Книга
← К списку книгЗагрузка разделов…
активнаАктивные записи участвуют в каталоге и синках. Неактивная книга скрыта, но не удалена из базы.
Книга
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АБК
АВА
— абсцизовая кислота
АГ
AG
— аппарат (комплекс) Гольджи
АДГ
ADH
— алкогольдегидрогеназа
АДФ
ADP
— аденозин-5'-дифосфат
АЛК
6А1А
— б-аминолевулиновая кислота
АМФ
АМР
— аденозин-5'-монофосфат
цАМФ
сАМР
— цикло-аденозин-3', 5'-монофосфат
АТФ
АТР
— аденозин-5'-трифосфат
АТФаза
ATPase
— аденозинтрифосфатаза
Н+АТФаза
H+ATPase
— Н+аденозинтрифосфатаза (протонная помпа)
АФК
AOS
— активные формы кислорода
АФС
APS
— аденозин-5'-фосфосульфат
АЦК
ACC
— 1-аминоциклопропан-1-карбоновая кислота
БТШ
HSP
— белки теплового шока
гдг
GDG
— глутаматдегидрогеназа
ГДФ
GDP
— гуанозин-5'-дифосфат
ГТФ
GTP
— гуанозин-5'-трифосфат
ГК
GA
— гиббереллин
ГК3
GA3
— гибберелловая кислота
ГОГАТ
GOGAT
— глутамин: оксоглутарат аминотрансфераза (глутаматсинтаза)
ГС
GS
— глутаминсинтаза
TST
GST
— глютатион-S-трансфераза
ДГАФ(ФДА)
DHAP
— дигидроксиацетонфосфат
ДНК
DNA
— дезоксирибонуклеиновая кислота
кДНК
cDNA
— клонированная дезоксирибонуклеиновая кислота
мДНК
mDNA
— митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота
плДНК
plDNA
— пластидная дезоксирибонуклеиновая кислота
ИМК
IBA
— индол ил масляная кислота
ИПВК
IPA
— индолилпировиноградая кислота
ИУК
IAA
— индолил-3-уксусная кислота
КаМ
CaM
— кальмодулин
кс/дкс
Red/Far red
— красный свет/дальний красный свет
КС
CW
— клеточная стенка
КсЭТ
XET
— ксилоглюкан-эндотрансгликозилаза
КоА
CoA
— кофермент А (Коэнзим А)
KoQ
Q(CoQ)
— убихинон (кофермент Q) окисленный
KoQH2
QH2(CoQH2)
— убихинон (кофермент Q) восстановленный
лдг
LDH
— лактатдегидрогеназа
МАП
МАР
— митоген-активированная протеинкиназа
МАПК
МАРК
— митоген-активируемая протеинкиназа
мдг
МОН
— малатдегидрогеназа
НАД+
NAD+
— никотинамидадениндинуклеотид окисленный
НАДН
NADH
— никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
НАДФ+
NADP+
— никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный
НАДФН
NADPH
— никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный
НиР
NiR
— нитритредуктаза
HP
NR
— нитратредуктаза
НУК
NAA
— а-нафтилуксусная кислота
ПВК
pyruvate
— пировиноградная кислота
ПМ
PM
— плазматическая мембрана
ПОЛ
POL
— перекисное окисление липидов
пх
PQ
— пластохинон окисленный
пхн2
pqh2
— пластохинон восстановленный (пластохинол)
РНК
RNA
— рибонуклеиновая кислота
мРНК
mPNA
— матричная (информационная) рибонуклеиновая кислота
рРНК
rRNA
— рибосомальная рибонуклеиновая кислота
тРНК
tRNA
— транспортная рибонуклеиновая кислота
РуБФ
RuBP
— рибулозо-1,5-бисфосфат
РуБФК (Рубиско)
Rubisco
— рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза/оксиге- наза
сод
SOD
— супероксиддисмутаза
ССК
LHC
— светособирающий комплекс
ТПФ
TPP
— тиаминпирофосфат
УДФ
UDP
— уридин-5'-дифосфат
УТФ
UTP
— уридин-5'-трифосфосфат
Ф(А)
PhyA
— фитохром А
ФАД
FAD
— флавинадениндинуклеотид окисленный
фадн2
fadh2
— флавинадениндинуклеотид восстановленный
ФАИ
PAL
— фенилаланинаммиаклиаза
ФАФ
PAP
— 3'-фосфоаденозин-5'-фосфата
ФАФС
PAPS
— 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат
Ф(В)
Phy(B)
— фитохром В
ФД
Fd
— ферредоксин
Фдкр
Phyfr
— форма фитохрома с максимумом поглощения в дальней красной области
Фео
Pheo
— феофитин
ФЕП
PEP
— фосфоенолпировиноградная кислота (фосфо- енолпируват)
ФЕПК
PEPC
— фосфоенолпируват-карбоксилаза
Фкр
Phyr
— форма фитохрома с максимумом поглощения
в красной области
ФМН
FMN
— флавинмононуклеотид окисленный
ФМНН2
fmnh2
— флавинмононуклеотид восстановленный
Фн
Pi
— фосфат неорганический
ФС1
PSI
— фотосистема I
ФСП
PSII
— фотосистема II
ФФн
PPi
— пирофосфат
Хл
Chi
— хлорофилл
Хл*
Chi*
— возбужденный хлорофилл
Хл+
ChF
— катион-радикал хлорофилла
цтк
TCA-cycle
— цикл трикарбоновых кислот
ЭДТА
EDTA
— этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭР
ER
— эндоплазматический ретикулум
ЭТЦ
ETC
— электрон-транспортная цепь
ЯМР
NMR
— ядерный магнитный резонанс
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ КОНСТАНТЫИ ПОКАЗАТЕЛИ (ПАРАМЕТРЫ)
Е Е°'
Г АС
A G° h Km Ка pKa ДЦц*
— окислительно-восстановительный потенциал
— стандартный окислительно-восстановительный потенциал при pH 7,0
— постоянная Фарадея
— изменение свободной энергии
— стандартное изменение свободной энергии
— постоянная Планка
— константа Михаэлиса — Ментен
— константа диссоциации кислоты
— отрицательный логарифм
— трансмембранный градиент электрохимического потенциала ионов водорода
Na
— число Авогадро
Ч^о —■ водный потенциал
ПРЕДИСЛОВИЕ
Физиология растений — раздел ботаники, который занимается изучением метаболических систем, составляющих основу жизнедеятельности растительного организма и обеспечивающих его существование в разнообразных условиях среды. Такие метаболические системы находятся в сложных взаимоотношениях друг с другом. Изучение координации функционирования этих систем во времени и пространстве составляет важную цель физиологии — познание закономерностей жизнедеятельности растений, раскрытие биохимических, молекулярных и генетических основ взаимозависимости сложных функций и механизмов их регуляции в системе целого организма.
Объект физиологии растений — эукариотный организм, осуществляющий фототрофный образ жизни. Полнота знаний о нем может быть достигнута при сочетании исследования на различных уровнях организации системы — субклеточном, клеточном, организменном, биоценотическом. Разработанные в последние годы методические подходы позволили значительно продвинуться в понимании принципов функционирования организма как целостной системы. Важные результаты достигнуты и в понимании структуры генома, полиморфизма растительной ДНК, процессов модификации ДНК и их влияния на экспрессию ядерных генов, вскрыты многие особенности регуляции экспрессии ядерных генов, а также координации регуляторных систем трех генетически автономных компартментов растительной клетки — ядерного, пластидного и митохондриального.
Успехи в познании особенностей строения и работы растительной клетки, уникальных свойств, определяемых функциями клеточной оболочки, совместной работой трех геномов, строением множественных мембранных систем, свойствами транспортных и сигнальных механизмов, позволили многое понять в организации ее онтогенеза и стали предпосылкой для разработки биотехнологических приемов управления программами развития клетки.
Обменные реакции в организме требуют значительных затрат энергии, источником которой служат универсальные для клеток бактерий, хлоропластов и митохондрий растений и животных процессы трансформации энергии. Во всех этих системах световая энергия или энергия окисляемых субстратов используются для организации электронного транспорта в мембране, сопряженного с созданием протонного градиента, который используется для синтеза молекул АТФ.
В связи с этим важно понять общие принципы организации электрон-транс- портных цепей в сопрягающих мембранах и дать характеристику основным компонентам, участвующим в переносе электрона. Специфические черты дыхательного метаболизма растительной клетки, в том числе связанные с наличием альтернативных ферментов и действием альтернативных метаболических
путей, обеспечивают большую гибкость и пластичность метаболизма растительного организма при частой смене окружающих условий. Вопросы метаболизма, напрямую не связанные с дыханием, но протекающие с участием молекулярного кислорода, а также проблема взаимодействия клетки с активными формами кислорода и данные, свидетельствующие о сигнальной роли активных форм кислорода, составляют важный раздел стресс-физиологии растений.
Особую роль в жизни растительного организма играют взаимодействия митохондрий и хлоропластов, во время которых между ними устанавливаются системы прямых и обратных связей, имеющих существенное значение в поддержании клетки как целостной функциональной единицы, гибко приспосабливающей интенсивность дыхания к действию различных эндогенных и экзогенных факторов.
Для понимания сущности процессов жизнедеятельности растения важнейшей задачей является изучение современных представлений относительно фотосинтеза как физиологической функции, составляющей основу биоэнергетики.
В последние годы ученые, используя новейшие физико-химические техники и принципы, серьезно исследуют основные фундаментальные процессы фотосинтеза: структурно-функциональную организацию фотосинтетического аппарата, молекулярную структуру и физико-химические свойства пигментных систем, механизмы первичных процессов преобразования энергии, структуру и функционирование реакционных центров.
Детально изучены природа компонентов и организация основных функциональных комплексов электрон-транспортной цепи, физиологические механизмы регуляции транспорта электронов, проведен анализ основных путей фотоассимиляции углекислоты и фотосинтетического метаболизма углерода у разных групп растений, исследованы вопросы энергетики фотосинтеза и значение фотоэнергетических реакций в регуляции активности всего комплекса метаболических систем в растении, рассмотрены механизмы эндогенной регуляции фотосинтеза на уровне целого растения, физиологические основы действия внешних факторов, вопросы фотоингибирования, взаимосвязь фотосинтеза с дыханием, минеральным питанием, ростом и другими физиологическими функциями, проблема фотосинтетической продуктивности растений. Важнейший результат этих разносторонних исследований — переоценка общих масштабов фотосинтетической деятельности в биосфере в прошлом и настоящем, а также прогноз ее состояния в ближайшие периоды как функции антропогенного воздействия.
Растения являются компонентами биосферы, которые выполняют огромную геохимическую работу, обусловленную прежде всего их способом минерального питания и водообмена.
За последние 10 лет представления о поступлении ионов и воды в растение существенно изменились, значительно расширились знания о функциях элементов минерального питания.
Большой комплекс работ по механизмам поступления ионов и воды в апоп- ласт, по системам их транспорта через мембраны, изучение транспорта веществ на ближние и дальние расстояния и их круговорота по растению позволили понять роль этих процессов в формировании функционально целостной системы.
Наряду с генной и метаболитной (биохимической) регуляцией исследуется феномен компартментации ионов как способ пространственно-временной регуляции процессов поступления и включения элементов минерального питания в метаболизм. Новые данные о функциях элементов минерального питания, о взаимосвязи процессов минерального питания с водообменом, фотосинтезом и дыханием в онтогенезе, о механизмах регуляции поступления и реализации функций элементов минерального питания на разных уровнях структурной организации растений составляют бурно развивающуюся область физиологии растений, тесно связанную с прикладными аспектами агрохимии.
Функции водного обмена нельзя рассматривать без связи с особенностями молекулярного строения воды и ее физико-химических свойств. Движущие силы и механизмы транспорта воды на клеточном уровне и уровне целого растения — предмет новых исследований, которые позволили вскрыть количественные зависимости потока воды от гидравлической проводимости системы, определяемой как молекулярными, так и анатомическими особенностями корневой системы. Последние характеризуют водный обмен у высших растений различных экологических групп. Значительный интерес для понимания механизмов устойчивости растений к неблагоприятным условиям водообеспечения представляют сведения о водных каналах мембран и белках водных каналов — аква- поринах, которые выступают в качестве систем регуляции гидравлической проводимости мембран.
Рост и развитие растений выступают как интегральные физиологические функции, в которых через сложные системы метаболических взаимодействий и регуляторных систем раскрываются генетические возможности организма, обеспечивающие адаптивный и репродуктивный потенциал вида. Современное состояние раздела физиологии растений, описывающего закономерности роста и развития, демонстрирует мощь интегративного подхода, основанного на сочетании методов классической физиологии, физиологической и молекулярной генетики, молекулярной биологии, биохимии, цитологии и др.
Изучение принципов гормональной регуляции роста и развития растений составляет важнейший раздел физиологии как в фундаментальном, так и в прикладном смысле: общие принципы гормональной регуляции, представление о гормон-рецепторных отношениях, о вторичных мессенджерах и об ответах на уровне мембран, генома, целой клетки, органа и целого растения, специфическая и неспецифическая компоненты ответа — это все существенные звенья в понимании общих закономерностей реализации онтогенеза и его относительной устойчивости.
И хотя сведения об основных группах гормонов (ауксины, цитокинины, гиббереллины, абсцизовая кислота, этилен, брассиностероиды, жасмоновая кислота, салицилат и другие фенольные соединения, олигосахариды) и их биосинтезе и спектрах действия являются крайне важными для понимания условий регулирования онтогенеза и широко используются в фундаментальных и прикладных работах, регуляция онтогенеза осуществляется также другими (не химическими) системами, среди которых определяющее место, по- видимому, принадлежит свету.
Современные данные описывают отличие фоторецепторных регуляторных комплексов от энергопреобразующих и выделяют физиологически важные об-
ласти спектра: красную и синюю и, соответственно, фитохромную и крипто- хромную системы, отвечающие за различные физиологические реакции. Однако участие света в регуляции развития у растений имеет более сложный характер, что проявляется в фотопериодизме — явлении, подробно изучавшимся несколькими поколениями исследователей, но до сих пор остающимся не до конца понятым.
Давно открыта связь между гормональным воздействием на растение и его фотопериодическим ответом (так называемая гормональная теория цветения Чайлахяна), но и сегодня работы показывают, что такая связь реализуется через сложные многокомпонентные регуляторные системы, описанные еще не полностью.
Жизнь растительного организма протекает в постоянном взаимодействии с факторами внешней среды как абиотической природы (физическими, химическими), так и биотической (другими растениями, животными, микроорганизмами). И эти взаимодействия могут существенно модифицировать развитие растения, ухудшать его физиологическое состояние и потенцию к воспроизведению. Очевиден урон, который может понести производство, основанное на использовании культивируемых растений. Очевидны и возможные изменения в структуре ценозов, обусловленные гипервлиянием абиотических и биотических факторов.
Эволюция выработала множество механизмов, которые позволяют растению преодолеть неблагоприятные воздействия и сохранить потенциал размножения и распространения. Такие механизмы широко исследуются во многих лабораториях.
Действие каждого стресс-фактора рассматривается как с позиций его повреждающего эффекта, который стрессор оказывает на растение, так и с точки зрения ответных реакций растительного организма, направленных на формирование механизмов адаптации, которые позволяют преодолевать или избегать неблагоприятные воздействия. Повреждающие эффекты и механизмы адаптации образуют сложную систему, включающую изменения функциональной организации растения от молекулярного уровня до уровня целого организма.
Уникальной особенностью высших растений является их способность синтезировать огромное количество вторичных метаболитов — разнообразных, сравнительно низкомолекулярных соединений, обладающих, как правило, биологической активностью и обеспечивающих особый химический тип взаимодействия организмов в сообществах. Этот интереснейший аспект физиологии растений, включающий изучение фитохимии вторичных метаболитов (строение, распространение и классификация), характеристик основных классов (алкалоиды, изопреноиды, фенольные соединения) и их минорных компонентов (цианогенные гликозиды, тиогликозиды, небелковые аминокислоты, необычные липиды, ацетиленовые соединения, растительные амины, ацетогенины и др.), путей их биосинтеза и энзимологии, вскрывает механизмы чрезвычайно высокой гибкости систем коммуникации, выживания и приспособления растений.
Физиология вторичного метаболизма, анализ временной и пространственной организации их синтеза и накопления, а также анализ их функций в интактном растении значительно расширяют представления об адаптивных воз-
можностях растений и возможностях саморегуляции онтогенетических событий.
Предлагаемый вниманию читателей учебник написан профессорами и преподавателями кафедры физиологии растений Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова. В нем на современном уровне и с использованием новейших данных изложены физиологические функции и механизмы их интеграции и регуляции в целом растении в его онтогенезе и взаимодействии с факторами среды обитания.
И. П. Ермаков
ГЛАВА 1
РАСТИТЕЛЬНАЯ КЛЕТКА
Все живые существа состоят из клеток. Все клетки имеют много общих черт. Они ограничены от внешней среды цитоплазматической мембраной, содержат системы хранения и реализации генетической информации (ДНК, РНК, бе- локсинтезирующий аппарат), системы получения и преобразования энергии (прежде всего — синтеза и расходования АТФ), системы обеспечения клетки необходимыми компонентами (перенос веществ в клетку и из нее), системы восприятия внешних сигналов, их анализа и организации адекватного ответа. В то же время клетки разных организмов, а также органов и тканей многоклеточного организма имеют существенные различия. В последнем случае структурные и функциональные особенности клеток обусловлены их специализацией (дифференцировкой). Подобная специализация позволяет клеткам максимально эффективно выполнять конкретную функцию, «заданную» организмом.
Наиболее сильно различаются клетки организмов, относящихся к разным царствам. Подобные различия возникли в результате длительной эволюции клеток и представляют общебиологический интерес. Все клетки живых организмов традиционно принято разделять на прокариотические и эукариотические. Первоначально основой этого разделения послужил чисто морфологический признак — наличие или отсутствие ядра. Однако позже выяснилось, что различия между этими типами клеток гораздо существеннее.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
ОРГАНЕЛЛЫ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
Прокариотическая клетка не имеет внутренних перегородок. Она состоит как бы из одного отсека, отграниченного от внешней среды плазматической мембраной. У эукариотической клетки таких отсеков несколько, т. е. эти клетки разделены на различные, окруженные мембранами области (компартменты). Компартменты эукариотической клетки называются органеллами. Органеллы специализируются на выполнении различных функций. Разделение клетки на компартменты, возможно, является следствием больших размеров современной эукариотической клетки: в среднем она больше бактериальной в 10 — 30 раз. При этом принципиально важными оказываются два момента:
увеличение объема клетки сопровождается существенно меньшим увеличением площади поверхности ее плазматической мембраны, тогда как именно на мембранах протекают многие важнейшие метаболические процессы;
с увеличением объема клетки затрудняется координация ее метаболизма, в частности рациональное распределение по объему множества катаболических и анаболических процессов, «доставка» нужных веществ в нужное место.
Формирование компартментов позволяет пространственно разделить «блоки» метаболизма.
В цитозоле любой (не только растительной) современной эукариотической клетки находятся следующие органеллы:
ядро — содержит основную часть генома и является местом синтеза ДНК и РНК;
эндоплазматический ретикулум (ЭР) — место синтеза большинства липидов клетки, а также белков, предназначенных для органелл или секреции;
аппарат Гольджи (АГ)— место сортировки и модификации белков и липидов, получаемых от эндоплазматического ретикулума;
митохондрии — «энергетические станции клетки», основное место синтеза АТФ, имеют собственный геном и белоксинтезирующую систему;
пероксисомы — здесь происходят многие окислительные процессы;
лизосомы (е растительных клетках — литические вакуоли") — место ком- партментации литических ферментов.
Растительная клетка наряду с этими органеллами обязательно содержит:
пластиды — органеллы, выполняющие различные функции в зависимости от типа клетки, в которой находятся; основная функция — фотосинтез; имеют собственный геном и белоксинтезирующую систему;
вакуоли — органеллы, выполняющие несколько функций, в том числе литические (литические вакуоли) и запасающие (запасающие вакуоли).
Классификацию органелл эукариотической клетки целесообразно построить на предполагаемой схеме ее эволюции. Практически доказано, что митохондрии и пластиды имеют симбиотическое происхождение, т.е. являются потомками микроорганизмов, «захваченных» предшественником эукариотической клетки. При этом внешняя мембрана пластид и митохондрий соответствует плазматической мембране «хозяйской» клетки, внутренняя — плазматической мембране захваченной бактерии, а строма пластид и матрикс митохондрий — бактериальной цитоплазме (рис. 1.1).
Происхождение ядра менее ясно. Скорее всего, двухслойная ядерная оболочка образовалась из глубокого впячивания плазматической мембраны. В результате часть цитоплазмы оказалась изолированной от остального пространства клетки. Следовательно, внутреннее пространство ядра происходит из цитозоля и при определенных условиях эти пространства могут объединиться (иногда для обозначения подобных пространств применяют математический термин «топологически эквивалентные пространства»). Известно, что во время митоза у высших эукариот ядерная оболочка разрушается и содержимое ядра полностью смешивается с цитозолем. Этого не происходит ни с одной другой мембранной органеллой.
Эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи и вакуоли образовались, по-видимому, также за счет впячивания плазматической мембраны с последующим «отшнуровыванием». Если это верно, то внутренняя поверхность мембран этих органелл должна быть топологически эквивалентна внешней поверхности плазмалеммы. Это справедливо для ЭР, АГ, вакуолей и многих проме-
Наружная мембрана хлоропласта
(из мембраны «хозяина»)
Внутренняя мембрана хлоропласта (из мембраны цианобактерии)
Тилакоид
(из мембраны цианобактерии)
Древняя
клетка-предшественник
Рис. 1.1. Схема предполагаемого эволюционного происхождения ядра и хлоропластов(пластид):
А — происхождение ядра и ЭР; Б — происхождение пластид
жуточных везикул, участвующих в эндоцитозе, экзоцитозе и транспортных процессах между этими органеллами.
Пероксисомы представляются «потомками» древних органелл, возникших для защиты клеток от кислорода, накопившегося в атмосфере в результате оксигенного фотосинтеза.
Исходя из сказанного основные внутриклеточные компартменты эукариотической клетки можно разделить на пять групп:
ядро и цитозоль — разделены мембраной, выполняют разные функции, но топологически эквивалентны;
митохондрии;
пластиды (только в растительной клетке);
пероксисомы;
эндомембранная система клетки — остальные мембранные органеллы: ЭР, аппарат Гольджи, вакуоли (в растительных клетках), лизосомы (в животных клетках), транспортные везикулы.
Целесообразность объединения последней группы органелл в одну систему вытекает не только из эволюционной схемы, но и по функциональным признакам, о которых будет сказано позже.
1.1.2. ТРАНСПОРТ И СОРТИРОВКА БЕЛКОВВ ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ КЛЕТКЕ
С возникновением компартментов эукариотическая клетка получает не только очевидные преимущества, но и ряд проблем. Одна из них связана с необходимостью сортировки и доставки нужных соединений в определенные органеллы. Прежде всего это касается белков. Судьба синтезированных белков различна и зависит от мест их последующего функционирования. Существуют два магистральных пути транспорта белков, которые начинаются в разных местах цитоплазмы (рис. 1.2).
Цитоплазматический путьЦитоплазматический путьСекреторный путьСекреторный путьКлеточнаяКлеточнаястенкастенкаРис. 1.2. Схема двух путей транспорта белков в растительной клетке.Рис. 1.2. Схема двух путей транспорта белков в растительной клетке.
Цитоплазматический путь
Цитоплазматический путь
Секреторный путь
Секреторный путь
Клеточная
Клеточная
стенка
стенка
Рис. 1.2. Схема двух путей транспорта белков в растительной клетке.
Рис. 1.2. Схема двух путей транспорта белков в растительной клетке.
Цифры — сигналы сортировки белков, описанные в табл. 1.1; * — путь, не требующий специального сигнала сортировки
Первая транспортная ветвь обеспечивает белками пластиды, митохондрии, ядро и пероксисомы, т. е. все компартменты клетки, кроме органелл эндомемб- ранной системы. Синтез этих белков происходит на свободных рибосомах цитозоля. Белки, предназначенные для транспорта, содержат сигналы сортировки, направляющие их в соответствующие органеллы. Подобными сигналами обычно служат один или несколько участков белка, которые называют сигнальными или лидерными пептидами. В мембране органеллы находится специальный белок-транслокатор, который «узнает» сигнальный пептид. Молекула транспортируемого белка должна развернуться, чтобы подобно нитке развернувшегося клубка «продеться» через «игольное ушко» белка-транслокатора. В табл. 1.1 представлены некоторые характеристики различных сигналов сортировки в растительной клетке. Этот путь транспорта белков иногда называют цитозольным. Следует отметить, что большинство белков, синтезируемых на свободных рибосомах цитозоля, не имеют сигналов сортировки и остаются в цитозоле в качестве постоянных компонентов.
Другая транспортная ветвь используется для секретируемых белков, а также для белков, предназначенных для органелл эндомембранной системы и плазматической мембраны. Синтез этих белков также начинается на рибосомах цитозоля, но после инициации трансляции рибосомы прикрепляются к мембране ЭР, при этом формируется шероховатый ЭР. Образующиеся белки переносятся в ЭР по мере их синтеза, т. е. котрансляционно. Это означает, что очередной участок полипептидной цепи сразу после синтеза пересекает мембра-
Таблица 1.1. Сигнальные последовательности для транспорта белков
в растительной клетке (цифры в скобках — пути транспорта, показанные на рис. 1.2)
Целевая органелла
Сигнальная последовательность
Характеристика
Хлоропласты:
строма (9)
люмен и мембраны
тилакоидов (9')
Митохондрии:
матрикс (<?)
внутренняя мембрана, межме мбранное пространство (й")
Пероксисомы(6)
Ядро (7)
Сигнальный пептид секреторного пути (У)
Эндоплазматически й
ретикулум (2)
Вакуоль (5, 4)
N-концевой лидерный пептид («стромальный») Два последовательных N-концевых лидерных пептида
N-концевой пресиквенс
Два последовательных N-концевых пресик- венса
Сигналы пероксисо- мальной локализации PTS1 и PTS2
Сигналы ядерной локализации NLS. Не отщепляются после переноса белка в ядро
N-концевой лидерный пептид
Сигнал локализации в ЭР
Сигналы локализации в вакуолях: NTPP, СГРР, внутрибелковый сигнал
Последовательность из 40—50 аминокислот
Первый пептид — «стромальный», второй — «люменальный»
Формирует положительно заряженную амфипатическую а -петлю Первый пресиквенс — как для белков матрикса, второй состоит из остатков гидрофобных аминокислот
PTS1 — С-концевой трипептид — Ser-Lys-Leu
PTS2 локализован на N-конце
NLS типа 1: Pro-Lys-Lys-Lys-Arg- Lys
NLS типа 2: две последовательности, разделенные спейсером NLS типа 3. Lys-Ile-Pro-lle-Lys 10—15 остатков гидрофобных аминокислот, формирующих а-спираль
С-концевой тетрапептид KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu)
NTPP — N-концевой сигнал: Asn-Pro-lle-Arg
СТРР — С-концевой сигнал
ну ЭР. Некоторые из белков попадают в просвет ЭР, другие закрепляются в мембране и становятся трансмембранными белками ЭР. Эту транспортную ветвь часто называют секреторным путем клетки.
Две ветви транспорта различаются схемой транспортировки. Пути цитозольного транспорта белков параллельны, т.е. из цитозоля белки сразу направляются в нужную органеллу. С момента высвобождения белка в цитозоль до поступления его в органеллу проходит не больше 1 — 2 мин.
Транспорт белков по секреторному пути происходит последовательно — от органеллы к органелле. До достижения конечного пункта белок может побывать в нескольких органеллах (ЭР, разные отделы АГ). Путь от мембраны ЭР до места назначения может занять десятки и даже сотни минут. В процессе переноса белки могут претерпевать значительные модификации (прежде всего в АГ). На заключительных этапах транспорт может происходить параллельно: в вакуоль, периплазматическое пространство или в плазмалемму.
И наконец, два пути транспорта белков различаются по механизму переноса молекул. Для цитозольного пути возможен только мономолекулярный механизм транспорта белков, при котором каждая молекула белка индивидуально пересекает мембрану через соответствующий транслокатор. Для секреторного пути характерен везикулярный механизм транспорта белковых молекул, который опосредован транспортными пузырьками (везикулами). Везикулы отшну- ровываются от одного компартмента, при этом происходит захват определенных молекул из его полости. Затем везикулы сливаются с другим компартмен- том, доставляя в него свое содержимое. При везикулярном транспорте белки не пересекают никаких мембран, транспорт возможен только между топологически эквивалентными компартментами. Везикулярный механизм транспорта избирательно контролируется с помощью специальных белков, выполняющих функции сигналов сортировки. В транспортный пузырек белок попадает, если его сигнал сортировки связывается с рецептором на мембране везикулы. В настоящее время в составе белков установлены лишь некоторые сигналы сортировки, большинство комплементарных им мембранных рецепторов остаются пока неизвестными.
1.2. РАСТИТЕЛЬНАЯ КЛЕТКА —РЕЗУЛЬТАТ ДВОЙНОГО СИМБИОЗА
Стратегия существования высших растений обусловлена прежде всего двумя их главными свойствами — фототрофным типом питания и отсутствием
Рис. 1.3. Схема строения растительной клетки
активной подвижности. Эти два свойства наложили отпечаток на все уровни организации растительного организма, вплоть до клеточного.
Помимо общих для всех эукариотических клеток признаков, клетки растений обладают рядом особенностей. Главные из них — наличие пластид, вакуолей и жесткой клеточной стенки. Схема строения типичной растительной клетки представлена на рис. 1.3.
Присутствие пластид связано прежде всего с фототрофным типом питания растений. Пластиды, как и митохондрии, имеют собственный геном. Таким образом, еще одной особенностью растительной клетки является то, что она совмещает в себе три относительно автономные генетические системы: ядерную (хромосомную), митохондриальную и пластидную. Наличие трех геномов является следствием симбиотического происхождения растительных клеток. При этом растительная клетка, в отличие от других эукариотических клеток, образовалась как минимум из трех исходно самостоятельных форм:
«хозяйского» организма, генетический аппарат которого переместился в ядро;
гетеротрофной бактерии (похожей на родоспириллу), послужившей предшественницей митохондрии;
древней бактерии с оксигенным фотосинтезом, похожей на цианобактерию Scinechocystis, ставшей родоначальницей пластид.
Длительная коэволюция симбионтов привела к перераспределению функций между ними и их генетическими системами, при этом многие гены митохондриальной и пластидной ДНК были перемещены в ядро.
1.3. ПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ МЕМБРАНА РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ(ПЛАЗМАЛЕММА)
СТРУКТУРА ПЛАЗМАЛЕММЫ
Общая характеристика. Плазматическая (цитоплазматическая) мембрана — обязательный компонент любой клетки. Она отграничивает клетку и обеспечивает сохранение существующих различий между клеточным содержимым и окружающей средой. Мембрана служит высокоизбирательным «входным» селективным фильтром и отвечает за активный транспорт веществ в клетку и из нее.
Цитоплазматическую мембрану растительной клетки обычно называют плаз- малеммой. Как и любая биологическая мембрана, она представляет собой липидный бислой с большим количеством белков. Основу липидного бислоя составляют фосфолипиды. Помимо них в состав липидного слоя входят гликолипиды и стерины. Липиды достаточно активно перемещаются в пределах своего монослоя, но возможны и их переходы из одного монослоя в другой. Такой переход, называемый «флип-флоп» (от англ, flip -flop), осуществляется ферментом флипазой.
Кроме липидов и белков в плазмалемме присутствуют углеводы. Соотношение липидов, белков и углеводов в плазматической мембране растительной клетки составляет приблизительно 40:40: 20.
Мембранные белки связаны с липидным бислоем различными способами. Первоначально белки мембран разделяли на два основных типа: периферийные и интегральные. Периферийные белки ассоциированы с мембраной за счет присоединения к интегральным белкам или липидному бислою слабыми связями: водородными, электростатическими, солевыми мостиками. Они в основном растворимы в воде и легко отделяются от мембраны без ее разрушения. Некоторые периферийные белки обеспечивают связь между мембранами и цитоскелетом. Интегральные белки мембран нерастворимы в воде. Как минимум один из доменов интегрального белка встроен в гидрофобную часть бислоя мембраны, поэтому интегральный белок, как правило, не может быть удален из мембраны без ее разрушения.
В последнее время показано существование третьей группы белков, так называемых «заякоренных» в мембране белков (рис. 1.4). Эти белки фиксируются в мембране за счет специальной молекулы, в качестве которой могут выступать жирная кислота (ЖК), стерин, изопреноид или фосфатидилинозитол. Белки, связанные с изопреноидами (пренилированные белки) или жирной кис-
Рис. 1.4. Варианты фиксации «заякоренных» в мембранах белков
лотой, обратимо соединяются с эндоплазматической (внутренней) поверхностью мембраны. Из жирных кислот чаще используется миристиновая (С14) или пальмитиновая (С^). В первом случае образуется амидная связь с терминальной аминогруппой глицина. К остаткам пальмитиновой кислоты белки присоединяются за счет тиоэфирных связей с цистеинами в С-конце полипептид- ной цепи. Для пренилирования белков обычно используется фарнезил или геранилгеранил, которые также присоединяются к остаткам цистеина в карбоксильном конце полипептида. В отличие от этих двух групп белков фосфати- дилинозитолсвязанные белки находятся с внешней (экстрацеллюлярной, или люменальной) стороны мембраны. Подобным образом, по-видимому, связаны с плазматической мембраной большинство арабиногалактановых белков. Холестеринсвязанные белки недавно были обнаружены в плазматической мембране животных клеток, но в растительных клетках подобные белки пока не найдены.
Особенностью липидного состава плазмалеммы по сравнению с другими мембранами растительной клетки является высокое содержание стеринов, но
О-Х
СН— О
II
Глицерин О
Гидрофильнаячасть мембраныГидрофильнаячасть мембраныГидрофобнаячасть мембраныГидрофобнаячасть мембраныСтигмастеринСтигмастеринКампестеринКампестеринСитостеринСитостеринХолестеринХолестеринГидрофиль-ная частьГидрофиль-ная частьГидрофобнаячастьГидрофобнаячастьГидрофиль-ная частьГидрофиль-ная частьГидрофобнаячастьГидрофобнаячастьОстатки ЖК
Гидрофильнаячасть мембраны
Гидрофильнаячасть мембраны
Гидрофобнаячасть мембраны
Гидрофобнаячасть мембраны
Стигмастерин
Стигмастерин
Кампестерин
Кампестерин
Ситостерин
Ситостерин
Холестерин
Холестерин
Гидрофиль-ная часть
Гидрофиль-ная часть
Гидрофобнаячасть
Гидрофобнаячасть
Гидрофиль-ная часть
Гидрофиль-ная часть
Гидрофобнаячасть
Гидрофобнаячасть
Рис. 1.5. Структура фосфолипидов (/1) и фитостеринов (5)
в отличие от плазматической мембраны животной клетки для плазмалеммы характерна высокая вариабельность их состава в зависимости от вида растения, органа и ткани. Например, у ячменя (Hordeum vulgaris) в клетках корня количество свободных стеринов превышает количество фосфолипидов более чем в два раза, тогда как в листьях фосфолипидов больше, чем стеринов почти в 1,5 раза. В листьях шпината (Spinacia oleracia) соотношение фосфолипиды: свободные стерины почти на порядок выше — 9:1.
Структурные особенности плазмалеммы. Помимо высокой степени вариабельности плазматическая мембрана растительной клетки имеет ряд структурных особенностей, отличающих ее от других эукариотических клеток.
Жирнокислотный состав. Основными жирными кислотами плазмалеммы являются пальмитиновая (16:0), олеиновая (18:1; А9), линолевая (18 : 2; А9,12) и линоленовая (18 :3; А9-12-15). Практически отсутствует стеариновая кислота (18:0) и полностью — арахидоновая (20:4; А5,8,11,14), характерные для мембран клеток животных и грибов. Известно, что арахидоновая кислота в очень низких концентрациях является мощным стимулятором фитоиммунитета для некоторых видов растений (например, обеспечивает устойчивость картофеля к фитофторе).
Набор стероидов. В плазмалемме, как и во всех мембранах растительной клетки, почти нет холестерина. Его заменяют фитостерины, которые являются С-24-замещенными стеринами (рис. 1.5). Основные фитостерины — ситостерин, стигмастерин и кампестерин. Помимо свободных фитостеринов присутствуют значительные количества эфиров, гликозидов и ацилгликозидов стеринов, что не характерно для клеток животных.
Набор белков. Наличие специфических белков, прежде всего арабиногалактанов (AGPs), обеспечивающих структурное и функциональное взаимодействие плазмалеммы с клеточной стенкой.
ФУНКЦИИ ПЛАЗМАЛЕММЫ
Плазмалемма, будучи плазматической мембраной, выполняет все общие для этих структур функции, однако некоторые из них она выполняет особым образом. Кроме того, плазмалемма имеет ряд специфичных функций, характерных только для растительной клетки (например, синтез целлюлозы, осуществление контакта с клеточной стенкой).
Функции плазмалеммы, общие для плазматических мембран. I. Контроль поглощения и секреции веществ. В плазмалемме находятся множество транспортных систем, прежде всего для транспорта ионов, — ионные каналы, ионные переносчики и ионные насосы. Благодаря им осуществляется очень точный и селективный транспорт ионов как внутрь клетки, так и наружу, т.е. оптимальное снабжение клетки необходимыми ионами (подробнее о механизмах этого процесса см. в гл. 6 «Минеральное питание»).
Через плазмалемму происходит также перенос макромолекул. Так, в пери- плазматическое пространство транспортируются строительные блоки клеточной стенки — полисахариды и структурные белки. Эти соединения обычно находятся в везикулах аппарата Гольджи и высвобождаются из них путем экзоцитоза.
Запасание и использование энергии. Плазмалемма любой клетки является энергизованной мембраной, т. е. на ней существует градиент электрохимиче-
ского потенциала Д^ш, который используется для выполнения полезной работы, прежде всего для активного переноса веществ через мембрану (подробнее о механизмах см. в гл. 4 и 6).
Размещение и обеспечение работы ферментов. В плазмалемме находится множество ферментов. Это ферменты построения клеточной стенки (целлю- лозосинтаза), ферменты сигнальных систем (фосфолипазы С, А; аденилат- циклаза) и ряд других ферментов (например, цитохром Ь5, возможно — десатуразы).
Рецепторные функции. Многие белки плазмалеммы являются рецепторами различных сигналов. Можно сказать, что плазмалемма клетки — это мозаика различных рецепторов эндогенных сигналов (прежде всего фитогормонов) и внешних воздействий. К последним относятся рецепторы элиситоров (веществ, выделяемых патогенами) и рецепторы физических факторов — температуры, давления и др. Температура изменяет жесткость (текучесть) мембраны, т.е. ее механические свойства. Изменение этих свойств плазмалеммы приводит к открытию или закрытию находящихся в ней механосенсорных ионных каналов. Таким образом, плазмалемма является местом рецепции (восприятия) различных сигналов химической и физической природы.
Сигнальная функция. Многие компоненты плазмалеммы после восприятия сигналов служат источником вторичных мессенджеров — молекул, которые «передают» сигнал по эстафете и усиливают его. В качестве вторичных мессенджеров выступают инозитол-1,4,5-трифосфат, диацил глицерин, фосфатидная кислота, продукты перекисного окисления липидов мембран. Все эти соединения образуются из липидов плазмалеммы под действием специальных ферментов, активируемых в результате воздействия сигнала на рецепторы. Таким образом, плазматическая мембрана является местом не только рецепции сигналов, но также их усиления и дифференцирования (см. гл. 7).
Функциональные особенности плазмалеммы. 1. Градиент электрохимического потенциала плазматической мембраны создается за счет активного переноса сопрягающего иона с одной стороны мембраны на другую. Для плазмалеммы растительной клетки сопрягающим ионом выступает Н , тогда как для цитоплазматической мембраны животной клетки это Na+. Очевидно, что фермент, который за счет гидролиза АТФ активно «выкачивает» сопрягающий ион из клетки, также другой: у растительной — Н+-АТФаза p-типа, у животной клетки — К+/№+-АТФаза. Существует несколько изоформ фермента Н+-АТФазы p-типа: в геномах арабидопсиса и табака обнаружено как минимум по 10 генов. По-видимому, эти изоферменты работают в разных тканях на разных этапах онтогенеза.
У растительной клетки одна из составляющих электрохимического потенциала мембраны — электрическая разность потенциалов Ду — находится в пределах от 100 до 250 мВ, что существенно выше, чем у животной клетки. При этом пассивная составляющая Ду у обеих клеток практически одинакова; разница обусловлена активной составляющей этого потенциала, т. е. различием в работе электрогенных транспортных систем (АТФаз и переносчиков ионов).
Плазмалемма растительной клетки вместе со специфичным участком ЭР образует плазмодесмы — специальные цитоплазматические каналы, пронизывающие клеточную стенку и соединяющие смежные клетки. В результате плаз- модесменных контактов большинство живых клеток растения имеют физиче-
ски объединенную плазматическую мембрану. Этим растения существенно отличаются от животных, у которых клетки большинства тканей практически полностью отделены друг от друга плазматической мембраной.
Существенно различаются и условия функционирования плазмалеммы и мембраны животной клетки. Плазмалемма в норме всегда испытывает давление как со стороны цитоплазмы, так и со стороны клеточной стенки. Животная клетка, как правило, находится в изотоническом окружении, поэтому к ее плазматической мембране внешние силы не приложены.
ЯДРО РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ
СТРОЕНИЕ ЯДРА
Ядро растительной клетки представляет собой органеллу, размер и форма которой варьируют у клеток различных тканей и видов. Оно может быть сферическим (в диаметре около 10 нм), удлиненным или лопастным. Основная функция ядра — хранение и копирование генетической информации.
Содержимое клеточного ядра (нуклеоплазма) отделено от цитоплазмы ядер- ной оболочкой, образованной двумя мембранами толщиной по 8 нм. Между мембранами находится перинуклеарное пространство шириной 10—20 нм. Внутренняя ядерная мембрана содержит специфические белки, которые контактируют с хромосомами и ядерными РНК. Внешняя ядерная мембрана похожа на мембрану эндоплазматического ретикулума, в которую она переходит в определенных местах контакта. Подобно мембранам шероховатого ЭР, внешняя ядерная мембрана содержит рибосомы, участвующие в синтезе белка. Белки, образованные на этих рибосомах, переносятся в перинуклеарное пространство. Перинуклеарное пространство связано с полостью ЭР, по-видимому, через специальные «шлюзовые» участки. В клетках, подготовленных сверхбыстрым замораживанием, зона контактов ядерной оболочки и ЭР проявляется как очень узкие (наружный диаметр 25 — 30 нм), но физически непрерывные мембранные области. Предполагают, что такие зоны сжатых мембранных областей необходимы для ограничения движения белков (но не липидов) между перинуклеарным пространством и ЭР, т.е. являются «пропускными шлюзами». По предварительной оценке одно ядро в клетках кончика корня гороха содержит 30 — 50 подобных «шлюзов».
Ядро содержит множество белков, необходимых для обеспечения его функций. Эти белки (гистоны, ДНК- и РНК-полимеразы, белки-регуляторы различных генов и белки, участвующие в процессинге РНК) синтезируются в цитозоле и затем попадают в ядро. Избирательный транспорт белков в ядро обеспечивается прежде всего ядерными порами.
ТРАНСПОРТ МАКРОМОЛЕКУЛ МЕЖДУ ЯДРОМИ ЦИТОПЛАЗМОЙ
У всех эукариот, в том числе и у растений, ядерная оболочка пронизана ядерными порами. Поры окружены большими кольцевыми структурами, на-
Рис. 1.6. Схема строения ядерных пор
зываемыми поровыми комплексами (рис. 1.6). Плотность ядерных пор сильно различается в зависимости от типа клетки. В растительных клетках поры занимают от 8 до 20 % поверхности оболочки, плотность пор составляет от 6 до 25 на 1 мкм2. Каждая пора состоит из сложного макромолекулярного ансамбля — порового комплекса, который имеет размеры 120 нм в глубину и около 50 нм в диаметре. Комплекс содержит приблизительно 120 различных видов белков, называемых нуклеопорипами. Масса всех белков комплекса составляет около 124 МДа.
Ядро порового комплекса имеет октагональную симметрию относительно центральной оси. По периферии комплекса расположено восемь водных каналов диаметром 9 нм. Они обеспечивают свободную диффузию небольших молекул, например белков, с молекулярной массой до 40 кДа. Больший регулируемый центральный канал предназначен для активного транспорта белков и молекул РНК. Он содержит частицу диаметром около 35 нм, которую называют «штепселем». Эта частица, по-видимому, представляет собой комплекс белков-транспортеров, который управляет ядерно-цитоплазматическим обменом.
Большинство белков из цитоплазмы могут транспортироваться в ядро только в том случае, если они содержат сигнальную последовательность ядерной локализации NLS (nuclear localization signals). Узнавание этого сигнала ядер- ным поровым комплексом приводит к открыванию центрального канала. Многие ядерные белки содержат несколько сигналов ядерной локализации. Известно три класса подобных сигналов (см. табл. 1.1).
Характерной особенностью сигналов ядерной локализации является то, что они не отделяются от белка после его транслокации в ядро. Возможно, это связано с необходимостью повторного перемещения белка в ядро после митоза, в ходе которого нуклеоплазма смешивается с цитозолем. Большинство импортированных белков остаются в ядре, даже если они находятся в растворимой форме и могут свободно перемещаться по нуклеоплазме. Некоторые белки перемещаются между ядром и цитоплазмой несколько раз.
ПЛАСТИДЫ
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПЛАСТИД
Пластиды — органеллы, найденные исключительно в клетках высших растений и водорослей. Они ответственны за фотосинтез, хранение разнообразных продуктов метаболизма, а также за синтез многих ключевых молекул растительных клеток. Как следует из названия (от греч. plastikos — изменчивый, пластичный), пластиды различны по размеру, форме, содержанию и функциям. Пластиды обладают также замечательной способностью дифференцировать- ся, дедифференцироваться и повторно редифференцироваться.
Всем пластидам свойствен ряд общих черт. Как уже было сказано, они имеют собственный геном, одинаковый у всех представителей одного вида растений, собственную белоксинтезирующую систему; от цитозоля пластиды отделены двумя мембранами — наружной и внутренней. Для некоторых фототроф- ных организмов число пластидных мембран может быть больше. Например, пластиды эвглен и динофлагеллят окружены тремя, а у золотистых, бурых, желто-зеленых и диатомовых водорослей они имеют четыре мембраны. Это связано с происхождением пластид. Считается, что симбиотический процесс, результатом которого стало формированием пластид, в процессе эволюции происходил неоднократно (как минимум, трижды).
ТИПЫ ПЛАСТИД И ИХ ФОРМИРОВАНИЕ
Пропластиды являются предшественниками остальных типов пластид и всегда присутствуют в меристематических клетках. Клетки меристем покрытосеменных растений, как правило, содержат около 20 пропластид. Форма пропластид чаще всего сферическая или эллипсоидная, размеры от 0,2 до 1,0 мкм. Внутренняя среда пропластид — строма — имеет зернистую структуру и достаточно однородна. В ней можно идентифицировать один или несколько нуклеоидов в виде электронно-прозрачных областей с кольцевыми структурами ДНК диаметром около 3 нм. Пропластиды содержат гораздо меньше рибосом, чем высокодифференцированные этиопласты или хлоропласты. В пропластидах внутренняя мембранная система развита слабо. Она состоит лишь из нескольких инвагинаций внутренней мембраны и небольшого числа уплощенных мешочков, называемых ламеллами. Иногда в пропластидах присутствуют везикулы с запасными белками. В ряде случаев в строме пропластид содержатся отложения белка фитоферритина, основной функцией которого является хранение ионов железа. Фитоферритин в растительной клетке находится почти исключительно в пластидах, больше всего в пластидах запасающих органов. ^
Из пропластид формируются остальные типы пластид — амилопласты, лейкопласты, этиопласты, хлоропласты, хромопласты. Набор пластид в конкретной клетке зависит от типа ее дифференцировки (рис. 1.7).
Амилопласты — неокрашенные пластиды, которые внешне похожи на пропластиды, но содержат гранулы крахмала. Их название происходит от амилозы — линейного, растворимого в воде полисахарида, состоящего из а (1 ->4)- глюкопиранозильных единиц, основного компонента крахмала. Амилопласты
Рис. 1.7. Схема взаимопревращений пластид
обычно присутствуют в клетках запасающих органов. Крахмальные зерна, которые могут быть весьма массивными, располагаются в строме. В клубнях картофеля, например, зерно крахмала обычно заполняет всю пластиду, за исключением тонкого слоя стромы у внутренней мембраны. В грависенсорных клетках кончика корня амилопласты выполняют функции статолитов, седиментирующих под действием силы тяжести и вызывающих таким образом гравитро- пический ответ. Структура «статолитного» амилопласта отличается от запасающего наличием матрикса, который охватывает все крахмальные гранулы.
Лейкопласты — бесцветные пластиды, вовлеченные в синтез изопреноидов, чаще всего моно- и сесквитерпенов, составляющих основу эфирных масел. В литературе термин «лейкопласты» часто используется в качестве синонима и для амилопластов, ч^о неверно. Лейкопласты представляют собой уникальный тип пластид, синтезирующих изопреноиды, иногда их называют «терпеноидными пластидами». Для них характерно наличие плотной стромы, небольшого количества внутренних мембран и рибосом, а также небольших пла- стоглобул (капель липидов). Типичный признак лейкопластов — наличие «ретикулярного футляра», т.е. они обычно окружены обширной сетью трубчатых мембран гладкого ЭР, которые также участвуют в синтезе изопреноидов.
Этиопласты — развиваются из пропластид в темноте, при освещении они превращаются в хлоропласты. Этиопласты представляют собой специальный вид пластид, образующихся в клетках этиолированных листьев и других, в норме зеленых, тканях растений, выращиваемых в темноте. В этиопластах нет хлорофилла, но зато присутствует большое количество протохлорофиллида.
Рис. 1.8. Строение проламеллярно- го телаРис. 1.8. Строение проламеллярно- го телаМембранные липиды в них хранятся в форме рельефной мембранной структуры, называемой проламеллярным телом (рис. 1.8). Эта структура формируется из липидов, которые обычно составляют внутренние мембраны хлоропластов. Образование проламеллярных тел обусловлено отсутствием мембранных белков, необходимых для формирования нормальных тилакоидов хлоропластов Липиды образуют мембранные трубочки, которые ветвятся в трех измерениях и формируют квазикристаллическую решетчатую структуру. После освещения этиопласты начинают развиваться в хлоропласты. Свет вызывает
Рис. 1.8. Строение проламеллярно- го тела
Рис. 1.8. Строение проламеллярно- го тела
синтез хлорофилла из протохлорофиллида, а также синтез белков мембран. Это приводит к формированию хлорофилл-белковых комплексов, при этом липиды проламеллярного тела трансформируются в тилакоиды.
Хлоропласты — зеленые фотосинтезирующие пластиды, отвечающие за поглощение и трансформацию энергии света. В высших растениях хлоропласты имеют преимущественно сферическую или эллипсоидную форму, у мхов и водорослей она может быть иной. Например, каждая клетка в нитчатой морской водоросли Spirogyra содержит единственный лентообразный хлоропласт. У высших растений длина хлоропластов варьирует от 5 до 8 мкм при ширине от 3 до 4 мкм. Количество хлоропластов в разных клетках неодинаковое. Клетка палисадной хлоренхимы листьев клещевины (Ricinus communis) содержит около 35 хлоропластов, в клетке губчатой хлоренхимы их около 20. В листе клещевины насчитывается приблизительно 500 000 хлоропластов на 1 мм2, из них 82 % приходится на палисадную хлоренхиму. Клетка хлоренхимы зрелого листа арабидопсиса (Arabidopsis thaliana) включает приблизительно 120 хлоропластов (подробно структура и функция хлоропластов изложена в гл. 3 «Фотосинтез»),
Хромопласты — желтые, оранжевые или красные пластиды. Их цвет зависит от комбинации каротиноидов — единственных липофильных пигментов высших растений. Хромопласты ответственны за окраску многих плодов (например, помидоров, цитрусовых), цветков (лютиков, бархатцев) и корней (морковь). Хромопласты могут развиваться непосредственно из пропластид или повторно дифференцироваться из хлоропластов, как, например, в созревающих плодах помидора. Хромопласты могут редифференцироваться в хлоропласты, что наблюдается, в частности, в выступающих из земли и освещаемых участках корнеплодов моркови. Развитие хромопластов сопровождается мощной индукцией ферментов, катализирующих биосинтез каротиноидов. Неактивные формы этих ферментов обычно находятся в строме, активные формы присутствуют только в мембранах пластид, где локализованы как липофиль
ные предшественники каротиноидов, так и сами каротиноиды.
Механизмы превращения пропластид в ту или иную форму пластид полно
стью неизвестны, однако установлено, что главную роль в регуляции этого процесса играет ядерный геном. Ядерные мутации могут переключать развитие с хромопластов на хлоропласты или же полностью блокировать развитие пла-
стид. У таких мутантов образуются либо различные формы лейкопластов, либо незрелые хлоропласты с аномальной пигментацией, свойственные многим декоративным растениям.
Важнейшим фактором, определяющим развитие и функционирование пластид, является свет. Свет регулирует примерно пятую часть из 100—120 генов, входящих в состав хлоропластного генома.
ОБОЛОЧКИ ПЛАСТИД
Через мембраны пластид происходит интенсивный обмен метаболитов в обоих направлениях. В отличие от других мембран эукариотической клетки, внутренняя и внешняя мембраны пластид, как и мембраны тилакоидов, бедны фосфолипидами и обогащены галактолипидами. По мнению ряда исследователей, это может отражать эволюцию фотосинтетических организмов в морской среде, где содержание фосфора ограничено.
Внешняя мембрана оболочки содержит неспецифичный поровый белок (по- рин), который разрешает свободный транспорт воды, разнообразных ионов и метаболитов с размером до 10 кДа в межмембранное пространство. Внешняя мембрана не имеет складок и никогда не сливается с внутренней мембраной. В то же время существуют места контактов внешней и внутренней мембран. В этих зонах осуществляется перенос пластидных белков из цитозоля в пластиду. На внешней мембране пластид локализованы белки, выполняющие те или иные функции, в частности ферменты, вовлеченные в обмен галактолипидов.
Внутренняя мембрана оболочки проницаема для маленьких незаряженных молекул, включая О2 и NH3, а также для недиссоциированных низкомолекулярных монокарбоновых кислот. Большинство метаболитов пересекают внутреннюю мембрану пластид при помощи специальных переносчиков. Внутренняя мембрана оболочки пластид содержит также ферменты, участвующие в формировании тилакоидных мембранных липидов.
РАЗМНОЖЕНИЕ ПЛАСТИД
Пластиды образуются за счет деления существующих пластид, причем это происходит независимо от деления клетки. Пропластиды способны к интенсивному делению, причем все гены, контролирующие этот процесс, обычно имеют ядерную локализацию. Чаще делятся пропластиды, этиопласты и молодые хлоропласты, однако способность к делению сохраняет даже полностью развившийся хлоропласт В апексах корня, стебля и других меристемах скорость деления пропластид коррелирует со скоростью деления клеток, таким образом, количество пластид у дочерних и исходных клеток примерно одинаково. Число пропластид в клетке на этой стадии невелико: около 20. В онтогенезе растения на стадии растяжения клеток их деление останавливается, тогда как деление пластид продолжается, что приводит к увеличению их количества в клетке. Например, по мере развития листа шпината количество пластид в клетке возрастает приблизительно в 10 раз и достигает 150 — 200 органелл на клетку. Одновременно значительно увеличивается копийность пластидной ДНК. Число копий хлоропластного генома в одной клетке мезофилла листа может варь-
ировать от 500 до 10 000, а количество ДНК может достигать 10 — 20% всей ДНК клетки листа.
Деление начинается с заметного сжатия пластиды в центре. Сжатие углубляется, образуя узкую перетяжку между двумя будущими дочерними пластидами, после чего они полностью разъединяются. На стадии перетяжки на внешней мембране пластиды со стороны цитозоля образуется электронно-плотное кольцо. Недавние исследования показали, что это кольцо содержит белок, близкий сократительному (контрактильному) белку FtsZ бактерий, который необходим для формирования перетяжки при делении бактериальных клеток.
НАСЛЕДОВАНИЕ ПЛАСТИД
Эндоплазматические органеллы могут переходить от одного поколения к другому через яйцеклетку (материнское наследование), через спермин (отцовское наследование) либо обоими способами (двуродительское наследование). У большинства покрытосеменных растений пластиды и митохондрии наследуются по материнской линии. Эти органеллы от отцовской линии либо не попадают в спермин, либо деградируют в процессе развития мужского гаметофита или двойного оплодотворения. Независимо от исходной локализации (в яйцеклетке или спермин) в момент наследования пластиды находятся на стадии пропластид.
В ряде видов цветковых растений, включая герань {Pelargonium), свинчатку {Plumbago), ослинник {Oenothera), было зарегистрировано двуродительское наследование пластид и митохондрий. У Pelargonium «мужские» пластиды и митохондрии отличаются от «женских» по ультраструктуре. Это позволяет визуально определить в развивающемся зародыше присутствие органелл от каждого родителя. Наследование органелл в свинчатке своеобразно. Данный вид характеризуется наличием диморфных спермиев: одна из мужских гамет обогащена митохондриями, тогда как другая — пластидами. При этом происходит предпочтительное оплодотворение: «пластидный» спермий сливается с яйцеклеткой гораздо чаше, чем «митохондриальный».
Некоторые растения (например, саговники, гинкго) кардинально отличаются по способу наследования пластид: пластиды переходят к следующему поколению через сперматозоид (в этом случае мужской гаметофит живет довольно долго, развиваясь в женской шишке после опыления). Таким образом, для некоторых голосеменных характерно наследование пластид по отцовской линии.
ГЕНОМ И БЕЛОКСИНТЕЗИРУЮЩАЯСИСТЕМА ПЛАСТИД
Все пластиды имеют собственный геном и белоксинтезирующую систему. У современных фотосинтезирующих эукариот пластидная ДНК (плДНК), как правило, представлена многокопийной кольцевой молекулой размером от 120 до 290 тыс. п. н. У большинства видов эта молекула содержит два инвертированных повтора (IRa и IRb — от англ, inverted repeats), разделяющих ее на две неравные области (рис. 1.9). У многих бобовых и большинства голосеменных
Рис. 1.9. Схема строения кольцевой ДНК пластид
растений ДНК пластид имеет всего лишь один IR-повтор и обладает измененным порядком генов.
Для некоторых видов высших растений проведено полное секвенирование плДНК. Установлено, что ДНК пластид содержит около 100 генов, причем их набор близок для разных видов. Все идентифицированные гены можно разделить на две группы:
гены, обслуживающие процессы транскрипции и трансляции белков пластид (гены «домашнего хозяйства»);
гены белков, обеспечивающих «полезную работу» пластид, прежде всего процесс фотосинтеза.
Многие пластидные гены организованы в виде оперонов — блоков генов, считывающихся с единого промотора. Ряд пластидных генов имеют мозаичную структуру, т. е. состоят из чередующихся экзонов и интронов.
РНК-полимеразы пластид
Транскрипция пластидных генов обеспечивается двумя типами РНК-поли - мераз, одна из которых кодируется в ядре растительной клетки, тогда как другая — пластидной ДНК.
Собственная РНК-полимераза пластид обладает типичными прокариотическими чертами и очень близка соответствующему ферменту Escherichia coli (рис. 1.10). Она состоит из четырех типов субъединиц а2РР'Р" (У эубактерий из трех — «гРР')- Эти субъединицы кодируются в пластидном геноме. Структура фермента а2РР'Р" характерна лишь для пропластид и этиопластов. Такая РНК- полимераза не может узнавать промоторные области генов, для этого к ней должна присоединиться ст-субъединица. Она кодируется ядерным геномом и присоединяется к ферменту при освещении пластиды. У арабидопсиса выявлено как минимум три гена ст-субъединиц. Несмотря на ядерное кодирование, продукты этих генов имеют высокую гомологию с ст-субъединицами цианобактерий и эффективно распознают типичные промоторы прокариот. Ядерная локализация этих генов, вероятно, является результатом перемещения генетического материала пластид в ядро.
Поскольку в темноте и в пропластидах собственная РНК-полимераза пластид неактивна, то в этих условиях работает другая РНК-полимераза, которая кодируется ядерным геномом. Она представляет собой мономерный фермент, очень похожий на РНК-полимеразу бактериофагов ТЗ и Т7. В геноме арабидопсиса идентифицирован ген, кодирующий эту РНК-полимеразу. Продукт данного гена имеет сигнальную последовательность транспорта в пластиды.
Имеется своеобразное «распределение ролей» в работе двух РНК-полимераз пластид, которое обеспечивается различными промоторами пластидных генов. Все гены пластид можно разделить на три группы:
имеющие стандартные эубактериальные промоторы — к ним относятся почти все гены белков, участвующих в процессах фотосинтеза, их транскрипцию обеспечивает собственная РНК-полимераза пластид;
имеющие нестандартные промоторы — такие промоторы свойственны лишь немногим генам; важно, что таким промотором снабжен rif-оперон, содержащий гены собственной пластидной РНК-полимеразы; их активность связана с мономерной РНК-полимеразой фагового типа;
имеющие универсальные промоторы — подобные промоторы характерны для большинства генов «домашнего хозяйства» пластид; успешно распознаются обеими РНК-полимеразами.
Пластидная РНК-полимераза бактериального типа
Рис. 1.10. Схема строения пластидных РНК-полимераз:
-35; -10 — расстояние до места начала транскрипции (в парах нуклеотидов)
Транскрипция пластидной РНК
Можно предположить, что в пропластидах работает только РНК-полимераза фагового типа. Этот фермент обеспечивает экспрессию лишь немногих генов, в том числе собственной РНК-полимеразы пластид, однако она неактивна. Свет активирует РНК-пол имеразу за счет присоединения о-субъединицы, и транскрипционная активность в пластидах избирательно увеличивается почти в 100 раз.
В дифференцированных хлоропластах транскрипция пластидных генов также регулируется весьма эффективно. Основным регулирующим фактором и в этом случае является свет. Для большинства пластидных генов максимальная транскрипционная активность приходится на предрассветные часы. С началом интенсивного освещения транскрипция ДНК хлоропластов заметно снижается, что, однако, не препятствует активной экспрессии пластидных генов.
На более поздних этапах дифференцировки пластид активность некоторых генов может блокироваться. Например, в амилопластах клеток клена явора (Acer pseudoplatanus) происходит неравномерное метилирование пластидной ДНК, в результате чего одни гены (в том числе rml6, psbA) продолжают нормально считываться, в то время как другие {rbcL, atpA, atpB, atpE, psaA) подвергаются практически полной репрессии. Подобная ситуация показана для хромопластов томата и перца. Таким образом, частичное метилирование пластидной ДНК может играть существенную роль в регулировании активности пластидных генов и преобразовании хлоропластов в другие формы пластид.
Созревание пластидной РНК
После транскрипции происходит процесс созревания пластидных РНК. К нему относится сплайсинг транскриптов, у которых есть интрон-экзонная структура; формирование зрелых концов у транскриптов; редактирование некоторых мРНК (рис. 1.11). Пластидные интроны отличаются отядерных прежде всего способностью к автосплайсингу. Это означает, что вырезание пластидных интронов происходит автокаталитически, т.е. без участия каких-либо ферментов.
Одной из своеобразных модификаций информационных РНК пластид является их «редактирование» — химическая модификация в мРНК некоторых пиримидиновых оснований. В результате редактирования происходит замена одного основания на другое, что изменяет нуклеотидную последовательность транскрипта и кодирование соответствующей информации. Обычно остаток цитозина заменяется на урацил. Процесс редактирования может приводить к образованию инициаторного кодона, отсутствующего в исходной РНК, замене стоп-кодонов на смысловые триплеты или превращение одних смысловых кодонов в другие (рис. 1.12). Редактирование мРНК представляет собой мощный регуляторный механизм экспрессии пластидных генов. Важно отметить, что до сих пор все известные случаи редактирования пластидных мРНК обнаружены только в хлоропластах высших растений.
Стабильность РНК рассматривается как один из основных факторов, способных регулировать экспрессию пластидных генов. Большинство зрелых пластидных РНК содержат в своей З'-некодирующей области характерную шпильку. Подобная вторичная структура предохраняет молекулу РНК от разрушающего
tmV
rm 16
tm I
tm A
rm 23
rm 4,5 rm 5
ДНК
Транскрипция
16S
23S
4,5S 5S
Интрон Интрон
Процессинг
Процессинг, сплайсинг
Процессинг
16S
23S
4,5S 5S
Зрелые pPHK
GAU
Зрелые тРНК
Рис 1.11. Схема созревания пластидных РН К
ЗаменааминокислотыЗаменааминокислотыUAU UUAТир ЛейUAU UUAТир ЛейВозникновениестоп-кодонаФен Глн Сер5' UUC САА UCC 3'IUAAСтопВозникновениестоп-кодонаФен Глн Сер5' UUC САА UCC 3'IUAAСтоп
Заменааминокислоты
Заменааминокислоты
UAU UUA
Тир Лей
UAU UUA
Тир Лей
Возникновениестоп-кодона
Фен Глн Сер5' UUC САА UCC 3'
I
UAA
Стоп
Возникновениестоп-кодона
Фен Глн Сер5' UUC САА UCC 3'
I
UAA
Стоп
Возникновениеинициаторного кодона
Тре Ала Лиз
5' AAU ACG GCG ААА 3'
I
AUG
Мет
Вал Гис Сер Сер5' GUU CAU ... UCA UCA 3'
Рис. 1.12. Варианты редактирования пластидных мРНК
Инициаторный кодон Терминальный кодон
Кодирующая область
Рис. 1.13. Сопоставление структуры цитозольной и пластидной мРНК: А — схема строения цитозольной мРНК; Б — схема строения пластидной мРНК
действия рибонуклеаз (рис. 1.13), однако наличие З'-концевой шпильки не гарантирует сохранность РНК. При определенных условиях (например, в темноте) такая шпилька распознается специфическими белковыми комплексами. Они разрушают 3'-конец молекулы РНК, и молекула РНК становится доступной для рибонуклеаз.
Даже при эффективной защите своего З'-конца зрелые пластидные мРНК подвержены быстрой деградации за счет рибонуклеазной атаки с 5'-конца. Этого не происходит лишь при трансляции мРНК, когда она связана с пластидными рибосомами. Таким образом, стабильность пластидных мРНК находится в тесной зависимости от уровня их трансляции.
Трансляция белков в пластидах
Пластидный аппарат белкового синтеза находится под двойным генетическим контролем. Одни компоненты этого аппарата кодируются ядерными генами, другие (в том числе рибосомные и все транспортные РНК, а также приблизительно треть рибосомных белков) кодируются пластидной ДНК.
Рибосомы пластид существенно отличаются от цитозольных рибосом растительной клетки, но близки к рибосомам эубактерий. В пластидной рибосоме белков значительно меньше, чем в цитозольной. Это приводит к заметному снижению ее коэффициента седиментации (70S вместо 80S). Рибосомы пластид, как правило, содержат четыре типа рРНК, три из которых (23S, 5S и 16S) характерны для эубактерий. Четвертая рРНК (4.5S) гомологична З'-кон- цу 23S-pPHK и не обнаруживается ни в одном другом типе рибосом. Пластидные рибосомы близки эубактериальным и по комплексу белков. Оба типа рибосом имеют практически одинаковое количество белков, обладают похожими иммунологическими характеристиками и чувствительны к одним и тем же антибиотикам (хлорамфеникол, стрептомицин). Для большинства белков пластидной рибосомы показана высокая степень гомологии с соответствующими полипептидами эубактерий.
Весь набор пластидных тРНК кодируется приблизительно 30 различными генами tm, локализованными в пластидной ДН К. Подавляющее большинство этих генов представлено единственной копией.
Синтез белка в пластидах эффективно регулируется различными факторами, прежде всего светом. Показано, что у некоторых пластидных мРНК (например, мРНК psbA хламидомонады) 5'-область имеет характерную шпильку, распознаваемую крупным белковым комплексом. Входящий в него белок RB47 (мол. массой 47 кДа) в темноте находится в окисленной форме и не способен взаимодействовать со шпилькой мРНК. Освещение хлоропласта приводит к восстановлению сульфгидрильных групп белка RB47. В восстановленной форме он способен связываться со шпилькой, что является обязательным условием инициации трансляции. Таким образом, синтез белка, кодируемого геном psbA, активно идет на свету, но останавливается с наступлением темноты.
Белки, кодируемые в пластидном геноме
3333Процесс фотосинтеза в хлоропластах осуществляется сложными пигмент- белковыми комплексами, расположенными в тилакоидных мембранах. К ним
33
33
2 Физиология растений
относятся фотосистемы I и И, ^/-комплекс, пластидная АТФ-синтаза. Формирование этих белковых структур находится под двойным генетическим контролем, т. е. каждый белковый комплекс, обслуживающий процесс фотосинтеза, содержит как белки, кодируемые ядерным геномом, так и белки, кодируемые в геноме хлоропластов.
Хлоропласты высших растений содержат около 40 генов, кодирующие «рабочие» белки пластид. У разных организмов набор генов хлоропластного генома может быть различным. В целом можно отметить следующую закономерность: функциональные белки фотосинтетического аппарата чаще кодируются в геноме хлоропластов, тогда как регуляторные или «дополнительные» — в ядерном геноме. Например, в хлоропластном геноме кодируются основные белки реакционных центров обеих фотосистем, апопротеины цитохромов ^ и/, а- и р-субъединицы АТФ-синтазы, большая (каталитическая) субъединица рибу- лезобисфосфаткарбоксилазы (Рубиско). Под ядерным генетическим контролем находится весь спектр антенных хлорофиллсвязывающих белков, малая (регуляторная) субъединица Rubisco.
ТРАНСПОРТ ЦИТОЗОЛЬНЫХ БЕЛКОВВ ПЛАСТИДЫ
Для транспорта в хлоропласты на N-конце белков должен находиться сигнальный пептид, состоящий из 40 — 50 аминокислот (табл. 1.1). Белок транспортируется в строму хлоропластов в местах «слипания» их мембран. Транспорт требует энергии в виде АТФ.
Если белок должен остаться в строме, то довольно сложный комплекс шаперонов, составленный из больших (Hsp60, мол. масса 60 кДа) и малых (10 кДа) субъединиц, обеспечивает его сворачивание в АТФ-зависимом процессе. Наоборот, белки, которые предназначены для люмена тилакоидов либо их мембран, поддерживаются шаперонами в развернутой форме, что необходимо для их дальнейшего транспорта. Белки, направляемые к внешней мембране, не транспортируются в строму, а попадают в мембрану непосредственно из цитозоля.
Белки, предназначенные для тилакоидов, содержат два сигнальных пептида («стромальный» и «люменальный), расположенных последовательно один за другим. Первый пептид идентичен лидерному пептиду стромальных белков и направляет белок в строму хлоропласта. В строме протеаза удаляет «стромальный» пептид, что «открывает» второй лидерный пептид, который обеспечивает дальнейший транспорт белка через мембрану тилакоида. В люмене тилакоида второй сигнальный пептид отщепляется протеазой, и белок либо остается в люмене, либо встраивается в мембрану тилакоида.
Механизм встраивания интегральных белков в мембрану не совсем ясен. Скорее всего, белки встраиваются в мембрану за счет своих гидрофобных участков.
Существует, по крайней мере, два механизма транспорта белков через тилакоидную мембрану. Один путь требует для транслокации АТФ и ДрН на мембране. Другой путь АТФ-независим и для его осуществления достаточно только ДрН. '
ФУНКЦИИ ПЛАСТИД
Принципиально важно, что пластиды растений — это органеллы, выполняющие в растительной клетке разнообразные функции. При этом функции пластид различны для клеток различных тканей. Безусловно, главнейшей функцией пластидной системы является фотосинтез, происходящий в хлоропластах.
Другая важнейшая функция пластид — биосинтез многих соединений растительной клетки. Это связано с необходимостью компартментации в эукариотической клетке синтезируемых веществ. Растительная клетка в этом смысле имеет преимущества перед другими эукариотами, так как имеет два дополнительных компартмента — пластиды и вакуоли, которые используются клеткой весьма активно. В пластидах протекают промежуточные стадии многих метаболических процессов. Здесь у растений, помимо образования хлорофиллов и каротиноидов, синтезируются пурины и пиримидины, большинство аминокислот и все жирные кислоты (у животных эти процессы осуществляются в цитозоле). В пластидах также происходит восстановление ряда неорганических ионов — нитрита (МОД, который является продуктом цитозольного восстановления нитрата, и сульфата (SO4). Пластиды — основное место запасания железа: в них локализовано до 85 % фитоферритина. Пластидный компартмент образно можно назвать «фабрикой экологически вредных и энергоемких производств» растительной клетки, связанных с токсичными интермедиатами, свободнорадикальными процессами и высокими энергиями.
Особо следует отметить, что в пластидах часто протекают синтезы, дублирующиеся в цитозоле. Например, в них обнаружен шикиматный путь синтеза ароматических соединений, который обеспечивает синтез фенольных соединений вплоть до образования флавоноидов. Аналогичный путь известен и в цитозоле, однако там работают другие изозимы (например, халконсинтазы). В пластидах обнаружен также новый путь синтеза изопреноидов (см. подразд. 1.11).
Ферменты практически всех описанных биосинтетических путей хлоропластов имеют ядерное кодирование и, следовательно, транспортируются в пластиды из цитозоля, т. е. в данном случае пластиды используются для сегрегации биосинтетических путей.
РАСТИТЕЛЬНЫЕ МИТОХОНДРИИ
СТРОЕНИЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ МИТОХОНДРИЙ
Митохондрия — основная органелла, осуществляющая процесс дыхания в эукариотической клетке. Растительные митохондрии представляют собой сферические или удлиненные органеллы диаметром от 0,5 до 1,0 мкм и длиной от 1 до 3 мкм. Число митохондрий в растительной клетке варьирует в зависимости от метаболической активности соответствующей ткани, однако для клеток одного типа (ткани) концентрация митохондрий в единице объема цитоплазмы обычно достаточно постоянна. Например, небольшие клетки кончика корня проростка кукурузы содержат приблизительно по 200 митохондрий, тогда как гораздо более крупные клетки зрелого корня могут иметь до 2000 митохондрий. В метаболически активных клетках, например клетках-спутницах ситовид-
ных трубок или секреторных клетках, значительная часть (до 20 % от объема цитоплазмы) может быть занята митохондриями, сливающимися в единую «митохондриальную сеть» — хондриом. Некоторые одноклеточные водоросли (типа Chlamydomonas) содержат всего лишь несколько небольших митохондрий.
Митохондрии, как и хлоропласты, имеют две мембраны — наружную и внутреннюю. Поверхность внутренней мембраны больше, чем внешней. На ее долю приходится более 90 % всех митохондриальных липидов. Существенное увеличение поверхности внутренней мембраны митохондрий связано с наличием впячиваний — крист, которые достаточно глубоко внедряются в матрикс. На внутренней мембране расположены белковые комплексы дыхательной цепи. В матриксе находятся растворимые ферменты (в частности, цикла Кребса), митохондриальная ДНК (mtDNA), а также рибосомы.
Наружная мембрана митохондрий содержит белки-порины, гомологичные бактериальным, и проницаема для небольших молекул. Внутренняя мембрана энергизованна и практически непроницаема для ионов и органических молекул. Транспорт через внутреннюю мембрану, как и у пластид, осуществляется белками-переносчиками (транспортерами) или через специальные каналы.
Митохондрии размножаются делением. В отличие от пластид при их делении обычно не обнаруживается разделительного кольца. Подобное кольцо было обнаружено только при делении митохондрии у одноклеточной красной морской водоросли Cyanidium catdarium.
ГЕНОМ МИТОХОНДРИЙ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ
Высшие растения, по-видимому, имеют наиболее крупный митохондриальный геном среди всех эукариотических организмов. Если у подавляющего большинства эукариот (в том числе й у водорослей), размер митохондриаль-
123
2.
к х 6
54./ хГ'
4/ * 1
250 тыс. п.н. 1 '\
6/^\
L 320 тыс. п.н]
2 А х./
1
. КА 6
V) <%
X.У 67 тыс. п.н.
250 тыс. п.н.
, з 123- ,
./ХХуhr^d
'о/ti4
570 тыс. п.н.1 "* Г* 1490 тыс. п.н. 1
Г5\л5
./12\/
3 80 тыс. п.н.
Рис. 1.14. Кольцевые молекулы митохондриальной ДНК кукурузы, возникающие в результате внутримолекулярной рекомбинации.
Цифрами обозначены повторы, по которым может происходить рекомбинация
Рис. 1.15. Схема строения кольцевой ДНК («мастср»-хромосомы) митохондрий кукурузы
ной ДНК небольшой и составляет десятки тысяч пар оснований, то у высших растений — сотни тысяч.
Структура митохондриального генома растений также необычна. У большинства высших растений и водорослей ДНК митохондрий (мтДНК) представлена многочисленными кольцевыми молекулами размером не более 80 тыс. п. н., однако у целого ряда организмов, например у хламидомонад, она имеет не кольцевую, а линейную структуру. Крупная митохондриальная ДНК высших растений часто содержит значительное количество протяженных повторов, а потому способна к внутри- и межмолекулярной рекомбинации с образованием большого числа кольцевых молекул различного размера (рис. 1.14). В митохондриальном геноме растений, помимо крупных кольцевых молекул ДНК, часто присутствуют кольцевые и линейные плазмиды.
К настоящему времени проведено полное секвенирование митохондриальной ДНК некоторых водорослей, а также высших растений (печеночника, ара- бидопсиса, риса). Показано, что у разных объектов в составе мтДНК содержится от 25 (у хламидомонады) до 104 (у печеночника) генов. У высших растений мтДНК содержит, как правило, чуть больше 50 генов (рис. 1.15).
Подавляющая часть генома митохондрий растений состоит из некодирующих последовательностей. Гены отделены друг от друга по меньшей мере несколькими тысячами нуклеотидных пар, поэтому каждый ген обычно считывается автономно.
БЕЛОКСИНТЕЗИРУЮЩИЙ АППАРАТРАСТИТЕЛЬНЫХ МИТОХОНДРИЙ
Транскрипцию генов осуществляет мономерная РНК-полимераза фагового типа, кодируемая в ядре и способная эффективно мигрировать в митохондрии. Процесс созревания митохондриальных транскриптов в общих чертах сходен с таковым для пластид. Для ряда митохондриальных генов отмечен транссплайсинг. У высших растений практически все мРНК митохондрий подвержены интенсивному редактированию. Этот процесс включает не только типичное для пластид преобразование С -> U, но и обратную химическую модификацию U ^ С.
Митохондриальные рибосомы растений заметно отличаются от цитозольных и пластидных рибосом. В частности, их малая субъединица содержит 18S рРНК, а в большой субъединице помимо 26S рРНК присутствует 58-фрагмент рРНК. Все типы митохондриальных рРНК кодируются митохондриальным геномом. В отличие от многих эукариот, у которых белки митохондриальных рибосом кодируются исключительно ядерными генами, у высших растений, криптомонад и золотистых водорослей более десятка рибосомальных белков кодируются собственным геномом. Особенность митохондриальной белоксинтези- рующей системы растений состоит в том, что не все тРНК кодируются митохондриальным геномом. Недостающие варианты тРНК транспортируются в митохондрию из цитозоля.
Молекулярный аппарат аэробного дыхания у растений также находится под двойным генетическим контролем. У всех эукариот растворимые ферменты цикла Кребса находятся под ядерным контролем. Белки электрон-транс- портной цепи митохондрий, напротив, обычно находятся под двойным контролем. В геноме митохондрий высших растениях кодируются около 20 белков дыхательной цепи.
ТРАНСПОРТ ЦИТОЗОЛЬНЫХ БЕЛКОВ В МИТОХОНДРИИ
)
Транспорт цитозольных белков в митохондрии по механизму похож на транспорт в хлоропласты, но основан на других сигнальных последовательностях и других транспортных системах. Чаше всего кодируемые ядром митохондриальные белки синтезируются с N-терминальной лидерной областью, называемой пресиквенсом. Многие пресиквенсы формируют положительно заряженную ам-
фипатическую а-петлю. Гидрофобные остатки аминокислот пресиквенса расположены на одной поверхности петли, а заряженные остатки — на другой. Пресиквенс обеспечивает транспорт белка в матрикс митохондрий, после чего расщепляется эндопептидазой. Перенос белков происходит в специальных участках «слипания» внешней и внутренней мембраны митохондрий. В них мембраны не сливаются, но очень тесно контактируют в области площадью 4 — 6 нм. Эти участки занимают приблизительно от 5 до 10% поверхности наружной мембраны. В переносе белков участвуют шапероны. Для переноса белков в митохондрию необходимы АТФ и градиент электрохимического потенциала на мембране.
Транспорт белков во внутреннюю мембрану и межмембранное пространство, как и у хлоропластов, требует двух сигналов. Такие белки обладают вторым пресиквенсом — гидрофобной последовательностью аминокислот, расположенной сразу после N-концевого пресиквенса.
ФУНКЦИИ МИТОХОНДРИЙ РАСТЕНИЙ
Митохондрии растений, аналогично пластидам, помимо своей основной задачи — окислительного фосфорилирования — имеют ряд дополнительных функций. Это прежде всего биосинтез некоторых соединений растительной клетки: ряда аминокислот, фолата, тимидилата. В митохондриях проходят важные метаболические процессы, например декарбоксилирование и дезаминирование аланина в системе фотодыхания.
ПЕРОКСИСОМЫ
Пероксисомы (иногда их называют микротельцами) — обязательные органеллы эукариотической клетки, в основном округлой формы и размером в пределах 0,2— 1,5 мкм. Они существенно отличаются от митохондрий и хло- ропластов. Прежде всего пероксисомы имеют только одну мембрану и не содержат ДНК и рибосом. У них нет собственного генома, поэтому все их белки поставляются из цитозоля. Функции пероксисом в значительной степени зависят от типа клеток, которым они принадлежат.
Подобно митохондрии, пероксисома является одним из главных центров утилизации кислорода в клетке Существует красивая гипотеза, согласно которой пероксисома — это древняя органелла, которая выполняла в примитивных клетках все функции метаболизма кислорода. Когда в результате возникновения оксигенного фотосинтеза в атмосфере начал накапливаться кислород, для большинства древних анаэробов он оказался весьма токсичным. В этих условиях вполне вероятным было возникновение специальной органеллы — предка пероксисомы, в функции которой входило снижение концентрации кислорода в клетках. При этом представлялась возможность использовать кислород для проведения целого ряда окислительных реакций. Однако появившиеся в результате симбиогенеза митохондрии оказались гораздо более «выгодными» органеллами, так как реакции, ранее протекавшие в пероксисомах без производства энергии, теперь за счет окислительного фосфорилирования мог-
ли образовывать АТФ. Таким образом, появление митохондрий сделало пероксисомы в значительной мере ненужными органеллами. Несмотря на это пероксисомы сохранились в современных эукариотических клетках и выполняют целый ряд реакций, связанных с утилизацией кислорода. Механизм протекающих в этих органеллах реакций достаточно уникален: пероксисомы используют в реакциях окисления молекулярный кислород с образованием перекиси водорода (отсюда произошло их название):
RH2 + О2 —► R + Н2О2
Кроме окислительных ферментов пероксисома обязательно содержит каталазу. Каталаза разлагает образовавшуюся перекись водорода, поскольку она также достаточно токсична. Разложение идет с пользой для клетки: оно используется для окисления множества субстратов, например фенолов, муравьиной кислоты, формальдегида, спирта. Этот тип окислительных реакций особенно важен для обезвреживания (окисления) ксенобиотиков (токсичных органических соединений антропогенного происхождения):
Н2О2 + R'H2 — R' + 2Н2О
Пероксисомы представляют собой разнообразные органеллы, содержащие сильно различающиеся наборы ферментов в разных клетках даже одного и того же организма. В некоторых случаях в зависимости от условий изменяются и размеры пероксисом.
У растений хорошо изучены три типа пероксисом. Пероксисомы в листьях являются ключевыми органеллами в процессе фотодыхания (см. гл. 3). Пероксисомы в прорастающих семенах служат для превращения жирных кислот, запасенных в липидах семян, в сахара, которые используются для роста формирующегося растения. Пероксисомы этого типа носят название глиоксисом, так как превращение жиров в сахара происходит в серии реакций, известных под названием глиоксилатного цикла (см. гл. 3). В животных клетках глиоксилатный цикл отсутствует, поэтому они не способны превращать жирные кислоты, содержащиеся в жирах, в углеводы. Третий тип пероксисом характерен для растений, использующих ризобиальный симбиоз для фиксации азота.
Все мембранные белки пероксисом поступают из цитозоля. Вероятно, липиды, требуемые для построения новой мембраны пероксисом, также поступают в них за счет обмена (без процесса слияния мембран) с мембранами ЭР, где они синтезируются. Процесс осуществляют специальные ферменты типа флипаз.
Существует по крайней мере два разных сигнала, ответственных за транспорт белков в пероксисомы: PTS1 и PTS2. Первый представляет собой трипептид Ser-Lys-Leu или близкие к нему варианты. Этот сигнал имеют большинство белков, предназначенных для матрикса пероксисом. В отличие от большинства других сигнальных участков, эта короткая последовательность расположена на С-конце транспортируемого белка и не удаляется после его транслокации в пероксисому. Удаление PTS1 прекращает импорт в пероксисому большинства белков, однако у ряда белков он сохраняется. Для них показано существование дополнительного сигнала транспорта PTS2, который находится на N-конце кодирующей области белка. Чужеродные белки, соединен-
ные с PTS-подобными последовательностями, эффективно транспортируются в пероксисомы. Пероксисомы содержат как минимум один уникальный белок, расположенный на обращенной к цитозолю поверхности их мембраны, который работает в качестве рецептора, распознающего сигнал на импортируемом белке.
Новые пероксисомы всегда возникают из предсуществующих и формируются путем роста и деления органеллы, т. е. размножаются подобно митохондриям и хлоропластам. Это свидетельствует в пользу гипотезы о независимом происхождении пероксисом.
ЦИТОСКЕЛЕТ
Цитоплазма эукариотических клеток пронизана трехмерной сетью из белковых нитей, называемой цитоскелетом. В зависимости от диаметра нити разделяются на микрофиламенты (6 — 8 нм) и микротрубочки (около 25 нм). Все эти волокна представляют собой полимеры, состоящие из субъединиц особых глобулярных белков (рис. 1.16).
АКТИН
Микрофиламенты (актиновые нити) состоят из белка актина, наиболее распространенного в эукариотических клетках. Актин может существовать в виде мономера (G-актин, «глобулярный актин») или полимера (F-актин, «фибриллярный актин»). G-актин — асимметричный глобулярный белок (42 кДа), состоящий из двух доменов. По мере повышения ионной силы G-актин обратимо агрегирует, образуя линейный скрученный в спираль полимер F-актин. Молекула G-актина несет прочно связанную молекулу АТФ, которая при переходе в F-актин медленно гидролизуется до АДФ, т. е. F-актин имеет свойства АТФазы.
При полимеризации G-актина в F-актин ориентация всех мономеров одинакова, поэтому F-актин обладает полярностью. Волокна F-актина имеют два разноименно заряженных конца: (+) и (-), которые полимеризуются с различной скоростью. В растительной клетке эти концы не стабилизированы специальными белками (как, например, в мышечных клетках), и при критической концентрации F-актина (+)-конец будет удлиняться, а (-)-конец укорачиваться. В условиях эксперимента этот процесс может быть ингибирован токсинами грибов. Например, фаллоидин (яд бледной поганки) связывается с (-)-кон- цом и ингибирует деполимеризацию, в то время как цитохалазин (токсин из плесневых грибов, обладающий свойством цитостатика) присоединяется к (+)-концу, блокируя полимеризацию.
В цитоплазме клеток имеется более 50 различных типов актинассоцииро- ванных белков, которые специфически взаимодействуют с G- и F-актином. Эти белки выполняют различные функции: регулируют объем G-актинового пула (профилин), оказывают влияние на скорость полимеризации G-актина (виллин), стабилизируют концы нитей F-актина (фрагин, р-актинин), сшивают филаменты друг с другом или с другими компонентами (как, например,
F-актин(полимерный)
А
Б
Рис. 1.16. Схема строения элементов цитоскелета:
А — строение мономерного (G) и полимерного (F) актина; принцип движения актина; Б — строение микротрубочек тубулина; принцип их сборки и разборки
Рис. 1.17. Актин-ассоциированпые белки:
а — разъединяющие; б — «блокировочные»; в — «скрещивающие»; г — связующие; д — «моторные»
виллин, а-актинин, спектрин) или разрушают спираль F-актина (гель-золин). Активность актин-ассоциированных белков регулируется ионами Са + и про- теинкиназами (рис. 1.17).
ТУБУЛИН
Микротрубочки построены из глобулярного белка тубулина, представляющего собой димер а- и р-субъединиц (53 и 55 кДа). Гетеродимеры аир образуют линейные цепочки, называемые протофиламентами; 13 протофиламентов образуют циклический комплекс, затем кольца полимеризуются в длинную трубку. Как и микрофиламенты, микротрубочки представляют собой динамические полярные структуры с (+)- и (-)-концами. Конец (-) стабилизирован за счет связывания с центросомой (центр организации микротрубочек), в то время как для (+)-конца характерна динамическая нестабильность. Он может либо медленно расти, либо быстро укорачиваться. Тубулиновые мономеры связывают ГТФ, который медленно гидролизуется в ГДФ. С микротрубочками ассоциируют два вида белков: структурные белки МАР и белки-транслокаторы.
БЕЛКИ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ВОЛОКОН
Для цитоскелета животных клеток характерно наличие промежуточных волокон. Типичными представителями таких белков являются цитокератины, десмин, виментин, кислый фибриллярный глиапротеин. Все эти белки имеют в центральной части базовую стержневую структуру — суперспирализованную а-спираль. Такие димеры ассоциируют антипараллельно, образуя тетрамер. Агрегация тетрамеров по принципу «голова к голове» дает протофиламент.
Восемь протофиламентов образуют промежуточное волокно. В отличие от микрофиламентов и микротрубочек свободные мономеры промежуточных волокон едва ли встречаются в цитоплазме. Их полимеризация ведет к образованию устойчивых неполярных полимерных молекул.
Белки подобного типа обнаружены в растительных клетках, однако формирование типичных промежуточных волокон не зарегистрировано.
ФУНКЦИИ ЦИТОСКЕЛЕТА
Цитоскелет выполняет три главные функции:
формирует механический каркас, который придает клетке форму и обеспечивает связь между мембраной и органеллами; каркас представляет собой динамичную структуру, которая постоянно обновляется по мере изменения внешних условий и состояния клетки. Для растительной клетки, имеющей жесткую клеточную стенку, формообразующая роль цитоскелета несущественна;
действует как «мотор» для клеточного движения: компоненты цитоскелета определяют деление клеток, перемещение органелл, движение цитоплазмы (моторная функция цитоскелета также более важна для животных клеток);
служит «рельсами» для транспорта органелл и других крупных комплексов внутри клетки.
ЭНДОМЕМБРАННЫЕ СТРУКТУРЫРАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ
ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКИЙ РЕТИКУЛУМ (ЭР)
Общая характеристика растительного ЭР
Эндоплазматический ретикулум (ЭР) представляет собой непрерывную трехмерную сеть канальцев, составленную из пластинчатых и трубчатых цистерн. Канальцы ЭР образованы одинарной мембраной (мембраной ЭР), на которую приходится более половины общего количества всех мембран клетки. Канальцы лежат под плазмалеммой, пронизывают всю цитоплазму и соединяются с ядер- ной оболочкой. Несмотря на многочисленные складки и изгибы, мембрана ЭР образует непрерывную поверхность, ограничивающую единое внутреннее пространство — называемое полостью, или люменом ЭР. Оно часто занимает более 10 % общего объема клетки. Таким образом, полость ЭР отделена от цитозоля только одинарной мембраной. Обмен молекул между ЭР и цитозолем происходит через мембрану преимущественно по мономолекулярному механизму. Особенностью ЭР растительной клетки является то, что его полость простирается не только внутри отдельной клетки, но за счет плазмодесм — и вне ее границ.
Эндоплазматический ретикулум, расположенный под плазматической мембраной, носит название кортикального. Он характеризуются практически неподвижным фиксированным расположением спиралеобразных участков сети и канальцев со слепыми окончаниями. Кортикальный ЭР может выполнять функ-
Рис. 1.18. Основные области растительного ЭР
ции неподвижного фиксатора для актиновых филаментов цитоскелета, которые осуществляют движение цитоплазмы. Трубчатые элементы ЭР, находящиеся во внутренних слоях клетки, характеризуются большей подвижностью. В отличие от животных клеток, где реорганизация ЭР цистерн и канальцев зависит от микротрубочек цитоскелета, движение ЭР в растительных клетках, по- видимому, зависит от актино-миозиновой системы.
Мембранная система ЭР — наиболее универсальная и адаптивная органелла эукариотических клеток. Эта гибкость обусловлена большой мембранной поверхностью, способной включать различные наборы интегральных и периферийных белков.
Основные функции ЭР — синтез, обработка и сортировка белков, гликопротеидов и липидов. На мембранах ЭР начинается синтез белков, предназначенных для транспорта по секреторному пути. Здесь же синтезируются большинство липидов для мембран митохондрий и пероксисом. ЭР является также важным участником сигнальных систем клетки, регулируя цитозольную концентрацию кальция.
Принято выделять две области ЭР — шероховатый и гладкий ЭР, однако в последнее время в ЭР было идентифицировано несколько специализированных областей, отличных «классических». В частности, в растительных клетках можно выделить зону «шлюза» между ЭР и оболочкой ядра, области фиксации актиновых филаментов, формирования белковых и масляных тел, образования вакуолей, контактов с плазмалеммой, вакуолью и с митохондриями; области плазмодесм и рециркуляции липидов (рис. 1.18).
Функциональные области растительного ЭР
Шероховатый и гладкий ЭР существуют в динамическом равновесии. Они различаются соответственно по присутствию или отсутствию рибосом на мембранной поверхности. Гладкий ЭР состоит из трубчатых канальцев, а шероховатый ЭР — из уплощенных цистерн.
Исходной структурой ЭР являются трубчатые канальцы, характерные для гладкого ЭР. При формировании шероховатого ЭР появляются чисто пространственные ограничения, связанные с прикреплением на мембраны ЭР рибосом (полисом). Это приводит к уплощению трубчатых канальцев. Таким образом, различия между шероховатым и гладким ЭР обусловлены закреплением рибосом на мембранах ЭР. Закрепление первой рибосомы на ЭР способствует образованию рядом дополнительных рецепторов и каналов транслокации. Это приводит к закреплению новых рибосом и локальному расширению шероховатого ЭР возле данной области, т. е. фактически происходит самосборка шероховатого ЭР (рис. 1.19).
Шероховатый ЭР — место отправления белков по секреторному пути. Большинство растворимых белков, предназначенных для этого, синтезируются в виде предшественников с транзиентным N-концевым сигнальным пептидом для мембраносвязанных полисом. Полипептиды котрансляционно транспортируются в полость ЭР, после чего сворачиваются и подвергаются определенным модификациям. Прежде всего соответствующая пептидаза отщепляет сигнальный пептид. Сворачивание белков в большой степени осуществляется за счет образования дисульфидных мостиков между остатками цистеинов. Правиль-
Рис. 1.19. Синтез белка в шероховатом ЭР
ность положения образования этих мостиков контролирует фермент протеин- дисульфидизомераза.
Наиболее важной модификацией белков, поступивших в ЭР, является их N-гликозилирование. Исходно в ЭР формируются 14-членные олигосахариды определенной структуры. Они присоединены к находящемуся в мембране ЭР долихолу — изопреноиду, состоящему из различного (от 14 до 24) числа изопреновых единиц. За счет долихола олигосахариды фиксируются на мембране и «ожидают» белки, поступающие в просвет ЭР. По мере поступления белка специфичные трансферазы переносят олигосахаридный фрагмент от долихола на определенный остаток аспарагина белка. Олигосахарид, используемый для N-гликозилирования белков ЭР, в растительной и животной клетке имеет различную структуру (рис. 1.20).
Правильное сворачивание растущей полипептидной цепи обеспечивают шапероны. Эти резидентные белки фиксируют растущий полипептид и направляют процесс сворачивания, ограничивая нежелательные взаимодействия. Наиболее важное значение имеют люмен-связанный шаперон Bip. Белки, которые не в состоянии сформировать правильную трехмерную структуру, в конечном счете подвергаются деградации. Некоторые белки, не свернутые должным образом в ЭР, возвращаются в цитозоль обратным переносом через мембрану ЭР. Если белок, поступивший в ЭР, имеет С-концевой сигнальный тетрапептид KDEL, он остается в ЭР, а при отсутствии этой последовательности отправляется в аппарат Гольджи.
Функциональные свойства гладкого ЭР растительных клеток изучены недостаточно. По-видимому, одна из основных его функций — синтез липидных молекул. Мембраны гладкого ЭР обогащены ферментами биосинтеза глицеро- липидов, изопреноидов, фенилпропаноидов, флавоноидов, восков. Косвенное свидетельство синтеза подобных соединений ферментами, расположенными в ЭР, получено при изучении ультраструктуры железистых клеток, осу-
Исходный гликан N-гликозилированныхбелков эукариотических клеток
-C-NH-CH-C-NH--C-NH-CH-C-NH-Гликан N-гликозилированных белков растенийГликан N-гликозилированных белков растений- С—NH—CH—С—NH—- С—NH—CH—С—NH—ООСН2 ос=оСН2 ос=оNHNHсн2 о с=оINHсн2 о с=оINHГликан N-гликозилированных белков животныхГликан N-гликозилированных белков животных-С—NH—CH—С—NH—-С—NH—CH—С—NH—оосн2ос=оINHсн2ос=оINHО N-Ацетилнейраминовая кислотаО N-АцетилглюкозаминО МаннозаО Галактоза♦ Фукоза■ КсилозаО N-Ацетилнейраминовая кислотаО N-АцетилглюкозаминО МаннозаО Галактоза♦ Фукоза■ КсилозаРис. 1.20. Различия в гликозилировании белков в ЭР растительной и животной клетки:Рис. 1.20. Различия в гликозилировании белков в ЭР растительной и животной клетки:А — схема строения гликанов N-гликозилированных белков растительной и животной клеток; Б — схема формирования гликана N-гликозилированных белков в ЭР растительной клеткиА — схема строения гликанов N-гликозилированных белков растительной и животной клеток; Б — схема формирования гликана N-гликозилированных белков в ЭР растительной клетки
-C-NH-CH-C-NH-
-C-NH-CH-C-NH-
Гликан N-гликозилированных белков растений
Гликан N-гликозилированных белков растений
- С—NH—CH—С—NH—
- С—NH—CH—С—NH—
О
О
СН2 ос=о
СН2 ос=о
NH
NH
сн2 о с=о
I
NH
сн2 о с=о
I
NH
Гликан N-гликозилированных белков животных
Гликан N-гликозилированных белков животных
-С—NH—CH—С—NH—
-С—NH—CH—С—NH—
о
о
сн2о
с=о
INH
сн2о
с=о
INH
О N-Ацетилнейраминовая кислота
О N-Ацетилглюкозамин
О Манноза
О Галактоза
♦ Фукоза
■ Ксилоза
О N-Ацетилнейраминовая кислота
О N-Ацетилглюкозамин
О Манноза
О Галактоза
♦ Фукоза
■ Ксилоза
Рис. 1.20. Различия в гликозилировании белков в ЭР растительной и животной клетки:
Рис. 1.20. Различия в гликозилировании белков в ЭР растительной и животной клетки:
А — схема строения гликанов N-гликозилированных белков растительной и животной клеток; Б — схема формирования гликана N-гликозилированных белков в ЭР растительной клетки
А — схема строения гликанов N-гликозилированных белков растительной и животной клеток; Б — схема формирования гликана N-гликозилированных белков в ЭР растительной клетки
ществляющих синтез и секрецию масел и флавоноидов. Эти клетки содержат обширные сети гладких ЭР мембран.
Участки формирования белковых тел. Запасные белки семян синтезируются в течение развития семени и служат основным источником аминокислот при прорастании и развитии проростка. Этот процесс различен у разных видов растений. Хлебные злаки синтезируют два класса запасных белков. Водорастворимые глобулины синтезируются рибосомами шероховатого ЭР и затем транспортируются через АГ к запасающим вакуолям. Более гидрофобные проламины кукурузы, сорго и пшеницы образуют белковые тела непосредственно в поло-
Рис. 1.21. Формирование масляных (/1) и белковых (5) тел в ЭР
сти шероховатого ЭР. При этом синтезируемые молекулы белка остаются связанными с Bip в течение длительного периода времени, а затем самоорганизуются в большие агрегаты (рис. 1.21). Эти агрегаты могут увеличиваться за счет «поимки» полисом, синтезирующих проламин. Полисомы, образующие другие полипептиды, агрегатами не захватываются.
Участки формирования масляных тел. Триацилглицериды — запасающие масла семян, которые на ранних стадиях прорастания обеспечивают их энергией и липидами — строительными блоками образующихся мембран. Эти молекулы жиров синтезируются ЭР-связанными ферментами и запасаются в виде сферических масляных тел. Размер масляных тел зависит от вида растения и варьирует от 0,6 до 2,0 мкм.
Масляные тела возникают путем накопления молекул триацилглицеридов в специальных местах ЭР. Эти места определены присутствием олеозинов — интегральных белков мембран массой 16 — 25 кДа. Олеозины имеют «кнопкоподобную» структуру и подобно кнопкам вставлены в ЭР мембраны масляных тел. «Острие» кнопки состоит из 72 гидрофобных остатков аминокислот, организованных в форме антипараллельного p-скрученного домена, который присоединен своими обоими концами к «шляпке». Присутствие олеозинов, по- видимому, заставляет вновь синтезируемые молекулы триацилглицеридов накапливаться между биослоями мембраны и образовывать сферические масляные тела, которые затем отпочковываются от ЭР (см. рис. 1.21). Каждое масляное тело окружено фосфолипидным монослоем, который содержит, помимо плотно упакованных олеозинов, и другие характерные белки. Размер масляных тел зависит от соотношения триацилглицеридов и олеозинов.
Область рециркуляции липидов. В плазмалемму постоянно встраиваются везикулы, отшнуровывающиеся от АГ, что приводит к увеличению ее поверхности. Обычно избыточный материал плазматических мембран возвращается внутрь клетки за счет эндоцитоза. Однако в растительных клетках эндоцитоз значительно осложнен, так как тургорное давление препятствует впячиванию плаз- малеммы в цитозоль и формированию везикул. Оказалось, что возврат (рецир-
куляция) липидов в растительной клетке происходит путем их перемещения из плазмалеммы в ЭР. Этот процесс происходит в специальных областях, где плазматическая мембрана образует складку и пальцеподобный контакт с ЭР. Поскольку в этих местах не происходит слияния между ЭР и плазматический мембраной, предполагается, что рециркуляция липидов в зоне контакта происходит по мономолекулярному механизму.
Трубчатые участки ЭР являются структурной основой формирования плаз- модесм. Плазмодесмы обеспечивают взаимосвязь между клетками растения. Первичные плазмодесмы образуются в течение цитокинеза, когда пакеты трубчатого ЭР «захватываются» строящейся срединной пластинкой, которая формирует новую клеточную стенку. Вторичные плазмодесмы образуются после формирования клеточных стенок. Механизм их образования включает ограниченное растворение клеточной стенки и формирование мостов между плазматической мембраной и ЭР смежных клеток.
Установлена физическая непрерывность как плазматических мембран двух смежных клеток, так и центрального цилиндра сжатой мембраны ЭР. При использовании флуоресцентных мембранных липидных зондов было показано, что от ЭР одной клетки к ЭР смежной клетки быстро диффундируют только те липиды, которые преобладают в мембранах ЭР. Липиды, характерные исключительно для наружного слоя плазматической мембраны, через плазмодесмы не передвигаются, несмотря на физическую непрерывность плазматической мембраны соседних клеток.
Пространство между плазматической мембраной и центральным ЭР цилиндром называется «эндоплазматическим кольцом». Оно содержит спицеобразные линкерные белки, ограничивающие размер молекул, которые могут проходить по плазмодесме между клетками.
До недавнего времени плазмодесмы в целом рассматривали как функциональные эквиваленты щелевых контактов животных клеток, так как эксперименты с мечеными молекулами показали, что эти два межклеточных перехода имеют сходные «пропускные» пределы для транспортируемых молекул — около 900 Да. Однако, по-видимому, правильнее сравнивать их с ядерными порами, прежде всего из-за способности достаточно быстро увеличивать степень открытия. При этом становится возможным проход через плазмодесмы больших молекул, в том числе белков, вирусных нуклеопротеидных комплексов и даже интактных вирионов. Транспорт вирусов через плазмодесмы — принципиальный момент в инфекционном процессе. Это свойство растительных вирусов позволило идентифицировать и охарактеризовать вирусные белки «движения», которые обладают способностью увеличивать «пропускной» предел плаз- модесм, позволяя вирусу распространяться по всему растению.
АППАРАТ ГОЛЬДЖИ
Аппарат (или комплекс) Гольджи (АГ) занимает центральную позицию в секреторном пути транспорта макромолекул. Он получает вновь синтезируемые белки и липиды от ЭР и направляет их либо к поверхности клетки, либо к вакуолям. У растений в АГ происходит сборка сложных полисахаридов матрикса клеточной стенки, синтез и процессинг углеводных фрагментов О- и N-гли-
копротеинов. Гликозилтрансферазы и гликозидазы, которые осуществляют эти реакции, являются интегральными белками мембран АГ. Специфичные мембранные белки-переносчики поставляют нуклеотиды сахаров из цитозоля к гли- козилтрансферазам, которые синтезируют различные углеводные продукты.
Принципиальное различие в функционировании аппарата Гольджи и системы ЭР связано с механизмом транспортировки синтезируемых и/или обрабатываемых продуктов внутри органеллы. Эндоплазматический ретикулум представляет собой единую полость, и молекулы имеют возможность распределяться по всей органелле. Аппарат Гольджи состоит из отдельных цистерн, и синтезируемые им продукты последовательно перемещаются между ними путем везикулярного транспорта.
Строение растительного АГ
Функциональная единица АГ растительной клетки представляет собой стопку цистерн, ассоциированную с ними транс-Гольджи-сеть и Гольджи-матрикс, который окружает обе структуры. Количество единиц АГ в клетке может варьировать в зависимости от ее вида, размера и стадии развития, а также от объема и типа секретируемых клеткой молекул. Например, маленькие клетки апикальной меристемы иван-чая (Epilobium) содержат приблизительно 20 единиц АГ, тогда как клетки хлопка (Gossipium), продуцирующие волокна, — более 10 000.
Стопки цистерн АГ носят название диктиосом, или стеков. Диктиосома включает 5 — 8 уплощенных цистерн. Цистерны морфологически полярны и имеют формирующуюся (цис-) и секреторную (транс-) сторону. Ц«с-сторона тесно связана с переходными элементами ЭР. Транс -сторона расширяется, образуя трубчатый ретикулум, называемый тронс-Гольджи-сетью (рис. 1.22).
Т^онс-Гольджи-сеть (ТГС) — искривленная, полигональная сетчатая структура, построенная из канальцев с гладкой поверхностью. Она может иметь контакты с несколькими единицами АГ. От ТГС отделяется множество везикул, которые транспортируют различные молекулы к вакуолям или плазма- лемме. ТГС представляет собой главный пункт разветвления секреторного пути: в частности, белки, предназначенные для экзоцитозного транспорта, отделяются от белков, направляемых в вакуоли. Размеры ТГС зависят от типа клетки.
Гольджи-матриксом называют тонкую нитевидную сетчатую структуру, которая окружает диктиосомы и ТГС. В Гольджи-матриксе нет рибосом и цитозольных белков. Предполагают, что в его функции входит защита диктиосом и предотвращение потерь транспортных везикул.
Со стопками Гольджи всегда ассоциировано множество мелких (диаметром около 60 нм), ограниченных мембраной пузырьков (везикул). Они группируются на стороне, примыкающей к ЭР, а также по периферии стопки вблизи расширенных краев каждой цистерны. Полагают, что эти пузырьки (везикулы Гольджи) переносят белки и липиды в АГ и транспортируют их между цистернами.
В животной клетке АГ, как правило, располагается вблизи центра клетки. В растительной клетке, напротив, комплексы Гольджи (диктиосомы + ТГС) обычно рассеяны по всей цитоплазме — либо по одиночке, либо небольшими группами. Подобная локализация, а также актинзависимое передвижение диктиосом по цитоплазме гарантируют, что даже в большой вакуолизированной
Рис. 1.22. Схема строения растительного аппарата Гольджи.
Оболочки везикул: 1 — везикулы, содержащие белки оболочки СОР (Coat Protein); 2 — везикулы без белкового покрытия; 3 — везикулы, покрытые клатрином (окаймленные везикулы)
растительной клетке секретируемые вещества будут доставлены по назначению. Анализ характера движений диктиосом показал, что они движутся по типу «остановились-пошли» («stop-and-go»). Это послужило основанием для гипотезы, согласно которой диктиосомы могут делать паузу у экспортных участков ЭР, чтобы «принять груз», а также недалеко от формирующейся клеточной стенки, чтобы «разгрузиться».
В растительной клетке АГ остается структурно целостным и функционально активным в течение митоза, что необходимо для формирования мембран и макромолекул срединной пластинки. Новые диктиосомы образуются путем деления, которое может начинаться как с цис-, так и с /я^онс-стороны. Это обычно происходит в течение фазы С2 клеточного цикла.
Транспорт продуктов в аппарате Гольджи
Стопки Гольджи состоят из морфологически неоднородных типов цистерн, содержащих различный набор ферментов и выполняющих разные функции. Цис-цистерны являются «станциями приемки» продуктов, транспортируемых в везикулах от ЭР. После первого цикла обработки продукты транспортируются к промежуточным цистернам, затем — к лирудс-цистернам и, наконец, отправляются в ТГС. Тронс-цистерны Гольджи и ТГС имеют наиболее кислый pH по сравнению с другими компартментами АГ. Это связано с активностью в их
мембранах Н+-АТФазы V-типа (см. ниже). Помимо регуляции ферментов, находящихся в этих компартментах, низкий pH, по-видимому, способствует формированию транспортных везикул.
Большинство везикул, отпочковывающихся от цистерн Гольджи и ТГС, имеют белковую оболочку (см. рис. 1.22). Она выполняет несколько функций: определяет типы молекул, помещаемые в данную везикулу, контролирует процесс формирования везикулы и, самое главное, определяет «место назначения» данной везикулы, так как ряд белков оболочки специфичны по отношению к мембране «назначения» везикулы.
Везикулы, участвующие в транспортных путях ЭР -» Гольджи, Гольджи -> -> Гольджи и Гольджи -> ТГС, отпочковываются от мембран за счет механизма, использующего специальные белки оболочки — СОР (от англ, coat protein). После завершения формирования везикулы большинство белков отделяются от нее и могут участвовать в образовании другой везикулы.
У везикул, которые формируются в ТГС и предназначены для экспорта ва- куолярных ферментов и запасных белков, оболочки содержат белок клатрин (рис. 1.22). Покрытые клатрином везикулы, называемые окаймленными пузырьками, транспортируют вещества исключительно в вакуоли. Молекулы, не попавшие в окаймленные пузырьки, впоследствии упаковываются в везикулы другого типа, которые отправляют их к клеточной поверхности. Этот вариант транспорта известен как «путь дефолта». Покрытые клатрином везикулы с различными «адаптерными» белками участвуют также в поглощении растворимых и мембранных белков в процессе эндоцитоза.
Функции аппарата Гольджи растительных клеток
Аппарат Гольджи участвует в сборке углеводных фрагментов N- и О-свя- занных гликопротеидов и протеогликанов, а также в синтезе сложных полисахаридов. Одна из основных функций гликозилирования — защита белков от протеолиза. В ряде случаев углеводные группы могут участвовать во взаимодействии клеточной стенки с плазмалеммой, определять правильное сворачивание белка или регулировать образование белковых ассоциаций. Большинство белков, имеющих N-гликозилирование, являются ферментами, тогда как 0-гликозилированные белки часто выполняют структурные роли. Как N-, так и О-связанные гликаны представляют собой боковые цепи гликозилированных арабиногалактанов.
Синтез N-связанных гликопротеидов начинается в ЭР, где на поступающие в люмен ЭР белки переносятся от долихола 14-членные олигосахариды. Последующая обработка олигосахарида, включающая систематическое удаление остатков маннозы и введение остатков других сахаров, происходит в АГ. Ферменты, вовлеченные в этот процесс, упорядоченно распределены по цис-, промежуточным и /л/юдс-цистернам в соответствии с последовательностью реакций формирования конкретного N-связываемого гликана.
Относительно образования О-гликозилированных белков в АГ известно меньше. Гликозилирование — важный момент образования многих структурных белков клеточной стенки (см. ниже). Сахара, главным образом арабиноза и галактоза, присоединяются к гидроксилсодержащим аминокислотам — гидроксипролину, серину и треонину. Посттранскрипционное образование гидрокси-
пролина в белке происходит скорее всего в ЭР, тогда как О-гликозилирование белка — в ^дс-цистернах АГ.
Наиболее важной функцией растительного аппарата Гольджи следует считать синтез полисахаридов. В АГ синтезируются все полисахариды клеточной стенки, за исключением целлюлозы и каллозы. Полная картина синтеза этих соединений не ясна, однако известен ряд интересных деталей. Установлено, в частности, что в синтезе пектиновых соединений участвуют ферменты, расположенные во всех цистернах аппарата Гольджи, тогда как ферменты, ответственные за синтез ксилогликанов, расположены преимущественно в транс- цистернах и ТГС.
ВАКУОЛИ
Вакуоли растительных клеток были обнаружены в ранних микроскопических исследованиях. Как следует из этимологии названия («вакуоль» — от слова «вакуум»), первоначально они были определены как «пустые», т.е. свободные от цитоплазмы части клетки. Вакуоли растительной клетки весьма разнообразны по форме, размеру, своему содержимому и функциональной роли. Отдельная клетка может содержать несколько видов вакуолей.
Вакуолями называют органеллы, заполненные жидкостью и окруженные одинарной мембраной — тонопластом. Вакуоли обычно занимают более 30 % объема клетки. Клетки апикальных меристем, как правило, содержат много маленьких вакуолей, которые сливаются в одну или несколько больших вакуолей по мере роста и развития клетки. В большой зрелой растительной клетке вакуоль может занимать до 90 % ее объема.
Общая характеристика вакуолей растительной клетки
Вопрос, почему растительная клетка имеет столь значительную по размерам вакуоль, является одним из наиболее интересных в физиологии растений. Ответ на него можно искать исходя из способа существования растений — прежде всего фототрофности. Для эффективного фотосинтеза фиксированного в пространстве организма необходима большая площадь поглощающей свет поверхности. Именно поэтому большинство листьев имеет плоскую форму. На клеточном уровне также необходимо увеличение поверхности клетки. Возможно, в этом и состоит главная причина увеличения объема вакуолярного ком- партмента клетки. Такой способ увеличения размеров клеток, по-видимому, экономически наиболее выгодный («дешевый»), так как не требует увеличения объема цитозоля — метаболически «дорогого», обогащенного азотом ком- партмента клетки. Последнее особенно важно, так как растения «добывают» азот с большим трудом и со значительными энергетическими затратами. Формируя большой объем клетки за счет «недорогого» вакуолярного содержимого, главным образом воды и минеральных солей, растение способно кардинально снизить затраты на создание больших плоских структур — листьев, эффективных солнечных коллекторов.
Увеличение размеров (растяжение) растительной клетки происходит за счет осмотического поглощения воды вакуолью и изменения прочности клеточной
стенки. Вода, поглощаемая вакуолью, создает тургорное давление, которое не только расширяет первичную клеточную стенку, но и обеспечивает тургор клетки (см. гл. 5 «Водный обмен). Для поддержания высокого осмотического потенциала вакуоли расширяющихся клеток в нее должны постоянно поступать соли и/или другие соединения. Транспорт этих соединений происходит активно, за счет электрохимического градиента протонов на тонопласте. Градиент ионов Н в свою очередь создается и поддерживается за счет работы двух электрогенных протонных насосов: Н+-АТФазы V-типа (от англ, vacuolar) и вакуолярной Н -дифосфатазы (пирофосфатазы). Таким образом, тонопласт является энергизованной мембраной. Основные осмотические компоненты ваку- олярного сока представлены ионами — К+, Na+, Са2+, Mg2+, СГ, SO4”, РО4 , NO3 и первичными метаболитами типа аминокислот, органических кислот и сахаров. Транспорт этих веществ осуществляется через тонопласт за счет работы специфичных транспортеров и каналов. Перемещение воды через тонопласт происходит также через специальные каналы — аквапорины, сформированные специфичными для тонопласта белками — TIPs (от англ, tonoplast intrinsinc proteins).
Функции вакуолей
В растительной клетке вакуоли представляют собой мультифункциональные органеллы, которые играют ключевую роль в клеточных стратегиях развития растения. Функционально вакуоли являются органеллами, которые находятся в конце секреторного пути растительных клеток. Экспериментальные данные свидетельствуют, что содержимое растительных вакуолей образуется как из внутриклеточного материала, так и за счет эндоцитоза.
Основные функции вакуолей. Хранение. Кроме ионов, сахаров, полисахаридов, пигментов, аминокислот и органических кислот, в вакуолях растения хранится также большое количество белка. Особенно это характерно для вакуолей семян. Все перечисленные первичные метаболиты могут быть востребованы из вакуолей и использоваться в метаболизме клетки.
Лизис веществ. Вакуоли содержат те же типы кислых гидролаз, что и лизосомы животной клетки. Эти ферменты — протеазы, нуклеазы, гликозидазы и липазы — вместе способны обеспечить процесс разборки и рециклизации практически любых компонентов клетки. Подобная рециркуляция необходима не только для нормального метаболизма клеточных структур, но и для возврата ценных питательных веществ в течение запрограммированной смерти клетки, связанной с развитием и старением.
Регулирование pH и ионный гомеостаз. Большие вакуоли служат резервуарами для протонов и метаболически важных ионов, например кальция. Как правило, вакуоли растения имеют pH между 5,0 и 5,5, однако диапазон изменения pH простирается от 2,5 (или ниже — вакуоли клеток плода лимона) до более чем 7,0 (вакуоли, запасающие белки). Контролируя поток протонов и других ионов из вакуолей в цитозоль, клетки могут регулировать не только pH цитозоля, но также и работу многих ферментов, сборку и разборку структур цитоскелета и процессы взаимодействия (слияния) мембранных структур.
Защита от патогенов и травоядных. В вакуолях растительных клеток накапливается удивительно разнообразное количество токсичных соединений. Особенно это характерно для специализированных клеток, расположенных в стра-
тегически важных тканях (типа эпидермиса листа). Такая особенность позволяет растению эффективно бороться с патогенами и снижать риск быть съеденным насекомыми и животными. К токсичным соединениям относятся:
фенольные соединения, алкалоиды, изопреноиды, цианогенные гликозиды и другие вторичные соединения;
ферменты, разрушающие клеточные стенки, — хитиназы, глюканазы и др.;
полимеры (латекс, каучук, гутта и др.).
Пигментация. Еще в XIX столетии было установлено, что многие пигменты находятся в вакуолях эпидермальных клеток цветков, листьев и стеблей. Недавние исследования показали, что мембраны таких специализированных вакуолей содержат специальные транспортные системы — АВС-переносчики (транспортеры) (от англ. ATP binding cassette transporters'). Вакуоли, содержащие водорастворимые пигменты (антоцианы, беталаины), найдены во многих типах растительных клеток. Окраска лепестков цветка и плодов важна для привлечения опылителей или «распространителей» семян соответственно. Некоторые водорастворимые пигменты листа поглощают УФ-излучение и видимый свет, предотвращая тем самым фотодеструкцию фотосинтетического аппарата. Это свойство, по-видимому, наиболее существенно для листьев вечнозеленых растений в течение зимних месяцев.
Изолирование и обезвреживание токсичных веществ. Растения не имеют возможности избегать загрязненных ядовитыми и токсическими веществами мест обитания, но могут эффективно изолировать токсичные соединения (например, тяжелые металлы или ядовитые метаболиты типа оксалата) от метаболически активных компартментов клетки. Для этого они используют вакуоли. Например, для удаления оксалата специальные клетки формируют вакуоли, содержащие органический матрикс, внутри которого оксалат реагирует с кальцием с образованием щавелевокислого кальция. В других типах растительных клеток из цитозоля в вакуоли переносятся различные ксенобиотики. Для этого обычно используются белки-переносчики из семейства АВС-транспортеров. Накопление ядовитых веществ в вакуолях листа происходит достаточно часто. С листопадом токсичные соединения устраняются из растения полностью.
Формирование вакуолей
В отличие от других мембранных систем вакуоли — единственные органеллы, которые могут возникать путем дифференцирования из других мембранных систем, независимо от роста и деления клетки. Вопрос об их происхождении окончательно не решен. Были предложены две модели формирования вакуолей de novo. Одна модель постулирует, что вакуолярный компартмент исходно образуется из транс-Гольджи-сети. Согласно другой концепции, вакуоли формируются из расширения частей гладкого ЭР. К настоящему времени ряд экспериментальных фактов подтверждает реальность последней модели. Показано, что в дифференцирующихся клетках кончика корня, где первоначально большая центральная вакуоль отсутствует, моноклональные антитела к р-субъединице вакуолярной АТФазы овса были локализованы только в провакуолях и в гладком ЭР. Из ЭР образуются автофаговые вакуоли. Существуют данные, показывающие формирование вакуолей из тронс-Гольджи-сети. Не исключено, что образование различных вакуолей в клетке происходит несколькими способами.
Автофагия — особый случай формирования вакуолей
В некоторых клетках (например, клетках семенной оболочки) вакуоли могут образоваться в результате автофагии. При формировании автофаговых вакуолей трубчатые участки гладкого ЭР формируют пальцеобразные выросты, которые подобно щупальцам захватывают часть цитоплазмы. Смежные «щупальца» смыкаются и образуется ранняя автофагосома — эндоплазматическая область, ограниченная двумя мембранами ЭР. После окончательного формирования автофагосомы, т.е. полного отделения от цитозоля, цитоплазма в ней деградирует, внутренняя мембрана разрушается, а наружная становится тонопластом. Автофагосомы имеют кислый pH и содержат много кислых гидролитических ферментов. В конечном счете транспорт воды, облегченный у-Т1Р- аквапорином, приводит к быстрому расширению вакуоли. Автофагия может повторно происходить в уже вакуолизированных клетках в ответ на голодание (например, в суспензионных культурах клеток, лишенных сахарозы).
Два типа вакуолей растительных клеток
До недавнего времени одной из нерешенных проблем физиологии растений был парадокс сосуществования в вакуолях запасных веществ и литических ферментов. Сейчас установлено, что растения имеют как минимум две различные вакуолярные системы: одну для хранения, а другую для выполнения литических функций. Эти два типа вакуолей различаются кислотностью вакуо- лярного сока: запасающие вакуоли имеют нейтральный pH, а литические —
nh2-
SP
NTPP
-соон
nh2-
SP
СТРР
-соон
nh2-
SP
IPP
-соон
А
N-концевые сигнальные последовательности (NTPP):
спорамин батата- Н—S—R— F N—Р—I—R—L—Р—W—W— Н—G—Р—А
спорамин ячменя: S-S-S-S-F-A-D-S-N-P-1-R-P-V-W-N-R-A-A-S-W-L-G
С-концевые сигнальные последовательности (СТРР):
лектин ячменя: V— F—A— G—AIА-А— N—S—W— L—V—A— G
хитиназа табака: N—G—L—L—V— D—W~М
р-глюконаза табака: V—S—G—G—V—W—D—S—S—V—G—W—N—A—W—A—S—L—V—S—G—М
Б
Рис. 1.23. Схема строения белков, транспортируемых в вакуоли (Л), и примеры сигнальных последовательностей (£):
SP — сигнальный пептид, направляющий белок в ЭР, — (7) в табл. 1.1; NTPP — N-концевой сигнал (пропептид) вакуолярной локализации; СТРР — С-концевой сигнал (пропептид) вакуолярной локализации; IPP — внутренний сигнал (пропептид) вакуолярной локализации; консервативный мотив Asn-Pro-lle-Srg в NTPP подчеркнут
кислый, что оптимально для работы содержащихся в них протеаз и других гидролаз. Кроме того, вакуоли различаются составом интегральных белков, встроенных в тонопласт (TIPs). Для запасающих вакуолей характерны а-Т1Р, тогда как Т1Р-Ма27 (у-TIP) являются маркерами литических вакуолей. Кроме того, в запасающих вакуолях находится аквапорин 8-TIP. Наличие в клетке двух типов вакуолярных систем также объясняет присутствие у транспортируемых в вакуоли белков нескольких типов сигналов на N- и С-концах. В частности, спорамин и алеураин содержат N-терминальный сигнал, фазеолин, лектин ячменя, хитиназа табака — С-терминальный. В некоторых вакуолярных белках (например, фитогемагглютинин и легумин) сигнал локализован во внутренней области зрелого белка. Белки, направляющиеся к запасающим вакуолям, обычно имеют лидерный участок на С-конце, тогда как гидролитические ферменты литических вакуолей — на N-конце. N-терминальный сигнал обычно содержит около 20 аминокислот с мотивом Asn-Pro-Ile-Arg. С-конце- вая сигнальная последовательность более вариабельна и содержит гидрофобные аминокислоты (рис. 1.23).
Когда в клетке образуются большие вакуоли, два типа вакуолей могут сливаться. В этом случае оба маркерных белка — а-TIP и у-TIP — обнаруживаются в мембране некоторых областей вакуолярного компартмента одновременно.
Таким образом, для вакуолей растительной клетки характерно большое разнообразие форм и функций. По-видимому, цитологическое определение вакуолей охватывает несколько биохимически и физиологически разных структур. Более корректно вакуоли могут быть охарактеризованы только с учетом их функций в клетке и в связи с динамикой развития.
КЛЕТОЧНАЯ СТЕНКА
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ
Стенка растительной клетки представляет собой сложный внеклеточный матрикс, окружающий каждую клетку. Многие животные клетки, а тем более клетки грибов, на своей поверхности также формируют внеклеточный матрикс. Однако стенка растительной клетки существенно толще, прочнее и жестче. Она в гораздо большей степени определяет стратегию существования как самой клетки, так и целого растения.
Стенка растительной клетки — тонко организованный сложный комплекс многих разнообразных полисахаридов, белков и ароматических веществ. Молекулярный состав и организация полимеров клеточной стенки могут быть различными у представителей разных таксонов, клеток разных тканей одного вида, у индивидуальных клеток и даже у разных частей стенки вокруг отдельного протопласта.
Клеточная стенка — динамичный компартмент, который изменяется в течение жизни клетки. Первичная клеточная стенка образуется при делении клетки и быстро увеличивает свою поверхность, в некоторых случаях более чем в сто раз. При специализации (дифференциации) большинство клеток формируют вторичную клеточную стенку, образуя сложные структуры, идеально подходящие для конкретных функций специализированных клеток.
СТРУКТУРА КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ
Первичная клеточная стенка состоит из двух или трех структурно независимых, но взаимодействующих сетей полимеров. Каждая из сетей выполняет свои специфические функции. Основная сеть, образующая каркас клеточной стенки, построена из линейных микрофибрилл целлюлозы и соединяющих их связующих гликанов. Вторая сеть состоит из пектиновых полисахаридов. Третья независимая сеть построена из структурных белков или фенилпропаноидов.
Существуют два основных типа клеточных стенок — тип I и тип II. Они различаются по строению, химическому составу и принадлежат растениям разных таксономических групп.
Сахара, участвующие в построении клеточной стенки
Полисахариды (полимеры сахаров) формируют главный структурный остов клеточной стенки. В построении всех ее углеводных полимеров обычно участвует лишь 10—11 различных моносахаридов, причем они обязательно находятся в циклической (фуранозной или пиранозной) форме (рис. 1.24).
Полисахариды клеточных стенок принято называть по основным сахарам, входящим в их структуру. Большинство полисахаридов имеет основную линей-
a-D-Галактоза (Gal)a-D-Галактоза (Gal)a-D-Апиоза (Api)a-D-Апиоза (Api)a-D-Ксилоза (Xyl)a-D-Ксилоза (Xyl)p-L-Арабиноза (Ага)p-L-Арабиноза (Ага)a-D-Глюкуроновая кислота (GlcA)a-D-Глюкуроновая кислота (GlcA)a-D-Галактуроновая кислота (GalA)a-D-Галактуроновая кислота (GalA)
a-D-Галактоза (Gal)
a-D-Галактоза (Gal)
a-D-Апиоза (Api)
a-D-Апиоза (Api)
a-D-Ксилоза (Xyl)
a-D-Ксилоза (Xyl)
p-L-Арабиноза (Ага)
p-L-Арабиноза (Ага)
a-D-Глюкуроновая кислота (GlcA)
a-D-Глюкуроновая кислота (GlcA)
a-D-Галактуроновая кислота (GalA)
a-D-Галактуроновая кислота (GalA)
Рис. 1.24. Сахара, участвующие в строенииклеточной стенки
ную цепь, и составляющий ее сахар помещается в названии полимера на последнем месте. Например, ксилоглюкан имеет основную цепь из р-1 ->4-глюкозильных остатков, к которым присоединены боковые ксилозные единицы. Глю- куроноарабиноксилан имеет основную цепь из ксилозных остатков с боковыми группами из глюкуроновой кислоты и арабинозы.
Первая (целлюлозная) сеть клеточной стенки
Целлюлоза является основным строительным компонентом всех типов клеточных стенок. Это самый распространенный растительный полисахарид. Она составляет от 15 до 30 % сухой массы всех первичных клеточных стенок, во вторичных клеточных стенках ее содержание выше.
Целлюлоза представляет собой линейный полимер, состоящий из нераз- ветвленного р-1->4-В-глюкана. Подобная связь обуславливает поворот на 180° каждого последующего глюкозного остатка относительно предыдущего. Такая структура позволяет отдельным цепочкам полимера соединяться между собой водородными связями. Целлюлоза существует в форме микрофибрилл — паракристаллических ансамблей, состоящих из нескольких дюжин цепочек
Рис. 1.25. Строение целлюлозыРис. 1.25. Строение целлюлозыЦеллобиоза:Р-Ц-глюкозил-(1 -» 4)Ц-глюкозаЦеллобиоза:Р-Ц-глюкозил-(1 -» 4)Ц-глюкоза
Рис. 1.25. Строение целлюлозы
Рис. 1.25. Строение целлюлозы
Целлобиоза:
Р-Ц-глюкозил-(1 -» 4)Ц-глюкоза
Целлобиоза:
Р-Ц-глюкозил-(1 -» 4)Ц-глюкоза
этого глюкана. В высших растениях каждая микрофибрилла состоит в среднем из 36 отдельных глюканов (рис. 1.25). Микрофибриллы морских водорослей могут образовывать более широкие кольцевые филаменты или плоские ленты, состоящие из нескольких сотен цепей глюкана.
Каждая макромолекула целлюлозы может состоять из несколько тысяч остатков D-глюкозы и достигать в длину от 2 до 5 мкм. В пределах микрофибриллы отдельные цепочки р-1->4-О-глюканов начинаются и заканчиваются в различных местах, что позволяет микрофибрилле достигать в длину сотен микрометров и содержать тысячи индивидуальных глюкановых цепочек. Структура микрофибриллы целлюлозы подобна длинной хлопчатобумажной нити, которая состоит из тысяч отдельных хлопковых волокон длиной всего 2—3 см. Важно отметить, что все индивидуальные молекулы целлюлозы в микрофибриллах ориентированы одинаково, т. е. редуцирующие концы всех цепочек находятся с одной стороны.
Связующие, или «сшивочные», гликаны — класс полисахаридов, которые могут образовывать водородные связи с микрофибриллами целлюлозы. Они имеют достаточную длину, чтобы одновременно связываться с несколькими микрофибриллами целлюлозы, при этом образуется сеть углеводных полимеров клеточной стенки. В отличие от целлюлозы связующие гликаны имеют, за редким исключением, разветвленную структуру, что способствует их «сшивочной» функции в клеточной стенке. Нередко связующие гликаны неудачно называют «гемицеллюлозами» (полуцеллюлозами), поскольку первоначально их принимали за недосинтезированную целлюлозу.
У всех цветковых растений в первичных клеточных стенках имеются только два основных класса связующих гликанов — ксилоглюканы (XyGs) и глюкуро- ноарабиноксиланы (GAXs) (рис. 1.26). Ксилоглюканы характерны для всех двудольных и примерно половины однодольных растений. Глюкуроноарабинокси- ланы в качестве главного связующего гликана в клеточных стенках имеют «ком- мелиноидные» однодольные растения — пальмы (Агесасеае), коммелиновые (Commelinaceae), бромелиевые (Bromeliaceae), имбирные (Zingiberalesi) и близкие к ним семейства, а также большинство осок и злаков. Особая группа связующих гликанов — неразветвленных — обнаружена у злаков.
Ксилоглюканы представляют собой линейную цепочку р-1->4-О-глюкана, к которой по 0-6-положению глюкозного остатка регулярно присоединены остатки D-ксилозы. К некоторым из ксилозильных фрагментов в свою очередь присоединяются остатки L-арабинозы или D-галактозы. В ряде позиций к галактозе присоединяется L-фукоза. Ксилоглюканы построены из повторяющихся одинаковых блоков — структурных единиц, каждая из них содержит от 6 до 11 сахаров. Строение блоков специфично для разных тканей и видов растений. Фукозогалактоксилоглюканы характерны для всех «не-коммелиноидных» однодольных и большинства двудольных видов. Арабиноксило глюканы характерны для семейства Пасленовые (Solanaceae) и мяты {Mentha).
Глюкуроноарабиноксиланы {GAXs) — основные связующие гликаны «комме- линоидных» однодольных. В GAXs этих видов арабинозный остаток присоединен исключительно по 0-3-положению, а остатки глюкуроновой кислоты — по 0-2-положению.
Характерные для порядка Злаковые (Poales) неразветвленные связующие гликаны получили название «глюканы со смешанной связью», или р(1 ->3)(1->4)
Фукогалактоксилоглюкан
Арабиноксилоглюкан пасленовых
“~'Glc—Glc—Glc—Glc—Glc—Glc—Glc—Glcwv’ Illi
Xyl 6-OAc Xy! 6-OAc
СТ\
Глюкоараби!юксилан коммелиноидных
Рис. 1.26. Строение разных типов ошибочных гликанов (фоном выделена основная цепь)
глюканы. Они на 90% состоят из имеющих р(1 —>4) связи целлотриозных и целлотетраозных (фрагментов в соотношении 2:1. Указанные фрагменты соединены между собой р( 1 —> 3) связью. За счет этого полимер образует складчатовинтообразную структуру.
В первичных клеточных стенках практически всех исследованных покрытосеменных растений найдены также другие связующие гликаны, прежде всего маннаны (глюкоманнаны, галактоглюкоманнаны, галактоманнаны и др), однако их количество существенно меньше, чем основных связующих гликанов.
Главная (функция целлюлозы и связующих гликанов — формирование основной структурной сети клеточной стенки.
Вторая (пектиновая) сеть клеточной стенки
Пектины — смесь гетерогенных, разветвленных и сильно гидратированных полисахаридов, обогащенных D-галактуроновой кислотой. Пектины клеточных стенок состоят из двух основных компонентов — гомогалактоуронанов (HGA), основная цепочка которых построена исключительно из остатков галактуроновой кислоты, и рамногалактоуронанов I (RG I), у которых в цепочке остатки галактуроновой кислоты чередуются с остатками рамнозы.
Гомогалактуронаны (IIGAs) — гомополимеры (l->4)p-D-GalA, содержащие как минимум 200 галактуроновых фрагментов. Их длина составляет около 100 нм (рис. 1.27). Помимо классических гомогалактуронанов известно два типа их структурных модификаций — ксилогалактуронаны и рамногалактуронаны II (RG П\ Они представляют собой цепочку из остатков галактуроновой кислоты с различными боковыми заместителями. RG И отличаются разнообразием сахаров и типов связей между ними. В их состав могут входить апиоза, яблочная кислота, 2-О-метилфукоза, 2-О-метилксилоза. Структура RG II очень консервативна у всех цветковых растений. В клеточных стенках были обнаружены также димеры RG II. Связывание в них происходит через остатки апиозы каждого мономера путем образования двух диэфирных связей с молекулой борной кислоты.
Рамногалактуронаны I (RG 7) представляют собой гетерополимеры, основная цепочка которых построена из повторяющихся дисахаридных остатков: (!->2)-L-Rha-(l->4)-D-GalA (см. рис. 1.27). В цепочке к большинству остатков рамнозы по 0-4 положению присоединены боковые полисахариды. Они составлены главным образом из нейтральных сахаров — арабинанов, галактанов и сильно разветвленных арабиногалактанов типа I (AGs I); AGs-I присутствуют только в связанном с пектинами виде. Другой класс арабиногалактанов — арабиногалактаны II — участвует в формировании арабиногалактановых белков клеточной стенки (см. ниже).
Считается, что пектины выполняют множество функций в клеточной стенке: определяют размеры пор («порозистость» — от англ, porozity) клеточной стенки (см. ниже); обеспечивают поверхностный заряд клеточной стенки, который обуславливает ее pH и ионный баланс; участвуют в регулировании межклеточной адгезии и образовании срединной пластинки; служат источниками сигнальных молекул, участвующих во взаимодействии клетки с насекомыми, патогенами и симбионтами. Пектины могут локализовать действие специфических ферментов клеточной стенки путем электростатического фиксирования ферментов на заряженной сети пектинов.
A
Гомогалактоуронан
Рис. 1.27. Строение пектинов: галактуронаны (Л), рамногалактуронаны I (5)
3 Физиология растений
65
Рис. 1.27. Окончание
Третья (белковая или фенилпропаноидная) сетьклеточной стенки
Основными структурными компонентами каркаса клеточной стенки являются углеводы, однако структурные белки могут также образовать в стенке соответствующую сеть.
Известно четыре главных класса структурных белков клеточной стенки, три из которых названы по преобладающей в данном белке аминокислоте, — это гидрокси пролинобогащенные гликопротеиды (HRGPs — от hydroxyprolin-rich glycoproteins), пролинобогащенные белки (PRPs) и глицинобогащенные белки (GRPs) (рис. 1.28). Их количество зависит от типа ткани и вида растений. Структурные белки клеточной стенки обычно кодируются большими мульти- генными семействами. Их синтез находится под контролем развития. Все мРНК белков клеточной стенки имеют сигнальную последовательность, направляющую белки по секреторному пути.
Один из наиболее изученных гидроксипролиновых белков растений — экстенсии — кодируется мультигенным семейством. Он состоит из повторяю-
Экстенсин томатов (сильно гликозилирован)
Thr ХРго X LysThr ХРго X LysТреонинобогащенныс HGRP кукурузы (умеренно гликозилированные)Треонинобогащенныс HGRP кукурузы (умеренно гликозилированные)(^гоХРпОС^РСбтХЬулХРщХРщХ5^РСТуОСГуО(?йОСРго^^(^гоХРпОС^РСбтХЬулХРщХРщХ5^РСТуОСГуО(?йОСРго^^
Thr ХРго X Lys
Thr ХРго X Lys
Треонинобогащенныс HGRP кукурузы (умеренно гликозилированные)
Треонинобогащенныс HGRP кукурузы (умеренно гликозилированные)
(^гоХРпОС^РСбтХЬулХРщХРщХ5^РСТуОСГуО(?йОСРго^^
(^гоХРпОС^РСбтХЬулХРщХРщХ5^РСТуОСГуО(?йОСРго^^
Пролинобогащенные белки сои (слабо гликозилированные)
Глицинобогащенные белки петунии (не гликозилированные)
Рис. 1.28. Строение структурных белков клеточной стенки: Ага и Gal — остатки арабинозы и галактозы соответственно
щихся последовательностей Ser-(Hyp)4 и Tyr-Lys-Tyr, что оказывается важным для формирования вторичной и третичной структуры белка. Гидроксипролин в белке образуется из пролина посттранскрипнионно.
Пролинобогащенные белки также кодируются большим мультигенным семейством. Эти белки содержат более 70 % глицина и скорее всего имеют р-склад- чатую структуру. Полагают, что GRPs играют роль в контактах клеточной стенки с плазматической мембраной. В их состав входят ароматические аминокислоты, функция которых не ясна.
Четвертый класс структурных белков — арабиногалакановые белки (AGPs). Видимо, правильнее их считать протеогликанами, поскольку основная часть молекулы (до 95 %) состоит из углеводов, а именно арабиногалактанов II (AGs-II), которые представлены группой коротких (1->3)-(1->6)р-О-галакта- новых цепочек с сильно разветвленной структурой. AGPs обнаруживаются в везикулах аппарата Гольджи, плазмалемме и клеточной стенке. Клонирование генов некоторых AGPs показало, что эти белки обогащены пролином (гидроксипролином), аланином и серином/треонином.
Первичные нелигнифицированные клеточные стенки однодольных растений, относящихся к «коммелиноидам», а также растений семейства Маревые — Chenopodiaceae (например, сахарной свеклы — Beta vulgaris и шпината) содержат значительные количества ароматических веществ. Они представлены гидроксикоричными кислотами, прежде всего феруловой и и-кумаровой. Гид- роксикоричные кислоты присоединены сложноэфирной связью к 0-5 позиции некоторых из арабинозных единиц глюкуроноарабиноксиланов (GAXs). Некоторая часть остатков феруловой кислоты на GAXs может соединяться фенил-фенильной или фенил-эфирной связью с соседним GAXs, объединяя таким образом глюкуроноарабиноксиланы в сложную сеть. У растений семейства Chenopodiaceae оксикоричные кислоты присоединены к галактозным или арабинозным остаткам боковых цепей RG I. Таким образом, третья сеть клеточной стенки у этих видов состоит из фенилпропаноидов.
ТИПЫ СТРОЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК
Тип I строения клеточных стенок характерен для большинства двудольных и «некоммелиноидных» однодольных. Клеточные стенки этого типа содержат относительно равные количества целлюлозы и ксилоглюканов. XyGs прочно связываются с поверхностными глюкановыми цепочками в целлюлозных микрофибриллах и фиксируют микрофибриллы в нужном пространственном положении, связываясь не только с целлюлозой, но и между собой. При этом они заполняют пространство между смежными целлюлозными микрофибриллами.
В клеточной стенке первого типа Каракас, состоящий из целлюлозы и XyGs, помещен в матрикс пектинов, который регулирует, помимо других физиологических свойств, размер пор клеточной стенки. У гомогалактоуронанов (HGAs), секретируемых из цитоплазмы, большинство карбоксильных групп метилировано, т. е. HGAs попадают в клеточную стенку в виде высокометоксилирован- ных полимеров. В клеточной стенке работает фермент пектинметилэстераза (РМЕ), которая отщепляет некоторые из метильных групп. Освободившиеся карбоксильные группы могут соединяться с ионами Са +. Кальций как двухвалент-
A
Рис. 1.29. Образования «замковых зон» в пектиновой сети (Л) и формирование пор в клеточной стенке (5)
Рис. 1.29. ОкончаниеРис. 1.29. Окончание
Рис. 1.29. Окончание
Рис. 1.29. Окончание
ный катион может связываться с двумя карбоксильными группами двух цепей пектинов. При этом образуются «замковые зоны», соединяющие две антипа- раллельные цепи HGAs. Наиболее сильные связи между цепями HGAs образуются, если в «замковой зоне» расположены не менее семи неэтерифицирован- ных остатков галактуроновых кислот. Полагают, что от расстояния между «замковыми зонами» зависит, какого размера поры образуют в клеточной стенке несвязанные участки HGAs: чем больше расстояние между «замковыми зонами», тем больше размер пор (рис. 1.29).
Наряду с гомогалактоуронанами в формировании пор клеточных стенок принимают участие и рамногалактоуронаны I (RG I). Во-первых, их рамнозные остатки в основной цепи и боковые цепочки мешают образованию прочных «замковых зон». Во-вторых, нейтральные полимеры (арабинаны или галактаны), прикрепленные одним концом к RG I, имеют много степеней свободы и достаточно подвижны. Они могут располагаться внутри пор, уменьшая их размеры (рис. 1.29). На некоторых стадиях развития клетки значительно повышается активность специфичных гидролаз, при этом нейтральные полимеры отщепляются и размер пор увеличивается. Другие компоненты пектиновой сети также могут участвовать в регулировании «порозистости» клеточной стенки.
Тип II строения клеточных стенок характерен для «коммелиноидных» однодольных. Подобно типу I он содержат микрофибриллы целлюлозы, однако они соединяются между собой не ксилоглюканами, а глюкуроноарабиноксиланами (GAXs). Боковые цепочки у основной ксилановой цепи GAXs по-разному влияют на образование связей. Ответвления, состоящие из L-арабинозы и L-глюкуроновой кислоты, предотвращают формирование водородных связей и блокируют перекрестное сшивание между полисахаридами. Напротив, D-ксилозные единицы стабилизируют линейную структуру полимера и способствуют его связыванию с глюканами.
Клеточные стенки второго типа достаточно бедны пектинами. Частично функции пектинов могут выполнять остатки L-галактуроновах кислот, входящих в состав GAXs. Порозистость и прочность клеточной стенки зависит от интервала между боковыми Ага и GlcA единицами GAXs, которые таким образом функционально заменяют пектиновые вещества клеточных стенок первого типа.
И наконец, клеточные стенки типа II имеют очень немного структурных белков по сравнению с двудольными и другими однодольными растениями. В то же время в них часто формируются обширные сети фенилпропаноидных соединений, особенно после прекращения роста клетки.
БИОСИНТЕЗ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ
Клеточная стенка образуется в результате развития срединной пластинки. Сразу после полного разделения ядра растительной клетки в телофазе митоза поперек делящейся клетки образуется фрагмопласт. Он состоит из множества уплощенных мембранных везикул — фрагмосом, содержащих компоненты клеточной стенки. В их построении участвует цитоскелет. Все полисахариды клеточной стенки, за исключением целлюлозы, синтезируются в аппарате Гольджи. Они упаковываются в везикулы, которые транспортируются к растущей
срединной пластинке и сливаются с ней. Срединная пластинка увеличивается по направлению к пл азмалемме и соединяется с ней, разделяя две дочерние клетки. Наконец, вновь образующаяся клеточная стенка соединяется с уже существующей первичной клеточной стенкой.
Практически все «нецеллюлозные» компоненты клеточной стенки — полисахариды, структурные белки, широкий спектр ферментов — образуются в аппарате Гольджи и в его везикулах координированно направляются к клеточной стенке.
До сих пор не идентифицированы гены, кодирующие полисахаридсинтазы, участвующие в синтезе основных цепей «нецеллюлозных» полимеров. Идентифицированы гены нескольких фукозил- и галактозилтрансфераз, которые присоединяют отдельные сахара к главной цепочке.
Единственными полимерами, которые синтезируются с внешней стороны плазмалеммы, являются целлюлоза и каллоза. Целесообразность этого становится очевидной, если принять во внимание большую длину образующихся микрофибрилл целлюлозы и необходимость их филигранной укладки в клеточную стенку. Каллоза отличается от целлюлозы наличием р1->3-О-глюкано- вых цепочек, которые могут образовывать спиральные дуплексы и триплексы. Каллоза образуется в нескольких типах клеток на определенных стадиях формирования клеточной стенки, например в прорастающей пыльцевой трубке или срединной пластинке делящихся клеток. Каллоза может также синтезироваться при стресс-реакциях или в ответе на грибную инфекцию.
Синтез целлюлозы катализируется мультимерными комплексами ферментов, расположенными на концах удлиняющихся микрофибрилл целлюлозы. Эти терминальные комплексы хорошо различимы под электронным микро-
скопом. В некоторых морских водорослях терминальные комплексы синтеза целлюлозы расположены линейно; у всех покрытосеменных растений они формируют розеточные структуры. Терминальные комплексы появляются в мембране плазмалеммы в момент активации синтеза целлюлозы.
Исходным субстратом для целлюлозосинтазы является УДФ-глюкоза. Она образуется с помощью фермента сахарозосинтазы непосредственно из сахарозы. Ряд изоформ этого фермента находятся в плазматической мембране. Они ассоциированы с целлюлозосинтазой и могут поставлять УДФ-глюкозу непосредственно к ее каталитическому центру (рис. 1.30).
Относительно недавно были идентифицированы несколько растительных генов, кодирующих ферменты синтеза целлюлозы, в частности гены CesA, которые интенсивно экспрессируются в хлопковых волокнах во время активного синтеза целлюлозы вторичной клеточной стенки. Кодируемые этими генами полипептиды имеют восемь трансмембранных доменов и массу около ПО кДа. Открытие генов CesA дало возможность идентифицировать ряд других генов, кодирующих синтазы полисахаридов клеточной стенки.
ОНТОГЕНЕЗ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ
Под термином онтогенез (греч. он — род. падеж, ontos — существо; лат. genesis — происхождение, формирование) понимают индивидуальное развитие организма, органа, клетки от момента образования до естественной гибели. Онтогенез клетки может происходить двояко: либо от деления до ее смерти, либо от деления до деления.
Второй вариант онтогенеза (от деления до деления) характерен для клеток меристем, а также для каллусных клеток in vivo и in vitro. Для таких клеток часто применяют термин пролиферирующие, т. е. постоянно делящиеся. В этом случае клетка последовательно проходит клеточный (митотический) цикл, т. е. период от митоза до митоза. Клеточный цикл делится на четыре периода (фазы): собственно митоз М, пресинтетический (постмитотический) период G, (от англ, gap — интервал), синтетический период S (происходит удвоение ДНК) и постсинтетический (премитотический) период G^. Продолжительность клеточного цикла зависит от вида растения и типа клеток, однако в среднем составляет около суток. Длительность периодов цикла также варьирует: митоз может длиться от 1 до 4 ч, фаза G, — 0,5 —8 ч, S — 1,5 —12 ч и G2 — 1 —13 ч.
Онтогенез многих растительных клеток проходит по первому варианту — от митоза до естественной смерти. В этом случае он также слагается из нескольких этапов: деление клетки, рост растяжением, дифференцировка, активное функционирование, старение и смерть. В процессе дифференцировки формируются различия между клетками, т. е. происходит их специализация. Деление на этапы достаточно условно: дифференцировка клетки, в частности, начинается уже на стадии роста.
Особенностью растительных клеток является возможность ее дедифференцирования, т.е. перехода специализированных клеток обратно к пролиферации. Это происходит in vivo при образовании каллуса (травматической ткани двудольных), а также in vitro при получении культур клеток. Культивируемые in vitro клетки можно получить из любой ткани любого органа растения, т. е. к
дедифференциации способна практически любая живая клетка растения, независимо от типа ее дифференцировки.
Дедифференцированные пролиферирующие клетки in vitro при определенных условиях могут вновь дифференцироваться и привести к формированию тканей, органов и целых растений. Таким образом, растительная клетка истинно тотипотентна, т.е. не только содержит полную информацию о целом организме, но из нее реально можно получить интактное растение. Напомним, что под тотипотентностью понимают свойство соматических клеток в полной мере реализовать находящуюся в них наследственную информацию. Получаемые таким образом растения носят названия регенерантов. Получение растений-регенерантов из отдельной дедиференцированной клетки и даже из отдельного протопласта в настоящее время является рутинной процедурой и служит основой многих биотехнологий. Заметим, что в случае животных клеток подобные свойства сохраняют лишь немногие стволовые клетки.
Способность растительной клетки к дифференцировке и дедифференцировке позволило расширить понятие клеточного цикла. Для состояния дифференцированной клетки введено понятие фаза Go клеточного цикла. В эту фазу пролиферирующие клетки могут входить из фазы G] или G2. Клеточный цикл пролиферирующих клеток проходит без фазы Go, с началом процесса дифференцировки клетка входит в фазу Go и может оставаться в ней до своей гибели. При некоторых условиях (травма, условия in vitro) клетка переходит из фазы Go в G, или G2 и опять становится пролиферирующей.
КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ
Регуляция клеточного цикла достаточно консервативна для всех эукариот. Ее ключевыми фигурами являются несколько циклинзависимых протеинкиназ CDKs (cyclin dependent kinases). CDKs представляет собой комплекс, состоящий из двух субъединиц — каталитической и активаторной, которая называется циклином. Каталитическая субъединица не активна и должна быть активирована циклином — это первая ступень активации киназного комплекса. Многие одноклеточные эукариоты (например, дрожжи) имеют только одну CDK-каталитическую единицу. У многоклеточных эукариот каталитических единиц несколько.
Ассоциация CDKs со специфичным циклином — ключевой момент в регулировании соответствующих фаз клеточного цикла. Все эукариоты имеют много циклинов, и каждый требуется на специфичной регуляторной стадии клеточного цикла. При этом специфические циклины связываются со «своей» CDK. Эти взаимосвязи определяют смену активности CDKs. Большое количество CDK и соответствующих циклинов обеспечивает тонкую регуляцию клеточного цикла.
CDKs — очень консервативный класс протеинкиназ. В комплексе с циклином они фосфорилируют субстрат по остатку серина или треонина. На N-концевом участке белка они имеют АТФ-связывающий домен, далее следует небольшой домен PSTAIRE, который получил свое название по последовательности входящих в него аминокислот в однобуквенном коде. Этот домен является участком связывания с циклином. В последовательности аминокислот этого домена возможны вариации, при этом CDK с одинаковыми PSTAIRE-доменами связываются с одинаковыми циклинами.
Разные CDK играют специфичную роль на каждом этапе клеточного цикла. Для животных клеток показано, что CDK1 контролирует переход от G2 к митозу, CDK2 и CDK3 — переход от G, к S-фазе, при этом CDK2 необходима в течение всей S-фазы; CDK4 и CDK5 в течение С,-фазы «контролируют решение» о переходе в новый митотический цикл. В клетках растений также показано участие различных CDK в разных фазах клеточного цикла и их активация различными факторами, в частности, ауксином. В дополнение к CDKs клеточный цикл контролируют как минимум еще две протеинкиназы — CDC5 (в М-фазе для регулирования «моторных» белков для сегрегации хромосом) и CDC7. *
Циклины классифицируют на две группы — митотические и Ох-циклины.
Митотические циклины включают циклины В-типа (или М-циклины — от М-фазы цикла) и A-типа (или S-циклины — от S-фазы). Циклины В-типа характеризуются большим консервативным центральным доменом, так называемым циклиновым боксом (cyclin box), который взаимодействует с киназной субъединицей CDK. Они имеют также «разрушающий» домен, ответственный за деградацию циклинов в позднем митозе. Циклины В-типа работают на участке перехода клетки из фазы G2 в митоз. Циклины A-типа также содержат разрушающий домен. Их присутствие обязательно для S-фазы клеточного цикла. Дрожжи содержат около десятка митотических циклинов А- и В-типа. У высших растений таких циклинов существенно больше.
Gx-циклины включают прежде всего D-циклины, позже к ним были добавлены циклины Е-типа. D-циклины, аналогично циклинам В-типа, содержат центральный домен, но он менее консервативен. D-циклины нестабильны, но «разрушающий» домен не регулирует процесс их распада. Одни из D-циклинов накапливаются только в Сгфазе и быстро деградируют в течение S-фазы, тогда как другие в низких концентрациях присутствуют в течение всего клеточного цикла. D-циклины регулируют переход клеток из G, в S-фазу клеточного цикла, т. е. довольно часто они участвуют в стартовой точке его запуска.
D-циклины являются одними из основных молекул, воспринимающих внешние сигналы регуляции клеточного цикла. У животных их накопление регулируется гормонами роста. У растений циклин D3 регулируется цитокинином. Это один из основных путей влияния цитокининов на пролиферацию растительных клеток.
Активность комплекса CDK-циклин контролируется специальными киназами и фосфатазами, что составляет второй уровень регуляции системы митотического цикла.
Weel-киназа (названа по фенотипу дрожжей с мутацией по этому гену) фосфорилирует треонин или тирозин около N-концевого участка CDK. Это фосфорилирование Thr 14 или Thr 15 ингибирует активность CDK. Гомолог weel+ найден у растений.
Мулътифункционалъная фосфатаза CDC25p убирает фосфаты с тирозина, треонина или серина. В частности, у CDK она «снимает» фосфаты, «посаженные» weel-киназой, т.е. является ее антагонистом. CDC25p — мощный регулятор клеточного цикла. В частности, при дефектах ДНК или ее повреждениях CDC25 не активируется. При этом фосфорилированные CDK не работают, что обусловливает паузу в протекании цикла. За это время происходит реперация поврежденной ДНК.
Помимо обратимого фосфорилирования, CDK может быть выключена ингибитором. Идентифицированы ингибиторы CDK — CKIs. Они обратимо связываются с комплексом CDK-циклин и ингибируют его работу. Это обратимое ингибирование активности CDK используется для контроля до прохождения клеточного цикла.
В двух точках клеточного цикла регуляторную роль играют специфичные протеазы. На старте цикла они нужны для инициации репликации ДНК, а при переходе от метафазы к анафазе протеазы разрушают когезионные белки, соединяющие две сестринские хроматиды.
РОСТ КЛЕТКИ
Роль клеточной стенки в росте клетки
Рост клетки, т. е. необратимое увеличение ее массы и объема, может происходить путем экспансии (увеличение размера клетки в двух или трех измерениях) или удлинения (экспансия по одному измерению). Причиной разнообразия форм растительных клеток может быть любой из этих двух процессов, протекающий в определенных областях поверхности клетки. Интенсивное удлинение растительных клеток происходит в особых зонах корня и побега. Такой рост носит название рост растяжением.
Процесс роста — один из основных этапов онтогенеза клетки, в результате которого клетка достигает оптимальных для дальнейшего функционирования размера и формы (механизмы, регулирующие переход клетки к росту растяжением, обсуждаются в гл. 7). Основными структурами, обеспечивающими процесс роста, являются вакуоль и клеточная стенка.
При росте клетки клеточная стенка должна растягиваться или деформироваться. В то же время отдельные целлюлозные микрофибриллы неспособны растягиваться, следовательно, при подобных изменениях должно происходить либо скольжение микрофибрилл относительно друг друга, либо расхождение соседних микрофибрилл. Имеется достаточно экспериментальных подтверждений использования клеткой второго способа — расхождения микрофибрилл. Движущей силой роста клетки является осмотическое давление, развиваемое протопластом, прежде всего вакуолью. Снижение прочности, т. е. ослабление связей между компонентами клеточной стенки, рассматривается как первичный механизм роста клеток. В клетке существуют механизмы, осуществляющие дискретное биохимическое ослабление матрикса клеточной стенки. После расхождения микрофибрилл целлюлозы образовавшиеся «пустоты» заполняются новыми полисахаридами или другими компонентами стенки.
Роль цитоскелета в росте клетки
Растительные клетки обладают множеством кортикальных микротрубочек, связанных с плазмалеммой. Ориентация микротрубочек обычно определяет ориентацию образующихся целлюлозных микрофибрилл. Механизм этого явления до конца не установлен. Кортикальные микротрубочки могут направлять цел- люлозосинтазные комплексы либо через опосредованный белком контакт,
либо определяя в мембране каналы, по которым движется синтаза. В последнем случае микротрубочки могут выполнять роль своеобразных направляющих, которые запрещают синтазному комплексу «сворачивать» вправо или влево. Считается, что начало растущей целлюлозной микрофибриллы жестко закрепляется в клеточной стенке, таким образом, вектор движения комплекса по мембране строго определен: вперед он движется за счет жесткости целлюлозной микрофибриллы (наращивая цепочку, «отталкивается» от зафиксированного конца), а отклонения от «правильного курса» запрещают лежащие по бокам микротрубочки.
В свою очередь, ориентация микрофибрилл целлюлозы определяет вариант роста клетки (экспансия или удлинение) и направление удлинения. В клетках, которые растут путем экспансии, слои микрофибрилл ориентированы в клеточном матриксе случайным образом, тогда как в удлиняющихся клетках они выстроены в поперечной или спиральной ориентации к оси удлинения. Под действием осмотического давления протопласта спирально расположенные микрофибриллы целлюлозы раздвигаются, и размеры клетки увеличиваются в продольном направлении. Поскольку микрофибриллы целлюлозы не способны растягиваться, их спиральное расположение предотвращает увеличение размеров клетки в ширину: они охватывают клетку подобно обручам, набитым на бочку. В то же время удлинение клетки может происходить весьма легко при условии слабой связи между «витками» целлюлозы. В качестве аналогии можно привести металлическую пружинку. Она легко увеличивается вдоль длинной оси, но изменить ее диаметр практически невозможно.
Таким образом, процесс растяжения клеточной стенки при росте клетки растяжением можно рассматривать как раздвижение многих взаимодействующих между собой концентрических пружин в право- и левозакрученных ориентациях.
Новые микрофибриллы, образующиеся на внутренней поверхности клеточной стенки, в основном формируются в поперечной ориентации и функционально заменяют старые микрофибриллы. Старые микрофибриллы отодвигаются во внешние слои клеточной стенки и пассивно переориентируются в продольном направлении при удлинении клетки
Гипотеза «кислого роста»
Несмотря на отмеченные различия в составе и строении клеточных стенок I и II типа, механизмы роста всех цветковых растений сходны. Одним из механизмов, которым ауксин стимулирует растяжение клеток, может быть регулирование активности гидролаз клеточных стенок. Согласно гипотезе «кислого роста», ауксин активирует Н-АТФазу плазмалеммы, которая подкисляет клеточную стенку. Низкий pH, в свою очередь, активизирует локализованные в апопласте специфичные гидролазы, которые расщепляют связи, соединяющие микрофибриллы целлюлозы с другими полисахаридами. Расщепление этих связей ослабляет клеточную стенку. Снижение прочности клеточной стенки ведет к нарушению равновесия водного потенциала клетки (осмотического потенциала и потенциала давления — см. подробнее в гл. 5), происходит поглощение воды и увеличение размеров клетки. Таким образом, ослабление связей
клеточной стенки («сшивок» между микрофибриллами) пассивно ведет к увеличению размеров клетки.
Основные принципы гипотезы «кислого роста» прошли «испытание временем», однако существует как минимум три нерешенных проблемы:
во-первых, не найдено ни одного фермента, который бы гидролизовал связи между гликанами исключительно при pH < 5,0;
ХЕТЭкспансии
Сшивочные гликаныМикрофибриллы целлюлозы
Рис. 1.31. Схема растяжения клеточной стенки.
Затемненными стрелками показаны действующие на микрофибриллы силы, которые возникают за счет тургорного давления, тонкими стрелками — степень расхождения микрофибрилл целлюлозы
во-вторых, нет разумного объяснения, каким образом регулируется рост после того, как гидролазы активизированы путем снижения pH;
в-третьих, гидролазы, извлеченные из клеточной стенки и добавленные к изолированным фрагментам тканей, приводят к удлинению клеток in vitro, независимо от внешнего pH.
В настоящее время известно два фермента, которые могут играть основную роль в снижении прочности клеточных стенок. Один из них — ксилоглюкан- эндотрансгликозилаза (ХЕТ) — осуществляет трансгликозилирование ксилоглюканов, при котором одна цепочка XyG расщепляется, а затем снова присоединяется к нередуцирующему концу другого XyG. При таких перестройках микрофибриллы могут «скользить» относительно друг друга, однако общая прочность ксилоглюканового матрикса не снижается.
Другие белки катализируют растяжение клеточной стенки без гидролитической или трансгликолитической активности. Подобные белки были названы экспансинами (англ, expansins). Их функция состоит, скорее всего, в разрушении водородных связей между целлюлозой и связующими гликанами, что приводит к ослаблению клеточной стенки. Экспансины — единственные белки, которые могут осуществлять удлинение клеточной стенки in vitro. Они обязательно присутствуют в растущих тканях всех цветковых растений. Похоже, что они разрушают водородные связи между целлюлозой и связующими гликанами независимо от их химической структуры. Показано, что экспансины злаков стимулируют удлинение тканей с клеточной стенкой I типа (рис. 1.31). Исходя их этого, заманчиво предположить, что экспансины являются универсальными ферментами, которые участвуют в быстрых ростовых ответах клеточных стенок любого типа. Однако новейшие исследования показали, что второе муль- тигенное семейство р-экспансинов, преобладающее в травянистых растениях, практически не активно в отношении клеточных стенок I типа.
XETs и экспансины могут быть не единственными белками, участвующими в ослаблении клеточной стенки. Продолжается выяснение роли гидролаз в этом процессе.
«Фиксация» окончательных размерови формы клетки
Как только удлинение завершено, первичная клеточная стенка «замыкает» клетку в соответствующую форму. Одним из компонентов подобной фиксации в клеточной стенке I типа являются гидроксипролинобогащенные белки типа экстенсина. Их гибкие участки могут обертывать микрофибриллы целлюлозы, а жесткие выполнять функции «распорок». Однако до сих пор неизвестно, каким образом экстенсии встроен в клеточную стенку. Другие белки могут быть необходимы для соединения экстенсинов. В частности, такую роль может выполнять пролинобогащенный белок с молекулярной массой 33 кДа. Большие количества этого PRP синтезируются на поздних стадиях развития клетки, особенно в тех клетках, где накапливается и экстенсии.
Клеточные стенки II типа также фиксируют свою форму в течение дифференциации, но они не используют при этом гидроксипролинобогащенные белки. Они содержат треонинобогащенный белок с последовательностями, напоми-
нающими структуру экстенсина. Кроме того, в клеточных стенках II типа присутствуют фенольные соединения, которые могут выполнять «сшивочные» функции. Как и в случае с экстенсином, растворимые предшественники треонин- обогащенного белка накапливаются на ранних фазах клеточного цикла, а в процессе удлинения клетки и ее дифференцировки становятся нерастворимыми. Однако основную связующую и фиксирующую роль в клеточных стенках II типа, вероятно, играют фенольные соединения — прежде всего оксикорич- ные кислоты, которые могут образовывать между собой эфирные и сложно- эфирные связи. Формирование подобных перекрестных связей ускоряется в конце ростовой фазы клетки. Структуры с фенольными соединениями, связанные такими мостиками, достаточно прочны и укрепляют стенки закончившей свой рост клетки.
ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ КЛЕТКИ
После роста растяжением растительная клетка специализируется для выполнения той или иной функции. Этот процесс носит название дифференциации. Дифференциация клеток приводит как к возникновению специфичной формы клетки, так и к специализации выполняемых функций. Процесс дифференциации клетки в ее онтогенезе является составной частью дифференциации ткани и органа в онтогенезе всего растения (механизмы, вызывающие и регулирующие процесс дифференциации, обсуждаются в гл. 7). Особенности дифференциации растительной клетки во многом связаны с изменениями в структуре ее клеточной стенки.
Роль вторичной клеточной стенкив дифференциации клетки
Для многих типов клеток процесс дифференцирования связан с формированием на первичной клеточной стенке со стороны плазматической мембраны вторичной стенки. Независимо от химического состава первичная стенка всегда определяется как структура, которая участвует в росте клетки. Когда рост клетки прекращается, первичная клеточная стенка укрепляется поперечными сшивками и принимает свою окончательную форму. В этот момент начинается формирование вторичной клеточной стенки. Вторичные стенки часто связаны со сложными специализациями клеток. Хлопковое волокно, например, состоит из целлюлозы почти на 98 %. Чаще вторичная стенка содержит дополнительные «нецеллюлозные» полисахариды, белки и ароматические вещества типа лигнина. В трахеидах вторичные стенки могут формировать специальные образования (кольцевые или спиральные утолщения, сетчатые или перфорированные пластинки). Колленхима характеризуется сильным утолщением клеточной стенки по углам клетки. Многие структурные белки, специфичные для определенных типов клеток, встречаются только во вторичной стенке.
Внешние слои эпидермальных клеток покрываются кутином и суберином, что предотвращает испарение воды. Смежные боковые стенки клеток эндодермы импрегнированы суберином для обеспечения передвижения воды по сим- пласту в стелу.
Суберин и кутин делают вторичную клеточную стенкуводонепроницаемой
Для многих дифференцированных клеток характерно наличие кутикулы — специального слоя, который покрывает клеточную стенку и делает ее непроницаемой для воды. Кутикула состоит из сетчатого матрикса, «пустоты» которого заполнены гидрофобными кутикулярными восками.
Кутин является матриксом кутикулы надземных органов. Он представляет собой сложный полимер, составленный из длинноцепочечных гидроксилированных жирных кислот и спиртов. Кутикулярные жирные кислоты имеют, как правило, 16 либо 18 атомов углерода и содержат одну, две или три гидроксильные группы. В результате образования сложноэфирных связей между карбоксильными и спиртовыми группами этих кислот получается сложная макромолекула с нерегулярной структурой. За счет присутствия в одной кислоте двух или трех гидроксилов образуется сетчатая структура, составляющая матрикс кутикулы.
Суберин представляет собой матрикс кутикулы подземных органов растения. Он обнаруживается в пробковых клетках перидермы, раневой поверхности клеток и участках эндодермы. В целом строение кутина и суберина сходно, однако в составе суберина присутствуют длинноцепочечные (от С16 до С22) дикарбоновые кислоты. Второе отличие суберина — наличие фенольных компонентов, которые часто составляют большую его часть.
Матрикс, образованный кутином или суберином, обычно пропитывается и покрывается сверху кутикулярным восками. Воск представляет собой сложную смесь гидрофобных длинноцепочечных углеводородов, кутикулярных спиртов, альдегидов, кетонов, кислот и эфиров. Специфичными компонентами кутикулярного воска являются восковые эфиры. Это сложные эфиры длинноцепочечных насыщенных жирных кислот и спиртов.
Лигнин — главный компонент некоторыхвторичных клеточных стенок
Наиболее характерная отличительная особенность многих дифференцированных клеток — лигнификация их клеточных стенок. Образование лигнинов свойственно всем сосудистым растениям. Принято считать, что появление лигнинов эволюционно было связано с выходом растений на сушу. При этом растениям необходимо было решить две принципиальные задачи: образовать жесткую структуру для существования в воздушном пространстве и сформировать системы транспорта воды в надземные органы. Ни целлюлоза, ни связующие гликаны, ни пектины это обеспечить не могли. Проблема была решена благодаря включению во вторичную клеточную стенку фенольного полимера лигнина.
Лигнинами называют нерегулярные трехмерные полимерные сети из фенил- пропаноидов — ароматических фенольных соединений со структурой С6—С3. За редкими исключениями, лигнин отсутствует в первичных клеточных стенках. Его синтез строго совпадает с началом дифференциации клетки и образованием вторичной клеточной стенки. Фенилпропаноиды, входящие в состав
лигнина, представлены оксикоричными спиртами «монолигнолами». К ним относятся n-кумаровый, конифериловый и синаповый спирты. Конденсация этих трех компонентов и образует сеть лигнина. Монолигнолы могут связываться между собой различным образом — простой эфирной связью, сложно- эфирной связью либо С—С-связями.
Синтез монолигнолов довольно хорошо изучен. Все его этапы происходят в цитозоле, где образуются СоА-эфиры монолигнолов, и, кроме того, они могут быть гликозилированы. Гликозилирование может быть важно для направленного мембранного транспорта. После попадания СоА-эфиров монолигнолов в клеточную стенку происходит их окислительная полимеризация. В клеточных стенках этот процесс могут осуществлять три фермента — лакказа, полифенолоксидаза и пероксидаза. В последнее время получены данные, свидетельствующие о том, что за полимеризацию лигнина ответственна прежде всего пероксидаза.
СМЕРТЬ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ
Смерть растительной клетки может наступить по двум причинам: внезапно, в результате неблагоприятных внешних воздействий — вынужденная гибель, и по программе, определяемой онтогенезом растения, — запрограммированная гибель — PCD (от programming cell death). В качестве примера смерти от внешних факторов можно привести гибель тканей после воздействия экстремальных температур или атаки патогена. Запрограммированная гибель растительных клеток происходит, например, при образовании ксилемы, созревании плодов, опадании листьев или при образовании листьев специальной формы (например, у монстеры).
По механизму (типу) гибель клеток подразделяется на некроз (внезапная смерть) и апоптоз (программная смерть). Их принципиальное различие заключается в характере воздействия на окружающие клетки и ткани. Апоптоз проходит «незаметно» для соседних клеток. Его основная «цель» — «разобрать» клетку на составные части и строительные материалы, которые потом можно будет использовать для метаболизма других клеток. PCD всегда проходит по типу апоптоза, тогда как вынужденная смерть может проходить как по типу апоптоза, так и некроза. Типичным примером вынужденной гибели по типу апоптоза является смерть клеток в процессе реакции сверхчувствительности при инфекции. Таким образом, часто встречаемое в литературе отождествление PCD и апоптоза не совсем верно.
Апоптоз. Типичные признаки апоптоза — конденсация и дробление ядра, разрыв нити ДНК на олигонуклеосомные фрагменты, формирование апоптоз- ных телец — мембранных структур, содержащих фрагменты ДНК. При этом цитоплазматическая мембрана остается интактной до образования апоптоз- ных телец. В процессе апоптоза клетка резко уменьшается в объеме, протопласт съеживается, а мембрана приобретает складчатость Далее разрыхляется хроматин. Уровень ядерного гетерохроматина увеличивается, и он перемещается к краям ядра. Ядерная ДНК разрывается на фрагменты длиной приблизительно 50 тыс. пар оснований. В дальнейшем такие фрагменты под действием Са -зависимой эндонуклеазы разрываются на олигонуклеосомные фрагменты
длиной около 180 пар оснований. Апоптозные тельца с фрагментами ДНК мигрируют из центра клетки к ее периферии.
Признаки апоптоза у животных и растений сходны, однако у животных апоптозные везикулы поглощаются соседними или специализированными клетками, такими, как макрофаги. У растений фагоцитозу препятствует клеточная стенка.
Важную роль в гибели растительных и животных клеток по типу апоптоза играют митохондрии. Под воздействием сигналов клеточной гибели во внутренней мембране митохондрий образуются поры большого размера (через них могут проходить вещества с молекулярной массой до 1,5 кДа). Это ведет к быстрой деполяризации мембраны и потере ею электорхимического потенциала. Указанные процессы приводят к набуханию митохондриального матрикса и разрыву наружной мембраны митохондрии. Высвобождаются белки межмембранного пространства митохондрий, прежде всего цитохром с, что составляет важный этап апоптоза. Хлоропласты также могут принимать участие в непосредственном регулировании программируемой гибели растительных клеток и в запуске апоптоза. Возможно участие других мембранных структур, например тонопласта.
Некроз. При некрозе объем клетки значительно увеличивается. Изменяется проницаемость цитоплазматической и внутриклеточных мембран. Цитоплазма вакуолизируется. Повреждается тонопласт. Органеллы набухают и разрушаются. В дальнейшем мембраны разрываются, происходит дезинтеграция клетки. Остатки органелл лизируются. Содержимое клетки попадает в межклеточное пространство.
Прочие различия некроза и апоптоза. При некрозе не активируется какая- либо генетическая программа. Апоптоз, напротив, является результатом запуска определенной генетической программы. Показано участие в этом процессе ряда сигнальных систем. В частности, одной из основных сигнальных систем, участвующих в индукции и разворачивании апоптоза, является НАДФН-окси- дазная система. Стоит отметить, что многие компоненты этой системы у растительных и животных клеток достаточно близки. Мембранные белки НАДФН-оксидаз содержат Са2+-связывающие области, что свидетельствует об участии в этом процессе Са .
На молекулярном уровне основным признаком апоптоза считается активация ряда протеаз, прежде всего каспаз. Каспазы представляют собой семейство эволюционно консервативных цистеиновых протеаз, которые специфически расщепляют белки по остаткам аспарагиновой кислоты. В настоящее время идентифицировано около десяти каспаз. Помимо активации каспаз, у растений выявлено возрастание активности сериновой и аспарагиновой протеаз, каль- паинов (Са +-зависимых протеаз) и убиквитинов. Протеазы образуют каскад взаимосвязанных протеолитических реакций. Они последовательно активируют друг друга, участвуют в упорядоченной передаче сигнала апоптоза, могут являться компонентами единого протеазного комплекса.
Наряду с механизмами уничтожения клетки, в ней есть несколько механизмов, защищающих ее от «случайного» самоуничтожения.
Во-первых, протеазы синтезируются в клетке в неактивной форме, их процессинг происходит за счет автолиза или протеолиза другими протеазами. Каспазы синтезируются в клетке в виде прокаспазы — неактивного мономера с
молекулярной массой 30 — 50 кДа. Активные формы являются тетрамерами, содержащими две малые и две большие субъединицы. При процессинге от прокаспазы отделяется регуляторный N-концевой домен. Оставшаяся часть молекулы разделяется на большую (20 кДа) и малую (10 кДа), после чего происходит их ассоциация с образованием активной каспазы.
Во-вторых, протеазы обратимо взаимодействуют с эндогенными белковыми ингибиторами, образуя неактивные комплексы. Такие комплексы описаны для цистеиновых, Са -зависимых и ряда других протеаз. При действии различных индукторов апоптоза происходит диссоциация неактивных комплексов протеаза—ингибитор.
В-третьих, протеазы обычно являются компонентами специальных сигнальных систем. Путь передачи апоптозного сигнала состоит из цепочки: индукторы —рецепторы — адаптеры — каспазы первого эшелона—регуляторы — каспазы второго эшелона. Только полный набор компонентов, состоящий из рецептора, его лиганда, адаптера и прокаспазы, формирует специфичный комплекс, в котором происходит активация каспаз. Этот комплекс называется апоп- тосомой, или апоптозным шапероном.
До определенной стадии процесс апоптоза обратим. После активации каспазами первого эшелона каспаз второго эшелона процесс становится необратимым. Эти каспазы способны к самоактивации (автокатализу или автопроцессингу) и активируют фактор фрагментации ДНК на нуклеосомные фрагменты.
ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯРАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ
ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ КЛЕТКИ — КООРДИНИРОВАННАЯ РАБОТАМНОГИХ ОРГАНЕЛЛ
Основу работы клетки составляет четко скоординированное взаимодействие всех ее органелл. В настоящее время о механизмах, регулирующих этот процесс, известно немного, однако отдельные примеры подобных взаимодействий, показывающих их целесообразность и сложность, изучены достаточно подробно.
Типичным примером точности взаимодействия систем растительной клетки является синтез основного фермента фотосинтеза — рибулезобисфосфат- карбоксилазы — оксигеназы (Рубиско). Фермент состоит из двух типов субъединиц — малой и большой — в равных пропорциях (по восемь). Малая субъединица кодируется в ядерном геноме, большая — в хлоропластном. В ядерном геноме обычно находится около 10 копий генов малой субъединицы Рубиско, из них функционируют, как правило, 4—5. Плоидность фотосинтезирующих клеток в основном составляет ЗС, следовательно, максимальное количество работающих генов малой субъединицы в клетке не превышает 20 — 30. В той же клетке находится приблизительно 50 — 60 хлоропластов, а в каждом хлоропласте не менее 10 копий ДНК. Следовательно, количество генов большой субъединицы в клетке около 500, т.е. на порядок больше, чем малой субъединицы. Очевидно, что должны быть строгие системы координации синтеза субъединиц, чтобы обеспечить их близкие количества в клетке. Белок малой субъсди-
ницы синтезируется в цитозоле, белок большой субъединицы — в хлоропласте. Следовательно, должны быть также скоординированы системы транспорта белка большой субъединицы из цитозоля в хлоропласт. Таким образом, в синтезе и сборке только одного фермента координированно работают две белоксинтези- рующих системы, система транспорта и целый ряд других белков и ферментов клетки.
В качестве примера согласованной работы трех органелл можно привести процесс фотодыхания (подробно см. гл. 3). В нем участвуют хлоропласты, пероксисомы и митохондрии. Образовавшийся в результате работы Рубиско (ее оксигеназная функция) гликолат транспортируется из хлоропласта в пероксисому, где окисляется и аминируется. Образовавшийся глицин транспортируется в митохондрию, где образуется серин. Серин может вернуться назад в пероксисому, где из него образуется глицерат. И наконец, глицерат возвращается обратно в хлоропласт, где снова вовлекается в цикл Кальвина. Таким образом, для работы одного биохимического цикла используются ферментные системы трех органелл. В процессе работы эти органеллы тесно контактируют мембранами между собой.
РАБОТА РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ —
ПЕРЕПЛЕТЕНИЕ «ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ» И «ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ»МЕТАБОЛИЧЕСКИХ СИСТЕМ
Анализируя в целом работу растительной клетки, можно заметить, что в ней причудливо и весьма эффективно сплелись прокариотические и эукариотические системы метаболизма, приобретенные, видимо, от исходных симбионтов. Это касается не только систем энергетического обмена. Например, синтез жирных кислот в хлоропластах растений имеет много общих черт с их синтезом у бактерий. Субстрат синтеза — ацетил СоА — образуется из пирувата внутри пластид за счет работы пируватдегидрогеназы, однако для некоторых хлоропластов показана очень низкая активность этого фермента. Следовательно, субстраты для синтеза жирных кислот должны поступать из других ком- партментов клетки. Их синтез возможен за счет митохондриальной пируватдегидрогеназы или цитозольной АТФ-цитратлиазы.
На следующем этапе образуется малонил-СоА за счет работы ацетил-СоА- карбоксилазы (АСС). В растительных клетках существует два фермента — в пластидах и цитозоле. В пластидах он обеспечивает собственно синтез жирных кислот, в цитозоле — их удлинение в ЭР, а также синтез флавоноидов и некоторых других соединений. Пластидная АСС имеет 4 субъединицы (карбоксилпереносящий белок, биотинкарбоксилазу и две карбоксилтрансферазы), три из которых кодируются в ядерном геноме, а одна — в пластидном. Фермент имеет явное сходство с прокариотической АСС. Цитозольный фермент состоит из одного большого полипептида, в котором соответствующие домены интегрированы в одном белке. Цитозольный фермент похож на фермент грибов и животных.
Далее в синтезе участвуют синтазы жирных кислот (FAS). Этим термином называют все ферменты, участвующие в синтезе жирных кислот, за исключением АСС. Клетки животных и дрожжей используют FAS типа I (FAS-I), тогда как растения и большинство бактерий — FAS типа II (FAS-II). FAS-I представ-
ляет собой единый мультифункциональный энзиматический комплекс, составленный из достаточно больших субъединиц (около 250 кДа), и каждая может осуществлять несколько различных реакций. В FAS-II, наоборот, каждая реакция катализируется отдельным белком и может быть отделена от других превращений жирных кислот. В FAS-II входит также ацил-переносящий белок — АСР (acyls-transport protein). FAS-II работает как метаболическая цепочка, тогда как FAS-I — как большой белковый комплекс. Для формирования С18-кис- лоты синтазой типа II требуется 48 реакций, в осуществлении которых участвуют не менее 12 различных белков. Формирующаяся жирная кислота транспортируется от одного фермента к другому в связанном с АСР виде. Реакцию наращивания цепи жирных кислот (конденсации) осуществляют 3-кетоацил- АСР-синтазы — KAS.
Таким образом, синтез жирных кислот в растительной клетке осуществляется в хлоропластах по «прокариотическому» типу. Затем жирные кислоты попадают в цитозоль, где происходят их модификации и изменения — десатурация, удлинение, образование необычных жирных кислот — за счет работы «эукариотических» систем.
Достаточно часто в растительной клетке «прокариотические» и «эукариотические» системы работают параллельно. В качестве примера можно привести образование изопреноидов — «рога изобилия» химических структур клетки. Только в растительной клетке работают две системы синтеза изопреноидов — «эукариотический» (мевалонатный) в цитозоле и «прокариотический» в пластидах (подробнее см. гл. 9 «Вторичный метаболизм»).
Наконец, некоторые системы рецепции и трансдукции сигнала в растительной клетке также «заимствованы» у прокариотов. Это касается прежде всего двухкомпонентной системы с участием гистидинкиназ. Такая система не обнаружена у животных клеток (там работают серин/треониновые и тирозиновые киназы), но широко распространена у прокариот. В растительных клетках она несколько модифицирована и тоже распространена достаточно широко: в геноме арабидопсиса, например, обнаружено более 10 генов гистидинкиназ. К ги- стидинкиназам относятся, в частности, рецепторы цитокининов и этилена.
ГЛАВА 2
ОСНОВЫ БИОЭНЕРГЕТИКИ
В этой главе, которую можно представить как введение к гл. 3 «Фотосинтез» и гл. 4 «Дыхание растений», обсуждаются элементарные основы процессов, дающих клетке необходимую энергию, а также рассматриваются некоторые физико-химические понятия, связанные с механизмом энергообмена в живой клетке.
ЖИВЫЕ ОРГАНИЗМЫ МОГУТ ИСПОЛЬЗОВАТЬ
ДВЕ ФОРМЫ ЭНЕРГИИ — СВЕТОВУЮ И ХИМИЧЕСКУЮ
Все живые организмы не могут оставаться живыми и поддерживать высокий уровень организации без постоянного притока энергии извне. При этом они могут использовать только две формы внешней энергии — световую и химическую. Именно по способу получения энергии организмы делят на фототрофы и хемотрофы. Растения получают энергию в виде электромагнитного излучения Солнца, а животные используют энергию, заключенную в ковалентных связях органических молекул, которые поступают в организм с пищей. Полагают, что первые организмы древней Земли располагали избытком органических соединений, образующихся в ходе геохимических процессов. Они извлекали энергию, окисляя органические соединения в процессах, видимо, сходных с различными видами брожения. Эту способность сохранили клетки всех ныне живущих организмов, способные получать энергию при анаэробном распаде глюкозы в процессе гликолиза. Однако по мере исчерпания запасов органики эволюционное развитие получили фототрофы, использующие энергию света в процессе фотосинтеза и способные синтезировать углеводы из атмосферного СО2 и воды. Фотосинтез сопровождался образованием молекулярного кислорода. Насыщение атмосферы кислородом привело к возникновению и эволюционному доминированию аэробных форм жизни, которые научились получать необходимую им энергию в результате окисления углеводов кислородом в процессе дыхания. Дальнейшая эволюция разделила живых существ на прокариоты и эукариоты, одноклеточные и многоклеточные, на растения и животные, но возникшие на ранних этапах эволюции механизмы использования клеткой энергии остались в своей основе неизменными. При всем разнообразии живых существ и условий среды, в которых они обитают, для получения энергии ими используются три основных процесса — гликолиз, дыхание и фотосинтез. При этом, несмотря на вес различия в метаболизме растений, животных и бактерий, способы преобразования внешней энергии, будь то энергия света или энергия субстратов дыхания, в клеточные формы
энергии базируются на общих фундаментальных принципах и подчиняются общим законам. Основой этих законов является прежде всего то, что все процессы в живой клетке подчиняются законам физики и химии и могут быть описаны с позиций термодинамики.
УПОРЯДОЧЕННОСТЬ БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМИ ОБМЕН ЭНЕРГИЕЙ С ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДОЙ
Первый закон термодинамики — закон о сохранении энергии, согласно которому энергия не может появляться или исчезать и переходит из одной формы в другую. Живая клетка как раз и представляет собой систему, в которой постоянно происходит преобразование, или трансформация, одних форм энергии в другие, и прежде всего энергии внешних источников во внутренние энергетические ресурсы самой клетки.
Второй закон термодинамики утверждает, что в изолированной системе самопроизвольно могут идти только те процессы, в результате которых степень неупорядоченности, или энтропия, возрастает, и система переходит из менее вероятного в более вероятное состояние.
В то же время очевидно, что все живые системы организованы сложным образом — множество атомов собраны в чрезвычайно сложные молекулы, а молекулы — в исключительно точные структуры. При этом живая клетка демонстрирует удивительную стабильность и, поддерживая свой внутренний порядок, координирует в пространстве и во времени множество реакций и процессов.
С термодинамической точки зрения поддержание внутренней организации возможно благодаря постоянному поступлению в клетку энергии извне, часть которой выделяется в окружающее пространство в виде тепла. Тепловая энергия усиливает хаотичное движение молекул. Выделяя тепло, клетка тем самым компенсирует внутреннюю упорядоченность, повышая энтропию окружающей среды. Постоянная потеря тепла требует ввода в клетку энергии, отличной от тепловой. Растения используют для этой цели поглощенную световую энергию, а животные — энергию, выделяемую при окислении органических молекул.
НАПРАВЛЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИОПРЕДЕЛЯЕТСЯ ВЕЛИЧИНОЙ AG
Все реакции, протекающие в клетке, можно разделить на экзергонические и эндергонические. Первые идут с выделением энергии, которая может быть рассеяна в виде тепла в окружающую среду. Вторые требуют энергетических затрат и, как правило, способствуют созданию сложной организации и поддержанию внутреннего порядка.
Изменение энергии, которое сопровождает химические реакции, можно проанализировать количественно, используя термодинамические параметры: Т — абсолютная температура (К); Р — давление; V — объем; Е — внутренняя полная энергия системы; S — энтропия; Н — энтальпия, или теплосодержание системы; G — свободная энергия системы (энергия Гиббса).
При постоянных Р, Т и V изменение общей энергии системы ЛЕ в результате химической реакции будет равно изменению теплосодержания системы ЛЯ, т. е. тепловому эффекту реакции. В этих условиях термодинамические параметры связаны соотношением:
AG = АН- TAS.
Для характеристики реакций, которые протекают при постоянных температуре, давлении и объеме, наиболее важным термодинамическим параметром является изменение свободной энергии Гиббса AG. Этот показатель характеризует энергию, которая поглощается или выделяется в ходе реакции или может быть передана другой химической реакции. Для биохимических реакций в растворе при низких концентрациях веществ изменение свободной энергии в результате реакции аА + 6В = сС + dD можно определить по уравнению:
AG = AG” + 2,ЗЯТ1ё([С]с[О]7[А]а[В]Л) [Дж-моль"1],
где R — газовая постоянная (8,31 Дж • град"1 моль"1); Т — абсолютная температура (К); [AJ, [В], [С], [D] — молярные концентрации реагирующих веществ; AG0 — изменение стандартной свободной энергии данной реакции.
Величина AG имеет значение стандартной AG”, если реакция протекает при температуре 25 °C и давлении 1 атм, а концентрации субстратов и продуктов реакции одинаковы и равны 1 М. Для биохимических реакций используется показатель AG”', определяемый при pH 7,0.
Для данной реакции AG”' величина постоянная, тогда как AG' зависит от концентрации реагирующих веществ и указывает, насколько данная реакция далека от равновесия. При достижения равновесия AG’ = 0, и тогда AG6' можно определить через константу равновесия химической реакции:
AG”' = -2,3ATlg^aBH,
где Яравн — константа равновесия химической реакции.
Значения AG°' установлены для большого числа биохимически важных реакций и приводятся в специальной литературе.
Для того чтобы оценить энергетику реакции и предсказать ее направление, важно знать, положительное или отрицательное изменение AG' сопровождает данную реакцию. Если AG' — величина отрицательная, то мы имеем дело с экзергонической реакцией, которая может протекать спонтанно с выделением энергии. Если реакция характеризуется положительным значением AG', то она требует энергетических затрат и самопроизвольно идти не может. Такая эндергоническая реакция возможна только в том случае, если существует механизм, с помощью которого она получит энергию от экзергонической реакции с отрицательным AG'. Процесс, в результате которого энергия, выделяемая в ходе экзергонической реакции, не рассеивается в виде тепла, а передается другой
реакции, называется энергетическим сопряжением, а сами реакции — сопряженными.
Каким образом происходит сопряжение множества энергодающих и энергозависимых реакций в клетке, где они протекают в разных компартментах и разделены во времени? Для интеграции метаболизма в единое целое вся поступающая в клетку энергия, будь то световая энергия или энергия субстратов дыхания, сначала преобразуется и запасается в форме универсальных энергетических и восстановительных эквивалентов. Универсальными, или конвертируемыми, формами клеточной энергии в растительной клетке является трансмембранный градиент электрохимического потенциала ионов водорода, или электрохимический протонный градиент Лцщ и АТФ. Важнейшими восстановительными эквивалентами являются никотинамидадениндинуклеотид (НАДН) и никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФН). В фотосинтезе поглощение света сопровождается восстановлением НАДФН и синтезом АТФ в хлоропластах. В процессе дыхания, который имеет место в клетках растений и животных, восстановленный НАДН и АТФ образуются в митохондриях. В обоих случаях синтез АТФ опосредован образованием на тилакоидной или митохондриальной мембране электрохимического протонного градиента АДн*-
ЭНЕРГОЗАВИСИМЫЕ РЕАКЦИИ СОПРЯЖЕНЫС РЕАКЦИЕЙ ГИДРОЛИЗА АТФ
Молекула АТФ имеет сложную структуру, основой которой являются нуклеотид аденин, остаток рибозы и три остатка фосфорной кислоты (рис. 2.1). Между фосфатными группами имеются две высокоэнергетические, или мак- роэргические связи, при разрыве которых освобождается много энергии. В результате гидролиза молекула АТФ теряет одну концевую фосфатную группировку, которая переносится на гидроксил воды, в результате чего образуется аденозиндифосфат (АДФ) и неорганический фосфат. Последний представляет собой стабильный ион (НРО4) и обозначается как Фн (Pj).
АТФ + Н2О —- АДФ + Фн.
ДС°' = -30,6 кДж моль"1 (-7,3 ккал • моль"1).
В молекулах АТФ и АДФ фосфатные группы способны к ионизации, степень которой зависит от pH среды. При pH 7,0 АТФ и АДФ представлены анионами с высоким зарядом: АТФ4" и АДФ". В ионизированной форме АТФ и АДФ образуют комплексы с ионом магния, который, как правило, необходим для протекания реакций с участием АТФ.
Величина ДС' реакции гидролиза АТФ может быть рассчитана по уравнению
ДС = ДС°' + 2,3/?Т^([АДФ][ФН]/[АТФ]).
О О-Р=ОО О-Р=ОРис. 2.1. Структура АТФРис. 2.1. Структура АТФКонцентрация воды как стандартного растворителя принята за 1 М. В реальных условиях значение AG' зависит от температуры, содержания ионов магния, концентрации реагирующих веществ и составляет -11 ...-13 ккал • моль-1. Для синтеза АТФ — это та же величина, взятая с обратным знаком.
О О-Р=О
О О-Р=О
Рис. 2.1. Структура АТФ
Рис. 2.1. Структура АТФ
В некоторых реакциях гидролиз АТФ идет с отщеплением сразу двух фосфатных групп с образованием аденозинмонофосфата (АМФ) и пирофосфата (ФФН), который подвергается дальнейшему гидролизу с образованием энергии:
Н2О + НО—P-О—Р-О" —* 2НРО4 II II
ДС°' = -33,5 кДж • моль *.
АТФ представляет собой универсальное макроэргическое соединение, реакция гидролиза которого сопряжена со множеством энергозависимых процессов. Сопряжение осуществляется через образование общего для двух реакций промежуточного продукта: отщепляемый от АТФ фосфат временно переносится на молекулу одного из реагирующих веществ. В результате такого фосфорилирования энергия молекулы повышается, и это дает возможность пройти энергетически невыгодной реакции. Помимо АТФ в клетке есть и другие соединения с макроэргической связью и высокими значениями свободной энергии гидролиза (см. гл. 4), однако именно АТФ является наиболее общим и прямым источником энергии в клетке. В то же время следует заметить, что роль АТФ в метаболизме гораздо шире — это универсальный донор фосфатных групп в реакциях фосфорилирования, катализируемых ферментами киназами. Такие реакции важны не только для синтеза новых соединений, но и для регуляции ферментативной активности, а также играют важную роль в процессах, связанных с клеточной сигнализацией (см. гл. 7).
ПРЕОБРАЗОВАНИЕ ЭНЕРГИИ
НА СОПРЯГАЮЩИХ МЕМБРАНАХ СВЯЗАНОС ОБРАЗОВАНИЕМ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГОПРОТОННОГО ГРАДИЕНТА (АМ
Расход АТФ на обеспечение энергозависимых реакций должен восполняться ее синтезом, который требует адекватных энергетических затрат. Каким же образом происходит синтез АТФ в клетке и каким образом используется для этого энергия внешних ресурсов?
Небольшая часть АТФ может быть образована при анаэробном разложении глюкозы в биохимических реакциях гликолиза (см. гл. 4). Основная же
часть АТФ в клетках растений, животных и многих бактерий образуется в процессах фотосинтеза или дыхания. В основе трансформации энергии (будь то энергия света или субстратов дыхания) в энергию молекулы АТФ лежит общий и единый механизм, который получил название хемиосмотического сопряжения. Впервые хемиосмотическая теория была постулирована в 1960 г. английским биохимиком Питером Митчеллом. Однако идеи Митчелла были столь необычны, что стали общепризнанными лишь спустя некоторое время, когда получили неопровержимые экспериментальные подтверждения. Впоследствии П. Митчелл получил за свое открытие Нобелевскую премию (1978). Рассмотрим в общих чертах, в чем смысл хемиосмотического сопряжения и какие события лежат на пути преобразования энергии в клетке.
В системах трансформации энергии ключевая роль принадлежит замкнутой, сопрягающей мембране, непроницаемой для ионов. К сопрягающим относятся тилакоидная мембрана хлоропластов, внутренняя мембрана митохондрий и плазматические мембраны бактериальных клеток. Как правило, сопрягающая мембрана обогащена белком и биохимически отличается от других мембран клетки, так как содержит уникальный фосфолипид — кардиолипин, который делает мембрану более жидкой и более непроницаемой для ионов.
Энергопреобразующие мембраны содержат электрон-транспортные цепи (ЭТЦ). В процессах фотосинтеза и дыхания реализация энергии света или окисляемых субстратов в тилакоидной или митохондриальной мембране связана с возникновением электронного транспорта в ЭТЦ. Перенос электрона в фотосинтетической или дыхательной цепи неразрывно связан с векторной транслокацией иона Н+ через мембрану против сил электрического поля и в направлении большей концентрации. В фотосинтезе действие ЭТЦ сопряжено с накоплением протонов внутри тилакоидного пространства. Дыхательная цепь перекачивает протоны из матрикса в межмембранное пространство митохондрий. Процесс транслокации протона сопровождается энергизацией мембраны, т.е. возникновением на ней трансмембранной разности, или градиента электрохимического потенциала ионов водорода (Дцш), или протондви- жущей силы Др. Генерируемый на мембране Дщ^ представляет собой форму энергии, запасенную на мембране. Он используется для синтеза АТФ в процессах фотофосфорилирования (см. гл. 3) и окислительного фосфорилирования (см. гл. 4). Синтез АТФ катализируется ферментом АТФ-синтазой, также локализованным в сопрягающих мембранах хлоропластов, митохондрий или бактерий.
Таким образом, система трансформации энергии включает следующие основные компоненты:
замкнутая сопрягающая мембрана;
локализованная в мембране ЭТЦ;
трансмембранный электрохимический протонный градиент Дцш, генерируемый работой цепи;
АТФ-синтаза, катализирующая синтез АТФ из АДФ и Фн за счет энергии ДЦщ.
Так выглядит общая схема преобразования энергии на мембране. Рассмотрим теперь более подробно, что представляет собой энергия Дцн» и каким образом она превращается в энергию макроэргической связи в молекуле АТФ.
ТРАНСМЕМБРАННЫЙ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЙПРОТОННЫЙ ГРАДИЕНТ И ЕГО СОСТАВЛЯЮЩИЕ
Состояние вещества s в растворе можно охарактеризовать через химический потенциал щ, который измеряется в единицах свободной энергии. При условии, что активность вещества равна его концентрации и гидростатическим давлением можно пренебречь, химический потенциал вещества s равен:
Us = И$ + 2,3/?Tlg [Cs] [Дж - моль-1],
где gs — стандартный химический потенциал вещества s при концентрации 1 М; [CJ — молярная концентрация вещества s.
Состояние иона i определяют через электрохимический потенциал р, который учитывает, что состояние иона зависит не только от его концентрации, но и от электрического потенциала раствора:
pi = щ + 2,37?Tlg[Cj] + Z-Fy [Дж - моль-1], где р- — стандартный электрохимический потенциал при концентрации иона 1 М; R — газовая постоянная (8,314 Дж-моль-1-К-1); Т — абсолютная температура, К; [С,] — концентрация иона в молях; F — число Фарадея (96,49 кДжх хВ"1 • моль-1); z — заряд иона; у — электрический потенциал раствора.
Электрохимический потенциал оценивает свободную энергию иона и учитывает все силы, способные побудить ион к движению из одной области в другую. Спонтанное движение ионов через мембрану из области с более высоким в область с более низким электрохимическим потенциалом представляет собой пассивный транспорт, или диффузию. Движущей силой диффузии является разность электрохимических потенциалов, или трансмембранный электрохимический градиент иона Дц,-. Движение иона против градиента электрохимического потенциала требует энергии и называется активным транспортом. Если потенциалы ионов по обе стороны мембраны равны, т.е. Дщ = 0, это означает, что ионные потоки через мембрану находятся в равновесии.
Представим, что мембрана разделяет две области, в которых содержание ионов Н+ разное и электрохимические потенциалы Н+ соответственно равны Рнг и йн;-
Область 1: йн; = ц^ + 2,3/?Tlg[H+h + z^yi-Область 2: йн? = Йн+ + 2,37?Tlg[H+]2 + zFy2.
йн;
йн;
Н+Н+Н+Н+
Н+Н+ОН"
Н+Н'Н+Н+
И" ОН" н+ н+
Н+ ОН" ОН"
ОН" ОН"
Н+Н+Н+Н+
ОН" ОН"
Н+Н+Н+Н+
ОН" ОН"
В результате неравномерного распределения иона Н+ возникает трансмембранный градиент электрохимического потенциала Лцщ, равный разности электрохимических потенциалов протонов по обе стороны мембраны:
Мн(- Мн; = АЙФ = ^ЛЧй-2 + гДЛТ^Н^^ [Н+]2 [Дж - моль"1], где Ацн+ ~ разность электрохимических потенциалов иона Н+ по обе стороны мембраны; z — заряд иона Н+, равный +1; Ду,_2 — разность электрических потенциалов между двумя водными фазами, разделенными мембраной, т. е. электрический потенциал на мембране в вольтах; [H+h и [Н+]2 — молярные концентрации ионов Н+ по обе стороны мембраны (индексы 1 и 2 относятся к растворам, находящимся внутри и снаружи замкнутой мембраны).
Частное отделения величины Ацн+ на постоянную /"называется протондви- жущей силой Ар и измеряется в вольтах. Если ввести константы и выразить логарифм концентраций ионов Н+ в единицах pH (pH = -1g [Н+], то для температуры 25 °C получим простое выражение
Ар = Арн7^ = Av ~ 59ДрН [мВ].
Как видно из уравнения, протондвижущая сила состоит из двух компонентов. Первый — это градиент АрН, т. е. разность концентраций ионов Н+ по обе стороны мембраны. Градиент pH заставляет ионы Н+ и ОН" концентрироваться около поверхности мембраны. Это приводит к возникновению мембранного потенциала Ду (второй компонент), созданного избытком положительного заряда на одной стороне мембраны и отрицательного — на другой. Эффект мембранного потенциала усиливается другими ионами разных знаков, которые также притягиваются и концентрируются около мембраны. Следует подчеркнуть, что, хотя одна стороны мембраны заряжена более положительно по отношению к другой, основной раствор остается в целом электронейтраль- ным, т.е. содержит равное число катионов и анионов. Дело в том, что число «лишних», несбалансированных ионов, формирующих слой заряда на мембране, ничтожно мало в сравнении с общим числом ионов в растворе.
ЭНЕРГИЯ АДН+ ИСПОЛЬЗУЕТСЯ ДЛЯ СИНТЕЗА АТФИЗ АДФ И Фн ПРИ УЧАСТИИ АТФ-СИНТАЗЫ
Неравномерное распределение протонов по обе стороны мембраны побуждает их к диффузии по градиенту концентрации и заряда, которой препятствует мембрана. Энергия Ацн*, или Др, является мерой свободной энергии (AG = Арн4)* которая запасена на мембране и может быть освобождена, если протоны начнуг проходить мембрану по градиенту своего потенциала. Эта энергия может быть использована, если есть механизм сопряжения диффузии с энергозависимой реакцией. Такой механизм представляет собой АТФ- синтаза (FjF0 — АТФаза, или Н+ АТФаза F-muna), интегрированный в сопрягающую мембрану ферментный комплекс, который использует энергию Дцн* для синтеза АТФ из АДФ и Ф„. Синтез сопряжен с обратным током протонов по градиенту своего потенциала через АТФ-синтазный комплекс, т.е. осуществляется в момент разрядки мембраны при уменьшении, или диссипации Дцщ.
Обе составляющие Др — градиент ДрН и мембранный потенциал Лхр — стремятся заставить протоны пересекать мембрану по градиенту концентрации и заряда, и обе составляющие, таким образом, равноценны для синтеза АТФ. Этот тезис подтверждается в экспериментах in vitro. АТФ-синтазы могут быть выделены из мембраны с помощью детергентов и встроены в искусственные мембранные пузырьки (липосомы), приготовленные из очищенных фосфолипидов. В этом случае синтез АТФ можно наблюдать, если искусственно создать градиент pH или приложить к мембране разность электрических потенциалов.
Хотя основная функция АТФ-синтазы — синтез АТФ, этот фермент в определенных условиях может проявлять АТФазную активность, т.е. перекачивать протоны против градиента за счет гидролиза АТФ. Следовательно, АТФ-син- таза (Н+-АТФаза) в принципе способна к взаимопревращению двух форм энергии:
АТФ-синтаза
АрЩ *Г АТФ
АТФаза
Энергия Дцщ может быть использована не только для синтеза АТФ, но и в других целях. Например, в митохондриях она используется для транспорта веществ через мембрану. Кроме того, рассеивание ДДН+ имеет значение в терморегуляторном образовании теплоты (см. гл. 4).
СИНТЕЗ АТФ СВЯЗАН С КОНФОРМАЦИОННЫМИИЗМЕНЕНИЯМИ АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ АТФ-СИНТАЗЫ.
РОТАЦИОННЫЙ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТА
АТФ-синтазы разного происхождения — из митохондрий, хлоропластов или бактериальных мембран — имеют в целом схожее строение, что говорит о несомненно древнем эволюционном происхождении фермента. На снимках, полученных при помощи электронной микроскопии, АТФ-синтазы выглядят как локализованные в мембранах грибовидные структуры. Хорошо видно, что фермент состоит из двух частей — двух белковых комплексов, которые обозначают как фактор Fl и фактор Fo (CF, и CF0 — для АТФ-синтазы хлоропластов). Фактор, или комплекс, F, расположен вне мембраны и на снимках представляет собой «шляпку» гриба высотой 8 нм и шириной 10 нм. Этот гидрофильный сферический комплекс представляет собой каталитический центр, на
котором осуществляется синтез АТФ. Гидрофобный Р0-фактор интегрально встроен в мембрану и формирует канал, по которому ионы Н+ могут пересекать мембрану, двигаясь по градиенту своего потенциала. Более детально структура фермента была исследована с помощью рентгеноструктурного анализа с разрешением 0,28 нм на комплексах, выделенных из митохондрий сердца быка и мембран Escherichia coli (рис. 2.2).
Комплекс F| состоит из пяти разных субъединиц в определенном соотношении: адРзубе. Основу его структуры составляют гомологичные субъединицы а и Р, чередующиеся друг с другом. Места связывания для нуклеотидов есть на обеих субъединицах, но три активных центра, где происходит синтез АТФ, расположены в основном на субъединицах р. Субъединицы аир расположены поочередно вокруг у-субъединицы, которая представляет собой стержень (~ 9 нм) и, как втулка, проходит через каталитический центр, связывая факторы F, и Fo. Субъединица 5, расположенная на внешней стороне одной из р-субъеди- ниц, служит сайтом прикрепления двух 6-субъединиц, которые заякоривают комплекс Fi в мембране. Функции e-субъединицы связаны с регуляцией: e-субъединица избирательно препятствует гидролизу АТФ. Фактор Ft легко диссоциирует от Fo и проявляет in vitro АТФазную активность, гидролизуя АТФ.
Комплекс Fo состоит из трех типов белковых субъединиц в следующем соотношении: й|62С9_|2. Он обеспечивает связывание F, с мембраной и перенос протона. Небольшие, очень гидрофобные с-субъединицы, имеющие по два
Рис. 2.2. Модель АТФ-синтазы FjFo-типа.
Периферический Ргфактор состоит из пяти видов субъединиц (а3Р3убЕ) и несет на (3-субъединицах каталитические центры. Ргфактор заякорен в мембране с помощью у-субъединицы и Fo-фактора. Fy-комплекс состоит из трех видов субъединиц в соотношении aiA2c10_12. Субъединицы а и с формируют протонный канал, через который ионы Н' входят с одной, а выходят с другой стороны мембраны. Движение протонов внутри кольца из с-субъединиц сопровождается его вращением и вращением связанных с ним ус-субъединиц. Ротация сопровождается конформационными изменениями каталитических центров Ргкомплекса, в которых идет синтез АТФ. По-видимому, а3(33-комплекс не вращается, так как удерживается в фиксированном положении с помощью 8- и двух b-субъединиц. В митохондриях Р,-комплекс обращен в матрикс
трансмембранных участка, формируют проводящий протоны канал, который обеспечивает прохождение Н+ через всю мембрану. Интересно отметить, что такой сложный ферментный комплекс, как АТФ-синтаза, находится под двойным генетическим контролем: три субъединицы Р0-фактора и а-субъединицы фактора F( кодируются геномом митохондрий или хлоропластов, тогда как синтез остальных субъединиц контролируется ядерными генами.
Исследования АТФ-синтазных комплексов велись давно, но механизм их действия и структурно-функциональная связь факторов F, и Fo стали понятными относительно недавно. Здесь следует отметить приоритет работ Р. Boyer и J. Walker (Нобелевская премия, 1997). Благодаря исследованиям этих ученых стал понятным принцип работы фермента, получивший название ротационного механизма. Согласно ротационному механизму, энергия, освобождаемая при диффузии протонов через Р0-канал, используется для вращения у-субъединицы. Результатом ротации у-субъединины является последовательная смена конформационных состояний активных центров, расположенных на трех р-субъ- единицах Р,-комплекса. Синтез АТФ из АДФ и Фн идет в активных центрах спонтанно благодаря конформационным перестройкам. Энергия Дрн+, освобождаемая в результате протонного транспорта через Р0-канал, используется не на синтез АТФ, а для освобождения АТФ из активного центра в результате изменения его конформации. Прямое доказательство ротационного механизма было получено японскими учеными, которым удалось продемонстрировать вращение у-субъединицы относительно сидящего на ней фактора Fh Изолированный комплекс F| был иммобилизован на неподвижной подложке, а к концу у-субъединицы был химически пришит флуоресцирующий фрагмент нити актина длиной 1 мкм. С помощью флуоресцентного микроскопа в реальном времени удалось наблюдать вращение нити актина при работе фермента, гидролизующего АТФ.
Часто АТФ-синтазу называют молекулярным мотором и используют механические термины для описания ее работы. Считается, что комплекс а3р3-субъ- единиц удерживается в фиксированном положении, так как за якорем в мембране через субъединицы 8, 26, а, выполняющие функцию «статора». Ток Н+ вызывает вращение кольца, состоящего из субъединиц с и контактирующих с ним субъединиц у и в, которые все вместе выполняют функцию вращающегося «ротора».
Известно, что субъединица а образует 5 трансмембранных «-спиралей и формирует пути для входа Н+ с одной стороны мембраны и выхода — с другой. Движение Н+ внутри кольца из субъединиц с связано с последовательным протонированием/депротонированием ключевого остатка аспартата (Asp-61), расположенного на одной из двух «-спиралей с-субъелиниц. Этот процесс сопряжен с поворотом каждой с-субъединицы и запускает пошаговое вращение с-кольца (ротора) относительно с62-статора. Расчеты показывают, что синтез одной молекулы АТФ сопряжен с транспортом 3-4Н+ через Р0-канал.
Рассмотрим подробно, в результате каких событий происходит синтез АТФ в каталитическом центре фермента. Согласно последним данным (Р. Boyer, 2002), в результате вращения у-субъединицы относительно «3р3-комплекса изменяется конформация расположенных на р-субъединицах трех активных центров, каждый из которых в данный момент времени может находиться в трех разных состояниях (рис. 2.3) Эти конформационные состояния, названные «откры-
Рис. 2.3. Состояние каталитических центров АТФ-синтазы:
А — Ргкомплекс на трех р-субъединицах несет три активных центра, которые одновременно могут находиться в одном из трех конформационных состояний — О-центр, Т-центр и L-центр. Ротация у-субъединицы в момент движения протонов через Р0-канал вызывает изменение конформации сразу трех центров; Б — конформационные изменения одного активного центра при повороте у-субъединицы на 360°. Субстраты, АДФ и Фн связываются в «открытом» О-центре. Ротация у-субъединицы на 120° переводит центр в «закрытое» Т-состояние. В Т-центре спонтанно идут реакции синтеза и гидролиза АТФ. При следующем шаге вращения на 120° Т-центр переходит в L-центр, из которого возможен выход синтезированной АТФ. Пунктиром указаны возможные промежуточные состояния центров
тым» («open» — О), «закрытым» («tight» — Т) и «слабосвязанным», или «неплотным» («loose» — L), центрами, различаются по степени сродства к АДФ, АТФ и Фн. Принципиальным моментом является тот факт, что в результате тесного контакта между а-, р- и у-субъединицами конформационные изменения возникают одновременно на всех трех р-субъединицах при повороте у-субъединицы на 120°. При этом каждый активный центр последовательно проходит через три смены конформаций и возвращается в исходное состояние при пол-
ном повороте у-субъединицы на 360° (см. рис. 2.3). Каталитический цикл начинается со связывания АДФ и Фн в О-центре: в «открытом» состоянии центр имеет высокое сродство к АДФ и крайне низкое — к АТФ. В то же время АДФ и Фн относительно слабо удерживаются в центре и могут выходить из него. Поворот у-субъединицы на 120° переводит О-центр в «закрытое» Т-состояние. В Т-центре молекулы АДФ и Фн уже прочно связаны и не могут его покинуть. Конформация Т-центра такова, что в нем самопроизвольно идут акты образования и разрыва ковалентной связи АДФ ~ Фн, т. е. синтеза и гидролиза АТФ.
Важно, что синтез АТФ в «закрытом» центре идет спонтанно, энергетически даром, только за счет создания особой конфигурации между активными группами фермента и молекулами АДФ и Фн. Более того, синтез АТФ в «закрытом» центре может идти даже в условиях деэнергизованной мембраны или даже вне мембраны на изолированном F,-комплексе. Однако освобождения синтезированной АТФ из «закрытого» центра не происходит: для этого необходим следующий этап вращения и переход в состояние L-центра. В этом состоянии связи АТФ с центром ослабевают и молекула может его покинуть и перейти в водную фазу. Следует отметить, что в момент открытия Т-центра в нем находится именно молекула АТФ. Предполагается, что в момент перехода равновесие АДФ + Фн -*-*- АТФ сдвигается в сторону синтеза АТФ под влиянием протондвижущей силы. Следующий этап вращения переводит центр в исходное, «открытое» состояние, из которого, вероятно, также возможен выход АТФ. В течение синтеза АТФ конформационные состояния активных центров последовательно меняются в направлении: О —*■ Т —► L —► О.
Таким образом, согласно ротационному механизму, энергия Дцн+ расходуется не на стадии образования химической связи АДФ ~ Фн, а необходима для смены конформаций и выхода АТФ из активных центров фермента. При наличии Др для быстрого синтеза АТФ в Т-центре второй каталитический центр в О-конформации должен содержать связанные АДФ и фосфат.
В условиях, неблагоприятных для синтеза АТФ, например при низком содержании АДФ или Фн или при низкой Др, возможны гидролиз АТФ и перекачка протонов против градиента. В этом случае происходит связывание АТФ в L-центре и гидролиз АТФ, сопряженный с последовательной сменой конформаций в обратном направлении L —*■ Т —► О.
В настоящее время интенсивно изучаются все аспекты работы АТФ-синтазы. Аминокислотные остатки и функциональные группы, критичные для вращения и для конформационных изменений, исследуются с помощью точечного мутагенеза, позволяющего получать мутации, связанные с заменой в структуре фермента одной единственной аминокислоты. В то же время молекулярные механизмы сопряжения двух физически дистанцированных процессов — транспорта протонов и синтеза АТФ — остаются пока неясными.
ЦИРКУЛЯЦИЯ ИОНОВ ЧЕРЕЗ МЕМБРАНЫ.
ДРУГИЕ АТФазы
Синтез АТФ при использовании протонного потенциала на мембранах хлоропластов и митохондрий не единственный случай взаимопревращений ионных градиентов и АТФ. Большинство клеточных мембран, а именно плазма-
лемма, тонопласт, мембраны ЭПР, содержат ферменты, действие которых направлено на создание ионных градиентов при использовании энергии АТФ. Эти ферменты известны под общим названием АТФаз, их называют также ионными помпами, или насосами. АТФазы функционируют как электроген- ные ионные насосы, эффективно перекачивая ионы через мембрану против их электрохимического градиента за счет энергии гидролиза АТФ. В то же время в условиях крутого градиента транспортируемых ионов in vitro некоторые из них могут обращать свое действие, осуществляя синтез АТФ. Таким образом, среди АТФаз есть обратимые сопрягающие системы, которые способны к взаимопревращению энергии ионных градиента и макроэргической связи в молекуле АТФ.
На основе строения, локализации и механизма действия АТФазы делят на три группы: Н+-АТФазы F-типа, Н+-АТФазы V-типа и АТФазы Р-типа.
В первую группу входят рассмотренные выше АТФ-синтазы (Е|Е0-АТФазы) из мембран митохондрий и хлоропластов, а также сопрягающих бактериальных мембран. В физиологических условиях эти ферменты работают на синтез АТФ, но могут функционировать как АТФазы, и поэтому рассматриваются в общем контексте.
В клетках эукариот имеются вакуолярные АТФазы, или АТФазы V-типа, локализованные в тонопласте, мембранах ЭПР и лизосом, которые в норме работают на создание протонного градиента (АТФ —► ДцнО- Сопряженно с гидролизом АТФ они переносят Н+ через мембрану из цитозоля, закисляя пространство вакуолей или других органелл (см. подразд. 6.2.2). По своей структуре и составу субъединиц АТФазы V-типа сильно напоминают F^q-АТФазы. Они также состоят из двух компонентов — трансмембранного Vo и гидрофильного V1-кoмплeкcoв — и работают, вероятно, по аналогичному принципу.
Клетки животных и растений содержат АТФазы, относящиеся к Р-типу. Для АТФаз P-типа характерно, что в ходе каталитического цикла механизм переноса ионов связан с фосфорилированием самого фермента за счет АТФ. АТФазы P-типа имеют простое строение: большинство ферментов этой группы представляют собой единый полипептид, имеющий сходные аминокислотные последовательности и молекулярную массу около 100 кДа. Исключение составляет Na+/K+-ATФaзa, у которой есть вторая небольшая субъединица с неизвестной функцией. Все АТФазы P-типа содержат 6, 8 или 10 трансмембранных спиральных участков и гидрофильную петлю, где и происходит обратимое фосфорилирование по остаткам аспартата. Кроме того, характерной особенностью этих АТФаз является то, что все они ингибируются ортованадатом (H2VO4) — структурным аналогом иона фосфата.
К P-типу относится хорошо изученная Иа+/К+-АТФаза клеток животных. Этот фермент, локализованный в плазматической мембране, катализирует транспорт ионов натрия и калия: на каждую молекулу гидролизованного АТФ фермент выкачивает из клетки 3 иона Na+ в обмен на 2 иона К4 Na /К+-АТФаза создает на мембране AjlNa+ (АТФ —► ApNa+), который используется животной клеткой для активного транспорта веществ, а также при проведении нервных импульсов. В клетках растений Ка+/К+-АТФаза отсутствует. На плазмалемме клеток растений, а также водорослей и грибов функционирует Н+-АТФаза Р-типа, которая выкачивает Н+ из цитозоля в фазу клеточной стенки, осуществляя реакцию АТФ —► Арщ и тем самым внося основной вклад в поляризацию
плазмалеммы. К АТФазам P-типа относится также Са2+-АТФаза, расположенная на плазмалемме и внутренних мембранах ЭПР у растений и животных. Этот фермент откачивает Са * из цитозоля, либо выводя его из клеток, либо закачивая внутрь компартментов. На каждую гидролизованную молекулу АТФ через мембрану переносится 2 иона Са +. В результате работы этого фермента концентрация Са + в цитозоле очень низкая.
Ионные градиенты на мембранах, создаваемые АТФазами, — это еще один источник энергии в клетке. Ионные градиенты могут быть движущей силой активного транспорта веществ через мембраны (см. гл. 6). С ними связаны такие процессы, как рост растительных клеток и трансдукция сигнала (см. гл. 7).
НАПРАВЛЕНИЕ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ В ЭТЦОПРЕДЕЛЯЕТСЯ РЕДОКС-ПОТЕНЦИАЛОМ ПЕРЕНОСЧИКОВ
Создание Дцщ сопряжено с электронным транспортом в тилакоидной и митохондриальной мембранах. Рассмотрим, что представляет собой ЭТЦ и какие события в ней происходят. Прежде всего нужно сказать, что электронный транспорт связан с происходящими в мембране окислительно-восстановительными реакциями.
В широком смысле слова окислением называется процесс, связанный с отдачей электронов (с-), а восстановлением — процесс, связанный с их присоединением. Соединение, присоединяющее электроны, является акцептором, а отдающее электроны — донором электронов. Окисленная и восстановленная формы соединения, способного отдавать и принимать е-, называется окислительно-восстановительной, или редокс-парой: донор электронов -** акцептор электронов + не".
Способность данной редокс-пары быть донором или акцептором ё" определяется на основе окислительно-восстановительного, или редокс-потенциала, £', выраженного в вольтах:
2,3RT [акцепторе ]
Е= Е + — Igj-nF [донор е ]
где R — газовая постоянная (8,314 Дж • моль-1 • К-1); Т — абсолютная температура, К; п — число переносимых электронов; F— число Фарадея (96,4 кДж • В *х хмоль *); [акцептор е"], [донор е ] — концентрации в молях окисленной и восстановленной форм редокс-пары; Е”’ — стандартный редокс-потенциал.
Стандартный потенциал Е°' определяется экспериментально. Помещая электрод в раствор, содержащий данную редокс-пару, можно измерить э.д.с. цепи, составленной из данного электрода и электрода сравнения. В качестве стандарта используется водородный электрод (потенциал реакции Н2 = 2ё" + 2Н+ при давлении газообразного Н2 1 атм, концентрации ионов водорода 1М (pH 0) и 25 °C условно принят за нуль). В биохимии электродные потенциалы Е°' определяются при pH 7,0. Потенциал водородного электрода равен -0,42 В.
По определению, Е°' (или потенциал средней точки £т7) равен ЭДС, возникающей в полуэлементе, содержащем донор и акцептор е в равной концентрации (при 25 °C и pH 7,0) и находящемся в равновесии с электродом, способным обратимо принимать электроны. Значение Е°' характеризует способ-
ность данной редокс-пары быть донором или акцептором электронов и позволяет предсказать направление переноса е от одной редокс-пары к другой при стандартных условиях. Система с более положительным Е°' может быть окислителем по отношению к системе с более отрицательным Е°'. Например, редокс- пара НАДН/НАД+ имеет потенциал -0,32 В, что указывает на сильно выраженную способность НАДН к отдаче электронов. Наоборот, Е°' пары Н2О/1/2О2 составляет +0,82 В, что отражает слабую тенденцию воды к отдаче е~ и сильно выраженную способность кислорода к их присоединению. Следует отметить, что в этом интервале находятся редокс-потенциалы многих соединений, принимающих участие в процессах фотосинтеза и дыхания.
В мембране тилакоидов и внутренней мембране митохондрий локализованы и определенным образом ориентированы соединения, которые являются переносчиками электронов и имеют разные редокс-потенциалы. Эти соединения, реагируя друг с другом, способны обратимо окисляться и восстанавливаться, поочередно выступая в роли доноров и акцепторов электронов. В результате последовательных окислительно-восстановительных реакций происходит перенос ё" по цепочке от одного переносчика к другому в соответствии со значениями их редокс-потенциалов. Процесс этот называется электронным транспортом, а переносчики электрона формируют электрон-транспортную цепь. Важно знать, что переносчики электрона имеют разную природу, и реакции с их участием могут быть связаны с транспортом непосредственно электрона (е"), атома водорода (Н") или гидрид-иона (Н? = 2е~ +Н+) от донора к акцептору.
Согласно законам термодинамики, перенос ё" в ходе редокс-реакций в ЭТЦ сопровождается изменением свободной энергии G, которое для стандартных условий может быть рассчитано по уравнению
AG0' = -nF ■ кЕ°' [Дж-моль"1],
где AG°' — стандартное изменение свободной энергии; п — число переносимых электронов; kF”' — разность стандартных потенциалов конечного акцептора и исходного донора ё" в реагирующей системе. •
Редокс-потенциалы определены практически для всех участников ЭТЦ дыхания и фотосинтеза. В дыхательной цепи митохондрий электронный транспорт от НАДН на О2 идет по градиенту редокс-потенциала. В процессе фотосинтеза энергия света используется для инициации электронного транспорта от воды к НАДФ+ против градиента редокс-потенциала.
ОРГАНИЗАЦИЯ ЭТЦ В МЕМБРАНЕ
Электрон-транспортные цепи фотосинтеза и дыхания организованы в мембране сложным образом и представляют собой встроенные в нее суперкомплексы, состоящие из многих субъединиц белка. В их составе обязательно присутствуют трансмембранные белки, закрепляющие весь комплекс в мембране. Каждый суперкомплекс содержит, как правило, несколько активных центров: на белках в качестве простетических групп или за счет нековалентных взаимодействий удерживаются соединения, которые участвуют в переносе электрона. Некоторые комплексы из тилакоидных и митохондриальных мембран удалось выделить с помощью детергентов и получить в кристаллизованном состоянии.
Это позволило изучить их молекулярную организацию методом рентгеноструктурного анализа. Связь между комплексами осуществляют подвижные переносчики, которые могут перемещаться либо в липидной фазе мембраны (хиноны), либо в водной фазе вблизи мембраны. Реакции в ЭТЦ идут с большими скоростями, измеряемыми в интервалах 10-4—10“9 с.
Организация электронного транспорта такова, что перенос электрона по цепи неразрывно связан с направленной транслокацией ионов Н через мембрану и генерацией Дцн+. В тилакоидной мембране протоны переносятся внутрь тилакоидного пространства, а в митохондриях — из матрикса в межмембранное пространство. Механизмы транслокации Н+ через мембрану могут быть разными и в ряде случаев пока остаются неясными. Общим случаем является перенос протона через мембрану при участии подвижных переносчиков — хинонов (см. гл. 4).
Если в процессе электронного транспорта на мембране возникает Дцщ, который используется на синтез АТФ, то транспорт называется сопряженным. Однако могут быть ситуации, когда работа цепи не сопряжена с генерацией Дцн* и синтезом АТФ. Тогда электронный транспорт называется разобщенным. Разобщение электронного транспорта с фосфорилированием имеет место in vivo, при этом энергия электронного потока преобразуется (диссипирует) в тепло. Разобщение имеет место в митохондриях животных и растений и представляет особый механизм регуляции метаболизма (см. подразд. 4.3.8).
НЕКОТОРЫЕ ПЕРЕНОСЧИКИ ЭЛЕКТРОНОВЯВЛЯЮТСЯ ОБЩИМИ ДЛЯ ЭТЦ ВСЕХ ТИПОВ
Никотинамидадениндинуклеотид (НАД(Н)) и никотинамидадениндинук- леотидфосфат (НАДФ(Н)) — это близкие по структуре растворимые соединения, функциональной частью которых является ароматическое кольцо (рис. 2.4). НАД(Н) и НАДФ(Н) являются коферментами НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ. Эти ферменты катализируют реакции, связанные с отнятием или присоединением двух атомов водорода, при этом коферменты переносят гидрид- ион Н7(2е" + Н+), а недостающий протон захватывается или отдается в водную фазу:
АН2 + НАД(Ф)+ ^ А + НАД(Ф)Н + Н+
Большая часть НАД(Н) и НАДФ(Н) растворена в водной фазе, так как их связи с ферментными белками непрочные и возникают только в момент ферментативной реакции. Окисленные формы НАД+ и НАДФ имеют полосу поглощения при 260 нм, а при их восстановлении появляется полоса поглощения при 340 нм. Это позволяет регистрировать редокс-состояние коферментов в ходе реакций. Стандартный Е°' этих соединений равен -0,32 В. Роль НАД(Н) и НАДФ(Н) в клетке очень велика. Принимая участие во многих реакциях в качестве доноров или акцепторов электронов, они обеспечивают взаимодействие разных процессов и в целом контролируют редокс-статус клетки.
Флавопротеиды. Компонентами ЭТЦ являются флавопротеиды — белки, содержащие в качестве прочно связанной простетической группы флавинмононуклеотид (ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД). Функциональная
Рис. 2.4. Редокс-превращения в молекулах НАД(Н) и НАДФ(Н).
Окисленные формы НАД' и НАДФ' несут положительный заряд на атоме азота никотинамидного кольца
часть этих соединений представлена системой ароматических колец (рис." 2.5), в состав которой входит остаток рибофлавина (витамин В2). Окисление — восстановление флавопротеидов связано с переносом двух атомов водорода. Окислен-
I нс-онII нс-онIV-он онV-он он
I нс-он
I
I нс-он
I
V-он он
V-он он
Рис. 2.5. Редокс-превращения в молекулах ФМН и ФАД
ные формы флавинов имеют два максимума поглощения — при 375 и 450 нм, которые исчезают при восстановлении. Редокс-потенциалы флавопротеидов варьируют в широких пределах (от -0,49 до +0,19 В) в зависимости от структуры апобелка.
Цитохромы. Обязательными компонентами ЭТЦ являются цитохромы — железосодержащие белки, в составе которых присутствует гем. Основой структуры гема является порфириновое кольцо, образованное из четырех пиррольных ко
лец, в центре которого расположен атом железа (рис. 2.6). В редокс-превраще- ниях цитохромы функционируют как одноэлектронные переносчики, при этом железо меняет свою валентность, переходя из состояния Fe+ в состояние Fe+ .
Восстановленные формы цитохромов имеют три характерных полосы поглощения в областях 545 — 600, 520 — 535, 415 — 445 нм — это полосы а, р, у. На основе положения основного максимума a-полосы цитохромы разделяют на три группы: цитохромы а, b и с. Если цитохромы находятся в окисленном
состоянии, то полосы аир исчезают, а у-полоса сдвигается в более коротковолновую область. Стандартные Е°' цитохромов варьируют в диапазоне от 0,0 до +0,6 В. ’
Железосерные белки. Железосерные белки, или Fe-S-белки, содержат так называемые Fe-S-кластеры, или центры. Центры состоят из двух или четырех
атомов железа, комплексно связанных с атомами неорганической серы или серы в остатках цистеина в структуре белка. В основе классификации железосерных белков лежит структура кластера; в зависимости от этого различают 2Fe-2S- или 4Ре-48-белки (рис. 2.7).
В состав центра входят несколько атомов железа, но каждый из центров способен принимать или отдавать только один электрон. Восстановление железосерных белков сопровождается исчезновением в спектре полосы 450 нм и появлением сигнала ЭПР (метод электронного парамагнитного резонанса), что указывает на появление свободного радикала. Для этой группы соединений диапазон значений Е°' также достаточно широк: от -0,42 В до +0,35 В.
Хиноны. В качестве подвижных переносчиков, действующих в липидной фазе мембраны, функционируют хиноны, обозначаемые буквой Q (от англ, quinon)'.
—Cys—S^ /S—Cys—Fes\ >-Cys—SZ ^S—Cys——Cys—S^ /S—Cys—Fes\ >-Cys—SZ ^S—Cys——Cys—S—Fe~;S
—Cys—S^ /S—Cys—Fes\ >
-Cys—SZ ^S—Cys—
—Cys—S^ /S—Cys—Fes\ >
-Cys—SZ ^S—Cys—
SFe— S—Cys—
^SFe—S—Cys—
—Cys—S—FeS
4Fe-4S-4Fe-4S-2Fe-2S-
4Fe-4S-
4Fe-4S-
Рис. 2.7. Структура железосерных центров 2Fe-2S- и 4Fe-4S-THna
Рис 2.8. Структура (/1) и редокс-превращения (Б) в молекуле убихинона
пластохинон в ЭТЦ фотосинтеза и убихинон в ЭТЦ дыхания. Хиноны состоят из ароматического кольца и боковой липофильной цепи, в составе которой может содержаться 9 (пластохинон) или 10 (убихинон) изопреноидных остатков (рис. 2.8). Свободно диффундирующие в мембране хиноны осуществляют связь между белковыми комплексами и могут переносить два атома водорода. Хиноны обладают двумя свойствами, исключительно важными для работы ЭТЦ по переносу протонов через мембрану. Во-первых, в ходе редокс-реакций хиноны могут захватывать или освобождать 2Н+ на границе раздела двух фаз — липид/вода с любой стороны мембраны. Во-вторых, в ходе электронного транспорта хиноны могут принимать или отдавать только один электрон, при этом находясь в течение какого-то времени в форме свободного анион-радикала — семихинона (Q7). Спектры поглощения хинонов находятся в УФ-области и маскируются поглощением других соединений, поэтому их окислительно- восстановительные состояния отслеживают, как правило, методом ЭПР. Редокс-потенциалы хинонов близки к нулю или имеют низкие положительные значения.
Итак, живые организмы используют энергию света и химическую энергию органических соединений в процессах фотосинтеза и дыхания. И в том и другом случае клетка превращает внешние энергетические ресурсы в конвертируемые формы клеточной энергии — АТФ и трансмембранный электрохимический протонный градиент ДДН+. Преобразование энергии в процессах фотосинтеза и дыхания основано на общем механизме хемиосмотического сопряжения.
Основной компонент систем трансформации энергии — сопрягающие мембраны хлоропластов и митохондрий, содержащие электронтранспортные цепи. Энергия солнечного излучения или энергия, заключенная в окисляемых субстратах, реализуется таким образом, что в мембране начинает работать элект- ронтранспортная цепь. Электронный транспорт в цепи неразрывно связан с векторным переносом протона через мембрану против электрохимического
СветСветСубстраты дыханияСубстраты дыханиячерез мембранучерез мембрануРис. 2.9. Преобразование энергии в растительной клеткеРис. 2.9. Преобразование энергии в растительной клетке
Свет
Свет
Субстраты дыхания
Субстраты дыхания
через мембрану
через мембрану
Рис. 2.9. Преобразование энергии в растительной клетке
Рис. 2.9. Преобразование энергии в растительной клетке
потенциала. В результате работы цепи энергия внешних источников трансформируется и запасается на мембране в форме Лцн+- АТФ-синтазы используют △цщ, сопрягая обратную диффузию ионов Н+ по градиенту электрохимического потенциала с энергозависимой реакции синтеза АТФ из АДФ и Фн. В соответствии с ротационным механизмом обратный ток протонов через АТФ-син- тазный комплекс сопровождается конформационными изменениями каталитических центров, в которых спонтанно идет синтез АТФ. Образованная в процессах фотосинтеза и дыхания АТФ обеспечивает энергией разнообразные клеточные процессы, и в том числе используется для энергизации других клеточных мембран при участии АТФаз разных типов. АТФазы, или ионные помпы, эффективно перекачивают некоторые ионы через мембрану против их электрохимического градиента за счет энергии гидролиза АТФ. Создаваемые помпами ионные градиенты на мембранах служат еще одним источником клеточной энергии (рис. 2.9).
Таким образом, общим принципом клеточной биоэнергетики является взаимопревращение на мембранах двух форм клеточной энергии — энергии ионных градиентов и АТФ. Благодаря этим превращениям клетка обеспечивает энергией разнообразные процессы, протекающие как в растворе, так и на мембранах.
ГЛАВА 3
ФОТОСИНТЕЗ
В главе «Фотосинтез» изложены современные представления о механизме преобразования в фотосинтезе солнечной энергии в химическую энергию органических соединений. Рассмотрено участие различных групп пигментных систем в поглощении и миграции энергии света к реакционным центрам, организация реакционных центров и механизмы первичного преобразования энергии света в энергию разделенных зарядов, структура электрон транспортной цепи фотосинтеза и ее участие в образовании НАДФН и АТФ — соединений с высоким восстановительным и энергетическим потенциалом, механизмы сопряжения транспорта электронов с синтезом АТФ. Дан анализ механизмов ассимиляции углерода при фотосинтезе у разных групп растений в зависимости от генетических и экологических факторов, а также закономерностей фотосинтетической деятельности целого растительного организма.
ФОТОСИНТЕЗ КАК ОСНОВА БИОЭНЕРГЕТИКИ
КОСМИЧЕСКАЯ РОЛЬ ЗЕЛЕНОГО РАСТЕНИЯ
В ТРАНСФОРМАЦИИ ВЕЩЕСТВА И ЭНЕРГИИ
Проблема фотосинтеза представляет собой одну из наиболее важных и сложных проблем общей биологии. Фотосинтезу принадлежит центральная роль в общей энергетике растений и животных организмов, поскольку именно этот процесс служит первичным источником всей энергии, используемой живыми организмами в процессе жизнедеятельности.
Фотосинтез — один из наиболее мощных процессов преобразования солнечной энергии (т. е. энергии термоядерных процессов, протекающих на Солнце), которая высвобождается в результате превращения водорода в гелий:
4Н —► Не + 2е" + h\ (фотоны высокой энергии)
Солнечная энергия при участии зеленых растений и фотосинтезирующих бактерий преобразуется в свободную энергию органических соединений. Для осуществления этого уникального процесса в ходе эволюции был создан фотосинтетический аппарат, содержащий: 1) набор фотоактивных пигментов, способных поглощать электромагнитное излучение определенных областей спектра и запасать эту энергию в виде энергии электронного возбуждения, и 2) специальный аппарат преобразования энергии электронного возбуждения в разные формы химической энергии. Прежде всего это редокс-энергия, связанная с образованием высоковосстановленных соединений, энергия электро-
химического потенциала, обусловленная образованием электрических и протонных градиентов на сопрягающей мембране (Лцщ), энергия фосфатных связей АТФ и других макроэргических соединений, которая затем преобразуется в свободную энергию органических молекул.
Все эти виды химической энергии могут быть использованы в процессе жизнедеятельности для поглощения и трансмембранного переноса ионов и в большинстве реакций метаболизма, т. е. в конструктивном обмене.
Способность использовать солнечную энергию и вводить ее в биосферные процессы и определяет «космическую» роль зеленых растений, о которой так много и горячо говорил и писал великий русский физиолог К. А. Тимирязев.
ПРИРОДА ОСНОВНЫХ РЕАКЦИЙ
И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ФОТОСИНТЕЗА
Процесс фотосинтеза представляет собой очень сложную систему по пространственной и временной организации. Использование высокоскоростных методов импульсного анализа позволили установить, что процесс фотосинтеза включает различные по скорости реакции — от 10"15 с (в фемтосекундном интервале времени протекают процессы поглощения и миграции энергии) до 104 с (образование продуктов фотосинтеза). Фотосинтетический аппарат включает структуры с размерами от 10 27 м3 на низшем молекулярном уровне до 105 м3 на уровне посевов.
Принципиальная схема фотосинтеза. Весь сложный комплекс реакций, составляющих процесс фотосинтеза, может быть представлен принципиальной схемой, в которой отображены основные стадии фотосинтеза и их сущность. В современной схеме фотосинтеза можно выделить четыре стадии, которые различаются по природе и скорости реакций, а также по значению и сущности процессов, происходящих на каждой стадии:
I II III IV
н н н
hv -* П —* П* — П(Рц5—- Ех —* Е.-^ ,..-^Еп — —С—С—С-
он он он
(ССК) (РЦ) (ЭТЦ) (углеродный цикл)
I стадия — физическая. Включает фотофизические по природе реакции поглощения энергии пигментами (П), запасания ее в виде энергии электронного возбуждения (П*) и миграции в реакционный центр (РЦ). Все реакции чрезвычайно быстрые и протекают со скоростью 10-15—10"9 с. Первичные реакции поглощения энергии локализованы в светособирающих антенных комплексах (ССК).
IIстадия — фотохимическая. Реакции локализованы в реакционных центрах и протекают со скоростью 10'9 с. На этой стадии фотосинтеза энергия электронного возбуждения пигмента (П*РЦ)) реакционного центра используется для разделения зарядов. При этом электрон с высоким энергетическим потенциалом передается на первичный акцептор А, и образующаяся система с раз-
деленными зарядами (П<рц) — А ) содержит определенное количество энергии уже в химической форме. Окисленный пигмент П<рц) восстанавливает свою структуру за счет окисления донора (Д).
Происходящее в реакционном центре преобразование одного вида энергии в другой представляет собой центральное событие процесса фотосинтеза, требующее жестких условий структурной организации системы. В настоящее время молекулярные модели реакционных центров растений и бактерий в основном известны. Установлено их сходство по структурной организации, что свидетельствует о высокой степени консервативности первичных процессов фотосинтеза.
Образующиеся на фотохимической стадии первичные продукты (П+, А ) очень лабильны, и электрон может вернуться к окисленному пигменту П+ (процесс рекомбинации) с бесполезной потерей энергии. Поэтому необходима быстрая дальнейшая стабилизация образованных восстановленных продуктов с высоким энергетическим потенциалом, что осуществляется на следующей, III стадии фотосинтеза.
III стадия — реакции транспорта электронов. Цепь переносчиков с различной величиной окислительно-восстановительного потенциала (£„) образует так называемую электрон-транспортную цепь (ЭТЦ). Редокс-компоненты ЭТЦ организованы в хлоропластах в виде трех основных функциональных комплексов — фотосистемы I (ФС1), фотосистемы II (ФСН), цитохром ^/-комплекса, что обеспечивает высокую скорость электронного потока и возможность его регуляции. В результате работы ЭТЦ образуются высоковосстанов- ленные продукты: восстановленный ферредоксин (ФДВОССТ) и НАДФН, а также богатые энергией молекулы АТФ, которые используются в темновых реакциях восстановления СО2, составляющих IV стадию фотосинтеза.
IV стадия — «темновые» реакции поглощения и восстановления углекислоты. Реакции проходят с образованием углеводов, конечных продуктов фотосинтеза, в форме которых запасается солнечная энергия, поглощенная и преобразованная в «световых» реакциях фотосинтеза. Скорость «темновых» энзиматических реакций — 10"2—104 с.
Анализ рассмотренной выше принципиальной схемы фотосинтеза показывает, что весь ход фотосинтеза осуществляется при взаимодействии трех потоков — потока энергии, потока электронов и потока углерода. Сопряжение трех потоков требует четкой координации и регуляции составляющих их реакций. Исследование регуляторных механизмов фотосинтеза представляет собой физиологическое направление в исследовании этого процесса, связанное с изучением внутренних и внешних факторов, определяющих максимальную эффективность реакций отдельных стадий и общего процесса фотосинтеза на уровне целого растения.
Физико-химическая сущность процесса фотосинтеза. Фотосинтез можно определить как процесс преобразования электромагнитной энергии в энергию химических связей, сопровождающийся увеличением энергетического потенциала системы.
Все живые системы представляют собой термодинамически открытые системы, осуществляющие непрерывный обмен веществом и энергией с внешней средой. Для высших растений, водорослей и некоторых бактерий источником энергии является энергия солнечного излучения, при поглощении которой возрастают уровни свободной энергии (А/1) и обшей энергии (At/) (в послед-
ней значительную часть составляет электронная энергия) и снижается энтропия системы (T&S);
&F = kU - TbS.
Накопление энергии при фотосинтезе сопряжено с химической и электронной перестройкой участвующих в процессе компонентов.
В химическом отношении накопление энергии в процессе фотосинтеза связано с перестройкой химических связей. В соответствии с общим уравнением при фотосинтезе происходит разрыв связей в молекулах СО2 (О=С=О) и Н2О (Н—О—Н) и возникает иной тип химических связей (С—С, С—Н, СН2О):
hx
6СО2 + 6Н2О — С6Н12О6 + 6О2
Разрыв связей в молекулах СО2 и Н2О требует затраты энергии +2510,4 кДж/моль (+600 ккал/моль), в расчете на СН2О. При образовании связей (в СН2О) энергия освобождается -2037,6 кДж/моль (-487 ккал/моль) и накапливается в продуктах реакции. Следовательно, необходимо ввести дополнительные Д£ = = 472,8 кДж/моль, чтобы из прочных, но бедных энергией СО2 и Н2О образовался СН2О, или 2871,5 кДж/моль для синтеза молекулы углевода С6Н!2О6, — менее стабильного, но богатого энергией соединения. Источником дополнительной энергии служит солнечная энергия, которая и накапливается в конечных продуктах фотосинтеза.
Физический смысл фотосинтеза состоит в том, что в этом процессе происходит электронная перестройка молекул. В целом фотосинтез — окислительно- восстановительный процесс, в ходе которого электроны от воды (редокс-потенциал Н2О/О2 £м = +0,81 В) переносятся к пиридин нуклеотидам (редокс- потенциал НАДФ+/НАДФН £м = -0,32 В), где электроны находятся на более высоком энергетическом уровне. Перенос электрона идет против термодинамического потенциала и требует энергии. Разность окислительно-восстановительных потенциалов окисления воды и восстановления НАДФ+ равна 1,2 В. Следовательно, для переноса одного электрона термодинамически «вверх» (против термодинамического потенциала) необходимо затратить 1,2 эВ энергии. В итоге электронной перестройки компонентов и образования восстановленных соединений (НАДФН) накапливаются электроны с высоким энергетическим потенциалом. Таким образом, в световых реакциях фотосинтеза при поглощении энергии фотонов создается мощный восходящий поток электронов против градиента термодинамического потенциала. В результате создается большой фонд богатых энергией электронов с запасом энергии 1,5 — 2 эВ. Эта редокс-
-0,32 В-0,32 ВНАДФН (е*)НАДФН (е*)Конструктивный обменКонструктивный обмене"е"+0,81 В+0,81 ВН2ОН2ОФоторегуляцияФоторегуляцияЭнергетическийЭнергетическийСО2 no2 SO3"СО2 no2 SO3"УглеводыNH3H2SУглеводыNH3H2Sобмен Тиоредоксин —- Активация ферментов /углеродных цикловАктивация CFj и др.обмен Тиоредоксин —- Активация ферментов /углеродных цикловАктивация CFj и др.
-0,32 В
-0,32 В
НАДФН (е*)
НАДФН (е*)
Конструктивный обмен
Конструктивный обмен
е"
е"
+0,81 В
+0,81 В
Н2О
Н2О
Фоторегуляция
Фоторегуляция
Энергетический
Энергетический
СО2 no2 SO3"
СО2 no2 SO3"
Углеводы
NH3
H2S
Углеводы
NH3
H2S
обмен Тиоредоксин —- Активация ферментов /углеродных циклов
Активация CFj и др.
обмен Тиоредоксин —- Активация ферментов /углеродных циклов
Активация CFj и др.
Рис. 3.1. Использование в метаболизме клетки энергетического и восстановительногопотенциалов, возникающих в фотохимических реакциях
энергия в процессах фотосинтетического и окислительного фосфорилирования преобразуется в другие виды химической энергии (электрохимический потенциал, энергия фосфатных связей АТФ). Соединения, образующиеся в результате работы ЭТЦ, имеют высокий восстановительный потенциал (-0,43 В, -0,6 В). Создание мощного восстановительного потенциала в фотосинтезе имеет решающее значение для осуществления важнейших метаболических процессов и, прежде всего, для восстановления СО2. Образующийся восстановительный потенциал используется также для восстановления NO2, SO3 и ряда соединений, участвующих в регуляции ферментов углеродного цикла (рис. 3.1).
Таким образом, главное значение фотосинтеза состоит в генерации электронов с высоким энергетическим и восстановительным потенциалом. Фотосинтез находится в центре энергетического и конструктивного обмена и тесно связан со всеми физиологическими функциями растительного организма.
ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ ПРЕДСТАВЛЕНИЙО МЕХАНИЗМЕ ФОТОСИНТЕЗА
Фотосинтез как физиологический процесс был открыт в 1771 г. английским ученым Джозефом Пристли. Вся 230-летняя история изучения фотосинтеза — это большая цепь научных исследований, в ходе которых были определены основные контуры этого сложнейшего процесса и изучены реакции, составляющие его физико-химическую основу. Можно выделить ряд периодов, которые отражают главные ступени в познании механизма фотосинтеза.
Период 1771—1850 гг. включает работы Дж. Пристли, Я. Ингенхауза, Ж. Се- небье, Н.Соссюра, в которых были установлены основные закономерности газообмена, зависимость фотосинтеза от интенсивности света, концентрации углекислоты, содержания воды, т.е. был заложен фундамент учения о воздушном питании растений.
Период 1850—1900 гг. характеризуется работами в области энергетики фотосинтеза, утверждается понимание фотосинтеза как процесса фиксации солнечной энергии. Основная идея была высказана Робертом Майером в 1842 г. и получила дальнейшее развитие в работах по изучению роли в фотосинтезе отдельных участков спектра. Эта идея была экспериментально подтверждена блестящими опытами К.А.Тимирязева (1867—1904), в которых была установлена прямая связь между энергетической характеристикой отдельных лучей электромагнитного спектра, активностью поглощения их пигментами и интенсивностью фотосинтеза. В дальнейших работах этого периода была определена доля энергии, усваиваемой растениями в процессе фотосинтеза от всего количества падающей и поглощенной листом энергии (Ф.Н. Крашенинников, 1912—1915; К.А. Пу- риевич, 1913). В связи с общим интересом к процессам поглощения энергии проводятся глубокие исследования химии пигментов (М. Ненцкий, 1902; М. С. Цвет, 1906; Р. Вильштеттер, А. Штоль, 1913; Г. Фишер, 1939), которые завершились в 1940 г. расшифровкой химической структуры молекулы хлорофилла а.
Период 1900—1940 гг. — время расцвета физиологических исследований фотосинтеза. В эти годы впервые экспериментально обосновано представление о включении в фотосинтез двух различных по природе реакций — световых фотохимических и темновых энзиматических реакций, составляющих две основные
стадии фотосинтеза и протекающих с разной скоростью: световая — 10"5 с, темновая — 10-2 с (Ф. Блэкман, 1905; А.А. Рихтер, 1914; О. Варбург, 1920). Работы В.Н.Любименко (1921) по определению ассимиляционного числа (СО2/Хл) и опыты Р. Эмерсона и А. Арнольда (1932, 1943) с прерывистым светом легли в основу современной концепции о «фотосинтетической единице» (ФСБ) и двух фотосистемах. Изучение природы фотохимических реакций привело к утверждению фундаментального положения современного фотосинтеза о том, что кислород, образующийся в процессе фотосинтеза, освобождается в реакциях фотоокисления воды (К.Ван-Ниль, 1931; С. Рубен и М. Камен, 1939; АП.Виноградов и Р.В.Тейс, 1941; Р.Хилл, 1951). К этому периоду относятся исследования С. П. Костычева с corp. (1930), Л.А. Иванова (1946), В. А. Бриллиант (1949), Е. Р.Гюббенет (1951) и др., в которых были установлены основные физиологические закономерности зависимости фотосинтеза от внутренних и внешних факторов, а также от уровня жизнедеятельности растения.
Период 1940—1950 гг. можно назвать временем расцвета биохимических исследований фотосинтеза. Изучение химизма темновых реакций в серии работ лаборатории М. Кальвина с использованием метода меченых атомов (14С) завершилось в 1956 г. открытием восстановительного пентозофосфатного цикла превращения углерода, известного в настоящее время как «цикл Кальвина». В этот период активно изучаются ферментные системы хлоропластов, выделяются различные коферменты и другие физиологически активные группы соединений. В работах Р. Хилла (1951), связанных с изучением геминовых соединений, в хлоропластах были обнаружены цитохромы Z>6 и /, что имело большое значение для современных представлений о функционировании цитохромного комплекса в ЭТЦ.
Период 1950—1960 гг. отмечен бурным развитием исследований различных сторон проблемы фотосинтеза. Работы Д. Арнона показали, что хлоропласт содержит все каталитические системы, необходимые для транспорта электронов с выделением кислорода из воды, синтеза восстановленных соединений (НАДФН) и АТФ в процессе фотофосфорилирования, восстановления СО2. В 1954 г. в лаборатории Д. Арнона было открыто циклическое, а в 1957 г. — нециклическое фотофосфорилирование и была сформулирована «теория электронного потока». В этот период интенсивно развиваются фотохимические и физические исследования в области фотосинтеза. Основные положения фотохимии пигментов, механизма их окислительно-восстановительных превращений, процессов миграции энергии представляют собой итог большой серии работ А. Н. Теренина, А. А. Красновского, В. Б. Евстигнеева и др. Работы Л. Дюй- зенса (1951) по изучению флуоресценции хлорофилла позволили исследовать механизмы энергетического взаимодействия молекул пигментов в возбужденном состоянии и миграции энергии в биологических системах. Это послужило основой современных представлений о процессах миграции энергии от пигментов антенного комплекса в реакционный центр.
Большое значение для дальнейшего развития исследований в области фотосинтеза имели проведенные в этот период работы Р. Эмерсона с сотр. (1942— 1957) по изучению спектра действия фотосинтеза. Были открыты два феномена: «эффект красного падения» — резкое снижение квантового выхода фотосинтеза при освещении хлоропластов дальним красным светом (680 — 700 нм) и «эффект усиления Эмерсона» — значительное усиление фотосинтеза при до-
бавлении коротковолнового света (650 нм). В 1961 г. ряд авторов сформулировали представление о функционировании двух фотореакций в фотосинтезе (Р.Хилл, Ф.Бендалл, 1960; Л.Дюйзенс, 1961; Б.Кок, Г.Хох, 1961; Х.Т.Витт с сотр., 1961), что легло в основу современной двухквантовой Z-схемы фотосинтеза. В рамках этих представлений в настоящее время проводятся детальные исследования физических, химических и функциональных особенностей фотосистемы I (ФС1) и фотосистемы II (ФСП), структурной организации их реакционных центров.
Современный период характеризуется комплексным подходом к изучению процесса фотосинтеза. Исследования на молекулярном уровне позволили выяснить основные принципы организации и функционирования фотосинтетического аппарата, физический и биохимический механизмы его световых и темновых стадий. Получены новые данные о функциональной организации пигментов. Выделены и изучены светособирающие комплексы ФС1 и ФСП, раскрыт принципиальный механизм распределения энергии между ними. Сформулированы представления о функционировании ЭТЦ как взаимодействии трех функциональных комплексов — ФС1, ФСП, цитохром ^/-комплекса, изучены механизмы их работы, структурная организация и локализация в мембранах стромальных и гранальных тилакоидов. Исследованы молекулярная организация реакционных центров и механизмы преобразования энергии. Большой прогресс в последние годы достигнут в исследовании фотоэнергетиче- ских реакций фотосинтеза. На основе хемиосмотической теории П. Митчелла (1961) и конформационной теории П. Бойера (1977) разработаны новые представления о молекулярной организации АТФ-синтазного комплекса и механизма синтеза АТФ в каталитических центрах АТФ-синтазы.
Таким образом, анализ истории более чем 230-летнего периода изучения фотосинтеза позволяет проследить логику развития научной мысли и установить главные направления в развитии научных идей, которые завершились в настоящее время построением достаточно стройной общей теории фотосинтеза.
СТРУКТУРНАЯ И БИОХИМИЧЕСКАЯ ОРГАНИЗАЦИЯФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА
Фотосинтетический аппарат растения — сложно организованная система, обеспечивающая поглощение света и преобразование его энергии в энергию химических связей. Структурно-функциональная организация фотосинтетического аппарата может быть рассмотрена на двух уровнях:
на уровне листа как органа фотосинтеза в растении;
на уровне хлоропласта — клеточной органеллы, где сосредоточены все структуры, обеспечивающие фотосинтез.
ЛИСТ — СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЙ ОРГАН ФОТОСИНТЕЗАВ РАСТЕНИИ
Лист как орган растения, приспособленный к фотосинтезу, сформировался в результате длительного эволюционного процесса. Он представляет собой эф-
Рис. 3.2. Спектры отражения и пропускания листа шпината (по Merzlyak et al., 2002). Заштрихованная область соответствует величине поглощения листаРис. 3.2. Спектры отражения и пропускания листа шпината (по Merzlyak et al., 2002). Заштрихованная область соответствует величине поглощения листа
Рис. 3.2. Спектры отражения и пропускания листа шпината (по Merzlyak et al., 2002). Заштрихованная область соответствует величине поглощения листа
Рис. 3.2. Спектры отражения и пропускания листа шпината (по Merzlyak et al., 2002). Заштрихованная область соответствует величине поглощения листа
фективную систему для поглощения и преобразования энергии света в ходе фотосинтеза. Структура листа обеспечивает наиболее полное поглощение квантов света, поступление углекислого газа из атмосферы к хлоропластам, а также возможность оттока ассимилятов из автотрофных клеток. Организация фотосинтетического аппарата на уровне листа может быть охарактеризована на основе анализа его мезоструктуры. Понятие «мезоструктура» предложено А. Т Мокроносовым в 1975 г. Оно охватывает целый ряд морфофизиологиических характеристик листа, позволяющих оценить ассимиляционную способность листа в целом. Основными показателями мезоструктуры листа являются: площадь листа, число клеток хлоренхимы на единицу площади листа, число хлоропластов в клетке и их объем, площадь поверхности хлоропластов, а также содержание хлорофилла в расчете на единицу площади листа, содержание ферментов углеродного цикла фотосинтеза в листе и их активность, общая интенсивность фотосинтеза. Показатели мезоструктуры листа могут значительно варьировать в зависимости от внешних факторов среды, а также от физиологического состояния растений.
Лист представляет собой уникальную оптическую систему — ловушку для света. Как видно из рис. 3.2, лист поглощает значительную часть излучения в видимой области спектра (400—700 нм). Большую часть синего и красного света поглощают пигменты хлоропластов первых слоев клеток хлоренхимы. Свет, не поглощенный в верхних слоях листа, обогащен лучами зеленой области спектра. Его многократное отражение от стенок мезофильных клеток в толще листа значительно увеличивает оптический путь и повышает вероятность поглощения лучей
этой области спектра, несмотря на то что коэффициент поглощения хлорофилла в зеленой области значительно меньше, чем в синей и красной.
Структура листа обеспечивает поступление углекислого газа из воздуха для реакций фотосинтетической ассимиляции углерода. Газообмен мезофилла листа с окружающим воздухом осуществляется через устьица. Количество устьиц, их свойства (величина устьичной щели, устьичное сопротивление и др.) являются важными факторами регуляции фотосинтеза. Значительный объем подустьичного пространства, а также достаточно рыхлое расположение мезофильных клеток в листе и существование больших межклетников в ткани хлоренхимы позволяют создать большие воздушные запасы в толще листа для непрерывного снабжения углекислым газом углеродных циклов фотосинтеза.
Лист — донор ассимилятов в растении. Отток органических веществ,
образовавшихся в процессе фотосинтеза, происходит по клеткам сосудистых пучков флоэмы. Транспорт ассимилятов из автотрофных клеток предполагает вынос сахарозы (основного транспортного соединения фотосинтеза) из автотрофной клетки в апопласт и последующую загрузку флоэмы листа. Основные закономерности донорно-акцепторных взаимодействий листа и аттрагируюших центров растения рассмотрены в подразд. 3.10.
ХЛОРОПЛАСТЫ — ЦЕНТРЫ ФОТОСИНТЕЗА КЛЕТОК РАСТЕНИЙ
Фотосинтез в растительной клетке осуществляется специализированными органеллами — хлоропластами. От других типов пластид хлоропласты отличаются наличием зеленых пигментов хлорофиллов и сложно организованной системой внутренних мембран. Хлорофилл обеспечивает поглощение и первичное преобразование энергии света при фотосинтезе, а высокая степень организации внутренних мембранных структур хлоропластов составляет физическую основу для эффективного поглощения и преобразования энергии света в ходе фотосинтеза. Благодаря высокой степени организации внутренней мембранной структуры хлоропластов достигаются условия, необходимые для преобразования энергии:
определенная ориентация пигментов в мембране, обеспечивающая эффективное поглощение и преобразование энергии света;
пространственное разделение восстановленных и окисленных фотопродуктов, возникающих в результате первичных актов фотосинтеза, связанных с разделением зарядов в реакционном центре;
строгая упорядоченность компонентов реакционного центра, где сопряжены быстропротекающие (10-15—10“9 с) фотофизические и более медленные (КГ4—10“2 с) ферментативные реакции; наличие определенных структур, где фотовозбужденный пигмент и химический акцептор жестко ориентированы относительно друг друга (необходимо для преобразования энергии в реакционных центрах);
пространственная организация электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) хлоропластов, основанная на определенной последовательности и строгой ориентации переносчиков в мембране (необходима для быстрого и регулируемого транспорта электронов и протонов);
определенным образом организованная система мембран в хлоропластах, обеспечивающая сопряжение транспорта электронов и синтеза АТФ.
Основные принципы структурной организациихлоропластов
Основные элементы структурной организации хлоропластов у высших растений представлены на рис. 3.3, где можно видеть внешнюю оболочку, строму и хорошо развитую систему внутренних мембран.
Внешняя оболочка хлоропластов отграничивает его внутреннее содержимое от цитоплазмы. Это барьер, осуществляющий контроль обмена веществ между хлоропластом и цитоплазмой. Оболочка состоит из двух мембран — наружной и внутренней. Наружная мембрана проницаема для большинства органических
1134 234 2AAООТорцевые мембраныТорцевые мембраныЛюменЛюменМембраны стромыМембраны стромыФотосистема IФотосистема IФотосистема IIФотосистема IIАТФ-синтазаАТФ-синтазаГранаГранаСпаренные мембраныСпаренные мембраныМаргинальные мембраныМаргинальные мембраныЦитохром Z>e/-комплексЦитохром Z>e/-комплексРис. 3.3. Внутренняя структура хлоропластов:Рис. 3.3. Внутренняя структура хлоропластов:
1
1
34 2
34 2
A
A
О
О
Торцевые мембраны
Торцевые мембраны
Люмен
Люмен
Мембраны стромы
Мембраны стромы
Фотосистема I
Фотосистема I
Фотосистема II
Фотосистема II
АТФ-синтаза
АТФ-синтаза
Грана
Грана
Спаренные мембраны
Спаренные мембраны
Маргинальные мембраны
Маргинальные мембраны
Цитохром Z>e/-комплекс
Цитохром Z>e/-комплекс
Рис. 3.3. Внутренняя структура хлоропластов:
Рис. 3.3. Внутренняя структура хлоропластов:
А — электронная фотография хлоропласта." 1 — оболочка хлоропласта; 2 — граны, состоящие из стопок тилакоидов гран; 3 — тилакоиды стромы; 4 — строма; Б — схема организации тилакоидов гран и стромы; В — трехмерная модель организации тилакоидов в хлоропластах высших растений
и неорганических молекул. Вместе с тем она содержит специальные транслокаторы белков, через которые поступают пептиды из цитоплазмы в хлоропласт. Внутренняя мембрана оболочки хлоропластов обладает избирательной проницаемостью и осуществляет контроль над транспортом белков, липидов, органических кислот и углеводов между хлоропластом и цитоплазмой. Внутренняя мембрана оболочки участвует также в формировании внутренней мембранной системы хлоропластов.
Строма — гидрофильный, слабоструктурированный матрикс хлоропластов, содержащий водорастворимые органические соединения, а также неорганические ионы. В строме располагаются ферменты углеродного цикла фотосинтеза, здесь осуществляются реакции фотосинтетической ассимиляции углерода. Кроме того, строма содержит ферменты синтеза фотосинтетических пигментов, а также полярных липидов мембран хлоропластов. В строме находятся кольцевая ДНК (может быть несколько одинаковых копий), рибосомы, ферменты матричного синтеза, обеспечивающие синтез белков, входящих в состав мультипептидных комплексов мембран тилакоидов, а также водорастворимого белка — большой субъединицы рибулозо-бисфосфаткарбоксилазы-ок- сигеназы — ключевого фермента углеродного цикла фотосинтеза.
Внутренняя мембранная система хлоропластов — здесь протекают световые реакции фотосинтеза. Она хорошо развита и неоднородна. На фотографиях зрелого хлоропласта видно (рис. 3.3, А), что внутренние мембраны (ламеллы), занимают большую часть общего объема хлоропластов. Мембраны образуют тилакоиды, которые либо тесно соприкасаются друг с другом и уложены в стопки, или граны (тилакоиды гран), либо пронизывают строму, соединяя граны между собой (тилакоиды стромы). Соответственно образующие их мембраны называют мембранами (ламеллами) гран и мембранами (ламеллами) стромы. Пространство внутри тилакоидов называется внутритилакоидным пространством, или люменом (рис. 3.3, Б).
Трехмерная модель структурной организации тилакоидов представлена на рис. 3.3, В. Согласно современным представлениям, при образовании гран внутренняя мембрана образует не замкнутые «мешочки», а, скорее, наслоения, складки. В результате внутри хлоропласта возникает единая внутренняя мембрана, которая разделяет внутреннее пространство хлоропластов на два отсека (ком- партмента) — строму и люмен. Интеграция внутреннего пространства тилакоидов гран и стромы достигается за счет того, что тилакоиды гран пронизаны одной или несколькими тилакоидами стромы. Тилакоиды стромы могут быть сильно перфорированы, в результате чего образуются узкие или широкие мембранные каналы, называемые фретами, которые связывают граны между собой.
Значение столь сложной организации внутренних мембран хлоропластов состоит в следующем.
Внутренние мембраны хлоропластов включают мультипептидные комплексы, обеспечивающие поглощение и преобразование энергии света в ходе световых реакций фотосинтеза. Благодаря значительному мембранному пространству достигается увеличение числа функциональных единиц, способных осуществлять световые реакции фотосинтеза.
Единство внутренней мембранной системы хлоропластов позволяет отдельным компонентам мембраны мигрировать латералъно и вступать между собой в структурный и функциональный контакт. Это необходимо для переноса
энергии квантов света в реакционные центры, а также для транспорта электронов по электрон-транспортной цепи в ходе световых реакций фотосинтеза.
Разделение мембраной всего внутреннего пространства хлоропластов на два компартмента — стромальное и внутритилакоидное пространство (люмен) — позволяет создавать электрохимические градиенты ионов между ними. Создание электрохимического градиента Н+ на внутренних мембранах хлоропластов — важный этап в трансформации энергии квантов света в энергию макро- эргических связей АТФ.
Образование гранальной структуры внутри хлоропластов значительно повышает общую эффективность фотосинтеза и создает дополнительные возможности для регуляции световых реакций. Сегрегация (разделение) в отдельных отсеках мембраны (в стромальных или гранальных тилакоидах) компонентов мембран с различными функциями позволяет добиться определенной независимости их функционирования. Гранальная структура хлоропластов высших растений — итог длительного эволюционного процесса. Она впервые появилась у зеленых водорослей (эвгленовых), что было сопряжено с появлением у них хлорофилла Ь.
Химический состав и физические свойстватилакоидных мембран
Общий принцип организации тилакоидных мембран хлоропластов подобен структуре любой другой мембраны клетки: основу мембраны составляет били- пидный слой, в который погружены в большей или меньшей степени отдельные белки и белковые комплексы. Вместе с тем существует определенная специфика липидного и белкового состава, а также особое распределение компонентов в мембранной системе хлоропластов. Это позволяет мембранам осуществлять уникальные энергопреобразующие реакции фотосинтеза и регулировать их в соответствии с меняющимися внешними условиями.
Химический анализ внутренних мембран хлоропластов показывает, что они включают липиды, белки и углеводы. Соотношение липидов и белков по весу близко к отношению 1:1. С учетом того, что молекулярная масса липидов меньше молекулярной массы белков, считают, что в среднем на 1 молекулу белка приходится около 500 молекул липидов. Углеводы главным образом входят в состав липидов (галактолипидов).
Липидный состав мембран тилакоидов (рис. 3.4). В мембранах хлоропластов найдены две группы липидов: циклические и нециклические.
Циклические липиды составляют около 65 % липидов мембран хлоропластов. К ним относятся хлорофиллы и каротиноиды — фотосинтетические пигменты хлоропластов, а также хиноны — пластохиноны и филлохиноны (витамин Kt). Эти соединения непосредственно участвуют в реакциях фотосинтеза. Кроме того, в мембранах хлоропластов в больших количествах присутствует а-токоферол, который повышает структурированность мембран и их устойчивость к свободнорадикальным процессам (их вероятность в хлоропластах на свету велика — см. ниже).
Нециклические липиды в мембранах хлоропластов представлены галактолипидами {нейтральными липидами), фосфолипидами и сулъфолипидами. Они фор-
ноноО-СН2HCO-CO-R1О-СН2HCO-CO-R1ДигалактозилдиглицеридДигалактозилдиглицерид0Н Н2СО—СО—R20Н Н2СО—СО—R2НОНОСГСГо-сн2HCO-CO-R1 0Н Н2СО—СО—R2о-сн2HCO-CO-R1 0Н Н2СО—СО—R2Н2СО-Р-О-СН2Н2СО-Р-О-СН2НО-СН ОНО-СН ОHCO-CO-R1HCO-CO-R1н2с-онн2с-онН2СО—СО—R2Н2СО—СО—R2ФосфатидилглицеринФосфатидилглицеринСульфохиновозилдиглицеридСульфохиновозилдиглицерида-Токоферилхинона-ТокоферилхинонРис. 3.4. Структурные формулы липидов мембран хлоропластовРис. 3.4. Структурные формулы липидов мембран хлоропластов
но
но
О-СН2
HCO-CO-R1
О-СН2
HCO-CO-R1
Дигалактозилдиглицерид
Дигалактозилдиглицерид
0Н Н2СО—СО—R2
0Н Н2СО—СО—R2
НО
НО
СГ
СГ
о-сн2
HCO-CO-R1 0Н Н2СО—СО—R2
о-сн2
HCO-CO-R1 0Н Н2СО—СО—R2
Н2СО-Р-О-СН2
Н2СО-Р-О-СН2
НО-СН О
НО-СН О
HCO-CO-R1
HCO-CO-R1
н2с-он
н2с-он
Н2СО—СО—R2
Н2СО—СО—R2
Фосфатидилглицерин
Фосфатидилглицерин
Сульфохиновозилдиглицерид
Сульфохиновозилдиглицерид
а-Токоферилхинон
а-Токоферилхинон
Рис. 3.4. Структурные формулы липидов мембран хлоропластов
Рис. 3.4. Структурные формулы липидов мембран хлоропластов
мируют липидный матрикс и участвуют в структурной организации мембран. Особенностью мембран хлоропластов является высокое содержание в них галактолипидов, в отличие от других мембран клетки, где преобладают фосфолипиды. В мембранах тилакоидов хлоропластов галактолипиды составляют до 75 % всех липидов мембран. Галактолипиды содержат один или два остатка углевода, в соответствии с чем выделяют моногалактолипиды (моногалакто- зилдиацилглицеролы — МГДГ) и дигалактолипиды (дигалактозилдиацилгли- церолы — ДГДГ). Галактолипиды не формируют истинный бислой, однако их
присутствие важно для образования изгибов мембран и формирования тилакоидов. Кроме того, клиновидная форма молекул галактолипидов способствует встраиванию белков в липидный слой мембраны.
Фосфолипиды и сульфолипиды — анионные липиды, несущие отрицательный заряд при физиологических условиях pH. Основным представителем фосфолипидов в мембранах хлоропластов является фосфатидилглицерол (11 % от общего содержания в них липидов). В фосфатидилглицерол мембран хлоропластов входит специфичная для хлоропластов жирная кислота — транс-гексадеценовая (транс-С^: i)- Ее присутствие необходимо для сборки светособирающих комплексов хлоропластов. Сульфолипиды (сульфохиновозилдиацилглицеролы), содержащие серу полярные липиды, найдены только у растений. Они составляют около 10 % от общего содержания липидов мембран. Липиды этой группы определяют поверхностный заряд мембран, а также влияют на функциональную активность белковых комплексов тилакоидных мембран.
Жирнокислотный состав липидов внутренних мембран хлоропластов также уникален. Он характеризуется высоким процентным содержанием ненасыщенных жирных кислот — линолевой (С^^) и линоленовой (С18:з). Обогащенность липидов ненасыщенными жирными кислотами приводит к сдвигу температуры фазового перехода мембран тилакоидов в область более низких температур по сравнению с другими мембранами клетки. Кроме того, большое содержание ненасыщенных жирных кислот определяет высокую текучесть внутренних мембран тилакоидов и способствует латеральной, ротационной и трансмембранной диффузии компонентов мембран, наблюдаемой в ходе световых реакций фотосинтеза. Вместе с тем ненасыщенные жирные кислоты подвержены перекисному окислению, что в условиях образования активных форм кислорода в хлоропластах становится чрезвычайным фактором риска повреждения мембран.
Белковые компоненты тилакоидных мембран. В мембранах хлоропластов насчитывают более 60 различных белков. Большая их часть — интегральные белки мультипептидных комплексов, осуществляющие процессы поглощения и трансформации энергии при фотосинтезе. Другая часть белков располагается на поверхности тилакоидных мембран либо со стороны стромы, либо со стороны люмена. Поверхностные белки входят в периферические домены мультипептидных комплексов. Ряд поверхностных белков являются самостоятельными компонентами мембран.
Пять основных полипептидных комплексов встроены во внутренние мембраны хлоропластов (рис. 3.5): комплекс фотосистемы 1(ФС1), комплекс фотосистемы II (ФСП), светособирающий комплекс II (ССКП), цитохромный Ь6ф-комплекс и АТФ-синтаза (CF0— СРГкомплекс). Комплексы ФС1, ФСП и ССКП содержат пигменты (хлорофиллы, каротиноиды), большинство которых функционируют как пигменты-антенны, собирающие энергию для пигментов реакционных центров ФС1 и ФСП. Комплексы ФС1 и ФСП, а также цитохромный Ьбрктл- плекс имеют в своем составе редокс-кофакторы и участвуют в фотосинтетическом транспорте электронов. Белки этих комплексов отличаются высоким содержанием гидрофобных аминокислот, что обеспечивает их встраивание в мембрану. АТФ-синтаза (CF0—CFr комплекс) осуществляет синтез АТФ.
Кроме крупных полипептидных комплексов в мембранах тилакоидов имеются небольшие белковые компоненты — пластоцианин, ферредоксин и ферре-
Рис. 3.5. Схема организации основных функциональных комплексов в мембране тилакоидов (по Stachelin, van der Staay, 1996, с изменениями):
ФС1 — фотосистема I; ФСП — фотосистема И; CCKI — светособирающий комплекс I; CCKII — светособирающий комплекс II (мобильная антенна); CF0 — сопрягающий фактор 0; Ср! — сопрягающий фактор 1
доксин-НАДФ-оксидоредуктаза, расположенные на поверхности мембран. Они входят в электрон-транспортную систему фотосинтеза.
Вода и неорганические ионы. Вода играет структурную роль, участвуя в формировании функционально активной конформации белковых компонентов мембран, стабилизирует мембраны, непосредственно участвует в процессах фотосинтеза. Неорганические ионы (в первую очередь одно- и двухвалентные катионы — К+, Na+, Са , Mg +) определяют общий поверхностный заряд мембран и возможность взаимодействия отдельных мембран друг с другом. Они контролируют образование гран в хлоропласте. Ионы важны также для сборки комплексов белков в мембране и создания определенной функционально активной конформации.
Ультраструктура внутренних мембран хлоропластов. Расположение отдельных белковых комплексов в мембране и их ориентировочные размеры, установленные с использованием техники замораживания, скалывания и травления мембран и электронной микроскопии, представлены на рис. 3.5.
Отдельные компоненты мембран занимают положение, строго детерминированное их физико-химическими свойствами. Гидрофобные аминокислоты в белках комплексов позволяют им встраиваться в билипидный слой мембран. Гидрофильные участки этих белков, напротив, выталкиваются из гидрофобного слоя мембран и занимают поверхностное положение. В результате гидрофобных, гидрофильных, а также электростатических взаимодействий на поверхности мембран пептиды определенным образом ориентированы относительно друг друга в комплексах и относительно поверхности мембраны. Электростатические взаимодействия между отдельными пептидами направляют и регулируют сборку полипептидных комплексов мембран хлоропластов. С электростатическими и отчасти ковалентными взаимодействиями белков и кофакторов (пигментов, редокс-агентов) связано формирование активных функциональных центров в этих комплексах.
Асимметрия мембран. Различают трансмембранную и латеральную асимметрию (гетерогенность) внутренних мембран хлоропластов.
Трансмембранная асимметрия выражается в неоднородности химического состава и структуры внешнего и внутреннего слоя (лепестка) билипидной мембраны. Мультипептидные комплексы определенным образом ориентированы в мембране, причем существует достаточно высокая консервативность в расположении отдельных субъединиц и связанных с ними кофакторов относительно наружной и внутренней поверхностей мембраны. Первичные и вторичные доноры электронов в ФС1 и ФСП всегда расположены в доменах, приближенных к люменальной части комплексов, а акцепторы электронов — в доменах, обращенных к строме. Поверхностные белки мембран также всегда располагаются на определенной стороне мембраны (пластоциа- нин — со стороны люмена, ферредоксин и ферредоксин-НАДФ-оксидоре- дуктаза — с наружной, стромальной, стороны). Неравномерно также распределение липидных компонентов в мембране: с внешним липидным слоем (лепестком) бислоя ассоциированы около 60 % всех галактолипидов и около 70 % фосфатидилглицерола, тогда как сульфохиновозилглицерол сосредоточен главным образом во внутреннем слое мембраны. Трансмембранная асимметрия внутренних мембран хлоропластов чрезвычайно важна для осуществления первичных реакций фотосинтеза, связанных с первичным разделением зарядов на мембране, а также для последующих процессов транспорта электронов и протонов, сопряженных с реакциями трансформации энергии при фотосинтезе.
Латеральная асимметрия {гетерогенность) состоит в том, что мембраны тилакоидов гран и стромы существенно различаются по химическому составу, структуре и функциям. Гранальные мембраны также различаются в зависимости от расположения в гране: мембраны торцевых {концевых) областей, боковых {маргинальных) областей и внутригранальные мембраны, тесно контактирующие друг с другом {спаренные) (см. рис. 3.3, Б).
Фотосистема I находится в стромальных тилакоидах (32 %), а также в маргинальных (36 %) и торцевых (32 %) областях гран. Фотосистема II в основном локализована в гранах, в области тесного контакта — «стэкинга» (85 %). Цитохромный комплекс распределен между стромальными и гранальными тилакоидами относительно равномерно. АТФ-синтазный комплекс располагается главным образом в мембранах стромальных тилакоидов, а также в маргинальных и торцевых мембранах гран. Такое неоднородное распределение комплексов во внутренней мембране создает структурную основу для функциональной гетерогенности разных областей внутренней мембранной структуры и обеспечивает возможность регуляции фотосинтетических процессов на уровне мембраны. В зависимости от условий освещения распределение компонентов мембран может меняться.
БИОГЕНЕЗ ХЛОРОПЛАСТОВ
Основные этапы образования хлоропластов. Предшественники хлоропластов — пропластиды (см. гл. 1). Пропластиды образуются из инициальных частиц {зачатков), содержащихся в меристематических клетках. Их образование связано с разрастанием внутренней мембраны оболочки и образованием из нее нескольких складок, направленных внутрь параллельно поверхности.
Рис. 3.6. Биогенез хлоропластов (по Mohr, Sitte, 1971, с изменениями). Пояснения см. в тексте
Формирование хлоропласта может осуществляться двумя путями: непосредственно из пропластид и опосредованно, через образование этиопластов. Последовательность преобразования этих органелл в зрелый хлоропласт представлена на рис. 3.6.
Первый путь биогенеза хлоропластов — непосредственное преобразование пропластид в хлоропласты — реализуется при росте растений в условиях нормального соотношения дня и ночи. Пропластиды меристематических клеток листа превращаются в хлоропласты параллельно с ростом и дифференцировкой клеток листа. Биогенез хлоропластов сопровождается формированием тилакоидных мембран хлоропластов при участии внутренней мембраны оболочки пропластиды.
Второй путь — образование хлоропластов из этиопластов. Этиопласты — органеллы клеток растения, растущего в отсутствие света (этиолированного растения). Они образуются из пропластид и имеют некоторые особенности внутреннего строения: содержат проламелярное тело, сформированное в результате скопления ограниченных мембраной пузырьков и разветвленных трубчатых структур. Мембраны проламелярного тела содержат небольшие количества каротиноидов и предшественника хлорофилла — протохлорофиллида. Формиро-
вание тилакоидных мембран хлоропластов в этиопластах происходит при участии мембран проламелярного тела в ответ на освещение.
Таким образом, формирование хлоропласта непосредственно из пропластиды или опосредованно, из пропластиды через этиопласт происходит только на свету.
Выделяют три этапа фотоморфогенеза хлоропластов из этиопластов.
На первом этапе из трубчатых элементов проламелярных тел образуются крупные пузырьки, располагающиеся по радиусу. Этот процесс сопровождается образованием хлорофилла из имеющегося в этиопластах протохлорофиллида.
На втором этапе происходит накопление белков, липидов, пигментов и самосборка мембран тилакоидов. Свет активирует синтез белков внутренних мембран хлоропластов и фотосинтетических пигментов. Самосборка мембран идет на основе белковых компонетов, синтезируемых как в хлоропластах, так и в цитозоле, при скоординированной работе их белоксинтезирующих систем и транспорте белковых компонентов из цитоплазмы в хлоропласт. В основе самосборки мембран лежат физико-химические процессы (гидрофобные и электростатические взаимодействия), а также «молекулярное узнавание», обусловленное конформационными взаимодействиями.
На третьем этапе происходит дифференциация гран. Эта стадия совпадает с интенсивным синтезом хлорофилла. Для формирования гран необходим высокий уровень содержания хлорофиллов в хлоропластах, при этом особенно важна концентрация хлорофилла Ь. Хлорофилл b входит главным образом в состав ССКП — антенного комплекса ФСП. Сборка ССКП в мембранах определяет возможность образования гран в хлоропластах.
Белки ССКП, связывающие хлорофилл Ь, кодируются генами ядра, их экспрессия регулируется светом.
Регуляция биогенеза хлоропластов. Биогенез хлоропластов подвергается контролю и регуляции со стороны внешних и внутренних факторов. Выделяют световую (фоторегуляция), гормональную и генетическую регуляции.
Фоторегуляция связана с активацией светом синтеза пигментов и белков, входящих в светособирающие комплексы. Контроль синтеза фотосинтетических пигментов (хлорофиллов и каротиноидов) основан на регуляции светом активности осуществляющих его ферментов (подробнее см. подразд. 3.3). Фоторегуляция синтеза белков хлоропластов осуществляется на генетическом уровне. В регуляции биогенеза хлоропластов участвуют сигнальные фоторецепторные системы — фитохромная система и рецепторы синего света (см. гл. 7).
Гормональная регуляция связана с влиянием на синтез пигментов и белков хлоропластов ряда фитогормонов. Так, цитокинины, активируя синтез хлорофиллов и апобелка ССКП, способствуют формированию структуры хлоропласта. Этилен, напротив, ингибирует развитие листьев и дифференцировку хлоропластов в этиолированных проростках (подробнее о влиянии гормонов на фотосинтетический аппарат растений см. в гл. 7).
Генетическая регуляция включает контроль биогенеза хлоропластов на всех уровнях реализации генетической информации, включая транскрипцию, трансляцию, процессинг, транспорт белков, сборку мультипептидных комплексов. Обнаружена регуляция экспрессии ряда генов ядерной ДНК, обслуживающих хлоропласт светом, гормонами, продуктами фотосинтеза.
3.3. ПИГМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХОРГАНИЗМОВ
ПИГМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ КАК ПЕРВИЧНЫЕ ФОТОРЕЦЕПТОРЫ
Фоторецепторная система фотосинтеза строится на основе двух важнейших типов химических соединений: 1) тетрапирролов, образующих циклическую структуру хлорофиллов (магнийпорфиринов), а также открытую структуру пигментов фикобилинов; 2) полиизопреноидов, образующих большой и разнообразный класс пигментов каротиноидов.
В каждой из этих групп пигментов путем модификации основной структуры образуется несколько химически различных структур, имеющих максимумы поглощения в разных частях видимой области электромагнитного спектра. Известно 10 различных структурных форм хлорофиллов (хлорофиллы a, b, с, d, е, бактериохлорофиллы a, b, с, d и протохлорофилл), несколько форм фикобилинов, более 100 различных модификаций каротиноидов. Кроме того, одна и та же химическая структура в живом листе в комплексе с белками и липидами образует целую серию так называемых «нативных» форм. Так, для хлорофилла а известно около 10 таких спектрально различных форм, из них 4 формы с максимумами поглощения в красной части спектра считаются универсальными — 661, 670, 678, 683 нм. Для каротиноидов известно несколько различных состояний одной и той же структуры: например, максимум поглощения р-каротина мономерного — 450 нм, в комплексе с белком — 455 — 460 нм, кристаллического — 540 нм. В итоге формируется мощная фоторецепторная система с большим набором различных спектральных форм. Это определяет поглощение большей части видимой области спектра (от 400 до 800 нм) — так называемую фотосинтетически активную радиацию (ФАР) с энергией квантов от 1 до 3 эВ, и высокую эффективность миграции энергии в пигмент-белковых комплексах хлоропластов.
Физические механизмы процессов поглощения, запасания и миграции энергии молекулами хлорофилла достаточно хорошо изучены.
Поглощение фотона (hv) обусловлено переходом системы в различные энергетические состояния. В молекуле в отличие от атома возможны электронные, колебательные и вращательные движения, и общая энергия молекулы равна сумме этих видов энергий. Основной показатель энергии поглощающей системы — уровень ее электронной энергии, определяется энергией внешних электронов на орбите. Согласно принципу Паули, на внешней орбите находятся два электрона с противоположно направленными спинами, в результате чего образуется устойчивая система спаренных электронов. Поглощение энергии света сопровождается переходом одного из электронов на более высокую орбиту с запасанием поглощенной энергии в виде энергии электронного возбуждения. Важнейшая характеристика поглощающих систем — избирательность поглощения, определяемая электронной конфигурацией молекулы. В сложной органической молекуле есть определенный набор свободных орбит, на которые возможен переход электрона при поглощении квантов света. Согласно «правилу частот» Бора, частота поглощаемого или испускаемого излучения v должна строго соответствовать разности энергий между уровнями:
V = № - Д)/А,
где h — постоянная Планка, равная 6,626 • Ю"34 Дж/с.
Каждый электронный переход соответствует определенной полосе поглощения. Таким образом, электронная структура молекулы определяет характер электронно-колебательных спектров.
Запасание поглощенной энергии связано с возникновением электронно-возбужденных состояний пигментов. Физические закономерности возбужденных состояний Mg-порфиринов могут быть рассмотрены на основе анализа схемы электронных переходов этих пигментов (рис. 3.7). Известно два основных типа возбужденных состояний — синглетные и триплетные. Они отличаются по энергии и состоянию спина электрона. В синглетном возбужденном состоянии спины электронов на основном и возбужденном уровнях остаются антипараллельны- ми, при переходе в триплетное состояние происходит поворот спина возбужденного электрона с образованием бирадикальной системы. При поглощении фотона молекула хлорофилла переходит из основного (50) в одно из возбужденных синглетных состояний — 5] или 52, что сопровождается переходом электрона на возбужденный уровень с более высокой энергией. Возбужденное состояние 5г очень нестабильно. Электрон быстро (в течение 10~12 с) теряет часть энергии в виде тепла и опускается на нижний колебательный уровень 5Ь где может находиться в течение 10“9 с. В состоянии 5, может произойти обращение спина электрона и переход в триплетное состояние 7Ь энергия которого ниже 5^
Возможно несколько путей дезактивации возбужденных состояний:
превращение энергии возбуждения в тепло (термальная диссипация энер- гии);
Рис. 3.7. Схема электронных переходов для магнийпорфиринов в полярном растворителе:
50 — основное состояние; 5Ь S2 — первое и второе синглетные возбужденные состояния; Гь Т2 — первое и второе триплетные возбужденные состояния
излучение фотона с переходом системы в основное состояние (флуоресценция или фосфоресценция);
перенос энергии на другую молекулу;
использование энергии возбуждения в фотохимической реакции.
Миграция энергии между молекулами пигментов может осуществляться по следующим механизмам. Индуктивно-резонансный механизм (механизм Фёрстера) возможен при условии, когда переход электрона оптически разрешен и обмен энергией осуществляется по экситонному механизму. Понятие «экситон» означает электронно-возбужденное состояние молекулы, где возбужденный электрон остается связанным с молекулой пигмента и разделения зарядов не происходит. Перенос энергии от возбужденной молекулы пигмента к другой молекуле осуществляется путем безызлучательного переноса энергии возбуждения. Электрон в возбужденном состоянии представляет собой осциллирующий диполь. Образующееся при этом переменное электрическое поле может вызвать аналогичные колебания электрона в другой молекуле пигмента при выполнении условий резонанса (равенство энергии между основным и возбужденным уровнями) и условий индукции, определяющих достаточно сильное взаимодействие между молекулами (расстояние не более 10 нм).
Обменно-резонансный механизм миграции энергии Теренина—Декстера имеет место в том случае, когда переход оптически запрещен и диполь при возбуждении пигмента не образуется. Для его осуществления необходим тесный контакт молекул (около 1 нм) с перекрыванием внешних орбиталей. В этих условиях возможен обмен электронами, находящимися как на синглетных, так и на триплетных уровнях.
ХЛОРОФИЛЛЫ
Основные элементы структурыи их значение в поглощениии преобразовании энергии
Из большого числа разнообразных пигментов только две структуры — хлорофилл а и бактериохлорофилл а — способны осуществлять преобразование энергии, все остальные пигменты участвуют в процессах поглощения и миграции энергии. Анализ химического строения молекулы хлорофилла а показывает, что данная структура прекрасно приспособлена для выполнения трех основных функций в фотосинтезе — поглощения, запасания и преобразования энергии.
Главные функции хлорофиллов, представляющих собой магнийпорфири- ны, определены спецификой химического строения молекулы, ее физико-химическими свойствами, природой электронно-колебательных спектров. Функции Mg-порфиринов формировались в процессе эволюции в тесной связи с эволюцией фоторецепторных структур. В основе молекулы Mg-порфирина лежит тетрапиррольная структура порфина, включающая 4 пиррольных кольца, соединенных метиковыми мостиками (рис. 3.8). Пиррольное кольцо, состоящее из 4 атомов углерода и атома азота, является хромофором, способным поглощать энергию инфракрасной области спектра. Замыкание пиррольных колец в тетрапиррольную структуру порфина, химически более устойчивую,
(2)(a) (3)ннн(2)(a) (3)нннДигидропорфинДигидропорфинТетрагидропорфинТетрагидропорфин129129
(2)(a) (3)
ннн
(2)(a) (3)
ннн
Дигидропорфин
Дигидропорфин
Тетрагидропорфин
Тетрагидропорфин
129
129
с с с
НС' У У Yh (4) C-NH N=C
НСХ)зн (Р)
C-N HN-C
Н<4 У ^ )сН (5) ССс
ннн
(у)(6)
Порфин
Рис. 3.8. Структурная формула порфина и его производных — дигидропорфинаи тетрагидропорфина
имело решающее значение в эволюции хлорофиллов как первичных фоторецепторов. Благодаря формированию циклической системы и эффекту сопряжения появляются интенсивные полосы поглощения в видимой области спектра с более высокой энергией квантов. Образующиеся в процессе эволюции порфирины представляют собой сложную систему с общим л-электронным облаком, объединяющим 4 пиррольных кольца в единый цикл.
Порфириновый макроцикл обладает всеми свойствами, необходимыми для выполнения важнейших функций в фотосинтезе:
имеет определенный спектр поглощения в зеленой области (порфирины красного цвета);
проявляет активную красную флуоресценцию, что свидетельствует о фотохимической активности порфиринов;
является хелатообразователем, способным включать Mg, что позволяет осуществлять реакции, идущие с запасанием энергии;
обладает способностью к обратимым окислительно-восстановительным превращениям — фотовосстановлению (может служить акцептором электрона, т. е. осуществлять фотоокисление органических веществ в отсутствие О2) и фотоокислению (электрон-донорная функция при включении Mg).
В процессе эволюции пигментов изменяются свойства их полярности. Формируются порфирины, различающиеся по числу СООН-групп — от уропорфирина (8 СООН) и копропорфирина (4 СООН) до протопорфирина (2 СООН). Появляется также гидрофобный радикал фитол. Возникновение менее полярных, более гидрофобных порфиринов обеспечило возможность включения их в мембранные структуры и образования пигмент-белковых комплексов с более длинноволновыми максимумами поглощения, а также определенную ориентацию пигментов, что необходимо для активных процессов поглощения и миграции энергии.
Дальнейшая эволюция пигментов шла по пути все большего усложнения их структуры. Изменяется степень восстановленности пигментов. По этому показателю различают три основные пигментные системы: порфин, дигидропорфин (хлорин) и терагидропорфин (бактериохлорин) (см. рис. 3.8). Изменение уровня восстановленности Mg-порфиринов, связанное с гидрированием двух полу- изолированных двойных связей в положениях углерода в кольце 3 — 4 и 7 — 8
5 Физиология растений
(3=4 и 7=8), имело большое значение для формирования оптимальной электронной структуры молекулы и сопровождалось изменением спектральных и электрон-донорных свойств. Дополнительное гидрирование порфиринового макроцикла у хлорофилла и бактериохлорофилла привело к уменьшению потенциала ионизации и снижению количества энергии, необходимой для фотоокисления пигментов, что имело решающее значение для процесса преобразования энергии в реакционных центрах.
Усложнение общей структуры молекулы Mg-порфирина связано с формированием пятого циклопентанного кольца, т. е. с образованием системы «форбина». Структура форбина характерна для всех представителей группы хлорофилла (рис. 3.9).
Известно 10 различных модификаций хлорофилла и бактериохлорофилла. Рассмотрим важнейшие из них.
СН=СН2 |сн31СН=СН2 |сн31СООС20Н39СООС20Н39Хлорофилл аХлорофилл аХлорофилл bХлорофилл b
СН=СН2 |сн31
СН=СН2 |сн31
СООС20Н39
СООС20Н39
Хлорофилл а
Хлорофилл а
Хлорофилл b
Хлорофилл b
Н3С-СОн-с"с» I f C-N.н< .С—NН3Сн'7с;Н I сн2 сн2 о=с оН3С-СОн-с"с» I f C-N.н< .С—NН3Сн'7с;Н I сн2 сн2 о=с о
Н3С-СО
н-с"с» I f C-N.
н< .
С—N
Н3С
н'7с;
Н I сн2 сн2 о=с о
Н3С-СО
н-с"с» I f C-N.
н< .
С—N
Н3С
н'7с;
Н I сн2 сн2 о=с о
Нн3С н ^с^с-н х ,.л=<4^ - Mgx )сн
XN-C
5
I 10 6 I
нс——с=о
I 9с=о
Iо
СН3
С20Н39
Бактериохлорофилл а
Рис. 3.9. Структура хлорофиллов а, b и бактериохлорофилла ст.I — IV — нумерация пиррольных колец
Хлорофилл а — универсальный пигмент высших растений и водорослей. У некоторых водорослей (синезеленых, некоторых красных) он представляет единственную форму хлорофилла. Максимум поглощения в органических растворителях в красной области спектра находится при длинах волн 660 — 664 нм.
Хлорофилл b — дополнительный пигмент высших растений и водорослей, впервые появляется у эвгленовых водорослей, заменяя фикобилины. Отличается от хлорофилла а наличием альдегидной группы вместо метильной — СН3 во II пиррольном кольце. Красный максимум поглощения в ацетоне 645 нм.
Хлорофилл с — дополнительный пигмент бурых и диатомовых водорослей. Он содержит магний, не этерифицирован фитолом, связь 7=8 не гидрирована, остаток пропионовой кислоты при С7 имеет двойную связь: —СН=СН—СООН.
Хлорофилл d — дополнительный пигмент красных водорослей, отличается от хлорофилла а наличием альдегидной группы при С2 вместо — СН=СН2. Красный максимум поглощения в органических растворителях 686 нм.
Бактериохлорофилл а — главный пигмент у фотосинтезирующих бактерий. Красный максимум поглощения — 770—780 нм.
Предшественником хлорофиллов является протохлорофилл или его безфи- тольная форма протохлорофиллид. У протохлорофилла в отличие от хлорофилла а двойная связь 7=8 в IV пиррольном кольце не гидрирована, восстановление ее осуществляется фотохимическим путем на заключительных стадиях биосинтеза хлорофилла.
Все рассмотренные модификации затрагивают лишь боковые группы, центральная часть молекулы остается неизменной. К числу основных элементов структуры относятся: 1) циклическая 18-членная система сопряженных связей, 2) центральный атом магния, 3) циклопентанное кольцо, 4) фитол (у бактериохлорофиллов с и d — фарнезол). Исследования последних лет позволяют раскрыть функциональное значение отдельных элементов структуры.
Конъюгированная система сопряженных связей у всех хлорофиллов представляет собой основную хромофорную группу, ответственную за избирательное поглощение световой энергии. Циклическая система сопряженных двойных связей, образующая делокализованную л-орбиту, имеет ряд дополнительных
Рис. 3.10. Спектры поглощения хлорофиллов а (7) и b (2): г — удельный коэффициент экстинкцииРис. 3.10. Спектры поглощения хлорофиллов а (7) и b (2): г — удельный коэффициент экстинкциисопряжений: винильную группу в I кольце, полуизолированную связь во II кольце, С=О группу в V кольце. В результате возникает сложноразветвленная конъюгированная система, которая обеспечивает высокую поглощающую способность Mg-порфиринов. Спектры поглощения магнийпорфиринов имеют два хорошо выраженных максимума поглощения в сине-фиолетовой (полоса Соре) и красной областях спектра (рис. 3.10). У хлорофилла b оба максимума расположены между максимумами поглощения хлорофилла а, что увеличивает области поглощаемой энергии хлоропластами высших растений.
Рис. 3.10. Спектры поглощения хлорофиллов а (7) и b (2): г — удельный коэффициент экстинкции
Рис. 3.10. Спектры поглощения хлорофиллов а (7) и b (2): г — удельный коэффициент экстинкции
Центральный атом магния определяет важнейшие физические и химические свой-
ства молекулы магнийпорфирина. Включение магния в тетрапиррольную структуру значительно изменяет спектральные свойства хлорофилла. Влияние магния осуществляется через атомы азота пиррольных колец — двух третичных (—N=) и двух иминных (=NH). В щелочной среде два протона от иминных атомов азота замещаются на магний, образующий с двумя атомами иминного азота электровалентные связи. Два третичных атома азота стабилизируют это соединение за счет неподеленных пар электронов посредством координационной связи. При образовании комплексного соединения порфиринов с металлом электронная плотность по всем пиррольным кольцам выравнивается и они становятся эквивалентными. В результате этого изменяется симметрия молекулы, что сопровождается изменением ее спектральных характеристик.
Центральный атом магния определяет уникальные функции молекулы хлорофилла в фотосинтезе, связанные с поглощением, запасанием и преобразованием энергии. Д. Мозеролл (1974) считает, что использование магния первичными фототрофными организмами для построения фоторецепторных систем обусловлено определенными физико-химическими свойствами этого элемента. Магний отличается наиболее низкой величиной электроотрицательности (по Л. Полингу, Mg = 1,3; Zn = 1,6; Си = 1,9), а магнийхелат порфирина имеет наиболее низкое значение редокс-потенциала, т. е. отличается наименьшей способностью удерживать электроны. При включении магния в тетрапиррольную структуру снижается также величина потенциала ионизации. Поэтому магнийпроизводные порфирина являются сильными восстанавливающими агентами и в возбужденном состоянии способны восстанавливать соединения с высоким восстановительным потенциалом (-0,9 В).
Магний определяет ряд химических свойств хлорофилла. Обладая координационным числом 6, магний способен образовать дополнительно две координационные связи с атомами кислорода и азота. Благодаря этому магний участвует в образовании ассоциатов молекулы хлорофилла с другими молекулами пигментов (при образовании димеров в реакционных центрах), с белками, липидами, фосфолипидами и другими компонентами хлоропласта. Образование ассоциатов обусловливает сильное смещение абсорбционного максимума в длинноволновую область. В результате этого (по данным К. Френча, 1972 и Ф.Ф. Литвина, 1973) образуется серия так называемых «нативных» спектральных форм хлорофилла, выполняющих различные функции. Более коротковолновые формы (661, 670, 678 нм) участвуют главным образом в процессах поглощения энергии, более длинноволновые формы (683 нм) — в процессах ее миграции, а пигменты реакционных центров (П680, П700) — в процессах преобразования энергии.
Дополнительное циклопентанное кольцо. Значение V кольца хлорофилла определяется наличием в нем двух полярных групп — кетогруппы С9=О при 9-м атоме углерода и кетоэфирной группы при С10. Кетогруппа при С9 участвует в образовании водородной связи хлорофилла и молекулы воды. Через атом кислорода вода может образовать координационную связь с магнием одной молекулы хлорофилла и одновременно водородную связь с группой С=О другой молекулы. В результате образуются структуры Mg—О(Н)—Н—О=С. В данном случае воде принадлежит очень важная роль в образовании высокоорганизованных структур антенных комплексов. Неподеленные электроны ато-
Рис. 3.11. Схема образования димера П700 (Ф. Фонг, 1974)Рис. 3.11. Схема образования димера П700 (Ф. Фонг, 1974)ма кислорода С9=О группы V кольца могут участвовать в поглощении световой энергии и возбуждаться с переходом на л-орби- ту, обусловливая так называемые и-^’“-переходы.
Рис. 3.11. Схема образования димера П700 (Ф. Фонг, 1974)
Рис. 3.11. Схема образования димера П700 (Ф. Фонг, 1974)
Большое значение в образовании светпо- глощающих структур хлоропластов принадлежит кетоэфирной группе V кольца. В отличие от группы С9=О, которая образует дополнительное сопряжение с л-электронной системой макроцикла, кетоэфирная группа при Сю не конъюгирует с циклической л-элект-
ронной системой, вследствие чего образует более прочную связь с молекулой воды. Кроме того, кетоэфирная группа находится в трснс-положении по отношению к плоскости порфинного кольца. Это позволило предположить участие кетоэфирной группы в образовании димеров П700 и П68о в реакционных центрах фотосистем. Согласно модели Ф. Фонга (1974), образование симметричного димера в реакционном центре ФС1 осуществляется при участии центральных атомов магния, кетоэфирных групп двух молекул хлорофилла а и двух молекул Н2О с образованием структур типа (хл. а — Н2О)2 (рис. 3.11). Результаты работ японских ученых показали, что П700 представляет собой димер хлорофилла а и хлорофилла а', у которого кетоэфирная группа находится в цисположении относительно плоскости молекулы (Т. Watanabe et al., 1985). Таким образом, магний и кетоэфирная группа в молекуле хлорофилла являются главными компонентами для формирования димерных структур пигментов реакционного центра.
Фитол представляет собой полиизопреноидную цепь, состоящую из 20 углеродных атомов (спирт фитол — С20Н39ОН), и является гидрофобным радикалом молекулы хлорофилла. Фитольная цепь не находится в электронном сопряжении с макроциклом и поэтому практически не влияет на электронную структуру хлорофилла в возбужденных состояниях 5] и 52. В нативной системе взаимодействие фитола с гидрофобными белками позволяет регулировать положение макроцикла по отношению к свету и, таким образом, изменять активность светопоглощения молекулой хлорофилла.
Метаболизм магнийпорфиринов
Современные представления о путях биосинтеза зеленых пигментов основаны на работах Д. Шемина с использованием меченых атомов углерода 14С и азота 15N, на опытах С. Граника с мутантами хлореллы, многолетних работах Т.Н.Годнева с сотр., А.А.Шлыка и др. Ключевым соединением в биосинтезе порфиринов является 8-аминолевулиновая кислота (АЛК). У растений биосинтез АЛК идет через 5-углеродные соединения — глутаминовую или а-кетоглу- таровую кислоту (С5-путь). Начальные реакции биосинтеза АЛК в растениях представляют АТФ- и НАДФН-зависимые процессы. Согласно современным представлениям, превращение глутамата в 8-АЛК по С5-пути включает участие трех ферментов:
Глутаминовая кислота
Глутамил-Глутамат-1 -
тРНКсемиальдегид
соон
СООНсоон
11
сн2
1тРНК, АТФ, Mg2+
СИ 2**
1Глутамил-
CHNH2 тРНК-синтетаза
СН2СН2Пиридоксалъ-
IНАДФНIфосфат
СН2•- СН2►
1Глутамил-1Аминотранс-
CHNH2 тРНК-редуктаза CHNH2фераза
соон
с=осно
тРНК
5-Ами нолевул и- новая кислота соон сн2 — сн2 с=о I ch2nh2
Последующие реакции превращения АЛК в циклический пиррол и тетра- пиррольные структуры идут согласно классической схеме (рис. 3.12). В реакции конденсации двух молекул АЛК, катализируемой АЛК-дегидратазой, образуется первичный монопиррол — порфобилиноген, который затем при участии ряда ферментов через серию тетрапиррольных соединений с различным числом групп СООН последовательно превращается в уропорфириноген III (8 СООН), копропорфириноген (4 СООН) и, наконец, в протопорфирин IX (2 СООН), который служит ключевым интермедиатом в биосинтезе Fe- и Mg-порфиринов. Включение железа в протопорфирин IX при участии фермента феррохелатазы приводит к образованию железопорфирина. Магниевая ветвь биосинтеза пигментов начинается включением магния в протопорфирин IX (рис. 3.13). Эта реакция требует присутствия АТФ и Mg +. Образовавшийся Mg-протопорфирин IX этерифицируется метиловым спиртом с образованием Mg-протопорфиринмонометилового эфира.
На заключительных этапах биосинтеза хлорофилла происходят следующие реакции: 1) окисление пропионовой кислоты в положении 6 с образованием кетогруппы: —СН2—СН2—СООСН3 —► —СО—СН2—СООСН3; 2) замыкание V кольца и образование Mg-дивинилфеопорфирина а5 (дивинилпротохлорофиллида); 3) восстановление винильной группы (—СН=СН2) в положении С4 до этильной (—СН2—СН3) при участии восстановленных пиридиннуклео- тидов и образование магнийвинилфеопорфирина о5 (моновинилпротохлорофиллида). В результате этих преобразований возникает молекула протохлорофиллида, непосредственного предшественника хлорофилла а в биосинтетической цепи.
На свету в процессе зеленения этиолированных растений превращение протохлорофиллида а в хлорофиллид а включает реакцию фотохимического восстановления полуизолированной двойной связи 7=8 в IV пиррольном кольце
25 АЛК
-Н2О
АЛК-дегидратаза
соон
I соон сн2
+4 ПБГ
-4 NH2 ПБГ-дезаминаза
Порфобилиноген (ПБГ)
Копропорфириноген III
Протопорфирин IX
Рис. 3.12. Основные стадии биосинтеза протопорфирина IX:
6АЛК — 5-аминолевулиновая кислота; Ас — остаток уксусной кислоты (—СН2СООН); Рг —остаток пропионовой кислоты (—СН2СН2СООН)
макроцикла. В листьях этиолированных растений протохлорофиллид накапливается в виде трех основных форм с максимумами поглощения 628, 638 и 648 (650) нм. Фотоактивными являются только две более длинноволновые формы, образующие прочные комплексы с белком. В 1974 г. В. Гриффитс изолировал из этиопластов фермент, который катализирует восстановление протохлорофиллида в хлорофиллид. Фермент получил название НАДФН-протохлорофилли- доксидоредуктаза (ПОР). Фермент связан с проламелярным телом этиопласта, где он образует фотохимически активный комплекс с донором водорода НАДФН и протохлорофиллидом (650 нм). При освещении этого фотоактивно- го тройного комплекса атомы водорода от НАДФН переносятся к протохлорофиллиду с образованием хлорофиллида а, что сопровождается изменением спектра поглощения. Дальнейшее превращение хлорофиллида в хлорофилл связано с его этерификацией фитолом путем присоединения к макроциклу
Протопорфирин IX
Mg-хелатозаMg-хелатозаМё2+-ДТФМё2+-ДТФ
Mg-хелатоза
Mg-хелатоза
Мё2+-ДТФ
Мё2+-ДТФ
НАДФННАДФНВинилредуктазаВинилредуктазаНАДФНАДФМоновинилпротохлорфиллид аМоновинилпротохлорфиллид аХлорофиллид аХлорофиллид аХлорофиллсинтазаХлорофиллсинтазаХлорофилл а-► Хлорофилл ЬХлорофилл а- оксигеназаХлорофилл а-► Хлорофилл ЬХлорофилл а- оксигеназа(присоединение фитола)(присоединение фитола)
НАДФН
НАДФН
Винилредуктаза
Винилредуктаза
НАДФ
НАДФ
Моновинилпротохлорфиллид а
Моновинилпротохлорфиллид а
Хлорофиллид а
Хлорофиллид а
Хлорофиллсинтаза
Хлорофиллсинтаза
Хлорофилл а-► Хлорофилл Ь
Хлорофилл а- оксигеназа
Хлорофилл а-► Хлорофилл Ь
Хлорофилл а- оксигеназа
(присоединение фитола)
(присоединение фитола)
Mg-протопорфирин
^Л^-протопорфирин IX- метилтрансфераза
S-аденозилметионин
<(метилирование
пропионовой кислоты III кольца)
/*" S-аденозилгомоцистеин
Mg-протопорфиринмонометиловый эфир
(fl-окисление 6-пропионовой кислоты, образование С=О, замыкание V кольца)
Дивинилпротохлорофиллид а
(восстановление С4
винильной группы до этильной)
(восстановление 7=8 связи)
Рис. 3.13. Схема заключительных этапов биосинтеза хлорофилла
геранилгеранилпирофосфата — полиизопреноидной структуры (С2о) с четырьмя двойными связями. При гидрировании трех из них образуется фитольная структура — гидрофобный радикал молекулы хлорофилла.
Механизмы регуляции биосинтеза тетрапирролов включают сложную систему регуляторных механизмов, обеспечивающих строгую координацию всех реакций биосинтетического пути. В нормальных условиях порфирины в клетке не накапливаются. Скорость синтеза порфиринов хорошо скоординирована со скоростью их последующих превращений. При нарушении какого-либо проме-
жуточного звена накопление порфиринов идет лишь до определенного уровня, находящегося под контролем регуляторных механизмов. Биологическое значение действия регуляторных механизмов состоит в том, что ими предотвращается накопление свободных порфиринов, обладающих высокой фотосенсибилизирующей активностью, а также бесцельная трата исходных продуктов и энергии в тех случаях, когда образующиеся порфирины не могут быть использованы для биосинтеза конечных продуктов — хлорофиллов или гемопротеидов.
Система регуляторных механизмов включает метаболитный контроль — уровень содержания в клетке необходимых субстратов (АЛК), кофакторов (АТФ, НАДФН) и ферментов (АЛК-синтетаза), генетический контроль — осуществляет образование всех ферментных белков биосинтетической цепи, фитохромный контроль — фоторегуляция экспрессии генов, контроль синтеза хлоропластных полипептидов, кодируемых ядерным и пластидным геномами. За счет взаимодействия названных контролирующих механизмов координируются все звенья сложной системы процессов биосинтеза порфиринов в клетке.
ФИКОБИЛИНЫ
Фикобилины фикоцианин, фикоэритрин и аллофикоцианин входят в состав пигментных систем цианобактерий и красных водорослей, где вместе с хлорофиллом а выполняют функции фоторецепторов в фотосинтезе. Фикобилины представляют группу тетрапиррольных пигментов с открытой цепью (рис. 3.14). Они не содержат металла, отдельные пиррольные кольца соединены метиновыми (—СН=) и метиленовыми (—СН2—) мостиками и включают различные радикалы в форме метильных (—СН3), винильных (—СН=СН2), этильных (—СН2—СН3) групп, а также два остатка пропионовой кислоты (-СН2-СН2-СООН).
Фикоцианобилин
Рис. 3.14. Структурные формулы фикобилинов
Основной пигмент этой группы фикоцианин (синего цвета) представляет собой комплекс фикоцианобилина (простетическая группа пигмента) с белком и является, таким образом, фикобилипротеидом с молекулярной массой 273 кДа.
Фикоэритрин (красного цвета) — комплекс фикоэритробилина с белком (молекулярная масса 226 кДа). Аллофикоцианин — синий пигмент с молекулярной массой 134 кДа, состоящий из трех субъединиц.
Простетическая группа пигментов при участии двух свободных карбоксильных групп образует прочную ковалентную связь с белком, разрываемую только при нагревании с НС1. Пигментные комплексы водорастворимы и могут быть извлечены из клеток водорослей горячей водой.
Хромофорной группой фикобилинов является система сопряженных связей, которая образуется при участии атомов углерода и азота пиррольных колец и —СН-мостиков. Молекула фикоэритробилина содержит 6 двойных связей, у фикоцианобилина их 8. Спектры поглощения фикобилинов имеют, как правило, один главный максимум, расположенный в желто-зеленой области спектра, которая слабо используется хлорофиллами (рис. 3.15). Через толщу воды наиболее глубоко проникают зеленые лучи, активно поглощаемые фикобилинами.
Для фикобилипротеидов характерна яркая флуоресценция-, у фикоэритрина — оранжевая с максимумом около 575 нм, у аллофикоцианина — красная с максимумом 660 нм. При денатурации белка и нарушении связей простетические группы фикобилинов теряют способность флуоресцировать.
В клетках водорослей фикобилины находятся в специальных гранулах — фикобилисомах, расположенных на поверхности мембран (рис. 3.16). Пигменты в грануле образуют последовательный ряд функционально связанных пигментных комплексов. На поверхности фикобилисомы расположены коротковолновые пигменты (фикоэритрин, 570 нм), ближе к мембране — пигменты с более длинноволновым максимумом (фикоцианин, 630 нм; аллофикоцианин, 650 нм и аллофикоцианин В, 670 нм). Такое расположение пигментов в фико- билисоме позволяет с высокой скоростью и эффективностью осуществлять процессы миграции энергии, поглощаемой фикобилинами, на хлорофилл а, локализованный в мембране.
Фикобилины функционируют как дополнительные пигменты в составе фотосистемы И. По данным ряда авторов (L.Duysens, 1951; К. French, 1952),
Рис. 3.15. Спектры поглощения фикобилинов
Фикоэритрин (570 нм) Фикоцианин (630 нм) Аллофикоцианин (650 нм) Аллофикоцианин В (670 нм)
Хлорофилл а (670 нм)
Рис. 3.16. Организация фикобилисом в клетках водорослей
90 % энергии, поглощенной фикобилинами, мигрирует на хлорофилл а и используется в фотохимических реакциях. Для понимания физиологической роли данной группы пигментов большое значение имеет явление хроматической адаптации, исследованное в работах Н. М. Гайдукова, А. А. Рихтера, Т. Зигельмана и др. Было установлено, что содержание и состояние пигментов у водорослей зависят от условий освещения, и при изменении спектрального состава света изменяется пигментный состав, увеличивается количество пигментов, поглощающих дополнительный по отношению к падающему свет. Процесс хроматической адаптации позволяет водорослям оптимально использовать световую энергию, проникающую через толщу воды. В процессе эволюции, начиная с эвгленовых водорослей, фикобилины как дополнительные пигменты были заменены на хлорофилл Ь, циклическая структура которого более устойчива по сравнению с открытой цепью фикобилинов, и дальнейший путь эволюции фотоавтотрофных организмов происходил на основе двух циклических тетрапирролов — хлорофиллов аи Ь.
КАРОТИНОИДЫ
Общая характеристика класса каротиноидов
Каротиноиды — большая и разнообразная группа желтых, оранжевых, красных пигментов, поглощающих коротковолновую часть видимой области спектра (400 — 550 нм) и выполняющих ряд очень важных функции в фотосинтезе.
По химической природе каротиноиды представляют собой полиизопреноид- ную цепь, состоящую из 40 атомов углерода, которая у большинства каротиноидов замыкается по концам в два иононовых кольца. Центральная часть молекулы, состоящая из 18 атомов углерода, представляет собой систему сопряженных связей, образуя основную хромофорную группу молекулы пигмента.
В зависимости от содержания кислорода в молекуле каротиноида различают каротины (например, p-каротин), не содержащие кислорода, и ксантофиллы — содержащие кислород в форме гидрокси-группы —ОН или эпокси-группы
I
I /О. У высших растений главными представителями ксантофиллов являются
I
лютеин, виолаксантин, зеаксантин и неоксантин (рис. 3.17).
Большое разнообразие пигментов в группе каротиноидов в значительной мере связано с наличием разных изомерных форм. Цис- и троис-изомеры с неодинаковым расположением заместителей относительно двойной связи (рис. 3.18) различаются по спектральным и химическим свойствам и имеют разную конфигурацию молекулы: транс-изомеры — линейную, цис-изомеры (9, 11, 13, 15-ц«с) — изогнутую. Большая часть каротиноидов ССК представлена транс- конфигурацией.
Каротиноиды присутствуют в мембранах у всех фотосинтезирующих организмов, где они выполняют ряд важнейших функций в процессе фотосинтеза — антенную (дополнительные пигменты в процессе поглощения солнечной энергии), защитную (тушители триплетного хлорофилла и синглетного кислоро-
Н3С сн:Н3С сн:/С^/Ч10 Н2с21^с 7 с 9 с I з с II Н Н/С^/Ч10 Н2с21^с 7 с 9 с I з с II Н НСНз СНзI Н I н н н н нСНз СНзI Н I н н н н н1111Н3С СНзН3С СНзС СНз н2С СНз н2н 13 н 15 н ,4'Т ,2' П ПiСНзн 13 н 15 н ,4'Т ,2' П ПiСНзс нс нЧ7' 8' С н СНз Н3СЧ7' 8' С н СНз Н3СP-КаротинP-КаротинС6.1уСЦС ’ ♦ зСН с Н2С6.1уСЦС ’ ♦ зСН с Н2l2l2ЧЧН3С СНН3С СНН3С СНзН3С СНзСН3СН3/С^ /СчН2Ссс сIIIн нНО-С^ /С^' С СНз н н2/С^ /СчН2Ссс сIIIн нНО-С^ /С^' С СНз н н2ННСН3СН3с с н нс с н нн н/С с нн н/С с нннСН3СН3н - /С с нн - /С с нН /С^С^ СН СН2С' IIН /С-ОНСН3 Н3С с х нНН /С^С^ СН СН2С' IIН /С-ОНСН3 Н3С с х нНЛютеинЛютеинН3С СН-Н3С СН-СН3СН3ННСН3СН3Н3С СНзН3С СНзН2С но-с.нН2С но-с.нс( с сi/О н нс( с сi/О н н/С"С СН, н2/С"С СН, н2с сн нс сн нн н/С с нн н/С с нННСН3СН3Н Н /С.. /С^ ,С^ СН сн2 с V с' । i Н I Н /С^ /С-ОНСН3Н3С I С х но н2 нН Н /С.. /С^ ,С^ СН сн2 с V с' । i Н I Н /С^ /С-ОНСН3Н3С I С х но н2 нНеоксантинНеоксантинН3С ,снН3С ,снН2С но-с нН2С но-с н/С.С СНН2/С.С СНН2СНСНннС нС нссСНз н н н /С^ /С ссснннСНз н н н /С^ /С ссснннСНзСНзВиолаксантинВиолаксантинН3с СНзН3с СНз/С>С/С>Сн н С-н Н /СН3 и р СнзС и2н н С-н Н /СН3 и р СнзС и2СН2 с-он \ нСН2 с-он \ н
Н3С сн:
Н3С сн:
/С^/Ч10 Н2с21^с 7 с 9 с I з с II Н Н
/С^/Ч10 Н2с21^с 7 с 9 с I з с II Н Н
СНз СНз
I Н I н н н н н
СНз СНз
I Н I н н н н н
11
11
Н3С СНз
Н3С СНз
С СНз н2
С СНз н2
н 13 н 15 н ,4'Т ,2' П Пi
СНз
н 13 н 15 н ,4'Т ,2' П Пi
СНз
с н
с н
Ч7' 8' С н СНз Н3С
Ч7' 8' С н СНз Н3С
P-Каротин
P-Каротин
С6.1уСЦ
С ’ ♦ зСН с Н2
С6.1уСЦ
С ’ ♦ зСН с Н2
l2
l2
Ч
Ч
Н3С СН
Н3С СН
Н3С СНз
Н3С СНз
СН3
СН3
/С^ /Сч
Н2Ссс с
IIIн н
НО-С^ /С^
' С СНз н н2
/С^ /Сч
Н2Ссс с
IIIн н
НО-С^ /С^
' С СНз н н2
Н
Н
СН3
СН3
с с н н
с с н н
н н
/С с н
н н
/С с н
н
н
СН3
СН3
н - /С с н
н - /С с н
Н /С^
С^ СН СН2
С' II
Н /С-ОН
СН3 Н3С с х нН
Н /С^
С^ СН СН2
С' II
Н /С-ОН
СН3 Н3С с х нН
Лютеин
Лютеин
Н3С СН-
Н3С СН-
СН3
СН3
Н
Н
СН3
СН3
Н3С СНз
Н3С СНз
Н2С но-с.
н
Н2С но-с.
н
с( с сi/О н н
с( с сi/О н н
/С"
С СН, н2
/С"
С СН, н2
с с
н н
с с
н н
н н
/С с н
н н
/С с н
Н
Н
СН3
СН3
Н Н /С.
. /С^ ,С^ СН сн2 с V с' । i Н I Н /С^ /С-ОН
СН3Н3С I С х но н2 н
Н Н /С.
. /С^ ,С^ СН сн2 с V с' । i Н I Н /С^ /С-ОН
СН3Н3С I С х но н2 н
Неоксантин
Неоксантин
Н3С ,сн
Н3С ,сн
Н2С но-с н
Н2С но-с н
/С.
С СН
Н2
/С.
С СН
Н2
СН
СН
н
н
С н
С н
с
с
СНз н н н /С^ /С ссс
ннн
СНз н н н /С^ /С ссс
ннн
СНз
СНз
Виолаксантин
Виолаксантин
Н3с СНз
Н3с СНз
/С
>С
/С
>С
н н С-
н Н /
СН3 и р С
нзС и2
н н С-
н Н /
СН3 и р С
нзС и2
СН2 с-он \ н
СН2 с-он \ н
Рис. 3.17. Структурные формулы основных каротиноидов высших растений
'Все-транс'Все-транс15-г<ис15-г<исРис. 3.18. Конфигурация цис- и транс-изомерных форм каротиноидовРис. 3.18. Конфигурация цис- и транс-изомерных форм каротиноидов11-цис11-цис
'Все-транс
'Все-транс
15-г<ис
15-г<ис
Рис. 3.18. Конфигурация цис- и транс-изомерных форм каротиноидов
Рис. 3.18. Конфигурация цис- и транс-изомерных форм каротиноидов
11-цис
11-цис
да) и фотопротекторную (предохраняют реакционный центр от мощных потоков энергии при высоких интенсивностях света и стабилизируют липидную фазу тилакоидных мембран, защищая ее от переокисления).
Антенная функция каротиноидов
Антенная функция предполагает энергетическое взаимодействие каротиноидов и хлорофиллов. Антенная функция имеет место в ССК и обусловлена синглетно-возбужденным состоянием каротиноидов, которые находятся в форме «все-транс». Возможность миграции энергии в пигмент-белковом комплексе
Рис. 3.19. Спектры поглощения каротиноидов в органических растворителях:
360440520360440520Длина волны, нм БДлина волны, нм Б380420460500380420460500Длина волны, нмДлина волны, нмВВА — p-каротин (/ — свободный; 2 — связанный с белком); Б — лютеин; В — виола- ксантин
360440520
360440520
Длина волны, нм Б
Длина волны, нм Б
380420460500
380420460500
Длина волны, нм
Длина волны, нм
В
В
от возбужденных каротиноидов к хлорофиллу доказана экспериментально работами Л.Дюйзенса в опытах с сенсибилизированной флуоресценцией в системе p-каротин -^ бактериохлорофилл и опытами Дж.Гудхира со спектром действия, в которых установлен перенос энергии между каротиноидами и хлорофиллами в фотосистемах I и II. Таким образом, главная функция каротиноидов в ССК — поглощение энергии и перенос ее на хлорофилл. Для этой цели в эволюции были отобраны «все-транс» каротиноиды.
Каротиноиды характеризуются определенным спектром поглощения в сине- зеленой области (400—550 нм) (рис. 3.19). Хромофорная группа различных каротиноидов может включать от 9 до 13 двойных связей, что определяет положение максимумов, энергию возбуждения и общий вид спектра поглощения. У большинства каротиноидов спектр поглощения имеет главный максимум и два более или менее выраженных «плеча», что отражает три колебательных подуровня, одного электронного перехода на второй возбужденный уровень (50->52). Переход электрона в первое синглетное возбужденное состояние (50-> 5,) оптически запрещен. Однако фотофизические исследования возбужденных состояний каротиноидов, проведенные в последние годы, показали, что p-каротин (Кр) и другие каротиноиды (Кар) обладают лежащим ниже возбужденным синглетным уровнем 5Ь на который возможен переход электрона из состояния 62 путем реакции внутренней конверсии (J. Koyama, 1991). На рис. 3.20 представлена диаграмма энергетических уровней p-каротина и бак-
P-Каротин Бактериохлорофилл аP-Каротин Бактериохлорофилл аРис. 3.20. Диаграмма уровней энергии Р-каротина и бактериохлорофилла а (по Koyama, 1991, с изменениями)Рис. 3.20. Диаграмма уровней энергии Р-каротина и бактериохлорофилла а (по Koyama, 1991, с изменениями)тер иохлорофилла а, где на оси ординат отложены значения волнового числа (v), характеризующие энергию уровней. Можно видеть хорошее соответствие положения энергетических уровней p-каротина и бактериохлорофилла, что свидетельствует о возможностях миграции энергии электронного возбуждения от p-каротина к молекуле хлорофилла.
P-Каротин Бактериохлорофилл а
P-Каротин Бактериохлорофилл а
Рис. 3.20. Диаграмма уровней энергии Р-каротина и бактериохлорофилла а (по Koyama, 1991, с изменениями)
Рис. 3.20. Диаграмма уровней энергии Р-каротина и бактериохлорофилла а (по Koyama, 1991, с изменениями)
При возбуждении молекулы р-кароти- на переход на возбужденный уровень 52 (5о->52) оптически разрешен, и этот переход определяет характер спектра поглощения в коротковолновой части видимой области спектра (-500 нм). Время жизни этого возбужденного состояния очень мало (200 фс), обнаружена флуоресценция при 570 нм с очень низким квантовым выходом 6 • КГ5.
Переход ib-^^i оптически запрещен, поэтому соответствующие ему полосы поглощения не обнаружены. Предполагают, что имеет место внутренняя конверсия энергии S2-^ 5] со временем 200 фс. Положение возбужденного уровня 51 определено методом интерполяции по скорости релаксации S^-»^ в опытах с серией каротиноидов с различным числом двойных связей в конъюгированной цепи.
Проведенные исследования позволяют предполагать, что положение возбужденного уровня 5] для p-каротина близко 17 000 см"1 (-600 нм). Квантовый выход флуоресценции от ^ к 50 с максимумом около 840 нм очень мал (2 • 10“5), в несколько раз меньше, чем для S2. Время жизни молекулы p-каротина в возбужденном состоянии 5] около 10 пс. Большее время жизни и лучшее совпадение энергетических уровней p-каротина и бактериохлорофилла позволяет считать состояние 5] более удобным для переноса энергии возбуждения на хлорофилл (см. рис. 3.20).
Механизм миграции энергии в ССК от каротиноидов к хлорофиллам изучен недостаточно. Экспериментально доказано, что имеет место очень эффективный перенос энергии от каротина (Кр) к хлорофиллу (Хл). Поскольку переход SQ->S2 разрешен, в данном случае возможен дипольный механизм Фёрстера. При очень коротком времени жизни S2 (200 фс) необходим теснейший контакт молекул p-каротина и хлорофилла. Время жизни 5] значительно больше (10 пс) и лучше совпадение энергетических уровней, что более удобно для переноса энергии. Однако переход 50-^^ Для p-каротина оптически запрещен, и дипольный механизм миграции энергии невозможен. В данном случае предполагается обменно-резонансный механизм Теренина- Декстера.
Таким образом, перенос энергии может идти двумя путями:
52(Кр) -^ 52(Хл) и
52(Кр) -> ^(Кр) -> ^(Хл).
Этим можно объяснить тот факт, что в процессе эволюции для антенной функции были отобраны каротиноиды в форме «все-транс»; они обеспечивают работу двух каналов переноса энергии на хлорофилл (цыс-формы каротиноидов флуоресцируют только в состоянии Si).
Защитная функция каротиноидов
Каротиноиды в антенном комплексе и реакционном центре выполняют уникальную «защитную» функцию, которая осуществляется с участием Тх-состояний и связана с тушением возбужденных триплетных состояний хлорофилла и синглетного кислорода ('О2). Механизм фотоповреждения фотосинтетического аппарата в случае оксигенного фотосинтеза обусловлен фотоде- структивным действием активных форм кислорода, главным образом синглетного кислорода 'О2, образующегося при взаимодействии основной формы кислорода в атмосфере 3О2 с триплетно-возбужденным пигментом-сенсибилизатором (хлорофилл, бактериохлорофилл и др.) (рис. 3.21).
Рис. 3.21. Механизм защитного действия каротиноидов:
пигмент-сенсибилизатор ('5 и 3S — соответственно синглетное и триплетное состояния);R- — радикальные соединения. Объяснение в тексте
Образующийся синглетный кислород является сильным окислителем и вызывает фотоокисление окружающих структур. Особенно активно эти процессы протекают в реакционных центрах, где образование триплетного хлорофилла (3Хл) происходит в результате возможного возврата богатого энергией электрона от первичного акцептора к пигментам реакционного центра Пб80 или П700. Каротиноиды, содержащие 9 и более двойных связей, могут эффективно тушить триплетное состояние хлорофилла и образовавшийся синглетный кислород. Механизм защитного действия [3-каротина в реакционном центре включает перенос энергии от 3Хл или 'О2 к [3-каротину и диссипацию энергии образующегося триплетного каротина через процесс нерадиационной релаксации в тепло с переходом [3-каротина в состояние З^. Каротиноиды способны также путем переноса электрона модифицировать структуру радикальных соединений и тушить свободные радикалы, возникающие при освещении.
Фотопротекторная функция каротиноидов
Фотопротекторная функция каротиноидов состоит в защите фотосинтетического аппарата от излишка энергии возбуждения при высокой интенсивности света. Эта функция связана с каротиноидами, образующими так называемый «ксантофилловый цикл».
Внутритилакоидное пространство (pH 5,0)
Строма (pH 7,5)
Мембрана
(Аскорбат) 4 [Н]
виол ф
3 виол //
2Н2О
Деэпоксидаза
Эпоксидаза
2Н2О
зеа [
4[Н] + 2О2 (НАДФН)
Рис. 3.22. Виолаксантиновый цикл. Объяснение в тексте
У высших растений и зеленых водорослей ксантофилловый цикл включает энзиматическое превращение виолаксантина в зеаксантин через интермедиат антераксантин (рис. 3.22). Процесс катализируется ферментом деэпоксидазой, требует участия аскорбата и кислой среды (оптимум действия фермента при pH 5,0). Такие условия pH создаются в люмене при освещении хлоропластов. В темноте протекает обратная реакция превращения зеаксантина в виолаксан- тин, которая катализируется эпоксидазой. Реакция эпоксидации осуществляется на внешней стороне мембраны при участии НАДФН и требует присутствия кислорода. Один из атомов молекулы кислорода включается в зеаксантин, другой атом в присутствии НАДФН образует Н2О. Повторная реакция со второй молекулой О2 приводит к образованию виолаксантина. Главная функция в защите фотосинтетического аппарата от повреждений высокой интенсивностью света принадлежит зеаксантину.
Известно несколько возможных путей протекторного действия зеаксантина. Один из них — синглет — синглетный перенос энергии от возбужденного хлорофилла (У^ к молекуле зеаксантина (Дж.Франк и др., 1994, 2000). Увеличение числа двойных сопряженных связей при образовании зеаксантина (11 двойных связей) из виолаксантина (9 двойных связей) приводит к изменению уровней энергии первых синглетных возбужденных состояний пигментов: у виолаксантина — 15 200 см"1 (энергия выражена в волновых числах), у зеаксантина — 14 200 см""1 и у хлорофилла — 14 700 см"1, (рис. 3.23). Тот факт, что энергия У]-состояний виолаксантина лежит выше энергии хлорофилла а, в то время как энергия зеаксантина лежит ниже энергии У,-состояния хлорофилла а, позволяет предположить прямое энергетическое взаимодействие виолаксантина и зеаксантина с хлорофиллом, в результате чего ксантофилловый цикл высших растений и водорослей может играть важную роль в регуляции распреде-
s2
I*2
I52
у Виолаксантин
15 200 см-1""'--.^
(657 нм) У]'*- ХлороФ1™1 ti
у Зеаксантин 14200 см-1 (704 нм)у Зеаксантин 14200 см-1 (704 нм)14700 см-1 (680 нм)■S'l —2k.
у Зеаксантин 14200 см-1 (704 нм)
у Зеаксантин 14200 см-1 (704 нм)
Рис. 3.23. Энергия .^-состояний (см-1) виолаксантина, хлорофилла а и зеаксантина высших растений (по Frank et al, 1996):
1 — разрешенные абсорбционные переходы; 2 — внутренняя конверсия энергии. Q$ — переход
и ления энергии между виолаксантином, зеаксантином и хлорофиллом а. Ксантофилловый цикл может быть активным регулятором светового потока в пиг- мент-белковых комплексах. При низком освещении каротиноиды действуют преимущественно как светособирающие пигменты, перенося энергию к хлорофиллу. При высокой интенсивности света происходит деэпоксидация виолаксантина и система переносит энергию от 5]-состояния хлорофилла к зеак- сантину с более низко лежащим уровнем 5h Таким образом, образование зеаксантина снижает избыточное поглощение световой энергии антенным хлоро- 1 филлом и защищает систему от фотоингибирования.
Увеличение числа двойных связей от 9 до 11 не только изменяет энергию возбужденного состояния ксантофиллов, но и влияет также на конформацию молекулы (кольцо-цепь): от перпендикулярной структуры у виолаксантина до | планарной конформации у зеаксантина. Эти конформационные изменения могут контролировать способность каротиноидов образовывать агрегаты. Показано, что молекулы зеаксантина образуют агрегаты легче, чем виолаксантин. Поскольку виолаксантиновый цикл находится в минорных субъединицах ССК ФСП, которые служат каналами для стока энергии от внешнего ССКП к реакционному центру, то высокая концентрация в них зеаксантина и способность его к агрегации могут нарушить макроструктуру пигмент-белковых ССК и бло- 1 кировать поток энергии электронного возбуждения к реакционному центру ФСП. Отмечено, что с одновременным превращением виолаксантина в зеаксантин заметно увеличивается эмиссия тепла, что, возможно, является результатом изменения конформационного состояния или агрегации хлорофилл- | связывающего комплекса и ускорения перехода возбужденного хлорофилла в основное состояние. Это позволяет предполагать, что важнейшей фотопротек- торной функцией зеаксантина является увеличение термальной диссипации энергии в условиях светового стресса. Связанный с зеаксантином процесс тер
мальной диссипации энергии является уникальным и очень важным фотопро- текторным действием, так как в ССК зеаксантин осуществляет превращение избытка поглощенной энергии в тепло еще до переноса энергии возбуждения в реакционный центр. Это защищает фотохимическую систему хлоропластов от необратимого повреждения, связанного с притоком огромного количества энергии в реакционный центр, которая не может быть использована в фотохимических реакциях.
В последние годы установлено, что каротиноиды хлоропластов могут выполнять важную структурную роль. При действии света высокой интенсивности ксантофиллы распределяются между ССК и липидной фазой мембран. Молекула зеаксантина ориентируется в липидном слое перпендикулярно к поверхности мембраны. Присутствие двух полярных гидроксильных групп на кольцах молекулы позволяет зеаксантину закрепляться на обеих сторонах мембраны, соединяя два липидных слоя. Благодаря этому при взаимодействии зеаксантина с липидами снижается свойство высокой текучести, характерное для тилакоидных мембран, и увеличивается вязкость мембран, что уменьшает их чувствительность к переокислению активными формами кислорода. Повышение вязкости мембраны и уменьшение ее проницаемости по отношению к молекулярному кислороду при участии ксантофиллов и некоторых терпеноидов (а-токоферол) стабилизирует и защищает липидную фазу тилакоидных мембран от фотодеструкции.
Следует отметить еще одну возможность проявления защитной функции каротиноидов. Дж. Барбер и др. (1993) обнаружили, что в условиях, когда реакции окисления воды блокированы, p-каротин может выступать в роли редокс- активного защитного агента. В реакционном центре ФСП p-каротин может подвергаться светоиндуцированным редокс-реакциям с образованием катион- радикала (Кр+) с поглощением при 950 нм. В данном случае p-каротин в реакционном центре ФС2 II действует как альтернативный электронный донор к Пб8о:
Кр + Пб80 —•* КР + Пб80-
Эта функция p-каротина связана с защитой реакционного центра от фотоповреждений, которые могут быть при фотонакоплении П^о, имеющего высокий окислительный потенциал (выше 1,1 В), в результате чего возможна деградация пигментов и белка D1. В этих условиях p-каротин восстанавливает Пб8о и защищает реакционный центр от повреждения. Восстановление Кр+ возможно через цитохром 6559.
Биосинтез каротиноидов
Биосинтез каротиноидов в хлоропластах связан с общим путем образования полиизопреноидных соединений (стеролы, боковые цепи пластохинона, убихинона, хлорофилла и др.) (рис. 3.24).
В хлоропластах высших растений обнаружен особый путь — через 1 -дезок- сиксилулозо-5-фосфат. Этот биосинтетический путь начинается с взаимодействия глицеральдегид-3-фосфата и пирувата с образованием 1-дезокси-D-кси- лулозо-5-фосфата. Затем следует серия реакций, которая завершается образованием изопентенилпирофосфата, главного продукта этого пути:
Н-ССН(ОН)СН2О(Р) + СНзСОСООН —
ОПируват
Глицералвдегид-З-фосфат
—* СН3СОСН2(ОН)СН2(ОН)СН2О® - - СН3-ССН2СН2О(рХр)
1-Дезокси-В-ксилулозо-5-фосфатСН2
Изопентенилпирофосфат
Изопентенилпирофосфат и его изомер диметилаллилпирофосфат представляют собой структурную единицу изопреноидов. Конденсация этих 5-углеродных единиц служит основой для образования соединений с различной длиной цепи: фарнезилпирофосфат (С-15), геранилгеранилпирофосфат (С-20) и др. (рис. 3.24). В результате конденсации двух молекул геранилгеранилпирофос- фата образуется фитоен — первый интермедиат в биосинтезе С40-каротино- идов. Молекула фитоена имеет только 3 сопряженных двойных связи. Превращение фитоена в каротин осуществляется путем удаления атомов Н в реакциях десатурации при участии фермента фитоендесатуразы. В результате 4 последовательных реакций дегидрирования фитоен превращается в ликопин. При замыкании двух иононовых колец в структуре ликопина образуется молекула каротина.
Изопентенил —© —© (С5)
С5
Геранил —© —© (СЮ)
С5
Фарнезил —© -© (С15)
Витамин К,
С5С5ХлорофиллХлорофиллТокоферолыТокоферолыГеранилгеранил — ©-© (С20)Геранилгеранил — ©-© (С20)Фитол (С20)Фитол (С20)5(С5)5(С5)ДимеризацияДимеризацияФитоен (С40)Фитоен (С40)-4(2Н)-4(2Н)Соланезил — 45 — ©—© (С45)Соланезил — 45 — ©—© (С45)Каротиноиды (С40)Каротиноиды (С40)Рис. 3.24. Схема биосинтеза каротиноидов и других полиизопреноидных соединенийРис. 3.24. Схема биосинтеза каротиноидов и других полиизопреноидных соединенийПластохинон (боковая цепь)Пластохинон (боковая цепь)
С5
С5
Хлорофилл
Хлорофилл
Токоферолы
Токоферолы
Геранилгеранил — ©-© (С20)
Геранилгеранил — ©-© (С20)
Фитол (С20)
Фитол (С20)
5(С5)
5(С5)
Димеризация
Димеризация
Фитоен (С40)
Фитоен (С40)
-4(2Н)
-4(2Н)
Соланезил — 45 — ©—© (С45)
Соланезил — 45 — ©—© (С45)
Каротиноиды (С40)
Каротиноиды (С40)
Рис. 3.24. Схема биосинтеза каротиноидов и других полиизопреноидных соединений
Рис. 3.24. Схема биосинтеза каротиноидов и других полиизопреноидных соединений
Пластохинон (боковая цепь)
Пластохинон (боковая цепь)
Ксантофиллы образуются путем энзиматического окисления а- и [3-каротина с образованием эпокси-, гидрокси- и кетогрупп. Только лютеин является производным а-каротина, все остальные ксантофиллы — производные [3-каротина. Зеаксантин образуется путем гидроксилирования [3-каротина. Другие компоненты ксантофиллового цикла синтезируются позже через эпоксидацию зеаксантина.
Механизм регуляции биосинтеза каротиноидов включает действие фотоак- тивной системы с участием криптохрома. Небольшие количества каротиноидов образуются в темноте, но свет заметно активирует синтез каротиноидов и других соединений, имеющих боковую полиизопреноидную цепь, путем светоиндуцированной экспрессии каротиноидных генов.
ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПИГМЕНТОВВ ХЛОРОПЛАСТАХ
ОБРАЗОВАНИЕ ПИГМЕНТ-БЕЛ КОВЫХ КОМПЛЕКСОВ
Структурные изменения молекул хлорофилла в процессе эволюции и, прежде всего, включение гидрофобных радикалов (—СН3, фитол) и обусловленное этим изменение свойств полярности обеспечило возможность включения пигментов в мембранные белки хлоропластов с образованием разного типа пигмент-бел ковых комплексов.
Впервые идею о том, что большая часть хлорофилла в живом листе связана с белком, высказал В.Н.Любименко в 1921 г. на основании значительного длинноволнового сдвига красного максимума поглощения в живом листе по сравнению с раствором (660->680 нм). Систематическое изучение пигмент- белковых комплексов началось в 1970 году, когда в лаборатории Дж.Торнбера (1974) методом препаративного электрофореза было выделено из живых листьев три окрашенных комплекса, различающихся по составу пигментов, белков и спектрам поглощения. Позже Дж. Андерсон (1980) выделил 6 различных комплексов и показал, что пигменты образуют с белками довольно стабильные комплексы, где пигменты связаны с определенными полипептидами и имеют различные химические и спектральные характеристики. Эти работы позволили заключить, что в листе все светособирающие хлорофиллы нековалентно связаны с белками.
Механизм образования пигмент-белковых комплексов включает электростатическое взаимодействие аминокислотных групп белка с С=О-группой молекулы хлорофилла, координационные взаимодействия с центральным атомом магния и гидрофобные взаимодействия с фитолом. В результате в тилакоидных мембранах хлоропластов формируются пигмент-белковые комплексы, включающие фоторецепторные системы, что имеет решающее значение для осуществления основных (перечисленных ниже) функций пигментов в фотосинтезе.
Организация пигментов фотосинтетического аппарата в виде светособирающих (антенных) комплексов, функционально сопряженных с реакционным центром, обеспечивает коллективное и эффективное поглощение энер-
гии фотонов и передачу ее в реакционные центры, где энергия электронного возбуждения используется для фотохимических реакций.
Связь пигментов с белком определяет межмолекулярное расстояние между ними (1,15 нм) и взаимную ориентацию молекул пигментов в светособирающих (антенных) комплексах, что необходимо для эффективной миграции
энергии в реакционные центры.
Стабильные условия микроокружения пигментов в белковой глобуле обеспечивают создание устойчивых спектральных форм в ССК, в результате чего формируется широкий, сильно перекрывающийся спектр поглощения, необходимый для эффективного экситонного взаимодействия пигментов и направленной миграции энергии.
Образование связи пигментов с белками создает возможность участия белков в транспорте электронов в первичных процессах фотосинтеза, например, образование «электронной тропы» между Qa и Qb в электронтранспортной цепи хлоропластов, перенос энергии от тирозина (Tyrz) к П68о.
Образование пигмент-белковых комплексов создает возможность регуляции фотопоглощающей активности пигментов путем изменений конформации белков (в зависимости от pH, ионной силы, фосфорилирования белка) и изме
нения ориентации пигментов по отношению к направлению светового луча.
Значение ориентации пигментов в пигмент-белковом комплексе активно изучается в последние годы. Установлено, что внутри антенного комплекса моле
кулы пигментов жестко организованы и определенным образом ориентированы относительно плоскости мембраны и относительно друг друга, что имеет большое значение для процессов поглощения и миграции энергии. Эффективность поглощения электромагнитной энергии будет максимальной, если век
тор электрического поля световой волны будет параллелен переходному дипольному моменту в молекуле пигмента (вектор, определяющий направление диполя, образующегося при возбуждении и переходе электрона с основной на возбужденную л-орбиту). Исследования ори
ССКССКРис. 3.25. Ориентация дипольных моментов (^-переходов молекул хлорофилла относительно плоскости мембраны:Qy — переход 5(1->S|; Qx — переход So-> ^21 ССК — светособирающий комплексРис. 3.25. Ориентация дипольных моментов (^-переходов молекул хлорофилла относительно плоскости мембраны:Qy — переход 5(1->S|; Qx — переход So-> ^21 ССК — светособирающий комплексентации пигментов в антенном комплексе и реакционном центре показали, что дипольные моменты (^-переходов (.So-^.S]) молекул хлорофилла а лежат близко к плоскости мембраны, образуя с ней небольшие углы (25 — 35°). Дипольные моменты (^-переходов у хлорофиллов реакционных центров — димеров П68о, П700 и П87о — ориентируются примерно параллельно плоскости мембраны и электрическому вектору световой волны (рис. 3.25). Параллельная ориентация дипольных моментов (^-переходов в молекуле пигментов антенного комплекса и реакционного центра важна и для процесса миграции энергии между ними. Поэтому образование комплекса пигментов с белком и их упорядоченная организация в мембране имеют большое значение для первичных процессов фотосинтеза.
ССК
ССК
Рис. 3.25. Ориентация дипольных моментов (^-переходов молекул хлорофилла относительно плоскости мембраны:
Qy — переход 5(1->S|; Qx — переход So-> ^21 ССК — светособирающий комплекс
Рис. 3.25. Ориентация дипольных моментов (^-переходов молекул хлорофилла относительно плоскости мембраны:
Qy — переход 5(1->S|; Qx — переход So-> ^21 ССК — светособирающий комплекс
ОСНОВНЫЕ ТИПЫ ПИГМЕНТ-БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ
В настоящее время выделено 4 главных типа светособирающих (антенных) комплексов. Два из них, локализованные в реакционных центрах ФС1 и ФСП, связывают только молекулы хлорофилла а и 0-каротин; два других — белки внешних светособирающих комплексов — связывают хлорофиллы а и b и каротиноиды.
Фотосистема I включает центральный комплекс I {ядро комплекса), содержащий димер хлорофилла а (П700), 2 молекулы 0-каротина и около 100 молекул хлорофилла а, расположенных вокруг электрон-транспортной цепи реакционного центра (внутренняя антенна). Внешний светособирающий комплекс CCKI (LHC I) содержит 80—120 молекул хлорофиллов а и Ь, каротиноиды и состоит из 4 субъединиц: Lhca 1, Lhca 2, Lhca 3 и Lhca 4 — с молекулярными массами 17-24 кДа.
Фотосистема II включает центральный комплекс II {ядро комплекса), содержащий димер хлорофилла а П680 и хлорофилл a-содержащие белки — СР43 и СР47 (внутренние антенны). ФСП имеет также большой внешний антенный комплекс ССКП (LHC II), содержащий хлорофиллы а и b и каротиноиды, а также ряд «минорных» ССК: СР24, СР26 и СР29 — расположенных между ССКП и реакционным центром и выполняющих важную роль в регуляции переноса энергии в реакционный центр (см. рис. 3.34).
Структурная организация всех антенных комплексов в целом подчинена основному требованию поглощения квантов света — возможности эффективной миграции энергии возбуждения среди молекул ССК и направленному переносу всей энергии в реакционные центры. В связи с этим различные спектральные формы пигментов должны быть расположены определенным образом в антенных комплексах, однако точная архитектура антенн еще мало изучена.
ЭНЕРГЕТИЧЕСКОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПИГМЕНТОВВ АНТЕННЫХ КОМПЛЕКСАХ И РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРАХ
Идея коллективного функционирования пигментов, отраженная в представлении о фотосинтетической единице (ФСБ), предполагает необходимость их энергетического взаимодействия. В основе процессов энергетического взаимодействия пигментов в антенном комплексе, взаимодействия пигментов антенного комплекса и реакционного центра и взаимодействия молекул хлорофилла а в димере реакционного центра лежит механизм «экситонного взаимодействия», поскольку обмен энергией между молекулами пигментов идет по индуктивно-резонансному механизму Фёрстера, в основе которого лежит эк- ситонный перенос энергии (см. подразд. 3.1).
Энергия экситонного взаимодействия {J) может быть различной и определяет эффективность межмолекулярного переноса энергии. Экситонное сопряжение пигментов зависит от их ориентации и расстояния. На эффективность переноса энергии в ССК влияет ряд факторов: положение энергетических уровней, время жизни и геометрические параметры.
В антенном {светособирающем) комплексе пигменты достаточно жестко организованы и ориентированы относительно друг друга. Кроме того, благода-
ря взаимодействию пигментов с различными аминокислотами белка в антенном комплексе присутствует большой набор различных спектральных форм, поэтому пигменты имеют широкий и сильно перекрывающийся спектр поглощения. В результате быстро устанавливается равновесие энергии, поглощенной пигментами антенного комплекса, между молекулами пигментов внутри антенны (в течение долей пикосекунд) и между антенной и реакционным центром. При участии серии пигментов с различными спектральными характеристиками энергия электронного возбуждения направленно мигрирует к наиболее длинноволновым пигментам реакционного центра, где происходит захват энергии возбуждения и преобразование ее в форму химической энергии. Эффективное экситоннос сопряжение между пигментами обеспечивает очень высокую скорость переноса энергии. Так, для переноса возбуждения между молекулами хлорофилла в антенне требуется в среднем 0,3 —5,0 пс, от антенны к реакционному центру — 50—100 пс, тогда как время разделения заряда (время между поглощением фотона и разделением заряда в реакционном центре) — около 300 пс. Следовательно, время переноса энергии в реакционный центр (П68О) значительно меньше времени разделения заряда.
Понимание механизма переноса энергии возбуждения в антенных комплексах требует знания структуры комплекса, расстояния между пигментами, действительной ориентации молекул пигментов в антенне. Методом электронной кристаллографии показано, что в мономерах ССКП пигмент-пигментное расстояние равно 0,9 —1,4 нм. Следовательно, экситонное сопряжение между молекулами хлорофилла может достигать значительной силы. Однако исследования показали, что энергия экситонного взаимодействия между молекулами хлорофилла в ССК не превышает 100 см"1. Это может быть обусловлено не очень строгой ориентацией молекул: дипольные моменты их ^-переходов не строго параллельны, что подтверждает эффект деполяризации флуоресценции в ССК.
В реакционных центрах энергия экситонного взаимодействия между молекулами хлорофилла в димере значительно выше. В димере реакционного центра II (П68о) J = 142 — 300 см"1, в димере ФС1 (П700) J = 400 см"1, а у пурпурных бактерий (П870) J = 600— 1500 см"1. Различия энергий экситонного взаимодействия в разных реакционных центрах обусловлены неодинаковой конфигурацией молекул хлорофилла в димерах реакционных центров ФС1, ФСП и у бактерий. У пурпурных бактерий плоскости макроциклов двух молекул бактериохлорофилла в димере строго параллельны и находятся на расстоянии 0,36 нм. В димере реакционного центра ФС1 плоскости тетрапиррольных колец несколько раздвинуты. Геометрия специальной пары ФСП (П680) существенно отличается — плоскости макроциклов в реакционном центре расположены дальше и сдвинуты относительно друг друга, что в результате снижает энергию экситонного взаимодействия двух молекул хлорофилла до 300 см"1 (рис. 3.26).
Энергетическое взаимодействие антенных комплексов ФС1 и ФСП включает иной механизм, связанный с изменением «переходных состояний». ФС1 и ФСП пространственно разделены в мембране хлоропластов, что определяется разной плотностью их поверхностного заряда. Согласно представлениям Дж. Андерсона (1980) ФСП локализована главным образом в районе спаренных мембран гран, в то время как ФС1 расположена в стромальных тилакоидах, в краевых частях гран и поверхностных мембранах гран. Это предполагает необходимость электронного и энергетического взаимодействия двух фотосистем. Пред-
Люмен
Рис. 3.26. Структурная модель димера П680 (по Satoh, 1988 с изменениями): П, и П2 — молекулы хлорофилла а в димере; D, Е — а-спирали белков D1 и D2
ложено несколько моделей взаимодействия — теория пакетов, теория переливов (спилловер) и др.
П. Хортон (1983) и Дж. Беннет (1983) предложили принципиально новый механизм регуляции распределения световой энергии между двумя фотосистемами, основанный на обратимом фосфорилировании мембранных белков и образовании «переходных состояний» 1 и 2. При возбуждении ФСП светом высокой интенсивности отдельные субъединицы ССКП (Lhcbl, Lhcb2 и Lhcb3), образующие так называемую мобильную антенну, при фосфорилировании их ферментом протеинкиназой получают дополнительный отрицательный заряд и в силу электростатического отталкивания и, возможно, конформационных изменений белков и механизма «молекулярного узнавания» (F. Allen, 1999) отделяются от ФСП и мигрируют из района соприкасающихся мембран в зону мембран, экспонированных в строму и обогащенных ФС1 (рис. 3.27). Это увеличивает сечение поглощения антенны ФС1 и приток энергии в реакционный центр I, и система переходит из состояния 1 в состояние 2. Активность протеинкина- зы и фосфорилирование белков мобильного домена ССКП регулируется сложной системой, включающей редокс-контроль через пластохиноны и цитохром /^/-комплекс, а также определенное тиоловое редокс-состояние хлоропластов. Для перехода в состояние 2 существенное значение имеет определенная связь мобильной антенны с ФС1, которая осуществляется при участии Н-субъеди- ницы ФС1. При окислении пластохинона происходит обратная реакция дефосфорилирования мобильной антенны ферментом протеинфосфатазой, возвращение ее в район спаренных мембран гран и увеличение миграции энергии к ФСП, что сопровождается переходом системы из состояния 2 в состояние 1.
Таким образом, перераспределение энергии возбуждения между двумя фотосистемами в состояниях 1 и 2 достигается путем изменения процессов связывания части ССКП с каждой из двух фотосистем, что зависит от редокс-
Рис. 3.27. Механизм энергетического взаимодействия ФС1 и ФСП:
ССКП — светособирающий комплекс II (мобильная антенна); PQ — пластохинон окисленный; PQH2 — пластохинон восстановленный (пластохинол); bf — цитохром 66/-комплекс, окисленный и восстановленный. Объяснение в тексте
состояния переносчиков ЭТЦ, определяющих активность протеинкиназы, и структурных изменений белков тилакоидной мембраны.
В результате определенной структурной организации пигментов в тилакоидной мембране и их экситонного взаимодействия энергия возбуждения быстро распределяется в массе пигментов светособирающего комплекса и происходит направленная миграция ее к пигменту реакционного центра с наиболее длинноволновым максимумом поглощения. Миграция энергии возбуждения в массе пигментов внешних и внутренних антенных комплексов ФС1 и ФСП завершается процессом «захвата» энергии реакционными центрами, где осуществляется фотохимическая реакция разделения зарядов и энергия электронного возбуждения преобразуется в химическую форму энергии.
ПЕРВИЧНЫЕ ПРОЦЕССЫ ФОТОСИНТЕЗА.РЕАКЦИОННЫЕ ЦЕНТРЫ
Понятие «первичные процессы фотосинтеза» включает реакции первой (фо- тофизической) и второй (фотохимической) стадий фотосинтеза — процессы поглощения, миграции и преобразования энергии в реакционных центрах. Работы последних лет показали очень высокую эффективность первичных процессов фотосинтеза благодаря специфике их структурной организации.
СТРУКТУРНАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯРЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРОВ
Функциональная структура, обеспечивающаяся протекание первичных процессов, известна как фотосинтетическая единица (ФСЕ). Она отражает взаи-
модействие двух пигмент-белковых комплексов — светособирающего (антенного) комплекса и реакционного центра. Понятие ФСЕ было предложено в 1936 г. X. Гаффроном и К. Волем. В последующие годы идея ФСЕ была развита в работах Л.Дюйзенса (1952) — «уницентральная модель» и в работах Р. Клейтона (1965) — «мультицентральная модель».
Представление о ФСЕ — одно из фундаментальных положений современного фотосинтеза. В его основе лежат две идеи: 1) о групповом функционировании пигментов (была сформулирована по итогам работ Р. Эмерсона и В. Арнольда 1943 г., установивших, что в выделении одной молекулы О2 участвует комплекс, содержащий 2400 молекул хлорофилла) и 2) о функциональной гетерогенности пигментов. В опытах В.Н.Любименко (1930) с определением ассимиляционного числа (СО2/Хл) показано, что не все молекулы хлорофилла фотохимически активны: 99 % всех пигментов находятся в антенных комплексах и выполняют функцию сборщиков энергии, и только около 1 % пигментов, локализованных в реакционных центрах, непосредственно участвуют в процессах преобразования энергии. В результате формируется высокоэффективная система поглощения и преобразования световой энергии в первичных процессах фотосинтеза. Вторым фактором, определяющим высокую квантовую эффективность первичных процессов фотосинтеза, является структурнофункциональная организация непосредственно самого реакционного центра.
Первые схемы строения реакционных центров были предложены в 1969 г. Р. Клейтоном (для бактерий) и Л. Верноном (для высших растений). Активное изучение структурной организации реакционных центров охватывает период 1972— 1977 гг. В результате было выделено четыре основных типа реакционных центров, включающих пигменты — П870 (у пурпурных бактерии), П840 (у зеленых бактерий), П700 (у высших растений), относящийся к ФС1, и П680 (у высших растений) — к ФСИ. Дальнейшие исследования показали сходство структурной организации и механизма работы всех четырех типов реакционных центров, что позволяет говорить о высококонсервативной (в плане эволюции) организации структур фотосинтетического аппарата, осуществляющих процесс преобразования электромагнитной энергии в химическую. Благодаря строгой упорядоченности организации фотохимических реакционных центров в них структурно и функционально сопряжены быстрые первичные фотофизические процессы, протекающие со скоростью 10-12—10~9 с, и более медленные энзиматические процессы, имеющие скорость 10“5—10“2 с.
Структурная модель бактериального реакционного центра. Этот центр включает цитохром с2, 2 молекулы бактериохлорофилла, образующие димер с максимумом поглощения 870 нм («специальная пара»), 2 молекулы бактериохлорофилла с максимумом поглощения в области 800 нм, 2 молекулы бактерио- феофитина, 2 молекулы хинона в комплексе с Ее + и 2 молекулы р-каротина. Пространственная организация реакционного центра пурпурных бактерий представлена на рис. 3.28.
Компоненты бактериального реакционного центра организованы на трех субъединицах — L (light, 21 кДа), М (medial, 24 кДа), Н (heavy, 28 кДа). Комплекс L-M — минимальная единица, способная к фотохимическим реакциям. Комплекс очень гидрофобен и содержит мало полярных аминокислот. Субъединица Н более полярна и выполняет функции белкового экрана, препятствуя переносу электрона к внешнему акцептору.
В субъединицах L и М бактериального реакционного центра формируются две ветви переноса электронов — L и М. На оси симметрии находится П870 — димер («специальная пара»), который координируется с белками субъединиц L и М двумя молекулами гистидина. Рядом с димером П870 вдоль каждой ветви локализованы молекулы бактериохлорофилла 800 (BL и Вм). Каждая ветвь включает бактериофео- фитин (Феоь и Феом) и хинон — Ql Q (менахион) и QmQ (убихинон). Хотя отдельные компоненты реакционного центра образуют две ветви (L и М), фотохимически активна только L-ветвь. При возбуждении П870 электрон быстро (в течение 200 пс) переносится на первичный хинон (QA) вдоль L-ветви,
НаружнаяНаружнаяРис. 3.28. Пространственная организация реакционного центра пурпурных бактерий: L, М, Н — субъединицы; MQ — менахинон;UQ — убихинон. Объяснение в текстеРис. 3.28. Пространственная организация реакционного центра пурпурных бактерий: L, М, Н — субъединицы; MQ — менахинон;UQ — убихинон. Объяснение в текстеа затем на вторичный хинон (QB) М-ветви. В настоящее время считают, что причиной активности только L-ветви является структурная асимметрия реакционного центра. Так, хинон L-ветви (QA) представлен менахиноном (нафтохинон), в то время, как М-ветвь включает вторичный хинон QB — убихинон (бензохинон). Кроме того, различен аминокислотный состав субъединиц L и М, и в силу разного микроокружения мономеры бактериохлорофилла в диме
Наружная
Наружная
Рис. 3.28. Пространственная организация реакционного центра пурпурных бактерий: L, М, Н — субъединицы; MQ — менахинон;
UQ — убихинон. Объяснение в тексте
Рис. 3.28. Пространственная организация реакционного центра пурпурных бактерий: L, М, Н — субъединицы; MQ — менахинон;
UQ — убихинон. Объяснение в тексте
ре П870 не эквивалентны. В одной молекуле бактериохлорофилла при участии карбонильной группы (С=О) в V кольце и ацетильной группы (СН3—СО—) в I кольце образуются дополнительные водородные связи с ионизированными группами белка. Это увеличивает ее редокс-потенциал на 50—120 мВ (а следовательно, электрон-движущую силу) и обеспечивает движение электрона к бактериофеофитину по L-ветви (W. Williams, 1992).
На основании изучения кинетики переноса электронов высказано предположение об участии мономерного бактериохлорофилла П800 в перемещении электрона между П870 и БФеоь.
Реакционный центр фотосистемы II. Этот центр высших растений наиболее близок к реакционному центру пурпурных бактерий по структуре, составу пигментов и коферментов.
Реакционный центр ФСП был выделен в 1971 г. в работах Л. Вернона. В изучение его структурной организации особый вклад внесли исследования X. Т. Витта (1969), в которых методом дифференциальной спектрофотометрии был выделен пигмент Пб8о, и лаборатории А.А.Красновского (В. В. Климов, В. А. Шувалов, А.А. Красновский, 1977), в которых методом импульсной спектроскопии был найден первичный акцептор реакционного центра II — феофитин.
Современная модель реакционного центра ФСП и последовательность составляющих его редокс-компонентов представлены на рис. 3.29 и 3.34. Реакционный центр ФСП включает 6 молекул хлорофилла а: две молекулы образуют димер с максимумом поглощения 680 нм (П680), две дополнительные молекулы хлорофилла располагаются между ПС80 и феофитином (на рисунке не пока-
Рис. 3.29. Кофакторы переноса электронов реакционного центра ФСП:(Мп)4 — Mn-содержащий кластер; Tyrz — тирозин-161 белка D1 — первичный донор электронов для П680; цит. bsss — цитохром 6559; Хл2 — дополнительный хлорофилл a; QA, QB — пластохиноныРис. 3.29. Кофакторы переноса электронов реакционного центра ФСП:(Мп)4 — Mn-содержащий кластер; Tyrz — тирозин-161 белка D1 — первичный донор электронов для П680; цит. bsss — цитохром 6559; Хл2 — дополнительный хлорофилл a; QA, QB — пластохиноны
Рис. 3.29. Кофакторы переноса электронов реакционного центра ФСП:
(Мп)4 — Mn-содержащий кластер; Tyrz — тирозин-161 белка D1 — первичный донор электронов для П680; цит. bsss — цитохром 6559; Хл2 — дополнительный хлорофилл a; QA, QB — пластохиноны
Рис. 3.29. Кофакторы переноса электронов реакционного центра ФСП:
(Мп)4 — Mn-содержащий кластер; Tyrz — тирозин-161 белка D1 — первичный донор электронов для П680; цит. bsss — цитохром 6559; Хл2 — дополнительный хлорофилл a; QA, QB — пластохиноны
заны); две молекулы мономерного хлорофилла с максимумами поглощения 672 и 678 нм (Хл2 и Хло — сопровождающие пигменты) связаны с внутренней антенной ФСП — СР43 и СР47, через которую энергия возбуждения поступает в реакционный центр. В состав первичных акцепторов входят две молекулы феофитина, из которых только одна непосредственно участвует в фотохимических реакциях. Реакционный центр ФСП включает два хинона: QA в комплексе с железом (QAFe2+) и QB, а также две молекулы p-каротина и цитохром 6559. Донором электронов для восстановления окисленного П680 служит тирозин Z (Tyrz), сопряженный с (Мп)4-комплексом фотоокисления воды.
Реакционный центр организован на двух мембранных белках — D1 и D2. По аминокислотной последовательности они подобны L- и М-субъединицам реакционного центра пурпурных бактерий. Детальное описание структуры ФСП приведено в подразд. 3.6.2.1.
Главная функция реакционного центра ФСП — создание мощного окислительного потенциала. При возбуждении и фотоокислении П680 возникает П680 с редокс-потенциалом +1,12 В, способный индуцировать уникальный процесс фотоокисления воды и мобилизацию электронов из молекул воды, связанных с марганецсодержащим комплексом. Освобожденные электроны поступают в ЭТЦ и таким образом за счет энергии, поглощенной ФСП, и работы реакционного центра создается мощный восходящий поток электронов от воды к
последующим компонентам ЭТЦ и в итоге — к НАДФ+ с образованием НАДФН (-0,32 В).
Структурная модель реакционного центра фотосистемы I. Реакционный центр ФС1 по сравнению с реакционными центрами других типов построен наиболее сложно. Это обусловлено тем, что весь комплекс ФС1 работает в области высоких энергий. При возбуждении пигмента реакционного центра П700 и дальнейшего разделения зарядов возникают соединения с высоким восстановительным и энергетическим потенциалом. Для сохраненя и использования этого потенциала в дальнейших процессах преобразования энергии в реакционном центре ФС1 формируется очень сложный акцепторный комплекс, включающий 5 редокс- компонентов. Благодаря им перенос электронов с высоким энергетическим потенциалом от возбужденного П700 к стабильному акцептору в цепи переносчиков осуществляется с запасанием достаточно высокого количества энергии.
Состав редокс-кофакторов акцепторной системы реакционного центра ФС1 включает следующие компоненты:
+0,52 В ^ -1,2 В -1,1 В-0,9 В-0,7 В
П70°' П™ гУ^ ^ 1^ А1(вит. Kj 20—200 н<Г Fx 30_200 мк;
-0,6 В -0,55 В
-* Fa — FB
П700 — первичный электронный донор; в основном состоянии имеет редокс- потенциал +0,5 В, при возбуждении потенциал резко изменяется (-1,2 В); по химической структуре — димер хлорофилла о; Ао — первичный акцептор, мономер хлорофилла а; редокс-потенциал -1,1 В; А! — вторичный акцептор; витамин Кь филлохинон с потенциалом -0,9 В; Fx, FB и FA — терминальные акцепторы; железосерные белки с редокс-потенциалами соответственно -0,7, -0,6 и -0,55 В; содержат 4Ре-48-группы.
Эти редокс-центры образуют цепь, которая пересекает организованный в мембране комплекс ФС1 от люменальной стороны к стромальной. Расстояние между двумя соседними редокс-центрами около 1 нм, что обеспечивает эффективный перенос электронов.
Согласно новым данным, реакционный центр ФС1 подобно реакционному центру пурпурных бактерий содержит две симметричных ветви переноса электрона между П700 и Fx: ветвь А и ветвь В, соответственно с обозначением субъединиц А и В, составляющих ядро ФС1, на которых они расположены (рис. 3.30). В отличие от бактериального реакционного центра, где активна только L-ветвь, в реакционном центре ФС1 обе ветви участвуют в переносе электрона от П700 к Fx. Между П700 и Ао в обеих ветвях обнаружены дополнительные мономерные молекулы хлорофилла а (А). На расстоянии 1,6 нм от П700 находятся еще два хлорофилла, которые могут участвовать в переносе возбуждения от антенного комплекса к реакционному центру. Присутствие двух ветвей для начального разделения заряда должно удвоить скорость захвата энергии возбуждения и тем самым увеличить эффективность разделения зарядов в ФС1. Редокс- кофакторы реакционного центра ФС1 организованы на трех субъединицах — А, В, С. Пространственная организация ФС1 изложена в подразд. 3.6.2.2.
Увеличение редокс-потенциала в цепи акцепторов обеспечивает быстрое снижение энергии, что предотвращает обратный возврат электрона к пигмен-
Рис. 3.30. Организация редокс- кофакторов реакционного центра ФС1 (по Brettel, 1997, с изменениями).
П700 — димер хлорофиллов а и а', «специальная пара»; А — дополнительный хлорофилл а; Ао — хлорофилл а695 — первичный акцептор электронов; А] — витамин Кь фил- лохинон; Fx, FA, FB — [4Fe-4SJ- центры. Цифры на стрелках — расстояния между кофакторами
1,8
< П?00 (1,77 эВ)
Стандартная свободная энергия, эВ
1,6
П7оо Ад (1,52 эВ) — первичная У \ радикальная пара
-П700 V
П?оо А,
1,4
1,2
1,0
0,8
П?оо
П700 F" (1,22 эВ)
П700 (FAFB) (1,03 эВ) — вторичная радикальная пара
Рис. 3.31. Изменение свободной энергии при переносе электрона по акцепторному комплексу реакционного центра ФС1 (по Brettel, 1997, с изменениями)
ту и бесполезную трату энергии электронного возбуждения пигмента П$оо. Благодаря этому энергия электронного возбуждения эффективно используется для разделения зарядов. Система с разделенными зарядами содержит определенное количество свободной энергии. На рис. 3.31 показано изменение свободной энергии при переносе электрона по акцепторному комплексу. Свободная энергия возбужденного П*оо равна 1,77 эВ; свободная энергия первичной радикальной пары П700А0 — 1,52 эВ; свободная энергия вторичной радикальной пары П7оо(РдРв)~ — 1,03 эВ, что составляет 60 % от энергии поглощенного фотона (1,77 эВ). При переносе электрона по акцепторному комплексу энергия последовательных состояний снижается, но при этом время их жизни возрастает от 1 пс до 200 мкс, в результате чего энергия разделенных зарядов стабилизируется и запасается в конечных компонентах акцепторного комплекса.
МЕХАНИЗМ ПРЕОБРАЗОВАНИЯ ЭНЕРГИИВ РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРАХ
Анализ структуры реакционных центров бактерий и высших растений показывает, что общий принцип их организации в значительной степени одинаков. Первичные процессы фотосинтеза очень консервативны. Процесс преобразования одной формы энергии в другую диктует жесткие условия к структурной организации реакционных центров.
Особенности организации реакционных центров. Димерная структура пигмента реакционного центра. Две молекулы хлорофилла а расположены на двух субъединицах (L и М — у пурпурных бактерий; А и В — в фотосистеме I; D1 и D2 — в фотосистеме II). Димерная структура пигмента обеспечивает сдвиг максимума поглощения в длинноволновую область, что позволяет пигменту реакционного центра служить эффективной ловушкой энергии возбуждения других пигментов, используя их в качестве светосборщиков. При образовании димеров в два раза увеличивается площадь поперечного сечения пигмента, что обеспечивает эффективный захват фотона. В связи с образованием у димера более длинноволнового максимума поглощения снижается константа скорости флуоресценции, которая обратно пропорциональна длине волны излучения. Поскольку флуоресценция — конкурирующий процесс, димерная структура ограничивает бесполезную дезактивацию возбужденного состояния и потерю энергии в виде флуоресценции.
Первичный акцептор во всех реакционных центрах — тетрапиррол. Это увеличивает константу скорости переноса электрона, которая зависит от перекрывания орбиталей П и А, т.е. донора и акцептора электронов. Многокомпонентный акцепторный комплекс в реакционных центрах бактерий и растений позволяет эффективно осуществлять трансмембранное разделение зарядов. Увеличение редокс-потенциала в цепи акцепторов обеспечивает снижение энергии и увеличение электрон-движущей силы. Это позволяет быстро удалить электрон от пигмента («сток» электрона) и снизить возможность рекомбинации зарядов с бесполезной потерей энергии.
Таким образом, особенности структурной организации реакционных центров создают высокую квантовую эффективность первичных процессов и высокую скорость реакций переноса электронов. За счет близкого расположения П
и А и сходства их химической структуры константа скорости переноса электрона в реакционных центрах достигает 5 • 1О~10 с.
Фотохимический механизм преобразования энергии. Все реакционные центры имеют не только общий принцип организации, но и единый фотохимический механизм преобразования энергии. В реакционном центре происходит первичное фотохимическое разделение зарядов между фотовозбужденным пигментом реакционного центра П*РЦ) и первичным акцептором А. Поскольку П*рЦ) взаимодействует с А в реакциях окислительно-восстановительного типа, структура, осуществляющая преобразование энергии, должна быть способна к обратимым окислительно-восстановительным реакциям. Как известно, молекула хлорофилла способна к фотовосстановлению и фотоокислению. Исследования с применением лазеров и высокоскоростной импульсной спектрофотометрии показали, что в реакционном центре реализуется фотоокислительный путь. Реакция фотоокисления хлорофилла требует особых условий: присутствия ионов магния в центре молекулы (Дж. Гудхир, 1966) и слабокислых условий среды (В Б. Евстигнеев, 1967). Именно такие условия создаются в нем при освещении и векторном движении протонов во внутритилакоидное пространство.
В основе преобразования энергии лежит процесс разделения зарядов. Первичный этап включает две сопряженных окислительно-восстановительных реакции:
Av
Хл —► Хл+ + е (для реакции необходима затрата энергии, равная энергии ионизации хлорофилла);
А + ё —► А” (освобождается энергия, равная энергии ионизации акцептора А).
Энергия, запасаемая в процессе разделения зарядов, равна разности энергий ионизации акцептора и хлорофилла: Д£ = £А - Е№ Следовательно, чем меньше энергия ионизации хлорофилла, тем больше величина запасаемой энергии Д£. Снижение энергии потенциала ионизации Mg-порфиринов достигается: 1) включением Mg — металла с низким значением электроотрицательности по Полингу; 2) гидрированием двух полуизол ированных связей 3=4 и7=8 и переходом от структуры порфина к структуре хлорина или бактериохлорина — это увеличивает энергию орбиталей движения электронов и снижает энергию ионизации; 3) формированием димерной структуры. Поскольку две молекулы хлорофилла в димере не эквивалентны, при возбуждении димера П*РЩ происходит внутримолекулярный сдвиг электронов (образование диполя), что облегчает дальнейший перенос электронов на акцептор. Таким образом, в реакционном центре есть ряд механизмов, направленных на снижение энергии ионизации пигмента П*РЦ) и увеличение количеств запасаемой энергии.
Разделение зарядов в реакционном центре включает три стадии.
Первая стадия — первичное разделение зарядов. Высоко разрешающая техника в фемтосекундном интервале (1045 с) позволила выделить два процесса на начальной стадии преобразования энергии — перенос энергии и перенос электронов в реакционном центре:
^ Ш0ф7 П*8о-фео 3_6тГ Пб8о-Фео- 200 п^ П6+80-Фео-9А СпециальнаяПервичная ради-Вторичная ради-
паракальная паракальная пара
В первые мгновенья (в пределах 100 фс) устанавливается равновесие энергии возбуждения между П680 и молекулой хлорофилла а «внутренней» фокусирующей антенны, т.е. перенос энергии происходит быстрее, чем перенос электрона. До переноса электрона от П*80 на Фео происходит ряд событий. Так же, как и у пурпурных бактерий, реакционный центр ФСП асимметричен и две молекулы хлорофилла в димере не эквивалентны. В одной молекуле хлорофилла а (П0 кето-группа при С9 и кетоэфирная группа при С]0 образуют водородные связи с аминокислотами белка D1, а вторая молекула хлорофилла а (П2) на белке D2 образует только одну водородную связь за счет кетоэфирной группы (см. рис. 3.26) Поскольку П1 образует большее число водородных связей, ее редокс-потенциал выше и электрон-движущая сила больше. В связи с этим при возбуждении димера (П*) электрон переходит с одной молекулы хлорофилла в димере к П| и образуется диполь. Электрон локализуется на одной молекуле хлорофилла а в димере. Возникает переходное состояние, которое представляет собой состояние с переносом заряда. Образование диполя и локального электрического поля вблизи П] вызывает переориентацию окружающих молекул Н2О. Это приводит к изменению конформации специальной пары и снижению энергии П*8о, что облегчает перенос электрона к Фео. Таким образом, внутримолекулярное движение электрона в димере облегчает перенос электрона к Фео и, следовательно, сдвиг электрона в димере к П, можно рассматривать как начальную стадию разделения зарядов (Е. Эванс с сотр., 1993).
Вторая стадия — фотоокисление пигмента П^о- Разделение зарядов между возбужденным П*80 и первичным акцептором электрона Фео осуществляется в течение нескольких пикосекунд. В результате образуется первичная радикальная пара (П^-Фео). В течение следующих 200 пс происходит перенос электрона от Фео на Qa с образованием вторичной радикальной пары (П680-Фео-0А) — восстановленного QA и окисленного Пб80.
Третья стадия — восстановление пигмента. Окисленный пигмент Пб8о имеет высокий окислительно-восстановительный потенциал (+1,12 В) и является очень активным окислителем, который может вызвать окислительную деструкцию окружающих структур. Донором электрона для Пб8о в нормальных физиологических условиях является тирозин Z, для которого источником электрона служит сложная система фотоокисления воды. В ряде случаев при нарушении процессов фотоокисления воды в восстановлении Пб80 могут участвовать тирозин D, цитохром b^g, X.nz, р-каротин.
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИРЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРОВ БАКТЕРИЙ И ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ
Механизм преобразования энергии в реакционных центрах всех фотосинтезирующих организмов в принципе одинаков, однако энергетическая эффективность их работы существенно различается.
По структурной и биохимической организации реакционные центры ФСП и реакционные центры пурпурных бактерий очень близки. Аминокислотная последовательность белков D1 и D2 высших растений подобна последовательности для L и М субъединиц бактериального реакционного центра. Оба типа реакционных центров имеют сходный пигментный состав: 4 молекулы хлоро-
филла а (бактериохлорофилла а) и 2 молекулы феофитина (бактериофеофи- тина), кроме того, они включают близкие по химической природе коферменты (Fe-Q). Однако несмотря на общее структурное сходство, они значительно различаются в функциональном отношении.
П68О генерирует очень высокий окислительный потенциал. Редокс-потенциал П68о на 600 — 800 мВ более положителен (+1,12 В), чем у П870 (+0,4 В). Это может быть связано с существенными различиями в структуре хромофора и в молекулярном окружении. Окисленный Пб80 — один из наиболее сильных окислителей, генерируемых в биологических системах и поэтому может осуществлять уникальный процесс фотоокисления Н2О до молекулярного кислорода. ФСП содержит систему окисления воды, главными компонентами которой являются 4Мп-кластер и тирозин Z.
В связи с тем, что димерная структура ФСП существенно отличается от бактериального реакционного центра (иная геометрия специальной пары, большее расстояние между мономерами хлорофилла а в димере), энергия экситон- ного сопряжения в димере П680 значительно меньше (300 см"1), чем у пурпурных бактерий (1300— 1900 см"1); в димере ФС1 она равна 400 см"1.
Уменьшение экситонного сопряжения в ФСП снижает красный сдвиг специальной пары димера П680 относительно дополнительных хлорофиллов. Так, у пурпурных бактерий дополнительный бактериохлорофилл поглощает при 800 нм, тогда как димер имеет максимум поглощения при 870 нм. Различия по энергии составляют 1000 см"1, или 0,15 эВ. Для реакционного центра ФСП максимум поглощения димера — 680 им, дополнительного пигмента — 670 нм, т.е. различия в энергии достигают только 200 см"1, или 0,03 эВ. В результате перенос энергии в реакционном центре пурпурных бактерий осуществляется довольно легко («глубокая ловушка»), тогда как в реакционном центре ФСП перенос и захват энергии затруднены («мелка ловушка») и разделение зарядов будет ограничено захватом энергии. Медленная скорость захвата энергии позволяет регулировать уровни возбужденных состояний в антенне ФСП, что защищает реакционный центр от фотоингибирования. Оба явления — снижение экситонного сопряжения и уменьшение различий в энергии дополнительных хлорофиллов и специальной пары (димера) — отражают определенную стратегию эволюции окси генных реакционных центров.
Вследствие отмеченных различий реакционный центр ФСП в термодинамическом отношении намного более эффективен реакционного центра пурпурных бактерий. В ФСП квант при 680 нм (1,84 эВ) используется для фотоиндуцирован- ного разделения зарядов с образованием стабильной радикальной пары П^о—Qa Редокс-потенциал Пб80 равен +1,12 В, потенциал QA составляет -0,13 В. Таким образом, из энергии поглощенного фотона 1,84 эВ в стабильной радикальной паре сохраняется 1,25 эВ, т. е. эффективность составляет 68 %. Для реакционного центра ФС1 эта величина составляет 58 %. У пурпурных бактерий фотоны с энергией 1,44 эВ (870 нм) продуцируют стабильную радикальную пару П870— QA, которой соответствует энергия 0,5 эВ, т.е. эффективность процесса равна 35 %.
Таким образом, реакционный центр ФСП эволюционировал так, что его эффективность разделения зарядов оказалась вдвое выше по сравнению с реакционным центром пурпурных бактерий. Следовательно, эволюция стратегии слабого сопряжения создает значительное преимущество в эффективности фотохимического преобразования энергии в реакционных центрах оксигенных систем.
ЭЛЕКТРОН-ТРАНСПОРТНАЯ ЦЕПЬ ХЛОРОПЛАСТОВ
Фотохимические процессы в реакционных центрах ФС1 и ФСП приводят к быстрому первичному запасанию энергии квантов света в форме лабильных соединений с высоким энергетическим потенциалом. Дальнейшие реакции фотосинтеза направлены на преобразование энергии света в более стабильную форму: сначала в форму восстановленного НАДФН и АТФ, а затем, при использовании этих продуктов в реакциях углеродных циклов, — в форму углеводов и других стабильных органических соединений. Образование восстановленного НАДФН и АТФ в хлоропластах связано с работой электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) фотосинтеза.
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯЭЛЕКТРОН-ТРАНСПОРТНОЙ ЦЕПИ ХЛОРОПЛАСТОВ
Электрон-транспортная цепь — это цепь редокс-агентов, определенным образом расположенных в мембране хлоропластов, осуществляющих фотоин- дуцируемый транспорт электронов от воды к НАДФ+ (рис. 3.32, 3.33). Движущей силой транспорта электронов по ЭТЦ фотосинтеза являются окислительно-восстановительные реакции в реакционных центрах (РЦ) двух фотосистем (ФС). Первичное разделение зарядов в РЦ ФС1 приводит к образованию силь-
Е., В
-1,2 -
—1,0 -
-0,8
(П(8о)
-0,6
-0,4
-0,2
0
Qa"Qb
+0,2
ФСП
PQ
PQ
PQ
Цит. b6L
Цит. Ь^Н
+0,4
+0,6
+0,8
н2оч
I S-компле
Цитохром66/- комплекс
(П700)
Й/Рв
фД "-ФНР—НАДФ
Fe2S2^
Цит./-—Пц
сс
+1,0
- ’. Tyrz
O2+4H+ X
+1,2
Рис. 3.32. Электрон-транспортная цепь хлоропластов(Z-схема фотосинтеза):
S — водоокисляющий комплекс; Tyrz — донор электроновреакционного центра ФСП (тирозин-161 белка D1); Фео —
феофитин; QA, QB — пластохиноны, вторичные акцепторы электронов ФСП; PQ — пул пластохи-нонов; цит. Ь(Н — цитохром Ь6 высокопотенциальный; цит. b6L — цитохром Ь6 низкопотенциаль-ный; Fe2S2 — центр Риске; цит./— цитохром/; Пц — пластоцианин; Ад — хлорофилл а (первич-ный акцептор электронов реакционного центра ФС1); А, — витамин К,; Рл, F^, Fe — железосер-ные белки акцепторного комплекса ФС1; ФД — ферредоксин; ФНР — ферредоксин-НАДФ+-оксидоредуктаза
Фотосистема I
Рис. 3.33. Схема организации ЭТЦ в мембранах тилакоидов:
CCKI — светособирающий комплекс I; ССКН — свстособирающий комплекс II (мобильная антенна); PQ — пластохинон окисленный; PQHZ — пластохинон восстановленный (пластохи- нол); FQR — ферредоксинхинон-оксидоредуктаза. Остальные обозначения, как на рис. 3.32
кого восстановителя А”, окислительно-восстановительный потенциал которого обеспечивает восстановление НАДФ+ через цепь промежуточных переносчиков. В РЦ ФСП фотохимические реакции ведут к образованию сильного окислителя Пб80, который вызывает ряд окислительно-восстановительных реакций, приводящих к окислению воды и выделению кислорода. Восстановление П700, образованного в РЦ ФС1, происходит за счет электронов, мобилизованных из воды фотосистемой II, при участии промежуточных переносчиков электронов (пластохинонов, редокс-кофакторов цитохромного комплекса и пластоцианина). В отличие от первичных фотоиндуцированных реакций разделения зарядов в реакционных центрах, идущих против термодинамического градиента, перенос электрона на других участках ЭТЦ идет по градиенту окислительно-восстановительного потенциала и сопровождается высвобождением энергии, которая используется на синтез АТФ.
Компоненты ЭТЦ хлоропластов, их природаи физико-химические свойства
ЭТЦ хлоропластов включает ряд переносчиков, общих для всех типов ре- докс-цепей живых организмов. К ним относятся цитохромы, железосерные белки, хиноны, флавиновые ферменты и пиридиннуклеотиды (см. гл. 2). Вместе с тем в ЭТЦ хлоропластов входят специфические переносчики электронов, такие как циклические тетрапирролы (хлорофиллы реакционных центров, феофитин), марганецсодержащий кластер, осуществляющий окисление воды, некоторые аминокислотные остатки белков (тирозин в ФСП) и медьсодержащий белок пластоцианин.
Редокс-агенты ЭТЦ хлоропластов включены в состав трех интегральных мультипептидных комплексов, расположенных в мембранах тилакоидов, — ФС1, ФСП и цитохромный ^/-комплекс. Кроме того, некоторые компоненты ЭТЦ свободно перемещаются по поверхности мембраны (пластоцианин, ферредоксин) или в ее толще (пластохиноны) и осуществляют связь между функциональными комплексами (см. рис. 3.33). Ниже дана краткая характеристика редокс-компонентов ЭТЦ хлоропластов.
Цитохромы в ЭТЦ хлоропластов представлены двумя цитохромами группы b (цитохром 6559 и цитохром 6563, или цитохром Ьф и цитохромом группы с (цитохром Л- Каждый из двух цитохромов группы Ь найден в хлоропластах в виде двух редокс-форм — низкопотенциальной (Е) и высокопотенциальной (И). Цитохромы Ь6 (цит. b6L с £0' = -0,15 В и цит. Ь6Нс Её = -0,05 В), а также цитохром / (Её = +0,37 В) входят в состав цитохромного /^/-комплекса и участвуют в окислении пластохинолов и восстановлении пластоцианина; цитохром 6559 связан с комплексом ФСП.
Железосерные белки. В ЭТЦ хлоропластов входят 3 железосерных центра, содержащих [4Fe-4S]~ кластеры F^, F^ и Fs, и 2 белка с [2Ре-28]-кластерами — ферредоксин (ФД) и центр Риске. Железосерные кластеры Р^, Р^ и Р5 и ферредоксин отличаются низкими окислительно-восстановительными потенциалами (от -0,7 В до -0,42 В). Они участвуют в восстановлении НАДФ+ в ФС1. Центр Риске имеет необычно высокий для железосерных белков окислительно-восстановительный потенциал (около +0,3 В). Он находится в цитохромном ^/-комплексе и осуществляет окисление пластохинолов.
Хиноны. Представители двух групп хинонов — бензохиноны (пластохиноны) и нафтохиноны (филлохинон) включены в ЭТЦ фотосинтеза. Филлохинон (витамин К^ — переносчик электронов на акцепторной стороне ФС1 (АЦ, участвует в переносе электронов от первичного акцептора электронов (Ао) к железосерному кластеру F^. Имеет очень низкий окислительно-восстановительный потенциал (около -0,8 В). Пластохиноны (PQ) осуществляют транспорт электронов на акцепторной стороне ФСП (QA и QB), а также между комплексом ФСП и цитохром ^/-комплексом в составе пула пластохинонов. Окислительно-восстановительный потенциал пластохинонов близок к нулю.
Флавинсодержащий переносчик электронов ЭТЦхлоропластов. Фермент ферредоксин НАДФ оксидоредуктаза (ФНР) содержит в качестве редокс-кофактора ФАД. Восстанавливает НАДФ+ в ФС1. Электроны для восстановления получает от восстановленного ферредоксина (ФД). Окислительно-восстановительный потенциал равен -0,36 В.
Пластоцианин (Пц) — водорастворимый белок, содержащий 1 атом меди. Осуществляет перенос электронов по одноэлектронному типу, причем атом меди изменяет свою валентность (Си -•-*- Си ). Окислительно-восстановительный потенциал Пц равен +0,37 В. Пц восстанавливает окисленный пигмент РЦ ФС1 П7оо и окисляет цитохром /цитохром ^/-комплекса хлоропластов.
Марганецсодержащий кластер (Мп-кластер1). Располагается в комплексе ФСП и образует систему окисления воды (5). Кластер включает 4 атома марганца, валентность которых меняется в ходе индуцируемых светом окислительно-восстановительных реакций. Окислительно-восстановительный потенциал максимально окисленного кластера около +0,9 В. Mn-кластер окисляет воду с образованием молекулярного кислорода.
Электроны от Mn-кластера передаются на Пб8о через промежуточный переносчик электронов (Tyrz) — остаток тирозина (Туг-161) белка D1 ФСП. Окислительно-восстановительные реакции идут с образованием нейтрального радикала тирозина.
Тетрапиррольные переносчики электронов — уникальные компоненты ЭТЦ хлоропластов. Они являются первичными донорами и первичными акцепторами электронов в реакционных центрах ФС1 и ФСП. Окислительно-восстановительные реакции циклических тетрапирролов сопровождаются образованием заряженных радикалов.
Z-схема фотосинтеза. Нециклический, циклический, псевдоциклический транспорт электронов в хлоропластах
Последовательность расположения редокс-агентов в ЭТЦ хлоропластов в соответствии с их окислительно-восстановительным потенциалом и данными по их локализации в комплексах отражает Z-схема фотосинтеза (см. рис. 3.32). Согласно Z-схеме, существует последовательный перенос электронов от ФСП к ФС1 и две фотосистемы объединяются в единую цепь переноса электронов от воды к НАДФ+. Представление о существовании в хлоропластах двух фотосистем и их совместной последовательной работе впервые возникло в 1940-е гг. на основании опытов лаборатории Р. Эмерсона, обнаруживших эффект красного падения квантового выхода фотосинтеза при освещении хлоропластов монохроматическим дальним красным светом (Х> 680 нм), возбуждающим только ФС1, и эффект усиления квантового выхода фотосинтеза при добавлении к дальнему красному свету подсветки с длиной волны около 650 нм (возбуждающей ФСП). Позднее было показано, что в хлоропластах транспорт электронов возможен не только от воды к НАДФ+ с участием двух фотосистем, но и другие альтернативные пути с участием лишь одной из двух фотосистем. Кроме того, конечным акцептором электронов в ЭТЦ фотосинтеза вместо НАДФ+ может выступать молекулярный кислород. В настоящее время различают нециклический, циклический и псевдоциклический транспорт электронов в хлоропластах.
Нециклический транспорт электронов — это перенос электронов от воды к НАДФ+, осуществляемый с участием двух фотосистем, цитохромного ^/-комплекса и промежуточных низкомолекулярных переносчиков — пула пластохинонов (PQ), пластоцианина (Пц), ферредоксина (ФД) и ферредоксин-НАДФ- оксидоредуктазы (ФНР). Он сопровождается выделением кислорода и восстановлением НАДФ+. Сопряжен с синтезом АТФ (нециклическое фотофосфорилирование).
Циклический поток электронов осуществляют отдельно ФС1 или ФСП.
Циклический транспорт с участием ФС1 (см. рис. 3.33) включает перенос электронов от восстановленного ферредоксина (ФДВОСст) обратно к окисленному П700. При этом участвует пул пластохинонов, цитохром 66-/комплекс и, вероятно, особый фермент ФД-хиноноксидоредуктаза (FQR). Циклический поток электронов с участием ФС1 сопряжен с синтезом АТФ (циклическое фотофосфорилирование) и может обеспечивать дополнительный синтез АТФ, необходимый для процессов ассимиляции углерода. Он может быть альтернативным путем использования энергии света при его высоких интенсивностях.
Рис. 3.34. Структурно-функциональная организация комплекса ФСП (по Wei-Zhong Не, 1996, с изменениями):
(Мп)4 — Mn-содержащий кластер; Tyrz — тирозин-161 белка D1 — первичный донор электронов для Пб80; TyrD — тирозин-161 белка D2; цит. 6559 — цитохром 6559; Хл7, ХлГ) — сопровождающие хлорофиллы о; Кар — p-каротин; QA, QB — пластохиноны; I — белок; а, р— субъединицы.
Пунктиром обозначен возможный циклический поток электронов
Циклический поток электронов в ФС//связан с обратным переносом электронов от восстановленных первичных хинонов QA и (или) QB к окисленному пигменту реакционного центра Пб80. При этом участвуют цитохром 6559, р-каротин и сопровождающие молекулы хлорофилла а (Хл7 или Хло) реакционного центра ФСП (рис. 3.34).
Циклический поток электронов в ФСП является альтернативным путем использования энергии света. Он активируется в условиях, когда интенсивность света превышает возможности ЭТЦ утилизировать его энергию или при повреждении водоокисляюшей системы хлоропластов.
Псевдоциклический поток электронов — перенос электронов от воды на кислород — впервые был исследован А. Мелером (Mehler, 1951) и назван его именем — реакция Мелера.
Восстановление кислорода может происходить как в ФС1, так и в ФСП. При этом поглощение кислорода может компенсировать его выделение в ходе окисления Н2О. В результате единственным продуктом этого процесса, как и в случае циклического потока электронов, будет АТФ, синтезируемая при псевдоцикл ическом фотофосфорилировани и.
Псевдоциклический поток электронов приводит к образованию активных форм кислорода (супероксиданионрадикала О|, перекиси водорода Н2О2), поэтому активация процесса может вызвать нарушения фотосинтетического аппарата. Этот альтернативный транспорт электронов активируется при высоких интенсивностях света в условиях дефицита в хлоропластах окисленного НАДФ+. '
ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ КОМПЛЕКСЫ ЭТЦ ХЛОРОПЛАСТОВ
ЭТЦ фотосинтеза организована в мембранах тилакоидов в виде трех отдельных функциональных комплексов — ФС1, ФСП и цитохромый ^/-комплекс, — связанных между собой подвижными низкомолекулярными редокс- компонентами — липорастворимыми пластохинонами и водорастворимым периферическим белком пластоцианином. Кроме того, в переносе электронов на участке цепи от ФС1 к НАДФ+ участвуют два периферических белка — ферредоксин и ферредоксин-НАДФ-оксидоредуктаза (см. рис. 3.33).
К настоящему времени в основном определены полипептидный состав и субмолекулярная организация комплексов, установлена локализация в них редокс-кофакторов. Биохимический и генетический подходы позволили выявить функциональную роль отдельных белковых субъединиц. Показано, что комплексы ФС1 и ФСП имеют общий принцип организации: в каждом из них можно выделить центральную часть — структурное и функциональное ядро, способное осуществлять основные, характерные для всего комплекса реакции и периферические домены. Белки ядра присоединяют компоненты РЦ и вторичные переносчики электронов, а также пигменты внутренних фокусирующих антенн. Периферические домены комплексов включают белки, связывающие пигменты внешней антенны комплекса, а также белки, участвующие во взаимодействии с подвижными переносчиками электронов или выполняющие структурную и регуляторную роль. Как правило, белки центральной части комплекса кодируются хлоропластным геномом, тогда как белки периферических доменов кодируются в ядре.
Комплекс фотосистемы II. Механизмы фотоокисленияводы и выделения молекулярного кислорода
Комплекс ФСП осуществляет окисление воды и восстановление пластохинонов, т. е. является Н2О-пластохиноноксидоредуктазой. Окислительно-восстановительные реакции в комплексе инициируются светом. В ходе первичных фотохимических реакций в РЦ ФСП образуется сильный окислитель П^о с уникально высоким редокс-потенциалом (£0' = +1,12 В), который способен вызвать цепь окислительно-восстановительных реакций, приводящих в итоге к окислению воды. Система окисления воды ФСП поставляет электроны в ЭТЦ хлоропластов, которые через ряд промежуточных переносчиков (пластохиноны, цитохром 66/-комплекс и пластоцианин), попадают в ФС1 и используются на восстановление НАДФ+. Фотолиз воды, осуществляемый ФСП, сопровождается выделением молекулярного кислорода. Благодаря этому процессу фотосинтез растений является основным источником кислорода на Земле.
Пептидный состав, редокс-центры, структурная организация ФСП. Комплекс ФСП высших растений и водорослей включает около 20 полипептидов, большая часть которых представлена интегральными белками, и только 5 полипептидов располагаются на поверхности мембраны, обращенной к люмену, формируя периферийный домен комплекса. Структурно и функционально в комплексе ФСП можно выделить ядро, ряд низкомолекулярных интегральных белков, примыкающих к ядру, функциональная роль которых остается до сих пор
не вполне ясной, и белки водоокисляющего комплекса (ВОК). Структурно-функциональная организация комплекса ФСП представлена на рис. 3.34.
Редокс-агенты, участвующие в транспорте электронов ФСП, располагаются в центральной части — ядре — комплекса ФСП и связаны с интегральными белками D1 и D2. Белки D1 (38 кДа) и D2 (39 кДа) имеют высокую степень гомологии друг с другом по первичной структуре и сходное расположение в мембране. Аминокислотные последовательности белков D1 и D2 также очень близки аминокислотным последовательностям L- и М-полипептидов реакционного центра пурпурных бактерий. Белки образуют по 5 трансмембранных а-спиралей, аминокислотные остатки которых и связывают компоненты реакционного центра ФСП, а также редокс-кофактры вторичного транспорта электронов. На белках D1 и D2 организован димер П680. Кроме того, каждый из белков присоединяет еще по 2 молекулы хлорофилла а (дополнительный и сопровождающий хлорофиллы), молекулу феофитина а (Фео), p-каротин и пластохинон (QA связан с белком D2, a QB — с белком D1). Между QA и QB находится ион двухвалентного железа, в координировании которого участвуют оба белка. Люменальный домен полипептида D1 присоединяет 4 иона марганца и формирует Мп-кластер, осуществляющий окисление воды. По данным рентгеноструктурного анализа, пигмент реакционного центра П680 располагается в области ФСП, обращенной к люменальному пространству тилакоида. На противоположной стороне комплекса, обращенной к строме, находятся хиноны Qa и Qb и негеминовое железо. Почти симметрично оси, соединяющей П68() и негеминовое железо, на каждом из белков располагаются остальные тетра- пиррольные кофакторы: молекулы феофитина (на белке D1 — ФеоА, на белке D2 — Феов), сопровождающие хлорофиллы (Хл2 и Хло) и дополнительные хлорофиллы, занимающие промежуточное положение между пигментом реакционного центра и Фео (ВА — на белке D1, Вв — на белке D2, на рисунке не показаны).
Кроме белков D1 и D2 в состав ядра ФСП входят белки СР47и СР43, которые связывают около 30 молекул хлорофилла а и составляют внутреннюю, фокусирующую антенну комплекса, цитохром Ь559, включающий а- и р-субъ- единицы, участвующий в циклическом транспорте электронов в ФСП и наряду с белком I (4,8 кДа) необходимый для сборки функционально активного комплекса ФСП. Таким образом, ядро комплекса ФСП, способное окислять воду и восстанавливать пул пластохинонов, составляют белки DI, D2, СР47, СР43, а- и р-субъединицы цитохрома 6559 и белок I (см. рис. 3.34).
Оптимизацию работы системы окисления воды обеспечивают 3 гидрофильных белка с молекулярными массами 33, 23 и 17 кДа. Они составляют периферийный домен комплекса ФСП. Эта группа белков, называемых белками водоокисляющего комплекса (ВОК), располагается на люменальной стороне мембраны вблизи локализованного на белке D1 марганцевого кластера и играет структурную и регуляторную роль в системе окисления воды. Белок 33 кДа влияет на состояние марганцевого кластера, а два других белка важны для создания в области марганцевого кластера необходимой для окисления воды концентрации ионов кальция и хлора.
С комплексом ФСП связаны полипептиды, составляющие внешнюю (дистальную) антенну комплекса. Одни из них (Lhcbl, 2, 3) образуют мобильную антенну — светособирающий комплекс II (ССКП), другие (Lhcb4-6) представляют
собой группу минорных, низкомолекулярных белков {СР29, СР26, СР24), занимающих промежуточное положение между ядром комплекса и ССКП. Белки дистальной антенны присоединяют более 150 молекул хлорофилла а и около 100 молекул хлорофилла Ь, осуществляющих поглощение и передачу энергии света в реакционные центры ФСП. В дистальную антенну входят также около 50 молекул каротиноидов, функция которых связана не только с поглощением и передачей энергии, но также с защитой комплекса ФСП от избыточной энергии света.
Транспорт электронов в ФСП. Первичные фотохимические реакции в РЦ ФСП запускают вторичный транспорт электронов по ЭТЦ. Акцепторная сторона ЭТЦ ФСП осуществляет перенос электрона от восстановленного Фео" к пулу пластохинонов. Донорная сторона ЭТЦ включает ряд окислительно-восстановительных реакций, приводящих к окислению воды. При этом электроны воды используются для восстановления первичного донора электронов Пб80. Процесс сопровождается выделением молекулярного кислорода и переносом протонов в люменальное пространство.
Рассмотрим подробно окислительно-восстановительные процессы, проходящие на донорной и акцепторной сторонах ЭТЦ фотосистемы II.
Донорная сторона ЭТЦ ФС//связана с работой системы окисления воды и передачей электронов от воды к П^о через промежуточный переносчик электронов Tyrz — остаток тирозина белка D1 (Туг-161).
Окисление, или фотолиз, воды — уникальное свойство ФСП растений. Процесс окисления воды при фотосинтезе приводит к выделению кислорода без образования промежуточных продуктов окисления и описывается уравнением
2Н2О -* О2 + 4Н+ + 46-
Механизм окисления воды в настоящее время еще не вполне понятен, но можно считать экспериментально доказанными следующее. Движущей силой окисления воды является образование в ходе первичных фотохимических реакций очень сильного окислителя П^о- Потенциал П^о (+1,12 В) достаточно высок, чтобы произвести окисление воды, окислительно-восстановительный потенциал которой около +0,8 В. Однако окисление воды осуществляет не сам окисленный пигмент реакционного центра П^о, а особая система окисления воды, включающая марганцевый кластер (Мп-кластер). Между Mn-кластером и окисленным П^о имеется промежуточный переносчик электронов Tyrz — остаток тирозина белка D1 {Туг-161). Одна из современных моделей, описывающих процесс окисления воды в марганцевом кластере, основана на металло-радикальном механизме, согласно которому существует тесное взаимодействие двух реакций — окисления тирозина и окислительно-восстановительной реакции в марганцевом комплексе. Близость расположения Tyrz к марганцевому кластеру позволяет рассматривать тирозин как компонент водоокисляющей системы ФСП.
Последовательность реакций представляется следующим образом. Первым событием, происходящим вслед за первичным разделением заряда в РЦ ФСП, является окисление Tyrz и восстановление П^о- Окисление тирозина идет с образованием нейтрального радикала (Yz), что указывает на сопряженность процесса отнятия электрона от гидроксила тирозина с процессом передачи его протона на акцептор.
В качестве акцептора протона могут выступать остатки гистидина Н190 и глутаминовой кислоты Е189 белка D1, расположенные вблизи тирозина-161 (Y161, Yz\ Далее протон может быть передан по цепочке аминокислот к люме- нальной поверхности мембраны, где происходит либо локальное изменение концентрации протонов, либо выброс протона в люменальное пространство. Восстановление тирозина идет за счет работы марганцевого кластера и окисления воды: образующийся нейтральный радикал Y^ осуществляет отрыв атомов водорода от субстратной воды, связанной с атомами Мп в кластере. Полное окисление воды и образование кислорода требует четырехкратного повторения описанных событий.
Состояние системы окисления воды меняется в зависимости от уровня окис- ленности атомов марганца в кластере. Представление о существовании отдельных функционально различимых состояний (5-состояний) водоокисляющей системы возникло на основе результатов работ П. Жолио с сотр. (1969). Используя мощные кратковременные вспышки света для индукции выделения кислорода в адаптированных к темноте хлоропластах, исследователи обнаружили осцилляцию выделения кислорода с периодом 4 (рис. 3.35, А\ Первые две вспышки не приводили к заметному выделению кислорода. Максимальное количество кислорода выделялось на третью вспышку, второй максимум приходился на четвертую вспышку. После примерно 20 вспышек устанавливалась стационарная величина выделения кислорода. Для объяснения этих результатов была пред-
612182430
Номер вспышки А
Mn4 (II, III, IV2)
или (III3, IV) 50
Mn4(III2, IV2)
Рис. 3.35. Фотоокисление воды в хлоропластах: А — выделение кислорода хлоропластами в ответ на серию кратковременных вспышек (по Joliot et al., 1969); Б — модель изменения 5-состояний системы окисления воды при освещении (по Kok et al., 1970); В — модель изменений степени окисленности ионов марганца при освещении (по Robblee et al., 2001). Объяснение в тексте
[5,1
е
Мп4 (III, 1У3у
Мп4(Ш, IV3)
ложена модель работы водоокисляющей системы (В. Кок et al., 1970), согласно которой система окисления воды может находиться в различных состояниях, обозначаемых 50, 51, 52, 53, S4 (рис. 3.35, Б). Переход из одного состояния в следующее совершается в результате действия вспышки света и удаления электрона из системы. Выделение молекулярного кислорода из двух молекул воды происходит лишь при переходе из состояния 53 в состояние 54, причем состояние 54 нестабильное и сразу же переходит в состояние 50. Согласно современным представлениям, в ходе 5-цикла изменяется валентность двух из четырех составляющих кластер атомов Мп. Схема возможного поэтапного изменения валентности марганца представлена на рис. 3.35, В. В результате изменения окислительно-восстановительных свойств кластера достигается высокий положительный окислительно-восстановительный потенциал (Её около +0,9 В) и становится возможным окисление воды.
Окисление воды сопровождается выделением 4 протонов в люменальное пространство тилакоидов, однако оно не синхронно с выделением кислорода: по одному протону Н+ выделяется при переходе из состояния 50 в 5| и из состояния Sv в 52, два оставшихся протона выделяются после перехода из состояния 53 в состояние 50 через нестабильное состояние 54.
В организации водоокисляющей системы хлоропластов участвуют как минимум 4 атома марганца, связанных с белком D1. Кроме того, для активной работы системы окисления воды требуются ионы хлора и кальция. Одна из моделей пространственной организации Mn-кластера представлена на рис. 3.36.
Альтернативный путь восстановления П^п- В условиях нарушения донорного участка ЭТЦ фотосистемы П, например при повреждении системы окисления воды, восстановление П^о идет за счет альтернативных доноров электронов (см. рис. 3.34). К ним относятся цитохром 6559, сопровождающий хлорофилл Хл2, и ^-каротин (Кр). При реализации этого пути транспорта электронов непосредственным донором электронов для окисленного П^о является р-каро-
Рис. 3.36. Схема организации Mn-кластера (по Tommas, Babcock, 2000)
тин. Его окисление приводит к окислению хлорофилла Хл? и (или) цитохрома 6559. Восстановление этих компонентов может происходить с участием пластохинона ФСП QB. Таким образом, в ФСП возможен циклический транспорт электронов, позволяющий восстановить окисленный Пб80 при заблокированном потоке электронов от воды.
В ФСП обнаружены две формы цитохрома 6559: высокопотенциальная (цит. b^H, Eq = +0,37 В) и низкопотенциальная (цит. b559L, Её = +0,08 В). Высокопотенциальная форма протонирована, низкопотенциальная — депротонирована. При определенных условиях наблюдается взаимопревращение двух форм цитохрома 6559, поэтому цитохром Ь559 может осуществлять не только циклический транспорт электронов, но и трансмембранный транспорт протонов в ФСП в ходе редокс-реакций.
Акцепторая сторона ЭТЦ ФСП включает первичный акцептор электронов реакционного центра — феофитин (Фео) и вторичные акцепторы электронов — пластохиноны QA и QB, осуществляющие перенос электронов от Фео" на пул пластохинонов (PQ). Пластохиноны А и В составляют так называемый «двухэлектронный затвор» на акцепторной стороне ФСП. Переход от одноэлектронного типа переноса электронов к двухэлектродному на уровне пластохинонов Qa и Qb происходит следующим образом. Одноэлектронное восстановление QA приводит к образованию семихинона, который сейчас же передает электроны на QB. При этом QA окисляется и готов принять следующий электрон от Фео", a QB находится в форме семихинона до следующего акта передачи электронов от Qa. Получив от Qa второй электрон, QB полностью восстанавливается, используя два Н+ из стромального пространства. В форме пластохинола QBH2 он диссоциирует из комплекса ФСП в гидрофобную фазу мембран и становится компонентом пула пластохинонов. Для передачи электрона от QA к QB необходим ион двухвалентного железа.
Комплекс фотосистемы I
Фотосистема I (ФС1) является пластоцианин-ферредоксин-оксидоредуктазой. Окислительно-восстановительные реакции в ФС1 индуцируются светом. Фотохимическое разделение зарядов в РЦ ФС1 приводит к формированию сильного восстановителя Ад (Её = -1,1 В), способного через цепь переносчиков электронов осуществить восстановление НАДФ+ Таким образом, при участии ФС1 синтезируется НАДФН — источник электронов для последующих реакций восстановления углерода в хлоропластах. Кроме того, ФС1 может осуществлять циклический транспорт электронов, сопряженный с синтезом АТФ, обеспечивая дополнительный синтез АТФ в хлоропластах.
Пептидный состав, редокс-центры, структурная организация ФСК Комплекс ФС1 хлоропластов растений и водорослей включает 13 пептидов, из которых 8 — интегральных и 5 — периферических. В структуре комплекса выделяют центральную интегральную часть (ядро) и два периферийных домена — со стороны стромы и со стороны люмена. К комплексу ФС1 примыкают белки внешней антенны CCKI, которые в отличие от ССКП не меняют своего расположения в мембране и всегда связаны с комплексом ФС1. Структурная организация комплекса ФС1 показана на рис. 3.37.
Рис. 3.37 Структурно-функциональная организация комплекса ФС1.
Буквами обозначены отдельные пептиды. Остальные обозначения, как на рис. 3.32
Кофакторы ЭТЦ, осуществляющие первичный и вторичный транспорт электронов в ФС1, связаны с двумя наиболее крупными интегральными белками комплекса — А (83 кДа) и В (82,4 кД), а также с белком С (8,9 кДа), расположенным на поверхности мембраны со стороны стромы. Белки А и В присоединяют димер П700, по одной молекуле мономера хлорофилла а (Хл695) — первичного акцептора электронов (Ао), по одному дополнительному хлорофиллу а (А) (на рисунке не показано), и по одной молекуле филлохинона (А,), а также железосерный кластер Рл. Белок С содержит редокс-центры терминального участка ЭТЦ ФС1: Fz и Fs.
По данным рентгеноструктурного анализа кристаллов ФС1, редокс-цепь пронизывает комплекс от люменальной к стромальной части (П700 расположен ближе к люменальной стороне комплекса, F^- — ближе к строме). Два набора дополнительных хлорофиллов (А), первичных акцепторов электронов (Ао) и филлохинонов формируют две почти симметричные ветви транспорта электронов от П700 к Fy (см. рис. 3.37). В отличие от реакционных центров бактерий и ФСП, где из двух ветвей транспорт электронов осуществляет лишь одна, в ФС1 активны обе ветви транспорта электронов, хотя они неидентичны.
Белки А и В кроме редокс-центров присоединяют пигменты внутренней антенны ФС1 (около 95 молекул хлорофилла о и 22 молекулы р-каротина, 5 из которых находятся в ^ис-конформации). Это отличает ФС1 от ФСП, где пигменты внутренней антенны расположены на отдельных белках СР43 и СР47. Пигменты внутренней антенны располагаются в виде цилиндра, окружающего редокс-агенты ЭТЦ ФС1.
Белки А и В составляют ядро комплекса ФС1. Белок С вместе с тремя низкомолекулярными белками - D, Е и Н - организуют периферийный домен комплекса со стороны стромы. Белки D, Е и Н не содержат редокс-агентов, но участвуют в организации центра связывания ферредоксина с ФО. Белок Н обеспечивает также взаимодействие ФО с ССКП при переходе хлоропластов из состояния 1 в состояние 2 (см. подразд. 3.4). Перифериный домен со стороны люмена у растений и водорослей составляют периферийный белок N (9 кДа) и большой люменальный домен интегрального белка F (15,7 кДа). Здесь формируется центр связывания восстановленного пластоцианина с ФО.
Транспорт электронов в ФС1. Работа реакционного центра ФО приводит к быстрому разделению зарядов: первичный донор электронов П700 окисляется, первичный акцептор электронов Ао (Хл695) — восстанавливается. Последующий транспорт электронов к ферредоксину связан с работой акцепторной стороны ФО, а восстановление П700 — с донорной стороной ФО.
Акцепторную сторону ФС1 составляют филлохинон (витамин КД и низкопотенциальные [4Fe-4S]-железосерные кластеры, образующие центры F^-, Рл и Ей(см. рис. 3.37).
Филлохинон (А^, промежуточный переносчик электрона от аниона А” к железосерному кластеру F^, имеет низкий окислительно-восстановительный потенциал (Ем пары А]/А( находится в интервале от -0,755 до -0,785 В). Передача электрона между А(| и А, происходит за 4 —50 пс. Разная скорость восстановления Аь возможно, является отражением работы двух ветвей транспорта электронов в ФО.
Железосерный кластер F^ (Её = -0,700 В) окисляет восстановленный Аь Дальнейший транспорт электронов осуществляют железосерные кластеры ЕА и Ев, характеризующиеся низкими окислительно-восстановительными потенциалами (соответственно -0,59 и около -0,55 В). Согласно современным представлениям, происходит последовательный перенос электронов от F^- к F^, затем к Ей, а от него — на ферредоксин. Время переноса электронов на этом участке ЭТЦ порядка 500 нс.
Ферредоксин восстанавливается комплексом ФО на стромальной стороне мембраны. Ферредоксин (ФД) — растворимый белок, содержащий [2Fe-2S]- кластер с низким окислительно-восстановительным потенциалом. Восстановленный ферредоксин (ФДВОСст) — сильный восстановитель (Её = -0,43 В), может быть источником электронов для различных реакций, происходящих в хлоропластах. Так, ФДвосст поставляет электроны для восстановления нитритов и ассимиляции серы в хлоропластах. Он восстанавливает тиоредоксин — низкомолекулярный серосодержащий белок, участвующий в редокс-регуляции метаболизма хлоропластов (подробно см. подразд. 3.8). ФДвосст выполняет функцию медиатора нециклического, циклического и псевдоциклического транспорта электронов и, возможно, именно через ФД происходит регуляция этих потоков. Для транспорта электронов от ФО к ФД необходимо их взаимодействие за счет электростатических сил. В образовании комплекса ФО-ФД участвуют белки D и Е.
При нециклическом потоке электронов за счет восстановленного ферредоксина восстанавливается НАДФ+. В реакции передачи электрона от ФДВОСст к НАДФ+ участвует фермент ферредоксин-НАДФ+-оксидоредуктаза (ФНР). Образование комплекса ФО с ферредоксином и ферментом ферредоксин-НАДФ+- оксидоредуктазой является обязательным условием восстановления НАДФ+,
при этом важную роль играет белок Е ФСК Фермент ФНР — водорастворимый белок, содержащий в качестве редокс-кофактора ФАД. Фермент имеет два центра связывания субстратов реакции: центр связывания ФД и центр связывания НАДФ+. Энергизация мембран хлоропластов на свету увеличивает сродство фермента к НАДФ+ в сотни раз.
Циклический поток электронов с участием ФС1 обеспечивает перенос электрона бт восстановленного ферредоксина к окисленному Пда. Вначале электрон перемещается от ФДиосСт на пул пластохинонов (PQ). Затем от PQ через цитохромный b(J-комплекс и пластоцианин электрон вновь попадает в ФС1, где используется на восстановление П^. Полагают, что существует особый фермент — ферредоксин-хинон-оксидоредуктаза (FQR), окисляющий ФДВОСст и восстанавливающий пул пластохинонов.
Донорная сторона ФС1. Восстановление Пу00 производит пластоцианин (Пц) — медьсодержащий белок с молекулярной массой около 10 кДа. Этот водорастворимый белок электростатическими силами удерживается на поверхности мембраны, обращенной к люмену. Белок имеет форму, близкую к цилиндрической, с явно выраженной полярностью распределения зарядов. Окислительно-восстановительный потенциал Пц около +0,37 В. Пластоцианин переносит электроны от цитохромного bbf-комплекса к комплексу ФС1. Восстановление П700 осуществляется по трехстадийному кинетическому механизму, который включает формирование комплекса Пц с ФС1, его реорганизацию и собственно транспорт электрона. Пластоцианин присоединяется к ФС1 за счет электростатических и гидрофобных взаимодействий.
Цитохромный Ь6Лкомплекс хлоропластов
Цитохромный ^/-комплекс осуществляет окисление пластохинолов и восстановление пластоцианина, обеспечивая этим электронную связь между реакционными центрами ФС1 и ФСП. Наряду с подвижными переносчиками электронов — пластохинонами и пластоцианином, он функционально объединяет две фотосистемы в единую цепь переноса электронов от воды к НАДФ+, т. е. является участником нециклического потока электронов. Кроме того, цитохромный комплекс вовлечен в циклический поток электронов, осуществляемый ФС1.
Цитохромный комплекс занимает особое стратегическое положение в ЭТЦ — между ФС1 и ФСП. Именно здесь наблюдается наибольший перепад редокс- потенциала и, следовательно, наибольшее выделение энергии. Поэтому главная функция цитохромного ^/-комплекса — сопряжение редокс-энергии с образованием Ацн+. В ходе окислительно-восстановительных реакций с участием цитохромного комплекса происходит трансмембранный перенос протонов из стромы в люмен и формируется электрохимический градиент протонов, энергия которого используется АТФ-синтазным комплексом на синтез АТФ.
Редокс-состояние цитохромного комплекса играет важную роль в регуляции распределения потока энергии между двумя фотосистемами, определяя переход хлоропластов от состояния 1 к состоянию 2.
Пептидный состав, редокс-центры и структурная организация. Цитохромный ^/-комплекс включает 5 — 7 интегральных пептидов, 3 из них несут редокс- центры, участвующие в транспорте электронов.
В организации функционального домена комплекса участвуют: субъединица 34 кДа, включающая гем цитохрома / (£„ = +0,37 В); субъединица 23,5 кДа, содержащая два протогема цитохрома Ь^, с различными окислительно-восстановительными потенциалами (цитохром Ь6Н, Её = -0,05 В, и цитохром b^L, Её = -0,15 В), и белок Риске (20 кДа), несущий железосерный [2Ее-25]-кластер и обладающий высоким потенциалом (£„ = +0,3 В). Высокое значение редокс- потенциала центра Риске объясняется участием в координационных связях с железом наряду с двумя остатками цистеина двух остатков гистидина белка. Гистидин не только влияет на окислительно-восстановительный потенциал железосерного кластера. Его остатки могут протонироваться и депротониро- ваться в зависимости от редокс-условий и таким образом обеспечивать закачивание протонов во внутритилакоидное пространство. Это приобретает особое значение в реакциях окисления пластохинолов, в ходе которых происходит перенос протонов в люмен.
Комплекс погружен в тилакоидную мембрану таким образом, что функциональные группы центра Риске и цитохрома / выходят на ее внутреннюю, лю- менальную, поверхность, тогда как два протогема цитохрома 66 находятся в толще мембраны, причем один из них (цитохром Ь^Е) приближен к ее внутренней стороне, а другой (цитохром 66//) к наружной. Такое асимметричное расположение редокс-центров в мембране обеспечивает существование двух пространственно разделенных цепей транспорта электронов внутри одного комплекса (рис. 3.38). Одна из них, низкопотенциальная цепь транспорта электрона, формируется за счет двух цитохромов Ь6 — низкопотенциального b6L (£о = -0,15 В) и высокопотенциального Ь^Н(Её = -0,05 В). Вторая, высокопотенциальная, цепь включает белок Риске (Её = +0,3 В) и цитохром/(Её = +0,37 В). При окислении пластохинолов в цитохромном комплексе реализуются два сопряженных потока электронов — по низкопотенциальному и высокопотенциальному пути.
Цитохромный комплекс примерно в равных количествах присутствует в мембранах тилакоидов стромы и гран. В мембранах гран он участвует в нециклическом транспорте электронов, а в мембранах стромы, где присутствует только ФС1, — в циклическом
Транспорт электронов. Цитохромный комплекс окисляет пластохинолы и восстанавливает Пц (см. рис. 3.38). В окислительно-восстановительных реакциях участвуют обе электрон-транспортные цепи комплекса — высокопотенциальная и низкопотенциальная. При этом восстановление Пц происходит через высокопотенциальный путь переноса электронов и является первичным, пусковым для низкопотенциального пути транспорта электронов, необходимого для окисления пластохинолов.
Окислительно-восстановительные реакции в цитохромном комплексе запускаются светом. Действие света на его работу опосредовано ФС1. После возбуждения светом Пуоо и его окисления последовательно окисляются пласто- цианин, цитохром / и центр Риске. В свою очередь, центр Риске окисляет пластохинолы, восстановленные фотосистемой II.
Механизм окисления пластохинола цитохромным комплексом отражает Q-цикл, представленный на рис. 3.38. В цитохромном комплексе существуют два центра взаимодействия с пластохинонами/пластохинолами: центр Qy расположенный вблизи внутренней поверхности тилакоидной мембраны, и центр Qc,
Рис. 3.38. Организация ЭТЦ в цитохромном />6/-комплексе:
Q-цикл хлоропластов. В скобках указаны редокс-потенциалы переносчиков Обозначения, как на рис. 3.32 и 3.33. Объяснение в тексте
расположенный вблизи ее наружной поверхности. Центр Qz характеризуется высоким сродством к пластохинолам (PQH2) и слабым сродством к пластохинонам (PQ). Промежуточный продукт окисления семихинон не стабилен в этом центре и обладает способностью отдавать электрон. Центр Qc, напротив, отличается низким сродством к PQH2 и высоким сродством к PQ, семихинон в этом центре более стабилен и обладает способностью принимать электрон.
Окисление пластохинола происходит в центре Qz. Ведущая роль при этом принадлежит центру Риске. Высокое значение редокс-потенциала железосерного кластера определяет способность центра Риске окислять пластохинолы, индуцируя реакции Q-цикла. Центр Риске, окисленный в результате активности ФС1, отнимает от PQH2 один электрон, который через цитохром/и пла- стоцианин переносится к ФС1. Процесс сопровождается освобождением одного протона в люмен. Семихинон, образованный в результате одноэлектронного окисления пластохинола, отдает свой электрон на низкопотенциальный цитохром b^L. При этом второй протон освобождается и поступает в люмен. Электрон от восстановленного b6L передается на высокопотенциальный цитохром Ь6Н, а от него — на пластохинон, связанный с центром Qc. В результате в центре Qc образуется семихинон. При окислении еще одной молекулы пластохинола в центре Qz в центре Qc образуется пластохинол, который диссоциирует от цитохромного /^/-комплекса. Это восстановление сопровождается протонированием пластохинона с участием протонов стромы. В результате работы
Q-цикла на каждую пару электронов, достигших П700, четыре протона переносятся из стромального во внутритилакоидное пространство. Кроме того, при переносе электронов по цепи двух цитохромов Ь6 от центра Qz к центру Qc поперек мембраны осуществляется электрогенная реакция, которая вместе с протолитической вносит существенный вклад в создание трансмембранного электрохимического градиента. Таким образом, цитохромный bbf-комплекс участвует в создании трансмембранного электрохимического потенциала, энергия которого используется для синтеза АТФ в хлоропластах.
Цитохромный ^/-комплекс является важным регуляторным участком ЭТЦ. Во-первых, он осуществляет координацию скорости нециклического потока электронов и восстановления НАДФ+ с синтезом АТФ в хлоропластах. Взаимосвязь всех этих процессов осуществляется через pH внутритилакоидного пространства. Во-вторых, цитохромный бб^комплекс является редокс-сенсором ЭТЦ хлоропластов. При повышении уровня восстановленности пула пластохинонов (PQ) он индуцирует переход хлоропластов из состояния 1 в состояние 2 путем активации специфической протеинкиназы, фосфорилирующей белки ССКП. В результате фосфорилирования меняется расположение ССКП в мембране и снижается поток энергии света в ФСП (см. рис 3.27).
ПЛАСТОХИНОНЫ — ПОДВИЖНЫЕ ПЕРЕНОСЧИКИЭЛЕКТРОНОВ ЭТЦ ФОТОСИНТЕЗА
Липорастворимые пластохиноны переносят электроны от комплекса ФСП к цитохромному 66/-комплексу. Они участвуют также в переносе электронов от ФС1 к цитохромному комплексу в ходе циклического транспорта электронов. Перенос осуществляется пулом пластохинонов: на один реакционный центр ФС1 приходится 10—14 молекул пластохинона. При циклическом транс- । порте электронов в ФС1 перенос электронов на пул пластохинонов происходит от восстановленного ферредоксина при участии особого фермента — фер- редоксинхинон-оксидоредуктазы (FQR). При нециклическом переносе электронов связь комплекса ФСП с пулом PQ осуществляет вторичный переносчик электронов ФСП — пластохинон QB. После полного восстановления он покидает центр связывания на белке D1 ФСП в форме пластохинола QBH2 и оказывается в билипидном слое мембраны, а освободившееся место занимает пластохинон из пула.
Перенос электронов пластохинонами сопряжен с трансмембранным переносом протонов (см. с. 178, здесь Q-цикл), поэтому пластохиноны являются своеобразной «протонной помпой», осуществляющей трансмембранный перенос протонов из стромы хлоропластов в люмен. Энергия сформированного при этом электрохимического градиента протонов используется затем на синтез АТФ.
Пул пластохинонов служит электронным буфером ЭТЦ хлоропластов, способным до определенных пределов концентрировать электроны, поступающие из ФСП. Это позволяет поддерживать функциональный баланс между двумя фотосистемами в условиях, когда скорость поступления электронов от ФСП превышает скорость их оттока в ФС1 (например, при световых условиях, благоприятных для ФСП, или в отсутствие достаточного количества окисленного НАДФ+).
КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ РАБОТЫ ЭТЦ.РЕГУЛЯЦИЯ ЭЛЕКТРОННОГО ТРАНСПОРТА
Z-схема фотосинтеза предполагает взаимодействие двух фотосистем и их согласованную работу. Координация работы фотосистем достигается, во-первых, благодаря определенному соотношению функциональных комплексов и низкомолекулярных компонентов ЭТЦ в мембране, а во-вторых, кинетическими закономерностями работы отдельных участков цепи.
Кратковременная и долговременная адаптацияхлоропластов к условиям освещения
Оценка содержания функциональных компонентов мембран хлоропластов показывает, что в среднем на 1 комплекс ФС1 приходится 1,5 — 1,8 комплексов ФСП, 8 ССКП, 1,5 цитохром ^/-комплекса, 10—14 молекул пластохинона, 6 — 8 молекул пластоцианина и около 10 молекул ферредоксина. По-видимо- му, при таком соотношении потоки электронов через комплексы выравниваются и достигается оптимальная координация их работы. Значительное превышение количества подвижных компонентов ЭТЦ над мультипептидными комплексами указывает на возможность взаимосвязи нескольких электрон-транс- портных цепей через мобильные компоненты ЭТЦ и обмена электронами между ними. Кроме того подвижные компоненты, передвигаясь латерально, объединяют пространственно разъединенные в мембранах тилакоидов фотосистемы.
Электрон-транспортная система хлоропластов динамична и меняется в зависимости от внешних условий. Это могут быть быстрые изменения, связанные с перераспределением компонентов в мембране, — кратковременная адаптация, либо более длительные, затрагивающие стехиометрию компонентов мембран — долговременная адаптация.
Интенсивность света и его спектральный состав — важнейшие внешние факторы регуляции состояния системы транспорта электронов в хлоропластах. При адаптации к условиям освещения существуют два основных пути достижения баланса потоков электронов между двумя фотосистемами: первый — через изменение размеров антенн двух фотосистем, второй — через изменение биосинтеза и соотношения двух фотосистем в мембранах хлоропластов. При кратковременной адаптации (несколько минут), как правило, изменяется размер антенн двух фотосистем (переход хлоропластов из состояния 1 в состояние 2 и обратно). При длительной адаптации (несколько часов, суток) изменяются число и соотношение фотосинтетических комплексов. Изменения в соотношении ФС1 и ФСП связаны главным образом с изменением количества ФС1. При изменении условий освещения меняется также количество ССКП: при низких интенсивностях света его содержание увеличивается. Сенсором, определяющим кратковременную и, по-видимому, долговременную адаптацию растений к условиям освещения, служит цитохромный туркомплекс, реагирующий на редокс-состояние ЭТЦ.
Динамичный механизм адаптации дает растениям значительное эволюционное преимущество над фиксированным соотношением фотосистем в тилакоидных мембранах и позволяет осуществлять преобразование энергии света с высоким квантовым выходом при изменении внешних условий.
Кинетические характеристики реакцийпереноса электронов в ЭТЦ
Исследования кинетических закономерностей работы ЭТЦ показывают, что скорость транспорта электронов на отдельных участках ЭТЦхлоропластов варьирует в широких временных пределах. Наиболее быстрые процессы проходят в реакционных центрах, где первичное разделение зарядов достигается за 1 — 3 пс. Перенос электронов на других участках ЭТЦ идет значительно медленнее, чем в РЦ (за время порядка нано-, микро- и миллисекунд). Наиболее медленная стадия переноса электронов (5 мс) находится на участке ЭТЦ между двумя фотосистемами, она связана с окислением пластохинолов цитохромным комплексом. На втором участке цепи, где скорость переноса электронов также оценивается в миллисекундном интервале, происходит перенос электронов от восстановленного ферредоксина к НАДФ+. В связи с этим общая скорость переноса электронов в ЭТЦ хлоропластов по нециклическому пути, очевидно, будет определяться скоростью потока электронов именно на этих двух участках ЭТЦ — между двумя фотосистемами и на акцепторной стороне ФС1.
Различия в скорости транспорта электронов на отдельных участках связаны с реализацией разных физических механизмов переноса электронов. В мультипеп- тидных комплексах наиболее вероятен резонансный механизм, когда перенос электрона от донора к акцептору предполагает резонансные взаимодействия редокс-центров с белковой молекулой, при которых возникает эффект туннелирования электрона через энергетический барьер. Скорость переноса электронов при этом определяется физическим контактом компонентов. Особое значение в этом случае приобретают электронно-конформационные взаимодействия в комплексах, создание особого конформационного состояния белка в ходе окислительно-восстановительных реакций. Перенос электронов между комплексами предполагает миграцию подвижных низкомолекулярных переносчиков в мембране или по ее поверхности и осуществляется по диффузионному механизму. Диффузионные процессы — более медленные, чем резонансные, поэтому именно они являются скорость-лимитирующими в ЭТЦ.
Механизмы регуляции электронного транспортав хлоропластах
Кинетические закономерности работы ЭТЦ лежат в основе регуляции транспорта электронов в хлоропластах. Рассмотрим некоторые механизмы регуляции скорости переноса электронов на наиболее медленных участках ЭТЦ.
Скорость окисления пластохинолов цитохромным комплексом в значительной степени регулируется величиной pH во внутритилакоидном пространстве. При повышении концентрации Н+ в люменальном пространстве задерживается окисление QH2. Любые воздействия, снижающие концентрацию протона во внутритилакоидном пространстве (АДФ + Фн, разобщители), будут увеличивать скорость окисления пластохинола. В условиях in vivo выход протонов из люмена осуществляется через АТФ-синтазный комплекс и сопровождается синтезом АТФ из АДФ и Фн, отсюда понятно, что концентрации АДФ и Фн (субстратов реакции синтеза АТФ) играют важную роль в регуляции процесса окисления пластохинолов в хлоропластах.
Скорость транспорта электронов на акцепторной стороне ФС1 определяется концентрацией окисленного НАДФ+. Содержание НАДФ+ в хлоропластах не велико, и необходим баланс между процессами его восстановления и окисления. Главным потребителем НАДФН в хлоропластах является цикл ассимиляции углерода углекислого газа, поэтому от активности реакций метаболизма углерода зависит скорость потока электронов в ЭТЦ хлоропластов. При недостатке НАДФ+ перенос электронов с восстановленного ферредоксина может происходить либо по циклическому, либо по псевдоциклическому пути. Таким образом, уровень окисленного НАДФ+ в хлоропластах не только задает скорость нециклического потока электронов, но и влияет на соотношение различных путей транспорта электронов в хлоропластах.
Возможность переноса электронов в ЭТЦ в значительной степени связана с редокс-состоянием переносчиков. Полная восстановленность всех редокс-центров, так же как и их полное окисление, приводит к ингибированию окислительно-восстановительных реакций в хлоропластах. Необходим баланс между поступлением электронов в ЭТЦ и их использованием. Поэтому активность работы ФСП, ее водоокисляющей системы, поставляющей электроны в ЭТЦ, и активность углеродных циклов, использующих конечный акцептор электронов НАДФН, — два фактора, определяющие в конечном счете редокс-состояние цепи. Электронным буфером в хлоропластах служит пул PQ, который до определенных пределов может накапливать избыточные электроны, поступающие от ФСП и не используемые для восстановления НАДФ+.
Регуляцию окислительно-восстановительного состояния пула PQ в хлоропластах помимо изложенных выше механизмов может осуществлять хлородыхание. Хлородыхание — это процесс транспорта электронов в хлоропластах, сходный с дыхательным транспортом электронов митохондрий растений. Он связан с работой двух ферментов, недавно обнаруженных в хлоропластах, — НАД(Ф)Н-дегидрогеназным комплексом, гомологичным бактериальному комплексу I, и альтернативной оксидазой, гомологичной альтернативной оксидазе митохондрий растений (см. гл. 4). Первый фермент способен восстанавливать пул пластохинонов за счет окисления НАД(Ф)Н, а второй окисляет пул PQ с участием кислорода. Таким образом, в ходе хлородыхания происходит нефотохимическое окисление и восстановление пула пластохинонов. Хлородыхание стимулируется в условиях высокого уровня восстановленное™ пиридиннуклео- тидов и пула PQ.
Уровень восстановленности пула пластохинонов играет важную регуляторную роль в хлоропластах. От редокс-состояния пула пластохинонов и цитохром ^/-комплекса зависят положение ССКП в мембранах хлоропластов и переход хлоропластов из состояния 1 в состояние 2 и обратао. Кроме того редокс-состояние пула PQ является ключевым звеном в регуляции таких процессов, как транскрипция генов, кодирующих апопротеины реакционных центров ФС1 и ФСП, а также cab генов, кодирующих апопротеины светособирающего комплекса.
Фотоингибирование. Механизмы защиты растенийот фотодеструкции в условиях высоких интенсивностей света
Модуляция размера антенн и изменения стехиометрии ФС1 и ФСП позволяют растениям сохранять высокую и практически постоянную квантовую
эффективность фотосинтеза в довольно широких пределах интенсивности света. Однако при высокой интенсивности света, когда поток световой энергии превышает способности хлоропластов использовать ее в фото-химических реакциях, квантовый выход фотосинтеза снижается. Это явление получило название фотоингибирование. В основе фотоингибирования лежит снижение фотохимической активности хлоропластов — вначале без значительного разрушения пигментов и белков мембран, а при длительном действии высоких интенсивностей света, особенно в условиях стресса (например, при низких температурах), — фотоокисление пигментов и разрушение структур хлоропластов.
Наиболее чувствительным звеном фотосинтетического аппарата к действию высоких интенсивностей света является ФСП. Это связано с рядом особенностей ее структурно-функциональной организации, способствующих протеканию в ФСП фотоокислительных процессов. Во-первых, ФСП отличается большим размером светособирающего комплекса, что обеспечивает мощный поток солнечной энергии в реакционный центр; во-вторых, фотохимическая активность реакционного центра ФСП приводит к образованию очень сильного окислителя Пб80, в-третьих, в ФСП за счет процессов фотолиза воды создается высокая локальная концентрация молекулярного кислорода. В условиях высокой инсоляции вероятность протекания фотоокислительных процессов в ФСП увеличивается. Начальные процессы фотоингибирования совершаются в реакционном центре ФСП. Они могут быть вызваны нарушениями в работе ЭТЦ как с донорной, так и с акцепторной стороны фотосистемы П. Фотоингибирование ФСП возникает вследствие появления в РЦ триплетных форм хлорофилла и (или) активных окислителей (окисленных форм пигментов, синглетного кислорода, свободных радикалов). Повреждение белков РЦ и фотодеградация пигментов нарушают фотохимическую активность ФСП, инициируют процессы фотодеструкции белка D1.
Кроме того, при высоких интенсивностях света на уровне ФС1 и ФСП увеличивается вероятность сброса электронов на кислород в ЭТЦ, что приводит к образованию активных форм кислорода, способных вызвать повреждение пигментов и мембран.
Так, в комплексе ФС1 электроны от восстановленных [4Fe-4S] кластеров F^-, F^ и F£ могут быть направлены или на восстановление ФДОК с последующим образованием НАДФН или, в случае недостатка НАДФ+ и окисленного ферредоксина, на восстановление О2 с образованием супероксиданион-радикала (О2), перекиси водорода (Н2О2) и других активных форм кислорода, вызывающих процессы оксидативной деструкции компонентов ЭТЦ и липидов мембран.
В растениях существует ряд механизмов защиты фотосинтетического аппарата от повреждения в условиях высоких интенсивностей света.
Процессы дезактивации активных форм кислорода. Быстрое удаление О2 в центре его генерации достигается при участии фермента супероксиддисмутазы (СОД) с образованием перекиси водорода, которая восстанавливается до Н2О аскорбатспецифичной пероксидазой, при этом донором электронов является аскорбат. Восстановление окисленного аскорбата (дегидроаскорбата) осуществляет фермент дегидроаскорбатредуктаза с использованием восстановленного глутатиона.
Тушение триплетных возбужденных состояний хлорофилла и выскореактив- ного синглетного кислорода ]О2 каротиноидами (см. с. 143).
Процессы, предотвращающие поступление избыточной энергии света в реакционные центры-.
рассеивание избыточной энергии в виде тепла с участием зеаксантина, образующегося в реакциях виолаксантинового цикла (см. с. 144);
переход хлоропластов из состояния 1 в состояние 2 и активация циклического потока электронов в ФС1 (с. 153);
активация циклического транспорта электронов в ФСП с участием цитохрома 6559.
Репарация поврежденных комплексов. Благодаря системе репарации белка D1 возможно восстановление поврежденных комплексов ФСП.
ФОТОЭНЕРГЕТИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ХЛОРОПЛАСТОВ
Важнейшей функцией ЭТЦ хлоропластов является ее энергетическая функция — накопление солнечной энергии в форме соединений с высоким энергетическим потенциалом. Свободная энергия, освобождаемая в реакциях фотосинтетического транспорта электронов, запасается частично в форме восстановленных кофакторов (ФДВОССТ, НАДФН), большая часть поглощенной энергии используется для синтеза АТФ. Процессы образования этих соединений составляют основу биоэнергетики живых систем.
В 1954 г. Д. Арнон впервые показал, что хлоропласты при освещении способны синтезировать АТФ. Этот процесс, сопряженный с транспортом электронов в хлоропластах, получил название «фотосинтетическое фосфорилирование». Количество энергии, необходимой для синтеза молекулы АТФ, определяется потенциалом переноса фосфорильной группы и может быть описано уравнением
АТФ
А Сдтф = A G° +1,361g,’ (АДФ)(ФН)
где АС° — стандартная свободная энергия гидролиза АТФ, равная -30,4 кДж/моль, или -0,34 эВ на молекулу. В хлоропластах, по данным ряда авторов, АСдтф = = 56,4 кДж/моль.
Источником свободной энергии для синтеза АТФ в хлоропластах является изменение свободной энергии в окислительно-восстановительных реакциях ЭТЦ. Энергия фотовозбужденного пигмента в реакционных центрах используется для разделения зарядов и запасается в форме окислительно-восстановительной энергии (Клейтон, 1984). В системе с разделенными зарядами электрон, удаленный от ядра при поглощении энергии кванта, обладает более высоким энергетическим потенциалом, который может быть реализован при обратном движении электрона через ряд переносчиков в сторону более электроположительных компонентов (по градиенту редокс-потенциала). При этом освобождается энергия, количество которой определяется разностью редокс-потенциалов реагирующих систем и может быть рассчитано по формуле
АС° = -nF^Eо,
где ^G° — стандартное изменение свободной энергии (кДж/моль); п — число электронов, участвующих в реакции; F — число Фарадея (96,4 кДж • В-1 • моль-1),
^Ео — разность стандартных окислительно-восстановительных потенциалов реагирующих систем.
Расчеты показывают, что для образования макроэргической связи АТФ достаточна разность окислительно-восстановительного потенциала донора и акцептора электрона в 0,25 В.
ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ.
ОСНОВНЫЕ ТИПЫ, ИХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
Различают два основных типа фотофосфорилирования — циклическое, сопряженное с циклическим потоком электронов в ЭТЦ, и нециклическое, сопряженное с нециклическим потоком электронов от Н2О к НАДФ+. Разновидностью нециклического типа является псевдоциклическое фотофосфорилирование, при котором акцептором электоронов, мобилизованных из воды, служит кислород. Физиологическое значение отдельных типов фотофосфорилирования различно.
Циклическое фотофосфорилирование — один из наиболее древних процессов запасания солнечной энергии в форме АТФ. Система включает циклическую редокс-цепь, сопряженную с ФС1 (см. рис. 3.33). Электроны от возбужденного П700 и восстановленного Fe-S-центра с высоким отрицательным потенциалом (-0,7 В) через отдельные переносчики (ФД, PQ, цитохром 66/-комплскс и пластоцианин) возвращаются обратно к П700 (+0,52 В), и в итоге вся освобождаемая при этом окислительно-восстановительная энергия запасается в форме АТФ. Процесс циклического фотофосфорилирования не сопровождается ни выделением О2, ни синтезом восстановленных кофакторов (НАДФН) и может быть представлен уравнением
Av
АДФ + Н3РО4 —- АТФ + Н2О
Естественными кофакторами циклического фотофосфорилирования являются ФД, ФМН, хиноны. Искусственным кофактором циклического фотофосфорилирования, широко применяемым в современных исследованиях, служит феназинметосульфат (ФМС), растворимый в липидах переносчик электронов и протонов. ФМС, восстановленный на наружной стороне мембраны компонентами акцепторного комплекса ФС1 и протонированный, передвигается через липидный матрикс мембраны во внутритилакоидное пространство, где отдает электроны на пластоцианин или непосредственно на П700, при этом протоны освобождаются и участвуют в генерации протонного градиента.
Циклическое фотофосфорилирование играет важную роль в различных метаболических процессах клетки. Оно служит источником дополнительного снабжения АТФ для восстановления СО2 в цикле Кальвина и ассимиляции ионов NH4, требующих высокого отношения АТФ/НАДФН, а также источником энергии для процессов синтеза белков и полисахаридов. У группы С4-растений в клетках обкладки циклическое фотофосфорилирование является единственным источником АТФ. Исследования с использованием акустических методов показали увеличение активности циклического фотофосфорилирования и его защитную роль в стрессовых условиях (тепловой и солевой стрессы, фотоингибирование).
Нециклическое фотофосфорилирование, открытое Д.Арноном в 1957 г., сопряжено с нециклическим потоком электронов от воды к НАДФ+. Нециклический тип фотофосфорилирования — эволюционно более поздний процесс, требующий совместного действия ФС1 и ФСП. Энергия света, поглощаемая двумя фотосистемами, преобразуется не только в форму макроэргических связей АТФ, но также в химический потенциал восстановленного НАДФН и молекулярного кислорода:
Av
АДФ + Н3РО4 + НАДФ+ + Н2О — АТФ + НАДФН + Н+ + !/2О2
Определение нециклического фотофосфорилирования позволяет учесть количество не только молекул АТФ, образующихся в ходе опыта, но и количество перенесенных при этом электронов. Величина отношения Р/2е~ — важный показатель при исследовании процесса нециклического фотофосфорилирования, позволяющий судить о степени сопряжения процессов фотофосфорилирования с транспортом электронов в ЭТЦ в зависимости от условий эксперимента.
Физиологическое значение нециклического фотофосфорилирования определяется его ведущим вкладом в общую энергетику клетки. Нециклическое фотофосфорилирование является не только основным источником энергии для эндэргонических реакций, протекающих в растительной клетке. В ходе этого процесса образуются другие очень важные метаболиты и в первую очередь высоковосстановленные соединения — Fe-S-белки (-0,7 В), ФДВОССТ (-0,43 В), НАДФН (-0,32 В), необходимые для восстановления СО2 в углеродных циклах и образования ряда регуляторных систем (ФД-тиоредоксин-регуляторная система, медиаторы действия света).
МЕХАНИЗМ СОПРЯЖЕНИЯ ЭЛЕКТРОННОГО ТРАНСПОРТАС ФОРМИРОВАНИЕМ ТРАНСМЕМБРАННОГО ГРАДИЕНТАЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА
Важнейшим интермедиатом в реакциях превращения энергии в биологических системах является трансмембранный градиент электрохимического потенциала. В соответствии с хемиосмотической теорией П. Митчелла и развиваемой в настоящее время ротационной теорией П. Бойера АТФ синтезируется в хлоропластах в результате сложного комплекса сопряженных процессов: транспорта электронов, генерации электрохимического потенциала и преобразования его энергии в серии конформационных изменений отдельных субъединиц сопрягающего комплекса, передачи конформационных сигналов в каталитические центры.
Механизм сопряжения электронного транспорта с генерацией электрохимического потенциала рассматривается в настоящее время в рамках хемиосмотической теории Митчелла (теории протонного сопряжения), сформулированной в 1961 г. и развитой в последующие годы (1966). Теория Митчелла включает два основных положения: 1) энергия, освобождаемая в редокс-реакциях, первично запасается в форме протонного градиента (АрН); 2) признается необходимость сопрягающей мембраны, непроницаемой для Н+. При работе ЭТЦ сопряженно с транспортом электронов происходит энергозависимый перенос
протонов через гидрофобный слой мембраны из стромы в люмен, направленный против электрического и концентрационного градиента.
Сопрягающей мембране в теории Митчелла отводится ведущая роль в процессе фотофосфорилирования. Благодаря тому, что мембрана непроницаема для протонов, может быть создана разность свободных энергий в двух водных фазах, разделенных мембраной. Тилакоидная мембрана ориентирует комплексы, участвующие в транспорте электронов, таким образом, что создается векторный поток электронов и протонов через мембрану. В результате сопряженных процессов переноса электронов (на стромальную поверхность мембраны) и Н (внутрь тилакоидов) возникает градиент протонов (ДрН), который служит источником энергии для синтеза АТФ. Значительный вклад в суммарное значение разности энергий двух фаз, разделенных мембраной (строма, люмен), дает образующийся при работе ЭТЦ электрический мембранный потенциал. Электрическое поле на мембране образуется в течение 10 мс при первичном фотохимическом разделении зарядов.
В результате определенного расположения и взаимодействия участников редокс-реакций в мембране редокс-энергия непосредственно преобразуется в энергию электрохимического потенциала (Дцщ), который представляет собой сумму электрической (Ду) и осмотической (ДрН) энергии и является источником свободной энергии для клетки:
Дцщ = -2,3/?ТДрН + ^Ду.
Электрохимический трансмембранный градиент Дщц формируется в результате сопряжения электрогенных и протолитических реакций при работе ЭТЦ. В нециклическом фотофосфорилировании известны три электрогенные реакции, в результате которых происходит перенос электронов с внутренней на наружную, стромальную поверхность мембраны с запасанием энергии в форме электрического мембранного потенциала. Две реакции имеют место в реакционных центрах ФС1 и ФСП. Они связаны с быстрым переносом электрона от фотовозбужденного пигмента к конечному компоненту акцепторного комплекса, локализованному на стромальной поверхности мембраны. Одна, медленная электрогенная реакция связана с работой Q-цикла, с переносом электрона от молекулы PQH2, окисляемой Fe-S-белком Риске, к высокопотенциальному цитохрому 66.
При работе ЭТЦ электрогенные реакции сопряжены с протолитическими. В реакциях трансмембранного переноса протонов из стромального пространства в люменальное значительная роль принадлежит цитохромному ^/-комплексу. При окислении пластохинола в центре Qz цитохромного комплекса удаление двух электронов из молекулы PQH2 сопряжено с освобождением двух Н , которые поступают в люмен, а окисленный пластохинон может быть снова восстановлен в QB центре (ФСП) или Qc-центре (цитохромный ^/-комплекс) на стромальной стороне мембраны с использованием двух протонов из стромы. Другая реакция образования протонного градиента обусловлена процессом фотоокисления воды ФСП, в результате которого при разложении двух молекул Н2О выделяется молекулярный кислород, электроны поступают в ЭТЦ, а в люменальное пространство высвобождаются четыре протона. Перенос протонов через мембрану происходит также при циклическом транспорте электронов вокруг ФСП при участии цитохрома 6559.
Таким образом, энергия, освобождаемая при переносе электронов в отдельных участках ЭТЦ, преобразуется в осмотическую и электрическую энергию градиента электрохимического потенциала.
Градиент электрохимического потенциала, согласно ротационной теории П. Бойера (1993, 1997), служит источником энергии для конформационных изменений белков АТФ-синтазного комплекса CF0-CF,, в результате которых в каталитическом центре сопрягающего фактора I (CF,) образуется молекула АТФ из АДФ и Фн.
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И МЕХАНИЗМ РАБОТЫ АТФ-СИНТАЗНОГО КОМПЛЕКСА
Рентгеноструктурные и генетические исследования, проведенные в последние годы, позволили выяснить пространственную организацию АТФ-синтазного комплекса, предполагаемая структура которого дана на рис. 2.2 (см. гл 2).
АТФ-синтаза хлоропластов представляет собой мембранно-связанный белковый комплекс, который можно разделить на две части — CF0 и CF,. Сопрягающий фактор CF0 — это интегральный гидрофобный белок мембраны, вы полняющий функцию протонного канала. У высших растений CF0 состоит из 4 типов субъединиц: субъединица I осуществляет связь CF0 с CF,; субъединица II организует 12 копий субъединицы III, которые образуют олигомерное кольцо и, взаимодействуя с субъединицей IV, обеспечивают транслокацию Н+ из люмена в строму. Стехиометрический состав CF0:1], Пь Ш^, ГУ, У Escherichia coli Fo (гл. 2, рис. 2.2) состоит из трех типов субъединиц: a,, b,, Ь',, С9_12.
Сопрягающий фактор 1 (CF,), водорастворимый белковый комплекс на стромальной поверхности мембраны, состоит из 5 типов субъединиц в соотношении а3, р3, у, б, е. CF, содержит три каталитических центра синтеза АТФ, расположенных на трех р-субъединицах, и выполняет также структурную функцию, закрывая протонный канал мембраны. При удалении CF, с поверхности мембраны (обработкой растворами ЭДТА, бромида натрия) хлоропласты теряют способность к фосфорилированию, что обусловлено не только удалением структур, несущих каталитические центры, но также увеличением протонной проводимости мембран и потерей их способности сохранять протонный градиент.
Три пары субъединиц аир образуют гексамер (ар)3, который содержит каталитические и регуляторные центры. Субъединицы у и е формируют «ствол» АТФ-синтазы и играют ведущую роль в энергетическом сопряжении процессов зранслокации протонов и работы каталитических центров. При вращении субъединиц у и в в ходе катализа конформационные сигналы передаются на пары субъединиц ар. В результате этого происходит захват нуклеотидов (АДФ), синтезируется АТФ и высвобождается ранее синтезированная молекула АТФ.
Центральную роль в каталитическом процессе играет у-субъединица. Регуляция каталитической активности фермента осуществляется при участии ре- докс-механизма, включающего обратимое окисление и восстановление дисульфидной связи в у-субъединице CF,. Субъединица с выполняет также регуляторную функцию: будучи ингибитором АТФазной активности CF,, она осуществляет кинетический контроль активности фермента. Субъединица б участвует в
связи CF0 и CFf она ассоциирована с парой субъединиц а и р и с субъединицами I и II.
В соответствии с ротационной теорией Бойера (ротационный механизм детально описан в гл. 2, рис. 2.3) для нормального функционирования АТФ- синтазы необходимо прочное сопряжение процессов транслокации протонов, вращательного движения субъединиц е и у и взаимодействия их с (а.р)3-гекса- мером.
Согласно ряду исследований (M.Futai et al., 2000), субъединицы III и IV (в CF0) образуют единый комплекс, в котором субъединица IV совместно с субъединицами I, II и 8 функционирует как статор, удерживающий (оф)3- гексамер, а 12 субъединиц III служат основанием ротора, сопряженным с субъединицами у и с. При транслокации протонов через каналы субъединицы IV и последовательном протонировании и депротонировании карбоксильной группы аминокислоты (аспарагин-61) в каждой из 12 субъединиц III происходит вращение олигомера III с последующим переносом протона в стромальное пространство. Движущей силой движения Н+ является трансмембранная разность протонных потенциалов в люмене (высокий) и строме (более низкий). Вращательное движение олигомера III благодаря аминокислотным контактам сопряжено с вращением субъединицу и е. Это вызывает их конформационные изменения с последующей передачей конформационных сигналов в каталитические центры субъединиц р благодаря взаимодействию а-спиралей субъединиц у с тремя субъединицами р.
Таким образом, в результате взаимодействия CF0 и CF] осуществляется передача конформационных сигналов, индуцированных транслокацией протонов через мембрану при участии субъединиц III и IV. Функциональное сопряжение между субъединицами осуществляется за счет ионизированных остатков аминокислот.
Структурная организация каталитических центров CF, исследована методом рентгеноструктурного анализа. Показано, что три р-субъединицы имеют неодинаковую конформацию и их каталитические центры связывают разные нуклеотиды. Один из центров содержит АТФ (Ртф), другой — АДФ (рдф), а в третьем нуклеотида нет (рЕ). Каталитические центры р-субъединиц, связанных с нуклеотидами (АТФ и АДФ), находятся в закрытой конформации, а центры р-субъединиц, не связанных с нуклеотидами, — в открытой конформации. При функционировании фермента имеет место переход от закрытой к открытой конформации рЕ.
Основу гипотезы Бойера составляет идея кооперативности работы каталитических центров, согласно которой каждый из трех каталитических центров последовательно проходит через три различных конформационных состояния в течение каталитического цикла (П. Бойер, 1993). Нуклеотидсвязывающие центры р-субъединиц в ходе катализа взаимодействуют сопряженно и кооперативно. Последовательная передача конформационных изменений от одних центров к другим осуществляется путем изменения ориентации боковых цепей аминокислот в каждом каталитическом центре.
Механизм работы каталитических центров включает ряд этапов. Фермент содержит три кооперативно функционирующих каталитических центра. Константа связывания субстратов (АДФ + Фн) и продуктов реакции (АТФ) в каждом центре изменяется в ответ на энергозависимые конформационные изме-
Треонин-156
НО—Р-гОО—Р„-О—Р— О—Аденозин
। Vip го. zo о
'н HZ
N
Лизин-155
Рис. 3.39. Синтез АТФ в каталитическом центре АТФ-синтазы на р-субъединипс CF, (по Futai et al., 2000, с изменениями)
нения фермента. Изменения идут последовательно: первый этап — непрочное связывание АДФ и Фн (L-состояние), второй этап — прочное связывание субстратов с образованием АТФ и выделением Н2О (Т-состояние), третий этап — энергозависимое освобождение прочносвязанной молекулы АТФ и свободная диссоциация АТФ (О-состояние) (см. рис. 2.3, гл. 2).
Главными участниками в реакциях синтеза АТФ в каталитических центрах являются фосфатная группа АДФ, неорганический фосфат и ион магния, образующий координационную связь с одной из аминокислот каталитического центра (рис. 3.39). В реакции синтеза АТФ р-фосфат АДФ и неорганический фосфат образуют связь с аминогруппой лизина-155, а также с магнием при участии треонина-156. В ходе катализа в результате конформационных изменений каталитического центра между р-фосфатом молекулы АДФ и неорганическим фосфатом возникает фосфоэфирная связь и синтезируется молекула АТФ. Ангидридная связь при синтезе АТФ не требует специальных затрат энергии и образуется в результате резкого уменьшения константы равновесия реакции, обусловленного изменением микроокружения активного центра.
Согласно теории Бойера, энергия Дрщ используется для конформационных преобразований структур каталитического центра АТФ-синтазы, в результате которых изменяются константы связывания нуклеотидов. Это завершается синтезом АТФ из АДФ и Фн и освобождением молекулы АТФ из активного центра фермента.
МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕРОДА ПРИ ФОТОСИНТЕЗЕ
Фиксация углерода углекислого газа и восстановление его до уровня органических соединений — заключительный этап фотосинтеза. Реакции ассимиляции углерода получили название темновых реакций фотосинтеза. Однако в настоящее время установлено, что для их прохождения необходим свет, поэтому заключительный этап фотосинтеза принято сейчас называть метаболизмом углерода при фотосинтезе, или углеродными циклами фотосинтеза. При ас-
симиляции углерода используются продукты световой стадии фотосинтеза — АТФ и НАДФН.
Фиксация углекислого газа из атмосферы и включение его в органические соединения у разных групп растений может происходить по-разному. В соответствии с механизмом первичных реакций фиксации углекислого газа и природой образующихся при этом первых стабильных продуктов различают: С3-путь фотосинтеза, С4-путь фотосинтеза и фотосинтез по типу толстянковых — САМ-фотосинтез (от crassulacea acid metabolism). Восстановление углерода углекислого газа до уровня углеводов практически у всех фотосинтезирующих организмов происходит по единому пути, называемому восстановительным пен- тозофосфатным циклом (ВПФ-цикл). ВПФ-цикл — основной путь ассимиляции углерода в растениях.
Сз-ПУТЬ ФОТОСИНТЕЗА (ЦИКЛ КАЛЬВИНА, ВПФ-ЦИКЛ)
С3-путь фотосинтеза был открыт в лаборатории М. Кальвина (1946—1956) при изучении фотосинтеза у одноклеточных зеленых водорослей с использованием меченого углерода и фосфора. Анализ динамики включения метки в органические соединения показал, что первыми органическими соединениями, содержащими меченый углерод, являются трехуглеродные соединения — 3-фосфоглицериновая кислота (3-ФГК) и 3-фосфоглицериновый альдегид (3-ФГА) (отсюда название «С3-путь фотосинтеза»). Позже метка обнаруживается в углеводах, содержащих от 4 до 7 атомов углерода. М. Кальвину с сотр. удалось установить последовательность превращения углеводов в хлоропластах. На основании этого был открыт восстановительный пентозофосфатный цикл углерода, названный в честь исследователей циклом Кальвина.
Химизм цикла Кальвина. Выделяют три стадии ассимиляции углерода в цикле Кальвина: карбоксилирование, восстановление и регенерацию (рис. 3.40). Все ферменты, осуществляющие фиксацию углерода углекислого газа и его восстановление до сахаров в цикле Кальвина, находятся в строме хлоропластов.
Стадия карбоксилирования. Молекулы углекислого газа воздуха присоединяются к 5-углеродному сахару — рибулозо-1,5-бисфосфату (РуБФ). В результате карбоксилирования РуБФ образуется нестойкое 6-углеродное соединение, которое распадается на 2 молекулы 3-фосфоглицериновой кислоты (3-ФГК) (рис. 3.41). Реакцию карбоксилирования осуществляет фермент рибуло- зобисфосфаткарбоксилаза (РуБФ-карбоксилаза). Фермент кроме карбоксилазной активности может проявлять оксигеназную активность (см. ниже), поэтому полное название фермента — рибулозобисфосфаткарбоксилазаоксигеназа (4.1.1.39), или сокращенно Рубиско.
Рубиско высших растений и зеленых водорослей — один из наиболее высокомолекуляных белков на Земле: его молекулярная масса 560 кДа. Он состоит из 8 больших (L) (55 кДа) и 8 малых (S) (15 кДа) субъединиц. Большие субъединицы кодируются геном хлоропластов (rbcL), малые — ядерным геном VbcSY Сборка белка проходит в хлоропластах с участием «белка-няньки» (белок 60 кДа), который кодируется в ядре. Поэтому для сборки функционально активного фермента в хлоропластах необходима согласованная работа двух геномов.
3 -Фосфоглицериноваякислота (3-ФГК)
1,3 - Дифосфоглицериновая
зн2о
ЗСО2
соон
6АТФ
6НС-ОН
н2с-о@
кислота
соо©
6НС-ОН
с=о
3 X НС-ОН нс-он
ЗАТФ
н2с-он с=о
Рибулозо- 1,5-бисфосфат
зX нс-он нс-он
6НАДФН
НС=О
нс-он
нс-он
нс-он
нс-он
нс-он
нс-он н2с-о© Рибозо-5-фосфат
Н2С-О©_
Дигидроксиацетонфосфат (ДГАФ)
З-Фосфоглицериновый альдегид (3-ФГА) нс=о "
6НО-СН н2с-о@
Метаболический пул
рибулозо-5-фосфат
н2с-онс=о
2XНС-ОН
нс-он
н2с-о©
Ксилулозо-5-фосфат
н2с-онс=о
нс-онн2с-о@Седогептулозо-7-фосфат
н2с-он
2 X С=О
нс-он
■ нс=о
н2с-о@с=о
НС-ОН
нс-он
нс-онн2с-о©Фруктозо-1,6-бисфосфат
Н2О
нс-он
Н2О
нс-он
нс-он
нс-он
нс-он
Седогептулозо- 1,7-бисфосфат
нс-он н2с-о© Фруктозоб-фосфат
нс-он н2с-о@ Эритрозо-4-фосфат
с=о
нс-он
Рис. 3.40. Восстановительный пентозофосфатный цикл (цикл Кальвина)
н2с-онс=о
Фосфогликолат Гликолат
н2с-онСОО’ -н2с-онСОО’ -ФотодыханиеФотодыханиеН2С-ОРОз"с=оIнс-онIнс-онН2С-ОРОз2РуБФН2С-ОРОз"с=оIнс-онIнс-онН2С-ОРОз2РуБФН2С-ОРОз2" сооН2С-ОРОз2" сооОксигеназа о2Оксигеназа о214 соо нс-он Н2С-ОРО32"3-ФГК14 соо нс-он Н2С-ОРО32"3-ФГККарбоксилазаКарбоксилазаФотосинтезФотосинтез
н2с-он
СОО’ -
н2с-он
СОО’ -
Фотодыхание
Фотодыхание
Н2С-ОРОз"
с=о
I
нс-он
I
нс-он
Н2С-ОРОз2
РуБФ
Н2С-ОРОз"
с=о
I
нс-он
I
нс-он
Н2С-ОРОз2
РуБФ
Н2С-ОРОз2" соо
Н2С-ОРОз2" соо
Оксигеназа о2
Оксигеназа о2
14 соо нс-он Н2С-ОРО32"
3-ФГК
14 соо нс-он Н2С-ОРО32"
3-ФГК
Карбоксилаза
Карбоксилаза
Фотосинтез
Фотосинтез
Рис. 3.41. Основные функции РуБФ-карбоксилазы-оксигеназы
Каталитический центр фермента формируют аминокислотные остатки С- и N-концов полипептидов двух больших соседних субъединиц. Таким образом, функционально активной структурной единицей фермента является димер больших субъединиц. В Рубиско высших растений имеется 8 каталитических центров, сформированных 8 большими субъединицами. Малые субъединицы играют регуляторную роль, влияя на каталитическую активность больших субъединиц фермента.
Субстратом карбоксилазной активности фермента является СО2. Присоединение молекулы углекислого газа требует ионов Mg +. Оптимум pH реакции карбоксилирования около 8,0. Оксигеназная активность Рубиско заключается в окислении РуБФ путем включения в сахар кислорода. В результате образуются 3-ФГК и фосфогликолат (см. рис. 3.41). Эта реакция лежит в основе процесса фотодыхания (см. далее), снижающего синтез углеводов при фотосинтезе
Карбоксилазная и оксигеназная реакции связаны с работой одних и тех же каталитических центров фермента, вследствие чего существует конкуренция между кислородом и углекислым газом за каталитический центр. При обычном содержании кислорода и углекислого газа в воздухе в среднем на три реакции карбоксилирования приходится одна реакция оксигенирования. Увеличение относительного содержания углекислого газа способствует карбоксилазной активности фермента. Рубиско является ключевым ферментом цикла Кальвина, поэтому регуляция его активности — важнейший фактор регуляции цикла Кальвина в целом (см. ниже).
193193Стадия восстановления. Восстановление 3-фосфоглицериновой кислоты (3-ФГК) до 3-фосфоглицеринового альдегида (3-ФГА) — вторая стадия цикла Кальвина. Она осуществляется в два этапа. На первом этапе происходит фосфорилирование 3-ФГК и образование 1,3-бисфосфоглицериновой кислоты. Реакцию осуществляет фермент фосфоглицерокиназа (ЕС 2.4.2.3) при использовании АТФ. На втором этапе при участии НАДФН и фермента глицеральдегид 3-фосфатдегидрогеназы (ЕС 1.2.1.13) идет восстановление 1,3 бис - фосфоглицериновой кислоты до 3-ФГА. В стадии восстановления достигается восстановленность углерода до уровня углеводов. 3-ФГА и его изомер дигид-
193
193
7 Физиология растений
роксиацетонфосфат (ДГАФ), в который он легко превращается под действием фермента 3-ФГА изомеразы (ЕС 5.3.1.1), являются первыми моносахарами, образующимися при фотосинтезе в ходе цикла Кальвина.
Молекулы 3-ФГА (или его изомера ДГАФ) могут быть использованы для регенерации РуБФ — акцептора углекислого газа и экспортированы из хлоропластов в цитоплазму. В цитоплазме автотрофной клетки из триоз синтезируются гексозы (глюкоза и фруктоза) и дисахарид сахароза — главная транспортная форма углеводов в растении.
Стадия регенерации. На этой стадии происходит регенерация акцептора углекислого газа РуБФ. В ходе реакций образуются различные углеводы с числом углеродных атомов 4, 5, 6 и 7. Чтобы проследить весь цикл преобразования углеродных скелетов в цикле Кальвина, необходимо представить фиксацию как минимум трех молекул СО2 с использованием трех молекул рибулозо-1,5-бисфосфата. В этом случае после стадии карбоксилирования получаются 6 молекул 3-ФГК, а после их восстановления — 6 молекул 3-ФГА. При этом используются 6 молекул АТФ и 6 молекул НАДФН. Пять молекул 3-ФГА используются для регенерации трех молекул РуБФ, а шестая молекула 3-ФГА может быть выведена из цикла и транспортирована в цитоплазму автотрофной клетки.
В реакциях регенерации РуБФ одна молекула 3-ФГА взаимодействует с ДГАФ с образованием фруктозе-1,6-бисфосфата (фермент фруктозобисфосфатальдо- лаза, 4 1.2.7), который дефосфорилируется с образованием фруктозо-6-фос- фата (фермент фруктозобисфосфатаза, 3.1.3. II). Последний взаимодействует с 3-ФГА с образованием ксилулозо-5-фосфата и эритрозо-4-фосфата (фермент транскетолаза, активный только в присутствии тиамин пирофосфата — ТПФ). Эритрозо-4-фосфат реагирует с ДГАФ, образуя седогептулозе-1,7-бисфосфат (фермент альдолаза), который затем дефосфорилируется до седогептулозо-7- фосфата (фермент седогептулозобисфосфатаза), который далее взаимодействует с 3-ФГА с образованием ксилулозо-5-фосфата и рибозо-5-фосфата (фермент транскетолаза). Две молекулы ксилулозо-5-фосфата подвергаются эпимеризации по третьему атому углерода (фермент эпимераза) и превращаются в 2 молекулы рибулозо-5-фосфата. Рибоза-5-фосфат изомеризуется также в рибулозо- 5-фосфат (фермент рибозофосфатизомераза). Таким образом, в ходе трансальдолазных и транскетолазных реакций углеродные скелеты перестраиваются и в результате образуется 3 молекулы рибулозо-5-фосфата. Заключительная стадия регенерации акцептора углекислого газа — фосфорилирование трех молекул рибулозо-5-фосфата с образованием трех молекул рибулозо-1,5-бисфосфата. Реакцию катализирует фермент фосфорибулокиназа (2.7.1.19). При этом используются 3 молекулы АТФ. В итоге вновь образуются 3 молекулы РуБФ. Триоза, не использованная для регенерации РуБФ, является продуктом фотосинтеза, который может пойти на синтез гексоз и более высокомолекулярных углеводов как в самом хлоропласте, так и в цитоплазме автотрофной клетки.
Итак, фиксация трех молекул СО2 и синтез одной молекулы триозы в цикле Кальвина потребовали 6 молекул НАДФН и 9 молекул АТФ, т.е. для ассимиляции одной молекулы углекислого газа по С3-пути фотосинтеза необходимо 2 молекулы НАДФН и 3 молекулы АТФ
Регуляция цикла Кальвина. Система регуляции цикла Кальвина сложно организована и включает метаболический, энергетический и генетический контроль. В основе регуляции лежит возможность изменения направления и
скорости протекания биохимических реакций цикла. Это реализуется, во-первых, за счет изменения каталитической активности ферментов, а во-вторых, за счет влияния метаболитов и коферментов на протекающие процессы по принципу действия масс. Транспорт метаболитов из хлоропластов становится при этом важнейшим фактором регуляции метаболизма углерода.
Регулируемыми, как правило, являются ферменты, катализирующие «необратимые» реакции, т. е. реакции, в ходе которых имеет место значительный отрицательный перепад свободной энергии. В цикле Кальвина «необратимыми» являются 4 реакции: 1) карбоксилирование, катализируемое Рубиско (РуБФ —► 3-ФГК, ^G' =-41 кДж); 2 и 3) две реакции, связанные с работой фосфатаз — фруктозе-1,6-бисфосфатазы (ФБФ —► Ф6Ф, ^G' = -27,2 кДж) и седогептулозе-1,7-бисфосфатазы (СБФ —*- С7Ф, ДС' =-29 кДж); 4) фосфорилирование Ру5Ф, катализируемое фосфорибулокиназой (Ру5Ф —► РуБФ, ^G' = =-15,9 кДж). Кроме того, две реакции восстановительной стадии, катализируемые ФГК-киназой и трифосфатдегидрогеназой (ФГК —► 1,3-ДФГК —► ФГА) при суммарной небольшой потере энергии в значительной степени подвержены действию метаболитов и зависят от действия масс. Концентрации АДФ, АТФ и ФГК оказывают значительное влияние на прохождение первой из этих реакций и определяют направление ее протекания.
Важной особенностью «регулируемых» ферментов цикла Кальвина является зависимость их активности от света. По крайней мере 5 ферментов цикла Кальвина активируются светом: рибулозобисфосфаткарбоксилаза, триозофос- фатдегидрогеназа, фруктозобисфосфатаза, седогептулозобисфосфатаза и фос- форибулокиназа.
Контроль реакций цикла Кальвина светом включает ряд механизмов:
световые реакции фотосинтеза обеспечивают синтез АТФ и НАДФН — соединений, непосредственно используемых в цикле Кальвина;
создание на свету в строме хлоропластов оптимальных для активности ряда ферментов цикла Кальвина условий pH и концентрации ионов Mg +;
светозависимая ковалентная модификация ферментов цикла Кальвина через систему тиоредоксина (см. рис. 3.1).
Своеобразная ковалентная и конформационная модификация светом происходят в Рубиско:
на свету благодаря повышению концентрации магния в строме облегчается присоединение молекулы СО2 и магния к регуляторному центру Рубиско; карбамилизация фермента необходима для проявления его карбоксилазной активности;
свет вызывает присоединение к Рубиско низкомолекулярного белка-регулятора активазы, который вытесняет из каталитического центра Рубиско рибулозо-1,5-бисфосфат и его изомер ксилулозо-1,5-бисфосфат, прочно связанные с каталитическим центром фермента в темноте и препятствующие присоединению к нему молекул углекислого газа и магния в отсутствие света.
Таким образом, световая активация цикла Кальвина включает ряд механизмов, изменяющих каталитическую активность ферментов. Одни из них связаны с ковалентными модификациями ферментов за счет восстановления дисульфидных связей или карбамилизации аминогрупп, другие — вызывают нековалентные, конформационные изменения ферментов, обусловленные присоединением метаболитов или созданием оптимальных условий для активности
ферментов. Помимо этого свет контролирует содержание ферментов цикла Кальвина на генетическом уровне. Установлено, что свет активирует экспрессию генов малой субъединицы РуБФ-карбоксилаз-оксигеназы через фоторецепторы красного и синего света (см. гл. 7).
С4-ПУТЬ ФОТОСИНТЕЗА (ЦИКЛ ХЭТЧА—СЛЭКА—КАРПИЛОВА)
С4-путь фотосинтеза был впервые обнаружен у двух тропических злаков — кукурузы и тростника. В работах Ю. С. Карпилова (1965), М. Хэтча и К. Слэка (1966) с использованием меченого углерода (14СО2) было показано, что первыми продуктами фотосинтеза у этих растений являются органические кислоты щавелевоуксусная и яблочная — соединения, содержащие 4 атома углерода (отсюда название «С4-путь фотосинтеза»). Позже метка обнаруживалась в фосфоглицериновой кислоте и фосфоглицериновом альдегиде. Анализ динамики включения метки в продукты фотосинтеза позволил определить последовательность происходящих реакций и выявить цикл превращения углерода, отличный от цикла Кальвина, названный впоследствии циклом Хэтча—Слэка. В цикле Хэтча—Слэка растения осуществляют первичную фиксацию углекислоты через карбоксилирование фосфоенолпирувата (ФЕП) при участии фермента ФЕП-карбоксилазы. Вслед за этим происходит синтез малата (или аспартата) — промежуточных продуктов фиксации СО2, которые затем становятся источниками углекислого газа для восстановительного пентозофосфатного цикла. В цикле Кальвина у С4-растений, как и у С3-растений, восстанавливается углерод СО2 и синтезируются углеводы.
Для С4-растений характерна особая структура листа, так называемая кранц- структура (рис. 3.42). В нем структурно и функционально различают клетки обкладки и клетки мезофилла. Клетки обкладки крупные, плотно прилегают к
сосудам листа, хлоропласты в них могут не иметь гран, часто содержат зерна крахмала. Клетки мезофилла мелкие, расположены рыхло; хлоропласты в них всегда имеют граны, редко содержат крахмал. Клетки обкладки связаны с клет
ками мезофилла множеством плазмодесм, благодаря чему между ними возможен активный обмен метаболитами. Рубиско — карбоксилирующий фермент
цикла Кальвина, найден в основном в хлоропластах клеток обкладки, тогда
Рис. 3.42. Анатомия листа у С4-растенийРис. 3.42. Анатомия листа у С4-растенийкак в клетках мезофилла обнаружен другой карбоксилирующий фермент — ФЕП-кар- боксилаза. В клетках мезофилла проходит цикл Хэтча—Слэка, в клетках обкладки — цикл Кальвина.
Рис. 3.42. Анатомия листа у С4-растений
Рис. 3.42. Анатомия листа у С4-растений
Существует ряд модификаций С4-пути фотосинтеза, связанных с химической природой продуктов-переносчиков углекислого газа в клетки обкладки (транспортным соединением может быть малат или аспартат), а также с характером последующих декарбоксилирующих реакций. В соответствии с ферментом, осуществляющим декарбоксилирование в клетках обкладки, различают сле-
дующие три группы С^-растений, использующие для декарбоксилирования разные ферменты:
НАДФ-малатдегидрогеназу (например, кукуруза — Zea mays, сахарный тростник — Sacharum officinarum)',
НАД-малатдегидрогеназу (амарант — Amarantus retrophlexus, портулак — Portulaca ole асе ае и др.);
ФЕП-карбоксикиназу (например, просо — Panicum maximum, хлорис — Ch loris gay an а).
Химизм НАДФ-малатдегидразного типа С4-фотосинтеза, характерного для растений первой группы, представлен на рис. 3.43. Как видно из рисунка, в клетках мезофилла происходит первичная фиксация СО2 через присоединение его (в форме НСО3) к ФЕП с образованием щавелевоуксусной кислоты (ЩУК). Карбоксилирующий фермент ФЕП-карбоксилаза (4.1.1.31), локализованный в цитозоле клеток мезофилла, отличается высоким сродством к НСО3. Использование ферментом в качестве субстрата бикарбоната значительно увеличивает скорость фиксации углерода, поскольку содержание в клетке НСО3 выше, чем углекислого газа. Синтезированная ЩУК переносится в хлоропласты клеток мезофилла и там восстанавливается до малата с использованием НАДФН. Реакцию катализирует фермент малатдегидрогеназа (1 1.1.8.2). Образовавшийся малат по плазмодесмам транспортируется в клетки обкладки. В клетках обкладки происходит реакция окислительного декарбоксилирования малата. Она катализируется ферментом Е1АДФ-малатдегидрогеназой (декарбоксилирующей) (1.1.1.40). В ходе реакции образуется пируват, выделяется углекислый газ и восстанавливается НАДФ+. СО2 и НАДФН используются в цикле Кальвина, а пируват по плазмодесмам возвращается в клетки мезофилла В клетках мезофилла пируват
Клеткаспои
мезофиллаАТф дмф
Рис. 3.43. С4-путь фотосинтеза (НАДФ-малатдсгидрогеназный вариант)
превращается в высокоэнергетическую форму ФЕП в реакции, катализируемой ферментом пируватортофосфатдикиназой (2.7.9.1). При этом используются АТФ и неорганический фосфат. Пирофосфат, образующийся в реакции, гидролизуется до ортофосфата ферментом неорганической пирофосфатазой (6.6.1.1), а образовавшийся АМФ фосфорилируется за счет АТФ под действием аденилаткиназы. В итоге превращение ПВК в ФЕП требует 2 молекул АТФ.
Расчет затрат АТФ и НАДФН на фиксацию одной молекулы СО2 в С4-пути фотосинтеза показывает, что для этого пути ассимиляции углерода необходимо большее количество АТФ, чем для С3-пути фотосинтеза. Если принять, что в цикле Кальвина у С4-растений, так же как и у С3-растений, для фиксации одной молекулы СО2 используется 3 молекулы АТФ и 2 молекулы НАДФН, то для превращения ПВК в ФЕП в цикле Хэтча—Слэка требуются дополнительные 2 молекулы АТФ. В итоге для осуществления фиксации 1 молекулы СО2 в ходе С4-пути фотосинтеза необходимы 5 молекул АТФ и 2 молекулы НАДФН.
Регуляция С4-пути фотосинтеза. Регуляция включает метаболитный, генетический и световой контроль активности ферментов цикла Хэтча—Слэка. Особое значение при этом имеет регуляция ФЕП-карбоксилазы — ключевого фермента цикла Хэтча—Слэка. Установлено, что ФЕП-карбоксилаза ингибируется органическими кислотами (в первую очередь малатом). Фосфорилирование ФЕП-карбоксилазы повышает устойчивость фермента к малату. Свет активирует специфическую киназу ФЕП-карбоксилазы, которая фосфорилирует ФЕП- карбоксилазу и тем самым защищает фермент от аллостерического ингибирования малатом. В результате активность ФЕП-карбоксилазы на свету повышается. Кроме того, свет активирует НАДФ-зависимую малатдегидрогеназу через тиоредоксиновую систему и фермент пируватортофосфатдикиназу (ПФДК) — путем активации системы дефосфорилирования фермента.
Таким образом, существует ряд механизмов регуляции С4-пути фотосинтеза на уровне специфических для цикла Хэтча—Слэка ферментов. Вместе с тем, все регуляторные механизмы, отмеченные для С3-пути фотосинтеза в ВПФ-цикле (см. подразд. 8.2.2), реализуются и в С4-растениях.
Растения с С4-типом фотосинтеза отличаются от С3-растений: 1) световое насыщение фотосинтеза достигается у них при более высоких интенсивностях света; 2) у С4 значительно выше скорость фотосинтеза при насыщающих интенсивностях света (40 — 80 мг СО2/дм2 листа в час по сравнению с 15—40 мг СО2/дм2 листа в час у С3-растений); 3) температурный оптимум фотосинтеза смещается в область более высоких температур (около 30 —35СС); 4) значительно меньшие потери воды при синтезе органических веществ в ходе фотосинтеза (250 — 350 г воды при увеличении сухого веса на 1 г по сравнению с 450 — 950 г воды/г сухой массы у С3-растений); 5) очень низкий уровень фотодыхания; 6) высокая скорость роста и высокая продуктивность.
МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕРОДА ПО ТИПУ ТОЛСТЯНКОВЫХ(САМ-ФОТОСИНТЕЗ)
Фотосинтез по типу толстянковых — САМ осуществляют, как правило, растения-суккуленты из жарких, засушливых регионов. САМ-фотосинтез, так же как и С4-фотосинтез, связан с обменом органических кислот. Однако в
отличие от С4-растений, у которых реакции синтеза органических кислот и ВПФ-цикла разделены в пространстве (первые проходят в клетках мезофилла, вторые — в клетках обкладки), у толстянковых эти реакции разделены во времени (рис. 3.44). Первичная фиксация углекислоты у суккулентов происходит ночью, когда устьица открыты, а днем, уже при закрытых устьицах, осуществляются реакции цикла Кальвина.
Химизм САМ-фотосиитеза. При CAM-фотосинтезе первичная фиксация углекислоты (в форме НСО3), как и у С4-растений, осуществляется ФЕП-кар- боксилазой. Используемый для карбоксилирования ФЕП образуется в ходе реакций гликолиза в цитоплазме клеток. В результате карбоксилирования ФЕП образуется оксалоацетат (щавелевоуксусная кислота), который затем восстанавливается до малата с участием фермента НАД-малатдегидрогеназы. Синтезированный ночью малат переносится в вакуоли клетки путем активного транспорта и там накапливается, а днем, когда устьица закрыты, идет обратный транспорт малата в цитоплазму, где происходит его декарбоксилирование.
Таким образом, CAM-фотосинтез связан с суточной ритмичностью цикла Кальвина и цикла органических кислот. Это позволяет растениям жить в жарких, засушливых условиях, когда во избежание больших потерь воды их устьица должны быть закрытыми и могут открываться только ночью. Производя первичную фиксацию углекислоты из атмосферы ночью, растения уже на внутренних запасах углерода в виде малата могут осуществлять восстановление углерода за счет АТФ и НАДФН, синтезируемых в хлоропластах на свету. Регуляция CAM-фотосинтеза в течение суток связана с суточным ритмом активности ключевого фермента САМ-фотосинтеза — ФЕП-карбоксилазы.
ФОТОДЫХАНИЕ
Фотодыханием называют поглощение растениями кислорода и выделение углекислого газа на свету. У С3-растений его интенсивность может составлять до 50 % от интенсивности фотосинтеза. У С4-растений фотодыхание практически отсутствует. Начальный этап фотодыхания связан с оксигеназной активностью фермента РуБФ-карбоксилаза и осуществляется в хлоропластах, последующие реакции проходят в пероксисомах и митохондриях.
Фотодыхание имеет ряд отличий от «темнового» дыхания клеток, связанного с процессами окисления органических соединений в ходе цикла Кребса и работы ЭТЦ митохондрий. Во-первых, фотодыхание активируется светом высокой интенсивности, тогда как процессы «темнового» дыхания митохондрий на свету ингибируются. Во-вторых, фотодыхание усиливается в присутствии высоких концентраций кислорода, что связано с активацией в этих условиях оксигеназной функции фермента РуБФ-карбоксилазы; максимум «темнового» дыхания наблюдается при концентрации кислорода около 2 %. В-третьих, фотодыхание требует совместного функционирования хлоропластов, пероксисом и митохондрий; «темновое» дыхание связано исключительно с митохондриями. В-четвертых, первичными продуктами фотодыхания являются фосфо- гликолат, гликолат и глиоксилат — двухуглеродные органические кислоты, дальнейшее преобразование которых приводит к образованию аминокислот глицина и серина.
Химизм фотодыхания. Процесс фотодыхания требует совместной работы трех органелл клетки — хлоропластов, пероксисом и митохондрий (рис. 3.45). Начальный этап фотодыхания проходит в хлоропластах. Ключевой реакцией фотодыхания является окисление РуБФ при участии кислорода с образованием фосфогликолата и 3-ФГК (см. рис. 3.41). Реакция осуществляется благодаря оксигеназной активности фермента Рубиско и сопровождается поглощением кислорода. В результате оксигеназной активности образуется лишь одна молекула 3-ФГК (а не две, как при карбоксилазной активности этого фермента), которая может быть включена в реакции цикла Кальвина. Второй продукт оксигеназной реакции — фосфогликолат. Под действием фермента фосфогликолат- фосфатазы (3.1.3.18) он превращается в гликолат, который покидает хлоропласты и поступает в пероксисомы. Здесь гликолат окисляется до глиоксилата с использованием кислорода. Реакцию осуществляет флавинсодержащая оксидаза — гликолатоксидаза (1.1.3.1). Второй продукт реакции, перекись водорода, благодаря высокому содержанию в пероксисомах фермента каталазы расщепляется до воды и кислорода. В пероксисоме происходит реакция аминирования глиоксилата с образованием глицина. Фермент глицинаминотрансфераза осуществляет реакцию переноса аминогруппы с глутаминовой кислоты на глиоксилат. При этом образуется 2-оксоглутаровая кислота. Глицин из пероксисом переносится в митохондрии, где происходит реакция конденсации двух молекул глицина с образованием одной молекулы L-серина и выделением одной молекулы аммиака и молекулы углекислого газа. Реакция идет в две стадии и катализируется ферментами глицинсинтазой и серингидроксиметилтрансфе- разой. Реакция сопровождается восстановлением НАД. Окисление НАДН в митохондриях сопряжено с дополнительным поглощением клеткой кислорода.
Таким образом, в ходе фотодыхания происходят реакции, связанные с поглощением кислорода (в хлоропластах и пероксисомах) и выделением СО2 (в митохондриях). Общий баланс газообмена в листьях на свету складывается из двух процессов — фотосинтеза и фотодыхания.
Дальнейший метаболизм серина, образующегося при фотодыхании (см. выше), может быть связан с его включением в белки или превращением в глицерин. Реакции преобразования серина в глицерин показаны на рис. 3.45.
Регуляция фотодыхания. Поскольку фотодыхание связано с работой фермента РуБФ-карбоксилазыоксигеназы, соотношение двух путей использова-
„ СООН IV |ch2nh2„ СООН IV |ch2nh2
„ СООН IV |
ch2nh2
„ СООН IV |
ch2nh2
С°2—
— РуБФ-^ч
Хлоро
СООН пласт।3-ФГК
снон
Атф СН2ОР .
Глицерат- А \ киназа * соон снон
СН2ОН
Цикл \
КальвинаСООН Фосфогликолат
.1
t сн2ор
СООН Гликолат 1 СН2ОН
1соон
СООН
Пероксисома1
Глицерат
СНОН
СН2ОН НАДФН t соон 1 со
Гидрокси-
СН2ОН
Оксидаза_ q
гликолевой Г кислоты Г*- Н2О2
СООН Глиоксилат
СН2ОН
Амино- ‘ трансфераза
СООН
1
пируват
СНО
Аминотрансфераза
СООН Глицин
chnh2
^СН2ОН
Серин
1 ch2nh2
Митохондрия
соон
^ СНМН2
Серин СН2ОН
Рис. 3.45. Фотодыхание: последовательность превращений гликолата(объяснение в тексте)
ния РуБФ будет зависеть от соотношения карбоксилазной и оксигеназной активности этого фермента. Поэтому такие факторы, как кинетические свойства фермента, температура и субстраты реакций (СО2 и О2), определяющие направление ферментативной активности Рубиско, будут модулировать скорость фотодыхания. Повышение температуры, снижение парциального давления углекислого газа и повышение интенсивности света активирует фотодыхание.
Физиологическая роль фотодыхания до сих пор не вполне ясна. С одной стороны, у С3-растений до 50 % продуктов фотосинтеза может использоваться на
фотодыхание, а это значительно снижает продуктивность фотосинтеза. С другой стороны, снижение интенсивности фотодыхания в результате генетических нарушений его отдельных реакций сопровождалось снижением интенсивности фотосинтеза. Возможно, фотодыхание важно для метаболических реакций, связанных с аминокислотам!/ глицином и серином. Возможно, оно необходимо для переориентации пути преобразования органических молекул с синтеза углеводов на синтез аминокислот или глицерина.
ЭКОЛОГИЯ ФОТОСИНТЕЗА
Фотосинтетическая деятельность растений зависит от многих внешних факторов, и главные из них — условия освещения (интенсивность, спектральный состав света), доступность и концентрация углекислого газа, температура среды, водоснабжение и минеральное питание. Факторы внешней среды (экзогенные, экологические, факторы), воздействуя на отдельные реакции фотосинтеза, вызывают изменение активности фотосинтетического аппарата в целом, что в конечном итоге определяет общую продуктивность растений. Влияние на фотосинтез основных экзогенных факторов рассматривается здесь раздельно, но следует помнить, что в природе они действуют на растение одновременно, и его продуктивность является, таким образом, интегральной функцией совокупности экологических факторов.
ВЛИЯНИЕ НА ФОТОСИНТЕЗ ИНТЕНСИВНОСТИИ СПЕКТРАЛЬНОГО СОСТАВА СВЕТА
Зависимость фотосинтеза от интенсивности света выражается световой кривой фотосинтеза (рис. 3.46). Как видно из рисунка, она имеет логарифмический характер: при низких интенсивностях света существует прямая пропор
синтеза становится все менее выраженным, и,синтеза становится все менее выраженным, и,наконец, при достижениинаконец, при достижениинасыщение фотосинтетиченасыщение фотосинтетичеопределенного уровня освещенности наступаетопределенного уровня освещенности наступаетциональная зависимость между интенсивностью падающего на растение света и фотосинтеза. По мере увеличения интенсивности света нарастание фото
синтеза становится все менее выраженным, и,
синтеза становится все менее выраженным, и,
наконец, при достижении
наконец, при достижении
насыщение фотосинтетиче
насыщение фотосинтетиче
определенного уровня освещенности наступает
определенного уровня освещенности наступает
Интенсивность света, кал/см2-минИнтенсивность света, кал/см2-минРис. 3.46. Световые кривые фотосинтеза С4- (7) и С3-растений (2) (по А. А. Ничипоровичу, 1973)Рис. 3.46. Световые кривые фотосинтеза С4- (7) и С3-растений (2) (по А. А. Ничипоровичу, 1973)ской активности листа (плато световой кривой фотосинтеза). Анализ световой кривой фотосинтеза послужил основанием для представления о существовании в этом процессе световых, фотохимических, реакций, прямо пропорционально зависящих от интенсивности света, и «темновых», энзиматических, реакций, скорость которых становится лимитирующей при ВЫСОКИХ интенсивностях света (F. Black-
Интенсивность света, кал/см2-мин
Интенсивность света, кал/см2-мин
Рис. 3.46. Световые кривые фотосинтеза С4- (7) и С3-растений (2) (по А. А. Ничипоровичу, 1973)
Рис. 3.46. Световые кривые фотосинтеза С4- (7) и С3-растений (2) (по А. А. Ничипоровичу, 1973)
man, 1905)
Зависимость световых реакций фотосинтеза
от интенсивности света отражает прямолинейный участок световой кривой. На этом этапе интенсивность света является лимитирующим
фактором фотосинтеза. Угол наклона прямолинейного участка световой кривой характеризует эффективность использования световой энергии в ходе фотохимических реакций.
Стационарный уровень фотосинтеза достигается у разных групп растений при разной интенсивности света (см. рис. 3.46). Фотосинтетическая активность в области насыщающих интенсивностей света зависит главным образом от работы систем поглощения и ассимиляции углекислого газа. Чем выше положение кривой в области насыщения, тем больше мощность системы ассимиляции углекислого газа у растения. Условия внешней среды, активирующие углеродные циклы растения (такие, как температура и концентрация СО2), позволяют ему более эффективно использовать высокие интенсивности света. На световой кривой фотосинтеза обычно отмечается световой компенсационный пункт (СКП) — наименьшая интенсивность света, при которой активности фотосинтеза и дыхания растений уравновешены по газообмену. Положение СКП зависит от соотношения фотосинтеза и темнового дыхания и меняется в зависимости от температуры и концентрации углекислого газа в среде.
Интенсивность света влияет на характер фотохимических и метаболических процессов в хлоропластах. При низких интенсивностях света в первую очередь активируется нециклический поток электронов. Увеличение интенсивности света стимулирует циклический поток электронов и повышает долю циклического транспорта электронов в общем потоке электронов по ЭТЦ хлоропластов. В условиях избыточной освещенности циклический транспорт электронов может
играть защитную роль в хлоропластах, а также служить источником энергии для дополнительного синтеза АТФ и тем самым способствовать активации процессов ассимиляции углерода. С интенсивностью света связано образование различных продуктов фотосинтеза. Так, при слабой освещенности образуются главным образом аминокислоты, тогда как синтез углеводов в хлоропластах
требует высокой интенсивности света.
Спектральный состав света определяет общую интенсивность фотосинтеза, активность его отдельных реакций и набор синтезируемых продуктов. Кривая зависимости интенсивности фотосинтеза от качества света при выровненном количестве квантов (спектр действия фотосинтеза) демонстрирует два отчет
ливых максимума — в синей и красной области спектра, совпадающих со спектрами поглощения фотосинтетических пигментов (рис. 3.47). Максимумы по
Рис. 3.47. Спектры действия фотосинтеза (7) и поглощения пигментов (2)Рис. 3.47. Спектры действия фотосинтеза (7) и поглощения пигментов (2)глощения отражают наиболее эффективное использование этих лучей при фотосинтезе.
Рис. 3.47. Спектры действия фотосинтеза (7) и поглощения пигментов (2)
Рис. 3.47. Спектры действия фотосинтеза (7) и поглощения пигментов (2)
В опытах Н. П. Воскресенской было показано специфическое действие синего света на фотосинтетический аппарат растений. При выравнивании синего и красного освещения по квантам на синем свету у растений увеличивалась общая активность ассимиляции СО2, что было обусловлено активацией в этих условиях транспорта электронов в ЭТЦ хлоропластов и ферментов углеродного цикла. Качество света определяло и состав продуктов, образующихся при фотосинтезе. Так, на синем свету преимущественно синтезирова-
лись органические кислоты и аминокислоты, а позднее — белки, тогда как красный свет индуцировал сначала синтез растворимых углеводов, а в дальнейшем — крахмала.
ВЛИЯНИЕ НА ФОТОСИНТЕЗ КОНЦЕНТРАЦИИ УГЛЕКИСЛОГО ГАЗА
Содержание СО2 в окружающей среде является одним из важнейших факторов, определяющих скорость фотосинтеза. Как видно из рис. 3.48, зависимость интенсивности фотосинтеза от концентрации СО2 имеет логарифмический характер, т.е. увеличение концентрации СО2 приводит к быстрому увели-
Рис. 3.48. Кривая зависимости фотосинтеза от концентрации СО2Рис. 3.48. Кривая зависимости фотосинтеза от концентрации СО2чению интенсивности фотосинтеза. При концентрации СО2 0,06 — 0,15 % у большинства растений достигается насыщение фотосинтеза. Увеличение интенсивности фотосинтеза при повышении концентрации СО2 обусловлено реализацией в этих условиях потенциальной карбоксилазной активности Рубиско и созданием в хлоропластах большого пула акцептора СО2 — ри- булозобисфосфата.
Рис. 3.48. Кривая зависимости фотосинтеза от концентрации СО2
Рис. 3.48. Кривая зависимости фотосинтеза от концентрации СО2
Концентрация СО2, при которой его поглощение в процессе фотосинтеза уравновешено выделением углекислоты в ходе дыхания (темнового и светового), называется углекислотным компенсационным пунктом (УКП). Положение УКП может существенно зависеть от вида расте
ния. Особенно выражены различия между С3- и С4-растениями. Так, у С3-рас- тений УКП находится при довольно высоких концентрациях СО2 (около 0,005 %). Это связано с наличием у них активного фотодыхания. С4-растения, обладающие способностью фиксировать СО2 через фермент ФЕП-карбоксилазу, производят рефиксацию углекислого газа при слабом фотодыхании, поэтому у них УКП приближается к нулевой концентрации СО2.
ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА ФОТОСИНТЕЗ
Интегральный ответ фотосинтетического аппарата на изменения темпе
ратуры может быть представлен графически в виде, как правило, одновер
шинной кривой (рис. 3.49), причем вершина соответствует области оптимальных для фотосинтеза температур. Для большинства С3-растений умеренной климатической зоны оптимальная для фотосинтеза температура находится в интервале 20 — 25 °C. У растений с С4-путем фотосинтеза и CAM-фотосинтезом температурный оптимум
Рис. 3.49. Зависимость фотосинтеза от температуры у С3- (7) и С4-растений (2)
приходится на 30 — 35 °C. При дальнейшем повышении температуры фиксация СО2 уменьшается вследствие снижения тургора в листьях и закрывания устьиц.
В растениях наибольшую термозависимость проявляют реакции углеродных циклов. Весьма чувствительны к температуре также транспорт электронов и синтез АТФ. Первичные реакции фотосинтеза, связанные с поглощением света, миграцией энергии возбуждения в реакционные центры и разделением зарядов в реакционных центрах, от температуры практически не зависят.
ВЛИЯНИЕ ВОДНОГО РЕЖИМА НА ФОТОСИНТЕЗ
Значение водного режима для фотосинтеза определяется в первую очередь действием воды на состояние устьиц листа: до тех пор, пока устьица остаются оптимально открытыми, интенсивность фотосинтеза не изменяется под влиянием колебаний водного баланса. Частичное или полное закрывание устьиц, вызванное дефицитом воды в растении, приводит к нарушению газообмена и снижению поступления углекислого газа к карбоксилируюшим системам листа. Вместе с тем, при водном дефиците снижается активность ферментов ВПФ цикла (цикла Кальвина), обеспечивающих регенерацию рибулозобисфосфата, и в значительной степени ингибируется фотофосфорилирование. В результате в условиях водного дефицита наблюдается ингибирование фотосинтетической активности растений. При длительном дефиците воды возможно снижение общей фотосинтетической продуктивности растений, в том числе и за счет уменьшения величины листьев, а сильное обезвоживание может в итоге вызвать нарушение структуры хлоропластов и полную потерю их фотосинтетической активности.
ФОТОСИНТЕЗ КАК ОСНОВАПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ
Крупные успехи последних лет в области молекулярной биологии, физиологии и генетики определили глубокий интерес исследователей к познанию и раскрытию внутренних взаимосвязей физиологических функций и регуляторных механизмов, определяющих высокий уровень продуктивности растительного организма.
ХЛОРОПЛАСТЫ — ИСТОЧНИК АССИМИЛЯТОВ И АТФ
Фотосинтезу принадлежит ведущая роль в продукционном процессе. В хлоропластах в ходе фотохимических и последующих энзиматических реакций ассимиляции и восстановления СО2 образуются органические вещества и активные метаболиты, необходимые для энергетического и пластического обмена растений, для осуществления его физиологически функций. Образующиеся в первичных процессах фотосинтеза соединения с высоким энергетическим (АТФ) и восстановительным потенциалом (НАДФН, ФДВОССТ) служат регуляторами важнейших метаболических систем и составляют основу интегратив-
пых механизмов, обеспечивающих взаимосвязь функциональных систем на уровне целого растительного организма.
Первичные продукты фотосинтеза, включаясь в реакции вторичного метаболизма, служат источником энергии и углерода для разнообразных конструктивных процессов в растительной клетке. Интермедиаты цикла Кальвина и С4-пути (эритрозо-4-фосфат, рибозо-5-фосфат, триозы, гексозы и др.) включаются в синтез липидов, циклических соединений, нуклеотидов, органических кислот, аминокислот и других органических соединений. Часть этих веществ используется самими хлоропластами для построения липопротеидных мембранных структур, пигментов, компонентов ЭТЦ, а также коферментов и ферментов, катализирующих весь комплекс фотосинтетических реакций. Однако значительная часть образующихся в процессе фотосинтеза веществ транспортируется из хлоропластов в цитоплазму и включается в общий метаболизм растений.
В связи с этим важнейшей проблемой физиологии растений является исследование механизмов экспорта продуктов фотосинтеза из хлоропластов в цитоплазму. Опыты с радиоактивным диоксидом углерода |4СО2 показали быструю миграцию меченых соединений из хлоропластов, однако не все образующиеся в процессе фотосинтеза вещества могут служить транспортной формой углерода.
Известно, что хлоропласты отделены от цитоплазмы двойной мембраной, при этом внутренняя мембрана обладает избирательной проницаемостью. Она
Рис. 3.50. Система переноса триозофосфатов, энергетических и восстановительных эквивалентов через внутреннюю мембрану хлоропластов
практически непроницаема для конечных продуктов фотосинтеза (сахарозы, фруктозофосфатов) и хорошо проницаема для фосфоглицериновой кислоты, фосфоглицеринового альдегида, дигидроксиацетонфосфата и ряда соединений с короткой углеродной цепью — гликолата, малата и др. Это обусловлено функционированием специальных переносчиков триозофосфатов через мембрану хлоропластов. Во внутренней мембране локализованы специальные «переносчики ортофосфата», осуществляющие сопряженный транспорт ФГК и триозофосфатов в обмен на неорганический фосфат (рис. 3.50). Органические кислоты — малат, оксалоацетат (ЩУК на рис. 3.50) и др., а также аминокислоты (аспартат, глутамат) переносятся через внутреннюю мембрану хлоропластов при помощи специального переносчика дикарбоновых кислот.
Обмен энергетическими и восстановительными эквивалентами между хлоропластами и цитоплазмой обеспечивается специальной транспортной (шунтовой) системой (рис. 3.50). Она включает транспорт дигидроксиацетонфосфата (ДГАФ) в цитоплазму. Здесь ДГАФ окисляется в ФГК при участии НАДзависимой обратимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы с образованием НАДН и АТФ. Возникающий в результате реакций 3-фосфоглицерат возвращается в хлоропласт, замыкая шунт.
Таким образом в ходе описанных превращений богатые энергией соединения (ФГА, ДГАФ) переносятся из хлоропластов в цитоплазму, где преобразуются в ФГК с образованием НАДН и АТФ. В итоге благодаря работе ряда транслокирующих механизмов хлоропластные и цитоплазматические реакции объединяются в высокоинтегрированную метаболическую систему.
ДОНОРНО-АКЦЕПТОРНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯКАК ФАКТОР ЭНДОГЕННОЙ РЕГУЛЯЦИИ ФОТОСИНТЕЗА
В СИСТЕМЕ ЦЕЛОГО РАСТЕНИЯ
Донорно-акцепторная система включает донор (source) и акцептор (sink), соединенные канализированными системами транспорта веществ и передачи информационных сигналов.
Согласно А. Т. Мокроносову (1981, 1983), элементарная донорно-акцепторная единица объединяет следующие основные структурно-функциональные и регуляторные единицы.
Донор ассимилятов — первичным донором является, как правило, зеленый лист.
Акцептор — функции акцептора выполняют структурные зоны растения (аттрагирующие центры), способные ориентировать на себя поток ассимилятов. Выделяют три основных типа аттрагирующих систем: а) ростовые зоны, связанные с активными ростовыми процессами (меристемы, зоны морфогенеза); б) запасающие центры, связанные с синтезом запасных соединений и отложением веществ в запас (семена, клубни, плоды и др.); в) метаболитные центры с интенсивным метаболизмом, сопряженным с поглощением веществ (корни) или вторичным метаболизмом.
Аттрагирующий фактор неизвестной природы — определяет способность ориентировать на себя поток ассимилятов против концентрационного градиента.
Транспорт ассимилятов из листа включает ближний транспорт, загрузку флоэмы, дальний (флоэмный) транспорт и разгрузку флоэмы. Главная транспортная форма — сахароза.
Система сигналов гормональной, электрофизиологической, метаболитной или осмотической природы, поступающих от акцептора к донору. Сигналы несут на ассимиляты информацию о «запросе» аттрагирующего центра и составляют основу обратной связи в эндогенной регуляции фотосинтеза.
Исполнительные механизмы эндогенной регуляции фотосинтеза. «Запрос», поступивший от акцептора, служит сигналом к изменению интенсивности фотосинтеза. Это достигается быстрой регуляцией активности ЭТЦ и ферментов углеродных циклов, обеспечивающей поддержание фотосинтеза на необходимом уровне.
Фонды ассимилятов выполняют резервную функцию — поддерживают буферность и надежность донорно-акцепторной системы.
Весь комплекс донорно-акцепторных взаимодействий составляет основу эндогенной регуляции фотосинтеза в системе целого растительного организма. Доноры и акцепторы ассимилятов образуют хорошо согласованную систему. Ведущая роль в ней принадлежит процессам эпигенеза, определяющим активность аттрагирующих центров.
ТЕОРИЯ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ
Основные положения теории фотосинтетической продуктивности были сформулированы в 1950-х гг. А. А. Ничипоровичем. Теория фотосинтетической продуктивности включает анализ количественных взаимосвязей между величиной солнечной радиации, приходящейся на единицу поверхности фитоценоза, с общим уровнем продуктивности сельскохозяйственных растений. Этот анализ предполагает проведение глубоких исследований продукционного процесса — физико-химической организации и активности фотосинтетического аппарата на уровне хлоропластов, листа и целого растения, а также взаимосвязи интенсивности фотосинтеза, роста и развития растений с процессами минерального питания, дыхания, транспорта веществ и формированием генеративных и запасающих органов.
Исследования ставили своей задачей повышение коэффициента использования солнечной энергии в аграрном производстве, где КПД использования фотосинтетической активности радиации (ФАР) достаточно низок: всего 0,5 — 2%. Согласно теории фотосинтетической продуктивности, имеется несколько способов интенсификации продукционных процессов:
создание ценозов с максимально возможным ассимиляционным потенциалом (производное площади листьев в посеве и длительности функционирования растений);
формирование оптимальной пространственной организации (архитектоники) фитоценоза (общего габитуса растений, размеров и формы листовых пластинок, их ориентации), что определяет эффективное распределение ФАР в толще ценозов и обеспечивает энергией все ярусы листьев;
обеспечение продукционного процесса основными ресурсами — углекислотой, водой, азотом и необходимыми элементами минерального питания;
показана возможность математического моделирования продукционного процесса с учетом времени и количества введения каждого элемента, от которых зависит формирование урожая.
Исследования физико-химической организации фотосинтеза и сопряженных с ним физиологических функций, образующих систему донорно-акцепторных связей, позволят увеличить КПД фотосинтеза. В последнее время теория первичной биопродуктивности развивается не только с целью повышения урожайности сельскохозяйственных растений, но и в связи с оценкой биологических ресурсов биосферы и природных экосистем. Ведутся широкомасштабные международные исследования, позволяющие получить представление о глобальной первичной биопродуктивности различных типов природных ценозов. При определении общих масштабов фотосинтетической деятельности растений в биосфере большое значение имеет применение дистанционных методов сканирования хлорофиллсодержащих систем на планете. По современным оценкам, глобальная фотосинтетическая продуктивность составляет 300 — 400 млрд т углекислоты, связываемых ежегодно в процессе фотосинтеза, что эквивалентно образованию 160 — 200 млрд т органического вещества и 100 — 150 млрд т кислорода. Из них на долю Мирового океана приходится 30 — 35 %, а на долю континентов 65 — 70% первичной продукции фотосинтеза.
ГЛАВА 4
ДЫХАНИЕ РАСТЕНИЙ
В этой главе рассматриваются процесс аэробного дыхания, в котором освобождаемая при окислении углеводов свободная энергия преобразуется в энергию, заключенную в молекулах АТФ, а также механизмы, позволяющие растению контролировать энергетический статус клетки. Особое внимание уделено особенностям растений, связанным с наличием альтернативных путей в дыхательном метаболизме. Кроме того, обсуждаются вопросы, связанные с генерацией клеткой активных форм кислорода.
В процессе фотосинтеза растения синтезируют углеводы, которые транспортируются из листьев в другие органы. На свету и в темноте клетки растения «дышат», окисляя углеводы молекулярным кислородом с образованием СО2 и воды. При этом освобождается большое количество свободной энергии:
СбН12Об + 6О2 = 6СО2 + 6Н2О + энергия;
^G°, =-2882 кДж/моль (-686 ккал/моль)
Эта формула в общем виде отражает чрезвычайно сложный, а главное, контролируемый процесс, который условно можно разбить на три этапа: гликолиз, цикл трикарбоновых кислот и окислительное фосфорилирование в дыхательной цепи (рис. 4.1).
Гликолиз и цикл трикарбоновых кислот — это биохимические пути окисления глюкозы, протекающие соответственно в цитозоле и матриксе митохондрий. В биохимических реакциях синтезируется небольшое количество АТФ, и главный их результат — образование соединений с высоким восстановительным потенциалом — НАДН и ФАДН2. На заключительном этапе восстановительные эквиваленты окисляются в электрон-транспортной цепи, локализованной во внутренней мембране митохондрий. Перенос электрона в цепи завершается восстановлением кислорода до воды. В процессе электронного транспорта на мембране образуется электрохимический протонный градиент Арш» энергия которого используется для синтеза АТФ из АДФ и Фн. Процесс, в котором работа дыхательной цепи сопряжена с синтезом АТФ, получил название окислительного фосфорилирования. Именно в этом процессе синтезируется основная масса АТФ, образуемого при дыхании.
И у растений, и у животных дыхание выполняет три основные функции. Во-первых, освобождаемая при окислении углеводов энергия преобразуется в конвертируемые формы клеточной энергии — Ацщ и АТФ. Вторая, не менее важная функция — снабжение клетки метаболитами, которые образуются в ходе окисления глюкозы и используются в разнообразных биосинтезах. Третья функция связана с термогенезом, т.е. рассеиванием энергии в виде тепла. Процесс дыхания принципиально сходен у животных и растений, но у последних
Крахмал
Сахароза
Глюкоза
Рис. 4.1. Основные этапы дыхания.
Окисление глюкозы в процессе гликолиза сопровождается восстановлением двух молекул НАД*, синтезом двух молекул АТФ и завершается образованием двух молекул пирувата. В митохондриях пируват подвергается полному окислению до СО2 в реакциях, катализируемых пируватде- гидрогеназным комплексом (ПДК) и ферментами цикла трикарбоновых кислот (ЦТК). В этих процессах образуются 4НАДН, 1ФАДН2, а также одна молекула АТФ. Восстановительные эквиваленты окисляются, отдавая электроны в электрон -транс портную цепь, локализованную во внутренней митохондриальной мембране. Электронный транспорт приводит к восстановлению кислорода до воды и сопряжен с синтезом основной массы АТФ в процессе окислительного фосфорилирования
имеет свои особенности. Все вместе они отражают пластичность растительного метаболизма и связаны с функционированием, наряду с основными, альтер- нативных ферментов и реакций. Наличие альтернативных путей расширяет адаптивные возможности растений, но усложняет (с точки зрения исследователя) систему регуляции метаболических процессов.
МатриксМатриксВнутренняя мембранаВнутренняя мембрана
Матрикс
Матрикс
Внутренняя мембрана
Внутренняя мембрана
БИОХИМИЧЕСКИЕ ПУТИ ОКИСЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ
СТРУКТУРА МИТОХОНДРИЙ
Основные события, связанные с дыханием, происходят в митохондриях. Растительные митохондрии, как правило, сферической или цилиндрической формы, их число может сильно варьировать в зависимости от метаболической активности клетки. Две мембраны, наружная и внутренняя, делят митохондрию на два функциональных компартмента — межмембранное пространство и матрикс (рис. 4.2). Особые белки, называемые поринами, образуют в наружной мембране крупные гидрофильные каналы, или поры, через которые в межмембранное пространство из цитозоля свободно могут проникать соединения
ПорыПоры
Поры
Поры
Межмембранное/пространство С
Наружнаямембрана
Рис. 4.2. Структура митохондрий
с молекулярной массой не более 10 кДа. Это практически все основные метаболиты клетки. Внутренняя мембрана образует многочисленные складки, кристы, которые увеличивают ее поверхность. Во внутреннюю мембрану интегрированы электрон-транспортная цепь (ЭТЦ) и АТФ-синтаза. В отличие от других клеточных мембран внутренняя мембрана митохондрий обогащена белком (75 %) и содержит особый фосфолипид (дифосфатидилглицерол) — кардиолипин. Она пропускает газы, воду и небольшие липофильные молекулы, но непроницаема для заряженных молекул и ионов, что является обязательным условием ее функционирования как сопрягающей мембраны. Однако в мембране есть белки — транспортеры, с помощью которых возможен обмен метаболитами между матриксом и цитозолем (см. подразд. 4.1.8 и 4.2.11). Матрикс, т.е. окруженное внутренней мембраной пространство, содержит ферменты цикла трикарбоновых кислот.
ГЛЮКОЗА — ОСНОВНОЙ СУБСТРАТ ДЫХАНИЯ У РАСТЕНИЙ
Основным субстратом дыхания у растений являются глюкоза и ее производные, хотя в особых случаях дыхание могут поддерживать белки и жиры, запасенные в семенах. Глюкоза образуется в клетках растений при гидролизе крахмала и сахарозы — продуктов фотосинтеза. Крахмал представляет собой смесь двух полисахаридов — амилозы и амилопектина. Молекулы амилозы — это длинные, неразветвленные цепи a-D-глюкопиранозных остатков, соединенных гликозидными а(1->4)-связями. Молекулы амилопектина также пред-
ставлены цепями a-D-глюкопиранозных остатков, которые в точке ветвления образуют а(1—>6)-связь. Крахмал как запасный полисахарид накапливается в хлоропластах и пластидах гетеротрофных тканей. Некоторые растения — топинамбур (Heliantus tuberosus), георгин (Dahlia sp.) в качестве запасных углеводов могут использовать инулин и гемицеллюлозы. Сахароза — это дисахарид, образованный остатками глюкозы и фруктозы. Она синтезируется в цитозоле, из фотосинтезирующих клеток по апопласту листа и сосудам флоэмы транспортируется в другие органы растения.
Крахмал расщепляется до моносахаридов при участии ряда ферментов (а- и р-амилазы, а-1,6-глюкозидазы, крахмалфосфорилазы и др.) с образованием D-глюкозы или D-глюкозо-1 -фосфата. Распад сахарозы может идти при обращении реакций ее синтеза, но в основном происходит в результате гидролиза при участии фермента инвертазы.
сахароза + Н2О —► фруктоза + глюкоза
В геноме таких растений, как томат (Lycopersicon esculentum), кукуруза (Zea mays), арабидопсис (Arabidopsis thaliana), морковь (Dancus carota), обнаружено целое семейство ядерных генов, кодирующих разные изоформы инвертазы. Например, у моркови кислые инвертазы (оптимум pH 4,5 —5,0) в пяти разных изоформах присутствуют в вакуоли и клеточной стенке. В цитозоле есть нейтральная инвертаза (оптимум pH 7,0—8,0), которая также может иметь несколько изоформ. Таким образом, у растений гидролиз сахарозы может идти в разных клеточных компартментах и контролируется сложным образом через активность инвертаз, обладающих разными свойствами.
ГЛИКОЛИЗ — ПЕРВЫЙ ЭТАП ДЫХАНИЯ
Гликолиз — это универсальная последовательность реакций, общая для всех известных науке организмов, в ходе этих реакций глюкоза последовательно окисляется до пирувата. Окисление сопровождается образованием двух молекул НАДН и синтезом 2 молекул АТФ. Несомненно, что гликолиз — эволюционно самый ранний из известных способов получения энергии, и единственный для многих анаэробных бактерий. В аэробный метаболизм гликолиз включен как начальный этап окисления глюкозы.
Реакции гликолиза (рис. 4.3) протекают в цитозоле и катализируются ферментами, легко экстрагируемыми из клеток. Вначале богатая энергией, но стабильная молекула глюкозы фосфорилируется за счет АТФ в реакции (1), катализируемой гексокиназой. Образованный глюкозо-б-фосфат изомеризуется во фруктозо-б-фосфат (2) и еще раз фосфорилируется до фруктозе-1,6-бисфосфата с использованием еще одной молекулы АТФ (3). Эта необратимая реакция, ключевая в регуляции гликолиза (см. подразд. 4.1.7), имеет у растений следующую особенность. Если у животных данную реакцию катализирует только один фермент — АТФ-зависимая фосфофруктокиназа (3), то в клетках растений на этой стадии действуют сразу два фермента. Помимо АТФ-зависимой фосфофруктокиназы растения содержат также пирофосфатзависимую фосфофруктокиназу, которая катализирует фосфорилирование фруктозо-6-фосфата, используя не АТФ, а пирофосфат (4). Впервые этот фермент был обнаружен у
Фруктозо-6-фосфат
СН2О®
СН2О®
НО
ОН
Глюкозо-6-фосфат
он
он
Фруктозе-1,6-бисфосфат
НАДН
НАЦ
нс=о З-Фосфоглицериновый алвдегид
сн2о® снон
СН2ОН с=о СН2О® Фосфодиоксиацетон
СН2О® снон о=с-о~® 1, З-Фосфоглицерат
АДФ
АТФ
СН2О®
СНОН <■
СОО"
З-Фосфоглицерат
СН2ОН
—► ено®СОО"2-Фосфоглиперат
СОО"Фосфоснолпируват
Н2О
СН2
СОО"
Пируват
СН3 с=о
СО2
АТФ
АДФ
СОО"
С=О
сн2
СОО"
Оксалоацетат
НАДН
НАД
АДФ
АТФ
СОО"
носн
СН2
СОО" «АД
Малат
С=О
НАДН
► I
сн2
СОО"
Оксалоацетат
Рис. 4.3. Реакции гликолиза.
Реакции 1—17 катализируют следующие ферменты: 1 — гексокиназа; 2 — фосфоглюкоизомераза; 3 — АТФ-зависимая фосфофруктокиназа (АТФ: D-фруктозо-б-фосфат-!-фосфотрансфераза); 4 — ФФн-зависимая фосфофруктокиназа; 5 — фруктозе-1,6-бисфосфат альдолаза; 6 — трио- зофосфатизомераза; 7 — глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа; 8 — фосфоглицераткиназа; 9 — фосфоглицеромутаза; 10— енолаза; 11— пируваткиназа (АТФ:пируват-фосфотрансфераза); 12 — пируваткарбоксилаза; 13, 14 — НАД-зависимая малатдегидрогеназа; 15 — ФЕП-карбоксикина- за; 16— фруктозе-1,6-бисфосфатаза; 17 — глюкозо-6-фосфатаза; »- — необратимая реакция; <—► — обратимая реакция; —*- — обходные реакции при обращении гликолиза; (?) —
Оо -
фосфатная группа:= —Р—О
О'
У растений обнаружены ферменты, при участии которых возможен «обход» некоторых реакций гликолиза. Так, в клетках растений есть НАДФ-зависимая глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа, катализирующая реакцию
3-ФГА + НАДФ+ + Н2О -* 3-ФГК + НАДФН + 2Н+
В вакуолях некоторых растений (у Catharanthus roseus, Cupinus albus, Brassica nigra, Allium сера) обнаружена ФЕП-фосфатаза, катализирующая реакцию
ФЕП-фосфатаза _
ФЕП + Н2О ► Пируват + Фн
Оба альтернативных фермента активируются при фосфорном голодании.
Энергетический выход гликолиза небольшой. Если учесть, что на первом этапе активация глюкозы связана с расходом двух молекул АТФ, суммарный баланс можно выразить через уравнение
Глюкоза + 2НАД+ + 2ФН + 2АДФ —► 2Пируват + 2НАДН + 2Н+ + 2АТФ + 2Н2О
У растений гликолиз протекает не только в цитозоле, но и в пластидах. Пластидные и цитозольные изоформы кодируются разными ядерными генами и могут существенно различаться по своим свойствам. Пластидный гликолиз, связанный с мобилизацией крахмала, имеет место в гетеротрофных и фотосинтезирующих тканях. Однако в хлоропластах процесс, по-видимому, протекает только в темноте. Считается, что на свету активность пластидной изоформы АТФ-зависимой фосфофруктокиназы подавлена из-за высокой концентрации АТФ (см. подразд. 4.L7). Пирофосфатзависимая фосфофруктокиназа не обнаружена в хлоропластах и пластидах.
Предполагается, что образованные в гликолизе пируват, АТФ и НАДН используются в синтезе жирных кислот, который у растений протекает в пластидах. Следует также иметь в виду, что пластидный гликолиз может идти не до конца, так как такие соединения, как ФГА и ФГК, могут выходить из хлоропластов и включаться в гликолиз, протекающий в цитозоле.
При прорастании семян, если еще достаточно прочная наружная оболочка препятствует доступу кислорода, или при затоплении корней растений гликолиз завершается реакциями спиртовою или молочнокислого брожения. При этом образованный ранее НАДН вновь окисляется при восстановлении пирувата соответственно до этанола или молочной кислоты. Обычно сначала при участии лактатдегидрогеназы образуется молочная кислота:
+ Лактатдегидрогеназа+
Пируват + НАДН + Н ► Лактат + НАД
При накоплении молочная кислота подкисляет цитозоль, что необходимо для активации пируватдекарбоксилазы, которая при pH > 7,0 находится в неактивной форме. При участии этого фермента на конечном этапе синтезируется этанол:
Пируватдекарбоксилаза
Пируват► Ацетальдегид + СО2;
Алкогольдегидрогеназа
Ацетальдегид + НАДН + Н+*- Этанол + НАД+
Этанол в отличие от молочной кислоты способен выходить из клеток в межклеточники, что менее опасно, чем накопление в цитозоле лактата. Брожение
обеспечивает выживание растений ограниченное время в условиях недостаточного снабжения кислородом, т. е. при аноксии. По устойчивости к этому стрессу растения могут сильно различаться. Если некоторые болотные растения выживают в условиях аноксии в течение месяцев, то проростки ячменя или пшеницы не выдерживают и нескольких часов. Следует отметить, что в развивающихся пыльцевых зернах кукурузы (Zea mays) и табака (Nicotiana tabacum) спиртовое брожение имеет место в аэробных условиях и протекает наряду с дыханием.
СИНТЕЗ САХАРОВ ПРИ ОБРАЩЕНИИ ГЛИКОЛИЗА
Реакции гликолиза могут идти в обратном направлении, в результате чего из пирувата вновь будут синтезированы углеводы. Такой обращенный гликолиз носит название глюконеогенеза:
_Гликолиз _ ,
Глюкоза -«=^ Пируват
Глюконеогенез
Большинство реакций гликолиза близки к равновесию и легко обратимы. Только три реакции, катализируемые киназами (гексокиназой, фосфофруктокиназой и пируваткиназой), необратимы. На этих участках гликолиз идет в обратном направлении с помощью других ферментов и реакций (см. рис. 4.3). Для обращения реакции, катализируемой пируваткиназой, и получения ФЕП из пирувата необходим обходной путь, в котором участвуют ферменты цитозоля и митохондрий. Сначала пируват поступает в митохондрии, где при участии пируваткарбоксилазы карбоксилируется в энергозависимой реакции (72) с образованием оксалоацетата (ОАА). В митохондриях ОАА восстанавливается за счет НАДН с образованием малата (73) при участии НАД-зависимой малатдегидрогеназы. Этот фермент катализирует легко обратимую реакцию, которая идет в направлении синтеза малата, так как соотношение НАДН/НАД+ в митохондриях высокое. Далее малат выносится в цитозоль и вновь окисляется до ОАА U4). И наконец, оксалоацетат превращается в ФЕП в энергозависимой реакции, катализируемой ФЕП-карбоксикиназой (75). Далее фосфоенол- пируват легко превращается во фруктозе- 1,6-бисфосфат за счет обращения реакций гликолиза. Обращение реакций (76 и 77), катализируемых гексокиназой и фосфофруктокиназами, достигается при действии соответствующих фосфатаз. Из бС-сахаров, образованных в результате глюконеогенеза, возможен синтез сахарозы при участии сахарозофосфатсинтазы. Таким образом, в метаболизме растений существует способ синтеза сахаров из пирувата. Наиболее активно глюконеогенез протекает в прорастающих семенах тех растений, в которых запасными соединениями являются жиры (см. подразд. 4.1.9).
ОБРАЗОВАНИЕ ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ ЭКВИВАЛЕНТОВ,АТФ И СО2 В ЦИКЛЕ ТРИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ
В процессе гликолиза освобождается лишь незначительная часть той энергии, которая потенциально заключена в такой сложной молекуле, как глюкоза. В аэробных условиях пируват поступает в митохондрии, где подвергается окончательному окислению с образованием СО2.
Сначала окисление пирувата катализирует сложный пируватдегидрогеназ- ный комплекс (ПДК) (рис. 4.4). В его состав входят три фермента (пируватдегидрогеназа, дигидролипоилтрансацетилаза, дигидролипоилдегидрогеназа) и пять коферментов (тиаминпирофосфат — витамин Вь липоевая кислота, НАД+, ФАД и коэнзим А).
В реакции окисления пирувата участвует коэнзим А (СоА—SH) — сложная молекула, в составе которой есть активная SH-группа. Коэнзим А функционирует как универсальный переносчик ацетильных групп в разных ферментативных реакциях. Это соединение способно связывать остатки уксусной кислоты с образованием макроэргической тиоэфирной связи в молекуле ацетил-СоА. Окислительное декарбоксилирование пирувата (7) пируватдегидрогеназным комплексом сопровождается восстановлением НАД+ до НАДН, отщеплением СО2 и образованием ацетил-СоА. Ацетил-СоА вступает на путь дальнейших превращений в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК), известным также как цикл Кребса, или цикл лимонной кислоты. Цикл был открыт в результате блестящих работ, выполненных в лаборатории английского биохимика Г. А. Кребса в 30-х гг. XX в. на летательных мышцах голубя. Как выяснилось впоследствии, ЦТК — универсальный путь окисления остатков уксусной кислоты, включенный как обязательный компонент в дыхательный метаболизм аэробных организмов. У животных и растений все ферменты цикла кодируются ядерными генами, обладают несомненным сходством и, за единственным исключением, локализованы в матриксе митохондрий.
Первой реакцией цикла можно считать реакцию конденсации ацетил-СоА с оксалоацетатом с образованием цитрата (2), катализируемую цитратсинта- зой (см. рис. 4.4)
Изомеризация цитрата в изоцитрат включает две реакции, связанные сначала с отщеплением, а затем присоединением воды (5). Обе реакции катализируются одним ферментом — аконитазой. Далее следуют две реакции окислительного декарбоксилирования, каждая из которых связана с восстановлением НАД+ и выделением СО2. Сначала НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа окисляет изоцитрат (4) с образованием а-кетоглутарата, СО2 и НАДН. Эта самая медленная реакция определяет скорость оборота всего цикла. Образованный а-кетоглутарат подвергается дальнейшему окислению а-кетоглутаратдегидро- геназным комплексом, который по своей структуре и механизму действия является аналогом ПДК. В результате реакции (5) образуются НАДН, СО2 и сукци- нил-СоА. Далее сукцинил-СоА-синтетаза катализирует превращение сукцинил- СоА в сукцинат (6), что сопровождается фосфорилированием АДФ за счет энергии тиоэфирной связи в молекуле сукцинил-СоА. Это единственная реакция цикла, в которой за счет субстратного фосфорилирования синтезируется АТФ (растения) или ГТФ (животные).
Сукцинат окисляется до фумарата (7) сукцинатдегидрогеназой. Этот фермент локализован не в матриксе, а во внутренней мембране митохондрий и представляет собой один из компонентов дыхательной цепи — комплекс II. В ходе окисления сукцината электроны передаются на молекулу ФАД, которая является простетической группой в составе комплекса. Электроны с ФАДН2 прямо уходят в дыхательную цепь. Таким образом, сукцинатдегидрогеназа — это общий компонент ЦТК и дыхательной цепи (см.' подразд. 4.2.3). Далее фумараза гидратирует фумарат с образованием малата (5). И наконец, цикл
CoA-SH
СН3 с=о
COO-
CO2
О
CH3—C~S—CoA
Пируват
НАД
| НАДН
НАД
Н2О
СОО"
носн
сн2 соо-
Малат
СОО"
сн
сн
соо-
Фумарат
ФАДН
СОО-
ФАД
НАДН |
сн2 сн2 соо- Сукцинат
АТФ
CoA-SH
COO-
c=o
сн2 соо- Оксалоацетат
Ацетил-СоА
СОО" н>°
H2O
АДФФн
сн2но-^-соо-
сн2 - соо- Цитрат
О
H2O
СОО"
с=о
сн2 сн2 CoA-SH £ОО-
C-S-CoA I сн2 сн2
СОО"
соо-
неон
СН-СОО-
6н2
СОО"
Изопитрат
НАД
НАДН
а-Кетоглутарат
со2
НАД
Сукцинил-СоА НАДН
CoA-SH
Рис. 4.4. Окисление пирувата в матриксе митохондрий через пируватдегидрогеназныйкомплекс и цикл трикарбоновых кислот.
Окислительное декарбоксилирование пирувата сопровождается выделением СО2, восстановле-нием НАДН и синтезом ацетил-СоА. В реакции, катализируемой цитратсинтазой, ацетил-СоАконденсируется с оксалоацетатом с образованием цитрата. В 1ДТК цитрат окисляется с выделе-нием двух молекул СО2, в результате вновь синтезируется оксалоацетат. В реакциях НТК образу-ются 3 НАДН и 1 ФАДН2, а также синтезируется 1 АТФ. Образованный оксалоацетат вновьреагирует с ацетил-СоА, запуская следующий оборот цикла. Реакции 1—9 катализируют следу-ющие ферменты: 1 — пируватдегидрогеназный комплекс; 2 — цитратсинтаза; 3 — аконитаза; 4 —НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа; 5 — а-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс; 6 —сукцинил-СоА-синтетаза; 7 — сукцинатдегидрогеназа; 8 — фумараза; 9 — НАД-зависимая ма-латдегидрогеназа
замыкается реакцией окисления малата в оксалоацетат (9) при участии НАДзависимой малатдегидрогеназы. Это третья реакция цикла, в которой генерируются НАДН. Хотя данная реакция легкообратима, in vivo ее равновесие сдвинуто в сторону образования оксалоацетата. Сдвиг происходит потому, что продукты реакции быстро используются: оксалоацетат вновь реагирует с очередной молекулой ацетил-СоА и вступает в следующий оборот цикла, а НАДН окисляется в дыхательной цепи. Хотя большинство реакций цикла обратимы, две из них, катализируемые цитратсинтазой и а-кетоглутаратде- гидрогеназным комплексом, физиологически необратимы и контролируют направление цикла.
Таким образом, в матриксе митохондрий завершается процесс окисления глюкозы, начавшийся в цитозоле. В результате действия ПДК и одного оборота ЦТК молекула пирувата полностью окисляется с образованием 3 молекул СО2. Окисление пирувата сопровождается образованием 4 молекул НАДН, восстановлением ФАД и синтезом одной молекулы АТФ.
Энергетический выход при окислении глюкозы принято приравнивать к 36 молекулам АТФ. Эта цифра базируется на том, что окисление в дыхательной цепи НАДН, образованного в ЦТК, связано с синтезом трех молекул АТФ, а ФАДН2 — двух. Образованный в цитозоле НАДН также может быть окислен в цепи с образованием двух молекул АТФ (см. подразд. 4.2.6 и 4.2.9). При полном окислении глюкозы 2НАДН образуются при гликолизе в цитозоле, 8НАДН и 2ФАДН2 — в матриксе при окислении двух молекул пирувата. При окислении всех восстановленных эквивалентов в дыхательной цепи в сумме может быть получено 32 АТФ. Если учесть 4 молекулы АТФ, образованных на уровне субстратного фосфорилирования (2 АТФ в гликолизе и 2 АТФ в ЦТК), общий итог составит 36 молекул АТФ. Следует отметить, что эта цифра достаточно приблизительна и скорее всего завышена. Ряд данных указывает на то, что число молекул АТФ, синтезированных при окислении НАДН, может быть меньше трех (см. подразд. 4.2.7).
ОСОБЕННОСТЬ РАСТИТЕЛЬНЫХ МИТОХОНДРИЙ —ПРИСУТСТВИЕ МАЛИК-ЭНЗИМА
Стабильная работы ЦТК во многом зависит от концентрации промежуточных соединений, а значит, и от процессов, связанных с их удалением или, наоборот, вовлечением в цикл. Многие интермедиаты цикла активно из него уходят и используются в различных реакциях в цитозоле (см. подразд. 4.1.8). В связи с этим важное значение имеют так называемые анаплеротические реакции, которые катализируют взаимопревращение продуктов гликолиза и ЦТК, и при необходимости «подкармливают» цикл, пополняя пулы промежуточных соединений.
Так, ФЕП-карбоксилаза катализирует синтез оксалоацетата из ФЕП:
ФЕП + НСОзФЕП + НСОзФЕП-карбоксилазаФЕП-карбоксилазаОАА + ФнОАА + Фн
ФЕП + НСОз
ФЕП + НСОз
ФЕП-карбоксилаза
ФЕП-карбоксилаза
ОАА + Фн
ОАА + Фн
Как уже было показано (см. подразд. 4.1.4; рис. 4.3), оксалоацетат может быть также синтезирован из пирувата при участии пируваткарбоксилазъг.
Цитрат
Цикл трикарбоновыхкислот
Рис. 4.5. Альтернативные пути образования пирувата в растительной клетке.
Образованный в гликолизе фосфоеполпируват (ФЕП) может метаболизировать с образованием пирувата или малата. ФЕП-карбоксилаза катализирует взаимодействие ФЕП с НСО3 с образованием оксалоацетата, который превращается в малат. Малат, как и пируват, поступает в митохондрии и может поддерживать ЦТК, превращаясь в пируват при участии малик-энзима. Реакции 1— 7 катализируют ферменты: 1 — пируваткиназа; 2 — ФЕП-карбоксилаза; 3 — малатдегидрогеназа в цитозоле; 4 — малатдегидрогеназа в митохондриях; 5 — малик-энзим; 6 — пируватдегид- рогеназный комплекс; 7 — цитратсинтаза
Пируват карбоксилаза
Пируват + СО2 + АТФ► ОАА + АДФ + Фн
Малатдегидрогеназа катализирует легко обратимое взаимопревращение ок- салоацетата и малата:
НАД-зависимая малатдегидрогеназа.
Малат + НАД+*- ОАА + НАДН + Н+
Особый интерес вызывает функционирование в растительной клетке малик- энзима, который катализирует окислительное декарбоксилирование малата:
НАД'-зависимый малик-энзим,
Малат + НАД+»■ Пируват + СО2 + НАДН + Н
У растений малик-энзим присутствует не только в цитозоле, но и в митохондриях (НАД+-зависимая изоформа) и хлоропластах (НАДФ+-зависимая изоформа). Наличие этого фермента в митохондриях делает возможным получать пируват из малата и тем самым обходить последнюю реакцию гликолиза (рис. 4.5). Действительно, образованный в гликолизе ФЕП является субстратом сразу двух реакций. При участии пируваткиназы он превращается в пируват (7), а при участии ФЕП-карбоксилазы — в оксалоацетат (2). Последний легко восстанавливается до малата (5). Поступив в митохондрии, малат либо сразу включается в ЦТК, либо окисляется малик-энзимом до пирувата (5). На самом деле не совсем понятно, насколько этот альтернативный способ образования пирувата из малата используется in vivo в нормальной физиологической ситуации. Сообщалось, что этот путь активируется у некоторых растений при фосфорном голодании. Возможно, он включается при регуляторном подавлении активности пируваткиназы (см. подразд. 4.1.7). Тем не менее дублирование реакций, связанных с синтезом пирувата, отражает пластичность растительного метаболизма и, безусловно, расширяет их адаптивные возможности. Так, трансгенные растения табака (Nicotiana tabacum}, лишенные пируваткиназы, выживали и поддерживали нормальный метаболизм за счет этого обходного пути.
РАСПАД ГЛЮКОЗЫ РЕГУЛИРУЕТСЯ КЛЮЧЕВЫМИМЕТАБОЛИТАМИ И ПОДЧИНЕН КОМПЛЕКСНОЙ СИСТЕМЕ КОНТРОЛЯ
В гликолизе и ЦТК действуют несколько ключевых реакций, благодаря которым весь процесс окисления глюкозы от начала до конца является контролируемым. Наиболее важная точка контроля — реакции гликолиза, связанные с превращением фруктозо-б-фосфата во фруктозо-1,6-бисфосфат и обратно. Все ферменты, участвующие в прямой и обратной реакциях, подвержены аллостерической регуляции (рис. 4.6). В клетках животных АТФ-зависимая фосфофруктокиназа активируется АДФ и подавляется АТФ, тогда как в клетках растений этот фермент активируется ионом фосфата, а ингибируется ФЕП. Обратная реакция, катализируемая фосфатазой, в обоих случаях активируется АТФ и цитратом и подавляется АДФ. Такая система регуляции означает, что накопление в клетке нереализованного АТФ и фосфоенол пирувата на фоне низкого уровня АДФ и Фн приведет к подавлению активности фосфофруктокиназы и активации фосфатазы, т.е. к торможению скорости распада глюкозы.
фр-6-ффр-6-ффр-1,6-ффр-1,6-фРис. 4.6. Регуляция гликолиза у растений на уровне реакции фосфорилирования фрук- тозо-6-фосфата:Фр-6-Ф — фруктозо-6-фосфат; Фр-1,6-Ф — фруктозе-1,6-бисфосфат; Фр-2,6-Ф — фруктозо- 2,6-бисфосфат; АТФ-ФФК — АТФ-зависимая фосфофруктокиназа; ФФН-ФФК — пирофосфат- зависимая фосфофруктокиназа; фосфатаза — фруктозо-1,6-бисфосфатаза; ft — активирование;1 — ингибированиеРис. 4.6. Регуляция гликолиза у растений на уровне реакции фосфорилирования фрук- тозо-6-фосфата:Фр-6-Ф — фруктозо-6-фосфат; Фр-1,6-Ф — фруктозе-1,6-бисфосфат; Фр-2,6-Ф — фруктозо- 2,6-бисфосфат; АТФ-ФФК — АТФ-зависимая фосфофруктокиназа; ФФН-ФФК — пирофосфат- зависимая фосфофруктокиназа; фосфатаза — фруктозо-1,6-бисфосфатаза; ft — активирование;1 — ингибирование
фр-6-ф
фр-6-ф
фр-1,6-ф
фр-1,6-ф
Рис. 4.6. Регуляция гликолиза у растений на уровне реакции фосфорилирования фрук- тозо-6-фосфата:
Фр-6-Ф — фруктозо-6-фосфат; Фр-1,6-Ф — фруктозе-1,6-бисфосфат; Фр-2,6-Ф — фруктозо- 2,6-бисфосфат; АТФ-ФФК — АТФ-зависимая фосфофруктокиназа; ФФН-ФФК — пирофосфат- зависимая фосфофруктокиназа; фосфатаза — фруктозо-1,6-бисфосфатаза; ft — активирование;
1 — ингибирование
Рис. 4.6. Регуляция гликолиза у растений на уровне реакции фосфорилирования фрук- тозо-6-фосфата:
Фр-6-Ф — фруктозо-6-фосфат; Фр-1,6-Ф — фруктозе-1,6-бисфосфат; Фр-2,6-Ф — фруктозо- 2,6-бисфосфат; АТФ-ФФК — АТФ-зависимая фосфофруктокиназа; ФФН-ФФК — пирофосфат- зависимая фосфофруктокиназа; фосфатаза — фруктозо-1,6-бисфосфатаза; ft — активирование;
1 — ингибирование
В регуляцию этих реакций включен еще один фактор —- фруктозо-2,6-бис- фосфат, регуляторная молекула у всех эукариот. Фруктозо-2,6-бисфосфат действует как активатор прямой и ингибитор обратной реакции, т. е. стимулирует гликолиз и подавляет глюконеогенез. У животных фруктозо-2,6-бисфосфат активирует АТФ-зависимую фосфофруктокиназу и подавляет активность фосфатазы. У растений в отличие от животных фруктозо-2,6-бисфосфат не действует на АТФ-зависимый фермент, но четко активирует ФФ1Гзависимую фосфофруктокиназу и ингибирует фосфатазу. Пластидная изоформа АТФ-зависимой фосфофруктокиназы, как и цитозольная, активируется фосфатом и подавляется ФЕП, а также АТФ. О способах регуляции пластидной фосфатазы известно мало.
Фруктозо-2,6-бисфосфат образуется и деградирует при участии двух ферментов: фруктозо-6-фосфат 2-киназы и фруктозо-2,6-бисфосфатазы:
2-киназа
АТФАДФ
Фруктозо-6-фосфат ^ ^- <^ * Фруктозо-2,6-бисфосфат
ФнН2о
2-фосфатаза
Активность 2-киназы активируется ионом фосфата и фруктозо-6-фосфатом и ингибируется трехуглеродным продуктом гликолиза — ФГА и ФГК. Таким образом, синтез самой регуляторной молекулы сложным образом зависит от соотношения Сб/СЗ-сахаров в растительной клетке. На это соотношение будут влиять интенсивность синтеза сахарозы и транспорт в хлоропласт Фн в обмен на триозофосфат (см. гл. 3).
Второй регуляторный фермент гликолиза, пируваткиназа, аллостерически ингибируется метаболитами ЦТК, цитратом и малатом и активируется АДФ и Фн.
Следующая точка контроля на пути окисления глюкозы — ПДК, на примере которого можно видеть, как иногда сложно регулируется активность клю-
чевых ферментов. Одним из способов «быстрого реагирования» в клетке является изменение активности ферментов за счет их обратимого фосфорилирования—дефосфорилирования при участии специальных протеинкиназ и фосфатаз. Именно такому способу регуляции подвержен и ПДК: АТФ-зависимое фосфорилирование комплекса по остатку серина подавляет его активность, а при отщеплении фосфатной группы активность восстанавливается (рис. 4.7). Состояние комплекса зависит от активности киназы, которая в свою очередь подвержена аллостерической регуляции. Киназа активируется АТФ и ионом аммония и ингибируется субстратом комплекса — пируватом. Регуляторные свойства фосфатазы остаются пока неясными. Кроме того, ПДК ингибируется по типу обратной связи НАДН и ацетил-СоА.
Регуляторные ферменты ЦТК — цитратсинтаза и НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа. Активность цитратсинтазы аллостерически подавляется АТФ и НАДН. Изоцитратдегидрогеназа активируется АДФ и цитратом и ингибируется АТФ и НАДН. Кроме того, работа дегидрогеназ цикла зависит от соотношения НАД’/НАДН в матриксе. Следовательно, ключевую роль в управлении ЦТК играет соотношение НАДН/НАД+ и АТФ/АДФ в матриксе митохондрий. При высоком содержании АТФ и НАДН работа цикла будет тормозиться.
НАДН Ацетил-СоАНАДН Ацетил-СоАИтак, на всем пути окисления глюкозы действуют ферменты, активность которых сложным образом зависит от многих факторов. В то же время в системе регуляции прослеживается общий принцип: ключевые реакции регулируются «снизу вверх», т. е. метаболитами, которые образуются в последующих реакциях, и прежде всего на заключительной стадии, когда в процессе окислительного фосфорилирования синтезируется основная масса АТФ из АДФ и Фн. Во всех случаях ключевые ферменты реагируют либо на абсолютное содержание, либо на соотношение АДФ, АТФ и Ф„. Такая система регуляции очень логична и направлена на поддержание в клетке режима экономии, при котором ско-
НАДН Ацетил-СоА
НАДН Ацетил-СоА
АТФNH4АТФNH4Пируват1Киназа
АТФ
NH4
АТФ
NH4
Рис. 4.7. Регуляция пируватдегидрогеназного комплекса за счет обратимого фосфори-лирования/дефосфорилирования.
Киназа катализирует АТФ-зависимое фосфорилирование одного из белков комплекса, переводя его в неактивное состояние. Киназа активируется АТФ и ионами аммония, ингибируется пируватом. Дефосфорилирование при участии фосфатазы восстанавливает активность комплекса. Кроме того, активность ПДК подавляется продуктами реакции — НАДН и ацетил-СоА; 1 — ингибирование; 8 — активирование
рость распада глюкозы соответствовала бы потребностям клетки в АТФ и других продуктах дыхания. При высоком уровне АДФ и Фн, который отражает быстрый расход в клетке синтезируемой АТФ, ключевые реакции гликолиза и ЦТК активируются, а при накоплении АТФ тормозятся. Благодаря такой системе регуляции скорость окисления глюкозы и дыхания в целом координируется в соответствии с энергетическим статусом клетки.
ОБМЕН МЕТАБОЛИТАМИ ЦТК
МЕЖДУ МИТОХОНДРИЯМИ И ЦИТОЗОЛЕМ
Цикл трикарбоновых кислот — это не только необходимый этап энергообмена, но и источник соединений, необходимых для многих биосинтезов, протекающих в цитозоле и других компартментах. Благодаря интенсивному обмену с цитозолем в митохондриях пересекается обмен трех групп важнейших соединений — углеводов, белков и липидов (рис. 4.8). Например, ацетил-СоА — исходное соединение для синтеза жирных кислот и полиизопреноидных соединений, необходимых при биосинтезе липидов, каротиноидов, растительных гормонов. Важнейшей функцией цикла является экспорт так называемых
Глюкоза
Гликолиз
Липиды
АланинАланинПируват
Аланин
Аланин
Ацетил-СоААцетил-СоАЖирные кислотыЖирные кислоты
Ацетил-СоА
Ацетил-СоА
Жирные кислоты
Жирные кислоты
Изопреноидныесоединения
ДругиеаминокислотыДругиеаминокислотыБелкиБелкиАспартат *~Аспартат *~ПорфириныПорфириныГлутаматГлутаматДругиеаминокислотыДругиеаминокислотыЦитохромыЦитохромыФитохромыФитохромыХлорофиллыХлорофиллыБелкиБелки
Другиеаминокислоты
Другиеаминокислоты
Белки
Белки
Аспартат *~
Аспартат *~
Порфирины
Порфирины
Глутамат
Глутамат
Другиеаминокислоты
Другиеаминокислоты
Цитохромы
Цитохромы
Фитохромы
Фитохромы
Хлорофиллы
Хлорофиллы
Белки
Белки
Рис. 4.8. Цикл трикарбоновых кислот как центр метаболизма.
225225Интермедиаты ЦТК активно используются как исходные субстраты при образовании аминокис-лот, липидов и во многих других биосинтезах. Предлагаемая схема не является полной, она лишьдемонстрирует активный отток метаболитов с основного пути дыхания
225
225
8 Физиология растений
«углеродных скелетов» в виде кетокислот, необходимых для синтеза аминокислот в реакциях переаминирования.
Интеграция митохондрий в общий метаболизм возможна благодаря интенсивному обмену метаболитами между матриксом и цитозолем. Наружная мембрана благодаря наличию пор не препятствует такому обмену. Транспорт соединений через внутреннюю мембрану осуществляется с помощью интегрированных в нее белков-транспортеров. Транспортеры переносят кето- и аминокислоты, адениннуклеотиды, НАД', коэнзим А и многие другие соединения (см. также подразд. 4.2.11). Так, во внутренней мембране есть целое семейство похожих по своей структуре белков, которые осуществляют транспорт анионов ди- и трикарбоновых кислот, участвующих в ЦТК (рис. 4.9). Особенно интенсивно из митохондрий идет вынос а-кетоглутарата, который необходим для ассимиляции аммония и синтеза аминокислот в хлоропластах. В мембране обнаружены два обменных переносчика, которые выносят в цитозоль а-кето-
Рис. 4.9. Обмен метаболитами между матриксом и цитозолем.
Внутренняя мембрана митохондрий содержит белки-переносчики. Пируват и оксалоацетат поступают в митохондрии в обмен на ион ОН или фосфат и метаболизируют в ЦТК с образованием цитрата. Вынос цитрата или а-кетоглутарата в цитозоль в обмен на малат обеспечивает углеродными скелетами синтез аминокислот в пластидах, в том числе в хлоропластах. В цитозоле цитрат может превращаться в а-кетоглутарат при участии цитозольной НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы. Малат/оксалоацетат шаттл обеспечивает обмен НАДН между матриксом и цитозолем. Шаттл работает благодаря переносчику (известному как ОАА-транспортер), который осуществляет обменный транспорт через мембрану малата и оксалоацетата в ту и другую сторону. Важным транспортером является АТФ/АДФ-транслокатор и переносчик фосфата (см. подразд. 4.2.11)
глутарат и/или цитрат в обмен на малат. В цитозоле цитрат превращается в изоцитрат (при участии аконитазы), а затем окисляется с образованием а-кето- глутарата в реакции, катализируемой НАДФ'-зависимой изоцитратдегидрогеназой. В обмен на а-кетоглутарат или цитрат в митохондрии поступает малат, тем самым возмещая углеродные потери ЦТК.
Между митохондриями и цитозолем возможен также обмен восстановительными эквивалентами. Образующийся в ЦТК НАДН не только окисляется в дыхательной цепи, но и выносится в цитозоль, где используется как восстановитель в разных реакциях, например при восстановлении нитрата (см. гл. 6). И, наоборот, в ряде случаев НАДН из цитозоля может доставляться в матрикс. В то же время белок-переносчик для НАДН неизвестен. Обмен НАДН между матриксом и цитозолем осуществляется с помощью так называемых «челночных систем», или «шаттлов». Наиболее важная из них — малат/оксалоацетат- шаттл (рис. 4.9), оперирующий при участии НАД-зависимой малатдегидрогеназы, изоформы которой есть и в матриксе, и в цитозоле. В митохондриях, где содержание НАДН высокое, оксалоацетат за счет НАДН восстанавливается до малата. В мембране присутствует белок-переносчик, обменивающий малат на оксалоацетат. Оказавшись в цитозоле, малат может быть вновь окислен в обратной реакции с образованием НАДН. Этот простой челнок в принципе может работать в двух направлениях в зависимости от соотношения НАДН/НАД+ по обе стороны митохондриальной мембраны. В то же время есть данные, что in vivo он работает в основном «на экспорт»: около 25 —50 % НАДН, образованного в матриксе, окисляется в цитозоле благодаря малат/оксалоацетат-шаттлу.
Цикл трикарбоновых кислот не только поставляет метаболиты, необходимые для синтеза белков и липидов, но также включен в деградацию этих соединений. Хотя растения «дышат» в основном углеводами, в некоторых случаях дыхание поддерживают белки или жиры. Например, при развитии проростков образованные при распаде запасных белков аминокислоты через реакции переаминирования превращаются в кетокислоты — интермедиаты ЦТК и включаются в цикл. Использование жиров при прорастании семян масличных растений представляет собой особый случай, связанный с функционированием глиоксилатного цикла.
КОНВЕРСИЯ ЖИРОВ В УГЛЕВОДЫ. ГЛИОКСИЛАТНЫЙ ЦИКЛ
В семенах некоторых растений жиры являются доминирующими запасными соединениями. К их числу относятся клещевина {Ricinus communis), арахис {Arachis hypogaea), рапс {Brassica napus), подсолнечник {Helianthus annuus), тыква {Cucurbita pepo), соя {Glycine max), арабидопсис {Arabidopsis thaliana), пальма {Elaeis guineensis) и др.
В зависимости от вида растения жиры могут накапливаться в клетках семядолей (подсолнечник, рапс, арахис, соя) или в эндосперме (клещевина), т. е. в тканях, предназначенных «кормить» развивающийся проросток. При прорастании таких семян действует особый путь метаболизма, через который жиры превращаются в сахарозу, и она транспортируется в органы развивающегося проростка, где используется как субстрат дыхания и как источник углеводов для биосинтезов (например, клеточной стенки).
На пути превращения жиров в углеводы в тканях эндосперма или семядолей действует глиоксилатный цикл, ферменты которого локализованы в особых органеллах — глиоксисомах.
Глиоксисомы принадлежат к пестрому семейству микротелец, которое у растений представлено глиоксисомами и пероксисомами. По мере развития проростка глиоксисомы либо исчезают вместе с эндоспермом, либо превращаются в типичные пероксисомы при зеленении семядолей.
Уникальная конверсия жиров в углеводы включает три этапа: окисление жирных кислот, глиоксилатный цикл и глюконеогенез. Все три этапа связаны между собой через взаимодействие четырех компартментов — жировых телец, глиоксисом, митохондрий и цитозоля (рис. 4.10, 4.11). Обычно растения запасают триацил глицеролы, которые в клетке находятся в виде жировых телец, или олеосом. Олеосомы отделены от водной фазы мембраной, состоящей из одного слоя фосфолипидов. Такая необычная структура возникает при образовании олеосом: жиры синтезируются в полостях ЭПР, откладываются между двумя монослоями мембраны, а затем отщепляются в виде капель. Специальные белки, олеозины, покрывают их поверхность и предотвращают слипание. При прорастании семян жиры подвергаются гидролизу при участии липазы с образованием жирных кислот и глицерола. Глицерол может превращаться в триозофосфат и участвовать в гликолизе, а свободные жирные кислоты поступают в глиоксисомы, которые как правило находятся с олеосомами в тесном контакте. Здесь начинается процесс ^-окисления, в результате которого от жирной кислоты последовательно отщепляются 2С-фрагменты с образованием аце-
Н3С—CO-S-CoA СоААцетил-СоАН3С—CO-S-CoA СоААцетил-СоА' Н2ОСОО”' Н2ОСОО”СОО” I сн2НО-С-СОО”Iсн2СОО”ЦитратСОО” I сн2НО-С-СОО”Iсн2СОО”Цитратсн2 с=осн2 с=онс-соо-неонСОО”нс-соо-неонСОО”НАДННАДНСОО”ОксалоацетатСОО”Оксалоацетатсоо-соо-Н2ОН2ОНАДНАДноснноснСОО” ГлиоксилатСОО” Глиоксилатнс=онс=оИзоцитратИзоцитратсоосооСН2СО°” СоАН3С—CO~S-CoAМалатАцетил-СоАСН2СО°” СоАН3С—CO~S-CoAМалатАцетил-СоАСН2 сн2 СОО” СукцинатСН2 сн2 СОО” Сукцинат
Н3С—CO-S-CoA СоААцетил-СоА
Н3С—CO-S-CoA СоААцетил-СоА
' Н2О
СОО”
' Н2О
СОО”
СОО” I сн2
НО-С-СОО”
I
сн2
СОО”
Цитрат
СОО” I сн2
НО-С-СОО”
I
сн2
СОО”
Цитрат
сн2 с=о
сн2 с=о
нс-соо-
неон
СОО”
нс-соо-
неон
СОО”
НАДН
НАДН
СОО”
Оксалоацетат
СОО”
Оксалоацетат
соо-
соо-
Н2О
Н2О
НАД
НАД
носн
носн
СОО” Глиоксилат
СОО” Глиоксилат
нс=о
нс=о
Изоцитрат
Изоцитрат
соо
соо
СН2
СО°” СоАН3С—CO~S-CoA
МалатАцетил-СоА
СН2
СО°” СоАН3С—CO~S-CoA
МалатАцетил-СоА
СН2 сн2 СОО” Сукцинат
СН2 сн2 СОО” Сукцинат
Рис. 4.10. Глиоксилатный цикл.
Реакции 1—5 катализирут ферменты: 1 — цитратсинтаза; 2 — аконитаза; 3 — изоцитратлиаза; 4 — малатсинтаза; 5 — НАД-зависимая малатдегидрогеназа. Все ферменты, участвующие в цикле, локализованы в глиоксисоме, за исключением, возможно, аконитазы. Есть данные, что аконитаза в прорастающих семенях клещевины и тыквы является цитозольным ферментом
тил-СоА. Процесс сопровождается восстановлением НАД+ и образованием перекиси. Образованный НАДН может выноситься из глиоксисом через малат- оксалоацетат-челнок, а перекись разлагается каталазой (см. подразд. 4.3.2).
Ацетил-СоА является субстратом глиоксилатного цикла, который представляет собой модифицированный ЦТК (рис. 4.10). Три фермента — цитратсинта-
Рис. 4.11. Взаимодействие компартментов в процессе превращения жиров в углеводы при прорастании семян масличных растений.
Запасенные в виде жировых капель жиры подвергаются гидролизу липазой. Свободные жирные кислоты конденсируются с коэнзимом А и образуют ацил-СоА. Последний поступает в глиоксисомы, где происходит процесс р-окисления, в котором от жирной кислоты последовательно отщепляются ацетильные остатки в виде ацетил-СоА. Ацетил-СоА метаболизирует через глиок- силатный цикл, продуктом которого является сукцинат. Сукцинат поступает в митохондрии, где под действием ферментов ЦТК превращается в малат. Образованный в цикле малат выходит из митохондрий и метаболизирует в цитозоле с образованием фосфоенолпирувата. Фосфоенолпи- руват через глюконеогенез превращается в бС-углеводы
6 X
он
Глюкозо-6-фосфат
6НАДФ+
СН2ОН с=о
носн
1
6НАДФН
2
СНОН
СН2О®
Ксилулозо-5-фосфат
нс=о
2 х
СНОН I снон
5
снон
СН2О® Рибозо-5- фосфат
4
носн
СНОН
СН2О®
Ксилулозо-5-фосфат
соон
снон носн
6НАДФ+ 6НАДФН
СНОН снон СН2О®
6-Фосфоглюко-новая кислота
3
нс=о
Седогептулозо- 7-фосфат
СНОН
СН2О®
3- Фосфоглицериновый альдегид
СН2ОН с=о носн
2 X СНОН снон
нс=о
СН2ОН с=о
СНОНсн20®З-Фосфоглицери-новый альдегид
НОСН
= снон
СН2ОН с=о
нс=о снон снон сн2о® Эритрозо- 4-фосфат
СНОН
СН2О® Фруктозо- 6-фосфат
СН2ОН с=о снон
I снон СН2О®
Рибулозо-5-фосфат
СН2ОН З-Фосфодиокси- ацетон
СН2ОН с=о носн
2 X СНОН снон СН2О® Фрукгозо- 6-фосфат
сн2о® с=о
СН2О® с=о носн снон снон
I
СН2О®
н20
СН2ОН с=о носн снон
СНОН
Фруктозо- 1,6-дифосфат
12
нс=о
снон
СН2О® Фруктозоб-фосфат
НОСН
X снон
снон сн2о® Глюкозо- 6-фосфат
бхбСбхбС6СО2 + б х 506СО2 + б х 50Рис. 4.12. Пентозофосфатный цикл.Рис. 4.12. Пентозофосфатный цикл.
бхбС
бхбС
6СО2 + б х 50
6СО2 + б х 50
Рис. 4.12. Пентозофосфатный цикл.
Рис. 4.12. Пентозофосфатный цикл.
Первые три реакции цикла необратимы и сопровождаются образованием НАДФН и рибулозо-5-фосфата. Последующие реакции обратимы ипредставляют собой рекомбинацию 6 молекул 5С-сахаров с образованием 5 молекул глюкозо-6-фосфата. Реакции 1—12 катализируют следу-ющие ферменты: 1 — глюкозо-б-фосфатдегидрогеназа; 2 — глюконолактоназа; 3 — фосфоглюконатдегидрогеназа; 4 — пентозофосфатэпимераза;5 — пентофосфатизомераза; 6 — транскетолаза; 7 — трансальдолаза; 8 — транскетолаза; 9 — триозофосфатизомераза; 10 — альдолаза; 11 —фосфатаза; 12 — глюкозофосфатизомераза
за, аконитаза и малатдегидрогеназа, общие для глиоксилатного цикла и ЦТК, представлены в глиоксисомах другими изоформами. Две первые реакции глиоксилатного цикла идентичны двум первым реакциям ЦТК. Ацетил-СоА конденсируется с оксалоацетатом с образованием цитрата, который затем превращается в изоцитрат при участии аконитазы. Последующие две реакции специфичны для глиоксилатного цикла и катализируются двумя ферментами, уникальными для растений. В первой из них изоцитратлиаза катализирует расщепление изоцитрата с образованием сукцината и глиоксилата. Сукцинат уходит из цикла, а глиоксилат в реакции, катализируемой малатсинтазой, вновь конденсируется с еще одной молекулой ацетил-СоА с образованием малата. Замыкает цикл реакция окисления малата до оксалоацетата, идентичная аналогичной замыкающей реакции ЦТК. Таким образом, в результате пяти реакций из двух молекул ацетил-СоА (ацетильных остатков) синтезируется сукцинат, который уходит из глиоксисом и используется в синтезе углеводов. Согласно простейшей схеме сукцинат поступает в митохондрии, где включается в реакции ЦТК и восстанавливается до малата. Малат выносится из митохондрий в цитозоль и окисляется до оксалоацетата при участии малатдегидрогеназы. ФЕП-карбокси- киназа катализирует реакцию, в которой оксалоацетат превращается в ФЕП. Фосфоенолпируват, ключевой метаболит гликолиза, может быть превращен в глюкозу и сахарозу в процессе глюконеогенеза (см. подразд. 4.1.4).
Глиоксилатный цикл функционирует не только в прорастающих семенах масличных растений, но и в стареющих листьях, а также при созревании пыльцы. Предполагается, что гены, кодирующие ферменты глиоксилатного цикла, имеются у всех растений, но экспрессируются не во всех тканях и не на всех стадиях онтогенеза. При старении листьев пероксисомы, вероятно, трансформируются в глиоксисомы, и в них начинает функционировать глиоксилатный цикл, с помощью которого метаболизирует ацетил-СоА, образованный при деградации липидов мембран. Образующиеся сахара в дальнейшем уходят из стареющих листьев в другие органы.
ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ ПЕНТОЗОФОСФАТНЫЙ ЦИКЛ
В клетках растений и животных существует еще один способ окисления глюкозы, не связанный с энергообменом, но играющий важную роль в конструктивном обмене, — окислительный пентозофосфатный цикл (оПФЦ). В ПФЦ можно выделить два этапа (рис. 4.12). На первом из них первые три реакции цикла необратимы и связаны с последовательным окислением глюкозо-б-фос- фата при участии глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и 6-фосфоглюконатдегидрогеназы. В результате этих двух реакций теряется СО2, восстанавливаются две молекулы НАДФ+ и образуется рибулезо-5-фосфат. Второй этап включает реакции, связанные с рекомбинацией 5С-сахаров, в результате которых образуется исходный субстрат — глюкозо-6-фосфат. Для того чтобы цикл был замкнут, необходимо участие 6 молекул глюкозо-6-фосфата и образование соответственно 6 молекул рибулезо-5-фосфата. Перегруппировка молекул сопровождается превращением 6 молекул х 5С-сахаров в 5 молекул х бС-сахаров.
У растений ферменты оПФЦ обнаружены как в цитозоле, так и в пластидах. Пластидные и цитозольные изоформы кодируются разными ядерными генами.
В гетеротрофных тканях корня оПФЦ в пластидах протекает достаточно активно, но функционирование оПФЦ в хлоропластах вызывает много вопросов. Дело в том, что на свету в хлоропластах действует цикл Кальвина, многие ферменты которого (фосфатазы, транскетолазы, альдолаза, триозофосфати- зомераза) являются также ферментами оПФЦ. Поэтому полагают, что в хлоропластах оПФЦ действует только в темноте. «Выключение» цикла на свету связано с механизмом регуляции пластидной изоформы глюкозо-6-фосфатде- гидрогеназы. Как уже говорилось, активность ферментов может изменяться в результате их обратимого фосфорилирования. Еще один распространенный способ регуляции — это окисление или восстановление фермента по особой, регуляторной дисульфидной связи. На свету глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа переходит в неактивное состояние в результате восстановления по дисульфидной связи (—S—S ► — SHHS—), тогда как в темноте происходит спонтанное окисление фермента. Полагают, что в восстановлении участвует ферредоксин или тиоредоксин, восстановленные в ходе фотосинтеза. Основная функция оПФЦ — это генерация НАДФН, который требуется во многих биосинтезах, а также синтез углеводов с разным числом углеродных атомов. Образующиеся в цикле 5С- и 4С-углеводы активно уходят из цикла, так как необходимы для синтеза нуклеотидов, ароматических соединений, витаминов, флавоноидов, полисахаридов клеточной стенки и т. д. ЗС- и бС-сахара также могут покидать цикл и включаться в процесс гликолиза, который протекает в тех же компартментах. С учетом этого функционирование полного и замкнутого оПФЦ in vivo как в цитозоле, так и в хлоропласте представляется маловероятным.
ЭЛЕКТРОННЫЙ ТРАНСПОРТ И СИНТЕЗ АТФ
В МИТОХОНДРИЯХ РАСТЕНИЙ
ЭЛЕКТРОН-ТРАНСПОРТНАЯ ЦЕПЬ ДЫХАНИЯ.ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНА ОТ НАДН НА КИСЛОРОД
В предыдущем разделе были рассмотрены окислительные превращения глюкозы в биохимических реакциях, в результате которых образуются небольшое количество АТФ и восстановительные эквиваленты в виде НАДН и ФАДН2. Заключительный этап дыхания связан с трансформацией энергии на сопрягающей мембране и синтезом основной массы АТФ. Образованные в ЦТК НАДН и ФАДН2 окисляются в ЭТЦ дыхания, локализованной во внутренней мембране митохондрий. Окисление сопровождается транспортом 2е- по цепи переносчиков на О2, который восстанавливается до воды. Переносчиками электронов (кроме убихинона) в дыхательной цепи служат белки, содержащие про- стетические группы. Это флавопротеиды, в составе которых есть ФМН или ФАД, цитохромы и железосерные белки (см. подразд. 2.2). Способность этих соединений отдавать или принимать электроны может быть охарактеризована через стандартный редокс-потенциал Е°'. В дыхательной цепи перенос электрона от НАДН ^Е"' = -0,32) на О2 (Е°' = +0,82) идет через цепь переносчиков по градиенту, т. е. от соединений с более отрицательным к соединениям с более положительным редокс-потенциалом (рис. 4.13). Последовательность располо-
Е"', В
соответствии со значениями редокс-потенциала
жения в цепи переносчиков впервые была определена в начале 50-х гг. XX в. Б. Чансом. Дело в том, что многие компоненты дыхательной цепи имеют разные спектры поглощения в окисленном и восстановленном состояниях. При использовании высокочувствительной спектрофотометрии удалось определить их переходы из окисленного в восстановленное состояние и обратно во времени. Обнаружение ингибиторов, избирательно блокирующих электронный транспорт на разных участках, оказалось чрезвычайно полезным в этих исследованиях.
В митохондриальной мембране ЭТЦ организована сложным образом. В составе основной цепи, т. е. общей для животных, растений и грибов, есть четыре трансмембранных белковых комплекса (I —IV) и АТФ-синтаза (комплекс V)
Межмембранное пространство
Рис. 4.14. Электрон-транспортная цепь внутренней мембраны растительных митохондрий.
В состав основной цепи, общей для митохондрий животных и растений, входят комплексы I— IV, связь между которыми осуществляют подвижные переносчики электронов — убихинон (Q) и цитохром с. Для каждого комплекса известен специфический ингибитор: ротенон, антимицин A, KCN и СО. Комплексы 1, III и IV работают как протонные помпы: стрелками указана транслокация Н+ из матрикса в межмембранное пространство. Энергия Дцн+ обеспечивает работу АТФ- синтазы, катализирующей синтез АТФ из АДФ и Фн. Дыхательная цепь растений дополнительно содержит четыре ротеноннечувствительные НАД(Ф)Н-дегидрогеназы и альтернативную оксидазу (АО). НАД(Ф)Н-дегидрогеназы расположены на внешней (ДГМ) и внутренней (ДГ,„) сторонах мембраны. Альтернативная оксидаза является второй терминальной оксидазой растений и восстанавливает О2 до воды в обход комплексов III и IV. Специфическим ингибитором альтернативной оксидазы является салицилгидроксамовая кислота (SHAM). I — комплекс I: НАДН- дегидрогеназа; II — комплекс II: сукцинатдегидрогеназа; III — комплекс III: цитохром ЬС]-ком- плекс; IV — комплекс IV: цитохромоксидаза
(см. рис. 4.13, 4.14). Каждый из комплексов состоит из многих субъединиц белка, часть которых кодируется митохондриальной ДНК, а часть ядерным геномом. Переносчики электронов входят в состав комплексов: их простетические группы, или редокс-центры, формируют пути переноса электрона. Связь между комплексами осуществляют подвижные переносчики: убихинон и цитохром с. Участники транспорта могут функционировать как двухэлектронные (фла- вопротеиды и убихинон) и одноэлектронные (цитохромы и Fe-S-белки) переносчики.
Общая схема работы основной дыхательной цепи (далее ДЦ) такова (рис. 4.14). Образованный в матриксе в ходе ЦТК НАДН окисляется на комплексе I, который представляет собой НАДН-дегидрогеназу. Окисление НАДН сопровождается переносом 2е~ на убихинон или просто хинон (Q — от англ, quinon). Как было показано в гл. 2 «Биоэнергетика», для полного восстановления Q необходимо два атома водорода. Поэтому, принимая 2е~, убихинон захватывает недостающие 2Н из матрикса и переходит в восстановленную форму убихинола
(QH2). Убихинон может быть также восстановлен в результате окисления сукцината на комплексе II, который представляет собой сукцинатдегидрогеназу и является также компонентом ЦТК. Окисление сукцината до фумарата в ЦТК сопровождается восстановлением ФАД — простетической группы комплекса II, с которой е~ передаются на убихинон.
Убихинон в виде пула Q и QH2 растворен в липидном бислое мембраны. С пула QH2 электроны уходят на комплекс III, или цитохром 6/сгкомплекс, с которого передаются на цитохром с, локализованный в межмембранном пространстве. Этот небольшой водорастворимый белок действует как одноэлектронный переносчик между комплексами III и IV, перемещаясь путем диффузии вдоль мембраны. Комплекс IV, или цитохромоксидаза, — последний комплекс ДЦ, терминальная оксидаза всех аэробных организмов. Комплекс акцептирует электроны с цитохрома с и передает их на О2, который в итоге восстанавливается до Н2О.
Для полного восстановления О2 необходимо 4е“, поэтому 4 цитохрома с должны быть окислены на комплексе IV, чтобы произошла реакция
О2 + 4Н+ + 4е- = 2Н2О
Перенос е- в цепи по градиенту редокс-потенциала представляет собой экзергонический процесс с отрицательным значением Z\G°'. Освобождаемая при этом свободная энергия запасается на мембране в форме Дцн+- Электронный транспорт сопряжен с генерацией АЦН+, так как неразрывно связан с направленным переносом ионов Н+ через мембрану. Три комплекса цепи — I, III, ГУ — функционируют как протонные помпы, перекачивая протоны из матрикса в межмембранное пространство. Энергия АЦн* реализуется для синтеза АТФ из АДФ и Фн на АТФ-синтазных комплексах (Р0РгАТФазах), также интегрированных во внутреннюю мембрану митохондрий.
Сопряженный с электронным транспортом синтез АТФ получил название окислительного фосфорилирования. Такой является основная, или «стандартная», дыхательная цепь, общая для животных и растений, но у растений в отличие от животных дыхательная цепь организована сложнее: помимо комплексов I — IV она содержит пять дополнительных ферментов: четыре НАД(Ф)Н-дегидроге- назы, способные наряду с комплексом I окислять НАДН, а также и НАДФН. Но наиболее интересная и удивительная особенность дыхания растений связана с присутствием во внутренней мембране растительных митохондрий альтернативной оксидазы. Альтернативная оксидаза (АО) окисляет QH2 и восстанавливает О2 до воды и является, таким образом, второй терминальной оксидазой в дыхательной цепи растений. С пула QH2 электроны могут идти по двум направлениям — по цитохромному пути через комплексы III и ГУ, или по альтернативному пути через альтернативную оксидазу (рис. 4.14). Электронный транспорт по альтернативному пути не сопровождается генерацией Ацн*, поэтому большая часть энергии электронного потока рассеивается в виде тепла.
Рассмотрим подробно события, которые происходят на комплексах ДЦ и которые являются предметом интенсивного изучения во многих лабораториях мира. Все комплексы удалось выделить из мембран и исследовать (за исключением комплекса I) их трехмерную молекулярную структуру с разрешением 0,29 нм с помощью ренгеноструктурного анализа. В то же время события на комплексах нельзя считать до конца установленными, и полученные факты
только приближают нас к истине. При этом следует признать, что исследований на растительных объектах было мало, и во многом наши знания базируются на аналогиях с другими, более изученными системами животного или бактериального происхождения.
КОМПЛЕКС I, ИЛИ НАДН-ДЕГИДРОГЕНАЗА. ЭЛЕКТРОННЫЙТРАНСПОРТ В КОМПЛЕКСЕ СОПРЯЖЕН С ГЕНЕРАЦИЕЙ Арщ
Комплекс I (НАДН-убихинон-оксидоредуктаза), был выделен из ряда объектов: митохондрий сердца быка, из митохондрий сахарной свеклы (Beta vulgaris), картофеля (Solarium tuberosum), бобов (Viciafaba), арабидопсиса и риса (Огу^а sativa), а также митохондрий гриба Neurospora crassa и мембран Escherichia coli. Исследования показали, что по своим свойствам он существенно не отличается у объектов животного и растительного происхождения. У эукариот этот крупный комплекс с молекулярной массой 700 — 900 кДа состоит из 24—43 (в зависимости от объекта) белковых субъединиц. У прокариот комплекс I состоит из 14 субъединиц: семи чрезвычайно гидрофобных, локализованных в мембране, и семи относительно гидрофильных, расположенных вне мембраны. У эукариот этот эволюционно-консервативный кор-комплекс обрастает «шубой» из многих дополнительных субъединиц, функции которых по большей части неизвестны. Электронная микроскопия показала, что комплекс имеет характерную L-образную форму, напоминающую башмак. Гидрофобная «подошва» представлена белками, встроенными в мембрану, а гидрофильная часть — «лодыжка» — обращена в матрикс (рис. 4.15). У растений девять субъединиц, входящих в состав гидрофобной части комплекса, кодируются митохондриальной ДНК, а остальные компоненты находятся под контролем ядерных генов. Интересно, что мутации, затрагивающие комплекс I, возникают при некоторых заболеваниях человека, например в случае болезни Альцгеймера. У растений мутации по комплексу I описаны у табака (Nicotiana silvestris) и кукурузы (Zea mays)-. мутации сопровождались патологией пыльцы и приводили к такому явлению, как цитоплазматическая мужская стерильность.
В качестве редокс-центров в комплексе действует один ФМН, расположенный в гидрофильной части комплекса, а также 6—7 железосерных центров (2Fe-2S- и 4Ре-48-кластеры), обозначаемых как Nl, N2, N3 и т.д. (рис. 4.15). Кроме того, в гидрофобной части комплекса есть по крайней мере два сайта связывания для Q, в одном из которых, по-видимому, находится прочно связанный убихинон, фиксированный в структуре комплекса.
Классическими ингибиторами комплекса I являются ротенон, амитал натрия и пиерицидин А. Ротенон — флавоноид, эстрагируемый из корней некоторых тропических растений, блокирует электронный транспорт между одним из Fe-S-кластеров и пулом убихинона. Ротенон давно используется как инсектицид и рыбный яд, так как митохондрии насекомых и рыб особенно к нему чувствительны. Амитал натрия представляет производное барбитурной кислоты. Пиерицидин А — антибиотик, продуцируемый Streptomyces, является структурным аналогом убихинона и конкурирует с ним за места связывания. Комплекс окисляет «внутренний», т.е. образованный в матриксе НАДН (Е°' =-0,32 В), и восстанавливает убихинон (Е°' = +0,09 В). (Комплекс I имеет низкое сродство
Рис. 4.15. Организация в мембране и функционирование комплекса 1, НАДН:убихинон оксидоредуктазы.
Комплекс состоит из гидрофобного компонента, встроенного в мембрану, и гидрофильной части, обращенной в матрикс. Комплекс действует как НАДН-дегидрогеназа, т.е. окисляет НАДН и восстанавливает убихинон. В комплексе транспорт электрона идет через ФМН, несколько Fe- S-центров и фиксированный в структуре комплекса убихинон (Q,). Транспорт двух электронов сопровождается восстановлением Q с использованием 2Н+, а также транслокацией из матрикса в межмембранное пространство предположительно 4Н+ за счет плохо изученного механизма
к НАДФН и не вносит существенного вклада в его окисление.) При этом комплекс работает как протонная помпа: на каждый окисленный НАДН и восстановленный Q через мембрану из матрикса (in) в межмембранное пространство (out) перекачивается как минимум 4Н+:
НАДН + Н+ + Q + 4Htn — НАД+ + QH2 + 4Н™,
Известно, что НАДН при окислении отдает 2е“ на ФМН (Д0' —0,30 В), с которого электроны поочередно уходят на Fe-S-центры (£“' ~-0,25...-0,05 В), функционирующие как одноэлектронные переносчики. При этом точный путь е" в комплексе не установлен: есть данные, что восстановление Q идет с N2- кластера. В конечном итоге хинон принимает 2е“ и полностью восстанавливается до QH2, захватывая из матрикса 2Н+. Транспорт электрона в комплексе сопряжен с направленным переносом протонов и генерацией на внутренней мембране Ацщ- Механизм этого процесса не установлен. Обсуждаемые модели (P.L. Dutton et al., 1998) основаны на предположении, что в комплексе оперирует система, похожая на Q-цикл (см. подразд. 4.2.4). Дело в том, что в комплексе методом ЭПР (электронно-парамагнитного резонанса) обнаружены сайты, в которых связанные хиноны могут находиться в разных редокс-состояни-
ях: окисленном (Q), восстановленном (QH2) и в состоянии семихинона (Q"). Предполагается, что электронный транспорт в комплексе связан с обратимым восстановлением и окислением связанных хинонов. Процесс организован так, что при восстановлении Q протоны захватываются из матрикса, а при окислении — освобождаются в межмембранное пространство.
КОМПЛЕКС II, ИЛИ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗА
Комплекс II (сукцинат-убихинон-оксидоредуктаза) функционирует как часть ЦТК и как компонент дыхательной цепи. Комплекс был выделен из митохондрий картофеля (Solatium tuberosum), батата (Ipomoea batatas), маша (Vigna radiata), а также из объектов животного происхождения и бактерий. Его кристаллическая структура была определена у ряда бактерий. Комплекс (мол. масса ~ 125 кДа) состоит из четырех крупных полипептидов (А, В, С, D), кодируемых ядерным геномом (рис. 4.16). Субъединицы С и D — трансмембранные белки; А и В — представляют гидрофильную часть, обращенную в матрикс. С основной частью могут быть также ассоциированы мелкие гидрофобные белки, функции которых остаются неизвестными.
Редокс-центрами комплекса являются ФАД (Е°' ~ 0,0 В) и три железосерных центра: 2Fe-2S-, 4Fe-4S- и ЗРе-48-кластеры (Е°* —0,12...0,0 В). Кроме того, в комплексе обнаружен гем 6-типа (цитохром 65^0), который не участвует
Межмембранное
Рис. 4.16. Организация в мембране и функционирование комплекса II.
Комплекс состоит из 4 крупных полипептидов. Две гидрофильные субъединицы комплекса (А и В) обращены в матрикс и проявляют сукцинатдегидрогеназную активность. Две гидрофобные субъединицы (С и D) встроены в мембрану. При окислении сукцината электроны передаются на ковалентно связанный ФАД, затем на Fe-S-центры, обозначаемые как SI, S2 и S3, и далее на Q, точное место связывания которого остается неизвестным. Транспорт двух электронов сопровождается восстановлением Q с использованием 2Н+ из матрикса. В комплексе обнаружен гем Z>560, с неясной функцией
в электронном транспорте и функция которого неясна. Специфическими ингибиторами комплекса II являются щавелевоуксусная кислота и структурный аналог сукцината — малонат.
Комплекс окисляет сукцинат (£°' = -0,025 В) до фумарата и восстанавливает убихинон (Е"' = +0,09 В):
Сукцинат + Q —* Фумарат + QH2
Электроны, отнимаемые от сукцината, переносятся сначала на ФАД, а затем через Fe-S-кластеры на Q. Электронный транспорт в комплексе не сопровождается генерацией Арн+. Образующиеся при окислении сукцината 2Н+ остаются на той же стороне мембраны, т. е. в матриксе, и затем поглощаются при восстановлении хинона. Таким образом, комплекс II не вносит вклад в энергиза- цию мембраны и работает только как переносчик е" от сукцината к убихинону.
КОМПЛЕКС III, ИЛИ ЦИТОХРОМ ЬсгКОМПЛЕКС. ЭЛЕКТРОННЫЙТРАНСПОРТ В КОМПЛЕКСЕ СОПРЯЖЕН С ГЕНЕРАЦИЕЙ Арщ
Комплекс III (убихинол-цитохром с-оксидоредуктаза) выделен из митохондрий сердца быка, цыпленка, кролика и митохондрий дрожжей. В состав комплекса из митохондрий сердца быка (мол. масса -248 кДа) входит порядка 11 белковых субъединиц, 8 из которых представляют собой мелкие гидрофобные мембранные белки с неизвестной (возможно, структурной) функцией. Известно, что комплекс образует в целом 13 белковых петель, пересекающих мембрану. Из всех белков комплекса только цитохром Ь кодируется митохондриальным геномом.
Функциональными компонентами комплекса, несущими редокс-центры, являются:
цитохром Ь, в составе которого есть два гема 6-типа с разными редокс- потенциалами: гем 6L с низким (£“' —0,075...0,09 В) и гем 6Н с высоким (£“' - +0,05 В) потенциалом;
железосерный белок Риске, в составе которого есть 2Ре-25-центр (£°' - - +0,28 В);
цитохром Ci (£”' -+0,23...+0,25 В);
центры связывания для убихинона: Qm-центр и ОоиГцентр.
Известно, что in vivo комплекс функционирует как димер. Ингибитором комплекса является антибиотик антимицин А, который связывается и блокирует Qin-ueHTp. Кроме того, места связывания хинонов блокируются антибиотиками, получаемыми из миксобактерий, — миксотиазолом и стигмателлином.
Цитохром б^-комплекс окисляет восстановленный убихинон и восстанавливает цитохром с (Е°' - +0,25 В) согласно уравнению
QH2 + 2 цит. с+3 + 2Н*П —► Q + 2 цит. с+2 + 4HoUt
Электронный транспорт в комплексе сопряжен с переносом протонов из матрикса (in) в межмембранное пространство (out) и генерацией на мембране Арн*. События, которые при этом происходят, известны как Q-цикл, который был постулирован П. Митчеллом (1976). Принцип Q-цикла состоит в том, что перенос Н+ через мембрану происходит в результате окисления и восста-
новления хинонов на самом комплексе. При этом хиноны соответственно отдают и забирают 2Н+ из водной фазы избирательно с разных сторон мембраны (рис. 4.17, А, Б).
В структуре комплекса III есть два центра, или два «кармана», в которых могут связываться хиноны. Один из них, Qout-neHTp, расположен между 2Fe- 28-центром и гемом bv вблизи внешней (out) стороны мембраны, обращенной в межмембранное пространство. В этом кармане связывается восстановленный QH2. Другой, Qin-KapMaH, предназначен для связывания окисленного убихинона (Q) и расположен вблизи внутренней (in) стороны мембраны, контактирующей с матриксом. Транспорт электрона в комплексе организован следующим образом. Сначала первый QH2 связывается и окисляется в Qout-ueHT- ре, освобождая при этом 2Н в межмембранное пространство. При этом один е" уходит на 2Ре-25-центр белка Риске и далее на цитохром сх и цитохром с (рис. 4.17, Л). В результате в Qout-uenTpe остается анион-радикал — семихинон Q" (см. подразд. 2.12 и рис. 2.8). В Qout-ueHTpe Q7 крайне нестабилен и быстро отдает второй электрон на гем Ь^ и далее на гем 6Н. Расположение этих гемов в комплексе перпендикулярно плоскости мембраны, в результате чего электрон пересекает мембрану в направлении к Qin-ueHTpy. В этом «кармане» уже связан окисленный Q, который принимает один е" с гема 6Н и восстанавливается до семихинона (Q"), находящегося здесь в более стабильном состоянии. Затем все события повторяются при окислении второго QH2 (рис. 4.17, Б). Один е" уходит на 2Ре-28-центр и далее на цитохромы с, и с, а второй е" передается через два гема в Qin-KapMaH; здесь семихинон Q" принимает второй электрон и полностью восстанавливается до QH2 захватывая 2Н+ из матрикса. Восстановленный таким образом QH2 покидает Qitl~ центр, уходит в мембранный пул и может быть вновь окислен в Qout-ueHTpe комплекса. Таким образом, при окислении двух QH2 в Qout-neHTpe каждый раз 2Н+ уходят в межмембранное пространство. Из 4е, отданных в комплекс, 2е" идут на восстановление цитохрома с, т.е. уходят по цепи, а два других последовательно восстанавливают Q до QH2 в Qin- центре, что сопровождается захватом из матрикса еще 2Н+. Написав общее уравнение, а затем сократив его, получим выражение, приведенное выше:
2QH2 + 2 цит. с3* + 2Н* + Q = 2Q + QH2 + 2цит. с2+ + 4HoUt,или QH2 + 2цит.с3+ + 2Н^П = Q + 2цит.с2+ + 4HoUt
В итоге на каждый е, уходящий по цепи, 2Н+ переносятся из матрикса в межмембранное пространство (2е"/4Н+).
Необходимым и парадоксальным условием работы Q-цикла является тот факт, что время жизни и состояние семихинонов в двух центрах связывания разное. В Qout-центре Q- нестабилен и действует как сильный восстановитель, способный отдать е" на низкопотенциальный гем 6L. В Q^-центре образуется относительно долгоживущий Q7, потенциал которого позволяет ему действовать в качестве окислителя, принимая электроны с гема 6Н. Еще один ключевой момент Q-цикла связан с расхождением двух электронов, входящих в комплекс, по двум разным путям. Механизм такой транспортной «развязки» интригует исследователей. Изучение кристаллической структуры комплекса показало, что позиция 2Ре-25-нентра относительно других редокс-центров может смещаться. Оказалось, что белок Риске имеет подвижный домен, на котором
Рис. 4.17. Организация в мембране комплекса III и работа Q-цикла.
В электронном транспорте участвуют: 2Ре-28-центр белка Риске, гемы 6L и Ьн цитохрома Ь,цитохром сь а также убихиноны, связанные в Q,- и Qo-ueinpax.
А — первый QH2 связывается в Q,-ncinpe и окисляется, отдавая 2Н' в межмембранное пространство. При этом 1 е" уходит на 2Ре-28-центр и далее на цитохром с, и цитохром с. В Q„-центре остается нестабильный семихинон Q", который отдает второй электрон на гем bL и далее на гем Ьн. В итоге второй электрон попадает в Q,-центр и восстанавливает окисленный хинон с образованием более стабильного семихинона Q"; Б — при окислении второго QH2 один электрон опять уходит на 2Ре-28-центр и последовательно восстанавливает цитохромы с, и с. Второй электрон через гемы bL и Ьн попадает в Q,-центр и восстанавливает Q" с образованием QH2. При этом 2Н* захватываются из матрикса. Образованный в Q,-центре QH2 уходит в мембранный пул и может быть вновь окислен на комплексе. Транспорт двух электронов через комплекс сопровождается восстановлением двух цитохромов с и переносом 4Н' через мембрану за счет работы Q-цикла
собственно и расположен 2Ре-25-центр. Принимая электрон и восстанавливаясь, 2Fe-2S центр меняет свое положение, отдаляясь от Qoilt-центра и гема bL на 1,64 нм (2,12 нм) и тем самым приближаясь к цитохрому с^ Отдав электрон цитохрому, 2Ре-28-центр, наоборот, сближается с Рош-центром для установления более тесного контакта. Таким образом, функционирует своеобразный челнок (шаттл), гарантирующий уход второго электрона на гемы bL и Ьн- Пока это единственный пример, когда электронный транспорт в комплексах связан с подвижным доменом в структуре белка.
Данные рентгеноструктурного анализа, позволяющие определить положение активных групп относительно друг друга, дают основание думать, что электронный транспорт возможен не только между двумя гемами комплекса, но и между двумя гемами bt, расположенными на разных комплексах, ассоциированных в димер.
Комплекс III полифункционален. Недавние исследования на митохондриях пшеницы (Triticum aestivum), картофеля (Solatium tuberosum) и шпината (Spinacia oleracea) показали, что одна (две) из субъединиц комплекса, обращенных в матрикс, обладает MPP(Mitochondrial Processing Рерйба5е)-пептидазной активностью и принимает участие в транспорте белков в митохондрии (см. подразд. 4.2.11).
Следует сказать, что среди комплексов, способных генерировать Ацщ, комплекс III наиболее универсальный. Он присутствует не только в митохондриальной мембране, но и в мембранах хлоропластов и хроматофоров. В ЭТЦ фотосинтеза функционирует цитохром ^/-комплекс, аналогичный цитохром /^-комплексу дыхательной цепи.
Итогом сложной работы комплекса III является восстановление цитохрома с. Цитохром с — это небольшой (мол. масса - 12,5 кДа) белок, единственный белок цепи, не интегрированный в мембрану. Цитохром с курсирует вдоль мембраны в межмембранном пространстве и переносит по одному е ' на следующий и последний комплекс дыхательной цепи — цитохромоксидазу.
КОМПЛЕКС IV, ИЛИ ЦИТОХРОМОКСИДАЗА. ЭЛЕКТРОННЫЙТРАНСПОРТ В КОМПЛЕКСЕ СОПРЯЖЕН С ГЕНЕРАЦИЕЙ Арщ
Комплекс IV (цитохром с-кислород-оксидоредуктаза) или цитохромоксида- за, был выделен и изучен на таких объектах, как митохондрии сердца быка и мембраны бактерии Paracoccus denitriflcans. Комплекс из митохондрий быка (мол. масса -125 кДа) состоит из 13 белковых субъединиц.
Три большие трансмембранные субъединицы кодируются митохондриальной ДНК и окружены 9—10 более мелкими, синтез которых контролируется ядерными генами.
Редокс-центры комплекса расположены на двух крупных субъединицах I и II, интегрально встроенных в мембрану (рис. 4.18). На субъединице II расположен СиА-центр (Е°' ~ +0,24 В). В его составе есть два атома меди, лигандами которых являются остатки гистидина, метионина, глутамата и цистеина. Несмотря на присутствие двух атомов меди, СиА-центр функционирует как одноэлектронный переносчик, при этом медь меняет свою валентность Си2+ ■*-*- CuI+. Известно, что субъединица I образует 12 трансмембранных петель и содержит три редокс-центра: гем а (Е°' = +0,22 В) и так называемый биядерный центр
Межмембранное пространство
Рис. 4.18. Организация в мембране и функционирование комплекса IV, цитохром с-ки- слород-оксидоредуктазы.
На рисунке изображены две крупные субъединицы комплекса (I и II), на которых расположены редокс-центры. Комплекс последовательно окисляет четыре цитохрома с. Акцептируемые электроны сначала поступают на CuA-центр, затем на гем а и биядерный центр гем с3-СиВ. В биядер- ном центре происходит акт восстановления О2 с образованием двух молекул Н2О. При этом 4Н* захватываются из матрикса. Электронный транспорт в комплексе сопряжен со встречным движением протонов: на каждый электрон, поступивший в комплекс, один ион Н' выкачивается из матрикса в межмембранное пространство. Пути, по которым протоны пересекают комплекс, получили название D-, К- и Н-каналов
гем а3-СиВ (Е°’ = +0,38 В), в состав которого входит гем а3 и атом меди. Атом Fe в составе гема а3 и атом Си связаны с остатками гистидина в структуре белка. Кроме того, недавно в комплексе обнаружены ионы Mg2+ и Zn2+. Известно, что комплекс IV проявляет наибольшую активность в форме димера. Классические ингибиторы комплекса — цианид, азид и СО.
Комплекс IV последовательно окисляет 4 цитохрома с (Е”' = +0,25 В) и, принимая 4е", восстанавливает О2 до Н2О (£”' = +0,82 В). Электронный транспорт сопряжен с генерацией на мембране Ацн '• Два различных механизма вносят вклад в образование Дцн+: ПРИ восстановлении О2 четыре Н+ захватываются из матрикса для образования 2 молекул Н2О и еще 4Н+ активно перекачиваются из матрикса в межмембранное пространство, пересекая через комплекс мембрану:
4цит. с2+ + 4Н^п + 4Н^П + О2 = 2Н2О + 4Ноы + 4цит.с3+
Путь электрона в комплексе известен. Цитохром с связывается на субъединице II и восстанавливает Си А-центр, расположенный вблизи поверхности мембраны. С СиА-центра е уходит на гем а и далее на биядерный центр гем а3 — СиВ, расположенные в толще мембраны. В биядерном центре происходит связывание О2 и его восстановление до Н2О. Механизм восстановления кислорода уже давно является предметом интенсивного изучения, но ясен не до конца. Известно, что необходимые для восстановления О2 электроны поступают в биядерный центр последовательно. При этом фиксируются разные редокс-состояния, которые возникают при переходе окисленного центра [Fe3+—Си2+] в полностью восстановленное [Fe2+—Cu1+] состояние.
Помимо того, что комплекс IV захватывает из матрикса 4Н+ для образования двух молекул воды, он еще работает как протонная помпа, перекачивая Ш+ из матрикса наружу на каждый электрон, входящий в комплекс (4е /4Н+). Механизм захвата и транслокации ионов Н+ точно не установлен. Рентгеноструктурный анализ, а также данные, полученные с помощью метода сайт- специфичного мутагенеза, выявили в структуре субъединицы I пути, по которым протоны могут проникать и через комплекс пересекать мембрану. Эти пути получили название D-, К- и Н-каналов. В каналах, выстланные полярными аминокислотными остатками, по-видимому, удерживаются молекулы воды. Обнаруженный недавно в комплексе ион Mg2+, возможно, как раз и нужен для стабилизации этих молекул. Предполагается, что К-канал связывает водную фазу матрикса с биядерным центром и служит для доставки «субстратных» протонов, необходимых при образовании воды. D-канал, по-видимому, формирует сквозной путь, и по нему могут проходить как «субстратные» протоны, так и протоны, перекачиваемые через мембрану. У эукариот обнаружен еще Н-ка- нал, который, вероятно, также является сквозным. Несмотря на то что молекулярная структура комплекса IV достаточно полно расшифрована, механизм его работы остается непонятным. Предполагается, что встречный транспорт Н+ и электронов в комплексе тесно сопряжен с редокс-реакциями в биядер- ном центре. Данные, полученные методом сайт-специфичного мутагенеза, доказывают, что активную роль в этом играют определенные аминокислотные остатки, мутации по которым блокируют те или иные стадии в работе комплекса. Речь идет прежде всего об остатках гистидина-284, тирозина-288 и глутамата-286, расположенных вблизи биядерного центра, а также остатках лизина- 362 и аспартата-132, играющих ключевую роль в функционировании каналов.
ЭЛЕКТРОННЫЙ ТРАНСПОРТ СОПРЯЖЕН С СИНТЕЗОМ АТФ
С точки зрения термодинамики, транспорт двух электронов по градиенту потенциала от ПАДИ (£“' = -0,32 В) к кислороду (£’’ = +0,82 В) сопровождается отрицательным изменением стандартной свободной энергии, величина которого может быть рассчитана по формуле AG°' = -nF&E°' и составляет -52,7 ккал. Освобождаемая свободная энергия используется для синтеза АТФ из АДФ и Фн. Известно, что для этой реакции необходимо около 11 — 13 ккал, так что теоретически окисление НАДИ может быть сопряжено с синтезом как минимум трех молекул АТФ. Возникает вопрос, а сколько молекул АТФ образуется реально? В начале 1950-х гг. были проведены опыты по определению коэффициента P/О, равного числу молекул ортофосфата, используемого для фосфорилирования АДФ в расчете на каждый атом поглощенного кислорода. Оказалось, что отношение P/О зависит от природы окисляемого субстрата и при окислении НАДН может приближаться к трем (2,5 —2,7), а при окислении сукцината — к двум (1,5—1,8). Отсюда возникло представление, основанное также на величинах перепада свободной энергии на разных участках цепи, что в самой дыхательной цепи существуют три места, или пункта сопряжения, где происходит синтез АТФ. Транспорт ё" может идти через три или два пункта сопряжения и сопровождаться соответственно синтезом трех или двух молекул АТФ.
Теперь мы знаем, что эти представления оказались не совсем верными: синтез АТФ происходит не в дыхательной цепи. Работа цепи состоит лишь в перекачке через мембрану протонов для образования градиента Ацщ, который необходим для работы АТФ-синтазы. Исследователи продолжают использовать термин «пункты сопряжения», но теперь под ними подразумевают те участки цепи, на которых возникает Ацн+, т. е. комплексы I, III и IV. Если при окислении НАДН электроны идут по полной цепи, т. е. через три пункта сопряжения, величина генерируемого Ацн+ будет максимальной. Окисление сукцината на комплексе II сопряжено с транспортом е~ только через два пункта сопряжения. В итоге величина генерируемого цепью Ацн+ будет меньше, и меньше будет число синтезируемых молекул АТФ. У растений альтернативный путь дыхания через АО потенциально имеет только один пункт сопряжения (комплекс I) и диссипирует большую часть энергии в тепло. Следовательно, в зависимости от преобладания того или иного пути окисления субстрата in vivo величина Ацн+, а значит, и число синтезируемых молекул АТФ будут варьировать.
Итак, работа трех протонных помп в цепи приводит к неравномерному распределению протонов по обе стороны мембраны и ее энергизации. (Энергиза- ция мебраны сопровождается изменением ее свойств. В энергизованном состоянии мембрана становится визуально тоньше. Давно замечено, что в условиях активного дыхания митохондрии становятся более компактными, а при подавлении дыхания разбухают.) Возникающий на мембране электрохимический протонный градиент Ацн+, который может быть также представлен как протондвижущая сила Ар, имеет две составляющие:
АцнуЕ= Ар = Avg - 59 АрН (мВ).
Из-за «дырявости» наружной мембраны митохондрий pH в межмембранном пространстве такой же, как и в цитозоле, поэтому градиент АрН складывается небольшой (АрН = 0,2 —0,5) и не вносит существенного вклада в величину Ар. Основной вклад вносит электрическая составляющая — мембранный потенциал Ау. В результате концентрации ионов Н+ на внешней, а ионов ОН на внутренней поверхности мембраны, одна ее сторона заряжается более положительно, а другая более отрицательно. Возникающий заряд способствует концентрации по обе стороны мембраны и других ионов: любой отрицательный ион будет стремиться покинуть, а положительный — вернуться в матрикс, что усиливает составляющую мембранного потенциала. На мембране растительных митохондрий Ар обычно составляет -150 — 200 мВ.
Величина Арщ, или протондвижущей силы Ар, является мерой свободной энергии, запасенной в трансмембранной разности электрохимических потенциалов иона Н+. Эта энергия может быть реализована в результате движения протонов в обратном направлении по градиенту электрохимического потенциала. АТФ-синтаза сопрягает диффузию протонов обратно в матрикс с синтезом АТФ. Обратный ток протонов через Е0-канал приводит в движение АТФ- синтазные комплексы, катализирующие синтез АТФ из АДФ и Фн.
Следовательно, работа АТФ-синтаз приводит к уменьшению, или диссипации Ацн+, и разрядке мембраны. Подробно процесс синтеза АТФ при работе АТФ-синтазных комплексов рассмотрен в гл. 2 (подразд. 2.7 и 2.8).
Во внутренней мембране митохондрий локализована F0F|-АТФ-синтаза (Е0ЕгАТФаза), ориентированная своей каталитической частью (Ргфактор) в
матрикс (рис. 4.14). В отличие от СЕ0СЕгАТФазы хлоропластов, митохондриальные АТФ-синтазы проявляют высокую чувствительность к антибиотику оли- гомицину, который блокирует транспорт Н+ через Р0-канал и тем самым запрещает синтез АТФ. Общее число протонов, переносимых через мембрану при работе дыхательной цепи, точно не установлено, так как до конца не ясен механизм их транслокации на комплексах I и IV. Считают, что это число равно как минимум 10Н+ на каждые 2е~, переносимых от НАДН на О2 по полной цепи (см. рис. 4.14 и 4.20). Если считать, что данный процесс может привести к синтезу трех молекул АТФ, то для синтеза одной молекулы может быть достаточно ЗН+, проходящих через Е0-канал. Однако эти расчеты не принимают во внимание побочные затраты, также связанные с использованием Дцщ- Например, транспорт в матрикс фосфата (необходим для синтеза АТФ) идет в сим- порте, т. е. совместно с Н+ и, следовательно, связан с определенной диссипацией протонного градиента (см. подразд. 4.2.11).
СКОРОСТЬ ЭЛЕКТРОННОГО ТРАНСПОРТА.ДЫХАТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ
Скорость электронного транспорта обычно измеряют по скорости поглощения О2 суспензией митохондрий при наличии субстрата дыхания, например НАДН или сукцината.
Если митохондрии удалось выделить без существенного повреждения мембран, то скорость поглощения О2 будет четко зависеть от присутствия в реакционной среде АДФ (рис. 4.19). Если в среде содержится фосфат, то добавление АДФ даже в незначительной концентрации сразу же доводит скорость поглощения О2 до максимальной, и она остается таковой до тех пор, пока весь АДФ не превратится в АТФ. Тогда скорость дыхания падает вплоть до 10 — 15 % от максимальной и может снова возрасти при внесении АДФ. Этот экспериментальный факт получил название дыхательного контроля.
Каков же механизм лежит в основе дыхательного контроля? В нормально функционирующих митохондриях электронный транспорт сопряжен с синтезом АТФ. При сопряженном транспорте дыхательная цепь работает на создание
Рис. 4.19. Дыхательный контроль.
Поглощение кислорода суспензией митохондрий регистрируется полярографически кислородным электродом и характеризует скорость электронного транспорта. В отсутствие субстрата поглощение О2 практически не регистрируется (7). При добавлении субстрата скорость дыхания возрастает (2), достигает максимальных значений при внесении АДФ (5) и снижается, когда весь добавленный АДФ превратится в АТФ (4). Соотношение скоростей поглощения О2 в присутствии АДФ и без (3/4) является важным показателем степени сопряженности электронного транспорта с фосфорилированием
Рис. 4.20. Образование и диссипация Лрн+ на внутренней мембране митохондрий.
Комплексы I, III и IV работают на создание Дцщ, или протондвижущей силы Др, энергия которой используется ЛТФ-синтазами для синтеза АТФ из АДФ и Ф„. Энергизованное состояние мембраны контролируется действующими АТФ-синтазами и через механизм разобщения. Работа АТФ-синтаз, для которой необходим АДФ, сопровождается диссипацией Дцн+, что стимулирует работу трех протонных помп и электронный транспорт в цепи. Рассеивание Дцн* в виде тепла может быть достигнуто в результате разобщения, вызванного утечкой ионов Н+ обратно непосредственно через мембрану. В системе in vitro разобщение наступает при действии разобщителей. В системе in vivo разобщение возможно с помощью жирных кислот и разобщающего UCP-белка
ДДн*, работающие АТФ-синтазы рассеивают ЛДН+, и °ба процесса находятся в динамическом равновесии (рис. 4.20).
При наличии АДФ и фосфата АТФ-синтазы функционируют бесперебойно, но, если возникнет дефицит АДФ, их работа будет блокирована из-за недостатка субстрата. Это значит, что прекратится обратный ток протонов в матрикс через Fo-канал и величина АДщ начнет расти. При достаточно высоких значениях АДН ■ неизбежно возникнут трудности в работе трех протонных помп в цепи, что автоматически приведет к торможению электронного транспорта. Если в эксперименте создать очень высокий градиент ДцнЭ то электронный транспорт может прекратиться полностью. Если в систему вновь добавить АДФ и тем самым активировать АТФ-синтазы, то величина Ацн+ снизится и скорость электронного транспорта вновь возрастет.
Таким образом, механизм дыхательного контроля основан на прямом ингибирующем влиянии ДДН+ на электронный транспорт. Отсюда следует важный вывод: in vivo скорость переноса электрона в цепи прямо зависит от работы АТФ-синтаз, а значит от соотношения АТФ/АДФ в матриксе. В свою очередь, это соотношение определяется скоростью расхода АТФ в клетке и отражает ее энергетический статус.
Итак, дыхательный контроль — это часть уже рассмотренной нами фундаментальной системы регуляции дыхания через содержание АТФ и АДФ. Эта система контролирует скорость окисления глюкозы, начиная с гликолиза, ЦТК и кончая электронным транспортом в дыхательной цепи.
Следует отметить, что в литературе обсуждается «второй» механизм дыхательного контроля. Некоторые экспериментальные факты, полученные при работе с митохондриями животных, указывают, что на комплексе IV есть сайты (расположенные на одной из обращенных в матрикс субъединиц), в кото-
рых прямо могут связываться АТФ и АДФ. Предполагается, что, связываясь с комплексом, АТФ его ингибирует, а АДФ вытесняет АТФ из сайтов связывания. Таким образом, возможно, существует еще одна возможность контроля скорости дыхания: при высоком соотношении АТФ/АДФ в матриксе АТФ ал- лостерически ингибирует активность цитохромоксидазы.
РАЗОБЩЕНИЕ ЭЛЕКТРОННОГО ТРАНСПОРТАС ФОСФОРИЛИРОВАНИЕМ
Электронный транспорт в дыхательной цепи может быть не только сопряженным, но и разобщенным. Мы знаем, что непременным условием создания и поддержания Ацн+ является непроницаемость сопрягающей мембраны для ионов. Разобщение — это моментальная диссипация создаваемого цепью Ащ-р в результате увеличения ионной проницаемости мембраны. Впервые явление разобщения электронного транспорта с фосфорилированием было показано при изучении соединений, которые впоследствии стали называть разобщителями. Разобщители делают мембрану проницаемой для Н+ или других ионов, а значит либо полностью снимают Ацщ, либо снижают его величину (рис 4.20). В присутствии разобщителей цепь работает вхолостую: перекачка протонов через мембрану не приводит к созданию Арщ> так как ионы быстро возвращаются обратно. В этих условиях АТФ-синтазы прекращают работу, а электронный транспорт идет с максимальной скоростью из-за отсутствия «сдерживания» со стороны Ацщ. В этом случае электронный транспорт разобщен с синтезом АТФ и называется разобщенным.
Разобщители разных типов представляют собой чрезвычайно удобный инструмент для исследования энергетики мембран. Благодаря их специфичности можно избирательно влиять на две составляющие Ар: АрН и мембранный потенциал. Как правило, функцию разобщителей выполняют небольшие гидрофобные молекулы, легкорастворимые в липидном бислое. Некоторые из них, например антибиотики грамицидин, нонактин, аламетицин, встраиваются в липидный бислой и формируют каналы, по которым ионы Н+ и К+ и Na+ могут свободно проходить мембрану. Другой случай, когда разобщители (ионофоры) образуют с ионом подвижный комплекс. Например, антибиотик вали- номицин связывает ион К+ координационными связями в центре молекулы и в таком виде пересекает митохондриальную мембрану, двигаясь по градиенту заряда в более отрицательную область. Перенос положительно заряженного К+ снимает на мембране заряд, т. е. составляющую Avp, не влияя на величину АрН. Наоборот, протонофоры, будучи слабыми гидрофобными кислотами, пересекают мембрану в протонированной форме и снимают градиент pH. К числу протонофоров относятся такие широко используемые разобщители как 2,4- динитрофенол, нигерицин, моненсин, FCCP (карбонилцианид-л-трифторме- токсифенилгидразон). Следует также отметить, что сопряжение электронного транспорта с фосфорилированием легко нарушается в процессе выделения
митохондрий, особенно из растительных объектов (из-за жестких клеточных стенок гомогенизация растительного материала часто сопровождается повреждением митохондриальных мембран).
Однако не следует считать, что разобщение представляет собой лишь частный случай, наблюдаемый в эксперименте. Разобщение электронного транспорта с синтезом АТФ играет важную роль в метаболизме как животных, так и растений. Дело в том, что помимо запасания энергии в конвертируемой форме Дрщ и АТФ, одной из важных функций клеточного дыхания является рассеивание энергии в виде тепла. У животных разобщение — это один из способов повышения температуры тела. В митохондриях бурого жира (особая ткань млекопитающих, вырабатывающая дополнительное тепло при охлаждении) энергия Дцщ может использоваться не на синтез АТФ, а рассеиваться в виде тепла. Рассеивание Дцн+ происходит в результате повышения протонной проводимости мембраны на фоне резкого увеличения содержания в клетке свободных жирных кислот, образующихся при гидролизе жиров. Свободные жирные кислоты представляют собой природные протонофоры: циркулируя через мембрану, они способны оказывать разобщающее действие. Это выглядит так: анион жирной кислоты (пальмитиновой, линолевой, олеиновой) связывает ион Н+ на внешней поверхности мембраны и пересекает ее в протонированной форме, двигаясь по градиенту pH (рис. 4.21). На внутренней стороне мембраны наступает обратная диссоциация, однако чтобы система работала, необходимо вернуть анион жирной кислоты обратно. И здесь в процесс включаются специальные белки-переносчики, при помощи которых анион жирной кислоты диффундирует через мембрану в обратном направлении, двигаясь уже по градиенту заряда. Во внутренней мембране митохондрий бурого жира и других тканей млекопитающих обнаружено семейство так называемых разобщающих UCP (uncouple рго!е1п)-белков, выполняющих именно эту функцию (см. рис. 4.20 и 4.21). Не так давно стало ясно, что разобщение электронного транспорта с фосфорилированием имеет место in vivo и у растений. Растительные митохондрии содержат аналоги UCP-белков. Так, иСР5-белок обнаружен в митохондриях картофеля и арабидопсиса. У арабидопсиса показано наличие нескольких ядерных генов, кодирующих изоформы иСР5-белка, экспрессия которых стимулировалась на холоду. Таким образом, растения, как и животные, с помощью жирных кислот и UCP-белков способны ликвидировать Дцн+, освобождая энергию в виде тепла.
Если животные через разобщение могут значительно повысить температуру тела, то растения к этому не способны. Физиологическая функция разобщения
Рис. 4.21. Механизм разобщающего действия жирных кислот.
На внешней поверхности мембраны анион жирной кислоты RCOO” присоединяет Н+ и в протонированном виде (RCOOH) пересекает мембрану. Внутри митохондрий наступает диссоциация на RCOO” и Н+. В обратном направлении анион пересекает мембрану с помощью UCP-белка
в растительном метаболизме связана, видимо, только с регуляцией электронного транспорта. Иногда на фоне избытка нереализованного АТФ необходимо быстро окислить НАДН в дыхательной цепи, чтобы поддержать работу ЦТК. Для этого необходимо увеличить скорость электронного транспорта, который заторможен под действием высоких значений Лцн+- Снизив величину ДЦН+ на мембране через механизм разобщения, можно увеличить скорость электронного транспорта даже при высоком соотношении АТФ/АДФ в матриксе, т.е. «обмануть» систему дыхательного контроля.
Функцией разобщения может быть также защита от окислительного стресса. Дело в том, что при работе комплексов I, II и III часть электронов сбрасывается на кислород. Даже в норме в цепи идет прямое одноэлектронное восстановление О2 с образованием супероксидрадикала О; (см. подразд. 4.3.1). В свою очередь О2 быстро нейтрализуется супероксиддисмутазой с образованием более стабильного продукта — перекиси водорода:
20; + 2Н+ = Н2О2 + 02
Супероксидрадикал и Н2О2 представляют опасность для клетки, так как обладают большой окислительной способностью. В то же время угроза их накопления в клетке вполне реальна, особенно при насыщении цепи электронами. При высоком Дцщ торможение электронного транспорта способствует пе- ревосстановлению редокс-центров цепи, электроны с которых начинают интенсивно сбрасываться на кислород. В этих условиях можно снизить интенсивность образования супероксидрадикала, если увеличить скорость транспорта и разгрузить цепь через разобщение. Данный вывод подтвержден экспериментально. Так, ингибирование UCP-белка в митохондриях клубней картофеля сопровождалось чрезмерным накоплением Н2О2. И, наоборот, при активации разобщения жирными кислотами уровень этого опасного соединения в клетке был низким.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ НАД(Ф)Н-ДЕГИДРОГЕНАЗЫ
Дыхательная цепь растений содержит четыре дополнительные НАД(Ф)Н- дегидрогеназы (НАД(Ф)Н-убихиноноксидоредуктазы), способные окислять НАДН и НАДФН, восстанавливая пул убихинона. Альтернативные дегидрогеназы кодируются ядерными генами и представлены одним небольшим полипептидом (мол. масса 26 — 43 кДа), содержащим ФАД в качестве кофермента. Общим свойством этих ферментов является то, что их активность не подавляется ротеноном, «классическим» ингибитором комплекса I. В то же время специфические ингибиторы для них четко не установлены. Между собой дегидрогеназы различаются по кинетике, степени чувствительности к ингибитору ди- фенилениодиду и по потребности в ионах Са2+.
Ротеноннечувствительные НАД(Ф)Н-дегидрогеназы расположены по обе стороны внутренней митохондриальной мембраны (см. рис. 4.14). На обращенной к матриксу стороне есть две дегидрогеназы (НАДН-ДГ,П и НАДФН-ДГ,П), одна из которых специфична к НАДН, а другая к НАДФН. Они способны окислять эндогенный НАДН и НАДФН и в какой-то мере конкурируют с комплексом I, объективно снижая величину Дцн+. В то же время НАДН-ДГ;П
обладает значительно меньшим сродством к НАДН, чем комплекс I, и, вероятно, включается в работу только при достаточно высоком уровне НАДН в матриксе. Две другие, НАДН-ДГех и НАДФН-ДГех, расположены на внешней стороне внутренней мембраны. Их присутствие объясняет тот факт, что митохондрии растений в отличие от митохондрий животных способны окислять цитозольный НАД(Ф)Н, проникающий в межмембранное пространство через поры наружной мембраны. Присутствие внешних НАД(Ф)Н-дегидрогеназ в дыхательной цепи растений делает излишним использование некоторых челночных механизмов, работающих на доставку НАДН в митохондрии животных. В то же время следует учесть, что три альтернативные дегидрогеназы являются Са2+-зависимыми, а это значит, что они, вероятно, активируются только при увеличении цитозольной концентрации Са2+, которая в норме очень низка.
Физиологическая роль альтернативных НАД(Ф)Н -дегидрогеназ в ДЦ растений остается не совсем ясной. Очевидно, что она связана с контролем пулов НАДН и НАДФН в цитозоле и матриксе митохондрий. Следует отметить, что наличие нескольких ферментов, выполняющих одну и ту же функцию, в данном случае еще раз подтверждает свойства пластичности растительного метаболизма.
АЛЬТЕРНАТИВНАЯ ОКСИДАЗА В МИТОХОНДРИЯХ РАСТЕНИЙ
Изучение особенностей дыхания растений, связанных с альтернативной оксидазой (АО), имеет давнюю и интересную историю. Еще в XIX в. ботаники описали явление, которое впоследствии назвали термогенезом ароидных растений-. при цветении некоторых видов температура цветка резко повышается, иногда превышая температуру окружающего воздуха на десятки градусов. Этот феномен ярко выражен при цветении таких растений, как Arum maculatum, Symplocarpus foetidis, Sauromatum guttatum, Philodendron selloum. Так, температура цветка лилии Arum italium может достигать 51 °C при температуре воздуха 15 °C, а початок (цветка) скунсовой капусты {Symplocarpus foetidis) нагревается до 30 °C при температуре воздуха всего лишь 5 °C. Гиперпродукция тепла в цветке ароидных лилий необходима для испарения пахучих (иногда, неприятно пахнущих) соединений, привлекающих насекомых-опылителей.
В определенных температурных пределах скорость поглощения О2 и продукция тепла повышается при понижении и, наоборот, снижается при повышении температуры воздуха. При этом температура цветка может поддерживаться на высоком и постоянном уровне от нескольких часов до нескольких дней. Таким образом, хотя терморегуляция считается функцией теплокровных животных, в случае термогенеза у ароидных природа не была столь догматична.
При исследовании этого феномена оказалось, что повышение температуры тканей сопровождается вспышкой дыхательной активности, при этом поглощение О2 не подавляется цианидом и СО — классическими ингибиторами дыхания животных. Вскоре выяснилось, что и другие ткани высших растений имеют в процессе поглощения О2 компоненту, не подавляемую цианидом. Так было открыто цианидрезистентное дыхание, характерное для всех семенных растений, а также грибов, водорослей и даже некоторых простейших. Если
цианид (1 мМ) полностью подавляет дыхание животных, то у растений циа- нидрезистентное дыхание варьирует от 10 до 90 % в зависимости от вида и физиологического состояния. Целенаправленное изучение этого явления привело к открытию в дыхательной цепи растений альтернативной оксидазы (АО) и связанного с ней альтернативного пути переноса электрона. Активность АО не подавляется цианидом, а также другими ингибиторами комплекса IV — СО и азидом. Специфическими ингибиторами АО признаны соли гидроксамовых кислот (SHAM — Salicylhydroxamic acid — салицилгидроксамовая кислота) и и-про пил галлат.
Альтернативная оксидаза — убихинол-кислород-оксидоредуктаза — представляет собой один полипептид (мол. масса ~ 32 кДа), синтез которого кодируется ядерным геном — Лох1. У растений Sauromatum guttatum, сои (Glycine max) и арабидопсиса обнаружено три ядерных гена, кодирующих изоформы АО, экспрессия которых зависела от типа ткани.
Во внутренней мембране растительных митохондрий АО может находиться в мономерной или димерной форме (рис. 4.22). В структуре белка АО есть два остатка цистеина, при окислении которых образуется дисульфидная связь, ковалентно связывающая два мономера. При восстановлении фермента по дисульфидной связи активность АО возрастает в несколько раз.
Альтернативная оксидаза прямо восстанавливает О2 до Н2О за счет одного акта, связанного с отнятием от двух молекул QH2 4е' согласно реакции
2QH2 + О2 — 2Q + 2Н2О
Механизм восстановления О2 точно не установлен. Известно, что в каталитическом центре АО есть два атома железа, для связывания которых лигандами служат остатки глутамата, аспартата и гистидина. Точечный мутагенез по этим остаткам сопровождается инактивацией фермента. Реакция, катализируемая АО, не сопряжена с транслокацией протонов и не вносит вклад в создание на мембране Дрщ.
В дыхательной цепи растений реализуются два возможных пути, или две цепи, по которым отнимаемые от субстратов дыхания электроны переносятся на О2. Эти пути не автономны: они имеют общий участок, на котором работают комплексы I и II, а также альтернативные НАД(Ф)Н-дегидрогеназы, сбрасывающие электроны в пул убихинона (см. рис. 4.14, 4.23). Однако с пула убихинона электронные потоки могут разветвляться и идти по основному цитохромному или альтернативному пути. Электронный транспорт по цитохромному пути включает комплексы III и IV, а значит, связан с работой протонных помп и синтезом АТФ. Если с пула убихинона электронный поток сворачивает на альтернативный путь через АО, значительная часть его энергии теряется в виде тепла и не используется для синтеза АТФ. В этом случае при окислении
Межмембранное пространствоМежмембранное пространствоАллостерическиактивирует АОАллостерическиактивирует АОПируватПируватВосстановленный тиоре-доксин восстанавливаетдисульфидную связьВосстановленный тиоре-доксин восстанавливаетдисульфидную связьНАДФННАДФНРис. 4.22. Регуляция активности альтернативной оксидазы.Рис. 4.22. Регуляция активности альтернативной оксидазы.
Межмембранное пространство
Межмембранное пространство
Аллостерическиактивирует АО
Аллостерическиактивирует АО
Пируват
Пируват
Восстановленный тиоре-доксин восстанавливаетдисульфидную связь
Восстановленный тиоре-доксин восстанавливаетдисульфидную связь
НАДФН
НАДФН
Рис. 4.22. Регуляция активности альтернативной оксидазы.
Рис. 4.22. Регуляция активности альтернативной оксидазы.
АО может находиться в димерной и мономерной форме. Переход связан с образованием дисульфидной связи (—S—S—), образованной остатками цистеина, или с ее восстановлением (—SH HS—). Восстановление дисульфидной связи сопровождается активацией фермента и наоборот. Восстановителем является НАДФН или белок тиоредоксин, предварительно восстановленный НАДФН. Пул НАДФН в митохондриях поддерживается за счет окисления изоцитрата НАДФ- зависимой изоцитратдегидрогеназой. В восстановленном состоянии фермент аллостерически активируется пируватом
НАДН генерация Дцн+ потенциально возможна только на комплексе I, т.е. как минимум два из трех пунктов сопряжения теряются. При окислении сукцината или, если в окислении НАДН участвуют альтернативные НАДН-дегидрогеназы, вся заключенная в субстратах дыхания энергия рассеивается в виде тепла. Таким образом, вклад альтернативного пути в энергетический баланс в лучшем случае составляет треть от возможного. Поэтому в случае преобладания альтернативного дыхания клетки для получения АТФ должны использо-
Рис. 4.23. Альтернативные пути переноса электронов в дыхательной цепи растений.
Перенос электрона по цитохромному пути (темная стрелка) идет через комплексы I —IV и проходит через три пункта сопряжения (комплексы I, III и IV). У растений с пула убихинона электроны могут идти по альтернативноу пути (светлая стрелка) на альтернативную оксидазу (АО), минуя два из трех пунктов сопряжения. Кроме того, у растений ротеноннечувствительные дегидрогеназы могут пополнять пул QH2, окисляя НАДН и НАДФН по обе стороны митохондриальной мембраны
вать в три раза больше субстрата. Избыточное тепло, образуемое из-за необходимости сжигать большее количество субстрата для получения того же количества АТФ, лежит в основе термогенеза. Можно сказать, что альтернативное дыхание представляет собой вид несопряженного электронного транспорта, который не зависит от дыхательного контроля.
В митохондриях растений цитохромный и альтернативный пути дыхания конкурируют за электроны, а их вклад в общее поглощение О2 объективно зависит от активности каждого. В первую очередь их соотношение будет зависеть от содержания и активности альтернативной оксидазы. Определить вклад альтернативной оксидазы в общее поглощение О2 in vivo достаточно трудно. Долгое время считали, что электроны идут преимущественно по цитохромному пути и переключение потока е на альтернативный путь наступает только в условиях «сверхпотока», т.е. при насыщении основного пути. Полагали, что «диспетчером» в этом процессе выступает пул убихинона: при переходе 40— 60 % пула в восстановленное состояние цитохромный путь насыщается и избыточные электроны начинают уходить, можно сказать «переливаться» на альтернативную цепь. Основываясь на этом допущении, вклад цитохромного и альтернативного пути в общее поглощение О2 определяли с помощью ингибиторного анализа, используя цианид как ингибитор цитохромоксидазы и SHAM как ингибитор АО. Считалось, что подавление поглощения О2 SHAM отражает реальный вклад альтернативного дыхания в общую дыхательную активность. Однако оказалось, что все обстоит гораздо сложнее. Дело в том, что цитохром-
ный путь дыхания in vivo практически не достигает насыщения. АО включается при достижении определенного уровня восстановленное™ пула Q, после чего активно конкурирует с цитохромной цепью за электроны. Стало ясно, что в норме электроны с пула убихинона сразу перераспределяются по двум путям в соответствии с активностью каждого из них. Отсюда следует, что при подавлении одного из путей ингибитором, электронный поток быстро сворачивает в другое русло, что может привести даже к усилению дыхания. Например, при подавлении АО SHAM эффект ингибитора будет компенсирован усилением электронного потока по цитохромной цепи и не отразится на общем поглощении кислорода. В настоящее время реальный вклад АО определяют довольно сложным и малодоступным методом масс-спектрометрии. Метод основан на разном дифференциальном фракционировании АО и цитохромоксидазой изотопов кислорода О18 и О16 в составе образующейся воды. Следует отметить, что даже в присутствии KCN и SHAM поглощение кислорода растительной клеткой полностью не подавляется. Так называемое «остаточное» дыхание может варьировать от 5 до 30 % от общего и обусловлено поглощением О2 в реакциях, прямо не связанных с дыханием и протекающих в цитозоле и пероксисомах.
Активность АО прежде всего определяется тем, в каком состоянии находится фермент — окисленном или восстановленном. В то же время непосредственный восстановитель дисульфидной связи фермента точно не установлен (см. рис. 4.22). Им скорее всего является НАДФН, образованный в матриксе при участии НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы. По-видимому, НАДФН сначала восстанавливает белок тиоредоксин, который в свою очередь прямо восстанавливает дисульфидную связь в составе АО. Кроме того, активность АО зависит от уровня пирувата, который аллостерически активирует фермент.
Соотношение цитохромного и альтернативного дыхания варьирует достаточно широко и зависит как от стадии онтогенеза, так и от физиологического состояния растения. Наиболее впечатляющий тому пример — резкое увеличение интенсивности альтернативного дыхания при цветении ароидных. Но активация альтернативной оксидазы наблюдается и во многих других случаях: при прорастании семян, при старении листьев и цветков, при формировании пыльцы. Вспышка дыхательной активности (так называемый климактерический подъем дыхания) при созревании плодов также связана с усилением альтернативного дыхания. Интересно, что стимуляция альтернативного дыхания, связанная с экспрессией гена Aoxv и синтезом АО de novo, часто наблюдается в неблагоприятных условиях. Стрессы разной природы, такие, как низкотемпературный стресс, засоление, засуха, поранение или внедрение патогена, сопровождаются увеличением активности АО.
Физиологическая роль АО понятна только в случае термогенеза в цветках ароидных. В других случаях интенсивность дыхания и активность АО не столь велики, чтобы вызвать заметное повышение температуры тканей. Тогда зачем же у растений существует этот способ дыхания, в котором энергия дыхатель-
ных субстратов рассеивается и не используется для синтеза АТФ? На этот вопрос существует несколько ответов, и возможно, все они правильные.
Есть мнение, что альтернативное дыхание — это эволюционно возникший способ, позволяющий растениям поддерживать дыхание при подавлении основной цитохромной цепи цианидом. Дело в том, что многие виды (около 2500 видов, принадлежащих к разным семействам) в естественных условиях в качестве продуктов вторичного метаболизма образуют цианкогенные гликозиды, распад которых может сопровождаться образованием HCN. К таким растениям относятся, например, клевер {Trifolium repens), лотос {Lotus corniculatus), кас- сава {Manihot esculenta), Vicia sp., многие виды акаций.
Растения, накапливающие цианкогенные гликозиды, иногда становятся причиной массовых отравлений скота. Есть мнение, что причиной одного из заболеваний, распространенного среди населения Африки, является перманентное отравление организма цианидами из-за употребления в пищу клубней кас- савы. Биологическая роль этих соединений может быть защитной, направленной против патогенных микроорганизмов или травоядных животных. В свою очередь цианид может продуцировать и некоторые патогенные бактерии и грибы. Так, грибок Stemphylium loti, поражающий растение Lotus corniculatus, способен к образованию цианида, и инфекция сопровождается активацией АО в клетках растения. Однако образование в ряде случаев цианида некоторыми растениями не объясняет, почему АО есть у всех растений и какую роль она выполняет в нормально функционирующей клетке.
Впервые подобное объяснение было предложено X. Ламберсом (Lambers, 1985). Гипотеза «сверхпотока» предполагала, что альтернативное дыхание — это своего рода «выхлопной клапан», через который «сжигается» избыток углеводов, если клетка не в состоянии эффективно использовать их или запасти. Сейчас эта гипотеза трансформировалась: альтернативное дыхание рассматривают как механизм поддержания баланса между углеводным метаболизмом и скоростью электронного транспорта. Понять смысл этого утверждения поможет следующий пример. Известно, что скорость электронного транспорта контролируется через систему дыхательного контроля и снижается при высоком соотношении АТФ/АДФ в матриксе (см. подразд. 4.2.7). Предположим, что электронный транспорт по цитохромной цепи заторможен действием дыхательного контроля. В этих условиях уровень НАДН в матриксе возрастет. Мы знаем, что ключевые ферменты ЦТК регулируются через соотношения АТФ/АДФ и НАДН/НАД+. При высоком уровне НАДН и АТФ работа ЦТК будет блокирована, что должно привести к накоплению пирувата. Но пируват является аллостерическим активатором АО, и его накопление приведет к увеличению активности АО. Это в свою очередь стимулирует электронный транспорт по альтернативной цепи, который, с одной стороны, не будет сопряжен с синтезом АТФ, а с другой стороны, приведет к быстрому окислению избытка НАДН. Тем самым будет снят тормоз с ЦТК, интермедиаты которого активно используются в различных биосинтезах. Следовательно, функция АО может заключаться в том, чтобы в нужный момент стимулировать быстрое окисление НАДН в дыхательной цепи и тем самым снять с ЦТК «аденилатный контроль», т.е. разрешить работу цикла в условиях, когда концентрации АТФ в матриксе достаточно велики.
Вторая важная функция АО заключается в защите клетки от окислительного стресса. Как уже упоминалось, митохондрии являются местом образования
супероксидрадикала и Н2О2 (см. подразд. 4.2.8). Интенсивному образованию и накоплению этих опасных соединений способствуют торможение электронного транспорта и «перевосстановление» цепи при высоких значениях Ацн+- В этой ситуации повышение активности АО и увеличение скорости транспорта приведет к «разгрузке» цепи за счет быстрого сброса электронов на кислород с образованием «безопасной» воды. Существуют убедительные доказательства в пользу того, что альтернативная оксидаза препятствует генерации в цепи О2 и накоплению в митохондриях перекиси. Одно из них было получено при использовании трансгенных растений табака {Nicotiana tabacum). К культурам клеток с низкой (линия AS8) и супервысокой (линия S11) активностью АО добавляли антимицин А, ингибитор комплекса III. В результате блокирования электронного потока сброс е" на кислород с комплексов I, II, III резко возрастал. В клетках с низкой активностью АО это приводило к чрезмерной генерации Of и накоплению перекиси, что в итоге заканчивалось их гибелью. В клетках с высокой активностью АО уровень перекиси был не столь высоким, и они выживали. Эти опыты доказывают, что действие альтернативной оксидазы препятствует развитию окислительного стресса. Однако наиболее убедительным доказательством защитной функции АО служит тот факт, что перекись водорода является вторичным мессенджером в сигнальном каскаде, приводящем к экспрессии гена Ло-у и синтезу АО de novo (см. подразд. 4.3.4).
ЭНЕРГИЯ Дцщ ИСПОЛЬЗУЕТСЯ ДЛЯ ТРАНСПОРТА МЕТАБОЛИТОВЧЕРЕЗ ВНУТРЕННЮЮ МЕМБРАНУ МИТОХОНДРИЙ
Внутренняя мембрана содержит множество белков-транспортеров, которые переносят метаболиты и ионы через мембрану в обе стороны. Все они имеют небольшую молекулярную массу (30—34 кДа) и общий тип строения, характерной чертой которого является наличие шести трансмембранных «-спиралей. Некоторые из них показаны на рис. 4.24. Переносчик может переносить через мембрану только одну молекулу или ион — такой вид транспорта называется унипорт. Однако большинство транспортных белков митохондрий действуют как портерные системы, способные одновременно перетаскивать через мембрану два соединения в одном {симпорт) или в противоположных {антипорт) направлениях. При этом транспорт заряженных молекул и ионов так или иначе связан с Дри* на мембране и идет с использованием его составляющих ДрН и Ду. Если перенос заряженных молекул влияет на величину Ду, то такой транспорт называют электрогенным. Электронейтральный транспорт не вносит изменений в заряд мембраны.
Движущей силой транспорта может быть градиент pH в том случае, если соединение переносится совместно с ионом Н+ или ОН . Например, в мемб-
Рис. 4.24. Белки-транспортеры во внутренней мембране митохондрий.
Транспорт заряженных молекул или ионов прямо или косвенно связан с использованием составляющих Дрн+ на мембране — Дц/ или ДрН. Белок-переносчик может транспортировать соединение в симпорте или антипорте с ионами IГ или ОН, используя в качестве движущей силы градиент pH. При электрогенном транспорте белок-переносчик транспортирует заряженную молекулу по градиенту Ду и тем самым изменяет заряд мембраны. Множество переносчиков осуществляют электронейтральный обмен транспортируемых соединений
Межмембранное пространство
н+ -•—этц
Матрикс
Катион*
ЭТЦ формирует Дцн*на мембране
Унипорт катионапо градиенту Ду
ОН-
ОН-
АТФ4-
НРОГ
Оксалоацетат2
Цитрат3 /Н+
Н2РО4
Пируват
Антипортпо градиенту ДрН
Антипортпо градиенту ДрН
Н2РО4
Симпорт
н+
по градиенту ДрН
АДФ3-
Антипортпо градиенту Ду
Малат2
Электронейтральный обмен
Малат2
Электронейтральный обмен
Малат2
Электронейтральныйобмен
ране локализованы переносчики, которые осуществляют электронейтральный транспорт в матрикс фосфата и пирувата в антипорте, т.е. в обмен на ион ОН , который при этом выносится из митохондрий по градиенту pH. Движущей силой электрогенного транспорта является потенциал на мембране Ду. Ионы или несущие заряд молекулы с помощью транспортеров пересекают мембрану, двигаясь согласно заряду на мембране, внутренняя сторона которой заряжена отрицательно, а внешняя — положительно. По такому принципу действует, например, очень важный белок-транспортер — АТФ/АДФ-трансло- катор. Этот переносчик выносит в цитозоль АТФ в обмен на АДФ, тем самым обеспечивая субстратом АТФ-синтазные комплексы. Адениннуклеотиды переносятся через мембрану в виде ионов АТФ4"" и АДФ3" согласно градиенту Ду: заряд молекул таков, что в результате их обмена один избыточный отрицательный заряд выносится со стороны матрикса.
АТФ/АДФ-транслокатор имеет специфические ингибиторы. Это бонгкреко- вая кислота и антрактилозид — яды соответственно бактериального и растительного происхождения.
Как уже говорилось (см. подразд. 4.1.8), в митохондриальной мембране функционируют транспортеры анионов ди- и трикарбоновых кислот, участвующих в ЦТК. Хотя карбоксильные группы кислот в физиологических условиях несут отрицательный заряд, их транспорт электронейтральный, так как идет по типу антипорта в обмен на ион фосфата или другую дикарбоновую кислоту. Характерно, что в подобном обмене участвуют транспортные каскады, когда транспорт одного соединения из митохондрий зависит от транспорта другого в митохондрию. К примеру, транспорт в митохондрии малата идет в обмен на фосфат, который перед этим поступил в матрикс в обмен на ион ОН" при использовании градиента pH.
Генерируемый работой цепи Ду используется при транспорте не только небольших молекул и ионов, но и белков. Известно, что большинство митохондриальных белков кодируются ядерными генами и синтезируются в цитозоле. Некоторые из них синтезируются в форме предшественников и наряду со структурной основой содержат особую N-концевую аминокислотную последовательность, которая называется сигнальной, или транзитной. Обычно сигнальный пептид содержит около 80 аминокислотных остатков, среди которых много положительно заряженных остатков аргинина и лизина. От сигнальной последовательности зависит связывание белка с рецептором во внешней мембране и его проникновение в матрикс, где сигнальный пептид отрезается МРР- пептидазой (Mitochondrial processing peptidase). В растительных митохондриях МРР-пептидаза ассоциирована с цитохром Ьсх-комплексом, тогда как у животных этот фермент локализован в матриксе. В то же время белки-переносчики внутренней мембраны не имеют характерной N-сигнальной последовательности, а содержат «внутренние сигналы», которые не отрезаются. Оба типа белков проникают в митохондрии через крупные белковые комплексы — транслоказы, одна из которых находится во внешней (ТОМ-комплекс — translocase outer membrane), а две — во внутренней мембране митохондрий (TIM22- и TIM23- комплексы — translocase inner membrane). В составе транслоказ есть белки-рецепторы и белки, формирующие каналы для протаскивания транспортируемых белков. Транслоказы «узнают» и сортируют белки, либо обеспечивая их встраивание во внутреннюю мембрану (TIM22), либо пропуская их в матрикс (TIM23).
И в том, и в другом случае процесс протекает успешно только при наличии Ду на мембране. При рассеивании мембранного потенциала разобщителями типа валиномицина белки в момент прохождения застревают в мембране.
КЛЕТКА И АКТИВНЫЕ ФОРМЫ
КИСЛОРОДА
В предыдущем подразделе речь шла о том, что функции альтернативной оксидазы и механизма разобщения могут быть направлены на то, чтобы снизить интенсивность образования в дыхательной цепи супероксидрадикала 0$. В настоящем подразделе рассмотрены процесс генерации в клетке активных форм кислорода и роль, которую играют эти соединения в метаболизме растений.
ОБРАЗОВАНИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДАВ ПРОЦЕССЕ НОРМАЛЬНОЙ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИРАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ
Аэробные организмы и растения в особенности сталкиваются с постоянной опасностью: многие процессы, в которых участвует молекулярный кислород, сопровождаются образованием так называемых активных форм кислорода (АФК). Под этим термином подразумевают соединения, которые возникают в результате неполного восстановления О2. Постоянное образование АФК в растительной клетке является нормой и происходит главным образом в хлоропластах, митохондриях и пероксисомах. Наиболее значимые АФК — супероксидради- кал (Oj), пероксид водорода Н2О2 и гидроксилрадикал ОН". Кроме того, к АФК можно отнести синглетный кислород *О2, возникающий при взаимодействии О2 с возбужденным светом хлорофиллом (см. подразд. 3.6.4):
'О2 — О2 — О; —- Н2О2 —- ОН"
Первым продуктом восстановления кислорода является супероксидрадикал (Of), который образуется в результате захвата молекулой О2 одного электрона. Одноэлектронное восстановление происходит при взаимодействии О2 с восстановленными компонентами электрон-транспортных цепей. У растений О2 образуется в норме в ЭТЦ дыхания и фотосинтеза. Донорами электрона могут быть восстановленные Fe-S-кластеры и редокс-центры, содержащие семихи- нонрадикал. Например, в дыхательной цепи даже в физиологических условиях 2—5% электронов идет на образования Of в сайтах, расположенных на комплексах I, II и III. В нефотосинтезирующих клетках митохондрии являются основными сайтами образования Of. При фотосинтезе приоритет в образовании О2, возможно, принадлежит хлоропластам, хотя вопрос этот практически не изучен. Кроме того, образование супероксидрадикала возможно в коротких ЭТЦ, локализованных в мембранах пероксисом, функция которых связана с синтезом или, наоборот, деградацией некоторых соединений (рис. 4.25). Образование О2 связано также с катаболизмом ксантина (соединения, которое образуется при разрушении нуклеотидов) в реакции, катализируемой ксантинок- сидазой.
Рис. 4.25. Образование Oj в мембранах пероксисом.
В мембранах пероксисом из эндосперма клещевины и листьев гороха функционируют короткие ЭТЦ, использующие кислород как акцептор электронов в НАД(Ф)Н-зависимой реакции. Эти цепи состоят из двух (или трех) интегральных белков с молекулярной массой 32, 18 и 29 кДа. Один из белков (32 кДа) представляет собой флавопротеид (ФП), а белок с молекулярной массой 18 кДа — цитохром 65. Цепь устроена так, что генерация супероксидрадикала осуществляется на цитозольной стороне мембраны
Супероксидрадикал имеет короткое время жизни (10~6 с) и быстро нейтрализуется при участии супероксиддисмутазы (СОД) с образованием перекиси водорода:
Oj + Of + 2Н+ = Н2О2 + О2
Супероксиддисмутаза —• жизненно важный фермент всех аэробных организмов, в составе которого есть атомы металлов. В клеточных компартментах СОД присутствует в разных изоформах. У растений это три изоформы: Мп- СОД (митохондрии, пероксисомы), Cu-Zn-СОД (цитозоль, хлоропласт, пероксисомы) и Fe-СОД (хлоропласт).
Перекись водорода образуется не только в результате нейтрализации Of су- пероксиддисмутазой, но и в других реакциях, особенно интенсивно протекающих в пероксисомах В зеленых тканях Н2О2 образуется в фотодыхательном цикле при участии гликолатоксидазы (см. гл. 3), а также при окислении аминокислот, пуринов и других соединений в реакциях, катализируемых так называемыми флавиновыми оксидазами. Перекись является более стабильным продуктом, чем Of, и может диффундировать в клетке на значительные расстояния и даже пересекать мембраны через аквапорины.
Третий и самый опасный продукт неполного восстановления молекулы кислорода — гидроксилрадикал (ОН") — образуется в реакции Фентона при участии ионов железа:
Of + Fe3+ — Fe2+ + О2,
Н2О2 + Fe2+ -^ Fe3+ + ОН" + ОН"
Of + Н2О2 — ОН" + ОН" + О2
Образование гидроксилрадикала фиксируется при патологических состояниях. Он очень реакционноспособен и может окислять практически все. Его появление связано с существенным накоплением перекиси. Однако время жизни ОН" мало (10~9 с), и он не может диффундировать на значительные расстояния от мест своего образования. Таким образом, реальными АФК в клетке являются О| и Н2О2, образующиеся в нормальных физиологических условиях в разных процессах и реакциях.
Супероксидрадикал и перекись, будучи химически активны, способны реагировать с разными соединениями, что может привести к деградации липидов и белков, вызывать повреждение ДНК и дезорганизацию цитоскелета (см. подразд. 8.6). Так, АФК могут вступать в реакцию с полиненасыщенными жирнокислотными цепями в составе фосфолипидов, формирующих бислой мембраны, и тем самым спровоцировать процесс перекисного окисления липидов. В результате цепной реакции окисления, идущей с образованием свободнорадикальных продуктов, нарушаются гидрофобность липидного бислоя и его проницаемость. Именно это приводит к разрушению мембран при старении клеток. Особенно остро проблема, связанная с образованием АФК, имеет место у растений в связи с фотосинтезом. Образование синглетного кислорода и супероксидрадикала в хлоропластах может сопровождаться разрушением фотосинтетического аппарата в результате фотоингибирования и деградацией хлорофилла (см. подразд. 3.5.4).
АНТИОКСИДАНТНЫЕ СИСТЕМЫ
Если растения и животные образуют АФК в процессе нормальной жизнедеятельности и при этом остаются живыми, значит, они контролируют их содержание, избегая накопления опасных молекул. В хлоропластах нейтрализация *О2 связана с эффективной защитой каротиноидных пигментов (см. гл. 3 «Фотосинтез»), В митохондриях действие альтернативной оксидазы и механизма разобщения с помощью UCP-белков снижает вероятность генерации в дыхательной цепи супероксидрадикала (см. подразд. 4.2.8 и 4.2.10). Вторую линию защиты в клетках аэробных организмов создают эффективно действующие соединения и ферменты-антиоксиданты, работающие на ликвидацию АФК и репарацию возможных повреждений. Важнейшими антиоксидантами являются аскорбиновая кислота (витамин С), глутатион, а-токоферол (витамин Е) (рис. 4.26). Последний локализован в мембранах и способен неферментативно взаимодействовать с АФК, предотвращая процесс перекисного окисления липидов (рис. 4.27). Ткани растений в больших количествах содержат аскорбиновую кислоту, которая присутствует во всех клеточных компартментах, включая апопласт. Окисление аскорбата сопровождается образованием моно- или дегидроаскорбата. Глутатион — это небольшой пептид, имеющий активную SH-группу. При окислении две молекулы глутатиона образуют дисульфидную связь: 2Г— SH = Г—S—S—Г + 2Н". Аскорбиновая кислота и глутатион активно участвуют в защитных ферментативных реакциях.
Содержание О| и Н2О2 в клетке контролируется ферментами — антиоксидантами: супероксиддисмутазой, каталазой, гваяколовой пероксидазой, аскорбатпероксидазой, глутатионпероксидазой, а также ферментами аскорбат-глу-
соон
hc-nh2
(CH2)2
I o=cIHOC оIIHOCIHCI HOCHCH2OHI o=cIHOC оIIHOCIHCI HOCHCH2OHI o=c I 2H* o=c о:—►I1— O=CI HCHOCHCH2OHI o=c I 2H* o=c о:—►I1— O=CI HCHOCHCH2OHc=o
I o=c
I
HOC о
II
HOC
I
HC
I HOCH
CH2OH
I o=c
I
HOC о
II
HOC
I
HC
I HOCH
CH2OH
I o=c I 2H* o=c о
:—►I
1— O=C
I HC
HOCH
CH2OH
I o=c I 2H* o=c о
:—►I
1— O=C
I HC
HOCH
CH2OH
I
NH
I
CH—CH2—SH
c=o
I
NH
I
COOHГлутатион (Г—SH)COOHГлутатион (Г—SH)Аскорбиновая кислота (АК)Аскорбиновая кислота (АК)Дегидроаскорбиновая кислота (ДГА)Дегидроаскорбиновая кислота (ДГА)CH3CH3а-Токоферол (витамин Е)а-Токоферол (витамин Е)Рис. 4.26. Молекулы-антиоксиданты.При окислении 2 молекулы восстановленного глутатиона Г—SH образуют дисульфидную связь: -2Н"2Г—SH ^ Г—S—S—Г. При окислении аскорбиновой кислоты до дегидроаскорбиновой кислоты (АК —^- ДГА) в качестве промежуточного продукта может быть образован монодегидроасРис. 4.26. Молекулы-антиоксиданты.При окислении 2 молекулы восстановленного глутатиона Г—SH образуют дисульфидную связь: -2Н"2Г—SH ^ Г—S—S—Г. При окислении аскорбиновой кислоты до дегидроаскорбиновой кислоты (АК —^- ДГА) в качестве промежуточного продукта может быть образован монодегидроасCH2
COOH
Глутатион (Г—SH)
COOH
Глутатион (Г—SH)
Аскорбиновая кислота (АК)
Аскорбиновая кислота (АК)
Дегидроаскорбиновая кислота (ДГА)
Дегидроаскорбиновая кислота (ДГА)
CH3
CH3
а-Токоферол (витамин Е)
а-Токоферол (витамин Е)
Рис. 4.26. Молекулы-антиоксиданты.
При окислении 2 молекулы восстановленного глутатиона Г—SH образуют дисульфидную связь: -2Н"
2Г—SH ^ Г—S—S—Г. При окислении аскорбиновой кислоты до дегидроаскорбиновой кислоты (АК —^- ДГА) в качестве промежуточного продукта может быть образован монодегидроас
Рис. 4.26. Молекулы-антиоксиданты.
При окислении 2 молекулы восстановленного глутатиона Г—SH образуют дисульфидную связь: -2Н"
2Г—SH ^ Г—S—S—Г. При окислении аскорбиновой кислоты до дегидроаскорбиновой кислоты (АК —^- ДГА) в качестве промежуточного продукта может быть образован монодегидроас
корбат (АК МДГА)
татионового цикло. Каталаза — это гемсодержащий фермент, локализованный в пероксисомах и, по некоторым данным, в митохондриях, эффективно разлагает перекись в реакции:
2Н2О2 — 2Н2О + О2
Пероксидаза — это также гемсодержащий гликопротеид, который в разных изоформах присутствует практически во всех клеточных компартментах, включая и клеточную стенку. Пероксидазы способны восстанавливать перекись до воды, окисляя различные соединения. Так называемая гваяколовая пероксидаза, участвующая в биосинтезе лигнина (компонент клеточных стенок), окисляет фенольные соединения. Аскорбатпероксидаза и глутатионпероксидаза используют аскорбат и восстановленный глутатион для удаления перекиси в реакции:
АН2 + Н2О2 —- А + 2Н2О,
где АН2 — аскорбат или восстановленный глутатион.
Для постоянного удаления перекиси необходимо, чтобы уровень восстановленных аскорбиновой кислоты и глутатиона был достаточно высоким. Для этого совместно действуют нескольких ферментов в так называемом аскорбат-
НАД(Ф)Н
МДГАР
АФК(ОН*)
-RH—ROO'
липид
алкилпероксил- радикал
НАД(Ф)
липид
Рис. 4.27. Защитное действие а-токоферола в мембране.
АФК атакуют липиды мембран, провоцируя цепные реакции перекисного окисления. При этом образуются свободнорадикальные продукты, которые могут быть нейтрализованы а-токоферо- лом, который отдает атом водорода. Тушение свободного радикала а-токоферола связано с окислением пула аскорбата. АК — аскорбат; МДГА — монодегидроаскорбат; МДГАР — моноде- гидроаскорбатредуктаза
глутатионовом цикле, целью которого является ликвидация перекиси. Цикл включает взаимосвязанные окислительно-восстановительные реавдии с участием аскорбата, глутатиона и НАДФН (рис. 4.28). Поддержание пула восстановленных аскорбата и глутатиона зависит от содержания НАДФН. Последний активно образуется при фотосинтезе в хлоропластах, при работе оПФЦ в цитозоле, а также в митохондриях с участием НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы. Аскорбат-глутатионовый цикл активно действует в хлоропластах и цитозоле. Вопрос о наличии цикла в растительных митохондриях, где активность глутатионпероксидазы высокая, остается дискуссионным.
Таким образом, образование АФК в клетке и их ликвидация системами защиты находятся в состоянии динамического равновесия. При серьезной разбалансировке этих процессов уровень АФК будет расти, что может привести к окислительному стрессу и повреждению клеточного содержимого. Именно это и происходит в неблагоприятных условиях, при действии на организм стрессов разной природы.
Подобно тому, как многие болезни человека сопровождаются увеличением в клетках активных форм кислорода, у растений накопление АФК наблюдается при старении тканей, а также при стрессах, вызванных засухой, высокой интенсивностью света, повышенным содержанием озона и УФ-облучением, низкой температурой, внедрением патогена, засолением, действием гербицидов, высокими концентрациями кадмия, алюминия и т.д. Стресс сопровождается на только чрезмерной генерацией АФК, но и изменением активности ферментов-антиоксидантов в ту или другую сторону. Полагают, что уровень антиоксидантной защиты и способность быстро среагировать на опасную ситуацию увеличением активности определяют устойчивость растений к стрессу.
Рис. 4.28. Образование и нейтрализация супероксидрадикала.
Супероксидрадикал образуется при функционировании ЭТЦ в мембранах хлоропластов и митохондрий и быстро превращается в перекись при участии супероксиддисмутазы. Нейтрализация перекиси может быть связана с функционированием аскорбат-глутатионового цикла в строме хлоропластов, цитозоле и, возможно, в матриксе митохондрий. СОД — супероксиддисмута- за; АПер — аскорбатпероксидаза; АК — аскорбат; МДГА — монодегидроаскорбат; МДГАР — монодегидроаскорбатредуктаза; ДГА — дегидроаскорбат; ДГАР — дегидроаскорбатредуктаза; Г—SS—Г — глутатион окисленный; Г—SH — глутатион восстановленный; ГР — глутатионре- дуктаза
К настоящему моменту получены трансгенные растения с оверэкспрессией ряда ферментов-антиоксидантов, локализованных в тех или иных клеточных компартментах. Растения табака (Nicotiana tabacum) с оверэкспрессией Cu-Zn- СОД или глутатионредуктазы в цитозоле проявляли большую устойчивость к высоким концентрациям озона; растения риса (Ory^a saliva') с оверэкспрессией каталазы проявляли большую устойчивость к низкотемпературному стрессу. В то же время оверэкспрессия хлоропластной изоформы аскорбатпероксидазы у табака не влияла на устойчивость растений к озону. Следует заметить, что исследования, связанные с получением трансгенных растений с более высокой антиоксидантной активностью, начались недавно и представляют большой интерес как в практическом отношении, так и для теоретической стресс- физиологии растений.
АФК ЗАЩИЩАЕТ РАСТЕНИЕ ПРИ ВНЕДРЕНИИ ПАТОГЕНА
АФК являются опасным и неизбежным следствием аэробного образа жизни, однако они выполняют и другие функции, в частности защитную. И здесь существует удивительная аналогия между растениями и животными. Давно известно, что фагоциты животных поглощают О2 с большой скоростью, что сопровождается интенсивным образованием О| и Н2О2. Эти соединения как раз и являются тем оружием, которым фагоциты убивают чужеродные клетки.
Дыхательный «взрыв» у растений, связанный с чрезмерной генерацией АФК, был впервые зарегистрирован в ответ на внедрение патогена в реакции «сверхчувствительности».
В клетках растений сверхгенерация супероксидрадикала, так же как и у фагоцитов, происходит в результате реакции:
НАДФН + 2О2 —- НАДФ+ + 2Oj + Н+
Как и в фагоцитах, данная реакция катализируется НАДФН-оксидазой, расположенной в плазмалемме растительных клеток. Есть данные, что в реакцию сверхчувствительности вовлекаются пероксидазы клеточной стенки, которые способны катализировать образование 02 и Н2О2 при избытке НАДН в Мп2+- зависимой реакции.
СУПЕРОКСИДРАДИКАЛ И ПЕРЕКИСЬ ВОДОРОДАДЕЙСТВУЮТ КАК СИГНАЛЬНЫЕ МОЛЕКУЛЫ
Как выяснилось, в клетках животных и растений Of и Н2О2 в низких концентрациях могут действовать как сигнальные молекулы, влияющие на экспрессию генов. Показано, что в клетках животных они стимулируют накопление цАМФ и цГМФ, вход в клетку ионов Са2+, вызывают активацию протеинки- наз и т.д. Регуляторная роль этих молекул в жизни растений стала понятной при исследовании ответных реакций на действие стрессовых факторов. Давно было замечено, что некоторые стрессы сопровождаются у растений повышением клеточного уровня Of и Н2О2. В этом случае роль этих опасных молекул двойственная. С одной стороны, они провоцируют окислительные реакции, способные привести клетку к гибели, с другой — выступают как участники сигнальных каскадов, в результате которых происходит экспрессия генов, контролирующих синтез компонентов защитных систем. Выше (см. подразд. 4.2.10) было показано, что альтернативная оксидаза препятствует развитию окислительного стресса и часто ее активность увеличивается в неблагоприятных для растения условиях. В эксперименте синтез АО de novo в растении можно стимулировать действием таких стимулов, как низкая температура, атака патогена, обработка салициловой кислотой и антимицином А. Во всех случаях наблюдается четкая корреляция между экспрессией гена Дох1 и накоплением перекиси. Так, в культурах клеток табака подавление цитохромного дыхания антимицином А сопровождалось интенсивным образованием Of и накоплением переки-
си. В этих условиях уже через 60 мин резко возрастало содержание мРНК Aoxl, а через несколько часов увеличивались содержание и активность АО. Отсюда следует важный вывод: сигнал для синтеза АО de novo возникает в митохондриях и передается в ядро (рис. 4.29). Как было показано на культурах клеток табака и петунии {Petunia sp.), транскрипцию гена Aoxl и синтез АО можно вызвать обработкой клеток экзогенной перекисью водорода или салициловой кислотой. Известно, что салициловая кислота связывает и блокирует каталазу, что, естественно, приводит к повышению внутриклеточного содержания перекиси. На основании этих данных исследователи вполне справедливо пришли к выводу, что Н2О2 действует как сигнальная молекула, вторичный мессенджер в цепи сигнальной трансдукции, результатом которой являются экспрессия гена Aoxl и синтез АО.
Перекись является также звеном в цепи передачи сигнала, включающего экспрессию генов, кодирующих синтез ферментов аскорбат-глутатионового цикла. Например, добавлением перекиси можно инициировать синтез аскорбатпероксидазы в культурах клеток риса {Огит.а sativay Известно, что салициловая кислота, которая синтезируется в растении, обладает гормональной активностью и участвует в индукции ответных реакций растения на внедрение патогена. Оказалось, что в этом случае эффект объясняется способностью салициловой кислоты блокировать активность каталазы. Именно накопление перекиси влияет на транскрипцию генов, контролирующих синтез PR (pathoge- пе818-ге1а1еб)-белков. Таким образом, при внедрении патогена появление в клетке Н2О2 является сигналом для экспрессии генов, включенных в системную устойчивость.
Однако наиболее интригующей является роль АФК в апоптозе, т. е. генетически программируемой клеточной смерти. Апоптоз в клетках животных связан с деградацией белков, конденсацией хроматина и сопровождается характерными цитологическими изменениями. Специфические протеазы (caspases) и эндонуклеаза, которые в норме присутствовали в цитозоле в неактивной форме, вовлекаются в апоптоз и участвуют в разрушении белков и фрагментации ДНК. Известно, что активация каспаз связана с их протеолитическим расщеплением. Долгое время считали, что митохондрии не вовлекаются в апоптоз, так как не подвергаются видимым изменениям. Однако оказалось, что именно митохондрии — главные участники активной программы клеточной смерти. Внутреннее пространство митохондрий содержит особые белки, которые при выходе в цитозоль вызывают активацию каспазы и эндонуклеазы, тем самым инициируя апоптоз. Прежде всего, это так называемый AIF-фактор (apoposis- induced factor) и цитохром с, локализованные в межмембранном пространстве. Однако что же заставляет эти соединения выходить из митохондрий и как они это делают? Еще до наступления видимых изменений, характерных для апоптоза, в митохондриях фиксируется повышенный уровень О2. Супероксидради- кал, действуя прямо или косвенно, инициирует формирование специальных mtPTP-nop (permeability transition роге). Они представляют собой комплекс белков, формирующий в месте контакта внутренней и наружной мембран широкий канал, или пору, через которую в цитозоль выходят AIF-фактор и цитохром с (рис. 4.30). В образовании mtPT-nop принимают участие белки, которые в норме выполняли в митохондриях другие функции. Точный состав mtPT-nop неизвестен, но есть основания думать, что в их состав входят:
Салициловаякислота
Синтез АО
Митохондрия
Рис. 4.29. Взаимодействие ядра и митохондрий в регуляции синтеза альтернативной оксидазы.
АО кодируется ядерным геном Аох\, на экспрессию которого влияет уровень Н2О2 в клетке. Факторы, способствующие накоплению перекиси, стимулируют синтез АО
AACD (циклофилин D) — белок матрикса, необходимый для формирования mtPT-пор; 1, 3, 4 —CD (циклофилин D) — белок матрикса, необходимый для формирования mtPT-пор; 1, 3, 4 —
A
A
CD (циклофилин D) — белок матрикса, необходимый для формирования mtPT-пор; 1, 3, 4 —
CD (циклофилин D) — белок матрикса, необходимый для формирования mtPT-пор; 1, 3, 4 —
Рис. 4.30. Формирования mtPT-пор:
А — нормальное состояние митохондрий. Во внутренней мембране работает дыхательная цепь и синтезируется ЛТФ. Цитохром с находится в межмембранном пространстве и участвует в работе дыхательной цепи. Обмен АТФ на АДФ осуществляется через АТФ/АДФ транс- локатор, локализованный во внутренней мембране. AIF-фактор присутствует в матриксе. VDAC-канал формирует крупные поры в наружной мембране; Б — интенсивное образование в дыхательной цепи супероксидрадикала на комплексах 1 и 3 провоцирует формирование mtPT-пор в месте контакта внутренней и наружной мембраны. Поры формируются при участии АТФ/АДФ-транслокатора, VDAC-канала и белков матрикса и цитозоля. Выход в цитозоль через mtPT-поры цитохрома с и AIF-фак- тора необходим для инициации апоптоза в клетке. АМТ — АТФ/АДФ-транслокатор; цит. с — цитохром с; VDAC — потенциалзависимый анионный канал; Вах — белок цитозоля, необходимый для формирования mtPT-пор, х — точно не установленные белки из цитозоля;
комплексы цепи
АТФ/АДФ-транслокатор — (ANT — adenylate translocator) в нормально функционирующих митохондриях этот транспортный белок интегрально встроен во внутреннюю мембрану и осуществляет обмен АТФ и АДФ;
VDAC (voltage dependent anion channel)— потенциал-зависимый анионный канал внешней мембраны;
циклофилин D (cyclophilin D) — белок, в норме присутствующий в матриксе митохондрий;
неизвестные белки из цитозоля.
На формирование и открытие mtPT-пор оказывают влияние многие факторы, такие, как величина Аф на мембране, концентрация Са2+, уровень АТФ и АДФ в матриксе и цитозоле. Кроме того, косвенным образом состояние mtPT- пор зависит от эффективности антиоксидантных систем, нейтрализующих О2. Открытие mtPT-пор приводит к цепи необратимых событий, заканчивающих ся гибелью клетки. Выход из митоходрий в цитозоль AIF-фактора и цитохрома с сопровождается активацией специфической протеазы и запуском каскада протеолитических реакций, результатом которых является разрушение белков и деградация ДНК (рис. 4.31). Помимо этого, нарушение замкнутости внутренней мембраны приводит к коллапсу Ар и энергетическому кризису, что также ускоряет гибель клетки.
У растений программируемая клеточная смерть (ПКС) является неотъемлемой частью нормального роста и развития. Старение листьев и цветков, отмирание клеток при формировании сосудов ксилемы и корневого чехлика, гибель клеток в реакции «сверхчувствительности» — примеры, когда смерть клеток является генетически детерминированной. Апоптоз растений сопровождается несколько иной, чем у животных, цитологической картиной, но можно предполагать, что сценарий этого процесса у тех и других включает общие
Рис. 4.31. Инициация апоптоза.
Выход из митохондрий в цитозоль факторов апоптоза запускает каскад событий, результатом которого является разрушение белков и ДНК. Из митохондрий через mtPT-поры выходят цитохром с и AIF- фактор (apoptosis-induced factor). В цитозоле цитохром с в комплексе с белком apafl и АТФ активирует протеазы, специфически разрушающие белки. AIF- фактор активирует еще один белок — DFF (DNA- fragmentation factor) — фактор, необходимый для активации эндонуклеазы и фрагментации ДНК
ПротеазаРазрушениебелковПротеазаРазрушениебелковэлементы. Показано, что смерть клеток, формирующих сосуды ксилемы у циннии (Zinnia sp.), клеток табака, в реакции сверхчувствительности сопровождалась активацией специфических протеаз и эндонуклеаз, а также фрагментацией ДНК. Сигнал, индуцирующий ИКС у растений, неизвестен. Однако им вполне вероятно являются О; и Н2О2, накопление которых предшествует гибели клеток, например при старении листьев и цветков. При этом АФК, видимо, не только разрушают клеточные структуры как окислители. Есть данные, что при старении листьев Н2О2 вызывает экспрессию генов, включенных в процесс разрушения хлорофилла, однако вопрос о роли митохондрий в ПКС у растений остается пока неизученным. Существуют лишь единичные и косвенные данные, подтверждающие, что апоптоз у растений также связан с событиями в митохондриях. Так, выход в цитозоль цитохрома с и фрагментация ДНК наблюдались при гибели клеток огурца (Cucumis sativa) в результате теплового шока. Трансгенные линии табака (AS8), лишенные альтернативной оксидазы, погибали при обработке экзогенной перекисью водорода. При этом наблюдали выход в цитозоль цитохрома с и фрагментацию ДНК. На примере клеток животных известно, что Са2+ на фоне низкого содержания АТФ способствует открытию mtPT-nop и развитию апоптоза. Аналогично этому на клетках кукурузы было показано, что вход в клетку кальция при низком уровне АТФ может спровоцировать их смерть по типу апоптоза.
Протеаза
Разрушениебелков
Протеаза
Разрушениебелков
ДЫХАНИЕ В ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩЕЙ КЛЕТКЕ
В зеленых тканях растений фотосинтез и дыхание протекают в одной клетке. В темноте дыхание является основным источником АТФ. Однако что случается с дыханием на свету, когда мощным энергодающим процессом в клетке становится фотосинтез? Известно, что на свету митохондрии вовлекаются в про-
цесс фотодыхания, а у некоторых С4-видов — в процессы, связанные с ассимиляцией СО2. Продолжается ли в этих условиях собственно дыхание и если да, то с какой интенсивностью? На этот вопрос пока нет четкого ответа. Дело в том, что определить скорость дыхания на фоне идущего фотосинтеза очень сложно, так как выделение О2 при фотосинтезе по интенсивности во много раз перекрывает поглощение О2 при дыхании. До недавнего времени полагали, что дыхание на свету полностью подавлено. Считалось, что в результате фотосинтеза уровень АТФ в цитозоле возрастает, и это ведет к торможению гликолиза (см. подразд. 4.1.7), а значит, к подавлению митохондриального дыхания ввиду нехватки субстрата. Но в последнее время изучение газообмена фотосинтезирующих клеток с применением методов масс-спектрометрии во всех случаях показало, что дыхание на свету продолжается. Однако разные объекты, условия и возможные ошибки приводят к неоднозначным выводам о степени этого дыхания: по разным оценкам, интенсивность дыхания на свету составляет от 100 до 30 % от темновой. При этом, если эффект света на поглощение О2 сильно варьирует, то выделение СО2 однозначно снижается и составляет 30—40 % от темнового уровня. Следовательно, на свету цикл трикарбоновых кислот функционирует гораздо медленнее, чем в темноте. Этому факту можно дать следующее объяснение. На свету митохондрии участвуют в фотодыхатель- ном цикле и окисляют глицин с очень большой скоростью (см. подразд. 3.7.4). При окислении глицина в матриксе образуется ион аммония, который способствует инактивации пируватдегидрогеназного комплекса. Аммоний, как было показано выше, активирует протеинкиназу, которая фосфорилирует ПДК, переводя его в неактивное состояние (см. подразд. 4.1.7, рис. 4.7). Возможно, именно по этой причине снижается активность ЦТК.
Тем не менее работа цикла трикарбоновых кислот на свету продолжается, хотя и с меньшей интенсивностью. Какое значение это может иметь для фотосинтезирующей клетки? Прежде всего, цикл продолжает поставлять НАДН для восстановления в цитозоле нитрата и углеродные скелеты для синтеза аминокислот. Важнейшей функцией митохондрий остается экспорт а-кетоглута- рата, необходимого для светозависимой ассимиляции азота в хлоропластах. Дискуссионным остается вопрос, как изменяется (или не изменяется) интенсивность окислительного фосфорилирования и каков вклад митохондрий в энергообмен фотосинтезирующей клетки? Ранее преобладала точка зрения, что все энергопотребности клетки на свету обеспечивает фотосинтез. Сейчас так уже не думают. Показано, что даже на свету синтезируемая в митохондриях АТФ используется в энергозависимых процессах, протекающих в цитозоле, например при синтезе сахарозы и в белковом синтезе. Некоторые исследователи даже полагают, что образованный при фотосинтезе АТФ в основном расходуется в хлоропласте на фотоассимиляцию СО2, тогда как пул АТФ в цитозоле поддерживается митохондриальным дыханием.
Долгое время процессы фотосинтеза и дыхания изучались автономно, и вопрос о их взаимодействии в фотосинтезирующей клетке остается, пожалуй, наименее изученным. В то же время появляются факты, доказывающие, что фотосинтез и дыхание более интегрированы, чем это полагали ранее. Удивительным доказательством такой интеграции стали опыты, проведенные на протопластах листьев ячменя (Hordeum vulgaris). Выяснилось, что при подавлении митохондриальной АТФ-синтазы олигомицином (в концентрации, кото-
рая не действует на АТФ-синтазу в хлоропластах) скорость фотосинтеза налает на 30—40 %. Этот факт неожиданно продемонстрировал, что синтез АТФ в митохондриях необходим для поддержания нормального фотосинтеза. Пока этому факту можно дать следующее объяснение. Возможно, между хлоропластами и митохондриями на свету идет активный обмен метаболитами, и дыхание участвует в окислении избытка восстановительных эквивалентов, выносимых в цитозоль из хлоропластов. Восстановленные НАДН и НАДФН могут поступать в митохондрии с помощью челночных систем или непосредственно окисляться в дыхательной цепи через внешние альтернативные дегидрогеназы. Удаляя избыток НАД(Ф)Н, митохондриальное дыхание тем самым снижает вероятность фотоингибирования (см. подразд. 3.5.4). Возможно, наличие альтернативной оксидазы и альтернативных дегидрогеназ в дыхательной цепи растений объясняется именно необходимостью сбалансировать фотосинтетическую активность с потребностями метаболизма.
ДЫХАНИЕ ЦЕЛОГО РАСТЕНИЯ
Дыхание на уровне целого растения является интегральным показателем, значение которого может сильно варьировать в зависимости от объекта, стадии онтогенеза, физиологического состояния и действия факторов окружающей среды. Наиболее высока интенсивность дыхания этиолированных проростков, но при переходе к фотосинтезу она снижается. Характерно, что скорость дыхания различных органов и тканей растений не одинакова. Наиболее интенсивны дыхательные процессы в меристематических и недифференцированных тканях, по мере достижения зрелости скорость дыхания снижается и далее остается относительно постоянной. По дыхательной активности могут различаться молодые и зрелые листья, лепестки и ткани пестика, цветки и листья и т.д. Особые случаи связаны со вспышками дыхательной активности тканей. Такие случаи имеют место при термогенезе ароидных, при созревании плодов (климактерический подъем дыхания при созревании яблок, авокадо, бананов), при старении срезанных цветов и листьев. Интенсивность дыхания может изменяться в условиях стресса, вызванного засухой, засолением, понижением или повышением температуры, однако ответная реакция растений не однозначна и варьирует в зависимости от вида растения и его устойчивости к действующему фактору.
Интенсивность и эффективность дыхания во многом определяют рост и накопление растением биомассы. Эти показатели, во многом определяющие продуктивность растений, зависят от количественных затрат дыхательного субстрата, с одной стороны, на рост, а с другой — на обновление, или поддержание, биомассы. С этой точки зрения в физиологии растений существуют такие понятия, как дыхание роста и дыхание поддержания. Дыхание поддержания снабжает метаболитами и энергией процессы, связанные с обновлением и организацией уже существующей биомассы, тогда как дыхание роста обеспечивает энергией и метаболитами новообразование биомассы, т.е. рост. Количественно оценить вклад обоих составляющих в общее дыхание довольно сложно. Для этой цели сравнивают интенсивность дыхания растения в условиях оптимального роста и при условиях, когда рост экспериментально подавлен. Например,
варьируют условия освещения: выращенные в оптимальных условиях растения затем выдерживают в темноте. После того как дыхание в темноте стабилизируется, его уровень принимают за дыхание поддержания. Близок по смыслу и другой способ, когда растения с полной питательной среды переносят на среду, лишенную азота. В таких условиях рост растений прекращается из-за отсутствия азота, и уровень дыхания принимается за дыхание поддержания. При стрессах разной природы рост растений, как правило, тормозится, однако интенсивность дыхания остается прежней или даже усиливается. Это говорит о том, что при адаптации к стрессу увеличиваются энергозатраты на поддержание биомассы и выживание. В то же время экофизиологические исследования растений показали, что между величиной дыхания поддержания и условиями обитания растений нет четкой корреляции. Так, растения, адаптированные к стрессовым условиям (засоление, засуха), не отличались по этому критерию от растений, растущих в благоприятных условиях. В то же время ряд авторов отмечали, что у арктических растений компонента дыхания поддержания выше по сравнению с видами умеренных широт.
Аэробное дыхание — это контролируемый процесс окисления восстановленных органических соединений до СО2 и воды. Все живые клетки растения «дышат», окисляя в процессе дыхания углеводы, образованные при фотосинтезе. Процесс дыхания можно разбить на три этапа — гликолиз, цикл трикарбоновых кислот и окислительное фосфорилирование. В процессе окисления глюкозы в реакциях гликолиза и ЦТК образуются ключевые метаболиты клетки, необходимые для разнообразных биосинтезов, и восстановительные эквиваленты. Протекание гликолиза и цикла трикарбоновых кислот в клетках растений имеет свои особенности. Они связаны с функционированием дополнительных ферментов и альтернативных реакций, дублирующих основные, общие для растений и животных, пути. Кроме этого, гликолиз в растениях протекает не только в цитозоле, но и в пластидах. Восстановленные НАДН и ФАДН2 отдают электроны в электрон-транспортную цепь, по которой они переносятся на кислород. Интегрированная во внутреннюю мембрану митохондрий дыхательная цепь включает четыре трансмембранных комплекса и АТФ-синтазу. Три комплекса цепи — НАДН-дегидрогеназа, цитохром Ьсх-комплекс и ци- тохромоксидаза — работают как протонные помпы, преобразуя энергию электронного потока в энергию Дцн+- Структура комплексов в общих чертах известна, однако механизм работы этих замечательных молекулярных машин остается во многом загадочным. Создаваемый работой цепи Дцщ используется АТФ- синтазой для синтеза АТФ, а также в процессах транспорта заряженных молекул через митохондриальную мембрану с участием белков-транспортеров.
Гибкость и многообразие, свойственные метаболизму растений, проявляются и в организации дыхательной цепи, в которой существуют альтернативные пути для переноса электрона. Эти пути являются нефосфорилирующими, т. е. в основном не сопряжены с генерацией Дцщ и синтезом АТФ. Наряду с комплексом I митохондриальная мембрана растений содержит еще четыре роте- ноннечувствительные НАД(Ф)Н-дегидрогеназы. Эти ферменты расположены так, что могут окислять НАДН и НАДФН по обе стороны мембраны, сбрасывая электроны в пул убихинона в обход комплекса I. Фундаментальным отли-
чием растений является наличие в дыхательной цепи двух терминальных оксидаз и двух конкурирующих путей переноса электронов на кислород. Наряду с основной, цитохромной цепью у растений действует альтернативный путь электронного транспорта, связанный с функционированием альтернативной оксидазы. Электронный поток с пула убихинона на альтернативную оксидазу обходит два из трех пунктов сопряжения и теряет большую часть энергии в виде тепла. Таким образом, эффективность трансформации энергии в растительных митохондриях зависит от соотношения цитохромного и альтернативного дыхания, активность которых контролируется экзогенными и эндогенными факторами.
Растительные митохондрии поддерживают свой восстановительный и энергетический статус с помощью дыхательного контроля, разобщения и альтернативной оксидазы. Дыхательный контроль устанавливает связь между электронным транспортом, величиной Ацн* и работой АТФ-синтазных комплексов. Скорость переноса электронов в цепи контролируется величиной Ацн+ на мембране и замедляется, когда эта величина достигает высоких значений. Работа АТФ-синтаз сопровождается диссипацией Др.н+ и объективно способствует ускорению электронного транспорта. В условиях высокого соотношения АТФ/ АДФ в матриксе АТФ-синтазы замедляют или прекращают свою работу, что ведет к росту Дрн+ и торможению электронного транспорта по цитохромной цепи. У растений существуют два способа «обойти» систему дыхательного контроля и сделать электронный транспорт независимым от работы АТФ-синтаз. Во-первых, электронный транспорт и фосфорилирование могут быть разобщены с помощью жирных кислот и разобщающих UCP-белков. Разобщенный транспорт идет с высокой скоростью и не сопровождается синтезом АТФ. Во- вторых, альтернативное дыхание также можно рассматривать как способ разобщения электронного транспорта с фосфорилированием. Быстрый сброс электронов с пула убихинона на альтернативную оксидазу также ускоряет электронный транспорт и позволяет снизить эффективность синтеза АТФ. Физиологический смысл разобщения тем и другим способом — ускорение электронного транспорта в условиях высокого отношения АТФ/АДФ в матриксе, когда на электронный транспорт по цитохромной цепи наложен тормоз со стороны дыхательного контроля. Иногда быстрая разгрузка цепи необходима для быстрого окисления избытка НАДН и снижения вероятности генерации в цепи активных форм кислорода. Оба способа разобщения приводят к рассеиванию энергии окисляемых субстратов в тепло, но между ними есть принципиальная разница. Альтернативная оксидаза, объективно снижая эффективность запасания энергии, не влияет на величину Арш, тогда как механизм разобщения связан с ликвидацией протонного потенциала и тем самым прямо влияет на энергизованное состояние мембраны и величину Ацн+.
В последнее время появились доказательства того, что роль митохондрий не ограничивается традиционными функциями синтеза АТФ и полезных соединений. По-видимому, происходящие в клетке события каким-то образом интегрируются в митохондриях. Возникающие ответные изменения могут провоцировать чрезмерную генерацию в дыхательной цепи активных форм кислорода. Результатом этого может быть экспрессия ядерных генов или активация программы клеточной смерти. В этом плане изучение роли митохондрий в растительном метаболизме — новое и интересное направление в физиологии растений.
ГЛАВА 5
ВОДА В ЖИЗНИ РАСТЕНИЙ
ФУНКЦИИ ВОДЫ
В главе рассмотрены общие принципы организации водного обмена у растений. Изложение закономерностей движения воды на уровне клетки, тканей и целого растения базируется на термодинамическом подходе.
Жизнь на Земле зародилась в первичном океане и для первых организмов вода стала не только средой обитания, но и основой их внутренней среды. Последующее эволюционное развитие жизни также происходило в водной среде. С возникновением суши и появлением наземных растений и животных огромное значение воды в процессах жизнедеятельности не было утрачено. Существование современных организмов мы тоже не можем представить себе без воды.
Среди химических соединений, входящих в состав клеток растений, животных и прокариот, вода в количественном отношении доминирует. Ее содержание в клетках мезофитов (растений зоны умеренного климата) составляет 85 — 99 % (в расчете на сырую массу) в зависимости от вида растения, ткани и условий окружающей среды.
Вода, содержащаяся в растениях в столь больших количествах, выполняет множество функций:
водная фаза в системе почва—корень—стебель—лист—атмосфера образует непрерывную среду, благодаря и при участии которой осуществляется перенос веществ между различными частями этой системы;
вода для реагирующих веществ является растворителем, взаимодействие веществ в реакциях метаболизма происходит в водной среде;
вода образует гидратные оболочки биополимеров и участвует в формировании их молекулярной структуры;
вода подвергается химическим превращениям в некоторых жизненно важных процессах, например окислению и образованию молекулярного кислорода при фотосинтезе;
обладая высокой удельной теплоемкостью, вода сглаживает колебания температуры растительных тканей при резких колебаниях температуры окружающей среды;
вода препятствует перегреву растений за счет ее испарения с поверхности надземных органов, главным образом листьев, — процесса, получившего название транспирации;
благодаря явлению осмоса и наличию у растительных клеток относительно жестких клеточных стенок (КС), вода поддерживает в клетках положительное тургорное давление, придавая им нужную форму, и отвечает за их растяжение при росте.
Можно сказать, что вода является «матрицей» жизни. Это образное выражение А. Сент-Дьёрди полностью отражает многообразие тех функций, которые вода выполняет в организме.
ОТНОСИТЕЛЬНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ВОДЫ В КЛЕТКАХ —ВАЖНЫЙ ПАРАМЕТР ВОДНОГО ОБМЕНА
Чтобы вода могла выполнять свои функции, все части растения должны быть в достаточной степени оводнены. Степень оводненности клеток тканей и органов растений определяется относительным содержанием воды (ОСВ).
м^СЫр «^-сух
ОСВ = —100,
^сыр.нас _ ttl^^
где /псыр и тсух — соответственно сырая и сухая масса ткани, /„сь1Рнас — сырая масса в состоянии полного насыщения водой. Когда потребление и потери воды у растения сбалансированы, ОСВ поддерживается на постоянном уровне. У большинства мезофитов ОСВ составляет 85 — 95%. Если ОСВ падает ниже некоторого критического значения, ткань отмирает. Критическое значение ОСВ зависит от вида растения и ткани; для тканей мезофитов оно близко в среднем к 50 %.
В течение вегетационного периода содержание воды в почве сильно колеблется. Основная задача водного обмена в условиях изменяющегося водоснабжения состоит в регуляции потоков воды в растении и поддержании в клетках, органах и тканях ОСВ в пределах, необходимых для обеспечения процессов жизнедеятельности.
КЛАССИФИКАЦИЯ РАСТЕНИЙ
ПО ИХ СПОСОБНОСТИ РЕГУЛИРОВАТЬ ВОДНЫЙ ОБМЕН
Различные виды растений по-разному реагируют на изменяющиеся условия водоснабжения. Одни приспособлены к резким колебаниям содержания воды в среде и при этом сохраняют способность к поглощению воды из почвы, поддерживая оводненность клеток и тканей на должном уровне. Для других губительным оказывается даже незначительное снижение содержания воды в среде.
Согласно классификации X. Вальтера, основанной на способности растений регулировать водный обмен, весь растительный мир можно разделить на пойкилогидрические и гомойогидрические растения (рис. 5.1).
Рис. 5.1. Классификация растений по их способности регулировать водный обмен
Пойкилогидрические растительные организмы не способны сами регулировать водный обмен. К ним относятся эпифитные и почвенные водоросли, лишайники, некоторые мхи и папоротникообразные, а также некоторые покрытосеменные растения. Для подавляющего большинства этих организмов нужна водная среда или высокая влажность воздуха В засушливый период они теряют воду и погибают. Некоторые представители этой группы при дегидратации сохраняют жизнеспособность, благодаря снижению интенсивности метаболизма и последующего перехода в состояние анабиоза (криптобиоза). С окончанием засушливого периода они поглощают воду и возвращаются к активной жизнедеятельности, восстанавливая рост и другие функции. К таким организмам, в частности, относятся красные водоросли Bangia и Porphyra, мох Funaria, а из высших растений различные виды рода миротамнус, например Myrothamnus flabellifolia.
Гомойогидрические растения обладают способностью регулировать водный обмен, поддерживая ток воды в системе почва—растение —атмосфера, а также надлежащую оводненность клеток, тканей и органов. Они составляют большинство обитателей суши, однако в эту группу входят и водные растения. К гомойогидрическим растениям относятся наземные папоротникообразные, все голосеменные и подавляющая часть покрытосеменных растений. Различия в водоснабжении и других условиях среды привели в процессе эволюции к формированию нескольких типов (экологических групп) гомойогидрических растений, различающихся по характеру и эффективности регуляции их водного обмена. Современные гомойогидрические растения подразделяют на три экологические группы.
Гигрофиты — растения, обитающие в местах с высокой влажностью почвы и воздуха. В умеренном климате к ним относятся, в частности, тонколистные папоротники, например кочедыжник женский (Athyrium felix-femina), пузырник ломкий (Cystopteris fragilis), а из высших растений кислица (Oxalis acetosella), чистяк (Ficaria verna), калужница (Calthapalustris). У гигрофитов нет приспособлений, ограничивающих расход воды. Их листья содержат мало устьиц, которые почти всегда открыты, а кутикула на поверхности листьев слаборазвита, поэтому доля транспирации через кутикулу у них велика. Поглощенная в избытке вода выделяется гигрофитами наружу с помощью специальных приспособлений на листьях — видоизмененных устьиц, называемых гидатодами. Этот процесс называется гуттацией. При недостатке воды гигрофиты очень быстро завядают и гибнут. К гигрофитам близки гидрофиты (водныерастения) — растения, полностью или частично погруженные в воду. К ним относятся, например, валлиснерия (Vallisneria spiralis), кувшинка (Nuphar alba) и стрелолист (Sagittaria sagittifolia). У полностью погруженных в воду гидрофитов транспирация отсутствует. Движение воды осуществляется только за счет корневого давления, которое клетки корня развивают в сосудах ксилемы, накачивая туда воду. Если растения не полностью погружены в воду, то некоторая транспирация у них наблюдается. Основная стратегия регуляции водного обмена у гидрофитов состоит в ограничении поступления воды, которую они поглощают всей или почти всей поверхностью.
Мезофиты — наземные растения умеренного климата, осуществляющие жизненный цикл при резких колебаниях влажности почвы и воздуха. В эту группу входят многие древесные растения, лесные и полевые травы, подавляющее большинство сельскохозяйственных растений. Мезофиты эффективно регули-
руют водный ток через свое тело с помощью устьичного аппарата и путем сбрасывания листьев. У них хорошо развита корневая система, обеспечивающая во многих случаях высокое корневое давление.
Ксерофиты — растения аридного (сухого) климата, очень неоднородны по способам адаптации к засухе. Среди них есть сильно- и слаботранспирирую- щие формы, а также формы, способные и неспособные переносить большой водный дефицит.
Одной из характерных групп ксерофитов являются суккуленты, утолщенные мясистые органы которых удерживают большой запас воды. К типичным представителям суккулентов относятся кактусы, например (Parodia chrysacanthion и Pachycereuspringlei), молодило (Sempervivum sobohferum) и очиток (Sedum acre). Поглощенная ими вода экономно используется и хранится в клетках водоудерживающей ткани, поэтому вакуоли клеток этой ткани сильно увеличены в размерах. Благодаря низкому отношению площади поверхности растения к его объему потери воды при транспирации у суккулентов значительно снижены. Наличие волосков и толстой кутикулы на поверхности, а также небольшое число устьиц, почти всегда закрытых, также способствует сохранению воды в растениях.
Многие виды ксерофитов приспособились к засушливому климату за счет развившейся способности их клеток переносить значительную дегидратацию, сохраняя при этом жизненно важные функции. Эта группа ксерофитов получила название эуксерофитов, т.е. настоящих ксерофитов. Для них, как правило, характерна ксероморфная структура. Ксероморфизм выражается в уменьшении размеров листьев и клеток, увеличении числа клеток, а также в приспособлениях эпидермиса к снижению транспирации (толстая кутикула, опушение).
К эуксерофитам относятся, например, вероника сизая (Veronica incana), некоторые виды полыней (Artemisia glauca) и астр (Aster villosus).
Другим широко распространенным способом приспособления растений к засушливому климату является развитие глубоко проникающей корневой системы. Ксерофиты, обладающие этим свойством, получили название гемиксерофитов. С помощью такой корневой системы они добывают грунтовую воду, залегающую на глубине до нескольких десятков метров. Для гемиксерофитов характерны тонкие листья с большим числом устьиц и высокая скорость транспирации, так как их водоснабжение не лимитировано. Глубоко проникающая корневая система позволяет избегать засухи, поэтому их нельзя считать истинными ксерофитами. К этой группе растений относятся многие виды полыней, кустарники, такие, как белый саксаул (Haloxylon persicum) и джузгун голова Медузы (Calhgonum caput-medusae), а из древесных форм — черный саксаул (Haloxylon ammodendron).
К растениям зоны аридного климата относятся также эфемеры. Эти растения, как и гемиксерофиты, нельзя считать истинными ксерофитами, поскольку они избегают условий, приводящих к развитию водного дефицита. Стратегия приспособления к аридному климату у эфемеров состоит в ускоренном жизненном цикле и использовании влаги, в обилии содержащейся в почве сразу после весеннего таяния снега. Все фазы жизненного цикла они успевают пройти за очень короткий период до наступления засухи. Примеры растений такого типа — мятлик луковичный (Роа bulbosa) и осока толстостолбиковая (Carexpachystylis).
ОБЩИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ТРАНСПОРТА ВОДЫЧЕРЕЗ МЕМБРАНЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК
Для описания закономерностей транспорта воды используют такие понятия, как химический потенциал воды, осмотическое давление, водный и матричный потенциалы.
ХИМИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ВОДЫ
Любое вещество, в том числе вода, движется в направлении уменьшения ее свободной энергии, или (что то же самое) в направлении ее более низкого химического потенциала. В соответствии с законами термодинамики, химический потенциал воды (pw) при изменяющемся давлении можно представить уравнением
И» = И» + RT\naw + VWP, (5.1) где ц° — стандартный химический потенциал воды [Дж/моль]; R — газовая постоянная (8,314 Дж/(моль-град К); Т — абсолютная температура; aw — активность воды; Vw — парциальный молярный объем воды; Р — давление. Рассмотрим отдельные составляющие уравнения 5.1.
Химический потенциал, как и другие виды потенциальной энергии, является относительной величиной, поэтому в выражение химического потенциала включен стандартный химический потенциал ц°. Поскольку при расчетах движущих сил транспорта воды используют разность химических потенциалов в двух рассматриваемых точках системы, а не их абсолютные значения, то ц° сокращаются при вычитании и не фигурируют в выражении градиента химического потенциала, определяющего направление перемещения воды. Величина ц° соответствует стандартному состоянию системы, определение которому будет дано ниже.
Влияние концентрации воды в системе на ее химический потенциал представлено в выражении (5.1) членом RT\naw. Концентрация воды связана с фигурирующей в этом выражении активностью aw соотношением aw = ywxw, где yw — коэффициент активности воды, безразмерная величина, характеризующая отклонение системы от идеального состояния при наличии в ней растворенных веществ; xw — концентрация воды в системе, выраженная в мольных долях. При исследовании транспорта воды в растениях, как правило, не учитывают отклонение системы от идеального состояния, принимая, что yw близка к 1, a /?74n<zw « 7?Tlnxw. Из уравнения (5.1) следует, что химический потенциал воды тем выше, чем больше ее активность (концентрация). Растворенные вещества снижают активность воды, так как уменьшают ее мольную долю в системе и соответственно концентрационную составляющую ее химического потенциала.
Член VWP в уравнении (5.1) отражает влияние давления на химический потенциал. Развивающееся в биологических системах давление по своей природе гидростатическое, по величине оно может быть как больше, так и меньше атмосферного. Примером гидростатического давления, больше атмосферного, является давление протопласта на клеточную стенку, называемое тур-
горным давлением. Пример гидростатического давления, меньше атмосферного — давление в сосудах ксилемы при транспирации. Следует обратить внимание на то, что в физиологии растений при исследовании влияния давления на транспорт воды за нулевую точку отсчета принимается давление, равное атмосферному. В соответствии с этой шкалой гидростатическое давление протопласта на КС является величиной положительной, а гидростатическое давление в сосудах ксилемы при транспирации — отрицательной. Величина Vw — парциальный молярный объем воды — является частной производной объема системы по числу молей воды при постоянных значениях температуры, давления и постоянном содержании других компонентов в системе. Vw показывает, насколько увеличивается объем системы с увеличением в ней количества воды на 1 моль. Данное определение можно записать уравнением
К -Г—1
const
где V — объем системы; nw — число молей воды; и, — число молей всех других веществ, присутствующих в системе. Посколысу объем жидкости слабо изменяется с давлением, можно принять для воды Ew » 18 см3/моль. Таким образом, величина химического потенциала воды зависит от ее активности (концентрации) и давления в системе.
Величина ц° — химический потенциал воды в стандартном состоянии. За стандартное состояние принимают состояние чистой воды при атмосферном давлении и фиксированной температуре. Если концентрацию и активность воды выражают в мольных долях, то в стандартном состоянии xw = 1; yw = 1; aw = 1; RT\naw = 0 и, согласно выбранной нами нулевой точке отсчета давления, Р = 0 и VWP= 0. Отсюда следует, что в стандартном состоянии pw = ц° (уравнение 5.1).
Как отмечалось в начале этого раздела, вода движется по градиенту своего химического потенциала, т.е. из области более высокого в область менее высокого потенциала. Зная разность химических потенциалов воды в двух точках, например в двух компартментах клетки, разделенных мембраной, можно предсказать направление самопроизвольного движения воды через мембрану.
ОСМОТИЧЕСКОЕ ДАВЛЕНИЕ
Чтобы понять природу осмотического давления и вывести выражение, описывающее взаимосвязь между осмотическим давлением и активностью воды, обратимся к рис. 5.2. Два отсека камеры разделены полупроницаемой мембраной, пропускающей молекулы растворителя, но не пропускающей молекулы растворенного вещества. В левом открытом отсеке находится чистая вода (aw = 1), в правом отсеке, который герметически закрыт, — раствор низкомолекулярного вещества, например сахарозы. Молекулы воды будут диффундировать через мембрану из отсека, где содержится чистая вода, в отсек с раствором сахарозы. Диффузия воды будет осуществляться по градиенту ее химического потенциала (химический потенциал чистой воды выше химического потенциала воды в растворе сахарозы). В то же время движение молекул сахарозы в обратном направлении, т.е. из правого отсека в левый, окажется невозмож-
дексы «л» и «пр» относятся к левомудексы «л» и «пр» относятся к левомуРис. 5.2. Осмотическая ячейка. Стрелкамиуказано направление движения воды
дексы «л» и «пр» относятся к левому
дексы «л» и «пр» относятся к левому
ным, так как мембрана не проницаема для растворенного вещества. При диффузии воды через мембрану давление в правом отсеке будет возрастать, и при достижении им некоторого значения система придет в равновесное состояние (ц„ = ц„р, где ин- и правому отсеку соответственно), и
поток воды через мембрану прекратится. На основании этого и в соответствии с уравнением 5.1 можно записать
(5-2)(5-2)ц; + RTlna” + VwPn = ц; + /?Лп^р + VwPnp.
(5-2)
(5-2)
Так как после установления равновесия а" остается равным 1, а Рп, в соответствии с выбранной нами точкой отсчета давления, равным 0, то R Лпа^ = О и VwPn = 0. Тогда в соответствии с равенством (5.2)
RTAna"» + F>np = 0.(5.3)
Осмотическое давление — это давление, избыточное по отношению к атмосферному, которое необходимо приложить к раствору вещества, чтобы привести его в равновесие с чистым растворителем (или с раствором этого вещества иной концентрации), отделенным от него полупроницаемой мембраной. В соответствии с этим определением, осмотическое давление раствора сахарозы (лпр) равно избыточному гидростатическому давлению (Рпр), которое останавливает ток воды через мембрану. Заменив на этом основании в уравнении (5.3) Р"р на лпр, получим
ртлпр = -^-1п^р,V
или для общего случая
rt,,,
и = -—та,,.(5.4)
Следует подчеркнуть, что явление осмоса имеет место только в том случае, если два раствора (или раствор и чистая вода) отделены друг от друга полупроницаемой мембраной. При описании процессов водного обмена часто пользуются термином «осмотическое давление раствора» применительно к системам, в которых отсутствуют мембраны. Следует иметь в виду, что, используя его, подразумевают осмотическое давление, которое развивал бы раствор, находясь в осмотической ячейке.
Осмос и осмотические явления играют особую роль в жизни растений. Осмос приводит к возникновению тургорного давления в клетках. Тургорным
называется гидростатическое давление, возникающее в клетках при поглощении ими воды в результате осмоса. Это давление придает форму и упругость растительным тканям. Часто используемый в физиологии растений термин «тургор» является качественной характеристикой клеток, указывающей на наличие в них тургорного давления.
Представленная на рис. 5.2 осмотическая ячейка может служить моделью клетки, находящейся в водной среде, например клетки пресноводной микроводоросли, которая лишена крупной центральной вакуоли. Роль полупроницаемой мембраны при этом выполняет ПМ. Поскольку растительные клетки имеют центральную вакуоль, которая занимает подавляющую часть клеточного объема, то в модельных системах КС, ПМ цитоплазму и тонопласт рассматривают как одну мембрану, а роль внутреннего компартмента осмотической ячейки отводят вакуоли.
ОСМОТИЧЕСКОЕ ДАВЛЕНИЕ КАК ФУНКЦИЯ КОНЦЕНТРАЦИЙРАСТВОРЕННЫХ ВЕЩЕСТВ
В 1877 г. В.Пфеффер, используя сконструированный им осмометр, исследовал влияние концентрации растворенных веществ на осмотическое давление растворов. Основываясь на этих данных, Я. X. Вант-Гофф в 1886 г. показал, что концентрация раствора и его осмотическое давление связаны уравнением
к = КТ^сь (5.5) j
где q — молярная концентрация вещества в растворе; суммирование производится по концентрациям всех растворенных веществ.
Таким образом, для выражения осмотического давления раствора мы имеем два уравнения. В уравнении (5.4) л является функцией активности воды, тогда как в уравнении (5.5) — функцией суммарной концентрации растворенных веществ. В соответствии с этими уравнениями при увеличении концентрации веществ в растворе его осмотическое давление возрастает, тогда как активность воды снижается.
Из уравнения (5.5) следует, что вклад в осмотическое давление могут вносить вещества разной химической природы. Величина осмотического давления раствора определяется суммарной концентрацией всех имеющихся в водном растворе осмотически активных частиц (молекул и ионов), которая носит название осмолярности. Осмолярность клеточного сока мезофитов в среднем составляет 0,3 моль/л. Из них около 0,1 моль/л приходится на долю ионов К+, столько же на долю ионов СГ, остальные 0,1 моль/л составляют сахара, органические кислоты и другие соединения. Для перевода осмолярности в осмотическое давление ее нужно умножить на произведение RT, которое составляет 2,437 л ■ МПа/моль при 20 °C (293 К). Для приведенного примера с клеточным соком мезофитов, имеющим осмолярность 0,3 моль/л, осмотическое давление составляет 0,73 МПа. В физиологии растений давление выражают в мегапаскалях (МПа) или в барах, но возможно использование и других единиц. Соотношения между единицами давления приведены ниже:
1 МПа = 10 бар = 9,88 атм = 107 дин/см2.
ВОДНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ
Заменим в уравнении (5.1), согласно уравнению (5.4), RT\naw на -Р^л. Тогда выражение для химического потенциала воды примет вид
И» = М» + VWP- Kwn.(5.6)
Величина (pw - ц°) определяет способность воды в растворе, находящемся при некотором давлении, производить работу по сравнению с подобной способностью чистой воды, находящейся при атмосферном давлении. Различие в значениях разности (ци, - ц°) в одной точке по сравнению с другой показывает, что вода между ними не находится в состоянии равновесия. Поэтому она будет перетекать из области с большим значением в область меньшего значения (pw - ц°). При исследовании процессов движения воды в растениях используют величину, пропорциональную разности (pw - ц°), которая получила название водного потенциала (Ч/). Водный потенциал определяют как величину, равную разности химических потенциалов воды в системе (pw) и чистой воды (ц°) при той же температуре и том_же давлении, отнесенную к величине парциального молярного объема воды (1Q, что можно записать в виде соотношения
^ = Ри. Ни-/5 7)
r W
В соответствии с определением Ч/ и уравнением (5.6) водный потенциал можно выразить соотношением
^=Р~л.(5.8)
Так же, как Р и л, водный потенциал выражается в единицах давления. Согласно определению осмотического давления, Р не может быть больше л, поэтому в соответствии с уравнением (5.8) водный потенциал не может принимать положительные значения. Поскольку активность чистой воды при атмосферном давлении равна 0 (уравнение (5.4)), то ее водный потенциал при этих условиях тоже равен нулю. Это максимально возможное значение водного потенциала. По мере увеличения концентрации растворенного вещества Ч1 снижается и принимает все более отрицательные значения.
Химический потенциал паров воды в воздухе определяется через давление пара воды. Допуская, что пары воды ведут себя подобно идеальному газу, т.е. парциальное давление паров воды определяет химическую активность паров воды в воздухе, получаем
PWL относительная влажность
где Pwu — наблюдаемое парциальное давление паров воды в воздухе; P°wu — давление насыщенных паров, находящихся в равновесии с чистой водой при той же температуре. Если принять во внимание эту зависимость, выражение водного потенциала для паров воды в воздухе будет иметь вид
(5.9)(5.9)RT, RT, (относительная влажность
(5.9)
(5.9)
Ч7 == -^- In aw = -=- In —
VVКIЮО
vw*wK wX*
В соответствии с уравнением (5.9) при относительной влажности, равной 100 %, водный потенциал паров воды в воздухе будет равен 0. Снижение относительной влажности всего лишь на 1 % приводит к уменьшению ^до -1,36 МПа. Средние значения водного потенциала зеленых листьев, например овощных растений, составляют -0,5 Мпа. Согласно уравнению (5.9), такое значение Ч7 соответствует относительной влажности 99,6 %. Даже во время проливного дождя влажность воздуха редко превышает 99 %. Следовательно, листья, водный потенциал которых составляет -0,5 МПа, постоянно теряют воду. В листьях большинства наземных растений водный потенциал колеблется от -0,4 до -0,3 МПа. У некоторых растений пустынь водный потенциал растений может снижаться до -5,0 МПа.
МАТРИЧНОЕ ДАВЛЕНИЕ
В водном обмене растений большое значение имеет взаимодействие воды с биомолекулами. Такое взаимодействие осуществляется как внутри клеток, так и в апопласте и происходит в основном за счет образования водородных связей между молекулами воды и биополимерами. Водородные связи постоянно распадаются и образуются вновь. Связывание части молекул воды функциональными группами биополимеров понижает ее термодинамическую активность. Таким образом, биомолекулы наряду с низкомолекулярными растворенными веществами участвуют в снижении активности воды и вносят вклад в снижение ее химического потенциала. В связи с этим фактически измеряемое в экспериментах осмотическое давление в клетках, равное —=— lnaw, можно представить в виде суммы л = тс5 + т, где л5 — осмотическое давление, вызываемое присутствием низкомолекулярных растворенных веществ; т — матричное давление, являющееся результатом взаимодействия воды с биополимерами. Принимая во внимание наличие двух составляющих осмотического давления, мы можем переписать выражение (5.8) следующим образом:
Ч7 = Р - л$ - т. (5.10)
Часто в физиологии водного обмена водный потенциал представляют в виде суммы потенциалов:
T = 'Pp + 'Ps + T"pMM1, (5.11) где Ч'р — потенциал давления, равный Р; ^ — осмотический потенциал давления, равный -л8; ^т — матричный потенциал, равный -т.
Направление движения воды из наружной среды в клетку или обратно будет определяться направлением градиента водного потенциала. Условием поступления воды в клетку является более высокий водный потенциал наружной среды, чем водный потенциал клетки. Направление движения воды в системе целого растения также определяется направлением градиента водного потенциала.
Примечание 1. В древесных растениях вода может подниматься по сосудам ксилемы на большую высоту. Поднимаясь вверх, она приобретает в гравитационном поле Земли потенциальную энергию, которую следует учитывать при определении химического
потенциала воды. Вклад земного притяжения в водный потенциал учитывается как давление, оказываемое столбом воды, равным по высоте расстоянию, на которое перемещается вода в гравитационном поле. В связи с этим в выражение водного потенциала (уравнение (5.11)) для клеток, находящихся на большой высоте, вносят еще одну составляющую, получившую название гравитационного потенциала (Ч171) и равную pwgh, где рк — плотность воды; g — ускорение свободного падения; h — расстояние, на которое перемещается вода в гравитационном поле. Расчет в соответствии с выражением для гравитационного потенциала показывает, что при перемещении воды по вертикали на расстояние 10 м вклад гравитационной составляющей в водный потенциал приблизительно равен 0,1 МПа.
СООТНОШЕНИЕ МЕЖДУ ОСМОТИЧЕСКИМ ДАВЛЕНИЕМИ ГИДРОСТАТИЧЕСКИМ ДАВЛЕНИЕМ В КЛЕТКЕ
Познакомившись с понятиями химического и водного потенциалов, а также с явлением осмоса, рассмотрим некоторые закономерности водного обмена на уровне клетки. Главным барьером, отделяющим клетку от наружной среды, является ПМ, которую в первом приближении можно считать полупроницаемой мембраной. В то же время наличие относительно жесткой КС ограничивает объем протопласта при поступлении воды в клетку и этим способствует развитию внутриклеточного гидростатического (тургорного) давления. Клетку вследствие этого можно рассматривать как осмотическую ячейку.
Согласно уравнению (5.8), гидростатическое давление и осмотическое давление — главные составляющие водного потенциала клетки. В зависимости от ее оводненности соотношение между этими двумя составляющими различно. Помещая клетки растений (кусочки тканей), находящиеся в состоянии тургора, т. е. в состоянии высокой оводненности, в растворы нейтрального осмотически активного вещества, например сахарозы, можно изменять внутриклеточное содержание воды (рис. 5.3).
Вода будет входить в клетки или выходить из них в зависимости от концентрации сахарозы, т.е. в зависимости от направления градиента водного потенциала на границе раздела клетка — среда:
д\р — vpcp _ укл
где ДЧ7 — градиент водного потенциала между наружной средой и клеткой; Ч'ср — водный потенциал среды; Ч7^1 — водный потенциал клетки. При инкубации клеток в растворах за определенное время достигается состояние равновесия. Приведенные ниже рассуждения относятся к равновесному состоянию. В общем случае водный потенциал клеток можно выразить как ТЮ1 = Р^ - л™, а водный потенциал среды как Ч743 = -лср, поскольку в соответствии с выбранной нами точкой отсчета давления Рср = 0. В состоянии равновесия Ч71^ = Чср и, следовательно, Р™ - л1"1 = -лср.
Рассмотрим сначала предельный случай, когда клетки находятся в чистой воде. Активность чистой воды максимальна, она равна 1, и в соответствии с уравнением (5 4) для воды, не содержащей растворенных веществ, лср = 0. Из этого следует, что в чистой воде Р™ = л™. Тургорное давление Р™ при этом достигает максимально возможного значения, так как клетки содержат макси-
Рис. 5.3. Соотношение между водным потенциалом Y, гидростатическим давлением Р и осмотическим давлением л в клеткеРис. 5.3. Соотношение между водным потенциалом Y, гидростатическим давлением Р и осмотическим давлением л в клеткемально возможное количество воды, т.е. находятся в предельно тургесцентном состоянии. Максимальное количество воды в клетках означает предельное разбавление внутриклеточных веществ, и осмотическое давление внутриклеточ
Рис. 5.3. Соотношение между водным потенциалом Y, гидростатическим давлением Р и осмотическим давлением л в клетке
Рис. 5.3. Соотношение между водным потенциалом Y, гидростатическим давлением Р и осмотическим давлением л в клетке
Рис. 5.4. Вид растительных клеток при их обезвоживании в гипертонических растворах (растворах высокой осмолярности):А — плазмолиз; Б — циторризРис. 5.4. Вид растительных клеток при их обезвоживании в гипертонических растворах (растворах высокой осмолярности):А — плазмолиз; Б — циторризной среды (л101) поэтому минимально. В этих условиях в силу равенства Р™ и л™ водный потенциал клетки 'Р^1 равен 0, т е. имеет свое максимально возможное значение. По мере увеличения концентрации сахарозы лср возрастает и соответственно 'Рср снижается, что усиливает тенденцию к оттоку воды из клеток, к уменьшению их объема и снижению тургора. Концентрирование внутриклеточных веществ при этом приводит к повышению л™. При некоторой достаточно высокой концентрации сахарозы в среде будет достигнуто состояние, при котором Д" = 0. Иными словами, клетки потеряют тургесцентность. Осмотическое давление л™ при этом примет некоторое высокое значение, а ^ будет представлено только его осмотической составляющей. Дальнейшее увеличение концентрации сахарозы в среде (на графике не показано) приведет к еще большему выходу воды из клеток, что будет сопровождаться уменьшением объема протопласта и отделением его от КС (рис. 5.4, А). Этот процесс получил название плазмолиза. Нарушение связи ПМ с клеточными стенками обусловлено их ограниченной эластичностью. Считается, что пространство между КС и ПМ при плазмолизе заполняет наружный раствор.
Рис. 5.4. Вид растительных клеток при их обезвоживании в гипертонических растворах (растворах высокой осмолярности):
А — плазмолиз; Б — циторриз
Рис. 5.4. Вид растительных клеток при их обезвоживании в гипертонических растворах (растворах высокой осмолярности):
А — плазмолиз; Б — циторриз
Точку начального плазмолиза, т.е. концентрацию осмотика, при которой Р101 = 0, можно использовать для оценки осмолярности и осмотического давления внутриклеточной среды. Это определение основано на следующих допущениях: при инкубации клеток в растворах осмотика вещества, содержащиеся в клетках, не выходят наружу; объем клеток не зависит от изменения наружной концентрации осмотика. В действительности некоторый обмен осмотически активными веществами между клетками и средой происходит. Изменяется также и клеточный объем, так как КС некоторой эластичностью все-таки обладают, однако для грубой оценки осмотического давления внутриклеточной среды эти процессы можно не принимать во внимание. Учитывая указанные допущения, для точки начального плазмолиза, когда Т3^1 = 0, можно записать: л^ = л101, где индекс «пл» означает начальный плазмолиз. Оценка внутриклеточной осмолярности в этом случае сводится к определению концентрации осмотически активного вещества в среде, при которой плазмолиз едва начинается. Зная осмолярность, по уравнению (5.5) можно рассчитать л101.
В некоторых случаях плазмолиз протекает без отделения протопласта от КС, свидетельствуя о высокой прочности их связи. В этом случае сокращающиеся протопласты тянут за собой КС и заставляют их прогибаться внутрь. За счет сил упругости КС тургорное давление Т3^1 приобретает отрицательное значение, что приводит к еще большему снижению водного потенциала ^^ и усилению тенденции к поглощению клеткой воды. Такая разновидность плазмолиза называется циторризом (рис. 5.4, 5). Явления плазмолиза и циторриза можно наблюдать не только в лабораторных условиях, но и в природе, например в условиях засухи или почвенного засоления.
ВОДНЫЕ КАНАЛЫ МЕМБРАН: АКВАПОРИНЫ
Молекулы воды могут преодолевать биологические мембраны двумя путями: (7) через липидный бислой и (2) через поры, образуемые специфическими белками — аквапоринами. Хотя молекула воды является диполем, она элек- тронейтральна и вследствие этого может в отличие от ионов диффундировать через липидную фазу мембраны. Долгое время путь воды через липидный бислой рассматривался как единственный. Однако наличие в мембранах пор, пропускающих молекулы воды, стали предполагать начиная уже с 1960-х гг. Позднее существование таких пор было доказано, и они получили название водных каналов.
Одним из критериев участия водных каналов в транспорте воды является высокое отношение осмотического коэффициента водной проницаемости (7^) к диффузионному коэффициенту водной проницаемости мембраны (Pd). Pf характеризует общую водную проницаемость мембраны, когда ток воды осуществляется как через водные каналы, так и через липидный бислой. Значение Pj определяют при наложении на мембрану градиента водного потенциала (градиента осмотического или гидростатического давления). Pd характеризует проницаемость мембраны, связанную только с диффузией, т. е. с движением молекул воды, которое происходит даже в отсутствие градиента водного потенциала. Соответственно, его определяют в условиях, когда ДЧ3 на мембране равен нулю. Значения Pjh Pd приблизительно равны, если транспорт воды осу-
ществляется только через липидный бислой, что, в частности, наблюдается на искусственных липидных бислоях, а также на биологических мембранах, в которых водные каналы отсутствуют или инактивированы. Показано, что для ПМ клеток многих растений Pj намного превосходит Pd. Это свидетельствует об участии водных каналов в транспорте воды через эту мембрану.
В отличие от диффузионной водопроницаемости осмотическая водопроницаемость оказалась чувствительной к соединениям ртути. Последняя ковалентно связывает сульфгидрильные группы. Ингибирование транспорта воды соединениями ртути в условиях наложенного на мембрану Д'? позволило предположить, что водные каналы образованы белками, содержащими остатки цистеина. Чувствительность транспорта воды к ртутьсодержащим соединениям используется в качестве другого критерия участия в нем водных каналов.
Еще одним критерием вовлечения водных каналов в транспорт воды является его низкая энергия активации (Еа <21 кДж/моль). В отличие от движения воды через каналы диффузия воды через липидный бислой характеризуется намного более высокими значениями энергии активации (Еа = 58 — 70 кДж/моль).
На основании вышеприведенных критериев исследователи пришли к выводу, что водные каналы отвечают за основной поток воды через мембраны.
Использование молекулярно-биологических подходов в исследованиях позволило идентифицировать белки водных каналов — аквапорины. Первым идентифицированным белком с выраженной водно-транспортной активностью был белок мембраны эритроцитов CHIP28 (channel-forming integral protein), переименованный затем в AQP1. На основании гомологии с AQP1 позже были идентифицированы аквапорины у представителей различных систематических групп, в частности у бактерий, грибов, растений и животных. В растительных клетках аквапорины обнаружены в плазматической мембране и тонопласте. Аквапорины ПМ входят в семейство интегральных белков PIP (plasma membrane intrinsic protein), аквапорины тонопласта — в семейство интегральных белков TIP (tonoplast intrinsic protein). Для многих идентифицированных на основании гомологии с AQP1 растительных белков была продемонстрирована водно-транспортная активность. С этой целью кДНК идентифицированных белков (предполагаемых аквапоринов) были транскрибированы /и vitro. Полученная РНК была введена в ооциты африканской травяной лягушки Xenopus laevis. Через некоторое время, необходимое для синтеза белка и встраивания его в плазматическую мембрану, ооциты переносили на гипотонический раствор и регистрировали скорость их набухания (скорость входа воды). Набухание происходило значительно быстрее у ооцитов, ПМ которых содержала продукт внедренной РНК, свидетельствуя, что исследуемый белок является аквапорином. Такого рода доказательство наличия водно-транспортной активности было получено для гомологов AQP1 ПМ и тонопласта из арабидопсиса (Arabidopsis thaliana), растений табака (Nicotiana tabacum), хрустальной травки (Mesembryanthemum crystallinum), бобов (Viciafaba), подсолнечника (Helianthus annus), шпината (Spina- ciaa oleracea) и кукурузы (Zea mays).
289289Молекулярная масса аквапоринов варьирует от 23 до 31 «Да. На рис. 5.5 представлена гипотетическая структура аквапорина, образующего канал в мембране. Полипептидная цепь аквапорина 6 раз пересекает липидный бислой. Домены, погруженные в липидный бислой, гидрофобны и образуют а-спирали. С- и N-концы аквапоринов ПМ и тонопласта расположены с цитоплазмати-
289
289
10 Физиология растений
Рис. 5.5. Структура аквапоринов и схема, иллюстрирующая транспорт воды через водные каналы и липидный бислой мембраны (по S.D.Tyerman et al., 1999):
А — вторичная структура мономера акванорина AQP1. Цилиндры, обозначенные цифрами 1—6, отражают а-спирали, пересекающие липидный бислой мембраны. N, Р, А — аминокислотные остатки аспарагиновой кислоты, пролина и аланина; Б — предполагаемый способ, посредством которого два N, Р, A-мотива формируют в мембране водный канал (показан стрелками); В — четыре полипептида формируют в мембране тетрамерную структуру. Ток воды осуществляется через каждый из четырех мономеров
ческой стороны мембраны. Гидрофильные домены полипептидной цепи соединяют а-спирали. Между 2-й и 3-й, а также между 5-й и 6-й а-спиралями гидрофильные домены включают небольшие гидрофобные петли. Последние, как и а-спирали, погружены в липидный бислой. Каждая из этих двух петель содержит высококонсервативный мотив Asp-Pro-Ala, так называемый NPA- бокс. Две петли, содержащие этот мотив, совмещаются в центре липидного бислоя и формируют две полусферические поры, которые вместе создают узкий водный канал. Полагают, что такого рода двухосевая симметрия обеспечивает ток воды через мембрану в обоих направлениях, в зависимости от направления градиента водного потенциала, а также отвечает за селективность водного канала по отношению к молекулам воды.
Содержание белков PIP- и TIP-семейств в мембранах растительных клеток сильно варьирует. Оно зависит от вида растения, ткани, условий водного ре-
жима и в некоторых случаях может достигать очень высоких значений. Было показано, например, что в плазматической мембране листьев шпината на долю белков PIP-семейства приходится до 20 % от общего содержания белков в этой мембране.
Аквапорины не только отвечают за быстрый транспорт воды через мембраны, но также дают организму возможность регулировать водные потоки как между клетками, так и внутри клеток. Эта регуляция осуществляется как путем изменения числа водных каналов в мембране, так и путем изменения их активности. Содержание водных каналов в мембране зависит от биосинтеза аква- поринов, который находится под контролем транскрипционных факторов. Регуляция активности уже сформированных водных каналов осуществляется путем фосфорилирования. Водная проводимость мембран меняется в онтогенезе, изменяя потоки воды в соответствии с запросами роста и развития растения. Установлено, что при росте, когда происходит растяжение клеток, активность генов TIP-семейства возрастает. Экспрессия генов тонопластных аквапоринов и повышение транспортной активности последних в условиях роста растяжением необходимы для обеспечения усиленного притока воды в вакуоли и поддержания тургора в клетках.
Контролирование водных потоков в растении имеет большое значение и в условиях водного дефицита. Регуляция водно-транспортной активности ПМ путем фосфорилирования — дефосфорилирования аквапоринов и общие принципы регуляции экспрессии генов при водном дефиците рассмотрены в гл. 8 (см. подразд. 8.2).
ПОТОК ВОДЫ В КЛЕТКУ
Когда водный потенциал клетки отличается от водного потенциала среды, вода не находится в состоянии равновесия и движется в направлении от большего потенциала к меньшему. При этом объемный поток воды Jw, т.е. объем воды, протекающий через единицу площади мембраны в единицу времени, пропорционален разности водных потенциалов по обе стороны мембраны:
Jw = ТрАТ = ZpC^P - Г), (5.12) где Jw — объемный поток воды [см3- см"2■ с"1] или [см ■ с"1]; Lp — коэффициент гидравлической проводимости [см ■ с"1 ■ МПа"1]; АТ — градиент водного потенциала; Т^ — водный потенциал наружного раствора; Т° — водный потенциал клетки.
Если величина гидравлической проводимости известна, то, используя приведенное уравнение, можно рассчитать разность водных потенциалов, необходимую для обеспечения того или иного потока воды. Так, например, показано, что коэффициент водной проводимости у клеток междоузлий харовых водорослей Nitella и Chara равен 10"5 см ■ с"1 ■ МПа"1. Можно принять, что эти гигантские клетки имеют форму цилиндра длиной 10 см и диаметром 1 мм. Площадь поверхности, через которую проходит вода, равна 2л/-1С1/, где г^ — радиус клетки; / — ее длина; кг^! — объем клетки. Подставляя значения ^ и / в эти выражения, получим численные значения площади поверхности — 2л ■ 0,05 • 10 = л см2 и объема — л ■ 0,052-10 = л/40 см3. Установлено, что ско-
рость прироста этих клеток составляет приблизительно 1 % от их объема в сутки. Соответственно содержание воды в них возрастает тоже на 1 % в сутки. Следовательно, суточный приток воды в такую клетку составляет 0,01л/40 см3, или Зл ■ 10-9 см3 ■ с1. Этот приток воды осуществляется через поверхность л см2, так что объемный поток поступающей воды составит 3 ■ 10-9 см ■ с"1. Используя полученное значение для объемного потока и известную величину коэффициента гидравлической проводимости для клеток междоузлий, находим, что А^ = 3-10-5 МПа. Эти расчеты показывают, для поддержания притока воды, сопровождающего рост клетки на I % в сутки, Ч^ должен быть всего лишь на 3 ■ 10-5 МПа меньше Ч/ср.
Уравнение Jw = £р(АР - Ал) справедливо, если единственным веществом, движущимся через мембрану, является вода. Если через мембрану переносятся также и растворенные вещества, например ионы, то градиент осмотического давления, одна из движущих сил транспорта воды, уменьшается. В этом случае уравнение потока будет иметь вид
/w = £р(АР - стАл), (5.13) где ст — коэффициент отражения, характеризующий селективность мембраны по отношению к воде, является величиной безразмерной, изменяется в диапазоне от 0 до 1. Уравнение (5.13) показывает, что вклад осмотического давления в движущую силу транспорта воды изменяется в о раз, когда через мембрану проходят как вода, так и растворенные вещества. Если избирательность по отношению к воде отсутствует полностью, т.е. мембрана одинаково хорошо проницаема для воды и растворенных веществ, то ст = 0 и £ = £рАР. Если мембрана представляет абсолютный барьер для растворенных веществ и пропускает только воду, то ст = 1 и Jw = £р(АР - Ал). Изменения коэффициента отражения in vivo связаны с модификациями свойств мембран. Предполагают, что коэффициент отражения изменяется под действием факторов окружающей среды и таким образом вносит вклад в регуляцию тургорного давления и осмотического водного потока.
Коэффициент отражения и гидравлическую проводимость мембран определяют с помощью клеточного зонда давления. У клеток высших растений значения £р лежат в области 10“6—10-9 м ■ с"1 ■ МПа-1, а значения ст по отношению к ионам минерального питания близки к 1.
Методом корневого зонда давления измеряют гидравлическую проводимость (£р) и коэффициент отражения (стк) целого корня. Величина £р, как правило, одного порядка с величиной гидравлической проводимости клеток, а значения стк чаще всего лежат в интервале от 0,2 до 0,8.
ДВИЖЕНИЕ ВОДЫ В ЦЕЛОМ РАСТЕНИИ
Вода образует непрерывную фазу в системе почва—корень—стебель—лист— атмосфера. Поглощенная корнями из почвы вода транспортируется по стеблю в листья. Лишь незначительная доля всей поглощенной воды потребляется клетками растения. Подавляющая часть воды, оказавшейся в растении, достигнув листьев, испаряется. В глобальном масштабе растения возвращают обратно в атмосферу до половины того количества воды, которое ежегодно выпадает на Землю в виде осадков.
ТЕОРИЯ КОГЕЗИИ И НАТЯЖЕНИЯ
Более 100 лет назад Дж. Бём разработал теорию когезии и натяжения, которая легла в основу современной модели транспорта воды в целом растении. В середине прошлого столетия Т. X. Ван ден Хонерт, основываясь на физико- химических свойствах воды, в рамках этой теории разработал термодинамические принципы дальнего транспорта воды (транспорт между органами растений и в целом растении). Основные положения теории когезии и натяжения формулируются следующим образом.
За счет водородных связей между молекулами воды возникают большие силы сцепления (когезии). В связи с этим вода может подвергаться натяжению величиной от десятков до нескольких сот МПа, прежде чем столб воды, находящейся в капилляре, в частности в сосуде ксилемы, разрушится.
Вода в растениях формирует непрерывную водную систему, идущую от почвы к поглощающей поверхности корня и далее через корень и стебель к испаряющей поверхности листьев. За некоторым исключением, ток воды в этой непрерывной системе является гидравлическим по происхождению, и система может быть описана как цепь сопротивлений, размещенных последовательно и параллельно.
Испарение воды листьями приводит к снижению их водного потенциала и тем самым заставляет воду двигаться из ксилемы к испаряющим клеткам листьев. Это в свою очередь снижает давление в ксилеме до значений, меньших атмосферного давления (Р < 0).
Вдоль транспирирующего растения устанавливается градиент давления. Это является причиной тока воды из почвы в корни и далее через стебли к испаряющим воду листьям. Разность в водном потенциале между атмосферой и почвой достаточна для подъема воды даже у самых высоких деревьев.
Когда натяжение в сосудах ксилемы достигает некоторой критической величины, через поры в стенках сосудов проникают пузырьки воздуха. Объединяясь, они могут сформировать пузырек достаточной величины, чтобы разорвать столб ксилемного сока в сосуде, т. е. привести к эмболии.
Рассмотрим в общих чертах ток воды в растении, приняв за основу вышеприведенные положения.
По аналогии с законом Ома поток воды (Jt) в гидравлической цепи представляют как произведение гидравлической проводимости (Lp — величина, обратная гидравлическому сопротивлению R) на градиент водного потенциала (Jv = £pAY). В соответствии с этой аналогией, если цепь состоит из нескольких сопротивлений, расположенных последовательно, в цепи течет гидравлический ток, величина которого может быть определена уравнением
(5.14)(5.14)уду, v ' AY
(5.14)
(5.14)
У Я, " R ’
где J„ — поток воды через гидравлическую цепь; AY, — разность водных потенциалов между концами z-го элемента цепи; R, — сопротивление элемента /; R — сопротивление всей цепи. Если элементы соединены параллельно, суммарный поток воды может быть описан следующим образом: Jv = У LiA4'l = £pAY, где Lj — гидравлическая проводимость /-го элемента цепи; Lp — гидравличе-
АтмосфераАтмосфераПочваПочваРис. 5.6. Упрощенная модель установившегося тока воды по растению. Стрелка указывает направление движения воды в системе почва— растение — атмосфераРис. 5.6. Упрощенная модель установившегося тока воды по растению. Стрелка указывает направление движения воды в системе почва— растение — атмосфера
Атмосфера
Атмосфера
Почва
Почва
Рис. 5.6. Упрощенная модель установившегося тока воды по растению. Стрелка указывает направление движения воды в системе почва— растение — атмосфера
Рис. 5.6. Упрощенная модель установившегося тока воды по растению. Стрелка указывает направление движения воды в системе почва— растение — атмосфера
ская проводимость всей цепи; ЛТ — разность водных потенциалов между концами цепи.
В гидравлической цепи целого растения выделяют три основных последовательно соединенных сопротивления: (R^ сопротивление на участке от поверхности клеток эпидермиса до сосудов ксилемы; (Л2) сопротивление, которое оказывают элементы ксилемы; ^R^ сопротивление при испарении воды в атмосферу из листьев (рис. 5.6). В цепи целого растения ксилема характеризуется наименьшим сопротивлением, тогда как самое большое сопротивление возникает при диффузии воды из листьев в атмосферу. В каж-
дом из трех участков цепи целого растения можно выделить более дробные элементы, соединенные между собой последовательно или параллельно. Последовательно соединены ткани, которые вода пересекает, передвигаясь от периферии корня к центру; па
раллельно соединенные элементы — апоп- ластный и симпластный пути движения воды.
Испарение воды с поверхности листьев в атмосферу определяет направление движения воды во всей системе почва—корень—стебель—лист—атмосфера и генерирует движущие силы для поглощения воды корнями. Снижение
водного потенциала листьев при транспирации увеличивает градиент водного потенциала на участке ксилема — листовая пластинка, что приводит к усилению поглощения воды клетками листа из ксилемы и соответственно к стимуляции поглощения воды корнями из почвы. Падение водного потенциала на каждом участке системы происходит в соответствии с величиной его сопротивления. Рассмотрим весь путь движения воды по отдельным элементам гидравлической цепи. Ради удобства изложения этапы водного пути будем рассматривать в обратном порядке, т.е. от атмосферы к почве.
ДВИЖЕНИЕ ВОДЫ В ЛИСТЬЯХ И ТРАНСПИРАЦИЯ
Вода поступает из корней в сосуды ксилемы, движется по ним вверх к листьям, а затем попадает в отдельные клетки листа, где движение осуществляется в основном по клеточным стенкам.
Процесс испарения воды растением получил название транспирации. Поскольку листья растения формируют большую часть его поверхности, транспирация происходит в основном через листья. Вода, попав в листья, испаряется из ксилемных окончаний и клеточных стенок. Пары воды, диффундируя через межклеточные воздухоносные полости, достигают устьиц и оттуда проникают в атмосферу. Замыкающие клетки устьиц, изменяя ширину устьичной щели, регулируют скорость транспирации так же, как и газообмена растения в целом. Открытые на свету устьица не только обеспечивают приток СО2 в ли-
стья, но и создают благоприятные условия для транспирации. Чем интенсивнее транспирация, тем выше скорость движения сока по ксилеме, а следовательно, и скорость доставки фотосинтезирующим клеткам необходимых веществ. Одним из наиболее важных аспектов устьичной регуляции является прямая зависимость ширины устьичной щели от водного потенциала почвы. Когда водный потенциал почвы снижается (условия водного дефицита или почвенного засоления), клетки растения, в том числе замыкающие клетки устьиц, теряют воду. Снижение оводненности замыкающих клеток приводит к утрате их тургора, закрытию устьиц, что предотвращает избыточную потерю воды растением (о регуляции работы устьичного аппарата см. гл. 6 и подразд. 8.3.1.2).
У большинства растений транспирация осуществляется в основном через устьица и лишь незначительная доля воды испаряется с поверхности листьев. Процесс испарения воды через устьица называется устьичной транспирацией, а с поверхности листа — кутикулярной транспирацией. Испарение воды с поверхности листа — процесс нерегулируемый, поэтому растения избегают кутикулярную транспирацию. В связи с этим эпидермис листьев мезофитов и ксерофитов покрыт хорошо развитой кутикулой, которая образована воскоподобными веществами, непроницаемыми для молекул воды.
Поскольку транспирация является генератором градиента водного потенциала, ее называют верхним концевым двигателем транспорта воды в растении.
ДВИЖЕНИЕ ВОДЫ ПО КСИЛЕМЕ И КЛЕТОЧНЫМ СТЕНКАМ
Поглощенная корнем вода транспортируется в радиальном направлении к проводящим пучкам и оказывается в конце концов в сосудах ксилемы. Дальнейшее движение воды происходит в восходящем направлении последовательно по ксилеме корня, стебля и листьев.
Ксилема специально приспособлена к выполнению функции водопроведе- ния. Проводящие элементы этой ткани имеют одревесневшие, т.е. пропитанные лигнином, клеточные стенки и лишены протопластов. Сосудистые растения формируют два типа проводящих клеток ксилемы — членики сосудов (обнаруживаются преимущественно у покрытосеменных) и эволюционно более примитивные трахеиды (встречаются у покрытосеменных, голосеменных и папоротникообразных). И членики сосудов, и трахеиды вытянуты вдоль оси растения. Концы трахеид заострены, тогда как концы члеников сосудов имеют, как правило, тупую форму. Членики сосудов, соприкасаясь друг с другом перфорированными концами, образуют водопроводящие сосуды. Трахеиды соприкасаются боковыми стенками или заостренными концами. Контакт между ними осуществляется с помощью так называемых окаймленных пор. Окаймленная пора одной проводящей клетки точно совпадает с такой же порой соседней клетки, образуя водопроводящий путь между двумя клетками. Окаймленные поры, строго говоря, не являются порами, так как в них сохраняются перегородки, состоящие из первичной КС и срединной пластины. Вода, передвигаясь от клетки к клетке, вынуждена вследствие этого просачиваться через указанный барьер. Сосуды представляют собой более совершенную водопроводящую структуру, чем трахеиды. Гидравлическое сопротивление сосудов меньше, чем у трахеид, поскольку диаметр первых больше, чем диаметр вторых, а
наличие перфорации на концах члеников делает движение воды более свободным по сравнению с ее движением через окаймленные поры. Влияние диаметра ксилемного элемента на его гидравлическую проводимость рассмотрено ниже.
Важную роль в движении воды по проводящей системе играет взаимодействие молекул воды друг с другом и с внутренними поверхностями элементов ксилемы и КС. Непрерывность водного тока в этих структурах обеспечивается силами адгезии и когезии. За адгезию отвечают водородные связи, образующиеся между молекулами воды и полярными группами соединений, входящих в состав ксилемы и КС, тогда как за когезию — водородные связи, образующиеся между молекулами самой воды. Силы когезии обеспечивают непрерывность и высокую прочность водных нитей в условиях интенсивной транспирации, когда нити растягиваются и испытывают высокую нагрузку на разрыв.
Внутри ксилемных окончаний и в порах КС при транспирации формируется газовая фаза. В трехфазной системе имеет место поверхностное явление, называемое смачиванием. Оно заключается во взаимодействии жидкости (транспортируемого раствора) с твердым телом (КС) при их одновременном контакте с воздухом. Степень взаимодействия воды со стенками капилляра (воды с клеточными стенками в сосудах ксилемы) характеризуется величиной косинуса угла смачивания (cos6). Если Z6 < 90° (cos6 > 0, рис. 5.7, слева'), жидкость хорошо смачивает поверхность (гидрофильная поверхность). Если Z6 > 90° (cos 6 < 0, рис. 5.7, справа), поверхность не смачивается данной жидкостью (гидрофобная поверхность). Поверхность клеточных стенок, несущих большое число полярных групп, относится к гидрофильным поверхностям, так как для нее Z6 —> 0°, a cos 6 -> 1.
В сосудах ксилемы (капиллярах) адгезия воды к КС и смачивание стенок водой приводят к капиллярным явлениям. Они возможны тогда, когда диаметр капилляров соизмерим с радиусом кривизны поверхности жидкости в них, что характерно для ксилемных элементов и КС. Кривизна поверхности, возникающая благодаря адгезии жидкости к стенкам, приводит к изменению свойств ее поверхностного слоя.
Особенность капиллярных явлений заключается в том, что с появлением кривизны поверхности давление жидкости внутри капилляра изменяется. В зависимости от свойств поверхности капилляра (угла смачивания) давление жидкости в нем может быть больше или меньше атмосферного. Возникающий
Рис. 5.7 Иллюстрация капиллярных явлений:
ДР — избыточное давление; г' — радиус кривизны; г — радиус капилляра; h — высота поднятия или опускания жидкости в капилляре; cos 6 — косинус краевого угла Слева и справа — капилляры с гидрофильной и гидрофобной поверхностью соответственно
градиент давления между жидкой и газовой фазами в капилляре (ДР) выражается уравнением Лапласа
пяж
ДР = —,(5.15)
г'
где г' — радиус кривизны поверхности жидкости; бж — поверхностное натяжение жидкости; ДР — капиллярное, или лапласовское давление.
Возникающее вследствие кривизны поверхности капиллярное давление всегда направлено к центру кривизны (рис. 5.7). Центр кривизны может находиться вне жидкости (отрицательная кривизна) и внутри жидкости (положительная кривизна), в первом случае ДР уменьшает внутреннее давление жидкости, а во втором — увеличивает его, т.е. в одном случае происходит растягивание жидкости, а во втором — сжатие.
Существованием капиллярного давления объясняется поднятие или опускание жидкости в капилляре. Рассмотрим изменение уровней в двух погруженных в воду капиллярах, один из которых имеет гидрофильную поверхность (рис. 5.7, слева), а другой — гидрофобную (рис. 5.7, справа) В левом капилляре поверхность жидкости имеет отрицательную кривизну, поэтому лапласовское давление стремится растянуть воду (давление направлено к центру кривизны) и поднимает ее вверх. Кривизна поверхности в правом капилляре положительна, лапласовское давление направлено внутрь воды и поэтому происходит ее опускание. Высота капиллярного поднятия воды (или опускания) определяется уравнением Жюрена
,25" cos 6
п =,
^(Р^-Ро)
где р", ро — плотности жидкости и воздуха соответственно; g — ускорение
2 §w cos Освободного падения. Так как р" » ро и р" близко к 1, h =—. Уравне-rg
ние Жюрена показывает, что при отсутствии смачивания (6 > 90°, cosO < 0) уровень жидкости в капилляре опускается на величину h (рис. 5.7, справа). При полном смачивании (6 -> 0°, cos 6 -> 1) уровень жидкости поднимается (рис. 5.7, слева). Вода хорошо смачивает стенки сосудов ксилемы и поры клеточных стенок, поэтому искривленная поверхность на границе стенка—вода будет вогнутой. Поскольку стенки элементов ксилемы гидрофильны, то вода будет подни- 25" маться по ним вверх, и высота поднятия будет определяться выражением h =.
rg
Расчеты показывают, что величина h в тонких капиллярах может достигать весьма больших значений (табл. 5.1). Таким образом, капиллярные силы могут обеспечить подъем воды на нужную высоту даже у древесных растений.
Поток воды в системе равен произведению ее гидравлической проводимо-
сти на градиент водного потенциала в этой системе. Поскольку осмотическое давление ксилемного сока, как правило, не превышает 0,2 МПа, основной
Таблица 5.1. Расчетные значения высоты поднятия воды (й) в капилляре в зависимости от его радиуса (г)
вклад в АТ ксилемы вносит ДР. Осмо- тической составляющей градиента водного потенциала в этом случае можно
г 1 мм 20 мкм
1 мкм 0,1 мкм 1 нм
h 1,5 см 75 см
15 м 150 м 15 км
пренебречь. Объемный поток воды для ксилемы вследствие этого можно выра
зить как: Jw = £рАР. Согласно закону Пуазейля, гидравлическая проводимость (£р) цилиндрических труб (такими в грубом приближении можно считать эле-
.лг4
менты ксилемы) равна —— (ламинарное движение), где г — внутренний
радиус трубы; ц — вязкость раствора. Соответственно объемный поток воды в
ксилемном элементе будет равен Jw =АР. Знак «минус» в уравнении
потока Пуазейля означает, что положительный объемный поток (Jw > 0) направлен в сторону уменьшения гидростатического давления (АР< 0). Градиент гидростатического давления в элементах ксилемы и КС создается в основном благодаря транспирации. При интенсивной транспирации в ксилеме некоторых растений может развиваться большое натяжение (отрицательное гидростатическое давление) вплоть до -10 МПа, которое поддерживается за счет поверхностных явлений на границе ксилемный сок—стенка. Когда транспирация прекращается или ослабевает, что происходит ночью или при высокой влажности воздуха, гидростатическое давление в ксилеме падает до значений, близких к 0, а в некоторых случаях может принимать положительные значения (т. е. выше атмосферного). Экспериментально показано, что изменения гидростатического давления в ксилеме (от положительного до отрицательного) на протяжении суток приводят к заметным колебаниям в диаметре дерева. При положительном давлении вода выделяется из растения через гидатоды листьев (видоизмененные устьица).
Приведенное выше уравнение Пуазейля показывает, что диаметр проводящего воду канала имеет огромное влияние на его гидравлическую проводимость, а следовательно, и на величину потока воды. У растений поперечные размеры проводящих элементов ксилемы сильно колеблются. Например, около кончика корня кукурузы диаметр сосудов протоксилемы равен 5—10 мкм. На расстоянии 25 мм от кончика средний диаметр сосудов ранней метаксилемы составляет 23 мкм, а на расстоянии больше 250 мм от кончика сосуды поздней метаксилемы достигают в диаметре 100 мкм. Вследствие такого различия в диаметре сосуды поздней метаксилемы обладают значительно более высокой гидравлической проводимостью, чем сосуды ранней метаксилемы. Расчеты по уравнению Пуазейля показывают, что проводимость одного зрелого сосуда поздней метаксилемы с диаметром 100 мкм эквивалентна 357 сосудам ранней метаксилемы с диаметром 23 мкм. Созревание поздней метаксилемы имеет большое значение для зрелой части основного корня, который собирает воду, поступающую из многочисленных боковых корней, и транспортирует ее в стебель.
ДВИЖЕНИЕ ВОДЫ В КОРНЕ *
Движение воды в радиальном направлении из почвенного раствора в проводящие элементы ксилемы осуществляется как непосредственно через клетки, так и по апопласту тканей корня (рис. 5.8). Напомним, что под термином апопласт у растений понимают единую систему клеточных стенок и межклеточных полостей. Транспорт воды через клетки получил название движение
воды от клетки к клетке («cell to cell»). В этом случае, преодолевая последовательно расположенные в радиальном направлении ткани корня, вода при движении от клетки к клетке может пересекать мембраны или идти по непрерывному цитоплазматическому пути через соединяющие соседние клетки плазмодесмы. Единая система, объединяющая с помощью плазмодесм протопласты растительных клеток, называется симпластом. В соответствии с этим путь движения воды от клетки к клетке подразделяется на трансмембранный и симпластный (рис. 5.8). При трансмембранном движении вода в пределах одной клетки дважды пересекает плазмалемму и клеточную стенку, а если заходит в вакуоль, то дважды пересекает и тонопласт. В трансмембранном движении воды важную роль играют образованные аквапоринами водные каналы, которые характеризуются высокой водопроницаемостью (см. подразд. 5.6). Таким образом, движение воды от клеток эпидермиса к сосудам ксилемы может осуществляться по трем параллельным направлениям: 1) через клеточные мембраны (трансмембранный путь); 2) по цитоплазме и плазмодес- мам (симпластный путь); 3) по клеточным стенкам и межклетникам (апоп- ластный путь). Эти три пути движения воды не автономны: вода может перемещаться по комбинированным траек-
Рис. 5.8. Направления водного тока в растительных тканях (по Е. Steudle and С. A. Peterson, 1998)Рис. 5.8. Направления водного тока в растительных тканях (по Е. Steudle and С. A. Peterson, 1998)ториям, например пройти некоторый путь по апопласту, затем пересечь ИМ иториям, например пройти некоторый путь по апопласту, затем пересечь ИМ идалее передвигаться от клетки к клетке по симпласту.
Рис. 5.8. Направления водного тока в растительных тканях (по Е. Steudle and С. A. Peterson, 1998)
Рис. 5.8. Направления водного тока в растительных тканях (по Е. Steudle and С. A. Peterson, 1998)
ториям, например пройти некоторый путь по апопласту, затем пересечь ИМ и
ториям, например пройти некоторый путь по апопласту, затем пересечь ИМ и
В настоящее время отсутствуют экспериментальные подходы, которые позволили бы количественно оценить трансмембранный и симпластный потоки воды в корне. Тем не менее имеющиеся данные уже сейчас позволяют предположить, что при движении воды от клетки к клетке трансмембранные потоки значительно превосходят симпластные. Из-за отсутствия возможности различать транспорт воды через мембраны и по симпласту, как правило, используют упрощенную транспортную модель, в которой рассматривают два параллельных пути — путь от клетки к клетке, включающий потоки трансмембранного и симпластного путей, и апопластный путь. Оба потока существуют в растении одновременно. Вклад того или иного пути в суммарный поток воды определяется многими факторами, такими, например, как вид растения, его
возраст, условия выращивания, действие неблагоприятных факторов среды и т.д. Однако главным фактором, определяющим относительный вклад клеточного и апопластного путей в общий поток воды в корне, является интенсивность транспирации.
При апопластном транспорте от поверхности клеток корня до просвета в элементах ксилемы и далее в восходящем направлении в побеги вода ни разу не пересекает мембраны, а сам апопласт не обладает свойством полупроницаемости. Все это означает, что осмотические явления не вовлечены в формирование движущих сил апопластного транспорта воды. В этой связи ток воды через апопласт имеет гидравлическое происхождение, так как движущей силой для него служит преимущественно градиент гидростатического давления, и ток воды по апопластному пути также называют гидравлическим. Основным процессом, приводящим к формированию kP, при апопластном (гидравлическом) транспорте является транспирация, что и определяет ее влияние на соотношение потоков воды через клетки и апопласт. При отсутствии водного дефицита в дневное время, когда устьица открыты и интенсивность транспирации высока, поток воды через апопласт в значительной степени превышает поток через клетки. При низкой интенсивности транспирации преобладающим становится движение воды от клетки к клетке.
При движении воды от клетки к клетке, когда вода на своем пути пересекает мембраны, явления осмоса играют определяющую роль. Ток воды в этом случае называют осмотическим, хотя градиент водного потенциала для него включает не только осмотическую, но и гидравлическую составляющую. Градиент водного потенциала между двумя клетками описывается уравнением
АТ = &Р - оАл, (5.16)
где АР, Ал — разности тургорного и осмотического давления между двумя клетками соответственно; о — коэффициент отражения мембран. С учетом того, что о для мембран стремится к единице, выражение для АТ принимает вид
АТ = АР - Ал.
Следует обратить внимание на то, что при апопластном транспорте воды и транспорте воды через клетки генерация АР обусловлена в целом разными процессами. Как обсуждалось выше, апопластный транспорт связан в основном с градиентом гидростатического давления, создаваемым натяжением жидкости в проводящих элементах ксилемы. Основной вклад в АР при транспорте воды через клетки вносит градиент тургорного давления, развивающегося в клетках корня.
В условиях пониженной транспирации поток воды через клетки преобладает над ее потоком через апопласт. Поскольку клеточные мембраны высокопроницаемы для воды, градиент водного потенциала между клетками и апопла- стом быстро уравновешивается, создавая локальные равновесия между двумя указанными потоками.
Так как для апопласта коэффициент отражения стремится к нулю, а для мембран — близок к единице, коэффициент отражения целого корня составляет некоторую промежуточную величину. Если вышеприведенное уравнение (5.16) использовать для целого корня, в котором вода движется как по апо- пласту, так и через клетки, то оно примет вид
где ДЧ7, ДР, Дл — градиенты соответственно водного потенциала, гидростатического давления и осмотического давления между почвой и ксилемным соком в корне; ок — коэффициент отражения корня. Величина окДл в приведенном уравнении выражает эффективную составляющую осмотического градиента водного потенциала при движении воды через целый корень. Экспериментальное определение коэффициента отражения показывает, что для целого корня эта величина изменяется в пределах 0,2 —0,8.
Поддержание необходимых концентраций осмотически активных частиц в клетках и формирование ДР и Дл в радиальном направлении корня, вызывающее движение воды от клетки к клетке и далее к проводящим элементам ксилемы, осуществляется за счет (7) поглощения ионов клетками корней из почвы и (2) биосинтеза в цитоплазме клеток низкомолекулярных органических соединений, которые получили название осмолитов (см. подразд. 8.2.2). К основным функциям осмолитов относятся поддержание осмотического равновесия между внутриклеточными компартментами и осморегуляция клеток при водном дефиците (см. подразд. 8.2.2).
Поглощение ионов из почвы и биосинтез осмолитов в клетках корня могут обеспечить движение воды от клетки к клетке в радиальном направлении в отсутствие транспирации или при ее очень низкой интенсивности, т.е. когда гидравлический поток по апопласту мал. В этом случае движение воды к элементам ксилемы обусловлено процессами, протекающими преимущественно в клетках корня. Силы, под действием которых вода перемещается из почвенного раствора в сосуды ксилемы корня в отсутствие транспирации, называют корневым давлением, а механизм, который его осуществляет, — нижним концевым двигателем транспорта воды.
Корневое давление можно наблюдать при удалении надземной части растений. Истечение из перерезанных сосудов ксилемы сока, получившего название пасоки, является результатом транспорта воды из почвы в ксилему, который осуществляется без участия надземных органов и, следовательно, транспирации. Корневое давление проявляется в весеннем движении сока у березы и клена, когда листья на растениях еще не сформировались, т.е. транспирация практически отсутствует. Упоминавшийся выше процесс гуттации, наблюдаемый при закрытых устьицах, также возникает вследствие корневого давления. Считается, что корневое давление создается за счет транспорта воды по градиенту водного потенциала. При этом предполагается наличие такого процесса, как загрузка ионами или другими веществами ксилемы корня, — процесса приводящего к повышению осмотического давления ксилемного сока (понижению его водного потенциала) и формированию ДЧ7, направленного из почвы в ксилему.
Вода, двигаясь в радиальном направлении корня к проводящим элементам ксилемы, проходит через разные последовательно расположенные ткани: эпидермис, кору, эндодерму, перицикл, стелярную паренхиму и стенки сосудов (рис. 5.9). Поэтому ток воды в радиальном направлении корня можно рассматривать как движение воды в гидравлической цепи через разные по величине и последовательно расположенные гидравлические сопротивления. Рассмотрим путь воды в радиальном направлении по апопласту корня с учетом гидравлической проводимости разных типов тканей и начнем со стенок сосудов.
Среда
Эндодерма Эпидермис+ 1 кора
Центральный цилиндр
Зрелыйсосудксилемы
Эндодерма Эпидермис+, кора
Среда
Низкаяосмолярность
Высокаяосмолярность
Низкаяосмолярность
Пояски Каспари
Протоплазма
)ОИОООООООООООО гюоооооооооооооо. ооооооооооооооооо/ ^оооооооооооооооооо/ Хоооооооооооооооооосу
ХроооооооооооооооооосуХоооооооооооооооооооо/
ХроооооооооооооооооосуХоооооооооооооооооооо/Хоооооооооооооооод/ХООООООООООООО/Х^ооооооооо/
\_оо
Рис. 5.9. Транспортная модель корня (пояснение в тексте)(по Е. Steudle and С. A. Peterson, 1998)
Вода, чтобы попасть в просвет сосудов, должна пройти через их стенки. Полагают, что основной ток воды идет через окаймленные поры, а не через утолщенные и лигнифицированные части стенок. В корнях кукурузы такие поры имеют диаметр 2 мкм и занимают до 14 % от общей площади поверхности сосудов ранней метаксилемы. Вклад стенок сосудов в общее сопротивление транспорту воды в корне кукурузы оценен экспериментально. Показано, что стенки сосудов отвечают не более чем за 10 —30 % общего сопротивления движению воды в радиальном направлении. У других видов растений эта величина может быть еще меньше.
Апопласт эндодермы корня включает пояски Каспари (рис. 5.9). Последние представляют собой отложения лигнина, а в некоторых случаях и суберина. До недавнего времени полагали, что движение воды по апопласту в радиальном направлении корня прерывается на уровне эндодермы, так как пояски Каспари представляют для нее непреодолимую преграду. В соответствии с этой точкой зрения вода и растворенные в ней вещества, достигнув по апопласту эндодермы, должны перейти в симпласт, чтобы продолжить свое движение в радиальном направлении корня. Если основной ток воды осуществляется по апопласту, а пояски Каспари — главный барьер на пути ее движения, то повреж-
дение эндодермы должно значительно увеличить гидравлическую проводимость корня. Было, однако, показано, что в молодых зонах корня кукурузы гидравлическая проводимость заметно не увеличивается при повреждении эндодермы. Результаты этих опытов привели к заключению, что эндодерма с ее поясками Каспари не может быть главным препятствием на пути движения воды к сосудам ксилемы.
Сделанный вывод был подтвержден биохимическими исследованиями, которые показали, что основным химическим компонентом поясков Каспари является не суберин, как полагали ранее, а лигнин. Поскольку в отличие от суберина лигнин — гидрофильное соединение, содержащие его структуры не могут быть препятствием на пути движения воды. Если пояски Каспари содержат не только лигнин, но и суберин, который встречается в КС корня у многих видов растений, то гидравлическая проводимость может заметно снизиться. Таким образом, по крайней мере, у молодых корней стенки проводящих элементов ксилемы и эндодерма без субериновых отложений не создают существенного препятствия на пути водного тока. Следует подчеркнуть, что при относительно низком сопротивлении апопласта эндодермы водному току апоп- ласт является препятствием для движения ионов. При всех условиях транспорт ионов по апопласту корня прерывается на уровне эндодермы, и они переходят в симпласт, чтобы продолжить свое движение в радиальном направлении к сосудам ксилемы.
В экспериментах на молодых корнях кукурузы было показано, что повреждение эндодермы приводит к резкому падению корневого давления, которое свидетельствует о выходе ксилемного раствора через повреждение из компарт- мента с высоким осмотическим давлением (центральный цилиндр) в компарт- мент с низким давлением (внешняя среда). Эти результаты подтвердили давно предполагавшуюся роль эндодермы как барьера для обратной диффузии ионов из центрального цилиндра в апопласт тканей коры. Эндодерма удерживает ионы в центральном цилиндре, обеспечивая, с одной стороны, высокую эффективность снабжения надземных органов элементами минерального питания, а с другой — формирование корневого давления. Таким образом, транспортные свойства корня оптимизированы как для воды, так и для ионов. Поглощенные корнем ионы удерживаются в центральном цилиндре, в то время как низкое гидравлическое сопротивление эндодермы позволяет в достаточной мере обеспечивать водой надземные органы.
Движение воды от поверхности корня к эндодерме лежит через клетки эпидермиса и коры. Исследование гидравлической проводимости этих тканей показало, что в корне главное сопротивление водному току оказывают ткани коры. Удаление некоторой части коры уменьшает его приблизительно пропорционально числу удаленных слоев этой ткани.
Выше, при рассмотрении тканей, через которые вода движется от периферии корня к центру, основное внимание было сфокусировано на апопластном пути. Однако путь от клетки к клетке играет не менее важную роль в транспорте воды к проводящим элементам ксилемы. У всех растений такой путь воды от клетки к клетке доминирует в отсутствие градиента гидростатического давления, создаваемого транспирацией. У некоторых видов, например у гороха (Pisum sativum) и ячменя (Hordeum vulgare), путь от клетки к клетке преобладает при всех условиях.
ДВИЖЕНИЕ ВОДЫ ИЗ ПОЧВЫ В КОРЕНЬ
Условием поглощения воды растением является более высокий водный потенциал почвы (Ч7ПО4), чем водный потенциал корня. Почва — это многофазная система, состоящая из четырех главных компонентов: (7) твердых минеральных частиц; (2) образующих коллоиды сложных органических соединений, получивших название гумуса; (5) почвенного раствора; (4) смеси газов, близкой по составу воздуху. Первые две составляющие образуют почвенный скелет и формируют пористую структуру почвы, два других заполняют пустоты, или поры, внутри этого скелета.
Величина водного потенциала почвы определяется выражением: Ч71104 = Р - - л1104 - тПО4, где Р, л1104, тПО4 — гидростатическое, осмотическое и матричное давление в почве соответственно. Давление (Р) оказывает заметное влияние на Ч7™4 только ПрИ глубоком залегании почвенных горизонтов; лПО4 отражает влияние на Ч7™4 осмотических сил. Этот компонент водного потенциала определяется, в основном, набуханием коллоидных частиц и в меньшей степени — концентрацией осмотически активных частиц в почвенном растворе; т"°4 отражает влияние поверхностных явлений в капиллярах почвы на границах раздела фаз вода—твердое тело —газ. Значение Ч7™4, равное 0, — это максимально возможное значение водного потенциала почвы. Все указанные взаимодействия воды с почвенной структурой приводят к снижению ее водного потенциала, поэтому даже в насыщенной водой почве его величина имеет отрицательное значение.
Величина Ч7™4 сильно варьирует в зависимости от окружающих условий и типа почвы. В насыщенной водой почве водный потенциал может составлять всего -0,01 МПа, тогда как устойчивое завядание растений часто происходит, когда Ч7™4 падает ниже -1,5 МПа. Можно считать, что мезофиты хорошо обеспечены водой, если Ч7™4 не опускается ниже -0,5 МПа. В природных условиях, а также при выращивании культурных растений без полива в средней климатической зоне Ч7™4 колеблется в диапазоне от -0,5 до -1,2 МПа. В этих условиях вода остается доступной для растений без заметного снижения скорости ее поглощения и подавления роста. При более низких значениях водного потенциала почвы наблюдаются, как правило, снижение скорости поглощения воды растением и подавление роста.
РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСПОРТА ВОДЫ В ЦЕЛОМ РАСТЕНИИ
Регуляция водного режима растений осуществляется комплексом взаимосвязанных внешних и внутренних факторов. Внешние факторы, контролирующие водные потоки, включают влажность воздуха, содержание в почве воды, химический состав и структуру почвы, температуру, освещенность, скорость ветра и др. Неблагоприятные условия внешней среды, такие как, например, водный дефицит, почвенное засоление, низкие температуры, некоторые патогены и недостаток элементов минерального питания, могут существенным образом повлиять на транспорт воды и снизить оводненность клеток и тканей в растении. К внутренним факторам относят эффективность работы ион-транс- портных систем и систем биосинтеза осмолитов, водный потенциал клеток, тканей и органов, функционирование устьичного аппарата, гормональный статус растения и др. Водные потоки зависят как от градиента водного потен-
циала, так и величины гидравлической проводимости тканей (клеток). В соответствии с этим различные факторы, контролирующие водные потоки в растении (внешние и внутренние), изменяют либо градиент водного потенциала, либо гидравлическую проводимость, либо оба параметра вместе.
В условиях достаточного увлажнения почвы и при отсутствии неблагоприятных внешних воздействий важную роль в регуляции водного тока в растении играет интенсивность транспирации и, следовательно, работа устьичного аппарата. Поток воды в растении многократно усиливается в условиях интенсивной транспирации, т. е. при открытых устьицах. При интенсивной транспирации растет натяжение воды в ксилеме и увеличивается градиент водного потенциала за счет его гидростатической составляющей. Натяжение жидкости в ксилеме «включает» гидравлический апопластный транспорт в дополнение к осмотическому (от клетки к клетке). Следует отметить, что при возрастании интенсивности транспирации увеличивается гидравлическая проводимость корня. При малой интенсивности транспирации она низкая. Это препятствует избыточной потере воды клетками корня при возможном в этих условиях обращении градиента водного потенциала между почвой и корнем. Регуляция водного тока в растении посредством изменения натяжения жидкости в ксилеме считается «грубой» регуляцией в отличие от «тонкой» регуляции, которая обеспечивается изменением активности водных каналов. Она ярче выражена и более эффективна, если имеются апопластные барьеры, другими словами, если происходит суберинизация клеточных стенок и движение воды через апопласт ограничено. Такого рода барьеры часто развиваются в апопласте растений, произрастающих при неблагоприятных условиях. Полагают, что образование барьеров в апопласте корня на пути движения воды представляет собой фундаментальную адаптивную стратегию растений при действии неблагоприятных факторов окружающей среды. Преимущественное в этих условиях движение воды по клеткам, а не через апопласт, позволяет осуществлять метаболический контроль водных потоков более эффективно.
Важная роль в регуляции водного режима растений принадлежит абсцизовой кислоте (АБК) — гормону, синтез которого стимулируется водным дефицитом (см. гл. 7). АБК синтезируется в цитоплазме всех клеток корня, но больше всего ее образуется в невакуолизированных клетках кончика этого органа. АБК распределяется между апопластом и симпластом в соответствии с разностью pH между ними. Увеличение pH в апопласте корня до слабощелочных значений происходит при водном дефиците за счет снижения активности Н-АТФазы ПМ. При защелачивании апопласта в нем повышается содержание АБК и стимулируется перенос АБК с транспирационным током к листьям. При возрастающей концентрации АБК в листьях закрываются устьица (см. гл. 6). Закрытые в условиях водного дефицита устьица сокращают потери воды растением. При сниженной интенсивности транспирации или в ее отсутствие повышение концентрации АБК в клетках корня приводит к увеличению активности водных каналов и усилению водопоглотительной способности корней растений за счет активирования водного пути от клетки к клетке. АБК вовлечена также в пути передачи сигналов, активируемых водным дефицитом и приводящих к включению биосинтеза защитных белков. К числу последних относятся ферменты, катализирующие биосинтез осмолитов — веществ, включенных в регуляцию осмотического и тургорного давления клеток.
ГЛАВА 6
МИНЕРАЛЬНОЕ ПИТАНИЕ
В главе рассматриваются структура и рост корневой системы в связи с поступлением и перемещением в надземные органы элементов питания. Изложены современные данные о системах транспорта и механизмах, обеспечивающих перемещение ионов через мембраны клеток и на дальние расстояния в тканях и между органами. В разделах, посвященных роли элементов минерального питания, описаны особенности их транспортных систем, формы, в виде которых они присутствуют в тканях, механизмы ассимиляции и образования комплексов с органическими молекулами. Рассмотрены функции элементов в процессах жизнедеятельности и особенности их накопления, компартмента- ции и распределения в клетке, тканях и между органами.
ЗНАЧЕНИЕ РАСТЕНИЙ В ЦИРКУЛЯЦИИМИНЕРАЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ В БИОСФЕРЕ.
ОСОБЕННОСТИ МИНЕРАЛЬНОГО ПИТАНИЯ РАСТЕНИЙ
Автотрофность — свойство целостного растительного организма, которое определяется не только способностью синтезировать органическое вещество из углекислого газа и воды, используя энергию Солнца, но также способностью растений (в отличие от животных) извлекать и метаболизировать минеральные элементы почвенной или водной среды. Растения как первичные продуценты служат для животных и человека источником не только углеводов, но и минеральных элементов, поступающих в гетеротрофные организмы в составе органических молекул и комплексов, а также в виде ионов в сбалансированных концентрациях. После гибели организмов и разложения их остатков минеральные элементы вновь могут использоваться растениями. Растения и микроорганизмы — центральное звено, обеспечивающее циркуляцию в биосфере элементов минерального питания, необходимых для жизнеобеспечения всех организмов планеты. Каждый из элементов минерального питания подвергается круговороту, но биогеохимические циклы отдельных элементов включают разные компартменты биосферы, разные пулы соединений и характеризуются разными скоростями превращений.
Цикл азота (рис. 6.1) затрагивает воздущную зону и литосферу и включает все формы этого элемента от газообразных до ионных с областью валентности от +5 (NO3) до -3 (NH3). Для растений доступны две формы азота — нитратная и аммонийная. Значительная часть азота Земли (4 ■ 1015 т) находится в воздухе в
Рис. 6.1. Упрощенная схема цикла азота в биосфере.
Цифры указывают последовательность превращений азота: 1 — биологическая и химическая фиксация; 2 — нитрификация; 3 — поглощение и ассимиляция азота аммония и нитрата; 4 — использование растений животными и отмирание организмов; 5 — разложение остатков, минерализация азота; б — денитрификация
виде N2. В литосфере предполагаемые запасы азота составляют 18 ■ 1015 т, но большая часть находится в недоступной для растений форме (органические остатки, гуминовые и фульвокислоты, гумин). Минерализация органических остатков — стадия, лимитирующая пополнение запасов минерального азота почвы. Поглощаемые растениями нитрат и аммоний составляют только 0,2 — 5 % от общего азота почвы. Круговорот серы подобно азоту включает превращение соединений, где сера находится в самой высокой степени окисленности +6, как у сульфата (SO4 ), через самородную серу S с нулевой валентностью до восстановленного состояния с валентностью -2 у сероводорода (H2S). В биосферной циркуляции серы, как и азота, участвуют газообразные соединения — H2S, а также оксиды серы (SO2, SO3).
Круговороты других элементов (Р, К, Mg, Са и т.д.) не затрагивают атмосферу и осуществляются в системе литосфера—организмы, но и в этом случае почвенные микроорганизмы, грибы и растения являются компонентами, с помощью которых циклы запускаются и функционируют. Для цикла фосфора (рис. 6.2) характерно, что при всех превращениях и в разных компартментах (биологические объекты или среда) он остается в окисленной форме. В почвенном растворе концентрация Р чрезвычайно низкая, и значительные его количества присутствуют в литосфере в виде труднорастворимых минералов. В масштабе Земли наблюдаются очень медленное вымывание Р с суши в водную среду морей и океанов и осаждение на дне в форме труднорастворимых минералов.
Наука о минеральном питании растений как самостоятельное направление зародилась во второй половине XIX—начале XX в. Тогда решались две основные проблемы: I) какие элементы минерального питания необходимы для растений; 2) каким способом эти элементы попадают в растительный организм. В первой половине XX в. начала разрабатываться третья кардинальная проблема — как происходит ассимиляция поглощенных элементов минерального питания и каковы их функции в процессах обмена.
Окончательное становление науки о минеральном питании связано с разработкой вегетационного метода, который стал основным в физиологии растений. Искусственные питательные смеси (чаще водные растворы солей), разработанные немецким физиологом В.Кнопом (1817—1900), стали инструментом для изучения потребности растений в минеральных элементах, их накоп-
Рис. 6.2. Упрощенная схема основных потоков неорганического (Фн) и органического (Форг) фосфора в системе почва —растения—животные —почвенные организмы, обеспечивающих доступность фосфора растениям (по Stewart, Me Kercher, 1982, модификация)
лении и функциях в тканях и клетках. Хотя в растениях можно обнаружить почти все элементы таблицы Менделеева, к началу XX в. было выяснено, что им необходимы 7 элементов: N, Р, S, К, Са, Mg и Fe. Далее была установлена потребность растений еще в 5 элементах — Си, Мп, Mo, Zn и В. На основе количественной потребности и содержания в растении минеральные элементы были разделены на макроэлементы и микроэлементы. Дополнительно была выделена группа «полезных» элементов, куда были отнесены Na, Cl, Si, Со. Для некоторых видов растений эти элементы необходимы в больших количествах (Na и С1 для галофитов, Si — для хвощей). Кроме того, натрий, хлор и кобальт (для бобовых) необходимы в качестве микроэлементов. Критерии необходимости, введенные Арноном и Стоутом (1937), предполагают, что элемент должен быть включен в процессы обмена и при его отсутствии в среде растение не может пройти весь цикл развития.
Особенность минерального обмена растений — накопление элементов в тканях в концентрациях значительно более высоких, чем во внешней среде. Для калия и фосфора характерно наибольшее концентрирование. Вместе с тем растение может накапливать и ненужные ему вещества. Например, концентрация кадмия в тканях культурных растений в 2—16 раз выше, чем в почве (рис. 6.3).
Другая характерная черта минерального питания — специфичность в потребности, накоплении и распределении по органам отдельных элементов у разных растений. Это касается и токсических элементов (рис. 6.3): репа (Brassica гара) накапливает кадмий в 4 раза больше, чем морковь (Daucus sativus), но в корнеплоде (съедобной части) репы его концентрация вдвое ниже, чем в корнеплоде моркови. Специфичность в накоплении элементов, в том числе токсичных для человека и животных (тяжелых металлов, нитрата и др.), учитывается при оценке качества сельскохозяйственной продукции. В то же время способность растений извлекать и накапливать ионы-загрязнители может быть
полезна. В настоящее время некоторые виды растений используются в такой технологии очистки окружающей среды, как фиторемедиация.
Способность растений накапливать и поддерживать высокую концентрацию минеральных элементов в тканях должна обеспечиваться соответствующими механизмами. Вплоть до 40-х гг. XX в. господствовала обоснованная В. Пфеффе- ром (1845—1920) диффузионно-осмотическая теория поступления ионов из среды. Развитие теории переносчиков (см. подразд. 6.2.2.2, Е. Epstein et al., 1966) и хемиосмотической теории Митчела (см. гл. 2) позволило обосновать новые, принятые теперь механизмы транспорта веществ. В настоящее время наука о минеральном питании растений имеет три генеральных комплексных направления: 1) исследование поступления ионов из среды в интактное растение и их включение в обмен веществ, транспорт ионов в клетке, тканях и между органами; 2) изучение функций элементов и их ассимиляции; 3) выяснение систем регуляции минерального питания и взаимодействия органов.
Элементы, которые названы минеральными, составляют в сумме всего около 4% от массы сухого вещества растения (S — 0,1; Р — 0,2; Mg — 0,2; Са — 0,5; К — 1; N — 1,5 %), на органогенные элементы углерод, кислород и водород приходится 45, 45 и 6 %, соответственно. Но благодаря минеральным элементам молекула хлорофилла улавливает свет, работают электрон-транспортные цепи фотосинтеза и дыхания, синтезируются такие классы соединений, как белки, нуклеиновые кислоты, высокоэнергетические биомолекулы и др. В конечном итоге такое количественно небольшое включение элементов в состав клеток является неотъемлемой частью того, что называется жизнедеятельностью.
ПОГЛОЩЕНИЕ ЭЛЕМЕНТОВ МИНЕРАЛЬНОГО ПИТАНИЯ
КОРЕНЬ — ОРГАН ПОГЛОЩЕНИЯ МИНЕРАЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ
Источником практически всех элементов (кроме углерода и частично азота, поступающих из воздуха), необходимых для жизнедеятельности наземных растений, является почва. Из почвы минеральные элементы и вода поглощаются высокоспециализированным органом — корневой системой растения. Помимо
поглощения корни выполняют и другие важнейшие функции: снабжение надземных частей элементами минерального питания, синтез ряда специфических веществ (алкалоиды и фитогормоны); усвоение азота и синтез транспортных форм органического азота; синтез и выделение некоторых веществ, необходимых для взаимодействия с другими организмами (фитоалексины) или видоизменения свойств окружающей среды (органические кислоты, фитосидерофоры, кислые фосфатазы); накопление и запасание веществ; наконец, закрепление растения в почве, определяющее неподвижный образ жизни.
Рост корня как основа добывания веществ из почвы
Строение и распространение корней в почве — важный фактор, обеспечивающий поглощение веществ. Типы корневых систем различны у однодольных и двудольных, у древесных и травянистых, у наземных и водных растений. Но практически у всех видов растений суши надземная часть превосходит корневую систему по массе вдвое и более раз, тогда как поверхность корней неизмеримо (в 50—150 раз) больше, чем поверхность надземных органов.
Рост в длину и новообразование дополнительных корней (придаточных и/ или боковых разного порядка в зависимости от вида) обеспечивают, помимо закрепления растения в почве, возможность эффективно использовать запасы минеральных элементов. Например, при истощении верхнего слоя и зоны почвы вокруг оси растения, растущие корни добывают из более глубоких слоев и отдаленных участков почвы все большее
Рис. 6.4. Соотношение массы сухого вещества корней и побегов и морфологические изменения у 21-дневных растений пшеницы (водная культура) в зависимости от условий азотного питания (Е. И. Каширина, Н.Д.Алехина, 2000)Рис. 6.4. Соотношение массы сухого вещества корней и побегов и морфологические изменения у 21-дневных растений пшеницы (водная культура) в зависимости от условий азотного питания (Е. И. Каширина, Н.Д.Алехина, 2000)количество элементов.
Рис. 6.4. Соотношение массы сухого вещества корней и побегов и морфологические изменения у 21-дневных растений пшеницы (водная культура) в зависимости от условий азотного питания (Е. И. Каширина, Н.Д.Алехина, 2000)
Рис. 6.4. Соотношение массы сухого вещества корней и побегов и морфологические изменения у 21-дневных растений пшеницы (водная культура) в зависимости от условий азотного питания (Е. И. Каширина, Н.Д.Алехина, 2000)
Доступность элементов минерального питания — важное условие роста корней и растения в целом. У пшеницы (Triticum aestivum), росшей при нитратном и аммонийном питании или дефиците азота, меняется масса (интегральный показатель роста) корней и их морфология (рис. 6.4). На нитратном фоне активно образуются придаточные корни с большим числом боковых, а при аммонийном питании формируются короткие и визуально утолщенные придаточные корни с небольшим числом боковых. Дефицит питания приводит к образованию длинных, относительно тонких придаточных корней с незначительным числом боковых, но тоже длинных корней. При этом у голодающих по азоту растений увеличивается как абсолютная, так и относительная масса корней.
У ячменя (Hordeum vulgaris), росшего при дефиците азота, в ответ на локальное увеличение концентрации нитрата в среде (1 мМ) корни реагируют образованием большого числа боковых корней и
Рис. 6.5. Рост боковых корней у растений ячменя, индуцированный высокой локальной концентрацией нитрата ([NO3]) в среде (по Drew et al., 1975).
Основной корень ячменя находился в трехкамерной системе с проточным питательным раствором. Средняя часть корня находилась в камере, где концентрация нитрата была в 100 раз выше, чем в двух других камерах. Такой же эффект условий снабжения NO3 был получен на корнях Arabidopsis (по Zhang, Forde, 1998)
их ветвлением (рис. 6.5). При этом рост основного корня мало зависит от наличия зоны высокой концентрации аниона. У растений, развивающихся при нормальном снабжении азотом, подобных изменений в росте боковых корней не происходит.
Другой тип реакции на дефицит элементов питания в среде — образование так называемых «протеоидных корней». Необычная морфология корней была описана около 100 лет назад для растений семейства Proteaceae. Протеоидным
называют корень, на котором образуются плотные кластеры корешков ограниченного роста (корень выглядит подобно бытовому ершу), покрытых в свою очередь корневыми волосками. В настоящее время появление протеоидных корней обнаружено у растений и других видов при дефиците элементов минерального питания в среде, особенно фосфора и железа. Увеличение поверхности контакта с почвенными частицами при образовании протеоидных корней также является стратегией максимального извлечения фосфора и железа, которые находятся в почве в составе малорастворимых соединений. Экстраполируя ситуацию на рост корней в почве (в естественных условиях), можно сделать вывод,
что корневые системы адаптированы «проводить разведку» в пространстве на бедных почвах (длинные, распространяющиеся на большие расстояния корни) и «эксплуатировать» встречающиеся участки с высокой концентрацией элементов (образование большого числа боковых корней). Длительный рост корней практически на протяжении всего периода до старения и гибели и изменение их морфологии необходимы для выполнения функции поглощения.
Структурно-функциональные особенности корняи поглощение веществ
Поглощающая апикальная часть каждого отдельного корня обычно не превышает нескольких сантиметров, хотя общая длина корня может достигать очень больших значений. Растущая часть состоит из клеток разных типов, которые формируют так называемые зоны роста. Самый кончик представлен тканью из делящихся клеток меристемы, которая покрыта корневым чехликом, выделяющим полисахаридную слизь (рис. 6.6). За меристемой следует зона растяжения, в которой клетки достигают своей окончательной длины, удлиняясь
Рис. 6.6. Схема распределения зон роста (Л — поверхность; Б — продольный срез) и последовательность дифференцировки тканей в кончике корня:
КЧ — корневой чехлик; Мр — зона меристемы; РК и ПД — зона растяжения клеток и первичной дифференциации корня; КВ — зона корневых волосков и первичной эндодермы; ОКВ — зона отмирания КВ и образования вторичной эндодермы; ФЛК — зона формирования латеральных корней, образования гиподермы и третичной эндодермы; 7 — перицикл; 2 — незрелые элементы флоэмы; 3 — зрелые элементы флоэмы; 4 — эндодерма без поясков Каспари; 5 — незрелые элементы ксилемы; 6 — ризодерма; 7 — первичная кора; 8 — эндодерма с поясками Каспари; 9 — зрелые элементы ксилемы; 10 — корневые волоски; 11 — центральный цилиндр
за несколько часов в 10—20 раз. Следующий участок корня — зона дифференцировки, или корневых волосков. Часть эпидермальных клеток этой зоны (трихо- бласты) образуют корневые волоски, которые многократно увеличивают корневую поверхность. Выше начинается образование боковых корней и отмирание эпидермальных клеток, происходит образование гиподермиса, его лигнифика- ция и суберинизация. Незрелые элементы флоэмы (протофлоэма) (рис. 6.6, £) формируются уже в зоне меристемы, а в начале зоны растяжения флоэмные сосуды сформированы и активно участвуют в обеспечении клеток зон растяжения и меристемы необходимыми веществами. Клетки эндодермы, но еще без поясков Каспари, также появляются в меристематической зоне. Ксилема формируется только в конце зоны растяжения — в начале зоны корневых волосков (рис. 6.6, Б), хотя протоксилемные элементы присутствуют уже в зоне растяжения. Структура корня на поперечном срезе в зоне корневых волосков представлена на рис. 6.7. Кора в этой зоне состоит из эпидермиса, нескольких слоев паренхимных клеток и заканчивается эндодермой, образованной одним слоем клеток, у которых радиальные и орбитальные стенки лигнифицированы и суберенизированы, образуя пояски Каспари. Такая структура непроницаема для воды и растворенных веществ, вследствие чего апопласт стели (центрального цилиндра) изолируется от апопласта коры и их взаимодействие возможно только через симпласт. Стель — «система коммуникаций», включающая проводящие ткани флоэмы (нисходящий ток), ксилемы (восходящий ток) и окружающие их клетки паренхимы.
Зоны корня различаются не только структурно. Они неравнозначны также по своей метаболической и функциональной активности, в частности в отношении поглощающей и проводящей функций. Разная роль зон корня в поглощении ионов была обоснована Д. А. Сабининым и его учениками О. М.Тру- бецковой, Н. Г. Потаповым — сотрудниками кафедры физиологии растений биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова. В обеспечении растений минеральными элементами особая роль принадлежит зоне корневых волосков, где поверхность взаимодействия корня со средой наибольшая и полно-
Рис. 6.7. Схема структуры корня на поперечном срезе в зоне корневых волосков:1 — корневой волосок; 2 — эпидермис; 3 — кора; 4 — эндодерма; 5 — пояски Каспари; 6 — перицикл; 7 — пропускная клетка; 8 — ксилема; 9 — флоэма, 10 — плазмодесмыРис. 6.7. Схема структуры корня на поперечном срезе в зоне корневых волосков:1 — корневой волосок; 2 — эпидермис; 3 — кора; 4 — эндодерма; 5 — пояски Каспари; 6 — перицикл; 7 — пропускная клетка; 8 — ксилема; 9 — флоэма, 10 — плазмодесмыстью сформированы проводящие структуры. Корневые волоски, увеличивая поверхность корня, позволяют освоить объем почвы, в 10—15 раз превышающий тот, из которого идет поглощение безволосковыми корешками. Частички почвы буквально прилипают к поверхности корня, покрытой корневыми волосками (рис. 6.8). Этому способствует покрывающая эпидермис слизь, которая увеличивает возможность поглощения ионов за счет обменной адсорбции с ионами твердых частиц почвы.
Рис. 6.7. Схема структуры корня на поперечном срезе в зоне корневых волосков:
1 — корневой волосок; 2 — эпидермис; 3 — кора; 4 — эндодерма; 5 — пояски Каспари; 6 — перицикл; 7 — пропускная клетка; 8 — ксилема; 9 — флоэма, 10 — плазмодесмы
Рис. 6.7. Схема структуры корня на поперечном срезе в зоне корневых волосков:
1 — корневой волосок; 2 — эпидермис; 3 — кора; 4 — эндодерма; 5 — пояски Каспари; 6 — перицикл; 7 — пропускная клетка; 8 — ксилема; 9 — флоэма, 10 — плазмодесмы
Основная масса воды поглощается также в зоне корневых волосков. Поэтому кроме фактора увеличения контакта и увеличения осваиваемого объема почвы поступлению ионов в этой зоне способствует «массовый ток», обусловленный поглощением воды и доставляющий растворенные ионы к поверхности корня.
Преимущества в поглощении зоной корневых волосков проявляются главным образом в условиях дефицита питательных элементов (часто это — естественное свойство среды обитания). Так, при наличии корневых волосков у плс-
Рис. 6.8. Корневые волоски и их взаимодействие с почвенными частицами у проростков белой горчицы (/, //, III по Посту, 1914; IV по Schmidt, Schikora, 2001): / — проросток, извлеченный из земли, с чехлом из приставших почвенных частичек в зоне корневых волосков; II — то же после отмывания корешков водой; III — кончик корневого волоска с прилипшими частичками почвы; IV — формирование корневых волосков: а — обычное (нормальное), за счет асимметричного деления клеток эпидермиса; б — при образовании из клеток эпидермиса и субэпидермиса в условиях дефицита Р и Fe
вела (Lolium perenne L.) поглощение калия из среды с низкой концентрацией увеличивается на 50 —70 %, а поглощение фосфора возрастает в 2 — 3 раза. Дефицит фосфата или железа в среде индуцирует изменения в программе дифференциации эпидермальных клеток кончика корня Arabidopsis'. в обоих случаях увеличиваются длина и частота расположения корневых волосков (рис. 6.8, IV). Корневые волоски дополнительно располагаются в местах, которые обычно занимают безволосковые клетки, или образуются даже у лежащих под эпидермисом клеток коры.
Для полноценного обеспечения растения минеральными элементами большое значение имеет не только то, на каком участке корня происходит наибольшее поглощение ионов, но и откуда они наиболее эффективно перемешаются в надземные органы. Так, у кукурузы (Zea mays) наибольшее поглощение 32Р приходится на участок корня на расстоянии 30 см от кончика, но из этой зоны фосфор практически не перемещается. Наибольший отток как в абсолютных величинах, так и относительно поглощенного Р, идет из апикальных участков кончиков корня.
Для разных ионов приуроченность степени поглощения и перемещения к одной зоне корня могут не совпадать в связи с их различными физико-химическими свойствами (коэффициент растворимости соли, степень диссоциации, гидратация иона, его диффузии и т.д.) и функциями в растении. Так, из зоны кончика (12—16 мм) корня проростка кукурузы поглощаемый калий перемещается в нижележащие растягивающиеся клетки и в меньшей степени — вверх по корню. В кончике уже развиты флоэмные элементы, и подвижный ион К+ активно транспортируется к клеткам, где формируются вакуоли и происходит рост растяжением. Из зоны поглощения, расположенной выше (90 мм), К+ поступает как в надземные органы, так и в кончик корня. Малоподвижный кальций плохо транспортируется по флоэме. Он поступает в ксилему и обеспечивает потребности побегов лучше, если поглощается зрелыми участками корня. В апикальную часть 45Са2+ не транслоцировался независимо от места его поступления в корень.
Эффективность поглощения в естественных условиях обеспечивается также благодаря образованию микоризы и развитию микрофлоры в ризосфере. Симбиоз с микоризой — универсальное явление, присущее всем наземным растениям, в том числе сельскохозяйственным. Воздействие микоризы на поступление ионов наиболее четко проявляется в увеличении доступности и скорости поглощения фосфора и железа корнями. Предполагается, что гифы активно выделяют кислые фосфатазы, способствующие высвобождению ионов фосфата из органических остатков и минералов, а также органические кислоты, хелатирующие Ре+3, что делает эти элементы доступными для поглощения симбиотической системой микориза — растение. Но главным образом эффект микоризы связывают с увеличением площади контакта растения с почвой.
В целом, можно заключить, что степень участия разных зон корня в поглощении ионов и снабжении элементами минерального питания других органов или отдельных частей растения значительно варьирует в зависимости от видовой принадлежности растения, типа корневой системы и расположения поглощающей зоны на первичном, придаточном или боковом корне, а также от возраста растения, условий питания, влажности почвы и многих других факторов среды.
ПОСТУПЛЕНИЕ ИОНОВ ИЗ СРЕДЫ В КЛЕТКУИ КОРЕНЬ
Перемещение ионов из среды в корень — комплексный и многоэтапный процесс, который обозначают такими терминами, как поступление, поглощение, транспорт, вход, выход, а также приобретение, захват и добывание, когда описываются возможности корневых систем адаптироваться к условиям ограниченной доступности ионов в среде.
В связи с особенностями строения растительной клетки поступление веществ из среды в корень связано с преодолением двух барьеров: клеточной стенки и плазмалеммы. Наличие клеточной стенки определяет существование двух структурных и функциональных континиумов — апопласта и симпласта, объединяющих все элементы растения. Апопласт включает клеточные стенки с их межмицеллярными и межфибриллярными просветами, межклетники, сосуды ксилемы, а в корне также слизи, покрывающие его поверхность. Сим- пласт состоит из протопластов клеток, соединенных плазмодесмами, его внешней границей служат плазматические мембраны. В силу особенностей растительной клетки он имеет и вторую внутриклеточную границу — тонопласт, отделяющий цитозоль от вакуоли. Транспорт минеральных веществ из среды в растение включает: поступление ионов в апопласт и симпласт, накопление в вакуолях, радиальный транспорт в корне и загрузку ксилемы, дальний транспорт по ксилеме, циркуляцию и перераспределение минеральных элементов по органам и тканям.
Поступление ионов в апопласт
Апопласт корней выполняет многочисленные функции, и важнейшие из них — поглощение воды и минеральных веществ. Питательные вещества не просто проходят через этот компартмент на пути к плазмалемме, но благодаря физико-химическим свойствам этой структуры включаются в создание «внутренней физиологической среды» организма. Минеральные ионы попадают в апопласт корня из почвенного раствора путем диффузии либо в результате конвекционных потоков (массового тока), связанных с перемещением воды по градиенту водного потенциала.
Поступление в апопласт, а точнее в его часть, названную клеточным свободным пространством (СП), структурно представляющим собой систему межмицеллярных и межфибриллярных пор и межклетников, исчисляется минутами. Проводимость клеточной стенки для воды по сравнению с плазмалеммой значительно выше. Коэффициент проницаемости Р свободного пространства для ионов также значительно выше (»10“5—10“4 м • с-1), чем у клеточной мембраны («КГ10— КГ9 м ■ с"1). Высокая проводимость обеспечивается тем, что поры в клеточной стенке имеют диаметр на порядок больше (3—4 нм), чем гидратированные ионы (диаметр К+ — 0,54 нм). Но пропитывание матрикса клеточной стенки суберином или лигнином уменьшает проводимость для воды и ионов до величин, которые соответствуют или даже ниже проницаемости плазмалеммы.
С позиций физической химии СП корня представлено двумя составляющими: «водным свободным пространством» (ВСП) и «доннановским сво-
Рис. 6.9. Поглощение К+ (использован его аналог 86Rb*) и его выход из свободного пространства корней кукурузы (Sutcliffe, Baker, 1974, цит. по Baker, Hall, 1988):
ВСП — водное свободное пространство; ДСП — доннановское свободное пространство; I, II — см. в тексте
бедным пространством» (ДСП) (рис. 6.9). Доннановское СП обусловлено наличием фиксированного отрицательного заряда клеточной стенки, который взаимодействует с поступающими катионами и определяет возникновение доннановского потенциала. Количественная оценка СП, его составляющих, а также поступление в ВСП и ДСП могут быть получены в экспериментах с корнями, когда оценивается динамика поступления (входа) и выхода иона. Кривую поступления, например, 86Rb+ (аналог К+) в корни растения можно разделить на две составляющие (рис. 6.9): I — быстрое начальное поглощение, которое заканчивается в течение »10 мин, II— последующее стационарное поглощение, которое может продолжаться много часов. Быстрое поглощение обратимо, малоизбирательно и практически не зависит от метаболизма (не меняется под действием ингибиторов и в отсутствие О2). Если растение переместить на воду, то большая доля от поглощенного в начальную фазу 86Rb+ будет быстро вымыта из корней. Эта часть составляет «водную обменную фракцию», а поступление иона в корни, равное его выходу, — поступление в ВСП. Из корней, перенесенных затем на раствор КС1, будет выходить 86Rb+, который относится к ионной обменной фракции. В этом случае поступающий К+ замещает 86Rb+, адсорбированный клеточной стенкой, и равная вышедшему 86Rb+ доля К+ соответствует поступлению в ДСП клеточной стенки. Считается, что оставшаяся в корне фракция — ионы, поступившие в симпласт.
Оценив количество К+ (86Rb+), вымытого из корней в воду, и допустив, что концентрация иона во внешнем растворе и в растворе клеточной стенки равны, можно рассчитать объем СП корня. При таком способе расчета не учитывается количество иона, которое находится в адсорбированном состоянии, поэтому полученные величины объема СП завышены. В связи с этим процентные величины объема стали рассматривать как оценку размеров «кажущегося СП» (КСП). Его относительная величина составляет 5 — 7 % (не более 10 %) от общего объема тканей корня. В настоящее время такого рода оценка СП используется редко, и современные исследователи предпочитают для характеристики ВСП и ДСП использовать единицы количества (рис. 6.9) либо концент-
Клеточная стенкаКлеточная стенкакатионыкатионыкатионыкатионыРис. 6.10. Эффективность нейтрализации отрицательного заряда клеточной стенки (КС) моно- и поливалентными катионами (по Haynes, 1980)Рис. 6.10. Эффективность нейтрализации отрицательного заряда клеточной стенки (КС) моно- и поливалентными катионами (по Haynes, 1980)рации иона, а не единицы объема. Считается, что в среднем отношение ВСП : ДСП составляет 4:1.
Клеточная стенка
Клеточная стенка
катионы
катионы
катионы
катионы
Рис. 6.10. Эффективность нейтрализации отрицательного заряда клеточной стенки (КС) моно- и поливалентными катионами (по Haynes, 1980)
Рис. 6.10. Эффективность нейтрализации отрицательного заряда клеточной стенки (КС) моно- и поливалентными катионами (по Haynes, 1980)
Количественные параметры ВСП и ДСП позволяют более точно и правильно оценить функции клеточной стенки и в целом апопласта. Присутствие фиксированных отрицательно заряженных групп в клеточной стенке влияет на поступление ионов в апо- пласт и их накопление. Благодаря заряженным группам стенка обладает катионно-обменной способностью (КОС). При этом 70 — 90% КОС связано с карбоксильными группами галактоуроновых кислот пектина, а вклад дру-
гих полисахаридов матрикса и белков
составляет 10 — 30 %. Аминогруппы белков определяют способность обмена с
анионами; безусловно, она более слабая, чем возможность обмена с катио
нами.
Модель поступления ионов в апопласт корня учитывает существование двойного электрического слоя (рис. 6.10) и описывает клеточную стенку как систему отрицательно заряженных пор, на поверхности которых адсорбируются подвижные катионы и образуется двойной заряженный слой. Распределение поступающих ионов внутри порового пространства зависит от плотности их электрического заряда, размера поры, а также от знака и величины заряда иона. Поливалентные катионы экранируют отрицательный заряд КС более эффективно, чем моновалентные, и насыщение СП двух- и поливалентными катионами способствует сохранению большого свободного просвета в поре для перемещения других ионов.
При диффузии ионов в системе с фиксированным зарядом, подобной КС, возникает градиент электрического потенциала (рис. 6.11). Когда ионы диссоциированной соли «К+А~» перемещаются в водной фазе системы, где имеется фиксированный заряд (X"), катион К^ будет перемещаться в направлении заряда X", нейтрализуя его и оставляя сопутствующий анион AJ. Катион К2 будет диффундировать так, чтобы сбалансировать заряд А], однако в своем движении он будет ограничен А2. В результате происходит разделение зарядов и возникает градиент электрического потенциала £D. Его величина при равновесном распределении может быть рассчитана по уравнению Доннана (рис. 6.11). При доннановском равновесии фаза, содержащая недиффундирующий заряд (в данном случае КС), имеет более высокую концентрацию ионов, чем внешняя фаза (раствор), и будет обладать более высоким осмотическим давлением (или более низким водным потенциалом Ч^о), что важно для поступления воды в апопласт корня.
Модель двойного слоя — большое упрощение комплексной системы СП. В корневом волоске ион от поверхности корня до следующей клетки коры проходит через КС по системе пор диаметром 3—3,5 нм путь длиной в 100000 нм. Сопротивление диффузии в этом пути для одновалентных катионов в 100—1000 раз,
Неуравновешенный ионНеуравновешенный ион
Неуравновешенный ион
Неуравновешенный ион
Рис. 6.11. Возникновение доннановского потенциала (£D) в системе клеточная стен-ка— раствор:
Х[ — фиксированный отрицательный заряд клеточной стенки; К( и К^ — одновалентные катионы; А( и Aj — одновалентные анионы диссоциированной соли. Стрелки указывают на перемещение ионов; большая стрелка отражает возникновение градиента электрического потенциа-
RTла. Еи = —— InFzRTла. Еи = —— InFz"inс.."inс..RT=InFzRT=InFz^out ск,^out ск,, где Л — газовая постоянная; Т — абсолютная температура;, где Л — газовая постоянная; Т — абсолютная температура;F - число Фарадея; г - заряд иона; СК1п(Ая1) и Ск;ш|(А-ш1) -F - число Фарадея; г - заряд иона; СК1п(Ая1) и Ск;ш|(А-ш1) -концентрации ионов А и К+ вконцентрации ионов А и К+ вклеточной стенке (in) и в растворе (out)клеточной стенке (in) и в растворе (out)
RTла. Еи = —— InFz
RTла. Еи = —— InFz
"in
с..
"in
с..
RT=In
Fz
RT=In
Fz
^out ск,
^out ск,
, где Л — газовая постоянная; Т — абсолютная температура;
, где Л — газовая постоянная; Т — абсолютная температура;
F - число Фарадея; г - заряд иона; СК1п(Ая1) и Ск;ш|(А-ш1) -
F - число Фарадея; г - заряд иона; СК1п(Ая1) и Ск;ш|(А-ш1) -
концентрации ионов А и К+ в
концентрации ионов А и К+ в
клеточной стенке (in) и в растворе (out)
клеточной стенке (in) и в растворе (out)
а для одновалентных анионов в 10 раз больше по сравнению с сопротивлением в слое раствора такой же толщины. Поскольку клеточная стенка заряжена отрицательно, перемещение катионов в ней может быть уподоблено движению по хроматографической колонке за счет их ассоциации-диссоциации на обменных местах. Но обычно КОС клеточных стенок корня полностью реализована, и большинство отрицательно заряженных мест занято Са2+. Тогда по аналогии с колонкой поступление новых ионов с одной стороны стенки (из среды) должно приводить к их высвобождению с другой. Однако подобная модель также является упрощением, так как «удаление» ионов из клеточной стенки со стороны, граничащей с протопластом, определяется их транспортом через плазмалемму. Внешняя сторона этой мембраны — не только граница симпла- ста, но и зона отделения от апопласта. И плазмалемма вносит «метаболическую» компоненту в пассивное, в целом, поступление ионов в КС и их перемещение в ней.
Итак, поступление ионов в СП корня и их перемещение в нем происходит с конвекционным потоком вместе с водой, а также с помощью диффузии. При наличии фиксированного заряда ионы концентрируются преимущественно в растворе апопласта коры корня (или только КС эпидермиса при низкой концентрации в среде) по сравнению с раствором. Эти процессы происходят по тем же физико-химическим законам, как и в капиллярах почвы вблизи отрицательно заряженных глинистых минералов или органических веществ. Однако апопласт — это внутренняя «физиологическая среда», подвергающаяся изменениям, связанным с обменом веществ, не только в период формирования клеточных стенок, но и в зрелых тканях (особенно при механических, химических, биологических воздействиях). Как модифицируется этот компартмент в разных физиологических ситуациях и в какой мере поступление, перемещение и накопление ионов в апопласте корня определяют интенсивность и характер поглощения ионов интактным растением, пока неясно.
Механизмы транспорта через мембрану
Поверхностная клеточная мембрана (плазмалемма) — основной барьер для транспорта молекул в клетку и из клетки. Строение и состав мембраны обусловливают ее универсальные свойства: полупроницаемость и асимметричность. Транспорт растворенных веществ через мембрану практически полностью происходит с участием интегральных белков. Кроме того, свойства мембраны обеспечивают возникновение и поддержание электрического мембранного потенциала. Изучение процесса поглощения ионов и понимание того, как вещества переносятся через мембрану, включает две основные проблемы: первая — каковы движущие силы, источники энергии для транспорта; вторая — что из себя представляют сами системы переноса через мембраны, как они действуют и регулируются.
Движущие силы транспорта. Движущая сила переноса ионов на расстояние х — градиент электрохимического потенциала Ар (или d^/dx) (см. гл. 2).
Существует два основных типа транспорта через мембрану: пассивный, при котором растворенное вещество движется по градиенту электрохимического потенциала без использования дополнительной энергии; и активный, сопряженный с тратой энергии (например, АТФ или пирофосфата), которая используется для перемещения ионов против градиента электрохимического потенциала.
Ион пассивно входит в клетку, если pout > pin, где индексы out и in указывают на внешнюю и внутреннюю стороны мембраны соответственно. Когда pin > pou], то ион движется пассивно из клетки. Движение продолжается до установления равновесия, когда pin = pout.
Если в равенство pin = pou( поставить уравнение электрохимического потенциала (E71nC0Ut + zEtpout = 7?71nCin + zE<pin) и преобразовать его, то получим уравнение Нернста:
(„) = £» (6.1)
Cin
где разность потенциалов наружной и внутренней стороны мембраны (<pout - -<pin) представляет потенциал Нернста (ENY При выражении символами уравнение Нернста аналогично уравнению Доннана (рис. 6.11). В уравнении Нернста En предсказывает величину электрического потенциала (мВ), когда его градиент уравновешивает различия в химическом потенциале по обе стороны мембраны. Ионы могут двигаться пассивно в результате действия движущих сил, возникающих из разниц химического потенциала (Ар), обусловленного концентрационной асимметрией, и/или разниц электрического потенциала (-АЕ). В соответствии с принципами термодинамики градиент электрического потенциала энергетически может перекрывать градиент химического и тогда поступление иона внутрь будет идти пассивно, даже если Cin > Cout.
Уравнение Нернста можно использовать как критерий оценки характера транспорта некоторых катионов и анионов. У корней гороха (Pisum sativum), которые поглощали ионы из питательного раствора с известной концентрацией, были измерены мембранный потенциал и концентрация ионов в тканях (табл. 6.1). Подставив значения измеренного АЕи концентрации ионов в среде в уравнение Нернста, можно найти «равновесную» концентрацию ионов в тканях.
Таблица 6.1. Измеренные и предсказанные как равновесные концентрации ионов (мМ • л1) в тканях корней гороха (Р. sativum), имеющих мембранный потенциал -ПО мВ (по Higinbotham et al., 1967)
Катион
Концентрация в растворе (См)
Внутренняя концентрация (С|п)
Анион
Концентрация в растворе (См)
Внутренняя концентрация (Сп)
рассчитанная
измеренная
рассчитанная
измеренная
К+
1
74
75
NO;
2
0,0272
28
Na+
1
74
8
ci-
1
0,0136
7
Mg2+
0,25
1340
3
Н2РО;
1
0,0136
21
Са2+
1
5360
2
so/-
0,25
0,00005
19
Из сравнения рассчитанных (равновесных) и действительных (измеренных) концентраций ионов в тканях были сделаны следующие выводы: 1) распределение К+ между раствором и корнями гороха практически равновесное; 2) Са , Mg +, Na+ транспортируются пассивно, но их концентрация в тканях значительно ниже (особенно, для Са +), чем равновесная, рассчитанная по уравнению Нернста; это предполагает либо исключительно низкую проницаемость мембраны для этих ионов, что маловероятно, либо активный механизм их выкачивания из клетки; 3) анионы транспортируются активно, а поскольку различия мембранного потенциала отрицательны относительно внутреннего компартмента и концентрация анионов в корне выше, чем снаружи, их поглощение идет активно, против градиентов и электрического, и химического потенциалов.
Основной вклад в создание электрического потенциала на клеточных мембранах (плазмалемме, тонопласте, мембране ЭР) вносят диффузионный потенциал (Ed), который является результатом пассивного транспорта ионов, и электрогенный потенциал (ЕР), возникающий вследствие активного (с использованием энергии) выкачивания протона.
Диффузионный потенциал обусловлен разницей в проницаемости мембраны (Р) для катионов и анионов, что приводит к различиям в величине потоков ионов через мембраны. Если по обе стороны мембраны (в отсеках «А» и «Б») находится раствор с разной концентрацией КО (рис. 6.12) и мембрана более проницаема для К+, чем для О" (Рщ > Pcv), то диффузия К+ из отсека «А» (концентрация КО 100 мМ) в отсек «Б» (концентрация 1 мМ) будет происходить быстрее, чем О . В течение короткого времени быстрое перемещение К+ и относительно медленное О” приведет к небольшому разделению зарядов и накоплению на поверхности мембраны в отсеке «А» слабо диффундирующего аниона, а на поверхности в отсеке «Б» — катиона. Вследствие этого на мембране возникает отрицательный электрический потенциал (-ДЕ). В живой клетке количество заряда, которое должно разделиться для возникновения ДЕ -100 мВ (типичная величина для плазмалеммы), ничтожно мало по сравнению с суммой положительных и отрицательных зарядов в цитоплазме: по расчетам достаточно присутствия одного лишнего аниона снаружи на каждые 100 000 в клетке. Образование ДЕзамедляет перемещение К и даже приводит к некоторому обратному выходу К в отсек «А». Когда градиент электрического потенциала достигает некоего постоянного уровня, нетто-перемеще- ние К+ из «А» в «Б» прекратится. Разность концентраций, которая может со-
Рис. 6.12. Возникновение диффузионного потенциала ^Е^ при разной проницаемости (Р) мембраны для катиона и аниона (Рк* > Рсг):
а — исходная система электронейтральна; б — возникает -&Е; при равновесии потоков через мембрану между ее наружной (Л) и внутренней (6) поверхностью электрический потенциал мембраны соответствует диффузионному потенциалу Ed; стрелки — градиенты химических и электрического потенциалов и их направления
храниться ([Кд] > [Kg]), уравновесится градиентом электрического потенциала, названного диффузионным — Ed. Поскольку СГ также перемещается через мембрану, то стационарный градиент концентрации К' (A[K+J) и убудут ниже, чем в случае, когда диффузии аниона не происходит. Величина Ed может быть рассчитана из уравнения Гольдмана, где Р — коэффициент проницаемости:
(6.2)(6.2)ЯГ,/к Юб + Рс, [Cl ]АF "^'П^к + ^а [С1 ]Б'
(6.2)
(6.2)
Итак, величина Ed является функцией концентрации ионов в растворе и проницаемости мембраны, и уравнение Гольдмана позволяет описать вклад пассивных ионных потоков и Е(/в общий мембранный потенциал.
Поддержание трансмембранного электрического потенциала обеспечивается также процессом активного переноса через мембрану протона (Н+). Выкачивание Н+ осуществляют протонные помпы — интегральные белки мембран, проявляющие гидролитическую активность. Работа Н+-помпы сопряжена с использованием энергии, которая поставляется главным образом за счет гидролиза АТФ. В этом случае выкачивание Н+ и создание электрогенного потенциала Ер связаны с функционированием Н -АТФаз (рис. 6.13). Обычно у растений на плаз-
Рис. 6.13. Образование электрогенного потенциала (£р) на плазма- лемме (ПМ) и тонопласте (ТП) с участием Н+- АТФазыРис. 6.13. Образование электрогенного потенциала (£р) на плазма- лемме (ПМ) и тонопласте (ТП) с участием Н+- АТФазы-120 до -160 мВ-ДЕ цит.—*-апо.-120 до -160 мВ-ДЕ цит.—*-апо.+30 мВЕЕ вак,—► цит.+30 мВЕЕ вак,—► цит.
Рис. 6.13. Образование электрогенного потенциала (£р) на плазма- лемме (ПМ) и тонопласте (ТП) с участием Н+- АТФазы
Рис. 6.13. Образование электрогенного потенциала (£р) на плазма- лемме (ПМ) и тонопласте (ТП) с участием Н+- АТФазы
-120 до -160 мВ
-ДЕ цит.—*-апо.
-120 до -160 мВ
-ДЕ цит.—*-апо.
+30 мВ
ЕЕ вак,—► цит.
+30 мВ
ЕЕ вак,—► цит.
321321
321
321
11 Физиология растений
малемме поддерживается градиент (цитозоль -+ апопласт) отрицательного электрического потенциала в пределах от -120 до -160 мВ (возможны вариации от -100 до -300 мВ), и на внутренней (цитозольной) стороне мембраны потенциал более отрицательный, чем на внешней. На тонопласте д£ (вакуоль —> цитозоль) в среднем составляет +30 мВ (меняется от 10 до 70 мВ), и внешняя сторона тонопласта, так же как у плазмалеммы, имеет более отрицательный заряд.
Электрогенный потенциал (Ер) вместе с диффузным (Ed) обеспечивают создание на плазмалемме суммарного градиента электрического потенциала (△£). При этом вклад Ер в суммарную величину мембранного потенциала у растений составляет более половины, что гораздо больше, чем у животных, у которых основной вклад в ^E плазмалеммы вносит диффузионный потенциал (90—95 %).
У всех биологических мембран потенциал регулируется внутри ограниченных пределов, что важно по ряду причин. Обычный цитозоль-отрицательный потенциал плазмалеммы обеспечивает движущую силу для пассивного (электрофоретического) транспорта ионов против их химического потенциала. Мембранный потенциал играет ключевую роль в некоторых системах клеточной сигнализации. Деполяризация мембраны (сдвиг -Д£ в сторону более положительных значений), вызванная некоторыми воздействиями, приводит, например, к активации Са +-каналов, являющихся компонентами путей передачи информации (см. подразд. 3.4.3). Кроме того, уровень потенциала на мембране должен поддерживаться в пределах, активирующих электрогенную помпу (Н -АТФазу), которая удаляя из цитозоля метаболически продуцируемый Н+, стабилизирует pH цитозоля и обеспечивает движущую силу для активного поступления ионов. При активации Н -АТФазы мембрана может гиперполяризо- ваться, т.е. ее потенциал станет еще более отрицательным. Некоторые ионные каналы активируются в этих условиях, выполняя определенные функции в тех или иных физиологических процессах (см. подразд. 3.5.3).
Н+-помпы мембран растительной клетки. У растений наиболее весомый вклад в энергизацию мембран вносят три типа помп: Н+-АТФаза плазмалеммы (ПМН+- АТФаза), выкачивающая Н+ из клетки, и Н+-АТФаза (УН+-АТФаза) и пирофосфатаза (Н+-ПФаза) на тонопласте, которые вытесняют Н+ из цитозоля в вакуоль (рис. 6.14).
Н+-помпы могут быть идентифицированы по их гидролитической активности, связанной с использованием АТФ или пирофосфата (ФФН). Белок Н+-помп составляет 1 — 5 % от очищенного белка мембран, что выше, чем для каких- либо других транспортных белков. Возможно, их обилие в мембранах компенсирует низкую скорость транспорта протонов, которая составляет около 100 ионов в секунду или менее (котранспортеры переносят 300—1000 ионов/с, а через каналы могут переносится 106— 108 ионов/с).
Н -АТФаза плазмалеммы. Этот комплекс представлен единственным полипептидом с молекулярной массой 100 кД и относится к P-типу АТФаз, образующих в ходе реакции промежуточный фосфорилированный продукт (аспартил фосфат). Субстратом для ПМН+-АТФазы служит MgATФ и константа Михаэлиса Кт варьирует у растений от 0,3 до 14 мМ; оптимум pH около 6,6. Мономер образует 10 интегрированных в мембране доменов, а с цитозольной стороны между 4-м и 5-м доменами — гидролитическую петлю, на которой находится АТФ-связывающий участок (рис. 6.14). Стехиометрия удаления Н и гидролиза АТФ (Н+/АТФ) равна единице.
Рис. 6.14. Предполагаемые структурные модели Н+-помп растительной клетки (модификация по: Sze et al., 1999; Morsommc, Boutry, 2000; Rutajczak, 2000; Maeshima, 2001): /— Н+-АТФаза плазмалеммы (ПМН+-АТФаза): 1 —10 — участки полипептидной цепи, пересекающие ПМ; D — каталитический участок, содержащий аспартатный остаток, связывающий Mg-АТФ; AID — автоингибиторный домен С-конца, который вследствие фосфорилирования (®) протеинкиназой и присоединения 14-3-3-белка переводит ПМН+-АТФазу из неактивной (НАк) в активную (Ак) форму; //— вакуолярная Н'-АТФаза (VI Г-АТФаза): V, — цитозольная, Vo — мембранная части комплекса; A—G — субъединицы Vn a—d — субъединицы Vo. Детали пространственного расположения субъединиц С, Е, F, G, Н и d у VI Г-АТФазы не выяснены (по Maeshima, 2001); III — вакуолярная пирофосфатаза (Н+-ПФаза): 1 — 14 — участки полипептидной цепи Н+-ПФазы, пересекающие мембрану (домены 3, 4 и 8—13 не представлены); ГП — гидрофильная цитозольная петля между 5-м и 6-м трансмембранными доменами с консервативным сегментом (CS1) и местами связывания субстрата (Mg-ФФн), К+ и Mg ’
Механизм протонного транспорта с участием этой помпы еще окончательно не выяснен. Каталитический цикл, обеспечивающий выкачивание Н , предполагает следующую ступенчатую последовательность: связывание Н+ и на участке D — Mg-АТФ, затем образование высокоэнергетического продукта (аспартил фосфата) и высвобождение АДФ; как следствие этих реакций происходят конформационные изменения фермента, которые приводят к высвобождению Н+ с наружной стороны плазмалеммы; возвращение фермента пос-
ле высвобождения Фн в исходное состояние. Работу этой помпы ингибирует ванадат. Предполагают, что он имитирует Фн, и связывание ванадата в активном центре блокирует переход фермента в исходное активное состояние.
На посттрансляционном уровне ПМН+-АТФаза регулируется с участием протеинкиназы/протеинфосфатазы и 14-3-3-белка (рис. 6.14, /). В состоянии низкой активности реакционный центр фермента блокирован автоингибиторным доменом, расположенным на С-конце полипептида. Активация Н+-АТФазы осуществляется при последовательных реакциях фосфорилирования и присоединения 14-3-3-белка на автоингибиторном участке. В результате происходят конформационные перестройки, вызывающие перемещение С-конца, и реакционный центр становится доступным для присоединения Mg-АТФ и протона. Давно известен эффект активации ПМН-АТФазы фузикокцином (токсическое соединение, продуцируемое грибом Fusicoccum amigdali). Оказалось, что и в этом случае полная активация Н+-АТФазы достигается, если к С-автоинги- биторному домену присоединяются не только фузикокцин, но и 14-3-3-белок.
Н'-АТФазы плазмалеммы растительных клеток кодируются мультигенным семейством: идентифицировано 10 генов у арабидопсиса (Arabidopsis), 9 у табака (Nicotiana), 7 генов у томата (Lycopersicon) и 5 у бобов (Vieta faba). В ряде случаев разные гены кодируют отдельные изоформы, и высокий уровень их экспрессии коррелирует с накоплением Н+-АТФаз в специфических типах клеток, например клеток корневого волоска (aha2), или флоэмы (aha3), где Н-помпы участвуют в выполнении специфических физиологических функций (поглощение ионов, транспорт сахаров). Другие Н+-АТФазные гены экспрессируются в клетках многих тканей. Например, ген рта4 табака экспрессируется в клетках эпидермиса корня, в сопровождающих клетках флоэмы и замыкающих клетках устьиц. При действии факторов среды (солевой стресс, низкий ТН2о, темнота) уровень экспрессии генов ПМН+-АТФаз также может меняться.
Вакуолярная Н-АТФаза (УН+-АТФаза) присутствует не только в тонопласте, но и в мембранах эндоплазматического ретикулума (ЭР), аппарата Гольджи, везикулах. VH -АТФаза отличается от Н -помпы плазмалеммы по всем основным параметрам, характеризующим свойства и структуру. Прежде всего, это не мономерная полипептидная цепь, а самый большой многосубъединичный белковый комплекс тонопласта с молекулярной массой, по разным источникам, от 650 до 750 кДа. Величина Кт для Mg-АТФ у VH -АТФазы составляет от 0,1 до 0,2 мМ, т. е. ниже, чем у ПМН+-АТФазы, а соотношение Н+/АТФ, наоборот, выше (от 2 до 3), что свидетельствует о различии их кинетических параметров. Специфические ингибиторы VH -АТФазы — бафиломи- цин А, конканамицин С и нитрат. При связывании АТФ и выкачивании протона в вакуоль не образуется промежуточного фосфорилированного интермедиата и, таким образом, VH'-АТФаза не относится к АТФазам P-типа. По своей четвертичной структуре УН+-АТФаза сходна с АТФ-синтазой F-типа митохондрий и хлоропластов (см. гл. 2) и представлена двумя функциональными частями: цитозольной (V,) и мембранной (Уо) (рис. 6.15, И). Ансамбль Уь где происходит гидролиз АТФ, состоит из 5 — 8 типов субъединиц, а интегральная часть (Уо) представлена 3 — 5 типами субъединиц и функционирует, как Н+-канал. У разных видов растений выявлено разное количество типов субъединиц и некоторые субъединицы V]- и У0-частей присутствуют в нескольких копиях.
¥гкомплекс включает по три повторности субъединиц А и В, которые соответствуют а- и р-субъединицам F-АТФаз и осуществляют каталитическое (А) и некаталитическое (В) связывание АТФ (рис. 6.14, //). Субъединица D, соответствующая у-субъединице F-АТФазы, выполняет роль связующего стержня между периферийной (Vj) и мембранной (Уо) частями. Остальные субъединицы Угкомплекса (от С до Н) выполняют функции стабилизации, поддержания активности, обеспечения контакта и сопряжения работы V]- и У0-частей. Точное пространственное расположение субъединиц С —Н в общем мультиге- терогенном ансамбле VH -АТФазы пока не установлено.
Интегральный У0-комплекс содержит большую (100 кД) субъединицу а, шесть или более субъединиц с (их молекулярная масса равна 16 кД, т е. вдвое выше, чем у с-субъединиц F-АТФазы) и субъединицу d (32 — 36 кД) (рис. 6.14, II). Как установлено на дрожжах, взаимодействие между а- и с-субъединицами обеспечивает путь для транспорта протона через мембрану. Данные о связи субъединицы а с комплексом Vi — Уо и ее функциях противоречивы. Возможно, она имеет отношение к агрегации комплекса, а не к транслокации Н+, или о-субъединица функционирует как статор в относительно слабой ассоциации с гексамером из с-субъединиц.
Хотя УН+-АТФаза растений, как и других организмов, ингибируется специфическим токсином бафиломицином А,, субъединица, которая его связывает, не выявлена (у бычьего фермента это субъединица а). Так что, модели структуры растительной УН+-АТФазы, которые имеются в настоящее время, в значительной мере гипотетичны (рис. 6.14, II), а функции отдельных субъединиц часто предположительные. К настоящему времени большинство субъединиц УНЧ- АТФазы Arabidopsis (кроме F-13 кД, Н-51 кД, а-100 кД и d~45 кД) клонированы.
Предполагают, что механизм превращения одной формы энергии в другую (АТФ <-> Дрщ) У УН+-АТФазы и F-АТФ-синтазы сходен, но реакции, связанные с АТФ, идут в противоположных направлениях. Ротационный механизм катализа сопрягает проводимость протона через Уо (или Fo) с гидролизом АТФ в Угкомплексе и с синтезом в Fj.
Пирофосфатаза (Н+-ПФаза) — помпа, альтернативная УН -АТФазе, перекачивающая протон из цитозоля в вакуоль (рис 6.14, III). Источником энергии для Н+-ПФазы служит пирофосфа! (ФФ„) — простейшее высокоэнергетическое соединение, и стехиометрия реакции Н/ФФн равна 1, а скорость транспорта протона ниже, чем у двух других Н+-помп. Н-ПФаза имеет молекулярную массу 80 — 81 кДа и представлена единственной полипептидной цепью из 14 мембранных доменов и нескольких гидрофильных петель (на рис. 6.14, III представлены не все домены и только одна петля) N- и С-концы находятся на вакуолярной стороне тонопласта Функциональный участок находится на цитозольной петле между 5-м и 6-м доменами и включает один из консервативных мотивов (указан как консервативный сегмент CS1), где происходит связывание и гидролиз Mg-ФФ,,, а также транспорт Н+. Механизм сопряжения этих реакций неясен, но установлено, что важную роль в связывании и гидролизе играют кислые остатки аминокислотной последовательности участка CS1. Активность фермента ингибируется Са и стимулируется К и Mg , для которых имеются сайты связывания. Предполагается, что Са блокирует реакцию гидролиза пирофосфата магния (Mg-ФФн), заменяя его на пирофосфат кальция (Са-ФФн). Н+-ПФазы клонированы из многих организмов (высших на-
земных растений, водорослей, фотосинтезирующих бактерий и простейших), но в клетках млекопитающих и дрожжей они отсутствуют.
Функции Н-помп в растительной клетке. Электрогенные помпы благодаря поддержанию и регуляции электрохимического протонного градиента обеспечивают движущую силу для перемещения веществ через мембрану. Выкачивание Н+ (иначе, первичный транспорт) и генерация Арн+ ведет к образованию альтернативной к АТФ форме энергии (см. гл. 2), которая может быть использована для активного вторичного транспорта других ионов. Возвращение Н+ через мембрану по градиенту Арш, сопряженное с перемещением через мембрану других веществ (минеральных, органических ионов и нейтральных молекул), обеспечивает их активный транспорт против градиента электрохимического потенциала (рис. 6.15).
С участием Н+-помп поддерживается гомеостаз pH в цитозоле, подкисляются вакуолярный сок и среда в клеточной стенке (рис. 6.13 и 6.15), что необходимо для протекания целого ряда процессов, активности ферментов и функционирования транспортных систем. Реализуя свои функции, Н -АТФазы участвуют в таких физиологических процессах, как устьичные движения, осморегуляция, устойчивость к солевому стрессу и низким значениям pH среды, поступление сахаров и аминокислот из апопласта в клетки, загрузка флоэмы, клеточный рост и др.
Общая характеристика белков, транспортирующих минеральные вещества. Своеобразный по количеству и качеству состав минеральных элементов в растительных клетках — результат активности специфических интегральных белков мембран, транспортирующих ионы, исходным источником которых является окружающая среда. По своим биохимическим, термодинамическим и молекулярным характеристикам, а также механизмам регуляции системы транспорта ионов могут быть разделены на несколько основных групп: АТФазы, переносчики, или котранспортеры, и каналы (рис. 6.15).
Особая группа АТФаз Р-типа — Са ‘ -АТФазы. Они присутствуют в плазма- лемме, тонопласте и других мембранах растительной клетки (рис. 6.15). Основная функция Са +-АТФаз — поддержание низкой концентрации Са + в цитозоле, что необходимо для реализации его роли вторичного мессенджера (см. подразд. 3.4.2). Кальциевые помпы плазмапеммы включены в радиальный транспорт Са в корнях (см. подразд. 2.3.1).
У животных в создании и регуляции электропотенциала на клеточной мембране большая роль принадлежит №+/К+-АТФазе. У фотосинтезирующих одноклеточных водорослей (но не у высших растений) обнаружена Na+-ATФaзa, которая удаляет Na+ из клетки (см. гл. 8) и так же, как Са +-АТФаза, не вносит существенного вклада в поддержание А£ на плазмалемме.
Таким образом, для активного перемещения Са и Na+ из цитозоля против их градиентов электрохимического потенциала энергия АТФ используется непосредственно при работе Са - и Na+-ATФaз.
Переносчики, или транспортеры. Концепция переносчиков (carrier) была разработана в 1960-е гг. на основании ставших классическими исследований Э. Эпштейна с соавт. и других научных групп кинетики поглощения ионов клетками водорослей и отсеченными, так называемыми «обессоленными», корнями растений, выращенных на воде или временно перенесенных на воду. Поглощение «обессоленными» корнями рассматривается как поглощение клет-
Помпы: ( -•-) Н+-, Na+-, Са+-АТФазы; (-•-) — VH^ АТФаза вакуолярного типа;
(-*) — Н+-ПФаза-пирофосфатаза; (Т2;-о) — транспортеры; (S) — каналы
Рис. 6.15. Схема основных систем транспорта ионов через плазмалемму (ПМ), мембраны вакуоли (В) и эндоплазматического ретикулума (ЭР) в растительной клетке.
Справа представлены помпы и транспортеры ('А — анионы; 2С — катионы; JS — органические вещества: сахара, аминокислоты, органические кислоты); слева — каналы (4РУ — рецептор- управляемые каналы; 5БВ и 6МВ — быстрые и медленные вакуолярные каналы; 7VD — потенциалзависимый канал; in и out — входной и выходной каналы; макси «кат» — неспецифический Са2+, К’ входной канал). Пунктиром показана связь транспорта иона с транспортом Н* и работой Н*-АТФазы
кой, при этом проводится аналогия между механизмами поддержания ионного баланса клеткой и целым корнем, в котором апопласт уподобляется стенке клетки, симпласт — цитозолю, а вакуом корня — вакуоли одиночной клетки. Результаты таких исследований были использованы для разработки клеточной модели корня (см. подразд. 6.2.4.2; рис. 6.32). Позднее исследование кинетики поглощения проводили также на выделенных протопластах и сконструированных мембранных везикулах.
Скорость поглощения К+ отсеченными корнями ячменя меняется при изменении концентрации КС1 в растворе, и изотерма поглощения имеет вид
^тах[С]^тах[С](6.3)(6.3)гиперболической кривой подобной кривой кинетики насыщения для реакции, катализируемой ферментом (рис. 6.16, Л). Поэтому, как и кинетика ферментативной реакции, зависимость скорости поглощения от концентрации иона соответствует уравнению Михаэлиса—Ментен:
^тах[С]
^тах[С]
(6.3)
(6.3)
т, каж + [С]ои1
где V — наблюдаемая скорость поглощения при концентрации иона [C]out в растворе; Итах — скорость, достигаемая при выходе на плато, когда увеличение
Рис. 6.16. Скорость поглощения как функция концентрации иона в растворе:Рис. 6.16. Скорость поглощения как функция концентрации иона в растворе:
Рис. 6.16. Скорость поглощения как функция концентрации иона в растворе:
Рис. 6.16. Скорость поглощения как функция концентрации иона в растворе:
А — изменение скорости поглощения К+ отрезанными корнями ячменя при низких (7) и высоких (2) концентрациях КС1 в среде (Epstein, 1966); Б — многофазная (фазы 7—4) кинетика скорости поглощения К+ по механизму II (пунктирная линия — Ктах поглощения по механизму 1) (Epstein, Hains, 1965); В — скорость поглощения нитрата диким типом (7) и chel мутантом В1 (2) Arabidopsis в зависимости от концентрации NO3 в среде (по Daddema, Telkamp, 1979); Г — многофазная кинетика (фазы 7—5) скорости поглощения фосфата из растворов с разной концентрацией; фосфатом снабжали только участок корня кукурузы (по Nandi et al., 1987); Кт — константа Михаэлиса
[C]out не приводит к увеличению скорости поглощения (вследствие насыщения связующих мест переносчика); Кткаж — кажущаяся константа Михаэлиса—Ментен, Соответствующая [C]out При ДОСТИЖеНИИ 1/2 ^max-
Fl о аналогии с ферментной реакцией Кт каж характеризует сродство транспортера к иону: чем ниже Кт каж, тем эффективнее работает переносчик при низких концентрациях ионов в растворе. Ртах отражает (условно) число мест переноса (количество фермента в ферментативной реакции) и определяет возможности системы транспортировать ион при его высоких концентрациях.
При исследовании кинетики поступления были получены двухфазные и даже многофазные кривые, на основании которых были постулированы, а затем и выявлены системы транспорта, достигающие насыщения в разных диапазонах внешних концентраций и с разным сродством к иону (рис. 6.16): механизм I — с небольшой Етах и высоким сродством (низкая А^) к иону (высоко- афинные переносчики) и механизм II — с низким сродством (высокой Хт) и высокой Ктах (рис. 6.16, Л), а в ряде случаев (рис. 6.16, Б) с несколькими точками насыщения.
Переносчики перемещают растворенные вещества либо против, либо по градиенту электрохимического потенциала со скоростями 102— 104 ионов в секунду. Однако в зависимости от условий, при которых они исследуются, транспортеры иногда ведут себя как каналы, или, наоборот, каналы ведут себя подобно транспортерам (особенно это касается К+), поэтому различия между ними в настоящее время не совсем ясны. Активное перемещение, или вторичный транспорт, ионов и других веществ происходит одновременно (или в ко- транспорте) с Н+ и обеспечивается конформационными изменениями транспортирующего белкового комплекса. Котранспорт протона и иона может идти в одном (симпорт) или в противоположном {антипорт) направлениях (см. рис. 6.15). В симпорте с протоном через плазмалемму транспортируются анионы, К+ (при низких концентрациях), а также сахара и аминокислоты. В антипорте с Н+ переносятся Na+ через плазмалемму и тонопласт, а Са +, сахароза и гексоза через тонопласт. Некоторые переносчики функционируют на плазма- лемме в системе унипорта.
Исследование кинетики поглощения К+ отрезанными корнями ячменя из раствора КС1 в широком диапазоне концентраций (Е. Epstein et al., 1963) показало, что при поступлении К+ как в области низких (<1 мМ), так и высоких концентраций (> 1 мМ) изменение скорости следует кинетике Михаэлиса- Ментен (рис. 6.16). При низкой концентрации поглощение происходит активно (механизм I) и, видимо, в симпорте с Н+ (см. рис. 6.15), а при высокой (механизм II) — пассивно. Первый высокоафинный К+-транспортер НКТ1 (high- affinity К+ transporters 1) был идентифицирован в корнях пшеницы. Другой транспортер К+ из корней AtKUPl (Arabidopsis taliana К+ uptake) функционирует в зависимости от предшествующих условий выращивания растений (голодание или обеспечение К+) как переносчик с высоким (Кт 44 мкМ) и низким (Кт 11 мМ) сродством к К+ (см. подразд. 6.3.5).
По градиенту электрохимического потенциала в системе унипорта через мембрану переносится цинк (см. рис. 6.15). Его транспортер идентифицирован у Arabidopsis (ZIP 1—4). Экспрессия ZIP1 и ZIP3 в корнях растений, голодающих по цинк^, дает основание считать, что эти транспортеры участвуют в поглощении Zn + из почвы.
Анионы транспортируются против градиента химического потенциала, и концентрация NO3 и РО4~ в тканях в десятки и даже сотни раз превышает равновесную, предсказанную из уравнения Нернста (см. табл. 6.1). Поглощение анионов имеет ту особенность, что не только низкоафинные, но и вы- сокоафинные переносчики электрогенны, т. е. функционируют в сопряжении с Н -помпой.
Поглощение NO3 осуществляется транспортерами высокого и низкого сродства и в обоих случаях происходит симпорт 2H+/NO3- При низкой концентрации скорость поглощения NO3 соответствует кинетике Михаэлиса—Ментон, достигая насыщения при 0,1 — 0,5 мМ (рис. 6.16, В). При дальнейшем увеличении концентрации скорость опять возрастает. Но у дикого типа Arabidopsis зависимость скорости V как функции от [NO3] в среде гиперболическая, а у мутанта chel — линейная, что является ярким примером генетического контроля транспортных систем.
Фосфор транспортируется активно в виде иона Н2РО4 в симпорте с Н+. Концентрация Р в почвенном растворе чрезвычайно низкая (см. рис. 6.2), но может сильно возрастать, например, после внесения удобрений. Растения приспособились использовать фосфор как при низкой, так и при высокой концентрации. Функционируют две системы поглощения Н2РО4: система I с высоким сродством (Кт 3 — 7 мкМ), которая экспрессируется или деэкспрессиру- ется при голодании по фосфору, и система II, представленная конститутивными переносчиками с низким сродством (Кт изменяется от 50 до 350 мкМ), проявляющими многофазность кинетики насыщения в зависимости от концентрации (рис. 6.16, Г).
Ионные каналы — большая и разнообразная группа интегральных белковых комплексов, которые присутствуют во всех клеточных мембранах (см. рис. 6.15). Одна из основных функциональных характеристик каналов — их способность распознавать и достаточно селективно, с высокой скоростью (106—108 ион/с) транспортировать ионы. Перемещение ионов по каналу происходит по градиенту ц, т. е. пассивно, и основной составляющей движущей силы часто является разность концентраций иона по обе стороны мембраны. Другая особенность каналов — регуляция их пропускной способности в ответ на специфические стимулы. Активность каналов модулируется мембранным потенциалом, pH, концентрацией ионов, внутриклеточными сигнальными молекулами и рядом других эндогенных и экзогенных факторов.
Большой прогресс в исследовании функциональной активности и регуляции ионных каналов был достигнут благодаря разработке метода «пэтч-кламп» (patch clamp). Метод основан на локальной фиксации потенциала на мембране и измерении проводимости тока, которая отражает проницаемость иона через одиночные ионные каналы с использованием протопластов клеток, изолированных вакуолей или везикул выделенных мембран. По признаку ионной специфичности каналы классифицируются по видам переносимых катионов (калиевые, кальциевые) и анионов (хлоридные, малатные) (см. рис. 6.15). При более детальной функциональной систематизации каналов учитываются проводимость и селективность каналов, направление транспорта иона, принадлежность к разным мембранам, способы регуляции, электрические и фармакологические характеристики. При этом основные характеристики, используемые для классификации каналов, транспортирующих тот или иной ион, могут
быть разными. Калиевые каналы плазмалеммы подразделяются на входные (inward) и выходные (outward), а калиевые каналы тонопласта — на быстрые (fast) и медленные (slow) в зависимости от скорости их активации (см. рис. 6.15). Кальциевые каналы, участвующие в передаче информации и определяющие специфику кальциевого сигнала (см. подразд. 6.3.4), делятся на потенциал- и рецептор-управляемые и классифицируются по местоположению в мембранах (плазмалемма, тонопласт, эндоплазматический ретикулум) и характеру регуляции. Важные характеристики анионных каналов (исследованы, главным образом, хлорные каналы) — их селективность, направление движения ионов (in, out) и кинетика (быстрые, медленные), а также локализация в мембранах.
Свойство селективности, как правило, не является абсолютным, а отражает преимущественную проводимость определенного иона (при физиологических концентрациях часто близкую к абсолютной). В настоящее время выявлена целая группа неселективных катионных каналов (НСКК — английская аббревиатура NSCC). Среди них наибольший интерес представляют К+/Са +-«макси»- катионный канал замыкающих клеток устьиц Vicia faba (см. рис. 6.15), потенциал нечувствительный K+/NH4-канал корней A. taliana и К+/Ка+-канал корней пшеницы. Вакуолярный анионный входной канал пропускает СГ, NO3 и малат2+.
Сложность при классификации каналов связана также с необходимостью совмещать известные электрофизиологические и биохимические характеристики с результатами их идентификации на молекулярном уровне. Например, К -каналы, согласно их молекулярно-структурным характеристикам (число доменов и гидрофильных петель и др.) (см. рис. 6.18), разделены на четыре типа (семейства). К так называемому «шейкерному» семейству (Shaker family) относят идентифицированные у A. taliana К+-каналы с разными функциями: АКТ1 (Arabidopsis thaliana К+ transporters) экспрессируется в эпидермисе и коре корня и связан с поступлением К+ из среды; КАТ1 (К+ Arabidopsis transporters) переносит К+ в замыкающие клетки устьица, a SKOR (stellar К+ outward rectifier) осуществляет загрузку ксилемы (см. подразд. 2.3.2; 3.5.1).
Ионная специфичность, пропускная способность, характер регуляции и другие свойства канала определяются его структурой. По модели, разработанной главным образом на базе исследования Na+/K+- и К+-каналов животных, ионы перемещаются по специальной структуре — поре, которая имеет полость, заполненную водой, и множество мест связывания (рис. 6.17). Пора формируется отдельными участками полипептидных цепей гомологичных а-субъ- единиц. Часть поры канала, находящаяся на внешней стороне плазмалеммы, достаточно широкая (не менее 1 нм в диаметре), названа «устьем». Центральная часть гидрофильной поры имеет меньший диаметр (~0,7 нм), величина которого варьирует в разных местах. Зона, где находится, так называемый селективный фильтр, — самая узкая часть поры (0,4 —0,5 нм). Благодаря селективному фильтру пропускная способность калиевого канала для К+ в 100 и более раз выше, чем для Na+. Механизм, который контролирует активность канала, был объяснен с помощью английского слова «gate», для которого в русском варианте был выбран термин «ворота». Управление активностью осуществляется благодаря переходу канала в состояния «открытый—закрытый» (через открывание/закрывание или отпирание/запирание канала) при помощи воротного механизма (рис. 6.17). Регуляция активности потенциалзависи-
Рис. 6.17. Структурно-функциональные элементы условной модели потенциалзависимого ионного канала.
Изменение положения «воротных» доменов а-субъединиц указано стрелками; (-) и (+) — заряды на участках селективного фильтра и сенсора
мых каналов обеспечивается по крайней мере двумя системами: сенсором потенциала, индуцирующего открывание ворот канала, и системой, которая инактивирует воротный механизм, приводя к закрыванию канала. В обоих случаях происходит обратимое изменение конформации субъединиц на участках поры, составляющих структуру ворот и обеспечивающих функционирование воротного механизма.
Исследования К+-каналов Shaker-типа, проведенные на дрозофиле {Drosophila) и арабидопсисе, стали базой для моделирования механизма активации канала в зависимости от изменения мембранного потенциала и для выяснения взаимосвязи между структурой и функцией. У растений К+-канал Shaker-типа (АКТ1, КАТ1, SKOR) представляет собой гомотетрамер (рис. 6.18, В), у которого полипептидная цепь каждой из четырех а-субъединиц имеет 6 трансмембранных участков (segments): SI — S6 (рис. 6.18, А). Сегмент S4 отвечает за восприятие потенциала и контролирует активность канала. Его сенсорные свойства связаны с семью положительно заряженными остатками аминокислот. В субъединице этот домен (S4), реагирующий на изменения мембранного потенциала, окружен другими трансмембранными участками, которые изолируют положительный заряд (рис. 6.18, Б). Между 5-м и 6-м сегментами расположен особый домен — Н5 (helix), или Р (роге). Эта петля формирует часть водной поры и отвечает за проницаемость канала. Но мутации, затрагивающие структуру S6- и 84-85-петель, показали, что эти участки цепи полипептида тоже связаны с К+-проницаемостью и/или чувствительностью канала к блокирующим ионам. Функциональные участки находятся также на цитозольных N- и С-концах полипептидной цепи (рис. 6.18, А). Одна из моделей регуляции активности Shaker-канала предполагает наличие на N-конце домена («мяча»), осуществляющего открывание/закрывание канала (рис. 6.18, Г). Модель, названная «мяч на привязи», исходит из существования трех состояний канала: покой — В (rest); открытое — О (open) и инактивированное — /. При измене-
Рис. 6.18. Структура калиевого канала Shaker-типа:
А — трансмембранная топология полипептидной цепи: SI —S6 — трансмембранные сегменты; S4 — сенсорный участок; Н5(Р) — гидрофильная петля; «мяч» — участок с МН3-концевой группой; цНМФ — домен С-конца, связывающий циклический нуклеотид (например, цГМФ); КцА — домен, обогащенный гидрофобными (Н) и кислотными (А) остатками; Б — тетрамер из четырех а-субъединиц (вид сверху); В — модель тетрамера: стабилизация с помощью Кнл-доме- на; Г — схема активации/инактивации К+-канала Shaker-типа по модели «мяч на привязи»: R (rest) — состояние покоя, О (open) — открытое состояние, I — инактивированное состояние
нии потенциала в положительную сторону канал открывается (А^ О), что сопряжено с конформационными перестройками, а затем инактивируется вследствие того, что N Н3-терминальная группа «мяча» перемещается в пору между S5 и S6 сегментами субъединиц. На С-конце полипептида имеются домен цНМФ (cNMP), связывающий циклический нуклеотид монофосфат (цГМФ — возможный вторичный мессенджер, регулирующий активность канала), и домен взаимодействия КНА, обогащенный гидрофобными (Н — hydrophobic) и кислыми (А — acidic) остатками. КНА-домены а-субъединиц отдельного канала или двух соседних каналов могут взаимодействовать, что будет стабилизировать тетрамер (рис. 6.18, 6) или приводить к образованию на мембране кластеров из тетрамеров калиевых каналов.
Каналы вносят большой вклад в поступление ряда минеральных веществ, радиальный и дальний транспорт ионов в корне и распределение минеральных элементов в клеточных структурах, тканях и органах. Кроме того, каналы — неотъемлемые участники многих комплексных физиологических процессов, таких, как поддержание и регуляция потенциала на мембране, осморегуляция и солеустойчивость, устьичные движения, а также передача сигнала и ответные реакции на разные внешние воздействия и др.
РАДИАЛЬНЫЙ И ДАЛЬНИЙ ТРАНСПОРТ ИОНОВ ПО РАСТЕНИЮ
Пути радиального транспорта
Корни переносят в надземные органы более 80 % поглощенных ионов. Это перемещение включает радиальный транспорт, загрузку ксилемы и дальний транспорт веществ по сосудам ксилемы. От эпидермиса, где ионы поглощаются из среды, к сосудам ксилемы ионы могут транспортироваться по симпласту и апопласту (рис. 6.19). Соотношение потоков по этим двум компартментам различается для разных ионов и зависит от их концентрации в растворе. При низкой доступности элементов минерального питания, обычной для почвенной среды, большинство ионов, поглощенных в зоне корневых волосков, сразу в ризодерме поступает в симпласт. При высокой концентрации в среде значительная часть ионов (до 50 % от поглощенных) перемещается по апопласту (кальций и бор транслоцируются преимущественно по апопласту). Апопласт- ный радиальный транспорт в корне возможен только до эндодермы, у которой клеточные стенки имеют пояски Каспари (см. подразд. 6.2.1, рис. 6.6, Б и 6.7) и не пропускают воду и растворенные вещества. Поэтому, достигнув эндодермы, все ионы загружаются в симпласт (рис. 6.19). Однако непроницаемость клеточных стенок эндодермы не является абсолютной, так как в этой ткани имеются пропускные клетки с тонкими стенками. Развитие боковых корней выше зоны корневых волосков также создает участки, где ионы могут перемещаться из коры в стель по апопласту, поэтому часть ионов и воды может достигать ксилемы, не поступая в симпласт. Симпластная транслокация ионов из клетки в клетку происходит по плазмодесмам, и эффективность перемещения зависит от плотности плазмодесм, пронизывающих клеточную стенку. Число плазмо- десм на единице площади поверхности клетки меняется в зависимости от тканевой принадлежности клетки и ориентации стенки (рис. 6.20). В эпидермисе
ПасокаПасокаСтелярнаяСтелярнаяСимтитастСимтитаст** Апопластныи путь** Апопластныи путьСимпластныи путьСимпластныи путьРизо- Наружный I дерма I растворРизо- Наружный I дерма I растворЭндо- Стелярная I дерма паренхимаЭндо- Стелярная I дерма паренхимаКора АпопластКора АпопластРис. 6.19. Упрощенная схема путей радиального транспорта ионов по симпласту и апопласту в зоне корневых волосковРис. 6.19. Упрощенная схема путей радиального транспорта ионов по симпласту и апопласту в зоне корневых волосков
Пасока
Пасока
Стелярная
Стелярная
Симтитаст
Симтитаст
** Апопластныи путь
** Апопластныи путь
Симпластныи путь
Симпластныи путь
Ризо- Наружный I дерма I раствор
Ризо- Наружный I дерма I раствор
Эндо- Стелярная I дерма паренхима
Эндо- Стелярная I дерма паренхима
Кора Апопласт
Кора Апопласт
Рис. 6.19. Упрощенная схема путей радиального транспорта ионов по симпласту и апопласту в зоне корневых волосков
Рис. 6.19. Упрощенная схема путей радиального транспорта ионов по симпласту и апопласту в зоне корневых волосков
1г i i г0,60,21 0,14*^2,06—^—0,1—^—0,1^—1г i i г0,60,21 0,14*^2,06—^—0,1—^—0,1^—Тангенциальное распределениеТангенциальное распределениеРис. 6.20. Плотность плазмодесм(число/мкм2) в стенке разныхклеток корня:А — клетки на поперечном срезе эпидермиса: 1 — Trianea bogotensis;2 — Raphanus sativus (Д. В. Вахмистров и др., 1979; 1981); Б — распределение плазмодесм в радиальных и тангенциальных стенках на стыках клеток коры, эндодерРис. 6.20. Плотность плазмодесм(число/мкм2) в стенке разныхклеток корня:А — клетки на поперечном срезе эпидермиса: 1 — Trianea bogotensis;2 — Raphanus sativus (Д. В. Вахмистров и др., 1979; 1981); Б — распределение плазмодесм в радиальных и тангенциальных стенках на стыках клеток коры, эндодермы и перицикла семинальногомы и перицикла семинальногоРадиальное распределениеРадиальное распределениекорня ячменя (Hordeum vulgaris)(по Robards, 1975)корня ячменя (Hordeum vulgaris)(по Robards, 1975)Направление потокаНаправление потокаiКора — кора: Эндодерма— эндодерма: Перицикл— перицикл:iКора — кора: Эндодерма— эндодерма: Перицикл— перицикл:/t/ Кора—кора:' Кора — эндодерма:Эндодерма— перицикл:Перицикл—стелярная паренхима:/t/ Кора—кора:' Кора — эндодерма:Эндодерма— перицикл:Перицикл—стелярная паренхима:0,280,370,750,250,280,370,750,25
1
г i i г
0,60,21 0,14
*^2,06—^—0,1—^—0,1^—
1
г i i г
0,60,21 0,14
*^2,06—^—0,1—^—0,1^—
Тангенциальное распределение
Тангенциальное распределение
Рис. 6.20. Плотность плазмодесм(число/мкм2) в стенке разныхклеток корня:
А — клетки на поперечном срезе эпидермиса: 1 — Trianea bogotensis;
2 — Raphanus sativus (Д. В. Вахмистров и др., 1979; 1981); Б — распределение плазмодесм в радиальных и тангенциальных стенках на стыках клеток коры, эндодер
Рис. 6.20. Плотность плазмодесм(число/мкм2) в стенке разныхклеток корня:
А — клетки на поперечном срезе эпидермиса: 1 — Trianea bogotensis;
2 — Raphanus sativus (Д. В. Вахмистров и др., 1979; 1981); Б — распределение плазмодесм в радиальных и тангенциальных стенках на стыках клеток коры, эндодер
мы и перицикла семинального
мы и перицикла семинального
Радиальное распределение
Радиальное распределение
корня ячменя (Hordeum vulgaris)(по Robards, 1975)
корня ячменя (Hordeum vulgaris)(по Robards, 1975)
Направление потока
Направление потока
i
Кора — кора: Эндодерма— эндодерма: Перицикл— перицикл:
i
Кора — кора: Эндодерма— эндодерма: Перицикл— перицикл:
/t
/ Кора—кора:
' Кора — эндодерма:
Эндодерма— перицикл:
Перицикл—стелярная паренхима:
/t
/ Кора—кора:
' Кора — эндодерма:
Эндодерма— перицикл:
Перицикл—стелярная паренхима:
0,28
0,37
0,75
0,25
0,28
0,37
0,75
0,25
больше всего плазмодесм находится в стенках трихобластов. При этом на тангенциальной стороне плазмодесм больше, чем на радиальной, у трианеи в 3 раза, а у редиса в 1,7 раз (рис. 6.20, А). У безволосковых клеток число плазмодесм в стенках уменьшается по мере удаления от трихобласта.
По направлению от поверхности корня к центру площадь цилиндрической поверхности каждого последующего ряда клеток, а в коре и их число в ряду, уменьшаются (см. рис. 6.7). Для того чтобы скорость симпластного потока не снижалась, число плазмодесм должно возрастать. Действительно, количество и распределение плазмодесм в клеточных стенках меняется таким образом, чтобы обеспечить необходимую скорость радиального перемещения ионов. У корня ячменя плотность плазмодесм на тангенциальном стыке двух клеток коры меньше, чем на стыке кора/эндодерма (рис. 6.20, Б). Но особенно большое число плазмодесм находится на внутренней тангенциальной стороне эндодермы на границе с перициклом. Такое значительное увеличение плотности плазмодесм (двукратное по сравнению с границей кора/эндодерма) необходимо для обеспечения перемещения ионов из двух слившихся потоков — симпластного и апопластного (рис. 6.19). В радиальных стенках перицикла также сосредоточено большое число плазмодесм. Это может быть связано с функцией распределения веществ по периметру стели — ионов, поступающих из коры, и ассимилятов из флоэмы — для более успешного транспорта к местам назначения.
Строение плазмодесмы таково, что она не просто связывает протопласты соседних клеток, но и объединяет через десмотрубочку эндоплазматический ретикулум клеток в единую систему. Наличие подобного отдельного компарт- мента в симпластном континиуме позволяет объяснить существование потоков веществ, идущих в двух противоположных направлениях: ионов — от поверхности корня к сосудам ксилемы и ассимилятов — из флоэмы в клетки коры и эпидермиса.
Рис. 6.21. Схема радиального транспорта нитрата в корнях кукурузы при низкой коцентрации NO3 (0,2 мМ) в питательном растворе (по Rufty et al., 1986):
ЭР — эндоплазматический ретикулум; В — вакуоль; АНР — активная нитратредуктаза; ПК — пояски Каспари
Использование того или иного пути для радиального перемещения от поверхности корня до ксилемы зависит от специфики иона, его накопления и распределения в клетке и тканях, а также от его функций. Отдельным компарт- ментом, по которому осуществляется радиальный транспорт, по крайней мере, некоторых ионов, могут быть эндоплазматический ретикулум и десмотрубочки. В качестве теста на радиальное перемещение веществ по эндоплазматическому ретикулуму использовали активность нитратредуктазы (АНР) — цитозольного фермента, который индуцируется собственным субстратом, когда нитрат поступает в клетку через плазмалемму. У растений, выращенных без нитрата, а затем помещенных на среду с низкой концентрацией нитрата, нитратредуктаза индуцируется только в эпидермисе корня, где анион поступает в симпласт (рис. 6.21). Никакой индукции фермента в клетках коры или стели не происходит, хотя значительное количество нитрата обнаруживается в ксилемном экссудате, а, следовательно, нитрат радиально перемещался через корень. Этот транспорт должен идти по симпласту, но очевидно, что потоки нитрата и нитратредуктаза цитозоля каким-то образом изолированы друг от друга. Если корни снабжать нитратом в высокой концентрации (20 мМ), то активная нитратредуктаза обнаруживается в клетках коры и стели, поскольку значительная часть иона движется радиально по апопласту и поступает в клетки всех тканей, индуцируя цитозольную нитратредуктазу (HP). Такие результаты означают, что симпластный транспортный компартмент — это нечто иное, чем вся цитоплазма, а именно эндоплазматический ретикулум. На проростках пшеницы было выяснено, что нитрат, предназначенный для перемещения в побеги, составляет % 15 % от общего количества нитрата в корнях. Этот пул, названный «подвижным», представляет собой поток со скоростью обновления —2,5 ч или меньше (см. рис. 6.38).
Возможно, что путь по ЭР используется и для радиального транспорта кальция, концентрация которого в цитоплазме поддерживается чрезвычайно низкой, а в мембране ЭР имеются два типа Са +-АТФаз, с участием которых в люменах ЭР изолируется значительное количество этого иона (см. подразд. 6.3.4.1 и 6.3.4.2). Большее признание получила модель апопластного радиального транспорта кальция по коре и его поступления в симпласт по кальциевому каналу
Рис. 6.22. Транспорт Са2+ из апопласта коры в стель через эндодерму с участием на внешней (коровой) стороне Са2+- каналов и Са -АТФаз, выкачивающих катион на внутренней (стелярной) стороне клетки
только на уровне клеток эндодермы, откуда он выкачивается в апопласт стели с участием Са +-АТФазы плазмалеммы (рис. 6.22). Клетки эндодермы при этом функционируют аналогично эпителиальным клеткам животных: среда по обе стороны данной ткани различается по ряду параметров (концентрации веществ, метаболической активности и т.д.), а поток Са + на входе и выходе обеспечивается разными системами транспорта и регулируется разными механизмами.
Известно, что поглощенный анион фосфата в пасоке присутствует также в минеральной форме, перемещаясь исключительно по симпласту. При этом уже в коре фосфор активно включается в состав метаболитов с большими скоростями обновления (см. подразд. 6.3.1.4). Радиальный транспорт фосфора исследовали на растениях кукурузы с использованием методов двойной метки (33Р и 32Р), хроматографии сахаров, ядерно-магнитного резонанса (ЯМР)31Р, гистохимии фермента глюкозо-6-фосфатазы и с применением ингибиторов. По мо-
Рис 6.23. Модель радиального транспорта фосфора и загрузки ксилемы в корнях кукурузы (по Sasaki et al., 1987): g — глюкозо-6-фосфатаза; В — вакуоль
дели, разработанной на основе результатов, фосфат перемещается через корень в составе глюкозо-6-фосфата (ГлбФ), а загрузка ксилемы происходит с участием глюкозо-6-фосфатазы, локализованной в плазмалемме клеток ксилемной паренхимы (рис. 6.23). Фермент расщепляет глюкозо-6-фосфат на глюкозу, которая возвращается в клетку, и неорганический фосфат, который переносится в ксилему. Другие фосфорилированные сахара, вероятно, также транспортируются радиально, но их количества незначительны. Быстрое включение в корне поглощенного фосфата в АТФ, а затем в различные органические соединения — факт хорошо известный (см. подразд. 6.3.1.4). Но способ радиального транспорта, специфичный только для фосфата, и особый характер загрузки ксилемы, установленные в результате комплексного исследования на корнях кукурузы, позднее, на других объектах, не были ни подтверждены, ни опровергнуты. В настоящее время идентифицирован транспортер, участвующий в загрузке фосфора в ксилему (см. подразд. 6.3.1.3).
Движущие силы радиального транспорта ионови загрузка ксилемы
Конечный пункт радиальной симпластной транслокации — сосуды ксилемы, составляющие важную часть апопласта стели. В ксилему ионы поступают из клеток ксилемной паренхимы, и существует специальный термин — «загрузка ксилемы». Движущая сила транскорневого транспорта ионов — градиент их электрохимического потенциала (Др) между границами симпласта: на входе в него (плазмалемма клеток ризодермы) и при выходе (плазмалемма клеток ксилемной паренхимы) (рис. 6.24).
В соответствии с принципами термондинамики для активного передвижения ионов через корень в ксилему достаточно, чтобы активный мембранный транспорт имел место только в одном из пунктов — либо на входе, либо на выходе из симпласта.
Измерения электрических потенциалов и концентраций ионов в клетках тканей корня (кукурузы, подсолнечника (Heliantus) и др. растений) демонстрируют, что из среды в симпласт анионы и калий поступают активно против электрохимического градиента, что обеспечивается работой протонной помпы на плазмалемме клеток ризодермы (рис. 6.24, Б\ Ионы Са2+ и Mg2+ поступают в симпласт пассивно. Эти результаты соответствуют оценке, сделанной с использованием уравнения Нернста (см. табл. 6.1). В то же время выход из симпласта для всех исследованных ионов происходит пассивно (рис. 6.24, Б). Результаты этих экспериментов, ставших классическими, легли в основу концепции пассивного радиального перемещения и пассивного выхода в ксилему катионов и анионов.
Гипотеза об активном выходе ионов из клеток стелярной паренхимы в сосуды ксилемы по типу секреции (A.Lauchli et al., 1971, 1978) была обоснована результатами оценки мест накопления поглощаемых ионов в клетках разных тканей корня. Концентрация ионов в клетках ксилемной паренхимы оказалась выше, чем в коровых клетках корня. Косвенным свидетельством работы насоса в плазмалемме стелярных клеток служат данные по их ультраструктуре. Клетки, окружающие ксилему, имеют относительно большой объем цитоплазмы, многочисленные митохондрии и везикулы, разветвленную сеть эндоплазмати-
Рис. 6.24. Перемещение ионов по симпласту (Л) и механизм загрузки ксилемы (5):
А — Кат+ — катионы; Ан” — анионы; Пд — плазмодесма; ПМ — плазмалемма клеток коры и стели. Каналы ксилемной паренхимы корня ячменя: K„ut — селективный выходной калиевый канал; Кат„и1 — неселективный выходной катионный канал; К^п — селективный входной калиевый канал; БАн”и1 — быстроактивируемый выходной анионный канал; МАно||1 — медленноакти- вируемый выходной анионный канал; Ан7п — входной анионный канал (по Wegner, Raschke, 1994; Kohler, Raschke, 2000); Б — профиль электрохимических потенциалов некоторых ионов вдоль радиуса корня подсолнечника (по Dunlop, Bowling, 1971; Bowling, 1973)
ческого ретикулума, что указывает на высокую метаболическую активность и способность обеспечить выкачивание протонов. Работа помпы на выходе из клеток стелярной паренхимы подтверждается и тем, что pH пасоки, имеющей кислую реакцию, активно регулируется. Через сегмент корня лука {Allium сера) прокачивали растворы фосфатного буфера pH 8,0 разной концентрации. Пропущенный через ксилему раствор собирали и измеряли его pH. Оказалось, что
в протекающий по ксилеме буфер выделяются протоны, подкисляющие его до pH 6,5 —7,5. При этом чем больше концентрация буфера, тем больше скорость выделения протонов, что свидетельствует об их активном выкачивании из клеток паренхимы с участием «стелярной помпы».
Убедительным доказательством существования двух насосов и, как теперь выясняется, систем транспорта с различающимися характеристиками на внешней и внутренней границах симпласта стали данные о дифференцированном действии фитогормонов и ингибиторов на поступление и транслокацию ионов. Гормоны абсцизовая кислота и цитокинин (бензиладенин) не оказывали или оказывали очень малое воздействие на поступление ионов в корень, но ингибировали транслокацию. Циклогексимид (ингибитор синтеза белка) также не влиял на поглощение, но на 90 % ингибировал транслокацию. Такое же избирательное действие оказывал аналог фенилаланина — парафторадениналанин: поступление ионов в корень не угнеталось, но на 50—90 % снижался их транспорт в ксилему. Ингибитор синтеза РНК (б-метилпурин) также действует на транслокацию избирательно.
Итак, оценка транскорневых химических потенциалов свидетельствует, что загрузка ксилемы ионами происходит пассивно (рис. 6.24, 5), но при этом на выходе из симпласта работает Н -помпа. Кроме того, системы, транспортирующие ионы из симпласта в ксилему, находятся под строгим метаболическим контролем и более чувствительны к разного рода воздействиям.
Важным является вопрос о том, какие транспортеры обеспечивают загрузку ксилемы. Результаты исследования на корнях ячменя (Hordeus vulgaris) свидетельствуют, что выход ионов в ксилему происходит пассивно через ионные каналы. В плазмалемме клеток стелярной паренхимы методом пэтч-кламп выявлено три типа катионных и три типа анионных каналов (рис. 6.24, Л), которые различаются по селективности, проводимости и характеру потенциал-за- висимости. Выходной селективный Кои1-канал стелярной паренхимы KORC (К+ outward rectifying conductance) — основной путь поступления К+ из симпласта в ксилему. KORC проницаем для Na почти так же, как для К+, но мало проницаем для других моновалентных катионов (Cs+, Li+) и может функционировать как фильтр, ограничивающий поступление токсичных металлов в надземные органы. Селективный выходной К+-канал shaker-типа (см. рис. 6.18) SKOR (stelar К+ outward rectifier) был идентифицирован на молекулярном уровне в клетках корня Arabidopsis thaliana. Установлено, что функциональные характеристики SKOR и KORC-каналов очень сходны.
Роль неселективного выходного катионного канала КаТоШ (рис. 6.24, А) (NORC — nonselective outward rectifying cation conductance), видимо, сводится к регуляции мембранного потенциала (предотвращает сдвиг в положительную область). Участие NORC в загрузке ксилемы катионами, очевидно, незначительно.
Селективный входной К^-канал KIRC (К+ selective inward-rectifying conductance) обеспечивает поступление К+ из ксилемы снова в окружающие ее клетки. Канал К* малопроницаем для Na+, но проявляет значительную проницаемость для Cs+. Гиперполяризация мембраны вследствие выкачивания протонов Н+-АТФазой клеток стелярной паренхимы активирует К^п канал и увеличивает пассивное поступление К+ из ксилемы в клетки паренхимы в местах, расположенных выше места загрузки, обеспечивая циркуляцию К+ и его распреде-
ление по органам (см. далее рис. 6.29). Возможно, подобным образом могут ресорбироваться и токсичные ионы (во всяком случае, Cs+), что предотвращает их поступление в побеги.
Загрузка ионами солей ксилемы — процесс электронейтральный, поэтому проницаемость плазмалеммы для анионов должна быть сопоставимой с проницаемостью для катионов. Анионные каналы, обнаруженные в клетках сте- лярной паренхимы корней ячменя, различаются по своим свойствам и обеспечивают как выход анионов из симпласта, так и их поступление из ксилемы обратно (рис. 6.24, Л). Быстрый анионный выходной канал БАн^щ, или XQUAC (xylem quickly activating anion conductance), имеет характеристики, типичные для анионных каналов плазмалеммы клеток разных тканей у разных видов растений. Канал проницаем для СГ и NO3, активируется при гиперполяризации плазмалеммы и низкой концентрации Са + в цитозоле. Медленный анионный канал (рис. 6.24, Л) МАнм, или XSLAC (xylem slowly activating anion conductance), проявляет меньшую проницаемость, и, видимо, число таких каналов в мембране меньше, чем XQUAC.
Входной анионный канал Ан7п, или XIRAC (xylem inwardly rectifying anion chanal), также относится к медленным анионным каналам (время открытости ~ 1 с). Он активируется при гиперполяризации и, возможно, работает в сопряжении с Н+-помпой, обеспечивающей регуляцию pH в ксилемном соке. Таким образом, электронейтральный выход К+, NO3 и СГ происходит пассивно, и основные потоки идут через каналы K^ut (KORC) и БАн^ш (XQUAC) (рис. 6.24).
Итак, радиальная транслокация ионов связана с функционированием двух Н+-помп и двух различающихся совокупностей переносчиков и каналов, обеспечивающих транспорт ионов через плазмалемму из среды в симпласт и из симпласта в ксилему. Ансамбли транспортных белков контролируются разными механизмами. Ограниченность данных, о системах транспорта и регуляции транспортных процессов на уровне органа пока не позволяет разработать обоснованную в деталях модель, включающую «поглощение — радиальный транспорт — загрузка ксилемы». Сведения о том, что отдельные ионы могут транспортироваться разными путями (см. рис. 6.21, 22, 23), усложняют задачу разработки единой схемы поглощения и транспорта веществ через корень.
Дальний транспорт ионов
Сосуды ксилемы и флоэмы — основные коммуникационные системы, обеспечивающие транспорт веществ в целом растении и взаимодействие его органов (рис. 6.25). По ксилемным сосудам из корней в надземные части растений поступают вода, ионы и ряд органических веществ, синтезируемых в корнях. Раствор сосудов называется ксилемным соком. Его количественный и качественный состав был исследован методом сбора и анализа ксилемного эксудата или пасоки. Пасока выделяется из сосудов ксилемы после срезания надземной части благодаря «нижнему концевому двигателю», обеспечивающему транспорт воды (см. гл. 5). Большой вклад в разработку этого метода и исследование функций корневых систем внесли Д. А. Сабинин и его ученики (1971). Было показано, что, хотя поступление и перемещение воды и ионов у растений тесно взаимосвязаны, скорости этих потоков и распределение воды и ионов по органам не одинаковы и изменяются по-разному в течение суток и в зави-
Рис. 6.25. Схема циркуляции элементов минерального питания в растении:
В — основные пункты взаимодействия; Зг, Рг — основные места загрузки и разгрузки (соответственно) систем дальнего транспорта; А — области ассимиляции некоторых минеральных элементов; Пк — места расположения передаточных клеток. Стрелками указано направление потоков (по Pate, 1975)
симостр от факторов среды. Исследования, проведенные методом сбора и анализа пасоки, позволили обосновать синтетическую функцию корня, связанную с ассимиляцией в корнях аммонийного и нитратного азота (А. Д. Сабинин, 1971). Модифицированные методики сбора ксилемного сока и анализа массовых потоков минеральных веществ по ксилеме и флоэме активно используются и в настоящее время.
В пасоке содержание сухого вещества может составлять от 1 до 20 мг на 1 мл, и большинство элементов присутствует в виде ионов в концентрациях, как правило, превышающих их концентрацию в почве, но ниже, чем в клетках или во флоэмном экссудате (табл. 6.2). Азот представляет исключение, поскольку присутствует в пасоке как в минеральной (NO3), так и в органической форме (рис. 6.26).
Перемещение железа, меди, цинка, марганца происходит, очевидно, в виде комплексов с органическими хелатирующими кислотами, например лимонной.
Ксилемный сок имеет pH < 7. Его величина может существенно варьировать (табл. 6.2), что обусловлено видовой специфичностью и изменениями ионного состава и специфического селективного поступления ионов в ксилему и/или выхода ионов из нее в клетки паренхимы (см. рис. 6.24).
Состав ксилемного сока (качественный, но особенно количественный) варьирует и зависит от вида и возраста растения, статуса минеральных элементов в тканях, состава и концентрации ионов в среде, их циркуляции в растении, а также времени суток. Как правило, существует положительная корреляция между концентрацией иона в наружном растворе и в ксилемном соке. Но степень концентрирования различается в зависимости от иона и его концентрации в среде. Так, если концентрация ионов в растворе 0,1 мМ, то в пасоке, собранной с декапитированных растений кукурузы, концентрации К+, Са + и Na+, составляют соответственно 14,7; 1,4 и 0,8 мМ (для К* степень концентрирования — в 147 раз!). При 1 М концентрации этих ионов в растворе возрастает
Таблица 6.2. Концентрации и форма макроэлементов, присутствующих в почвенном растворе, ксилемном и флоэмном соке (по A. D. Robson, M.G. Pitman, 1983)
Почвенный раствор
Ксилема
Флоэма
питательный элемент
концентрация, мМ
форма
концентрация, мМ
форма
концентрация, мМ
среднее значение
область
Кальций
1,5
0-5
Са2+
0,4-4,5
нд
0,25-2,65
Калий
1,3
0-5
К+
0,5-11,5
к-
20-85
Магний
4
0-6
Mg2-
0,08-1,125
НД
2,1-23
Натрий
0,125
НД
Na-
1,6-2,6
НД
0,06-19
Фосфор
0,001
0-0,002
н2ро4-
0,03-1,5
нд
10
Сера
0,5
0-2
SO/-
1,4
нп, 5орг
0,9-1,2
Азот
1,5
0-3
NO", аминый азот
0,7-30
нп, аминый
азот
Хлор
0,2
НД
ci-
1,3-3,3
а-
7,9-11,9
Железо
<0,000030,003
Fe-комплекс
0,015-0,03
нд
0,075-0,22
pH
4-8
pH
4,9-6,3
pH
7,9-8,2
Примечание, нд — нет данных; нп — не присутствует.
их концентрация в пасоке (19,4; 3,3 и 1,2 мМ для К+, Са2+ и Na+ соответственно), но степень концентрирования уменьшается.
Количество минеральных веществ, поступающих из корней в надземные органы, зависит не только от их концентрации в ксилемном соке, но и от скорости потока раствора. Существенный вклад в транслокацию ионов из корней в надземные органы может вносить градиент водного потенциала. У расте-
Рис. 6.26. Соотношение органических и неорганических соединений азота в пасоке (% от общего количества азота в пасоке) у разных видов с/х культур.
Данные полевых опытов (Н. Г. Потапов, 1936; А.Д. Сабинин, 1971)
Рис. 6.27. Взаимосвязь между транспирацией, потоком СГ (1С1) и концентрацией СГ ([СГ]) у растений ячменя (питательный раствор содержал 50 мМ NaCl) (графики построены поданным Greenway, 1965)Рис. 6.27. Взаимосвязь между транспирацией, потоком СГ (1С1) и концентрацией СГ ([СГ]) у растений ячменя (питательный раствор содержал 50 мМ NaCl) (графики построены поданным Greenway, 1965)
Рис. 6.27. Взаимосвязь между транспирацией, потоком СГ (1С1) и концентрацией СГ ([СГ]) у растений ячменя (питательный раствор содержал 50 мМ NaCl) (графики построены поданным Greenway, 1965)
Рис. 6.27. Взаимосвязь между транспирацией, потоком СГ (1С1) и концентрацией СГ ([СГ]) у растений ячменя (питательный раствор содержал 50 мМ NaCl) (графики построены поданным Greenway, 1965)
Рис. 6.28. Взаимоотношение между скоростями транспорта Са2+ и Mg2+ и водного тока транспирации при высокой и низкой концентрации ионов в растворе (из Lazaroff, Pitman, 1966; по Sutcliffe, 1976)
ний ячменя при возрастании скорости транспирационного потока с 2,2 до 35,0 мм3 - м"2- с"1 (т.е. в 16 раз) концентрация хлора в ксилемном соке снижается почти в 8 раз (рис. 6 27). Тем не менее общее поступление хлора в побеги увеличивается, так как вдвое возрастает скорость его потока в побег. Однако возрастание транслокации как эффект транспирационного тока проявляется только при высокой концентрации иона в среде (концентрация СГ в растворе в экспериментах с ячменем, результаты которых показаны на рис. 6.27, превышала норму). При низкой внешней концентрации ионов увеличение транспирационного тока воды не приводит к увеличению скорости поглощения ионов и их транслокации из корней в надземные органы. Наиболее четко эта закономерность проявляется для Са + и Mg ' (рис. 6.28). На проростках ячменя было продемонстрировано два типа взаимодействий между поступлением и перемещением по растению воды и двухвалентных катионов: линейное увеличение скорости поступления ионов в зависимости от увеличения транспирации при высокой концентрации Са + и Mg + в растворе (15 мМ) и отсутствие какого-либо возрастания скорости потока ионов при их низкой (0,5 мМ) концентрации в растворе. В этих экспериментах поступление К+ и Na4 не зависело от транспирации не только при низкой, но даже и при высокой концентрации ионов в растворе.
Отсутствие корреляции между перемещением воды и ионов свидетельствует о различии в движущих силах, механизмах контроля и организации транспорта молекул воды и минеральных элементов в системе целого растения. Транслокация катионов по ксилеме (так же, как при транспорте по клеточной стенке) может рассматриваться как их перемещение по катионно-обменной колонке с фиксированным отрицательным зарядом. Катионно-обменная способность стенок сосудов ксилемы достаточно высокая и, например, для томата составляет 1000 молей ■ мл"1. Степень торможения транслокации ионов зависит от валентности иона (Са 4 > К4), его собственной активности и поверхностного заряда, а также плотности заряда фиксированных анионов, активности других конкурирующих ионов, pH ксилемного сока и, наконец, от проводимости ксилемных сосудов, связанной с их структурными особенностями.
Рис. 6.29. Изменение концентрации К+ в пасоке подсолнечника в зависимости от уровня места среза на стебле, где ее собирали (Л), и схема рециркуляции калия в растении (Б) (по Зялалову, Газизову, 1989).Время сбора пасоки: / — утром; 2 — в полдень; 3 — вечером; *а) — перемещение ионов из ксилемы во флоэму еще в корне отражено на основании других данных литературы и схемы рис. 6.25Рис. 6.29. Изменение концентрации К+ в пасоке подсолнечника в зависимости от уровня места среза на стебле, где ее собирали (Л), и схема рециркуляции калия в растении (Б) (по Зялалову, Газизову, 1989).Время сбора пасоки: / — утром; 2 — в полдень; 3 — вечером; *а) — перемещение ионов из ксилемы во флоэму еще в корне отражено на основании других данных литературы и схемы рис. 6.25и загрузка ксилемыи загрузка ксилемыв зону роста корняв зону роста корня
Рис. 6.29. Изменение концентрации К+ в пасоке подсолнечника в зависимости от уровня места среза на стебле, где ее собирали (Л), и схема рециркуляции калия в растении (Б) (по Зялалову, Газизову, 1989).
Время сбора пасоки: / — утром; 2 — в полдень; 3 — вечером; *а) — перемещение ионов из ксилемы во флоэму еще в корне отражено на основании других данных литературы и схемы рис. 6.25
Рис. 6.29. Изменение концентрации К+ в пасоке подсолнечника в зависимости от уровня места среза на стебле, где ее собирали (Л), и схема рециркуляции калия в растении (Б) (по Зялалову, Газизову, 1989).
Время сбора пасоки: / — утром; 2 — в полдень; 3 — вечером; *а) — перемещение ионов из ксилемы во флоэму еще в корне отражено на основании других данных литературы и схемы рис. 6.25
и загрузка ксилемы
и загрузка ксилемы
в зону роста корня
в зону роста корня
По мере передвижения ионов из корней в надземные органы концентрация некоторых ионов (особенно К , Na+) в ксилемном соке падает. Это происходит вследствие того, что на отдельных участках пути в верхние части растения ионы выгружаются из ксилемы в ткани различных органов (самого корня, стебля, листьев) и могут включаться в процесс циркуляции по растению. В пасоке, которую собирали со срезов стебля подсолнечника, сделанных на разной высоте, концентрация К* была тем меньше, чем выше была высота пенька (рис. 6.29, Л). При этом картина изменений концентрации зависела от времени суток, когда собирали пасоку; в утренние часы резкого падения концентрации по длине стебля не наблюдали.
Исследование поглощения, транслокации и распределения К+ по органам у разных видов растений позволило разработать схему рециркуляции этого иона в растении. Калий, покидающий ксилему, не накапливается в паренхимных клетках стебля, а через передаточные клетки (см. рис. 6.25) перемешается во флоэму и возвращается в корень, где вновь включается в акропетальный ксилемный транспорт (рис. 6.29, Б\ Акропетальная транслокация К+ по флоэме также возможна, но этот поток значительно меньше базипетального. Калий — преобладающий минеральный элемент во флоэмном соке, так же как и в ксилемном (см. табл. 6.2). В рециркуляцию вовлекается значительное количество К4 (до 50 % и более от поглощенного). Этот процесс выявлен
у разных видов растений и составляет часть общефизиологического процесса круговорота минеральных элементов в растении, связанного с реализацией их функций (см. рис. 6.25). Например, рециркуляция К+ поддерживает высокий уровень концентрации осмотически активного иона в ксилемном соке (вклад К+ вместе с противоионным в осмотический потенциал пасоки достигает 60 %), что может повышать поглощение и транспорт по ксилеме воды.
Основные различия потоков веществ, перемещаемых по флоэмным и ксилемным сосудам, можно свести к следующему:
по ксилеме, как правило, не переносятся сахароза и другие сахара (исключение — зимний и весенний транспорт у деревьев или у кукурузы после выметывания пестичных столбиков);
по флоэме не переносятся ионы нитрата и сульфата (см. табл. 6.2);
концентрация фосфора, органического азота (аминного и амидного) и многих других ионов во флоэмном соке выше, чем в ксилемном (исключение составляет кальций) (см. табл. 6.2);
флоэмный сок имеет слабощелочную реакцию, и уровень его pH колеблется незначительно, ксилемный сок кислый (см. табл. 6.2);
скорость флоэмного потока значительно ниже ксилемного.
Максимальная скорость потока по ксилеме черешка белого люпина составляла 147 смч"1, а по флоэме 22 см ч~*. При этом отдельные минеральные элементы по скорости перемещения сильно различаются и могут быть разделены на три группы: с высокой (К, Mg, Р, S, N, Cl, Na), низкой (Fe, Zn, Си, В, Мо) и очень низкой (Са, Мп) подвижностью. Взаимодействие коммуникационных систем в растении — составная часть комплексной системы регуляции поглощения минеральных элементов.
Круговорот минеральных веществ в системе целого растения обеспечивает реутилизацию и рациональное перераспределение минеральных элементов в онтогенезе растения, особенно при формировании репродуктивных органов, а также в периоды действия неблагоприятных факторов, что определяет возможности дальнейшего роста и развития.
ПОГЛОЩЕНИЕ ИОНОВ ИНТАКТНЫМ РАСТЕНИЕМСТАЦИОНАРНОГО СОСТОЯНИЯ
Успех изучения поступления ионов на модельных системах (клетки водорослей, протопласты, везикулы, обессоленные отсеченные корни) не вызывает сомнений: выявлены транспортеры, включенные в перенос разных ионов, выяснены молекулярные, электрофизиологические и кинетические характеристики многих переносчиков и каналов.
Однако исследования подобного рода не дают возможности получить ответы на ряд важных вопросов:
Как происходит поступление ионов в естественной среде, где действуют многие факторы, некоторые из которых могут достаточно быстро меняться (доступность воды и ионов, температура и другие факторы)?
Каким образом взаимодействуют надземные и подземные органы, обеспечивая поглощение ионов, и как регулируется процесс поступления элементов минерального питания в целостном организме?
Какова взаимосвязь между доступностью элементов минерального питания, их накоплением в тканях, ростом организма и реализацией программы полного цикла развития?
Исследования на интактных растениях, которые находятся в стационарном состоянии, т. е. имеют определенный статус минеральных элементов (содержание или концентрация отдельных элементов и их соотношение) и приспособлены к тем или иным условиям среды, позволяют частично понять некоторые особенности функционирования систем поступления в целом организме.
Кинетика поглощения ионов интактным растением
Для интактных растений, которые находятся в стационарном состоянии, изотерма поглощения имеет вид типичной кривой зависимости поступления от концентрации иона в растворе (рис. 6.30) и аналогична изотермам, полученным на модельных системах (гигантские клетки харовых водорослей или отрезанные, обессоленные корни), где отсутствует взаимодействие корень— побег (транслокация ионов из корней и поступление ассимилятов).
В экспериментах, более приближенных к естественным условиям, для описания изотермы поглощения часто используют иные параметры. Это связано с тем, что поступление минеральных элементов в необессоленные корни, из которых ионы перемещаются в побеги, представляет собой чистый (нетто) поток /„ (расчет на поглощающую поверхность или на корни одного растения). Нетто-поток складывается из двух потоков: входа I (от influx) в корни и выхода Е (от efflux) из них. Именно величину /„ измеряют, когда поглощение оценивают по изменению концентрации наружного раствора. В связи с этим показатель Стах в уравнении кинетики поглощения (6.3) заменяют на 7тах — максимальный нетто-поток ионов в корни растений. Поэтому, когда поступление оценивается как поток ионов, 7„ может быть определен по модифицированному уравнению Михаэлиса—Ментен (рис. 6.30). 7тах отражает число мест переноса, включая рабочую поглощающую поверхность корня. Величина Кт каж показывает, какие системы переноса (высоко- или низкоафинные) включены в транспорт иона; Е„ и Cmin дают представление о соотношении входа и выхода. Следует подчеркнуть, что соотношение вход/выход при более высоких концентрациях может быть иным. Однако для характеристики поглощения интактными растениями из растворов питательных смесей в экспериментальных условиях по-прежнему используют кинетические параметры «классического» уравнения Михаэлиса—Ментен — Ктах и Кт каж.
Рис. 6.30. Поток фосфора 1п в корни 18-дневных растений кукурузы в зависимости от его концентрации в растворе ([Р]) (по Барберу, 1988):'
Сах — максимальный нетто-поток; Е„ — нетто- выход при низкой концентрации иона в растворе; Cmin — концентрация, при которой потоки иона в корни и из корней равны; [Coul] — концентрация иона в растворе; Кт — константа Михаэлиса
Рис. 6.31. Изменение скорости поступления ионов К+(И) в зависимости от их концентрации в растворе ([К+]) при кратковременной экспозиции 10-дневных проростков ячменя, предварительно выращенных в водной культуре с концентрацией К+, мкМ: 7 — 5; 2 — 10; 3- 50; 4- 100.
Пунктирные линии от каждой кривой на ось ординат указывают на скорость поступления К+ в условиях, когда его концентрация в экспериментальном растворе совпадала с концентрацией в среде выращивания (по Siddiqi, Glass, 1983)
Концентрация ионов в растворе — один из наиболее важных факторов, определяющих характер поступления ионов в корни. Растения, произрастающие при разной доступности иона в среде, адаптируются к условиям среды, изменяя не только морфологию растущих корней (см. рис. 6.4), но и качественные характеристики транспортных систем. Так, скорость поглощения К+ проростками ячменя, росшими при низкой концентрации К+ в среде (5 мкМ), возрастает почти в восемь раз, если в растворе, из которого шло поглощение в эксперименте, она составляла 100 мкМ (рис. 6.31). Проростки, росшие при более высокой концентрации, тоже реагировали на увеличение [К+] в «экспериментальном» растворе, но изменение скорости поступления было тем меньше, чем больше была концентрация иона в среде при выращивании. Оценка кинетических параметров свидетельствует, что системы транспорта К+ у корней проростков, росших при 5 мкМ, имеют наибольшую поглотительную способность (самая высокая Ктах) и наибольшее сродство к К+ (самая низкая Кт каж) (рис. 6.31, величины Ктах и Кт даны справа от графиков). У корней ячменя, росшего при более высоких концентрациях К+ в среде, Итах снижается, а Кт, каж возрастает. При этом скорости (К) поглощения К+ проростками разных групп при той концентрации, которая соответствуют условиям выращивания (рис. 6.31, экстраполяция на ось ординат), практически одинаковы и близки к величине 2 мкМ ■ г"1 • ч-1 (за исключением растений, росших при 5 мкМ). Следовательно, растения приспосабливаются поглощать «требуемое» количество К+ независимо от его концентрации в среде.
Таким образом, транспортные системы растения адаптируются к условиям произрастания, что обеспечивается синтезом и функционированием переносчиков и каналов с разными кинетическими характеристиками (сродством к иону и скоростями переноса). При поглощении ионов из почвенного раствора
множество других факторов определяют зависимость «скорость поглощения — концентрация в среде»; такие, например, как перемешиваемость раствора, массовый ток, истощение в ризосфере, скорость диффузии ионов, процессы адсорбции на почвенных частицах и десорбции в раствор и т.д.
Модель корня и регуляция поступления ионовв интактном растении
Изменения кинетических параметров систем поглощения у интактных растений отражают возможности регуляции поступления ионов. Однако адаптивные изменения (Итах и Кт каж) не могут быть связаны только с этапом транспорта из среды в корень, поскольку поступление в целостное растение включает: /„ (т.е. вход и выход), радиальный транспорт и загрузку ксилемы, а также поток по ксилеме. Все этапы поглощения учитывает одноклеточная трехком- партментная (апопласт, цитоплазма, вакуоль) модель корня (рис. 6.32). Она также предусматривает возможность регуляции по принципу обратной связи систем транспорта ионов при поступлении в симпласт (цитозоль) и при загрузке ксилемы. Согласно этой схеме, важным элементом регуляции является концентрация иона в цитоплазме, которая поддерживается на определенном (постоянном) уровне. Модель учитывает также перераспределение иона в клетках корня между цитозолем и вакуолью, а следовательно, включение переносчиков тонопласта в регуляцию общего транспортного процесса.
Нетто-поступление (/„) — суммарная величина двух разнонаправленных потоков, поэтому возникает вопрос: на этапе входа (/ос) или выхода (£со) осуществляется регуляция поглощения? Чтобы ответить на этот вопрос, необходимо выяснить, как меняются все три параметра в разных условиях.
Нетто-поступление, вход и выход могут меняться в зависимости от вида поглощаемого иона и/или от действия факторов иной природы, а также от их сочетаний. Так, у пшеницы стационарного состояния, росшей при 25 или 12 °C в зоне корней, скорости нетто-поступления и входа нитрата уменьшаются при низкой температуре, а скорость выхода увеличивается (рис. 6.33). У быстрора-
Рис. 6.32. Эмпирическая модель поступления ионов и регуляции транспортных систем в интактных корнях: 1„ — нетто-поступление; /ос — вход из среды в цитозоль (симпласт); Есо — выход из клеток в среду; /cv, /сх, ^vc, ^хс — вход и выход, соответствующие цитозольному (С), вакуолярному (V) и ксилемному (X) компартмеитам; [АБК] — концентрация абсцизовой кислоты; [Иоп]с, |Иои]у — концентрации иона в цитозоле и вакуоли соответственно; --*- — регуляция по принципу обратной связи в корне; —е- — регуляция через сигнал из надземных органов;е- — АБК регуляции; /о — поток по симпласту; /(А) — поток по апопласту; /(Х) — поток по ксилеме в надземные органы
ВыходВыходТранслокация l5NO3Транслокация l5NO3Iiii ii । 1,02,0 3,0 4,0 5,0 6,015NO3, mkM • г”1 сыр. массы корней • ч-1Iiii ii । 1,02,0 3,0 4,0 5,0 6,015NO3, mkM • г”1 сыр. массы корней • ч-1Рис. 6.33. Вход, нетто-поступление, транслокация и восстановление нитрата в зоне корней у проростков пшеницы, росших при 25 и 12 °C.Рис. 6.33. Вход, нетто-поступление, транслокация и восстановление нитрата в зоне корней у проростков пшеницы, росших при 25 и 12 °C.
Выход
Выход
Транслокация l5NO3
Транслокация l5NO3
Iiii ii । 1,02,0 3,0 4,0 5,0 6,0
15NO3, mkM • г”1 сыр. массы корней • ч-1
Iiii ii । 1,02,0 3,0 4,0 5,0 6,0
15NO3, mkM • г”1 сыр. массы корней • ч-1
Рис. 6.33. Вход, нетто-поступление, транслокация и восстановление нитрата в зоне корней у проростков пшеницы, росших при 25 и 12 °C.
Рис. 6.33. Вход, нетто-поступление, транслокация и восстановление нитрата в зоне корней у проростков пшеницы, росших при 25 и 12 °C.
Вход 15NO3
|> Нетто-поступление
{;:•:] in situ восстановление 15NO3
Нетто-поступление определяли по убыли аниона из раствора питательной смеси (K15NO3, 3,0 мМ), вход и транслокацию — на основании содержания l5N—NO3 в тканях, выход — по разнице между входом и нетто-поступлением, in situ восстановление — по количеству восстановленного ISN в тканях корней (Е.В.Харитонашвили, Н.Д.Алехина, 1997)
стущих растений при низкой концентрации ионов в среде, нетто-поступление К , С1 и Н2РО4 регулируется главным образом через скорость входа, хотя это не означает, что скорость выхода незначительна и/или не подвержена изменениям. Таким образом, скорость нетто-поступления обусловлена величиной соотношения вход/выход и вклад каждого из потоков (/ос и ЕСо) либо их сочетание могут быть определяющими в регуляции поглощения (см. рис. 6.32).
Цитоплазма (симпласт), куда из среды поступают минеральные элементы, — место интенсивных метаболических превращений; поддержание гомеостаза в цитозоле, в том числе концентрации отдельных ионов и катионно/анионного баланса, — основной клеточный приоритет. При обильном снабжении элементами минерального питания и избыточном поступлении их в симпласт, помимо того, что ионы могут активнее переноситься в побег и выходить из корня, увеличивается их поступление в вакуоль (занимает 90 % от объема клетки), где концентрация многих ионов (Са +, Н2РО4, NO3, Na+, СГ) значительно выше их концентрации в цитоплазме. Эти ионы служат запасным фондом и в условиях их дефицита в среде могут выходить из вакуоли, включаясь в транслокационный поток (см. рис. 6.32).
Модель регуляции поступления по принципу обратной связи постулирует, что сигналы, включенные в механизм управления транспортным потоком, поступают из цитозоля, и основным эффектором служит кратковременное изменение концентрации поглошаемого иона в этом компартменте (рис. 6.32). Однако поступление NO3 может ингибироваться одновременно поглощаемым ионом NH4, а также глутамином (продукт ассимиляции NH4 и NO3), который рассматривается как эффектор переносчиков NO3.
Реальная картина регуляции поглощения сложнее. Системы управления процессом поступления так же комплексны, как и сам многоэтапный процесс поглощения элементов минерального питания. В системе in vivo этап загрузки ксилемы может быть лимитирующим и определить как поступление ионов, так и дальний транспорт. У проростков пшеницы, росших при 12 °C в зоне
корней, масса корней не менялась и, хотя нетто-поступление NO3 снижалось (рис. 6.33), происходило накопление нитрата в тканях корней (62 и 49 мкМ/г сырой массы при 12 и 25 °C, соответственно). Восстановление нитрата в корнях было одинаковым (рис. 6.33). Поэтому можно заключить, что основная причина накопления нитрата в тканях корней при 12 °C — снижение транслокации 15NO3 в побеги. События, которые определяют поглощение NO3 проростками, росшими при 12 °C, выстраиваются в следующую последовательность: снижение скорости транслокации инициирует накопление нитрата в корнях, это приводит к уменьшению нетто-поступления за счет уменьшения скорости входа и возрастания скорости выхода (рис. 6.33). Таким образом, транспорт NO3 в ксилему — основной этап в регуляции поступления нитрата в интактное растение при разных температурных условиях.
Какова природа сигнала и механизма ингибирования загрузки NO3 в ксилему? Возможно, регуляция транслокации NO3 связана с К' - катионом, ко- транспортируемым по ксилеме с NO3. Вероятным кандидатом на роль сигнального вещества может быть гормон абсцизовая кислота (АБК). Она синтезируется в корнях и листьях, быстро передвигается по флоэме и ксилеме и распределяется между разными компартментами в клетках и тканях. Изменение водного потенциала тканей, вызванное, например, засухой и возникающее как следствие изменения pH и концентрации ионов, приводит к модификации потоков АБК, которые можно рассматривать как сигналы стресса. Под контролем АБК наряду с устьичными движениями, ростом листьев и ответными реакциями на стресс находится и дальний транспорт (см. рис. 6.32). Добавление АБК тормозит загрузку К+ в ксилему корней и не влияет на поступление К+ из почвы в корни. АБК ингибирует выходной К+ канал клеток стелярной паренхимы корней кукурузы, т.е. /сх — см. рис. 6.32 (см. подразд. 6.3.5.4). Тем не менее наши представления о том, как регулируется этап загрузки ксилемы и транслокации ионов в надземные части растения, остаются неполными. Так, АБК ингибирует загрузку К в ксилему только у растений, росших при его низкой концентрации в среде. У «высокосолевых» растений ингибирующий эффект гормона отсутствует. Неясно также, в какой мере изменение концентрации АБК в корнях in vivo обусловлено синтезом гормона в самих корнях и какой вклад вносит АБК, синтезируемая в листьях и транспортируемая в корни по флоэме.
Скорость поглощения некоторых ионов, видимо, регулируется системами контроля побегов, а не корней. Об этом свидетельствуют результаты экспериментов с «разделением» корневой системы, когда часть корней растения находится в камере вегетативного сосуда со всеми элементами минерального питания, а другая часть — в камере без одного из элементов (К, Р или N). Уменьшение доли корней, которые снабжались калием, приводит к уменьшению содержания К+ в побегах, но не в самих поглощающих калий корнях (табл. 6.3). При этом Ущах становится тем выше, чем меньшая доля корней участвует в поглощении К+. Таким образом, снижение содержания К+ в листьях передается как сигнал в корни и инициирует повышение их поглотительной способности (см. рис. 6.32).
В подобных, но более комплексных экспериментах с фосфатом и нитратом было установлено, что скорость поглощения ионов и их дальнейшее перемещение в ксилему корня зависят от «потребности» в данном элементе, которая существует в листьях или других органах побега. «Потребность», или «запрос»,
Таблица 6.3. Содержание К+ в корнях и побегах растений кукурузы и изменение Ктах поступления К+ в зависимости от доли корней, которые обеспечивались калием (эксперименты с разделением корней) (по J. Barber, 1979)
Доля корней, снабжаемых К+, %
Содержание К+, мкМ/г сухой массы
пкМ-см-2-с"‘
надземные части
корни
100
2,05
1,48
15,8
50
1,64
1,41
28,0
25
1,10
1,28
33,8
15
1,05
1,41
36,8
в данном случае означает количество данного элемента, необходимое для поддержания определенной скорости роста, когда в надземных органах скоординированы фотосинтетическая ассимиляция СО2 и доставка элементов минерального питания и воды корневыми системами. При дефиците какого-либо элемента, когда он становится фактором, лимитирующим рост побегов, происходит целый ряд изменений в росте и развитии корней, а также в процессах поступления ионов и распределении минеральных элементов по органам (см. подразд. 6.2.1). Для решения проблемы, связанной с регуляцией процессов транспорта в интактном растении, важны следующие экспериментально установленные факты: 1) увеличение поглощающей способности корней в отношении иона, дефицитного в надземных органах (повышение Ц1ак поглощения этого иона) (см. табл. 6.3; рис. 6.31); 2) возрастание сродства систем транспорта к дефицитному иону (уменьшение Кт каж) (см. рис. 6.31); 3) возможное изменение доли иона, транслоцируемого в побег, от нетго-поступления из среды (рис. 6.33).
Вопрос о природе сигнала, поступающего в корни из листьев, где возникает «потребность» в том или ином элементе, наименее ясен. Предполагают, что сигналами могут быть сами высокоподвижные ионы (К+, Mg +, Р„) и/или какие-то их производные, которые транспортируются по флоэме. Нитрат индуцирует в корнях и в листьях ряд генов, которые кодируют: NO3 — переносчики, нитрат- и нитритредуктазу, ферменты ассимиляции азота, углеводного метаболизма и обмена органических кислот. Сам ион NO3 по флоэме не транслоци- руется и какое-то неидентифицированное соединение, связанное с МОз-ста- тусом в листьях (возможно, индолилуксусная кислота), может быть включено в регуляцию роста боковых корней (см. рис. 6.5), образования корневых волосков и изменения потоков нитрата. То, что разные ионы могут выступать индукторами систем, обеспечивающих адаптацию растительного организма к условиям минерального питания, — важное открытие последних лет.
Передвижение веществ — одна из наиболее важных функций, присущая всем живым организмам. В растении через транспортные потоки веществ (асси- милятов, воды, элементов минерального питания) осуществляется интеграция физиологических процессов корней и побегов. За счет поглощения корнями и транслокации воды и ионов по ксилеме минеральные элементы распределяются в тканях надземных органов, обеспечивая их рост. Но минеральные вещества перемещаются также по флоэме. Циркуляция минеральных веществ — физиологический процесс, связанный с выполнением таких важных функций, как реутилизация минеральных элементов из вегетативных частей при
созревании семян и плодов, запасание в специализированных органах, перераспределение минеральных веществ при стрессовых воздействиях. Процессы передвижения минеральных элементов зависят не только от внешних условий и эндогенных факторов, но также от той специфической биологической роли, которую выполняет данный минеральный элемент. Часто функция элемента может быть непосредственно связана с транспортом данного иона через мембраны (транспорт К+ поддерживает потенциал на клеточной мембране, а транспорт Са + приводит к возникновению Са + сигнала и передаче информации). В других случаях функции минеральных элементов реализуются через их перемещение и компартментацию (осморегуляция, запасание, устьичные движения).
ВКЛЮЧЕНИЕ В ОБМЕН ВЕЩЕСТВ
И ФУНКЦИИ ЭЛЕМЕНТОВ МИНЕРАЛЬНОГО ПИТАНИЯ
Деление минеральных питательных веществ на группы макро- и микроэлементов в соответствии с потребностью в них и содержанием в тканях удобно и широко принято, но несет мало информации о роли, которую они выполняют. Поэтому были предложены иные типы классификаций, которые в какой-то мере отражают функции минеральных элементов в растительном организме. Наиболее лаконичная классификация делит необходимые высшим растениям элементы на две группы в соответствии с формой, в виде которой они выполняют свои функции. Азот, фосфор и сера являются ковалентно-связанными составляющими органических веществ растений, в которых азот присутствует только в восстановленной форме, фосфор — в окисленной, а сера — ив восстановленной, и в окисленной. Эти элементы входят как неотъемлемые компоненты в такие классы соединений, как аминокислоты, нуклеиновые кислоты, фосфолипиды, макроэргические молекулы, пептиды, белки и другие вещества.
Остальные макро- и микроэлементы находятся в тканях в виде ионов (иногда солей) или в форме металл-белковых комплексов с органическими молекулами и составляют пол и функциональную группу. Они определяют конформацию и структурную стабильность макромолекул, свойства мембран и управление их проницаемостью, поддержание гомеостаза, катализ реакций и окислительновосстановительные превращения.
Содержание отдельных элементов и их соотношение в тканях значительно варьируют у разных видов и в зависимости от условий произрастания. Однако один и тот же основной набор минеральных элементов необходим всем зеленым растениям и каждый элемент используется разными растениями в одинаковых целях.
ФОСФОР
Характерные особенности фосфорного питания
Растения поглощают фосфор из почвенного раствора в форме однозамещенных или двузамещенных солей ортофосфорной кислоты:
353353Н3РО4 ^ Н+ + Н2РО4 ^ 2Н+ + НРО4- ^ ЗН+ + РО4"
353
353
12 Физиология растений
Следует выделить две наиболее характерные особенности фосфорного питания. Во-первых, дефицит доступного для растений неорганического фосфата (Фн) в почвах. Как правило, концентрация Фн в почвенном растворе на большинстве почв составляет от 1 до 10 мкМ (см. рис. 6.2). Специальную помощь в поглощении труднодоступного для растения Фн оказывают микориза и корневые выделения. Во-вторых, неизменность степени окисленности этого элемента в метаболических реакциях, в отличие от N и S. Биохимия фосфора ограничивается главным образом присоединением или переносом остатка ортофос- форной кислоты на различные субстраты.
Основные типы фосфорсодержащих соединений
Содержание фосфора в растительных тканях составляет 0,04 % от сырой массы или 0,3 % от сухого вещества. Обычно немногим более 50 % фосфора представлено в тканях в виде фосфата Фн и пирофосфата ФФН. С органическими соединениями ионы ортофосфата образуют моноэфиры, диэфиры и ангидриды.
Можно выделить пять основных типов фосфорсодержащих соединений: 1) ДНК и РНК; 2) фосфолипиды; 3) фосфорные эфиры (С—О—Р); 4) нуклеозидфосфаты АТФ, АДФ, НАДФН; 5) Фн и ФФН. В составе двух первых типов соединений фосфор выполняет структурную функцию, в остальных — метаболическую. В структуру нуклеиновых кислот фосфат входит в форме стабильного диэфира. Фосфатные группы в составе фосфолипидов обуславливают гидрофильность молекулы с одного конца, в то время как остальная часть молекулы липофильна. Двойственность свойств фосфолипидов лежит в основе структуры всех биомембран (см. гл. 1). Фосфор играет особо важную роль в энергетике клетки. Энергия запасается в клетке в виде пирофосфатных связей (ФФН, АТФ, АДФ) или в форме высокоэнергетических эфирных связей фосфора (С—О~Р) (см. гл. 2).
У растений основной запасной формой фосфора является фитин — Са +Mg +-соль инозитолфосфорной кислоты (инозитолгексафосфат). Значительные количества фитина накапливаются в семенах.
Фитиновая кислота
Фосфатный метаболизм включает: транспорт ионов фосфата через мембраны, химическую и пространственную компартментацию Фн, транспорт на дальние расстояния и реутилизацию, участие в регуляции метаболических процессов.
Транспорт фосфата через мембраны
Транспорт Фн через плазмалемму. Поступление в клетку через плазмалемму, или вход, происходит против «крутого» электрохимического потенциала
на мембране и обеспечивается белками-транспортерами. Выход Фн из клетки происходит пассивно через канал.
Идентифицированы два подсемейства фосфатных транспортеров плазма- леммы: 1) РТ — индуцируемые, с высоким сродством к переносимому аниону ^Кт = 3 — 7 мкМ); 2) Pht — конститутивные, с низким сродством к фосфату (Кт = 50—330 мкМ). Механизм транспорта: симпорт с 2Н+ или 4Н+. Транспорт Фн через плазмалемму зависит от ДрН и не зависит от ^E (рис. 6.34).
Фосфатные транспортеры — интегральные мембранные белки с молекулярной массой около 58 кДа. Каждый белок образует 12 гидрофобных внутри- мембранных доменов в конфигурации 6 + 6 (рис. 6.35). Две области, по 6 доменов каждая, соединены большой гидрофильной «петлей», ориентированной внутрь клетки.
Такой тип строения присущ многим транспортным белкам, которые объединяют в одно большое семейство MFS (major facilitator super family) — одно из самых больших семейств переносчиков, образованных одиночной полипеп-
Рис. 6.34. Схема распределения транспортных систем Фн в мембранах растительной клетки:
О — Н^-АТФазы плазмалеммы; А — Н+-АТФаза тонопласта, О — пирофосфатаза тонопласта; РТ — фосфатный транспортер высокого сродства; Pht — фосфатный транспортер низкого сродства; 1,2 — системы транспорта Фн из клетки (2 — предположительно канал); 3, 4 — системы входа и выхода на тонопласте; 5— 8 — фосфатные транслокаторы внутренней мембраны хлоропласта- (5 — ТФТ; б и 7 — ФФТ; 8 — ГФТ)
Рис. 6.35. Модель фосфатного транспортера.
В состав белка входях 12 мембраносвязанных доменов в конфигурации 6 + 6. Две области, по 6 доменов каждая, соединены большой гидрофильной «петлей», ориентированной внутрь клетки. Такой тип строения присущ многим транспортным белкам, которые объединяют в большое семейство MFS (Major Facilitator Super Family)
тидной структурой, осуществляющих транспорт через мембраны небольших молекул за счет энергии хемиосмотического ионного градиента. Это семейство включает переносчики сахаров, нуклеозидов, фосфата, нитрата, фосфорилированных органических соединений и других небольших молекул.
Множество фосфатных транспортеров высокого сродства обеспечивает транспорт Фн через мембраны в различных тканях. В первую очередь, гены РТ экспрессируются в корнях растений, испытывающих дефицит по фосфору. Индукция наблюдается в клетках корневых волосков, эпидермальных клетках внешнего слоя по всей длине корня и в поверхностных клетках протеоидных корней. Таким образом, фосфатное голодание приводит корни растений в состояние высокой готовности поглощать неорганический фосфат из среды после периода голодания даже при его ничтожных концентрациях. Гены РТ экспрессируются также в клетках других органов: листа, стебля, пыльцевой трубки, цветка (данные для томатов и картофеля).
О подсемействе транспортеров Фн низкого сродства известно пока немного: идентифицированы гены Pht, конститутивно экспрессированные в клетках корней и листа арабидопсиса.
Транспорт фосфата через тонопласт. Основной клеточный компартмент накопления свободного фосфата — вакуоль, где концентрации Фн достигают 25 мМ. Транспорт иона фосфата через тонопласт, так же как и через плазма- лемму, осуществляется в двух направлениях: в и из вакуолярного компартмен- та (см. рис. 6.34). Движущей силой для транспорта ортофосфата в вакуоль является электрический градиент kE и в значительно меньшей степени — протонный градиент Ацщ. В этом принципиальное отличие механизма транспорта Фн через тонопласт от транспорта через плазмалемму. Фосфатные транспортеры тонопласта еще предстоит идентифицировать и выделить.
Потоки фосфата через мембраны пластид. Особого внимания заслуживает транспорт Фн между цитозолем и пластидами. Пластиды содержат группу различных по структуре белков «фосфатных транслокаторов», для переноса через мембрану в антипорте с Фн низкомолекулярных соединений: триозофосфатов, ФЕП и гексозофосфатов. Внутренняя мембрана хлоропласта высокоселективна и содержит, в частности, триозофосфат/фосфат-транспортер (ТФТ) (см. рис. 6.34, 5). Этот белок присутствует исключительно в фотосинтезирующих
тканях. У мутантных растений с низким содержанием ТФТ в хлоропластах происходит избыточное накопление крахмала. В норме большая часть фиксированного углерода на свету экспортируется из хлоропласта в виде фосфотриоз в обмен на Фн.
Еше один «фосфатный транслокатор» пластид — ФЕП/фосфат-транспор- тер (ФФТ) (см. рис. 6.34, 6). Транспорт ФЕП из цитозоля в хлоропласт необходим для дальнейших реакций биосинтеза аминокислот, жирных кислот или предшественников шикиматного пути, так как хлоропласты и незеленые пластиды у большинства растений не содержат полный набор гликолитических ферментов для превращения гексозофосфатов и/или триозофосфатов в ФЕП. ФФТ высоко селективен: переносит только ФЕП и фосфат. В хлоропластах мезофилла С4-растений, вероятно, ФФТ-подобный белок (см. рис. 6.34, 7) работает на вынос ФЕП из хлоропластов в цитозоль. В хлоропластах, где представлены и ТФТ, и ФФТ, в результате их совместной деятельности фосфотриозы обмениваются на ФЕП без видимого нетто-транспорта фосфата (см. рис. 6.34, 5 и 6).
Незеленые пластиды в гетеротрофных тканях для импорта углерода содержат также гексозофосфат/фосфат-транслокатор (ТФТ) (см. рис. 6.34, 8\ В амилопласты запасающих тканей транспортируется и Гл-6-Ф и Гл-1-Ф, которые идут затем на биосинтез крахмала.
Загрузка ксилемы. Для загрузки ксилемы существует специальный механизм транспорта Фн через мембраны клеток ксилемной паренхимы. Хорошо известен мутант арабидопсиса phol, который не способен транспортировать фосфат в надземные органы. Другой, не менее известный, мутант арабидопсиса pho2, наоборот, аккумулирует фосфаты в надземной части в избыточных количествах. Примечательно, что ни один из девяти известных сегодня генов фосфатных транспортеров не является аллельным кphol иpho2. Это подтверждает особый характер транспортных процессов при загрузке ионов в сосуды ксилемы, которые до сих пор наименее изучены в физиологии минерального питания.
Метаболизм фосфата
Главный биохимический путь включения фосфата в органические соединения идет через АТФ: неорганический фосфат вовлекается в реакции углеводного обмена (см. гл. 3 и 4) и биосинтеза фосфолипидов. В состав нуклеиновых кислот АТФ входит как ключевое соединение. Поскольку химическая форма фосфора не меняется, можно говорить о «химической» компартментации фосфата или распределении Фн между различными типами органических соединений. В табл. 6.4 приведены величины времени обновления различных химических Р-пулов.
Уже через 30 с поглощенный Фн включается в состав АТФ в у-положении: а р у аденозин—Р~Р~Р
Далее имеет место быстрая обменная реакция между АТФ и УТФ, катализируемая нуклеозиддифосфаткиназой, поэтому следует говорить о быстро обновляемом пуле (АТФ + УТФ). Высокая скорость обновления р-Р в этом пуле
Таблица 6.4. Время обновления и скорость синтеза различных типов фосфорсодержащих органических соединений (по R. L. Bieleski, 1. В. Ferguson, 1983)
Тип соединения
Время обновления, мин
Скорость синтеза, нмоль Р ■ г1 ■ мин 1
Тип соединения
Время обновления, мин
Скорость синтеза, нмоль Р ■ Г"1 ■ мин 1
АТФ + УТФ(уР)
0,50
340
Аденозин «Р
160
1
АДФ+УДФ (РР)
3,5
85
Уридин аР
160
2
Гл-6-Ф
7
95
РНК
2800
2
3-ФГА
6,5
50
ДНК
2800
0,2
Фосфатидилхолин
6
12
Фн
5
650
Фосфолипиды
130
20
свидетельствует, что примерно 1 из 4 молекул нуклеотидфосфатов окисляется до мононуклеотида. В стационарном состоянии до 45 % поглощаемого фосфата проходит через нуклеотидный пул. Второе место по интенсивности вовлечения фосфата в метаболизм занимают реакции фосфорилирования глюкозы и триоз в гликолизе. Менее быстрые реакции включения Р — через фосфатидилхолин в состав фосфолипидов биомембран. Обновление «структурного» фосфата в составе нуклеотидов, где АТФ — ключевое соединение, идет чрезвычайно медленно, и содержание Р в ДНК достаточно стабильный показатель для вида. Доля Р в других формах фосфорсодержащих соединений от общего содержания Р меняется в зависимости от типа ткани, возраста и фосфорного питания.
После заполнения пулов быстро обновляемого органического фосфата в клетке начинается накопление неорганического фосфата. За исключением строгого фосфорного голодания, цитозольная концентрация Фн поддерживается на постоянном уровне (5—10 мМ) независимо от экзогенной концентрации Фн. Постоянство концентрации Ф„ в цитозоле необходимо для обновления и поддержания химических пулов Р и протекания множества ферментативных реакций. Вакуолярная концентрация, напротив, широко варьирует: быстро возрастает в ответ на улучшение фосфатного питания и снижается вплоть до нуля при фосфатном голодании. Максимальная концентрация в запасном пуле обычно не превышает 25 мМ.
Наиболее значительный прогресс в картировании внутриклеточных пулов Р был достигнут с применением ЯМР-спектроскопии. На рис. 6.36 представлен достаточно типичный спектр распределения Р между различными клеточными пулами, полученный для суспензионной культуры клеток моркови in vivo.
Фосфорилирование и дефосфорилирование белковых молекул — важнейший способ регуляции их активности. Включение фосфата в молекулу белка приводит к перераспределению в ней электрических зарядов, модификации структуры и функций. Фосфорилирование белков регулирует активность многих ферментов, синтез РНК и белка, как следствие — деление и дифференцировку клеток. Это способ быстрой регуляции метаболической активности на уровне клетки и тканей.
Активности ферментов синтеза сахаров, аминокислот и изопреноидов, а также ферментов расщепления сахарозы и Н+-АТФаза P-типа в цитозоле регулируются обратимым фосфорилированием белковых молекул по серину/треонину.
Рис. 6.36. Типичный спектр распределения фосфата между различными клеточными пулами, полученный для суспензионной культуры клеток моркови in vivo (по Carrol et al., 1994)
Рассмотрим пример пост-трансляционного контроля за распределением потоков С между сахарами и аминокислотами в ответ на действие факторов среды. Активность сахарофосфатсинтазы (СФС) может модулироваться разными типами фосфорилирования. Если фотосинтез заингибирован, СФС инактивируется фосфорилированием по серину в положении 158. В ответ на водный стресс СФС активируется фосфорилированием по серину-424 через Са2+-зави- симую киназу. Пул сахарозы и растворимых сахаров при этом увеличивается.
Известен механизм более тонкой регуляции активности ферментов путем фосфорилирования, в котором принимает участие низкомолекулярный белок 14-3-3. Белки, фосфорилированные по серину, становятся мишенью для присоединения 14-3-3-белка, который связывается с определенным фосфопептидом: Арг-Сер-Х-фосфоСер-Х-Про. После связывания белок-мишень меняет свои свойства: активность, стабильность, субклеточную локализацию и характер взаимодействия с другими белками. Такой тип регуляции — фосфорилирование по серину с последующим связыванием с 14-3-3-белком — установлен для многих ферментов: HP, ГС, СФС, ФЕПК, 3-ФГА-дегидрогеназы, Н+-АТФа- зы плазмалеммы и др.
У хорошо обеспеченных Фи растений большая часть поглощенного корнями фосфата транспортируется по ксилеме в более молодые листья. Радиальный транспорт по корню идет в виде фосфорных эфиров сахаров. В ксилему фосфат загружается после дефосфорилирования ГлбФ и по ксилеме транспортируется в виде Фн (см. рис. 6.23). Использование меченого фосфата показало, что он достигает ксилемы примерно за 8 мин. В зависимости от доступности в среде концентрация Фн в ксилеме варьирует от 1 до 7 мМ.
Наблюдается также быстрая ретранслокация Фн по флоэме. В экспериментах на растениях фасоли с разделенной корневой системой было показано, что через 6 ч после внесения меченого фосфата под одну часть корня он появляется в другой части. Приблизительно половина Фн, ретранслоцированного из надземных органов в корни по флоэме, затем переносится в ксилему и возвращается обратно в листья. Если в ксилеме Р всегда транспортируется исключительно как свободный фосфат, то во флоэме обнаруживаются значительные количества органического фосфора.
Ответные реакции растительного организмана дефицит фосфата
Ответные реакции растения на дефицит фосфата могут наблюдаться на морфологическом, физиологическом, биохимическом или молекулярно-биологическом уровнях.
На уровне морфологии отмечаются: усиленный рост корня и увеличение его относительной массы в целом растении, преимущественное развитие боковых корней по сравнению с главным, повышенная пролиферация корневых волосков (на их долю в среднем приходится 63 % поглощения фосфатов), растяжение корневых волосков, образование протсоидных корней, более интенсивное формирование микоризы.
Изменение структуры корневой системы сопровождается изменениями на уровне физиологических реакций. Отмечаются повышенное выделение органических кислот (малата и цитрата) корнями и подкисление почвы, выделение хелатирующих веществ для удаления двухвалентных катионов, образующих нерастворимые соли ортофосфорной кислоты и, наконец, выделение фосфатаз в среду обитания корней. Увеличивается скорость поглощение Фн из почвы и уменьшается отток Фн из корней. Увеличивается скорость ретранслокация Фн из более старых листьев и мобилизация вакуолярного запаса Фн вплоть до исчерпания. За этим следует драматическое снижение концентрации фосфата в цитозоле вплоть до 0,01 мМ. Это сказывается на размере аденилатного пула Р (АТФ, ГТФ, ЦТФ и УТФ), который снижается до 20—30% и менее от нормального уровня. В противоположность этому пул пирофосфатов (ФФ„) не зависит от снабжения Фн. При остром фосфорном голодании ФФН может выполнять функции автономного донора энергии в цитозоле, что во многом определяет метаболическую или биохимическую адаптацию.
В целом на биохимическом уровне изменения при дефиците Р выражаются в увеличении количества фосфатаз, рибонуклеаз и органических кислот; изменяется уровень фосфорилирования белков и активируется гексозомонофос- фатный путь дыхания. На уровне гликолиза подключаются альтернативные шунтирующие реакции: 1) ФФн-зависимое фосфорилирование фруктозо-6-фос- фата, катализируемое пирофосфатзависимой фосфофруктокиназой (см. гл. 4); 2) нефосфорилирующее (необратимое) окисление ФГА до ФГК НАДФ-зави- симой ФГА-дегидрогеназой, которое шунтирует гликолитические реакции, катализируемые НАД-зависимой ФГА-дегидрогеназой совместно с 3-ФГА-ки- назой. Активность двух вышеназванных ферментов при фосфорном голодании увеличивается примерно в 20 раз.
На молекулярном уровне активируются гены рибонуклеаз, фосфатаз, белков-транспортеров фосфата, Са +-АТФаз, вегетативных запасных белков, р- глюкозидаз, ФЕПК и др. Экспрессия семейства генов, кодирующих белки- транспортеры Фн плазмалеммы или тонопласта, увеличивается с течением времени от начала голодания. У арабидопсиса по крайней мере три гена, кодирующих фосфатные транспортеры, экспрессируются в корнях и находятся под контролем фосфатного голодания. Аналогично у растений картофеля (Solanum tuberosum) идентифицирован один ген в корнях и столонах, который специфически индуцируется при голодании, и второй ген, который экспрессируется и при высоких, и при низких концентрациях фосфата.
Если снабжение фосфором адекватное (достаточное) и Фн поглощается в количествах, превышающих запрос, начинают работать процессы, предотвращающие накопление токсических концентраций Фн. К ним относятся: превращение Фн в запасные фосфорсодержащие соединения (фитин), ограничение скорости поглощения Фн из внешней среды (белок-транспортер высокого сродства РТ репрессируется высокими экзогенными концентрациями фосфата), потери Фн через увеличение его выхода, который достигает от 8 до 70 % входа.
Растительные клетки отвечают на изменения Фн в среде или в вакуоли изменениями на уровне экспрессии генов. Тем не менее внутриклеточные сигналы и факторы, которые влияют на экспрессию генов в ядре, остаются неизвестными, в то время как концентрация Фн в цитозоле сохраняется относительно постоянной.
АЗОТ
Формы азота, используемые растением
В среде обитания растений азот представлен в виде газообразного азота атмосферы N2 (~78 %) и в составе органических и неорганических соединений в почве, пресной и морской воде (см. рис. 6.1). Растениям недоступны напрямую огромный запас азота в воздухе и органический азот почвы, на долю которого приходится 99 % общего азота почвы. Они поглощают азот из почвы в виде минеральных ионов нитрата и аммония.
Азот почвы происходит из атмосферы в результате процессов химической и биологической азотфиксации. Биологическая азотфиксация — уникальная способность некоторых прокариот (цианобактерий, актиномицетов, зеленых серных бактерий, бактерий родов Azotobacter и Clostridium и др.) восстанавливать N2 до NH4 при обычных температуре и давлении. Органический азот почвы может быть превращен в NH4 в процессе аммонификации — разложения органического вещества гетеротрофными бактериями. Пополнение пула нитратного азота почвы обеспечивают бактерии нитрификаторы, которые используют для жизнедеятельности энергию окисления аммония до нитрата. Процессы денитрификации, осуществляемые анаэробными микроорганизмами, приводят к потерям почвенного минерального азота и его переходу в атмосферный М2 (см. рис. 6.1).
Биологическая азотфиксация вносит наиболее значительный вклад в круговорот азота в биосфере. Азотфиксирующие организмы можно разделить на две
группы: свободноживущие и симбиотические формы. Существует три основных типа азотфиксирующих симбиозов микроорганизмов с растениями: ризо- бий с большой группой бобовых растений (Fabaceae), цианобактерий с голосеменными и актиномицетов с небобовыми покрытосеменными растениями. Бобовые — самая большая группа растений, образующих «товарищество» с бактериями-азотфиксаторами рода Rhizobium. В симбиотические отношения вступают арахис (Arachis hypogaea), маш (Vigna radiata), соя (Glycine max), чечевица (Lens culinaris), горох (Pisum sativum), фасоль (Phaseolus vulgaris), люцерна (Medicago saliva), клевер (Trifolium acer), люпин (Lupinus), бобы (Vicia faba) и другие. Растение-хозяин снабжает бактерии углеводными компонентами и получает зафиксированный атмосферный N2 в виде аминокислот, амидов или уреидов.
ПОГЛОЩЕНИЕ И УСВОЕНИЕ НИТРАТА
Нитрат считают основным источником минерального азота для растений, хотя для его усвоения необходимо высокое содержание углеводов и большие запасы энергии. На хорошо аэрируемых не очень кислых почвах большая часть минерального азота представлена именно нитратом, который находится в водной фазе Анион легко перемещается с током воды в почве. Особенно быстро происходит его вымывание из поверхностного слоя, в котором расположены корни растений. В силу высокой подвижности концентрация NO3 в почвенном растворе изменяется в широких пределах: от 5 мкМ до 2 мМ и выше и во многом зависит от климатических факторов.
Усвоение нитрата — сложно организованная система последовательных биохимических и физиологических процессов, включающая поступление аниона в корень, его восстановление и накопление в корнях, радиальный транспорт, загрузку NO3 в сосуды ксилемы и транслокацию в надземные органы, восстановление и накопление нитрата в листьях (рис. 6.37). У некоторых растений доля нитрата, транспортируемого в побег, достигает 80—90 %. Из листьев же в
ЛИСТЬЯ
NO3NO3NH4+NH4+АминокислотыАминокислотыNO3-NO3-NO3NO3КСИЛЕМАКСИЛЕМААминокислотыАминокислотыБелкиБелкиФЛОЭМАФЛОЭМААминокислотыАминокислотыКОРНИNH4 —КОРНИNH4 —АминокислотыАминокислотыБелкиБелки
NO3
NO3
NH4+
NH4+
Аминокислоты
Аминокислоты
NO3-
NO3-
NO3
NO3
КСИЛЕМА
КСИЛЕМА
Аминокислоты
Аминокислоты
Белки
Белки
ФЛОЭМА
ФЛОЭМА
Аминокислоты
Аминокислоты
КОРНИ
NH4 —
КОРНИ
NH4 —
Аминокислоты
Аминокислоты
Белки
Белки
ПОЧВЕННЫЙ РАСТВОР
NO3-
Рис 6.37. Общая схема поступления и усвоения нитрата в растении
корни NO3 не перемещается. Азот нитрата, восстановленный в корнях, в виде аминокислот, амидов или уреидов поступает в побеги. На уровне целого растения происходит довольна интенсивный круговорот аминокислот и амидов между надземными органами и корнями. Содержание N в ксилеме достигает 0,01 — 0,21 % (масса/объем), во флоэме оно в 10—20 раз ниже.
Усвоение нитрата генетически детерминировано, что выражается в видовой и сортовой специфике поглощения NO3, распределения по органам, восстановления и накопления. Накопление нитрата в тканях, достигающее при определенных условиях высоких значений, — одна из особенностей азотного обмена растений. С одной стороны, в условиях возникшего азотного дефицита накопленный ранее NO3 служит эндогенным источником N для новых азот- потребляющих синтезов. С другой, стороны, нитрат, местом накопления которого служит вакуоль, выполняет осморегуляторную функцию.
Поглощение нитрата. Механизмы транспорта через плазмалемму. Движущей силой транспорта через плазмалемму является протонный градиент. Это вторичный активный транспорт в симпорте с протоном.
Кинетически в растительной клетке идентифицированы две системы транспорта NO3: 1) высокого сродства — HATS (high-affinity transport system), или механизм I, 2) низкого сродства — LATS (low-affinity transport system), или механизм IL
Работа HATS описывается кинетической кривой Михаэлиса—Ментен: скорость поглощения нитрата достигает насыщения при концентрациях 0,2 — 0,5 мМ NO3; Кт обычно колеблется в диапазоне от 10 до 100 мкМ. Система транспорта высокого сродства может быть конститутивной, которая индуцируется в отсутствие нитрата, и индуцибельной, индуцируемой нитратом.
Поглощение нитрата через LATS наблюдается при концентрациях NO3 выше 0,5 мМ и не достигает насыщения. Считается, что система транспорта нитрата низкого сродства является конститутивной, однако последние работы с мутантными формами Arabidopsis выявили индуцируемую нитратом форму LATS.
Идентифицированы два семейства мембранных белков, которые могут осуществлять активный транспорт нитрата через плазмалемму в симпорте с протоном: нитрат-нитритные портеры — NNP (nitrate-nitrite porters) и пептидные транспортеры — PTR (peptide transporter). Оба семейства представлены у прокариот и эукариот и относятся к главному суперсемейству транспортных белков MFS. К нему же относятся и фосфатные транспортеры, о которых речь шла выше (см. подразд. 6.3.1.3).
Методами молекулярной биологии были идентифицированы два семейства генов: NRT1 (nitrate reductase transporter) — кодируют переносчики с двойственными свойствами (с высокими и низким Кт), или переносчики низкого сродства, и NRT2 — кодируют индуцируемые переносчики NO3 высокого сродства.
При изучении и описании поглощения нитрата растениями обязательно следует принимать во внимание, что это результат двух разнонаправленных потоков: входа (influx) и выхода (efflux). Транспортная система выхода нитрата индуцируется самим нитратом и стимулируется аммонием. Однако, в отличие от индуцируемых систем транспорта входа, система выхода, будучи индуцированной один раз, остается стабильной в присутствии ингибиторов РНК и синтеза белка в период до тех пор, пока нитрат и нитрит имеются в наличии в цитозоле. Возможно, это белок с большим периодом полуобновления, кото-
рый работает как селективный канал. Транспортная система оттока кинетически описывается кривой насыщения с Кт = 5 мМ, что близко к значениям концентрации нитрата в цитозоле.
Транспорт нитрата через мембраны может быть важным звеном в регуляции усвоения нитрата в растении. На уровне плазмалеммы контролируется поглощение нитрата из среды, на уровне тонопласта — накопление и ремобилизация запасенного ранее NO3, на уровне транспорта через мембрану ЭР — сим- пластный транспорт на средние расстояния и, наконец, выход нитрата из клеток стелярной паренхимы определяет загрузку ксилемы — наименее изученный транспортный поток нитрата.
Накопление и компартментация нитрата в растительных тканях. Накопленный в растительных тканях нитрат асимметрично распределен между двумя основными клеточными компартментами: цитозолем и вакуолью (рис. 6.38). По мере накопления сперва заполняется доступный для восстановления метаболический пул (МП) в цитозоле, затем формируется запасной, или вакуоляр- ный, пул (ЗП). Различия по содержанию нитрата (мкМ МО3/г сырой массы) у растений, выращенных при разной его доступности, связаны в первую очередь с размерами ЗП. Однако на уровне клетки нитрат еще и перемещается по симпласту. Поэтому более достоверно компартментацию нитрата отражает трех- компартментная модель, которая учитывает, наряду с метаболическим и запасным, подвижный пул (ПП) нитрата (рис. 6.38).
Восстановление нитрата. Характеристика нитратредуктазы. Восстановление нитрата в растениях (а также в водорослях, грибах и микроорганизмах) осуществляется в две стадии: первая — двухэлектронное восстановление нитрата до нитрита, катализируемое нитратредуктазой (HP), вторая — шестиэлектронное восстановление нитрита до аммония, катализируемое нитритредуктазой
Рис. 6.38. Схема компартментации нитрата на уровне клетки:
МП — метаболический пул; ЗП — запасной пул; ПП — подвижный пул нитрата; ПР — нитратредуктаза
Рис. 6.39. Функциональная модель мономера HP
(НиР). Далее аммоний включается в состав аминокислот в реакциях первичного аминирования и амидирования:
NO3NO32еHP2еHPбеNO2" —- nh4НиРбеNO2" —- nh4НиРаминокислотыаминокислоты
NO3
NO3
2е
HP
2е
HP
бе
NO2" —- nh4
НиР
бе
NO2" —- nh4
НиР
аминокислоты
аминокислоты
Первая реакция самая медленная и лимитирует весь процесс в целом. Нитрит и аммоний токсичны для растения и в норме не накапливаются. Их концентрации в листьях составляют ~ 15 нМ и ~ 10 мкМ на 1 г сырой массы соответственно.
По структуре HP (ЕС 1.6.6.1) — металлофлавопротеин, образующий гомодимеры с молекулярной массой 100 кДа, и гомотетрамеры. Каждая субъединица состоит примерно из 1000 аминокислот и включает три кофактора: ФАД, гем-Fe (цитохром Ь5) и молибдоптерин, которые обеспечивают передачу электронов от НАДН на МО3 (рис. 6.39). Их окислительно-восстановительные потенциалы (£°') соответственно равны -272, -160 и -10 мВ. Фермент имеет центры связывания с НАДН и нитратом. Большинство форм HP у растений используют в качестве восстановителя НАДН, но некоторые (соя, кукуруза, ячмень, рис) биспецифичны и связываются либо с НАДН, либо НАДФН. Электроны от восстановителя передаются на ФАД, затем через геминовое железо на молибден и далее на нитрат (рис. 6.39).
HP локализована в цитозоле. У большинства видов она обнаружена как в корнях, так и в листьях. У клюквы, белого клевера, цикория HP локализована только в корнях, а у Cocklebur — исключительно в листьях. На схеме (рис. 6.40) представлены данные по распределению ассимиляции нитрата между корнями и листьями у разных видов растений.
Древесные (хвойные, листопадные) |LupinusIPisum|Zea|"Triticum|| Heliantus| Oryza| Xanthium, GossipiumРис. 6.40. Вклад корней и листьев в усвоение нитрата у разных видов растенийДревесные (хвойные, листопадные) |LupinusIPisum|Zea|"Triticum|| Heliantus| Oryza| Xanthium, GossipiumРис. 6.40. Вклад корней и листьев в усвоение нитрата у разных видов растенийВ корнях при низких экзогенных концентрациях нитрата HP обнаруживается в эпидермальных и кортикальных клетках ближе к поверхности корня. При высоких концентрациях NO3 в среде HP есть во всех клетках коры и стели. В листьях С4- растений HP локализована в клетках мезофилла, но не в клетках обкладки, так как хлоропласты мезофилла в большей степени продуцируют восстановитель при нециклическом фотосинтетическом транспорте электронов.
Древесные (хвойные, листопадные) |
LupinusI
Pisum|
Zea|"
Triticum|
| Heliantus
| Oryza
| Xanthium, Gossipium
Рис. 6.40. Вклад корней и листьев в усвоение нитрата у разных видов растений
Древесные (хвойные, листопадные) |
LupinusI
Pisum|
Zea|"
Triticum|
| Heliantus
| Oryza
| Xanthium, Gossipium
Рис. 6.40. Вклад корней и листьев в усвоение нитрата у разных видов растений
НАД(Ф)Н -хНАД(Ф)+^ ФАДНАД(Ф)Н -хНАД(Ф)+^ ФАДНР активная - NO2~НР активная - NO2~
НАД(Ф)Н -х
НАД(Ф)+^ ФАД
НАД(Ф)Н -х
НАД(Ф)+^ ФАД
НР активная - NO2~
НР активная - NO2~
Регуляция активности HP. Регуляция активности HP может осуществляться на стадии транскрипции, трансляции и на пост-трансляционном уровне.
Транскрипционный уровень. HP — фермент, индуцируемый субстратом, со временем полуобновления /]/2 ~4—5 ч. Индукция нитратом зависит от конститутивного «нитрат-сенсорного» белка неизвестной природы, который предположительно связывается с регуляторной областью гена HP. Регуляторная последовательность, или «нитратный бокс», в промоторе HP идентифицирована. В ответ на поступление нитрата уровень мРНК (HP) быстро увеличивается в течение минут и достигает стационарного состояния в течение нескольких часов. Чувствительность индукционной системы регуляции: 50 мкМ NO3 в течение 10 мин. Изменения в уровне мРНК (HP) наблюдаются в ответ и на другие сигналы: свет, углеводы (сахароза), глутамин. Действие света опосредовано через фитохром. Наиболее четко индукция HP светом проявляется у этиолированных проростков. В темноте накопление сахаров коррелирует с повышением уровня мРНК (HP). Увеличению концентрации Глу—NH2 соответствует снижение количества транскриптов HP. У растений в стационарном состоянии с индуцированной HP количество мРНК демонстрирует суточную периодичность с максимумом в предрассветные часы. Возможно, в премоторной области гена HP есть места связывания с разными регуляторными белками, воспринимающими свет, концентрацию Глу—NH2, водный и углеродный статус, скорость фотосинтеза и другие лимитирующие условия, которые модулируют вос
становление нитрата на транскрипционном уровне.
Этап трансляции генетической информации также может быть местом регуляции ассимиляции нитрата, но этот вопрос изучен недостаточно.
Пост-трансляционный уровень. Потенциальная активность HP зависит от: 1) количества функционально активного белка HP; 2) уровня активности белка HP и 3) доступности субстратов в цитозоле.
Доступность отдельных структурных компонентов не лимитирует количество функционально активного белка HP. Однако у растений в условиях опти-
мального роста и достаточного снабжения нитратом потенциальная возможность его восстановления (количество функционально активного белка, активность HP in vitro) больше, чем реальная активность HP Un vivo).
В основе механизма управления активностью фермента лежит процесс быстрой и обратимой инактивации HP, который происходит в два этапа (рис. 6.41): первый — фос-
Рис. 6.41. Регуляция активности нитрат- редуктазы (HP) путем фосфорилирования и последующим связыванием с белком 14-3-4:
ПК — протеинкиназа; ПФ — пирофосфа-таза
форилирование активной HP Са2+-зависимой протеинкиназой по серину «первой петли»; второй — связывание 14-3-3-белка с фосфорилированной HP и переход HP в неактивное состояние. На втором этапе необходимо наличие ионов Mg + или Са +. Сродство фермента к субстратам в неактивном состоянии не меняется, но блокируется поток электронов от гема на молибдоптерино- вый домен фермента.
Регуляция на уровне транскрипции и обратимая инактивация фермента совместно позволяют растениям точно настраивать интенсивность ассимиляции нитрата в соответствии с конкретным состоянием. Например, транскрипция HP в фотосинтезирующих тканях подчиняется циркадному ритму. Гены HP наиболее интенсивно транскрибируются в предрассветные часы, но синтезируемый белок HP в это время обратимо ингибируется темнотой и низкой доступностью СО2.
Метаболитная регуляция на пост-трансляционном уровне определяется содержанием свободного Глу—NH2 и отношением Глу—КН2/Глу. Когда уровень Глу—NH2 низкий и нитрат доступен, скорость восстановления нитрата возрастает, в то время как высокий уровень Глу—NH2 тормозит его восстановление. Предполагается, что регуляторная область связывания Глу—NH2 расположена на N-конце фермента. У трансгенных растений с конститутивно экспрессированной мРНК (HP) и белком, у которого пост-трансляционный контроль потерян в результате делении N-конца, регуляторная роль Глу—NH2 утрачивается и восстановление контролируется только доступностью НАДН.
Нитритредуктаза. Нитрит, образующийся при восстановлении нитрата, транспортируется в хлоропласты или пластиды в нефотосинтезирующих тканях, где восстанавливается до аммония. Нитритредуктаза (НиР) (ЕС 1.7.7.1), катализирующая эту реакцию, использует в качестве донора 6е“ восстановленный ферредоксин:
NO2 + 6Фдвосст + 8Н+ —*■ NH4 ь 6Фд0К + 2Н2О
В хлоропластах восстановление нитрита через ферредоксин обеспечивается за счет нециклического потока электронов в ЭТЦ фотосинтеза, в нефотосинтетических тканях — за счет НАДФН из окислительного пентозофосфатного пути при участии ферредоксин-НАДФ+-редуктазы:
НАДФН + 2Фдок(Ее3+) НАДФ+ + 2Фдвосст(Ее2+) + Н+
НиР — мономер с молекулярной массой 60—70 кДа, состоит из двух доме
Рис. 6.42. Функциональная модель нитритредуктазыРис. 6.42. Функциональная модель нитритредуктазынов и кофакторов, которые передают электроны от ферредоксина на нитрит. Ферредоксин связывается с N-терминальной последовательностью белковой молекулы. На второй половине белка на С-конце локализовано место связывания с нитритом. Это два железосерных центра [4Fe—4S] и сирогем (рис. 6.42).
Рис. 6.42. Функциональная модель нитритредуктазы
Рис. 6.42. Функциональная модель нитритредуктазы
Активность НиР на порядок выше активности HP, поэтому нитрит в обыч
ных условиях не накапливается и скорость ассимиляции нитрата лимитиру-
ет первая реакция. НиР, так же как и HP, индуцируется нитратом (а не нитритом) и светом.
Поглощение и ассимиляция аммония
Следующий этап ассимиляции азота — собственно реакции превращения аммония в азот органических соединений. Помимо аммония — продукта восстановления нитрата — растения усваивают NH4, поглощенный из почвы и образующийся эндогенно в реакциях распада азотсодержащих соединений и при фотодыхании (см. гл. 3).
Поглощение аммония высшими растениями обеспечивается двумя различными транспортными системами: высокого и низкого сродства. Транспорт с низким сродством происходит через канал. Система транспорта высокого сродства представлена аммонийным транспортером (Km ~ 10—200 мкМ) с низким сродством к калию. Перенос NH4 осуществляется в антипорте с Н+.
Семейство аммонийных транспортеров. У прокариот и эукариот аммонийные транспортеры представлены большим семейством АМТ (ammonium transporter family). Все белки АМТ имеют 11 трансмембранных доменов и N-ko- нец, обращенный в экстраклеточный матрикс. Идентифицировано 8 аммонийных транспортеров у арабидопсис, а также у других видов, например томатов.
Усвоение аммония. Независимо от происхождения, NH4 включается в органические соединения через синтез аминокислот. В процессах усвоения аммония наиболее значимы реакции биосинтеза глутамата и глутамина (рис. 6.43).
Хронологически раньше было установлено, что усвоение аммония идет через восстановительное аминирование 2-оксоглутаровой кислоты, катализируемое глутаматдегидрогеназой (ГДГ), с образованием глутаминовой кислоты (Глу):
Рис. 6.43. Главные пути ассимиляции аммония у растений. Пояснения в тексте
2-оксоглутаровая + NH3 + НАД(Ф)Н + Н+ ^=^ Глутамат + НАД(Ф)+ + Н20.
Фермент работает в обе стороны, и соотношение аминирующей и дезаминирующей активности зависит от доступности субстрата и восстановителя. ГДГ обнаружена практически у всех высших растений. В корнях и листьях фермент локализован преимущественно в митохондриях (НАДН-зависимая ГДГ), хотя в листьях обнаруживается хлоропластная (НАДФН-зависимая ГДГ). Первоначально ГДГ считали главным ферментом ассимиляции аммония, однако его сродство к NH4 невелико: Кт = 10—80 мМ. В норме концентрация аммония в тканях таких значений не достигает. С другой стороны, активность ГДГ увеличивается при прорастании семян и старении, т. е. в те периоды развития, когда ускорены процессы распада, в том числе аминокислот. Количество мРНК (ГДГ) и активность фермента увеличиваются в темноте при снижении уровня углерода. В результате образующийся после дезаминирования а-кетоглутарат дополнительно включается в цикл Кребса. В целом эти факты свидетельствуют о важной функции ГДГ в катаболизме аминокислот и в реассимиляции больших количеств аммония, образующегося при фотодыхании в митохондриях.
В 1974 г. Р.Ли и Б. Мифлином был описан глутаматсинтазный цикл, который включает две последовательные сопряженные реакции (рис. 6.44). NH4 сначала включается в глутамин в реакции, катализируемой глутаминсинтета- зой — ГС (ЕС 6.3.1.2). Далее глутаматсинтаза (глутаминоксоглутаратаминотрансфераза — ГОГАТ) катализирует взаимодействие глутамина с 2-оксоглу- таровой кислотой. В результате образуются две молекулы глутамата, одна из которых может быть использована в качестве субстрата для ГС, а другая — для
h2nx /)
СОО" I СН2сн2СОО" I СН2сн2С
СОО" I СН2
сн2
СОО" I СН2
сн2
I
сн2
с=оIСОО'с=оIСОО'СН2^H3N-c-cocrн
с=о
I
СОО'
с=о
I
СОО'
+ H3N-C-COO“*H3N—С~COO
нн
ГлутаматГлутамат
Рис. 6.44. ГС/ГОГАТ путь ассимиляции аммония
Рис. 6.45. Внутриклеточная локализация ГС1 и ГС2
Листья
Корни
Аминокислоты А
Аминокислоты А
Поглощение из почвы
Рис. 6.46. Внутриклеточное распределение ферментов ГС/ГОГАТ циклов в корнях и листьях высших растений
транспорта, запасания или дальнейшей метаболизации. Восстановителями для этой реакции могут быть ферредоксин (ФдВОсст) или НАДФН (Фд-ГОГАТ; ЕС 1.4.7.1 и НАДФН-ГОГАТ; ЕС 1.4.1.14 соответственно). Обе реакции формируют ГС/ГОГАТ-цикл с чистым преобразованием одной молекулы а-кетоглута- рата и аммония в одну молекулу глутамата. Этот цикл является важнейшим механизмом первичной и вторичной ассимиляции аммония — «входными воротами» для N в азотный метаболизм растений.
ГС представлена двумя изоформами, обнаруженными у большинства видов и отличающимися по субклеточной локализации: цитозольной — ГС1 и пластидной — ГС2 (рис. 6.45). Обе формы кодируются гомологичными, но отдельными ядерными генами. ГС1 и ГС2 по биохимическим характеристикам in vitro значительно не различаются. Сродство ГС к NH4 очень высокое ^Кт = 3 — 5 мкМ). Различия отчетливо проявляются in vivo1. ГС2 преобладает в листьях, работая на первичную ассимиляцию и реассимиляцию аммония при фотодыхании.
ГОГАТ также представлена двумя изоформами. Фд-ГОГАТ выявлена исключительно у фотосинтезирующих организмов, НАДФН-ГОГАТ — у растений и бактерий. Последняя иногда более активна в присутствии НАДН, чем НАДФН, и поэтому называется НАДН. Обе формы локализованы в пластидах (рис. 6.46).
Интеграция азотного метаболизмана уровне целого растения
С и N — два главных конструктивных элемента, обеспечивающих рост и развитие растений. Фиксация СО2 за счет световой энергии происходит исключительно в хлоропластах. Усвоение минерального азота — процесс «делокализованный». Весь поглощаемый аммоний и часть нитрата превращается в азот органических соединений в корнях, но энергией и органическими субстратами ассимиляцию N обеспечивает фотосинтез в виде притока сахаров по флоэме. Азотный обмен на основе продуктов фотосинтеза составляет наиболее развитую сторону метаболизма корней: здесь синтезируются аминокислоты и амиды, уреиды, никотин, нуклеиновые кислоты, цитокинины и другие азотсодержащие органические соединения.
Нитрат ассимилируется как в корнях, так и в листьях. При усвоении в листьях только первая реакция восстановления нитрата до нитрита локализована в цитозоле. Азот нитрита включается в состав аминокислот и амидов в строме хлоропластов и обеспечивается энергией за счет световых реакций фотосинтеза. Общая субклеточная компартментация азотного и углеродного метаболизма на уровне хлоропласта ставит в первую очередь вопрос о распределении энергоресурсов между обменом С и N в хлоропласте.
После ассимиляции СО2 восстановление и включение азота нитрита в состав аминокислот — наиболее значимый энергопотребляемый процесс в хлоропласте. Редукция 1 моль СО2 до уровня восстановленное™ сахаров требует приблизительно 4е или 8 квантов света (2 моль НАДФН и 3 моль АТФ) (рис. 6.47). Для превращения NO2 в NH4 с использованием восстановленного Фд в хлоропласте требуется бе" (12 квантов) и еще 2е“ (4 кванта) требуется для превращения Глу—NH2 в Глу. Дополнительно к этому 1 моль АТФ нужен для синтеза Глу—NH2. Если принять во внимание, что нитрат в цитозоле может
Рис. 6.47. Распределение восстановительных и энергетических эквивалентов фотосинтеза на ассимиляцию одного моля углекислоты и нитрата.
Пояснения в тексте
быть восстановлен также за счет энергии фотосинтеза в виде челночного выноса и превращения триоз в цитозоле, общий расход будет больше на 2е“, или 4 кванта. Таким образом, на усвоение нитрата в фотосинтезирующей клетке расходуется по меньшей мере 20 квантов. Кроме того, необходимо учесть затраты энергии на реассимиляцию в хлоропласте аммония фотодыхания, приток которого на порядок превышает приток нитрита.
Хотя энергозатраты на ассимиляцию 1 моль нитрата в 2,5 больше, чем на ассимиляцию 1 моль СО2, величина ассимиляции СО2 в 5 — 20 раз выше, чем величина светозависимой ассимиляции нитрата, и можно думать, что активность электронного транспорта в хлоропласте используется предпочтительно на ассимиляцию углерода. Однако в стационарных условиях пул Фд (2 мМ), как правило, восстановлен даже в темноте, и его достаточно, чтобы обеспечить электронами все взаимодействующие с ним ферментные системы (Фд- НАДФ-оксидоредуктазы, НиР, ГОГАТ, сульфитредуктазу и тиоредоксинре- дуктазу). Более того, нитрит, будучи акцептором электронов, участвует в поддержании редокс-статуса компонентов ЭТЦ, стимулируя нециклический электронный транспорт. Кроме того, нитрит конкурирует за электроны с кислородом и, вероятно, препятствует появлению токсических активных форм кислорода. Возможно также, что увеличение чувствительности к фотоингибированию у хлоропластов растений, испытывающих азотное голодание, обусловлено отсутствием значительного стока электронов на восстановление NO2.
Таким образом, процессы фотоассимиляции СО2 и NO2 не конкурируют за восстановительные эквиваленты в хлоропластах. Отсутствие конкуренции между двумя этими базовыми процессами находится в полном соответствии с тем, что обычно наблюдается в естественной среде: снабжение азотом усиливает рост и, следовательно, общую фиксацию СО2.
Взаимодействие и регуляция процессов ассимиляции углекислоты и азота в хлоропласте существует также на уровне притока субстратов (СО2, NOJ, а-кетоглутаровая кислота) и удаления продуктов ассимиляции (глутаминовая кислота, ФГА). Одним из главных факторов регуляции образования нитрита в цитозоле выступает доступность восстановителя в виде НАДН (см. выше). Если источником восстановителя служат фотосинтетические реакции, то восстановительная сила поступает в цитозоль из хлоропласта за счет выноса ФГА или дигидроксиацетонфосфата и их окисления до ФГК с образованием НАДН и АТФ. У С4-видов растений особое значение имеет челночный транспорт оксалат (ЩУК) — малат.
Транспорт нитрита из цитозоля в хлоропласт регулируется через светозависимые изменения pH, концентрации Mg + и образование АТФ в ФС1, а также через редукцию NO2; вероятно, это и есть то самое место, где контролируется процесс усвоения окисленного азота в хлоропласте.
Данных о сколь-либо существенном синтезе а-кетоглутаровой кислоты в хлоропласте нет. Транспорт а-кетоглутарата в хлоропласт происходит одновременно с экспортом глутамата и с участием двух транслокаторов. Перенос а-кетоглутарата активируется в присутствии NH4, NO2 и дикарбоновых кислот (малата, сукцината, фумарата). Большая часть метки |4С-а-кетоглутарата включается в глутаминовую кислоту, экспортируемую из хлоропласта. При этом только незначительное количество глутамина выходит из хлоропласта.
Таким образом, взаимодействие фотосинтеза и азотного обмена в хлоропласте может опосредованно регулироваться доступностью образующихся вне хлоропласта нитрита и а-кетоглутарата, возникновение которых в цитозоле связано с реакциями дыхания.
Нитрат — регуляторная молекула. Нитрат проявляет свойства сигнальной молекулы для многих ферментов и процессов. Сигнальная функция нитрата проявляется в быстром (в течение 0,5 — 1 ч) увеличения уровня мРНК индуцируемых генов при низких концентрациях нитрата порядка 10 — 250 мкМ даже в присутствии ингибиторов белка. Так у Arabidopsis идентифицировано более 40 генов, индуцируемых нитратом. В табл. 6.5 приведен далеко не полный перечень генов, индуцируемых нитратом.
Таким образом, на физиологическом уровне ион NO3 выступает индуктором путей ассимиляторного усвоения нитрата и перепрограммирует метаболизм С на создание восстановительного потенциала и углеродных субстратов для путей ассимиляции.
Нитрат также влияет на формирование и рост боковых корней. Локальные аппликации нитрата к корню при его дефиците индуцируют локальную пролиферацию боковых корней. Данный эффект сохраняется у мутантных по HP растений, т. е. не связан с метаболизацией NO3. С другой стороны, постоянно высокие концентрации NO3 в среде приводят к уменьшению частоты боковых корней. Наиболее вероятно, что это обусловлено неидентифицированным фактором, поступающим из надземных органов, где нитрат преимущественно накапливается (рис. 6.48). Таким образом, NO3-сигнал экзогенной или эндогенной природы «модулирует» рост и морфологию корня.
О путях восприятия и передачи NOз-cигнaлa известно мало. Действие сигнальной молекулы обычно начинается со взаимодействия с рецептором. Такой белок-рецептор для нитрата не выявлен. Предполагается, что в передачу сиг-
Таблица 6.5. Некоторые гены, регулируемые нитратом (механизм передачи сигнала неизвестен)
Физиологическая функция
Гены
-Белок
Регуляция в листьях
Регуляция в корнях
Поглощение нитрата
NRT1
NOj'-трапспортер высокого сродства
+
NRT2
КОз"-транспортер низкого сродства
+
Ассимиляция нитрата
NIA
Нитратредуктаза
+
+
NIR
Нитритредуктаза
+
+
Ассимляция аммония
DLN1
Пластидная ГС
+
+
GLN2
Цитозольная ГС
+
+
GLU
ГОГАТ
+
+
Метаболизм
РРС
ФЕП
+
+
органических кислот
PKs
Цитозольная пиру ватки наза
+
+
СС
Цитратсинтаза НАДФ"
+
+
ICDH1
Изоцитратдегидрогеназа
+
+
Окисл ительно- восста-
PGD
6 -фосфоглюконат
9
+
новител ьный потенци-
дегидрогеназа
ал (метаболизм)
FNR
Ферредоксин:
НАДФ-оксидоредуктаза
9
+
FD
Ферредоксин
?
+
Биосинтез крахмала
AGPS
АДФ-глюкоза пирофосфорилаза (регуляторная субъединица)
—
?
Плазмалемма
Системное ингибированиеСистемное ингибированиеФормирование и рост боковых корнейФормирование и рост боковых корнейНитратный транспортерНитратный транспортерГипотетический рецептор нитратаГипотетический рецептор нитратаЭкзогенный NO3Экзогенный NO3, тстимуляция „ ,►Неизвестные ——- --► ANRI-гены ч\ стимуляция, тстимуляция „ ,►Неизвестные ——- --► ANRI-гены ч\ стимуляция/ Локальная стимуляция Гены / вторичного ответа/ Локальная стимуляция Гены / вторичного ответа
Системное ингибирование
Системное ингибирование
Формирование и рост боковых корней
Формирование и рост боковых корней
Нитратный транспортер
Нитратный транспортер
Гипотетический рецептор нитрата
Гипотетический рецептор нитрата
Экзогенный NO3
Экзогенный NO3
, тстимуляция „ ,
►Неизвестные ——- --► ANRI-
гены ч
\ стимуляция
, тстимуляция „ ,
►Неизвестные ——- --► ANRI-
гены ч
\ стимуляция
/ Локальная стимуляция Гены / вторичного ответа
/ Локальная стимуляция Гены / вторичного ответа
Другие гены первичного ответа (например, HP иНиР)
Рис. 6.48. Схема регуляции нитратом формирования боковых корней
нала включены ионы Са2+, фосфатазы и киназы. Был идентифицирован также ген ANR1, гомологичный фактору транскрипции MADS-box. Этот ген быстро и специфично индуцируется ионом NO3 в корнях растений, голодавших по азоту. Если экспрессия этого гена заблокирована, то образование латеральных корней под действием нитрата не происходит.
СЕРА
Растения, как первичные продуценты серосодержащих органических соединений, наряду с микроорганизмами, играют ключевую роль в круговороте серы в биосфере. Поглощение серы растениями происходит в основном из почвы в виде иона SO4". После поглощения сульфат-ион может накапливаться в тканях корней и надземных органов в невосстановленном виде. Восстановление сульфата, необходимое для включение серы в состав органических соединений, происходит в пластидах, преимущественно в хлоропластах.
Серосодержащие органические соединения
Сера в первую очередь необходима для синтеза и регуляции количества и качества производимого растениями белка, так как входит в состав двух серосодержащих аминокислот: цистеина и метионина, различающихся по положению серы в молекуле.
СООН
I
hc-nh2
СООНсн2
II
hc-nh2сн2
СН2S
II
SHсн3
ЦистеинМетионин
Цистеин — главный продукт ассимиляторного восстановления серы и ключевой компонент биосинтеза белка, глутатиона и фитохелатинов. SH-группы цистеиновых остатков участвуют в образовании ковалентных, водородных, меркаптидных связей, поддерживающих трехмерную структуру белковой молекулы. Свободные тиоловые группы определяют каталитическую активность многих ферментов, например взаимодействие белка с коферментом. Четыре SH- группы, хелатируя атом железа, формируют железосерные центры в белках— компонентах электрон-транспортных цепей энергопреобразующих мембран.
Метиониновые остатки придают молекуле белка гидрофобные свойства, что важно при стабилизации активной конформации белковой молекулы. S-адено- зилметионин участвует в реакциях трансметилирования. Метионил-тРНК выступает инициатором роста полипептидных цепей. Донором S для биосинтеза метионина является цистеин.
Из наиболее функционально важных серосодержащих органических молекул следует назвать ацетилкоэнзим А (ацетил-СоА), липоевую кислоту, биотин, тиаминпирофосфат (витамин BJ. SH-группа коэнзима А образует высокоэнергетическую тиоэфирную связь с ацильными группами кислот. В частности, ацетил-СоА служит переносчиком ацетильной группы в реакциях биосинтеза жирных кислот, углеводов и аминокислот. Ряд вторичных соединений образуется из цистеина при замещении и окислении сульфгидрильной группы, например аллиины и а-аминоакриловая кислота. Серу содержат многие растительные масла, в том числе горчичное и чесночное. У растений серосодержащие вторичные метаболиты широко представлены в семействах Liliaceae, Brassiaceae, Mimosaceae.
Поглощение и транспорт сульфата
Поглощение сульфата корнями в широком диапазоне концентраций описывается двухфазной кривой. Механизм транспорта — симпорт с протоном со стехиометрией 3H+/SO4 . При диссипации протонного градиента поглощение SO4" снижается.
Молекулярно-генетический анализ выявил семейство генов транспортеров сульфата на плазмалемме. Белки семейства сульфатных транспортеров различаются по сродству к SO4- и различным образом экспрессируются. По крайней мере, можно говорить о двух типах транспортных систем: высокого сродства — Sultrl, или ST1 (Кт ~ 10 мкМ), и низкого сродства — Sultr2, или ST2 (Кт ~ 100 мкМ), с молекулярной массой 69—75 кДа. ST1 экспрессируются исключительно в корнях, ST2 — как в корнях, так и в листьях. Предполагаемая структура белков сульфатных транспортеров —12 мембраносвязанных доменов, типичных для катионных симпортеров, С- и N-концы обращены в цитозоль. В отличие от фосфатного транспортера центральная аминокислотная петля, обращенная в цитозоль, отсутствует. Время полуобновления белков сульфатных транспортеров невелико — примерно 2,5 ч, и это делает возможным контроль за поглощением на уровне транскрипции. Главным фактором индукции ST1 выступает сульфатное голодание, а синтез de novo ST2 в этой ситуации выражен слабо или отсутствует.
Хотя транспорт сульфата в вакуоль значителен, сульфатные транспортеры на тонопласте пока не идентифицированы. Известно, что поток SO4 в вакуоль зависит от электрохимического потенциала на тонопласте, механизм транспорта в этом случае — унипорт, а движущей силой выступает электрический градиент на этой мембране. Таким образом, транспорт SO4- через плазмалем- му и тонопласт принципиально различается.
Ассимиляторное восстановление сульфата
Активация сульфата. АТФ-сульфурилаза. Первоначально относительно инертный сульфат активируется: пирофосфорильная группа АТФ под действием фермента АТФ-сульфурилазы замещается сульфатом, в результате чего образуются аденозин-5'-фосфосульфат (АФС) и пирофосфат (ФФ„) (рис. 6.49, реакция 7). АТФ-сульфурилаза представлена двумя сходными по структуре и ки-
NH2
N
-N
O’
o=s=o
О’
Сульфат
фф,
АТФ
А ТФ-сульфурилаза
АТФ ФФ„
о
о
АФС-сулъфо-трансферазаили АФС-редуктаза
Г-SH S'-АМФ
о
о
О
O-S-O-P-O-CH;
N'
O-S-O-P-O-CH2
О
О’
О
О’
12
4a
Нефермента-тивная стадия
Г-SH r-ss-r
G-S-S-O-
О
46
O’
o=s
он он
Аденозин-5'-фосфосульфат (АФС)
АФС-киназа
2 /I
АТФ
О"
NH2
о=с-сн-сн2—он
Серинацетил-трансфераза6
nh2
АДФ
Серин
О
■N
Сульфо-трансферазы3
СоА—S—С—СН3 Ацетил-СоА
О
R-O-S-O’
R—ОН З'-Фосфо-
О
н [ о он
аденилат О-Сульфатированные соединения
О’-Р=О
О"
З'-Фосфоаденозин-5'-фосфосульфат (ФАФС)
Сульфит-редуктаза
ФДвосст ФДоК
О’
Сульфит
О’ NH2
5
- S2’ Сульфид
7
О-Ацетил-серинлиаза
о
О=С-СН-СН2—О-С-СНз ^
СоА—SH
О-Ацетилсерин
Ацетат
О’ мн2 I I
О=С-СН-СН2— S’
Цистеин
Рис. 6.49. Реакции (7— 7) ассимиляторного восстановления сульфата
Рис. 6.50. Схема строения и работы АФС-редуктазы.
Две молекулы восстановленного Г—SH передают 2е" на тиоредоксинподобный домен. Электроны по градиенту окислительно-восстановительного потенциала переходят на редуктазный домен и затем передаются на АФС. В результате выделяются свободный сульфит и окисленный глутатион. Пояснения в тексте
нетике реакции изоформами: пластидной и цитозольной. Обе формы есть и в листьях, и в корнях. В тканях корня активность фермента всегда ниже, чем в листьях. В пластидах образование АФС предшествует ассимиляторному восстановлению серы. В цитозоле АФС в дальнейшем может быть использован в реакциях сульфатирования. Реакциям сульфатирования предшествует образование 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфата (ФАФС), катализируемого АФС-киназой (рис. 6.49, реакция 2). Именно ФАФС является донором SO4” в реакциях сульфатирования (рис. 6.49, реакция 3), катализируемых сульфотрансферазами, локализованными преимущественно в цитозоле. Но ФАФС наряду с АФС может быть и субстратом для ферментативного восстановления.
Первый этап восстановления сульфата до сульфита до сих пор не считается окончательно установленным. По доминирующей гипотезе восстановление (рис. 6.49, реакции 4а, 46) проходит две стадии: перенос сульфата с АФС на глутатион Г—SH с образованием S-сульфоглутатиона, катализируемый АФС-суль- фотрансферазой (4а), и неферментативное восстановление S-сульфоглутатиона за счет Г—SH с образованием Г—SS—Г и выделением сульфита (46).
Комплементарная ДНК (кДНК) пластидной АФС-сульфотрансферазы была выделена и клонирована у зеленых морских водорослей и арабидопсис. По структуре фермент оказался близок к тиолзависимым редуктазам (но не к сульфотрансферазам) и был назван АФС-редуктаза. Он состоит из трех доменов: на N-конце локализован транзитный пептид, который удаляется после транспорта белка в хлоропласт; далее следует собственно редуктазный домен, гомологичный ФАФС-редуктазам бактерий; на С-конце расположен тиоредоксинподобный домен (рис. 6.50). Однако в тиоредоксинподобном домене последовательность аминокислот между двумя функционально активными молекулами цистеина типична для глутаредоксина. Именно эта последовательность определяет окислительно-восстановительный потенциал системы. Поэтому С-домен АФС-редуктазы функционирует как глутаредоксин, а не тиоредоксин. Установленный факт объединения редуктазы и кофактора в одном белке позволил сформулировать новую гипотезу: реакция восстановления сульфата до сульфита катализируется белком АФС-редуктазой и состоит в переносе двух электронов от двух молекул восстановленного глутатиона через тиоредоксинподоб-
ный домен на АФС, при этом выделяются свободный сульфит и окисленный глутатион:
АФС + 2E-SH -* SO2" + 2Н+ + F-SS-Г + АМФ
Таким образом, АФС-сульфотрансфераза и АФС-редуктаза — названия одного и того же фермента.
Второй этап восстановления. Сульфитредуктаза. На втором этапе сульфит восстанавливается до сульфида (бе") под действием сульфитредуктазы (см. рис. 6.49, реакция 5). Донором электронов служит ФдВОСст
SO32" + 6Фдвосст —- S2" + 6Фдок
Фермент локализован в пластидах и кодируется одним геном, который экспрессируется как в зеленых, так и в гетеротрофных тканях. Сульфитредуктаза растений — гемопротеин, состоящий из 2 или 4 идентичных субъединиц с мол. массой 64—71 кДа каждая. Подобно нитритредуктазе каждая субъединица сульфитредуктазы содержит один сирогем и один железосерный кластер (4Fe-4S).
В отличие от АФС-редуктазы количество мРНК сульфитредуктазы в клетке практически не меняется и не зависит от доступности сульфата или количества восстановленных соединений серы в клетке. Сродство фермента к SO2 очень высокое (Кт = 10 мкМ), и это позволяет не накапливать токсичный для клетки сульфит.
Различают две изоформы сульфитредуктазы: в листьях — ферредоксинзави- симую, в корнях — ферредоксин-НАДФ+-зависимую. Восстановление сульфита в хлоропластах обеспечивается энергией света, а в пластидах корней восстановителем служит НАДФН из пентозофосфатного окислительного цикла
Биосинтез цистеина. Совместная работа серинацетилтрансферазы и О-аце- тилсеринлиазы обеспечивает превращение серина в цистеин. Включение S2' в цистеин — последний этап ассимилятор но го восстановления серы. Сульфид передается на О-ацетилсерин при участии фермента О-ацетилсеринлиазы (см. рис. 6.49, реакция 7). О-Ацетилсерин образуется из серина и ацетил-СоА в реакции, катализируемой серинацетилтрансферазой (см. рис. 6.49, реакция 6). Цистеин — первый продукт восстановления сульфат-иона. Его концентрация в растительных тканях поддерживается на постоянном и довольно низком уровне (10 мкМ). Считается, что Г—SH играет главную роль в регуляции размеров пула свободного цистеина.
В упрощенном виде последовательность реакций ассимиляторного восстановления сульфата представлена на рис. 6.51.
Регуляция ассимиляции сульфата осуществляется на разных уровнях и различными путями, которые сильно отличаются от регуляции нитратного и углеродного метаболизма. Восстановление сульфата преимущественно обеспечивается энергией фотосинтеза, но строго от света не зависит. Восстановление Фдок может обеспечивать окислительный пентозофосфатный цикл. Пул восстановленного глутатиона, необходимый для работы АФС-редуктазы в пластидах, обычно не меняется Более того, хотя активность восстанавливающих серу ферментов увеличивается в несколько раз после освещения растущих в темноте растений, эти же ферменты активны и в этиолированных растениях, тогда как нитратредуктаза и Рубиско не экспрессируются в этиолированных растениях. И наконец, в отличие от ферментов ассимиляции нитрата и углерода
Реакции сульфатированияРеакции сульфатированияРис. 6.51. Схема ассимиляторного восстановления сульфатаРис. 6.51. Схема ассимиляторного восстановления сульфата
Реакции сульфатирования
Реакции сульфатирования
Рис. 6.51. Схема ассимиляторного восстановления сульфата
Рис. 6.51. Схема ассимиляторного восстановления сульфата
ферменты ассимиляции сульфата не проявляют суточных колебаний активности.
Более значимый фактор регуляции ассимиляции серы — стадия развития растения. Все ферменты ассимиляции серы активны в молодых листьях и кончике корня, и их активность заметно падает в более старых тканях. Ассимиля- торное восстановление идет там, где велика потребность в цистеине и метионине для белкового синтеза.
Распределение SO4" между двумя клеточными компартментами (вакуолью и хлоропластом) — важный этап в регуляции усвоения сульфата. Концентрация сульфата в хлоропласте строго контролируется. При выращивании ячменя на среде с концентрацией сульфата 200 — 250 мМ концентрация SO4 в листьях увеличивалась в 10 раз: с 5 —10 до 60—70 мМ. Концентрация же сульфата в хлоропластах листьев ячменя увеличивалась при этом только в два раза: с 4— 5 до 10 — 12 мМ. Избыток поступающего в листья сульфата эффективно транспортируется в вакуоль — основной сульфатзапасающий компартмент, где его концентрация может достигать 100 мМ.
При сульфатном голодании увеличивается активность всех ферментов, вовлеченных в последовательность реакций усвоения сульфата, особенно — АФС- редуктазы. Количество мРНК для этих ферментов повышается параллельно с повышением активности. Индукция АФС-редуктазы хорошо выражена в корнях и в меньшей степени в листьях.
Глутатион и его производные
Глутатион — один из главных небелковых тиоловых продуктов ассимиляторного восстановления сульфата в растительной клетке. Его содержание достигает миллимолярных значений, что значительно превышает микромоляр-
ные концентрации цистеина. Г—SH — трипептид, состоящий из остатков глутаминовой кислоты, цистеина и глицина (у-глутамилцистеинилглицин). В отличие от животных у растений химические формы глутатиона разнообразнее: у некоторых бобовых это гомоглутатион (у-глутамилцистеинил-р-аланин), а у злаковых — у-глутамилцистеинилсерин и у-глутамилцистеинилглутамат.
Биосинтез глутатиона. Г—SH синтезируется в двух последовательных АТФ- зависимых реакциях, катализируемых у-глутамилцистеинсинтетазой (7) и глу- татионсинтетазой (2) (рис. 6.52).
Эти ферменты обнаружены в цитозоле и хлоропластах и обладают примерно одинаковой активностью. Регуляция биосинтеза осуществляется на первой стадии. С одной стороны, скорость реакции 1 зависит от доступности цистеина, с другой — у-глутамилцистеинсинтетаза ингибируется Г—SH по принципу обратной связи.
Функции глутатиона. Глутатионовый пул восстановленной серы в количественном отношении самый большой, а в функциональном — разноплановый.
Г—SH — запасная и транспортная форма серы у растений. Например, Г— SH транспортируется из щитков кукурузы в развивающиеся корни и побеги, из зрелых листьев в молодые листья и корни у растений Ricinus, при созревании плодов грейпфрута идет перераспределение глутатиона из листьев в плоды и т.д. Происходит обмен Г—SH между ксилемой и флоэмой.
■у-Глутамилцисте- инсинтетаза1■у-Глутамилцисте- инсинтетаза1АТФ АДФ + ФнАТФ АДФ + ФнСистема 2Г—SH/Г—SS—Г работает на поддержание окислительно-восстановительного потенциала в клетке за счет взаимопревращений дитиол ^^ дисульфид. В норме глутатионовый пул на 95 % представлен восстановленной
■у-Глутамилцисте- инсинтетаза
1
■у-Глутамилцисте- инсинтетаза
1
АТФ АДФ + Фн
АТФ АДФ + Фн
соон соон II
h2n-c-h + h2n-c-h
сн2сн2
СН2SH
соон
Глутатион- синтетаза2Глутатион- синтетаза2АТФ АДФ + Ф„АТФ АДФ + Ф„Глутамат Цистеин
Глутатион- синтетаза
2
Глутатион- синтетаза
2
АТФ АДФ + Ф„
АТФ АДФ + Ф„
н н н О нсоон
I I I II II
— HOOC-C-C-C-C-N-C-COOH + h2n—с—н
III III
H2N н н н сн2н
SH
у-ГлутамилцистеинГлицин
н н н О но нI I I II I II I— HOOC-C-C-C-C-N-C-C-N-C-COOHIII II IIh2n н н н сн2 н н
SH
Глутатион
Рис. 6.52. Схема биосинтеза глутатиона.
Г—SH синтезируется в двух последовательных АТФ-зависимых реакциях, катализируемыху-глутамилцистеинсинтетазой (/) и глутатионсинтетазой (2)
Рис. 6.53. Редокс-контроль, или поддержание окислительно-восстановительного потенциала, в клетке за счет взаимопревращений дитиол/дисульфида
формой. Баланс ферментативно сдвинут в сторону Г—SH за счет активности глутатионредуктазы (ЕС 1.6.4.2), донором е" служит НАДФН (рис. 6.53). Пул восстановленного глутатиона поддерживает в активном состоянии многие белки- ферменты в разных клеточных компартментах: цитозоле, строме хлоропластов, матриксе митохондрий. Когда баланс сдвигается в сторону окисленного глутатиона, ферменты переходят в неактивное состояние в результате образования дисульфидных связей по цистеиновым остаткам.
Защитная функция Г—SH и некоторых глутатионзависимых ферментов (глу- татионтрансферазы (ГТазы), формальдегиддегидрогеназы, глиоксилазы, глутатионпероксидазы, глутатионэстеразы, глутатионизомеразы и др.) проявляется в детоксикации электрофильных низкомолекулярных соединений эндогенного происхождения и ксенобиотиков, в первую очередь гербицидов. Глу- татионтрансферазы катализируют конъюгацию электрофильных и часто гидрофобных токсических соединений с глутатионом, образуя нетоксичные производные пептида, которые изолируются в вакуоли:
R-X + Г-SH — Г-S-R + НХ
При стрессовых ситуациях увеличиваются биосинтез и содержание восстановленного глутатиона. И злаки, и широколиственные древесные растения с высоким содержанием и активностью ГТаз более устойчивы к действию гербицидов.
О производных Г—SH в вакуоли на основе субстратов эндогенного происхождения известно мало. Ими могут быть антоциановые пигменты, флавоноиды, растительные гормоны.
Фитохелатины. Г—SH является предшественником фитохелатинов (ФХ) — защитников растений от высоких концентраций тяжелых металлов: Cd, Zn, Pb и др. Фитохелатины — семейство низкомолекулярных пептидных лигандов (у-Глу-Цис)„-Гли (я = 2 — 5), которые образуют комплексы с ионами тяжелых металлов и в таком виде транспортируются в вакуоль.
Например, чувствительность к кадмию проявляется в неспособности накапливать фитохелатины. У неустойчивых к кадмию мутантов арабидопсиса cad2 с мутацией по гену у-глутамилцистеинсинтетазы концентрация Г—SH снижена на 70 — 85 %, хотя растения при нестрессовых условиях выглядят нормальными. При экспозиции на Cd2+ мутанты cad2 могут синтезировать фитохелатины в количестве только 10 % по сравнению с диким типом в тех же усло-
виях и в итоге погибают. Другой чувствительный к кадмию мутант арабидоп- сис — cadi — не способен к синтезу фитохелатинов (не обнаруживается активность ФХ-синтазы), но синтез глутатиона у него не нарушен. Таким образом, устойчивость к высоким концентрациям тяжелых металлов обусловлена именно ФХ. Фитохелатирование служит механизмом удаления тяжелых металлов в вакуоль или биоминерализацией.
КАЛЬЦИЙ
Содержание кальция в растениях составляет 0,5 —1,5 % от массы сухого вещества, но в зрелых тканях кальциофильных растений может достигать 10%. Надземные части накапливают на единицу массы больше кальция, чем корни. Химические свойства кальция таковы, что он легко образует достаточно прочные и в то же время лабильные комплексы с кислородными лигандами макромолекул. Кальций может связывать внутримолекулярные сайты белков, приводя к изменению конформации, и образовывать мостики между лигандами липидов и белков в мембране или пектиновыми соединениями в клеточной стенке, обеспечивая стабильность этих структур. Физиология обмена ионов Са2+, реализация его функций имеют ряд особенностей по сравнению с другими катионами. К ним относятся: низкая цитоплазматическая концентрация Са2+, ограниченная уровнем -10 7 М; низкая метаболическая подвижность, что выражается в низкой скорости накопления, транспорта из клетки в клетку, ограниченного флоэмного транспорта и слабой реутилизации; безусловная и значимая необходимость Са2+ для функционирования апопласта; ограниченная роль Са2+ как непосредственного энзиматического кофактора; исключительная роль Са2+ как вторичного посредника в регуляции сложных метаболических взаимодействий, связанных с ростом и развитием, и ответных реакций растительного организма на различные воздействия. Описания нарушений в этих процессах, вызванных дефицитом Са2+, относятся к классическим исследованиям физиологии растений.
Распределение Са2+ в структурах клетки.Функциональное значение компартментации
У растений кальций распределяется между большим числом компартмен- тов клетки, чем у животных. Но подобно другим организмам, у растений концентрация Са2+ в цитоплазме (|Са2+]цит) и ядре поддерживается на уровне, который на 3—4 порядка величин ниже, чем в других клеточных структурах (табл. 6.6). Предполагают, что низкая концентрация Са2+ в цитозоле — следствие работы возникшего на самых ранних этапах эволюции приспособительного механизма «выкачивания», который обеспечивал поддержание в клетке- организме уровень Са2+ ниже, чем в морской воде.
Наибольшая часть Са2+ запасается в клеточной стенке и вакуоли (табл. 6.6), где его концентрация варьирует от I до 10 мМ. В апопласте кальций клеточной стенки образует мостики между карбоксильными группами и таким образом участвует в создании эффективного двойного слоя зарядов и способствует образованию доннановского потенциала (см. рис. 6.10 и 6.11). Буферные свойства
Компартмент клетки
Концентрация
Цитоплазма
100-200 нМ
Ядро
10-20 нМ
Вакуоль
1 — 10 мМ
Клеточная стенка
1 — 10 мМ
Эндоплазматический
~1 мМ
ретикулум
Хлоропласт, пластида
~1,5 мМ
Митохондрия
~1 мМ
Таблица 6.6. Распределение Са2+ в растительной клеткеТаблица 6.6. Распределение Са2+ в растительной клеткеапопласта, поддержание pH в клеточной стенке, проницаемость и структурная стабильность плазмалеммы также в значительной мере связаны с Са2+. Доля Са2+ апопласта от общего содержания в тканях может достигать 50 % и при уменьшении доступного кальция в среде его доля в апопласте обычно возрастает. В вакуоли Са2+ находится в виде солей фосфата, карбоната, органических кислот или в соединении с танни- нами. При повышенном снабжении поступление Са в вакуоль увеличивается. Поскольку вакуоль занимает 90 — 95 % клеточного объема, подавляющая часть
Таблица 6.6. Распределение Са2+ в растительной клетке
Таблица 6.6. Распределение Са2+ в растительной клетке
кальция может находиться именно в этом компартменте. Фактор концентрирования Са2+ в вакуоли может достигать величины порядка 10s по сравнению с цитозолем. Один из способов выведения Са2+ из цитозоля и в целом из обмена — образование в вакуоли и апопласте кристаллов оксалата кальция, нерастворимых в воде.
Хранилищем, из которого Са2+ вновь поступает в цитозоль, является и эндоплазматический ретикулум (ЭР), где его концентрация составляет, по косвенным данным, 1 мМ (табл. 6.6). Цистерны аппарата Гольджи и везикулы также могут быть местом накопления и высвобождения кальция. В митохондриях и хлоропластах концентрация кальция значительно превышает концентрацию в цитозоле, что не связано с функцией изоляции Са2+, но необходимо для протекания в этих органоидах окислительно-восстановительных процессов и фотохимических реакций.
Системы транспорта кальция
- Содержание кальция в отдельных структурах клетки регулируется с участием Са2+-помп и Са2+-каналов (рис. 6.54). Градиент электрохимического потенциала для Са2+ на плазмалемме (ПМ), тонопласте (ВМ) и мембране ЭР таков, что поступление Са2+ в цитозоль происходит по каналам пассивно, а удаление с участием помп — с затратой энергии.
Низкая концентрация кальция в цитозоле — необходимое условие для функционирования Са2+ в качестве универсального посредника при передаче информации. Реализация функций мессенджера связана с очень малыми его потоками через мембраны. Разнообразные стимулы (гормоны, свет, механические воздействия, гипоосмотики и окислители, засуха, низкая и высокая температура, Nod- фактор, сигналы межклеточных взаимодействий, гравиотропизм и др.) через быстрое изменение потенциала клеточной мембраны приводят к открыванию Са2+-каналов и возрастанию его концентрации в цитозоле. Возвращение концентрации Са2+ к стационарному уровню покоя обеспечивается работой Са- АТФаз. Такое изменение концентрации Са2+ в цитозоле названо нестационарным, или переходным (transient), состоянием. Локальное и часто кратковременное увеличение концентрации Са2+ в цитозоле действует как сигнал,
5S5S««Са2+-АТФаза ПМЗСа2+-АТФаза ПМЗООСа2+-АТФаза ПМ1Са2+-АТФаза ПМ1ЭРЭР[Са2+] = 1мМ[Са2+] = 1мМСа2 -АТФаза ЭРСа2 -АТФаза ЭРЭРУОСа2+-канЭРУОСа2+-канИФ3 Са2+-канИФ3 Са2+-канЦитозоль [Са2+]=100-200нМ[ИФ3]Цитозоль [Са2+]=100-200нМ[ИФ3]VD-мех Са2+-канVD-мех Са2+-канVD Са2+-канVD Са2+-канМакси «Кат»-канМакси «Кат»-канСа2+-АТФаза ПМ2Са2+-АТФаза ПМ2Вакуоль ВИФ3 Са2+-канВакуоль ВИФ3 Са2+-кан
5
S
5
S
«
«
Са2+-АТФаза ПМЗ
Са2+-АТФаза ПМЗ
О
О
Са2+-АТФаза ПМ1
Са2+-АТФаза ПМ1
ЭР
ЭР
[Са2+] = 1мМ
[Са2+] = 1мМ
Са2 -АТФаза ЭР
Са2 -АТФаза ЭР
ЭРУОСа2+-кан
ЭРУОСа2+-кан
ИФ3 Са2+-кан
ИФ3 Са2+-кан
Цитозоль [Са2+]=100-200нМ[ИФ3]
Цитозоль [Са2+]=100-200нМ[ИФ3]
VD-мех Са2+-кан
VD-мех Са2+-кан
VD Са2+-кан
VD Са2+-кан
Макси «Кат»-кан
Макси «Кат»-кан
Са2+-АТФаза ПМ2
Са2+-АТФаза ПМ2
Вакуоль ВИФ3 Са2+-кан
Вакуоль ВИФ3 Са2+-кан
ФЛ «С»
S кS кН+-АТФазаН+-АТФаза5 к5 кННСа Са2+/Н+-АПСа Са2+/Н+-АПцАДФРиб Са2+-кан [Са2+] = 1-10мМцАДФРиб Са2+-кан [Са2+] = 1-10мМSVD Са2+-канSVD Са2+-кане к ее к епмпмBVDBVD[Са2+]цитСа2+-кан[Са2+]цитСа2+-канООСтимул |Стимул |пмпм
S к
S к
Н+-АТФаза
Н+-АТФаза
5 к
5 к
Н
Н
Са Са2+/Н+-АП
Са Са2+/Н+-АП
цАДФРиб Са2+-кан [Са2+] = 1-10мМ
цАДФРиб Са2+-кан [Са2+] = 1-10мМ
SVD Са2+-кан
SVD Са2+-кан
е к е
е к е
пм
пм
BVD
BVD
[Са2+]цит
Са2+-кан
[Са2+]цит
Са2+-кан
О
О
Стимул |
Стимул |
пм
пм
Рис. 6.54. Основные системы транспорта Са2+ в мембранах растительных клеток. Слева представлены Са2+-помпы (по Evans, Williams, 1998; Geisler et al., 2000; Hirschi, 2001); справа — Са2+-каналы (no Fox, Guerinot, 1998; Sanders et al., 1999; White, 1998, 2000;
Blatt, 2000):
ПМ — плазмалемма; В — вакуоль; BM — вакуолярная мембрана; ЭР — эндоплазматический ретикулум; АП — антипортер; кан — канал; VD (voltage-dependent) — потенциалзависимый (потенциалуправляемый); Рец — рецептор; G-бел — регуляторные G-белки плазмалеммы, состоящие из субъединиц а, р, у; ФЛ «С» — фосфолипаза «С»; ФИФ2 — фосфоинозитол-4,5- бисфосфат\ИФ3 — инозитол-(1,4,5)-фосфат; цАЦФРиб — циклическая АДФ-рибоза; (+) — активация соответствующими лигандами. Са2+-помпы: Са24 АТФазы P-типа (ПМ1, ПМ2 и ПМЗ) и ЭР-типа; антипортер — Са24/Н4-АП. Потенциалзависимые (кальциевые каналы) (VD Са2+-кан): на ПМ: макси «Кат»-кан — неспецифичный макси-катионный канал; VD Са24-кан — Са2+-спе- цифичный; УВ-мехСа24-кан — механочувствительный канал (активируется гиперполяризацией); на вакуолярной мембране: BVD Са24-кан — потенциалуправляемый (активируется гиперполяризацией), SVD Са 4-кан — медленно (slowly) активируемый деполяризацией; на мембране ЭР локализован 3PVD Са24-кан. Лигандо-управляемые кальциевые каналы: на ВМ: ИФ3-активируе- мый ВИФ3 Са 4-кан; цАДФРиб-активируемый, предположительно имеющий рецептор рианодина цАДФРиб Са 4-кан; на ЭРМ: рецептор-управляемый канал — ИФ3Са2+-кан (более подробную характеристику см. в тексте)
передающий информацию от поверхности клетки внутрь. Кальциевый сигнал может усиливаться за счет дополнительного выхода Са2+ в цитозоль из вакуоли или ЭР.
Са2+-помпы. Выкачивание Са2+ из цитозоля осуществляют Са2+-АТФазы, которые принадлежат к большому семейству АТФаз P-типа, и Са2+/Н-анти- портеры.
Са2+-АТФазы растений и животных подразделяют на помпы: ПМ (или ПВ)- типа, стимулируемые кальмодулином (КаМ), и ЭР (или ПА)-типа, которые непосредственно КаМ не стимулируются. У растений в отличие от животных Са -АТФазы ПМ-типа локализованы не только на плазмалемме (Са2+-АТФаза ПМ1), но и на эндомембранах (Са2+-АТФаза ПМ2 и ПМЗ) (рис. 6.54). Са2+- АТФазы ЭР-типа также присутствуют как на мембране ЭР, так и на тонопласте. На тонопласте, помимо Са2+-помпы, функционирует Са2+/Н+-антипортер. Выкачивание Са2+ из цитозоля с участием антипортера сопряжено с работой вакуолярной Н+-АТФазы, для которой гомеостатирование кальция считается конститутивной функцией. Более того, вакуолярная Н+-АТФаза, пирофосфатаза (Н+-ПФаза) и Са2+/Н+-антипортер совместно участвуют в поддержании pH и ионного гомеостаза в цитозольном и вакуолярном компартментах. Некоторые Са2+-АТФазы и Са2+/Н+-антипортеры идентифицированы на генном уровне.
Итак, Са2+-помпы выполняют несколько важных функций. Наряду с центральной — поддержание низкой концентрации кальция и создание фона для возникновения кальциевого сигнала — они обеспечивают создание пулов Са2+ в апопласте, вакуоли, ЭР, откуда он может контролируемо возвращаться в цитозоль. Функционирование Са2+-АТФаз, связанное с восстановлением [Са2' |11ИТ до уровня покоя, одновременно обеспечивает завершение переходного состояния и, таким образом, формирование Са2+-сигнала (см. подразд. 6.3.4.3).
Са2+-каналы. Кальциевые каналы подразделяют на две группы: потенциалзависимые (VD — voltage-dependent) и рецепторуправляемые, или лигандозависимые. К настоящему времени изучены электрические и биохимические свойства, регуляция и физиологическая роль ряда кальциевых каналов из разных мембран растений, но пока не осуществлена их идентификация на генетическом уровне.
В плазмалемме клеток, главным образом корней и замыкающих клеток устьица, обнаружено несколько VD Са2+-каналов, которые могут быть подразделены на каналы, активируемые при деполяризации и при гиперполяризации плазмалеммы. К первому классу относится так называемый «макси-катионный канал» (рис. 6.54), который имеет высокую проводимость единичного канала, но малоселективен. Он пропускает К+, Na+, Ва+, Mg2+, Мп+ и некоторые другие ионы, хотя вход Са2+ через этот канал при физиологических концентрациях ионов, видимо, доминирует. Другой Са-канал, также активируемый при деполяризации (VD Са2+-канал), более селективен для Са2+, но имеет меньшую проводимость. Неселективные каналы, очевидно, служат основными воротами поступления кальция в клетку из внешней среды, например в корнях, или из апопласта в устьичные клетки листа. В класс VD Са -каналов плазмалеммы, активируемых при гиперполяризации, входят механочувстви- тельные (stretch-activated) каналы разных типов, в том числе и Са-канал замыкающих клеток устьица, который регулируется АБК, — VD-мех Са-канал (рис. 6.54). У других клеток подобные каналы также могут иметь большое значение в восприятии тургора, например при удлинении корневого волоска и пыльцевой трубки.
На тонопласте функционируют потенциалзависимые каналы, активирующиеся при гиперполяризации — BVD Са2+-канал и при деполяризации — медленный (slowly) SVD Са2+-канал (рис. 6.54). Оба типа VD-каналов не являются
строго специфичными для Са2+ и проницаемы также для Mg2+, К+; SVD Са2+- канал проницаем также и для Na+, Rb+, Cs+. Выход Са2+ через SVD Са2+- канал активируется, помимо потенциала, при увеличении [Са2+]цит и регулируется другими факторами (pH, концентрацией других ионов, соотношением [Са2+]цит/[Са2+]вак, КаМ, 14-3-3-белками и, возможно, состоянием фосфорилированное-дефосфорилированное). Функции SVD Са2+-канала связывают с осморегуляцией и поддержанием гомеостаза. Кроме того, через этот канал происходит Са2+-индуцируемое высвобождение Са2+ из вакуоли (CICR — Са2+ induced Са + release), что приводит к увеличению его концентрации в цитозоле и вносит вклад в специфичность сигнала (см. подразд. 6.3.4.3).
Из вакуоли Са2+ выходит также через рецепторуправляемые каналы, которые открываются при рецепции вторичных мессенджеров: инозитол-1,4,5-фосфата (ИФ3 — инозитолтрифосфат) или циклической АДФ-рибозы (цАДФриб) (рис. 6.54). С активацией этих вакуолярных каналов связаны ответные реакции на гиперосмотический (ВИФ3 Са2+-кан) и холодовой (цАДФриб Са2+-кан) шок. В ответ на действие АБК при закрывании устьиц активируются оба эти канала.
В мембране ЭР также присутствуют потенциал- и лигандозависимые Са2+- каналы. Одним из первых каналов ЭР мембраны растений был охарактеризован потенциалзависимый механочувствительный канал (3PVD Са2+-кан) (рис. 6.54) из усиков переступня двудомного {Bryonia dioica) (назван ВСС1 — Bryonia calcium channal). Предполагают, что ВСС1 регулируется через изменение концентрации кальция в люмене ЭР, хотя pH цитозоля также влияет на его активность. С ИФ3 Са-каналом ЭР мембраны связывают увеличение [Са2+]цит и передачу информации в растущей пыльцевой трубке.
Итак, в растительной клетке в ответ на действие разных стимулов увеличивается концентрация кальция в цитозоле, что является Са2+-сигналом для передачи информации. Первичными источниками изменений концентрации являются Са -каналы с разными пропускными характеристиками, разными способами регуляции и расположенные на плазмалемме и эндомембранах. Разнообразие путей входа Са2+ в цитозоль вместе с разнообразием путей выхода (Са +-помпы) создают большую гибкость в контроле за его потоками как в пространстве клетки, так и во времени, и обеспечивают возникновение специфического Са -сигнала, локализованного в связи с участием каналов разных типов в определенных участках клетки.
Са2+ и системы внутриклеточной сигнализации
Изменение программ роста и развития, контроль метаболизма и формирование ответных реакций на действие условий среды происходят вследствие передачи сигналов на белки-мишени или в геном по сложной сети информационных (сигнальных) путей. В клетке информация передается цитозольным структурам и компартментам через изменения концентраций множества вторичных мессенджеров (посредников), которые действуют в той или иной сигнальной системе вместе с кальцием или самостоятельно. Однако Са2+ в комплексной сети передачи информации (transduction) служит универсальным посредником, поскольку ни один вторичный мессенджер не реагирует на столь большое число стимулов, как свободный Са2+ цитозоля. Включение Са2+ в широкую сеть сигнальных путей, которые передают послания от разных сти-
мулов (внешних и внутренних) и заканчиваются соответствующими ответными реакциями, поднимает вопрос о том, каким образом в растительной клетке с участием одного и того же мессенджера достигается специфичность сопряжения стимула и ответа.
Специфичность Са2+-сигнала. Исходно в основе специфичности кальциевой сигнализации лежит компетентность клетки, ее функциональное предназначение. Способность реагировать на определенные стимулы и формировать соответствующий ответ зависит от экспрессии генов, кодирующих компоненты каскадного пути передачи конкретного сигнала в соответствующих клетках. Комплекс характерных свойств клетки, определяющий особенность ее сигнальной системы, получил название «физиологического адреса», который различается у разных клеток (например, у замыкающих клеток устьиц и трихо- бластов корня). Информация от стимулов, включая силу их воздействия, первоначально кодируется в кальциевом сигнале, отражающем характер возрастания концентрации Са + в цитозоле ([Са2+])цит. Это переходное (транзитное) состояние может иметь вид всплесков, волн, пульсаций или осцилляций, плато, градиента или быть сочетанием этих проявлений (рис. 6.55). Основные варьирующие параметры Са -сигнала, которые могут быть оценены количественно, это: уровень увеличения [Са2+]цит; продолжительность лаг-периода от момента воздействия до начала подъема [Са2+]; продолжительность подъема, нахождения на высоком уровне и возвращения к уровню покоя. Сигнальная информация может быть закодирована в амплитуде и частоте осцилляций (пульсаций), а также их регулярности. Даже самое общее сравнение характера Са2+-сигналов при действии разных стимулов (рис. 6.55) свидетельствует об их разнообразии: кратковременное (холодовой шок) или очень продолжительное (красный свет) увеличение [Са +]цит; появление двухфазной кинетики переходного состояния (гипоосмотический шок) или образование градиента концентрации Са2+ (растущий корневой волосок). Кинетика изменения концентрации Са2+ может меняться в зависимости от силы и продолжительности действия стимула. Однако только в редких случаях величина изменения [Са2+]цит и конечная ответная реакция на стимул коррелируют со степенью его воздействия. Это обусловлено множеством причин, в частности тем, что стимул (фактор) в своем действующем начале имеет две составляющие: само воздействие (физическое, химическое или комплексное) и параметры времени. При холодовом шоке, например, увеличение уровня [Са2+]цит (которое начинается сразу) (рис. 6.55, 7) зависит не от абсолютного значения низкой температуры, а от скорости ее снижения. При действии многих стимулов увеличение [Са2+] в цитоплазме связано с осцилляциями (пульсациями), которые имеют определенную амплитуду и частоту и могут повторяться через менее или более регулярные интервалы (рис. 6.55, 4, 6). Характер осцилляций также определяет специфику Са-сигнала.
Разнообразие свойств и способов регуляции Са2+-каналов является основой, обеспечивающей взаимодействие путей передачи сигналов с участием разных посредников. Идентифицирован ряд вторичных мессенджеров, которые связаны с возникновением и спецификой Са2+-сигнала (ИФ3, цАДФриб, Н+ и др.). Инозитол-1,4,5,-фосфат — конечный продукт превращения минорного компонента плазмалеммы фосфатидилинозитола (ФИ), но непосредственным предшественником ИФ3 является ФИФ2 (ФИ-4,5-бисфосфат) (см. рис. 6.54). При рецепции определенных стимулов активируются регуляторные G-белки
Стимул
Ответная реакция
Характер возрастания [Са2+]цит (подъем—высокий уровень—спад)
1. Холодовой шок
Экспрессия генов COR, KIN-1; синтез пролина; изменения состава липидов; акклимация к холоду
\Кратковременное
увеличение: 0-(4-5)-30(с)
2. Гипоосмоти- ческий шок
Осмоадаптация
Двухфазная
/А /динамика:
30—60 —150(c)
1 1 мин
3. Красный свет
Фотоморфогенез
/Продолжительное стацио-
/нарное состояние:
30-150—420 (мин) сигнал
4. АБК и потенциал на мембране
Закрывание устьиц
.Осцилляции с большим
jv\периодом (мин) и центро-
V \МА У стремительная волна
Г(не указана), которая рас/пространяется 5—10 с и
11 Mlojрелаксируется за 40—50 с
5. Сигналы межклеточного взаимодействия
Полярный рост кончиком корневого волоска
. Са2+-АТФаза
—ф^Са2-канал
Л Продолжительный ^ и устойчивый градиент с максимумом у кончика
6. Nod-фактор
Скручивание корневых волосков, образование клубеньков
Продолжительное
X увеличение через 5 мин С22^Т и осцилляция в области
1Т ядра
ядро
Рис. 6.55. Особенности переходного состояния [Са2+]цнт в зависимости от стимулов (по данным: 1 — Malho et al., 1998; Plieth et al., 1999; 2 — Malho et al., 1998; Cessna et al., 1998; 3 — Malho et al., 1998; Legue et al., 1997; 4 — Grabov, Blatt, 1998; Staxen et al., 1999; Blatt, 2000; Hamilton et al., 2000; 5 — Bibikova et al., 1997; Wymer, Bibikova, 1997; 6 — Cardenas et al., 1999, 2000).
Время в секундах (с) или минутах (мин) указывает па продолжительность:подъема —высокого уровня —спада [Са2+]цит; стрелкой отмечен момент воздействия
плазмалеммы, в результате этого диссоциирует их а-субъединица, активирующая фосфолипазу С (ФЛ «С»). Активированная ФЛ «С» гидролизует ФИФ2 с
образованием двух вторичных мессенджеров: 1,2-диацетилглицерола (ДАГ) — активатора протеинкиназы С и ИФ3 — регулятора активности Са2+-каналов эндомембран (его считают основным участником формирования Са2+-волны). Другой распространенный вторичный мессенджер животных и растительных клеток — цАДФриб также действует как сигнальная молекула, активирующая выход Са2+ из эндогенных депо.
Поступление кальция в цитозоль через рецепторуправляемые Са2+-каналы эндомембран вносит дополнительный (к притоку Са2+ извне) вклад в увеличение [Са2+]цит и приводит к возникновению и поддержанию осцилляций (например, в базальной части растущей пыльцевой трубки, при осмотическом стрессе, при действии АБК в замыкающих клетках устьица) (рис. 6.55, 4\ Таким способом сигнальная информация не только кодируется по амплитуде и частоте всплесков, но с помощью осцилляции сигнал усиливается и меняется по продолжительности, что обеспечивает регуляцию его передачи во времени.
Специфичность Са2+-сигнала обусловлена также его локализацией в клетке и, если это касается такой формы сигнала как градиент или волна, — вектором их распространения. Разный характер увеличения концентрации Са2+ в цитозоле может быть результатом его поступления из разных депо (апопласт, вакуоль, ЭР) через разнообразные Са2+-каналы, а снижение [Са2+]циТ при возвращении к уровню покоя (новый уровень может не совпадать с исходным) за счет работы Са2+-АТФаз разных мембран (см. рис. 6.54). В клетках, растущих кончиком (трихобласт, пыльцевая трубка и др.), сигналом ориентированного роста служит градиент с высокой концентрацией Са2+ в растущем кончике (см. рис. 6.55, 5). Основой поддержания этого градиента является пространственное разделение входа Са2+ в цитозоль по Са2+-каналам плазмалеммы в зоне активного роста кончика и выкачивания Са2+-АТФазами плазмалеммы и эндомембран в базальной части клетки корневого волоска. При воздействии Nod-фактора, вызывающего образование азотфиксирующих клубеньков у бобовых, кальций также поступает извне через Са2+-каналы кончика корневого волоска (см. рис. 6.55, 6). Но Са2+-сигнал проявляется как быстро нарастающее увеличение [Са2+]цит и всплески в области ядра, что приводит к скручиванию корневого волоска и смене программ дифференциации и функционирования.
Образование всплесков, осцилляций, волн, градиентов концентрации Са2+ цитозоля, их разнообразных субпроизводных и сочетаний, а также различия в динамике и локализации изменений [Са2+]цит отражают комплексность системы формирования Са2+-сигнала в каждой отдельной клетке. Возникающий в ответ на определенный стимул Са2+-сигнал настолько специфично кодирует информацию, что получил название Са2+-подписи (Са2+ signature). Подобный специфичный Са2+-сигнал — первый этап возникновения специфичной ответной реакции.
Пути передачи Са2+-сигнала. Зашифрованная информация для достижения нужных белков-мишеней, определяющих ответ на стимул, передается по сигнальным путям благодаря образованию комплексов кальция со специальными белками. К группе регуляторных белков растений, связывающих Са2+, относят-
ся: кальмодулин — КаМ (СаМ — calmodulin); Са2+-зависимые протеинкиназы — Са2+-завПК (CDPKs — calcium dependent protein kinases) и Са2+/КаМ-зависи- мые протеинкиназы — Са2+/КаМ ПК (CCaMKs — calcium and calmodulin dependent protein kinases) (рис. 6.56). Эти белки имеют специальные места связывания Са2+, называемые EF-руками. Термин возник из обозначения двух ос-спиралей, Е и F, являющихся частью Са2+-связывающего центра. Часто белки, имеющие подобные домены связывания кальция, называют, как группу регуляторных белков, «EF-рука».
Со +-завПКзы принадлежат к одной из групп суперсемейства протеинкиназ (ПК) эукариотических клеток. ПКазы катализируют обратимый перенос фосфата с АТФ на боковые участки аминокислот белковой цепи. Функции ПК могут быть обращены действием протеиновых фосфатаз (ПФФ). Реакции фосфорилирования-дефосфорилирования оказывают значительное воздействие на активность белков и их взаимодействие с другими белками. Са2+-завПКазы имеют три функциональных домена — каталитический, автоингибиторный и С-тер- минальный кальмодулинподобный регуляторный домен с четырьмя EF-руками, связывающими Са2+. Это позволяет считать Са2+-завПКазы (как и КаМ) первичными сенсорами путей передачи Са2+-сигнала (рис. 6.56, 4а, 46). Впервые Са +-завПКзы были обнаружены у растений и простейших и пока не найдены в клетках дрожжей и животных. Считают, что у растений большая часть киназной активности, которая стимулируется кальцием, связана именно с Са2+- завПКазами (меньшая — с Са2+/КаМ ПКазами и КаМ). Обнаружено множество изоформ Са -завПКаз (у Arabidopsis идентифицировано более 40 изоформ). Это ставит вопрос о функциях этих изоформ. Есть основание полагать, что разные изоформы могут «специализироваться» на узнавании Са2+-сигналов. Постоянно пополняемый список белков-мишеней для Са2+-завПК включает транспортные белки мембран (Н+АТФазу ПМ, калиевые и анионные каналы замыкающих клеток устьиц, аквапорины и др.), ферменты (сахарофосфатсинтазу (СФС), фосфоенолпируваткарбоксилазу (ФЕПК), нитратредуктазу (HP), фосфатиди- линозитолкиназу и др.), факторы транскрипции, элонгации, белки цитоскелета и другие мишени (рис. 6.56, 5). Таким образом, Са2+-завПК включены в передачу Са2+-сигнала, связанную с поддержанием мембранного потенциала, регуляцией углеводного и азотного обмена, устьичными движениями, ответами на стрессовые воздействия, формированием архитектуры клетки и т.д.
Однако, по-видимому, полная активация фермента при фосфорилировании с участием Са -завПКаз возможна, если к регуляторному участку одновременно присоединяется 14-3-3-белок. Оба компонента включены в передачу сигнала и функционируют как адапторы, шапероны, активаторы и репрессоры. Они участвуют в регуляции активности СФС, HP, ФЕПК, что обеспечивает согласованное функционирование этих ферментов в условиях дня и ночи. 14-3-3-белкам приписывается также роль обеспечения взаимосвязи между различными путями передачи сигналов, которые вызываются разными, действующими одновременно стимулами (экзогенными и эндогенными).
Кальмодулин (КаМ) относится к семейству белков «EF-рука» и является наиболее распространенным Са2+-связывающим белком, который играет центральную роль у всех организмов. Растительные КаМ — высококислые белки с молекулярной массой 14 кДа, локализованные в цитозоле (обнаружены в ядре и, возможно, прикреплены к плазмалемме). КаМ эукариотных организмов
обладает большой консервативностью: аминокислотные последовательности белка растений идентичны КаМ позвоночных и дрожжей на 90 и 60 % соответственно. Но у растений, в отличие от животных, обнаружены мультигенные семейства КаМ-родственных генов, экспрессия которых индуцируется физическими (касание, тепловой и холодовой шок, темнота-свет) и химическими (ауксин, NaCl) стимулами. Индуцированная экспрессия некоторых из этих КаМ-генов опосредована увеличением [Са2+]цит (рис. 6.56, 4в\ Предполагается, что характер их экспрессии, заканчивающийся появлением изоформ КаМ (рис. 6.56, 6), и/или конечные мишени сигнального пути (рис. 6.56, 5, 5а, 5в)
Рис. 6.56. Общая схема путей передачи Са2+-сигнала на мишени и ответная реакция растительной клетки на разные стимулы (Н.Д. Алехина, 2004):
Рев; — рецепторы на плазмалемме и эндомембранах; [Са2+] — концентрация Са2+; КаМ и Са +-КаМ — кальмодулин и его комплекс с Са '; Са +-завПК и ПФФ — Са ^-зависимые проте- инкиназы и протеинфосфатазы; Са '/КаМ ПК, ПФФ — кальций и кальмодулинзависимая про- теинкиназа, ПФФ; (+++) — деполяризация мембран; 1—6 — последовательность событий при восприятии стимула, возникновении Са '-сигнала и путей его передачи (downstream transduction): 1 — рецепция различных абиотических (свет, холод, температура, гипоксия, засуха, ветер, механические воздействия и др.) и биотических (фитогормоны, патогены, симбионты и др.) стимулов, изменение мембранного потенциала (+ + +) и активация Са '-каналов; 2 — инфлакс Са ' через каналы в цитозоль из внешней среды и внутриклеточных депо и кратковременное увеличение [Са ']„„,; 3 — выкачивание Са ' благодаря работе Са '-помп, окончание переходного состояния [Са ']цит; 4 — связывание Са ' с первичными сенсорами (4а — Са '-завП Казани и ПФФазами; 46 — образование комплекса Са '-КаМ; 4в — индукция синтеза КаМ); 5 — активация белков-мишеней: 5а, 56 — при каскадной передаче через активацию Са '/КаМ ПК или ПФФ; 5в — регуляция экспрессии генов через Са '-КаМ-комплекс или с участием Са '/КаМ ПФФ; 6 — общие ответные реакции на стимул (быстрые или более медленные, если включается геном)
различаются в зависимости от стимула. Таким образом, наличие изоформ КаМ значительно расширяет возможности адресной доставки сигнала. КаМ и комплекс Са2+-КаМ не обладают свойствами фермента и включаются в передачу сигнала и регуляцию клеточных процессов, присоединяясь к белкам-мишеням. Связывающий кальций центр КаМ имеет структуру спираль—петля — спираль. Петля, где связывается Са2+, состоит из 12 аминокислот и ограничена с С- и N-концов а-спиральными участками, состоящими также из 12-14 аминокислот и обозначенными буквами Е и F. Разные Са2+-связывающие белки могут иметь разное число центров для связывания Са2+. Кальмодулины растений имеют четыре функциональные «EF-руки» с Са2+-связывающими доменами. Связывание Са2+ при увеличении его концентрации в цитоплазме вызывает пространственную переориентацию аминокислот в петле и а-спиралях и переупаковку этих центров, связывающих Са2+, в структуре всего КаМ-белка. Передача сигнала становится возможной, если эти конформационные перестройки «узнаются» белками-мишенями, которые, в конечном итоге, преобразуют изменения концентрации Са2+ в цитозоле в ответ на специфический сигнал (рис. 6.56, 5).
Концентрация КаМ в цитозоле может составлять 5 — 20 мкМ и варьирует в разных типах клеток. Это предполагает вероятность конкуренции за КаМ между КаМ-связывающими белками, что может играть роль в детерминировании клеточного ответа на увеличение [Са2+]цит. Взаимодействие между Са +-КаМ и КаМ-регулируемыми белками главным образом гидрофобное, и даже незначительные модификации последовательностей на гидрофобном прикрепляющем участке КаМ могут лишить его возможности активировать белки-мишени.
Важное отличительное свойство Са2+-КаМ-комплекса — способность связываться с большим числом разнообразных белков-мишеней. Са -КаМ-комплекс активирует непосредственно или через модификацию реакций фосфорилирования-дефосфорилирования много больше 100 белков. У животных идентифицировано более 30 ферментов и других белков, которые регулируются Са-КаМ. В растительной клетке таких белков идентифицировано и охарактеризовано значительно меньше. Са2+-КаМ-зависимыми являются: Са +-АТФазы
II В-типа; SV — вакуолярный катионный канал; НАД-киназа, глутаматдекарбоксилаза, супероксиддисмутаза; миозин V, киназин; ПКазы и ПФФаза 2В, белки кончика корня и некоторые другие (см. рис. 6.56, 5, 5а\
Мишенями, на которые передаются Са2+-сигналы, часто являются транспортные системы, в том числе Са2+-помпы. Са2+-АТФазы II В-типа обеспечивают регуляцию [Са2+]цит, необходимую для возникновения Са2+-сигнала, определяют характер переходного состояния, связанный с завершающей стадией, и в то же время сама их активность регулируется с участием Са2+-КаМ. Са2+-АТФазы II В-типа являются компонентами не только плазмалеммы, но и эндомембран (см. рис. 6.54), и, возможно, локализованы в оболочке ядра. КаМ регулирует активность Са2+-помпы, связываясь на автоингибиторном домене С-конца, что меняет пространственное расположение этого участка и снимает его блокирующее действие. У растительных Са2+-АТФаз (по крайней мере у некоторых: АСА2 — Arabidopsis Са2+-АТФазы, локализованной на мембране ЭР, и SCA1 — soybean Са2+-АТФазы, локализованной на ПМ) КаМ-связывающий домен находится не на С-конпе, а на N-терминале. У растений, как и у животных, КаМ-зависимые Са2+-АТФазы эндоплазматического ретикулума могут быть ведущими в регуляции и поддержании осцилляций и волны [Са2+]цит.
Комплекс Са2+- КаМ может включаться в каскадную передачу Са2+-сигнала, взаимодействуя с киназами, относящимися к группе кальций/кальмодулинза- висимых протеинкиназ (Са/КаМ ПК) (см. рис. 6.56, 5а\ Эти ПК имеют не четыре, как Са2+-завПК и КаМ, а три «EF-руки» на регуляторном домене. Са2+- КаМ связывается на сайте автоингибиторного домена, вследствие чего, как предполагают, происходит активирование Са2+/КаМ-протеинкиназы, которые могут выполнять специальные функции в каскадной передаче сигнала. Это обусловлено их субстратной специфичностью, субклеточной локализацией и чувствительностью к кальцию, которые не совпадают с подобными характеристиками у Са2+-завПК. Параллельно с митогенактивируемыми протеин киназами (МАПК) Са2+/КаМ-протеинкиназы регулируют экспрессию гена, фосфорилируя фактор транскрипции при получении Са2+-сигнала (см. рис. 6.56, 5в\
Действие протеинкиназ может быть нейтрализовано или обращено проте- инфосфатазами. По существу, именно баланс фосфорилирования—дефосфорилирования белков регулирует многочисленные реакции и процессы в клетке и включен в систему передачи сигналов. ПФФазы (как и ПКазы) подразделяют на две большие группы по субстратной специфичности аминокислот (се- рин/треонин либо тирозин) в сайте, где связывается и отщепляется фосфатная группа. В группу Сер/Тре ПФФ входит четыре семейства, среди которых ПФФазы 2В-типа являются Са2+-КаМ-зависимыми. Сведений о ПФФазах значительно меньше, чем о ПКазах. Установлено, что они не только выполняют функции контрагентов киназ, но также играют ведущую роль во многих сигнальных каскадах: при передаче сигнала от АБК на ионные каналы в замыкающих клетках устьиц, при стрессовых ответах на патогены, при регуляции роста корневого волоска, при свето- и гравиотропизмах и т.д.
У животных наиболее изучена Са2+-КаМ ПФФаза кальцийнейрин (КН). В клетках A. taliana также обнаружена ПФФаза, подобная КН. Она взаимодействует с Са2+-КаМ и активируется при возникновении Са2+-сигнала. КН — гетеродимер, состоящий из консервативной каталитической субъединицы A-типа (объединена с одной из вариабельных субъединиц) и регуляторной субъединицы
В-типа (КНВ, где В — буква латинского алфавита). В корнях и стебле арабидоп- сиса присутствует 6 изоформ КНВ, синтез одной из них активируется при действии засухи, холода, ветра. Наличие изоформ у КНВ и КаМ значительно увеличивает число возможных комбинаций при их совместном регулировании активности белков-мишеней, расширяя спектр специфичности ответов.
Функция КНВ может быть связана с прикреплением фермента к цитоскелету или мембране: это определит место в пространстве, где будет проявляться дефосфорилирующая активность. Предполагают, что КН может являться одним из компонентов трансдукона — большого комплекса разнообразных белков плазмалеммы, включенных в каскад стимул-ответ. Например, трансдуксон может служить системой поддержания и регуляции тургора и объединять рецепторы, вторичные мессенджеры, К+- и Са2+- и анионные каналы, Са-ПКазу и КН, Са2+-АТФазу и КаМ, если помпа активирована. Подобный трансдукон может быть включен в разнообразные двигательные реакции растений (устьичные движения, тропизмы, настии и т.д.). Возможно, КН — один из компонентов механизма контроля ионных потоков из среды в корни.
С реакцией дефосфорилирования связывают еще одну важную функцию — декодирование информации, зашифрованной в виде пиков и осцилляций кальциевого сигнала. Модель дешифровки этой информации предполагает совместное функционирование ПКаз и ПФФаз, имеющих разную кинетику Са - зависимой активации.
Итак, передача Са2+-сигнала на белки-мишени может происходить разными путями с участием первичных сенсоров (Са2+-ПКазы, КаМ) либо по более длинным каскадным путям (см. рис. 6.56). При этом через КаМ, ПК и ПФФ, имеющих множество изоформ, осуществляются специфическое декодирование Са2+-сигнала и передача информации к нужному белку-эффектору (мишени). Часто белками-мишенями становятся Са -каналы, Са -АТФазы и другие ионные каналы и помпы. Мишенями для сигналов, передаваемых по различным Са2+-зависимым сигнальным путям, могут быть отдельные ферментные системы, цитоскелетные белки, белки факторов транскрипции и др. (см. рис. 6.56).
Ответные реакции, связанные с Са-сигнализацией, ранее подразделяли на быстрые, происходящие на пост-трансляционном уровне, и медленные, связанные с экспрессией генома. В настоящее время быстрый и медленный ответы рассматриваются как разные стадии одного общего процесса адаптивной модификации метаболизма. Связанная с экспрессией генома Са +-сигна- лизация часто сочетается с гормональной регуляцией процессов, это еще больше осложняет расшифровку сети разных путей передачи сигнала в клетке.
КАЛИЙ
Условия внешней среды, в которых существуют растения, часто меняются и могут вызывать дисбаланс их внутренней среды. Однако для протекания метаболических процессов необходимо поддерживать относительно постоянными клеточный объем, осмотическое давление, трансмембранный потенциал, равновесие зарядов, катионно-анионный баланс, pH — все то, что составляет гомеостаз клеток и тканей. В поддержании гомеостаза исключительная роль принадлежит калию.
Неизвестно ни одного органического соединения, куда К входил бы как составляющий элемент, но в ионной форме он присутствует во всех органах, тканях и структурах клетки в концентрациях, превышающих концентрацию других ионов. Свойство нетоксичности высокой концентрации К+ является определяющим в выполнении его функций, но еще не получило своего объяснения. Накопление К+ в растении зависит от его концентрации в среде, но в надземных органах его содержание выше, чем в корнях (см. табл. 6.3 — контроль).
Концентрация калия в цитозоле, хлоропластах и митохондриях составляет 100—250 мМ. Калий этого пула не может быть замещен другими катионами, например Na+. В вакуоли он выполняет роль осмотика; его концентрация варьирует от 10 до 200 мМ и может достигать 300—500 мМ в замыкающих клетках открытого устьица, в клетках, связанных с тургорными движениями, а также в клетках в фазе роста растяжением. Осмотическая функция калия в какой-то мере может быть заменена накоплением в вакуоли других осмотиков. В апопла- сте концентрация К+ низкая за исключением апопласта специализированных клеток устьица, листовых подушечек и др
Системы транспорта К и их характеристика
Реализация функций калия возможна благодаря его высокой подвижности и активному распределению по клеточным и тканевым компартментам и между различными частями растения. Поддержание высокой концентрации К+ и доставка к местам действия связана с его транспортом через клеточные мембраны, радиальным и дальним перемещением и циркуляцией по растению (см. рис. 6.29). Поглощение калия из среды может происходить с участием переносчиков и каналов по механизму / (активный транспорт высокого сродства к К+), действующему при его низкой наружной концентрации, и по механизму II, осуществляющему пассивный перенос транспортерами с низким сродством к К+ (см. рис. 6.16, Л). Использование метода пэтч-кламп позволило установить наличие в плазмалемме входящих К+-каналов, активируемых при гиперполяризации мембраны, т.е. при Е, более отрицательном, чем потенциал покоя. Это предполагает, что вход К* может происходить при его микромолярной концентрации в среде по градиенту цк+ против очень большого концентрационного градиента и не сопряжен с энергизацией мембраны и выходом Н+. Это не соответствует прежним представлениям о переносчиках как системах, которые осуществляют активный транспорт при низкой внешней концентрации К+, и каналах, переносящих калий пассивно при более высоком его содержании в среде.
Исходя из важной роли систем поступления калия для обеспечения растений этим элементом многие исследования были сфокусированы на выяснении механизмов и молекулярной основы высокоаффинных (High-affinity) и низкоаффинных (Low-affinity) транспортных систем. Выяснено, что транспортеры типа переносчиков и К+-входящие каналы типа KIRC (К* inwardly rectifying conductance) могут иметь как высокое, так и низкое сродство к К+, проявлять разную степень специфичности к иону и быть конститутивными или индуцируемыми. Ряд переносчиков и каналов растительных мембран, включенных в поглощение К+, идентифицирован на генном уровне.
Белок HvHAKl (Hordeum vulgare high-affinity К’) из корней ячменя имеет 12 трансмембранных участков и относится к большому консервативному семей-
ству высокоселективных К+-переносчиков с некоторыми свойствами канала (или наоборот), имеющих высокое сродство к К+. HvHAKl транспортирует К+, вероятно, в симпорте с Н+. Кроме ячменя, гомологичные HvHAKl-2 транспортеры найдены в корнях пшеницы, риса и арабидопсиса, что дает основание считать этот переносчик основной системой поглощения К+ при низкой концентрации в среде. У Arabidopsis thaliana изолировано несколько изоформ переносчика К+.
I Один из них — AtKUPl (A. taliana 1С uptake), экспрессируемый в корнях, имеет высокое и низкое сродство к К+. Следовательно, этот транспортер вносит вклад в поглощение К+ не только при низких, но и при высоких концентрациях. HAK/KUP-транспортеры найдены также в бактериях, грибах и у человека.
Другой класс переносчиков — НКТ1 (high-affinity К* transporter), исходно клонированный из пшеницы, осуществляет транспорт по механизму очень высокого сродства (Кт = 3 мкМ) в симпорте К+: Na+ (при внешней концентрации Na+ в мкМ) или симпортирует только натрий Na+:Na+ (при внешней концентрации Na+ в мМ). Гомологи НКТ1 найдены у ячменя, риса и A. thaliana. Возможно, функцией НКТ1 скорее всего является поступление Na+, а не К+.
К каналам, участвующим в поступлении К+ из среды, относят селективный канал АКТ1 (Arabidopsis К+ transporter) из корней A. thaliana. Этот KIRC-канал экспрессируется преимущественно в зрелых клетках эпидермиса, коры и эндодермы. Интересным свойством АКТ1 является высокое сродство к К+ в присутствии иона NH4. Уровень экспрессии АКТ1 не меняется при калиевом голодании и, очевидно, он вносит вклад в конститутивное поступление К+. При высокой внешней концентрации К+ АКТ1 функционирует по механизму II низкого сродства, но, видимо, не является основной системой входа К+ в этих условиях. Таким образом, один и тот же переносчик AtKUPl или канал АКТ1 могут функционировать при разных внешних концентрациях К+ как транспортеры высокого и низкого сродства.
АКТ1, так же как идентифицированные в стелярной паренхиме A. thaliana (выходной) SKOR (см. рис. 6.18) и в замыкающих клетках устьица входной КАТ1 (IU Arabidopsis transporter) (см. рис. 6.60), относятся к членам суперсемейства калиевых каналов Shaker-типа, которые у животных функционируют только как потенциалзависимые входные Ktn-каналы.
Многообразие систем транспорта К+, в том числе связанных с поглощением из среды, может быть важным свойством, необходимым для выживания растений при большом разнообразии концентраций ионов в почве и апоплас- те и при наличии конкуренции с другими ионами, в том числе токсическими. Конститутивные и индуцибельные системы поступления высокого сродства также могут реагировать на изменения доступности и обеспечения ионами. В разных мембранах клетки (плазмалемме или тонопласте) и тканях (корневые волоски эпидермиса или ксилемная паренхима) для обеспечения многочисленных функций К+, видимо, должны экспрессироваться разные транспортеры.
Регуляция мембранного потенциала
Основная роль К+-каналов в животных клетках — регуляция и кратковременная реполяризация мембранного потенциала. В растительных клетках калий, перемещаемый через К|п- и КоиГканалы (см. рис. 6.15), также включен в
контроль мембранного потенциала. Обычно на плазмалемме поддерживается отрицательный потенциал £в пределах 100—160 — 200 мВ (см. рис. 6.13 и 6.15). Участие К+ в регуляции потенциала плазмалеммы определяется тем, что равновесный потенциал для К+ (Ек) находится в границах общего мембранного потенциала Е (см. табл. 6.1). Ек* можно рассчитать, ориентируясь на концентрации К+, которые обычно бывают внутри клетки и снаружи (в почве или в апопласте). Обычно в цитозоле высших растений концентрация калия [K+]jn находится в пределах 80 — 200 мМ. В почве и апопласте колебания концентрации калия ([K+]out) более значительные: от 0,5 до 10 мМ. Используя уравнение Нернста для К+ £к+ = 59 • log([K+]out/[K ]in), получим, что при таких вариациях наружных и внутриклеточных концентраций калия Е^ будет меняться в пределах от -60 до -150 мВ. Если при работе Н+-АТФазы мембрана гиперполяризует- ся и Е мембраны становится более отрицательным, чем Ек*, потенциалзависимые К^-каналы открываются, К+ поступает внутрь, предотвращая дальнейший сдвиг потенциала мембраны в отрицательную сторону.
Некоторые физиологические воздействия индуцируют быструю деполяризацию мембраны, например, через активацию анионных и кальциевых каналов. Если заряд мембраны при этом станет позитивнее Ек+, то это будет стимулировать открывание Кущ-каналов и выход К+ из клетки, чтобы ограничить степень деполяризации. Добавочная (с участием Са2+-завПК) активация KyUt- канала постепенно восстановит Е мембраны до более отрицательного уровня. Свойство Куш- и К*п-каналов стабилизировать мембранный потенциал универсально и является их конститутивной функцией у эукариот.
Регуляция активности ферментов и синтез белка
Активность ферментов может регулироваться изменением конформации белковых структур. Белки гидратированы, и благодаря гидратному слою поддерживается определенная стабильность конформации. Катионы, и особенно К+, при цитозольной концентрации 100— 150 мМ могут сильно менять гидратный слой, тем самым вызывая изменения конформации и активацию фермента. Известно большое количество ферментов, активность которых зависит от К+, но число энзимов, для которых показана прямая необходимость К+, невелико. Наиболее известна роль калия в активации пируваткиназы. Она катализирует последнюю реакцию гликолиза — превращение фосфоенолпирувата в пируват, связанное с образованием АТФ. Другой К+-активируемый фермент — крахмалсинтаза, осуществляющая перенос АДФ-глюкозы и присоединение глюкозы к крахмалу, что обеспечивает удлинение полисахаридной цепочки. На вакуолярной Н+-ПФазе имеется место для связывания К+ и, очевидно, он может регулировать этот фермент (см. рис. 6.14).
Такую же роль поддержания пространственной организации белков К+ выполняет на некоторых этапах их синтеза белков. Калий необходим для поддержания требуемого пространственного объединения тРНК и рибосомы при трансляции иРНК. Он нужен для проявления максимальной активности пептидилт- рансферазы, с участием которой наращивается полипептидная цепь. Изменяя через гидратацию структурную организацию мембраны, а через К+-каналы мембранный потенциал, К+ становится «ответственным» за функционирование многих белковых структур мембраны.
Осморегуляция и катионно-анионный баланс
Роль К+ в поддержании катионно-анионного баланса и осморегуляции может быть продемонстрирована на клеточном и тканевом уровне. В реакциях обмена синтезируется много органических кислот и веществ с отрицательно заряженными группами и очень мало органических веществ с щелочными свойствами (некоторые аминокислоты). Калий, преобладающий катион, вносит большой вклад в нейтрализацию как минеральных, так и органических анионов.
Дальний транспорт ионов и воды по ксилеме и флоэме связан с реализацией обеих функций калия: создания и поддержания осмотического потенциала и регуляции катионно-анионного баланса. Стель, и особенно клетки ксилемной паренхимы, — место накопления калия (рис. 6.57). Эндодерма — граница, которая делит ткани растения на две зоны: 1) кору и ризодерму, клетки которых находятся в низкосолевой среде, и 2) все остальные ткани растений, включающие стель корня и далее до листовой паренхимы, клетки которых функционируют в высокосолевом окружении апопласта (см. подразд. 6.2.3). Из симпла- ста ксилемной паренхимы (см. рис. 6.24) калий поступает в ксилему. В клетках корня A. thaliana был идентифицирован селективный, выходной К+-канал Shaker-типа (возможно, идентичен КОКС, см. подразд. 6.2.3.2). Ген этого KoUt- канала, названного SKOR (Stelar IC outward rectifier), экспрессируется в сте- лярной паренхиме корня, и у мутантов, дефицитных по этому гену, поступление К+ из корней в надземные органы сильно снижается. АБК может регулировать активность SKOR, так как установлено, что увеличение этого гормона в апопласте снижает высвобождение К+ в ксилему и его транслокацию в побеги.
Рис. 6.57. Распределение К+ в корне кукурузы (по Lauchli et al., 1971).
Представлено относительное количество К+, измеренное с помощью рентгеновского микроанализа
ХлоропластХлоропластNH2 + НАД + ОН"NH2 + НАД + ОН"НАДННАДНNO3 + К4NO3 + К4КСИЛЕМАКСИЛЕМАK+NOjK+NOjNOj + К4NOj + К4NO3 К"NO3 К"NO3" К4NO3" К4АТМОСФЕРА С°2АТМОСФЕРА С°2листлистсо2со2НСО3НСО3К++ МалатК++ МалатФЛОЭМАФЛОЭМАМалат калияМалат калияК++ МалатК++ МалатМитохондрияМитохондрияПировинограднаякислотаПировинограднаякислотаКОРЕНЬКОРЕНЬНАРУЖНЫЙ РАСТВОРНАРУЖНЫЙ РАСТВОР
Хлоропласт
Хлоропласт
NH2 + НАД + ОН"
NH2 + НАД + ОН"
НАДН
НАДН
NO3 + К4
NO3 + К4
КСИЛЕМА
КСИЛЕМА
K+NOj
K+NOj
NOj + К4
NOj + К4
NO3 К"
NO3 К"
NO3" К4
NO3" К4
АТМОСФЕРА С°2
АТМОСФЕРА С°2
лист
лист
со2
со2
НСО3
НСО3
К++ Малат
К++ Малат
ФЛОЭМА
ФЛОЭМА
Малат калия
Малат калия
К++ Малат
К++ Малат
Митохондрия
Митохондрия
Пировинограднаякислота
Пировинограднаякислота
КОРЕНЬ
КОРЕНЬ
НАРУЖНЫЙ РАСТВОР
НАРУЖНЫЙ РАСТВОР
Рис. 6.58. Циркуляция К+ при поглощении NO3 и поддержании pHпри восстановлении NO3 в листе (по Ben-Zioni et al., 1971)
Это в свою очередь приводит к увеличению концентрации К+ в клетках стели, способствует снижению водного потенциала ТН2о и удержанию воды клетками при водном стрессе. Среди ионов ксилемного и флоэмного эксудата концентрация калия самая высокая (см. табл. 6.2). Но, как и в тканях, в ксилемном соке должен сохраняться катионно-анионный баланс и, следовательно, электронейтральность. Основным котранспортируемым анионом для К+ часто является NO3. В пасоке декапитированных растений концентрация К+ и NO3 возрастала одинаково при увеличении снабжения корней этими ионами.
Но К+ не только сопровождает NO3 и другие анионы при их дальнем транспорте. Он участвует в поддержании pH в листьях. При восстановлении NO3 в цитозоле клеток листа образуются ионы ОН-, и К+ остается неуравновешенным. В результате происходит подщелачивание цитозоля, которое активирует ФЕП-карбоксилазу и синтез малата (рис. 6.58). По схеме, разработанной на растениях, у которых восстановление NO3 происходит в основном в листьях, К+ и малат" возвращаются по флоэме в корни, где малат" используется как субстрат, а К+ может вновь возвращаться в ксилемный поток или перемещаться по флоэме в кончики корней (см. рис. 6.29), обеспечивая их рост.
Таким образом, калий обеспечивает создание и поддержание эндогенной «комфортной среды» — гомеостаза, необходимой для протекания всех физиолого-биохимических процессов.
ДВИЖЕНИЯ УСТЬИЦ: ТРАНСПОРТ ИОНОВ И РЕГУЛЯЦИЯ
Наиболее ярко роль К+ как регулятора осмотического потенциала и тургора проявляется в движениях замыкающих клеток устьица. У растений С3-видбв при условиях в пределах нормы процесс устьичных движений имеет циркадный ритм: днем устьица открыты, а ночью закрыты (или полузакрыты). Но в полдень, когда возникает дефицит воды в листе, устьица могут быть частично закрыты и днем. Устьичные движения связаны с ионными потоками К+, СГ и воды из апопласта в вакуоль при открывании, и в обратном направлении — из вакуоли в апопласт при закрывании (рис. 6.59). Все потоки из апопласта идут через плазмалемму, поскольку зрелые устьичные клетки не имеют плазмодесм. У некоторых видов растений в качестве котранспортируемого с К+-аниона, либо дополнительно к СГ, либо преимущественно, используется малат, синтезируемый на свету и окисляемый при закрывании устьиц. При открывании устьичной щели поступающие в вакуоль ионы калия, концентрация которых достигает уровня 300 мМ, понижают водный потенциал, и из апопласта (частично из соседних клеток) в вакуоль по ДЧ^о поступает вода. В понижении Ч'нзО участвуют также сахара. При закрывании устьиц потоки ионов и воды направлены из клетки в апопласт. При поверхностной оценке можно посчитать, что процесс открывания и закрывания утьиц различается только по на-
Ч^о.АБК,высокая [СО2],деполяризация ПМЧ^о.АБК,высокая [СО2],деполяризация ПМСтимулы
Ч^о.
АБК,
высокая [СО2],деполяризация ПМ
Ч^о.
АБК,
высокая [СО2],деполяризация ПМ
Синий свет,низкая [СО2] в ЗКУ,внешняя ИУК,гиперполяризация ПМ
ОТКРЫВАНИЕ (2-3 ч)ОТКРЫВАНИЕ (2-3 ч)ЗАКРЫВАНИЕ (30 мин)ЗАКРЫВАНИЕ (30 мин)
ОТКРЫВАНИЕ (2-3 ч)
ОТКРЫВАНИЕ (2-3 ч)
ЗАКРЫВАНИЕ (30 мин)
ЗАКРЫВАНИЕ (30 мин)
Хлоропласт КрахмалХлоропласт КрахмалВАКУОЛЬВАКУОЛЬФГАФГАН2ОМалат", ^(ю^ГН2ОМалат", ^(ю^ГХлоропласт КрахмалХлоропласт КрахмалФЕНФЕНЩУК—* Малат" СО2+Н2ОАТФ? АДФЩУК—* Малат" СО2+Н2ОАТФ? АДФИМИМАпопластАпопластн2о(кЧсгн2о(кЧсгН2ОН2О^_ — Малат кчсг):^_ — Малат кчсг):Д\ | Сахара [у Митохондрия) ГПируватД\ | Сахара [у Митохондрия) ГПируват
Хлоропласт Крахмал
Хлоропласт Крахмал
ВАКУОЛЬ
ВАКУОЛЬ
ФГА
ФГА
Н2О
Малат", ^(ю^Г
Н2О
Малат", ^(ю^Г
Хлоропласт Крахмал
Хлоропласт Крахмал
ФЕН
ФЕН
ЩУК—* Малат" СО2+Н2О
АТФ? АДФ
ЩУК—* Малат" СО2+Н2О
АТФ? АДФ
ИМ
ИМ
Апопласт
Апопласт
н2о(кЧсг
н2о(кЧсг
Н2О
Н2О
^_ — Малат кчсг):
^_ — Малат кчсг):
Д\ | Сахара [
у Митохондрия) Г
Пируват
Д\ | Сахара [
у Митохондрия) Г
Пируват
Рис. 6.59. Потоки ионов, воды и сигналы, вызывающие открывание и закрывание за-мыкающих клеток устьица (ЗКУ):
АБК — абсцизовая кислота; ФГА — фосфоглицериновый альдегид; ФЕП — фосфоенолпируват;ЩУК — щавелевоуксусная кислота; ПМ — плазмалемма; [СО2] — концентрация СО2; ИУК —индолилуксусная кислота
правлению потоков. На самом деле и системы транспорта, и механизмы регуляции, и сигналы, запускающие эти два вида движений устьичных клеток, а также временные параметры совершенно разные. Общим у них является то, что как открывание, так и закрывание устьиц связаны с событиями, которые развиваются во времени и происходят на плазмалемме, в цитозоле, тонопласте и в вакуоли замыкающих клеток, затрагивая также апопласт и соседние клетки мезофилла.
Открывание устьиц
Существует иерархия стимулов, запускающих процессы устьичных движений (открывание-закрывание). Она основана на значимости стимулов и степени их воздействия. Главный стимул — ^н^ клеток листа, и при недостатке воды устьице закрывается или не открывается полностью. Расширение устьичной щели вызывают синий свет, низкая концентрация СО2 в самой замыкающей клетке, индолилуксусная кислота (ИУК), действующая как внешний стимул, цитокинин (см. рис. 6.59). При естественном ходе событий утром синий свет приводит к открыванию устьиц. Устьичная щель увеличивается в ответ на единственный импульс синего света, который воспринимается зеаксантином
Рис. 6.60. Регуляция светом ионных каналов при открывании устьица:
ССв — синий свет; * — сегмент тилакоида; ЗеКс — зеаксантин; ВиКс — виолаксантин; ПК — протеинкиназа (Ser/Tre-группы или фототропин); НАк — неактивная и Ак — активная формы Н+-АТФазы; ПФаза — пирофосфатаза; 14-3-3 — белок;® — фосфатная группа; ПМ — плазма- лемма; ТП — тонопласт; ' — гиперполяризация ПМ;@ — активация; |К ] — концентрация К+; VDK^-кан — потенциалзависимый входной калиевый канал, идентифицированный у араби- допсис как КАТ1, а у картофеля — KST1; БВК+, MB(Ca2t, К+) и ВК+ — быстрые, медленные, вакуолярные калиевые каналы соответственно; А”-кан — неспецифичный анионный вакуоляр- ный канал
(ЗеКс), входящим в состав пигментов светособирающего комплекса (рис. 6.60). Виолаксантин (неактивная форма) и зеаксантин (активная форма) — основные составляющие ксантинового цикла. Соотношение их концентраций зависит от pH в люмене тилакоида, величина которого модулируется работой ЭТЦ, потреблением АТФ и НАДФН, фиксацией СО2. Начинающийся на свету процесс фотосинтеза, включающий световые и темновые реакции, имеет следствием снижение pH в тилакоиде и снижение концентрации СО2 в строме. Низкий pH способствует сдвигу реакции в сторону образования рецептора синего света зеаксантина. Возможно, такая многоступенчатая связь и лежит в основе механизма открывания устьица под действием низкой концентрации СО2.
Уровень ответа на синий свет зависит от концентрации ЗеКс и числа поглощенных квантов синего света. Возбуждение ЗеКс является сигналом, который по неизвестному пока пути с участием вторичных мессенджеров передается в цитоплазму, где в результате активируется протеинкиназа «Сер-Тре»-типа. Активированная протеинкиназа фосфорилирует Н+-АТФазу плазмалеммы (см. рис. 6.14, /). К автоингибиторному участку С-конца неактивной Н+-АТФазы присоединяются фосфатная группа и 14-3-3 — белок. Н+-АТФаза становится активной и, выкачивая протоны, гиперполяризует плазмалемму. Поступление калия идет через селективный потенциалзависимый входной канал (VDK^n- кан), который активируется при гиперполяризации мембраны (см. рис. 6.60). Такой канал идентифицирован у арабидопсиса (КАТ1) и картофеля (KST1 — K+Solanum tuberosum transporter). Оба канала высокоселективны, сходны по своей активности в замыкающих клетках и электрофизиологическим характеристикам и относятся к большому семейству К+-каналов Shaker-типа (см. рис. 6.18).
Кроме механизма сопряжения работы Н+-АТФазы с активаций входного К+-канала через гиперполяризацию может действовать другой механизм регуляции, связанный с подкислением среды в апопласте за счет выкачивания Н+. В исследованиях на замыкающих клетках устьица (протопласты и снятый с листа эпидермис) показано, что снижение pH активирует входные К+-каналы плазмалеммы. Подкисление цитозоля в ответ на действие ИУК также активирует поступление К+ в замыкающие клетки. Таким образом, сенсор входного К+-канала (положительно заряженные гистидиновые остатки четвертого сегмента белка канала — см. рис. 6.18) реагирует на изменение апопластного и цитозольного pH. Вход СГ может идти через хлорный канал (С17п-кан), но вероятнее осуществляется через механизм Н+/СГ-симпорта (см. рис. 6.60).
Параллельно с поступлением в цитозоль ионы транспортируются в вакуоль. На тонопласте имеются неспецифичный анионный канал, пропускающий СГ, малат" и NO2 (см. рис. 6.15), и несколько катионных каналов, которые в большей или меньшей степени специфичны к иону К+. Они одновременно пропускают Na+, Са2+, Mg2+ и др. ионы и могут работать в режиме как «in», так и «out». О регуляции транспорта ионов в вакуоль при открывании устьиц пока известно мало. Можно предполагать, что эти каналы осуществляют поступление ионов из цитоплазмы в вакуоль в соответствии со своими электрофизиологическими характеристиками, степенью специфичности и потенциалом на мембране и становятся объектом регуляции только при закрывании устьиц. Поступление воды, по крайней мере в вакуоль, происходит через аквапорины (см. гл. 5).
Закрывание устьиц
Закрывание устьиц индуцируется понижением Ч^о, возрастанием концентрации АБК, увеличением концентрации СО2 в клетке и деполяризацией плаз- малеммы (см. рис. 6.59). Механизм закрывания устьица разработан главным образом при изучении его ответа на АБК. Совокупность «участников» и последовательность событий, которые включены в процесс закрывания устьиц, являются сложным комплексом, состоящим из двух систем: той, которая обеспечивает собственно выход из клеток К+, СГ и Н2О, и той, которая регулирует этот выход. При закрывании устьица основная роль в передаче сигнала и регуляции активности KoUt- и Clout-каналов принадлежит Са2+, однако протон также включен в регуляцию ионных потоков как независимый вторичный мессенджер. Управление через обе сигнальные системы, где мессенджерами служат Са2+ и Н+, скоординировано между собой и с регуляцией каналов посредством фосфорилирования-дефосфорилирования. События на плазмалемме, тонопласте и в цитоплазме могут следовать друг за другом (рис. 6.61, 1— 8) или совпадать по времени, но общая продолжительность закрывания устьица составляет около 30 мин.
АБК (вне- или внутриклеточная — не установлено) связывается с неиден- тифицированным рецептором плазмалеммы и/или внутренних мембран (7) и индуцирует увеличение концентрации Са2+ в цитозоле, открывая механочув- ствительный Са2+-канал, который активируется при гиперполяризации плаз-
Рис. 6.61. Модель закрывания устьица в ответ на абсцизовую кислоту (АБК).
Предполагаемая последовательность событий: 1 — рецепция АБК на вне- и/или внутриклеточном рецепторе; 2 — поступление Са2" из апопласта и увеличение [Са2+]цит; 3 — активация Са2+- каналов эндогенных мембран, дополнительное увеличение [Са2+] и кодирование сигнала; 4а — открывание Са2*-зависимого С1 -канала ПМ; 46 — ингибирование ПМН'-АТФазы; 4в — увеличение pH цитозоля; 4г — активация вакуолярной Н*-АТФазы; 5 — инактивация VDK^-канала ПМ; б — деполяризация ПМ и открывание К„и1-канала; 7 — открывание вакуолярных ВК+- и БВК*-каналов; 8 — открывание СГ-канала ТП.
ПМ — плазмалемма; ТП — тонопласт; ЭР — эндоплазматический ретикулум; МВ Са +, К+ — медленный вакуолярный неспецифичный канал; ВК+, БВК1 — вакуолярный и быстрый вакуолярный калиевые каналы; ИФ3 — инозитол-1,4,5-трифосфат; ® — рецептор АБК; () —
гиперполяризация; (+++) — деполяризация
малеммы ПМ (2). Связывание АБК приводит также к активации G-белков и образованию инозитол-1,4,5-трифосфата (ИФД, который активирует ИФ3Са2+- каналы тонопласта и мембран эндоплазматического ретикулума (5). Но, вероятно, более значительная часть кальция вакуоли поступает через канал, регулируемый цАДФРиб, который также активируется АБК (5). Это вызывает дополнительное увеличение концентрации Са2+ в цитозоле (возможно возрастание до 1 мкМ) и появление осцилляций (см. рис. 6.55, 4). Возможен выход Са2+ через медленный вакуолярный канал (МВСа2+, К+-канал), открывающийся при деполяризации тонопласта ТО и активируемый Са2+-КаМ (5) (см. подразд. 4.3.2). Этот неспецифичный канал пропускает также калий.
Высокая концентрация Са2+ в цитоплазме активирует открывание Са2+-за- висимых медленных хлорных каналов плазмалеммы (Clout-канал) (4а), которые регулируются через фосфорилирование-дефосфорилирование, и ингибирует Н+-АТФазы плазмалеммы (45). Параллельно, но независимо увеличивается pH цитозоля (4в) (от величины покоя pH 7,3 до pH 7,5 —7,7), чему способствует активация вакуолярной Н+-АТФазы (4г). Еще одно следствие увеличения [Са2+]цит и возрастания pH цитозоля — инактивация входного калиевого канала плазмалеммы (УОК|п-кан) (5). Это не оказывает существенного влияния на закрывание устьица, но, видимо, ускоряет процесс. Подщелачивание цитоплазмы и активация Оощ-канала плазмалеммы деполяризуют мембрану, результатом чего является активация К„11(-канала ПМ (6), причем выход К+ поддерживается в течение продолжительного времени.
Основная часть К+ и СГ, которые «покидают» замыкающие клетки, — это ионы вакуолярного компартмента, которые транспортируются через цитоплазму к выходным каналам плазмалеммы. Очевидно, основной поток К+, индуцируемый АБК, осуществляется через Са2+-активируемый потенциалзависимый вакуолярный К+-канал тонопласта ВК+ (7). Быстрый К+-канал БВК+ вносит меньший вклад в выход калия из вакуоли (7). Выход хлора через анионный канал тонопласта (Clout-кан) (8) регулируется Са2+-зависимой протеинкина- зой. Высвобождение К+ и СГ из вакуоли, а затем выход из замыкающей клетки изменяет АЧ^о в системе протопласт—апопласт и приводит к потере воды, падению тургорного давления в замыкающих клетках и закрыванию устьица.
Другие стимулы, такие, как СО2 и окислительный стресс, также быстро индуцируют увеличение концентрации Са2+ в цитозоле замыкающих клеток и, видимо, механизм, обеспечивающий закрывание отдельного устьица, будет похожим.
До недавнего времени считали, что все устьица одного листа ведут себя одинаково в одних условиях: все открываются утром или закрываются при водном дефиците. Но оказалось, что в интактном листе устьица часто демонстрируют поразительную пространственную и временную гетерогенность состояния открытости — закрытости. Это явление, названное «пятнистостью устьичной проводимости», заключается в том, что небольшие «пятна» (участки поверхности листа) устьиц реагируют на стимул не так, как устьица на соседнем участке. Во времени те устьица, которые были закрыты, открываются и наоборот, но предсказать их поведение невозможно. Такое кооперативное поведение пока не нашло удовлетворительного объяснения. Возможно, в его основе лежит механизм гидролитических взаимодействий, связанный с распределением в эпидермальных клетках воды, поступающей в лист по сосудам.
ХЛОР
Хлор относили сначала к полезным элементам, но в настоящее время его относят к микроэлементам. Из поглощаемых минеральных анионов только СГ не ассимилируется и остается в клетках и тканях в ионной форме. В цитозоле концентрация СГ (~3 — 10 мМ) превышает концентрацию нитрата (~1 — 5 мМ) и органического аниона — малата (~1 — 5 мМ). В вакуоли, наоборот, концентрация NO3 (10 — 80 мМ) и малата (5—100 мМ) значительно выше, чем СГ (7—40 мМ). В клетках при регуляции тургора концентрация хлора в вакуоли может достигать 50—150 мМ.
На плазмалемме и тонопласте имеются входные и выходные СГ-каналы, и этот анион очень подвижен (см. рис. 6.15). Транспорт анионов через плазма- лемму вносит существенный вклад в реализацию нескольких важных функций: 1) электрической и Са2+-сигнализации; 2) контроль мембранного потенциала и градиента pH; 3) осморегуляция. Хлор не просто участвует в выполнении этих функций наряду с другими анионами, а играет ведущую роль. Есть данные, что СГ специфически активирует вакуолярную Н+-АТФазу. Хлор вместе с калием включен в механизм устьичных движений и, если может быть заменен малатом (см. рис. 6.59), то лишь частично и не у всех видов растений. При открывании устьиц у растений, у которых малат не участвует в устьичных движениях (лук — Allium сера, кокосовая пальма — Cocos nucifera L.), перемещаются значительные количества хлора, и между потоками К+ и СГ существует строгая связь. Поэтому у СГ-дефицитных растений этих видов полное открывание устьица растягивается на несколько часов. Для выполнения осморегуля- торной функции в замыкающих клетках и для поддержания Тц2О в клетках корней СГ должен накапливаться в вакуолях в больших количествах и не может быть отнесен в группу микроэлементов.
Накапливаясь в вакуолях зрелых клеток корней и надземных частей, СГ как осмотически активный ион может заменить NO3, активируя его выход в цитозоль и ассимиляцию в клетке.
Концентрация СГ в хлоропласте значительна — 80—90 мМ, но для реакции фотолиза Н2О он требуется в микроколичествах (на этом основании его относят к микроэлементам). Хлор присутствует в кислородвыделяющем комплексе ФС II, где наряду с Мп2+ он необходим в процессе фотолиза Н2О. Хлор может действовать либо как лиганд-мостик, стабилизирущий окисленное состояние Мп2 , либо как структурный компонент других белков ФС II.
Таким образом, хлор, как и калий, участвует в общефизиологических процессах поддержания гомеостаза, где он скорее необходим, а не полезен. Как необходимый (уже без оговорок) микроэлемент, хлор требуется для реакции фотолиза Н2О в ФС II.
МАГНИЙ
Содержание магния при оптимальном росте обычно находится в пределах 0,15 — 0,35 % от сухой массы растений. Ионная концентрация Mg2+ в растительных тканях достаточно высокая, и ~ 70 % от общего содержания (~80 мМ на г сухого вещества) свободно диффундирует в растении. По подвижности этот двух-
валентный катион сравним с К+. От других биологически важных катионов Mg2+ отличается своими уникальными характеристиками. Он имеет наименьший ионный радиус, большую плотность заряда, самый большой гидритный радиус (по сравнению с К+, Са2+ и Na+) и особый характер взаимодействия с водой и другими лигандами. Он образует 6 координационных связей, в основном с кислородом анионных трупп белков, нуклеиновых кислот и фосфолипидов (т.е. с О--лигандами, где О является «трудным» слабополяризованным основанием). Реже лигандом для связывания служит N, с которым наряду с координационными Mg2' может образовать ковалентную связь, как, например, в порфириновом кольце хлорофилла (см. рис. гл. 3).
Эти свойства магния предполагают специфику систем переноса и функций этого двухвалентного катиона. Исходя из величин обычного мембранного потенциала плазмалеммы и среднестатической концентрации магния в цитозоле (3—4 мМ), его транспорт происходит пассивно (см. табл. 6.1). Но до самого последнего времени не было известно, какие транспортные системы ответственны за поступление и перемещение магния у растений (так же как и у животных). Считалось, что неспецифичные Са2+-каналы (см. рис. 6.54) участвуют в переносе через плазмалемму не только кальция, но и магния. Наконец, в 2001 г. (Zi et al.) у арабидопсиса было идентифицировано 10 членов генного семейства, кодирующих Mg2+-TpaHcnopTHbie белки (AtMGT). Показано, что AtMGTl локализован в плазмалемме и, видимо, участвует в поступлении Mg2+ из среды. AtMGT5 и AtMGT6 экспрессируются главным образом в митохондриях. Очевидно, различные белки AtMGT семейства имеют разные транспортные характеристики и выполняют разные функции. Ранее в тонопласте клеток арабидопсиса был обнаружен транспортер AtMHX, функционирующий как электрогенный обменник (Mg +/Н exchanger) протонов Mg2+ и Zn2+. AtMHX присутствует в основном в центральном цилиндре стебля, и большая часть AtMHX мРНК локализована в клетках паренхимы, окружающей ксилему. Это предполагает участие AtMHX в распределении Mg2+ и Zn2+ между органами. Радиальный транспорт Mg2+ в корне так же, как кальция, происходит в основном по апопласту.
Диффундирующий в цитозоле Mg2+ образует лабильные связи, нейтрализуя наряду с калием определенные органические соединения (группы сахаров, нуклеотидов, органические и аминокислоты). В клеточной стенке находится -2,5% от общего содержания магния. Здесь Mg2+ координационно связан с карбоксильными группами пектиновых веществ по типу Са2+ и участвует в создании внутренней физиологической среды растения.
Самое известное магнийсодержащее соединение в растении — хлорофилл. В его молекуле Mg2+ находится в составе порфиринового ядра, соединенный двумя координационными и двумя ковалентными связями с азотом пиррольных колец (см. гл. 3). В хлоропласте сосредоточено 15 % Mg2’’ листа, до 6 % Mg2+ может находиться в составе хлорофилла. При дефиците магния (голодании) доля Mg2+ в пигменте может достигать даже 50 % от общего содержания в листе. Участие Mg2+ в процессах, идущих в хлоропласте, связано не только с функциями в составе хлорофилла. При освещении Mg2+ транспортируется из тилакоидов в строму, компенсируя Н+, закачиваемый в тилакоид, и обеспечивая поддержание (наряду с К+) катионно-анионного баланса в этом компартменте хлоропласта. За счет разнонаправленного перемещения Н+ и Mg2+ в строме создаются благоприятные условия для фиксации СО2: pH 8,0 и высокая концентра-
ция Mg2+. Ионы Mg2+ являются аллостерическим регулятором активности Ру- биско (см. гл. 3), неактивной в темноте. Щелочные значения pH (8,0) и высокая концентрация магния — оптимальные условия для глутаминсинтетазы (ГС) — фермента, локализованного в строме хлоропласта и катализирующего ассимиляцию NH4 (см. рис. 6.45, 6.46).
Значительная часть АТФ (до 90 %) находится в клетках растений и животных в виде комплекса с Mg2+:
Этот магний связан координационными связями с кислородом фосфатной группы и азотом аденина. В комплексе с магнием как АТФ, так и фосфоинозитол (фитин) запасаются в семенах (см. подразд. 6.3.1.2).
Магний активирует практически все киназные реакции, в которых требуется АТФ и происходит фосфорилирование субстрата. В реакциях переноса фосфата (фосфатазы, киназы, АТФсинтазы) или карбоксильных групп (карбоксилазы) Mg + образует координационные связи между кислородом фосфатных групп и лигандами фермента. Эти стабильные комплексы имеют в сайте связывания Mg2+ регулярную структуру, поэтому Mg2+ является незаменимым кофактором ферментных реакций, когда требуется сформировать в реакционном центре тройной комплекс между субстратом и определенными лигандами без искажения конформации. Помимо активации большого числа ферментов, включенных в реакции переноса фосфата и карбоксильных групп, магний активирует некоторые дегидрогеназы, мутазы и лиазы (ГС обсуждалась выше). Для функционирования некоторых ферментов (глутатионсинтаза) его необходимость абсолютна, в других случаях Mg2+ значительно увеличивает активность ферментов (ФЕП-карбоксилаза). В терминальной реакции гликолиза (образование пирувата из ФЕП) Mg2+ активирует пируваткиназу дополнительно к калию. Mg2+ необходим для сохранения целостности рибосом и поддержания их структуры при синтезе белка. Кроме того, на стадии связывания аминокислоты с тРНК магний активирует аминоацил-тРНК синтетазу.
Таким образом, у растений Mg2+ включен в активацию генеральных процессов ассимиляции СО2 и азота. Не менее важна его роль в реакциях синтеза и использования АТФ. Координационная связь Mg2+ с фосфорсодержащими соединениями (АТФ, фитиновая кислота и др.) переводит их в форму, удобную для запасания. Перераспределение магния между компартментами (цитозоль-вакуоль или строма—тилакоид), а также его участие в нейтрализации органических анионов, вносят большой вклад в регуляцию pH и поддержание катионно-анионного баланса.
ЖЕЛЕЗО
Железо относят к группе микроэлементов, и обычно с него начинают обсуждение их функций. В отличие от макроэлементов, которые выполняют широкий спектр функций «общеорганизменного» уровня, микроэлементы реализу-
ют свои функции в конкретных процессах и реакциях, как правило, в локальных клеточных структурах. Здесь микроэлементы определяют пространственную конформацию, активность некоторых ферментов или участвуют в окислительно-восстановительных реакциях.
В почве содержание железа больше, чем любого другого элемента, но доступного железа так мало, что даже при относительно малой потребности растения часто страдают от его недостатка (хлороз). При физиологических величинах pH концентрация соединений трех- и двухвалентного железа ниже, чем 10~5 мМ, и для поглощения его нужно сначала растворить. Чтобы обеспечить себя железом (концентрация в тканях составляет 10-6 М), растения развили механизмы, позволяющие добывать Ре3+/2+ из почвы. Эти механизмы активируются в ответ на еще больший, чем обычно, дефицит Ее и различны у двудольных и однодольных растений (рис. 6.62). У двудольных и незлаковых однодольных видов реализуется стратегия I, связанная с интенсификацией дыхания. Активация дыхания корней способствует работе Н+-помпы (за счет увеличения доступности АТФ) и обеспечивает дополнительный синтез органических кислот, которые хелатируют железо (например, лимонная кислота). Выкачивание протонов способствует растворению железа почвенных частиц, а вышедшие хелаторы образуют хелатные комплексы с Fe3+. Хелатированное Fe3+ восстанавливается расположенной на ПМ Ре3+-хелатредуктазой (этот фермент, видимо, способен также восстанавливать Си2+ до Си+). Двухвалентное железо (Fe2+) переносится через мембрану специфическим Ре2+-т^занспортером — IRT1, который, видимо, осуществляет также транспорт Мп , но Си подавляет его активность. Перенос осуществляется одновременно с активацией Н+-АТФазы. Считают, что именно переносчик IRT1 отвечает за поступления железа из почвы.
У однодольных злаков адаптация, обеспечивающая поглощение железа {стратегия II), связана с синтезом специальных хелатирующих веществ — фитосидерофоров. Фитосидерофоры — низкомолекулярные соединения, относящиеся к непротеиногенным аминокислотам, — синтезируются (в ответ на дефицит железа) из метионина с образованием на первом этапе никотинами- на, который затем превращается в мугеновую кислоту. Последняя является хелатором железа. Железо (Fe3+) в составе комплекса переносится специфической, пока неохарактеризованной транспортной системой. Никотинамин также может быть хелатором, принимающим участие в транспорте металлов по механизму стратегии II. Кроме того, комплекс металла с никотинамином может участвовать в дальнейшем транспорте Си, Zn по ксилеме и Си, Zn, Fe2+ — по флоэме.
Дефицит железа вызывает также изменения морфологии корней, индуцируя рост корневых волосков, которые обильно покрывают поверхность корня. Это способствует лучшему контакту с почвой и почвенным раствором, увеличивая поглощение железа (см. подразд. 6.2.1.1).
В клетках железо находится либо в комплексе с тетрапирольным кольцом (гемопротеины), либо в комплексе с сульфидной серой многочисленных железо-серных белков. И те и другие соединения железа входят в состав ферментов ЭТЦ дыхания и фотосинтеза (см. гл. 2, 3, 4). Железогемопротеины в сумме составляют до 8,5 % от общего белка клетки. К гемопротеинам относятся пероксидаза и каталаза, связанные с антиоксидантной защитой (см. гл. 3). Пероксидаза участвует также в синтезе лигнина. Лег-гемоглобин связывает кислород
СТРАТЕГИЯ IСТРАТЕГИЯ IСТРАТЕГИЯ IIСТРАТЕГИЯ II
СТРАТЕГИЯ I
СТРАТЕГИЯ I
СТРАТЕГИЯ II
СТРАТЕГИЯ II
Рис. 6.62. Ответная реакция корней на дефицит железа.
Стратегия I — у двудольных и однодольных незлаковых растений (/ — активация протонной помпы; 2 — увеличение выхода восстановителей/хелаторов); ОК — органические кислоты; ред- за — индуцируемая хелатредуктаза; IRT1 (Iron reduced transporter) — транспортер Fe11. Стратегия Il — синтез фитосидерофоров у однодольных злаков; ФСД — фитосидерофоры; ПМ — плазма- лемма; Ув — увеличение синтеза и выхода ФСД; Тр — транспортеры комплексов металла с ФСД
и служит защитным барьером от его проникновения в клубеньки бобовых, поскольку О2 инактивирует нитрогеназу, фиксирующую N2.
Первым из белков, содержащих негеминовое железо, был открыт ферредоксин. В хлоропласте этот железосерный белок является донором электронов для НАДФ оксидоредуктазы, ферментов сульфитредуктазы и нитритредуктазы (у двух последних ферментов простетической группой является Fe-содержа-
щий сирогем) (см. рис. 6.42 и 6.49). Соотношение Fe и S в кластере железосерных белков может различаться и составлять 2Fe—2S, как у ферредоксина, или 4Fe—4S, как у многих других ферментов (см. гл. 2).
К железосерным белкам помимо белков ЭТЦ хлоропластов и митохондрий относятся аконитаза, ксантиноксидаза, липоксигеназа, нитрогеназа и ключевой фермент азотного обмена — нитратредуктаза. В сумме железо белков, связанное с серой, составляет 18,5 % общего содержания железа; на митохондриальные комплексы приходится 9 %, на ферредоксин 2,5 %. Одна из суперок- сиддисмутаз (СОД), присутствующая в хлоропласте, также включает Fe.
Запасной формой железа в растительной клетке является ферритин — многомерный белок, состоящий из 24 полипептидов. Отдельные полипептиды представляют собой полые сферы, разграничивающие внутреннюю полость четвертичной структуры ферритина, которая заполнена железом (Fe2O3 лН2О). Каждая молекула может запасать до 4500 атомов железа в растворимой, нетоксичной и доступной форме. Основная масса ферритина находится в строме хлоропласта. В целом до 60 % железа, содержащегося в листе, приходится на хлоропласты.
МЕДЬ
Растения в норме накапливают медь в количестве 5 — 20 мкг/г сухой массы. В почве ее концентрация колеблется от 10-4 до 10 9 М и до 98 % меди почвы находится в комплексе с низкомолекулярными органическими соединениями. Пока неизвестно, существует ли индивидуальный транспортер, обеспечивающий поглощение меди из почвы (см. рис. 6 62).
Особенность восстановленной формы меди — способность легко передавать электрон прямо на кислород, а окисленной формы — легко восстанавливаться. Медь имеет высокий редокс-потенциал и вместе с железом входит в состав терминальной оксидазы ЭТЦ дыхания — цитохромоксидазы (см. гл. 4). Более 50% меди, локализованной в хлоропластах, связано с пластоцианином. Си- Zn-супероксиддисмутаза присутствует в хлоропластах, митохондриях, пероксисомах и цитозоле, где она участвует в детоксикации супероксида. Аскорба- токсидаза содержит по крайней мере 4 атома Си, которые участвуют в четырехэлектронном восстановлении О2 до Н2О. Аскорбатоксидаза цитозоля может действовать, как терминальная оксидаза, самостоятельно или в комбинации с полифенолоксидазой. Полифенолоксидаза включена в синтез такого комплексного полимера, как лигнин. Высокая реакционная способность меди, полезная в редокс-реакциях, делает ее токсичной даже при не очень высоких концентрациях.
Например, медь разрушает тиоловые связи в белках, что приводит к их деструктуризации. Поэтому транспорт поглощенной меди к местам использования или реутилизации, где она будет включена в специфические медьсодержащие белки, осуществляется в виде комплекса со специальными цитоплазматическими белками-шаперонами. Шапероны переводят медь в нереактивную форму и при участии транспортных белков доставляют медь к местам, где благодаря шаперонам обеспечивается сборка необходимой пространственной структуры фермента, включающего медь.
МАРГАНЕЦ
В биологических системах Мп находится в состоянии окисленности II, III и IV. Содержание марганца в вегетативных частях растений (побеги, листья) колеблется от 25 до 40 мкг/г сухого вещества, но у цитрусовых достигает 125 мкг. Концентрация марганца в разных структурах клетки варьирует от 0,01 до 50 мкМ, и в листьях ~90 % Мп находится в хлоропластах, где марганец выполняет особую функцию, связанную с фотохимическим разложением воды и выделением О2 кислородвыделяющим комплексом (КВК) ФСП (см. гл. 3). Марганец — кофактор более 35 ферментов, и в системах in vitro может с успехом заменять магний. В тканях концентрация Мп2+ значительно ниже, чем Mg2+, поэтому именно магний становится основным активатором таких ферментов, как киназы, фосфатазы, глутаминсинтетаза и др. В клетках in vivo марганец при высоких концентрациях может вытеснить магний из Mg-АТФ комплекса, но для активации некоторых реакций (как и в КВК) потребность в Мп2+ абсолютна. Например, у С4-растений в хлоропластах обкладки, где оксалат действует как углеродный челнок и где карбоксилирование катализируется ФЕП-карбокси- лазой, Мп2+ не может быть заменен на Mg2+, который ингибирует активность фермента.
Активацию ИУК оксидазы, разрушающей индолилуксусную кислоту, также осуществляет Мп . Изоцитратдегидрогеназа митохондрий активируется Mg2+ и Мп , но только Мп + активирует цитозольную форму этого фермента. Изоцитратдегидрогеназа катализирует превращение вышедшего из митохондрий в цитозоль изоцитрата в 2-оксоглутарат, который затем используется в реакции ассимиляции азота в хлоропластах. Мп2+ вместе с Mg2+ активирует малик-энзим, несколько ферментов шикиматного пути, ведущего к образованию ароматических аминокислот, и супероксиддисмутазу. Mn-СОД распространена менее широко, чем другие супероксиддисмутазы, и присутствует только в митохондриях и пероксисомах. В активации РНК-полимеразы хлоропластов Мп2+ действует эффективнее, чем Mg2+, даже если концентрация последнего во много раз выше.
МОЛИБДЕН
Молибден в водных растворах существует как МоО2 , т.е. в его наиболее окисленной форме — Mo(VI). Как компонент ферментов он может быть в форме Mo(VI) и Mo(V). Поглощается молибден, видимо, в комплексе с фитосидерофорами (см. рис. 6.62).
Потребность в молибдене у растений меньше, чем в других микроэлементах, и его концентрация в тканях очень низкая. Однако у растений Мо является компонентом ключевого фермента — нитратредуктазы (HP) (см. подразд. 3.2.3); у нитрогеназы, осуществляющей фиксацию N2, в одной из субъединиц также присутствует Мо. Кроме того, в растениях Мо входит в состав ксантиноксидазы. Во всех этих ферментах молибден выполняет каталитическую и структурную функции. У нитратредуктазы и ксантиноксидазы молибден присутствует в составе молибдоптерина, или молибдокофактора (Мо-Со) (см. рис. 6.41):
Структурную основу Мо-Со составляет производное птерина с боковой цепью в шестом положении. Четырехуглеродная боковая цепь содержит дити- ольную (связывающую Мо), гидроксильную и фосфатную группы. МоСо всех молибденсодержащих ферментов растений, бактерий, грибов и животных (ас- симиляторные и диссимиляторные нитратредуктазы, алкогольдегидрогеназа, сульфитоксидаза, ксантиноксидаза/дегидрогеназа) сходны и близки по свойствам. МоСо нековалентно связан с белком фермента и в связанном виде устойчив к окислению. У нитратредуктазы МоСо является активным центром, где с участием молибдена NO3 восстанавливается до NOj. Кроме того, он выполняет структурную функцию, связывая две субъединицы. При отщеплении МоСо от апофермента HP инактивируется и может переходить в латентное состояние. «Разборка» фермента может происходить под действием неблагоприятных факторов, например засоления Однако четвертичная структура Мо-Со-фер- мента собирается так же легко, как и разрушается. В системе in vitro восстановление структуры HP активируется добавлением молибдена.
ЦИНК
Цинк поглощается как двухвалентный катион, в клетках он не окисляется и не восстанавливается. Обнаружен переносчик Zn2+, который функционирует в системе унипорта (см. рис. 6.15), обеспечивая поглощение цинка из среды. Роль цинка как двухвалентного катиона основана на его свойстве формировать тетраэдрические комплексы:
L J х^ис
/П\
Асп Глу
Известно около 300 ферментов из разных организмов, где цинк является стабилизатором. У растений цинк — компонент карбоангидразы (см. гл. 4), щелочной фосфатазы, алкогольдегидрогеназы. В клетках листа наряду с Mg2+- зависимой пирофосфатазой, обнаружен 2п2+-зависимый изоэнзим. В суперок- сиддисмутазе Zn ассоциирован с Си2+. В этом антиоксидантном изоэнзиме медь, очевидно, представляет каталитический, а цинк — структурный компонент. Cu-Zn-СОД локализована во всех компартментах цитоплазмы.
Цинк играет важную роль в метаболизме ДНК и РНК, в синтезе белка и клеточном делении. Выделен класс Zn-зависимых белков, которые включены в репликацию ДНК, транскрипцию и, следовательно, в регуляцию экспрессии генома. Включение цинка в эти белки необходимо для связывания со специфическими генами. Он встраивается в структуру белка, образуя тетраэдраль-
ные комплексы с аминокислотными остатками полипептидной цепи. Таким образом, полипептидная цепь формирует петли, или «цинковые пальцы», состоящие из 11 — 13 аминокислотных остатков. Структура типа «цинковые пальцы» присутствует у многих факторов транскрипции. «Цинковые пальцы» взаимодействуют с двойной спиралью ДНК, что позволяет белковой молекуле, несущей эту структуру, узнавать и специфически связываться с определенными последовательностями нуклеотидов в геноме клетки. Такое связывание в свою очередь приводит к активации или ингибированию транскрипции данного гена. Кроме этого, структура типа «цинковые пальцы» может участвовать в белок-белковом узнавании, и поэтому играет важную роль в процессах передачи сигнала внутри клетки.
БОР
Бор входит в группу металлоидов и в водных растворах при концентрации менее 25 мМ присутствует в мономерной форме — В(ОН)3 или в ионной —
Первичные последствияПервичные последствияВторичные последствияВторичные последствия
Первичные последствия
Первичные последствия
Вторичные последствия
Вторичные последствия
Изменение в химическом составе и ультраструктуре КСНакопление некоторых феноловИзменения в структурной целостности (ПМ)Ингибирование синтеза лигнинаАктивация ИУК оксидазыУменьшение уровня ИУК, поступающего в КСМорфологические и физиологические изменения во взаимосвязи КС-ПМИзменение в химическом составе и ультраструктуре КСНакопление некоторых феноловИзменения в структурной целостности (ПМ)Ингибирование синтеза лигнинаАктивация ИУК оксидазыУменьшение уровня ИУК, поступающего в КСМорфологические и физиологические изменения во взаимосвязи КС-ПМ. Уменьшение уровня (транспортируемой) ИУКУсиление образования""свободныхрадикалов О". Уменьшение уровня (транспортируемой) ИУКУсиление образования""свободныхрадикалов О"Повреждения ПМПовреждения ПМНарушенияв метаболизмеРНК и ДНКНарушенияв метаболизмеРНК и ДНКИндукциядефицита Са2+Индукциядефицита Са2+
Изменение в химическом составе и ультраструктуре КС
Накопление некоторых фенолов
Изменения в структурной целостности (ПМ)
Ингибирование синтеза лигнина
Активация ИУК оксидазы
Уменьшение уровня ИУК, поступающего в КС
Морфологические и физиологические изменения во взаимосвязи КС-ПМ
Изменение в химическом составе и ультраструктуре КС
Накопление некоторых фенолов
Изменения в структурной целостности (ПМ)
Ингибирование синтеза лигнина
Активация ИУК оксидазы
Уменьшение уровня ИУК, поступающего в КС
Морфологические и физиологические изменения во взаимосвязи КС-ПМ
. Уменьшение уровня (транспортируемой) ИУК
Усиление образования
""свободныхрадикалов О"
. Уменьшение уровня (транспортируемой) ИУК
Усиление образования
""свободныхрадикалов О"
Повреждения ПМ
Повреждения ПМ
Нарушенияв метаболизмеРНК и ДНК
Нарушенияв метаболизмеРНК и ДНК
Индукциядефицита Са2+
Индукциядефицита Са2+
I
ИнгибированиеАТФаз, транс-портеров, сдвигипотенциала ПМИнгибированиеАТФаз, транс-портеров, сдвигипотенциала ПМИнгибированиероста растяже-нием и дифферен-циации ксилемы
ИнгибированиеАТФаз, транс-портеров, сдвигипотенциала ПМ
ИнгибированиеАТФаз, транс-портеров, сдвигипотенциала ПМ
Изменения в распре-делении углеводов и т.д.
Рис. 6.63. Физиолого-биохимические нарушения в тканях при дефиците бора(по Marschner, 1995)
В(ОН)4. Поглощение бора сильно зависит от pH, а его распределение по растению происходит преимущественно с транспирационным током. По флоэме бор также может транслоцироваться и ретранслоцироваться в относительно больших количествах. Необходимость бора для растений установлена очень давно, но до сих пор неясно, каким образом реализуются его функции: в какие конкретные реакции он включен и каков механизм его участия в отдельных процессах. Бор присутствует в растениях в большей концентрации, чем другие микроэлементы (по крайней мере у двудольных), и значительное его количество находится в клеточной стенке (КС). У бор-дефицитных растений почти весь бор (90—95%) находится в апопласте. До 70% бора клеточной стенки приходится на комплекс с пектином:
=с-ох ЮНI /В\=с—оон=с-ох ЮНI /В\=с—оон=с-ох ю—с= I /вх =с-о о—с=
=с-ох ЮНI /В\=с—оон
=с-ох ЮНI /В\=с—оон
При недостатке бора физические свойства клеточной стенки значительно изменяются, что сопровождается быстрым ингибированием растяжения клеток. Эти нарушения в синтезе клеточной стенки, как предполагают, приводят к «каскадному эффекту» и к последовательным (иногда одновременным) изменениям в комплексе взаимосвязанных процессов. Последствия дефицита бора можно разделить на первичные и вторичные; они затрагивают образование клеточной стенки и функционирование плазмалеммы (рис. 6.63).
Таким образом, конкретные пути включения бора в процессы обмена и механизмы реализации его функций неизвестны. Однако можно составить длинный список процессов, где бор необходим: синтез и структура клеточной стенки, лигнификация, метаболизм углеводов, РНК, ИУК, фенолов, дыхание, транспорт сахаров, функционирование плазмалеммы.
ГЛАВА 7
РОСТ И РАЗВИТИЕ РАСТЕНИЙ
В главе изложены основные принципы регуляции процессов роста и развития на разных уровнях организации. Особое внимание уделено интеграции ростовых процессов. Подробно рассмотрены химические вещества-регуляторы роста и роль световых стимулов в развитии растений. Процессы цветения, плодоношения, перехода в стояние покоя, листопада и др. рассматриваются с точки зрения адаптации растения к факторам внешней среды: климату, фито- ценотическому окружению, а также патогенов и вредителей. Многие из проблем, возникающих при действии этих факторов, растения решают комплексно. Спектр физиологических реакций растения на тот или иной сигнал тесно связан с первоочередными задачами, которые растение должно решить на каждом этапе онтогенеза.
ОБЩЕЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ О РОСТЕИ РАЗВИТИИ
ПАРАМЕТРЫ РОСТА
В слове растение заключено фундаментальное свойство растений — способность к росту в течение всей жизни. Если роста нет — значит растение находится в условиях стресса или погибло.
Казалось бы, о росте можно судить по увеличению общей (сырой) биомассы растения. Однако сырая биомасса может не только увеличиваться, но и уменьшаться: при засухе ткани теряют воду, а при поливе вода поглощается, сырая масса увеличивается (здесь, очевидно, увеличение сырой биомассы говорит о выходе из стресса, а не о росте). При росте синтезируются новые вещества, поглощаются элементы минерального питания, т.е. увеличивается сухая биомасса. Взятый в отрыве от других критериев роста и этот показатель может оказаться ошибочным. Так, при прорастании семян сухая биомасса уменьшается (запасные органические вещества расходуются при дыхании), хотя рост происходит. Еще один показатель роста — увеличение числа клеток. Если число клеток растет, можно уверенно говорить о росте, но постоянное число клеток еще не говорит об отсутствии роста: в зоне растяжения увеличение числа клеток незначительно, тем не менее рост идет. О росте можно судить по увеличению линейных размеров — высоты растения, длины корня, ширины листа и т.д.
Таким образом, ростом можно назвать необратимое увеличение растения хотя бы по одному из параметров: по числу клеток, линейным размерам, сырой и/или сухой биомассе. Самый быстрый и экономичный способ роста —
Рис. 7.1. Кривая роста в периодической суспензионной культуре:Рис. 7.1. Кривая роста в периодической суспензионной культуре:I — лаг-фаза; II — фаза экспоненциального роста; /// — фаза замедления роста; IV — стационарная фаза; V — фаза деградацииI — лаг-фаза; II — фаза экспоненциального роста; /// — фаза замедления роста; IV — стационарная фаза; V — фаза деградации417417
Рис. 7.1. Кривая роста в периодической суспензионной культуре:
Рис. 7.1. Кривая роста в периодической суспензионной культуре:
I — лаг-фаза; II — фаза экспоненциального роста; /// — фаза замедления роста; IV — стационарная фаза; V — фаза деградации
I — лаг-фаза; II — фаза экспоненциального роста; /// — фаза замедления роста; IV — стационарная фаза; V — фаза деградации
417
417
растяжение, при котором происходит сильная вакуолизация клеток. Для растяжения основными «строительными материалами» являются вода и углеводы (целлюлоза, пектин и др.), тогда как для обеспечения деления клеток нужен приток минеральных веществ, прежде всего — азота, фосфора и др.
КРИВАЯ РОСТА
Хорошей модельной системой для изучения роста является культура растительных клеток in vitro. В среду добавляют сахара, минеральные соли и ростовые факторы, самые важные из которых — ауксины и цитокинины (см. подразд. 7.2.2, 7.2.3, 7.2.4). При перемешивании в жидкой среде растительные клетки образуют небольшие агрегаты (по 5 — 25 клеток). Такой способ выращивания клеток называют суспензионной культурой-, клетки находятся в ней примерно в одинаковых условиях. В суспензии легко измерять число клеток, сырую и сухую биомассу. Питательную среду со временем приходится заменять: клетки периодически пересаживают в новую среду. Такой способ выращивания называют периодической культурой.
График изменения параметров роста от времени называют кривой роста (рис. 7.1). На этой кривой выделяют несколько характерных участков. На начальной стадии (рис. 7.1, Z) клетки не растут, их число и биомасса не изменяются — это так называемая лаг-фаза. В течение лаг-фазы клетки адаптируются к новым условиям и происходит изменение химического состава среды (кондиционирование). За лаг-фазой идет фаза экспоненциального роста (II). Большинство клеток вовлекается в процесс деления. Клетки слабо вакуолизированы, интенсивно используются ресурсы питательной среды. В фазе замедления роста (III) число клеток, участвующих в митозах, постепенно уменьшается, нарастает вакуолизация. Иногда между фазой экспоненциального роста и фазой замедления роста выделяют фазу линейного роста. Вследствие исчерпания
ресурсов среды наступает стационарная фаза (IV) — кривая роста выходит на плато, число клеток и их биомасса меняется слабо, митотический индекс падает. Обычно на этой стадии периодическую суспензионную культуру пересаживают. Если этого не сделать, наступает фаза деградации (Г) — клетки начинают погибать.
Кривая роста, полученная для периодической суспензионной культуры, достаточно показательна. Аналогичные кривые можно получить и на целых растениях. Например, у однолетников лаг-фаза соответствует периоду покоя семени, на начальных этапах рост идет медленно, усиливаясь по мере развития листьев (экспоненциальный рост). Замедление роста связано с формированием цветков и плодов, в конце жизни растение больше не
14 Физиология растений
растет (фаза стационара) и после плодоношения погибает (деградация). Получение кривых роста для деревьев более трудоемко (трудно точно оценить биомассу и количество клеток, фаза деградации иногда затягивается на 400 лет и более и т.д.), но общий характер кривой роста сохраняется.
В природе растение подвергается действию внешних факторов, которые изменяют характер кривой роста. Даже в благоприятных условиях скорость роста различна днем и ночью (различаются температура, испарение, поступление воды и минеральных веществ, доступность фотоассимилятов). При этом в течение суток наблюдаются кратковременные периоды интенсивного роста и «стационары». Для деревьев характерны сезонные колебания роста. Наиболее известный пример — различная скорость отложения древесины. Каждая почка растет в соответствии с S-образной кривой роста. И в этом случае внешние факторы обусловливают чередование интенсивного роста с фазой «стационара», которая стыкуется с лаг-фазой следующего ритма роста. Общая кривая роста оказывается составленной небольшими (разномасштабными) S-образными участками. Таким образом, кривая роста целого растения обычно имеет более сложную форму, чем кривая роста в периодической суспензионной культуре.
ДИФФЕРЕНЦИРОВКА
Термин дифференцировка (от лат. differentia — различие) был введен для обозначения процесса приобретения различий между клетками (тканями, органами, системами органов и т.д.). Предполагается, что есть начальное недифференцированное состояние, когда наблюдатель не может установить различий между клетками, затем появляются видимые различия клеток и они становятся дифференцированными. Традиционно недифференцированными считают: делящиеся клетки эмбриона; меристематические клетки апексов корня и стебля, камбия, феллогена, интеркалярных меристем; клетки, неорганизованно делящиеся в экспериментальных условиях (суспензионная и каллусная культура in vitro).
Клетки, покинувшие зону деления, приступают к дифференцировке. Результат этого процесса можно увидеть, например, при образовании проводящей системы: возникает прокамбий, который дифференцируется на флоэму, ксилему и камбий. Во флоэме дифференцируются ситовидные элементы и клетки-спутницы, в ксилеме — паренхимные клетки и трахеиды. Проводящий пучок может быть усилен дифференцирующимися механическими тканями и т. д. В данном примере клетки поэтапно приобретают анатомические различия в связи с выполняемыми функциями, многообразие клеток растет.
Анатомической дифференцировке предшествует биохимическая дифференцировка, когда видимых различий между клетками мало, но они не одинаковы по содержанию тех или иных веществ. Удобнее следить за дифференциальной экспрессией генов: появлением новых или снижением уровня старых мРНК, белков. Эти данные позволяют зарегистрировать различия между клетками раньше, чем они станут видимыми на анатомическом уровне. Таким образом, дифференцировка начинается с изменения активности генома, экспрессии одних генов и подавления активности других.
При таком подходе делящиеся клетки меристемы придется считать дифференцированными, так как для прохождения клеточного цикла нужна опреде-
ленная активность генома, которая и будет отличать эти клетки от других. Анатомы давно обратили внимание на неоднородность клеток меристемы. Можно сказать, что апикальная меристема корня дифференцирована на каллиптроген (инициали чехлика), дерматоген (инициали эпидермальной ткани), инициали коры, покоящийся центр и инициали осевого цилиндра. Для каждой из групп делящихся клеток характерны определенная локализация, направление веретена делений и тип производных клеток. Исследование меристемы методами молекулярной генетики показывает, что обнаруженная анатомами дифференцировка меристемы на зоны совпадает с зонами дифференциальной экспрессией определенных генов. Более того, саму меристему в целом можно достаточно четко выделить по зонам дифференциальной экспрессии. Таким образом, меристема является биохимически дифференцированной тканью.
Дифференциальная экспрессия генов — фундаментальное проявляение дифференцировки, и, как это ни парадоксально, недифференцированных клеток вообще не существует. Понятие «недифференцированный» хорошо работает только там, где в соответствии с задачами исследования исходные различия между клетками не учитывают (или нет методов их обнаружить).
Итак, дифференцировкой можно назвать процесс изменения профиля генной активности, приводящий к дальнейшему изменению функции клеток.
ТОТИПОТЕНТНОСТЬ. ТЕРМИНАЛЬНАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА
В эмбриологии животных процесс дифференцировки изображают как сложный «ландшафт», по которому катится «шар». Шар — это символ клетки, дающей начало новому организму. В развилках шар «совершает выбор» и скатывается по одной из нескольких возможных траекторий. Так и клетки, возникшие при делении зиготы, направляются по одному из возможных путей дифференцировки. При этом клетки теряют «морфогенетический потенциал». Все «траектории» заканчиваются в «море», символизирующем смерть организма. Если в начале пути у «шара»-клетки много потенциальных возможностей, то по мере приближения к «морю» их становится все меньше (рис. 7.2). По имени
Рис. 7.2. Морфогенетическийландшафт Уоддингтона.
Развилки на траектории обозначают выбор путей дифференцировки, крестики — нереализованные пути. При «скатывании» шара к «морю» возможностей выбора становится все меньше
ученого, предложившего такую аналогию, ее называют морфогенетическим ландшафтом Уоддингтона. Процесс дифференцировки равносилен потере морфогенетического потенциала.
В отличие от клеток животных большинство клеток растений после анатомической дифференцировки легко переходят к делению. Такой процесс называют дедифференцировкой (потерей специализации). При механическом повреждении растения, а также в условиях эксперимента дедифференцировка приводит к образованию каллуса — ткани, обладающей быстрым ростом, и без строгой пространственной организации веретен деления.
В каллусной культуре можно вызвать образование новых органов: корней, побегов, эмбриоидов (см. подразд. 7.2.3). При отсутствии видимого порядка кал- лусная ткань частично сохраняет профиль генной активности, характерный для исходных тканей. Так, каллусы, полученные из тканей листа, при соответствующей обработке развивают вегетативные побеги, каллусы из цветоножек образуют цветки, а каллусы из стенок завязи — рыльца. Из большинства клеток можно получить новый организм (для клеток животных это невозможно).
Практически любая клетка многоклеточного организма содержит полный набор генов, необходимый для формирования организма, однако не каждая клетка может дать начало целому организму. Свойство клетки реализовать имеющуюся генетическую информацию и дать начало целому организму называют тотипотентностью (лат. totalis — общий, целый; potentia — способность). Тотипотентность клеток растения сравнительно легко реализовать, тогда как большинство животных клеток не могут образовать новый организм. Таким образом, понятие дифференцировки как снижения морфогенетического потенциала, заимствованное из эмбриологии животных, не применимо к тотипотентным растительным клеткам, так как их морфогенетический потенциал долго остается высоким. Тотипотентную клетку можно уподобить путнику, путешествующему в горах, которому так и не суждено увидеть море.
В растениях есть клетки, не вступающие в клеточный цикл, — это мертвые клетки ксилемы или живые клетки ситовидных элементов, потерявшие ядро. В более мягких случаях за счет эндоредупликации без деления клетка увеличивает плоидность. Так, у Arabidopsis в растягивающихся клетках гипокотиля содержание ДНК повышается до 8с, у одноклеточных волосков — до 32с, а в клетках суспензора — до 1024с. Все эти клетки выполняют присущие им функции и не могут дедифференцироваться. К ним применимо понятие терминальной дифференцировки (необратимый процесс, после которого клетка не может дедифференцироваться и реализовать свою тотипотентность). Для клеток с терминальной дифференцировкой аналогия Уоддингтона оказывается справедливой: вместе с потерей тотипотентности снижается морфогенетический потенциал клеток, и они гибнут.
ПЕРИОДИЗАЦИЯ ИНДИВИДУАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ
Если рост можно охарактеризовать как количественное явление, то развитие — это качественное явление. В процессе развития растение приобретает новые структуры. В развитии растения выделяют эмбриональный, ювенильный, (иногда — виргинильный), генеративный и сенильный этапы. Нетрудно видеть
параллели как с кривой роста (лаг-фаза, экспоненциальный рост, замедление роста, стационар, деградация), так и с периодизацией жизни человека (внутриутробный, детство, юность, зрелость, старость).
Эмриональный период начинается со слияния яйцеклетки и спермия (т. е. с образования зиготы). У цветковых растений зигота делится поперек, образуя материнскую клетку суспензора (нижняя клетка) и будущий проэмбрио (верхняя клетка). В суспензорной части деления ориентированы в плоскости первого деления зиготы, в результате образуется суспензор (подвесок), продвигающий зародыш в глубь эндосперма. В верхней части два деления происходят в меридианальной плоскости, и одно — в экваториальной. Дальнейшие деления приводят к дифференцировке протодермы (покровная ткань зародыша) и внутренней паренхимы. На стадии глобулы зародыш имеет шаровидную форму.
Далее сценарий развития зависит от систематической группы. У двудольных синхронно растут две семядоли, что приводит к стадии сердечка, а затем — торпеде. У голосеменных семядолей больше двух, а у однодольных — одна, поэтому форма зародыша отличается от сердцевидной. У некоторых растений на эмбриональной стадии формируются уникальные органы (например, щиток, колеоптиль и колеориза у злаков или гаустория на верхушке семядоли у лука). Эмбриональный этап заканчивается переходом в состояние покоя, которое наступает как на ранних стадиях (например, на стадии глобулы у орхидных и заразихе вых), так и после формирования примордиев настоящих листьев.
После периода покоя начинается ювенильный период. Его можно разделить на стадию проростка (пока функционируют семядоли и другие зародышевые органы) и собственно ювенильный этап (растет вегетативная масса). Иногда выделяют отдельную виргинильную стадию, когда растение по всем признакам не отличается от генеративного, но еще не цветет.
Генеративный этап роста — это период цветения и плодоношения.
Длительность этапов, как и число стадий, на которые разбивают индивидуальное развитие, зависит от жизненной стратегии. У однолетников ювенильный этап бывает коротким, его трудно разделить на отдельные фазы. У многолетников, напротив, ювенильный этап может занимать несколько лет: у колокольчиков (Campanula spp.) — 2 года, у тюльпанов (Tulipa spp.) — 4—5 лет, у пионов (Paeona sppd — 7 — 9 лет и т.д. Чем длиннее ювенильный период, тем больше отдельных стадий в нем можно выделить. Генеративный период продолжителен только у поликарпиков (растений, способных цвести многократно). У монокарпиков после цветения наступает программированная гибель, деградация идет очень быстро. Так, у бамбуков (подсем. Bambusoidae) ювенильный и виргинильный периоды продолжаются 100—150 лет, а генеративный период и программированная гибель происходят за один сезон. Иногда многолетний поликарпик оказывается угнетенным (например, из-за внезапного похолодания гибнет значительная часть растения), тогда растение не цветет один или несколько сезонов. Такое состояние интерпретируется как что-то похожее на «старость» (квазисенильное). На деле временное ослабление растения не означает, что оно состарилось и не может цвести.
Классический объект для изучения перехода из ювенильного состояния в генеративное — плющ (Hedera). Молодой плющ имеет лопастные или рассе-
ченные листовые пластинки, у цветущего — листья цельные. Длительность ювенильной стадии определяется тем временем, которое необходимо плющу, чтобы подняться по опоре. Пока побеги растут горизонтально, они образуют рассеченные листья, а если побег растет вертикально, появляются цельные листья и цветки. При потере опоры побеги вновь примут горизонтальное положение и плющ образует рассеченные листья. Считается, что при горизонтальном росте происходит «реювенилизация» (повторное омолаживание), а цельные листья — признак генеративного состояния, «старения». Однако цикл такого «старения—омоложения» можно повторять в условиях эксперимента до бесконечности, и гибель растения «от старости» не наступит. Этот пример показывает, что понятие «старение» необходимо применять к растению с большой осторожностью.
ГОРМОНАЛЬНАЯ СИСТЕМА РАСТЕНИЙ
ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ГОРМОНАЛЬНОЙ РЕГУЛЯЦИИ
Регуляторные молекулы растений
Клетка должна не только поддерживать собственную целостность, но и функционировать согласованно с другими клетками организма растения, поэтому между клетками происходит обмен информацией. Одна группа клеток при этом становится «отправителями» сигнала, а другая воспринимает его. Если сигнал химической природы, молекулу с сигнальной функцией называют первичным мессенджером (от англ, message — послание).
Растительная клетка воспринимает разнообразные химические стимулы и реагирует на них. Физиологический ответ вызывают изменение концентрации сахаров во флоэмном токе, олгигомерные сахара и фрагменты хитина, индо- лилуксусная кислота, брассиностероиды и др. Среди обширного списка первичных мессенджеров можно выделить гормоны растений.
Вещество можно отнести к гормонам, если оно обладает следующими свойствами:
вызывает специфический физиологический ответ; особенность растительных гормонов в том, что они запускают крупные программы развития не только на уровне клеток, но и на уровне тканей, органов, целого растения;
синтезируется в растении одной группой клеток, а отвечает на него другая группа (разобщено место синтеза и место действия, т. е. сигнальное вещество транспортируется). К синтезу гормонов потенциально способна любая клетка растений; как правило, фитогормоны являются низкомолекулярными соединениями (не более 2 кДа);
практически не играет роли в основном метаболизме клетки, а используется лишь для сигнальных целей.
Иногда эти свойства расширяют:
вещество действует в низкой концентрации — не более 10"5 моль/л.
Перечисленные свойства позволяют ограничить круг веществ, традиционно считающихся растительными гормонами (в научной литературе их принято называть фитогормонами): ауксины, цитокинины, гиббереллины, абсцизины,
этилен. Часто к ним добавляют брассиностероиды, жасминовую кислоту, салициловую кислоту, некоторые фенольные соединения и др. Однако всеми классическими свойствами обладают немногие гормоны, например ауксины. Абсцизины обычно действуют в точке синтеза, распространяясь лишь на небольшое расстояние. Этилен транспортируется только в виде предшественника; фенолы, салициловая и жасминовая кислоты действуют в концентрациях более 10"5 моль/л.
К сигнальным молекулам можно также отнести олигосахарины (олигосахариды с физиологической активностью), лектины (белки, взаимодействующие с полисахаридами) и короткие пептиды. Их действующая концентрация может быть очень низкой: 10"12—10"15 моль/л.
Рецепция и усиление сигнала
Первичные мессенджеры, воспринимаемые клеткой как сигналы, специфически взаимодействуют со многими белковыми молекулами. Так, ауксин с высокой аффинностью связывается с рецепторами, транспортными белками, ИУК-оксидазой, ИУК-гликозидазой, но не каждое взаимодействие приводит к физиологическому ответу. Чтобы клетка ответила на стимул, нужно включить внутриклеточную систему вторичных мессенджеров. Одна из функций вторичных мессенджеров — усиление сигнала (один G-белок активирует более 10 молекул фосфолипазы С; одна молекула ауксина приводит в движение до 104 протонов).
Для поиска рецепторов применяют следующие правила:
рецептор взаимодействует с гормоном и его аналогами; чем больше физиологический ответ, вызываемый аналогом, тем выше аффинность;
при взаимодействии рецептор не должен менять химическую структуру гормона (так, исключают белки, метаболизирующие гормоны);
взаимодействие гормона с рецептором приводит к включению системы вторичных мессенджеров.
Кроме биохимического выделения белков-рецепторов применяют генетические методы. У мутантов с нарушенной чувствительностью к гормонам часто оказываются поврежденными гены белков-рецепторов. Далее ген клонируют и путем экспрессии в кишечной палочке {Escherichia coli) или дрожжах {Saccharo- myces cerevisiae) получают много белкового продукта.
Большинство систем вторичных мессенджеров, изученных у животных, в настоящее время обнаружены и у растений. Каскад усиления сигнала называют по характерным мессенджерам. Наиболее известны фосфатидилинозитольная, аденилатциклазная и гуанилатциклазная системы, MAP-киназный каскад и др.
Рецепторы обычно локализованы на плазмалемме, но не исключена их локализация в других компартментах клетки. Рецептор при этом связан с разными вторичными мессенджерами. Так, при его локализации в цитоплазме первостепенную роль играют белок-белковые взаимодействия, активирующие каскад фосфорилирования/дефосфорилирования, что приводит к изменению ме-
таболизма и работы цитоскелета. При внутриядерной локализации рецептор взаимодействует с белками ядра так, чтобы включить одни и выключить другие промоторы, обеспечивая специфический ответ на уровне генома.
Фосфатидилинозитольная системавторичных мессенджеров
Принципы работы вторичных мессенджеров в данном подразделе показаны на примере фосфатидилинозитольной системы (рис. 7.3). Фосфатидилинозитол — один из липидов плазмалеммы, поэтому фосфатидилинозитольная система работает с рецепторами, расположенными на внешней мембране.
При связывании с гормоном белок-рецептор меняет конформацию и передает сигнал на G-белок. G-белки названы так за способность связывать и гидролизовать ГТФ. Конформация белкового комплекса рецептора влияет на способность G-белка связывать и удерживать ГТФ.
Пока молекула ГТФ остается связанной с G-белком, он успевает активизировать до 10 молекул фосфолипазы С, входящей в состав мембранных белков. После этого происходит гидролиз ГТФ, ГДФ и фосфат освобождаются, G-белок переходит в неактивное состояние, пока не захватит новую молекулу ГТФ. Работа G-белка регистрируется в первые 1 — 5 с после обработки рецептора гормоном (рис. 7.3, Б).
Активизация фосфолипазы С приводит к гидролизу фосфатидилинозитолдифосфата. При этом в мембране остается гидрофобный остаток диацилглицери- на, а в цитоплазму поступает инозитол-1,4,5-трифосфат (ИФ3). Именно это событие и дало название всему каскаду вторичных мессенджеров. Уменьшение доли фосфатидилинозитолтрифосфата и поступление инозитолтрифосфата в цитоплазму наблюдается уже через 10—15 с после получения сигнала, достигая максимума к 60 с.
Инозитолтрифосфат может взаимодействовать с Са -каналами на мембране. Через 2 мин после обработки гормоном в цитоплазму начинает поступать кальций. Этот процесс имеет характер осцилляций (так называемые «кальциевые волны»). Концентрация кальция в клетке изменяется приблизительно с 1 до 100 ммоль/л. Дальнейшее повышение концентрации кальция может вызвать автолиз клетки: активизируются Са +-зависимые фосфолипазы (например, фосфолипаза А), что приведет к разрушению мембраны. Чтобы избежать автолиза, клетка модулирует уровень кальция через концентрацию инозитолтрифосфата. Так, при превышении уровня ИФ3 может происходить дополнительное фосфорилирование, а инозитолтетрафосфат (ИФ4) уже не взаимодействует с Са +-каналами. При этом инозитолтетрафосфат используется как депо, из которого можно «изъять» новую порцию активного инозитолтрифосфата. После достижения максимума инозитолтрифосфат поэтапно гидролизуется до инозитола. Далее инозитол включается в состав фосфатидилинозитола, и только в составе мембраны фосфорилируется до фосфатидилинозитолдифосфата и используется еще раз. Фосфатидилинозитолдифосфат является важным модулятором при взаимодействии мембран с цитоскелетом. Так, повышение его доли в составе мембран провоцирует сборку актиновых филаментов, а дефосфорилирование приводит к разборке цитоскелета.
Инозитол в растительных клетках может полностью фосфорилироваться, превращаясь в инозитолгексафосфат (фитин). Обычно это соединение рассматривают как депо фосфора в семенах и запасных тканях. У дрожжей инозитолгексафосфат необходим для транспорта РНК из ядра в цитоплазму. Возможно, похожие явления будут обнаружены и у растений.
Кроме фосфатидилинозитольной системы у растений обнаружены еще несколько сигнальных систем. Например, аденилатциклазная система похожа по действию на аналогичную систему животной клетки. В липоксигеназной системе в регуляцию сигнального каскада вовлечена также фосфолипаза А, активируемая кальцием. После ее активизации в мембране появляются свободные жирные кислоты. Кроме того, кальций активизирует липоксигеназу, которая включает кислород в состав полиненасыщенных жирных кислот с образованием пятичленных углеродных колец. Одним из результатов работы липоксигеназы является синтез жасминовой кислоты, блокирующей Са +-каналы, что предотвращает избыточное поступление кальция. Есть сведения о работе в растительной клетке NO-системы, системы фосфатидной кислоты, НАДН-окси- дазной системы, пероксидазной системы, MAP-киназного каскада (Mitogene activated proteinkinase).
Следующими по времени активируются функциональные системы клетки, происходит активация/инактивация генов, изменяется мембранный потенциал. Так, активация фосфатидилинозитольной системы ауксином вызывает выброс протонов из цитоплазмы за счет активизации Н+-помпы. Через 5 — 7 мин после воздействия гормона наблюдается закисление матрикса клеточной стенки. Ответ этого компартмента на закисление зависит от состава клеточной стенки, в частности от присутствия кислых гидролаз, инвертазы, доли пектиновых веществ и т.д. Увеличение размеров клетки начинается через 10—12 мин после обработки ауксином.
При закислении клеточной стенки из пектина освобождается кальций, связанный с кислотными группировками. Таким образом, растительная клетка использует клеточную стенку как депо Са +. Уровень Са + в цитоплазме зависит от концентрации инозитолтрифосфата и жасминовой кислоты, состояния матрикса клеточной стенки, работы Са +-каналов и Са +-АТФаз. Эти факторы действуют не одновременно, причем приток кальция в клетку провоцирует процессы, приводящие к снижению его концентрации и наоборот. В результате поток кальция оказывается неравномерным во времени, возникают волны поступления/удаления кальция. Динамика волн кальция существенно различается для разных внешних сигналов (см. подразд. 6.3.4.3). До 70 % поступившего в клетку кальция связывается с цитоскелетом, активизируя его работу.
Важным вторичным мессенджером в передаче сигнала являются небольшие белки — кальмодулины. Кальмодулин имеет 4 центра, связывающихся с Са +, и его конформация различается в зависимости от числа занятых кальцием центров. От активности кальмодулинов, в частности, зависит работа Са -АТФаз: полностью заполненный кальцием кальмодулин усиливает выкачивание кальция из клетки. Гидрофобный диацилглицерин также является вторичным мессенджером. Он взаимодействует с протеинкиназой С, повышая ее фосфорилирующую активность. Далее запускается каскад фосфорилирования белков. Вторичными мессенджерами в приведенном примере выступают G-белки, фос-
УИФ3 (инозитол-1,4, ' /
иф2 Ф^ -у J'^0^ 7 J
( <^Х_ деп°У:У ИФз
( ИФбТ^ ИФ,’^ ИФ41 *^> .3
1 1(фитйн)Т^/Агатная
форма
У @ Транспорт РНК через ядерную мембрануА
Каскад фосфо-/ / / |Ф°=Ф°™пазаА
рилирования]
/ Кальмодулин
Активация цитоскелета
Кальмодулин- зависимые реакции
Система II мессенджеров
О 12345678910 И 121314151617181920120
Время, мин
Рис. 7.3. Фосфатидилинозитольная система вторичных мессенджеров:
А — последовательность активизации вторичных мессенджеров в пространстве; Б — последовательность событий на шкале времени. И — инози-тол; ИФ — инозитолфосфат; ИФ2 — инозитолдифосфат; ИФ3 — инозитолтрифосфат; ИФ4 — инозитолтетрафосфат; ИФ5 — инозитолпентафос-фат; ИФб — инозитолгексафосфат (фитин); ДАГ — диацилглицерин
фолипазы С и А, инозитолтрифосфат, жасминовая кислота, кальций, диа- цилглицерин, протеинкиназа С. При добавлении в клетку какого-либо из этих мессенджеров даже без первичного сигнала можно наблюдать физиологический ответ (обычно такой ответ бывает неполным).
Взаимодействие сигналов
Несмотря на большое многообразие первичных сигналов, при ответе клетка часто активизирует одни и те же механизмы, которые можно назвать неспецифическим ответом. Так, при действии ауксинов, гиббереллинов, абсцизовой кислоты, красного света и даже при оказании механического давления на клетку уже через 1 мин можно зарегистрировать гидролиз фосфатидилинозитолдифосфата со всей цепочкой последующих событий. Активизируются и другие системы вторичных мессенджеров. Один и тот же компонент может входить в несколько каскадов усиления сигнала. Так, многие системы вторичных мессенджеров включает Са +. Часто происходит изменение редокс-статуса клетки и увеличивается концентрация активных форм кислорода.
Протеинкиназы и факторы транскрипции изменяют активность в ответ на несколько воздействий. Оказывается, что участники одного каскада вторичных мессенджеров вовлечены и в другие реакции ответа. Тогда говорят о «переговорах» путей передачи сигнала (от англ, signaling path cross-talk). При повреждении узловых точек в перекрестной регуляции нарушается физиологический ответ на несколько стимулов одновременно. Так, мутант nph 4 (non-phototropic hypocotyl) не чувствителен ни к свету, ни к силе тяжести. Очевидно, белковый продукт гена N РН 4 участвует в «переговорах» между каскадами мессенджеров фото- и гравитропизма (см. подразд. 7.2.2.4). Если бы на каждом этапе передачи сигнала происходило только усиление, ответ слишком быстро охватил бы все молекулы в клетке. Этого не происходит благодаря «переговорам»: если один сигнал «противоречит» другим, в результате «переговоров» число его мессенджеров уменьшается. Востребованный сигнал в результате «переговоров» усиливается. Таким образом, одна из функций «переговоров» между сигнальными путями — модуляция сигнала.
Специфический ответ клетки предполагает, что 1) разные клетки в одном организме отвечают на стимул не одинаково; 2) одна и та же клетка отвечает на разные стимулы по-разному. Это достигается за счет того, что в ядре экспрессируется разный набор мРНК, в клетке вырабатываются новые белки, что позволяет развить адекватную реакцию на стимул. Восприятие сигнала зависит от состояния, в котором находилась клетка перед его получением, — от набора рецепторов, экспрессированных в данный момент, наличия вторичных мессенджеров, результатов «переговоров» между сигналами и т.д.
В организме растения существует позиционная информация, т.е. клетки «умеют оценивать» свое положение. Это позволяет им интегрироваться в единый организм и давать адекватный ответ на внешние и внутренние стимулы. Программированная гибель клеток — это ответ растения как единого целого, идущий вопреки «интересам» отдельных клеток. Запрограммированная гибель характерна для элементов ксилемы, пробковой ткани, при реакции сверхчувствительности (ответ на внедрение патогена).
АУКСИНЫ — ГОРМОНЫ АПЕКСА ПОБЕГА
История открытия ауксинов
В 1880 г. Ч. и Ф. Дарвины решали проблему воспринимающего свет органа. Растения изгибаются к боковому источнику света, причем изгиб происходит в субапикальной зоне (ниже апекса побега). Исследователи защищали от света субапикальную область — зону изгиба — светонепроницаемой тканью (рис. 7.4) и наблюдали при этом, что растения все-таки изгибались. Когда незакрытую верхушку (стеблевой апекс) проростка накрыли черным колпачком, изгиб в сторону света не происходил, хотя зона изгиба была хорошо освещена. По- видимому, направление света воспринималось апексом стебля, откуда сигнал передавался в нижележащую зону изгиба. Ч. и Ф. Дарвины предположили, что апекс стебля вырабатывает вещество, транспортирующееся вниз и вызывающее неравномерный рост, и это гипотетическое вещество они назвали ауксином (от греч. аихо — расту).
Гипотеза Ч. и Ф. Дарвинов — не единственное объяснение. Сигнал мог передаваться в виде электрических импульсов и приводить к тому же эффекту. Ауксиновая гипотеза нуждалась в экспериментальной проверке. Через 50 лет наш соотечественник Н. Г. Холодный и немец Ф. В. Вент независимо друг от друга провели эксперименты для изучения природы этого сигнала. Вещество, передающее сигнал из апекса в зону изгиба, должно растворяться в воде. Значит, при помещении побеговых апексов в воду в раствор перейдут и гипотетические ауксины. Затем нужно создать несимметричное распределение «ауксина»: верхушку с собственными ауксинами удалить, а на срез несимметрично нанести водный экстракт апексов. По техническим причинам опыт видоизменили: апексы располагали на агаровом геле, а растение декапитировали и сбоку накладывали на срез кубик агара с экстрактом. В таких условиях растения изгибались в сторону, противоположную наложенному агаровому блоку. Контролем служил агаровый блок, не пропитанный экстрактом побеговых апексов, — изгиба не было (рис. 7.5).
Рис. 7.4. ОпытЧ. и Ф. Дарвинов:Рис. 7.4. ОпытЧ. и Ф. Дарвинов:
Рис. 7.4. ОпытЧ. и Ф. Дарвинов:
Рис. 7.4. ОпытЧ. и Ф. Дарвинов:
А — отрицательный контроль (темнота): нет изгиба; Б — положительный контроль (свет справа):есть изгиб; В — опыт (свет справа, закрыта зона изгиба): есть изгиб; Г — опыт (свет справа,закрыт апекс): нет изгиба
Рис. 7.5. Опыт Ф. В. Вента:
А — начало опыта: ауксин из апексов колеоптилей диффундирует в агар (затемненные участки); Б — продолжение опыта: наложенный сбоку кубик агара с ауксином вызывает изгиб; В — контроль: агар без ауксина не вызывает изгиба
Н. Г. Холодный и Ф. В. Вент доказали, что ростовое вещество существует и вызывает растяжение клеток. Можно предположить, что при одностороннем освещении ауксин перетекает на затененную сторону и вызывает изгиб к свету. Не имея препарата выделенного ауксина, исследователи изучили его основные свойства. Если зону изгиба вырезать и блок с экстрактом ауксина накладывать на базальную сторону, изгиба не будет. Отсюда следовало, что ауксин движется по растению полярно — от апекса побега к его основанию, а затем — к апексу корня. Была измерена скорость транспорта ауксинов: на участок заданной длины помещали сверху агар с ауксином, а снизу — агаровый блок без ауксина. Верхний агаровый блок служил донором ауксинов, а нижний — коллектором. Нижний блок через равные промежутки времени заменяли новым. Полученную серию нижних блоков анализировали на проростках на наличие ауксинов. Таким способом удалось определить, что скорость транспорта ауксинов составляет от нескольких миллиметров до нескольких сантиметров в час.
Немецкий химик Ф. Кёгль в 1939 г. выделил из мочи вегетарианцев индолил- уксусную кислоту {ИУК). Для определения ее малых количеств Кёгль испробовал ИУК в разных живых системах. Выяснилось, что ИУК усиливает рост проростков с отрезанной верхушкой подобно ауксину. При асимметричном наложении агарового блока с ИУК наблюдается характерный изгиб в субапикальной зоне.
Вскоре ИУК была выделена из верхушек побегов, тем самым было показано, что ИУК является одним из естественных акусинов. Известен ряд веществ, обладающих ауксиновой активностью (фенилуксусная кислота, индолилпи- ровиноградная кислота), но их активность ниже, чем ИУК, и они менее распространены.
Кроме того, удалось синтезировать вещества, вызывающие такой же физиологический эффект, как и природные ауксины. Поскольку такие вещества не встречаются в растениях, их называют синтетическими аналогами ауксинов. К ним относятся 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), а-нафтилуксус- ная кислота (НУК) и др. Синтетические аналоги эффективно связываются с рецепторами ауксина, но слабо взаимодействуют с системами транспорта и окислительной деградации.
Биосинтез и деградация ауксинов
Ауксины синтезируются в растениях разными путями. Ранее считалось, что ИУК образуется единственным путем — из триптофана. Синтез ИУК идет как минимум в три стадии: декарбоксилирование (удаления СО2); дезаминирование (удаление МН2-группы); окисление (рис. 7.6).
Для исследования метаболических путей, ведущих от триптофана к ИУК, получены мутанты, не способные к синтезу триптофана, тем не менее у мутантов синтез ауксина не менялся. Очевидно, есть и другие пути синтеза ИУК, в которых триптофан не участвует. В некоторых растениях таких путей несколько: триптофановый и «нетриптофановые». После образования ИУК может связываться с сахарами, аминокислотами или небольшими белками, образуя неактивные (запасные) формы. При необходимости ИУК освобождается из конъюгатов.
В упомянутых выше опытах Ч. и Ф. Дарвинов с проростками злаков ауксин в апексе колеоптиля не синтезируется! ИУК образуется в период роста зародыша, а при созревании накапливаются ИУК-гликозиды. В проростках они транспортируются в апекс колеоптиля, где активный ауксин высвобождается и перераспределяется по колеоптилю в зависимости от освещенности. Колеоптиль — временный орган проростка злаков, необходимый для пробивания почвы. Внутри него заключена апикальная меристема побега, образующая стебель и листья. Именно в апикальной меристеме, а не в верхушке колеоптиля сосредоточен синтез ауксинов. ИУК может необратимо разрушаться. Это происходит либо специфически (с помощью ИУК-оксидазы), либо неспецифически (по- лифенолоксидазой) (см. рис. 7.6).
Таким образом, по мере удаления от точки синтеза концентрация ауксинов падает за счет необратимого окисления и связывания в неактивные формы.
Транспорт ауксинов
Гипотеза транспорта ауксинов была разработана для клеток субапикальной паренхимы в 1950-х гг. и с тех пор почти не изменилась. Считается, что клетка получает ауксин из внешнего пространства (апопласта), где ИУК протонирована. ИУК° (нейтральная) через белок-переносчик {influx carrier) проникает в клетку по градиенту концентрации. Предполагают, что «каналом» для ИУК° служит белок AUX 1 (рис. 7.7).
В цитоплазме среда более щелочная, чем снаружи, поэтому ИУК диссоциирует и становится ИУК"-анионом. Выход ИУК" из клетки активный — с помощью трансмембранных переносчиков, работающих с затратой энергии. «Насосы» {efflux carrier) расположены в нижней части клетки, что обеспечивает полярный транспорт. Переносящий белок конкурентно ингибируется трииод- бензоатом (ТИБК). Получены мутанты, не чувствительные кТИБК, у которых изменены белки-переносчики ИУК". Таким белком оказался PIN. При мутации pin полярный транспорт ауксина сильно снижается, что приводит к изменениям в морфологии растений, связанным с нарушением пространственного распределения ауксина. С белком PIN, выносящим ИУК" из клетки, ассоциирована регуляторная субъединица, которая связывается с нафтилфталаминовой кислотой (НФК) — еще одним блокатором транспорта ИУК.
ТриптаминТриптаминИндолилацетальдегидИндолилацетальдегидИндолилацетонитрилИндолилацетонитрилооАВР1АВР1РецепторРецепторФосфолипаза СФосфолипаза СИнозитолтрифосфат ДиацилглицеринИнозитолтрифосфат ДиацилглицеринАктивная форма—сн2—сн2—сн2—соонАктивная форма—сн2—сн2—сн2—соонNН •Индолилмасляная кислотаNН •Индолилмасляная кислотаАктивная формаАктивная формасн2-соонсн2-соонN НИндолилуксуснаякислотаN НИндолилуксуснаякислотау ИУК- ПФО/оксидазау ИУК- ПФО/оксидазаСН2СН2ДЕПО, транспортГликозиды ИУК,конъюгатыс белкамии аминокислотамиДЕПО, транспортГликозиды ИУК,конъюгатыс белкамии аминокислотами
Триптамин
Триптамин
Индолилацетальдегид
Индолилацетальдегид
Индолилацетонитрил
Индолилацетонитрил
о
о
АВР1
АВР1
Рецептор
Рецептор
Фосфолипаза С
Фосфолипаза С
Инозитолтрифосфат Диацилглицерин
Инозитолтрифосфат Диацилглицерин
Активная форма
—сн2—сн2—сн2—соон
Активная форма
—сн2—сн2—сн2—соон
N
Н •
Индолилмасляная кислота
N
Н •
Индолилмасляная кислота
Активная форма
Активная форма
сн2-соон
сн2-соон
N Н
Индолилуксуснаякислота
N Н
Индолилуксуснаякислота
у ИУК- ПФО/оксидаза
у ИУК- ПФО/оксидаза
СН2
СН2
ДЕПО, транспортГликозиды ИУК,конъюгатыс белкамии аминокислотами
ДЕПО, транспортГликозиды ИУК,конъюгатыс белкамии аминокислотами
Рис. 7.6. Биосинтез, деградация и рецепция ауксинов:
Al, А2, АЗ — варианты путей биосинтеза индолилуксусной кислоты (ИУК) из триптофана,реализуемые у разных растений; Б1, Б2 — «нетриптофановые» пути биосинтеза ИУК; В — ре-цепция и передача сигнала; Г — необратимая деградация; Д — депонирование ИУК в виденеактивных форм
/i\
Рис. 7.7. Транспорт ауксинов через клетку:
ТИБК — трииодбензойная кислота, конкурентный ингибитор транспорта ауксина; НФК —нафтилфталаминовая кислота; ингибирует транспорт ауксина, связываясь с регуляторной субъ-единицей комплекса белков-переносчиков
Из синтетических аналогов ауксинов некоторые участвуют в транспорте (НУК взаимодействует с переносчиками ИУК), а другие не участвуют (2,4-Д проникает путем диффузии). Очевидно, ИУК -насосы связаны с цитоскелетом и при изменении освещения передвигаются на теневую сторону. Ауксин очень быстро перераспределяется: через [0— 15 мин наблюдается ответ клеток на его неравномерное распределение.
Цитохолазин D, разрушая актиновые филаменты, нарушает полярный транспорт ауксинов. Транспорт ауксинов в зоне вторичного утолщения у древесных растений изучен недостаточно. По-видимому, здесь ауксины транспортируются по флоэме (симпласту).
Физиологические эффекты ауксинов
На роль рецептора ауксина претендует белок АВР 1 (auxin binding protein). В больших количествах он обнаруживается в эндоплазматическом ретикулуме, откуда путем встраивания мембран ЭПР попадает в плазмалемму. Присутствие АВР 1 в плазмалемме показано с помощью специфических антител. При обработке протопластов эти антитела экранируют сайт связывания ауксина на АВР 1, ответы на ауксины блокируются. Через 60—120 с после связывания ауксина с рецепторами (АВР 1) и включения системы вторичных мессенджеров регистрируются токи Са + через мембрану, а через 5 — 7 мин активируется Н+-помпа и заметен эффект закисления апопласта (Н+ выходят из клетки). После первичной реакции на ауксин дальнейший ответ зависит от положения клетки в целом растении. Ауксины — гормоны, вырабатываемые в апикальных меристемах побегов. Для растения в целом ауксиновый сигнал означает, что побег интенсивно растет и нужно обеспечивать его потребности. Образно ауксин можно назвать «гормоном благополучия апекса побега».
Самый первый эффект ауксинов — аттрагирующий (от лат. attractio — привлечение). Клетки меристемы «привлекают» к себе питательные вещества. Аттрагирующий механизм ауксинов не установлен, но наиболее вероятен следующий сценарий. Способность клетки к поглощению зависит от Аф г на мембране (см. подразл. 6.2.2.2). Так, сахароза проникает в клетку в симпорте с Н+, и чем больше Дцщ на плазмалемме, тем больше сахарозы клетка может захватить. Активизация работы Н+-помпы идет на усиление трансмембранного транспорта веществ. Таким образом, клетки, нуждающиеся в питательных веществах, создают больший Дцщ на мембране, увеличивающий поглотительную способность. Кроме сахарозы, клетки апикальной меристемы побега агграги- руют аминокислоты, нуклеотиды, неорганические ионы, воду и др. Аттрагирующий эффект проявляется в зоне делений клеток. Совместно с цитокининами ауксины вызывают деление клеток в определенной зоне апекса побега.
В субапикальной зоне ауксин вызывает растяжение клеток, которое также активизируется через Н+-помпу.
Клеточная стенка — прочная экстрацеллюлярная структура. При растяжении прочность снижается, силы тургорного и осмотического давления приходят в дисбаланс. Протопласт, не сдерживаемый клеточной стенкой, поглощает воду, образует крупные вакуоли и за счет этого его объем увеличивается, а клеточная стенка растягивается. Активный перенос ионов Н+ из цитоплазмы в матрикс клеточной стенки приводит к так называемому «кислому росту» и растяжению клетки (см. подразд. 1.10).
С растяжением клеток в субапикальном районе связаны более сложные явления — тропизмы. Главная задача растягивающихся клеток — правильно ориентировать растущую верхушку побега в пространстве. При боковом освещении ауксины перераспределяются на теневую сторону, вызывая неравномерное растяжение и наклон в сторону света. Это явление называют фототропизмом (гелиотропизмом). Если побег изменил положение в пространстве (наклонился, повален ветром и т.д.), ауксины перераспределяются на физически нижнюю сторону. Субапикальная зона стремится вновь направить рост по вертикали. Это явление получило название гравитропизма (геотропизма). Обычно для побегов характерен отрицательный геотропизм — побег растет по направ-
лению от центра Земли. Корни обладают положительным геотропизмом (к центру Земли).
Иногда побеги растут диагеотропно (плагиотропно), т. е. перпендикулярно силе тяжести, например боковые ветви ели (Picea abies), подземные корневища многих растений.
У лиан имеется тигмотропизм — ростовой изгиб в сторону прикосновения. Тигмотропизм важен для растений, нуждающихся в опоре: вьюнка (Convolvulus), фасоли (Phaseolus), ипомеи (Ipomoea), повилики (Cuscuta) и др.
Ниже зоны растяжения начинается дифференцировка проводящей системы и механических тканей: клетки лигнифицируются и после этого теряют способность к растяжению. Более того, если начнут растягиваться окружающие клетки, то происходит разрыв проводящих сосудов. Таким образом, ниже зоны дифференцировки сосудов побеги не могут изгибаться. Ауксин важен для регуляции анатомической дифференцировки. Потоки ИУК определяют положение прокамбия. В связи с тем, что стеблю необходим приток питательных веществ от корня, под действием ауксина и сахаров формируются проводящие пучки, в основном ксилема. На фоне ауксина в каллусной культуре in vitro формируется ксилема, если сахарозы менее 2 %, или флоэма, если сахарозы 4 % и более.
Ауксин влияет па расположение листьев. Каждый молодой лист, пока растет, служит источником ауксинов. Если нарушить транспорт ауксина из при- мордия листа в окружающие клетки (сделать надрез), то следующий лист закладывается у края надреза. У мутантов pin с нарушением транспорта ауксина (см. подразд. 7.2.2.3) листья располагаются в беспорядке, соседние примор- дии сливаются, образуя уродливые органы. Дефекты затрагивают все листья, начиная от семядолей — их число доходит до 6 (в норме 2) — и заканчивая органами цветка. Такой же эффект вызывают ингибиторы транспорта ИУК (ТИБК, НФК). Меристема листа, как и меристема побега, «привлекает» питательные вещества и обеспечивает себя правильной сетью жилок. Закладка сосудистых элементов в листьях также находится под контролем ауксинов и рас- согласуется при нарушениях транспорта ИУК.
В пазухах листьев создаются благоприятные условия для закладки и развития боковых побегов (почек). У большинства растений боковые побеги не развиваются, пока активно растет главный побег. Подавление роста боковых почек в пользу апикальной меристемы получило название апикального доминирования.
Роль ауксинов в апикальном доминировании показана экспериментально (рис. 7.8). Удаление апекса побега стимулирует рост боковых побегов. Если наложить на срез агаровый блок с ИУК, боковые почки не пробудятся. Растение воспринимает агар с ауксином как активно растущий апекс побега и ингибирует рост новых побегов. Дефицит ауксина — сигнал о повреждении побегово- го апекса: апикальное доминирование снимается и боковые почки идут в рост.
Утрата апекса побега в природе может быть вызвана как абиотическими (ураган, молния, гибель от заморозков), так и биотическими факторами (инфекция, нападение насекомых, травоядных или вмешательство человека). При потере апекса растение регенерирует побеговую систему, снимая апикальное доминирование.
Интересно снятие апикального доминирования по эндогенным причинам. При этом важна ориентация главного побега в пространстве. Различают два
Рис. 7.8. Апикальное доминирование:
А — контроль: растущий апекс побега доминирует над боковыми почками; Б — при удалении апекса доминирование снимается; В — агаровый блок с ауксином вызывает апикальное доминирование; Г — контроль: агаровый блок без ауксина, апикальное доминирование снято; Д — изменение направления роста с горизонтального на вертикальное снимает апикальное доминирование с плагиотропных боковых побегов; Е — изменение направления роста с вертикального на горизонтальное снимает апикальное доминирование с ортотропных боковых побегов. Стрелки — рост побега; крестики — остановка роста
основных направления роста — вертикальное {ортотропное) и горизонтальное {плагиотропное). Главный ортотропный побег не дает образовать новые вертикальные побеги и не мешает расти плагиотропным ветвям, но стоит повредить ортотропный побег, как из пазух листьев вырастут замещающие вертикальные побеги. Это наблюдается у кофе {Coffea arabica), араукарии {Araucaria), ели.
Чтобы снять апикальное доминирование, достаточно изменить направление роста. Этим приемом часто пользуются в интенсивном плодоводстве, сгибая ортотропные побеги и подвязывая их к опоре горизонтально. У роз и шиповника главный ортотропный побег наклоняется под собственной тяжестью (изменяет направление роста). Видимо, в зоне перегиба создается механическое напряжение, что приводит к синтезу этилена, замедлению транспорта и ускорению деградации ауксинов (см. подразд. 7.2.7).
Если главный побег плагиотропный, он доминирует над боковыми плагио- тропными побегами, но не мешает росту боковых вертикальных. Так, у растений с горизонтальным подземным корневищем есть две фазы роста: первая —- летний рост в горизонтальном направлении, апекс плагиотропного побега не дает расти боковым горизонтальным корневищам; вторая — зимой происходит «разворот» и верхушка корневища становится вертикальной, весной из нее развивается ортотропный побег. «Разворот» позволяет снять апикальное доминирование с боковых плагиотропных почек, развиваются новые горизонталь-
ные звенья корневища. При экстремальных обстоятельствах «разворот» апикальной меристемы происходит раньше (при утрате надземных ортотропных побегов). Эта форма роста характерна для тысячелистника (Achillea), вербейника обыкновенного (Lysimachia vulgaris), отчасти — картофеля (Solatium tuberosum) и др. Цветение также снимает апикальное доминирование. Если побег образует верхушечный цветок или соцветие, то ниже начинают расти боковые побеги.
В зоне вторичного утолщения у большинства деревьев умеренных широт возникает кольцо делящихся клеток — камбий. Для работы камбия нужен ауксин, поступающий через флоэму. Чем интенсивнее растет побег, тем сильнее утолщается нижележащая ось, и наоборот. Напомним: для делений клеток необходимы одновременно ауксины и цитокинины, причем ауксин обеспечивает закладку преимущественно ксилемы.
Ауксин влияет на рост корневой системы. Большое количество ауксинов — это сигнал о росте побегов: растению требуется больше воды и минеральных веществ, т.е. оно должно образовать большее число корней. Ауксины стимулируют ризогенез — закладку придаточных корней на стебле и боковых корней на главном корне. Этим пользуются в сельском хозяйстве, обрабатывая черенки раствором ИУК для укоренения.
Ауксины и неоднородность внешней среды
Суммируя эффекты ауксинов, следует отметить адекватность ответов растений на внешние стимулы, которая достигается за счет прераспределения единственной группы гормонов — ауксинов. По теории тропизмов Холодного— Вента, концентрация ауксинов повышается на теневой (при фототропизме) или на нижней (при отрицательном геотропизме) стороне побега (рис. 7.9).
Апекс побега воспринимает внешние стимулы и перераспределяет ауксины. В субапикальной зоне более интенсивно растут нижние (теневые) клетки, что приводит к тропизму (т. е. наилучшей ориентации верхушки побега в пространстве). В зоне ветвления стекающий по теневой стороне ауксин не дает разви-
КлеткиКлетки=> образование боковых доминирование=> образование боковых доминированиеи адвентивных корнейи адвентивных корнейРис. 7.9. Неоднородное распределение ауксиновРис. 7.9. Неоднородное распределение ауксинов
Клетки
Клетки
=> образование боковых доминирование
=> образование боковых доминирование
и адвентивных корней
и адвентивных корней
Рис. 7.9. Неоднородное распределение ауксинов
Рис. 7.9. Неоднородное распределение ауксинов
ваться боковым почкам, а на более освещенной части стебля боковые почки «просыпаются» раньше. В итоге побеговая система занимает малейшее хорошо освещенное пространство. Если побег упал на землю, стекающий вниз ауксин не дает развиваться нижним боковым почкам — побеги растут на верхней стороне. На нижней стороне, контактирующей с почвой, образуются придаточные корни, позволяя стеблю укорениться.
Ауксин и плоды
Ауксин стимулирует развитие бессемянных плодов. В норме плоды с многочисленными семенами лучше обеспечены питательными веществами, чем те, в которых семян нет. В силу агтрагирующего эффекта ауксинов чем больше семян образовалось в плоде (чем больше точек синтеза ауксинов), тем лучше плод обеспечивается питательными веществами. При обработке бессемянных плодов ИУК у растения создается «иллюзия», что семена в них есть. Туда направляются питательные вещества, стимулируя развитие плодов.
Ауксин как гербицид
Если ауксинов слишком много, то начинается синтез гормона-антагониста
этилена. Этилен угнетает рост побегов и корней в длину и вызывает листопад (см. подразд. 7.2.7). При обработке естественными ауксинами (ИУК, ИПВК и
2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислотаРис. 7. (0. Примеры синтетических аналогов ауксиновРис. 7. (0. Примеры синтетических аналогов ауксиновдр.) начинается их окисление и/или образование конъюгатов. Систем инактивации синтетических аналогов (ПУК, 2,4-Д) у растений нет (рис. 7.10). При обработке растений 2,4-Д синтезируются антагонисты (в основном этилен), рост угнетается, листья желтеют и опадают и т.д. У двудольных под действием 2,4-Д отмирают кончики корней, и это позволяет использовать 2,4-Д как селективный гербицид. На плантациях пшеницы (Triticum aestivum), ржи {Secale cereale) или кукурузы {Zea mays) 2,4-Д используют ограниченно (2,4-Д — канцероген, мутаген и яд). Газоны состоят из однодольных (злаков), которым 2,4-Д не причиняет вреда, а одуванчики {Taraxacum officinale), маргаритки {Bellis perennis) и другие двудольные по- гибают. Низкие дозы 2,4-Д применяют в посадках
2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота
2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота
Рис. 7. (0. Примеры синтетических аналогов ауксинов
Рис. 7. (0. Примеры синтетических аналогов ауксинов
декоративных луковичных растений.
Гербицидные свойства ауксинов могут проявиться при укоренении черенков: превышение дозы препарата или времени обработки ведет к синтезу этилена, что неблагоприятно для растений.
Гравитропизм
Как модель для изучения гравитропизма обычно используют корни. Во многих клетках растения есть крупные крахмальные зерна (амилопласты). Поддей-
ствием силы тяжести они опускаются на нижнюю сторону клетки. Была выдвинута гипотеза, что крахмальные зерна отвечают за восприятие силы тяжести, а амилопласты назвали статолитами.
В центрифуге растения воспринимают центробежную силу, что коррелирует с оседанием статолитов. Однако корреляция не дает права утверждать, что статолиты действительно играют роль в восприятии силы тяжести. При хирургическом удалении ткани с крахмалом (корневого чехлика) гравитропизм корня нарушается, но чехлик важен для ростовых процессов в корне, нарушение тропизма может быть вызвано с травмой, а не удалением клеток с крахмалом.
Более корректный эксперимент был поставлен в середине 1970-х гг. У мутантов по синтезу крахмала скорость изгибания корня при гравистимуляции составила около 70 % ответа нормальных растений. Отсюда следовало, что крахмал отвечает не более чем за 30 % чувствительности к силе тяжести. По современным данным, значительную роль в восприятии силы тяжести играет распределение органелл в клетке и состояние цитоскелета.
После восприятия первичного стимула (изменение положения растения относительно вектора силы тяжести) потоки ауксинов перераспределяются. У всех мутантов с пониженной чувствительностью к ауксинам гравитропизм нарушен. Возможно, что у них восприятие силы тяжести и перераспределение ауксинов происходят нормально, но клетки, не чувствительные к ауксинам, не в состоянии на это ответить. В гравитропизме участвует Са + как вторичный мессенджер ответа на ауксин. Хелатирование ионов Са + в апопласте с помощью ЭДТА нарушает гравитропический ответ. Без направленных потоков катионов через корневой чехлик гравитропизм невозможен. Удаление чехлика нарушает ответ, а при замене чехлика агаровым блоком с раствором солей калия происходит гравистимулированный изгиб.
ЦИТОКИНИНЫ — ГОРМОНЫ КОРНЕВОГО АПЕКСА
История открытия
Первые стерильные культуры клеток животных были получены в начале XX в., но до 1950-х гг. получить культуры растительных клеток не удавалось. Над этой проблемой работал американец Ф. Скуг. Полученную из стеблей табака (Nicotiana tabacum) сердцевинную паренхиму помещали на искусственные среды, содержащие минеральные вещества, сахар, витамины, аминокислоты, а также ИУК. Клетки паренхимы приступали к делениям, но рост быстро останавливался. В лаборатории Ф. Скуга перепробовали различные добавки: экстракт дрожжей, томатный сок, сок листьев табака, и все безрезультатно. Небольшого успеха удалось добиться только при добавлении в среду кокосового молока, В 1950-х гг. ученые обнаружили, что наследственная информация передаете^ от родителей к потомкам с помощью ДНК (механизм этого явления был не известен). Ф. Скуг предположил, что растительным клеткам не хватает ДНК. В среды начали добавлять ДНК из молок сельди (самый дешевый источник ДНК), но клетки не делились.
Открытие цитокининов состоялось благодаря ошибке, допущенной в ходе эксперимента. По методике флаконы со средой помещали в автоклав, где ра-
6-Бензиладенин (6-бензиламинопурин)6-Бензиладенин (6-бензиламинопурин)6-Фурфуриладенин (кинетин)6-Фурфуриладенин (кинетин)Рис. 7.11. Примеры естественных цитокининов и их синтетических аналоговРис. 7.11. Примеры естественных цитокининов и их синтетических аналогов
6-Бензиладенин (6-бензиламинопурин)
6-Бензиладенин (6-бензиламинопурин)
6-Фурфуриладенин (кинетин)
6-Фурфуриладенин (кинетин)
Рис. 7.11. Примеры естественных цитокининов и их синтетических аналогов
Рис. 7.11. Примеры естественных цитокининов и их синтетических аналогов
створ нагревается выше 100 °C. Случайно режим автоклавирования был нарушен, и среда вместе с ДНК перегрелась. Именно на этой среде сердцевинная паренхима табака начала интенсивно расти. Выяснилось, что в перегретом препарате ДНК есть вещество, которое на фоне ауксина вызывает деление клеток, — фурфуриладенин (рис. 7.11). По физиологическому эффекту это вещество назвали кинетином (от греч. kinesis — деление). Вскоре из эндосперма кукурузы выделили аналогичное природное вещество — зеатин {Zea — кукуруза). Так была открыта новая группа фитогормонов — цитокинины.
Первые неудачи Ф. Скуга объяснялись разрушением природных цитокининов при нагревании. В растительных экстрактах содержались природные цитокинины, но они разрушались при автоклавировании.
Биосинтез и инактивация цитокининов
В клетке цитокинины образуются из аденина; к нему присоединяется боковая изопентильная группа и это приводит к образованию цитокининового скелета. Далее происходит дефосфорилирование и отщепляется рибоза. Самый простой из цитокининов — изопентениладенин, который проявляет большую физиологическую активность, чем изопентениладенинрибозид, или изопен- тенил-АМФ. Другие цитокинины образуются при модификации изопентиль- ного фрагмента (гидроксилирование, окисление, восстановление).
Цитокинины в клетке присутствуют в активной и неактивной форме. Неактивные формы цитокининов — Ng-гликозиды и гликозиды по гидроксилам изопентенильного фрагмента (рис. 7.12). Присоединяя или отсоединяя сахара, клетка регулирует концентрацию активных цитокининов. Возможно необратимое разрушение цитокининов, поэтому по мере удаления от точки синтеза их концентрация падает.
N’
N
nh2
N
п с
CH2O-©
Н3С^ )с=с.
Н3С
H
CH2-O-®-®
нм-сн2-сн=с
•N
■СНз
СН3
ОН ОН
АМФ
Изопентенилпирофосфат
Активные формы
n^n
О
CH2O-®
Н.
С=С
HN-CH,
Н
,СН2-ОН CHi
ОН ОН
Транс-зелтинриботид
он он Изопентениладенинриботид
HN—СН2
ДЕПО
Изопентинил-адснинрибозид
Транс-зеатинрибозид
N
N
N9-гликозиды
Дигидрозеатин- рибозид
ОН ОН
Дигидрозеатинриботид
/СН2-ОН с=с^
си,-он
Н.
HN-CH,
N
N14
NН
Рис. 7.12. Биосинтез, инактивация, дегра-дация и рецепция цитокининов:
1 — ключевой этап биосинтеза цитокининов: присоединение изопентенильной группиров-
Н^/СН3
/С=СHN-CHt'"СНз
Рибоза
ОН 0 СН2ОН
Изопентениладенин
н.
Рибоза
Рибоза
Рибоза
Гликозили- рование .
HN—СН:
N
Н
Транс-зеатин
/СН2-ОН С=С^ СНз
Рибоза
Аденин
/СН2ОН С=С
^СН2—О (Сахару
Н^ /СН-ОН с=с
HN-CH, ^СН2-ОН
Дипадрозеатин
Дегра
дация* Изопенте- нильная
CRE1
ки к адениновому ядру; 2а, 26 — гидроксилирование изопентенильной группировки создает многообразие природных цитокининов; За, 36, Зв — дефосфорилирование, приводящее к неактивным (запасным) ^-гликозидным формам; 4а, 46, 4в — удаление/присоединение рибозы контролирует баланс активных и неактивных форм цитокининов; 5 — депонирование при гликозилировании изопентенильной группировки; 6 — рецепция цитокининов; 7 — необратимая деградация цитокининов путем отсоединения изопентенильной группировки
Выделены гены растений, белковые продукты которых связываются с цитокинином и имеют характерную для рецепторов структуру. Так, у белка CRE 1 (от cytokinine receptor) есть фрагмент, выступающий на наружную поверхность плазмалеммы и связывающийся с молекулой цитокинина. Ближе к С-концу в белке расположены гистидинкиназный домен и два домена, участвующие в переносе фосфатной группы (REC — Receiver domains). Предполагают, что рецептор цитокинина взаимодействует с MAP-киназной системой трансдукции сигнала.
Цитокинины способствуют синтезу ДНК в клетке, контролируют S-фазу клеточного цикла у растений. Аденин с заместителями, похожими на радикал цитокининов, входит в состав тРНК. Если брать синтетические аналоги цитокининов (бензиламинопурин — БАП), то радикал-бензил появляется в тех же тРНК в характерном положении. По-видимому, цитокинин не встраивается в тРНК, происходит лишь «переброска» радикала с молекулы цитокинина на аденин тРНК.
Эффекты цитокининов от апекса корнядо апекса побега
Цитокинины оказались во многом похожими на ауксины, но между ними есть и существенные различия. Главное отличие — у цитокининов иная точка синтеза. Если ауксины синтезируются в апексе побега, то цитокинины — биохимический маркер апекса корня. Ауксин транспортируется по растению сверху вниз и активно, а цитокинин — снизу вверх и пассивно.
Цитокинины образно можно назвать «гормонами благополучия апекса корня».
Аттрагирующий эффект. Апекс корня для своего роста нуждается в питательных веществах. Минеральных солей и воды у корня в достатке, поэтому необходимо «притягивать» органические вещества. Этот эффект проявляется в зоне деления корня.
Иногда цитокинины называют гормонами «омоложения» растительных тканей. При обработке цитокинином листа, готовящегося к листопаду, он долго остается зеленым. Это настолько впечатляло, что физиологи считали «омоложение» главным эффектом цитокининов. При более пристальном рассмотрении окажется, что так проявляется аттрагирующий эффект. Перед листопадом все белковые молекулы листа разрушаются, и аминокислоты перетекают в корень (т. е. к источнику цитокининов). К листопаду в листьях почти нет азота. Оттекают из осеннего листа и другие органические вещества. Таким образом, происходит не старение, а запрограммированная гибель листа (вечнозеленые листья в тропиках остаются живыми в 3 — 5 раз дольше, чем листья листопадных растений умеренной зоны).
Если ввести в лист меченый глицин и обработать часть листа цитокинином, глицин соберется в обработанной половине.Так как источником цитокининов была соседняя половина листа, метка переместилась именно туда. Таким образом, лист не омолаживается, цитокинин не дает ему погибнуть от истощения, притягивая и удерживая питательные вещества.
Цитокинин и дифференцировка клеток. В зоне дифференцировки корня цитокинины отвечают за образование проводящей системы. Так как корень
нуждается в продуктах фотосинтеза, транспортируемых флоэмой, цитокинины стимулируют закладку элементов флоэмы.
Цитокинин — это запрос на фотоассимиляты. Если ткань способна образовать хлоропласты, то под действием цитокинина синтезируется хлорофилл. Даже при недостатке света семядоли тыквы (Cucurbitapepo), обработанные цитокинином, приобретают зеленый цвет, появляются хлоропласты.
Распространяется цитокинин вверх с ксилемным током. Ксилема — мертвая ткань, поэтому она не может обеспечить ни активного транспорта, ни полярности: для этого нужны живые мембраны. Цитокинины транспортируются пассивно и неполярно.
О том, что цитокинины содержатся в ксилеме, догадывался еще Ф.Скуг. Если сердцевинную паренхиму стебля не отделить от ксилемы, то некоторое время клетки паренхимы делятся (это было известно до открытия цитокининов). При вторичном утолщении цитокинины стимулируют работу камбия и образование флоэмных элементов.
Повышенная концентрация цитокининов «говорит» растению о благополучном развитии корневой системы. Это означает, что нет необходимости в новых корнях. Цитокинины подавляют рост боковых корней.
Вместе с тем нужны побеги, которые образуют новые листья и позволят лучше снабжать растущие корни. Под действием цитокининов развиваются боковые почки на побегах. Таким образом, цитокинины снимают апикальное доминирование, вызванное ауксинами.
Следует отметить, что ауксины и цитокинины — антагонисты в процессе регуляции развития боковых почек. В другом процессе — регуляции клеточных делений — они синергисты.
Характерна реакция устьичных клеток на цитокинин: если вода поступает из корня (обогащена цитокининами), устьица открываются. Если вода поступает из других органов, она бедна цитокининами и богата абсцизовой кислотой, устьица закрываются (см. подразд. 7.2.6.4).
Цитокинины стимулируют рост бессемянных плодов. Этот эффект напоминает действие ауксина. В зародыше появляется корневой полюс, который синтезирует цитокинины, т.е. чем больше в плоде семян, тем выше концентрация. цитокининов. При обработке цитокининами растение «считает», что в бессемянном плоде есть зародыши, работает аттрагирующий эффект.
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АУКСИНОВ И ЦИТОКИНИНОВ
Физиологическое действие ауксинови цитокининов в культуре in vitro
С открытием цитокининов началось культивирование растительных клеток in vitro. Первым типом ткани, полученным из паренхимы табака, был каллус. В природе каллусы образуются в местах повреждения: растению необходимо быстро зарастить шрам, заполняя его бесформенной массой клеток. Поврежденная проводящая система (сосуды), покровные и механические ткани восстанавливаются позже. Клетки каллуса быстро делятся, веретено деления располагается в случайном направлении. При этом получается рыхлая клеточная масса.
Рис. 7.13. Действие ауксинов и цитокининов на каллусную ткань:
А — физиологическая активность ауксинов и цитокининов приблизительно равны — развивается каллусная ткань; Б — ауксины преобладают над цитокининами — ризогенез (образование корней); В — цитокинины преобладают над ауксинами — геммагенез (образование побегов)
Для стимуляции деления клеток /и vitro в среду добавляют и ауксины, и цитокинины. Показано, что ауксины активируют CDK-протеинкиназы клеточного цикла (cycline dependent kinases), а цитокинины — соответствующие цик- лины. Комплекс CDK-циклин необходим для запуска клеточного деления. Изменение соотношения ауксин/цитокинин приводит к морфогенезу in vitro. При преобладании ауксинов начинается ризогенез (от греч. rhiz.a — корень; genesis — рождение). Если же преобладают цитокинины, то образуются меристемы побегов, т.е. начинается геммагенез (от греч. gemma — почка) (рис. 7.13).Такое поведение культуры клеток хорошо согласуется с функцией ауксинов и цитокининов как «гормонов благополучия» побегов и корней соответственно. Недостаток ауксинов воспринимается клетками как недостаточное развитие побегов и служит сигналом для их образования. В дифференцированных побегах синтезируется ауксин и баланс гормонов восстанавливается. Аналогичный механизм работает при недостатке цитокининов, тогда формируются корни. При удалении из среды и ауксинов, и цитокининов в культуре клеток иногда образуются биполярные структуры — эмбриоиды {embryo — зародыш; eidos — похожий). У каждого эмбриоида есть свой источник цитокининов (корневой полюс) и ауксинов (побеговый полюс). Культуру клеток используют в технологиях ускоренного размножения растений.
Баланс между ауксинами и цитокининамив интактном растении
Итак, для нормальной жизни в растении всегда должен существовать баланс между ауксинами и цитокининами. Процесс вегетативного роста растений можно моделировать, рассматривая только полярный транспорт и взаимодействие ауксинов и цитокининов. Если главный стебель отделить от корня, то в верхней части останется точка синтеза ауксинов и возникнет дефицит цитокининов. ИУК из апекса транспортируется к основанию черенка, где создается избыток ауксинов. Для восстановления баланса нужны цитокинины, т. е. формируются корни. У оставшейся нижней части растения есть точки синтеза цитокининов,
но не хватает ауксинов. Цитокинины транспортируются вверх и накапливаются около среза. Это также вызывает нарушение баланса и ведет к синтезу ауксинов: пробуждаются спящие почки или из каллусной массы возникают новые побеги.
В интактном растении активные деления клеток происходят в апексах корня и побега. Согласно модели, чем дальше находится орган от кончика корня, тем меньше в нем цитокинина. Апексом побега транспорт заканчивается, и происходит накопление цитокинина. Ауксин синтезируется в апексе побега. Таким образом, в меристеме побега концентрация цитокининов и ауксинов оказывается достаточной для поддержания клеточных делений.
Обратная ситуация в апексе корня. Ауксин накапливается, так как апекс корня — конечный пункт транспорта ИУК. Вместе с синтезируемыми в корне цитокининами ауксины вызывают клеточные деления в меристеме корня. Чем больше расстояние от кончика корня до верхушки побега преодолевают гормоны, тем меньше их содержание в меристеме. Наконец, наступает момент, когда цитокининов, поступающих в апекс побега, недостаточно для делений. Рост стебля вверх останавливается. Аналогично регулируется рост корня вглубь. Таким образом, полярный рост растения можно моделировать на основании баланса ауксинов/цитокининов.
Расположение камбия в растении также не случайно. По флоэме вниз движется ауксин, а по ксилеме вверх — цитокинин. Между ними на «перекрестке» потоков ауксинов и цитокининов (а также фотоассимилятов и минеральных веществ), необходимых для деления, находятся делящиеся клетки камбия. Работа камбия также моделируется исходя из теории баланса фитогормонов: если ауксин преобладает, камбий откладывает больше ксилемы, обеспечивая приток цитокининов из корней, избыток цитокининов ведет к закладке флоэмы (по ней поступят новые порции ауксина, снова возникнет равновесие между двумя типами гормонов). Поврежденные корни и ветви утолщаются гораздо хуже. Причина этого — в низкой способности к синтезу гормонов. Однако чем больше потоки гормонов через ветку или корень, тем сильнее работа камбия, больше флоэмы и ксилемы, выше механическая прочность.
Цитокинины и паразиты растений
Образно говоря, грибы и бактерии за миллионы лет совместного существования с растениями гораздо лучше усвоили физиологию растений, чем человек. У них возникли блестящие приспособления для «эксплуатации» организма растений: достаточно подать запросы на питательные вещества, и растение само направит вещества к месту инфекции. Многие фитопатогенные грибы вырабатывают цитокинины. В местах инфекции возникает опухоль, из которой растут многочисленные побеги — так называемая ведьмина метла.
Бактерии Pseudomonas savastanoi синтезируют не только цитокинин, но и ауксин. Они поражают сирень (SyringaY бирючину (Ligustrum), оливу (Olea еигораеа) (сем. Маслинные). Пораженная псевдомонадами ткань интенсивно делится, образуя каллус, питательные вещества аттрагируются к месту инфекции, но при обработке антибиотиками рост опухоли прекращается.
Высокоспециализированный механизм нарушения гормонального баланса есть у Agrobacterium tumefaciens и др. видов агробактерий. Фрагмент ДНК (Т-ДНК),
содержащий гены синтеза ИУК, цитокининов и опинов, переносится из агробактерий в ядра растительных клеток — происходит трансформация. Трансформированные клетки растений начинают опухолевый рост и синтезируют опины, которые не утилизируются растениями, но служат источником углерода и азота для агробактерий. При обработке антибиотиками опухоль продолжаем расти, так как клетки продолжают производить ауксины и цитокинины за счет встроенной Т-ДНК.
ГИББЕРЕЛЛИНЫ — ГОРМОНЫ ЛИСТА
История открытия
В Японии распространено заболевание риса (Огуга sativa) баканоэ (в пер. с яп. — бешеный рис). Больные растения опережают в росте здоровый рис, но больные колосья уродливые и зерна не бывает. В 1926 г. Э.Куросава выделил возбудителя болезни — гриб Gibberella fujikuroi (сейчас его перенесли в род Fusarium). Выяснилось, что симптомы баканоэ вызываются культуральной жидкостью этого гриба, т.е. Gibberella fujikuroi выделяет вещество, усиливающее рост риса. Гипотетическое вещество было названо гиббереллином.
В 1930 г. японские химики выделили гиббереллин в кристаллическом виде и предложили структурную формулу. Эту работу прервала война, и до 1950 г. о гиббереллине знали мало. Исследования возобновили в Англии и США, и к 1955 г. структура первого гиббереллина была окончательно установлена. Оказалось, что растения вырабатывают похожие вещества — эндогенные гиббереллины. Это — самый обширный класс растительных гормонов, их известно уже более 100.
Поскольку большинство гиббереллинов — кислоты, их принято обозначать ГК (гибберелловая кислота) с соответствующим индексом, например: ГК24, ГК53 и т.д. Наиболее часто в экспериментах используют ГК3.
Биосинтез гиббереллинов
Биосинтез гиббереллинов начинается в пластидах: из дезоксиксилулозо-5- фосфата образуются изопентенилпирофосфат, геранилпирофосфат и геранил- гераниолпирофосфат. Ключевая стадия биосинтеза — циклизация последнего продукта с образованием энт-копалилдифосфата и энт-каурена, предшественника гиббереллинов (рис. 7.14). Энт-каурен покидает пластиду, и дальнейший синтез идет в ЭПР и цитозоле: он последовательно окисляется до энт-кауре- новой кислоты, энт-гидроксикауреновой кислоты, ГК12-альдегида и ГК12-кис-
Рис. 7.14. Биосинтез гиббереллинов:
1 — общая часть биосинтеза терпеноидов в пластидах; 2 — образование энт-каурена — универсального предшественника гиббереллинов; 3 — окисление энт-каурена в эндоплазматическом ретикулуме; 4 — разветвление путей биосинтеза гиббереллинов, большинство предшественников имеет слабую физиологическую активность; 5 — образование активных форм гиббереллинов; 6 — превращение в неактивные формы (ГК8, ГК34); 7 — депонирование в форме гликозидов
Активные формы
СН2
НО
о®©
ГК 34
сн2
соон
СН3
сн2-о®@
,0
СООН
ГК9
СН,
гкм
s;
сн2-о®©
Энт-кауренол
Энт-кауреналь
Энт-каурен
Энт-каурен
Энт-7а-гидро кси- кауреновая кислота
н,с
О'
н он
^с-с—с-сн2-сн2-о®
1 он н
1 -Дезоксиксилулозо-5-фосфат
Н3С^ _ ,н
н3с"С—^СН-О®®
Изопентенилпирофосфат
'— Геранилгераниолпирофосфат
Копалилдифосфат
сн.
СООН
О,
СН20
Неактивные ГК-гликозиды
ДЕПО ГК v
соон гк
снэ
ОН L
НО
гк20 но
ГК19
сн2
Энт-кауреновая кислота
сн2
ГК 44
гк15
СН,
гк8
соон 8
СН;
СООН соон
СН2
СООН соон
ГК53
ГКП
СН2
соон f-0н
ГК12-альдегид
лоты. Далее биосинтез гиббереллинов разделяется на параллельные ветви, которые путем модификации радикалов и замыканием дополнительных циклов внутри молекул приводят ко всему разнообразию гиббереллинов. Физиологически активны далеко не все гиббереллины. Активны, в частности, ГК], ГК3, ГК4, ГК? и др. Физиологическая активность зависит от вида растения: один и тот же гиббереллин может быть активен у одного вида, но не вызывает физиологического эффекта других.
Биосинтез гиббереллинов контролируется многими факторами. Начальные стадии находятся под контролем развития (т. е. включаются на определенных этапах развития и дифференцировки). Переходы ГК12 -> ГК9 и ГК53 -» ГК20 зависят от продолжительности светового дня и уровня ауксинов. В этой точке метаболизма регулируется переход к цветению под действием гиббереллинов. На переход от ГК9/20 к активным ГК4/1 влияют как ауксины, так и красный свет. Эта стадия биосинтеза находится под контролем при прорастании семян. Рецепция гиббереллинового сигнала приводит к замедлению синтеза активных ГК, усиливает превращение активных ГК4/1 в неактивные ГК34/8.
Как и большинство растительных гормонов, гиббереллины образуют с сахарами неактивные гликозиды (запасные формы гиббереллинов). Кроме того, в растениях есть специфические оксидазы, необратимо разрушающие гиббереллины до неактивных соединений. Пути передачи гиббереллинового сигнала изучены мало. Рецепторы, связывающиеся с гиббереллинами, еще не охарактеризованы. Показано, что в трансдукции сигнала участвует цГМФ
Был выделен мутант арабидопсис spy (spindly) с конститутивным ответом на гиббереллин: мутанты сильно вытягиваются, семена преждевременно прорастают и т. п. Вероятно, белок SPY работает как N-ацетилглюкозаминтрансфераза, и гликозилирование является важным для репрессии ответа на гиббереллин. У мутантов spy репрессия снимается, и наблюдается постоянный ответ на гиббереллин, не зависящий от добавления ГК. Еще один белок гиббереллинового ответа был выделен благодаря мутации gai (GA-insensitive). Он оказался транскрипционным регулятором. Мутанты gai не чувствительны к гиббереллинам.
Гиббереллины вызывают синтез специфических факторов транскрипции, которые обозначены как GAMyb. GAMyb-белки узнают последовательности в промоторах многих генов, например узнают промотор а-амилазы (см. подразд. 7.2.5.4).
Основные физиологические эффекты гиббереллинов
Образно гиббереллины можно назвать «гормонами благополучия зеленого листа». Гиббереллины вырабатываются в основном в фотосинтезирующих листьях, но могут синтезироваться и в корнях. Действуют гиббереллины прежде всего на интеркалярные меристемы, расположенные в непосредственной близости от узлов, к которым прикреплены листья. Это можно наблюдать при обработке гиббереллинами злаков: растения сильно вытягиваются, механическая прочность соломины понижается, стебель полегает. Кроме того, при действии ГК у риса и кукурузы не образуется фертильная пыльца, поэтому при болезни баканоэ рис не дает урожая.
Если наблюдать за ростом побегов деревьев, выяснится, что апикальная меристема активна только во второй половине лета (при закладке почки). Ви-
димый рост побега идет весной: из почки образуется длинный побег. Весенний рост целиком происходит за счет интеркалярных меристем. Почки растений не одинаковы. Так, почки конского каштана (Aesculus hippocastanea), тополя (Populus tremula), яблони (Malus domestica), березы (Betula pendula) покрыты почечными чешуями (катафиллами). Это видоизмененные листья, в которых идет фотосинтез. Междоузлия между почечными чешуями сохраняются короткими, а в основании побега остается почечное кольцо (близко расположенные рубцы ката- филлов). Выше лежат фотосинтезирующие листья, и чем больше их площадь, тем длиннее междоузлие под ними. Видимо, крупный лист производит гиббереллина больше и дает более мощный сигнал в интеркалярную меристему. Клетки активнее делятся и растягиваются там, где больше гиббереллина. Междоузлие оказывается длиннее. Чешуевидные катафиллы почти не вырабатывают ГК, интеркалярная меристема не работает, образуется почечное кольцо.
У крушины (Frangula alnus), дёрена (Cornus albus), облепихи (Hippophae rhamnoides) почечных колец нет. Их почки прикрыты листьями, которые весной становятся хорошо развитыми и зелеными. Они подают ГК-сигнал вставочным меристемам, междоузлия растягиваются, возникает листовая мозаика. У ясеня (Fraxinus excelsa) весной катафиллы зеленеют, но они меньше типичных фотосинтезирующих листьев. Вставочные меристемы получают слабый сигнал, расстояния между катафиллами несколько увеличивается.
Сложнее реагируют на гиббереллины розеточные растения. В начале сезона они образуют прикорневую розетку крупных листьев, однако междоузлия не увеличиваются. Гиббереллиновый сигнал направляется к апексу побега, и, когда уровень ГК превышает некоторый порог, меристема образует соцветия. Междоузлия в соцветии гораздо длиннее, чем между листьями розетки. Таким образом, ГК-сигналы могут поступать в интеркалярные меристемы из нижележащих листьев.
Биосинтез ГК ингибируется паклобутразолом (промышленный ретардант). Его используют в растениеводстве, когда высокие стебли нежелательны (многие цветки на коротких цветоножках эффектнее, чем на длинных). При обработке паклобутразолом получаются «искусственные карлики». Из Голландии, например, экспортируют «карликовые» хризантемы (Chrysanthemum), каланхоэ (Kalanchoe) и другие растения. Они пользуются большим спросом, но после продажи ретардант перестает действовать, синтезируется ГК и рост нормализуется.
Гиббереллины и прорастание зерна
Гиббереллины мобилизуют запасные питательные вещества при прорастании семян. Детально этот процесс изучен у злаков (ячменя (Hordeum vulgare), ржи, пшеницы), так как имеет практическое значение в производстве пива.
Зерновка злаков состоит из зародыша, эндосперма и семенной кожуры. Запас питательных веществ сосредоточен в эндосперме в виде крахмала (рис. 7.15). К моменту созревания зерна крахмалистый слой уже не содержит живых клеток. На периферии эндосперма остается слой живых клеток с запасными белками — алейроновый слой. Зародыш злаков контактирует с эндоспермом щитком. При прорастании щиток выделяет ГК. Гиббереллины диффундируют через крахмалистый эндосперм к алейроновому слою. В живых клетках алейро-
нового слоя синтезируются мРНК амилаз — ферментов, разрушающих крахмал. Промоторы амилаз содержат консенсус, узнаваемый GAMyb-факторами транскрипции (см. подразд. 7.2.5.2). Белковые гранулы (алейрон) растворяются: запасной белок разрушается до аминокислот, из которых синтезируются амилазы. Амилазы поступают из алейронового слоя к крахмальным зернам. Крахмал разлагается до мальтозы и глюкозы, их впитывает щиток и передает тканям зародыша. Таким образом, гиббереллины обеспечивают аттрагирующий эффект.
Гидролиз крахмала в зерновках злаков важен для пивоварения. По технологии ячмень проращивают, выжидают, когда крахмал разрушится, варят проростки в воде. Экстракт упаривают и получают темную сладкую массу — солод. Качество солода зависит от жизнеспособности зародышей (и от синтеза ГК): чем ниже всхожесть, тем хуже солод.
Качественный солод можно получать из плохо прорастающих семян, если обработать их раствором ГК, способствующих разрушению крахмала. Наличие зародыша не обязательно: обломки семян пригодны для производства солода. ГК, ускоряя процесс получения солода, широко используется в пивоварении.
Еще один пример аттрагирующего действия гиббереллинов — стимуляция развития бессемянных плодов (например, бескосточковых сортов винограда (Vitis vinifera)). Применение ГК повышает урожай.
Гиббереллины стимулируют прорастание не только злаков, но и других растений. У подсолнечника (Helianthus annuus) и тыквы ГК запускают разруше-
Рис. 7.15. Зерновка злаков при прорастании:
1 — вода поступает в зародыш; 2 — ткани зародыша синтезируют/освобождают из депо активные гиббереллины; 3 — гиббереллины транспортируются к алейроновому слою эндосперма; 4 — в алейроновом слое синтезируется амилаза (4а — тот же процесс при большом увеличении); 5 — амилаза поступает в крахмалоносную ткань эндосперма и деполимеризует крахмал; 6 — глюкоза поступает к зародышу
ние запасных жиров и их окисление до сахаров, у бобовых мобилизуют гранулы запасных белков и т.д. Перед посадкой рекомендуют обрабатывать гиббереллином семена, клубни и луковицы: увеличивается процент прорастания, рост становится более активным.
Гиббереллин и проявление пола у растений
Гиббереллины контролируют проявления пола у растений. В 1970-х гг. под руководством М.Х.Чайлахяна исследовали регуляцию пола у огурца (Cucumis sativus) и конопли (Cannabis sativa). Огурцы образуют мужские и женские цветки на одном растении, а конопля — двудомное растение (есть мужские и женские экземпляры). Обработка ГК вызвала увеличение процента мужских растений у конопли и увеличила закладку мужских цветков на огурцах. Гор- моном-антагонистом был цитокинин, вызывающий феминизацию. Опыты, проведенные в США на кукурузе, показали обратный эффект: при обработке ГК3 за 8 — 9 дней до мейоза в мужской метелке образовались женские цветки и семена, а обработка за 3 дня до мейоза приводила к мужской стерильности. Мужскую стерильность можно вызывать гиббереллином и у риса (при болезни баканов-. см. подразд. 7.2.5.1). Проявление пола зависит не только от вида, но и от генетической линии, к которой принадлежит растение. Так, обработка ГК томатов (Lycopersicon esculentum) дикого типа вызвала образование избыточного числа гнезд в завязях (стимулировала женское развитие). У мутантов томата stamenless, лишенных тычинок, ГК вызывала нормализацию андроцея (стимулировала мужское развитие).
Несомненно, уровень гиббереллинов влияет на пол растений, но результат зависит от вида и генетической линии.
Гиббереллин и цветение растений
Гиббереллины стимулируют цветение ряда растений. Обычно уровень эндогенных ГК повышается при увеличении длины дня. У многих растений цветение контролируется фотопериодом. Виды, цветущие на длинном дне, можно заставить цвести с помощью гиббереллинов. В опытах М. Х.Чайлахяна к ГК оказались чувствительными рудбекия (Rudbeckid), каланхоэ, морковь (Daucus carota), другие виды не цвели. Участие гиббереллина в регуляции цветения очевидно, хотя результат зависит от частной физиологии объекта (см. подразд. 7.4.2).
АБСЦИЗОВАЯ КИСЛОТА — СИГНАЛ ВОДНОГО СТРЕССА
Открытие абсцизовой кислоты
В 1949 г. были проведены эксперименты с покоящимися почками березы. Водный экстракт почек замедлял рост гипокотилей, а при нанесении совместно с ауксинами ингибировал растяжение. Когда покой почек заканчивался, экстракт не угнетал рост. Исследователи предположили, что в почках содержится ростовой регулятор — дормин (от англ, dormancy — покой).
В 1962—1964 гг. в США Дж. Лью и Г. Р. Карнс изучали созревание и опадение коробочек хлопчатника (Gossypium hirsutum). Они предположили, что в хлопчатнике накапливается вещество, стимулирующее обезвоживание плода, его растрескивание и формирование отделительного слоя. Гипотетический гормон назвали абсцизином (от лат. abscisio — опадение). В 1965 г. абсцизин был выделен и были изучены его основные свойства. Выяснилось, что абсцизин и дормин — одно и то же соединение. Из-за приоритета сегодня установилось название, данное Лью и Карнсом, — абсцизовая кислота (АБК). Заметим, что АБК редко регулирует опадение плодов и листьев (обычно за это отвечает этилен: см. подразд. 7.2.7.7). АБК нужна для регуляции покоя, поэтому название «дормин» гораздо лучше отражает суть регулируемых процессов.
У.2.6.2. Биосинтез абсцизовой кислоты
АБК является изопреноидом с 15 атомами углерода, соединенными в изопреновые С5-звенья (см. подразд. 9.6.2). Обычно изопреноиды синтезируются в пластидах из общего предшественника — изопентенилпирофосфата. В ранних работах было высказано предположение, что АБК синтезируется сразу после конденсации трех С5-звеньев, т.е. эта гипотеза предполагает прямой синтез АБК из более простых предшественников. В дальнейшем прямой синтез АБК был показан только для фитопатогенных грибов (для возбудителя серой гнили Botrytis).
Гипотеза прямого синтеза доминировала до 1990-х гг., пока не выяснилось, что у мутантов по биосинтезу каротиноидов нарушен и биосинтез АБК. На сегодня получены мутации по ферментам почти всех этапов биосинтеза АБК. Таким образом, АБК синтезируется через более сложные предшественники, можно рассматривать ее как продукт специфической деградации каротиноидов.
Первые этапы биосинтеза АБК связаны с ксантофилловым циклом (см. подразд. 3.3.4.4). Зеаксантин через промежуточный продукт антераксантин превращается в все-/и/?й«с-виолаксантин. Дальнейшие превращения включают 9-цисизомеризацию каротиноидного предшественника (на эту роль претендуют ви- олаксантин и неоксантин). В конечном итоге 9-цис-предшественник расщепляется на два неравных фрагмента: Ci5 (ксантоксин) и С25. С25-фрагмент быстро деградирует, а ксантоксин превращается в абсцизовый альдегид (рис. 7.16). Для последнего этапа биосинтеза необходим молибденсодержащий белок, катализирующий окисление АБ-альдегида до АБК. Молибденовый кофактор этого фермента общий с нитратредуктазой и ксантиндегидрогеназой. При мутациях по синтезу молибденового кофактора растение не может восстанавливать нитрат и окислять АБ-альдегид.
Рис. 7.16. Биосинтез, инактивация и деградация АБК:
7 — виолаксантиновый цикл в пластидах; 2 — ключевой этап биосинтеза АБК — цис-изомеризация каротиноидов; 3 — расщепление каротиноидов на С15- и С25-фрагменты и выход ксантокси- на в цитозоль; 4 — превращение ксантоксина в абсцизовый альдегид, стрелками показаны связи в молекулах, которые претерпевают модификацию на каждом этапе; 5 —окисление АБ-альдегида до физиологически активной АБК; 6 — депонирование АБК; 7 — необратимая деградация АБК
7.2.6.3. Передача АБК-сигнала
Белки-рецепторы АБК еще недостаточно охарактеризованы. Один из них — белок RPK 1 (receptor-like protein kinase) — является трансмембранным, связывается с АБК и содержит протеинкиназный цитоплазматический домен.
Известны некоторые компоненты системы трансдукции АБК-сигнала. Так, сразу после действия АБК в замыкающих клетках устьиц из НАД+ синтезируется циклическая АДФ-рибоза, которая может активизировать Са -каналы (рис. 7.17). Са + поступает в цитоплазму из внутриклеточных депо, цитозоль подщелачивается. Высокий pH активизирует протеинфосфатазы ABI 1 и ABI 2, дефосфорилирующие гипотетический белок-репрессор АБК-сигнала. Пока репрессор фосфорилирован, он не дает проявляться ответам на АБК. Потеря фосфата инактивирует репрессор, и клетка отвечает на АБК. Если протеинфосфатазы не активны, репрессор постоянно подавляет ответ на АБК, растение теряет чувствительность (ABA-insensitive — abi). Мутации Arabidopsis по этим фосфатазам идентифицированы как нечувствительные к АБК, а соответствующие гены названы ABI 1 и ABI 2.
Предполагают, что в развитии ответа на АБК играют роль Са2+-волны, распространяющиеся с интервалом около 1 — 2 мин. В ответ на АБК у замыкающих клеток устьиц на плазмалемме открываются быстрые К+-каналы и медленные анионные каналы, через которые К+, СГ и малат выходят из клетки. Осмоти-
Рис. 7.17. Схема рецепции и передачи сигнала АБК:
1 — взаимодействие АБК с мембранным рецептором; 2а, 26, 2в — возможные пути передачи сигнала по системе вторичных мессенджеров; 3 — активизация фосфатидилинозитольной системы (см. рис. 7.3), ИФ3 — инозитолтрифосфат; 4 — открывание Са2+-каналов; 5— белки-продукты генов ABI 1 и ABI 2 передают сигнал в ядро; 6 — взаимодействие транскрипционных факторов с промоторами и экспрессия АБК-зависимых генов; 7а, 76, 7в — синтез веществ-протекторов, защищающих клетку от стресса; 8 — синтез запасных белков при переходе в состояние покоя
ческое давление понижается, выходит вода и теряется тургор, устьичная щель закрывается. Закрывание устьиц — очень быстрый ответ на АБК, и геномная регуляция не успевает включиться.
Для активизации/инактивации генов в ядре важен белок ABI 3 у Arabidopsis (VP 1 у кукурузы), содержащий домены, характерные для активаторов транскрипции. Без ABI 3 или VP 1 не экспрессируются ДМ-гены (от англ, embryo maturation'), не идет синтез антоцианов, не накапливаются запасные белки в семенах и т.д. В соответствующих промоторах найден достаточно консервативный мотив — АБК-регулируемый консенсус (ABRC). Впрочем, одного белка ABI 3 или VP 1 недостаточно для активации транскрипции через ABRC-мотив. Необходим довольно сложный транскрипционный комплекс, в который могут входить ЕМВ-белки (димерные транскрипционные факторы типа «лейциновой застежки»). Повреждение белков ABI 3 или VP 1 в результате мутации ведет к нарушению процессов формирования зрелого семени и преждевременному прорастанию.
У.2.6.4. АБК — гормон осмотического стресса
Абсцизовая кислота появляется в клетке в ответ на изменение состояния воды, вызванный тремя факторами: подсушиванием, повышением концентрации веществ в клетке, охлаждением. В этих случаях вода для клетки менее доступна, т.е. наблюдается водный дефицит.
Для нормальной жизнедеятельности все молекулы должны находиться в определенных условиях овод нения. Белки и нуклиновые кислоты удерживают воду с помощью водородных связей. В клетке поддерживается также определенная ионная сила, что не менее важно для поддержания конформации биополимеров. Нехватка воды и повышение ионной силы приводят к денатурации биологически активных молекул. При повторном увлажнении вернуть им активность сложно. При стрессе клетка должна «принять меры» по сохранению конформации ДНК, РНК и белков. Этим и обусловлены эффекты АБК. В ответ на АБК в клетке повышается уровень оксипролина, сахарозы и других осмотически активных веществ. Осмотическое давление увеличивается, что препятствует потере воды. Кроме этого в клетках появляется небольшой крайне гидрофильный белок осмотин, повышающий матричный потенциал воды (см. подразд. 5.4.5). В клетках можно увидеть даже появление гранул, состоящих из осмотина.
АБК усиливает синтез полиаминов (спермидина, путресцина). Полиамины несут положительный заряд (азот аминогрупп протонирован). Молекулы ДНК и РНК заряжены отрицательно, они легко ассоциируются с молекулами полиаминов, а в комплексах с полиаминами ДНК и РНК более устойчивы и к изменению ионной силы, и к обезвоживанию. Синтез новых ДНК и РНК под действием АБК прекращается, клетка переходит в состояние покоя.
При холодовом стрессе главная задача клетки — не допустить кристаллизации воды, так как кристаллы льда нарушают структуру мембран. Опасен также эффект «вымораживания»: растворенные в воде вещества не включаются в кристаллы льда и в незамерзшем растворе их концентрация повышается, т.е. увеличивается ионная сила. При охлаждении АБК останавливает синтез белков, ДНК и РНК, накапливаются полиамины, оксипролин, сахара и осмотин. Ос-
мотически активные вещества препятствуют кристаллизации воды: вода становится аморфной и не повреждает мембраны. От АБК зависит биосинтез антоцианов, т. е. при понижении температуры растения становятся красными (фиолетовыми), но физиологический смысл этой реакции пока не ясен. Мутанты по синтезу АБК гибнут при легкой засухе и слабых заморозках. Хотя все защитные механизмы имеются, они не включаются без абсцизовой кислоты. Если перед стрессом такие мутанты обработать АБК, их устойчивость повышается.
Для предотвращения водного дефицита нужно закрыть устьица. Действительно, в ответ на АБК устичные щели закрываются за 10—15 мин. При почвенной засухе корень синтезирует АБК, передает этот сигнал листьям, и устьица закрываются. В сильную засуху растение сбрасывает часть листьев, чтобы избавиться от лишней испаряющей поверхности. АБК отвечает за листопад только при засухе. При водном дефиците должны остановиться процессы роста (на 95 —98 % органы растений состоят из воды): АБК ингибирует транспорт ауксина и растяжение клеток. .
Абсцизины синтезируются при увеличении концентрации осмотически активных веществ, например сахаров, образующихся в листьях активно растущих веток. В молодых ветках яблони содержание АБК повышается, и деревья в середине лета впадают в состояние физиологического покоя. Мы не наблюдаем видимого роста, но меристемы продолжают работать. На насыщенном АБК побеге развиваются почки. Из физиологического покоя растение сложно вывести внешними факторами. Высокий уровень АБК не дает транспортироваться ауксинам из апекса побега, т.е. нет апикального доминирования и боковые почки развиваются в пазухах всех листьев.
АБК действует на почки все лето, но заканчивается ее действие в разное время. У большинства деревьев умеренной зоны действие АБК прекращается зимой, а у конского каштана — осенью (в теплую осень почки, освободившиеся от АБК, открываются, каштан цветет повторно). У других растений высокое содержание АБК держится до заморозков, и даже до января — февраля. Только тогда АБК может начать разрушаться.
Разрушению АБК препятствует низкая температура воздуха. Это — фаза вынужденного покоя, вызванного неблагоприятными факторами (низкая температура, дефицит воды). Как только стресс закончится, АБК разрушается и начинается видимый рост.
Регуляция покоя семян АБК
Когда зародыш семени достигнет окончательного размера, синтезируется АБК. У кукурузы синтез АБК стимулирует сахароза, которую зародыш аттраги- рует в большом количестве. АБК через белки VP 1 (ABI 3) активизирует синтез ЕМ-белков или белка EEC 1 (leafy cotyledon), которые регулируют дальнейший переход в состояние глубокого физиологического покоя.
Абсцизовая кислота вызывает синтез крахмала в эндосперме и белков в алейроновом слое. Запасной белок алейроновых гранул функционирует как осмотин. ДНК и РНК упаковываются белками-шаперонами и полиаминами, рост прекращается и начинается обезвоживание. Зародыш теряет воду, ее концентрация падает от 95 — 97 до 14 % и ниже. Сухой плод (как у хлопчатника)
теряет воду вместе с зародышем. В створках вскрывающихся плодов есть механически ослабленные слои клеток, при усыхании эти слои лопаются и плод вскрывается. Если плод сочный, а семена уже прошли стадию обезвоживания, дальнейшее созревание регулирует этилен (см. подразд. 7.2.7.8).
Глубина подсушивания семян и концентрация в них накопленной АБК варьируют. Так, у лесных растений (пролески (Scilla), хохлатки (Corydalis') и др.) обезвоживание слабое, семена не приспособлены к сильному подсушиванию. Накопленная АБК действует в течение всего лета и часто осени, мешая им прорастать. У степных и пустынных растений (ковыли (Stipa), тюльпаны и др.) семена усыхают очень сильно, а АБК разрушается лишь после сезона дождей и зимней прохлады (см. подразд. 7.4.4.2). Часто АБК вымывается из семян весенними талыми водами. Чтобы прорастить такие семена, достаточно промыть их проточной водой. У культурных растений (пшеница, горох (Pisum sativum)) период действия АБК очень краткий: достаточно предоставить зародышу влагу, как АБК разрушится, и семя пойдет в рост. Зарегистрировано прорастание семян осенью в промокших колосьях или бобах.
Синдром дефицита АБК
Абсцизовая кислота — важный фитогормон, хотя он не является необходимым. Если отсутствие ауксина или цитокинина летально, то при недостатке АБК растения жизнеспособны, но хуже переносят стрессы. Этим можно воспользоваться для отбора мутантов по биосинтезу АБК. После мутагенеза растения второго поколения высаживают, не поливают и наблюдают, какие подвинут первыми. (Без АБК растение не может закрыть устьица и завядает при малейшей засухе.) Мутантов помечают, отсаживают и «отпаивают» водой. Они почти не отличаются от нормальных растений, но семена не накапливают питательные вещества, состояния покоя нет, и семена прорастают тут же, еще в плоде. Такое явление получило название вивипарии. У кукурузы мутации с таким фенотипом называют viviparous (vp). Оказалось, что ген VP 8 отвечает за превращение АБ-альдегида в АБК, а ген VP 1 — за передачу АБК-сигнала на уровне транскрипции.
1Л.6Л. АБК и форма листьев
У многих водных растений есть два типа листьев. Подводные листья тонкие, с неразвитой механической тканью, без устьиц и кутикулы. Газообмен с водной фазой происходит по всей поверхности. Оказавшись в воздушной среде, подводный лист гибнет. Надводные листья более прочные, покрыты кутикулой и имеют устьица для газообмена с воздухом. Под водой эти листья не справляются с газообменом: устьица в таких условиях сжаты окружающими клетками эпидермиса.
Условия воздушной среды воспринимаются водными растениями как засуха, поэтому как только апекс побега оказывается над водой, повышается уровень АБК и меристема формирует надводные листья. Если поместить растение в аквариум с раствором АБК, меристема «решит», что ее «вынули» из воды и образует воздушные листья (рис. 7.18). Более 50 проанализированных видов
ВВРис. 7.18. Регуляция формы листьевАБ К:
В
В
А — под водой синтез АБК низкий, растения развивают подводные листья; Б — при росте в воздушной среде синтез АБК усиливается, развиваются надводные листья; В — при добавлении АБК в водный раствор растения развивают надводные листья
водных растений продемонстрировали одинаковый механизм регуляции типа листьев. Смена генераций листьев у полупустынных растений также контролируется АБК: во влажный сезон развиваются С3~, а в сухой — С4-листья. Эти листья различаются анатомически (см. подразд. 3.8.2). При засухе под действием АБК наблюдается листопад С5-листьев, а на смену им развиваются более приспособленные к водному дефициту С4-листья.
У луковичных растений АБК по-разному действует на подземную и надземную части листа. У лука (Allium сера) обработка АБК вызывает перестройку цитоскелета в клетках подземной части: продольное расположение кортикальных микротрубочек меняется на поперечное. Клетки утолщаются и запасают сахара (концентрация сахаров достигает 7 —10 % от сырой массы!). Надземная часть листа под действием АБК увядает, вещества перемещаются в подземную чешую. Луковица переходит в состояние покоя.
ЭТИЛЕН — СИГНАЛ МЕХАНИЧЕСКОГО СТРЕССА
Открытие физиологической роли этилена
АБВАБВВ 1901 г. в Санкт-Петербурге Д. Н. Нелюбов при выращивании гороха обнаружил, что в лаборатории проростки были укороченные, искривлялись, верхушка была согнута в апикальную петельку. В теплице и на свежем воздухе проростки были ровные, рослые, апикальная петелька на свету распрямлялась.
АБВ
АБВ
Рис. 7.19. Тройной ответ проростка на этилен: А — при низкой концентрации этилена происходит сгибание апикальной петельки; Б — при повышении концентрации этилена побег утолщается в субапикальной зоне, рост в длину замедляется; В — при высокой концентрации этилена изменяется направление роста с вертикального на горизонтальное
Нелюбов предположил, что фактор, вызывающий такой эффект, находится в воздухе лаборатории.
В те годы помещения и улицы освещали газом. Было замечено, что при аварии в газопроводе ближайшие деревья преждевременно желтели и сбрасывали листья. Для удаления примеси светильного газа Нелюбов пропускал воздух через нагретый оксид меди. В «очищенном» воздухе проростки гороха развивались нормально. Добавляя компоненты светильного газа по очереди, Нелюбов установил, что экзогенный этилен вызывает: 1) замедление роста в длину и утолщение проростка (рис. 7.19, Б); 2) «не разгибающуюся» апикальную петельку (рис. 7.19, Д); 3) изменение ориентации проростка в пространстве (рис. 7.19, В).
Наблюдаемая физиологическая реакция была названа тройным ответом на этилен. Оказалось, что растения «чувствуют» этилен уже в концентрации >0,0001 %. Этилен вызывает листопад, созревание плодов и другие ответы. Этилен при этом синтезируется в растениях, т. е. является гормоном.
Биосинтез этилена
Синтез этилена в растениях начинается с метионина (рис. 7.20), который, взаимодействуя с АТФ, образует S-аденозилметионин. (Этот интермедиат используется также в синтезе полиаминов и других соединений как донор метильных группировок.) S-аденозилметионин превращается в 1-аминоциклопропан-1-карбоновую кислоту (АЦК) с помощью АЦК-синтазы. АЦК рассматривают как неактивную транспортную форму этилена. Образование этилена зависит от экспрессии гена АЦК-синтазы.
Циклопропановая группировка напряжена (между атомами углерода нехарактерный угол в 60е), тем не менее, разрушение АЦК с образованием этилена — ферментативный процесс, нуждающийся в О2. При аноксии (например, при затоплении) АЦК, синтезированная в корнях, транспортируется в стебель и там превращается в этилен. В итоге надземная часть страдает от избытка этилена. После образования этилен может окисляться в растительных клетках, что, вероятно, нужно для модуляции физиологического эффекта. Процесс окисления этилена изучен слабо.
Рецепция и передача сигнала
У Arabidopsis есть небольшое генное семейство белков-рецепторов этилена. По фенотипическому проявлению гены были названы ETR1, ETR2 (ethyleneresistant), EIN4 (ethylene-insensitive), ERS1 и ERS2. Белки-рецепторы высоко- гидрофобны, т. е. входят в состав мембран. Для связывания этилена необходим атом меди, который входит в состав рецепторного комплекса. Рецепторы этилена похожи на двухкомпонентные гистидинкиназы, они участвуют в автофосфорилировании и фосфорилируют другие белки. Рецепторный белок образует комплекс с серин/треонинкиназой CTRL Ближайшим мессенджером является мембранный белок EIN2 с еше не выясненной функцией. В каскаде усиления участвуют MAP-киназы и некоторые транскрипционные факторы (например, EIN3).
соон
MAP-киназный каскад
Рис. 7.20. Биосинтез и рецепция этилена:
— начальный этап биосинтеза этилена: активизация метионина путем присоединения к адено-зину; 2 — разветвление путей биосинтеза полиаминов и этилена; 3 — окислительная деградацияАЦК до этилена; 4а, 46, 4в, 4г, 4д — рецепция этилена, показана множественность рецепторовна этилен в клетке; 5 — включение системы вторичных мессенджеров; 6 — передача сигнала вядро; 7 — взаимодействие транскрипционных факторов с промоторами и экспрессия этиленза-висимых генов
Пути восприятия этилена в растении продублированы несколькими рецепторами, поэтому получить полностью нечувствительные к нему растения достаточно трудно. Для этого необходимо, чтобы растение оказалось мутантным по 4 — 5 генным локусам одновременно.
Этилен как гормон механического стресса
Выделение этилена связано с механическим воздействием на клетки растений. Рассмотрим это на примере тройного ответа (см. подразд. 7.2.7.1). Пока росток не достиг поверхности, нужно защищать нежные клетки верхушечной меристемы от повреждения. Поэтому происходит изгиб и образуется апикальная петелька. Сквозь почву растет не меристема, а более прочный нижележащий участок (см. рис. 7.19).
При появлении на пути проростка механического препятствия (камень) растение выделяет больше этилена, рост в длину приостанавливается и начинается утолщение. Проросток стремится преодолеть препятствие, усилив давление. Если это удалось, концентрация этилена падает и рост в длину восстанавливается, но если препятствие слишком крупное, продукция этилена усиливается. Проросток отклоняется от вертикали и огибает камешек. В воздушной среде концентрация этилена падает и апикальная петелька проростка разгибается.
Этилен и прикосновение
До 1991 г. у физиологов были отрывочные сведения о механизмах ответа растений на прикосновение. Методом вычитания кДНК-библиотек было установлено, что при опрыскивании водой Arabidopsis синтезируются новые мРНК. Опрыскивание действует как комплексный фактор: меняется влажность, создается тень водяных брызг, листья подвергаются механической нагрузке. Каждый из факторов был исследован отдельно. Выяснилось, что влажность не играет роли, но если растение потереть палочкой, оно почувствует это и через 10—15 мин ответит экспрессией новых генов (уровень мРНК возрастает на 2 порядка). Эти гены были обозначены ТСН (от англ, touch — прикосновение).
Если, не касаясь растения, внезапно накрыть его черным колпаком, уровень ТСН-матриц также повышается. Мощные звуковые эффекты не привели к желаемому результату: мРНК ТСЯ-генов не появились. Гены ТСН1, ТСН2к ТСНЗ похожи на связывающие кальций белки — кальмодулины. Вместе с Са + эти белки активизируют цитоскелет, способствуют переходу из золя в гель и т.д. Растения при частом механическом беспокойстве отстают в росте от тех, к которым не прикасались, но становятся механически более прочными. Белковый продукт гена ТСН4 оказался ксилоглюкан-эндотрансгликозилазой. Ее синтез можно вызвать и брассиностероидами (см. подразд. 7.2.8.1). Похожие эффекты вызывает этилен. При этом также происходит синтез Са +-связывающих ТСН-белков.
Этилен и заживление ран
Многие растения образуют млечники, которые содержат латекс (натуральный каучук). Каучук не «застывает» внутри млечников, но при повреждении
латекс выступает на поверхность и быстро твердеет, закупоривая рану. Латекс склеивает споры грибов и бактерий; в ротовом аппарате насекомых он застывает или приклеивает их к капельке выступившего каучука. На плантациях гевеи {Hevea brasiliensis) затвердение латекса — вредный процесс: приходится вновь делать насечки на стволах, подставлять сосуды для сбора каучука в новые места, что создает лишнюю работу. Выяснилось, что латекс застывает под действием этилена. Важную роль при этом играет минорный белок латекса гевеин. С застыванием латекса можно бороться, обрабатывая гевею ингибиторами синтеза этилена (наиболее известный ингибитор — Ag+, но есть и более дешевые). Таким образом, у каучуконосов этилен способствует заживлению механических повреждений.
Этилен активизирует раневую перидерму. Образуется пробковый камбий, который формирует суберинизированную пробку, отделяющую здоровую (живую) ткань от больной (мертвой). Пробка — гидрофобный барьер, предохраняющий раны от чрезмерного испарения и препятствующий проникновению инфекции в поврежденном месте. Размеры и место образования раневой перидермы отличаются у разных растений. Так, медуница {Pulmonaria obscura) образует раневую перидерму вокруг зоны повреждения грибами. Участок листа вместе с мицелием гриба выпадает. У фасоли {Phaseolus vulgaris) раневая перидерма расположена в основании листовой пластинки, и растение жертвует поврежденной частью сложного листа для безопасности целого растения.
При нападении насекомых и клещей выделяется этилен, в основании листа активизируется перидерма, происходит локальный «листопад»: поврежденный лист опадает на землю вместе с вредителем. Шансы вновь добраться до кроны у вредителей уменьшаются.
Регуляция листопада в умеренных широтах
Этилен регулирует явление листопада, поэтому его иногда считают гормоном старения растений. Ежегодный листопад — это не совсем старение: ведь в тропиках отдельные листья живут 3—4 года и больше. Сокращение сроков жизни листа связано с защитой от механического стресса.
При опадании листьев в местах их прикрепления образуется очень много раневых поверхностей. Чтобы лист отделился без вреда для целого растения, в его основании формируется отделительный слой (фактически — та же раневая перидерма). Место будущего повреждения закрывается пробкой, вышележащая ткань разрыхляется и становится непрочной, лист опадает. Чтобы разрыхлить клеточную стенку, выделяются пектиназы, расщепляющие пектин. При этом высвобождаются физиологически активные вещества олигосахарины (см. подразд. 7.2.S.4), стимулирующие дальнейшее размягчение клеточных стенок.
Таким образом, листопад и защита раневых поверхностей тесно связаны. Зимой листья повреждаются морозом, на них падает снег, вызывая усиление механической нагрузки на ветки. В случае листопада в умеренных широтах мы видим опережающую физиологическую реакцию: растения как бы «предусматривают» будущий механический стресс и заранее освобождаются от листьев. Листопад в районах со снежной зимой контролирует этилен — гормон механического стресса.
Формирование и созревание плодов
Развитие плода начинается с оплодотворения завязи. На рыльца попадают пыльцевые зерна, они прорастают и механически давят на проводниковую ткань столбика. При этом ткани столбика начинают выделять этилен. Разные части цветка по-разному отвечают на сигнал этилена. Все органы, привлекающие опылителей, отмирают или меняют окраску. У ипомеи лепестки быстро теряют тургор и увядают. В основании листочков околоцветника лилии (Lilium) активизируется отделительный слой, и они опадают (см. подразд. 7.2.7.7). У медуницы меняется pH вакуолярного сока, цветки из розовых превращаются в синие. У белокрыльника (Calla palustris) этилен изменяет цвет покрывала соцветия с белого на зеленый. Покрывало служит дополнительным источником фотоассимилятов для развивающихся плодов. Подчеркнем, что этилен обычно вызывает разрушение хлорофилла, пожелтение и опадание листьев, но у ароидных после опыления он усиливает фотосинтез. Тычинки при действии этилена увядают, а завязи начинают активно расти, привлекая новые питательные вещества.
Особенно важен этилен на последнем этапе созревания сочных плодов. Здесь «играют» практически все рассмотренные эффекты. Плод перестает расти, начинается выделение пектиназ в апопласт (плоды размягчаются), образуются физиологически активные олигосахарины (см. подразд. 7.2.S.4). В ножках плодов активизируется отделительный слой и образуется раневая перидерма (как при листопаде), меняется pH — плоды становятся менее кислыми, а также меняется их окраска с зеленой на желтую или красную (как у лепестков некоторых растений). Поврежденные плоды созревают и опадают раньше. Механический стресс вызывают птицы, личинки насекомых или фитопатогенные грибы. Как в случае поврежденных листьев, растение сбрасывает некачественный плод, чтобы остальные остались здоровыми. Созревание плодов под действием этилена — это такая же упреждающая физиологическая реакция, как листопад. Сочные плоды распространяют птицы и млекопитающие, которые повреждают плоды при поедании, а растение продуцирует этилен заранее (до механического стресса).
Ускорение созревания плодов этиленом изучено в 1920-х гг. С тех пор это явление широко используют. При транспортировке плоды должны оставаться прочными и зелеными: их перевозят в проветриваемой таре, оберегают от механических повреждений, вызывающих синтез этилена. Биосинтез этилена замедляется при пониженной температуре и при высокой концентрации СО2. Ингибиторы синтеза этилена токсичны для человека, их применяют только при транспортировке букетов. Торговцы ставят цветы в специальный раствор ингибиторов синтеза этилена с минеральными солями, сахаром и антисептиками. Эти добавки позволяют сохранять букеты в течение многих дней.
При нарушении биосинтеза этилена плоды не дозревают. На основе мутантов по биосинтезу этилена уже получены сорта томатов, которые очень долго хранятся и выдерживают дальние перевозки. Перед продажей для ускорения созревания плодов обрабатывают этиленом, однако эта технология снижает их вкусовые качества. Существует поговорка: «одно гнилое яблоко портит бочку яблок». Гнилое яблоко — источник этилена, который вызывает размягчение остальных яблок. Каждый плод синтезирует свой этилен по мере созревания, и в бочке начинается «цепная реакция» производства этилена.
Биотический стресс
Самый распространенный из механических стрессов вызывают травоядные животные. В ответ растения выделяют этилен, который запускает синтез веществ, препятствующих поеданию биомассы.
С этим столкнулись, в частности, на Африканском континенте, когда решили приручить антилоп (антилопы более приспособлены к местным условиям, чем европейский скот). Для них построили загоны вокруг зарослей акации, природного корма антилоп. Хотя корма явно хватало, животные в загонах погибали. Оказалось, что антилопы гибнут от отравления.
Химический анализ листьев акации в загоне показал, что они богаты полимерными фенольными соединениями — таннинами, ядовитыми для антилоп. В природе акации содержат мало таннинов. Выяснилось, что образование таннинов можно вызвать этиленом. Антилопы повреждают акации, при этом выделяется этилен, что приводит к синтезу таннинов. Этиленовый сигнал передается по воздуху (этилен — газ). У акаций, которые росли рядом с загоном, «на всякий случай» повысилась концентрация таннина. В природе антилопы не живут на одном месте, меняя пастбища, и когда таннины накапливаются, они уже пасутся на другом месте.
Еще один класс защитных соединений — ингибиторы протеиназ. Для переваривания пищи необходимы протеиназы, разрушающие белки (например, компонент желудочного сока трипсин). Некоторые растения вырабатывают вещества, инактивирующие трипсин и другие протеиназы. Под действием механического стресса растения вырабатывают этилен, этилен вызывает синтез ингибиторов протеиназ, они попадают в желудок теплокровных или насекомых, вызывая сильные нарушения пищеварения.
Под действием этилена растения вырабатывают фитогемагглютины — вещества, склеивающие эритроциты. При поедании растительной биомассы фитогемагглютины попадают в желудок и кишечник, а оттуда всасываются в кровь. Эритроциты склеиваются, образуются тромбы, происходит закупорка кровеносных сосудов. Высокие дозы фитогемагглютинов смертельны.
В природе механические повреждения вызываются разнообразными причинами (например, ветром, градом и т.п.). Растение должно точно различать абиотические повреждения и нападение фитофагов. Для этого под действием этилена клетки выделяют в апопласт хитиназу и р-глюканазу. Напомним, что хитин содержится в насекомых и грибах, а глюкан — компонент растительной клеточной стенки. Хитиназа до некоторой степени разрушает хитин. Казалось бы, полное разрушение хитина может спасти растение от нападения, но хитиназы вырабатывается очень мало. Перечисленные ферменты образуют олигомерные фрагменты хитина и гликана. Эти фрагменты воспринимаются растением как сигнал опасности. Тогда начинается второй этап ответа на повреждение. Если хитиназа и р-глюканаза не обнаруживают в зоне повреждения грибов, то токсичные вещества перестают вырабатываться.
В случае инфекции самый сильный ответ — реакция сверхчувствительности. Пораженная клетка «отключает» систему защиты от активных форм кислорода, образуется очень много перекисей, супероксид-анионов и других свободных радикалов, в результате чего клетка гибнет. Но вместе с ней гибнет и попавший в растение паразит. В развитии реакции сверхчувствительность важ-
ную роль играют салициловая и жасминовая кислоты (см. подразд. 7.2.8.2, 7.2.8.3), которые синтезируются в том числе и при действии этилена. Клетки, окружающие зону инфекции, синтезируют токсичные вещества. Если эти вещества синтезируются в процессе инфекции de novo, их называют фитоалексинами. Химическая природа фитоалексинов зависит от систематического положения растения. Так, картофель образует сесквитерпеноидные фитоалексины, у бобов (Vicia faba) фитоалексины синтезируются на основе фенольных соединений и т. п.
К высокомолекулярным защитным веществам растений можно отнести лектины (белки и гликопротеиды, способные связывать полисахариды). Некоторые лектины связываются с хитином в клеточных стенках грибов. При росте гиф ослабляются связи между хитиновыми волокнами. Но эти волокна прочно склеены лектинами, и клеточная стенка гриба не может растягиваться. То же самое происходит и с бактериями, которые оказываются склеенными другой группой лектинов.
Кроме перекисей, фитоалексинов и лектинов к месту инфекции транспортируются и ингибиторы протеиназ. Это позволяет остановить разрушение белков растительных клеток в месте инфекции.
Немаловажную роль в защите играет непосредственно этилен. Так, грибы, вызывающие ржавчину, для своего роста нуждаются в полиаминах — путресцине и спермидине (эти вещества продуцируют растения). Полиамины имеют общее звено биосинтеза с этиленом: S-аденозилметионин (см. подразд. 7.2.7.2). Продукция этилена вызывает остановку синтеза полиаминов. Грибы оказываются лишенными фактора роста и гораздо хуже инфицируют растения. Подавление биосинтеза этилена ведет к усилению инфекции, а если ингибировать синтез полиаминов, ржавчина почти не развивается.
Этилен и цветение ананасов
Цветение ананасов (^Ananas sativus) (как и других растений из сем. бромели- евых (Bromeliaceae)) можно вызвать обработкой этиленом. В природе бромели- евые цветут, когда им удается набрать некоторый «критический» размер. Но в промышленной культуре это свойство не очень полезно: растения цветут и плодоносят не одновременно.
Цветение ананасов можно регулировать. В оранжереях Санкт-Петербурга царские садовники использовали для этого специальный прием: ананасы вынимали из горшка и на несколько дней подвешивали корнями кверху. Механический стресс (подвешивание) вызывал синтез этилена и ананасы начинали цвести. Вопрос лишь в том, как добыть этилен и массово обработать им ананасы на плантациях, чтобы они зацвели одновременно. На Гавайских островах среди ананасов расставляют плошки с нефтепродуктами и поджигают. При неполном сгорании получаются небольшие порции этилена, но вполне достаточные для стимуляции цветения. На Кубе ананасы поливали карбидной водой. Карбид кальция при взаимодействии с водой дает ацетилен, микрофлора почвы восстанавливает его до этилена. Можно рекомендовать помещать горшок с ананасом в полиэтиленовый пакет вместе со спелым бананом, плотно завязав его. В настоящее время существуют более совершенные технологии. В частности, применяют химические агенты (например, этрел), которые сами разру-
шаются в организме растения с образованием этилена. Именно этими препаратами обрабатывают ананасы.
Стимуляция образования цветков не характерна для этилена. Скорее дело не в этилене, а в эволюционных связях и экологии бромелиевых. Представители этого семейства распространены в тропиках и субтропиках Нового Света. Подавляющее большинство бромелиевых — эпифиты. Их листья собраны в плотную розетку, в которой скапливаются дождевая вода, пыль и листовой опад; здесь же выводят свое потомство комары и лягушки. Таким способом бромеливые создают резервуары воды на большой высоте от земли с уникальной развивающейся в них биотой. Из резервуара листья впитывают минеральные соли, отсюда же растения «пьют» в засушливое время. Главный поглощающий орган не корень, а лист, и без воды в розетке бромеливые существовать не могут (рис. 7.21).
Когда растение вырастает достаточно крупными, в самом центре розетки образуется цветонос. Это происходит в сухой сезон. Розетка, в которой развился цветонос, после плодоношения отмирает и вокруг нее появляются вегетативные потомки — детки.
У всех бромелиевых этилен вызывает цветение в нехарактерное время года. Уникальный механизм регуляции цветения объясняется следующей гипотезой. Если по какой-то причине растение потеряло вертикальную ориентацию розетки (например, ее наклонило животное, растение упало вместе с веткой), это становится фатальным: розетка из листьев не может накапливать воду. Механический стресс вызывает образование этилена. При угрозе гибели бромели- евые стремятся как можно быстрее образовать семена. В этой ситуации этилен служит сигналом к ускоренному зацветанию. Представители бромелиевых цветут и одновременно образуют боковые побеги (молодые розетки будут ориентированы правильно). Хотя у ананасов вода в розетках не задерживается и они освоили наземный образ жизни, этилен по-прежнему вызывает такой же ответ, какой был у эпифитных предков ананаса.
Рис. 7.21. Эпифитные бромелиевые и регуляция цветения
7.2.8. ДРУГИЕ ГОРМОНАЛЬНЫЕ ВЕЩЕСТВА РАСТЕНИЙ
Брассиностероиды
Еще в 1930—1940 гг. была высказана догадка о том, что у растений есть стероидные регуляторы роста (по аналогии с животными). В многочисленных биотестах растения подвергали обработке тестостероном или эстрогеном, которые оказывали физиологическое действие. Так, эстрогены вызывали деление клеток в зародышах гороха, а тестостерон изменял пол у шпината (с женского на мужской) и стимулировал дифференцировку архегониев на заростках хвоща. Однако животные гормоны приходилось использовать в слишком высоких концентрациях (до 0,1 %), и вряд ли их действие было специфичным.
Попытки выделить фитогромоны стероидной природы не прекращались. В 1979 г. М.Д. Гроув с соавт. обнаружили, что масляный экстракт из пыльцы рапса стимулировал рост проростков в длину. Из 10 кг пыльцы удалось выделить всего 4 мг действующего вещества! Это оказалось стероидное соединение. Вещество было названо брассинолидом (от лат. Brassica napus — рапс), а все похожие на него вещества с физиологической активностью называют брасси- ностероидами. Вскоре из настоящего каштана {Castanea satica) был выделен кастастерон, из рогоза (Typha) — тифастерол, из чая (Thea) — теастерон, из катарантуса {Catharanthus) — катастерон и т.д. В настоящее время известно более 60 брассиностероидов.
Биосинтез брассиностероидов включает общие для других терпеновых соединений стадии: изопентенилпирофосфат, геранилпирофосфат, фарнезил- пирофосфат, сквален. Первым специфическим продуктом, из которого синтезируются остальные брассиностероиды, является 24-метиленхолестерол, превращающийся в кампестерин и кампестанол (рис. 7.22). От кампестанола расходятся две параллельные ветви биосинтеза, часто одновременно сосуществующие в растениях: с ранним и с поздним окислением в С-6-положении. В итоге обе ветви биосинтеза заканчиваются брассинолидом — физиологически активным брассиностероидом.
Ферменты биосинтеза брассиностероидов были выделены и охарактеризованы благодаря мутациям, приводящим к карликовости, которая восстанавливается брассинолидом. Так, у арабидопсис мутации dwf 1 (от dwarf — карлик) и dwf 6 нарушают ранние этапы биосинтеза (до разделения на «раннее» и «позднее» окисление) и наиболее сильно проявляются фенотипически — мутанты достигают не более 1/30 высоты растений дикого типа. Мутация dwf 4 затрагивает более поздние этапы (после развилки в метаболизме), поэтому проявление карликовости мягче.
Брассиностероиды — гидрофобные молекулы, но зарегистрировано образование гидрофильных гликозидов, сульфатов и ацил производных брассиностероидов. Только гидрофильные формы могут быть транспортными. Хотя ферменты биосинтеза брассиностероидов обнаружены почти во всех тканях растения, концентрация этих гормонов более высока в молодых тканях: этиолированных проростках, меристемах, флоральных примордиях, развивающейся пыльце. По-видимому, неравномерное распределение брассиностероидов вызвано процессами дальнего и ближнего транспорта.
Рис. 7.22. Биосинтез брассиностероидов:
/ — ранние этапы биосинтеза, общие с другими терпеноидами; 2 — образование стероидов; 3 —путь раннего бС-окисления; 4 — путь позднего бС-окисления, оба пути протекают параллельнос участием одних и тех же ферментов; звездочкой отмечено бС-положение в молекуле; 5 —схождение путей раннего и позднего бС-окисления на кастастероне; 6 — образование брассино-лида — активной формы брассиностероидов; 7 — гликозилирование делает брассиностероидыболее гирофильными и снижает их физиологическую активность
Реакции на брассиностероиды отсутствуют у мутанта bri 1 (brassinosteroid insensitive). Анализ аминокислотной последовательности белка BRI 1 показал ее гомологию с трансмембранными рецепторными киназами (у белка BRI 1 есть лигандный, трансмембранный и протеинкиназный домены). Однако до сих пор не показано, что брассиностероиды непосредственно связываются с BRI 1, т.е. проблема рецептора брассиностероидов не решена окончательно.
Брассиностероиды (как и ауксины) действуют на проростки, усиливая растяжение. Однако если для ауксинов характерно быстрое растяжение с активацией Н+-помпы через 10 мин и максимумом растяжения через 30—45 мин, то для брассиностероидов типична более замедленная реакция, которая начинается через 30 мин после воздействия и продолжается 1,5 —2 ч. Если добавлять брассиностероиды вместе с ауксинами, то они вызывают гораздо больший эффект, чем при разделенном применении.
На молекулярном уровне эффект растяжения по-видимому обусловлен активацией генов ксилоглюканэндотрансгликозилаз (КсЭТ) — это ген ТСН 4 ара- бидопсис, ген BRU 1 сои и др. Активация таких генов обнаружена в разных растительных объектах. Белки КсЭТ после биосинтеза направляются в апо- пласт и при взаимодействии с ксилоглюканами размягчают матрикс клеточной стенки. Таким образом, ауксины запускают процесс растяжения, а брассиностероиды важны для его длительного поддержания. Брассиностероиды взаимодействуют и с гиббереллинами, усиливая растяжение клеток.
При недостаточном синтезе брассиностероидов наблюдается частичная и полная мужская стерильность. У мутантов по генам биосинтеза брассиностероидов тычиночные нити не достигают длины, достаточной для самоопыления. Даже если пыльцевые зерна попадают на рыльца, рост пыльцевой трубки существенно замедлен. Проростки мутантов в темноте не удерживают апикальную петельку в согнутом состоянии, семядоли преждевременно раскрываются и начинается биосинтез хлорофилла. Все эти реакции не характерны для растений, выращенных без света. Поэтому обсуждают участие брассиностероидов при передаче световых сигналов и «перекрестный разговор» путей фоторецепции и брассиностероидов (см. подразд. 7.3.2.3).
Брассиностероиды регулируют процессы клеточной дифференцировки. У мутантов bri 1 нарушено формирование столбчатого мезофилла и уменьшено количество проводящих элементов ксилемы. Как и в случае растяжения, акусины запускают процесс дифференцировки, а брассиностероиды поддерживают его. В дифференцировке ксилемных элементов можно выделить три стадии: 1) первичная экспрессия генов, приводящая к накоплению фенилаланинаммикали- азы (ФАЛ) и гидроскилазы коричной кислоты (ГКК); 2) остановка экспрессии этих генов и переориентация актиновых филаментов; 3) вторичный запуск синтеза ФАЛ и ГКК с сильной лигнификацией и программированной гибелью клеток. Переход от стадии 2 к стадии 3 контролируют брассиностероиды.
Действие брассиностероидов и ауксинов на корневую систему противоположно: ауксины стимулируют ризогенез, а брассиностероиды ингибируют образование корней.
В больших дозах брассиностероиды сдерживают рост и повышают устойчивость к неблагоприятным внешним факторам: перегреву, заморозкам, засухе, инфекции. Препарат «Эпин» (сельскохозяйственный эпибрассинолид) помогает вырастить более крепкие и здоровые растения.
Жасминовая кислота
Впервые жасминовая кислота (жасмонат) была выделена в 1962 г. из эфирного масла жасмина крупноцветкового (Jasminum grandiflorum), где она присутствует в виде летучего эфира метилжасмоната. Это достижение фитохимии осталось бы незамеченным, если бы в 1980-х гг. не было обнаружено физиологическое действие этого вещества на растения. Жасмонат и метилжасмонат ингибировали рост проростков, прорастание пыльцевых трубок, образование каллуса, способствовали закрытию устьиц, стимулировали образование клубней и луковиц, влияли на цитоскелет, переориентируя его.
Синтез жасминовой кислоты начинается с гидролиза фосфолипидов фосфолипазой А (см. подразд. 7.2.1.3). Освободившаяся из липидов линоленовая кислота под действием липоксигеназы превращается в перекисное производное и далее формирует пятичленный цикл, служащий основой для жасмоната (рис. 7.23, 1—6). После синтеза жасминовая кислота может метилироваться, переходя в физиологически активный метилжасмонат, но возможно и гликозилирование, и тогда жасмонат переходит в неактивную (запасную) форму.
У Arabidopsis обнаружены два гена, ответственные за синтез липоксигеназы: один из них (ATLOX 1) экпрессируется в листьях, корнях, проростках при нормальном развитии и не зависит от внешних условий, тогда как экспрессия ATLOX2 повышается в ответ на механическое повреждение и патогенез. Интересно, что жасмонаты повышают активность липоксигеназы, стимулируя свой собственный биосинтез.
Кроме жасминовой кислоты найдены другие вещества этого класса, выполняющие те же функции: кукурбиновая кислота из тыквы и тубероновая кислота из картофеля. У животных близкими по структуре и биосинтезу являются простагландины.
Очевидно, жасмонаты участвуют в двух приниципиально различных регуляторных процессах: 1) сдерживают вегетативный рост и способствуют переходу в состояние покоя; 2) усиливают иммунный ответ.
Во многих тестах АБК и жасмонаты вели себя как синергисты. Так, при воздействии жасмонатами до суток подавляется синтез РБФК и разрушается хлорофилл. За подавление биосинтеза белка отвечает Jip60 (Jasmonate-induced protein, мол. масса 60 кДа). Появление Jip60 в клетках вызывает разрушение полисом и общее подавление трансляции. Обработка клеток 10~5 М жасминовой кислотой в течение 48 ч и более вызывает их гибель.
Жасмонаты вызывают в зародышах синтез белков позднего эмбрионального развития — Lea (Late embryogenesis abundant proteins). К уникальной физиологической реакции, запускаемой жасмонатами, относится синтез вегетативных запасных белков — VSP (Vegetative storage proteins). У некоторых растений эти белки совпадают по структуре с запасными белками семян, но у других заметно отличаются. Синтез VSP наблюдается только при хорошем снабжении азотом, а при голодании VSP не откладываются. Очевидно, жасмонаты регулируют депонирование нерастворимых азотных соединений и донорноакцепторные отношения. Параллельно с VSP и Lea синтезируются белки, характерные для водного дефицита (перекрывающаяся реакция с АБК). Появление этих белков сопровождается ослаблением флоэмного тока и закрытием устьиц.
H-O-Q,H-O-Q,9,13,12-Оксофитодиеновая кислота9,13,12-Оксофитодиеновая кислотаЛетучая формаЛетучая форма_/ 10,11-Дигидро-12-оксофитодиеновая]кислота_/ 10,11-Дигидро-12-оксофитодиеновая]кислота33I 0-ОкислениеI 0-ОкислениесоонсоонсоонсоонТубероновая кислотаТубероновая кислотаСООНСООНКукурбиновая кислотаКукурбиновая кислотаДепо ГликозидДепо ГликозидРис. 7.23. Биосинтез жасминовой кислоты:Рис. 7.23. Биосинтез жасминовой кислоты:Активная формаОНАктивная формаОНАктивная формаАктивная форма
H-O-Q,
H-O-Q,
9,13,12-Оксофитодиеновая кислота
9,13,12-Оксофитодиеновая кислота
Летучая форма
Летучая форма
_/ 10,11-Дигидро-12-оксофитодиеновая
]кислота
_/ 10,11-Дигидро-12-оксофитодиеновая
]кислота
3
3
I 0-Окисление
I 0-Окисление
соон
соон
соон
соон
Тубероновая кислота
Тубероновая кислота
СООН
СООН
Кукурбиновая кислота
Кукурбиновая кислота
Депо Гликозид
Депо Гликозид
Рис. 7.23. Биосинтез жасминовой кислоты:
Рис. 7.23. Биосинтез жасминовой кислоты:
Активная форма
ОН
Активная форма
ОН
Активная форма
Активная форма
.СООН(СН2)<
Линоленовая кислота
| Липоксигеназа
-=\ >/СООН (сн2<
13-Гидропероксилиноленовая кислота
/СООН(СН2)<
12,13-Эпоксиоктадека-9,11,15-триеновая кислота
С-О-СНз (CH2)f II
Метилжасмонат
Жасминовая кислотаАктивная форма
1 — окисление линоленовой кислоты до ее эпоксипроизводного; 2 — циклизация углеродного скелета — ключевой этап биосинтеза жасминовой кислоты; 3 — заключительные этапы биосинтеза с укорочением углеродного скелета; 4 — об-
разевание кукурбиновой и тубероновой кислот — физиологически активных аналогов жасмино-вой кислоты; 5 — депонирование в форме неактивных гликозидов; 6 — этерификация позволяетувеличить летучесть жасмоната, что важно для передачи сигнала другим растениям
Если в растениях ингибировать работу липоксигеназы, жасминовая кислота не образуется и теряется иммунитет к фитопатогенам. В иммунном ответе жасминовая кислота вызывает синтез экстенсинов (происходит упрочнение клеточной стенки и замедление роста, что неблагоприятно для патогенов), синтез белков тионинов (небольшие богатые цистеином белки, связывающиеся с мембранными структурами патогена с токсическим эффектом), синтез фитоалексинов (индуцибельных защитных соединений), салициловой кислоты (см. подразд. 7.2.8.3) и короткого пептида системина (см. подразд. 7.2.8.5).
Этерификация жасминовой кислоты придает ей летучесть. Предполагают, что метилжасмонат (как и этилен) через воздух действует на соседние растения, «информируя» их о «нападении» патогенов. Растительное сообщество «заранее узнает» об инфекции и «принимает защитные меры».
Салициловая кислота
Салициловая кислота, выделенная из ивы (Salix) еще в XIX в., нашла широкое применение в медицине. Самое известное производное — ацетилсалициловая кислота (аспирин).
Биосинтез салицилата начинается с активизации фенилаланинаммиаклиазы (ФАЛ): она превращает фенилалланин в транс-коричную кислоту, которая при дальнейшем окислении дает бензоат. Бензоатгидроксилаза окисляет его до салицилата. Салицилат может депонироваться в виде неактивного гликозида.
Физиологический эффект салицилатов в растениях открыт в 1980-х г. при изучении термогенеза у ароидных. Sauromatum guttatum — субтропическое растение с типичной для ароидных стратегией опыления (рис. 7.24). Женские цветки собраны на початке у основания в камере, образованной покрывалом. Выше расположены щетинки, прилегающие к покрывалу, а также тычинки. Початок венчает утолщенный стерильный придаток. Покрывало отогнуто и образует посадочную площадку для опылителей.
Первый термогенный эпизод начинается в середине ночи с нагревания стерильного придатка и длится около 7 ч (рис. 7.24, А). Разница температур (АГ) между початком и окружающей средой достигает 12 °C. При этом испаряются вещества, имитирующие запах гниющего мяса. На запах слетаются насекомые- опылители и забираются по покрывалу в нижнюю камеру. Их обратному выходу препятствуют щетинки. Насекомые остаются на день в камере, а вечером их ожидает второй (14-часовой) термогенный эпизод: разогревается нижняя часть початка (перепад температур АС = 10 °C) (рис. 7.24, Б). Пыльники раскрываются и осыпают насекомых пыльцой. Щетинки к этому времени усыхают, и опылители свободно покидают камеру.
Термогенные эпизоды распределены в течение суток так, что начало первого эпизода у одних растений в данной популяции совпадает с освобождением насекомых после второго эпизода у других. В верхнем придатке за день до цветения салициловая кислота накапливается с 12.00 и достигает максимума в 17.00 часов. Концентрация салицилата повышается в 100 раз. В середине ночи уровень салицилата повышается в нижней части початка. После термогенеза уровень салицилата возвращается к исходному (около 10—15 ммоль).
В вырезанном из растения початке термогенез можно вызвать экзогенным салицилатом, причем в темноте салицилата нужно добавить больше, чем на
Рис. 7.24. Термогенез у Sauromatum guttatum (ароидные) (Л, Б) и салициловая кислота (В).
Q — выделение тепла
свету. Очевидно, Sauromatum не склонен к термогенезу, если соцветие находится в почве и не доступно для опылителей. По-видимому, салициловая кислота индуцирует синтез мРНК альтернативной оксидазы (см. подразд. 4.3.10). Под действием салицилата в придатке повышается содержание летучих веществ, привлекающих насекомых.
Вряд ли салициловая кислота является непосредственным триггером потока электронов в ЭТЦ митохондрий, так как повышение ее уровня наблюдаются не у всех термогенных видов. Так, при развитии стробила саговников (Сусах), цветка виктории королевской (Victoria regia) или соцветия у пальм температура повышается, но термогенез не связан с салицилатом. Уровень салицилата в листьях риса повышен, но рис почти не способен к термогенезу. Таким образом, регуляция термогенеза салициловой кислотой характерна для ароидных и некоторых других растений. У ряски (Lemna gibba) добавление салицилата стимулирует цветение.
Салициловая кислота регулирует ответ при действии патогенов. Например, при обработке салицилатом повышается устойчивость табака к вирусу табачной мозаики. При механическом повреждении активизируется начальный фермент биосинтеза салицилата — фенилаланинаммиаклиаза (ФАЛ). Если растение не может синтезировать салицилат (блокированы гены ФАЛ или бензоат- гидроксилазы), его иммунная реакция снижается.
При обработке салициловой кислотой синтезируются PR-белки (pathogenesis related) различных классов. PR-1-класс отвечает за системную устойчивость (т. е. устойчивость всего растения, далеко от непосредственного места контакта с патогеном). Белки PR-1 токсичны для грибов.
Белки PR-2 — р-1,3-глюканазы, расщепляющие глюканы клеточной стенки. Фрагменты глюканов также способны вызывать иммунную реакцию растительных клеток. Класс белков PR-3 — хитиназы, они расщепляют хитин клеточных стенок грибов. К классу PR-4 относят гевеинподобные белки, отвечающие за застывание латекса. Эти физиологические ответы частично перекрываются с ответами на этилен и жасминовую кислоту (см. подразд. 7.2.7.6, 7.2.7.9, 7.2.8.2).
Салициловая кислота вызывает синтез ФАЛ, усиливая собственный биосинтез. Кроме того, салициловая кислота может связываться с некоторыми Ресодержащими белками (например, с каталазой). При взаимодействии с салицилатом активность каталазы падает, концентрация перекиси водорода и других активных форм кислорода растет. К этому же эффекту приводит взаимодействие салицилата с аскорбатоксидазой. Повышение концентрации активных форм кислорода стимулирует образование новых порций салициловой кислоты, что также усиливает эффект. Высокие дозы салицилата вызывают гибель клеток (запускается реакции сверхчувствительности).
Таким образом, салицилат не только регулирует процессы через рецепторные системы, но и непосредственно участвует в аллостерической регуляции работы ряда ферментов, т. е. для развития физиологического ответа необходима сравнительно высокая концентрация салицилата (до 10“3—10"5 моль/л). Это не характерно для «типичных» гомонов (см. подразд. 7.2.1.1), поэтому включение салицилата в список фитогормонов дискуссионно.
Олигосахарины
В регуляции физиологических процессов у растений участвуют короткие углеводы — олигосахариды. В 1980-х гг. обнаружено, что продукты деградации клеточной стенки Phytophthora вызывают специфичную иммунную реакцию. Даже небольших перестроек углеводного скелета было достаточно, чтобы этот эффект исчез, т.е. большинство олигосахаридов не обладает активностью. Олигосахариды, вызывающие физиологический эффект, называют олигосахаринами. (Каждый олигосахарин — олигосахарид, но не каждый олигосахарид — олигосахарин!)
Они образуются как продукты расщепления полисахаридов клеточной стенки. Расщепление вызывают как собственные ферменты, так и ферменты грибов/ бактерий. В состав олигосахаринов могуг входить ксилоза, рамноза, галактоза и остатки уроновых кислот. Из гликолипидов, входящих в состав мембран, образуются олигосахарины, содержащие инозитол (см. подразд. 7.2.1.3). Короткие фрагменты хитина, образующиеся под действием растительных хитиназ, также относят к олигосахаринам, хотя они происходят из чужеродного объекта.
Обнаружено, что олигосахариды суспензионной культуры клена стимулируют деление клеток в культуре in vitro. Это говорит о том, что в экстрактах есть и олигосахарины.
В физиологической регуляции созревания плодов также участвуют олигосахарины. Ферменты, разрушающие гликаны клеточной стенки, высвобождают активные олигосахарины, стимулирующие дальнейшее созревание. Важную роль играют пектолитические ферменты и образующиеся фрагменты пектина. Специфические олигосахарины являются сигналами при узнавании симбионтов в системе Rhizobium—растение — хозяин. Без обмена олигосахаринами клубеньки у бобовых не образуются.
Короткие пептиды
Сигнальные короткие пептиды растений, как правило, синтезируются в виде крупных белков-предшественников, а затем в результате протеолиза происходит их «созревание». Короткие пептиды выходят в апопласт и действуют на другие клетки.
Один из первых пептидов, выделенный из томатов, отвечал за системный ответ на механическое повреждение и внедрение патогена (индукция ингибиторов протеиназ и фитоалексинов). В результате иммунный ответ наблюдается не только в месте повреждения, но и во всем растении (системная устойчивость). Этот короткий пептид, состоящий из 18 аминокислот, назван системи- ном. Предшественник системина содержит 200 аминокислотных остатков. Биосинтез системина контролирует жасмонат. У томатов найден белок-рецептор (мол. масса 160 кДа), связывающийся с системином. Системин специфичен для томатов и картофеля, но не вызывает системного ответа у табака (из табака был выделен другой системин, не похожий на томатный).
Из суспензионной культуры аспарагуса (Asparagus) был выделен еще более короткий пептид (всего 4—5 аминокислот), в состав которого входил сульфатированный тирозин, названный фитосульфокином. Он стимулирует деление клеток in vitro, повышает митотический индекс. Фитосульфокин обнаруживается в местах активного деления клеток, способствуя органогенезу (образованию листьев, боковых корней и т.д.). По-видимому, фитосульфокин —
Центральная
зона
Рис. 7.25. Контроль размера меристемы коротким пептидом CLV3 у Arabidopsis thaliana (крестоцветные):
А — в покоящемся центре активен ген WUSHEL, что приводит к появлению сигнала, стимулирующего деления клеток; Б — делящиеся клетки центральной зоны синтезируют и выделяют в апопласт короткий пептид-продукт гена CLAVATA 3; В — в покоящемся центре короткий пептид CLAVATA 3 взаимодействует с мембранным рецептором CLAVATA 1. что приводит к инактивации экспрессии гена WUSHEL, Г — в центральную зону не поступает сигнал о делении клеток, пептида CLAVATA 3 становится меньше. Создаются условия для повышения экспрессии гена WUSHEL
универсальный регуляторный пептид — он вызывает деление клеток у риса и других не родственных растений.
Другие короткие пептиды регулируют специфичные функции. Так, пептид CLAVATA 3 (состоит из 78 аминокислот), синтезируется в верхних слоях центральной зоны меристемы (делящихся клетках). Он регулирует размер апикальной меристемы побега у Arabidopsis. Пептид CLAVATA 3 связывается с белком-рецептором CLAVATA 1, причем рецептор сосредоточен в покоящемся центре меристемы (рис. 7.25). Короткий пептид CLAVATA 3 служит сигналом о количестве делящихся клеток в центральной зоне меристемы: высокая концентрация «говорит» покоящемуся центру о том, что делящихся клеток много, а низкая — что их мало. Покоящийся центр посылает обратно сигнальные молекулы, стимулирующие (или ингибирующие) клеточные деления.
Интенсивное взаимодействие короткого пептида CLAVATA 3 с CLAVATA 1 означает, что число делящихся клеток чрезмерно, и из покоящегося центра направляется сигнал, уменьшающий число делящихся клеток. Концентрация CLAVATA 3 закономерно уменьшается, после чего покоящийся центр вновь стимулирует деление клеток в центральной зоне. Механизм обратной связи с участием CLAVATA 3 и его рецептора CLAVATA 1 поддерживает объем меристемы на определенном уровне. При мутации, как в гене рецептора clvl, так и в гене короткого пептида с!иЗ, меристема становится очень крупной (иногда в 1000 раз больше, чем у дикого типа), а стебель плоским (фасциированным).
Короткий пептид SCR (53 — 57 аминокислот) выделяется прорастающим пыльцевым зерном у капусты. Для каждой линии капусты характерен свой вариант SCR-пептида. Рецепторы к SCR-пептиду находятся в тканях рыльца, и при узнавании развитие пыльцевой трубки останавливается. Таким способом капуста избегает самоопыления.
РЕЦЕПЦИЯ СВЕТОВЫХ СИГНАЛОВ
ПРИНЦИПЫ ФОТОРЕЦЕПЦИИ
Чтобы растение «почувствовало» квант света, необходимы пигмент-белко- вые комплексы (фоторецепторы), поглощающие в данной части спектра и преобразующие квант в биохимический сигнал, т. е. должна произойти фотохимическая реакция. Энергия поглощенного кванта преобразуется двумя путями (в зависимости от фоторецептора): 1) изменяется конформация белка и запускается каскад фосфорилирования (рецептор красного света); 2) идут реакции восстановления вторичных мессенджеров (рецептор синего света). Далее активизируется система вторичных мессенджеров, передающих световой сигнал.
Как в световой фазе фотосинтеза, так и при сигнальной фоторецепции энергия квантов света преобразуется в энергию химических связей. Но при этом в фотосистемах хлоропластов конформация белковых комплексов изменяется мало, низкая чувствительность к свету и высокий КПД энергопреобразования. В отличие от фотосистем фоторецепторы сильно изменяют конформацию белковых комплексов, очень чувствительны к свету, имеют низкий КПД энергопреобразования, локализованы в ядре и в цитоплазме (см. подразд. 3.3.1).
Рис. 7.26. Фотоконверсия форм фитохрома:
1 — свет с длиной волны 660 нм (пригодный для фотосинтеза) приводит к превращению красной формы фитохрома в дальнюю красную; это аналогично переключению выключателя в положение «ON» (слева); 2 — свет с длиной волны 730 нм (не пригодный для фотосинтеза) приводит к переходу дальней красной формы фитохрома в красную; это аналогично переключению выключателя в положение «OFF» (справа). Обратите внимание, что промежуточные короткоживущие формы фитохрома для «красного» перехода (Prelumi-R, tumi-R^, meta-Ra663, meta-Rc725) отличаются от промежуточных форм для «дальнего красного» перехода (Prelumi-F, lumi-F675, meta-F66S); 3 — темновой самопроизвольный переход аналогичен выключению красного света («OFF»)
Физиологически важные области спектра. Поскольку жизнь растений зависит от фотосинтеза, они должны оценивать количество и качество света. Согласно физическим принципам, есть предел энергии кванта для преобразования в световых реакциях фотосинтеза: фотосистема I поглощает и преобразует кванты из красной области спектра при X < 700 нм, а фотосистема II — при X < 680 нм. Если зеленые растения освещать более длинноволновыми квантами (Х> 700 нм), растение погибнет: энергии этих квантов недостаточно для световой стадии фотосинтеза (см. подразд. 3.4 и 3.5). Таким образом, красные лучи можно разбить на две резко отличающиеся области — собственно красную, пригодную для фотосинтеза (Х< 700 нм), и дальнюю красную, для фотосинтеза не пригодную (Х> 700 нм). Дальний красный свет и темнота должны приводить к похожим ответам — это сигнал, что условий для фотосинтеза нет.
Фитохром и криптохром. Для оценки качества и количества квантов в красной области у растений есть фоторецептор фитохром, состоящий из фитохромобилина (пигмент, аналогичный фикобилинам) в комплексе с белком.
Фитохром может находиться в двух основных формах: красной Фкр(660) и дальней красной Фдкр(730) (рис. 7.26). «Красные кванты» (Х = 660) поглощаются красной формой фитохрома, и происходит переход Фкр -> Фдкр. Появление Фдкр под действием света с Х = 660 нм — сигнал о том, что свет пригоден для фотосинтеза. Дальняя красная форма фитохрома Фдкр переходит в Фкр (1) при действии света с X = 730 нм, и (2) самопроизвольно в темноте (этот переход
медленнее). Появление Фкр под действием света с Х = 730 нм или в темноте — сигнал о том, что условий для фотосинтеза нет. Фитохромная система похожа на переключатель: если есть кванты с Х = 660 нм, то система ожидает сигнала от Х = 730 нм, и наоборот. В полной темноте чувствительность растений к свету возрастает: содержание фитохрома увеличивается. Как только растения переносят на свет, концентрация фитохрома уменьшается.
На основании сигналов фитохромной системы растение изменяет стратегию роста: готовится к фотосинтезу или все силы расходует на рост; приступает к цветению или к листопаду; семена прорастают или дожидаются более благоприятного освещения и т.д.
Максимумы поглощения каротиноидов, флавинов, хлорофиллов и др. пигментов находятся в синей области спектра, она также физиологически важна. У растений синий свет воспринимают криптохромы, фототропин. Фоторецепторы синего света работают иначе: происходят окислительно-восстановительные реакции. Поступающие сигналы «помогают принять локальные решения»: определить направление максимальной освещенности при фототропизме, открыть устьица и т.д. Рецепторы красного и синего света функционируют взаимодействуя друг с другом. У растений есть системы, «чувствующие» ультрафиолет и активирующие защитные механизмы, но фоторецепция в УФ-части спектра изучена недостаточно.
ФОТОРЕЦЕПЦИЯ В КРАСНОЙ ОБЛАСТИ СПЕКТРА:ФИТОХРОМНАЯ СИСТЕМА
История открытия фитохрома
В 1952 г. американец Г. А. Бортвик изучал прорастание семян салата. В полной темноте набухшие семена не прорастали, но прорастали после нескольких секунд освещения. Семена были настолько чувствительными к свету, что приходилось работать с ними как с фотоматериалами, обертывая образцы светонепроницаемой бумагой или фольгой. Был получен спектр физиологической реакции: график зависимости процента проросших семян от длины волны. Оказалось, что дальний красный свет (л = 730 нм) тормозит реакцию прорастания. При последовательном освещении красным (660 нм) — дальним красным (730 нм) — красным (660 нм) семена прорастают, но если последнюю вспышку света заменить на дальнюю красную (730 нм), то прорастание замедлялось. Наблюдается К/ДК — обратимость, т.е. физиологический ответ при низкой интенсивности освещения можно обратить. В итоге растения дают тот ответ, который вызывает последняя вспышка света.
Была выдвинута гипотеза, что в семенах есть пигмент-рецептор, который обладает свойством «переключаться» при действии внешнего стимула: красного или дальнего красного света. Этот фоторецептор был назван фитохромом (phyton — растение; chromos — краска, пигмент).
Спектр физиологической реакции прорастания семян позволил начать поиски и выделение пигментов, обладающих таким же спектром поглощения. Из растений выделяли очередной пигмент, его спектр сравнивали с физиоло- гическим спектром. Эта стратегия поиска увенчалась успехом: всего через 7 лет
Рис. 7.27. Спектр поглощения фитохрома Фббо и ФуЗО-
Для сравнения показаны положения максимумов поглощения Р680 и Р70о- ФАР — область фотосинтетически активной радиации
У. Л. Батлер и С. Б. Хендрикс выделили фитохром в чистом виде и охарактеризовали его (рис. 7.27).
Физиологические ответы фитохромной системы были разделены на три груп
пы: 1) ответ на сверхнизкую интенсивность света (0,1 — 1 мкмоль квантов/м2); 2) ответ на низкую интенсивность (1—1000 мкмоль квантов/м2); 3) высокоэнергетический ответ (более 1000 мкмоль квантов/м2).
Фотоконверсия фитохрома. Фитохромы А и В
Фитохром представляет собой димер белка с ковалентно связанной хромофорной группировкой из четырех пиррольных колец (А, В, С и D). Молекула хромофора синтезируется сначала как замкнутый тетрапиррол (гем), а затем размыкается и встраивается в белок. Хромофор имеет структуру, близкую к фикобилинам (см. подразд. 3.3.3).
Как и ожидалось, хромофор фитохрома (фитохромобилин) существует в двух основных спектральных формах, которые переходят друг в друга. Форма Ф660 (красная) улавливает «красные кванты» света и переходит в Ф730 (дальнюю красную). Это объясняет эффект К/ДК-обратимости: при освещении красным светом форма Фвео исчезает (форма Ф730 накапливается). Если после этого осветить растение светом с длиной волны 730 нм, форма Ф73о перейдет в Фббо- Последовательные вспышки приводят к тому, что сначала весь фитохром переходит в одну форму, а потом в другую и т.д. Для физиологической реакции важна именно последняя форма фитохрома, т. е. последняя короткая вспышка, которой освещали растение.
Главным событием, приводящим к фотоконверсии форм фитохрома, является поворот кольца D относительно кольца С (цис-транс-изомеризация в ме- тиновом мостике) (рис. 7.28). Эта реакция приводит к изменению конформации белкового окружения хромофора и димера в целом. Первичная форма возбужденной хромофорной группировки оказывается недостаточно стабильной и самопроизвольно через ряд этапов переходит в более стабильные формы, причем промежуточные формы для перехода из Фббо в Ф73о отличаются от промежуточных форм для обратного перехода (см. рис. 7.26).
У арабидопсис известны 5 генов, отвечающих за биосинтез белкового компонента фитохрома. По количеству белка преобладают фитохром А и фито-
домендоменРис. 7.28. Структура фитохрома:Рис. 7.28. Структура фитохрома:
домен
домен
Рис. 7.28. Структура фитохрома:
Рис. 7.28. Структура фитохрома:
А — структура хромофорной группировки и ее изменение при фотоконверсии форм фитохро-ма (см. также рис. 7.26); Б — функциональные домены белковой части фитохрома
хром В, различающиеся не только белковой частью, но и спектром поглощения (эффект различного окружения хромофора). Фитохромы С, D и Е — минорные. В белковой части всех фитохромов ближе к N-концу есть консервативный домен, ковалентно связывающий фитохромобилин. При его повреждении хромофор не встраивается в фитохром. С-концевые участки отвечают за передачу сигнала (обычно есть два гистидинкиназных домена).
481481По сравнению с Ф(В) в спектре поглощения фитохрома А более широкие пики, у Ф(А)ббо максимум поглощения — 660, однако широкое плечо выходит в дальнюю красную область. Это означает, что Ф(А)ббо переходит в Ф(А)730 не только при облучении квантами с X = 660 нм, но и при освещении дальним красным светом высокой интенсивности. Следовательно, у реакций, вызываемых Ф(А), нет К/ДК-обратимости. Фитохром А отвечает как за ответы на сверх-
481
481
16 Физиология растений
низкие интенсивности красного света (X = 660 нм), так и за высокоэнергетический ответ на дальний красный (Х= 730 нм). В спектре поглощения фитохрома В пики более узкие, у формы Ф(В)б60 плечо не заходит в дальнюю красную область. Фитохром В отвечает за ответы на низкую интенсивность и обеспечивает К/ДК-обратимость. Наличие фитохромов А и В, отличающихся спектрами поглощения, «позволяет» растению различать (1) полную темноту, (2) свет, обогащенный ДК-квантами, и (3) освещение, пригодное для фотосинтеза.
Растения, выращенные в темноте, «стараются» повысить чувствительность к свету, повышая содержание фитохрома А (именно Ф(А) отвечает за восприятие света любого качества). При освещении (независимо от того, К или ДК), концентрация Ф(А) снижается примерно в 100 раз.
Киназная активность фитохромов зависит от состояния хромофора. Форма Ф730 является активной (она получила красный свет с X = 660), а Ф660 (образуется в темноте или на ДК) не активна как киназа. Фосфорилирование фитохромов также меняет их активность. Возможно, фитохромы могут автофосфо- рилироваться. В число возможных вторичных мессенджеров фитохромного сигнала входят гетеротримерные G-белки, циклическая ГМФ и кальций.
У растений, выращенных в темноте, фитохромы обычно находятся в цитозоле. Для перемещения фитохромов А и В в ядро нужны разные световые стимулы. Так, в конформации Фбво фитохром В не может пересекать ядерную мембрану, а после фотоконверсии красным светом аккумулируется в ядре. Ф(А) переходит в ядро при освещении как ДК высокой интенсивности, так и красным светом. Интересно, что на С-концевом участке у фитохромов есть два PAS-домена, которые встречаются в транскрипционных факторах. PAS-доме- ны важны для ДНК-белковых и для белок-белковых взаимодействий. Повреждение PAS-доменов нарушает функционирование фитохрома. Это означает, что, проникая в ядро, фитохром участвует в геномной регуляции, связываясь в комплексы с факторами транскрипции.
Этиоляция и деэтиоляция
У цветковых растений в отсутствие условий для фотосинтеза хлорофилл не образуется, не происходит сборка светособирающих комплексов, пластиды имеют агранальную структуру (этиопласты) (см. подразд. 3.2.3). Растения, выросшие в темноте, становятся белыми или желтоватыми, междоузлия удлинены, а листовые пластинки часто превращаются в чешуи. Процесс «обесцвечивания» растений при недостатке света называют этиоляцией. Этиоляция — адекватная реакция на недостаток света: фотосинтетическая функция сведена к минимуму, рост происходит за счет растяжения (форма роста, требующая минимум пластических веществ) (рис. 7.29). Растение «экономит» органические вещества, «отказавшись» от роста пластинок листьев.
Отсутствие света при прорастании является сигналом, что растение, вероятно, находится под землей, и проросток формирует апикальную петельку, защищающую меристему от возможных механических воздействий. В отличие от тройного ответа на этилен, гипокотиль при этиоляции интенсивно растет.
Рис. 7.29. Синдром этиоляции:
А — этиолированное растение; Б — процесс деэтиоляции, регулируемый светом через фитохромную систему; В — деэтиолированное растение; Г — этиоляция возникает при недостатке света; сигнал поступает через фитохромную систему
В результате усиленного роста растение может оказаться в зоне с благоприятным освещением. Как только оно получит сигнал, что свет пригоден для фотосинтеза, у листьев появляется развитая пластинка (что контролирует фитохром С), рост междоузлий ингибируется, синтезируется хлорофилл и пластиды превращаются в хлоропласты, разгибается апикальная петелька, а рост гипокотиля тормозится. Цепь этих процессов называют деэтиоляцией. Деэтиоляция характеризуется не только синтезом хлорофилла, но и экспрессией генов белков светособирающего комплекса (хлорофилл а/й-связывающего белка). Благодаря гидрофобным свойствам хлорофилл а/й-связывающего белка тилакоиды, содержащие ССК, собираются в граны.
Избегание тени
Ситуация, когда растение попадает на свет, обогащенный ДК-лучами, заметно отличается от полной темноты. С одной стороны, дальний красный свет (как и просто красный) вызывает переход фитохрома А в форму Ф(А)730 (это означает, что растение почувствовало свет). С другой стороны, дальним красным светом невозможно перевести Ф(В)660 в Ф(В)730. Растение получает два противоречащих друг другу сигнала: от фитохрома А — о том, что свет есть, а от фитохрома В — о том, что этот свет не пригоден для фотосинтеза. Ответ зависит от «интегрирования» этих взаимно противоположных сигналов.
В природе интенсивный свет, обогащенный ДК, бывает под пологом растений. В нижних ярусах много дальнего красного, так как листья поглощают красные кванты в процессе фотосинтеза. Много дальнего красного — это сигнал о том, что рядом есть более высокие соседи. Однако есть надежда, что рядом обнаружится свободное светлое «окно», не занятое другими растениями.
Если растение получило положительный сигнал от фитохрома А и отрицательный от фитохрома В, развивается «синдром избегания тени». Для этого синдрома характерны черты как этиоляции, так и нормального развития на свету. Хлорофилл синтезируется, но его содержание меньше. Листовые пластинки формируются, но они не такие крупные, как при полном освещении. Удлинение междоузлий менее интенсивно, чем в темноте, но все же скорость роста выше, чем на прямом солнце. В результате образуются длинные побеги со слабо развитыми механическими тканями. Они легко полегают, при этом меристема побега оказывается на новом месте. Происходит новая «оценка ситуации», если по-прежнему в спектре много дальнего красного и мало красного, снова развивается побег с «синдромом избегания тени».
Полное развитие фотосинтетического аппарата возможно только в том случае, когда на растение падает много красного света (и он не обогащен дальним красным). Тогда и от фитохрома А, и от фитохрома В приходят одинаковые сигналы о том, что свет есть и он пригоден для фотосинтеза.
Образно можно назвать фитохром А «оптимистическим» рецептором, а фитохром В — «критиком», или «пессимистом».
Интересно, что поведение растений в тени заметно отличается у мутантов по фитохрому А и В. Если в растении поврежден фитохром В, оно развивает нормальный «синдром избегания тени» и в конечном итоге выживает. Мутанты по фитохрому А при интенсивном дальнем красном освещении сильно вытягиваются и погибают. Этот пример показывает, что отсутствие «оптимизма» бывает очень опасным, и даже смертельным при определенных внешних обстоятельствах. Растению нужно не только «уметь правильно и критически оценить ситуацию» с освещением (функция Ф(В)), но и «почувствовать положительные тенденции — понять», что свет все-таки есть и «жить стоит» (функция Ф(А)). Кроме того, синдром избегания тени регулируется фитохромами D и Е.
Регуляция прорастания семян
Семена примерно 50 % рудералов, среди которых немало сорняков, прорастают только после кратковременного освещения. Эти растения в природе занимают нарушенные места, поэтому зародышу важно определить, свободно ли место от растений-конкурентов. Если травостой сомкнут (место занято), семена не прорастают. В агроценозах основной экологический фактор — перекопка почвы. При этом семена сорняков могут оказаться как глубоко под землей, так и близко к поверхности. Семена, находящиеся глубоко в почве, не получают светового стимула и впадают в состояние покоя, образуя семенной фонд. Но стоит вынести такое семя на поверхность, как оно прорастает.
В регуляции прорастания заметную роль играет фитохромная система. Для восприятия светового сигнала необходимо набухание семян (если семя метаболически не активно, фитохром не может передать информацию в ядро). Как это и следует из свойств фитохрома А и В, прорастание можно вызвать небольшим количеством «красных квантов» (через Ф(В) и минорный Ф(Е)),
тогда можно наблюдать К/ДК-обратимость. Освещение интенсивным ДК-све- том также приводит к прорастанию (через Ф(А)), причем обратить этот эффект не удается.
На чувствительность семян к свету влияют условия выращивания материнского растения. Если арабидопсис вырастить на ярком свету, семена прорастут и в полной темноте. В зародыше при развитии на материнском растении фитохромная система получает достаточно красных лучей, и фитохромы переходят в форму Ф73о (сигнал к прорастанию). После периода покоя семя прорастает без света. Если материнское растение выросло в тени других растений (или при недостатке света), фитохромы в зародышах остаются в форме Фбво и «ожидают» красных лучей — свет нужен для прорастания. Свойства фитохромной системы позволяют предложить приемы, снижающие прорастание сорняков на полях. Например, можно вспахивать и засевать поле ночью, чтобы свет не попадал на семена сорняков (большинство культурных растений прорастают без света). Вспашка поля ночью показала, что засоренность снижается на 30 — 60 % по сравнению с участком, вспаханным днем.
Внутренние часы и фитохромная система
В растениях важную роль играют циркадные процессы, связанные со сменой дня и ночи (от лат. circa — вокруг, dies — день). У растений существуют «внутренние часы», которые отмеряют время. Чтобы обнаружить их, использовали растение Pharbitis nil (сем. Вьюнковые). Цветение фарбитис зависит от длины светового дня: если день короче определенного интервала, то растение цветет, если длиннее — вегетирует. Уникальность физиологических свойств фарбитис в том, что цветение можно вызвать единственным днем «удачного» освещения. Проростки фарбитис, растущие в темноте, обрабатывали вспышками красного света. Если вторая вспышка света следовала через короткий промежуток после первой, то растения переходили к цветению. Как только интервал между двумя вспышками превышал критическую величину, растение не давало цветков. Однако если дать вторую вспышку более чем через 24 ч, оно снова цвело (рис. 7.30).
Вероятно, у фарбитис есть «эндогенные часы», которые «запускаются» первой вспышкой света. С этого момента растение «отмеряет сутки». «Внутренние сутки» разбиты на фотофильный (photos — свет) и скотофильный (skotos — темнота) периоды. Если вторая вспышка приходится на фотофильный период, фарбитис цветет, а если на скотофильный — вегетирует. Фитохромная система взаимодействует с внутренними часами растения. Растение «подстраивает» циркадные ритмы по сигналам фитохромной и криптохромной (см. подразд. 7.3.3) систем. Эндогенный ритм часов и внешний ритм освещения интегрируются в единый сигнал, на который растение должно ответить адекватно (в частности, фарбитис запускает программу цветения или вегетативного развития).
В течение суток условия освещения меняются из-за того, что солнце находится под разными углами к горизонту. Когда оно в зените (угол, близкий к 90°), спектр падающих лучей искажается незначительно. Однако при малых углах (раннее утро или поздний вечер) спектр оказывается обогащенным К- и ДК-квантами. Утром и Ф(А), и Ф(В) активизируются, растение «просыпает-
Рис. 7.30. Опыт (варианты), демонстрирующий наличие часов у Pharbitis nil (вьюнковые): 1, 2 — вторая вспышка приходится на 1 фотофильную фазу, растение цветет (цв.); 3—5 — вторая вспышка приходится на скотофильную фазу, растение вегетирует (вег.); 6, 7 — вторая вспышка приходится на 11 фотофильную фазу, растение цветет; 8 — схематическое изображение внутренних часов (эндогенного циркадного осциллятора); Им — вспышки света; длительность темного времени показана штриховкой
ся». Вечером растения получают большую дозу дальних красных лучей, активизируется только Ф(А), тем самым фитохромная система «говорит» растению о времени суток. Часто ночью температура воздуха заметно ниже, чем днем, поэтому, получив фитохромный сигнал и «сверив» его с часами, растение «предпринимает превентивные меры» (о механизмах защиты от холода см. в гл. 8). Если растения вовремя не получат сигнал о наступлении ночи, они не успевают адаптироваться к суточным колебаниям температуры и хуже растут.
Важность фитохромов для циркадной температурной адаптации выяснили случайно. В целях повышения продуктивности лесных насаждений были получены трансгенные осины {Populus tremulaY в геном которых был встроен ген фитохрома А под сильным промотором. Это привело к снижению эффекта «избегания тени» (растениям «казалось», что они постоянно получают ДК- свет высокой интенсивности). Ученые предложили высаживать осину более плотно, чтобы получить больше древесины с той же площади. При посадке в грунт осины с измененной активностью фитохрома А не могут адаптироваться к суточным колебаниям температуры, страдают от ночных заморозков.
Таким образом, фитохромная система важна для восприятия растениями чередования дня и ночи. «Сверяя» фитохромные сигналы с «внутренними часами», растения «определяют» длительность дня и ночи (иногда с точностью до 10 минут!).
ФОТОРЕЦЕПЦИЯ В СИНЕЙ ОБЛАСТИ СПЕКТРА:КРИПТОХРОМ И ФОТОТРОПИН
История изучения фоторецепциив синей области спектра
В 1881 г. Ч. Дарвин в опытах с фототропизмом у канареечной травы {Phalaris) показал, что экран из раствора бихромата калия, не пропускающий синий свет, полностью снимает эффект фототропизма. В 1883 г. немецкий физиолог растений Ю. Сакс провел опыты с применением цветных стекол и различных растворов, чтобы более полно оценить спектральные характеристики света, вызывающего реакцию фототропизма. В итоге стало понятным, что растение «чувствует» синий свет (красный не вызывал фототропизма).
В дальнейшем эта часть спектра была сужена до 400 — 500 нм. Было показано, что от синего света зависят и другие физиологические ответы: синтез каротиноидов, антоцианов, устьичные движения. Вызванный синим светом ответ невозможно было обратить квантами света с другой длиной волны. Значит, у растений есть еще один фоторецептор, отвечающий за восприятие синей части спектра. Методы, которые применяли для изучения фитохрома, оказались почти неприемлемыми для нового рецептора, выделить и охарактеризовать его не удавалось вплоть до конца XX в. Гипотетический фоторецептор был назван криптохромом (от греч. cryptos — скрытый).
Наложение физиологического спектра действия при фототропизме на спектры поглощения пигментов давало расплывчатые результаты: на роль криптохромов претендовали флавины, птерины и производные каротиноидов. Более того, в синей части спектра есть максимумы поглощения и у фитохромобили-
на, и у хлорофиллов. По объективным причинам изучение восприятия синего света оказалось сложной проблемой.
В 1993 г. проблему криптохрома смогли решить А. Р. Кашмор и М. Ахмад. Они отобрали среди мутантных растений арабидопсис те, которые давали удлиненный гипокотиль как в темноте, так и на свету. Оказалось, что часть мутантов не реагирует на синий свет (гипокотиль длинный), а на красном свету гипокотили этих мутантов короткие. Очевидно, что фитохромная система работает нормально, а мутанты имеют нарушения в криптохромной системе. Удалось выделить мутации как по биосинтезу хромофора, так и по белковой части криптохрома, клонировать эти гены и получить их полную последовательность.
Криптохром — рецептор синего света, локализованныйв ядре и цитоплазме
У Arabidopsis криптохромная система представлена двумя белковыми комплексами: CRY 1 и CRY 2. У папоротника Adiantum capillus-veneris обнаружено 5 генов, кодирующих различные криптохомы. Судя по последовательности нуклеотидов, белки криптохромов родственны ДНК-фотолиазам. Эти ферменты позволяют репарировать сшивки, возникающие в ДНК вследствие облучения ультрафиолетом. ДНК-фотолиаза несет две хромофорные группы: флавин и птерин (или деазафлавин). Восстановление ДНК фотолиазами возможно только в присутствии света.
Криптохромы обладают консервативным участком с двумя карманами для хромофорных группировок и дополнительным участком на С-конце. По-види- мому, именно С-концевой домен приводит к изменениям свойств фотолиазы и превращению в фоторецептор (рис. 7.31).
Рис. 7.31. Структура криптохрома:
/ — получение кванта синего света птериновым ядром; 2 — передача возбуждения на ядро флавина; 3 — ответ в форме редокс-реакции; 4 — функциональные домены белковой части криптохрома
Криптохром не может непосредственно восстанавливать ДНК, но первичные акты захвата света у него такие же, как у фотолиазы. Птерин (метенилтетрагидрофолат) функционирует как светособирающий хромофор. При попадании «синего кванта» света возбуждение передается в «реакционный центр» криптохрома — на молекулу ФАД. Наличие двух хромофоров объясняет тот факт, что физиологический спектр действия криптохрома совпадает как со спектром флавинов, так и со спектром птеринов. ФАД в составе криптохрома 1 находится в стабильной семихинонной форме (он частично восстановлен и легко отдает электроны). Семихинон ФАД поглощает не только в синей, но и в зеленой части спектра. Таким образом, физиологический ответ вызывает не только синий, но и интенсивный зеленый свет.
Получив квант света, электрон флавинового ядра возбуждается, т. е. переходит на более высокую орбиталь, и редокс-потенциал резко изменяется. Возбужденный флавин — сильный восстановитель. В настоящий момент существует три гипотезы работы криптохрома. 1. Происходит самовосстановление молекулы криптохрома с изменением ее конформации, что активизирует вторичные мессенджеры. 2. В систему передачи сигнала вовлечен промежуточный редокс-партнер. 3. Партнеру передается не электрон, а возбуждение квантом синего света, и этот квант приводит в действие еще одну хромофорную молекулу. Если эффективного взаимодействия не состоялось, возбужденное флавиновое ядро теряет энергию (флуоресцирует).
На свету криптохром 1 (CRY 1) связывается с фитохромом А, и криптохром фосфорилируется. Очевидно, без фосфорного остатка криптохром не активен. Фитохром А, получив из окружающей среды сигнал о том, что «свет в принципе есть», активизирует систему синего света. Криптохром in vitro взаимодействует с некоторыми фосфатазами, изменяя их активность. Возможно, каскад фосфорилирования/дефосфорилирования — один из механизмов передачи сигнала. Криптохром локализован в ядрах, что неудивительно: он очень похож на ДНК-фотолиазы, которые, по определению, имеют внутриядерную локализацию. Предполагают светозависимый транспорт криптохрома через ядерную мембрану. Вторичные мессенджеры криптохромной системы также располагаются в ядре и участвуют в регуляции экспрессии генов.
Криптохром 2 пока еще недостаточно изучен. Белковая часть молекулы на N-концевом участке похожа на криптохром 1 (соответствует доменам, связывающим хромофоры), отличаются только С-концевые участки. Белок CRY 2 связывает ФАД. При мутациях cry 2 повреждаются ответы на синий свет низкой интенсивности, а если нарушена работа криптохрома 1, то растения не реагируют на высокую интенсивность синего света. Как и в системе фитохромов, у криптохромов есть разделение по функциям: криптохром 1 дает «приблизительный» сигнал (есть много света в синей и соседней зеленой областях), а криптохром 2 сигнализирует более точно (низкая интенсивность синего).
Благодаря спектральным свойствам дополнительного пигмента — птерина, криптохромы поглощают кванты не только синей области, но и из ближнего ультрафиолета (UV-А), поэтому криптохромы рассматривают как возможные УФ-фоторецепторы. Одним из механизмов, защищающих организм от жесткого излучения, является биосинтез антоцианов и каротиноидов. Неудивительно, что их синтез контролируется криптохромами. От криптохромного сигнала зависит экспрессия генов халконсинтазы, халконизомеразы, дигидрофлавонолредук-
тазы и других ферментов биосинтеза антоцианов. Заметим, что для биосинтеза антоцианов необходимы как фитохромная, так и криптохромная системы.
Криптохромная система участвует в «настройке» внутренних часов в растении и получении фотопериодического стимула, однако она не является главной. Интересно, что у животных (мыши, дрозофилы) также обнаружены криптохромы. У животных криптохромы играют основную роль в фотопериодической регуляции сезонных форм поведения. Криптохромный сигнал замедляет рост гипокотиля (или междоузлий) на свету, помогает фитохрому контролировать процессы деэтиоляции. Обе фоторецепторные системы, действующие в ядерном компартменте, — криптохром и фитохром — в заметной мере дополняют друг друга. Пути передачи сигнала от этих систем, по-видимому, сходятся и взаимодействуют, что приводит к интеграции информации о физиологически важных областях спектра — синей и красной.
Фототропин — мембранный рецептор синего света
В 1995 г. был изучен первый мутант арабидопсис из серии non phototropic hypocotyl — nphl. У мутанта нарушен только фототропический ответ (как положительный, так и отрицательный), но не нарушены другие светозависимые реакции (деэтиоляция, циркадные ритмы и т.д.). Белок был назван фототропином 1 — PHOT I, или NPH 1 — по названию мутации.
Фототропин — ассоциированный с мембраной белок, хотя в его аминокислотной последовательности нет протяженных гидрофобных участков. Очевидно, он входит в мембранные белковые комплексы. В последовательности фототропина 1 можно выделить два LOV-домена (light—oxygen—voltage) (рис. 7.32). Они встречаются в рецепторных белках, ответственных за фототропизм, хе-
Рис. 7.32. Структура фототропина:
1 — фотоактивация синим светом одного из двух флавиновых ядер; 2 — передача возбуждения в форме изменения конформации на киназный домен; 3 — фосфорилирование вторичных мессенджеров; 4 — функциональные домены белковой части фототропина
мотропизм (по градиенту кислорода или редокс-потенциала) и потенциалзависимые мембранные процессы. In vitro фототропин 1 связывает ФМН, причем каждый LOV-домен связывает только одно флавиновое ядро. Очевидно, в клетке также происходит связывание ФМН. По-видимому, фототропин 1 является протеинкиназой, т. е. участвует в каскаде фосфорилирования. После кратковременного освещения белок PHOT 1 на освещенной стороне фосфорилируется больше, чем на теневой. Это ведет к быстрому первичному изгибу.
У Arabidopsis найден и другой белок — фототропин 2 (PHOT 2). Он немного короче, чем PHOT 1, но при нарушении его работы фототропизм также пропадает. Предполагают, что в мембране оба фототропина образуют гетеродимер, и нарушение работы как PHOT 1, так и PHOT 2 вызывает распад активного комплекса и нарушение фототропизма.
Мутанты по криптохромной системе icryl и/или сгу2) обладают первичными реакциями фототропизма, однако у них снижена амплитуда фототропическо- го ответа. Того же эффекта можно добиться нарушением гена фитохрома А. Это означает, что фито- и криптохромная системы нужны на поздних стадиях фото- тропического ответа, но направление изгиба определяют фототропины 1 и 2.
Суперхром — «кентавр с головой фитохромаи туловищем фототропина»
У папоротника Adiantum capillus-veneris был найден ген, гомологичный как фитохромам, так и фототропинам. Выделенный in vitro белковый продукт этого гена связывает фитохромобилин и показывает К/ДК-обратимость. Наличие LOV-доменов заставляет предположить, что он связывается также и с ФМН. «Двойной» фоторецептор был назван суперхромом. Как и фототропин, суперхром обладает протеинкиназной активностью.
Таким образом, если у одних растений фототропин взаимодействует с фитохромами опосредованно, то у Adiantum проблема взаимодействия красного и синего световых сигналов решена на уровне «гибридного» фоторецептора.
РЕГУЛЯЦИЯ РОСТА И РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ
ЭНДОГЕННЫЕ ФАКТОРЫ РАЗВИТИЯ
Образование листьев
Апикальная меристема побега растет неравномерно. Один из периодических процессов, который можно наблюдать, — это закладка листовых примордиев. Промежуток времени от закладки одного примордия до закладки следующего называют пластохроном. Каждый пластохрон обозначен определенными событиями. Например, синтез ауксинов в апексе побега осциллирует во времени, что вызывает волны транспорта ауксинов. При анализе содержания ауксинов вдоль побегов сосны участки с повышенным и пониженным содержанием ауксина чередуются. Место закладки примордия листа определяется вектором транспорта ауксина, причем у зон будущих примордиев наблюдается явление до-
минирования: на соседних участках закладка примордиев не происходит, листья максимально удалены друг от друга.
Нарушение транспорта ауксинов химическими агентами (НФК, ТИБК) или генетическими методами (мутация pin 1 — см. подразд. 7.2.2.3) приводит к нарушениям как в расположении листьев, так и в закладке проводящей системы. В одном узле может закладываться несколько слившихся листьев, обеспеченных несколькими главными жилками, или образуется единый кольцевой примордий. В этом случае осцилляции в биосинтезе ауксинов происходят, а положение примордиев определяется простой диффузией.
После поступления ауксинов в зоне будущего примордия изменяется экспрессия генов. Главную роль в «разбиении» пространства на примордии и междоузлия играют гены, содержащие гомеобокс (транскрипционные регуляторы, часто используемые при эмбриогенезе животных). Первым геном из этой серии был ген KNOTTED 1 {KN 7) кукурузы, наиболее активный в меристеме, в будущих примордиях он «выключается». Полосы экспрессии гена KN 7 обнаруживаются до того, как начались первые периклинальные деления, обозначающие примордий. Аналогичные гены были выделены из арабидопсис {STM — shootmeristemless) и других растений. Гены с гомеобоксом позволяют контролировать различия между развивающимся листом и боковой осью. У томатов нарушения в работе гомеобокссодержащих генов приводят к тому, что листья теряют дорсовентральное строение и приобретают черты боковой оси. Активность промотора гена KN 7 зарегистрирована только во внутренних слоях (клетках L2), а белковый продукт и мРНК обнаруживаются в слое L1. Клетки обмениваются по плазмодесмам крупными информационными молекулами (белками, мРНК). Транспорт этих молекул — еще одна возможность регуляции роста и развития. Некоторые гены, наоборот, экспрессируются в будущих примордиях листьев, но не в меристеме. Так, ген NFL 7 табака появляется в примордиях листьев до начала морфологической дифференцировки.
Более позднее событие, приводящее к морфологическим эффектам, — биосинтез белков экспансинов (от англ, expansion — расширение). Экспансины выделяются в апопласт и размягчают клеточную стенку, нарушая водородные связи в гликанах (при созревании плодов, листопаде, прорастании пыльцы и т.д.). Размягчение клеточной стенки изменяет механические свойства апекса, давление слоя L1 ослабевает, и в слое L2 начинаются периклинальные деления, т.е. изменяется направление веретена деления, образуется новый «вектор роста». Агаровый блок с экспансином можно поместить рядом с заложенным при- мордием, что вызовет аномально близкое расположение нового листа.
При изменении положения веретена деления меняется и общая поляризация клеток, элементы цитоскелета располагаются вдоль новых осей. Это приводит к таким изменениям направления целлюлозных фибрилл, что растяжение и рост примордия оказываются возможными только в одном направлении. Направление фибрилл целлюлозы определяет форму будущего листа.
Далее лист становится дорсовентральным. Этот процесс контролируют гены FANTASTICA (львиный зев {Antirrhinum majus)) и FILAMENTOUS FLOWER (арабидопсис). На начальных стадиях эти гены экспрессируются во всем объеме примордия. Вероятно, апикальная меристема посылает «дорсовентральный» сигнал (природа его еще не выяснена), и в верхней части примордия экспрессия генов FANTASTICA и FILAMENTOUS FLOWER ослабевает. Зона их эксп-
рессии определяет будущую нижнюю (абаксиальную) поверхность листа. При мутациях fantastica и filamentous flower лист становится цилиндрическим и вся поверхность приобретает свойства адаксиальной.
Переход к цветению
Апикальная меристема побега участвует в более сложных ритмах, связанных с образованием листовых серий, или цветением. Ярче всего ритмические процессы выражены у растений тропического климата. Так, гевея бразильская {Hevea brasiliensis) за один ритм роста образует листовую серию, состоящую из почечных чешуй и зеленых листьев. Далее следуют период покоя и закладка новой почки. За 1 год меристема гевеи образует до 7 листовых серий, причем покой и активный рост не связаны с внешними условиями! Итак, у растений есть эндогенные ритмы развития. В примере с гевеей чередуются ритмы вегетативного роста.
Не менее примечательно явление «подсчета» листьев. Так, гиппеаструм {Hippeastrum X hybridum) закладывает соцветие ровно через 4 вегетативных листа (закладка листьев у гиппеаструма не зависит от внешних обстоятельств: примерно 1 лист в месяц). Подснежник-галантус {Galanthus nivalis') «отсчитывает» ровно 3 листа, хотя многие другие растения довольствуются лишь приблизительной их оценкой. Растению «важно знать», сколько листьев имеется, чтобы «приступить к цветению».
Были предложены две модели «расчета»: 1) меристема не способна образовать другое количество листьев (детерминирована); 2) меристема получает сигнал от листьев и по нему «оценивает» их число. До образования верхушечной метелки меристему кукурузы отделяли и укореняли. Оказалось, что меристема «восстанавливает» необходимое число листьев и только после этого формирует цветки. Если меристему лишь надрезать, но оставить связь с листьями, то происходит укоренение, однако листья «сверх нормы» не образуются. Таким образом, меристема у кукурузы компетентна к образованию большего числа листьев, а в «подсчете» опирается на сигналы от листьев.
Мутант id 1 {indeterminate) кукурузы обладает длительным вегетативным ростом, образует аномальные соцветия с вегетативными чертами. Очевидно, мутация затрагивает ген системы «подсчета» листьев. Продукт гена ID 1 сосредоточен в кончиках листовых примордиев. Предполагают, что сам продукт не является сигнальным, но важен для «отправки» сигнала в меристему.
Другой механизм «подсчета» у Arabidopsis: переход к цветению зависит от экспрессии гена LEAFY {LFY). При мутации соцветие несет многочисленные листья, а цветки обладают вегетативными чертами. (У мутанта львиного зева по гомологичному гену FLO цветков нет вообще.) В норме экспрессия гена LFY начинается у молодых растений и постепенно усиливается. При определенном уровне экспрессии меристема закладывает соцветие. Белковый продукт LFY — транскрипционный фактор, содержащий MADS-бокс, его гомологи найдены у многих растений.
При повреждении системы оценки числа листьев все же наблюдается переход к цветению. Это означает, что сигнал к цветению — не единственный, он дублирован другими генами. Для Arabidopsis это ген АР 1 {АРЕТALA 1), «запускающий» программу образования цветков. АР 1 — транскрипционный фактор того же типа, что и LFY.
Итак, меристема получает сигнал, что «накопилось» достаточное количество листьев, и после этого начинается переход к цветению. Покоящийся центр, характерный для вегетативных меристем, исчезает, все клетки вступают в клеточный цикл. Меристематические клетки вакуолизуются, происходят биохимические перестройки, которые М.Х.Чайлахян называл «эвокацией цветения» (т.е. скрытой, самой ранней стадией развития цветков). Изменяется и расположение примордиев на меристеме. У гиппеаструма и галантуса происходит поворот листовой серии на 90°, у лилии — переход от филлотаксиса 3/8 к филлотаксису 2/5, а у львиного зева — смена супротивного листорасположения на очередное. У растений с терминальным цветком должна произойти перестройка листорасположения вегетативной оси на мутовчатое (круговое), характерное для цветка.
При эвокации цветения меристема на время «замирает»; образуется зона, отделяющая соцветие от вегетативной части; снимается апикальное доминирование.
Образование цветка
На ранних этапах в меристеме цветка происходит экспрессия специфических генов. Повреждение этих генов в результате мутации приводит к замене одних органов цветка на другие и (часто) к нарушению в расположении органов. При закладке цветка можно выделить два взаимовлияющих процесса: 1) пространственную разметку флорального примордия на отдельные органы цветка; 2) определение судьбы заложенных органов (developmental fate). Хотя эти процессы находятся в тесной корреляции, иногда возникает несогласованность, и тогда из примордия развиваются органы мозаичного строения (с тканями, характерными для органов двух соседних кругов).
Наиболее подробно исследованы гены, определяющие судьбу органов в развитии. Условно эти гены делят на три группы: А, В и С. Поэтому существующую модель развития цветка называют ABC-моделью (рис. 7.33). У Arabidopsis к генам с функцией А относится АРЕТ ALA 2 (АР 2), продукт которого является транскрипционным фактором. В зоне экспрессии этого гена развиваются чашелистики и лепестки (при мутации лепестки исчезают: apetala — безлепестковый). Функцией В «заведуют» гены APETALA 3 (АР 3} и PISTILLATA (РГ)- Их продукты образуют гетеродимер, связывающийся с промоторами других генов. У АР 3 и PL обнаружен MADS-бокс. Эти гены экспрессируются в зоне закладки лепестков и тычинок. При мутациях ар 3 или pi лепестки превращаются в чашелистики, а тычинки приобретают черты пестиков. Функция С контролируется геном AGAMOUS (ЛС) — транскрипционным фактором с MADS-боксом. Ген A G определяет судьбу тычинок и плодолистиков, а также отвечает за остановку роста во флоральном примордии. При мутации ag тычинки заменяются на лепестки, плодолистики — на чашелистики и далее процесс образования цветка повторяется несколько раз.
По ABC-модели исходным состоянием является вегетативный лист, а гены из групп А, В и С только модифицируют его развитие. Это подтверждается тем, что у тройных мутантов, где затронуты все три группы генов, вместо цветка образуется укороченный побег со спиральным листорасположением. Для образования чашелистиков достаточно генов группы А. Двойной мутант agpi образует «бесконечный» цветок из одних чашелистиков. У растений повреждаются
Рис. 7.33. ABC-модель развития цветка у Arabidopsis thaliana (крестоцветные):
— цветок дикого типа с полным набором органов (чашелистики, лепестки, тычинки, плодолистики); 2 — мутант с нарушением функции В (pistillata): вместо лепестков — чашелистики, вместо тычинок — плодолистики; 3 — мутант с нарушением функции С (agamous): вместо тычинок — лепестки, вместо плодолистиков — чашелистики. Рост оси цветка не детерминирован; 4 — мутант с нарушением функции A (apetala 2): вместо чашелистиков — плодолистики, вместо лепестков — органы, похожие на тычинки; 5 — двойной мутант с нарушением функций В и С (.agamous pistillata)'. все органы цветка являются чашелистиками, рост оси цветка не детерминирован; А — гены, контролирующие развитие чашелистиков или (в сочетании с В) лепестков. Пример: ген APETALA 2; В — гены, контролирующие развитие лепестков (в сочетании с А) или тычинок (в сочетании с С). Пример: гены PISTILLATA и APETALA 3; С — гены, контролирующие развитие плодолистиков или (в сочетании с В) тычинок. Пример: ген AGAMOUS; Чшл — чашелистик; Лп — лепесток; Тч — тычинка; Пл — плодолистик. Стрелкой вверх показан недетерминированный рост
функции В и С, активными остаются только гены группы А. Чтобы в цветке осуществилась закладка плодолистиков, нужна активность генов только С-класса. У соответствующих мутантов ар 2pi, где повреждены функции А и В, цветок состоит из одних плодолистиков. Гены А и С являются антагонистами (взаимно ингибируют экспрессию друг друга). При повреждении генов группы А во всем примордии цветка образуются продукты генов С и наоборот. Генов группы В недостаточно для строгого определения типа органов, они работают в комбинации с другими классами. Во флоральном примордии в зоне, где перекрывается экспрессия А и В, образуются лепестки. Там, где одновременно экспрессируются гены В и С, образуются тычинки.
Модель АВС получила подтверждение на большом экспериментальном материале. Гены, гомологичные АР2, АРЗ, Р1и AG, обнаруживают у все большего числа растений. Анализ экспрессии показывает то же пространственное распределение продуктов этих генов в примордии цветка, что и у арабидопсис. Более того, перенос генов из арабидопсис в табак или петунию {Petunia hybrida) методами генетической инженерии вызывает изменения в строении цветка, предсказанные ABC-моделью. Таким образом, генетическая регуляция закладки органов цветка консервативна у цветковых растений.
Меньше известно о разметке флорального примордия на отдельные органы. С одной стороны, гены ABC-модели заметно влияют на количество и положение органов в цветке. Мутации с сильным выражением по этим генам изменяют структуру цветка. Специфических генов, изменяющих только структуру цветка, обнаружено сравнительно немного: у арабидопсиса это ген PENTA- MEROUS ANTHER {PAN). У мутанта pan цветок пентамерный: 5 чашелистиков, 5 лепестков, 10 тычинок (в норме цветок с типичной для крестоцветных симметрией: 4 чашелистика, 4 лепестка, 6 тычинок и 2 плодолистика).
За образование зигоморфного цветка у львиного зева отвечает ген CYCLOIDEAradialis (СУС). Ген влияет на верхнюю (ближнюю к главной оси) тычинку, превращая ее в стаминодий, модифицирует развитие лепестков. При мутации по генам A-класса лепестки превращаются в тычинки. Они оказываются под действием гена CYC, и вместо одного стаминодия возникает три. При мутации сус цветок радиально-симметричен, все тычинки одинаково хорошо развиты.
Еще одним фактором разметки является объем флоральной меристемы. Если он увеличивается, то в цветке закладываются дополнительные органы. У мутантов арабидопсиса из серии clavata (см. подразд. 7.2.8.5) меристема более крупная, что приводит к закладке плода с 4 гнездами вместо типичного двухгнездного стручка. Аналогичное явление приводит к закладке дополнительных кругов плодолистиков у апельсинов {Citrus sinensis). Мутации, уменьшающие объем меристемы, приводят к потере органов (обычно тычинок и лепестков).
Развитие растения можно представить как последовательный каскад внутренних регуляторных стимулов. Некоторые регуляторные события происходят на протяжении всего морфогенеза: неоднородный синтез и транспорт ауксинов, «включение» и «выключение» генов, содержащих гомеобокс, выделение экспансинов, периклинальные деления в L2, определение «верхней» и «нижней» поверхности примордия.
Другие события в регуляторном каскаде приводят к образованию цветков. Меристема побега, образующая примордии, «оценивает» число образовавшихся листьев по концентрации фотоассимилятов, гиббереллинов, других низкомолекулярных веществ и по экспрессии генов {LEY). По достижении порогового значения наступает эвокация цветения. В меристеме исчезает покоящийся центр, меняется листорасположение, появляются продукты новых генов. Для образования цветка необходимы гены с функциями А, В и С и гены, определи-
ющие расположение органов внутри цветка (отвечающие за позиционную информацию).
Повреждение регуляции ранних этапов отражается на структуре цветка: при нарушении транспорта ауксинов боковые цветки не развиваются, а верхушечный состоит из слившихся органов; повреждение «системы определения дор- совентральной симметрии» (мутация filamentous flower) приводит к превращению всех органов цветка в цилиндрические структуры; с помощью агарового блока с экспансином можно создать «лишний» лепесток или тычинку и т.д. Нарушение поздних этапов в этом каскаде затронет только цветок.
ВЛИЯНИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ НА РОСТ И РАЗВИТИЕ
Пищевые ресурсы экотопа. Регуляция цветения элементамиминерального питания
Прежде чем приступить к цветению, растение «оценивает» доступность минеральных веществ, в первую очередь азота. Когда азота много, все силы растения расходуются на вегетативный рост и накопление азотных соединений, а цветение наступает позже, чем при умеренном питании. Это явление было замечено достаточно давно. В конце XIX в. возникло предположение, что для вегетации необходимо высокое содержание азота в растениях, а для цветения — много сахаров (продуктов фотосинтеза). Экспериментальную проверку этой гипотезы в 1904 г. провел немецкий физиолог растений Г. Клебс. Часть растений лобелии {Lobelia), будры {Glechoma) и молодила {Sempervivum) обильно удобряли нитратами и поливали, другие высаживали в почву, бедную азотом. Чтобы повлиять на процесс фотосинтеза, листья затеняли или освещали ярким светом. Оказалось, что цветение ускоряется на ярком свету. Это коррелирует с высоким содержанием сахаров в растениях и низким содержанием азота. При затенении или удобрении нитратами накапливается больше азота и меньше углеводов, что коррелирует с быстрым вегетативным ростом и задержкой цветения.
Г. Клебс выдвинул азотно-углеродиую (трофическую) теорию регуляции цветения. Если в растении много соединений азота и мало соединений углерода, оно будет расти, а если углеводы преобладают над азотом, то растение цветет. По концентрации азота растение «оценивает работу» корневой системы, а по сахарам — «работу» листового аппарата. Если листовой аппарат «работает хорошо», то возможно плодоношение, а если работа корня слишком интенсивна, то нужно восстановить баланс между активностью корневой системы и площадью листового аппарата. Растение образует много листьев (вегетирует), а когда баланс восстановится, образует цветки и плоды.
Теория Клебса нашла отклик в сельском хозяйстве. Были разработаны методы интенсивного плодоводства, основанные на обрезке. Для ускорения цветения на молодые ветви деревьев накладывали плодовый пояс: ветку перетягивали проволокой так, чтобы сосуды флоэмы оказались сжатыми, или часть флоэмы удаляли. Это замедляло отток сахаров из кроны и ускоряло закладку цветков. Теория Клебса стимулировала изучение потребностей растений в элементах минерального питания, был накоплен материал по частной физиологии
растений. Выяснилось, что избыток азота препятствует переходу в состояние покоя, запас крахмала снижается, покой менее глубокий, растение менее устойчиво к инфекции и к климатическим факторам.
Фотопериодизм и климатические факторы
В каждой точке планеты существуют сезонные колебания влажности и температуры, определяющие климат той или иной местности. Виды растений должны быть адаптированы к климату.
Многообразие климатов достаточно высоко. На территории России один из самых важных климатических факторов — зимнее снижение температур. В Средней и Центральной Азии к этому добавляется летняя засуха. Растения «вынуждены рассчитывать» время развития так, чтобы цветение, образование плодов и семян приходилось на благоприятный сезон. Наступление неблагоприятных факторов обычно коррелирует с изменением длины дня. Самые заметные колебания длительности светлого времени суток наблюдаются в высоких широтах: за полярным кругом бывают полярный день (24 ч света/сут) и полярная ночь (0 ч света/сут). Чем ближе к тропическим областям, тем'незначительнее изменение длины суток. И, наконец, на экваторе день всегда равен ночи (12 ч света/сут), т. е. на экваторе растения не могут оценить изменение длины дня. В тропических районах длина дня меняется незначительно, и отсюда происходят растения, наиболее чувствительные к изменениям длины дня. Этим растениям приходится «оценивать» время с точностью до 1 — 3 %! Растения умеренных широт оценивают длину дня менее точно, но она играет более заметную регуляторную роль в развитии.
Закономерное изменение длины дня в течение'года называют фотопериодизмом. Физиологический ответ на этот внешний стимул — это фотопериодическая реакция растений. Так, в умеренных широтах уменьшение длины дня говорит о надвигающемся похолодании. Растения готовятся к состоянию покоя: происходит листопад, питательные вещества перемещаются из надземной части в подземную, рост останавливается. В Средиземноморье сокращение длины дня говорит о наступлении зимы — самого влажного сезона года с приемлемыми для роста температурами. Растения дают противоположный физиологический ответ: усиливают рост. Кроме того, существуют климатические зоны, где влажный период приходится на осень или весну. Растениям приходится «оценивать» не общую тенденцию, а точно «измерять» длину дня. Если день соответствует «внутреннему эталону», то сезон благоприятный, а если дни длиннее или короче «эталона», условия неблагоприятны и растение готовится к покою. Бывает и «симметричная» ситуация, когда климат в целом благоприятен, но весной или осенью наблюдается засуха. Тогда измеренная «эталонная» длина дня говорит об условиях, неблагоприятных для роста.
По отношению к длине дня выделяют несколько групп растений.
Нейтральные растения (HP) — длина дня не оказывает заметного влияния, растения цветут по достижении определенного возраста или размера. Обычно нейтральные растения происходят из экваториальных областей.
Длиннодневные растения (ДДР) — зацветают только в том случае, если длина дня больше некоторой критической величины. ДДР происходят из умеренных областей с равномерным увлажнением по сезонам.
Короткодневные растения (КДР) — зацветают только при длине дня, меньшей некоторой критической величины. Они происходят из субтропических и тропических областей с зимним максимумом увлажнения.
Длиннокороткодневные растения (ДКДР) — для цветения необходима определенная последовательность: сначала длинные дни, а затем короткие. Эти растения «настроены» на благоприятный осенний период.
Короткодлиннодневные растения (КДДР) — для цветения необходима смена коротких дней на длинные (но не наоборот). Благоприятный период у этой группы «ассоциируется» с весенним сезоном.
Среднедневные растения (СДР) — для цветения необходим определенный интервал длины дня: ни при увеличенной, ни при уменьшенной длине дня эти растения не цветут. Это — сравнительно редкий тип регуляции цветения.
Амфифотопериодичные растения (АФПР) — для цветения неблагоприятен узкий интервал, а при большей или меньшей длине дня цветение наступает. Этот тип физиологических ответов также достаточно редок.
Под контролем фотопериодизма находятся многие процессы. Так, от длины дня зависит перестройка работы меристемы: образование цветков, летний покой и формирование почек у деревьев. Земляника {Fragaria vesca) образует расселительные побеги (усы) при наступлении длинных дней. Сбрасывание листьев у репчатого лука и тюльпанов происходит на длинном дне, а у березы и осины — на коротком. Образование запасающих органов (кочанов у капусты {Brassica oleracea), клубней у диких видов картофеля {Solanum) и топинамбура {Melianthus tuberosus)) также зависит от длины дня. Растения пустынь могут изменять листья С3 типа на С4 и наоборот, а водные растения сменяют подводные листья на надводные, получая из внешней среды фотопериодический сигнал.
Фотопериодические ответы бывают не только у растений. У птиц и крупных млекопитающих с фотопериодизмом связана сезонная миграция. Не менее важна сезонная половая активность. Фотопериод влияет на пищевое поведение: под влиянием коротких дней животные умеренных широт начинают искать более калорийную пищу. Человек также подвержен фотопериодическому воздействию, которое часто не осознается, а действует на уровне инстинктов. Фотопериодом регулируются сезонные эмоциональные состояния, изменения пищевых предпочтений и связанные с ними летне-зимние колебания веса.
ФОТОПЕРИОДИЗМ
История открытия фотопериодизма
В двадцатые годы XX в. американские исследователи У. У. Гарнер и Г. А. Аллард изучали влияние длины светового дня на табак. Объектом их исследований был табак сорта «Maryland Mammoth». Этот сорт отличался более крупными размерами и поздним цветением, поэтому для сбора семян приходилось доращивать растения в теплице. Гарнер и Аллард выяснили, что этот сорт цветет только при коротком дне, экспериментальное укорочение длины дня также вызывало цветение, т.е. табак «Maryland Mammoth» — типичное растение короткого дня (большинство сортов табака — нейтральные растения). Гарнер и
Рис. 7.34. Эффект прерывания ночи:
А — контроль: длиннодневное растение в условиях 8-часового дня/16-часовой ночи вегетирует; Б — опыт: 16-часовая ночь прервана 5 минутами освещения; длиннодневное растение цветет; В — контроль: короткодневное растение в условиях 8-часового дня/16-часовой ночи цветет; Г— опыт: 16-часовая ночь прервана 5 минутами освещения; короткодневное растение вегетирует. На нижней полосе темное время суток показано штриховкой, периоды освещения — белым
Аллард пробовали прерывать светлое время суток периодом темноты, а ночное время — вспышками света. Прерывание дня не дало результата, прерывание ночи задерживало цветение, и чем ближе к середине ночи проводили освеще-
ние, тем эффективнее была обработка. Для предотвращения цветения достаточно нескольких минут ночного освещения (рис. 7.34).
Изученный феномен получил название эффекта прерывания ночи. Был сделан вывод, что для оценки длительности дня важно не светлое (дневное) время, а продолжительность ночи. Условно каждое короткодневное растение можно было назвать «растением длинной ночи», а каждое длиннодневное — «растением короткой ночи». (Впрочем, такой вывод оказался преждевременным.)
Опыты М.Х.Чайлахяна
В 1935 г. в Институте физиологии растений АН СССР начались исследования М.Х.Чайлахяна. Для большинства экспериментов он использовал простейшее оборудование: темную плотную ткань и скальпель. Для решения вопроса об органе, воспринимающем длину дня, были взяты хризантемы (КДР). В летнее время, чтобы вызвать цветение, достаточно было в течение 10—15 дней в строго определенное время накрывать и открывать растения черной тканью. Если ткань снимали на 10 ч и менее, хризантемы цвели (положительный контроль). Если растения оставались на естественном 16-часовом дне, то они вегетировали (отрицательный контроль).
На свету оказывались листья и апикальные меристемы побегов, поэтому нужно было выяснить, какой из этих двух органов воспринимает световой сигнал. Чайлахян оставил на каждом растении по одному крупному листу и по одной точке роста. Чтобы избежать влияния листьев, образуемых меристемой, каждые 2 дня молодые листья удаляли (рис. 7.35). Накрывая черным футляром
АБвАБвгг
АБв
АБв
г
г
Рис. 7.35. Опыт М.Х.Чайлахяна с короткодневным растением Chrysanthemum indicum(Сложноцветные), показывающий роль листьев в восприятии длины дня:
А — хризантема в условиях 16-часового дня вегетирует (отрицательный контроль); Б — хризан-тема при 8-часовом дне цветет (положительный контроль); В — меристема получает 8 часовсвета, лист — 16 часов света ежедневно: хризантема вегетирует; Г — меристема получает 16часов света, лист — 8 часов света ежедневно: хризантема цветет
меристему, Чайлахян добивался того, чтобы листья оказывались на длинном дне (16 ч), а меристема получала короткий день. В другом варианте футляром закрывали лист: меристема оставалась на длинном дне, а лист освещался 8 ч. В результате меристемы образовали соцветия только там, где для листьев создавался короткий день. Ученый сделал вывод, что длина дня воспринимается листьями, далее преобразуется в сигнал и передается в меристему побега, где вызывает переход к состоянию цветения. Опыты с другими группами растений (ДДР, ДКДР, КДДР) подтвердили этот вывод.
Один из самых изящных экспериментов был проведен с периллой {Perilla nankensis) (очень живучее КДР из сем. губоцветные {Labiatae)). М.Х. Чайлахян вырастил периллу на длинном дне (неиндуктивные условия), затем отрезал листья и поместил их во влажной камере на короткий день (индуктивные условия), а затем привил эти листья на нецветущис растения. Несмотря на низкий процент приживаемости листьев, в удачных вариантах листья стимулировали цветение периллы! Это означало, что даже отрезанные от растения листья могут воспринимать длину дня, вырабатывать и накапливать сигнальные вещества, вызывающие цветение. Оставляя почки в нижней части растения, а листья в верхней, М.Х.Чайлахян выяснил, что сигнал может распространяться сверху вниз, т.е. нельзя говорить о полярном распространении флорального стимула. Более того, периллу удалось аккуратно разрезать почти до кончика корня. Листья одной половины растения, получавшие день нужной длины, передавали сигнал цветения к почкам в другой половине. Этим опытом было доказано, что сигнал передается не только по стеблям, но и через корневую систему. Была измерена скорость распространения сигнала, и выяснилось, что она зависела от температуры: при 5 °C скорость сигнала падала.
Опыты с надламыванием ксилемных пучков и удалением наружного слоя флоэмы со стебля показали, что сигнал от листьев к меристеме передастся по флоэме, т.е. по живым клеткам.
Чтобы растение восприняло длину дня как стимул к цветению, оно должно достигнуть определенного возраста. М. X. Чайлахян называл этот возраст цветочно-спелым состоянием, т.е. внутренние факторы развития должны привести растение к определенному состоянию. После получения сигнала меристема не сразу образует видимые органы цветка. Этому предшествует период «скрытой подготовки» к цветению {эвокация по Чайлахяну).
Гормональная теория цветения Чайлахяна
Гипотетический стимул, вызывающий цветение, М.Х.Чайлахян назвал флоригеном {/lore — цветки, genesis — рождение). По теории М.Х.Чайлахяна, у нейтральных растений флориген образуется постоянно и не зависит от длины дня, у ДДР флориген образуется на длинном, у КДР — на коротком дне.
В конце 1950-х гг. А.Ланг (бывший аспирант М. X.Чайлахяна, который уехал в США) прислал в Москву только что открытые гормоны — гиббереллины. Чайлахян исследовал влияние гиббереллинов на цветение. Оказалось, что у рудбекии, укропа (Anethum graveolens), салата-латука {Lactuca saliva) и других ДДР гиббереллин ускоряет образование цветков даже на коротком дне. К гиббереллину оказались отзывчивыми и КДДР (каланхоэ и др.). Таким образом, гиббереллин мог заменить длинный день для ДДР. Измерение уровня гиббе-
реллинов в листьях показало, что на длинном дне содержание гиббереллина выше, чем на коротком. М.Х.Чайлахян сделал вывод, что для цветения необходим гиббереллин. Однако обработка гиббереллинами КДР в условиях длинного дня не вызывала цветения: растения сильно вытягивались, но продолжали вегетировать.
На основании полученных результатов М.Х.Чайлахян разработал гормональную теорию цветения растения. Флориген (стимул, вызывающий образование цветков) он «разбил» на два компонента: гиббереллины и гипотетические антезины. Для цветения необходимо одновременное присутствие обоих компонентов (рис. 7.36). У HP и гиббереллин, и антезин синтезируются конститутивно. У ДДР антезин все время присутствует в растении, а уровень гиббереллина повышается на длинном дне и происходит цветение. У КДР, наоборот, гиббереллина всегда достаточно для цветения, а антезин синтезируется только на коротком дне. Более сложное объяснение было предложено для переходных групп растений: у них гиббереллин синтезируется на длинном дне, а антезин — на коротком. Различия между группами состоят в способности длительно депонировать гиббереллины и антезины. ДКДР образуют гиббереллины на длинном дне и могут их долго хранить. Антезины у них синтезируются на коротком дне, и быстро разрушаются. КДДР, в отличие от ДКДР, запасают антезины, но быстро разрушают гиббереллины.
Предложенная М.Х.Чайлахяном гормональная теория цветения не охватывает амфифотопериодичные и среднедневные растения (см. подразд. 7.4.2.2). Усилия ученых по выделению антезинов до сих пор не увенчались успехом. В последние годы, тем не менее, интерес к гормональной теории цветения Чайла- хяна возрос в связи с открытием процессов транспорта высокомолекулярных веществ в растениях (мРНК, белков, включая транскрипционные факторы, факторы сайленсинга и т.д.). Возможно, попытки найти антезин не привели к успеху потому, что поиск был направлен на низкомолекулярное вещество.
Отметим, что гиббереллины не играют универсальной роли стимуляторов цветения, какая отводится им в гормональной теории Чайлахяна. Так, при цветении ДДР сурепки (Raphanus) решающим является накопление ауксинов на длинном дне. Многие озимые и двулетние ДДР (пшеница, колокольчик средний) нельзя заставить цвести с помощью гиббереллинов. Отсюда следует, что вопрос о числе компонентов флорального стимула и о том, насколько эти компоненты похожи у разных растений, остается открытым.
«Эффект прерывания ночи» позволил Г. А. Бортвику, С. Б. Хендриксу и М. У. Паркеру (см. подразд. 7.3.2.1) получить физиологический спектр действия света. Для этого была построена установка, в которой яркий белый свет разлагался с помощью призмы, а спектр был спроецирован на полосу 14 м длиной! Вдоль линии спектра были выставлены вазоны с короткодневным табаком. Длинную ночь прерывали световой вспышкой через призму. Оказалось, что зависимость процента растений, у которых цветение стимулируется соответственно длине волны X, совпадает с физиологическим спектром прорастания семян салата-латука. Последовательное освещение красным и дальним красным светом показало типичную К/ДК-обратимость (см. подразд. 7.3.2.1). При прерывании ночи важна последняя вспышка: если она была «красной», ночь «прерывается», если «дальней красной», то эффект отсутствует. Из этих данных следует, что эффект прерывания ночи обусловлен фитохромом.
A — constA — constАнтезинГиббереллинАнтезинГиббереллинФлоригенФлориген
A — const
A — const
Антезин
Гиббереллин
Антезин
Гиббереллин
Флориген
Флориген
var — синтез зависит от фотопериода const — синтез конститутивный
Рис. 7.36. Гормональная теория цветения М.Х.Чайлахяна.
По Чайлахяну, цветение наступает, когда в растении присутствует гормональный комплекс цветения флориген, состоящий из гиббереллина (G — показано штриховкой) и гипотетического антезина (А — показано серым цветом). А — нейтральное растение: конститутивный синтез гиббереллинов и антезинов, цветение при произвольной длине дня; Б — длиннодневное растение; конститутивный синтез антезина, гиббереллин синтезируется на длинном дне; флориген возникает на коротком дне; В — короткодневное растение: конститутивный синтез гиббереллина, антезин синтезируется на коротком дне; флориген возникает на коротком дне; Г — длиннокороткодневное растение: антезин синтезируется на коротком дне, но быстро разрушается; гиббереллин синтезируется на длинном дне и депонируется; цветение при смене длинных дней на короткие; Д — короткодлиннодневное растение: антезин синтезируется на коротком дне и депонируется; гиббереллин синтезируется на длинном дне и разрушается; цветение при смене коротких дней на длинные
Вывод о том, что длительность светлого времени суток не имеет значения для цветения, оказался преждевременным. Если поместить КДР в условия длинного дня и длинной ночи (при этом суммарная длина суток заметно больше 24 ч), растения не цветут. Это означает, что длинной ночи недостаточно для цветения.
В опытах с фарбитис (см. подразд. 7.3.2.6) показано, что у растений существуют внутренние часы — осциллятор с 24-часовой периодичностью — позволяющие «различать» две фазы: фотофильную и скотофильную. Длина дня оценивается при сравнении фазы осциллятора и сигналов от фоторецепторов. При прерывании ночи сигнал фитохрома попадает на скотофильную фазу осциллятора, растению «кажется», что оно находится в условиях длинного дня. При увеличении суток (более 24 ч) внутренний и внешний ритм не совпадают, растения не цветут.
ТЕРМОПЕРИОДИЗМ. СТРЕСС-ПЕРИОДИЗМ
Сезонная специализация растений
В мягком субтропическом климате зима не бывает холодной, и осень плавно переходит в весну. Растения вегетируют с осенних дождей до летней засухи. Из-за генетической неоднородности среди одного вида попадаются растения, начинающие вегетацию позже или раньше.
По мере продвижения растений в более высокие широты в середине влажного периода появляется сезон низких температур. Начинается специализация: одни растения прорастают весной (после холодов) и цветут в том же теплом сезоне (т.е. сроки вегетации сокращаются), другие растения прорастают осенью и приспосабливаются к вынужденному покою в течение зимы. У них сроки вегетации более растянуты, влажное время года используется более полно. Но за это приходится «платить» новой адаптацией: пока не окончились холода, цветение не наступает.
В мягком умеренном климате специализация не заходит глубоко, расы растений, взятые из этих мест, физиологически пластичны. В начале XX в. их называли «двуручками». Они могут цвести и в теплые, и в холодные зимы. В более суровом умеренном климате механизмы адаптации более устойчивы. Выделяют
две расы: озимую (вегетация начинается осенью, а для цветения нужно охлаждение) и яровую (растения не нуждаются в холоде для цветения). У злаков морфологические различия между озимыми и яровыми расами невелики. Среди рас капусты имеется большое разнообразие форм: кочанная, брюссельская, кольраби — это «озимые» капусты (для цветения нужен холод), а цветная капуста и брокколи — это «яровые» капусты. В последние годы получены озимые формы цветной капусты и брокколи, образующие съедобные соцветия только после периода зимнего охлаждения (растут в мягком умеренном климате). В более сухих континентальных районах, где за летней засухой следует длительная зима, озимые формы не могут существовать, и остаются только яровые (более приспособленные). На территории Якутии или в горном Памире растут только скороспелые яровые сорта хлебных злаков.
Параллельные изменения происходят по мере географического распространения родов растений из Средиземноморья в более суровые районы. Средиземноморские виды крокусов, галантусов, безвременников цветут и вегетируют с осени до весны. На Кавказе, т. е. в зоне с более суровым климатом, часть видов осваивают нишу осеннего цветения (вегетация и созревание семян приходятся на следующую весну), а другие сдвигают ритм развития на весеннее время. В Средней Азии с сухой осенью осеннецветущие виды не выживают, распространяться могут только весеннецветущие виды. Интересно, что безвременники (Colchicum), цветущие осенью (родина — Кавказ), при пересадке на Кольский полуостров «сдвигают» цветение на весну: листья и цветки развиваются одновременно, что говорит о физиологической пластичности ритмов цветения. Чем больше селективное давление климата, тем жестче физиологические механизмы, позволяющие выжить в этих обстоятельствах.
Термопериодизм: стратификацияи яровизация
У многих растений есть механизмы, позволяющие оценить, миновала ли угроза длительного понижения температур. Температурные явления закономерно меняются в течение года и называются термопериодизмом. Для весеннего прорастания семена растений умеренной зоны нуждаются в воздействии низких температур (стратификация). Температурный диапазон стратификации от 0° до 10 °C, причем интервал от 2 до 5 °C оказывается наиболее эффективным. Для восприятия температурного стимула семена должны получать достаточно влаги, иначе их чувствительность к стратификации резко падает. Аналогичное явление было отмечено для образования цветков у двулетних растений (без понижения температур они не цветут). Стимуляцию цветения низкими положительными температурами называют вернализацией, или яровизацией. Яровизация была открыта в 1918 г. Г.Гасснером.
Растяжение междоузлий у подснежников, нарциссов (Narcissus), тюльпанов приводит к появлению над почвой цветоносов. Растяжение, как и рост листьев, можно вызвать низкими положительными температурами. Таким образом, прерывание покоя клубней и луковиц некоторых растений контролируется термопериодизмом. Это явление было изучено голландскими исследователями под руководством проф. А. X. Блау в 1930-х гг. и положило начало промышленной выгонке луковичных растений в зимнее время.
Естественная вернализация происходит в конце зимы — начале весны. Длительность низкотемпературной обработки зависит от привычных (естественных) для растения экологических условий. При продолжительной суровой зиме растения нуждаются в обработке в течение 1—2 месяцев (например, озимые сорта пшеницы, районированные в Нечерноземье). Если период низких положительных температур короткий (оттепель среди зимы), активизации роста не происходит. В зонах с мягкой короткой зимой для вернализации достаточно 1 — 2 недель (например, ирис голландский (Iris hollandica), альстремерия (Alstroemeria) и др.).
К яровизации растения чувствительны в разном возрасте: у пшеницы пониженную температуру воспринимает уже зародыш в зерне, а у двухлетних растений должна развиться крупная розетка листьев или корнеплод (до этого яровизация не эффективна). Двухлетники — крайнее выражение озимой стратегии роста: вегетация начинается в начале лета, к осени накапливается запас питательных веществ, а для цветения нужна вернализация. Обычно необходимость в вернализации коррелирует с фотопериодической реакцией: в вернализации нуждаются ДДР и КДДР (см. подразд. 7.4.2.2), что совпадает со световым режимом весны и начала лета умеренных широт.
Опыты М.Х.Чайлахяна
Чтобы выяснить, какие органы чувствительны к пониженным температурам, М.Х.Чайлахян использовал тот же подход, что и при изучении фотопериодизма. У корнеплодов свеклы (Beta vulgaris) перед холодовой обработкой срезали листья, у контрольной группы оставили. Даже без листьев растения восприняли температурный стимул (это естественно, так как в районах с суровой зимой листья обычно отмирают). Далее Чайлахян яровизировал одну
Рис. 7.37. Опыт с прививкой яровизированных почек, показывающий роль меристемы побега в восприятии холодового стимула:
А — охлаждение корня с почкой (яровизация); Б — неохлажденное растение; В — прививка почки с охлажденного растения на неохлажденный корень, и наоборот; Г — побег, выросший из неохлажденной почки, вегетирует; Д — побег, выросший из охлажденной почки, цветет
группу растений, а другую содержал при высоких температурах. Затем он привил почки от яровизированных растений на неяровизированные корни, и наоборот. Зацвели только растения с яровизированными почками (рис. 7.37). М.Х.Чайлахян сделал вывод, что чувствительным органом является меристема побега.
Обработка гиббереллинами при высоких температурах у моркови, рудбе- кии, золотарника {Solidago) вызвала цветение, а свекла, колокольчик средний и пшеница не образовали цветков (но междоузлия были вытянутыми, что говорит об активности выбранных доз ГК). Вероятно, под действием низких температур происходит сдвиг гормонального баланса, который приводит к цветению. Часто одной температурной обработки недостаточно, и растения нуждаются в последующем фотопериодическом стимуле.
Стресс-периодизм
Если самым важным климатическим фактором является засуха, то растения выходят из состояния покоя только после того, как «убедятся», что опасность водного дефицита миновала. Для стимуляции роста им необходима определенная «порция засухи». Некоторые пустынные растения «связывают» ее с термопериодизмом. У многих кактусов (сем. Cactaceae} и литопсов (сем. Aizoaceae} период сухого низкотемпературного покоя стимулирует цветение. Воздействие засухи в комбинации с высокой температурой оказывается важным фактором для закладки цветков у тюльпанов и гиацинтов {Hyacinthus orientalist.
У многих амариллисовых (сем. Amaryllidaceae} температура не оказывает заметного влияния на удлинение цветоноса. Этим растениям для цветения нужен водный дефицит, причем длительность стимула зависит от продолжительности засухи в природе. Эухарису {Eucharis amazonica), растущему в увлажненных местах тропической Америки, достаточно 1 месяца, а гиппеаструму {Hippeastruni}, происходящему из полупустынь, нужно от 2 до б месяцев засухи. Без засухи заложенный в луковице цветонос не удлиняется и через некоторое время погибает. Явление стресс-периодизма хорошо известно в садовой практике, однако физиологические механизмы изучены слабо.
Поскольку растение ведет прикрепленный образ жизни, важной стратегией существования является опережающая физиологическая реакция на климатические стрессы. Например, листопад должен совершиться до того, как снег создаст реальную механическую угрозу для растения. Листья С3-растений должны смениться на С4 до наступления засухи. Клубни и луковицы эфемероидов в дубравах должны перейти в состояние покоя до того, как освещенность под пологом леса упадет ниже критического уровня. Растение «вынуждено рассчитывать» сроки цветения так, чтобы плоды успели созреть во время благоприятного периода и т.д.
Чтобы осуществить превентивную реакцию, растение «оценивает» информацию из внешней среды. Наиболее значимы для растения спектральный состав и интенсивность света, колебания температуры и увлажненности, механическое давление, направление вектора силы тяжести, доступность элементов минерального питания и др. Каждый из факторов воспринимается с помо-
шью рецепторов, превращаясь в сигнал. Далее сигнал трансформируется и передается в виде «возмущения» гормональной системы, системы вторичных мессенджеров, активности генома, изменений метаболизма, поведения цитоскелета и т. п.
Разные группы клеток также служат сигналами внутри растения. Для того чтобы рост был пропорциональным, развитие шло через определенные стадии и удовлетворялись первоочередные потребности каждого органа, растение также использует различные соединения в качестве сигналов. Разнородные сигналы интегрируются в растении так, чтобы его ответ стал максимально адекватным в создавшихся обстоятельствах. «Оценить» все «за» и «против» на биохимическом уровне позволяет взаимосвязь потоков информации, «перекрестный разговор» сигнальных систем. В одних случаях сигналы от разных систем подтверждают друг друга (например, длина дня и понижение температур), и тогда стимулы действуют как синергисты, усиливая друг друга. Если растение оказывается в противоречивой, непривычной ситуации, между сигналами возникает антагонизм.
ГЛАВА 8
РАСТЕНИЯ В УСЛОВИЯХ СТРЕССА
Растения часто подвергаются действию стрессоров — неблагоприятных факторов окружающей среды. Состояние, в котором находится растение под действием того или иного стрессора, называется стрессом. Стрессоры бывают биотического и абиотического происхождения. К биотическим стрессорам относятся патогены — болезнетворные грибы, бактерии и вирусы, а также растительноядные насекомые. Стрессоры абиотической природы — это недостаток влаги (засуха), экстремальные температуры (высокие и низкие), высокое содержание в почве ионов (почвенное засоление), гипоксия (недостаток кислорода), очень высокая или очень низкая освещенность, ультрафиолетовая радиация, повышенное содержание токсичных газов (SO2, NO2, О3) в атмосфере и ряд других. В этой главе рассматриваются механизмы устойчивости растений к действию некоторых, наиболее распространенных стрессоров абиотической природы. Под устойчивостью понимают способность растений сохранять постоянство внутренней среды (поддерживать гомеостаз) и осуществлять жизненный цикл в условиях действия стрессоров.
СТРАТЕГИИ ПРИСПОСОБЛЕНИЯ РАСТЕНИЙК ДЕЙСТВИЮ СТРЕССОРОВ
Наиболее общим проявлением действия стрессоров является подавление роста и развития растений, а на уровне фитоценозов — снижение продуктивности. Стрессоры приводят к уменьшению скорости роста до уровня более низкого, чем уровень, обусловленный генетическим потенциалом растения. Силу вредного действия различных стрессоров можно оценить, если сравнить рекордные урожаи сельскохозяйственных культур со средними урожаями, рассчитанными за много лет. Если рекордный урожай принять как продуктивность культуры в идеальных условиях (100 %), то потери от стрессоров в мире составят от 65 до 87 % в зависимости от культуры. Случается, что несколько стрессоров действуют в комбинации друг с другом, и тогда их вредное действие усиливается. Например, действие засухи часто сочетается с действием высоких температур.
Явления, которые наблюдаются в растениях при действии стрессоров, могут быть разделены на две категории: 1) повреждения, проявляющиеся на различных уровнях структурной и функциональной организации растения, например денатурация белковых молекул, нарушения метаболизма и торможение роста растяжением при обезвоживании клеток в условиях засухи или почвенного засоления; 2) ответные реакции, позволяющие растениям приспосабли-
ваться к новым стрессовым условиям-, они затрагивают изменения в экспрессии генов, метаболизме, физиологических функциях и гомеостазе. Совокупность такого рода реакций называется аккламацией. В процессе акклимации растение приобретает устойчивость к действию стрессора. Акклимация происходит при жизни организма и не наследуется. Вместе с тем она осуществляется на основе тех возможностей, которые заложены в генотипе, т. е. в пределах нормы реакции — наследственно обусловленной амплитуды возможных изменений в реализации генотипа. Примером акклимации растений является закаливание. Некоторые растения, в частности озимые злаки, приобретают способность переживать низкие отрицательные температуры в зимний период, так как осенью подвергаются закаливанию — действию низких положительных и близких к О °C отрицательных температур. Биохимические изменения в тканях, происходящие осенью, придают озимым злакам способность переживать морозы. Если же осень была теплой, то озимые злаки зимой вымерзают.
Важную роль в устойчивости растений к действию стрессоров играют адаптации. В отличие от акклимации адаптация — наследственно закрепленный конститутивный признак, присутствующий в растении независимо от того, находится оно или нет в стрессовых условиях. Адаптации делают популяцию организмов приспособленной к соответствующим условиям окружающей среды. Пример адаптации растений к засухе — морфологические особенности суккулентов, в частности кактусов. Мясистый стебель, листья, превращенные в иголки, незначительное число устьиц, глубоко погруженных в ткань, толстая кутикула и ряд других признаков позволяют кактусам осуществлять жизненный цикл в режиме экономии влаги и таким образом выживать в условиях засушливого климата. Адаптации проявляются также на биохимическом уровне — это, например, биосинтез стеройдных псевдоалкалойдов (гликоалкалой- дов) у некоторых видов пасленовых, в частности у картофеля (Solanum tuberosum), токсичных для травоядных животных и насекомых-фитофагов. Биосинтез гликоалкалойдов — конститутивный признак этих растений, сформировавшийся в процессе эволюции как защита от поедания.
Защитные механизмы как конститутивные (адаптации), так и формирующиеся в ходе акклимации, могут быть разделены на две основные категории.
Механизмы избежания. Они дают возможность растениям избегать действия стрессоров. Ярким примером таких механизмов служит поглощение воды глубоко проникающей в грунт корневой системой растений. У некоторых ксерофитов (растений засушливых мест обитания), например у черного саксаула (Haloxylon ammodendron), длина корневой системы достигает нескольких десятков метров, что позволяет растению использовать грунтовую воду и не испытывать недостатка влаги в условиях почвенной и атмосферной засухи. К этой же категории относятся механизмы ионного гомеостатирования цитоплазмы у растений, устойчивых к почвенному засолению. Способность поддерживать низкие концентрации Na+ и СГ в цитоплазме при почвенном засолении дает возможность этим растениям избегать токсического действия ионов на цитоплазматические биополимеры.
Механизмы резистентности (выносливости). Посредством этих механизмов растения, не избегая действия стрессора, переживают стрессовые условия. К таким механизмам относится, в частности, биосинтез нескольких изоферментов, осуществляющих катализ одной и той же реакции, при этом каждая
изоформа обладает необходимыми каталитическими свойствами в относительно узком диапазоне некоторого параметра окружающей среды, например температуры. Весь набор изоферментов в целом позволяет растению осуществлять реакцию в значительно более широком температурном диапазоне, чем это делал бы только один изофермент, и, следовательно, приспосабливаться к изменяющимся температурным условиям (см. подразд. 8.4.1.1).
Изменения в метаболизме, физиологических функциях и ростовых процессах при стрессах связаны с изменениями в экспрессии генов. Ответ на действие стрессора происходит, если растение «распознает» стрессор на клеточном уровне. Распознавание стрессора, т.е. рецепция сигнала, приводит к активации пути передачи сигнала. Последний поступает в геном, индуцируя или подавляя синтез тех или иных белков. Связанные с экспрессией генов ответные реакции клеток на действие стрессора интегрируются в ответ целого растения, выражающийся в наиболее общем случае в ингибировании роста и развития растения и одновременно в повышении его устойчивости к действию стрессора.
Подавляющая часть клеточных механизмов устойчивости сформировалась на ранних этапах эволюции, поэтому защитные системы, проявляющиеся на клеточном уровне у высших растений, и защитные системы более примитивных организмов имеют общую основу. В связи с этим исследование механизмов устойчивости к действию стрессоров у бактерий, дрожжей и одноклеточных водорослей проливает свет и на клеточные механизмы устойчивости у высших растений. Значительная часть знаний о рецепции сигнала и путях его передачи, так же как и о клеточных механизмах устойчивости в целом, исследователи получили, опираясь на базовые работы, выполненные на бактериях Esherichia colt и дрожжах Saccharomyces ceretisiae. Механизмы рецепции и пути передачи сигнала непосредственно у растений начинают изучаться только сейчас. Показано, что в регуляцию ответа растения на стрессорные воздействия вовлечены гормоны, особенно абсцизовая кислота (АБК), этилен и жасмоновая кислота. В ответ на действие стрессоров экспрессия некоторых генов усиливается, тогда как экспрессия других генов подавляется. Часто образуются новые белки, которые не обнаруживаются в клетках в нестрессовых условиях. Хотя значительная часть исследований сфокусирована на активации транскрипции генов, данные, полученные в последнее время, показывают, что образование продуктов стрессовых генов, а также активность этих продуктов в клетках регулируется и на посттранскрипционном уровне. К таким механизмам относятся: активация трансляции, посттрансляционная стабилизация, изменение ферментативной активности уже синтезированных белков и др.
ВОДНЫЙ ДЕФИЦИТ
Растения испытывают водный дефицит, когда скорость транспирации превосходит скорость поглощения воды корневой системой. Такая ситуация возникает не только при засухе, но и в условиях почвенного засоления, а также при низких температурах. В двух последних случаях дегидратация является компонентом стрессов «неводной» природы и развивается в растениях, когда количество воды в почве чаще всего не ограничено, однако эта вода недоступна для растения. Например, при почвенном засолении вода не поглощается кор-
невой системой из-за высокого осмотического давления (низкого водного потенциала) почвенного раствора.
Снижение содержания воды в клетках при водном дефиците и сопутствующее обезвоживанию увеличение концентрации ионов в цитоплазме вызывают различного рода нарушения в структуре и функциях биополимеров, в частности происходит денатурация белков и подавляется их ферментативная активность, изменяется структура липидного бислоя мембран и нарушается их целостность. Деструктивные изменения в мембранах в свою очередь приводят к нарушению внутриклеточной компартментации веществ и подавлению электрогенеза. На клеточном уровне водный дефицит выражается в потере тургора. На уровне целого растения водный дефицит часто проявляется в обращении градиента водного потенциала в системе почва —корень—побег и ингибировании роста. Способность растения адекватно отвечать на водный дефицит и выживать в условиях водного дефицита зависит от эффективности защитных механизмов растения. Некоторые ответные реакции растения на водный дефицит могут наблюдаться уже через несколько секунд после начала действия стрессора. К ним относятся, например, изменения в фосфорилировании белков. Другие ответы требуют более длительного времени — от нескольких минут до нескольких часов, как в случае изменений в экспрессии генов.
В результате индукции механизмов устойчивости к водному дефициту растение становится способным пережить действие стрессора. Развитие устойчивости может быть результатом индукции как механизмов избежания, так и механизмов резистентности. Обе категории реакций, вовлеченные в процесс акклимации растений к водному дефициту, более детально рассмотрены ниже.
ПОНИЖЕНИЕ ВОДНОГО ПОТЕНЦИАЛА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОККАК СТРАТЕГИЯ ИЗБЕЖАНИЯ ОБЕЗВОЖИВАНИЯ
Вода движется пассивно по градиенту водного потенциала АТ из области, где водный потенциал выше, в прилегающую область, где он ниже (см. подразд. 5.7 и 5.8).
Растение не может извлекать воду из почвы, если водный потенциал клеток корня Т1"1 выше водного потенциала почвы Тср. Для того чтобы вода передвигалась из почвы в клетки корня, Т1"1 должен быть доведен до более низкого уровня, чем Тср. Некоторые растения высокочувствительны к водному дефициту и завядают (теряют тургор), когда Тср становится слишком низким. Другие могут переносить засуху или высокие концентрации соли в почвенном растворе без очевидной потери тургора. Клетки засухоустойчивых и солеустойчивых растений способны снижать свой водный потенциал за счет повышения внутриклеточного осмотического давления л101 — процесса, получившего название осморегуляции. Повышение л1"1 осуществляется за счет увеличения суммарной концентрации осмотически активных веществ в клетках (рис. 8.1). Достигаемые при этом внутриклеточные осмолярности превосходят те, которые получаются в результате пассивного концентрирования веществ при дегидратации. Благодаря повышению л1"1 вода поступает в корни по градиенту водного потенциала. Процесс осморегуляции играет важнейшую роль в акклимации растений к засухе и почвенному засолению.
Рис. 8.1. Осморегуляция при водном дефиците (Е. Bray et al., 2000).
Без осморегуляпии
В условиях водного дефицита осморегуляция осуществляется за счет накопления в клетках низкомолекулярных веществ В цитоплазме синтезируются осмолиты, а в вакуолях аккумулируются ионы. Внутриклеточное осмотическое давление при этом повышается (снижается водный потенциал), что приводит к току воды, направленному в клетки. В клетках растений с низкоэффективным механизмом осморегуляции вещества при дегидратации концентрируются пассивно, однако овод- ненность клетки и тургор не восстанавливаются, так как низкомолекулярные соединения не накапливаются. Р — тургорное давление; л — осмотическое давление; Т — водный потенциал
Так как осмотическое давление является функцией общего числа частиц, растворенных в данном объеме, в повышении л101 участвуют как низкомолекулярные органические соединения, так и неорганические ионы. Регуляция осмотического давления в цитоплазме клеток при водном и солевом стрессах осуществляется преимущественно за счет биосинтеза низкомолекулярных органических соединений, которые получили название осмолитов, тогда как в ва- куолярном компартменте главную роль в регуляции осмотического давления играет аккумуляция неорганических ионов.
ОСМОЛИТЫ
Свойства и функции осмолитов
Осмолиты образуют сравнительно небольшую группу химически разнообразных низкомолекулярных органических соединений. Они хорошо растворимы в воде, нетоксичны и в отличие от неорганических ионов не вызывают изменений в метаболизме, отчего и получили свое второе название совместимых веществ (compatible solutes). Синтез и накопление осмолитов органической природы в цитоплазме клеток — широко распространенное явление в растительном мире, однако в распределении разных осмолитов по видам растений наблюдаются значительные вариации. У совместимых веществ существу-
ет тенденция быть нейтральными при физиологических значениях pH. В цитоплазме они находятся в недиссоциированной форме либо в форме цвиттерионов, т. е. молекул, несущих положительный и отрицательный заряды, которые пространственно разделены. Некоторые осмолиты являются амфифильными соединениями. Молекулы амфифильных веществ несут как неполярные (гидрофобные), так и полярные (гидрофильные) группы. К осмолитам относятся также некоторые полигидроксильные соединения. Химическая структура наиболее широко распространенных осмолитов показана на рис. 8.2.
Общая функция осмолитов — участие в процессе осморегуляции. Многие неорганические ионы, такие, например, как Na+ и СГ, в высоких концентрациях токсичны, поэтому не могут быть использованы растительной клеткой в регуляции осмотического давления цитоплазмы. В то же время совместимые с биополимерами осмолиты могут аккумулироваться в цитоплазме до концентраций в несколько сот микромоль на грамм без видимых токсических эффектов. Вследствие этого именно осмолиты, а не неорганические ионы клетка использует для регуляции осмотического давления цитоплазмы. Роль осмолитов особенно важна в условиях засухи и засоления, когда необходимо сконцентрировать в клетках осмотически активные вещества. Различия растений по устойчивости к дегидратации связаны со степенью эффективности у них систем биосинтеза осмолитов. Ксерофиты и галофиты — растения, обитающие соответственно при низком содержании влаги в среде и на засоленных почвах,
АминокислотыАминокислотыПролинПролинТретичные соединения сульфония
Аминокислоты
Аминокислоты
Пролин
Пролин
Н3С.
СН2~ СН2~ СООН3С
S-диметилсульфониопропионат
Н3СН3С—N— (СН2)—СООН3Сп = 1 — глицин-бетаинл = 2 — аланин-бетаинН3СН3С—N— (СН2)—СООН3Сп = 1 — глицин-бетаинл = 2 — аланин-бетаинПролин-бетаинПролин-бетаинОН онОН онПинитолПинитолЧетвертичные соединения аммония
Н3С
Н3С—N— (СН2)—СОО
Н3С
п = 1 — глицин-бетаин
л = 2 — аланин-бетаин
Н3С
Н3С—N— (СН2)—СОО
Н3С
п = 1 — глицин-бетаин
л = 2 — аланин-бетаин
Пролин-бетаин
Пролин-бетаин
ОН он
ОН он
Пинитол
Пинитол
НзСхY
н3с—n-ch2-ch2-o-s=o
Н3Сq-
Многоатомные спиртыМногоатомные спиртыХолин-сульфат
Многоатомные спирты
Многоатомные спирты
СН2ОНно-с-н
Iно-с-н
I н-с-он
I н-с-он
I СН2ОН
Маннитол
Рис. 8.2. Химические структуры некоторых наиболее распространенных осмолитов
синтезируют осмолиты с более высокой скоростью и аккумулируют их в клетках до более высоких концентраций по сравнению с растениями, обитающими в условиях нелимитированного водоснабжения и при отсутствии почвенного засоления.
В вакуолях, которые занимают приблизительно 90 % объема созревших клеток, осморегуляция осуществляется в основном путем аккумуляции неорганических ионов — К , Na+ и Cl . За счет осмолитов достигается осмотическое равновесие цитозоля с вакуолями и всеми остальными органеллами клетки.
Наряду с осморегуляцией совместимые вещества выполняют еще одну, очень важную при дегидратации функцию. Эта функция может быть определена как защитная {протекторная) по отношению к цитоплазматическим биополимерам. Подчеркивая двойную функциональную роль осмолитов, их часто называют осмопротекторами. К настоящему времени накопилось много экспериментальных фактов, свидетельствующих об их защитных свойствах. Следует, однако, отметить, что доказательства защитного действия совместимых веществ получены в основном в экспериментах in -vitro. Например, на препаратах из листьев растений показано, что глицин-бетаин предотвращает NaCl-индуци- рованную инактивацию рибулозобисфосфаткарбоксилазы и дестабилизацию выделяющего О2 комплекса фотосистемы II.
Считается, что осмолиты не разрушают гидратные оболочки биополимеров. На рис. 8.3 показана гидратная оболочка белка, состоящая из упорядоченных молекул воды. Ионы, например Na+ и СГ, могут проникать через гидратную оболочку и влиять на нековалентные связи, которые поддерживают структуру белковой молекулы. В отличие от Na+ и СГ осмолиты, такие, как пролин и глицин-бетаин, не проникают через гидратную оболочку и не вступают в прямой контакт с белком, но создают препятствие для разрушения ионами гидратной оболочки белка и его денатурации.
Некоторые низкомолекулярные органические соединения, синтез которых индуцируется стрессорным воздействием, образуются в клетках в количествах, явно недостаточных для выполнения осморегуляторной функции. Тем не менее они играют важную роль при стрессах как протекторы биополимеров. К таким соединениям относятся диамин путресцин и образующиеся из него полиамины спермидин и спермин (см. далее рис. 8.8). Полиамины широко распространены в растениях. Они стимулируют реакции, вовлеченные в синтез ДНК, РНК и белков. Как поликатионы, полиамины обладают высоким сродством к биомолекулам, несущим отрицательные заряды, в частности к ДНК, РНК, фосфолипидам и кислым белкам, а также к анионным группам компонентов мембран и клеточных стенок. В растениях полиамины вовлечены во многие физиологические процессы, включая клеточное деление, формирование цитоскелета, инициацию роста корней, эмбриогенез и созревание плодов.
Полиамины предотвращают повреждения биомолекул, вызываемые засухой, засолением, низкими температурами и озоном. Структуры ДНК, РНК, рибосом, а также мембран, находящихся в комплексе с полиаминами, стабилизируются. Снижая активности РНКаз и протеаз, увеличенные в стрессовых условиях, полиамины повышают точность считывания информации при синтезе белков и тормозят лизис клеточных структур.
Механизм стабилизирующего действия полиаминов может быть рассмотрен на примере ДНК, являющейся сильной многоосновной кислотой. Она полнос-
Денатурированный белок (дезорганизованная структура гидратной оболочки молекулы белка)Денатурированный белок (дезорганизованная структура гидратной оболочки молекулы белка)Интактный белок (высокоупорядоченная структура молекул воды, окружающих белок)Интактный белок (высокоупорядоченная структура молекул воды, окружающих белок)
Денатурированный белок (дезорганизованная структура гидратной оболочки молекулы белка)
Денатурированный белок (дезорганизованная структура гидратной оболочки молекулы белка)
Интактный белок (высокоупорядоченная структура молекул воды, окружающих белок)
Интактный белок (высокоупорядоченная структура молекул воды, окружающих белок)
Рис. 8.3. Протекторная функция пролина (Про). Пролин препятствует денатурациибелка, вызываемой ионами Na+ и СГ (Е. Bray et al., 2000)
тью ионизирована при pH выше 4. При цитоплазматических значениях pH отрицательно заряженные фосфатные группы, расположенные на периферии двойной спирали, образуют ионные связи с положительно заряженными аминогруппами спермидина и спермина, что предохраняет ДНК от повреждений.
Биосинтез некоторых наиболее распространенныхосмолитов
Пролин. Осмолит пролин широко распространен в растениях. Эта аминокислота может синтезироваться двумя путями, в которых исходным веществом для синтеза является либо глутамат, либо орнитин (рис. 8.4). Ключевой фермент глутаматзависимого пути синтетаза Д'-пирролин-5-карбоновой кислоты обладает двойной функцией. Сначала благодаря свойственной этому ферменту у-глутамилкиназной активности происходит АТФ-зависимое фосфорилирова-
LZ100LZ100СинтетазаД'-Пирролин-5-карбоновойкислоты (у-глутамилН2ССН2 киназная активность) Н2ССН2^ А" АТФ МФ соосенH3N COO"H3N СОО"СинтетазаД'-Пирролин-5-карбоновойкислоты (у-глутамилН2ССН2 киназная активность) Н2ССН2^ А" АТФ МФ соосенH3N COO"H3N СОО"L- ГлутаматL- ГлутаматZ-Глутамил-у-фосфатZ-Глутамил-у-фосфатСинтетазаД'-Пирролин-5-карбоновой кислоты(ПАГ-дегидрогеназа)СинтетазаД'-Пирролин-5-карбоновой кислоты(ПАГ-дегидрогеназа)< НАДФН^НАДФ+ ^Ф„< НАДФН^НАДФ+ ^Ф„Н2ССН2СНО узяH3N СОО"Н2ССН2СНО узяH3N СОО"у-Полуалвдегидглутаминовойкислоты (ПАГ)у-Полуалвдегидглутаминовойкислоты (ПАГ)Спонтанно^ Н2С СН2НС» +Н20N СОО"2нД'-Пирролин-5-карбоновая кислота(П5К)Спонтанно^ Н2С СН2НС» +Н20N СОО"2нД'-Пирролин-5-карбоновая кислота(П5К)П5К-редуктаза Н2С СН2Н2С^ + ХСХНАДФН >N СОО"НАДФ+Н2Z-ПролинП2К-редуктазаП5К-редуктаза Н2С СН2Н2С^ + ХСХНАДФН >N СОО"НАДФ+Н2Z-ПролинП2К-редуктазан2ссн2h2cnh; zch h;n СОО"L- Орнитинн2ссн2h2cnh; zch h;n СОО"L- ОрнитинОрнитин-а-аминотрансферазаОрнитин-а-аминотрансферазаКетокислота АминокислотаКетокислота АминокислотаН2Сh2cnh3+Н2Сh2cnh3+СН2СН2СпонтанноСпонтаннон2с—сн2н2с—сн2О СОО"О СОО"н2с.н2с.N СОО" нN СОО" на-Кето-5-амино-валерьяновая кислотаа-Кето-5-амино-валерьяновая кислотаД'-Пирролин-2-карбоновая кислота(П2К)Д'-Пирролин-2-карбоновая кислота(П2К)
LZ1
00
LZ1
00
Синтетаза
Д'-Пирролин-5-карбоновойкислоты (у-глутамил
Н2ССН2 киназная активность) Н2ССН2
^ А" АТФ МФ соосенH3N COO"H3N СОО"
Синтетаза
Д'-Пирролин-5-карбоновойкислоты (у-глутамил
Н2ССН2 киназная активность) Н2ССН2
^ А" АТФ МФ соосенH3N COO"H3N СОО"
L- Глутамат
L- Глутамат
Z-Глутамил-у-фосфат
Z-Глутамил-у-фосфат
Синтетаза
Д'-Пирролин-5-карбоновой кислоты(ПАГ-дегидрогеназа)
Синтетаза
Д'-Пирролин-5-карбоновой кислоты(ПАГ-дегидрогеназа)
< НАДФН
^НАДФ+ ^Ф„
< НАДФН
^НАДФ+ ^Ф„
Н2ССН2
СНО узя
H3N СОО"
Н2ССН2
СНО узя
H3N СОО"
у-Полуалвдегидглутаминовойкислоты (ПАГ)
у-Полуалвдегидглутаминовойкислоты (ПАГ)
Спонтанно^ Н2С СН2НС» +
Н20N СОО"
2н
Д'-Пирролин-5-карбоновая кислота(П5К)
Спонтанно^ Н2С СН2НС» +
Н20N СОО"
2н
Д'-Пирролин-5-карбоновая кислота(П5К)
П5К-редуктаза Н2С СН2
Н2С^ + ХСХНАДФН >N СОО"
НАДФ+Н2
Z-Пролин
П2К-редуктаза
П5К-редуктаза Н2С СН2
Н2С^ + ХСХНАДФН >N СОО"
НАДФ+Н2
Z-Пролин
П2К-редуктаза
н2ссн2
h2cnh; zch h;n СОО"
L- Орнитин
н2ссн2
h2cnh; zch h;n СОО"
L- Орнитин
Орнитин-а-аминотрансфераза
Орнитин-а-аминотрансфераза
Кетокислота Аминокислота
Кетокислота Аминокислота
Н2С
h2cnh3+
Н2С
h2cnh3+
СН2
СН2
Спонтанно
Спонтанно
н2с—сн2
н2с—сн2
О СОО"
О СОО"
н2с.
н2с.
N СОО" н
N СОО" н
а-Кето-5-амино-валерьяновая кислота
а-Кето-5-амино-валерьяновая кислота
Д'-Пирролин-2-карбоновая кислота(П2К)
Д'-Пирролин-2-карбоновая кислота(П2К)
Рис. 8.4. Биосинтез пролина
ние Z-глутамата. Образующийся Z-глутамил-у-фосфат превращается далее в у- полуальдегид глутаминовой кислоты (ПАТ) с помощью этого же фермента, функционирующего как НАДФН-зависимая ПАГ-дегидрогеназа. Далее ПАГ подвергается спонтанной циклизации с образованием Д'-пирролин-5-карбо- новой кислоты (П5К), восстанавливающейся затем до пролина при участии НАДФН-зависимой П5К-редуктазы.
В орнитинзависимом пути биосинтез пролина из орнитина начинается с реакции переаминирования, катализируемой орнитин-а-аминотрансферазой. Образующаяся а-кето-8-аминовалерьяновая кислота спонтанно превращается в Д'-пирролин-2-карбоновую кислоту (П2К), которая далее с помощью П2К- редуктазы восстанавливается до пролина.
В катаболическом превращении пролина ключевую роль играет пролинде- гидрогеназа, которая катализирует окисление пролина до Д'-пирролин-5-кар- боновой кислоты.
Глицин-бетаин образуется в клетках многих водорослей и высших растений. Метаболический путь биосинтеза глицин-бетаина обнаружен у всех исследованных представителей семейства маревые (Chenopodiaceae), однако в клетках растений других семейств глицин-бетаин синтезируется лишь у отдельных видов.
В отличие от пролина и других осмолитов, внутриклеточные концентрации которых регулируются путем баланса скоростей их синтеза и катаболизма, однажды образовавшийся глицин-бетаин не подвергается катаболическим превращениям. Считается, что внутриклеточные концентрации глицин-бетаина зависят от скорости его биосинтеза и скорости оттока через флоэму к растущим тканям.
Глицин-бетаин образуется в хлоропластах из холина. Процесс протекает в две стадии (рис. 8.5). Первый фермент, холинмонооксигеназа, катализирует окисление холина до бетаинальдегида, используя фотосинтетически восстановленный ферредоксин и молекулярный кислород. Второй фермент, бетаинальде- гиддегидрогеназа, катализирует окисление бетаинальдегида до глицин-бетаина. Оба фермента выделены, очищены и получены клоны их кДНК. Как показали эксперименты с мечеными предшественниками глицин-бетаина, активность обоих ферментов увеличивается в несколько раз при повышении осмотического давления наружного раствора, при этом возрастают количества их транскриптов. При последующем снабжении растений пресной водой содержание транскриптов снижается.
Холин, предшественник глицин-бетаина, образуется в разных растениях неодинаково (рис. 8.5). В шпинате {Spinacia oleracea) и сахарной свекле {Beta vulgaris) синтез холина осуществляется путем метилирования этаноламинфос- фата с образованием холинфосфата. Последний гидролизуется, образуя холин. В шпинате активность ферментов, вовлеченных в этот путь биосинтеза холина, возрастает при повышении наружной концентрации соли. В ячмене {Hordeum vulgare) холин образуется через обмен фосфатидилхолина — фосфолипида, входящего в состав мембран (рис. 8.5).
Накопление глицин-бетаина в клетках способствует повышению засухо- и солеустойчивости растений. Растения, накапливающие глицин-бетаин при водном дефиците и солевом стрессе, поддерживают относительное содержание воды (ОСВ) и тургорное давление на более высоком уровне, а также осуществляют фотосинтез с большей скоростью, чем растения, не накапливающие
h3n-ch2-ch2oh
Этаноламин
^^ Этаноламин
. киназа
АДФ^ h3n-ch2-ch2o(p) Этаноламинфосфат 38-аденозил- метионин ' N-Метил- 38-аденозил- «Р^ФеР"™ гомоцистеин н3сх h3c-n-ch2-ch2o(p) - Н3С Холинфосфат
Н3С.
О II н2с—о—с—r
О HC-O-C-R'
h3c-n-ch2-ch2-o—р—о—сн2 о
н,сI,
Фосфатидилхолин
Фосфатидная . Фосфолипаза D кислота
Холинфосфат-фосфатаза
р,
Н3С
h3c-n-ch2-ch2oh
Н3С
Холин
О2 + 2Н + 2Фд
' Холинмоно-
2Н2О + 2Фд V оксигеназа
h3c-n-ch2-c<
н3с/н
Бетаин-альдегид
^^ Бетаин-альдегид-удцц ^ дегидрогеназа
Н3С\
H3C-N-CH2-COO
Н3С
Глицин-бетаин
Рис. 8.5. Биосинтез глицин-бетаина
его. Подавляющее большинство сельскохозяйственных культур не аккумулирует глицин-бетаин. Были сделаны попытки повысить засухо- и солеустойчи- вость ряда растений путем получения трансформантов с генами ферментов, отвечающих за биосинтез глицин-бетаина. Растения табака {Nicotiana tabacumY трансформированные геном бактериальной холиндегидрогеназы, отвечающей за превращение холина в бетаин-альдегид, демонстрировали более высокую скорость роста при солевом стрессе, чем исходные растения.
Маннитол. Многоатомный спирт маннитол представляет собой восстановленную форму сахара маннозы. Он встречается у многих растений, а у некоторых из них на его долю приходится большая часть всех углеводов, образующихся при фотосинтезе. Концентрации маннитола возрастают в клетках в ответ на гиперосмотический шок. В отличие от глицин-бетаина содержание маннитола в клетках регулируется не только скоростью его биосинтеза, но и активностью ферментов, которые отвечают за утилизацию маннитола, а также ферментов, осуществляющих его катаболизм. Например, у злаков осмотический шок приводит к снижению активности НАД+-зависимой маннитолдегид- рогеназы — фермента, окисляющего маннитол.
®осн2 n
он
н
| I СН2ОН он н
Маннозофосфат- изомераза
Н
СН2О®
Н
НАДФН
( НАДФ
Маннозо-6-фос-фатредуктаза
Фруктозо-6-фосфат
но—
нФн но
—н
но—
—ну но—
—н
н—
—ОН Маннитол-1-фос-у—
—он
фатфосфатаза
н—
—онн—
—он
СН2О®
СН2ОН
СН2ОН
Маннитол
СН2ОН
Маннитол-1 -фосфат
он 1< ОН
н н
Маннозо-6-фосфат
Рис. 8.6. Биосинтез маннитола
На рис. 8.6 показан путь биосинтеза маннитола. В условиях осмотического стресса три фермента осуществляют превращение интермедиата цикла Кальвина и гликолиза — фруктозо-6-фосфата — в маннитол. Фруктозо-6-фосфат с помощью маннозо-6-фосфатизомеразы превращается в маннозо-6-фосфат, который затем восстанавливается до маннитол-1-фосфата НАДФН-зависимой
Н ОН
Миоинозитол-1- фосфатсинтаза
НАД"
Глюкозо-6-фосфат
он он
н он
Миоинозитол-1 -фосфат
Миоинозитол-1- фосфатфосфатаза
Фн
ОН ОН
н он
Миоинозитол
Миоинозитол-6-о- метилтрансфераза
он он
н он
Ононитол
Ононитол- эпимераза
S-Адено- зилме- S-Аденотионин зилгомо-
цистеин
ОН он
н он
Пинитол
Рис. 8.7. Биосинтез пинитола
маннозо-6-фосфатредуктазой. Маннитол-1-фосфат дефосфорилируется при участии маннитол-1-фосфатфосфатазы, превращаясь в маннитол.
Превращение маннитола во фруктозо-6-фосфат в катаболической ветви цикла в ответ на повышение наружного осмотического давления происходит с участием двух ферментов: НАД+-зависимая маннитолдегидрогеназа окисляет маннитол до фруктозы, а фруктокиназа катализирует образование фруктозо-6- фосфата из фруктозы.
Растения табака и арабидопсиса (Arabidopsis thaliana), чувствительные к осмотическому шоку, были трансформированы геном из Е. coli, отвечающим за превращение фруктозо-б-фосфата в маннитол-1 -фосфат. Трансформированные растения накапливали маннитол, который обычно они не содержат, и демонстрировали более высокую устойчивость к осмотическому шоку, чем нетранс- формированные растения. Семена аккумулирующих маннитол трансгенных растений арабидопсиса были способны прорастать в присутствии соли.
S-Аденозилметионин (SAM)S-Аденозилметионин (SAM)Декарбоксилирова! пгый SAMДекарбоксилирова! пгый SAMНI
S-Аденозилметионин (SAM)
S-Аденозилметионин (SAM)
Декарбоксилирова! пгый SAM
Декарбоксилирова! пгый SAM
H2N—(СН2)з—с-соон
nh2
L- Орнитин
Sco2
H2N— (СН2)4—nh2
СпермидинсинтазаСпермидинсинтазаПутресцин
Спермидинсинтаза
Спермидинсинтаза
H2N—(СН2)3—NH—(СН2)4—NH2
5'-Метилтиоаденозин5'-МетилтиоаденозинСпермидин
5'-Метилтиоаденозин
5'-Метилтиоаденозин
Сперминсинтоза
H2N—(СН2)3—NH—(СН2)4—NH—(СН2)3
Спермин
Рис. 8.8. Биосинтез полиаминов
Пинитол. D-пинитол — циклический многоатомный спирт, основной осмолит многих растений семейств сосновые (Pinaceae), бобовые (Leguminosae) и гвоздичные (Caryophyllaceae). Концентрации пинитола, как правило, более высоки у видов, адаптированных к засухе и почвенному засолению. Пинитол накапливается в клетках факультативного галофита хрустальной травки (Mesem- bryanthemum crystallinum), если растение поливают раствором, содержащим NaCl. При поливе раствором NaCl в концентрации 400 мМ доля пинитола в клетках М. crystallinum достигает 70 % от всех растворимых карбогидратов и лишь 5 % — в клетках контрольных растений, не обработанных NaCl. В клетках пинитол локализован в хлоропластах и цитозоле, но не обнаруживается в вакуолях.
Пинитол образуется из глюкозо-6-фосфата (рис. 8.7). Главное событие в цепи реакций биосинтеза пинитола — о-метилирование миоинозитола, которое осуществляется миоинозитол-6-о-метилтрансферазой. В этой реакции донором метильной группы служит S-аденозилметионин. Образующийся ононитол подвергается далее эпимеризации с образованием пинитола.
При выращивании М. crystallinum в присутствии NaCl возрастание концентрации пинитола в клетках сопровождалось почти 60-кратным увеличением активности миоинозитол-6-о-метилтрансферазы. Показано, что активность этого фермента регулируется на транскрипционном уровне, т.е. увеличение активности фермента, вызванное высоким осмотическим давлением среды, связано с возрастанием количества его мРНК в клетках.
Полиамины спермидин и спермин. Предшественником спермидина и спермина является диамин путресцин, образующийся из аминокислоты орнитина, (рис. 8.8). Спермидин образуется в результате конденсации молекулы путресцина и пропиламинного остатка декарбоксилированного S-аденозилметиони- на. Реакция осуществляется с помощью спермидинсинтазы за счет богатой энергией метил-сульфониевой связи декарбоксилированного S-аденозилмети- онина. Другой фермент, сперминсинтаза, переносит на спермидин еще один пропиламинный остаток декарбоксилированного S-аденозилметионина с образованием спермина.
БЕЛКИ, ОБРАЗУЮЩИЕСЯ В КЛЕТКАХ РАСТЕНИЙПРИ ДЕГИДРАТАЦИИ
В формирование механизмов устойчивости растений к водному дефициту вовлечены белки, выполняющие различные функции. Многие из них синтезируются de novo как ответная реакция растения на дегидратацию.
Lea-белки
Часть индуцируемых водным дефицитом белков защищает цитоплазматические биополимеры и формируемые ими клеточные структуры от повреждений, вызываемых дегидратацией (рис. 8.9). К ним относятся Lea (late embryogenesis abun- баЩ)-белки, которые сначала были идентифицированы как продукты генов LEA, экспрессирующихся в семенах в фазе их созревания и высушивания. Позже некоторые Lea-белки были обнаружены в вегетативных тканях растений в период потери ими воды при водном, солевом и низкотемпературном стрессах.
Связывание ионов
Рис. 8.9. Протекторные функции белков, индуцируемых водным дефицитом ' (Е.Вгау, 1993).
Образующиеся белки поддерживают метаболизм и физиологические процессы в период потери клеткой воды и последующего восстановления оводненности в ходе осморегуляторного процесса
Lea-белки в подавляющем большинстве гидрофильны, что согласуется с их цитоплазматической локализацией. Многие из них обогащены аланином и глицином и лишены цистеина и триптофана. Lea-белки в соответствии с их аминокислотными последовательностями и структурой объединяют в пять групп (1 — 5). Существуют предположения о специфических функциях белков каждой группы. Lea-белки группы 1 характеризуются высоким содержанием заряженных аминокислот и глицина, что позволяет им эффективно связывать воду. Наличие Lea-белков этой группы в цитоплазме придает ей высокую водоудерживающую способность.
Предполагается, что Lea-белки группы 2 выполняют функции шаперонов. Образуя комплексы с другими белками, они предохраняют последние от повреждений в условиях дегидратации клетки. Некоторые Lea-белки (группы 3 и 5) участвуют в связывании ионов, которые концентрируются в цитоплазме при потере клетками воды. Наличие гидрофобной области у этих белков приводит к формированию гомодимера с гидрофобными последовательностями, обращенными друг к другу, тогда как заряженные области на наружных поверхностях белка участвуют в связывании ионов. Lea-белки группы 4 могут замешать воду в примембранной области и этим поддерживать структуру мембран при дегидратации. Lea белки играют важную роль в устойчивости растений к водному дефициту. На ряде видов растений показана корреляция между выжи-
ваемостью при водном дефиците и накоплением в их клетках Lea-белков. Например, сверхэкспрессия генов, кодирующих Lea-белки в трансформантах риса (Ory^a sativa), коррелировала с высокой устойчивостью растений к водному дефициту.
Шапероны и ингибиторы протеаз
Шаперонами называют белки, которые связывают полипептиды во время их сворачивания (folding), т.е. при формирования третичной структуры, и сборки белковой молекулы из субъединиц, т. е. при формировании четвертичной структуры. Взаимодействуя с полипептидами, шапероны предотвращают ошибки в сворачивании и сборке и этим препятствуют аггрегации полипептидных цепей. Некоторые шапероны играют роль «ремонтных станций», исправляющих неверное сворачивание. Одна из главных функций шаперонов — сворачивание и разворачивание (unfolding), а также сборка и разборка белков при их транспорте через мембраны. Полипептидная цепь может пройти через пору в мембране лишь в развернутом виде. Некоторые содержащиеся в цитозоле шапероны взаимодействуют с вновь синтезированными полипептидными цепями и поддерживают их линейную структуру, так что полипептидные цепи могут сразу транспортироваться в нужный компартмент клетки. Другие шапероны связываются с аминокислотами полипептидной цепи, как только она покажется на другой стороне мембраны, и осуществляют сворачивание. При дегидратации клеток тенденция к повреждениям и денатурации белков усиливается, поэтому защитная роль шаперонов в этих условиях возрастает. Стрессовые условия активируют биосинтез шаперонов в клетках (см. рис. 8.9).
При осмотическом стрессе происходит также индукция биосинтеза ингибиторов протеаз, препятствующих протеолитическому расщеплению белков, которые при дегидратации клетки сохраняют свою структуру и функциональные свойства (см. рис. 8.9).
Протеазы и убиквитины
При обезвоживании клеток, несмотря на действие протекторных соединений и шаперонов, часть клеточных белков подвергается денатурации. Денатурированные белки должны быть гидролизованы. Эту функцию выполняют протеазы и убиквитины, экспрессия генов которых также индуцируется стрессовыми условиями. Убиквитины представляют собой низкомолекулярные (8,5 кДа) высококонсервативные белки. Присоединяясь к N-концу денатурированного белка, они делают белок доступным для действия протеаз (см. рис. 8.9). Таким путем осуществляется селективная деградация денатурированных белков.
Аквапорины
Трансмембранное движение воды происходит в основном через водные каналы, образованные белками аквапоринами (см. рис. 8.9, а также подразд. 5.6). За счет изменения числа водных каналов в мембране и их проводимости осуществляется быстрая регуляция трансмембранных потоков воды, это особенно
важно при водном дефиците. Показано, что поглощение воды клетками в ответ на увеличение внутриклеточных концентраций осмолитов, сопровождающееся восстановлением ОСВ и тургора при засухе, происходит через водные каналы. В A. thaliana водный дефицит индуцировал экспрессию гена RD28, который кодирует аквапорин, локализованный в плазматической мембране. Гены, кодирующие аквапорины, идентифицированы в М. crystallinum. Показано, что количество транскриптов этих генов коррелирует с тургорным давлением в клетках листьев М. crystallinum при действии на растение соли в высоких концентрациях. После обработки растений хлористым натрием число транскриптов в период снижения тургорного давления уменьшалось. В последующем оно увеличивалось по мере того, как в клетках накапливались осмолиты и восстанавливался тургор. Возросшая концентрация транскриптов в клетках активировала трансляцию. Увеличение содержания аквапоринов в мембране и их последующая активация приводили к возрастанию водной проводимости ПМ и, соответственно, к увеличению потока воды в клетку в период восстановления тургора. Во время засухи содержание аквапоринов возрастает не только в ПМ, но и в тонопласте Это способствует увеличению водной проводимости тонопласта, что также, по-видимому, необходимо для восстановления ОСВ и тургорного давления.
Изменение активности уже существующих в мембране водных каналов играет важную роль в регуляции водной проводимости мембран при стрессах. Одним из механизмов такой регуляции является фосфорилирование и дефосфорилирование аквапоринов. Фосфорилирование приводит к активации, а дефосфорилирование соответственно к снижению активности водных каналов.
ЗАЩИТНЫЕ И РЕГУЛЯТОРНЫЕ ФУНКЦИИ БЕЛКОВ,ИНДУЦИРУЕМЫХ ВОДНЫМ ДЕФИЦИТОМ
Из множества белков, появление которых в клетках растений вызвано водным дефицитом, одни вовлечены в формирование механизмов устойчивости непосредственно, тогда как другие участвуют в регуляции экспрессии генов, индуцируемых стрессором. В соответствии с этим гены, экспрессируемые в растениях при водном стрессе, подразделяют на функциональные и регуляторные. Первая группа включает гены, которые отвечают непосредственно за формирование механизмов устойчивости, т. е. биосинтез аквапоринов, образующих водные каналы, ферментов, требующихся для биосинтеза осмолитов (пролина, глицин-бетаина, многоатомных спиртов и др.), белков, которые защищают макромолекулы и мембраны (Lea-белков, шаперонов и др.), протеаз и убиквитинов, ускоряющих белковый обмен в стрессовых условиях, а также ферментов, участвующих в детоксикации (супероксиддисмутаза, аскорбатпероксидаза, глутатион-8-трансфераза и др., см. гл. 4 и подразд. 8.6.2).
Вторая группа содержит гены белков, которые участвуют в передаче сигнала при экспрессии других генов, формирующих механизмы устойчивости, таких, например, как гены протеинкиназ, фосфолипазы С и 14-3-3-белков. К этой группе относятся гены транскрипционных факторов, которые «узнают» ДНК- элементы в генах, экспрессируемых при стрессе.
РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ,ИНДУЦИРУЕМЫХ ВОДНЫМ ДЕФИЦИТОМ
Рецепция сигнала
Первым этапом в регуляции экспрессии генов при водном дефиците является рецепция сигнала. Воспринятый клеткой сигнал приводит к включению систем сигнальной трансдукции и активированию белков, образующих цепь передачи сигнала. Имеются данные, свидетельствующие о том, что у растений рецепция сигнала при водном стрессе осуществляется аналогично тому, как это происходит у Е. coli и дрожжей. У этих организмов восприятие изменений осмотического давления наружной среды совершается с помощью сенсорной системы, состоящей из локализованного в мембране осмосенсора {сенсорной киназы) и находящегося в цитоплазме регулятора ответа (рис. 8.10). Эта система воспринимает изменения в натяжении ПМ при водном дефиците. В ПМ дрожжей осмосенсор, трансмембранный белок Slulp, при высокой осмолярности среды активируется путем автофосфорилирования, приводя затем к последовательному фосфорилированию белков цитоплазмы Ypdl и Ssklp, которые образуют регулятор ответа.
MAP-киназный каскад. У дрожжей фосфорилированный белок Ssklp активирует различные пути передачи сигнала, в частности MAP (mitogen activated рго1еш)-киназный каскад, состоящий из трех последовательно фосфорилируемых в присутствии АТФ протеин-киназ: Ssk2p (МАРККК) — МАРКК-кина- зы, Pbs2p (МАРКК) — МАРК-киназы и Hoglp (МАРК) — МАР-киназы (рис. 8.11).
Активированная фосфорилированием MAP-киназа индуцирует экспрессию многих генов дрожжевой клетки при водном и солевом стрессах, в частности генов, кодирующих ферменты биосинтеза глицерина — главного осмолита у дрожжей. Гомологи некоторых компонентов MAP-киназного каскада дрожжевых клеток обнаружены у растений. Экспрессия генов этих компонен-
Водный дефицит
Рис. 8.10. Двухкомпонентная сенсорная система, воспринимающая изменения осмотического давления наружной среды (A.Trewavas, 2000).
Система состоит из локализованного в мембране осмосенсора и находящегося в цитозоле регулятора ответа. Сигнал возникает при изменении натяжения плазмалеммы в ответ на изменение осмотического давления наружной среды. При получении сигнала осмосенсор, подвергаясь автофосфорилированию, активируется. С гистидинового остатка молекулы осмосенсора фосфатная группа затем переносится на остаток аспарагиновой кислоты регулятора ответа. Фосфорилированная молекула регулятора ответа приводит к включению MAP-киназного пути передачи сигнала
ЯдроЯдроГенГенПромоторПромоторРис. 8.11. MAP-киназный путь передачи сигнала (по A.Trewavas, 2000, с изменениями).Рис. 8.11. MAP-киназный путь передачи сигнала (по A.Trewavas, 2000, с изменениями).Фосфорилированные белки регулятора ответа (РО) активируют МАР-киназный каскад, состоящий из МАРККК (МАРКК- киназы), МАРКК (МАРК-киназы) и МАРК (MAP-киназы). Последняя осуществляет прямую регуляцию транскрипционных факторов (ТФ), вовлеченных в индукцию стрессовых белков при водном дефицитеФосфорилированные белки регулятора ответа (РО) активируют МАР-киназный каскад, состоящий из МАРККК (МАРКК- киназы), МАРКК (МАРК-киназы) и МАРК (MAP-киназы). Последняя осуществляет прямую регуляцию транскрипционных факторов (ТФ), вовлеченных в индукцию стрессовых белков при водном дефиците
Ядро
Ядро
Ген
Ген
Промотор
Промотор
Рис. 8.11. MAP-киназный путь передачи сигнала (по A.Trewavas, 2000, с изменениями).
Рис. 8.11. MAP-киназный путь передачи сигнала (по A.Trewavas, 2000, с изменениями).
Фосфорилированные белки регулятора ответа (РО) активируют МАР-киназный каскад, состоящий из МАРККК (МАРКК- киназы), МАРКК (МАРК-киназы) и МАРК (MAP-киназы). Последняя осуществляет прямую регуляцию транскрипционных факторов (ТФ), вовлеченных в индукцию стрессовых белков при водном дефиците
Фосфорилированные белки регулятора ответа (РО) активируют МАР-киназный каскад, состоящий из МАРККК (МАРКК- киназы), МАРКК (МАРК-киназы) и МАРК (MAP-киназы). Последняя осуществляет прямую регуляцию транскрипционных факторов (ТФ), вовлеченных в индукцию стрессовых белков при водном дефиците
тов индуцируется стрессовыми условиями. В частности, у A. thaliana ген МАР-киназы (АТМРКЗ) и ген МАРККК (АТМЕКК1) индуцируются засухой, низкими температурами и высокими концентрациями соли.
Вторичные мессенджеры. В регуляции тургорного давления растительной клетки участвуют вторичные мессенджеры (рис. 8.12). Локализованный в мембране фосфа- тидилинозитол-4,5-дифосфат расщепляется активируемой при осмотическом стрессе фосфолипазой С, освобождая вторичный мессенджер инозитол-1,4,5-трифосфат. Последний индуцирует выход Са +, другого вторичного мессенджера, из вакуоли и эндоплазматического ретикулума в цитозоль и соответственно концентрация Са2+ в нем возрастает. Концентрация Са2+ в цитозоле может увеличиваится также за счет его поступления в клетку через потенциалзависимые Са +-каналы плазмалеммы при индуцируемой стрессором деполяризации этой мембраны. Возросшие концентрации Са + активируют Са +/кальмодулинзависи- мые протеинкиназы (CDPK), что в свою очередь стимулирует биосинтез стрессовых белков.
АБК-зависимые и АБК-независимые гены. Важную роль в регуляции экспрессии генов при осмотическом стрессе играет гормон АБК. Экспрессия многих генов в условиях засухи, засоления или низких температур требует предварительного накопления в тканях эндогенной АБК, тогда как экспрессия других генов происходит без участия АБК. На основании этого и анализа действия АБК на экспрессию индуцируемых водным дефицитом генов в АБК- дефицитном (аба) и АБК-нечувствитель- ном (аЫ) мутантах A. thaliana был сделан вывод, что существуют АБК-зависимые и АБК-независимые пути передачи сигнала в ответной реакции растений на водный дефицит (рис. 8.13).
Несколько транскрипционных факторов и специфических нуклеотидных последовательностей в генах идентифицированы для обоих путей. АБК-индуцируемые гены со-
Рис. 8.12. Участие вторичных мессенджеров, инозитол-1,4,5-трифосфата и ионов Са2+ в путях передачи сигналов, приводящих к индукции стрессовых белков при водном дефиците:
ФЛС — фосфолипаза С; ФИФ2 — фосфатидилинозитол-4.5-дифосфат; ИФ3 — инозитол-1,4,5- трифосфат; ТФ — транскрипционные факторы
АБК-независимые геныАБК-независимые геныАБК-зависимые геныАБК-зависимые геныРис. 8.13. Индукция АБК-зависимых и АБК-независимых генов водным дефицитом. Промоторная область АБК-независимых генов содержит специфическую последовательность нуклеотидов DRE, которая связывается с транскрипционными факторами, белками DREBP и АР2. Промоторная область АБК-зависимых генов содержат нуклеотидную последовательность ABRE, которая связывается с транскрипционным фактором — белком ЕтВР. Помимо ABRE промоторная область АБК-зависимых генов включает сопрягающий элемент СЕ1, взаимодействующий с белком СЕВРРис. 8.13. Индукция АБК-зависимых и АБК-независимых генов водным дефицитом. Промоторная область АБК-независимых генов содержит специфическую последовательность нуклеотидов DRE, которая связывается с транскрипционными факторами, белками DREBP и АР2. Промоторная область АБК-зависимых генов содержат нуклеотидную последовательность ABRE, которая связывается с транскрипционным фактором — белком ЕтВР. Помимо ABRE промоторная область АБК-зависимых генов включает сопрягающий элемент СЕ1, взаимодействующий с белком СЕВР
АБК-независимые гены
АБК-независимые гены
АБК-зависимые гены
АБК-зависимые гены
Рис. 8.13. Индукция АБК-зависимых и АБК-независимых генов водным дефицитом. Промоторная область АБК-независимых генов содержит специфическую последовательность нуклеотидов DRE, которая связывается с транскрипционными факторами, белками DREBP и АР2. Промоторная область АБК-зависимых генов содержат нуклеотидную последовательность ABRE, которая связывается с транскрипционным фактором — белком ЕтВР. Помимо ABRE промоторная область АБК-зависимых генов включает сопрягающий элемент СЕ1, взаимодействующий с белком СЕВР
Рис. 8.13. Индукция АБК-зависимых и АБК-независимых генов водным дефицитом. Промоторная область АБК-независимых генов содержит специфическую последовательность нуклеотидов DRE, которая связывается с транскрипционными факторами, белками DREBP и АР2. Промоторная область АБК-зависимых генов содержат нуклеотидную последовательность ABRE, которая связывается с транскрипционным фактором — белком ЕтВР. Помимо ABRE промоторная область АБК-зависимых генов включает сопрягающий элемент СЕ1, взаимодействующий с белком СЕВР
держат в премоторной области специфическую последовательность нуклеотидов, получившую сокращенное название ABRE (ABA-responsive element). ABRE функционирует как цис-элемент ДНК, вовлеченный в АБК-регулируемую экспрессию генов. Такого рода элемент был сначала идентифицирован в Ет- гене пшеницы (Triticum aestivum), а затем обнаружен в АБК-индуцируемых генах кукурузы (.Zea mays), ячменя, риса, табака и арабидопсиса. Для индукции экспрессии генов необходимо, чтобы ABRE связался с белком EmBPl. В большинстве случаев ABRE достаточен для АБК-регулируемой экспрессии генов, но в некоторых генах ABRE ассоциирован с еще одной нуклеотидной последовательностью, которая называется сопрягающим элементом (СЕ). Например, в гене HVA22 ячменя сопрягающий элемент СЕ1 требуется для экспрессии наряду с ABRE. Для экспрессии таких генов требуется еще один ДНК-связыва- ющий белок, специфичный к СЕ, — СЕВР (coupling element binding protein). ABRE, СЕ и оба белка EmBPl и СЕВР образуют комплекс, индуцирующий экспрессию АБК-зависимого гена. Однако до настоящего времени не ясно, как АБК активирует EmBPl, вызывая его последующее взаимодействие с ABRE и инициацию транскрипции. В ряде генов, регулируемых с участием АБК, обнаружены другие цис-элементы, отличающиеся от ABRE. Индукция таких генов происходит при специфическом связывании этими элементами транскрипционных факторов МУС и MYB.
Премоторная область АБК-независимых генов содержит последовательность нуклеотидов DRE (drought-responsive element). DRE вовлечен в регуляцию генов, индуцируемых непосредственно водным дефицитом и не требующих АБК для экспрессии. Транскрипционные факторы для таких генов — DRE-связыва- ющие белки DREBP и АР2 — обнаружены в ядерном экстракте из A. thaliana.
СОЛЕВОЙ СТРЕСС
Согласно современным оценкам, одна пятнадцатая часть земной суши, включая территории, используемые в сельскохозяйственном производстве, занята засоленными почвами. Приблизительно 5 % земель мировых сельскохозяйственных угодий и почти 20 % орошаемых земель в той или иной степени засолены.
Если содержание суммы неорганических ионов в почве в расчете на ее сухую массу не превышает 0,2 %, то такие почвы считаются незасоленными, от 0,2 до 0,4 % — слабозасоленными, от 0,4 до 0,7 % — среднезасоленными и от 0,7 до 1,0% — сильнозасоленными. При содержании неорганических ионов свыше 1,0 % почвы называют солончаками. В засоленных почвах из катионов преобладает по массе, как правило, Na+, однако встречаются почвы с высоким содержанием Mg + и Са +. Из анионов наибольший вклад в почвенное засоление чаще всего вносят СГ и SO4, но встречается также засоление карбонатного типа.
Растения, эволюционно сформировавшиеся на засоленных почвах и адаптированные к высоким концентрациям солей в почвенном растворе, называют галофитами (от греч. galos — соль, phyton — растение), а сформировавшиеся на незасоленных почвах — гликофитами (греч. glycos — сладкий, phyton — растение). Подавляющее большинство видов сельскохозяйственных культур относится к гликофитам. Гликофиты выдерживают лишь слабое засоление и только
некоторые из них, такие как хлопчатник (Gossipium hirsutum), овес (Ovena cativa), рожь (Secale sereale) и пшеница, — среднее. При высоком содержании солей в почве снижается продуктивность посевов. Галофиты в отличие от гликофитов способны осуществлять жизненный цикл на сильнозасоленных почвах и солончаках. К типичным галофитам относятся растения семейства маревые (Chenopodiaceae), такие, как солерос европейский (Salicomia еигораеа), кохия распростертая (Kochia prostrata), петросимония трехтычинковая (Petrosimonia triandra) и др. Высокое содержание солей в почве не только не подавляет, но даже стимулирует их рост.
ПОВРЕЖДАЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ СОЛЕЙ
При повышенном содержании солей в почве у гликофитов нарушается водный и ионный гомеостаз как на клеточном уровне, так и на уровне целого растения. В свою очередь это ведет к различным токсическим эффектам, которые выражаются в повреждениях биополимеров цитоплазмы. В целом почвенное засоление затормаживает рост и может вызвать гибель растений.
Эффекты, проявляющиеся на клеточном уровне
Первым был открыт эффект соли, связанный с дегидратацией клеток. В начале XX в. А. Ф. Шимпер показал, что в условиях засоления растения теряют воду вследствие высокого осмотического давления почвенного раствора. Выражаясь современным языком, можно сказать, что дегидратация клеток при засолении происходит в результате снижения водного потенциала почвенного раствора. Осмотическое действие соли при этом не зависит от того, какими ионами оно вызвано, важна суммарная концентрация ионов и других осмотически активных веществ в почвенном растворе (см. подразд. 5.4.3).
В 50-х гг. XX в. Б. П. Строгонов обратил внимание на различие симптомов поражений, вызванных у растений хлоридным и сульфатным засолениями. На основе этого была выдвинута концепция токсического действия ионов, согласно которой разные ионы вызывают нарушения метаболизма, приводящие к специфическим токсическим эффектам. В настоящее время осмотическое и токсическое действия солей признаны главными повреждающими факторами на клеточном уровне.
Природа токсического действия ионов, особенно первичных молекулярных повреждений, изучена мало. Известно, что ионы в высоких концентрациях могут дезинтегрировать клеточные мембраны, подавлять активность ферментов и приводить к нарушениям таких жизненно важных функций, как клеточное деление, ассимиляция углерода, поглощение элементов минерального питания и др. NaCl в концентрациях выше 0,4 М ингибирует многие ферменты вследствие нарушения гидрофобно-электростатического баланса сил, поддерживающих структуру белковых молекул. Однако токсические эффекты проявляются уже при гораздо более низких концентрациях соли (меньше 0,1 М), указывая на специфические мишени действия ионов. Практически ничего не известно о мишенях токсического действия ионов хлора. О может конкурировать с РНК и анионными метаболитами, такими, как бикарбонат, карбокси-
латы и фосфаты сахаров, за анионные сайты связывания. Ион Na+ может взаимодействовать с катионными сайтами, вовлеченными в связывание К+, Са2+ и Mg .
Молекулярно-генетические исследования, проведенные на дрожжах 5. cerevisiae, выявили две мишени токсического действия Na+: протеинфосфатазу На12 и рибонуклеазу MRP. Ионы Li+ и Na+ являются сильными ингибиторами На12. Фосфатаза На12 относится к семейству инозитол-фосфатаз, которые требуют для катализа Mg +. Она нужна для превращения в АМФ 3'-фосфоаденозин-5'- фосфата (ФАФ), образующегося при утилизации так называемого активированного сульфата — 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфата (ФАФС) (см. гл. 6). В дрожжевых клетках, обработанных Li+ или Na+ в токсических концентрациях, вследствие ингибирования На12-фосфатазы накапливается ФАФ. Это в свою очередь ингибирует ФАФС-утилизирующие ферменты, ФАФС-редуктазу и сульфотрансферазы, а также экзорибонуклеазы Rati и Xrnl, осуществляющие процессинг РНК. Общее свойство сайтов мишеней токсического действия Na+ у этих ферментов, — слабая связь с Mg + (константа Михаэлиса Кт, находится в миллимолярном диапазоне концентраций Mg +). Сайты образованы фосфатными группами субстратов и карбоксильными группами аминокислот активных центров. При высокой плотности ионов Li+ или Na+ в микроокружении названных выше ферментов происходит вытеснение ионов Mg +, которые необходимы для их функционирования. Ионы К+ противодействуют ингибированию фермента На12 ионами Ма+. Эффект ионов К+ может быть общим для всех мишеней токсического действия Na+.
Факторами, повреждающими макромолекулы, являются активные формы кислорода (АФК) — синглетный кислород, супероксидный радикал, гидро- ксил-радикал, пероксид водорода и ряд других форм. Их концентрации в клетках растений при почвенном засолении и засухе возрастают. Наблюдающиеся в этом случае токсические эффекты не связаны с непосредственным действием ионов на молекулярные мишени. Они возникают в результате вторичных процессов — взаимодействий биополимеров с накапливающимися при стрессе АФК. Процессы, приводящие к образованию АФК, их действие на биополимеры клетки и защитные механизмы, снижающие концентрации АФК в клетках, рассмотрены в гл. 4, подразд. 8.6.
Эффекты, проявляющиеся на уровне целого растения
Высокие концентрации солей, как уже отмечалось, подобно многим другим стрессорам ингибируют рост растений. Ингибирование опосредовано уменьшением содержания в растениях гормона цитокинина, стимулирующего рост, и увеличением содержания ингибирующей рост абсцизовой кислоты (АБК). В условиях стресса в растениях увеличивается также содержание 1-аминоциклоп- ропан-1-карбоновой кислоты — предшественника рост-ингибирующего гормона этилена. Изменения в гормональном статусе растений стимулируют механизмы устойчивости. Многие исследователи считают, что подавление роста при солевом стрессе обусловлено не столько повреждающим действием соли, сколько адаптивными гормональными ответами растения. Такой взгляд подкрепляется тем, что в природе степень устойчивости к действию стрессора часто характеризуется обратной корреляцией со скоростью роста. Медленный
рост позволяет растениям выживать при стрессе, так как освобождает множество ресурсов (строительных блоков и энергии), необходимых для реализации защитной программы.
Один из главных механизмов ингибирования роста — снижение устьичной проводимости. Низкий водный потенциал почвенного раствора при засолении и водном дефиците приводит к потере воды клетками, в частности замыкающими клетками устьиц, что в свою очередь уменьшает апертуру устьичных щелей и, следовательно, снижает скорость поступления в листья СО2, а также транспирационного тока воды. В снижении тургорного давления замыкающих клеток в этих условиях наряду с непосредственным действием соли участвуют процессы, индуцируемые АБК. При накоплении гормона в замыкающих клетках изменяется активность ион-транспортирующих белков ПМ. АБК ингибирует Н+-АТФазу, что вызывает деполяризацию ПМ. При этом инактивируются входные и активируются выходные К+-каналы, активируются также выходные анионные каналы (см. гл. 6 и подразд. 8.3.3). Отток К+ и СГ из замыкающих клеток сопровождается потерей тургора и закрытием устьиц. Последний эффект сберегает воду для растения, но снижает скорость фотосинтеза и ингибирует рост.
Высокие концентрации соли и водный дефицит могут ингибировать рост, влияя на процессы деления и дифференцировки клеток. Подавление роста сопряжено с экспрессией некоторых генов, индуцируемых стрессорным воздействием и не экспрессирующихся в нормальных условиях. К ним относятся, например, гены CBF1, DREB1 и ICK1 у A. thaliana. Продукты этих генов ингибируют процессы клеточного деления и растяжения и таким путем подавляют рост. В частности, продукт ICK1 ингибирует циклинзависимые протеинкина- зы, вовлеченные в индукцию клеточного цикла.
АДАПТАЦИИ, ПРОТИВОДЕЙСТВУЮЩИЕОСМОТИЧЕСКОМУ ЭФФЕКТУ СОЛЕЙ
К осмотическому действию солей растения приспосабливаются теми же способами, что и к обезвоживанию в условиях засухи. В основе приспособительных процессов лежит биосинтез осмолитов в цитоплазме (см. подразд. 8.2.2) и накопление неорганических ионов в вакуолях. Механизмы аккумуляции ионов в вакуолях обсуждаются в следующем подразделе.
ИОННОЕ ГОМЕОСТАТИРОВАНИЕ ЦИТОПЛАЗМЫРАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ КАК СТРАТЕГИЯ ИЗБЕЖАНИЯТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ СОЛЕЙ
В условиях солевого стресса токсическое действие ионов наблюдается при их накоплении в цитоплазме. У растений, различающихся по устойчивости к солям, эффективность механизмов, поддерживающих ионный гомеостаз, различна. В норме концентрации Na+ и СГ в цитоплазме клеток гликофитов и галофитов поддерживаются приблизительно на одинаковом уровне. Этот уровень, как правило, не превышает нескольких ммоль/кг сырой биомассы. У гало-
фитов способность поддерживать такие низкие концентрации Na+ и СГ в цитоплазме выработалась при росте на засоленных почвах. В отличие от галофитов гликофиты не в состоянии справиться с задачей поддержания низких концентраций ионов в цитоплазме в условиях засоления. Способность солеустойчивых растений поддерживать при засолении цитоплазматические концентрации ионов на низком уровне подтверждается, в частности, высокой чувствительностью к Na+ и СГ биополимеров цитоплазмы их клеток. Показано, например, что in vitro гомологичные ферменты, выделенные из пресноводных и галотолерантных (солеустойчивых) водорослей, а также их органеллы проявляют практически одинаково высокую чувствительность к NaCl (рис. 8.14).
Стратегия избежания токсического действия солей, основанная на ионном гомеостатировании цитоплазмы, сформировалась на ранних этапах эволюционного развития органического мира. Из организмов, обитающих в наше время на засоленных субстратах, только у галофильных (солелюбивых) бактерий адаптация к токсическому действию солей строится не на основе регуляции цитоплазматических концентраций ионов, а на основе специфической структуры их белков, позволяющей белкам функционировать в микроокружении с высокой концентрацией Na+. Примером таких бактерий является Halobacterium halobium. Водорастворимые белки цитозоля, а также мембраносвязанные и рибосомальные белки клеток галофильных бактерий характеризуются повышенным содержанием дикарбоновых аминокислот (глутаминовой и аспарагиновой), вследствие чего изоэлектрические точки этих белков смещены в кислую
Рис. 8.14. Зависимости скорости выделения О2 от концентрации NaCl у интактных клеток водорослей при фотосинтезе (Л) и у выделенных из этих же водорослей хлоропластов в реакции Хилла (Л) (Ю. В.Балнокин, 1995).
Три вида водорослей различаются по солеустойчивости: 1 — пресноводная водоросль Chlorella pyrenoidosa; 2 — морская водоросль Dunaliella maritima; 3 — водоросль Dunaliella salina, обитающая в водоемах с предельно высокими концентрациями NaCl. При измерении скорости выделения О2 клетки и выделенные из них хлоропласты были освещены светом насыщающей интенсивности. Несмотря на резкие различия в солеустойчивости этих организмов, о чем свидетельствуют различия в оптимальных концентрациях NaCl для фотосинтеза интактных клеток, выделенные из них хлоропласты характеризуются одинаковой чувствительностью к соли
Белок, активный в присутствии высоких концентраций ионов натрия
При отсутствии ионов натрия белок неактивен
Рис. 8.15. Кислые белки галофильных бактерий.
Водорастворимые, мембраносвязанные и рибосомальные белки галобактерий характеризуются высоким содержанием дикарбоновых аминокислот. Для поддержания структуры таких белков необходимы высокие концентрации ионов Na+ или К+, нейтрализующих ионизованные карбоксильные группы
область (рис. 8.15). В нейтральной среде цитоплазмы кислые белки несут отрицательные заряды, которые должны быть нейтрализованы катионами. Наличие ионов в высоких концентрациях в цитоплазме не только допустимо, но даже необходимо для таких белков В противном случае за счет электростатического отталкивания неизбежна денатурация. В клетках галофильных бактерий суммарная концентрация Na+ и К+ измеряется молями. По-видимому, столь высокие концентрации ионов в клетках галобактерий нужны также для стабилизации гидрофобных взаимодействий в белках. Клетки всех прочих современных организмов, включая остальные прокариоты, клетки животных, растений и грибов, поддерживают низкие концентрации Na+ (и СГ) в цитоплазме.
Поддержание цитоплазматических концентраций того или иного иона на определенном уровне основывается на балансе входящих и выходящих потоков этого иона. В частности, цитоплазматические концентрации Na+ определяются балансом скоростей пассивного поступления Na+ в цитоплазму и его активного выведения (экспорта) из цитоплазмы.
Для простоты рассмотрим сначала клетку без крупной центральной вакуоли (рис. 8.16, А). Такое строение типично для меристематических клеток высших растений, а также для многих морских и пресноводных одноклеточных водорослей. Наличием компартмента, образованного микровакуолями, можно пренебречь, так как они занимают незначительную часть клеточного объема. Поступающие в цитоплазму такой клетки ионы Na+ по градиенту электрохи-
Рис. 8.16. Потоки Na+ через плазмалемму и тонопласт у морских водорослей:
[Na+] 500 мМ
Б
А — клетка морской микроводоросли, лишенная крупной центральной вакуоли. Ионы Na4 поступают пассивно из наружной среды в цитоплазму через ионные каналы плазмалеммы. Низкие концентрации Na4 в цитоплазме поддерживаются благодаря работе локализованного в ПМ Na4- насоса. Транспорт Na4 наружу происходит с затратой метаболической энергии; Б — клетка морской водоросли с крупной центральной вакуолью. Ионы Na4 поступают пассивно в цитоплазму не только из наружной среды, но и из вакуоли. Активный транспорт Na4 осуществляется как в наружную среду, так и в вакуоль. Градиенты электрохимического потенциала Na4 формируются на ПМ и тонопласте
мического потенциала ApNa+, т.е. пассивно, откачиваются обратно в окружающий клетку раствор. Ионные насосы, экспортирующие Na+, локализованы в этом случае в ПМ.
Клетки высших растений (за исключением меристематических), многоклеточных морских водорослей (макрофитов) и некоторых одноклеточных водорослей имеют крупную центральную вакуоль. Помимо экспорта Na+ из цитоплазмы в наружную среду они могут осуществлять активный транспорт этого иона в вакуоль, что приводит к генерации ApNa+ также и на тонопласте (рис. 8.16, 5). Необходимо отметить, что физиологическая роль Na+-Hacoca тонопласта и осуществляемого им активного переноса Na в вакуоль не сводится к поддержанию низких концентраций Na+ в цитоплазме. Натриевый насос тонопласта обеспечивает также накопление Na+ в вакуоли, благодаря чему повышается осмотическое давление вакуолярного сока. Это в свою очередь вносит вклад в формирование градиента водного потенциала между окружающим клетку раствором и клеткой и обеспечивает таким образом ток воды, направленный внутрь клетки. Особенно ярко выражена двойная физиологическая роль активного транспорта Na+ через тонопласт у соленакапливающих галофитов. Примерами могут служить S. еигораеа, сведа высокая (Suaeda altissima), К. prostrata и др. Этим растениям в условиях экстремально высоких концентраций Na+ в почвенном растворе приходится не только поддерживать цитоплазматические концентрации Na+ на нетоксическом уровне, но и решать задачу поглощения корнями воды из почвенного раствора, водный потенциал которого за счет растворенных солей может достигать -5 МПа и меньше. Эти растения для
поддержания водного потенциала в клетках на более низком уровне, чем в почвенном растворе, аккумулируют Na+ и Cl в вакуолях до концентраций 1,0-1,5 М.''
Поступление Na+ и СГ в клетки корняиз почвенного раствора
Ионы поступают в цитоплазму клеток эпидермиса и коры корня из почвенного раствора по градиенту электрохимического потенциала. Градиент электрохимического потенциала иона j выражается соотношением
Сср
^ = КТУп-^-^ГЕм,(8.1)
где R — газовая постоянная; Т — абсолютная температура; F— число Фарадея; j — концентрация иона j в почвенном растворе; С) — концентрация иона j в цитоплазме; гу — элементарный заряд иона j; Ем — трансмембранный электрический потенциал.
При высокой солености среды С^а+ > Сца+, поэтому концентрационная составляющая градиента электрохимического потенциала Na+ положительна, т. е. направлена из почвенного раствора в клетку. Член, отражающий электростатические взаимодействия, в уравнении (8.1) стоит со знаком «минус». Так как Ем отрицателен («минус» внутри клетки) и zNa+ равен +1, выражение (-^ца+Т£'м) в уравнении (8.1) также принимает положительное значение. Это означает, что и электрическая составляющая градиента Ацца4 тоже является движущей силой переноса Na+ из среды в цитоплазму. При отсутствии засоления, когда концентрация Na+ в почвенном растворе не превышает 1 мМ, в жидкой среде цитоплазмы она может достигать нескольких мМ, т. е. С^а+ < С иа+. Концентрационный член в уравнении (8.1) в этом случае становится отрицательным, однако за счет электрической составляющей градиент электрохимического потенциала Na+ в целом может оказаться положительным, означая, что и в отсутствие засоления Na+ будет пассивно поступать в клетки.
Ион хлора несет отрицательный заряд (zCr = -1), поэтому электрическая составляющая его электрохимического градиента Ацсг всегда направлена из клетки в среду. Другими словами, отрицательный внутри клетки Ем создает препятствие для входа СГ в цитоплазму. Отсюда следует, что только концентрационная составляющая электрохимического градиента СГ может обеспечить пассивное поступление СГ в клетки корня. Необходимые для этого условия создаются при засолении почвы хлористым натрием. При этом Ссг > Сд- и
*£СР
концентрационный член RT\n-^ положителен. Противодействие для входа _^ст
С1 в клетки со стороны отрицательного внутри электрического потенциала в этих условиях ослабляется NaCl-индуцированной деполяризацией плазмалем- мы (ПМ).
Скорости поступления иона j (его потоки) в цитоплазму из наружной среды и вакуоли (рис. 8.16, Б) прямо пропорциональны движущим силам (Ajly) и коэффициентам ионной проницаемости плазмалеммы и тонопласта (Pj\ Уравнение (8.2), известное как уравнение потока Гольдмана, связывает поток иона
j (Jj) через мембрану (количество иона j, переносимое через единицу площади мембраны в единицу времени) с концентрационной и электрической составляющими Ащ, а также с Ру
Т. - J'. _ J" - ^j^M ^ /Г ср _ ^^„ZjFE^/RT \ /о пч J RT e^FE,dRT-V J J
где /у — приток иона в клетки; J" — его отток; их разность составляет суммарный поток Jy, Pj — коэффициент проницаемости мембраны для иона j.
Анализ уравнения (8.2) приводит к важному практическому выводу, что ионная проницаемость мембран в значительной мере определяет степень соле- устойчивости растительного организма, поскольку концентрация того или иного иона в цитоплазме, а, следовательно, и сила его токсического действия в значительной степени зависит от пассивного потока этого иона через мембрану из среды в клетку. Исследования транспорта Na+ через ПМ на модельной системе одноклеточных микроводорослей, у которых механизмы регуляции цитоплазматических концентраций Na+ находятся в основном в ПМ, показали, что PNa* плазмалеммы тем ниже, чем выше концентрация NaCl в среде обитания, т.е. чем выше устойчивость организма к соли (табл. 8.1).
У Dunaliella salina, обитающей в водоемах с предельно высоким содержанием NaCl и способной осуществлять жизненный цикл даже в насыщенном растворе NaCl, /*Na на два порядка ниже, чем у пресноводной водоросли Chlorella pyrenoidosa и приближается к PNa+ искусственных липидных пленок. При аккли- мации Ch. pyrenoidosa к среде, содержащей 340 мМ NaCl, PNa+ ПМ снижался почти на порядок, свидетельствуя о том, что NaCl индуцирует перестройки в химическом составе и микроструктуре мембраны, направленные на ограничение ионных потоков в цитоплазму при высокой солености среды.
Следует отметить, что ионная проницаемость плазматической мембраны и других мембран может быстро изменяться в ответ на изменение ионного состава среды. Это связано с изменением активности ионных каналов. Измерения PNa+ ПМ водорослей (табл. 8.1) были проведены при постоянных концентрациях NaCl и других ионов в средах культивирования. Установленная на микроводорослях закономерность, выражающаяся в обратной корреляции между величиной PNa- и уровнем засоления среды обитания, не может быть безоговорочно перенесена на высшие растения. Организация транспорта ионов в целом
Таблица 8.1. Коэффициент проницаемости плазматической мембраны для ионов Na+ (^NaO У различающихся по устойчивости к NaCl водорослей* (Ю.В.Балнокин, 1995)
Параметр
Chlorella pyrenoidosa
Dunaliella maritime
Dunaliella salina
Концентрация NaCl в среде культивирования, мМ
Коэффициент проницаемости Т^,, М - С"1
0
8,5 IO"12
340
1,1 10 12
500
5,4- IO'14
2000
1,6 IO14
* Chlorella pyrenoidosa — пресноводная водоросль; Dunaliella maritime — морская планктонная водоросль; Dunaliella salina — экстремально галотолерантная водоросль, обитающая в водоемах с предельно высокими концентрациями NaCl
растении выдвигает в отношении ионной проницаемости мембран клеток разных органов и тканей разные требования. Ответ на вопрос, как связана величина PNa+ той или иной мембраны с солеустойчивостью растения, осложняется тем обстоятельством, что разные виды растений, даже близкие между собой по степени солеустойчивости, имеют свои особенности организации дальнего транспорта ионов.
Транспортные белки плазматической мембраны,вовлеченные в перенос Na+ и СГ из наружной среды в цитоплазму
Na+ и другие ионы не проникают в клетки через липидный бислой мембраны. Вход ионов в клетки осуществляется через ионные каналы, а также с помощью переносчиков. Ка+-селективные каналы, подобные №+-селективным каналам животных клеток, в растительных клетках не найдены. Применение электрофизиологических методов, и особенно метода регистрации токов одиночных ионных каналов (patch clamp), в сочетании с молекулярно-биологическими подходами позволило обнаружить в ПМ клеток корней несколько белков, через которые Na+ входит в клетки, и в ряде случаев идентифицировать их на молекулярно-генетическом уровне. К таким белкам относятся К -каналы плаз- малеммы, обладающие низким сродством к ионам К+ {Кт в миллимолярном диапазоне концентраций К ), низкоселективные ионные каналы и высокоаффинные переносчики К+ (Кт в микромолярном диапазоне концентраций). Ниже приведена более подробная информация об этих белках (рис. 8.17).
Входные {inward rectifying) Кканалы — активируются при гиперполяризации ПМ, т. е. при смещении Ем к более отрицательным значениям. Они обнаруживают высокую K+/Na+ селективность при физиологических концентрациях К+ и Na+ в наружной среде, однако при высоких концентрациях солей натрия в среде могут вносить существенный вклад в поглощение Na+ клетками. Такие каналы обнаружены во многих растениях, их транспортные свойства хорошо изучены электрофизиологическими методами. Из корней A. thaliana выделен ген входных К+-каналов — АКТ1.
Выходные {outward rectifying) ^каналы — активируются в ответ на деполяризацию ПМ, т. е. при смещении Ем к более положительным значениям. При деполяризации ПМ через выходные К+-каналы может осуществляться диффузия К+ из цитоплазмы в наружную среду. Через эти же каналы Na+ может диффундировать из среды в цитоплазму. Несколько каналов этого типа было идентифицировано на молекулярно-генетическом уровне, например, КСО1 в клетках A. thaliana. Один из них, известный как NORC, обладает слабой избирательной способностью по отношению к транспортируемым катионам и активируется возрастающими концентрациями Са + в цитозоле.
Потенциалнезависимые катионные VIC {voltage-independent channel)-каналы — обладают относительно низкой K+/Na+ селективностью и, в отличие от потенциалзависимых входных и выходных К+-каналов, не изменяют ионной проводимости при изменении трансмембранного электрического потенциала.
Из высокоафинных К+-транспортирующих механизмов в поглощении Na принимает участие HKTl-переносчик — К+,Ка+-симпортер. Этот транспортный белок переносит два иона в одном направлении (симпорт). НКТ1 был
выделен из корней пшеницы. Была показана тканеспецифическая экспрессия гена НКТ1 в клетках коры корня. Переносчики, подобные НКТ1, обнаружены также в A. thaliana и ячмене. Первоначально НКТ1 был описан как К+,Н+- симпортер, при участии которого корни осуществляют поглощение иона К+ из среды с его микромолярными концентрациями. Ионы калия при этом транспортируются в клетки за счет градиента электрохимического потенциала Н . Позже было показано, что при высокой солености среды для энергизации поглощения К+ вместо Ацн+ используется ApNaA и ионы К+ в этом случае поглощаются клетками вместе с ионами Na+.
Исследования транспорта Na с помощью радиоактивного изотопа 22Na+ и электрофизиологических методов показали, что из вышеперечисленных транспортных белков ПМ наибольший вклад в поглощение Na+ клетками корней вносят VIC-каналы. Результаты этих экспериментов имеют важное практическое значение, поскольку обнаруживают одну из потенциальных молекулярных мишеней для манипуляций с геномом растений методами генетической инженерии в целях повышения солеустойчивости растений. VIC-каналы, однако, до настоящего времени не идентифицированы на молекулярно-генетическом уровне. Существенно, что Са +, конкурируя за места связывания с Na+, блокирует VIC-каналы и ингибирует поглощение Na+ корнями. Это согласуется с известной способностью солей кальция повышать урожайность некоторых культур на засоленных почвах.
Поступление ионов СГ в клетки растений при высоких концентрациях NaCI в почвенном растворе происходит через анионные каналы ПМ по градиенту электрохимического потенциала (рис. 8.17; см. рис. 8.20). Когда наружная концентрация NaCI повышается, более быстрая диффузия в клетки Na+ по сравнению с СГ приводит к диссипации £м на ПМ. Градиент электрохимического потенциала СГ смешается вследствие этого к более положительному значению, способствуя пассивному входу СГ в клетки корня.
Анионные каналы обнаружены в мембранах высших растений, водорослей и грибов. Методом регистрации токов одиночных ионных каналов в ПМ и
рНцит7,0 —7,4
Рис. 8.17. Транспортные белки плазмалеммы (ПМ) через которые осуществляется вход Na+ и СГ в клетки.
Различные К^-транспортирующие белки ПМ вовлечены в перенос Na*: входные Кн-каналы, АКТ1; выходные К+-каналы, NORC; потснциалнезависимые VIC-каналы и К',№*-симпортер, НКТ1. Вход СГ осуществляется через анионные каналы и Н+,СГ-симпортер, энергизуемый A^hS который генерируется Н+-АТФазой. Ем — потенциал мембраны
тонопласте растительных клеток было выявлено несколько типов каналов с различной избирательностью по отношению к анионам, разными свойствами и кинетическими характеристиками. До настоящего времени твердо не установлено, какой тип анионных каналов вовлечен в перенос СГ в клетки при почвенном засолении. В ПМ клеток корней пшеницы обнаружены анионные каналы, активирующиеся при деполяризации мембраны, а также в ответ на повышение концентрации Са + в цитоплазме и анионов в наружной среде. Такие условия возникают при увеличении наружной концентрации NaCl. Эти каналы относятся к группе так называемых «быстрых» анионных каналов, характеризующихся миллисекундной кинетикой транспорта СГ. Предполагается, что именно через них С1 поступает в клетки корня при повышении концентрации соли в среде. На основании гомологии с СГ-каналами животных клеток некоторые анионные каналы идентифицированы на молекулярно-генетическом уровне, в частности CLC-Ntl и CLC-Nt2 — в растениях табака, AtCLC-a-d — у арабидопсиса, St-CLC — у картофеля. При этом, однако, локализация, функциональные характеристики и физиологическая роль продуктов идентифицированных генов остаются нераскрытыми.
Через некоторое время после возрастания наружной концентрации соли и входа Na+ и СГ в клетки обмен веществ и ионный гомеостаз клеток переходят в новое стационарное состояние. Считается, что после достижения нового стационарного состояния и реполяризации ПМ СГ транспортируется в клетки против градиента электрохимического потенциала с помощью СГ, Н -симпортера, который использует Ацщ как движущую силу для входа СГ в клетки.
Экспорт Na и СГ из цитоплазмы
Низкие концентрации Na* и СГ в цитоплазме при высокой солености среды поддерживаются не только за счет ограничения входных потоков этих ионов, но и благодаря их энергозависимому экспорту из цитоплазмы. Экспорт может осуществляться в двух направлениях: обратно через ПМ в экстрацеллюлярное пространство и в вакуоль через тонопласт. Ниже рассмотрены Na+- и СГ-экс- портирующие механизмы плазмалеммы и тонопласта.
Na/H-антипортер плазматической мембраны — представляет собой механизм ион-обменной диффузии, который осуществляет перенос Na+ из цитоплазмы в наружную среду в обмен на Н+ (рис. 8.18). Экспорт Na+ происходит против градиента электрохимического потенциала этого иона за счет энергии ДцН' и является вторично активным видом транспорта. Генерация Ацщ осуществляется Н+-АТФазой ПМ. На функциональном уровне Ка+/Н+-антипортер обнаружен в ПМ высших растений, водорослей и дрожжей. Недавно ген SOS1, кодирующий На+/Н'антипортер ПМ, выделен из A. thaliana.
Первичный Na+-Hacoc (Na -АТФаза). В плазматической мембране некоторых дрожжей и галотолерантных водорослей обнаружен первичный Na+-Hacoc, который является Na -транспортирующей АТФазой (рис. 8.18). Na -АТФазы транспортируют Na+ из цитоплазмы в наружную среду за счет энергии фосфатных связей АТФ. Эти ферменты относятся к семейству АТФаз P-типа, образующих в каталитическом цикле фосфорилированный интермедиат. Na4-ATФaзa из дрожжей 5. cereuisiae исследована на молекулярно-генетическом уровне. Экспрессия
Ем =-140 мВЕм =-140 мВрНцит 7,0 —7,4рНцит 7,0 —7,4Рис. 8.18. Экспорт Na* из цитоплазмы в наружную среду.Рис. 8.18. Экспорт Na* из цитоплазмы в наружную среду.
Ем =-140 мВ
Ем =-140 мВ
рНцит 7,0 —7,4
рНцит 7,0 —7,4
Рис. 8.18. Экспорт Na* из цитоплазмы в наружную среду.
Рис. 8.18. Экспорт Na* из цитоплазмы в наружную среду.
Перенос Na* в среду осуществляется №*/Н*-антипортером плазмалеммы (SOS1) против градиента электрохимического потенциала. Источником энергии для переноса Na* является Дрн*> генерируемый Н*-АТФазой плазмалеммы (ПМ). В плазмалемме некоторых водорослей и грибов наряду с №*/Н*-антипортером и Н*-АТФазой функционирует первичный Na*-nacoc, которым является Na*-тpaнcпopтиpyющaя АТФаза
гена ENA1, кодирующего Na+-ATФaзy из этого организма, существенно стимулирует экспорт Na , а также Li+ из цитоплазмы и вносит заметный вклад в солеустойчивость этого организма. Na^-АТФазы из галотолерантных водорослей подробно исследованы на функциональном уровне. Установлено, что Na+- АТФаза Tetraselmis viridis осуществляет перенос Na+ в обмен на Н+, тогда как фермент из Heterosigma akashivo по своим свойствам близок Na+,K+-ATФaзe животных клеток. Подобного рода На+-транспортирующие АТФазы в клетках высших растений не обнаружены
Na+/H+-aiiTMnopTep тонопласта. Подобно тому, как №+/Н+-антипортер плазмалеммы переносит Na+ из цитоплазмы в экстрацеллюлярное пространство, снижая цитоплазматические концентрации Na+, Ка+/Н+-антипортер тонопласта переносит Na+ в вакуоль, выполняя ту же самую физиологическую функцию (рис. 8.19). Наряду с Кач/Н+-антипортером тонопласта ключевым транс-
Рис. 8.19. Депонирование Na* в вакуоли.
Транспорт Na* в вакуоль осуществляется №*/Н*-антипортером тонопласта (NHX) против градиента электрохимического потенциала. Источником энергии для переноса Na* является Ддн+, генерируемый Н*-АТФазой и Н*-пирофосфатазой (ФФН) тонопласта (Т). Через катионные каналы тонопласта, характеризующиеся низкой избирательной способностью, происходит утечка Na* из вакуоли в цитоплазму
портным механизмом в этом процессе является локализованная в тонопласте Н -АТФаза. Напомним, что последняя относится к АТФазам V-типа, ее функция состоит в переносе Н+ из цитоплазмы в вакуоль и генерации таким образом Ацн* на тонопласте. В генерации на тонопласте Лцн+ принимает участие также Н -транспортирующая пирофосфатаза этой мембраны. Na/ГГ-антипор- тер и Н+-АТФаза тонопласта играют чрезвычайно важную роль в солеустойчи- вости высших растений, так как образуют у них главную систему экспорта Na+ из цитоплазмы. Как детерминанты солеустойчивости они привлекают особое внимание исследователей. Использование молекулярно-биологических подходов позволило идентифицировать ген №+/Н+-антипортера тонопласта (AtNHX) в A. thaliana.
Системы экспорта СГ, локализованные в плазматической мембране и тонопласте. При солевом стрессе поступающие в клетки корня ионы СГ, так же как ионы Na , должны выводиться назад в экстрацеллюлярное пространство или депонироваться в вакуолях (рис. 8.20). Экспорт СГ из цитоплазмы через ПМ или тонопласт, как и его вход, происходит через анионные каналы. Направле-
Клеточная стенка
Рис. 8.20. Транспортные белки плазмалеммы и тонопласта, вовлеченные в поглощение и экспорт СГ в клетках растений.
Перенос СГ через плазмалемму (ПМ) и тонопласт (Т) осуществляется через анионные каналы. Направление движения СГ (в цитоплазму или из цитоплазмы) определяется направлением градиентов электрохимических потенциалов СГ на этих мембранах. При солевом стрессе происходит NaCl-индуцированная деполяризация ПМ. В этих условиях градиент электрохимического потенциала СГ (Дца ) на ПМ направлен из наружной среды в цитоплазму и СГ поступает в клетки. При отсутствии засоления СГ может поглощаться клеткой с помощью Н+,СГ-сим- портера, использующего для этого Дрн+ как движущую силу. Экспорт СГ из цитоплазмы через анионные каналы происходит при гиперполяризации ПМ и тонопласта. Гиперполяризация происходит при включении Н*-АТФаз ПМ и тонопласта, а также Н*-ФФназы тонопласта. При гиперполяризации градиент электрохимического потенциала СГ на этих мембранах приобретает такое направление, что СГ транспортируется из цитоплазмы в наружную среду и вакуоль
ние движения ионов С1 (вход в цитоплазму или выход из нее) определяется направлением градиентов электрохимических потенциалов СГ на ПМ и тонопласте. В связи с этим Н+-АТФаза ПМ, Н+-АТФаза тонопласта и Н+-пиро- фосфатаза тонопласта — генераторы электрических потенциалов на этих мембранах (минус на цитоплазматической стороне для обеих мембран) — играют важнейшую роль в экспорте СГ из цитоплазмы. Включаясь, эти транспортные белки приводят к гиперполяризации ПМ и тонопласта и соответственно к изменению электрохимического градиента ионов СГ, так что последние транспортируются из цитоплазмы наружу и в вакуоль. Предполагают, что анионные каналы, осуществляющие экспорт СГ, активируются в ответ на гиперполяризацию мембран. Эти анионные каналы до настоящего времени остаются неизученными.
К7Ма+-селективность — индикатор солеустойчивостирастений
Калий как макроэлемент необходим для роста и развития всех растений. Напротив, натрий важен для сравнительно небольшого числа видов. Во всех живых клетках цитоплазматические концентрации К+ относительно велики, тогда как концентрации Na+ относительно низкие. У растений концентрации К+ в цитоплазме составляют от нескольких десятков до 200 ммоль/кг, тогда как концентрации Na+ не превышают нескольких ммоль/кг, а чаще составляют несколько сот мкмоль/кг. В почвенном растворе К+ и Na конкурируют за поглощение клетками корня. Эта конкуренция может иметь серьезные негативные последствия для растений при засолении, когда концентрация Na в почвенном растворе существенно превышает концентрацию К . В связи с этим способность клеток сохранять высокое отношение К /Na в цитоплазме при высокой солености среды рассматривают как одно из свидетельств высокой солеустойчивости растения. Низкие концентрации Na+ и высокие концентрации К+ в животных клетках поддерживаются благодаря функции Na , К -АТФазы. В цитоплазме клеток растений преимущественное содержание К по сравнению с содержанием Na+ в нормальных условиях обусловлено, во-первых, ионной избирательностью транспортных систем ПМ, через которые К и Na проникают в клетки, и, во-вторых, экспортом Na+ (но не К ) из цитоплазмы. При высокой солености среды сниженная активность ионных каналов и переносчиков, через которые Na+ поступает в клетки, и повышенная активность систем, экспортирующих Na+, могли бы затормозить накопление Na в цитоплазме и этим повысить K+/Na+ отношение. Активность и/или количество молекул этих белков в расчете на единицу площади мембраны определяют отношение K+/Na+ в цитоплазме.
Как отмечалось выше, VIC-каналы ПМ — главные «ворота» для входа Na в клетки корня при засолении, однако о регуляции активности VIC-каналов известно очень мало. Некоторая информация имеется по поводу регуляции активности систем, экспортирующих Na+ из цитоплазмы. Показано, что у A. thaliana экспрессия генов S0S1 и AtNHX, кодирующих №+/Н+-антипортеры ПМ и тонопласта соответственно, возрастает в ответ на внесение в почву NaCl. Мутации по S0S1 делали растения чувствительными к NaCl. Известно также, что
при действии на растение NaCI возрастает активность Н+-АТФаз ПМ и тонопласта. NaCl-индуцированная стимуляция активности АТФаз происходит за счет увеличения числа молекул фермента в мембранах.
ИНТЕГРАЦИЯ КЛЕТОЧНЫХ МЕХАНИЗМОВ УСТОЙЧИВОСТИ К ВОДНОМУ ДЕФИЦИТУ И ВЫСОКИМ КОНЦЕНТРАЦИЯМ СОЛЕЙ
В ЗАЩИТНУЮ СИСТЕМУ ЦЕЛОГО РАСТЕНИЯ
В предыдущих подразделах рассматривались функции отдельных клеток, направленные на противодействие осмотическому и токсическому эффектам солей. В этом подразделе показано, как защитные механизмы отдельных клеток складываются в единую систему, позволяющую решать эти задачи в стрессовых условиях на уровне целого организма. Как указывалось выше, одна из основных стратегий в адаптации к высоким концентрациям солей, проявляющаяся на клеточном уровне, состоит в поддержании низких концентраций Na+ и СГ в цитоплазме и создании таким путем благоприятного микроокружения для функционирования цитоплазматических биополимеров. Одновременно за счет биосинтеза осмолитов в цитоплазме и депонирования этих ионов в вакуолях клетки поддерживают ОСВ на необходимом для жизнеобеспечения уровне.
С появлением в ходе эволюции многоклеточных организмов, дифференцированных на органы и ткани, наряду с прежней появилась новая стратегия в водном обмене и ионном гомеостатировании. Стало важным, во-первых, поддерживать водный ток в системе: почва —корень—побег, во-вторых, избегать накопления ионов, присутствующих в среде в высоких концентрациях, в молодых, активно метаболизирующих частях растения, прежде всего в меристематических тканях и генеративных органах. Известно, что в меристематических клетках, цветках, семенах и плодах содержание Na+ и СГ в расчете на сырую биомассу не превышает нескольких ммоль/кг даже при сильном почвенном засолении.
545545Вода и растворенные в ней вещества движутся из почвенного раствора в клетки эпидермиса и коры. Далее они транспортируются в радиальном направлении к центру корня и затем по ксилеме вверх, в листья. Движение ионов в радиальном направлении корня, также как и движение воды (см. гл. 5), может осуществляться по апопласту (апопластный путь), и через клетки (путь от клетки к клетке). За счет функционирования локализованных в ПМ и тонопласте ион- транспортирующих белков формируется ионный состав цитоплазмы клеток корня, в котором содержание Na+ и СГ ограничено, а К доминирует над Na . Значительная часть ионов, передвигающаяся в радиальном направлении корня, достигнув эндодермы, вынуждена из-за поясков Каспари пересекать ПМ и входить в цитоплазму клеток этой ткани, однако наличие обходных путей (пропускные клетки эндодермы и незрелые ткани кончика корня) позволяет ионам передвигаться и через апопласт. Эндодерма, таким образом, не может быть абсолютным барьером для ионов, хотя мембраны ее клеток вносят существенный вклад в регуляцию ионных потоков через корень. В связи с этим, когда интенсивность транспирации высока, апопластный путь играет заметную роль в транспорте Na+ и СГ. Ионы движутся в этом случае с массовым потоком
545
545
18 Физиология растений
воды и растворенных веществ по градиенту гидростатического давления (гидравлический поток). При низкой интенсивности транспирации движение Na+ и С1 осуществляется преимущественно от клетки к клетке. В этот путь движения ионов вовлечены ионные каналы, переносчики и ион-транспортирующие АТФазы. Для транспорта ионов в растении очень важен этап загрузки ионами ксилемы. Функцию загрузки выполняет плазматическая мембрана паренхимных клеток, окружающих ксилему. Показано, что у гликофитов в норме основным по массе катионом, транспортируемым в ксилему, является К+, а перенос К из клеток обкладки в ксилему осуществляется через активируемые при деполяризации ПМ выходные К+-каналы. У галофитов, а также при высокой солености среды и у гликофитов из транспортируемых в ксилему катионов доминирует Na+. Установлено, что у A. thaliana перенос ионов Na+ из паренхимных клеток обкладки в ксилему осуществляет На"7Н+-антипортер ПМ этих клеток, кодируемый геном SOS1. У ячменя в паренхимных клетках, прилегающих к сосудам ксилемы корня, идентифицированы анионные каналы, через которые происходит загрузка ксилемы ионами СГ. Исследование транспорта СГ через эти каналы показало, что они относятся к анионным каналам так называемого «медленного» типа. Кинетика транспорта СГ через них характеризуется секундным диапазоном.
При движении ксилемного сока вверх между ним и клетками, прилегающими к ксилеме, происходит обмен ионов, в результате которого ионный состав раствора, достигающего клеток листьев, существенно отличается от ионного состава первичного ксилемного сока в корне. Оказавшись в листьях, ионы Na и С1 проникают в клетки и там депонируются в вакуолях, повышая осмотическое давление вакуолярного сока. Процесс депонирования Na+ и СГ в вакуолях наиболее ярко выражен у галофитов. Следует отметить, что депонирование Na+ и СГ наблюдается также и у гликофитов, которые характеризуются относительно высокой устойчивостью к водному дефициту и высоким концентрациям солей.
Согласованное функционирование ион-транспортирующих систем в отдельных клетках обеспечивает при стрессах поддержание низких концентраций Na+ и Cl в цитоплазме самих клеток, низкое содержание Na+ и СГ в генеративных органах и активно метаболизирующих тканях и вносит вклад в формирование градиентов водного потенциала в системе: почва—корень—побег, путем накопления Na+ и О в вакуолях.
Как уже отмечалось, стратегия ионного транспорта и осморегуляции, основанная на накоплении ионов в вакуолях надземных органов, характерна для большинства галофитов, в том числе и тех, чьи листья снабжены солевыводящими, как у кермека (Limonium gmelinii), и солелокализующими, как у М. ciystallinum, железами. Соль в вакуолях, занимающих большую часть клеточного объема, является «дешевым» осмотиком, тогда как «дорогие» осмолиты органической природы поддерживают осмотическое давление в цитоплазме. В связи с функцией накопления ионов в вакуолях важное значение у галофитов имеет баланс потоков Na и СГ из почвенного раствора в корни, с одной стороны, и из корней в побеги, с другой. Количество ионов, переносимое в побеги, должно быть достаточным для поддержания осмотического давления в вакуолях на нужном уровне. Если скорость аккумуляции ионов в вакуолях клеток надземных органов галофитов высока, т.е. высока активность Na /Н -ан-
типортера тонопласта, доставка ионов из корней в побеги в достаточных количествах приводит к стимуляции их роста.
Гликофиты в условиях почвенного засоления не способны поддерживать низкие концентрации Na+ и СГ в цитоплазме и аккумулировать ионы в вакуолях своих клеток столь эффективно, как это делают галофиты. Большое значение в формировании признака солеустойчивости у гликофитов (в целом более низкой, чем у галофитов) имеет ограничение входящих потоков Na+ и СГ в корни. При этом осморегуляция их клеток, даже в вакуолярном компартменте, осуществляется в значительной степени за счет осмолитов органической природы. Однако способность гликофитов синтезировать осмолиты весьма ограничена. Распределение поступающих из почвенного раствора ионов между корневой системой и надземными органами у гликофитов определяется, как и у галофитов, функцией паренхимных клеток обкладки ксилемы корня, которые могут ограничивать поступление ионов в надземные органы. Различные виды и сорта растений различаются по эффективности этой функции. У сои (Glycine max) и пшеницы (Triticum aestivum) различия между сортами в ограничении ионных потоков из корней в побеги определяются одним геном. Генетический анализ показал, что такой ген KNA1 у пшеницы локализован в хромосоме 4D.
Согласованное действие ион-транспортирующих белков в мембранах клеток различных органов и тканей, поддерживающих ионный гомеостаз и формирующих ионные градиенты в системе целого растения, подразумевают орган- и тканеспецифическую экспрессию ион-транспортирующих белков. Биосинтез осмолитов в растении также регулируется органо- и тканеспецифическим образом. Тот или иной белок, индуцируемый стрессом, должен появиться не только в нужном месте, но и в нужное время. Важную роль в пространственной и временной регуляции экспрессии стрессовых генов играют гормоны и орган- и тканеспецифические промоторы.
К механизмам адаптации к засолению и водному дефициту, которые проявляются на уровне целого растения, относятся С4- и CAM-пути фиксации углерода (см. гл. 3). Транспирационный ток воды многократно ускоряет поступление в растения ионов Na+ и СГ, в избытке содержащихся в почвенном растворе при засолении. Полностью открытые устьица, поддерживающие высокую интенсивность транспирации, создавали бы не только угрозу потери воды растением, но и ускоряли бы накопление Na+ и О в цитоплазме клеток. При высоких концентрациях соли в среде и водном дефиците апертура устьичных щелей, однако, уменьшается, что делает СО2 менее доступным для растений и приводит к подавлению фотосинтеза. В связи с этим у многих представителей флоры в зоне аридного климата, обитающих при недостатке влаги и избытке солей в почве, фотосинтез идет по С4- или CAM-пути. Преимущество С4- и CAM-метаболизма в условиях водного дефицита и почвенного засоления состоит в возможности осуществлять фотосинтез при высоком устьичном сопротивлении. Можно считать поэтому, что С4- и САМ-пути — это такие способы фотосинтеза, которые не только экономят воду при низком водном потенциале почвенного раствора, но и препятствуют избыточному поглощению растениями Na+ и СГ. У некоторых растений, в частности у галофита М. cristallinum, высокие концентрации NaCl в почве приводят к индукции ферментов САМ- пути.
РЕГУЛЯЦИЯ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К NaCI
Пути передачи сигналов, индуцирующих экспрессию генов при солевом стрессе, только начинают изучаться. В подразд. 8.2.5 был рассмотрен путь сигнальной трансдукции, включающий гистидинкиназу и MAP-киназный каскад и ответственный за биосинтез осмолитов при осмотическом стрессе. Эти же механизмы участвуют в нейтрализации осмотического эффекта солей, так как включаются неспецифически в ответ на действие любого осмотика. При солевом стрессе помимо индукции синтеза белков, вовлеченных в биосинтез осмолитов, активируются системы ионного гомеостатирования. Поглощенные клеткой ионы Na должны быть выведены обратно в наружную среду или компар- тментализованы в вакоули. Это требует активации На+-насосов ПМ и тонопласта. Показано, что экспрессия SOS1 — гена №+/Н+-антипортера ПМ, и NHX — гена Na /Н+-антипортера тонопласта, у A. thaliana индуцируются специфически высокими концентрациями солей. Для путей передачи сигнала, индуцирующих экспрессию генов при солевом стрессе, идентифицировано несколько транскрипционных факторов и промоторных элементов.
Недавно у A. thaliana был открыт специфический для Na* стресса АБК- независимый SOS-путь передачи сигнала, приводящий к экспрессии гена №+/Н+-антипортера ПМ SOS1 (рис. 8.21). SOS-путь включает белок кальци- нейрин (SOS3), который является Са +- и кальмодулинзависимой протеин- фосфатазой. Этот фермент состоит из каталитической А-субъединицы (СпА) и регуляторной В-субъединицы (СпВ) и имеет три EF-лиганда, связывающих Са . Полная активация фермента нуждается в образовании комплексов Са +- СпВ, и Са -кальмодулин. В состав SOS-цепи передачи сигнала входит также серин/треонин-протеинкиназа, кодируемая геном SOS2. При функционировании SOS-пути рецептор неизвестной природы воспринимает сигнал (высокие концентрации Na+), что приводит к возрастанию концентрации свободного Са + в цитозоле. SOS3 связывает Са и активирует протеинкиназу SOS2, образуя протеинкиназный комплекс SOS2 —SOS3. Активированная протеинкиназа фосфорилирует белки, непосредственно вовлеченные в экспрессию SOS1, а также других генов, в том числе ответственных за транспорт К+. SOS-путь может также регулировать активность других транспортных белков на посттрансляционном уровне.
Следует отметить важную роль в сигнальной трансдукции при NaCl-стрес- се цитоплазматического Са '. Наряду с участием в передаче сигнала через SOS-путь ион Са + выполняет функцию вторичного мессенджера в сигнальных путях, включающих протеинкиназы, которые содержат Са +-связываю- щий домен, подобный Са -связывающему домену в молекуле кальмодулина. Один из механизмов, приводящих к возрастанию концентрации Са + в цитоплазме, связан с образованием инозитол-1,4,5-трифосфата, который освобождает Са + из вакуолярного компартмента. Другой механизм основан на активации потенциалзависимых Са +-каналов при NaCI-индуцированной деполяризации ПМ и входе в клетку содержащегося в апопласте свободного Са . Экспрессия генов NaCI-индуцируемых белков и регуляция гранспортной активности продуктов этих генов обеспечиваю т поддержание ионного гомеостаза при стрессе, что наряду с другими механизмами повышает устойчивость растения к NaCI.
Рис. 8.21. SOS-путь передачи сигнала при индукции биосинтеза NaVFE-антипортера высокими концентрациями Na+ в среде (по J.-K.Zhu, 2000, с изменениями).
Высокие концентрации Na* приводят к увеличению концентрации Са2‘ в цитозоле Са2*-зави- симая протеинфосфатаза, кальцинейрин (SOS3) связывает Са2 и активирует протеинкиназу, кодируемую геном SOS2. Образующийся комплекс SOS2—SOS3 индуцирует экспрессию гена Na*/ Н+-антипортера SOS1. SOS-путь, по-видимому, отвечает также за регуляцию активности SOS1 и, возможно, других ион-транспортирующих систем при солевом стрессе на пост-трансляционном уровне. Экспрессия гена SOS1 и регуляция ион-транспортной активности обеспечивают поддержание ионного гомеостаза при стрессе и вносят вклад в солеустойчивость растений
Хорошо изучена индукция гена Ка+-АТФазы плазмалеммы (ENA1) у дрожжей 5. cerevisiae. Индукция осуществляется двумя независимыми механизмами. При относительно низких концентрациях NaCl (0,1 —0,3 М) сигнал передается через MAP-киназный путь — систему, активируемую неспецифически различными осмотиками (см. подразд. 8.2.5). Недавно транскрипционный фактор Scol был идентифицирован как репрессор ENA1. Инактивируя Scol, осмо- тик через MAP-киназный путь индуцировал экспрессию ENA1. Этот случай интересен как пример негативной регуляции, при которой стрессор снимает действующую в дострессовых условиях репрессию. Предполагается, что такого рода негативная регуляция осуществляется при экспрессии многих защитных генов.
Индукция ENA1 при высоких концентрациях NaCl (0,6—1,0 М) осуществляется через Са -активируемый SOS-путь с участием кальцинейрина (рис. 8.22). Последний представляет собой важный детерминант солеустойчивости дрожжей, так как осуществляет положительную регуляцию гена Ка+-транспортиру- ющей АТФазы ENA1, а также гена высокоафинного транспортера К+ Trkl.
Как отмечалось выше, степень устойчивости растений к действию стрессора характеризуется обратной корреляцией со скоростью роста. Антагонистические отношения между процессами роста и акклимации реализуются через
Рис. 8.22. Пути передачи сигналов при экспрессии генов, отвечающих за (7) поддержание ионного гомеостаза, (2) оводненности клеток, (3) детоксикацию и (4) регуляцию ростовых процессов (по J.-K.Zhu, 2001, с изменениями).
Через SOS-путь передаются сигналы, активирующие биосинтез ион-транспортирующих белков, например №+/Н+-антипортера ПМ (S0S1). MAP-киназный путь отвечает за индукцию биосинтеза осмолитов и соответственно за регуляцию осмотического и тургорного давления. Первичные стрессы, ионный и осмотический, индуцируют вторичные стрессы, связанные с образованием токсичных соединений, например АФК. Некоторые белки, индуцируемые засухой, засолением или низкими температурами, обеспечивают устойчивость к вторичным стрессам. К ним относится, в частности, белок Lea-типа, кодируемый геном RD29A. Эти белки участвуют в детоксикациии и предотвращают повреждения биополимеров. Транскрипционные факторы СВР/ DREB регулируют экспрессию генов, вовлеченных в детоксикацию. Регуляция ионного гомеостаза, осмотического гомеостаза и детоксикации сопряжена с регуляцией клеточного деления и роста растяжением
сеть путей сигнальной трансдукции. Такого рода сеть в упрощенном виде представлена на рис. 8.22.
Из многообразия ответных реакций растения на высокие концентрации соли виден полигенный характер солеустойчивости. Согласованное функционирование защитных систем, которые включаются в ответ на повышение наружной концентрации соли, следует рассматривать в трех взаимосвязанных аспектах: 1) гомеостаз должен быть восстановлен в новых стрессовых условиях; 2) молекулярные повреждения должны быть устранены; 3) рост должен быть возобновлен, хотя и с меньшей скоростью.
РАЗЛИЧИЯ МЕЖДУ ГЛИКОФИТАМИ И ГАЛОФИТАМИ
Различия между защитными механизмами устойчивых и не устойчивых к солевому и водному стрессам растений проявляется как на клеточном уровне, так и на уровне целого организма. Клетки солеустойчивых растений по сравне-
нию с солечувствительными обладают более эффективными системами поддержания водного и ионного гомеостаза. Скорости биосинтеза осмолитов и уровни их аккумуляции в цитоплазме клеток галофитов выше, чем у гликофитов, поэтому галофиты могут регулировать внутриклеточное осмотическое давление в более широком диапазоне водного потенциала почвенного раствора. Локализованные в мембранах клеток устойчивых растений белки-экспортеры Na из цитоплазмы обладают, по-видимому, более высокой активностью, чем гомологичные транспортные системы у неустойчивых растений. В первую очередь это относится к №+/Н+-антипортеру тонопласта и вакуолярной Н+-АТФазе, поставляющей энергию для транспорта Na+ через тонопласт. За счет более высокой активности системы (№+/Н+-антипортер + Н+-АТФаза тонопласта) вакуо- лярные концентрации Na+ и градиенты электрохимического потенциала Na+ на тонопласте у галофитов достигают более высоких значений, чем у гликофитов.
Между устойчивыми и неустойчивыми растениями существуют также различия и в ионной проницаемости (селективности) мембран, через которые Na пассивно входит в цитоплазму. Проницаемость плазмалеммы для Na+ зависит в основном от свойств ионных каналов и транспортеров, через которые он пассивно поступает в клетки, однако в сравнительном аспекте ионные каналы и транспортеры различающихся по солеустойчивости растений на молекулярном уровне практически не исследованы.
Устойчивые к NaCl растения, по-видимому, отличаются от неустойчивых еще в одном аспекте: они имеют более эффективные системы детоксикации ядовитых соединений, в том числе АФК, содержание которых при стрессе возрастает.
Итак, солеустойчивые растения обладают более эффективными системами биосинтеза осмолитов, ионного гомеостатирования и детоксикации. Этот вывод подкрепляется недавними успехами в получении устойчивых к NaCl трансгенных растений со сверхэкспрессией генов, вовлеченных в вышеперечисленные функции. Приведем несколько примеров.
Чувствительные к высоким концентрациям солей и водному дефициту растения табака были трансформированы геном пирролин-5-карбоксилатсин- тетазы — лимитирующего звена в биосинтезе пролина. Ген был выделен из засухоустойчивого растения маша (Vigna radiata). Сверхэкспрессия этого гена увеличивала содержание пролина в клетках и повышала устойчивость растений табака к NaCl.
При сверхэкспрессии гена №+/Н+-антипортсра тонопласта, ответственного за депонирование Na+ в вакуоли, увеличивалась вакуолярная концентрация Na+ и повышалась устойчивость к NaCl растений A. thaliana.
Защитное действие системы детоксикации ядовитых веществ при NaCl- стрессе проявилось в трансформантах табака со сверхэкспрессией гена фермента, обладающего комбинированной активностью глутатион-5-трансфера- зы и глутатионпероксидазы. Более высокая ферментативная активность у трансформантов по сравнению с исходными растениями коррелировала при действии NaCl с их более быстрым ростом.
Различия между солеустойчивыми и солечувствительными растениями на уровне целого растения рассматривались в подразд. 8.3.4 в связи с обсуждением вопроса об организации транспорта воды и ионов в системе почва—корень— побег.
Физиологические функции и биохимические процессы у солеустойчивых и солечувствительных растений (галофитов и гликофитов) различаются скорее в количественном отношении, чем в качественном. За исключением солевых желез, имеющихся лишь у некоторых видов, какие-либо особые признаки у галофитов отсутствуют. Для осуществления жизненного цикла в условиях засоления галофиты в целом используют те же самые исполнительные механизмы, которые обнаружены у гликофитов. Типичный гликофит арабидопсис, согласно проведенным исследованиям, содержит большинство генов (если не все), найденных у галофитов. Считается, что высокая вариабельность растений по чувствительности к засолению и степени их солеустойчивости обусловлена лишь различиями в регуляции экспрессии их генов.
ИЗМЕНЕНИЯ ТЕМПЕРАТУРНЫХ УСЛОВИЙ
Важная роль температуры во взаимоотношениях организма и среды проявляется на всех уровнях его структурной и функциональной организации. Температурные сдвиги вызывают изменения структуры биополимеров, а следовательно, и скоростей биохимических реакций и физиологических процессов. От температуры в конечном счете зависит выживаемость организма, а географическое распределение видов на Земле происходит в соответствии с температурными градиентами.
ПОДДЕРЖАНИЕ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИИ СТРУКТУРНОЙ ЦЕЛОСТНОСТИ БИОПОЛИМЕРОВПРИ ИЗМЕНЕНИИ ТЕМПЕРАТУРНЫХ УСЛОВИЙ
Растения относятся к эктотермным (пойкилотермным) организмам, не способным поддерживать температуру своих органов и тканей на постоянном уровне. Этим они отличаются от эндотермных (гомойотермных} организмов, сохраняющих постоянство температуры тела (млекопитающие и птицы). Отсюда следует, что у растений приспособления к изменяющимся температурным условиям не связаны со стратегией избежания, а основаны на механизмах резистентности. Вместе с тем эндотермныс механизмы в растительном мире могут встречаться в зачаточной форме (см. подразд. 8.4.3).
Эктотермные организмы, в том числе растения, способны модифицировать биополимеры своих клеток таким образом, чтобы компенсировать изменения метаболизма, вызываемые температурными сдвигами. Новые разновидности макромолекул появляются в ходе акклимации растений к изменившейся температуре. Модификации макромолекул могут происходить также в эволюционном масштабе времени, т.е. при адаптации к новым температурным условиям. За счет модификаций биополимеров, происходящих в ходе эволюции, растениям различных климатических зон удается поддерживать относительно одинаковую интенсивность метаболизма. К такого рода модификациям биополимеров относится образование новых разновидностей ферментов с измененной каталитической активностью. Изменения в эффективности катализа направлены на компенсацию температурозависимых изменений скоростей реакций.
Поддержание скорости реакции на должном уровне может быть связано не только с появлением новой разновидности молекулы фермента, но и с изменением его содержания в клетке.
Помимо температурозависимых модификаций ферментов известны температурозависимые модификации липидов, связанные с изменениями их текучести. От состояния мембранных липидов зависит каталитическая активность локализованных в мембранах ферментов.
Компенсация температурных эффектов путемизменения свойств ферментов
С увеличением температуры скорости ферментативных реакций возрастают. Зависимость скорости реакции от температуры носит экспоненциальный характер, что описывается уравнением Аррениуса:
к = Ае №, (8.3)
где к — константа скорости реакции; Еа — энергия активации реакции; R — газовая постоянная; Т — абсолютная температура; А — коэффициент пропорциональности.
Из уравнения (8.3) следует, что энергия активации наряду с температурой определяет скорость реакции. Скорость реакции тем выше, чем ниже энергия активации. Функция ферментов состоит в снижении энергии активации ферментативных реакций. Чем выше эффективность фермента, тем до более низкого значения снижается энергия активации.
У эктотермных организмов, обитающих при пониженных температурах, ферменты характеризуются более эффективным катализом, т.е. более низкими значениями энергия активации реакций. У эктотермных организмов, обитающих в условиях теплого климата, наоборот, ферменты менее эффективны, т.е. энергия активации катализируемых ими реакций имеет более высокие значения.
Энергии активации ферментативных реакций изменяются также при аккли- мации организмов к новым температурным условиям: при понижении температуры они снижаются, а при повышении возрастают. Таким образом, энергия активации той или иной ферментативной реакции не является величиной постоянной: она изменяется в соответствии с температурными условиями среды обитания. Это положение получило обоснование при изучении каталитических свойств ферментов, выделенных из холодоустойчивых и теплолюбивых организмов, а также организмов, акклимированных к различным температурам.
Изменения каталитических свойств ферментов, т. е. их энергий активации, являются одним из важнейших типов приспособительных реакций организмов к изменяющимся температурным условиям и происходят в результате модификаций молекул ферментов.
Конформационные изменения фермента в ходе каталитической реакции сопровождаются разрывом или образованием слабых связей (водородных, электростатических, ван-дер-ваальсовых и гидрофобных), при этом освобождается или поглощается энергия. Энергетические сдвиги, связанные с изменением конформации, лежат в основе различий в величинах энергий активации ферментативных реакций.
Для конформационных изменений ферментов с более гибкой структурой при катализе требуется меньше энергии. У фермента с жесткой структурой конформационные изменения невозможны. Он был бы стабильным и долговечным, но нереакционноспособным. Фермент может сохранять свою структурную целостность и в то же время функционировать, когда между его стабильностью и гибкостью существует равновесие. Ферменты организмов, приспособленных к высоким температурам, для сохранения структурной целостности и функциональной активности должны иметь более жесткую структуру. Для ферментов организмов, приспособленных к низким температурам, необходима повышенная гибкость.
Стратегия приспособления к тому или иному температурному диапазону состоит в изменении числа (или типа) слабых взаимодействий в молекуле фермента. Приспособление к более высоким температурам связано с приобретением одной или нескольких дополнительных слабых связей. Дополнительные связи повышают термостабильность белка и в то же время снижают его каталитическую эффективность (увеличивают энергию активации). Разновидности ферментов, осуществляющих эффективный катализ при изменении температурных условий, появляются в результате модификаций их первичной структуры.
Другим типом приспособительных реакций растений к изменяющимся температурным условиям является поддержание относительно постоянного соотношения между константой Михаэлиса (А„) и концентрацией субстрата [S]. Константа Михаэлиса для субстрата должна поддерживаться в пределах, приблизительно соответствующих середине диапазона физиологических концентраций субстрата. При таком соотношении Кт и [S] используется значительная часть каталитического потенциала фермента, и в то же время фермент далек от состояния насыщения субстратом, т.е. сохраняет резерв для ускорения реакции в ответ на повышение концентрации субстрата или регуляторные сигналы.
Как показали эксперименты на выделенных ферментах, изменения температуры приводят к изменениям Кт. Константа Михаэлиса растет при повышении температуры. Вместе с тем и у растительных, и у животных организмов, обитающих при различных температурных условиях, Кт ферментов и концентрации их субстратов в клетках различаются очень мало. Относительное постоянство Кт и [S] поддерживается и при акклимации организма к изменившейся температуре.
Известно два пути поддержания постоянства Кт: 1) за счет изменений первичной структуры белка; 2) за счет изменения среды, в которой фермент функционирует.
Изменения первичной структуры белка, приводящие к изменениям Еа и Кт, могут происходить в эволюционном масштабе времени и приводить к появлению новых форм белка и соответственно новых конститутивных признаков (адаптация). Новые разновидности фермента с кинетическими свойствами, отвечающими новым температурным условиям, могут появляться также в результате индукции стрессовых генов при акклимации растения к температурному сдвигу. Они могут появляться даже тогда, когда температура среды колеблется в пределах всего лишь 6—8 °C. Поскольку многие растения обитают в средах, где сезонные и даже суточные колебания температуры превышают б—8 °C, фермент, представленный только одной формой, не мог бы функци-
онировать во всем диапазоне температур. Нужны две или больше разновидности фермента. Такие разновидности называются изоферментами. Изоцитратдегидрогеназа, например, существует в виде целого семейства изоферментов, каждый из которых функционирует в узком температурном диапазоне. Известна сезонность в появлении множественности форм ферментов.
Поддержание относительно постоянного отношения /^/[S] часто связано с изменением pH среды, в которой фермент функционирует. Хорошо известно, что при повышении температуры в клетках растений снижается pH цитоплазмы. У ряда ферментов это компенсирует изменения Кт, индуцированные температурными сдвигами.
Компенсация температурных эффектов путем изменения внутриклеточного содержания ферментов
Многие растения способны компенсировать влияние температуры на скорость биохимических реакций путем изменения содержания ферментов в клетках. В первую очередь это относится к ферментам, которые лимитируют скорость ключевых процессов метаболизма, таких, например, как фотосинтез и дыхание. Так, активность фруктозо-1,6-бисфосфатазы в листьях коррелировала со скоростью фотосинтеза при акклимации олеандра (Nerium oleander) к температурным сдвигам. У олеандра этот фермент — главное лимитирующее звено в углеродном цикле и соответственно главный лимитирующий фактор в температурной компенсации фотосинтеза. Электрофорез показал, что число изоферментов фруктозо-1,6-бисфосфатазы при акклимации оставалось постоянным, но при этом изменялось количество фермента. При акклимации к низким температурам оно возрастало, а при акклимации к высоким — снижалось.
Термофильные бактерии — модельдля изучения механизмов термостабильности
Существуют организмы, способные жить в среде с температурой около 100 °C. К таким организмам относятся термофильные бактерии, обитающие в термальных источниках. Thermus aquaticus, например, сохраняет жизнеспособность при температурах до 95 °C. Белки термофильных бактерий необычайно устойчивы к тепловой денатурации. In vitro они выдерживают длительный прогрев при 90 °C, сохраняя функциональную активность. Высокая структурная и функциональная устойчивость белков термофильных бактерий объясняется особенностями их аминокислотного состава. Повышение термостабильности обеспечивается всего одной или двумя дополнительными электростатическими связями. Увеличение числа солевых мостиков служит универсальным механизмом повышения термоустойчивости.
Сравнительные исследования трехмерной структуры белков (лактатдегидрогеназы, ферредоксина и др.), проведенные с помощью рентгеноструктурного анализа, показали, что термоустойчивость белкам термофильных бактерий придают также некоторые другие особенности их структуры. Гидрофобность внутренних частей белка у термофилов больше, чем у мезофилов (микроорганизмов, обитающих при умеренных температурах). Поскольку при по-
вышении температуры гидрофобные взаимодействия стабилизируются, структура такой белковой молекулы становится более прочной. У белков термофилов боковые цепи алифатических аминокислот удлинены, что усиливает гидрофобные взаимодействия. Кроме того, найдены замены аминокислот, повышающие стабильность a-участков и p-слоев в молекулярной структуре. Таким образом, устойчивость белков термофильных бактерий связана с изменениями их первичной структуры.
Изменение суммарной свободной энергии, требуемой для стабилизации белков термофилов, составляет 130—210 кДж/моль. Это соответствует энергии лишь нескольких слабых связей, т. е. лишь несколько слабых связей требуется для превращения мезофильного белка в термофильный. Для большинства аминокислотных замен, необходимых для этой цели, достаточно заменить лишь одно основание в триплете. Из этого следует, что образование термофильных белков может легко осуществляться в процессе эволюции.
Устойчивость к высоким температурам придают термофилам также протекторные соединения. Аппарат белкового синтеза у Thermus thermophilus защищен от денатурации полиаминами. У термофилов обнаружены также структурные модификации тРНК и рибосомальных РНК. Они содержат больше Г-Ц-пар оснований, чем гомологичные РНК мезофилов. Пары оснований Г—Ц более термостабильны, чем пары А—У. У термофилов тРНК содержат также 5-ме- тил-2-тиоуридин. Производные тиоуридина усиливают взаимодействия оснований в спиральной структуре тРНК.
Роль белков теплового шока в акклимации растенийк высоким температурам
Растения часто испытывают тепловой шок (ТШ), который может повреждать органы и ткани, задерживать рост и даже вызывать гибель растений. ТШ обычно возникает в результате действия высоких температур при недостаточной скорости транспирации. Растения могут стать толерантными к ТШ, если предварительно на протяжении нескольких часов подвергнуть их действию нелегальных высоких температур. В процесс акклимации вовлекаются белки теплового шока (БТШ^ синтез которых индуцируется предварительной тепловой обработкой.
Некоторые из основных БТШ консервативны: показана высокая степень их гомологии среди представителей прокариот и эукариот. Многие из БТШ функционируют как шапероны. Они восстанавливают структуру других белков, денатурированных при тепловом воздействии. Некоторые БТШ синтезируются в клетках в ходе развития растений и не индуцируются тепловым воздействием, однако их относят к БТШ на основании гомологии аминокислотных последовательностей с БТШ, индуцируемых теплом.
БТШ подразделяют на пять семейств в соответствии с их молекулярными массами.
БТШ-100 выполняют функцию шаперонов (см. подразд. 8.2.3.2). Они осуществляют распад белковых агрегатов, образующихся вследствие денатурации белков при тепловом воздействии, и предотвращают ошибки в сворачивании (folding) полипептидной цепи при формировании третичной структуры белковых молекул.
БТШ-90 обнаружены в цитозоле, ядре и эндоплазматическом ретикулуме (ЭР). Считается, что они тоже могут функционировать как молекулярные шапероны, однако в отличие от типичных шаперонов, высокоспецифичны по отношению к определенным белкам и вступают с ними в длительное взаимодействие.
БТШ-70 — АТФ-зависимые молекулярные шапероны. Некоторые члены этого семейства экспрессируются конститутивно, другие индуцируются тепловым или холодовым шоком. БТШ-70 обнаруживаются в цитозоле, ЭР, митохондриях, пластидах и других органеллах. БТШ-70 участвуют в сворачивании и разворачивании (unfolding) полипептидных цепей, сборке и разборке четвертичной структуры белка. Во время теплового шока БТШ-70 находятся в ядрышке и мигрируют в цитоплазму после окончания теплового воздействия. N-терми- нальная область БТШ-70, содержащая АТФ-связывающий домен, высококонсервативна, тогда как их С-концевая последовательность у различных организмов вариабельна и определяет субстратную специфичность.
БТШ-60, по-видимому, также являются молекулярными шаперонами. Они обнаруживаются в митохондриальном матриксе и строме хлоропластов. БТШ-60 не только индуцируются ТШ, но присутствуют в растениях также и при нормальных температурах. Их главная функция состоит в сборке белковых молекул, состоящих из субъединиц. Один из БТШ-60, кодируемый ядерным геномом, представляет собой хлоропластный белок, который участвует в сборке рибуло- зобисфосфаткарбоксилазы. In vitro БТШ-60 предотвращают белки от агрегации.
Низкомолекулярные БТШ с молекулярными массами от 15 до 30 кДа обнаруживаются в клетках растений в больших количествах. Они распределяются по различным компартментам клетки. Низкомолекулярные БТШ формируют комплексы с молекулярными массами от 200 до 800 кДа. Хотя их роль во мно
гом остается неясной, предполагается, что они вносят существенный вклад в термотолерантность растений. Нет сведений о том, что они требуются для нормальных клеточных функций, т.е. в отсутствие ТШ. Низкомолекулярные БТШ не требуют АТФ. Показано, что БТШ-18,1 из гороха (Pisum sativum^ предотв
ращает агрегацию белков при высоких температурах.
™.ATHSF1[ ) ) тример|н$Е|| Кодирующая область |™.ATHSF1[ ) ) тример|н$Е|| Кодирующая область |Экспрессия генов многих БТШ контролируется транскрипционным фактором HSF (heat shock factor), который взаимодействует с консервативной последовательностью HSE (heat shock element) премоторной области генов БТШ (рис. 8.23). HSFy A. thaliana (ATHSF1) может связывать ДНК, только находясь в форме тримера. ТШ требуется для триме- ризации. ДНК-связывающий домен HSF и тримеризация консервативны среди различных организмов. Механизм, контроли-
™.ATHSF1
[ ) ) тример
|н$Е|| Кодирующая область |
™.ATHSF1
[ ) ) тример
|н$Е|| Кодирующая область |
Рис. 8.23. Контроль экспрессии геновбелков теплового шока.Экспрессия генов БТШ у растений контролируется транскрипционным фактором HSF1, который взаимодействует с консервативной последовательностью HSE про- моторной области БТШ. HSF у Arabidopsis thaliana (ATHSF1) может связывать ДНК, находясь только в форме тримераРис. 8.23. Контроль экспрессии геновбелков теплового шока.Экспрессия генов БТШ у растений контролируется транскрипционным фактором HSF1, который взаимодействует с консервативной последовательностью HSE про- моторной области БТШ. HSF у Arabidopsis thaliana (ATHSF1) может связывать ДНК, находясь только в форме тримерарующии тримеризацию, не ясен, однако показано, что образование тримера HSF, его связывание с ДНК и транскрипционная активность подавляются при снятии ТШ. Растения, которые экспрессируют HSF, демонстрируют повышенную теплоустойчивость в отсутствие предварительной тепловой обработки.
Рис. 8.23. Контроль экспрессии геновбелков теплового шока.
Экспрессия генов БТШ у растений контролируется транскрипционным фактором HSF1, который взаимодействует с консервативной последовательностью HSE про- моторной области БТШ. HSF у Arabidopsis thaliana (ATHSF1) может связывать ДНК, находясь только в форме тримера
Рис. 8.23. Контроль экспрессии геновбелков теплового шока.
Экспрессия генов БТШ у растений контролируется транскрипционным фактором HSF1, который взаимодействует с консервативной последовательностью HSE про- моторной области БТШ. HSF у Arabidopsis thaliana (ATHSF1) может связывать ДНК, находясь только в форме тримера
Температурозависимые модификациилипидного бислоя мембран
Как обсуждалось выше, при рассмотрении влияния температуры на белки (подразд. 8.4.1.1), фермент может функционировать и в то же время сохранять свою структурную целостность, если существует равновесие между гибкостью и стабильностью молекулы. Такое равновесие характерно и для мембранных структур, основу которых составляют липиды. Мембранным липидам в нормальных условиях присуще жидкокристаллическое состояние (жидким кристаллом называют анизотропную жидкость с признаками упорядоченности). В этом состоянии мембрана сохраняет свою структурную целостность, но в то же время липиды мембраны и локализованные в ней белки достаточно подвижны, чтобы осуществлять свои функции. Жидкокристаллическому состоянию отвечает определенная вязкость липидного бислоя. Она выше, чем вязкость липидов в состоянии их крайней текучести, когда исчезают признаки упорядоченности, характерные для жидкого кристалла, и ниже вязкости липидов, находящихся в твердом гелеобразном состоянии. Переход липидов из жидкокристаллического в гелеобразное состояние (La -> Lp) (см. подразд. 8.4.2.2; рис. 8.28) и сопутствующее этому переходу возрастание вязкости бислоя происходят при снижении температуры.
Вместе с тем поддержание мембраны в жидкокристаллическом состоянии с соответствующей этому состоянию вязкостью имеет решающее значение для функционирования локализованных в ней белков: ферментов, водных и ионных каналов, различного рода переносчиков, компонентов электрон-транс- портных цепей и пр. Особенно чувствительны к изменениям вязкости липидов транспортные АТФазы. В связи с этим сохранение бислоя в жидкокристаллическом состоянии при снижении температуры — одна из важнейших стратегий приспособления растений к холоду. Эта стратегия состоит в снижении температуры фазового перехода мембранных липидов (La -> Lp). Обитание при высоких температурах выдвигает задачу поддержания структурной целостности мембран. Повышение температуры до некоторых критических пределов приводит к сверхвысокой текучести липидов и дезинтеграции мембран, поэтому у термоустойчивых растений модификации липидов направлены на повышение структурной прочности бислоя и повышение температуры фазового перехода липидов.
Температура фазового перехода и сопровождающее его изменение вязкости зависят от длины углеводородных цепей и числа двойных связей жирных кислот (ЖК), входящих в состав липидов. При наличии двойных связей, которые находятся почти всегда в ^wc-положении, в цепях образуются изгибы, и это уменьшает энергию стабилизации бислоя, т.е. делает мембрану более текучей. На прочность бислоя оказывают влияние и содержащиеся в нем стероиды, а также ионный состав прилегающей к мембране жидкой фазы.
Основной механизм регуляции температуры фазового перехода, а следовательно и поддержания нужной вязкости бислоя при изменении температурных условий, состоит в изменении жирнокислотного состава липидов. Известны два типа изменений химического состава липидов, которые вовлечены в температурозависимые модификации мембран: 1) изменение длины углеводородных цепей в остатках ЖК и 2) изменение числа двойных связей в них. Для того
Таблица 8.2. Содержание линоленовой кислоты (С 18:3) в мембранных препаратах из листьев озимой пшеницы Triticum aestivum, прошедшей и не прошедшей закалку (% от суммарного содержания жирных кислот)
Общая микросомальная фракция
Плазмалемма
Тилакоиды
контроль
закалка
контроль
закалка
контроль
закалка
4,8
9,4
18,2
28,3
6,8
9,9
Примечание. Растения выращивали при 20 °C. Закалку (акклимацию к низким температурам) проводили при 2 °C (Г. В. Новицкая, Т. А. Суворова, 1994)
чтобы мембрана не затвердевала при понижении температуры, липиды должны содержать ЖК с меньшим числом углеродных атомов и с большим числом двойных связей. Приспособление к повышенным температурам связано, напротив, с включением в липиды ЖК с более длинными углеводородными цепями и с меньшим числом двойных связей. Указанные способы сохранения надлежащей вязкости мембран при адаптации и акклимации к изменяющимся температурным условиям обнаружены не только у растений, но и у животных, а также у прокариот. Иллюстрацией повышения степени ненасыщенности ЖК в липидах мембран при акклимации растений к низким температурам являются данные, представленные в табл. 8.2.
Линоленовая кислота несет три двойные связи. Ее доля в общем содержании ЖК, входящих в состав липидов мембран, достаточно высока и может служить показателем общего уровня ненасыщенности мембранных липидов. При акклимации к холоду во всех фракциях мембран относительное содержание линоленовой кислоты возрастало.
Изменение степени ненасыщенности жирных кислот (ЖК) и длины ацильных цепей в липидах контролируется с помощью ряда ферментов. К ним относятся десатуразы, тиоэстеразы и элонгазы.
Десатуразы жирных кислот. Десатуразы ЖК образуют семейство ферментов, катализирующих превращение одинарной связи между атомами углерода —СН2—СН2— в двойные связи — СН=СН— в ацильных цепях ЖК. Предполагается, что десатуразы связывают трехвалентное железо, которое формирует активный комплекс с атомами кислорода Ее—О—Ее. Реакции, катализируемые десатуразами, называют реакциями десатурации, образующиеся двойные связи между атомами углерода — ненасыщенными связями, а жирные кислоты с несколькими ненасыщенными связями — полиненасыщенными жирными кислотами (ПНЖК). Десатурация требует молекулярного кислорода и протекает в аэробных условиях.
Десатурация осуществляется через сложную цепь биохимических превращений, в котором десатураза подключается на конечной стадии (рис. 8.24). Суть происходящих превращений состоит в сопряжении окисления ЖК с восстановлением О2. Процесс десатурации можно представить следующим образом. Из 4 электронов, требующихся для восстановления О2 и образования 2Н2О, два электрона поставляются молекулой ЖК, которая при этом окисляется, а источником двух других является НАДФН. Перенос электронов от НАДФН к О2 происходит через цепь переносчиков, включающей флавопротеин и ферредоксин. Участвующие в десатурации переносчики электронов локализованы в
Фотосинтез
21^0
Рис. 8.24. Реакции, вовлеченные в процесс десатурации жирной кислоты с участиемфермента десатуразы.
Окисление жирной кислоты и образование двойной связи в ацильной цепи, катализируемое десатуразой, сопряжено с восстановлением молекулы О2. Из четырех электронов, необходимых для восстановления молекулы О2, два электрона поставляются молекулой жирной кислоты (ЖК), а два других поступают от НАДФН (НАДН) через цепь переносчиков электронов, локализованных в мембранах пластид или эндоплазматического ретикулума. ФП — флавопротеид
мембранах эндоплазматического ретикулума или пластид. При этом десатураза может находиться в свободной или мембраносвязанной форме.
Десатуразы подразделяют на несколько типов, в зависимости от того, осуществляют ли они превращение ЖК, находящейся в свободной форме или в составе липида, и от того, какая ЖК используется в качестве субстрата. Десатуразы, использующие в качестве субстратов свободные ЖК, позволяют регулировать липидный состав мембран и, следовательно, их текучесть еще до образования липидов и формирования самой мембраны. Иными словами, текучесть мембраны может определяться уже на стадии предварительного синтеза ЖК. Синтезированные в этом случае ЖК с определенным числом ненасыщенных связей транспортируются затем к местам встраивания в мембраны. Десатуразы различаются также специфичностью по отношению к положению остатка ЖК на глицериновой молекуле и к позиции десатурации в ацильной цепи.
Липидный состав мембран и степень ненасыщенности ЖК варьируют в широких пределах при изменении температуры, а также других условий, например интенсивности освещения, водного потенциала и ионного состава среды. Десатуразы у растений играют важную роль в адаптации и акклимации к изменяющимся условиям среды. В настоящее время клонированы гены некоторых десатураз растительного происхождения. Клонирование сделало возможным изучение экспрессии генов и роли модификаций липидного состава мембран в приспособительных реакциях. Экспрессия генов ряда десатураз у растений зависит от температуры, что позволяет говорить об участии десатураз в процессах акклимации к изменяющимся температурным условиям. Экспрессия генов других десатураз у растений не зависит от температуры, т. е. является конститутивной. Регуляция экспрессии генов десатураз осуществляется на транскрипционном уровне. Активация десатурации при снижении температуры сопряжена с накоплением мРНК генов тех десатураз, которые отвечают за синтез ПНЖК. Накопление мРНК этих генов приводит в свою очередь к повышению уровня синтеза соответствующих белков и, как следствие, к индукции синтеза ПНЖК.
Продукты десатуразных реакций ПНЖК регулируют посредством обратной связи активность десатураз.
У высших растений устойчивость к низким температурам коррелирует со способностью клеток синтезировать ПНЖК. Так, у A. thaliana мутанты fad5 и fad6, дефицитные по синтезу локализованных в хлоропластах десатураз пальмитиновой и олеиновой ЖК соответственно, характеризуются хлорозом листьев, замедленным ростом и измененной формой хлоропластов при пониженных температурах. Экспрессия Fad7, гена десатуразы A. thaliana, отвечающего за синтез триеновых (с тремя ненасыщенными связями) ЖК в хлоропластах, в N. tabacum приводит к повышению устойчивости семян растений табака к низким температурам. В то же время блокирование экспрессии Fad7позволяет растениям легче приспосабливаться к повышенным температурам. При нарушении функций соответствующих десатураз изменяются физические свойства мембран, что выражается в смещении температуры фазового перехода из жидкокристаллического в гелеобразное состояние в область более высоких температур.
Молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов десатураз при изменении температурных условий в значительной степени остаются нераскрытыми, однако общие принципы такой регуляции понятны уже сейчас (рис. 8.25). При снижении температуры уменьшается текучесть мембраны. Клетка воспринимает это изменение с помощью сенсора, расположенного, по-видимому, в мембране. Сигнал от сенсора передается к регуляторным молекулам или непосредственно воспринимается регуляторными последовательностями генов десатураз. Вследствие этого индуцируется экспрессия генов, что приводит к усиленному синтезу десатураз в клетке и ускорению синтеза ПНЖК в мембранных липидах. В конечном счете восстанавливаются исходная текучесть мембран и биохимическая активность связанных с ними систем, в частности активность ФС1 и ФСН в хлоропластах, а также АТФ-синтезирующих комплексов.
Итак, растения, способные синтезировать ПНЖК в повышенных количествах, оказываются более устойчивыми к холодовому стрессу. Напротив, снижение доли ПНЖК в мембранных липидах, приводящее к снижению молекуляр-
Рис. 8.25. Индукция десатуразных генов при акклимации растений к холоду.
Десатурация необходима для поддержания надлежащей вязкости липидного бислоя и функциональной активности мембраны при изменившихся температурных условиях (Д. А. Лось, 2001)
ной подвижности липидного бислоя, должно вносить вклад в термотолерантность растений. Последнее предположение подтверждается получением трансгенных растений табака, в которых снижена экспрессия хлоропластной десатуразы, отвечающей за образование триеновых ЖК. Полученные растения оказались более устойчивыми к высоким температурам, чем исходные растения.
Тиоэстеразы и элонгазы жирных кислот. Как отмечалось выше, текучесть липидного бислоя определяется не только степенью ненасыщенности ЖК, но и длиной углеводородных цепей. Число углеродных атомов в цепи зависит от функций тиоэстераз и элонгаз ЖК. Тиоэстеразы отвечают за терминацию удлинения ацильной цепи и обеспечивают преимущественное накопление С8_10, С12, С!4 и С16_18 ЖК. Элонгазы осуществляют удлинение цепи ЖК до 20, 22 и 24 углеродных атомов. Гены некоторых тиоэстераз и элонгаз из различных видов растений клонированы.
Энергия активации ферментативных реакций,протекающих в мембранах
Функционирование белков, связанных с мембраной, часто зависит от локальной вязкости их липидного микроокружения. Активность многих мембранных ферментов снижается при возрастании вязкости (снижении текучести) липидов мембраны. Как обсуждалось в подразд. 8.4.1.1, ферментный белок должен иметь возможность изменять свою конформацию во время катализа. Для этого нужно, чтобы могли перемещаться и окружающие его молекулы липидов. Если липидная фаза обладает низкой вязкостью, то изменения конформации фермента не требуют больших затрат энергии. При высокой вязкости липиды необходимо локально расплавить, для чего требуется дополнительная энергия. Температура плавления липидов должна устанавливаться на таком уровне, при котором поддерживается их оптимальная текучесть в физиологическом диапазоне температур. Следует, однако, помнить, что текучесть мембраны не должна быть чрезмерной, так как в слишком жидком липидном бислое может произойти дезинтеграция многокомпонентной системы.
Связь температурной зависимости активности локализованного в мембране фермента с температурой плавления липидного бислоя мембраны может быть продемонстрирована с помощью графика Аррениуса — зависимости логарифма константы скорости ферментативной реакции от обратной величины абсолютной температуры 1/Т (рис. 8.26). Такая зависимость выражается отрезком прямой линии, так как
1пЛ = 1пА- ——,R Т
что следует из уравнения (8.3). Точки перегиба на графиках отражают изменения свойств липидов. При температуре фазового перехода наклон прямой линии резко меняется. Из наклона для данного температурного диапазона может быть рассчитана энергия активации ферментативной реакции. При температурах более низких, чем температура фазового перехода, энергия активации выше, так как для конформационных изменений белка необходимо дополнительно разорвать некоторые слабые химические связи в липидах, находящихся в гелеобразном состоянии. При температурах более высоких, чем температура фазо-
Рис. 8.26. Кривые Аррениуса (зависимость логарифма константы скорости реакции от величины, обратной абсолютной температуре) для локализованного в мембране фермента (по П.Хочачка,
Дж. Семеро, 1988, с изменениями).
Точки перегиба на кривых (Т^) отражают температуры фазовых переходов мембранных липидов. У организмов, адаптированных (акклимированных) к холоду (7), фазовый переход липидов происходит при более низкой температуре, чем у организмов, адаптированных к теплу (2). Различия в температурах фазовых переходов связаны с различиями в липидном составе их мембран, например, в степени ненасыщенности жирных кислот или в длине ацильных цепей и т. д. Из наклона отрезков прямых линий можно рассчитать энергии активации Еа ферментативной реакции выше и ниже температуры фазового перехода
вого перехода, липиды находятся в жидкокристаллическом состоянии и требуется меньше энергии для конформационных изменений белка. При аккли- мации к холоду происходит сдвиг точки перегиба на графиках, отражающий смещение температуры фазового перехода к более низким значениям. Это связано с изменением химического состава мембраны — с включением в состав липидов ЖК, имеющих меньшее число углеродных атомов и большее число ненасыщенных связей. Повышение устойчивости к теплу обусловлено возрастанием вязкости (снижением текучести) липидного бислоя и стабилизацией взаимодействий между компонентами мембран.
Рис. 8.27. Влияние температуры выращивания и температуры проведения эксперимента на скорость фотосинтеза при нелимитирующем освещении (Л) (по Bjorkman et al., 1980) и интенсивность флуоресценции листьев (5) (по Raison et al., 1980) у Nerium oleander. Растения были акклимированы к 20 и 45 С°. Скорость фотосинтеза выражена в наномолях поглощенного СО2 на 1 см2 поверхности листа в 1 сРис. 8.27. Влияние температуры выращивания и температуры проведения эксперимента на скорость фотосинтеза при нелимитирующем освещении (Л) (по Bjorkman et al., 1980) и интенсивность флуоресценции листьев (5) (по Raison et al., 1980) у Nerium oleander. Растения были акклимированы к 20 и 45 С°. Скорость фотосинтеза выражена в наномолях поглощенного СО2 на 1 см2 поверхности листа в 1 сТепловые повреждения приводят к дезорганизации процессов, протекающих в мембранах. В частности, в тилакоидах нарушается механизм переноса энергии: блокируется перенос энергии от хлорофилла а к хлорофиллу b и изменяется распределение энергии между ФСП и ФС1. В этих условиях возрастает
Рис. 8.27. Влияние температуры выращивания и температуры проведения эксперимента на скорость фотосинтеза при нелимитирующем освещении (Л) (по Bjorkman et al., 1980) и интенсивность флуоресценции листьев (5) (по Raison et al., 1980) у Nerium oleander. Растения были акклимированы к 20 и 45 С°. Скорость фотосинтеза выражена в наномолях поглощенного СО2 на 1 см2 поверхности листа в 1 с
Рис. 8.27. Влияние температуры выращивания и температуры проведения эксперимента на скорость фотосинтеза при нелимитирующем освещении (Л) (по Bjorkman et al., 1980) и интенсивность флуоресценции листьев (5) (по Raison et al., 1980) у Nerium oleander. Растения были акклимированы к 20 и 45 С°. Скорость фотосинтеза выражена в наномолях поглощенного СО2 на 1 см2 поверхности листа в 1 с
флуоресценция хлорофилла, что объясняется следующим образом. Свободный хлорофилл флуоресцирует очень сильно. В интактных хлоропластах флуоресценция низка, так как энергия возбуждения хлорофилла улавливается реакционными центрами. Наблюдаемые in vivo при тепловом воздействии усиление флуоресценции и тесно коррелирующее с ним подавление фотосинтеза связаны с распадом хлорофилл-белковых комплексов и переходом хлорофилла в свободное состояние (рис. 8.27). Температурный диапазон, в котором происходит усиление флуоресценции и снижение скорости фотосинтеза, зависит от того, к какой температуре были акклимированы или адаптированы растения. Пустынные растения сверхустойчивы к высоким температурам. Они характеризуются также высокой термоустойчивостью процесса фотосинтеза и термостабильностью тилакидных мембран, что в первую очередь связано с особенностями химического состава и структуры их липидного бислоя.
УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТЕНИЙ К ЗАМОРАЖИВАНИЮ
Растениям, обитающим в зоне отрицательных температур, приходится не только поддерживать внутриклеточные биополимеры в функционально активном состоянии, но и регулировать процессы образования льда в тканях. Внутриклеточное образование льда неизбежно приводит к гибели как теплолюбивых, так и морозоустойчивых растений, так как образующиеся внутри клеток кристаллы льда разрывают мембраны, приводя к нарушениям функций клеточных органелл. Теплолюбивые растения погибают даже тогда, когда лед образуется в межклетниках. Растения холодного климата, а также мезофиты (растения умеренного климата) выдерживают образование льда в межклеточной среде. У морозоустойчивых растений выработались механизмы, которые препятствуют образованию льда внутри клеток. Это можно рассматривать как важнейшую стратегию приспособления растений к отрицательным температурам.
Дегидратация клеток как механизм,предотвращающий внутриклеточное образование льда
Один из механизмов, предотвращающих внутриклеточное образование льда, сопряжен с выходом воды из клеток в экстрацеллюлярное пространство. При падении температуры до отрицательных значений в экстрацеллюлярной среде образуются кристаллы льда. Лед формирует градиент водного потенциала, направленный из клеток в межклетники. Выход воды из клеток по градиенту вызывает дальнейшую дегидратацию клеток и рост кристаллов льда в межклетниках, в то же время снижается вероятность образования внутриклеточного льда.
Образование внеклеточного льда и связанный с этим отток воды из клеток стимулируются специальными веществами, которые клетки экскретируют в апопласт. Являясь центрами кристаллизации воды, они повышают температурный порог зародышеобразования льда. Такие соединения называются гетерогенными нуклеаторами, а стимулируемый ими процесс зародышеобразования льда — гетерогенной нуклеацией. Гетерогенные нуклеаторы могут быть белковой, фосфолипидной или полисахаридной природы. Гетерогенными нуклеаторами становятся различные твердые включения, выполняющие роль «затра-
вок» для образования кристаллов. Часто такими «затравками» служат эпифитные бактерии, населяющие межклеточную среду.
От гетерогенной отличают гомогенную нуклеацию. Она происходит в среде, не содержащей нуклеаторов, и характеризуется гораздо более низкой пороговой температурой зародышеобразования льда, чем гетерогенная нуклеация. При гомогенной нуклеации кристаллы льда не формируются и не растут до тех пор, пока достаточное число молекул воды не сформирует зародыш льда.
Гомогенную нуклеацию можно получить, если чистую воду диспергировать на мелкие капли. В этом случае вода замерзает только при -38 °C. При гомогенной нуклеации водные растворы низкомолекулярных веществ, например солей, сахаров и полиспиртов, за счет их криоскопического действия замерзают при еще более низких температурах. Благодаря гетерогенным нуклеаторам лед в межклетниках образуется при более высоких температурах, чем те, которые требуются для замерзания внутриклеточной среды (как отмечалось выше, образование льда в клетках более губительно, чем в межклетниках).
Выход воды наружу при внеклеточном образовании льда хотя и предотвращает образование внутриклеточного льда, тем не менее сопровождается неблагоприятными для клеток эффектами дегидратации. В связи с этим адаптация и акклимация растений к низким температурам включает формирование механизмов, которые повышают резистентность клеток к обезвоживанию. Считается, что морозоустойчивость мезофитов в первую очередь определяется способностью их клеток выдерживать дегидратацию. Защита клеток при дегидратации, вызываемой отрицательными температурами, так же, как при засухе и солевом стрессе, связана с биосинтезом осмопротекторов, прежде всего низкомолекулярных сахаров и полиспиртов. Одна из основных функций этих веществ состоит в защите внутриклеточных биополимеров. Специфической функцией осмопротекторов при дегидратации клеток, вызванной низкими температурами, является понижение температуры замерзания внутриклеточной среды. Остается неясным, как соотносится выход воды из клеток при образовании льда с увеличением внутриклеточного осмотического давления, происходящего в результате накопления осмопротекторов.
Последствия обезвоживания клеток
Потеря воды клетками при внеклеточном образовании льда приводит к уменьшению объема протопластов и концентрированию содержащихся в них веществ, некоторые из них при повышенных концентрациях становятся токсичными для клеток. К таким веществам относятся неорганические ионы, например Na+ и С1 , активные формы кислорода и ряд органических соединений. Увеличение внутриклеточных концентраций ионов и накопление токсичных соединений в свою очередь приводит к изменениям конформации биополимеров, а в наиболее острых случаях — к денатурации белков. При этом может происходить образование или разрыв ковалентных связей в белках. Одним из наиболее часто встречающихся эффектов такого рода является окисление SH-групп и образование дисульфидных связей между различными участками полипептидной цепи или различными цепями.
Дегидратация клеток оказывает непосредственное действие на структурное состояние липидов мембран. Мембраны в норме связывают до 30 —50 % воды
Рис. 8.28. Фазовые переходы липидов мембран при изменениях температуры и содержания воды в клетках:
La — ламеллярная форма в жидкокристаллическом состоянии; £р — ламеллярная форма в твердом, гелеобразном состоянии; Ни — гексагональная форма
Смешанная форма
(в расчете на их сухую массу). Взаимодействуя с заряженными и полярными группами белков и фосфолипидов, вода стабилизирует структуру мембран. Дегидратация вызывает обратимые и необратимые (в зависимости от степени дегидратации) нарушения мембранных структур (рис. 8.28). На начальной стадии потери воды мембраной липиды переходят из жидкокристаллического в гелеобразное состояние (£а-> L^. При более сильной дегидратации, когда остается не более 20 % воды, липиды переходят в гексагональную форму (£р -> Ни). В мембранах клеток, устойчивых к высушиванию, гексагональная форма не образуется даже когда остается 2—11% воды. Изменения структуры мембран в ответ на потерю ими воды при внеклеточном образовании льда могут накладываться на эффекты, вызванные непосредственными температурными сдвигами. Дегидратация липидов повышает температуру фазового перехода £а^ £р, т е- термотропный переход из жидкокристаллического состояния в гелеобразное при дегидратации мембраны осуществляется при более высокой температуре. Можно сказать, что неблагоприятное действие низкой температуры при дегидратации усиливается.
При быстром замораживании выделенных протопластов ржи при -10 °C, которое сопровождалось потерей ими воды, в липидах мембран происходило образование 77и-фазы. При медленном снижении температуры до -10 °C вода в протопластах сохранялась, и они переходили в переохлажденное состояние (см. подразд. 8.4.2.3). Образования Дц-фазы при этом не наблюдалось. Повышение осмотического давления среды, в которой находились переохлажденные протопласты, путем внесения в нее сорбитола сопровождалось выходом воды из протопластов и образованием Яи-фазы. При этом утрачивалась осмотическая реакция протопластов. Процент гибели протопластов коррелировал с числом участков мембраны, находящихся в гексагональной фазе. Следует отметить, что акклимация растений к отрицательным температурам (закалка) снижает температуру перехода мембранных липидов в гексагональную фазу. У протопластов, выделенных из закаленных растений, даже при -35 °C в мембранах почти не было участков, содержащих //п-фазу.
Сильная дегидратация может стать причиной нарушения связи между липидами и белками мембран. При внеклеточном образовании льда, особенно у неустойчивых к замораживанию растений, в мембранах появляются участки, не содержащие белков. В переохлажденных клетках лишенные белков участки отсутствуют (см. подразд. 8.4.2.3), указывая на то, что потеря белков связана не столько с влиянием низкой температуры, сколько с дегидратацией клеток.
К наиболее общим эффектам обезвоживания клеток, наблюдаемым у многих растений при действии низких температур, засухи и почвенного засоления, относится деградация фосфолипидов мембран вследствие активации фосфолипазы D. Роль активатора играют ионы Са2+, концентрация которых в клетках неконтролируемым образом повышается при деструктивных изменениях клеточных мембран. Расщепление фосфолипазой D фосфатидилхолина стимулирует образование перекисных соединений липидов свободнорадикальной природы, накопление малонового диальдегида и других токсичных соединений (см. подразд. 8.6).
Перечисленные выше изменения в белках и липидах вызывают различного рода нарушения метаболизма и один из них — подавление биохимической и фотохимической активности хлоропластов. В частности, снижается скорость ассимиляции углерода и фотофосфорилирования. Подавление фотофосфорилирования связано с увеличением протонной проводимости тилакоидов и снижением АТФ-синтазной активности. Сниженное содержание воды и высокие концентрации ионов в клетках ведут к потере тилакоидами сопрягающего фактора АТФ-синтазы Ср! и пластоцианина. При отделении Ср! открывается АТФ- синтазный канал; это ведет к увеличению Непроводимости мембраны, снижению генерируемой в ходе переноса электронов Ацщи соответственно к снижению уровня синтезируемого АТФ. Такой эффект наблюдается при отрицательных и низких положительных температурах, а также при засухе и почвенном засолении. Следует отметить, что осмолиты, в частности сахара и полиспирты, защищают тилакоиды. Они предотвращают отделение CF] от СР0, поддерживая этим низкую Непроводимость тилакоидов и, следовательно, высокий уровень сопряжения переноса электронов и фотофосфорилирования.
При дегидратации клеток, вызванной образованием внеклеточного льда, и последующем оттаивании возрастает проницаемость плазмалеммы для ионов и ряда органических веществ. Тонопласт при этом тоже, как правило, повреждается. Об этом свидетельствует возросший экзоосмос веществ, содержащихся в вакуоли.
Механизм переохлаждения
Выход воды из клеток и образование внеклеточного льда, стимулируемое гетерогенными нуклеаторами, происходит при относительно высоких отрицательных температурах. Для тканей многих древесных пород пороговые температуры внеклеточного образования льда лежат в диапазоне от -2° до -5 °C. В листьях высокоустойчивой к морозу озимой ржи (Secale cereale) нуклеация льда в межклетниках происходит при -5°...-12 °C, тогда как нижний температурный предел выживаемости этого растения составляет -30°...-35 °C. Оставшаяся в клетках вода после образования льда в межклеточной среде не замерзает при последующем снижении температуры. Такая вода называется переох-
лажденной. Температура образования льда в клетках, выше которой вода находится в переохлажденном состоянии, приблизительно совпадает с нижним температурным пределом выживаемости растения.
В основе способности растений сохранять воду в клетках в жидком состоянии при очень низких отрицательных температурах лежит так называемый механизм переохлаждения. Он чрезвычайно важен в обеспечении резистентности растений к замораживанию.
Для исследования способности клеток к переохлаждению используют термический дифференциальный анализ. Ткань или орган растения постепенно охлаждают и с помощью термопар регистрируют разность температур между охлаждаемым и котрольным образцами. Образование льда — процесс экзотермический, т. е. происходит с выделением тепла, и на термограмме ему соответствует экзотермический пик, который называется низкотемпературной экзотермой (НТЭ). Дифференциальный термический анализ был сделан для многих растений. Рекордно низкая температура замерзания клеток была установлена для таких растений холодного климата, как черный ясень (Fraxinus nigra) (-47 °C) и виргинский можжевельник (Juniperus virginiana) (-52 °C). У растений теплого климата НТЭ лежат в области -10°...-20 °C. Низкие температуры замерзания внутриклеточной среды характерны для цветочных почек древесных и травянистых растений, а также зародышей семян. Переохлаждение характеризуется температурным гистерезисом, т. е. различием в температуре замерзания и последующего оттаивания. Например, если НТЭ выявляется при -30°...-40 °C, то оттаивание может происходить при -20°C.
Чтобы понять, на чем основана способность клеток к переохлаждению, необходимо ответить на два вопроса: 1) почему внутриклеточная вода не замерзает до НТЭ, т. е. что препятствует образованию льда в клетках и 2) почему не замерзающая до НТЭ вода не выходит из клеток?
Ответ на первый вопрос следует искать в необычных свойствах внутриклеточной воды, в наличии в клетках низкомолекулярных криопротекторов и в отсутствии гетерогенных нуклеаторов. Значительная часть внутриклеточной воды находится в связанном состоянии. В связывании воды участвуют как биополимеры клетки, так и осмопротекторы, особенно те из них, которые содержат большое число гидроксильных групп. Гидратная оболочка маннитола содержит, например, 200—250 молекул воды. Необычные свойства внутриклеточной воды связаны также с наличием в клетках многочисленных поверхностей раздела фаз. Вода вблизи этих поверхностей может сильно переохлаждаться. Моделью такой системы являются тонкие кварцевые капилляры, вода в них замерзает при -34 °C. В ионообменных смолах ячеистого строения вода также переохлаждается, замерзая при -30 °C. Остается неясным, участвуют ли в предотвращении образования внутриклеточного льда высокомолекулярные антифризы (см. подразд. S.4.2.4).
Ответ на второй вопрос связан прежде всего с анатомическими особенностями тканей, способных к переохлаждению. Отсутствие оттока воды в межклетники в таких тканях нельзя объяснить низкой водной проницаемостью плазмалеммы. Препятствие для миграции воды из клеток создают анатомические барьеры.
Отсутствие оттока воды из клеток в тканях цветочных почек у древесных растений обусловлено лигнификацией и суберинизацией клеточных стенок. Нео-
бычно жесткие и упругие стенки паренхимных клеток древесины препятствуют сжатию связанных с ними протопластов. За счет этого водоотнимающие силы развивают в клетках отрицательное тургорное давление, понижающее водный потенциал клеток. Важная роль в удержании воды клетками отводится также осмолитам, концентрация которых в клетках морозоустойчивых растений высока и повышается при акклимации к отрицательным температурам. Высокое содержание в клетках осмолитов полигидроксильной природы не только отвечает за повышение внутриклеточного осмотического давления (снижение водного потенциала), но и приводит, как уже отмечалось, к увеличению уровня связанной воды.
Механизм переохлаждения имеет ряд преимуществ по сравнению с механизмом, основанным на внеклеточном образовании льда. При обезвоживании клеток наблюдаются различного рода нарушения структуры макромолекул, биохимических процессов и физиологических функций. При переохлаждении потери воды минимальны, что важно для активно метаболизирующих тканей, например тканей развивающегося из почки побега. Наблюдаемые весной бурный рост и развитие побега из почки при дегидратации потребовали бы предварительной репарации меристематических клеток, на что необходимо время. В случае механизма переохлаждения растения при повышении температуры могут сразу перейти к активной вегетации, так как в этом случае все структуры остаются неповрежденными. Состояние переохлажденных клеток можно охарактеризовать как физиологический покой. В этом состоянии отсутствуют рост и дифференцировка, но идут процессы поддержания. С процессами поддержания связано сохранение дыхания и фотосинтеза. У ели (Picea abies), например, фотосинтез наблюдается при -14 °C. У многих морозоустойчивых растений дыхание сохраняется при -18°...-20 °C. Механизм переохлаждения типичен для жизненно важных тканей и органов, которые переходят в активное состояние сразу при весеннем потеплении. К ним относятся почки, генеративные органы, паренхимные клетки древесины, клетки проводящих пучков. У хвойных механизм переохлаждения типичен для тканей листьев. В этих органах и тканях образование льда крайне нежелательно не только внутри клеток, но и в межклетниках. В то же время процесс образования внеклеточного льда, начавшийся в каком-то одном месте, быстро распространяется по растению и может захватить жизненно важные части растения. Как защита от этого, у зимостойких растений сформировались механизмы, регулирующие образование и распространение льда по межклетникам и сосудам ксилемы.
Биологические антифризы
В клетках некоторых растений синтезируются высокомолекулярные соединения, тормозящие процессы нуклеации и роста кристаллов льда. Эти соединения получили название биологических антифризов. Их биосинтез и экскреция в межклеточную среду являются ткане- и органоспецифическими. Антифризы можно выделить экстракцией из апопласта. Сведения об антифризной активности внутри клеток отсутствуют, поэтому считается, что они препятствуют внеклеточному образованию льда, особенно в тех органах и тканях, чьи клетки должны сохранить максимальное количество воды и находиться в переохлажденном состоянии. У зимующих растений антифризная активность обнару-
жена в клеточных стенках всех органов. Она меняется в зависимости от сезона и возрастает при акклимации растений к отрицательным температурам. В осенний период при закалке экскреция антифризов в межклеточную среду усиливается.
Известны антифризы белковой, гликопротеиновой и полисахаридной природы. У озимой ржи обнаружено шесть полипептидов с молекулярными массами 13, 19, 26, 32, 34 и 36 кДа, обладающих антифризной активностью. Из паслена горько-сладкого {Solarium dulcamara) выделен антифризный гликопротеин (молекулярная масса 67 кДа), содержащий в качестве углеводного компонента остатки галактозы. Из антифризов полисахаридной природы известны арабиноксиланы. Они выделены из клеточной стенки прошедшей закалку озимой ржи. Арабиноксиланы состоят из основных ксилановых цепей с боковыми цепями, образованными остатками арабинозы. Считается, что действие антифризов основано на наличии в их молекулах большого числа полярных группировок. В соответствии с гипотезой А. де Фриза, в гликопротеиновых антифризах полярные ОН-группы углеводных остатков образуют сплошной правильный фронт, располагаясь в одной плоскости вдоль линейной молекулы антифриза. Такая геометрия молекулы способствует ее сильному взаимодействию с молекулами Н2О в кристалле льда. За счет образующихся водородных связей молекула антифриза прочно адсорбируется на кристалле, что создает термодинамический барьер для присоединения к кристаллу новых молекул Н2О. Таким образом осуществляется блокада роста кристаллов льда.
Анатомические барьеры
Важная роль в резистентности к замораживанию принадлежит анатомическим барьерам, которые препятствуют распространению процесса образования льда по сосудам ксилемы. Эту роль можно оценить в полной мере, если учесть, что именно по ксилеме процесс нуклеации и роста кристаллов распространяется с наибольшей скоростью. Одним из типов анатомических барьеров для распространения образования льда является сегментация сосудов ксилемы: сосуды прерываются зонами, состоящими из трахеид. Сегментация сосудов обнаружена у многих зимостойких злаков и древесных растений. В почках некоторых растений сосуды ксилемы отделены от прилегающих к ним паренхимных клеток слоем аморфного вещества пектиновой природы, создающим непреодолимую преграду для распространения нуклеации льда в меристему.
Роль белков холодового шока в акклимации растенийк замораживанию
Растения отвечают на низкотемпературную обработку экспрессией ряда генов. Продукты этих генов получили название белков холодового шока (БХШ). Значительная часть этих белков идентифицирована, однако функциональная роль большинства из них остается неясной. Низкотемпературной обработкой индуцируются Lea-белки, относящиеся ко второй и пятой группам (см. подразд. 8.2.3.1). Индукция этих белков происходит в ответ на водный дефицит, который является составной частью холодового шока (ХШ). К БХШ относятся
также продукты некоторых уникальных генов, экспрессирующихся в растениях при отрицательных температурах. Один из генов, COR15a, входит в состав ядерного генома. Продуктом этого гена является гидрофильный белок, который транспортируется в хлоропласт и там подвергается процессингу, превращаясь в зрелый белок CORlSam (мол. масса 9,4 кДа). Протопласты не прошедших акклимацию трансгенных растений A.thaliana, которые конститутивно экспрессируют ген COR15a, характеризуются повышенной резистентностью к замораживанию.
Многие гены белков ХШ содержат в премоторной области DRE-элемент, который связывается с активатором транскрипции DREBP (см. подразд. 8.2.5). Сверхэкспрессия DREBP в протопластах трансгенных растений A. thaliana, обладающих повышенной устойчивостью к низким температурам, вызывала увеличение количества транскриптов всех генов COR, причем устойчивость повышалась в большей степени, чем при сверхэкспрессии одного гена COR15a. Это указывает на важную роль генов регуляторных белков в формировании толерантности к низким температурам.
МЕХАНИЗМЫ ТЕРМОРЕГУЛЯЦИИ У РАСТЕНИЙ
Теплопродукция при дыхании
Растения в целом являются эктотермными организмами, тем не менее у холодоустойчивых растений отдельные ткани и органы способны к терморегуляции. Исследования процесса дыхания свидетельствуют о наличии у них термогенеза, т. е. производства тепла.
При снижении температуры у холодоустойчивых растений повышается уровень дыхательного газообмена при одновременном разобщении транспорта электронов и фосфорилирования. У растений, чувствительных к холоду, реакция дыхания на низкие температуры иная: скорость дыхательного газообмена понижается, тогда как дыхательный контроль остается на прежнем уровне или даже возрастает, указывая на поддержание высокого уровня сопряжения переноса электронов и фосфорилирования. Переход митохондрий в низкоэнергетическое состояние у толерантных растений связан с необходимостью выработки тепла. Разобщение переноса электронов и фосфорилирования происходит за счет повышения содержания в митохондриях свободных жирных кислот. Они увеличивают проводимость внутренней мембраны митохондрий для Н , что приводит к диссипации протонного градиента, который генерируется при окислении дыхательных субстратов. Аналогичные процессы происходят в митохондриях бурой жировой ткани у адаптированных к холоду, а также впадающих в зимнюю спячку животных. В этой ткани энергия химических связей дыхательных субстратов используется только для теплопродукции. Через имеющийся в цепи синтеза АТФ шунт протоны транспортируются через мембрану в обход АТФ-синтазы. У растений к эндогенным разобщающим агентам, участвующим в выработке тепла, относятся также некоторые белки.
Одним из способов превратить энергию химических связей дыхательных субстратов в тепло является переключение дыхательного пути с цитохромного на альтернативный цианидрезистентный путь, который ответвляется от цито-
хромного пути на уровне убихинона (см. гл. 4). Цианидрезистентный путь не связан с генерацией трансмембранного градиента электрохимического потенциала протонов (Дрн+) и, следовательно, с синтезом АТФ, но его включение приводит к термогенезу. Альтернативный путь дыхания, по-видимому, имеется у всех растений, но его доля особенно велика в тех организмах, органах и тканях, которые осуществляют теплопродукцию. Выделение тепла свойственно в большей степени генеративным органам. Теплопродукция была зарегистрирована у цветков симплокарпуса (Symplocarpusfoetidus), филодендрона (Philodendron selloum), ароника (Arum maculatum) и многих других растений.
Теплопродукция при замораживании
Превращение воды в лед является экзотермическим процессом, поэтому замерзание межклеточной жидкости сопровождается локальным повышением температуры. На этом основана приспособительная стратегия к резким суточным колебаниям температуры воздуха у некоторых растений рода лобелия (Lobelia telekii и L. deckenii). Они обитают в горах, где ночью температура воздуха опускается до -10 °C, тогда как днем температуры плюсовые. Днем растения должны активно метаболизировать, а ночью необходима толерантность к замораживанию. Суточную терморегуляцию у этих растений обеспечивает большая межклеточная полость в соцветии, которая содержит раствор полисахаридов и других карбогидратов. Растворенные вещества выполняют функцию гетерогенных нуклеаторов. Лед образуется в полости при близких к 0 °C отрицательных температурах. Выделяющееся при этом тепло обогревает соцветие. При колебаниях наружной температуры в диапазоне от -8° до +12 °C температура соцветия не опускается ниже 0 °C. Такая же стратегия обнаружена у некоторых видов опунций, например у Opuntia humifusa и O.ficusindica. Эти растения обитают в пустынях, тем не менее выдерживают снижение температуры до -10 °C. В их межклетниках находится вязкая жидкость, содержащая полисахариды, масса которых достигает 45 % в расчете на сухую массу ткани. Полисахариды выступают в роли гетерогенных нуклеаторов.
КИСЛОРОДНЫЙ ДЕФИЦИТ
Растения, как облигатные аэробы, используют молекулярный кислород в качестве терминального акцептора электронов в митохондриальной электрон-транспортной цепи (ЭТЦ). При нормальных аэробных условиях окисление 1 моля гексозы в реакциях лимоннокислого цикла приводит к образованию 30—32 молей АТФ (см. гл. 4). В отсутствие кислорода окислительный распад гексозы ограничен реакциями гликолиза, а количество образующегося при этом АТФ составляет лишь 2 моля.
Концентрация кислорода в газовой фазе хорошо дренированной пористой почвы почти равна его концентрации в атмосфере и составляет 20,6 %, что соответствует парциальному давлению кислорода 0,0206 МПа. Концентрация кислорода в почве снижается чаще всего из-за избыточного содержания в ней воды. Затопление водой существенно снижает скорость кислородного обмена
между почвой и воздухом, так как коэффициент диффузии О2 в воде на 4 порядка ниже, чем в воздухе. Снабжение кислородом корней зависит не только от содержания в почве воды, но и от таких факторов, как пористость почвы, температура, густота корней и глубина, на которую они проникают в почву, от метаболической активности корней, а также присутствия в почве конкурирующих за кислород микроорганизмов. Дефицит кислорода испытывают также озимые культуры, которые часто оказываются под ледяной коркой. Такая ситуация возникает, когда период зимней оттепели сменяется морозами. Дефицит О2 в среде приводит к кислородной недостаточности растений.
В зависимости от степени кислородной недостаточности различают гипоксию и аноксию. Гипоксия наблюдается при неполном удалении О2 из среды, так что аэробное дыхание сохраняется, хотя и с пониженной скоростью. По мере снижения концентрации О2 в почве и подавления аэробного дыхания отношение АТФ/АДФ в цитоплазме становится меньше, доля участия окислительного фосфорилирования в синтезе АТФ снижается, а доля участия в этом процессе гликолиза возрастает. При гипоксии процессы, приводящие к акклимации растений к дефициту О2, стимулируются. Условия аноксии создаются при практически полном отсутствии О2 в почве. Такая ситуация возникает чаще всего при затоплении почвы и растений водой. При аноксии АТФ синтезируется лишь гликолитическим путем, аэробное дыхание полностью выключается. Концентрация АТФ и отношение АТФ/АДФ в цитоплазме снижаются в большей степени, чем при гипоксии. Синтез белка, рост и развитие растений подавляются.
Чтобы выжить в условиях дефицита кислорода, растения должны не только поддерживать концентрацию АТФ в клетках надостаточном для жизнеобеспечения уровне, но и регенерировать НАД+ и НАДФ+, поскольку при кислородной недостаточности равновесия НАД+/НАДН и НАДФ+/НАДФН смещаются в сторону восстановленных форм. Необходимо устранять также накапливающиеся в клетках токсические соединения.
В зависимости от способности выдерживать временное затопление водой растения подразделяют на чувствительные и резистентные к О^-дефициту. К первым относятся, в частности соя, горох и томаты (Licopersicon esculentum), ко вторым — арабидопсис, овес, картофель, пшеница, кукуруза (Zea mays). В третью группу включают самые устойчивые к кислородному дефициту растения водных и влажных (заболоченных) мест обитания. К ним относятся, например, рис, кубышка (Nuphar luteum), стрелолист (Sagittaria sagittifolia) и валлис- нерия (Vallisneria spiralis). У растений второй и третьей групп в процессе эволюции сформировались биохимические механизмы, а также разнообразные морфологические и анатомические приспособления, позволяющие противостоять дефициту кислорода в среде.
АНАТОМО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ,ПОЗВОЛЯЮЩИЕ РАСТЕНИЯМ ПОДДЕРЖИВАТЬ АЭРОБНЫЙ ОБМЕН
В УСЛОВИЯХ ДЕФИЦИТА КИСЛОРОДА
Рост в водной и влажной средах способствует формированию толстой гиподермы в корнях, снижающей поток кислорода из тканей в почву, бедную кислородом. Многие водные и устойчивые к временному затоплению растения
Рис. 8.29. Аэренхима в коре стебля водного растения Myriophyllum (по К. Даддингтону, 1972)Рис. 8.29. Аэренхима в коре стебля водного растения Myriophyllum (по К. Даддингтону, 1972)формируют специфическую структуру — аэренхиму, представляющую собой непрерывную межклеточную полость, которая обеспечивает транспорт О2 от находящихся в воздушной среде структур к погруженным в воду частям растения и этим поддерживает в них аэробный обмен (рис. 8.29). Функцию снабжения растений кислородом при их росте в водной среде часто выполняют боковые корни, отходящие от гипокотиля или стебля, воздушные корни, в том числе пневматофоры — воздушные корни, характеризующиеся отрицательным геотропизмом (растущие по направлению из залитой во
Рис. 8.29. Аэренхима в коре стебля водного растения Myriophyllum (по К. Даддингтону, 1972)
Рис. 8.29. Аэренхима в коре стебля водного растения Myriophyllum (по К. Даддингтону, 1972)
дой почвы вверх). Все эти разновидности корней снабжены аэренхимой. Аэробному метаболизму при О2-дефиците способствуют также чечевички на стеблях,
открывающиеся в перидерму.
Наличие аэренхимы у риса является конститугивным признаком, а бескислородные условия способствуют ее более сильному развитию. Затопление растений риса, относящихся к глубоководным сортам, ускоряет рост междоузлий стебля (ускоряет удлинение клеток). Вследствие этого верхняя часть побега постоянно находится над поверхностью воды. Хотя в условиях затопления ультраструктура митохондрий клеток корня у риса изменяется, их функциональная активность поддерживается на высоком уровне. Развитие аэренхимы не воссоздает полностью те условия обеспечения тканей кислородом, которые наблюдаются в норме, поэтому при дефиците О2 даже при наличии хорошо развитой аэренхимы в тканях растений активируется гликолиз. Таким образом, способность расти в анаэробных условиях связана и с активированием гликолиза, и с аэробным метаболизмом, который поддерживается благодаря доставке кислорода из верхней части побега в корни через аэренхиму. У резистентных к затоплению растений (вторая группа) развитие аэренхимы не является конститутивным признаком и происходит только в ответ на дефицит О2.
У некоторых водных растений, таких, например, как аир (Acorus calamus'), способность переживать кислородный дефицит связана с подавлением метаболизма и переходом в состояние покоя, который может длиться несколько месяцев. При этом процессы, поддерживающие жизнедеятельность, идут за счет
запасного крахмала.
АКТИВИРОВАНИЕ АНАЭРОБНОГО МЕТАБОЛИЗМАВ УСЛОВИЯХ ДЕФИЦИТА КИСЛОРОДА
Устойчивые к затоплению (аноксии) растения, т.е. растения второй группы, могут выдерживать его лишь ограниченный период времени. При затоплении они синтезируют АТФ за счет анаэробного метаболизма. В это время ростовые процессы в корне (удлинение клеток) подавляются. Общая скорость син-
теза белка снижается, а в экспрессии генов происходят заметные изменения. Проростки устойчивых к затоплению сортов кукурузы могут выдерживать аноксию на протяжении 3 — 5 дней в зависимости от генотипа и возраста растений. Устойчивость к затоплению возрастает, если молодые растения предварительно подвергнуть гипоксической обработке. Гипоксия активирует гликолиз, а также способствует формированию боковых корней, несущих аэренхиму в коре.
У чувствительных растений (первая группа), как и у резистентных, скорость гликолиза в ответ на затопление возрастает, однако они быстро повреждаются, поскольку активирование гликолиза у них приводит к закислению цитоплазмы. Скорость синтеза белка в этих условиях снижается, митохондрии подвергаются деструктивным изменениям, процессы деления и растяжения клеток подавляются, нарушается транспорт ионов, а клетки корневой меристемы отмирают. В условиях аноксии у чувствительных растений аэренхима не образуется. Они способны выдержать затопление на протяжении не более суток. Таким образом, непродолжительное затопление активирует в растениях гликолитический путь, независимо от степени их устойчивости к дефициту О2. Простые сахара, субстраты гликолиза, транспортируются из листьев по флоэме в затопленные органы. В затопленных колеоптилях риса происходит гидролиз крахмала, дополнительно снабжающий растения гликолитическими субстратами.
В результате гликолиза б-углеродная молекула глюкозы расщепляется на две 3-углеродные молекулы пировиноградной кислоты (ПВК); образуются две молекулы АТФ, а НАД+ восстанавливается до НАДН (рис. 8.30). Чтобы гликолиз продолжался в отсутствие митохондриального дыхания, необходимо постоянно регенерировать НАД+. Регенерация осуществляется в последующих реакциях ферментации. Существует два основных пути превращений ПВК, ведущих к регенерации НАД+. Первый путь связан с декарбоксилированием ПВК и последующим восстановлением продукта декарбоксилирования — ацетальдегида. В этих превращениях участвуют два фермента: пируватдекарбоксилаза (ПВД) и алкогольдегидрогеназа (АДГ) соответственно. Конечным продуктом этих двух реакций является этиловый спирт. Второй путь осуществляется лактатдегидрогеназой
Пируват-декарбоксилаза
Гликолиз
2 НАДН
Глюкоза
2НАД
Пируват СОО'
с=о
сн
Лактат-дегидрогеназа
Рис. 8.30. Образование этанола и молочной кислоты из конечного продукта гликолиза — пировиноградной кислоты в условиях кислородного дефицита.
Образование обоих продуктов сопряжено с регенерацией НАД*. Образование этанола не приводит к изменениям pH цитозоля, тогда как образование молочной кислоты вызывает ацидоз
С-0
СН3
Ацетальдегид
со2
НАДН НАД* C^q-
нс-он
Алкоголь- ^— НАДН дегидро
геназа . 4 ** НАД *
СН3Молочнаякислота
СН2ОН сн3
Этанол
(ЛДГ), которая восстанавливает ПВК до молочной кислоты (МК). Доли двух путей в превращениях ПВК различны в зависимости от вида растения, его устойчивости к недостатку кислорода, ткани, а также от продолжительности и степени О2-дефицита. Оба пути ведут к регенерации НАД+, однако образование молочной кислоты связано с нежелательным явлением — закислением цитозоля, тогда как при образовании этилового спирта pH цитозоля не изменяется. Говоря иначе, накопление молочной кислоты может вызвать вторичные токсические эффекты в результате ацидоза цитоплазмы. В связи с этим можно считать, что важная роль в устойчивости растений к О2-дефициту принадлежит способности клетки предотвращать закисление цитозоля.
Согласно гипотезе Дэвиса—Робертса, регуляция pH цитозоля при анаэробном метаболизме зависит от соотношения активностей лактатдегидрогеназы и пируватдекарбоксилазы (см. рис. 8.30). Образующаяся при гликолизе ПВК превращается в МК в реакции, катализируемой ЛДГ. Этот фермент имеет оптимум активности при физиологических значениях pH цитоплазмы. При образовании МК цитоплазма закисляется. По мере снижения pH ЛДГ прогрессивно ингибируется, тогда как ПДК, включенная в путь образования этилового спирта, активируется, поскольку ее оптимум активности смещен в кислую область. Таким образом, аккумуляция МК стимулирует превращение ПВК в ацетальдегид, который далее восстанавливается алкогольдегидрогеназой до этилового спирта. В отличие от МК молекула этилового спирта не несет заряда и может легко диффундировать через плазмалемму в среду. В результате включения пути, ведущего к образованию этилового спирта, pH цитозоля стабилизируется на уровне слабокислых значений. О таком регуляторном механизме свидетельствуют эксперименты с трансгенными растениями табака со сверхэкспрессией пируватдекарбоксилазы. Повышенная активность ПДК у трансформантов по сравнению с растениями дикого типа стимулировала ферментацию этанола и приводила к подавлению образования МК в цитозоле. Роль ферментации этанола в предотвращении ацидоза и в обеспечении устойчивости растений к недостатку О2 была продемонстрирована на мутанте кукурузы, дефицитном по АДГ. Нормальные растения кукурузы характеризуются резистентностью к затоплению. Мутант, дефицитный по алкогольдегидрогеназе, которая не требуется для роста в аэробных условиях, оказался более чувствительным к затоплению, чем растения дикого типа. В анаэробных условиях накопление ацетальдегида в его клетках и закисление цитоплазмы было сильнее, чем у растений дикого типа. Таким образом, резистентные к затоплению растения обладают способностью переключать ферментацию молочной кислоты, приводящей к ацидозу, на ферментацию этилового спирта — нейтрального соединения. Чувствительные к затоплению растения, например горох, хотя и накапливают этанол в условиях О2-дефицита, не способны избежать закисления цитоплазмы. У них ферментация этанола осуществляется параллельно с ферментацией МК.
При физиологических значениях pH цитозоля значительная часть образующейся МК находится в анионной форме и вследствие этого не может транспортироваться через плазмалемму. При ацидозе доля недиссоциированных, т. е. способных пересекать мембрану, молекул молочной кислоты возрастает и она может диффундировать из цитозоля наружу. Считается, что выход образующейся при дефиците О2 МК в наружную среду является одним из механизмов,
останавливающих закисление цитоплазмы. Полагают, что клетки толерантных к дефициту О2 растений по сравнению с клетками чувствительных растений более эффективно экспортируют МК наружу.
АККЛИМАЦИЯ РАСТЕНИЙ К АНОКСИИ
В природных условиях аноксии (затоплению растений водой) часто предшествует гипоксия. Если проростки резистентных к О2-дефициту растений, например риса или кукурузы, подвергнуть гипоксической предобработке, то это приведет к индукции процессов, направленных на повышение их устойчивости к создаваемым затем условиям аноксии. Гипоксическая предобработка стимулирует при последующей аноксии ростовые процессы и значительно снижает процент погибших растений.
Акклимация к аноксии достигается во многом за счет активирования гликолиза и сопряженного с гликолизом синтеза АТФ. Гипоксические условия приводят к индукции гликолитических ферментов: гексокиназы, фосфофруктокиназы, пируваткиназы, глюкозофосфатизомеразы, глицеральдегид-3-фос- фатдегидрогеназы, фруктозе-1,6-дифосфатальдолазы, енолазы и др.; ферментов, приводящих к образованию этанола, — пируватдекарбоксилазы и алкогольдегидрогеназы; ферментов, расщепляющих крахмал, в частности «-амилазы. Гипоксическая предобработка способствует мобилизации субстратных резервов и транспорту субстратов из надземных органов в аноксические корни. Считается также, что у резистентных к кислородному дефициту растений предварительные гипоксические условия стимулируют выведение МК из цитозоля, что повышает способность клеток к устранению ацидоза. Низкая эффективность экспорта МК из клеток у чувствительных к О2-дефициту растений сохраняется при гипоксической предобработке, что не способствует устранению ацидоза во время последующей аноксии. Внутриклеточный ацидоз у растений можно рассматривать как главный повреждающий фактор кислородной недостаточности.
ИЗМЕНЕНИЯ В ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ПРИ ПЕРЕХОДЕОТ АЭРОБНОГО МЕТАБОЛИЗМА К ГЛИКОЛИЗУ
Вопрос о последовательности событий, приводящих к запуску ответной реакции растения на О2-дефицит, и о природе рецептора сигнала до настоящего времени остается нерешенным. В анаэробных условиях быстро снижается уровень АТФ, увеличивается содержание НАДН (НАДФН) и происходит закисление цитозоля Любой из этих факторов может принимать участие в процессах сигнальной трансдукции. Как будет показано ниже, в пути передачи сигналов, отвечающих за образование аэренхимы при О2-дефиците, вовлечен гормон этилен. Возможно, что этилен, а также АБК участвуют в запуске и других процессов, индуцируемых О2-дефицитом.
577577Вторичным мессенджером в путях сигнальной трансдукции, активируемых аноксией, является Са +: его содержание в протопластах кукурузы при анаэробных условиях возрастает. Повышенные концентрации Са + необходимы для инициации транскрипции гена алкогольдегидрогеназы Adhl.
577
577
19 Физиология растений
При аноксии в корнях проростков кукурузы происходят существенные изменения в экспрессии генов и метаболизме. Они обнаруживаются уже через несколько часов после создания анаэробных условий. Общий синтез белков подавляется на 70 %. Гипоксия приводит к аналогичному эффекту, однако он выражен в значительно меньшей степени.
Изменения в синтезе белка при аноксии связаны с регуляцией экспрессии генов на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях. Большая часть генов, активных в присутствии О2, при аноксии репрессируется. В то же время некоторый набор генов, не экспрессирующихся до создания анаэробных условий, в условиях аноксии активируется. Экспрессия этих генов чрезвычайно важна для выживания растений в бескислородных условиях. Подавляющая их часть относится к генам ферментов, которые осуществляют (см. подразд. 8.5.3) процессы деградации крахмала, гликолиза и ферментации этанола. Некоторые из этих ферментов, в частности АДГ и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, представлены в клетках несколькими изоформами. Одни изоформы образуются в клетках в аэробных условиях, т.е. характеризуются конститутивным синтезом и участвуют в нормальном метаболизме, другие индуцируются в ответ на О2-дефицит. Гены, кодирующие эти две группы изоформ, различаются по нуклеотидным последовательностям промоторов. Гены, экспрессирующиеся в ответ на О2-дефицит, называются анаэробными генами, а их продукты анаэробными белками. Некоторые анаэробные гены клонированы, в частности гены алкогольдегидрогеназы Adh из кукурузы и арабидопсиса, а также гены пируватдекарбоксилазы Pdc из арабидопсиса. Были охарактеризованы гены Adh. Их про- моторные области содержат специфические гщс-элементы, которые необходимы для экспрессии в условиях кислородного дефицита (рис. 8.31). Известны две такие специфические последовательности: ARE (anaerobic response element) и так называемый G-бокс. Идентифицированы два транскрипционных фактора, взаимодействующих с G-боксом гена Adhl из арабидопсиса: GBP (G-box-binding protein) и GF14 (G-factor). Для индукции транскрипции Adhl GF14 должен сформировать комплекс с GBP, чтобы последний мог вступить в непосредственное взаимодействие с нуклеотидной последовательностью G-бокса.
Как отмечалось выше, биосинтез многих белков нормального метаболизма в бескислородных условиях ингибируется. Хотя гены этих белков при переходе к анаэробному метаболизму продолжают транскрибироваться с той же интенсивностью, которая наблюдается в аэробных условиях, трансляция их мРНК в значительной степени подавляется. Напротив, эффективность трансляции
CGFlj)
(gbpz
ТП J J | Кодирующая область | ARE G-бокс
Рис. 8.31. Гены алкогольдегидрогеназы АДГ из кукурузы и Arabidopsis.
Эти гены содержат в премоторной области специфические цис-элементы, которые необходимы для экспрессии в анаэробных условиях, — ARE (anaerobic response element) и G-бокс. Два транскрипционных фактора взаимодействуют с G-боксом гена Adhl из Arabidopsis GBP (G-box-binding factor) и GF14 (G-factor). Для индукции транскрипции GF14 должен сформировать комплекс с GBP, чтобы последний мог вступить в непосредственное взаимодействие с нуклеотидной последовательностью G-бокса
мРНК анаэробных генов, в частности Adhl, при аноксии резко возрастает. Таким образом, регуляция экспрессии генов на уровне трансляции играет важную роль не только в подавлении синтеза белков нормального метаболизма, но и в индукции анаэробных белков.
В ПРОЦЕСС ОБРАЗОВАНИЯ АЭРЕНХИМЫ ПРИ ДЕФИЦИТЕ О2ВОВЛЕЧЕН РАСТИТЕЛЬНЫЙ ГОРМОН ЭТИЛЕН
Синтез этилена в растениях стимулируют низкие концентрации кислорода в среде (0,003 — 0,012 МПа), т.е. условия гипоксии. Этот гормон индуцирует образование аэренхимы в коре корня. Аноксия по сравнению с гипоксией в меньшей степени способствует образованию аэренхимы, так как для синтеза этилена требуется кислород. Предшественник этилена — 1-аминоциклопропан-1-карбоновая кислота (АЦК). Количества АЦК-синтазы и АЦК-оксидазы (ферментов, вовлеченных в биосинтез этилена) существенным образом возрастают в ответ на гипоксию в корнях кукурузы. В пути передачи сигнала, который запускается этиленом и приводит к формированию аэренхимы, участвуют в качестве вторичного мессенжера ионы Са . Переданный сигнал индуцирует процессы, приводящие к гибели клеток в центральной части коры корня кукурузы и к их последующему лизису. Наиболее вероятно, что гибель клеток в этом случае — результат апоптоза, т.е. запрограммированной смерти. В лизисе клеток участвуют ферменты, осуществляющие деградацию клеточных стенок, — целлюлазы и ксилоглюканазы, синтезируемые в больших количествах в гипоксических корнях.
Этилен вовлечен также в ответ на затопление у глубоководных сортов риса. Такие сорта могут расти в воде, уровень которой достигает 4 м.
Затопление молодых растений приводит к усиленному образованию этилена, за которым следуют увеличение содержания в клетках АБК и возрастание отзывчивости растений на гибберелин. В результате скорость деления клеток в интеркалярной меристеме возрастает, а также усиливается растяжение клеток в междоузлиях. Благодаря этому соревнование в скорости между ростом и затоплением выигрывает рост растения, так что верхняя часть побега оказывается над поверхностью воды, снабжая кислородом затопленные части растения через аэренхиму.
Поддержание аэробного метаболизма в корнях при затоплении за счет формирования О2-проводящих путей, наряду с переходом на анаэробный метаболизм, можно рассматривать как важнейшую стратегию устойчивости растений к кислородному дефициту.
ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС
Окислительный стресс в растениях возникает в условиях, способствующих формированию активных форм кислорода (АФК). Напомним, что к АФК относят анион-радикал О;, пероксид водорода Н2О2, гидроперекисный радикал НО2, гидроксил-радикал НО', а также синглетный кислород 'О2 и озон О3. Высокое содержание АФК в клетках приводит к повреждению биомолекул и
может вызвать гибель растений. Процессы, приводящие к образованию АФК, роль АФК в растениях и антиоксидантные системы, снижающие их концентрации в клетках до нетоксического уровня, уже рассматривались в гл. 3 и 4 в связи с функционированием электрон-транспортных цепей в различных клеточных органеллах и защитой клеток от избыточного освещения, приводящего к фотоингибированию фотосинтеза. В связи с этим в этом разделе мы остановимся в основном на АФК-индуцируемых повреждениях биомолекул, на процессах детоксикации вторичных продуктов взаимодействия АФК с биомолекулами, а также на эффектах озона, которые не рассматривались в других разделах.
Окислительный стресс в растениях возникает в результате действия практически всех неблагоприятных факторов внешней среды, включая засуху, почвенное засоление, загрязнение воздуха токсическими соединениями, такими, например, как озон, оксиды серы и азота, тяжелые металлы, низкие и высокие температуры, свет высокой интенсивности, ультрафиолетовое излучение, недостаток элементов минерального питания, некоторые гербициды, в частности паракват (метил-виологен), патогены различной природы и др. Можно сказать, что окислительный стресс входит как компонент в большинство других стрессов. Такая универсальность в индукции окислительного стресса при действии на растения самых разнообразных неблагоприятных факторов внешней среды указывает на принципиально важную роль антиоксидантных систем, снижающих внутриклеточные концентрации АФК, а также систем, ликвидирующих токсические продукты взаимодействия АФК с биополимерами и повышающих устойчивость растений к неблагоприятным факторам среды вообще.
ПОВРЕЖДЕНИЯ БИОМОЛЕКУЛАКТИВНЫМИ ФОРМАМИ КИСЛОРОДА
В норме концентрации АФК в клетках не высоки: концентрация Of составляет порядка 10"11 М, Н2О2 — 10"8 М, НО" — меньше 10"11 М. Возрастание внутриклеточных концентраций АФК при стрессах, и особенно НО", ведет к повреждениям молекул липидов, нуклеиновых кислот и белков. Взаимодействуя с ними, АФК вызывают образование органических гидропероксидов типа ROOH. Изменения макромолекул под действием АФК называются окислительными модификациями (ОМ) макромолекул. Органические гидропероксиды ROOH по своей структуре подобны Н2О2 (ср.: R—О—О—Н и Н—О—О—Н) и характеризуются высокой реакционной способностью. При последующих превращениях они переходят в спирты, альдегиды, эпоксиды и другие окисленные органические соединения. Образование ROOH называют перекисным окислением.
Ниже рассматривается действие АФК на молекулы трех классов наиболее важных биомолекул.
Повреждения липидов
АФК приводят к перекисному окислению липидов {ПОЛ), вызывая в остатках полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) цепные реакции с образованием липидных радикалов L", пероксилов LOO", гидропероксидов LOOH и алкоксидов LO":
LH
+Н0’
-H20
L*
+02
+Fe2+
-Fe3t
LO'
+LH
-LOH
L'^
-HO
Первые три превращения (верхняя строка) представляют собой начало и ход цепной реакции. В ходе третьего превращения наряду с липидным радикалом L" образуется гидропероксид LOOH. Последний, взаимодействуя с ионами металлов переменной валентности, находящихся в восстановленной форме, например с Fez+ или Си+, создают разветвления цепи (нижняя строка). Накапливающиеся в результате цепной реакции гидропероксиды жирных кислот, входящих в состав липидов, подвергаются распаду по следующей схеме:
-сн2-снч-сн=сн*о-онГидропероксид-сн2-снч-сн=сн*о-онГидропероксид-СН2-СС + /С-СН2-н-СН2-СС + /С-СН2-нКарбонильные соединенияКарбонильные соединения
-сн2-снч-сн=сн*
о-он
Гидропероксид
-сн2-снч-сн=сн*
о-он
Гидропероксид
-СН2-СС + /С-СН2-н
-СН2-СС + /С-СН2-н
Карбонильные соединения
Карбонильные соединения
^с-сн2-с^стн^с-сн2-с^стнПродукты расщепления, несущие двойную связь, под действием радикалов подвергаются дальнейшему перекисному окислению и распаду. В результате ЖК образуют целый спектр соединений. Многие из них представляют собой альдегиды, которые обладают высокой биологической активностью и часто высокотоксичны. При распаде жирных кислот, сопровождающем ПОЛ, сначала образуются диеновые конъюгаты, а затем такие метаболиты, как малоно
^с-сн2-с^стн
^с-сн2-с^стн
вый диальдегидвый диальдегидПродуктами ПОЛ могут быть и более про
вый диальдегид
вый диальдегид
стые соединения, например такие, как пентан и этан. ПОЛ прежде всего повреждает клеточные мембраны, что в свою очередь приводит к нарушениям функций мембранных белков и нарушению внутриклеточной компартмента- ции веществ. Продукты ОМ липидов (4-гидроксиалкенали, соединения типа С5Н9—СПОН—СН = СН—СПО и малоновый диальдегид) вызывают мутации и блокируют клеточное деление.
Прежде ПОЛ считали исключительно спонтанным процессом, протекающим без участия ферментов. Затем было показано, что важную роль в ПОЛ играют и ферментативные реакции, в частности реакции, катализируемые липоксигеназами. Окисление липидов с помощью этих ферментов приводит к образованию специфических веществ — эйкозаноидов, выполняющих функ
цию сигнальных молекул при экспрессии генов.
Повреждения нуклеиновых кислот
АФК вызывают окислительную модификацию нуклеотидов и нуклеиновых кислот, особенно ДНК. Наиболее заметное действие оказывает НО", который модифицирует все четыре основания в молекуле ДНК, образуя множество производных форм. 'О2 избирательно атакует гуанин, а СД и Н2О2 не реагируют с основаниями ДНК вообще. Под действием АФК нуклеотиды подвергаются перекисному окислению. Так, из тимина образуется 5-СН2ООН-урацил:
ТиминТимин5-СН2ООН-урацил5-СН2ООН-урацил
Тимин
Тимин
5-СН2ООН-урацил
5-СН2ООН-урацил
Дальнейшее превращение образовавшихся перекисей приводит к гидропроизводным типа ROH или R(OH)2, главным из которых является 8-гидроксигу- анин:
8-Гидроксигуанин
Эта окислительная модификация гуанина приводит к нарушениям ферментативного процесса метилирования цитозиновых оснований, которые соседствуют с модифицированными гуанозиновыми основаниями. Модификации оснований, вызванные АФК, становятся причиной разрывов цепей ДНК и повреждений хромосом. АФК являются мощными мутагенными агентами, ингибиторами синтеза ДНК и деления клеток.
Повреждения белков
Белки, так же как липиды и нуклеиновые кислоты, повреждаются активными формами кислорода. При действии АФК происходит окисление аминокислот с образованием пероксильных радикалов:
-NH-CH-C(O)-
R
|но-
-NH-C-C(O)-
R
О'ОСУООН
III
-NH-C-C(O)- NH-C-C(O)* —NH-C-C(O)-
RRR
Алкоксильный радикал Пероксильный радикалГидропероксид
Из пероксильных радикалов образуются гидропероксиды и алкоксильные радикалы. Последние обладают высокой реакционной способностью и сами могут индуцировать образование высокореактивных соединений радикальной природы. Гидропероксиды также генерируют новые радикалы, если имеются
ионы металлов переменной валентности. Производными пероксидных групп (—С—О—ОН) являются группы —СОН (о- и .м-тирозины), —С(ОН)2, карбонилы и другие соединения. Образуются также димеры (дитирозины) и происходит окислительное гликозилирование белков. АФК-индуцированные окислительные модификации аминокислот приводят к нарушению третичной структуры белков, к их денатурации и аггрегации с сопутствующей потерей функциональной активности.
ДЕТОКСИКАЦИЯ ПРОДУКТОВ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙМОДИФИКАЦИИ БИОМОЛЕКУЛ
Наряду с ферментами, осуществляющими ликвидацию АФК (супероксид- дисмутазой, аскорбатпероксидазой, глютатионредуктазой и др.) — (см. гл. 4), большое значение в устойчивости растений к окислительному стрессу имеют ферменты, включенные в детоксикацию продуктов взаимодействия АФК с биомолекулами, т.е. продуктов окислительной деградации липидов, белков и нуклеиновых кислот. К таким ферментам относятся глиоксалаза I (Гл I) и глиоксалаза II (Гл II), образующие глиоксалазную систему. Кофактором реакций, осуществляемых глиоксалазами, является восстановленный глютатион (Г-SH). Глиоксалазная система осуществляет превращение многих кетоальдегидов в органические кислоты по следующей схеме:
RCOCHO
Кетоальдегид
Г-SHГ-SHСпонтанноСпонтанно
Г-SH
Г-SH
Спонтанно
Спонтанно
RCOCH(OH)-Sr
| Гл I
RCH(OH)CO-Sr
H2O-v
Гл IIГ-SH ^,
RCH(OH)COOH
Органическая кислота
Важная роль в детоксикации продуктов окислительной модификации биомолекул принадлежит также глютатион-8-трансферазам (TST). Эти ферменты осуществляют превращение самых разнообразных химических соединений, имеющих электрофильную природу, т.е. способных принимать электрон от нуклеофильного донора. Функцию нуклеофильного донора электронов в реакциях, катализируемых Г5Т, выполняет атом серы восстановленного глутатиона. В rST-реакции электрофильные продукты окислительной модификации биополимеров (R—X) взаимодействуют с восстановленным глутатионом, формируя конъюгат:
ГлуITSTЦис—SH + R—X'ГлГлутатион Токсичный продукт ОМГлуITSTЦис—SH + R—X'ГлГлутатион Токсичный продукт ОМГлуЦис—S—R + X—НГлКонъюгатГлуЦис—S—R + X—НГлКонъюгат
Глу
ITST
Цис—SH + R—X'
Гл
Глутатион Токсичный продукт ОМ
Глу
ITST
Цис—SH + R—X'
Гл
Глутатион Токсичный продукт ОМ
Глу
Цис—S—R + X—Н
Гл
Конъюгат
Глу
Цис—S—R + X—Н
Гл
Конъюгат
Здесь X означает химическую группу, которая, восстанавливаясь в ходе ферментативной реакции, отделяется от молекулы токсичного вещества (как это показано на схеме) или остается в его составе. И в том и в другом случае продукты ферментативной реакции подвергаются дальнейшим превращениям с участием других ферментов, образуя в конце концов нетоксичное соединение. Следует отметить важную роль FST в детоксикации не только продуктов окислительной модификации биомолекул, но и ксенобиотиков.
АТМОСФЕРНЫЙ ОЗОН ВЫЗЫВАЕТОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС В РАСТЕНИЯХ
Озон, так же как и синглетный кислород, и Н2О2, не является радикалом, однако, обладая высокой реакционной способностью, он при взаимодействии с химическими компонентами клетки продуцирует кислородные радикалы. На основании этого его можно отнести к АФК.
В последние годы вследствие интенсивного развития промышленности наметилась стабильная тенденция к росту концентрации озона в тропосфере (нижних слоях атмосферы). Концентрация тропосферного озона колеблется от 0,02— 0,05 мкл/л в не затронутых развитием промышленности районах до 0,40 мкл/л в загрязненной воздушной среде больших городов. По мере роста концентрации озона в воздухе проблема устойчивости растений к нему будет обостряться, поэтому окислительный стресс, индуцируемый озоном, заслуживает специального рассмотрения.
Подавляющая часть (90 %) атмосферного озона находится в стратосфере (верхних слоях газовой оболочки Земли), остальные 10 % распределены в тропосфере. Увеличение содержания О3 в тропосфере происходит за счет накопления в воздухе продуктов сгорания нефти, газа и угля. При взаимодействии с кислородом под действием ультрафиолетового излучения Солнца они превращаются в О3:
hv
СО + 2О2 — СО2 + О3
hv
RH + 4О2 — RCHO + 2Н2О + 2О3
_hv
NO2 + О2 —► NO + О3
Образование озона в этих реакциях и его приток в тропосферу усиливаются также за счет интенсификации ультрафиолетовой радиации, поскольку стратосферный озон, формирующий защитный экран от УФ-излучения Солнца, все больше разрушается. Это связано с действием радикалов СГ и Вг", которые возникают при облучении О- и Br-содержащих промышленных фреонов, аэрозолей и растворителей:
hv
CCl2Br2(CCl3Br) -* СГ, Bf
СГ, Br'
2O3- 3O2
Накапливающийся в воздушной среде О3 повреждает растения. Отрицательное действие озона проявляется в снижении скорости фотосинтеза, повреждении листьев, подавлении роста корней и побегов, ускорении старения и снижении урожая. Растения различаются по их способности противостоять действию озона. Устойчивость к озону обеспечивается как механизмами избежания, так и механизмами резистентности. Подавляющее действие озона на растения, индукция процессов защитной программы и участие этилена в запуске этой программы отражены на схеме (рис. 8.32).
Одним из механизмов избежания действия озона у растений является закрытие устьиц — главного канала, через который он проникает в организм.
Рис. 8.32. Схема, описывающая процессы повреждения растений, включения программы антиоксидантной защиты и участие этилена в передаче сигнала при действии озона
В основе другого механизма избежания действия О3 лежат повреждения листьев, которые развиваются по типу реакции сверхчувствительности при поражении растений несовместимыми расами (штаммами) патогенов. При высоких дозах О3, как и в случае поражения патогенами, в листьях образуются некрозы. Гибель клеток в некротизированных тканях — это запрограммированная реакция (апоптоз). Вокруг погибших клеток живая ткань формирует барьер, препятствующий дальнейшему распространению окислительного процесса, аналогично тому, как в реакции сверхчувствительности окружающие некроз ткани не позволяют патогену распространяться дальше. В клетках, прилегающих к некрозу, происходит «взрыв» активности антиоксидантных систем и наблюдается лигнификация клеточных стенок. При относительно низких дозах О3 некрозы не образуются, происходит системное распространение процессов ОМ и ускоряется старение растений.
Реакции резистентности основаны прежде всего на индукции антиоксидантных систем клетки, ликвидирующих АФК, систем детоксикации и,возможно, на процессах репарации. Озон, проникающий через устьица в межклеточные полости листьев, вступает во взаимодействие с компонентами клеточных стенок и образует АФК — НО", 0$ и Н2О2. Молекула озона полярна и поэтому плохо проникает в клетки через плазматическую мембрану. Первичные повреждения растений озоном связаны с АФК-индуцированным перекисным окислением липидов и белков ПМ и с их окислительной модификацией. Поврежденная в результате атаки АФК плазмалемма становится более проницаемой для озона. Попадая в цитоплазму, он вызывает образование АФК внутри клеток. Вызываемые озоном повреждения ПМ сопровождаются нарушениями ее функции, в частности, ингибированием Н+-АТФазы, диссипацией элект- рического потенциала, усилением поглощения Са из апопласта и др.
Среди клеточных органелл наиболее чувствительны к разрушительному действию озона хлоропласты. Повреждающее воздействие на них проявляется в торможении фотосинтеза, падении активности ферментов и подавлении синтеза хлоропластных белков. Один из наиболее общих эффектов 03 — подавление активности ФС1 и ФСП. У многих растений при обработке озоном уменьшается содержание РБФ-карбоксилазы в хлоропластах. Это происходит как за счет О3-индуцированной деградации уже синтезированного фермента, так и вследствие торможения его синтеза. Деградация фермента происходит, как правило, в созревших листьях и связана с их ускоренным старением при действии 03.
Торможение синтеза РБФ-карбоксилазы связано со снижением уровня транскриптов малой субъединицы фермента rbcS. Уменьшение содержания мРНК, вызванное озоном, было обнаружено и у других хлоропластных белков, кодируемых ядерными генами, в частности у хлорофилл(о/6)-связывающего белка cab и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (gapAH gapB). Снижение содержания мРНК в значительной степени обусловлено деградацией уже синтезированных мРНК активируемыми при действии 03 РНКазами. Вклад в уменьшение содержания транскриптов вносит также подавление транскрипции, индуцируемое этиленом. Продукция этого гормона в тканях при обработке растений озоном существенно возрастает.
Таким образом, О3-индуцированное образование АФК, с одной стороны, повреждает биополимеры клетки, а с другой — приводит к индукции антиок-
сидантных систем. В пути сигнальной трансдукции, активирующие защитные системы, включен этилен. Биосинтез этилена активируется сразу после обработки клеток озоном. Возросшая продукция этилена связана с ускорением биосинтеза его предшественника 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты (АЦК) за счет индукции АЦК-синтазы. Активация экспрессии АЦК-синтаз- ных генов при действии О3 осуществляется на транскрипционном уровне. При больших дозах озона или высокой чувствительности к нему растений окислительная модификация биомолекул клетки может принять масштабы, приводящие к непрограммируемой гибели клеток.
ГЛАВА 9
ВТОРИЧНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ
Растения синтезируют огромное количество разнообразных веществ, которые не участвуют в основном обмене клеток. Традиционно такие соединения называют вторичными, а их обмен — вторичным метаболизмом. По способности образовывать вторичные метаболиты растения являются «рекордсменами», оставляя далеко позади представителей других царств живых существ. Наряду с фотосинтезом, вторичный метаболизм — характеристическое свойство растительного организма, его «визитная карточка». Парадоксально, но биологи достаточно долго оставляли этот важнейший аспект жизнедеятельности растений без должного внимания. Гораздо больше знали о вторичных метаболитах провизоры, фармацевты и криминалисты, поскольку лекарственные и ядовитые свойства растений чаще всего обусловлены именно этими соединениями. В последние годы наметился значительный прогресс в изучении вторичного метаболизма, при этом основными являются три направления. Фотохимия изучает строение вторичных метаболитов и их распространение по царству растений, биохимия вторичного метаболизма — пути синтеза и энзимологию процесса, физиология вторичного метаболизма исследует локализацию вторичного метаболизма в растении, его изменение в процессе онтогенеза и, главное, — роль вторичных метаболитов в жизнедеятельности растения.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ
В 1891 г. немецкий биолог Альбрехт Коссель в лекции «О химическом составе клеток», которую он прочел для Берлинского общества физиологов, впервые ввел понятие «первичных» и «вторичных» компонентов клетки: «Я предлагаю называть соединения, имеющие важность для каждой клетки, первичными, а соединения, не присутствующие в любой растительной клетке, — вторичными. ... В то время как первичные метаболиты присутствуют в любой растительной клетке, способной к делению, вторичные метаболиты присутствуют в клетках только “нечаянно” и не необходимы для жизни растения». Отсюда становится понятен термин «вторичные метаболиты» — второстепенные, «случайные», некоторые «чудачества» растительного метаболизма, допустимые «излишества». Такие соединения в литературе иногда даже называли «веществами роскоши клеток».
Ситуация радикально изменилась в последние десятилетия с возникновением новых методов анализа и идентификации веществ: прежде всего высокоэффективной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) и хромато-масс-спек- трометрии (ГЖХ-МС). Выяснилось, что растения содержат десятки, если не
сотни тысяч различных вторичных метаболитов, и их структура чрезвычайно разнообразна. К настоящему времени на предмет присутствия вторичных метаболитов исследовано около 20 — 30 тыс. видов растений, т.е. 10 —15 % от всей флоры Земли. Несмотря на это уже идентифицировано около 100000 индивидуальных соединений вторичного метаболизма, и ежедневно в мире идентифицируют около десятка новых. Очевидно, что при таком широком представительстве в мире растений считать вторичные метаболиты синтезированными «случайно» не корректно. Также маловероятно, что такое количество разнообразных соединений не имеет функциональной роли в жизни растения.
Наиболее аргументирована к настоящему времени гипотеза, согласно которой соединения вторичного метаболизма в отличие от первичных метаболитов имеют функциональное значение не на уровне клетки, а на уровне целого организма. Скорее всего эти вещества выполняют «экологические» функции, т.е. имеют значение для защиты растения от различных вредителей и патогенов; они участвуют в размножении растения (окраска и запах цветков, плодов), во взаимодействии растений между собой и другими организмами в экосистеме. Условия окружающей среды для разных видов растений весьма разнообразны, более того, каждый вид растения может «решать» сходные задачи по-своему. Отсюда становится понятным огромное разнообразие соединений вторичного метаболизма растений и уникальность их набора для вида растения, зависимость от фазы развития растения, условий его выращивания. Из «экологических» задач также следует, что многие вторичные метаболиты должны обладать биологической активностью. Действительно, большинство лекарственных и ядовитых растений обязаны своими свойствами присутствию вторичных метаболитов. Выделение и химический анализ действующих веществ из таких растений показали еще одну особенность вторичных метаболитов: эти соединения, как правило, имеют относительно низкую молекулярную массу (у большинства она не превышает 2,0 —3,0 кДа).
И, наконец, еще одна черта вторичных метаболитов — они синтезируются из очень небольшого числа предшественников: 7 — 8 аминокислот для алкалоидов, фенилаланин или тирозин для фенольных соединений, мевалоновая кислота или 5-оксиксилулоза для изопреноидов.
ПРИЗНАКИ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ
По химической структуре молекулы отличить вторичные метаболиты от первичных можно далеко не всегда. На рис. 9.1 приведены некоторые примеры первичных и вторичных метаболитов. Фитостерины (ситостерин, кампестерин, стигмастерин) — обязательные компоненты мембран растительной клетки, и, следовательно, — типичные первичные соединения. Экдистероиды (гормоны линьки насекомых) — вторичные метаболиты, они присутствуют лишь у некоторых видов растений. Эти вещества, как полагают, участвуют в защите растений от насекомых. Протопанаксатриол является агликоном гинзенозидов — вторичных метаболитов женьшеня, присутствующих только в роде Ранах и в большой степени отвечающих за его биологическую активность. В то же время структуры молекул этих соединений похожи и отличаются только числом и расположением метильных и гидроксильных групп. Структуры белковых ами-
Рис. 9.1. Структуры кампестерина (первичный метаболит), экдизона и протопанаксатриола (вторичные метаболиты)
нокислот (первичные метаболиты) и небелковых аминокислот (типичные вторичные метаболиты) часто отличаются лишь наличием или отсутствием метильной, гидроксильной либо другой функциональной группы.
На основе анализа литературы можно сформулировать четыре признака вторичных метаболитов:
присутствие не во всех растениях;
наличие биологической активности;
относительно низкий молекулярный вес;
небольшой набор исходных соединений для их синтеза.
Это именно признаки вторичных метаболитов, поскольку каждый из них, в общем-то, не обязателен. Ряд вторичных метаболитов найден практически во всех растениях (например, многие фенил про пано иды); достаточно много вторичных метаболитов без выраженной биологической активности (хотя не исключен вариант, что ее просто не обнаружили); известны высокомолекулярные вторичные метаболиты (например, каучук и гуттаперча). Однако совокупность указанных признаков достаточно четко очерчивает круг вторичных метаболитов растений.
Наиболее обоснованно отнести соединение к первичным или вторичным метаболитам можно только после выяснения его роли в жизнедеятельности растения, т. е. на основе его функциональной значимости. Функциональное определение вторичного метаболизма в первом приближении можно дать как метаболизм соединений, имеющих значение на уровне целого организма, но не на уровне клетки.
ПРИНЦИПЫ КЛАССИФИКАЦИИВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ
Принципы классификации вторичных метаболитов, как и названия индивидуальных соединений, изменялись по мере их изучения. Сейчас можно встретить элементы по крайней мере четырех вариантов классификации.
Эмпирическая (тривиальная) классификация. Самый «древний» принцип классификации, основанный на определенных свойствах вторичных метаболитов. Например, алкалоиды — соединения, имеющие щелочные свойства; сапонины — вещества, образующие при встряхивании пену (от Saponaria — мыльнянка); горечи — соединения с горьким вкусом; эфирные масла — ароматные летучие вторичные метаболиты. Подобный принцип классификации имеет много недостатков, однако его элементы встречаются до сих пор в силу традиции и длительного употребления.
Вторичные метаболиты получали (и получают) свои названия, как правило, также эмпирически. Чаще всего названия происходят от растения, из которого впервые было выделено соединение. Например, алкалоиды папаверин (Рараиег — мак), берберин (Berbens — барбарис), кокаин (Erythroxylum coca — кокаиновый куст). Довольно часто названия связаны с мифологией, историей, личностями и т.д. Например, алкалоид морфин получил свое название в честь бога сна Морфея, алкалоид тебаин — от египетского города Тебаис, рядом с которым в древности был центр по производству наркотиков, каучук в переводе с индейского — «слезы дерева».
Подобный способ классификации и формирования названий соединений часто приводит к недоразумениям. Например, биологически активные тритерпеновые гликозиды женьшеня практически одновременно начали изучать в Японии и в России. Японские исследователи предложили их называть гинзено- зидами — по видовому названию женьшеня (Panax ginseng), тогда как русские исследователи — панаксозидами, т. е. по родовому названию. Позже, когда стало ясно, что одни и те же соединения называются по-разному, пришлось публиковать «таблицы соответствия» гинзенозидов и панаксозидов.
Химическая классификация. Этот вариант классификации основан на признаках химической структуры вторичных метаболитов и на данный момент времени наиболее разработан и распространен. Однако и эта классификация не лишена недостатков. Например, алкалоиды по такой классификации — соединения, имеющие атом азота в гетероцикле. По этому признаку гликоалкалоиды картофеля или томатов — типичные алкалоиды, однако по способу синтеза, структуре и ряду свойств эти соединения являются изопреноидами.
Биохимическая классификация. Эта классификация базируется на способах биосинтеза вторичных метаболитов. Например, согласно этой классификации упомянутые выше гликоалкалоиды относятся к тритерпеновым псевдоалкалоидам, так как синтезируются, как и стероидные гликозиды, по изопреноидному пути. Это, по-видимому, наиболее объективный вариант классификации. Однако поскольку биохимия вторичного метаболизма еще недостаточно разработана, такая классификация находится в периоде становления.
Функциональная классификация. Основана на функциях вторичных метаболитов в интактном растении. Этот вариант принципиально отличается от пре-
дыдущих и должен существовать параллельно с ними. Согласно функциональной классификации в одну группу соединений могут попадать химически разные структуры. Например, фитоалексины (вторичные метаболиты, имеющие защитные функции и синтезирующиеся в ответ на атаку патогена) представлены в разных видах фенольными соединениями, изопреноидами, полиацетиленами и др. Разработка функциональной классификации вторичных метаболитов только начинается, но она имеет принципиальное значение для физиологии растений.
Наличие разных вариантов классификации вторичных метаболитов приводит к определенным сложностям. В частности, при использовании разных признаков, используемых при химической классификации, возможно «перекрытие» групп вторичных метаболитов. Например, в «фармакогнозии» в качестве действующих веществ многих лекарственных растений выделяют гликозиды (соединения, молекула которых состоит из агликона и углеводного фрагмента) в отдельную группу. В то же время по структуре агликона эти гликозиды могут быть отнесены к фенольным соединениям, изопреноидам или другим группам вторичных метаболитов. Еще больше проблем возникает, когда соединение содержит ряд признаков, характерных для разных групп вторичных метаболитов (например, пренилированные фенольные соединения). В ряде случаев появляющиеся проблемы можно снять, корректируя химическую классификацию биохимической.
ОСНОВНЫЕ ГРУППЫ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ
В настоящее время известно более десятка групп (классов) вторичных метаболитов. При этом некоторые группы насчитывают по несколько тысяч индивидуальных соединений, тогда как другие — лишь единицы. Также неравномерно распределены группы в растительном мире. Например, изопреноиды и фенольные соединения присутствуют во всех видах растений, тогда как некоторые группы (например, тиофены или ацетогенины) характерны лишь для единичных видов.
Хорошо известны три самые большие группы вторичных метаболитов — алкалоиды, изопреноиды {терпеноиды) и фенольные соединения. Каждая из этих групп состоит из несколько тысяч соединений и подразделяется на многочисленные подгруппы. Известно также около десятка менее многочисленных групп вторичных метаболитов: растительные амины, небелковые аминокислоты, цианогенные гликозиды, глюкозинолаты, полиацетилены, беталаины, алкил- амиды, тиофены и др. Количество соединений, входящих в эти группы, колеблется от единиц до нескольких сотен.
Вторичные метаболиты в растении практически никогда не присутствуют в «чистом виде», они, как правило, входят в состав сложных смесей. Такие смеси в зависимости от их состава и нахождения в растении часто носят собственные, исторически сложившиеся названия.
Эфирные масла, как правило, представляют из себя смесь легко испаряющихся изопреноидов (моно- и сесквитерпенов).
Смолы представлены главным образом дитерпенами.
Камеди состоят преимущественно из полисахаридов, но в их состав часто входят алкалоиды, фенольные соединения.
Слизи — это смесь водорастворимых олиго- и полисахаридов, сахаров, а также небольших количеств фенольных соединений, алкалоидов или изопреноидов.
ЗАКОНОМЕРНОСТИ СТРОЕНИЯВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ
При анализе структур вторичных метаболитов создается впечатление, что их огромное разнообразие происходит по определенной схеме. Как правило, имеется определенная «базовая» структура, на основе которой образуются многочисленные варианты. При этом можно отметить несколько способов возникновения таких вариантов.
Модификации базовой структуры: обычно это либо присоединение, либо замена функциональных групп, изменение степени окисленности молекулы; в качестве функциональных групп часто используются гидроксильные, метильные либо метоксильные группы.
Образование конъюгатов: присоединение к базовой структуре «унифицированных блоков»; чаще всего различных сахаров (моно- или олигосахариды), органических кислот или некоторых групп вторичных метаболитов.
Конденсация: объединение нескольких одинаковых или различных базовых структур, например образование пренилированных фенольных соединений или димерных индольных алкалоидов.
Для разных групп вторичных метаболитов характерны специфические изменения структуры. Например, для алкалоидов характерно метоксилирование, но не гликозилирование; для изопреоидов, наоборот, типично гликозилирование, но не метоксилирование; у фенольных соединений наблюдаются оба типа этих модификаций.
Определенные модификации молекул, по-видимому, имеют существенное функциональное значение. Многие из них (в частности, гликозилирование) значительно изменяют биологическую активность молекулы. Очень часто гликозилирование является универсальным способом перевода активной (функциональной) формы вторичного метаболита в неактивную (запасную). По этой причине, видимо, нецелесообразно выделять все гликозиды в отдельную группу вторичных метаболитов.
ФИТОХИМИЯ ВТОРИЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА
АЛКАЛОИДЫ — АЗОТСОДЕРЖАЩИЕ ВТОРИЧНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ
Название этой группы веществ происходит от арабского alcali — щелочь и греческого eidos — подобный. В настоящее время известно около 10000 индивидуальных алкалоидов.
В случае алкалоидов достаточно удачно совпали эмпирическая и химическая классификация. Согласно химической классификации, алкалоиды — это соединения, содержащие один или несколько атомов азота в молекуле, что и придает им щелочные свойства. По химической структуре алкалоиды обычно
разделяют на две подгруппы: протоалкалоиды, которые содержат азот не в гетероцикле, и истинные алкалоиды, содержащие азот в гетероцикле. В распределение алкалоидов на подгруппы внесла коррективы биохимическая классификация. Гликоалкалоиды, а также ряд других алкалоидов (например, алкалоиды аконита) по типу синтеза и по структуре фактически являются изопреноидами. Поэтому было решено выделить их в особую группу — изопреноидных псевдоалкалоидов. Таким образом, по «модифицированной» химической клас-
R = СОСН3 — Колхицин R = СНз — КолхаминR = СОСН3 — Колхицин R = СНз — КолхаминРис. 9-2. Структуры некоторых протоалкалоидовРис. 9-2. Структуры некоторых протоалкалоидовГруппа пиперидинаГруппа пиперидинаГруппа пиридинаГруппа пиридинаГруппа пирролизидинаГруппа пирролизидинаГруппа хинолизидинаГруппа хинолизидинаГруппа пирролизидинаГруппа пирролизидинаГруппа изохинолинаГруппа изохинолинаГруппаГруппаГруппа индолаГруппа индолаГруппа имидазолаГруппа имидазолахинолинахинолинаГруппа акридинаГруппа акридинаРис. 9.3. Основные группы истинных алкалоидовРис. 9.3. Основные группы истинных алкалоидовГруппаГруппахиназолинахиназолинаГруппа пуринаГруппа пуринаГруппа трепанаГруппа трепана
R = СОСН3 — Колхицин R = СНз — Колхамин
R = СОСН3 — Колхицин R = СНз — Колхамин
Рис. 9-2. Структуры некоторых протоалкалоидов
Рис. 9-2. Структуры некоторых протоалкалоидов
Группа пиперидина
Группа пиперидина
Группа пиридина
Группа пиридина
Группа пирролизидина
Группа пирролизидина
Группа хинолизидина
Группа хинолизидина
Группа пирролизидина
Группа пирролизидина
Группа изохинолина
Группа изохинолина
Группа
Группа
Группа индола
Группа индола
Группа имидазола
Группа имидазола
хинолина
хинолина
Группа акридина
Группа акридина
Рис. 9.3. Основные группы истинных алкалоидов
Рис. 9.3. Основные группы истинных алкалоидов
Группа
Группа
хиназолина
хиназолина
Группа пурина
Группа пурина
Группа трепана
Группа трепана
сификации сейчас принято разделять алкалоиды на три подгруппы: протоалкалоиды (азот не в гетероцикле); истинные алкалоиды (азот в составе гетероцикла); псевдоалкалоиды (синтез не из аминокислот). Каждая подгруппа разделяется в свою очередь на 3—10 классов.
По биохимической классификации алкалоиды подразделяются на подгруппы в соответствии с исходной для их синтеза аминокислотой: алкалоиды, синтезирующиеся из L-орнитина (простые пирролидиновые алкалоиды, тропано-
Рис. 9.4. Структуры некоторых истинных алкалоидов
а-Соланин
Рис. 9.5. Структура соланина — тритерпенового псевдоалкалоида
вые алкалоиды, пирролизидиновые алкалоиды); L-лизина (пиперидиновые алкалоиды, хинолизидиновые алкалоиды); L-триптофана (сложные индольные алкалоиды, p-карболиновые алкалоиды); L-фенилаланина (сложные изохинолиновые алкалоиды); антраниловой кислоты (протоалкалоиды, хинолиновые алкалоиды, хиназолиновые алкалоиды); L-тирозина (сложные изохинолиновые алкалоиды); гистидина (пуриновые алкалоиды) и алкалоиды, синтезирующиеся по изопреноидному пути (изопреноидные или псевдоалкалоиды).
Наиболее широко алкалоиды распространены среди покрытосеменных растений. Особенно богаты ими семейства маковых, пасленовых, бобовых, кутро- вых, мареновых, лютиковых. Во мхах, папоротниках, голосеменных алкалоиды встречаются относительно редко.
Разные органы и ткани растения могут содержать разные алкалоиды. Обычно их концентрация невелика и составляет десятые и сотые доли процента. При содержании алкалоидов около 1 — 3 % растение считается богатым алкалоидами (алкалоидоносным). Только немногие растения, например культивируемые формы хинного дерева, могут накапливать до 15 — 20% алкалоидов. Протоалкалоиды встречаются довольно часто в растениях разных семейств, но, как правило, не накапливаются в значительных количествах. Примеры некоторых из них приведены на рис. 9.2. Истинные алкалоиды классифицируют в зависимости от химической структуры гетероциклического кольца. На рис. 9.3 представлены основные группы алкалоидов и характерный для них тип гетероцикла, а на рис. 9.4 — структуры некоторых из известных алкалоидов. Из псевдоалкалоидов наиболее известны стероидные гликоалкалоиды пасленовых, структура одного из них представлена на рис. 9.5.
ИЗОПРЕНОИДЫ (ТЕРПЕНОИДЫ)
Изопреноиды — обширная группа соединений, имеющих общую формулу (С5Н8)П. С5Н8 — это единица изопрена, таким образом изопреноиды являются соединениями, «составленными» из нескольких изопреновых единиц. Их био-
синтез действительно идет соединением пятиуглеродных фрагментов, поэтому название этой группы веществ совпадает с их биохимической классификацией. Второе название изопреноидов — «терпеноиды» — берет начало от немецкого
Рис. 9.6. Структура некоторых монотерпеновРис. 9.6. Структура некоторых монотерпеново-Фарнезена-БисаболенЭлеманГермакрано-Фарнезена-БисаболенЭлеманГермакрано-КадиненСелинанГвайанАмброзано-КадиненСелинанГвайанАмброзанРис. 9.7. Структура некоторых сесквитсрпеноидов и дитерпеноидовРис. 9.7. Структура некоторых сесквитсрпеноидов и дитерпеноидов
Рис. 9.6. Структура некоторых монотерпенов
Рис. 9.6. Структура некоторых монотерпенов
о-Фарнезена-БисаболенЭлеманГермакран
о-Фарнезена-БисаболенЭлеманГермакран
о-КадиненСелинанГвайанАмброзан
о-КадиненСелинанГвайанАмброзан
Рис. 9.7. Структура некоторых сесквитсрпеноидов и дитерпеноидов
Рис. 9.7. Структура некоторых сесквитсрпеноидов и дитерпеноидов
ФуростаноловыеФуростаноловыеCym-p-D-Glc-a-D-GlcCym-p-D-Glc-a-D-GlcЦимаринVY/К-строфантин-p vу.> К-строфантозидСердечные гликозидыЦимаринVY/К-строфантин-p vу.> К-строфантозидСердечные гликозиды
Фуростаноловые
Фуростаноловые
Cym-p-D-Glc-a-D-Glc
Cym-p-D-Glc-a-D-Glc
Цимарин
VY/
К-строфантин-p vу.> К-строфантозид
Сердечные гликозиды
Цимарин
VY/
К-строфантин-p vу.> К-строфантозид
Сердечные гликозиды
Рис. 9.8. Примеры структур тритерпеноидов
слова Terpentin (скипидар), так как скипидар представляет собой смесь легких изопреноидов. «Терпенами» называют соединения, содержащие целое число С5 единиц, независимо от присутствия в молекуле функциональных групп (гидроксильных, карбонильных и др.). Название «терпеноиды» применяют для соединений с различным числом углеродных атомов, но биосинтез которых явно
прошел из С5 единиц. В настоящее время известно более 30 000 различных изопреноидов.
Классификация изопреноидов основана на количестве изопреновых единиц, входящих в состав молекулы. Соединения на основе только одной изопреновой единицы в растениях обнаружили лишь сравнительно недавно. Поэтому исторически сложилось, что монотерпенами назвали соединения, содержащие две изопреновые единицы и, следовательно, имеющие общую формулу (С5Н8)2, т.е. С10Н16. Изопреноиды, содержащие три изопреновые единицы, назвали сесквитерпенами {«полуторатерпенами»), общая формула Ci5H24. Соответственно дитерпены построены из четырех, тритерпены — из шести и тетратерпены — из восьми пятиуглеродных фрагментов. Когда же обнаружили соединения, состоящие из одного и пяти изопреновых единиц, то их пришлось назвать соответственно гемитерпенами и сестертерпенами. Политерпеноиды каучук и гута имеют в своем составе от 100 до 5000 единиц изопрена.
Моно- и сесквитерпеноиды — как правило, легкоиспаряющиеся жидкости, часто с разнообразным запахом. Известно более 3000 этих соединений. Их классификация основана на наличии или отсутствии кольцевой структуры в молекуле, типе кольца, а также наличии и количестве двойных связей в молекуле. Моно- и сесквитерпены могут быть алифатическими (углеводород с незамкнутой цепочкой атомов), циклическими с различным количеством циклов (от одного до трех), а также содержать различные функциональные группы (гидрокси-, карбокси-, кето-группы). Они составляют основу эфирных масел. Моно- и сесквитерпеноиды часто обладают бактерицидным действием.
Дитерпеноиды также насчитывают несколько тысяч структур. Они являются главными компонентами смол у голосеменных (ель, сосна, пихта, кедр). Часто дитерпеноиды смол обладают бактерицидными свойствами.
Структуры некоторых моно-, сескви- и дитерпеноидов показаны на рис. 9.6 и 9.7.
Тритерпеноиды представлены несколькими группами соединений. Прежде всего это соединения первичного метаболизма — фитостерины, однако большинство тритерпеноидов являются типичными вторичными метаболитами. Тритерпеноиды обладают широким спектром биологической активности. К ним относятся сердечные, стероидные, тритерпеновые гликозиды, экдистероиды (рис. 9.8).
Тетратерпеноиды представлены в растениях главным образом каротиноидами, некоторые из них участвуют в основном обмене (фотосинтез), однако большинство (около 500) — это типично вторичные метаболиты.
ФЕНОЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ (РАСТИТЕЛЬНЫЕ ФЕНОЛЫ)
Фенольные соединения — вещества ароматической природы, содержащие одну или несколько гидроксильных групп у ароматического кольца. Фенолами называют соединения с одним атомом гидроксила, полифенолами — с двумя и более. Многие фенольные соединения участвуют в основном обмене (в частности, в процессах фотосинтеза и дыхания), однако большинство из них — типичные представители вторичного метаболизма.
Фенольные соединения классифицируются в зависимости от числа ароматических колец и количества присоединенных к ним атомов углерода. Феноль-
ные соединения принято разделять на три большие подгруппы: с одним и двумя ароматическими кольцами, а также полимерные фенольные соединения. Иногда в особую группу выделяют димерные фенольные соединения.
Фенольные соединения с одним ароматическим кольцом в зависимости от дополнительных атомов углерода разделяются на:
соединения Сб-ряда (без дополнительных атомов углерода); к ним относят простые фенолы, а иногда также и бензохиноны, хотя у них ароматическое кольцо почти всегда соединено с длинной изопреноидной цепочкой;
соединения С6-С1-ряда (один дополнительный атом углерода) — производные оксибензойной кислоты, которые часто называют фенольными кислотами, или фенолокислотами-,
соединения С6-С2-ряда (два дополнительных атома углерода), включающие фенолоспирты, фенилуксусные кислоты, ацетофеноны,
соединения Сб-СЗ-ряда (три дополнительных атома углерода); эту наиболее многочисленную и важную группу веществ часто называют фенилпро- паноидами; она включает: оксикоричные кислоты (по международной номенклатуре — гидроксикоричные), оксикоричные (гидроксикоричные) спирты, фенилпропены, а также кумарины, изокумарины и хромоны — соединения, у которых дополнительные атомы углерода замыкаются в конденсированное лактонное кольцо; некоторые фенилпропаноиды образуют димеры, т. е. соединения типа (С6-С3)2, и такие вещества называют лигнанами;
СН=СН-СООН
Ri = Н, R2 = ОН — Протокатеховая кислота R[ = R2 = Н — л-Оксибензойная кислота Ri = Н, R2 = ОСН3 — Ванилиновая кислота Ri = R2 = ОСН3 — Сиреневая кислота Ri = R2 = ОН — Галловая кислота
Рис. 9.9. Оксибензойные (Л), оксикоричные (Б) кислоты и кумарины (Б)
R, = R2 = Н — л-Оксикоричная кислота (л-кумаровая)
Rj = ОН, R2 = Н — Кофейная кислота
Rj = ОСН3, R2 = Н — Феруловая кислота
R, = R2 = ОСН3 — Синаповая кислота
Ангелинин
— соединения С6-С4-ряда (четыре дополнительных атома углерода), к которым относятся нафтохиноны.
На рис. 9.9 представлены некоторые из фенольных соединений с одним ароматическим кольцом.
ББ
Б
Б
Rj = R2 = Н — ПиносильвинR! = ОН, R2 = Н — РезвератролRj = R2 = Н — ПиносильвинR! = ОН, R2 = Н — РезвератролR] = R2 = ОН, R3 = R4 = Н — ХризацинRj = R2 = R3 =ОН,Rj= СН3 — Реум-эмодинRj = R2 = ОН,R3 =Н,Rj= СН2ОН — Алоэ-эмодинR, = R2 = ОН,R3 =Н,Rj= СН3 — ХризофанолR, = R2 = ОН,R3 =Н,Rj= СООН — РейнR] = R2 = ОН, R3 = R4 = Н — ХризацинRj = R2 = R3 =ОН,Rj= СН3 — Реум-эмодинRj = R2 = ОН,R3 =Н,Rj= СН2ОН — Алоэ-эмодинR, = R2 = ОН,R3 =Н,Rj= СН3 — ХризофанолR, = R2 = ОН,R3 =Н,Rj= СООН — Рейн
Rj = R2 = Н — Пиносильвин
R! = ОН, R2 = Н — Резвератрол
Rj = R2 = Н — Пиносильвин
R! = ОН, R2 = Н — Резвератрол
R] = R2 = ОН, R3 = R4 = Н — Хризацин
Rj = R2 = R3 =ОН,Rj= СН3 — Реум-эмодин
Rj = R2 = ОН,R3 =Н,Rj= СН2ОН — Алоэ-эмодин
R, = R2 = ОН,R3 =Н,Rj= СН3 — Хризофанол
R, = R2 = ОН,R3 =Н,Rj= СООН — Рейн
R] = R2 = ОН, R3 = R4 = Н — Хризацин
Rj = R2 = R3 =ОН,Rj= СН3 — Реум-эмодин
Rj = R2 = ОН,R3 =Н,Rj= СН2ОН — Алоэ-эмодин
R, = R2 = ОН,R3 =Н,Rj= СН3 — Хризофанол
R, = R2 = ОН,R3 =Н,Rj= СООН — Рейн
ХалконХалконФлавонФлавонФлаванонФлаванонФлавонолФлавонолАнтоцианидинАнтоцианидинОНОН
Халкон
Халкон
Флавон
Флавон
Флаванон
Флаванон
Флавонол
Флавонол
Антоцианидин
Антоцианидин
ОН
ОН
R = ОН, Ri = Н — Цианидин R = Ri = Н — Пеларгонидин R = R, = ОН — Дельфинидин R = ОСН3, R] = Н — Пеонидин R = ОН, R] = ОСН3 — Петунидин R = R| = ОСН3 — Мальвидин
Рис. 9.10. Фенольные соединения с двумя ароматическими кольцами: стильбены (Л),антрахиноны (Б), основные группы флавоноидов (5), антоцианидины (Г)
Фенольные соединения с двумя ароматическими кольцами. Эти соединения подразделяются на:
соединения Сб-С1-С6-ряда (два ароматических кольца соединены мостиком из одного углеродного атома), к ним относятся бензофеноны и ксантоны;
соединения С6-С2-С6-ряда (два ароматических кольца соединены двумя атомами углерода), к ним относятся стильбены (два кольца соединяются цепочкой из двух атомов углерода) и антрахиноны (два ароматических кольца соединяются двумя атомами углерода с образованием центрального конденсированного третьего кольца);
— соединения Сб-СЗ-Сб-ряда (два ароматических кольца соединены тремя атомами углерода) — наиболее многочисленная группа фенольных соединений, представленная прежде всего флавоноидами, которые в свою очередь включают целый ряд подгрупп; к этой же группе соединений относятся изофлавоноиды и неофлавоноиды, также состоящие из нескольких подгрупп.
На рис. 9.10 представлены некоторые из фенольных соединений с двумя ароматическими кольцами.
Полимерные фенольные соединения. Эти вещества принято подразделять на четыре подгруппы: гидролизуемые дубильные вещества (таннины — сложные эфиры глюкозы и галловой кислоты), конденсированные дубильные вещества (танниды — полимеры флавоноидов), лигнины (полимеры оксикоричных спиртов) и меланины.
Отличительной чертой фенольных соединений является формирование огромного числа соединений за счет модификаций молекулы и образования конъюгатов с разнообразными структурами. Из модификаций для фенольных соединений характерны образование гликозидов, метилирование и метоксили- рование. За счет гидроксильных и карбоксильных групп фенольные соединения могут связываться с сахарами, органическими кислотами, растительными аминами, алкалоидами. Помимо этого растительные фенолы могут соединяться с изопреноидами, образуя большую группу пренилированных фенолов. Такие свойства фенольных соединений обеспечивают огромное разнообразие структур, характерное для растительных фенолов.
МИНОРНЫЕ ГРУППЫ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ
Растительные амины. В высших растениях присутствует большое количество аминов — первичных, вторичных, третичных и четвертичных. Многие из них структурно представляют собой декарбоксилированные аминокислоты, причем как белковые, так и небелковые. Растительные амины подразделяют на моноамины (с одной аминогруппой), диамины (с двумя аминогруппами) и полиамины.
Беталаины. Так называются водорастворимые азотсодержащие пигменты высших растений. Они присутствуют только в растениях порядка гвоздичные (Caryophyllalles). До сих пор не найдены растения, где две группы водорастворимых пигментов — антоцианы и беталаины — встречаются одновременно. Группу беталаинов составляют бетацианины и бетаксантины — соответственно красно-фиолетовые и желтые соединения. Бетацианины представляют собой гликозиды и ацил гликозиды всего двух агликонов.
Цианогенные гликозиды. Цианогенные гликозиды являются р-гликозидами 2-гидроксинитрилов (цианогидринов). К настоящему времени в высших растениях обнаружено несколько десятков подобных соединений. Основные структурные вариации обусловлены природой заместителей Bq и R2. В качестве углеводного фрагмента как правило, выступает D-глюкоза. При гидролизе цианогенных гликозидов специфичной гликозидазой выделяется синильная кислота.
Небелковые аминокислоты. Под этим термином подразумеваются природные аминокислоты, их амиды, иминокислоты, которые в норме не входят в состав белков. Сейчас известно более 400 небелковых аминокислот. Многие из них можно рассматривать как модификации белковых. Наиболее часто встречаются варианты удлинения или сокращения углеродной цепи (добавление или удаление СН2- или СН3-фрагментов), гидрирование и дегидрирование, гидроксилирование, аминирование. Встречаются и необычные (например, селенсодержащие) аминокислоты. Небелковые аминокислоты преимущественно весьма токсичны, поскольку могут включаться в белки вместо «нормальных» аминокислот и нарушать их функции.
Необычные липиды. К ним относятся прежде всего «необычные» жирные кислоты, которые отличаются от «обычных» длиной углеродной цепи, иным расположением и количеством двойных связей, наличием дополнительных функциональных групп и циклов. Чаще всего необычные жирные кислоты обнаруживаются в масле семян. Во многих видах высших растений обнаружены соединения с одной или несколькими тройными связями. Такие соединения получили название ацетиленовых производных, или полиацетиленов. Известно несколько сотен таких структур. В отличие от необычных жирных кислот, ацети-
Б R2 О-р-Сахар
В
R-C-SGlc
N-ОСОзХ"
Общая формула
H3G O-p-Glc
Ri ON
Н3С C=N
Н3С, O-p-Glc
QH/tON
Общая формула
Линамарин
(Л)-Амигдалин
(Л)-Вицианин
Рис. 9.11. Некоторые минорные классы вторичных метаболитов: растительные амины (Л), цианогенные гликозиды (Б), гликозиды горчичных масел (В)
Лотаустралин
(Я)-Аукумин
леновые производные могут находиться во всех органах и частях растения. К необычным липидам относятся также цианолипиды, при гидролизе которых выделяется синильная кислота.
Серосодержащие вторичные метаболиты. К ним относятся прежде всего тиогликозиды (S-гликозиды). Наиболее известны гликозиды горчичных масел (глю- козинолаты). Эти гликозиды характерны для растений семейства крестоцветных. Они обладают сильным антимикробным действием и обуславливают острый или жгучий вкус горчицы, хрена, редьки. Механизм действия глюко- зинолатов весьма сходен с действием цианогенных гликозидов: после отщепления сахара мирозиназой образуются изотиоцианаты, обуславливающие жгучий вкус и раздражающее действие. Другую группу серосодержащих вторичных метаболитов составляют аллицины чеснока и лука, которые синтезируются из цистеина. Они также ответственны за жгучий вкус и антимикробные свойства этих растений.
На рис. 9.11 представлены структуры некоторых минорных вторичных метаболитов.
БИОХИМИЯ ВТОРИЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА
ПУТИ БИОСИНТЕЗА ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ
Пути синтеза большинства вторичных метаболитов установлены достаточно хорошо. В настоящее время интенсивно изучается энзимология вторичного метаболизма. На основании имеющейся информации можно сформулировать некоторые закономерности биосинтеза этих соединений. Предшественниками синтеза служит относительно небольшое количество первичных метаболитов. Многие группы вторичных метаболитов могут синтезироваться несколькими путями. Часто этапы синтеза дублированы в разных компартментах клетки (например, пластиды — цитозоль). Синтез четко спланирован и обслуживается набором специальных ферментов, в большинстве случаев весьма специфичных.
Биосинтез алкалоидов. Образование этих веществ тесно связано с общим обменом азота клетки. Для большинства алкалоидов показано, что схемы их синтеза унифицированы, т. е. имеют сходную последовательность реакций. Предшественниками синтеза протоалкалоидов и истинных алкалоидов являются аминокислоты, список которых приведен на с. 595 и 596. В процессе биосинтеза молекула аминокислоты практически полностью включается в структуру алкалоида. Синтез алкалоидов разных групп включает одинаковые типы реакций: декарбоксилирование, окислительное дезаминирование, альдольная конденсация, но для каждой группы алкалоидов эти реакции осуществляют «собственные» ферменты. На первом этапе синтеза происходит декарбоксилирование аминокислоты при участии соответствующей декарбоксилазы. Образовавшиеся биогенные амины подвергаются окислительному дезаминированию с участием аминооксидаз. Полученные в результате аминоальдегиды или аминокетоны в результате серии последовательных реакций образуют ключевые гетероциклические соединения. Затем происходит модификация базовой структуры с участием разнообразных реакций — гидроксилирования, метилирования и др. В формировании окончательной структуры алкалоида могут принимать уча-
стие дополнительные углеродные единицы, например ацетат (в виде ацетил- СоА) или монотерпеновая единица (для сложных индольных алкалоидов). В зависимости от сложности алкалоида его биосинтез включает от трех-четырех до десяти—пятнадцати реакций.
Для целого ряда алкалоидов не только установлена схема синтеза, но охарактеризованы и выделены ферменты. Оказалось, что некоторые ферменты синтеза не очень специфичны (в качестве субстратов могут использовать различные соединения), однако в цепочке синтеза обязательно присутствуют высокоспецифичные ферменты, которые используют только один субстрат (или ряд очень близких субстратов) и выполняют очень специфичную реакцию. Например, при синтезе изохинолинов гидроксилирование базовой структуры по каждому положению выполняют разные ферменты. По мере продвижения к заключительным этапам синтеза сродство ферментов к субстрату обычно повышается: например, для ряда ферментов синтеза бербериновых алкалоидов Кт составляет менее 1 мкМ. В качестве примера на рис. 9.12 представлена схема синтеза изохинолиновых алкалоидов.
Биосинтез изопреноидов. Если при синтезе алкалоидов сходная цепочка превращений используется для различных исходных соединений (аминокислот), то синтез колоссального числа изопреноидов происходит из единственного предшественника — изопентенилдифосфата (ИПДФ). Под действием фермента изопентенилдифосфатизомеразы, которая сдвигает двойную связь, ИПДФ превращается в диметилаллилдифосфат (ДМАДФ). Далее ИПДФ присоединяется к ДМАДФ по двойной связи и образуется Сю-соединение — геранилдифосфат. Он служит источником всех монотерпеноидов. Затем к геранилдифосфату присоединяется еще один ИПДФ и образуется С ^-соединение фарнезилдифосфат — исходное вещество для синтеза сесквитерпеноидов. Далее фарнезилдифосфат может либо присоединить еще одну молекулу ИПДФ с образованием геранилгеранилдифосфата (С2о-соединение — источник дитерпеноидов), либо димеризоваться с образованием сквалена (С30-соединение — исходное соединение для всех тритерпеноидов). Наконец, геранил геранилди - фосфат может димеризоваться с образованием фитоина — С40-соединения, источник тетратерпеноидов. Кроме того, к геранилгеранилдифосфату может последовательно присоединиться большое количество ИПДФ, формируя в конечном итоге полиизопреноиды — каучук и гуттаперчу. В результате описанных реакций образуется полный гомологический ряд С5-соединений разной длины. Далее эти алифатические молекулы могут «свернуться» в циклические структуры, причем количество циклов, их размер и типы сочленения могут быть самыми разными. На рис. 9.13 представлена общая схема синтеза изопреноидов.
Синтез базовых изопреноидных структур осуществляют всего два типа ферментов — пренилтрансферазы, которые «наращивают» длину изопреноидов, и циклазы, которые формируют соответствующий циклический скелет молекулы. При этом каждый тип структуры формирует специфическая циклаза. Так как типов циклических структур изопреноидов довольно много, то и количество циклаз должно быть внушительным. К настоящему времени их известно более ста. После формирования базовой структуры (или одновременно с этим), происходит ее модификация и «оснащение» функциональными группами.
но
Тирозин-декарбо-ксилаза
соон
nh2
L-Тирозин Трансаминаза
Н3СО
NCH3
но
но
н
NH2
но
Тирамин
<-со2
Фенол-оксидаза
о2 Си-
Фенолоксидаза
O2Cu2"
НО
МН2
НО
Дофамин
но
12-
НО
L-ДОФА
О
но
НО
(8)-3'-Гидрокси-М-метилкоклаурин
соон
nh2
СООН
р-Гидрокси-фенилпируват
со2 но
Н3СО
НО
^-N-метил-коклаурин-3' -гидроксилаза
Н2О
О2
NADP+ NADPH
(S)-Hop ко-кл аурин-синтаза
Декарбоксилаза
Н
о
р-Гидроксифенил-ацетальдегид
НО
н
NCH3 Коклаурин-N- метилтрансфереза
SAH SAM
НО
(8)-М-метил-Коклаурин
NH
но
Н
НО
(S) -Норкоклаурин
SAM -х, Норкоклаурин- 6-0-метил- SAH -^, трансфераза
Н3СО
NH
но
н
НО
(8)-Коклаурин
SAM ^
SAH -^
3' -Гидрокси-N-метилкоклаурин-4-О-метилтрансфераза
NADPH
O2
Канадин-синтаза
Рис. 9.12. Схема биосинтеза изохинолиновых алкалоидов
Н2О2 О2
(S)- Тетрагидро- протоберберин- оксидаза
ОО
| Димеризация
Каротиноиды
Б
НО,
СОО“
с=о
/TPP4D
С
•СН2О® н-с-он
•сн2о®
Н-С-ОН NADPH
•сн3
со2
•СН3
Пируват трр—Q
<Н2О® н-с-он
С ГАФ
Н о.
2Ацетил-СоА
О. ZS—СоА С
но-с-н
но-с—ТРР—©
•СНз
О^ ZS—СоА
СООН
С=О
•СН3
Пируват
•СНз
А
О S-CoA
Ацетил-СоА
н—о—с
о=с
NADP
1 -Дезокси-О-ксилу-лозо-5-фосфат
СН2
2 CoASH
•СН2НО-С-СНз
•сн2
СООН
НМО-СоА
2NADPH
2NADP
CoASH
СН2ОН I
•СН2но-с-СНз
•СН2
СООНМевалоноваякислота
Н3С; .ОН
/С. -очн2
Н2С ^о® онн он
2-С-метил-П-эритритол-4-фосфат
ИПДФ
5
42
ИПДФ
Рис. 9.13. Общая схема биосинтеза изопреноидов (Я) и два О®® пути синтеза изопен- тенилдифосфата (Д) в растениях.
Точками показаны ме- оГрУр) ченые атомы в исходных соединениях и в образовавшихся ИПДФ
Таким образом, биосинтез изопреноидов можно представить себе как своеобразный биохимический «моделист-конструктор». Вначале из унфицирова- ных С5-модулей изготовляются гибкие линейные конструкции разной длины. Они представляют собой практически идеальный материал для «биохимического конструирования» и формирования множества вариантов циклических структур.
Долгое время считалось, что во всех организмах исходное соединение для образования изопреноидов — ИПДФ — формируется единственным способом, а именно из мевалоновой кислоты, которая в свою очередь синтезируется из трех молекул ацетил-СоА. Недавно было установлено, что разные организмы используют различные способы синтеза ИПДФ. В клетках животных и грибов все изопреноиды синтезируются по «классическому» мевалонатному пути. Целый ряд микроорганизмов, в том числе многие цианобактерии и зеленые водоросли, используют другой вариант образования ИПДФ. В этом случае его предшественником является 1-дезоксиксилулозо-5-фосфат, который синтезируется из пирувата и глицеральдегид-3-фосфата. Такой путь синтеза был назван «альтернативным», или «немевалонатным». Оказалось, что растения используют оба варианта образования изопреноидов: в цитозоле синтез идет по классическому пути, а в пластидах — по альтернативному (рис. 9.13). При этом возможно не только дублирование синтеза изопреноидов в разных ком- партментах клетки, но и разделение по типу синтезируемых структур. Тритерпеноиды (включая стероиды) синтезируются в цитозоле из мевалоната, тогда как дитерпеноиды (включая фитол хлорофилла) и тетратерпеноиды (прежде всего каротиноиды) — в пластидах по альтернативному пути. Моно- и сесквитерпены, вероятно, могут образовываться разными вариантами в зависимости от структуры молекулы и вида растения.
Биосинтез фенольных соединений. К настоящему времени известно два пути образования фенольных соединений — шикиматный (через шикимовую кислоту) и ацетатно-малонатный. Основной путь шикиматный, это практически единственный способ формирования ароматического кольца. В качестве исходных соединений для синтеза выступают фосфоенолпируват (ФЕП) и эритрозо- 4-фосфат. При их конденсации возникает семиуглеродная кислота (2-кето-З- дезокси-7-фосфоарабогептановая), которая затем циклизуется в 5-дегидрохин- ную кислоту. Из дегидрохинной кислоты образуется шикимовая кислота, которая имеет шестичленное кольцо, одну двойную связь, и ее легко перевести в соединения ароматического ряда. Из шикимовой кислоты возможно образование оксибензойных кислот — n-оксибензойной, протокатеховой, галловой. Однако основной путь использования шикимовой кислоты — образование через префеновую кислоту ароматических аминокислот фенилаланина и тирозина. Фенилаланин (возможно, в ряде случаев и тирозин) — основной предшественник синтеза фенольных соединений. Дезаминирование фенилаланина осуществляет фермент фенилаланинаммиаклиаза (ФАЛ). В результате образуется коричная кислота, гидроксилирование которой приводит к образованию пара- кумаровой (оксикоричной) кислоты. После дополнительного гидроксилирования и последующего метилирования из нее образуются остальные оксико- ричные кислоты.
609609Оксикоричные кислоты представляют центральное звено синтеза всех фенольных соединений клетки. Орщо-кумаровая кислота является предшествен-
609
609
20 Физиология растений
ником кумаринов. После ряда реакций укорочения алифатической части молекулы образуются Сб-Сз- и Се-Ci -соединения — это второй путь образования оксибензойных кислот (первый — непосредственно из шикимовой кислоты). Оксикоричные кислоты могут образовывать различные конъюгаты, прежде всего с сахарами, однако основная масса оксикоричных кислот активируется путем взаимодействия с СоА. Два магистральных пути использования СоА-эфиров оксикоричных кислот — синтез лигнинов и синтез флавоноидов. Для синтеза лигнинов СоА-эфиры оксикоричных кислот восстанавливаются до спиртов, которые выступают в качестве мономеров синтеза. При синтезе флавоноидов СоА-производное оксикоричной кислоты взаимодействует с тремя молекулами малонил-СоА с образованием халкона. Реакцию катализирует фермент хал- консинтаза. Образовавшийся халкон легко преобразуется в флаванон. Из флаванонов за счет реакций гидроксилирования, окисления—восстановления образуются другие группы флавоноидов. Затем может происходить модификация молекулы — гликозилирование, метоксилирование и др.
Ацетатно-малонатный путь синтеза фенольных соединений широко распространен у грибов, лишайников и микроорганизмов. У растений он является минорным. При синтезе соединений по этому пути ацетил-СоА карбоксилиру- ется с образованием малонилацетил-СоА. Затем происходит каскад аналогичных реакций, в результате наращивается углеродная цепь и возникает поли-р- кетометиленовая цепочка. Циклизация поликетидной цепи приводит к образованию различных фенольных соединений. Таким способом синтезируются флороглюцин и его производные, некоторые антрахиноны. В структуре флавоноидов кольцо В формируется по шикиматному пути (из оксикоричной кислоты), тогда как кольцо А — по ацетатно-малонатному.
В клетке работают два шикиматных пути синтеза флавоноидов — один в пластидах, другой в цитозоле. В этих компартментах находится полный набор изоферментов шикиматного пути, а также ферментов фенольного метаболизма, в том числе ФАЛ и халконсинтазы. Таким образом, в растительной клетке существует две параллельные цепочки синтеза фенольных соединений (аналогично изопреноидам).
Синтез минорных классов вторичных соединений. Образование этих веществ также изучено достаточно полно. Для многих азотсодержащих соединений исходными веществами являются аминокислоты. Например, синтез цианогенных гликозидов начинается с декарбоксилирования соответствующей аминокислоты, затем последовательно формируются альдоксим, нитрил и а-гидро- ксинитрил. На последнем этапе синтеза образуется цианогенный гликозид за счет гликозилирования а-гидроксинитрила при помощи УДФ-глюкозы. Синтез обычно осуществляет комплекс ферментов: например, для дуррина этот комплекс состоит из четырех ферментов. Гены ферментов клонированы. Трансгенное по двум генам растение арабидопсиса приобрело способность к синтезу цианогенных гликозидов. Синтез беталаинов начинается от тирозина, который гидроксилируется и образуется диоксифенилаланин (ДОФА). ДОФА служит источником для двух фрагментов молекулы бетацианинов — беталамовой кислоты и цикло-ДОФА. Объединение этих двух соединений приводит к формированию бетацианинов. При синтезе бетаксантинов беталамовая кислота конденсируется с пролином. Серосодержащие вторичные метаболиты обычно синтезируются из серосодержащих аминокислот.
ЭНЗИМОЛОГИЯ ВТОРИЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА
Изучение энзимологии вторичного метаболизма привело к открытию удивительно большого количества различных ферментов, участвующих в этом процессе.
Модификация вторичных метаболитов — источник их поразительного разнообразия. Модификация происходит прежде всего в реакциях замещения (их осуществляют ацилтрансферазы), метилирования, гликозилирования. В геноме арабидопсиса обнаружены гены 43 различных ацилтрансфераз. Несколько структурно близких ацилтрансфераз используют в качестве субстратов ацил-СоА, в их активном центре содержится консервативный гистидин. Гены ацилтрансфераз в геноме собраны в кластеры. Метилтрансферазы представляют собой суперсемейство ферментов, в которое входят О-, С-, N-, S-метилтрансферазы. Они используют в качестве метилирующего субстрата S-аденозинметионин (SAM) и осуществляют метилирование фенилпропаноидов, флавоноидов, алкалоидов, поликетидов, сахаров. С-, N-, S-метилтрансферазы структурно (и, видимо, эволюционно) не связаны, тогда как О-метилтрансферазы имеют сходную первичную структуру и консервативный SAM-связывающий мотив. Гликозилирование осуществляют гликозилтрансферазы, причем существуют три типа ферментов: О-, С-, S-гликозилтрансферазы. Гликозилирование существенно изменяет свойства молекулы, прежде всего увеличивает ее растворимость и снижает токсичность.
Окислительно-восстановительные превращения кардинально изменяют свойства молекулы. Эти реакции катализируют окислительно-восстановительные (редокс) ферменты вторичного метаболизма — «метаболические волшебные палочки». У растений обнаружили более 300 цитохром-Р450-оксигеназ и более 100 диоксигеназ; при этом следует учесть, что диоксигеназы обычно мульти- субстратны и образуют несколько продуктов.
ФИЗИОЛОГИЯ ВТОРИЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА
ЛОКАЛИЗАЦИЯ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ В РАСТЕНИИ
Вторичные метаболиты могут находиться в различных частях клетки, ткани, органа растения.
Внутриклеточная локализация. Вторичные метаболиты, как правило, накапливаются в «метаболически неактивных» компартментах клетки — вакуолях и периплазматическом пространстве (клеточной стенке), но синтез их проходит обычно в других компартментах — чаще всего в цитозоле, ЭР и хлоропластах. Таким образом, в клетке синтез и накопление вторичных метаболитов пространственно разобщены; после синтеза должен происходить их транспорт по секреторному пути.
Места синтеза и накопления вторичных метаболитов различны для разных классов соединений. Алкалоиды накапливаются, как правило, в вакуолях, а в периплазматическое пространство практически не поступают. Возможно, это является следствием «бережного отношения» растения к азотсодержащим со-
единениям. Транспорт алкалоидов в вакуоли проходит с участием специфичных переносчиков (видимо, ABC-транспортеров). Во всяком случае в изолированные вакуоли эффективно поступают только «собственные» алкалоиды, т.е. характерные для данного растения. В вакуолях алкалоиды обычно находятся в виде солей. Синтез алкалоидов проходит преимущественно в пластидах (например, хинолизидновых) либо в цитозоле (чаще всего ЭР).
Изопреноидные вторичные метаболиты, в отличие от алкалоидов, обычно после синтеза выводятся из клетки. Помимо клеточной стенки, они могут иногда накапливаться в вакуолях. Синтез изопреноидов может проходить в двух ком- партментах — в пластидах или в цитозоле. При этом существуют два независимых пути синтеза изопреноидов: мевалонатный — в цитоплазме, альтернативный — в пластидах. «Пластидный» синтез изопреноидов часто осуществляется в лейкопластах — специализированных «изопреноидных» пластидах, которые имеют ряд морфологических особенностей (например, отсутствие рибосом, особое расположение внутренних мембран). Для них характерны тесные контакты с ЭР («ретикулярный футляр»), что косвенно указывает на взаимодействие пластид и ЭР при синтезе изопреноидов.
Фенольные соединения накапливаются как в вакуолях, так и в периплазма- тическом пространстве. При этом в вакуолях обычно содержатся гликозилированные фенольные соединения, тогда как в периплазматическом пространстве — метаксилированные соединения или агликоны. Синтез фенольных соединений происходит в хлоропластах и цитозоле. Показано существование двух независимых путей синтеза ароматических соединений (шикиматные пути) — в цитозоле и в пластидах.
Многие соединения других классов вторичных метаболитов также накапливаются в вакуолях. Подобную локализацию имеют, например, цианогенные гликозиды, глюкозинолаты, беталаины.
Локализация в тканях. Вторичные метаболиты могут быть равномерно распределены по клеткам ткани, однако это бывает достаточно редко. Гораздо чаще они накапливаются в ткани неравномерно, при этом для их локализации могут быть использованы разные структуры. В наиболее простых случаях соединения накапливаются в специализированных клетках — идиобластах. Идиобласты, накапливающие разные вторичные метаболиты, могут иметь характерные особенности. Например, идиобласты, накапливающие алкалоиды у руты (Ruta graveolens) содержат большое количество мелких вакуолей. В идиобластах, содержащих таннины, вакуоль занимает почти весь объем клетки. Изопреноидсодержащие идиобласты часто характеризуются сильно развитым гладким ЭР. Идиобласты, накапливающие вторичные метаболиты, могут находиться в различных тканях растения, однако чаще всего они присутствуют в покровных тканях. Например, в эпидермальных тканях листа и стебля разных видов найдены идиобласты, накапливающие фуростаноловые гликозиды, стероидные гликоалкалоиды, хинолизидиновые алкалоиды.
Довольно часто вторичные метаболиты локализуются в тканях в специализированных структурах — ходах, каналах, млечниках. Эти структуры разделяются на две группы — производные внеклеточного пространства и производные вакуоли. Можно сказать, что на уровне тканей сохраняется «клеточный» принцип накопления вторичных метаболитов — в периплазматическом пространстве и в вакуолях.
Смоляные ходы, камедиевые и масляные каналы (протоки) представляют собой внеклеточные структуры. Они могут образовываться схизогенно (за счет увеличения межклетников) либо лизогенно (за счет гибели и лизиса некоторых клеток). Вторичные метаболиты (например, терпеноиды — компоненты эфирных масел и смол) синтезируются в клетках, выстилающих ходы и каналы, а затем и секретируются в них.
Млечники, производные вакуолярной системы растений, имеются как минимум у представителей 20 семейств высших растений. Содержимое млечников — латекс — фактически является вакуолярным соком и представляют собой эмульсию, содержащую алкалоиды, изопреноиды и ряд других соединений вторичного и первичного метаболизма.
Таким образом, на уровне тканей можно проследить закономерность, аналогичную клеточной: разделение мест синтеза и накопления вторичных метаболитов.
Установить общие закономерности локализации вторичных метаболитов по органам растений, по-видимому, невозможно. Она зависит от вида растения, условий окружающей среды, типа вторичного метаболита и, вероятно, главное — от его физиологической функции. Вторичные метаболиты могут синтезироваться и накапливаться во всех органах растений. Например, эфирные масла могут накапливаться в лепестках цветков (роза), плодах (анис, кориандр), корнях (валериана, девясил), листьях (мята, шалфей). Сердечные гликозиды могут находиться в листьях (олеандр, наперстянка), коре (обвойник), семенах (строфант), цветках (ландыш). В то же время закономерность разделения мест синтеза и накопления вторичных метаболитов часто наблюдается и на уровне органов и целого растения. Например, стероидные гликозиды диоскореи (Dioscorea deltoidea) синтезируются в листьях интактного растения и с флоэмным током транспортируются по растению преимущественно в эпидермальные ткани и корневище. В эпидермисе листьев и стеблей они локализуются в идиобластах. Основная масса гликозидов накапливается в корневище (до 8 % от сухой массы). Похожая ситуация наблюдается для хинолизидиновых алкалоидов.
Достаточно часто вторичные метаболиты выделяются растением в окружающую среду. Для этого существуют различные механизмы и морфологические структуры. Простейшей системой выделения вторичных метаболитов можно считать железистый эпидермис с железистыми пятнами. Железистые пятна используются для выделения эфирных масел и представляют собой его скопления под кутикулой. Моно- и сесквитерпеноиды, составляющие основной компонент эфирного масла, синтезируются отдельными группами клеток, мозаично расположенными в железистом эпидермисе. Образовавшееся эфирное масло скапливается под кутикулой в виде железистого пятна, а затем выделяется в окружающую среду. Такой способ выделения эфирных масел характерен для розы, ландыша, почек тополя.
Более сложными секреторными структурами являются железистые волоски (трихомы) и железки. Они состоят из базальной клетки, одно- или многоклеточной ножки и головки. Одноклеточная головка характерна для трихом, многоклеточная — для железок. Количество железистых волосков может достигать десятков тысяч на лист.
По-видимому, все клетки трихом и железок способны к синтезу и выделению эфирных масел. Трихомы и железки являются достаточно универсальными
выделительными структурами и могут использоваться для выделения не только эфирных масел. В различных видах растений они могут осуществлять выделение дитерпеноидов, фенольных соединений и некоторых других вторичных метаболитов. Выделение в наружную среду для алкалоидов не характерно.
ИЗМЕНЕНИЕ ВТОРИЧНОГО МЕТАБОЛИЗМАВ ОНТОГЕНЕЗЕ РАСТЕНИЙ
Синтез и накопление вторичных метаболитов зависит от стадии развития растения. В то же время общих закономерностей изменений вторичного метаболизма в онтогенезе, по-видимому, не существует. Разворачивание вторичного метаболизма во времени зависит от вида растения, типа вторичного метаболита и его физиологической роли и — очень сильно — от внешних воздействий. Например, максимальный уровень накопления многих изопренилов (эфирных масел, стероидных гликозидов) часто приходится на период бутонизации и цветения. Синтез алкалоидов закономерно разворачивается в процессе онтогенеза. Например, в семенах и всходах мака алкалоидов нет. Через две недели появляется наркотин, а когда проростки достигают в длину 5 —7 см — кодеин, морфин, папаверин, сангвинарин. К моменту цветения к ним прибавляются тебаин и нарцеин. В млечном соке коробочек мака присутствует уже до 25 алкалоидов. В чистотеле на третьи сутки после прорастания появляется аллокриптопин, на четвертые — протопин, причем его сразу больше, чем аллокриптопина. Хинолизидиновые алкалоиды в период от прорастания до цветения постепенно накапливаются во всех органах растения, но к моменту созревания плодов появляются в них, исчезая из всех других органов. Приведенные примеры и целый ряд других фактов показывают, что процесс вторичного метаболизма — четко работающая система, отслеживающая как внутренние факторы (этапы онтогенеза растения), так и внешние воздействия.
ФУНКЦИИ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ
В процессе изучения вторичных метаболитов было выдвинуто несколько гипотез о функциональной значимости этих соединений. Однако поразительное разнообразие вторичных метаболитов и практически полное отсутствие корректных подходов к доказательству выдвигаемых гипотез оставляют этот вопрос предметом острых дискуссий до настоящего времени.
Первой появилась гипотеза об отсутствии какой-либо роли вторичных метаболитов в жизни растений. Она существовала со времен А. Косселя, который, собственно, и определил вторичные метаболиты как «нечаянно» синтезируемые растительной клеткой. Исходя из этой гипотезы, вторичные метаболиты считаются «отбросами» жизнедеятельности растений, «тупиками метаболизма», возможно, продуктами детоксикации ядовитых первичных метаболитов (например, свободных аминокислот). В настоящее время подобный взгляд на роль вторичных метаболитов не пользуется успехом и подвергается критике. Основные аргументы «против» — слишком большое количество вторичных метаболитов (растение «могло бы придумать» более рациональные способы
утилизации отходов). Кроме того, процесс вторичного метаболизма слишком хорошо организован во времени и пространстве, чтобы быть «случайным».
Вторая гипотеза утверждала запасающую роль вторичных метаболитов. В ряде случаев концентрация вторичных метаболитов в органах может достигать значительного уровня. Показано, что многие из них действительно утилизируются клеткой: при определенных условиях алкалоиды могут служить источником азота, фенольные соединения — субстратами дыхания. По всей видимости, ряд вторичных метаболитов выполняет эту функцию, однако в большинстве случаев после образования они не реутилизируются, а накапливаются в клетках или специальных структурах, либо экскретируются.
Довольно своеобразной стала гипотеза относительно «первичности» всех вторичных метаболитов. Согласно этому представлению мы просто еще не знаем, в каких важных процессах они участвуют. Исходной точкой для такой идеи было открытие шикиматного пути синтеза ароматических соединений. С его открытием много «типично вторичных» соединений — например, хинная, дегидрохинная, шикимовая кислоты — автоматически перешли в разряд первичных. Очевидно, что если эта гипотеза и справедлива, то лишь для очень немногих веществ, так как основной признак вторичных метаболитов — не обязательное присутствие в каждой растительной клетке — справедлив для большинства соединений.
Наибольшее признание в настоящее время получила гипотеза о защитной роли вторичных соединений. Систему зашиты растения от биотических стрессов образно можно представить в виде «кругов обороны» и, в зависимости от опасности патогена, растение последовательно использует соответствующие «круги». Все защитные соединения можно разделить на три группы — конститутивные, полуиндуцибельные и индуцибельные. Конститутивные соединения постоянно присутствуют в тканях и органах растения и относятся к «первому кругу» обороны. Они, как правило, обладают широким спектром активности (антимикробной, фунгицидной, инсектицидной), но уровень активности невысок. Эти соединения не могут накапливаться в больших количествах прежде всего из-за своей токсичности и часто локализуются в мертвых тканях (например, корке).
Полуиндуцибельные соединения находятся в тканях в виде неактивного предшественника и после соответствующего сигнала или воздействия быстро превращаются в активные вещества. Эти соединения часто работают на «втором круге» обороны, образующиеся соединения, как правило, более токсичны, чем конститутивные. Поскольку предшественник нетоксичен, его концентрация в тканях может быть достаточно высокой. Система получения активного соединения, как правило, основана на компартментации процесса. Неактивный предшественник обычно располагается в вакуоле клетки или пе- риплазматическом пространстве, тогда как фермент, осуществляющий его перевод в активную форму, — в цитозоле. Возможна компартментация на уровне ткани. В этом случае предшественник может находиться в идиобластах, а ферменты его активации — в соседних клетках. При нарушении целостности клетки или ткани (за счет прямого повреждения «агрессором» либо в процессе патогенеза) субстрат становится доступным для фермента и быстро образуется токсичное соединение.
Наконец, индуцибельные соединения обычно участвуют в работе «третьего круга» обороны. Они характеризуются очень высокой токсичностью и форми-
руются de novo в результате разворачивания процесса патогенеза. Их образование обычно запускается в результате работы сигнальных систем клетки, которые включают гены ферментов их синтеза. Многие вторичные метаболиты являются важнейшими участниками каждого из «кругов обороны» растения.
Среди вторичных метаболитов практически любого класса можно обнаружить конститутивные защитные соединения. Например, монотерпены камфен и мирцен представляют собой инсектициды, ментол и а-пинен — реппеленты. Многие дитерпеноиды, входящие в состав смол, обладают бактерицидной и фунгицидной активностью. Карденолиды и многие алкалоиды — мощные яды для травоядных животных. Экдистериоды относятся к инсектицидам. Гликоалкалоиды пасленовых обладают широким спектром активности. Основная проблема для накопления ощутимых количеств ядовитых веществ — их токсичность для самого растения. Небелковые аминокислоты в этом аспекте — почти идеальные конститутивные защитные соединения («почти» — поскольку белок- синтезирующая система некоторых насекомых «научилась» различать белковые аминокислоты от их небелковых аналогов). Следовательно, для них растения, содержащие соответствующие небелковые аминокислоты, перестают быть ядовитыми. Более того, такие насекомые эффективно используют эти аминокислоты против своих врагов, поэтому питаются только такими растениями. Избежать токсичности конститутивных защитных соединений можно, например, если «хранить» их в специальных структурах либо выделять на поверхность растения или в окружающую среду. Видимо этим объясняется высокая концентрация вторичных соединений в идиобластах, смоляных ходах, масляных и камедиевых каналах, млечниках. Предельный случай — выделение летучих соединений, что характерно для эфирных масел. Большинство их компонентов обладает антимикробными, фунгицидными или реппелентными свойствами. Подобная стратегия позволяет создавать «защитный ореол» вокруг растения (эффективнее — вокруг группы близкорастущих растений, как в хвойном лесу) и «обезвреживать» патогены на «дальних подступах». Однако такой подход требует больших энергетических и конструктивных затрат.
Достаточно часто вторичные метаболиты выступают в роли полуиндуци- бельных соединений. В этой системе часто используются характерные модификации молекул вторичных метаболитов, связанные с изменением их биологической активности. Обычно неактивными предшественниками являются гликозилированные формы соединений. К полуиндуцибельным защитным веществам относятся, например, цианогенные гликозиды, глюкозинолаты, гликозиды о-коричных кислот. Для них характерно присутствие гликозида в вакуоле, а гидролизующего фермента — в цитоплазме или клеточной стенке. После нарушения целостности тонопласта происходит гидролиз и быстро образуется токсичное или активное соединение — синильная кислота, нитрил или кумарин.
В растениях встречается целая система конститутивных и полуиндуцибель- ных защитных соединений. Например, спиростаноловые стероидные гликозиды действуют как конститутивные защитные вещества; они нерастворимы в воде и обладают фунгицидной, атимикробной активностью, а также цитотоксическими свойствами. Фуростаноловые гликозиды растворимы в воде и не токсичны. Перевод фуростаноловых гликозидов в спиростаноловые осуществляется одностадийной реакцией — отщеплением глюкозного фрагмента при С26 с участием специфичной р-гликозидазы. Стероидные гликозиды синтези-
руются в листьях растения в фуростаноловой форме. Затем они транспортируются по всему растению и накапливаются в идиобластах эпидермиса листьев и стеблей. Основная масса гликозидов транспортируется в корневище, где гликозидаза переводит их в спиростаноловую (активную) форму. В надземных органах фуростаноловые гликозиды находятся в идиобластах, а специфичная гликозидаза располагается поблизости (обычно в мезофилле листа). При повреждении ткани очень быстро образуются спиростаноловые гликозиды. Этот пример иллюстрирует принцип пространственной дифференциации защитных механизмов: в корневище (органе вегетативного размножения) в большом количестве присутствует активная форма соединения, тогда как в надземных, активно работающих органах эффективнее оказывается стратегия с использованием полуиндуцибельных защитных соединений.
Вторичные метаболиты, участвующие в работе третьего «круга обороны», где происходит индукция синтеза мощных защитных веществ, носят название фитоалексинов. Их образование — важнейшая стадия реакции сверхчувствительности. Фитоалексины никогда не присутствуют в здоровом растении, и их синтез начинается только в ответ на инфекцию. Развивающиеся события можно представить следующим образом.
Любой организм, в том числе патоген, выделяет множество экзометаболитов — продуктов нормальной жизнедеятельности. На ряд экзометаболитов патогена (например, патогенного гриба) у растений в процессе коэволюции выработались специальные рецепторы. Такие экзометаболиты патогена получили название элиситоров. Они могут иметь разную химическую природу, но обязательно должны быть специфичными для данного патогена. К элиситорам относятся фрагменты клеточной стенки гриба, ферменты, выделяемые им для разрушения растительной клеточной стенки или кутикулы. Связывание элиситоров с соответствующими рецепторами запускает ряд сигнальных систем растительной клетки — прежде всего пероксидазную, NO-оксидазную и липоксигеназную. Их работа приводит к парадоксальному на первый взгляд эффекту — гибели клетки. Эта реакция получила название реакции сверхчувствительности (так как клетки погибают не от прямого воздействия патогена, а только при получении информации о его приближении). В результате гибели клеток разрушаются полимеры клеточных стенок, ряд образовавшихся фрагментов оказываются олигосахаринами, т.е. сигнальными молекулами. В частности, олигосахаринами являются фрагменты ксило глюканов, содержащие 7 — 9 углеводных остатков, из которых один обязательно должен быть фукозой. Клетки, расположенные рядом с погибшими, имеют рецепторы к олигосахаринам. После связывания олигосахаринов с рецепторами в этих клетках также включаются сигнальные системы. Благодаря им активируются гены, отвечающие за синтез фитоалексинов. Однако фитоалексины в силу своей чрезвычайной токсичности не накапливаются в живых клетках, а сразу транспортируются в мертвые клетки очага сверхчувстительности. Таким образом, к «приходу» патогена в мертвых клетках должны накопиться высокие концентрации сильных ядов. Если растение успевает это сделать, гриб погибает. Таким образом, стратегия реакции сверхчувствительности — гибель части во имя целого — оказывается вполне целесообразной.
Фитоалексинами могут быть соединения различных классов вторичных метаболитов. К сесквитерпеноидным фитоалексинам относятся ришитин и лю-
ФитоалсксиныСесквитерпеныФитоалсксиныСесквитерпеныCHO ОНОН СНОCHO ОНОН СНОИзофлавоноидыИзофлавоноидыГенистеин FabaceaeГенистеин FabaceaeGossypium herbaceumGossypium herbaceumОрхинол OrchidaceaeОрхинол Orchidaceae
Фитоалсксины
Сесквитерпены
Фитоалсксины
Сесквитерпены
CHO ОНОН СНО
CHO ОНОН СНО
Изофлавоноиды
Изофлавоноиды
Генистеин Fabaceae
Генистеин Fabaceae
Gossypium herbaceum
Gossypium herbaceum
Орхинол Orchidaceae
Орхинол Orchidaceae
Полиацстилены
СН3СН=СН(С=С)3СН=СН-СН-СН2СОж онСафинолAsteraceae
Рис. 9.14. Структура некоторых фитоалексинов
бимин (пасленовые, в частности картофель), гемигоссипол (мальвовые), ипо- меамарон (вьюнковые), к дитерпеноидным фитоалексинам — касбен (клещевина). Довольно часто фитоалексины представлены фенольными соединениями, такими как стильбены, изофлавоноиды. Последние почти исключительно используются в семействе Бобовые. Фитоалексинами являются ацетиленовые производные сложноцветных сафинол и виероновая кислота (рис. 9.14).
Таким образом, многие вторичные метаболиты выполняют функции конститутивных, полуиндуцибельных или индуцибельных защитных соединений, и хотя они представляют только часть сложной системы защиты растений, но эта часть довольно важная.
Роль вторичных метаболитов в жизни растения далеко не исчерпывается защитными функциями. Хорошо известно, что многие из них активно участвуют в размножении растений. Флавоноиды, прежде всего антоцианы, беталаины, каротиноиды, обеспечивают окраску цветков и плодов, привлекающую опылителей цветков и распространителей семян. Метилбензоат (метилированная бензойная кислота) — аттрактант для насекомых. Ряд вторичных метаболитов растения могут использовать в качестве «нападающих факторов». Например, находящиеся среди экзометаболитов корней бархатцев тиофены останавливают прорастание семян конкурирующих видов. Юглон, который образуется в опавших листьях грецкого ореха за счет гликозидаз почвенных микробов, достаточно токсичен. Он подавляет развитие патогенной микрофлоры почвы и прорастание семян других видов. Ряд флавоноидов используются бобовыми растениями как сигналы при формировании ризобиольного симбиоза и арбус- кулярной микоризы.
В целом можно сказать, что основная функция вторичных метаболитов в растениях — экологическая в широком смысле. Это те биохимические «рычаги», которыми прикрепленный организм — растение — решает множество экологических проблем на протяжении всей своей жизни.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1
ДеДюв К. Путешествие в мир живой клетки. — М.: Мир, 1987.
Генетика развития растений / Л.А.Лутова, Н. А. Проворов, О. Н.Тиходеев и др. Подред. С. Г. Инге-Вечтомова. — СПб.: Наука, 2000.
Маргелис Л. Роль симбиоза в эволюции клетки. — М.: Мир, 1983.
Молекулярная биология клетки / Б. Альбертис, Д. Брей, Дж.Льюис и др. В 3 т. — М.: Мир, 1994.
Общая и молекулярная фитопатология / Ю. Т. Дьяков, О. Л. Озерецковская, В. Г. Джа- вахия и др. — М.: Изд-во «Общество фитопатологов», 2001.
Саламатова Т. С. Физиология растительной клетки. — Л.: Изд-во ЛГУ, 1983.
ГЛАВА 2
Геннис Р. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. — М.: Мир, 1997.
Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. — Т. 1. — М.: Мир, 1986.
Молекулярная биология клетки / Б.Альбертис, Д. Брей, Дж.Льюис и др. ВЗт.—
Т. 1.-М.: Мир, 1994.'
Скулачев В.П. Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии. — М.: Высшая школа, 1989.
Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. — М.: Наука, 1989.
Скулачев В. П. Законы биоэнергетики // Соросовский образовательный журнал, 1997. — № L —С. 9—14."
Рубин А. Б. Биофизика. В 2 т. — Т. 2. Биофизика клеточных процессов. — М.: «Университет», 2000.
Boyer Р. D. The ATP-syntase: A splendid molecular machine // Ann. Rev. Biochem. 1997. - V. 66. - P. 717-749.
Boyer P.D. Catalytic site forms and controls in ATP synthase catalysis // В BA, 2000. — V. 1458. - P. 252-262.‘
Capaldi R.A., Aggeler R. Mechanism of the FIFo — type ATP Synthase, a biological rotary motor // Trends in Biochem. Sci., 2002. — V. 27. — P. 154—160.
ГЛАВА 3
Андрианова Ю. У, Тарчевский И. А. Хлорофилл и продуктивность растений. — М.: Наука, 2000.
Владимиров Ю.А., Потапенко А. Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. — М.: Высшая школа, 1989.
Гавриленко В. Ф., Гусев М. В., Никитина К. А., Хоффман П. Избранные главы физиологии растений. — М.: Изд-во МГУ, 1986.
Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. В 2 т. — М.: Мир, 1986.
Клейтон Р. Фотосинтез. Физические механизмы и химические модели. — М.: Мир, 1984.
Кочубей С. М. Организация фотосинтетического аппарата высших растений. — Киев: Изд-во «Альтерпрес», 2001.
Мокроносов А. Т. Онтогенетический аспект фотосинтеза. — М.: Наука, 1981.
Мокроносов А. Т, Гавриленко В. Ф. Фотосинтез. Физиолого-экологические и биохимические аспекты. — М.: Изд-во МГУ, 1992.
Николас Д. Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию. — М.: Мир, 1985.
Полевой В. В. Физиология растений. — М.: Высшая школа, 1989.
Рубин А. Б. Биофизика. В 2 т. — М.: Книжный дом «Университет», 1999, 2000.
Фотосинтез / Под ред. Говинджи. В 2 т. — М.: Мир, 1987.
ХоллД., Рао К. Фотосинтез. — М.: Мир, 1983.
Эдвардс Дж., Уокер Д. Фотосинтез С3- и С4-растений: механизмы и регуляция. — М.: Мир, 1986.
Futai М., Omote Н., Sambongi К, Wada Y. Synthase (H+-ATPase): coupling between catalysis, mechanical work and proton translocation // Biochim. Biophys. Acta, 2000. — V. 1458,-P. 276-288.
Nugent J. H.A., Rich A. N., Evans M. C. W. Photosynthetic water oxidation: towards a mechanism // Biochim. Biophys. Acta, 2001. — V. 1503. — P. 138—146.
Robblee J. H, Cinco R. M., Yachandra V. K. X-ray spectroscopy-based structure of Mn cluster and mechanism of photosynthetic oxygen evolution. // Biochim. Biophys. Acta, 2001.— V. 1503,-P. 7-23.
Wellman F.-A., Minai L., Nechushtai R. The biogenesis and assembly proteins in thylakoid membranes. // Biochim. Biophys. Acta, 1999. — V. 1411. — P. 21 — 85.
ГЛАВА 4
Головко Т.К. Дыхание растений. Физиологические аспекты. — СПб., Наука, 1999.
Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений В 2 т. — М.: Мир, 1986.
Ленинджер А. Основы биохимии. В 3 т. — М.: Мир, 1985.
Скулачев В.П. Кислород в живой клетке: добро и зло // Соросовский образовательный журнал, 1996. — № 3. — С. 4—10.
Breusegem van F., Vranova E., Dat J.F., Inze D. The role of active oxygen species in plant signal transduction // Plant Sci., 2001. — V. 161. — P. 405 — 414.
Dutton P.L., Moser С. C., Sled V.D. etal. N reductant-induced oxidatin mechanism for Complexl. Ц BBA, 1998. - V. 1364. - P. 245-257.
Jones A. Does the plant mitochondrion integrate cellular stress and regulate programmed cell death? // Trends in plant science, 2000. — V. 5. — N 5. — P. 225 — 229.
Kerscher S.J. Diversity and origin of alternative NADH: ubiquinone oxidorcducrases. // BBA, 2000. - V. 1459. - P. 274-283.
Mackenzie S., McIntosh L. Higher plant mitochondria. // Plant Cell, 1999. — V. 11. — P. 571-585.
Matsuno-Yagi A., Yagi T. Complex 1 — an L-Shapcd Black Box. //J. Bioenergetics and Biomembranes, 2001. —V. 33.— P. 155—157.
Rasmusson A. G., Heiser V, Zabaleta E. et al. Physiological, biochemical and molecular aspects of mitochondrial complex I in plants // BBA, 1998. — V. 1364. — P. 101 —111.
Siedow J. N., Day D.A. Respiration and photorespiration. // Biochemistry and Molecular biology of plants. B. Buchanan, W.Gruissem, R. Jones, eds.: Amer. Soc. of Plant Physiologists, 2000.
Skulachev V. P. Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics. // BBA, 1998. - V. 1363. - P. 100-124.
Vanlerberghe G. C, McIntosh L. Alternative oxidase: From Gene to function. //Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1997. — V. 48. — P. 703 — 734.
Wikstrom M., Verkhovsky M.J., Hummer G. Water—gated mechanism of proton translocation by cytochrome c oxidase // BBA, 2003. — V. 1604. — 61—62.
Zaslavsky D., Gennis R.B. Proton pumping by cytochrome oxidase; progress, problems and postulates. — BBA, 2000. — V. 1458. — P. 164—179.
ГЛАВА 5
Жолкевич В. Н. Транспорт воды в растении и его эндогенная регуляция: LXI Тимирязевские чтения. — М.: Наука, 2001.
Нобел П. Физиология растительной клетки. — М.: Мир, 1973.
Слейчер Р. Водный режим растений. — М.: Мир, 1970.
Фролов Ю.Г., Белик В. В. Физическая химия. — М.: Химия, 1993.
Фролов Ю.Г. Курс коллоидной химии. — М.: Химия, 1982.
Steudle Е. The cohesion-tension mechanism and the acquisition of water by plant roots // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 2001. — P. 847 — 875.
Steudle E., Peterson C.A. How does water get through roots? // J. Exp. Botany, 1998. — V. 49. - N 322. — P. 775-788.
Tomos A. D., Leigh R.A. The pressure probe. A Versatile Tool in Plant Cell Physiology // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1999. — V. 50. — P. 447—472.
ГЛАВА 6
Алехина Н.Д., Кренделева T.E., Полесская О. Г. Взаимосвязь процессов усвоения азота и фотосинтеза в клетке листа С3-растений // Физиология растений, 1996. — Т. 43. — С. 136-148.'
Вахмистров Д. Б. Пространственная организация ионного транспорта в корне: LXI Тимирязевские чтения. — М.: Наука, 1991.
Гусев Н.Б. Внутриклеточные Са-связывающие белки. — 4.1. Классификация и структура. — Ч. 2. Структура и механизм функционирования // Соросовский образовательный журнал, 1998. — № 5. — С. 2—16.
Измайлов С. Ф. Азотный обмен в растениях. — М.: Наука, 1986.
Люттге У, Хигинботам Н. Передвижение веществ в растениях. — М.: Колос, 1984.
Островская Л. К. Железо в растительном мире и карбонатный хлороз. — Киев: Наука, 1983.
Сабинин Д. А. Избранные труды по минеральному питанию растений. — М.: Наука, 1971.''
Ткачук И. А. Мембранные рецепторы и внутриклеточный кальций // Соросовский образовательный журнал, 2001. — Т. 7. — № 1. — С. 10—15.
Campbell W.H. Nitrate reductase structure, function and regulation: Bridging the Gap between Biochemistry and Physiology//Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1999. — V. 50,-P. 277-303.'"'
Gilroy S. G., Jones D. U. Through form to function: root hair development and nutrient uptake // Trends in plant sci., 2000. — V. 5. — N 2. — P. 56—60.
Leustek T, Saito K. Sulfate Transport and Assimilation in Plants // Plant Physiology, 1999.-V. 120.-P. 637-643.*"
Maathuis F. G.M. et al. Roles of higher plant K+ channels // Plant Physiol, 1997. — V. 114. — P. 1141-1149.
Miflin B.J., Lea P.J. Ammonia assimilation // Miflin BJ, ed. The biochemistry of plants. — V. 5. — Toronto: Acad. Press., 1980.
Raghothama K. G. Phosphate transport and signaling // Curr. Opinion in Plant Biol., 2000.-V.3.-P. 182-187.'
Sanders D. et al. Calcium at the crossroads of signaling // The Plant Cell. Supl., 2002. — S. 401-417.
Schachtman D.P., Reid R. J., AylingS.M. Phosphorus Uptake by Plants: From Soil to Cell Ц Plant Physiol., 1998. - V. 116. - P. 447-453.
5ze H, Li X., Palmgen M.G. Energization of plant cell membranes by H+-pumping ATP-ases: regulation and biosynthesis // The Plant Cell, 1999. — V. 1. — P. 677 — 689.
Flugge Ulf-Ingo. Metabolite transporters in higher plastids // Curr. Opinion in Plant Biol., 1998. — V. 1 — P. 201 — 206.
White P. Y Calcium channels in higher plants // BBA, 2000. — V. 1465. — P. 171 —189.
Williams L.E., Miller A. J. Transporters responsible for the uptake and partitioning of nitrogen solutes//Ann. Rev. Plant Plant. Physiol. Plant. Mol. Biol., 2001. — V. 52. — P. 659—688.
Zimmermann S., Sentenac H. Plant ion channels- from molecular structures to physiological functions // Curr. Opinien in Plant Biol., 1999. — V. 2. — P. 477 — 482.
ГЛАВА 7
ГэлстонА., Девис П., Сеттер Р. Жизнь зеленого растения. — М.: Мир, 1983.
Дутова Л. А., Проворов Н.А., Тиходеев О.Н. и др. Генетика развития растений. — СПб.: Наука, 2000.
Тарчевский И. А. Сигнальные системы клеток растений. — М.: Наука, 2002.
Уоринг Ф., Филипс И. Рост растений и дифференцировка. — М.: Мир, 1984.
Чайлахян М.Х. Регуляция цветения высших растений. — М.: Наука, 1984.
ГЛАВА 8
Балнокин Ю.В. Ионный гомеостаз и осморегуляция у галотолерантных микроводорослей Ц Физиол. раст., 1993. — Т. 40. — С. 567 — 576.
Кашнер Д. (ред.) Жизнь микробов в экстремальных условия. — М.: Мир, 1981.
Косулина Л. Г., Луценко Э.К., Аксенова В. А. Физиология устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды. — Ростов-на-Дону: Ростовский университет, 1993.
Красавцев О. А. Усп. совр. биол., 1985. — Т. 100. — Вып. 3 (6). — С. 450.
Кулинский В. И. Активированные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита // Соросовский образовательный журнал, 1999. — № 1.-С. 2-7.
Мерзляк М. Н. Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах растительной клетки // Итога науки и техники. — Сер. Физиология растений, 1989. — Т. 6.
Мерзляк М. Н. Активированный кислород и жизнедеятельность растений // Соросовский образовательный журнал, 1999. — № 9. — С. 20—26.
Нобел П. Физиология растительной клетки. — М.: Мир, 1973.
Скулачев В. П. Кислород в живой клетке: добро и зло // Соросовский образовательный журнал, 1996. — № 3. — С. 4—10.
Тарчевский И. А. Метаболизм растений при стрессе. — Казань: Фэн, 2001.
Тарчевский И. А. Сигнальные системы клеток растений. — М.: Наука, 2002.
Хочачка П., Семеро Дж. Биохимическая адаптация. — М.: Мир, 1988.
Чиркова Т.В. Физиологические основы устойчивости растений. — СПб.: Изд-во Санкт-Петербургского университета, 2002.
Alsher R. G., Donahue J.L., Cramer C.L. Reactive oxygen species and antioxidants: relationships in green cells // Physiol. Plant., 1997. — V. 100. — P. 224—233.
Vartapetian B.B. Plant adaptation to anaerobic stress //Ann. Botany, 1997. — V. 79. — P. 3-20.
ГЛАВА 9
Ботанико-фармакогностический словарь / Под ред. К.Г. Блиновой, Г П.Яковлева. — М.: Высшая школа, 1990.
Гудвин Т, Мерсер Э. Введение в биохимию растений. В 2 т. — Т. 2. — М.: Мир, 1986.
Запрометов М. Н. Фенольные соединения. — М.: Наука, 1993.
Лукнер М. Вторичный метаболизм у микроорганизмов, растений и животных. — М.; Мир, 1979. '
Райс Э. Природные средства защиты растений от вредителей. — М.: Мир, 1986.
Рощина В.Д., Рощина В.В. Выделительная функция высших растений. — М.: Наука, 1989.
Фитоалексины / Под ред. Дж. А. Лейли, Дж. В. Мансфильда. — Киев: Наукова Думка, 1985.
Харборн Дж. Введение в экологическую биохимию. — М.: Мир, 1985.
Secondary Plant Products / Ed. E. A. Bell and B.V.Charlwood. Encyclopedia of Plant Physiology. New Series. — V. 8. — 1980: Springer-Verlag.
ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений3
Физико-химические константы и показатели (параметры)5
Предисловие6
Глава 1. РАСТИТЕЛЬНАЯ КЛЕТКА (Я. М. Носов)
Общая характеристика эукариотических клеток 11
Органеллы эукариотических клеток И
Транспорт и сортировка белков в эукариотической клетке 13
Растительная клетка — результат двойного симбиоза 16
Плазматическая мембрана растительной клетки (плазмалсмма) 17
Структура плазмалеммы 17
Функции плазмалеммы20
Ядро растительной клетки22
Строение ядра22
Транспорт макромолекул между ядром и цитоплазмой22
Пластиды24
Общая характеристика пластид24
Типы пластид и их формирование24
Оболочки пластид27
Размножение пластид27
Наследование пластид28
Геном и белоксинтезирующая система пластид28
РНК-полимеразы пластид30
Транскрипция пластидной РНК31
Созревание пластидной РНК31
Трансляция белков в пластидах33
Белки, кодируемые в пластидном геноме33
Транспорт цитозольных белков в пластиды34
Функции пластид35
Растительные митохондрии35
Строение растительных митохондрий35
Геном митохондрий высших растений36
Белоксинтезирующий аппарат растительных митохондрий38
Транспорт цитозольных белков в митохондрии38
Функции митохондрий растений39
Пероксисомы39
Цитоскелет41
Актин41
Тубулин43
Белки промежуточных волокон43
Функции цитоскелета44
Эндомембранные структуры растительной клетки44
Эндоплазматический ретикулум (ЭР)44
Общая характеристика растительного ЭР 44
Функциональные области растительногоЭР46
Аппарат Гольджи50
Строение растительного АГ51
Транспорт продуктов в аппарате Гольджи52
Функции аппарата Гольджи растительных клеток53
Вакуоли54
Общая характеристика вакуолей растительной клетки54
Функции вакуолей55
Формирование вакуолей56
Автофагия — особый случай формирования вакуолей 57
Два типа вакуолей растительных клеток57
Клеточная стенка58
Общая характеристика клеточной стенки58
Структура клеточной стенки59
Сахара, участвующие в построении клеточной стенки59
Первая (целлюлозная)сеть клеточнойстенки60
Вторая (пектиновая)сеть клеточнойстенки64
Третья (белковая или фснилпропаноидная) сеть клеточной стенки67
Типы строения клеточных стенок68
Биосинтез клеточной стенки71
Онтогенез растительной клетки73
Клеточный цикл74
Рост клетки76
Роль клеточной стенки в ростеклетки76
Роль цитоскелета в росте клетки76
Гипотеза «кислого роста»77
«Фиксация» окончательных размеров и формы клетки79
Дифференциация клетки80
Роль вторичной клеточной стенки в дифференциации клетки80
Суберин и кутин делают вторичную клеточную стенку водонепроницаемой81
Лигнин — главный компонент некоторых вторичных клеточных стенок81
Смерть растительной клетки82
Особенностифункционирования растительной клетки84
Функционирование клетки — координированная работа многих органелл 84
Работа растительной клетки — переплетение «прокариотических» и «эукариотических» метаболических систем85
Глава 2. ОСНОВЫ БИОЭНЕРГЕТИКИ (О. Г. Полесская)
Живые организмы могут использовать две формы энергии — световую и химическую87
Упорядоченность биологических систем и обмен энергией с окружающей средой88
Направление химической реакции определяется величинойAG88
Энергозависимые реакции сопряжены с реакциейгидролиза АТФ90
Преобразование энергии на сопрягающих мембранах связано с образованием электрохимического протонного градиента (АрнО91
Трансмембранный электрохимический протонный градиент и его составляющие93
Энергия Арн1 используется для синтеза АТФ из АДФ и Фн при участии АТФ-синтазы94
Синтез АТФ связан с конформационными изменениями активных центров АТФ-синтазы. Ротационный механизм действия фермента95
Циркуляция ионов через мембраны. Другие АТФазы99
Направление переноса электронов в ЭТЦ определяется редокс- потенциалом переносчиков 101
Организация ЭТЦ в мембране 102
Некоторые переносчики электронов являются общими для ЭТЦ всех типов 103
Глава 3. ФОТОСИНТЕЗ (В. Ф. Гавриленко, Т. В. Жигалова)
Фотосинтез как основа биоэнергетики 108
Космическая роль зеленого растения в трансформации вещества и энергии 108
Природа основных реакций и физико-химические основы фотосинтеза 109
История развития представлений омеханизме фотосинтеза 112
Структурная и биохимическая организация фотосинтетического аппарата 114
Лист — специализированный орган фотосинтеза в растении 114
Хлоропласты — центры фотосинтеза клеток растений 116
Основные принципы структурной организации хлоро пластов 116
Химический состав и физические свойства тилакоидных мембран 119
Биогенез хлоропластов 123
Пигментные системы фотосинтезирующих организмов 126
Пигментные системы как первичные фоторецепторы 126
Хлорофиллы 128
Основные элементы структуры и их значение в поглощении и преобразовании энергии.' 128
Метаболизм магнийпорфиринов 133
Фикобилины 137
Каротиноиды 139
Общая характеристика класса каротиноидов 139
Антенная функция каротиноидов; 140
Защитная функция каротиноидов 143
Фотопротекторная функция каротиноидов 143
Биосинтез каротиноидов 146
Функциональная организация пигментов в хлоропластах 148
Образование пигмент-белковых комплексов 148
Основные типы пигмент-белковых комплексов 150
Энергетическое взаимодействие пигментов в антенных комплексах и реакционных центрах 150
Первичные процессы фотосинтеза. Реакционные центры 153
Структурная и функциональная организация реакционных центров.... 153
Механизм преобразования энергии в реакционных центрах 159
Сравнительный анализ энергетической эффективности реакционных центров бактерий и высших растений 161
Электрон-транспортная цепь хлоропластов 163
Структурно-функциональная организация электрон-транспортной цепи хлоропластов 163
1.1. Компоненты ЭТЦ хлоропластов, их природа и физико-химические свойства 164
.1.2. Z-схема фотосинтеза. Нециклический, циклический, псевдоциклический транспорт электронов в хлоропластах 166
Функциональные комплексы ЭТЦ хлоропластов 168
Комплекс фотосистемы И. Механизмы фотоокисления воды и выделения молекулярногокислорода 168
Комплекс фотосистемы 1 173
Цитохромный б^-комплексхлоропластов 176
Пластохиноны — подвижные переносчики электронов ЭТЦ фотосинтеза 179
Кинетические закономерности работы ЭТЦ. Регуляция электронного транспорта 180
Кратковременная и долговременная адаптация хлоропластов к условиям освещения 180
Кинетические характеристики реакций переноса электронов в ЭТЦ 181
Механизмы регуляции электронного транспорта в хлоропластах 181
4.4. Фотоингибирование. Механизмы защиты растений от фотодеструкции в условиях высоких интенсивностей света 182
Фотоэнергетические реакции хлоропластов 184
Фотосинтетическое фосфорилирование. Основные типы, их физиологическое значение 185
Механизм сопряжения электронного транспорта с формированием трансмембранного градиента электрохимическогопотенциала 186
Структурно-функциональная организация и механизм работы АТФ-синтазного комплекса 188
Метаболизм углерода при фотосинтезе 190
С3-путь фотосинтеза (цикл Кальвина, ВПФ-цикл) 191
С4-путь фотосинтеза (цикл Хэтча—Слэка—Карпилова) 196
Метаболизм углерода по типу толстянковых (САМ-фотосинтез) 198
Фотодыхание 199
Экология фотосинтеза202
9.1. Влияние на фотосинтез интенсивности и спектрального состава света 202
Влияние на фотосинтез концентрации углекислого газа204
Влияние температуры на фотосинтез 204
Влияние водного режима на фотосинтез205
Фотосинтез как основа продуктивности растений205
Хлоропласты — источник ассимилятов и АТФ205
Донорно-акцепторные взаимодействия как фактор эндогенной регуляции фотосинтеза в системе целого растения207
Теория фотосинтетической продуктивности208
Глава 4. ДЫХАНИЕ РАСТЕНИЙ ( О. Г. Полесская)
Биохимические пути окисления глюкозы212
Структура метохондрий212
Глюкоза — основной субстрат дыхания у растений 212
Гликолиз — первый этап дыхания213
Синтез сахаров при обращении гликолиза 217
Образование восстановительных эквивалентов, АТФ и СО2 в цикле трикарбоновых кислот217
Особенность растительных митохондрий — присутствие малик-энзима220
Распад глюкозы регулируется ключевыми метаболитами и подчинен комплексной системе контроля222
Обмен метаболитами ЦТК между митохондриями и цитозолем 225
Конверсия жиров в углеводы. Глиоксилатный цикл227
Окислительный пентозофосфатный цикл232
Электронный транспорт и синтез АТФ в митохондриях растений233
Электрон-транспортная цепь дыхания. Перенос электрона от НАДН на кислород233
Комплекс I, или НАДН-дегидрогеназа. Электронный транспорт в комплексе сопряжен с генерацией ДЦщ237
Комплекс И, или сукпинатдегидрогеназа239
Комплекс III, или цитохром Ьс|-комплекс. Электронный транспорт в комплексе сопряжен с генерацией ДЦц+240
Комплекс IV, или цитохромоксидаза. Электронный транспорт в комплексе сопряжен с генерацией Дрн+243
Электронный транспорт сопряжен с синтезом АТФ245
Скорость электронного транспорта. Дыхательный контроль247
Разобщение электронного транспорта с фосфорилированием249
Альтернативные НАД(Ф)Н-дегидрогеназы251
Альтернативная оксидаза в митохондриях растений252
Энергия Дрн+ используется для транспорта метаболитов через внутреннюю мембрану митохондрий258
Клетка и активные формы кислорода261
Образование активных форм кислорода в процессе нормальной жизнедеятельности растительной клетки261
Антиоксидантные системы263
АФК защищает растение при внедрениипатогена267
Супероксидрадикал и перекись водорода действуют как сигнальные молекулы267
Дыхание в фотосинтезирующей клетке271
Дыхание целого растения273
Глава 5. ВОДА В ЖИЗНИ РАСТЕНИЙ (Я. Р. Мейчик, Ю. В. Балнокин)
Функции воды276
Относительное содержание воды в клетках — важный параметр водного обмена277
Классификация растений по их способности регулировать водный обмен277
Общие закономерности транспорта воды через мембраны растительных клеток280
Химический потенциал воды280
Осмотическое давление281
Осмотическое давление как функция концентраций растворенных веществ283
Водный потенциал284
Матричное давление285
Соотношение между осмотическим давлением и гидростатическим давлением в клетке286
Водные каналы мембран: аквапорины288
Поток воды в клетку291
Движение воды в целом растении292
Теория когезии и натяжения293
Движение водыв листьях итранспирация 294
Движение водыпо ксилемеи клеточным стенкам295
Движение воды в корне298
Движение водыиз почвы в корень 304
Регуляция транспорта водыв целом растении 304
Глава 6. МИНЕРАЛЬНОЕ ПИТАНИЕ (Н.Д. Алехина, Е. В. Харитонашвили)
Значение растений в циркуляции минеральных элементов в биосфере. Особенности минерального питания растений 306
Поглощение элементов минерального питания309
Корень — орган поглощения минеральных веществ 309
Рост корня как основа добывания веществ из почвы 310
Структурно-функциональные особенности корня и поглощение веществ 311
Поступление ионов из среды в клетку и корень 315
Поступление ионов в апопласт 315
Механизмы транспорта через мембрану319
Радиальный и дальний транспорт ионов по растению334
Пути радиального транспорта334
Движущие силы радиального транспорта ионов и загрузка ксилемы338
Дальний транспорт ионов341
Поглощение ионов интактным растением стационарного состояния... 346
Кинетика поглощения ионов интактным растением347
Модель корня и регуляция поступления ионов в интактном растении 349
Включение в обмен веществ и функции элементов минерального питания .. 353
Фосфор353
Характерные особенности фосфорного питания 353
Основные типы фосфорсодержащих соединений 354
Транспорт фосфата черезмембраны 354
Метаболизм фосфата 357
Ответные реакции растительного организма на дефицит фосфата 360
Азот361
Формы азота, используемыерастением 361
Поглощение и усвоение нитрата.. . 362
Поглощение и ассимиляцияаммония 368
Интеграция азотного метаболизма на уровне целого растения371
Сера375
Серосодержащие органические соединения375
Поглощение и транспорт сульфата376
Ассимиляторное восстановление сульфата376
Глутатион и его производные380
Кальций 383
Распределение Са2* в структурах клетки. Функциональное значение компартментации 383
Системы транспорта кальция384
Са2+ и системы внутриклеточной сигнализации 387
Калий 395
Системы транспорта К+ и их характеристика 395
Регуляция мембранного потенциала 396
Регуляция активности ферментов и синтез белка 398
Осморегуляция и катионно-анионный баланс399
Движения устьиц: транспорт ионов и регуляция401
3.6.1. Открывание устьиц 402
.3.6.2. Закрывание устьиц404
Хлор406
Магний 406
Железо408
Медь411
Марганец412
Молибден412
Цинк413
Бор414
Глава 7. РОСТ И РАЗВИТИЕ РАСТЕНИЙ (В. В. Чуб)
Общее представление о росте и развитии416
Параметры роста416
Кривая роста417
Дифференцировка418
Тотипотентность. Терминальная дифференцировка419
Периодизация индивидуального развития420
Гормональная система растений422
Общие принципы гормональной регуляции422
Регуляторные молекулы растений422
Рецепция и усиление сигнала423
Фосфатидилинозитольная система вторичных мессенджеров ... 424
Взаимодействие сигналов428
Ауксины — гормоны апекса побега429
История открытия ауксинов429
Биосинтез и деградация ауксинов431
Транспорт ауксинов431
Физиологические эффекты ауксинов434
Ауксины и неоднородность внешней среды437
Ауксин и плоды438
Ауксин как гербицид438
2.2.8. Гравитропизм438
Цитокинины — гормоны корневого апекса.439
История открытия439
Биосинтез и инактивация цитокининов440
Эффекты цитокининов от апекса корня до апекса побега442
Взаимодействие ауксинов и цитокининов443
Физиологическое действие ауксинов и цитокининов в культуре in vitro443
Баланс между ауксинами и цитокининами в интактном растении444
Цитокинины и паразиты растений445
Гиббереллины — гормоны листа446
История открытия446
Биосинтез гиббереллинов446
Основные физиологические эффекты гиббереллинов448
Гиббереллины и прорастание зерна449
Гиббереллин и проявление пола у растений451
Гиббереллин и цветение растений451
Абсцизовая кислота — сигнал водного стресса451
Открытие абсцизовой кислоты451
Биосинтез абсцизовой кислоты452
Передача АБК-сигнала454
АБК — гормон осмотического стресса455
Регуляция покоя семян АБК456
Синдром дефицита АБК457
АБК и форма листьев457
Этилен — сигнал механического стресса458
Открытие физиологической роли этилена458
Биосинтез этилена459
Рецепция и передача сигнала459
Этилен как гормон механического стресса461
Этилен и прикосновение461
Этилен и заживление ран461
Регуляция листопада в умеренных широтах462
Формирование и созревание плодов463
Биотический стресс464
Этилен и цветение ананасов465
Другие гормональные вещества растений467
Брассиностероиды467
Жасминовая кислота471
Салициловая кислота473
Олигосахарины475
Короткие пептиды476
Рецепция световых сигналов477
Принципы фоторецепции477
Фоторецепция в красной области спектра: фитохромная система479
История открытия фитохрома479
Фотоконверсия фитохрома. Фитохромы А и В480
Этиоляция и деэтиоляция482
Избегание тени483
Регуляция прорастания семян484
Внутренние часы и фитохромнаясистема485
Фоторецепция в синей области спектра: криптохром и фототропин.... 487
История изучения фоторецепции в синей области спектра487
Криптохром — рецептор синего света, локализованный в ядре и цитоплазме488
Фототропин — мембранный рецептор синего света490
Суперхром — «кентавр с головой фитохрома и туловищем фототропина»491
Регуляция роста и развития растений491
Эндогенные факторы развития491
Образование листьев491
Переход к цветению493
Образование цветка494
Влияние внешних факторов на рост и развитие497
Пищевые ресурсы экотопа. Регуляция цветения элементами минерального питания497
Фотопериодизм и климатические факторы498
Фотопериодизм499
История открытия фотопериодизма499
Опыты М.Х.Чайлахяна501
Гормональная теория цветения Чайлахяна502
Термопериодизм. Стресс-периодизм505
Сезонная специализация растений505
Термопериодизм: стратификация и яровизация506
4.4.3. Опыты М.Х.Чайлахяна507
Стресс-периодизм508
Глава 8. РАСТЕНИЯ В УСЛОВИЯХ СТРЕССА (ТО. В. Балнокин)
Стратегии приспособления растений к действию стрессоров 510
Водный дефицит512
Понижение водного потенциала растительных клеток как стратегия избежания обезвоживания513
Осмолиты514
Свойства и функцииосмолитов514
Биосинтез некоторых наиболее распространенных осмолитов 517
Белки, образующиеся в клетках растений при дегидратации523
Lea-белки523
Шапероны и ингибиторы протеаз525
Протеазы и убиквитины525
Аквапорины..525
Защитные и регуляторные функции белков, индуцируемых водным дефицитом 526
Регуляция экспрессиигенов,индуцируемых воднымдефицитом527
Рецепция сигнала 527
Солевой стресс 530
Повреждающее действие солейj531
1. Эффекты, проявляющиесяна клеточномуровне531
Эффекты, проявляющиеся на уровне целого растения532
Адаптации, противодействующие осмотическому эффекту солей533
Ионное гомсостатированис цитоплазмы растительной клетки как стратегия избежания токсического действия солей533
Поступление Na+ и СГ в клетки корня из почвенного
раствора537
Транспортные белки плазматической мембраны, вовлеченные в перенос Na+ и СГ из наружной среды в цитоплазму539
Экспорт Na иСГ из цитоплазмы541
3.3.4. K+/Na+-ceлeктивнocть — индикатор солеустойчивости растений 544
Интеграция клеточных механизмов устойчивости к водному дефициту и высоким концентрациям солей в защитную систему целого растения545
Регуляция генов устойчивости кNaCl548
Различия между гликофитами игалофитами550
Изменения температурных условий552
Поддержание метаболической активности и структурной целостности биополимеров при изменении температурных условий552
Компенсация температурных эффектов путем изменения свойств ферментов553
Компенсация температурных эффектов путем изменения внутриклеточного содержания ферментов555
Термофильные бактерии — модель для изучения механизмов термостабильности555
Роль белков теплового шока в акклимации растений к высоким температурам556
Температурозависимые модификации липидного бислоя мембран558
Энергия активации ферментативных реакций, протекающих в мембранах562
Устойчивость растений к замораживанию564
Дегидратация клеток как механизм, предотвращающий внутриклеточное образование льда564
Последствия обезвоживанияклеток565
Механизм переохлаждения 567
Биологические антифризы569
Анатомические барьеры 570
Роль белков холодового шока в акклимации растений к замораживанию570
Механизмы терморегуляцииу растений 571
Теплопродукция придыхании571
Теплопродукция призамораживании572
Кислородный дефицит572
Анатомо-морфологические особенности, позволяющие растениям поддерживать аэробный обмен в условиях дефицита кислорода573
Активирование анаэробного метаболизма в условиях дефицита кислорода 574
Акклимация растенийк аноксии 577
Изменения в экспрессии генов при переходе от аэробного метаболизма к гликолизу577
В процесс образования аэренхимы при дефиците О2 вовлечен растительный гормон этилен579
Окислительный стресс579
Повреждения биомолекул активными формами кислорода580
Повреждения липидов580
Повреждения нуклеиновых кислот581
Повреждения белков582
Детоксикация продуктов окислительной модификации биомолекул583
Атмосферный озон вызывает окислительныйстресс в растениях584
Глава 9. ВТОРИЧНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ (Л. М. Носов)
Общая характеристика вторичных метаболитов588
Признаки вторичных метаболитов589
Принципы классификации вторичных метаболитов 591
Основные группы вторичных метаболитов 592
Закономерности строения вторичных метаболитов 593
Фитохимия вторичного метаболизма593
Алкалоиды — азотсодержащие вторичные метаболиты593
Изопреноиды (терпеноиды)596
Фенольные соединения (растительные фенолы)599
Минорные группы вторичных метаболитов602
Биохимия вторичного метаболизма604
Пути биосинтеза вторичных метаболитов604
Энзимология вторичного метаболизма611
Физиология вторичного метаболизма611
Локализация вторичных метаболитов в растении611
Изменение вторичного метаболизма в онтогенезе растений614
Функции вторичных метаболитов614
Список литературы620
Учебное издание
Алехина Наталия Дмитриевна,
Балнокин Юрий Владимирович,Гавриленко Вероника Феодосьевна и др.
Физиология растений
Учебник
Редактор Г. Г. Есикова
Технический редактор Н. И. Горбачева
Компьютерная верстка: Л. А. ВишняковаКорректоры: В. А. Жилкина, Г. Н. Петрова
Диапозитивы предоставлены издательством.
Изд. № А-1086-1. Подписано в печать 24.12.2004. Формат 70х 100/16.
Бумага тип. № 2. Печать офсетная. Гарнитура «Таймс». Усл. печ. л. 52,0.
Тираж 5100 экз. Заказ №14300.
Лицензия ИД № 02025 от 13.06.2000. Издательский центр «Академия».
Санитарно-эпидемиологическое заключение № 77.99.02.953.Д.004796 07.04 от 20.07.2004. 117342, Москва, ул. Бутлерова, 17-Б, к. 360. Тел./факс: (095)330-1092, 334-8337.
Отпечатано на Саратовском полиграфическом комбинате.
410004, г. Саратов, ул. Чернышевского, 59.
качестве конвертируемой формы энергии используется трансмембранный градиент ионов
Высшее профессиональное образование
ФИЗИОЛОГИЯ
РАСТЕНИЙ
academia
ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ
ФИЗИОЛОГИЯРАСТЕНИЙ
Под редакцией проф. И. П. ЕРМАКОВА
Допущено
Министерством образования Российской Федерации в качествеучебника для студентов высших учебных заведений, обучающихсяпо биологическим специальностям и направлению 510600 «Биология»
Москва
"^8Т]
ACADEMA
УДК 581.1(075.8)
ББК 28.57я73
Ф504
Авторы:
Н.Д.Алехина, Ю. В. Балнокин. В. Ф. Гавриленко, Т. В.Жигалова, Н.Р.Мейчик,А. М. Носов, О. Г. Полесская, Е. В.Харитонашвили, В. В. Чуб
Рецензенты:
проф В. В. Кузнецов (зав. кафедрой ботаники, физиологии растенийи агробиотехнологии Университета дружбы народов);
проф. С. С. Медведев (зав. кафедрой физиологии и биохимии растенийСанкт-Петербургского государственного университета)
Физиология растений: Учебник для студ. вузов / Н.Д.Алехина, Ф504 Ю. В. Балнокин, В. Ф. Гавриленко и др.; Под ред. И. П. Ермакова. — М.: Издательский центр «Академия», 2005. — 640 с.
ISBN 5-7695-1669-0
В учебнике на современном уровне дано описание физиологических функций и механизмов их регуляции в онтогенезе целого растения и его взаимодействии с факторами среды. Изложены особенности строения и работы растительной клетки, обсуждены вопросы регуляции поступления и реализации функций элементов минерального питания на разных уровнях структурной организации растений. Рассмотрены физико-химические закономерности формирования движущих сил и механизмы транспорта воды в растении. Рост и развитие растений представлены с позиций современной физиологии, молекулярной биологии и генетики.
Для студентов биологических специальностей вузов. Может быть полезен специалистам, работающим в различных областях экспериментальной ботаники.
УДК 581.1(075.8)
ББК 28.57я73
Оригинал-макет данного издания является собственностьюИздательского центра «Академия», и его воспроизведение любым способомбез согласия правообладателя запрещается
© Коллектив авторов, 2005
ISBN 5-7695-1669-0ISBN 5-7695-1669-0© Издательский центр «Академия», 2005
ISBN 5-7695-1669-0
ISBN 5-7695-1669-0