара, 180 г в слое под кожицей и только 166 г в центральной зоне.
С точки зрения технологии такая гетерогенность ягоды ведет к тому, что при виноделии по белому сусло-самотек отличается по своему составу от прессового сусла. Самотек часто имеет более высокую сахаристость, чем сусло, полученное при прессовании. Для винограда с благородной гнилью этот процесс имеет обратный характер, что часто отмечают на практике.
Органические кислоты
Кислотность сусла следует считать таким же важным энологическим фактором, как и содержание сахаров. Она может колебаться в зависимости от сорта, климата, года, т. е. в зависимости от состояния зрелости, от 3 до
г/л в пересчете на серную кислоту , иногда больше.
Кислотность зрелого винограда образуется главным образом за счет трех кислот: винной, яблочной и лимонной. Пропорция других кислот, которые могут присутствовать в винограде, относительно мала, но число их велико. Это кислоты аскорбиновая, а-кетоглутаро- вая, фумаровая, галактуроновая, глицериновая, гликолевая, гликуроновая, глиоксиловая, миндальная, щавелевая, щавелевоуксусная, пировиноградная, хинная, шикимовая.
Винная, яблочная и лимонная кислоты находятся во всех органах винограда. Их источником являются дыхательные процессы в зеленых частях растения, но они существуют также и в корнях; в частности, в них обильно представлена лимонная кислота. Они находятся во всех органах в свободном виде и в составе солей, образуемых основаниями, которые извлекаются из почвы. Именно эти минеральные вещества, необходимые для роста, мигрируют в растение в виде солей.
Концентрация свободных кислот возрастает от периферии к центру ягоды. В трех указанных выше зонах в одном случае обнаружили кислотность 3 г/л около кожицы, 5,7 в промежуточной зоне и 8,8 г/л около семян. Когда виноград еще зеленый, наблюдается обратное соотношение. Винная и яблочная кислоты распределяются таким же образом; лимонную кислоту извлечь труднее, так как она находится в частицах, связанных с клеточными перегородками. Известно, что кислоты и основания распределены в тканях ягоды в точно таких же концентрациях, но в обратном порядке. В результате происходит то, что сусло, получаемое при прессо-
вании, бывает перенасыщено битартратом калия и дает кристаллический осадок в виде винного камня. Такая гетерогенность позволяет при прессовании по шампанскому способу реализовать селективную экстракцию кислот в свободном состоянии и в составе солей, на чем основаны особые качества и состав шампанских вин.
Минеральные вещества
Минеральные вещества различных частей грозди и мякоти винограда те же, как и в других его частях. Главным из них является калий, составляющий 50% минеральных веществ зольного остатка. Затем идет кальций, которого всегда больше, чем магния; в готовом вине, когда виннокислый кальций выпадает, соотношение бывает обратным. Фосфорная кислота является наиболее значительным анионом.
В табл. 3.7 дан примерный состав минеральных веществ в листьях, гребнях, кожице, семенах и мякоти винограда.
Азотистые вещества
Азот мякоти представляет лишь четвертую или пятую часть общего азота виноградной ягоды.
Азотистые вещества встречаются в сусле в аммиачной и органической формах; они состоят из аминокислот, по-
Состав минеральных веществ (в мг на 1 г зольного остатка) в различных частях виноградного растения
Элементы
Лист
Гребень
Кожица
Семена
М.якоть
к
400
362
360
230
180
Na
12
16
14
10
24
Са
100
97
150
228
52
Mg
36
41
30
51
34
Fe
5
6
6
3
2
липептидов и белков. В табл. 3.8 приведено несколько примеров распределения азота в виноградной ягоде.
Аммиачный азот присутствует в значительном количестве, достаточном для обеспечения брожения; будучи лучшим питательным веществом для дрожжей, азот в этой форме является совершенно необходимым для успешного хода брожения. Всегда присутствует также белковый азот: его источником является цитоплазма. В некоторых районах и у некоторых сортов винограда азот находится в таком большом количестве, что сразу же после прессования сусло становится местом последовательных флокуляций белков при контакте с танином вакуолей; выпадение осадка похоже на настоящую оклейку; осадок удаляют отстаиванием.
Сорт виноградаМасса1000 ягод, гАзот, мг на 1000 ягодобщийтвердой частижилкой частив жидкой частисеменакожицаnh4органическийамин-белко-полипе- птидныйСовиньон160019304659904808339720445148Семильон13301590386865363982652395571Каберне Совиньон1320127052353021450164652574Мерло162015106305253551542018447■ 70Сорт виноградаМасса1000 ягод, гАзот, мг на 1000 ягодобщийтвердой частижилкой частив жидкой частисеменакожицаnh4органическийамин-белко-полипе- птидныйСовиньон160019304659904808339720445148Семильон13301590386865363982652395571Каберне Совиньон1320127052353021450164652574Мерло162015106305253551542018447■ 70Таблица 3.8Таблица 3.8Распределение азотистых веществ в ягоде зрелого виноградаРаспределение азотистых веществ в ягоде зрелого виноградаМетодом хроматографии на бумаге
Сорт винограда
Масса
1000 ягод, г
Азот, мг на 1000 ягод
общий
твердой части
жилкой части
в жидкой части
семена
кожица
nh4
органический
амин-
белко-
полипе- птидный
Совиньон
1600
1930
465
990
480
83
397
204
45
148
Семильон
1330
1590
386
865
363
98
265
239
55
71
Каберне Совиньон
1320
1270
523
530
214
50
164
65
25
74
Мерло
1620
1510
630
525
355
154
201
84
47
■ 70
Сорт винограда
Масса
1000 ягод, г
Азот, мг на 1000 ягод
общий
твердой части
жилкой части
в жидкой части
семена
кожица
nh4
органический
амин-
белко-
полипе- птидный
Совиньон
1600
1930
465
990
480
83
397
204
45
148
Семильон
1330
1590
386
865
363
98
265
239
55
71
Каберне Совиньон
1320
1270
523
530
214
50
164
65
25
74
Мерло
1620
1510
630
525
355
154
201
84
47
■ 70
Таблица 3.8
Таблица 3.8
Распределение азотистых веществ в ягоде зрелого винограда
Распределение азотистых веществ в ягоде зрелого винограда
и путем микробиологического анализа в сусле были идентифицированы 24 вида аминокислот. 17 из них определены Лафон-Лафуркад и Пейно (1959), которые дали следующие средние значения (в мг на 1л): аргинин 327, пролин 266, треонин 258; глутаминовая кислота 173, серин 69, гликокол 22, лейцин 20, лизин 16, гистидин И, изолейцин 7, валин 6, фенилаланин 5, аспарагиновая кислота 2, метионин 1, триптофан 0,6; не было ни цистина, ни тирозина, которые можно было бы установить количественным анализом. По этому вопросу см. работы Лотти и Анелли (1971).
Существует определенная корреляция между процентным содержанием аминного азота сусла в состоянии зрелости и титруемой кислотностью. Табл. 3.9, содержащая средние значения большого числа определений для различных урожаев, является хорошей иллюстрацией этого факта.
Таблица 3.9
Соотношение между кислотностью винограда и содержанием в нем аминного азота
Сорт винограда
Титруемая кислотность, мг-экв/л
Аминный азот, мг/л
Мерло
80
52
Каберне Совиньон
88
59
Семильон
92
73
Мальбек
96
82
Каберне фран
104
92
Совиньон
112
98
Пти Вердо
116
104
Сорта, наиболее кислые, наиболее богатые органическими кислотами, оказываются также и наиболее богатыми по содержанию аминокислот. С другой стороны, виноград содержит наибольшее количество аминного азота в годы, когда он имеет наибольшую кислотность. Фактически синтез ами- 72
нокислот осуществляется в цикле Кребса, который объясняет образование органических кислот.
Кор донье и Дюгаль (1968) показали, что виноград обладает ферментами, способными гидролизовать белки; при поражении серой гнилью активность этих ферментов увеличивается в 4— 5 раз; протеолитические ферменты находятся главным образом в твердых частях здоровой ягоды и в соке загнивших ягод.
Пектиновые вещества
Пектиновые вещества, извлеченные из целлюлозо-пектиновой мембраны и являющиеся межклеточным цементом, представляют собой смесь пектинов в собственном смысле слова и камеди (растительной смолы) или пентозанов.
Чистый пектин образуется цепью по- лигалактуроновых молекул, называемых еще пектиновой кислотой, более или менее этерифицированных метанолом. Различают пектин растворимый, который находится в сусле, и пектин нерастворимый, или протопектин, фиксированный в твердых частях виноградной ягоды.
Камеди винограда обычно состоят из арабанов, ангидридов арабинозы и иногда из галактанов.
Виноград относительно беден пектинами; обычно он содержит больше смол, чем пектинов. В 50 образцах виноградного сусла было найдено от 0,23 до 6,91 г/л пектиновых веществ; содержание истинного пектина колебалось от 0,06 до 1,08, тогда как содержание смол составляло от 0,08 до 5,83 г/л.
Ароматические вещества
Ароматические вещества, характеризующие различные сорта, и, следовательно, ответственные за первичный аромат вин, локализованы главным об-
разом в кожице; они, вероятно, существуют также и в мякоти, но в незначительных количествах. Можно допустить существование двух типов ароматических веществ:
вещества, существующие в зрелых и перезрелых ягодах и переходящие в вино естественным путем. Они в первую очередь ответственны за характерные ароматы Мускатов, а также за лисий запах некоторых американских гибридов (Labrusca). Эти тона наиболее интенсивны в хорошо вызревшем и богатом сахаром винограде, культивируемом в жарком климате;
вещества, не обладающие особым запахом и присутствующие от природы в кожице ягод и даже в листьях винограда; они способны к превращениям во время брожения и старения вина, образуя новые вещества, ответственные за характерный аромат некоторых тонких вин (Пино, Каберне). В противоположность веществам первой группы они достигают максимальной интенсивности и наивысшей тонкости в винограде, созревающем в относительно холодных районах, у границы культуры винограда.
При современном уровне знаний нет никаких данных о природе веществ второй группы. С другой стороны, существуют более точные сведения относительно веществ первой группы. Например, известно (Холли и сотрудники, 1955), что метилантранилат при концентрации примерно 5 мг/л в виноградном соке ответствен за лисий запах V. Labrusca и ее гибридов. (Конкорд) . Точно так же были реализованы важные работы о роли терпеновых соединений в аромате винограда Мускат; самыми последними и наиболее полными из них являются работы Терье (1972) и Терье и сотрудников (1972). Эти авторы указывают на присутствие линалоола, нерола, гераниола, а-тер- пинеола и четырехокисного линалоола.
Кроме того, два других вещества этого же семейства, пока еще неидентифици- рованные,по-видимому, играют заметную ,роль в образовании органолептических характеристик. Содержание общих терпенов составляет от 816-10-3 мг/л для Муската гамбургского, собранного в Жиронде, до 3326-10-3 мг/л для Муската фрснтиньянского, культивируемого в Греции, при среднем значении 2000-10-3 мг/л. Анализ данных о порогах восприятия этих веществ обонянием показывает, что они участвуют в аромате плода, особенно линалоол и гераниол. Смесь восьми терпенов при концентрациях, близких к их концентрациям в винограде, довольно точно воспроизводит характерный аромат Муската, намного лучше, чем каждое вещество, взятое отдельно от других.
В немускатных сортах, но также с ароматическими характеристиками, например в эльзасских сортах (Рислинг. Сильванер, Мюллер — Тургау, Гевурц- траминер) находят эти же терпены, но в значительно более слабых концентрациях, порядка 200-10~3 мг/л. И в этом случае терпены ответственны за специфический аромат винограда.
В сортах с меньшим ароматом, таких, как Совиньон или Мюскадель, присутствуют эти же самые терпены, но в концентрациях только порядка 50-Ю-3 мг/л.
Наконец, эти терпеновые производные отсутствуют или присутствуют как следы во всех сортах, ягоды которых не имеют выраженной ароматической характеристики.
Независимо от специфической проблемы терпеновых производных, достаточно хорошо изученных в настоящее время, виноград содержит большое чи-. ело других летучих веществ, обладающих ароматом, которые были обнаружены газовой хроматографией (Рибе- ро-Гайон, 1971). На рис. 3.4 показана
Рис. 3.4. Хроматограмма экстракта, полученного из сока винограда Каберне Совиньон (Берт- раи и сотрудники, 1967). Идентификация пиков:
с / по 5— неизвестны; 6—гексан+эфир; 7— этаналь; 8— метилформиат; 9—пропаналь; 10— изобутаналь; // —этилформиат + метилацетат; 12— ацетон; 13— этилацетат; 14 — метил-3-бута- нол; 15—метанол; 16 — этанол; 17—пропанол; 18 и 19 — неизвестны; 20— гексаналь; 21— ме- тил-2-пропанол-1; 22 — водаф- пентанол-3; 23 — пентанол-2; 24— бутанол-1; 25 — неизвестен; 26 — гексен-2-аль + метил-2-бутанол-1 4- метил-З-бутанол-1; 27— неизвестен; 28— гексаиол-Г, 29 — неизвестен; 30 — цисгексен-З-ол-1; 31 — неизвестен.
хроматограмма экстракта, полученного из сока Каберне Совиньон в токе азота (Бертран и сотрудники, 1967). Но эти же самые вещества находятся во всех сортах, которые не проявляют в этом отношении характерных различий.
Эффективное участие летучих' веществ в общем аромате ягод остается невыясненным.
В частности, среди летучих компонентов винограда отмечают спирты и альдегиды с Се: гексанол, гексенол-1, гексаналь и гексен-2ол. Присутствие этих веществ часто наблюдают в растениях, которым они придают довольно своеобразный запах листьев, травы; они частично уничтожаются во время
брожения, и в винах находят исключительно гексанол.
ЛИТЕРАТУРА
Bertrand А., В old г on J. N. et R i b ё- reau-Gayon P. (1967), Bull. Soc. chim., 9, 3149.
В ess is M. (1972), C. R. Acad. Sci., 274, 2158 et 2991.
В о u rz ei x M., Heredia N. et Dubernet M, O. (1972), C. R. Acad. Agric., 58, 452.
Brechot P„ Chauvet J., Croson M. et Irrmann R. (1966), C. R. Acad. Sci., 263, 1004.
Brechot P., Chauvet J., Dupuy P., Croson M. et R a b a t u A. (1971), Ann. Tech- nol agric., 20, 103.
Cordonnier R. et Dugal A. (1968), Ann. Technol. agric., 17, 189.
Girard A. et Lindet L. (1895), Recherches
sur la composition des raisins des principaux cepages de France. Imprimerie nationale, Paris.
H о 11 e у R. W., S t о у I a B. e t H о 11 e у A. D. (1955), Food Research, 20, 326.
L a f о n-L a f о u г c a d e S. et Peynaud E. (1959), Vitis, 2, 53.
Lotti G. e t A n e 11 i G. (1971), Scienza Teen. Alim., 1, 25.
Manzoni L. (1955), Rivista Vitic. Enol.,8, 323 et 367.
Masquelier J. et Point G. (1954), Bull.
Soc. Pharm. Bordeaux, 92, 33.
Masquelier J. (1956), Bull. Soc. Pharm.
Bordeaux, 38, 65.
Mourgues J., Maugenet J., Jouret C. et Puech J. L. (1971), Fruits, 26, 449. ■
Peynaud E., GuimberteauG. et N a u- zin P. (1970), Conn. Vigne Vin, 4, 285.
Radler F. (1965), Am. J. Enol. Vitic,, 16, 159.
R a d 1 e r F. (1968), Conn. Vigne Vin, 2, 271.
Radler F. (1970), Angew. Botanik, 44, 187.
R i b e r ea u-G а у о n P. (1954), Ann. Falsif. Fraudes, 47, 431. •
R i b 6 r e a u-G а у о n P. (1956), Ann. Falsif. Fraudes, 49, 381.
R i b 6 r e a u-G а у о n P. (1957), C. R. Acad. Agric., 43, 197, 596 et 821.
R i b e r e a u-G а у о n P. (1959), Recherches sur les anthocyanes des vegetaux: Application au genre Vitis. These Sciences physiques, Paris, R i b ё г e a u-G а у о n P. (1971), Bull. O.I.V., 483, 428.
R i b ё г e a u-G а у о n P. et S u d r a u d P. (1957), C. R. Acad. Sci., 244, 233.
Robinson W. B, Shaulis N. J. et Pederson C. S. (1949), Fruit Prod. J., 29, 36 et 54.
Terrier A. (1972), Les composes terpeniques dans I’arome des raisins et des vins de certai- nes varietes de V. vinifera. These Docteur-In- genieur, Bordeaux.
Terrier А., В о 1 d г о n J. N. et Ribereau- Gayon P. (1972), C. R. Acad. Sc., 275 D, 495 et 941.
Глава4. ИССЛЕДОВАНИЕ
СОЗРЕВАНИЯ ВИНОГРАДА
В конце последнего столетия созревание плодов, и в частности винограда, стало предметом работ многих авторов: Фаминцин, Нойбауэр, Мах, Сен-Пьер и Манван, Мюллер-Тургау, Жирар и Лондэ, Жербе и др. Механический анализ винограда, его морфологическая эволюция были детально описаны; в дальнейшем проводились более глубокие исследования этих проблем. Ученые Венециа, Моро, Вине, Марто добились больших успехов в изучении роли углеводов, Феррэ, Пейно и Морие провели ряд успешных работ по исследованию эволюции органических кислот. Женевуа, Гатэ, Америн опубликовали монографии по этим же вопросам.
В последующее время исследования продолжались, в частности, на Энологической станции Бордо.
В данном случае наблюдения проводили на растениях без прямого вмешательства в природные условия/Следо
вательно, они фактически не были экспериментами. Эксперименты, как известно, состоят в систематическом изменении условий. Здесь же довольствовались учетом тех различий, которые возникали стихийно на разном агротехническом фоне и в течение ряда лет всегда при различных условиях погоды. Работы Ж. Риберо-Гайона и его сотрудников (1966, 1971), в частности, по применению меченых атомов углерода Сн значительно расширили наши познания в области биохимии виноградного растения и виноградной ягоды. Солнье-Блаш (1966, 1967, 1970), затем Пейно и сотрудники (1970) сделали попытку произвести более точное исследование кинетики созревания, СегэН (1965, 1971, 1973) связал эволюцию винограда с влажностью почвы на уровне корней и определил влияние некоторых естественных факторов на ха-’ рактеристики вин. Вуар (1966, 1971) подверг критическому исследований)
прежние концепции о миграции и использовании резервов древесины.
Необходимо также указать на интересные публикации Гайслера и Радле- ра (1963), Суза (1964), Радлера (1965), Сарториуса (1969) и важную монографию о винограде (Пейно и П. Риберо-Гайон, 1971).
ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ
Когда хотят проследить за ходом созревания с возможно большей точностью и получить данные, позволяющие сравнивать различные компоненты винограда на разных виноградниках за каждую неделю, из года в год, способ отбора образцов виноградных ягод приобретает первостепенное значение.
Действительно, нет ничего более гетерогенного, чем виноград на одном и том же винограднике, рассматриваемый в данный момент, даже если имеют в виду один и тот же сорт. Как уже было показано выше, степень зрелости ягод в грозди и различных гроздей одного и того же куста никогда не бывает одинаковой. Грозди, находящиеся ближе к штамбу, имеют более высокую сахаристость, чем те, которые находятся у оконечности побегов; наиболее зрелые грозди, как правило, находятся выше относительно почвы, так как растительный сок лучше всего поступает к верхушкам и в наиболее длинные побеги. У разных кустов эти различия еще больше. Одни кусты развиваются быстрее, чем другие.
В серии точных определений установлено, что расхождения по сахаристости между гроздьями в ряду кустов одного и того же сорта могут достигать 64 и 54 г/л, если грозди относятся к одному и тому же кусту; у ягод одной и той же грозди разница может составлять до 37 г/л. Эта гетерогенность также может объяснять тот факт, что определение сахаристости с помощью ручно
го рефрактометра при раздавливании нескольких ягод не обеспечивает точных данных.
Можно рекомендовать два способа взятия проб в зависимости от важности отбора образцов, которые позволяют получать довольно правильную кривую созревания.
Берут 250 виноградных ягод с 250 кустов однородною участка, по одной ягоде с куста, но с разных мест по высоте и по освещенности с обеих сторон ряда и тщательно следят за тем, чтобы отбор имел случайный характер, производился наугад, а отнюдь не путем отбора по каким-либо признакам. Такой способ рекомендуют применять многие авторы, в том числе Хюглен л Жуйяр (1959), Америн и Роеслер (1958, 1963), Ранкин и сотрудники (1962). Затем ягоды взвешивают, раздавливают, прессуют ручным прессом или обрабатывают в центробежном сепараторе. Состав сусла в обоих случаях практически один и тот же. Определяют сахаристость и кислотность.
Собирают 1,5—2 кг винограда с количеством ягод порядка 800—1000 путем срезания ножницами частей гроздей по 3—4 ягоды в каждой, примерно с сотни кустов каждого сорта на участке, где производят опыт, и добиваясь того, чтобы условия сбора были все время одинаковыми. При этом необходимо учитывать освещенность солнцем, срезать кисточки гроздей, закрытых листьями, а также и находящихся на свету, находящихся в разных местах, брать ягоды поочередно с каждой стороны ряда на разной высоте над почвой.
Затем ягоды считают, взвешивают, чтобы определить среднюю массу одной ягоды, раздавливают и производят двукратный отжим на ручном прессе каждый раз одним и тем же образом. Измеряют объем полученного сока. Когда нужно сохранять его в течение
длительного времени, прежде чем производить анализы, к нему добавляют равный объем воды, таким образом, чтобы избежать осаждения солей винной кислоты. Консервация обеспечивается нагреванием до 75° С в бутылях, плотно закрытых пробкой.
Оба эти метода дают довольно постоянные и полностью сравнимые результаты (Пейно, 1971). Де Суза (1964) предложил отбирать шесть образцов по 50 ягод в каждом, собранных на 50 кустах.
Когда ставят целью исследовать состав твердых частей плода или листьев, экстракцию проводят классическими способами, применяемыми для растительных тканей, различающихся между собой в зависимости от природы извлекаемых веществ. Экстрагирование кислот, свободных и в составе солей, хорошо делать, погружая достаточно разделенный материал на десять минут в значительный объем кипящей воды или пропуская его непосредственно через автоклав. Извлечение сахаров требует большей тщательности, чтобы избежать гидролиза, его следует производить в кипящем спирте в присутствии карбоната кальция.
УВЕЛИЧЕНИЕ ВИНОГРАДНОЙ ЯГОДЫ
Ягода постоянно увеличивается в объеме и в массе, начиная с завязывания и до достижения зрелости. Это увеличение можно проследить различными путями: измерением диаметра ягод, выполняемым на месте, и последующим вычислением объема, прямым измерением объема ягоды путем погружения в наполненную водой градуированную пробирку, которое можно также выполнять на кусте при условии достаточно длинной плодоножки грозди, если она свободно свисает на побеге, или же после снятия ягод путем взвешивания.
По наблюдениям авторов, которые приводятся в качестве примера, средняя масса 100 ягод в середине периода созревания составляет 97 г для сорта Мерло и 77 г для сорта Каберне Совиньон. Но эти массовые величины подвержены очень большим колебаниям: для Мерло — от 65 до 127 г, для Каберне Совиньон — от 48 до 111 г. Размер ягод во многом зависит от условий года. В момент зрелости средняя масса 100 ягод достигает 138 г для сорта Мерло и 114 г для сорта Каберне Совиньон. Таким образом, увеличение объема ягоды во второй половине периода созревания достигает почти50%. В зависимости от года отмеченные колебания, которые отражаются на выходе сока, имеют очень большие амплитуды: от 106 до 175 г для сорта Мерло, от 78 до 160 г для сорта Каберне Совиньон.
Средняя величина зрелой ягоды зависит в первую очередь от количества дождей. Так, ягоды были очень большими в 1960 г., когда с апреля по сентябрь включительно выпало 691 мм осадков; в засушливом 1961 г. они были мелкими, так как за такой же период осадков выпало только 319 мм. Но на изменение объема и массы ягод могут влиять и другие факторы: например, в 1954 г. масса ягод понизилась из-за поражения винограда серой гнилью; в 1957 г. этому, по всей вероятности, способствовало снижение продуктивности, что позволило ягодам увеличить свой объем в результате лучшего питания.
Отмечают также тот факт, что максимальной массы ягоды достигают за несколько дней до начала сбора винограда. Обычно на последней неделе констатируют небольшую потерю средней массы ягод, которая может достигнуть 10%. Такое уменьшение соответствует небольшой концентрации ягоды вследствие потери воды.
Элементы ягоды25 августа4 сентября14 сентября24 сентября1 октября8 октябряМякоть645738изо119012001280Кожица166145205200263265Семена797785868778Общая масса89J9601420147615501623Элементы ягоды25 августа4 сентября14 сентября24 сентября1 октября8 октябряМякоть645738изо119012001280Кожица166145205200263265Семена797785868778Общая масса89J9601420147615501623Измеиеиие массы (в г иа 1000 ягод) органов вяиоградиого растения в период созреванияИзмеиеиие массы (в г иа 1000 ягод) органов вяиоградиого растения в период созревания
Элементы ягоды
25 августа
4 сентября
14 сентября
24 сентября
1 октября
8 октября
Мякоть
645
738
изо
1190
1200
1280
Кожица
166
145
205
200
263
265
Семена
79
77
85
86
87
78
Общая масса
89J
960
1420
1476
1550
1623
Элементы ягоды
25 августа
4 сентября
14 сентября
24 сентября
1 октября
8 октября
Мякоть
645
738
изо
1190
1200
1280
Кожица
166
145
205
200
263
265
Семена
79
77
85
86
87
78
Общая масса
89J
960
1420
1476
1550
1623
Измеиеиие массы (в г иа 1000 ягод) органов вяиоградиого растения в период созревания
Измеиеиие массы (в г иа 1000 ягод) органов вяиоградиого растения в период созревания
Известно, что масса ягоды связана с числом семян.
Различные органы виноградного растения неодинаково увеличиваются в массе в период созревания. Мякоть растет больше, чем кожица, масса семян во время созревания остается после начала созревания почти постоянной.
Табл. 4.1 показывает эти различия для красного сорта Мерло.
Виноградные ягоды, которые считают зрелыми и готовыми для сбора, содержат 20% недозревших ягод, сахаристость их составляет лишь две трети среднего содержания сахара, а кислотность почти в 2 раза выше нормальной. В связи с таким запаздыванием созревания этой части ягод можно считать, что сахаристость урожая снижается на 10%, а кислотность значительно выше. Поэтому, когда советуют ждать полного созревания винограда, имеется в виду достижение зрелости именно этими запоздалыми ягодами.
НАКОПЛЕНИЕ САХАРОВ
Сочные ягоды, как правило, являются органами аккумуляции углеводов. Отмечено, что уже цветок представляет собой такой орган, где собираются эти вещества. После оплодотворения приток углеводов становится постоян-. ным. Но накапливание сахаров по-настоящему начинается только с началом созревания; су. зеленого винограда содержание, сахара не-превышает 10—^
15 г/кг. Затем резко, за несколько недель, сахаристость повышается от 1 до 20%. Трудно понять, почему сахара накапливаются так быстро в созревающем винограде. Объяснение, согласно которому приток питательных веществ, необходимых для образования и роста семени, продолжается и после достижения им физиологической зрелости и что при этом остаток неиспользованных глюцидов накапливается в мякоти плода, нельзя признать в полной мере удовлетворительным. Оно лишь частично соответствует реальному положению; ниже будет показано, что содержание сахара меньше, когда число семян в ягоде больше. В табл. 4.2 приведено сравнение винограда с различной степенью окрашенности в момент начала созревания.
Миграция фотосинтезированных глюцидов в листьях во время созревания
Основной вклад в исследование этой проблемы сделали Венециа, Гихар и Марго.
' Явления миграции в винограде изучали Сувенсон и Эль Шишини (1968)- с помощью сахаров, меченных радиоактивным углеродом, а также Ж. Рибе- ро-Гайон введением СИО2 в листья^ Результаты этих работ доказывают^ что лист -винограда постоянно седер-1 життлюкозу, фруктозу, сахарозу, крахмал, которые образуются в процесс®
Химические показатели винограда в зависимости от состояния его зрелости (район Грав; пробы были взяты 18 августа 1971 г.)
Масса 100 ягод,
Восстанавливающие сахара, г
Кислотность, мг-экв
МН4, мг-экв
Винная кислота, мг-экв
Состояние винограда
Яблочная кислота, мг-экв
Сорт Мерло
Зеленый
74
76
412
14,0
202
250
Полузрелый
92
112
252
8,0
156
135
Зрелый
111
162
176
6,4
130
90
Сорт Каберне фран
Зеленый
65
66
426
14,0
186
270
Полузрелый
81
114
292
13,2
155
180
Зрелый
92
140
216
8,0
130
120
Сорт Каберне Совиньон
Зеленый
58
48
476
17,6
198
305
Полузрелый
69
98
316
16,4
160
190
Зрелый
107
152
250
13,2
150
130
Таблица 4.3
Дата
Часы
Листья
Лоза
Гребин
восстанавливающие сахара
сахароза
восстанавливающие сахара
сахароза
восстанавливающие сахара
сахароза
31
августа
14
8,8
18,5
4,5
5,1
11,6
4,4
1 сентября
5
7,1
11,5
з,з
4,2
10,3
3,1
7
>
14
10,0
15,2
4,2
5,2
13,2
2,2
8
5
8,0
8,0
3,9
4,1
12,7
3,0
14
14
6,9
10,6
3,3
4,1
5,9
1,7
15
5
7,3
8,7
3,7
4,5
10,5
3,9
21
14
6,7
12,2
3,5
5,3
10,0
3,6
22
5
6,8
7,8
3,6
4,4
7,4
1,9
28
14
12,3
7,0
4,8
3,2
5,5
2^5
29
5
8,5
4,8
4,0
5,5
6,5
2,5
5
октября
14
9,5
14,5
4,0
7,0
7,9
3,6
6
5
8,5
8,2
4,0
6,0
5,2
3,2
Изменение содержания сахаров
(в г на 1 кг
массы винограда) в различных органах виноградного растения в период созревания (по данным Марте)
фотосинтеза.
Крахмал
представляет собой вид резерва, который стабилен
но
амплитуда изменений в содержании
до пожелтения листа. Процентное содержание восстанавливающих сахаров претерпевает небольшие колебания: незначительное увеличение в течение дня и слабое снижение в течение ночи,
сахарозы намного больше. Ее образование в дневное время происходит тем интенсивнее, чем сильнее освещенность кустов солнцем; оно снижается ночью в результате миграции к другим органам. Следовательно, сахароза состав-
ляет углеводный резерв быстрого использования. Ее находят во всех органах растения, и в частности в побегах, черешках листа, гребнях, представляющих органы трансмиссии, но в значительно меньших количествах, чем в листьях. Известно, что миграции обычно осуществляются в форме небольших, более подвижных молекул. Таким образом, по выходе из листа сахароза гидролизуется в инвертный сахар в древесно-лубяных сосудах, и ее содержание уменьшается на всем пути от черешка листа до побега, от побега до гребня и от гребня до ягоды. Наконец, в винограде остаются лишь с трудом обнаруживаемые следы сахарозы.
Табл. 4.3 показывает колебания в содержании углеводов в различных органах винограда во время созревания.
Можно констатировать, что эволюции общих сахаров в листьях, побегах и гребнях совершенно параллельны; следовательно, интенсивность миграций находится в прямой зависимости от интенсивности фотосинтеза.
Таким образом, в этом двойственном явлении синтеза и миграции различают три фазы: 1 — в течение всего периода начала созревания ягод содержание сахаров в зеленых органах растения непрерывно возрастает; 2 —во время созревания они становятся беднее сахарами, теряя их в пользу плода; 3 — наконец, при перезревании и после сбора урожая содержание углеводов снова повышается. В период зрелости винограда отмечается минимальное содержание сахара, особенно заметное’в гребнях, когда рассматривают анализы проб, взятых в конце ночи; этот минимум соответствует технической зрелости винограда и свидетельствует о максимальной потребности ягод в сахаре в это время.
Кроме того, анализ отношения сахарозы к восстанавливающим сахарам, превышающего 1 в листе (за исключе-
нием момента зрелости, когда оно снижается до 0,6), равного 1 в побеге и намного меньшего 1 в гребне, доказывает, что миграция происходит нормально, как уже было указано, после гидролиза сахарозы. Это же отношение, будучи значительно более слабым утром, чем в течение дня, указывает на использование в ночное время резерва сахарозы, создавшегося в листе при освещении солнцем. По достижении зрелости это отношение снова возрастает, так как лист восстанавливает резервы сахарозы.
Отношение между сахаристостью и температурой ■ ,
Ниже будет показано влияние климатических условий данного района и года на состав винограда и качество вина. Здесь же яю результатам опытов, проведенных в районе Бордо, будет показано отношение между содержанием сахаров в начале созревания и по достижении зрелости и температурами.
В районе Бордо для сортов Мерло и Каберне Совиньон полусозревание (момент, когда 50% ягод изменили окраску) наступает тогда, когда содержание сахара в винограде достигает в
Рис. 4.1. Рост виноградной ягоды и обогащение ее сахарами (сорт Мерло) (Песак, 1957):
1 — содержание сахара в 1000 ягодах; 2 — масса 100 ягод.-
среднем 80 г/л. Но в действительности этот уровень очень изменчив: от 33 до 110 г/л — для сорта Мерло, от 36 до 108 г/л— для Каберне Совиньон. Оно во многом зависит от условий года.
Кривые обогащения ягод сахарами (рис. 4.1) имеют вид, отличный от кривых, характеризующих рост ягоды. Содержание сахара возрастает очень быстро в течение месяца с начала созревания. Сахара накапливаются быстрее, чем увеличивается объем ягоды. Затем миграция сахара становится очень медленной, и нередко в течение последних двух недель перед сбором винограда среднее содержание сахара более не повышается; оно может даже несколько снизиться.
Отношение глюкозы к фруктозе
Выше было показано, что зеленый виноград содержит мало восстанавливающих сахаров (от 10 до 15 г/л). Эти сахара в основном состоят из глюкозы (85%). Но к моменту начала созревания с усилением притока сахаров количество фруктозы возрастает и отношение глюкозы к фруктозе (Г/Ф) быстро уменьшается. К концу начального периода созревания оно приближается к единице. С давних пор известно, что это отношение постоянно снижается во время созревания на кусте. То же самое происходит и во время заизюмли- вания винограда или длительного хранения столового винограда. По достижении зрелости всегда отмечается небольшой избыток фруктозы и отношение Г/Ф для винограда Vitis vinifera составляет около 0,95. Для 19 сортов в Калифорнии Америк и Тукис (1958) находят отношения Г/Ф от 0,83 до 1,12 при среднем значении 0,92.
В табл. 4.4 приведен один из примеров эволюции двух сахаров.
Гидролиз сахарозы (резервного вещества) дает равное количество обоих
Эволюция глюкозы и фруктозы в период созревания винограда (сорт Каберне фран, район Грав)
Дата
Восстанавливающие сахара, г
Глюкоза, г
Фруктоза, г
Г/Ф
10
августа
12,1
8,1
4,0
2,02
20
»
55
31,5
23,5
1,35
31
»
132
68,2
63,8
1,07
10
сентября
179
88,5
90,5
0,98
20
»
192
93,6
98,4
0,95
30
»
210
101,0
109,0
0,93
сахаров; все происходит, как если бы глюкоза поглощалась во время миграции в большей степени, чем ее изомер. Глюкоза более чувствительна к клеточному дыханию, чем фруктоза; об этом говорит ее быстрое сгорание во время искусственного заизюмливания. Нужно также отметить, что растительные клетки легко изомеризуют сахара и могут превращать глюкозу в фруктозу.
Отношение Г/Ф нельзя считать показателем зрелости.
МИГРАЦИЯ МИНЕРАЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ
Если проследить эволюцию массы зольного остатка и щелочности золы виноградной ягоды, то можно наблюдать непрерывное возрастание их в течение всего времени формирования и созревания плода. Минеральные катионы постоянно извлекаются из почвы корнями и распределяются в растении и плоде. Однако в циркуляции минеральных веществ между листом и плодом имеется узкое место, потому что последний всегда содержит меньше зольного остатка, чем зеленые органы.
Поступление этих веществ в ягоду происходит неравномерно, как все явления миграции. Оно протекает быстро
Минеральные вещества12 августа20 августа30 августа10 сентября20 сентября30 сентября7 октябряЗола, г1,72,32,13,72,83,95,0Щелочность золы, мг-экв22,823,027,039,036,739,828,0К, МГ-ЭКВ16,220,521,635,442,450,542,8Na, мг-экв0,50,80,90,81,00,91 ',7■Ca-j-Mg, мг-экв7,0И,212,611,58,89,513,0Минеральные вещества12 августа20 августа30 августа10 сентября20 сентября30 сентября7 октябряЗола, г1,72,32,13,72,83,95,0Щелочность золы, мг-экв22,823,027,039,036,739,828,0К, МГ-ЭКВ16,220,521,635,442,450,542,8Na, мг-экв0,50,80,90,81,00,91 ',7■Ca-j-Mg, мг-экв7,0И,212,611,58,89,513,0Содержание минеральных веществ в виноградном соке на 1000 ягодСодержание минеральных веществ в виноградном соке на 1000 ягод
Минеральные вещества
12 августа
20 августа
30 августа
10 сентября
20 сентября
30 сентября
7 октября
Зола, г
1,7
2,3
2,1
3,7
2,8
3,9
5,0
Щелочность золы, мг-экв
22,8
23,0
27,0
39,0
36,7
39,8
28,0
К, МГ-ЭКВ
16,2
20,5
21,6
35,4
42,4
50,5
42,8
Na, мг-экв
0,5
0,8
0,9
0,8
1,0
0,9
1 ',7
■Ca-j-Mg, мг-экв
7,0
И,2
12,6
11,5
8,8
9,5
13,0
Минеральные вещества
12 августа
20 августа
30 августа
10 сентября
20 сентября
30 сентября
7 октября
Зола, г
1,7
2,3
2,1
3,7
2,8
3,9
5,0
Щелочность золы, мг-экв
22,8
23,0
27,0
39,0
36,7
39,8
28,0
К, МГ-ЭКВ
16,2
20,5
21,6
35,4
42,4
50,5
42,8
Na, мг-экв
0,5
0,8
0,9
0,8
1,0
0,9
1 ',7
■Ca-j-Mg, мг-экв
7,0
И,2
12,6
11,5
8,8
9,5
13,0
Содержание минеральных веществ в виноградном соке на 1000 ягод
Содержание минеральных веществ в виноградном соке на 1000 ягод
в начале фазы созревания, когда приток минеральных веществ пропорционально более значителен, чем развитие плода; он ослабевает по достижении зрелости.
Изменение содержания минеральных веществ в период созревания винограда (сорт Мерло) приведен в табл. 4.5.
Щелочность золы параллельно определяли также в мякоти, кожице и в гребнях в двух сортах винограда (табл. 4.6). Везде наблюдается увеличение количества кислот в виде солей. В кожице в течение одного месяца количество неорганических веществ удваивается или утраивается; в гребне содержание их возрастает в 1,5—2,5 раза, в мякоти же только в 1,2—1,9 раза. Самая большая часть минеральных веществ находится не в вакуолях клеток, а на пектинах клеточных перегородок. В период виноделия калий и кальций кожицы и семян малорастворимы. В вине содержится только одна пятая калия, находящегося в винограде, и всего одна десятая кальция; и, наоборот, магний, все соли которого обладают хорошей растворимостью, экстрагируется почти полностью.
Щелочность золы не является постоянной величиной; она изменяется в зависимости от условий года. Дождливая погода и связанное с ней повышение влажности почвы — лишь одни из факторов, обусловливающих подъем неорганических веществ. Транспирация ра
стений, которая нуждается в растительных соках, также играет определенную роль. Максимальное содержание щелочности золы бывает в годы с жарким летом, с дожливым периодом в июне и в июле, и, наоборот, если лето холодное, циркуляция воды в растении замедляется.
Эволюция металлов, значительно менее изученная, также выражается в прогрессивном увеличении. В целом плод во время созревания обогащается всеми элементами.
Железо находится в одинаковых количествах в мякоти и в кожице, но его значительно меньше в семени, тогда как марганец распределяется во всех трех фракциях виноградной ягоды в почти одинаковых пропорциях. Семена относительно богаты марганцем,, а кожица богата железом. Содержание этих двух металлов возрастает в мякоти и в кожице, но остается стабильным в семенах.
В то же время, как и у катионов, непрерывно возрастает процентное содержание анионов минеральных веществ (сульфаты, фосфаты, хлориды, силикаты). Фосфаты, которые в большом количестве содержатся в семенах, с приближением зрелости накапливаются в еще большей степени в мякоти ягоды.
Карль и сотрудники (1967) исследовали минерализацию сорта Шасла в Муасаке на различных типах почв. По
Изменение содержания минеральных веществ в различных частях винограда
Сорта
Щелочность золы, мг-экв на 1000 ягод
S
S
S
Семильон'‘ мякоть
29
46
52
55
54
кожица
16
26
32
43
45
гребень
7
8
9
14
12
Мерло мякоть
41
45
48
48
51
кожица
11
10
10
13
14
гребень
6
7
7
10
10
мнению этих авторов, самые различные реакции сортов на почву независимо от подвоев выдвигают проблему крю (участков или районов, дающих вина особо высокого качества); эти реакции объясняют (при одинаковых климатических условиях) различия в зрелости винограда и качестве вина, констатируемые на разных почвах.
РЕСПИРАЦИЯ ВИНОГРАДА
Респирация плодов и ее связь с созреванием известны очень давно. Плоды не могут развиваться и созревать в атмосфере, лишенной кислорода.
.Можно вычислить коэффициент респирации (КР), или отношение выделенного углекислого газа к объему поглощенного кислорода за одно и то же время. Численное значение этого "коэффициента представляет интерес в том отношении, что оно в определенной мере раскрывает природу веществ, разрушаемых дыханием винограда. В табл. 4.7 даны значения КР для различный компонентов виноградной ягоды, которые могут разрушаться "таким путем.
Считают, что 1 л поглощенного кислорода "Соответствует горению 1,3. г caJ
харов или 2,0 г яблочной кислоты или 1,9 г лимонной кислоты или 2,6 г винной кислоты.
КР, измеренный на целых ягодах, близок к 1. Но когда интересует метаболизм мякоти, нужно различать слабую респирацию перикарпия, КР которой в действительности больше 1, и значительно более интенсивную респирацию семян с КРср, равным 0,75. Следовательно, точное экспериментирование возможно только на виноградных ягодах, не имеющих семян. Именно таким путем были получены значения, приведенные в табл. 4.8.
В зеленом винограде КР соответствует сгоранию яблочной кислоты; иногда он даже превышает эту цифру. Жербе сделал из этого вывод, что основным питанием респирации является яблочная кислота и, как исключение, винная. С приближением зрелости КР приближается к 1, что дает основание предполагать, что сахара также будут сгорать. КР является результатом сложения различных процессов горения, происходящих одновременно. Когда у винограда находят КР, равный 1,33, соответствующий горению яблочной кислоты, то похоже, что эта кислота не является единственным деградируемым продуктом и одновременно происходит сгорание небольшого количества глюцидов и винной кислоты.
кг зеленого винограда выделяет больше 100 см3 углекислого газа в час, т. е. 2,5 л в сутки; 1 кг зрелого винограда выделяет 20 см3 углекислого газа в час, т. е. около 0,5 л в сутки; с Другой стороны, КРо6щ , определяемый здесь как среднее арифметическое между коэффициентами респирации семян и мякоти, кажется довольно постоянным на протяжении всей эволюции виноградной ягоды (табл. 4.9). . -
Наиболее важным фактором дыхания является температура ■ окружающей среды, в которой находится вино-1
Коэффициент респирации (КР), соответствующий сгоранию некоторых компонентов виноградной ягоды
КомпонентыФормула окисления
Значение КР
УглеводыС6Н,2О6+6 О2->-6 СО2+6 Н2О
Кислоты
яблочнаяС4Н6О5+3 О2=4 СО2+3 Н2О
лимоннаяС6Н8О?+4,5 О2->6 СО2+4 Н2О
виннаяСДМУ+2,5О2^4СО2+ЗН2О
жирнаяСсеНзбОг+Зб О2->-18СОг+18 Н2О
6/6=1,00
4/3=1,33 6/4,5=1,33 4/2,5=1,60
18/26=0,70
Таблица 4.8
Респирация бессемянною винограда (по данным Жербе)
Вил плода
Сорт Султанина
1,13
1,60
Зеленый Зрелый
136 58,5 43,31,35
63 41,6 35,61,17
Сорт Блек Мароко
1,00Зеленый
1,38Зрелый
140 46,7 35,2
62 35,0 81,6
1,33
1,И
Примечание. Объем газов измерен при 30° С.
Рис. 4.2. Интенсивность газообмена винограда в зависимости от температуры.
град. Интенсивность респирации достигает максимума при 37° С, при температуре ниже 30° С она очень быстро снижается, при 20° С составляет только Vs от интенсивности, проявляющейся при 30° С. На рис. 4.2 представлена кривая газообмена винограда в зависимости от температуры. Начиная с 20° С, дыхание резко усиливается.
Кэффициент респирации также быстро уменьшается с понижением темпе-
ратуры. Достигая значения 1,44 при 37° С и будучи близким к 1,33 при 30° С, он затем понижается до 1,00 при 20° С и до 0,70 при 0° С. Отсюда можно заключить, и это имеет первостепенное значение для понимания явлений созревания, что химические компоненты винограда, деградируемые при дыха-
ДатаКислотность, мг-эквСахара, гМасса ягоды, гсо2, мм3/гО3. мм’/гСО2, мм8 на 1 ягодуОе, мм8 на 1 ягодуКР10 ИЮЛЯ4252,30,1210912313,214,70,8813»3805,00,6574,971,348,746,41,0525 »3605,21,9555,552,41081051,068 августа39511,53,1038,337,51181161,0223 »38724,23,3035,034,01151121,033 сентября11513,55,8520,722,01211290,9415 »79140,05,2223,022,11201151,04ДатаКислотность, мг-эквСахара, гМасса ягоды, гсо2, мм3/гО3. мм’/гСО2, мм8 на 1 ягодуОе, мм8 на 1 ягодуКР10 ИЮЛЯ4252,30,1210912313,214,70,8813»3805,00,6574,971,348,746,41,0525 »3605,21,9555,552,41081051,068 августа39511,53,1038,337,51181161,0223 »38724,23,3035,034,01151121,033 сентября11513,55,8520,722,01211290,9415 »79140,05,2223,022,11201151,04Респирация винограда в различные периоды его развития (сорт Панс)Респирация винограда в различные периоды его развития (сорт Панс)Примечание. Объемы газов измерены при 30° С.Примечание. Объемы газов измерены при 30° С.Таблица 4.10Таблица 4.10
Дата
Кислотность, мг-экв
Сахара, г
Масса ягоды, г
со2, мм3/г
О3. мм’/г
СО2, мм8 на 1 ягоду
Ое, мм8 на 1 ягоду
КР
10 ИЮЛЯ
425
2,3
0,12
109
123
13,2
14,7
0,88
13»
380
5,0
0,65
74,9
71,3
48,7
46,4
1,05
25 »
360
5,2
1,95
55,5
52,4
108
105
1,06
8 августа
395
11,5
3,10
38,3
37,5
118
116
1,02
23 »
387
24,2
3,30
35,0
34,0
115
112
1,03
3 сентября
115
13,5
5,85
20,7
22,0
121
129
0,94
15 »
79
140,0
5,22
23,0
22,1
120
115
1,04
Дата
Кислотность, мг-экв
Сахара, г
Масса ягоды, г
со2, мм3/г
О3. мм’/г
СО2, мм8 на 1 ягоду
Ое, мм8 на 1 ягоду
КР
10 ИЮЛЯ
425
2,3
0,12
109
123
13,2
14,7
0,88
13»
380
5,0
0,65
74,9
71,3
48,7
46,4
1,05
25 »
360
5,2
1,95
55,5
52,4
108
105
1,06
8 августа
395
11,5
3,10
38,3
37,5
118
116
1,02
23 »
387
24,2
3,30
35,0
34,0
115
112
1,03
3 сентября
115
13,5
5,85
20,7
22,0
121
129
0,94
15 »
79
140,0
5,22
23,0
22,1
120
115
1,04
Респирация винограда в различные периоды его развития (сорт Панс)
Респирация винограда в различные периоды его развития (сорт Панс)
Примечание. Объемы газов измерены при 30° С.
Примечание. Объемы газов измерены при 30° С.
Таблица 4.10
Таблица 4.10
нии, меняются по мере изменения температуры. При 30° С респирация протекает главным образом за счет яблочной кислоты, при более высоких температурах больше сгорает винной кислоты. При более низких температурах количество сгоревшей яблочной кислоты уменьшается, и можно предпола- 1ать, что плод использует прежде всего свои углеводы.
Эти гипотезы довольно хорошо согласуются с фактами. Данные анализов подтверждают сгорание яблочной и винной кислот в течение лета; в периоды понижения температуры кислотность винограда в фазе созревания почти не изменяется. Экспериментальное подтверждение тому привел Л. Гате, который на одном и том же винограде определял прямым дозированием количество потребленного кислорода и сгоревшей яблочной кислоты в течение 30 ч при 30 °C (табл. 4.10).
До начала созревания объем использованного кислорода всегда намного больше количества, необходимого для сгорания исчезнувшей яблочной кислоты. Следовательно, эта кислота не является ни единственным, ни возможно главным сгоревшим компонентом. В период созревания соотношение между потреблением кислоро-
Соответствие между потребленным кислородом и исчезнувшей яблочной кислотой (в ммолях на 1 г свежей массы, сорт Совиньон)
Дата измерений
Исчезнувшая яблочная кисло-
О,, соответствующий яблочной кислоте
О, потребленный
29 июня
20
60
147
1 июля
36
108
135
5 »
20
60
101
19 »
24
■ 72
80
13 сентября
6
18
18
15»
8
24
30
21»
9
27
33
да и убылью яблочной кислоты значительно лучше, и эта кислота в данной фазе, безусловно, представляет собой один из наиболее разлагаемых элементов.
Эти измерения интенсивности респирации производили на ягодах, отделенных от куста, но можно думать, что респирация ягоды на побеге представляет величину такого же порядка. Надо также иметь в виду, что у гроздей, хорошо освещаемых солнцем, температуры могут быть очень высокими. Они выше у черных, чем у белых сортов. В безветренный день, когда температура воздуха была около
ЦатаСахара, гpHКислотность, мг-эквЩелочность золы, мг-эквnh4>МГ-ЭКвСумма катионовКислоты, мг-экв на 1 л суслаСумма анионов-виннаяяблоч-лимоннаяЦатаСахара, гpHКислотность, мг-эквЩелочность золы, мг-эквnh4>МГ-ЭКвСумма катионовКислоты, мг-экв на 1 л суслаСумма анионов-виннаяяблоч-лимоннаяАцидометрические балансы сусла во время созревания (Пойак, Медок, 1970)Ацидометрические балансы сусла во время созревания (Пойак, Медок, 1970)18 августа722,70360386,84051812002,838424»1002,82268424,83151431652,431031»1342,98184424,82311241002,02237 сентября1663,15140464,0190104751,818114»1723,20116462,816599601,816121»1923,35100524,4156100502,415228»1923,40104545,2163118402,0160Сорт Каберне Совиньон18 августа842,75356409,64061712002,737424»1082,85264407,63121521402,429431»1283,00184406,42301181052,02257 сентября1563,17152446,0202119752,219114»1563,17136465,6188114652,018121»1783,30128466,4180124иО2,417628»1883,35120507,6178124452,11715 октября■1843,35108484,4160106453,615518 августа722,70360386,84051812002,838424»1002,82268424,83151431652,431031»1342,98184424,82311241002,02237 сентября1663,15140464,0190104751,818114»1723,20116462,816599601,816121»1923,35100524,4156100502,415228»1923,40104545,2163118402,0160Сорт Каберне Совиньон18 августа842,75356409,64061712002,737424»1082,85264407,63121521402,429431»1283,00184406,42301181052,02257 сентября1563,17152446,0202119752,219114»1563,17136465,6188114652,018121»1783,30128466,4180124иО2,417628»1883,35120507,6178124452,11715 октября■1843,35108484,4160106453,6155Сорт МерлоСорт Мерло27° С, температура ягод, измерявшаяся посредством термоэлектрических пар Годаром на винограднике в Монпелье, достигала 44° С. Эти расхождения температуры воздуха и ягод меньше, если дует слабый ветер или же грозди защищены листьями. Понятно, что для южных районов частота дней с ветром, смягчающим дневную жару, является фактором, способствующим созреванию.
Цата
Сахара, г
pH
Кислотность, мг-экв
Щелочность золы, мг-экв
nh4>
МГ-ЭКв
Сумма катионов
Кислоты, мг-экв на 1 л сусла
Сумма анионов-
винная
яблоч-
лимонная
Цата
Сахара, г
pH
Кислотность, мг-экв
Щелочность золы, мг-экв
nh4>
МГ-ЭКв
Сумма катионов
Кислоты, мг-экв на 1 л сусла
Сумма анионов-
винная
яблоч-
лимонная
Ацидометрические балансы сусла во время созревания (Пойак, Медок, 1970)
Ацидометрические балансы сусла во время созревания (Пойак, Медок, 1970)
18 августа
72
2,70
360
38
6,8
405
181
200
2,8
384
24»
100
2,82
268
42
4,8
315
143
165
2,4
310
31»
134
2,98
184
42
4,8
231
124
100
2,0
223
7 сентября
166
3,15
140
46
4,0
190
104
75
1,8
181
14»
172
3,20
116
46
2,8
165
99
60
1,8
161
21»
192
3,35
100
52
4,4
156
100
50
2,4
152
28»
192
3,40
104
54
5,2
163
118
40
2,0
160
Сорт Каберне Совиньон
18 августа
84
2,75
356
40
9,6
406
171
200
2,7
374
24»
108
2,85
264
40
7,6
312
152
140
2,4
294
31»
128
3,00
184
40
6,4
230
118
105
2,0
225
7 сентября
156
3,17
152
44
6,0
202
119
75
2,2
191
14»
156
3,17
136
46
5,6
188
114
65
2,0
181
21»
178
3,30
128
46
6,4
180
124
иО
2,4
176
28»
188
3,35
120
50
7,6
178
124
45
2,1
171
5 октября
■184
3,35
108
48
4,4
160
106
45
3,6
155
18 августа
72
2,70
360
38
6,8
405
181
200
2,8
384
24»
100
2,82
268
42
4,8
315
143
165
2,4
310
31»
134
2,98
184
42
4,8
231
124
100
2,0
223
7 сентября
166
3,15
140
46
4,0
190
104
75
1,8
181
14»
172
3,20
116
46
2,8
165
99
60
1,8
161
21»
192
3,35
100
52
4,4
156
100
50
2,4
152
28»
192
3,40
104
54
5,2
163
118
40
2,0
160
Сорт Каберне Совиньон
18 августа
84
2,75
356
40
9,6
406
171
200
2,7
374
24»
108
2,85
264
40
7,6
312
152
140
2,4
294
31»
128
3,00
184
40
6,4
230
118
105
2,0
225
7 сентября
156
3,17
152
44
6,0
202
119
75
2,2
191
14»
156
3,17
136
46
5,6
188
114
65
2,0
181
21»
178
3,30
128
46
6,4
180
124
иО
2,4
176
28»
188
3,35
120
50
7,6
178
124
45
2,1
171
5 октября
■184
3,35
108
48
4,4
160
106
45
3,6
155
Сорт Мерло
Сорт Мерло
ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ
Известно, что кислотность винограда образуется в основном за счет трех органических кислот: винной,яблочной и небольшого количества лимонной. Каждая из. этих кислот ведет себя по-своему как во.время созревания,, так и во время брожения и хра- неивд вина; именно, такое индивиду^
альное поведение этих кислот в большей мере определяет состав и качество вина.
Результаты, выраженные в милли- грамэквивалентах и отнесенные к 1 л сусла, представлены в виде ациДо- метрических балансов в табл. 4.11.
Исходя из этих аналитических результатов и зная число ягод, необходимых для получения 1 л сока, вычисляют значения для 1000 виноградных ягод, приводимые в табл. 4.12.
Различия в изменении цифр в табл. 4.11 и табл. 4.12 являются следствием простого эффекта разбавления; эти различия увеличиваются с ростом ягоды. В таблице, которая относится к соку, цифры, выражающие сахара, возрастают не так быстро, как уменьшаются численные значения, обозначающие содержание кислот;
Обычно ссылаются на три одновременна' действующие причины пониже-
ДатаМасса1000 ягод, гСахара, гКислотность, мг-эквЩелочность золы, мг-эквnh4, мг-эквКислоты, мг-экв на 1000 ягодвиинаяяблочнаялимоннаяСорт Мерло18 августа10641208223,81041151,624»13172192303,41031181,731»147111152354,0103831,77 сентября151151128423,695681,614»156157106422,590551,621»15116586453,886432,028»14417394494,7106361,8Сорт Каберне Совиньон18 августа9352221255,91061241,724»ПО78189285,41091001,7.31»128101145315,093831,67 сентября125125120354,895601,714»131126ПО374,592551,621»128143102375,1100401,928»12114895396,098351,65 октября11814376343,175322,3ДатаМасса1000 ягод, гСахара, гКислотность, мг-эквЩелочность золы, мг-эквnh4, мг-эквКислоты, мг-экв на 1000 ягодвиинаяяблочнаялимоннаяСорт Мерло18 августа10641208223,81041151,624»13172192303,41031181,731»147111152354,0103831,77 сентября151151128423,695681,614»156157106422,590551,621»15116586453,886432,028»14417394494,7106361,8Сорт Каберне Совиньон18 августа9352221255,91061241,724»ПО78189285,41091001,7.31»128101145315,093831,67 сентября125125120354,895601,714»131126ПО374,592551,621»128143102375,1100401,928»12114895396,098351,65 октября11814376343,175322,3Изменение состава виноградной ягоды во время созревания (Пойак, Медок, 1970)Изменение состава виноградной ягоды во время созревания (Пойак, Медок, 1970)ния кислотности винограда в период созревания: явление разбавления, мобилизация оснований, нейтрализующих кислоты ягоды, и явление респи- рационного горения.
Дата
Масса
1000 ягод, г
Сахара, г
Кислотность, мг-экв
Щелочность золы, мг-экв
nh4, мг-экв
Кислоты, мг-экв на 1000 ягод
вииная
яблочная
лимонная
Сорт Мерло
18 августа
106
41
208
22
3,8
104
115
1,6
24»
131
72
192
30
3,4
103
118
1,7
31»
147
111
152
35
4,0
103
83
1,7
7 сентября
151
151
128
42
3,6
95
68
1,6
14»
156
157
106
42
2,5
90
55
1,6
21»
151
165
86
45
3,8
86
43
2,0
28»
144
173
94
49
4,7
106
36
1,8
Сорт Каберне Совиньон
18 августа
93
52
221
25
5,9
106
124
1,7
24»
ПО
78
189
28
5,4
109
100
1,7
.31»
128
101
145
31
5,0
93
83
1,6
7 сентября
125
125
120
35
4,8
95
60
1,7
14»
131
126
ПО
37
4,5
92
55
1,6
21»
128
143
102
37
5,1
100
40
1,9
28»
121
148
95
39
6,0
98
35
1,6
5 октября
118
143
76
34
3,1
75
32
2,3
Дата
Масса
1000 ягод, г
Сахара, г
Кислотность, мг-экв
Щелочность золы, мг-экв
nh4, мг-экв
Кислоты, мг-экв на 1000 ягод
вииная
яблочная
лимонная
Сорт Мерло
18 августа
106
41
208
22
3,8
104
115
1,6
24»
131
72
192
30
3,4
103
118
1,7
31»
147
111
152
35
4,0
103
83
1,7
7 сентября
151
151
128
42
3,6
95
68
1,6
14»
156
157
106
42
2,5
90
55
1,6
21»
151
165
86
45
3,8
86
43
2,0
28»
144
173
94
49
4,7
106
36
1,8
Сорт Каберне Совиньон
18 августа
93
52
221
25
5,9
106
124
1,7
24»
ПО
78
189
28
5,4
109
100
1,7
.31»
128
101
145
31
5,0
93
83
1,6
7 сентября
125
125
120
35
4,8
95
60
1,7
14»
131
126
ПО
37
4,5
92
55
1,6
21»
128
143
102
37
5,1
100
40
1,9
28»
121
148
95
39
6,0
98
35
1,6
5 октября
118
143
76
34
3,1
75
32
2,3
Изменение состава виноградной ягоды во время созревания (Пойак, Медок, 1970)
Изменение состава виноградной ягоды во время созревания (Пойак, Медок, 1970)
В течение 45 дней от начала созревания до зрелости, несмотря на транспирацию, вода поступает в плод непрерывно. Ягода удваивает свой объем. Массу воды, полученной виноградом, можно приблизительно вычислить по увеличению его массы, за вычетом массы сахаров. При этом констатируют, что процентное содержание кислот пропорционально снижается в сусле в 2 раза больше, чем в виноградной ягоде. Следовательно, разбавление и горение поровну участвуют в уменьшении кислотности.
Синтез винной и яблочной кислот
Когда сравнивают содержание в винограде винной и яблочной кислот в два четко определенных периода его развития: в начале созревания и в фазе зрелости, в разные годы, то констатируют, что не только эти содержания колеблются по годам, но и отношения содержания винной кислоты к содержанию яблочной кислоты также будут разными. По результатам анализов (двух сортов), проводившихся авторами на шести разных виноградниках в течение двух десятков лет, это отношение изменялось в начале созревания от 0,71 до 2,07 и в момент зрелости— от 1,27 до 5,20.
ГодВ половине фазы начала созреванияВ фазе зрелостивиннаякислотаяблочная кислотаотношение винной кислоты к яблочнойвинная кислотаяблочная кислотаотношение винной кислотык яблочной19651642070,79109821,3319661561970,79117442,6619671762020,87102323,1919681512060,73104731,42• 19691832030,90132552,4019701531860,82103343,01ГодВ половине фазы начала созреванияВ фазе зрелостивиннаякислотаяблочная кислотаотношение винной кислоты к яблочнойвинная кислотаяблочная кислотаотношение винной кислотык яблочной19651642070,79109821,3319661561970,79117442,6619671762020,87102323,1919681512060,73104731,42• 19691832030,90132552,4019701531860,82103343,01Таблица 4.13Таблица 4.13Среднее содержание винион и яблочной кислот по годам в мг-экв на 1 л сокаСреднее содержание винион и яблочной кислот по годам в мг-экв на 1 л сока
Год
В половине фазы начала созревания
В фазе зрелости
винная
кислота
яблочная кислота
отношение винной кислоты к яблочной
винная кислота
яблочная кислота
отношение винной кислоты
к яблочной
1965
164
207
0,79
109
82
1,33
1966
156
197
0,79
117
44
2,66
1967
176
202
0,87
102
32
3,19
1968
151
206
0,73
104
73
1,42
• 1969
183
203
0,90
132
55
2,40
1970
153
186
0,82
103
34
3,01
Год
В половине фазы начала созревания
В фазе зрелости
винная
кислота
яблочная кислота
отношение винной кислоты к яблочной
винная кислота
яблочная кислота
отношение винной кислоты
к яблочной
1965
164
207
0,79
109
82
1,33
1966
156
197
0,79
117
44
2,66
1967
176
202
0,87
102
32
3,19
1968
151
206
0,73
104
73
1,42
• 1969
183
203
0,90
132
55
2,40
1970
153
186
0,82
103
34
3,01
Таблица 4.13
Таблица 4.13
Среднее содержание винион и яблочной кислот по годам в мг-экв на 1 л сока
Среднее содержание винион и яблочной кислот по годам в мг-экв на 1 л сока
В табл. 4.13 приведены данные содержания винной и яблочной кислот.
Изменение содержания винной кислоты
Обычно считают, что в противоположность яблочной кислоте, содержание которой постоянно уменьшается, процентное содержание винной кислоты в виноградной ягоде остается довольно постоянным. Это в общем точно для большей части урожаев, когда содержание кислот определяют лишь в начале и в конце периода созревания, но при детальном рассмотрении, это оказывается далеко не так. В действительности процентное содержание винной кислоты непрерывно изменяется (рис. 4.3; 4.4; 4.5).
Например, летом 1937 г. климатические факторы в районе Бордо позволили зафиксировать явления, которые обычно проходили незамеченными. Для этого лета характерным был период засухи и сильной жары, который продолжался с начала созревания до 10 сентября (средняя из максимальных температур 29° С). В течение этого времени содержание винной кисло
ты заметно понизилось у всех сортов, потому что она сгорала быстрее, а приток ее замедлился. Затем в течение одиннадцати дней подряд шли дожди с общим количеством осадков 75 мм. В таких случаях наблюдают резкое повышение кислотности в ягодах в форме винной кислоты (см. рис. 4.3). Повышается щелочность золы и одновременно увеличивается содержание как тартратов, так и винной кислоты в свободном состоянии (см. рис. 4.4 и 4.5).
Если кривая эволюции винной кислоты в ягоде представляет четко выраженный подъем, за которым следует снижение, то такой характер кривой объясняется контрастами метеорологических условий лета. После жарких дней, когда наблюдается уменьшение содержания винной кислоты, выпадают обильные дожди, которые вызывают интенсивную миграцию; последующие 3 нед сухой и солнечной погоды привели к новому уменьшению содержания этой кислоты.
Таким образом, содержание винной кислоты в виноградных ягодах находится в тесной связи с температурой и особенно с циркуляцией воды в. штамбе.
Изменение содержания яблочной
кислоты
По аналогии можно подумать, что процентное содержание яблочной кислоты зависит от этих же явлений миграции и горения, но в начале созревания миграция этой кислоты не компенсирует очень интенсивного горения. В данном случае концентрация
Рис. 4.3. Эволюция ВИННОЙ КИСЛОТЫ В BHUO- граднон ягоде в период созревания в 1937 г. (Район Бордо) сортов:
/ — Каберне; 2— Мерло; 3— Совиньон; 4— Семильон; 5 — Мальбек.
Рис. 4.4. Эволюция винной кислоты в виноградной ягоде в период созревания в 1938 г. (район Бордо) сортов:
1 — Каберне фран; 2— Мерло; 3— Совиньон; 4 — Семильон; 5 — Мальбек.
яблочной кислоты непрерывно и очень быстро уменьшается. Выше было показано, что интенсивность дыхания всегда более чем достаточна для объяснения исчезающих количеств яблочной кислоты. С другой стороны, в зре-
Число дней после начала созребания
Рис. 4.5. Сравнительная эволюция винной кислоты в виноградной ягоде в период созре вания, по наблюдениям за 6 лет. Во избежание взаимного наложения графики сдвинуты относительно один другого (интервал между горизонтальными линиями сетки равен 10 мг-экв):
/ — 1952 г.; 2 — 1953; 3 — 1954; 4 — 1955; 5 — 1956; 6— 1957 г.
лом винограде активно протекает превращение яблочной кислоты в глюкозу (Ж Риберо-Гайон, 1959).
На содержание яблочной кислоты в винограде влияют три основных фактора: метеорологические условия лета, сорт и крю, под которым понимают комплекс «почва — микроклимат». На рис. 4.6 показана эволюция яблочной кислоты во время созревания в различные годы. Содержание этой кислоты уменьшается более или менее равномерно, очень быстро в пе-
риод созревания винограда и более медленно в последующий период. Иногда отмечают небольшое повышение содержания яблочной кислоты в дни, предшествующие достижению полной зрелости. В некоторые годы виноградное растение синтезирует больше винной и меньше яблочной
Рис. 4.6. Эволюция яблочной кислоты в период созревания по наблюдениям за 6 лет:
/— 1953 г.; 2— 1954; 3— 1955; 4— 1952;
5— 1956; 3— 1957 г.
кислоты, следовательно, винная кислота в ягодах, так же, как и яблочная, участвует в образовании окончательной кислотности.
Как правило, процентное содержание винной кислоты больше зависит от года, чем от крю, т. е. от особенностей почвенно-климатического комплекса на данном участке; яблочная же кислота зависит от крю в такой же степени, как и от года.
Для ряда сортов, культивируемых в
Западной Германии, Вейнар (1965, 1967) подтверждает хорошо известное отношение между температурами лета и содержанием яблочной кислоты. Когда число дней с максимальной температурой не менее 25° С составляет от 45 до 60, яблочная кислота в суслах имеет 'концентрацию, примерно, 5 г/л; если же число таких дней меньше 30, ю концентрация будет, примерно, 10 г/л.
Кливер (1967) сравнил концентрации тартратов и малатов у ягод 26 видов Vitis и 50 сортов Vitis vinifera, культивируемых в сравнимых условиях. Винная кислота составляла от 14 до 80% содержания всех анионов в ягодах различных видов Vitis и от 42 до 79% у сортов Vitis vinifera. Этот же автор в 1971 г. установил определяющее влияние температуры на уменьшение концентрации органических кислот; интенсивность освещения играет лишь второстепенную роль.
Изменение содержания кислот в гребне и в кожице
Выше отмечалось, что твердые ткани грозди примерно с одинаковым процентным содержанием анионов содержат намного больше кислот в виде солей, чем мякоть. Это выражается в явно более высоких значениях pH этих тканей, чем у сусла (например, pH 4,3 вместо 3,3). Отсюда также следует, что настаивание на мезге, состоящей из кожицы и семян, и в известных случаях на гребнях заметно снижает кислотность красных вин и несколько повышает pH.
В табл. 4.14, составленной для винограда сорта Семильон, показано постоянство содержания винной кислоты в гребне и уменьшение в кожице, а также снижение содержания яблочной кислоты в гребне и стабильность в кожице. У красных сортов со-
Часть гроздиДата измерения■ pHКислот ность, МГ-ЭКВЩелочность золы, МГ-ЭКВСумма катионовКислоты, мг-экв на 1 кг свежей массыСумма анионоввиннаяяблоч-лимоннаяГребень4 сентября4,257114221386102719514 сентября4,4081140■ 221701407217 -24 сентября4,2069112181689741691 октября4,30721442161069072038 октября4,305810416286805172Кожииа4 сентября3,551307320385106419514 сентября4,109410519974105318224 сентября4,20791081876610031691 октября4,3063110173. 639531618 октября4,3067116183' 641103177Мякоть4 сентября2,8034635381108255336614 сентября3,011864022688147223724 сентября3,25131411727510021771 октябоя3,2912545170 '809221748 октября3,381094515469852156Часть гроздиДата измерения■ pHКислот ность, МГ-ЭКВЩелочность золы, МГ-ЭКВСумма катионовКислоты, мг-экв на 1 кг свежей массыСумма анионоввиннаяяблоч-лимоннаяГребень4 сентября4,257114221386102719514 сентября4,4081140■ 221701407217 -24 сентября4,2069112181689741691 октября4,30721442161069072038 октября4,305810416286805172Кожииа4 сентября3,551307320385106419514 сентября4,109410519974105318224 сентября4,20791081876610031691 октября4,3063110173. 639531618 октября4,3067116183' 641103177Мякоть4 сентября2,8034635381108255336614 сентября3,011864022688147223724 сентября3,25131411727510021771 октябоя3,2912545170 '809221748 октября3,381094515469852156Ацидотиетрические балансы в различных частях грозди (сорт Семильон) (Леоньан)Ацидотиетрические балансы в различных частях грозди (сорт Семильон) (Леоньан)яблочной кислотыяблочной кислоты55держаниедержаниераз выше,раз выше,кожицекожицеиногдаиногдачемчемначаленачалеи ви вввввПо мере созревания вино-По мере созревания вино-минерального непрерывно, возрастает, аминерального непрерывно, возрастает, а
Часть грозди
Дата измерения
■ pH
Кислот ность, МГ-ЭКВ
Щелочность золы, МГ-ЭКВ
Сумма катионов
Кислоты, мг-экв на 1 кг свежей массы
Сумма анионов
винная
яблоч-
лимонная
Гребень
4 сентября
4,25
71
142
213
86
102
7
195
14 сентября
4,40
81
140
■ 221
70
140
7
217 -
24 сентября
4,20
69
112
181
68
97
4
169
1 октября
4,30
72
144
216
106
90
7
203
8 октября
4,30
58
104
162
86
80
5
172
Кожииа
4 сентября
3,55
130
73
203
85
106
4
195
14 сентября
4,10
94
105
199
74
105
3
182
24 сентября
4,20
79
108
187
66
100
3
169
1 октября
4,30
63
110
173
. 63
95
3
161
8 октября
4,30
67
116
183
' 64
110
3
177
Мякоть
4 сентября
2,80
346
35
381
108
255
3
366
14 сентября
3,01
186
40
226
88
147
2
237
24 сентября
3,25
131
41
172
75
100
2
177
1 октябоя
3,29
125
45
170 '
80
92
2
174
8 октября
3,38
109
45
154
69
85
2
156
Часть грозди
Дата измерения
■ pH
Кислот ность, МГ-ЭКВ
Щелочность золы, МГ-ЭКВ
Сумма катионов
Кислоты, мг-экв на 1 кг свежей массы
Сумма анионов
винная
яблоч-
лимонная
Гребень
4 сентября
4,25
71
142
213
86
102
7
195
14 сентября
4,40
81
140
■ 221
70
140
7
217 -
24 сентября
4,20
69
112
181
68
97
4
169
1 октября
4,30
72
144
216
106
90
7
203
8 октября
4,30
58
104
162
86
80
5
172
Кожииа
4 сентября
3,55
130
73
203
85
106
4
195
14 сентября
4,10
94
105
199
74
105
3
182
24 сентября
4,20
79
108
187
66
100
3
169
1 октября
4,30
63
110
173
. 63
95
3
161
8 октября
4,30
67
116
183
' 64
110
3
177
Мякоть
4 сентября
2,80
346
35
381
108
255
3
366
14 сентября
3,01
186
40
226
88
147
2
237
24 сентября
3,25
131
41
172
75
100
2
177
1 октябоя
3,29
125
45
170 '
80
92
2
174
8 октября
3,38
109
45
154
69
85
2
156
Ацидотиетрические балансы в различных частях грозди (сорт Семильон) (Леоньан)
Ацидотиетрические балансы в различных частях грозди (сорт Семильон) (Леоньан)
яблочной кислоты
яблочной кислоты
5
5
держание
держание
раз выше,
раз выше,
кожице
кожице
иногда
иногда
чем
чем
начале
начале
и в
и в
в
в
в
в
По мере созревания вино-
По мере созревания вино-
минерального непрерывно, возрастает, а
минерального непрерывно, возрастает, а
ниже. Эволюция органических кислот в гребне и кожице происходит иначе, чем в мякоти. Бедные сахарами, богатые неорганическими веществами и полифенолами, эти ткани по своему составу ближе к листу, чем к мякоти. Плодоножка и эпидермис в некотором роде не являются частями сочного плода.
ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ
АЗОТИСТЫХ ВЕЩЕСТВ
После Жирара и Линде, которые - наблюдали обогащение азотом виноградной ягоды во время созревания, Лаборд и Вантр в своих работах указали на уменьшение содержания гидрата окиси аммония, а Пейно — на эволюцию аминного азота.
В табл. 4.15 показана эволюция различных форм азота в винограде.
В состоянии зрелости содержание азота в мякоти, как правило, в 2, а
созревания.
град накапливает азот.
Катион аммония или азота поступает в ягоду но его концентрация не
обычно даже уменьшается, так как по мере созревания он расходуется на синтез органических азотистых веществ. В зеленом винограде катион аммония часто составляет ’/г и даже 4/5 общего азота; начало созревания является исходным моментом активного протеосинтеза.
Во время созревания содержание различных свободных аминокислот в ягодах и в сусле непрерывно возрастает (Лафон-Лафуркад и Гимберто, 1962). Пропорция аминного азота, содержащегося в зеленом винограде, всегда мала, иногда близка к нулю; и только после начала созревания виноград начинает синтезировать значительные количества аминокислот. Увеличение содержания аминного азота
Таблица 4,15
Распределение и изменение содержания азота в виноградной ягоде (сорт Семильон)
Дата
Масса 100 ягод, г
Азот, мг-экв на 1000 ягод
общий
нерастворимый
растворимый
Растворимый в мякоти
семена
кожица
мякоть
NH,
хн2
белко-
азот
нолипептид- ный азот
25
августа
950
970
435
345
195
95
75
6
19
4
сентября
1000
ИЗО
444
208
208
64
98
16
30
14
1640
1250
474
481
292
80
128
40
44
24
»
1710
1360
400
620
341
68
150
57
66
1
октября
1790
1520
394
770
354
85
138
63
68
8
1830
1590
386
865
363
98
139
55
71
менее пропорционально, чем возрастание общего азота. Отмечается, что по мере созревания винограда азотистые вещества мякоти образуются за счет более тяжелых молекул. Так же возрастают гексозамины (Дейбнер, 1964).
Катион аммония, аминокислоты, слабо полимеризованные полипептиды являются обычными формами миграции; незначительный объем их молекул позволяет им легко циркулировать в растении. Катион аммония поступает из нитратов почвы и остатков разложения; аминный азот и полипептиды поступают из листьев. С другой стороны, пептоны и белки, имеющие большие молекулы, образуются в самой ягоде из предшествующих веществ.
Все изложенное выше относится только к эволюции азотистых веществ в мякоти. В целом мякоть относительно бедна азотом; в ней содержится или Vs часть всего азота ягоды, тогда как по массе мякоть составляет от 70 до 80%. Почти весь азот находится в кожице и семенах.
Если рассматривать ягоду в целом виде, то часто в конце периода созревания наблюдают прекращение миграции азота и перераспределение его в виноградной ягоде. Семя достигает
физиологической зрелости до полного созревания плода и начинает отдавать свой азот тканям мякоти. Таким образом, семя теряет от 15 до 20% своего азота в виде аммиака. Несомненно, оно отдает и другие вещества, представляющие интерес с точки зрения энологии.
Содержание азота в зрелом винограде является одной из характеристик сорта. Например, в одинаковых условиях культуры Каберне Совиньон, Мальбек, Совиньон богаты азотом; Семильон, Мерло относятся к сортам, содержание азота в которых относительно невелико.
Вопросы биосинтеза аминокислот и белков детально разработали Ж- Риберо-Гайон и П. Риберо-Гайон (1971).
ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
Исследование этой эволюции сталкивается с трудностями экстракции этих соединений из различных частей винограда. П. Риберо-Гайон (1971— 1972) реализовал экстракцию фенольных соединений из кожицы и семян с помощью водно-спиртового раствора (15° Гей-Люссака), частично подкисленного винной кислотой (pH 2,45).
Проводили три операции по экстрагированию при температуре окружающей среды и затем три другие — при температуре 100° С. Такая методика позволяет оценить применительно к исследуемой растительной ткани способность этих веществ переходить в раствор. Легкость растворения их представляет собой важный энологический фактор.
В табл. 4.16 приведены результаты нескольких экспериментов, проведенных автором в период созревания винограда способом общей экстракции.
Таблица 4.16
Изменение содержания фенольных соединений в период созревания винограда (по данным П. Риберо-Гайона, 1972) (сорт Каберне
Совнньон, урожай 1970 г.)
Дата
В кожице
В семенах
а о
* *
8°
со
5 ^ О
=8
11
ж
- о
2 Ж
Жо
24 августа
0,45
37,5
4,20
76,0
7,35
31»
1,20
46,5
4,15
56,5
3,65
3 сентября
1,45
39,0
2,70
69,0
3,50
14»
2,15
49,5
3,75
30,5
2,10
21»
2,30
60,5
4,25
29,5
2,10
28»
|2,65
55,5
8,30
26,0
1,40
5 октября
2,10
46,0
4,35
29,5
2,15
В случае антоцианов 75% и более пигментов экстрагировали на холоде; можно считать, что после второй экстракции они были извлечены полностью; кожица стала совершенно бесцветной. Что касается танинов, то здесь было другое положение; экстракция на холоде составляла примерно 30% и, как исключение, достигала 50%; экстракция была неполной даже после обработки при повышенной температуре.
Понятен интерес, который представляют для энологов эти наблюдения. Нетрудно вычислить, что 1,3 кг вино-
града, необходимого для приготовления 1 л вина, содержат около 2 г антоцианов и 9 г танина. Однако в молодом красном вине содержится только 'Д часть этих количеств, 3Д этих веществ выбрасываются с выжимкой. Обер и Пу (1969) пришли к этому же выводу.
Уже в начале созревания содержание танина в кожице достигает значительной величины и иногда составляет больше половины того количества, которое бывает в состоянии зрелости. Антоцианы же появляются с момента
начала созревания, и их содержание непрерывно возрастает; как и у танинов, накопление -их достигает максимума и затем в состоянии зрелости и перезрелости содержание антоцианов уменьшается. Это явление наблюдали также Лепадату и сотрудники (1971).
Общие танины семян сильно уменьшаются в начальной стадии периода созревания. Сорт Каберне Совиньон, как правило, богаче фенольными соединениями, чем сорт Мерло; особенно различие проявляется в содержании этих веществ в семенах.
Когда сравнивают урожаи 1969, 1970 и 1971 гг., то наблюдают значительные расхождения: в 1969 г. виноград был с меньшим содержанием фенольных соединений, а в 1970 г. был слабее окрашен и имел больше дубильных веществ. В расчете на 1000 ягод содержание антоцианов колеблется от 1,2 до 2,2 г для сорта Мерло, от 1,4 до 2,4 —для сорта Каберне Совиньон, содержание танинов в кожице изменяется соответственно от 3,8 до 4,6 г и от 4,0 до 5,9 г.
П. Риберо-Гайон сделал заключение, что фенольные соединения и особенно антоцианы относятся к тем компонентам винограда, которые больше всего подвержены влиянию климатических условий года. Отсюда понятна важная роль, которую играют феноль-
Изменение содержания витаминов группы В во время созревания винограда (в мкг на 1000 ягод)
Витамины, мкг
Эволюция витаминов через определенное количество дней
начало созревания
через 10 дней
через
20 дней
через
30 дней
через
40 дней
через 50 дней (зрелость)
Тиамин
152
212
214
306
357
253
Рибофлавин
8,8
5,2
7,5
5,6
4,5
3,6
Пантотеновая кислота
340
460
580
630
610
660
Никотинамид
390
460
590
630
660
700
Пиридоксин
140
230
290
300
260
260
Биотин
3,1
3,0
1,8
2,3
2,2
2,2
Мезоинозит, мг
118
184
212
247
238
297
АминоСензойная кислота
1,0
—
4,4
9,4
12
14
Фолиевая кислота
0,4
0,6
0,9
1,2
1,3
Холин, мг
9
—
20
22
22
24
ные соединения в характеристике вина с указанием года урожая.
- Кливер (1970), Кливер и сотрудники (1972) исследовали влияние факторов температуры и оовещенности на окраску винограда различных сортов. Чем больше освещенность, тем интенсивнее окраска виноградных ягод. С другой стороны, самые высокие температуры отнюдь не являются самыми благоприятными; например, дневная температура порядка 35° С препятствует образованию антоцианов. Важное значение имеют температуры ночи; при постоянной дневной температуре (25° С) виноград оказывается тем больше окрашенным, чем ниже температуры ночью.
Ж. Риберо-Гайон и П. РибероТай- юн (1971) описали общие механизмы, позволяющие истолковывать биосинтез фенольных соединений у высших растений, а также дали документальное обоснование образования и эволюции этих соединений в винограде.
ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ВИТАМИНОВ ГРУППЫ В
Витамины группы В винограда общим числом десять можно определять
микробиологическими методами. Пей- но и Лафуркад (1958) составили приведенную табл. 4.17 эволюции этих витаминов в виноградной ягоде.
Чаще всего количество витаминов в винограде возрастает во время созревания, за исключением биотина, содержание которого уменьшается. Некоторые витамины, и в частности тиамин, достигают своего максимума за несколько дней или несколько недель до полной зрелости.
Наиболее зрелые ягоды необязательно содержат наибольшее количество витаминов. Перезрелость ягод также сопровождается небольшими понижениями их содержания (табл. 4.17).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗРЕЛОСТИ
Очень трудно дать строгое определение состояния зрелости винограда. Все имеют представление о зрелом винограде, но зрелость не является абсолютной характеристикой. К моменту уборки виноград является более или менее зрелым в зависимости от температур лета. Зрелость бывает большей или меньшей или наступает более или
менее быстро в зависимости от сорта, способов культуры и условий года. Не существует какого-то жесткого, определенного состояния физиологической зрелости, легко поддающегося определению, но имеются определенные градации зрелости.
Определение может изменяться в зависимости от того, какую цель себе ставят; оно будет различным для столовых и технических сортов, а для последних — также в зависимости от качества и типов вырабатываемых вин. Если речь идет только об объеме урожая, зрелость определяется моментом, когда средний объем ягод и их масса достигают максимума. При продаже вина с учетом спиртуозности в процентах объемных исследуют только производство спирта, в этом случае зрелость соответствует максимальной сахаристости ягод, и тогда определяют выход сахара на 1 га. Когда же прежде всего интересует качество, то не следует спешить с началом уборки даже в ущерб количеству, чтобы в некоторых случаях обеспечить небольшое концентрирование сахаров и более полное сгорание яблочной кислоты. В районе Бордо, в Бургундии стараются таким путем добиться легкой перезрелости винограда, без чего не бывает настоящего качества вин. С другой стороны, для сортов, выращиваемых в некоторых жарких районах, а также для сортов, предназначенных для производства белых сухих вин, с целью сохранения достаточной кислотности можно начинать уборку винограда до достижения срока его нормальной зрелости.
Делались попытки определить состояние зрелости винограда путем простых аналитических величин или по отношениям между этими величинами. Однако эта проблема так легко не решается, особенно в таких районах, где состояние зрелости изменяется .в
зависимости от года. Для этого нужно, чтобы кривые изменений для различных компонентов были правильными и всегда похожими и особые условия каждого года выражались только изменением даты, когда виноград достигает заданного состояния зрелости. Между тем нет никакой зависимости между изменениями сахаров, кислот, оснований, красящих веществ, так как эти явления имеют различные физиологические механизмы. Зрелость не является постоянным состоянием, существует много различных состояний зрелости (за исключением некоторых жарких районов, где виноград хорошо вызревает каждый год и в каждом урожае дает вина одного и того же состава).
Показатель созревания
Было отобрано большое количество показателей отношений между компонентами винограда для того, чтобы определить состояние зрелости, и, конечно, отношение содержания сахара к кислотности, называемое показателем зрелости, или глюкоацидометри- ческим показателем, является наиболее простым и показательным. Это отношение основано на эмпирическом выводе, согласно которому в период созревания сахаристость изменяется обратно пропорционально кислотности. Однако такое отношение не имеет физиологического обоснования, и поэтому было много случаев, когда сообщали об исключениях из этого правила. Определенному количеству накопленных сахаров не всегда соответствует такая же потеря кислотности.
Отношение сахара к кислотности плохо подходит для сравнения сортов между собой, так как среди них существуют такие, которые одновременно и содержат много сахара и имеют высокую кислотность, как, например.
Изменение отношения сахара к кислотности во время созревания (Пойак, 1970)
Дата
Сахара, г/л
Кислотное гь, г/л
Сахара
Сахара, г/л
Кислотное ть,
Сахара
кислотность
кислотность
18 августа
72
Сорт Me
17,6
ЗЛО
4,0
Сс
84
рт Каберне
17,4
2овиньон
4,8
24»
100
13,1
7,6
108
13,0
8,2
31»
134
9,02
14,0
128
9,02
14,0
7 сентября
166
6,86
24,0
156
7,96
19,0
14»
172 '
5,68
30,0
156
6,67
23,0
21»
192
4,90
39,0
178
6,27
28,0
28»
192
5,10
37,0
188
5,88
32,0
5 октября
—
—
—
184
5,30
34,0
аорт Пти Вердо. Однако не будучи абсолютно правильным, это отношение удобно для использования в практической работе и обладает определенной сравнительной ценностью.
Отношение сахара к кислотности рассчитывают по содержанию сахара, выраженному в граммах на 1 л сусла, при прямом определении качества, -или же на практике, вычисляют просто по плотности сусла и по титруемой кислотности, выражаемой в граммах серной кислоты на 1 л сусла (обычно для винограда технических сортов) или в граммах винной кислоты (для столового винограда). В других странах рассчитывают отношение Кельхофера путем деления градусов Эксле сусла на кислотность, выраженную в граммах винной кислоты. Градус Эксле, применяемый также в Эльзасе, представляет собой разность между 1000 и плотностью сусла, например, плотность сусла 1083,5 соответствует 83,5° Эксле.
В табл. 4.18 показана эволюция отношения сахара к кислотности для двух сортов.
Учитывая, что содержание яблочной кислоты в период созревания постоянно возрастает, а винной обычно почти стабильно, Бараджьола предложил
определять степень зрелости отношением
Винная кислотах 100
Общая кислотность
кислотность выражена в граммах винной кислоты.
Ферре видоизменил этот расчет и назвал коэффициентом созревания следующее отношение:
Винная кислотахЮО
Кислотность+щелочность золы
Это отношение в целом выражает процентное содержание винной кислоты относительно содержания общих анионов. Полностью избегая количественного анализа яблочной кислоты, оно дает те же результаты, как и отношение
Винная кислота
Винная кислота+яблочная кислота ’
однако известно, что нет связи между синтезами этих двух кислот.
Ферре также указал на коэффициент связывания кислот
/ Щелочность золыХЮО \ 2
\Кислотность+щелочность золы/ ’
который бывает относительно более высоким в год хорошей зрелости.
Коэффициенты созревания винограда в разные годы
Дата
Сахара
Коэффициенты
Винная кислота х 10 яблочная кислота
Коэффициент связывания
Бараджьола
Ферре
кислотность
18 сентября, 1970 г.
38
из
74
39
68
26»1966 г.
33
95
69
32
45
2 октября, 1967 г.
59
93
65
21
59
29 сентября, 1969 г.
21
82
63
17
45
2 октября, 1968 г.
29
62
46
10
51
5»1965 г.
23
82
64
20
43
Примечание. Коэффициенты рассчитаны во время сбора винограда сорта Мерло на одном и том же участке Пойак, годы даны в порядке убывания качества.
В общем этот показатель связывания основан на непрерывном накоплении катионов, в то время как органические кислоты постепенно уменьшаются. Это накопление, по существу, не зависит от сгорания кислот и увеличения количества сахаров.
Эти отношения могут показаться приемлемыми, так как в процессе созревания кислотность понижается, тогда как концентрация сахаров и минеральных веществ возрастает. Но эти явления вызываются различными факторами: количество сахаров связано с инсоляцией, мобилизацией глюцидных резервов; винная кислота зависит прежде всего от режима дождей, сгорание яблочной кислоты особенно зависит от температуры; неорганические основания зависят от циркуляции воды в растении.
Сравнение всех коэффициентов показано в табл. 4.19.
Из рассмотрения приведенных выше данных можно сделать вывод, что ни один из этих показателей не может дать логической классификации урожаев в зависимости от состояния их зрелости.
4 Зак. 1929
Фиксирование даты сбора винограда
Во многих районах имеется тенденция убирать урожай возможно раньше. Это повторяют со времен Оливье де Серр и констатируют почти при каждой уборке. Это первая причина, из-за которой качество вина далеко не всегда такое, каким оно могло бы быть. Конечно, спешку с началом уборки можно, с одной стороны, понять. Дело в том, что виноградарь опешит скорее убрать продукт годового труда в надежное место. Нужно также учитывать обязанность назначать заранее начало сбора, трудность изменить эту дату, если потребуется, или прервать уже начатую уборку, невозможность предвидеть погоду и, наконец, условия найма рабочей силы и организацию работ. Имеет значение и пример соседей, перед которым трудно устоять. Так как на некоторых виноградниках сбор урожая тянется несколько недель, то иногда его начинают слишком рано, чтобы не рисковать закончить уборку слишком поздно. Серьезную угрозу для урожая всегда представляют непогоды. Град и
9T
ночные заморозки в это время бывают редко, но затяжные дожди могут сильно затруднить работу, вызвать снижение сахаристости и потерю части урожая из-за развития гнили или опадания ягод. Эти трудности и риск — реальные вещи, но когда добиваются качества, возможен только один выход, потому что слишком ранняя уборка наносит ему непоправимый ущерб.
Дату начала сбора урожая все еще зачастую определяют на основе опыта. Однако недостаточно учитывать внешний вид грозди, сахаристость или кислотность ягод, их сочность, устойчивость к отделению, цвет гребня и др. Нужно определить массу ягоды, ее сахаристость, процентное содержание кислот. В некоторых районах эту дату назначают по длительности вегетационного цикла винограда, который в каждом году считают постоянным. Таким путем можно намечать начало уборки за 3 мес, считая, что от периода полного цветения до уборки проходит около 100 дней; кроме того, считают, что с начала созревания до полной зрелости проходит 1,5 мес. Эти вегетационные циклы достаточно точные, если брать среднее значение за несколько лет, но все же зависят от метеорологических условий. Заранее намеченные сроки могут быть нарушены климатологическими аномалиями, непрерывными дождями или длительной засухой, что задерживает нормальную эволюцию созревания.
Табл. 4.22 и 4.23, где приведены климатологические условия за несколько лет в районе Бордо, показывают относительное постоянство вегетационного цикла. С середины периода цветения и до наступления зрелости насчитывают от 104 до 120 дней и от середины периода начала созревания до наступления зрелости — от 41 до 53 дней. Следовательно, в июне уже можно рассчитать дату начала
уборки с точностью до 8 дней. В августе ее можно назначить с точностью от 4 до 5 дней, считая, что с_момента, когда половина ягод изменит свою окраску, потребуется 45 дней. У сортов раннего созревания вегетационный цикл короче.
Виноградарю весьма полезно следить каждый год за ходом созревания винограда на одном и том же винограднике, определяя содержание сахара (сахариметром) и кислотность.
Таким образом, можно констатировать, что созревание в одном и том же районе и даже на одном и том же участке протекает по-разному; существуют очень благоприятные микроклиматы, обеспечивающие более раннее созревание. В каждом хозяйстве и в каждом году бывают делянки, с которых начинают сбор урожая. Это исследование является основой рационального определения даты начала уборки; кроме того, оно позволяет знать заранее состав сусла и соответственно информировать винодела об особенностях переработки винограда данного урожая.
Таким образом, продолжает соблюдаться старинный обычай провозглашения начала сбора винограда. Возникшая еще в эпоху феодализма, такая церемония проводится в наши дни во Франции по инициативе властей коммун. Раньше этого дня виноградарям не разрешается начинать сбор урожая. Такой порядок обеспечивал поддержание качества вин и престижа их марок.
В районе Бордо начало уборки винограда чаще всего приходится на последнюю неделю сентября. Согласно записям, которые ведутся уже более 150 лет, крайние сроки зарегистрированы 18 августа 1893 г. и 27 октября 1816 г. Двадцать раз сбор винограда начинали до 15 сентября и двадцать раз — после 30 сентября.
Уместно подчеркнуть еще раз, что для получения возможно лучшего качества необходимо ждать полной зрелости. Сбор винограда следует проводить сорт за сортом и в этом отношении, очевидно, более целесообразно производить посадки каждого сорта на отдельных участках. Некоторые авторы рекомендуют сбор урожая в два срока; сначала снимать грозди с верхней части куста, а по истечении некоторого времени — с остальных побегов.
Нужно также подчеркнуть, что способы коррекции сусел не позволяют компенсировать нарушение равновесия, вызываемое неполной зрелостью. Шаптализация, концентрация повышают процентное содержание сахаров без снижения кислотности недостаточно зрелого винограда. С другой стороны, раскисление удаляет винную, а не молочную кислоту, как это происходит в процессе естественного созревания. Следовательно, • разрешение проводить коррекцию сусел не должно побуждать к более раннему началу сбора винограда.
ФАКТОРЫ СОЗРЕВАНИЯ И КАЧЕСТВА ВИНОГРАДА
Существуют различные виды факторов, влияющих на состав винограда: а) перманентные факторы, которые действуют постоянно и не подвержены годовым изменениям, включая в себя сорт, подвой, климат, характер почвы, возраст насаждений. Они представляют собой достояние виноградника; б) климатологические факторы, которые могут изменяться с каждым годом и которые создают характерные особенности урожая данного года — это температура, инсоляция, влажность и их периодичность по отношению к вегетационному циклу; в) изменяемые факторы — условия культуры, обрезка, удобрения и т. д.; г) факторы случайные — грибные болезни,
например мильдью, оидиум, гниль, и не менее важные резкие изменения метеорологических условий.
Ниже будет рассмотрено влияние некоторых из этих факторов на процесс созревания и на состав винограда в состоянии зрелости.
Ранкин и сотрудники (1971) провели в Австралии глубокое изучение факторов, определяющих состав винограда и качество вин.
Сравнительный состав винограда различных сортов
Сорта различаются особенностями своего развития и видом разных органов растения: листьев, ветвей, гроздей. Но между ними существуют также различия физиологического порядка, выражающиеся в исключительном разнообразии состава мякоти и других частей винограда. Различные ароматические вещества кожицы придают винограду его вкус, а вину — его особый аромат. Наряду с этим знание химических характеристик разных сортов, и в частности элементов кислотности, имеет большое значение для понимания различий между разными типами вин. В данном случае будут рассмотрены только бордоские сорта, которые лучше известны авторам, и в качестве примера проанализированы аналитические данные табл. 4.20, относящиеся к этим сортам.
Ясно, что ягоды разных сортов ведут себя неодинаково в период созревания; известно также, что сусла имеют значительные различия по своему составу. Кислотность и особенно содержание яблочной кислоты являются наиболее изменчивыми элементами сортов винограда. В некоторые годы сорта Пти Вердо и Мальбек в состоянии зрелости имеют в 3 раза больше яблочной кислоты, чем сусло сорта Мерло.
Средний состав сусел бордоских сортов (данные в сравнимых условиях в разные годы)
Сорта, культивируемые на одной и той* же почве
1
Оф^
££ S U С S
о и
S Я
ж „
is
Красные
Мерло
12,0
92
110
36
Каберне фран
11,3
99
102
40
Каберне Совинь-
И.4
102
111
50
ОН
Мальбек
и.о
108
98
55
Пти Вердо
12,5
120
120
60
Белые
Совиньон
13,0
90
80
45
Семильон
12,4
80
82
32
Мюскадель
11,2
84
90
38
По содержанию яблочной кислоты бордоские сорта разделяют на богатые и бедные. Эту классификацию определяют каждый год снова; следовательно, речь идет об особенности сорта. Если расположить бордоские сорта по их кислотности в убывающем порядке, то получится следующая последовательность; Пти Вердо, Маль- бек, Каберне Совиньон, Каберне фран и Мерло.
Вполне вероятно, что кислотность сортов имела решающее значение при эмпирическом подборе сортового состава района. Можно также отметить, что в департаменте Жиронда сорт Каберне, который стал основным благодаря особому аромату, был дополнен на некоторых виноградниках сортом Мальбек, более богатым яблочной кислотой для получения гармоничных вин; на других виноградниках таким дополнительным сортом стал Пти Вердо, придающий вину свежесть и крепость в годы хорошего вызревания, а также обладающий малой кислотностью сорт Мерло, который придает вину бархатистость в менее жаркие годы.
Тенденция к развитию производства бархатистых вин привела к тому, что после войны в Жиронде в основном производили посадки малокислотных сортов Мерло и Семильон. Этому же способствовали и причины агротехнического порядка. В настоящее время в первую очередь расширяются насаждения сортов Совиньон и Каберне Совиньон, которые дают меньшую продуктивность, но имеют более выраженный сортовой аромат.
Выбор сорта в зависимости от климата
Виноград культивируют между 35 и 50 град северной широты; он хорошо адаптируется в относительно жарком климате благодаря своей засухоустойчивости, а также в относительно холодных климатических условиях.
В зоне холодного климата стремятся иметь сорта раннего созревания, которое заканчивается до наступления осенних заморозков. Они не требуют большого количества- тепла в период от вступления в вегетацию до достижения зрелости и дают виноград с малой кислотностью. В основном культивируют белые сорта; красные сорта требуют для синтеза антоцианов и танинов большего количества солнечных дней.
В жаркой зоне климата, который характерен для Юга Франции, Испании, южной части Италии, Греции Северной Африки, культивируют сорта позднего созревания третьего и четвертого сроков, которые дают высокие показатели как по сахаристости винограда, так и по общей массе урожая.
В зонах умеренного климата используют сорта первого и второго срока. Таким образом, если сорт Пино, культивируемый в Бургундии, относится к первому сроку (созревает раньше сортов Шасла, Мерло и Ка-
берне Совиньон), типичные бордоские сорта являются сортами второго срока, а Каберне Совиньон даже поздне-' го срока созревания. Необходимо отметить, что сорт Каберне намного лучше переносит повышенную влажность Атлантического побережья, чем другие сорта винограда.
Сорт Пино дает в Бургундии тонкие вина, а если лучшее созревание обеспечивает получение более высокого качества, то дальше на юг сорт Пино должен был бы давать еще более лучшие вина. Однако на деле происходит обратное явление, и даже сорт Каберне Совиньон в зоне жаркого климата не дает таких особо тонких вин, которые можно было бы сравнить с бордоскими винами этого сорта.
Влияние подвоя и возраста насаждений
Хорошо известно, что подвой играет важную роль в процессе созревания и в достижении полной зрелости. Его влияние сказывается главным образом через силу роста, которую он придает вегетативной системе, причем наиболее сильнорослый виноград созревает всегда позднее, и плоды в конечном счете получаются более сахаристыми и с меньшим содержанием кислот. Известен и основной принцип выбора подвоя в районах производства тонких вин — искать подвой с относительно слабой силой роста и одновременно с относительно коротким периодом вегетации; эти условия необходимы для получения раннего и полного созревания, дающего высокое качество. И наоборот, существуют подвои с продолжительным периодом вегетации, подходящие для ранних сортов.
Влияние подвоя зависит от природы почвы, но, как правило, Рипариа Глу- ар, гибриды Берландьери, особенно 161-49, относят к подвоям, которые ус
коряют созревание, тогда как подвои 1202, 3309, 5ВВ, 41В вследствие избыточной силы роста, которую они сообщают растению оказывают неблагоприятное воздействие на зрелость.
Пока еще нет точных данных, показывающих влияние возраста насаждений, но виноградарям оно хорошо известно. Допускают, что возраст кустов, от которого в большой мере зависит их сила роста, влияет на скороспелость; старые растения являются менее продуктивными и дают плоды более раннего созревания. Более приспособленные к почве благодаря своей развитой до максимума корневой системе, они, кроме того, менее чувствительны к резким изменениям температуры и к засухе. Их плоды созревают первыми и имеют больше сахаров, меньшую кислотность, более интенсивную окраску, большее содержание полифенолов и ароматических веществ. Эти различия в составе винограда обычно влияют на качество продукции. И все же часто сбор винограда начинают именно с молодых насаждений; они дают ягоды с меньшим содержанием всех элементов, склонные к поражению гнилью, и более легкие вина с недостатком тела и коротким сроком хранения.
Влияние климатологических условий года. Понятие о миллезиме (год урожая, давший вино особо высокого качества)
Метеорологические условия года влияют на качество вина посредством трех основных внешних факторов созревания: тепла, света, влажности. Эти факторы имеют очень большое значение, и характер года всегда доминирует над характером крю, т. е. комплексом почвенно-климатических условий данного участка. С другой стороны, они исключительно изменчи-
Связь между качеством выдающихся урожаев (миллезимов) и климатологическими условиями района Бордо (апрель — сентябрь)
Год
Сумма средних температур а, °C
Продолжительность инсоляции Ь, ч
Количество особо жарких дней с
Уровень атмосферных осадков d^ мм
Разность [a—d
Качество вин
1947
3478
1317
42
259
3219
Исключительное
1949
3458
1508
43
286
3172
То же
1945
3361
1444
25
253
3108
1961
3294
1302
27
213
3081
1943
1964
3308
3327
1366
1435
24
31
282
339
3026
2988
Очень хорошее То же
1959
3310
1293
21
331
2979
1952
3270
1399
24
306
2064
1970
3184
1338
12
232
2952
1973
1944
3299
3212
1296
1289
19
17
354
302
2945
2910
Хорошее
1950
3252
1361
26
346
2906
1962
3123
1489
18
249
2874
1955
1967
1953
1942
1948
3247
3120
3198
3227
3126
1474
1419
■ 1259
1331
1248
19
22
20
21
11
375
278
367
414
315
2872 •2842 2831 2813 2811
Очень хорошее
Хорошее
Очень хорошее
Хорошее
1966
3161
1320
16
359
2802
1946
1971
3061
3269
1175
1275
12
17
261
496
2800
2773
Довольно хорошее Хорошее
1940
1957
3094
3043
1329
1231
11
14
339
371
2755
2672
Довольно хорошее Среднее
1960
3130
1362
7
459
2671
1969
3168
1169
18
521
2647
1958
3142
1125
18
497
2645
1956
1968
3083
3102
1420
1302
5
И
441
458
2642
2644
Посредственное
То же
1963
ЗОЮ
1229
7
370
2640
Плохое
1951
1954
3052
2904
1186
1119
14
6
443
311
2609
2593
Посредственное
То же
1972
2900
1114
5
331
2569
»
1965
3005
1058
15
461
2544
Плохое
1941
3009
1210
15
536
2473
Посредственное
Примечание. Годы урожаев расположены в порядке убывания значений разности: (a—d) сумма средних температур минус уровень осадков, приблизительно в порядке снижения показателей качества.
вы, так что два климатических года и два года урожая никогда не могут быть одинаковыми.
Капорали (1972) в районе Пизы попытался связать состав сусел некоторого числа сортов с метеорологическими факторами периода созревания урожаев десятка лет.
Можно допустить, что в районе Бордо имеются следующие условия для правильного созревания винограда традиционных сортов: 1) сумма активного тепла, зарегистрированная с апреля по сентябрь, должна быть равна или выше 3100° С; когда сумма тепла ниже этой цифры, урожаев, дающих
Климатические условия от цветения до созревания винограда в районе Бордо за 12 лет
Дата середины
Дата середины
Сумма
Число дней
Сумма
Число
Год
периода цвете-
периода
дней
средних тем-
большой
осадков,
дождливых
иия
созревания
ператур, °C
жары
мм
дней
1961
1 июня
7 августа
67
1296
12
64
21
•1962
15 »
22 »
68
1338
10
69
19
1963
18 »
25 »
68
1294
7
150
27
1964
9 »
14 »
66
1354
16
67
21
1965
22 »
27 »
66
1234
7
141
25
1966
9 июня
13»
65
1213
8
147
21
1967
12 »
19 »
68
1374
19
53
-17
1968
18 »
23 » '
66
1470
8
184
25
1969
22 »
24 »
63
1293
13
65
27
1970 -
15 »
21»
67
1340
8
83
23
1971
15 »
21»
67
1383
15
197
26 ■
1972
26 ■ »
1 сентября
67
1305
4
143.
21
Табл
ища 4.23
Климатические условия от созревания винограда до его зрелости в районе Бордо за 12 лет
Гох
Дата середины периода созрева-
'■ иия
Дата зрелости
Число дней
Сумма средних температур, °C
Число дней большой жары
Сумма осадков, ' мм
Число дождливых дне й
1961
7 августа
29 сентября
53
1040
14
27
13
1962
22 »
10 октября
49
841
8
92
и
1963
25 »
11 »
47
■744
0
138
28
1964
14 »
28 сентября '
45
866
12
67
13
1965
27 »
8 октября
42
584
0
226.
23 '
1966
13 »
28 сентября
46
842
7
50
14
1967
19 »
4 октября
46
792
6
84 ;
22
1968
23 »
10 »
48
797
2
152
28
1969
24»
4 »
41
720
3 .
214
25
1970
21»
2 »
42
793
5
34
12
1971
21»
1 »
41
762
2
99
18
1972
1 сентября
12 »
42
742
'0
90
21
высококачественные вина, не бывает; 2) число дней с максимальной температурой не ниже 30° С должно быть в этот период более 15; 3) не слишком большое количество осадков (250—350 мм); 4) хорошая освещенность, не менее 1250. ч инсоляции. Но год, дающий вина лучших марок, дол
жен иметь больше солнца, больше тепла и Меньше дождей по сравнению с указанными в этих нормах.
В районе Бордо, на побережье Ат
лантического океана, лучшие вина получают в самые жаркие и самые сухие годы; то же самое относится к Бургундии, Шампани, , Эльзасу и к
долине -Луары. Другое положение в долине Роны и в бассейне Средиземного моря, где избыток тепла и сухости блокирует созревание.
Качество высокого урожая также связано с различным временем созревания сортов в зависимости от условий года. Иногда сорт Мерло созревает раньше и дает лучшее вино (например, 1970 г.), в другой раз качество вина обязано высокой устойчивости сорта Каберне Совиньон (дождливые годы) или Каберне фран (1971) /табл. 4.21).
Сущность связи климат — качество ■можно представить лишь схематически. Представление о метеорологических условиях в течение периода вегетации может быть искажено, если его сводить к простой сумме факторов. Несомненно, абсолютная температура или общее количество выпавших осадков меньше влияют на качество, чем периоды заморозков, жары, дождей, засухи. Таким же образом качество собираемого винограда во многом зависит от хорошей погоды в период уборки урожая, которая реализует хорошее завершение созревания и обеспечивает перезревание, и, наоборот, качество, ■ приобретенное в течение жаркого лета, может ухудшиться, если во время уборки винограда будет стоять плохая погода (табл. 4.22).
Народная поговорка утверждает, что метеорологические условия июня (периода цветения) определяют количество урожая, тогда как погода в августе обеспечивает его качество. Действительно, в районе Бордо хорошее качество получают всякий раз, когда сентябрь стоит сухой и теплый * (табл. 4.23).
Обычно хорошими годами бывают года с относительно ранним созреванием. Объясняется это тем, что в такие годы больше шансов на достижение полной зрелости, поскольку со
зревание начинается раньше и протекает в более длинные и более теплые дни. С другой стороны, годы раннего созревания обычно характеризуются теплой весной, поэтому более высокие температуры в конце зимы и в начале весны влияют на распускание почек. Можно провести довольно четкую параллель между датой начала уборки и суммой температур первых месяцев года. Однако может получиться так, что холодные и дождливые погоды в мае и июне могут надолго оттянуть начало цветения.
Иногда противопоставляют качество и количество урожая и считают их несовместимыми. Лафорг (1954) в интересном исследовании развития виноградарства в Жиронде за 150 лет отметил, что годы хорошего качества довольно часто были также и годами высоких урожаев (например, 1947, 1955, 1970). Поэтому кажется логичным допустить, что обильный урожай, когда он является следствием естественных хороших условий вегетации винограда, должен сопровождаться хорошим качеством винограда. Исключительно благоприятные климатические условия могут привести к получению и исключительного по качеству урожая, но такие совпадения редки, а в посредственный год высокая продуктивность ожазывается фатальной для качества.
Можно также представить климатологические условия в течение периода вегетации в виде кривых, соединяя линиями месячные амплитуды со средними показателями температуры и уровня осадков. Схемы такого рода очень показательны, по крайней мере, для района Бордо с точки зрения метеорологических условий года и значения миллезима.
На рис. 4.7 приведены данные для исключительно хорошего урожая (1961 г.) и для посредственного урожая (1965 г.). Температуры обозначе-
ны сплошной линией, уровень осадков — пунктиром.
В 1961 г. среднемесячные температуры почти всегда превышали или были, по крайней мере, равны среднего-
Рис. 4.7. Графики отклонений от нормальной температуры месяца и месячной нормы осадкоз в районе Бордо:
а— 1965 г. посредственный; б — 1961 г.; — температура; —уровень осадков.
довой, тогда как осадков было намного меньше нормы; но замечательное качество вина в этом году было получено благодаря исключительно теплой и сухой погоде, стоявшей в сентябре. 1965 г. является примером сезона, в котором температура всегда была ниже нормальной, а сентябрь был крайне дождливым.
Изменяемые факторы: обрезка, агротехнические приемы, удобрение почвы
Предполагают, что существует зависимость между площадью поверхности
лйстьев и качеством урожая; оптимальные значения основаны на равновесии питательных веществ.
Если в порядке эксперимента увеличить листовую поверхность растения, виноград достигает лучшей зрелости, он богаче сахарами, фенольными соединениями и содержит меньше кислот, но до определенных пределов (табл. 4.24).
Таблица 4.24
Зависимость между урожайностью и сахаристостью винограда (Ферре)
Масса винограда на 1 куст, кг
Количество сахаров, г
на 1 кует
на 1 л сусла
0,4
65
235-
0,8
126
225.
1,2
168
200
1,6
184
165
2,0
182
130
Из табл. 4.24 видно, что количество сахаров на 1 куст винограда тем выше, чем больше на нем ягод, разумеется, до некоторого предела. Но с другой стороны, сахаристость сусла тем выше, чем ниже урожайность, хотя здесь и нет точной пропорциональной зависимости. Кроме того, повышенное процентное содержание сахаров в винограде является признаком, хорошей зрелости, которая обусловливает обычно другие показатели качества: цвет, танины, аромат, малокис-* лотв ость и др.
Луанже и Саф-рам (1971) в зоне жаркого климата отметили определенную взаимозависимость между урожайностью и качеством вин, во вся- ком случае, когда сравнивают виноградники различных районов.
Примеры зависимости числа и дли* ны побегов от числа гроздей приводит также Конлехнер (1957).
Эрнандес (1971) в недавнем исследовании констатирует тот факт, что
удаление молодых листочков при прищипывании, подавление пасынковых почек и обломка ■ листьев на уровне гроздей, снижая фотосинтетическую способность растения, уменьшают урожай и сахаристость винограда и могут отрицательно повлиять на закладку цветковых почек следующего года.
Внесение удобрений (навоза или химических веществ) имеет большое значение для количества и качества урожая, но этот вопрос еще недостаточно изучен для виноградников, дающих тонкие вина. Опыты по изучению этой проблемы трудны, и требуются многие годы работы, чтобы можно было сделать обоснованные выводы, так как на такое многолетнее растение, как виноград эффект от удобрения почвы сказывается только по истечении более или менее длительного времени.
Таблица 4.25
Влияние удобрений на производство винограда (средние данные за 5 лет наблюдений)
Удобрение, кг/га '
О
Коэффициент производства
содержание спирта х урожайность
N
Р
к
as»
, о и So □ я
0 10 20 30
0
24
48
72
0
48
96
144
100
102
107
119
10,48
10,62
10,56
10,44
1048 1083 ИЗО
1242
В табл. 4.25 приведены в качестве примера результаты влияния различных минеральных удобрений на продуктивность винограда. Пейно (1972) проанализировал опыты, проводившиеся в широких масштабах, о влиянии сильных доз азотных удобрений на производство и состав винограда и получаемых из него вин. Как правило, внесение азотных удобрений влечет за собой некоторое снижение спиртуоз- ности вин, которое обычно компенси
руется более высокой продуктивностью. Изменяется и состав винного экстракта: уменьшается количество неорганических веществ, полифенолов, антоцианов и, наоборот, увеличивается содержание азотных соединений, и в частности некоторых аминокислот и полипептидов. Наиболее заметным результатом интенсивного внесения удобрений является определенное ослабление- окраски красных вин; вина, полученные из винограда с удобряемых участков, также содержат меньше дубильных веществ, они менее тельные, могут показаться более бархатистыми, но иногда бывают немного пустыми.
Известно, что только земли, относительно бедные удобряющими элементами, дают тонкие вина. Поэтому вполне логично, что продуктивность таких виноградников можно повышать умеренным удобрением, так чтобы это не отражалось на качестве урожая, но нужно иметь в виду, что допустимый предел удобрения достигается довольно скоро. Качество винограда в значительной мере зависит от равновесия между питанием растения и продуктивностью; рациональное внесение удобрений имеет целью поддерживать это равновесие и не допускать чрезмерной продуктивности.
Случайные факторы: болезни и 1 неблагоприятные метеорологические условия
Грибные болезни всегда отрицательно влияют на продуктивность и качество независимо от того, какая часть растения поражена. Мильдью на листьях, с которой не ведется борьбы, вызывает их чрезмерное и раннее опадение; нарушается состав резервов древесины, снижается содержание сахаров в винограде, кислотность остается высокой; это показывают данные Миларде и Гайона (табл. 4.26).
Таблица 4.26 ходит в состоянии склеротиний: зара-Таблица 4.26 ходит в состоянии склеротиний: зара-
Таблица 4.26 ходит в состоянии склеротиний: зара-
Таблица 4.26 ходит в состоянии склеротиний: зара-
Влияние грибных болезней иа виноград
Показатели
Куст, обработанный препаратом
Куст, не обработанный препаратом
Число листьев
424
42
Выход сусла из ягод, % Плотность сусла, кг/м3
/0,8
68,4
1080
1037
Содержание сахаров на 1 л сусла, г
175
39,4
Кислотность на 1л, мг-экв
161
190
Мильдью на гроздьях ведет к их полной гибели, если она появляется во время цветения и первоначального развития ягод. Если же болезнь развивается после завязывания ягод, то в этом случае созревание бывает очень поздним с одновременным уменьшением содержания сахаров и высокой кислотностью; ягода не созревает вследствие поражения плодоножки.
Оидиум, против которого, как известно, применяют серу, поражает различные органы виноградного растения. В период цветения пораженная гроздь засыхает и может погибнуть. Появляясь в более позднее время, оидиум поражает только кожицу, которая приобретает бурую окраску и больше не развивается. Когда рост ягоды прекращается, она деформируется, растрескивается и в образовавшихся разрывах иногда видны семена. Однако процесс созревания не прекращается, и ягоды, пораженные оидиумом, хотя и менее сочные, могут быть более сахаристыми, но часто остаются более кислыми, чем при нормальном созревании.
Гниль является результатом развития на винограде в состоянии зрелости или несколько раньше различных грибов и плесеней, чаще всего Botrytis cinerea. В цикле развития этого гриба его зимняя консервация проис-
жение при контакте осуществляется через мицелий, распространяется же гриб путем конидий. Размножение происходит особенно быстро в теплую погоду при высокой влажности воздуха. Некоторые сорта подвержены этой болезни чаще, чем другие; гниль особенно поражает плотные грозди и ягоды с тонкой кожицей; ее развитию также способствуют растрескивание кожицы вследствие разбухания ягод во время длительных дождей, а также повреждение плодов насекомыми. Botrytis cinerea поражает кожицу, которая изменяет окраску, утончается, становится хрупкой. Появляются конидии, образующие нечто вроде серого войлока; это серая, или вульгарная, гниль. Но дело бывает намного серьезнее, если наряду с Bptrytis cinerea развиваются другие грибы: Penicilli- um, Aspergillus, Mucors и др. При сильном развитии серой гнили Botry- cis cinerea вино пробретает характерный привкус плесени,
Биология гриба Botrytis cinerea, условия развития его на винограднике и профилактические обработки детально освещены в недавно опубликованных работах таких авторов, как Рус- сел и Буар, 1971; Ж. Лафон и Куйо, 1971; Бюли и Р. Лафон, 1972; Делас, 1972; Шабусу, 1972, Р. Лафон и сотрудники, 1972.
Гниль всегда проявляется в уничтожении окраски винограда. Кроме того, вина, получаемые из винограда с гнилью, поражаются оксидазным кассом. Botrytis cinerea выделяет лакказу, действие которой будет рассмотрено. ниже и с которой можно эффективно бороться с помощью сернистого ангидрида. В районах, где стремятся сохранить в белых сухих винах возможно более выраженный привкус свежего винограда, перед началом переработки удаляют все гнилые ягоды
путем тщательной сортировки гроздей.
Вредители винограда — гроздевая листовертка и др.—наносят большой вред как во время цветения, так и в последующие фазы, включая состояние полной зрелости. Ягоды прокалываются, более или менее опустошаются и засыхают. В сухую погоду отмечают возрастание концентрации сахаров и кислотности и сильное уменьшение урожая. Когда стоит теплая погода с высокой влажностью воздуха, наблюдается быстрое развитие плесневых грибов. Нередко в такое время на поверхности ягод развиваются уксусные бактерии, вызывающие образование летучей кислотности, которая придает винам характерный вкус. Образуются также кислоты: глюконовая, кетогклюконовая, гликуроновая. Больные ягоды становятся источником опасного заражения, поэтому все более или менее пораженные ягоды должны быть удалены.
Буроватость листьев выражается в увядании их от солнца или засухи и особенно нежелательна, когда кусты имеют о шнь большую нагрузку. Чаще всего это заболевание возникает от нарушения равновесия питательных веществ, и в частности при недостатке калия. Оно может также быть результатом нападения цикадок и влечет в этом случае такие же последствия, как и чрезмерное опадение листьев, и задержка созревания. Ягоды могут быть обожжены, тогда их созревание прекращается. Такой же эффект может дать окуривание серой в очень жаркие дни. Виноград, увядший или засохший под воздействием солнца или теплого ветра, должен быть удален при уборке урожая. Грозди на побегах, развившихся из замещающих почек в более поздние сроки, никогда не созревают нормально. Осенние заморозки непосредственно перед началом
сбора урожая неопасны: лист погибает тогда, когда он уже малоактивен. Если же заморозки происходят раньше, виноград увядает, сусло получается более концентрированным, но остается кислым.
Град наносит более или менее значительные повреждения в зависимости от его интенсивности и времени. Если градобитие произошло рано, могут появиться новые ягоды, но они плохо вызревают из-за задержки цветения; если же град выпадает позднее, побитые ягоды засыхают. Если повреждены плодоножки и древесина побегов, созревание протекает плохо. Виноградные ягоды, поврежденные градом в последний момент перед сбором, становятся местом развития плесневых грибов и процессов брожения; в этом случае нужно возможно быстрее проводить уборку с сортировкой винограда. Вкус града, получающийся в винах из такого винограда, не что иное, как привкус плесени.
ЛИТЕРАТУРА
Amerine М. А. (1956), Wines and Vines, 37, 27 et 53.
Amerine M. A. e t R о e s s 1 e r E. B. (1958), Amer. J. Enol. Vitic., 9, 37. Hilgardia, 28, 93; (1963) Amer. J. Enol. Vitic., 14, 144.
Am eri n e M. A. etThoukisG. (1958), Vi- tis 1, 224.
Amerine M. A. et Winkler A. J. (1958), J. Amer. Soc. Hort. Sci., 71, 199.
Aubert S. e t Poux C. (1969), Ann. Technol. agric., 18, 93 et 111.
Bouard J. (1966), Recherches physiologiques sur la vigne et en particulier sur 1’aoutement des sarments. These Doctorat Sc. nat, Bordeaux.
Bouard J. et P о u g e t R. (1971), «Physiolo- gie generale de la vigne», In Sciences et techi- ques de la vigne, Tome I, Dunod, Paris.
Branas J., BernonG. et LevadouxL. (1946), Elements de viticulture generale, Montpellier.
Branas J. (1974), Viticulture, Dehan imp., Montpellier.
В u 1 i t J. e t L a f о n R. (1972), Rev. Zool. agric. Pathol. vAgetale, Iе4 trimestre, p. 1.
Cap о rali F. (1972), Scienza Teen. Allimen- ti, 2, 160.
Carles J., Fallot J. et MagnyJ. (1967), C. R. Acad. Sci., 264, 1420.
ChaboussouF. (1972), Rev. Zool. agric. Pathol. vegetate, 1 trimestre, p. 18.
De В о i x о P. (1947), Progr. agric, vitic., 127, 367.
Deibner L. (1964), Rev. Ferm. Ind. alim., 19, 141.
De las J. (1972), Rev. Zool. agric. Pathol, ve- getale, 1 er trimestre, p. 11.
De Souza E. e t H о 1 s t e i п-В e с к M. (1964), Vinea et Vino, Portugal, п° 1, 2 et 6.
Ferre L. (1925), IVе Congres de Chimie in- dustrielle, p. 585.
Ferre L. (1956), Traite d’Oenologie bourguig- nonne, Bull. I.N.A.O., nob 57 a 61.
Gatet L. (1940), Recherches biochimiques sur la maturation des fruits, These Sciences, Bordeaux.
C e i s 1 e r G. et R a d 1 e r F. (1963), Ber. De- uts. Bot. Gesell., 76, 112.
Genevois L. (1938), Rev. Vitic., 88, 103.
Gerber C. (1897), Recherches sur la maturation des fruits charnus. These Sciences, Paris.
G i r a r d A. e t LindetL. (1895), Rev. de Vitic., 4, 317, 342; (1896), 6, 173, 201, 225, 249.
Girard A. et LindetL. (1898), C. R. Acad. Sci., 126, 1310.
Gui chard C. (1953), Contribution a 1’etude des glucides de la vigne, These Sciences, Bor- deaux
Hernandez A. (1971), Conn, Vigne Vin, 5, 277 et 405..
Huglin P. et Juliard B. (1959), Progres agric, vitic., 152, 11 et 37.
KI i ewer W. M. (1967), Amer., J. Enol. Vitic, 18, 87.
Kliewer W. M. (1970), J. Amer. Soc. Hort. Sci., 95, 693.
Kliewer W. M. (1971), J. Amer. Soc. Hort. Sci., 96, 372.
Kliewer W. M., Howarth L. et Omori M. (1967), Amer. J. Enol Vitic., 18, 42.
К 1 i e w e r W. M. et Torres R. E. (1972), Amer. J. Enol. Vitic., 23, 71.
Konlechner H. (1957), Mitteilungen, 7, 209. Lafforgue G. (1954), Bull. Tech. Int. Services agric., n° 90, p. 5.
L a f о n J. e t С о u i 11 a u d P. (1971), Traite- ments des maladies cryptogamiques. In Sciences et techniques de la vigne, Dunod, Paris.
Lafon R., Ver du D. et Bulit J. (1972), Rev. Zool. agric. Pathol, vёgёtale, ler trimestre, p. 31.
Lalon-Lafourcade S. et G u i m b e r- t e a u G. (1962), Vitis, 3, 130.
Lefebvre A. (1968), Recherches sur la bioge-
nese de Tacide tartrique chez V. vinifera L. utilisant les molecules marquees au 14C. These Doctorat 3е Cycle, Bordeaux.
Lepadatu V., A 1 exiu A. et M u j d a b a F. (1971), 13е Congres international de la Vigne et du Vin, Mendoza.
Loin ger C. et Safran B. (1971), Ann.
Technol. agric., 20, 225.
Marteau G. (1955), C. R. Acad. Agric., 41, 193.
Masquelier J. (1956), Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 38, 65.
M о r e a u L. e t V i n e t E. (1932), Ann. agron., p. 363.
Mourgues J., Maugenet J., Jouret C. et Puech J. L. (1971), Fruits, 26, 449.
Peynaud E. (1938), Soc. Sci. Phys. Nat. Bordeaux, 5 et 19 mai 1938 et 30 mars 1939.
Peynaud E. (1946a), Contribution a Tetude biochimique de la maturation du raisin et de la composition des vins. These Ingdnieur-Do- cteur, Bordeaux.
Peynaud E. (1946 b), C. R. Acad, ^gric., 32, 480.
Peynaud E. (1947), Bull. Intern. Vin, 191, 34.
Peynaud E. (1971), De l’ampelologie a Toeno- logie. In Sciences et techniques de la vigne, Dunod, Paris.
Peynaud E. (1972), IIIе Symposium international d’oenologie, Afrique du Sud.
Peynaud E., GuimberteauG. et N a u- z i n P. (1970), Conn. Vigne Vin, 4, 285.
Peynaud E. et Lafourcade S. (1958), Qualitas plantarum, 3, 405..
Peynaud E. et M a u r i ё A. (1953), Ann. Technoil, agric., 2, 15 et 2, 83.
Peynaud E. et M a u r i ё A. (1956), Ann.
Technol. agric., 5, 111.
Peynaud E. e t M a u r i ё A. (1958), Amer. J. Enol, 9, 32.
Peynaud E. e t R i b ё r e a u-G а у о n P. (1971), The grape, In «The biochemistry of fruits and their products», vol. II, Academic Press, Londres.
Pri 11 in g er F. etMadnerM. (1969), Mitteilungen, 19, 361.
Rad ler F. (1965), Amer. J. Enol. Vitic., 16, 38 et 159.
Rankine В. C., CellierK. M. et Boehm E. W. (1962), Amer. J. Enol. Vitic., 13, 58.
Rankine В. C., Fornachon J.C.M., В o- ehm E. W. et Celli er KM. (1971), Vitis, 10, 33.
R i b ё г e a u-G а у о n G. (1959), C. R. Acad. Sci., 248, 3481 et 3606; C. R. Acad. Agric., 45, 588.
R i b ё r e a u-G а у о n G. (1966), Etude du тё- tabolisme des glucides, des acides organiques
et des acides amines chez V. vinifera L. These Doct. Sciences Phys., Paris.
R i b ё r e a u-G а у о n G. et R i b ё r e ац-G a- yon P. (1971), Biochimie de la vigne et du raisin, In Sciences et techniques de la vigne. Tome I, Dunod, Paris.
R i b ё r e a u-G а у о n P. (1971), Conn. Vigne Vin, 5, 247.
R i b ё r e a u-G а у о n P. (1972), Conn. Vigne Vin, 6, 161.
Ri b ё r e a u-G а у о n P. et Sudraud P. (1957), C. R. Acad. ScL, 244, 233.
R о u s s e 1 C. e t В о u a r d J. (1971), Maladies cryptogamiques, In Sciences et techniques de la vigne, Dunod, Paris.
Saint-Pierre et Magnien (1878), Ann. agron., 4, 161.
Sartorius O. (1969), Wein-Wissens., 24, 428.
Saulnier-Blache P. (1963), Ann. Phys. vёgёtale, 5, 217.
Saulnier-Blache P. et В ruzeau F. (1966), Ann. Phys, vdgdtale, 8, 25.
Saulnier-Blache P. et В ruzeau F. (1967), Ann. Phys, vёgёtale, 9, 179.
Saulnier-Blache P. et Peresse M. (1970), Conn. Vigne Vin, 4, 31.
Seguin G. (1965), Etude de quelques profils de sols du vignoble bordelais, These Doctoral ■ 3е Cycle, Bordeaux.
Seguin G. (1970). Les sols de vignobles de Haut-Medoc. Influence sur Г alimentation en eau de la vigne et sur la maturation du raisin. Doctorat Sciences naturelles, Bordeaux, Seguin G. (1971), Influence des facteurs na- turels sur les caracteres des vins, In Sciences et techniques de la vigne, Dunod, Paris.
Seguin G. (1973), C. R. Acad. ScL, 277, 2493.
Swanson C. A. et E1 ShishinyE. D. (1958), Plant Phys., 33, 33.
Tar an tola C. (1954), Industrie agrarie. Eno- logia, Union tipografico, Turin.
Terrier A. (1972), Les сотрозёз terpeniques dans 1’агбте des raisins et des vins de cer- taines vari6tes de Vitis vinifera. These Doct.- Ing., Bordeaux.
Venezia M. (1934), Atti. 1st. Ven. Set, 94, 273.
Venezia M. (1937), Atti. 1st. Ven. ScL, 96, 357.
Wejnar R. (1965), Ber. Deutsch. Bot. Ges., 78, 314; (1967) Ibid., 80, 447.
Часть третья
ДРОЖЖИ — ВОЗБУДИТЕЛИ СПИРТОВОГО БРОЖЕНИЯ
Главаб. ЦИТОЛОГИЯ, СИСТЕМАТИКА И ЭКОЛОГИЯ ВИННЫХ ДРОЖЖЕЙ
В данной третьей части будут рассмотрены одноклеточные организмы, дрожжи и бактерии — возбудители брожений. Но сначала необходимо дать несколько определений для тех . читателей, которые недостаточно знакомы с терминологией микробиологов.
Цитологией называют науку о клетке, ее морфологии, структуре, свойствах и функциях.
Для исследования микроорганизмов необходимо знать их положение в классификации. Систематика занимается такой классификацией и включает описание видов. Таксономия является наукой, которая исследует законы классификации.
Микроорганизмы подразделяют по сходству их морфологических, цитологических и физиологических характеристик. Их делят на классы, подклассы, порядки, семейства, роды, виды; расами называют различные штаммы дрожжей в рамках одного вида.
Чтобы лучше уяснить место, которое занимают микроорганизмы в живом мире, нужно иметь в виду, что известны три группы живых существ: две первых представлены растениями и животными, многоклеточными организмами с сильно развитой дифференциацией тканей; третью образуют простейшие организмы, одноклеточные
или многоклеточные, но без тканевой дифференциации; они включают водоросли, простейшие одноклеточные организмы, грибы и бактерии.
Среди простейших организмов выделяют две подгруппы, различающиеся элементарной структурой их клетки: простейшие прокариоты, к которым относятся бактерии, и простейшие эукариоты, включающие грибы, и в частности дрожжи.
Грибы делятся на многие классы, среди которых находятся аскомицеты, размножающиеся половым путем и образующие споры (аскоспоры) внутри клетки с уплотненной оболочкой, называемой зеком. Аскомицеты включают много семейств, среди которых находятся Saccharomycetaceae (см. табл. 5.2). К этому семейству принадлежат дрожжи спиртового брожения.
Но не все дрожжи образуют аски и, следовательно, не все являются аско- мицетами; такие дрожжи принадлежат к семейству Cryptococcaceae (см. табл. 5.1). Другие дрожжи относятся к классу несовершенных грибов (Fungi imperfeeti), с бесполым размножением; дрожжи находят также в классе баэидиомицетов.
Таким образом, в действительности термин «дрожжи» не является в полном смысле слова ботаническим; он обозначает не связанную с другими
группу микроорганизмов, рассеянную в трех семействах грибов. Однако удобство такого термина, некоторое единство структуры, сходство формы и внешнего вида придают этой группе, несмотря на отдельные различия в физиологических свойствах, определенную монолитность.
Более детальные сведения по цитологии и систематике можно найти в работах по общей микробиологии (Ламбен и Жерман, 1961; Стание и сотрудники, 1966; Сенец, 1968; Шам- паньят и сотрудники, 1969) и в недавно опубликованных монографиях о дрожжах (Роз и Харрисон, 1969— 1971). Имеется лишь небольшое количество монографий по микробиологии вина; заслуживают упоминания труды таких авторов, как Шандерль (1959), Америк и Куике (1968), Кастелли (1969).
ЦИТОЛОГИЯ ДРОЖЖЕЙ
В целом структура дрожжевой клетки мало отличается от структуры клеток растения. Чтобы увидеть под микроскопом структуру молодой дрожжевой клетки, обнаружить различные органоиды, ее необходимо покрасить. В более старых клетках или в клетках, содержащих аскоспоры, можно непосредственно при микроскопировании различить некоторые детали внутреннего строения. Наблюдение с помощью электронного микроскопа позволило осуществить детальное исследование клеток различных видов дрожжей. Как и любой организм подгруппы эукариотов, дрожжевая клетка включает клеточную оболочку, цитоплазму и ядро (рис. 5.1).
Клеточная оболочка
Клеточная оболочка включает клеточную стенку и цитоплазматическую
мембрану. Клеточная стенка дрожжей относительно толстая и жесткая. В ее состав входят полисахариды — маннан и глюкан в примерно равном соотношении. У некоторых дрожжей маннан отсутствует. Кроме того, клеточная стенка содержит белки, липиды, фосфаты, глюкозамин и у большей части видов хитин. Внешний слой стенки образуется в первую очередь маннаном, глюкан же входит в состав промежуточного слоя, богатого белками.
Белки стенок состоят из обычных аминокислот, с сильной пропорцией глутаминовой и аспарагиновой кислот; они также богаты серуоодержа- щими аминокислотами и находятся в виде комплексных соединений с полисахаридами.
1м км
I
Рис. 5.1. Схема строения клетки — Saccha- romyces ellipsoideus, по Роуз и Харрисон, 1969:
1 —■ ядро; 2 — ядрышко; 3 — центриоль; 4 — ядерная оболочка; 5—митохондрии; 6— липидные зерна; 7—цитоплазматическая мембрана; 8 — вакуоль; 9 — метахроматическая корпускула; 10— клеточная стенка; 11 — рубец от почкования; 12 — цитоплазма.
На внутренней стороне стенки клетки локализованы ферменты: инвертаза, фосфатаза, пептидаза и другие гидролазы. \
Оболочка дрожжевой кХртни играет роль защитного покрытия, taK как она устойчива против механического воздействия. Она придает клетке\специ- фичеокую форму. \
Подсчитано, что поверхность клеток, содержащихся в 1 л бродящего сусла, равна 10 м2, хотя по внешнему виду клеточная оболочка выглядит гладкой, фактически она представляет собой тонкую решетку, активная поверхность которой составляет еще большую площадь. Этим объясняется быстрота обмена веществ у дрожжей.
В то же время оболочка имеет относительно мелкие поры. Коллоиды с молекулярной массой более 4500 через них не проходят. В результате этого дрожжи не могут использовать белки среды непосредственно. Клеточную оболочку следует рассматривать как некий фильтр, пропускающий только микромолекулы. Роль ферментов стенки заключается в том, чтобы обеспечивать проникновение гидролизуемых веществ.
С помощью электронного микроскопа наблюдали на поверхности оболочки рубцы, образующиеся при (последовательных почкованиях.
Цитоплазматическая мембрана сама состоит из трех исключительно тонких слоев, образованных липидами, белками, полисахаридами.
Роль мембраны сводится к контролю движения веществ, содержащихся во внешней среде, внутрь клетки и обратно. С одной стороны, мембрана пропускает питательные вещества к местам их ассимиляции: ионы, сахара, аминокислоты, витамины и другие, с другой — она контролирует выделение в среду продуктов метаболизма, таких, как этанол и другие вещества.
Этот непрерывный обмен между дрожжами и средой происходит посредством систем — транспортеров. Они придают цитоплазматической мембране свойства высокоселективного фильтра..
Цитоплазма и ее органоиды
Обычно цитоплазма занимает большую часть объема клетки и содержит некоторое число органоидов, растворимые ферменты, в частности те, которые участвуют в процессе гликолиза. '
В ней различают включения (гранулы гликогена) и органоиды, главными из которых являются рибосомы, вакуоли, митохондрии.
Рибосомы дрожжевой клетки наблюдаются под электронным микроскопом рассеянными в цитоплазме. Химически они состоят из примерно одинаковых частей белков и нуклеиновых кислот. Полагают, что рибосомы являются местом синтеза белков.
Г л и к о г ен — полисахарид, довольно похожий на крахмал растений, находится почти во всех дрожжах; в некоторых условиях он может составлять до 40% их сухой массы. В начале брожения гликоген в клетках появляется в виде небольших скоплений с правильными очертаниями, разбросанных в цитоплазме, которые в дальнейшем быстро сливаются в большую массу, отталкивающую вакуоль и ядро к периферии. Гликоген легко обнаружить: при окрашивании клеток красителем с йодом ан становится коричневым. К концу брожения он постепенно исчезает. Когда дрожжи спо- рулируют, гликоген накапливается в аоках и используется аскоспорами во время их прорастания. Он является резервным веществом.
Другие часто встречающиеся запасные вещества — липиды — находятся в плазме дрожжей в виде гранул. Эти
образования, преломляющие свет, очень хорошо различимы под микроскопом у пленчатых дрожжей, развивающихся на поверхности вин.
Вакуоли — это органоиды клетки, часто неправильной формы, ограниченные одной мембраной. В цитоплазме молодых клеток дрожжей содержится одна вакуоль, если они имеют сферическую или эллиптическую форму, и две вакуоли, расположенные соответственно на каждом из полюсов и связанных плотным цитоплазменным мостом, в котором находится ядро, если клетки удлиненные. Содержащие жидкость с кислой реакцией вакуоли отделены полупроницаемой мембраной от цитоплазмы, которая нейтральна или обладает слабой щелочностью. Вакуоли играют большую роль в явлениях осмоса, содержат соли, кислоты, сахара, белки и другие вещества.
Во время фазы роста вакуолярный аппарат не имеет видимых элементов структуры. В старых клетках вакуоль имеет сферические образования, состоящие из полиметафосфатов, которые за их легкую окрашиваемость назвали «метахроматическими корпускулами», а также полифосфатов, называемых валютином.
В вакуолях находят также липиды и много гидролитических ферментов: протеазы, рибонуклеазы, эстеразы и др. Локализация этих гидролаз в вакуолях наводит на мысль, что эти органоиды представляют собой наиболее подходящее место для реализации реакций гидролиза. Вакуоли также являются местом аккумуляции пуринов, некоторых аминокислот, ионов калия и других веществ, которые здесь накапливаются до начала метаболизма.
Митохондрия встречается в различных формах: сферической, в виде палочек, нитей. Дрожжевая клетка со- 114
держит около дюжины митохондрий, которые имеют тенденцию располагаться вблизи ядра. Богатые липидами, фосфолипидами, эргостерином,, митохондрии содержат нуклеиновые кислоты, отличные от тех, которые находятся-в ядре и в рибосомах. Они содержат дыхательные ферменты, цитохромы, флавины, железо, медь и являются местом процесса дыхания; размеры их уменьшаются при дыхательной недостаточности, когда дрожжи культивируют в анаэробиозе или в среде, лишенной стеринов.
Ядро
Хотя ядро и имеет диаметр около 1 мкм, его трудно наблюдать при микроскопировании в живых дрожжах, развивающихся в жидкой среде; оно легче обнаруживается при фазовоконтрольной микроскопии дрожжей, размножающихся в аэробных условиях. У почкующихся клеток ядро обычно наблюдается между почкой и вакуолью; сразу же после отделения почки оно перемещается в противоположную сторону материнской клетки.
Ядро окружено оболочкой; вокруг оболочки можно наблюдать в электронный микроскоп поры, которые исчезают и вновь образуются в разных точках мембраны. Во время почкования оболочка ядра не разрывается; ядро удлиняется, часть его проникает в почку.
Ядро состоит из двух ясно различимых частей; одна оптически плотная имеет форму полусферы и называется нуклеусом, над ней находится другая, более прозрачная часть в виде колпака нуклеоплазма.
Ядро содержит нуклеиновые кислоты, в частности рибонуклеиновую кислоту. Оно делится мнтотически, как все ядра эукариотных клеток.
Хромосомы дрожжей из-за малых
размеров трудно обнаружить, и относительно их числа существуют противоречивые мнения. Для Saccharomy- ces, ellipsoideus число хромосом, по- видимому, составляет не менее 13.
РАЗМНОЖЕНИЕ ДРОЖЖЕЙ \
Размножение — это процесс, в результате которого воспроизводится новая особь, идентичная той, от которой она произошла. Для дрожжей это означает образование новых клеток половым или бесполым путем из клеток, уже существующих. Слово «размножение» является синонимом слов «развитие» или «воспроизводство». Применяют также термин «рост», не в ограниченном смысле увеличения размеров отдельной клетки, а для обозначения образования колонии, культуры, популяции дрожжей путем размножения клеток. Рост — это увеличение двух параметров: микробиальной плотности, или клеточной массы и клеточной концентрации, или числа клеток на единицу объема среды.
Бесполое размножение
В зависимости от условий возможны два вида размножения спорогенных дрожжей: вегетативное — бесполое и половое с образованием спор, которые после прорастания снова дают дрожжевые клетки. Неспорогенные дрожжи размножаются только бесполым вегетативным путем.
В зависимости от рода бесполое размножение совершается или почкованием, что свойственно большей части видов винных дрожжей, или делением на две части, что характерно для дрожжей Schizosaccharomyces.
При размножении почкованием (рис. 5.2) ядро клетки перемещается к периферии, вытягивается; часть его
проникает в почку, которая появляется на поверхности клетки. Когда почка достигает достаточных размеров, она отделяется от материнской клетки; образованная таким путем новая клетка в свою очередь будет почковаться. Дочерняя клетка может так-
Рис. 5.2. Различные фазы процесса почкования дрожжевой клетки; схематически показано перемещение ядра.
же оставаться связанной с клеткой- матерью, в результате чего образуются колонии, длинные цепи или скопления дрожжей. Почкование происходит быстро; под микроскопом можно прослеживать процесс такого размножения, которое в виноградном сусле длится в течение 1—2 ч, в фазе активного брожения число дрожжевых клеток удваивается каждые 2 ч. Почкование называют полярным, если новая клетка появляется на одном из концов материнской клетки; биполярным, когда почки развиваются на обоих концах, и мультиполярным, если почки появляются в любом месте.
В случае размножения делением, которое напоминает . деление бактерий, клетка удлиняется, ядро вытягивается, делится пополам, после чего появляется перегородка, разделяющая материнскую клетку. Обе дочерние клетки отделяются повторным делением по этой перегородке, не изменяя общей формы дрожжей.
Половое размножение
При неблагоприятных условиях развития дрожжей, например когда исчерпан весь сахар из питательной среды, спорообразующие дрожжи перестают почковаться, оболочка утолщается и клетки превращаются в аски, содержащие одну или несколько аскоспор (рис. 5.3).
Рис. 5.3. Различные фазы споруляции дрожжевой клетки:
а — вегетативные клетки (диплоиды); б — прекращения почкования; в — аски и аскоспоры; г — споры, выходящие из аска (у некоторых видов).
Ядро дрожжевой клетки претерпевает мейотическое деление. Каждое новое ядро обволакивается частью цитоплазмы и образует новую клетку в старой с утолщенной оболочкой. Аски дрожжевых клеток обычно содержат от одной до четырех аскоспор, иногда больше в зависимости от рода. Спорулируют не все клетки культуры; даже в наиболее благоприятных условиях для споруляции лишь небольшая часть дрожжевых клеток превращается в аски.
Помимо достаточных клеточных резервов спорообразование требует определенных физико-химических условий: соответствующей влажности и температуры, питательной среды и особенно присутствия кислорода. Именно поэтому спорообразование
происходит особенно хорошо на поверхности плотной питательной среды. В обычных условиях дрожжи не могут спорулировать в вине; в дрожжевом осадке они представляют собой старые или мертвые, но не спо- рулирующие клетки.
Форма спор изменяется в зависимости от вида дрожжей: сферическая, с гладкими или бородавчатыми стенками, почковидная, веретенообразная, полусферическая, в виде шляпы и т. д.
Помещенные в благоприятные условия среды аскоспоры прорастают, иногда освобождаются от аска, стенка которого разрывается, и размножаются, образуя каждая новую вегетативную клетку.
В зависимости от вида дрожжей половое размножение происходит в разное время и подразделяется на три типа жизненных циклов.
Диплофаза (рис. 5.4, 777): вегетативная клетка перестает почковаться и превращается в аок, содержащий четыре аскоспоры; когда позволяют условия, аскоспоры прорастают и сразу же сливаются, образуя диплоидные вегетативные клетки, которые размножаются почкованием; хромосомная редукция или мейоз происходит как раз перед образованием аскоспор, следовательно, такие клетки являются диплоидными в течение всего вегетативного роста; это относится к многим видам Saccharomyces.
Гаплофаза (рис. 5.4, /7): сливаются две вегетативные клетки; образовавшаяся диплоидная зигота подвергается хромосомной редукции и сразу же превращается в аск; когда аскоспоры становятся свободными, они -прорастают, образуя гаплоидные клетки, которые размножаются почкованием; такие клетки остаются гаплоидными в течение всего периода вегетативного роста; по старой классифика-
Рис. 5.4. Половое размножение и цикл развития дрожжей (Шампаньят и сотрудники, 1969):Рис. 5.4. Половое размножение и цикл развития дрожжей (Шампаньят и сотрудники, 1969):а —аскоспоры; б — оплодотворение; в — хромосомная редукция; г—диплс 1дные слетки, преобразующиеся в аски и образующие аскоспоры в количествах, изменяющихся в зависимости от вида. Гаплоидная генерация изображена пустыми фигурами, диплоидная генерация заштрихована.а —аскоспоры; б — оплодотворение; в — хромосомная редукция; г—диплс 1дные слетки, преобразующиеся в аски и образующие аскоспоры в количествах, изменяющихся в зависимости от вида. Гаплоидная генерация изображена пустыми фигурами, диплоидная генерация заштрихована.ции такие дрожжи относили к Zygo- saccharomyces.
Рис. 5.4. Половое размножение и цикл развития дрожжей (Шампаньят и сотрудники, 1969):
Рис. 5.4. Половое размножение и цикл развития дрожжей (Шампаньят и сотрудники, 1969):
а —аскоспоры; б — оплодотворение; в — хромосомная редукция; г—диплс 1дные слетки, преобразующиеся в аски и образующие аскоспоры в количествах, изменяющихся в зависимости от вида. Гаплоидная генерация изображена пустыми фигурами, диплоидная генерация заштрихована.
а —аскоспоры; б — оплодотворение; в — хромосомная редукция; г—диплс 1дные слетки, преобразующиеся в аски и образующие аскоспоры в количествах, изменяющихся в зависимости от вида. Гаплоидная генерация изображена пустыми фигурами, диплоидная генерация заштрихована.
Гаплодиплофаза (рис. 5.4,/): аскоспоры прорастают в гаплоидную популяцию путем почкования; когда популяция достигает определенного возраста, возникают явления оплодо- творения в результате слияния двух гаплоидных клеток; образуются диплоидные зиготы, которые непрерывно размножаются почкованием; лишь некоторые из этих диплоидных клеток претерпевают хромосомную редукцию, чтобы дать гаплоидные аскоспоры.
По своей форме гаплоидные клетки чаще всего круглые или сферические,
они меньше, чем клетки в диплоидной фазе, которые бывают овальными или удлиненными. В гаплоидной форме третья и четвертая ночки часто появляются около первой, что дает типичные розетки; в жидких культурах клетки имеют тенденцию к группировке. В противоположность этому в диплоидной форме на материнской клетке вторая почка появляется напротив первой; клетки редко группируются.
В последние годы открыты и описаны необычные формы размножения. Греваль и Миллер (1972) выявили бесполую споруляцию, в частности у одной расы Saccharomyces ellipsoide-
От 5 до 10» 25 » 50» 4,8 » 12» 30 » 75» 2 » 5От 5 до 10» 25 » 50» 4,8 » 12» 30 » 75» 2 » 5
От 5 до 10
» 25 » 50
» 4,8 » 12
» 30 » 75
» 2 » 5
От 5 до 10
» 25 » 50
» 4,8 » 12
» 30 » 75
» 2 » 5
us (19 и 1) из коллекции Агрономической и энологической станции Бордо; образовавшиеся аски содержат диплоидные споры; в период цикла развития таких дрожжей не наблюдали ни разу явления слияния.
ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ ДРОЖЖЕЙ
Дрожжи имеют очень изменчивый химический состав, зависящий от вида и культуральной среды. Этот состав представляет интерес для определения количества веществ, которые могут быть использованы или выделены дрожжами. Дрожжи содержат в среднем 75% воды и 25% сухого вещества, имеющего примерно следующий состав (в %):
Неорганические вещества
Углеводы (глюциды)
Азот
Белки (NX6,25)
Липиды
Основными фракциями неорганических веществ являются фосфорная кислота (около 50%) и калий (около 25%).
Выше было сказано, что углеводы дрожжей состоят из полисахаридов и гликогена. Белки изменяются в обратной пропорции к гликогену; высокое процентное содержание азота коррелирует с большим количеством золы. В дрожжах находятся все необходимые аминокислоты. Среднее содержание их (в % белковых веществ на сухую массу) выражается следующими значениями: •
Аланин
6,1
Лизин
7,3
Аргинин
4,7
Метионин
1.5
Аспарагин
7,9
Феннлалаиин
3,5
Цистин
1,2
Пролин
4,2
Глутамин
10,8
Серин
5,0
Гликол
4,1
Треонин
5,5
Гистидин
2,6
Триптофан
1,4
Изолейции
4,8
Тирозин
4.4
Лейцин
6,3
Валин
5,7
118
Пуриновые и пиримидиновые формы азота, входящие в нуклеиновые кислоты дрожжей, составляют соответственно 8 и 4% от общего азота.
Ниже приведено содержание витаминов в дрожжах (в мкг на 1 г сухих дрожжей).
Тиамин
От 20 до 100
Рибофлавин
« 30» 62
Пантотеновая кислота
«118» 198
Никотинамид
«190» 585
Пиридоксин
« 25» 100
Биотин
«0,5» 1,8
Фолиевая кислота
« 19» 35
Мезоинозит
«2700» 5000
КЛАССИФИКАЦИЯ ДРОЖЖЕЙ
Присутствие в бродящей жидкости микроскопических клеток, размножающихся почкованием, впервые наблюдал Каньяр де ла Тур (1887), который также указал на возможность их культивирования. Но до появления работ Пастера была принята теория Либиха (1839), видевшего в дрожжах органическое вещество, разложение которого вызывает распад тел, находящихся в контакте с ним, и в частности сахара. Пастер (1857) установил связь между присутствием живых «ферментов» и превращением сахара в спирт во время брожения. Брожение соответствует жизни без воздуха, и именно дрожжи в этих условиях разлагают сахар с образованием спирта.
Довольно скоро благодаря методам использования чистых культур было установлено, что существует большое число видов дрожжей, различных по внешнему виду под микроскопом и по своим свойствам. Ганзен (1881) вывел культуры из одной клетки путем последовательных разбавлений жидкой среды. Кох (1883) применил метод плотной среды; распределяя
Подсемейство12345TrichosporoldeaeProca-ndldoldeaeCandidoldeaeTorulopsoideaeCryptococcoideaeРодыGeotrichumTrichosporum Fermentotri- chonAzymopro- candida ProcandidaAzymocandidaCandida * Brettanomy- ces *Torulopsis *Kloeckera*Paratorulop- sis Cryptococcus Nigrococcus Rhodotorula * Dioszegia Trigonospis PityrosporumПодсемейство12345TrichosporoldeaeProca-ndldoldeaeCandidoldeaeTorulopsoideaeCryptococcoideaeРодыGeotrichumTrichosporum Fermentotri- chonAzymopro- candida ProcandidaAzymocandidaCandida * Brettanomy- ces *Torulopsis *Kloeckera*Paratorulop- sis Cryptococcus Nigrococcus Rhodotorula * Dioszegia Trigonospis PityrosporumТаблица 5.1Таблица 5.1Классификация аспорогенных дрожжей. семейства Cryptococcaceae (по данным Лоддер, 1970)Классификация аспорогенных дрожжей. семейства Cryptococcaceae (по данным Лоддер, 1970)* Роды дрожжей, встречающихся в суслах или винах.* Роды дрожжей, встречающихся в суслах или винах.
Подсемейство
1
2
3
4
5
Trichosporoldeae
Proca-ndldoldeae
Candidoldeae
Torulopsoideae
Cryptococcoideae
Роды
Geotrichum
Trichosporum Fermentotri- chon
Azymopro- candida Procandida
Azymocandida
Candida * Brettanomy- ces *
Torulopsis *
Kloeckera*
Paratorulop- sis Cryptococcus Nigrococcus Rhodotorula * Dioszegia Trigonospis Pityrosporum
Подсемейство
1
2
3
4
5
Trichosporoldeae
Proca-ndldoldeae
Candidoldeae
Torulopsoideae
Cryptococcoideae
Роды
Geotrichum
Trichosporum Fermentotri- chon
Azymopro- candida Procandida
Azymocandida
Candida * Brettanomy- ces *
Torulopsis *
Kloeckera*
Paratorulop- sis Cryptococcus Nigrococcus Rhodotorula * Dioszegia Trigonospis Pityrosporum
Таблица 5.1
Таблица 5.1
Классификация аспорогенных дрожжей. семейства Cryptococcaceae (по данным Лоддер, 1970)
Классификация аспорогенных дрожжей. семейства Cryptococcaceae (по данным Лоддер, 1970)
* Роды дрожжей, встречающихся в суслах или винах.
* Роды дрожжей, встречающихся в суслах или винах.
клетей в жидкой среде, он фиксировал ее желатином и таким путем получал колонии, вырастающие из одной клетки и легко выделяемые.
Эти методы, значительно усовершенствованные, в дальнейшем привели к открытию большого числа видов, многочисленность и разнообразие которых сделали неизбежной разработку очень сложной классификации. Прежде всего, было необходимо определить особенности каждого вида. Со времени первой классификации Ганзена (1904), в которой дрожжи делятся на спорогенные и аспорогенные, таксономия дрожжей дала повод для огромного количества работ, приведших к созданию более точной .классификации дрожжей.
Вехами на этом пути являются описательные монографии Штеллинг- Деккер, (1931), Лоддер (1934), Дид- денса и Лоддер (1942), Лоддер и Крегер-Ван Рижа (1952), Кудрявцева (1960), Коцковой-Кратохвиловой (1961) и, как завершение, исчерпывающая систематика Лоддер (1970), коллективный труд, объединяющий работы большого числа специалистов.
Ниже приведены таблицы распределения различных видов дрожжей (табл. 5.1 и 5.2). Спорогенные дрожжи включают 25 родов, объединяющих 190 видов, аспорогенные дрожжи — 12 родов и около 170 видов.
Место винных дрожжей в новой классификации
Если составить опись всех дрожжей в мире, выделенных из винограда, из бродящего сусла, из вин или найденных в помещениях винзаводов, то приходится констатировать, что согласно последней классификации они принадлежат не менее как к 36 спорогенным видам, входящим в 8 родов, и к 31 неспорогенному виду дрожжей, которые представляют 7 различных родов.
В Трактате по энологии (1960) место винных дрожжей в общей класси- кации было уточнено в 50-х годах в свете фундаментальных работ де Кастелли в Италии и С. Домерк во Франции. Тем самым был восполнен значительный пробел в энологической науке, существовавшей до этого времени.
С тех пор наши знания еще более
Подсемейство1234Schlzosaccharomy- coldeaeNadsonioideaeSaccharomycoideaeLipomicetoideaeРодыSchizosaccharo- myces *Nadsonia Saccharomyco- des * Hanseniaspora * WickerhamiaSaccharmyces * Kluyveromyces * Lodderomyces Wingea Endomycopsis * Pichia * Hansenula * Pachysolen Citeromyces Debaromyces * Schwanniomyces Dekker a Saccharomycop- sisLipomycesПодсемейство1234Schlzosaccharomy- coldeaeNadsonioideaeSaccharomycoideaeLipomicetoideaeРодыSchizosaccharo- myces *Nadsonia Saccharomyco- des * Hanseniaspora * WickerhamiaSaccharmyces * Kluyveromyces * Lodderomyces Wingea Endomycopsis * Pichia * Hansenula * Pachysolen Citeromyces Debaromyces * Schwanniomyces Dekker a Saccharomycop- sisLipomycesКлассификация спорогенных дрожжей семейства Saccharomycetaceae (по- данным Лод- дер, 1970)Классификация спорогенных дрожжей семейства Saccharomycetaceae (по- данным Лод- дер, 1970)* Роды дрожжей, встречающихся в суслах или в* Роды дрожжей, встречающихся в суслах или ввинах.винах.
Подсемейство
1
2
3
4
Schlzosaccharomy- coldeae
Nadsonioideae
Saccharomycoideae
Lipomicetoideae
Роды
Schizosaccharo- myces *
Nadsonia Saccharomyco- des * Hanseniaspora * Wickerhamia
Saccharmyces * Kluyveromyces * Lodderomyces Wingea Endomycopsis * Pichia * Hansenula * Pachysolen Citeromyces Debaromyces * Schwanniomyces Dekker a Saccharomycop- sis
Lipomyces
Подсемейство
1
2
3
4
Schlzosaccharomy- coldeae
Nadsonioideae
Saccharomycoideae
Lipomicetoideae
Роды
Schizosaccharo- myces *
Nadsonia Saccharomyco- des * Hanseniaspora * Wickerhamia
Saccharmyces * Kluyveromyces * Lodderomyces Wingea Endomycopsis * Pichia * Hansenula * Pachysolen Citeromyces Debaromyces * Schwanniomyces Dekker a Saccharomycop- sis
Lipomyces
Классификация спорогенных дрожжей семейства Saccharomycetaceae (по- данным Лод- дер, 1970)
Классификация спорогенных дрожжей семейства Saccharomycetaceae (по- данным Лод- дер, 1970)
* Роды дрожжей, встречающихся в суслах или в
* Роды дрожжей, встречающихся в суслах или в
винах.
винах.
расширились в результате 'исследований, проводившихся в различных винодельческих районах мира. С другой стороны, классификацию следует пересмотреть, с тем чтобы привести ее в соответствие с последним вариантом, данным Лоддер (1970). Табл. 5.3 и 5.4 отражают изменения, иногда существенные, которые были внесены в классификацию в последнее десятилетие. В этой книге приняты новые обозначения, за исключением двух (Sacch. ellipsoideus и Sacch. ovifor- mis), из-за причин, изложенных в гл. 6.
Уместно напомнить, что дрожжи всегда обозначают латинским наименованием рода, сопровождаемым названием вида, которое может быть или именем автора, открывшего этот вид (Saccharomyces chevalieri, Saccharo- mycodes ludwigii), или названием, подсказанным формой (Torulopsis stella- ta, Kloeckera apiculata), или же названием места, где были найдены эти
дрожжи (Saccharomyces italicus, Kloeckera africana). В точной номенклатуре применяют двойное латинское обозначение имени автора, который изучил данные дрожжи и дал им название (Saccharomyces bayanus Sac- cardo).
Тесты классификации дрожжей
Техника выделения. Прежде чем приступить к исследованию какого-то штамма дрожжей и попытаться выделить его, необходимо получить из него абсолютно чистую культуру, выводя ее из одной клетки в самом строгом смысле слова. При этом поступают следующим образом. Пробирку, содержащую 10 см3 стерильного виноградного сусла, засевают минимальным количеством дрожжей, подлежащих изучению, беря из суспензии с помощью прокаленной платиновой петли. После перемешивания взбалтыванием эта пробирка служит для засева со-
Основные виды аспорогенных дрожжей, выделенных из сусел и вин [измененные названия, употребляемые в монографиях Лоддер и Крегер-Ван Рижа (1952—1967) и ■Лоддер (1970), и названия новых видов]
Ролы
Названия дрожжей
-прежние
новые
неизмененные
новые виды
Brettanomyces
Br. schanderlii
Br. vini
Br. intermedins
Br. bruxellensis
—
■Candida
C. mycodenna
C. vanrijii
C. vini
C. sake
C. guilliermondii
C. krusei
C. melinii
C. parapsilopsis
C. pelliculosa
C. solani
C. utilis
C. zeylanoides
—
Cr.yptococcus
Cr. albidus
Cr. laurentii
—
Kloeckera
KL jensenii KL magna
Ki. javanica KL corticis
KL africana KL apiculata
Metschnikowia
C. puldaerrima
M. pulcherrima
iRhodotorula
Rh. glutinis
Rh. mucilaginosa
T. colliculosa
T. dattila
T. cantarellii
T. domercqii
Torulopsis
T. famata
T. bacillaris
T. stelllata
T. candida
T. stellata
T. holmii
T. glabrata
T. inconspicua
T. versatilis
держимого другой пробирки, которая в свою очередь используется для приготовления третьей. Содержимое этих трех пробирок выливают в три стерильные чашки Петри и смешивают с таким же объемом 20%-ного желатина, расплавленного легким нагреванием. Оставляют остыть и затвердеть на ровной поверхности.
После нескольких дней пребывания чашек Петри в покое при температуре 20°С на поверхности плотной питательной среды или в глубине появляются колонии. С помощью ушка иглы из платины или нержавеющей стали, прокаленных в пламени спиртовки, отбирают некоторое число колоний (одну за другой), выросших каждая
Основные виды спорогенных дрожжей, выделенных из сусел вин [измененные названия, употребляемые в монографии Лоддер (1970), и названия новых видов]
Рода
Название дрожжей'
прежние
новые
неизмененные
новые виды
Endomycopsis
E. lindneri
E. vini
Hanseniaspora
H’spora valby- ensis
H’spora osmo- phila
H’spora uvarum
Hansenula
H. anomala
H. subpelliculosa
Kluyveromyces
Sacch. veronae
K. veronae
Pichia
P. fermentans
P. membranae- faciens
P. vini
Sacch. acidifa-]
ciens. [
Sacch, elegans'
Sacch. bayanus)
Sacch. ovifor-|
mis
Sacch, pastoria- nus
Sacch. chevalieri1
Sacch. fructuum/
Sacch. bailii
Sacch. bayanus
Sacch. chevalieri
Sacch. bisporus
Sacch. delbrueckii
Sacch. aceti
Sacch. capensis
Sacch. coreanus
Saccharomyces
Sacch. cerevisiae1
Var. ellipsoideus J
Sacch. cerevisiae
Sacch. exiguus Sacch. fermen- tati
Sacch. florenti- nus
Sacch. geteroge- nicus
Sacch. italicus
Sacch. microel- - lipsodes
Sacch. rosei
Sacch. rouxii
Sacch. globosus
Sacch. inconspi- cuus
Sacch. kluyveri
Sacch. prosto- serdovii
Роды
Названия дрожжей
прежние
новые
неизмененные
новые виды
Sacch.carlsber-]
gensis)
Sacch.uvarumJ
Sacch. uvarum
Sacch. trans- vaalensis
Saccharomyco- des
S’codes ludwigii
Schizosaccharo- myces
Schiz. pombe
Schiz. malide-
■{ orans
из одной клетки. В гетерогенной культуре они могут принадлежать к различным видам. Каждую вводят в пробирку со стерильным суслом. Проводят второй рассев на чашки Петри и выделение культур, прежде чем применить тесты классификации.
Питательная среда. Наиболее подходящей средой для размножения винных дрожжей является виноградный сок. Сусло, полученное в период сбора урожая и консервированное посредством пастеризации, фильтруют, затем разливают по 10 см3 в пробирку, закрывают ватной пробкой. Наполненные пробирки нагревают до 100° С.
Можно также использовать пивное сусло, обработанное таким же образом, или искусственные среды следующего состава:
дрожжевой отвар из 200 г хлебопекарных дрожжей на 1 л, более или менее разбавленный, или дрожжевой экстракт из сушеных дрожжей из расчета 5 г/л;
синтетическая среда, содержащая в 1 л 100 г сахарозы; 6 г лимонной кислоты; 5 г дрожжевой золы (или смеси неорганических веществ); 2 г кис
лого фосфорнокислого калия; 2 г аспарагина, 1 г сульфата аммония.
Среду доводят до нужного pH едким кали, добавляют следующие витамины: тиамин, пиридоксин, никотинамид, пантотеновую кислоту, Р-амино- бензойную кислоту (от 0,2 до 1 мг), биотин (от 20 до 100 мкг), мезоинозит (от 5 до 10 мг).
Для сохранения штаммов используют солодовый агар, приготовленный на натуральном- солодовом сусле, разбавленном до 15% СВ (d= 1,059) и нейтрализованном до pH 7; в нем растворяют в горячем состоянии агар из расчета 15 г/л, распределяют по пробиркам, стерилизуют 15 мин при 120° С и оставляют остывать в пробирках в наклонном положении.
Следующая среда, на которой Sacc- haromyces хорошо спорулируют и долго сохраняются, приготовляется таким путем: настаивают 125 г тертой моркови в 1 л воды в течение 1 ч; настой доводят до кипения и через 10 мин кипячения фильтруют через вату, доводят до pH 5 и растворяют 30 г агара на 1 л.
Культуры дрожжей хранят на жид-
кой или плотной среде при низких температурах. Их пересевают каждые 4—6 мес и .после .нескольких дней развития вновь помещают на холод. Пересев производят из жидкой среды на плотную или наоборот. Пробирки с культурами закрывают колпачками во избежание проникновения плесеней и уменьшения испарения.
Форма и размеры клеток дрожжей. В микроскоп (увеличение 900 раз) можно видеть молодые клетки в сос тоянни полной активности и почкования через 3 или 4 дня культивирования в жидкой среде при 25° С. Можно также рассмотреть более старые культуры; при этом некоторые формы становятся более выраженными. Уже такое изучение позволяет различать не- > которые роды по величине и форме клеток: Kloeckera и Hanseniaspora (маленькие заостренные), Saccharo- mycodes (большие заостренные), То- rulopsis stellata (очень маленькие эллиптические). Размеры клеток определяют с помощью микрометра, отмечают также характер почкования. В действительности дрожжевая популяция в чистой культуре состоит из клеток всех размеров и часто различной формы. Иногда трудно определить средние размеры и форму. К тому же и описание оказывается недостаточным ввиду неточности эпитетов: овальная, эллиптическая, удлиненная; ее требуется дополнять рисунком или фотографией.
Образование спор. Эта характеристика имеет фундаментальное значение, так как она позволяет относить изучаемые дрожжи к спорогенным видам семейства Saccharomycetacees или же к аспорогенным — Cryptococ- cacees. Но это иногда трудно выявить, так как обычно во время длительного хранения некоторые виды теряют способность к спорулпрованию. Чтобы наблюдать споруляцию, куль
туру выращивают на поверхности в среде с агаром: солодовом сусле, морковном отваре или на среде Город- ковой (на 1л): 1г глюкозы, 10 г пептона, 5 г хлористого натрия. Дрожжи заостренной формы (апикулятус) хорошо спорулируют на солодовом сусле-агаре. Наблюдения с помощью
Рис. 5.5 Гигантские колонии некоторых штаммов Saccharomyces: а, б, г — Sacch. ellip- soidcus; в — Sacch. rosei.
микроскопа проводят по нескольку раз в месяц.
Характеристики культуры. Нельзя разработать классификацию на основании только этих характеристик, но они дают возможность подтверждать другие тесты дифференциации. Отмечают: 1) вид колонии на сусле с желатином, ее способность разжижать желатину (протеолиз); 2) вид культуры на виноградном сусле: появление осадка, флоккуляция, образование поверхностного кольца, пленки, устойчивой пены; 3) вид культуры на сусле-ага-
ре: цвет, поверхность (блестящая или матовая, гладкая или морщинистая), особая форма; 4) характерные признаки гигантской колонии на виноградном сусле с желатиной.
Для того чтобы получить гигантскую колонию, опускают одну каплю дрожжевой разводки в центр чашки Петри, затем чашку оставляют при температуре 20° С и наблюдают по ис-
Рис. 5.6. Трубки для брожения: а—Дурхэма; б—Эйнгорна.
течении 1 или 2 мес. При этом отмечают цвет, форму развития (концентрическую или лучевую), вид поверхности (матовую или блестящую, сухую или влажную), рельеф, толщину. Некоторые дрожжи можно опознать по их гигантским колониям, другие же не образуют характерных колоний. Кроме того, штаммы одного и того же вида могут образовать гигантские колонии различной формы и в то же время разные виды могут представлять собой одинаковые гигантские колонии. Внешний вид гигантской колонии зависит от скорости размножения, формы клеток и особенностей их почкования, от угла, под которым образу
ются древовидные ответвления дочерних клеток на материнских, а также от состава и консистенции плотной среды. Тест не всегда можно воспроизвести. На рис. 5.5 показаны некоторые гигантские колонии.
Сбраживание различных сахаров. Способность сбраживать различные- сахара (см. гл. 15, раздел «Брожение сахаров дрожжами») зависит от присутствия в клетке различных специфических ферментов. Следовательно,, это одна из стабильных характеристик дрожжей, которая может служить основой для классификации. Ключ для определения видов, например, в роде Saccharomyces, основан на этом признаке.
Для сбраживания сахаров характерно выделение углекислого газа, наблюдаемого в трубке Дурхэма или в- трубке Эйнгорна (рис. 5.6). Считают,, что первый прибор более чувствителен, чем второй. Для опытов используют глюкозу, галактозу, сахарозу,, мальтозу, лактозу, рафинозу. Дрожжи, которые сбраживают глюкозу,, сбраживают также фруктозу и маннозу и нет необходимости испытывать эти два сахара. Основная питательная^ среда содержит 5 г дрожжевого экстракта на 1 л. Каждую трубку с одним из сахаров (5 г на 1 л) засевают двумя каплями исследуемых дрожжей; помещают в термостат с температурой 25° С. Десять дней подряд проверяют появление пузырьков углекислого газа.
Инвертаза или сахараза, которая превращает сахарозу в глюкозу и фруктозу, дает возможность дрожжам, обладающим этим ферментом, сбраживать сахарозу. В действительности сахарозу могут сбраживать два. разных фермента — фруктозидаза, расщепляющая фруктозу, и глюкозидаза,, разлагающая глюкозу. Рафиназа, которая отделяет фруктозу от молекулы.
рафинозы, также является фруктози- дазой. Рафиноза представляет собой трисахарид, образованный из моносахарида фруктозы и из дисахарида ме- либиозы, которая в свою очередь состоит из глюкозы и галактозы. Мальтаза, расщеляющая мальтозу на две молекулы глюкозы, также является глюкозидазой. Большая часть дрожжей, которые сбраживают сахарозу, сбраживают также и рафинозу, но могут не действовать на мальтозу (например, в случае Sacch. chevalier!).
Санта Мария (1964) исследовала использование сахарозы и мальтозы дрожжами. Мелибиаза или, «-галактозидаза, гидролизует мелибиозу рафинозы в глюкозу и галактозу. Следовательно, в зависимости от вида дрожжей рафиноза может быть сброжена на !/з (дрожжами, имеющими фруктозидазу, но не имеющими «-галактозидазу), на 2/3 (дрожжами, имеющими фруктозидазу и «-галактозидазу, но не сбраживающими галактозу) или полностью (дрожжами, обладающими, кроме того, способностью сбраживать галактозу).
Поскольку рафиноза не относится к восстанавливающим сахарам, а сахара после ее гидролиза являются таковыми, нетрудно определить титрованием раствора Фелинга через 3—4 нед брожения, какое влияние исследуемые дрожжи оказали на рафинозу. Методом хроматографии на бумаге можно также выявить сахара, оставшиеся после сбраживания рафинозы. Лактаза, или р-галактозидаза, мало распространенная в дрожжах, разделяет лактозу на глюкозу и галактозу.
Более полный тест включает также испытания целлобиозы, трегалозы, инулина, крахмала и др.
Ассимиляция различных сахаров. Все сахара, сбраживаемые дрожжами, усваиваются также в аэробной культуре, но не все ассимилируемые
сахара сбраживаются, следовательно, тест ассимиляции применим только к несброженным сахарам. Основной средой является синтетическая среда, описанная выше в разделе «Питательная среда».
Засевают каждую трубку, содержащую 5 г субстрата на 1 л двумя каплями дрожжевой разводки (культура трехдневная), параллельно приготовляют одну контрольную трубку с глю- -к-озой, другую — без какого-либо сахара; эти трубки показывают интенсивность развития. Результаты регистрируют в течение 15—30 дней при температуре 25° С; приводят дрожжевой осадок во взвешенное состояние и сравнивают степень помутнения. Можно использовать абсорбцио-метр, позволяющий вычислить интенсивность развития. Тем не менее интерпретация полученных результатов не всегда бывает легкой, иногда более интенсивное развитие отмечается в среде без сахара, особенно для пленчатых дрожжей.
Полные тесты ассимиляции включают помимо тех, которые используются в тестах брожения, следующие вещества: сорбозу, ксилозу, арабинозу, рибозу, рамнозу, этанол, глицерин, эритрит, рибит, галактит, маннит, инозит, сорбит, салицин, кислоты: молочную, лимонную, янтарную и др. Такие тесты требуют значительных объемов питательной среды и соответствующего оборудования. Шарпантье и Бержере (1972) описали оборудование и стандартные способы исследования процессов сбраживания и аэробной ассимиляции 39 углеводных соединений. К качественным характеристикам прибавляют количественную информацию, отмечая скорость появления характеристик, что дает возможность определить штаммы (расы) в пределах вида. Разрабатывают карточки, показывающие «профили» штаммов.
Такие карточки обрабатываются на ЭВМ в числовой классификации.
Избирательное сбраживание глюкозы и фруктозы. Известно, что в при-
Рис. 5.7. Схема манометрического аппарата Варбурга для измерения интенсивности дыхания и брожения:
а —■ исходное положение манометра; б — измерение интенсивности дыхания; в — измерение интенсивности брожения.
сутствии смеси глюкозы и фруктозы, такой, как инвертный сахар, дрожжи воздействуют прежде всего на глюкозу и после этого поглощают фруктозу, По этой причине сахар, который остается в белых ликерных винах, представляет собой главным образом фруктозу. Но некоторые дрожжи ведут себя по-другому. При расчете процентного содержания сброженной глюкозы, когда 50% фруктозы уже
исчезло, различают три категории дрожжей:
дрожжи, сбраживающие к этому моменту от 80 до 85% глюкозы. Это наиболее многочисленные, глюкозо- фильные дрожжи. К этой категории относится большая часть видов Sacc- haromyces, а также Sacch aromycodes и Brettanomyces;
дрожжи, которые предпочтительно поглощают фруктозу или фрутозо- фильные; они используют в этих условиях только от 5 до 10% глюкозы. Их представляют три вида: Sacch. bailii, Sacch. rouxii и T. stellata;
дрожжи, разлагающие оба сахара с почти одинаковой скоростью, во всяком случае, с начала брожения. К моменту, когда они поглощают половину фруктозы, исчезает от 40 до 60% глюкозы. В эту категорию входят восемь видов дрожжей, в том числе виды Hanseniaspora.
Интенсивности дыхания и брожения. Уровни интенсивности дыхания (Qo, и сбраживания (Q^) у молодых клеток, культивируемых на одной и той же синтетической среде, содержащей глюкозу, полной с точки зрения содержания минеральных и азотсодержащих веществ, а также витаминов и исследуемых на одной стадии развития, измеряют с помощью манометрического прибора Варбурга (рис. 5.7). Процентное содержание дыхательного фермента клетки изменяется в зависимости от степени аэрации питательной среды. В противоположность этому интенсивность сбраживания является относительно постоянной в течение всего периода брожения и снижается только к его концу, когда число живых клеток уменьшается. Интенсивность сбраживания выражают в мм3 газа на 1 мг сухих дрожжей в час.
Лафон разделил дрожжи по этому признаку на шесть групп:
дрожжи только окисляющие. De- baryomyces, выделенные из вин, и С. vini не вызывают сбраживания сахаров или сбраживают их только в виде следов. Интенсивность дыхания равна примерно 25;
Р. fermentans и Н. anomala имеют интенсивность дыхания, часто равную и иногда превосходящую интенсивность сбраживания;
М. pulcherrima имеет достаточную окислительную способность и ма- .лоактивна с точки зрения сбраживания. Отношение дыхания к брожению равно 30:90;
для Sacch. bailii дыхание состав- ,ляет от 13 до 18%. В эту же категорию входят виды Hanseniaspora. Интенсивность сбраживания составляет ют 100 до 150 при интенсивности дыхания от 15 до 20;
у рода Saccharomyces отношение .дыхания к брожению всегда ниже 10% при интенсивности брожения от Д00 до 300. Такие же данные и у То- .rulopsis stellata при несколько более .слабой интенсивности брожения;
Brettanomyces—дрожжи с замед- .ленным метаболизмом, имеют слабую интенсивность дыхания при интенсивности сбраживания около 50. '
Кривые брожения — спиртообразую- чцая способность. Последняя определя- <ется по максимальной спиртуозности, полученной при использовании иссле- .дуемых дрожжей в сусле с достаточным содержанием сахара. Опыты проводили в небольших склянках для ^брожения вместимостью 90 см3, содержащих 60 см3 сусла. В одной серии .склянок ведут анаэробное брожение под стеклянной трубкой с оттянутым тонким концом, в другой — они закрыты простыми ватными пробками. ‘Склянки оставляют на брожение в ■термостате при 25°С. Повторные взвешивания позволяют начертить кривые потерь массы. В конце брожения оп-
ределение спиртуозности или количественный анализ остаточного сахара показывает спиртообразующую способность данного вида дрожжей.
Побочные продукты сбраживания сахара. Известно, что при брожении наряду со спиртом и углекислым газом по схеме глицериио-пировиноград- ного брожения Нейберга образуется ряд побочных и вторичных продуктов. Эквивалентность между глицерином (г) и суммой других вторичных продуктов: уксусной кислоты (у), янтарной кислоты (я), 2,3-бутандиола (б), ацетоина (а), остаточного свободного ацетальдегида (э) — с коэффициентом при каждом из них, выведенным из химического уравнения, установлена аналитически. Было предложено следующее уравнение, вытекающее из баланса спиртового брожения Нейберга:
5я + 2у + б + 2а + э = 2 < г.
Анализы многих сотен брожений, проведенных в различных условиях, показали, что 2 изменяется от 0,8 до 1,0 г. Это уравнение эквивалентности подтверждается для всех дрожжей родов Saccharomyces и Saccharomycodes. Эти дрожжи имеют только бродильный метаболизм.
Для другой группы дрожжей, включающих роды Torulopsis и Hansenula, это отношение действительно только в условиях абсолютного анаэробиоза и непригодно даже при очень слабой аэрации; эти дрожжи образуют много уксусной и янтарной кислот, часть которых образуется в процессе дыхания.
Для дрожжей рода Hanseniaspora предыдущее равенство справедливо только при слабой аэрации и не подходит для среды с большим доступом воздуха.
Отношение глицерина к спирту в конце брожения при прочих равных условиях мало изменяется в зависимо-
сти от дрожжей и не позволяет различать -их виды. Но они дифференцируются пропорциями различных побочных продуктов брожения. Существуют также дрожжи, образующие уксусную кислоту, янтарную и глицерин. Знание этих характеристик, в частности образование летучих -кислот, имеет непосредственный интерес к энологии.
Следует также указать на образование этилацетата, сложного эфира, известного как вещество, придающее испорченным винам признаки скисания. Все винные дрожжи вырабатывают этилацетат в различном процентном содержании. Тогда как виды Sac- charomyces и Torulopsis являются наименее эстерогенными (дают наименьшие количества сложных эфиров), Hanseniaspora uvarum, Saccharomy- codes ludwigii и особенно виды Pichia и Hansenula, образующие на поверхности -пленки, дают повышенное процентное содержание этилацетата, способного придавать винам признаки испорченных вин.
Образование высших спиртов, частично связанное с питанием дрожжей азотом и изменяющееся в зависимости от видов, может также дать дополнительные данные, полезные для классификации.
Ассимиляция нитратов. Свойство использовать нитраты, т. е. превращать их в усвояемый азот, является важным критерием в та-ксономии дрожжей в силу его надежности. Большинство дрожжей не усваивают нитраты; с другой стороны, род Hansenula характеризуется своей способностью использовать их и тем отличается от рода Pichia. Некоторые дрожжи рода Brettanomyces также усваивают нитраты.
Ассимиляция гидрата окиси аммония, введенного в виде сульфата аммония, может также способствовать дифференциации видов Kloeckera,
Hanseniaspora, которые не могут его использовать, и видов Torulopsis, плохо усваивающие его. Другие дрожжи в качестве азотного питания лучше усваивают гидрат окиси аммония.
Жидкая среда, использованная для изучения этого признака, имела следующий состав (в г на 1 л): глюкоза — 10, кислый фосфорнокислый калий — 1; сернокислый магний — 0,5; хлористый кальций — 0,1; хлористый натрий— 0,1. Факторы роста добавляют в той же дозе, как и для усвоения сахаров (или 1 г нитрата калия, или 1 г сернокислого аммония).-
Использование этанола. Такой анализ имеет лишь второстепенное значение для идентификации дрожжей, так как этим свойством обладают только редкие виды. Используемая среда идентична описанной выше, без глюкозы, но с сульфатом аммония. Перед посевом добавляют 3% этилового спирта. Контроль развития проводят через 2 нед путем сравнения со склянкой без спирта.
■ Потребности в факторах роста. Потребность дрожжей в факторах роста (биотин, пиридоксин, тиамин, пантотеновая кислота, мезоинозит, никотинамид, парааминобензойная кислота) характерна для всех видов, встречающихся в винах. Определения ведут на простой среде, описанной выше в разделе «Питательные среды», содержащей только перекристаллизованные вещества. Для каждой культуры дрожжей тотовят восемь пробирок; одна пробирка не получает ни одного фактора роста, другая получает их все, остальные шесть пробирок получают все факторы роста, за исключением одного, каждый раз разного. Таким образом, изучают индивидуально все случаи недостаточности. При обсеменении реализуют постоянную исходную популяцию из одной или двух дрожжевых клеток на 1 мм3.
Поведение дрожжей контролируют в три этапа:
в первые часы оценивают рост нефелометрическим изменением, проводимым непосредственно на пробирках после взбалтывания;
за ходом брожения следят путем взвешивания пробирок, закупоренных трубкой с оттянутым концом через одинаковые промежутки времени, например через каждые 2 дня;
переходят к подсчету дрожжей с помощью счетчика клеток.
В результате получают данные одновременно как по скорости роста, так и по скорости и пределу сбраживания сахара.
Таким образом, различают протот- рофные дрожжи, которые могут развиваться и вызывать брожение в среде, совершенно лишенной факторов роста, так как они способны их синтезировать, и дрожжи ауксотрофные, К1о- eckera, Saccharomycodes, Hanseniaspo- га, неспособные размножаться, если в питательном растворе не хватает какого-нибудь витамина. Для протот- рофных видов, для которых факторы роста не являются обязательными, они тем не менее играют роль активаторов в процессах размножения и брожения.
Эти характеристики довольно специфичны, чтобы быть использованными при идентификации дрожжей.
Влияние температуры. Наблюдая за ходом брожения виноградного сусла путем взвешивания склянок при различных температурах, например 4, 13, 20, 25, 30 и 35° С, и вычерчивая кривые потерь углекислого газа, можно сравнивать поведение различных видов дрожжей.
По этим данным винные дрожжи разделяют на пять групп:
Виды Saccharomyces, представляющие собой прекрасную иллюстрацию к закону: «начало брожения про-
ходит тем быстрее и получаемая спир- туозность тем ниже, чем выше температура» (см. гл. 7, раздел «Влияние температуры на скорость и предел брожения виноградного сусла»). Для этих довольно холодоустойчивых дрожжей максимум сброженного сахара достигается при 13° С; при 4° С сбраживается от 55 до 75% этого максимума; при 30 и 35° С трансформируется только половина;
более термофильные дрожжи, включающие Sacch. bailii, Sacch. he- terogenicus, T. stellata и Saccharomycodes ludwigii. Эти дрожжи имеют оптимум брожения при 25° С и еще более активны при 30—35° С, с другой стороны, они плохо сбраживают сахара при 4 и 13° С. Отсюда можно было бы заключить о целесообразности использования этих дрожжей в районах жаркого климата; к сожалению, это плохие дрожжи с точки зрения виноделия (слабая способность опиртооб- разования, образование значительных количеств уксусной кислоты и этилацетата);
виды Hanseniaspora и Kloeckera, к которым можно присоединить Sacch. rosei. Эти дрожжи классифицируются между группами 1 и 2. Здесь оптимальная температура равна 20° С.
виды Brettanomyces, сбраживающие преимущественно при высоких температурах. Лаг-фаза у этих дрожжей довольно продолжительная при 25°С (от 8 до 10 дней), очень короткая при 30—35°С (2—3 дня);
дрожжи, мало подверженные действию температуры, ведут себя почти одинаково при всех температурах— от 13 до 35°С. К ним относятся М. pulcherriima, Sacch. rouxii.
Устойчивость к сернистому ангидриду. Знание устойчивости дрожжей к сернистому ангидриду, внесенному в сок или в бродящую среду, чтобы задержать . забраживание, и к дозам
SO2, применяемым для консервирования вин с остаточным сахаром (недо- бродов), имеет непосредственное значение для практики виноделия. Опыты по сбраживанию виноградного сусла при введении доз сернистого ангидрида от 100 до 400 мг/л, засеянного -сразу же после такого добавления постоянным числом дрожжей, позволяет разделить дрожжи на три группы:
чувствительные к этому антисептику и не развивающиеся при сульфитации сусла дозами от 100 до 150 мг/л; это Sacch. rosei, Kloeckera и -Hanseniaspora;
- 2) устойчивые к дозам от 100 до 150 мг/л, но не более; к ним относятся Sacch. ellipsoideus, Т, stellata, один штамм Sacch. oviformis;
высокоустойчивые, способные выдержать очень высокие дозы. Штаммы разновидности oviformis вызывают брожение при 250 мг/л сернистой кислоты. С дрожжами Sacch. bailii брожение может начаться при дозах от 250 ■ до 400 мг/л; Saccharomycodes ludwigii прекрасно выдерживают 400 мг/л.
Устойчивость к актидиону. Ингибирующее действие актидиона было определено для многих видов дрожжей, в частности для тех, которые играют определенную роль в приготовлении и хранении вин( см. гл. 9, раздел «Про- тивогрибные антибиотики»). Ниже приведен спектр противодрожжевого действия актидиона; он показывает концентрации (в мг/л), оказывающие ингибирующее воздействие в течение месяца на брожение виноградного сока, обсемененного дрожжами из расчета 10 000 клеток на 1 см3 (Пейно и сотрудники, 1962).
Sacch. bailii5
Sacch. ellipsoideus10
Sacch. ovifomis, chevalier!, roseif, fer- 20 mentati Saccharomycodes ludwigii, Hansenula 20 anomala Sacch. heterogenicusЗЭ
Sacch. delbrueckii100
T. Stellata, Br. vini, Br. schanderlii 100 Hanseniaspora uvarum, Kloeckera apicu- lata!
Этот тест может помочь идентификации устойчивых дрожжей. Однако выявлены некоторые штаммы Sacch. ■oviformis и Sacch. bailii, безразличные к актидиону.
Исследование антигенов. Классификация дрожжей с помощью серологических тестов была испытана многими ■авторами. Используя моноспецифиче- ские сыворотки и два серологических .способа, Шарпантье и сотрудники (1971) доказали существование антигенного родства между семью видами винодельческих дрожжей; эти черты сходства, вероятно, могли бы объяснить, по мнению этих авторов, постоянство порядка появления видов дрожжей во время приготовления вина,
ЭКОЛОГИЯ и РАСПРОСТРАНЕНИЕ ДРОЖЖЕЙ
Экология является наукой, которая изучает живой организм во взаимоотношении с его физической и биологической средой. Экологические исследования дрожжей охватывают распределение различных видов в существующих природных условиях в зависимости от климата, разнообразия субстратов и их численности.
Во время Пастера спонтанное брожение собранного винограда могло казаться более странным, чем, например, брожение пивного сусла, где дрожжи сохраняются в процессе непрерывного производства. Пастер, который доказал необходимость присутствия дрожжей в бродящей среде, должен был также доказать, что осенью дрожжи находятся на кожице спелых виноградных ягод, а не внутри их. С этой целью он провел несколько
экспериментов, которые имели решающее значение, в том числе: : *-
виноградный сок был взят из ягоды посредством тонкой стеклянной трубочки в асептических условиях и перенесен в небольшую стерильную колбу. Такой сок не забраживал, следовательно, внутри ягоды сахар не подвергается спонтанному сбраживанию из-за отсутствия дрожжей, а не из-за отсутствия воздуха, как думали раньше;
прокипяченное сусло в колбе, закрытой ватным тампоном, может храниться неопределенно долгое время и, наоборот, оно быстро забраживает, если в него ввести воду, использованную для мойки зрелого винограда;
грозди еще зеленого винограда, не отделяя их от куста, накрывают стерильными банками и закрывают ватой. Когда виноград созревает, раздавленные в сосудах ягоды не бродят, так как на кожице ягод, изолированных от внешней среды, не было дрожжей. Таким путем Пастер установил, что на зеленом винограде дрожжей не бывает; они появляются только на созревших ягодах и приносятся туда воздухом.
Сержан и Ружебьеф (1926) уточнили определяющую роль насекомых в этом явлении. Они помещали в начале июля целые кусты винограда в три типа клеток: первая — застекленная, куда не могли проникнуть ни насекомые, ни пыль; вторая — покрытая сеткой с очень мелкими ячейками, через которые не могли проникнуть насекомые, включая и дрозофилл, но свободно проходили воздух и пыль; третья—• с сеткой такого же типа, но с более крупными ячейками, пропускавшими насекомых.
По достижении зрелости виноградные ягоды вводили в стерильные трубки и раздавливали в асептических условиях. Авторы констатировали, что
виноград, созревший в первой клетке и не имевшей контакта с внешней средой, никогда не подвергался самопроизвольному брожению, равно -как и виноград, который был защищен от насекомых, но имел контакт с пылью; бродил только виноград из клетки, в которую имели доступ насекомые. Отсюда можно заключить, что распространение дрожжей на винограднике в период зрелости происходит в первую очередь посредством насекомых. В частности, дрозофиллы переносят на виноград дрожжи и другие микроорганизмы, захватывая их в очагах брожения, которые всегда существуют в природе в это время года: испорченные фрукты, скопление выжимки от предыдущих лет, разлагающиеся органические вещества и др.
Допускали, что личинки дрозофилл питаются дрожжами и взрослые насекомые содержат дрожжи в своих внутренностях, оставляя их в виде отбросов на зрелых ягодах. Однако Фафф считает, что дрожжи гибнут в процессе пищеварения и насекомые распространяют дрожжи просто путем контакта. Как бы то ни -было, распределение дрожжей происходит неравномерно и можно встретить ягоды или обрывки гроздей, лишенные дрожжей. Наряду с дрожжами на винограде находятся плесневые грибы, бактерии молочнокислого и уксусного брожения, заносимые таким же образом. Помимо этого, дрожжи находятся на различных органах виноградного растения в течение всего года; зимой их находят на древесных частях. Но основным местом обитания дрожжей зимой является почва: их находят на поверхности, а также и на некоторой глубине.
Белин (1972), Белин и Анри (1972), подчеркнув, что изучение распределения дрожжей до настоящего времени производилось с использованием несовершенных способов исследования
Частота выделения дрожжей из виноградных сусел в Италии (по данным Кастелли, 1960), %
Район
Авторы
° ч
э- ?
и с я
О X 3
2 Sr
и й 3
‘о.
2
2е
2.2
а: =
*5 га
/Ё
.с га
^5
К Е
Е
8g
о
>
Умбрия
Де Росси
92
379
80,0
82,0
12,7
1,1
2,1
17,0
1,0
5,8
—
Тоскана
Кастелли
103
588
72,0
87,1
19,4
—
6,4
2,1
4,3
1,о
1,0
17,2
11,8
—
—
Лацио
Кантарелли
22
194
90,9
100,0
40,9
—
22,7
13,6
13,6
—
4,5
4,5
13,6
—
—
Пьяченца
Кастелли
40
203
77,5
92,5
15,0
—
15,0
7,5
12,5
—-
2,0
7,5
10,0
—■
—
Марке
Беччи
15
125
73,5
100,4
13,3
—
13,3
6,6
20,0
—
—
13,4
—
—
—
Абруцци
Агриппа
10
60
90,0
100,4
—
—
—
—
30,0
—
—
—
—
—
—
Тревизо
Кантарелли и
Каприотти
19
143
100,4
94,0
16,0
—
5,0
5,0
—
21,0
5,0
—
5,0
—
Трентино— В. Адидже
Каприотти
10
565
95,0
100,4
17,5
—
5,0
10,0
2,5
—
2,5
7,5
—
—
Апулия
Кастелли
31
363
100,4
64,5
25,8
32,3
25,8
9,6
19,6
6,4
16,1
22,5
6,4
—
—
Сицилия (западная) Калабрия
Кастелли
12
170
100,4
92,0
33,0
55,0
33,0
8,5
—
41,0
25,0
—
8,5
—
Каприотти
26
447
94,1
50,0
15,0
65,0
46,0
4,0
—
38,0
42,0
4,0
—
—
Сицилия (западная)
Кастелли и Дель Джудиче
27
375
100,4
48,0
14,8
51,8
40,7
74,0
—
0,4
29,6
И ,0
14,8
—
Сицилия (восточная)
Кастелли и Дель Джудиче
24
335
100,4
50,0
25,0
28,0
—
67,0
—
—
50,0
8,0
—
—
Руфина (Тоскана)
Каприотти
17
328
100,4
82,7
32,2
—
52,0
43,7
13,0
32,2
39,0
43,7
6,2
—
6,2
Сардиния
Каприотти
4
88
100,4
75,0
37,5
—
—
37,5
12,5
62,5
25,0
12,5
—
25,0
—
Верона
Кастелли и Терцароли
16
311
100,4
100,4
—
—
—
—
—
—
—
—
—
43,0
31,0
Нижняя Пьяве
Мартини
'1
148
100,0
90,0
60,0
—
30,0
20,0
Примечание. Учтены изменения в названиях видов.
* В новой иомеклатуре Sacch. oviformis является синонимом Sacch. bayanus.
CD со
микробиологических процессов, высказали новые замечания о распределении дрожжей на поверхности виноградной грозди, частоте их появления и о местах их обитания, применяя прямое наблюдение в электронный микроскоп с разверткой изображения. Таким путем они уточнили,. что дрожжей на гребнях относительно мало и они находятся главным образом на плодоножке ягоды и в порах ее подушечки. На поверхности ягоды образуются небольшие скопления дрожжей; иногда дрожжи изобилуют на уровне старых устьиц, по соседству с разрывами, с другой стороны, размножение дрожжей прекращается при контакте с восковидным пруином. Следовательно, дрожжи удерживаются не пруином, как считали ранее, а выделениями, происхождение которых еще не установлено.
Практически невозможно сделать обзор всех работ, посвященных исследованию экологии винных дрожжей; кроме того, старые работы представляют лишь ограниченный интерес ввиду недостаточной идентификации изучавшихся дрожжей. В предшествующем издании данной книги дана обстоятельная характеристика прежних публикаций по этому вопросу, поэтому здесь приводятся только наиболее важные работы последнего времени. Более глубокое познание природы дрожжей возможно лишь на основе дальнейшего прогресса в их общей классификации.
Дрожжи виноградарских районов Италии
Работы по дрожжам, проводимые в различных университетах и исследовательских учреждениях Италии, ввиду их широкой тематики и объемов нужно рассматривать каждую отдельно. Работы Росси (1933) относительно су-
сел в районе Умбрии можно рассматривать как исходный пункт многочисленных и систематических исследований по выделению, идентификации и классификации дрожжей, которые затем продолжались на всем Аппенинском полуострове. Сотрудники Института микробиологии Университета Перузы под руководством Кастелли интенсивно исследовали эти проблемы.
Здесь невозможно дать полный анализ этих работ, содержащих около тысячи страниц публикаций. В табл. 5.5 показаны для различных районов основные виды идентифицированных дрожжей и процент частоты содержания их в суслах. К этому следует прибавить публикацию Мартини (1962) о мускатных винах острова Пантелле- рия. В этой работе, резюме которой представил Кастелли (1959, I960, 1965, 1967), было рассмотрено более 700 сусел и выделено свыше 7000 штаммов дрожжей.
Другие итальянские авторы со станции Асти и из институтов микробиологии Пизы и Турина проводили подобные работы в других районах Италии: Казале и Мензио—в северной части; Верона — в Марке, Тоскане, Сардинии; Малан — в Пьемонте; Бандини— в районе Асти (1964, 1968).
Ниже приведены основные выводы из работ Кастелли.
Число видов дрожжей, обнаруженных на винограде и в бродящих суслах, очень велико. Давно известно, что KI. apiculata и Sacch. ellipsoideus встречаются чаще других и считаются основными видами, ответственными за брожение. В то же время многие другие виды встречаются так часто, что их вмешательство в нормальный процесс брожения нельзя недооценивать. Это, в частности, такие виды, как Sacch. rosei, Sacch. bayanus, Sacch. chevalieri, Sacch. uvarum, Sacch. itali- cus. M. pulcherrima. Наряду с этими
двумя группами имеются многие другие виды, которые следует рассматривать как случайные.
Если разделить дрожжи на две группы: спорогенные и аспорогенные, то видно, что в Центральной или Северной Италии обе эти группы представлены одинаково, тогда как в Южной Италии явно преобладают спорогенные дрожжи. Заостренные дрожжи Северной Италии относятся к роду Kloeckera, которые не образуют спор; те же, которые встречаются на о-ве Сицилия и в Апулии, относятся к роду Hanseniaspora и образуют споры. Чем теплее климат, тем более распространены спорогенные формы; они более, чем аспорогенные дрожжи, устойчивы к температуре и к сухости или, по Крегер-Ван Риж, речь идет о видах, теряющих способность к споруляции в условиях более холодного климата.
Забраживание сусла обычно вызывают заостренные дрожжи. В Центральной Италии встречаются более крупные заостренные дрожжи и с более высокой способностью спиртооб- разования — KI. corticis, которых нет ни в южных, ни в северных районах Италии.
Сравнивая бродильную способность изолированных штаммов, т. е. предельное содержание этанола, которое они могут обеспечить при прочих равных условиях, можно сделать вывод, что наиболее высокие значения получаются при использовании дрожжей из зон с более теплым климатом.
Из этих исследований вытекают многочисленные положения для практики; лучшее знание дрожжей позволяет использовать их в лучших целях. В целом эти работы представляют очень большой интерес, поскольку они содержат обильный документальный материал о стране с высокоразвитой культурой винограда, часть которой
находится на одной широте с виноградарскими районами Франции. Они открыли путь для развития современной энологической микробиологии; можно утверждать, что итальянские авторы создали свою школу.
Дрожжи других зарубежных винодельческих районов
Как уже было указано выше, в предыдущем издании были описаны работы по распространению и идентификации дрожжей в разных странах, опубликованные до 1955—1958 гг. Ниже будут кратко рассмотрены публикации, появившиеся в последующие годы. . -
Начиная с 1955 г. микробиологическая школа Братиславы сделала значительный вклад в общую таксономию дрожжей и исследовала дрожжевую микрофлору в различных виноградарских районах Словакии. Эти работы, которые подтвердили универсальность характеристик винных дрожжей, выполнили Минарик, Лаго, Коцкова- Кратохвилова, Швейцар. В конце данной главы приводится обобщенная библиография этих публикаций. Табл. 5.6 резюмирует классификацию дрожжей, изученных чехословацкими исследователями. Здесь мы вновь находим с их обычной частотой появления обыкновенные виды рода Saccharomy- ces; были обнаружены также некоторые более редкие виды — Candida и Torulopsis.
Было исследовано 285 виноградных сусел. Общее число выделенных штаммов составило 3739.
В течение последних 15 лет распределение дрожжей в Испании определяли Иньиго и его сотрудники. Эти работы проводились в следующих винодельческих районах: Риоха в 1957 г., Манча в 1958 г., Херес в 1963 г., Кон- дадо, Альхарафе, Морилес и Монти-
Дрожжи, выделенные в виноградных суслах в Чехословакии (по данным Лаго и сотрудников, 1970)
Дрожжи
Число штаммов
-Дрожжи
Число штаммов
С. krusei
1
Sacch. chevalier!
7
С. mycoderma
3
Sacch. ellipsoideus
2415
С. parapsilosis
1
Sacch. exiguus
8
Н. anomala
49
Sacch. heterogenicus
3
KI. apuculata
511
Sacch. italicus
5
K.L africana
1
Sacch. oviformis '
176
К. veronae
3
Sicch. rosei
36
М. pulcherrima
346
Sacch. uvarum
116
Р. fermentans
3
T. glabrata
3
Р. membranaefaciens
9
T. inconspicua
1
Sacch. ballii
6
T. stellata
3
Sacch. bayanus
22
T. versatilis
8
Примечание. Учтены новые названия видов.
лья в 1964 г.; Арагон в 1969 г. В табл. 5.7 приведен перечень 30 идентифицированных видов; здесь также находятся обычные виды. К более специфическим относятся дрожжи, выделенные Иньиго из пленок, развивающихся на поверхности вина, особенно в южной части Испании; это агенты специальной технологии производства вин Мон- тилья и Херес, созревающих под дрожжевой пленкой. Обладающие большой окислительной способностью, эти дрожжи, как правило, не похожи на дрожжи брожения.
Санта-Мария (1964) провел полное таксономическое исследование некоторых штаммов Saccharomyces, выделенных из вина, близких к Sacch. oviformis.
Сюцевич-Сафор (1955, 1960) изучал в Югославии дрожжи, выделенные из сусел и десертных вин с большой спиртообразующей способностью, которые в основном принадлежали к видам Sacch. oviformis и ellipsoideus.
Кастелли и Сиковеч (1969) составили перечень дрожжей Словении, охватывающей 592 изученные культуры.
Для 26 идентифицированных видов они нашли картину, обычную для районов с умеренным климатом: преобладание Sacch. ellipsoideus, большая частота Sacch. uvarum, Sacch. oviformis, T. stellata, присутствие некоторых редко встречающихся дрожжей, таких, как Sacch. fermentati,, Sacch. heterogenicus, Sacch. florenti- nus.
Пиччи и сотрудники (1959), изучая 190 штаммов, выделенных из сусел Пелопоннеса, охарактеризовали 17 видов дрожжей, в том числе Sacch. mic- roellipsodes и Sacch. transvaalensis. Кастелли и Георгантас (1970) выделили 306 дрожжей из 15 образцов винограда в Северной Греции. Выделяли дрожжи до брожения; 12 идентифицированных видов принадлежали главным образом к видам со слабой опиртообразующей способностью, виды Saccharomyces представляли только 5% найденных штаммов.
В Болгарии Радучев и сотрудники (1970) выделили и изучили 30 штаммов рода Saccharomyces.
Тюрина (1962) подтвердила преоб-
Вродящие суслаПленки, развившиеся на винахаспорогенныеспорогенныеаспорогенныеспорогенныеС. guilliermondiiH. subpelliculosaС. viniН. anomalaС. solaniH’spora uvarumCr. laurentiiР. membran aefaciensKI. africanaK. veronaeRh. glutinisSacch. bailiiKL apiculataSacch. bailiiSacch. bayanusKI. javanicaSacch. bisporusSacch. oviformisM. pulcherrimaT. stellataSacch. chevalieri Sacch. delbrieckii Sacch. ellipsoideus Sacch. exiguus Sacch. fermentati Sacch. florentinus Sacch. italicus Sacch. oviformis Sacch. rose!Sacch. uvarumSacch. rouxiiВродящие суслаПленки, развившиеся на винахаспорогенныеспорогенныеаспорогенныеспорогенныеС. guilliermondiiH. subpelliculosaС. viniН. anomalaС. solaniH’spora uvarumCr. laurentiiР. membran aefaciensKI. africanaK. veronaeRh. glutinisSacch. bailiiKL apiculataSacch. bailiiSacch. bayanusKI. javanicaSacch. bisporusSacch. oviformisM. pulcherrimaT. stellataSacch. chevalieri Sacch. delbrieckii Sacch. ellipsoideus Sacch. exiguus Sacch. fermentati Sacch. florentinus Sacch. italicus Sacch. oviformis Sacch. rose!Sacch. uvarumSacch. rouxiiДрожжи, выделенные из сусел и вин в Испании (по данным работ Иньиго и его сотрудников)Дрожжи, выделенные из сусел и вин в Испании (по данным работ Иньиго и его сотрудников)ладание Saccharomyces в суслах Украины. Мавлани (1969) идентифицировала 3000 штаммов, происходящих из 480 образцов сусел и вин Узбекистана.
Вродящие сусла
Пленки, развившиеся на винах
аспорогенные
спорогенные
аспорогенные
спорогенные
С. guilliermondii
H. subpelliculosa
С. vini
Н. anomala
С. solani
H’spora uvarum
Cr. laurentii
Р. membran aefaciens
KI. africana
K. veronae
Rh. glutinis
Sacch. bailii
KL apiculata
Sacch. bailii
Sacch. bayanus
KI. javanica
Sacch. bisporus
Sacch. oviformis
M. pulcherrima
T. stellata
Sacch. chevalieri Sacch. delbrieckii Sacch. ellipsoideus Sacch. exiguus Sacch. fermentati Sacch. florentinus Sacch. italicus Sacch. oviformis Sacch. rose!
Sacch. uvarum
Sacch. rouxii
Вродящие сусла
Пленки, развившиеся на винах
аспорогенные
спорогенные
аспорогенные
спорогенные
С. guilliermondii
H. subpelliculosa
С. vini
Н. anomala
С. solani
H’spora uvarum
Cr. laurentii
Р. membran aefaciens
KI. africana
K. veronae
Rh. glutinis
Sacch. bailii
KL apiculata
Sacch. bailii
Sacch. bayanus
KI. javanica
Sacch. bisporus
Sacch. oviformis
M. pulcherrima
T. stellata
Sacch. chevalieri Sacch. delbrieckii Sacch. ellipsoideus Sacch. exiguus Sacch. fermentati Sacch. florentinus Sacch. italicus Sacch. oviformis Sacch. rose!
Sacch. uvarum
Sacch. rouxii
Дрожжи, выделенные из сусел и вин в Испании (по данным работ Иньиго и его сотрудников)
Дрожжи, выделенные из сусел и вин в Испании (по данным работ Иньиго и его сотрудников)
Можно также назвать работы Бенда (1962, 1964) в Южной Германии, которые охватывают свыше 4000 штаммов и указывают на преобладание в этом районе дрожжей на винограде, обладающих невысокой бродильной способностью: KL apiculata и М. pulcherrima (75% выделенных штаммов дрожжей).
Кано Маротта и де Каламар (1962, 1964) обнаружили в различных винодельческих районах Уругвая виды, обычные для старых виноградников, и меньшее число видов в районах более молодых насаждений. Они подчеркивают тесную связь, которая существует между дрожжами и сброженным продуктом. В провинциях Сан Хуан и де Риоха в Аргентине Ригоне де Риц (1964) исследовал энологические характеристики шести видов рода Sacc-
horomyces. Эрнандес и сотрудники (1964) идентифицировали дрожжи различных районов Чили. Зардетто де Толедо и сотрудники (1959) провели таксономическое исследование дрожжей, выделенных из винограда и сусел в зоне Сан Пауло (Бразилия); в своей работе авторы показывают, как дрожжи Р. fermentans и KL apiculata, в изобилии находящиеся на винограде, уступают место Sacch. ellipsoideus, Sacch. uvarum, Sacch. oviformis, которые становятся преобладающими в конце брожения.
Ван Зил и дю Плесси (1961) в Южной Африке обратили внимание на то, что в числе трех десятков выделенных ими видов преобладали малоценные с точки зрения энологии: KL apiculata. Rh. glutinis, С. Krusei, в связи с чем особое значение приобретает вопрос о введении чистой культуры дрожжей. Однако при спонтанном брожении Sacch. ellipsoideus и Sacch. oviformis быстро становятся доминирующими. В этом же районе Ван Керкен (1962)
провел детальное исследование микрофлоры и нашел большое число видов, в частности рода Candida.
Охара (1965) дал каталог двух десятков видов дрожжей, выделенных из сусел и вин Японии; он дополняет предыдущее исследование Ионосуха (1954). Микрофлора винограда Японии богата дрожжами Candida и То- rulopsis. Шиматани и сотрудники (1967) также нашли только дикие и пленчатые дрожжи.
Парль и Менна (1966) изучали дрожжевую микрофлору винограда и вин в Новой Зеландии. Как и в Европе, на зеленом винограде встречаются в основном дрожжи, не вызывающие брожения: KI. apiculata и Sacch. ellip- soideus, а -также другие виды Saccha- romys, встречающиеся реже, появляются на винограде в период зрелости. Значительную роль в спонтанном обсеменении дрожжами играет винодельческое оборудование.
Релан и Ивас (1971) в Индии идентифицировали 6 родов и 14 видов дрожжей винограда и вина в районе Хариана.
В.работах, проведенных в пяти частях света, бросается в глаза то, что повсюду на винограде преобладают так называемые дикие дрожжи со слабой бродильной способностью и удивляет почти полное отсутствие полезных дрожжей Saccharomyces. Поэтому можно понять реакцию авторов, которые делают из своих наблюдений вывод о необходимости использования в виноделии дрожжевой разводки культуры Saccharomyces. Однако приведенные работы в этих странах позволяют констатировать также преобладание дрожжей Saccharomyces и особенно Sacch. ellipsoideus с начала самопроизвольного брожения. Следовательно, повсюду находят на винограде, с одной стороны, и при спиртовом брожении — с другой, почти одни и те
же формы экологического равновесия между различными видами встречающихся дрожжей. Преобладающие виды одни и те же: изменчива только активность дрожжей, что связано с климатом и, вероятно, со способом выделения.
Дрожжи винодельческих районов Франции
Первые работы по идентификации дрожжей во Франции выполнила С. Домерк (1956). При этом она не ограничивалась изучением микрофлоры винограда и сусел или изучением дрожжей для приготовления вина, но исследовались также дрожжи, остающиеся в винах во время их хранения и могущие вызвать повторное брожение, если вина имеют остаточный сахар. Наконец, также были определены дрожжи, находящиеся в производственных помещениях, на технологическом оборудовании и в местах их хранения.
Дрожжи винограда и сусел — дрожжи виноделия. В процессе уборки винограда в 1951, 1952, 1953 гг. были проведены исследования приблизительно на сотне проб (виноград, дробленая масса, сбраживаемое сусло), взятых на винодельческих предприятиях района Бордо. Были выделены 2023 штамма дрожжей, которые идентифицировали каждый индивидуально. Они принадлежат к 25 различным видам, перечень которых приведен в табл. 5.8.
Из табл. 5.8 видно большое разнообразие дрожжей, обитающих на винограде. Наиболее распространенными видами, которые находятся в сусле, являются Sacch. ellipsoideus и КЕ apiculata или Hanseniaspora uvarum. Эти виды составляют не менее 90% штаммов (по данным табл. 5.8 — 78%, но здесь в статистических данных допущено искажение, так как штаммы
Дрожжи, выделенные из винограда в районе Бордо
Виды дрожжей
Производство вин
3
3
О о <а §:
Br. vini
4
0
4
Deb. hansenii
5
0
5
Н. anomala
7
0
7
H’spora uvarum) KI. apiculata J
409
154
563
KL africana
1
0
1
KL javanica
1
1
1
K. veronae
0
1
1
M. pulcherrima
6
0
6
P. fermentans
3
1
4
P. membranaefaciens
2
1
3
Sacch. bailii
0
9
9
Sacch. bayanus
3
0
3
Sacch. chevalieri
48
23
71
Sacch. ellipsoideus
501
513
1018
Sacch. delbrueckii
0
1
1
Sacch. florentinus
5
1
6
Sacch. heterogenicus
0
5
5
Sacch. italicus
5
14
19
Sacch. oviformis
18
76
94
Sacch. rosei
22
13
35
Sacch. uvarum
9
9
18
S’codes ludwigii
0
1
1
T. candida
5
0
5
T. stellata
12
127
139
Число исследуемых сусел
58
38
96
Число выделенных рас
1070
953
2023
Примечание. Учтены изменения в названиях видов.
заостренных дрожжей сознательно не включены в число выделенных). Затем в порядке частоты приводятся Sacch. chevalieri для красных сортов винограда, а для белых сусел — Т. stellata и Sacch. oviformis. Т. stellata, мелкие удлиненные дрожжи являются специфическими для винограда, пораженного благородной гнилью. Выделение грибом Botrytis cinerea противодрож- жевого антибиотика до некоторой сте*
пени является причиной того, что дрожжевая микрофлора винограда, пораженного гнилью, отлична от микрофлоры здорового винограда. Эти наблюдения подтвердил Гандини (1973).
Можно также отметить постоянное и одинаковое присутствие Sacch. rose!. Другие виды в незначительном количестве распространены очень неравномерно: из тысячи выделенных колоний находят только несколько видов. Не имеющие значения с точки зрения статистики, они, однако, могут проявлять себя в отдельных случаях. Следовательно, микрофлора винограда очень изменчива качественно, интерес с точки зрения энохимии, несмотря на ее разнообразие, сосредоточивается на небольшом числе видов. Действительно, можно схематически выделить три большие группы дрожжей: во-первых, группа, образуемая заостренными дрожжами и намного более важными, ответственными за брожение Sacch. ellipsoideus; другая группа состоит из вспомогательных дрожжей, почти всегда присутствующих в сусле, причем некоторые из них, такие, как, например, Sacch. oviformis, обладают боль- щэй спиртообразующей способностью; и, наконец, в третью группу входят дрожжи, использование которых в виноделии практически можно не принимать во внимание. Однако некоторые из этих дрожжей, находящиеся на винограде в небольших количествах, в последующем остаются в вине, приспосабливаются, развиваются в среде и могут быть в отдельных случаях агентами пороков вина.
В более поздних экспериментах, проведенных в Жиронде, в Лоэ-Гарон и в Од, С. Домерк (1970) установила интересные факты, относящиеся к количественной эволюции видов дрожжей и их распределению в бродильных емкостях. Оказалось, что наиболее вьи сокая концентрация дрожжей имеется
Дрожжи аспорогенныеЧисло штаммовДрожжи спорогеииые чЧисло штаммовBr. vini10Н. anomala1C. guillermondii .3К. veronae4C. krusei2Sacch. bisporus1C. meliniiИSacch. chevalieri6C. pelliculosa2Sacch. ellipsoideus234C. sake6Sacch. eviguus1C. solani2Sacch. heterogenicus1C. vini37Sacch. italicus30C. utilis2Sacch. oviformis2KL apiculata26Sacch. rosei1KL javanica2Rh. mucilaginosa1T, candida2T. colliculosa3T. dattila1T. holmii1T. stellata7Дрожжи аспорогенныеЧисло штаммовДрожжи спорогеииые чЧисло штаммовBr. vini10Н. anomala1C. guillermondii .3К. veronae4C. krusei2Sacch. bisporus1C. meliniiИSacch. chevalieri6C. pelliculosa2Sacch. ellipsoideus234C. sake6Sacch. eviguus1C. solani2Sacch. heterogenicus1C. vini37Sacch. italicus30C. utilis2Sacch. oviformis2KL apiculata26Sacch. rosei1KL javanica2Rh. mucilaginosa1T, candida2T. colliculosa3T. dattila1T. holmii1T. stellata7Дрожжи, выделенные из виноградных сусел в районе Божоле (по данным Брешо и сотрудников, 1962)Дрожжи, выделенные из виноградных сусел в районе Божоле (по данным Брешо и сотрудников, 1962)Примечание. Учтены изменения в названиях видов.Примечание. Учтены изменения в названиях видов.
Дрожжи аспорогенные
Число штаммов
Дрожжи спорогеииые ч
Число штаммов
Br. vini
10
Н. anomala
1
C. guillermondii .
3
К. veronae
4
C. krusei
2
Sacch. bisporus
1
C. melinii
И
Sacch. chevalieri
6
C. pelliculosa
2
Sacch. ellipsoideus
234
C. sake
6
Sacch. eviguus
1
C. solani
2
Sacch. heterogenicus
1
C. vini
37
Sacch. italicus
30
C. utilis
2
Sacch. oviformis
2
KL apiculata
26
Sacch. rosei
1
KL javanica
2
Rh. mucilaginosa
1
T, candida
2
T. colliculosa
3
T. dattila
1
T. holmii
1
T. stellata
7
Дрожжи аспорогенные
Число штаммов
Дрожжи спорогеииые ч
Число штаммов
Br. vini
10
Н. anomala
1
C. guillermondii .
3
К. veronae
4
C. krusei
2
Sacch. bisporus
1
C. melinii
И
Sacch. chevalieri
6
C. pelliculosa
2
Sacch. ellipsoideus
234
C. sake
6
Sacch. eviguus
1
C. solani
2
Sacch. heterogenicus
1
C. vini
37
Sacch. italicus
30
C. utilis
2
Sacch. oviformis
2
KL apiculata
26
Sacch. rosei
1
KL javanica
2
Rh. mucilaginosa
1
T, candida
2
T. colliculosa
3
T. dattila
1
T. holmii
1
T. stellata
7
Дрожжи, выделенные из виноградных сусел в районе Божоле (по данным Брешо и сотрудников, 1962)
Дрожжи, выделенные из виноградных сусел в районе Божоле (по данным Брешо и сотрудников, 1962)
Примечание. Учтены изменения в названиях видов.
Примечание. Учтены изменения в названиях видов.
в виноградной выжимке. С другой стороны, наиболее сильные популяции дрожжей создаются при виноделии в потоке: 160 млн. дрожжевых клеток на 1 см3 в вине, 350 млн. в выжимке. Идентификация дрожжей подтвердила в общих чертах уже сложившиеся представления, однако распределение подсчитанных дрожжей отличается от того, какое было установлено на юго- западе; это наводит на мысль, что микрофлора юга еще мало изучена. Достойно сожаления, что исследование дрожжей во Франции все еще проводится в очень ограниченных масштабах. После 1961 г. отмечено только несколько работ по этому вопросу.
Каз (1961) в экспериментах по выработке натуральных шипучих вин и в исследовании штаммов со средней спиртообразующей способностью выделил из сусел Гайяка 186 штаммов, 40 из которых принадлежали к видам Sacch. uvarum и Sacch. florentinus.
Брешо и сотрудники (1962) класси-
фицировали дрожжи, выделенные ими на протяжении 3 лет на одном и том же предприятии в Божоле. В табл. 5.9 дан перечень идентифицированных видов; на винограде много аспорогенных дрожжей рода Candida и Torulop- sis; определение видов Saccharomyces сходно с наличием их в других районах.
Розе (1970) исследовал 118 штаммов дрожжей с низкой спиртообразующей способностью, выделенных с винограда в районе Русилон. Были идентифицированы следующие виды: С. krusei, С. vini, Brettanomyces, Н. anomala, Н. subpelliculosa, KI. api- culata, KL corticis, Rhodotorula, T. stel- lata, T. colliculosa.
Изучая 299 культур, выделенных из местных сортов района Коньяк, Кастелли (1971) нашел Sacch. ellipsoide- us в 68% сусел; эти штаммы имеют большую спиртообразующую способность. Были найдены следующие виды: Sacch. chevalieri, coreanus, fructu-
Виды дрожжей, выделенных в районе Коньяк (по данным Парка, 1974)
Дрожжи спорогенные
Число штаммов
Дрожжи аспорогенные
Число штаммов
Sacch. ellipsoideus
328
Sacch. rosei
50
Sacch. uvarum
41
Sacch. kluyverii
10
Sacch. chevalieri
9
Sacch. capensis
6
Sacch. oviformis
4
Sacch. pretoriensis
3
Sacch. cidri
3
Sacch. diastaticus
2
Sacch. globosus ■
4
Sacch. prostoserdovii
1
Pichia membranaefaciens
3
Pichia kluyveri
3
Pichia polymorpha
'1
Debaromyces phaffii
1
Metschnikowia pulcherri-
2
ma
101
Hanseniaspora uvarum
Hanseniaspora osmophila
14
Hanseniaspora valbyensis
1
Saccharomycodes ludwigti
12
Nadsonia elongata
1
H. anomala
1
um, italicus, microellipsodes, ovifor- mis, rosei.
Парк (1974) co своей стороны идентифицировал в этом же районе около 30 видов на 650 изученных штаммов (табл. 5.10). 87% спорогенных дрожжей составляют Sacch. ellipsoideus и Hanseniaspora uvarum. Среди видов Saccharomyces часто встречаются Sacch. rosei, Sacch. uvarum, Sacch. ca- pensis, Sacch. chevalieri и Sacch. glo- bosus.
Автор идентифицировал много видов, которые никогда и никто еще не выделял из винограда, сусла или вина: Sacch. pretoriensis, Sacch. cidri, Sacch. kluyveri, Sacch. duastaticus, P. kluyveri, P. polymorpha, D. phalli,
Torulopsis stellata
14
Torulopsis etchellsii
3
Torulopsis lactis condensi
1
Torulopsis candida
2
Candida valida
30
Candida sake
4
Candida intermedia
2
Rhodotorula glutinis
1
N. elongata, T. etchellsii, T. lactis con- sensi, C. sake.
Парк определил летучие продукты, образуемые найденными дрожжами; результаты этих исследований представляют большой интерес для технологии производства шарантских коньячных спиртов.
Подсчет дрожжевых клеток в период уборки винограда. Все авторы, которые занимались подсчетом дрожжей, находящихся на винограде в состоянии спелости, сходятся на том, что число обнаруживаемых видов Saccharomyces невелико. Обсеменение сусла «хорошими» дрожжами, вносимыми непосредственно виноградом, является относительно слабым. Это подтверждают следующие наблюдения. На 13 виноградниках подсчитывали дрожжи в сусле из винограда, собранного в асептических условиях; в сусле из винограда, собранного обычным порядком и отобранного из транспортных емкостей по их прибытии на завод; и, наконец, в сусле, взятом на выходе из дробилки-гребнеотделигеля. Результаты представлены в табл. 5.11.
Число колоний дрожжей, получаемых на каждую партию гроздей, собранных с куста, невелико и очень неравномерно. Когда срезают несколько здоровых гроздей и раздавливают их
Номера виноградников
Виноград, взятый на поле
Виноград, взяаый по прибытии на винзавод
Сусло-самотек после дробления
1
г
5
800
2
30
1360
3
26
-
4
1
25
- ■ •
5
120
—
— 1II
6
160
23
.—
7
2
.40
663
8
50
10
6400
9
4
280
460
10
65
—
——
11
1
2
—
12
1
4
1800
13
1
15
1500
с соблюдением
всех предосторожно
Подсчет дрожжей (число дрожжевых клеток на 1 мм3 сусла) в различные периоды сбора винограда
стей по предотвращению загрязнения или заражения, может случиться даже так, что брожение не проявится ввиду отсутствия дрожжей. В винограде, взятом из контейнеров, наполняемых сборщиками вручную, дрожжей, которые могут быть выделены, в среднем несколько больше, но в изобилии дрожжи встречаются только в сусле- самотеке при дроблении винограда. При этом дробилки играют главную роль в обсеменении, так же как и прессы в производстве белого вина. Эти машины всегда покрыты виноградным соком, находящимся в постоянном контакте с воздухом, и дрожжи развиваются в нем очень быстро. Гальзи (1958) также отмечает отсутствие хороших дрожжей на винограде и наличие их в транспортных емкостях, приемных бункерах и в разного рода таре.
В зависимости от цели, .которую себе ставит исследователь, изучение микрофлоры винограда и сусел можно проводить двумя разными способа-
ми, различающимися техникой взятия проб. Энологи, которых в первую очередь интересуют дрожжи, участвующие в брожении, дробят виноградные грозди и изучают главным образом дрожжи бродящего сусла. Микробиологи же исследуют с возможно большей точностью распределение дрожжей на винограде и берут колонии до начала их развития.
Так действовали Барнетт и сотрудники (1972) в своих опытах на бордоском винограде. Их способ позволяет определять лишь наиболее многочисленные дрожжи, концентрация которых превосходит 500 клеток на 1 см3 виноградного сока. По их подсчетам число дрожжевых клеток, присутствующих на винограде, составляет в среднем 50 000 на 1 мм2 поверхности. Были выделены четыре вида дрожжей: М. pulcherrima, два вида Rhodotorula и KI. apiculata. Также были обнаружены развивающиеся колонии Aureobasidium pullulans, Penicilli- um и штаммы грамотрицательных бактерий.
Последовательность смены дрожжей во время брожения. Домерк особо изучала порядок последовательности замены одних дрожжей другими в ходе брожения. В табл. 5.12 воспроизведено в качестве примера распределение дрожжей до начала брожения, в середине его и после завершения этого процесса для сусел из белых сортов винограда.
Аспорогенные дрожжи обеспечивают начало, первую фазу брожения и образование первых процентов объемных спирта. Это КТ apiculata или H’spora uvarum для красных вин в сочетании с Т. stellata для сусел из винограда, пораженного гнилью. Но заостренные дрожжи дают лишь 2—3% об. спирта. Сильнее оказывается действие Т. stellata, которая может довести спиртуозность до 7 или 10% об.
■Таблица 5.12
Последовательность действия основных видов дрожжей во время брожения
(по данным Домерк)
Виды дрожжей
Распределение дрож-
w § и
О Я2
К К — s s С я та 11g
Я §S
и ^^
H’spora uvarum 1
36 1
о
о
или KJ- apiculata J
К. veronae
0
0,5
0
Sacch. bailii
0,5
1,0
1,2
Sacch. chevalieri
1,4
3,8
4,2
Sacch. ellipsoideus
31,4
87,5
50,3
Sacch. delbrueckii
0,5
0
0
Sacch. heterogenicus
0
0,5
1,8
Sacch. italicus
2,3
1,9
1,2
Sacch. oviformis
0,5
2,4
28,1
Sacch. rosei
0,9
0,5
2,4
Sacch. uvarum
2,8
1,0
0
S’codes ludwigii
0
0
0,6
T. stellata
23,4
1,0
0
Они сульфитоустойчивы, поэтому их применение ограничивается сульфити- рованными суслами. Затем среду быстро заполняют дрожжи Saccharomy- ces, и к концу брожения заостренные дрожжи уже больше не встречаются. Среди эллиптических дрожжей встречаются штаммы с различной спиртообразующей способностью, которая колеблется от 8 до 16% об. К концу брожения преобладающим видом после Sacch. ellipsoideus является Sacch. oviformis и в высокосахаристых сус- лах, дображивание которых проходит трудно, эти дрожжи завершают брожение и придают вину тонкость. Они спиртовыносливы и часто обладают более высокой спиртообразующей способностью; половина штаммов Sacch. oviformis, выделенных в районе Бордо, способны выдержать концентрацию
спирта выше 18% об. при брожении в лабораторных условиях.
Наблюдения, проведенные над этими дрожжами, очень важны для энологии. Например, на винограде или в суслах до брожения было найдено всего 5 раз Sacch. oviformis на тысячу выделенных; как только брожение проявилось, пропорция повышается до 18%; к концу же брожения, в момент, когда сбраживаются последние граммы сахара, частота этих дрожжей становится еще более значительной, достигая 73 штаммов на 220, т. е. 7з. Таким образом, процент Sacch. oviformis в ходе брожения непрерывно возрастает, особенно в суслах из белых сортов винограда. Минарик (1965) подтвердил эти наблюдения.
Последовательность дрожжей при брожении виноградного сусла ставит две проблемы, которые пока что еще не получили достаточно удовлетворительного объяснения: полное исчезновение заостренных дрожжей и постоянное преобладание Sacch. ellipsoideus.
В виноделии по красному констатируют,. что количество живых клеток заостренных дрожжей снижается с 79% в начале до 19% в середине брожения и в конце его оно равно нулю. Поэтому в этот момент нельзя выделить не только клетки, способные к самовоспроизводству, но их больше не находят при микроскопировании ни в вине, ни в дрожжевом осадке. Все происходит так, как если бы эти дрожжи были разрушены и каким-то образом растворены. Однако при совместном брожении на чистых культурах было невозможно воспроизвести исчезновение, наблюдавшееся на практике; одновременно была отмечена неожиданная устойчивость заостренных дрожжей к спиртовым средам со спиртуоз- ностью до 12% об. Следовательно, эти работы (С. Сапис-Домерк, 1969)
не дали ключа к решению задачи, какой является исчезновение заостренных дрожжей в бродильных чаиах.
Таблица 5.13
Конкуренция среди различных видов дрожжей при их обсеменении (из расчета 500 дрожжевых клеток каждого вида на 1 см3 сусла)
Виды дрожжей
Соотношение видов дрожжей (в %)
S
ё s S « « s
я А
Sacch. ellipsoideus +
50
92
98
Sacch. oviformis
50
8
2
Sacch. ellipsoideus +
50
86
84
Sacch. chevalieri
50
14
16
Sacch. ellipsoideus
50
100
100
Sacch. rosei
50
0
0
Sacch. ellipsoideus
50
64
88
Sacch. italicus
50
36
12
Sacch. ellipsoideus
33
56
72
Sacch. oviformis +
33
6
8
Sacch. chevalieri
33
38
20
Опыты по совместному брожению показали явление конкуренции между различными видами дрожжей при обсеменении одинаковыми количествами виноградного сусла. Табл. 5.13 дает характерные примеры такого соперничества между видами Saccharomyces. Из данных табл. 5.13 видно, что Sacch. ellipsoideus всегда превалируют над другими видами и почти полностью исключают их к концу брожения.
Sacch. italicus и Sacch. chevalier! проявляют несколько большую сопротивляемость, чем Sacch. oviformis и Sacch. rose!. Эти результаты подтверждают наблюдения практиков о том, что Sacch. ellipsoideus всегда является господствующим видом. Доминирование Sacch. ellipsoideus не объясняется его лучшей спиртообразующей способностью, более быстрым почкованием, меньшей потребностью в азотистых веществах или в факторах роста. Превосходство этого вида, по всей вероятности, связано с большей активностью брожения (Qqo, )•
Винные дрожжи — дрожжи болезней вина. Иногда в практике хранения вин наблюдают развитие дрожжей, вызывающих помутнение вин и образование осадков. Когда в винах содержится достаточно много сбраживаемых сахаров, может начаться брожение и вино становится газированным, т. е. содержащим избыточное количество углекислоты. Такие дефекты наблюдаются при хранении вина в чанах, в деревянных бочках и в бутылках. С другой стороны, случается, что в ликерных винах, несмотря на. повторные добавления сернистого ангидрида, дрожжи продолжают развиваться и постепенно связывают этот антисептик. Дефекты повторного брожения выдвигают трудные проблемы хранения вин как перед производством, так и в сфере сбыта.
Важно знать количество дрожжей, которые остаются в винах в обычных условиях хранения, и идентифицировать их. В настоящее время имеется значительная литература относительно определения числа дрожжевых клеток, остающихся живыми в течение многих месяцев или многих лет после сезона виноделия в сухих или ликерных винах после осветления путем центрифугирования, фильтрации или.
оклейки. В практику работы начинает внедряться микробиологический контроль.
Что касается идентификации, то она проведена как для винных дрожжей, так и для дрожжей, вызывающих помутнения и повторные брожения.
Подсчет дрожжевых клеток в винах. Во многих винохранилищах в промышленности и в торговой сети перешли к подсчету дрожжевых клеток в винах, подготовленных к отправке, и
в винах, недавно разлитых в бутылки. Техника этой операции описана в первом томе настоящей книги, с. 543. Такие подсчеты указывают на эффективность способов осветления, техническое состояние оборудования, общий уровень чистоты на производстве. Поучительно также проследить концентрацию дрожжей на различных стадиях обработки. Ниже приведен пример для одного винохранилища, где было проверено около 30 вин.
от 300 до 1380676от 270 до 20201086от 300 до 1380676от 270 до 20201086Количество дрожжей (на 1 см3)ОбщееСреднееКоличество дрожжей (на 1 см3)ОбщееСреднееот 340 до 55002197от 340 до 55002197
от 300 до 1380
676
от 270 до 2020
1086
от 300 до 1380
676
от 270 до 2020
1086
Количество дрожжей (на 1 см3)
ОбщееСреднее
Количество дрожжей (на 1 см3)
ОбщееСреднее
от 340 до 55002197
от 340 до 55002197
Вина хранившиеся в дубовых бочках в положении «шпунтом на бок» хранившиеся в железобетонных емкостях со стеклянным защитным покрытием
в бутылках через несколько недель после розлива
Следовательно, популяции дрожжей, которые остаются в осветленных винах, характеризуются очень высокой плотностью.
На практике еще далеко до достижения полной стерильности, из приведенных выше цифр видно, какова частота появления дефектов. Вина в деревянных бочках имеют в среднем в три раза больше дрожжей, чем вина в железобетонных резервуарах с покрытием из стекла; шероховатая неровная поверхность дерева труднее поддается чистке, чем сравнительно гладкая поверхность стеклянного покрытия. На практике почти невозможно добиться полной стерилизации внутренней поверхности бочки; вода, которой промывали бочки опорожненные и окуренные, в течение нескольких недель после мойки все еще содержала дрожжи. В заполненной бочкотаре древесина способствует развитию дрожжей, которые находят в щелях места, благоприятные для своего
размножения. Дерево является далеко не лучшим материалом для хранения и транспортирования белых сладких вин.
Приведенные выше значения выражают общее число всех дрожжевых клеток.
Число живых дрожжевых клеток, способных к самовоспроизводству, непостоянно и колеблется от 5 до 50% от общего количества; наиболее высокие проценты соответствуют более позднему загрязнению. Следовательно, в винах всегда есть живые дрожжи, даже в присутствии свободного сернистого ангидрида. Содержание его в исследованных винах составляло от 56 до 132 мг/л. Однако такие высокие дозы не убивают дрожжи, по крайней мере все виды, как можно было думать; в действительности сернистый ангидрид не проявляет стерилизующее действие, а просто блокирует размножение и его воздействие, в определенной мере является обратимым. •
Указанные выше цифры представляют скорее минимальные значения. В винах, подготовленных для реализации, т. е. для потребления населением, часто находят популяции от 5300 до 72 000 дрожжевых клеток на 1 см3, в том числе от 1060 до 38 000 живых.
Между прочим, внешне эти вина были прозрачными. Естественно, что до проведения каких-либо обработок неос- ветленные вина содержат намного большие количества дрожжей. Ниже приведены данные эффективности фильтрования.
Общее количество дрожжей иа 1 см3
Вино
№ 1№2№ 3
до фильтрации
после первой фильтрации через диатомит
после второй фильтрации через диатомит
после фильтрации через пластинчатый целлюлозно-асбестовый фильтр
после повторной фильтрации через такой же фильтр
140С00102000—
6480——
2700-—
81018300—
—900—
до обработки — — 265000 после центрифугирования — — 42100 после охлаждения н грубого фильтрования — — 28400 после тонкого фильтрования- — — 910
Хорошо проведенное фильтрование через инфузорную землю или через пластинчатый целлюлозно-асбестовый фильтр оставляет менее 5% первоначального количества дрожжей. Но когда работают с фильтрующими пластинами слишком большой пористости или производят прямое фильтрование вин, имеющих слишком высокую концентрацию дрожжей, их удаление становится значительно менее эффективным, поскольку действие таких фильтров основано на принципе адсорбции, которая ограничена. Фильтрование может быть эффективным только на совершенно чистом оборудовании. Рукоятки фильтров, рифленые подложки фильтрующих пластин, некоторые детали аппаратов, трубопровода питания и выхода могут быть иногда причинами загрязнения.
Подсчет дрожжевых клеток в винных подвалах необходим для контроля эффективности обработок. Этот подсчет следует проводить постоянно также для того, чтобы контролировать степень загрязненности чанов, разли
вочных машин и фильтров для проверки чистоты и стерилизации оборудования и помещений винохранилищ.
Идентификация винных дрожжей. С. Домерк выделила 207 штаммов из 70 образцов вина. Эти штаммы принадлежат к трем различным родам и восьми видам. В табл. 5.14 обобщены результаты этой работы.
В наибольшей степени представлены виды Saccharomyces. Sacch. oviformis является преобладающим видом; он составляет 40% штаммов, выделенных из белых вин. Этот вид дрожжей является ответственным за половину всех случаев повторного брожения. Высокая спиртовыносливость позволяет ему сбраживать последние следы сахара. Sacch. oviformis часто образует пленку на поверхности вин Юры и Хереса. Этот вид также обычно применяют в качестве тиражных дрожжей при выработке шампанских вин.
Sacch. bailii, обладающие хорошей сульфитоустойчивостью, составляют 26% всех штаммов; они ответственны за */з всех случаев повторного броже-
Виды дрожжейВиды дрожжейКоличество дрожжей, выделенных нз винКоличество дрожжей, выделенных нз вин393176151 0393176151 00 51017162 0220 51017162 022360334777122360334777122
Виды дрожжей
Виды дрожжей
Количество дрожжей, выделенных нз вин
Количество дрожжей, выделенных нз вин
3
9
3
17
6
15
1 0
3
9
3
17
6
15
1 0
0 51
0
17
1
62 0
22
0 51
0
17
1
62 0
22
3
60
3
34
7
77
1
22
3
60
3
34
7
77
1
22
Дрожжи, встречающиеся в винах (по данным С. Домерк)
Вг. schanderlii
Sacch. bailii
Sacch. chevalieri Sacch. ellipsoideus Sacch. heterogenicus Sacch. oviformis Sacch. uvarum S’codes ludwigii
Число исследованных об
17
53
70
разцов вин
Число выделенных рас
54
153
207
ния. Особенно часто Sacch. oviformis вызывают дображивание у вин с несколько повышенной спиртуозностью. Sacch. bailii ускоряет брожение суль- фитированных вин с крепостью ниже 11,5°.
Sacch. ellipsoideus — обычно эллиптические дрожжи, к которым относится 16% всех выделенных штаммов, занимают лишь третье место. У них отмечено лишь пять случаев повторного брожения из 70, причем большая часть относится к молодым красным винам. Поражает то, как редко этот вид встречается в старых винах. Будучи типичными дрожжами для сбраживания сусла, они быстро исчезают с последними граммами сахара. Способные к быстрому размножению, клетки Sacch. ellipsoideus отмирают, как только обнаруживается недостаток сахара, или через несколько часов после обработки сусла сернистым ангидридом.
Saccharomycodes ludwigii — крупные заостренные дрожжи, легко опознают
ся под микроскопом, ответственны за 15% всех случаев дображивания белых вин. Это специфические дрожжи белых сульфитированных вин и в особенности сусел, мютированных сернистым ангидридом, или же вин, подслащенных законсервированным суслом. Отмечены случаи повторного брожения, которое вызывают эти дрожжи после розлива в бутылки вин, несмотря на то, что они содержали от 80 до 120 мг свободного сернистого ангидрида. Брожению предшествовала фаза инкубации в течение нескольких недель, в процессе которой S’mycodes ludwigii размножается, склеиваясь в характерные хлопья, не разделяющиеся при взбалтывании и принимаемые за хлопья оклеивающего вещества или белков. Дрожжи размножаются внутри этих хлопьев, причем клетки на периферии связывают сернистый ангидрид выделением ацетальдегида и защищая таким образом другие. Брожение проявляется, когда содержание свободного сернистого ангидрида снижается до нуля.
Другие виды: Sacch. chevalieri, Sacch. uvarum, Sacch. heterogenicus и Br. intermedius — встречались лишь в редких случаях. Микрофлора красных вин, подверженных повторному брожению, более изменчива, чем у белых вин.
Повторное брожение, связанное с порчей сладкого вина, обычно является чистым брожением, проводимым одним видом, селекционированным условиями хранения вина, в противоположность первичному брожению сусла, которое вызывается смесью различных видов дрожжей.
Эти исследования привели к выработке нового, очень важного энологического понятия о существовании так называемых дрожжей, вызывающих болезни вина. Обычно дрожжи не относили к числу возбудителей болез-
ней, и все же целесообразно считать некоторые виды, ответственные за появление помутнений в сухих винах и повторное брожение сладких вин, как дрожжи, опасные для качества в такой же степени, как и некоторые бактерии.
В последующее время эти работы воспроизводили и подтвердили многие авторы. Ван дер Вальт и сотрудники (1958, 1959) идентифицировали 15 видов дрожжей, ответственных за помутнения вин Южной Африки после розлива в бутылки. Здесь часто встречались: Sacch. oviformis, ellipsoideus, bailii, P. membranaefaciens. Brettano- myces также являются обычной причиной помутнений.
Малан и Эйнар (1962) подтверждают частое появление в пьемонтских винах в бочках или в бутылках дрожжей Sacch. oviformis, Brettanomyces и Р. membranaefaciens. Последний вид доминирует в старых винах Риоха (Руис, 1963).
Асвани (1971) провел аналогичные исследования на венгерских винах.
Дрожжи винных подвалов — дрожжи, вызывающие помутнения. Изложенные выше замечания показывают, что вина всегда содержат большое количество дрожжей и, в частности, видов, наиболее способных вызывать помутнения и повторное брожение их; такие дрожжи селекционируются условиями хранения вин. Однако случаи развития дрожжей являются результатом загрязнения вин микрофлорой, находящейся на оборудовании или в помещениях. Нередко приходится видеть вина стабильными в течение длительного времени благодаря некоторому состоянию равновесия между содержанием сернистого ангидрида и числом содержащихся в них дрожжей; однако они становятся мутными, появляются признаки брожения после ■каких-либо операций или переливки,
во время которых происходит их обсеменение. В винных подвалах существуют очаги развития дрожжей, настоящие источники эпидемий.
Так, в одном из экспериментов, проводившихся в январе, были взяты пробы в винохранилищах и на винзаводах, которые считались чистыми. Были проверены наружные и внутренние поверхности бочек, шпунты, почва, стены, оборудование для снятия с дрожжей, доливки, розлива в бутылки и фильтрования. В табл. 5.15 приведены виды обнаруженных дрожжей и оценка количества выявленных штаммов. Ввиду того что не производили прямого подсчета клеток, соотношение сбраживающих дрожжей выражено скоростью забраживания питательной среды, засеянной взятой пробой. Знак «-|--|-» соответствует периоду инкубации только от 24 до 48 ч, знак «+» от 3 до 4 дней, знак «—» более длительному времени.
Даже зимой дрожжи встречаются в винных подвалах в очень больших количествах. Из 28 проб 25 имели дрожжи брожения в количествах, достаточных для того, чтобы после введения в питательную среду большая часть их вызывала бурное брожение в течение 1—2 дней, 3 другие пробы дали рост пленчатых дрожжей (С. vini).
Дрожжи, относящиеся к группе пленчатых, которые вызывают «цвель» вина, находятся в особенно больших количествах на древесине наружной поверхности бочек, на каучуковых шлангах, на бетонных стенках и в поверхностном слое земляных полов на винзаводах. Эти дрожжи не могут вызывать брожения, но они размножаются в результате свободного контакта с воздухом. Их мало на металлических поверхностях, которые легче поддаются чистке. «Цвель» вин часто вызывается дрожжами Pichia, также образую-
Дрожжи, встречающиеся на винзаводах
Место взятия пробы
Концентрация дрожжей
Число штаммов
Идентифицированные виды
Внешняя поверхность бочек
+ +
23
13. С. vini
1. Pichia
3. Sacch. ellipsoideus
6. Sacch. oviformis
Поверхность шпунтов бочек
+
11
9. Sacch. bailii
2. C. vini
Внутренняя поверхность бочек (многократно вымытых -и окуренных)
+
11
9. Sacch. bailii
1. Sacch. ellipsoideus
1. Sacch. oviformis
Железобетонные емкости в плохом состоянии
++
12
C. vini
Sacch. oviformis
Sacch. chevaliri
2. Sacch. ellipsoideus
Оборудования для снятия с дрожжей а доливки
++
16
3. C. vini
3. Sacch. oviformis
10. Sacch. ellipsoideus
Оборудование для розлива в бутылки
23
5. Brettanomyces
10. C. vini
4. Sacch. bailii
4. Sacch. oviformis
Оборудование для фильтрования
4- +
5
3. Brettanomyces
2. Pichia
Полы винохранилищ и винзаводов
++
19
7. C. vini
3. Sacch. bailii
1. Sacch. oviformis
1. Sacch. ellipsoideus
7. Pichia
Стены винзаводов
+
6
6. Brettanomyces
щими пленку на поверхности той среды, в которой они развиваются.
Brettonomyces в изобилии встречаются во влажных винодельческих цехах, среди плесеней различных цветов, которые их покрывают. Плесневые грибы усваивают небольшие количества спирта, которые испаряются из вин. Среди них постоянно находят Bretta- nomyces.
Вследствие аэробного образования уксусной кислоты и неприятных органолептических качеств, которые они придают вину, эти дрожжи следует рассматривать как дрожжи, вызывающие нежелательные изменения в винах.
Saccharomyces, находящиеся в помещениях винзаводов, можно разделить на две группы: первую образуют Sacch. ellipsoideus и Sacch. ohevalieri, классические эллиптические дрожжи, вызывающие активное брожение. Присутствуя в винных подвалах, и в частности на оборудовании и в помещениях, эти дрожжи небезопасны; случайное массовое обсеменение вина этими дрожжами может вызвать возобновление брожения или образование осадка, особенно если этому благоприятствуют условия окружающей среды.
Загрязнение дрожжами второй группы является более серьезным. Известно, что Saccharomyces oviformis, которые встречаются в винных подвалах повсюду, способны развиваться в винах с повышенной спиртуозностью. Что касается Sacch. bailii, то эти дрожжи выделяются своей высокой сульфито- устойчивостью.
В конечном счете ни один вид дрожжей, встречающихся в винном подвале, не является абсолютно безвредным. Существует много возможностей для загрязнения, и для того, чтобы исключить такое положение, надо полностью пересмотреть существующие в настоя-
щее время способы размещения и обработки вин.
Нужно представить себе, что внутренние поверхности стен и оборудования производственных цехов винзаводов покрыты своеобразным ковром из дрожжей; в отдельные периоды года их размножение может быть еще более значительным. Тогда становится понятным, почему в отдельных случаях операция по снятию с дрожжей не достигает своей цели и в ходе ее в вино снова попадают дрожжи, которые должны были бы быть удалены вместе с дрожжевым осадком; понятным становится и то, почему операция по доливке способствует развитию сильной популяции дрожжей путем периодического обсеменения.
.Минарик (1969) исследовал дрожжи, загрязняющие винодельческие помещения, и пришел к таким же выводам.
ЛИТЕРАТУРА
A m е г i и е М. A. et Kunkee R. Е. (1968), Ann. Rev. Microbiol., 22, 323.
As v any A. (1971), Kem. Kolzl. Magyar. 36, 149.
Barnett J. A., Delaney M. A., Jones E., W a g s о n A. B. e t W i n c h (1972), Arch. MikrobioL, 83, 52.
Belin J. M. (1972), Vitis, 11, 135.
Belin J. M. et Henry P. (1972), C. R.
Acad. Sci., 274, 2318.
Benda I. (1962), Bay. Landwirt. Jahrbuch., 39, 595
Benda I. (1964), Weinberg u. Keller, 11, 67. В г ё c h о t P., Chauvet J. et Girard H.
(1962), Ann. Technol. agric., 11, 235.
Cano Marotta C. R. e t De К a 1 a- m a r D. B. (1962), Atti Accad. ital, Vite Vino, 14, 275.
Cano Marotta C. R. e t De К a 1 a- mar.D. B. (1964), Atti Accad. ital. Vite Vino, 16, 85.
Cases P. Y. (1961), Essai de selection de le- vures pour un vin mousseux nature!, These Doct.-Ing., Toulouse.
Castelli T. (1959), Introduzione alia micro- biologia enologica, L’Assicuratrice dell’Oltre- po, Voghera.
Castelli T. (1960), Lieviti e fermentazioni in enologia, L. Scialpi.
Castelli T. (1965), La collezione dei lieviti vinari dell’Istituto di Microbiologia agraria e tecnica di Perugia, Ann. Facol. Agrar. Perugia, vol. XX.
Castelli T. (1967), IIе Symposium intern. d’OEnologie, Bordeaux, C. R., vol. 1, p. 89.
Castelli T. (1969), II vino al microscopio, L. Scialpi Ed., Rome.
Castelli T. (1971), Vini d’Italia, 13, 523.
Castelli T. (1973), L’ecologie des levures, Colloque intern. d’OEnologie, Arc et Senans.
Castelli et Georgantas S. (1970), Vini d’Italia, 12, 185.
C a s t e 11 i T. e t I n i g о В. (1958), Patrona- to J. de la Cierva de Investigacion tecnica, n. 13.
Castelli T. et Sikovec S. (1969), Atti Accad. ital. Vite Vino, 21, 71.
Champagnat P., О zenda P. et Baillaud L. (1969), Biologie vegetale, Ш, Croissance, Morphogenese, Reproduction, Masson, Paris.
Charpentier C., IsoardP., Bergeret J. et Fontanges R. (1971), Ann. Technol. agric., 20, 323.
Charpentier C. e t Bergeret J. (1972), Ind. alim. agric., 89, 1605.
Domereq S. (1956), Etude et classification des levures de vin de la Gironde, These Doct.- Ing., Bordeaux.
Galzy P. (1958), Progr. agric, vitic., 75, 58.
Gandini A. (1964), Atti Accad. ital, Vite Vino, 16, 447.
Gandini A. (1968), Vini d’Italia, 10, 275.
Gandini A. (1973), Vini d’Italia, 15, 27.
G r e w a 1 N. S. e t M i 11 e r J. J. (1972), Canadian J. Microb., 18, 1897-
Hernandez A., Estrada P. et Ossa F. (1964), Boletin n° 5, Universidad catolica de Chile.
Inigo B. (1964), Rev. Agro. Teen, alim., 4, 166.
I n i g о B. e t А г г о у о V. (1960), Rev. Cien- cia, aplic-, n° 72, p. 18.
Inigo B. e t A г г о у о V. (1964), Rev. Cien- cia, aplic., n° 96, p. 23.
Inigo B., Tomes-L a с rue M. et H e- gardt F. G. (1969), Rev. Agro. Teen. Alim., 9, 437.
Inigo B., Vazquez D. e t Arroyo V. (1963), Rev. Ciencia aplic., n° 93, p. 296.
К о с к о va-Kratochvilova A. et К u t- kova M. (1961), Atlas kvasinek a kvasin- kovitych mikroorganismu (en tchecoslovaque et en russe), Prague-Bratislava.
Kudrjawzew W. I. (1960), Die Systematik der Hefen, Akademie Verlag, Berlin.
Lafon M. (1955), Contribution a I’etude de la formation des produits secondaires de la fer
mentation alcoolique. These Doct. Sciences. Bordeaux.
Laho L., M i n a r i к E. e t N a v a r a A. (1970), Chimie, microbiologie et analyse des vins (en tchecoslovaque), Bratislava.
Lambin S. et German A. (1961), Precis de microbiologie, Masson, Paris.
Lodder J. (1970), The yeasts, North. Holland Pub. Co., Amsterdam.
Malan С. E. et Gay-Eynards. (1962), Atti Accad. ital. Vite Vino, 14, 255.
Martini A. (1960), Rivista Vitic. Enol., 13, 117 et 263.
Martini A. (1962), Rivista Vitic. Enol., 15, 57.
M a 1 v a n i M. I. (1969), Yeast Symposium, Antonie van Leewenhoek, vol. 35, D 3.
Minarik E. (1963), Mitteillungen, 13, 186.
Minarik E. (1964), Mitteillungen, 14, 75 et 306.
Minarik E. (1964), Vitis, 4, 368.
Minarik E. (1965), Biologia, Bratislava, 20,
Minarik E. (1968), Mitteilungen, 18, 10.
Minarik E. (1969), Yeast Symposium, Antonie . van Leeuwenhoek, vol. 35, D 7.
Minarik E. (1971), C. R. Rechefches viti-vi- nicoles, Bratislava, p. 275.
Minarik E., К о с к о v a-K r a t о c h v i 1 o- v a A. et Laho L. (1965), Wein-Wissens., 20 193.
Minarik E. et Lah о L. (1962), Mitteilungen, 12, 7 et 288.
Minarik E., L a h о L. e t Navarra A. (1960), Mitteillungen, 10, 218.
Ohara Y. (1965), The yeasts of Japanese table wine, Japanese Society of Enologists.
Park Y. (1974), Contribution a I’etude des levures de la region de Cognac. These Doct. OEnologie, 3 cycle, Bordeaux.
Parle J. et MennaM.E. (1966), New- Zealand J. Agr. Res, 9, 98.
Peynaud E. (1956). Ind. agric, alim., 73, 253.
Peynaud E., Laf о n-Laf о urcade S. et Domereq S. (1962), Ann. Inst. Pasteur, 102, 469.
Picci G., Melas-Joannidis Z., К ar- n i s A. e t В a s i I a t о s G. (1959), Arch. Inst. Pasteur Hellenique, 5, 44.
RadutschewSt., KoIewaZ. et G a r a- bedian M. (1970), Nautsch. Issled. Inst. Winar. Piwo. Prom., Bulgarie, 11, 37.
Ragala P. e t Mi n ari к E. (1971), C. R. Recherches viti-vinicoles, Bratislava, p. 262.
Rei an S. et Vyas S. R. (1971), Vitis, 10, 131.
Rigone de Ritz M.J.A. (1958). Bol. tech. Univers. Nac. Cuyo, Mendoza, n° 18.
Rigone de Ritz M.J.A/ e t Vega R,
(1958), Bol. teen. Univers. Nac. Cuyo, Mendoza, n° 17.
Rose A. H. et Harrison J. S. (1969— 1971), The yeasts, 3 volumes, Academic Press, Londres.
Roset M. (1970), Etude de quelques levures dites «sauvages». Essais en vue de leur emp- loi dans Tindustrie des jus de raisin, These Doct.-Ing., Toulouse.
Ruiz M. (1963), Semana Vitivinicola, n° 903.
Santa-Maria J. (1964), Bol. Inst. Nac. Invest. agron., 51, 1 et 527.
S a p i s-D о m e r c q S. (1969), Conn. Vigne Vin, 4, 379.
S a p i s-D о m e r c q S. (1970), Conn. Vigne Vin, 4, 45.
Schanderl H. (1959), Die Mikrobiologie des Mostes und Weines, E. Ulmer, Stuttgart.
Senez J. C. (1968), Microbiologie generate, Doin, Paris.
Shimatani Y. et Nagata Y. (1967), J. Ferment, Japon, 45, 179.
Shimatani Y et Nonaka M. (1967), J. Ferment. TechnoL, Japon, 45, 185.
StanierR. Y., DoudoroffM. et Adel
berg E. A. (1966), Microbiologie generale, Masson, Paris.
S u c e v i c-S a f a r O. (1955), Biljne proizvod- nje, 4, 127.
Sucevi c-S afar O. (1960), Jugosl. Mikrob., 1, 147.
Svejcar V. (1968), Wein-Wissens., 23, 251.
Tiurina L. V. (1962), Station de Recherches Oenologiques de Magaratch, 11, 42.
Van d e r W a 11 J. P. e t V a n К e г к e n A. E. (1958), Antonie van Leeuwenhoek, 24, 239.
Van der Wa 11 J. P. et V an Kerken A. E. (1959), Antonie van Leeuwenhoek, 25, 145.
Van Kerken A. E. (1962), Contribution to the ecology of yeasts occuring in wine, These Doct, Pretoria.
Van Zyl J. A. e t du Plessis L. d e W, (1961), South Afr. J. Agr. Sci., 4, 393.
Yokotsuka I. (1954), Studies of Japanese wine yeasts, Research Institut of Fermentation, Yamanashi.
Z a r d e 11 о de Toledo O., G о n z a 1- ves C. et Verona O. (1959), Annali Mi- crob. Enzimol., 9, 22.
Глава 6. ОПИСАНИЕ ОСНОВНЫХ
ВИДОВ ВИННЫХ ДРОЖЖЕЙ
В этой главе будет описано 30 видов дрожжей, принадлежащих к 12 различным родам: Brettanomyces, Candida, Hanseniaspora, Hansenula, Kloeckera, Kluyveromyces, Metschnikowia, Pichia, Saccharomyces, Saccharomycodes, Schi- zosaccharomyces, Torulopsis.
Роды и виды рассматриваются в алфавитном порядке. Термином «винные дрожжи» обозначаются дрожжи, выделенные из винограда, бродящих сусел и непосредственно из вина.
В предыдущей главе приведены перечень винных дрожжей и их положение в классификации (см. гл. V раздел «Техника выделения»), а также описание тестов идентификации и все определения.
Винные дрожжи рода Brettanomyces Куфферат и Ван Лаер
Род Brettanomyces включает 7 видов. О присутствии Brettanomyces в
суслах и винах сообщалось много раз.
Шандлер и Драчински (1952) нашли такие дрожжи в шипучих винах, Агостини (1950)—в пленке вина с признаками уксусного скисания, Баррет и сотрудники (1955) —в пленках молодых вин в районе Юра; загрязнение этими дрожжами вредит качеству. Домерк получила четыре вида Brettanomyces из сброженных виноградных сусел и большое число культур, выделенных из популяций дрожжей на стенках и на полу винных подвалов. Галь- ци и Риу (1957) получили семь видов Brettanomyces из вин, пораженных цвелью. Пейно и Домерк (1956) проводили сравнительное изучение различных видов Brettanomyces, выделенных из вин различного происхождения. Они выявили два новых вида: Вг. vini и Вт. schanderlii. В последнем каталоге Лоддер (1970) эти дрожжи описаны под названием Br. intermedius Ван дер Вальт и Ван Керкен.
Морфологические признаки дрожжей Brettanomyces intermedins
Культура на виноградном сусле. Размножение происходит очень медленно. Клетки эллиптические, немного удлиненные (54-8) X (34-4) мкм; они изолированы или сгруппированы по
Рис. 6.1. Brettanomyces intermedins, культи- вируемый в среде:
а — жидкой; б — плотной.
две или в небольшие цепочки, имеющие по пяти элементов (рис. 6.1). Жидкость прозрачна. Некоторые штаммы образуют более или менее густые поверхностные пленки.
Культура на сусле-агаре. Большинство клеток имеют такие же размеры, как и в жидкой среде, но некоторые удлинены до 20x3 мкм и представляют собой разветвленные цепи (псевдомицелий) . Эти клетки имеют овальную форму. Наблюдаются вакуоли и грануляция. Культура кремового цвета, обычно выглядит влажной и блестящей; края лопастные, слабовыра- женные. Спор не наблюдали. Желатину разжижают.
Физиологические характеристики
Физиологические характеристики дрожжей приведены в табл. 6.1.
Интенсивность дыхания и брожения:
Qp^ = от 2 до 3; Qqo2 = от 30 до 42;
QCO, = от 37 до 52.
Спиртообразующая способность, определенная на виноградном сусле,
Рис. 6.2. Кривые сбраживания виноградного сусла различными расами Brettanomyces:
1—Bruxellensis; 2— vini Gironde; 3— vini arbois; 4 — Schanderlii.
имеющем 325 г сахара на 1 л, колеблется от 11 до 12° в анаэробиозе и до 13° при доступе воздуха; образование летучей кислотности нормальное, в условиях анаэробиоза может превысить 2 г, если Brettanomyces развиваются на воздухе, и, наоборот, образование этилацетата идет лучше без доступа воздуха (в одном случае 176 мг/л вместо 31 мг/л на воздухе). На рис. 6.2 воспроизведено несколько кривых брожения.
С точки зрения потребностей в факторах роста род Brettanomyces является гомогенным. Все его виды относятся к прототрофам; всегда отмечается рост
СахараBr. vinlBr. schanderiiiброжениеассимиляцияброжениеассимиляцияГлюкоза4*++Галактоза+++Сахароза+++Мальтоза4"—+Лактоза+(или оченьРафиноза—слабая)—Аэробная ассимиляция Использование нитратов Использование аммиачных со-Нет Положительно »Нет Положительно »лейСахараBr. vinlBr. schanderiiiброжениеассимиляцияброжениеассимиляцияГлюкоза4*++Галактоза+++Сахароза+++Мальтоза4"—+Лактоза+(или оченьРафиноза—слабая)—Аэробная ассимиляция Использование нитратов Использование аммиачных со-Нет Положительно »Нет Положительно »лейСбраживание и ассимиляция сахаров и другие характеристикиСбраживание и ассимиляция сахаров и другие характеристики
Сахара
Br. vinl
Br. schanderiii
брожение
ассимиляция
брожение
ассимиляция
Глюкоза
4*
+
+
Галактоза
+
+
+
Сахароза
+
+
+
Мальтоза
4"
—
+
Лактоза
+
(или очень
Рафиноза
—
слабая)
—
Аэробная ассимиляция Использование нитратов Использование аммиачных со-
Нет Положительно »
Нет Положительно »
лей
Сахара
Br. vinl
Br. schanderiii
брожение
ассимиляция
брожение
ассимиляция
Глюкоза
4*
+
+
Галактоза
+
+
+
Сахароза
+
+
+
Мальтоза
4"
—
+
Лактоза
+
(или очень
Рафиноза
—
слабая)
—
Аэробная ассимиляция Использование нитратов Использование аммиачных со-
Нет Положительно »
Нет Положительно »
лей
Сбраживание и ассимиляция сахаров и другие характеристики
Сбраживание и ассимиляция сахаров и другие характеристики
при полном отсутствии витаминов. Эти дрожжи можно неопределенно долго пересевать в неорганической среде, лишенной витаминов. Но в таких условиях скорость размножения понижается и введение отдельных факторов роста оказывает положительное действие на размножение и брожение.
Энологическое значение дрожжей Brettanomyces
Культуры Brettanomyces на виноградном сусле вызывают довольно характерные запахи. Наряду с тонким эфирным запахом этилацетата, свойственным некоторым из них, ощущается острый запах скисшего вина, а также фруктовый аромат с альдегидным тоном, напоминающим яблочный; некоторые культуры придают запах масляной кислоты. Но все культуры имеют неприятный, более или менее интенсивный запах, напоминающий ацетамид. Это зловоние, которое трудно назвать иначе как «мышиный запах», ощущается после проглатывания вина и, по-ви- димому, обязано присутствию малоле
тучих веществ. Этот запах легко распознать, если смочить пальцы бродящим суслом и понюхать их через некоторое время, необходимое для испарения.
Этот привкус ацетамида иногда встречается в плохо приготовленных или плохо хранимых винах. Такой же привкус могут дать бактерии молочнокислого брожения. Во всяком случае, участие Brettanomyces в виноделии и при хранении вин, хотя довольно редкое, всегда опасно для качества. Эти дрожжи следует включить в категорию дрожжей, вызывающих заболевание вин.
ВИННЫЕ ДРОЖЖИ РОДА CANDIDA БЕРГУТ
Краткое описание рода
Лоддер и Крегер-Ван Риж характеризуют этот род следующим образом: «Клетки различной формы. Размножение путем многостороннего почкования. Могут присутствовать хламидоспоры. Псевдомицелий развит более
или менее обильно; кроме того, может существовать истинный мицелий. В жидкой среде развивается в глубине, при этом на поверхности часто образуется кольцо и нередко пленка. Наряду с окислительным обменом веществ, встречается много видов, вызывающих более или менее сильное брожение».
Род Candida Бергут состоит из большого числа довольно распространенных видов. В каталоге Лоддер (1970) описан 81 вид Candida; сообщают о 19 видах, найденных в винах. Наиболее часто встречается С. mycoderma; другими видами являются: albicans, bo- idini, brumptii, guilliermondii, ingens, intermedia, krusei, lipolytica, melinii, parapsilosis, pelliculosa, rugosa, sake, scotii, solani, sorbosa, stellatoidea, tro- picalis, zeylanoides.
C. sake, по старому C. vanrijii, была обнаружена в виноградных соках, сохранявшихся при низкой температуре (Пейно и С. Домерк, 1964).
Candida vini Ван Уден и Бакли
Еще со времен Пастера микроорганизм, ответственный за «цвель» вин, т. е. пленку, которая покрывает поверхность вин, оставленных в контакте с воздухом, обычно называли Mycoderma vini. В современной номенклатуре этот вид получил название Candida vini.
Длительное время считали, что всякая пленка, появляющаяся на вине, помимо, разумеется, пленки, образуемой бактериями уксусного брожения, вызывающими скисание, является результатом жизнедеятельности одного и того же вида микодермы. Однако при более глубоком рассмотрении можно заметить большое разнообразие морфологических и физиологических характеристик, которые выражаются в разном виде пленок, в неодинаковой спир-
товыносливости и в различии форм образования ацетальдегида, в разрушении или, наоборот, в образовании уксусной кислоты, в химическом действии связанных кислот. Правда, уже Пастер предвидел многие разновидности микодермы. В последнее время, не говоря уже о многочисленных опытах по изучению «хересных» дрожжей, идентифицированы в пленках «цвели» многие виды, принадлежащие к различным родам.
Морфологические признаки и физиологические характеристики
В жидкой среде быстро образуется сухая и морщинистая пленка белого или желтого цвета; она утолщается, обрывки пленки опускаются на дно культу-
Рис. 6.3. Candida mycoderma, образующий пленку на поверхности жидкой питательной среды.
ры. С течением времени клетки осадка приобретают форму, отличную от клеток, находящихся на поверхности. Последние являются более удлиненными (рис. 6.3) и имеют размеры (24- 4-4) X (64-12) мкм. Клетки часто имеют одно или два сферических образования, преломляющих световые лучи. На плотной среде культура имеет беловатую окраску, она матовая с морщинистой поверхностью. Разжижения желатины не наблюдается. Брожения в сахаристой среде не вызывают; ассимилируется только глюкоза. Хороший рост на этаноле, как единственном источнике углерода. Нитраты не используются.
Интенсивность дыхания и брожения: QOi = ot 24 до 27; Q^ = 2;
Было изучено также действие С. vi- ni на компоненты вина (Спеттоли, 1971), но нужно сказать, что энологическое исследование этих дрожжей еще не завершено.
ВИННЫЕ ДРОЖЖИ РОДА
HANSENIASPORA ЗИКЕС
Краткое описание рода
Дрожжи Hanseniaspora представляют собой диплоидные клетки заостренной, яйцевидной. формы, с. удлиненные ми, как у лимона, концами и размерами (24-4) X (44-10) мкм (рис. 6.4).
Рис. 6.4. Hanseniaspora uvarum, культивируемый в жидкой среде и на плотной, приготовленной на основе солодового экстракта.
Они размножаются биполярным почкованием и дают или полусферические споры в виде шапки от двух до четырех в аске или же споры шаровидной формы, с шероховатой поверхностью, по одной-две в аске; споры прорастают почкованием. Конъюгация происходит после деления ядра и после митоза, первая почка восстанавливает диплофазу. Дрожжи обладают бродильной способностью.
Аспорогенная форма Hanseniaspora представлена родом Kloeckera.
Ниже приведены виды Hanseniaspora, встречающиеся в виноделии, и ключ идентификации:
H’spora osmophila (Нигаус) Фафф, Миллер и Шифрин — споры неосвобожденные, сбраживают глюкозу, ассимилируют мальтозу и целлобиозу; H’spora uvarum (Нигаус) Шехата, Мрак и Фафф —■ споры неосвобожденные, сбраживают глюкозу, ассимилируют целлобиозу; H’spora valbyensis Kloecker. Споры полусферические, освобожденные, сбраживают глюкозу, ассимилируют целлобиозу.
Впервые различие между заостренными дрожжами спорогенными и аспорогенными сделал Зикес (1911). Клок- кер (1912) опубликовал результаты систематического исследования заостренных дрожжей, описав 15 видов Psevdo- saccharomyces аспорогенных и один спорогенный вид, который он назвал Hanseniaspora valbyensis. Нигаус (1932) среди видов Kloeckera описал виды osmophila и uvarum. H’spora valbyensis была найдена после этого во многих винодельческих районах. Кастелли (1948) наблюдал, что в зонах жаркого климата брожение виноградных сусел вызывают сначала заостренные спорогенные дрожжи, или Hanseniaspora, тогда как в холодных зонах первыми проявляют себя заостренные аспорогенные дрожжи, или Kloeckera.
Детальное сравнительное исследование родов Kloeckera и Hanseniaspora провел Кантарелли (1955).
Все штаммы заостренных дрожжей, которые Домерк выделила в районе Бордо и которые были классифицированы как KL apiculata, действительно спорулируют на среде (солодовый сусло-агар), предложенной Крегер-Ван Риж и Ахеарн (1968). Так же ведут себя и заостренные дрожжи, выделенные Парком в 1974 г.
Похоже, что H’spora uvarum значительно более распространены, чем предполагали, и было бы вернее дать заостренным дрожжам именно это название, чем термин Kloeckera apiculata: эту позицию занимают авторы книги.
Крайне мобильные, заостренные ■дрожжи встречаются на всех видах плодов в зонах умеренного климата. Это первые дрожжи, находимые на винограде с начала созревания. В период зрелости заостренные дрожжи составляют 99% всех выделяемых дрожжей. Они относятся к дрожжам, обладающим слабой бродильной способностью; их также называют «дикими» дрожжами. Большое число работ было посвящено выяснению их роли в виноделии. Они первыми размножаются в виноградном сусле.
Помимо KL apiculata на винограде найдены три следующих вида Kloeckera: africana, javanica (бывший jense- nii), corticis (бывший magna). Несколько штаммов KL africana были найдены в Италии и в районе Бордо во Франции. KI. javanico была найдена в Сардинии. KL corticis обнаружена в суслах в области Умбрия (Италия) (табл. 6.2).
Физиологические характеристики
H’spora uvarum не способны использовать аммонийный азот; в действи-
Таблица 6.2 Физиологические характеристики Hanseniaspo- ra uvarum
Сахара
Брожение
Аэробная ассимиля-
Глюкоза
+
+
Галактоза
—
Аэробная ассимиляция
этанола
Использование нитратов
Нет
»
тельности эти дрожжи поглощают от 10 до 15% аммонийного азота виноградного сусла и обычно вызывают слабый протеолиз с увеличением аминного азота. Следовательно, H’spora uvarum не забирает из сусла азотистые вещества, необходимые дрожжам Sac- charomyces.
Интенсивность дыхания и брожения:
Qq2 = ot 5 до 17; QCq2 = от 88 до 135;
Qco2= от 105 Д° Н4.
Физиологические характеристики, определенные на виноградном сусле с сахаристостью 185 г/л для многих сотен штаммов, приведены в табл. 6.3.
Эти дрожжи сбраживают фруктозу немного быстрее, чем глюкозу; за время, которое требуется для исчезновения 50% фруктозы, сбраживается 39%. глюкозы. Все заостренные дрожжи являются ауксотрофными. Совершенно необходим только один витамин — мезоинозит (витамин В7), тогда как пантотеновая кислота, никотинамид и тиамин способствуют размножению клеток.
Энологическое значение дрожжей Hanseniaspora uvarum
Вместе с Мюллер-Тургау (1905) некоторые авторы рассматривают эти дрожжи как нежелательные, потому что они используют сахар и дают много летучих кислот. Авторы рекомендуют освобождаться от этих дрожжей путем сульфитирования винограда перед, и сразу после дробления. H’spora uvarum обладает низкой сульфитоустойчи- востью. Дозы сернистого ангидрида, почти не влияющие на активность эллиптических дрожжей, являются смертельными для дрожжей заостренных.. Введение 10 г сернистого ангидрида на 1 гл заметно уменьшает их численность. Для удаления этих дрожжей
Условия броженияСпиртообразующая способность, % об.Летучая кислотность, г/лЭтилацетат, мг/лАнаэробиозОт 2,3 до 4,8От 0,64 до 2,65От 33 до 279Аэробиоз» 3,7 » 6,4От 0,70 до 2,64»125 » 374Условия броженияСпиртообразующая способность, % об.Летучая кислотность, г/лЭтилацетат, мг/лАнаэробиозОт 2,3 до 4,8От 0,64 до 2,65От 33 до 279Аэробиоз» 3,7 » 6,4От 0,70 до 2,64»125 » 374Физиологические характеристики H’sporaФизиологические характеристики H’spora
Условия брожения
Спиртообразующая способность, % об.
Летучая кислотность, г/л
Этилацетат, мг/л
Анаэробиоз
От 2,3 до 4,8
От 0,64 до 2,65
От 33 до 279
Аэробиоз
» 3,7 » 6,4
От 0,70 до 2,64
»125 » 374
Условия брожения
Спиртообразующая способность, % об.
Летучая кислотность, г/л
Этилацетат, мг/л
Анаэробиоз
От 2,3 до 4,8
От 0,64 до 2,65
От 33 до 279
Аэробиоз
» 3,7 » 6,4
От 0,70 до 2,64
»125 » 374
Физиологические характеристики H’spora
Физиологические характеристики H’spora
был придуман также метод «брожения суперкатр», предложенный Семишоном (1926; 1929). При этом методе виноделия в сусло добавляют вино и брожение начинается в среде с содержанием спирта от 3 до 4% об. Таким образом, размножаться могут только спиртовыносливые дрожжи. Однако этот метод не получил распространения, так как преимущества, которые он дает, не компенсируют его недостатков.
Другие авторы, наоборот, считают заостренные дрожжи полезными. Благодаря образуемым ими сложным эфирам они придают вину особый плодовый тон. Не исключено, что эти дрожжи также играют полезную роль при выработке тонких вин, и возможно лучше не пытаться задержать их развитие посредством сильной сульфитации.
ВИННЫЕ ДРОЖЖИ РОДА
HANSENULA СИДОВ
Вегетативное размножение дрожжей Hansenula происходит почкованием в различных местах клетки. Они могут иметь различные формы и размеры и иногда бывают удлиненными. Споры часто имеют полусферическую форму, в виде колпака. В состоянии зрелости они высвобождаются из аска.
Эти дрожжи могут сбраживать или не сбраживать сахара; пленки на поверхности может быть или не быть; могут образовывать сложные эфиры.
Род Hansenula отличается от дрожжей рода Pichia в первую очередь возможностью ассимиляции нитратов.
Дрожжи, принадлежащие к родам Hansenula и Pichia, выделенным из вин, довольно часто образуют пленку на поверхности питательной среды. Им присущ окислительный метаболизм. Иногда они обладают бродильной способностью. Обычно дают много этилацетата наряду с относительно малыми количествами уксусной кислоты.
Известны 25 видов Hansenula. Впервые дрожжи, соответствующие описанию Н. anomala, образующие пленку и выделяющие запах эфира, обнаружил в виноградном сусле Нажели в 1879 г. Эти дрожжи, довольно распространенные в различных бродящих средах, часто встречаются на винограде в виде пленки и в спонтанно сбраживаемых винах в Тоскане, Сардинии, Калабрии, Германии, Португалии, Калифорнии, Японии и в других странах. В ходе исследований дрожжей района Бордо Домерк (1956) получила 7 рас Н. anomala, происходящих из двух сусел. Другой вид дрожжей Hansenula был обнаружен в винах — это Н. subpelli- culosa (Иньиго и сотрудники, 1961).
Морфологические особенности дрожжей
Hansenula anomala
В виноградном сусле клетки имеют эллиптическую удлиненную форму с
размерами (44-10) X (34-4) мкм, оди- Физиологические характеристикиразмерами (44-10) X (34-4) мкм, оди- Физиологические характеристики
размерами (44-10) X (34-4) мкм, оди- Физиологические характеристики
размерами (44-10) X (34-4) мкм, оди- Физиологические характеристики
ночные или сгруппированные попарно или в цепочки (рис. 6.5). Жидкость мутная; на поверхности обоазуется морщинистая пленка. На солодовом сусле-агаре наблюдается споруляция, причем споры имеют вид колпака. Культура на плотной среде первоначально имеет белую ровную, матовую окраску, становится более обильной и образует складки. Гигантская колония на сусле с желатином выглядит влажной, слегка вздувшейся, почти гладкой.
Рис. 6.5. Hansenula anomala, культивируемые в жидкой и плотной среде.
Содержание Глицерин Уксусная спирта,. кислота
% Об.
4,04011,2
Энологическое значение дрожжей Hansenula
Эти дрожжи, редко встречающиеся в нормальных условиях приготовления и хранения вин, нежелательны ввиду высокой концентрации этилацетата, которую они создают; они могут оказывать лишь отрицательное влияние на качество вин. Обладая большой окислительной способностью, дрожжи Hansenula могут развиваться в виноградной выжимке в начале и в процессе брожения, на поверхности вина, на стенках бочек, пропитанных вином. Их
Брожение и ассимиляция глюкозы, мальтозы, сахарозы, галактозы и рафинозы — на Vs-
Аэробная ассимиляция этанола положительная; использование нитратов положительное.
Интенсивности дыхания и брожения:
QOj=ot 25 до 51; QCOi = от И до 28;
Qco, = от 35 до 45.
Спиртообразующая способность в анаэробиозе на виноградном сусле от 2,6 до 5,3% об.
Образование летучей кислотности— от 0,52 до 1,68 г/л.
Образование этилацетата — в среднем 416 мг/л без доступа воздуха, 879 мг/л — на воздухе. Способность этих дрожжей к образованию сложных эфиров побудила многих ученых провести большое количество экспериментов.
Вторичные продукты сбраживания сахара (в ммоль/л) приведены ниже.
Янтарная Бутанди- Ацетальдекислотаол-2,3гид
4,01,60,5
можно отнести к опасной разновидности микодермы. Это дрожжи, вызывающие болезни вин. То же самое можно сказать и о дрожжах рода Pichia.
ВИННЫЕ ДРОЖЖИ РОДА
KLUYVEROMYCES ВАН ДЕР ВАЛЫ
Дрожжи этого типа имеют различные формы, они размножаются почкованием. Kluyveromyces отличаются от Saccharomyces формой спор, их тенденцией к слипанию после разрыва зеков, своей потребностью в факторах роста. Из 18 описанных видов два —
К. vanudenii (Ван дер Вальт и Нель, 1963) и К. Veronae— были найдены в бродящем сусле. Открытые в Сардинии исследователем Верона (1951), эти круглые дрожжи первоначально были ■описаны в монографии Лоддер и Кре- тер-Ван Рижа под названием Sacch. veronae. С тех пор их находили в виноградных суслах во многих винодельческих странах.
Верона (1951) показано, что присутствие К. veronae в бродящих суслах совместно с Sacch. ellipsoideus, замедляя процесс брожения, заметно снижало процент летучей кислотности, образуемой последними. Ниже приводится пример брожения, вызванного последовательным обсеменением виноградного сусла (табл. 6.4).
Таблица 6.4
Брожение сусла на различных дрожжах
Виды дрожжей
Создаваемая спирту озность, % об.
Образующаяся летучая кислотность. г/л
Sacch. ellipsoideus
15,2
0,88
К. Veronae
9,6
0,15
К. veronae, затем через 5 дней Sacch. ellipsoi- •deus
14,6
0,23
Пейно и сотрудники (1967) открыли специфическое свойство К. veronae — образование значительных количеств L ( + )-молочной кислоты, в то время как дрожжи Saccharomyces, сбраживая виноградный сок, образуют в среднем 200 мг D (—)-молочной кислоты. Все штаммы К. veronae, испытываемые в одинаковых условиях, образуют до 1,8 г L( + )-молочной кислоты.
Морфологические особенности дрожжей К. veronae
Культура на виноградном сусле. Молодые клетки (рис. 6.6) имеют округ- 160
лую форму размером (34-6) X (44- 4-6) мкм, существуют отдельно или попарно. После месяца выдержки при температуре 25° С в пробирке наблюдают кольцо на поверхности культуры.
Культура на сусле-агаре. Форма и размеры идентичны культуре в жидкой среде. Культура имеет вид пасты кремового цвета, гладкой и блестящей.
Рис. 6.6. Kluyveromyces veronae, культивируемые в жидкой плотной среде.
Легко образуется хорошо развитый псевдомицелий. Обычно изогамной конъюгации предшествует образование аска. Споры имеют сферическую форму от 1 до 4 в аске.
Физиологические характеристики
Глюкоза, сахароза, мальтоза, рафиноза (7з) сбраживаются. Галактоза ассимилируется.
Спиртообразующая способность в аэробиозе — от 8,6 до 10,8% об.
Образование летучей кислотности слабое — от 0,12 до 0,18 г/л, производство этилацетата незначительно. Эти дрожжи являются сукциногенными.
Вторичные продукты сбраживания сахара дрожжами Kluyveromyces veronae (в ммоль/л) приведены ниже.
Содержаниеспирта,% об.10,8Содержаниеспирта,% об.10,882822,42,4Янтарнаякислота14,0Янтарнаякислота14,03,90,63,90,6
Содержаниеспирта,% об.
10,8
Содержаниеспирта,% об.
10,8
82
82
2,4
2,4
Янтарная
кислота
14,0
Янтарная
кислота
14,0
3,90,6
3,90,6
К. veronae является ауксотрофом и нуждается для своего роста в мезоинозите. Его можно использовать в качестве микроорганизма-индикатора для определения мезоинозита. Важным фактором является также пантотеновая кислота. Отмечают также влияние биотина и никотинамида на конечную популяцию. Эти же факторы роста в той мере, в которой их недостаток затрудняет размножение, определяют скорость сбраживания сахара.
Энологическое значение дрожжей К. veronae
Этих дрожжей очень мало на винограде, чтобы вызвать самопроизвольное брожение его; с другой стороны, они размножаются очень медленно, а интенсивность сбраживания слишком низка для того, чтобы быть хорошими винодельческими дрожжами. В то же время они представляют определенный интерес, так как К. veronae образуют много молочной кислоты и очень мало уксусной кислоты, они повышают количество связанных кислот и уменьшают летучую кислотность. Использование этих дрожжей является примером тоге, что можно получить при совместном брожении.
ВИННЫЕ ДРОЖЖИ РОДА METSCHNIKOWIA КАМЕНСКИ
Metschnikowia pulcherrima Питт и Миллер
Более известные под названием Candida pulcherrima, эти дрожжи находили в небольших количествах, по нескольку единиц на 1000 штаммов, недавно их обнаружил также Бенда (1962). С. Домерк дала им следующее
описание: «На виноградном сусле через 3 дня при 25°С клетки эллиптические, средней величины, довольно правильной формы, непрозрачны, (3-4-7) X X (44-8) мкм. На солодовом сусле- агаре спор не видно, но наблюдаются мелкие клетки; некоторые намного более крупные, похожи на блестящие шарики (рис. 6.7). На виноградном су-
Рис. 6.7. Metschnikowia pulcherrima, культивируемый в жидкой среде и на плотной.
еле жидкость культуры прозрачна; иногда образуется кольцо. На солодовом сусле-агаре культура образует гладкую, влажную колонию кремового цвета. Гигантская колония слегка разжижает желатин».
Этот вид дрожжей сбраживает только глюкозу. Мальтоза, сахароза и галактоза усваиваются. Нитраты не используются. Отмечается слабое развитие на этаноле.
Интенсивности дыхания и брожения:
QOa = от_27 до 29; QCOa = от 36 до 43;
Qc8: = 89;
Спиртообразующая способность в анаэробиозе от 0,8 до 2,4% об.
Вторичные продукты брожения (в ммоль/л) приведены ниже.
36369,39,3Морфологические особенностиНа виноградном сусле через 3 дня выдержки при 25° С клетки приобретают овальную, удлиненную форму, группируясь в более или менее длинные или разветвленные цепи (З-ьЮ) X (2-н -т-4) мкм, особенно у Р. fermentans. На солодовом сусле-агаре выделенные клетки имеют более округлую форму, чем в жидкой среде, но наблюдаются также и другие формы. На среде Го- родковой клетки округлые, одиночные или сгруппированные попарно. Спорообразование затруднено, споры круглые.В жидкой среде по истечении 3 дней развивается морщинистая пленка. НаМорфологические особенностиНа виноградном сусле через 3 дня выдержки при 25° С клетки приобретают овальную, удлиненную форму, группируясь в более или менее длинные или разветвленные цепи (З-ьЮ) X (2-н -т-4) мкм, особенно у Р. fermentans. На солодовом сусле-агаре выделенные клетки имеют более округлую форму, чем в жидкой среде, но наблюдаются также и другие формы. На среде Го- родковой клетки округлые, одиночные или сгруппированные попарно. Спорообразование затруднено, споры круглые.В жидкой среде по истечении 3 дней развивается морщинистая пленка. На1 — Hansenula anomala; 2 —Pichia membranaefaciens; 3 —Pichia fermentans; 4— Saccharomyces ellipsoideus.1 — Hansenula anomala; 2 —Pichia membranaefaciens; 3 —Pichia fermentans; 4— Saccharomyces ellipsoideus.
36
36
9,3
9,3
Морфологические особенности
На виноградном сусле через 3 дня выдержки при 25° С клетки приобретают овальную, удлиненную форму, группируясь в более или менее длинные или разветвленные цепи (З-ьЮ) X (2-н -т-4) мкм, особенно у Р. fermentans. На солодовом сусле-агаре выделенные клетки имеют более округлую форму, чем в жидкой среде, но наблюдаются также и другие формы. На среде Го- родковой клетки округлые, одиночные или сгруппированные попарно. Спорообразование затруднено, споры круглые.
В жидкой среде по истечении 3 дней развивается морщинистая пленка. На
Морфологические особенности
На виноградном сусле через 3 дня выдержки при 25° С клетки приобретают овальную, удлиненную форму, группируясь в более или менее длинные или разветвленные цепи (З-ьЮ) X (2-н -т-4) мкм, особенно у Р. fermentans. На солодовом сусле-агаре выделенные клетки имеют более округлую форму, чем в жидкой среде, но наблюдаются также и другие формы. На среде Го- родковой клетки округлые, одиночные или сгруппированные попарно. Спорообразование затруднено, споры круглые.
В жидкой среде по истечении 3 дней развивается морщинистая пленка. На
1 — Hansenula anomala; 2 —Pichia membranaefaciens; 3 —Pichia fermentans; 4— Saccharomyces ellipsoideus.
1 — Hansenula anomala; 2 —Pichia membranaefaciens; 3 —Pichia fermentans; 4— Saccharomyces ellipsoideus.
Содержание спирта % об.
0,8
ВИННЫЕ ДРОЖЖИ РОДА
PICHIA ГАНЗЕН
Описание рода Pichia довольно близко к характеристике рода Hansenula. Основное различие состоит в том, что Pichia не усваивает нитратов.
Из 35 видов этого рода три выделены из винограда и из вин: Pichia fer- mentans Лоддер, Pichia membranae- faciens Ганзен, Pichia vini (Циммерман) Фафф.
Вид P. fermentans выделен из винограда в районе Медок (Пейно и С.До- мерк, 1953), из сусел в Словакии (Лаго и сотрудники, 1970); Р. vini выделен из вин в Германии и Южной Африке (Ван дер Вальт, 1957).
Р. membranaefaciens распространен намного шире. Под различными названиями он найден в Италии, Германии, Калифорнии, во Франции, в Испании, Японии, Чехословакии и в ряде других стран.
3,91,60,2
твердой среде культура плотная, очень тонкая, испещрена мелкими морщинками. В некоторых случаях колонии в сусле с желатином разжижали его. Гигантские колонии имеют в зависимости от штамма различный вид.
Физиологические характеристики
Эти дрожжи сбраживают только глюкозу и фруктозу; Р. membranafa- ciens обладает слабой бродильной способностью; другие сахара не ассимилируются. Этанол усваивается в аэробиозе.
Интенсивность дыхания и брожения: QOa = от 45 до 49; QCO1 = от 1 до 14;
Qcoa = от 41 до 51.
Сбраживание сахара происходит медленно (рис. 6.8).
Спиртообразующая способность колеблется от 5,1 до 9,3% об. для Р. fermentans и от 1,8 до 3,0% об. для
P. membranafaciens. Образование летучей кислотности колеблется от 0,46 до 1,04 г/л и этилацетата — от 85 до 256 мг/л. На жидких или плотных сре-
Содержание Глицерин Уксусная спирта,кислота
% об.
1,85214,8
Выводы относительно роли этих дрожжей в виноделии те же, что и для Hansenula: эти окисляющие и образующие уксусную кислоту дрожжи следует рассматривать как дрожжи, вредные для здоровья.
ВИННЫЕ ДРОЖЖИ РОДА SACCHAROMVCES РЕЕС
Дрожжи Saccharomyces являются основными агентами спиртового брожения и играют главную роль в технологии виноделия. Из описанных 41 вида около 20 используются для приготовления вин.
Краткое описание рода
Клетки разнообразной формы: округлые, овальные, удлиненные или нитевидные. Размножение вегетативное, многосторонним почкованием. Может образовать псевдомицелий. Изогамная или гетерогамная конъюгация предшествует образованию асков или она отсутствует. Споры обычно круглые или овальные, от 1 до 4 в аске.
Таким образом, общей чертой для этих дрожжей является то, что они интенсивно сбраживают глюкозу, а часто и другие сахара. Нитраты не усваиваются.
Ключ идентификации наиболее распространенных видов дрожжей Saccharomyces
Сбраживают глюкозу, слабо или нерегулярно сбраживают сахарозу;
дах культуры издают отчетливый запах амилацетата.
Вторичные продукты брожения (в ммоль/л) приведены ниже.
Янтарная кислота
Бутанди- ол-2,3
Ацетальдегид
3,9
1,4
0,5
не сбраживают рафинозу—Sacch. aceti;
слабо или нерегулярно сбраживают рафинозу, растут на среде без витаминов — Sacch. incospicuus;
слабо и нерегулярно сбраживают рафинозу, отсутствует рост на среде без витаминов — Sacch. bailii;
сбраживают глюкозу и галактозу;
клетки имеют выступы, напоминающие трубки конъюгации; 1—2 споры в аске — Sacch. delbrueckii;
вегетативные клетки непосредственно образуют аски, от 1 до 4 спор в аске: Sacch. globosus;
сбраживают глюкозу и мальтозу;
ассимилируют этанол, растут в среде, имеющей 60% глюкозы — Sacch. rouxii;
не ассимилируют этанол, не растут в среде с 60% глюкозы — Sacch. prostoserdovii;
сбраживают глюкозу, сахарозу и мальтозу — Sacch. heterogenicus;
сбраживают глюкозу, сахарозу и рафинозу на Уз;
ассимилируют мальтозу и этанол, образуют перед споруляцией выпуклости, напоминающие трубки конъюгации— Sacch. rosei;
не ассимилируют мальтозу и этанол, отсутствуют выступы — Sacch. capensis;
сбраживают глюкозу, сахарозу, мальтозу и рафинозу на Уз;
во время споруляции клетки имеют выступы; в жидкой среде клетки
Физиологические характеристики основных видов рода Saccharomyces, встречающихся в виноделии
Сбраживание
Ассимиляция
Виды дрожжей
СО
cd
СО
со
СО
СО
СО
СО
5
S
и
S
V
S
*=
Sacch. aceti
—
V
—
f
-Н
Sacch. bailii
—
V
—
—
V
V
V
—
—
V
+
Sacch. bayanus
.—
+
+
—
+ УЗ
—
+
+
——
+
Sacch. capensis
+
—
—
I уз
—■
+
—
—
+
Sacch. chevalieri
+
+
—
—
+У3
+
+
V
—
+
Sacch. coreanus
+
+
—
+
+ С
+
+
—
+
+
Sacch. delbrueckii
—
—
—
—
+
—
—
—
V
Sacch. ellipsoideus
+ -
+
+
—
+1/з
+
+
+
—
+
—
Sacch exiguus
+
—
—
_|_1/3
+
+
—
—
+
V
Sacch. fermentati
.—
+
+
—
+ 1/3
—
+
+
—
+
V
Sacch. florentinus
+
+
+ С
+
+
+
+
Sacch. globosus
+
а
а
—
а
+
а
а
——
а
Sacch. heterogenicus
•—
+
+
—
—
—
+
+
.—
—
—
Sacch. inconspicuus
.—
V
—
—
V
—
+
—
—
V
V
Sacch. italicus
+
+
+
—
'—
+
+
+
—
—
—
Sacch. oviformis
—
+
+
—
+1/з
—
+
+
■
+
—
Sacch. prostoserdovii
—
а
+
—
а
—
а
+
—
а
—
Sacch. rosei
+
—
—
_|_1/3
—
+
V
—
+
V
Sacch. rouxii
.—
V
+
—
V
V
+
—"™
—
+
Sacch. uvarum
+
+
+
+
+ С
+
+
+
4-
+
Примечание. Тлю
коза сб
раживается и
ассимилируется всеми видами дро
жжей.
У —
переменная; t—слабая; я—приобретенный признак; с— полное сбраживание рафинозы.
Таблица 6.6
Активность брожения основных видов Saccharomyces
Виды дрожжей
Дыхание V
Брожение
Спиртообразующая способность, % об.
Qco,
VCO2
минимальная
максимальная
Sacch.
bailii
13-19
53-64
95—175
8,0
12,6
Sacch.
chevalieri
11—19
191—234
247-249
11,2
18,3
Sacch.
ellipsoideus
6-18
56-329
89-420
8,0
16,8
Sacch.
fermentati
23
100
237
4,3
9,1
Sacch.
florentinus
—
—
—
8,1
9,0
Sacch.
heterogenicus
5
119
149
9,2
18,2
Sacch.
italicus
2-20
146—257
151-283
12,6
17,0
Sacch.
oviformis
12-20
■ 160—176
164-212
11,9
18,4
Sacch.
rosei
16
63
81
7,8
13,0
Sacch.
uvarum
4-7
47-56
89-99
7,2
9,9
Образование вторичных продуктов брожения (в ммоль/л) различными видами Saccharomyces
Виды дрожжей
Спирту- озность, % об.
Глицерин
Уксусная кислота
Янтарная кислота
Бутандиол-
2,3
Этанол
Sacch. bailii
6,0
131
21,2
15,1
2,0
1,1
Sacch. chevalier!
12,1
88
15,1
8,7
8,2
1,1
Sacch. ellipsoideus
12,3
98
12,4
10,7
8,7
0,8
Sacch. fermentati
9,7
77
1,8
12,8
4,8
0,4
Sacch. florentinus
4,9
56
14,2
5,5
4,5
1,0
Sacch. heterogenicus
11,0
84
10,1
7,4
9,8
1,8
Sacch. italicus
12,1
64
8,4
6,1
4,8
1,2
Sacch. oviformis
13,5
83
14,2
7,1
9,8'
2,4
Sacch. rose!
7,1
49
1,2
8,9
3,6
1,2
Sacch. uvarus
7,1
64
13,9
5,9
5,5
0,8
Те
блица 6.8
Потребность в факторах роста основных видов дрожжей
к
Виды дрожжей
ки§
хо§а
як£н»
ЯcdgoЯ
S35яч%
Cd »s нo
' О ОxЯ
CU со ЧС «из
si”
SSо
XС
S S
Sacch. bailii
—
A
Sacch. chevalieri
—
+
Sacch. ellipsoideus
A
Sacch. fermentati
—.
A
Sacch. florentinus
—
A
Sacch. heterogenicus
A
—
Sacch. italicus
—
A
Sacch. oviformis
—.
A
Sacch. rosei
—
—
Sacch. uvarum
—
—
Примечание. — Практически не влияет; 4необходим для роста.
шаровидной формы (3,04-6,5) X (3,54- 4-7,0) мкм—Sacch. fermentati;
у клеток нет выступов; в жидкой среде клетки овальной, более или менее удлиненной формы (3,54-7,5) X X (4,54-10,04-17,5) мкм — Sacch. bayanus (синоним oviformis);
сбраживают глюкозу, галактозу, сахарозу и рафинозу на V3;
рост в присутствии актидиона в концентрации 100 мг/л — Sacch. exi- guus;
—
—
—
—
A
—
—
A
—
—
A
—
A
——
A
A
—
—
—
—
+
—•
—•
—
—
A
A
A
—
—
—.
—
—
A
A
—
A
—
—
A
A — играет роль
активатора роста;
не растут в присутствии актидиона в концентрации 100 мг/л — Sacch. ohevalieri;
полностью сбраживают глюкозу, галактозу, сахарозу, мелибиозу и рафинозу— Sacch. coreanus;
сбраживают глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу; не сбраживают рафинозу — Sacch. italicus;
сбраживают глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу и рафинозу на */з — Sacch. ellipsoideus;
полностью сбраживают глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, мели- биозу и рафинозу;
клетки мелкие и круглые, устойчивые к актидиону; образуют псевдомицелий — Sacch. florentinus;
клетки круглые или овальные, более крупные; отсутствует псевдомицелий— Sacch. uvarum (табл. 6.5).
Этот ключ идентификации видов Saccharornyces, встречающихся в сус- лах и винах, является упрощенным и, разумеется, несовершенным; он позволяет определять дрожжи, имеющие четко выраженные признаки. Для более точной идентификации необходимо пользоваться более подробными опи
саниями второго издания таксономического справочника Лоддер (1970). Авторы книги придерживались номенклатуры, данной в этом справочнике, за исключением видов Sacch. ellipsoideus и Sacch. oviforrnis, у которых сохранены прежние наименования.
Рис. 6.9. Фотография (увеличение X 1000)а — Sacch. ellipsoideus в виноградном сусле; б — Sacch. ellipsoideus на солодовом сусле- в виноградном сусле; д — Sacch. bailii на виноградном сусле; е, ж—Sacch. bailii на солодо-Рис. 6.9. Фотография (увеличение X 1000)а — Sacch. ellipsoideus в виноградном сусле; б — Sacch. ellipsoideus на солодовом сусле- в виноградном сусле; д — Sacch. bailii на виноградном сусле; е, ж—Sacch. bailii на солодо-Ван дер Вальт, автор главы, посвященной Saccharornyces, в этом каталоге перегруппировал несколько видов, имеющих небольшие различия с точки зрения морфологии. Он установил новые пределы для Sacch. cerevisiae, чтобы включить в них разновидности ellipsoideus и tetrasporus, а также Sacch. willianus. Таким же образом, этот автор модифицировал границы у Sacch.
Рис. 6.9. Фотография (увеличение X 1000)
а — Sacch. ellipsoideus в виноградном сусле; б — Sacch. ellipsoideus на солодовом сусле- в виноградном сусле; д — Sacch. bailii на виноградном сусле; е, ж—Sacch. bailii на солодо-
Рис. 6.9. Фотография (увеличение X 1000)
а — Sacch. ellipsoideus в виноградном сусле; б — Sacch. ellipsoideus на солодовом сусле- в виноградном сусле; д — Sacch. bailii на виноградном сусле; е, ж—Sacch. bailii на солодо-
разлпчных Saccharomyces:разлпчных Saccharomyces:агаре, в фазовом контрасте; в—Sacch. oviformis в виноградном сусле; г — Sacch. heterogenicus вом сусле-агаре; з—Sacch. uvarurn на виноградном сусле.агаре, в фазовом контрасте; в—Sacch. oviformis в виноградном сусле; г — Sacch. heterogenicus вом сусле-агаре; з—Sacch. uvarurn на виноградном сусле.
разлпчных Saccharomyces:
разлпчных Saccharomyces:
агаре, в фазовом контрасте; в—Sacch. oviformis в виноградном сусле; г — Sacch. heterogenicus вом сусле-агаре; з—Sacch. uvarurn на виноградном сусле.
агаре, в фазовом контрасте; в—Sacch. oviformis в виноградном сусле; г — Sacch. heterogenicus вом сусле-агаре; з—Sacch. uvarurn на виноградном сусле.
uvarurn, чтобы включить в них Sacch. carlsbergensis и Sacch. logos, а также у Sacch. bayanus,чтобы добавить к ним Sacch. oviformis.
Однако трудно назвать cerevisae видом дрожжей, выделяемых из вин (или пивными дрожжами); более правильным был бы термин Sacch. vini, предложенный Кудрявцевым (1960). Авторы будут придерживаться общепринятого в технологии виноделия названия Sacch. ellipsoideus.
С другой стороны, если Sacch. oviformis по своим технологическим свойствам отличается от Sacch. bayanus, то, только в отношении спиртовыносливо- сти п сульфитоустойчивости (табл. 6.6).
Sacch. oviformis хорошо известен практикам и используется для обсеменения; в настоящее время нет необходимости менять название этого вида. Кастелли (1973) выдвинул такие же возражения этой новой классификации Saccharomyces.
Ниже приведено суммарное описание 20 видов Saccharomyces, выделенных из сусел и из вина.
Табл. 6.5, 6.6, 6.7, 6.8 дают соответственно физиологические характеристики, бродильную способность, образование вторичных продуктов и потребность в факторах роста. Для каждого вида этих дрожжей указываются их частота и роль в приготовлении и хра-
нении вин. Некоторые виды Saccharomyces показаны на рис. 6.9.
Saccharomyces aceti Санта Мария
Санта Мария (1959) выделил Sacch. aceti из пленки, образовавшейся на поверхности красного вина в районе Галисии (Испания). Он дал этим дрожжам такое название за их способность окислять этанол в условиях аэробиоза с образованием уксусной кислоты.
Saccharomyces bailii Линднер
Этот вид (рис. 6.10) объединяет Sacch. acidifaciens и Sacch. elegans, дрожжи детально описанные в предыдущем издании.
Рис. 6.10. Sacch. bailii, культивируемый в жидкой среде и на плотной.
Эти дрожжи выделены в 1943 г., но похоже, что их находили раньше. Действительно, Дюбург (1897) сообщал о присутствии на гроздьях, пораженных Botrytis cinerea, и в ликерных винах Сотерн дрожжей, которые не сбраживали сахарозу и обладали способностью сбраживать в растворах инвертного сахара фруктозу раньше глюкозы. Sacch. bailii является одним из видов редких дрожжей, имеющих такую спо
собность (Пейно и Домерк, 1955). Они редко встречаются в районе Бордо в виноградном сусле, зато очень часто бывают в сульфитированных винах; из 33 случаев повторного брожения белых подслащенных вин в 13 случаях его вызывают Sacch. bailii. Исследование молодых белых вин с повышенным содержанием свободного сернистого ангидрида также часто обнаруживало присутствие этих дрожжей. Благодаря своей сульфитоустойчивости они в какой-то степени селекционируются при консервировании ликерных вин. Эти дрожжи являются наиболее опасными для стабильности белых сульфитированных вин вместе с Saccharomycodes ludvigii и Sacch. oviformis, и не, будет преувеличением, если отнести их к болезнетворным дрожжам. Эти дрожжи находят также на винодельческом оборудовании, на поверхности бочек, вокруг шпунтов. В этом месте бочек, влажном от вина, часто развиваются дрожжи, маслянистые на ощупь. Таким образом, Sacch. bailii, скорее, являются дрожжами винных подвалов и вина, чем дрожжами винограда. Отмечено, что загрязнение этими дрожжами помещений или оборудования вызывает настоящие эпидемии повторного брожения в подвалах, с которыми трудно бороться.
Saccharomyces bayanus Саккардо
Первоначально эти дрожжи были найдены в пиве, затем их постоянно обнаруживали в виноматериалах. Они встречались во всех винодельческих районах, где исследовали дрожжи, но всегда с относительно низким коэффициентом частоты. Присутствуя везде, они в то же время мало распространены и, очевидно, что Sacch. bayanus занимает в виноделии довольно скромное место.
Будучи гомологом, Sacch. oviformis
при брожении и ассимиляции сахаров, что заставило в последних таксономических исследованиях отнести те и другие к одному и тому же виду bayanus, в то же время отличаются один от другого некоторыми признаками: удлиненная форма клеток, замедленное брожение, явно более слабая спиртообразующая способность и спиртовыносли- вость, меньшая устойчивость к сернистому ангидриду, более выраженная потребность в факторах роста. Sacch. bayanus действительно заметно отличается от дрожжей этого же рода особенным ауксологическим поведением. Практически это ауксотрофные дрожжи, и мезоинозит является необходимым фактором их роста, затем отмечают большую эффективность биотина. Из-за этих причин, по мнению авторов, нелогично включать Sacch. oviformis в род bayanus.
Sacch. pastorianus был упразднен как особый вид и рассматривается как синоним вида Sacch. bayanus.
Однако Гилиланд (1969) показал, что Sacch. pastorianus могут сбраживать рафинозу на 2/3, тогда как Sacch. bayanus сбраживали только V3 молекулы. Sacch. pastorianus были найдены и описаны при исследовании спонтанного брожения виноградных сусел. Мартини (1964) исследовал их развитие в суслах при различных температурах.
Saccharomyces capensis Ван дер Вальт и Чейнер
Авторы этих дрожжей выделили их из виноградных сусел в Капской провинции (Южная Африка). Их также находили в Испании (Санта Мария, 1959, 1964) и на острове Пантеллерия (Мартини, 1962).
Sacch. capensis близки к Sacch. bayanus и Sacch. rosei, они отличаются сбраживанием мальтозы: положитель
ным— у Sacch. bayanus, отрицательным— у Sacch. rosei и Sacch. capensis; но сбраживание и ассимиляция мальтозы являются признаками, которые могут быть приобретены последним видом дрожжей. При образовании аскоспор клетки Sacch. rosei имеют выпуклости, напоминающие трубки конъюгации (см. рис. 6.13); это не относится к Sacch. capensis.
Saccharomyces chevalieri Гильермон
Гильермон (1914) выделил из сброженных африканских напитков серию дрожжей, довольно близких к Sacch. lindneri, которые он описал под названием Sacch. chevalieri. Различие между этими двумя дрожжами заключалось в возможности сбраживания галактозы. Лоддер и Крегер-Ван Риж показали, что этот признак является относительным и объединили эти дрожжи в вид Sacch. chevalieri.
Кастелли и Дель Джюдиче (1953) приняли эту новую классификацию, и сейчас можно включить многочисленные расы, которые Кастелли и его ученики выделили из итальянских сусел в рубрику Sacch. chevalieri.
Эти дрожжи часто находили во время брожения винограда; они встречаются довольно часто в сусле, но число изолированных рас всегда меньше, чем у Sacch. ellipsoideus. Кроме того, имея точно такие же свойства, активность этих дрожжей часто не отличается от активности группы Saccharomyces. По завершении брожения они исчезают, так как их слабая спиртовыносливость и сульфитоустойчивость не обеспечивают их выживания в точности так, как это происходит с Sacch. ellipsoideus; они редко бывают причиной дефектов повторного брожения вин.
В последнем издании каталога «Дрожжи» (Лоддер, 1970) Sacch. fruc- tum показаны как синоним Sacch. che-
valieri. В действительности эти дрожжи близки друг к другу и различаются только ассимиляцией мальтозы, положительной лишь для Sacch. fructum. Авторы нашли, что эти дрожжи обладают более слабой ферментативной активностью и более медленным развитием по сравнению с Sacch. chevalieri.
Saccharomyces coreanus Сайто
Эти дрожжи найдены были в виноградных суслах в Южной Африке (Ван Керкен, 1963), в Словакии (Минарик, 1963), в двух суслах в районе Коньяк (Кастелли, 1971).
Sacch. coreanus внешне похожи на Sacch. microellipsoideus и на Sacch. mrakii, но более приближаются к Sacch. chevalieri и Sacch. uvarum; они являются промежуточными между этими двумя видами. Sacch. coreanus отличается от Sacch. chevalieri использованием мелибиозы и от Sacch. uvarum тем, что сбраживание и ассимиляция мальтозы являются приобретенными свойствами.
Saccharomyces delbrueckii Линднер
Эти дрожжи распространены относительно мало. Сапис-Домерк (1970) нашла несколько рас этого вида в районе Бордо, а Гандини (1964) обнаружил одну расу в районе Асти; Иньиго и сотрудники (1963) выделили эти дрожжи в пяти суслах в районе Херес.
Сбраживая только глюкозу и галактозу, эти дрожжи напоминают Sacch. globosus. В виноградном сусле или на солодовом сусле-агаре клетки Sacch. delbrueckii имеют шаровидную форму, из-за чего их относили к старому роду Torulaspora.
Saccharomyces ellipsoideus Ганзен
Точное название этого вида в современной номенклатуре: Saccharomyces
cerevisiae Ганзен (рис. 6.11). Но вероятно не совсем правильно давать определение cerevisiae — латинского слова, обозначающего пиво, .дрожжам, которые находят на винограде, в бродящих суслах и в винах; поэтому авторы будут применять для их обозначения термин Saccharomyces ellipsoideus. Впрочем так же поступали и авторы, которые впервые описали эти дрожжи и
Рис. 6.11. Sacch. ellipsoideus, культивируемый в жидкой среде и иа плотной.
провели различие между этими терминами. Для Ганзена Sacch. cerevisiae соответствовали дрожжам верхнего брожения пивоваренного производства, a Sacch. ellipsoideus — дрожжам, выделенным на зрелом винограде. Помимо их разного происхождения различия между этими двумя видами выражены слабо, они относились к более округлой форме клеток у первого и к оптимальной температуре споруляции. Позднее стали считать, что эти различия недостаточны для того, чтобы считать эти виды разными и ради таксономического единообразия описали Sacch. ellipsoideus как разновидность Sacch. cerevisiae.
Однако у энологов осталась привычка называть ellipsoideus эллиптическими дрожжами винограда и вина. Авторы могут применять этот термин и в
дальнейшем. Кроме того, дифференциация двух разновидностей основана на слабовыраженных морфологических особенностях, и между ними неизбежно существует переходная форма. Поэтому удобнее считать Sacch. ellipsoi- deus скорее синонимом Sacch. cerevi- siae, чем его разновидностью.
Sacch. ellipsoideus является, пожалуй, наиболее распространенным видом дрожжей в бродящих плодах. Так, из 1286 рас эллиптических дрожжей, выделенных на винограде и из вин в департаменте Жиронда, 1021, т. е. почти 80%, принадлежали к виду Sacch. ellipsoideus. Все работы, проведенные в мире по дрожжам, вызывающим спонтанное брожение, также показывают большое численное преобладание этого вида. Это также наиболее исследованные и лучше других известные дрожжи.
Обладая высокой ферментативной активностью и хорошей способностью к размножению, они быстро становятся доминирующими в брожениях, вызываемых совместным обсеменением. Можно считать, что эти дрожжи сбраживают наиболее значительную часть сахара в виноградных суслах. Это они «делают» вино, придают ему характер, определяют его состав, тогда как действие других дрожжей является случайным или же проявляется лишь при завершении брожения.
Но когда исследуют Sacch. ellipsoideus в старых винах, то поражаются тому, как редко они здесь встречаются, причем отмечают, что, если эти дрожжи присутствуют, они сопровождаются другими видами. Типичные винодельческие дрожжи в большинстве случаев быстро исчезают в вине, выполнив свою работу.
Повторное брожение сладких вин почти всегда вызывают другие виды, более спиртовыносливые и сульфитоустойчивые.
Saccharomyces exignus Ганзен
Об этих дрожжах много раз сообщали исследователи микрофлоры брожения: Каприотти, 1953; Кастелли, 1960, 1969; Мартини, 1960; Минарик и сотрудники, 1960; Брешо и сотрудники, 1962; Гандини, 1964. Saccharomyces exiguus Ганзен были найдены в дрожжевом осадке греческих вин (Стефанопулос и Георгантас, 1972). И все же эти дрожжи распространены мало и не представляют большого интереса для энологии.
По своей способности сбраживать глюкозу, галактозу, сахарозу и рафинозу на Vs, по отсутствию ассимиляции мальтозы они приближаются к Sacch. chevalieri, но отличаются от последних своей устойчивостью к акти- диону или ассимиляцией этаноламин- хлоргидрата.
Saccharomyces fermentati (Сайто) Лоддер и Крегер-Ван Риж
Известно большое число ссылок на присутствие этих дрожжей в виноградных суслах: Кастелли и Дель Джюди- че, 1953; Иокотсука, 1954; Федюши, 1956; Ван Зил и Дю Плеси, 1961; Гандини, 1964. Эти дрожжи находили в Сицилии, в Пьемонте, в Испании, в Японии, в Южной Африке.
Имея почти шаровидную форму и первоначально называвшиеся Torulas- рога fermentati, эти дрожжи похожи по своим физиологическим характеристикам на Sacch. bayanus. Они различаются формой, поскольку Sacch. bayanus имеет удлиненную форму, а также выступами, наблюдающимися во время споруляции. Sacch. fermentati имеет ограниченную спиртообразующую способность от 6 до 9% об.; эти дрожжи дают только следы уксусной кис-, лоты и относительно много янтарной кислоты; они проявляют небольшую потребность в факторах роста. Их роль в виноделии очень ограничена.
Saccharomyces florentinus (Кастелли) Лоддер и Крегер-Ван Риж
Кастелли (1938) впервые выделил Zygosaccharomyces florentinus из суль- фитированного сусла во Флоренции. Кроме того, сообщали о присутствии этих дрожжей в сусле Кьянти (Кастелли, 1948), в трех суслах в Сицилии.
Не сохранив в своей монографии рода Zygosaccharomyces, Лоддер и Крегер-Ван Риж классифицировали его как Sacch. florentinus.
Их описание согласуется с тем, какое сделал Кастелли, за исключением ассимиляции нитратов, которая полностью отсутствует у голландских авторов.
Домерк нашла штамм Sacch. florentinus в районе Бордо, Пиччи и сотрудники (1959)—на Пелопоннесе, Ван Керкен (1963) —в Южной Африке.
По сбраживанию глюкозы, галактозы, сахарозы, мальтозы, мелибиозы и рафинозы Sacch. florentinus напоминают Sacch. uvarum; но они отличаются от последних использованием этанола- мина, устойчивостью к актидиону, более округлой формой клеток.
Saccharomyces globosus Остервальдер
Согласно Лоддер (1970) эти дрожжи были обнаружены в виноградных суслах в Испании, в Южной Африке. Ка- приотти (1952) сообщил об их присутствии в Италии.
Sacch. globosus похожи на Sacch. delbrueckii; они отличаются от последних прямым превращением вегетативных клеток в аски, без конъюгации.
Saccharomyces heterogenicus Остервальдер
Эти дрожжи (рис. 6.12) не сбраживают галактозу и не усваивают рафи
нозу. Как и Sacch. italicus, они используют сахарозу, а не рафинозу. Эта неспособность сбраживать рафинозу отличает их от Sacch. bayanus.
В литературе имеется мало данных относительно этих дрожжей. Они были найдены в Сицилии. Домерк (1956), Сапис-Домерк (1970) выделили несколько штаммов из сусел и из вин. Лаго и сотрудники (1970) сообщили о них из Чехословакии.
Рис. 6.12. Sacch. heterogenicus, культивируемый в жидкой среде и на плотной.
Благодаря своему очень слабому распространению эти дрожжи следует отнести к случайным винодельческим дрожжам, не имеющим практического значения. Однако их неоднократно находили в винах, бродящих — в бутылках или в бочках. В одном красном вине спиртуозностью 13% об., сохранившем 4 г восстанавливающих сахаров, спонтанное брожение Sacch. heterogenicus проявилось через несколько месяцев. Однако расы из этого вина, хотя и происходили из клеток, способных размножаться в присутствии спирта крепостью 13% об., показали малую спиртообразующую способность.
Saccharomyces inconspicuus Ван дер В альт
Речь идет о новом виде, которой До- мерк впервые выделила в 1953 г. из бордоских сусел. Ван дер Вальт (1965) провел таксономическое изучение этих дрожжей и дал им название. Минарик (1969) также исследовал их. Они мало отличаются от Sacch. rose!, имея такие же морфологические характеристики, очень слабую способность к сбраживанию сахарозы и рафинозы или полное ее отсутствие.
Saccharomyces italicus Кастелли
Штейнер (1924) описал под названием Sacch. chodati дрожжи, выделенные из виноградного сусла района Вале в Швейцарии, которые сбраживали сахарозу, но не сбраживали рафинозу. Лоддер и Крегер-Ван Риж (1952) назвали их Sacch. steineri. Кроме того, Кастелли (1938) выделил из сусла Кьянти штамм, который он приписал новому виду Sacch. italicus; эти дрожжи вызывают слабое брожение сахарозы и не сбраживают рафинозу.
Пейно и Домерк (1956) смогли показать, что Sacch. steineri и Sacch. italicus относятся к одному и тому же виду. Они морфологически идентичны. Некоторые штаммы могут иметь в условиях культуры в дрожжевой воде .-.-более удлиненную лаг-фазу при сбраживании сахарозы; но если в этом испытании заменить субстрат на среду с большим содержанием питательных веществ, все расы быстро сбраживают сахарозу. Точные манометрические измерения скорости брожения показывают, что все расы способны сбраживать этот сахар.
Эти наблюдения были подтверждены исследователями Центрального бюро по изучению плесневых культур в
Дельфте, которые предлагают сохранить название Sacch. italicus Кастелли; Sacch. steineri можно рассматривать как синоним.
Начиная с 1938 г. эти дрожжи находили во всех районах Италии, которые были обследованы Институтом микробиологии в Перузе. В южных районах они встречались чаще. Так, если в сус- лах центральной части Италии их находили лишь в одном из 100, то на юге страны они встречались в 38 суслах из 100.
Флоренцано обнаружил эти дрожжи в тосканских суслах.
Домерк выделила в районе Бордо 19 рас этих дрожжей или 0,9% из четырех партий сусла из винограда красных сортов и из девяти партий сусла из белого винограда (на 95 исследованных). Sacch. italicus были найдены, хотя и при низком уровне частоты, в Чехословакии (Лаго и сотрудники, 1970), а также в Южной Африке (Ван Керкен, 1963).
Эти второстепенные дрожжи обычно не играют значительной роли в выработке вин. Многие расы очень медленно развиваются в виноградном сусле. В условиях, когда Sacch. ellipsoideus образует максимум этанола за 12 дней, некоторым расам Sacch. italicus нужно 30 дней для завершения брожения. Конечное содержание спирта для обоих видов дрожжей почти одинаково, равно как и летучая кислотность, и другие вторичные продукты. Пока что никто не сообщил о случаях повторного брожения сладких вин, которое можно было бы приписать действию Sacch. italicus.
Однако в отдельных случаях эти дрожжи могут стать преобладающими. Так, Маркеш Гомеш и Де Кастро (1961—1962) констатировали преобладание Sacch. italicus в фазе брожения (до спиртования) при выработке вин Порто.
Saccharomyces oviformis Остервальдер
Эти дрожжи (рис. 6.13) имеют большое энологическое значение. Обычно их находят на винограде и в винах. Впервые они были выделены из винограда Шампани Остервальдером (1924). Этот вид встречается во всех винодельческих районах мира: в Ита-
^°о0о
Рис. 6.13. Sacch. oviformis, культивируемый в жидкой среде и на плотной.
лии, Франции, Испании, Израиле, Венгрии, Японии, Калифорнии, Болгарии, Чехословакии и др. В районе Бордо он находится в более значительных количествах в суслах белых сортов винограда, чем в суслах красных сортов. В последнем случае частота его обнаружения равна 1,3% по сравнению с частотой 7,4% в суслах белых сортов. Похоже, что Sacch. oviformis более распространены в районах, дающих более спиртуозные вина.
Пейно и Домерк (1955), Пейно (1956) подчеркнули свойства этих дрожжей, которые в некоторых районах делают их очень важными для производства и хранения вин. Такой же точки зрения придерживаются в своих многочисленных работах Мана- рик и сотрудники и другие авторы.
В начале брожения Sacch. oviformis развиваются медленнее, чем Sacch.
ellipsoideus, но их соотношение по мере развития брожения непрерывно возрастает; до начала брожения в сусле было найдено только 4 клетки на 1000, но уже 1,8 на 100 через несколько дней и 33,2% в конце брожения (подсчет сделан только на 800 клетках). Следовательно, в ходе сбраживания сусла процент Sacch. oviformis неуклонно, возрастает. Высокое конечное соотношение ('/з выделенных штаммов) хорошо выражает значение этих дрожжей. Очень часто именно они завершают брожение; это дрожжи окончательной «отделки» вина.
Большая часть рас Sacch. oviformis являются более спиртовыносливыми, чем Sacch. ellipsoideus. Sacch. oviformis, обладают наибольшей спиртообразующей способностью, чем какие- либо другие в районе Бордо: более половины выделенных штаммов оказались способными производить вина крепостью 18° в лабораторных условиях. Из-за своей спиртовыносливости эти дрожжи часто вызывают повторное брожение вин в бочках или в бутылках. Авторы много раз наблюдали, что Sacch. oviformis является ответственным за половину случаев повторного брожения у красных вин и почти за все случаи у белых полусладких вин со спиртуозностью свыше 12% об.
Этот вид также много раз идентифицировали в пленках, образующихся на поверхности вин повышенной спир- туозности, типа Херес. Это не единственные дрожжи, обладающие таким свойством, поскольку было доказано, что многие Saccharomyces могут развиваться на поверхности вина и расти за счет дыхания; все штаммы Saccharomyces oviformis не могут вегетировать на поверхности, но в процессе «хересования» большинство пленчатых дрожжей принадлежит к этому виду или к видам, очень близким к нему.
Применение дрожжевой разводки
'Sacch. oviformis в практике виноделия Всегда было выгодным, оно оправдывается для сусел с высокой сахаристостью, когда необходимо довести брожение до конца и получить сухие вина.
До сих пор никто не констатировал каких-либо особых органолептических характеристик, образуемых этими дрожжами, если не считать, что иногда у отдельных белых сухих вин появляется более тонкий, более сильный аромат, тот «яркий» тон, который указывает на белое вино лучшей марки. Образование вторичных продуктов и сложных эфиров происходит так же, как и у Sacch. ellipsoideus, и эти два вида, по-видимому, не отличаются один от другого ни по физиологическим особенностям, ни по потребностям в факторах роста. Кроме того, они не различимы под микроскопом по своей форме.
Sacch. oviformis обладают высокой сульфитоустойчивостью. Наблюдали присутствие живых клеток этих дрожжей в белых ликерных винах, хранившихся в течение многих лет с содержанием свободной сернистой кислоты, близким к 100 мг/л. В момент мютиро- вания эта устойчивость выражается в повышенном образовании ацетальдегида и в фиксировании более значительных доз сернистого ангидрида в связанных формах.
Зато Sacch. oviformis обладает такой же чувствительностью к актидиону и к сорбиновой кислоте, как и Sacch. ellipsoideus.
Saccharomyces prostoserdovii
Кудрявцев
Кудрявцев (1960) выделил много рас этого вида из бродящих сусел и из пленок, развившихся на винах различного происхождения в Армении. Другой штамм выделил Андре.
Эти дрожжи напоминают Sacch. го- uxii, не имея их осмофильных свойств,
а также Sacch. bay anus. Их ферментативные характеристики нестабильны и являются переходными от одного вида к другому. Как и Sacch. rouxii, они не сбраживают сахарозу и рафинозу, но могут приобретать это свойство и в этом случае сближаются с дрожжами Sacch. bayanus.
Saccharomyces rosei (Гильермон) Лоддер и Крегер-Ван Риж
Гильермон (1914) дал название То- rulaspora rosei круглым дрожжам (рис. 6.14), которые выделил Розе. Они сбраживают глюкозу, сахарозу и рафинозу и описаны под различными назва-
О СЮро§9
Рис. 6.14. Sacch. rosei, культивируемый в жидкой среде и на плотной.
ниями. Лоддер и Крегер-Ван Риж (1952) не сохранили род Torulaspora и назвали эти дрожжи Sacch. rosei. .
Их часто находили на винограде или в бродящих суслах. Об этих дрожжах сообщали Остервальдер (1924) из Швейцарии, Кремер и Крумгольц (1931) из Германии, Де Росси (1935) из Италии. Работы школы в Перузе, неоднократно излагавшиеся Кастелли (1948, 1959, 1960), которые проводились на многих сотнях сусел, показывают, что эти дрожжи распространены довольно широко. Процент частоты об-
наружения колеблется в зависимости от района от 13 до 41%. Похоже, что они чаще встречаются в районах с жарким климатом.
Другие итальянские авторы подтвердили эти наблюдения и этот вид позднее был найден в Калифорнии, Японии, Южной Африке, Чехословакии, Греции и в других странах.
Домерк (1956) на более чем 2000 дрожжевых рас в районе Бордо нашла 35 штаммов Sacch. rosei в 15 суслах из 95 исследованных.
Эти дрожжи представляют некоторый интерес с точки зрения энологии не своим распределением на винограде, а своим свойством сбраживать сахар медленно и равномерно, без заметного образования летучих кислот. Хорошие результаты от применения дрожжевой разводки Sacch. rose! в виноделии получил Кастелли (1942). Эти дрожжи дают винам слабую летучую кислотность, чаще всего от 0,05 до 0,15 г/л. Они образуют мало глицерина, бутандиола-2,3, являются явно сук- циногенными; 3Д или 4/а пировиноградной кислоты при глицерино-пировино- градном брожении идет на образование янтарной кислоты.
Кантарелли (1953) наблюдал, что обсеменение в два приема — сначала дрожжевой разводкой Sacch. rosei, затем спустя несколько дней разводкой Sacch. ellipcsoideus— позволяло получать вина с хорошим вкусом и букетом, со значительным снижением процентного содержания летучих кислот по сравнению со спонтанным брожением или брожением, проводимым только с Sacch. ellipsoideus. Зардетто де Толедо и Тексейра (1955) подтвердили эти результаты.
Saccharomyces rouxii Бутру
Со времени, как их впервые наблюдали Кремер и Крумгольц (1931), эти
осмофильные дрожжи много раз находили на винограде, пораженном благородной гнилью, в сахаристых суслах жарких районов. Домерк (1956) нашла их в районе Бордо, а Каприотти (1965) —в Сардинии. Они часто развиваются на поверхности концентрированных сусел, содержащих от 600 до 900 г сахара на 1 л, в несколько разбавленной зоне, создаваемой гигроскопическими свойствами продукта.
В противоположность большинству Saccharomyces, Sacch. rouxii являются фруктофильными дрожжами (Пейно и Домерк, 1955), т. е. сбраживающими в виноградном сусле в первую очередь фруктозу, а не глюкозу, свойство, которое они разделяют с Sacch. bailii и Т. stellata.
Saccharomyces uvarum Бейеринк
В последнем издании «The Yeasts» Ван дер Вальт объединил Sacch. carls- bergensis с видом uvarum. Эти дрожжи (рис. 6.15) отличаются одни от других только формой своих клеток, которые у Sacch. uvarum, как правило, более удлиненные.
Этот вид первоначально был найден в различных плодовых соках и винах,
Рис. 6.15. Sacch. uvarum, культивируемый в жидкой среде и на плотной.
затем в других средах, и ^ частности в пиве. Их часто встречали и в виноградных суслах и всегда упоминают в работах по исследованию микрофлоры в винодельческих районах всего мира.
Кастелли и его ученики находили эти дрожжи почти постоянно как в Центральной, так и в Южной Италии. В Западной Сицилии они встречаются очень часто и присутствовали в 14 суслах из 27 исследовавшихся. Малан и Таран- тола (1956) описали биохимические и энологические признаки этих дрожжей. Домерк (1956) получила 23 штамма Sacch. uvarum в районе Бордо. Мина- рик обнаружил их в 20% исследованных сусел в Чехословакии, а Кано Маротта (1962, 1964)—в Уругвае. Ган- дини (1968) изучил их роль в производстве Муската Асти.
По полному сбраживанию рафинозы эти дрожжи приближаются к Sacch. florentinus и к Sacch. coreanus. Они отличаются от первых формой клеток, шаровидных у Sacch. florentinus, отсутствием ассимиляции этаноламина, своей чувствительностью к актидиону и от вторых — сбраживанием мальтозы.
С точки зрения энологии Sacch. uvarum не имеет большого значения; с одной стороны, они встречаются редко, это скорее случайные дрожжи, с другой— они развиваются медленно и обладают лишь средней по силе способностью спиртообразования. По характеру брожения и образования вторичных продуктов они ненамного расходятся, например, с Sacch. ellipsoideus. Эти дрожжи не придают продуктам брожения отчетливо выраженных аналитических характеристик. Это же самое можно сказать и в отношении органолептических качеств, как показали опытные работы по приготовлению белого вина. Один раз Sacch. uvarum обнаружили в красном вине, оставшемся сладким и подвергшемся вторичному брожению весной. К этому виду при
надлежат многие дрожжи, способные образовывать небольшие количества сернистого ангидрида (см. гл. 15, раздел «Восстановление сульфатов в сульфиты и сероводород»).
ВИННЫЕ ДРОЖЖИ РОДА SACCHAROMYCODES ГАНЗЕН
О дрожжах Saccharomycodes в виноградных суслах и винах сообщали много раз. В Италии Мензио (1911) обнаружил их в сульфитированном сусле. По мнению этого автора, дрожжи Saccharomycodes ответственны за брожение в суслах, обработанных сернистым ангидридом, которое ведет к ухудшению состава вина. Из всех видов винных дрожжей они наиболее сульфитоустойчивые. Кремер и Гейн- рих (1913, 1922) описали разновидность vini, принадлежащую к Saccharomycodes ludwigii, выделенную из сильно сульфитированного виноградного сусла в Рейнской области (ФРГ); Кремер несколько раз описал такие же наблюдения, Де Росси выделил из сусла Умбрии две расы, которые могли доводить спиртуозность до 16,8% об.
Описаны многие виды, расы или штаммы Saccharomycodes, но в конечном счете род Saccharomycodes состоит только из одного вида ludwigii.
S’codes ludwigii редко находят на винограде и в нормально бродящих суслах. Всего две расы выделили Капри- отти и Кантарелли (1952) в суслах провинции Тревизо и только одну расу изолировал Малан в суслах области Пьемонт, Домерк нашла лишь одну расу в бродильном чане в районе Бордо, но эти дрожжи довольно часто встречаются в сульфитированных суслах. Им же обязаны и некоторые случаи повторного брожения сладких вин в бочках или в бутылках (Пейно и Домерк, 1955). Однако Маркеш Гомеш и Ваз де Оливейра (1961—1962) под-
черкнули полезное значение S’codes ludwigii, которые используют в сбраживании вин Порто до спиртования в бродильном чане.
Под микроскопом эти дрожжи имеют вид крупных заостренных клеток, с удлинением на концах в форме лимона. Как и у всех заостренных дрожжей, некоторые клетки не имеют характерной формы и являются просто удлиненными (рис. 6.16). Это наиболее крупные дрожжи, встречающиеся в сусле и вине: (5—9) X (10—25) мкм.
Рис. 6.16. Saccharomycodes ludwigii, культивируемый в жидкой среде и на плотной.
Поскольку род Saccharomycodes содержит только один вид, а форма и размеры клеток являются очень характерными, эти дрожжи являются единственными, которые можно уверенно идентифицировать в вине путем обычного наблюдения их под микроскопом.
Saccharomycodes — дрожжи ацето- генные, но они вырабатывают также и этилацетат. В среднем производство этилацетата в виноградном сусле составляет 80 мг/л при аэробном брожении и до 200 мг/л при брожении без доступа воздуха. В последнем случае при дегустации ощущается характерный запах этилацетата. Отмечают, что способность к образованию сложных эфиров у S’codes ludwigii достигает
максимума при анаэробном брожении в противоположность тому, что наблюдается у других дрожжей.
S’codes ludwigii можно рассматривать как дрожжи, вызывающие болезни вина, и их присутствие в винах с остаточным сахаром, консервируемых сернистым ангидридом, является настоящей болезнью, компрометирующей их хранение. В исследованиях, проводившихся для выяснения причин ненормального повторного брожения вин, в 8 случаях из 69 оно было приписано этим дрожжам. Были также отмечены случаи развития повторного брожения в бутылках даже в винах, имеющих от 80 до 120 мг/л свободной сернистой кислоты. Брожению предшествует фаза инкубации продолжительностью много недель, в течение которой происходит размножение S’codes ludwigii и преобразование их в характерные хлопья, не разделяющиеся при взбалтывании. Клетки размножаются внутри этих хлопьев, при этом дрожжевые клетки периферии связывают сернистую кислоту путем образования ацетальдегида и таким образом защищают другие; брожение всей массы проявляется тогда, когда содержащееся в сусле количество свободной сернистой кислоты снизится до значения, близкого к нулю.
Заражение подвалов этими дрожжами— довольно частое явление. Оно обычно производится сульфитирован- ными суслами, применяемыми для подслащивания вин. Высокая сульфито- устойчивость делает их особенно опасными в практике работы. Они редко встречаются в бродящих суслах. Опыты виноделия по белому способу с S’ludwigii показали, что брожение протекает медленно и равномерно (рис. 6.17), но одновременно наблюдали образование неприятного кислого запаха, вызываемого значительным процентным содержанием этилацетата. Следо-
' вательно, на всех стадиях производства вина эти дрожжи ухудшают его качество; их следует отнести к микроорганизмам, вызывающим болезни вин.
ДРОЖЖИ РОДА SCHIZOSACCHAROMYCES ЛИНДНЕР
Чаленко (1941) выделил из фруктового сока дрожжи, которые вызывали почти полное исчезновение L-яблочной кислоты из питательной среды; они
Рис. 6.17. Кривые сбраживания виноградного сусла различными расами:
1, 2, — Saccharomycodes ludwigii, 3—Saccha- romycodes ellipsoideus.
принадлежат к роду Schizosaccharo- myces; автор назвал эти дрожжи acido- devoratus и подчеркнул опасность присутствия их в яблочных и других напитках, получаемых из фруктов путем брожения (Чаленко и Корсакова, 1960).
Анализ этих работ содержится в монографии о дрожжах Кудрявцева (1960). Ржедовски и Ржедовска (1960), Ржедовска и Горецка (1962), Буяк и Сурма (1962), Якубовска (1963) в Польше также исследовали случайное биологическое кислотопонижение яблочных сусел дрожжами Schizosaccharomyces, их устойчивость к антисепти
кам и методы микробиологического контроля, которые необходимо применять в отношении их в производстве сидра.
Риберо-Гайон и Пейно (1962) разработали основы возможного применения этих дрожжей для производства вина из кислого винограда. Майер и Темперли (1963) в своем исследовании метаболизма Schizosaccharomyces дали доказательство спиртового брожения яблочной кислоты путем измерения посредством аппарата Варбурга количества выделенного углекислого газа и энзиматический анализ получающегося при этом этанола. Одна молекула яблочной кислоты дает две молекулы углекислого газа и одну молекулу этанола.
Хотя Schizosaccharomyces очень редко встречается в виноградных суслах, один из авторов этой книги посвятил ряд работ их способности усваивать яблочную кислоту (Пейно и сотрудники, 1964; Пейно и Сюдро, 1964; Пейно, 1965; Пейно и Лафон-Лафуркад, 1965).
Клетки Schizosaccharomyces имеют эллиптическую или цилиндрическую форму, с закругленными концами и размерами (34-5) X(64-16) мкм (рис. 6.18). Они размножаются путем деления, а не почкованием. Сообщали о четырех видах; два из них Schiz. pombe и Schiz. malidevorans находятся исключительно на винограде. Schiz. pombe сбраживает глюкозу, сахарозу, мальтозу, рафинозу; Schiz. malidevorans не сбраживает мальтозу.
Эти дрожжи могут обладать хорошей спиртообразующей способностью, но сбраживание сахара обычно протекает медленно (рис. 6.19), при этом они испытывают сильное соперничество со стороны Saccharomyces. Образование глицерина, летучих кислот, бутандио- ла-2,3 слабое. Schizosaccharomyces являются ауксотрофными и, в частности, требуют для своего развития мезоино-
Рис. 6.18. Schizosaccharomyces pombe, культивируемые в жидкой среде и на плотной.Рис. 6.18. Schizosaccharomyces pombe, культивируемые в жидкой среде и на плотной.Рис. 6.19. Кривые сбраживания виноградного сусла различными расами и Schizosaccharomyces:1, 2, 3, 4— Schizosaccharomyces; 5— Sacch. ellipsoideus и Sacch oviiormis (температура 25° С).Рис. 6.19. Кривые сбраживания виноградного сусла различными расами и Schizosaccharomyces:1, 2, 3, 4— Schizosaccharomyces; 5— Sacch. ellipsoideus и Sacch oviiormis (температура 25° С).
Рис. 6.18. Schizosaccharomyces pombe, культивируемые в жидкой среде и на плотной.
Рис. 6.18. Schizosaccharomyces pombe, культивируемые в жидкой среде и на плотной.
Рис. 6.19. Кривые сбраживания виноградного сусла различными расами и Schizosaccharomyces:
1, 2, 3, 4— Schizosaccharomyces; 5— Sacch. ellipsoideus и Sacch oviiormis (температура 25° С).
Рис. 6.19. Кривые сбраживания виноградного сусла различными расами и Schizosaccharomyces:
1, 2, 3, 4— Schizosaccharomyces; 5— Sacch. ellipsoideus и Sacch oviiormis (температура 25° С).
ванием. Полисахаридов крахмалистого типа не производят. Псевдомицелия нет совсем или едва заметные элементы. В жидкой среде образуют осадок, на поверхности •— кольцо, редко — пленку, способны бродить. Красных или желтых пигментов каротиноидной природы нет. Споруляции не наблюдается.
Описаны 36 видов Torulopsis, из них 6 найдены в суслах, в винах или на винодельческом оборудовании. Это Т. api- cola (Охара и сотрудники, 1960), Т. cantarelli (Ван дер Вальти Ван Кер- кен, 1961; Охара и сотрудники, 1964), Т. domercquii (Ван дер Вальт и Ван Керкен, 1960), Т. norvegica (Ван дер Вальт и Ван Керкен, 1961), Т. stellata (в который вошел более известный вид Т. bacillaris) и Т. vanderwaltii (Видал- Лейриа, 1966). Здесь будут описаны только дрожжи вида Т. stellata.
Torulopsis stellata (Кремер и Крумгольц) Лоддер
Кремер и Крумгольц (1931) выделили эти неспорогенные дрожжи (рис. 6.20) из винограда в Германии. Хотя образование спор не наблюдалось, они отнесли их к роду Saccharomyces и на-
зит и пантотеновую кислоту. Они сбраживают глюкозу и фруктозу в смешанном состоянии с одинаковой скоростью. Оптимальная температура их активности (30° С) выше, чем у Saccharomyces. Наконец, они обладают хорошей суль- фитоустойчивостью.
ВИННЫЕ ДРОЖЖИ РОДА
TORULOPSIS БЕРЛЕЗЕ
Краткое описание рода
Клетки округлые или овальные, или, что очень редко, немного удлиненные. Размножаются многосторонним почко- 180
Рис. 6.20. Torulopsis stellata, культивируемый в жидкой среде и на плотной.
звали bacillaris из-за формы и размеров клеток, которые на твердой среде напоминают палочки. Лоддер включила эти дрожжи в род Torulopsis. Они также были найдены на винограде в Италии (Верона и Флоренцано, 1947) и описаны под названием Br. italicus. Флоренцано выделил 6 штаммов этих дрожжей из тосканских вин; Малан обнаружил расу Т. bacillaris в виноградном сусле в Пьемонте. Каприотти и Кантарелли (1952) выделили 2 штамма во время исследования 19 сусел провинции Тревизо. Наконец, Каприотти встретил Т. bacillaris в четырех суслах из 26 в Калабрии и в пяти суслах из 40 в Венеции Трентино.
Пейно и Домерк (1951) сообщили о присутствии этих дрожжей в сусле в районе Медок. Во время сбора винограда Домерк выделила 133 штамма Т. bacillaris из 33 сусел, полученных в основном из винограда белых сортов. Эти дрожжи часто встречаются в суслах из винограда, пораженного «благородной гнилью» (Botrytis cinerea).Домерк обнаружила 99 штаммов Т. bacillaris из 572 исследованных штаммов, т. е. 17% в белых суслах из районов «благородной гнили» и 28 штаммов из 398, т. е. всего 7% в суслах из белых сортов винограда, поступившего из районов без гнили с незначительным процентом поражения. Из 1078 штаммов, выделенных из 56 сусел винограда красных сортов, Т. bacillaris представлена только 12 расами.
В каталоге Лоддер (1970) эти дрожжи включены в вид Т. stellata. Они сбраживают глюкозу, сахарозу и рафинозу на 7з. В противоположность тому, что происходит у большинства дрожжей в смеси восстанавливающих сахаров, Т. stellata быстрее сбраживает ■фруктозу, чем глюкозу. Наблюдения показывают, что, когда фруктоза в виноградном сусле сбраживается наполовину, эти дрожжи используют только
5% содержания глюкозы. Это одна из характеристик вида.
Т. stellata обладает довольно хорошей устойчивостью. Сообщали о его ос- мофильных свойствах; дрожжи этого вида способны развиваться в присутствии высоких концентраций сахара (до 60%). Кроме того, они хорошо развиваются при несколько повышенной температуре (30—35° С), будучи чувствительными к холоду. Они имеют такую же сульфитоустойчивость, как и Sacch. ellipsoideus, и более высокую устойчивость по отношению к актидио- ну.
Т. stellata могут рассматриваться как преимущественно дрожжи винограда. Они почти специфичны для винограда с гнилью, поскольку свыше 70% рас
Рис. 6.21. Кривые сбраживания виноградного сусла различными расами Torulopsis stellata:
1, 2—Torulopsis bacillaris; 3— Saccharo- myces ellipsoideus.
T. bacillaris происходят из сусел в районах «благородной гнили», производящих белые ликерные вина.
Эти дрожжи совместно с заостренными дрожжами вызывают забраживание сусла, поэтому их чаще всего находят в первой фазе брожения, в дальней-
Рис. 6.22. Дрожжи, принадлежащие к различным годам (увели чениеХ 1 000):
а — Sacch. rosei в виноградном сусле; б — Sacch. rosei на солодовом сусле-агаре; в-—Нап- ре; д - Torulopsis stellata на солодовом сусле-агаре, е — Hanseniaspora uvarum на солодовом
шем частота появления их равномерно понижается. Брожение, которое они вызывают, протекает с медленным нарастанием и продолжается более месяца (рис. 6.21). Под микроскопом клетки Т. stellata наблюдаются в бродящем сусле дольше, чем заостренные дрожжи, так как они имеют явно более высокую способность спиртообра- зования, чем последние. Способные создать среднюю спиртуозность в среднем до 10,8% об., они выдерживают более высокие концентрации и могут развиваться даже в присутствии 12,5% спирта, однако не отмечалось случаев повторного брожения вина, которое
приписывали действию этих дрожжей.
Если из сусла, полученного из белого винограда с гнилью, удалить Sacch. ellipsoideus путем добавления 10 мг актидиона на 1 л, то Т. stellata вместе с Hanseniaspora будут преобладать и вести брожение. Т. stellata не истощает аммонийный азот, источник питания дрожжей Saccharomyces.
Среды, сброженные Т. stellata, не имеют каких-либо особых органолептических или аналитических характеристик.
На рис. 6.22 даны фотографии (уве- личениеХ 1000) дрожжей различных родов.
senula anomala на солодовом сусле-агаре; г — Pichia membranaefaciens на солодовом сусле-ага- сусле-агаре; ж, з—Saccaromyces ludwigii— на солодовом сусле-агаре.
ЛИТЕРАТУРА
Agostini О. (1950), Agricultura italiana, 50, 193
В а г г е 1 А., В i d а п Р. et Andre L. (1955), С. R. Acad, agric., 41, 426.
Benda I. (1962), Antonie van Leeuwenhoek, 28, 208.
Brechot P., Chauvet J. et Girard H. (1962), Ann. Technol. agric., 11, 235.
Bujak S. et Surma W. (1962), Przem. Spez., 16, 139.
Cano Marotta C. et Bracho de Ka- lamar D. (1962), Atti Accad. ital. Vite Vino, 14, 275.
Cano Marotta C. et Bracho de Ka- lam ar D. (1964), Atti Accad. ital. Vite Vino, 16, 85.
C a n t a r e 11 i C (1953), Riv. Vitic. Enol., 6, 82. Cantarelli C. (1955), Annali Microb., 6, 85. Capriotti A. (1952), Ann. Fac. agrar., Perouse, 8.
Capriotti A. (1953), Atti Accad. ital Vite Vino, 5, 262.
Capriotti A. (1965), Studi Sassaresi, 13, 287.
Capriotti A. et Cantarelli C. (1952), Rivista Vitic. Enol, 5, 213.
Castelli T. (1938), Archiv. Mikrob., 9, 449.
Castelli T. (1942), Annali Microb., 2.
Castelli T. (1942), Archiv. Mikrob., 12, 260. Castelli T. (1948), Riv. Vitic. Enol., 8, 258 Castelli T. (1959), Introduzione alia micro biologia enologica. L’Assicuratrice dell’Ol- trepo, Voghera.
Castelli T. (1960), Lieviti e fermeutazioni in enologia. L. Scialpi editeur, Rome
Castelli T. (1969), Il vino al microscopic. L. Scialpi editeur, Rome.
Castelli T. (1971), Vini d’Italia, 13, 523.
Castelli T. (1973), L’ecologie des levures, Colloque international d’OEnologie, Arc-et-Se- nans (Institut technique du Vin).
Castelli et Del Giudice E. (1953), Riv. Vitic. Enol., 6, 307.
Chalenko D. K. (1941), Les causes de la diminution de l’acidite pendant la fermentation des vins de fruits (en russe). Laboratoire central d’Oenologie, Moscou.
Chalenko D. K. et KorsakowaT. F. (1960), Mikrobiologija, 29, 587.
De Rossi G. (1917), Staz. sperim. agrar., 50, 529
De R о s s i G. (1953), Congres Intern. Vigne Vin, Lausanne.
Domereq S. (1956), Etude et classification des levures de vin de la Gironde, These Doct. Ingenieur, Bordeaux.
Feduchy E. (1956), Inst. nac. Invest, agron., Madrid.
Florenzano G. (1949), Ann. Sperim. agron., 3, 887.
G a 1 z у P. et Rioux J. A. (1957), Progr. agric, vitic, 144, 365.
Ga nd ini A. (1964), Atti Accad. ital. Vite Vino, 16, 447.
Gandini A. (1968), Vini d’Italia, 10, 351.
Gilliland R. B. (1969), Antonie van Leeuwenhoek, 35, 13.
G u i 11 i e rm о n d A. (1914), Arch. Protistenk., 28, 52.
Inigo B., Arroyo V., Bravo F. e t L e a- guno C. (1961), Rev. Agroquim. Technol. alim., 1, 11.
Inigo B„ Vasquez D. e t Arroyo V. (1963), Rev. Ciencia appl,, 93, 296.
Jakubowska J. (1963), Zest. Naukowe Po- litechn. Lodzkiej., 54, 5.
Kloecker A. (1912), Centr. Bakt. Parasitenk., 35, 375.
К о с к о v a-K r a t о ch v i 1 о v a A. et Ku- tkova M. (1961), Atlas kvasinek a kvasin- kovitych mikroorganismii, Prague.
Kreger-Van Rij. N.J.W. et Ahearn D. G. (1968), Mycologia, 60, 604.
Kroemer K. et Heinrich F. (1913), Ber. Konigl. Wein-Obst. Gartenbau Geisenheim, p. 105.
Kroemer K. et Heinrich F. (1922), Ber. Konigl. Wein-Obst Gartenbau Geisenheim, p. 258.
Kroemer K. et Krumbholz G. (1931), Archiv. Mikrobiol., 2, 352.
Kudrjawzew W. (1960), Die Systematik der Hefen. Academie-Verlag, Berlin.
Laho L., M i n a r i к E. e t N a v a r a A.
(1970), Vinarstvo chemia mikrobiol, a analy- tika vina, bratislava.
L о d d e r J. et Krege r-V an R ij N.J.W. (1952), The yeast. A taxonomic study, North- Holland Pub. Co., Amsterdam, 2“ edition 1967.
Loader J. (1970), The yeast, North-Holland Pub. Co., Amsterdam.
Malan С. E. (1951), Atti Accad. ital. Vite Vino, 3, 338.
Malan С. E. (1953), Atti Accad. ital. Vite Vino, 5, 477.
Malan С. E. etCano Ma г о 11 a C. (1959), Atti Accad. ital. Vite Vino, 11, 405.
Malan С. E. et G a y-E у n a r d G. (1962), Atti Accad. ital. Vite Vino, 14, 255.
M a 1 a n С. E. e t L о v i s о 1 о R. (1955), Atti Accad. ital. Vite Vino, 7, 443.
M a 1 a n С. E. e t L о v i s о 1 о R. (1958), Atti Accad. ital. Vite Vino, 10, 125.
Malan С. E. et Tarantola C. (1956), Atti Accad. ital. Vite Vino, 8, 559.
Marques Gomes J. V. et de Castro Reis A.M.L. (1961-62), Anais Inst. Vinho Porto.
Marques G о mes J. V. e t V a z de Oliveira A.M.F. (1961-62), Anais Inst. Vinho Porto.
Martini A. (1960), Riv. Vitic. Enol., 13, 263.
Martini A. (1962), Riv. Vitic. Enol., 15, 57.
Martini A. (1964), Atti Accad. ital. Vite Vino, 16, 151.
Mayer K. et Temperli A. (1963), Arch. Microbiol., 46, 321.
Me ns io C. (1911), Staz. sperim. agrar. ital., 44, 829.
Minarik E. (1963), Biologia Bratislava, 18, 160.
Minarik E. (1969), Wein Wissens., 24, 378.
Minarik E., Laho L. e t N a v a r a A. (1960), Mitteilungen, 10, 218.
Muller-Thurgau H. (1905) in La far F., Handbuch der technischen Mykologie.
Niehaus J. G. (1932), Zentr. Bakt. Parasitenk., 87, 97.
Osterwalder A. (1924), Zentr. Bakt. Parasitenk., 60, 481.
Park Y. (1974), Contribution a 1 etude des levures de la region de Cognac, These 3е Cycle, Bordeaux.
Peynaud E. (1956), Vignes et Vins n° 51 et suivants.
Peynaud E. (1965), Weinberg u. Keller, 12, 229.
Peynaud E. e t D о mercq S. (1953), Ann. Technol. agric., 4, 265.
PeynaudE.etDomereqS.(1955),
R. Acad, agric., 41, 103.
PeynaudE.etDomereqS.(1955),
Ann. Inst. Pasteur, 89, 346.
Peynaud
e t D о m e r c q
Archiv. Mikrobiol., 24, 266.
Peynaud E. et Domereq Ann. Inst. Pasteur, 91, 574.
Peynaud E. et Domereq Ann. Technol. agric., 4, 265.
Peynaud E. e t D о m e r c q Archiv. Mikrobiol., 47, 219.
Peynaud E., Do me req S., A. M., Laf о n-Lafourcade
S.
S.
S.
S.
(1956),
(1956),
(1956),
(1964),
В о i d г о n
S. et Gu-
imberteau G. (1964), Archiv. Mikrobiol., 48, 150.
Peynaud E. et Laf о n-Laf о urca de S.
(1965), Ann. Technol. agric., 16, 49.
Peynaud E., Laf о n-L af о urcade S. et Guimberteau G. (1967), Antonie van Leeuwenhoek, 33, 49.
Peynaud E. e t S u d r a u d P., (1964), Ann. Technol. agric., 13, 335.
P i с c i G., M e 1 a s-I о n n i d i s Z., К a r n i s A. e t BasilatosG. (1959), Arch. Inst. Pasteur hellen., 5, 44.
Reiff F., Kautzmann R., Ltiers H. et Lindermann M. (1960), Die Hefen, 2 vol., Hans Carl, Nuremberg.
R i b ё r e a u-G а у о n J. e t Peynaud E. (1962), C. R. Acad, agric., 48, 558.
Rose A. H. et Harrison J. S. (1969-1970), The yeasts, 3 vol., Academic Press, Londres.
Ro set M. (1970), Etude de quelques levures dites «sauvages». Essais en vue de leur em- ploi dans 1’industrie des jus de raisin, These Doct. Ingenieur, Toulouse.
Rzedowska H. et Goree к a H. (1962), Przem. Fermentacying, 62, 66.
Rzedowski W. et Rzedowska H.
(1960), Recherches sur la desacidification bio- logique des moilts de fruits (en polonais), Inst. Industries Fermentation, Varsovie.
Santa Maria J. (1959), Anales Inst. nac. ’ Invest, agron., 8, 715.
Santa Maria J. (1964), Bol. Inst. nac. Invest. agron., 51, 527.
S a p i s-D о m e r c q S. (1970), Conn. Vigne Vin, 4, 45.
Schanderl H. e t Draczinski M. (1952), Wein und Rebe, 20, 462.
Semi ch on L. (1926), Rev. Vitic., 65, 21.
Semi ch on L. (1929), Rev. Vitic., 70, 85.
Spettoli P. (1971), Industrie agrar., 9, 381.
Steiner J. M. (1924), Etude sur les levures actives des vins valaisans, These Doct., Geneve.
Stephanopoulos O. et Ge о rgan- tas S. (1972), Vini d’Italia, 14, n° 81.
Taranto la C. (1945), Annali Accad. agric., Turin, p. 80.
Van der W a 11 J. P. (1957), Antonie van Leeuwenhoek, 23, 23.
Van der Walt J. P. (1965), Antonie van Leeuwenhoek, 31, 187.
Van der Wa 11 J. P. et Tscheunerl. T. (1956), Antonie van Leeuwenhoek, 22, 257.
Van der W a 11 J. P. e t N e 1 E. E. (1963), Mycopat. Mycol. appi., 20, 71.
Van Ker ken A. E. (1963), Contribution to the ecology of yeast occuring in wine, These Doct., Pretoria, Afrique du Sud.
Van Z у 1 J. A. e t du Plessis L. W. (1961). South Afric. J. Agric. Sci., 4, 393.
Verona O. (1951), Ann. Fac. agrar. Pisa, 12, 123.
Yokotsuka I. (1954), Studies on Japanese wine yeasts. Research Inst. Ferm., Yamanashi.
Yokotsuka I. et Goto S. (1955), J. agric, chem. Soc. Japon, 29, 39 et 123..
Z a r d e 11 о de Toledo O. e t Teixeira C. G. (1955), Agric, italiana, 15, 155.
Zikes H. (1911), Zentr. Bakt. Parasitenk., 30, 145.
Глава 7. УСЛОВИЯ РАЗВИТИЯ И АКТИВНОСТИ ДРОЖЖЕЙ
АНАЛИЗ МИКРОБИАЛЬНОГО РОСТА
Для роста микроорганизма необходимо взаимодействие ряда факторов (питательные вещества, факторы роста) и физико-химических условий (температура, pH, аэрация). Всякий фактор или условие, отсутствие или изменение которых влечет приостановку или прекращение роста, называют
«лимитирующим фактором». Если в соответствующую питательную среду внести несколько клеток микроорганизмов (обсеменение), они будут размножаться до полного использования лимитирующего фактора (например, сахара) или до того момента, когда лимитирующий фактор достигнет критического значения (например, концентрации выделяемого спирта). .
В своем развитии это явление проходит различные стадии, которые теоретически сводят к следующим (рис. 7.1).
Латентная фаза. В течение этой фазы коэффициент роста (т. е. число клеточных делений в единицу времени) равен нулю; клетки, введенные для обсеменения, должны адаптироваться к этой новой для них среде или, если они старые, восстановить свой ферментативный потенциал.
Рис. 7.1. Кривые микробиального роста в полулогарифмических координатах:
1 — латентная фаза; 2 — фаза ускорения; 3 — экспоненциальная или логарифмическая фаза; 4— фаза замедления; 5— стационарная фаза; 6—фаза снижения (по Сенез, 1968; см. также Моно, 1942) log2: логарифм основания 2; среднее время клеточного деления илч генерации соответствует промежутку времени, в течение которого log2 популяции увеличивается на единицу.
Фаза ускорения. С началом роста микроорганизмы начинают размножаться. На рис. 7.1 кривая живых клеток, до сих пор параллельная оси абсцисс, изгибается вверх.
Эти две первые фазы необязательны и тем короче, чем более благоприятны условия роста.
Экспоненциальная или логарифмическая фаза. Коэффициент роста в этой фазе постоянный и максимальный, отмирание отсутствует. Кривая является показательной (экспоненциальной), что выражается в полулогарифмических координатах посредством прямой.
Число живых клеток идентично с общим числом клеток.
Фаза замедления. Один из ограничивающих факторов почти исчерпан или приближается к своему критическому значению; кривая изгибается вниз.
Стационарная (неподвижная) фаза. Один из лимитирующих факторов исчерпан или достиг своего критического значения; коэффициент роста равен нулю; рост останавливается. Графически кривая становится параллельной оси абсцисс. Популяция остается неизменной в течение более или менее длительного времени в зависимости от условий эксперимента и применяемого микроорганизма.
Фаза отмирания. Популяция уменьшается. Клетки отмирают, высвобождая продукты выделения. Они автолизируются, как бы растворяясь в среде, разлагаясь на свои составные части, которые, впрочем, тут же поглощаются еще живыми микроорганизмами, чтобы жить вплоть до полного отмирания популяции.
РОСТ ДРОЖЖЕЙ
Рост дрожжей протекает в порядке описанной выше схемы. В главах 7, 8 и 9 будут изложены факторы размножения дрожжей, которые в то же время являются факторами сбраживания сахара. Как все живые существа, дрожжи могут жить и развиваться только в строго определенных условиях. Они очень чувствительны к условиям аэрации и температуры. Дрожжи имеют совершенно точные потребности в питании углеродными, азотистыми и минеральными веществами и требуют некоторых факторов роста. С другой стороны, они также очень чувствительны к присутствию в среде ингибирующих веществ, ядов, способных нарушить или блокировать некоторые важнейшие функции их клеток: размножение, ды-
хание или брожение. В этих главах приведены результаты большого числа опытов, которые в лабораторных условиях позволили определить основные факторы и оптимальные условия активности винных дрожжей. Знание их находит прямое применение в практике виноделия, так как биохимические законы, регулирующие активность дрожжей, не зависят от объема ферментирующей среды. При переходе от лабораторных работ к промышленному производству могут измениться лишь некоторые физико-химические факторы, такие, как температура или проникновение кислорода. -
Прежде всего необходимо уточнить, что существует тесная связь между размножением дрожжей и сбраживанием сахаров. Действительно, не зная этого, невозможно понять некоторые явления, наблюдаемые при производстве вина. Чтобы развиваться, т. е. вырабатывать свое собственное вещество и размножаться, дрожжи реализуют некоторое число реакций синтеза. Это реакции эндотермического типа, т. е. они поглощают тепло. Следовательно, они нуждаются в источнике энергии и черпают ее в сбраживании глюкозы, которая к тому же является источником углерода. Таким образом, рост и брожение неразделимы. И действительно, если во время брожения виноградного сусла проследить за исчезновением сахара и развитием дрожжей, то всегда будет отмечаться, что оба эти процесса протекают параллельно. Кривые, которые представляют в зависимости от времени процентное содержание сброженного сахара и развитие популяции дрожжей, имеют совершенно одинаковый вид. Если оценить кривые размножения в зависимости от сброженного сахара, то констатируют, что они всегда являются восходящими; это доказывает, что сахар трансформируется по мере размножения дрожжей.
В практике виноделия сбраживание сахара точно так же может происходить только при одновременном развитии дрожжей; в это время при наблюдении под микроскопом они представляются прозрачными и почкующимися. Если дрожжи быстро размножаются, брожение также протекает быстро, и, наоборот, при прекращении роста по любой причине через очень короткий промежуток времени останавливается брожение. Все происходит так, как если бы одни почкующиеся или способные почковаться дрожжевые клетки были достаточно богаты ферментами, необходимыми для превращения сахара в спирт. Следовательно, в виноделии для получения полного сбраживания сахара важно, чтобы дрожжи могли размножаться до полного израсходования этого субстрата, несмотря на высокую концентрацию образуемого ими спирта. Точно так же неудачи, которые имеются при дображивании красных вин — недобродов, несмотря на сильные дозы обсеменения, в первую очередь объясняются трудностью адаптации и размножения внесенных дрожжей.
Прежде всего дрожжи нуждаются, в воде и углеродном питании. Поскольку они всегда находят эти два элемента в сусле или в вине в достаточном количестве, на этом вопросе можно не задерживаться. '
Минимальные значения влажности, способствующие росту различных видов дрожжей, известны. Большинству дрожжей требуется 90—95% относительной влажности. Однако некоторые виды продолжают развиваться при более низких значениях в пределах—90— 85% и иногда еще меньше; это осмо- фильные дрожжи. Их находят, например, в концентрированных виноградных соках при 30 или 36° Боме (от 630 до 800 г сахара на 1л); здесь они развиваются первоначально на поверхно-
сти, в увлажненной зоне этой гигроскопической среды.
В отношении углеродного питания необходимо напомнить, что сахара представляют собой основной источник углерода для дрожжей; они также являются источником энергии. Выше было показано, что их использование может быть ферментативным или окислительным. Дрожжи могут использовать и много других углеродных соединений: глюкозиды, многоатомные спирты, продукты метаболизма или промежуточные продукты брожения, кислоты цикла Кребса, аминокислоты и др. Дрожжи могут также развиваться в сухих винах, практически лишенных сахаров, пригодных для сбраживания за счет некоторых других компонентов. Похоже, что дрожжи усваивают даже углекислый газ.
Условия среды и факторы роста дрожжей в их совокупности обстоятельно описал Уль (1960, 1967). В недавно изданной монографии по дрожжам (Кук, 1958; Роз и Харрисон, 1971) имеются главы о питании, энергетике роста и его условиях и влиянии температуры.
НЕОБХОДИМОСТЬ КИСЛОРОДА ДЛЯ РАЗВИТИЯ ДРОЖЖЕЙ
«Брожение — это жизнь без воздуха», —■ сказал Пастер. Он показал, что отношение" Д/С — сухой массы дрожжей к массе использованного сахара — значительно снижается с уменьшением площади контакта питательной среды с воздухом. Сусло, дезаэрированное кипячением, лишенное доступа воздуха и обсемененное небольшим количеством дрожжей, может бродить, хотя и очень медленно. В одном из опытов Пастера в течение 3 мес в таких условиях образовалось 255 мг дрожжей против 45 г исчезнувшего сахара. Из этого он заключил, что дрожжи могут полностью обходиться без кислорода.
При полном отсутствии воздуха размножение дрожжей невозможно (рис. 7.2). Контарелли (1956) провел эксперимент в строгих условиях. Табл. 7.1 дает результаты одного из таких опытов.
Небольшое развитие в колбах 1 и 2 объясняют присутствием в обсемененных дрожжах дыхательных ферментов
Рис. 7.2. Аппарат Кошэна для последова- тельного обсеменения питательной среды при полном отсутствии кислорода.
в стадии повышенного окисления. В условиях анаэробиоза эта система представляет собой резерв кислорода и обеспечивает рост нескольких генераций до того, как он будет использован полностью. Уайт и Маннз (1951) в результате проведенных ими экспериментов констатировали, что за счет резервов дыхательных ферментов в окисленной форме у первых дрожжей могут образоваться от 4 до 5 генераций. В таких условиях существует отношение между общим числом дрожжей и степенью обсеменения, что всегда наблюдают в практике брожения, проводимого без доступа воздуха. Известно также, что аэрация всегда рекомендовалась при приготовлении дрожжевой разводки.
Более поздние работы подтвердили большую чувствительность первых поколений дрожжей к кислороду, они также подтвердили, что размножение дрожжей, уменьшение количества азо-
ПоказателиКолба 1Колба 2Колдо открытия и впуска воздуха6а 3через несколько дней после впуска воздухаСахар, г/лисходныйостаточныйМасса образовавшихся дрожжей, мг/л17,90 3002,44092,442,44 02,440 650ПоказателиКолба 1Колба 2Колдо открытия и впуска воздуха6а 3через несколько дней после впуска воздухаСахар, г/лисходныйостаточныйМасса образовавшихся дрожжей, мг/л17,90 3002,44092,442,44 02,440 650Развитие дрожжей и брожение при последовательном обсеменении в условиях полного отсутствия воздухаРазвитие дрожжей и брожение при последовательном обсеменении в условиях полного отсутствия воздуха
Показатели
Колба 1
Колба 2
Кол
до открытия и впуска воздуха
6а 3
через несколько дней после впуска воздуха
Сахар, г/л
исходный
остаточный
Масса образовавшихся дрожжей, мг/л
17,9
0 300
2,44
0
9
2,44
2,44 0
2,44
0 650
Показатели
Колба 1
Колба 2
Кол
до открытия и впуска воздуха
6а 3
через несколько дней после впуска воздуха
Сахар, г/л
исходный
остаточный
Масса образовавшихся дрожжей, мг/л
17,9
0 300
2,44
0
9
2,44
2,44 0
2,44
0 650
Развитие дрожжей и брожение при последовательном обсеменении в условиях полного отсутствия воздуха
Развитие дрожжей и брожение при последовательном обсеменении в условиях полного отсутствия воздуха
та в сусле, скорость сбраживания сахара непосредственно связаны с количеством кислорода, поставляемого дрожжам (Рэнкин, 1955; Зинченко, 1962). На различных стадиях брожения вин количество потребляемого кислорода может достигать от 1 до 3 мг в час на 1 млрд, дрожжевых клеток (Гончарова и сотрудники, 1971). Такое потребление кислорода можно считать значительным; популяция численностью 1 млн. дрожжей на 1 см3 может полностью израсходовать за 4 ч весь объем кислорода в вине, насыщенном воздухом при атмосферном давлении.
В последнее время потребность дрожжей в кислороде при производстве вина оспаривали Фланзи и Кассиньяр, основываясь на присутствии специфических активаторов дрожжей в анаэробиозе, имеющихся в кожице виноградных ягод. Анаэробная активация дрожжей будет рассмотрена в следующей главе.
ЭФФЕКТ ПОСТОЯННОЙ АЭРАЦИИ
Для ассимиляции сахара необходим кислород. В условиях брожения в крупных емкостях кислород является фактором, лимитирующим рост дрожжей.
Эффект аэрации был первоначально исследован в пивоваренном производстве и на предприятиях, вырабатывающих прессованные дрожжи. Макси
мальный выход дрожжей требует значительных количеств кислорода: например, 1,6 г кислорода на 1 л питательной среды в час для ассимиляции 1 г сахара.
В пределах этих максимальных условий, соответствующих максимальному росту, чем выше аэрация среды, тем значительнее рост дрожжей и тем быстрее происходит разложение сахара. Если же проводить брожение в присутствии большого количества воздуха, происходит очень интенсивное размножение дрожжей. Например, для того, чтобы приготовить большое количество дрожжей, применяют большие бродильные емкости с тонким слоем питательной среды, содержащей сахар, или же непрерывно нагнетают воздух. В противоположность этому, если проводить брожение при полном отсутствии воздуха, количество дрожжей, образованное этой же питательной средой, очень незначительно. Это положение иллюстрирует опыт Ферре (1949), результаты которого приведены в табл. 7.2.
По мнению Ферре, данные табл. 7.2 объясняют влияние степени наполнения бочек при изготовлении белого вина. Для получения быстрого и полного брожения важно иметь возможно большее число дрожжей и рекомендуется оставлять в бочке надвинное простран-
Влияние обьема воздуха, находящегося в контакте с дрожжами, на брожение
Объем воздуха но отношению к объему сусла, %
Число дрожжевых клеток (в тыс.
на 1 мм8)
Продолжительность брожения, дниJ
0
32
8
10
52
7
25
76
5
50
112
4
ство, которое должно быть тем больше, чем выше сахаристость сусла, и, наоборот, для сохранения некоторого количества сахара нужно уменьшить численность дрожжей, заполняя бочки как можно полнее (под шпунт) .
Скорость брожения вначале тесно связана с условиями аэрации. Забра- живание происходит тем быстрее и протекает тем интенсивнее, чем большей аэрации были подвергнуты дрожжи. Точно так же время брожения очень сахаристого сусла зависит от количества воздуха, которым располагают дрожжи. В присутствии воздуха брожение всегда протекает полнее.
Отмечают, что в бутылях, закрытых тампоном из ваты, брожение протекает быстро, с полным сбраживанием сахара (рис. 7.3). С другой стороны, в бутылях, снабженных бродильным затвором, оно происходит медленнее, а если сахаристость сусла достаточно высока, брожение останавливается, оставляя после себя сахаристую жидкость; оно останавливается тем быстрее, чем больше сахара содержит сусло и чем выше его температура.
В конце опыта в каждой бутыли подсчитывают дрожжевые клетки после приведения их во взвешенное состояние. В качестве примера в табл. 7.3 приведены результаты эксперимента, проведенного с очень сахаристым сус-
Рис. 7.3. Бутыли для брожения, реализующие условия аэробиоза и анаэробиоза:
а — с ватным тампоном; б — с пробкой с заостренной трубкой; в—с пробкой-барботером.
лом (270 г восстанавливающих сахаров) при температуре 25° С. Число дрожжей обсеменения было незначительным.
Из табл. 7.3 видно, что при аэрации брожение бывает более быстрым и более полным. Оно обеспечивает получение более высокой спиртуозности, зато без доступа воздуха брожение останавливается задолго до того, как будет преобразован весь сахар. Если бы исходного сахара было меньше, он был бы сброжен в обоих случаях, но с заметной разницей в скорости брожения. Впрочем, если при забраживании сахара было бы еще больше, он в обоих случаях не сбраживался бы полностью, а большее количество превратилось бы в спирт в бутыли, закрытой ватой.
Такие опыты проводились много раз на полупромышленных и эксперимен-
Время определения, черезТампон из ватыТонкая трубкуБродильный затворсахарачисло дрожжейсахарачисло дрожжейсахарачисло дрожжей7 дней8614614014»27275—21 день210772527550Время определения, черезТампон из ватыТонкая трубкуБродильный затворсахарачисло дрожжейсахарачисло дрожжейсахарачисло дрожжей7 дней8614614014»27275—21 день210772527550Изменение сбраживаемых сахаров (в г/л) и числа дрожжей (в тыс./мм3) в зависимости от условий обтюрации бродильных емкостейИзменение сбраживаемых сахаров (в г/л) и числа дрожжей (в тыс./мм3) в зависимости от условий обтюрации бродильных емкостейтальных установках; частые случаи остановки процесса брожения, которые наблюдались на практике, подтвердили опасность поддержания строгого анаэробиоза в течение длительного времени.
Время определения, через
Тампон из ваты
Тонкая трубку
Бродильный затвор
сахара
число дрожжей
сахара
число дрожжей
сахара
число дрожжей
7 дней
86
146
140
14»
2
72
75
—
21 день
2
107
72
52
75
50
Время определения, через
Тампон из ваты
Тонкая трубку
Бродильный затвор
сахара
число дрожжей
сахара
число дрожжей
сахара
число дрожжей
7 дней
86
146
140
14»
2
72
75
—
21 день
2
107
72
52
75
50
Изменение сбраживаемых сахаров (в г/л) и числа дрожжей (в тыс./мм3) в зависимости от условий обтюрации бродильных емкостей
Изменение сбраживаемых сахаров (в г/л) и числа дрожжей (в тыс./мм3) в зависимости от условий обтюрации бродильных емкостей
Демонстрация действия кислорода подсчетом дрожжевых клеток
Эти опыты относятся к воздействию воздуха на уровень активности дрожжей, определяемый сравнительным подсчетом общего числа клеток и живых клеток (Лафуркад, 1954).
Рис. 7.4. Кривые роста общего количества дрожжей и живых клеток при брожении виноградного сусла с доступом и без доступа воздуха:
1 — живые клетки в анаэробиозе; 2 — живые клетки в аэробиозе; 3— общее число живых клеток в анаэробиозе; 4 — общее число живых клеток в аэробиозе.
Брожение сусла проводят в условиях полуаэробиоза, получаемого посредством тампона из уплотненной ваты, и в условиях относительного анаэробиоза. Определяют скорости брожения измерением остаточного сахара и каждый день подсчитывают дрожжевые клетки.
В аэрируемой среде брожение протекает быстро: через 10 дней после обсеменения сбраживается весь сахар.
В условиях анаэробиоза брожение идет медленнее и оставляет в среде 25 г несброженного сахара. Если вычертить кривые, представляющие количество живых клеток и общее число их в зависимости от времени, то приходится констатировать, что они не совпадают (рис. 7.4).
Таким образом, эволюцию количества живых клеток в бродящем виноградном сусле можно выразить кривой в виде колокола. За логарифмическим периодом роста следует замедление, соответствующее вмешательству фактора ограничения роста: израсходование кислорода, одного или многих факторов роста, сахара, подавление образовавшимся при брожении спиртом и др. За этим периодом следует быстрое отмирание клеток.
Понятна заинтересованность виноделов, в том, чтобы точно знать что эта фаза уменьшения количества дрожжей наступает только после преобразования всего количества сахара. Другими
словами, на практике только сахар должен быть лимитирующим фактором. Недоброд, т. е. остановка брожения до истечения положенного срока, серьезное дело, так как среда оказывается на какое-то время лишенной дрожжей, способных размножаться и завершить брожение.
ЭФФЕКТ КРАТКОВРЕМЕННОЙ АЭРАЦИИ
Аэрация, проводимая в процессе анаэробного брожения, ускоряет его и позволяет сбраживать больше сахара. В общем можно заменить стимуляцию, которую дает постоянный доступ кислорода, кратковременной, перемежающейся аэрацией. Иллюстрацией к этому положению является следующий опыт (Риберо-Гайон и сотрудники, 1951).
Аэрация в различные моменты брожения
Виноградное сусло бродит при 25° С в серии бутылей под пробками с тонкими суживающимися трубками, следовательно, при полном отсутствии воздуха. Через 2, 4 или 8 дней с начала брожения вводят за один раз приблизительно известные количества растворенного кислорода (от 0,14 до 6 см3/л). Затем измеряют количества сброженного сахара и подсчитывают дрожжевые клетки, сравнивая полученные результаты с данными контрольного образца, где брожение происходило без доступа воздуха.
Чтобы ввести достаточно определенные количества кислорода, его вводят в измеренные объемы бродящей среды, дегазированной и насыщенной кислородом (около 6 см3 на 1 л), путем длительного взбалтывания сначала под вакуумом, затем в воздухе.
Параллельное брожение в бутыли, закрытой ватой, дает скорость броже
ния и развитие дрожжей в условиях, когда воздух поступает постоянно. Наконец, в бутыль, снабженную пробкой с суживающейся тонкой трубкой, помещали то же самое сусло, которое насыщали воздухом перед обсеменением.
Наиболее показательные результаты приведены в табл. 7.4.
Таблица 7.4
Действие кислорода, вводимого в различные моменты брожения, на виноградное сусло, содержащее 228 г/л восстанавливающих сахаров
Условия брожения
5
О
После 14 дней брожения
о
5 5 г S
И
о
Брожение в присутствии воздуха, постоянная аэрация
—.
93
225
Брожение без доступа воздуха, без аэрации Аэрация
0
51
164
до брожения
6,0
62
164
на 2-й день
0,15
58
190
0,75
61
196
1,5
63
205
6,0
75
223
» 4-й »
0,75
53
184
1,5
60
202
6,0
60
202
» 8-й »
6,0
52
173
В бутыли, закупоренной пробкой с тонкой суживающейся трубкой, брожение остановилось при 26 г сахара, тогда как в бутыли, закрытой ватой, оно завершилось быстро и полностью. Показательно также число дрожжевых клеток: 93 млн. на 1 см3 при аэробном брожении, 51 млн. — при анаэробном.
Брожение без доступа воздуха в сусле, предварительно насыщенном кислородом, протекало в первые дни более активно, чем в контрольном; число дрожжевых клеток увеличилось. Таким образом, действие, оказываемое не-
большим количеством кислорода, вводимого в бродящую среду, вначале значительно, но оно не сохраняется и не способствует лучшему завершению брожения.
Положение меняется, когда кислород вводят в среду, где дрожжи находятся в состоянии активности. Аэрация через 2 дня после обсеменения, когда брожение уже началось, была очень эффективной. Даже введение незначительных количеств кислорода, порядка 0,15 см/л (т. е. около 0,2 мг), заметно влияло на скорость брожения и на число дрожжевых клеток, которое возрастает на 15%. Введение 0,75 см3 кислорода увеличивает популяцию на 20%, 1,5 см3 — на 25 и 6 см3 — на 50%. Однако в последнем случае не достигают концентрации клеток, полученной при брожении под ватным тампоном, следовательно, количество кислорода, которое проникает в среду через вату, значительно превосходит дозу, равную 6 см3/л.
Аэрация, проводимая на 2-й день из расчета 6 см3 кислорода на 1 л сусла, обеспечивает практически такое же
Рис. 7.5. Эффект от аэрации в различные моменты брожения иа популяцию живых дрожжевых клеток:
быстрое завершение брожения, как и в бутыли, закрытой ватой, но меньшая аэрация была бы недостаточной. Введение таких же количеств кислорода, проводимое через 4 дня после обсеменения, в момент когда % сахара уже сброжена, имеет явно менее выраженное действие; 0,15 см3 кислорода не оказали на этот раз никакого влияния на число дрожжевых клеток и на скорость брожения. 0,75 см3 повышают количество сброженного сахара только с 15 до 20 г. Чтобы получить ощутимый эффект, нужно ввести 1,5 см3. Наконец, аэрации, проводимые на 8-й день, когда остается еще 100 г не- сброженного сахара, практически не производят никакого действия.
На рис. 7.5 показаны кривые эволюции числа живых клеток в различных случаях аэрации (Лафуркад, 1954).
В конце брожения с доступом воздуха все дрожжи еще живы, тогда как при анаэробном брожении активность проявляет только половина популяции. Ввод воздуха на 2-й день вызывает брожение, которое по своей скорости и по числу образующихся дрожжевых клеток является типично аэробным.
Аэрация на 4-й день проводится в условиях, когда жидкость уже имеет высокую концентрацию спирта и когда 15% дрожжей уже не способны больше размножаться. Хотя через 2 дня после введения воздуха число живых клеток возрастает на 12%, этот эффект непродолжителен.
Через 8 дней после обсеменения в бутыли, содержимое которой находится в условиях полного анаэробиоза, лишь только 50% клеток все еще остаются живыми. Аэрация, проводимая в этот момент, вызывает быстрое оживление популяции. В течение трех последующих дней число клеток, способных размножаться, достигает 78% общей численности, которая остается неизменной. Следовательно, действие ки-
слорода, вводимого во время брожения, выражается в увеличении общего числа дрожжей и особенно активных клеток, способных к самовоспроизвод- ству. На основании этих данных можно сделать следующий вывод для практики: для того, чтобы брожение было полным, нужно воздействовать на среду таким образом, чтобы возможно большая часть дрожжевых клеток оставалась живыми и активными вплоть до полного израсходования сахара.
Изменение условий аэрации в различные периоды брожения
Риберо-Гайон и сотрудники (1951) описали следующий эксперимент, который представляет особый случай отношений между ростом дрожжей и кислородом. Виноградное сусло, содержащее 245 г/л восстанавливающих сахаров, подвергают брожению в двух сериях бутылей. Одни закрывают ватными тампонами, другие — пробками с проходящими через них тонкими суживающимися трубками. Через различное время после начала брожения (2 дня, 4 или 8 дней) взаимно меняют закупорку бутылей; брожение, начавшееся с доступом воздуха, продолжается при его полном отсутствии, и наоборот. В общем, таким путем реализуют до некоторой степени условия открытых емкостей на производстве, которые в различное время закрывают, и условия в закрытых чанах, люки которых открываются во время брожения. В табл. 7.5 приведены полученные результаты.
Закрытие бутылей пробкой с тонкой трубкой на 2-й день брожения, когда сброжена ‘А часть сахара, выражается в замедлении брожения и уменьшении числа клеток. Но когда закупорка производится на 4-й день, ход брожения и численность популяции дрожжей больше не изменяются.
Изменение условий аэрации в ходе брожения
Условия брожения
После 11 дней броже-
число дрожжевых клеток, млн./см*
сбраживание сахара, г/л
Аэробное брожение контроль
96
235
без доступа воздуха на 2-й день
88
229
» 4-й »
97
234 .
» 8-й »
96
234
Анаэробное брожение контроль
42
190
с доступом воздуха на 2-й день
95
236
» 4-й »
48
204
» 8-й »
40
190
В серии бутылей, снабженных тонкими отводными трубками, где контрольное брожение . не могло завершаться, открытие бутыли на 2-й день вызвало' ускорение брожения и увеличение числа клеток; импульс, который дает эта аэрация, был таков, что на 11-й день брожение находится на той же стадии, как в 'бутыли, первоначально закрытой ватой. Если открытие производят позднее, на 4-й или на 8-й день, возрастание числа клеток и ускорение брожения становятся незначительными, так как дрожжи уже не способны использовать этот кислород для своего размножения.
Таким образом, эти результаты подтверждают использование кислорода дрожжами только на первой стадии брожения и их неспособность воспользоваться аэрацией, когда брожение продвинулось очень далеко и содержание спирта в среде стало слишком большим.
ИЗМЕРЕНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНО- ВОССТАНОВИТЕЛЬНОГО ПОТЕНЦИАЛА
В предшествующих разделах говорилось об аэробиозе, полуаэробиозе, анаэробиозе, аэрированной среде, которая имеет доступ воздуха или кратковременный, или постоянный, о бутылях открытых или закрытых. Эти термины недостаточно точно определяют условия брожения, даже если и делаются ссылки на количества растворенного кислорода, так как состояние «аэрации» среды зависит не только от процентного содержания в ней свободного кислерода, но также от присутствия веществ, способных к окислению или к восстановлению.
Кроме того, кислород эффективен при уровнях концентрации, которые трудно измерить точно, потому что дрожжи используют его очень быстро. После насыщения воздухом процентное содержание кислорода резко уменьшается, однако его эффект сохраняется в течение длительного времени. Дыхательные ферменты захватывают кислород, чтобы принять свою окисленную форму; они восстанавливаются только в меру потребностей клетки.
В конечном счете, чтобы дать более полное определение среды в отношении аэрации, представляется необходимым прибегнуть к измерению окислительно-восстановительного потенциала (ОВ-потенциала), который зависит одновременно как от внесения кислорода, так и от наличия в составе среды окисляющихся веществ (примерно таким же образом, как при определении кислотности среды, нужно прибегать к pH).
Авторы проследили в лабораториях и в условиях производства в ходе большого числа брожений в течение многих лет эволюцию окислительно-восстановительного процесса, используя потенциометр, дающий прямые показания
потенциала в милливольтах. Для обеспечения точности измерений ллатино- вый электрод должен быть уравновешен со средой. Это достигается погружением электрода в среду на все время брожения. Достаточно подключить электрод к измеряющему аппарату и ввести соединительный мостик, содержащий каломельный электрод, до контакта с жидкостью, чтобы произвести измерения без каких-либо манипуляций с суслом.
Этот метод, использованный также и другими авторами, был подвергнут критике (Танкус, 1965; Дейбнер . и Мург, 1967) из-за потери чувствительности постоянно установленных платиновых электродов вследствие изменения состояния их поверхности; однако расхождения в измерениях не превосходят десятка милливольт.
Изменения окислительно- восстановительного потенциала при . брожении с доступом воздуха и без доступа
Такие изменения представлены на рис. 7.6. В течение латентной фазы брожения окислительно-восстановительный потенциал остается без изменений. Он достигает своего минимума в аэрированной среде порядка 95— 100 мВ на 4-й день после быстрого понижения. В это время дрожжи находятся в экспоненциальной фазе и половина сахара подвергается превращению. Затем ОВ-потенциал постепенно повышается вследствие непрерывного поступления воздуха.
В условиях анаэробиоза падение ОВ-потенциала происходит медленнее. С 4-го по 9-й день ОВ-потенциал изменяется от 175 до 95 мВ. В этот период популяция живых дрожжей находится уже в состоянии угнетения и около 80% сахара сброжено. После ОВ-по-
Рис. 7.6. Изменение ОВ-потенциала во время брожения виноградного сусла (pH 3,5) с доступом и без доступа воздуха:Рис. 7.6. Изменение ОВ-потенциала во время брожения виноградного сусла (pH 3,5) с доступом и без доступа воздуха:1 — без доступа воздуха; 2 — с доступом воздуха.
Рис. 7.6. Изменение ОВ-потенциала во время брожения виноградного сусла (pH 3,5) с доступом и без доступа воздуха:
Рис. 7.6. Изменение ОВ-потенциала во время брожения виноградного сусла (pH 3,5) с доступом и без доступа воздуха:
тенциал снова несколько повышается, но на этот раз без доступа воздуха.
В обоих случаях минимальные значения ОВ-потенциала примерно одинаковы.
Изменения окислительно- восстановительного потенциала при кратковременной аэрации во время брожения
Эти изменения иллюстрируются кривыми на рис. 7.7. На 2-й день брожения анаэробная среда имеет потенциал 260 мВ. Аэрация, проводимая в этот момент, вызывает быстрое повышение потенциала до 400 мВ. Затем потенциал понижается, быстро в первые часы, потом более медленно и через 24 ч уменьшается до минимального значения от 100 до НО мВ.
Более поздняя аэрация вызывает совершенно аналогичные изменения потенциала: быстрый подъем от 175 до приблизительно 350 мВ, сопровождаемый на следующий день понижением до 100—ПО мВ. Во всех трех случаях минимум потенциала идентичен. То же
самое отмечается и после аэрации, проводимой тогда, когда уже трансформирован весь сахар.
Похоже, что потенциал изменяется в соответствии с развитием дрожжей. Но если в присутствии воздуха предельное значение потенциала достигается в тот момент, когда популяция является максимальной, то в условиях анаэробиоза она достигается позднее, в момент, когда число живых клеток уже намного уменьшилось, следовательно, потенци-
400
Аэрация на 8-й деньАэрация на 8-й день32000дрожжевых клеток32000дрожжевых клетокАэрация на 4-й деньАэрация на 4-й день33000 дрожжевых клеток33000 дрожжевых клеток14 ч14 чАэрация 35000 дрожжевых клетокАэрация 35000 дрожжевых клеток7ч7чАэрация на 2-й деньАэрация на 2-й день10000дрожжебых клеток10000дрожжебых клеток66000 дрожже вых клеток66000 дрожже вых клетокАэрацияАэрация11ч Аэрация 43000дрожжд- бых клеток11ч Аэрация 43000дрожжд- бых клетокзоо-зоо-II111001-1001-200 •.200 •.6 12 18 246 12 18 24 б 12 18 2t
Аэрация на 8-й день
Аэрация на 8-й день
32000дрожжевых клеток
32000дрожжевых клеток
Аэрация на 4-й день
Аэрация на 4-й день
33000 дрожжевых клеток
33000 дрожжевых клеток
14 ч
14 ч
Аэрация 35000 дрожжевых клеток
Аэрация 35000 дрожжевых клеток
7ч
7ч
Аэрация на 2-й день
Аэрация на 2-й день
10000дрожжебых клеток
10000дрожжебых клеток
66000 дрожже вых клеток
66000 дрожже вых клеток
Аэрация
Аэрация
11ч Аэрация 43000дрожжд- бых клеток
11ч Аэрация 43000дрожжд- бых клеток
зоо-
зоо-
I
I
1
1
1001-
1001-
200 •.
200 •.
бремя, ч
Рис. 7.7. Изменение потенциала в виноградном сусле после проведения аэрации.
ал может убывать без того, чтобы на это указывало размножение дрожжей. По Хьюиту (1950) ОВ-потенциал — это «состояние динамического равновесия культуры между активностью ферментов клетки и компонентами среды».
Данные, полученные авторами, показывают, что ОВ-потенциал связан не только с размножением дрожжей и скоростью брожения, но и с другими факторами.
ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ
Обычно микроорганизмы делят на три категории в зависимости от их поведения в условиях различной темпера-
туры, что отражает приспособляемость или устойчивость их ферментативного аппарата к этому фактору. Микроорганизмы называют психрофильными, мезофильными или термофильными, оптимальное развитие которых происходит при температурах ниже 20° С, между 20 и 45 и выше 45° С соответственно. Дрожжи относятся к двум первым категориям.
Температура является важным фактором жизнедеятельности всех дрожжей; для каждой из различных функций дрожжевых клеток: дыхания, брожения, роста ■— существуют оптимальные, минимальные и максимальные температурные условия. В действительности эти пределы зависят от вида дрожжей и даже от расы, а также от аэрации, состава среды, особенно присутствия спирта и определяют таким образом более или менее широкую зону, в которой возможно размножение дрожжей и сбраживание сахара.
Действие температуры на дрожжи стало объектом многих работ, и на этот счет можно найти точные данные (Уль, 1960, 1967; Роз, 1962; Стокс, 1971). Вопрос о значении температур в виноделии разработала Димотаки-Кмраку (1966).
Уг (1964, 1966) провел эксперимент по изучению влияния температур от 10 до 33° С на скорость брожения виноградного сусла в корреляции с другими факторами: pH, сахаристость, спирту- озность, содержание гидрата окиси аммония; замедляющее действие низкого pH и присутствия спирта усиливается высокой температурой. Мартини (1964) исследовал дрожжи Sacch. pastorianus и в первую очередь продолжительность брожения.
Влияние температуры на метаболизм дрожжей
Интенсивность дыхания (Qc,) и брожения (Q^.) винных дрожжей при
различных температурах, например от 15 до 45° С, можно измерить с помощью аппарата Варбурга (см. рис. 5.7). Необходимо напомнить, что этот аппарат, который действует как микроманометр, регистрирует выделение углекислого газа (брожение) или поглощение кислорода (дыхание) дрожжами данной массы в течение короткого времени. Та-
Таблица 7.6
Средние значения интенсивности дыхания и брожения различных видов Saccharomyces в зависимости от температуры, мм3 газа на 1 г сухих дрожжей в час
Температура, °C *
Интенсивность дыхания Qq
Интенсивность бро« ^С02 жения Qcq2
15
4,2
118
20
6,7
168
25
9,6
229
30
: 1,4
321
35
6,2
440
40
3,0
376
Таблица 7.7
Скорость брожения для различных дрожжей в зависимости от температуры (по Кантарелли, 1966), г СО, за 24 ч
Темпера тура брожения, °C
Saccharomyces ellipsoi- dei.s
Saccharomyces ovi-
Saccharo- myces pastorianus
Saccharo- m yces rose!
15
5,3
4,8
5,0
4,0
20
7,5
4,4
5,4
4,3
25
9,6
8,7
8,9
30
9,8
8,8
13,1
6,0
35
Н.8
10,8
10,8
3,1
39
10,7
15,2
3,3
5,2
кпм путем измеряют мгновенную скорость этих явлении (табл. 7.6). Можно также проследить выделение газа путем взвешивания через более длительный период (табл. 7.7).
Интенсивность дыхания дрожжей возрастает с повышением температуры
Температура, °CСброженный сахар,Спир1уодность образовавшегося спирта, % об.Глицерин, ммоль/лУксусная кислота, ммоль/лЯнтарная Кислота, ммоль/лАцетоин, ммоль/л2, 3-бутиленгликоль, мм >ль/лЭтаналь, ммоль/л1522012,66211,86,51,15,30,62019111,56915,36,11,15,70,72.519811,96815,55,4-1,56,41,13017510,57314,15,21,36,41,2351397,87814,35,32,27,41,2Температура, °CСброженный сахар,Спир1уодность образовавшегося спирта, % об.Глицерин, ммоль/лУксусная кислота, ммоль/лЯнтарная Кислота, ммоль/лАцетоин, ммоль/л2, 3-бутиленгликоль, мм >ль/лЭтаналь, ммоль/л1522012,66211,86,51,15,30,62019111,56915,36,11,15,70,72.519811,96815,55,4-1,56,41,13017510,57314,15,21,36,41,2351397,87814,35,32,27,41,2Влияние температуры на образование вторичных продуктовВлияние температуры на образование вторичных продуктов
Температура, °C
Сброженный сахар,
Спир1уодность образовавшегося спирта, % об.
Глицерин, ммоль/л
Уксусная кислота, ммоль/л
Янтарная Кислота, ммоль/л
Ацетоин, ммоль/л
2, 3-бутиленгликоль, мм >ль/л
Этаналь, ммоль/л
15
220
12,6
62
11,8
6,5
1,1
5,3
0,6
20
191
11,5
69
15,3
6,1
1,1
5,7
0,7
2.5
198
11,9
68
15,5
5,4
-1,5
6,4
1,1
30
175
10,5
73
14,1
5,2
1,3
6,4
1,2
35
139
7,8
78
14,3
5,3
2,2
7,4
1,2
Температура, °C
Сброженный сахар,
Спир1уодность образовавшегося спирта, % об.
Глицерин, ммоль/л
Уксусная кислота, ммоль/л
Янтарная Кислота, ммоль/л
Ацетоин, ммоль/л
2, 3-бутиленгликоль, мм >ль/л
Этаналь, ммоль/л
15
220
12,6
62
11,8
6,5
1,1
5,3
0,6
20
191
11,5
69
15,3
6,1
1,1
5,7
0,7
2.5
198
11,9
68
15,5
5,4
-1,5
6,4
1,1
30
175
10,5
73
14,1
5,2
1,3
6,4
1,2
35
139
7,8
78
14,3
5,3
2,2
7,4
1,2
Влияние температуры на образование вторичных продуктов
Влияние температуры на образование вторичных продуктов
До 30° С, через каждые 10° С значения примерно удваиваются; при температурах выше 30° С дыхание уменьшается. Что касается интенсивности брожения, то ее оптимуму соответствует температура около 35° С, т. е. немного более высокая, чем для оптимума дыхания; до этой температуры уровень интенсивности брожения также удваивается через каждые 10° С; при 40° С он понижается на 15%.
Нетрудно . заметить значительное влияние температуры на метаболизм дрожжей, которое можно выразить следующим примерным правилом: «сбраживание сахара при 30°С происходит в 2 раза быстрее, чем при 20° С», или «на каждый дополнительный градус температуры дрожжи преобразуют за то же время на 10% больше сахара».
Оптимальная температура сбраживания сахара изменяется в зависимости от вида дрожжей, как было показано в гл. 5. В табл. 7.7 она колеблется от 30 до 39° С.
Температура действует не только на кинетику и на предел брожения, но и на образование получающихся при брожении продуктов (Лафон, 1955). ■При брожении с повышенной температурой выход спирта обычно ниже, с другой стороны, вторичных продуктов глицеропировиноградного брожения Нейберга образуется больше (глице-
рин, ацетоин, 2, 3-бутиленгликоль, уксусная кислота). Исключением является янтарная кислота (табл. 7.8). Пировиноградная и а-кетоглутаровая кислоты накапливаются больше при высокой температуре (Лафон-Лафуркад и Пейно, 1966). Высшие спирты являются, безусловно, продуктами, которые в наибольшей степени изменяются в зависимости от температуры. Максимальное образование их происходит при 20° С. Оно уменьшается по мере повышения температуры. При 35° С это образование составляет не более ’Д того, какое наблюдается при 20° С (Пейно и Гимберто, 1962). Это, видимо, является одной из причин того, почему вина, полученные при высокой температуре, имеют менее выраженный аромат.
Влияние температуры на скорость и предел брожения виноградного сусла
Как правило, чем выше температура (в пределах между 15 и 35°С), тем короче латентная фаза, тем быстрее начинается забраживание. Например, чтобы полностью выбродить виноградное сусло, имеющее 200 г/л сахара, при 10° С, потребуются многие недели, при 20° С—'15 дней, при 30° С — от 3 до 4 дней. Но с другой стороны, чем выше температура, тем более ограничено брожение и тем больше остается не-
Скорость забраживания и предел брожения в зависимости от температуры
Температура, °C
Забра живаиие через
Полученная спиртуозность, % сб.
10
8 дней
16,2
15
6 »
15,8
20.
4 дня
15,2
25
3 »
14,5
30
36 ч
10,2
35
24 ч
6,0
сброженного сахара. В табл. 7.9 приведены результаты наблюдений, сделанных с этой целью на очень сахаристом сусле сорта Сотерн.
Все происходит, как если бы дрожжи уставали, истощались, тем быстрее, чем выше их активность при повышенных температурах. Даже между 30 и 35° С температура является ограничивающим фактором брожения. Число дрожжевых клеток в конце брожения тем больше, чем ниже температура. При высокой температуре размножение происходит быстрее, но прекращается раньше обычного срока.
Этот закон много лет тому назад сформулировал Мюллер-Тургау; позднее его подтвердили многие экспериментаторы, в том■ числе Кастелли (1941). В табл. 7.10 приведены результаты фундаментального эксперимента, проведенного Мюллер-Тургау. Сбраживали одно и то же сусло, но с различным содержанием сахаров (127, 217 и 303 г) и при разных температурах; опыт показал одновременно и задержку, вызванную повышенной сахаристостью, и влияние температуры.
Лимитирующее действие температуры иногда проявляется даже при спир- туозности, меньшей 10 или 11% об., при относительно невысоких уровнях, например, ниже 27° С и, во всяком слу
Спиртуозность в % об. в зависимости от температуры брожения (по Мюллер-Тургау)
Температура брожения. °C
Сахаристость сусла, г/л
127
217
33 3
9
7,0
И,8
9,9
18
6,9 ‘
11,0
9,1
27'
6,9
9,4
7,7
36
4,2
4,8
5,1
Спиртуозность теоретическая
7,2
12,4
17,3
чае, значительно ниже 36° С, т. е. температура, которую часто считают критическим пределом. Эти результаты имеют большое значение, так как они показывают, как трудно установить точный предел температуры брожения. На рис. 7.8 воспроизведена кривая пределов брожения для различных видов дрожжей в зависимости от температуры. Большинство видов Saccharo- myces имеют оптимум около 20° С. Неспорогенные дрожжи, в частности Brettanomyccs, лучше сбраживают сахар при температуре около 23° С.
Графики на рис. 7.9 и 7.10 показывают эволюцию брожения для двух видов Saccharomyces, обладающих различной чувствительностью к температурным условиям. Чем ниже температура сусла, тем больше кривая брожения приобретает вид прямой; при 4° С эволюция становится почти линейной, и, наоборот, чем выше температура, тем больше исходный угол, тем больше и быстрее кривая стремится к асимптоте. При низкой температуре фактически она одна является ограничивающим фактором; тормозящее действие спирта и исчерпывание питательных веществ играют меньшую роль. С другой стороны, чем выше темпера-
тура, тем больше спирт по мере своего образования подавляет рост дрожжей.
Другое важное замечание относительно влияния температуры на рост
Рис. 7.8. Пределы брожения, измеренные по выделившемуся СО2 для различных родов дрожжей в зависимости от температуры:
1—Kloeckera; 2— Torulopsis; 3— Brettano- myces; 4— Saccharomycodes; 5— Saccharomy- ces.
дрожжей: аэрация, которую можно практиковать и рекомендовать в начале брожения, производит неодинаковый эффект в зависимости от температуры среды. Наибольшее ускорение получается при 25° С. При более высоких температурах дрожжи не используют весь растворенный кислород. С другой стороны, аэрация на холоде малоэффективна; например, аэрация посредством переливки при 20°С менее выгодна, чем при 25° С.
Рис. 7.9. Ход брожения виноградного сусла с измерением количества выделившегося СО2 с Sacch. baillii при температурах (оптимальная 25° С) (в °C):
7—4; 2 — 13; 3 — 20; 4 — 25; 5 — 30; 6 — 35.
Рис. 7.10. Ход брожения виноградного сусла с измерением количества выделившегося СО* С Sacch. uvarum при температурах (оптимальная 13°С) (в °C):
7—4; 2 — 20; 3 — 25; 4—13; 5 — 30; 6 — 35.
Изменение температуры во время брожения
На рис. 7.11 показано, как протекало брожение. Ниже приведены некоторые выводы из наблюдений, однако без намерения дать их полное обобщение.
Нагревание может привести к .противоположному эффекту в зависимости от степени и интенсивности аэрации. Возможно, что оптимум темпе-
Сброженный сахар, г/лСброженный сахар, е/лСброженный сахар, г/лСброженный сахар, е/л
Сброженный сахар, г/лСброженный сахар, е/л
Сброженный сахар, г/лСброженный сахар, е/л
ратуры для дрожжей в аэробиозе и в анаэробиозе различен.
Охлаждение, например, от 30 до 25° С ускоряет брожение с доступом воздуха и задерживает его при отсутствии воздуха. Понижение температуры к концу брожения в момент, когда дрожжи больше не могут размножаться, может иметь в конечном счете эффект, противоположный тому, которого добиваются.
В условиях без доступа воздуха, чем выше исходная температура, вплоть до 25° С, тем быстрее и полнее происходит брожение, когда в дальнейшем ее понижают до 20. Этот факт наблюдал уже Мюллер-Тургау (1884), Следовательно, повышенная температура вначале способствует брожению.
В присутствии воздуха в бутыли, закрытой ватой, наблюдается как раз обратное явление, и скорость брожения при данной температуре была настолько больше, насколько ниже была температура при забраживании.
На это обратил внимание Саллер (1953).
Температура, при которой дрожжи начинают развиваться, является определяющей для всего последующего процесса брожения. Наилучшее брожение достигается при температуре, которая остается неизменной от начала до конца, следовательно, выгодно применять систему брожения с постоянной температурой.
Может показаться парадоксальным, что дрожжи лучше выдерживают температуру 35° С от начала до конца, чем постепенное повышение ее от 25 до 35° С. Чтобы реализовать хорошее брожение при повышенной температуре, в целом было бы лучше начинать и проводить его при этой температуре. Так, наблюдали спонтанное брожение подогретого винограда при температурах, намного более высоких, чем те, кото-
рые выдерживаются в обычных условиях.
Можно полагать, что ферментативная активность дрожжей зависит от температуры и имеет место адаптация к начальной температуре брожения. Чувствительность к отклонениям температуры при брожении может быть специфическим свойством, приобретенным первыми поколениями дрожжей.
ПОТРЕБНОСТИ ДРОЖЖЕЙ В МИНЕРАЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВАХ
Факторы развития дрожжей, которые рассматривались в предыдущих разделах, относились к физико-химическим условиям. Остается исследовать факторы, также очень важные, относящиеся к составу среды. Действительно, для проведения брожения нужно, чтобы в жидкости, в которой развиваются дрожжи, помимо сбраживаемых сахаров. находились минеральные и азотистые вещества, усваиваемые в достаточных количествах. Прежде всего, это пластические элементы, необходимые для построения клеток дрожжей. В главе 8 будет показано, что дрожжи должны также находить в питательных средах некоторые специфические вещества— витамины, которые играют роль факторов роста. В целом дрожжам, как и всякому живому существу, нужны, с одной стороны, элементы питания, с другой — витамины, обеспечивающие их усвоение.
Пастер культивировал дрожжи в следующей среде: вода— 1000 мл; сахар— 100 г; виннокислый аммоний — 1 г; зола от сжигания 10 г дрожжей. Дрожжевая зола вносит с собой все минеральные элементы, необходимые дрожжам. Сухие дрожжи содержат от 5 до 10% минеральных веществ, которые составляют (в % к общей массе золы):
КгОот23до.48
Na2O»0,06»2,2
СаО»1,0»4,5
MgO»3,7»8,6
Fe2O3»0,06»7,3
Р2О5»45»69
SO3»0,4»6,3
SiO2»0»1,8
Cl»0,03»1,0
Другие элементы, которые не фигурируют в этом перечне, присутствуют в виде следов: А1, Вг, Сг, Си, РЬ, Мп, Ag, Sr, Tl, Sn, Zn и др. Их называют микроэлементами. Может быть они не все необходимы, но многие из них даже в очень слабых дозах являются существенными компонентами ферментативных систем.
В настоящее время известна точная функция некоторых из этих минеральных веществ. Фосфор находится в клетках в виде органических или неорганических соединений; он тесно связан с механизмом спиртового брожения. Сера нужна для синтеза цистеина, метионина, глутатиона. Железо входит в состав пигментов фермента дыхания; магний активирует многие ферменты. Кремний является обязательным компонентом клеточной мембраны. Марганец, цинк, медь в малых дозах (несколько десятых миллиграмма на 1 л) стимулируют рост и брожение. Ломан- дер (1965) исследовал влияние кальция и цинка на рост Sacch. pastorianus. Можно считать, что виноградное сусло содержит и качественно, и количественно достаточно минеральных веществ, чтобы обеспечить хорошее развитие дрожжей. Однако при экспериментах брожение виноградного сусла почти всегда активируется обогащением фосфатами, калием, магнием.
ПИТАНИЕ ДРОЖЖЕЙ АЗОТИСТЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ
Как: все живые организмы, дрожжи нуждаются в усвояемом азоте для-об
разования клеток и для размножения. Фактически сухие дрожжи содержат азота от 4 до 10% своей массы, т. е. от 25 до 60% азотистых веществ, следовательно, рост дрожжей можно рассматривать как явление протеосинтеза; размножение и активность дрожжей регулируются степенью использования ими азота. Отмечают, что в начале брожения дрожжи быстро поглощают и фиксируют большую часть азота виноградного сусла. Тарантела (1955) показал, что может быть усвоено от 50 до 70% азота. Винные дрожжи способны использовать азот из различных источников: катионы аммония, аминокислоты, амиды, полипептиды. В противоположность этому азотные основания: аденин, гуанин, тимин, урацил, ксантин, добавляемые в пористую питательную среду, не активируют сбраживание сахара. Некоторые формы азота используются очень быстро, в частности аммиачный азот или катион аммония. Со времен Пастера известно, что в соответствующей синтетической среде аммонийная форма азота может полностью обеспечить потребности Saccharomyces. Некоторые виды, содержащие протеазу, атакуют поли- пептпдные или белковые молекулы, но, с другой стороны, плохо используют неорганический азот; это относится к дрожжам аппикулятус.
В течение последних двадцати лет было опубликовано много работ относительно питания дрожжей азотистыми веществами. Авторы этого трактата и их сотрудники: Риберо-Гайон и Пейно, 1959, 1966; Риберо-Гайон и сотрудники, 1959; Лафон-Лафуркад и Пейно, 1961, 1963; Пейно и Лафон-Лафуркад, 1962; Лафон-Лафуркад, 1962 — со своей стороны продолжали детальное ИС; следование влияния азотистых веществ на рост и образование продуктов метаболизма. Они определили возможности усвоения различных аминокислот, их
питательное значение. Кроме того, Они указали на важную роль, которую играют в составе вин явления выделения аминокислот дрожжами, и выяснили отношение между природой азотистых питательных веществ и образованием вторичных продуктов брожения, а именно высших спиртов. Дюпюи и сотрудники (1967) опубликовали работу об азотном метаболизме дрожжей в виноделии.
ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНОГО СОДЕРЖАНИЯ АЗОТА НА ОБМЕН ВЕЩЕСТВ У ДРОЖЖЕЙ
При прочих равных условиях активность дрожжей зависит от их насыщенности азотом. Уместно привести такой пример. Одну из рас Sacch. ellipsoideus культивируют в средах, содержащих большее или меньшее количество азотистых веществ, чтобы таким образом получить дрожжи, более или менее обогащенные азотом. Интенсивности дыхания и брожения этих дрожжей измеряют аппаратом Варбурга. Результаты приведены в табл. 7.11.
Т а б л и ц а 7.11
Содержание азота и метаболизм
Азот в дрожжах, мг на 100 мг сухих : дрожжей
Qq , мм” на 1 г сухих дрожжей
„СО,
УсОг «и* яа 1 г сухих дрожжей
4,1
33
189
5,1
33
193
5,8
37
205
7,5
22
258
8,5
18
298
8,9
15
301
Из табл. 7.11 видно, что чем богаче дрожжи азотом, тем выше интенсивность брожения и тем слабее интенсивность дыхания. Когда содержание азота в дрожжах удваивается, дыхание уменьшается наполовину, фермента-
тивная же способность возрастает на 50%. Отсюда понятна заинтересованность в том, чтобы иметь в своем распоряжении среду, хорошо обеспеченную "азотистыми веществами для получения быстрого брожения.
Эффект обогащения сусла аммиачным азотом
Обычно аммиачное сусло содержит достаточное количество аммиачного азота. И все же в некоторые годы хорошей зрелости винограда можно наблюдать недостаточность аммиачного азота в винограде; то же самое происходит с суслом из винограда, пораженного гнилью, когда Botrytis cinerea поглощает эту форму азота. Недостаток этого элемента может затруднить брожение сусла. Для того чтобы иметь лучшее брожение, правила предусматривают возможность добавления в виноград аммиачной соли перед дроблением. В качестве стимулятора размножения дрожжей в виноделии также разрешается применять фосфат аммония, в котором фосфорная кислота играет второстепенную роль и практически активирование брожения является результатом действия только введенного в сусло аммиачного азота.
Из рис. 7.12. видно, что 200 мг/л фосфорного аниона несколько облегчают забраживание, но после 12 дней популяция дрожжей и концентрация остаточного сахара совершенно идентичны с этими же показателями в контрольном сусле.
50 мг/л аммиачного азота в виде хлорида, сульфата или фосфата вызывают довольно заметное ускорение брожения и при дозе 100 мг/л масса сахара, сбраживаемого в течение 24 ч, удваивается. Общее число дрожжевых клеток за это же время возрастает на 25%. При дозе аммиачного азота, равной 200 мг/л, результаты такие же.
Рис. 7.12. Влияние добавления аниона фосфора и катиона аммония в сусло (в мг/л):Рис. 7.12. Влияние добавления аниона фосфора и катиона аммония в сусло (в мг/л):а — на ход брожения; б — на рост дрожжей; 1— контроль; 2— 200 РО4; 3 — 20 NH4; 4 — 50NH4; 5— 100NH4; 5 — 200 NH4.а — на ход брожения; б — на рост дрожжей; 1— контроль; 2— 200 РО4; 3 — 20 NH4; 4 — 50NH4; 5— 100NH4; 5 — 200 NH4.При равных дозах аммиачного азота активация, вызываемая фосфатом аммония, имеет интенсивность того же порядка, как и вызываемая другой солью.
Рис. 7.12. Влияние добавления аниона фосфора и катиона аммония в сусло (в мг/л):
Рис. 7.12. Влияние добавления аниона фосфора и катиона аммония в сусло (в мг/л):
а — на ход брожения; б — на рост дрожжей; 1— контроль; 2— 200 РО4; 3 — 20 NH4; 4 — 50NH4; 5— 100NH4; 5 — 200 NH4.
а — на ход брожения; б — на рост дрожжей; 1— контроль; 2— 200 РО4; 3 — 20 NH4; 4 — 50NH4; 5— 100NH4; 5 — 200 NH4.
Если исследовать поведение дрожжей в случае брожения, когда они развиваются после введения аммиачного азота, сравнивая число живых клеток и общую популяцию с контролем, то приходится констатировать, что действие аммиака, введенного в сусло, продолжается до конца брожения. Число живых клеток несколько повышается по сравнению с контролем, и задержка во времени, в течение которого они продолжают размножаться, растягивается до двух дней, что позволяет им сбраживать больше сахара.
Фиксированию аммиачного азота дрожжами явно способствует наличие
кислорода. Данные количественного анализа аммиачного азота, проводившегося до и после брожения, показывают, что дрожжи могли использовать 200 мг/л азота, когда они развивались 'без воздуха, и до 300 мг/л — в присутствии воздуха.
Поскольку размножение клеток особенно интенсивно протекает в первые часы брожения, то ясно, что аммиачные соли следует добавлять в точно рассчитанный момент. В серию бутылей с виноградным суслом, обсемененным одной и той же расой дрожжей, добавляли азот из расчета 100 мг/л в виде солей аммиака в различные моменты брожения. По окончании брожения определяли количество аммиачного азота, оставшегося в вине, т. е. того, который не был использован. Полученные данные приведены ниже.
Момент добавленияДо брожения Через 2 дня Через 4 дня Через 8 дней
Количество остаточного аммиачного 1344766
азота в конце брожения, мг/л
Следовательно, дрожжи лучше усваивают аммиачный азот, когда его вводят в сусло до начала брожения. Через
2 дня они усваивают только 2/з, через 4 дня лишь половину и через 8 дней всего Уз добавленного азота. Поэтому
аммиачный азот следует вносить до начала брожения. В отдельных случаях, когда к концу брожения дрожжи становятся недеятельными, рекомендуется добавлять соли аммиака, чтобы их активировать. В этих условиях они используют этот азот не полностью.
Необходимо также отметить, что добавление аммиачных солей в сусло производит подкисляющее действие, так как дрожжи фиксируют катион и высвобождают анион. Так, прибавление 10 г азота на 100 л повышает общую кислотность на 0,35 г/л (в переводе на серную кислоту).
Фланзи и сотрудники (1964), Флан- зи и Пу (1965) подтвердили, что дрожжи способны фиксировать большие количества катиона аммония, добавляемые к суслу. Дрожжи образуют аминокислоты, и поэтому можно обогащать вина аминокислотами в довольно значительном количестве и увеличить в 3 или 4 раза содержание общего азота. По мнению этих авторов, к аминокислотам, содержание которых увеличивается в наибольшей степени, относятся гистидин, лизин, ароматические аминокислоты, аспарагиновая кислота, аланин. Содержание глутаминовых кислот, по-видимому, увеличивается в вине меньше по сравнению с другими, однако Риберо-Гайон и' Пейно (1966) наблюдали обратное.
Ассимиляция аминокислот
Рост дрожжей Saccharomyces стимулируется присутствием в среде некоторых аминокислот. Хотя эти дрожжи способны синтезировать из аммиачного ■ азота все необходимые аминокислоты, их размножение явно улучшается, когда добавляют каждую аминокислоту отдельно, и еще в большей степени, когда .вводят смесь аминокислот. Йог пользуемые в качестве единственного источникам азота/, они ■ обЫннр,: имеют
меньшую питательную ценность по сравнению с аммиачным азотом, за исключением лишь аспарагиновой и глутаминовой кислот и их амидов.
Допускают, что аминокислоты усваиваются дрожжами на основе трех различных механизмов:
Реакция Эрлиха, которая в результате дезаминирования и декарбоксилирования является источником образования высших спиртов, тирозола, триптофана, янтарной кислоты и др.
Реакция окисления-восстановления Стрикленда; она объясняет почему смесь аминокислот более эффективна как элемент питания, чем тот или иной из ее компонентов, взятый в отдельности. Существуют аминокислоты-доноры (1) и аминокислоты-акцепторы (2) водорода:
R' —(CHNH2 - СООН + 2Н2О -> R' - СООН +
+ NH3 + С . 2 + 4Н. (1)
R" _ CHNH2 - COOK +2Н->
->R"-CH2-COOH + NH3, (2) или для общей реакции
R' - CHNH2 - СООН 4- R" - CHNH2 -
— СООН 4- 2Н2О х R' - СООН 4- R" - СН2 -- СООН 4- СО2 4- 2NH3 4- 2Н.
Согласно этим реакциям аминокислоты являются питательными веществами за счет аммиака, который они высвобождают.
Торн указал на существование прямого усвоения аминокислот среды. Дезаминирование путем других механизмов может быть необходимо, когда смесь присутствующих аминокислот не в точности соответствует дрожжам.
Ассимиляция аминокислот и их био,- синтез—• два процесса азотного питания — стали предметом многочисленных работ последнего времени, и в настоящее время известно много ферментативных реакций, протекающих при <этих явлениях. Они;/заинтересовали
АминокислотыАссимиляция, %Выход дрожжей, r/лСостав дрожжей, %Аминокислоты, выделенные дрожжамииндивидуальнаяв смесиживымимертвыми1234567ЛейцинLeu. 1Arg. nT 70Leu. 1Glu. )GluGluИзолейцннiLeu.T_CtT /иMet.Lys. > Свыше 10ProProМетионинiLeu. д0 100Ser. 1Vai. 1MetLysЦистеинС vs 1итУ0> ТТЛ 100Cys.Glu. 10т 1,0Thr.ArgSerГлутаминоваяGlu. (д•Met.Vai. до 2,0Ser.CysAspкислотаТриптофанTry.His-egTry.iLeu. 1.0т 5GlyLeuГликоколGly.VaL KotoPro.' /Leu. [до 10SerVaiАспарагинAsp. QT gQAsp. д0 70Tyr.Asp. JVaiiLeuФенилаланинPhe.Thr.iLeu. От 0,5Gly. IThrAlaВалннVai. доTyr.Phe. (до 1,0Pro. 1HisPheТреонинThr.Phe.Asp.Ala.ThrТирозинTyr.Ser.Gly.Arg.GlyАргининArg.Lus.His.Phe.TyrСеринSer. (От 16Cl у (Менее 50Thr. о 5CysПролинPro. до 50Glu.Arg. ।’Met. [MeHee 0HisГистндннHis.Leu. 'nCvs.His.ArgЛизинLus.0Pro.ULys.0Cys.MetTry.TryАминокислотыАссимиляция, %Выход дрожжей, r/лСостав дрожжей, %Аминокислоты, выделенные дрожжамииндивидуальнаяв смесиживымимертвыми1234567ЛейцинLeu. 1Arg. nT 70Leu. 1Glu. )GluGluИзолейцннiLeu.T_CtT /иMet.Lys. > Свыше 10ProProМетионинiLeu. д0 100Ser. 1Vai. 1MetLysЦистеинС vs 1итУ0> ТТЛ 100Cys.Glu. 10т 1,0Thr.ArgSerГлутаминоваяGlu. (д•Met.Vai. до 2,0Ser.CysAspкислотаТриптофанTry.His-egTry.iLeu. 1.0т 5GlyLeuГликоколGly.VaL KotoPro.' /Leu. [до 10SerVaiАспарагинAsp. QT gQAsp. д0 70Tyr.Asp. JVaiiLeuФенилаланинPhe.Thr.iLeu. От 0,5Gly. IThrAlaВалннVai. доTyr.Phe. (до 1,0Pro. 1HisPheТреонинThr.Phe.Asp.Ala.ThrТирозинTyr.Ser.Gly.Arg.GlyАргининArg.Lus.His.Phe.TyrСеринSer. (От 16Cl у (Менее 50Thr. о 5CysПролинPro. до 50Glu.Arg. ।’Met. [MeHee 0HisГистндннHis.Leu. 'nCvs.His.ArgЛизинLus.0Pro.ULys.0Cys.MetTry.TryКлассификация аминокислот в зависимости от их усвояемости (2,3), питательной ценности (4), процентного содержания в дрожжах (5), роли в явлениях выделения (6) и эксорбции (7)Классификация аминокислот в зависимости от их усвояемости (2,3), питательной ценности (4), процентного содержания в дрожжах (5), роли в явлениях выделения (6) и эксорбции (7)
Аминокислоты
Ассимиляция, %
Выход дрожжей, r/л
Состав дрожжей, %
Аминокислоты, выделенные дрожжами
индивидуальная
в смеси
живыми
мертвыми
1
2
3
4
5
6
7
Лейцин
Leu. 1
Arg. nT 70
Leu. 1
Glu. )
Glu
Glu
Изолейцнн
iLeu.
T_CtT /и
Met.
Lys. > Свыше 10
Pro
Pro
Метионин
iLeu. д0 100
Ser. 1
Vai. 1
Met
Lys
Цистеин
С vs 1итУ0
> ТТЛ 100
Cys.
Glu. 10т 1,0
Thr.
Arg
Ser
Глутаминовая
Glu. (д•
Met.
Vai. до 2,0
Ser.
Cys
Asp
кислота
Триптофан
Try.
His-eg
Try.
iLeu. 1.0т 5
Gly
Leu
Гликокол
Gly.
VaL Koto
Pro.' /
Leu. [до 10
Ser
Vai
Аспарагин
Asp. QT gQ
Asp. д0 70
Tyr.
Asp. J
Vai
iLeu
Фенилаланин
Phe.
Thr.
iLeu. От 0,5
Gly. I
Thr
Ala
Валнн
Vai. до
Tyr.
Phe. (до 1,0
Pro. 1
His
Phe
Треонин
Thr.
Phe.
Asp.
Ala.
Thr
Тирозин
Tyr.
Ser.
Gly.
Arg.
Gly
Аргинин
Arg.
Lus.
His.
Phe.
Tyr
Серин
Ser. (От 16
Cl у (Менее 50
Thr. о 5
Cys
Пролин
Pro. до 50
Glu.
Arg. ।’
Met. [MeHee 0
His
Гистнднн
His.
Leu. 'n
Cvs.
His.
Arg
Лизин
Lus.0
Pro.U
Lys.0
Cys.
Met
Try.
Try
Аминокислоты
Ассимиляция, %
Выход дрожжей, r/л
Состав дрожжей, %
Аминокислоты, выделенные дрожжами
индивидуальная
в смеси
живыми
мертвыми
1
2
3
4
5
6
7
Лейцин
Leu. 1
Arg. nT 70
Leu. 1
Glu. )
Glu
Glu
Изолейцнн
iLeu.
T_CtT /и
Met.
Lys. > Свыше 10
Pro
Pro
Метионин
iLeu. д0 100
Ser. 1
Vai. 1
Met
Lys
Цистеин
С vs 1итУ0
> ТТЛ 100
Cys.
Glu. 10т 1,0
Thr.
Arg
Ser
Глутаминовая
Glu. (д•
Met.
Vai. до 2,0
Ser.
Cys
Asp
кислота
Триптофан
Try.
His-eg
Try.
iLeu. 1.0т 5
Gly
Leu
Гликокол
Gly.
VaL Koto
Pro.' /
Leu. [до 10
Ser
Vai
Аспарагин
Asp. QT gQ
Asp. д0 70
Tyr.
Asp. J
Vai
iLeu
Фенилаланин
Phe.
Thr.
iLeu. От 0,5
Gly. I
Thr
Ala
Валнн
Vai. до
Tyr.
Phe. (до 1,0
Pro. 1
His
Phe
Треонин
Thr.
Phe.
Asp.
Ala.
Thr
Тирозин
Tyr.
Ser.
Gly.
Arg.
Gly
Аргинин
Arg.
Lus.
His.
Phe.
Tyr
Серин
Ser. (От 16
Cl у (Менее 50
Thr. о 5
Cys
Пролин
Pro. до 50
Glu.
Arg. ।’
Met. [MeHee 0
His
Гистнднн
His.
Leu. 'n
Cvs.
His.
Arg
Лизин
Lus.0
Pro.U
Lys.0
Cys.
Met
Try.
Try
Классификация аминокислот в зависимости от их усвояемости (2,3), питательной ценности (4), процентного содержания в дрожжах (5), роли в явлениях выделения (6) и эксорбции (7)
Классификация аминокислот в зависимости от их усвояемости (2,3), питательной ценности (4), процентного содержания в дрожжах (5), роли в явлениях выделения (6) и эксорбции (7)
биохимиков, специалистов пивоваренного производства (Халворсон и Коэн, 1958; Джоунс и сотрудники, 1964; Монет и Ахмад, 1965; Брэди, 1965; Абади, 1967; Палмквист и Эйрепее, 1969, 1970).
Не вдаваясь в подробности, необходимо указать на некоторые из связей биосинтеза аминокислот, которые показывают его большую сложность. В исследованиях с использованием изотопов выявилось тесное родство между глутаминовой кислотой, аргинином, пролином и гидроксипролином. Однако природа ферментативных реакций, ведущих к синтезу пролина и аргинина, была определена не полностью. Кроме того, известно, что биосинтез лизина проходит через а-кетоглутаровую кис
лоту, аспарагиновая кислота преобразуется в гомосерин, который в свою очередь образует треонин, изолейцин и метионин. Серин и гликокол легко вза- имозаменяются под воздействием дрожжей. Известно, что синтез гистидина происходит за счет аденозинфосфата; менее точные данные имеются о синтезе ароматических аминокислот.
Ассимиляция и использование аминокислот подвержены воздействию многих факторов, и в частности температуры и степени аэрации культуры. Например, пролин, который не используется в анаэробиозе, может быть использован в брожении с доступом воздуха. Различные виды дрожжей по-разному ассимилируют аминокислоты. Ассимиляция аминокислот может слу-
жить тестом в классификации Saccha- romyces (Бреди, 1965).
Риберо-Гайон и Пейно (1966) составили табл. 7.12 с классификацией аминокислот в зависимости от различных аспектов их азотного метаболизма.
Из анализа данных'табл. 7.12 Риберо-Гайон и Пейно сделали следующие выводы.
Аминокислота в среде может интенсивно поглощаться дрожжами, при этом не наблюдается ни более сильного роста их, ни более сильной концентрации аминокислоты в их клетках в дальнейшем. Очевидно, дрожжи не забирают аминокислоты сусла пропорционально их потребностям для образования своих белков. Таким образом, наиболее усвояемые аминокислоты не являются обязательно наиболее важными составными элементами. Помимо этого, использование той или иной аминокислоты среды колеблется в зависимости от того, представляет ли она единственный источник азота или находится в составе смеси или же в присутствии аммиачного азота. Ярким примером является аргинин: дрожжи плохо усваивают его, когда он представляет собой единственную аминокислоту среды, и, наоборот, очень хорошо усваивают, когда он находится в смеси; в присутствии катиона аммония дрожжи его больше не используют»
Когда в питательной среде содержится смесь всех аминокислот, что предоставляет дрожжам все возможности для выбора, масса дрожжей значительно больше, чем при нахождении в среде только соли аммония. Но в естественной среде выход дрожжей еще больше.
■ Некоторые аминокислоты (гликокол, цистеин), хотя и широко используемые, обеспечивают образование лишь незначительной массы дрожжей. Они легко усваиваются, легко трансаминируются, но как бы в одном направлении. Сле-
довательно, различие между ассимиляцией, т. е. потреблением, фиксацией аминокислот клеткой и питанием, т. е. использованием их для синтеза живых клеток, является оправданным. Впрочем, существует также и обратный пример: пролин и серин усваиваются плохо, но способны обеспечить создание относительно высоких масс дрожжей.
Содержание аминокислот в дрожжах
Протеиды могут составлять больше половины сухой массы дрожжей. Лишь небольшая часть общих аминокислот в клетке находится в свободном состоянии и может быть легко экстрагирована при кипячении (от 10 до 20%) наряду с небольшим количеством аммиачного азота (около 8% общего азота). Большая часть остатка приходится на белки ферментов протоплазмы. Наконец, азот пуриновых оснований нуклеиновых кислот составляет от 10 до 12% общего азота.
В табл. 7.13 объединены несколько примеров (Риберо-Гайон и Пейно, 1966). Для каждой взятой аминокислоты указана масса в процентах от общего количества белков. Данные каждой колонки в табл. 7.13 относятся к различной питательной среде, включающей одну аминокислоту (за исключением первой колонки). Из этой таблицы видно, что дрожжи способны синтезировать все белки своих клеток из любого источника азота — будь то одна аминокислота или сложная смесь.
В этих опытах содержание каждой аминокислоты в дрожжах заметно колеблется в зависимости от состава питательной среды.
Некоторые аминокислоты, когда они используются в качестве единственного источника азотного питания, оказываются в дрожжах в пропорциях, намного превосходящих обычные. Например, содержание в дрожжах метиони-
Аминокислоты в 1 итательиой средеАминокислоты в дрожжахArg.Asp.Gly.His.Lea.Zls.туг.Смесь аминокислот3,66,06,21,46,311,83,0АргининП,46,35,80,95,88,42,1Аспарагин3,310,56,40,97,510,62,9Глицирин3,413,010,60,410,24,61,4Гистидин•3,45,64,524,25,25,82,1Лейцин3,59,65,51,66,511,53,5Тирозин '2,27.16,21,07,69,05,8Аминокислоты в 1 итательиой средеАминокислоты в дрожжахArg.Asp.Gly.His.Lea.Zls.туг.Смесь аминокислот3,66,06,21,46,311,83,0АргининП,46,35,80,95,88,42,1Аспарагин3,310,56,40,97,510,62,9Глицирин3,413,010,60,410,24,61,4Гистидин•3,45,64,524,25,25,82,1Лейцин3,59,65,51,66,511,53,5Тирозин '2,27.16,21,07,69,05,8Содержание некоторых аминокислот в дрожжах в зависимости от их азотистого питания (по Риберо-Гайону и Пейно, 1966), % к массе белкаСодержание некоторых аминокислот в дрожжах в зависимости от их азотистого питания (по Риберо-Гайону и Пейно, 1966), % к массе белкаПрим е ч а н и е. Выделены наиболее характерные значения. -Прим е ч а н и е. Выделены наиболее характерные значения. -
Аминокислоты в 1 итательиой среде
Аминокислоты в дрожжах
Arg.
Asp.
Gly.
His.
Lea.
Zls.
туг.
Смесь аминокислот
3,6
6,0
6,2
1,4
6,3
11,8
3,0
Аргинин
П,4
6,3
5,8
0,9
5,8
8,4
2,1
Аспарагин
3,3
10,5
6,4
0,9
7,5
10,6
2,9
Глицирин
3,4
13,0
10,6
0,4
10,2
4,6
1,4
Гистидин
•3,4
5,6
4,5
24,2
5,2
5,8
2,1
Лейцин
3,5
9,6
5,5
1,6
6,5
11,5
3,5
Тирозин '
2,2
7.1
6,2
1,0
7,6
9,0
5,8
Аминокислоты в 1 итательиой среде
Аминокислоты в дрожжах
Arg.
Asp.
Gly.
His.
Lea.
Zls.
туг.
Смесь аминокислот
3,6
6,0
6,2
1,4
6,3
11,8
3,0
Аргинин
П,4
6,3
5,8
0,9
5,8
8,4
2,1
Аспарагин
3,3
10,5
6,4
0,9
7,5
10,6
2,9
Глицирин
3,4
13,0
10,6
0,4
10,2
4,6
1,4
Гистидин
•3,4
5,6
4,5
24,2
5,2
5,8
2,1
Лейцин
3,5
9,6
5,5
1,6
6,5
11,5
3,5
Тирозин '
2,2
7.1
6,2
1,0
7,6
9,0
5,8
Содержание некоторых аминокислот в дрожжах в зависимости от их азотистого питания (по Риберо-Гайону и Пейно, 1966), % к массе белка
Содержание некоторых аминокислот в дрожжах в зависимости от их азотистого питания (по Риберо-Гайону и Пейно, 1966), % к массе белка
Прим е ч а н и е. Выделены наиболее характерные значения. -
Прим е ч а н и е. Выделены наиболее характерные значения. -
на или гликокола удваивается, тирозина или аргинина утраивается; количество цистеина и гистидина увеличивается еще больше. Эти результаты подтверждают факт прямой ассимиляции аминокислот среды путем реакции, о которой сообщил Торн.
Данное явление особенно четко прослеживается у некоторых аминокислот. Другие аминокислоты, которые при использовании в чистом виде находятся в дрожжах в нормальной пропорции или не подвергаются прямой ассимиляции, или легко трансаминируются. Это относится к лейцинам, серину, глутаминовой кислоте, метионину, триптофану. Таким образом, можно обогащать любую клетку селективно некоторыми аминокислотами, культивируя ее на среде, где они присутствуют одни, без смешения с другим, но такое обогащение возможно не для всех аминокислот. Некоторые из них (аргинин, серин, валин) вызывают мало изменений в нормальном составе азотистых веществ в дрожжах, когда они применяются индивидуально. Из этих различных азотистых компонентов дрожжи синтезируют точно такие же пропорции аминокислот, как если бы в среде была сложная их смесь, и, на
оборот, другие аминокислоты, как гликокол и триптофан, вызывают глубокие изменения в обычном составе азотистых веществ в дрожжах. Наконец, некоторые аминокислоты повышают процентное содержание в дрожжах других аминокислот.
Выделение аминокислот живыми и мертвыми дрожжами
Всегда отмечают большое разнообразие в составе амидного азота перебродивших сред, в которых дрожжи в начале брожения располагают лишь одним источником азота. Живые дрожжи в период роста высвобождают аминокислоты как продукты жизнедеятельности. Табл. 7.12 (графа 6) дает перечень аминокислот, более всего выделяемых дрожжами. Отмечено значительное выделение аминокислот, когда источником азотного питания является аммиак или, еще лучше, аммиак и аспарагин. В первом случае выделяются 10 аминокислот, которые в сумме дают 31 мг/л аминного азота, во втором—18 аминокислот, дающих 206 мг/л аминного азота. Следовательно, основная среда, содержащая при забражи- вании лишь одну аминокислоту, пред
ставляет после брожения более или менее изменчивую гамму аминокислот, синтезированных и выделенных дрожжами
Две аминокислоты высвобождаются дрожжами почти одинаковым образом независимо от природы присутствующего источника азота: глутаминовая кислота в значительных дозах (может достигать сотни мг/л) и в меньшем количестве серин; именно эти две аминокислоты находятся в дрожжах в больших концентрациях.
Иногда констатируют высвобождение соли аммония, например при использовании аргинина. Такое увеличение содержания аммиака не наблюдается в натуральных средах, где дрожжи располагают разнообразным азотным питанием.
Эти важные явления выделения аминокислот живыми дрожжами не следует путать с не менее важными явлениями, при которых мертвые клетки медленно отдают в жидкость аминокислоты, синтезированные ими во время своего роста. В то время как выделение живыми дрожжами селективно и нет какого-либо количественного отношения между выделенными аминокислотами и их концентрацией в дрожжах, что хорошо видно из сравнения данных в графах 5 и 6 табл. 7.12, у аминокислот, выделяющихся мертвыми дрожжами, такая пропорциональность хорошо выражена. Это наиболее важные компоненты дрожжей, за исключением пролина. Пу и Урнак (1970) доказали выделение пептидов мертвыми дрожжевыми клетками.
Дюпюи и сотрудники (1967) указали на различие между автолизом, или ферментативным разложением макромолекул азотистых веществ внутренними ферментами отмершей клетки, и простым выделением или растворением веществ, входящих в состав клетки, в то время, когда вино находится на
дрожжевом осадке. Было бы важно уточнить природу этих явлений, особенно в технологии производства шипучих вин.
Может возникнуть вопрос, влияют ли изменения в азотном метаболизме дрожжей на качество вина. На современном уровне наших знаний трудно дать однозначный ответ. Образование высших спиртов способствует аромату вин, но интенсивность и тонкость аромата не связаны с их содержанием. Аминокислоты, за исключением глутаминовой кислоты, придающей характерный горько-соленый привкус, по-ви- димому, не оказывают прямого влияния на вкус, но с другой стороны, аминокислоты, нуклеотиды, витамины, выделяемые дрожжами в вино после окончания брожения, могут способствовать росту бактерий яблочно-молочного брожения.
Влияние кислотности на развитие дрожжей
Практики нередко имеют ложное представление о роли кислотности сусла в процессе брожения. Обычно они говорят: «Хорошая кислотность помогает брожению». Некоторые думают, что дрожжи лучше развиваются, легче и вполне трансформируют сахар, когда сусло содержит больше кислот. В действительности повышенная кислотность не способствует росту, а наоборот, дрожжи сбраживают больше сахара в нейтральной, чем в кислой среде. Считают, что оптимальная зона pH для роста дрожжей находится между 4,0 и 6,0. Однако реальная кислотность виноградных сусел колеблется от pH 3,0 до pH 3,8 в зависимости от районов виноделия или условий созревания винограда. При этих значениях кислотности винные дрожжи развиваются очень хорошо. При pH от 2,8 до 2,5 или 2,6, редко встречающихся в натуральных
средах, брожение становится затрудненным. Рост дрожжей также замедляется в слегка щелочной среде, следовательно, дрожжи выносят большие колебания кислотности, но не без нарушения своих механизмов брожения; точно так же значительно изменяется образование глицерина и других вторичных продуктов в зависимости от pH бродящей среды.
В гл. 13 будет показано, что когда брожение останавливается (это возможно в жаркие годы) из-за недостаточной аэрации или чрезмерно высокой температуры и в красном вине остается несброженный сахар, то это происходит не из-за недостаточной кислотности винограда. Но слабая кислотность может сделать последствия такой остановки более тяжелыми, так как бактерии молочнокислого брожения развиваются тем легче, чем слабее кислотность, следовательно, роль кислотности в виноделии следует понимать таким образом, что она не способствует развитию дрожжей, а подавляет опасные бактерии в случае остановки брожения.
ЛИТЕРАТУРА
Abadie F. (1967), Ann. Inst. Pasteur, 113, 81. AyrapaaT. et PalmqvistU. (1970), J. Inst. Brew, 75, 181.
Brady F. (1965), Antonie van Leeuwenhoek, 31, 95.
Cantarelli C. (1956), Ann. Inst. Pasteur, 90, 645.
Cantarelli C. (1966), Bull. O.I.V., 39, 1191. Castelli T. (1941), Ann. Microb., 2, 8.
Cochin D. (1880), Ann. Chim. Phys., 21,551. С о о k A. H. (1958), The chemistry and biology of yeasts, Academic Press, New York. . .
Deibner L. et MourguesJ. (1967), Ind. alim. agr., 84, 1483.'
D i m о t a k i-K о u r a k о u V. " (1966), Bull.
O.I.V,, 39, 73, 190, 327, 482_
Dupuy ...P., Mor faux J. N.. e t. Us cia t i M. (1967), Metabolisme azote'des levu- res en Oenologie, IIе Symposium'- intern. ' d’Oendlogie, Bordeaux-Cognac, C, R., p. 108.
Ferre L. (1949), Ind. agr. alim., 66, 259.
Flanzy C. et P о u x C. (1965), Ann. Tech- nol. agric., 14, 35 et 87.
GontcharovaE. M„ PotorokoG. V. et Martakov A. A. (1971), Prikl. Biokhim. Mikrobiol., U.R.S.S., 7, 313.
H a 1 v о r s о n H. O. e t С о h e n G. N. (1958), Ann. Inst. Pasteur, 95, 73.
Hankus A. (1965), Brauwissenschaft, 18, 86.
Hewitt L. F. (1950), Oxydation-reduction potentials in bacteriology and biochemistry. Livingstone ed., Edimbourg.
Jones M. et Pierce J. S. (1964), J. Inst.
Brew., 70, 307.
Lafon M. (1955), Contribution a Tetude de la formation des produits secondaires de la fermentation alcoolique, These Sciences, Bordeaux.
La f о n-La f о urca de S. etPeynaudE. (1961), Ann. Technol. agric., 10, 143.
L a f о n-L a f о u r c a d e S., R i b ё r e a iu-G ay о n J. et PeynaudE. (1962), C. R. Acad.
Sci, 255, 3266.'
La f о n-L a f о urcade S. et PeynaudE. (1963), Qualitas Plantarum, 9, 365.
Laf о n-L af о urcade S. et PeynaudE. (1966), Ann. Inst. Pasteur, 110, 766; (1966), Ind. agr. alim., 83, 119.
Lafourcade S. (1954), Ind. agr. alim., 71, 15.
Lomander L. (1965), Physiol. Plant., 18,153.
Martini A. (1964), Alli Accad. ital. Vite Vino, 16, 101.
Moat A. G. et Ahmad F. (1965), Waller- stein Lab. Comm., 28, 111.
Monod J. (1942), Recherches sur la croissance des cellules bacteriennes, Hermann, Paris, 2 е edition, 1958.
MourguesJ. et Dcibner L. (1967), Ind. alim. agric., 84, 1483.
Muller-Thurgau H. (1884), Bericht Wein- bau Vereins. Geisenheim, p. 158.
О ugh C. S. (1964), Amer. J. Enol. Vitic., 15. 167; (1966) Ibid., 17, 20 et 74.
Palmqvist U. et Ay rap a a T. (1969), J. Inst. Brew., 75, 181.
Peynaud E. et Guimberteau G. (1962), Ann. Technol. agric., 11, 85.
Peynaud E., L a f о n-L a f о u r c a d e S. (1962), Rev. Ferm. Ind. alim., 17, 11.
Poux C., Flanzy C. et M. (1964), Ann, Technol. agric., 13, 5 et 283.
Poux C. et О urn a c A. (1970), Ann. Technol. agric., 19, 217..'
Rankine В. C. (1955), Australian J. Applied Sci., 6, 408.
Ribereau-Gayon J. (1945), Soc. Sci. phys. nat., Bordeaux.,'
R i b ё r e a u-G а у о n J., P e у n a u d E. e t L a- fourcade S. (1951), Ind. agr. alim., 68, 141.
Rebdreau-Gayon J., Peynaud E. et Lafourcade S. (1952), C. R. Acad. Sci., 234, 251 et 478.
Ribereau-Gayon J. et Peynaud E. (1959), 84cCongres Societes, Savantes, C. R., p. 247.
Ribereau-Gayon J., Peynaud E. et Guimberteau G. (1959), C. R. Acad. Sci., 248, 749.
Ribereau-Gayon J. et Peynaud E. (1966), Ann. Nutrit. Alim., 20, 1.
Rose A. H. (1962), Wallerstein Lab. Comm., 25 5
R о se A. H. et Harrison J. S. (1971), The yeasts. Vol. 2: Physiology and biochemistry of yeasts, Academic Press, Londres.
Sailer W. (1953), Mitteilungen, 3, 195.
Senez J. C. (1968), Microbiologie generate, Editions Doin, Paris.
Stokes J. L. (1971), Influence of temperature
on the growth and metabolism of yeasts, in The yeasts, Rose A. H. et Harrison J. S., Tome 2, p. 119, Academic Press, Londres.
Suomalainen H. et Oura E. (1971), Yeast nutrition and solute uptake, in The Yeasts, Rose A. H. et Harrison J. S., Tome 2, p. 3. Academic Press, Londres.
Tar an to la C. (1955), Riv. Vitic. Enol., 8, 10 et 259.
Uhl A. (1960), In Die Hefen; p. 209—257. Verlag Hans Carl, Nuremberg.
U h 1 A. (1967), Conditions de milieu et facte- Urs de la croissance des levures, IIе Symposium intern, d’ Oenologie, Bordeaux-Cognac. C. R. p. 129.
White J. et Munns D. J. (1951), Wallerstein Lab. Comm., 14, 199.
Wiken T. O. (1967), L’influence de I’oxygene sur la fermentation alcoolique par les levures, IIе Symposium intern, d’Oenologie, Bordeaux-Cognac, C. R. p. 155—171.
Zintchenko V. I. (1962), Station de Maga- ratch, 11, 60.
Глава 8. ФАКТОРЫ РОСТА ДРОЖЖЕЙ И АКТИВАТОРЫ БРОЖЕНИЯ
В предыдущей главе были исследованы потребности дрожжей в питании пластическими элементами, необходимыми для построения их составных частей. Эти микроорганизмы требуют также присутствия небольших количеств других веществ, называемых факторами роста. Они являются одновременно и факторами размножения, и факторами клеточной активности; недостаток их влечет за собой нарушение механизмов обмена веществ.
Факторы роста — это органические вещества, которые играют роль основных метаболитов; они необходимы для жизнедеятельности микроорганизмов. Факторы роста должны быть доставлены тем организмам, которые, сами не синтезируя их, не могут развиваться в их отсутствие. Одной из характеристик их является способность действовать в очень слабых концентрациях.
Некоторые аминокислоты, пурины и
пиримидины служат факторами роста для многих бактерий, которые требуют относительно больших количеств этих веществ. Но факторами роста в собственном смысле слова являются как раз те витамины, которые необходимы и высшим организмам. Витамины представляют структуру, идентичную или очень близкую к той, которая характерна для некоторых коферментов, а именно активной части ферментов.
В зависимости от потребности в факторах роста микроорганизмы делят на две категории: прототрофы, способные синтезировать все свои составные части из различных органических источников, и ауксотрофы, неспособные синтезировать некоторые составные части; они должны находить их в питательной среде в готовом виде. Различные виды дрожжей принадлежат к обеим категориям.
По мере брожения виноградного сус-
ла и последовательной смены одних генераций дрожжей другими используются факторы роста сусла. Если в порядке эксперимента подвергать брожению несколько раз подряд одно и то же виноградное сусло, отбирая каждый раз спирт и добавляя сахар и соли аммония, то в конечном счете получается сахаристая жидкость, которая больше не бродит вследствие истощения факторов роста. Но достаточно прибавить немного натурального сока, и брожение снова становится возможным.
Некоторые факторы роста, дополнительно введенные в виноградное сусло, могут играть роль стимуляторов дрожжей, даже если последние могут их синтезировать. Известны и другие категории веществ, которые, не являясь необходимыми, ускоряют деление клеток и превращение сахара в полных питательных средах. Их называют стимуляторами, или активаторами, брожения. Эти вещества классифицируют по многим категориям; изучение их также является целью данной главы.
К другому классу следует отнести некоторые инертные продукты, которые в виде взвесей ускоряют брожение среды; это волокна целлюлозы, асбест, инфузорная земля, тальк, бентонит, уголь, древесная щепа, обломки пробки и т. п. Некоторые из них действуют в качестве поддержки дрожжей (Ша- мис и сотрудники, 1963). Они черпают свой эффект активации из совершенно различных механизмов.
ФАКТОРЫ РОСТА
У дрожжей эти факторы относятся к классу витаминов: биотин, пиридоксин, тиамин, пантотеновая кислота, мезоинозит, никотинамид, парааминобензой- ная кислота. Для молочных бактерий нужно добавить еще рибофлавин и птероилглутаминовую (фолиевую) кислоту.
Необходимо кратко напомнить химические и биологические характеристики этих факторов. Их действие на винные дрожжи, процентное содержание в винограде и вине, повеление в процессе брожения стали предметом многочисленных работ, в том числе и авторов настоящего трактата и их сотрудников (Риберо-Гайон и сотрудники, 1954; Пейно и Лафуркад, 1954, 1957, 1958).
Биотин
Биотин, или витамин Н, был открыт в 1936 г., и активность его в отношении дрожжей известна давно. Биотин играет основную роль в ряде ферментных реакций декарбоксилирования, дезаминирования и азотного биосинтеза; он обеспечивает транспорт и активацию углекислого газа в реакциях карбоксилирования, связывает метаболизм глюцидов и азота.
Присутствие биотина не является необходимым ни для какого вида винных дрожжей, т. е. они способны синтезировать его сами. Но отсутствие биотина значительно ограничивает число генераций, хотя и не оказывает слишком большого влияния на эффективность брожения. Как показывают анализы, проводимые после брожения среды, лишенной биотина в момент забражива- ния, дрожжи способны синтезировать достаточное количество биотина. Биотин также участвует в синтезе пантотеновой кислоты. Биологически он очень активен; его действие проявляется уже при концентрациях, примерно равных 1 ммкг.
На отсутствие биотина дрожжи реагируют повышенным синтезом тиамина, никотинамида и рибофлавина. Недостаток биотина уменьшает интенсивность глицерино-пировиноградного брожения и снижает процентное содержание янтарной кислоты.
Пиридоксин
Название пиридоксин, или одермин, или витамин В6, обозначает группу из трех близких по своей структуре и составу веществ: пиридоксина, пиридоксаля и пиридоксамина. Пиридоксин состоит из ядра пиридина, замещенного в 2, 4, 5 положениях.
Фосфат пиридоксаля играет в реакциях декарбоксилирования и трансаминирования роль кофермента. Пиридоксин является эффективным стимулятором дрожжей, хотя и никогда не бывает абсолютно необходимым. Некоторые дрожжи, в частности Sacch. fructuum, Kloeckera, Torulopsis, сильно реагируют на этот фактор, отсутствие которого ограничивает развитие популяций, а также снижает образование глицерина и янтарной кислоты. Дрожжи компенсируют этот недостаток большим образованием тиамина. Эти два фактора взаимозаменяемы у Sacch- aromycodes, у некоторых Torulopsis. Фактически брожение при отсутствии одного из этих факторов все еще протекает легко, но при одновременном отсутствии обоих факторов оно становится невозможным.
Тиамин
Тиамин, или аневрин, или витамин В1( образуется при конденсации пиримидинового ядра и ядра тиазола. Сульфит расщепляет тиамин на две составные части и разрушает витаминную активность. Тиаминдифосфат (кокарбок- силаза) представляет собой кофермент, требующийся для многих реакций декарбоксилирования, и в частности при спиртовом брожении для декарбоксилирования пировиноградной кислоты в ацетальдегид. Кроме того, тиамин регулирует-конденсацию ацетоина и образование бутандиола-2,3. ' ' и ;
Тиамин действует. на большинство
дрожжей, повышая скорость брожения в большей степени, чем скорость роста; во всяком случае, дрожжи Kloeckera плохо размножаются без тиамина. Он является очень важным фактором метаболизма углеводов. Содержание пировиноградной кислоты в бродящей среде зависит от исходного процентного содержания тиамина. Добавление тиамина в сусло ограничивает процесс образования пировиноградной кислоты и, следовательно, степень связывания сернистого ангидрида.
Пантотеновая кислота
Это один из самых сильных факторов роста дрожжей. Само название говорит о том, что пантотеновая кислота присутствует повсюду в мире живых существ. Она состоит из деривата бутановой кислоты, пантоиновой кислоты и р-аланина.
Пантотеновая кислота входит в состав кофермента А, который имеет решающее значение для процессов биологического ацетилирования. Недостаточное содержание ее хак главного фактора роста дрожжей вызывает глубокие изменения в образовании вторичных продуктов во время спиртового брожения. В ее отсутствие глицерино- пировиноградное брожение протекает. намного более интенсивно, возрастает процентное содержание бутандиола-2,3, накапливается уксусная кислота. Пантотеновая кислота регулирует в известной мере процентное содержание этой кислоты в бродящей среде.
Некоторые дрожжи не способны синтезировать пантотеновую кислоту и абсолютно нуждаются в ней; это относится к некоторым расам Kloeckera, Saccharomyces ellipsoideus, Saccharo- myces chevalieri.
Синтез у прототрофных дрожжей всегда протекает трудно. В отсутствие пантотеновой кислоты они становятся
беднее биотином, никотинамидом, пиридоксином и в то же время накапливают больше мезоинозита, рибофлавина, тиамина.
Мезоинозит
Это был первый фактор роста, идентифицированный химическим путем (1928). Мезоинозит — многоатомный циклический спирт, имеющий большое, число изомеров, различающихся положениями Н и ОН-групп на каждой стороне плана. Один из этих изомеров — мезоинозит — является биологически активным. Его роль в метаболизме не выяснена.
Мезоинозит является фактором роста, необходимым для развития некоторых дрожжей, в частности Kloeckera, Sacch. veronae, Torulopsis stellata.
Он всегда играет роль активатора для других видов. В средах без мезоинозита отмечают менее интенсивное образование глицерина и янтарной кислоты. Недостаток мезоинозита нарушает поведение Sacch. ellipsoideus, которые в этом случае накапливают рибофлавин и тиамин.
Мезоинозит — это важный компонент вина, содержащийся в .количестве примерно 0,5 г/л.
Никотинамид
Формула никотинамида, или никотиновой кислоты, или витамина РР, или ниацина, является производной от формулы пиридина, гексагонального гетероцикла с одним атомом азота.
Никотинамид входит в состав НАД (никотинамидадениндинуклеотид) и НАДФ (никотинамидадеиндинуклео- тидфосфат), коэнзимов, выступающих в механизмах дегидрогенизации.
Никотинамид может быть в большей или меньшей степени синтезирован дрожжами в зависимости от их вида.
Некоторые виды увеличивают первоначальное содержание его в соке винограда в 4 раза. В противоположность этому большая часть заостренных дрожжей не способны вырабатывать этот фактор и должны находить его в среде.
Парааминобензойная кислота
Это вещество редко бывает необходимо для дрожжей, однако в нем нуждается Т. stellata — единственный вид дрожжей, обладающий этим веществом. Для бактерий молочнокислого брожения парааминобензойная кислота играет ауксологическую роль первого порядка, может быть просто как предшественник птероилглутаминовой кислоты.
Птероилглутаминовая кислота
Этот фактор, который еще называют фолиевой кислотой, является одним из ферментативных факторов, выделенных в самое последнее время. Роль птероилглутаминовой кислоты в качестве коэнзима заключается в активации и транспорте формальдегидной группы (СНО) в реакциях, которые завершаются добавлением одного звена к цепи атомов углерода. Она участвует в синтезе некоторых аминокислот и нуклеиновых кислот. Не оказывая влияния на дрожжи, птероилглутаминовая кислота представляет собой основной фактор для деятельности бактерий молочнокислого брожения, которые его синтезируют из глюкозы через пара- аминобензойную кислоту. Фолиевая кислота содержит в своей структуре парааминобензойную, глутаминовую кислоты и пуриновые основания (2- амино-4-окси-6-метилптерина).
Рибофлавин
Рибофлавин, или лактофлавин, или витамин В2, имеет формулу, составлен-
ную из одного бензольного цикла, который соединен двумя атомами азота с гетероциклом, включающим два азота и образовавшимся из пиридина путем окисления; боковое гидроксилированное звено представляет рибит, специфический многоатомный спирт. Рибофлавин не является фактором роста для дрожжей, которые к тому же синтезируют его в значительных количествах (от 0,2 до 0,3 мг/л). Но это необходимый фактор для бактерий молочнокислого брожения.
Рибофлавин представляет собой коэнзим многих ферментов дыхания, участвующих в реакциях клеточного дегидрирования.
Содержание факторов роста в суслахи винах
Данные, о содержании витаминов группы В в винограде и винах интересуют энолога с трех точек зрения: прежде всего они способствуют определению пищевой ценности этих продуктов; затем эти витамины являются факторами роста для микроорганизмов, дрожжей и бактерий, участвующих в процессах выработки вина; наконец,
они играют главную роль в сбраживании углеводов.
Данное исследование было выполнено в Институте энологии в Бордо в 50-е годы С. Лафон-Лафуркад с помощью способов микробиологического количественного анализа в отношении каждого витамина на более сотни различных винах. Были прослежены эволюция винограда в период созревания (см. гл. 4, раздел «Эволюция витаминов В»), затем поведение во время брожения и, наконец, было изучено влияние старения и различных обработок вина (Пейно и С. Лафон-Лафуркад, 1955, 1956, 1957; Риберо-Гайон и сотрудники, 1955, 1956; С. Лафуркад, 1956; С. Лафон-Лафуркад, 1958).
В табл. 8.1 приведены экстремальные значения содержания витаминов в сус- лах и винах.
Эволюция факторов роста во время спиртового брожения
Рассмотрение запаса витаминов в вине по сравнению с суслом ясно показывает, что в результате брожения не уменьшается содержание витаминов в среде, но происходит глубокая пере-
Таблица 8.1
Содержание витаминов в суслах и винах. Экстремальные значения (по данным Пейно и С. Лафои-Лафуркад)
Витамины
Виноградное сусло
Вина
белые
красные
Тиамин, мкг
160-450
2-58
103-245
Рибофлавин, мкг
3-60
8-133
0,47-1,9
Пантотеновая кислота, мг
0,5-1,4
0,55—1,2
0,13-0,68
Пиридоксин, мг
0,16-0,5
0,12-0,67
0,13-0,68
Никотинамид, мг
0,68-2,6
0,44—1,3
0,79-1,7
Биотин, мкг
1,5-4,2
1-3,6
0,6—4,6
Мезоинозит, мг
380-710
220—730
290-334
Кобаламин, мкг
0
0—0,16
0,04-0,10
Парааминобензойная кислота, мкг
15-92
15-133
15-133
Птероилглутамииовая кислота, мкг
0,9-1,8
0,4—4,5
0,4—4 ,t>
Холин, мг
19-39
19—27
20—43
стройка витаминного состава. Женевуа и Флавье (1939) впервые указали на эту эволюцию; они наблюдали, что в ходе брожения тиамин быстро убывает, тогда как рибофлавин накапливается. Другие авторы проследили эволюцию витаминов группы В от винограда до вина (Кастор, 1953; Холл и сотрудники, 1956) . Пейно и Лафон-Ла- фуркад (1957) детально описали эти превращения. Рис. 8.1 воспроизводит поведение некоторых факторов роста.
Рис. 8.1. Эволюция основных факторов роста во^время сбраживания виноградного сусла дрожжами Sacch. ellipsoideus: '
тиамин (100 мкг); 2— биотин (1 мкг); 3 —рибофлавин (100 мкг), 4— никотинамид (1 мг); 5— пантотеновая кислота (1 мг); 6— пиридоксин (1 мг).
Пантотеновая кислота изменяется во время брожения по-разному в зависимости от вида дрожжей, на которых проводят эксперимент. В первые часы Sacch. ellipsoideus синтезирует ее или
высвобождает из своих связанных форм. Затем процентное содержание этого витамина быстро снижается в период логарифмического размножения клеток; наконец, оно возрастает, по всей видимости, в результате выделения. Другие прототрофные дрожжи ведут себя таким же образом. Наблюдают непрерывное поглощение пантотеновой кислоты ауксотрофными дрожжами, такими, как KL apiculata. В виноделии обычно констатируют увеличение содержания этой кислоты, и красные вина несколько богаче ею, чем вина белые. Во время выдержки наблюдается медленное разрушение пантотеновой кислоты.
KL apiculata и Sacch. rosei вызывают почти полное исчезновение пиридоксина во время брожения, и, наоборот, другие дрожжи, такие, как С. pul- cherrima и Т. stellata, удваивают или учетверяют процентное содержание пиридоксина в среде. Sacch. ellipsoideus поглощают значительное количество пиридоксина в стадии быстрого размножения клеток; затем его содержание в бродящей среде прогрессивно возрастает, заметно приближаясь к исходному уровню. В нормальных условиях приготовления вина 1ти модификации завершаются выравниванием содержания пиридоксина в сусле и винах. Белые или красные вина содержат его в очень близких дозах. Длительное хранение вина не оказывает влияния на пиридоксин.
Все дрожжи поглощают значительные количества биотина, особенно в условиях аэробиоза, во время фазы размножения. На 5-й день 9/ю первоначального количества биотина в сусле исчезали. Концентрация биотина возрастает вследствие выделения, и в конечном счете, в условиях производства вина практически содержат такое же количество биотина, как и сусло, из которого они изготовляются.
Никотинамид широко используется в сусле всеми дрожжами. Sacch. ellip- soideus снижают его содержание в среде уже на 3-й день с 2,2 до 0,1 мг. В дальнейшем процентное содержание никотинамида в жидкости возрастает, но не достигает первоначального уровня. Этот фактор роста необходим тем более, чем более анаэробными являются условия культуры (Суомалайнен и сотрудники, 1965). Вино обычно беднее никотинамидом, чем сусло, из которого оно изготовлено. Красные вина имеют более высокое содержание никотинамида, чем белые. Впоследствии никотинамид становится стабильным витамином.
Потребности дрожжей в тиамине очень различны в зависимости от их вида, в то время как некоторые, например Sacch. ellipsoideus, KL apiculata, Sacch. rose!, практически истощают среду (первоначальная концентрация 330 мкг снижается до 18), другие дрожжи, как Р. fermentans, синтезируют значительные дозы тиамина. Однако первые имеют большее распространение в производстве. В конце концов, брожение завершается исчерпанием тиамина в бродящей среде; в белых винах остаются лишь незначительные дозы его. Максимальное количество тиамина, которое могут поглощать Sacch. ellipsoideus, составляет от 600 до 800 мкг/л. В суслах не всегда бывают такие большие концентрации; понятно, что нередко добавление тиамина могло бы оказывать благоприятное влияние на ход спиртового брожения.
Урнак (1970) исследовал кинетику выделения тиамина; необнаруживае- мый в первые дни, он выделяется в течение 3 мес, следовательно, выпадение дрожжевого осадка и снятие с дрожжей прерывают этот процесс, как правило, до того, как будет выделен весь тиамин дрожжей.
Мезоинозит не претерпевает замет-
ных изменений в период брожения, поскольку потребности дрожжей в нем меньше чем 0,5 мг/л, а в сусле содержится в тысячи раз больше мезоинозита, чем необходимо. Белые вина богаче им, чем красные; последние могут подтвергаться молочнокислому брожению, бактерии которого потребляют мезоинозит; некоторые красные вина лишены его.
Цианкобаламин, или витамин Bi2, может быть обнаружен в винах в дозах порядка нескольких десятых микрограмм на 1 л. Присутствие в винах следов этого витамина можно объяснить способностью дрожжей синтезировать очень малые количества веществ, обладающих активностью В12.
В первой фазе брожения наблюдают значительный синтез парааминобен- зойной кислоты дрожжами. В частности, Sacch. rosei доводят за 48 ч ее содержание в среде с 25 до 175 мкг/л, и, наоборот, к концу брожения дрожжи, и это относится к Sacch. ellipsoideus, поглощают эту кислоту. KI. apiculata проявляет себя непрерывным образова- телем этого витамина.
Что касается холина, то после увеличения на несколько миллиграммов в начале брожения отмечается расходование при снижении его в вине до 2/з первоначального количества, имевшегося в сусле. С заостренными дрожжами расходование происходит слабо. Как и другие витамины, холин выделяется дрожжами. В практике виноделия брожение сусла характеризуется незначительным потреблением холина и интенсивным образованием параами- нобензойной кислоты.
Содержание рибофлавина в сусле невелико, от 3 до 60 мкг/л. Брожение всегда сопровождается синтезом этого витамина, более значительным в аэрированной среде. Синтез протекает энергичнее с окислительными дрожжами, образующими пленку на поверхно-
сти питательной среды. В сусле, которое сбраживается обычной микрофлорой, уже со второго дня наблюдают возрастание процентного содержания рибофлавина. Оно достигает максимума в период между пятым и десятым днем. В дальнейшем процентное содержание рибофлавина понижается. Условия приготовления вина мало изменяют его уровень. Красные и белые вина также имеют в своем составе рибофлавин (до 240 мкг/л). Но его большая светочувствительность является одной из причин последующего снижения содержания в белых винах этого фактора роста бактерий молочнокислого брожения. .
В конечном счете спиртовое брожение перестраивает и даже дополняет витаминный состав сусла. В действительности это хороший способ сохранения витаминных элементов плода. Прежде всего, отмечается контраст между изменениями тиамина и рибофлавина: когда в сусле много тиамина и мало рибофлавина, вино богато рибофлавином и практически лишено тиамина. Содержание никотинамида в белых винах составляет только 60% от содержания его в сусле, но в красных винах он находится в таких же количествах, как и в винограде. Пантотеновая кислота, пиридоксин, биотин используются и затем выделяются дрожжами, вследствие чего в конечном счете они находятся в таком же количестве в вине после брожения, как и перед его началом; мезоинозит практически не изменяется.
Запас витаминов в молодом вине может со временем уменьшаться. Воздействие работы бактерий, обработки для осветления, экспортирование на свету, длительная выдержка могут разрушить некоторые витамины полностью или частично. В то время как пантотеновая кислота, никотинамид, пиридоксин проявляют достаточную стабиль
ность, биотин и особенно рибофлавин мугут почти полностью исчезать.
Потребности дрожжей в факторах роста
Если некоторые факторы роста иногда и содержатся в вине в недостаточном количестве, оно никогда не бывает полностью лишено ни одного из основных факторов. И соответственно, если допустить, что в некоторых случаях вследствие частичной недостаточности того или иного фактора вино становится менее восприимчивым к воздействию микроорганизмов, то совершенно невозможно реализовать хорошую биологическую стабильность истощением того или иного необходимого фактора. В действительности нужно учитывать тот факт, что многие микроорганизмы вина и в особенности дрожжи являются прототрофами, т. е. они способны в определенной мере синтезировать недостающий фактор. .
Здесь умышленно не рассматриваются качественные потребности дрожжей. Этот вопрос был описан в гл. 5, а примеры приводились в гл. 6. Эти потребности были также исследованы в многочисленных работах (Верона и Пиччи, 1954; Викен и сотрудники, 1954; Викен и Агте, 1958; Вайнфуртнер и сотрудники, 1959; Виндиш и сотрудники, 1967). Было также показано, что потребности дрожжей в факторах роста могут изменяться в зависимости от температуры и степени аэрации (Бич, 1969).
Влияние обогащения сусла факторами роста
Можно сказать, что сусло и вина имеют достаточное содержание факторов роста, чтобы обеспечить развитие микроорганизмов; верно также и то, что этот уровень не всегда является оптимальным для роста и активности
Влияние различных факторов роста на количество сброженного сахара при добавлении их в виноградное сусло сахаристостью 192 г/л
Добавление витаминов
Показатели
Определение через
3 дня
5 дней
8 дней
Контроль
Сброженный сахар, г/л
56
138
180
Количество дрожжей, тыс./мм3
60
72
76
10 мкг биотина
Сброженный сахар, г/л
74
159
187
Количество дрожжей, тыс./мм3
65
74
86
0,5 мг тиамина
Сброженный сахар, г/л
96
176
191
Количество дрожжей, тыс./мм3
82
102
106
10 мкг биотина плюс
Сброженный сахар, г/л
95
174
191
0,5 мг тиамина
Количество дрожжей, тыс./мм3
83
102
105.
дрожжей. Риберо-Гайон и Пейно (1952) сообщили, что обогащение виноградного сусла некоторыми факторами роста может вызвать заметное ускорение брожения. Но активны не все факторы. Например, добавление пиридоксина, пантотеновой, никотиновой кислот в отдельности или вместе обычно не оказывает влияния на скорость брожения сусла из нормального винограда, следовательно, можно думать, что он содержит их в достаточном количестве. С другой стороны, добавление биотина и особенно тиамина ускоряет процесс брожения, но интенсивность их действия зависит от состава испытываемого сусла и особенно от качества винограда, которое само изменяется по годам урожая.
Для примера можно привести один из стандартных опытов, проведенный на виноградном сусле, содержащем 192 г/л сахара. Оно было обсеменено несколькими каплями свежей дрожжевой разводки Sacch. ellipsoideus. Затем сусло сбраживали при температуре 25° С, сделав предварительно одно из следующих добавлений, из расчета на 1 л: 25 мкг биотина, 0,5 мг тиамина и обоих факторов одновременно в таких 220
же дозах. Из табл. 8.2 видно, что биотин обладает небольшой стимулирующей способностью. Внесение тиамина вызывает опережение брожения приблизительно на 20 г сахара по сравнению с контрольным. Такое опережение продолжается до конца брожения. На 3-й день число дрожжевых клеток возрастает на 36%. Совместное действие обоих витаминов не превосходит действия тиамина, вводимого отдельно.
Тиамин оказывает воздействие на рост дрожжей; он увеличивает численность популяции и удлиняет период ее активности. Опыт, в котором подсчитывали одновременно и живые клетки, и общее количество клеток, показал, что на 10-й день анаэробного брожения в контрольном образце проявляла активность только половина дрожжевых клеток. При добавлении 0,5 мг/л тиамина эта пропорция достигает к этому же времени 79% общего количества клеток.
Добавление 0,5 мг/л обычно вызывает оптимальную активность, но тиамин действует, хотя и слабее, и при меньших дозах. Добавление 0,1 мг/л в сусло может привести к заметному усилению активности.
Ускорение брожения, вызываемое обогащением сусла тиамином, может изменяться от урожая к урожаю. Видимо, что в некоторые годы, когда недостаточная зрелость возможно ведет к более низкому процентному содержанию тиамина в винограде, добавление этого витамина в собранный виноград или в сусло оказывается выгодным, тогда как в годы более высокой зрелости введение тиамина практически бесполезно. Этим можно, вероятно, объяснить расхождения, отмечаемые в экспериментах разных авторов. Некоторые авторы подтверждали эффективность тиамина, тогда как другие не обнаруживали увеличения числа дрожжевых клеток и ускорения сбраживания сахара (Фланзи и Урнак, 1963; Урнак, 1969). Интересно также рассмотреть вопрос о содержании тиамина в применяемой дрожжевой разводке. При введении тиамина в дрожжи, которые содержали его менее чем 115 мг на 100 г сухой массы, имело место ускорение брожения. Эти авторы применяли большие дозы обсеменения (2 млн. дрожжевых клеток на 1 см3). В таких условиях факторы роста, вносимые с дрожжами, полностью устраняли явление недостаточности.
С. Лафон-Лафуркад и сотрудники (1967) в опытах большого масштаба, проводившихся в производственных условиях, в большинстве случаев констатировали вызываемую тиамином активацию брожения сусла из винограда сорта Сотерн с благородной гнилью.
Были предложены некоторые составы активаторов брожения. Эффективным средством интенсификации брожения среды, имеющей мало витаминов и бедной азотистым питанием, может быть следующая смесь, применяемая в дозе 200 мг/л: сульфат аммония — 100 г, тиамин — 250 мг, пантотенат кальция — 250 мг, биотин — 2 мг. Пан
тотенат предотвращает чрезмерное образование уксусной кислоты. Для до- браживания вин-недобродов можно использовать эту же смесь без сульфата аммония. Необходимо уточнить, что применять такие составы при производстве вин в настоящее время запрещено.
Активаторы брожения
Помимо витаминов, которые рассмотрены в первой части настоящей главы, известно большое число веществ, способных действовать на дрожжи, стимулируя их размножение и активизируя брожение виноградного' сусла. Такие активаторы можно подразделить на следующие категории: промежуточные продукты сбраживания, в частности ацетальдегид и пировиноградная кислота; стерины, активные только в условиях анаэробиоза; жирные кислоты с длинной цепью, действие которых равносильно действию биотина; экстракты дрожжей; вещества, экстрагированные из некоторых плесневых грибов.
Далее будет исследовано действие различных активаторов брожения виноградного сусла. Эти явления активации, безусловно, используются в практике виноделия. Продукты-активаторы рекомендуются и разрешены в ряде стран.
Активация ацетальдегидом и пировиноградной кислотой
Добавляемые в небольших количествах в сусло до и во время брожения, эти промежуточные продукты спиртового брожения изменяют его химические процессы, воздействуя на скорость сбраживания и на рост дрожжей, и тем самым облегчают ассимиляцию азотистых веществ. Примером этого может быть следующий опыт,- заимствован-
ный из диссертации С. Лафуркад (1954). Виноградное сусло, содержащее 210 г/л сахара, 253 мг/л общего азота и 22 мг/л аммиачного азота, сбраживают при 25° С. Сусло делят на две части: одна контрольная, другая обогащенная 150 мг/л аммиачного азота. Каждая из них разлита в три флакона; в первом находится контроль, в два других, начиная с момента забражива-
Рис. 8.2. Активирование брожения н размножения дрожжей последовательными добавлениями к виноградному суслу небольших количеств ацетальдегида и пировиноградной кислоты:
1 — контроль; 2 — пировиноградная кислота; 3— ацетальдегид.
ния, добавляют в течение 5 последующих дней по 14 мг/л ацетальдегида или по 60 мг/л пировиноградной кислоты. Прослеживают ход брожения и по его завершении, подсчитывают число дрожжевых клеток; выделяют их из жидкости, промывают сушат и взвешивают. Определяют количество азота в дрожжах. На рис. 8.2 показаны активация брожения и рост дрожжей, которые имеют место при добавлении этих незначительных количеств ацетальдегида и пировиноградной кислоты. Примеры таких же явлений показаны на рис. 8.8, где сравнивается активность этих про-
Влияние ацетальдегида и пировиноградной кислоты на ассимиляцию азотистых веществ (по данным С. Лафуркад, 1954).
й
S „
Вещества, добавляемые к суслу
2 s
gs
О *
й
О S
<! <=с
и и
Без обогащения сусла аммиачным азотом
Контрольное сусло Ацетальдегид Пировиноградная кислота
67
101
102
1,72
1,73
1,73
141
158
158
8,2
9,6
9,7
С добавлением 150 мг
амм№
кого а
зота
Контрольное сусло
84
2,68
158
5,9
Ацетальдегид
126
2,81
231
8,2
Пировиноградная кислота
124
2,90
245
8,4
дуктов с активностью других активаторов.
Оба эти вещества заметно ускоряют ход брожения. Опережение по сравнению с контрольным выражается за весь период сбраживания 20—30 г дополнительно сброженного сахара. Число дрожжевых клеток возрастает на 50% (табл. 8.3); при этом общая масса образовавшихся клеток меняется мало, поскольку лимитирующим фактором является содержание азота. При введении ацетальдегида или пировиноградной кислоты в среду, более богатую аммиачным азотом, процентное содержание азота, фиксированного дрожжами, возрастает.
Таким образом, ацетальдегид и пировиноградная кислота играют роль активаторов брожения, не только сокращая латентный период и возбуждая реакции гликолиза, но и способствуя
Виды дрожжейВарианты опытаКоличество сброженного caxaja в бредящем сусле (в г/л) через3 дня10 дней20 днейSacch. ellipsoideusКонтроль + эргостерин84175189150258258Sacch. oviformisКонтроль + эргостерин60175217126258258Sacch. roseiКонтроль + эргостерин——135——220Schizosacch. pombeКонтроль + эргостерин——140——235KL apiculataКонтроль + эргостерин——75——120S’codes ludwigiiКонтроль + эргостерин——170—250Sacch. bailiiКонтроль + эргостерин——94——252Виды дрожжейВарианты опытаКоличество сброженного caxaja в бредящем сусле (в г/л) через3 дня10 дней20 днейSacch. ellipsoideusКонтроль + эргостерин84175189150258258Sacch. oviformisКонтроль + эргостерин60175217126258258Sacch. roseiКонтроль + эргостерин——135——220Schizosacch. pombeКонтроль + эргостерин——140——235KL apiculataКонтроль + эргостерин——75——120S’codes ludwigiiКонтроль + эргостерин——170—250Sacch. bailiiКонтроль + эргостерин——94——252Влияние эргостерина на анаэробное сбраживание (при 25° С) виноградного сусла сахаристостью 260 г/л различными дрожжами (добавление 5 мг/л эргостерина в суспензии с Твином-80)Влияние эргостерина на анаэробное сбраживание (при 25° С) виноградного сусла сахаристостью 260 г/л различными дрожжами (добавление 5 мг/л эргостерина в суспензии с Твином-80)
Виды дрожжей
Варианты опыта
Количество сброженного caxaja в бредящем сусле (в г/л) через
3 дня
10 дней
20 дней
Sacch. ellipsoideus
Контроль + эргостерин
84
175
189
150
258
258
Sacch. oviformis
Контроль + эргостерин
60
175
217
126
258
258
Sacch. rosei
Контроль + эргостерин
—
—
135
—
—
220
Schizosacch. pombe
Контроль + эргостерин
—
—
140
—
—
235
KL apiculata
Контроль + эргостерин
—
—
75
—
—
120
S’codes ludwigii
Контроль + эргостерин
—
—
170
—
250
Sacch. bailii
Контроль + эргостерин
—
—
94
—
—
252
Виды дрожжей
Варианты опыта
Количество сброженного caxaja в бредящем сусле (в г/л) через
3 дня
10 дней
20 дней
Sacch. ellipsoideus
Контроль + эргостерин
84
175
189
150
258
258
Sacch. oviformis
Контроль + эргостерин
60
175
217
126
258
258
Sacch. rosei
Контроль + эргостерин
—
—
135
—
—
220
Schizosacch. pombe
Контроль + эргостерин
—
—
140
—
—
235
KL apiculata
Контроль + эргостерин
—
—
75
—
—
120
S’codes ludwigii
Контроль + эргостерин
—
—
170
—
250
Sacch. bailii
Контроль + эргостерин
—
—
94
—
—
252
Влияние эргостерина на анаэробное сбраживание (при 25° С) виноградного сусла сахаристостью 260 г/л различными дрожжами (добавление 5 мг/л эргостерина в суспензии с Твином-80)
Влияние эргостерина на анаэробное сбраживание (при 25° С) виноградного сусла сахаристостью 260 г/л различными дрожжами (добавление 5 мг/л эргостерина в суспензии с Твином-80)
синтезу белков и росту дрожжей. Об активации ацетальдегидом сообщали Фланзи и Банос (1938).
Активация стеринами и жирными кислотами с длинной цепью
Андреасен и Штир (1953) показали, что при введении эргостерина в бродящую среду можно получать, действуя в строго анаэробных условиях, среднюю численность популяции от ПО до 125 млн. клеток на 1 см3, которые накапливаются после большого числа последовательных пересевов в среде, совершенно лишенной кислорода. Оптимальная доза эргостерина равна 7 мг/л. С другой стороны, в анаэробиозе наблюдается небольшой ингибирующий эффект. Авторы пришли к заключению, что эргостерин следует рассматривать как один из необходимых факторов развития дрожжей в условиях анаэробиоза, потому что именно в таких условиях они не способны реализовывать синтез стеринов. Эта потреб
ность также удовлетворяется холестерином, но не всеми стеринами. Эргостерин оказывается также необходимым для развития дрожжей при 40° С, так как его синтез сильно тормозится высокой температурой (Старр и Паркс, 1962).
Большой интерес, который представляют эти наблюдения для практики брожения, не ускользнул от внимания исследователей, дающих на них многочисленные ссылки (Можене и Дюпон, 1964; Шове и сотрудники, 1966).
В табл. 8.4 приведены результаты серии экспериментов, проведенных на различных винных дрожжах (Институт энологии, Бордо, 1965), которые полностью подтверждают стимулирующие свойства эргостерина при добавлении его в суспензию (5 мг/л) с Твином-80. Этот продукт действует на все дрожжи. Он обеспечивает более полное сбраживание сахара, и разница в конце брожения составляет от 40 до 150 г сахара. Такое брожение имеет характеристики аэробного процесса: более ин-
ПоказателиПоказателиКон-трольКон-трольбелых сортовбелых сортовкрасных сортовкрасных сортов1318413184126156126156124140124140
Показатели
Показатели
Кон-троль
Кон-троль
белых сортов
белых сортов
красных сортов
красных сортов
131
84
131
84
126
156
126
156
124
140
124
140
тенсивное образование глицерина, меньшее образование ацетальдегида и уксусной кислоты.
Роль эргостерина проявляется также при брожении в условиях повышенной температуры: он позволяет, например, дрожжам лучше выдерживать температуру 37° С и при этом образовывать дополнительно около 4% об. спирта. Действие эргостерина тем эффективнее, чем раньше его вводят во время брожения; но даже и при добавлении в конце он может помочь сбродить больше сахара.
Было взято виноградное сусло сахаристостью 260 г/л. Брожение проводили без доступа воздуха первые 3 дня при 25° С и в последующие 15 дней при 37° С.
Количество сброженного сахара (в г/л) приведено ниже.
Контроль 84 4-5 мг/л эргостерина при забражи- 150 вании
+ 5 мг/л эргостерина через 3 дня 136 при 25° С
Таким образом, подтверждается, что эргостерин активирует брожение и рост дрожжей в анаэробиозе и придает этим процессам характеристики, присущие им в условиях аэробиоза. Эргостерин замещает в некотором роде кислород для дрожжей. Состояние анаэробиоза затрудняет синтез эргостерина, так как достаточно добавить это вещество, чтобы смягчить недостаток кислорода.
Поскольку эргостерин нерастворим, его переводили во время этих экспериментов в состояние стабильной суспензии с помощью Твина-80 (частичный сложный эфир олеиновой кислоты и ангидрида сорбита). Этот продукт вызывает помутнение сусел и вин. Будучи растворимым в спирте при высоких температурах, эргостерин осаждается, когда его добавляют в водную среду. Его можно диспергировать в диатоми
те, но получаемый порошок имеет меньшую активность, чем коллоидная суспензия.
Активностью, аналогичной активности эргостерина, обладают также некоторые стероиды и жирные кислоты с длинной цепью. Некоторые из них входят в состав пруина виноградных ягод, что делает их в свете недавних исследований очень важными для виноделия.
Опыты, проведенные в прошлом, показали неожиданно большое влияние кожицы винограда на анаэробное брожение сусла (табл. 8.5). При этом констатировали, что кожица (мезга) в виде плавающей или погруженной шапки не ускоряла аэробного брожения, но активировала брожение в анаэробных условиях до такой степени, что в присутствии кожицы было сброжено большее количество сахара без доступа воздуха, чем в аэробных условиях. Промывание кожицы водой или разведенным спиртом не уменьшало количества активного вещества.
Таблица 8.5
Влияние кожицы виноградных ягод (Мезги) на брожение сусла
Копичество сахара, сброженного на 5-й тень (в г/л), при добавлении кожицы винограда (100 г/л)
Брожение с доступом воздуха без доступа воздуха
Точно так же и семена винограда несколько активируют брожение и заметно ускоряют рост дрожжей. В одном из опытов популяция дрожжей возросла на 40%, но семена уступают по своему воздействию на ход брожения активаторам сусла.
Экстракт пруинаКоличество дрожжевых клеток через 5 дней (в тыс. на 1 мм3)контроль без пруннапри добавлении экстракта пруина (в г/л)при добавлении эргостерина - (25 мг/л) 4- 4-Твин-80 (2 мл/л)0,370,751,50Экстракт в хлороформе507283102107в эфире1941456694Экстракт пруинаКоличество дрожжевых клеток через 5 дней (в тыс. на 1 мм3)контроль без пруннапри добавлении экстракта пруина (в г/л)при добавлении эргостерина - (25 мг/л) 4- 4-Твин-80 (2 мл/л)0,370,751,50Экстракт в хлороформе507283102107в эфире1941456694Влияние экстрактов пруина на размножение дрожжей в анаэробиозе (по данным Брешо и сотрудников, 1966)Влияние экстрактов пруина на размножение дрожжей в анаэробиозе (по данным Брешо и сотрудников, 1966)
Экстракт пруина
Количество дрожжевых клеток через 5 дней (в тыс. на 1 мм3)
контроль без прунна
при добавлении экстракта пруина (в г/л)
при добавлении эргостерина - (25 мг/л) 4- 4-Твин-80 (2 мл/л)
0,37
0,75
1,50
Экстракт в хлороформе
50
72
83
102
107
в эфире
19
41
45
66
94
Экстракт пруина
Количество дрожжевых клеток через 5 дней (в тыс. на 1 мм3)
контроль без прунна
при добавлении экстракта пруина (в г/л)
при добавлении эргостерина - (25 мг/л) 4- 4-Твин-80 (2 мл/л)
0,37
0,75
1,50
Экстракт в хлороформе
50
72
83
102
107
в эфире
19
41
45
66
94
Влияние экстрактов пруина на размножение дрожжей в анаэробиозе (по данным Брешо и сотрудников, 1966)
Влияние экстрактов пруина на размножение дрожжей в анаэробиозе (по данным Брешо и сотрудников, 1966)
Работы Брешо и сотрудников (1966, 1971) должны были дать объяснение этим явлениям. Авторы готовили экстракты пруина из винограда сорта Гаме вымачиванием гроздей в хлороформе или в эфире. После испарения растворителей полученный экстракт пруина растворяли в абсолютном спирте и добавляли в различных дозах в виноградный сок. В табл. 8.6 приведены некоторые результаты этих опытов. Они показывают положительное действие экстрактов пруина, эргостерина и сложного эфира олеиновой кислоты. Брожение сусла сахаристостью 250 мг/л проводилось под азотом.
Следовательно, по мере того как активные вещества пруина становятся при переработке винограда растворимыми, они ведут себя как факторы роста дрожжей. Брешо и сотрудники (1966) видят в этом явлении объяснение факта хорошего роста дрожжей при виноделии с настаиванием без доступа кислорода.
Между тем известно, что некоторые ненасыщенные жирные кислоты, как олеиновая, линолевая (Нордгейм и Ри- хе, 1966), линоленовая играют в отношении бактерий молочнокислого брожения роль такого же фактора роста, как биотин. Суомалайнен (1965) пока
зал, что в присутствии аспарагиновой кислоты пальмитиновая и олеиновая кислоты также могли бы заменять биотин для Saccharomyces (рис. 8.3).
Наконец, Радлер (1968) в своем исследовании компонентов пруина или кутикулярного воска виноградной ягоды показал, что он наполовину состо-
Рис. 8.3. Рост пекарских дрожжей с применением биотина и без него, но с добавлением аспарагиновой и олеиновой кислот:
1 — без биотина; 2 — олеиновая кислота; 3—■ аспарагиновая кислота; 4— олеиновая кислота; 5 — биотин.
ит из окситерпеновой и олеанолевой кислот. Другая же половина представлена парафинами, альдегидами, сложными эфирами, спиртами, ненасыщенными и насыщенными жирными кислотами большой молекулярной массы (см. гл. 3, раздел «Состав кожицы»). Родство структур олеанолевой кцсло-
Рис. 8.4. Структура некоторых стероидов, участвующих в росте дрожжей.
ты и стеринов дрожжей приведено на рис. 8.4.
Содержание этой кислоты и ненасыщенных жирных кислот в пруине заставили Брешо и сотрудников (1971) поставить перед собой вопрос, не играет ли этот стероид, один или вместе с олеиновой кислотой, какую-то роль в анаэробном росте дрожжей.
Табл. 8.7 составлена по результатам экспериментов этих авторов. Она по- 223 .
зволяет измерять соответствующую эффективность этих различных факторов. Олеанолевая кислота оказывает неоспоримое стимулирующее действие, даже большее, чем у эргостерина. То же самое можно сказать и о смеси олеанолевой и олеиновой кислот при сравнении со смесью эргостерина и олеиновой кислоты. В присутствии стероидов число клеток удваивается или утраивается по отношению к анаэробному контролю и может даже превосходить значения аэробного контроля.
Эти результаты показывают, что олеанолевая кислота, одна или совместно с олеиновой кислотой, способствует росту дрожжей в анаэробных условиях, несмотря па почти полную нерастворимость этого вещества. Этим объясняются стимулирующие свойства пруина винограда в анаэробных условиях, обычно имеющих место при некоторых способах виноделия. Они также могли бы, наверное, объяснить скорость брожения и свою удивительную эволюцию при повышенной температуре в процессах переработки винограда с применением термической обработки перед дроблением.
Активация концентрированными . экстрактами дрожжей
Некоторые активаторы брожения имеют вид пасты или порошка с большей или меньшей интенсивностью окраски и с запахом, напоминающим концентраты для супов. Речь идет об экстрактах гидролизованных дрожжей, богатых усвояемым азотом, факторами роста, иногда минеральными солями. Применение этих экстрактов рекомендуется в бродильной промышленности в повышенных дозах (до 4 г/л). Их использование в виноградном сусле исследовали Бремои и Куртуазье (1955), Сале (1957). Авторы пришли к заключению, что эти препараты очень эффек-
Вещества, добавленные к средеБрожение с доступом воздухаБрожение без доступа воздухадрожжи, ты с./мм3сброженный сахар, г/лдрожжи, тыс./мм*сброженный сахар, г/лКонтроль12491•6759Эргостерин (86 мг/л)——7458Олеанолевая кислота (100 мг/л)——9063Олеиновая кислота (20 мг/л)——6663Эргостерин + олеиновая кислота——8374Олеанолевая кислота +——17789-(-олеиновая кислотаВещества, добавленные к средеБрожение с доступом воздухаБрожение без доступа воздухадрожжи, ты с./мм3сброженный сахар, г/лдрожжи, тыс./мм*сброженный сахар, г/лКонтроль12491•6759Эргостерин (86 мг/л)——7458Олеанолевая кислота (100 мг/л)——9063Олеиновая кислота (20 мг/л)——6663Эргостерин + олеиновая кислота——8374Олеанолевая кислота +——17789-(-олеиновая кислотаВлияние добавления эргостерина, олеанолевой и олеиновой кислот на брожение синтетической среды (по данным Брешо и сотрудников, 1971)Влияние добавления эргостерина, олеанолевой и олеиновой кислот на брожение синтетической среды (по данным Брешо и сотрудников, 1971)Примечание. Данные получены через 48 ч.Примечание. Данные получены через 48 ч..Таблица 8.8.Таблица 8.8
Вещества, добавленные к среде
Брожение с доступом воздуха
Брожение без доступа воздуха
дрожжи, ты с./мм3
сброженный сахар, г/л
дрожжи, тыс./мм*
сброженный сахар, г/л
Контроль
124
91
•67
59
Эргостерин (86 мг/л)
—
—
74
58
Олеанолевая кислота (100 мг/л)
—
—
90
63
Олеиновая кислота (20 мг/л)
—
—
66
63
Эргостерин + олеиновая кислота
—
—
83
74
Олеанолевая кислота +
—
—
177
89
-(-олеиновая кислота
Вещества, добавленные к среде
Брожение с доступом воздуха
Брожение без доступа воздуха
дрожжи, ты с./мм3
сброженный сахар, г/л
дрожжи, тыс./мм*
сброженный сахар, г/л
Контроль
124
91
•67
59
Эргостерин (86 мг/л)
—
—
74
58
Олеанолевая кислота (100 мг/л)
—
—
90
63
Олеиновая кислота (20 мг/л)
—
—
66
63
Эргостерин + олеиновая кислота
—
—
83
74
Олеанолевая кислота +
—
—
177
89
-(-олеиновая кислота
Влияние добавления эргостерина, олеанолевой и олеиновой кислот на брожение синтетической среды (по данным Брешо и сотрудников, 1971)
Влияние добавления эргостерина, олеанолевой и олеиновой кислот на брожение синтетической среды (по данным Брешо и сотрудников, 1971)
Примечание. Данные получены через 48 ч.
Примечание. Данные получены через 48 ч.
.Таблица 8.8
.Таблица 8.8
Активирование брожения продуктами иа основе экстракта
Сброженный сахар (в г/л) через
Количество добавлен-
ного дрожжевого
в
экстракта, г
S
S
5
СМ
<О
*—1
со
Контрольное сусло
32
130
214
242
1
38
157
224
240
2
51
200
246
258
3
51
208
262
272
4
46
197
232
242
тивны для ускорения брожения при малоблагоприятных питательных средах. С их помощью можно получать более высокое содержание спирта.
Авторы сами получили четко выраженное ускорение брожения сусел, применяя такое дополнительное питание дрожжей; результаты этих опытов приведены в табл. 8.8. Оптимальный эффект получается при 3 г/л. Эти продукты не разрешены к использованию в виноделии, кроме того, некоторые из них могут придавать плохой вкус. Их также пробовали применять в технологии производства игристых вин для облегчения вторичного брожения в бу-
тылках, обеспечения лучшей шампанизации и придания более тонкого аромата.
В связи с этими наблюдениями было сообщено, что добавление в сусло (сахаристостью 330 г/л) от 0,5 до 1,0 г/л нуклеиновой или дезоксирибонуклеиновой кислот явно активирует его брожение.
Активирование продуктами грибного происхождения
Нильсен (1937) указал на присутствие в питательной среде Aspergillus niger веществ, способных ускорять рост дрожжей. Этот активатор, отличный от уже изученных факторов роста, является термостабильным и устойчивым к условиям кислотности или щелочности. Он растворим в воде и не растворяется в спирте и эфире.
Активатор Нильсена не является необходимым для дрожжей, но их число и скорость брожения в некоторых средах в его присутствии могут удваиваться. Кислинг (1949) уточнил механизм действия этого продукта; он значительно повышает при забраживании образование и накопление триозофосфатов и тем самым ускоряет сбраживание сахара. Ж. Риберо-Гайон и сотрудники
0) доказали, что этот активатор облегчает глицерино-пировиноградное брожение, что выражается в глубоком изменении процентного содержания вторичных продуктов.
Применение в практике винодетия достаточно очищенного порошка мицелия Aspergillus niger, содержащего активатор Нильсена, получило очень высокую оценку. Ниже изложены некоторые экспериментальные работы, выполненные на энологической станции Бордо.
Свежий мицелий Aspergillus был высушен при низкой температуре, тонко измолот, промыт в спирте, который отбирает от него характерный запах плесени. Это серый порошок мелкозернистого строения, имеет следующий состав (в ,% мае.):
Сухие вещества90,16
Вода'9,84
Зола13,69
Вещества, растворимые вводе9,35
Общий азот3,42
Соответствующие белковыевещества 21,45
Прежде всего была подсчитана активность, полученная в .зависимости от массы использованного мицелия (рис. 8.5). 80 мг мицелия, соответствующие лишь 7,4 мг растворимых веществ, обеспечивают по сравнению с контролем опережение на 33 г сброженного сахара. При добавлении от 0,5 до 1 г расхождение с контролем достигает 50 г. На рис. 8.6 представлены кривые размножения дрожжей в таких- же условиях. В конце брожения общее число дрожжевых клеток возросло на 45% при самом слабом добавлении; оптимальное активирование составляет 80%. Активатор заметно продлевает фазу активности дрожжей. В одном из опытов, когда в контроле было 20 тыс. живых дрожжевых клеток на 1 мм3, эта цифра при активированном брожении увеличивалась более чем в 2 раза.
Фаза отмирания дрожжей, очень быстро протекающая без доступа воздуха, в этом случае была задержана на
gillus niger (в мг/л) на скорость сбраживанияgillus niger (в мг/л) на скорость сбраживаниясахара:сахара:
gillus niger (в мг/л) на скорость сбраживания
gillus niger (в мг/л) на скорость сбраживания
сахара:
сахара:
1 — контроль; 2 — 80; 3 — 2000; 4 — 500.
Рис. 8.6. Влияние порошка мицелия Aspergillus niger (в мг/л) на размножение дрожжей: '
1 — контроль; 2 — 80; 3—150; 4 — 500.
дней, что обеспечило более полное сбраживание. '
Присутствие активаторов в мицелии Botrytis
Свойство мицелия содержать в себе активаторы для дрожжей может быть распространено на некоторое число
плесневых грибов (Ж. Риберо-Гайон и сотрудники, 1952).
В процессе наблюдений было отмечено, что мицелии различных рас Botrytis cinerea были способны после промывки, сушки и измельчения ускорять брожение таким же образом, как и мицелии Aspergillus niger. Ниже приведены данные об ускорении, которое дает по отношению к контролю добавление 0,5 г/л различных мицелий в высушенном состоянии и об увеличении популяции дрожжей, которое при этом происходит. Ускорение выражено количеством граммов сахара, дополнительно сброженного на 5-й день (табл. 8.9).
Таблица 8.9
Влияние мицеляя грибов на брожение
Виды плесеней
Ускорение брожения
Увеличение ^ числа дрожжевых клеток, %
Aspergillus oryzae
58
0
Penicillum notatum
77
50
Botrytis cinerea, albino sclerotia
59
32
Botrytis cinerea lini
58
20
Из Botrytis cinerea, культивируемой на виноградном сусле, можно приготовить порошок, обладающий стимулирующими свойствами. После выращивания мицелий отделяют от среды, измельчают, перетирают, несколько раз промывают (с целью удалить антибиотики, которые он содержит), обезжиривают, дезодорируют и обезвоживают, обрабатывая спиртом. Затем просушивают при температуре ниже 100° С и измельчают в порошок.
Заключение
На основе результатов сравнительного исследования активирующих веществ, которые рассмотрены в этой гла
ве, были построены графики (рис. 8.7 и 8.8). В данном случае видно, что помимо стеринов, стероидов активатор Нильсена является одним из наиболее сильнодействующих на размножение дрожжей и на эволюцию брожения (см. рис. 8.7).
Рис. 8.7. Влияние различных активаторов брожения виноградного сусла на содержание сброженного сахара:
1 — контроль; 2— аммиак; 3—витамин Вц 4— активатор Aspergillus niger.
Рис. 8.8. Влияние различных активаторов брожения виноградного сусла на размножение дрожжей:
1 — контроль; 2 — ацетальдегид или пировиноградная кислота; 3— витамин Bi; 4— аммиак и активатор Aspergillus niger.
Кантарелли (1957) провел важное исследование различных активирующих веществ для брожения сусла и для
дображивания вин с остаточным сахаром. К продуктам, давшим хорошее ускорение брожения, относятся азотистые вещества в аммиачной, аминной или -амидной форме. Азотистый и витаминный препарат, упоминавшиеся в разделе «Влияние обогащения сусла факторами роста», дал хорошие результаты, так же как и комплексные продукты на базе экстрактов из дрожжей, и, наоборот, фосфаты, олигоэлементы, витамины, нуклеиновые кислоты и их производные, промежуточные продукты брожения были малоэффективными (см. рис. 8.8).
Сусло и дробленый виноград представляют собой среду, которая может быть очень изменчивой в зависимости от сорта, экспозиции, года урожая. Из- за этих причин добавление аммиачного азота, которое было благоприятным при выработке вина в данном сезоне, может оказаться безрезультатным в следующем году, если условия созревания обеспечили накопление достаточного количества этого вещества. Это же относится и к тиамину. Такие изменения в эффективности активирующего' продукта в экспериментах и в производственных условиях объясняются трудностью определения состава исходного сырья. Количественные анализы различных природных активирующих факторов винограда в условиях производства обычно неприменимы.
Активаторы грибного происхождения могут до некоторой степени восполнять недостаточность азотистых веществ или витаминов, но они всегда способствуют спиртовому брожению. Они действуют очень слабыми дозами, если учесть, что растворимой и действительно эффективной бывает едва лишь Vio часть применяемой дозы. Они же оказывают влияние на аромат готового продукта. Большой интерес представили бы опыты по идентификации активных веществ, отличных от ранее рассматри
вавшихся витаминов, как в теоретическом плане, так и для практики. Действительно, нужно признать, что такие активирующие продукты существуют в загнившем винограде (совместно с ингибирующими веществами) и они необходимы для виноделия в районах, где виноград поражается гнилью, и в частности «благородной гнилью».
Открытие в пруине винограда веществ, которые стимулируют активность дрожжей именно в условиях анаэробиоза, обычных для виноделия, весьма важно для активирования дрожжей.
ЛИТЕРАТУРА
Andreasen A. A. et Stier Т. J. В. (1953>, J. Cell. Comp. Physiol., 41, 23. (1954) Ibid., 43, 271.
Beech F. W. (1969). Yeast Symposium. Antonie van Leeuwenhoek, vol. 35, F 11.
Brechot P., Chauvet J., Croson M. et Irrmann R. (1966), C. R. Acad. Set, 263, 1004.
Brechot P., Chauvet J., Dupuy R, Croson M. et Rabatu A. (1971), Ann. Technol. agric., 20, 103, C. R. Acad. Sci., 272, 890.
Bremond E. et Courtoisier J. (1955), Vignes et Vins, n° 41, p. 12.
Cantarelli C. (1957), Amer. J. Enol., 8, 167.
Castor J. G. B. (1953), Applied Microb., 1, 97.
Chauvet J., Brechot P., Croson M. e t Irrmann R. (1966), Ann. Technol. agric., 15, 99.
F 1 a n z у M. e t Banos M. (1938), C. R. Acad. Agric., 24, 98.
Fl anz у M. et Ournac A. (1963), Ann. Technol. agric., 12, 65.
Genevo is L. et Flavier H. (1939), Bull. Soc. Biol., 130, 497.
H a 11 A. P., Brenner L., Amerine M. A. et Morgan A. F. (1956), Food Research, 21. 362.
Ki ess ling W. (1949), Ind. agric, alim., 66, 111.
Lafon M. (1955), Contribution a 1’etude de la formation des produits secondaires de la fermentation alcoolique, These Sci. Phys., Bordeaux.
Lafon - Lafourcade .S., Blouin J., S u d-
raud P. et Peynaud E. (1967), C. R. Acad, agric., 53, 1046.
Lafon-Lafourcade S. et Peynaud E. (1958), Ann. Technol. agric., 7, 303."
Lafourcade S. (1954), Contribution a 1’etu- dur des activateurs et des inhibiteurs de la fermentation alcoolique des mouts de raisin, These Doct. Ing., Bordeaux.
Lafourcade S. (1956), Ind. agric, alim., 73, 779.
Maugenet J. e t Dupuy P. (1964), Ann. Techn. agric., 13, 329.
Nordheim W. et Rieche A. (1966), Na- turwissenschaft, 53, 114.
Ournac A. (1969), Ann. Technol. agric., 18, 187 et 199.
Ournac A. (1970), Ann. Technol. agric., 19, 5 et 285.
Peynaud E. et Lafourcade S. (1954), Xе Congres intern. Ind. agric, alim., Madrid (1957). IIе Colloque intern, qualite vegetate, Paris, Bull. Soc. Phys. Veget., 3, 60. (1958), Ann. Inst. Pasteur, 94, 78.
Peynaud E. et Lafourcade S. (1955), Ann. Technol. agric., 4, 381. C. R. Acad. Sci., 241, 127. Ind. agric, alim., 72, 575 (1956) C. R. Acad. Sci., 243, 1800 (1957). Ann. Technol. agric., 6, 301. Rev. Ferm. Ind. alim., 12, 9. Ind. agric, alim., 74, 897.
Radler F. (1968), Conn. Vigne Vin. 2, 271. R i b ё r e a u-G а у о n J. et Peynaud E. '(1952), C. R. Acad. Agric., 39, 444.
Ribereau-Gayon J., Peynaud E. et Lafon M. (1950), C. R. Acad. Sci., 67, 477.
R i b e r e a u-G а у о n J., Peynaud E. e t Lafon M. (1954), C. R. Acad. Sci., 239 1549.
Ribereau-Gayon J., Peynaud E. et Lafourcade S. (1952), C. R. Acad. Sci., 234, 251 et 478.
R i b ё r e a u-G а у о n J., Peynaud E. e t: Lafourcade S. (1955), Rev. Ferm. Ind. alim., 10, 119. (1956). Bull. Soc. Chim biol.v 38, 923
Sailer W. (1957), Mitteilungen, 7, 265.
S c h a m i s D. L„ К u r d i n a R. M. e t S a i - kewa L. K. (1963), d’apres Vitis (1965), 6, 160.
Starr P. R. et Parks L. W. (1962), J. Cell.
Comp. Physiol., 59, 107.
Suomalainen H. (1965), Mitt. Versuch.
Garungs., 19, 27.
Suomalainen H., Nurminen T., V i- hervaara K. et Oura E. (1965), J. Inst. Brew., 71, 227.
Weinfurtner F., Eschenbecker F. et Borges W. D. (1959), Zent. Bakt. Parasit. Infekt. Hyg., 113, 134.
Verona O. e t P i с c i G. (1954), Annali Spe- rim. agrar., 12, 105.
Wiken T., Somm A. et Sulzer F. (1954), Archiv. fiir Mikrob., 20, 201.
Wiken T. et Agthe C. (1958), Archiv. fiir Mikrob., 31, 289.
W i n d i s c h S., В о e r n e r G., J a n s e n S. e t Stern I. (1967), Branntwein Wirtsch., 107, 429.
Глава 9. ЯВЛЕНИЯ
ИНГИБИРОВАНИЯ ДРОЖЖЕЙ
Термин «ингибирование» применяется здесь в смысле торможения и остановки активности дрожжей, замедления и подавления их развития. Известно большое число химических веществ (антисептических или противогрибковых), которые препятствуют активности или размножению дрожжей.
Наблюдения показывают, что брожение виноградного сока уже само по себе представляет прогрессивно замедляющийся процесс. Это отчетливо проявляется на кривых брожения и росте дрожжей.
В одном из экспериментов, например, констатировали, что при сбраживании первых 85 г сахара на 1 л сусла, которое потребовало 48 ч, образовалось 60 000 дрожжевых клеток на 1 мм3, тогда как сбраживание остальных 60 г, длившееся 6 дней, дало только 3 000 клеток, следовательно, размножение дрожжей и брожение среды по мере их продолжения становятся все более и более трудными.
Интенсивность брожения снижается по двум причинам: в результате уменьшения в среде кислорода, легкоусвояе-
Добавление •спирта к суслу до спиртуозности, % об.Забр? жи- вание черезЧисло дрожжевых клеток, тыс ./мм8Достигнутая спиртуозиость, % об.Количествоостаточного сахара.образовавшегося спирта, % об.ассимилированного азота,глицерина, ммоль01 день8014,0214,02525712 дня6914,8213,82336522 »6715,6613,62336543 »6517,0813,02026864 »6218,21512,21947285 дней4518,05010,0126741012»3016,01256,08180Добавление •спирта к суслу до спиртуозности, % об.Забр? жи- вание черезЧисло дрожжевых клеток, тыс ./мм8Достигнутая спиртуозиость, % об.Количествоостаточного сахара.образовавшегося спирта, % об.ассимилированного азота,глицерина, ммоль01 день8014,0214,02525712 дня6914,8213,82336522 »6715,6613,62336543 »6517,0813,02026864 »6218,21512,21947285 дней4518,05010,0126741012»3016,01256,08180Брожение в присутствии спирта в условиях полуаэробиоза (при 25° С)Брожение в присутствии спирта в условиях полуаэробиоза (при 25° С)мых азотистых веществ и др. и вследствие образования веществ, способных тормозить нормальную активность дрожжей. Это главным образом спирт, который играет роль ингибитора. Замедляющее действие углекислого газа проявляется только в особых условиях, под давлением, когда он не может свободно выделяться из бродящей среды.
Добавление •спирта к суслу до спиртуозности, % об.
Забр? жи- вание через
Число дрожжевых клеток, тыс ./мм8
Достигнутая спиртуозиость, % об.
Количество
остаточного сахара.
образовавшегося спирта, % об.
ассимилированного азота,
глицерина, ммоль
0
1 день
80
14,0
2
14,0
252
57
1
2 дня
69
14,8
2
13,8
233
65
2
2 »
67
15,6
6
13,6
233
65
4
3 »
65
17,0
8
13,0
202
68
6
4 »
62
18,2
15
12,2
194
72
8
5 дней
45
18,0
50
10,0
126
74
10
12»
30
16,0
125
6,0
81
80
Добавление •спирта к суслу до спиртуозности, % об.
Забр? жи- вание через
Число дрожжевых клеток, тыс ./мм8
Достигнутая спиртуозиость, % об.
Количество
остаточного сахара.
образовавшегося спирта, % об.
ассимилированного азота,
глицерина, ммоль
0
1 день
80
14,0
2
14,0
252
57
1
2 дня
69
14,8
2
13,8
233
65
2
2 »
67
15,6
6
13,6
233
65
4
3 »
65
17,0
8
13,0
202
68
6
4 »
62
18,2
15
12,2
194
72
8
5 дней
45
18,0
50
10,0
126
74
10
12»
30
16,0
125
6,0
81
80
Брожение в присутствии спирта в условиях полуаэробиоза (при 25° С)
Брожение в присутствии спирта в условиях полуаэробиоза (при 25° С)
ВЛИЯНИЕ СПИРТА НА АКТИВНОСТЬ ДРОЖЖЕЙ
Спирт, образующийся при брожении, парализует активность дрожжей. Присутствие спирта уменьшает и затем останавливает ассимиляцию азотистых веществ. Это одна из причин постепенного прекращения брожения при определенном значении спиртуозности, а также одна из причин, из-за которых вино всегда бродит не так легко, как сусло, и потому иногда трудно вызвать дображивание остаточного сахара в красных винах-недобродах, особенно при повышенной спиртуозности. Концентрация спирта, способная блокировать брожение, зависит среди прочих факторов от вида дрожжей.
Действие этанола на различные функции дрожжей исследовано достаточно хорошо (Грей, 1941; Ферро, 1949;
Пиччи. 1955). Добавление спирта в питательную среду ведет к удлинению латентной фазы, которая находится в прямой зависимости от количества присутствующего спирта; экспоненциальная фаза роста удлиняется, и общий рост снижается. Повышение температуры еще более усиливает ингибирующее действие спирта. Спирт подавляет рост дрожжей и уменьшает скорость брожения даже при небольшом процентном содержании, начиная с забра- живания, как это показывает следующий эксперимент. Сбраживали виноградное сусло, содержавшее 252 г/л сахара, после того, как в него предварительно вводили различные дозы спирта. В табл. 9.1 приведены некоторые результаты этих опытов.
Присутствие спирта выражается в задержке забраживания, а число дрожжевых клеток к концу брожения тем меньше, чем выше исходная спиртуоз- ность. Количество сброженного сахара и соответственно образовавшегося спирта также уменьшается в присутствии спирта. Дрожжи усваивают азот тем меньше, чем больше спиртуозность среды. Глицерино-пировиноградное брожение облегчается за счет нормальных реакций гликолиза.
Измерения ферментной интенсивно-
Таблица 9.2
Влияние спирта иа ферментную интенсивности дрожжей Qco, • мм3 газа на 1 мг
дрожжей за 1 ч
Сг.иртуозность спирта, % об.
Sacch, ellip- soideus
Sacch, ovifor-
0
329
343
3
297
272
6
232
240
9
120
170
12
68
122
15
57
75
сти на аппарате Варбурга в присутствии спирта также дают интересные результаты; они приведены в табл. 9.2 в отношении двух видов дрожжей.
Необходимо уточнить, что корреляции между спиртоустойчивостью той или иной расы дрожжей и ее способностью образовывать спирт может и не быть. Некоторые дрожжи могут проявлять активность при более высокой концентрации внесенного спирта, чем при спиртуозности, образованной самими дрожжами.
Другие спирты также оказывают ингибирующее действие на дрожжи. Их интенсивность прямо пропорциональна числу атомов углерода и обратно пропорциональна растворимости этих спиртов в воде. Первичные спирты более токсичны, чем вторичные и третичные.
Кроме того, некоторые наблюдения дают основание предполагать, что в процессе брожения образуются летучие вещества, способные тормозить это явление. Опыты по брожению в присутствии жидкости, полученной при охлаждении до 20° С газа, выделившегося из винограда во время сбраживания, показывают, что этот конденсат содержит другие ингибирующие вещества помимо спирта. Сложные эфиры, в частности сложные эфиры высших
спиртов, которые здесь находятся в изобилии, могли бы быть активными веществами брожения.
^тс касается ингибирующего действия углекислого газа, выделяющегося в процессе брожения, оно больше всего проявляется в случае брожения под давлением; в условиях обычного виноделия, когда образующийся углекислый газ удаляется из среды, практически не наблюдается ингибирующего эффекта: Отмечают, что брожение почти не активируется, если в порядке эксперимента откачивают с помощью вакуум-насоса углекислый газ по мере его образования, но легко задерживается при создании небольшого внутреннего давления в резервуарах.
ВЛИЯНИЕ САХАРИСТОСТИ СУСЛА
В среде, содержащей лишь несколько граммов сахара на 1 л, спиртовое брожение протекает медленно. Скорость процесса увеличивается с возрастанием содержания сахара до 15 или 20 г/л. Винные дрожжи свободно сбраживают сахар при содержании от 100 до 200 г/л. Но более высокая исходная концентрация сахара обладает ингибирующим действием, которое складывается с подобным же действием спирта и способствует преждевременной остановке брожения. Этот эффект ощущается с момента забражива-’ ния и проявляется по мере развития брожения. В предыдущей главе (раздел «Влияние температуры на скорость и предел брожения виноградного сусла») приводилась та часть опыта (Мюллера-Тургау, 1884), которая показывает, что в конечном счете при сахаристости сусла 303 г образуется меньше спирта, чем при сахаристости 217 г. Вот еще один эксперимент влияния очень высокого содержания сахара.
Сахаристость сусла, г/л 370; 420; 470 550; 750
Спиртуозность за 2 мес., % об. 8,6; 6,3; 5,9; 3,4;0
Таким образом, виноградное сусло концентрацией до 36° Боме практически несбраживаемо (иногда констатируют лишь незначительное развитие дрожжей иа поверхности, в зоне с разжиженной влажностью воздуха из-за гигроскопичности продукта).
Ингибирование сахаром объясняется явлением осмоса: если дрожжевую клетку поместить в раствор сахара с осмотическим давлением, более сильным, чем давление содержимого ее вакуолей, эта клетка будет более или менее плазмолизована. В этом случае под микроскопом дрожжевые клетки выглядят как бы съежившимися, морщинистыми и значительно меньших размеров, чем обычно. Существуют дрожжи, более способные развиваться в концентрированных сахарных растворах, в частности Sacch. rouxii; их называют осмофильными дрожжами.
В прошлом был установлен эмпирический показатель стабильности ликерных вин (Делле). Этот показатель является функцией одновременно и сахаристости, и спиртуозности и суммирует их ингибирующие свойства. Аме- рин и Канки (1965)' Дали по этому вопросу разработку и список литературы.
Фенольные вещества в больших дозах, в которых они встречаются в винах некоторых сортов, и красящее вещество красного винограда могут в некоторых случаях тормозить активность дрожжей, фиксируясь а стенках дрожжевых клеток и затрудняя таким образом их обмен со средой. Трудности и остановки брожения, по-видимому, имеют место особенно в те годы, когда в винограде отмечается много фенольных и красящих веществ. Сиковец (1966) исследовал влияние полифенолов на дрожжи. Некоторые из них оказывают активирующее действие, другие
же ингибируют размножение, дыхание и ферментную активность дрожжей; возможна также ассимиляция некоторых из этих веществ дрожжами.
ВЕЩЕСТВА, ИНГИБИРУЮЩИЕ ДРОЖЖИ
Известно много категорий продуктов, оказывающих ингибирующее действие на микроорганизмы:
наркотики — вещества, обычно растворимые в маслах, которые блокируют все функции клеток, но действие их является обратимым. После их удаления клетки восстанавливают свою активность. Это карбиды, высшие спирты, простые или галогенные;
антисептики, способные убивать клетки. К этой группе, особенно распространенной и разнообразной, относятся бензойная и салициловая кислоты и их производные, фториды, сернистая кислота в больших дозах и при низком pH, аллилизотиоцианат и др.;
специфические ингибиторы брожения, способные блокировать спиртовое и молочнокислое брожение клетки, однако без прекращения ее дыхания и роста, по крайней мере, в узкой зоне концентраций. Это а-галогенные кислоты, такие, как монобромуксусная. При повышенных дозах или в кислых средах эти вещества входят в категорию обычных антисептиков;
некоторые поверхностно-активные ионизирующие вещества с сильной смачивающей и пенообразующей способностью, например четвертичные соли аммония;
антивитамины — вещества, близкие по своему химическому составу к некоторым факторам роста; они блокируют метаболизм и вызывают гибель клетки. Это вещества, аналогичные
сульфамидам, антивитаминам пара- аминобензойной кислоты;\фунгициды — химические вещества, образующиеся чаще всёго путем синтеза и действующие противуплесе- ней, грибов и дрожжей. Эти продукты находят практическое применение в садоводстве и виноградарстве в качестве пестицидов (действуют на мил\ дью винограда, на Botrytis cinerea); \антибиотики — вещества, образуемые плесневыми грибками, актино- мицетами или бактериями, которые оказываются способными ингибировать рост других микроорганизмов или даже разрушать их, тогда как большая часть перечисленных продуктов действует в большей или меньшей степени на все микроорганизмы. Антибиотики по своему ингибирующему воздействию являются очень специфичными, например некоторые активны только против отдельных категорий бактерий, другие же действуют только на определенные виды дрожжей.Дрожжевые клетки относительно устойчивы к различным антисептическим агентам. Они имеют сравнительно большие размеры и толстую мембрану. Такие клетки противопоставляют среде своего обитания определенную клеточную автономию. Бактерии же значительно более уязвимы. Например, если для ингибирования бактерий достаточно нескольких миллиграммов свободной сернистой кислоты, то для дрожжей в этом случае ее требуется в 10 раз больше.Ингибирующие продукты очень различны по своему химическому составу и механизму действия. Они парализуют ту или другую клеточную функцию, действуя против одного или многих ферментов и блокируя таким образом жизнедеятельность клеток. Некоторые из них убивают дрожжи; говорят, что они обладают фунгицидным действием. Другие парализуют только рост и засульфамидам, антивитаминам пара- аминобензойной кислоты;\фунгициды — химические вещества, образующиеся чаще всёго путем синтеза и действующие противуплесе- ней, грибов и дрожжей. Эти продукты находят практическое применение в садоводстве и виноградарстве в качестве пестицидов (действуют на мил\ дью винограда, на Botrytis cinerea); \антибиотики — вещества, образуемые плесневыми грибками, актино- мицетами или бактериями, которые оказываются способными ингибировать рост других микроорганизмов или даже разрушать их, тогда как большая часть перечисленных продуктов действует в большей или меньшей степени на все микроорганизмы. Антибиотики по своему ингибирующему воздействию являются очень специфичными, например некоторые активны только против отдельных категорий бактерий, другие же действуют только на определенные виды дрожжей.Дрожжевые клетки относительно устойчивы к различным антисептическим агентам. Они имеют сравнительно большие размеры и толстую мембрану. Такие клетки противопоставляют среде своего обитания определенную клеточную автономию. Бактерии же значительно более уязвимы. Например, если для ингибирования бактерий достаточно нескольких миллиграммов свободной сернистой кислоты, то для дрожжей в этом случае ее требуется в 10 раз больше.Ингибирующие продукты очень различны по своему химическому составу и механизму действия. Они парализуют ту или другую клеточную функцию, действуя против одного или многих ферментов и блокируя таким образом жизнедеятельность клеток. Некоторые из них убивают дрожжи; говорят, что они обладают фунгицидным действием. Другие парализуют только рост и за
сульфамидам, антивитаминам пара- аминобензойной кислоты;\
фунгициды — химические вещества, образующиеся чаще всёго путем синтеза и действующие противуплесе- ней, грибов и дрожжей. Эти продукты находят практическое применение в садоводстве и виноградарстве в качестве пестицидов (действуют на мил\ дью винограда, на Botrytis cinerea); \
антибиотики — вещества, образуемые плесневыми грибками, актино- мицетами или бактериями, которые оказываются способными ингибировать рост других микроорганизмов или даже разрушать их, тогда как большая часть перечисленных продуктов действует в большей или меньшей степени на все микроорганизмы. Антибиотики по своему ингибирующему воздействию являются очень специфичными, например некоторые активны только против отдельных категорий бактерий, другие же действуют только на определенные виды дрожжей.
Дрожжевые клетки относительно устойчивы к различным антисептическим агентам. Они имеют сравнительно большие размеры и толстую мембрану. Такие клетки противопоставляют среде своего обитания определенную клеточную автономию. Бактерии же значительно более уязвимы. Например, если для ингибирования бактерий достаточно нескольких миллиграммов свободной сернистой кислоты, то для дрожжей в этом случае ее требуется в 10 раз больше.
Ингибирующие продукты очень различны по своему химическому составу и механизму действия. Они парализуют ту или другую клеточную функцию, действуя против одного или многих ферментов и блокируя таким образом жизнедеятельность клеток. Некоторые из них убивают дрожжи; говорят, что они обладают фунгицидным действием. Другие парализуют только рост и за
сульфамидам, антивитаминам пара- аминобензойной кислоты;\
фунгициды — химические вещества, образующиеся чаще всёго путем синтеза и действующие противуплесе- ней, грибов и дрожжей. Эти продукты находят практическое применение в садоводстве и виноградарстве в качестве пестицидов (действуют на мил\ дью винограда, на Botrytis cinerea); \
антибиотики — вещества, образуемые плесневыми грибками, актино- мицетами или бактериями, которые оказываются способными ингибировать рост других микроорганизмов или даже разрушать их, тогда как большая часть перечисленных продуктов действует в большей или меньшей степени на все микроорганизмы. Антибиотики по своему ингибирующему воздействию являются очень специфичными, например некоторые активны только против отдельных категорий бактерий, другие же действуют только на определенные виды дрожжей.
Дрожжевые клетки относительно устойчивы к различным антисептическим агентам. Они имеют сравнительно большие размеры и толстую мембрану. Такие клетки противопоставляют среде своего обитания определенную клеточную автономию. Бактерии же значительно более уязвимы. Например, если для ингибирования бактерий достаточно нескольких миллиграммов свободной сернистой кислоты, то для дрожжей в этом случае ее требуется в 10 раз больше.
Ингибирующие продукты очень различны по своему химическому составу и механизму действия. Они парализуют ту или другую клеточную функцию, действуя против одного или многих ферментов и блокируя таким образом жизнедеятельность клеток. Некоторые из них убивают дрожжи; говорят, что они обладают фунгицидным действием. Другие парализуют только рост и за
трудняют распускание почек; их называют фунгистатическими. Один и тот же продукт может быть фунгистатиче- ским при слабой дозе и фунгицидным при сильных дозах. Таким же образом различают продукты бактерицидные и бактериостатические в зависимости от их действия на бактерии.
Разумеется, что применение этих продуктов для консервации вина категорически запрещено, за исключением сернистого ангидрида и сорбиновой кислоты, разрешенной во Франции с 1959 г. для использования в ограниченных дозах. Известны преимущества и эффективность сернистого ангидрида для предотвращения микробиальной порчи красных вин и дображивания сладких вин. Известны также и неудобства его применения в завышенных дозах, поэтому понятна необходимость изыскания других продуктов, которые могли бы заменить сернистый ангидрид, хотя, конечно, можно совершенствовать и дальше способы его применения. Однако для того чтобы получить право на технологическое использование с обеспечением достаточной эффективности, такие продукты должны отвечать требованиям в первую очередь абсолютного отсутствия токсичности, затем нейтральности в отношении органолептических характеристик и, наконец, стабильности. Именно в результате исследований такого рода было разрешено использование сорбиновой кислоты.
В намерения авторов не входит исчерпывающее исследование различных продуктов, способных ингибировать дрожжи. Перечень основных препаратов дан в соответствующих таблицах предыдущего издания (т. 1). С тех пор появилось много нового. Активные дозы зависят от многих факторов, они различны в суслах и в винах и в отношении их дозы во многом зависят от степени опиртуозности, фактической
кислотности, содержания усвояемого азота и т. д.
Авторы рекомендуют основные публикации по этому вопросу: Риберо- Гайон и сотрудники, 1952, 1958; Рибе- ро-Гайон и Пейно, 1952; Пейно, 1952; Пейно и С. Лафуркад, 1953; Пейно и сотрудники, 1957; С. Лафуркад, 1955.
Имеется большое количество работ по продуктам-консервантам, в том числе: Шормюллер, 1959; Рем, 1959, 1960, 1961.
Химические антисептики
Ниже перечислены химические антисептики и антибиотики, которые строго запрещается добавлять в напитки (за исключением сорбиновой кислоты, допускаемой в винах в концентрации, не превышающей 200 мг/л).
Бензойная, параоксибензойная, борная кислота и бораты — активная доза для сусла 1000 мг/л, для вина — от 200 до 500 мг/л.
Парахлорбензойная кислота и ее соли — слабый фунгицид; активные дозы для вина от 20 до 50 мг/л.
Дигидроуксусная кислота — фунги- статична; активные дозы для вина от 100 до 200 мг/л.
Фтористоводородная (плавиковая) кислота и ее соли (20 мг/л) замедляют брожение сусла и удваивают его продолжительность; дозы консервации вина от 30 до 50 мг/л.
Монобромуксусная кислота, монохлоруксусная кислота, их соли и сложные эфиры. Ядовиты для метаболизма; активные дозы для сусла от 20 до 30 мг/л, для вина — от 2 до 10 мг/л.
Салициловая кислота и ее соли — малоактивна; активные дозы для сусла от 500 до 1000 мг/л; для вина — от 200 до 500 мг/л.
Сорбиновая кислота — фунгистатич- на, блокирует бродильную функцию. Активные дозы для сусла от 500 до 236
1000 мг/л; для вина — от 100 до 200 мг/л.
Гераниевая кислота — оказывает фунгистатическое и бактериостатическое действие в тех же дозах, как и сорбиновая кислота.
Соли четвертичного аммония — продукт для очистки винодельческих емкостей.
Серебро (металлическое, ионизированное или коллоидное) —■ фунгицид, продолжительность действия ограничена; брожению не мешает, уменьшает сбраживаемость сусел и вин.
Каптан — фунгицид. В дозах от 30 до 50 мг/л останавливает брожение. Дозы консервации вина от 5 до 10 мг/л; малостабильный продукт.
Этиловый эфир хлоругольной кислоты (Матта, 1963) — неустойчивый фунгицид.
Октил галл ат (Лонжен, 1967) —фун- гистатичного действия. Активные дозы для сусла 50 мг/л; для вина — 10 мг/л.
Аллилизотиоцианат (эссенция горчицы) — фунгистатичный, без воздействия на метаболизм; не может остановить дображивание, но препятствует его началу. Активные дозы для сусла 10 мг/л; для вина — 2 мг/л.
5-нитрофурилакриловая кислота — активные дозы для сусла от 20 до 100 мг/л, для вина — 5 мг/л (С. Ла- фон-Лафуркад, 1974).
Нитрид натрия —- блокирует метаболизм дрожжей. Опасный протоплазменный яд. Активные дозы для сусла от 5 до 10 мг, для вина — от 1 до 2 мг/л.
Этилпирокарбонат —- фунгицид, химический стерилизант. Активные дозы для вина 100 мг/л.
Противогрибковые антибиотики
Актидион (циклогексимид) — фун- гистатический; действует только на рост. Активные дозы для сусла 10 мг/л, для вина—от 0,2 до 0,5 мг/л. Некого-
рые виды дрожжей выдерживают до 100 мг/л. \
Амфотерицин •— фунгистатический; активные дозы для сусла>20\г/л; для вина — от 0,5 до 5 мг/л. \
Антимицин А — фунгистатический; активные дозы для сусла>50 мг/лфпля вина — 0,5 мг/л. \
Кандицидин — фунгистатическииух активные дозы для сусла 20 мг/л, для
вина — 7 мг/л.
Фреквентин — фунгицид; останавливает брожение при дозе 20 мг/л.
Фунгихромин —■ фунгицид; активные дозы для сусла 5 мг/л, нестабилен в вине.
Микостатин — фунгицид; стерилизует среду или останавливает брожение при дозе 25 мг/л, нестабилен.
Микосубтилин — фунгистатический; активные дозы для сусла и для вина от 2 до 10 мг/л.
Натулин — малоактивен; был идентифицирован в винограде, пораженном зеленой гнилью.
Плеоцидин — фунгистатический; активные дозы для вина от 2 до 20 мг/л.
Трихомицин —■ фунгицид, менее активный, чем микостатин; дозы, необходимые для сусла и вина, 50 мг/л.
Виридин — фунгицид; активные дозы для сусла и вина от 10 до 20 мг/л.
Одно из направлений этих исследований получило особое развитие, а именно относительно влияния пестицидов на микрофлору винограда и на брожение мезги. Под пестицидом понимают такой химический продукт, который отдельно или в смеси с другими веществами используют как инсектицид, фунгицид, гербицид и т. д. для борьбы с вредителями растений и урожая. В случае винограда, пестициды, используемые против мильдью, черной плесени, серой плесени, являются фунгицидами.
Можно было бы привести много работ, опубликованных во Франции и в
других странах в области исследования последствий обработок виноградных насаждений на брожение. К числу их относятся труды: Минарик и Рагала, 1966; Гуртер и сотрудников, 1966; Эрен- хардт и Якоб, 1968; Лемперле и сотрудников, 1971; Белин и сотрудников, 1971; Касиньяр, 1972.
Ниже сравнивается задерживающее действие основных продуктов обработок, добавляемых из расчета 10 мг/л в виноградное сусло, обсемененное дрожжами.
\Дни задержки на-
х Пестицидычала брожения сус
ла при дозе 10 мг/л
Каптан5
Фальтан3
Дифолатаи4
Евпарен (дихлофлюанид)2
Пельт 44 (метилтиофаиат)0
Бенлат (беномил)0
Склекс (дихлозолин)0
Дитиокарбаматы0
Фунгициды, содержащие серу или хлор, обладают наиболее сильно выраженными противодрожжевыми свойствами; это каптан, фальтан и дифолатан, в особенности последний. Дихлорфлю- анид также имеет довольно выраженные фунгицидные и фунгистатические свойства. На практике нередко констатировали задержку брожения сусел из винограда, обработанного за несколько дней до уборки. Достаточное обсеменение дрожжами позволяет преодолеть этот недостаток, но трудности с завершением брожения можно приписать присутствию этого препарата для борьбы с плесенью. С другой стороны, дитиокарбаматы действуют на дрожжи только при повышенных дозах, порядка 0,5 г/л, и, следовательно, значительно выше концентраций, применяемых в винодельческом производстве.
Гераниевая кислота
(СН3)2 - С = СН - СН2— СН2 - С'— СН3
II II
НС - соон
является ингибирующим продуктом, явно более многосторонним, чем сорбиновая кислота. При дозах, близких к 200 мг/л, она оказывает заметное действие на пленчатые дрожжи, а также на бактерии уксуснокислого и молочнокислого брожения. Но при этой дозе продукт приобретает запах и вкус, несвойственные вину.
Механизм действия ингибиторов на метаболизм дрожжей
Эффект действия ингибиторов на интенсивность дыхания (Со,) и на интенсивность брожения q£q= одной из рас Sacch. ellipsoideus был определен посредством манометрического аппарата Варбурга. Измерения проводили в фосфатном буфере с pH 3,8. Оперировали только с известной сухой массой молодых клеток, культивированных на жидкой синтетической среде и выделенных центрифугированием после 48 ч роста, затем промытых и помещенных в воду в виде суспензии. Интенсивность дыхания определяли при 25°С на молочной кислоте, а интенсивность брожения — на глюкозе в условиях анаэробиоза, полученного длительным продуванием углекислым газом.
В табл. 9.3 приведены значения газообмена в опытах с различными продуктами.
Из табл. 9.3 видно, что доза микостатина 5 мг/л ингибирует 80% дыхания дрожжей и полностью останавливает брожение. Его активность во многом зависит от pH; этот антибиотик в 2 раза более активен при pH 3,8, чем при pH 4,8, и в 10 раз более активен при pH 3,8, чем при pH 7,0. Многие вещества вызывают ингибирование такого же типа, как и микостатин.
В предшествующем издании этого труда описано в качестве примера детальное исследование механизма антигрибкового действия микостатина.
Влияние различных веществ на интенсивность дыхания и брожения у Sacch. ellipsoideus (в мм3 газа на 1 мг сухих дрожжей за 1 ч)
Вещества
Добавляемая доза, мг/л
Q^
Контроль
—
23
197
Актидиои
100
18
№5
Сернистый ангидрид
100
0
110
Каптан
10
12
90
Парахлорбензоат
50
8
145
Фунгихромин
50
9
9
Аллилизотиоцианат
50
10
202
Монобромацетат
10
9
175
Монобром ацетат
50
7 -
12
Микостатин
5
4
0
Этот антибиотик оказался очень активным фунгицидом, способным убивать дрожжи, но весьма нестабильным. Это один из редких антибиотиков, обеспечивающий остановку спиртового брожения при дозе .25 мг/л. Дозы от 10 до 15 мг практически стерилизуют среды с 10% спирта. В дальнейшем микостатин теряет большую часть своей активности; через 2 нед он уже не обнаруживается, так как представляет собой стерилизующий продукт, который, произведя свое действие, исчезает. Эти данные подтвердил Гарольо (1960).
При 100 мг/л анионы сульфитов блокируют дыхание независимо от pH. С другой стороны, известно, что их действие на брожение подчинено pH. При pH 3,8 интенсивность брожения снижается после добавления 100 мг/л на 40%, после введения 200 мг/л — на 50% и при 500 мг/л — на 90%, следовательно, сульфиты активно действуют па дыхание дрожжей, но только сернистый ангидрид подавляет .брожение. К тому же его действие не является мгновенным; при добавлении 200 мг/л
в бродящую среду дрож\и продолжают сбраживать еще немного сахара в течение первого часа послК введения сернистого ангидрида. \
Каптан оказывает меньшее действие на респираторную функцию; его. действие на брожение возрастает постепенно и так же прекращается; брожение продолжается еще в течение 1 ч, после добавления препарата.
При низком pH монобромуксусная кислота ведет себя в отношении метаболизма как яд общего действия, скорее понижающий уровень дыхания, чем интенсивность брожения. Значительное расхождение между фунгистатической и фунгицидной дозами наводит на
мысль, что монобромуксусная кислота оказывает сильное действие на размножение дрожжей.
Парахлорбензоат натрия производит слабое фунгицидное действие даже при сильных дозах. 200 мг/л препарата практически прекращают дыхание, но еще сохраняется примерно 50% бродильной активности.
Наконец, еще одна группа состоит из продуктов только фунгистатического действия, которые ингибируют размножение дрожжей и практически не участвуют в процессах метаболизма; таковы, например, актидион и аллилизотиоцианат. Тогда как 0,2 мг/л актидиона тормозят размножение, 100 мг/л ока-
зывают лишь слабое воздействие на дыхание и брожение Sacch. ellipsoide- us. Аллилизотиоцианат даже в значительных дозах, порядка 50 мг/л, также не затрагивает бродильную функцию
клетки.
Обстоятельную работу по активности актидиона в отношении Sacch. ellipsoideus выполнил Монреаль (1961). Пейно и сотрудники (1962) показали, что несколько редких рас Saccharomyces обладают очень высокой устойчивостью и даже полной невосприимчивостью к актидиону. Эти
авторы исследовали действие нового антибиотика, стрептимидона, химическая - формула которого имеет определенное сходство со структурой актидиона. Оба антибиотика имеют одинаковое ядро имида глутаровой кислоты. Антидрож- жевой спектр стрептимидона довольно близок к спектру актидиона. Расы Saccharomyces, устойчивые к актиди- ону, устойчивы также и к стрептими- \ону.
^Различные противогрибковые вещества.резко отличаются одно от другого особенностями действия, своей специфичностью в отношении дрожжей, условиями и дозами, при которых они активны, своей стабильностью. Их мож-
но подразделить на две категории: фунгистатические ингибиторы, такие, как сорбиновая кислота и актидион, не действующие на уже начавшееся брожение, но имеющие стабильные и хорошие консервирующие свойства, и фунгициды, представленные этилпирокарбонатом и микостатином, — стери- лизанты мгновенного действия, но не обладающие стабильностью, оба последних продукта вызывают подлинную стерилизацию на холоде.
Антибиотики являются мощными ингибиторами дрожжей, но противо- дрожжевой спектр каждого из них ограничен отдельными видами. Иногда некоторые расы могут оказаться вне
воздействия того или иного из этих продуктов. Антисептики химического происхождения имеют более широкий спектр фунгицидного действия.
ПРИРОДНЫЕ ИНГИБИТОРЫ ВИНОГРАДА И ВИН
Явления антибиоза и антагонизма
Открытие явления антагонизма между различными микроорганизмами было сделано до появления антибиотиков. В начале XX в. было выполнено боль-
шое число наблюдений над дрожжами (Лебедев, 1900; Фернбах, 1909). Факт антагонизма дрожжей хорошо известен в практике процессов брожения. При неблагоприятных условиях, и особенно когда аэрация недостаточна, а температура слишком высока, дрожжи выделяют продукты, которые ингибируют их собственное развитие. Булар (1926) предложил на основе этого положения «способ, позволяющий останавливать, по желанию, брожение в любой момент» путем подогревания и последовательных обсеменений. Ж. Ри- беро-Гайон и сотрудники (1950) установили, что повторное брожение среды во многом зависит от условий, в которых развивалось первое брожение. Когда оно происходило в полном анаэробиозе или в присутствии повышенного содержания сахара, новый рост дрожжей в среде становился затрудненным.
Антагонизм дрожжей проявляется также и на других организмах, что подтверждается множеством экспериментальных данных. В ряде случаев сообщали, что удалось выделить из дрожжевых клеток активные вещества, например против плесеней или против грамположительных и грамотрицатель- ных бактерий.
Кох (1953) изучал антибиотическую способность у 145 рас пивных, винных и хлебопекарных дрожжей методом зон ингибирования на питательных пластинах в отношении бактерий, ответственных за помутнение пива. Все расы дрожжей в большей или меньшей степени ингибируют развитие этих микроорганизмов, некоторые с очень большой интенсивностью. Эффект антибиоза был также констатирован в жидкой среде, и стерильный фильтрат был эффективным. Нагревание до 100° С разрушает активные вещества.
Авторы показали, что на развитие бактерий яблочно-молочного брожения
влияет природа дрожжей, на которых проводится спиртовое брожение. Некоторые виды дрожжей, по-видимому, способствуют ему, другие же, наоборот, задерживают или затрудняют его (см. гл. 12, раздел «Антагонизм дрожжи — бактерии»).
Буадрон (1969) детальным образом исследовал поведение смешанных культур дрожжей и бактерий молочнокислого брожения, выделенных из вина.
В бродящей среде количество дрожжевых клеток всегда меньше, если они развиваются в присутствии бактерий; в смешанной культуре численность дрожжей бывает в 2—10 раз меньше, чем в чистой. Похоже, что неблагоприятное влияние бактерий больше сказывается на росте дрожжей, чем на брожении.
Что касается развития бактерий, которое вначале облегчается присутствием дрожжей, то в дальнейшем оно быстро ингибируется образующимся спиртом.
Антагонизм между дрожжами и бактериями получил различные объяснения: 1) эффект соперничества за сахар и другие питательные вещества, в частности азотистые. Например, некоторые аминокислоты быстро поглощаются в смешанных культурах; 2) бактерии поглощают пировиноградную кислоту и свободный ацетальдегид бродящей среды. Эти вторичные продукты являются активаторами спиртового брожения; 3) бактерии образуют вещества, которые подавляют дрожжи. Эти вещества термостойки, они проходят через ультрафильтры; 4) орнитин, высвобожденный бактериями, затрудняет размножение дрожжей и тормозит спиртовое брожение.
Эффект антибиотической активности культур Botrytis cinerea на дрожжи
Сусло из пораженного благородной плесенью винограда, богатое восстанав-
Сусло^^П^азатели\Продолжительное ть брожения, дниКоличество остаточного сахара через 1 мес, г5712ЗдоровоеСброженный сахар, г/л1161581943,4Количество дрожжей, тыс./мм3 Сброженный сахар, г/л525860—Плесневое8291235,4Количество дрожжей, тыс./мм332540—Плесневое с подогревомСброженный сахар, г/л1001421734,6до 120° СКоличество дрожжей, тыс./мм34951——Плесневое+Сброженный сахар, г/л108150192. 2,5+ 50 мг/л SO2Количество дрожжей, тыс./мм3505658—Сусло^^П^азатели\Продолжительное ть брожения, дниКоличество остаточного сахара через 1 мес, г5712ЗдоровоеСброженный сахар, г/л1161581943,4Количество дрожжей, тыс./мм3 Сброженный сахар, г/л525860—Плесневое8291235,4Количество дрожжей, тыс./мм332540—Плесневое с подогревомСброженный сахар, г/л1001421734,6до 120° СКоличество дрожжей, тыс./мм34951——Плесневое+Сброженный сахар, г/л108150192. 2,5+ 50 мг/л SO2Количество дрожжей, тыс./мм3505658—Изменения сброженного сахара и числа дрожжей при брожении сусла из винограда, пораженного Botrytis cinerea, по сравнению с суслом из здорового виноградаИзменения сброженного сахара и числа дрожжей при брожении сусла из винограда, пораженного Botrytis cinerea, по сравнению с суслом из здорового винограда
Сусло
^^П^азатели
\
Продолжительное ть брожения, дни
Количество остаточного сахара через 1 мес, г
5
7
12
Здоровое
Сброженный сахар, г/л
116
158
194
3,4
Количество дрожжей, тыс./мм3 Сброженный сахар, г/л
52
58
60
—
Плесневое
8
29
123
5,4
Количество дрожжей, тыс./мм3
3
25
40
—
Плесневое с подогревом
Сброженный сахар, г/л
100
142
173
4,6
до 120° С
Количество дрожжей, тыс./мм3
49
51
—
—
Плесневое+
Сброженный сахар, г/л
108
150
192
. 2,5
+ 50 мг/л SO2
Количество дрожжей, тыс./мм3
50
56
58
—
Сусло
^^П^азатели
\
Продолжительное ть брожения, дни
Количество остаточного сахара через 1 мес, г
5
7
12
Здоровое
Сброженный сахар, г/л
116
158
194
3,4
Количество дрожжей, тыс./мм3 Сброженный сахар, г/л
52
58
60
—
Плесневое
8
29
123
5,4
Количество дрожжей, тыс./мм3
3
25
40
—
Плесневое с подогревом
Сброженный сахар, г/л
100
142
173
4,6
до 120° С
Количество дрожжей, тыс./мм3
49
51
—
—
Плесневое+
Сброженный сахар, г/л
108
150
192
. 2,5
+ 50 мг/л SO2
Количество дрожжей, тыс./мм3
50
56
58
—
Изменения сброженного сахара и числа дрожжей при брожении сусла из винограда, пораженного Botrytis cinerea, по сравнению с суслом из здорового винограда
Изменения сброженного сахара и числа дрожжей при брожении сусла из винограда, пораженного Botrytis cinerea, по сравнению с суслом из здорового винограда
ливающими сахарами, обычно сбраживается трудно. Этот факт установлен уже давно. Объясняли его обеднением в питательных веществах, например в аммиачном азоте. Чтобы изучить эти трудности брожения, С. Лафуркад (1955), Риберо-Гайон и сотрудники (1955) оперировали чистыми культурами Botrytis cinerea на виноградном сусле. В опыте, когда брожение здорового сусла заканчивалось через 12 дней при 60 000 дрожжевых клеток на 1 мм3, в плесневом сусле к этому же времени остается половина несброженного сахара, а популяция составляет лишь 39 000 клеток.
Если в сусле восстановить вещества, которые у него могли быть взяты и могли бы действовать на дрожжи (аммиак, аспарагин, тиамин и т. д.), ход брожения не улучшается, лишь немного более эффективен и грибковый экстракт из Aspergillus или из Botrytis.
Действие нагревания весьма эффективно. Достаточно продолжительное нагревание при 120°С плесневого сусла заметно повышает скорость брожения и рост дрожжей. Таким образом, следует допустить, что запаздывание брожения такого сусла связано с присутствием веществ, которые большей
частью разлагаются при высокой температуре (табл. 9.4).
Примечательно действие на плесневой виноград сернистого ангидрида в слабых дозах. Добавление 50 мг/л SO2 в здоровое сусло практически не вносит никаких изменений в брожение, тогда как внесение такого же количества в плесневое сусло ускоряет ход брожения в такой степени, что оно становится похожим на брожение здорового сусла. Кроме того, сильно возрастает популяция дрожжей.
Таким образом, установлено присутствие в сусле из винограда, пораженного Botrytis, противодрожжевых антибиотических веществ, большей частью разрушаемых сернистым ангидридом и длительным нагреванием при 120° С. Авторы назвали эти ингибирующие вещества, еще не получившие точного определения, «ботритицином».
Разделение ботритицина
Когда плесневое сусло спиртуют до 70 или 80% об., образуется обильный осадок, который можно через 4—5 дней покоя собрать путем центрифугирования, промыть в спирте и осушить стеканием. Добавленный в равный объем
здорового сусла, этот экстракт вызывает сильное ингибирование (рис. 9.1). При больших добавлениях брожения не происходит вообще.
Экстракт помимо того, что он содержит антибиотическое вещество, насыщен веществами не растворяющимися в спирте (полисахариды, пектины, белки и т. д.). Если таким же путем обработать сусло, приготовленное из здо-
Рис. 9.1. Обнаружение ботритицина по кривым брожения сусел. обогащенных флоккулянтами культур Botrytis cinerea:
1 — контрольное сусло; 2—сусло + флоккулянт плесневого сусла; 3 — суслон-флоккулянт мицелия; 4 — плесневое сусло.
рового винограда, то также отмечают, что полученный экстракт способен задерживать брожение другого здорового сусла, хотя и в меньшей степени. Таким образом, здоровый виноград содержит в себе самом наряду с веществами, способствующими развитию дрожжей и активирующими спиртовое брожение, вещества, которые наоборот, затрудняют рост дрожжей и вызывают задержку брожения. Этими явлениями можно объяснить различия в степени сбраживаемости виноградного сусла, наблюдаемые в практике виноделия. Совершенно точно, что в живой клетке рядом друг с другом находятся
ускорители и ингибиторы в непрерывно изменяющихся концентрациях (Бас- тэн, 1954).
Ботритицин выпадает количественно в среде, содержащей 80% и лишь частично 70% спирта. Установлено, что антибиотическая способность водного препарата быстро разрушается при обычной температуре под действием ферментов среды, тогда как она сохраняется при нагревании препарата до 100° С. Следовательно, целесообразно до проведения всех других операций быстро довести плесневое сусло и водный экстракт мицелия до этой температуры с целью их стабилизации.
Обработка углем лишает почти полностью плесневое сусло его ингибирующей способности (рис. 9.2).
После систематического исследования была принята следующая методика: плесневое сусло, стабилизированное при 100° С, доводили до pH 3,5— 4,0, взбалтывали и оставляли в контакте с порошком активированного угля из расчета 30 г/л на 1—2 дня, возможно чаще перемешивая жидкость; затем уголь собирали путем центрифу-
Рнс. 9.2. Фиксация богритицина активированным углем и разрушение ботритищнна сернистым ангидридом:
1 — контрольное сусло; 2— ботритицин, обработанный углем; 3—ботритицин-рЗОг; 4— ботритицин.
гирования, хорошо отломали и приводили в состояние суспензии в фосфатном растворе, приведенном к pH 9,0; после смешивания собирали элюат центрифугированием и осаждали 80%-ным спиртом. Такой экстракт обладает сильным ингибирующим 'действием на дрожжи.
Условия продуктивности и эффективности ботритицина
После опытов на различных культурах Botrytis cinerea оказалось, что наиболее благоприятной средой для образования ботритицина являщся виноградное сусло. Влияние pH значительно. Botrytis cinerea дает максимум ингибирующих веществ при pH около 3,0—3,5. При pH выше 4,0 образование их идет слабо. Эти вещества находятся одновременно и в питательной среде, и в мицелии.
Концентрация ботритицина в питательной среде достигает максимума в момент появления конидий. В дальнейшем она быстро понижается в культуре в результате меньшего воспроизводства и разложения ранее образованного вещества. Содержание антибиотика в мицелии также возрастает до образования конидий.
Отмечено, что обычно pH мало влияет на спиртовое брожение сусла; зато оно оказывает заметное действие на активность ботритицина. Оно значительно сильнее, когда pH выше. Таким образом, ботритицин, который в первую очередь образуется в питательных средах с низким pH н экстрагируется также в кислой среде, сильнее действует на дрожжи при несколько повышенном pH.
Наконец, производство антидрожже- вых веществ является свойством и некоторых других плесеней (Aspergillus, Penicillium), однако Botrytis откосится
к таким, которые выделяют ингибиторы в наибольшей степени.
Милисавлевич (1954) исследовал производство патулина плесневыми грибками Penicillium notatum.
Но в действительности нет никакой возможности практического использования ботритицина из-за того, что он разрушается сернистым ангидридом, применяемым при производстве вин. По этой же причине ботритицин не на- ''ходят в винах, выработанных из плесневого винограда.
В зрелом винограде и в его сусле содержатся, с одной стороны, вещества, необходимые для размножения дрожжей, намного усиливающих эффективность их действия, а с другой — вещества, которые тормозят их рост, вплоть до полного его прекращения. Виноград, пораженный плесенью Botrytis cinerea, содержит особенно много веществ, принадлежащих к этим двум категориям. Однако они отличны от тех, которые находятся в зрелом винограде. Эти наблюдения объясняют некоторые пока еще неясные аспекты процесса брожения, относительно скорости его протекания на практике. В зависимости от соответствующих концентраций этих природных активаторов и ингибиторов брожение сусла может ускоряться, а повторное брожение вина облегчаться или же брожение может замедляться, становиться трудным или неполным, а полученные из них вина могут стать относительно стабильными в отношении дображивания остаточных сахаров.
Мы еще не знаем ни природы этих веществ, ни точных условий, в которых природные активаторы берут верх над ингибиторами. Можно считать, что полное и надежное брожение в желаемые сроки и получение вин, биологически стабильных как в отношении дрожжей повторного брожения, так и болезнетворных бактерий, будет рано или позд-
но освоено, не прибегая ни к каким искусственным добавлениям. Следует подчеркнуть, что природа дает нам в винограде, который содержит одновременно и стимулянты, и ингибиторы, средства для того, чтобы прекрасно реализовать его превращение в биологически стабильный продукт.
Выработку антибиотического вещества грибом Botrytis cinerea оспаривает Диттрих (1964), .который не наблюдал в сусле из плесневого винограда с немецких виноградников или в их спиртовом экстракте какого-либо ингибирующего эффекта. Однако первые наблюдения авторов были легко воспроизведены на урожаях 1971 и 1972 гг. в Сотерне. Кроме того, Каталано (1962) констатировал присутствие природных ингибиторов дрожжей в полусброжен- ных суслах и в винах в процессе опытов по поглощению их углем и путем экстракции.
ЛИТЕРАТУРА
Amerine М. A. et Kunkee R. Е. (1965), Vitis, 5, 187.
Bastin R. (1954), Rev. Ferm. Ind. agric., 9, 15.
Belin J. M., В e s s i s R., M о u i 11 e t L. e t Henry P. (1971), Conn. Vigne Vin, 5, 199.
Boi dr on A. M. (1969), Contribution a Tetu- de de Tantagonisme entre les levures et les bacteries lactiques du vin, These 3е Cycle, Bordeaux.
Boulard M. (1926), C. R. Acad. Agric., 12, 615.
Cassignard R. (1972), Vignes et Vins, n° 211, 15.
Catalano M. (1962), Boll, di Ricerche, n°2, 65.
Dittrich H. H. (1964), Wein-Wissens., 19, 528.
Ehrenhardt H. et Jakob L. (1968), Weinberg u. Keller, 15, 355.
Fern bach A. (1909), C. R. Acad. Sci., 142, 438.
Ferre L. (1949), Ind. agric, alim., 66, 259.
Flanzy M. et Benard P. (1959), Ann.
Technol. agric., 8, 145.
Gar о gl io G. (1960), Istituto di Industrie agrarie nell’Universsita di Firenze.
Gray W. D. (1941), J. of Bact., 42, 561.
Hurter J., Mayer K. et Zurrer H. (1966), Schweiz. Zeits. Obst. Weinbau, 102, 592
Koch T. (1953), Brasserie et malterie, 3, 250.
L a f о n-L a f о u r c a d e S. (1974). Ann. Falsif. Exp. Chim., 67, 275.
Lafourcade S. (1955), Contribution a Tsetu- de des activateurs et des inhibiteurs de la fermentation alcoolique des moots de raisins, These docteur-ing., Bordeaux.
Lebedeff A. (1900), Ann. Brass. Dist., 3, 290.
Lemperle E., Kerner E. et Waibel A. (1971), Wein-Wissens, 26, 293.
Loncin M. (1967), Ind. alim. agric., 84, 219.
Matta M. (1963), Industrie agrarie, 1, 80.
Milisavljevic D. (1954), Ann. Sci. agron.
Belgrade, 7, n° 17.
Minarik E. et Ragala P. (1966), Mittei- lungen, 16, 107.
Monreal K. (1961), Angew. Botanik, 35, 24.
Mii 1 1 e r-T h u r g a u H. (1884), Bericht Weinbau Vereins, Geisenheim, p. 58.
Peynaud E. (1952), C. R. Acad. Sci., 235, 1163.
Peynaud E. et Lafourcade S. (1953), C. R. Acad. Sci., 236, 1924.
Peynaud E„ Lafourcade S., et L a- fon M. (1957), C. R. Acad. Sci., 244, 2426.
Peynaud E„ Laf о n-Lafourcade S. et Dome req S. (1962), Ann. Inst. Pasteur, 102, 469.
Pic ci G. (1955), Ann. Sperim. agraria, 9, 1511.
Rehm H. J. (1959), Zeits Lebensm. Unters. Forsch., 110, 283, 356; (1960). Ibid., 113, 144; (1961) Ibid., 115, 27, 244.
R ib ё rea u-G а у о n J., Lafourcade S. et Lafon M. (1950), Ind. agric, alim., 67, 477.
R i b ё r e a u-G а у о n J., Peynaud E. e t Lafourcade S. (1952), C. R. Acad. Sci., 234, 251 et 478.
R i b ё r e a u-G а у о n J. e t Peynaud E. (1952), C. R. Acad. Agric., 39, 479.
Rib ё re a u-G а у о n J., Peynaud E., Lafourcade S. et Charpentie Y. (1955), Bull. Soc. Chim. biol., 37, 1055.
R i b ё r e a u-G а у о n J., Peynaud E., Lafourcade S. et Lafon M. (1958), Bull. Soc. Chim. biol., 40, 189.
Schormuller J. (1959), L’inhibition enzy- matique comme principe d’effets toxiques, Traduction du Service de la Рёргеззюп des Frau- des.
SHovec S. (1966), Mitteilungen, 16, 127 et
Часть четвертая
ВОЗБУДИТЕЛИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ
БРОЖЕНИЙ
Глава 10. МОРФОЛОГИЯ, СИСТЕМАТИКА, ЭКОЛОГИЯ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ ВИНА
Бактерии или шизомицеты принадлежат к подгруппам протистов прокариотных или низших одноклеточных (тогда как дрожжи относятся к проти- стам эукариотным или высшим одноклеточным) (см. гл. 5). В прокариотной клетке ядро не отделяется мембраной от цитоплазмы и при наблюдении в обычный микроскоп остается незамеченным. При большом увеличении оно представляется составленным из волокон дезоксирибонуклеиновой кислоты.
Эубактерии составляют очень широкую группу и в связи с этим они не имеют более или менее точного общего определения. Они включают 11 родов грампозитивных бактерий и 24 рода бактерий грамотрицательных. Окрашивание по Граму заключается в том, чтобы фиксировать бактерии и окрашивать их основным красителем (кристаллвиолет), затем последовательно обрабатывать раствором Луголя (йод+ +йодистый калий), спиртом и, наконец, кислотным красителем (сафранин). Обработанные таким образом клетки некоторых видов остаются окрашенными в фиолетовый цвет, их называют грамположительными, , тогда как другие, обесцвеченные спиртом и окрашивающиеся затем в красный цвет, являются грамотрицательными.
Молочнокислые бактерии определяют по совокупности их общих физио
логических и структурных свойств. Они грампозитивны, всегда неподвижны и не образуют спор. Основным источником, откуда они черпают свою энергию, является молочнокислое брожение сахаров. Молочнокислые бактерии, встречающиеся в вине, принадлежат к родам Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus. Уксуснокислые бактерии (см. гл. 14) являются грамотрицательными, они имеют окислительный метаболизм. Те из уксуснокислых бактерий, которые встречаются на винограде и в винах, принадлежат к родам Pseudomonas и Acetobacter.
Основные данные по общей бактериологии изложены в трудах Станье и сотрудников (1966), Сенез (1968) и особенно обстоятельно даны в работах Гюнсалю и Станье (1960—1964).
МОРФОЛОГИЯ молочнокислых БАКТЕРИЙ
Каждая бактерия имеет свою особую форму и размеры. Форма бактерий является достаточно стабильной характеристикой, чтобы составлять один из фундаментальных критериев в классификации этих микроорганизмов. Различают кокки круглой формы и бациллы или палочки цилиндрической формы. На рис. 10.1 показаны некоторые из таких видов. Кокки имеют диаметр
от 0,4 до 1,9 мкм; бациллы имеют толщину 0,5 мкм и достигают в длину от 2 до 5 мкм.
Кокки имеют сферическую форму, но в зависимости от того, разделяются
Рис. 10.1. Различные формы бактерий. Сверху вниз: кокк, диплококк, стрептококк, стреп- тодиплококк, тетрада, сарцина, стафилококк, бацилла, диплобацилла, стрептобацилла'.
ли две клетки сразу же после деления или же остаются более или менее длительное время рядом, они выглядят под микроскопом как изолированные кокки или как характерные клеточные группы: диплококки (клетки, соединенные попарно), стрептококки (клетки, расположенные в виде цепочки), сарцины (скопления клеток в виде кубиков),
стафилококки (Скопления клеток неправильной формы).
Бациллы представляют собой удлиненные клетки, образующие прямые и короткие палочки, но могущие, как и кокки, оставаться сросшимися во время клеточного деления, образуя при этом диплобациллы или стрептобацил- лы, цепочки, имеющие вид более или менее длинных и более или менее извилистых волокон. Длина волокон зависит от условий, и в частности от кислотности среды, температуры, присутствия спирта, скорости размножения и перемешивания жидкости.
Структура бактериальной клетки
Бактериальная клетка состоит из клеточных оболочек, цитоплазмы, вещества ядра и элементов, называемых факультативными, так как они имеются не у всех видов.
На рис. 10.2 п 10.3 воспроизведены снимки клеток молочнокислой бактерии и кокка, выделенных из вин. Эти снимки сделаны с помощью электронного микроскопа. Здесь прекрасно видны различные органоиды бактериальных клеток.
Клеточные оболочки. Эти оболочки состоят из клеточной перегородки и цитоплазменной мембраны.
Клеточную перегородку можно изолировать, подвергая бактерии воздействию ультразвука или путем измельчения их стеклянными микрошариками. Затем проводят дифференциальное центрифугирование, чтобы отделить перегородки от протоплазмы. Клеточная перегородка грамположительных бактерий гомогенна и содержит только один листок. Перегородка же грамот- рицательных бактерий содержит три наложенных один на другой листка. Толщина перегородки колеблется от 10 до 20 нм, а ее масса составляет 20°/о массы клетки.
Клеточная перегородка образуется комплексом, состоящим из сахаров (рамноза, арабиноза, глюкоза), аминированных сахаров, аминокислот, липидов. Природа компонентов, их относительные пропорции изменяются в зависимости от микроорганизма, а также
Рис. 10.2. Клетки Lactobacillus:
а — увеличение 80 000. Клетка в процессе деления; видно постепенное развитие центральной перегородки; различаются прямолинейные структуры, состоящие из нитей АДН; б—увеличение 80 000. Видна толстая клеточная стенка, четко выделяющаяся цитоплазменная мембрана, мезозомы (черные), связывающие с мембраной центральные (более светлые) участки вещества ядра.
от того, идет ли речь о грамположи- тельной или грамотрицательной бактерии.
Клеточная перегородка действует как фильтр, пропускающий воду, соли, метаболиты. Очень устойчивая к механическому воздействию, она играет исключительно важную защитную роль. Будучи упругой, придает свою форму бактерии, подвержена действию некоторых ферментов, таких, как лизозим.
Рис. 10.3. Клетки Leuconostoc. Увеличение 80 000. Различаются различные органиты клетки этого кокка: клеточная стенка и цитоплазменная мембрана, мезозомы (темное пятно) и вещество ядра (светлое пятно).
Цитоплазменная мембрана в 10 раз тоньше, чем перегородка. В ней находятся два тонких слоя белковой природы, между которыми располагается липидный слой (60—70% белков, 15— 20% липидов). Она содержит почти все бактериальные цитохромы (пигменты, участвующие в клеточном дыхании) и некоторые энзимы, в частности дегидрогеназы.
Цитоплазменная мембрана играет важную роль: это своего рода специализированный фильтр, который регулирует переход элементов питательной среды в цитоплазму. Мембрана действует как осмотический барьер, пропускающий воду, но не проницаемый для некоторых ионов, органических молекул, макромолекул.
С цитоплазменной мембраной связаны мезозомы, которые имеют вид мембранных клубков или мотков внутри цитоплазмы и служат связью между мембраной и веществом ядра.
Цитоплазма. Бактериальная цитоплазма представляет собой суспензию макромолекул; ее pH находится около 7. Под электронным микроскопом цитоплазма выглядит снабженной мелкими сферическими грануляциями, рибосомами, имеющими размеры от 10 до 30 нм; она содержит и другие включения: резервные органические вещества, минеральные вещества, хроматофоры.
Рибосомы состоят из двух сцепленных друг с другом частиц различных размеров. Они обязаны своим названием тем, что в них содержится много рибонуклеиновых кислот (РНК). В отличие от дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) рибосомные РНК неспецифичны по видам бактерий и идентичны во всех видах. Рибосомы играют первостепенную роль в синтезе белков.
Резервные вещества состоят из углеводов (гликоген может достигать 30% сухой массы клеток) и липидов.
Помимо обычных минеральных солей цитоплазма бактерий может содержать другие неорганические вещества: серу, метахроматические частицы, состоящие из минеральных полифосфатов (волютин).
Вещество ядра. По вопросу о существовании ядра у бактерий было высказано много противоречивых мнений. Было трудно обнаружить такую структуру вследствие очень малых размеров бактерий, а также потому, что при окраске нуклеиновых кислот специфическими красителями, обычно применяемыми для обнаружения ядер, они приобретают однообразный цвет. При попытках окрасить бактериальное ядро вся клетка окрашивалась одинаково; долгое время говорили о рассеянном ядре.
Исследование методами электронной микрографии внесло ясность в вопрос о структуре ядерного вещества бактерий. Ядерные районы имеют неправильные контуры, они не окружены мембраной, состоят из ДНК, наблюдаемой в виде запутанных волокон, или иногда в виде трубчатых параллельных структур. Ядерная структура примыкает к мезозомам, ее мембранные мотки проникают в цитоплазму (см. рис. 10.2).
Химически ДНК образуется цепями мононуклеотидов, каждый нуклеотид в свою очередь состоит из цикличного азотного основания, сахара, дезоксирибозы и молекулы фосфата. В состав. ДНК входят четыре основания. Аденин и гуанин являются пуриновыми основаниями, производными пурина; тимин и цитозин являются пиримидиновыми основаниями, производными от пиридина.
Молекула бактериальной ДНК состоит из двух нуклеотидных волокон, соединенных посредством азотных оснований. Она имеет конфигурацию двойной спирали. В виде пространственной конфигурации происходит соединение аденин — тимин и гуанин — цитозин.
Отношение (A+T)/(G + C) является константой для данного вида бактерий; в зависимости от вида это отношение меняется и может служить основанием для классификации.
Процесс деления ядра начинается репликацией или разделением двух волокон ДНК, сопровождаемой восстановлением нуклеотид за нуклеотидом, дополнительных нитей во всех пунктах, идентичных самой молекуле. Этот механизм в определенной мере регулирует деление клетки. Молекулы ДНК представляют собой генетический материал клетки, т. е. они несут в себе наследственную информацию и управляют ростом и размножением клетки.
Факультативные элементы. Эти эле-
менты встречаются только у некоторых видов бактерий: это капсулы, реснички или локомоторные органы, споры. Бактерии вина не имеют ресничек и не образуют спор.
Капсула представляет собой элемент вязкой консистенции, более или менее толстый и компактный, окружающий некоторые бактерии. Ее называют зб- огле, когда капсула образует нечто вроде липкой слизи, охватывающей скопление клеток со всех сторон. Так, некоторые Leuconostoc, выделенные из вин, образуют подобие утка, связывающего клетки между собой, и делают текучей питательную среду; такая ткань препятствует отделению 'клеток при центрифугировании.
Бактериальные капсулы состоят в основном из полисахаридов с высокой молекулярной массой. Они могут быть полимерами из одного сахара, такие, как декстраны или глюкозаны у зоогле Leuconostoc. Некоторые уксуснокислые бактерии образуют когерентный вязкий слой, состоящий из целлюлозы.
Размножение бактерий
Долгое время считали, что размножение бактерий происходит неполовым путем и совершается двумя основными процессами: дроблением, или шизогенезом, и споруляцией. Сейчас генетики допускают существование бактерий особого полового типа, между которыми могут иметь место конъюгации.
Винные бактерии не образуют спор и размножаются делением (шизогенез). После того как бактерия вытянется в длину, она делится на-две части. Явление начинается с деления ядерного аппарата по схеме, описанной для ядра. Это деление сопровождается образованием поперечной перегородки (см. рис. 10.2 вверху); наконец, сама капсула делится на две дочерние идентичные клетки.
ГОМО- ИЛИ ГЕТЕРОФЕРМЕНТАТИВНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
Этот признак является одним из фундаментальных критериев классификации молочнокислых бактерий. Он определяется продуктами, образующимися из глюкозы.
Гомоферментативные бактерии превращают около 95% глюкозы в молочную кислоту обычным путем гликолиза, который завершается образованием пирувата. Гетероферментативные бактерии образуют много других продуктов: этиловый спирт, уксусную кислоту, глицерин, углекислый газ.
Образование углекислого газа часто рассматривается как характеристика типа брожения. Способ Герра (парафиновая пробка) не всегда надежен: предпочтительнее точное измерение, позволяющее подводить итог использованного сахара и выделившегося углекислого газа. В этом случае определяют отношение СО2/молочная кислота, оно близко к 0,50 для гетероферментов и колеблется от 0 до 0,02 для гомоферментов, без промежуточных значений между этими двумя типами.
Можно также применить отношение молочная кислота/уксусная кислота, или, что более практично, образовавшаяся нелетучая кислотность/образо- вавшаяся летучая кислотность, которое предложил Карр. У гомофермента- тивных бактерий это отношение остается меньше 10. В действительности оно может колебаться без четко выраженного предела между <1 и >20, и поэтому иногда требуются добавочные тесты.
Пользуются также отношением этиловый спирт/молочпая кислота, которое для гетероферментативных бактерий колеблется от 1 до 2; речь идет о процессе, близком к спиртовому брожению с вторичным образованием молочной кислоты. Некоторые гомофермен-
тативные бактерии вырабатывают спирт, количественно определяемый как следы.
Гомоферментативные бактерии образуют ацетин, гетероферментативные же бактерии — бутандиол-2,3; некоторые исключения в обоих случаях не позволяют считать эти свойства надежным критерием классификации. Наконец, образование маннита из фруктозы также является определяющим при использовании для этой оценки: прямая кристаллизация выпариванием отстоявшейся среды; более точный количественный анализ маннита, например путем хроматографии на бумаге, мог бы выявить незначительные количества маннита в самих питательных средах гомоферментативных бактерий.
ОБЩАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ ВИННЫХ БАКТЕРИЙ
Классификация, которую предлагают авторы, разработана бригадой микробиологов Института энологии в Бордо, которая работала в течение 15 лет. Как уже отмечалось выше, было получено 750 рас грамположительных бактерий. 650 рас были выделены из 250 образцов винограда, бродящих сусел и главным образом вин. Пробы отбирали наполовину из продуктов района Бордо. 260 рас были выделены из вин других винодельческих районов Франции. В момент выделения все эти вина имели признаки микробиальных процессов. Чаще всего в них обнаруживали яблочно-молочное брожение, иногда молочнокислое скисание и реже такие бактериальные заболевания, как турн (брожение винной кислоты) или ожирение (тягучее вино). 134 расы были взяты из разных стран: Южной Африки, Алжира, ФРГ, Австрии, Аргентины, Калифорнии, Чили, Испании, Греции, Италии, Израиля, Японии, Португалии, Уругвая. Некоторые расы были
выделены из сидров (Англия) и сброженных фруктов (Бельгия).
Наконец, 32 расы молочнокислых бактерий, служивших эталонами, происходили из различных коллекций и использовались для сравнения.
Большое число исследованных рас и разнообразие источников их происхождения позволили составить систему классификации винных бактерий, хорошо вписывающуюся в общую классификацию молочнокислых бактерий и в то же время сохраняющую интерес с точки зрения энологии. В табл. 10.1 дан перечень видов винных бактерий, которые были выделены и охватывают всю совокупность бактериальной микрофлоры вин.
ЭКОЛОГИЯ и РАСПРОСТРАНЕНИЕ БАКТЕРИИ МОЛОЧНОКИСЛОГО БРОЖЕНИЯ
Присутствие молочнокислых бактерий на винограде
Присутствие молочнокислых бактерий на винограде было обнаружено совсем недавно (Пейно и С. Домерк, 1961, 1962). Радлер (1958) выделил из виноградных листьев бактерии, способные сбраживать яблочную кислоту, а по данным Окса (1959), эти бактерии могут вызывать болезни растения, выражающиеся в увядании гребней и плода.
На винограднике молочнокислые бактерии распределены неравномерно. На практике каждый год наблюдают, что яблочно-молочное брожение труднее происходит в винах с определенными характеристиками или из одних определенных районов по сравнению с другими винами, без какой-либо возможности объяснить это явление составом винограда.
В начале спиртового брожения присутствие бактерий остается незамечен-
Виды бактерийГомо-или гетеро] ерментатив- иая характеристикаРасы бактерийКоккиГомоферментативныеPediococcus cerevisiaePediococcus pentosaceusГетероферментативныеLeuconostoc gracile Leuconostoc oinos A+ Leuconostoc oinos X + Leuconostoc oinos P+БациллыГомоферментативныеLactobacillus plantarumLactobacillus casei Streptobacterium sp.ГетероферментативпыеLactobacillus fructivorans Lactobacillus desidiosus Lactobaccilus hilgardii Lactobacillus brevisВиды бактерийГомо-или гетеро] ерментатив- иая характеристикаРасы бактерийКоккиГомоферментативныеPediococcus cerevisiaePediococcus pentosaceusГетероферментативныеLeuconostoc gracile Leuconostoc oinos A+ Leuconostoc oinos X + Leuconostoc oinos P+БациллыГомоферментативныеLactobacillus plantarumLactobacillus casei Streptobacterium sp.ГетероферментативпыеLactobacillus fructivorans Lactobacillus desidiosus Lactobaccilus hilgardii Lactobacillus brevisТаблица 10.1Таблица 10.1Классификация молочнокислых бактерийКлассификация молочнокислых бактерийным, так как размножение дрожжей протекает намного быстрее и- в больших количествах; но при внимательном наблюдении с помощью микроскопа, начиная с четвертого или пятого дня брожения, в чане обнаруживают присутствие бактерий различного вида. Обычно это бактерии яблочно-молочного брожения. Что касается болезнетворных бактерий, то они, по всей видимости, присутствуют на винограде так же, как и другие микроорганизмы, но развиваются далеко не всегда, а лишь в тех случаях, когда этому способствуют условия и среда.
Виды бактерий
Гомо-или гетеро] ерментатив- иая характеристика
Расы бактерий
Кокки
Гомоферментативные
Pediococcus cerevisiae
Pediococcus pentosaceus
Гетероферментативные
Leuconostoc gracile Leuconostoc oinos A+ Leuconostoc oinos X + Leuconostoc oinos P+
Бациллы
Гомоферментативные
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus casei Streptobacterium sp.
Гетероферментативпые
Lactobacillus fructivorans Lactobacillus desidiosus Lactobaccilus hilgardii Lactobacillus brevis
Виды бактерий
Гомо-или гетеро] ерментатив- иая характеристика
Расы бактерий
Кокки
Гомоферментативные
Pediococcus cerevisiae
Pediococcus pentosaceus
Гетероферментативные
Leuconostoc gracile Leuconostoc oinos A+ Leuconostoc oinos X + Leuconostoc oinos P+
Бациллы
Гомоферментативные
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus casei Streptobacterium sp.
Гетероферментативпые
Lactobacillus fructivorans Lactobacillus desidiosus Lactobaccilus hilgardii Lactobacillus brevis
Таблица 10.1
Таблица 10.1
Классификация молочнокислых бактерий
Классификация молочнокислых бактерий
Пейно и Домерк провели систематические исследования по распределению молочнокислых бактерий. Необходимо подчеркнуть, что эти бактерии встречаются как в районах производства винограда, идущего на приготовление ликерных вин, в которых обычно не бывает яблочно-молочного брожения, так и в тех районах, в которых это превра
щение полезно. Однако можно считать, что бактерии яблочно-молочного брожения имеют меньшее распространение, чем дрожжи и уксуснокислые бактерии.
В серии сусел, обсемененных культурой Sacch. oviformis, присутствие бактерий наблюдалось только 5 раз вместо 8, что подтверждает факт угнетения яблочно-молочного брожения некоторыми дрожжами.
В 1961 г. параллельно с выделением бактерий из прессового сусла производили изоляцию их из воды, которой промывали грозди винограда на месте. До начала операции вода была стерильной. Промывной водой обсеменяли питательную среду, содержащую яблочную кислоту. При этом были отмечены случаи сбраживания яблочной кислоты.
Наблюдалось присутствие молочнокислых бактерий в прессовых суслах (в %):
Прессовые сусла
при их pH, не обсемененные дрож- 25 жами
три pH 3,8, не обсемененные дрож- 60 жами
при их pH, обсемененные дрожжа- 5 ми
Вода, использованная для мытья ви- 31 нограда
При естественном pH виноградного сусла, например при pH от 3,1 до 3,5, установлено, что большая часть молочнокислых бактерий винограда не способна развиваться.
Присутствие молочнокислых бактерий в подвалах
Присутствие таких бактерий на винодельческом оборудовании и в производственных помещениях вполне возможно; общеизвестен риск загрязнения нового вина при помещении его в бочки или в буты, ранее содержавшие испорченные виноматериалы. Точно так же в отдельных случаях может проявиться яблочно-молочное брожение вследствие обсеменения винодельческих емкостей. Но меры по поддержанию оборудования бродильных цехов и подвалов в чистом и стерильном состоянии, необходимые для предотвращения порчи вин, одновременно препятствуют и обсеменению их бактериями яблочно-молочного брожения. Ж. Риберо-Гайон установил постоянное присутствие бактерий, воздействующих на яблочную и иногда на винную кислоту, на полах винодельческих заводов и винных подвалов. Вина, приведенные к pH 4,0, и растворы винной кислоты были распределены по флаконам и стерилизованы нагреванием. Затем эти жидкости загрязняли различными способами, закупоривали и оставляли на несколько недель при температуре 25° С. В этих условиях наблюдали сбраживание винной кислоты во всех флаконах, загрязненных части-
цами, взятых с влажных или сухих полов бродильных цехов, и, наоборот, не отмечалось никакого развития бактерий из плесени на стенах, из кусочков дерева, взятых с наружной поверхности бочек или в результате контакта в течение многих часов с воздухом бродильных помещений. Аналогичные опыты с использованием вина с высоким содержанием яблочной кислоты показали присутствие бактерий яблочно- молочного брожения на полу и на древесине бочек и отсутствие их в плесени на стенах и в воздухе подвалов.
Вебб и Ингрэм (1960) указывают, что возбудитель самопроизвольного брожения вносится не с виноградом, а поступает прежде всего из бродильных чанов.
Присутствие молочнокислых бактерий в винах
Присутствие бактерий в молодых винах представляет обычное явление. Если при соблюдении необходимых условий асептики взять в бутылку некоторое количество молодого вина сразу же на выходе из бродильного чана, закупорить и оставить ее на несколько недель при температуре 25° С, то всегда наблюдают развитие бактерий, если только виноград или сусло не подвергались сильной сульфитации.
Молочная кислота L (+) как контроль присутствия молочнокислых бактерий в виноделии
Образование молочной кислоты в процессе спиртового брожения сахара имеет место всегда, но оно относительно невелико. Для такой природной среды, как виноградное сусло, среднее количество образующейся кислоты составляет около 200 мг/л. Все дрожжи, способные к брожению, за исключением одних, которые были исследованы
авторами, т. е. 30 видов, дают D(—)- молочную кислоту и лишь следы L (+) - молочной кислоты. Штаммы одного и того же вида различаются по общему производству молочной кислоты, но не по природе этой кислоты. При pH меньше 4,0 содержание образовавшейся L ( + )-молочной кислоты никогда не превосходило 15 мг/л. Sacch. veronae является единственным видом, способным образовать повышенные количества L( + )-молочной кислоты, вплоть до 1,8 г/л, но эти дрожжи в виноделии встречаются редко.
Таким образом, вина, не подвергшиеся действию бактерий, содержат мало молочной кислоты, обычно менее 0,5 г/л, включающей большую часть изомера D(—). В винах, где происходило яблочно-молочное брожение, молочная кислота находится в более значительных количествах и состоит в основном из изомера L( + ), поскольку при яблочно-молочном брожении образуется только эта кислота.
Другими словами, когда вино проходит чистое спиртовое брожение, в смысле «брожения, свободного от молочно-кислых бактерий», оно содержит почти исключительно D(—)-молочную кислоту; когда же оно подверглось, кроме того, яблочно-молочному брожению, оно содержит главным образом L( + )-молочную кислоту; наконец, когда действие бактерий направлено на восстанавливающие сахара (молочнокислое скисание), конфигурация молочной кислоты зависит от вида бактерий.
В качестве примера в табл. 10.2 показана эволюция L( + )-молочной кислоты, определенной ферментативным путем во время спиртового, брожения винограда красных сортов в нескольких чанах.
В чане А сусло сульфитировали из расчета 50 мг/л сернистого ангидрида путем перемежающегося орошения дро
Таблица 10.2
Образование молочной кислоты L (+)
(в г/л) в процессе виноделия
по красному
Дни брожения на мезге
Чан А
Чан B'j
Чан В
1
88
" 31
Следы
2
88
41
»
3
80
40
20
4
88
—
20
8
100
88
10
125
88
—
Вино из сусла первой фракции
—
—
20
Прессовое вино
—
—
210
бленой массы сернистым раствором, в чане Б — с помощью устройства с регулируемым стоком, в чане В — посредством автоматического дозировочного насоса для сульфитации; он был спущен по истечении 4 дней.
В отдельных чанах со слабой сульфитацией или совсем без нее образование небольшого количества L( + )- молочной кислоты начинается уже в день наполнения. Затем содержание ее постепенно возрастает, особенно в мезге на протяжении всего периода спиртового брожения и после его завершения. Оно бывает более интенсивным при длительном брожении на мезге, чем при коротком, и может достигать 150 мг/л ко времени спуска чана. Эти значения намного превосходят те, которые могут быть получены только дрожжами, и в самых благоприятных условиях составляют от 15 до 20 мг/л. Таким образом, можно сделать вывод, что молочнокислые бактерии присутствуют в дробленой массе и проявляют свою активность с момента наполнения бродильных емкостей. Внимательное наблюдение в микроскоп подтверждает их присутствие, следовательно, энзиматический анализ L( + )-молочной кис-
лоты представляет собой чувствительный и точный способ раннего обнаружения бактерий при производстве вин; он более чувствителен, чем прямое наблюдение под микроскопом,точнее, чем количественный анализ летучей кислотности или яблочной кислоты.
Таким путем авторам удалось наблюдать во время последних сезонов виноделия, что бактерии появляются в бродильных емкостях очень рано, значительно раньше, чем можно было думать; однако их развитие прерывается сульфитацией.
На винограде существуют молочнокислые бактерии; они, несомненно, находятся также на оборудовании и в производственных помещениях, следовательно, виноград в большей степени обсеменен самой разнообразной молочнокислой микрофлорой. Среди этих бактерий далеко не все способны развиваться в вине: некоторые не могут размножаться при pH сусла или вина, но они могут в дальнейшем развиваться в выжимке, в зонах с более высоким pH, которые создает мацерация кожицы и семян, тканей винограда, менее кислых и богатых минеральными веществами; другие бактерии быстро подавляются спиртом, образованным дрожжами. Наконец, остается лишь очень небольшой процент бактерий винограда, которые выживают и вызывают в последующем яблочно-молочное брожение, постепенно приспосабливаясь к условиям среды, в данном случае вина.
Весьма похоже на то, что некоторые молочнокислые бактерии начинают развиваться в сусле с момента дробления винограда и заполнения чанов соком, но они быстро ингибируются спиртом и в дальнейшем размножаются очень медленно. Некоторые бактериальные клетки приспосабливаются к среде через более или менее длительный латентный период. Нужно также учиты
вать тот факт, что в процессе брожения среда становится все менее и менее благоприятной для молочнокислых бактерий возможно вследствие истощения дрожжами питательных веществ. Последние конкурируют с бактериями и в целом находятся в более выгодном положении, поскольку они намного превосходят бактерии по численности, лучше приспособлены к условиям pH, а селективный эффект сульфитации идет им на пользу.
Все эти наблюдения показывают, что яблочно-молочное брожение, которое возникает через несколько дней или недель после окончания спиртового брожения, происходит после длительного периода адаптации бактерий, начавшейся сразу же после дробления винограда. Естественное яблочно-молочное брожение является результатом деятельности устойчивых бактериальных клеток и их медленной приспособляемости к среде.
Распространение различных видов молочнокислых бактерий
Как правило, кокки встречаются в винах в процессе яблочно-молочногэ брожения чаще, чем бациллы. Соотношение обеих форм бактерий может зависеть от климата или от исходной кислотности сусла.
Не претендуя на то, чтобы служить общим законом,, процентные отношения, приведенные в табл. 10.3 и рассчитанные на пробах Домерк, все же, по- видимому, хорошо отражают его сущность. Таким же образом Малан и сотрудники (1965) обнаружили на севере Италии только кокки, тогда как, наоборот, Пуатвэн и сотрудники (1963) в Уругвае, Ди Пляси и Ван Цил (1963) в Южной Африке, т. е. в значительно более теплом климате, не обнаружили гетероферментативных кокков.
В табл. 10.4 дано распределение
Таблица 10.3
Число кокков и бацилл в винах в процессе яблочно-молочного брожения, %
Виды бактерий
CL К О =
5^ о 3
о в
J)
<6 д
=в|
Кокки
63
74
93
Бациллы
37
26
7
штаммов, взятых из различных видов среды. На винограде было найдено больше бацилл, чем кокков, принадлежащих к небольшому числу видов. В суслах, находящихся в стадии спиртового брожения, находили больше кокков, чем бацилл. Наконец, в вине, подвергшемся бактериальной цорче, бациллы находятся в преобладающей пропорции.
В испорченных винах находятся все группы бактерий, так же как и в винах, в которых протекает яблочно-мо- лочное брожение. Однако бациллы чаще всего выделяют из больных вин, а кокки главным образом из вин в процессе биологического раскисления.
В испорченном вине обычно находили бактерии, принадлежащие только к одной группе. С другой стороны, бывает, что яблочно-молочное брожение молодого вина происходит под воздействием смеси нескольких видов бактерий. Так, авторам приходилось выделять из одного и того же вина иногда кокки и бациллы или смесь из Leuconostoc gracile и Leuconostoc oinos; штаммы, действующие или нет на лимонную кислоту; другие штаммы, воздействующие или нет на винную кислоту; наконец, штаммы, имеющие различные пороги pH. Самопроизвольное яблочно- молочное брожение необязательно вызывается одним видом бактерий.
Таблица 10.4
Частота и распределение видов молочнокислых бактерий (по данным Пейно и С. Домерк. Результаты статистической обработки опытов на 670 штаммах)
Виды бактерий
Число выделенных штаммов
Процент от общего количества штам»
виноград
бродящие сусла
яблочно- молочиое брожение
испорченные вина
Pediococcus cerevisiae
12
22
4,8
Leuconostoc gracile
14
16
100
10
20,6
Leuconostoc oinos A+.
10
36
133
53
34,0
Leuconostoc oinos X +
—
4
1
2
1,2
Leuconostoc oinos P +
—
7
3
3
1,9
Lactobacillus plantarum
—
—
12
2
2,1
Lactobacillus casei
—
—
О
3
1,2
Lactobacillus fructivorans
—
—
24
2
3,6
Lactobacillus desidiosus
—
—
2
1
0,4
Lactobacillus hilgardii
53
22
24
53
22,5
Lactobacillus brevis
—
1
10
41
7,7.
ЛИТЕРАТУРА
Amerine М. A. et Kunkee R. Е. (1968), Microbiology of winemaking. Ann. Rev. Mic- rob„ 22, 323.
Barre P. (1966), Ann. Technol. agric., 15, 173.
Barre P. (1969), Archiv. Mikrobiol., 68, 74.
Barre P. (1970), Taxonomie numerique de lactobacillus isoles des vins. Document de travail О. I. V., n° 36.
Barre P. et Galzy P. (1960), Ann. Technol. agric., 9, 331.
Bergey’s Manual of determinative bacte-
riology, 6е ed. (1948), 7е ed. (1957), The Williams and Wilkings Co., Baltimore.
Bezzegh T. (1963), Weinberg u. Keller. 10, 470.
Bid ап P. (1956), Ann. Technol. agric., 4, 597
Bi dan P. (1967), Etude de la fermentation lactique du vin. Taxonomie des bacteries lac- tiques du vin, Document de travail О. I. V. n° 14.
C a r r J. G. (1952), Ann. Rep. Long Ashton Res. Sta„ p. 144.
Carr J. G. (1957), J. Inst. Brew., 63, 436.
С a г г J. G. (1959), J. appl. Bact., 22, 377.
Chatelain R. e t Second L. (1966), Ann. Inst. Pasteur, 111, 630.
Douglas H. C. e t С г u e s s W. V. (1936), Food Res., 1, 113.
Du Plessis L. e t Van Zyl J. A. (1963), South African J. agric. Sci., 6, 261 et 673.
Dupuy P. (1957), Ann. Technol. agric., 6, 93.
Fornachon J. С. M., Douglas H. C. et Vaughn R. H. (1949), Hilgardia, 19, 129.
Fornachon J. С. M. (1957), Austr. J. appl. Sci., 8, 120.
Fornachon J. С. M. (1964), Amer. J. Enol.
Vitic., 15, 184.
Garvie E. I. (1960), J. Dairy Res., 27, 283.
Ga г vie E. I. et Mabbitt L. A. (1967), Archiv. Mikrobiol., 55, 398.
G а у о n U. (1897), Rev. Vitic., 7, 461.
Gi п i B. etVaughn R. H. (1962), Amer. J.
Enol. Vitic., 13, 20.
Gomez R. e t G a 1 z у P. (1966), Ann. Ecol. nat sup. agr., Montpellier 31, 117.
Guimberteau G., Peynaud E. et Do- mercq S. (1962), Mitteilungen, 12, 182.
Gunsa 1 us I. C. et Stanier R. Y. (1960— 1964). The bacteria. A treatise on structure and fonction (en 5 vol.). Academic Press, New York — Londres, Volume I : Structure.
Ingraham J. L., Vaughn R. H. et Cooke G. M. (1960), Amer. J. Enol. Vitic., 11, 1.
Kun к ее R. E. (1967), Adv. Appl. Microbiol., 9, 235.
La f о n-Lafourcade S. et Peynaud E. (1970), Ind. alim. agric., 87, 133.
La mb ion R. et Meskhi A. (1957), Rev. Ferment. Ind. alim., 12, 131.
De Ley J. (1962), Rev. Ferm. Ind. alim., 17, 183. Symposium of the Soc. for general Mic robiok, p. 164.
Lonvaud M. (1975), Recherches sur Ven zyme des bacteries lactiques du vin assurant la transformation du malate en lactate. These Doct. Oenologie. 3е Cycle. Bordeaux.
Malan С. E. (1962), Annali Fac. Sci. agrarie Torino, vol. 1.
Malan С. E., О z i и о О. I. e t G a n d i n i A.
(1965), Atti Accad. ital. Vite Vino, 17, 235.
Marques Gomes J. V., Da S i 1 va В a- bo M. F. et Guimarraes F. (1953),
Commissao Vitic. Regiao Vinhos Verdes.
M i 1 i s a v 1 j e v i c D. (1964), Bull. О. I. V., 37, 374.
Muller-Thurgau H. et Osterwalder A. (1913), Die Bakterien im Wein u. Obstwein u. die dadurch verursachten Veran- derungen, 210 p., Fischer.
Nakagawa A. e t Kitahara K. (1959), J. Gen. appl. Microbiol., 5, 95.
Nonomura H. et О hara Y. (1967), Mitteilungen, 17, 345 et 449.
Nonomura H., Yamazaki T. et О h a- r a Y. (1965), Mitteilungen, 15, 241.
Ochs G. (1959), Mitteilungen, 9, 55.
Orla-Jensen S. (1943), The lactic acid bacteria, Munksgaard, Copenhague.
Ozino О. I. (1967), Atti Accad. ital'. Vite Vino, 19, 99.
Pederson C. S. (1938), J. Bact.,. 35, 95.
Pederson C. S. (1952), Symposium of the lactic acid bacteria, Вас. Rev., 16, 228.
Peynaud E. (1955), Mitteilungen, 5, 183.
Peynaud E. (1956), Amer. J. Enol., 7; 150.
Peynaud E. (1956), Microbiologie appliquee et vinification, Colloque de Viticulture et d’ Oenologie, Barcelone.
Peynaud E. (1967), Etudes recentes sur les bacteries lactiques du vin. IIе Symposium intern, d’Oenologie, Bordeaux, C. R., p. 219.
Peynaud E. et Domereq S. (1961), C. R. Acad. Sci., 252, 3343.
Peynaud E. et Domereq S. (1961), Ann. Technol. agric., 10, 43.
Peynaud E. et Do me req S.(1962),
Boll. Ricerche Marsala, 1, 65.
Peynaud E. et Domereq S.(1967),
Arch. Mikrobiol., 57, 255.
PeynaudE.etDo me reqS.(1967),
Rev. Ferm. Ind. alim., 22, 133.
PeynaudE.etDomereqS.(1968),
Ann. Inst. Pasteur, Lille, 19, 159.
Peynaud E. et Dupuy P. (1964), Bull. О. I. V., n° 403, 903.
Reynaud E. et Guimberteau G. (1964), C. R. Acad. Sci., 258, 4626.
Peynaud E., L a f о п-L a f о u г c a de S. et D о m e rc q S. (1965), Bull. О. I. V., 38, 945.
Peynaud E., Lafon-Lafourcade S. et Guimberteau G. (1967), Rev. Ferm. Ind. alim., 22, 61.
Peynaud E. et S a p i s-D о m e r c q S. (1970), Arch. Mikrobiol., 70, 348.
P о i11evin E., Carrasco A. et Gioia
M. N. (1963), Rev. Latinoamer. Microbiol.,
147.
Prevot A. R. (1957), Manuel de classification et de determination des bacteries anaero- bies, Masson, Paris.
R a d 1 e r F. (1958), Arch. Mikrobiol., 30, 64.
R a d 1 e r F. (1962), Vitis, 3, 144.
Radler F. (1972), Weinberg u. Keller, 19, 357.
Ribereau-Gayon J. (1938), Bull. Assoc. Chim., 55, 601.
R i b ё r e a u-G а у о n J. (1939), Progr. agric, vi- tic., t. Ill et 112.
Ribereau-Gayon J. (1941), Ann. Ferment., 6, 228.
Ribereau-Gayon J. (1942), Ann. Ferment., 7, 21.
R ogos a M. et Sharp e M. E. (1959), J. appl. Bact, 22, 329.
Senez J. C. (1968), Microbiologie generale, Doin, Paris.
Sharpe E. (1961), Ann. Inst. Pasteur, Lille, 12, 133.
Sharpe E. (1962), Dairy Sci. Abstr., 24, 109 et 165.
S n e a t h P. H. A. (1967), J. gen. Microbiol., 17, 184.
Sneath P. H. A. (1962), in Microbial classification (Ainsworth G. C. et Sneath P. H. A.), United Press, Cambridge, p. 289—326.
Sneath P. H. A. (1964), Ann. Rev. Microbiol., 18, 335.
Stanier R. Y., Doudoroff M. e t A d e 1- berg E. A. (1966), Microbiologie generale, Masson, Paris.
Vaughn R. H. (1955), Advance Food Res.,
67.
Vaughn R. H„ Douglas H. C. etFor- nachon J. С. M. (1949), Hilgardia, 19, 133.
Vaughn R. H., Do ugla s H. C. et For- n a ch on J. С. M. (1955), Advance Food Res., 6, 67.
Webb R. B. et Ingraham J. L. (I960), Amer. J. Enol. Vitic, ll, 63.
W e i 11 e r H. G. e t Radler F. (1970), Zentr.
Bakt. Parasit. Infekt. Hygiene, 124, 707.
Глава 11. ОПИСАНИЕ ОСНОВНЫХ видов молочнокислых БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ВИН
В этой главе приведено в качестве примера описание признаков 13 штаммов основных видов молочнокислых бактерий, выделенных из вина. В эти характеристики включены все данные, которыми располагают авторы, относительно их морфологических и физиологических .свойств, около полусотни на один штамм. Они позволяют классифицировать любую бактерию, выделенную из вина, или, по меньшей мере, найти путем сравнения близкий ей вид из числа описанных. Таким образом, эти описания представляют собой карточки типов или карточки эталонов.
Рабочая группа «Микробиология вина» Международного бюро по виноградарству и виноделию собрала в свой
Международный каталог молочнокислых бактерий карты с описанием признаков на 144 штамма (1971). Этот каталог начали составлять в 1969 г. В настоящее время он включает 18 названий видов, которые имеют много синонимов. 15 штаммов не относятся по своему происхождению ни к винограду, ни к вину. Настоящий каталог можно составить только после точной кодификации.
В этой главе также дается несколько микрофотографических снимков молочнокислых бактерий, выделенных из вин. Некоторые из них выполнили с помощью электронного микроскопа Но- номура и сотрудники (1967) и Радлер (1972) (рис. 11.1, 11.2).
Рис. 11 1. Схематические изображения форм бактерий а — Leuconostoc; б — Lactobacillus.
Рис. 11.2. Микрофотографии, выполненные с помощью электронного микроскопа (Иономура и сотрудники, 1967); увеличено приблизительно в 5 000 раз-
а — Pediococcus parvulus (синоним cerevisiae); б — Leuconostoc infrequens (синоним oinos А + ); 6—Lactobacillus easel; г — Lactobacillus buchnerii (синоним desidiosus).
ГОМОФЕРМЕНТАТИВНЫЕ КОККИ
Pediococcus cerevisiae—штамм Jal
Этот штамм выделен в 1962 г. на Агрономической и энологической станции в Бордо из красного вина, обработан-
9*
ного сорбиновой кислотой. Издает запах герани.
Морфологические признаки. Выделены очень маленькие кокки, парные, тетрады или скопления (рис. 11.3).
Физиологические характеристики.
Рис 11.3. Микрофотографии, выполненные с помощью электронного микроскопа (Радлер, 1972):
а—Leuconostoc oinos (увеличение 600); б — Lactobacillus easel (увеличение 8500), в — Lactobacillus brevis (увеличение 5500), г — Pediococcus cerevisiae (увеличение 5000).
Гомоферментативные кокки: не образуют углекислого газа из глюкозы, и маннита из фруктозы. Тест Карра: нелетучая кислотность 21 мг-экв/.л; летучая—1,2 мг-экв/л, отношение НК/ЛК 17,5. Образование этилового спирта < < 1 ммоль/л.
Образующаяся молочная кислота: D(-) и L( + ). Оптимальная температура 25° С; отмечается рост при 15° С и отсутствие его при 45° С.
Рост на различных сахарах:
+ : глюкоза, фруктоза, манноза, трегалоза, целлобиоза;
—: арабиноза, рамноза, ксилоза, галактоза, лактоза, сахароза, мелибиоза, рафиноза.
Рост на других субстратах, содержащих углерод:
+ : яблочная кислота;
—: лимонная, винная, глюконовая, глюкуроновая, галактуроновая кислоты, глицерин, мезоинозит, сорбит, маннит.
Другие характеристики. Отсутствие образования гидрата окиси аммония из аргинина.
Образование глицерина (12 ммоль/л), бутандиола-2,3 (22 ммоль/л).
Потребности в аминокислотах: аргинин, глутаминовая кислота, лейцин, фенилаланин, серин, триптофан, тирозин, валин.
Потребности в факторах роста: пан-
тотеновая кислота (играет роль активатора).
Порог pH использования сахаров 3,0; для яблочной кислоты 3,8.
Предел спиртовыносливостп культуры 14% об.
Повышение кислотности в различных условиях аэрации: в открытой культуре 66 мг-экв/л.;
в пробирке с доступом воздуха 88 мг-экв/л;
в полном флаконе, закрытом пробкой, 126 мг-экв/л;
под пирогаллом 64 мг-экв/л.
Кокк микроаэрофильный, активирующее действие углекислого газа.
Pediococcus pentosaceus — штамм В 44
Выделен в 1966 г. в Институте микробиологии и энологии в Майнце (ФРГ) из вина района Пфальца.
Морфологические признаки. Кокк грамположительный; диаметр 0,6— 0,7 мкм.
Физиологические характеристики. Кокк гомоферментативный на глюкозе.
Образующаяся молочная кислота.
D(-) и L( + ).
Рост при 15° С, отсутствие роста при 45° С.
Рост на различных сахарах:
+: арабиноза, ксилоза, глюкоза, фруктоза, галактоза, манноза, сахароза, трегалоза, целлобиоза, лактоза;
—: рамноза, мелибиоза, рафиноза, крахмал.
Рост на других субстратах, содержащих углерод:
+ : яблочная кислота;
—: лимонная, винная кислоты, глицерин, мезоинозит, сорбит, маннит.
Другие характеристики. Отсутствие образования гидрата окиси аммония и$ аргинина.
Образование ацетоина, отсутствие образования декстрана.
Слабое подкисление скисшего (свернувшегося) молока.
Потребности в аминокислотах: треонин, триптофан, тирозин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, гликокол, изолейцин, лейцин, глутаминовая кислота, валин, аргинин, аспарагиновая кислота.
Выносливость к хлористому натрию 6,5%.
Рост в присутствии воздуха, отсутствие роста без доступа воздуха; кокк микроаэрофильный.
ЕЕТЕРОФЕРМЕНТАТИ ВНЫЕ КОККИ
Leuconostoc gracile — штамм ВС 33
Выделен в I960 г. на Агрономической и энологической станции в Бордо и т
Pile. 11.4. liuconoMoc grae.Ie (v.-e тензг 1000).
молодого красного вина «Медок» в процессе яблочно-молочного брожения.
Морфологические признаки. Стрептококки очень малых размеров, имеющие вид цепочек, состоящих из 4 — 10 яйцевидных клеток (рис. 11.4).
Физиологические характеристики. Кокк гетероферментативный: образует углекислый газ, уксусную кислоту, этиловый спирт на глюкозе, маннит на фруктозе. Тест Карра: нелетучая кислотность 15 мг-экв/л, летучая — 7,3 мг-экв/л; отношение НЛ/ЛК 2,0. Образующаяся молочная кислота D(-).
Оптимальная температура 15° С; при 45°С рост отсутствует.
Рост на различных сахарах:
+ : глюкоза, фруктоза, манноза, сахароза, трегалоза, целлобиоза;
—: арабиноза, ксилоза, рамноза, галактоза, лактоза, мальтоза, мелибиоза, рафиноза.
Рост на других субстратах, содержащих углерод:
+ : яблочная, лимонная, глюконовая кислоты;
—: винная, глюкуроновая, галакту- роновая кислоты;
глицерин, мезоинозит, сорбит, маннит.
Другие характеристики. Нет образования гидрата окиси аммония из аргинина.
Образование глицерина (11 ммоль/л), бутандиола-2,3 (200 мг/л).
Потребности в аминокислотах: глутаминовая кислота, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, тирозин, валин.
Потребности в факторах роста: пантотеновая кислота, никотинамид, урацил.
Порог pH использования сахаров 3,4; использования яблочной кислоты 3,0.
Предел спиртовыносливости культуры 14% об.
Повышение кислотности в различных условиях аэрации:
в открытой культуре 42 мг-экв/л;
в пробирке с доступом воздуха 82 мг-экв/л;
в полном флаконе, закрытом пробкой, 118 мг-экв/л;
под пирогаллолом 58 мг-экв/л.
Кокк микроаэрофильный, активирующее действие углекислого газа.
Leuconostoc oinos(A+)— штамм Bz3
Выделен в 1956 г. на Агрономической и энологической станции Бордо из молодого красного вина «Cotes de Buzet» во время яблочно-молочного брожения.
Морфологические признаки. Очень маленькие стрептококки обычно в виде цепочек, насчитывающих до 15 клеток.
Физиологические характеристики. ■Кокк гетероферментативный: образует углекислый газ, уксусную кислоту, этанол на глюкозе, маннит на фруктозе. Тест Карра: нелетучая кислотность 50 мг-экв/л, летучая — 20 мг-экв/л; отношение НК/ЛК 2,5. Образующаяся молочная кислота D(—).
Оптимальная температура 25° С, рост при 15° С, отсутствие роста при 45° С.
Рост на различных сахарах:
+ : арабиноза, глюкоза, фруктоза, манноза, сахароза, трегалоза, мелибиоза, целлобиоза, рафиноза;
—: ксилоза, рамноза, галактоза, мальтоза.
Рост на других субстратах, содержащих углерод:
+ : яблочная, лимонная, глюконовая кислоты;
—: винная, глюкуроновая, галакту- роновая кислоты, глицерин, мезоинозит, сорбит, маннит.
Другие характеристики. Нет образования гидрата окиси аммония из аргинина.
Образование глицерина (10 мг-экв/л), бутандиола-2,3 (400 мг/л).
Потребность в аминокислотах: аргинин, глутаминовая кислота, гистидин, лейцин, фенилаланин, серин, треонин, триптофан, тирозин, валин.
Потребности в факторах роста: пантотеновая кислота, никотинамид.
Порог pH сбраживания сахаров 3,6; яблочной кислоты 3,0.
Предел спиртовыносливости культуры 13% об.
Повышение кислотности в различных условиях аэрации:
в открытой культуре 52 мг-экв/л:
в пробирке с доступом воздуха 124 мг-экв/л;
в полном флаконе, закрытом пробкой, 160 мг-экв/л;
под пирогаллолом 162 мг-экв/л.
Кокк анаэробный, факультативный.
Leuconostoc oinos (Х+) — штамм SC122
Выделен в 1960 г. на Агрономической и энологической станции Бордо из сусла «Premieres C6tes» Бордо.
Морфологические признаки. Кокки толстые, образующие цепочки (рис. 11.5).
Физиологические характеристики. Кокк гетероферментативный: образу-
Рис 11 5. Leuconostoc oinos (X 4-) (увеличение 1000)
ет углекислый газ, уксусную кислоту, этанол на глюкозе, маннит на фруктозе. Тест Карра: нелетучая кислотность 37 мг-экв/л; летучая —9,1 мг-экв/л; отношение НК/ЛК 4,1. Образующаяся молочная кислота D(- ).
Оптимальная температура: 15—25° С; при 45° С роста нет.
Рост на различных сахарах:
+: ксилоза, глюкоза, фруктоза, манноза, сахароза, трегалоза, мелибиоза, целлобиоза, рафиноза;
—: арабиноза, рамноза, галактоза, лактоза, мальтоза.
Рост на других субстратах, содержащих сахар:
+ : яблочная, лимонная, глюконовая кислоты;
—: винная, глюкуроновая, галакту- роновая кислоты, глицерин, мезоинозит, сорбит, маннит.
Другие характеристики. Нет образования гидрата окиси аммония из аргинина.
Образование глицерина (17 мг-экв/л), бутандиола-2,3 (418 мг/л).
Потребность в аминокислотах; глутаминовая кислота, лейцин, фенилаланин, триптофан, тирозин, валин.
Потребности в факторах роста: пантотеновая кислота, никотинамид, пара- аминобензойная кислота.
Порог pH использования сахаров 3,8; — яблочной кислоты 3,2. Предел спиртовыносливости культуры 12% об.
Повышение кислотности в различных условиях аэрации:
в открытой культуре 100 мг-экв/л;
в пробирке с доступом воздуха 188 мг-экв/л;
в полном флаконе, закрытом пробкой, 182 мг-экв/л;
под пирогаллолом 180 мг-экв/л.
Кокк анаэробный факультативный.
Leuconostac oinos (Р + ) — штамм F12
Выделен в 1960 г. на Агрономической и энологической станции Бордо из сус-
ла, полученного в районе Сент-Эмиль- он.
Морфологические признаки. Очень маленькие стрептококки, имеющие вид более или менее длинных цепочек.
Физиологические характеристики. Кокк гетероферментатпвный: образует углекислый газ, уксусную кислоту, этанол на глюкозе, маннит на фруктозе. Тест Карра: нелетучая кислотность 111 мг-экв/л; летучая—17 мг-экв/л; отношение НК/ЛК 6,5. Образующаяся молочная кислота 1)( ).
Оптимальная температура 25° С, отсутствие роста при 45° С.
Рост на различных сахарах:
+ : арабиноза, ксилоза, глюкоза, фруктоза, галактоза, манноза, сахароза, мальтоза, трегалоза, мелибиоза, рафиноза;
—: рамноза, лактоза, целлобиоза.
Рост на других субстратах, содержащих углерод:
+ : молочная, лимонная, глюконовая кислоты.
—: винная, глюкуроновая, галакту- роновая кислоты, глицерин, мезоинозит, сорбит, маннит.
Другие характеристики. Образование гидрата окиси аммония из аргинина.
Образование глицерина (11 мг-экв/л), бутандиола-2,3 (358 мг/л).
Потребности в аминокислотах: аргинин, гистидин, метионин, фенилаланин, серин, треонин, триптофан, тирозин, валин.
Потребности в факторах роста: пантотеновая кислота, никотинамид, мезоинозит.
Порог pH сбраживания сахаров 3,6, яблочной кислоты — 3,4. Предел спир- товыносливости культуры 14% об.
Повышение кислотности в различных условиях аэрации:
в открытой культуре 70 мг-экв/л;
в пробирке с доступом воздуха 156 мг-экв/л;
в полном флаконе, закрытом пробкой, 140 мг-экв/л;
под пирогаллолом 158 мг-экв/л.
Кокк анаэробный факультативный.
ГОМОФЕРМЕНТАТИВНЫЕ БАЦИЛЛЫ
Lactobacillus plantarum — штамм LA1
Выделен в 1960 г. в лаборатории химического факультета Университета Монтевидео из одного из уругвайских вин. Исследован в 1963 г. на Агрономической и энологической станции в Бордо.
Рис. 116. Lactobacillus plantarum (увеличение 1000).
Морфологические признаки. Маленькие короткие палочки, существующие отдельно, попарно или в виде стрепто- бацилл (рис. 11.6).
Физиологические характеристики. Бациллы гомоферментативные: без образования углекислого газа на глюкозе и маннита на фруктозе. Тест Карра: нелетучая кислотность 129 мг-экв/л; летучая — 4,9 мг-экв/л; отношение НК/ЛК 26,3. Образование этанола <
<1 ммоль/л. Образующаяся молочная кислота D(—)+L( + ).
Оптимальная температура 25° С; рост при 15° С; отсутствие роста при 45° С.
Рост на различных сахарах:
+ : арабиноза, глюкоза, фруктоза, галактоза, лактоза, сахароза, мальтоза, мелибиоза, целлобиоза, рафиноза;
—: рамноза, ксилоза.
Рост на других субстратах, содержащих углерод;
+ : яблочная, лимонная, глюконовая кислоты, сорбит, маннит;
—: винная, глюкуроновая, галакту- роновая кислоты, глицерин, мезоинозит.
Другие характеристики. Нет образования гидрата окиси аммония из аргинина. Образование глицерина (25 ммоль/л), бутандиола-2,3 (34мг/л).
Потребности в аминокислотах: аланин, цистин, глутаминовая кислота, изолейцин, лейцин, треонин, валин.
Потребности в факторах роста: пантотеновая кислота, никотинамид.
Порог pH использования сахаров 3,0; яблочной, кислоты 3,4.
Предел спиртовыносливости культуры 13% об.
Повышение кислотности в различных условиях аэрации:
в открытой культуре 66 мг-экв/л;
в пробирке с доступом воздуха или в наполненном доверху и закрытом плотной пробкой стакане, или же под пирогаллолом 108 мг-экв/л. Бацилла анаэробная, факультативная.
Lactobacillus casei bap. casei —
штамм Q 16
Выделен в 1956 г. на Агрономической и энологической станции Бордо из молодого красного вина «Premieres Cotes de Bordeaux».
Морфологические признаки. Длинные и тонкие бациллы, существующие
изолированно или в виде стрептоба- цилл.
Физиологические характеристики. Бациллы гомоферментативные: без образования углекислого газа, уксусной кислоты на глюкозе, маннита на фруктозе. Тест Карра: нелетучая кислотность 41 мг-экв/л; летучая — 2,0 мг-экв/л; отношение НК/ЛК 20,5. Образование этанола<1 ммоль/л. Образующаяся молочная кислота L( + ).
Оптимальная температура 35° С; слабый рост при 15° С, отсутствие роста при 45° С.
Рост на различных сахарах:
+ : глюкоза, фруктоза, галактоза, лактоза, сахароза, мальтоза, целлобиоза;
—: арабиноза, рамноза, ксилоза, мелибиоза, рафиноза.
Рост на других субстратах, содержащих углерод:
+ : яблочная, глюконовая кислоты, маннит;
—: лимонная, винная, молочная, сорбиновая, глюкуроновая, галактуроно- вая кислоты, глицерин, мезоинозит, сорбит.
Другие характеристики. Нет образования гидрата окиси аммония из аргинина.
Образование глицерина (13ммоль/л), бутандиола-2,3 (34 мг/л); нет образования эритрита, арабита на глюкозе.
Потребности в аминокислотах: аланин, глутаминовая кислота, изолейцин, лейцин, фенилаланин, пролин, треонин, триптофан, тирозин, валин.
Потребности в факторах роста: рибофлавин, пантотеновая кислота, никотинамид.
Порог pH использования сахара 3,6; яблочной кислоты 3,4.
Предел спиртовыносливости культуры 11% об.
Повышение кислотности в различных условиях аэрации:
открытая культура 66 мг-экв/л; **
пробирки ■ с доступом воздуха 96 мг-экв/л;
флакон, наполненный доверху, закрытый пробкой, 138 мг-экв/л;
под пирогаллолом 84 мг-экв/л.
Бацилла микроаэрофильная, активирующее действие углекислого газа.
Streptobacterium sp. — штамм Е 1
Выделен в 1960 г. на Агрономической и энологической станции Бордо из белого больного (турн) вина.
Морфологические признаки. Маленькие короткие бациллы, существующие в одиночку или в виде стрептобацилл.
Физиологические характеристики. Бациллы гомоферментативные: без образования углекислого газа на глюкозе, маннита на фруктозе. Тест Карра: нелетучая кислотность 93 мг-экв/л; летучая — 3,7 мг-экв/л; отношение НК/Ж 25. Образование этанола < <1 ммоль/л. Образующаяся молочная кислота D(-) + L(+).
Оптимальная температура 30° С, слабый рост при 15° С, отсутствие роста при 45° С.
Рост на различных сахарах:
+ : глюкоза, фруктоза, целлобиоза;
—: арабиноза, рамноза, ксилоза, галактоза, лактоза, сахароза, мальтоза, мелибиоза, рафиноза.
Рост на других субстратах, содержащих углерод:
+ : яблочная кислота, глюкуроновая кислота, маннит;
—: лимонная кислота, винная кислота, глюконовая кислота, галактуроно- вая кислота, глицерин, мезоинозит, сорбит.
. Другие характеристики. Нет образования гидрата окиси аммония из аргинина.
Образование глицерина (3 ммоль/л), бутандиола-2,3 (50 мг/л).
Потребности в аминокислотах: аргинин, цистин, глутаминовая кислота,
изолейцин, лейцин, фенилаланин, серин, триптофан, валин.
Потребности в факторах роста: рибофлавин, пантотеновая кислота, никотинамид.
Порог pH использования сахаров 3,0; яблочной кислоты 3,8.
Предел спиртовыносливости культуры 12% об.
Повышение кислотности в различных условиях аэрации:
в открытой культуре 138 мг-экв/л;
в пробирке с доступом воздуха 158 мг-экв/л;
в полных флаконах, закрытых пробкой, 160 мг-экв/л;
под пирогаллолом 90 мг-экв/л.
Бацилла микроаэрофильная.
ГЕТЕРОФЕРМЕНТАТИВНЫЕ БАЦИЛЛЫ
Lactobacillus fructivorans — штамм
Bn 1
Выделен в 1963 г. на Агрономической и энологической станции в Бордо из молодого красного вина «Баньюл».
Морфологические признаки. Бациллы тонкие, отдельные или в виде стреп- тобацилл; длина палочек от 3 до 5мкм.
Физиологические характеристики.
Бациллы гетероферментативные: образуют углекислый газ, уксусную кислоту, этанол на глюкозе, маннит на фруктозе. Тест Карра: нелетучая кислотность 19 мг-экв/л, летучая—8 мг-экв/л; отношение НК/ЛК 2,4. Образующаяся молочная кислота D(—) + L( + ).
Оптимальная температура 25° С, слабый рост при 15° С, отсутствие роста при 45° С.
Рост на различных сахарах:
+ : глюкоза, фруктоза, сахароза, мальтоза, мелибиоза, рафиноза;
—: арабиноза, рамноза, ксилоза, галактоза, манноза, лактоза, трегалоза, целлобиоза.
Рост на других субстратах, содержащих углерод:
+: яблочная кислота, лимонная кислота, глюконовая кислота;
—: молочная кислота, глюкуроновая кислота, галактуроновая кислота, глицерин, мезоинозит, сорбит, маннит.
Другие характеристики. Образование гидрата окиси аммония из аргинина.
Образование глицерина (14 ммоль/л) бутандиола-2,3 (103 мг/л).
Потребности в аминокислотах: аспарагиновая кислота, цистин, глутаминовая кислота, лейцин, валин.
Потребности в факторах роста: никотинамид.
Порог pH использования сахаров 3,4; яблочной кислоты 3,4.
Предел спиртовыносливости культуры 14% об.
Повышение кислотности в различных условиях аэрации:
в открытой культуре 58 мг-экв/л;
в пробирке с доступом воздуха 98 мг-экв/л;
в полном флаконе, закрытом пробкой, 150 мг-экв/л;
под пирогаллолом 142 мг-экв/л. Бацилла анаэробная, факультативная.
Lactobacillus desidiosus — штамм CV241
Выделен в 1962 г. на Агрономической и энологической станции Бордо из винного дрожжевого осадка, доведенного до pH 3,8 и выдержанного в течение нескольких недель при 25° С; содержание летучей кислоты достигла 0,96 г/л.
Морфологические признаки. Бациллы очень длинные и тонкие — от 5 до 10 мкм.
Физиологические характеристики.
Бациллы гетероферментативные: образуют углекислый газ, уксусную кислоту и этанол на глюкозе. Тест Карра: нелетучая кислотность 69 мг-экв/л; летучая —■ 53 мг-экв/л; отношение
НК/ЛК 1,3. Образующаяся молочная кислота D (—) + L (+).
Оптимальная температура 25° С, рост при 15° С, отсутствие роста при 45° С.
Рост на различных сахарах:
+ : арабиноза, глюкоза, фруктоза, сахароза;
—: рамноза, ксилоза, галактоза, манноза, лактоза, мальтоза, трегалоза, ме- либиоза, целлобиоза, рафиноза.
Рост на других субстратах, содержащих углерод:
+ : яблочная кислота, глюконовая кислота;
—: лимонная кислота, винная кислота, глюкуроновая кислота, галактуроновая кислота, глицерин, мезоинозит, сорбит, маннит.
Другие характеристики. Образование гидрата окиси аммония из аргинина.
Образование глицерина (13 ммоль/л), бутандиола-2,3 (148 мг/л).
Потребности в аминокислотах: аспарагиновая кислота, цистин, глутаминовая кислота, лейцин, валин.
Потребности в факторах роста: пантотеновая кислота, никотинамид.
Порог pH использования сахаров 3,4; яблочной кислоты 3,6.
Предел спиртовыносливости культуры 13% об.
Повышение кислотности в различных условиях аэрации:
в открытой культуре, в пробирке, с доступом воздуха, в наполненном доверху флаконе, закрытом плотной пробкой, или под пирогаллолом — от 148 до 156 мг-экв/л.
Бацилла анаэробная факультативная, мало чувствительна к кислороду.
Lactobacillus hilgardii— штамм РМ 4
Выделен в 1960 г. на Агрономической и энологической станции Бордо из сусла Сотерн в процессе брожения.
Морфологические признаки. Бациллы большей или меньшей длины — в пределах от 2 до 10 мкм — существуют каждая отдельно.
Физиологичес кие характеристики. Бациллы гетерофермеитативные: образуют углекислый газ, этанол, уксусную Кислоту на глюко е, машин па фруктозе. Тест Карра: нелетучая кислотность G0 мг-экв/л, летучая - 69 мг-экв/л; отношение НК/ЛК 0,83. Образующаяся .молочная кислота D( -)+L( + ).
Оптимальная температура 25° С, рост при 15° С, отсутствие роста при 45° С.
Рост на различных сахарах:
+ : ксилоза, глюкоза, фруктоза, галактоза, сахароза, мальтоза, мелибио- за, рафиноза;
—: арабиноза, рамноза, манноза, лактоза, трегалоза, целлобиоза.
Рост на других субстратах, содержащих углерод:
+ : яблочная, глюконовая кислоты;
—: лимонная, винная, глюкуроновая, галактуроновая кислоты, глицерин, мезоинозит, сорбит, маннит.
Другие характеристики. Нет образования гидрата окиси аммония из аргинина.
Образование глицерина (9,4 ммоль/л), бутандиола-2,3 (459 мг/л).
Потребности в аминокислотах: глутаминовая кислота, изолейцин, лейцин, валин.
Потребности в факторах роста: пантотеновая кислота, никотинамид.
Порог pH использования сахаров 3,2, яблочной кислоты — 3,4.
Предел спиртовыносливости культуры 13% об.
Повышение кислотности в различных условиях аэрации:
в открытой культуре 112 мг-экв/л;
в пробирке с доступом воздуха, в полном флаконе, закрытом пробкой, или под пирогаллолом 152 мг-экв/л. Бацилла анаэробная, факультативная.
Lactobacillus brevis — штамм VF 1
Выделен в 1961 г. на Агрономической и энологической станции Бордо из тягучего красного вина (9,5% об., общая кислотность 4,70, летучая кислотность 0,79).
Рис. 11.7. Lactobacillus brevis (увеличение 1000)
Морфологические признаки. Бацил- цы тонкие, длина от 2 до 6 мкм; существуют отдельно или в виде стрепто- бацилл (рис. 11.7).
Физиологические характеристики. Бациллы гетерофермеитативные: образуют углекислый газ, уксусную кислоту, этиловый спирт на глюкозе, маннит на фруктозе. Тест Карра: нелетучая кислотность 83 мг-экв/л, летучая — 127 мг-экв/л; отношение НК/ЛК 0,65. Образующаяся молочная кислота D(-)+L( + ).
Оптимальная температура 25° С; рост при 15° С, отсутствие роста при 45° С.
Рост на различных сахарах:
+ : арабиноза, ксилоза, глюкоза, фруктоза, галактоза, лактоза, сахароза, мальтоза, мелибиоза, рафиноза;
—: рамноза, манноза, трегалоза, целлобиоза.
Рост на других субстратах, содержащих углерод;
+ : яблочная, глюконовая, глюкуроновая, галактуроновая кислоты.
—: лимонная, винная кислоты, глицерин, мезоинозит, сорбит, маннит.
Другие характеристики. Образование гидрата окиси аммония из аргинина.
Образование глицерина (53 мг-экв/л), бутандиола-2,3 (108 мг/л).
Потребности в аминокислотах: глутаминовая кислота, изолейцин, лейцин,
валин. Потребности в факторах роста: пантотеновая кислота, никотинамид.
Порог pH использования сахаров и яблочной кислоты 3,0.
Предельная спиртуозность культуры 15% об.
Повышение кислотности в различных условиях аэрации:
в открытой культуре 112 мг-экв/л;
в пробирке с доступом воздуха или в полном флаконе, закрытом пробкой, или под пирогаллолом от 152 до 158 мг-экв/л.
Бацилла анаэробная, факультативная.
Глава 12. УСЛОВИЯ РАЗВИТИЯ И АКТИВНОСТИ МОЛОЧНЫХ БАКТЕРИЙ ВИНА
СПОСОБЫ ИССЛЕДОВАНИЯ РОСТА БАКТЕРИЙ
Бактериальная популяция определяется двумя параметрами: микробиальной плотностью, т. е. массой клеток на единицу объема, и клеточной концентрацией, т. е. числом клеток на единицу объема. Возрастание этих двух параметров отражает рост бактерий. Масса клеток выражает массу синтезированного органического вещества, концентрация — число клеточных делений. В гл. 7 было показано на примере дрожжей, что для роста микроорганизмов необходимо сочетание определенного числа факторов и условий.
Понятие «ограничивающий фактор» было определено в гл. 7, как любой фактор, отсутствие или недостаток которого влекут за собой остановку роста. Определены также различные фазы роста: скрытое состояние, ускоренное развитие, экспоненциальная или
логарифмическая фаза, замедление, устойчивая фаза и отмирание (см. рис. 7.1).
Подсчет общего количества клеток и числа живых клеток
Для исследования размножения и активности молочнокислых бактерий можно использовать способы, аналогичные тем, какие применяют в отношении дрожжей. Метод прямого подсчета клеток с помощью гематиметра Маласеза может также применяться к бактериям, используя увеличение в 600 раз; подсчет стрептококков или стрептобацилл остается приблизительным, так как невозможно подсчитать элементы цепочек; в зависимости от их длины результаты могут иметь большие расхождения. Кроме того, можно определять число бактерий по отношению к дрожжам, которые легче поддаются подсчету, например, в молодом вине.
Камера счетчика клеток Салумбини разделена на 400 маленьких квадрат-
ных чашечек глубиной 0,04 мм и площадью 0,0025 мм2, т. е. объемом 1/10 000 мм3 каждая. Бактериальная суспензия фиксируется на формальдегиде и окрашивается метиленовой синью; через 5 мин покоя суспензию рассматривают под микроскопом. Трудности представляют наводка на фокус и определение местонахождения бактерий. Наряду с другими исследования-
Сухая масса молочнокислых бактерий, м.:,'л
Рис. 12.1. Калибровочная кривая зависимости между сухой массой бактерий молочнокислого брожения в суспензии и оптической плотностью, определенной прямым отсчетом на шкале нефелометра.
ми авторы отказались от метода прямого подсчета и предпочли способ, основанный на нефелометрических измерениях с эталонированием по массе.
Известно отношение между мутностью бактериальных суспензий и сухой массой бактерий; однако форма, в зависимости от того, кокки это или бациллы, и величина клеток могут исказить истинную картину. При очень тщательной работе в одних и тех же условиях среды, окраски и т. д. помутнение, измеренное нефелометром, можно выразить в сухой массе бакте
рий, находящихся в состоянии суспензии, в соответствии с заранее построенным графиком (Меламед, 1962). Для удобства работы можно использовать одну и ту же кривую для всех бактерий, хотя и существуют расхождения (в среднем около 10%) между бактериями различной формы. На рис. 12.1 представлена кривая среднего типа. В табл. 12.1 приведены отношения между массой бактерий и числом клеток для двух молочнокислых бацилл; в табл. 12.2 показано влияние формы и величины бактерий на определение методом нефелометрии.
Число живых бактерий определяют путем подсчета на чашках Петри. Этот способ труднее реализовать, и он менее точен, чем при работе с дрожжами. Он позволяет приближенно вычислять «жизнеспособность» культур, но не может быть мерой их реального роста. Размножаются не все живые клетки, а некоторые колонии могут возникнуть из групп клеток. Такой метод, который позволил, например, следить за поведением молочнокислых бактерий, введенных в вино, дает лишь сравнительные результаты. Когда живые бактерии находятся в большом объеме жидкости (например,. в осветленных винах), предпочтительно использовать фильтрующие мембраны; нужно, чтобы состав питательной среды, на которую помещают мембрану, подходил для развития молочнокислых бактерий вина; работу проводят в атмосфере углекислого газа (Пейно и Сапис-Домерк, 1972).
Эволюция молочнокислых брожений
За развитием культуры можно также следить путем периодического определения одного из поглощаемых или образуемых элементов. В случае молочнокислого сбраживания сахаров определяют молочную кислоту или,
Таблица 12.1
Отношение между массой молочнокислых бактерий Lactobacillus hilgardii и числом клеток
Штаммы бактерий
Число клеток на 1 см*
Влажная масса,* мг/л
Число клеток на 1 мг влажной массы
Сухая масса, мг/л
Число клеток иа 1 мг сухой массы
Штамм ВС 2
3,1 -108
5970
5,2-10’
335
9,5-108
Штамм BZ 14
2,0-10s
4980
4,0-10’
275
7,2-Ю8
* Масса остатка от центрифугирования, после обезвоживания.
Таблица 12.2
Отношение между' мутностью бактериальной суспензии и формой и величиной клеток
Виды бактерий
Приблизительные размеры, мкм
Масса бактерий (в мг/л), вызывающих одно и то же значение помутнения (75 делений нефелометра)
Средние кокки
0,8
3,62
Большие кокки
1,2
3,17
Малые стрептококки Бациллы
0,6
3,35
короткие
0,5-1,0
3,75
длинные, тонкие
0,5-5
3,25
длинные, то,петые
0,6-3
3,25
что проще, увеличение общей кислотности. При яблочно-молочном брожении вина можно проследить исчезновение яблочной кислоты, применяя хроматографию или количественный микробиологический, или энзиматический анализ; можно, наконец, определять количество углекислого газа манометрическим методом или применением специального электрода (Лонво, 1975).
При изучении молочнокислого брожения полной содержащей сахар питательной среды (разбавленное виноградное сусло, обогащенное 5 г/л дрожжевого экстракта и доведенного до pH 4,4), засеянной бактериями, вы-
Рис. 12.2. Эволюция роста бактерий, определенная:
а — по сухой массе бактерий, образовавшихся во время молочнокислого сбраживания сахаров; б — по увеличению кислотности во время молочнокислого сбраживания сахаров: 1 — Ре- diococcus cerevisiae; 2 — Leuconostoc oinos A+; 3 — Lactobacillus casei; 4 — Lactobacillus hil- gardii. .
деленными из вина, в количестве от 30 000 до 50 000 на 1 см3 при температуре 25° С (рис. 12.2), можно сделать следующие замечания:
помутнение, которое можно измерить, проявляется через 24—48 ч после засева; при прочих равных условиях скрытая фаза более продолжительна у кокков; гетеро- или гомофер- ментативный характер бактерий не оказывает на этот фактор никакого влияния;
максимальной численности популяция достигает у молочнокислых бацилл через 4 дня, у кокков за 8— 12 дней;
Рис. 12.3. Схема эволюции роста бактерий и яблочно-молочиого брожения при виноделии по красному.
урожаи бактерий выше у гетеро- ферментативных видов; массовые значения образующихся гетерофермента- тивных бацилл в 2 раза больше, чем у гомоферментативных бацилл;
образование кислотности начинается не сразу; жидкость непрозрачна, в то время как еще не образовалась .концентрация кислотности, достаточная для количественного определения;
образование кислотности происходит’ интенсивно после того, как популяция. достигнет стационарной фазы; кислотность может удвоиться, на
чиная с момента, когда констатируют максимальный рост бактерий. По истечении 20 дней подкисление все еще продолжается. Не отмечается параллелизма, который существует, например, между спиртовым брожением и размножением дрожжей. Бактерии растут быстрее, чем дрожжи, но имеется расхождение, разрыв между образованием молочной кислоты и ростом;
максимальные значения образующейся кислотности у различных бактерий мало различаются между собой, во всяком случае, они менее изменчивы, чем максимальные значения массы бактерий.
Когда анализируют процесс спонтанного роста бактерий с момента начала переработки винограда посредством указанных выше количественных способов, обычно различают два последовательных цикла роста, которые схематически отражены на рис. 12.3. Первый начинается в первые часы брожения на мезге и протекает параллельно с развитием дрожжей; размножение бактерий прекращается с образованием спирта, и популяция бактерий претерпевает очень сильное уменьшение. Число живых клеток, остающихся в новом вине после спиртового брожения, может сильно колебаться. Веч (1973) сообщает, что у швейцарских вин это число колеблется от 100 до 80 000 на 1 см3; 2/з вин имеют свыше 10 000 живых бактерий на 1 см3. Следующий^за этим латент- -ный период является "более или менее длительным. В отдельных редких случаях могут быть совмещения по времени спиртового и яблочно-молочного -брожения, что нежелательно; чаще всего латентный период длится несколько дней или несколько недель, если при этом выступает какой-либо ограничивающий фактор (сернистый -ангидрид,, неблагоприятная темпера-
тура); скрытый период может продолжаться в течение нескольких месяцев.
После этой фазы размножение возобновляется и вызывает сбраживание яблочной кислоты. На первой стадии образование молочной кислоты идет слабо. Яблочно-молочное брожение проявляется некоторой задержкой размножения клеток. Разложение яблочной кислоты начинается только тогда, когда рост достигает логарифмической фазы; оно продолжается во
Рис. 12.4. Приспособление, позволяющее экспериментально обнаружить начало яблочно-мо- лочного брожения благодаря образующемуся пузырьку углекислого газа.
время стационарной фазы и даже в фазе замедления. Когда популяция слаба, яблочная кислота не расходуется. Похоже, что численность популяции должна превзойти 1 млн. клеток на 1 см3, чтобы яблочно-молочное брожение действительно началось. Фактически речь идет не о настоящем брожении, поскольку оно не является источником энергии.
Затем после исчезновения яблочной кислоты популяция уменьшается более или менее быстро, и наконец в вине остается популяция живых клеток, численность которой зависит от их pH, степени сульфитации, способов освет
ления (Мартиньер и сотрудники, 1974).
Чтобы проследить эволюцию яблоч- но-молочного брожения, в лабораторных условиях было использовано следующее приспособление. Засеянную питательную среду или вина, подлежащие исследованию, помещали в колбы вместимостью 100 или 200 см3 с длинной тонкой калиброванной шейкой. Их наполняют до калибровочной метки и закрывают толстым слоем смеси, состоящей на 2/3 из парафина и на '/з из парафинового масла, которую сжижают легким нагреванием. Затем колбы ставят в термостат при 25° С. При этой температуре смесь затвердевает и сохраняет консистенцию пасты. Такое приспособление позволяет наблюдать пузырек углекислого газа, образующийся под парафиновой пробкой, и фиксировать его объемы, которые заставляют пробку подниматься вверх по горловине колбы (рис. 12.4). Исследуемые среды предварительно очищают от углекислого газа путем взбалтывания под вакуумом. Затем во избежание вмешательства дрожжей в вино вводят актидион из расчета от 2 до 5 мг/л. Система обтюрации действует надежно только при температуре 25° С.
Этот способ особенно чувствителен для определения момента начала яб- лочно-молочного брожения и позволяет быстро делать большое число сравнений. Этот способ применим и тогда, когда хотят оценить шансы еще кислого вина подвергнуться спонтанному яблочно-молочному брожению; для этого образец вина, помещенный в такую колбу, ставят в термостат и следят за появлением первого пузырька под парафином. Следует подтвердить аналитически исчезновение яблочной кислоты и титруемой кислотности, так как образование углекислого газа даже без участия дрожжей,
нельзя рассматривать как явление специфическое для яблочно-молочно- го брожения.
Чтобы точнее проследить этот феномен, можно использовать углекислотный электрод, который позволяет количественно определять углекислый газ, растворенный в жидкости (Лонво и Риберо-Гайон, 1973); углекислый газ диффундирует через тефлоновую мембрану в электролит, вызывая изменение pH, которое регистрируется. Эти авторы воспользовались аппаратом, созданным для количественного анализа углекислого газа в крови; результаты, выраженные в величинах парциального давления, могут быть представлены в виде концентрации на 1 л.
СПОСОБЫ ИССЛЕДОВАНИЯ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИЙ
Природа яблочно-молочного фермента
Молочнокислые бактерии, выделенные из вин, обладают различными способностями по превращению яблочной кислоты в молочную. Их клетку можно рассматривать как носитель более или менее значительного потенциала «яблочно-молочной активности» или «яблочно-молочного фермента», причем последний термин выражает ферментный комплекс, вызывающий яблочно-молочное превращение (см. гл. 15 «Механизм брожения»).
Этот яблочно-молочный фермент может иметь «конститутивный» или «индуктивный» характер. Конститутивным его называют потому, что он является интегрирующей и постоянной частью ферментного запаса клетки, а индуктивным потому, что, не существуя в клетке в момент ее возникновения, может быть индуцирован в среде ве- •ществ как раз таких, которые он способен метаболизировать, в данном
случае яблочную кислоту; таким образом, этот фермент является случайным.
Уайтинг и Коггинс (1963) определили свойства яблочно-молочного фермента 8 штаммов, выделенных из вин. С. Лафон-Лафуркад и Пейно (1970) исследовали 100 штаммов молочнокислых бактерий: они получили распределение, которое показано в табл. 12.3.
Таблица 12.3
Природа яблочио-молочного фермента молоч- кислых бактерий, выделенных из вин
Активность штаммов
Фермент яблочно- молочный конститутивный индуктивный
Штаммы, лишенные яблочио-мо-* лочиого фермента
Бациллы
Кокки
9
5
18 0
10
5
1
47
5
В условиях эксперимента 10% штаммов не обладали активностью декарбоксилирования яблочной кислоты. Среди бактерий с яблочно-молочным ферментом индуктивного типа оказалось 64% гомоферментативных или гетероферментативных бацилл. У кокков число штаммов повышается; оно достигает 83% для гомоферментативных и 86% для гетероферментативных кокков, следовательно, природа яблочно-молочного брожения скорее является признаком штамма, чем вида.
Разложение яблочной кислоты молочнокислыми бактериями, не размножающимися делением
Если в простой раствор яблочной кислоты внести достаточное массовое
2,00,1250,125от 50 до 602,00,1250,125от 50 до 60
2,0
0,125
0,125
от 50 до 60
2,0
0,125
0,125
от 50 до 60
количество свежевыделенных путем центрифугирования и промытых молочнокислых бактерий, то через несколько часов можно наблюдать превращение яблочной кислоты в молочную; например, свежие бактерии в концентрации 1 г/л превращают в течение 24 ч 50 мг-экв яблочной кислоты. На основе этого можно разработать тест яблочно-молочной активности бактериальных клеток, не размножающихся делением (Лафон-Лафур- кад, 1970).
Среда для эксперимента состоит из фосфатного буфера, обогащенного некоторыми катионами и не содержащего никаких других органических веществ, кроме L-яблочной кислоты; серия опытов, которые описаны ниже, побудила авторов установить pH, равный 4,0.
Вторичный фосфат калия, г/л
Сульфат магния, г/л
Сульфат марганца, г/л L-яблочная кислота, мг/экв
Экспериментальную среду распределяют по пробиркам из расчета по 10 см3 в каждую и стерилизуют при 115° С в течение 10 мин. После охлаждения суспензии засевают с определенной массой промытых бактерий, собранных из среды предварительной культуры путем центрифугирования при частоте вращения 9000 об/мин и температуре 0°С; ставят на инкубацию при 30° С. Количественный анализ общей кислотности проводят через одинаковые промежутки времени после удаления углекислого газа путем взбалтывания под вакуумом. Разница в кислотности основной среды до и после добавления яблочной кислоты позволяет вычислить точное содержание этой кислоты в среде. Исчезновение половины процентного содержания кислоты в экспериментальной сре
де означает завершение яблочно-мо- лочного брожения.
ВЛИЯНИЕ pH
Хорошо известно, что одним из важных факторов развития молочно-кислых бактерий является концентрация водородных ионов в среде. Для каждого штамма рост возможен только в гамме pH, заключающейся между минимальным pH роста (или порогом pH) и максимальным показателем pH. Между этими пределами находится оптимальный показатель pH роста, при котором происходит наиболее быстрое размножение бактерий. Каждый штамм может быть также охарактеризован порогом pH использования яблочной кислоты и порогом pH использования сахаров.
Оптимальный pH роста в среде, пригодной для молочнокислого брожения, может быть установлен для молочнокислых бацилл и кокков, выделенных из вин, в зоне pH от 4,3 до 4,8; большинство наблюдений авторов подтверждает это положение.
Нижний предел pH находится между 2,9 и 3,0; можно считать, что при меньших значениях молочнокислое брожение среды, содержащей сахар или яблочную кислоту, невозможно. Предел pH зависит от условий и состава среды; при благоприятных условиях он ниже; в неблагоприятных условиях— выше. Форнашон (1963) констатировал, что при повышении концентрации положительных ионов водорода потребности бактерий в питании удовлетворяются все труднее и труднее, тогда как их восприимчивость к некоторым веществам, спирту, сернистому ангидриду возрастает. В некоторых районах кислых вин был отмечен ряд случаев яблочно-молочно- го брожения, часто неполного, при pH 2,85 и даже при pH 2,78 (Бержере, 1958).
pH является элементом естественного отбора бактерий в спонтанном яб- лочно-молочном брожении; в винах с повышенным pH это брожение обычно проводится бактериями Lactobacillus, в винах же с низким показателем pH — бактериями Leuconostoc plantarum.
Рис. 12.5. Кривые роста Lactobacillus plantarum в среде, приготовленной на базе виноградного сока, при различных значениях исходного pH:
1 — 3,2; 2 — 3,6; 3 — 4,0; 4 — 4,4.
Рис. 12.6. Кривые образования молочной кислоты бактериями Lactobacillus plantarum в среде, приготовленной на базе виноградного сока, при различных значениях исходного pH:
— 3,2; 2 — 3,6; 3 — 4,0; 4 — 4,4.
Кривые графиков 12.5 и 12.6 отображают рост бактерий и образование молочной кислоты в полной питательной среде на основе виноградного сока в зависимости от исходного pH среды; бактерии, на которых проводили эксперимент, относятся к виду Lactobacillus plantarum.
Более низкий pH вызывает удлинение латентного периода. При значениях pH между 3,6 и 4,4 различия невелики, всего несколько часов, но при pH 3,2 латентная фаза длилась 9 дней.
дорода на рост различных бактерий (среда на томатном соке) (по данным Радлера, 1958):
1, 2 — Lactobacillus; 3, 4, 5 — Leuconostoc.
Пониженный pH замедляет развитие и удлиняет логарифмическую фазу; кривая роста все более и более приближается к прямой, что хорошо выражает тот факт, что в данном случае pH представляет собой ограничивающий фактор.
Развитие популяции бактерий и образование молочной кислоты более интенсивно протекают при высоких pH. Впрочем следовало бы учитывать постепенное снижение кислотности среды как следствие молочнокислого брожения и повышение показателя pH; последний по истечении несколь-
к-их дней становится однообразным независимо от условий исходной кислотности. На рис. 12.7 отражено влияние pH на рост различных штаммов Lactobacillus и Leuconostoc. Видно, что при pH около 3,0 урожай молочнокислых бактерий незначителен.
Когда рассматривают развитие молочнокислых бактерий в вине, то отмечают, что титруемая кислотность обладает двойным избирательным действием: она реализует сортировку яблочно-молочнокислых бактерий по их возможностям роста и сортировку компонентов, способных разлагаться. По мере понижения pH новые типы бактерий оказываются ингибированными и может быть использованным меньшее количество компонентов вина; в целом яблочно-молочное брожение становится чище. Оптимальное значение pH яблочно-молочного брожения в вине находится между pH 4,2 и 4,5. Оно, несомненно, такое же,
как и при молочнокислом сбраживании сахаров этими же бактериями; но когда экспериментируют на средах с более высоким pH, чем эти, молочнокислое брожение в результате подкисления среды вызывает понижение pH и тем самым создает благоприятные условия для роста, тогда как яблочно-молочное брожение, при котором повышается pH, имеет тенденцию к созданию менее благоприятных условий.
При pH выше 4,5 яблочно-молочное брожение замедляется; при этом значении pH большая часть яблочной кислоты превращается в соль и ее проникновение в клетку, несомненно, задерживается. Между pH 3,0 и 4,0 брожение начинается тем раньше и протекает тем быстрее, Чем выше pH.
Продолжительность яблочнонмолоч- пого брожения в вине, доведенном до различных pH, приведена ниже (по данным Бусбурас и Каики, 1971).
pH вина3,15;3,30;3,40;3,50;3,63;3,73;3,83Время, необходимоедля завершения 164;59;37;27;25;19;14pH вина3,15;3,30;3,40;3,50;3,63;3,73;3,83Время, необходимоедля завершения 164;59;37;27;25;19;14
pH вина3,15;3,30;3,40;3,50;3,63;3,73;3,83
Время, необходимоедля завершения 164;59;37;27;25;19;14
pH вина3,15;3,30;3,40;3,50;3,63;3,73;3,83
Время, необходимоедля завершения 164;59;37;27;25;19;14
яблочно-молочного брожения, дни
В табл. 12.4 приведены результаты аналогичного эксперимента, проведенного Настино и сотрудниками (1973).
Таблица 12.4
Влияние pH на эволюцию яблочно-молочного брожения вина Барбера (по данным Кастино и сотрудников, 1973)
pH
Содержание яблочной кислоты, г/л
в начале брожения
через 41 день
через 53 дня
через 63 дня
через 133 дня
3,00
5,30
5,10
5,02
4,58
0,20
3,20
5,30
4,18
1,78
0,20
0
3,40
5,30
1,62
0,15
0
—
3,60
5,30
0,25
0
—
—
В отношении использования мезоинозита бактериями яблочно-молочного брожения можно привести пример избирательного действия pH на вещества, разложенные бактериями. Красные вина помещали в бутылки при выходе их из бродильного чана; одну из них пастеризовали; другую хранили при pH вина; содержимое третьей приводили к pH 3,8. После выдержки в течение нескольких недель при 25° С в двух последних бутылках было отмечено яблочно-молочное брожение и развитие микроорганизмов. Во всех опытах, проведенных авторами, содержание мезоинозита при pH вина не изменилось в трех винах из 22, и, наоборот, мезоинозит всегда использовался, когда вино доводили до
pH 3,8. Он совершенно исчез (остаток менее 20 мг/л) в пяти винах из 22 при их собственном pH и в И винах при pH 3,8, следовательно, сбраживание мезоинозита происходит тем легче, чем выше pH, и это же отмечается у других веществ, метаболизируемых бактериями.
Приведенные выше результаты показывают, что титруемая кислотность среды оказывает влияние на некоторые функции (бактериальной клетки: клеточное размножение, в особенности питание азотистыми веществами, метаболизм, т. е. в целом на образование ферментов, участвующих в реакциях. Действие pH на «яблочно-мо- лочную активность» исследовала С. Лафон-Лафуркад (1970). Если культивировать бактерии при различных pH и измерять их яблочно^молоч- ную активность после центрифугирования и промывки, то приходится констатировать, что она практически одинаковая у бактерий из сред с pH от 3,5 до 5,0.
Клетки, взятые из культуры при меньших pH, имеют пониженную ферментативную активность; при pH 3,0 она составляет лишь 'Д активности, измеренной при оптимальном pH. Эти наблюдения позволяют понять многочисленные причины, из-за которых яблочно-молочное брожение так нелегко проходит в кислых винах. К трудностям роста при низком pH добавляются, с одной стороны, слабая «яблочно-молочная активность» выращенных таким образом бактерий, т. е. недостаточное содержание в них яб- лочно^молочного энзима, и, с другой стороны, тот факт, что с некоторыми бактериями не выдерживается оптимальный pH ферментативной реакции.
В этой же работе С. Лафон-Лафуркад (1970) исследовала также чувствительность самой ферментативной
реакции к pH. Для бацилл оптимальный pH деградации яблочной кислоты ферментом находится между 3,5 и 4,0; при pH 3,0 наблюдают четко выраженное ингибирование; обычно происходит только замедление реакции, но с некоторыми бактериями можно отметить прекращение ферментативной активности. На другом конце шкалы повышение pH до 4,5 обычно вызывает более или менее заметное уменьшение активности в зависимости от вида бактерий.
В присутствии кокков ферментативная реакция протекает, как правило, при пониженном pH и идентичным образом при pH от 3,0 до 4,0; процесс сильно тормозится при pH 4,5.
Можно до известной степени уменьшить неблагоприятное влияние pH в результате увеличения массы используемых бактериальных клеток.
Эксперименты показали, что существует корреляция между порогом pH роста штамма бактерий и исходным pH вина, из которого он был выделен. Бактерии, выделенные из вин с высоким pH, не сбраживают или сбраживают с трудом яблочную кислоту в средах с относительно слабым pH, и, наоборот, чем ниже начальный pH вина, тем больше способность бактерий действовать при подобных pH.
В условиях, когда яблочно-молочное брожение наиболее необходимо и его эффект на органолептические качества вина наиболее желателен, т. е. тогда, когда вина вырабатывают из недостигшего технической зрелости винограда и оно получается кислым, труднее всего провести яблочно-молочное брожение, и оно больше всего запаздывает. С другой стороны, молочнокислые бактерии могут использовать сахара или винную кислоту только в условиях пониженной кислотности вин. Таким образом, именно наиболее удавшиеся вина, самые мас-
Время определенияЧисло бактерий на 1 см8 при pH среды—3,253,453,65Сразу после засева 1 % вина в состоянии бурного яблочно-молочного брожения620 000620 000620 000Через 30 мии325 000410 000505 000»24 ч10 000120 000360 000»3 дия80045 000184 000»14 дней8019 000Время определенияЧисло бактерий на 1 см8 при pH среды—3,253,453,65Сразу после засева 1 % вина в состоянии бурного яблочно-молочного брожения620 000620 000620 000Через 30 мии325 000410 000505 000»24 ч10 000120 000360 000»3 дия80045 000184 000»14 дней8019 000Влияние pH на продолжительность жизнедеятельности молочнокислых бактерий в винах (Веч, 1973)Влияние pH на продолжительность жизнедеятельности молочнокислых бактерий в винах (Веч, 1973)
Время определения
Число бактерий на 1 см8 при pH среды
—
3,25
3,45
3,65
Сразу после засева 1 % вина в состоянии бурного яблочно-молочного брожения
620 000
620 000
620 000
Через 30 мии
325 000
410 000
505 000
»24 ч
10 000
120 000
360 000
»3 дия
800
45 000
184 000
»14 дней
8
0
19 000
Время определения
Число бактерий на 1 см8 при pH среды
—
3,25
3,45
3,65
Сразу после засева 1 % вина в состоянии бурного яблочно-молочного брожения
620 000
620 000
620 000
Через 30 мии
325 000
410 000
505 000
»24 ч
10 000
120 000
360 000
»3 дия
800
45 000
184 000
»14 дней
8
0
19 000
Влияние pH на продолжительность жизнедеятельности молочнокислых бактерий в винах (Веч, 1973)
Влияние pH на продолжительность жизнедеятельности молочнокислых бактерий в винах (Веч, 1973)
лянистые и гармоничные, больше всего подвержены болезням, вызываемым бактериями.
После завершения яблочно-молочно- го брожения устойчивость живых молочнокислых бактерий в винах все еще зависит от pH. Экспериментальные данные Веча (1973), проследившего постепенное исчезновение живых клеток Leuconostoc oinos, существующих в вине, которые были засеяны при трех значениях pH, приведены в табл. 12.5; автор отмечает уменьшение активной популяции, которое происходит тем быстрее, чем ниже pH среды. Нетрудно понять причины подверженности болезням у вин с повышенным pH, у которых все (более быстрый рост, более высокая ферментативная активность, более благоприятный порог pH, лучшая устойчивость живых клеток) способствует бактериальным превращениям.
ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ
Значение этого фактора для размножения бактерий и эволюции молочнокислого брожения хорошо известно. Большинство бактерий может расти только в относительно узкой гамме температур, и внутри этой зоны
температура оказывает влияние на скорость роста, на скорость превращений, а также на их потребности в питании. Было показано, что молочнокислые бактерии, выделенные из вин, относятся не к термофильным, а к мезофильным; они не размножаются при 45° С, и оптимальная температура для их роста обычно близка к 25 или 30° С.
Если проследить ход молочнокислого брожения в среде, основу которой составляет виноградный сок, в зависимости от температуры, то можно отметить, что при повышенных температурах (30, 35° С) длительность латентной фазы сокращается и ускоряется рост в логарифмической фазе, окончательные популяции того же порядка и в конце брожения уменьшение числа живых клеток становится заметно более быстрым. Но для многих штаммов бактерий различия в размножении выражены меньше, чем можно было думать и, наконец, при температурах от 20 до 35° С полученные кривые роста близки. Кроме того, образование молочной кислоты заметно достигает такого же уровня. В общем скорость размножения находится в тесной зависимости от температуры.
Эволюция яблочно-молочного бро-
жени я в винах намного более чувствительна к условиям температуры. Было отмечено, что при прочих равных условиях скорость этого превращения достигает максимума между 20 и 25° С; она меньше при температурах 15 и 30° С и может быть еще больше замедлена при температуре выше 30° С. В тех чанах, где во время брожения температура превышает этот предел и спиртовое брожение прекращается, оставляя несброженный сахар, в дальнейшем часто, хотя и с трудом, начинается яблочно-молочное брожение.
Вероятно, что бактерии первых генераций, присутствующие в соке до начала спиртового брожения, не выдерживают присутствия спирта при температуре, превышающей 30° С.
На практике обычно рекомендуют поддерживать температуру от 16 до 18° С в подвале, куда помещают вина, которые должны подвергнуться раскислению. Таким образом, избегают слишком быстрого и чрезмерно обильного развития бактерий, образующих летучую кислотность.
Если при этих средних температурах яблочно-молочное брожение облегчается, то оно возможно и при температуре 10° С или даже ниже при условии, что оно уже началось, т. е. достигнута определенная плотность популяции бактерий. Жоффруа (1959) смог наблюдать вина в разгаре яблоч- но-молочного брожения, когда они находились в условиях зимних морозов, при температурах, которые не превышали 5° С; несомненно, что рост бактерий начался тогда, когда температура была выше и яблочно-молочная деградация продолжалась при такой пониженной температуре до конца брожения. Во всяком случае, при температуре ниже 15° С брожение происходит исключительно медленно; если при 20° С оно завершается через не
сколько дней, то для окончания брожения при 15° С нужно несколько недель, а при более низких температурах и несколько месяцев.
Нужно признать, что в течение большей части зимы холода, особенно когда они наступают рано, представляют собой главное препятствие для начала, протекания и окончания яблочно- молочного брожения. Средства, позволяющие поддерживать температуру в нужных пределах, обеспечивают возможность регулирования хода этого процесса.
ВЛИЯНИЕ АЭРАЦИИ
Молочнокислые бактерии, выделенные из вин, принадлежат или к группе факультативных анаэробов, т. е. мало подверженных влиянию кислорода, или же к группе микроаэрофиль- ных, т. е. таких, которые лучше развиваются в присутствии растворенного в среде кислорода, чем при полном отсутствии доступа воздуха, следовательно, молочнокислые бактерии отнюдь не являются анаэробными, как считали, противопоставляя их уксуснокислым бактериям, развитие которых требует большой площади контакта между жидкостью и атмосферным воздухом. Молочнокислые бактерии живут в массе вина или даже в нижней части емкостей; это ни в коей мере не стесняет их, более того, присутствие растворенного воздуха зачастую даже стимулирует их рост.
Эксперименты Ша,рпентье (1954), которые затем неоднократно подтверждались, показывают, что биологическое раскисление вин происходит как в присутствии, так и без доступа' воздуха; однако абсолютный анаэробиоз неблагоприятен.
В табл. 12.6 показаны ход яблочно- молочного брожения, а также окислительно-восстановительные потенциа-
Таблица 12.6
Влияние окислительно-восстановительного потенциала на яблочно-молочиое брожение
Определения
Непрерывный аэробиоз
Постепенный анаэробиоз
Абсолютный анаэробиоз
потенциал, мВ
снижение кислотности, мг-экв
потенциал, мВ
снижение кислотности, мг-экв
потенциал, мВ
снижение кислотности мг-экв
До засева Через 12 дней после засева
460
420
и
460
285
9
300
300
1
лы, измеренные через различные промежутки времени.
Окислительно - восстановительный потенциал, который выражает в большей или меньшей мере окисленность или большую или меньшую степень восстановления среды, определяет состояние аэрации.
Замечено, что яблочно-молочное брожение завершается лучше при окислительно-восстановительном потенциале, равном 460 мВ, чем при 300 мВ. Присутствие кислорода не только не затрудняет яблочно-молочное брожение, но даже способствует ему; внесение в среду кислорода даже в малых количествах в некоторых условиях необходимо, и, наоборот, добавление восстанавливающих веществ (цистеин, аскорбиновая кислота) оказывает скорее ингибирующее действие.
Многочисленные наблюдения, сделанные в процессе производства, показали, что осторожно проводимая аэрация часто благоприятствует развитию бактерий. ■ Насыщение нового вина воздухом ведет к тому, что яблочно-молочное брожение проявляется на несколько дней раньше, наоборот, насыщение его чистым кислородом намного задерживает брожение, не прекращая, однако, полностью. В целом развитие бактерий и яблочно-молочное брожение возможны в широ
кой гамме окислительно-восстановительного потенциала.
АЗОТИСТОЕ ПИТАНИЕ БАКТЕРИЙ
Многие авторы изучали влияние аминокислот на рост молочнокислых бактерий (Люти, 1952, 1957; Йерхель и сотрудники, 1956; Флеш и Йерхель 1958; Радлер, 1958; Дю Плесси, 1963; Пейно и сотрудники, 1965). Потребности в аминокислотах зависят от вида, штамма, условий культуры. Согласно этим работам такие вещества, как аланин, аргинин, цистеин, глутаминовая кислота, гистидин, лейцин, фенилаланин, серин, триптофан, тирозин или валин, необходимы для роста молочнокислых бактерий; в зависимости от штаммов нужны или все эти аминокислоты или только некоторые из них. Аминокислоты, которые требуются меньше всего, являются как раз теми, которые составляют наибольшую пропорцию аминного азота вин: пролин, лизин, гликокол, гистидин, треонин.
Разница между кокками и бациллами в отношении их поведения значительна. Среди 18 исследованных аминокислот четыре оказываются необходимыми для всех бацилл: глута- минова-я кислота, изолейцин, лейцин, валин. Потребности в других аминокислотах у каждого штамма свои. Но все они являются необходимыми или
стимулирующими в зависимости от обстоятельств. Возможности синтеза очень различны в зависимости от вида или штамма бацилл, и эффект недостаточности более выражен в начале размножения. Так, аланин, аспарагиновая кислота, метионин, фенилаланин оказывают влияние на рост % штаммов в первые дни, но их недостаток затрудняет молочнокислое брожение только в 25% случаев.
Кокки значительно больше нуждаются в аминокислотах, и к четырем аминокислотам, упомянутым выше, как необходимым для бацилл, нужно добавить семь других, без которых кокки обычно не могут развиваться; это аргинин, гистидин, метионин, фенилаланин, серин, триптофан, тирозин. С другой стороны, на некоторые штаммы кокков изолейцин и лейцин оказывают только стимулирующее действие, и роль аланина и аспарагиновой кислоты в качестве активаторов явно меньше, чем для бацилл.
Эта разница в поведении бацилл и кокков отражает различия в процессах азотистого метаболизма. Гетеро- трофия кокков выражена больше, чем гетеротрофия бацилл. Более значительные потребности кокков в этой области объясняют большие трудности их культуры.
Аминокислоты, необходимые бактериям, обеспечивают пептоны, пептиды и аминокислоты вина. Автолизат или дрожжевой экстракт, мясной пептон, гидролизат казеина способствуют росту молочнокислых бактерий. В противоположность этому аммиачный азот не используется.
Пуриновые
и пиримидиновые осно-
вания и их
производные,
вещества,
а-Аланин
3,2
Гликокол
Аргинин
11,6
Гистидин
Аспарагиновая
5,0
Изолейцин
кислота
0,2
Лейцин
Цистин
Лизин
Глутаминовая
10
Метионин
кислота
Фенилаланин
которые могут происходить из дрожжей, играют важную роль (табл. 12.7); если приготовить питательную среду без аденина, гуанина, ксантина и урацила, рост снижается на 20—25%. '
'Таблица 12,7
Потребности молочнокислых бактерий в пуриновых и пиримидиновых основаниях
Бациллы, %
Кокки, %
Основания
—
S
+
—
S
+
Аденин
79
17
4
85
15
0
Гуанин
83
17
4
90
5
5
Урацил
48
26
26
56
22
22
Тимин
87
4
9
80
20
0
Тимидин
74
22
4
58
30
2
Ксантин
48
48
4
70
25
15
Примечание. Штаммы, для которых азотное основание является безразличным (—). стимулирующим (S) или обязательным (+)-
Достаточно большое количество наблюдений показывает, что яблочно-мо- лочное брожение легче возбуждается в молодых винах, сохраняемых на их дрожжевом осадке после брожения. Дрожжевой осадок может оказывать благоприятное влияние потому, что он богат бактериями, но можно думать, что здесь также выступают явления выделения из дрожжей в среду азотистых и ростовых веществ.
С. Лафон-Лафуркад определила состав азотистых веществ в клетках бактерий, принадлежащих к видам Leu- conostoc и Lactobacillus, выделенных из вин и развившихся на обогащенном дрожжевым экстрактом виноградном соке (pH 4,2, общий азот 756 мг/л). Ниже приведено среднее содержание аминокислот в протеидах этих бактерий, выраженное в % от
массы протеидов.
4,8.
Пролин
2,4
1,2
Серин
4,6
6,0
Треонин
4,6
5,3
Триптофан .
0,6
12,8
Тирозин
3,9
2,2
Валин
6,0
'2,3
Изменения в составе азотистых веществ во время молочнокислого сбраживания сахаров (питательная среда: разбавленное виноградное сусло, обогащенное дрожжевым экстрактом и приведенное к pH 4,2)
Состав азотистых веществ (в мг/л)
Аминокислоты
§после
ясбраживания
оf
тос Leu- I с Lac-
оconos- tobaci-
tec | Hus
а-Аланнн
88
НО
НО
Аргинин
150
41
41
Аспарагиновая кислота
110
20
19
Цистин
5
3
3
Глутаминовая кислота
194
71
73
Гликокол
102
36
35
Гистидин
20
9
9
Изолейцин
130
29
35
Лейцин
155
46
62
Лизин
63
0
0
Метионин
45
16
16
Фенилаланин
120
56
32
Пролин
205
148
148
Серин
124
92
92
Треонии
275
130
130
Триптофан
8
4
4
Тирозин
106
35
29
Валин
132
40
47
Азот общий
756
621
627
Азот аммиачный
87
78
78
Можно считать, что такой состав близок к составу протеидов дрожжей. Молочнокислые бактерии намного богаче аргинином и лизином, чем дрожжи, и несколько беднее аланином, аспарагиновой кислотой и пролином; различия в других аминокислотах незначительны.
В табл. 12.8 показаны изменения в составе азотистых веществ в подслащенной питательной среде, вызываемые развитием молочнокислых бактерий, принадлежащих к двум различным видам. За исключением аланина, процентное содержание которого за
метно возрастает, все аминокислоты расходуются и используются в процессе бактериального синтеза. Был собран приблизительно 1 г бактерий в сухой массе на 1 л.
В табл. 12.9 даны два примера эволюции аминокислот во время яблоч- но-молочного брожения. Некоторые из них, такие, как аргинин, всегда расходуются, содержание же других возрастает в результате протеолиза полипептидов или протеинов.
Таблица 12.9
Изменение состава азотистых веществ (в мг/л) в винах в процессе яблочно-молоч- ного брожения
Аминокислоты
Красное вино
Белое вино
11
5 *
о §
§ ж
у °
^ ° з! о §
с
S я
6 5
5 g.
'ж о о о
с 5 s 7 g § о£
2
g ж
о о
а-Аланин
9
0
Аргинин
24
14
58
14
Цистин
2
3
—
—
Глутаминовая кис-
34
71
34
47
лота
Изолейцин
12
27
16
18
Лейцин
6,6
37
18
21
Треонин
19
100
258
200
Триптофан
3,7
24
5,2
18
Валин
26
38
30
38
Азот аммиачный
7
28
3
17
Авторы давно наблюдали, что во время такого брожения содержание гидрата окиси аммония в винах повышается вследствие дезаминирования (Ж- Риберо-Гайон и Пейно, 1938); по мнению Аршинара и Будо (1955), только одни молочнокислые бактерии вина действуют таким образом.
Было также отмечено, что вина, подвергшиеся яблочно-молочному брожению, имеют большее содержание гистамина, чем другие (Майер и со-
грудники, 1971, Плюма, 1970). Рад- лер (1973) выделил один штамм Ре- diococcus cerevisiae, способный декарбоксилировать гистидин в гистамин.
ПОТРЕБНОСТЬ В ФАКТОРАХ РОСТА
Как видно из описательных карт видов бактерий, выделенных из вина (см. гл. И), потребности в факторах роста изменяются в зависимости от бактерий; они также могут изменяться в зависимости от состава среды и условий культуры.
Пейно (1955) на-блюдал, что обогащение вин факторами роста путем удвоения нормального содержания, в частности, тиамина, пантотеновой кислоты, никотиновой кислоты, пиридоксина, биотина и мезоинозита в отдельности или в сочетаниях заметно ускоряет сбраживание яблочной кислоты; но особенно эффективным оказывается добавление рибофлавина. Активаторы спиртового брожения, богатые витаминами групп В, также способствуют биологическому раскислению.
Потребности молочнокислых бактерий в ростовых веществах подверглись глубокому исследованию после публикации фундаментальных работ Снелла (1940, 1952), Орла-Енсена и сотрудников (1956). Наблюдения сосредоточивались на витаминных факторах или на потребности в аминокислотах, но для ограниченного числа штаммов, иногда плохо идентифицированных. Люти и Веч (1959) исследовали несколько штаммов, названных Bacterium gracile, ' Радлер (1963)—одну бациллу и три кокка, Дю Плесси (1963)—один кокк и четыре бациллы.
Результаты этих работ в целом согласуются. Пантотеновая и никотино-. вая кислоты необходимы; рибофлавин, фолиевая кислота, иногда тиамин нужны или являются стимулято
рами или не оказывают никакого влияния в зависимости от штамма.
Пейно и сотрудники (1965) опубликовали исследование 64 надежно идентифицированных штаммов. Потребности в факторах питания выражаются различно в зависимости от того, рассматривают ли явление роста в его логарифмическом или в его конечном периоде, или же явление молочнокислого сбраживания сахаров. Эти потребности более ощутимы в начале роста; в дальнейшем ограниченная возможность синтеза позволяет бактериям восполнить некоторые недостающие вещества. Недостаток гликокола, серина больше затрудняет молочнокислое брожение в целом, чем рост бацилл. Впрочем, в более общем плане не существует точной корреляции между образовавшимися бактериями и сроком молочнокислого брожения. Нормальному росту, близкому к развитию контрольного образца, может соответствовать слабое образование кислотности, тогда как ограниченный рост может в конечном счете обеспечить значительное превращение сахаров. В отсутствие отдельных факторов некоторые бактерии способны развиваться без образования при этом росте значительной кислотности.
В табл. 12.10 можно различить некоторые расхождения между потребностями в витаминных факторах у бацилл и кокков. Прежде всего видно, что пантотеновая и никотиновая кислоты одинаково необходимы или являются сильными стимуляторами для всех бактерий. Различия выражаются в значительно большей роли тиамина и особенно рибофлавина для- роста бацилл и в очень значительном и почти специфическом эффекте фолиевой кислоты в отношении кокков (75% штамов кокков активируются фолиевой кислотой против 5% штаммов бацилл). Если бациллы менее требова-
Потребности молочнокислых бактерий в факторах роста
Факторы роста
Бациллы, %
Кокки, %
—
S
+
-
S
+
Тнамин
31
43
26
70
12
18
Рибофлавин
22
13
65
40
35
25
Никотинамид
69
18
13
75
22
3
Пантотеновая кисло-
0
9
91
0
7
93
та
Никотиновая кислота
4
9
87
0
15
85
Парааминобензойная
83
13
4
75
20
5
кислота
Мезоинозит
83
13
4
72
23
5
Фолиевая кислота .
95
О
0
25
45
30
Биотин
87
13
0
83
12
О
Цианкобаламин
83
13
4
85
15
0
Примечание. Штаммы, для которых фактор роста безразличен (—), оказывает стиму- пирующее действие (S) или жизненно необходим (+).
тельны в части аминокислот, чем кокки, то они имеют несколько большую потребность в отношении витаминов. К тому же биотин и цианкобаламин являются почти безразличными факторами. Эти наблюдения подтвердили Вейлер и Радлер (1972).
В табл. 12.11 сопоставляется содержание витаминов в суслах и винах с количественными потребностями молочнокислых бактерий. Из этих данных нетрудно заключить, что трудности роста бактерий в винах, которые можно иногда наблюдать лишь в редких случаях, обусловлены недостатком витаминов.
Беельман и Галландер (1970) указали на присутствие в кожице ягод веществ, которые стимулируют рост Leuconostoc citrovorum (синоним L. gracile). В опытах, которые они проводили в винах, бродивших на мезге только в течение 24 ч, отмечался ограниченный рост бактерий и не было обнаружено никаких признаков яб-
лочно-молочного брожения; в винах, бродивших на мезге в течение 3 дней, наблюдалось неполное яблочно-молоч- ное брожение, тогда как для вин, бродивших в тех же условиях 5 дней, яб- лочно-молочное брожение завершалось через 11 недель. С другой стороны, экстракты, приготовленные из кожицы ягод, вызывают четко выраженный рост бактерий.
ПОТРЕБНОСТЬ В МИНЕРАЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТАХ
Для обеспечения роста и процессов обмена веществ молочнокислые бактерии нуждаются в определенном количестве минеральных элементов в довольно высоких концентрациях: Мп, Mg, К, Fe, SO4 и др. Их всегда вносят в подготовленную питательную среду.
Яблочно-молочный фермент содержит марганец; известное активирующее действие томатного сока, используемое при приготовлении некоторых сред, приписывали марганцу, входящему в состав плодов томатов. Магний играет значительную роль в клеточном делении. Экспериментально доказано, что обогащение вина марганцем (5 мг/л), магнием (200 мг/л) облегчает яблочно-молочное брожение; такое же действие производит и обогащение калием (1 г/л). Можно отметить, что вина недостаточно богаты минеральными элементами для обеспечения оптимального роста молочнокислых бактерий. На это также указ, л Никлер (1964): Leuconostoc gracile не развивается в питательном растворе, деминерализованном ионитами; добавление К+, N+, Mg++ обеспечивает нормальный рост бактерий и декарбоксилирование яблочной кислоты. Для оптимального роста К+ необходим в концентрации 0,1 моль, намного более высокой, чем имеется в винах.
Название витаминовСреднее содержание витаминов (в мкг/л)необходимоев суслахв винахТиамин' 2,53308Рибофлавин2521100Пантотеновая кислота25820890Пиридоксин2,5420460Никотинамид503 2601730Биотин0,0122,62,0Мезоинозит250500 000415 000Парааминобензойная кислота55167Фолиевая кислота0,51,22,0Холии500026 00025 000Название витаминовСреднее содержание витаминов (в мкг/л)необходимоев суслахв винахТиамин' 2,53308Рибофлавин2521100Пантотеновая кислота25820890Пиридоксин2,5420460Никотинамид503 2601730Биотин0,0122,62,0Мезоинозит250500 000415 000Парааминобензойная кислота55167Фолиевая кислота0,51,22,0Холии500026 00025 000Таблица 12.11Таблица 12.11Содержание витаминов в суслах и винах и потребности молочнокислых бактерийСодержание витаминов в суслах и винах и потребности молочнокислых бактерийИНГИБИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ СПИРТАИНГИБИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ СПИРТАБактерии, выделяемые из вин, и особенно бактерии яблочно-молочного брожения достаточно устойчивы к спирту, поскольку они могут существовать и развиваться в вине. Но это относится не ко всем бактериям, и среди большого числа молочнокислых бактерий, находимых на винограде, лишь очень незначительная часть способна в дальнейшем приспособиться к кислой водно-спиртовой среде, какую представляет собой вино.
Название витаминов
Среднее содержание витаминов (в мкг/л)
необходимое
в суслах
в винах
Тиамин
' 2,5
330
8
Рибофлавин
25
21
100
Пантотеновая кислота
25
820
890
Пиридоксин
2,5
420
460
Никотинамид
50
3 260
1730
Биотин
0,012
2,6
2,0
Мезоинозит
250
500 000
415 000
Парааминобензойная кислота
5
51
67
Фолиевая кислота
0,5
1,2
2,0
Холии
5000
26 000
25 000
Название витаминов
Среднее содержание витаминов (в мкг/л)
необходимое
в суслах
в винах
Тиамин
' 2,5
330
8
Рибофлавин
25
21
100
Пантотеновая кислота
25
820
890
Пиридоксин
2,5
420
460
Никотинамид
50
3 260
1730
Биотин
0,012
2,6
2,0
Мезоинозит
250
500 000
415 000
Парааминобензойная кислота
5
51
67
Фолиевая кислота
0,5
1,2
2,0
Холии
5000
26 000
25 000
Таблица 12.11
Таблица 12.11
Содержание витаминов в суслах и винах и потребности молочнокислых бактерий
Содержание витаминов в суслах и винах и потребности молочнокислых бактерий
ИНГИБИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ СПИРТА
ИНГИБИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ СПИРТА
Хотя устойчивость штаммов довольно различна, можно считать, что в среднем, учитывая лишь бактерии, выделенные из вина, концентрация спирта порядка 6% об. уменьшает урожай бактерий на 25% и образование молочной кислоты на 10%; концентрация спирта 10% об. вызывает снижение этих показателей наполовину и на Vt соответственно. При спиртуозности выше 10% об. понижение активности становится очень значительным, и для каждого штамма можно определить максимум спиртовыносливости, выше которого рост бактерий невозможен. Когда строят графики ингибирования роста бактерий спиртом, приходится учитывать явления двоякого рода: эф
фект постепенного замедления, имеющий место до спиртуозности 10—11% об. и сильное ингибирование, проявляющееся по достижении этих концентраций. До 11% об. жизнедеятельность бактерий тормозится, но они все еще остаются живыми. При спиртуозности выше этого предела, по-видимо- му, выживают только отдельные клетки. Присутствие спирта удлиняет латентный период, продолжительность роста и молочнокислого брожения, уменьшает образование молочной кислоты. Рост обычно затрагивается в большей степени, чем брожение.
Часто наблюдали высокую спирто- выносливость у некоторых штаммов бактерий и возможность их развития в десертных винах, имеющих спирту- озность 18—20% об. и больше. Однако присутствие спирта в винах является, несомненно, одним из факторов, ограничивающих рост бактерий и, следовательно, процесс яблочно-молочно- го брожения. Спирт реализует также определенный отбор гетерофермента- тивных бацилл за счет менее устойчивых кокков; это явление отражено в табл. 12.12. Таким образом можно объяснить тот факт, что яблочно-мо- лочное брожение в районах теплого
Сравнительные данные спиртовыносливости бацилл и кокков в зависимости от спиртуоз- ности питательной среды
Максимум спиртуозности, %, Об.
Бациллы, %
Кокки, %
15
38
2
14
14
12
13
22
35
12
13
35
11
13
12
10
—
2
8
—
2
климата или заболевания, вызываемые бактериями при высоких концентрациях спирта, обычно являются результатом активности молочнокислых бацилл.
Попытки адаптации их путем последовательных засевов спиртованных сред не дали достаточно убедительных результатов. Наоборот, когда бактерии развиваются одновременно с дрожжами в среде, которая, таким образом, постепенно обогащается спиртом, успех прямых обсеменений смешанной дрожжевой разводкой обеспечивается лучше.
ИНГИБИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ СЕРНИСТОГО АНГИДРИДА
Сернистый ангидрид является энергичным ингибитором молочнокислых бактерий и отчасти поэтому он получил такое широкое применение в производстве и хранении вина. Будучи более активным вотношении.бактерий, чем в отношении дрожжей, он блокирует активность бактерий в процессе приготовления вина и делает спиртовое брожение более чистым. В случае, когда хотят провести яблочно-молоч- ное брожение, варьируют применяемые дозы сернистого ангидрида таким образом, чтобы это превращение протекало в замедленном темпе, но не пре
кращалось. В дальнейшем во время хранения сернистый ангидрид применяют с целью полного подавления бактерий, что обеспечивает необходимую стабильность вин.
Токсичность сернистого ангидрида зависит от титруемой кислотности среды, поэтому трудно сравнивать экспериментальные результаты, полученные при различных pH. Кроме того следует учитывать реакционную способность среды, которая уменьшает эффективность. Известно, что сернистый ангидрид вступает в соединение со многими компонентами сусла и вина и образующиеся соединения являются более или менее стабильными в зависимости от их константы химической диссоциации.
Долгое время думали, что связанный сернистый ангидрид, который больше не обладает химическими свойствами сернистого ангидрида в свободном состоянии, не оказывает влияния на микроорганизмы. Это полностью подтверждается в отношении дрожжей, которые, преобразовывая сернистый ангидрид в ацетальдегид, инактивируют его, но это не совсем точно по отношению к бактериям.
Форнашон (1963) показал, что во время развития дрожжей в сахарсодержащей среде в присутствии аль- дегидсернистой кислоты некоторые молочнокислые бактерии, и главным образом гетероферментативные организмы, могут метаболизировать ацетальдегид и высвобождать таким образом сернистый ангидрид, находящийся в связанной форме. Именно посредством такого механизма альдегидсерни- стая кислота, по-видимому, обладает антибактериальным действием, меньшим, однако, чем свободный сернистый ангидрид.
Было продолжено исследование (С. Лафон-Лафуркад и Пейно, 1974) проблемы ингибирования бактерий
Прямое бактерицидное действие различных форм сернистого ангидрида
Число клеток, оставшихся живыми (в %), через несколько минут после внесения сернистого ангидрида (30 мг/л)
Виды бактерий
К
5 я
3
™ S
о § я и
S ГО я Cl.
К
О И
9 ч ж £
8 *
Pedicococcus cerevisiae
Leuconostoc gracile
Streptobacterium
Lactobacillus
hilgardii
сернистым ангидр
(3,о 3,2 (3,4
(3,0 3,2
13,4
(3,0 3,2 (3,4
<3,0
3,2
(3,4
)ИДО
0
0
15
0
0
0
10
23
33
5
6
8
м в
0 0
75
33
56
70
66
88
82
13
100
75
разл
0
48
75
63 .
79
87
96
76
85
35
37
68
тчных
формах, в разных условиях: непосредственно на суспензиях бактерий, при росте бактерий в процессе молочно
кислого сбраживания сахара или яблочной кислоты и с ферментативной активностью клеток, не размножающихся делением.
В табл. 12.13 показано прямое бактерицидное действие этих разных форм, примененных к суспензии бактерий в простой среде. Как и можно было ожидать, сернистый ангидрид развивает наибольшую активность в свободной форме. Она значительно усиливается при пониженном pH; разница pH в 0,2 дает очень ощутимый эффект; кокки обычно менее сульфитоус- тойчивы, чем бациллы. Уже 5 мг сер
нистого ангидрида на 1 л убивают большое число бактерий, а 100 мг уничтожают их полностью.
Бактерицидная способность сернистого ангидрида в связанной форме полностью доказана, но она меньше. Живая популяция Lactobacillus hil- gardii после внесения 5 мг связанного сернистого ангидрида уменьшается на 50%. Ингибирующее действие пировиноградно-сернистой кислоты обычно немного сильнее, чем действие альде- гидсерннстой кислоты, более стабильного соединения. Хотя и трудно дать оценку на основании только этих опытов, так как бактерицидная способность изменяется в зависимости от вида бактерий, можно считать, что связанные формы SO4 в 5—10 раз менее активны, чем свободная форма.
Эта антибактериальная способность проявляется также в случае молочнокислого сбраживания сахара (порог восприимчивости составляет 5 мг/л, порог полного ингибирования от 30 до 100 мг/л), в случае возбуждаемого яб- лочно-молочного брожения, а также когда считают, что имеют дело с яб- лочнопмолочной активностью бактерий, не размножающихся делением.
Введение свободной формы SO2 в дозе 10 мг/л в латентной фазе до начала яблочно-молочного брожения уменьшает популяцию бактерий на 75%; в связанной форме сернистый ангидрид в этой же дозе задерживает размножение и блокирует яблоч- но-молочное брожение. При добавлении во время экспоненциальной фазы такая же доза малоэффективна.
Сернистый ангидрид оказывает намного меньшее действие на молочнокислые бактерии, которые не размножаются делением. При равных дозах и в одинаковых условиях он больше воздействует на рост бактерий, чем на яблочно-молочное превращение.
Отсюда вытекают и возможности
использования его в технологии. Во всех случаях, когда хотят иметь яб- лочно-1молочное брожение, необходима осторожная сульфитация мезги небольшими дозами. Действительно, связанная форма сернистого ангидрида, которая переходит в вино, могла бы стать одним из главных препятствий для последующего развития молочнокислых бактерий и их яблочно- молочной активности. Для иллюстрации этого положения в табл. 12.14 приведены результаты наблюдений Сюд- ро и Касиньяра (1959), которые показывают число дней, необходимых для возбуждения яблочно-молочного брожения от сульфитации данного сусла.
Таблица 12.14
Влияние сульфитации сусла иа яблочно-мо- лочное брожение вина
Сульфитация, г/гл
Число дней, необходимых для начала яблочно-молочного брожения
сусло № 1
сусло № 2
Контроль
40
30
+2,5
45
40
+5
70
60
+ Ю
100
100
Результаты проведенных авторами экспериментов относительно роли связанной формы SO2 показывают в новом свете механизм действия сернистого ангидрида при приготовлении вина. До сих пор считали, что сульфитация дробленой массы винограда, проводимая наряду с другими целями Для того, чтобы ингибировать бактерии, действует на них только в течение короткого периода времени между введением SO2 и началом брожения, т. е. в то время, когда он находится в свободной форме. Однако в действительности, если бы это было так, SO2 быстро образовал бы соединения с
компонентами винограда и сусла, а это привело бы к его полной инактивации. Допускали также, что после его перехода в состояние альдегид- сернистой кислоты, формы, в которую превращается после брожения весь сернистый ангидрид, добавляемый в мезгу, SO2 больше не играет роли ингибитора. Фактически же сернистый ангидрид в связанной форме сам является ингибитором молочнокислых бактерий. И если он в 5—10 раз менее активен, чем в свободном состоянии, то нужно считаться с тем, что его может быть в 5—10 раз больше, следовательно, он имеет большое практическое значение до такой степени, что при концентрации связанного SO2 порядка 90—120 мг/л яблочно-молочное брожение в некоторых типах вин с низким pH (например, 3,20—3,30) может стать невозможным.
Когда хотят избежать яблочно-молочное брожение (в особенности у белых сухих вин), то нужно иметь в виду, что стабильность связана не только с одним бактерицидным действием сернистого ангидрида, вводимого в сусло, но, скорее, с дозой связанного SO2, который остается в вине после приготовления и действие которого будет продолжаться в период его хранения.
ДРУГИЕ ИНГИБИРУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА
Хотя применение этих веществ в вине с полным основанием запрещено, тем не менее продолжалось изучение ряда антибиотиков или других антисептических продуктов, способных ингибировать развитие молочнокислых бактерий.
Наиболее активными оказались суб- тилин и тиротроцин; концентрация их 2 мг/л обеспечивает полное ингибирование. Хлорамфеникол оказался почти таким же бактерицидом. Для биоми-
Доза лизоцима,- мг/лЧисло живых клеток на 1 см8красное вино № 1 (18 000 000 бактерий)красное вино № 2 (520 000 бактерий)белое вино (20 000 бактерий)через 4 ччерез 24 ччерез 4 ччерез 24 ччерез 24 ч42 600 0002 300[490 00012 0003081 430 0002 250200 0008 000101219 7001 7504 2002 400401615 8002 0004 7002 70010Доза лизоцима,- мг/лЧисло живых клеток на 1 см8красное вино № 1 (18 000 000 бактерий)красное вино № 2 (520 000 бактерий)белое вино (20 000 бактерий)через 4 ччерез 24 ччерез 4 ччерез 24 ччерез 24 ч42 600 0002 300[490 00012 0003081 430 0002 250200 0008 000101219 7001 7504 2002 400401615 8002 0004 7002 70010Действие лизоцима на молочнокислые бактерии винаДействие лизоцима на молочнокислые бактерии винацина и террамицина требуются вдвое большие дозы.
Доза лизоцима,- мг/л
Число живых клеток на 1 см8
красное вино № 1 (18 000 000 бактерий)
красное вино № 2 (520 000 бактерий)
белое вино (20 000 бактерий)
через 4 ч
через 24 ч
через 4 ч
через 24 ч
через 24 ч
4
2 600 000
2 300
[490 000
12 000
30
8
1 430 000
2 250
200 000
8 000
10
12
19 700
1 750
4 200
2 400
40
16
15 800
2 000
4 700
2 700
10
Доза лизоцима,- мг/л
Число живых клеток на 1 см8
красное вино № 1 (18 000 000 бактерий)
красное вино № 2 (520 000 бактерий)
белое вино (20 000 бактерий)
через 4 ч
через 24 ч
через 4 ч
через 24 ч
через 24 ч
4
2 600 000
2 300
[490 000
12 000
30
8
1 430 000
2 250
200 000
8 000
10
12
19 700
1 750
4 200
2 400
40
16
15 800
2 000
4 700
2 700
10
Действие лизоцима на молочнокислые бактерии вина
Действие лизоцима на молочнокислые бактерии вина
Лизоцим является природным веществом, вызывающим в малых дозах разложение бактерий лизинами, т. е. переваривание клеточной стенки. Не оказывая действия на дрожжи или на ускуснокислые бактерии, он обеспечивает почти полное уничтожение молочнокислых бактерий вина, кокков, бацилл, как это показано в табл. 12.15.
Живые клетки подсчитывали на чашках Петри через одинаковые промежутки времени после введения лизоцима в вино. Максимальный эффект разрушения бактерий достигался через 24 ч.
Увеличение дозы лизоцима ускоряет разложение бактерий, но мало изменяет число устойчивых клеток. В самом деле уничтожаются не все клетки, и таким путем нельзя получить стерилизацию вина. Некоторое число клеток, которое колеблется в зависимости от вида и штамма бактерий, избегает воздействия лизоцима. Эта пропорция составляет для красного вина № 1 от 1 до 9 000 клеток, для красного вина № 2 — от 2 до 210 клеток, для белого вина—от 1 до 1000 клеток.
Действие лизоцима не удалось выявить при оклейке яичным белком, веществом, в котором его очень много 290
(9 г/л). После оклейки яичным белком популяция бактерий уменьшилась не больше, чем после оклейки желатином или бентонитом. По всей видимости, лизоцим яичного белка не высвобождается в вино во время оклейки и осаждается с альбумином.
Молочнокислые бактерии довольно устойчивы к обычным антисептикам. Четвертичный аммоний, используемый для мойки винных емкостей, убивает молочнокислые бактерии при дозах от 5 до 20 мг/л. Наиболее активным антисептиком является монобромуксусная кислота (доза — порог ингибирования 1 мг/л).
Иногда среди веществ, которые оказывают подавляющее действие на размножение бактерий и яблочно-молоч- ное брожение, называют полифенолы (Дюпюи, 1959). В опытах, где испытывались следующие полифенолы: мальвидин, лейкоантоцианы, кварце- тин, кофейная кислота, паракумаровая кислота, хлорогеновая кислота (которая, впрочем, не существует в вине), галловая кислота, — только одна последняя вызывает заметное ингибирование при дозе 1 г/л. Было также отмечено, что энологические танины оказывали некоторое бактерицидное действие (Жандрон, 1967), что обогащение танинами вин в новых дубовых
бочках делало их более устойчивыми к яблочно-молочному брожению, что внесение в вино дубовой стружки оказывает такое же действие.
Все органические анионы вина в повышенных дозах производят легкое ингибирование. Наиболее выражено оно у лактатов, сукцинатов. Вероятно, те 80—100 мг-экв/л органических анионов, которые содержатся в винах, способствуют тому, чтобы эта среда стала менее благоприятной для яблочно- молочного брожения. Для блокирования этого брожения предлагали фумаровую кислоту (Челищев и сотрудники, 1971).
АНТАГОНИЗМ ДРОЖЖИ — БАКТЕРИИ
В главе 9 уже были описаны явления антагонизма между бактериями и дрожжами. Действие дрожжей на бактерии как прямое, так и смещенное по времени, часто отмечалось в пивоваренном производстве.
Подобные факты, но относительно яблочно-молочного брожения наблюдал Милисавлевич (1958), который показал, что на яблочно-молочное брожение оказывают влияние дрожжи, вызвавшие спиртовое брожение; существуют расы, которые временно приостанавливают рост бактерий, что задерживает яблочно-молочное брожение на период от 3 до 6 мес. Флеш и Йерхель (1960) точно так же наблюдали, что некоторые дрожжи явно задерживают образование молочной кислоты.
В связи с этим авторы провели специальный эксперимент. Стерильное виноградное сусло засевали серией дрожжей различных видов. По окончании брожения (в случае дрожжей с малой спиртообразующей способностью брожение завершается дрожжами Sacch. ellipsoideus) удаляли дрожжи путем фильтрования и засевали
полученное вино, разделенное на две серии, с помощью суспензии выращенных яблочно-молочных бактерий, принадлежащих к родам Leuconostoc и Lactobacillus. Через 50 дней определяли остаточную кислотность. Обнаружилось, что раскисление не было общим; яблочно-молочное брожение в этот период в средах, сброженных некоторыми дрожжами (Sacch. ellipsoi- deus, Sacch. chevalieri, Sacch. carls- bergensis, Sacch. uvarum, Sacch. acidi- faciens, Sacch. heterogenicus), оказалось невозможным, тогда как в других случаях оно протекало успешно. Действие дрожжей может выражаться в использовании некоторых необходимых элементов среды до полного их исчерпания, или образовании угнетающих веществ неизвестной природы.
С. Лафон-Лафуркад (1973) также показала, что, используя одну и ту же питательную среду, каждый штамм дрожжей создает сброженную среду, которая при таком же составе и в одинаковых условиях pH, спиртуозности, концентрации сернистого ангидрида, яблочной кислоты обладает свойственной только ей способностью облегчать или угнетать сбраживание яблочной кислоты молочнокислыми бактериями, размножающимися без деления, т. е. различной «сбраживаемостью».
СПОСОБНОСТЬ вин к ЯБЛОЧНО- МОЛОЧНОМУ БРОЖЕНИЮ
С. Лафон-Лафуркад (1970) разработала способ, позволяющий измерять «яблочно-молочную активность» бактерий, определяемую как способность метаболизировать яблочную кислоту в простой среде (фосфатный буфер при pH 4,0, содержащий ионы Mg и Мп).
Можно поставить вопрос, не происходит ли сбраживание яблочной кислоты при соблюдении одинаковых ус-
Таблица 12.16
Яблочно-молочная сбраживаемость вин
Количество яблочной кислоты (в мг-экв), сброженной за 24 ч свежими бактериями в концентрации 1 г/л
Образцы вин
5 2
8 о
° Й
Простая среда
42
63
17
50
Вино № 1
16
29
40
42
2
8
12
12
7
3
31
52
0
48
4
21
28
21
41
5
22
40
12
40
6
25
45
17
47
7
39
46
36
52
8
74
75
75
75
9
28
32
20
38
10
27
43
26
46
Примечание. Исходное количество яблочной кислоты — 75 мг-экв/л. Вина № 1, 2 и 3 — белые, остальные — красные.
ловии так же хорошо простой среде. Это применение понятия яблочно-молочному
в винах, как и в предусматривает о способности к брожению илив винах, как и в предусматривает о способности к брожению или«яблочно-молочной сбраживаемости» к вину. Под этим термином авторы понимают способность вина обеспечить ферментативную реакцию превращения яблочной кислоты культурой бактерий, размножающихся без деления клеток, по сравнению с простым раствором такой же спиртуозности и одинакового pH.
в винах, как и в предусматривает о способности к брожению или
в винах, как и в предусматривает о способности к брожению или
В табл. 12.16 даны примеры яблоч- но-молочной сбраживаемости для серии вин (Пейно и С. Лафон-Лафур- кад, 1972).
Из этой таблицы видно, что яблочно-молочная сбраживаемость может сильно изменяться в зависимости от типа вина. В некоторых винах яблоч
ная кислота очень мало метаболизируется, как например, в вине № 2.
У других же, наоборот, превращение происходит быстро и в большей степени, даже больше, чем у раствора яблочной кислоты, как это, например, происходит в вине № 8. В этом вине все бактерии сбраживают яблочную кислоту быстрее, чем в простой среде. Следовательно, можно думать, что некоторые вина обладают активаторами, способствующими яблочно-мо- лочной реакции. Но намного чаще присутствуют угнетающие вещества, поскольку в 13 винах из 15 брожение происходит не так быстро, как в простом растворе.
Эти результаты подтверждают то, чему всегда учит практика виноделия, а именно, что существуют большие различия в поведении вин при яблоч- но-молочном брожении.
Констатировали, что белые вина как правило, обладают меньшей сбраживаемостью, чем красные, и старые вина бродят труднее по сравнению с молодыми. Если процентное содержание общего сернистого ангидрида является важным фактором способности вина к брожению, то это не значит, что нет других, пока неизвестных ингибиторов. Например, красное вино № 10 разлагает свою яблочную кислоту более активно при 150 мг общего сернистого ангидрида, чем белое вино № 2 при 100 мг.
ЛИТЕРАТУРА
Archinard R. et В о и d о t J. (1955), Ann.
Falsif. Fraudes, 48, 17.
В e e 1 m a n R. B. e t G a 11 a n d e г J. F. (1970), Amer., J. Enol. Vitic., 21, 193.
Bergeret J. (1958), C. R. Acad. Agric., 44, . 673 et 783.
Bidan P. (1966), Physiologic des bacteries malolactiques. Groupe de travail Microbiologie de I’O. I. V.
Bidan P. (1967), IIе Symposium internati-
onal cT Oenologie, Bordeaux. C. R. Vol. I, p. 195.
Bousbouras G. E. et К un к ee R. E. (1971), Amer. J. Enol. Vitic., 22, 121.
Carr J. G. (1958), Antonie van Leewenhoeck, 24, 63.
C astin о M., Usseglio-Tomasset L. et Gand ini A. (1973), 4 th. Long Ashton Symposium: Lactic acid bacteria of beverages and foods.
Charpendie Y. (1954), Contribution a 1 etude biochimique des facteurs de l’acidite des vins, These Doct.-Ing., Bordeaux.
Domereq S., Sudraud P. et Cassig- nard R. (1959), 84е Congres des Societes Savantes, Dijon.
Du Plessis L. (1963), S. Afric. J. agric. Sci., 6, 485.
Dupuy P. (1959), Vignes et Vins, n° 80, p. 37.
Flesch P. et Jerchel D. (1958), Mitteilun- gen, 8, 301.
Flesch P. et Jerchel D. (1960), Mitteilun- gen, 10, 1.
Fornachon J. С. M. (1963), J. Sci. Food Agr., 14, 857.
Fornachon J. С. M. (1963), Symposium international d’Oenologlie, Bordeaux, Ann. Technol. agric., 12, numero hors serie, 45.
Gendron C. (1967), Recherches sur la fermentation malolactique. These Doct, Nantes. Geoffroy P. (1959), Vignes et Vins, n° 80, p. 25.
Jak и bow ska J. (1963), Bull. О. I. V., n° 389. 812.
Jerchel D., Flesch P. et Bauer E. (1956), Liebigs Ann. Chern,. 601, 40.
Lafon-Lafourcade S. (1970 a), Conn.
Vigne Vin, 4, 273.
Lafon-Lafourcade S. (1970 b), Ann. Technol. agric., 19, 141.
Lafon-Lafourcade S. (1973), Conn. Vigne Vin, 7, 203.
Laf о n-Lafourcade S, et Pe у naud E. (1970), C. R. Acad. Sci., 270, 228.
Lafon-Lafourcade S. et Pe у naud E. (1974), Conn. Vigne Vin. 8, 187.
Lonvaud M. (1975), Recherches sur 1’enzyme des bacteries lactiques du vin assurant la transformation du malate en lactate. These Doct. Oenologie. 3 Cycle. Bordeaux.
Lonvaud M. etRibereau-Gayon P. (1973), C. R. Acad. Sci., 276, 2329.
L ii t h i H. (1952), Landw. Jahrhuch Schweiz, 66, 631.
Liithi H. (1957), Rev. Ferm. Ind. alim., 12,
LiithiH. et V e t s c h V. (1959), Schweiz Obst. Weinbau, 68, 5, 127 et 144.
Martiniere P., Sapis J. C. et R i b ё re - a u-G а у о n J. (1974), C. R. Acad. Agric., 4, 255.
Mayer К., Pa us e G. etVetsch U. (1971), Mitt. Geb. Lebensm. Unters. Hyg., 62, 397.
Melamed N. (1962), Determination des sucres residuels des vins, leur relation avec la fermentation malolactique. These Sciences, Dijon.
Milisavljevic D. (1958), Ann. Sci. ag- ron. Belgrade, 11, n° 34.
Novel E. (1968), Mitteil. Lebensm. Unters.
Hyg., 59, 216.
Orla-Jensen S., Otte U. C. et Snog- Kjaer A. (1956), Kgl. Danske Vindensk. Silokrab. Naturw. Math., 6, 52.
Peynaud E. (1955), Mitteilungen, 5, 183.
Pe у n aud E., et Lafon-Lafourcade S. et Domereq S. (1965), Bull. О. I. V-, 38, 415 et 945.
Peynaud E. et Lafon-Lafoiurcade S. (1972), Ind. alim. agric., 89, 398.
Peynaud E. et Sapis-Domercq S. (1972), Conn. Vigne Vin, 6, 255.
Plumas B. (1970), Etude de la formation d’histamine dans les vins par le dosage si- multane de 1’histidine et de Thistamine, Diplo- me Ing. C. N. A. M.
Radler F. (1958), Archiv. Microb., 32, 1.
Radler F. (1958), Vitis, 1, 288.
Radler F. (1963), Vitis, 3,207.
Radler F. (1967), Conn. Vigne Vin, 3, 73.
Radler F. (1973), 4th Long Ashton Symposium : Lactic acid bacteria of beverages and foods.
Ri'bereau-Gayon J. et Peynaud E. (1938), Ann. Ferment., 4, 559.
Snell E. E. (1940), Wallerstein Lab. Comm., 11, 81.
Snell E. E. (1952), Bact. Rev., 16, 227.
Sudraud P. et Cassignard R. (1959), Vignes et Vins, n° 80, p. 18.
Tchelistcheff A., Peterson R. G. et Van Gelderen M. (1971), Amer. J. Enol. Vitic., 22, 1.
Vetsch U. (1973), Schweiz. Obst. Weinbau, 109, 468.
Weiller H. G. et Radler F. (1972), Mitteilungen, 22, 4.
Whiting G. L. et Coggins R. A. (1963), Ann. Depart. Agr. Hort. Res. Station Long Ashton, p. 157.
Zickler F. (1964), Zbl. Bakt. Parasit. Infekt. Hyg., 117, 702.
Глава 13. ПРЕВРАЩЕНИЯ ВИНА, ВЫЗЫВАЕМЫЕ БАКТЕРИЯМИ.
ЯБЛОЧНО-МОЛОЧНОЕ БРОЖЕНИЕ И БОЛЕЗНИ
Эта глава посвящена превращениям, благоприятным или неблагоприятным для качества, которые происходят в составе вина под действием молочнокислых бактерий. История исследований в области винных бактерий, проведенных до 1946 г., разделена на три основных этапа: 1) открытие Пастером связи между болезнями вина и активностью микробного возбудителя; 2) исследования Мюллер-Тур- гау и Остервальдера, которые дали химические определения этих болезней и классифицировали бактерии в зависимости от компонентов вина, которые они разлагают; 3) исследования Ж. Риберо-Гайона, в результате которых появились новые концепции и новые доктрины выделки и хранения вина.
В данной главе дан краткий исторический обзор работ по яблочно-мо- лочному брожению и уточнены вторично превращения, которыми оно сопровождается; обсужден также ущерб, наносимый качеству вин. Затем рассмотрены наиболее часто встречающиеся бактериальные болезни: ожирение вина, молочнокислое скисание, сбраживание винной кислоты, или турн, сбраживание глицерина, или прогоркание вина.
ЯБЛОЧНО-МОЛОЧНОЕ БРОЖЕНИЕ
Первые исследования яблочно- молочного брожения
Первые наблюдения сильного уменьшения общей кислотности вина по сравнению с уровнем кислотности в исходном сусле, уменьшения, намного превосходящего то, которое соот-
ветствует осаждению битартрата, сделали Вертело и Флерие (1864). Бу- сенго (1868) констатировал в яблочных винах снижение кислотности на 50%, не будучи в состоянии объяснить его. Ордонно (1891) сообщал об исчезновении яблочной кислоты во время созревания вин. Его также наблюдал Кулиш (1899), изучал Меслингер (1901), который вывел уравнение яб- лочно-молочного брожения; Кох (1900) и Зейферт (1901) выделили бактерии, способные разлагать яблочную кислоту, и, наконец, наиболее широкие исследования провели Мюллер- Тургау и Остервальдер (1913).
Во Франции разложение яблочной кислоты в винах наблюдали Местре- зат (1907), Розенштиль (1908), Маро (1906, 1913).
Присутствие значительного количества молочной кислоты в здоровых винах отметил еще Балар (1861).
Менсио и Гарино-Канина (1914) уже в то время рассматривали яблочно- молочное брожение как обычное явление в виноделии области Пьемонт.
Во Франции начиная с 1922 г. Ферре в ряде работ (1922, 1926, 1928) выяснил значение .и частоту понижения кислотности бактериями в бургундских винах лучших марок, а для красных вин района Бордо повсеместное и нормальное существование этого процесса доказал в ряде своих публикаций 1937—1946 гг. Риберо-Гайон. Параллельно с этим Пейно (1938—1946) подтвердил и уточнил полученные Ри- беро-Пайоном результаты.
Совершенно неправильно считать, что красные вина лучших марок получаются в результате чистого спиртового брожения. Не будет преувеличе-
Вино № 1
До яблочно-молочного брожения После яблочно-молочного брожения Изменения
2,0
1,7
3,38
3,47
Вино № 2
До яблочно-молочиого брожения После яблочно-молочного брожения
Изменения
2,6
1,9
3,15
3,23
98
8,1
44,2
36,8
5,4
3,8
—.
79
13,1
39,7
0
0,9
24,5
—
-19
+5,0
—22*
-36,8
-4,5
+20,7
-17,8
110
3,7
47,4
40,8
5,1
4,3
84
6,2
41,3
0
1,0
25,2
—
-26
+2,5
—3,0*
-40,8
-4,1
+20,9
—24,5
2ДКислотность, мг-экв/лКислотамг-экв/л|5Образцы винаняsсоуЙ23няОо 3и 3Омочч2О о2ДКислотность, мг-экв/лКислотамг-экв/л|5Образцы винаняsсоуЙ23няОо 3и 3Омочч2О оАналитические балансы яблочно-молочного броженияАналитические балансы яблочно-молочного брожения
2Д
Кислотность, мг-экв/л
Кислота
мг-экв/л
|5
Образцы вина
н
яs
соу
Й2
3н
яО
о 3
и 3
Ом
оч
ч2
О о
2Д
Кислотность, мг-экв/л
Кислота
мг-экв/л
|5
Образцы вина
н
яs
соу
Й2
3н
яО
о 3
и 3
Ом
оч
ч2
О о
Аналитические балансы яблочно-молочного брожения
Аналитические балансы яблочно-молочного брожения
* Уменьшение винной кислоты вызвано более значительным осаждением кислого винного калия после нсчезновенич яблочной кислоты.
нием сказать, что без яблочно-молоч- ного брожения не было бы выдающихся бордоских вин: все старые вина этого района, которые были анализированы, оказались почти или полностью лишенными яблочной кислоты и, наоборот, они были богаты молочной кислотой. Было известно, что присутствие бактерий в этих винах представляет обычное явление, но считали, что это не что иное, как начало заболевания. Авторы показали необходимость не препятствовать этому превращению, и в частности указали на меры предосторожности, которые следует принимать при приготовлении тонких вин в отношении использования сернистой кислоты в значительных дозах в технологии виноделия.
Для ординарных вин массового потребления, в отношении которых вопрос старения имеет меньшее значение, чем вопрос хранения, яблочночмолоч- ное брожение представляет собой еще
один элемент стабильности, а часто и значительного улучшения качества.
В табл. 13.1 даны примеры баланса превращений, происходивших в двух винах, анализируемых до и после яблочно-молочного брожения.
Бактерии полезные и бактерии вредные
Лишь одно бактериальное превращение полезно и желательно при производстве некоторых типов вин — сбраживание яблочной кислоты в молочную.
Всякое воздействие бактерий на другие компоненты вина опасно. Молочнокислое сбраживание органических кислот дает уксусную кислоту; сбраживание углеводов повышает как нелетучую, так и летучую кислотность. Пока не известны все составные части вина, которые могут быть метаболизированы бактериями (это могут быть
полисахариды, некоторые глюкозиды); не изучены продукты разложения некоторых веществ, например мезоинозита. Вина, потерявшие 0,5 г мезоинозита, что составляет его среднее содержание на 1 л, имеют низкие значения летучих кислот. Кроме того, некоторые ароматические вещества исчезают, тогда как образуются более или менее неприятно пахнущие продукты (молочнокислые запахи).
Идеальным видом молочнокислых бактерий, безопасным и полезным мог бы быть такой, который использует яблочную кислоту, не затрагивая других компонентов. В действительности такого вида бактерий не существует, и совершенно безвредных бактерий нет. Во всяком случае, поскольку разложение яблочной кислоты не является для бактерий энергетической реакцией, а яблочно-молочное брожение начинается только после роста бактерий, они должны по необходимости развиваться за счет других компонентов.
" Однако можно выделить два типа молочнокислых бактерий. С одной стороны, бактерии, вызывающие болезни, всегда опасны, потому что они способны поглощать значительные количества важнейших компонентов и часто лучше, чем яблочную кислоту; с другой стороны, бактерии, которые обычно вызывают яблочно-молочное брожение, опасны лишь в отдельных случаях, в некоторых условиях более способны превращать яблочную кислоту, чем сахара.
Гомоферментативный характер, т. е. чистое молочнокислое сбраживание глюкозы, не является гарантией безвредности, как можно было думать. Гомоферментативные бактерии образуют летучие кислоты из фруктозы и из пентоз; кроме того, они повышают нелетучую кислотность. К тому же их присутствие в испорченных винах яв-
ляется обычным явлением. Некоторые гомоферментативные молочнокислые бациллы используют даже винную кислоту.
Одним из факторов безвредности является порог pH. Выше было показано, каким образом некоторые кокки могут сбраживать яблочную кислоту среды, содержащей сахар, при низком pH, без какого-либо вреда для качества вина. Однако для многих бацилл не существует разницы между двумя порогами pH; некоторые бактерии при одинаковом pH лучше используют сахара, чем яблочную кислоту. Сахара могут сбраживаться при pH 3,0.
Классификация поражения вин бактериями по степени опасности в убывающем порядке может быть схематически представлена в следующем виде:
глубокие изменения состава, с образованием повышенной летучей кислотности, доходящей до полной порчи вина; сбраживание винной кислоты, глицерина, глюкозы и фруктозы;
ограниченные изменения, с образованием небольших количеств летучей кислотности и легкого снижения качества вина: сбраживание лимонной кислоты, арабинозы, ксилозы.
Способность метаболизировать арабинозу встречается у половины штаммов молочнокислых бактерий. 1 ммоль пентозы дает в среднем 0,8 ммоль уксусной кислоты и 0,7 ммоль молочной кислоты. Из 1 г арабинозы может образоваться 0,30 г летучей кислотности (выраженной в серной кислоте). Разложение ксилозы происходит в меньшей степени, поскольку этот сахар содержится в винах в малых количествах.
Сбраживание лимонной кислоты, также часто встречающееся в винах, является другой причиной увеличения летучей кислотности. 2/3 штаммов молочнокислых бактерий способны раз-
лагать лимонную кислоту. Преобразование 1 ммоль лимонной кислоты (192 мг) дает от 1,25 до 1,50 ммоль уксусной кислоты (от 75 до 80 мг); 2 ммоль лимонной кислоты, что соответствует среднему содержанию ее в винах, могут дать 0,20 г летучей кислотности.
Увеличение летучей кислотности в молодых винах
Хорошо известно, что яблочно-.мо- лочное брожение в надлежащих условиях сопровождается небольшим повышением летучей кислотности (0,1— 0,2 г/л). Такое повышение неизбежно, но можно блокировать дальнейшее повышение летучей кислотности посредством сульфитации с момента завершения яблочно-молочного брожения. С другой стороны, когда после исчезновения яблочной кислоты бактерии оставляют действовать без какого-либо вмешательства (переливки или сульфитации), наблюдают, что, как правило, летучая кислотность продолжает постепенно возрастать и в некоторые годы быстрее, чем в другие; главным фактором этой эволюции является pH вина. Это увеличение более заметно у красных вин. Ранкин и Бридсон (1971) обращают внимание на изменения состава, вызываемые бактериями, как следствие яблочно- молочного -брожения.
Наконец, во время хранения вина в деревянных бочках или чанах для вина бывает, что в течение первого или иногда только второго лета летучая кислотность резко возрастает, часто в каждой емкости по-разному.
Такую бактериальную активность очень часто встречавшуюся при хранении тонких красных вин лет 30 тому назад и нередко наблюдаемую еще и в настоящее время, гипотетически приписывали парциальному сбражива
нию глицерина. Но анализы не подтверждают этого. Объяснение резкого увеличения летучей кислотности в конце яблочно-молочного брожения и в период хранения заключается в поглощении остаточных сахаров, и в частности глюкозы и пентоз.
Меламед (1962) показал, что глюкоза, фруктоза, арабиноза и ксилоза, всегда присутствующие в молодых винах, исчезают параллельно во время яблочно-молочного брожения; вероятно, глюкоза расходуется быстрее, чем другие сахара. Именно за счет этих остаточных сахаров в винах размножаются бактерии яблочно-молочного брожения. Их среднее содержание в сухих винах, исследованных автором (восстанавливающие сахара 2,05 г/л), составляет 0,48 г для глюкозы, 0,67 г для фруктозы, 0,70 г для арабинозы, 0,16 г для ксилозы. Г-имберто нашел в серии вин после яблочно-молочного брожения от 0,3 до 1,0 г арабинозы; из 13 вин в 5 больше не было ксилозы, в 6 были ее следы, содержание сахаров в двух винах было меньше 50 мг/л.
В табл. 13.2 приведены примеры уменьшения содержания пентоз в трех винах, хранившихся с их молочнокислыми бактериями в течение нескольких недель после яблочно-молочного брожения.
В других опытах молодые вина, содержащие бактерии, обогащали некоторыми сахарами, уроновыми кислотами и выдерживали несколько месяцев в закупоренных бутылках. Пентозы, как и глюкоза, исчезают почти полностью. Наконец, в винах остается фруктозы не более 0,5 г/л. Летучая кислотность возрастает в большей или меньшей степени в зависимости от добавляемых компонентов. Уксусную кислоту больше всего производят пентозы. Отмечают также деградацию глюкуроновой кислоты, которая может
Таблица 13,2
Уменьшение содержания пентоз в процессе яблочно-молочного брожения, г/л
Образцы вина
Арабиноза
Ксилоза
№ 1
контроль
0,8
0,2
после яблочно-молоч-
0,3
0,1
кого брожения № 2
контроль
1,0
0,2
после яблочно-молоч-
0,6
0,2
ного брожения
№ 3
контроль
1,0
0,2
после яблочно-молоч-
0,2
0,1
ного брожения
объяснить ее отсутствие в некоторых винах. Метил-яблочная кислота не используется, галактуроновая кислота, полисахариды, возможно, используются, но в незначительной степени.
Из приведенных выше наблюдений вытекает, что в практике виноделия яблочно-молочное брожение должно находиться под таким же наблюдением и контролем, как спиртовое. Следует периодически определять общую кислотность, летучую кислотность и яблочную кислоту. Как только будет установлено исчезновение последней, необходимо немедленно производить переливку вина и сульфитировать его из расчета 3—5 г/л сернистого ангидрида.
Переливку молодых вин следует проводить не через какие-то заранее установленные промежутки времени или в фиксированные даты, а в зависимости от того, как протекает яблочно-молочное брожение.
Осветление нужно проводить возможно раньше, так как осаждение бактерий, особенно кокков, недостаточно, чтобы обеспечить их полное удаление; рекомендуется фильтрация
молодых вин; она даже необходима при хранении вин в больших емкостях.
Образование летучих веществ
Известно, что аромат вин подвергается глубоким изменениям в результате яблочно-молочного брожения и тем в большей степени, чем дольше вино находится в присутствии жизнеспособных бактерий.
Первичный аромат, аромат сорта ослабляется и может полностью исчезнуть; по этой причине некоторые белые ароматические вина не «выносят» такого превращения. С другой стороны, появляются новые запахи; обычно они приятны у тонких красных вин, аромат которых обогащается, таким образом, новыми и сложными компонентами. Но могут возникать и некоторые отклонения, особенно у белых вин. Вина могут приобретать устойчивые запахи кислого молока, сливочного масла, сыра, «молочной фермы», муки, пшеницы, квашеной капусты.
Этиллактат и диацетил, образуемые бактериями, известны своим влиянием на аромат вин. Запах диацетила или аромат сливочного масла считают более или менее допустимым; при этом в зависимости от содержания его расценивают как достоинство или как порок (Дитрих и Кернер, 1964; Форна- шон и Ллойд, 1965; Ранкин и сотрудники, 1969). В винах обычно находится от 0,1 до 2,0 мг/л диацетила; рекомендуемые дозы составляют от 5 до 7 мг/л.
Пилоне и сотрудники (1966) устанавливают завершение яблочно-молочного брожения в винах по повышенному содержанию в них летучих кислот, этиллактата, диацетила и ацетоина. Радлер и Герварт (1971) исследовали образование вторичных летучих продуктов молочнокислого бро-
жения. У гомофер-ментативных штаммов молочнокислого брожения они идентифицировали ацетальдегид, ацетоин, диацетил, а также следы метил-2 или З-бутанол-1 и изобутанол. Гетероферментативные бактерии молочнокислого брожения, кроме того, образуют наряду с этанолом очень малые количества пропанола, изопропанола, этилацетата, «-гексанола, «-октанола.
ОЖИРЕНИЕ, ИЛИ БОЛЕЗНЬ ТЯГУЧИХ ВИН
Оно характеризуется маслянистой консистенцией и тягучестью вин, хорошо заметной при наполнении стакана. Ожирение больше известно, как болезнь молодых белых вин, но оно может поражать и красные вина. По мнению многих авторов, в действительности речь идет не о болезни, а об особом проявлении яблочно-мо- лочного брожения.
Известно, что некоторые молочнокислые бактерии, чаще всего Leuconos- toc, окружены в некоторых условиях слоем декстрана, полисахарида с длинной цепью, растворы которого обладают тягучестью. Бактерии связаны друг с другом этой тканью и при наблюдении под микроскопом представляются как бы захваченными в сеть.
Что касается веществ, вызывающих густую, вязкую консистенцию вин, то их выделили и идентифицировали Бюши и Доэль (1954). Речь идет о полисахаридах, лишенных азота и состоящих из галактозы, маннозы, арабинозы и галактуроновой кислоты.
Из тягучих вин различного происхождения выделили бактерию, имевшую вид кокка, чистые культуры которого позволяют придавать здоровым винам свойство становиться тягучими и приобретать признаки ожирения; она получила название Strepto
coccus mucilaginosus bap. vini. Благодаря измерению степени вязкости удалось установить отношение между яб- лочно-молочным брожением и ожирением и проследить в одно и то же время за развитием этих процессов. Оказалось, что они начинаются практически одновременно, но редко заканчиваются в одно время. Большую часть времени после окончания биологического раскисления вина остаются в течение более или менее длительного периода тягучими и маслянистыми по своей консистенции. Поэтому не следует рассматривать ожирение как прямое следствие яблочно-молочного брожения: речь шла о двух различных явлениях. Чистые культуры Streptococcus mucilaginosus способны сбраживать яблочную кислоту, но оптимальный pH их развития довольно высокий. Кроме того, первостепенное значение для появления этой болезни имеет содержание в винах остаточных сахаров (Гумберт-Дроз, 1958).
Люти также доказал, что одновременное присутствие других микроорганизмов оказывает большое влияние и значительно повышает образование вязкого вещества. Это явление характерно для симбиоза. Этот же автор идентифицировал в качестве симбиозов столь различные микроорганизмы, как Acetobacter rancens, Debaryomy- ces kloeskeri и Penicillium roqueforti. Был изучен механизм вмешательства этих микроорганизмов. Они могут проявлять активность, реализуя более благоприятный окислительно-восстановительный потенциал и расходуя кислород питательной среды. Но похоже, что эти связи имеют намного более сложную природу. Streptococcus mucilaginosus способен развиваться в присутствии Acetobacter rancens при значительно более низких pH. В то же время образование вязкого вещества происходит более интенсивно. Исполь-
зуемое для эксперимента вино может приобрести консистенцию настоящего студня.
Подобные явления симбиоза могли бы иметь большое значение в эволюции других бактериальных болезней вин.
Нужно, однако, уточнить, что болезнь ожирения не изменяет сама по себе состава вина. Летучая кислотность вин, заболевших ожирением, необязательно повышается, некоторые тягучие вина имеют лишь 0,36 г летучей кислотности. Опасность этой болезни заключается в том, что ожирение часто сопровождается быстрым развитием бактерий, использующих винную кислоту или глицерин.
Профилактической обработкой является разумное применение сернистого ангидрида при выделке и хранении вина в дозах, которые не мешают процессу яблочно-молочного брожения, но достаточны для того, чтобы воспрепятствовать образованию слизистого вещества. Лечебная обработка предусматривает сульфитацию при 6 или 8 г/гл с энергичным перемешиванием вина. Это механическое действие разрушает ткань, которая делает вино тягучим и нарушает его вид; аэрация способствует этому разрушению.
МОЛОЧНОКИСЛОЕ СБРАЖИВАНИЕ САХАРОВ ИЛИ МОЛОЧНОКИСЛОЕ СКИСАНИЕ
Опасность присутствия молочнокислых бактерий в вине, содержащем восстанавливающие сахара, известна давно. Это разложение сахаров, происходящее даже во время брожения на мезге и, как правило, после снятия с дрожжей вин, с не полностью сброженным сахаром, в прошлом называли «маннитным брожением». Гайон и Дюбур (1894—1904) доказали, что присутствие маннита является резуль-
татом действия бактерий на фруктозу, еще не использованную дрожжами. Во избежание на практике маннитных болезней вин нужно прежде всего создать наиболее благоприятные условия для спиртового брожения; из этого вытекают и рекомендации, сформулированные Гайоном для ведения брожения: охлаждение чанов, перетяжка с доступом воздуха, короткое брожение на мезге и применение сернистого ангидрида.
Опасность, возникающая от присутствия в вине несброженного сахара, отнюдь не в том, что оно способствует турну, т. е. разложению винной кислоты или глицерина, а в том, что оно вызывает, если этот сахар разлагается бактериями вместо дрожжей, образование уксусной и молочной кислоты (молочнокислое скисание) в тем больших количествах, чем больше осталось несброженного сахара. Именно в годы больших урожаев богатые сахаром и бедные кислотами вина подвержены этому заболеванию, так как сбраживание сахара в этом случае протекает с трудом, а малая кислотность способствует развитию бактерий. Достаточно небольшого количества сахара, разложенного бактериями, чтобы заметно ухудшить вино, сделать его резким в результате увеличения летучей и общей кислотности.
Можно сказать, что молочнокислое скисание может проявляться в четырех различных ситуациях: во время приготовления вина; в момент яблочно-молочного брожения или после его завершения в винах с остаточным сахаром; в сладких натуральных винах и в ликерных винах.
Молочнокислое скисание может особенно быстро проявляться в не полностью выбродивших винах, содержащих довольно высокое количество остаточного сахара. Вначале оно проте-
кает очень скрытно: все молочнокислые бактерии, включая и бактерии яблочно-молочного брожения, способны участвовать в нем; следовательно, его трудно отличить от яблочно-молочного ■брожения, особенно если оно развивается одновременно и когда бактерии являются гомоферментативными. В этом случае прежде всего происходит повышение нелетучей кислотности. Гумберт Дроз (1958) предложил называть это гомоферментативное разложение сахаров фруктозо-молочнокислым брожением, которое может возникнуть во время, но чаще сразу же после яблочно-молочного брожения. Оно редко переходит в бурную форму с образованием маннита, но часто бывает причиной повышения летучей кислотности (Шопфер, 1973).
Некоторые способы виноделия способствуют молочнокислому скисанию, например виноделие без дробления или когда производят лишь частичное дробление. В этом случае прессовое вино остается с большим или меньшим содержанием сахара и опасность заключается в том, что дрожжи и бактерии могут здесь развиваться одновременно.
Ликерные вина
Выработка ликерных вин из винограда, пораженного «благородной гнилью», выдвигает в годы большого перезревания проблему бактерий, которую трудно решить. Действительно, сульфитация сусла может быть лишь в уменьшенных дозах, чтобы еще с начала брожения избежать накапливания связанного сернистого ангидрида. Спиртовое брожение иногда бывает вялым и продолжается несколько недель.
Однако такие вина обладают высокой летучей кислотностью (Сюдро, 1967). Повышенное образование уксус
ной кислоты является следствием трех главных причин: 1) уксуснокислые бактерии, развивающиеся на поверхности винограда, пораженного Botrytis cinerea, следовательно, летучая кислотность существует еще до получения сусла; 2) дрожжи, работающие в обедненной среде, в частности при недостатке усвояемого азота и пантотеновой кислоты; при наиболее замедленном брожении образуется большее количество летучих кислот; 3) молочнокислые бактерии, вмешательство которых облегчается замедленным темпом или даже остановкой спиртового брожения и присутствием сахаров.
Действительно, активность бактерий является обычным явлением в этом типе вин. Ее можно измерять по содержанию L(+)-МОЛОЧНОЙ кислоты, которая присутствует в винах после сульфитирования. Из примерно 60 исследованных вин Барзак и Сотерн из урожаев 1967—1970 гг. все имеют более 30 мг/л L(+)-молочной кислоты; однако известно, что выше уровня 10—15 мг/л вина наверняка были средой для размножения бактерий (С. Лафон-Лафуркад и Пейно, 1970). В 23 винах содержание этой кислоты превышает 100 мг/л, в четырех — свыше 500 мг/л и в двух больше нет яблочной кислоты.
Все ликерные вина, имеющие повышенную летучую кислотность, необязательно были местом развития молочнокислых бактерий, каждый раз, когда имеется бактериальная активность, существует риск дополнительного повышения летучей кислотности, т. е. более или менее развитого молочнокислого скисания.
Легкое сульфитирование, частичная очистка сусла и особенно активирование спиртового брожения являются средствами борьбы против этого вида бактериальных болезней.
Десертные вина
Речь идет о типах вин, известных под названием сладких натуральных вин, ликерных вин, мистелей, крепленых вин, специальных вин, получаемых с добавлением спирта, и обычно крепких, обладающих высоким содержанием восстанавливающих сахаров, низкой кислотностью и повышенным pH. Заболевание начинается еще в бродильном чане, но чаще всего после розлива в бутылки. Когда бутылке придают вращательное движение, наблюдаются «шелковистые волны». Эти вина содержат в избытке углекислый газ и приобретают кислый привкус, .более или менее испорченный аромат, иногда даже так называемый «мышиный тон» или запах ацетамида СН3—■ СОМН2. Авторы наблюдали такие изменения у мускатов Ривсальт, Самос, у вин Баньюль, Порто, Марсала.
Наиболее примечательное изменение вина выражается в возрастании связанной кислотности и летучей кислотности в результате разложения сахаров и образования молочной и уксусной кислот.
Молочнокислые бактерии, чаще всего ассоциируемые с этим видом заболевания сладких высокоспиртуозных вин, принадлежат к роду Lactobacillus (Форнашон, 1936, Форнашон и сотрудники, 1949; Вогн, 1955; Вогн и сотрудники, 1949). Наиболее распространен вид L. trichodes, так как он способен развиваться в винах со спиртуозно- стью выше 21% об. Он может вызывать заболевания итальянских вермутов (Милан, 1962). Но это не единственный идентифицированный вид. Форнашон (1943) занес в каталог пять групп бактерий, найденных в больных десертных винах: к группе I относятся гетероферментативные Lactobacillus, не сбраживающие ни пентоз, ни яблочной кислоты, которые по- 302
зднее описали под названием L. trichodes; они могут развиваться при спиртуозности вина 20—21% об. Группа II представлена гетерофермента- тивными Lactobacillus, которые сбраживают ксилозу и яблочную кислоту (родственные L. hilgardii) и развиваются в винах при спиртуозности 18— 20% об. Группы III и IV сбраживают пентозы (L. brevis?) и спиртовыносливы до 18—20% об. Группа V до некоторой степени аналогична группе II. Дюпюи (1957) описал гетерофермен- тативную бациллу, выделенную из ликерных вин, также сравнимую с бактериями группы V. Джини и Вогн (1962) нашли в этих типах вин бактерии, принадлежащие к виду Pedio- coccus cerevisiae или еще к семи видам рода Bacillus, способных образовывать споры и устойчивым к повышенным температурам.
МОЛОЧНОКИСЛОЕ СБРАЖИВАНИЕ ВИННОЙ КИСЛОТЫ, ИЛИ ТУРН
Пастер описал видимые признаки «турна» или «пусса» вин: помутнение, шелковистые волны, выделение углекислого газа, побурение на воздухе, плоский вкус, клееобразный осадок, образуемый выпадением волокон. Это не было разложением винной кислоты. Мюллер-Тургау и Остервальдер (1919) оставили термин «турн» за болезнью, характеризующейся одновременным разложением винной кислоты и глицерина, происходящим, по мнению авторов, в виде единого процесса. Риберо-Гайон показал, что если эти два компонента часто используются параллельно (см. табл. 13.3), то сбраживание винной кислоты может происходить без изменения содержания глицерина. В точной кодификации болезней вина «турн» является синонимом молочнокислого брожения винной кислоты. «Пусс» в этом случае мо-
Таблица 13.3
Аналитический баланс молочнокислого сбраживания винной кислоты и глицерина
Элементы вина
к ”
к
S
S
Глицерин, ммоль Восстанавливающие са-
70
46
—24
1,5
0,5
— 1,0
хара, г/л pH Кислотность, мг-экв/л
3,93
3,96
—
общая
54
74
+20,0
летучая
Кислота, мг-экв/л
И,2
33,8
+22,6
винная
40,0
26,9
-13,1
яблочная
0
0
лимонная
0,9
0,7
-0,2
молочная
16,2
25,2
+9,0
Сумма индивидуальных изменений кислот, мг- экв/л
—
—
+ 18,3
жет соответствовать яблочно-молочно- му брожению.
Разложение винной кислоты молочнокислыми бактериями не является признаком вида. Авторы этой книги наблюдали, а другие авторы подтвердили, что бактерии, принадлежащие к различным группам, могут обладать этим свойством. Использование винной кислоты в различных видах питательной среды иногда бывает полным, но чаще лишь частичным.
Крумперман и Вогн (1966) выделили 64 штамма молочнокислых бактерий, способных разлагать винную кислоту. 24 штамма являются гетерофер- ментативными и 40-гомоферментатив- ными. Их развитие возможно только в анаэробиозе. Речь идет только о молочнокислых бациллах, отнесенных авторами к видам L. plantarum, Р. leichmanii, L. brevis, L. buchneri, L. pastorianus, из которых отдельные штаммы определены неточно и не соответствуют принятой здесь современной номенклатуре. Продуктами раз
ложения являются молочная, янтарная, уксусная кислоты, углекислый газ.
На 78 штаммов молочнокислых, бактерий, выделенных из вин, Радлер и Яннис (1972) встретили четыре штамма L. plantarum и один штамм L. brevis, разлагающий тартраты. Фермент этого превращения может быть индуктирован. Продукты анаэробного разложения одной моли (грамм-молекулы) составляют: с L. plantarum 1,5 моль СОз, 0,5 моль уксусной кислоты, 0,5 моль молочной (Кислоты; с L. brevis 1,33 моль СОз, 0,67 моль уксусной кислоты и 0,3 моль янтарной кислоты.
При исследовании более 700 штаммов (Пейно, 1967) только 6 были признаны способными потреблять всю винную кислоту, содержащуюся в питательной среде, и около 20 штаммов могли сбраживать ее частично.
Один гомоферментативный штамм Streptobacterium был выделен из прессового сусла черного винограда урожая 1963 г. в районе Шампани; эта бактерия не сбраживает пентозы и сбраживает лимонную кислоту. Винная кислота в синтетической питательной среде исчезает полностью. Из этого же вина были выделены две ге- тероферментативные бациллы, не сбраживающие винную кислоту.
Другой штамм, принадлежащий к виду Leuconostoc oinos А+, происходит из здорового вина (Моргон 1963); три, по-видимому, идентичных штамма были выделены в то же время и из этого же вина, но не одинаковые по своим свойствам.
Четыре штамма L. brevis были выделены из одного больного испанского вина; три из них используют винную кислоту, четвертый же не воздействует на нее. Наконец, еще один штамм L. brevis происходит из сидра.
Таблица 13.4
Использование винной кислоты некоторыми молочнокислыми бактериями
Штаммы бактерий
Содержание винной кислоты (в мг-экв/л) по истечении одного месяца культуры (среда при pH 4,4)
з 5
М М
S СУ у* £ н g S
S О
К и 5
Контроль
21,0
32,0
Streptobacterium Ch 22
0
0
Lactobacillus plantarum U 555
18,6
21,0
U 564
15,3
18,0
Lactobacillus hilgardii
PC 1
14,0
15,6
HB 3
14,9
22,5
Lactobacillus brevis Ci
0
0
Fs 1, 2, 3
0
0
VRF1
14',0
20,5
L 6
9,3
20,5
Leuconostoc oinos A+
MO1
0
0
BR2
12,0
25,1
BOI
16,0
27,0
HBY
13,3
25,2
Эти примеры показывают разнообразие форм и свойств бактерий, способных разлагать винную кислоту; они также показывают, что бактерии, выделенные из одной и той же среды, могут иметь сходство во всех отношениях и в то же время быть различными в том, что касается этого единственного свойства. Однако нельзя создавать вид на основании одного этого признака. Bacterium tartarophtorum Мюллера-Тургау и Остервальдера не является видом бактерий. Другое важное замечание: можно выделить бактерии, воздействующие на винную кислоту, из здоровых вин и даже из сидра, среды, лишенной винной кис
лоты. Иногда же, наоборот, микроорганизмы, выделенные из вин, больных турном, не были бактериями, способными сбраживать эту кислоту.
Как. было показано выше, около 20 различных штаммов были признаны способными частично разлагать винную кислоту в различных средах. В табл. 13.4 дано несколько примеров такого рода.
Наиболее часто воздействию подвергается 7з, иногда половина содержащейся кислоты. В перечне представлено большое число разных видов. Таким образом, сбраживание винной кислоты представляется не как свойство одного вида, но как адаптация, которая может быть присущей очень различным бактериям, как вновь приобретенная функция или как потенциальность, проявляющаяся в благоприятной среде.
Естественное распределение бактерий, сбраживающих винную кислоту, еще недостаточно изучено. Еще не ясно, то ли заболевание вина связано исключительно с его составом или же с присутствием бактерий, разлагающих винную кислоту. Из проведенных опытов вытекает, что .в некоторых редких типах сусел или вин содержатся только бактерии, способные разлагать винную кислоту (или еще и глицерин) и, следовательно, способные вызывать глубокие изменения в жидкости.
Другими словами, многие вина не заболевают, несмотря на малый процент кислотности и сернистого ангидрида, потому что в них совершенно нет бактерий этого типа.
Вопрос заключается в том, чтобы знать, в каких условиях такие бактерии могут во время операций по обработке вин проникать в жидкости и развиваться в них. Вина, доведенные до pH 4,0, и питательные среды, содержащие винную кислоту, были рас-
пределены по флаконам и стерилизованы. Затем эти жидкости были засеяны различными способами, закрыты с соблюдением требований асептики и выдерживались в течение нескольких недель при 25° С. В этих условиях наблюдали разложение винной кислоты во всех флаконах, загрязненных частицами, взятыми с влажных и сухих полов винных подвалов. Известно, что некоторые бактерии почвы используют винную кислоту (Крампитц и Линен, 1964), но не ясно, относится ли это к молочнокислым бактериям. Против турна также действительны и должны полностью применяться классические правила относительно гигиены оборудования и производства технологических операций.
pH является важным лимитирующим фактором этого изменения: только при высоких значениях pH, превосходящих 3,50, винная кислота используется. Путем засев<а вина всегда можно получить «турн» и при pH 3,89, но при pH 3,65 — только для двух видов бактерий и никогда при более низких значениях.
В некоторых случаях молочная кислота, в конце концов, сама подвергается использованию.
Бактерии «турна» очень чувствительны к свободной сернистой кислоте, даже в виде следов. Были проведены опыты на винах, приведенных к pH 4,0, засеянных бактериями, которые разлагают винную кислоту, и помещенных в пробирки под пирогаллолом при 25° С: находившийся в пробирках свободный сернистый ангидрид постепенно исчезал. Даже в этих условиях добавление от 10 до 20 мг/л SO2 угнетает развитие бактерий, а добавление от 25 до 40 мг достаточно для отмирания всех клеток; развитие популяции полностью прекращается, и подсчет позволяет констатировать отсутствие живых клеток.
МОЛОЧНОКИСЛОЕ СБРАЖИВАНИЕ ГЛИЦЕРИНА, ИЛИ ПРОГОРКАНИЕ ВИНА
Болезнь вин, известная под названием прогоркание, в прошлом полностью уничтожала вина некоторых лет. По описанию Пастера она кажется очень похожей на турн.
Во всех винах, ставших прогорклыми в бутылках, которые Пастер исследовал, он наблюдал какие-то нити одни или вместе с осадком окрашенного вещества, «сильно разветвленные волокна, с множеством узелков большего или меньшего диаметра, более или менее расчлененные, бесцветные или слегка окрашенные в красный цвет, ярко светлые или с густо-коричневым оттенком».
Дюкло (1874) отметил различие между «турном» и «прогорклостью»: при первом кислотность уменьшается, при втором она повышается в результате одновременного образования как нелетучей, так и летучей кислотности, откуда и возникло предположение, что разложение затрагивает и такое нейтральное вещество, как глицерин. Но точной зависимости установлено не было. Танины всегда рассматривались как играющие важную роль в развитии горького вкуса.
Мюллер-Тургау и Остервальдер (1919) констатировали, что многие бактерии воздействуют одновременно на винную кислоту и глицерин. Также наблюдали в красных винах значительное разложение глицерина без заметного разложения в то же время винной кислоты. В семи швейцарских винах спиртуозностью от 6,9 до 10,6% об., не содержащих несброженного сахара, наблюдали: а) повышение летучей кислотности на 0,5—1,2 г/л; б) увеличение содержания молочной кислоты на 0,36—3,5 г/л; в) отсутствие снижения процентного содержания винной кислоты; г) уменьшение содержания
глицерина на 1—4,3 г/л, сопровождаемое снижением сухого экстракта в такой же или явно превосходящей про- порции; д) увеличение общей кислотности на 0,4—2 г/л. . '
Разложение глицерина дает уксусную кислоту и большее или меньшее количество молочной кислоты,.которая к тому же может сама частично разлагаться бактериями, образуя уксусную кислоту. Сумма летучих кислот и образовавшейся молочной кислоты обычно почти равна исчезнувшему глицерину; вероятно, что какая-то часть глицерина превращается в углекислый газ.
Эту болезнь тщательно исследовали многие авторы главным образом в начале века, но, поскольку ее превращения были недостаточно определены, а бактерии, вызывающие их, мало известны, ее истолкование привело к большей путанице. В наше время благодаря улучшению гигиенических условий и рациональному применению сернистого ангидрида как при производстве, так и при хранении вина эта болезнь редко достигает такой степени, когда продукт становится горьким и непригодным для потребления. Все же остается возможность незначительного разложения глицерина, происходящего при хранении в деревянной таре, которое делает вино более пустым. Но имеется много других, более часто встречающихся причин легкого повышения летучей и связанной кислотности в бочечных винах, в частности использование бактериями небольших* количеств сахара, а также адсорбция серной кислоты из дерева .после окуривания.
Ренчлер и Таннер (1951) исследовали причины развития горького привкуса во время заболевания вина прогорклостью в резко выраженной форме и показали, что существует зависимость между присутствием акролеина 306
и привкусом горечи. Действительно, если акролеин сам по себе не имеет горького вкуса, возможно, что при добавлении его в здоровые вина они становятся прогорклыми. Образование акролеина при болезни прогорклости было исследовано в ряде работ Вуазене (1910, 1913).
Авторы разделяют этот механизм на два этапа: в первом происходит превращение глицерина в акролеин под воздействием бактерий; во втором акролеин вступает в соединение с полифенолами и, таким образом, дает вещества, характерные для прогорклых вин. Отсюда понятно, почему красные вина, богатые полифенолами, прогоркают легче, чем белые. Для обозначения этой болезни авторы пользуются термином «акролеиновое скисание». Акролеин находят в коньячных спиртах, когда дистиллируют больные вина; его можно идентифицировать по его резкому запаху и по образованию динитро-2,4-фенилгидразо- на (точка плавления 57° С). Действие бактерий на виноградную выжимку при хранении в силосных емкостях иногда дает акролеин, который вызывает изменения в спиртах, получаемых при дистилляции. Такое образование акролеина отмечалось также в дрожжевом осадке или в винах с очень низким содержанием спирта, предназначенных для перегонки.
Лишь немногие молочнокислые бактерии обладают способностью разлагать глицерин. Из 700 штаммов, исследованных авторами, только 26 (т. е. 3,6%) уменьшают содержание глицерина в подслащенной среде на 5— 25 ммоль/л. Другие бактерии, культивируемые в точно таких же условиях, наоборот, образуют глицерин в количествах от 50 до 70 ммоль/л. Тесты культуры, проведенные с глицерином -в качестве единственного источника углерода, подтверждают, что бакте-
Число штаммов6112322Число штаммов6112322
Число штаммов
6
1
12
3
2
2
Число штаммов
6
1
12
3
2
2
рии, выделенные из вин и способные сбраживать глицерин, встречаются довольно редко. Эти штаммы распределяются следующим образом:
Pediococcus cerevisiae Leuconostoc gracile Leuconostoc oinos A+ Lactobacillus casei Lactobacilllus fructivorans Lactobacillus hilgardii
Частичное разложение глицерина, вызываемое этими бактериями, не ведет к образованию акролеина.
Как и для разложения винной кислоты, не существует четко определенного вида молочнокислых бактерий, использующих глицерин. Это является свойством отдельных штаммов, и такие бактерии, по^видимому, можно встретить среди всех видов.
ЛИТЕРАТУРА
Balard (1861), С. R. Acad. Sci„ 53, 1226.
Berthelot М. et de Fleurieu A. (1864), C. R. Acad. Sci., 58, 720.
Buchi W. et Deuel H. (1954), Mitt. Ge- biete Lebens. Unters. Hyg., 45, 222.
Dittrich H. H. et Kerner E. (1964), Wein-Wissens., 19, 528.
Duclaux E. (1874), Ann. Chim. et Phys., 2, 233 et 3, 108.
Dupuy P. (1957), Ann. Technol. agric., 6, 93.
Ferre L. (1922), Ann. Sci., agron., 277.
Ferre L. (1926), Ann. Falsif. Fraudes, 21, 75. (1928), Ibid. 23, 530-
Fornachon J. С. M. (1936), Aust. J. Exp.
Biol. Med. Sci., p. 215.
Fornachon J. С. M. (1943), Bacterial spoilage of fortified wines, Australian Wine Board, Adelaide.
Fornachon J. С. M., Douglas H. C. et Vaughn R. H. (1949), Hilgardia, 19, 129.
Fornachon J. С. M. et Lloyd B. (1965), J. Sci. Food. Agric., 16, 710.
Ga yon U. et Dubourg G. (1894), Ann. Inst. Pasteur, 8, 108; (1901), Ibid., 15, 400; (1904), Ibid., 18, 385.
G i n i B. e t Vaughn (1962), Amer. J. Enoi. Vitic., 13, 20.
Humbert-Droz J. R. (1958), Station d’essais viticoles d’Auvernier, Suisse.
Koch A. (1900), XIXе Deutscher Weinbau Kongress.
Krampitz L. O. et Lynen F. (1964), Bio- chem. Zeit, 341, 97.
Krumpermann P. H. et Vaughn R. H. (1966), Amer. J. Enol. Vitic., 17, 185.
Ku 1 is ch В (1899), Weinbau u. Weinhandel.
Lafon-Lafourcade S. et Pe у naud E. (1970), Ind. alim. agric., 87, 133.
L u t h i H. (1953), Mitt. Gebiete Lebens. Unters. Hyg., 44, 30.
Liithi H. (1957), Amer. J. Enol., 8, 176.
Malan С. E. (1962), Sul deposito cotonaceo prodotto dallo sviluppo di Lactobacillus tri- chodes in vermut piemontesi, Tip. V. Bona, Turin.
Melamed N. (1962), Ann. Technol. agric., 11, 5 et 107.
Me ns io C. et Garino-Canina E. (1914), Staz. sper. agr. ital., 47, 385.
Mestrezat W. (1970), C. R. Acad. Sci., 145, 260.
Moreau L. (1906), Rev. Vitic., 26, 128 et 210.
Moreau L. e t V i n e t E. (1913), Ann. Falsif. Fraudes, 6, 329.
Mos linger W. (1901), Zeits. Unters. Nah- riungsmittel, 673 et 1121.
Muller-Thurgau H. et О sterwa 1- d e r A. (1913), Die Bakterien im Wein und Obstwein und die dadurch verursachten Ve- randerungen, Fischer.
Muller -Thurgau H. et О sterwa 1- d e r A. (1919), Uber die durch Bakterien verursachte Zersetzung von Weinsaure und Glyzerin im Wein. Landwirts. Jahrbuch der Schweiz, 49 p.
Ordonneau C. (1891), Bull. Soc. Chim., 6, 261.
Pasteur L. (1866), Etudes sur le vin, 1 e edition, Masson, Paris.
Peynaud E. (1938), Ann. Falsif. Fraudes, 31, 332.
Peynaud E. (1946), Contribution a 1’etude biochimique de la maturation des raisins et de la composition des vins, These Ing. Doct, Bordeaux.
Peynaud E. (1967), Etudes recentes sur les bacteries lactiques du vin, IIе Symposium intern, d’ Oenologie, Bordeaux. C. R. vol. 1, p. 219.
Pilone G. J., Kunkee R. E. et Webb A. D. (1966), Appl. Microbiol., 14, 608.
Radler F. et Gerwarth B. (1971), Archiv. Mikrob., 76, 299.
Radler F. e t Y a n n i s i s S. (1972), Archiv. Mikrob., 82, 219.
Rankine В. C., Fornachon J. С. M. e t Bridson D. A. (1969), Vitis, 8, 129.
Rankine В. C. et Bridson A. (1971),
Wine, Brewing Spir. Rev., Australie, 90, 44. Rentschler H. et Tanner H. (1951),
Mitt. Gebiete Lebens Unters. Hyg., 42, 463. Ribereau-Gayon J. (1937), Ann. Falsif.
Fraudes, 30, 339.
Ribereau-Gayon J. (1938), C. R. Acad.
Agric., 34, 600.
Ribereau-Gayon J. (1938), Ann. Ferment., 4, 559.
Ribereau-Gayon J. (1941), Ann. Ferment., 6, 228. (1942), Ibid., 7, 21.
Ribereau-Gayon J. (1946), Bull. О. I. V., 182, 26.
SchopferJ. F. (1973), Bacteries lactiques et alterations Colloque international d" Oenolo- gie, I. T. V., Arc et Senans.
Seifert W. (1901), Zeits. Landw. Versuchs. Oesterreich, 980. (1903), Ibid., 567.
Sudraud P. (1967), C. R. Acad. Agric., 53, 339.
Vaughn R. H. (1955), Adv. Food. Research, 6, 67.
Vaughn R. H., Douglas H. C. et For- n a ch on J. С. M. (1949), Hilgardia, 19, 133.
Voisenet E. (1910), C. R. Acad. Set, 150, 40 et 1614; 151, 518 et 522. (1911), Ibid., 153, 363 et 398; (1913), Ibid., 156, 1181 et 1410.
Глава 14. УКСУСНОКИСЛЫЕ
БАКТЕРИИ
Возбудители образования уксуса и уксусного скисания или закисания, которых в просторечии называют уксусным ферментом, уксуснокислыми бактериями или ацетобактером— термины, которые заменили прежнее название Mycoderma aceti, данное Пастером, являются бактериями, принадлежащими к роду Acetobacter, семейства Pseudomonadaceae.
Под микроскопом уксуснокислые бактерии, развившиеся на вине, представляются в виде маленьких цилиндрических, очень коротких клеток, расположенных в виде цепочек, но чаще всего группирующихся по две в виде цифры восемь; их диаметр составляет 0,5 до 1 мкм (рис. 14.1). Они грам- отрицательны; на поверхности вина образуют беловатую пленку, которая выглядит по-разному в зависимости от вида бактерий; уксуснокислые бактерии развиваются быстро, и пленка через очень короткое время покрывает всю свободную поверхность.
Эти микроорганизмы очень широко распространены в природе. Их находят уже на зрелом винограде, еще чаще на загнивших гроздьях, хотя и в меньшем количестве, чем дрожжи. По наблюдениям авторов из 81 пробы по 1 кг винограда каждая, который собирали с соблюдением условий антисептики, около половины показали присутствие уксуснокислых бактерий; 3 раза было отмечено развитие Acetobacter xylinum, которые опознавали по образованию зооглеи (Пейно и До- мерк, 1961). При отборе проб из за- браживающего сусла 30% дают присутствие уксуснокислых бактерий;
О 6 , О
« У«X
ХШ ° °АЖ°\
О О 0Хо о 0
о
О О ооо^о- ооо °£°tfnt\
»О' ° 2
О О
^оо&оо 6 о
аоУ^о » 0
%0 О
О О оо0 о
^О°о%йоо00о°
Рис. 14.1. Клетки Acetobacter, изображенные по данным Глаубица (увеличение 1000).
сульфитация при 15 г/гл недостаточна для удаления их из сусла.
Блэквуд и сотрудники (1969) выделили из зрелого, в большей или меньшей степени загнившего винограда 51 штамм аэробных бактерий; они принадлежали к родам Pseudomonas и Acetobacter.
Энологи еще недостаточно изучили уксуснокислые бактерии, несмотря на то что они очень часто встречаются в винах. Заслуга . в заполнении этого пробела принадлежит Дюпюи, который в серии работ дал методику выделения в культуру (1952), идентификации штаммов, выделенных из вин (1957), описал факторы развития этих бактерий в винах (1957), их ингибирования сернистым ангидридом.
Можене (1962) наблюдал большую частоту присутствия уксуснокислых бактерий в сидрах; 45% исследованных сидров содержали уксуснокислые бактерии, принадлежавшие к пяти видам, наиболее часто встречающимся также и в винах. A. rancens представляет 70% изученных штаммов. Заболевание сидров выражается в образовании уксусной кислоты и ацетальдегида. Дюпюи и Можене (1963) дали разработку вопроса о факторах и условиях развития уксуснокислых бактерий, об их метаболизме и профилактических мерах для обеспечения сохраняемости вин.
ВЫДЕЛЕНИЕ В КУЛЬТУРУ УКСУСНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
Acetobacter в почти чистом виде можно встретить в сильно испорченных винах; они создают пленку, из которой можно легко взять пробу для нового обсеменения; в этом случае есть шансы получить чистую культуру. Стерильную стеклянную палочку погружают через пленку, затем в жидкость, подлежащую засеву; палочка
покрывается тонкой пленкой, которая потом остается на поверхности жидкости. Но чаще всего Acetobacter находится в вине вместе с винными дрожжами и микодермой. Для их разделения используют селективную среду, обогащенную уксусной кислотой (от 1 до 2% об.), которая за 2—3 пересева удаляет микодерму.
Для выделения Acetobacter из вина (Дюпюи, 1957) применяют следующий способ. Вино оставляют в контакте с воздухом в не полностью закрытых флаконах на 3—4 дня при температуре 28° С. С помощью платиновой петли отбирают очень небольшое количество вина в качестве образца и распространяют эту жидкость на поверхность пивного сусла с 2% агар- агара, слитого в чашку Петри и охлажденного. Через 4 дня выдержки в термостате при 28° С можно хорошо наблюдать выделяющиеся колонии бактерий Acetobacter, в некоторых случаях вместе с микодермой.
КЛАССИФИКАЦИЯ уксуснокислых БАКТЕРИЙ
Фратер (1950) опубликовал исследование по систематике уксуснокислых бактерий и дал классификацию, которая и поныне служит основным справочником, несмотря на различные точки зрения более поздних работ. Новая классификация Асаи и Шода (1958) учитывает открытие полярных или периферийных жгутиков, наблюдаемых под электронным микроскопом. Концепции Шимвелла (1959) вновь ставят вопрос о принадлежности этих бактерий к семейству Pseu- domonadaceae и вообще о возможности классификации в силу спонтанных изменений, которые происходят в период их культуры. Де Лей (1964) дал классификацию Pseudomonas и ближайших родов.
По классификации Фратера род Acetobacter соответствует бактериям, способным окислять этиловый спирт в уксусную кислоту; Pseudomonas не производят таких превращений. Бактерии Acetobacter классифицируют в зависимости от их окислительного метаболизма и кетогенной способности на четыре вида: peroxydans, oxydans, mesoxydans, suboxydans. Такое деление основано на трех фундаментальных свойствах:
для oxydans, mesoxydans и suboxydans— присутствие каталазы;
для peroxydans, oxydans и mesoxydans — окисление уксусной и молочной кислот;
для mesoxydans и suboxydans — кетогенная способность (образование диоксиацетона из глицерина).
Род Pseudomonas недавно был расширен в результате включения в него бактерий, не окисляющих уксусной и молочной кислот (Станье и сотрудники, 1966). Если принять эту точку зрения, бактерии, классифицируемые Фратером, как Acetobacter suboxydans, принадлежали бы к роду Pseudomonas.
УКСУСНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ ВИНОГРАДА И ВИН
Дюпюи выделил из вин Юга Франции следующие штаммы: Acetobacter paradoxum Фратера является видом, встречающимся в винах с частотой 32% (32 на 100 штаммов). Эта бактерия группы peroxydans каталазоотрицательная; она окисляет уксусную и молочную кислоты и не обладает кетогенной способностью.
Acetobacter ascendens Хеннеберг Бержи представляет 19% штаммов, выделенных Дюпюи. Эта бактерия группы oxydans каталазоположительная; она окисляет молочную кислоту, не всегда уксусную и не окисляет
глюкозу; она не способна образовывать кетоны.
Acetobacter rancens Бейеринка составляет 24% всех штаммов. Эта бактерия принадлежит к группе oxydans, она каталазоположительная, окисляет молочную кислоту, глюкозу, но не образует кетоны..
Acetobacter mesoxydans Фратера представляет 19% всех проб Дюпюи. Опа каталазоположительная, окисляет уксусную и молочную кислоты, глюкозу и проявляет некоторую способность кетонообразования при воздействии на глицерин, маннит, глюконовую кислоту.
Acetobacter suboxydans Клюйвера и Лееюва очень редко встречается в винах; она не окисляет уксусной и молочной кислот.
Для энолога может представлять интерес дополнительная информация относительно внешнего вида пленки, образуемой этими бактериями на вине, и скорости ее развития. Действительно, по виду различают три типа бактериальной пленки. Одна — белая, очень тонкая, почти прозрачная вначале, образуется быстро и поднимается очень высоко по стенкам бутылки, испуская радужные отблески. Другая—серого цвета, более толстая, маслянистая, трудно омачивается, по мере старения приобретает окраску и не поднимается вдоль стенок сосуда. Образование уксусной кислоты здесь происходит медленнее. Наконец, другая бактерия Acetobacter xylinum (Браун) Бейеринка дает толстые слои, могущие достигать нескольких сантиметров, твердые, прочные на разрыв, липкие на ощупь. В конце концов, такие пленки погружаются и обычно в больших количествах находятся на дне уксусных емкостей. Образовавшаяся когерентная кожица состоит из целлюлозы; говорят, что Acetobacter xylinum «одет в целлюло-
зу». Эта бактерия редко встречается в вине, но ее часто находят в винных подвалах и на винзаводах; иногда она образует скопление слизи в местах просачивания бочек или в соединени
ях кранов и трубопроводов винных емкостей.
Бактерии, выделенные Блэквудом (1969) из здорового винограда или из гроздей, пораженных Botrytis cinerea, распределяются следующим образом:
Род Acetobacter: (43 штамма) Род Pseudomonas (9 штаммов)Род Acetobacter: (43 штамма) Род Pseudomonas (9 штаммов)
Род Acetobacter: (43 штамма) Род Pseudomonas (9 штаммов)
Род Acetobacter: (43 штамма) Род Pseudomonas (9 штаммов)
peroxydansoxydansmesoxydans suboxydans
О16621
6 штаммов, окисляющих глюкозу
3 штамма, образующие дикето-2,5-глюконовую кислоту
Эти бактерий известны как паразитные формы у многих растений, поэтому нет ничего удивительного, что они встречаются на винограде.
Точный подсчет числа клеток в пробах не производили, но нетрудно понять, что уксуснокислых бактерий на винограде, пораженном гнилью, значительно больше, чем на здоровом винограде, и что в силу своего аэробного характера они в период виноделия обычно локализуются в мезге бродильных чанов и редко в сусле. Среди исследованных штаммов 38 происходят из винограда, 10 выделены из мезги и 3 из бродящего сусла.
В противоположность бактериям, выделенным из вин, большая часть бактерий, выделенных из винограда, является кетогенными. Блэквуд (1969) идентифицировал посредством хроматографии на бумаге основные кетоновые вещества, образуемые этими бактериями: две кислоты — кето-2-глюко- новая и дикето-2,5-глюконовая — встречались очень часто (см. рис. 15.32). У некоторых штаммов можно наблюдать кристаллы кето-2-глюкона- та кальция непосредственно в питательной среде. Из 51 штамма 43 образуют кето-2-глюконат, 31 штамм—■ дикето-2,5-глюконат; 18 штаммов образуют также одно или несколько кетоновых веществ и только 3 штамма не образуют их (табл. 14.1).
Блэквуд (1969) также идентифицировал а-кетобутановую кислоту, при-
Образование кетосоедииений бактериями
Виды бактерий
Acetobacter oxydans
Acetobacter mesoxydans
Acetobacter suboxydans Pseudomonas
Т а б л и ц а 14.1
уксуснокислыми
Штаммы, образующие
1456
555
18184
633
16
6
21
8
сутствующую главным образом в культурах Acetobacter suboxydans. Глицериновый альдегид и диоксиацетон были найдены в большинстве культур. Acetobacter suboxydans и Acetobacter mesoxydans образуют а-кетоглутаро- вую кислоту (до 150 мг/л).
Таким образом, доказано, что воздействие аэробных бактерий на загнивший виноград ведет еще до начала сбора к образованию веществ с кетоновой функцией. Это наблюдение представляет большой интерес для энологии. Оно позволяет объяснить ненормальное связывание в виде комбинированных неактивных форм повышенных количеств сернистого ангидрида в винах, полученных из винограда, подвергшегося интенсивному пора-
жению плесенью. Поэтому Acetobacter и Pseudomonas следует рассматривать как действительно патогенные бактерии винограда, сопровождающие порчу вин, связанную с Botrytis cinerea.
ФАКТОРЫ РАЗВИТИЯ УКСУСНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
Присутствие Acetobacter в винах не является достаточным условием, чтобы считать его больным; фактически отмечают, что вина, имеющие доступ воздуха, обладают большей или меньшей способностью заболевать скисанием. Отсюда вытекает необходимость предусматривать в практике хранения вина проведение испытаний на стабильность, помещая его в условия с доступом воздуха, благоприятные для размножения уксуснокислых бактерий.
Дюпюи (1957) исследовал различные факторы такого развития и в том числе значение исходной популяции, температуры, pH, содержания спирта, микроэлементов, фенольных соединений, содержания восстанавливающих сахаров и глицерина и т. д.
Скорость образования пленки, по крайней мере, вначале зависит от числа уксуснокислых бактерий, содержащихся в вине. Размножение Acetobacter происходит исключительно за счет клеток, остающихся на поверхности, и в частности тех, которые удерживаются силой капиллярного сцепления в контакте со стенками и с жидкостью. С другой стороны, как только образуется пленка, конечный результат не зависит от этой исходной популяции. В практике хранения важно возможно больше ограничить число уксуснокислых бактерий, содержащихся в вине, применяя соответствующие способы осветления; но в вине всегда содержится достаточно много бактерий, чтобы объяснить его заболевание,
когда оно вступает в контакт с воздухом.
Температура является одним из хорошо известных определяющих факторов; при повышенной температуре скисание возникает намного быстрее. Например, образование летучей кислоты происходит в 2 раза быстрее в начале заболевания при 28° С, чем при 23° С. pH представляет важнейший фактор развития; наблюдения показали, что скисание было очень редким явлением в винах с повышенной кислотностью. Оно мало встречается в винах северных районов, несмотря на их низкую спиртуозность, и наоборот, оно чаще бывает в южных винах. Дюпюи считает pH, близкий к 3,0, пределом развития уксуснокислых бактерий; при pH 3,1 развитие клеток протекает очень замедленно, начиная с 3,2 оно практически происходит также быстро, как и при 3,8.
Наблюдением установлено, что высокоспиртуозные вина редко подвергаются скисанию, но трудно установить уровень содержания спирта, выше которого вино становится устойчивым к воздействию Acetobacter. Действительно, токсичность спирта тесно связана с pH вина. Для данного вина при данном pH существует степень спир- туозности, выше которой уксуснокислые бактерии не .размножаются. Но даже и эти значения не полностью подтверждаются, когда обращаются к разным винам, следовательно, существуют какие-то другие, пока неизвестные факторы, которые также оказывают свое влияние (по всей вероятности, это процентное содержание азотистых веществ). Таким образом, невозможно на основании только одних данных спиртуозности и pH точно определить практическую устойчивость, которую может иметь данное вино по отношению к уксусному скисанию, однако более крепкие и более кислот-
ные вина обладают, как правило, лучшей устойчивостью.
Исследуя влияние металлов, присутствующих в винах, Дюпюи констатировал, что изменения в концентрации различных катионов в естественных пределах мало влияют на стойкость вина против закисания. Слабое отрицательное воздействие фенольных соединений на бактерии ощутимо лишь при крайне высоких дозах; присутствие глюкозы мало способствует развитию уксуснокислых бактерий.
Потребности в факторах роста уксуснокислых бактерий известны (Прескотт и Данн, 1959), большинство видов нуждаются прежде всего в пантотеновой кислоте, никотинамиде, парааминобензойной кислоте, реже в тиамине. С другой стороны, размножение бактерий требует присутствия следующих аминокислот: валина, изолейцина, аланина, цистеина, гистидина, пролина. Усвоение аммиачного азота позволяет дифференцировать некоторые виды.
Для того чтобы уксуснокислые бактерии могли размножаться и осуществлять уксуснокислое брожение, нужно много воздуха. Так, для образования 1 г уксусной кислоты и для увеличения летучей кислотности 1 л вина на 0,8 г бактерии фиксируют кислород, содержащийся, как минимум, в 2 л воздуха, следовательно, для того чтобы в вине возникло скисание, необходим широкий или продолжительный контакт с воздухом; небольшая площадь контакта, но с непрерывным обновлением воздуха также обеспечивает интенсивное скисание. Некоторые практики считают, что летучая кислотность может возрастать вследствие аэрации при переливке, из чего, по их мнению, вытекает необходимость исключать возможность контакта с воздухом при проведении таких операций со старыми винами.
Но это довольно распространенная идея является ошибкой. Количество кислорода, растворяющегося в вине во время переливки (около 3 ом3/л), обеспечило бы образование всего лишь 0,006 г летучей кислотности, допуская при этом, что уксуснокислые бактерии могут развиваться в массе вина.
Повышение летучей кислотности в винах, хранящихся в хорошо долитых или установленных «шпунтом на бок» бочках и подвергающихся нормальным переливкам, редко бывает обязано действию уксуснокислых бактерий. Потребность в больших объемах кислорода обусловливает их развитие только на поверхности, имеющей контакт с воздухом; кроме того, нужно, чтобы этот контакт осуществлялся в состоянии покоя. Уксуснокислые бактерии развиваются и портят вино прежде всего в неполностью долитых или недостаточно плотно закрытых бочках, при пористой клепке или в неполных емкостях для хранения виноматериалов, а также на поверхности мезги в конце брожения. Уксусное скисание является болезнью вин, хранящихся при наличии надвинного пространства или в недостаточно герметичных бочках.
Образование уксусной кислоты уксуснокислыми бактериями всегда сопровождается этерификацией, т. е. образованием сложного эфира. Это обусловливает важную роль этилацетата— вещества, ответственного за основные характеристики уксусного скисания в образовании вкусовых качеств вина.
ИСПЫТАНИЕ ВИН НА УСТОЙЧИВОСТЬ К СКИСАНИЮ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЕ ОБРАБОТКИ
Предотвращение скисания кажется простым; достаточно никогда не оставлять вино на длительный срок в
контакте с воздухом, хотя практически это не всегда удается. Частая и регулярная доливка винных емкостей и защита поверхности вина обеспечивают его сохраняемость и предотвращают скисание.
Устойчивость вина к скисанию нельзя точно определить на основании только данных анализа. Разумеется, что количественные анализы общей и летучей кислотности, измерение pH, определение содержания спирта дают полезные сведения, но их следует дополнять испытанием на стойкость при доступе воздуха и несколько повышенной температуре. Такое испытание заключается, например, в том, что подлежащее исследованию вино наливают в стерилизованный флакон вместимостью 125 см примерно до половины, закрывают ватным тампоном и ставят в термостат с температурой 27—28° С. Во избежание загрязнения отбор пробы вина производят в строго антисептических условиях. Особенно неустойчивые вина проявляют признаки заболевания уже через 48 ч после постановки их в термостат; некоторые выдерживают только 3—4 дня; наконец, другие не подвергаются заболеванию в течение этого времени и даже по истечении 8 дней. Когда по истечении такого срока не обнаруживается видимых признаков уксусного скисания, рекомендуется проводить количественный анализ летучей кислотности: и лишь в том случае, когда найденная величина заметно приближается к первоначальному значению, можно утверждать, что сохраняемость вина будет обеспечена без специальных обработок.
Испытания на устойчивость в термостате иногда показывают, что некоторые вина, имеющие относительно высокую летучую кислотность, могут в то же время легко выдерживаться в удовлетворительном санитарном сос-
тоянии и считаться стабилизированными, тогда как другие с. нормальным уровнем летучей кислотности подвергаются ■ риску быстрого закисания. В лаборатории можно нередко встретить вина с летучей кислотностью не более 0,35 г/л, которые покрываются пленкой Acetobacter через 2—3 дня при 27—28° С, тогда как другие, имеющие от 0,45 до 0,50 г/л, оказываются совершенно стабильными.
Как сообщал Лаваль (1960), для того чтобы выявить присутствие уксуснокислых бактерий в вине и его пригодность к закладке на хранение, образцы виноматериалов испытывают на устойчивость в термостате; ниже приведена в качестве примера методика такого испытания.
В эрленмейерскую колбу вместимостью 50 см3, закрытую ватной пробкой после предварительной стерилизации, вводят в антисептических условиях 30 см3 вина. Затем колбу ставят в термостат при 27° С на 4 дня. По истечении этого срока измеряют летучую кислотность образца. Считают, что все вина, летучая кислотность которых после этой выдержки превышает 1,50 г/л, не могут храниться и не могут быть приняты.
Автор сделал также наблюдение, интересное с точки зрения практики, что после розлива в бутылки вина, загрязненного бактериями без доступа воздуха (бутылки наполнялись доверху и плотно закупоривались), через 2 нед выдержки число уксусных бактерий начинало уменьшаться в результате отсутствия кислорода, но даже и 2 мес спустя их исчезновение было еще неполным.
Когда вино оказывается неустойчивым, следует проводить профилактическую обработку. Наиболее эффективным способом остается пастеризация при условии, что помещение для выдержки вина также стерильно,- На
практике наиболее простым средством является сульфитация, степень которой должна соответствовать подверженности вина заболеванию, например можно назначить дозы от 2—3 до 5— 6 г/л. Эффект сульфитации может быть дополнен осветлением посредством оклейки или фильтрования.
Уксуснокислые бактерии чувствительны к сернистому ангидриду, но следует иметь в виду, что они развиваются в зоне контакта с кислородом воздуха, где и происходит исчезновение сернистого ангидрида. Дюпюи исследовал это ингибирование и показал, что имеет место фиксация сернистого ангидрида на бактериальные клетки и торможение окисления этанола. Эти реакции являются обратимыми (по крайней мере, для малых доз сернистого ангидрида и ограниченной продолжительности его действия), поскольку посредством промывок можно снять с клеток сернистый ангидрид, который они фиксировали, и таким образом прекратить ингибирование окисления спирта. По мнению Дюпюи, это ингибирование может объясняться блокировкой тиоловых функций, присутствующих на ферментативных белках, фиксацией сернистым ангидридом.
ЛИТЕРАТУРА
Asai Т. et Shoda К. (1958), Journ. Gen.
Appl. Microb. (Japon), 4, 289.
Blackwood A. C, (1969), Conn. Vigne Vin. 3, 227 et 243.
Blackwood A. C„ Guimberteau G. et Peynaud E, (1969), C. R. Acad. Sci., 269, 802.
D ivies C. (1970), Ann. Technol. agric., 19, 187.
Di vies C. (1972), Ann. Technol. agric., 21, 5.
Di vies C. et Dupuy P. (1969), Ann. Technol. agric., 18, 339.
Dupuy P. (1952), Ann. Technol. agric., 1, 107.
Dupuy P. (1957), Ann. Technol. agric., 6, 217 et 391.
Dupuy P. (1959), L’inhibition par Pacide sul- fureux de i’oxydation de I’ethanol par Aceto- bacter rancens, These Doct. Ing., Paris., Ann. Technol. agric., 8, 233 et 337.
Dupuy P. et Maugenet J. (1962), Ann. Technol. agric., 11, 219.
Dupuy P. et Maugenet J. (1963), Conditions du development des bacteries ace- tiques et mesures preventives dans la conservation des vins, Symposium intern, d’ Oeno- logie, Bordeaux, Ann. Technol. agric., 12, - n° hors serie, p. 64.
Frateur J. (1950), Essai sur la'systematique des Acetobacter, La cellule, 53, 287.
Laval J. P. (1960). Soc. Pharm. Montpellier, p. 63.
de Lev J. (1964), Annal. Rev. Microb., 18, ■ 17.
Maugenet J. (1962), Ann. Technol. agric., 11, 45.
Maugenet J. (1962), C. R. Acad, Agric., 48, 214.
Pasteur L. (1868), Etudes sur le vinaigre, Gauthier-Villars, Paris.
Peynaud E. et Domereq S. (1961), C. R. Acad. Set, 252, 3343.
Presscott S. C. et Dunn C. G. (1959), Industrial Microbiology, McGraw; 3 е edition, New York.
Shim well J. L. (1959), Antonie van Leeuwenhoek, 25, 49.
S t a n i e r R. Y„ P a 11 e г о n i N. J. e t D о u- doroff M, (1966), Journ. Gen. Appl. Microbiology, 43, 159.
Часть пятая
БИОХИМИЯ БРОЖЕНИЙ
Глава 15. МЕХАНИЗМЫ БРОЖЕНИИ
В этой главе описаны биохимические реакции, благодаря которым микроорганизмы (дрожжи и бактерии) становятся способными делать превращения составных частей виноградного сока и вина. Эти превращения соответствуют явлениям нормальным (спиртовое или яблочно-молочное брожение) или случайным (болезни бактериального происхождения), которые регулируют химический состав, и следовательно, обусловливают органолептические характеристики вина. Дрожжи, прекратившие всякую ферментативную активность после использования всего сбраживаемого сахара, выделяют некоторые из своих химических компонентов. Эти аспекты деятельности микроорганизмов в энологии менее известны и не будут рассматриваться. Однако, для того чтобы правильно составлять балансы превращений, их следует учитывать.
Микробиологические явления, представляющие интерес для энологии и исследуемые в этой заключительной главе, в основном анаэробные. Однако наряду с анаэробными бактериями молочнокислого брожения в вине могут также находиться уксуснокислые бактерии (Acetobacter), вызывающие аэробное окисление этилового спирта в уксусную кислоту (уксусное скисание) .
Точно так же и дрожжи могут в зависимости от условий аэрации развиваться в аэробиозе по пути дыхания с образованием СО2 и Н2О или в анаэробиозе с образованием этанола и СО2. Из одной молекулы сахара дыхание предоставляет в распоряжение клетки в 20 раз большее количество энергии, чем то, которое выделяется при брожении: этим объясняется значительно больший рост клеток за счет дыхания, поскольку при брожении энергия углеводного питания используется слабо.
Во время брожения виноградного сусла дрожжи вырабатывают спирт путем анаэробного брожения. Тем не менее хорошо известно, что в процессе приготовления вина необходимо в определенной мере воздействие аэрации; впрочем речь идет о явлении обычного порядка, поскольку не бывает, за исключением особых случаев (см. гл. 8 «Активация стеринами и жирными кислотами с длинной цепью»), брожения при абсолютном отсутствии доступа воздуха. Но необходимые и даже обязательные небольшие количества кислорода требуются для размножения дрожжевых клеток. Число молекул сахара, разлагаемых в процессе дыхания, очень мало по сравнению с числом сбраживаемых молекул и в полном балансе превращения дыхание не учитывают.
Независимо от этого общего случая известны два особых случая вмешательства аэробных дрожжей, развивающихся в вине по пути дыхания, которые в этой главе подробно не разбираются. Речь идет, прежде всего, о дрожжах микодерма, ответственных за цвель, а также о некоторых дрожжах рода Saccharomyces, обладающих сильной окислительной активностью и способных образовывать пленку на винах с высоким содержанием спирта. Их называют пленчатыми дрожжами, они производят в винах различные превращения, и в частности образуют альдегиды, лежащие в основе приготовления специальных вин (херес, желтое вино Юры).
Хотя эти оба типа дрожжей имеют близкие биохимические характеристики, их энологическое значение очень различно. Можно допустить, что они реализуют следующие превращения:
Этилозый спирт +О2 ацетальдегид (эта- —>
нола).
Ацетальдегид +О2 уксусная кислота. —>
Уксусная кислота +О2 углекислый газ+ +вода.
В зависимости от ферментного набора штаммов та или другая реакция
протекает в более или менее благоприятных условиях. Важной характеристикой является отсутствие накапливания летучей кислотности, которая даже снижается во время реакции. Дрожжи, образующие цвель, превращают спирт, а также летучие и нелетучие кислоты в углекислый газ и воду. «Пленчатые дрожжи» образуют спирт, особенно из ацетальдегида, благодаря значительной активности одного из ферментов (Ллагуно и сотрудники, 1970).
КОФАКТОРЫ
•Известно, -что ферменты участвуют в катализе биохимических реакций. Для осуществления своей каталитической активности некоторые из них нуждаются в кофакторе, которым могут быть в зависимости от случая ион металла, прочно связанная простети- ческая группа, не отделимая от ферментного белка, или кофермент, не связанный с белком, он ведет себя как субстрат реакции. Ниже будут описаны четыре кофактора, которые играют важную роль в механизмах брожений.
Рис. 15.1. Никотинамидадениндинуклеотид, или НАД.Рис. 15.1. Никотинамидадениндинуклеотид, или НАД.Никотинамидадениндинуклеотид, или НАД. Его структура включает два нуклеотида, связанных пирофосфатной связью (рис. 15.1). В течение длительного времени его называли ди
Рис. 15.1. Никотинамидадениндинуклеотид, или НАД.
Рис. 15.1. Никотинамидадениндинуклеотид, или НАД.
фосфопиридиннуклеотид, или ДПН. Он выступает как кофермент различных дегидрогеназ; фактически может фиксировать два водорода посредством своего никотинамидного ядра (рис. 15.2). Этот окислительно-восстановительный процесс кратко записывается так:
NAD4"+2HTtNADH + Н+, или проще, но менее верно NAD + 2H;i NADH2.
Рис. 15.2. Механизм окисления-восстановления НАД.
NAD" NADH+HNAD" NADH+HДегидрогеназа 1^Дегидрогеназа 1^^ ^2 ^Дегидрогеназа 2^^ ^2 ^Дегидрогеназа 2^Реакция окисления-восстановления, в которой первое вещество АН2 окисляется в форме А, тогда как второе В восстанавливается в ВН2, схематически показана на рис. 15Д.
NAD" NADH+H
NAD" NADH+H
Дегидрогеназа 1^
Дегидрогеназа 1^
^ ^2 ^Дегидрогеназа 2^
^ ^2 ^Дегидрогеназа 2^
Рис. 15.3. Окисление-восстановление, катализируемое НАД.
Рис. 15.4 Тиаминпирофосфат, или 1'Р/ .
Тиаминпирофосфат (ТРР), или ко- карбоксилаза. Сложный пирофосфор- ный эфир тиамина или витамин Bi (рис. 15.4) является переносчиком альдегидных групп, и в частности ацетальдегида.
Тиаминпиросфосфат представляет собой кофактор декарбоксилаз — кетоновых кислот в соответствии с реакцией
R - СО - СООН ™, R- СНО + СО2.
Декарбоксилаза
Аденозиндифосфат, или АДФ, и аденозинтрифосфат, или АТФ. Эти вещества играют главную роль в процессах передачи энергии в биохимических реакциях. В молекуле АТФ (рис. 15.5)
А денозинконофосфатАизнозиндифсзфат, или АДР Аденозинтрифосфат, или АТРА денозинконофосфатАизнозиндифсзфат, или АДР Аденозинтрифосфат, или АТРРис. 15.5. Аденозинтрифосфат, или АТФ.Рис. 15.5. Аденозинтрифосфат, или АТФ.Рис. 15.6. Роль АТФ в энергообмене.Рис. 15.6. Роль АТФ в энергообмене.третья молекула фосфата связана с предыдущей так называемой «энергоемкой» связью, т. е. разрыв этой связи сопровождается высвобождением энергии; в то же время для образования такой связи необходима внешняя энергия. Схематически этот процесс можно представить так, что химические реакции, при которых высвобождается энергия (экзореакции), ведут к образованию из АДФ и минерального фосфата молекул АТФ, которые яв-
А денозинконофосфат
Аизнозиндифсзфат, или АДР Аденозинтрифосфат, или АТР
А денозинконофосфат
Аизнозиндифсзфат, или АДР Аденозинтрифосфат, или АТР
Рис. 15.5. Аденозинтрифосфат, или АТФ.
Рис. 15.5. Аденозинтрифосфат, или АТФ.
Рис. 15.6. Роль АТФ в энергообмене.
Рис. 15.6. Роль АТФ в энергообмене.
ляются формой накопления непосредственно используемой энергии (рис. 15.6). Эти АТФ в дальнейшем снова используются для реализации реакций синтеза и других реакций, нуждающихся в энергии . (эндореакции), необходимой клеткам, чтобы обеспечить их жизненные функции, и в частности их размножение.
Кофермент Л. Этот фактор (рис. 15.7) кратко записывается как СоА— —SH; такая запись указывает на химическую группу тиола (SH), которая является основой всех его свойств. Он дает с кислотами ацил-коферменты А, в сокращенной записи R—СО—S— —СоА, очень реакционно способные и обеспечивающие фиксирование радикала R—СО на другой молекуле. Он также участвует во многих реакциях синтеза, в частности в форме СНз— —СО—S—СоА, или ацетилкофермен- та или активного ацетата, лежит в основе синтеза жирных кислот и липидов.
гликолиз
Гликолиз включает совокупность реакций, которые позволяют живым клеткам превращать сахар С6 (глюкоза и фруктоза) в пировиноградную кислоту. Эти реакции одинаково успешно протекают как в анаэробиозе (спиртовое брожение и молочнокис
лое брожение), так и в аэробиозе (дыхание). Ввиду этого они описаны отдельно, прежде чем приступить к рассмотрению явлений микробиальной биохимии, интересующих энологию, из которых- многие вызывают гликолиз.
Первым этапом является образование сложных эфиров фосфорной кислоты сахаров (глюкозы или фруктозы) (рис. 15.8), обычный процесс в биохимических механизмах, который объясняется энергетическими причинами; действительно, молекулы фосфата могут делать с некоторыми органическими радикалами «связи, насыщенные энергией», и их передача с одной молекулы на другую сопровождается передачей энергии в соответствии с процессом, описанным для АТФ. Руководствуясь установившейся традицией, авторы обозначают во всех формулах молекулы фосфата символом Р.
Пантотеновая кислотаПантотеновая кислотаПантоинобая кислота^-АланинТиоэтиламинПантоинобая кислота^-АланинТиоэтиламинО" ОСН3IIIО" ОСН3IIIон онон онРис. 15.7. Кофермент А.Рис. 15.7. Кофермент А.Сн2-О-Р-О-Р-О-СН2-С-СНОН-СС -NH-CH2-CH2-CO-NH-CH2-СН2-SHСн2-О-Р-О-Р-О-СН2-С-СНОН-СС -NH-CH2-CH2-CO-NH-CH2-СН2-SHо оо осн3сн3Как у глюкозы, так и у фруктозы исходным пунктом разрыва молекулы является фруктоза-1,6-дифосфат, который обладает фурановым циклом с 5 малостабильными цепями. Разрыв ведет к двум изомерным триозам: 96,5% диоксиацетонфосфата и 3,5% глицеринового альдегидфосфата (рис.' 15.9). Но лишь последний участвует в последующих реакциях, и равновесие непрерывно нарушается в его пользу. В конечном счете все происхо-
Пантотеновая кислота
Пантотеновая кислота
Пантоинобая кислота^-АланинТиоэтиламин
Пантоинобая кислота^-АланинТиоэтиламин
О" ОСН3
III
О" ОСН3
III
он он
он он
Рис. 15.7. Кофермент А.
Рис. 15.7. Кофермент А.
Сн2-О-Р-О-Р-О-СН2-С-СНОН-СС -NH-CH2-CH2-CO-NH-CH2-СН2-SH
Сн2-О-Р-О-Р-О-СН2-С-СНОН-СС -NH-CH2-CH2-CO-NH-CH2-СН2-SH
о о
о о
сн3
сн3
Фруктоза -6 - фосфат (сложный эфир Найберга) АТРФруктоза -6 - фосфат (сложный эфир Найберга) АТРADPО-СН^О^ сн2-о-®ADPО-СН^О^ сн2-о-®дит так, как если бы одна молекула сахара С6 превращалась в две молекулы глицеринового альдегида (см. рис. 15.8 и 15.9).
Фруктоза -6 - фосфат (сложный эфир Найберга) АТР
Фруктоза -6 - фосфат (сложный эфир Найберга) АТР
ADP
О-СН^О^ сн2-о-®
ADP
О-СН^О^ сн2-о-®
®-
КН НОЛ
_/он
он н
Фруктоза -1,6 - дифосфат'сложный Эфир Гардена и Янга
Рис. 15.8. Образование сложных эфиров фосфорной кислоты и сахаров.
iCH2O-®
2С = О
IзСН2ОН
Дагидроксиацетон - фосфат, 96,50/о
н о
SCHOH
6 сн2о-®
Глицеоинальдегад-З-фосфт v,5 Ус
Рис. 15.9. Разрыв фруктозы-1,6-дифосфата на две молекулы триозофосфата в процессе гликолиза.
Превращение глицеринальдегида-3- фосфата в пировиноградную кислоту (рис. 15.10) включает окисление в глицериновую кислоту после гидрата- 320
ции, изомеризацию с передачей фосфатной группы, дегидратацию спиртовой функции в энолпировиноградную кислоту.
Окисление глицеринальдегида-З- фосфата, с одной стороны, отделение молекулы фосфата от фосфоэнолпи- ровиноградной кислоты, с другой, представляют собой реакции, которые высвобождают энергию, использованную на образование АТФ. Следовательно, превращение двух молекул глицеринальдегида-3-фосфата, происходящих из одной молекулы сахара С6, ведет к образованию 4АТФ. Но начальное фосфорилирование молекулы сахара С6 требует 2АТФ (см. рис. 15.8). В конечном счете чистым энергетическим балансом гликолиза является образование 2АТФ.
АНАЭРОБНЫЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ ПИРОВИНОГРАДНОЙ кислоты
Известно, что в аэробном дыхании пировиноградная кислота окисляется по реакции цикла Кребса в соответствии с уравнением
5
СН3 - СО - СООН + — О2 ЗСО2 + 2Н2О.
В анаэробиозе пировиноградная кислота, с одной стороны, не может окисляться из-за отсутствия воздуха, а с другой — должна служить акцептором, чтобы удалять водород, который появляется во время гликолиза в форме NADH2 (см. рис. 15.10). В этом случае она восстанавливается непосредственно в молочную кислоту (го- моферментативное брожение) или после декарбоксилирования ■— в этиловый спирт (спиртовое брожение). Но если два атома водорода гликолиза были использованы помимо этого (глицериношировиногр адное брожение), пировиноградная кислота не может больше восстанавливаться; а этом
г?н
г нон
СН2О-®
/ОН сн 1^-ОН снон
сн2о-®
‘ .ицеригальдегид -3 - фосфат
/О
I он- снон -*-
сн2о-®Фоссро -3- глицери-нобая кислота
/О с<
I он
СНО-®
СН2ОН
Фосфо -2- глицериновая кислота
.о С'< I он с=о
сн3 Кетен
/ОС <
I онс-он
II сн3 ■
Пиребиноградная кислота
Фосфззнолпирови- наградная кислота
Рис. 15.10. Превращение глицеринальдегида-3-фосфата в пировиноградную кислоту в процессе гликолиза.
случае она дает большое число вторичных продуктов, механизмы образования которых будут описаны ниже при характеристике различных типов брожения. На рис. 5.11 показаны основные (молочная кислота и этиловый спирт) и вторичные продукты, которые могут образовываться из пировиноградной кислоты в анаэробиозе.
РАЗЛОЖЕНИЕ САХАРОВ ДРОЖЖАМИ
В этом разделе описана совокупность превращений сахаров Се производимых дрожжами, известная под названием спиртового брожения. Однако в строгом смысле слова спиртовое брожение означает исключительно образование спирта из сахаров согласно уравнению Гей-Люссака
С6Н12О6^ 2СН3 - СН2ОН +-2СО2.
Но известно, что во время развития дрожжей, например, в бродильном чане не все молекулы сахара подвергаются такому превращению; некоторое число их разлагается в процессе гли- церино-пировиноградного брожения согласно уравнению Нейберга
С6Н12О6->- сн2он - снон - сн2он +Глицерин
+ СН3-СО — соон.
Пировиноградная кислота
Наряду с глицерином образуется пировиноградная кислота, в некоторых случаях декарбоксилированная в этаналь, но не восстановленная в спирт; она представляет собой основу для образования разнообразных вторичных продуктов.
Спиртовое брожение
Гликолиз является первым химическим актом спиртового брожения. Образующаяся пировиноградная кислота декарбоксилируется в ацетальдегид и восстанавливается в этиловый спирт. Эта реакция реализуется окисленной формой NAD, которая появляется в процессе окисления глицерин- альдегида-З-фосфата, следовательно, обе соответствующие реакции являются спаренными; они представляют окислительно-восстановительный процесс (рис. 5.12). Необходимость вторичного окисления NADH2 понятна. Если бы его не было, гликолиз прекратился бы с того момента, когда весь
СООН
CHOH
СН3
Молочнаякислота
< СН2ОН
CH3Зтилобый спирт
NAD^ 1
nadh2^
CHO
сн: со
HS-CoA СО;
соон
сн3
сн2-сн3
NAD NADH;
соон)
c=o
CH-
Nad
HS—СоА
2NAD
2NADH
FLO
HS-CoA
NADH,
co-ch.
Уксусная кислота
сн2-сооя Ацетилуксусная кислота
сн2- соон
Масляная кислота
CO;
со-сн.
сн2-соон
NADH;
NADH
NAD
CO-CH.
со-соон
Шдбелебоуксусная кислота
со-сн.
Диацетил
Пировиноградная Ц£— сод кислота
NAD 2HS~CoA
\ CH3
1 Ацетилкотермент 4
H-COOH Муравьиная кислота
снон-ся
Ацетоин '
NADH;
NAD
CHOH-CH.
CHOH-CH3
бутанбиол -2,3
сн-соон
снон-соон
Яблочная кислота
сн-соон
Фумаробаякислота (
H2O
NADH, NAD
2H2O
NAD
CH2-COOH
NADH3
сн2-соон ■ Янтарная кислота
Co
CH,
co
сн3Ацетон
CH-
CH,
СООН
Пропионовая кислота
Рис.Рис.
Рис.
Рис.
15.11. Эволюция пировиноградной кислоты в анаэробиозе.
NAD, присутствующий в клетке, был бы восстановлен.
Энергетический баланс спиртового брожения идентичен балансу гликолиза, т. е. на одну молекулу разложенного сахара образуется 2 молекулы АТФ. Химический баланс броже
ния, осуществляемого дрожжами, можно записать следующим образом:
C6Hi2O6+ 2АДР + 2Н3РО4 -^ 2СН3 - СН2 ОН++ 2СО2 + 2АТР + 2Н2О.
От химического превращения молекулы глюкозы в СО2 и этанол выде-
Глюкоза
фруктоза
Гликолиз
Гшиеринальдегид-З-фосфат
СИОН
СН2О-®
/О С^ I он снон
СН2О-@
Фосфо -З-глицеринобая кислота
сн2он
" сн3ЭтиловыйСпирт
А люгольдегидрогеназа
С\ I Н р сн,
Ацетальдегид
ср2
,оС<I он
J
С=О —
Декарбоксилаза > (тиамин)
1Н3
Пировиноградная
кислота
Рис. 15.12. Схема спиртового брожения.
ляется 40 ккал (Конн и Штумпф, 1972); поскольку энергия образования связи АТФ равна 7,3 ккал, из высвобожденных 40 ккал 14,6 используются дрожжевыми клетками для обеспечения их жизненных функций, в частности размножения. Разница, т. е. 25,4 ккал, высвобождается в виде теплоты и вызывает нагревание бродящей среды.
Разложение гексоз в аэробиозе во время дыхания происходит в соответствии с классическим уравнением:
C6Hi2O6 + 6О2 -> 6СО2 + 6Н2О.
Вторичное окисление NADH2 за счет кислорода воздуха, с одной стороны, и окисление пировиноградной кислоты при посредстве цикла Кребса, с другой, обеспечивают восстановление значительно большей энергии, соответствующей 38 молекулам АТФ на одну молекулу сахара. Соответствующая энергия выделяется из свободной энергии химического уравнения дыхания, которая составляет 686 ккал на одну молекулу сахара. Отсюда понятно, когда говорят, что «брожение — это плохое использование энергии углеводного питания», это значит, что «небольшое число дрожжей разлагают большое количество сахара».
Но сбраживание сахаров дрожжами всегда ведет к появлению небольшого количества молочной кислоты, порядка 400 мг/л, соответствующего превращению 0,0005% молекул саха-
Рис. 15.13. Образование двух изомеров молочной кислоты из пировиноградной кислоты.
ра (Пейно и сотрудники, 1967 6). Механизм этого образования близок к гомоферментативному брожению (см. рис. 15.25); пировиноградная кислота не подвергается действию декарбоксилазы, чтобы быть восстановленной непосредственно лактодегидрогеназой в молочную кислоту (см. рис. 15.11). Но существуют два изомера молочной кислоты [молочная кислота D (—) и L (+)], которые образуются из пировиноградной кислоты соответствую-
Глюкоза или фруктозаГлюкоза или фруктоза.о С X I н снон.о С X I н снонсн3о —®ГлиивринальЙегиЗ-З- [\ д [)фосфат^_сн3о —®ГлиивринальЙегиЗ-З- [\ д [)фосфат^_Н2ОН2О.ОI онс нон.ОI онс нон।Гликолизсн2о-®NAD Но ФосфО'З-глицеринобая2 кислота।Гликолизсн2о-®NAD Но ФосфО'З-глицеринобая2 кислота,О с( I он с=о,О с( I он с=оВторичной продукта'.Вторичной продукта'.СН2ОН с^о сн2о~® Диоксиацетон- фосфатСН2ОН с^о сн2о~® Диоксиацетон- фосфатСН2ОН I снон сн2о-® Глицеро-3- фосфа^СН2ОН I снон сн2о-® Глицеро-3- фосфа^сн3Пировиноградная кислотасн3Пировиноградная кислотаСНоОН снон сн,онСНоОН снон сн,онРис. 15.14. Схема глицерино-пировиноградного брожения.Рис. 15.14. Схема глицерино-пировиноградного брожения.
Глюкоза или фруктоза
Глюкоза или фруктоза
.о С X I н снон
.о С X I н снон
сн3о —®
ГлиивринальЙегиЗ-З- [\ д [)фосфат^_
сн3о —®
ГлиивринальЙегиЗ-З- [\ д [)фосфат^_
Н2О
Н2О
.О
I онс нон
.О
I онс нон
।Гликолиз
сн2о-®NAD Но ФосфО'З-глицеринобая2 кислота
।Гликолиз
сн2о-®NAD Но ФосфО'З-глицеринобая2 кислота
,О с( I он с=о
,О с( I он с=о
Вторичной продукта'.
Вторичной продукта'.
СН2ОН с^о сн2о~® Диоксиацетон- фосфат
СН2ОН с^о сн2о~® Диоксиацетон- фосфат
СН2ОН I снон сн2о-® Глицеро-3- фосфа^
СН2ОН I снон сн2о-® Глицеро-3- фосфа^
сн3
Пировиноградная кислота
сн3
Пировиноградная кислота
СНоОН снон сн,он
СНоОН снон сн,он
Рис. 15.14. Схема глицерино-пировиноградного брожения.
Рис. 15.14. Схема глицерино-пировиноградного брожения.
щи-ми дегидрогеназами (рис. 15.13). Дрожжи образуют почти исключительно молочную кислоту D (—); исключением является Saccharomyces veronae, так как они обладают специфическим свойством образовывать только молочную кислоту L (+), во всех случаях намного больше любого вида (Пейно и сотрудники, 1967 а).
Глицерино-пировиноградное брожение
При описании механизмов спиртового брожения авторы показали необходимость вторичного окисления NAD, восстановленного во время гликолиза, причем это окисление происходит за счет ацетальдегида. Но в начале брожения ацетальдегида в среде нет. Для того чтобы гликолиз протекал нормально, необходимо присутствие ацетальдегида, но он образуется только в результате гликолиза.
Таким образом объясняется существование своего рода пускового периода, периода индукции, в течение которого повторное окисление NADH2 происходит за счет молекулы дигидроксиацетонфосфата, которая сама образуется при разрыве молекулы сахара в процессе гликолиза (см. рис. 15.9). Это восстановление ведет к образова
нию глицерина (рис. 15.14). Одновременно фосфо-З-глицериновая кислота, получающаяся от окисления глице- р и н а л ьдегид а -3 -фосфата, р аз л а га ется согласно реакциям гликолиза на пировиноградную кислоту, которая сама в дальнейшем декарбоксилируется в ацетальдегид. Но этот ацетальдегид не может быть восстановлен в спирт потому, что два атома водорода (происходящие из NADH2), которые обеспечивают это восстановление в случае спиртового брожения, уже были использованы для образования глицерина из дигидроксиацетонфосфата. Каждый раз, когда происходит образование одной молекулы глицерина, одна молекула пировиноградной кислоты (или ацетальдегида) накапливается без превращения в молочную кислоту (или в этиловый спирт). Ниже будет показано, что эта пировиноградная кислота, получающаяся в результате глицерино-пировиноградного брожения, составляет основу многих вторичных продуктов.
Сопоставление схем спиртового и гл ицер ино-пи рови ногр адного брожения (см. рис. 15.12 и 15.14) показывает, что существует антагонизм между двумя акцепторами водорода, ацетальдегидом, с одной стороны, и ди-
гидроксиацетонфосфатом, с другой. Поскольку первый легче восстанавливается, именно он и фиксирует два атома водорода, происходящие из NADH2, когда эти два вещества находятся в эквивалентных концентрациях. Но если ацетальдегид отсутствует, а именно такое положение и имеется в начале развития дрожжей в среде, содержащей сахар, дигидроксиацетонфосфат служит акцептором водорода и в то же время обеспечивает накапливание ацетальдегида, необходимого для возбуждения спиртового брожения в собственном смысле слова.
В целом механизмы спиртового и глицерино-пировиноградного брожения тесно связаны между собой. В начале развития дрожжей преобладает глицеринощировиноградное брожение и, как следствие, образование глицерина, но даже в период бурного брожения никогда не бывает чисто спиртового брожения.
Учитывая тот факт, что в вине содержится приблизительно 8 г/л глицерина, или 0,087 молекулы, происходящей из 0,087 молекулы сахара на 100 г этанола, или 2,2 молекулы, происходящие из 1,1 молекулы сахара, можно подсчитать, что при брожении вина около 8% молекул сахара идет на глицерино-пировиноградное брожение и 92%—на собственно спиртовое брожение.
Вторичные продукты, образующиеся из пировиноградной кислоты
Как было указано выше, пировиноградная кислота, получающаяся в результате глицерино-пировиноградного брожения, не может быть восстановлена в молочную кислоту или в этаналь пэсле декарбоксилирования, потому что атомы водорода, необходимые для этого восстановления, уже
использованы для образования глицерина.
В конце брожения в вине находится лишь небольшая часть пировиноградной кислоты, поскольку вино всегда содержит ее в малых количествах (в среднем 80 мг/л, Блуэн и Пейно, 1963). Но она идет прежде всего на образование различных вторичных продуктов в соответствии с механизмами, общими для многих видов брожения (см. рис. 15Л1).
Сначала переход в ацетилкофер- мент А обеспечивает образование уксусной кислоты, которая обеспечивает всякое брожение; первый этап этой реакции может протекать на основе двух механизмов, один из которых включает окислительное декарбоксилирование, другой — образование муравьиной кислоты. Первый, конечно, более важен потому, что производство муравьиной кислоты всегда очень незначительно, несколько граммов на 1 л (Гимберто, 1969), частично этери- фицированной (Бертран и Риберо-Гай- он, 1968). Исходя из роли ацетилко- фермента А, можно также объяснить образование масляной кислоты и ацетоина в вине в виде следов, первая — в виде эфира. ■
Также на основе пировиноградной кислоты конденсация двух молекул, сопровождаемая декарбоксилированием, ведет к ацетоину или ацетилме- тилкарбинолу, который может дать сам или бутандиол-2,3 путем восстановления, или диацетил путем окисления; эти ацетоиновые вещества находятся в вине.
Можно также иметь в виду карбоксилирование пировиноградной кислоты (реакция Вуд-Веркмана), ведущее к образованию щавелево-уксусной кислоты. Эта кислота может быть превращена в яблочную кислоту, образование которой показали Карль и сотрудники (1967); но в брожении вина
СНз-СООНУксусная кислота+со-соонIсн3ПироЗинограднаякислотаСНз-СООНУксусная кислота+со-соонIсн3ПироЗинограднаякислота
СНз-СООН
Уксусная кислота
+
со-соон
I
сн3
ПироЗиноградная
кислота
СНз-СООН
Уксусная кислота
+
со-соон
I
сн3
ПироЗиноградная
кислота
Это превращение маскируется разложением яблочной кислоты натурального виноградного сока. Наконец, яблочная кислота дает через посредство фумаровой кислоты янтарную кислоту, о которой со времен Пастера известно, что она представляет один из важнейших вторичных . продуктов спиртового брожения. Этот же механизм ведет также к пропионовой кислоте, присутствующей в вине в виде следов, в частности в форме сложного эфира (Бертран и Риберо-Гайон, 1968).
Но янтарная кислота может быть также образована конденсацией двух молекул ацетилкофермента А (реакция Тунберга). Трудно определить, который из двух возможных механизмов ответствен за образование этой кислоты, так как имеются аргументы в пользу и того и другого: возможно, что они функционируют в дрожжах оба одновременно.
К продуктам брожения, образующимся из пировиноградной кислоты (см. рис. 15.11), нужно добавить ли- монно-яблочную кислоту, а также ди- метплглицериновую кислоту. Лимонно- яблочную кислоту впервые идентифицировали Карль и сотрудники, ее концентрация в вине находится в пределах от 0 до 300 мг/л (Дюбюс, 1969). Карль и сотрудники предложили гипотезу об образовании лимонной кислоты в процессе бактериального брожения согласно реакции, напоминающей яблочно-молочное брожение (рис. 15.15). Но этот механизм не подтвердил Димотаки-Кураку (1962), который показал, что уменьшение содержания лимонной кислоты во время яблочно-молочного брожения не сопровождается образованием лимонно- яблочной кислоты. Последняя появляется исключительно в процессе спиртового брожения, вызываемого дрожжами. Елшин (1962) показал на выс
ших растениях образование лимонно- яблочной кислоты при конденсации уксусной кислоты в виде ацетилко- фермента А с пировиноградной кислотой (см. рис. 15.15); можно предположить функционирование такой реакции в дрожжах.
Имеются сообщения об образовании лимонной кислоты в ходе спиртового брожения. В действительности
сн2-сооь. но-с-соон
сн2-соон
Лимонная кислота
^со,
сн2-соон I но-с-соон
I
СН3
Лимонна - яблочнаякислота
Рис. 15.15. Механизм образования лимоннс,- яблочной кислоты.
но-сн-сн3
НО-С-СООНIСН3
Рис. 15.16. Диметилглицериновая кислота.
методом количественного химического анализа, использованного этим автором, определяли одновременно и лимонную, и лимонно-яблочную кислоту. Сейчас известно, что образуется только последняя, а первая остается без изменения.
• Диметилглицериновая кислота (рис. 15.16) была идентифицирована в вине Карлем и сотрудниками (1966); ее концентрация находится в пределах от 0 до 600 мг/л (Дюбюс, 1969). Карль и сотрудники (1967) предполагают, что она также образуется из пировиноградной и уксусной кислот
согласно реакции, родственной той, которая схематически показана на рис. 15.45.
Баланс вторичных продуктов глицерино-пировиноградного брожения
В серии работ, выполненных в Бордо с 1936 до 1955 г. исследователями Женвуа (1936), Пейно (1947), Рибе- ро-Гайоном с сотрудниками (1955) я Лафон (1955), удалось установить баланс основных вторичных продуктов глицерино-пировиноградного брожения, которые находят в вине, — уксусной и янтарной кислот, бутандиола-2,3 и ацетоина (ацетилметилкарбинол).
Связь между этими веществам?! и этаналем, вытекающая из глицерино- пировиноградного брожения, доказывается простым экспериментом, заключающимся в том, что в бродящую среду постепенно добавляют небольшое количество этаналя. При этом констатируют увеличение содержания вторичных продуктов и уменьшение глицерина — явление, которое объясняется ускорением спиртового брожения за счет глицерино-пировиноградного брожения.
Обратный эксперимент заключается в том, что блокируют этаналь по мере его образования добавлением димедона; гакие условия способствуют глицерино-пировиноградному брожению и, как следствие, образованию глицерина, но этаналь не может давать вторичных продуктов, процентное содержание которых уменьшается.
Затем можно в качестве гипотезы записать реакции образования этих веществ, образующихся из этаналя.
Образование уксусной кислоты:
2С Н3 — СНО + Н2О — СН3 - СООН +
+ СН3 - СН2ОН.
Образование янтарной кислоты: 5СН3 - СНО + 2Н2О -» СООН- СН2 - СН2 -
- СООН + ЗСН3 - СН2ОН.
Образование ацетоина (ацетилме- гилкарбинола):
. 2СН3 - СНО-^ СН3 - СНОН - СО - сня.
Образование бутандиола-2,3:
СН3 - СНО + СН3 - СН2ОН —СН3 — СНОН - СНОН - сн3.
Этот способ записи отражает тот факт, что все эти вещества образуются из этаналя без изменения уровня окисления-восстановления, т. е. для каждой реакции, взятой отдельно, не может быть ни поглощения, ни высвобождения водорода. В таком виде записи этих реакций делается попытка выразить в целом образование вторичных продуктов, не предрешая промежуточных этапов.
Точность этих реакций проверяют составлением баланса вторичных продуктов.
В бродящей среде проводят количественный анализ перечисленных выше веществ путем определения следующих молярных концентраций: а — уксусной кислоты; s — янтарной кислоты; m—ацетилметилкарбинола; b— бутандиола-2,3; h — этаналя, остающегося в свободном состоянии по завершении брожения.
Сумма 2 = 2a-j-5s-j-2m + 6-j-/i представляет общее количество молекул этаналя, образовавшихся во время брожения, которые не были восстановлены в спирт и, следовательно, получаются от глицерино-пировиноградно- го брожения. Разумеется, что существует интерференция между этаналем обоих ферментативных механизмов, а именно этаналь глицерино-пировиноградного брожения служит для возбуждения спиртового брожения. Но, когда в ходе глицерино-пировиноградного брожения распадается одна мо-
лек-ула сахара, появляется одна молекула этаналя, которая не восстанавливается в спирт потому, что два атома водорода, необходимые для этого восстановления, уже использованы для образования глицерина. Это значит, что в соответствии с общим уравнением глицерино-пировиноградного брожения
С6Н12О6-> СН2ОН - снон-сн2он + Глицерин
+ СН3 -jCO - соон.
сн3 - сно + со2Этаналь
в этом процессе образуется столько же молекул глицерина, сколько и этаналя, следовательно, если эти гипотезы правильны, должно быть
2 = 2а + 5 s + 2т + b + h. = g и — -- 1, g
где g— обозначает молярную концентрацию глицерина.
Экспериментальная проверка (табл. 15.1) дает значения в пределах от 0,82 до 0,95, что, по-видимому, указывает на существование некоторых других вторичных продуктов, возможно, компонентов клеток в небольшом количестве, также использующих для своего образования этаналь глицерино-пиро- виноградного брожения. Но в анаэробиозе 2 никогда не бывает заметно больше g, отношение, которое противоречит всякой теории, поскольку в этом случае образовывалось бы больше этаналя, чем глицерина.
Нужно уточнить пределы, в которых этот баланс вторичных продуктов действителен. Прежде всего, если брожение проводится в синтетической среде, насыщенной глутаминовой кислотой, образование янтарной кислоты из этой аминокислоты возможно. В случае сбраживания натуральных продуктов, они также могут нормаль
но содержать некоторые из этих продуктов, например глицерин или уксусную кислоту в суслах, полученных из винограда, пораженного Botrytis cinerea. Наконец, если брожение происходит с доступом воздуха дрожжами, имеющими высокую интенсивность дыхания, может образоваться значительное количество уксусной кислоты путем окисления. Следовательно, чтобы можно было использовать такие балансы, необходимо реализовать очень чистое брожение при полном отсутствии воздуха. В случае вина значение 2 чаще всего превышает значение g за счет уксусной кислоты, образовавшейся при бактериальном брожении, даже в отсутствие заболеваний, характеризующих такое состояние. Между прочим, таким путем можно определить, было ли спиртовое брожение, которому подвергалось данное вино, чистым или нет.
Можно выдвинуть и другие возражения против самого принципа составления таких балансов. Прежде всего в них должны быть представлены все производные пировиноградной кислоты, и в частности лимонно-яб- лочная кислота и остаточная пировиноградная. С другой стороны, механизм образования янтарной кислоты, использованный для составления балансов, основан исключительно на реакции Тун-берга (см. рис. 15Л1); если эта кислота образуется по реакции Вуд-Веркмана, которая включает восстановление одной молекулы пировиноградной кислоты, то не может быть одновременное образование глицерина, и янтарная кислота не должна входить в баланс. Из этого видно, насколько сложен данный вопрос; возможно, что равновесие балансов возникает вследствие компенсации ошибок. Тем не менее эта теория образования вторичных продуктов подтверждается реализацией процессов бро-
Сре даГ ли церин gУксусная кислота аЯнтарная кислотаАнетоинБутандиол- 2,3 bЭ[аналь1г2^IgВиноградное сусло минимум5203148232164290,82максимум750119881157416730,94Синтетическая среда минимум6201253135245210,82максимум90025068991108370,95Сре даГ ли церин gУксусная кислота аЯнтарная кислотаАнетоинБутандиол- 2,3 bЭ[аналь1г2^IgВиноградное сусло минимум5203148232164290,82максимум750119881157416730,94Синтетическая среда минимум6201253135245210,82максимум90025068991108370,95Таблица I5;lТаблица I5;lОбразование продуктов глицерино-пировиноградного брожения различными штаммами дрожжей, ммольОбразование продуктов глицерино-пировиноградного брожения различными штаммами дрожжей, ммольТаблица 15.2Таблица 15.2СредаpHГлицерин g, ммольУксусная кислота а, ммольЯнтарная кислота S, ммольАцетоин т, ммольБутаидиол-2,3 bЭ т аналь. й, ммоль53/8Виноградное3,08416,66,31,07,21,0750,90сусло5,08016,46,30,87,21,1740,935,811231,95,60,76,31,31010,867,016953,19,30,54,81,01590,948,020980,510,10,54,11,02161,03СредаpHГлицерин g, ммольУксусная кислота а, ммольЯнтарная кислота S, ммольАцетоин т, ммольБутаидиол-2,3 bЭ т аналь. й, ммоль53/8Виноградное3,08416,66,31,07,21,0750,90сусло5,08016,46,30,87,21,1740,935,811231,95,60,76,31,31010,867,016953,19,30,54,81,01590,948,020980,510,10,54,11,02161,03Образование продуктов глицерино-пировиноградного брожения в зависимости от pHОбразование продуктов глицерино-пировиноградного брожения в зависимости от pHжения при различных pH (табл. 15.2); выход каждого продукта глицерино- пировиноградного брожения изменяется в больших пропорциях, но отношение ILjg остается всегда близким к 1.
Сре да
Г ли церин g
Уксусная кислота а
Янтарная кислота
Анетоин
Бутандиол- 2,3 b
Э[аналь
1г
2
^Ig
Виноградное сусло минимум
520
31
48
2
32
16
429
0,82
максимум
750
119
88
11
57
41
673
0,94
Синтетическая среда минимум
620
125
31
3
52
4
521
0,82
максимум
900
250
68
9
91
10
837
0,95
Сре да
Г ли церин g
Уксусная кислота а
Янтарная кислота
Анетоин
Бутандиол- 2,3 b
Э[аналь
1г
2
^Ig
Виноградное сусло минимум
520
31
48
2
32
16
429
0,82
максимум
750
119
88
11
57
41
673
0,94
Синтетическая среда минимум
620
125
31
3
52
4
521
0,82
максимум
900
250
68
9
91
10
837
0,95
Таблица I5;l
Таблица I5;l
Образование продуктов глицерино-пировиноградного брожения различными штаммами дрожжей, ммоль
Образование продуктов глицерино-пировиноградного брожения различными штаммами дрожжей, ммоль
Таблица 15.2
Таблица 15.2
Среда
pH
Глицерин g, ммоль
Уксусная кислота а, ммоль
Янтарная кислота S, ммоль
Ацетоин т, ммоль
Бутаидиол-
2,3 b
Э т аналь. й, ммоль
5
3/8
Виноградное
3,0
84
16,6
6,3
1,0
7,2
1,0
75
0,90
сусло
5,0
80
16,4
6,3
0,8
7,2
1,1
74
0,93
5,8
112
31,9
5,6
0,7
6,3
1,3
101
0,86
7,0
169
53,1
9,3
0,5
4,8
1,0
159
0,94
8,0
209
80,5
10,1
0,5
4,1
1,0
216
1,03
Среда
pH
Глицерин g, ммоль
Уксусная кислота а, ммоль
Янтарная кислота S, ммоль
Ацетоин т, ммоль
Бутаидиол-
2,3 b
Э т аналь. й, ммоль
5
3/8
Виноградное
3,0
84
16,6
6,3
1,0
7,2
1,0
75
0,90
сусло
5,0
80
16,4
6,3
0,8
7,2
1,1
74
0,93
5,8
112
31,9
5,6
0,7
6,3
1,3
101
0,86
7,0
169
53,1
9,3
0,5
4,8
1,0
159
0,94
8,0
209
80,5
10,1
0,5
4,1
1,0
216
1,03
Образование продуктов глицерино-пировиноградного брожения в зависимости от pH
Образование продуктов глицерино-пировиноградного брожения в зависимости от pH
ДРУГИЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ, ВЫЗЫВАЕМЫЕ ДРОЖЖАМИ
Брожение в присутствии уксусной кислоты
При рассмотрении процентного содержания уксусной кислоты, образовавшейся во время спиртового брожения, приходится констатировать, что она образуется неравномерно сброженному сахару. Вначале ее образование идет быстро, потом замедляет
ся; к концу брожения содержание кислоты может даже уменьшиться, иногда сильно (Вантер, 1937; Пейно, 1939 и 1946). Это явление протекает по-разному в зависимости от вида дрожжей (см. рис. 15.17). Более того, дрожжи способны поглощать уксусную кислоту, которую добавляют перед брожением (рис. 15.18).
Можно допустить, что такое использование уксусной кислоты дрожжами включает, прежде всего, ее восстановление в этаналь, которое способствует спиртовому брожению в ущерб брожению глицерино-пировиноградному, увеличивая образование спирта, а также вторичных продуктов при одновременном уменьшении содержания глицерина. На деле констатируют, что
добавление уксусной кислоты снижает уровень глицерина и повышает содержание бутандиола-2,3 и ацетилметил- карб-инола.
Косвенным следствием этого свойства дрожжей разлагать уксусную кислоту является возможность снижения путем повторного брожения содержания летучей кислотности в больном
Рис. 15.17. Образование уксусной кислоты в зависимости от сахара, сбраживаемого пятью различными видами дрожжей:
1 — дрожжи М; 2— дрожжи О; 3— дрожжи С; 4—дрожжи S; 5— дрожжи В.
вине. Если к виноградному суслу или к собранному винограду добавлять вино, обладающее повышенной летучей кислотностью, разумеется, после стабилизации его с точки зрения микробиальной активности в соотноше- , нии от ’/з До */г так, чтобы летучая кислотность смеси была порядка 0,60 г/л, то после брожения получают вино, в котором содержание уксусной кислоты обычно не превосходит уров
ня, соответствующего нормальному брожению. Одновременно снижается процентное содержание этилацетата. Понятно, что такой способ может быть разрешен только для вина, летучая кислотность которого не превосходит установленного предела (0,90г/л).
Рис. 15.18. Уменьшение содержания уксусной кислоты, добавляемой в сусло до брожения:
— контроль; 21-6,2 мг-экв уксусной кислоты; 3И 12,4 мг-экв уксусной кислоты.
Разложение яблочной кислоты
Давно известно, что содержание яблочной кислоты в виноградном сусле во время спиртового брожения уменьшается независимо от яблочно-молоч- ного брожения. Пейно (1938) показал, что это общее явление и что в зависимости от вида дрожжей потери
яблочной кислоты составляют от 10 до 24% ее первоначального количества; разложение тем более значительно, чем ниже pH, и при pH 5,0 оно прекращается. Но содержание яблочной кислоты в вине, хранившемся в течение года в -присутствии дрожжей, не изменяется; уменьшение содержания этой кислоты происходит исключительно в период брожения.
Пейно и сотрудники (1964) и Пейно и Сюдро (1964) показали, что некоторые дрожжи рода Schizosaccharomy- ces обладают свойством разлагать в анаэробиозе значительные количества яблочной кислоты (до 90%) (Schizo- saocharomyces pombe).
Каков бы ни был тип рассматриваемых дрожжей, разложение яблочной кислоты соответствует по своему характеру истинному брожению согласно общему уравнению.
СООН — СНОВ - сн2 - соон -
| _ СН3 - СН2ОН + 2СО2.
Фук и Радлер (1972) показали, что в первое время яблочная кислота превращается в пировиноградную кислоту (см. рис. 15.27), пировиноградная кислота затем участвует в реакциях спиртового брожения (см. рис. 15.12) с декарбоксилированием в этаналь, который сам восстанавливается в этанол.
Метаболизм азотистых компонентов и образование высших спиртов
Проблемы питания дрожжей азотом и превращений азотсодержащих -компонентов винограда во время брожения хорошо известны (Дюпюи и сотрудники, 1967) и описаны в гл. 7.
Синтез аминокислот и белков дрожжами основан на классических механизмах биохимии. Аммиачный азот поступает из ажетоглутаровой кислоты, чтобы дать глутаминовую кислоту
(рис. 15.19). Все другие аминокислоты образуются или изменением карбоновой структуры глутаминовой кислоты, например при образовании пролина (рис. 15.20), или же трансаминированием, например путем синтеза аспарагиновой кислоты из щавелево-ук- сусной или синтезом аланина из пировиноградной кислоты (рис. 15.21).
Среди продуктов метаболического разложения аминокислот наибольшее значение для энологии, -безусловно, имеют высшие спирты: действитель-
соон
соон
соон
С=О ™з
Н;° C=NH ^ NAD । н_№2
сн3 " \
/1
* СН2
сн2 1
сн2
сн2
соон
соон
соон
</-Кетоглутарр-
Иминоглутаробая
®ая кислота
кислота
Рис. 15.19. Образование глутаминовой кислоты из минерального азота.
но, они участвуют как -сами -по себе, так и в виде -своих сложных эфиров в образовании органолептических характеристик вин. С момента опубликования фундаментальных работ Эрлиха известно, что аминокислоты являются главными предшественниками высших спиртов. Механизм этой реакции, который специально исследовали Сенте Шанмуганатан и Эльсден (1958), включает дезаминирование аминокислоты в -кетокислоту, которая декарбоксилируется в альдегид, -в свою очередь восстанавливающийся в спирт (рис. 15.22).
В табл. 15.3 показано соответствие между аминокислотами с «+1 атомами углерода и спиртами с п атомами углерода. Роль кетоновых кислот, или, точнее, альдегидов, которые являются их производными, -как акцепторов водорода в форме NADH2, получающий-
ся -при гликолизе, по^видимому, указывает на то, что высшие спирты должны участвовать вместе с глицерином в -составлении баланса продуктов глицерино-пировиноградного брожения (раздел «Баланс вторичных продуктов
глицерино-пировиноградного брожения») .
Но, как заметили Дюпюи и сотрудники (1967), -в бродящих -средах содержатся высшие спирты, например пропанол-1, которые не имеют воз-
СООН
соон ”
^ООН 1
1 сн-мн2
соон
1 с=о
с=о +
1
сн-мн2
+1
1
сн2 1
сн2
сн.
сн2
1
1
СН2
1
СН2
соон
1
соон
соон
соон
Щабелебоуксусная
Гкутаминобая
Аспарагиновая
об - КетоелутароваЯ
кислота
кислота
кислйЙб
кислота
соон
соон
СООН
CH - мн2
соон
с=о 1
с-о +
сн2
ch-nh2
+ СН2
СН3
сн2
соон
сн2
^аробимоградная
соон
Аланин
соон
кислота
Рис. 15.21. Образование
аспарагиновой
кислоты и аланина
из глутаминовой кислоты
трансаминирования.
соон сп-соон nh2 Глутаминовая кислота
СИ,СН2
сн2 сн-соон
Прети»
Рис. 15.20. Образование -пролина за счет изменения молекулы глутаминовой кислоты.
путем
можных предшественников среди натуральных аминокислот (см. табл. 15.3). Кроме того, не установлено зависимости между содержанием аминокислот и -содержанием соответствующих высших -спортов. Помимо этого не существует связи между образованием высших спиртов и азотистым питанием дрожжей, например когда проводят несколько последовательных брожений одними и теми же не размножающимися делением дрожжами без внесения азотистого питания, то констатируют, что образование -высших спиртов каждый раз происходит в количестве, пропорциональном содержа-
нию сахара. Эти наблюдения подтверждают -гипотезу, выдвинутую Пейно и Гимберто (1958 и 1959), согласно которой реакция Эрлиха объясняет образование лишь части высших спиртов.
По этому же -вопросу -важные факторы сообщили Ингрээм И ГИМОН (1960), Ингрээм и сотрудники (1961) и Гимон (1966). Они провели серию оригинальных экспериментов, используя (мутанты Saccharomyces cerevisiae, потерявшие способность сбраживать некоторые аминокислоты. Авторы констатировали, что эти самые штаммы также потеряли способность синтезы-
ровать соответствующие высшие спирты и подтвердили существование взаимосвязи между синтезом этих спиртов и синтезом аминокислот. Но в то же время синтез других высших спиртов, в частности пропанола-1, бутанола- и -гексанола-1, для которых не су-, ществует аминокислот-предшественников, возрастает по отношению к пер-
С ООН
С ООНС ООНCH—NH,CH—NH,СООНСООНС=ОС=Осн2сн2СООНСООНch-nh2
С ООН
С ООН
CH—NH,
CH—NH,
СООН
СООН
С=О
С=О
сн2
сн2
СООН
СООН
c. ООНc. ООНС=ОС=Осн2сн2сн2сн2сн;сн;Виноградом нислотиВиноградом нислотион лара-Гибро- ксифенилпиро-он лара-Гибро- ксифенилпиро-СООНСООНГлутаминобаз лиглотаГлутаминобаз лиглотаСНОСНОсо2со2сб-Ке^зглутаро-бая мюлота
c. ООН
c. ООН
С=О
С=О
сн2
сн2
сн2
сн2
сн;
сн;
Виноградом нислоти
Виноградом нислоти
он лара-Гибро- ксифенилпиро-
он лара-Гибро- ксифенилпиро-
СООН
СООН
Глутаминобаз лиглота
Глутаминобаз лиглота
СНО
СНО
со2
со2
:н2он:н2онононЮНТирозилЮНТирозилNAD NADH2 СН2NAD NADH2 СН2Рис. 15.22. Механизм биосинтеза высших спиртов из соответствующих аминокислот: образование тирозола из тирозина.Рис. 15.22. Механизм биосинтеза высших спиртов из соответствующих аминокислот: образование тирозола из тирозина.
:н2он
:н2он
он
он
ЮН
Тирозил
ЮН
Тирозил
NAD NADH2 СН2
NAD NADH2 СН2
Рис. 15.22. Механизм биосинтеза высших спиртов из соответствующих аминокислот: образование тирозола из тирозина.
Рис. 15.22. Механизм биосинтеза высших спиртов из соответствующих аминокислот: образование тирозола из тирозина.
воначальному штамму. От этого штамма получен мутант. Таким образом, типы синтеза различных высших спиртов связаны общими механизмами, в которых участие аминокислот необязательно.
Из своих работ авторы заключают, что обязательными предшественниками высших спиртов являются не аминокислоты, а соответствующие кетоновые кислоты; именно их синтез ингибируется у мутантов. Эти кетоновые кислоты получаются не только от разложения аминокислот в соответствии <с реакцией Эрлиха (см. рис. 15.22),
но и в результате углеводного метаболизма. Отсюда следует, -что некоторые высшие спирты (изоамиловый, изобутиловый) могут иметь несколько механизмов синтеза (из аминокислот или путем углеводного метаболизма), тогда как другие образуются только одним способом (углеводного метаболизма). Взаимообратимость этих двух путей обмена веществ описана, в частности, в публикации Ги- мона (1966). В качестве примера можно указать на механизм образования «-пропилового спирта (-рис. 15.23), для которого не существует соответствующей аминокислоты. В этом случае уксусная кислота участвует в виде ацетилкофермента А. Так же, как можно перейти от пировиноградной кислоты с Сз к а-кетобу- тановой кислоте с С4, можно представить переход от последней к кетоновым кислотам с С5, Се или С7 и написать образование «-бутиловых, я- амиловых (пентанол-1) и я-гексило- вых спиртов. Этот механизм применим к разветвленным кетоновым кислотам и позволяет объяснить возможность синтеза основных высших спиртов (изобутилового, изоамилового и амилового активного) без вмешательства соответствующих аминокислот. Кроме того, гексанол вина должен происходить из альдегидов с Се (гексаналь, гексенал), присутствующих в винограде, как и во всех растениях.
Образование высших спиртов и их сложных эфиров зависит от штамма дрожжей, условий среды и аэрации (Бертран и Риберо-Гайон, 1968).
Восстановление сульфатов в сульфиты и в сероводород
Известно, что дрожжи способны образовывать из сульфата сероводород (Ранкин, 1963) и -в некоторых особых условиях — сульфитные ионы (SO," ),
Т а б л иц a 15.3
Основные высшие спирты вин и аминокислоты, производными которых они являются (у-бутнролактон получается от дегидратации у-окснбутановой кислоты
СООН—СН2—СН2—СН2ОН).
Высший спирт
Содержание в вине, мг/л
Соответствующая аминокислота
' СНз
От 80 до 300
СНзNH2■
СНд—СН—СНг—СН2ОН
СНз—сн—сн2—сн—СООН
Изоамиловый альдегид, или метил-
Лейцин
З-бутанол-1
СНз
От 30 до 100
СНз nh2
СН3—СН2—СН—СН2ОН
СНз—СН2—СН—СН—СООН
Альдегид амиловый активный, или
Изолейцин
метил-2-бутанол-1
СНд
От 50 до 150
СНз NH2
СНз—сн—СН2ОН
СНз—СН—СН—СООН
Изобутиловый альдегид, нли метил-
Валин
2-пропапол-1
От 10 до 100
<^^-сн2-снгон
. Фенилзтилебый злебегиб с
Фенилаланин'
От 20 до 50’
НО-^ У сн3-сн3он
но-\ усилен-со.
СНз—сн2—СН2ОН
н-Пропиловый альдегид, или пропанол-1
СН.—сн2-сн3-сн2он
От 10 до 50
Тирозин
NH,
н-Бутиловын альдегид, или бута-
нол-1
г- сн2— сн-соон
Г
От 1 до 10
*- NH
J-CHS-CH2OH
NH-'
От 0 до 1
Триптбфох
Триптофол
СО—СН2—сн2—сн2
От 0 до 5'
■nh2
■у-Бутиролактон
СООН—СН2—СН2-СН—СООН
СНз—сн2—СНОН—СНз
Следы
Глутаминовая кислота
Бутанол-2
СНз—СНз—сн2—СН2—СН2ОН
»
н-Амиловый альдегид, или пентанол-1
СНз— сн2—СН2—сн2—сн2—сн2он
н-Гексиловый альдегид, илн гекса-
нол-1
СНз-СООН
Уксусная гмлота
со-соон
сн3
ЛиооЬинограйнаякислота
сн2~соон но-с-соон
сн?
Лимонни-яблочная
кислота
соон
-снон
СН2ОН
сн9
сн3
п-Пропиловыйспирт
NAD NADH2
Пропионовый альдвгид
(пропаналь)
Рис. 15.23. Механизмы биосинтеза высших спиртов «-пропилового спирта или пропанола-1.
СООН
СИ- inH2
сн2 соон Рспираеино^ая кислота
so4-
соон
ch-nh2
сн2
Серин
со.
^NAD
со2*
(
>^nadh2
ООН
с=о
:н2
сн3 ов-Кетомасляная кислота
СН—СООп
сн
без участия аминокислот: образование
соон сн-мн2 сн, CH2-S-CH3
Метионин
Рис. 15.24. Биосинтез аминокислот, содержащих серу, с восстановлением сульфатов: образование метионина из аспарагиновой кислоты и Цистеина из серина.
которые в вине находятся в форме бисульфитных ионов (HSO,- ), и сернистой кислоты (H2SO3) (Дитрих и Штауденмайер, 1968; Вюрдиг и Шлот- тер, 1968, 1970 и 1971; Уикс, 1969).
Эшенбрух (1972) указывает, что в зависимости от природы дрожжей концентрации образующегося сернистого
ангидрида составляют от 10до80мг/л. Большинство дрожжей образуют SO2 в пределах от 10 до 20 мг/л, только особые штаммы, так называемые сульфитообразующие дрожжи, превосходят эти показатели. Состав среды (на базе виноградного сока) не оказывает решающего влияния. Для
случая H2S этот же автор указывает дозы от 10 до 100-103 мг/л. Природа дрожжей мало влияет на это значение и, наоборот, решающее значение имеет состав среды.
Что касается SO2, то этот же автор показывает, что его образование связано с необходимостью для дрожжей синтезировать аминокислоты, содержащие серу — метионин и цистеин (рис. 15.24). Брожение в присутствии этих аминокислот ведет к снижению содержания образующегося SO2. Можно представить, что необходимость для дрожжей синтезировать серусо- держащие аминокислоты обязывает их восстанавливать ионы SO/ в H2S с переходом через сульфитные ионы SO/ , часть которых блокируется в форме соединения с альдегидными или кетоновыми свойствами.
Образование дрожжами H2S в процессе брожения не следует смешивать с выделением этого вещества и меркаптанов в винах, заложенных на выдержку после снятия с дрожжей; эти продукты при концентрации в несколько миллиграммов на литр придают вину характерный, очень неприятный запах. Это явление связано с образованием бисульфитов, получающихся из сернистой кислоты, вводимой в сусло при производстве вина, или от разложения аминокислот, содержащих серу. Речь идет о восстановлении с помощью дрожжевых клеток еще живых, но уже не обладающих бродильной активностью.
РАЗЛОЖЕНИЕ САХАРОВ
МОЛОЧНОКИСЛЫМИ БАКТЕРИЯМИ
Разложение гексоз гомоферментативными бактериями
Известно, что гомоферментативный характер молочнокислых бактерий определяется превращением глюкозы, а
чаще всего-также и фруктозы в две молекулы молочной кислоты; образование вторичных продуктов равно нулю или очень ограничено (табл. 15.4). Баланс этого образования записывается следующим образом:
С6Н12О6-> 2СН3 - снон - соон.
ГлюкозаМолочная кислота
Продукты, дативными 200 ммоль
'Таблица 15.4
образуемые гомо- и гетерофермен-
бактериями при глюкозы н фруктозы
сбраживании
Продукты брожения,
Гомофермеи- тативные бактерии
Гетерофермен* тативные бактерии
ммоль
глюкоза или фруктоза
глюкоза
фрук-
Молочная кислота СО2
Этанол
Уксусная кислота
Янтарная кислота Маннит Бутандиол-2,3
Глицерин
360
0
0
След ы
0
0
0,3
10
60
100
100
120
10
0
10
80
40 50
0 100
10 50
10 40
Молекула сахара первоначально разлагается путем гликолиза (см. рис. 15.9 и 15.10), который ведет к пировиноградной кислоте. Пировиноградная кислота не декарбоксилируется в этаналь, как это происходит при спиртовом брожении (см. рис. 15.12), но непосредственно восстанавливается в молочную кислоту лактодегидрогеназой. Это восстановление идет параллельно с окислением гли- церинальдегида-3-фосфата в ходе гликолиза и обеспечивает одновременный возврат NaDH2 в форме NAD (рис. 15.25). •
Известно, что существуют две лак-- тодегидрогеназы (см. рис. 15.43), обеспечивающие синтез того или другого из двух стереоизомеров молочной кислоты: молочной кислоты D(—) и молочной кислоты L(+)- Пейно и со-
Глюкоза
/О С < I н
-г=7"* снон
сн2о-®
Гпиперина cede гид-3- фосфат
С<
I он снон
сн3
Молочная кислота
Рис. 15.25. Схема гомомолочнокислого брожения.
трудники (1976) показали, что гомо- ферментативные бактерии обычно образуют два изомера в различной пропорции, однако несколько гомофер- ментативных бактерий образуют исключительно .молочную кислоту L(+).
Энергетический баланс гомофер- ментативного брожения, как и баланс спиртового брожения, соответствует балансу гликолиза, т. е. две молекулы АТФ образуются во время разложения одной молекулы сахара.
Разложение гексоз гетероферментативными бактериями — молочнокислое скисание
Гетероферментативное брожение, вызываемое молочнокислыми бактериями, открыли в 1894 г. Гайон и Дю- бург в испорченных винах, содержащих большое количество маннита, что и дало основание называть эту болезнь маннитным брожением. Авторы показали, с одной стороны, образование большого числа продуктов брожения, с другой — различное поведение глюкозы и фруктозы, причем последняя является специфической для образования маннита. В противоположность гомоферментативному брожению молочная кислота является не
единственным продуктом, она даже количественно не самая большая (см. табл. 15.4). Понятно, что балансы такого брожения сильно изменяются в зависимости от видов бактерий и условий их развития.
Действующие здесь механизмы отличаются от тех, какие характеризуют гомоферментативное брожение: первые реакции относятся к циклу пентоз и идут по классическому пути разложения углеводов гликолизом (рис. 15.26). Глюкоза-6 фосфат, получающаяся как из глюкозы, так и из фруктозы, является исходным пунктом разрыва молекулы сахара. Этот сложный эфир окисляется в фосфо-6- глюконовую кислоту, которая сама подвергается окислительному декарбоксилированию, ведущему к пенто- зе-рибозе-5 фосфату. Изомеризация пентоз ведет к ксилозе-5-фосфату, разрыв молекулы которой дает ацетилфосфат (С2) и глицеринальдегид-3- фосфат (С3). Последний вновь подвергается гликолизу, образовавшаяся же пировиноградная кислота восстанавливается в молочную кислоту. Другой механизм обеспечивает переход глицеринальдегида-3-фосфата в глицерин, поскольку восстановление возможно благодаря NADH2, получаю-
OH н
Фруктоза
NADH2 NAD
CH2OH
СНОН
I
СНОН
СНОН
СНОН
I
СН2ОН
ATP
он н
Фруктоза - 6 - фосфат
Маннит
г н он
Глюкоза - 6-фосфат
^-NAD
ADP ATP
^NADH2
’соон-^-ОН NAD NAD№’соон-^-ОН NAD NAD№НО-С-ННО-С-Нн-с-онн-5с-он6сн2о-®Фосфо-6-глюконобая кислотан-с-онн-5с-он6сн2о-®Фосфо-6-глюконобая кислота►н-с-он н-с-он►н-с-он н-с-он"СН2ОН Зс=о"СН2ОН Зс=о2СН3ОН2СН3ОНС = ОС = О- но-с-нн-с-он- но-с-нн-с-он4СООН4СООН'СНОН'СНОН: °СН:: °СН:Молочная кислотаМолочная кислотаNAD NADH:NAD NADH:СООНСООНС=ОС=ОЛиробинограднаякислотаЛиробинограднаякислота4СН2ОН 5СНОН4СН2ОН 5СНОНСН2ОНСН2ОНГлицеринГлицеринСН2О-(Р)Рибулоза -5-фОСфатСН2О-(Р)Рибулоза -5-фОСфатNADH2 NAD 4Г_-О 2 ATP к /2ADP (''Н ; ^к 2/ С н онNADH2 NAD 4Г_-О 2 ATP к /2ADP (''Н ; ^к 2/ С н он6сн2о-®Ксилулоза - 5-фостат Н3РО46сн2о-®Ксилулоза - 5-фостат Н3РО4ГпиколизГпиколизН3РО4 Н2ОН3РО4 Н2ОСН2О~®Глицеринальдегид -3- фосфатСН2О~®Глицеринальдегид -3- фосфатН2О СН3 Зс-о-® оАцетилфассрат "I/ADPН2О СН3 Зс-о-® оАцетилфассрат "I/ADP-АТР-АТР— СНОНСН2О-®Глиуеринфосфорнанкислота— СНОНСН2О-®Глиуеринфосфорнанкислота2сн.2сн.'СН,'СН,'СН2ОН'СН2ОНСООН ‘СООН ‘Зтилобый спиртЗтилобый спиртУксусная кислотаУксусная кислота
’соон
-^-ОН NAD NAD№
’соон
-^-ОН NAD NAD№
НО-С-Н
НО-С-Н
н-с-он
н-5с-он
6сн2о-®
Фосфо-6-глюконобая кислота
н-с-он
н-5с-он
6сн2о-®
Фосфо-6-глюконобая кислота
►н-с-он н-с-он
►н-с-он н-с-он
"СН2ОН Зс=о
"СН2ОН Зс=о
2СН3ОН
2СН3ОН
С = О
С = О
- но-с-н
н-с-он
- но-с-н
н-с-он
4СООН
4СООН
'СНОН
'СНОН
: °СН:
: °СН:
Молочная кислота
Молочная кислота
NAD NADH:
NAD NADH:
СООН
СООН
С=О
С=О
Лиробинограднаякислота
Лиробинограднаякислота
4СН2ОН 5СНОН
4СН2ОН 5СНОН
СН2ОН
СН2ОН
Глицерин
Глицерин
СН2О-(Р)
Рибулоза -5-фОСфат
СН2О-(Р)
Рибулоза -5-фОСфат
NADH2 NAD 4Г_-О 2 ATP к /2ADP (''Н ; ^к 2/ С н он
NADH2 NAD 4Г_-О 2 ATP к /2ADP (''Н ; ^к 2/ С н он
6сн2о-®
Ксилулоза - 5-фостат Н3РО4
6сн2о-®
Ксилулоза - 5-фостат Н3РО4
Гпиколиз
Гпиколиз
Н3РО4 Н2О
Н3РО4 Н2О
СН2О~®
Глицеринальдегид -3- фосфат
СН2О~®
Глицеринальдегид -3- фосфат
Н2О СН3 Зс-о-® о
Ацетилфассрат "I/ADP
Н2О СН3 Зс-о-® о
Ацетилфассрат "I/ADP
-АТР
-АТР
— СНОН
СН2О-®
Глиуеринфосфорнанкислота
— СНОН
СН2О-®
Глиуеринфосфорнанкислота
2сн.
2сн.
'СН,
'СН,
'СН2ОН
'СН2ОН
СООН ‘
СООН ‘
Зтилобый спирт
Зтилобый спирт
Уксусная кислота
Уксусная кислота
Рис. 15.26. Схемы гетеромолочнокислого сбраживания глюкозы и фруктозы. Образующиеся при этом продукты заключены в прямоугольники. ■
щемуся от гликолиза; в этом случае происходит истинное глицерино-пиро- виноградное брожение и одна часть пировиноградной жислоты, которая не
может быть восстановлена в молочную кислоту, служит для образования вторичных продуктов (уксусной кислоты, янтарной и бутандиола-2,3), пока-
занных в табл. 15.4, по общим механизмам (ем. рис. 15.11).
Со своей стороны ацетилфосфат восстанавливается в этиловый спирт. Это восстановление необходимо для обеспечения вторичного окисления NADH2 в форму NAD. Действительно, если не учитывать образование глицерина, которое наблюдается во время этого процесса, 3 молекулы NAD восстанавливаются, причем две для окисления глюкозы и одна для окисления глице- ринальдегид-3-фосфата. Один из них повторно окисляется за счет пировиноградной кислоты, два других за счет ацетилфосфата. Таким образом, баланс гетероферментативного брожения в этой форме может быть записан (без учета возможного глицерино-пи- ровиноградного брожения) следующим образом:
С6Н12О6^ СН3 - СНОН - соон + ГлюкозаМолочная кислота
+ СН3 - СН2ОН + СО2. (1) Этанол
Но бактериальная клетка может располагать экзогенным акцептором водорода (или, что то же самое, электронов), т. е. веществом, присутствующим в питательной среде и способным проникать внутрь клетки, где оно подвергается восстановлению (Барр, 1972). В этом случае акцептор обеспечивает вторичное окисление двух молекул 2NADH2 вместо ацетилфосфата, который тогда сможет быть гидролизованным в уксусную кислоту с освобождением одного АТФ и, следовательно, дополнительной энергии. Трудность восстановления органических кислот (уксусная) отражает предпочтительное восстановление экзогенного акцептора. Обозначая акцептор через А, можно выразить баланс гетероферментативного брожения в следующем виде:
С6Н12О6 + 2А СН3 - СНОН - СООН + ГлюкозаМолочная кислота
+ СН3 - СООН + СО2 + 2АН2.(2)
Уксусная кислота
При натуральном брожении уравнения (1) и (2), равно как и при гли- церино-пировиноградном брожении, могут функционировать одновременно, В случае сбраживания фруктозы этот сахар может сам служить акцептором водорода А и именно поэтому источником маннита; этот же механизм объясняет образование небольших количеств других многоатомных спиртов: эритрита с С< и арабита с С5 (Гим- берто, 1969; Дюберне и сотрудники, 1974). Соответствующие сахара являются промежуточными звеньями цикла пентоз, реакции которого обеспечивают в схеме гетероферментативного брожения переход глюкозы-6-фосфата в ксилозу-6-фосфат. Опираясь на эту теорию и данные табл. 15.4, отмечают, что в гетероферментативном сбраживании фруктозы не происходит восстановления ацетилфосфата и, следовательно, образования этанола, который появляется исключительно при сбраживании глюкозы.
Схема этой совокупности механизмов (см. рис. 15.26) показывает, что чистое гетероферментативное брожение [см. уравнение (1)] обеспечивает освобождение одной молекулы АТФ во время разложения молекулы глюкозы. В уравнении (2) выигрыш энергии больше и соответствует двум молекулам АТФ.
Новый тип гетероферментативного брожения выявили Барр и сотрудники (1971) у некоторых Betabacterium, выделенных из вина; он характеризуется отсутствуем экзогенного акцептора водорода и выражается глобальным уравнением
iC6HI2O6-+(l — х)СН3 — СНОН — СООН 4 Г докозаПолочная кислота
+ (1 + л) CH, - СН2ОН + (1 + х)СО2.
Этиловый спирт
Пейно и сотрудники (1967) показали, что гетероферментативные кокки, выделенные из вина, образуют иоклю- чительно молочную кислоту D(—); некоторые гетероферментативные бациллы обладают такой же характеристикой, хотя большинство их образуют одновременно молочную кислоту D(—) и молочную кислоту L(+) с преобладанием второй. Известно, что процессы развития бактерий в винах ведут к образованию различных летучих кислот (муравьиная, пропионовая, масляная) в концентрациях порядка нескольких граммов на литр). Механизмы их образования из пировиноградной кислоты показаны на рис. 15.11.
Разложение пентоз
Виноградный сок содержит две пентозы— арабинозу и ксилозу. Некоторые винные бактерии используют оба сахара, другие — один из них, наконец, существуют такие, -которые не воздействуют на пентозы. Действие на пентозы не связано с гомо- или ге- тероферментативным характером брожения, который относится исключительно к сбраживанию глюкозы. Разложение -пентоз происходит всегда с образованием уксусной кислоты; она может быть источником небольшого повышения летучей кислотности красных вин, выдерживаемых в деревянных бочках. Деградация молекул пентозы осуществляется посредством ксилозы-5-фосфата, механизмы разложения которого описаны в разделе, относящемся к гетероферментативному брожению гексоз (см. рис. 15.26).
ДРУГИЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ, ВЫЗЫВАЕМЫЕ МОЛОЧНОКИСЛЫМИ БАКТЕРИЯМИ
Разложение яблочной кислоты — яблочно-молочное брожение
Значение этого явления для энологии и условия реализации яблочно-
молочного брожения описано в других главах. Это превращение сводится к исчезновению одной молекулы яблочной кислоты, преобразуемой в молочную кислоту со снижением кислотности и приданием вину бархатистости.
Глобально это явление записывается так:
1234
СООН - СН2 - СНОН - СООН
Яблочная кислота1234
-»со2 + СН3 - СНОН — СООН.
Молочная кислота
Биохимические механизмы, действующие в этом превращении, не выяснены в полной мере. С давних пор известны два фермента—маликодегид- рогеназа и яблочнокислый фермент, который обладает свойством разлагать яблочную -кислоту (рис. 15.27). Если вмеш а те л ьство мал икодегидро ге н азы в яблочно-молочное брожение всегда исключалось, то в течение длительного времени считали, что яблочнокислый фермент (см. рис. 15.27, реакция II) участвует в этом брожении. Это предполагает переход через пировиноградную кислоту й участие лактико- дегидрогеназы, поскольку яблочнокислый фермент обеспечивает только превращение яблочной кислоты в пировиноградную (см. рис. 15.27).
Исследуя этот вопрос, Пейно (1968) и Пейно и Лафон-Лафуркад (1970) обратили внимание на то, что молочнокислые бактерии вина обладают чаще всего двумя лактикодегидрогена- зами, поскольку при сбраживании сахаров они способны восстанавливать пировиноградную кислоту одновременно в молочную кислоту D(—) и в молочную кислоту L(+)- Между тем яблочно-молочное брожение ведет исключительно к молочной кислоте L(+) (Пейно и сотрудники, 1967); эти фак-
I -Маликодегидрогеназа
■соон
с=о
снон
MDH
NAD NADH2 СООН
cp2
соан
nadh2
сн2
Денарбомоилаза
с=о
DC5LDH
NAD
СООН
снон
СООН
Яблочная кислота
J - Яблочный
соон
фермент
NAD
нон
СООН
Ира^елеИорнерсназнес лот о
L(T, LDH
сн3
DH-молочная
L (^-молочнаякислота.
nadh2 /^со;
СН2
СООН
Яблочнаякислота
ЕМ-МЙ*
с=о
NAD
NADH
соон
соон
D.oLDH
L(+)LDH
СН3 Пиробинозрадная кислота
СН3ПиробинограМякислота
снон
Ш-Яблочно-молочный фермент СООН
СН3
DM-молочная
L М-молочнаякислота
снон
соон
сн2
EML
?
EML
снон
СООН Яблочная кислота
СН3
L (+Ямолачная.
кислота
(MDH-(MDH-Рис. 15.27. Различные механизмы ферментативного разложения яблочной кислоты.
(MDH-
(MDH-
маликодегидрогеназа; £Л1-иблочный фермент; £А1Л-яблочно-молочный фермент; LDH-лактико- дегидрогеназа).
торы показывают, что пировиноградная кислота не является промежуточным звеном или, по меньшей мере, лактикодегидрогеназы не участвуют в яблочно-молочном брожении. Эти результаты подтвердили Радлер и сотрудники (1970). Авторы выделили из молочнокислых бактерий ферментный препарат, который очистили от лак- тикодегидрогеназ; остаточный фермент способен был превращать яблочную кислоту в молочную. Свойства этого фермента исследовали Шютц и Радлер (1973) и Лонво (1975).
В личном сообщении д-р Лондон (Национальный институт здравоохранения, Мериленд, США) подтверждает существование двух ферментов, способных использовать яблочную кислоту (независимо от маликодегидроге- наз). Наиболее известный в биохимии истинный яблочнокислый фермент проявляет максимальную активность при
pH 8,5 и не синтезируется клетками, культивируемыми в среде, богатой глюкозой. Как было показано выше, он превращает яблочную кислоту в пировиноградную (см. рис. 15.27), а образование молочной кислоты связано с возможным присутствием лакти-. кодегидрогеназ; в этом случае оптическая природа образующейся молочной кислоты зависит от природы присутствующих лактикогидрогеназ.
Другой, менее известный фермент, который наиболее правильно было бы называть «яблочно-молочным ферментом», имеет максимум активности в кислой среде, и его синтез не подавляется присутствием большого количества глюкозы; его часто смешивают с яблочным ферментом в собственном смысле слова. Именно этот фермент участвует в яблочно-молочном брожении (Лонво, 1975), он превращает яблочную кислоту непосредственно в мо-
лочную, но возможные промежуточные реакции пока что не известны (см. рис. 15.27, реакция III). Возможно, что речь идет о простом декарбоксилировании, хотя этот тип реакции у гидроксилированной кислоты редко встречается в биохимии. Можно также предполагать, что промежуточным звеном является пировиноградная кислота и она остается фиксированной на белковой поверхности фермента, где восстанавливается в молочную кислоту самим яблочно-молочным ферментом, который в таком случае должен был бы обладать двумя видами активности. Таким образом, можно было бы объяснить невмешательство лак- тикодегидрогеназ и стереоспецифичность реакции и, следовательно, образование исключительно лишь молочной кислоты L(+). Лонво и Риберо- Гайон (1973) показали значение углекислотного электрода для исследования механизма этой реакции.
Более точно свойство яблочного фермента молочнокислых бактерий, выделенных из вина, определил Ла- фон-Лафуркад (1970). Этот автор показал, что в подавляющем большинстве штаммы обладают ферментом, активность которого не зависит от условий предшествующей культуры, некоторые же обладают индуктируемым ферментом, т. е. синтез которого индуктируется, если в питательной среде содержится яблочная кислота. Наконец, другие штаммы не проявляют никакой ферментативной активности, каковы бы ни были условия предшествующей культуры. Этот признак имеет важное значение для отбора штаммов, пригодных для использования в виноделии.
Известно, что реакция преобразования яблочной кислоты в молочную не сопровождается выделением энергии, которая могла бы использоваться химическим путем, это реакция эндо- 342
генного типа. Следовательно, это явление не является настоящим брожением, оно не позволяет бактериальным клеткам находить энергию, необходимую для их роста и размножения. Таким образом, яблочно-молочное брожение можно объяснить, только допуская возможность развития бактерий за счет других элементов вина, например, углеводов или азотистых веществ. Радлер (1958) подтвердил, что сахара должны неизбежно служить источником энергии для бактерий яблочно-молочного брожения, но необходимые количества исключительно малы; 1 г яблочной кислоты разлагается 10 мг бактерий (в сухой массе), которые требуют для своего роста 0,1 г сахара. В гетероферментативном брожении такое же количество сахара дает только 50 мг молочной кислоты, 26 мт спирта и 22 мг углекислого газа.
Азотистые вещества, также могли бы служить источником энергии. В действительности, параллельно с яблочно- молочным брожением наблюдается снижение белкового азота вина, следующее за увеличением содержания аммиачного азота вследствие дезаминирования органических азотистых веществ.
Наконец, не исключено, что другие компоненты вина могут служить источником энергии для развития бактерий яблочно-молочного брожения. В частности, мезоинозит, средняя концентрация которого составляет 0,5 г/л, иногда' исчезает в ходе этого явления, и его концентрация может даже упасть до нуля (Пейно и Лафон-Ла- фуркад, 1955). Такое разложение мезоинозита происходит без образования летучих кислот.
Разложение лимонной кислоты
О деградации лимонной кислоты молочнокислыми бактериями с обра-
зованием летучей -кислотности известно с давних пор. В частности, известно, что яблочно-молочное брожение иногда сопровождается более или менее глубоким разложением лимонной кислоты, которая ответственна за увеличение летучей кислотности, наблюдаемое во время брожения.
сн2-соон
но-с-соон
I
CHn-COOh
Лимонная кислота
Г"сн-соониксуснаякислотаГ"сн-соониксуснаякислотасо.со.Ааетилкофермент ААаетилкофермент Асн2-соон I
Г"
сн-соониксуснаякислота
Г"
сн-соониксуснаякислота
со.
со.
Ааетилкофермент А
Ааетилкофермент А
со-соон
Шдбвлебоумусная
кислота
С ООН I с=о
HS-CoA ।
/ СН3
уПиробиноградная
кислота
Ацетоиновые дещестба-бутандиол-2.3, ацетоин
МолочнаякислотаМолочнаякислотаРис. 15.28. Разложение лимонной кислоты молочнокислыми бактериями.
Молочнаякислота
Молочнаякислота
Исследуя баланс этого разложения, Шарпантье и сотрудники (1951) и Шарпантье (1954) показали, что одна молекула лимонной кислоты дает от 1,2 до 1,5 молекулы уксусной кислоты, очень малое количество молочной кислоты и от 0,2 до 0,3 молекулы ацетоиновых веществ (бутандиол-2,3 и ацетоин). Основываясь на предыдущих работах и на результатах собственных исследований, эти авторы предложили механизм деградации, включающий разрыв лимонной кислоты на щавелево-уксусную кислоту и уксусную (рис. 15.28). Первая декар
боксилируется в пировиноградную кислоту, которая сама по себе лежит в основе молочной .кислоты, с одной стороны, и ацетоиновых веществ (бутандиол-2,3 и ацетоин), с другой, посредством описанных выше реакций (см. рис. 15.11). Эта пировиноградная кислота может также образовывать уксусную кислоту с помощью ацетилко- фермента А с образованием одной молекулы СО2 или в некоторых случаях муравьиной кислоты (см. рис. 15.11). Эта схема, которая включает двоякий источник уксусной кислоты, построена с учетом образования более одной молекулы этой кислоты на одну молекулу разложенной лимонной кислоты.
Разложение глицерина — болезнь прогоркания
Использование глицерина бактериями и особые характеристики, которые оно придает вину, описано многими авторами, хотя этот случай встречается относительно редко. Однако механизмы, посредством которых осуществляется это разложение, остаются невыясненными. Кроме того, не определен баланс этого превращения, аналогичный приведенному выше относительно разложения лимонной кислоты. Рис. 15.29 составлен на основе общих сведений о разложении глицерина различными микроорганизмами. С одной стороны, это вещество превращается в пировиноградную кислоту сначала путем реакций, обратных реакциям глицерино-пировиноградно- го брожения (см. рис. 15.14), и затем путем гликолиза (см. рис. 15.10), с другой — оно трансформируется в акролеин и пропандиол-2,3 посредством особого механизма.
Таким образом, наряду с классическими продуктами бактериального метаболизма отмечают образование акролеина, который является ответствен-
СН2ОН I с нон I
СН2ОН
Обратная реакция глицерино- пиробинограОного брожения
СН2ОН с=о — сн2о-®
С НО
соон
— снон с=о
IГликолиз ।
Дигидроксиацетон-
с но н;°
СН2ОН
Альдегид ^-гадрокси- ороаионобый
С НО
- сн
II
сн2
Акролеин
фосфат
сн2о-®сн3
Глицеринальдегид-3-Пиробиногридная
Янтарная кшлота
NADH2
^NAD CH2OH
СН2
сн2он
Поопандиол-1,3
Рис. 15.29. Разложение глицерина молочнокислыми бактериями.Рис. 15.29. Разложение глицерина молочнокислыми бактериями.
Рис. 15.29. Разложение глицерина молочнокислыми бактериями.
Рис. 15.29. Разложение глицерина молочнокислыми бактериями.
NAD NADH2NAD NADH2СООНСНзУксуснаякислота *?СООНСНзУксуснаякислота *?ПироВинограднаякислота*?:ПироВинограднаякислота*?:
NAD NADH2
NAD NADH2
СООН
СНз
Уксуснаякислота *?
СООН
СНз
Уксуснаякислота *?
ПироВинограднаякислота*?:
ПироВинограднаякислота*?:
Механизм II
СООН ■ I с нон
Н2О СООНNAD
AINADH2 /
/с=о ^ у
соон
снон
СООНNAD СООН
Inadh2 /
сн у J
ЛН2
снон
сн2
' СН2
сн
СН2
соон
соон
соон
СООН
соон
Винная
Даделедоуксусная
Яблочная
Фумаробая
Янтарная
кислота *3
кислота *3
кислота *1
кислота*!
кислота к;
co2V х2
СООН I с=о
сн3
ным за особые органолептические характеристики «прогорклых вин» вследствие его связи с фенольными соединениями (Ренчлер и Таннер, 1951). Сбраживание глицерина дает также пропандиол-3 (Вуд, 1961), присутствие которого в больных винах кажется пока недоказанным. Наконец, обнаруживается муравьиная кислота (Вуд, 1961), которая (получается от перехода пировиноградной кислоты в уксусную с помощью ацетилкофермента А (см. рис. 15.11).
Разложение винной кислоты — пропионовокислое брожение (турн)
Лишь ограниченное число молочнокислых бактерий вина способно разлагать винную кислоту. Это разложение представляет собой серьезную болезнь вина — турн, иногда довольно частое явление, но в настоящее время встречающееся все реже и реже вследствие прогресса в технике хранения вина.
Механизм разложения винной кислоты исследовали Крампиц и Линен (1964) и особенно Радлер и Я-нисис (1972).
Из анализа балансов, полученных на различных штаммах, Радлер и 'Янисис сделали вывод, что известны .два пути разложения винной кислоты (рис. 15.30). Lactobacillus plantarum используют механизм I, который соответствует образованию из двух молекул винной кислоты трех молекул СО2, одной молекулы уксусной кислоты и одной молекулы молочной кислоты. Lactobacillus brevis использует механизм II, который соответствует образованию из трех молекул винной кислоты четырех молекул СО2, двух молекул уксусной кислоты и одной молекулы янтарной кислоты. В этих двух механизмах обеспечивается равновесие (кисления-восстановления в
том смысле, что число молекул NAD, восстанавливаемых в NADH2, равно числу молекул NADH2, окисляемых в NAD..
ПРЕВРАЩЕНИЯ, ВЫЗЫВАЕМЫЕ УКСУСНОКИСЛЫМИ БАКТЕРИЯМИ
Окисление спирта — уксусное скисание
Основное превращение, вызываемое уксусными бактериями, представляет собой окисление этилового спирта в уксусную кислоту, т. е. уксусное скисание. Часто говорят об «уксуснокислом брожении», хотя этот процесс является аэробным й нуждается в большом количестве кислорода.
Установлено, что для уксуснокислых бактерий известны два пути окисления этилового спирта с переходом через ацетальдегид, соответствующие различным ферментативным комплексам (Дивие, 1970).
Один из этих комплексов растворим, он находится в экстракте измельчённых бактерий; вводит в реакцию алкогольдегидрогеназу и альдегиддегидрогеназу, которые спарены с молекулами NAD на основе механизма, показанного на рис. 15.31, соответствующего общему уравнению ' сн3 — сн2он + О2 СН3 — соон + Н2О.
Вторичное окисление NADH2 происходит за счет кислорода воздуха с помощью дыхательной цепи, включающей различные системы переносчиков электронов; такое повторное окисление сопровождается выделением энергии в виде молекул АТФ.
Другим путем окисления спирта яв- .ляется нерастворимый ферментативный комплекс в виде частиц — переносчиков водорода (или электронов), фиксирующихся на цитоплазменной мембране бактерий; общий механизм
Рис. 15.31. Окисление спирта в уксусную кислоту за счет кислорода воздуха уксуснокислыми бактериями.
I с=оI СН2ОНI с=оI СН2ОНкето - S-Глюконобаякислотакето - S-Глюконобаякислота
I с=о
I СН2ОН
I с=о
I СН2ОН
кето - S-Глюконобаякислота
кето - S-Глюконобаякислота
С' снон-с-онно-с-нн-с-онн-<*:-он।СН2ОНВ- Глюкоза
соон
н-с-он I
но-с-н
н— с-он
н-с-он I сн2он D- Глюкакабая
^Н2ОН с=о
I но-с-н
Iн-с-он
н-с-он
сн2он
сн2он
с=о но-с-н Н-с-он
^=о
СН2ОН
кето -5-Фруктоза
СНОсно
н-с-онс=о
но- с-н но-^- н
н-с-онн-с-он
сн,онсн3он
СюзанаКсилозам
Рнс. 15.32. Продукты окисления сахаров уксуснокислыми оактериями.
окисления этанола остается тот же. Существование этих двух ферментативных комплексов ответственно за способность бактерий окислять спирт с различной скоростью в кислой или нейтральной среде (Дюпюи и Можене, 1962).
Некоторые бактерии могут реализовать частичное окисление уксусной кислоты в СО2 и Н2О, и соответствующая характеристика служит тестом для их классификации (Дивие и Дюпюи, 1969). Уравнение записывается:
СН3 — СООН + -2О2 2СО2 + 2Н2О.
В этом случае общее уравнение уксуснокислого брожения приобретает вид
СН3 — СН2ОН + ЗО2 -> 2СО2 + ЗН2О.
Точно так же уксуснокислые бактерии вызывают частичную этерификацию уксусной кислоты этиловым спиртом в соответствии с реакцией
сн3 - соон + сн3 — сн2он ^ сн3 - со - о — сн2 - сн3 + н2о.
Этилацетат играет важную роль в энологии; он ответственен за особые органолептические качества вин, пораженных при уксусном скисании.
Окисление сахаров
Кстогенность уксуснокислых бактерий обычно используется как тест классификации. Она соответствует их способности окислять сахара с образованием веществ, обладающих функцией кетонов. Различие между сахарами и этими кетоновыми веществами показано на рис. 15.32, который не предусматривает тесноовязанных механизмов и промежуточных реакций. О многих из этих веществ сообщали Вюрдиг и Шлоттер (1969), а также Салве и Пейно (1971). Кетоновые ве
щества присутствуют во всех винах, но их особенно много в винах, полученных из винограда, на котором гниль вызвала растрескивание ягод и развитие уксуснокислых бактерий. Кетоновые вещества также участвуют в связывании сернистого ангидрида.
ЛИТЕРАТУРА
Barre В. (1972), Rev. Franc. OenoL, 45, 37.
Barre В., Coutu C. e t Gasser F. (1971), C. R. Acad. Sci„ 237 D, 1068.
Bertrand A. et Ribereau-Gayon P. (1968), C. R. Acad. ScL, 267D, 1896.
Blouin J. et Peynaud E. (1963), C. R. Acad. ScL, 256, 4521.
Carles J., Lamazou-Betbeder H. et Pech R. (1958), C. R. Acad ScL, 246 D, 2160.
С a r 1 e s J., L а у о 11 e J. et L a 11 e s A. (1966), C. R. Acad. ScL, 262 D, 2788.
Carles J., Talieu-Rousseau M. et Mont ant C. (1967), C. R. Acad. ScL, 265 D. 1183.
Charpentie Y. (1954), Ann. Technol. agric., 3, 89.
Charpentie Y., Ribereau-Gayon J. et Peynaud E. (1951), Bull. Soc. Chim. biol., 44, 1969.
Conn E. E. e t S t u m p f P. K. (1972), Outlines of biochemistry, John Wiley and Sons Inc., New York.
Dimotaki-Kourakou V. (1962), C. R. Acad. ScL, 254 D, 4030.
D 111r 1 ch M. M. et Staudenmayer T. M. (1968), Deutsch. Weinzeitung, 104, 707.
Di vies C. (1970), Ann. Technol. agric., 19, 187.
Di vies C. et Dupuy P. (1969), Ann. Technol. agric., 18, 339.
Dubernet M. O., Bertrand A. et Ribereau-Gayon P. (1974), C. R. Acad. ScL, 279 D, 156.
Dub us G. (1969), Contribution a 1 elude de 1’acide citramalique dans les vins, These 3 e cycle, Bordeaux.
Dupuy P. et Maugenet J. (1962), Ann. Technol. agric., 11, 219.
Dupuy P., Mor faux J. et Usciati M. (1967), Fermentations et vinifications, 2 е Symposium intern. d'Oenologie de Bordeaux, p. 107.
Eschenbruch R. (1972), Ш 3 Symposium intern. d’Oenologie, Le Cap (Afrique du Sud).
Fuch et R a d 1 e r F. (1972), Arch. Mickro- biol., 87, 149.
Gayon U. et Dubourg E, (1894), Ann. Inst. Pasteur, 8, 108 et 1901.
G enevois L. (1936), Bull. Soc. Chim. biol., 18, 295.
Guimberteau G. (1969), Conn. Vigne Vin, 3, 1.
Guymon J. G. (1966), Developments in Industrial Microbiology, Vol. 7, American Institute of Biological Sciences, Washington.
Ingraham J. L. et Guymon J. F. (1960), Arch. Biochem. Biophys., 88, 157.
Ingraham J. L., Guymon J. F. et Crowell E. A. (1961), Arch. Biochem. Biophys., 95 169.
Jo Ichi ne J. (1962), Bull. Soc. Chim. biol., 44, 337.
К r a m p i t z L. O. e t L у n e n F. (1964), Biochem. Z., 341, 97.
Lafon M. (1955), Contribution a Tetude de la formation des produits secondaires de la fermentation alcoolique, These Sciences physiques, Bordeaux.
Lafon-Lafourcade S. (1970), Conn.
Vigne Vin, 4(3), 273.
Llaguno C., Fernandes M. J., Garrido M. D. et Garrido J. (1970), Conn. Vigne Vin, 4, 123.
Lonvaud M. (1975), Recherches sur Tenzy- me des bacteries lactiques du vin assurant la transformation du malate en lactate, These 3 е cycle, Bordeaux.
Lonvaud M. et Ribereau-Gayon P. (1973), C. R. Acad. Sci., 276 D, 2329.
Peynaud E. (1938), Ann. Falsif. Fraudes, 31, 392.
Peynaud E. (1939), Ann. Ferm., 5, 321.
Peynaud E. (1946), Contribution a Tetude biochimique de la maturation du raisin et de la composition des vins. These Ingenieur- Docteur, Bordeaux.
Pe ynaud E. (1947), Rev. Ferm. Ind. alim., 2, 150 et 189.
Peynaud E. (1968). C. R. Acad. Sci., 267, 121.
Peynaud E., Domereq S., Boidron A.. M., Lafon-Lafourcade S. et Guimberteau G. (1964), Archiv. fiir Mikrobiol., 48, 150.
Peynaud E. et Gumberteau G. (1958), Ann. Falsif. Fraudes, 51, 70.
Peynaud E. et Lafon-Lafourcade S. (1955), Ann. Technol. agric., 4, 381.
Peynaud E. et Lafon-Lafourcade S. (1963), C. R. Acad. Sci., 256, 4521.
Peynaud E. et Lafon-Lafourcade S. (1970), C. R. Acad. Sci., 270 D, 228.
Peynaud E., Lafon-Lafourcade S. et Guimberteau G. (1967 a), Antonie van Leeuwenhoek, 33, 49.
Peynaud E., Lafon-Lafourcade S. et Guimberteau G. (1967 b), Rev. Ferm. Ind. alim., 22, 61.
Peynaud E. et Sudraud P. (1964), Ann. Technol. agric., 13, 335.
Radler F. (1958), Archiv. Mikrobiol., 31, 224.
R a d 1 e r F., S c h ii t z M. e t D о e 11 e M. W. (1970), Die Naturwissenschaften, 57, 672.
Radler F. et Y a n ni s si s C. (1972), Archiv. Mikrobiol., 82, 219. .
Rankine В. C. (1963), J. Sci. Fd. Agric., 14, 79.
Rentschler H. et Tanner M. (1951), Mitteil. Geb. Lebensm. unters. Hygiene, 42, 463.
Ribereau-Gayon J., Peynaud E. et Lafon M. (1955), Bull. Soc. Chim. biol., 37, 457.
Sap is J. C. (1967), Contribution a Tetude dans- les vins du tyrosol, du tryptophol, de Taicool phenylethylique et de la y-butyrolacto- ne, produits secondaires de la fermentation alcoolique. These 3е cycle, Bordeaux.
Sap is J. C. et Peynaud E. (1971), Conn. Vigne Vin, 5, 217.
SchiitzM. et Radler F. (1973), Arch. Mikrobiol., 91, 183.
Senthe Shanmuganathan S. et Els- den R. (1958), Biochem. J., 69, 210.
Ventre J (1937), Ann. Ferm., 3, 447.
Weeks C. (1969),.Am. J. Enol. Vitic., 20, 32.
Wood W. A. (1961), The Bacteria, edite par Gunsalus J. C. et Stanier R. Y., Academic Press, New York.
Wiirdig G. etSchlotterM. A. (1968), Wein-Wissens, 23, 356; 1969, 24, 67; 1970, 25 283.
Wiirdig G. et Schlotter M. A. (1971), Dt. Lebensm. Rdsch., 17, 86.
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие к русскому изданию . . .5
Часть первая
ТИПЫ И ХАРАКТЕРИСТИКА ВИН
Глава 1. Понятия качества и типа вин
Определение качества7
Научные и технические аспекты проблемы качества 8
Случайный характеркачества ....9
Контроль качества 11
Натуральное вино и вмешательство человека 11
Стадии производствавина12
Различные типы виноградников и вин . Традиционные вина текущего потребления и гибридные вина Купажирование вин Заключение Литература
Глава 2. Дегустация. Вкусовая характеристика вин
Механизм дегустации
Зрительные ощущения
Обонятельные ощущения
Вкусовые ощущения
Стойкость
Другие ощущения
Трудности дегустации
Причины возможных ошибок . . . Техника дегустации
Практические правила дегустации . .
Дегустационные бокалы
Помещения для дегустации . . . . Различные темы дегустации . . . . Трехсторонняя дегустация Коллективная дегустация Дегустационные листки Оценка вин в баллах Значение дегустационной экспертизы . . Зависимость между составом вин и их вкусовыми характеристиками . . . .
Равновесие между компонентами вкусовых свойств Показатель бархатистости Терминология дегустации
Мягкие вина :
«Мужественные», полные вина . . .
Маслянистые вина
Зеленые вина
Кислый вкус
Белые вина:
Характеристика аромата и букета . .
Определения .
Присутствие первичного аромата в кожице ягод винограда Летучие вещества и характеристика запахов Обучение дегустации
Упражнения по теоретической дегустации Упражнения по аналитической дегустации Упражнения по прикладной дегустации Литература
Часть вторая
Глава 3. Описание и состав винограда 59Этапы развития винограда59Состав и форма грозди62Глава 3. Описание и состав винограда 59Этапы развития винограда59Состав и форма грозди62СЫРЬЕ: ВИНОГРАД И ЕГОСОЗРЕВАНИЕ
Глава 3. Описание и состав винограда 59
Этапы развития винограда59
Состав и форма грозди62
Глава 3. Описание и состав винограда 59
Этапы развития винограда59
Состав и форма грозди62
1213141515121314151516181920222424242526272829313334343637383940414144444546474848505152525557571618192022242424252627282931333434363738394041414444454647484850515252555757Состав гребня62
12
13
14
15
15
12
13
14
15
15
16
18
19
20
22
24
24
24
25
26
27
28
29
31
33
34
34
36
37
38
39
40
41
41
44
44
45
46
47
48
48
50
51
52
52
55
57
57
16
18
19
20
22
24
24
24
25
26
27
28
29
31
33
34
34
36
37
38
39
40
41
41
44
44
45
46
47
48
48
50
51
52
52
55
57
57
Состав семян63-
Состав кожицы65
Структура и состав мякоти68
Сахара69
Органические кислоты70
Минеральные вещества71
Азотистые вещества71
Пектиновые вещества72
Ароматические вещества72
Литература74
Глава 4. Исследование созревания винограда 75
Отбор и подготовка проб76
Увеличение винограднойягоды...77
Накопление сахаров78:
Миграция фотосинтезированных глю- цидов в листьях во времясозревания78:
Отношение между сахаристостью и температурой80
Отношение глюкозы к фруктозе...81
'Миграция минеральных веществ...81
Респирация винограда83:
Изменение содержания органических кислот 86
Синтез винной и яблочной кислот..87
Изменение содержания винной кислоты 88
Изменение содержания яблочной кислоты 89-
Изменение содержания кислот в гребне и в кожице90
Изменение содержания азотистых веществ 91
Изменение содержания фенольных соединений 92
Изменение содержания витаминов группы В 94
Определение зрелости94
Показатель созревания95
Фиксирование даты сбора винограда . 97
Факторы созревания и качества винограда 99'
Сравнительный состав винограда различных сортов99
Выбор сорта в зависимости от климата 100 Влияние подвоя и возраста насаждений 101
Влияние климатологических условий года. Понятие о миллезиме (год урожая, давший вино особо высокого качества) 104
Изменяемые факторы: обрезка, агротехнические приемы, удобрение почвы 105 Случайные факторы: болезни и неблагоприятные метеорологические условия 106
Литература108
Часть третья
ДРОЖЖИ — ВОЗБУДИТЕЛИСПИРТОВОГО БРОЖЕНИЯ
Глава 5. Цитология, систематика .и экология винных дрожжей111
Цитология дрожжей112
Клеточная оболочка 112
Цитоплазма и ее органоиды . . . .113
Ядро114
Размножение дрожжей115
Бесполое размножение115
Половое размножение116
Химический состав дрожжей . . . .118
Классификация дрожжей118
Место винных дрожжей в новой классификации 119
Тесты классификации дрожжей . . . 120
Экология и распространение дрожжей . 131
Дрожжи виноградарских районов Италии 134
Дрожжи других зарубежных винодельческих районов135
Дрожжи винодельческих районов Франции138
Литература 150
Глава 6. Описание основных видов винных дрожжей152
Винные дрожжи рода Brettanomyces
Куфферат и Ваи Лаер152
Морфологические признаки дрожжей Brettanomyces intermedius153
Физиологические характеристики . .153 Энологическое значение дрожжей
Brettanomyces154
Винные дрожжи рода Candida Бергут . 154
Краткое описание рода154
Candida vini Ван Уден и Бакли . . .155 Морфологические признаки и физиоло- гиче^кие характеристики 155
Винные дрожжи рода Hanseniaspora Зи- жес156
Краткое описание рода156
Физиологические характеристики . . 157 Энологическое значение дрожжей
Hanseniaspora uvarum157
Винные дрожжи рода Hansenula Сидов 158 Морфологические особенности дрожжей Hansenula Anomala . . . . . . .158 Физиологические характеристики . . 159 Энологическое значение дрожжей Hansenula ...159
Винные дрожжи рода Kluyveromyces
Ван дер Вальт159
Морфологические особенности дрожжей К. veronae160
Физиологическиехарактеристики..160
Энологическоезначениедрожжей
К- veronae161
Винные дрожжи рода Metschnikowia Ка- менски161.
Metschnikowia pulcherrima Питт и
Миллер 161
Винные дрожжи рода Pichia Ганзен . 162
Морфологические особенности . . .162
Физиологические характеристики . . 162
Винные дрожжи рода Saccharomyces
Реес163
Краткое описание рода163
Ключ идентификации наиболее распространенных видов дрожжей Saccharomyces 163
Saccharomyces aceti Санта Мария . .168
Saccharomyces bailii Линднер .. . 168
Saccharomyces bayanus Саккардо . .168 Saccharomyces capensis Ван ^cp Вольт и Чейнер169
Saccharomyces chevalieri Гильермон . 169
Saccharomyces coreanus Сайто . . . 170
Saccharomyces delbrueckii Линднер . 170
Saccharomyces ellipsoideus Ганзен . . 170 Saccharomyces exiguus Ганзен . . .171 Saccharomyces fermentati (Сайто) Лоддер и Крегер-Ваи Риж171
Saccharomyces florentinus (Кастелли)
Лоддер и Крегер-Ван Риж . . . . 172
Saccharomyces globosus Остервальдер 172 Saccharomyces heterogenicus Остервальдер 172
Saccharomyces inconspicuus Ван дер Вальт173
Saccharomyces italicus Кастелли . .173
Saccharomyces oviformis Остервальдер 174 Saccharomyces prostoserdovii Кудрявцев 175
Saccharomyces rosei (Гильермон) Лоддер и Крегер-Ван Риж175
Saccharomycesrouxii Бутру....176
SaccharomycesuvarumБейеринк..176
Винные дрожжи рода Saccharomyces Ганзен177
Дрожжи рода Schizosaccharomyces Линднер 179
Винные дрожжи родаTorulopsis Берлезе 180
Краткое описаниерода180
Torulopsis stellata (Кремер и Крум- гольц) Лоддер180
Литература£83
Глава 7. Условия развития и активно
сти дрожжей185
Анализ микробиального роста 1 . . . 185
Рост дрожжей . . \186
Необходимость кислорода для развития дрожжей■. . . . 188
Эффект постоянной аэрации189
Демонстрация действия кислорода подсчетом дрожжевых клеток191
Эффект кратковременной аэрации . . .
Аэрация в различные моменты брожения -
Изменение условий аэрации в различные периоды брожения
Измерение окислительно-восстановительного потенциала
Изменения окислительно-восстановительного потенциала при брожении с доступом воздуха и без доступа . . Изменения окислительно-восстановительного потенциала при кратковременной аэрации во время брожения . .
Влияние температуры
Влияние температуры на метаболизм дрожжей
Влияние температуры на скорость и предел брожения виноградного сусла Изменение температуры во время брожения
Потребности дрожжей в минеральных веществах Питание дрожжей азотистыми веществами
Влияние различного содержания азота на обмен веществ у дрожжей . . . Эффект обогащения сусла аммиачным азотом
Ассимиляция аминокислот
192194195195196196197198200202203204204206192194195195196196197198200202203204204206Содержание аминокислот в дрожжах . 208 Выделение аминокислот живыми н
192
194
195
195
196
196
197
198
200
202
203
204
204
206
192
194
195
195
196
196
197
198
200
202
203
204
204
206
мертвыми дрожжами209
Влияние кислотности на развитие дрожжей . 210
Литература211
Глава 8. Факторы роста дрожжей и активаторы брожения212
Факторы роста213
Биотин■213
Пиридоксин. 214
Тиамин214
Пантотеновая кислота 214
Мезоинозпт215
Никотинамид215
Парааминобензойная кислота...215
Птероплглутаминовая кислота...215
Рибофлавин215
Содержание факторов роста в суслах и винах216
Эволюция факторов роста во время спиртового брожения216
Потребности дрожжей в факторах роста 219
Влияние обогащения сусла факторами роста219
Активаторы брожения221
Активация ацетальдегидом и пировиноградной кислотой221
Активация стеринамп и жирными кислотами с длинной цепью 223
Активация концентрированными экстрактами дрожжей Активирование продуктами грибного происхождения Присутствие активаторов в мицелии Botrytis Заключение Литература
Глава 9. Явления дрожжей . . . .
ингибированияингибированияВлияние спирта на активность дрожжей Влияние сахаристости сусла Вещества, ингибирующие дрожжи . . .
ингибирования
ингибирования
Химические антисептики
Противогрибковые антибиотики . . . Механизм действия ингибиторов иа метаболизм дрожжей
Природные ингибиторы винограда и вии Явления антибиоза и антагонизма . . Эффект антйбиотической активности культур Botrytis cinerea на дрожжи . Разделение ботритицина Условия продуктивности и эффективности ботритицина
Литература
226227228229230’226227228229230’232 233.234236236238. 239'239-239241243.244232 233.234236236238. 239'239-239241243.244Часть четвертаяВОЗБУДИТЕЛИ БАКТЕРИАЛЬНЫХБРОЖЕНИИ
226
227
228
229
230’
226
227
228
229
230’
232 233.
234
236
236
238. 239'
239-
239
241
243.
244
232 233.
234
236
236
238. 239'
239-
239
241
243.
244
Глава 10. Морфология, систематика, экология молочнокислых бактерий вина 245- Морфология молочнокислых бактерий . 245-
Структура бактериальной клетки . . 246
Размножение бактерий249
Гомо- или гетероферментативная характеристика 249
Общая классификация винных бактерий 250 Экология и распространение бактерий молочнокислого брожения250'
Присутствие молочнокислых бактерий иа винограде 250-
Присутствие молочнокислых бактерий в подвалах . 252.
Присутствие молочнокислых бактерий в винах252
Молочная кислота L(-t-) как контроль присутствия молочнокислых бактерий в виноделии252
Распространение различных видов молочнокислыхбактерий254
Литература255
Глава И. Описание основных видов молочнокислых бактерий, выделенных из вин257
Гомоферментативные кокки259
Pediococcus cerevisiae — штамм Jal .259
Pediococcus pentosaceus — штамм B44 261
Гетероферментативные кокки . . . . 261
Leuconostoc gracile—штамм ВСЗЗ . 261
Leuconostoc oinos (A+) — штамм Bz3 262 Leuconostoc oinos (X+) — штамм
SC122 :263
Leuconostoc oinos (P+) — штамм Ft2 263
Гомоферментативные бациллы . . . . 264
Lactobacillus plantarum—штамм LAI 264 Lactobacillus casei bap. casei — штамм
Q16 .:265
Streptobacterium sp. — штамм El . ■ 266
Гетероферментативные бациллы . . . 266
Lactobacillus fructivorans—штамм Bnl 266
Lactobacillus dcsidiosus—штамм CV241 267
Lactobacillus hilgardii — штамм PM4 267
Lactobacillus brevis — штамм VF1 . . 268
Глава 12. Условия развития и активности молочнокислых бактерий вина . . 269 ■Способы исследования роста бактерий . 269
Подсчет общего количества клеток и числа живых клеток269
Эволюция молочнокислых брожений . 270
Способы исследования активности бактерий 274
Природа яблочно-молочного фермента 274 Разложение яблочной кислоты молочнокислыми бактериями, не размножающимися делением274
Влияние pH275
Влияние температуры279
Влияние аэрации 280
Азотистое питание бактерий 281
Потребность в факторах роста ....284
Потребность в минеральных элементах285
Ингибирующее действие спирта...286
Ингибирующее действие сернистого ангидрида' 287
Другие ингибирующиевещества...289
Антагонизм дрожжи —бактерии...291
Способность вин к яблочно-молочному брожению291
Литература292
Глава 13. Превращения вина, вызываемые бактериями. Яблочно-молочное брожение и болезни294
"Яблочно-молочное брожение294
Первые исследования яблочно-молочного брожения . . Ц—г—.—- . . . 294
Бактерии полезные и бактерии вредные 295
Увеличение летучей кислотности в молодых винах297
Образование летучих веществ . . . 298
Ожирение, или болезнь тягучих вин . . 299 Молочнокислое сбраживание сахаров или молочнокислое скисание300
Ликерные вина .. . 301
Десертные вина302
Молочнокислое сбраживание винной кислоты, или тури302
Молочнокислое сбраживание глицерина, или прогоркание305
Литература307
Глава 14. Уксуснокислые бактерии . 308
Выделение в культуру уксуснокислых бактерий309
Классификация уксуснокислых бактерий 309
Уксуснокислые бактерии, выделенные из винограда и вин310
Факторы развития уксуснокислых бактерий 312
Испытание вин на устойчивость к скисанию и профилактические обработки . . 313 Литература315
Часть пятая
БИОХИМИЯ БРОЖЕНИИ
Глава 15. Механизмы брожений . . 316
Кофакторы317
Гликолиз319
Анаэробные превращения пировиноградной кислоты320
Разложение сахаров дрожжами...321
Спиртовое брожение321
Глицерино-пировиноградноеброжение324
Вторичные продукты, образующиеся из пировиноградной кислоты 325
Баланс вторичных продуктов глицери- по-пировиноградного брожения . . . 327
Другие превращения, вызываемые дрожжами . . . 329
Брожение в присутствии уксусной кислоты 329
Разложение яблочной кислоты...330
Метаболизм азотистых компонентови
образование высших спиртов...331
Восстановление сульфатов в сульфиты и в сероводород333
Разложение . сахаров молочнокислыми бактериями336
Разложение гексоз гомоферментативны- ми бактериями336
Разложение гексоз гетероферментатив- ными бактериями — молочнокислое скисание337
Разложение пентоз340
Другие превращения, вызываемые молочнокислыми бактериями340
Разложение яблочной кислоты — яблочно-молочное брожение340
Разложение лимонной кислоты . . . 342
Разложение глицерина — болезнь прогоркания 343
Разложение винной кислоты — пропионовокислое брожение (турн) . . . . 345
Превращения, вызываемые уксуснокислыми бактериями 345
Окисление спирта — уксусное скисание 345
Окисление сахаров347
Литература347
1 — контрольные живые клетки; 2 — аэра
ция на 8-й день; 3 — аэрация на 4-й день; 4 —
Traite d’oenologie—
SCIENCES ET TECHNIQUES
DU VIN
Tome 2 — Caracteres des vins • Maturation du raisin Levures et bacteries
Par
Jean RIB6REAU-GAYON Professeur a I'Universite de Bordeaux II Directeur honoraire de la Station agronomique et oenologique de Bordeaux Directeur de I'lnstitut d’oenologie
Emile REYNAUD
Directeur du Service des Recherches
de la Station agronomique et oenologique de Bordeaux
Pascal RIBEREAU-GAYON
Professeur a I'Universite de Bordeaux II
Directeur de la Station agronomique et oenologique de Bordeaux
Pierre SUDRAUD,
Directeur de laboratoire. ,
du Service de la repression des fraudes et du^o^trole de la qualite Directeur de la Station agronomique et oenologique de §qrdeaux-
Dunod - Paris - 1975
GM^^3GM^^3
GM^^3
GM^^3
Ж. Риберо-ГайонЭ. Пейно
П. Риберо-ГайонП. Сюдро
ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА
ВИНОДЕЛИЯ
ДРОЖЖИ И БАКТЕРИИ
Перевод с французского Ф. Д. ШИТИКОВА
Под редакцией д-ра техн, наук,заслуженного деятеля науки УССРпроф. Г. Г. ВАЛУЙКО
ГЕСЛУБЛГЕСЛУБЛг'Mlг'Ml
ГЕСЛУБЛ
ГЕСЛУБЛ
г'Ml
г'Ml
МП”** <?■-• *
•Т. Омж«*»килзе СО АССР
МОСКВА • «ПИЩЕВАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ» • 1979
36.87
P3I
УДК 663.251/.252=03.40
ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА ВИНОДЕЛИЯ. Т. 2. Характеристика вии. Созревание винограда. Дрожжи и бактерии. Риберо-Гайон Ж-, Пей и о Э., Рнбе ро-Г а ft- он П., Сю др о П., пер. с франн., 1979.
В книге рассмотрены типы и приведены характеристики вин. Описано сырье для виноделия — виноград и его созревание.
Изложены вопросы спиртового брожения: цитология, систематика и экология винных дрожжей, их основные виды, условия развития и активности, факторы и явления ингибирования, активаторы брожения.
Освещены вопросы бактериального брожения: морфология, систематика, экология молочнокислых бактерий вина, их класонф1нюация и виды, условия развития.
Приведены новейшие достижения энологии франции.
Таблиц 116. Иллюстраций 121. Список литературы — 770 названий.
Жан Риберо-Гайон
Эмиль Пейно
Паскаль Риберо-Гайон Пьер Сюдро
ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА ВИНОДЕЛИЯ
Т. 2. ХАРАКТЕРИСТИКА ВИН. СОЗРЕВАНИЕ ВИНОГРАДА. ДРОЖЖИ И БАКТЕРИИ.
Редактор И. Н К о б ч и к о в а. Художник М. В. Носов. Художественный редактор В. В. Чуракова. Технический редактор Н. Н. Зиновьева. Корректоры Т. Н. Бобрикова, М. А. Шег а л
ИБ № 815
Сдано в набор 06.02.79. Подписано в печать 25.10.79. Формат 70 X90716. Бумага типографская № 1. Литературная гарнитура. Высокая печать. Объем 22,0 п. л. Уел. п. л. 25,74. Уч.-изд. л. 27,99. Тираж 5 700 экз. Заказ 1929. Цена 2 р. 30 к.
Издательство «Пищевая промышленность»,|
113035, Москва, М-35, 1-й Кадашевский пер., 12.^Вч^*®|
'г
Московская' типография № 8 Союзполиграфлрома пр^ГосударствеАгом комитете СССР по делам издательств, полиграфии и книжной торпщлш.''*.,.«
Хохловский пер., 7.
РР31709—057044(01)—7931709—057044(01)—7957—7957—7929080000002908000000(С) Bordas, Paris, 1975@ Перевод на русский язык. Издательство «Пищевая промышленность», 1979 г.(С) Bordas, Paris, 1975@ Перевод на русский язык. Издательство «Пищевая промышленность», 1979 г.
Р
Р
31709—057
044(01)—79
31709—057
044(01)—79
57—79
57—79
2908000000
2908000000
(С) Bordas, Paris, 1975
@ Перевод на русский язык. Издательство «Пищевая промышленность», 1979 г.
(С) Bordas, Paris, 1975
@ Перевод на русский язык. Издательство «Пищевая промышленность», 1979 г.