Книга
← К списку книгЗагрузка разделов…
активнаАктивные записи участвуют в каталоге и синках. Неактивная книга скрыта, но не удалена из базы.
Книга
Предисловие редактора перевода
Спектроскопия ЯМР высокого разрешения как наиболее информативный и мощный метод структурных и динамических исследований столь глубоко пронизывает все химические дисциплины, что без овладения ее основами нельзя рассчитывать на успех в работе в любой области химии. Поразительная особенность этого метода-необычайно быстрое его развитие на протяжении всех последних 45 лет с момента открытия ЯМР в 1945 г. События последних 10 лет завершились полным обновлением методического арсенала и аппаратуры ЯМР. Основу приборного парка сейчас составляют спектрометры, оснащенные мощными сверхпроводящими соленоидальными магнитами, позволяющими создавать постоянные и очень однородные поля напряженностью до 14,1 Т. Каждый из таких приборов представляет собой сложный измерительно-вычислительный комплекс, содержащий помимо магнита и радиоэлектронных блоков один или два компьютера, обладающие высоким быстродействием, большими объемами оперативной памяти и дисками огромной емкости. Импульсные методики возбуждения и регистрации сигналов с последующим быстрым фурье-преобразованием окончательно вытеснили режим непрерывной развертки, доминировавший в ЯМР до конца 70-х годов. Как правило, получаемая спектральная информация перед ее отображением в виде стандартного спектра подвергается сложной математической обработке. На несколько порядков возросла чувствительность приборов. Методы двумерной спектроскопии и другие методики, реализующие сложные импульсные последовательности при возбуждении систем магнитных ядер, кардинально изменили весь методический арсенал исследователей и открыли перед ЯМР новые области применений. Эти новые и новейшие достижения уже нашли свое отражение в нескольких монографиях, появившихся за рубежом и в переводах на русский язык. Но они рассчитаны на специалистов с хорошей физико-математической подготовкой. Между тем подавляющее большинство химиков-экспериментаторов не обладают такой подготовкой. Более того, для практического приложения современного ЯМР вполне Достаточно ясного понимания лишь основных физических принципов поведения ансамблей магнитных ядер при воздействии радиочастотных полей. Это понимание обеспечивает химику правильный выбор метода
или совокупности методов при решении многих структурных задач. Книга Э. Дероума представляет, на мой взгляд, весьма удачную попытку изложить современные методы ЯМР в таком практическом аспекте на качественном уровне. В ней автор очень умело воспользовался наглядными графическими схемами, позволяющими легко понять эволюции векторов намагниченностей в спиновой системе под воздействием импульсных последовательностей. В книге, богато иллюстрированной конкретными примерами спектров всех видов, подробно рассмотрено влияние разных экспериментальных факторов на результирующий спектр, а также весьма типичные ошибки, возникающие в практической работе. Поэтому такие непростые понятия, как перенос намагниченности и перенос когерентности, обретают совершенно реальный смысл даже для слабо подготовленного читателя, хотя и приходится мириться с некоторой долей вульгаризации. Я думаю, что тот, кто решил воспользоваться книгой Э. Дероума в качестве практического руководства для освоения современных методик ЯМР, не ошибся в выборе. Она быстро станет настольным руководством в каждой лаборатории ЯМР и вполне может быть использована как лекционный материал для студентов старших курсов и аспирантов.
Ю. Устынюк
Предисловие автора
Впервые открыв эту книгу и раздумывая, покупать ли ее, вы, возможно, спросите себя: «А зачем мне усложнять себе жизнь?». Ведь в ней много внимания уделяется физическим основам эксперимента ЯМР, хотя и делается это на качественном уровне. Такой подход может испугать химика или биолога. Здесь много экспериментальных деталей, которые могут показаться лишними тому, кто привык доверять специалистам решение спектральных проблем. Даже многие из тех, кто наслышан о последних достижениях метода ЯМР, часто получают больше удовольствия, занимаясь вопросами интерпретации и доверяя технические детали кому-то другому. На основании целого ряда соображений я считаю, что подобное отношение к методу ЯМР как к «черному ящику» нельзя считать правильным при решении химических и биологических задач. Подробное описание того, что содержится в этой книге, приведено в первой главе.
Почему ЯМР является столь полезным методом? Это вызвано многими причинами, но главная из них в том, что метод ЯМР позволяет устанавливать взаимосвязи между конкретными объектами. Высокая информативность, определяемая большим диапазоном химических сдвигов и интенсивностей сигналов, имеет по существу общий характер для остальных спектральных методов, в том числе для ИК-спектро- скопии. В этом отношении ЯМР не имеет больших преимуществ. Его особая ценность обусловлена тонкой структурой спектра, возникающей за счет взаимодействия между ядрами, а также различными другими взаимодействиями, такими, как ядерный эффект Оверхаузера, зависящий от взаимного расположения ядер. Если мы хотим охарактеризовать структуру выделенного чистого соединения, оценить протон-протонные расстояния в белке или выделить сигнал меченого метаболита из сложной природной смеси, то должны обратиться к тем свойствам, которые основаны на взаимодействии одного ядра с другим.
Исключительные достоинства импульсного ЯМР полностью раскрылись за последние примерно 10 лет, что привело к развитию ряда совершенно новых способов использования этих взаимосвязей. На первый взгляд один только перечень новых экспериментов может обескуражить. Этих экспериментов так много, что кажется невозможным хоть
как-то начать их понимать. Однако это не так сложно. В разных сочетаниях для этого используется несколько основных принципов. Если усвоить эти принципы, то любой новый эксперимент может быть легко встроен в общую картину. Это важная причина для того, чтобы попытаться понять, что же происходит во время импульсных экспериментов. Вы сможете оценить, на самом ли деле какой-то новый метод лучше подходит для решения вашей конкретной задачи. Важным свойством импульсного ЯМР является то, что в целом его легче понять, чем ЯМР с непрерывной разверткой, даже несмотря на то, что последний метод может быть хорошо знаком. В импульсном эксперименте система большую часть времени совершает эволюцию независимо от внешнего воздействия, поэтому здесь одновременно нужно учитывать меньшее число взаимодействий.
Современный импульсный эксперимент ЯМР выполняется исключительно в режиме с фурье-преобразованием. Вопрос о том, почему это так, детально рассматривается в этой книге, но сам факт столь широкого использования метода Фурье заставляет лишний раз задуматься о природе экспериментов ЯМР. Несомненна польза от реализации этого метода. Особенно эффективные результаты могут быть получены при использовании преобразования в пространстве более чем одной переменной. Важно при этом понимать и те ограничения, которые характерны для цифровой обработки сигналов. Оцифровка сигналов и их преобразование с помощью компьютера часто ограничивают точность измерений частоты и интенсивности, а в отдельных случаях могут даже делать невозможной одновременную регистрацию сигналов. В целом это нетрудно понять, но вопрос носит несколько абстрактный характер для тех, кто только начинает знакомство с методом фурье-спектро- скопии ЯМР. Даже если вы не собираетесь сами садиться за спектрометр, то вам целесообразно хотя бы бегло ознакомиться с тем, как ^связаны между собой следующие параметры: время регистрации и разрешение или интервал между импульсами, время релаксации и интенсивность сигнала. При использовании современного метода ЯМР много ошибок происходит из-за непонимания возникающих при этом ограничений.
Другая причина, по которой стоит изучать ЯМР, особенно его практические аспекты, заключается в том, что это просто приятно. Многие химические, а в последнее время и биологические проекты в своей кульминационной стадии оказываются завязанными на эксперимент ЯМР. После года упорной работы над синтезом какого-то меченого субстрата может потребоваться лишь несколько дней для того, чтобы провести решающий эксперимент методом ЯМР, с помощью которого может быть установлен механизм органической реакции или найден путь метаболизма внутри живой клетки. И несправедливо передавать специалисту-оператору не только хлопоты, но и радостные волнения при проведении такого эксперимента: учитесь делать это сами. Конечно, определенные усилия придется затратить для начального
ознакомления со спектрометром. Вас ждет несколько бессонных ночей, пока вы наконец не получите хоть какого-то удовлетворения. Придется изо всех сил поработать и для того, чтобы понять саму суть экспериментальной техники ЯМР. В итоге вы приобретете глубокое понимание наиболее важного спектрального метода, а заодно получите заряд бодрости и сделаете полезный перерыв в однообразной рутине лабораторной жизни.
Многие помогали мне в подготовке этой книги, и я выражаю им свою благодарность. Я приношу искренние извинения всем тем, кого по недоразумению не отметил. В первую очередь я признателен Джейн Макинтайр за первоначальное уведомление меня о том, что проект стал возможен. Некоторые мои коллеги из Лаборатории Дайсона Перринса и Лаборатории неорганической химии прочитали текст и сделали много полезных замечаний. Среди них есть и студенты-дипломники, и операторы ЯМР, и инженеры по электронике, и университетские лекторы, и дипломированные научные сотрудники. Я благодарен Барбаре До- мейн-Хейман, Элизабет Макгиннесс, Дермоту О’Харе, Майку Робертсону, Майку Робинсону, Крису Шофилду и Нику Тернеру. Особенно я признателен Элизабет Макгиннесс и Тине Джексон, которые вынесли основную нагрузку по обеспечению потребностей в ЯМР сотен исследователей из многочисленных химических подразделений Оксфорда, что дало мне возможность сосредоточиться на работе над текстом. Майк Робертсон провел значительную модификацию коммерческого спектрометра для некоторых из наиболее необычных экспериментов, а Тина Джексон осуществляла техническую помощь.
Многие исследователи предоставили мне рисунки и химические соединения для проведения вспомогательных экспериментов. Я благодарен Джону Брауну (рис. 9.6 и 9.7), Джорджу Флиту (соединение 1 в гл. 8-10), Нику Тернеру (соединение 6 в гл. 5) и Робу Янгу (соединение 6 в гл. 8) из Лаборатории Дайсона Перринса (Оксфорд); Дермоту О’Харе (рис. 8.45, 9.10 и 10.11) из Лаборатории неорганической химии (Оксфорд); Крису Бауэру (рис. 7.19), Рею Фримену (рис. 8.21) и Питеру Хору (рис. 2.23) из Лаборатории физической химии (Оксфорд); Джонатану Бойду (рис. 8.36) с Биохимического факультета (Оксфорд); Джеймсу Килеру (рис. 8.24 и 10.13) из университетской химической лаборатории (Кембридж); Дине Кеглевич (соединение 2 в гл. 8) из Института Рудера Бошковича (Загреб). Фирмы Oxford Instruments и Bruker Spectrospin также предоставили большое число рисунков (я выражаю им благодарность в соответствующих подписях). Рис. 5.10 воспроизводится с разрешения из книги: Noggle J. Н„ Schirmer R. Е., The Nuclear Overhauser Effect-Chemical Applications, Academic Press, 1972.
Как и другие книги серии «Органическая химия», этот текст подготовлен к печати методом фотокопирования с шаблона. Для того чтобы достичь наивысшего качества, я сам набирал текст с помощью устройства Monotype Lasercomp в службе компьютерного сервиса Оксфордского университета. Я признателен этой службе за предостав-
ленную возможность работать с таким устройством и Кэтрин Гриффин за ценные рекомендации по его использованию. Кристин Палмер из Лаборатории неорганической химии (Оксфорд) превосходно выполнила графические работы с моих едва разборчивых эскизов, причем зачастую с высокой скоростью; я благодарю ее за столь существенную помощь. Окончательное размещение текста выполнено в «Пергамон-пресс» под руководством эксперта Колина Дрейтона, который нашел возможность не огорчать меня даже в тот момент, когда весь проект на месяц отставал от графика.
Эндрю Дероум
С появлением в 50-х годах промышленных ЯМР-спектрометров высокого разрешения химики получили в руки новый исключительно мощный аналитический инструмент. Структура и симметрия молекул прямо связаны с видом спектра, что позволяет легко и быстро решать такие структурные задачи, которые раньше были под силу лишь немногим ученым, обладающим высоким интеллектом и химической интуицией. В те годы на все исследования, проводимые на спектрометре с мощным электромагнитом или постоянным магнитом, требовалось лишь 100 мг вещества.
Еще один переворот в области ЯМР происходит в наши дни. Он обусловлен внедрением надежных сверхпроводящих магнитов совместно с импульсными методиками и преобразованием Фурье. Разрешение и чувствительность приборов выросли настолько, что исследования можно проводить на микрограммовых количествах вещества. Но, возможно, еще более важное значение имеет развитие импульсных методик, позволяющих в небывалой степени контролировать намагниченность образца и управлять ею. В результате с помощью импульсной спектроскопии ЯМР химики получают, вероятно, более обширную структурную информацию, чем с использованием любого другого отдельно взятого аналитического метода.
В этой книге Э. Дероум знакомит химиков с практическими аспектами новых методов ЯМР. С ее помощью любой химик, не имеющий специальной подготовки физика-спектроскописта, сможет понять и использовать для решения структурных задач огромные возможности, заложенные в новом поколении фурье-спектрометров со сверхпроводящими магнитами. Я настоятельно рекомендую прочитать эту книгу химикам и биологам, работающим как в научных учреждениях, так и в промышленности, чтобы в полном объеме овладеть новыми возможностями спектроскопии ЯМР.
Джек Болдуин член Королевского обществаДжек Болдуин член Королевского обществаЛаборатория Дайсона Перринса
Джек Болдуин член Королевского общества
Джек Болдуин член Королевского общества
Оксфордский университет
Введение
Сигналы ЯМР отражают влияние целого ряда слабых взаимодействий между ядрами и электронами внутри молекулы, между различ- нымй ядрами одной молекулы и между ядрами соседних молекул. Если бы мы смогли различить и понять природу всех этих взаимодействий, то получили бы чрезвычайно богатый источник информации о структуре и конформации молекул, о межмолекулярных взаимодействиях и молекулярном движении.
Все это становится возможным благодаря очень большим временам релаксации, свойственным ядрам со спином 1/2 в подвижных жидкостях. Действительно, спектры с сигналами шириной 0,1 Гц или меньше на частоте 500 МГц кажутся просто невероятными. Ведь это означает, что мы можем различать даже сигналы, расположенные очень близко друг к другу.
Спектры высокого разрешения даже небольших молекул часто оказываются весьма сложными. Но упоминавшиеся выше взаимодействия являются слабыми, поэтому описывающие их перекрестные члены при измерениях в сильных магнитных полях становятся малыми. В результате получающиеся спектры интерпретируются достаточно легко, поэтому неудивительно, что спектроскопия ЯМР стала столь незаменима для химиков-органиков. -
С увеличением размеров молекул сложность спектров ЯМР быстро возрастает, сигналы начинают перекрываться, и в результате интерпретация спектров затрудняется. В этом случае приходится прибегать к гораздо более сложной последовательности экспериментов, и перед химиком-органиком возникает вопрос: насколько глубоко ему следует изучать технические аспекты современного ЯМР? Важно понимать, что, не освоив новых методов спектроскопии ЯМР, химик не будет даже представлять себе, каким же образом спектроскопия ЯМР может помочь ему решить конкретную структурную задачу. Не следует использовать ЯМР как некий «черный ящик», производящий непонятные операции.
Большинству химиков-органиков сегодня просто необходимо знать возможности современной спектроскопии ЯМР. В этой книге д-р Э. Дероум описывает основные принципы и способы практического использования ЯМР на понятном для химиков языке. Несмотря на
большой объем книги, ее все же стоит прочитать. Она окажет существенную помощь в работе тем, кто внимательно ее изучит. Я также надеюсь, что читатели получат большое удовольствие от энтузиазма, пронизывающего весь текст книги. Тем же, кто захочет получить более глубокие знания об описываемых экспериментах, помогут приводимые в книге ссылки на литературу.
Рекс Ричардс
член Королевского общества Оксфордский университет
Глава 1
О чем эта книга
Введение
На рис. 1.1 показан протонный спектр ЯМР холестерилацетата, зарегистрированный на спектрометре с непрерывной разверткой и с рабочей частотой 60 МГц. В 60-е годы и в начале 70-х годов было исследовано много соединений подобного типа. Тогда такой спектрометр считался прибором высшей категории для научных исследований. Даже такие грубые спектры произвели настоящую революцию в органической химии, что является прекрасной иллюстрацией больших возможностей ЯМР в решении химических задач и доблести первых исследователей, применявших этот метод.
В настоящее время мы вправе ожидать много большего от наших спектрометров (рис. 1.2), рабочие частоты которых почти в 10 раз больше, но и стоимость по крайней мере в 30 раз выше. Очевидно, что
Рис. 1.1. Спектр ЯМР, зарегистрированный на спектрометре с рабочей частотой 60 МГц в режиме непрерывной развертки.
Рис. 1.2. Спектр того же образца (см. рис. 1.1), записанный на фурье-спектро- метре с рабочей частотой 500 МГц.
спектр на рис. 1.2 лучше, однако я хочу подчеркнуть вовсе не это. Этот спектр все же недостаточно хорош. Внутренние ограничения ЯМР таковы, что, несмотря на все наши усилия по улучшению конструкции спектрометра, мы не можем интерпретировать протонные спектры даже относительно простых соединений «с первого взгляда». Такое положение сохранится и в обозримом будущем, если только не будет найдена совершенно новая конструкция магнита. Вспомним, например, что резкий скачок напряженности поля в 3-4 раза произошел при переходе от электромагнитов к сверхпроводящим магнитам. Но дальнейшие усилия по совершенствованию конструкции сверхпроводящих магнитов на протяжении почти 20 лет привели к увеличению напряженности поля только в 2 раза.
Одни лишь успехи в создании новых приборов не смогли бы обеспечить решение наших спектроскопических задач. Но, к счастью, одновременно с совершенствованием спектрометров ЯМР необычайно быстро развивались и наши знания о свойствах ядерных спиновых систем. Примерно в 1980 г. была достигнута некая критическая точка
в накоплении этих знаний, что привело к быстрой разработке целого ряда новых экспериментальных методик. Почти каждый химик-исследователь сейчас определенно наслышен о том, что в ЯМР произошло что-то необычное. Однако круг тех, кто действительно понимает суть событий, еще достаточно узок. Большинство статей по ЯМР имеет техническую направленность. Они появляются в самых разных и иногда необычных химических, физических и биологических журналах, поэтому неспециалисту трудно быть в курсе самых современных достижений. В курсах по спектроскопии ЯМР для химиков-органиков импульсная фурье-спектроскопия ЯМР до сих пор иногда остается лишь дополнением к методу ЯМР с непрерывной разверткой. Современные методы ЯМР в них почти никогда не рассматриваются. Так дальше оставаться не может, потому что понимание того, как использовать ЯМР для решения тех или иных проблем, составляет основу успеха в химических исследованиях.
Я стремился дать введение в современный ЯМР в такой доступной для неспециалиста форме, чтобы в книге можно было найти все необходимое. Конечно, для работы с ней нужны знания основ, о которых сказано в следующем разделе. Книга рассчитана на заинтересованного студента или начинающего научного работника. Она будет полезна и более опытным химикам, желающим познакомиться с новыми методиками ЯМР. В ее основу положен краткий курс лекций для аспирантов, который я читал в Оксфорде. Правда, в этом курсе не содержалось экспериментальных деталей и описания ряда методик. Я надеюсь, что основное содержание книги будет понятно для студентов старших курсов. Сейчас студентов редко учат применению современных методик ЯМР. Однако это лишь означает, что мы не поспеваем за событиями, и совсем не связано с чрезвычайной концептуальной сложностью предмета.
Что вам нужно знать
Я полагаю, что вы уже сталкивались с «традиционным» ЯМР и близко знакомы с использованием протонного магнитного резонанса ' (ПМР) для решения структурных задач. В связи с этим книга не содержит разделов о связи химических сдвигов или констант спин-спино- вого взаимодействия (КССВ) со структурой, так как эту информацию легко найти в других книгах и учебниках, но не только поэтому. Более важно то, что современные эксперименты ЯМР могут уменьшить нашу зависимость от таких эмпирических корреляций. До сих пор мы чаще всего ограничивались формулировками типа: «Спектр находится в соответствии со структурой X». Наша цель состоит в том, чтобы перейти к формулировкам: «Доказательство структуры X следует из...». Я ^ надеюсь, что вам знаком метод двойного протон-протонного резонанса, , представляющий собой подавление спин-спинового взаимодействия между протонами (гомоядерная развязка). Этот метод несколько раз
упоминается в тексте, но детально не объясняется. Вы могли также встречаться с ядерным эффектом Оверхаузера, ЯЭО (NOE, от англ. Nuclear Overhauser Effect), которому в книге посвящена гл. 5.
Что касается других ядер, то вам должно быть известно о возможности наблюдения ядра 13С и о трудностях регистрации спектров вследствие низкого естественного содержания этого изотопа. Если вы использовали в работе углеродные спектры, то в таком случае вы должны были встречаться и с экспериментами с внерезонансной развязкой, которые дают возможность определить число протонов, связанных с каждым из углеродов. Химики-неорганики или биологи в большей степени используют спектры 31Р. Ваш предварительный опыт в этой области не столь важен, так как изложение материала в книге в равной мере относится ко всем типам ядер. Примеры часто будут привлекаться из протонной и углеродной спектроскопии, поскольку я чаще всего использую их в своей работе на кафедре органической химии. Существенными являются различия между ядрами со спином 1/2 и ядрами с большим спином (квадрупольные ядра). Обсуждение большинства вопросов в этой книге концентрируется вокруг ядер со спином 1/2, но в некоторых случаях рассматриваются и квадрупольные ядра.
Время от времени мы будем использовать простую математику, но это не должно вызывать боязни, так как она не существенна для понимания материала. Эта книга написана не для физикохимиков, в ней нет выводов уравнений или детального математического анализа, но приводятся отдельные действительно полезные формулы. Физическая модель, введенная в гл. 4, требует знания основ тригонометрии и декартовых координат. В нескольких местах также используются уравнения скорости первого порядка, но более трудных математических вычислений нет, за исключением небольших по объему векторных вычислений в гл. 4, которые можно опустить без ущерба для понимания. В одном или двух местах потребуется понимание таких компьютерных терминов, как «память» или «байт».
Что вы найдете в этой книге
Эта книга не является полным обзором современных методов ЯМР. Любая попытка включить такой обзор в текст ограниченного объема не оставила бы возможностей для объяснений или примеров. Вместо этого я решил рассмотреть несколько типичных экспериментов, чтобы продемонстрировать принципы современного ЯМР и его некоторые практические аспекты. При описании новых экспериментов я попытался прежде всего показать их физический смысл и пояснить их в той мере, в какой это возможно без применения математики. Некоторые считают, что следует избегать такого подхода, поскольку он не является определенным и информативным. Но это дело личного вкуса, поэтому я надеюсь, что вы отнесетесь ко мне с должной терпимостью, если вам
иногда покажется, что я слишком упрощаю объяснения или провожу физические аналогии слишком далеко.
Начальной точкой для наших рассуждений должно быть введение в методы Фурье (гл. 2). Несмотря на то что они широко используются уже много лет, химики все еще имеют слабое представление об их достоинствах и ограничениях. Еще недавно можно было мириться с этой ситуацией, хотя она уже была далека от идеальной, поскольку в простых рутинных одномерных спектрах мы редко встречаемся с ограничениями метода Фурье. Но положение в корне меняется для двумерных экспериментов, которые описаны в гл. 8-10. Велико искушение пренебречь техническими аспектами спектроскопии ЯМР, особенно когда кажется, что математический смысл их не вполне ясен. Но в этом случае нужно себя перебороть. Спектроскопия ЯМР столь важна для химиков, что мы не можем пользоваться ею в качестве «черного ящика».
При обсуждении импульсных экспериментов нам потребуется некоторая модель для их описания. Наглядный способ описания дан в гл. 4. Большая часть содержания книги требует знания материала гл. 2 и 4, поэтому эти главы необходимо прочитать первыми. Остальные главы не так сильно связаны друг с другом. Гл. 5 посвящена только ядерному эффекту Оверхаузера. В гл. 6 идея переноса поляризации изложена сначала на частном примере, а затем развита в более общей форме в гл. 8 и 9. Общее представление о двумерном ЯМР вводится в первой части гл. 8. Эта часть является необходимым введением в последние три главы. Рассуждения о методиках двумерной спектроскопии с преобразованием Фурье отдельно от их приложений выглядят абстрактными, поэтому в гл. 8 также разбирается один из типов двумерного эксперимента -гомоядерная корреляционная спектроскопия. Гл. 9 посвящена гетероядерной корреляционной спектроскопии, а в гл. 10 описаны различные эксперименты, в которых имеют дело с мультиплетной структурой (J-спектроскопия).
Две оставшиеся главы (3 и 7) посвящены экспериментальным методикам. Я думаю, что очень важно уметь запасаться опытом экспериментальной работы с ЯМР всякий раз, когда для этого появляется возможность. Тогда достаточно сухие и абстрактные рассуждения приобретают совершенно другую окраску. Тот, кто сам постоянно работает на импульсном фурье-спектрометре, без большого труда может понять важность цифрового разрешения, времени регистрации данных, функций фильтра и т. п. Невозможно дать исчерпывающее руководство по всему экспериментальному ЯМР [1] в двух главах, поэтому я вынужден был провести отбор материала. Я сознаю, что мой выбор может показаться довольно странным. Он основан на моих личных наблюдениях за многими исследователями, которые начинали осваивать спектрометры с высокими магнитными полями, и на анализе тех трудностей, с которыми сталкивались такие новички.
Я включил изложение основ экспериментальной техники в первую часть гл. 3, так как часто имел возможность наблюдать, как многие
новички на чрезвычайно дорогом и трудно доступном спектрометре начинали измерять спектр образца, который непригоден даже для спектрометра на 60 МГц. Высокочастотные спектрометры ЯМР являются высокопрецизионными приборами, и образцы для них должны быть тщательно приготовлены. Большая часть гл. 3 посвящена методическим трудностям, связанным с разрешением и чувствительностью. В этой главе также дано критическое обсуждение тестов, используемых для проверки работы спектрометра. Я надеюсь, что оно будет полезно всякому, кто собирается покупать прибор.
В гл. 7 приводится дополнительная информация об экспериментальных методах. Новички быстро сообразили, что даже полное понимание теории гетероядерной корреляционной спектроскопии не приносит пользы, если экспериментатор не может измерить ширину импульса в канале развязки. Навыки таких экспериментов до сих пор передаются изустно. Собрав вместе несколько простых процедур, я попытался создать более доступное описание этих новых экспериментов. В гл.7 также рассказано о том, каким образом выбрать экспериментальные параметры для получения оптимальной чувствительности или количественных результатов. В ней также описаны различные процедуры, такие, как подавление сигналов, составные импульсы и селективное возбуждение, которые не вошли в другие главы, но заслуживают рассмотрения.
Что можно сделать с помощью ЯМР
Многие книги по спектроскопии включают главу по «способам решения задач» или подборки типичных спектров и задач. Несмотря на то что в книгу включено множество примеров, я совершенно намеренно уклонился от попытки подробно рассказать вам, что делать с новым экспериментом. Для этого существуют две причины. Первая полностью личного характера: я понял, что сам никогда не читаю подобные разделы в других книгах. Ведь спектральные проблемы либо тривиальны (в этом случае они неинформативны), либо требуют столь больших усилий, что большинство людей не будет в них вникать. Чтобы вы должным образом заставили работать свой мозг, вам нужен стимул. Изучаемое соединение должно быть творением ваших рук. Однако эта причина не столь важна, как вторая.
К настоящему времени многие новые эксперименты не используются настолько долго, чтобы судить об их полезности. Мой собственный взгляд на это, естественно, обусловлен личным опытом - типом соединений, которые мне приходилось изучать, и тем оборудованием, которым я располагал для работы. Это последнее обстоятельство особенно важно. Если бы вы спросили меня в прошлом году: «Что вы думаете о трехквантовой фильтрации?», то я бы ответил так: «Я не знаю, мы не получили достаточно хорошего фазовращателя». В этом году мой ответ звучал бы так: «Кажется работает, но мы еще не решали этим методом реальных задач». И кто знает, как я отвечу в следующем году. Моя
позиция состоит в том, что я не хочу навязывать вам мои сегодняшние идеи относительно быстро развивающегося предмета. Намного важнее развить у вас достаточное понимание предмета для того, чтобы вы сами были в состоянии оценить вашу позицию.
Говорят, что стоит попытаться обрисовать перспективу последних достижений в области ЯМР. Применение спектроскопии ЯМР охватывает очень широкий круг задач: с простого определения структуры к исследованию конформаций ферментов в растворе и далее к мониторингу метаболизма in vivo и медицинской диагностике. Несмотря на все это разнообразие, фактически существует всего несколько главных идей, лежащих в основе всех экспериментов. Следующие разделы могут стать более понятными позднее, когда вы дочитаете книгу до конца, но тем не менее приходится начинать именно с них.
Все эксперименты, описанные в книге, основаны на наличии связи между магнитными ядрами. Скалярное спин-спиновое взаимодействие (J-взаимодействие) хорошо известно. Это оно вызывает расщепление линий в обычных спектрах. Такое взаимодействие является важным для всех экспериментов, кроме тех, которые основаны на ЯЭО. Сам по себе ЯЭО также определяется взаимодействием между ядрами, но это дипольное взаимодействие, о котором подробнее рассказано в гл. 5.
Важность спин-спинового взаимодействия при определении структуры достаточно ясна из одномерных протонных спектров. Изучая структуру мультиплетов, мы часто можем решить, сколько соседей имеет протон. Мы даже можем проследить последовательность соседних протонов, анализируя расщепления. Эксперименты с гомоядерной развязкой еще более облегчают идентификацию ядер-соседей. Высокая информативность КССВ связана с тем, что их величины легко предсказать для разных фрагментов. Для протонов константы через 2 и 3 связи всегда лежат примерно в области от 2 до 20 Гц, а константы через большее число связей очень малы. Предсказуемость КССВ, а также тот факт, что они позволяют определить пары взаимодействующих ядер, делают их чувствительным индикатором молекулярной структуры. В противоположность этому химические сдвиги позволяют только грубо оценить химическое окружение индивидуального ядра.
Основу «современного» ЯМР составляет наше возросшее умение воздействовать на связанные системы. Более глубокое понимание их природы позволяет найти наилучшие способы проведения обычных измерений и разработать эксперименты, которые, подобно спиновой развязке, дают возможность создавать полную картину спиновой системы (гл. 8 и 9). На нем же основан ряд методов наблюдения ядер с низкими резонансными частотами, в которых их взаимодействие с протонами используется как «рычаг» для усиления их сигнала (гл. 6). Оба этих приема позволяют осуществлять то, что уже давно возможно и в традиционном ЯМР. Но они облегчают работу, ускоряют эксперимент, делают его более информативным или более общим. Некоторые эксперименты являются совершенно новыми. Примером может служить
МНОгоквантовая фильтрация, которая дает возможность различать спиновые системы по числу ядер в них (см. гл. 6 и 8). В последних главах разные эксперименты рассматриваются с точки зрения их возможных приложений, что делает их понимание более определенным. Но следует иметь в виду, что в основе всех этих экспериментов лежит воздействие на энергетические уровни спиновых систем, возникающие вследствие взаимодействий между магнитными ядрами.
Вторая большая область современного ЯМР-применение метода Фурье для анализа данных. В следующей главе будет показано, что это ускоряет процесс получения информации, что весьма существенно, поскольку сигналы ЯМР имеют низкую интенсивность. Использование метода получения данных как функции времени в экспериментах, включающих две или более временные переменные, может дать исключительные преимущества как в скорости, так и в разрешающей способности (гл. 8-10). Двумерное преобразование Фурье является важным дополнением к представлениям о взаимодействии, на которых основаны новые эксперименты. Оно увеличивает эффективность обработки данных. С его помощью можно косвенным методом обнаруживать такие явления, как, например, переходы между энергетическими уровнями, «запрещенные» квантовомеханическими правилами отбора.
Маленькая прогулка вокруг спектрометра ЯМР
Чтобы понять, о чем мы говорим в последующих главах, познакомимся с современным высокочастотным спектрометром и его важнейшими компонентами (рис. 1.3). Наблюдать протонные спектры на резонансных частотах выше 100 МГц можно только с использованием сверхпроводящих магнитов. Соленоид (рис. 1.4), намотанный из сплавов ниобия, погружен в емкость с жидким гелием, которая находится внутри высококачественного криостата (большой цилиндр справа на рис. 1.3). Криостат имеет внешнюю охлаждающую рубашку для охлаждения «радиационного экрана», заполненную жидким азотом. Продуманная конструкция и тщательное изготовление криостата обеспечивают низкий расход жидкого гелия. Его добавляют в криостат каждые 2-9 мес в зависимости от модели конструкции. Спектрометр на рис. 1.3 дает возможность наблюдать протоны на частоте 500 МГц, т. е. напряженность поля в центре магнита составляет 11,7 Т.
Внутри отверстия магнита помещен набор градиентных катушек для устранения градиентов поля («шиммы», см. гл. 3), а внутри их находится датчик ЯМР (рис. 1.5)., Датчик-самая ответственная часть всей системы. Он обеспечивает передачу импульсов к образцу и регистрацию сигналов ЯМР. В спектрометре, показанном на рисунке, датчики вставляются снизу с основания криостата в активную область магнита. При необходимости датчик можно заменить на другой. Образцы для измерений готовятся в обычных цилиндрических ампулах для ЯМР. Образец опускается через верхнее отверстие в зазор криостата и попадает
Рис. 1.3. Импульсный фурье-спектрометр ЯМР с рабо- Рис. 1.4. Соленоид чей частотой 500 МГц.магнита спектрометра
ЯМР на 470 МГц (любезно предоставлено Oxford Instruments
Ltd.).
в верхнюю часть датчика (рис. 1.6). Образец вращается вокруг вертикальной оси с помощью воздушной турбинки. Шиммирующие катушки для настройки однородности поля, датчик и образец находятся при комнатной температуре, хотя совсем рядом с ними поддерживается температура жидкого гелия 4 К.
Пульт спектрометра содержит генератор радиочастотных импульсов и приемник для регистрации сигналов ЯМР. Оба этих блока похожи на обычные радиоустройства. В частности, приемник весьма похож на приемный тракт в радио или телевизоре. В современных спектрометрах предусматриваются возможности для получения самых разных импульсных последовательностей с различной продолжительностью и фазой, т. е. для осуществления «импульсного программирования». Все функции спектрометра обычно находятся под контролем компьютера, который также используется для обработки данных и представления результатов. Электрические сигналы ЯМР превращаются в цифровые данные для ввода в компьютер с помощью аналого-цифрового преобразователя. Именно он часто является узким местом, ограничивающим класс экспериментов, которые мы можем выполнять (см. гл. 2 и 3).
Рис. 1.5. Набор датчиков ЯМР разной формы и размеров для образцов различного диаметра и магнитов с различными теплыми отверстиями.Рис. 1.5. Набор датчиков ЯМР разной формы и размеров для образцов различного диаметра и магнитов с различными теплыми отверстиями.
Рис. 1.5. Набор датчиков ЯМР разной формы и размеров для образцов различного диаметра и магнитов с различными теплыми отверстиями.
Рис. 1.5. Набор датчиков ЯМР разной формы и размеров для образцов различного диаметра и магнитов с различными теплыми отверстиями.
Рис. 1.6. Внутреннее устройство датчика. Образец удерживается внутри приемно-передающей катушки. Ниже можно видеть некоторые компоненты резонансного контура (см. гл. 3).
Разные стандартные компьютерные периферийные устройства (печатающее устройство, дисковод, графопостроитель и т. п.) применяются для обработки и представления данных. Почти все спектры в этой книге получены на спектрометре, показанном на рис. 1.3.
Литература
1. Подробный обзор традиционных аспектов экспериментального ЯМР см. в книге: Martin М. L„ Delpuech J.-J., Martin G. J„ Practical NMR Spectroscopy, Heyden, 1980.
Глава 2
Некоторые вопросыимпульсного ЯМР
Введение
Регистрация спектров методом непрерывной развертки кажется естественной. При этом простой и очевидной представляется идея воздействия на образец монохроматического излучения, частота которого варьируется для локализации максимума поглощения. Измерение поглощения энергии до сих пор довольно часто используется в оптической спектроскопии-инфракрасной (ИК) и ультрафиолетовой (УФ). Почему же в таком случае нам необходимо рассматривать столь неочевидную альтернативу, как импульсное возбуждение в случае ЯМР? Чтобы найти ответ на этот вопрос, надо познакомиться поближе с некоторыми особенностями ЯМР (рис. 2.1). На первый взгляд этот спектр выглядит достаточно красиво, но как только мы усилим его в 4 раза, мы обнаружим проклятие всех ЯМР-спектроскопистов-шум.
Трудность состоит в том, что в физически достижимых магнитных полях переходы между уровнями ЯМР имеют очень низкую энергию. Она мала даже по сравнению с параметром кТ(к-постоянная Больцмана) при комнатной температуре. Вследствие этого разность заселенностей нижнего и верхнего энергетических уровней также очень мала. Соответственно, получаемые нами сигналы слабые. Во многих случаях они незначительно превышают шумы, которые неизбежно возникают в электрических цепях спектрометра. Тщательно отрабатывая конструк-
Рис. 2.1. Шум - постоянная проблема в спектроскопии ЯМР.
цию, можно снизить до минимума число источников электрического шума, но сигналы ЯМР настолько слабые, что по сравнению с ними заметным оказывается даже тепловое движение электронов в куске проволоки. Поэтому, сколько бы мы ни совершенствовали конструкцию прибора, мы не сможем избежать весьма высокого уровня шума нулевой линии. Следовательно, необходимо найти какой-нибудь другой способ для улучшения отношения сигнал/шум в спектре ЯМР.
Одним из способов улучшения отношения сигнал/шум, позволяющим обойти естественные ограничения спектрометра, является накопление и усреднение сигналов. Мы воспользуемся тем, что можем записать один и тот же спектр несколько раз. Сигналы ЯМР каждый раз появляются на одном и том же месте, и, таким образом, их интенсивность растет пропорционально числу повторений. При этом судьба случайно возникающего шума немного сложнее; он не «усредняется», как это часто ошибочно полагают, но растет медленнее, чем сигнал. Фактически через п повторений амплитуда сигнала увеличивается ровно в п раз, а амплитуда шума при этом увеличивается примерно в ^/п раз. Таким образом, отношение сигнал/шум улучшается как ^/п. Доказательство того, что шум растет как квадратный корень из числа экспериментов, нетривиально, и если этот вопрос вас интересует, то обратитесь к «центральной предельной теореме» в учебниках по статистике.
В спектроскопии ЯМР почти всегда необходимо накопление и усреднение сигналов для улучшения отношения сигнал/шум. В этом состоит отличие ЯМР от других обычных спектральных методов; чувствительность УФ- и ИК-спектрометров значительно выше. Она обычно достаточна для получения спектров высокого качества при однократной записи. Сама по себе необходимость проводить накопление и усреднение многих экспериментов не является тем не менее основанием для использования импульсного возбуждения. В принципе усреднение сигнала может быть применено и в ЯМР с непрерывной разверткой. В начальный период становления ЯМР действительно применялся такой способ накопления с помощью компьютера (метод CAT, от англ. Computer Averaged Transients). Но этот метод оказался не очень жизнеспособным. Чтобы понять причину этого, необходимо рассмотреть проблемы, возникающие при многократной записи спектра в режиме с непрерывной разверткой. При этом камнем преткновения становится количество времени, требуемое для получения каждого спектра.
Скорость, с которой мы можем получать данные ЯМР в режиме с непрерывной разверткой, сильно ограничена фундаментальными условиями. Линии ЯМР (спин ядра 1/2) обычно являются «острыми», т. е. энергии соответствующего перехода незначительно изменяются для ядер одного типа. Поэтому нам часто приходится в экспериментах регистрировать близко расположенные линии. Предположим, что наименьшее расстояние между линиями, которые мы хотели бы разрешить, составляет 1 Гц. Это эквивалентно измерению разности энергий NE
в А Дж (А-постоянная Планка, Е = hv). Принцип неопределенности гласит:
(2.1)(2.1)kEkt ~ А
(2.1)
(2.1)
Следовательно, если Д£ = А, то, чтобы выполнить измерение, необходим временной интервал порядка 1 с. Что это означает в терминах эксперимента ЯМР с непрерывной разверткой? Измерения проводятся в некоторой полосе частот, где, по нашему мнению, могут находиться резонансные сигналы. Требование проводить измерения каждого интервала, равного 1 Гц, в течение 1 с ограничивает скорость развертки до 1 Гц/с. В настоящее время типичная ширина протонного спектра составляет 10 м. д., т. е. 1000 Гц для спектрометра с рабочей частотой на протонах 100 МГц. Таким образом, для записи такого спектра потребуется 7000 с (около 15 мин). Нам нужно 4 прохождения, чтобы улучшить отношение сигнал/шум вдвое, и 16-вчетверо, поскольку это соотношение растет пропорционально квадратному корню из числа экспериментов. Тогда, чтобы удвоить сигнал/шум, потребуется 1 ч, а еще раз его удвоить не удастся даже до обеда. Таким образом, применяемая в ЯМР с непрерывной разверткой методика накопления оказывается не очень полезной.
Заметим, что сложность возникла из-за того, что нам требуются измерения с «высоким разрешением». Если мы смягчим требования по разрешению, то сможем быстрее выполнить измерение. Это соотношение между скоростью регистрации спектра и разрешением необходимо учитывать не только для спектроскопии ЯМР, но и для всех видов спектроскопии. Просто для ЯМР эта проблема встает наиболее остро. При регистрации спектров ЯМР ядер со спином 1/2 в жидкостях или в растворах режим с непрерывной разверткой, как будет показано ниже, оказывается, заметно уступает импульсному методу. При регистрации широких линий, например, в спектрах твердых тел, недостатки метода непрерывной развертки не столь существенны, но в этой книге мы не рассматриваем такие спектры. Для решения наиболее важных химических задач нам нужно найти такой быстрый способ регистрации спектра, который бы позволил более эффективно использовать накопление и усреднение сигналов. Однако сначала обратимся к проблеме колоколов, хотя она и кажется здесь не относящейся к делу.
Настройка колоколов
Представим себе большой колокол, скажем церковный, только что отлитый в мастерской. Его еще нельзя использовать. При грубом литье не удается получить красивого гармоничного звучания. Колокол имеет много диссонирующих резонансных частот. Требуется его тщательная настройка, при которой с колокола срезаются слои металла, что изменяет относительные вклады разных гармоник. Предположим, что в качест-
ве физиков нас пригласили для того, чтобы изучить возможность автоматизации измерения состава гармоник колокола.
Мы можем предложить схему, немного похожую на следующую. Установим на колокол источник звука, например громкоговоритель, и какой-нибудь вид принимающего устройства, например микрофон. С помощью низкочастотного генератора будем создавать в колоколе звук и варьировать его частоту от самых низких до самых высоких, воспринимаемых человеческим слухом. Скорость, с которой мы изменяем частоту, будет ограничена требуемой точностью измерения и свойствами самого колокола. Регистрируемый микрофоном отклик колокола будет изменяться при изменении частоты. Мы сможем зафиксировать все его характеристические резонансные частоты, если подадим выходной сигнал на графопостроитель, с помощью которого получим спектр откликов как функции частоты. Получив спектр, мы можем снять с колокола слой металла и повторять всю процедуру до получения нужного отклика. Этим способом можно выполнить настройку, но работа займет очень много времени, поскольку мы воспользовались методом измерений с непрерывной разверткой.
Тем временем настройщик колоколов, имеющий за плечами годы практики, будет тихо веселиться в углу комнаты, потому что он знает намного более быстрый способ проведения данного эксперимента. Он держит наготове свой верный молоток и, как только мы перестанем путаться под ногами, произведет им по колоколу хороший удар. Любому, кто не глух к звуковым тонам, тут же станет ясно, что требуемую информацию дает звук колокола. Отклик колокола на импульс (удар молотка) содержит одновременно все характеристические частоты, и мы можем анализировать их прямо на слух. Мы переключились с непрерывной развертки на импульсный метод, и преимущество очевидно.
Импульсный ЯМР
Введение
Возможность получить полный частотный отклик системы сразу, с помощью одного эксперимента-это как раз то, что нам нужно для ускорения измерения спектра ЯМР. Способ осуществления «удара молотком» в спектроскопии ЯМР, а также способ расшифровки частотной информации в результирующем отклике пока не ясны, но потенциальные преимущества этого подхода легко оценить. В эксперименте с непрерывной разверткой для получения разрешения в 1 Гц на ширине спектра в 1000 Гц нужно затратить 1000 с. Но если мы научимся анализировать отклик образца на импульс, то, очевидно, сможем завершить такой альтернативный эксперимент как раз за Г с. При этом на измерение каждой частоты по-прежнему будет расходоваться 1 с, поскольку теперь мы измеряем все частоты одновременно, а не одну за Другой. Это очень важный вывод, и поэтому я повторю его еще раз. Мы
можем перейти от последовательного измерения (эксперимент с непрерывной разверткой) к одновременному измерению (импульсный эксперимент) и, таким образом, уменьшить полное время эксперимента.
На этом основании можно заключить, что мы получим тысячекратный выигрыш во времени (преимущество Фелгетта). На самом деле это верно только для единичного измерения. Выигрыш при многократном повторении, что необходимо для накопления и усреднения сигнала, будет значительно меньше. До сих пор мы рассмотрели только один фундаментальный вопрос точности. При более близком знакомстве с импульсным экспериментом мы увидим, что другие свойства ядерной системы ограничивают максимальную частоту повторения измерений. Однако оказывается, что в этом случае использование импульсных методов для возбуждения сигналов ЯМР дает весьма значительную экономию времени. Это и стало изначальным стимулом широкого распространения импульсного ЯМР. Далее в этой главе мы предполагаем показать, как осуществляются импульсные эксперименты и, в частности, как анализируются получаемые этим методом данные. Помимо быстроты импульсные методы обладают другими многочисленными интересными особенностями, которые и составляют предмет обсуждения в этой книге.
Возбуждение образца
При настройке колокола методом «непрерывной развертки» мы применяли слабое механическое возбуждение, а для выполнения эксперимента в «импульсном» режиме нам было необходимо сильное возбуждение. Поскольку в методе ЯМР с непрерывной разверткой также используется облучение «слабым» радиочастотным генератором, то, как легко представить, в импульсном эксперименте нужен мощный генератор. Это так, но из всего этого нельзя понять, что означает «слабый» или «мощный» в данном контексте, или как определить, что такое достаточно короткий «импульс» в эксперименте ЯМР. Для правильного понимания этих вопросов нам надо дойти до гл. 4. Тогда наши знания будут достаточными. для точного анализа процессов, протекающих внутри образца, когда он подвергается действию импульса. Однако уже на основании самых общих соображений мы можем доказать, что радиочастотный «импульс» должен иметь определенные характеристики.
Мы хотим возбудить сигналы ЯМР, лежащие в определенном частотном интервале, но в нашем распоряжении имеется радиочастотный генератор, настроенный на одну длину волны. Следовательно, мы должны разработать способ использования единственной частоты для возбуждения множества частот. Для того чтобы понять, как это можно сделать, мы вновь воспользуемся принципом неопределенности. Если облучение применяется в течение времени А/, то, рассуждая точно так же, как и раньше, мы имеем
АДуДг~й (2.2)
Следовательно, для монохроматического излучения появляется неопределенность по частоте, равная 1/Д Z Гц, если его длительность составляет Дгс. В импульсном эксперименте Д/ это ширина импульса. Поэтому, чтобы возбудить все сигналы в нашем спектре шириной 1000 Гц, нужен импульс не длиннее 1 мс. И вновь это лишь грубая оценка по порядку величины на основе самых общих принципов. Позднее мы поймем, почему импульс должен быть намного короче (порядка нескольких микросекунд). И все же из этого по крайней мере стало ясно, какой тип «импульса» требуется в ЯМР.
Вот основной способ проведения импульсного эксперимента ЯМР. Образец подвергается короткому, как всплеск, действию радиочастоты длительностью заведомо меньше 1 мс. Время измерения возникающих при этом сигналов зависит от требуемой точности. В обсуждаемом нами примере оно составляет 1 с.Точно так же как колокол перестает звучать совсем благодаря физическому затуханию его вибрации, так и отклик ЯМР спадет в течение следующего за импульсом периода времени. Такой затухающий отклик называют спадом свободной индукции (ССИ). Затем мы можем повторить эксперимент для улучшения отношения сигнал/шум. После выполнения достаточного числа повторений мы получаем в свое распоряжение данные, содержащие информацию обо всех частотах в спектре ЯМР, однако в непривычной для нас форме. В случае колокольного звона интуитивно очевидно, что такая необычная форма содержит такую же информацию, что и эксперимент с непрерывной разверткой, и, используя свои органы чувств, мы можем извлечь из нее желаемые детали. Теперь мы должны вернуться к вопросу о том, как выделить нужный нам спектр в его привычном виде из данных ЯМР, полученных в импульсном режиме.
Время и частота
Какая разница между сигналами, которые мы получаем в эксперименте с непрерывной разверткой и в импульсном эксперименте? В методе непрерывной развертки, меняя частоту радиочастотного поля, мы измеряем зависимость амплитуды сигнала от частоты (измерение в частотном представлении). Однако при регистрации данных после импульса мы измеряем то, как амплитуда развивается во времени (т.е. во временном представлений) (рис. 2.2). По своей природе время и частота обратно пропорциональны друг другу, поэтому может существовать прямая взаимосвязь между двумя формами представления данных, и оказалось, что это действительно так. Преобразование Фурье позволяет нам переходить от одного представления к другому и является обычным методом анализа результатов импульсных экспериментов. Сам по себе Фурье-анализ составляет целый раздел математики. У нас нет времени подробно рассматривать его в этой книге, но по крайней мере мы можем
Рис. 2.2. Два различных взгляда на одну и ту же электромагнитную волну: амплитуда как функция времени (временное представление) и амплитуда как функция частоты (частотный спектр).
убедиться, что переходы от частотного представления к временному и обратно являются реально выполнимыми операциями.
Для этого требуется тщательное рассмотрение природы каждой формы представления данных. Частотный спектр состоит из набора «пиков», интенсивности которых воспроизводят соотношения всех присутствующих частотных компонент. При предельном разрешении каждый пик был бы совершенно узким, но в действительности все они имеют конечную ширину по частоте. Во временном представлении в результате наложения всех резонирующих частот мы будем наблюдать осцилляцию, которая является суммой составляющих частот с соотношениями их амплитуд в частотном представлении. Вопрос о том, можем ли мы найти взаимный переход между этими двумя представлениями, эквивалентен вопросу, можно ли найти комбинацию частот и амплитуд, которая описывала бы осцилляцию, наблюдаемую во временном представлении. Эту процедуру можно выполнить прямым способом, просто численно моделируя различные комбинации частот и сравнивая результат с экспериментальными данными. В принципе эта процедура должна работать, хотя и неясно, сколько времени это потребовало бы на практике. Фактически ее удается осуществить, но объем вычислений при этом намного больше, чем требует метод фурье-преобразования (см. разд. 2.6).
Более детальный анализ проблемы приводит к следующему известному выражению, связывающему два типа представления данных [1]:
+ 00
Л®) = f f^eie»dt(2.3)
Здесь/(z) описывает данные во временном представлении, а/(®)-требуемый частотный спектр. Эта формула имеет ряд неприятных особенно-
стей. В нее входит интеграл, а подынтегральное выражение включает комплексное число. К счастью, их не так сложно преодолеть. Полученные сигналы ЯМР могут быть преобразованы к цифровому виду, интеграл может быть аппроксимирован суммой, а для его вычисления существует эффективный алгоритм-алгоритм быстрого фурье-преобразования Кули и Тьюки. Если принять, что соотношение (2.3) справедливо, то можно перейти к более неотложному вопросу о том, как его можно применять в практической деятельности.
Практическое выполнение импульсного ЯМР
Введение
В этом разделе я хочу показать, как довольно абстрактные идеи разд. 2.3 применяются на практике. Мы уже убедились, что измерять отклик ЯМР (ССИ), следующий за импульсом, весьма выгодно, так как эксперимент можно провести быстрее. Я утверждал, что у нас есть реальные возможности выделять из полученных данных известные спектральные частоты и что преобразование Фурье является наиболее общим способом для этого. Эта идея перехода от одного вида представления данных к другому составляет основную трудность для тех, кто впервые сталкивается с импульсной фурье-спектроскопией ЯМР. Лучший способ преодолеть ее-посидеть у спектрометра и понаблюдать за ходом вычислений. Если у вас есть шанс поступить таким образом, то не упустите его. Вы можете кое-что увидеть и понять.
На рис. 2.3 (вверху) показан ССИ образца (смесь H2O/D2O), в спектре которого содержится только одна линия. Он имеет ряд ожидаемых нами характерных особенностей. Осцилляции (биения), соответствующие по частоте химическому сдвигу линии, затухают в течение нескольких секунд. Почему это происходит, будет ясно из гл. 4. Но из простых физических соображений очевидно, что такой спад должен происходить. Ниже мы видим результат цифрового преобразования к частотному представлению. ССИ существует в течение конечного времени, поэтому возникает некоторая неопределенность в определении частоты и линия имеет характерную форму. Форму линии, которую мы видим на этом рисунке, называют лоренцевой. Она является результатом преобразования экспоненциально спадающего ССИ, что типично для сигналов в спектрах жидкостей.
Существует ряд трудностей, связанных с выполнением этой последовательности операций в импульсном ЯМР. Сигналы ЯМР представляют собой высокочастотные электромагнитные колебания, а нам необходимо анализировать их в цифровом виде. Процесс перевода данных ЯМР в удобную для цифрового анализа форму налагает на эксперимент определенные ограничения, которые очень важно понять. Мы должны взять электрическое колебание, превратить его в цифровой ряд и в таком виде записать его в память так, чтобы можно было повторять процесс
Р"'1""!|Н.,И„|,|,|,,25020015010050ГцР"'1""!|Н.,И„|,|,|,,25020015010050ГцРис. 2.3. Преобразование Фурье переводит сигнал во временном представлении (вверху) в соответствующий частотный спектр (внизу).
Р"'1""!|Н.,И„|,|,|,,
25020015010050
Гц
Р"'1""!|Н.,И„|,|,|,,
25020015010050
Гц
при накоплении и усреднении сигналов. Каждая из этих операций вносит свои трудности и ограничения. До недавнего времени вычисления при фурье-преобразовании требовали значительного времени на имевшихся компьютерах. Сейчас заметные трудности возникают только в случае двумерных экспериментов, в которых приходится обрабатывать большие массивы данных.
Детектирование и регистрация
Введение. Преобразование электрических сигналов к цифровому виду является весьма общей задачей. Для этого используются аналого-цифровые преобразователи (АЦП). АЦП превращает подаваемое на его вход напряжение в двоичное число, воспроизводящее его величину. Важными характеристиками АЦП являются время, затрачиваемое на эту операцию, и число бит, используемых для двоичного представления чисел (разрешение АЦП). Обе эти характеристики определяют, какой вид эксперимента ЯМР мы можем проводить. В гл. 3 (см. в разд. 3.4.3 параграф «Динамический диапазон и разрешение АЦП») обсуждается влияние скорости преобразования и разрешения АЦП.
Сигналы ЯМР возникают в приемнике нашего спектрометра, и на первый взгляд можно было бы прямо регистрировать их с помощью АЦП (рис. 2.4). Однако быстро выясняется, что это слишком трудно. Например, в протонном спектре на частоте 500 МГц все возникающие радиочастотные сигналы имеют частоты, близкие к 500 МГц, и мало различаются в соответствии со своими химическими сдвигами в этом
Рис. 2.4. Простейшая, но не самая лучшая схема для проведения фурье-эксперимента ЯМР. .
диапазоне. Для протонов типичен диапазон в 10 м. д. или 5000 Гц. Следовательно, резонансные частоты лежат, в интервале от 500 000 000 до 500 005 000 Гц. В принципе можно попытаться напрямую оцифровать эти сигналы. Однако задача заметно облегчается, поскольку в действительности нам нужно знать только разности резонансных частот (химических сдвигов). Вычтем из сигнала ЯМР некоторую опорную частоту, скажем 500 МГц. Тогда нужно провести оцифровку частот, которые изменяются от 0 до 5000 Гц, в соответствии с диапазоном химических сдвигов. В сущности высокая частота (все мегагерцы) не представляет интереса, поскольку она является всего лишь несущей частотой, а нужная информация содержится в химических сдвигах. Подобно этому в радиовещании радиоволны используются для переноса звуковых сигналов от одной точки к другой. Радиопередачи выглядели бы чрезвычайно странно, если бы мы сразу же не вычитали из сигнала несущую частоту!
Схема реального импульсного спектрометра должна содержать устройство для детектирования сигнала (рис. 2.5). В гл. 4 (разд. 4.3.5) мы увидим, что существуют различные способы детектирования. Здесь же мы можем представить его как- вычитание из сигнала частоты, которая ниже, чем частота самого низкочастотного ожидаемого сигнала в спектре. Выходной сигнал детектора, содержащий частоты от 0 до 5000 Гц для нашего протонного спектра на 500 МГц, направляется к АЦП. Теперь нам предстоит решить, как часто и как долго нужно вести выборку для этого сигнала.
Выборка данных. Мы уже касались вопроса о том, как много времени требует выборка ССИ, и пришли к выводу о преимуществах импульсного метода. Если мы хотим различить две линии, разделенные в спектре интервалом Av Гц, то выборка должна продолжаться не менее 1/Av с. При этом мы предполагаем, что сигналы ЯМР существуют в течение всего этого времени. Если же они затухают до нуля раньше, то мы не 3-75
Рис. 2.5. Более чувствительная схема фурье-эксперимента ЯМР включает детектирование от опорной частоты.
можем различить так близко расположенные линии, потому что собственная ширина линии в образце окажется слишком большой. Время, затрачиваемое на выборку данных, называется временем регистрации Av Индекс t может показаться лишним в данный момент, но он нужен для описания экспериментов, где используется несколько времен регистрации. С ними мы познакомимся позднее.
На практике необходимо, чтобы разрешение было ограничено свойствами образца, а не методом измерения. Поэтому используется достаточно длинное время регистрации протонных сигналов, чтобы зарегистрировать почти весь ССИ (обычно 2-3 с). Для других ядер достижение высокого разрешения не столь важно. Важнее быстро провести регистрацию данных. Поэтому для них мы проводим выборку только начальной части ССИ. Такое обрезание данных дает несколько интересных эффектов, обсуждаемых позже.
Продолжительность выборки зависит от минимальной разности частот, которую мы хотим зарегистрировать, а скорость выборки определяется общим диапазоном спектра. Выборка проводится по точкам через конечные интервалы времени. Ясно, что при этом нельзя точно воспроизвести полностью произвольную форму линии, поскольку не ясно, что происходит между точками. Однако сигналы ЯМР являются периодическими колебаниями, и для каждого эксперимента мы знаем, какая самая высокая частота может присутствовать в спектре. Это означает, что можно вычислить скорость выборки, достаточную для характеристики данных: если присутствуют частоты до Гц, то сигнал должен выбираться каждые 1/2 Ж с.
Самую высокую частоту Л", которая может быть охарактеризована при выборке с такой скоростью, называют частотой Найквиста, но в спектроскопии ЯМР она часто называется просто шириной спектра. По аналогии с методом ЯМР с непрерывной разверткой иногда ширину спектра, определяемую скоростью выборки, называют «шириной раз-
вертки». Однако это может ввести в заблуждение, так как нет развертки в импульсном эксперименте. В этой книге мы будем использовать термины «ширина спектра», «спектральный диапазон» или «частота Найквиста». Заметим, что максимально возможная ширина спектра для данного спектрометра определяется качеством его АЦП, поскольку существует верхний предел скорости выборки сигнала. В спектрометрах, предназначенных для регистрации спектров высокого разрешения, время самого короткого преобразования в АЦП обычно лежит в диапазоне от 10 до 3 мкс, при этом максимальная ширина спектра составляет от 50 до 150 кГц.
Вывод соотношения между скоростью выборки и шириной спектра был бы слишком большим отступлением от темы. Однако порядок величины этого соотношения легко оценить при рассмотрении процесса выборки данных (рис. 2.6). Пусть нам необходимо охарактеризовать синусоидальную волну, делая выборку значений напряжения в дискретных интервалах. Очевидно, что частота выборки не должна быть много ниже частоты волны, поскольку в таком случае каждый цикл характеризуется менее чем одной точкой. Подобным же образом не имеет смысла делать выборку много раз в течение одного цикла, так как мы можем восстановить полную форму периодической волны всего по нескольким точкам (фактически по двум).
Интересно рассмотреть, что происходит с формой волны, частота которой больше, чем частота Найквиста (рис. 2.7). Мы видим на рисунке два сигнала: один с частотой F(F < J^) и другой с частотой 2 Ж — F (явно больше ^V). Отметим, что оба они проходят через одни и те же точки выборки. Более высокочастотное колебание имеет дополнитель-
(показаны вертикальными линиями). При интервале между точками выборки 100 мкс этот рисунок представляет первые миллисекунды выборки при частоте Найквиста 5 кГц, а два представленных здесь колебания имеют частоты 4,5(показаны вертикальными линиями). При интервале между точками выборки 100 мкс этот рисунок представляет первые миллисекунды выборки при частоте Найквиста 5 кГц, а два представленных здесь колебания имеют частоты 4,5и 1,2 кГц.и 1,2 кГц.
(показаны вертикальными линиями). При интервале между точками выборки 100 мкс этот рисунок представляет первые миллисекунды выборки при частоте Найквиста 5 кГц, а два представленных здесь колебания имеют частоты 4,5
(показаны вертикальными линиями). При интервале между точками выборки 100 мкс этот рисунок представляет первые миллисекунды выборки при частоте Найквиста 5 кГц, а два представленных здесь колебания имеют частоты 4,5
и 1,2 кГц.
и 1,2 кГц.
ные максимумы между точками выборки, но после оцифровки информация о них будет утеряна. Этот пример демонстрирует очень важную особенность спектроскопии, использующей цифровую выборку: частоты, леждщие вне полосы, определенной данной скоростью выборки, все же детектируются, но их положения в спектрах неверны. Вследствие этого в спектрах возникают ложные сигналы, которые называют мнимыми или отраженными. Пример их проявления в реальном спектре приведен в разд. 2.5.5.
Эти соображения по поводу выборки имеют важные практические следствия для экспериментальной импульсной спектроскопии ЯМР. Предположим, что мы хотим иметь разрешение 0,2 Гц в эксперименте с временем регистрации At = 5 с. Если мы наблюдаем протоны при 500 МГц, то желательно иметь ширину спектра около 5000 Гц. Следовательно, в соответствии с критерием Найквиста необходимо проводить выборку сигнала каждые 1/10000 с (= 0,1 мс). В результате за 5 с будет получено 50 000 чисел, которые нужно запомнить и для которых впоследствии нужно выполнить преобразование Фурье. На большинстве современных спектрометров можно легко обрабатывать такие массивы данных, но при выполнении двумерных экспериментов, в которых число точек возрастает в квадрате, оцифровка на основе этого принципа становится немыслимой.
Контроль ширины полосы. При оцифровке сигнал будет содержать информацию о всех частотах, но часть их будет воспроизведена неверно. Это главный недостаток импульсного ЯМР, и чем больше об этом думаешь, тем хуже все кажется. Наиболее очевидной проблемой является невозможность исключить из спектра неинтересные для нас пики, например интенсивные резонансные сигналы растворителей. В спектро-
Рис. 2.8. В еще более совершенной схеме импульсного фурье-эксперимента ЯМР перед АЦП помещается полосовой фильтр.
скопии ЯМР с непрерывной разверткой, выбирая соответствующим образом диапазон развертки, мы можем просто не записывать область спектра, где находится такой очень интенсивный пик. Но в импульсном ЯМР импульс неселективно возбуждает все сигналы, а если при этом учесть особенности цифровой выборки, то станет ясно, что мы получим в спектре все пики, хотим мы того или нет. Связанные с этим трудности обсуждаются в гл. 3 (разд. 3.4.3), а различные сопутствующие им обстоятельства-в гл. 7 (разд. 7.7.2).
Даже если нам удастся сделать так, что все пики попадут внутрь спектрального диапазона при заданной нами скорости выборки, то все равно что-нибудь будет лежать за его пределами. Это электрический шум, который содержит бесконечный диапазон частотных компонент (белый шум) и от которого мы старались избавиться. На первый взгляд это кажется фатально слабым местом в схеме импульсного ЯМР. В сущности в спектре может отразиться неограниченное количество шума, что полностью сведет на нет любой выигрыш в чувствительности, полученный за счет накопления. Чтобы избежать этой катастрофы, необходимо ограничить электрическую ширину полосы спектрометра, поместив полосовой фильтр перед АЦП. Тогда мы получим третью схему приемника, показанную на рис. 2.8.
Для различных спектрометров необходимо задавать различные спектральные диапазоны, должна регулироваться ширина полосы в этом фильтре от нескольких герц до максимально возможной для данного АЦП. При работе спектрометра установка ширины полосы фильтра часто не видна. Ее задает программа компьютера, как только мы установим скорость выборки данных. Однако важно помнить о существовании этого фильтра. На рис. 2.9 показано, как влияет на вид спектра выбор ширины спектра и ширины полосы фильтра. Такой выбор является нетривиальной задачей, а связанные с этим разнообразные искажения в спектрах рассматриваются в других главах.
■ I ■-5000■ I ■-5000г- ■ ■ • ' — — • ■
■ I ■-5000
■ I ■-5000
50000
Гц
Г11 1 Ч 1 1 1 Ч 1 1 1 Ч 1 1 1 Ч 1 1 1 Ч 1 ,Т-,Г '1 1 ■ I ■ 11 1 Т ■200150100500-50-100 -150 -200ГЦГ11 1 Ч 1 1 1 Ч 1 1 1 Ч 1 1 1 Ч 1 1 1 Ч 1 ,Т-,Г '1 1 ■ I ■ 11 1 Т ■200150100500-50-100 -150 -200ГЦП " Ч | I I i и ' ' ■ I ■ ■ ■ ■ I ■ ' ■ ■ | ■ ■ «Г! ,: r-f I ।200ISO 100 SO О -50-100 -ISO -200ГЦП " Ч | I I i и ' ' ■ I ■ ■ ■ ■ I ■ ' ■ ■ | ■ ■ «Г! ,: r-f I ।200ISO 100 SO О -50-100 -ISO -200ГЦ
Г11 1 Ч 1 1 1 Ч 1 1 1 Ч 1 1 1 Ч 1 1 1 Ч 1 ,Т-,Г '1 1 ■ I ■ 11 1 Т ■
200150100500-50-100 -150 -200
ГЦ
Г11 1 Ч 1 1 1 Ч 1 1 1 Ч 1 1 1 Ч 1 1 1 Ч 1 ,Т-,Г '1 1 ■ I ■ 11 1 Т ■
200150100500-50-100 -150 -200
ГЦ
П " Ч | I I i и ' ' ■ I ■ ■ ■ ■ I ■ ' ■ ■ | ■ ■ «Г! ,: r-f I ।
200ISO 100 SO О -50-100 -ISO -200
ГЦ
П " Ч | I I i и ' ' ■ I ■ ■ ■ ■ I ■ ' ■ ■ | ■ ■ «Г! ,: r-f I ।
200ISO 100 SO О -50-100 -ISO -200
ГЦ
Рис. 2.9. Иллюстрация важности полосового фильтра. На спектре вверху большие значения имеют как спектральная ширина, так и ширина полосы фильтра. Ширина среднего спектра была уменьшена, в то время как фильтр остается неизменным; все шумы, наблюдаемые в верхнем спектре, отражаются на новую область наблюдения. При правильной установке фильтра, соответствующего новой ширине спектра (внизу), сильно улучшается отношение сигнал/шум.
Преобразование
После того как путем накопления и усреднения получено достаточно хорошее отношение сигнал/шум, цифровые данные должны быть преобразованы в частотное представление. В разд. 2.5 обсуждаются практические аспекты этой процедуры, а также ряд очень интересных операций, которые можно провести с временным представлением данных перед их
преобразованием. Здесь же, перед более обстоятельным обсуждением методов детектирования в гл. 4, я хочу кратко остановиться на смысле терминов, используемых в преобразовании Фурье. Тот, кто испытывает затруднения, может опустить этот раздел, взяв из него лишь то, что касается двух форм лоренцевой линии.
Вспомним формулу для преобразования Фурье:
/» = ^HtW^dt(2.3)
Здесь f^ может быть комплексной функцией, но при описании эксперимента мы показали, что она действительная и описывает временную зависимость амплитуды сигнала ЯМР. Несмотря на это, /(<о) может быть комплексной из-за того, что под знаком интеграла стоит комплексная экспонента. На первый взгляд это кажется непонятным, но объясняется весьма просто. Представим экспоненту в ее альтернативной форме как комбинацию тригонометрических функций:
е*™' = cos (со Z) + i sin (to Z)(2.4)
Видно, что преобразование в таком случае имеет действительную и мнимую части:
Re[/(<o)] = J /(z) cos (to 0 dt
+ 00
Im[/((o)]= J /(z) sin (to z) d t(2.5)
Каждая из этих частей содержит представление спектра, однако при этом с различными формами лоренцевой линии. Если выполняются определенные экспериментальные условия (см. гл. 4), то действительная часть преобразования соответствует сигналу поглощения, а мнимая-сигналу дисперсии (рис. 2.10). Спектры ЯМР принято записывать в форме сигналов поглощения, таким образом, для регистрации используется действительная часть спектра.
Рис. 2.10. Формы представления лоренцевой линии: в виде сигнала поглощения (слева) и в виде сигнала дисперсии (справа); отметим широкие крылья у линии дисперсии.Рис. 2.10. Формы представления лоренцевой линии: в виде сигнала поглощения (слева) и в виде сигнала дисперсии (справа); отметим широкие крылья у линии дисперсии.
Рис. 2.10. Формы представления лоренцевой линии: в виде сигнала поглощения (слева) и в виде сигнала дисперсии (справа); отметим широкие крылья у линии дисперсии.
Рис. 2.10. Формы представления лоренцевой линии: в виде сигнала поглощения (слева) и в виде сигнала дисперсии (справа); отметим широкие крылья у линии дисперсии.
Рис. 2.11. Два колебания с равными частотой и амплитудой могут различаться по фазе (в данном случае на л/5 рад).
Рис. 2.12. При изменении фазы сигнала во временном представлении (здесь шагами в 10°) в частотном спектре к сигналу поглощения примешивается сигнал дисперсии, что приводит к изменениям формы линии, показанным на рисунке.
Возникновение двух форм спектра при преобразовании показывает, что существует еще одна переменная во временном представлении, которую мы не рассматривали. Каждый сигнал ЯМР имеет свою характерную амплитуду и частоту, но колебание имеет еще и фазу, которая указывает момент времени, соответствующий началу волны (рис. 2.11). Все сигналы могут иметь отличную от нуля одинаковую фазу или различные фазы при различных частотах, что найдет отражение в соотношении действительной и мнимой частей преобразования. В гл. 4 мы рассмотрим этот вопрос более тщательно; там же предложена схема эксперимента, при которой функция /(?) становится комплексной, т. е. сигнал во временном представлении имеет две компоненты. Отметим,
что изменение фазы во временном представлении приводит к смещению действительной и мнимой частей частотного представления спектра. Это приводит к форме линии, содержащей наряду с компонентой поглощения также вклад дисперсии (рис. 2.12).
Практические аспекты фурье-спектроскопии ЯМР
Введение
Химики, использующие фурье-спектроскопию ЯМР от случая к случаю, часто не хотят вникать во все детали детектирования, оцифровки, запоминания и преобразования данных, которые рассматриваются в разд. 2.4. Для многих простых приложений ими действительно можно пренебречь, поскольку налагаемые методом ограничения не препятствуют интерпретации результатов на простом качественном уровне. Например, пусть протонный спектр шириной 10 м. д. занимает лист бумаги длиной 50 см. При рабочей частоте прибора 500 МГц это означает, что спектр записан в масштабе 100 Гц/см. Точки данных, воспроизводящие спектр, в этом случае располагаются на расстоянии 0,4 Гц друг от друга. Следовательно, на каждом сантиметре рисунка расположено 500 точек, которые образуют практически сплошную линию. Влияние оцифровки здесь незначительно, и в этом случае для нас не важно, что спектр может не быть непрерывной линией. Для рутинных анализов или проверок чистоты образцов таких спектров вполне достаточно. Но как только мы беремся за решение действительно сложных структурных задач, этот подход уже не может нас удовлетворить.
При решении таких задач необходимо использовать спектрометр на пределе его возможностей. Имея мощный и дорогостоящий фурье- спектрометр ЯМР, нет смысла применять его подобно прибору с непрерывной разверткой, спектры которого отличаются лишь тем, что не имеют раздражающих «виглей» после сигнала и занимают чуть больший диапазон частот. В следующих разделах описываются различные особенности спектров с преобразованием Фурье. Для них существуют как преимущества, так и ограничения.
Цифровое разрешение и время регистрации
Введение. До сих пор мы рассматривали параметры, используемые при выборке в основном в терминах времени. Ширина спектра определяет интервал между измерениями сигнала, а требуемое разрешение-общую продолжительность выборки. Это удобно при постановке эксперимента, поскольку измерения проводятся во временной области. Однако после преобразования данных более естественным становится проанализировать эти параметры в терминах частот. Если мы обозначим интервал между точками выборки данных в частотном спектре через Гц {цифровое разрешение), то получим
^d = IM, • (2.6)
Чтобы охарактеризовать спектральную ширину F, мы проводили выборку через каждые 1/2 Г с. Следовательно, общее число выбранных точек N равно 2F-A,. Поскольку только половина этих точек воспроизводит действительную часть спектра, цифровое разрешение равно 2F/N.
При ближайшем рассмотрении мы можем видеть, что это абстрактное рассуждение имеет очень конкретное следствие для спектра (рис. 2.13). Для протонных спектров обычно используется 94d, равное 0,3-0,4 Гц на точку. Однако ширины протонных линий в спектрах небольших молекул могут быть 0,1 Гц и меньше. Поэтому, если мы хотим наблюдать и интерпретировать тонкую структуру в протонном спектре, нам необходимо улучшить цифровое разрешение, поскольку, для того чтобы правильно воспроизвести форму линии в спектре, 944 должно быть заметно меньше ширины линии. Это достигается либо увеличением At, либо уменьшением ширины спектра, или же путем
—।—■—।—■—।—'—।—•—।—1—।—■—।—-—।—'—।—>—।—■—।—1—।—■—।
24222010161412108642
ГЦ
Рис. 2.13. Неадекватное цифровое разрешение может полностью скрыть особенности спектров. В нижнем спектре, зарегистрированном при совершенно «нормальных» условиях для протонного ЯМР (А, = 2 с, Std = 0,5 Гц на точку), можно ясно видеть отдельные точки представления данных (спектр как бы составлен из отдельных частей прямых линий). Улучшение оцифровки (верхний спектр. А, = = 65 с, ЛЛ = 0,015Гц на точку) позволяет получить истинный спектр. Форма сигналов в нем определяется естественными ширинами линий и разрешением на данном спектрометре (это тестовый образец для чрезвычайно узких линий). .
увеличения числа точек, используемых для регистрации спектра. Неизбежная плата за это-понижение чувствительности, потому что чем больше времени тратится на регистрацию каждого спектра, тем меньшее число накоплений и усреднений сигнала можно сделать.
При регистрации спектров других ядер, даже таких ядер, как 13С, дающих очень узкие линии в спектрах, принято работать с довольно низким цифровым разрешением (2-3 Гц на точку или хуже). Это вполне естественно, так как обычно в первую очередь приходится заботиться о чувствительности. Многие гетероядра имеют низкое природное содержание, а тонкая структура в их спектрах отсутствует. Среди обычных ядер заслуживающее упоминания исключение составляет 31Р. В ЯМР 31Р высокая резонансная частота сочетается с большим диапазоном химических сдвигов и наличием расщеплений за счет гомоядерного спин-спинового взаимодействия, поэтому достижение адекватного цифрового разрешения может оказаться трудным делом.
Дополнение нулями. Если нас интересует только получение хорошо разрешенных линий, то установление времени регистрации в соответствии с требуемым расстоянием между линиями автоматически обеспечит подходящее цифровое разрешение. Однако существует большая разница между тем, чтобы обнаружить расщепление сигналов и иметь возможность полностью охарактеризовать их форму реальными точками данных. В последнем случае требуется более высокое цифровое разрешение, чем мы могли бы получить при увеличении At. Тогда для
Рис. 2.14. Дополнение нулями данных во временной области увеличивает число точек в частотном спектре, улучшая его вид.Рис. 2.14. Дополнение нулями данных во временной области увеличивает число точек в частотном спектре, улучшая его вид.
Рис. 2.14. Дополнение нулями данных во временной области увеличивает число точек в частотном спектре, улучшая его вид.
Рис. 2.14. Дополнение нулями данных во временной области увеличивает число точек в частотном спектре, улучшая его вид.
улучшения ^d может быть использован метод дополнения нулями полученного ССИ, который спадает до величины, близкой к нулю, в конце Аг Если это так, то дальнейшее увеличение времени регистрации А, не приводит к получению дополнительной информации, а поэтому мы можем, не увеличивая А„ просто использовать компьютер для дополнения данных нулями перед преобразованием (рис. 2.14). Это дает прямой выигрыш, поскольку легко использовать дополнительную память компьютера, а времени для накопления сигнала всегда не хватает.
Улучшение за счет дополнения нулями оказывается лишь косметическим, поскольку никакой дополнительной информации в спектре не прибавляется. Тем не менее часто оно полезно. При работе с одномерным спектром обычно применяют дополнение нулями в сочетании со специальными приемами увеличения разрешения для улучшения вида сложных мультиплетов (см. разд. 2.5.4). В двумерных экспериментах, где время регистрации иногда бывает слишком коротким, дополнение нулями часто с успехом используется для улучшения вида спектра по крайней мере по одной из координат. Несколько подробнее этот вопрос обсуждается в гл. 8. При регистрации двумерных спектров или в других случаях, когда оказывается неверным предположение о том, что ССИ спадает почти до нуля в течение At, нужна большая аккуратность для выполнения корректной аподизации (см. ниже).
Обрезание и аподизация
С оцифрованными линиями ЯМР случаются довольно странные вещи, если А, оказывается коротким по отношению к естественному времени затухания ССИ. При таких условиях регистрации спектра мы имеем дело с данными, которые как будто бы являются произведением «полного» ССИ и ступенчатой функции, т. е. функции, равной 1 в интервале t от 0 до А, и равной 0 за пределами этого интервала. Такое умножение обрубает сигнал в момент времени At. В частности, такой вид имеет дополненный нулями ССИ на рис. 2.15. Оказывается, что фурье- образ этого произведения двух функций является в некотором смысле смешением (конволюциеи) фурье-образов каждой из них, т. е. нечто вроде текущего среднего двух кривых. Преобразование ступенчатой функции дает функцию (sinx)/x, которую часто обозначают как sincx (рис. 2.16). Ее конволюция с линией лоренцевой формы приводит к «виглям» в основании линии (рис. 2.17).
Этот тип искажения формы линии наблюдается только при относительно коротких At, поэтому он редко встречается в рутинных одномерных протонных спектрах, но иногда проявляется в появлении пьедестала у сигналов растворителя. Однако в гетероядерном и двумерном ЯМР устранение «виглей», вызванных обрезанием, становится важной проблемой. Ключ к ее решению лежит в том, чтобы сгладить «острый край» в конце ССИ, ответственный за появление «виглей». Если это сделать, то «вигли» исчезают. Край может быть сглажен умножением ССИ на
Рис. 2.15. Один из способов представления данных, полученных при слишком коротком Л,: это результат умножения полного ССИ на ступенчатую функцию.
преобразованиеФурье
Рис. 2.16. Фурье-преобразование ступенчатой функции довольно часто встречает-ся в фурье-спектроскопии ЯМР; оно представляет собой функцию sine х.
Рис. 2.17. Преобразование обрезанных данных (внизу) является «конволюцией»лоренцевой линии и функции sine; сглаживание обрезания ССИ при аподизацииустраняет «вигли», но уширяет линию (вверху).
функцию, которая начинается с 1 и плавно спадает до нуля к концу А,. Пример использования такой взвешивающей функции перед преобразованием Фурье показан на рис. 2.17. Такую операцию называют аподизацией («отсечением ступней»), В следующем разделе приведены примеры функций, используемых для этой цели.
Взвешивающие функции
Введение. Описанная в предыдущем разделе аподизация-это только один пример из целого ряда эффектов, которые можно получить при обработке ССИ перед преобразованием. По существу, подбирая форму огибающей затухания ССИ, мы можем управлять отношением сигнал/ шум и разрешением в преобразованном спектре. Используемые для этого средства применяются не только в фурье-спектроскопии ЯМР, но доступность данных в форме временного представления в этом случае делает требуемые вычисления довольно простыми. (Отметим также, что спектрометры с непрерывной разверткой обычно не имеют встроенных компьютеров.) Использование взвешивающих функций-существенная часть процесса анализа спектров. Их применение имеет целью либо оптимизацию чувствительности или разрешения, либо просто аподизацию данных. Предел возможностей спектрометра реализуется тогда, когда найдена и испробована оптимальная для данной задачи взвешивающая функция. Из большого набора функций, которые были предложены для этих целей, мы рассмотрим две: одну, предназначенную для увеличения чувствительности, и другую-для улучшения разрешения.
Чувствительность-согласованный фильтр. Сигнал ЯМР спадает во времени при каждом прохождении, а амплитуда шума остается постоянной. Поэтому, понижая относительный вклад хвоста в конце ССИ, можно улучшить отношение сигнал/шум. Это достигается умножением ССИ на спадающую экспоненциальную функцию. Естественный спад сигнала описывается выражением
У = Ае-‘1Т1 (2.7)
(В гл. 4 будет показано, почему символ Тг используется для временной постоянной этого спада.) Умножим ССИ на взвешивающую функцию ^:
^ = е-*10 (2.8)
Если а положительно, то произойдет нужное нам уменьшение вклада хвоста (рис. 2.18). Однако мы должны соблюдать некоторую осторожность. Такое умножение ускоряет наблюдаемое затухание сигнала. В частном представлении это приведет к уширению линии, поскольку очевидно, что у нас была возможность уменьшить в эксперименте время выборки сигнала. Ширина на полувысоте лоренцевой линии 8v соотно-
Рис. 2.18. Применение согласованного фильтра улучшает чувствительность.Рис. 2.18. Применение согласованного фильтра улучшает чувствительность.
Рис. 2.18. Применение согласованного фильтра улучшает чувствительность.
Рис. 2.18. Применение согласованного фильтра улучшает чувствительность.
сится с временной постоянной Т2 следующим образом:
(2.9)(2.9)1
(2.9)
(2.9)
л Т2
Применение взвешивающей функции 8 понижает значение Т2 до эффективного Т2, давая
(2Л0)(2Л0)J_ 1
(2Л0)
(2Л0)
Т'2 Т2 а
Но при таком уширении линии понижается ее высота. Следовательно, отношение высоты пика к амплитуде шума при умножении ССИ на 8 не обязательно улучшается. Тщательный анализ проблемы показывает, что чрезмерное уширение линии, т. е. выбор слишком маленькой величины а, понижает чувствительность. В то же время большие величины а не дают заметного эффекта. Существует оптимальный баланс между понижением шума и эффектами уширения линии, достигаемый при а = Т2, т. е. тогда, когда взвешивающая функция удваивает ширину линии в частотном представлении. Эта взвешивающая функция известна как согласованный фильтр и является наиболее подходящей для получения лучшей чувствительности (рис. 2.18). Отметим, что термин «согласованный» означает «согласованность с ССИ по скорости спада огибающей», так что, если огибающая-экспонента, идеальный согласованный фильтр также экспоненциальный. .
Требуемую величину а легко определить практически. Для этого сначала проведем преобразование ССИ без использования взвешивающей функции и выясним ширины интересующих нас сигналов. (Предва-
'рительно нужно убедиться, что Э14 подобрано правильно. Если необходимо, то следует провести дополнение нулями.) Затем вычислим Т2 по уравнению (2.9). Теперь, приняв а = Т2, умножим ССИ на взвешивающую функцию и повторим преобразование. Специальная программа в компьютере многих спектрометров сама рассчитывает параметр такой взвешивающей функции как фактор уширения линии. В таком случае нет необходимости считать в уме. Взвешивающие функции этого вида, или так называемое экспоненциальное умножение, могут оказаться полезными и для аподизации. Однако обычно при этом степень уширения линий не соответствует условию согласованного фильтра. В таком случае лучшие результаты можно получить, если использовать функцию, описанную в следующем разделе.
Разрешение-преобразование лоренцевой формы линии в гауссову. Поскольку ускорение спада ССИ при экспоненциальном умножении уширяет линии в частотном представлении, можно ожидать, что противоположный эффект достигнут при ослаблении его затухания. Другими словами, обратный знак а в уравнении (2.8) должен дать нам функцию улучшения разрешения. Это верно, но есть определенные проблемы: происходящее при этом усиление конечной части ССИ увеличивает уровень шума и может приводить к возникновению больших «виглей». Лучший результат получается при использовании функции, которая сильно уменьшает затухание начальной части ССИ, но к концу гладко спадает до нуля. Существует много функций, обладающих этим свойством. Одна из самых популярных-функция (2.11), которая осуществляет преобразование лоренцевой формы линии в гауссову:
= e~4“e"t2lb (2.11)
В этом случае а выбирается равным — Т2, а А-положительным. Затем можно отрегулировать параметр b в соответствии с требуемым результатом. На некоторых спектрометрах нельзя прямо вводить Ь, но обязательно есть параметр, связанный с ним, и нужно только выяснить из описания к программам, каким соотношением они связаны. Описываемая функция улучшает разрешение двояким образом. Прежде всего некоторые значения b действительно уменьшают ширину линии на полувысоте; однако при этом заметно понизится отношение сигнал/ шум. Но возможно, что более важным оказывается изменение формы линии, которая становится гауссовой (рис. 2.19). Гауссовы линии намно-
Рис. 2.19. Лоренцева (Л) и гауссова (5) линии с равными ширинами на полувысоте; гауссова линия намного уже в основании.
го уже у основания, чем соответствующие им лоренцевы. Например, при равных ширинах на полувысоте на расстоянии от основания пика, соответствующем 1% его амплитуды, гауссова линия в 5 раз уже, чем лоренцева. Именно это свойство преобразования лоренцевой формы линии в гауссову делает его столь полезным.
Лучший способ использования данной методики на практике-это метод проб и ошибок. Сначала определяют а тем же способом, который был описан выше, а затем варьируют b (или его эквивалент). Каждый раз при изменении параметров повторяется обработка данных и исследуется частотное представление спектра, чтобы увидеть, произошло ли желаемое улучшение. Поскольку а зависит от естественных ширин линий, задача выбора величины, оптимальной одновременно для всех пиков, может оказаться невыполнимой. Для сложного спектра часто необходимо применять несколько различных взвешивающих функций. Это тот случай, когда настойчивость и терпение определенно вознаграждаются, и в результате иногда удается выявить поразительно тонкую
Рис. 2.20. Улучшение разрешения при преобразовании лоренцевой формы линии в гауссову. Внизу показаны естественный ССИ и его преобразование. Вверху показан спектр, полученный после преобразования ССИ, у которого с помощью взвешивающей функции была ослаблена начальная часть (одновременно эта же функция обеспечивает аподизацию). Столь сильное воздействие можно применять к данным только с очень высоким отношением сигнал/шум.Рис. 2.20. Улучшение разрешения при преобразовании лоренцевой формы линии в гауссову. Внизу показаны естественный ССИ и его преобразование. Вверху показан спектр, полученный после преобразования ССИ, у которого с помощью взвешивающей функции была ослаблена начальная часть (одновременно эта же функция обеспечивает аподизацию). Столь сильное воздействие можно применять к данным только с очень высоким отношением сигнал/шум.
Рис. 2.20. Улучшение разрешения при преобразовании лоренцевой формы линии в гауссову. Внизу показаны естественный ССИ и его преобразование. Вверху показан спектр, полученный после преобразования ССИ, у которого с помощью взвешивающей функции была ослаблена начальная часть (одновременно эта же функция обеспечивает аподизацию). Столь сильное воздействие можно применять к данным только с очень высоким отношением сигнал/шум.
Рис. 2.20. Улучшение разрешения при преобразовании лоренцевой формы линии в гауссову. Внизу показаны естественный ССИ и его преобразование. Вверху показан спектр, полученный после преобразования ССИ, у которого с помощью взвешивающей функции была ослаблена начальная часть (одновременно эта же функция обеспечивает аподизацию). Столь сильное воздействие можно применять к данным только с очень высоким отношением сигнал/шум.
4-75
структуру сигналов, имевших вид безнадежных бугров и холмов (рис. 2.20). Но такой результат можно получить лишь тогда, когда холмы действительно состоят из многих перекрывающихся линий. Попытки обузить сигналы, широкие по своей природе (например, вследствие обмена), приведут только к потере чувствительности. С большими значениями а и Ь, подобранными так, чтобы понизить ССИ до нуля к концу А„ преобразование лоренцевой формы линии в гауссову также хорошо подходит для уменьшения «виглей», вызванных обрезанием. На рис. 2.17 показан результат обработки данных именно таким способом.
Распознавание отраженных пиков
Явление отражения, описанное в разд. 2.4.2, может причинять заметные неудобства. Даже при работе с «обычными ядрами», такими, как *Н, не всегда есть уверенность в том, что ширина спектра включает все пики. Время от времени возникают такие неожиданности, как протоны, включенные в водородную связь или присоединенные непосредственно к металлу. Следовательно, важно уметь находить в спектре отраженные пики. Существует несколько характерных для них признаков.
Обычно в протонном спектре большинство пиков находится внутри спектрального диапазона, а один или два необычных сигнала попадают за его пределы. В этом случае легко идентифицировать отраженные пики, поскольку они имеют отличающуюся от других фазу (рис. 2.21).
правильный спектрправильный спектрРис. 2.21. Идентификация отраженных пиков на основании их фазовых свойств.Рис. 2.21. Идентификация отраженных пиков на основании их фазовых свойств.
правильный спектр
правильный спектр
Рис. 2.21. Идентификация отраженных пиков на основании их фазовых свойств.
Рис. 2.21. Идентификация отраженных пиков на основании их фазовых свойств.
Рис. 2.22. При отсутствии других пиков, относительно которых можно делать сравнение по фазе, попытаемся сместить спектральное окно. Слева показан результат для правильно охарактеризованного пика, а справа-для сигнала, отраженного от границы спектрального окна. Во втором случае результат будет зависеть от того, как на спектрометре детектируются сигналы, но в любом случае положение отраженного сигнала будет неверным.
Но если спектр содержит только один сигнал, как это часто случается при работе с гетероядрами, то этот способ непригоден, поскольку нельзя провести сравнение фаз. В этом случае или если есть другие основания предполагать, что сигналы не попали в спектральный диапазон (например, при исследовании необычных ядер), нужно провести тест для проверки на отражение. Для этого смещают окно спектра на значительную величину, скажем на 100 Гц. Неотраженные пики, естественно, оказываются сдвинутыми в направлении, противоположном сдвигу спектрального окна, но на ту же самую величину (рис. 2.22). В то же время отраженные пики либо сместятся в том же (т.е. неверном) направлении, либо на другую (т. е. неверную) величину в зависимости от того, насколько их истинные частоты превышают частоту Найквиста.
Преобразование Фурье-не единственный способ
Все рассматриваемые в этой книге спектры получены с помощью преобразования Фурье. Однако, как уже указывалось в разд. 2.3.3, это не единственный путь выделения частотного спектра из данных во временном представлении. Альтернативная методика, известная как метод максимальной энтропии (МЕМ, от англ. Maximum Entropy Method), привлекла в последнее время столь пристальное внимание и многочисленные комментарии, что нам показалось уместным упомянуть о ней, хотя в дальнейшем мы не будем ее использовать. В грубом
приближении метод основан на реконструкции ССИ путем численного моделирования в виде суммы осцилляторов, т. е. линий ЯМР, и на построении соответствующего сигнала во временном представлении. Полученный модельный сигнал сравнивают с экспериментальным ССИ и по методу наименьших квадратов проводят оценку близости модели. Затем проводят варьирование модельного спектра и находят тот, который наилучшим образом совпадает с экспериментальным ССИ. Сложность заключается в том, что у этой задачи не существует единственного решения, поскольку экспериментальные данные не полные-они содержат шум и были измерены в течение ограниченного времени. Кроме того, поиск решения может быть очень долгим.
Как выбрать правильное решение из многих возможных, которые кажутся одинаково «близкими» к экспериментальным данным. Согласно критерию максимума энтропии, самый подходящий спектр тот, который содержит минимум информации, т. е. максимум энтропии. При таком подходе не существует риска получить из экспериментальных данных лишней информации, которую они не содержат. Этот подход широко используется в других областях, таких, как радиоастрономия и улучшение оптических изображений, когда необходимо проанализировать данные с шумом. Первые примеры применения МЕМ в ЯМР [2] породили надежду, что в спектрах, обработанных таким образом, можно получить намного более высокую чувствительность, так как МЕМ дает независимый от экспериментатора критерий идентификации пиков. Эта точка зрения все еще находит своих сторонников, но кажется, что действительные преимущества здесь весьма иллюзорны. Пока не ясно, является ли обработка спектра с помощью МЕМ лучшим способом выделения сигналов из данных с шумом, чем просто применение согласованного фильтра и выбор порога над уровнем шумов, ниже которого пики должны быть отброшены. Количественный ответ на этот вопрос еще не получен, причем складывается мнение, что между двумя этими методами в данном отношении нет большой разницы.
МЕМ действительно имеет большие преимущества при обработке либо очень неполных данных, либо спектров, накопленных с коротким временем регистрации. Используя в этом случае преобразование Фурье, мы должны применять аподизацию. При этом какую бы взвешивающую функцию мы ни выбирали, она неизбежно будет уширять линии. Применяя МЕМ, мы подбираем модельный сигнал во временной области независимо от уровня шума, и проблема обрезания просто не возникает (рис. 2.23). Весьма возможно, что МЕМ окажется особенно полезным при обработке двумерных спектров, для которых часто используются довольно короткие времена регистрации [3]. Большинство современных спектрометров еще не оснащено программами для применения МЕМ при обработке данных. Объем вычислений здесь больше, чем при использовании преобразования Фурье. Однако нет сомнений в том, что в скором времени такие программы станут доступными.
Рис. 2.23. Обработка сильно обрезанного ССИ с использованием метода максимальной энтропии (ср. с рис. 2.17).
Литература
В рамках качественного подхода в этой книге мы не будем пытаться объяснить смысл преобразования Фурье или обсуждать его математические свойства. Эти вопросы разбираются во многих других руководствах по ЯМР и по физике. См., например (по мере повышения трудности): Mullen К., Pregosin P.S., Fourier Transform NMR Techniques: A Practical Approach (Chapter 1), Academic Press, 1976; Shaw D., Fourier Transform NMR Spectroscopy, 2nd. edition (Chapter 3), Elsevier, 1984; Arjken G., Mathematical Methods for Physicists, 3rd. edition (Chapters 14, 15), Academic Press, 1985.
Sibisi S., Nature (London), 301, 134 (1983); Sibisi S., Skilling J., Brereton R.G., Laue E.D., Staunton J„ Nature (London), 311, 446 (1984).
Hore P.J., J. Mag. Res., 62, 561-567 (1985).
Глава 3
Основные экспериментальныеметоды
Введение
Эта глава-первая из двух глав (гл. 3 и 7), посвященных экспериментальным методам спектроскопии ЯМР. Наибольший интерес они представляют для тех, кто хочет научиться самостоятельно работать на спектрометре. Однако некоторые из обсуждаемых тем имеют прямое отношение и к химикам (приготовление образцов), и к тем, кто собирается купить спектрометр (тесты на качество прибора). Покупая прибор, очень полезно полностью владеть всеми тонкостями процедур тестирования, поскольку производители спектрометров по вполне понятным причинам стремятся слегка подтасовать получаемые результаты в свою пользу. Некоторые полезные, но не очень распространенные тесты обсуждаются в гл. 7. В двух коротких главах нельзя дать полный обзор всех экспериментальных методов, поэтому в них включены только те вопросы, которые вызывают наибольшие сложности у начинающих работать с импульсными спектрометрами, а также изложение общих принципов выполнения экспериментов, описанных в оставшейся части книги.
Приготовление образцов
Введение
В этом разделе основное внимание будет уделено вопросам, чаще всего возникающим при приготовлении образцов. Многие из обсуждаемых здесь факторов имеют принципиальное значение только для протонных спектров, однако нужно помнить о них и при выполнении всех других экспериментов. Возможно, содержание первых параграфов покажется вам очевидным и тривиальным, но пренебрежение этими простыми правилами приводит обычно к неудачам в практической работе и отсутствию понимания более сложных проблем, рассматриваемых в других главах книги. Подготовка к измерению спектра ЯМР вызывает вполне понятное оживление, поскольку она завершает многомесячный труд по синтезу вещества. Поэтому приготовление образца и помещение его в спектрометр часто производят с излишней поспешностью. А ведь несколько минут, потраченных на планирование этих действий, могут сэкономить вам часы приборного времени.
Выбор растворителя
Конечно же, прежде всего ваше вещество должно растворяться в выбранном растворителе. Но растворимость не обязательно должна быть очень высокой, особенно если вы собираетесь регистрировать протонный спектр. В этом случае 1 мг вещества в 0,4 мл растворителя вполне достаточно для получения хорошего спектра на приборе со средним и сильным полем. Растворитель может повлиять на получаемые результаты еще несколькими путями. При наблюдении протонов и углерода сигналы растворителя могут закрывать некоторые области спектра. Вязкость растворителя влияет на разрешение в спектре, особенно при работе с протонами. Некоторые растворители, например вода и метанол, содержат способные к обмену атомы водорода, что не позволяет наблюдать сигналы обменивающихся протонов в изучаемом веществе. Если планируются температурные эксперименты, то необходимо учесть температуры кипения и замерзания растворителей, равно как и возможные температурные изменения растворимости исследуемого вещества. Растворители ароматической природы, такие, как бензол и пиридин, могут вызывать большие изменения химических сдвигов в спектре растворенного вещества по сравнению со спектрами, полученными при использовании неароматических растворителей. Интенсивность и ширина сигнала дейтерия от растворителя могут оказывать влияние на результаты некоторых экспериментов, таких, как, например, разностная спектроскопия. И наконец, цены на дейтерированные растворители различаются очень сильно, что может оказаться важным фактором при выборе методик для ежедневного приготовления и измерения спектров большого числа образцов. От тщательного учета всех перечисленных факторов может во многом зависеть успех всего эксперимента.
В настоящее время в продаже имеется большое число частично или полностью дейтерированных соединений. В табл. 3.1 приведены некоторые физические свойства наиболее широко используемых в ЯМР растворителей. Самые дешевые из них-вода и хлороформ, причем свойства хлороформа значительно больше подходят для использования в ЯМР. Стоимость других растворителей растет пропорционально трудности получения их в дейтерированной форме. Так, стоимость наиболее распространенных в органических синтезах растворителей, таких, как бензол, толуол, диметилсульфоксид (ДМСО), ацетон, ацетонитрил, метанол, хлористый метилен, диметилформамид (ДМФ) и пиридин, оказалась приблизительно одинаковой. В то же время тетрагидрофуран (ТГФ) и циклогексан стоят значительно дороже.
Если нужно записать протонные спектры образцов, содержащих менее нескольких миллиграммов исследуемого вещества, то при выборе растворителя необходимо учитывать положение в спектре сигналов остаточных протонов растворителя. Существуют три источника дополнительных сигналов в спектре: остаточные протоны дейтерированного растворителя, растворенная вода и другие растворенные примеси. Обыч-
Таблица 3.1. Свойства некоторых распространенных дейтерированных ЯМР-раст- ворителей. Знак «~» перед величиной указывает на то, что она относится к соответствующему недейтерированному препарату. В столбце «Цена» приводятся примерные цены (в фунтах стерлингов за 10 г) на мелкорасфасованные растворители в Великобритании на 1985 г.
Растворитель
т„„, °C
Т„„, °C
8‘Н
813С
Цена
Уксусная кислота
15,8
115,5
11,53; 2,03
178,4; 20,0
15
Ацетон
-93,8
55,5
2,05
206,0; 29,8
10
Ацетонитрил
48,0
80,7
1,95
118,2; 1,3
15
Бензол
6,8
79,1
7,16
128,0
10
Хлороформ
-64,0
60,9
77,0
1
Циклогексан
~ 6,5
78,0
1,38
26,4
75
Хлористый метилен
97,0
40,0
5,32
53,8
20
Диметилформамид
61,0
~ 153,0
8,01; 2,91;
2,74
167,7; 35,2;
30,1
130
Диметилсульфоксид
~ 18,0
~ 190,0
2,50
39,5
10
Диоксан
~ 12,0
~ 100,0
3,53
66,5
ПО
Метанол
98,0
65,4
3,31
49,0
20
Нитробензол
~ 5,0
~ 210,0
8,11; 7,67;
7,50
148,6; 134,8;
129,5; 123,5
35
Нитрометан
29,0
100,0
4,33
62,8
25
Пиридин
42,0
114,4
8,71; 7,55;
7,19
149,9; 135,5;
123,5
20
Тетрагидрофуран
- 106,0
65,0
3,58; 1,73
67,4; 25,2
150
Толуол
93,0
110,0
7,09; 7,00;
6,98; 2,09
137,5; 128,9;
128,0; 125,2;
20,4
20
Трифторуксусная кислота
15,0
75,0
11,30
163,8; 115,7
5
Вода
3,8
101,4
4,63
—
3
Источники: Aldrich Catalogue Handbook of Fine Chemicals 1985; Merck, Sharp and Dohme NMR reference data; Aldrich Library of NMR Spectra 1983; PretschE., Seibl J., Simon W, Clerc T, Tabellen zur Strukturaufklarung organischer Verbindungen, Springer-Verlag, 1981.
но в спецификациях растворителей указывается содержание только остаточных протонов, но не меньшие осложнения могут вызвать и два других источника (особенно вода).
Продажные растворители обычно содержат от 99,5 до 99,995% дейтерия, при этом более чистые растворители часто поставляются в небольших (0,5 мл) ампулах. Чем выше чистота препарата, тем он дороже. Важно помнить, что в спецификациях указывается только степень дейтерирования, и в них не всегда есть указания о содержании остальных примесей. В растворителях большой степени дейтерирования содержание воды и других примесей иногда близко или даже превышает содержание остаточных протонов. Определить, нужен вам для данного эксперимента более чистый растворитель или нет, вы сможете, только накопив опыт его использования.
При идеальном подборе растворителя сигналы его остаточных протонов не должны перекрываться с сигналами растворенных веществ. Конечно, на практике это недостижимо, и приходится идти на компромисс. Сигналы из некоторой области, расположенной вблизи сигналов растворителя (их положение заранее известно), приходится считать недостоверными. Эта область может быть достаточно большой, поскольку в общем случае сигналы остаточных протонов представляют собой мультиплеты за счет спин-спинового взаимодействия с дейтерием. Исключения из этого правила составляют хлороформ и вода. Остаточные сигналы таких растворителей, как ацетон или диметилсульфоксид, представляют собой квинтеты и могут легко закрывать участки спектра шириной до нескольких десятых миллионных долей. При концентрации изучаемого вещества порядка 2 мг на 0,4 мл (для веществ средней молекулярной массы) интенсивность остаточных сигналов растворителей «нормальной» чистоты (т. е. 99,5-99,9%) превышает интенсивность сигналов. ■
Вода часто еще больше, чем сигналы остаточных протонов, мешает наблюдению спектров. Почти все ЯМР-растворители содержат воду, а большинство из них весьма гигроскопично. Например, сигнал воды в обычном хлороформе, как правило, интенсивнее сигнала остаточных протонов. Кроме того, этот широкий сигнал находится в неудобной области спектра (около 1,6 м. д.). С некоторыми растворителями, например с ДМСО, следует работать в инертной атмосфере с помощью шприцевой техники. Только в этом случае они останутся достаточно сухими для приготовления сильно разбавленных растворов. Дейтерированная вода тоже гигроскопична, и ее следует хранить в эксикаторе. Содержание воды в растворителе можно значительно уменьшить фильтрованием раствора через осушающие агенты, если, конечно, образец это позволяет. Обезвоживание можно совместить с фильтрованием образца с целью удаления твердых частиц при переносе его прямо в ампулу для ЯМР. Это позволяет избежать дополнительных процедур. Для обезвоживания можно использовать большинство обычных осушителей. Во многих случаях подходит активированный оксид алюминия. Менее удобны молекулярные сита, поскольку при фильтровании через них в раствор попадают очень мелкие, ухудшающие разрешение частицы, которые потом трудно отделить.
Значительное влияние на наблюдаемую ширину линии и релаксационные свойства образца оказывает вязкость растворителя. Эти эффекты будут подробно обсуждаться далее. В первом приближении можно разделить применяемые для ЯМР растворители на вязкие (бензол, ДМФ, ДМСО, пиридин, толуол и вода) и невязкие (ацетон, ацетонитрил, хлороформ, хлористый метилен и метанол). Предельно высокое разрешение можно получить только в невязких растворителях. Наиболее подходящими для использования в ЯМР свойствами среди них обладает ацетон, который обычно и применяется при изготовлении образцов для тестов на разрешение. В рутинных экспериментах ЯМР вязкость раство-
В
б
Р
В
а
Г"1"1 I I | I I I I I I I I I | I I I 1ТГГ1 Г | | I I I | I , I I | I | | | | I , I | ! | | , I |9876543210м.а.
рителя обычно не создает затруднений, но в прецизионных измерениях, особенно на обезгаженных образцах, она приобретает онень важное значение.
Для облегчения выбора растворителя на рис. 3.1 приведены спектры нескольких растворителей на частоте 500 МГц. Для измерений были использованы образцы дейтерированных растворителей с самым низким содержанием дейтерия фирмы Aldrich, поставляемые в ампулах по 5 или 10 мл. Растворители, хранившиеся какое-то время, обычно содержат
U
э«
В
Р
е
Рис. 3.1. Протонные спектры распространенных ЯМР-растворителей на частоте 500 МГц: а-хлороформ, б-метанол, в-бензол, г-ацетон, б-диметилсульфоксид, е- хлористый метилен, .ж-вода, з-толуол, и-ацетонитрил, к-пиридин. Сигналы растворителя помечены буквой Р, воды-буквой В. Иногда видны и некоторые другие примеси (см. текст).
значительно большее количество воды. Сигналы посторонних примесей малой концентрации приведены с усилением в 128 раз. Возможно, ваш растворитель не содержит этих примесей, но все же перед работой с очень разбавленными образцами обязательно проверьте его чистоту.
Ампула для регистрации спектров ЯМР
Фирма Wilmad, основной производитель и поставщик стекла для ЯМР, предлагает очень широкий выбор самых разнообразных ампул. Нужен определенный опыт, чтобы правильно выбрать ампулу для эксперимента, поскольку невозможно надежно предсказать, что произойдет при изменении, допустим, ее концентричности. При этом чем выше поле вашего спектрометра, тем больший смысл имеет покупать дорогостоящие высококачественные ампулы. Чаще всего признаком неправильно выбранной ампулы служат большие боковые линии от вращения. Они тем интенсивнее, чем больше дефектная ампула отклоняется от осевой симметрии.
Но как бы ни были хороши ваши ампулы, вы не получите качественных результатов, если не будете хранить их чистыми, без пыли и царапин. После того как из ампулы вылит раствор, ее можно вымыть без риска оцарапать опусканием в подходящий обезжиривающий раствор. Лучше не использовать традиционные ершики. Затем ампулы нужно вынуть из раствора и промыть дистиллированной водой или ацетоном. Сушить их можно продуванием через ампулу профильтрованного азота с помощью пипетки. Для фильтрования достаточно поместить в пипетку небольшую ватную пробочку. Обычный способ мытья ампул с последующей сушкой в печи создает массу возможностей для попадания в них пыли и порчи.
Обратите внимание на то, что совсем новые, только что распакованные ампулы обычно недостаточно чисты. Очень часто бывает так, что химик, решивший приготовить образец для очень точных измерений, специально для этого достает новую ампулу, не моет ее и получает в спектре целый лес огромных пиков от смазки, диоктилфталата или чего-нибудь еще. Храня свои ампулы постоянно в чистоте, вы легко избежите таких драматических историй.
Объем образца
Если мы располагаем для регистрации спектра неограниченным (разумеется, в масштабах эксперимента ЯМР) количеством вещества, то объем раствора можно сделать достаточно большим, и поэтому его точное количество не будет иметь значения. Но если мы приближаемся к пределу чувствительности прибора, что обычно и происходит даже при использовании спектрометров с самым сильным полем, подбор оптимального объема образца становится очень важным. Причина этого проста: катушки приемника регистрируют только сигналы ядер, находя-
шихся внутри некоторого конечного объема, а весь остальной образец для них как бы отсутствует. К сожалению, невозможно сконцентрировать все вещество внутри чувствительного объема датчика, поскольку, если внутрь его попадут границы раствор/воздух, это значительно снизит однородность поля, приведет к искажению формы линии и соответственно понизит чувствительность. В дальнейшем мы обсудим этот вопрос более подробно.
С практической точки зрения для каждого конкретного датчика лучше всего экспериментально найти минимальный объем образца и соответствующее ему положение ампулы в турбинке, позволяющие получить приемлемое разрешение. Их важно знать и в тех случаях, когда требуется очень высокое разрешение: взяв объем образца, в 1,5 раза больший минимального, вам легче будет настроить разрешение.
Имеется несколько приспособлений, облегчающих работу с образцами минимального объема. Наиболее важное из них-это так называемый подавитель мениска, представляющий собой тефлоновый или стеклянный вкладыш, выполненный точно по внутреннему диаметру ампулы. Он вставляется в ампулу и опускается до плотного касания поверхности раствора. Таким образом удается предотвратить образование глубоких «водоворотов» в ампулах большого диаметра. Кроме того, на границе раствор/тефлон не происходит столь резкого искажения поля, как на границе раствор/воздух. По этой причине подавитель мениска стоит использовать даже в ампулах диаметром 5 мм. Но надо помнить, что тефлон имеет очень большой коэффициент термического расширения и поэтому непригоден для температурных экспериментов. При низкой температуре вкладыш погрузится в раствор, а при высокой-раздавит ампулу.
Существуют тефлоновые вкладыши, которые помещают в нижнюю округлую часть ампулы, чтобы вытеснить исследуемый раствор в рабочий объем датчика. Эта идея уменьшения объема нашла свое воплощение в микроячейках различных конструкций. Обычно они представляют собой небольшие полые стеклянные шарики или цилиндры с образцом, помещаемые внутрь обычных ампул. Тогда удается расположить образец полностью внутри чувствительного рабочего объема и с целью уменьшения искажений поля окружить его не воздухом, а растворителем. Этот метод оправдывает себя при использовании ампул диаметром 10 мм и более. Однако для повышения чувствительности лучше все-таки приобрести датчик с ампулами меньшего диаметра (см. разд. 3.4.3). При попытках использовать микроячейки в ампулах диаметром 5 мм, по крайней мере при регистрации протонных спектров на спектрометре с высоким полем, по моему личному опыту, потеря разрешения оказывается настолько большой, что перекрывает выигрыш в чувствительности. Но для некоторых сочетаний конструкций датчиков и магнитов применение микроячеек может оказаться полезным, поэтому стоит их испробовать.
Приготовление образца
Спектры высокого разрешения можно получить только на образцах, полностью свободных от взвешенной пыли и других твердых частиц. Поэтому лучше всего ввести в свою постоянную практику обязательное фильтрование растворов непосредственно при их переносе в ампулу. Удивительно эффективным фильтром служит небольшая ватная пробочка, помещенная в сужение пипетки Пастера. При этом необходимо предварительно промыть ее небольшим количеством растворителя для удаления отделившихся волокон. Свежая медицинская вата не содержит растворимых в органических растворителях загрязнений, но этого совсем нельзя сказать о кусочках ваты, лежащих в лаборатории в течение месяцев. Поэтому храните вату в герметичных коробочках. Некоторые растворы способны реагировать с хлопковой ватой. В этом случае подойдет стеклянная вата, но она фильтрует не так хорошо. Тонкие суспензии можно удалить из образца фильтрованием через цеолиты. Неплохо также дополнить эту процедуру упоминавшимся ранее обезвоживанием раствора.
Еще ряд проблем, связанных с загрязнением, возникает при работе с разбавленными водными растворами. Следы пота из отпечатков пальцев каким-то образом часто попадают в такие образцы. Поэтому при приготовлении образцов, содержащих несколько сотен микрограмм вещества, необходимо надевать перчатки. Признаками загрязнения за счет отпечатков пальцев в спектрах образца служат появление дублета при 1,4 м. д. с константой 7 Гц и соответствующего ему квартета при 4 м. д. (эти сигналы, по-видимому, принадлежат аланину или молочной кислоте).
В преддверии обсуждения шиммирования в разд. 3.3.4 заметим, что оно сильно облегчается для образцов с достаточно высоким столбиком раствора. Если вы готовите образец добавлением концентрированного раствора вещества в ампулу с требующимся количеством растворителя, то его необходимо тщательно перемешать. Причиной удивительного и необъяснимого ухудшения разрешения может оказаться наличие непе- ремешавшихся слоев разной концентрации в ампуле диаметром 5 мм. Образование воронок в таких слоях очень сильно ухудшает разрешение, особенно в сильных полях.
Ядра, отличные от протонов
Остаточные сигналы растворителя не создают проблем при наблюдении гетероядер, т. е. ядер, отличных от протонов. В этом случае образцы можно готовить в обычных растворителях, добавив лишь такое количество дейтерированного, чтобы сигнал дейтерия был достаточно интенсивным для нормальной работы системы лока (см. разд. 3.3.4). При наблюдении спектров углерода все же лучше использовать полностью дейтерированные растворители. Это обусловлено тем, что
интенсивность углеродных сигналов в их спектрах значительно ниже, чем в спектрах недейтерированной формы, поскольку для них отсутствует ядерный эффект Оверхаузера (см. гл. 5), а сами линии расщеплены в мультиплеты за счет спин-спинового взаимодействия с дейтерием. В особенно трудных ситуациях, когда сигналы растворителя накладываются на сигналы растворенного вещества, можно использовать специальные растворители, не содержащие ядер углерода-13.
Настройка разрешения
Введение
Настроив прибор на предельно высокое разрешение, исследователь всегда испытывает большое удовлетворение. Но иногда настройка может причинять и огромные неприятности, особенно если спектрометр решил заупрямиться, а вы как раз собрались провести самые высокоточные измерения или за вашей работой начал наблюдать шеф. В разд. 3.3.4 мы расскажем о методах шиммирования магнитов с высокой напряженностью поля, которые позволяют быстро получать нужный результат. Ошибочно считать, что от качества настройки разрешения зависит только ширина линии. От нее также зависит чувствительность. Хорошая настройка нужна и для проведения экспериментов по разностной и двумерной спектроскопии, где требуется высокая стабильность отношения поле/частота. Каждый оператор, работающий на спектрометре с высокой напряженностью поля, должен уметь уверенно настраивать разрешение на любом образце. В первой части этого раздела обсуждаются методы измерения разрешения, которые особенно важны для тех, кто покупает новый прибор или занимается обслуживанием спектрометров. И все же, если вы только осваиваете ЯМР, но уже имеете доступ к прибору, проверьте, сумеете ли вы получить паспортное разрешение вашего прибора или превзойти его. Если вам это удалось, то можете быть уверены, что и для реальных образцов вы сможете получить хорошие результаты.
Критерии разрешения
Одной из основных характеристик спектрометра служит получаемое на данной комбинации магнит/датчик «разрешение». Очень важно понимать, что подразумевается под этим термином и какое большое число взаимосвязанных факторов его определяет. Чаще всего под разрешением понимается выраженная в герцах ширина некоторой линии ЯМР на ее полувысоте. Это очень простой, но вполне подходящий критерий, поскольку нет параметра, более сложного для оптимизации и более полно характеризующего спектрометр, чем ширина линии. Однако при этом надо учитывать степень отличия формы реальной линии от идеальной лоренцевой (или степень отличия сигнала ССИ от экспонен-
ты), которая очень важна для правильного определения ширины линии.
К сожалению, правильность формы линии в явном виде не учитывается в характеристиках спектрометра. Вместо этого ширину линии измеряют на полувысоте и в двух других специальных точках возле ее основания (на высоте 0,55 и 0,11% от максимальной амплитуды). Необходимо очень аккуратно интерпретировать данные таких измерений для правильного суждения о характеристиках спектрометра. Описываемый далее тест проводится на протонах. Существует набор образцов и для тестов на других ядрах (в частности, на углероде). На широкополосных датчиках настройку и измерение разрешения можно проводить при наблюдении протонов через катушку декаплера.
Стандартный образец для измерения ширины линии в протонном спектре представляет собой 10-15%-ный раствор орто-дихлорбензола (ODCB) в ацетоне. Он обычно поставляется обезгаженным и запаянным в ампулы разных диаметров. Как и многие другие тестовые образцы, ODCB был выбран для этой цели много лет назад, когда существовали только приборы с низкой напряженностью поля и непрерывной разверткой. Он очень прочно укрепился в этой роли, но по нескольким причинам его все же нельзя считать идеальным для современных спектрометров с высоким полем.
Спектр ароматических протонов ODCB представляет собой систему АА'ВВ', которая содержит 24 линии. Каждая из них может использоваться для измерения ширины. Но в сильных полях и сравнительно концентрированных растворах начинает проявляться эффект радиочастотного затухания, вызывающий уширение линии, поэтому надежные измерения можно делать только на самых слабых сигналах, находящихся с края мультиплетов. Радиочастотное затухание-это ускорение спада сигнала свободной индукции за счет индуктивной связи с резонансным окружением датчика. Оно в меньшей степени оказывается на сигналах малой интенсивности и может быть ослаблено небольшой преднамеренной расстройкой приемного контура. На приборах с частотой 400 МГц и выше можно использовать 1%-ные растворы ODCB. На рис. 3.2 приведены тестовые спектры приборов на 250 и 500 МГц. Еще одно неудобство представляют собой заметные изменения в спектрах второго порядка при переходе к более сильным полям. Обычно на 5-мм датчиках легко получается разрешение 0,1 Гц или немного меньше. Производители спектрометров в большинстве случаев гарантируют разрешение 0,2 Гц.
Измерения формы линии (т. е. ширины в точках на 0,55 и 0,11% высоты) производятся для раствора хлороформа СНС13 в дейтероацетоне. Опять стандартные запаянные образцы оказываются слишком концентрированными для тестирования приборов с высоким полем. К сожалению, здесь нельзя использовать очень разбавленные растворы, по-
Рис. 3.2. Тест на разрешение с образцом орто-дихлорбензола на приборахРис. 3.2. Тест на разрешение с образцом орто-дихлорбензола на приборахс частотой 250 МГц (Л) и 500 МГц (Б); ширина линии в последнем спектре равнас частотой 250 МГц (Л) и 500 МГц (Б); ширина линии в последнем спектре равна0,06 Гц.0,06 Гц.
Рис. 3.2. Тест на разрешение с образцом орто-дихлорбензола на приборах
Рис. 3.2. Тест на разрешение с образцом орто-дихлорбензола на приборах
с частотой 250 МГц (Л) и 500 МГц (Б); ширина линии в последнем спектре равна
с частотой 250 МГц (Л) и 500 МГц (Б); ширина линии в последнем спектре равна
0,06 Гц.
0,06 Гц.
скольку за малое число прохождений требуется получить достаточно высокое отношение сигнал/шум.
Производители спектрометров приводят некоторые максимальные значения ширины линии на двух высотах. Упоминавшиеся ранее высоты выбраны потому, что они соответствуют полной интенсивности 13С-са- теллитов линии СНС13 и их одной пятой доле. Однако реальный смысл этих величин становится ясен только при сравнении со значениями, вычисленными для идеальной лоренцевой линии той же ширины на полувысоте. Идеальные величины легко рассчитать по уравнению на рис. 3.3. Из него получаем, что на 0,55% высоты линия должна быть в 13,5 раз шире, чем на полувысоте, а на 0,11% высоты-в 30 раз. При
1°
Рис. 3.3. Лоренцеву линию можно описать с помощью ее амплитуды А и ширины на полу высоте 1Г:
A W1
W2 + 4(х0 - х)2 '
ширине линии 0,25 Гц это будет 3,4 Гц на 0,55% высоты и 7,5 Гц на 0,11% высоты. Обычные паспортные данные составляют 10-15 и 20-30 Гц соответственно, что заметно больше теоретических значений.
Если тест на форму линии выполнен с помощью усреднения нескольких прохождений, то очень интересно сравнить времена релаксации 1\ основной линии хлороформа и ее 13С-сателлитов (объяснение 7^ см. в гл. 4). Сателлиты имеют время релаксации, в 2 раза меньшее, чем у основной линии (обычно 15 и 30 с), поэтому основная линия случайно может оказаться насыщенной. В результате интенсивность сателлитов окажется завышенной. Это приведет к слишком хорошим показателям формы линии. Поэтому сначала следует проверить интенсивность сателлитов, которая должна составить 0,55% от интенсивности основной линии.
На практике часто удается превзойти паспортные величины, и нередко можно видеть линию, более узкую на высоте 0,55%, чем соответст-
Рис. 3.4. Пример теста на форму линии (протонный спектр на 500 МГц). Ширина линии на полувысоте 0,3 Гц; получены ожидаемые для лоренцевой формы ширины в тестовых точках-4 и 9 Гц. Видны боковые полосы первого порядка с интенсивностью, вполне допустимой для таких магнитов, и небольшие горбы справа от основного сигнала, от которых, по-видимому, можно избавиться за счет настройки ХУ-градиентов высших порядков.
вующая лоренцева. Такой ситуации лучше избегать, поскольку эта форма линии столь же неправильна, как и при слишком большой ширине на 0,55% высоты. Необходимо сначала измерить ширину тестируемой линии на полувысоте и по этим данным вычислить нужную ширину у основания. Конечно, лучше характеризовать форму линии степенью отклонения ее контура от идеального лоренцева, но пока нет способов для проведения такой оценки.
Второй параметр, измеряемый при выполнении теста на форму линии,-интенсивность боковых полос от вращения. Это сателлитные сигналы, находящиеся по обе стороны от основной линии на расстояниях, кратных скорости вращения образца (выраженной в герцах). Если в настройке поля не допущено очень грубых ошибок, то будут видны только две пары боковых полос, отделенные от основной линии расстояниями в одну и две скорости вращения. В соответствии с характеристиками прибора интенсивность боковых полос не должна превышать 1% амплитуды основного сигнала. Их реальная интенсивность сильно зависит от конкретного магнита, и на приборах со средним и низким полем боковые полосы часто вообще не видны. Природа возникновения боковых полос будет подробно обсуждаться в дальнейшем. На рис. 3.4 приведен тест на форму линии и боковые полосы, выполненный на 5-мм датчике прибора на 500 МГц.
Факторы, влияющие на разрешение
Отклонения формы линии от идеальной лоренцевой при небольших ширинах обусловлены большим числом факторов. Некоторые из них находятся под контролем оператора спектрометра, и умение обращаться с ними составляет большое искусство. Ряд других факторов определяется технологией изготовления блоков спектрометра, они составляют главную область соперничества различных фирм. Поскольку от качества формы линии зависит множество других характеристик спектрометра, при покупке нового прибора ее следует тестировать с особой тщательностью. '
Все линии ЯМР имеют свою собственную естественную ширину, определяемую релаксационными процессами. Однако при наблюдении ядер со спином 1 /2 в веществах с низкой молекулярной массой в невязких растворителях вклад естественной ширины линии в большинстве случаев пренебрежимо мал. Например, естественная ширина линии ядра 13С может составлять 0,02 Гц и менее, в то время как обычно наблюдаемая величина как минимум в 10 раз больше. Таким образом, отклонения от идеальной формы объясняются разнообразными аппаратурными дефектами. Существуют три основных источника этих дефектов: постоянное магнитное поле, датчик и сам образец.
На спектрометре с частотой 500 МГц можно наблюдать линию шириной 0,1 Гц. Это значит, что однородность постоянного магнитного поля в пределах образца поддерживается с точностью до 10 ~9. Посколь-
ку информация о любом спектре собирается в течение некоторого конечного промежутка времени, поле должно быть постоянным еще и во времени. Хорошими характеристиками с обеих точек зрения обладают соленоиды высокопольных сверхпроводящих магнитов, но и в них без корректировки однородности и стабилизации во времени обойтись нельзя. Корректировка и стабилизация осуществляются с помощью градиентных катушек, так называемых шиммов, и системы стабилизации отношения поле/частота. Хорошее представление об этих системах составляет непременное условие успешного проведения прецизионных экспериментов. Мы рассмотрим их далее в этой главе, а системе стабилизации, кроме того, посвящена и гл. 5.
Датчик неизбежно выполнен из каких-то материалов, и некоторые из них, в частности катушки, должны быть расположены вплотную к образцу. Если магнитная восприимчивость этих материалов отлична от нуля, то неизбежно возникают искажения постоянного магнитного поля. Очень часто именно эти искажения, а не собственная неоднородность поля являются причиной плохой формы линии и низкого разрешения. Исправить их с помощью градиентных катушек намного сложнее, чем собственные неоднородности поля магнита, поскольку искажениям в местах скачков магнитной восприимчивости соответствуют большие изменения напряженности поля на коротких расстояниях. В последние годы интенсивная разработка материалов с низкой магнитной восприимчивостью и подходящими электрическими свойствами позволила значительно уменьшить такие эффекты и, следовательно, поднять разрешение и чувствительность. В результате современные спектрометры значительно превосходят по своим характеристикам более ранние приборы с той же напряженностью поля. Однако вы легко можете усовершенствовать старый прибор простой заменой уже имеющихся датчиков более новыми. Конечно, можно поменять и некоторые другие элементы спектрометров, но смена датчиков обычно дает наибольший эффект.
Второй фактор, зависящий от конструкции датчика и влияющий на форму линии,-это коэффициент, с которым катушка принимает или передает радиочастотную энергию в различные части образца. Его называют однородностью радиочастотного поля Вх (постоянное поле обозначается В0). Этот параметр чрезвычайно важен для успешного проведения большинства сложных многоимпульсных экспериментов, описываемых далее. Он будет часто упоминаться в книге. Методики измерения однородности поля Bv не рассматриваются в данной книге, но мы приведем несколько примеров экспериментов, чувствительных к этой характеристике. К сожалению, однородность поля Вх обычно не входит в паспортные характеристики датчика.
Сам образец также неизбежно вносит искажения в постоянное магнитное поле. Искажения создаются во всех местах, где изменяется его магнитная восприимчивость. Это происходит и на торцах столбика жидкости, и на границах раствор/стекло или раствор/воздух (или раст- вор/тефлон при использовании подавителя мениска). По этой причине
хорошее разрешение можно получить только на образцах со стобликом жидкости, который заметно больше высоты чувствительной области датчика. Посмотрите на стандартный тестовый образец: высота столбика его раствора составляет много сантиметров. Но это не значит, что если вам нужно высокое разрешение, то следует разбавлять образец обязательно до этого объема. Лучше найти минимально допустимую высоту столбика, как это описывалось ранее. Однородность поля может нарушаться и изменениями каких-либо характеристик внутри раствора, например концентрации, температуры или при наличии взвешенных частиц. Эти факторы, которые легко устранить, уже обсуждались в предыдущем разделе. Наиболее неприятны температурные градиенты, поскольку они создают конвекционные потоки. Поэтому при выполнении температурных экспериментов необходимо делать значительную паузу после каждого изменения температуры образца.
Шиммирование
Введение. Этот курьезный термин пришел из инженерной практики использования небольших металлических пластинок (называющихся шиммами, т. е. клинышками) для точной подгонки друг к другу каких- либо механических частей. В спектроскопии ЯМР шиммами называются магнитные поля небольшой напряженности, которыми исправляют неоднородности сильного постоянного поля. При каждой смене образца в магните необходимо подобрать новые шиммы, и для эффективного проведения этого процесса потребуется некоторое умение. Трудности подбора шиммов возрастают (но не обязательно линейно) с увеличением напряженности поля магнита, резонансной частоты наблюдаемых ядер и объема катушки приемника. Таким образом, самая трудная ситуация возникает при наблюдении протонов на частоте 600 МГц (а в будущем и на более высоких частотах) в датчике большого диаметра. Затрачиваемые на настройку разрешения усилия и получаемый результат в огромной степени зависят от сочетания магнита и датчика. Рекомендации, которые даются в этой книге, больше относятся к сложным случаям, таким, как настройка спектрометра на 500 МГц или работа с датчиком очень большого диаметра. Только ваш собственный опыт сможет подсказать, сколько нужно подстроить градиентов и на какую величину, чтобы получить заданный результат.
Шиммы. В сверхпроводящих магнитах существует несколько уровней настройки однородности поля. В основном это зависит от конструкции соленоида, которая разрабатывается таким образом, чтобы по возможности оставлять наиболее простые, легко подстраиваемые градиенты. Существуют два набора градиентных катушек. Сверхпроводящие катушки, обычно называемые холодными шиммами, настраиваются только при зацуске магнита и в дальнейшем не используются. Шиммы, находящиеся при комнатной температуре, или теплые шиммы, подстраиваются
для каждого образца. Оператор спектрометра обычно настраивает только теплые шиммы. Чаще всего он работает лишь с небольшим числом имеющихся градиентов.
В магнитах с общепринятым вертикальным расположением зазора шиммовые катушки выполнены методом печатного монтажа на вставляемом в магнит цилиндрическом каркасе (рис. 3.5). Затем внутрь этого каркаса вставляется датчик так, чтобы его рабочий объем оказался в центре катушки Z-градиента. Расположение всего набора шиммов в свою очередь должно быть согласовано с расположением холодных шиммов, находящихся внутри криостата. Катушки, поле которых ориентировано вдоль вертикальной оси магнита, называются Z-градиентами (например, Z, Z2, Z3 и т. д.). Катушки, поля которых ориентированы вдоль двух других перпендикулярных осей, называют X- и У-градиента- ми различных порядков (или горизонтальными градиентами, или градиентами без вращения, см. ниже). В набор шиммов должна также входить катушка, позволяющая в некоторых пределах изменять общую напряженность магнитного поля. Она иногда называется катушкой
Рис. 3.5. Различные наборы теплых шиммов и их компоненты; на двух компонентах справа видны градиентные катушки. (Снимок любезно предоставлен фирмой Oxford Instruments.)
развертки, или 7°-градиентом. Диапазон подстройки поля с ее помощью обычно не превышает 100-200 м. д.
Если вы знакомы с выпускавшимися ранее спектрометрами с постоянными магнитами или электромагнитами, то. вы заметите, что в сверхпроводящих магнитах используются другие названия шиммов. Это объясняется тем, что в них направление поля совпадает с вертикальной осью образца, а не перпендикулярно ей. Два важнейших градиента Z и Z2 сверхпроводящих магнитов соответствуют У и R2 (последний иногда называется «кривизной») в случае электромагнитов. Используемые в этом разделе названия шиммов соответствуют стандартам фирмы Oxford Instruments.
Между градиентами, параллельными оси образца и перпендикулярными ей, есть существенное различие. Вращение образца с некоторой скоростью вокруг своей оси позволяет усреднить многие дефекты поля в плоскости х-у, но не оказывает влияния на вертикальные градиенты. Поэтому настройка однородности поля по вертикальной оси более существенна для получения хорошего результата и требует более тщательного подхода. Для настройки сверхпроводящих магнитов используются теплые Z-градиенты до четвертого порядка (т.е. Z, Z2, Z3 и Z4). Иногда имеется и градиент Z5, но обычно только в магнитах на 500 МГц или в магнитах с широким зазором. Настройка этих градиентов сильно влияет на ширину и форму получаемой линии. В отличие от них для подстройки горизонтального поля используются только шиммы до третьего порядка. Это X и У (первый порядок), XZ, YZ, ХУ и X2 — У2 (второй порядок) и XZ2 и YZ2 (третий порядок). На магнитах с высокой напряженностью поля могут также использоваться X3, У3, ZXY, Z(X2 — — У2) и др. Горизонтальные градиенты оказывают наиболее сильное влияние на упоминавшиеся ранее боковые полосы от вращения, но градиенты высших порядков частично влияют и на форму линии.
Глядя на изобилие регулировок, представленных на старых приборах в виде ужасающего количества ручек, можно прийти в отчаяние. И действительно, начальная настройка магнита после его запуска-очень трудная задача, которой по возможности лучше избегать. Но, к счастью, после того как получено приличное разрешение на конкретном датчике в конкретном магните, переход от образца к образцу не требует серьезных регулировок. В дальнейшем при изложении методов шимми- рования я буду исходить из того, что, если даже у вас пока и нет необходимости заниматься полной настройкой только что запущенного магнита, вам могут встретиться другие «сложные» задачи, как, например, настройка прибора с очень сильным полем или наблюдение спектров при большом объеме образца. Поэтому я постараюсь не надоедать вам длинным и скучным изложением. Но в то же время я не предлагаю вам просто покрутить Z и Z2 и закончить на этом. Превосходное подробное описание процесса шиммирования появилось несколько лет назад в журнале фирмы Nicolet Instruments (сейчас это фирма GE NMR Instruments), издававшемся для внутреннего пользова-
ния, и среди спектроскопистов ходило множество сделанных без разрешения копий этой статьи. Сейчас она опубликована, и я привожу здесь ссылку на нее [1].
В идеальном случае шиммирование могло бы быть очень простым процессом, поскольку градиенты конструируются таким образом, чтобы каждый из них не зависел от остальных. Поэтому, казалось бы, настройку каждого по очереди градиента можно проводить просто по достижении максимального разрешения. К сожалению, на практике невозможно полностью реализовать идеальную форму магнитного поля с помощью реальных катушек. И образец, который в идеале должен быть сферическим, на самом деле таким не бывает. Кроме того, изменение тока в катушке любого градиента неизбежно приводит к изменению других, «примешанных» к нему градиентов. В этом состоит основная сложность шиммирования: подбирая один градиент, мы тем самым сбиваем оптимизированные ранее. Если бы каждый градиент содержал в качестве примесей все другие, то при шиммировании было бы почти невозможно достичь хоть какого-нибудь прогресса. К счастью, не все так плохо. В действительности можно определить пары или небольшие группы градиентов, оказывающих сильное влияние друг на друга. Работа с взаимодействующими парами градиентов может быть продемонстрирована на примере очень часто подстраиваемой пары ZIZ1. Но сначала мы должны установить, каким способом будем определять, повышается ли однородность поля при изменении градиента.
Дейтериевая стабилизация (лок). Наиболее важным критерием однородности поля служит форма линии. Однако на практике довольно сложно после каждого изменения градиента получать новый спектр и проверять форму линии. На современных спектрометрах существуют два более простых способа определения однородности-по опорному сигналу дейтерия в канале стабилизации и по спаду свободной индукции. При решении обычных спектральных задач вполне достаточно первого метода; определенные преимущества второго мы обсудим позднее.
Дейтериевый лок используется для поддержания постоянной напряженности магнитного поля в течение длительных промежутков времени. Более подробное обсуждение работы этой системы проводится в гл. 5, где вводится необходимая для этого терминология. Но основная идея метода очень проста: наблюдается заданный сигнал ЯМР, его частота сравнивается с некоторой эталонной и затем производится подстройка поля до совпадения частоты сигнала с эталоном. Такой метод превращает задачу по поддержанию высокой стабильности магнитного поля
в задачу по поддержанию высокой стабильности частоты. Если у вас есть наручные кварцевые часы, то вам совершенно ясно, что эту задачу решить гораздо проще. В качестве наблюдаемого сигнала удобно использовать сигнал дейтерия ядер дейтерированного растворителя, что и делается во всех современных спектрометрах. Они обычно оборудованы индикатором уровня лука. Для этой цели можно использовать простой стрелочный индикатор или графический дисплей. Амплитуда сигнала лока зависит от нескольких факторов и в том числе от однородности поля. Поэтому ее можно использовать в качестве критерия при шиммировании. Для корректного шиммирования и корректной работы спектрометра в целом важно правильно выбрать условия регистрации сигнала лока.
По существу канал лока представляет собой самостоятельный спектрометр, работающий на частоте дейтерия совместно с основным спектрометром, работающим на частоте наблюдаемых вами ядер. В таком случае для оптимальной работы необходимо установить как минимум три параметра: мощность радиочастотного сигнала, использующегося для возбуждения резонансной линии дейтерия (мощность передатчика лока), усиление принимаемого сигнала (амплитуда лока или усиление лока) и опорную фазу приемника (объяснение этого термина дается в гл. 5). В описаниях спектрометров разных фирм применяются различные названия этих параметров. Полезно заполнить наиболее употребительные английские термины (мощность радиочастотного сигнала-lock transmitter power; усиление в канале лока-lock gain; фаза приемника лока-lock reference phase). Из этих трех параметров особенно важно правильно установить мощность передатчика и фазу приемника. Описываемая ниже настройка градиентов должна производиться уже при настроенном канале лока. Методика его настройки зависит от конкретного спектрометра. Подробное описание настройки канала лока вы можете найти в руководстве к своему прибору.
На первый взгляд может показаться, что мощность передатчика и усиление приемника лока выполняют одинаковые функции. Ведь, изменяя их, мы тем самым заставляем расти или уменьшаться интенсивность сигнала лока. Но между ними есть существенная разница. Изменение усиления приемника не влияет на процессы, происходящие в образце, и поэтому его можно менять совершенно свободно. Однако при высоком усилении в сигнале лока появляется дополнительный шум, в большинстве случаев не создающий затруднений (но см. гл. 5). Напротив, мощность передатчика можно увеличивать только до насыщения, т. е. до возникновения такой ситуации, когда в образец посредством облучения радиочастотным полем вводится больше энергии, чем он может рассеять с помощью релаксационных процессов (гл. 4). Одним из проявлений насыщения может служить уширение наблюдаемой линии, другим- непонятные постоянные изменения амплитуды лока. И то и другое крайне нежелательно в работе канала стабилизации.
С одной стороны, недопустимо работать с сигналом лока в условиях
насыщения, а с другой-желательно использовать по возможности большую мощность передатчика, чтобы получить максимальное отношение сигнал/шум. Значительное насыщение можно определить по большим случайным изменениям амплитуды сигнала лока, которые легко заметны. Небольшое насыщение на его первых стадиях можно обнаружить с помощью следующего эксперимента. Слегка увеличьте мощность передатчика и посмотрите на сигнал лока. Сначала он будет расти, но, если насыщение уже достигнуто, через короткий промежуток времени его амплитуда станет меньше первоначальной. Только в том случае, если сигнал вырастет на некоторую величину и после этого не изменится, можно утверждать, что насыщение отсутствует. Тот же эксперимент можно проделать и в обратном направлении. Понизим мощность передатчика и определим, произошло ли понижение амплитуды или после некоторого уменьшения она вновь восстановилась. Таким путем можно легко подойти вплотную к точке насыщения и затем установить подходящую амплитуду сигнала лока с помощью усиления приемника.
Важность установки опорной фазы приемника лока обсуждается в гл. 5. Обычно фаза подбирается просто по максимуму сигнала. Однако такая установка не будет правильной, если форма линии сигнала дейтерия существенно отличается от лоренцевой. Лучше поступить следующим образом: после обнаружения сигнала лока подстроить его фазу, затем подстроить градиенты Z и Z2 и снова вернуться к фазе. Неправильно установленная фаза может привести к нестабильности амплитуды сигнала. Такую нестабильность легко спутать с насыщением. При неправильно установленной фазе могут также отсутствовать заметные изменения амплитуды лока при подстройке шиммов. Понять причину такой нечувствительности может только оператор, достаточно освоившийся со спектрометром. Совершенно неправильная фаза сделает стабилизацию поля вообще невозможной. Методика предварительной настройки фазы до обнаружения сигнала лока зависит от конкретного спектрометра, поэтому следует внимательно изучить руководство к вашему прибору.
Настройка разрешения. Правильно настроенная система лока позволяет получать информацию об однородности магнитного поля, необходимую при настройке разрешения. Амплитуда сигнала лока зависит в первом приближении от однородности магнитного поля, поэтому цель настройки шиммов состоит в достижении ее максимума. Существование связей между определенными наборами шиммирующих катушек не позволяет разработать определенную схему этого процесса. Искусство шиммирования основано на знании того, какие именно катушки связаны друг с другом и как справиться с этим взаимным влиянием. Очень важно также чувствовать, насколько нужно изменить градиент для получения определенного эффекта и с какой скоростью его можно менять, чтобы не произошел сбой условий стабилизации. Здесь каждый конкретный спект-
рометр имеет свои особенности, поэтому для надежной настройки целесообразно сначала научиться «чувствовать» новый магнит. Попрактикуйтесь в настройке пары ZIZ21, что в реальной работе приходится делать постоянно. Очень часто процедура шиммирования на этом и заканчивается. Но все же не думайте, что это так просто.
При настройке пар градиентов мы будем следовать такому важному правилу: не заканчивать регулировку на шимме более высокого порядка (например, Z2). Лучше еще раз подстроить градиент более низкого порядка (Z) и только потом судить об общем эффекте-произошло улучшение или нет. Приводимая ниже процедура может быть использована для настройки Z и Z2.
Подвигайте Z-градиент в ту и другую сторону; уровень сигнала лока должен подниматься и опускаться. Выберите величину Z, при которой уровень максимален, и запомните ее. Это удобно сделать, если вы можете, подбирая усиление приемника, установить уровень на какую- либо отметку по делениям стрелочного измерителя или сетке графического дисплея. Теперь измените Z2 до появления смещения уровня сигнала, не обращая внимания на то, в какую сторону он изменился. Иными словами, не беспокойтесь, если он упадет или поднимется; пусть он поменяется хоть как-нибудь. После того как произошло заметное изменение в ту или другую сторону, подберите Z по максимальному сигналу. Сравнивая полученный уровень с установленным ранее, вы сможете определить, лучше или хуже стала новая комбинация шиммов. Если лучше, продолжайте смещать Z2 в ту же сторону, каждый раз заново подстраивая Z, до тех пор, пока наблюдается повышение уровня сигнала лока. Если хуже, изменяйте Z2 в обратном направлении. Для начинающих спектроскопистов трудно запомнить, в каком направлении менялся Z2, но, работая на приборе, вы скоро научитесь делать это не задумываясь. Эта процедура несколько отличается от описанной в работе [1], где различаются два типа взаимодействия шиммов, но мой опыт показывает, что она вполне отражает сущность шиммирования, без ввода чрезмерных усложнений.
Во многих случаях такая последовательность операций кажется слишком сложной, поскольку прямая настройка каждого градиента по максимуму сигнала часто дает удовлетворительный результат. Причина этого заключается в том, что если настройка шиммов близка к оптимальной, то установка градиентов низших порядков по максимуму сигнала позволяет сразу получить их правильное положение. Такая ситуация может возникать довольно часто, если вы правильно обращаетесь со своим прибором и используете рекомендуемый объем образца. Но не думайте, что по этой причине можно не изучать полных методик шиммирования; неизбежно придет время, когда они вам понадобятся. Например, вам нужно будет добиться хорошего разрешения на образце с низким столбиком вещества, а именно высота столбика оказывает наибольшее влияние на величины градиентов.
Или вы можете оказаться счастливчиком, имеющим доступ к прибо-
ру с очень сильным полем. По причинам, связанным с переходом от односоленоидных к двухсоленоидным конструкциям, усложнение процедуры шиммирования при переходе от прибора на 400 МГц к прибору на 500 МГц оказывается непропорционально большим. На приборах с частотой 500 МГц и выше для получения приемлемого разрешения приходится настраивать все четыре Z-градиента на каждом образце. Но в то же время разрешение, которое мы считаем «приемлемым», обычно тем больше, чем выше стоимость прибора. Поэтому на сильнопольных спектрометрах в любом случае стоит затратить побольше усилий, чтобы извлечь максимум результата. Но здесь шиммы третьего и более высоких порядков уже не настриваются непосредственно по максимуму сигнала лока, поэтому неизбежно приходится пользоваться описанной процедурой.
При выполнении обычных спектральных работ бывает полезно подстроить и другие градиенты - Z3, Z4 и горизонтальные градиенты низких порядков-X, Y, XZ, YZ и X2 — Y2. Однако их настройка требуется достаточно редко, обычно только на упоминавшихся выше сильнопольных спектрометрах. Она также бывает нужна при некоторых нетрадиционных экспериментах, например при наблюдении протонного спектра с помощью катушки спиновой развязки гетероядерного датчика. Чтобы судить о необходимости такой настройки, полезно иметь пред-
хх, xtxz
(боковые полосы1-го порядка)
Рис. 3.6. Некоторые дефекты формы линии.
ставление о том, какого рода искажения в форме линии вызывают ошибки в том или ином градиенте. На рис. 3.6 приводятся примеры линий при неправильно настроенных шиммах, полученные на протонном 5-мм датчике прибора на 500 МГц. Учтите, что на практике линия может одновременно содержать все эти искажения в различных соотношениях, что может сделать форму линии совсем непонятной.
Все Z-градиенты оказывают влияние на ширину линии, причем чем выше порядок градиента, тем в более низкой части линии проявляются искажения. Градиенты нечетных порядков (Z, Z3, Z5) вызывают симметричное уширение, а четных порядков (Z2, Z4)-несимметричное (рис. 3.6, б, г и д). Обычно чем выше порядок градиента, тем большие изменения требуются в нем; на уровне поворота ручки это определяется конструкцией спектрометра. Для получения заметных искажений линии, приведенных на рис. 3.6, использовались довольно большие смещения шиммов от правильного положения. При слабых отклонениях от правильных значений или в случае спектрометра с более слабым полем вместо отчетливых горбов на линии наблюдалось бы только ее уширение.
Теоретически Z-градиенты четных порядков в основном содержат в виде примесей также четные градиенты, а нечетные-в свою очередь примеси нечетных порядков. Таким образом, самое сильное взаимодействие будет только между Z и Z3, Z2 и Z4. Но на практике на это лучше не полагаться и после каждого изменения какого-либо градиента подстраивать все остальные шиммы более низких порядков. Следствием наличия примесей четных порядков в четных градиентах оказывается влияние Z2 и Z4 на Z0 (т. е. на напряженность поля), поэтому при слишком быстром их изменении может произойти сбой условий стабилизации. Это и есть те упоминавшиеся ранее градиенты, для которых на практике требуется определить максимально допустимую скорость изменения.
От горизонтальных шиммов низких порядков зависят интенсивность и форма боковых линий от вращения. Ошибки в X- и У-градиентах нечетных порядков (т. е. X, Y, XZ и YZ) приводят в основном к появлению боковых линий первого порядка, а ошибки в X- и У-градиентах четных порядков (XY, X1 — У2)-к линиям второго порядка (рис. 3.6,в и е). Поскольку неоднородности поля, устраняемые с помощью этих градиентов, усредняются при вращении, их следует настраивать без вращения’, отсюда и произошел термин «шиммы без вращения».
Каждый из перечисленных выше градиентов второго порядка следует считать взаимодействующим и с X, и с У одновременно, поэтому три этих градиента нужно настраивать совместно. Кроме того, после любого изменения горизонтального шимма, содержащего Z (XZ, YZ), необходимо подстраивать Z-градиент. Неплохо также подстраивать Z сразу после выключения вращения, поскольку при этом слегка изменяется высота столбика жидкости в образце относительно датчика.
Для сведения сложностей настройки шиммов к разумному уров-
ню некоторые их взаимодействия следует считать преобладающими (табл. 3.2) и соответствующие группы шиммов настраивать отдельно. Не входящие в эти группы градиенты низких порядков требуют подстройки только после значительных изменений в шиммах высоких порядков или при заключительной тонкой регулировке. Боковые полосы от вращения могут возникать не только из-за расстройки градиентов, но и от искажений в форме ампулы, образования воронки в ампуле большого диаметра, наличия в образце твердых частиц, загрязнений или царапин на турбинке; поэтому, прежде чем тратить время на настройку шиммов без вращения, проверьте, отсутствуют ли перечисленные выше причины.
Таблица 3.2. Основные группы взаимно влияющих друг надруга шиммов. Изменение каждого шимма из первогостолбца оказывает сильное влияние на шиммы второгостолбца. Значительные изменения первых градиентовмогут также создать необходимость подстройки градиен-тов третьего столбца
НастраиваемыйградиентНастраиваемыйградиентОсновныевзаимодействияОсновныевзаимодействияПрочиевзаимодействияПрочиевзаимодействия
Настраиваемыйградиент
Настраиваемыйградиент
Основныевзаимодействия
Основныевзаимодействия
Прочиевзаимодействия
Прочиевзаимодействия
Z2Z, Z3Z2, Z*Z Z ZZ2Z, Z3Z2, Z*Z Z ZX, УX, ZУ zX, у ZX,Y,ZX, УX, ZУ zX, у ZX,Y,Z
Z2Z, Z3Z2, Z*
Z Z Z
Z2Z, Z3Z2, Z*
Z Z Z
X, У
X, Z
У z
X, у ZX,Y,Z
X, У
X, Z
У z
X, у ZX,Y,Z
ZZ2Z3Z4Z5X
УXZYZXY
X1 - У2XZ1YZ1ZXYZ(X2 - У2)
X3 У3
Градиенты высоких порядков (Z5 и шиммы без вращения третьего порядка) имеют заметно меньшее влияние на однородность поля, чем остальные градиенты. XZ1 и YZ2 часто вызывают похожее на Z3 симметричное уширение линии, но в еще более низкой ее части. Кроме того, в сочетании с Z3 и Z4 они позволяют переходить от линии с узким основанием и большими боковыми полосами к широкой линии без боковых полос и наоборот. В этом случае приходится затрачивать большие усилия для поиска подходящего компромисса методом проб и ошибок, что требует слишком большого времени при проведении рутинных измерений. Расстройка остальных шиммов без вращения
может вызывать появление небольших (0,1% по интенсивности) горбов, находящихся очень далеко от основной линии (до сотен герц). Эти дефекты не выявляются при обычном тесте на форму линии, но иногда очень мешают проведению измерений. Обнаружив их появление, вам надо сообщить об этом специалистам и предоставить им устранение этих дефектов.
Настройка шиммов по ССИ. Хотя амплитуда лока довольно хорошо отражает однородность поля и вполне достаточна для настройки прибора при измерении рутинных спектров, иногда она может вводить оператора в заблуждение. Причина этого станет понятна, если задуматься, каким образом высота сигнала дейтерия связана с происходящими в магнитном поле изменениями. Сигнал лока-это просто синглетная линия дейтериевого спектра, принадлежащая обычно растворителю. Однородность магнитного поля не оказывает влияния на площадь под этой линией, но влияет на ее форму. Таким образом, при сужении линии, чтобы сохранить постоянной площадь, должна увеличиваться ее высота, которая как раз и отражает уровень лока. Теперь мы без труда можем вообразить такую ситуацию, когда линия становится выше, но при этом не приближается к идеальной лоренцевой форме. Например, так может произойти при сужении верхней части линии с сохранением широкого основания. Можно сказать, что амплитуда лока отражает в основном изменения ширины линии (в том числе и упомянутого типа), а для более строгой оценки формы линии требуются иные критерии.
Многие спектрометры обладают возможностью вывода на дисплей сигнала спада свободной индукции (ССИ) в масштабе реального времени после выполнения каждого прохождения. Эта возможность очень полезна при шиммировании. ССИ обладает двумя информативными характеристиками-протяженностью и формой. Протяженность ССИ дает информацию о действительной ширине линии, как и амплитуда сигнала стабилизации. Информация о форме линии содержится в огибающей ССИ (экспоненциальная она или нет). Конечно, такая оценка весьма субъективна, но с накоплением опыта она становится более надежной, чем оценка по амплитуде сигнала стабилизации. На рис. 3.7 показаны формы ССИ до и после настройки шиммов.
ССИ в форме простой затухающей экспоненты наблюдается только на образцах, где доминирует одна мощная синглетная линия (в нашем случае линия хлороформа в тестовом образце). У реальных образцов ССИ имеет огибающую более сложной модулированной формы. Настройка однородности поля по ССИ требует несколько иного стиля работы с градиентами, поскольку информация о происшедших изменениях становится доступна только после завершения прохождения. Лучше всего иметь возможность одновременно наблюдать ССИ и уровень лока, чтобы одновременно получать и более быструю и более медленную, но точную информацию. Удивительно, что эта простая и полезная возможность не всегда предусмотрена даже на современных спектрометрах.
Рис. 3.7. Правильная (Л) и неправильная (5) формы ССИ, наблюдаемые при шиммировании.
Настройка разрешения без лока. Иногда появляется необходимость регистрации спектров без лока. Например, это бывает при наблюдении спектров самого дейтерия или при невозможности использовать дейтерированный растворитель. Вместо сигнала дейтерия в канале лока можно использовать сигнал другого ядра, главным образом фтора, но на сверхпроводящих магнитах вполне можно настроить разрешение и без лока. Но в этом случае вам придется затратить побольше времени (до нескольких часов). При этом настройку нужно будет производить по ССИ.
Еще одну сложность создают «примеси» напряженности поля (градиент Z0) в градиентах Z2 и Z4. В отсутствие стабилизации изменения напряженности поля при подстройке градиентов не корректируются автоматически. Проявлением этого служат причудливые изменения формы ССИ, особенно если градиенты были смещены в течение одного прохождения. На них просто не следует обращать снимания. Важнее другое: поле может сдвинуться настолько сильно, что выбранное вами «спектральное окно» переместится совсем в другое место, поэтому, прежде чем запустить продолжительное накопление и уйти на обед, проверьте, виден ли интересующий вас участок спектра.
Достижение максимальной чувствительности
Введение
Название «Достижение максимальной чувствительности» вполне можно отнести к большей части этой книги, поскольку проблема чувствительности была и остается одной из самых важных в спектроскопии ЯМР. В этом разделе будет рассмотрена в основном аппаратурная сторона вопроса о чувствительности, т. е. проблема правильного подбора компонентов спектрометра и их настройки. Выбор параметров эксперимента, таких, как длительность импульса и задержки, которые также очень важны, будет обсуждаться в гл. 7. Существенное влияние на чувствительность оказывает форма линии, поскольку площадь сигнала
ЯМР, пропорциональная его мощности, постоянна. Таким образом уширение пика приводит к снижению его высоты. Поэтому все сказанное ранее о настройке разрешения очень важно для получения максимальной чувствительности.
Критерии чувствительности
Чувствительность спектрометров ЯМР-одна из важнейших областей конкуренции фирм-производителей приборов. Казалось бы, именно поэтому должны были появиться стандартные методики для ее определения. К сожалению, этого не произошло. Вместо стандартных методик мы вынуждены использовать запутанный список тестовых данных, на основании которых большинство фирм-производителей приходит к выводу о высокой чувствительности своих приборов. В последние годы, когда практически все фирмы добились на этом пути реального прогресса, такие претензии стали особенно энергичными. И все же на практике можно вполне честно сравнить два спектрометра, если иметь ясное представление о проводимых измерениях.
В этом разделе будет дан обзор проблемы чувствительности с точки зрения пользователя прибора, для которого важна совокупность всех его характеристик. Именно на это и рассчитаны приводимые здесь тесты. В последнее время производители спектрометров навязывают пользователям такие тесты, которые позволяют исключить дополнительные факторы, влияющие на тестируемый параметр. Например, в тесте ASTM (смесь 60% дейтеробензола и 40% диоксана) для определения чувствительности на ядрах углерода эффективность развязки от протонов и в некоторой степени качество настройки градиентов не влияют на измерения. Это очень удобно в том случае, если вы-производитель спектрометра и хотите измерить его собственную аппаратурную чувствительность. Но химиков значительно больше интересует чувствительность прибора в реальных экспериментах, где перечисленные выше факторы весьма важны. Вопрос формулируется ими, например, так: можно ли зарегистрировать углеродный спектр 2 мг вещества.
Прежде всего надо ясно понимать, что измеряемая величина чувствительности или отношение сигнал/шум -это статистический параметр. Мы сравниваем интенсивность пика, полученного в стандартных условиях, с уровнем шума, представляющего собой случайную величину. Нельзя интерпретировать статистические данные, проделав несколько измерений и выбрав из них лучшее; вместо этого следует вычислить среднюю величину. Неправильная интерпретация данных часто служит источником появления подозрительных величин чувствительности. Но, как мы увидим далее, существуют и более тонкие способы подтасовки данных. Одним из важнейших источников путаницы оказывается наличие двух понятий чувствительности: чувствительность при постоянной концентрации образца, измеряемая в большинстве тестов, и чувствительность при постоянном количестве образца, наиболее интересная для
химиков. Прежде чем начать с ними разбираться, мы обсудим практические вопросы измерения отношения сигнал/шум.
Как уже говорилось, для измерения отношения сигнал/шум надо зарегистрировать в определенных условиях спектр стандартного образца и вычислить отношение высоты некоторого сигнала к уровню шума. Но что же такое уровень шума? Если в шуме положительные и отрицательные значения встречаются одинаково часто (предполагается гауссово распределение вокруг нуля), то его амплитуда, усредненная по достаточно большому числу точек, будет нулевой. Поэтому интерес представляет среднеквадратичная амплитуда шума, или, что то же самое, стандартное отклонение амплитуды от нуля. Его можно получить, усреднив квадраты интенсивностей множества шумовых точек и взяв из них квадратный корень. Далее полученную величину нужно умножить на 2, поскольку шумовые точки находятся по обе стороны от нуля; поэтому при использовании вычисленной среднеквадратичной величины всегда проверяйте, было ли проведено это умножение.
К сожалению, из-за необходимости привлечения компьютера такой расчет выполняется довольно редко. Это еще один случай, где мы находимся в плену исторического прецедента, поскольку все современные спектрометры оборудованы компьютерами, способными легко проделать необходимые вычисления, а процедуры определения чувствтель- ности остаются неизменными со времен стационарных спектрометров. Вместо этого среднеквадратичная величина получается умножением пиковой интенсивности шума на некоторый преобразующий фактор. Это сразу вносит дополнительную неопределенность, так как при действительно случайной природе шума понятие пиковой интенсивности вообще не имеет смысла: просмотрев дополнительный участок шума, всегда можно найти еще более интенсивный шумовой пик. На практике для получения разумных и сравнительно точных величин очень важно выработать некоторый осмысленный подход.
Для правильного измерения разности интенсивностей самой положительной и самой отрицательной шумовых точек необходимо иметь хорошее представление шума, т.е. использовать достаточно большое количество точек (достаточно широкий участок спектра, не содержащий сигналов). Здесь возникает непреодолимое стремление к занижению оценки шума, особенно если вы потратили несколько часов на настройку прибора специально для этого теста. Точки с максимальными амплитудами будут встречаться довольно редко, и между ними и тем, что кажется основной частью шума, образуется большой пробел (рис. 3.8). Нужно быть твердым как сталь, чтобы не назвать эти пики случайными, не относящимися к шуму выбросами. Настоящие аппаратурные выбросы можно легко опознать и исключить из рассмотрения. Для этого нужно повторить эксперимент несколько раз и посмотреть, окажется ли подозрительный пик случайным (шумовым), или он обязательно присутствует в каждом спектре.
Измерение шума производится обычно по вычерченному на бумаге
Рис. 3.8. Правильное измерение пиковой интенсивности шума нужно действительно проводить по максимальным пикам.
спектру с помощью линейки. Проследите за тем, чтобы не внести на этом этапе дополнительных ошибок. Специфической особенностью плоттеров служит то, что чем быстрее они чертят спектр, тем в большей степени срезают углы; поэтому, если есть возможность изменения скорости, следует выбрать минимальную. Иногда для точных измерений бывает необходимо отдельно вычертить дополнительно усиленный участок шума. Не имеет смысла вычислять отношение 20-см сигнала к шуму высотой в несколько миллиметров. Усильте его настолько, чтобы он тоже стал высотой в несколько сантиметров. Необходимость такой процедуры кажется вполне очевидной, однако ее очень часто опускают.
Коэффициент для перевода пиковой интенсивности шума в среднеквадратичную равен 2,5. Он получается из выбора такой области в гауссовом распределении, чтобы вероятность встречи шумовой точки за ее пределами была «пренебрежимо малой». Если стандартное отклонение гауссова распределения равно ст, то в область ±2,5 ст вокруг нуля попадают 99% шумовых точек. Таким образом, отношение сигнал/шум определяется по формуле
где Л-интенсивность сигнала, a Npp-пиковая интенсивность шума. Можно сравнить использованный в этом выражении коэффициент 2,5 с упоминавшимся ранее коэффициентом 2 для вычисления более адекватного отношения сигнала к среднеквадратичному шуму. Если для определения пикового шума взят достаточно большой его участок (допустим, несколько тысяч точек), то коэффициент перехода к среднеквадратичной величине может оказаться немного больше, однако на практике во всех случаях используется 2,5. Различия в отношениях сигнал/шум, меньшие 10%, можно просто игнорировать, поскольку такая точность уже не нужна.
Теперь обсудим те стандартные условия, в которых должен регистрироваться спектр тестового образца. С тем, что проводить обсуждавшиеся ранее процедуры действительно необходимо, согласятся, по-видимо- му, все спектроскописты, даже те, кто на практике их и не делает. Что же касается стандартных условий, то здесь вообще нет никаких обязательных элементов, не считая того, что это должно быть одно прохождение с импульсом длительностью л/2 (см. гл. 4). В результате остаются произвольными такие параметры, как ширина спектрального диапазона, полоса фильтра и взвешивающая функция для обработки спектра. Поэтому единственное, что можно сделать для сравнения чувствительности спектрометров при их покупке, это настаивать на проведении тестов с совершенно одинаковыми, параметрами и в вашем присутствии.
Если же мы хотим проверить чувствительность прибора на протонах примерно в тех условиях, в каких он будет использоваться, то можно взять следующие параметры: спектральный диапазон Юм.д., время выборки 2-3 с, полосу фильтра, чуть большую ширины развертки, и умножение на подходящую экспоненциальную функцию перед преобразованием Фурье. Стандартный образец для протонного теста - 0,1%-ный раствор этилбензола в дейтерохлороформе. Измерения производятся по центральному пику квартета этильных протонов (рис. 3.9). Эти линии несколько шире обычных, поскольку на них проявляется связывание с ароматическими протонами, еще недостаточное для полного расщепления. Оптимальным в этом случае будет экспоненциальное взвешивание с уширением линии на 1-1,5 Гц.
Выбор условий регистрации углеродного спектра для теста на чувствительность менее однозначен. В рутинной спектроскопии 13С используется низкое цифровое разрешение (2-3 Гц на точку). Надежное измерение интенсивности пиков при таком цифровом разрешении возможно только с использованием значительного уширения линии, а соответст-
Рис. 3.9. Тест на чувствительность в протонном спектре по образцу этилбензола. Высота центрального пика квартета при 2,7 м. д. сравнивается с интенсивностью участка шума. Отношение сигнал/шум равно 270:1.
вующий ему фильтр далек от оптимального и может маскировать зависимость чувствительности от разрешения или эффективности развязки. Особенно важен последний аспект, поскольку изменения условий развязки от протонов оказывают существенное влияние на ширину линии. Один из используемых для этой цели образцов (ASTM) специально предназначен для исключения влияния развязки, а большая естественная ширина линии дейтеробензола снижает зависимость чувствительности от формы линии. Это позволяет определить чувствительность датчика и предусилителя отдельно от остальных компонентов спектрометра. Однако с точки зрения химиков более информативным будет тест на общую чувствительность. Его проводят на старомодном 10%-ном растворе этилбензола в хлороформе. Измеряется интенсивность самого высокого ароматического сигнала с развязкой от протонов.
Регистрировать следует полный спектральный диапазон (скажем, 200 м. д.), но с достаточно большим временем выборки (порядка 2-3 с), чтобы после оптимальной фильтрации получить удовлетворительно оцифрованный спектр. На современных спектрометрах с большой памятью это вполне реально. При использовании широкополосной развязки получаемая ширина линии во многом зависит от режима декаплера (методики обсуждаются в гл. 7). Лучший результат почти всегда удается получить с селективной развязкой от ароматических протонов, но этот метод проведения теста не совсем правильный.
Для тестов на чувствительность на других ядрах используются: 1%-ный раствор триметилфосфита в дейтеробензоле для 31Р (без развязки от протонов); 90%-ный раствор диметилформамида в дейтеродиметилсульфоксиде для 15N (может применяться с развязкой и без развязки); 0,1%-ный раствор трифторэтанола в дейтероацетоне для 19F; водопроводная вода для 2Ни17О (без лока). Если вы интересуетесь еще более необычными ядрами, то придумайте свой собственный тестовый образец и предложите его производителям спектрометров.
Теперь набор тщательно измеренных отношений сигнал/шум нами уже получен, и остается только правильно его интерпретировать. Заметьте, что во всех упоминавшихся ранее образцах оговаривалась концентрация раствора, а не общее количество вещества. Поэтому при выполнении теста с ампулой диаметром 10 мм мы получим существенно более высокую чувствительность, чем в ампуле диаметром 5 мм. Но означает ли это, что 10-мм датчик более чувствительный? Конечно, нет. Просто мы использовали большее количество вещества. В действительности 10-мм датчик скорее всего менее чувствителен (см. далее).
Зависимость чувствительности от диаметра ампулы вполне очевидна, но существует еще одно измерение активного объема дачика- высота, о которой часто забывают. Усовершенствованные в последние годы конструкции магнитов сделали возможным использование более высоких катушек; это позволило повысить паспортную чувствительность спектрометров, получаемую на стандартных тестовых образцах. Но увеличение высоты катушки может и не повысить чувствительность,
отнесенную к общему количеству вещества в образце (в этом случае применение высоких катушек скорее приносит вред).
Наибольший интерес представляет величина отношения сигнал/шум, отнесенная к одному молю вещества в образце. Для ее расчета необходимо узнать объем активной области датчика, вычислить содержащееся в нем количество вещества, например этилбензола, и поделить на него полученное отношение сигнал/шум. Под объемом активной области датчика подразумевается внутренняя площадь сечения ампулы, умноженная на ту минимальную высоту стоблика раствора, которая позволяет работать с образцом без искажения формы линии. Площадь сечения можно узнать из параметров ампулы: обычно 5-мм ампулы имеют внутренний диаметр 4,2 мм, а 10-мм ампулы-9 мм. Минимальную высоту стоблика определить гораздо труднее. Если вы не доверяете сведениям производителей спектрометра, то измерьте сами высоту приемной катушки датчика. Минимальный размер столбика должен быть заметно больше высоты катушки, но известно, что он ей пропорционален. Это позволяет более или менее объективно сравнить чувствительность двух спектрометров с разными высотами катушек.
И наконец, есть еще одна тонкость, на которую часто не обращают внимания. Все тестовые образцы представляют собой растворы ковалентных молекул в органических растворителях невысоких концентраций. Датчики, оптимизированные для работы с такими образцами, могут оказаться совсем неприспособленными для измерений 0,5 М водных растворов неорганических солей, а подобный состав могут иметь многие интересные образцы. Если вы собираетесь в дальнейшем с ними работать, то имеет смысл разработать собственный тестовый образец, моделирующий реальные растворы, и тестировать спектрометры с его помощью. '
Факторы, влияющие на чувствительность
Датчик. Самый важный компонент любого спектрометра ЯМР-это его датчик, т. е. некоторое устройство, в функции которого входит, регистрация слабых сигналов ЯМР при минимальном уровне привносимого шума. Уровень шума в значительной степени зависит и от первой ступени приемника (предусилителя). Но конструкции современных предусилителей весьма совершенны, поскольку они очень давно используются в радиолокационных приборах. Разница между предусилителями, выпускаемыми разными фирмами, не может быть существенной, поскольку их конструкции взяты из одних и тех же литературных источников. Датчик же, напротив, используется только в спектроскопии ЯМР. К его конструкции предъявляется необычное требование: он не должен вносить сильных искажений в напряженность магнитного поля возле образца. Соревнование фирм-производителей в области совершенствования конструкции датчиков составляет существенную часть прогресса в спектроскопии ЯМР. Естественно, покупатель спектрометра может
приобрести датчики только той фирмы, которая произвела и сам прибор, но их выбор обычно довольно широк. Далее мы рассмотрим ряд факторов, которые следует учитывать при выборе датчика для вашего эксперимента.
Прежде всего надо решить, какого он должен быть размера. Размер выражается диаметром ампулы, которую можно вставить в датчик. Обычно это 5, 10 и 15 мм. В последние годы с развитием медицинских и биологических применений ЯМР некоторые фирмы для спектрометров высокого разрешения стали выпускать датчики очень большого диаметра, в которые можно поместить, наиример, крысу, но все наши предыдущие обсуждения к ним не относятся. Часто химики совершенно неправильно подходят к выбору диаметра датчика, и это имеет свои исторические причины. Традиционно спектры малочувствительных ядер, таких, как 13С, регистрировались с помощью датчиков большого диаметра. Но нельзя делать выбор на основании только того, что для слабых сигналов лучше использовать большой диаметр датчика. Давайте сначала разберемся, почему так происходит.
Смысл использования датчика большого диаметра для регистрации малочувствительных ядер состоит в том, что вы помещаете в активную область датчика максимальное количество вещества. Это полезно только в том случае, когда концентрация образца ограничивается только его растворимостью. Такая ситуация возникает очень редко, поскольку насыщенные растворы большинства ковалентных соединений можно считать весьма концентрированными с точки зрения регистрации спектров обычных ядер (1Н, 13С и 31Р) на современных приборах средней и высокой напряженности поля. Конечно, часто бывает полезно использовать и датчики большого диаметра, например, при низкой растворимости вещества или при наблюдении совсем редких ядер.
Если же ограничивающим фактором служит не растворимость вещества, а его общее количество, то ситуация становится противоположной. В этом случае нужно использовать датчик минимально возможного размера, поскольку он обладает более высокой собственной чувствительностью. Причины этого в основном имеют аппаратурный характер; вы можете прочитать о них в работах [2, 3]. Помимо чувствительности на датчиках малого диаметра намного меньше проблем с формой линии, боковыми полосами от вращения и широкополосной развязкой от протонов. Если вам предстоит работать в основном с образцами несинтетического происхождения, например в биологических приложениях или при анализе природных веществ, то имеет смысл укомплектовать ваш прибор преимущественно датчиками малого диаметра. Если же вы занимаетесь синтезом, то вам будет полезно иметь и датчик большого диаметра, что во многих случаях позволит существенно экономить время. -
Второй аспект выбора конфигурации прибора заключается в наличии как широкополосных, так и селективно-настроенных датчиков. Широкополосные выглядят очень соблазнительно, поскольку кажется, что вы
приобретаете сразу несколько датчиков, заплатив при этом всего за один (или, скорее, за два*, они могут весьма дорого стоить). В значительной степени так оно и есть, но, конечно, кое-что (а именно чувствительность) приходится приносить в жертву. Однако не следует путать действительно широкополосный и просто настраиваемый датчики. К последнему типу относится, например, протонный датчик, который можно перестроить на ближайшие частоты фтора (чуть ниже) и трития (чуть выше). В таких настраиваемых датчиках не происходит потери чувствительности. Широкополосные же датчики настраиваются в очень широком диапазоне, где, скажем, минимальная частота в 10 раз ниже максимальной. В них следует ожидать в 2 раза меньшей чувствительности на оптимальной частоте (обычно 13С) и еще меньшей на других частотах.
Перед тем как отдать предпочтение одному широкополосному или двум селективным датчикам, надо тщательно обдумать, что вы хотите получить от наблюдения гетероядер. Для того чтобы скомпенсировать потерю чувствительности на обычных ядрах, вы должны быть уверены в информативности измерений на более редких. Если же вы не уверены, что вообще будете на них работать, то зачем вам широкополосный датчик? Всегда есть возможность договориться с коллегами или представителями фирмы и получить доступ к прибору с другой комплектацией для регистрации спектра на необычном ядре. Кроме того, если вы собираетесь часто работать с 15N или 109Ag, не лучше ли иметь оптимизированный именно для них датчик вместо широкополосного, далеко не оптимального на их частотах? Вообще довольно трудно придумать такую ситуацию, когда бы выбор широкополосного датчика оказался предпочтительным. Однако, если учесть чисто практические трудности, возникающие при смене датчиков, широкополосный может оказаться идеальным, когда вам надо, например, быстро регистрировать спектры 13С, 31Р и 2Н большого количества концентрированных образцов.
Настройка датчика. Основная составная часть датчика-это отрезок провода, свернутого в форме катушки, внутрь которого попадает образец после ввода в магнит. Это, если хотите, антенна, принимающая сигналы ЯМР. В большинстве датчиков для сверхпроводящих магнитов она еще и передает в образец импульсы. Для наиболее эффективного рассеяния импульса в образце и наибольшего усиления принятого сигнала полное сопротивление этого провода должно быть согласовано с выходным сопротивлением передатчика и входным сопротивлением приемника (т. е. просто равно им). Это следствие теоремы о максимальной мощности, которую вы, возможно, помните из школьной физики, где она была сформулирована для постоянного тока. Правда, в условиях радиочастот она несколько усложняется, поскольку наряду с активным сопротивлением в полное сопротивление входят реактивные члены.
Химику, работающему на спектрометре, не обязательно представлять электрическую сторону поведения полного сопротивления на ра-
диочастотах, но обязательно нужно уметь настраивать датчик до согласования сопротивлений на нужной частоте. Это следует делать по нескольким причинам. Только при условии правильной настройки можно добиться максимальной чувствительности. Только при правильной настройке импульсы будут иметь минимальную длительность, что снижает эффекты неоднородности импульса на краях спектрального диапазона (см. гл. 4). Длительности импульсов остаются постоянными при перестройке датчика с одного образца на другой. Поэтому, если на каком-либо образце невозможна калибровка импульсов из-за малой чувствительности, при условии правильной настройки датчика можно проводить многоимпульсные измерения с использованием длительностей, определенных на других образцах (см. гл. 7). Гетероядерные датчики часто имеют еще одну катушку для широкополосной развязки от протонов, и для правильной ее работы также требуется настройка, особенно при использовании составных импульсных последовательностей для развязки (см. гл. 7). Широкополосные датчики обязательно должны перестраиваться с одной частоты на другую. При этом часто используется сочетание заменяющихся или переключающихся конденсаторов (скачкообразная настройка) и тонкой подстройки, описываемой далее. И наконец, эксперименты, в которых применяется облучение низкой мощности (гомоядерная развязка или эксперименты по эффекту Оверхаузера), будут воспроизводимыми только при настройке датчика на каждый конкретный образец. Различные спектрометры имеют различные схемы настройки, но все они преследуют одну и ту же цель. Начинающие спектроскописты часто считают настройку датчика непонятным трюком. Но вы измените о ней свое мнение, если будете хорошо понимать смысл своих действий. В следующих параграфах будут рассмотрены две наиболее распространенные схемы настройки, которые должны помочь вам в понимании методики регулировки датчика.
Схема универсальной цепи для преобразования полного сопротивления провода (в которое входят его активное сопротивление и индуктивность) в сопротивление нужной величины (50 Ом) приведена на рис. 3.10. Два конденсатора обычно помещаются внутрь датчика возле катушки и настраиваются с помощью двух длинных стержней, проходящих через весь датчик. Настройка конденсаторов требуется для компенсации изме-
Рис. 3.10. Типичная схема резонансного контура датчика ЯМР. В сверхпроводящих магнитах с вертикальным зазором приемная катушка обычно не выполняется в форме соленоида. РЧ-радиочастотное поле.
Рис. 3.11. Настройка датчика с помощью моста.
нения индуктивности катушки при вводе в нее различных образцов. Нам не нужно разбираться в том, как именно работает эта цепь, но будет полезно понять различия двух подстраиваемых конденсаторов. С\ изменяет резонансную частоту контура, которая должна быть равна частоте регистрируемых ядер, а С2 изменяет полное сопротивление цепи. Сложность состоит в том, что обе эти регулировки зависят друг от друга, и для настройки цепи требуются многократные подборы емкости каждого конденсатора (это похоже на обсуждавшиеся ранее взаимодействия шиммов).
Для определения правильного положения обеих ручек нам нужен некоторый индикатор согласования сопротивлений и достижения частоты резонанса. Эта проблема обычно решается двумя способами. Первый и лучший из них-реальное измерение отклика цепи с помощью радиочастотного моста. Его устройство аналогично обычному мосту сопротивлений (мосту Уинстона), но модифицированному для работы с переменным током. Он имеет четыре вывода (обычно он представляет собой просто небольшую коробочку с четырьмя разъемами), два из которых используются для ввода сигнала опорной частоты и вывода ответа на измерительное устройство (лучше всего осциллограф). К одному из оставшихся двух подключается эталонное сопротивление (50 Ом), к другому-настраиваемый датчик (рис. 3.11). При равенстве полного сопротивления цепи датчика эталонному сопротивлению мост достигает балланса, и вывод на измерительное устройство становится минимальным.
Лучше всего в дополнение к этому непрерывно менять частоту опорного сигнала возле интересующей величины. Тогда на измерительном устройстве мы увидим периодическое колебание резонансного сигнала, амплитуда которого отражает согласованность сопротивлений. Теперь нам очень легко преодолеть взаимодействие двух регулировок, поскольку мы контролируем оба эффекта отдельно друг от друга по интенсивности и амплитуде колебаний сигнала на индикаторе. Некоторые спектрометры оборудованы именно таким устройством. Если в вашем приборе его нет, но вы заинтересованы в проведении очень точных измерений, то постарайтесь приобрести необходимое дополнительное оборудование. Генератор развертки и высокочастотный осциллограф довольно дорого стоят, чтобы их приобретать только для этой цели. Но их можно купить в подходящем комиссионном магазине (по крайней мере в Великобритании такие есть) или найти в своей лаборатории. Сам высокочастотный мост весьма дешев, и вы можете использовать его без генератора развертки (например, получать опорный сигнал из декаплера спектрометра), но это, конечно, лишает его основных достоинств.
Второй, более распространенный подход к определению качества настройки - это включение радиочастотного зонда между выходом передатчика и датчиком (рис. 3.12). На выходе он дает сигнал, пропорциональный отраженной от датчика энергии, которая зависит от настройки контура и согласования сопротивлений. Обычно отраженный сигнал выводится на стрелочный измеритель, который может быть выполнен как встроенным в спектрометр, так и в виде отдельного блока (в не очень дорогих спектрометрах). Это более прямой метод индикации согласова-
Рис. 3.12. Настройка датчика с помощью направленного ответвителя.
ния передатчика и цепи датчика, поскольку отраженная энергия характеризует согласование сопротивлений независимо от их абсолютной величины (в мостовом методе предполагалось, что она всегда составляет 50 Ом).
В последнем методе есть ряд проблем. Большинство радиочастотных зондов работает с сигналами большой мощности. Это очень хорошо при настройке передатчика, но хуже при настройке декаплера. Еще одна проблема заключается в том, что вместо отдельной индикации резонанса и согласования сопротивлений вы видите теперь только суммарный эффект. Поэтому для подбора конденсаторов необходимо пользоваться каким-то систематическим методом, например методом настройки градиентов Z и Z2 из раздела о шиммировании (см. параграф «Настройка разрешения» в разд. 3.3.4), где «Z» и «Z2» нужно заменить на «резонансную частоту» и «согласование сопротивлений» соответственно. Накопив опыт работы с датчиком, вы сможете очень легко определять точку оптимальной настройки, поскольку при правильном согласовании сопротивлений небольшое изменение резонансной частоты дает резкое увеличение показаний индикатора. Если же оба параметра далеки от правильных значений, то их изменение вообще не будет давать никакого отклика на измерителе, и вам может показаться, что достичь улучшения невозможно. Но это происходит только при сильной расстройке конденсаторов или если вы по неопытности слишком далеко повернули регулировочную ручку.
Динамический диапазон и разрешение АЦП. Необходимость предварительного преобразования аналогового сигнала ЯМР в цифровую форму для проведения численного преобразования Фурье оказывает определенное влияние на проведение эксперимента. Ранее мы уже обсудили метод разложения непрерывного в частотной области спектра на дискретные точки, но вернемся к нему еще раз в гл. 8. Дискретность реального спектра ЯМР можно легко увидеть глазами при тщательном его обследовании, и те, кто хоть раз работал на спектрометре, прекрасно это знают. В процессе оцифровки наибольшие трудности вызывает определение амплитуды точки, а не ее частоты. Очень важно тщательно контролировать оцифровку, поскольку в некоторых ситуациях недостаточно аккуратный подход может привести к полному исчезновению пиков, т. е. к резкому снижению чувствительности. В дальнейшем изложении предполагается, что вы уже знакомы с некоторыми компьютерными терминами, такими, как «бит» и «слово».
Входящий в компьютер электрический сигнал ЯМР должен преобразовываться в поток чисел. Мы уже знаем, с какой скоростью и в течение какого времени это следует делать. Осталось только разобраться, в каком виде должны быть представлены числа и где им храниться. При построении ССИ аналого-цифровой преобразователь (АЦП), ко входу которого прикладывается некоторое напряжение, выдает на выходе пропорциональное этому напряжению двоичное число, помещаемое
в память компьютера. Этот процесс характеризуется следующими наиболее важными параметрами: число бит, используемое АЦП для представления напряжения сигнала; максимально возможная скорость оцифровки; число бит в одном слове памяти компьютера. Сочетание этих параметров определяет такие характеристики спектрометра, как максимальная ширина спектрального диапазона, диапазон регистрируемых амплитуд сигналов и максимально возможное число прохождений.
При прочих равных условиях желательно, чтобы АЦП представлял сигнал максимальным’числом бит, но на практике большое число бит создает дополнительные проблемы. Причина этого станет понятна, если попытаться выяснить, какой диапазон амплитуд может быть представлен, например, в 12 бит (в спектрометрах ЯМР обычно используются 12-16-битные АЦП). Будем считать, что приемник спектрометра настроен таким образом, чтобы максимальный сигнал каждого прохождения как раз заполнял шкалу АЦП, т. е. чтобы ему соответствовало максимальное число. Поскольку один бит используется для знака, максимальное число будет 211 — 1 (немногим более 2000). Минимальный регистрируемый сигнал будет соответствовать минимальному числу, т. е. 1. Отношение этих величин (около 2000:1) и будет динамическим диапазоном 12-битного АЦП.
Необходимость соответствия амплитуды сигналов ЯМР и шкалы АЦП создает некоторые сложности. Если самый большой сигнал ССИ оказывается больше шкалы АЦП, то в спектре появляются искажения (рис. 3.13). Если максимальный сигнал точно подходит под шкалу АЦП, то сигналы, в 2000 и более раз меньшие его по амплитуде, оказываются ниже разрешения АЦП и вообще не регистрируются. В этом случае не поможет и сколь угодно длительное накопление, потому что такие слабые сигналы просто не оцифровываются. Однако, если амплитуда шума больше, чем минимальный оцифровываемый сигнал, малые сигналы, которые скрыты в шуме, обнаружатся при многократном усреднении. Таким образом, АЦП препятствует выделению сигналов только при сочетании широкого динамического диапазона с очень высоким отношением сигнал/шум. Обычно такие условия возникают только при наблюдении протонов.
На рис. 3.14 показано влияние длины слова АЦП на выделение сигналов. Использованный для этих спектров образец содержит еще один сигнал (не показанный на рисунке), в 100 раз больший максимального из трех приведенных. Самый маленький сигнал (видимый только на двух верхних спектрах) примерно в 100 раз меньше максимального, таким образом, динамический диапазон составляет 10 000:1. Спектры получены за три прохождения при длине слова АЦП в 10, 12 и 16 бит (все остальные параметры одинаковы); максимальный пик на всех спектрах имеет одинаковую высоту. Обратите внимание, насколько вырастает уровень шума с уменьшением разрешения АЦП: при использовании 10 бит минимальный сигнал уже не виден. Такой дополнительный шум называется шумом оцифровки. Ограничения по динамическому диапазо-
' Д2 4,0 ЗД ЗД Д4 ЗД ДО 2,8 г'б 2Д 2^2 гр 1,8 1,6 1,4 |£ 1,0 0,8 0,6
Рис. 3.13. Сильное искажение базовой линии при переполнении АЦП. Внизупоказан спектр, полученный при правильно подобранном усилении приемника,вверху-при слишком большом.
» 8
16 Sum
8812 бит12 бит
8
8
12 бит
12 бит
MM*f*SW*V«Ni^^^"в
10 Sum
1,гу1,);!);))j!Г*
3,43,2 Зр 2,82,62,42,22,01,81,61,41,2 ip Q8 0,60,4
М.9.
Рис. 3.14. Влияние разрешения АЦП на чувствительность (подробности см.в тексте).
ну чаще всего возникают в биологических исследованиях, где многие образцы должны быть приготовлены обязательно в протонной воде. В этом случае требуются АЦП с самой большой доступной длиной слова и тщательная настройка усиления приемника на точное соответствие максимального сигнала максимальному выходному числу АЦП. Можно также попробовать подавить самый большой сигнал (методики обсуждаются в гл. 7).
Существуют как минимум две чисто практические причины, по которым не всегда можно использовать максимальную длину слова АЦП. Поскольку создание длинного слова требует большего времени, снижается общая скорость оцифровки и соответственно ширина спектрального диапазона. Обычно 12-битный АЦП выполняет одну операцию за 3 мкс, и его максимальная рабочая частота составляет 300 кГц, что в соответствии с критерием Найквиста позволяет получать спектры шириной 150 кГц. Скорость 16-битного АЦП понижается до 30-50 кГц. Однако даже на приборах с частотой 500 МГц этого вполне хватает для полного перекрытия всего спектрального диапазона протонов в растворах, поэтому первая причина не так важна.
Более серьезные препятствия для использования длинных слов АЦП появляются при проведении длительных накоплений. При выполнении каждого прохождения к содержимому памяти компьютера добавляется массив 16-битных чисел. Если они по-прежнему представлены в форме двоичных целых чисел, то этот процесс может продолжаться только до тех пор, пока суммарное значение каждой точки данных умещается в слове памяти компьютера. Например, в таком нереальном случае, когда 16-битный АЦП (максимальное число 215 — 1 и знак) используется с 16-битным словом компьютера, переполнение произойдет уже при выполнении второго прохождения, содержащего сигнал максимальной величины.
Надо сказать, что такой случай не всегда бывает нереальным, поскольку 16 бит-это наиболее распространенная длина слова небольших компьютеров. Раньше, когда было очень трудно увеличивать объем памяти компьютера, недостаточная длина слова составляла довольно серьезную проблему. Для ее решения был предложен ряд схем усреднения данных в коротких словах [5]. Помимо этого часто изготовлялись спектрометры с необычной длиной слова в 20 или 24 бит, представляющие собой компромисс между стремлением к повышению длины слова и снижению стоимости, прибора. В последние годы произошло резкое снижение цен на компьютеры, и проблема исчезла сама собой. Поэтому мы прекратим дальнейшее обсуждение; заметим только, что 24-битное компьютерное слово при 12-битном АЦП достаточно для большинства применений (можно произвести несколько тысяч накоплений). При 16-битном АЦП 24-битного слова не хватает, и лучше использовать 32-битное. Более подробное обсуждение этой проблемы проводится в работах [4, 5].
Литература
Conover W. W„ in: Topics in Carbon-13 NMR Spectroscopy (ed. Levy G. C.), 4, 38-51, Wiley, 1984.
Hoult D.L, in: Topics in Carbon-13 NMR Spectroscopy (ed. Levy G. C.), 3, 16-27, Wiley, 1979.
Shoolery J.N., ibid., 28-38, 1979.
Martin M. L., Delpuech J.-J., Martin G. J., Practical NMR Spectroscopy, pp. 120-131, Heyden, 1980.
Cooper J. W, in: Topics in Carbon-13 NMR Spectroscopy (ed. Levy G. C.), 2, 411-419, Wiley, 1976.
Глава 4
Импульсная спектроскопия ЯМР
Введение
В этой книге рассматриваются физические процессы, но мы все же остаемся химиками и не станем моделировать их строгим математическим путем. Однако такой подход создает дилемму: стараясь не вдаваться в теоретические подробности импульсного ЯМР, мы рискуем превратить книгу просто в каталог экспериментов и остаться без всякого представления о процессах, происходящих в образце. В то же время попытки строгого описания даже такого простого двухимпульсного эксперимента, как COSY (гл. 8), могут привести к столь громоздким математическим выкладкам, что большинство из нас просто не станет их читать. Но мы постараемся удержаться между этими двумя крайностями и передать большинство основных концепций импульсного ЯМР с помощью простых физических представлений.
С их помощью можно на понятном качественном уровне описать релаксационный процесс (но не все его механизмы), воздействие идеальных радиочастотных импульсов на поведение макроскопической намагниченности, спиновое эхо и центральную концепцию двумерной спектроскопии - частотные метки. Однако еще две очень важные концепции импульсного ЯМР описать будет не так просто, хотя первую из них можно передать с помощью диаграмм заселенности простых спиновых систем. Это процесс переноса когерентности, а также возникновение и свойства многоквантовой когерентности.
В этой главе мы разработаем словарь, которым будем пользоваться в дальнейшем при описании импульсных экспериментов в форме образцов. Если она покажется вам слишком далекой от практики, то взгляните на любую из следующих глав, и вы поймете, что без глубинного понимания обсуждаемых здесь вопросов невозможно дальнейшее изучение книги. Самый лучший стимул к приобретению знаний о происходящих в образце процессах-это желание использовать их для решения практических задач. Поэтому будет очень хорошо, если вы попробуете реально выполнить некоторые многоимпульсные эксперименты.
Составные части эксперимента
Введение
Само явление ЯМР состоит во взаимодействии осциллирующего магнитного поля (радиочастотного поля) с объемной намагниченностью образца, которая возникла вследствие упорядоченности магнитных моментов входящих в него ядер в результате наложения постоянного магнитного поля. Это явление всегда наблюдается в макроскопических объектах, и большая часть его теории описывается в терминах классической физики. Например, полностью классической стала теория поглощения Блоха. Она не требует никаких представлений о квантовании уровней энергии. Но, как ни странно, часто именно это и вводит в заблуждение химиков, освоивших квантовую теорию. Они легко понимают переходы между различными дискретными энергетическими уровнями, но теряются, когда существование этих переходов выводится из простой классической намагниченности вещества.
Возможность описания явлений ЯМР как в терминах квантовой механики, так и классической физики дает большое преимущество и представляет собой одну из приятных особенностей предмета. Для наших целей больше подойдет классическая картина, и большая часть дальнейшего изложения будет связана с поведением именно макроскопической намагниченности. Об этом нужно постоянно помнить. Все те места текста, где мы будем переходить от микроскопической к объемной намагниченности, будут выделяться особо. Мы рассмотрим сначала поведение ядра в постоянном магнитном поле и природу радиочастотных электромагнитных волн и затем объединим их подходящим путем. Во всех последующих разделах мы будем рассматривать только ядра со спином 1/2. Символом В будет обозначаться магнитная индукция, которая удобна для измерения намагниченности в материалах с отличной от нуля магнитной восприимчивостью. Во многих публикациях вместо нее используется напряженность магнитного поля (символ Н) или В и Н совместно. При нашем эмпирическом подходе различие между ними не существенно. Кроме того, мы будем совершенно свободно переходить от угловой скорости (в рад/с), обозначаемой вектором ы или скаляром со, к соответствующей частоте v (в герцах), предполагая, что читатель будет преобразовывать их друг в друга мысленно по формуле со = 2л V.
Ядра
Мы, наверное, уже привыкли представлять себе ядро со спином 1/2 как маленький магнит, момент которого возникает вследствие вращения. Энергия этого ядра в постоянном магнитном поле становится зависимой от взаимной ориентации его спина и вектора напряженности поля. С точки зрения квантовой механики она может принимать два дискретных значения с квантовым числом т( + 1/2), которые в нашем
Рис. 4.1. Вращающийся заряд (например, протон) с угловым моментом J создает магнитный момент И = у — J. В магнитном поле его ось вращения будет прецессировать вокруг направления поля как гироскоп.
классическом представлении соответствует параллельной и антипарал- лельной ориентации спина ядра и поля. Таким образом, сигнал ЯМР- это последовательность переходов между двумя энергетическими уровнями, вызываемых воздействием радиочастотного поля. Для того чтобы перейти к макроскопическому описанию, рассмотрим движение наших маленьких ядерных магнитов более подробно.
Возникающие при движении угловой ядерный момент J и магнитный момент ц могут быть представлены в виде векторов. Их постоянное отношение мы назовем гиромагнитным отношением у. Именно эта константа определяет резонансную частоту ядра. Взаимодействие магнитного и углового моментов с постоянным магнитным полем Во (рис. 4.1) может быть описано в классических терминах:
di
— = Wx Во (4.1)
Это дифференциальное уравнение решить не так уж трудно (см. разд. 4.3.2), но нам этого делать не придется. Обратите внимание, что уравнение (4.1) аналогично уравнению движения тела, обладающего угловым моментом, в гравитационном поле, если вектор углового момента заменить на магнитный момент, а гравитационное поле-на магнитное. Почему это важно для нас? Потому что решение второго уравнения уже известно: это движение гироскопа. Гироскоп в гравитационном поле прецессирует, т. е. ось его вращения сама вращается вокруг направления поля. Точно такое же движение совершают и ядер- ные спины.
Таким образом, отдельное ядро имеет магнитный момент, прецессирующий с некоторой частотой вокруг направления поля. Эта частота называется ларморовой частотой ядра, а также частотой ЯМР-поглоще- ния со. Вы уже знаете, что она зависит от напряженности поля и внутренних свойств ядра, определяемых его гиромагнитным отношением: о = = — уВ0. Магнитный момент ядра может вращаться как по часовой стрелке, так и против (в зависимости от знака гиромагнитного отношения), но обязательно в одну и ту же сторону для всех одинаковых ядер.
Если мы расположим систему координат таким образом, чтобы
Рис. 4.2. При большом количестве магнитных моментов возникает избыточная намагниченность, направленная вдоль оси z. В этом направлении образец оказывается намагниченным.
направление поля совпадало с ее осью г, то магнитный момент ядра будет иметь постоянную проекцию на ось z и вращающуюся с ларморовой частотой проекцию на плоскость х — у. Вы можете считать z-компоненту магнитного момента тем самым маленьким магнитом из нашего начального представления о ядре. Именно ее ориентация определяет энергию системы. Заметьте, что с точки зрения ЯМР очень удобно определять напряженность магнитного поля как соответствующую ей частоту ларморовой прецессии, и часто можно слышать выражения типа: «Мы купили магнит на 500 МГц». Частота ларморовой прецессии оказывается удобной и для определения напряженности радиочастотного поля. Не забывайте, что каждое ядро имеет свою собственную ларморову частоту: магнит на 500 МГц для протонов-это то же самое, что магнит на 125 МГц для ядер углерода-13.
Теперь рассмотрим большое число спинов с одинаковой ларморовой частотой (рис. 4.2). Мы знаем, что параллельная ориентация z-компоненты магнитного момента и направления поля имеет более низкую энергию, чем антипараллельная. Поэтому, предположив, что между ними каким-то образом установилось термическое равновесие, можно ожидать в соответствии с уравнением Больцмана избыточного заселения низкого энергетического уровня. Таким образом, объемная намагниченность образца окажется параллельной направлению магнитного поля. В то же время все составляющие ее спины имеют прецессирующую в плоскости х — у компоненту. Но, поскольку все направления в этой плоскости эквивалентны и нет причин для выбора из них преимущественного, фаза прецессии будет случайной. Поэтому очень большое число равновесных спинов не будет иметь никакой намагниченности в плоскости х - у и общая намагниченность будет постоянна и параллельна направлению оси z.
Радиочастотное поле
Переменное напряжение, приложенное к катушке датчика ЯМР, создаст в образце переменное магнитное поле. Катушка имеет такую геометрию, что создаваемое ею поле оказывается перпендикулярным постоянному, т. е. его ось лежит в плоскости х — у. В идеальном случае
Рис. 4.3. Осциллирующее магнитное поле (в верхней части рисунка) эквивалентно двум вращающимся в противоположные стороны векторам намагниченности.
поле Bj (постоянное поле обозначается Во) должно быть однородным во всем объеме образца и резко спадать до нуля на его границах; на практике это, конечно, недостижимо. Напряженность переменного поля в несколько тысяч раз меньше напряженности постоянного, его частота должна совпадать с частотой наблюдаемого ядра, т. е. быть ларморовой.
Посмотрите на рис. 4.3. В его верхней части показана половина цикла осцилляции намагниченности при воздействии на нее радиочастотного поля. В нижней части рисунка намагниченность представлена в виде двух векторов постоянной амплитуды, вращающихся вокруг оси z в разных направлениях. Частота вращения совпадает с радиочастотой. Убедитесь, что сумма этих двух векторов будет вести себя точно так же, как осциллирующий вектор из верхней части рисунка. Иными словами, пара вращающихся в разные стороны векторов-тоже представление радиочастотного сигнала. Разложение переменного магнитного поля на два вращающихся вектора поможет нам яснее понять, каким образом оно взаимодействует с намагниченностью образца.
Вращающаяся система координат
Теперь посмотрим, что произойдет при взаимодействии радиочастотного поля с намагниченностью образца. Проблема состоит в том, что радиочастотное поле не постоянно, и даже постоянная намагниченность образца, будучи отклоненной от оси z, начнет совершать прецессирующее движение вокруг оси постоянного поля. В результате от такого большого числа различных вращательных движений может закружиться голова. Однако проблема легко решается, если подойти к ней с другой стороны. Чтобы исключить все вращения, достаточно ввести новую систему координат, связанную с прецессией ядра, и посмотреть, что при этом получится.
Вернемся ненадолго в микроскопический масштаб. Если наша система координат будет вращаться с той же скоростью и в том же
лабораторная система координатлабораторная система координатРис. 4.4. Типичная взаимная ориентация полей в эксперименте ЯМР. В лабораторной системе координат (слева) имеются постоянное поле, намагниченность образца и два вращающихся в противоположные стороны вектора радиочастотного поля. Переход к вращающейся системе координат упрощает картину за счет исчезновения постоянного поля и фиксации одного из векторов радиочастотного поля (второй просто игнорируется).Рис. 4.4. Типичная взаимная ориентация полей в эксперименте ЯМР. В лабораторной системе координат (слева) имеются постоянное поле, намагниченность образца и два вращающихся в противоположные стороны вектора радиочастотного поля. Переход к вращающейся системе координат упрощает картину за счет исчезновения постоянного поля и фиксации одного из векторов радиочастотного поля (второй просто игнорируется).Вращающаяся система координатВращающаяся система координат
лабораторная система координат
лабораторная система координат
Рис. 4.4. Типичная взаимная ориентация полей в эксперименте ЯМР. В лабораторной системе координат (слева) имеются постоянное поле, намагниченность образца и два вращающихся в противоположные стороны вектора радиочастотного поля. Переход к вращающейся системе координат упрощает картину за счет исчезновения постоянного поля и фиксации одного из векторов радиочастотного поля (второй просто игнорируется).
Рис. 4.4. Типичная взаимная ориентация полей в эксперименте ЯМР. В лабораторной системе координат (слева) имеются постоянное поле, намагниченность образца и два вращающихся в противоположные стороны вектора радиочастотного поля. Переход к вращающейся системе координат упрощает картину за счет исчезновения постоянного поля и фиксации одного из векторов радиочастотного поля (второй просто игнорируется).
Вращающаяся система координат
Вращающаяся система координат
направлении, что и прецессия ядра, то магнитный момент каждого индивидуального ядра будет в ней постоянным. Вместе с исчезновением прецессии должна исчезнуть и ее причина-внешнее поле, которого в новой системе координат уже нет. Однако объемная намагниченность образца остается по-прежнему направленной вдоль оси z (рис. 4.4). Поскольку частота поля Bt выбиралась равной ларморовой частоте, одна из двух компонент, на которые его можно разложить, становится постоянной в плоскости х — у. Вторая, вращающаяся с той же частотой в противоположном направлении, в новой системе координат вращается вдвое быстрее и не оказывает существенного влияния на эксперимент (для доказательства этого утверждения нам надо будет уйти далеко в сторону от основного предмета, поэтому мы примем его на веру).
Это преобразование координат изначально вводилось как некоторый математический прием для упрощения уравнений движения намагниченности, но мы позаимствуем эту идею и постараемся с ее помощью изобразить на рисунках процессы в образце. Подобный прием используется и в более известной задаче о вращательном движении, где переход к новой системе координат вызывает появление новой силы (центробежной) аналогично тому, как в нашем случае исчезло поле Во. В дальнейшем мы к этому еще вернемся и рассмотрим более строго. При обозначении осей стационарной и вращающейся систем координат принято использовать различные буквы, например х, х' и у, у', для того чтобы подчеркнуть их различие. Однако в этой книге мы будем иметь дело почти всегда с вращающейся системой координат и только на качественном уровне, поэтому не будем использовать такие обозначения. В тех же случаях, когда рассматривается стационарная система координат (в основном в следующем разделе), рисунки будут снабжены дополнительными указаниями.
Импульс!
Теперь мы уже можем рассмотреть, что же происходит в образце во время радиочастотного импульса, т. е. что происходит при включении на некоторый промежуток времени поля Bt и последующем его выключении. Во вращающейся системе координат вектор намагниченности образца и вектор поля В; постоянны; первый направлен по оси z, а второй-под прямым углом к нему, допустим, по оси х (рис. 4.5). В соответствии с правилом правой руки из школьного курса физики два перпендикулярных вектора намагниченности вызывают появление вращательного момента, перпендикулярного им обоим, и система начинает работать как настоящий мотор. Намагниченность образца вращается вокруг вектора поля В; (т. е. вокруг оси х) со скоростью, зависящей от напряженности поля, и в конце концов проходит через плоскость х — у. Если мы как-то узнали скорость его вращения, то можно рассчитать, в какой момент намагниченность будет направлена по оси у, и выключить поле Bv Мы осуществим поворот намагниченности на 90°, т. е. 90°- или л/2 (в радианах)-импульс. Теоретически, включая поле на различные промежутки времени, можно повернуть вектор намагниченности на любой угол, где каждые 360° будут возвращать намагниченность в начальное положение. Однако на практике возможно только несколько поворотов, после которых по целому ряду причин намагниченность исчезает.
Теперь рассмотрим, что будет происходить после выключения поля В; и поворота намагниченности на угол л/2. Мы хотим узнать, что обозначает ситуация, когда вектор намагниченности направлен по оси у, а поля В; уже нет (рис. 4.6). Доказав ранее, что во вращающейся системе координат радиочастотный сигнал может быть представлен в виде суммы постоянного и вращающегося с двукратно ларморовой частотой векторов, мы можем предположить (и вполне справедливо), что этот новый постоянный вектор сохраняет сущность радиочастотного сигнала. Вернувшись назад в стационарную систему координат (рис. 4.6), мы сможем яснее понять происходящее. В лабораторной системе координат
радиочастотное Выключенорадиочастотное ВыключеновключеновключеновыключеновыключеноРис. 4.5. Импульс! При включенном радиочастотном поле намагниченность образца совершает вращательное движение. Мы можем выключить поле в любой момент (в нашем случае в момент достижения вектором намагниченности оси у).Рис. 4.5. Импульс! При включенном радиочастотном поле намагниченность образца совершает вращательное движение. Мы можем выключить поле в любой момент (в нашем случае в момент достижения вектором намагниченности оси у).
радиочастотное Выключено
радиочастотное Выключено
включено
включено
выключено
выключено
Рис. 4.5. Импульс! При включенном радиочастотном поле намагниченность образца совершает вращательное движение. Мы можем выключить поле в любой момент (в нашем случае в момент достижения вектором намагниченности оси у).
Рис. 4.5. Импульс! При включенном радиочастотном поле намагниченность образца совершает вращательное движение. Мы можем выключить поле в любой момент (в нашем случае в момент достижения вектором намагниченности оси у).
Ьращакпцояся система коорОинат
Включено
частотное
Выключено
Рис. 4.6. После выключения поля В, намагниченность остается в плоскости х — у. В лабораторной системе координат мы увидим ее прецессию вокруг оси постоянного поля и, следовательно, появление радиочастотного сигнала.
Рис. 4.7. Импульсы с различными углами поворота намагниченности. Во многих экспериментах ЯМР используются только л/2- и л-импульсы.
намагниченность образца вращается с ларморовой частотой вокруг оси z. Построив проекции этого вращающегося вектора на оси х и у, мы получим два радиочастотных сигнала, в некотором смысле ортогональные друг другу. Именно эти два сигнала измеряются в эксперименте ЯМР в качестве спада свободной индукции (ССИ). Они могут регистрироваться как раздельно, так и в определенной смеси. Это зависит от условий регистрации, которые будут подробно разбираться далее.
Теперь нам легко понять эффект от импульсов различной длительности. На рис. 4.7 приведены некоторые примеры. Все импульсы с продолжительностью, отличной от л/2, оставляют некоторую часть z-на- магниченности, не создающей сигнала ССИ. Только ее компонента в плоскости х — у способна создавать напряжение в катушке приемника. Таким образом, л/2-импульс (или теоретически Зл/2, 5л/2 и т. д.) создает максимальный сигнал (это верно только для экспериментов из Одного прохождения). И напротив, л-импульс (или 2л, Зл, ...) вообще не вызывает появления сигнала, поскольку он помещает намагниченность на ось z. В гл. 7 это свойство будет использовано для определения длительности л-импульса, а следовательно, и напряженности поля ВР
Векторы и уровни энергии
Рассматривая объемную намагниченность как классическую величину, что мы и будем делать на протяжении большей части книги, мы тем самым избегаем погружения в пучины квантовой механики и матриц плотности. В этом состоит недостаток нашего подхода: мы не сможем понять подробностей, связанных с квантовомеханическими свойствами, такими, как перенос когерентности и критерий многоквантовой когерентности (гл. 8). Это необходимое для книги без формул упрощение, и оно должно вам понравиться. Однако неправильно будет полностью игнорировать тот факт, что молекула имеет квантованные уровни энергии. Мы вполне можем рассмотреть хотя бы влияние импульсов на заселенность этих уровней. Обсуждение заселенностей может помочь нам в понимании экспериментов с переносом когерентности. Этот подход мы и будем использовать в следующих главах.
Рассмотрим систему с двумя уровнями энергии а и Р (рис. 4.7а) и предположим, что на них должно разместиться N молекул. Если уровни равны по энергиям, то на каждом из них окажется по N/2 молекул. Но если энергия состояния а чуть меньше, чем р, то оно будет иметь некоторый избыток заселенности. Пусть на уровне а находится на 5 ядер больше, чем на уровне р. Тогда их заселенности равны (N + 8)/2 и ^ — 8)/2 соответственно. Для того чтобы рассчитать изменения заселенностей уровней при воздействии на систему импульса с углом поворота 6, мы рассмотрим поведение z-компоненты намагниченности. Для расчетов удобнее использовать избыток заселенностей (т. е. отклонения от числа 7V/2) Ра и Рр, которые изначально имели величины + 8/2 и - 8/2.
В любой момент времени z-компонента намагниченности пропорциональна разности заселенностей уровней:
Мг ос (Р« - Рр)(4.2)
поэтому сначала Мо пропорциональна 8. Кроме того, нам известно, что
Ра + Рр = 0(4.3)
После 0-импульса z-компонента равна (рис. 4.7а)
Mz = M0cosO(4.4)
Рис. 4.7а. Начальные заселенности двухуровневой системы (слева) и влияние импульса с углом поворота 6 на z-компоненту вектора намагниченности (справа).
отсюда
(4.5)(4.6)(4.5)(4.6)Ра — Рр = 8 COS 6
(4.5)
(4.6)
(4.5)
(4.6)
Учитывая (4.3), мы рассчитываем новые заселенности
8 cos 6„— 8 cos 6
Ра = -^—, Рр=
Эти простые формулы позволяют нам отнести все, что мы уже знаем о к/2- и к-импульсах, к поведению квантованных уровней энергии. Если О = к/2, то cos 6 = 0 и избыток заселенностей отсутствует, т. е. импульс выравнивает заселенности. Если 0 = к, то cos 0 = — 1 и заселенности инвертируются.
Реальный эксперимент
Введение
В разд. 4.2 мы исходили из предположения, что в эксперименте участвует только один сигнал, т. е. все ядра имеют одинаковую ларморову частоту, ту же, что и радиочастотное поле, попадающее таким образом точно в резонанс. В реальной спектроскопии такого не бывает; ее предмет состоит как раз в измерении различий резонансных частот ядер образца. Для того чтобы на одном рисунке во вращающейся системе координат одновременно изобразить несколько частот, в большей части книги мы будем поступать весьма свободно, выбирая такую частоту вращения, чтобы картина была наиболее простой. При этом нам придется игнорировать все последствия неидеальности условий поведения эксперимента. Однако, перед тем как войти в этот мир фантазий о бесконечно сильном и однородном поле Вп о бесконечно больших (в масштабах импульсных последовательностей) временах релаксации, мы постараемся коротко описать ситуацию нарушения резонансных условий каким-либо не очень сложным способом. Если этот вопрос вас не интересует, то пропустите разд. 4.3.2; это не должно причинить серьезного ущерба вашим знаниям. Но разд. 4.3.3 и 4.3.4 следует обязательно уделить внимание, поскольку в них будут приниматься некоторые используемые в дальнейшем условия.
Когда импульс не попадает в резонанс
Чтобы понять, что произойдет, когда поле Bt конечной мощности будет иметь частоту, отличающуюся от точно резонансной, нам надо подробнее рассмотреть поведение намагниченности во вращающейся системе координат. Хотя в этом разделе мы будем иметь дело только с магнитным моментом ц отдельного ядра, он в точности отражает поведение всей объемной намагниченности М. Если приводимая здесь алгебра покажется вам слишком сложной, то уделите больше внимания
приводимым в конце результатам в геометрической форме- они должны быть понятнее.
Мы уже приводили уравнение зависимости движения углового момента J от вращательного момента ц х Во, возникающего при взаимодействии ядерного магнитного момента и постоянного поля Во:
d5
— = Ц X Во(4.1)
at
Используя определение гиромагнитного отношения у:
p = 7J(4.7)
мы можем заменить J
du
= у р X Во(4.8)
at
в стационарной системе координат. Скорость изменения ц в системе координат, вращающейся с угловой скоростью ю, имеет вид
= у ц х ^Во + —у(4.9)
(эту формулу можно проверить в [1]). Если мы присвоим переменной о значение too, такое, что too = — у Во, то в системе координат, вращающейся со скоростью ю0,
= о(4.10)
о t
т. е. магнитный момент становится стационарным. Следовательно, в лабораторной системе координат он прецессирует с угловой скоростью — у Во, равной ларморовой частоте. Этот удивительно простой вид решения векторного дифференциального уравнения (4.8) как раз и послужил причиной преобразования координат.
Теперь добавим поле В] и выберем такое значение to, при котором один из компонентов В] стационарен во вращающейся системе координат. В этом случае
-^ = уцх Во + В1 + -(4.11)
Ы\у/
Если частота В] совпала с резонансной, то to = too и
— = уц X I Во + Bj + —I
\у /
= уц X (Во + Bj - Во) = уц X В](4.12)
Это уравнение имеет ту же форму, что и (4.8), описывающее, как мы уже знаем, прецессию вокруг Во. Следовательно, в последнем случае на-
лабораторная система координат
Ьращающаяся система координатЬращающаяся система координат(4.14)(4.14)
Ьращающаяся система координат
Ьращающаяся система координат
(4.14)
(4.14)
Рис. 4.8. Если импульс не попадает точно в резонанс, то во вращающейся системе координат влияние постоянного поля не исчезает полностью. Намагниченность образца вращается вокруг векторной суммы остаточного поля и Вр
магниченность будет вращаться со скоростью — yBj вокруг направления поля ВР
Если го не равна го0 (т.е. В] не попадает в резонанс), то
(4-13)(4-13)8 и/го\/го — гоп
(4-13)
(4-13)
— = ур х Во + - + Вх = ур х - + В
ot\У/X У '
Мы можем рассматривать член (го — ю0)/у как некоторое редуцированное постоянное поле Вг во вращающейся системе координат. Тогда ц будет прецессировать вокруг суммы Bt и Вг (рис. 4.8), т. е. вокруг так называемого эффективного поля Beff. Это дает нам критерий для выбора величины напряженности поля Bt: поскольку большинство экспериментов построено в расчете на то, что во вращающейся системе координат все векторы вращаются вокруг одной и той же оси, не следует слишком сильно отклоняться от этого условия. Другими словами, угол 9 на рис. 4.8 должен быть малым. О можно определить уравнением
„ <о — <оо tgo = ——
У Si
Поэтому член у Bv (скорость прецессии вокруг В] или, если хотите, напряженность поля, выраженная в единицах частоты, как мы это делали для постоянного поля в разд. 4.2.2) должен быть достаточно большим в сравнении с максимальной ожидаемой величиной расстройки резонанса го — <оо.
Рассмотрим какой-либо конкретный пример. Допустим, мы решили, что 0 не должно превышать 1°. Для протонного спектра с диапазоном в 10 м. д. на 200 МГц максимальный отход от резонанса составит
1000 Гц (5 м. д.). Тангенс 0 имеет величину порядка 0,017, поэтому напряженность поля должна быть 1000/0,017 « 60 кГц. При этих условиях длительность л/2-импульса составит около 4 мкс-вполне реальная величина для этой частоты на 5-мм датчике. Именно это требование вращения магнитных моментов различных серий ядер вокруг примерно одной и той же оси объясняет необходимость использования коротких мощных импульсов в фурье-спектроскопии ЯМР.
Проделав те же вычисления для наблюдения углерода на спектрометре с частотой 500 МГц (частота углерода 125 МГц), где максимальная расстройка резонанса составит около 15 кГц, мы получим длительность л/2-импульса 0,3 мкс. Однако на практике при работе с жидкостями на спектрометрах высокого разрешения эта величина составляет чаще всего 15-20 мкс на 10-мм датчике, что соответствует максимальному значению угла эффективного поля около 45°. Это служит основным камнем преткновения для проведения большого числа многоимпульсных экспериментов, и именно здесь ведутся активные конструкционные разработки. Частично решить эту проблему можно с помощью остроумной концепции составных импульсов, которой мы еще коснемся в гл. 7.
Воздействие на систему импульса, не попавшего в резонанс, зависит от его длительности. В случае л/2-импульса, когда основной объект облучения должен полностью потерять z-намагниченность, вектор намагниченности ядер, не попавших в резонанс, не доходит до плоскости х — у из-за наклонного положения оси вращения. Однако, поскольку напряженность эффективного поля ВеГГ больше, чем В^ вектор вращается быстрее. В результате такой «самокомпенсации» л/2-импульс вполне пригоден для элиминирования z-намагниченности в широком
Рис. 4.9а. Если нас интересует только степень переноса z-намагниченности в плоскость х — у, то для л/2-импульса эффекты расстройки резонанса не так велики.
Рис. 4.96. В случае л-импульса мы заинтересованы только в инверсии намагниченности; наклонное положение оси вращения создает большие помехи.
диапазоне частот, но векторы намагниченности с различной расстройкой от резонанса приходят в поперечную плоскость с фазовыми ошибками (рис. 4.9а).
В случае л-импульса, наоборот, важно полностью удалить намагниченность в плоскости х — у. Здесь уже не помогает повышенная скорость прецессии вокруг Beff, поскольку при этом вектор попадает в плоскость х — z (рис. 4.96). Большие различия в эффективности инверсии намагниченности могут составлять основной источник ошибок в таких экспериментах, как обсуждающийся далее метод инверсии-восстановления для измерения Tv
Когда детектируется несколько частот одновременно
Теперь, независимо от того, ознакомились вы с предыдущим разделом или решили сэкономить время, мы не будем прибегать к формальному математическому описанию, а постараемся на качественном уровне разобраться с образцами, дающими несколько линий в спектре. При этом мы будем полностью пренебрегать всеми рассмотренными в предыдущем разделе эффектами. Воздействуя на образец некоторым импульсом, мы предполагаем, что все векторы намагниченности различных ядер проделывают один и тот же поворот вокруг одной и той же оси. Таким образом, в результате л/2-импульса объемная намагниченность, представляющая собой сумму намагниченностей различных ядер, будет направлена по некоторой оси в плоскости х — у. Очень часто нас будет интересовать ее поведение в промежуток времени между последовательными импульсами. Поскольку вращающаяся система координат может вращаться со скоростью только одного из ядер, нам придется иметь дело со значительно более сложным объектом, чем сохраняющий
послеспустя</2-импулманекоторое бремяпослеспустя</2-импулманекоторое бремя
послеспустя
</2-импулманекоторое бремя
послеспустя
</2-импулманекоторое бремя
Рис. 4.10. Две линии во вращающейся системе координат. Мы выбираем такую скорость вращения системы координат, чтобы одна из линий была в ней стационарна. Вторая прецессирует с частотой, равной ее относительному химическому сдвигу.
неизменным свое направление стационарный вектор. В этом вопросе легче всего разобраться на нескольких примерах.
Рассмотрим сначала только две линии с разностью частот между ними v (рис. 4.10). Если мы выберем частоту вращения системы координат равной частоте одной из них, то намагниченность соответствующих ей ядер после л/2-импульса будет сохранять свое направление вдоль оси у. Намагниченность, соответствующая второй линии, также сразу после импульса оказавшаяся на оси у, прецессирует с отличной от первой линии частотой (различие незначительное, поскольку химические сдвиги обычно составляют несколько миллионных долей ларморовой частоты), и ее прецессия полностью не исчезает во вращающейся системе координат. Вектор намагниченности прецессирует вокруг оси z с частотой, равной разности химических сдвигов двух ядер. Если вспомнить, что единица измерения частоты-герц-соответствует просто числу оборотов в секунду, то мы легко можем рассчитать положение намагниченности в любой момент времени t. За каждые 1/v с она будет совершать полный оборот вокруг системы координат, за t с повернется на 2л vz рад. Такое преобразование абсолютной частоты прецессии ядра (порядка мегагерц) в частоту, представляющую разность химических сдвигов между ними (обычно порядка килогерц), напоминает процесс вычитания опорной радиочастоты из сигнала ЯМР перед его оцифровкой (гл. 2). И действительно, частота вращения системы координат вполне может служить опорной частотой.
Однако еще больший интерес представляет случай, когда различные компоненты намагниченности в плоскости х — у соответствуют частям мультиплета, иными словами, когда разность частот сигналов представляет собой не химический сдвиг, а константу спин-спинового взаимодействия. На рис. 4.11 показана эволюция компонент триплета. В качестве опорной частоты (скорости вращения системы координат) была выбрана частота центральной линии триплета (т.е. его химический сдвиг), и поэтому намагниченность этой линии остается постоянной. Две другие компоненты во вращающейся системе координат движутся в противоположных направлениях со скоростями + J и — J об/с
Рис. 4.11. Для мультиплета опорную частоту удобно установить равной химическому сдвигу сигнала. Так выглядит результат для триплета.
Рис. 4.12. Определите, где будут находиться компоненты дублета после 1/J с.
(+ 2kJ рад/с). Каждые 1/J с они собираются все вместе на оси + у.
Теперь аналогичным образом рассмотрим дублет. Поместим опорную частоту на его химический сдвиг (т. е. в центр между линиями, см. рис. 4.12). Через тот же промежуток времени его компоненты соберутся вместе, но на противоположном направлении оси у.
Оси и фазы
Итак, с одной стороны, мы совершенно произвольным образом выбирали направления в плоскости х — у, располагая поле Bt вдоль оси х и создавая л/2-импульсом начальную намагниченность образца вдоль оси у. С другой стороны, возвращаясь после импульса в лабораторную
Вращающаясясистемакоординат
Рис. 4.13. Тщательно проанализировав поведение намагниченности образца в лабораторной системе координат после (л/2)х-импульса, мы обнаружим два радиочастотных сигнала, отличающиеся только по фазе на 90°.Рис. 4.13. Тщательно проанализировав поведение намагниченности образца в лабораторной системе координат после (л/2)х-импульса, мы обнаружим два радиочастотных сигнала, отличающиеся только по фазе на 90°.после(ц/2)у импульсапосле(ц/2)у импульсасистему координат, мы по-прежнему находили два «в некотором смысле ортогональных» радиочастотных сигнала, осциллирующие вокруг различных осей неподвижной системы координат. Эта ситуация требует дополнительных разъяснений, поскольку именно поведение намагниченности после импульса в неподвижной системе координат дает нам ключ к пониманию происходящих событий. Рассмотрим рис. 4.13. Здесь мы снова возвращаемся к простейшему случаю единственной линии с точно резонансными опорной частотой и частотой импульса. Во вращающейся системе координат намагниченность образца поворачивается на 90° вокруг оси х и остается на оси у. Теперь вернемся в лабораторную систему и посмотрим, что произойдет, если намагниченность будет прецессировать с ларморовой частотой.
Рис. 4.13. Тщательно проанализировав поведение намагниченности образца в лабораторной системе координат после (л/2)х-импульса, мы обнаружим два радиочастотных сигнала, отличающиеся только по фазе на 90°.
Рис. 4.13. Тщательно проанализировав поведение намагниченности образца в лабораторной системе координат после (л/2)х-импульса, мы обнаружим два радиочастотных сигнала, отличающиеся только по фазе на 90°.
после
(ц/2)у импульса
после
(ц/2)у импульса
Предположим, что мы умеем независимо друг от друга детектировать проекции намагниченности на оси х и у лабораторной системы координат, но не будем задумываться, каким конкретно способом это можно сделать. Они, очевидно, будут различаться только тем, что непосредственно после импульса у-компонента будет иметь максимальную величину, а х- минимальную. Иными словами, они различаются только фазой-, осцилляция х-компоненты описывается функцией синус, а у-компоненты-функцией косинус. Однако наводимое в катушке приемника напряжение пропорционально не намагниченности, а скорости ее изменения, поэтому в нулевой момент времени х-компонента создает максимальное напряжение, а у-компонента-минимальное (производная синуса-косинус, а производная косинуса-минус синус). Эти два сигнала, различающиеся по фазе на 90°, называются сигналами поглощения и дисперсии. Им соответствуют две различные формы
8-75
бращоющоябясистемакоординат
Рис. 4.14. То же, что и на рис. 4.13, но после (л/2)у-импульса.Рис. 4.14. То же, что и на рис. 4.13, но после (л/2)у-импульса.К/2-импульсаК/2-импульсалоренцевой линии, с которыми мы уже встречались в гл. 2. В ЯМР с непрерывной разверткой спектрометр настроен на регистрацию только сигнала поглощения (там тоже существуют обе его компоненты, хотя и используется другая схема возбуждения). В фурье-спектроскопии им соответствуют действительная и мнимая части комплексного спектра. Как мы вскоре увидим, в общем случае это смеси двух компонент.
Рис. 4.14. То же, что и на рис. 4.13, но после (л/2)у-импульса.
Рис. 4.14. То же, что и на рис. 4.13, но после (л/2)у-импульса.
К/2-импульса
К/2-импульса
Теперь попробуем проделать все то же самое, но поместим поле Bt вдоль оси у (рис. 4.14). Легко видеть, что мы получим тот же результат, но синусная и косинусная компоненты поменяются местами (и косинусная еще поменяет знак). Повернем поле Bt еще на 90° так, чтобы оно совпало с осью — х (рис. 4.15). Ситуация станет похожа на исходную: но обе компоненты поменяют знак (их фазы сдвинутся на 180°). Если сигналы, возбужденные импульсами поля Bt с осей + х и — х, преобразовать независимо и первый из них будет «положительный», то во втором мы обнаружим «отрицательные» пики. Важно понимать, что это происходит по причине изменения фазы сигнала, а не от замены поглощения энергии ее испусканием. В обоих случаях энергия испускается образцом.
Нам не нужно подробно рассматривать экспериментальные методы разделения сигналов поглощения и дисперсии, но полезно в общих чертах узнать об основах этого процесса. Как уже упоминалось несколько раз, при детектировании сигнала ЯМР из него вычитается некоторая опорная частота, в результате чего все сигналы попадают в звуковой диапазон и могут быть оцифрованы. Мы приравнивали эту частоту скорости вращения системы координат. Прибор, выполняющий это вычитание (обычно так называемый двойной балансный смеситель, но возможны и другие варианты), контролирует сочетание фаз сигнала и опорной частоты (это фазочувствительный детектор). Соответствую-
вращающаясясистемакоординат
Рис. 4.15. То же, что и на рис. 4.13, но после (л/2)_,-импульса.Рис. 4.15. То же, что и на рис. 4.13, но после (л/2)_,-импульса.(«72^-импульса(«72^-импульсаWo ♦Wo ♦щий подбор фазы опорного сигнала позволяет выделять ту или другую компоненту или любые их смеси.
Рис. 4.15. То же, что и на рис. 4.13, но после (л/2)_,-импульса.
Рис. 4.15. То же, что и на рис. 4.13, но после (л/2)_,-импульса.
(«72^-импульса
(«72^-импульса
Wo ♦
Wo ♦
Если фаза опорного сигнала в точности равна фазе сигнала ЯМР, то он будет регистрироваться в режиме чистого поглощения. Если фазы отличаются на 90°, то будет выделяться чисто дисперсный сигнал. Однако на практике обычно регистрируется смесь компонент, поскольку нет никакой необходимости или удобства в настройке прибора на какой-либо специальный режим. Точно так же, как мы выбрали частоту опорного сигнала в качестве скорости вращения системы координат, мы можем использовать ее фазу для задания осей х и у. Но так как это не соответствует процедуре эксперимента на импульсном спектрометре, мы будем использовать другое определение, которое сейчас коротко обсудим. Если вы работали на спектрометре с непрерывной разверткой с низким магнитным полем, то вам почти наверняка приходилось подстраивать опорную фазу приемника для получения формы линии, соответствующей чистому поглощению, когда ее небольшая расстройка давала примесь дисперсионной компоненты (рис. 4.16).
Рис. 4.16. Влияние расстройки фазы детектора на вид спектра известно еще из спектроскопии ЯМР с непрерывной разверткой (это один из двух спектров на частоте 60 МГц во всей книге!).
Теперь вы уже можете догадаться о важности «установки поля Bj на ось х», т. е. настройки фазы радиочастотного импульса. Поскольку важна только относительная фаза, мы можем просто-напросто назвать наш первый импульс х-импульсом, и если нужно далее произвести у-импульс, то можно сместить фазу первого на 90°. Для — х-импульса потребуется смещение на 180°, для — у-импульса-на 270° (такие импульсы бывают нужны в некоторых экспериментах). Именно эти фазы передатчика и задают названия осей во вращающейся системе координат. В идеальном случае хотелось бы и опорную фазу приемника настроить таким образом, чтобы она соответствовала одной из осей, но, как уже упоминалось ранее, это оказывается невозможным на импульсных спектрометрах. Фаза приемника связана некоторым произвольным (но постоянным) соотношением с фазой передатчика, поэтому в экспери-
Рис. 4.17. Во всех экспериментах используются только импульсы с четырьмя фазами, приведенными на этом рисунке.Рис. 4.17. Во всех экспериментах используются только импульсы с четырьмя фазами, приведенными на этом рисунке.
Рис. 4.17. Во всех экспериментах используются только импульсы с четырьмя фазами, приведенными на этом рисунке.
Рис. 4.17. Во всех экспериментах используются только импульсы с четырьмя фазами, приведенными на этом рисунке.
менте регистрируется в общем случае смесь двух компонент сигнала. После выполнения преобразования Фурье они разделяются численным способом, который мы обсудим в дальнейшем. На этом этапе исправляются и фазовые ошибки, возникающие по другим причинам.
Все это станет намного яснее, когда мы перейдем к реальным экспериментам. Введение подходящих фазовых соотношений между наборами импульсов для воздействия на отдельные компоненты общей намагниченности-один из важнейших элементов импульсного ЯМР. Теперь мы будем обозначать импульсы в форме (л/2)ф, где <р обозначает фазу импульса и соответственно ось, вокруг которой вращается намагниченность во вращающейся системе координат. Таким образом, (л/2)х- импульс поворачивает намагниченность вокруг оси х и оставляет ее на оси + у; (л/2)у поворачивает вокруг оси у и т. д. (рис. 4.17). Повороты принято считать происходящими по часовой стрелке (реальное направление зависит от знака у, но, поскольку он постоянен для одного типа ядер, не имеет значения, какое конкретно направление мы выберем). Во многих экспериментах меняется также и фаза приемника, которую мы будем обозначать просто буквами х, у и т. д., подразумевая при этом, что при необходимости в дальнейшем будут использованы процедуры численной коррекции фазы. Дополнительные сложности, вносимые фазой приемника, будут обсуждены в следующем разделе.
Квадратурное детектирование
Вам может показаться, что данный раздел относится только к специалистам, поскольку квадратурное детектирование-это некоторая инструментальная методика, предназначенная для повышения чувствительности. Если вас интересуют только одномерные спектры, то такую точку зрения вполне можно допустить. Однако проблемы, которые мы намерены сейчас рассмотреть, снова появятся в слегка измененном виде в двумерной спектроскопии ЯМР, и нам будет намного легче ориентироваться в них, если мы сначала разберемся с одномерным случаем. Кроме того, при регистрации одномерных спектров с очень большим динамическим диапазоном неидеальность систем квадратурного детектирования может вызывать появление квадратурных отражений. Метод подавления этих отражений служит введением в теорию фазовых циклов, которая чрезвычайно важна в многоимпульсных экспериментах. Если вы впервые знакомитесь со спектроскопией ЯМР, то вам лучше пока пропустить этот раздел. Вернитесь к нему позже, когда почувствуете необходимость разобраться в этом материале.
Мы уже много раз говорили о том, что сигналы в импульсном ЯМР регистрируются посредством вычитания из них опорной частоты, близкой к резонансной частоте ядра, оцифровки и последующего их преобразования в частотный спектр. Свойства преобразования Фурье создают дополнительные проблемы при выборе опорной частоты. На первый взгляд может показаться, что лучше всего поместить ее в центр
Рис. 4.18. Середина спектрального окна кажется самым подходящим местом для помещения опорной частоты детектора, однако при этом нам нужно будет регистрировать как положительные, так и отрицательные частоты. Они будут различимы только при использовании двухфазного (квадратурного) детектиро- .вания.
спектрального диапазона, так чтобы половина линий имела частоты большие, а половина-меньшие, чем опорная (рис. 4.18). Основное преимущество такого выбора состоит в том, что он позволяет понизить необходимую скорость работы аналого-цифрового преобразователя (АЦП). Если ширина спектра составляет F Гц, то необходимо обрабатывать частоты только до F/2 (при этом в соответствии с критерием Найквиста АЦП должен работать со скоростью F Гц). Но, к сожалению, при использовании только одной компоненты сигнала для преобразования Фурье в получающемся частотном спектре положительные и отрицательные частоты будут неразличимы. Если во временном представлении ССИ содержится сигнал с частотой v0 + 8 (где 5-расстояние от сигнала до опорной частоты), то в частотном спектре ему будут соответствовать два пика + 5, поскольку положительные и отрицательные частоты неразличимы.
Чтобы понять, как это все происходит, вообразим себя ЯМР-детектором и посмотрим на сигналы во вращающейся системе координат. Чтобы отличить друг от друга положительные и отрицательные частоты, нам нужно узнать, в какую сторону прецессируют соответствующие им векторы намагниченности во вращающейся системе координат, которая вращается, разумеется, со скоростью v0. Если мы наблюдаем только проекцию вектора на одну какую-либо ось, то независимо от
сигнал ЯМРсигнал ЯМРсразо- чубстбитель- . ньш детекторсразо- чубстбитель- . ньш детекторО-опорнаяО-опорнаяфазафазаСОоСОо'-90-опорная'-90-опорнаяфазафазаАЦПАЦПЧ память ^компьютера АЧ память ^компьютера А
сигнал ЯМР
сигнал ЯМР
сразо- чубстбитель- . ньш детектор
сразо- чубстбитель- . ньш детектор
О-опорная
О-опорная
фаза
фаза
СОо
СОо
'-90-опорная
'-90-опорная
фаза
фаза
АЦП
АЦП
Ч память ^компьютера А
Ч память ^компьютера А
АЦПАЦПпомять тьютера Впомять тьютера Вуазо-чубстбцтель-a HblUдетектор
АЦП
АЦП
помять тьютера В
помять тьютера В
Рис. 4.19. Схема эксперимента для квадратурного детектирования.
направления его вращения мы увидим только осциллирующую вниз и вверх намагниченность. Такой взгляд слишком узок для полного понимания происходящих событий. Мы можем его расширить, наблюдая одновременно две проекции вектора намагниченности на разные оси. Сравнивая величины этих проекций друг с другом в каждый момент времени, мы сможем легко определить направление вращения вектора.
Такое наблюдение сигнала называется квадратурным детектированием. Реально оно состоит в использовании двух фазочувствительных детекторов с одинаковыми опорными частотами, но с различающимися на 90° фазами (рис. 4.19). Для простоты предположим, что первый настроен на регистрацию косинусной компоненты намагниченности, а второй-синусной (на практике каждый из них регистрирует смесь обеих компонент). Оба сигнала оцифровываются отдельно друг от друга и становятся действительной и мнимой частями комплексного спектра. После выполнения комплексного преобразования Фурье мы получим правильно распределенные положительные и отрицательные частоты. Чтобы понять, почему это происходит, нам пришлось бы углубиться в математику преобразования Фурье дальше, чем это нужно неспециалисту. Однако мы вполне можем понять происходящее на качественном уровне, если используем одно из известных свойств преобразования Фурье-сохранение симметрии функции.
Под симметрией функции подразумевается ее поведение при изменении знака переменной. Мы выделим два случая: если /(— х) = /(х), то функция / будет называться четной, если же /( — х) = — f(x),-нечетной. Мы сразу сообразим, что синус-это нечетная функция, а косинус-четная (рис. 4.20). Четность или нечетность функции во временной области (т. е. наличие косинусной или синусной компоненты) - сохранится и в частотной области, где будет проявляться в совпадении или различии знаков амплитуды двух компонент комплексного спектра поглощения на частотах + б и — б. Следовательно, выполнив преобразование, вклю-
_ четная составляющая_ четная составляющая— нечетнаясоставляющая— нечетнаясоставляющаясуммасуммаРис. 4.20. Очевидно, что си-нус-это нечетная функция, акосинус-четная (см. текст).
_ четная составляющая
_ четная составляющая
— нечетнаясоставляющая
— нечетнаясоставляющая
сумма
сумма
Рис. 4.21. Для того чтобы понять, как различаются положительные и отрицательные частоты, вообразим себе две компоненты комплексного спектра, полученные раздельно и затем совмещенные.
чающее обе компоненты, т. е. комплексное преобразование данных квадратурного детектирования, мы в частотном спектре одну линию усилим, а вторую уничтожим. На этом нашу дискуссию можно считать исчерпанной. На рис. 4.21 приведена иллюстрация из книги Фукусимы и Ройдера [2], где вы можете найти более подробное обсуждение предмета.
Может показаться, что вполне пригоден и такой способ регистрации, когда опорная частота помещается на один из краев спектрального диапазона и все детектируемые сигналы имеют одинаковый знак (рис. 4.22). Однако при этом появляются некоторые сложности. Даже если мы можем гарантировать, что по одну сторону опорной частоты не будет сигналов, то там все же неизбежно будет шум. В отсутствие квадратурного детектирования он будет накладываться на шум в интересующем нас диапазоне, понижая отношение сигнал/шум на ^/2 (именно на ^/2, а не на 2, потому что шум имеет случайную природу; применяется статистическая теорема о центральном пределе).
Повышение отношения сигнал/шум-одно из принципиальных преимуществ квадратурного детектирования, и именно по этой причине оно
Гц
Рис. 4.22. Такое помещение опорной частоты детектора позволяет решить проблему отрицательных частот, но при однофазном детектировании на спектр будет накладываться дополнительный шум (находящийся справа от опорной частоты на нашем рисунке).
так широко используется на современных спектрометрах. Но есть и другие более или менее существенные достоинства. При помещении опорной частоты в центр спектрального диапазона требуется регистрация максимальной частоты, в 2 раза меньшей ширины спектра, что снижает требования к скорости АЦП. Но здесь уже требуются два АЦП, и суммарные затраты на оцифровку можно считать неизменными. На большинстве спектрометров частота импульсов совпадает с опорной, поскольку в общем случае не очень удобно генерировать несколько близких радиочастот. В отсутствие квадратурного детектирования это означало бы помещение частоты импульса не в центр, а на край спектрального диапазона, что усиливает эффекты расстройки резонансных условий (разд. 4.3.2).
Проблемы квадратурного детектирования. Как это обычно бывает, использование квадратурного детектирования помимо повышения чувствительности создает и некоторые сложности. Основная проблема состоит в том, что мы рассчитываем на исчезновение ненужных пиков при сложении двух сигналов, полученных из разных блоков прибора. Это будет достигаться только при точном равенстве амплитуд сигналов в двух каналах и различии их фаз точно на 90°. В действительности же это идеальное условие недостижимо, и в спектрах присутствуют небольшие остаточные сигналы от неполного подавления так называемых
главный сигналглавный сигнал
главный сигнал
главный сигнал
остаточный
Сигнал
При CYCLOPS
остаточный
сигналж 32
'250 ' 200I50 ICK) 506-50 ’ -ЮО' ' -I50 ’ -200 ' -250 ' ' '
Гц
Рис. 4.23. Квадратурные отражения могут вносить искажения в спектры с широким динамическим диапазоном. Они в значительной степени подавляются при использовании фазового цикла CYCLOPS.
отраженных пиков. Они имеют вид отражения пиков от центра спектра, и их легко отличить от небольших настоящих сигналов по изменению фазы и частоты при изменении опорной (рис. 4.23). Обычно амплитуда таких квадратурных отражений не превышает 1% основного сигнала, поэтому они мешают только при измерении слабых пиков в присутствии сильных.
Фазовые циклы. Квадратурные отражения можно значительно уменьшить балансировкой каналов, применив простую идею о фазовых циклах. Здесь не так важны специфические детали, как сама концепция, поскольку она широко применяется в многоимпульсных экспериментах. Вернемся к рис. 4.19. После предварительного усиления до необходимого уровня сигнал ЯМР разделяется с помощью опорной частоты на две компоненты, которые независимо друг от друга оцифровываются и помещаются в две разные области памяти компьютера А и В. Легко видеть, что любые различия двух каналов приемника перестанут проявляться, если мы будем получать данные в результате усреднения многократных прохождений, и каждый канал будет давать одинаковый вклад как в данные области А, так и в данные области В. Но при этом мы не должны забывать, что в А можно помещать только данные с фазой 0°, а в В-только с фазой 90°. Поэтому при смене каналов мы должны поменять и фазы проходящих через них сигналов.
Каким образом в каналах можно изменять фазы сигналов? Вероятно,
Рис. 4.24. Так на двух первых шагах цикла CYCLOPS происходит обмен потоками данных между каналами приемника. Это позволяет усреднить их несбалансированность.
можно просто поменять фазы опорной частоты. Но здесь нужно быть очень осторожным, поскольку сама опорная частота вполне может служить источником разбалансировки каналов. Нам хотелось бы, не меняя аппаратурных режимов работы приемника, поменять местами выводы данных в области А и В (что представляет собой только программную компьютерную операцию) и в то же время сместить фазу сигналов на 90°. Мы уже видели в разд. 4.3.4, как это можно сделать,- просто сместив на 90° фазу импульса. Это позволит поменять местами сигналы поглощения и дисперсии именно так, как нам нужно. Внимательно посмотрев на рис. 4.24, вы заметите, что один из сигналов при этом еще и меняет знак; значит, после оцифровки его нужно дополнительно умножить на — 1. Теперь нужно только соответствующим образом обработать данные, что умеют делать управляющие программы всех спектрометров. В результате мы получим двухшаговый фазовый
цикл, меняющий на различных прохождениях фазу передатчика с 0 на 90° и одновременно переназначающий области памяти компьютера для размещения данных.
Неплохо сместить фазу передатчика и на 180°, заменив при этом сложение текущих данных с областями А и В на вычитание. Это позволит уничтожить все ложные сигналы, фаза, которых не зависит от фазы импульса. Такие сигналы могут образовываться из-за аппаратурных дефектов или каких-либо внешних наводок. Совместив эту процедуру с каждым из прохождений предыдущего цикла, мы получим четырехшаговый цикл CYCLOPS (табл. 4.1), который сейчас используется в качестве стандартного на всех спектрометрах, оснащенных квадратурным детектором. На рис. 4.23 приведено также сравнение интенсивности квадратурных отражений, полученных с применением и без применения цикла CYCLOPS. При определении фазового цикла принято обозначать различные режимы приемника х, у, — х и — у, как будто бы при этом действительно происходит переключение фазы опорного сигнала. Однако подробности реальной работы спектрометра остаются неясными, они зависят от его программного обеспечения.
Таблица 4.1. Фазовый цикл CYCLOPS для подавления квадратурных отражений. Два последних столбца отражают требующуюся при каждом прохождении обработку данных. Два канала приемника, отличающиеся по фазе на 90°, обозначаются цифрами 1 и 2, а два блока памяти - буквами А и В
Прохождение
Фаза импульса
Режим приемника
А
В
1
X
X
+ 1
+ 2
2
У
У
-2
+ 1
3
— X
— X
- 1
-2
4
~У
-у
+ 2
- 1
Фазовые циклы широко используются в многоимпульсных экспериментах для подавления артефактов (как в нашем примере) и для селективного воздействия на отдельные компоненты намагниченности. Это будет более подробно обсуждаться в других местах книги, особенно в главах, посвященных двумерной спектроскопии. Для того чтобы цикл производил желаемый эффект, общее число усредненных прохождений должно быть кратно числу его шагов. Во многих двумерных экспериментах это требование и определяет суммарные затраты времени. Конечно, разработку новых циклов лучше предоставить специалистам в этой области, но и вам не помешает приобрести некоторый опыт их интерпретации на своем спектрометре. Часто основные усилия при отлаживании методик новых экспериментов приходится тратить на исправление текста программы, управляющей фазами. Хотя это и не очень сложно,
но малейшие ошибки в фазовой части программы могут привести к совершенно неожиданным и непонятным результатам. По этой причине тестировать новые методики следует на таких образцах, для которых заранее известен ожидаемый результат, и желательно, чтобы этот результат можно было получить быстро.
Метод Редфилда. Для полноты добавим, что существует еще одна широко используемая реализация схемы квадратурного детектирования. Здесь нас опять больше всего будет интересовать то, что аналогичные методы используются в двумерной спектроскопии, и вполне может оказаться, что ваш спектрометр (например, прибор фирмы Bruker) использует один из них. Целью методики служит проведение квадратурного детектирования с помощью только одного АЦП, который представляет собой довольно дорогостоящий компонент спектрометра.
Это достигается оцифровкой сигнала со скоростью, в 2 раза превышающей ширину спектра, т. е. с такой же, как при однофазном детектировании. Но опорная частота, как и при нормальном квадратурном детектировании, помещается в центр спектра. Фаза приемника увеличивается на 90° после оцифровки каждой точки. Понять это можно, представив себе оцифровку единственной частотной компоненты. Из-за изменения фазы приемника фаза оцифровываемого сигнала на каждой точке будет получать приращение, на 90° большее, чем ожидалось. Поэтому аналого-цифровому преобразователю будет казаться, что это просто сигнал более высокой частоты. Если ширина всего спектрального диапазона F и мы ведем оцифровку со скоростью 2F, то смещение фазы на 90° (=1/4 цикла) приведет к кажущемуся увеличению частоты на 2F/4 = F/2. Если вспомнить, что мы оцифровывали частоты от — F/2 до F/2 (относительно опорной), то прибавление к ним F/2 даст нам диапазон от 0 до F. Таким образом, проблема отрицательных частот решена. Исходные данные для преобразования Фурье теперь представляют собой набор действительных чисел, а не комплексных пар, поэтому требуется несколько иная их обработка. Поскольку после выборки каждой точки фаза изменяется на определенную величину, метод получил название пропорционального времени фазового инкремента или TPPI (Time Proportional Phase Increment).
Однако на практике довольно сложно так часто изменять фазу приемника (тем чаще, чем больше ширина спектра). Удобный выход из этой ситуации состоит в использовании двух детекторов, как при обычном квадратурном детектировании, и только одного АЦП (рис. 4.25). Изменение фазы приемника на 90° достигается переключением АЦП с одного детектора на другой. Сдвиги на 180 и 270° можно получить умножением на — 1 данных со сдвигом 0 и 90° соответственно. В этом эксперименте, так же как и в двухканальном детектировании, могут получаться квадратурные отражения, подавить которые можно с помощью аналогичных фазовых циклов.
Рис. 4.25. Одна из реализаций схемы квадратурного детектирования Редфилда (TPPI).
Фазовые ошибки и коррекция фазы
В первое же свое знакомство с фурье-спектрометром вы столкнетесь с необходимостью коррекции фазы частотного спектра после выполнения преобразования. На одномерных спектрах возможна более или менее осмысленная настройка фазы. Но все же не следует забывать, что ее нельзя установить точно, поскольку она зависит от ряда предположений о характере фазовых ошибок, которые могут оказаться неправильными. При переходе к двумерной фазочувствительной спектроскопии картина резко усложняется. Обычно мы уже не можем настраивать фазу в интерактивном режиме (т.е. поворачивая ручку фазы и наблюдая за одновременным изменением спектра на дисплее). Вместо этого приходится разрабатывать какие-то методы определения необходимой коррекции фазы по отдельной части данных или по подходящему одномерному модельному спектру. Поэтому мы попробуем разобраться в причинах возникновения фазовых ошибок в фурье-спектрах и в численных методах их компенсации. Опять-таки этот раздел не будет существенным для понимания остальных частей книги, и вы можете не изучать его прямо сейчас, а вернуться к нему позже, когда почувствуете необходимость разобраться в описываемых здесь вопросах.
Мы уже несколько раз упоминали один из источников фазовых ошибок, который заключается в трудности настройки фазы опорной частоты таким образом, чтобы в обоих каналах регистрировались сигналы чисто поглощения и дисперсии. Возникающая при этом фазовая ошибка будет одинаковой на протяжении всего спектра, т. е. изменение фазы не зависит от частоты. При неправильной настройке фазы опорной частоты мы получим спектр, действительная (^) и мнимая (/) части которого будут представлять не абсорбционную (А) и дисперсионную (D) компоненты, а их смесь.
Итак, нам хотелось бы получить
a = ^ / = П(4.15)
Рис. 4.26. Расстройка резонансных условий вызывает изменение фазы сигнала после л/2-импульса. На рисунке представлены экспериментальные линии, полученные с помощью очень слабого поля В, (~80Гц); другими источниками фазовых ошибок можно пренебречь. Заметьте, что с увеличением расстройки резонанса амплитуда сигнала изменяется незначительно.
но вместо этого мы имеем .
^ = Acos 0 + D sin 0, X = Asin0 — Dcos0(4.16)
где 0-фазовая ошибка. Мы, очевидно, можем восстановить отдельные А- и D-компоненты, взяв линейную комбинацию & и ^\
А = ^ cos 0 + / sin 0, D = ^sin0 —/cos0(4.17)
Величина 0 определяется экспериментальным способом при наблюдении зависимости от нее формы линии.
Существует много разнообразных причин, вызывающих появление зависящих от частоты фазовых ошибок. В разд. 4.3.2 мы уже наблюдали эффект, возникающий при отклонении импульса от условий резонанса. На рис. 4.26 представлено увеличивающееся изменение фазы при постепенном увеличении разности частот импульса и возбуждаемой линии. Еще один неизбежный источник частотно-зависимых ошибок фазы состоит в том, что мы не можем начинать выборку данных сигнала ССИ сразу же вслед за импульсом. Приемник нельзя включать как минимум во время действия самого импульса, имеющего конечную длительность. Кроме того, после завершения импульса еще требуется небольшая (порядка десятков микросекунд) задержка для восстановления электроники приемника. Вносимые таким образом фазовые ошибки иллюстрируются рис. 4.27. Во время задержки перед началом выборки сигналы различной частоты успевают изменить свою фазу на разные величины. И наконец, электроника приемника сама может вносить изменения фазы в различные частоты. Это в особенности относится к фильтрам звуковых частот, использующимся после детектирования перед оцифровкой. Все эти источники вносят дополнительную фазовую ошибку,
f-0
первая оцифрованная точка
Рис. 4.27. Задержка выборки данных служит важным источником частотно-зависимых ошибок фазы. За время, протекающее до выборки первой точки, фазы сигналов с различными частотами, совпадавшие непосредственно после импульса, успевают разойтись на существенную величину.
которая, как мы считаем, линейно зависит от частоты v. Таким образом, 9 можно представить как
0(v) = а + Р v(4.18)
где а и P-два экспериментально подбираемых параметра. Лучше всего подбирать их следующим образом: выбрать два пика, находящиеся на большом расстоянии друг от друга, установить а по первому из них и P-по второму. При этом влияние частотно-зависимого члена будет максимальным, что позволит легко заметить небольшие фазовые ошибки.
При некоторых обстоятельствах подобная настройка фазы может быть очень трудна или вообще невозможна. Предположение о линейном характере фазовых ошибок может оказаться неверным. Но, даже если оно и верно, оценки правильности формы линии сигнала поглощения весьма субъективны, особенно когда в спектре нарушена базовая линия. Ее нарушения в большей степени оказываются на краях спектрального диапазона. Поэтому, если вы хотите точнее произвести коррекцию фазы, постройте эксперимент так, чтобы интересующие вас пики оказались в центре спектрального окна. В спектрах, полученных с небольшим временем выборки и недостаточной оцифровкой (обычная ситуация в спектроскопии 13С), могут появляться искажения формы линии, похожие на фазовые, но тем не менее имеющие иную природу [3].
Релаксация
Введение
В большинстве видов спектроскопии мы вводим в образец некую энергию, например пропускаем через него свет, и видим, что на одних частотах она поглощается в большей степени, а на других-в меньшей. Куда же при этом девается поглощенная энергия? Большинство людей ответят на это: «Она преобразуется в теплоту». Действительно, вопрос о том, куда уходит энергия, редко встречается в спектроскопии, по
крайней мере в оптической. Но в спектроскопии ЯМР этот вопрос или его более интересный вариант-«Как быстро это происходит?»-напротив, приобретает первостепенную важность. Причина этого состоит в том, что расстояние между рассматриваемыми в ЯМР уровнями энергии настолько мало, что часто время, требующееся для установления равновесия между ними, оказывается очень большим в шкале времени эксперимента. Это обстоятельство и диктует условия его проведения.
При наблюдении электронных переходов в молекуле посредством облучения ее ультрафиолетовым светом возбужденные электроны возвращаются на исходные орбитали очень быстро (за несколько десятков пикосекунд), и измерить время жизни возбужденного состояния оказывается совсем непросто. В ЯМР возбужденные состояния могут существовать на протяжении нескольких минут. Это создает большие неудобства в импульсном ЯМР, идея которого состоит в многократном повторении возбуждения ядра с целью повышения отношения сигнал/ шум при усреднении данных различных прохождений. И действительно, успех эксперимента в фурье-спектроскопии ЯМР во многом определяется скоростью возвращения наблюдаемого ядра из возбужденного состояния в основное, и если она очень велика или мала, то эксперимент может не дать требующейся информации.
Поскольку мы в большей степени химики, чем физики, мы можем заинтересоваться релаксацией (наиболее общий термин, обозначающий восстановление равновесия) по двум причинам. Первая состоит в том, что описываемые далее параметры коррелируют со структурой молекул и в особенности с их движением. Но, к сожалению, их связь со строением понятна в значительно меньшей степени, чем в случае химических сдвигов или констант спин-спинового взаимодействия. Хотя иногда релаксационные измерения могут удачно разъяснить структурные вопросы, полагаться на них в полной мере все же не следует. Объясняется это тем, что довольно трудно провести точные и воспроизводимые измерения времен релаксации, поскольку, как мы увидим, в них вносит вклад множество посторонних (с химической точки зрения) факторов. По этой причине и из-за стремления вообще не обсуждать в нашей книге эмпирических зависимостей мы не будем касаться этой стороны проблемы релаксации [4].
Второй и наиболее важный для нас аспект состоит в том, что изучение процессов релаксации необходимо для построения эксперимента ЯМР. Очевидность этого станет понятна, если вспомнить, что даже в простой одноимпульсной схеме то, что мы регистрируем под названием спада свободной индукции, как раз и представляет собой происходящий посредством процессов релаксации спад намагниченности. С практической точки зрения информация о временах релаксации нужна нам для достижения максимальной чувствительности, за которую приходится бороться даже на лучших современных спектрометрах. Обсуждаемая далее концепция поперечной релаксации привела к появле- 9-75
нию идеи спинового эха, которая легла в основу многих интересных экспериментов. Введенная нами модель вращающейся системы координат позволит легко разобраться в различиях нескольких путей релаксации, важных для спектроскопии ЯМР.
Двигаясь к равновесию
Если наш диамагнитный образец не находится в магнитном поле, то в нем не будет возникать намагниченность. Можно предположить, что при вводе его в магнит наведенное поле появится не мгновенно, а будет устанавливаться в течение некоторого промежутка времени. Вычисление его длины на основании фундаментальных законов природы и общих подходов к вопросам равновесия требует широкого привлечения всевозможных приближений и представляет собой отдельный раздел физики. Теория Блоха с помощью предположения об экспоненциальном характере релаксации сводит эту проблему к измерению константы скорости процесса. Погрузившись с головой в вывод формул времен релаксации, очень легко забыть о том, что экспоненциальный характер этого процесса-только гипотеза, а не универсальный факт. К счастью, для молекул в растворах, с которыми мы имеем дело, такое приближение очень точно отражает действительность. Выразим эту идею формулами. Наводимое в образце поле будет расти в соответствии с уравнением (рис. 4.28)
(4.19)(4.19)dMz _ Мо - Mz dt 7]
(4.19)
(4.19)
где Мо-равновесная намагниченность. Если намагниченность в начальный момент времени равна нулю, то
(4.20)(4.20)MZ = MO(1 -e",/ri)
(4.20)
(4.20)
Константа Tt известна как время продольной или спин-решеточной релаксации. Существование второго термина объясняется тем, что
dMz (Мо-М,) dt “ Т, Мг - M0(1-e^')dMz (Мо-М,) dt “ Т, Мг - M0(1-e^')Рис. 4.28. Продольная релаксация. В предположении об экспоненциальном нарастании напряженности наведенного поля мы должны бесконечно долго ожидать достижения Мо.Рис. 4.28. Продольная релаксация. В предположении об экспоненциальном нарастании напряженности наведенного поля мы должны бесконечно долго ожидать достижения Мо.
dMz (Мо-М,) dt “ Т, Мг - M0(1-e^')
dMz (Мо-М,) dt “ Т, Мг - M0(1-e^')
Рис. 4.28. Продольная релаксация. В предположении об экспоненциальном нарастании напряженности наведенного поля мы должны бесконечно долго ожидать достижения Мо.
Рис. 4.28. Продольная релаксация. В предположении об экспоненциальном нарастании напряженности наведенного поля мы должны бесконечно долго ожидать достижения Мо.
разработка основных концепций релаксации проводилась на твердых телах, где наибольший интерес представляет взаимодействие магнитного момента с кристаллической решеткой. В случае растворов этот термин не отражает характера происходящих процессов, и мы не будем его употреблять; однако он очень широко используется в литературе по ЯМР. Первый термин -продольная релаксация-будет напоминать нам о том, что имеется в виду поведение z-компоненты намагниченности. Мы предполагаем, что при отклонении вектора намагниченности от оси z и отсутствии внешних воздействий он будет возвращаться на эту ось по экспоненциальному закону с константой Tv
Теперь мы можем вернуться к импульсному эксперименту во вращающейся системе координат и добавить некоторые детали (рис. 4.29). Мы утверждали, что после воздействия тг/2-импульса вектор объемной намагниченности бесконечно долго прецессирует вокруг оси z. Применяя к нему модель экспоненциальной релаксации, мы получаем, что z-намагниченность будет восстанавливаться с константой Тц и, следовательно, намагниченность в плоскости х — у будет исчезать как минимум с такой же скоростью. Вскоре мы увидим, что иногда она может исчезать быстрее, чем восстанавливается z-намагниченность, но обратная ситуация, очевидно, невозможна. Нет причин предполагать, что все линии сложного спектра будут релаксировать с одной и той же скоростью, поэтому следует ожидать существования набора различных констант Г, для разных ядер молекулы. Из конечного времени жизни возбужденного состояния вытекает конечная ширина резонансной линии в частотном спектре. Поскольку время ЯМР-релаксации в растворах в большинстве случаев довольно велико, резонансные линии в спектре ЯМР оказываются очень узкими в сравнении, например, с УФ-спектрами поглощения.
Почему время релаксации Т, обычно велико? Для ответа на этот вопрос потребовалось бы несколько самостоятельных книг, но мы можем попробовать разобраться в этой проблеме хотя бы на качественном уровне. Прежде всего заметим, что небольшие энергии ЯМР-пере- ходов настолько малы в сравнении с общей тепловой энергией образца, что с их рассеянием не возникает абсолютно никаких проблем. Следова-
Рис. 4.29. Эволюция спиновой системы после импульса с учетом релаксации.
9*
тельно, релаксация замедляется не по причине невозможности рассеяния энергии, а из-за недостатка путей для ее вывода из спиновой системы. Мы знаем, что вероятность самопроизвольного излучения для случая близко расположенных энергетических уровней чрезвычайно мала (порядка 10“25 переходов в секунду), и ею можно пренебречь. Таким образом, релаксация должна происходить за счет стимулированного излучения. Большие наблюдаемые величины Т\ свидетельствуют об отсутствия подходящих источников стимулирования.
Иными словами, поскольку ЯМР-переходы инициируются осциллирующим магнитным полем, а при нормальных условиях регистрации спектра полей с подходящей частотой не так уж много, спиновая система ядра не имеет хорошей энергетической связи с окружающей средой. Мы будем строить нашу теорию релаксации на оценках эффективности инициирования ЯМР-переходов подходящими полями. Основным источником таких полей в растворе для ядер со спином 1/2 служит магнитное (диполь-дипольное) взаимодействие между ядрами, которое модулируется движением молекул. Следовательно, можно предположить, что скорость релаксации будет зависеть от таких параметров, как температура, вязкость раствора, размер и структура молекул и иногда напряженность постоянного магнитного поля. Эти сложные вопросы широко обсуждаются в классических учебниках по ЯМР, например в книгах Абрагама [5] и Сликтера [1].
Разработать методику эксперимента для измерения времен релаксации не так уж трудно. Для этого подойдет любая импульсная последовательность, дающая спектр с зависящей от времени релаксации интенсивностью сигналов. Один из популярных методов представлен на рис. 4.30 (это наш первый многоимпульсный эксперимент!). Его идея состоит в использовании следующей последовательности: л-импульс для инвертирования z-намагниченности; пауза для возвращения намагниченности к оси + z; и далее л/2-импульс и измерение сигнала. Заметьте, что если задержка т будет меньше Т1/1п2, то измеряемый сигнал будет производиться вектором намагниченности, расположенным сначала на оси — у. Мы уже знаем, что ему будут соответствовать пики отрицательной амплитуды, если фаза настроена таким образом, что намагниченность вдоль оси + у дает положительные пики. Результат этого эксперимента при различных т приведен на рис. 4.31; измерить величину 1\ можно
Рис. 4.30. Метод инверсии-восстановления для измерения ТР
Рис. 4.31. Результаты эксперимента по методике инверсии-восстановления. Группа пиков в слабом поле (т. е. в левой части спектра) имеет чуть большее время релаксации Гр чем группа сигналов в сильном поле.
графически, интерполируя высоту пиков. Поскольку схема этого эксперимента очень проста, получить точные результаты за разумный промежуток времени будет затруднительно, однако это не должно нас смущать. В большинстве случаев требуется быстро и довольно приблизительно оценить величины 1\ для оптимизации чувствительности, как это описано в гл. 7. Подробное обсуждение достоинств и недостатков различных методов измерения 1\ можно найти в книге [6].
Наконец, мы сами можем частично управлять величинами Tv контролируя доступность подходящих путей релаксации. Простейшей причиной ускорения релаксации служит присутствие в образце парамагнитных веществ, которые с помощью своих неспаренных электронов эффективно инициируют ЯМР-переходы. Их можно специально добавлять в образец, если нужно сократить время релаксации для ускорения эксперимента или для повышения точности количественных измерений. Для этой цели обычно используется ацетилацетонат хрома(Ш). В то же время приготовленные в обычных условиях образцы неизбежно содержат примеси парамагнитного вещества-растворенного кислорода, которые нужно удалить обезгаживанием, если мы хотим получить самые узкие из возможных линии или собираемся проводить измерения Т1; ядерного эффекта Оверхаузера или других параметров релаксационных процессов.
Релаксация в плоскости х — у
Вернемся к простому одноимпульсному эксперименту на образце с единственной линией, попадающей точно в резонанс с опорной частотой. Забудем на мгновение о существовании продольной релаксации и рассмотрим поведение объемной намагниченности, остающейся
Рис. 4.32. Поперечная релаксация. Различные изохроматы, составляющие объемную намагниченность, постепенно превращаются в «лопасть пропеллера» (сверху); в результате мы регистрируем экспоненциальный спад намагниченности (внизу).
постоянной в плоскости х — у вращающейся системы координат (рис. 4.32). Существуют ли в отсутствие продольной релаксации причины, препятствующие бесконечно долгому сохранению намагниченности? Вспомнив о том, что объемная намагниченность складывается из большого числа отдельных ядер, разбросанных по всему объему образца, мы можем предложить самую прозаическую причину: постоянное магнитное поле не может быть абсолютно однородным. .
Мысленно разделим образец на малые области, в пределах каждой из которых поле можно считать абсолютно однородным. Общая намагниченность складывается из намагниченности отдельных областей. Каждой из них будет соответствовать вектор в неподвижной системе координат, прецессирующей с точно заданной скоростью (такие векторы часто называют изохроматамй), но частота векторов различных областей не будет совпадать. Во вращающейся системе координат мы получим суммарный вектор, изначально помещенный на ось у и далее «размазывающийся» в плоскости х — .у, поскольку одни из изохроматов прецессируют чуть быстрее, а другие - чуть медленнее вращения системы координат (рис. 4.32). Таким образом, общая намагниченность будет спадать даже в отсутствие продольной релаксации. Этот процесс не сопровождается изменением энергии образца, поскольку не происходит переходов между энергетическими уровнями, но он снижает упорядоченность системы. Иными словами, энтальпия образца остается постоянной, а энтропия повышается.
Этот механизм также представляет собой форму релаксации и называется поперечной или спин-спиновой релаксацией. Опять же второй термин может создать некоторую путаницу, и поэтому мы не станем его употреблять, хотя вскоре и коснемся причин его возникновения. Слово «поперечная» будет напоминать нам о том, что процесс происходит
в плоскости х — у и не обязательно распространяется на ось z. Мы снова будем считать, что он развивается по экспоненциальному закону и характеризуется константой Т2. На практике невозможно разделить вклады в потерю упорядоченности от неоднородности магнитного поля (которая представляет собой аппаратурный недостаток) и от других причин (см. далее), к которым обычно и относят символ Т2. Константа реально наблюдаемого спада намагниченности, которая может состоять в основном из вклада неоднородности поля, в общем случае обозначается Т*.
Все процессы, сопровождающиеся потерей поперечной намагниченности, включая и ее возвращение на ось z, дают вклад в величину Т2. Таким образом, при отсутствии всех механизмов поперечной релаксации Т2 должна быть равной Tv поскольку переход намагниченности на ось z будет, очевидно, сопровождаться ее уходом из плоскости х — у. При нормально настроенной однородности поля такая ситуация довольно часто встречается в жидкости, поэтому огибающая ССИ будет иметь вид экспоненты с константой Tv В твердых телах, напротив, каким бы однородным ни было поле, константа Т2 будет очень малой по причине различия локальных магнитных полей вследствие неоднородности окружения молекул, a Тг, наоборот, будет очень большой из-за отсутствия вклада в релаксацию движения молекул. Обе причины серьезно затрудняют ЯМР в твердых телах.
Спиновое эхо
Введение. Если подействовать на образец двумя последовательными радиочастотными импульсами с небольшой (по сравнению с TJ задержкой между ними, то мы увидим чрезвычайно интересное явление. Следить за поведением намагниченности удобнее всего при использовании последовательности л/2-т-л (рис. 4.33), хотя подобный эффект производят и импульсы других длительностей. Рассмотрим еще раз простейшую схему с единственной линией в резонансных условиях. После воздействия л/2-импульса неоднородность магнитного поля постепенно превратит набор изохроматов, составляющих намагниченность, в «лопасть пропеллера», т. е. «размажет» вектор в плоскости х — у. На рис. 4.33 передний край «размазанного» вектора помечен
Рис. 4.33. Образование спинового эха при рефокусировке намагниченности, фаза которого «размазалась» из-за неоднородности поля.
знаком « + », поскольку находящиеся с этой стороны изохроматы прецессируют чуть быстрее системы координат, а задний край, где изохроматы прецессируют медленнее, помечен знаком « —». Далее лх-им- пульс повернет одновременно все изохроматы вокруг оси х и поместит «размазанный» вектор на ось — у. Обратите внимание, что сторона вектора со знаком « + » теперь находится позади усредненного положения изохроматов, а сторона со знаком « — »-перед ним. Следовательно, быстрые векторы теперь догоняют усредненное положение, а медленные как бы падают на него. Если скорость векторов осталась такой же, как и в период «размазывания», то в конце следующего промежутка времени т они опять соберутся вместе на оси — у: тг-импульс рефокусировал их.
Если при проведении этого эксперимента мы начнем наблюдать за ху-намагниченностью (т. е. сигналом ЯМР) сразу же после тг/2-импульса, то мы, следовательно, должны увидеть его спад до момента л-импульса; далее сигнал будет нарастать в течение т с и затем снова начнет спадать (рис. 4.34). Восстановление амплитуды сигнала в момент 2 т называется спиновым эхом. Оно широко используется в многоимпульсных экспериментах ЯМР.
Спиновое эхо, как мы вскоре увидим, обладает рядом исключительно полезных свойств. Но сначала более подробно обсудим, что нужно для его генерации. Основное требование заключается в том, чтобы изохроматы имели неизменную скорость прецессии до и после тг-импульса. Если предположить, что скорость зависит от однородности постоянного поля, то это требование при сохранении неизменного положения областей образца в течение всего эксперимента. Другими словами, скорость диффузии молекул внутри образца и скорость его вращения, так как образец обычно вращается, должны быть небольшими в сравнении с т.
Рис. 4.34. Сигнал, наблюдающийся в эксперименте по спиновому эху. Выборка данных начата сразу после л/2-импульса. л-Импульс последовал в момент времени т (импульс вносит возмущения в канал приемника, поэтому сразу после него сигнал искажен). Сигнал набрал максимальную амплитуду в момент 2т и далее затухает, как в обычном эксперименте.
Оба этих требования никогда полностью не выполняются на практике, но при использовании не очень больших величин т всегда удается получить эффективное спиновое эхо.
Интересно спросить, будет ли равна 7/ скорость затухания серии эхо с различными т с учетом того, что амплитуда эха не зависит от однородности поля? На этот вопрос иногда следует ответить «нет», потому что помимо неоднородности поля могут существовать и другие причины потери х — у-намагниченности, не сопровождающейся ее появлением на оси z. Однако для небольших молекул в растворе ответ чаще всего будет положительным. Один из возможных механизмов потери х — у-намагниченности-это совместная релаксация двух ядер, когда одно ядро переходит из основного состояния в возбужденное одновременно с переходом второго ядра в обратном направлении. При этом может происходить потеря фазовой когерентности в плоскости х — у без появления z-намагниченности. Такому механизму обязан своим появлением термин «спин-спиновая релаксация», часто неоправданно широко относимый ко всем видам поперечной релаксации. В твердом теле этот механизм играет очень важную роль. Константа, описывающая скорость затухания огибающей ССИ серии спиновых эхо, называется, как уже упоминалось ранее, естественным временем релаксации Т2, поскольку оно не зависит от однородности поля. В жидкостях оно может отличаться от 7/ по причине химического обмена или связывания с квадрупольными ядрами (т. е. имеющими спин больше 1/2).
Измерения Г2 с помощью спинового эха. Измерения Т2 сопряжены с большими экспериментальными трудностями. Простейший подход, заключающийся в получении серии эхо с различными величинами т и измерении скорости затухания амплитуды сигнала, не очень хорош, поскольку с увеличением т начинают сказываться такие эффекты, как диффузия. В качестве его замены рассмотрим последовательность
W2)x - т - лх - 2т - лх - 2т - лх - ...
(эксперимент Карра-Парселла), где мы должны измерять амплитуду сигнала посредине каждого 2 т-интервала или, как это чаще делается на практике, измерять каждый раз последнюю амплитуду, повторяя эксперимент с увеличивающимся числом задержек. Если выбрать т достаточно малым (в сравнении со скоростью диффузии), то проблема диффузии отпадает.
К сожалению, импульсы работают не точно так, как мы себе это представляем; в особенности это относится к л-импульсам. Уже самый простейший их дефект-неточная длительность - ухудшает эксперимент Карра-Парселла, поскольку в нем намагниченность постоянно вращается в одну и ту же сторону, в результате чего все ошибки накапливаются. В качестве упражнения на владение моделью вращающейся системы координат сравните эксперимент Карра-Парселла с его модификацией
Карра-Парселла-Мейбума-Джилла (CPMG), которая представляет собой последовательность
(я/2)х - т - лу - 2 т - ку - 2 т - лу - ...
и попробуйте доказать, что а) использование лу-импульса вместо кх позволяет создать эхо (но на оси + у) и б) ошибки в длительности импульса не накапливаются. Для решения второй задачи проще всего рассмотреть поведение только одного самого быстрого изохромата при использовании вместо л-импульса импульса длительностью л + е, где е-небольшая величина. Вы должны обнаружить, что эффект от этой ошибки отсутствует в эхо с четными номерами. Подробное решение задачи можно найти в книге [6] на с. 281-283.
Эксперимент CPMG служит примером одного из способов образования названий методов в спектроскопии ЯМР-составление названия из имен авторов. По отсутствию гласных букв и очень краткой форме названия мы можем легко догадаться: что CPMG-довольно старый эксперимент, поскольку в последние годы такие сочетания букв не используются. Пример недавнего названия, которое значительно легче произносить,-это WAHUHA (ВАХУХА), образовавшееся из имен Waugh, Huber, Haeberlen. Самое оригинальное название, образованное из имени автора, получила последовательность MLEV, которая не просто связана с именем Malcolm Levitt, но и напоминает каламбур от названия твердотельного эксперимента MREV, которое в свою очередь составлено из имен его авторов (Mansfield, Rhim, Elleman, Vaughan). Альтернативный метод, снимающий все проблемы выбора соавторов по созвучности фамилий, состоит просто в подобре любой подходящей аббревиатуры, например DANTE (Delays Alternating with Nutations for Tailored Excitation-чередование задержек и нутаций для «скроенного» возбуждения) и WALTZ (Wonderful ALternating phase Technique for Zero residual splittings-удивительная альтернативная фазовая методика для обнуления остаточного расщепления). Эти названия очень удачны, поскольку отражают сущность эксперимента (см. гл. 7).
К счастью, нам вообще не нужно измерять Т2. Обычно бывает вполне достаточно знать время поперечной релаксации Т*, включающее эффект неоднородности поля. Его можно определить при анализе огибающей ССИ: за Т* с ее амплитуда должна уменьшиться в 1/е раз, т. е. около 0,4 (рис. 4.35). Однако, если в спектре преобладает линия растворителя, такое измерение будет некорректным, поскольку растворитель как вещество с небольшой молекулярной массой обычно имеет большее время релаксации. Правильнее будет измерить в преобразованном спектре ширину линии на полувысоте Sv, которая связана с Г* соотношением 3v=l/nT*. Оценки величины Т* часто требуются для определения времени выборки. Особенно это важно в двумерных экспериментах, где желательно по возможности сократить время выборки без потери в чувствительности. Величины Т^ нужны и при оптимизации частоты повторения выборок и длительности импульсов (гл. 7), где в зависи-
мости от соотношения частоты повторения с 7) и Т2 используются различные критерии. Нужны они и при выборе параметров взвешивающей функции (хотя параметры чаще задаются в терминах ширины линии, а не временем релаксации).
Полезные свойства спинового эха. Важность понимания природы спинового эха определяется прежде всего тем, что оно служит составной частью многоимпульсных экспериментов, обладающей многими полезными свойствами. Первое из них-это рефокусировка однородности поля магнита. В гл. 10 мы встретим эксперимент, в котором с помощью спиновых эхо удается измерять спектры с естественной шириной линии, т. е. в некоторой степени освободиться от несовершенства реальных магнитов. Другие полезные свойства эха станут нам понятны при рассмотрении его воздействия на системы с различающимися химическими сдвигами и константами спин-спинового взаимодействия..
Сначала разберем наиболее простой случай двух сигналов с различающимися химическими сдвигами. На рис. 4.36 представлено воздействие спинового эха на такую систему. Частота вращения системы координат выбрана так, чтобы одна линия в ней была неподвижной. Тогда вторая будет прецессировать с частотой, равной относительному сдвигу V. Мы уже знаем о том, что в момент пика эха устраняется влияние неоднородности поля, и не будем изображать на диаграмме «размазывание» и рефокусировку каждой линии. Пусть т будет мало в сравнении с 1/v и прецессирующий вектор не будет выходить за пределы первой четверти плоскости х — у. Это предположение не влияет на приводимые доводы, но позволяет упростить рисунки. л-Импульс переместит постоянный вектор на ось — у, а вращающийся-во вторую четверть плоскости, где он сохранит свое движение по направлению к оси — у и догонит постоянный вектор в момент 2 т. Таким образом,
Рис. 4.36. Воздействие спинового эха на сигналы с различными химическимисдвигами.
сигналы с различными химическими сдвигами рефокусируются в момент пика эха. Этот факт кажется удивительным, поскольку получается, что с точки зрения эха не существует различий между химическим сдвигом и неоднородностью поля: и то и другое-просто различные источники изменения локального поля на ядре.
Важность этого свойства спинового эха трудно переоценить. Оно позволяет нам создавать такие воздействия на ядерную намагниченность, которые не зависят от химических сдвигов, по крайней мере в той степени, которую допускает неидеальность реальных импульсов. Это значит, что селективные эксперименты, которые неудобно проводить на практике, можно привести к обобщенному виду и, следовательно, резко повысить их эффективность. Таким способом, например, простейшая последовательность SPI (Selective Population Inversion-селективная инверсия заселенности) превращается в INEPT (Insensitive Nuclei Enhanced by Polarization Transfer-низкочувствительные ядра, усиленные с помощью переноса поляризации, см. гл. 6). 1
Избавившись таким путем от неоднородности поля и химического сдвига, мы можем больше не изображать их на диаграммах систем со спин-спиновым взаимодействием. Рассмотрим двухспиновую систему первого порядка, которая дает в спектре два дублета с соотношением интенсивностей линий 1:1 и константой J. Посмотрим на один из дублетов (рис. 4.37). На первый взгляд ситуация в точности повторяет предыдущую с той только разницей, что для удобства опорная частота помещена в центр дублета, и во вращающейся системе координат прецессируют обе линии со скоростью + J/2 и — J/2 об/с. До момента л-импульса все происходит так же, как и раньше,-два вектора оказываются во второй и третьей четвертях плоскости х — у (рис. 4.37). Но теперь, прежде чем предположить, что они будут продолжать двигаться к оси — у, вспомним, что другое ядро, вызывающее расщепление этой линии, также испытало воздействие л-импульса. Это воздействие очень
Рис. 4.37. Спиновое эхо в системе со спин-спиновым взаимодействием (см. текст).
Рис. 4.38. Уровни энергии спиновой системы АХ.
важно, поскольку именно оно объясняет поведение систем с гомоядер- ным спин-спиновым взаимодействием, отличающееся от всех других типов расщепления линий.
Для того чтобы понять происходящее, мы должны ненадолго вернуться к квантовой механике нашей системы. Если два состояния ядра со спином 1/2 назвать а и р, то две компоненты дублета будут соответствовать таким переходам ядра, когда его сосед находится в том или другом состоянии (рис. 4.38), т. е. переходам (аа) -> (Ра) и (аР) -> (РР) (в книгах по ЯМР встречаются разногласия по поводу выбора а или р в качестве состояния с наименьшей энергией; в этой книге будет использоваться а как наиболее часто употребляемое). Состояния соседнего ядра а и Р имеют приблизительно равную вероятность, поэтому обе компоненты дублета имеют равную интенсивность. л-Импульс инвертирует заселенность уровней (разд. 4.2.6), т. е. переводит каждое состояние а в р и наоборот. Следовательно, ядра, имеющие а-соседа и дающие линию с частотой, допустим, + J/2 (в действительности это зависит от знака J), после импульса обнаружат своего соседа в состоянии р и начнут прецессировать с частотой — J/2. То же самое произойдет и с другим ядром, т. е. л-импульс поменяет две линии местами.
Рис. 4.39. Спиновое эхо дублета с т = 1/4 J.
Теперь дополним нашу векторную диаграмму полученной информацией. Мы увидим, что в момент времени 2 т компоненты дублета не рефокусируются, поскольку после л-импульса направление их вращения изменилось. Если т не будет связано некоторым соотношением с J, то компоненты не выстроятся ни на какой оси. На рис. 4.37 изображен именно такой случай. Но в реальных экспериментах чаще требуется в момент пика эха выстроить компоненты каким-то определенным образом. Например, если мы возьмем т, равное 1/4 J с, то в случае дублета компоненты окажутся на оси + х в противофазе (рис. 4.39).
Очень важно понимать, что отсутствие рефокусировки в спиновой системе с гомоядерным спин-спиновым взаимодействием связано не с наличием спин-спинового взаимодействия, а с ее гомоядерностью. Компоненты дублета, обусловленного гетероядерным связыванием, например, сигнала углерода метановой группы без развязки от протонов, будут рефокусироваться так же, как сигналы с разными химическими сдвигами или изохроматы, поскольку протоны не ощутят воздействия л-импульса на частоте углерода и обмена компонент не произойдет. В этом конкретном случае мы можем, по своему усмотренйю, рефокусировать или не рефокусировать компоненты, так как можно генерировать л-импульс и на частоте протонов (если, конечно, спектрометр это позволяет). В гл. 10 мы обсудим эксперимент, позволяющий этим способом определить число протонов, связанных с конкретным ядром 13С.
Импульсный ЯМР
Теперь мы знаем все остальные части импульсной спектроскопии ЯМР. Это радиочастотные импульсы, поворачивающие намагниченность на любой угол (обычно на л/2 и л рад). Вращение намагниченности происходит по часовой стрелке вокруг любого из четырех направлений х, у, —хи — у или иногда вокруг других промежуточных направлений. Выбор оси вращения осуществляется установкой фазы импульса, которая задает названия осей во вращающейся системе
координат. Сигнал ЯМР регистрируется с помощью вычитания из него некоторой постоянной частоты, определяющей скорость вращения нашей системы координат. Фаза опорной частоты связана с фазой импульсов некоторым произвольным (но постоянным) соотношением, конкретный вид которого не имеет значения, поскольку мы подбираем фазу детектора численным способом при обработке спектра после преобразования Фурье.
После перехода с оси z в плоскость х — у компоненты намагниченности прецессируют (во вращающейся системе координат) в соответствии с величиной разности их ларморовой частоты и опорной частоты детектора. В то же время намагниченность восстанавливается на оси z с константой Г, и исчезает из плоскости х — у с константой Т^. При желании мы можем с помощью л-импульса создать спиновое эхо, т. е. устранить все расщепления компонент намагниченности, кроме возникших по причине гомоядерного спин-спинового взаимодействия, и попутно устранить вклад неоднородности постоянного поля в спад поперечной намагниченности. Константа экспоненциального затухания амплитуды серии спиновых эхо, последовательно создаваемых после начального импульса, называется Т2.
Для описания импульсного ЯМР мы будем продолжать пользоваться векторной моделью поведения объемной намагниченности, но не следует думать, что эта модель обеспечит строгость наших выводов. Реальная ситуация намного сложнее. Мы не рассматриваем влияние импульсов на относительные заселенности уровней связанных спиновых систем и их фазовую когерентность. Методы расчета заселенности уровней после воздействия импульса мы уже рассмотрели в разд. 4.2.6, но это только часть общей картины; таким способом нельзя моделировать фазовые соотношения различных состояний. Однако мы достигли предела, доступного при использовании нашего теоретического аппарата, и его будет вполне достаточно для обсуждения основ многих экспериментов. -
Возможно, оставшиеся неразрешенными вопросы послужат более смелым читателям поводом к дальнейшему изучению ЯМР. Наиболее ясное описание ядерных систем получается с помощью теории матриц плотности [7]. В этой теории используется обычная квантовомеханическая модель волновой функции системы в виде линейной комбинации ее собственных состояний. Каждый комплексный коэффициент этой комбинации содержит информацию и об амплитуде, и о фазе. Для описания реального образца мы должны усреднить огромное число коэффициентов для подсистем, находящихся в различном окружении. Полученные таким образом средние величины по ансамблям составляют матрицу плотности, которую можно представить себе как карту усредненных парных связей между энергетическими уровнями системы в данный момент времени. Импульсы представляются в виде операторов, преобразующих матрицу плотности. В промежутки между импульсами матрица плотности эволюционирует в соответствии с гамильтонианом
системы. Все это позволяет получить результат воздействия на образец любой импульсной последовательности в явном виде.
Неудобство формализма матрицы плотности состоит в том, что ее трудно соотнести с какими-либо физическими иллюстрациями, а для систем, содержащих более двух спинов, расчеты быстро становятся громоздкими. Существуют альтернативные подходы, часто оказывающиеся более плодотворными. Это формализм мультипликативных операторов [8] и определение траектории когерентности [9, 10]. Первый метод сочетает в себе элементы векторной модели и матрицы плотности, что позволяет совместить простые физические картины с квантовой механикой. Второй подход очень удобен для разработки фазовых циклов для реальных экспериментов, и его сравнительно легко понять. Но мы не будем их обсуждать, поскольку нам уже пора заняться конкретными экспериментами.
Литература
Сликтер Ч. Основы теории магнитного резонанса. Пер. с англ.-М.: Мир, 1981.
Fukushima Е„ Roeder S.B., Experimental Pulse NMR-a Nuts and Bolts Approach, Addison-Wesley, 1981.
Comisarow M.B., J. Mag. Res., 58, 209-218 (1984).
Примеры использования измерений Tv ядер 13C и 31P для решения структурных проблем: Lyerla J.R., Levy G.C., in: Topics in Carbon-13 NMR Spectroscopy (ed. Levy G.C.), 1, 79 148, Wiley, 1974; Hart P.A., in: Phosphorus-31 NMR-Prin- ciples and Applications (ed. Gorenstein D. G.), 317-347, Academic Press, 1984; James T. L„ ibid., 349-400. Применения в ‘Н-ЯМР более редки.
Abragam A., Principles of Nuclear Magnetism, Oxford University Press, 1983. (Имеется перевод издания 1961 г.: Абрагам А. Ядерный магнетизм. Пер. с англ.-М.: ИЛ, 1963.)
Martin М. L„ Delpuech J.-J., Martin G. J„ Practical NMR Spectroscopy, Heyden, 1980.■
См. ссылку 1, гл. 5.
Sorensen О. W„ Eich G. W„ Levitt M.H., Badenhausen G., Ernst R.R., Prog. Mag. Res., 16, 163-192 (1983). Хотя эта работа и насыщена математикой, она легко понятна и содержит много иллюстраций; с ней очень полезно ознакомиться "при дополнительном чтении.■
Badenhausen G„ Kogler Н., Ernst R.R., J. Mag. Res., 58, 370-388 (1984).
Bain A.D., J.Mag.Res., 56, 418-427 (1984).
Глава 5
Ядерный эффект Оверхаузера
Введение
Эксперименты, основанные на использовании ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО), занимают совершенно особое положение среди современных спектральных методов. Если вам приходилось использовать спектроскопию 1Н-ЯМР для решения структурных задач, то вы, вероятно, уже слышали о разностной ЯЭО-спектроскопии, которой нам предстоит заниматься в этой главе. Этот экспериментальный метод имеет принципиальное отличие от остальных, обсуждаемых в нашей книге. Только он позволяет получать структурную информацию о молекуле независимо от наличия скалярного спин-спинового взаимодействия между ядрами. В основе метода лежит прямое магнитное взаимодействие ядер (так называемое диполь-дипольное взаимодействие), обычно не оказывающее никакого влияния на внешний вид спектра в жидкой фазе. ЯЭО дает нам косвенный путь получения информации об этом диполь-дипольном взаимодействии, которое в свою очередь зависит от межъядерных расстояний и движения атомов в молекуле. Отсутствие других удобных способов измерения таких параметров молекул в растворе делает ЯЭО чрезвычайно важным инструментом.
При попытке выяснения природы ЯЭО и возможностей его применения для получения структурной информации мы сталкиваемся с несколькими проблемами. ЯЭО связан с релаксационными процессами. Он проявляется в изменении интенсивности одного резонансного сигнала при облучении каким-либо способом другого. Для полного понимания этого явления нам придется проанализировать возможные пути релаксации многоспиновой системы, выявить механизм их действия и рассчитать относительные вклады различных путей в общую скорость релаксации. Основная идея такого анализа не очень сложна, гораздо сложнее разобраться в его деталях. Например, в простой двухспиновой системе, как мы вскоре увидим, может существовать до шести различных путей релаксации, каждый из которых может реализоваться различными способами. При попытке строгого описания этой ситуации мы рискуем заблудиться в множестве надстрочных и подстрочных индексов. Механизмы релаксации связаны с движением молекул, которое, очевидно, носит случайный характер и может оказаться чрезвычайно сложным даже для небольших молекул. Нам лучше не связываться с такими
10-75
проблемами; в этом вы сразу убедитесь, взглянув на превосходную гл. 8 книги Абрагама [1].
Но отказываться полностью от изучения физических процессов ЯЭО тоже не очень хорошо. Это может привести к излишне упрощенному подходу, заключающемуся в одной фразе: «ЯЭО обратно пропорционален шестой степени межъядерного расстояния». К сожалению, очень часто интерпретация экспериментальных данных проводится на основе именно этого подхода. Он может создать большую путаницу, поскольку приведенное утверждение часто не выполняется. В следующем разделе мы попробуем настолько разобраться в механизмах ЯЭО, чтобы уметь надежно применять полученные знания на практике. Мы рассмотрим его возникновение в простейшем случае (двухспиновая гомоядерная система), его связь с релаксацией и диполь-дипольным взаимодействием между ядрами, а также способы его измерения. Мы выведем несколько формул, позволяющих в некоторых простых случаях получать количественную информацию о межъядерных расстояниях. В большинстве реальных экспериментов проводить количественный анализ не имеет смысла, поскольку лучший способ решения структурных задач для молекул разумной сложности - это чисто качественное сравнение различных ЯЭО. В разд. 5.2 обсуждается теоретическая сторона ЯЭО, а в разд. 5.3 и 5.4-способы его измерения и примеры интерпретации.
Происхождение ядерного эффекта Оверхаузера
Введение
ЯЭО представляет собой изменение интенсивности одного сигнала ЯМР при возбуждении другого. Под словом «возбуждение» в этой главе будет подразумеваться насыщение перехода, т. е. устранение разности заселенностей его уровней при облучении слабым радиочастотным полем, одновременно с наблюдением других сигналов. Таким образом, ЯЭО-это результат попыток системы в целом удержаться в состоянии теплового равновесия. Мы принудительно изменяем разность заселенностей одной части системы, и другие ее части пытаются скомпенсировать внесенное возбуждение. Способ компенсации можно продемонстрировать на очень простой системе из двух ядер со спином 1/2. Но сначала определим понятие величины ЯЭО. Пусть нормальная интенсивность сигнала в условиях теплового равновесия и при отсутствии возбуждения системы равна /0. Интенсивность, наблюдающаяся при насыщении какого-либо другого резонанса, достаточно длительном для установления нового равновесия, равна 1. Тогда ЯЭО равен
ц^Д = (/—/0)//0(5.1)
Это выражение часто умножается на 100 для перевода в проценты. Заметьте, что ЯЭО будет положительным, если новая интенсивность больше исходной, и отрицательным, если меньше. На практике встречаются оба случая. r);(s) обозначает ЯЭО на ядре I при насыщении ядра
s (использующееся в этой главе обозначение взято из книги Ноггла и Ширмера [2], но оригинальная буква/заменена на более обычную р). Методы оценки изменения интенсивности сигнала ядра i, которое может быть очень небольшим, обсуждаются в разд. 5.3; в этом разделе мы выясним, как и почему оно возникает.
Пути релаксации
В предыдущей главе мы рассматривали продольную релаксацию с макроскопической точки зрения. Мы предполагали, что при помещении образца в магнит наведенная намагниченность возникает в нем в соответствии с процессом первого порядка (т. е. экспоненциально) с константой Tv Это было всего лишь предположение, но оно часто подтверждается экспериментально. В основе изменений макроскопической намагниченности должен лежать весьма сложный процесс установления равновесия по всем многочисленным переходам системы ядер. Именно этим процессом мы сейчас и займемся.
Рассмотрим два ядра i и s со спином 1/2, одинаковыми у, но разными химическими сдвигами. Предположим, что они находятся в одной молекуле, но не испытывают спин-спинового взаимодействия. Такая система будет иметь четыре уровня энергии, соответствующие состояниям ядер аа, ар, Ра и РР (рис. 5.1). Химические сдвиги в общем случае очень малы в сравнении с ларморовой частотой (миллионные доли), поэтому переходы различных ядер будут иметь приблизительно равную энергию, а состояния ар и Ра будут почти вырожденными. На рисунке различие их энергий для наглядности сильно преувеличено. Мы предполагаем отсутствие косвенного спин-спинового взаимодействия, поэтому оба перехода ядра i, так же как и s, имеют в точности одинаковую энергию. В результате в обычном спектре будут наблюдаться два синглета равной интенсивности.
Пусть общее число ядер в образце равно 4 N. Если бы все четыре уровня имели равную энергию, то они были бы равнозаселены-по N ядер на каждом. Однако это не так. При тепловом равновесии заселенности будут соответствовать распределению Больцмана. Для простоты будем считать различие энергий состояний ар и Ра пренебрежимо малым, а их заселенности одинаковыми. Состояние аа с низкой
Рис. 5.1. Уровни энергии гомоядерной системы АХ и их заселенность.
энергией будет иметь избыток, а РР-недостаток одного и того же количества ядер. Если мы обозначим избыток или недостаток заселенности как б, то получим распределение, приведенное на рис. 5.1. Наибольший интерес представляют разности заселенностей. Запишем их в кратком виде:
переходы ядра г.
аа-ар) ра - ppj
переходы ядра s:
аа — Ра) ap-ppj ” переход ДМ = 0:
Ра — аР} ... 0
переход ДМ = 2:
аа —РР}...25(5.2)
Первые четыре разности соответствуют нормальным переходам, дающим линии в спектре, а два других перехода должны сопровождаться изменением квантового числа М (суммы индивидуальных квантовых чисел т двух ядер) на 2 (аа — рр) или на 0 (ра — ар). Хотя переходы такого типа и не наблюдаются в нормальных условиях (запрещены квантовомеханическими правилами отбора), мы не можем с уверенностью утверждать, что они не будут давать вклада в релаксацию системы, поскольку пока не существует описывающей их теории. Нам следует считать, что, если приведенные разности заселенностей нарушены, система старается восстановить их любыми доступными способами. Это приводит к целому набору возможных путей релаксации системы (рис. 5.2), эффективность которых мы должны подтвердить или опровергнуть экспериментально.
Сделаем некоторые предположения. Будем считать, что релаксация через один переход - процесс первого порядка, т. е. его скорость пропорциональна первой степени отличия разности заселенностей от ее равновесной величины. Будем обозначать константы скорости различных
Рис. 5.2. Связи различных уровней энергии системы АХ, способные принимать участие в релаксации.
процессов буквой Wс подстрочным индексом, указывающим на изменение М (например, % для Ра — ар, И^ для аа — ар и т. д.), и надстрочным, указывающим ядро, изменяющее свое состояние (И^ или И7)). В наиболее общем случае (когда может присутствовать и спин-спиновое взаимодействие) нет причин предполагать, что два перехода одного ядра будут иметь одинаковую скорость релаксации (т. е. понадобятся шесть констант скоростей), но для простоты мы будем считать, что такое предположение верно.
Мы ввели много новых символов, которые легко могут нас запутать, поэтому стоит ненадолго остановиться и задуматься о том, что мы делаем (см. рис. 5.2). Мы хотим представить релаксацию системы взаимодействующих ядер как совокупность отдельных переходов и соотнести измеряемые величины (например, TJ с реально происходящими процессами. При измерении Т\ мы наблюдаем процесс возвращения продольной намагниченности в состояние равновесия. Проделав этот эксперимент на ядре / нашей двухспиновой системы, мы увидим суммарную интенсивность двух вырожденных переходов. Следовательно, полученная величина Т\ будет каким-то образом связана со скоростями И'), W2 и Wo. Если две последние будут нулевыми (т. е. отсутствуют переходы ДМ = 0 и ДМ = 2), то Т\ можно будет представить в виде
ri = 1/2 W\ (5.3)
Поскольку И7-константа скорости, Т, - постоянная времени, общая скорость релаксации складывается из скоростей по двум переходам. Если W2 и Wo не равны нулю, то в общую скорость релаксации ядра i, очевидно, будет давать вклад разность заселенностей ядра s. Это опровергает сделанное при определении Тх предположение о том, что скорость изменения макроскопической намагниченности одного типа ядер зависит только от его собственного отклонения от равновесия и не связана с намагниченностью других ядер. Следовательно, в многоспиновых системах простое измерение Тх может не дать корректной информации. Это довольно важное замечание, но оно не относится к нашей дискуссии (более подробное изложение см. в книге Ноггла и Ширмера [2], гл. 1, разд. D, Е и G).
При выполнении эксперимента по ЯЭО мы принудительно изменяем разность заселенностей по некоторым переходам и наблюдаем сигналы других переходов. Мы должны стараться воздействовать на все переходы ядра в равной степени (неравное возмущение создает дополнительные сложности, обсуждаемые в разд. 5.3), т. е. мы должны насыщать оба перехода ядра s и наблюдать ядро / после установления нового равновесия. Для того чтобы проанализировать полученные данные с учетом сделанных замечаний о релаксации, мы должны составить систему уравнений, описывающих различные пути релаксации, и решить их с граничными условиями, заданными насыщением ядра s. Это вполне строгий путь, но он сопряжен с громоздкими вычислениями, поэтому мы не будем • его рассматривать. Исходное описание можно найти
Рис. 5.3. Заселенность уровней после насыщения переходов д.
в книге [2]. Вместо этого мы попробуем установить возможный вклад каждого пути релаксации. Рассмотрим состояние системы сразу после достижения насыщения ядра 5 (рис. 5.3). Новые разности заселенностей [для сравнения с равновесными (5.2)] теперь таковы:
переходы ядра i:
аа-ар)
Ра — ppj переходы ядра s:
аа — Ра]
> Оар - PPJ
переход ДМ = 0:
Ра — аР} ... 8
переход ДМ = 2:
аа — РР} ... 8(5.4)
Система в целом больше не находится в равновесии, но в соответствии с нашей гипотезой должна стремиться к нему. Рассмотрим каждый из возможных путей релаксации. W\, очевидно, не подходит, поскольку разность заселенностей по этому переходу зафиксирована его насыщением. Разность заселенностей каждого перехода ядра / в состоянии теплового равновесия была равна 8; эта же величина сохранилась и сейчас, следовательно, с точки зрения W\ никаких изменений не требуется. Если релаксация осуществляется только за счет одноквантовых переходов, то насыщение ядра s не будет оказывать влияния на интенсивность сигналов i; иными словами, при облучении s на ядре / не будет наблюдаться ЯЭО.
Интереснее попробовать учесть скорости W2 и Wo. Разность заселенностей уровней аР и Ра составляет сейчас 8, а при равновесии была нулевой. Следовательно, процесс WQ будет соответствовать переходам ядер из состояния Ра в аР, что способствует восстановлению равновесной нулевой разности заселенностей. Это приведет к повышению заселенности верхнего уровня первого перехода и понижению заселенности нижнего уровня второго перехода ядра i, т. е. к понижению общей
«4 8
ар —_
w01
—^Л^З
РР
>V-|8
аа —*—N* ^8
Рис. 5.4. Начальное направление кросс-релаксации после насыщения переходов s.
интенсивности его сигнала (рис. 5.4). Но этому процессу будет препятствовать W), так как с его точки зрения переходы i уже находились в состоянии равновесия. Суммарный эффект будет зависеть от соотношения W\ и Wo. Если в релаксации преобладает путь И^, то насьицение ядра s будет сопровождаться понижением интенсивности сигналов i, или ЯЭО на i при облучении s будет отрицательным.
Примем те же рассуждения к W2. Разность заселенностей аа — РР составляет теперь 5, в то время как в равновесии была 2 8. Следовательно, процесс И^ будет сопровождаться переходом ядер из состояния рр в аа для восстановления разности заселенностей 28. Это приведет к понижению заселенности верхнего уровня одного перехода и повышению заселенности нижнего уровня другого перехода ядра i, т.е. к повышению интенсивности его сигнала. Этому процессу препятствует W) и т. д. Если в релаксации преобладает путь W2, то насьицение ядра s будет сопровождаться повышением интенсивности сигналов /, или ЯЭО на / при облучении s будет положительным.
Формальное решение дифференциальных уравнений этой системы позволяет нам получить формулу, включающую W^, И^ и % в момент достижения системой новых равновесных условий:
(5.5) 2^+^+% 7
Мы получили это выражение, не задумываясь о том, как осуществляется релаксация. Мы рассмотрели ее абстрактные возможные пути. Теперь посмотрим, какой же из путей реализуется в эксперименте. Существование ЯЭО подтверждает участие в релаксации процессов И^ и/или И^ (они вместе называются кросс-релаксацией), а его знак позволяет определить доминирующий процесс. Для небольших молекул в невязких растворах ЯЭО должен быть положительным (подразумевается, что в этих условиях преобладает Иу, а для макромолекул или очень вязких растворов -отрицательным (преобладает Wo). Между ними Находится область, где W2 и Wo сбалансированы, и ЯЭО отсутствует. Это наблюдение подтверждает сделанное ранее предположение о том, что релаксация связана с движением молекул. Теперь мы должны более подробно проанализировать ее механизм.
Причины релаксации
Введение. Все описанные выше переходы не осуществляются самопроизвольно с какой-либо заметной скоростью. Для объяснения ядерной релаксации мы должны найти механизмы, способные инициировать переходы, и затем вычислить их эффективность. Переходы могут происходить под влиянием электромагнитных полей, осциллирующих на подходящей частоте. Мы попробуем найти их в окружении молекул. Сделать это будет не так просто, поскольку существует несколько возможных источников возникновения флуктуирующих электромагнитных полей. К счастью, только один из них будет эффективен на расстояниях порядка межъядерных. Количественное описание процессов релаксации осложняется еще и тем, что необходимо каким-то образом моделировать случайное движение молекул в растворе. Следовательно, нам недоступно получение более конкретных результатов в этой области. Но получить представление о физической природе механизма релаксации не так трудно. В любых теоретических книгах по ЯМР вы можете найти более строгое количественное описание этого предмета.
Магнитные диполи и днполь-дипольное взаимодействие. Как уже упоминалось ранее, ЯЭО обусловлен диполь-дипольным взаимодействием ядер. Осмыслить это утверждение не просто. Мы не знаем, что такое магнитный диполь, не говоря уже о взаимодействии диполей друг с другом. Рассмотрим сначала электрический диполь. Он состоит из двух точечных зарядов-положительного и отрицательного (рис. 5.5). Мы воображаем его окруженным силовыми линиями, которые задают направление силы, действующей на помещенный в его поле тестовый положительный заряд. Магнитный же диполь-это просто удобная выдумка (магнитный «монополь», т. е. аналог электрического заряда, видимо, не существует вообще). Она сделана на основе сходности силовых линий электрического диполя и петли с током на не слишком близком от нее расстоянии (рис. 5.5). Эта связь позволяет физикам
Рис. 5.5.Возможные диполи: элект-рический (а), петля с током (б),постоянный магнит (в), ядро (г).
Нах/ х/
Рис. 5.6. Взаимодействие двух диполей зависит от их взаимной ориентации.С-Северный полюс, Ю-Южный полюс.
сэкономить некоторую часть усилий по расчету сил взаимодействия двух петель с током: они могут просто взять готовые результаты, полученные для электростатического случая.
Ядро (имеющее заряд и угловой момент) и постоянный магнит-еще два источника магнитного поля, которые удобно описывать в терминах магнитных диполей (рис. 5.5). Вектор ц, использовавшийся в предыдущих главах для обозначения ядерного магнетизма, совпадает с направлением диполя; стрелка указывает воображаемый Северный полюс (С). Для наших целей вполне достаточно представлять себе взаимодействие ядер как усиление или ослабление одним ядром поля Во в точке расположения другого (рис. 5.6). Результат этого усиления или ослабления называется локальным полем на ядре, создаваемым другими ядрами. Ориентация ядерных диполей определяется внешним полем, но их относительные положения зависят от положения молекулы в целом, поэтому локальное поле на ядрах одного типа неодинаково в различных молекулах. В аморфных стеклообразных растворах или в поликристал- лических порошках положения отдельных молекул можно считать фиксированными, но их ориентации не одинаковы, что приводит к образованию целого диапазона резонансных частот и уширению линий. В монокристаллах, напротив, может быть только несколько или вообще одна относительная ориентация диполей, и диполь-дипольное взаимодействие непосредственно проявляется в спектре в виде расщепления линий, величина которого зависит от ориентации кристалла в магнитном поле. Заметьте, что это прямое магнитное взаимодействие намного превышает обычное скалярное спин-спиновое взаимодействие, но довольно часто превышает и разность химических сдвигов ядер. В результате изменение резонансной частоты может составлять много килогерц.
Однако нам хорошо известно, что ширина линии в растворах может составлять доли герца, что кажется удивительным при наличии диполь- дипольного взаимодействия. Быстрое хаотическое движение молекул усредняет диполь-дипольное взаимодействие по всем возможным их
ориентациям. Расчеты показывают, что это среднее значение равно нулю. Кроме того, быстрая переориентация диполей представляет собой хороший источник флуктуирующих полей для стимулирования продольной релаксации. Сила диполь-дипольного взаимодействия должна, очевидно, зависеть от расстояния между ядрами: в этом заключается связь наших физических идей с требующейся химической информацией. Логично будет предположить, что диполь-дипольное взаимодействие создает подходящие условия для кросс-релаксации (т. е. процессов Wo и Иу, поскольку оно обеспечивает энергетическую Связь между двумя ядрами (мы увидим и другие механизмы релаксации, которые не связывают ядер и, следовательно, не создают кросс-релаксации). Нам осталось только разобраться, каким образом движение молекул вызывает релаксацию через диполь-дипольное взаимодействие и как это соотносится с путями Wo, Wv и W2.
Релаксация через диполь-дипольное взаимодействие. Для того чтобы выразить продольную релаксацию и ЯЭО через диполь-дипольное взаимодействие, нам нужна модель движения молекул в растворе. Построить ее для больших сложных молекул, очевидно, не представляется возможным. Сама молекула может поступательно двигаться и вращаться, а различные ее части, кроме того, могут двигаться не так, как остальные. Большинство этих движений носит случайный характер. Обычно в этом случае делается грубое приближение, при котором для описания всех случайных движений вводится один параметр - время корреляции молекулы тс.
В зависимости от конкретной решаемой задачи используется несколько различных определений тс. Предположим, что молекула иногда совершает переходы от одной ориентации к другой и эти переходы мгновенны. Тогда тс характеризует величину промежутков времени между движениями молекулы. «Времена ожидания» между движениями будут распределены каким-то случайным образом, поэтому время корреляции тс выбирается так, чтобы интервалы, меньшие тс, встречались редко. Такое слегка необычное определение (более правильным кажется выбор среднего времени ожидания) обладает тем достоинством, что нижний предел времени ожидания соответствует верхнему пределу распределения частот флуктуирующих полей, образующихся в результате движения молекул.
Параметр тс объединяет целый комплекс различных факторов, оказывающих влияние на молекулярное движение. Поэтому он должен зависеть от молекулярной массы, вязкости раствора, температуры и, возможно, других специфических факторов, таких, как водородные связи и pH раствора. Сравнивать величины тс различных молекул следует, полагаясь на опыт и химическую интуицию. Например, молекулы с большой массой в растворах обычно движутся медленнее легких и поэтому имеют большее тс. Теперь нам нужно разобраться, каким образом изменения тс будут влиять на времена релаксации и относи-
тельные вклады различных путей. Вскоре мы получим формулу, связывающую Wo, Wj и W2 с тс (для двухспиновой системы), но сначала попробуем сделать предположение об их связи на основе физики. Для этого нам нужно будет понять, каким образом распределение частот осциллирующих полей, возникающих при движении молекул, зависит от тс, и затем сравнить их с частотами, необходимыми для инициирования процессов Wg, W2 и W2.
Учитывая, что энергия диполь-дипольного взаимодействия не зависит от тс (она зависит только от межъядерного расстояния, которое в нашей модели считается фиксированным), а скорость его изменения, наоборот, зависит от тс, мы можем предсказать, что общее число осциллирующих полей будет постоянным, а верхний предел их частот будет определяться тс. Если мы построим график зависимости напряженности флуктуирующих полей (спектральная плотность, обусловленная диполь-дипольным взаимодействием, обычно обозначается J) от частоты ю для нескольких значений тс, то они будут иметь одинаковую площадь под кривой, но различные верхние пределы (рис. 5.7). Мы можем также принять без доказательства, что при со « 1/тс спектральная плотность будет приблизительно постоянной, как это показано на рисунке (такое предположение доказывается теоретически и подтверждается экспериментально). Это позволяет нам дать некоторые количественные оценки величин Т, и даже W исходя из тс (т. е. с учетом температуры, вязкости и т. д.).
Скорость релаксации будет определяться интенсивностью поля, флуктуирующего с подходящей для соответствующих переходов частотой. Например, для процесса И^ это частота соо. Рассмотрим сначала случай, когда 1/тс намного больше соо, т. е. мы находимся на горизонтальной части кривой спектральной плотности. С уменьшением тс (например, при повышении температуры) высота кривой в точке соо будет также уменьшаться (поскольку площадь под кривой остается постоянной, а верхний предел отодвигается еще дальше). Следовательно, Г, будет расти (замедление релаксации). Если мы изменим Во, а значит, и ю0, то изменений Т2 не должно произойти, так как мы находимся на горизонтальном участке кривой спектральной плотности (см. рис. 5.7).
Рис. 5.7. Функции спектральной плотности для двух различных значений тс. Ядро с ларморовой частотой <в0 будет испытывать предельное сужение линии при коротких, а не длинных тс.
Если теперь постепенно увеличивать тс, то Тх будет понижаться, но только до области 1/тс« о)о. Здесь мы уходим с горизонтальной части кривой, и дальнейшее уменьшение тс будет вызывать увеличение Tv В этой области можно ожидать зависимости Тх от напряженности поля, поскольку кривая спектральной плотности не горизонтальна. Таким образом, на графике зависимости Тх от тс должен наблюдаться минимум, что и подтверждается экспериментально.
Каковы же будут относительные вклады в релаксацию процессов И^, И^ и И^? И^ будет стимулироваться самой высокой частотой (поскольку он представляет собой сумму двух обычных переходов), И^-самой низкой, a И)-средней между ними. Следовательно, в области 1/тс ж<в0 процесс W2 должен исчезать первым, a Wo еще будет достаточно эффективным. Такую ситуацию мы уже наблюдали, когда с увеличением размера молекул происходило изменение знака ЯЭО (разд. 5.2.2). Таким образом, наша модель релаксации по механизму диполь-дипольного взаимодействия способна хотя бы на качественном уровне объяснить наблюдаемую связь 7) и ЯЭО с молекулярным движением.
Количественный подход позволяет получить формулы, выражающие зависимость скорости релаксации от диполь-дипольного взаимодействия в системе из двух спинов, находящихся на расстоянии г друг от друга:
. Зтс
СС Г6(1 + (й? Т2)
т.
w ст-
° г6[1+(ш(-ш/гс2]
(5.6)(5.6)12т,
(5.6)
(5.6)
2 г6 [1 + (o)f + cos)2 т2]
Коэффициент пропорциональности в каждой формуле один и тот же; со; и со$-ларморовы частоты двух ядер. Заметьте, что W\ зависит только от частоты о);, a W2 и Иц-от суммы и разности частот двух ядер соответственно. Это согласуется с нашими предыдущими рассуждениями.
Условие 1/тс»соо (т. е. режим, когда Тх растет с уменьшением тс) можно выразить в форме о)2т2 « 1. В этом случае все частотно-зависимые члены в знаменателях выражений (5.6) можно считать пренебрежимо малыми, и они принимают вид
Зт, 2 т. 12 т.
^сс^, И^ос^, И^ос^ (5.7)
Условие со2 т2 « 1 известно под названием условие предельного сужения (это условие соответствует полному исчезновению диполь-дипольного уширения линий за счет усреднения по всем ориентациям молекулы). Считается, что это условие выполняется для всех обычных органи-
ческих молекул в невязких растворах, но в последнее время в связи с более широким применением сильнопольных спектрометров отклонения от него встречаются все чаще. При работе с белками и другими биологическими макромолекулами предельное сужение вряд ли может быть достигнуто, поэтому для описания скоростей релаксации нужны другие, более сложные выражения. Мы приведем их вместе с формулами для ЯЭО в разд. 5.2.4 и попробуем с их помощью измерять межъядерные расстояния.
Другие механизмы релаксации. Дипольное взаимодействие, промоду- лированное движением молекул, представляет собой наиболее важный механизм релаксации протонов и других ядер со спином 1/2 (таких, как 13С) в растворах. Мы кратко упомянем и другие существующие механизмы, чтобы уметь обнаруживать и подавлять их при проведении экспериментов по ЯЭО, поскольку все они не связаны с кросс-релаксацией и, следовательно, снижают ЯЭО. Прежде всего заметим, что до сих пор мы рассматривали диполь-дипольные взаимодействия только между ядрами одной молекулы, хотя нет никаких запретов на существование межмолекулярного диполь-дипольного взаимодействия. Межмолекулярные взаимодействия происходят на больших расстояниях, но это не значит, что ими можно пренебречь. Первым зарегистрированным ЯЭО был именно межмолекулярный эффект на протонах в смеси хлороформа и циклогексана. Поскольку при измерении ЯЭО используются только дейтерированные растворители, единственным вероятным межмолекулярным эффектом будет взаимодействие друг с другом молекул растворенного вещества. На практике для его подавления следует готовить достаточно разбавленные растворы.
Другой чрезвычайно эффективный механизм диполь-дипольной релаксации-взаимодействие с неспаренными электронами. Магнитный момент электрона приблизительно в 2000 раз больше, чем у протона, поэтому в присутствии парамагнитных веществ даже межмолекулярное взаимодействие оказывается сильным. Это приводит к большому сокращению времен релаксации, полностью останавливает кросс-релаксацию и подавляет гомоядерный ЯЭО. Умышленно добавляя в образец парамагнитные вещества, мы можем подавлять нежелательный ЯЭО и сокращать Tt (см. гл. 7). В то же время все обычные растворы содержат заметные количества парамагнитного кислорода, который следует удалять перед измерением ЯЭО (см. разд. 5.3).
Еще один широко распространенный механизм релаксации работает только на ядрах со спином, большим 1/2 (квадрупольные ядра). Такие ядра помимо магнитного поля способны взаимодействовать и с градиентом электрического поля, что служит очень эффективным механизмом релаксации. Поэтому квадрупольные ядра (например, 17О или 14N) имеют очень малые времена релаксации Т^ и Т2 и широкие линии. Однако ядра в симметричном окружении (например, 14N в соединениях типа R4N+ X-) или в окружении с малыми градиентами электрического
поля (классический пример-14N в изоцианидах) представляют собой исключение. Дейтерий (спин 1)-возможно, наиболее важное для химиков квадрупольное ядро-дает относительно узкие линии в небольших молекулах по причине малого квадрупольного момента. Но все же он релаксирует значительно быстрее ядер со спином 1/2. Большая скорость релаксации, не зависящая от процессов кросс-релаксации, делает ЯЭО нехарактерным для квадрупольных ядер.
Существует еще несколько механизмов релаксации, эффективных в определенных условиях, но мы не будем загружать ими свою память. Можно с уверенностью предположить, что для молекул среднего размера в невязких растворах (подразумевается, что надо исключить только очень маленькие и очень большие молекулы) основным механизмом релаксации протонов будет внутримолекулярный диполь-дипольный механизм. В необезгаженных образцах возможен вклад растворенного кислорода, другие межмолекулярные механизмы маловероятны. Исчерпывающий обзор всех остальных механизмов релаксации можно найти в гл. 9 книги Шоу [3].
ЯЭО и межъядерные расстояния
Максимальный ЯЭО. Мы можем объединить выражения для ЯЭО и скоростей различных процессов релаксации W и попробовать извлечь из них информацию о межъядерных расстояниях. Вспомним, что для двухспиновой системы, релаксирующей только через диполь-дипольное взаимодействие, ЯЭО выражается как
П((-$)П((-$)W2- 1Е02 W\ + W2+W0W2- 1Е02 W\ + W2+W0(5-5)(5-5)
П((-$)
П((-$)
W2- 1Е0
2 W\ + W2+W0
W2- 1Е0
2 W\ + W2+W0
(5-5)
(5-5)
Заменив все W на их выражения в условиях предельного сужения (5.7),
получим
(5-8)(5-8)(12 —2)тс/г61
(5-8)
(5-8)
(6 + 12 + 2) xjr6 - 2
Такого результата мы не ожидали! В соответствии с нашим предположением ЯЭО должен не зависеть от г и быть равным точно 0,5 (или 50%, как это принято записывать в химическом контексте). Мы не сделали ошибки: наше предположение совершенно верно, но оно применимо только к идеальной системе двух диполей, полностью изолированной от всех остальных источников релаксации. Если бы Вселенная состояла только из двух протонов, находящихся в условиях предельного сужения, то насыщение сигналов одного из них дало бы 50% ЯЭО на другом независимо от того, находились бы они на расстоянии в несколько ангстрем или в несколько световых лет. Отсюда можно сделать вывод, что, если реальный химический эксперимент достаточно близко подходит к ситуации двух изолированных протонов, ЯЭО может не
содержать никакой информации о межъядерных расстояниях. Для правильного использования величин ЯЭО необходимо помнить об этом.
Каким бы нереалистичным ни было наше вычисление, из него можно извлечь полезный результат. Максимальный положительный гомоядер- ный ЯЭО, который можно получить в эксперименте, составляет 50%. В гетероядерном случае максимальный ЯЭО определяется выражением 0,5 Oishi О- Оно объясняет значительное увеличение чувствительности при наблюдении гетероядер в условиях широкополосной развязки от протонов. Например, Yh//Yc составляет около 4, и максимальный ЯЭО-200%, что приведет к трехкратному увеличению интенсивности сигналов по сравнению с интенсивностью без ЯЭО (/ = 70(1 + г])). В то же время некоторые ядра имеют отрицательное значение гиромагнитного отношения (например, 29Si и 15N), поэтому облучение протонов может понизить или даже инвертировать их сигналы. Например, Ун/Уы составляет около — 5, и максимальный ЯЭО-около — 250%. Если же реализуется не полный ЯЭО, а около — 100%, то сигнал может исчезнуть вообще. Этот вопрос будет обсуждаться в следующей главе, где мы сравним ЯЭО с другими способами повышения интенсивности сигналов, использующими гетероядерное спин-спиновое взаимодействие с протонами.
Когда не выполняется условие предельного сужения. По мере того как растет напряженность полей спектрометров, а вместе с этим и наше стремление к изучению сложных молекул, довольно обычными становятся ситуации, когда предельное сужение уже отсутствует. Химики- органики, работающие с молекулами, массы которых составляют несколько тысяч единиц, попадают в ловушку сбалансированных W2 и Wo, где ЯЭО становится пренебрежимо малым. Единственный выход из нее-замена растворителя или изменение температуры с целью вернуться в область предельного сужения или перейти в другой режим, где основную роль будет играть Жо. Именно в этом режиме работают биохимики (см. ниже). Совсем недавно появилась новая экспериментальная методика (ЯЭО «во вращающейся системе координат» [4]), позволяющая надеяться на решение этой проблемы, но к моменту написания книги она еще недостаточно хорошо разработана, чтобы делать окончательные выводы.
При очень больших временах тс, наблюдающихся в растворах белков или нуклеиновых кислот с молекулярной массой более 10000, Жо полностью преобладает над W2. Подставив в выражение (5.5) нулевые W2 и W2, мы видим, что ЯЭО снова восстанавливается, но уже с максимальным значением — 1. Таким образом, в макромолекулах ЯЭО отрицателен и по величине в 2 раза превышает ЯЭО в условиях предельного сужения. Это очень удобно для отнесения сигналов в спектрах белков, особенно если ЯЭО определяется в двумерном варианте (см. гл. 8).
ЯЭО в реальных системах. Мы получили довольно пессимистический вывод о возможностях применения ЯЭО. Но, к счастью, если в образовании ЯЭО участвует большее число взаимодействий, он все-таки сохраняет связь с межъядерным расстоянием. Эту связь можно выявить двумя основными путями. Во-первых, ЯЭО даже в двухспиновой системе может зависеть от межъядерного расстояния, если имеются конкурирующие пути релаксации, всегда присутствующие в реальных экспериментах. Приняв некоторые допущения об этих путях, мы можем экспериментально прокалибровать зависимость ЯЭО от межъядерного расстояния. Во-вторых, в многоспиновых системах, где не наблюдается кросс-релаксация, иногда удается связать величины ЯЭО с отношениями межъядерных расстояний (но не с самими расстояниями). Ниже будет представлено особенно полезное уравнение такого типа.
Сравнение величин ЯЭО в двухспиновых системах. Первый подход, разработанный Беллом и Сондерсом [5], лег в основу большинства применений ЯЭО в органической химии. Посмотрев на уравнение (5.5), мы заметим, что его числитель содержит информацию о чистой кроссрелаксации и обычно обозначается ois:
^«=W2-W0 (5.9)
Знаменатель уравнения (5.5) выражает общую релаксацию ядра i и обычно обозначается р^
= 2 W\ + W2 + Wo (5.10) Наши предыдущие вычисления показывают, что для случая чисто гомоядерной диполь-дипольной релаксации двух ядер со спином 1/2
Р/ = 2ак (5.11)
(5.12)(5.13)(5.14)(5.12)(5.13)(5.14)т. е. ЯЭО составляет 0,5. В реальной ситуации будут присутствовать и другие механизмы релаксации. В предположении, что они не связаны с кросс-релаксацией, мы можем просто включить их в знаменатель (5.5) в виде дополнительного члена р*:
(5.12)
(5.13)
(5.14)
(5.12)
(5.13)
(5.14)
или с учетом (5.11):
2 (р; + р*)
Перевернем полученное выражение:
1,2р*
М») Pi
Используя нашу модель диполь-дипольной релаксации, в условиях
(5.15)(5-16)(5.15)(5-16)предельного сужения мы получаем
(5.15)
(5-16)
(5.15)
(5-16)
р-^7
Уравнение (5.14) приобретает форму
16
П.И \тс/
По Беллу и Сондерсу, для подобных молекул величину р*/тс часто можно считать постоянной, и измеряемый ЯЭО должен быть непосредственно пропорционален 1/г6. Они проверили это предположение на ряде молекул с известной геометрией и получили хорошее соответствие между 1/г6 и т|. Этот вывод позволяет сравнивать межъядерные расстояния в различных молекулах с помощью величин ЯЭО, однако для получения корректных результатов нужно тщательно проверять наличие необходимых условий. Особое внимание следует обратить на такие моменты:
тс будет постоянной только для молекул с близкими молекулярными массами в одинаковых растворителях при одинаковых температурах. Специфические взаимодействия с растворителем, способные изменить тс, должны отсутствовать. Не должно быть и внутримолекулярных движений, в результате которых эффективное корреляционное время конкретного ядра может отличаться от тс для молекулы в целом, т. е. эксперимент можно проводить только на жестких молекулах.
Необходимо работать с достаточно малыми молекулами, чтобы в поле вашего магнита достигался режим предельного сужения.
р*-дополнительная релаксация, обусловленная посторонними диполь-дипольными взаимодействиями. Ее скорость должна быть постоянной. Поэтому нельзя менять растворитель и концентрацию. Очень важно постараться исключить возможные различия во внутримолекулярных взаимодействиях сравниваемых молекул. Однако полностью этого достичь невозможно. Эти взаимодействия и представляют собой наиболее вероятный источник ошибок при интерпретации ЯЭО. В дальнейшем мы обсудим этот вопрос более подробно.
При переходе от соединения к соединению не должны изменяться структурные особенности, способные изменить зависящий от межмолекулярных взаимодействий член р*. Например, все используемые для измерений ядра должны находиться на периферии молекулы, а не в какой-либо полости. Не должно быть специфических взаимодействий, таких, как водородные связи, обусловливающих неодинаковое сродство различных частей молекулы к растворителю.
Образец нужно готовить очень тщательно, обращая особое внимание на удаление растворенного кислорода. Случайное попадание в образец кислорода может вызвать значительное снижение измеряемого ЯЭО, что приведет к получению неверных результатов. Этот момент будет обсуждаться в разд. 5.3.
11 -75
Рис. 5.8. Межъядерные расстоя-ния в трехспиновой системе.
ЯЭО в системе из нескольких ядер. Из предыдущего обсуждения ясно, что сравнение друг с другом величин ЯЭО, полученных для различных молекул, может быть не совсем корректным. Но, к счастью, многие задачи решаются с помощью сравнения ЯЭО для различных ядер внутри одной молекулы, если мы имеем о ней некоторую достоверную дополнительную информацию. В разд. 5.4 мы приведем несколько примеров использования этого метода на качественном уровне. Для ограниченного числа случаев можно вывести и количественные выражения. Например, для системы АМХ без посторонних источников кросс-релаксации (рис. 5.8) имеем [2]
ГахУ = Па(М) + т}А(Х)т]х(М)
Гам/ Па(Х) + Па(М)т|м(Х) ’
Если мы измерили все ЯЭО в такой системе и знаем некоторые межъядерные расстояния, это уравнение позволяет нам вычислить неизвестные межъядерные расстояния. Например, положение геминальных протонов у 5р3-гибридизованного углерода почти не меняется при переходе от молекулы к молекуле. Если эти протоны составляют AM-часть системы АМХ, то по измеренным ЯЭО мы можем определить положение ядра X. Применение формулы возможно только при условии жесткой связи между тремя ядрами (одинаковые тс для двух межъядерных векторов) и в отсутствие посторонних источников кросс-релаксации (т. е. в отсутствие поблизости других ядер со спином 1/2). Последнее требование надежно выполняется только в случае очень небольших молекул, однако убедиться в отсутствии других источников кросс-релаксации можно и с помощью изотопного замещения водорода на дейтерий. Кроме того, даже присутствующие в молекуле посторонние источники кросс-релаксации могут не оказывать существенного влияния на эксперимент, если они достаточно удалены от интересующих нас ядер. Проверить это условие можно с помощью ЯЭО: облучение посторонних ядер не должно давать заметного ЯЭО на исследуемых ядрах.
Два основных принципа для многоспииовых систем. Разбор нескольких конкретных примеров (рис. 5.9) поможет нам сделать довольно абстрактные рассуждения этого раздела более понятными. Сначала рассмотрим два протона в молекуле, не содержащей других ядер со спином 1/2. При правильном выборе условий проведения эксперимента дополнительных источников релаксации будет не так много (т. е. р* « 0), и мы получим почти максимальный (50%) ЯЭО на одном протоне при
Рис. 5.9. Двухспиновая системаи два возможных расположенияядер трехспиновой системы.
облучении другого независимо от расстояния между ними. Этот пример подтверждает первый принцип:
Наблюдение ЯЭО между двумя протонами само по себе еще не говорит об их близости.
Для правильной интерпретации таких измерений нужна дополнительная информация: другой эксперимент для сравнения, например, по методу Белла и Сондерса или уверенность в том, что использующийся для измерения ЯЭО протон не изолирован от других источников кросс-релаксации. Второе условие выполняется при наличии в молекуле как минимум еще одного спина (рис. 5.9,5). Пусть три протона находятся на одной линии и один из крайних (НА) находится ближе к центральному (Нв), чем другой (Нс). Облучение НА будет давать значительное повышение интенсивности сигнала Нв, поскольку он ближе, чем Нс, и преобладает его кросс-релаксация. По этой же причине облучение Нс будет давать небольшое увеличение сигнала Нв. Сравнение данных двух экспериментов позволяет нам с очевидностью сделать вывод об относительных межъядерных расстояниях. Однако облучение Нв даст похожие увеличения сигналов НА и Нс, поскольку с их точки зрения Нв-единственный ближайший протон; поэтому такое измерение делать бесполезно. Это подтверждает тот факт, что в общем случае ЯЭО между двумя ядрами неодинаков в различных направлениях, так как каждое ядро может иметь различные связи с другими источниками релаксации.
Очень интересно также посмотреть, что произойдет с Нс при облучении НА. В молекуле с описанной ранее геометрией НА не будет оказывать заметного прямого влияния на Нс; Нс «почувствует» только увеличение разности заселенностей уровней своего соседа Нв, которое произошло по причине ЯЭО от ядра НА. Поскольку понижение разности заселенностей при насыщении создает на соседнем ядре положительный ЯЭО, на ядре Нс мы должны получить отрицательный ЯЭО. Это известный «трехспиновый эффект», который нужно обязательно учитывать при интерпретации данных ЯЭО. Наличие отрицательного ЯЭО в условиях предельного сужения очень характерно для линейного (или почти линейного) расположения ядер. Можно представить себе и дальнейшее распространение ЯЭО по длинным цепям ядер, сопровождающееся чередованием его знака, но на практике непрямой ЯЭО более чем через два ядра почти всегда пренебрежимо мал.
и*
Рис. 5.10. Зависимость г), (2) от 0 иллюстрирует «трехспиновый эффект».
Другой аспект трехспинового эффекта можно рассмотреть на модели с геометрией, показанной на рис. 5.9,в. Расстояние НА-НС сделано здесь достаточно малым для того, чтобы прямой положительный ЯЭО между ними не был пренебрежимо малым. Суммарный ЯЭО, наблюдающийся на Нс при облучении НА, теперь будет определяться соотношением прямого положительного и непрямого (через Нв) отрицательного эффектов и при некотором отношении межъядерных расстояний может исчезнуть вообще. Поэтому иногда ЯЭО может отсутствовать даже у близко расположенных ядер при наличии значительной взаимной кросс-релаксации. На рис. 5.10 представлен диапазон ЯЭО при «трехспиновом эффекте». Отсюда вытекает наш второй принцип:
Отсутствие ЯЭО между двумя ядрами само по себе еще не , говорит об их удаленности друг от друга.
Использовать этот принцип нужно еще внимательнее, чем первый, поскольку отсутствие или малая величина ЯЭО может наблюдаться по целому ряду причин. Отсюда можно сделать общий вывод, что интерпретация ЯЭО требует учета всех испытываемых ядрами взаимодействий. Измерения ЯЭО в условиях равновесия можно также дополнить измерениями неравновесного ЯЭО (разд. 5.2.5).
Важность такого подхода можно проиллюстрировать на примере теоретической четырехспиновой системы, релаксирующей только за счет диполь-дипольного взаимодействия [6] (рис. 5.11). ЯЭО обозначен на рисунке стрелками, направленными от облучаемого протона к протону, сигнал которого регистрируется. Не отмеченные на рисунке возможные взаимодействия пренебрежимо малы. Сравните большую величину ЯЭО на протоне НА и малую на протоне Нс при облучении Нв. Некритичный подход к интерпретации таких данных позволил бы утверждать, что Нв
I11I
О467
относительное расстояние
Рис. 5.11. ЯЭО в линейной четырехспиновой системе. Величины, использованныев тексте, приведены в толстых рамках.
находится ближе к НА, чем к Нс, хотя правильно как раз обратное. Большой ЯЭО на НА объясняется тем, что он не имеет других источников релаксации, кроме Нв. Проанализировав все возможные в системе ЯЭО, мы, вероятно, уже не сделаем этой ошибки. На практике при более реальном соотношении межъядерных расстояний и ненулевом р* такой внезапный эффект, обусловленный величинами ЯЭО, не возникнет, но вывод ясен: к интерпретации данных нужно подходить очень аккуратно.
Неравновесный ЯЭО
Важная дополнительная информация о геометрии молекулы может быть получена при измерении не самой величины т], а скорости ее установления [7]. Величина ЯЭО зависит от соотношения эффективности различных конкурирующих путей релаксации, которое, как мы уже видели, может выражаться весьма непросто. Но начальная скорость роста зависит только от скорости кросс-релаксации между двумя рассматриваемыми ядрами. При постоянном тс она будет зависеть только от межъядерного расстояния, и в случае рассматривавшейся ранее четырехспиновой системы (разд. 5.2.4) начальная скорость роста т]А (В) должна быть значительно меньше скорости роста т]в (С), несмотря на то что их конечные величины близки. Измерение скоростей роста ЯЭО- менее надежный источник информации, чем определение равновесных значений, но простота интерпретации этих данных с избытком компенсирует усложнение методики эксперимента. Кроме того, на описываемой далее технике измерения неравновесного ЯЭО основан двумерный эксперимент NOESY (гл. 8).
В принципе скорость роста ц может быть измерена таким же путем, как и его равновесное значение,-с помощью разностного метода (см. разд. 5.3) при изменяющейся длительности периода насыщения. Однако для интерпретации таких данных потребуется довольно сложная модель, учитывающая рост как ЯЭО, так и насыщения, поскольку насыщение тоже не может быть достигнуто моментально. Для того чтобы обойти
эту трудность, сначала с помощью селективного л-импульса осуществляют инверсию заселенностей облучаемого ядра и перед выборкой данных дают задержку переменной длительности тт (рис. 5.12). Для определения интенсивностей можно по-прежнему использовать разностный метод. Сигнал, дающий в равновесных условиях положительный ЯЭО, в эксперименте на скорость роста при небольших тт также даст положительный резонанс, увеличивающийся от нуля до некоторого максимума с ростом тт. При дальнейшем увеличении тт он начнет постепенно уменьшаться за счет процессов обычной продольной релаксации, возвращающих систему в состояние теплового равновесия (рис. 5.13). Наклон кривой роста интенсивности в начальный момент времени представляет собой интересующую нас величину.
Практическая трудность определения скорости роста ЯЭО заклю-
быборкабыборкаРис. 5.12. Схема эксперимента для измерения нестационарного ЯЭО.Рис. 5.12. Схема эксперимента для измерения нестационарного ЯЭО.
быборка
быборка
Рис. 5.12. Схема эксперимента для измерения нестационарного ЯЭО.
Рис. 5.12. Схема эксперимента для измерения нестационарного ЯЭО.
Рис. 5.13. Нестационарный ЯЭО (наверху - обычный спектр, ниже-разностныеЯЭО-спектры с переменной задержкой тт). После селективной инверсии синглетав центре спектра на трех других сигналах наблюдается рост отклика. Придостаточно больших тт интенсивности инвертированного пика и возникших ЯЭОприближаются к нулю.
чается в том, что нам нужно проводить несколько измерений при различных тт. Такой эксперимент займет, вероятно, больше времени, чем измерение этого же ЯЭО в равновесных условиях, хотя, конечно, это зависит от соотношения используемой в равновесном эксперименте длительности периода насыщения с задержками тт и числом спектров при измерении скорости роста. Кроме того, в первых точках кривой ЯЭО далек от максимума, поэтому требуется большее отношение сигнал/шум. Селективность инвертирующих импульсов создает те же проблемы, что и насыщение; однако с помощью импульсов специальной формы удается получить очень хорошие результаты (гл. 7, разд. 7.7.3).
Измерение ЯЭО
Введение
Чтобы немного отдохнуть от теоретических выкладок, мы перейдем к практическим вопросам и рассмотрим, как ЯЭО измеряется на практике. Для регистрации столь небольших изменений в интенсивности сигнала (несколько процентов) нужна более высокая точность, чем в большинстве других экспериментов ЯМР. Это требует самой высококачественной работы как от спектрометра, так и от экспериментатора. Помимо описания разностного метода измерения ЯЭО, а также способов получения максимальных его значений и способов уменьшения помех в эксперименте, мы уделим здесь внимание и таким важным для разностной спектроскопии характеристикам спектрометра, как надежность канала дейтериевой стабилизации и стабильность частоты. Все сказанное полезно знать не только при измерениях ЯЭО, но и при выполнении других экспериментов, требующих длительной стабильности спектрометра, как, например, двумерная спектроскопия.
Приготовление образца
Основное требование к образцам для измерения ЯЭО-это отсутствие парамагнитных примесей (в основном кислорода), методы удаления которых обсуждались в гл. 3. Эффективным способом обезгажива- ния образца служит метод замораживания-откачивания-разморажива- ния, который лучше всего проводить непосредственно в ЯМР-ампуле (ампулы с удобными краниками, облегчающими эту процедуру, производит фирма Wilmad). Метод состоит из такой последовательности действий:
Охладите образец в осушенной атмосфере с помощью жидкого азота или смеси сухого льда с ацетоном.
Подсоедините его к хорошей вакуумной линии и откачайте.
Отсоедините образец от линии и нагрейте до комнатной температуры.
Напустите в образец азот и повторите всю процедуру с самого начала.
Эту последовательность нужно повторять много раз (как минимум пять). Удалить кислород полностью очень трудно; это легко продемонстрировать на растворе любого вещества с небольшими молекулами, как, например, бензол. Проделывайте над ним циклы замораживания - откачивания-размораживания и после каждого цикла проверяйте 7^ (быстрый метод определения Tv описан в гл. 7). Обратите внимание, насколько долго нужно обезгаживать образец до получения постоянного Tv Такой эксперимент, кроме того, позволит хорошо проверить ваше оборудование. Старайтесь проводить обезгаживание образца непосредственно перед измерением ЯЭО, поскольку кислород довольно быстро диффундирует внутрь образца даже в ампуле с краником. Очень полезно иметь вакуумную линию непосредственно в ЯМР-лаборатории.
Значительно труднее обезгазить водные растворы, при замораживании которых ампула может лопнуть. В этом случае обезгаживание следует проводить в колбе и переносить раствор в ампулу в инертной атмосфере. Используйте для переноса только специальные шприцы без металлических деталей, поскольку обычные шприцы и иглы обязательно внесут в раствор ионы металла. Нельзя обезгаживать образец пропусканием через раствор газообразного азота. Этот способ не эффективен, и при его использовании в образец может легко попасть еще большее количество парамагнитных примесей.
Обезгаживать водные растворы можно и с помощью простой откачки образца без замораживания (естественно, подразумевается, что раствор нелетуч). Это можно делать и непосредственно в ЯМР-ампуле (очень осторожно!), заполняя ее после каждого легкого вакуумирования инертным газом. Многократные повторения этого цикла позволяют сравнительно эффективно обезгазить образец.
Метод разностных спектров
Введение. При измерении ЯЭО мы должны насыщать один резонансный сигнал и сравнивать интенсивности остальных сигналов с их равновесными величинами. В принципе для этого можно просто проинтегрировать сигналы, полученные в условиях насыщения и без него, но такой способ недостаточно точен для измерения малых ЯЭО. Вместо него применяется методика, известная под названием разностной спектроскопии ЯЭО (рис. 5.14). Кроме собственно разностного метода этот эксперимент включает также использование прерываемой развязки.
Этот тип развязки позволяет производить сравнение спектра, получаемого при насыщении какого-либо сигнала, со спектром без насыщения. Облучение нужного сигнала с помощью декаплера создает новые разности заселенностей в соответствии со всеми ЯЭО. При этом совсем необязательно продолжать облучение сигнала и во время выборки ССИ, поскольку заселенность уровней вернется к равновесной только по
повторяется /V разповторяется /V развыборкавыборкаЯ- 2Я- 2выборкавыборкаповторяется ^poзповторяется ^poзА
повторяется /V раз
повторяется /V раз
выборка
выборка
Я- 2
Я- 2
выборка
выборка
повторяется ^poз
повторяется ^poз
66предварительноенасыщение
6
6
облучение с большой расстройкой
разностный спектр * А — Б
Рис. 5.14. Схема эксперимента разностной спектроскопии ЯЭО.
истечении промежутка времени порядка ТР Более того, желательно выключить декаплер при выборке (что обычно и делается непосредственно перед ее началом), чтобы избежать появления возможных сдвигов от развязки или сдвигов Блоха-Зигерта. На первый взгляд может показаться непонятным, почему в обычном эксперименте с развязкой облучение необходимо производить на протяжении всего эксперимента, а ЯЭО, будучи создан, продолжает существовать и без облучения. Но на самом деле здесь нет ничего сложного.
После накопления нескольких прохождений спектра с облучением сигнала нужно записать столько же прохождений без облучения. Чтобы различие условий двух экспериментов было минимальным, обычно вместо выключения декаплера просто смещают его частоту так, чтобы она была существенно удалена от всех сигналов спектра. Это позволяет предельно снизить все чисто аппаратурные эффекты, и разность полученных спектров будет отражать только ЯЭО (однако существует эффект селективного переноса заселенности, который мы обсудим позже). Вычитание невозбужденного ССИ из возбужденного и последующее преобразование Фурье даст нам спектр, в котором будут присутствовать только сигналы, не совпадающие в двух исходных ССИ (рис. 5.15). Обязательно будет присутствовать и пик самого облучавшегося сигнала. В разностном спектре он инвертирован.
Таким способом мы должны определять ЯЭО совершенно однозначно. Методы численного измерения его величины мы обсудим позднее. Однако на практике корректное вычитание спектров возможно только при очень стабильной работе спектрометра. На стабильность прибора влияет множество факторов, и многое здесь зависит от мастерства оператора. Вообще разностная спектроскопия-это хороший тест на качество спектрометра (гл. 7). Ниже мы рассмотрим трудности, возникающие в разностной спектроскопии, и те приемы, с помощью которых можно получить наилучшие результаты. -
Вычитание лоренцевых линий. Зарегистрировав два раза сигнал ССИ в одинаковых условиях, мы должны получить идентичные данные. Но на
■1 [ I I I Т | ! М I | I М I | I ! I 1 | I! I I | I 1 I 1 | IT I I [ М 4,5 4,0 3,5 3,0 q 2,5 2,0 1,51,0■1 [ I I I Т | ! М I | I М I | I ! I 1 | I! I I | I 1 I 1 | IT I I [ М 4,5 4,0 3,5 3,0 q 2,5 2,0 1,51,0Рис. 5.15. Разностный эксперимент по ЯЭО. Слева внизу представлен спектр с облучением, частота которого смещена от резонанса, а слева вверху - полученный при облучении помеченного стрелкой сигнала. В разностном спектре видны типичные для таких экспериментов особенности: пик с увеличившейся интенсивностью (7); пик с дисперсионной формой линии, возникший из-за ошибок вычитания (2); насыщавшийся резонанс, инвертированный в разностном спектре (3); интенсивный отрицательный пик, возникший из-за недостаточной селективности насыщения (4).Рис. 5.15. Разностный эксперимент по ЯЭО. Слева внизу представлен спектр с облучением, частота которого смещена от резонанса, а слева вверху - полученный при облучении помеченного стрелкой сигнала. В разностном спектре видны типичные для таких экспериментов особенности: пик с увеличившейся интенсивностью (7); пик с дисперсионной формой линии, возникший из-за ошибок вычитания (2); насыщавшийся резонанс, инвертированный в разностном спектре (3); интенсивный отрицательный пик, возникший из-за недостаточной селективности насыщения (4).■| ] I I I I p Г I I | I! ГГ' | I I I I | I I | l~[TT I I | I Г1 T [ I I I I4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 15 1,0 м3.■| ] I I I I p Г I I | I! ГГ' | I I I I | I I | l~[TT I I | I Г1 T [ I I I I4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 15 1,0 м3.
■1 [ I I I Т | ! М I | I М I | I ! I 1 | I! I I | I 1 I 1 | IT I I [ М 4,5 4,0 3,5 3,0 q 2,5 2,0 1,51,0
■1 [ I I I Т | ! М I | I М I | I ! I 1 | I! I I | I 1 I 1 | IT I I [ М 4,5 4,0 3,5 3,0 q 2,5 2,0 1,51,0
Рис. 5.15. Разностный эксперимент по ЯЭО. Слева внизу представлен спектр с облучением, частота которого смещена от резонанса, а слева вверху - полученный при облучении помеченного стрелкой сигнала. В разностном спектре видны типичные для таких экспериментов особенности: пик с увеличившейся интенсивностью (7); пик с дисперсионной формой линии, возникший из-за ошибок вычитания (2); насыщавшийся резонанс, инвертированный в разностном спектре (3); интенсивный отрицательный пик, возникший из-за недостаточной селективности насыщения (4).
Рис. 5.15. Разностный эксперимент по ЯЭО. Слева внизу представлен спектр с облучением, частота которого смещена от резонанса, а слева вверху - полученный при облучении помеченного стрелкой сигнала. В разностном спектре видны типичные для таких экспериментов особенности: пик с увеличившейся интенсивностью (7); пик с дисперсионной формой линии, возникший из-за ошибок вычитания (2); насыщавшийся резонанс, инвертированный в разностном спектре (3); интенсивный отрицательный пик, возникший из-за недостаточной селективности насыщения (4).
■| ] I I I I p Г I I | I! ГГ' | I I I I | I I | l~[TT I I | I Г1 T [ I I I I
4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 15 1,0 м3.
■| ] I I I I p Г I I | I! ГГ' | I I I I | I I | l~[TT I I | I Г1 T [ I I I I
4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 15 1,0 м3.
практике из-за несовершенства спектрометров данные этих двух экспериментов могут различаться по амплитуде, фазе и частоте. Поэтому после вычитания ССИ, при котором должны исчезнуть все совпадающие пики, в разностном спектре все же сохраняется ряд остаточных сигналов, интенсивность которых зависит от типа и величины искажений ССИ. Предельно допустимая интенсивность остаточных пиков зависит от типа проводимого эксперимента. При измерении ЯЭО желательно иметь возможность надежно регистрировать изменение амплитуды сигнала на 1%. Для этого интенсивность остаточных пиков не должна превышать 0,1%. В следующих параграфах мы увидим, насколько трудно выполнить это требование, поскольку оно затрагивает такие характеристики спектрометра, как стабильность фазы и частоты. Но сначала выясним, как нам провести измерение ЯЭО с минимальными трудностями.
Основа разностного эксперимента состоит в суммировании нескольких прохождений в условиях насыщения некоторого сигнала и такого же числа прохождений без насыщения. Это число можно выбрать в соответствии с требующимся отношением сигнал/шум. Однако существует и другой лимитирующий фактор, не позволяющий использовать малое число прохождений даже для протонных спектров. Усреднение сигналов позволяет повысить степень подавления паразитных пиков, если нестабильность прибора, приводящая к их появлению, носит случайный характер. В этом случае мы достигнем улучшения подавления паразитных пиков по сравнению с одним прохождением в число раз, равное квадратному корню из числа прохождений, как и при улучшении
отношения сигнал/шум. Но нестабильность прибора помимо случайных факторов может содержать также и систематические дрейфы параметров, возникающие, например, за счет постепенного изменения температуры. Поэтому лучше всего через некоторые промежутки времени чередовать накопление насыщаемого и ненасыщаемого спектров. Например, мы можем сделать 16 прохождений с облучением сигнала, затем 16 без облучения и повторить всю эту процедуру 10 раз, чтобы получить в сумме 160 прохождений в каждом ССИ.
Таким образом мы можем добиться дополнительного уменьшения интенсивности остаточных пиков в 10-12 раз. Это значит, что если нам в конечном счете нужна ошибка 0,1%, то точность при вычитании ССИ для простой пары прохождений не должна превышать 1-2%. Добиться хорошего воспроизведения амплитуды сигналов на практике достаточно легко. Значительно труднее устранить нестабильность фазы и частоты. Это два аспекта одного и того же явления, так как шум фазы непосредственно связан с модуляцией частоты. Но мы будем рассматривать их раздельно, поскольку они дают различные результаты. Наш подход основан на анализе реального разностного спектра после преобразования, т. е. спектра в частотной области. ■
Сначала рассмотрим последствия небольшого изменения фазы <р при переходе от одного прохождения к другому. Будем считать, что реальная часть ССИ после первого прохождения содержит чисто абсорбционный сигнал. Тогда при втором прохождении (см. гл. 4), результат которого мы собираемся вычитать из первого, сигнал за счет сдвига фазы будет представлять собой
^ = Acostp — Dsintp (5.18)
Поскольку <р-малый угол (если, конечно, спектрометр не сломан), мы можем значительно упростить это выражение. Градиент cos<p при <р = 0 минимален, а градиент sinq> максимален. Небольшие отклонения <р от нуля вызовут незначительное изменение абсорбционной составляющей, в то время как дисперсионная часть существенно вырастет. Таким образом, мы можем считать, что в разностном спектре с небольшим сдвигом фазы <р абсорбционная составляющая исчезнет полностью, а остаточные сигналы будут состоять только из дисперсионной части с амплитудой, пропорциональной sin<p. Остаточные сигналы такого типа можно легко найти почти во всех спектрах этой главы. Возьмем конкретный пример: если <р = 1°, то coscp = 0,99985, a sin <р = 0,017, т. е. даже такая небольшая ошибка фазы приводит к появлению предельно допустимых остаточных сигналов. Спектрометр с частотой 500 МГц, на котором получено большинство спектров для иллюстраций этой книги (самый совершенный прибор с цифровой генерацией частот и фаз), имеет среднюю нестабильность фазы порядка + 2°. Такая ошибка легко объясняет появление в разностных спектрах значительных остаточных сигналов. В этом отношении коммерческие приборы нуждаются в дальнейшем усовершенствовании.
pWpWРис. 5.16. При вычитании двух лорен- цевых линий, даже совсем немного отличающихся по частоте, остается значительный сигнал (в левой части рисунка различие частот едва заметно).
pW
pW
Остаточные пики могут появляться и при вычитании сигналов с одинаковой амплитудой и фазой, но различными частотами (рис. 5.16). Похожая ситуация встречается и в фазочувствительной двумерной спектроскопии (гл. 8) при перекрывании двух линий с противоположными фазами. В гл. 3 мы уже записывали уравнение лоренцевой линии с амплитудой А и шириной на полувысоте W (рис. 3.3):
AW2
W2 + 4(v0 — v)2
(5.19)(5.19)1111Уа'гг Л\1+(р-х)21+(р + х)2Уа'гг Л\1+(р-х)21+(р + х)2(5.20)(5.20)Рассмотрим две линии с v0 = (+ 1/2)р Wh (— 1/2) р W (т. е. разделенные на р ширин линий; нас интересуют случаи, когда р меньше 1). Пусть х = 2v/W, тогда их разность можно записать как
(5.19)
(5.19)
1
1
1
1
Уа'гг Л\1+(р-х)21+(р + х)2
Уа'гг Л\1+(р-х)21+(р + х)2
(5.20)
(5.20)
Это выражение не соответствует точно дисперсионной лоренцевой форме, но задаваемая им линия также проходит в центре через нуль: в точке х = 0 или посредине между двумя лоренцевыми линиями (рис. 5.16). Нам нужно узнать амплитуду этой линии, и мы найдем х-координаты ее максимума и минимума. Продифференцировав (5.20), приравняв полученное уравнение нулю и решив его относительно х, получим
х = ± (р2 + 2 + Р2 + 1 - 1)1/2 (5.21) V3
Это очень интересное уравнение. Из него следует, что даже для сравнительно больших величин р измеряемая разность частот двух противофазных пиков значительно отличается от их действительной разности. Например, для р = 4 ошибка составляет 17%. Об этом важно помнить при измерении в двумерном фазочувствительном спектре константы спин-спинового взаимодействия протонов порядка нескольких герц по двум линиям с противоположными фазами примерно той же ширины.
Техника таких измерений рассматривается в гл. 8, где приведено графическое решение уравнения (5.21).
Амплитуда остаточных пиков задается довольно сложным выражением (эта зависимость изображена графически на рис. 5.17), но нас с точки зрения разностной спектроскопии интересуют только малые величины р. Выражение (5.21) имеет предел х = + 1/\/з при р-»0, т. е. расстояние между максимумами близко к И^л/з при любых достаточно малых р. При этом условии амплитуда линии, т.е. разность интенсивностей самой положительной и самой отрицательной точек, отнесенная к амплитуде исходных линий, будет иметь вид
=(5.22)
Таким образом, для того чтобы интенсивность остаточных сигналов не превышала 2%, частота линий не должна изменяться от прохождения к прохождению более чем на 1% их ширины! Это значит, что для типичных протонных линий шириной 1 Гц флуктуации поля не должны превышать 10 мГц, т.е. 5-10"10 на 500 МГц. Это близко к пределу стабильности частоты термостатированных кварцевых генераторов. Такая стабильность может быть достигнута, но это требует использования оптимальных конструкций приборов и тщательного контроля условий эксперимента. Использование при обработке данных экспоненциального умножения ССИ уменьшает амплитуду остаточных сигналов этого типа, поэтому желательно использовать экспоненциальную функцию с большим уширением линии, чем в оптимальном фильтре.
Оптимальные условия разностной спектроскопии ЯЭО. Нам стало ясно, что измерение небольших ЯЭО требует от спектрометра предельной реализации всех его возможностей. Поэтому нужно выяснить, что
можно сделать для увеличения ЯЭО и улучшения подавления остаточных сигналов. Сначала рассмотрим последний вопрос. Стабильность спектрометра может зависеть от таких аспектов эксперимента, как дейтериевый лок и параметры окружающей среды образца. В гл. 3 мы уже рассматривали систему лока, в разд. 5.3.4 дан более подробный ее разбор. Здесь мы постараемся выяснить, какие факторы, связанные с условиями, в которых находится образец, могут дестабилизировать эксперимент.
Наиболее вероятный фактор - нестабильная температура. Химические сдвиги во многих случаях обладают значительной зависимостью от температуры, которая может проявляться на интересующих нас сигналах как непосредственно, так и через изменение химического сдвига опорного сигнала лока. Особенно сильно это проявляется в водных растворах. Таким образом, при измерении ЯЭО очень хорошо использовать температурную стабилизацию, которая легко достигается нагреванием образца чуть выше комнатной температуры. Нагревание полезно еще и потому, что оно приближает образец к области предельного сужения. При работе с большими молекулами может оказаться необходимым использовать максимально допустимую для раствора температуру. Следует иметь в виду, что обычный температурный блок спектрометра ЯМР довольно грубое устройство с точки зрения поддержания температуры, близкой к комнатной. По возможности, лучше купить или сделать самому более качественный блок [8]. В любом случае следует экспериментально проверить, дает использование температурного контроля улучшение или нет.
Другой фактор, влияющий на качество разностных экспериментов, - это, по рассказам ЯМР-спектроскопистов, перемещение людей и больших предметов возле лаборатории. Поэтому эксперименты по ЯЭО рекомендуется делать ранним утром или в воскресенье, хотя, по опыту автора, увеличение времени выборки позволяет полностью исключить влияние этих факторов. Но все-таки во время проведения разностных экспериментов лучше стараться избегать всяких движений в комнате, где стоит спектрометр, особенно если это прибор с высокой напряженностью поля. ’
Другое направление, в котором мы можем частично контролировать эксперимент по ЯЭО,-это сама величина ЯЭО. Минимизируя р* и обеспечивая условия предельного сужения, мы тем самым увеличиваем шанс измерения чистой кросс-релаксации. Это означает, что мы должны работать с разбавленными, тщательно обезгаженными образцами в дейтерированных растворителях высокой изотопной чистоты. Желательно выбирать наименее вязкий из подходящих растворителей. Надо проверить, достаточен ли период насыщения для установления новой равновесной заселенности, т е. длительность облучения должна быть как минимум в 3 раза больше максимального Tt, а лучше-еще больше. Особенно медленно возникает непрямой трехспиновый ЯЭО, поскольку установление промежуточного прямого ЯЭО, который должен появить-
ся первым, само требует времени порядка Tv Очень полезно предварительно оценить 7] по быстрой методике (гл. 7, разд. 7.5.3), особенно это важно в случае протонов, где в одной и той же молекуле Т, может меняться от долей секунды до 5 с и более. Величины Т, могут помочь и в интерпретации данных ЯЭО, поскольку необычно большие 1\ свидетельствуют об относительной изоляции протона от источников диполь-дипольной релаксации. Выводы из величин ЯЭО на таком протоне следует делать очень осторожно (вспомните протон НА четырехспиновой системы, обсуждавшейся в конце разд. 5.2.4).
Селективность н проблема селективного переноса заселенности. До сих пор мы предполагали, что можем произвольно насыщать все линии любого мультиплета. Однако на практике насыщение одного сигнала в сложном спектре без возмущения остальных может представлять собой столь сложную проблему, что именно она часто определяет возможность применения разностного метода измерения ЯЭО. Решить ее можно только методом проб и ошибок, используя различные напряженности радиочастотного поля и оценивая насыщение желательных и нежелательных сигналов (общее обсуждение проблемы селективного облучения полями малой напряженности см. в гл. 7, разд. 7.7.2). Обычно, чтобы избежать насыщения находящихся поблизости сигналов, мы вынуждены использовать неполное насыщение интересующего нас мультиплета, что приводит к понижению величин ЯЭО. В связанных спиновых системах эта проблема может усложняться еще и эффектом, известным под названием селективного переноса заселенности (SPT, от англ. Selective Population Transfer).
SPT может возникать в связанных спиновых системах, когда различные переходы одного и того же ядра испытывают неравное возмущение. В идеальном случае, когда все переходы насыщаются полностью, SPT не возникает вообще. Однако, пытаясь повысить селективность облучения, мы стремимся снизить напряженность радиочастотного поля и тем самым создаем возможность для появления SPT. Мы не будем здесь рассматривать механизм переноса заселенности, поскольку он подробно обсуждается в гл. 6; укажем только природу этого явления и способы его подавления. В отличие от ЯЭО, повышающего общую интенсивность мультиплета, SPT создает только разностную поляризацию, т. е. приводит к появлению линий с противоположными фазами, суммарный интеграл которых равен нулю (рис. 5.18). При интегрировании сигналов для определения ЯЭО линии SPT не изменяют величину интеграла, но интенсивные линии с противоположными фазами искажают спектр, поэтому имеет смысл попробовать их подавить.
К счастью, это легко достигается при использовании л/2-импульсов для регистрации спектра [9]. При этом задержки между прохождениями обязательно должны быть в несколько раз больше Tv Это необходимо также из соображений повышения чувствительности. Для действительно полного подавления SPT-сигналов рекомендуется использовать состав-
1 I I I I I I I I I Г4,54,44,34,24,14,03,93,83,23,6M. a.1 I I I I I I I I I Г4,54,44,34,24,14,03,93,83,23,6M. a.Рис. 5.18. При использовании импульсов небольшой длительности неравное насыщение мультиплетов создает в спектре значительный SPT-эффект (спектр в центре), полностью перекрывающий небольшие ЯЭО. Использование составных л/2-импульсов (верхний спектр) позволяет эффективно подавить SPT и выявить ЯЭО.Рис. 5.18. При использовании импульсов небольшой длительности неравное насыщение мультиплетов создает в спектре значительный SPT-эффект (спектр в центре), полностью перекрывающий небольшие ЯЭО. Использование составных л/2-импульсов (верхний спектр) позволяет эффективно подавить SPT и выявить ЯЭО.
1 I I I I I I I I I Г
4,54,44,34,24,14,03,93,83,23,6
M. a.
1 I I I I I I I I I Г
4,54,44,34,24,14,03,93,83,23,6
M. a.
Рис. 5.18. При использовании импульсов небольшой длительности неравное насыщение мультиплетов создает в спектре значительный SPT-эффект (спектр в центре), полностью перекрывающий небольшие ЯЭО. Использование составных л/2-импульсов (верхний спектр) позволяет эффективно подавить SPT и выявить ЯЭО.
Рис. 5.18. При использовании импульсов небольшой длительности неравное насыщение мультиплетов создает в спектре значительный SPT-эффект (спектр в центре), полностью перекрывающий небольшие ЯЭО. Использование составных л/2-импульсов (верхний спектр) позволяет эффективно подавить SPT и выявить ЯЭО.
ные л/2-импульсы (гл. 7, разд. 7.3). Все спектры в этой главе, кроме приведенного на рис. 5.18, были получены именно таким путем.
Количественные измерения. После того как получен удовлетворительный разностный спектр, нам остается провести интегрирование его сигналов и получить численные величины различных ЯЭО. Существуют два подхода к решению этой задачи. Прямой подход следует из определения д. Он состоит в получении величин /0 интегрированием мультиплетов в невозбужденном спектре (т.е. отдельно преобразованной части Б на рис. 5.14), которым приписывается интенсивность 100%. Интегрирование соответствующих мультиплетов в разностном спектре даст непосредственно величины д. Спектр должен иметь тот же масштабирующий фактор. Для этого, возможно, потребуется установить некоторый флажок в программном обеспечении спектрометра.
Хотя такая процедура и позволяет получить величину реального увеличения интенсивности каждого мультиплета, пользоваться ей можно не всегда. При снижении напряженности насыщающего поля для повышения селективности мы, вероятно, получим неполное насыщение. В этом случае имеет смысл как-то масштабировать полученные значения ЯЭО с учетом степени насыщения, чтобы определить те значения, которые были бы получены при полном насыщении. Это можно сделать при использовании в качестве эталона интенсивности насыщавшегося сигнала в разностном спектре. Ему нужно приписать интенсивность -100%, если это мультиплет одного протона. Интегралы остальных пиков вычисляются в этой шкале. Численные величины ЯЭО, приводимые в разд. 5.4, получены именно таким способом.
Какой бы способ измерения ни был выбран, не стоит рассчитывать на высокую точность результатов. Отношение сигнал/шум для разностного пика интенсивностью в несколько процентов обычно достаточно мало, и нет смысла приводить его величину с несколькими десятичными знаками. Но, к счастью, в большинстве случаев нас интересует отличие, скажем, 5% ЯЭО от 20%, которое можно заметить вполне отчетливо. Большая точность не нужна даже при выполнении вычислений по уравнению (5.17), поскольку обратная зависимость расстояний от шестой степени ЯЭО делает их нечувствительными к ошибкам отдельных величин тр
Некоторые замечания о дейтериевой стабилизации
Использование системы долговременной стабилизации поля с помощью системы дейтериевой стабилизации-необходимое условие осуществления разностной спектроскопии. Однако в масштабе времени отдельного прохождения такая система не в состоянии обеспечить достаточную стабилизацию. Причины этого станут нам вскоре ясны, но это не приведет к улучшению стабильности поля. Нам необходимо обеспечить оптимальные условия стабилизации. Мы уже обсуждали их в гл. 3, но теперь, когда объем наших знаний вырос, пора снова вернуться к этому вопросу. Сказанное здесь полностью относится и к двумерной спектроскопии, где эффекты кратковременной нестабильности отношения поле/частота проявляются как «г^шум» (см. гл. 8).
Задача системы стабилизации-поддержание постоянного отношения напряженности поля к рабочей частоте. Для этого постоянно наблюдают сигнал некоторой линии ЯМР, обычно дейтериевого резонанса от молекулы растворителя, и подстраивают постоянное поле так, чтобы эта линия оставалась на одном и том же месте. Для этой цели очень удобна дисперсионная форма линии, имеющая нулевую амплитуду в точке резонанса, которая становится положительной и отрицательной по разные от него стороны (рис. 5.19). Выделяемый таким образом сигнал можно непосредственно использовать для коррекции поля в петле обратной связи. Нам сразу, становится понятна необходимость правиль-
Рис. 5.19. Петля обратной связи системы стабилизации, обеспечивающая постоянное положение опорной линии, использованной в форме сигнала дисперсии.
ной настройки фазы канала стабилизации (гл. 3). Полностью неправильная установка фазы, например, соответствующая линии поглощения, нарушает стабилизирующую способность петли обратной связи, поскольку амплитуда сигнала в точке резонанса не будет нулевой. Даже небольшие ошибки фазы в канале стабилизации приводят к уменьшению градиента линии в ее центре, снижая тем самым эффективность его работы.
При отсутствии шума в опорном сигнале система будет способна устранять изменения отношения поле/частота с достаточно большой скоростью, ограничиваемой быстротой коррекции поля и необходимостью подавления возможных осцилляций или устранения сбоя резонансных условий. Однако сигналы ЯМР неизбежно содержат шум, и мы вынуждены увеличивать время регистрации опорной линии, чтобы этот шум не вызвал флуктуаций постоянного поля (это была бы просто аварийная ситуация!). Регистрируемый опорный сигнал стабилизации усредняется электронным интегратором в течение довольно длительного промежутка времени от десятков до сотен секунд. Обычно постоянная времени усреднения-это внутренняя характеристика спектрометра, которую не может менять оператор. Нет оснований ожидать выполнения коррекции поля в промежутки времени, меньшие указанного. Это очень плохо, поскольку именно такие времена и интересны с точки зрения разностной спектроскопии.
Таким образом, стабилизация вряд ли будет эффективно работать во временных интервалах порядка одного прохождения. Но тем не менее долговременная стабилизация остается важной, и мы можем обсудить способы оптимизации ее работы. Сигнал коррекции, получаемый из дисперсионной формы опорной линии, будет наиболее чувствителен
к изменениям отношения поле/частота при условии, что сигнал узкий, при правильно настроенной фазе и большом отношении сигнал/шум. Мы можем воздействовать на эти факторы как с помощью выбора режима работы спектрометра (тщательная настройка разрешения, правильная настройка мощности и фазы опорного сигнала стабилизации), так и подбором растворителя, поскольку ширины резонансных линий дейтерия в спектрах различных растворителей изменяются в широких пределах. Один из лучших ЯМР-растворителей-ацетон, дающий в спектре дейтерия очень узкую линию, так как его вязкость мала. Более вязкие растворители (например, диметилсульфоксид, пиридин), вероятно, создают худшие условия для стабилизации. Один из самых плохих в этом плане растворителей-неизбежная во многих экспериментах вода. Ее протоны (или ионы дейтерия) участвуют в обменных процессах. При определенных pH, температуре и типе растворенного вещества они могут давать чрезвычайно широкую линию. Эти факторы необходимо учитывать при планировании эксперимента, поскольку небольшие изменения характеристик водных растворов могут вызвать значительное уширение линии опорного сигнала в канале стабилизации.
Использование ЯЭО
Очень простой случай
Рассмотрим самую обычную проблему: надо различить цитраконовую (1) и мезаконовую (2) кислоты. В этом случае мы можем использовать подход Белла и Сондерса, поскольку обе молекулы
12
очень близки по структуре и нет опасности наложения посторонних диполь-дипольных взаимодействий. При выполнении эксперимента в растворе D2O в молекуле останутся только интересующие нас протоны: олефиновые и метильные. При исследовании изомерных олефинов полезно помнить об одном правиле: отношение межъядерных расстояний в цис- и транс-тонерах составляет около 1,3:1. В этом очень простом случае использование стандартных длин связей позволяет рассчитать (в предположении усреднения положений метильных протонов) отношение расстояний между олефиновым и метильными протонами в цис- и транс-изомерах, которое оказывается равным 1,32:1.
Удобнее всего измерить ЯЭО на олефиновом протоне при насыщении метильных. Возможен и обратный эксперимент, но он менее
разностный спектр ЯЭОразностный спектр ЯЭОмезаконовая кислотамезаконовая кислотацитраконовая кислотацитраконовая кислотаI нормальный | спектр
разностный спектр ЯЭО
разностный спектр ЯЭО
мезаконовая кислота
мезаконовая кислота
цитраконовая кислота
цитраконовая кислота
(—1 | I | ! | 1 | I | I <| I | 1! | I | I | Г
6,6 6,46,2 6,0 5,82,62,4 2,2 2,01,В 1,6
м.Э.м.д.
Рис. 5.20. Разностные спектры, обсуждающиеся в тексте.
интересен, поскольку метильные протоны релаксируют в основном за счет диполь-дипольного взаимодействия друг с другом и измеряемый на них ЯЭО будет намного меньше. На рис. 5.20 показаны протонные спектры обеих кислот и соответствующие разностные ЯЭО-спектры с облучением метильных протонов. Много усилий было затрачено на получение действительно равновесного ЯЭО. Это оказалось не самым простым делом для таких малых молекул: 7) олефинового протона в транс-изомере составляет около 18 с. Как и ожидалось, ЯЭО, полученный для цитраконовой кислоты, значительно превышает ЯЭО для мезаконовой кислоты. Для двух соединений интегрирование сигналов дает значения г), равные 0,29 и 0,06 соответственно. Предполагая зависимость т] от расстояния типа 1/г6, мы получаем отношение межъядерных расстояний 1,30:1, и если точность определения т] составляет + 0,01 (оптимистичная оценка!), то ошибка в величине отношения расстояний составляет ± 0,04. Таким образом, найденная величина совпадает с известными расстояниями в пределах ошибки эксперимента.
Итак, мы получили вполне удовлетворительный результат. Но все- таки рассмотрим, с какими проблемами мы столкнулись бы в случае доступности только одного из изомеров. Мы бы получили некоторый результат, допустим, 6%. Но какой вывод мы должны отсюда сделать? Не имея данных по второму веществу, мы не можем сказать, «большой» это или «малый» ЯЭО. Действительно, при плохом приготовлении образца и неоптимальном выборе параметров регистрации спектра мы легко можем получить такую величину и на цис-изомере. Например, если вы предварительно не проверили Tv и выбрали длительность периода насыщения только несколько секунд, то ЯЭО не успеет полностью установиться. Сущность использования ЯЭО для определения структуры состоит в сравнительном характере этого метода. В самом деле, надежные результаты можно получить только при сравнении двух
стереоизомеров. Чем дальше вы отходите от такой ситуации, тем осторожнее надо интерпретировать полученные данные.
Еще один интересный аспект эксперимента состоит в ширине диапазона возможных величин ЯЭО. Максимально возможный ЯЭО составляет, разумеется, 50%. Величины, меньшие 1%, трудно измерить достоверно. Таким образом, максимально возможное соотношение составляет 50:1, что соответствует отношению межъядерных расстояний чуть менее 2:1. Это задает «динамический диапазон» эксперимента; расстояния, имеющие большее отношение, оказываются несравнимыми.
Проверка трехспинового уравнения
Если в нашем образце можно выделить изолированную трехспиновую систему, то очень полезно попробовать использовать уравнение (5.17). В качестве примера рассмотрим акриловую кислоту. Протон карбоксильной группы снова можно заменить на дейтерий и оставить чисто трехспиновую систему, дающую на частоте 500 МГц спектр первого порядка. Измерение ЯЭО в этой системе представляет собой интересную техническую проблему, поскольку резонансы разделены всего на 120 Гц, что затрудняет селективное облучение. При облучении мультиплетов первого порядка хорошо работает процедура последовательного насыщения линий [10]. Частота декаплера настраивается на одну из линий, и на короткое время включается слабое поле (несколько герц). Затем частота облучения переводится на следующую линию и т. д.; этот цикл выполняется в течение всего периода насыщения.
Максимальное 7] акриловой кислоты в обезгаженном метаноле составляет около 10 с (протон Нх в формуле 3). При проведении эксперимента каждая линия мультиплета подвергается краткому облучению в течение 0,5 с, полный цикл для четырех линий составляет 2 с. Цикл повторяется 45 раз, и общая длительность периода насыщения получается равной 9Т,. Как видно из разностного спектра на рис. 5.21 (приведен только один из трех экспериментов), применение очень слабого радиочастотного поля позволяет добиться чрезвычайно высокой селективности. Полученные величины ц приведены в табл. 5.1 (обозначение протонов соответствует формуле 3).
Таблица 5.1. Величины ЯЭО для акриловой кислоты (индексы протонов даны в соответствии с формулой 3)
Облучается
А
М
X
Па
—
0,340
0,068
Пм
0,360
—
- 0,015
Пх
0,140
- 0,035
—
Рис. 5.21. Один из трех ЯЭО-экспериментов для акриловой кислоты.Рис. 5.21. Один из трех ЯЭО-экспериментов для акриловой кислоты.
Рис. 5.21. Один из трех ЯЭО-экспериментов для акриловой кислоты.
Рис. 5.21. Один из трех ЯЭО-экспериментов для акриловой кислоты.
При использовании уравнения (5.17) для данных такого типа необходимо выбрать наиболее удобное для расчетов отношение межъядерных расстояний. В нашем примере каждый изомер характеризуется только одним геометрическим соотношением, но выразить его можно разными способами. Например, мы можем выбрать отношение межъядерных расстояний в цис- и транс-изомерах, а можем выбрать и отношение одного из них к геминальному расстоянию (гАМ в формуле 3). Такие варианты соответствуют перестановке индексов А, М, X в уравнении (5.17). Анализируя уравнение и типичные данные для таких систем, легко догадаться, что наиболее точный результат может быть получен при такой расстановке индексов, когда взаимодействия АМ и АХ велики по сравнению с MX. Другая расстановка индексов (формула 4) поставит отношение межъядерных расстояний в зависимость от очень малой разности неточных величин, что внесет большую ошибку.
Итак, самым удобным для вычислений будет отношение расстояний между цис- и гем-протонами; исходя из длин связей, оно должно быть
1,30:1. Подставив нужные значения из табл. 5.1 в уравнение (5.17), мы получим 1,32:1. Это вполне удовлетворительный результат. Чтобы проиллюстрировать важность правильного выбора расстояний, попробуйте повторить расчеты с индексированием протонов по формуле 4. Вы будете сравнивать цис- и транс-расстояния; оценка их отношения с учетом длин связей составляет 0,79:1. Вычисленный по (5.17) результат должен значительно отличаться от этой величины. Объясняется это тем, что в системе преобладает взаимодействие MX, в то время как требующаяся информация содержится именно в разности взаимодействий АМ и АХ.
Реальная задача
При попытке использовать измерения ЯЭО для более интересных молекул, чем приведенные в предыдущем разделе, мы столкнемся с некоторыми трудностями. Вероятно, большое число взаимодействующих протонов сделает невозможным расчет межъядерных расстояний. Предположение о равных корреляционных временах для всех межъядерных векторов, на котором основаны такие расчеты, скорее всего вообще не выполняется для больших молекул, и мы не должны забывать об этом. Для того чтобы добиться успеха в определении структур сложных молекул, мы должны частично забыть о «двух основных принципах» из разд. 5.2.4. Мы будем считать, что наблюдаемая величина ЯЭО отражает относительную близость ядер, но при этом надо помнить, что в некоторых случаях наши выводы могут быть неверны. Попробуем решить реальную задачу.
При длительном нагревании трипептида 5 с ферментом изопеницил- лин-М-синтетазой (IPNS, схема 1) [11] из реакционной смеси выделяется соединение 6. Общая структура легко устанавливается при простом
SHSH55Схема 1Схема 166
SH
SH
5
5
Схема 1
Схема 1
6
6
анализе протонного спектра и подтверждается протонным двумерным корреляционным спектром (гл. 8). Задача состоит в выяснении стереохимии этого соединения и особенно в определении ориентации гидроксильной группы в семичленном цикле, которая частично определяется механизмом действия фермента. В более изученных циклических системах задачи такого типа легко решаются с помощью протон-протонных констант спин-спинового взаимодействия, но для подобных систем этих данных нет, и, кроме того, будет не так просто
k*V*****v*V*V^|l*v*^.| J \*V3*f*^,1,,1^1^v
H7s^s ' 'H7s^s ' '. JL.L. Li. ЛаЛЛ
H7
s^s ' '
H7
s^s ' '
H5 H3H2b H2o H4b H4o
«,03,S_3,02,S2,01,S
и. Э.
Рис. 5.22. Эксперимент по измерению ЯЭО для соединения 6.
определить конформацию большого цикла. Однако на основании протонных констант мы можем утверждать, что два протона в четырехчленном цикле находятся в г/нс-положении (как показано в формуле 6); это дает начальную информацию для построения эксперимента по ЯЭО.
Прежде чем представить полученные величины ЯЭО, делающие отнесение структуры почти очевидным, мы коснемся некоторых практических трудностей, встретившихся при решении этой задачи. Изучаемое соединение малоустойчиво, а в ферментативной реакции в каждом опыте можно получить его в очень небольших количествах (не более 1 мг). Как хорошо видно из некоторых разностных спектров на рис. 5.22, такое количество вещества соответствует пределу чувствительности даже спектрометра на 500 МГц. Это значит, что регистрация ЯЭО требует большого количества времени работы спектрометра-порядка 15 ч на каждый эксперимент, а достаточную информацию о структуре можно получить только за несколько дней. Трудно описать в книге эту сторону спектральной работы. Простой перечень результатов и сделанных из них выводов придают эксперименту излишне сухой и аналитический вид. На самом же деле это настоящая борьба и настоящий подвиг. Еще одним следствием трудной доступности вещества оказывается низкая точность полученных величин ЯЭО. Величины, отличающиеся друг от друга менее чем в 2 раза, приходится считать неразличимыми.
Результаты измерения ЯЭО на соединении 6 приведены на схеме 2.
Схема 2Схема 2
Схема 2
Схема 2
Сначала рассмотрим эксперимент на протонах Н2а и Н2Ь (на схеме слева). Нашей точкой отсчета будет протон Н7, которому мы приписываем изображенную стереохимию и который, как известно, находится в t/wc-положении по отношению к другому протону Р-лактама. Заметный ЯЭО (5%) на Н7 при облучении Н2а и нулевой эффект при облучении Н2Ь свидетельствуют о том, что Н2а также находится за плоскостью рисунка (см. формулу 6). (У авторов уже был большой опыт работы с Р-лактамными системами, поэтому такое отнесение не вызывало сомнений.) Как очевидно, Н2Ь находится по ту же сторону плоскости рисунка, что и Н5 (3% ЯЭО). Это позволяет зафиксировать относительные конфигурации С7 и С5. К сожалению, вопрос о конфигурации С3 не так ясен. Похоже, что Н2а создает на Н3 больший ЯЭО, чем Н2Ь, но низкая точность измерений и сложность спиновой системы делают рискованным отнесение конфигурации по этим данным.
Только что описанные эксперименты были выполнены в первой серии измерений, и задача, таким образом, осталась нерешенной. Спустя некоторое время была проделана вторая серия измерений с облучением протонов Н4а и Н4Ь (на схеме 2 справа), которые полностью прояснили структуру. Прежде всего большие величины ЯЭО на Н5 и Н3 при облучении Н4Ь свидетельствуют об их сходном положении, а поскольку Н5 уже связан с Н2Ь, можно утверждать, что гидроксильная группа находится за плоскостью рисунка. Конфигурация С4 была подтверждена взаимодействием Н4а и Н7, также свидетельствующим о предложенной конфигурации цикла. Таким образом, установленная стереохимия соответствует формуле 7. Позже она была подтверждена обратной картиной взаимодействия протонов при С2 с протоном Н3 в изомерном веществе 8.
СО2НСО2Нсо2нсо2н
СО2Н
СО2Н
со2н
со2н
Из этого примера можно сделать важный вывод: почти всегда имеет смысл измерять все возможные ЯЭО. Даже если вам кажется, что еще
один эксперимент будет пустой тратой времени, все-таки проделайте его - ведь он не потребует больших дополнительных усилий. Не думайте, что вы сможете заранее предсказать его результаты. Например, взаимодействие Н4а и Н7 в веществе 6 оказалось неожиданным и принесло полезную информацию. Чем- больше можно получить информации, подтверждающей гипотетическую структуру, тем лучше, поскольку ошибки в интерпретации данных по ЯЭО встречаются гораздо чаще, чем в других областях ЯМР.
Гетероядерный ЯЭО
До сих пор мы занимались только гомоядерным ЯЭО и упомянули гетероядерный эффект только как источник повышения чувствительности на ядрах со спином 1/2 и малым у. ЯЭО между протоном и гетероядром может быть информативен и в селективных экспериментах, позволяя преодолеть некоторые технические трудности. Возьмем, к примеру, 13С. Релаксация протонированного углерода происходит в основном за счет непосредственно связанных с ним протонов, и в этом случае ЯЭО не будет интересен-информацию легче получить с помощью развязки или двумерной гетероядерной корреляции химических сдвигов. Очень интересный момент состоит в том, что часто можно избежать создания прямого ЯЭО, поскольку он получается при насыщении не основного протонного сигнала, а его 13 С-сателлитов. На практике обычно удается облучать центральную 12С-линию, не задевая сателлитов, поскольку прямые константы протон-углеродного взаимодействия довольно велики. В этом случае мы должны увидеть ЯЭО только на четвертичных углеродах, связанных с тем атомом углерода, протоны которого облучались. Этот эксперимент может дать совершенно необычную стереохимическую информацию.
Важнейшая проблема таких экспериментов-чувствительность. Она осложняется еще и тем, что спектры необходимо регистрировать с широкополосной развязкой от протонов, поэтому между прохождениями приходится делать значительные задержки, чтобы все ненужные ЯЭО успели исчезнуть, а нужные-появиться. Задержки должны быть в несколько раз больше 7/ четвертичных углеродов, которые часто превышают 10 с. Тем не менее, используя концентрированные образцы и не жалея времени спектрометра, можно получить очень полезные результаты. На рис. 5.23 этот принцип проиллюстрирован на примере трет- бутильной группы. Внизу приведен спектр, полученный без ЯЭО с большой задержкой между прохождениями. Более сильнопольный метильный сигнал, как и ожидалось, в 3 раза интенсивнее сигнала четвертичного углерода. В разностном спектре (вверху), полученном при облучении протонов метильных групп (только 12С-линии), мы видим 80% ЯЭО на четвертичном углероде и отсутствие ЯЭО на метильном сигнале. Такая большая величина вполне нормальна, поскольку максимальный ЯЭО на углероде при насыщении протонов составляет 200%.
Рис. 5.23. Селективный гетероядерный ЯЭО для соединения с mpem-бутильной группой. Мультиплет в слабом поле принадлежит растворителю.
По причине недостаточной чувствительности такие эксперименты пока не нашли широкого применения. Тем не менее в литературе появляются отдельные примеры (см. [12-15]). В будущем они станут, видимо, более обычными, поскольку получаемая с их помощью информация труднодоступна другими путями.
Литература
Абрагам А. Ядерный магнетизм. Пер. с англ.-М.: ИЛ, 1963.
Noggle J.H., Schirmer R.E., The Nuclear Overhauser Effect - Chemical Applications, Academic Press, 1972.
Shaw D., Fourier Transform NMR Spectroscopy, 2nd edn., Elsevier, 1984.
Bothner-By A. A., Stephens R.L., Lee J., Warren C.D., Jeanloz R. W, J. Amer. Chern. Soc., 106, 811-813 (1984); Bax A., Davis D.G., J. Mag. Res., 63, 207-213 (1985).
Bell R. A., Saunders J. R.M., Can. J. Chem., 48, 1114-1122 (1970).
Mersh J.D., Saunders J. R.M., Prog. NMR Spec., 15, 353-400 (1982).
Примеры использования нестационарного ЯЭО для решения структурных задач: Heatley F., Akhter L., Brown R. T., J. Chem. Soc. Perkin II, 919-924 (1980).
Void R.L., VoldR.R„ J. Mag. Res., 55, 78- 87 (1983).
Shako A.J., Bauer C.J., Freeman R„ J. Mag. Res., 60, 479-485 (1984).
Rinns M., Saunders J.R.M., J. Mag. Res., 56, 518-520 (1984).
Baldwin J. E., Adlington R. M„ Derome A. E., Ting H.-H., Turner N. J., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1211-1214 (1984).
Rover R.E., Batta G., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 647-648 (1986).
Rover R.E., Batta G„ J. Amer. Chem. Soc., 107, 5829-5830 (1985) и ссылки в этой работе.
Aldersley M.F., Dean F.M., Mann B.E., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 107-108 (1983).
Leeper F.J., Staunton J., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 911-912 (1982).
Глава 6Перенос поляризации иредактирование спектров
Введение
По общему мнению, спектроскопия ЯМР- идеальный аналитический метод для решения химических задач: ЯМР имеет высокое разрешение, и его параметры (химические сдвиги и константы спин-спинового взаимодействия) связаны с химическими представителями об электронной структуре и топологии молекул вполне прямым и понятным путем. Но основной ее недостаток-это невысокая чувствительность. Слишком часто от ЯМР-спектроскопистов можно услышать слова: «Вот если бы у вас было еще 50 мг вещества...» Низкая чувствительность объясняется тем, что в существующих магнитных полях энергия ядерных переходов настолько мала, что они оказываются не так далеки от насыщения даже при комнатной температуре. При проведении ЯМР-эксперимента прибор должен регистрировать очень тонкое различие заселенностей энергетических уровней. Вообще эти переходы заметны только благодаря наличию резонансных условий. Недостаток чувствительности существенно снижает достоинства ЯМР, поскольку уже сейчас можно без больших преувеличений утверждать, что при наличии неограниченного количества любого вещества с молекулярной массой не более, скажем, 3000 единиц, можно подобрать такую последовательность ЯМР-экспериментов, которая с очевидностью установит его структуру. Но, к сожалению, интересующие нас вещества редко доступны в неограниченных количествах.
Любой метод повышения чувствительности чрезвычайно важен для ЯМР. Именно поэтому химики сегодня с радостью покупают магниты, которые в 10 раз дороже, чем двадцать лет назад. Повышение напряженности поля постоянных магнитов - прямой способ увеличения интенсивности сигналов ЯМР. Однако прогресс в этом направлении неизбежно имеет определенный предел. Современная технология производства стационарных постоянных сверхпроводящих магнитов (в отличие от магнитов, создающих мощные поля на короткие промежутки времени) позволяет получать напряженности полей, соответствующие протонным переходам на частотах 500-600 МГц. Прогресс в этом направлении пока еще не остановился, технология продолжает совершенствоваться, но трудно предположить возможность увеличения напряженности поля на несколько порядков. Даже если бы это и было достижимо, дальнейшее увеличение напряженности поля оказалось бы бессмысленным по ряду
других причин. Например, с ростом поля мы быстро приближаемся к такой ситуации, когда обычное молекулярное движение становится медленным в шкале времени ЯМР. Повышения чувствительности можно добиваться и с помощью других технических новшеств, как, например, использование криогенных датчиков [1], однако здесь также обязательно существует предел.
Практическим критерием эффективности спектроскопии ЯМР с точки зрения чувствительности служит ее способность анализировать такие количества вещества, с которыми обычно имеют дело химики. В настоящее время это количество составляет примерно! мг при использовании обычной хроматографической техники или несколько микрограммов при использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии. Это количество вещества химики уже «чувствуют». Вещество становится невидимым при уменьшении его количества, и с ним трудно обращаться. Биологи же, напротив, часто могут определить присутствие вещества по его биологической активности, поэтому микрограммовые количества считаются достаточными для работы. Мы будем использовать компромиссную величину 100 мкг в качестве наименьшего доступного количества вещества. Какие ЯМР-эксперименты можно провести с таким образцом на современных спектрометрах с не самой высокой напряженностью поля?
К сожалению, их не так много. Мы можем зарегистрировать протонный спектр (а также спектр на фторе и экзотическом тритии). Сможем, вероятно, провести некоторые эксперименты по ЯЭО и зарегистрировать протонный спектр COSY (гл. 8), хотя это и потребует много времени. С другими ядрами дело обстоит сложнее. На очень сильнопольных спектрометрах, возможно, удастся зарегистрировать спектр ядра 31Р и, поставив накопление в микроячейке на субботу и воскресенье, спектр 13С с широкополосной развязкой от протонов. Если же мы-химики- неорганики и хотим получить спектры низкочастотных металлов, то без увеличения количества вещества в сотни раз у нас не будет никакой надежды на успех. Вообще, протон-это единственное ядро, позволяющее проводить ЯМР-эксперименты с такими количествами вещества, которые обычно имеются в распоряжении химика. Для наблюдения других ядер необходимо получать его в больших количествах.
Возможность переноса этого замечательного свойства протонов на другие ядра была бы очень важна. В этой главе мы сначала рассмотрим очень старый эксперимент SPI и на его примере установим необходимые для такого переноса законы. В двух других разделах мы обсудим два наиболее общих эксперимента по переносу поляризации: INEPT и DEPT. Первый из них интересен по двум причинам. Во-первых, он был разработан первым и способствовал быстрому прогрессу в этой экспериментальной области, и, во-вторых, он более удобен для изложения с помощью нашего иллюстративного метода. DEPT же в большей степени подходит для практических применений и излагается в основном с этой точки зрения: понять его механизм в деталях невозможно без
привлечения концепции многоквантовой когерентности, которую мы рассмотрим в гл. 8.
Селективный перенос заселенности
Как это ни странно, метод, позволяющий перенести интересующие нас свойства протонов на другие ядра, известен уже много лет под названием селективного переноса заселенности SPT (Selective Population Transfer) или, что более точно соответствует нашему эксперименту, селективной инверсии заселенности SPI (Selective Population Inversion). Для того чтобы понять происходящие в нем процессы, мы должны подробнее рассмотреть уровни энергии спиновой системы и их заселенности. Мы проанализируем систему АХ, которую можно представлять себе состоящей из протона и ядра 13С, но это может быть и любая другая пара ядер со спином 1/2. На рис. 6.1 изображена диаграмма энергетических уровней этой системы и спектры каждого из ядер. Мы остановимся на нескольких существенных деталях рисунка. Энергии протонных и углеродных переходов переданы в масштабе. Ларморова частота протонов в 4 раза выше частоты углерода, поэтому протонные переходы имеют в 4 раза большую энергию. Различия энергий двух переходов (Ht и Н2, С\ и С2), обусловленные спин-спиновым взаимодействием, настолько малы в сравнении с общей энергией, что в масштабе диаграммы не видны. Нас больше интересует разность заселенностей по каждому из переходов. В условиях теплового равновесия, которое наблюдается в начале эксперимента, разность заселенностей по протонным переходам должна в соответствии с законом Больцмана в 4 раза превышать разность по углеродным переходам. Будем обозначать эти разности 2ДН и 2ДС, тогда ДН = 4ДС. Реальная заселенность каждого уровня и, следовательно, численные величины разностей зависят от
ДН * дс
Рис. 6.1. Энергетические уровни гетероядерной системы АХ и их заселенности.
общего числа присутствующих ядер N. Но нам удобнее пользоваться не собственно заселенностями уровней, а их отличием от N/4 (этот прием мы уже использовали для двухуровневой системы в разд. 4.2.6 гл. 4 и для гомоядерной двухспиновой системы в разд. 5.2.2 гл. 5); именно эти значения и приведены на диаграмме.
Теперь мы уже можем кое-что сказать об относительных интенсивностях сигналов 13С и ’Н в нашей системе. Избыток заселенности по протонным переходам в 4 раза больше углеродного, кроме того, протонный магнитный момент в 4 раза превышает углеродный (поскольку он пропорционален у); следовательно, воздействие л/2-импуль- са на протоны создает в 16 раз большую поперечную намагниченность, чем в случае 13С. Сигнал, наводимый в катушках приемника прецессией этой намагниченности, пропорционален скорости самой прецессии (в 4 раза большей у протонов). Таким образом, регистрируемый сигнал протонов будет в 64 раза интенсивнее сигнала углерода (т. е. в общем случае интенсивность сигнала ЯМР ядер с гиромагнитным отношением у пропорциональна у3). Помимо этого, низкое природное содержание изотопа 13С уменьшает сигнал еще примерно в 100 раз, но это уже несущественно для нашего обсуждения. Мы можем считать, что работаем с веществом, обогащенным изотопом 13С.
Именно по причине пропорциональности сигнала ЯМР величине у3 наблюдение протонов оказывается наиболее удобным. Следующее за ними ядро, представляющее широкий интерес (в отличие от ядер 19F, 3Н, 3Не и двух изотопов таллия, не представляющих интереса),-это 31Р, имеющее у, в 2,5 раза меньшее, чем у протонов, что приводит к 16-кратному понижению чувствительности, т. е. к увеличению в 256 раз времени накопления спектра для получения того же отношения сигнал/шум в предположении равных скоростей релаксации. Если же взять, например, родий (103Rh) с у, составляющим только 3% от *Н, то мы получим снижение чувствительности в 32 тысячи раз, несмотря на 100%-ное природное содержание этого ядра.
Эксперимент по SPI позволяет очень простым способом сделать зависимость от у только квадратичной. Наша система дает спектр первого порядка, поэтому каждая наблюдаемая в нем линия соответствует переходу отдельного ядра. Теперь представим себе, что одна из протонных линий подверглась воздействию селективного ти-импульса, в результате чего заселенности по соответствующему переходу инвертировались. На практике это достигается при использовании достаточно низкой мощности радиочастотного поля протонного декаплера, например импульса длительностью 20 мс при амплитуде поля 25 Гц.
На рис. 6.2 изображено состояние системы после селективной инверсии заселенности. Оно отличается от равновесного только тем, что заселенности по переходу Н, поменялись местами. Но посмотрите, что произошло с разностями заселенностей. Их величины по протонным переходам не изменились, не считая того, что одна из разностей поменяла знак. По углеродному же переходу С,, где разность раньше
дн-дсдн-дс
дн-дс
дн-дс
J?dO
Рис. 6.2. Новые заселенности после инверсии одного из протонных переходов.
составляла 2 АС, теперь мы получаем (АН + АС) — ( — АН — АС) или 2АН + 2АС. По переходу С2, наоборот, получаем ( — АН + АС) — (АН — — АС) или —2АН + АС. Таким образом, мы перенесли протонные разности заселенностей на углеродные переходы и прибавили их к существующим разностям! Если сразу после этого подействовать на углеродную намагниченность л/2-импульсом и зарегистрировать сигнал, то мы получим дублет с интенсивностями компонент + 5 и — 3 (относительно интенсивности сигналов при прямом наблюдении без селективной инверсии), поскольку АН = 4АС. Так как один из переходов получает отрицательный вклад от протонов, а другой-положительный, то говорят, что суммарный перенос намагниченности отсутствует, но наблюдается разностный перенос поляризации. Заметим, наконец, что полная инверсия заселенностей не обязательна, достаточно будет любого неравного их возмущения. Именно в такой ситуации возникает SPT-эффект, обсуждавшийся в разд. 5.3.3 гл. 5. На рис. 6.3 представлен результат эксперимента SPI.
Существует несколько проблем, связанных с экспериментом SPI. Первая-это его селективность; при выполнении эксперимента нам придется инвертировать не сами протонные линии, а их 13С-сателлиты. Кроме того, SPI не может использоваться для получения спектров с развязкой от протонов, поскольку включение декаплера приведет к частичной компенсации противофазных линий, т. е. восстановлению нормальных интенсивностей. Таким образом, эксперимент SPI интересен не сам по себе. Он важен тем, что открывает путь к целому классу
Рис. 6.3. Эксперимент SPI, выполненный для хлороформа: а-инвертирование сателлита в слабом поле; 6-инвертирование сателлита в сильном поле; «-нормальный спектр.
более общих методов переноса поляризации, разработанных после 1980 г. Обсуждаемые в этой главе эксперименты обычно осуществляют перенос поляризации от одного ядра к другому, сопровождающийся увеличением интенсивности регистрируемого сигнала в у,/у2 раз.
INEPT
■6.3.1. Введение
Основная идея. Основное ограничите эксперимента SPI-это недостаточная общность. Если мы найдем какой-либо способ поляризации всех протонных переходов независимо от частоты, то мы, очевидно, получим многообещающий эксперимент. Мы должны предложить такую последовательность импульсов, которая, как и SPI, придает парам протонных переходов противоположные фазы, но делает это с помощью неселективных импульсов и независимо от химических сдвигов. Такая последовательность может использовать спиновое эхо для ориентации компонент дублетов вдоль различных осей:
S:(я/2)х - т - ях - т - (я/2),
I:ях (я/2)х Выборка...
В этой записи, которая была приведена в первом сообщении об эксперименте INEPT [2] (Insensitive Nuclei Enhanced by Polarisation Transfer - низкочувствительные ядра, усиленные - с помощью переноса поляризации), буква S (sensitive) обозначает чувствительные ядра, т. е. дающие мощный сигнал, a I (insensitive)-низкочувствительные со слабым сигналом (в нашем случае *Н и 13С соответственно). К сожалению, не все авторы придерживаются этого обозначения, и во многих публикациях можно встретить использование буквы I для ядра,с которого переносится поляризация, и буквы S для ядра, на которое она переносится. Конечно, это совершенно произвольное обозначение, но от авторов
можно было бы ожидать большей последовательности. Везде в этой главе буквой S будут обозначаться ядра, с которых переносится поляризация, и буквой 1-ядра, на которые она переносится (независимо от того, какое из них чувствительнее).
Мы легко можем проанализировать воздействие приведенной выше последовательности на систему АХ с константой J (рис. 6.4). Задержка т выбирается равной 1/4J, и компоненты дублета (прецессирующие во вращающейся системе координат с частотой +J/1 Гц) успевают за это время пройти 1/8 полного цикла. л-Импульс на частоте ядра S переносит эти компоненты во вторую половину плоскости х-у, а импульс на частоте ядра I предохраняет его от рефокусировки с помощью изменения направления прецессии. Во время второй задержки т химические сдвиги и неоднородность поля рефокусируются, и в дальнейшем их можно не учитывать. В конце второй задержки компоненты дублета ядра S находятся на осях + х. Два заключительных л/2-импульса на ядрах S и I обычно производятся одновременно, но для облегчения понимания мы будем считать, что сначала производится S-импульс. Будучи (л/2)у-импульсом, он помещает находящиеся на осях + х компоненты на ось z: одна из них оказывается направленной вверх, а другая- вниз. В результате мы получили требующуюся противофазную ориентацию компонент дублета и после л/2-импульса на ядре I можем регистрировать более интенсивный сигнал, как и в случае SPI (рис. 6.5).
Исходная намагниченность ядра I. При воздействии на систему последовательностей SPI и INEPT перенесенная разность заселенностей накладывается на уже существующую разность по переходам ядра I. По этой причине интенсивности регистрируемых положительных и отрицательных сигналов не равны и в случае дублета 13С составляют +5 и — 3. Во многих применениях переноса поляризации такое влияние исходной намагниченности переходов ядра I оказывается нежелательным, поэтому требуется принимать какие-то меры для его исключения.
Существует несколько способов, позволяющих устранить влияние
959085802520
м.З.
Рис. 6.5. INEPT позволяет получить на всех дублетах эффект, который SP1 позволяет только на одном.
исходной намагниченности. Поскольку поляризация ядра I не требуется на протяжении всей последовательности, его можно, например, насытить до начала эксперимента. Для этого подойдут широкополосное облучение (но оно обычно недоступно на отличных от протонов ядрах), один или несколько л/2-импульсов на частоте I или создание градиента поля Во вслед за л/2-импульсом (т.е. нарушающий однородность tw- пульс-homospoil pulse). В разд. 6.4.6 мы обсудим эксперимент по переносу поляризации, использующий предварительное насыщение, но в обычных случаях при переносе поляризации с протонов на низкочастотные ядра предварительное насыщение не требуется. Исходную намагниченность ядра I можно нейтрализовать с помощью фазового цикла, поскольку она не так велика по сравнению с переносимой поляризацией.
В таком цикле должна изменяться фаза заключительного л/2-им- пульса на частоте ядра S (обычно протонов). Замена (л/2)у на (л/2)-у поменяет знак протонной поляризации; это значит, что те компоненты дублета, которые раньше были направлены по оси + z, теперь окажутся на оси — z и наоборот (рис. 6.6). В результате компонента намагниченности ядра I, обусловленная перенесенной поляризацией, будет противоположной, и для правильной ее регистрации необходимо изменить фазу приемника. Исходная же поляризация спина I создает сигнал с постоянной фазой (просто сигнал ядра I после л/2-импульса), поэтому
Рис. 6.6. Подавление исходной намагниченности ядра I при чередовании фазы заключительного импульса ядра S.
Рис. 6.7. Спектры INEPT ядра 13С без использования (левый) и с использованием (правый) подавления исходной намагниченности.
перемена фазы приемника полностью его нейтрализует. Обычно такое вычитание позволяет уменьшить интенсивность нежелательных сигналов в несколько сот раз, чего вполне достаточно при переносе поляризации с протонов на гетероядра (рис. 6.7).
INEPT с рефокусировкой. Спектры последовательности INEPT не могут быть получены с применением развязки от протонов, поскольку компоненты мультиплетов имеют противоположные фазы. Однако этот недостаток легко преодолеть с помощью небольшой задержки Д перед выборкой данных. Правильный выбор длительности Д позволяет компонентам спиновых мультиплетов снова стать синфазными, например
Рис. 6.8. Рефокусировка в системе АХ позволяет использовать во время выборки широкополосную развязку.Рис. 6.8. Рефокусировка в системе АХ позволяет использовать во время выборки широкополосную развязку.
Рис. 6.8. Рефокусировка в системе АХ позволяет использовать во время выборки широкополосную развязку.
Рис. 6.8. Рефокусировка в системе АХ позволяет использовать во время выборки широкополосную развязку.
для дублетов требуется А = 1/2.7 (рис. 6.8). Чтобы предотвратить влияние различия химических сдвигов, понадобится дополнительное спиновое эхо в виде я-импульса посредине задержки:
S:I:S:I:АА „— — к — --Развязка... 22АА „— — к — --Развязка... 22я Выборка (+х)...я Выборка (+х)...
S:
I:
S:
I:
АА „
— — к — --Развязка... 22
АА „
— — к — --Развязка... 22
я Выборка (+х)...
я Выборка (+х)...
Эта последовательность известна под названием INEPT с рефокусировкой. Она обладает очень интересными свойствами с точки зрения изменения длительности А (разд. 6.3.3), но пока при получении спектров с развязкой от протонов (рис. 6.9) мы будем считать А постоянной. В отличие от дублетов, для которых оптимальная задержка составляет 1/2-7, другим мультиплетам нужны другие величины А (см. табл. 6.2 в разд. 6.3.3), поэтому при наличии в спектре различных мультиплетов необходимо выбрать некоторое компромиссное значение. Для случая
«г
ГцГц
Рис. 6.9. Различные спектры хлороформа. В спектре INEPT с рефокусировкойможно заметить некоторое уменьшение интенсивности в сравнении с простымINEPT; это частично объясняется поперечной релаксацией во время периодарефокусировки и частично-неидеальностью импульсов.
углеродных спектров, которые могут состоять только из дублетов, триплетов и квартетов, подойдет величина 0,3/JCH. Но поскольку сама константа JCH может изменяться, такая задержка, конечно, не идеальна.
Характеристики спектров INEPT
Влияние на чувствительность. Повышение чувствительности для ядер I в Ys/Y] раз, т. е. замена зависимости интенсивности наблюдаемого сигнала вида у на у2-фундаментальное свойство последовательности INEPT. Однако это не такое уж и большое повышение, поскольку получаемую интенсивность правильнее будет сравнивать не с равновесной для сигналов ядер I, а с сигналом, полученным в условиях развязки от протонов. Широкополосная развязка от протонов будет повышать интенсивность сигнала за счет ЯЭО, который также зависит от отношения гиромагнитных постоянных. Правильное сравнение будет выглядеть так:
INEPT:I = I0 —
Yi(Тс \
2Yi/
Здесь буквой I обозначается интенсивность усиленного сигнала, а 10-интенсивность сигнала без усиления (обычно величина ЯЭО оценивается через коэффициент усиления г), а не через конечную интенсивность сигнала; в этой главе буквой 1 будет обозначаться именно конечная интенсивность, за исключением тех случаев, где это специально оговаривается). Важно отметить, что интенсивность сигнала последовательности INEPT зависит от модуля отношения гиромагнитных постоянных, в то время как ЯЭО зависит и от его знака. Таким образом, ЯЭО между протонами и ядром с отрицательным у может вызывать не увеличение интенсивности, а, наоборот, ее понижение; если величина г) окажется близкой к — 1, то сигнал может исчезнуть вообще (разд. 5.2.4 гл. 5). Вскоре мы вернемся к этой проблеме.
Проводя сравнение спектров, полученных с помощью INEPT, и спектров с полным ЯЭО, мы должны также учитывать релаксационные свойства ядер. Для эксперимента по ЯЭО важна величина Тх наблюдаемых ядер, в то время как в эксперименте INEPT на интенсивность конечного сигнала оказывает влияние только разность заселенностей ядра S, обычно протонов, и именно их Tv определяет частоту повторения прохождений. В результате частота прохождений в эксперименте INEPT не зависит от Тх ядра I, что на практике часто оказывается важнее, чем сам перенос поляризации.
Таблица 6.1. Сравнение интенсивностей сигналов при прямом наблюдении гетероядра в условиях полного ЯЭО со стороны протонов с результатом переноса поляризации с протонов на гетероядро. Приведенные значения вычислены относительно интенсивности сигнала при прямом наблюдении ядра без ЯЭО
Ядро
Максимальный ЯЭО
Перенос поляризации
31Р
2,24
2,47
13С
2,99
3,98
29Si
- 1,52
5,03
15N
- 3,94
9,87
57Fe
16,48
30,95
103Rh
- 14,89
31,78
Теперь мы можем рассмотреть реальные случаи. В табл. 6.1 сравниваются теоретические интенсивности сигналов некоторых ядер в спектрах INEPT (по отношению к равновесным величинам без ЯЭО) с интенсивностями при максимальном ЯЭО. Как мы видим, результаты довольно близки, хотя нельзя забывать о том, что условия эксперимента иногда не позволяют использовать INEPT и реализовать максимальный ЯЭО. Величина ЯЭО зависит от величины вклада ядер S в релаксацию ядра I по механизму диполь-дипольного взаимодействия, поэтому в зависимости от обстоятельств ЯЭО может быть небольшим или вообще отсутствовать, а в случае ядер с отрицательным у он может оказаться близким к — 1, что приведет к нулевой интенсивности сигнала. В таких случаях INEPT будет намного эффективнее даже без учета увеличения частоты повторения прохождений.
Однако для атомов 13С, связанных с протонами, чаще бывает характерен полный ЯЭО, а их времена релаксации ненамного превышают времена релаксации связанных протонов, поэтому использование INEPT с рефокусировкой, вероятно, не даст существенных преимуществ при регистрации спектров с развязкой от протонов. Для получения неразвязанных спектров, где ЯЭО отсутствует, использование переноса поляризации может оказаться очень полезным; к этому вопросу мы вернемся в дальнейшем.
В полной мере преимущества INEPT реализуются на ядрах с очень большим Тп и в особенности на ядрах с отрицательным у. Распространенные ядра, обладающие такими свойствами,-это 29Si и 15N. Рассмотрим гипотетическое вещество, содержащее ядро 15N и связанные с атомом азота протоны. Даже при наличии полного ЯЭО (относительная интенсивность —4) эксперимент INEPT будет в 2 раза эффективнее (относительная интенсивность 10). Помимо этого, величина Tt азота может составлять 32 с, в то время как Tt протонов-порядка 2 с. В результате за один и тот же промежуток времени мы сможем получить
в эксперименте INEPT в 16 раз больше прохождений, чем при непосредственном наблюдении азота, что приведет к дополнительному четырехкратному повышению отношения сигнал/шум. Таким образом, в реальной ситуации с помощью INEPT мы легко можем добиться 10-кратного повышения чувствительности на ядре 15N (рис. 6.10; см. также рис. 6.14 с примерами спектров 29Si). Сочетание этих двух достоинств эксперимента INEPT создает широкие возможности для наблюдения низкочастотных, медленно релаксирующих ядер.
Другая область, где повышение чувствительности позволяет получать новые результаты,-это спектроскопия ЯМР на ядрах переходных металлов. Для многих комплексных соединений из спектров металлов можно извлечь очень ценную информацию, но чрезвычайно низкая чувствительность и малое природное содержание ядер со спином 1/2, таких, как 103Rh или 109Ag, создают серьезные трудности при измерениях их спектров ЯМР. Для переноса поляризации требуется наличие значительной константы взаимодействия протон-металл, которая не всегда присутствует в реальных комплексах. Однако почти всегда есть константа взаимодействия с ядром 31Р, обусловленная широкой распространенностью фосфиновых лигандов. Обычно отношение yp/ymetai довольно велико, и перенос поляризации в этих условиях оказывается очень эффективным. На рис. 6.11 сравниваются спектры прямого наблюдения родия со спектрами переноса поляризации с фосфора на родий
оптимоемояоптимоемоя
оптимоемоя
оптимоемоя
Рис. 6.10. Различныеспособы регистрации спектров 15N. В нижней части рисунка приведены спектры с полной релаксацией (одинаковое число прохождений), а в верхней-с частотой повторения, оптимизированной по соответствующему (15N или *Н) времени 7] (одинаковое время регистрации). В использованном соединении (фталимиде) имеется протон, непосредственно связанный с азотом, поэтому время релаксации 15N сравнительно невелико (примерно в 2 раза больше, чем протона). Для азота, не связанного непосредственно с протонами, но все же имеющего с ними заметную константу спин-спинового взаимодействия, можно ожидать еще большего увеличения интенсивности.
INEPTЬ*,^^у^М^>^Ж\ jMir^MINEPTЬ*,^^у^М^>^Ж\ jMir^M'-4вЬ,0385^0 -520,0-54b,О-seb,о-sdo.oи. a.'-4вЬ,0385^0 -520,0-54b,О-seb,о-sdo.oи. a.Рис. 6.11. Усиление сигнала ядра 103Rh при переносе поляризации с 3|Р. (С любезного разрешения д-ра Бревара, фирма Bruker Spectrospin, и д-ра Тевиссена с сотрудниками, фирма ITC-TNO, Утрехт, Нидерланды.)Рис. 6.11. Усиление сигнала ядра 103Rh при переносе поляризации с 3|Р. (С любезного разрешения д-ра Бревара, фирма Bruker Spectrospin, и д-ра Тевиссена с сотрудниками, фирма ITC-TNO, Утрехт, Нидерланды.)
INEPT
Ь*,^^у^М^>^Ж\ jMir^M
INEPT
Ь*,^^у^М^>^Ж\ jMir^M
'-4вЬ,0385^0 -520,0-54b,О-seb,о-sdo.o
и. a.
'-4вЬ,0385^0 -520,0-54b,О-seb,о-sdo.o
и. a.
Рис. 6.11. Усиление сигнала ядра 103Rh при переносе поляризации с 3|Р. (С любезного разрешения д-ра Бревара, фирма Bruker Spectrospin, и д-ра Тевиссена с сотрудниками, фирма ITC-TNO, Утрехт, Нидерланды.)
Рис. 6.11. Усиление сигнала ядра 103Rh при переносе поляризации с 3|Р. (С любезного разрешения д-ра Бревара, фирма Bruker Spectrospin, и д-ра Тевиссена с сотрудниками, фирма ITC-TNO, Утрехт, Нидерланды.)
с помощью последовательности INEPT. Мы видим, что спектры, казавшиеся ранее недоступными, теперь можно получить достаточно просто. К сожалению, выпускаемые промышленностью спектрометры очень редко оборудуются для таких экспериментов (необходимы датчик, настраивающийся одновременно на две Х-частоты, и двухканальный широкополосный передатчик), но в будущем ситуация несомненно изменится.
Влияние на спектры без развязки. В спектрах INEPT, полученных без рефокусировки и развязки, мультиплетная структура сохраняется, но их вид становится совсем необычным. Дублеты, как мы уже видели, представляются парами линий в противофазе. Можно показать, что триплеты теряют свою центральную линию и дают сигналы с интенсивностями — 1:0:1, а квартеты имеют структуру — 1: — 1:1:1 (в гл. 8 вы увидите, что эти интенсивности, так же как и кросс-пики эквивалентных ядер в спектрах COSY, соответствуют правилу «противофазного треугольника»). Такую мультиплетную структуру можно считать как полезной (рис. 6.12), так и вредной, отвлекающей внимание. Описанная в разд. 6.4 последовательность DEPT позволяет получать спектры без развязки с нормальной мультиплетной структурой.
Рис. 6.12. Структура мультиплетов в спектрах INEPT без развязки.
Задержка
Получение оптимальной чувствительности. Исследуем более тщательно роль задержки А в последовательности INEPT с рефокусировкой. Сначала рассмотрим условия получения оптимальной интенсивности сигналов в спектре с развязкой. Как мы уже видели в разд. 6.3.1, величина 1/2J, подходящая для дублетов, совершенно не подойдет для триплетов (рис. 6.13). В конце периода задержки компоненты триплета окажутся в противофазе, что приведет к исчезновению сигнала при включении декаплера. Та же картина будет наблюдаться и для всех остальных мультиплетов, поэтому спектры, полученные с задержкой А = 1/2J, будут содержать только дублеты спиновых систем IS. С помощью несложных вычислений [3] мы получаем, что для произвольной спиновой системы IS„ оптимальное значение А последовательности INEPT с рефокусировкой и развязкой равно
А = — sin""1 (' (6.1)
В табл. 6.2 приведены некоторые величины А и соответствующие им коэффициенты усиления сигнала, зависящие от числа ядер п. Во многих случаях переноса поляризации на ядра, отличные от 13С, в спектрах
еостоение поем основной послевоВотепьиостиеостоение поем основной послевоВотепьиостирефокусировкоIрефокусировкоIрезультатрезультатРис. 6.13. Различное поведение дублетов и триплетов во время периода рефокусировки последовательности INEPT-основа для редактирования спектров.Рис. 6.13. Различное поведение дублетов и триплетов во время периода рефокусировки последовательности INEPT-основа для редактирования спектров.
еостоение поем основной послевоВотепьиости
еостоение поем основной послевоВотепьиости
рефокусировко
I
рефокусировко
I
результат
результат
Рис. 6.13. Различное поведение дублетов и триплетов во время периода рефокусировки последовательности INEPT-основа для редактирования спектров.
Рис. 6.13. Различное поведение дублетов и триплетов во время периода рефокусировки последовательности INEPT-основа для редактирования спектров.
Таблица 6.2. Оптимальные значения Д (в единицах 1/J) и соответствующее им усиление (в единицах Ys/y,) для последовательности INEPT с рефокусировкой при переносе поляризации с и ядер со спином 1/2
п1
2
3
4
5
6
Д(х 1/J)
0,5
0,25
0,196
0,167
0,148
0,134
Е(х Ys/Yi)
1,0
1,0
1,15
1,30
1,43
1,55
встречается только один тип мультиплетов, что позволяет выбрать оптимальную величину Д. Например, спектр 29Si широко распространенной триметилсилильной группы лучше всего получать с помощью INEPT с задержкой Д, соответствующей и = 9 (рис. 6.14).
Редактирование спектров. Изменение величины Д позволяет определить число ядер S, связанных с ядром 1, т. е. провести редактирование спектра в соответствии с мультиплетностью его сигналов. Например, в спектроскопии 13С можно получить отдельные спектры для групп СН, СН2 и СН3. Информацию, получаемую из неразвязанных спектров таким образом, мы можем получить в условиях широкополосной развязки, повышающей как чувствительность, так и разрешение. Вскоре мы рассмотрим практические способы регистрации таких спектров с помощью последовательности DEPT (разд. 6.4.3), но основные принципы легче изучить на примере INEPT.
Пусть 9-угол, определяемый условием 0 = л/Д. Проанализировав прецессию компонент мультиплетов групп СН, СН2 и СН3 во время
и ЯЭОи ЯЭОРис. 6.14. Спектр INEPT ядра 2’Si с переносом поляризации с *Н демонстрирует отчетливое увеличение интенсивности сигналов (все спектры получены с оптимальной частотой повторения за одинаковые промежутки времени).Рис. 6.14. Спектр INEPT ядра 2’Si с переносом поляризации с *Н демонстрирует отчетливое увеличение интенсивности сигналов (все спектры получены с оптимальной частотой повторения за одинаковые промежутки времени).
и ЯЭО
и ЯЭО
Рис. 6.14. Спектр INEPT ядра 2’Si с переносом поляризации с *Н демонстрирует отчетливое увеличение интенсивности сигналов (все спектры получены с оптимальной частотой повторения за одинаковые промежутки времени).
Рис. 6.14. Спектр INEPT ядра 2’Si с переносом поляризации с *Н демонстрирует отчетливое увеличение интенсивности сигналов (все спектры получены с оптимальной частотой повторения за одинаковые промежутки времени).
СН:СН2:СН3:СН:СН2:СН3:задержки А, мы можем выразить интенсивность сигнала каждой группы (в условиях развязки) как функцию угла 0:
СН:
СН2:
СН3:
СН:
СН2:
СН3:
/ ос sin 0
(6.2)(6.2)/ ос sin 20
(6.2)
(6.2)
3
/ ос — (sin в + sin 30) 4
Легко видеть, что рассмотренный ранее случай (А = 1/2J, т. е. 0 = л/2) согласуется с этими формулами. Чтобы выделить сигналы углеродов трех различных типов, необходимо зарегистрировать три спектра с такими задержками А, чтобы соответствующие им углы 0 были равны л/4, л/2 и Зл/4. В табл. 6.3 приведены относительные интенсивности каждой группы в таких спектрах.
Таблица 6.3. Относительные интенсивности сигналов при редактировании спектров
е(=я/д)
СН
СН2
СН,
л/4
1/72
1
3/2 V2
я/2
1
0
0
Зя/4
1/72
-1
3/272
Важность этих величин станет понятнее после анализа некоторых спектров (рис. 6.15). Спектр 0 = л/4 содержит сигналы всех групп, спектр 0 = л/2-только групп СН, а спектр 0 = Зя/4 опять содержит все резонансы, но сигналы групп СН2 инвертированы. Как мы вскоре увидим, складывая и вычитая эти спектры определенным образом, можно получить подспектры групп СН, СН2 и СН3.
Рис. 6.15. Вид сигналов групп СН, СН2 и СНЭ при редактировании спектров.
Как раз из таких манипуляций с фазами и интенсивностями сигналов и состоит редактирование спектров. В нем вообще нет ничего необычного. Механизм изменения фазы в последовательности DEPT будет менее понятен (поскольку в нем используется концепция гетероядерной многоквантовой когерентности), однако основные принципы останутся неизменными. Но эксперимент INEPT также требует весьма глубокого анализа. Мы избежали ситуаций, в которых векторная модель оказывается несостоятельной только потому, что ограничились случаем дублета и выбрали определенный порядок следования заключительных л/2-импульсов.
Для лучшего понимания редактирования спектров попробуйте сравнить процессы, происходящие во время задержки Д последовательности INEPT и во время периода эволюции эксперимента по гетероядерному J-модулированному спиновому эху (разд. 10.2 гл. 10). Начальные состояния спиновых систем в этих экспериментах различны, но в остальном они очень похожи.
DEPT
Введение
Буква D в названии эксперимента происходит от слова „Distortionless”-«без искажений» (расшифровать остальные буквы вы сможете сами). Эта последовательность осуществляет аналогичный эксперименту INEPT перенос поляризации, но с той существенной разницей, что все сигналы нечувствительных ядер перед началом выборки оказываются синфазными. Таким образом, спектры с развязкой от протонов можно получать, не прибегая к дополнительной рефокусировке с задержкой Д, а спектры без развязки сохраняют обычную мультиплетную структуру,
именно это и подразумевается под словами «без искажений». Это и многие другие достоинства делают DEPT наиболее удобной последовательностью для практического редактирования спектров с помощью переноса поляризации.
Последовательность DEPT как многоквантовыйфильтр
В разд. 6.4 в качестве наиболее часто встречающегося объекта для применения последовательности DEPT мы будем рассматривать перенос поляризации с протонов на углерод, но при этом не будем забывать о том, что их можно заменить любой другой парой ядер со спином 1/2. Последовательность DEPT выглядит так:
/л\ 1 1 1
Развязка...
С: 1-1 л Выоорка ( + х)...
где 6+j,- протонный импульс переменной длительности, который, как мы вскоре увидим, выполняет те же функции, что и задержка Д в INEPT. Переключение фазы этого импульса (вместе с переключением режима сложение/вычитание приемника) служит для устранения исходной намагниченности 13С. Фазы обоих л-импульсов также можно переключать для уменьшения интенсивности ложных сигналов. Во время выборки в зависимости от требований к спектру можно использовать, а можно и не использовать широкополосную развязку от протонов.
Если вы попытаетесь с помощью векторной модели во вращающейся системе координат проанализировать воздействие этой последовательности на спиновую систему, то обнаружите, что ситуация после углеродного л/2-импульса окажется не очень простой. Поперечная намагниченность будет одновременно присутствовать на углеродной и протонной частях связанной спиновой системы, и имеющихся у нас знаний оказывается недостаточно для предсказания ее поведения. Действительно, очень трудно описать это состояние системы (известное под названием гетероядерной многоквантовой когерентности) в терминах классической векторной модели [4]. Мы столкнемся с некоторыми проблемами и при попытках предсказать эффект 9-импульса без привлечения квантовой механики. В результате механизм эксперимента DEPT остается для нас не совсем понятным. Однако предварительно ознакомившись с гл. 8 (где в разд. 8.3.5 излагается, хотя и несколько метафизически, многоквантовая когерентность), вы вполне сможете понять дальнейшие комментарии к последовательности DEPT. В противном случае вам не стоит их читать. Если вы не хотите нарушать порядок чтения книги и переходить к гл. 8, то пропустите оставшуюся часть до разд. 6.4.3.
Рассмотрим сначала другую последовательность [5]:
'Н: ©(5
\2/Ф 2J 2J \2/ф\2/-х
13С:л - —Выборка (±х)...
\2/х
Ее существенное отличие от DEPT состоит в том, что 0-импульс заменен парой
а®.
где ^произвольная фаза (не обязательно х или у), определяющаяся через угол с осью у. Вы, наверное, сможете самостоятельно убедиться (хотя бы начиная с z-намагниченности) в том, что эта пара импульсов эквивалентна одному импульсу 0у, где (р = 0, поэтому DEPT и описанная последовательность оказываются одинаковыми. Группа импульсов до (л/2)ф включительно может рассматриваться как эквивалент критерия многоквантовой когерентности (разд. 8.4.3 гл. 8), расширенный для случая гетероядер. Таким образом, непосредственно перед (л/2)_х-им- пульсом существует двухквантовая когерентность для группы СН, трехквантовая для группы СН2 и четырехквантовая для группы СН3. Заключительный протонный импульс-это импульс «чтения», он восстанавливает одноквантовую когерентность углерода, пригодную для регистрации. В соответствии с рецептом, данным в гл. 8, изменение фазы последовательности возбуждения по отношению к фазе импульса «чтения» должно сделать возможным разделение сигналов по кратности квантовой когерентности, т. е. многоквантовую фильтрацию. Это и создает возможность редактирования спектров.
Такой способ редактирования был реализован в эксперименте с названием POMMIE [6] (это и есть приведенная выше последовательность с небольшими фазовыми поправками). Но мы не будем обсуждать это! метод, поскольку большинство доступных в настоящий момент спектрометров не способно создавать фазовый сдвиг, необходимый для разделения сигналов с квантовой когерентностью различного порядка. Если ваш спектрометр обладает таким свойством, то вам имеет смысл сравнить эту последовательность с DEPT, чтобы выбрать наиболее подходящую. Поскольку фазовый сдвиг в POMMIE эквивалентен 9-импульсу в DEPT, различие методик будет определяться не их принципиальными свойствами, а характеристиками спектрометра.
Редактирование спектров с помощью DEPT
Введение. Если вы пропустили разд. 6.4.2 и решили продолжить чтение с этого места, то принцип редактирования спектров при использовании 6-импульса в последовательности DEPT будет вам не
совсем понятен. Однако для практических нужд вполне достаточно понимать, что эксперимент DEPT с заключительным 0у-импульсом будет давать такой же результат, как и INEPT с задержкой А = ^JitJ. Следовательно, весь материал разд. 6.3.3 может быть без изменений перенесен на случай последовательности DEPT, только вместо nJA следует читать 0. В последовательности INEPT величина А зависит от J; например, оптимальная чувствительность на системе IS„ достигается при А = (l/HJIsin-VVV”) [уравнение (6.1)]. Тогда в соответствующем эксперименте DEPT величина 0 оказывается независящей от J. В этом состоит его принципиальное преимущество. Конечно, в последовательности еще есть зависящие от J величины, но процесс редактирования спектров к ним менее чувствителен.
Редактирование. Для разделения подспектров групп СН, СН2 и СН3 мы регистрируем спектры с 0-импульсом, равным я/4, л/2 и Зл/4, таким же образом, как мы это делали с помощью изменения задержки А в INEPT [7]. В эксперименте 0 = л/2 требуется зарегистрировать в 2 раза больше прохождений для получения одинакового с остальными спектрами отношения сигнал/шум. Как и в разностной спектроскопии ЯЭО, для уменьшения влияния медленных дрейфов экспериментальных условий очень хорошо через равные промежутки времени чередовать накопление разных спектров (разд. 5.3.3 гл. 5). Общее число прохождений определяется обычными требованиями чувствительности. По табл. 6.3 мы можем легко определить операции, необходимые для получения подспектров.
СН-подспектр мы получаем в эксперименте с 0 = л/2. Но он наверняка содержит ложные пики (в основном принадлежащие метильным группам), которые можно устранить после получения остальных подспектров (см. далее). Спектры 0 = тс/4 и 0 = Зтс/4 отличаются друг от друга только фазами сигналов групп СН2. Их разность даст нам СНг-подспектр. Сложив результаты этих двух экспериментов, мы получим спектр, содержащий сигналы групп СН и СН3. Вычитание из него данных эксперимента 0 = л/2 (умноженных на 1/^2) приведет к СНу-подспектру. В заключение можно из спектра 0 = я/2 вычесть небольшую часть суммы (0 = л/4) + (0 = Зя/4) (которую мы уже получали при работе над СН3-подспектром) с целью уменьшения в нем интенсивности метильных сигналов. Однако, по личному опыту автора, это требуется довольно редко. На рис. 6.16 изображен полный процесс получения подспектров.
Как наилучшим образом проделать все эти сложения и вычитания? Мы могли бы, например, поступить так же, как и в случае разностной спектроскопии ЯЭО, складывая и вычитая ССИ с необходимыми масштабирующими множителями. Однако на практике гораздо удобнее работать в частотной области, что позволяет анализировать комбинации спектров по мере их получения. Для этого программное обеспечение спектрометра должно позволять работать с двумя спектрами
1-я ступень,9=^ 11-я ступень,9=^ 12-я ступень2-я ступень3-я ступеньсн2—3-я ступеньсн2—Рис. 6.16. Полный процесс редактирования спектров в эксперименте DEPT (см. текст).Рис. 6.16. Полный процесс редактирования спектров в эксперименте DEPT (см. текст).
1-я ступень
,9=^ 1
1-я ступень
,9=^ 1
2-я ступень
2-я ступень
3-я ступень
сн2—
3-я ступень
сн2—
Рис. 6.16. Полный процесс редактирования спектров в эксперименте DEPT (см. текст).
Рис. 6.16. Полный процесс редактирования спектров в эксперименте DEPT (см. текст).
в интерактивном режиме; особенно удобно складывать и вычитать спектры с подбором масштабирующего множителя в реальном времени. В этом случае вам не нужно помнить о том, что 1/^/2 = 0,707; вы просто складываете спектры и подбираете их соотношение таким образом, чтобы исчезли нежелательные пики. При этом практически всегда легко отличить СН-пики от СН2 и т. д., поэтому не стоит беспокоиться о возможной потере информации. Такой способ позволяет автоматически скомпенсировать отклонения амплитуд сигналов различных групп от их теоретических величин. Если все сигналы группы имеют одинаковые ошибки, то редактирование сохраняет свою эффективность.
Какова точность редактирования? Нетрудно догадаться о причинах, по которым процесс редактирования может оказаться несовершенным. Например, амплитуды сигналов зависят от угла поворота 9-импульса, и неправильная его калибровка или неоднородность поля В2 вызовут появление ошибок. Далее, три входящие в последовательность задержки должны соответствовать величине прямой константы спин-спинового взаимодействия протон-углерод, которая может изменяться от 125 до
210 Гц. Обычно выбирается компромиссное значение 150 Гц, если в соединении есть олефиновые углероды или углероды, связанные с электроотрицательными заместителями, и 130 Гц во всех остальных случаях. Если соответствующая константа какого-либо углерода значительно отличается от этой величины, то в подспектрах могут появляться принадлежащие ему ложные сигналы [7]. В литературе по ЯМР этим проблемам уделялось много внимания, и в результате обе они были решены: DEPT GL [8] допускает большее различие констант спин- спинового взаимодействия, а модифицированный DEPT с составными импульсами [9] менее чувствителен к точности калибровки углов поворота импульсов.
В этих более совершенных экспериментах используются весьма сложные импульсные последовательности и фазовые циклы, и химику, поставившему своей задачей отнесение мультиплетов, не обязательно в них разбираться. Важно то, что даже при наличии ложных пиков анализ отдельных спектров DEPT позволяет отнести сигналы совершенно однозначно. Спектр 0 = п/4 содержит сигналы всех протонированных углеродов значительной интенсивности. При 9, близком к л/2, амплитуды сигналов групп СН2 и СН3 должны значительно уменьшиться. Пусть они и не станут точно нулевыми; одни останутся положительными, другие исчезнут, третьи станут отрицательными, но все они обязательно уменьшатся. При дальнейшем увеличении 9 в спектре могут происходить самые разные изменения, но сигналы групп СН3 в отличие от СН2 никогда не станут отрицательными (есть одно редкое исключение, когда частота повторения прохождений слишком велика для изолированных, свободно вращающихся метильных групп в молекулах с заторможенными конформационными переходами; см. работу [7], с. 283, и работу [19]). Сравнение исходных спектров позволяет полностью разобраться во всех непонятных пиках. А затем можно получить подспектры, которые можно считать наиболее подходящим способом представления результатов для большинства сигналов.
DEPT для спектров без развязки
Как мы выяснили в разд. 6.3, повышение чувствительности ядра 13С с помощью переноса поляризации с протонов-очень эффективный метод регистрации углеродных спектров без развязки. В этом случае DEPT позволяет получать спектры с точно такой же мультиплетной структурой, как и при прямом наблюдении без развязки от протонов. Однако из-за различия констант спин-спинового взаимодействия протон-углерод могут появляться некоторые искажения формы линии. Для подавления этих эффектов были предложены два эксперимента [11]: DEPT+ и DEPT+ +. Первый из них, видимо, представляет собой самый лучший компромисс между сложностью реализации и качеством получаемых результатов. Последовательность DEPT+ такова:
(неправильная задержка)
РЕРТ
(неправильная задержка)
DEPT
50151055И25201510
Рис. 6.17. Устранение фазовых ошибок в спектрах DEPT без развязки с помощью последовательности DEPT4". Два верхних спектра получены с задержкой, в 2 раза ' - превышающей правильную.
^г^г11.1й””-й-6±'~й-"11.1й””-й-6±'~й-"л Выборка ( + х)...л Выборка ( + х)...
^г
^г
11.1
й””-й-6±'~й-"
11.1
й””-й-6±'~й-"
л Выборка ( + х)...
л Выборка ( + х)...
Она в точности повторяет DEPT с дополнительным протонным л-им- пульсом на каждом втором прохождении. Так же как и DEPT, она требует точного подбора длительности задержек, но при наличии некоторого диапазона констант этот эксперимент дает меньшие фазовые искажения сигналов (рис. 6.17). Влияние неправильно установленных задержек сводится в DEPT+ к изменению интенсивности компонент мультиплетов. Возникающие при этом ошибки интенсивностей можно попробовать удалить с помощью DEPT+ + , который описан в работе [П].
* Этот л-импульс должен создаваться при каждом втором прохождении.
Квадрупольные ядра
Сфера применения переноса поляризации не ограничивается ядрами со спином 1/2. Любое из ядер спиновой системы или оба могут быть квадрупольными [12]. Единственное ограничение состоит в том, что суммарная длительность импульсной последовательности должна быть намного меньше времени релаксации. Эта длительность, очевидно, зависит как от величины константы спин-спинового взаимодействия (чем она больше, тем лучше), так и от релаксационных характеристик соединения. При выполнении этого условия можно попробовать провести все описанные выше типы экспериментов (повышение чувствительности в спектрах без развязки, редактирование и т.д.). Однако для наиболее общего случая редактирования неразвязанных спектров спиновой системы из произвольных ядер выбор параметров становится очень сложным [13], и мы не будем его рассматривать в нашей книге. Такой эксперимент может понадобиться только в весьма экзотических ситуациях. Мы сосредоточим свое внимание на повышении чувствительности в обычных спектрах с развязкой. Одним из наиболее интересных для химиков случаем может быть наблюдение дейтерия с развязкой от протонов. Для работы с квадрупольными ядрами последовательность DEPT следует несколько изменить:
о11 А„
S:|-лРазвязка...
\2Л 2J2J
<рх л — — — Выборка ( + х) ...
Эта последовательность получила название UPT (Universal Polarisation Transfer-универсальный перенос поляризации), хотя введение нового названия при изменении длительности всего лишь одного импульса может показаться излишним. Для оптимальной чувствительности необходимо подобрать 0, исходя из спина и числа ядер S, и <р, исходя из спина и числа ядер I. И в том и в другом случае это делается следующим образом. Пусть мы имеем N ядер со спином s. Каждое конкретное ядро i может находиться в состоянии, определяющемся спиновым квантовым числом ть которое может принимать 2s + 1 значение в диапазоне от — s до s с шагом 1. Если мы определим число М как
N
М =■
1=1
то оно будет принимать значения от —Ns до Ns (2Ns + 1 значение). Оптимальный угол поворота а для последовательности UPT (т. е. 0, если рассматриваются ядра, с которых переносится поляризация, и <р в случае ядер, на которые она переносится) можно найти из уравнения
^ DvM2cos 2М а = О (6.3) м
где DM-вырождение состояния М. Общую формулу для DM вывести не так просто, но в реальных случаях ее можно рассчитать прямым способом. Например, для двух ядер со спином 1 состояние М = 0 имеет вырождение DM = 3, поскольку оно реализуется в трех случаях: (0, 0), (1, — 1) и ( — 1, 1). В общем случае можно выписать все члены суммы (6.3) и получить из нее некий полином относительно cos а, который можно решить численно [13]. Таким образом, в общем случае рассчитать 9 и ф не так просто, но обычно хотя бы одно из ядер имеет спин 1/2, что позволяет при вычислении оптимального угла поворота пользоваться довольно простой формулой (6.1).
«Обращенные» эксперименты
Введение. Все применения переноса поляризации, с которыми мы до сих пор встречались, заключаются в переносе поляризации с ядра с большим у на ядро с меньшим у. В принципе нет никаких причин считать это «прямое» направление единственно возможным, вполне возможно провести перенос, например, с 13С на 2Н или с 2Н на 13С. Однако такие эксперименты могут показаться бессмысленными, поскольку они неизбежно должны приводить к потере чувствительности в сравнении с прямым наблюдением. Но, с другой точки зрения, подобные эксперименты могут оказаться полезными. Сравним спектроскопию *Н и 13С. Первая из них обладает той особенностью, что протоны присутствуют практически во всех объектах. Интересующие нас сигналы в протонных спектрах многих распространенных систем, таких, как среды с химическими реакциями или живые клетки, полностью закрываются интенсивными сигналами воды или других растворителей или таких распространенных в биохимии веществ, как липиды. Ядро 13С, напротив, имеет низкое природное содержание, что позволяет пометить им интересующие нас объекты или их части, которые далее можно контролировать с помощью 13С-ЯМР, не встречая помех со стороны интенсивных протонных сигналов. Таким образом, протонам присуща высокая чувствительность, а углероду (и другим ядрам с низким природным содержанием)-высокая селективность.
Теперь мы можем представить себе эксперимент, где «обратное» направление переноса поляризации могло бы оказаться полезным. В идеальном случае эксперимент (с помощью фазового цикла или другими путями) полностью подавляет исходную намагниченность чувствительных ядер. Если при этом мы будем переносить на протоны намагниченность с редких ядер, использованных в качестве меток, то в результате протонные спектры будут обладать селективностью редких ядер. Этот процесс, конечно, будет сопровождаться некоторой потерей чувствительности по сравнению с непосредственным наблюдением. На-
пример, при переносе поляризации с 13С на протоны разность заселенностей в самом худшем случае будет в 4 раза меньше наблюдаемой в обычном эксперименте, в результате в 4 раза понизится чувствительность. Но полученный спектр будет обладать достоинствами углеродных спектров в том смысле, что мы увидим сигналы только тех объектов, которые содержат ядра 13С. Поэтому правильнее проводить его сравнение с наблюдением углерода, а не протонов. Сигнал 13С при прочих равных условиях в 64 раза слабее сигнала 1Н, поэтому обратный перенос поляризации позволит в сравнении с непосредственным наблюдением углерода получить 16-кратное усиление. Далее, если мы будем облучать протоны в перерывах между прохождениями, то ЯЭО на углероде увеличит его разность заселенностей еще примерно в 3 раза. В результате чувствительность составит 3/4 прямого наблюдения протонов, что в 50 раз выше, чем при прямом наблюдении 13С.
Но с практической точки зрения такие оценки могут оказаться слишком оптимистичными. Например, сигналы 13С всегда синглетны, тогда как протоны часто входят в состав сложных спиновых систем. При каждом расщеплении линии на две части отношение сигнал/шум уменьшается в 2 раза. В то же время константы спин-спинового взаимодействия дают дополнительную информацию о структуре. Другая проблема состоит в том, что частота повторения прохождений ограничивается релаксацией редких ядер, которая может быть достаточно медленной. Поэтому вопрос об эффективности такого эксперимента надо решать в каждом конкретном случае. Например, времена релаксации углеродов пептида, спектры которого мы увидим ниже, очень небольшие, но для других соединений может наблюдаться обратная картина. Это необходимо учитывать при планировании эксперимента. Наконец, в реальном эксперименте мы можем и не получить теоретических интенсивностей. У большинства датчиков, настраивающихся на какое- либо гетероядро, катушка для наблюдения протонов (катушка декап- лера) редко оптимизируется по чувствительности. Однако очень хорошее подавление исходных сигналов протонов можно получить с помощью описываемой далее процедуры. Все эти моменты обязательно нужно учитывать при сравнении обратного DEPT с другими альтернативными методами, например с методом разностного спинового эха из гл. 10.
Обратный DEPT. Импульсную последовательность для реализации обратного переноса поляризации легко построить на основании принципов эксперимента UPT, описанного в предыдущем разделе [14]. Наибольший интерес представляет перенос поляризации с одного ядра со спином 1/2 (например, метка 13С) на несколько ядер со спином 1/2 (например, на два протона в группе СН2). Из уравнения (6.3) мы получаем величину 9-импульса л/2, а величина <р будет зависеть от числа ядер, на которые переносится поляризация. Если мы его заранее не знаем, то можно использовать компромиссное значение, позволяющее получить заметные интенсивности всех групп ХН„; для случая 13С такой
3С(^ - g - я - g - (^ Jpme««a
I'
'H j насыщение |(4^ я — у Выборка tx
Рис. 6.18. Схема обратного эксперимента DEPT.
величиной будет <р = л/4. Таким образом, для осуществления обратного DEPT нам потребуется последовательность, изображенная на рис. 6.18. Фазовый цикл последоват ельности должен быть похожим на обычный DEPT, его основная функция - чередование фаз заключительного импульса 13С и фазы приемника с целью подавления исходной намагниченности протонов. Поскольку исходная намагниченность протонов гораздо больше переносимой поляризации, одного фазового цикла будет, по-видимому, недостаточно для полного ее подавления, и чередование фаз следует сочетать с предварительным насыщением протонов с помощью широкополосного облучения. Насыщение, помимо этого, будет создавать на гетероядрах ЯЭО, соответствующим образом повышающий их чувствительность, поэтому предварительное облучение следует считать существенным элементом последовательности. Широкополосная же развязка от гетероядер во время выборки-это необязательный элемент. Она, с одной стороны, увеличивает интенсивность сигналов, но с другой-лишает спектр дополнительной информации, поэтому ее использование оказывается желательным далеко не всегда.
Рис. 6.19. В верхней части представлен нормальный протонный спектр трипептида, помеченного ядром 13С. На нижнем спектре сигналы протонов у помеченного углерода получены отдельно от остальных с помощью обратного DEPT с широкополосной развязкой от 13С во время выборки (эксперимент GARP-1, гл. 7). Другие небольшие сигналы, чуть видимые в спектре, возникают за счет природного содержания ядер 13С в положениях, связанных спин-спиновым взаимодействием с другими протонами.
Кроме того, широкополосная гетероразвязка от ядер типа 13С с их широким диапазоном химических сдвигов-далеко не простая задача (см. разд. 7.4 гл. 7).
На рис. 6.19 представлен спектр, полученный с помощью такой последовательности. Очень хорошее подавление протонных сигналов было достигнуто с помощью сочетания фазового цикла с насыщением протонов в течение 1 с перед каждым прохождением. С точки зрения отношения сигнал/шум полученный спектр сравним с прямым наблюдением протонов, но, как мы уже упоминали ранее, это соединение имеет очень благоприятные релаксационные свойства. Возможности эксперимента и его аналогов, которые обсуждаются в гл. 10, выглядят весьма внушительными, однако на сегодняшний день мы знаем лишь несколько примеров их применения [15].
Литература
Styles Р., Sofie N., J. Mag. Res., 50, 397-404 (1984).
Morris G.A., Freeman R., J. Amer. Chern. Soc., 101, 760-762 (1979).
Pegg D. T, Doddrell D. M„ Brooks W. M„ Bendall M. R„ J. Mag. Res., 44, 32-40 (1981).
Такие попытки делались; см.: Lynden-Bell R. M., Bulsing J. M., Doddrell D. M., J. Mag. Res., 55, 128-144 (1983).
Levitt M.H., Ernst R.R., Mol. Phys., 50, 1109-1124 (1983). Основная тема этой работы не включает DEPT, но он упоминается как многоквантовый фильтр в связи с поиском источников ошибок в импульсных последовательностях.
Bulsing J.M., Brooks W.M., Field J., Doddrell D.M., J. Mag. Res., 56, 167-173 (1984).
Bendall M.R., Pegg D.T., J. Mag. Res., 53, 272-296 (1983).
Sorensen O.W., Bilds^e S., Bildsfe FL, Jakobsen H. J., J. Mag. Res., 55, 347-354 (1983).
Pegg D. T, Bendall M.R., J. Mag. Res., 60, 347-351 (1984).
Bendall M.R., Pegg D. T, J. Mag. Res., 53, 40-48 (1983).
Sorensen O. W., Ernst R.R., J. Mag. Res., 51, 477-489 (1983).
Pegg D. T, Bendall M.R., J. Mag. Res., 55, 51-63 (1983).
Pegg D. T, Bendall M.R., J. Mag. Res., 58, 14-26 (1984).
Bendall M.R., Pegg D.T., Doddrell D.M., Field J., J. Mag. Ress., 51, 520-526 (1983).
Cm.: Brooks W.M., Irving M.G., Simpson S. J., Doddrell D. M., J. Mag. Res., 56, 521-526 (1984); Doddrell D.M., Staunton J., Laue E.D., J. Chem. Soc. Chem. Commun, 602-605 (1983).
Глава 7
Дополнительные сведенияоб экспериментальных методах
Введение
В этой главе мы рассмотрим экспериментальные проблемы, с которыми часто приходится сталкиваться в практической многоимпульсной спектроскопии ЯМР. Эта книга, как мы уже говорили в гл. 1, не претендует на роль исчерпывающего учебника по практическому ЯМР. В первую очередь мне хотелось бы сосредоточить внимание на процедурах, связанных с выбором параметров эксперимента, которые приходится выполнять каждый день, и описать, как их следует правильно выполнять. Описываемые далее некоторые современные приемы работы-это не «методы экспериментального ЯМР» в полном смысле слова. Они в сочетании с другими методиками позволяют повысить производительность спектрометра или ослабить влияние ошибок экспериментатора и недостатков спектрометра на качество получаемых результатов. Многие современные эксперименты чрезвычайно чувствительны к тщательному выбору длительностей импульсов, задержек и фазовых сдвигов и к тому, насколько точно заданные параметры воспринимаются спектрометром. К сожалению, к большинству спектрометров следует относиться с известным скептицизмом, поскольку очень часто реальные сигналы на выходе передатчика могут быть слабо связаны с тем, что мы от него требовали. Это в особенности относится к таким экспериментам, как, например, упоминающиеся в разд. 7.3 составные импульсы, где последовательность некоторых действий производится в микросекундном масштабе времени.
При любых многоимпульсных экспериментах нужно тщательно калибровать длительности импульсов, это особенно необходимо при первом выполнении нового эксперимента. Чтобы уменьшить вероятность ошибок и путаницы, важно изучить сущность вашего эксперимента и знать характеристики вашего спектрометра, наиболее для него критичные. Перед проведением нового эксперимента его следует оттестировать на таком объекте, для которого результат уже известен, а выполнение эксперимента не требует много времени. Это значит, что нужно использовать концентрированные растворы простых соединений, сложность которых, однако, еще достаточна для демонстрации возможностей эксперимента. Для увеличения частоты повторения полезно сократить величины Т, с помощью добавления ацетилацетоната
хрома(Ш) (в органические растворы) или хлорида марганца(И) (в водные растворы). Для работы с протонными спектрами полезно иметь образцы, дающие спектр с единственным сигналом (например, хлороформ в дейтерохлороформе с небольшой добавкой релаксационного реагента для сокращения 7j до 1 или 2 с), и с двух- и трехспиновой системами первого порядка (вполне подойдут p-хлоракиловая кислота и 1,2-дибромпропионовая кислота в дейтерохлороформе). Количество тестовых образцов для работы с гетероядерными системами может быть бесконечным. Тестирование большинства протон-углеродных экспериментов удобно проводить с помощью обогащенного по 13С метилиоди- да. Часто бывает нужно дополнительно сократить Tv
Длительность импульса и напряженность поля
Введение: шкала мощности в децибелах
При настройке спектрометра перед проведением многоимпульсного эксперимента часто приходится измерять мощности нескольких радиочастотных полей. Различные названия этой операции-калибровка длительности импульсов или измерение напряженности поля - отражают только разные стороны определения одного и того же параметра. Для измерения амплитуды радиочастотного поля можно использовать единицы типа гаусс (Гс) или тесла (Т): 1Т = 10000 Гс, но с точки зрения ЯМР ее наиболее удобно выражать, как мы это уже делали в гл. 4, через скорость прецессии ядерной намагниченности. В этом случае связь между амплитудой поля В в герцах, т. е. в числе поворотов намагниченности в секунду, и длительностью л-импульса ?к, вызывающего поворот намагниченности на 1/2 цикла, выглядит особенно просто (zK = 1/2S). Например, обычный жесткий л-импульс длительностью 10 мкс соответствует амплитуде поля 50 кГц, а обычная для гомоядер- ной развязки амплитуда поля 50 Гц эквивалентна мягкому л-импульсу длительностью 10 мс. Термины «жесткий» и «мягкий» довольно часто неправильно применяются для обозначения неселективных и селективных импульсов. Поэтому точное значение этих терминов зависит от контекста. Для измерения амплитуды радиочастотного поля нам потребуется некоторое чувствительное к этой величине явление ЯМР. Мы рассмотрим целый набор таких явлений, а выбор конкретного из них будет зависеть от обстоятельств.
Обычно передатчик и декаплер, если последний используется в импульсном режиме, работают на максимально возможной мощности. Однако во многих экспериментах, например при получении мягких импульсов заданной длительности или для селективной развязки, нужно использовать некоторую конкретную мощность. Более низкая мощность обычно получается делением максимальной мощности с помощью аттенюатора. Нам будет полезно иметь представление о том, как параметр, отражающий отношение мощностей (децибел или дБ), связан
с амплитудой радиочастотного поля в ЯМР-эксперименте. Децибел (дБ) дает нам логарифмическую шкалу отношения мощностей и определяется как
дБ=1018(^)(7.1)
где Рх и Р2-цре сравниваемые мощности. Очень часто удобнее сравнивать не мощности, а напряжения сигналов, которые связаны с мощностью соотношением
V2
Р = -^(7.2)
При выполнении расчетов, исходя из величин напряжений, нужно пользоваться соотношением
дБ = 20Ц£)(7.3)
Как мы видим, децибелы характеризуют отношение величин. Поэтому их обычное использование в качестве некоторой абсолютной величины в выражениях типа «громкость звука взлетающего самолета превышает 150 дБ» или в более важном для ЯМР (если, конечно, ваша лаборатория находится не возле аэропорта) «выходная мощность синтезатора составляет + 10 дБм» может несколько озадачить. Фокус состоит в том, что в этих выражениях говорится об отношении интересующей нас величины к некоторой стандартной; последняя, как предполагается, всем известна. Для обычных единиц измерения радиочастотной мощности (дБм и дБВт) эта величина составляет 1 мВт и 1 Вт соответственно. Обычные генераторы прямоугольных сигналов имеют на выходе мощность в несколько дБм, а обычные импульсные передатчики спектрометров ЯМР могут давать + 20 дБ Вт.
Двукратное снижение мощности соответствует ее изменению на — 3,01 дБ (101g0,5), или, можно считать, просто на — ЗдБ. Однако мощность радиочастотного поля пропорциональна напряжению сигнала, прикладываемого к катушке, поэтому для понижения напряженности поля в 2 раза нужно снизить напряжение сигнала на 6 дБ. Запомнив это простое соотношение, вы легко сможете подобрать величину соответствующего параметра для получения нужной амплитуды радиочастотного поля.
Импульсы на частоте наблюдаемых ядер
В случае высокой чувствительности. Длительность импульса передатчика измеряется легче всего, когда чувствительность ядер и концентрация образца достаточны для получения хорошего отношения сигнал/шум за одно прохождение. В этом случае мы можем искать
Рис. 7.1. Калибровка длительности импульса. Интенсивность сигналов проходит через нуль при углах поворота импульса л, 2 л...
длительность л-импульса, исходя из того, что ему должен соответствовать сигнал нулевой интенсивности. Сначала следует получить спектр с помощью короткого импульса, угол поворота которого заведомо меньше л/2. На обычных передатчиках спектрометров высокого разрешения таким требованиям должна удовлетворять длительность 1 -2 мкс. По этому спектру следует подобрать условия коррекции фазы для получения положительного сигнала поглощения. Повторение этого эксперимента с увеличивающейся длительностью импульса позволяет найти точку нулевого сигнала, соответствующую л-импульсу. Предварительное определение условий коррекции фазы облегчает поиск нулевой точки, поскольку после прохождения через нее сигналы инвертируются (рис. 7.1). Имейте в виду, что некоторые спектрометры автоматически масштабируют каждый новый спектр. Поэтому для получения таких спектров, как на рис. 7.1, автоматическое масштабирование необходимо отключить.
На практике такая процедура сопряжена с рядом сложностей. Если вы еще не очень освоились со спектрометром и не имеете представления о возможной длительности л-импульса, то убедитесь, что найденная вами нулевая интенсивность действительно первая. Аналогичные точки нулевой интенсивности соответствуют импульсам с углами поворота 2л, Зл и т.д., поэтому начинающему пользователю очень полезно иметь представление о приблизительных величинах длительностей импульсов на различных ядрах. Еще одно препятствие состоит в том, что оператору надо решить, какой спектр принять за «нулевой». л-Импульс не может
I I Г I Г II I I П I I I III I I I I 11 IНI I I I I М U1 so’ о 1 -soI I Г I Г II I I П I I I III I I I I 11 IНI I I I I М U1 so’ о 1 -soГцГц
I I Г I Г II I I П I I I III I I I I 11 IНI I I I I М U
1 so’ о 1 -so
I I Г I Г II I I П I I I III I I I I 11 IНI I I I I М U
1 so’ о 1 -so
Гц
Гц
Рис. 7.2. Остаточный сигнал, полученный с помощью л-импульса. На конкретном приборе его вид определяется конструкцией датчика.
быть идеальным, и во всех спектрах обязательно будут наблюдаться какие-либо остаточные сигналы. Одна из причин этого состоит в чувствительности л-импульсов к расстройке резонансных условий (гл. 4). Ее легко исключить, просто поместив несущую частоту точно на измеряемую линию. Но из-за неоднородности поля Вх специфические остаточные сигналы все равно сохранятся (рис. 7.2), и вам самостоятельно придется принимать решение о том, какая длительность импульса наиболее близка к искомой. При этом лучше всего учитывать среднюю часть линии сигнала, которая отражает поведение основного объема образца, и не обращать внимания на ее боковые части.
В случае низкой чувствительности. Если с одного прохождения становится трудно зарегистрировать сигнал образца, то при измерении длительности импульса приходится проявлять больше изобретательности и терпения. В зависимости от того, насколько плоха чувствительность, можно использовать различные пути. Если сигналы, видимые в некоторых спектрах, исчезают в шуме при приближении к л-импульсу, то может быть достаточно определить последний видимый положительный сигнал и первый видимый отрицательный и взять среднюю между ними величину. Кроме того, если оператору хватит терпения, можно использовать накопление. При калибровке длительности импульса большинства ядер делать задержку в несколько Тх, достаточную для полного восстановления z-намагниченности между прохождениями, не так просто. Можно повторять импульсы и не дожидаясь полной релаксации, но при этом выборка данных должна проводиться только после установления стационарного режима. В этом случае более эффективным будет поиск второго «нуля», соответствующего 2л-импульсу, поскольку длительность этого импульса и «нуль» л-импульса связаны довольно просто [1].
Если за разумные промежутки времени не удается увидеть вообще
никаких сигналов, то необходимо использовать предварительную калибровку. Можно, например, описанными ранее способами определить длительность импульса на концентрированном образце. При тщательной настройке датчика (гл. 3) эта величина должна воспроизвестись и на разбавленном образце. Исключение составляют случаи, когда интересующий нас образец сильно отличается по электрическим свойствам от раствора, на котором производилась калибровка. Это может быть при попытке работать с водными растворами электролитов, когда используются длительности импульсов, полученные на органических растворах. Значительно лучше приготовить образец, похожий по свойствам на исследуемый, но с достаточной для калибровки л-импульса концентрацией. Полученная таким образом величина может применяться без дополнительной настройки спектрометра. Некоторые ядра, например многие металлы, не позволяют получить видимые сигналы ни при каких концентрациях растворов. Если вам приходится заниматься экспериментами на таких ядрах, то единственный способ калибровки импульсов-это использование описываемого далее метода, когда импульс для интересующего вас ядра калибруется с применением гетероядерного спин-спинового взаимодействия с другими ядрами.
Импульсы на других ядрах
Во многих экспериментах импульсы должны производиться на частоте других ядер, связанных с наблюдаемыми. Это прежде всего эксперименты по переносу поляризации, такие, как DEPT, и соответствующие двумерные эксперименты. Чаще всего другим ядром оказывается 1Н, а наблюдаемым-13С или еще какое-либо гетероядро. Протонный импульс создается протонным декаплером, поэтому определение длительности л-импульса часто называют «калибровкой длительности импульса декаплера». Но мы сохраним этот термин для случая, когда нас будет интересовать именно развязка. Во множестве экспериментов протоны не используются в качестве «других» ядер. Это, например, DEPT с переносом поляризации с 31Р на металл или обратный перенос поляризации с 13С на протоны. Во всех этих случаях задача остается той же: найти длительность л-импульса ядер, не наблюдающихся непосредственно.
Все методы калибровки можно разделить на группы по типу зависимости интенсивности сигналов наблюдаемых ядер от угла поворота импульса, воздействующего на связанные с ними другие ядра. Например, вот простая последовательность [2]:
X:X:т-Выборка ...т-Выборка ...
X:
X:
т-Выборка ...
т-Выборка ...
а
где X-наблюдаемое ядро, Y-«другое» ядро, оба со спином 1/2. Для калибровки требуется спиновая система XV (т.е. дублет сигнала X). При
импульс 'Нимпульс 'НОО
импульс 'Н
импульс 'Н
О
О
г^т^г^г^^ ——miraT_T_T„,„
1Ш 0-*"1И 0-1001000-1001100 i -100
ГЧГцГцГц
Рис. 7.3. Калибровка импульсов на системе связанных ядер (первый метод).
т, равном 1/2Jxy, импульс на ядре Y с углом поворота а = л/2 (заметьте, л/2, а не л) приведет к регистрации сигнала нулевой интенсивности. Компоненты дублета всегда оказываются в противофазе. При переходе длительности а-импульса через точку л/2 фазы компонент инвертируются (рис. 7.3). Основной недостаток этого эксперимента состоит в невозможности развязки от ядра Y при выборке сигнала X, что приводит к потере чувствительности. Кроме того, оптимальная частота повторения прохождений определяется величиной 7j ядра X, что может вызвать затруднения в наиболее распространенном случае, когда Y-протон, а X-малочувствительное и, возможно, медленно релаксирующее ядро.
Лучше использовать последовательность DEPT (гл. 6), где допускается развязка от Y, а частота повторения прохождений определяется величиной 7^ ядер Y. Начиная с небольшого импульса 6 для настройки фазовой коррекции, нужно найти такую длительность 9-импульса, при которой сигналы групп XY2 и/или XY3 становятся нулевыми; эта величина будет соответствовать 9 = л/2 (рис. 7.4). При переносе поляризации с протонов на углерод можно вполне точно откалибровать длительность импульса на сильно разбавленных образцах, суммируя 8-16 прохождений, повторяющихся через 1 или 2 с. Но предварительно необходимо измерить длительность импульса на углероде и подобрать длительность входящей в последовательность задержки в соответствии с ожидающейся величиной константы спин-спинового взаимодействия протон - углерод.
Два этих метода пригодны для калибровки только достаточно сильных радиочастотных полей (соответствующих неселективным импульсам). Калибровка мягких импульсов на системе связанных ядер, которая требуется для проведения эксперимента SPI, может оказаться
ИМПуЛЬС <н
уЛу—■—25 мкс
23 мкс23 мксРис. 7.4. Калибровка импульсов на системе связанных ядер с помощью последовательностиDEPT.Рис. 7.4. Калибровка импульсов на системе связанных ядер с помощью последовательностиDEPT.
23 мкс
23 мкс
Рис. 7.4. Калибровка импульсов на системе связанных ядер с помощью последовательности
DEPT.
Рис. 7.4. Калибровка импульсов на системе связанных ядер с помощью последовательности
DEPT.
гораздо сложнее. Вероятно, для этого лучше использовать первый из описанных методов с резонансным импульсом на ядре Y при достаточно большой напряженности поля (например, около 1 кГц), чтобы его можно было считать неселективным. Когда найдена длительность импульса для этой напряженности поля, ее можно снизить до нужной величины с помощью точного аттенюатора.
Мощность радиочастотного поляпри гомоядерной развязке
Если нам необходимо осуществить непрерывное облучение ядер сигналом малой мощности, например при гомоядерной развязке, то удобнее использовать амплитуду поля, а не длительность импульса. Для выбора параметров эксперимента с целью получения эффективной развязки ■ или оптимальной селективности удобно иметь таблицу, отражающую связь амплитуды поля и мощности декаплера. Расчет эффективной амплитуды поля декаплера по длительности его л-импульса может оказаться очень сложным, поскольку на фурье-спектрометрах гомоядерная развязка реализуется при помощи облучения короткими импульсами (развязка с разделением времени), которая снижает эффективную амплитуду поля на неизвестную в общем случае величину.
(7.4)(7.4)Значительно лучший способ измерения амплитуды слабого поля для гомоядерной развязки состоит в использовании так называемых сдвигов Блоха-Зигерта. Они представляют собой изменение частоты сигналов относительно их обычного положения при облучении системы на близкой частоте (рис. 7.5). Это изменение связано с амплитудой поля декаплера (52) и разностью частот сигнала и облучения следующим образом:
(7.4)
(7.4)
3v = 2(v-v,)
11 II1'1'111
8060г4020о
Рис. 7.5. Сдвиг Блоха-Зигерта. Внизу изображен нормальный спектр, вверху- спектр, полученный при облучении системы на нулевой частоте; остальные параметры регистрации те же. Вычисленная из величины сдвига напряженность поля составляет около 20 Гц.
где Вг выражается в герцах, v- исходная частота наблюдаемого сигнала, v;-частота облучения и B2«v — v,. Это измерение удобно проводить с помощью разностного метода: нормальный спектр, содержащий одну линию, вычитается из спектра, облучаемого на близкой частоте, что позволяет непосредственно измерить сдвиг частоты. Частота облучения должна быть удалена от сигнала на расстояние, значительно большее ожидающегося сдвига Блоха-Зигерта. Серия таких экспериментов с различными аттенюаторами должна показать линейную зависимость напряженности поля от коэффициента деления в дБ.
Мощность радиочастотного поляпри гетероядерной развязке
Измерение мощности поля при гетероядерной развязке (т. е. развязке от ненаблюдаемых ядер) обычно требуется в двух случаях-в качестве предварительного эксперимента при определении длительности импульса по методу, описанному в разд. 7.2.3, и для настройки развязки от гетероядер. Конечно, длительность импульса можно определить и без измерения мощности поля. Но если вы определяете импульс на каком- либо экзотическом ядре или на незнакомом датчике, то предварительная калибровка поля альтернативным способом поможет ускорить эксперимент и снизит вероятность ошибок. Более важная сторона такого подхода состоит в том, что современные методики широкополосной развязки требуют использования фазовых сдвигов декаплера в соответствии с заданной последовательностью, скорость которых определяется мощностью поля (разд. 7.4). Если гетероядерный передатчик допускает работу в непрерывном режиме, то определение мощности поля позволяет обойтись вообще без процедуры, упомянутой в разд. 7.2.3.
Простой и не очень точный метод состоит в наблюдении эффектов развязки в нерезонансных условиях. Рассмотрим в качестве примера
группу СН. Сигнал углерода без развязки от протонов представляет собой дублет с константой J. Если мы будем с достаточной интенсивностью облучать систему точно на частоте протонов, то дублет углерода превратится в синглет. Смещение частоты облучения в сторону от протонного сигнала приведет к восстановлению дублета, но с меньшим расстоянием между линиями. В приближении значительно большей напряженности поля по сравнению с разностью частот протонного сигнала и облучения его можно выразить через величину остаточного расщепления:
S2S2J8v77J8v77(7.5)(7.5)
S2
S2
J8v
77
J8v
77
(7.5)
(7.5)
ВгВггде Jr - остаточное расщепление, 8v-разность частот протонного сигнала и облучения. Существует и более точная формула:
Вг
Вг
G-6)
но при В2 » 8v приближение (7.5) вполне приемлемо. Общая процедура будет состоять из измерения константы спин-спинового взаимодействия, измерения точной частоты протонного сигнала и последующего нерезонансного облучения с 8v, выбранным таким образом, чтобы получить небольшое, но надежно измеряемое остаточное расщепление (рис. 7.6). Такие измерения не очень точны, поэтому их можно использовать только в качестве предварительной оценки перед проведением калибровки более точными методами. Описанный метод больше подходит для измерения средних и высоких напряженностей поля декаплера в отличие от метода сдвигов Блоха-Зигерта, который лучше работает на слабых полях.
расстройкадекаплера
Рис. 7.6. Использование эффекта расстройки резонансных условий для измерения напряженности поля гетероядерной развязки.
Уменьшение неидеальности импульсов
Введение
Сколько бы сил вы ни затратили на точное измерение длительности импульсов с помощью описанных выше процедур, вам все же не удастся достичь эффекта идеального л/2-или л-импульса. Объясняется это двумя причинами — неоднородностью поля В, по объему образца, обусловленной несовершенством конструкции катушки передатчика, и отклонением эффективного угла поворота намагниченности, обусловленным конечной величиной напряженности поля В, (гл. 4, разд. 4.3.2). В рутинной одномерной спектроскопии, где используются только л/2-им- пульсы или более короткие, ни один из этих эффектов не заметен. Отклонение угла поворота намагниченности вызывает появление в спектре фазовых ошибок, которые суммируются с ошибками из других источников и корректируются при обработке данных, поскольку они приблизительно линейно зависят от величины расстройки резонансов. Небольшие изменения в эффективной длительности импульса, обусловленные неоднородностью поля Bv по объему образца, не оказывают заметного влияния на результаты.
Однако все виды многоимпульсных экспериментов могут быть в значительной степени подвержены влиянию этих факторов. Простым примером этого может служить упомянутый в гл. 4 метод инверсии-восстановления для измерения величин Т,. В этом методе измеряется скорость, с которой намагниченность, помещенная л-импуль- сом на ось — z, возвращается к состоянию равновесия. Легко догадаться, что некорректная отработка импульса приведет к получению неверных результатов. Другой пример, более важный для химических приложений,-это многие современные эксперименты по переносу поляризации, использующие прием размещения векторов намагниченности вдоль определенных осей. В эту категорию попадают рассмотренные ранее эксперименты INEPT и DEPT, их двумерные аналоги (гл. 9), а также другие одномерные и двумерные эксперименты, такие, как INADEQUATE (гл. 8). Отклонение векторов намагниченности от их идеального положения, которое может быть обусловлено их вращением вокруг наклонной оси или неправильным углом поворота, снижает чувствительность этих экспериментов, а в некоторых случаях может вызывать появление ложных сигналов. Потеря чувствительности может быть особенно нежелательна, поскольку многие из этих экспериментов разработаны специально для ее повышения. К дефектам импульсов очень чувствительны также все эксперименты, использующие спиновое эхо. В двумерных экспериментах, известных под названием J-спектроскопии, некорректность импульсов создает целые наборы ложных сигналов (гл. 10).
Составные импульсы
Одно из направлений борьбы с дефектами импульсов-это чисто аппаратурное совершенствование конструкции датчиков. Оно решает обе проблемы, поскольку позволяет повысить как однородность, так и амплитуду поля S1. Последний параметр, казалось бы, должен в большей степени зависеть не от датчика, а от передатчика, поскольку амплитуду поля St можно повысить, просто увеличивая напряжение радиочастотного сигнала. Действительно, на практике нет реальных препятствий (кроме стоимости прибора), мешающих повысить выходное напряжение, передатчика на несколько порядков. Препятствия создают именно компоненты датчика, которые должны работать при высоких напряжениях без деформаций и пробоя изоляторов. В настоящее время на датчиках небольших диаметров можно создать поля BY с амплитудой в 20-50 кГц (длительность д/2-импульса 12,5-5 мкс) и выше. Однако параллельно с совершенствованием конструкций датчиков происходит и рост напряженности постоянных магнитных полей, что требует дальнейшего расширения спектральных диапазонов. При амплитуде радиочастотного поля 20 кГц отклонение частоты импульса от резонанса на 3,5 кГц приводит к существенному (10°) наклону оси поворота намагниченности. При наблюдении ядра 13С на спектрометре с рабочей частотой 500 МГц для протонов диапазон 3,5 кГц составляет только 28 м. д., а полный спектральный диапазон может быть около ± 120 м. д.
Таким образом, неидеальность импульсов необходимо компенсировать каким-либо способом. Одним из самых впечатляющих достижений последних лет стали попытки разработки комплексных (составных) импульсов, эквивалентных в сумме одному к- или л/2-импульсу, но менее чувствительных к отклонению от резонанса и/или неоднородности поля Bv Исследования в этой области еще продолжаются, и проблема пока не решена, но достигнутые к настоящему времени успехи позволяют надеяться на ее решение. Для большинства последовательностей, реализующих составные импульсы, вполне очевидно, что желаемый эффект будет достигнут только в случае идеальности каждого из входящих в них импульсов. Иногда влияние на последовательность отклонения от резонанса или неоднородности поля можно изобразить графически в терминах векторной модели, как это сделано на рис. 7.7. Но в общем случае для правильного понимания этих эффектов вам нужно ознакомиться с оригинальными работами.
В первых попытках построения составных импульсов проблемы отклонения от резонанса и неоднородности поля Вх решались отдельно [3]. Дальнейшие последовательности разрабатывались для одновременного решения обеих проблем. Особое внимание уделялось л-им- пульсам, поскольку они в большей степени чувствительны к отклонению
Рис. 7.7. Диаграмма движения намагниченности системы после составного л-им- пульса. Движение начинается на оси + z и представлено в виде серии линий на поверхности сферы. Каждая линия соответствует уменьшению длительности л/2-импульса с шагом 5° от номинальной величины. Для различных величин BY строится несколько серий. Траектории заканчиваются гораздо ближе к оси — z, чем можно было бы ожидать в случае обычного л-импульса с той же ошибкой в напряженности поля.
от резонанса [4, 5]. Два первых составных импульса, эквивалентных ли л/2-импульсам, выглядят так:
Входящие в них импульсы должны создаваться без промежуточных задержек, но на практике это недостижимо, и между импульсами иногда нужно вставлять задержки в несколько микросекунд. Наибольший интерес для нас представляет л-импульс, который применяется как для инверсии z-намагниченности, так и для создания спинового эха. Мы еще вернемся к нему в гл. 10. Для того чтобы понять его работу, нужно рассмотреть траектории компонент намагниченности, первоначально находящихся на оси z, с увеличивающейся ошибкой компонент импульса (см., например, рис. 7.7). Составной импульс вставляется в нужную последовательность на место своего эквивалента. Для изменения его фазы следует на равные величины изменить фазы его компонент, так чтобы относительные фазы остались прежними.
Трехэлементный составной л-импульс обеспечивает хорошую компенсацию неоднородности поля BY (отклонения длительности импульсов от идеальной величины порядка +20% изменяют эффективность инверсии не более чем на 1%), но только при отсутствии отклонений от резонанса. Для компенсации обоих эффектов требуется более сложная
последовательность, наилучшая из доступных в настоящее время имеет весьма подозрительное название GROPE-16 («поиск-ощупью-16») [5]. Для описания более длинных последовательностей составных импульсов удобно пользоваться специальными правилами сокращения. Пусть л/2-импульс, поворачивающий намагниченность вокруг оси х, обозначается X. Такой же импульс вокруг оси у будет обозначаться Y, а 180°-фазовый сдвиг-при помощи верхней черточки, т. е. X и Y. Импульсы другой длительности будут записываться как кратные л/2-импульсу, например л_х-импульс-это 2Х. В качестве примера использования правил сокращения мы можем записать упоминавшийся ранее составной л-импульс как X2YX. Последовательность GROPE-16 будет выглядеть так:
3X4XY3Y4YX
Эта последовательность допускает ошибки в длительности импульсов до ±20% и отклонения от резонанса до ±0,55! при снижении эффективности инверсии намагниченности не более 1%. На примере поля BY в 50 кГц 99%-ная эффективность инверсии будет достигаться при задании длительности л/2-импульса от 3 до 6 мкс в диапазоне ±25 кГц вокруг резонанса. Это дает огромное преимущество при тестировании новых экспериментов и не только за счет большой допустимой погрешности в длительности импульсов.
Составные л/2-импульсы с двойной компенсацией особенно удобны для подавления SPT-сигналов в экспериментах по ЯЭО [6] (разд. 5.3.3 гл. 5). Последовательность Y3X4X, используемая в качестве составного л/2-импульса, создает поперечную намагниченность с 99%-ной эффективностью при тех же допусках по однородности поля BY и отклонению от резонанса, что и GROPE-16. Почти все разностные спектры ЯЭО в гл. 5 были получены с помощью этого импульса.
Однако дело обстоит не так благополучно, как это может показаться на первый взгляд. Описанные здесь последовательности разрабатывались для воздействия только на z-компоненту намагниченности-для ее устранения (л/2-импульс) или инверсии (л-импульс). Только к этой компоненте и относятся компенсационные свойства последовательностей. Наличие поперечной намагниченности значительно изменяет их влияние на спиновую ■ систему. Рассмотрим простой пример: последовательность (л/2), (л/2)у помещает z-намагниченность в поперечную плоскость с компенсацией неоднородности поля BY. Однако если мы подействуем этой парой импульсов на вектор, находящийся на оси +у, то он окажется на оси + х, чего мы вовсе не хотели. В то же время упоминавшийся составной л-импульс все же будет осуществлять вращение поперечной намагниченности на 180°, но при этом компенсационные свойства последовательности уменьшатся [7]. Было найдено, что составной импульс, такой, как X2YX, снижающий чувствительность амплитуды спинового эха к неоднородности поля BY, вносит ошибку в его фазу (в отличие от обычного л-импульса, создающего эхо с фазой,
не зависящей от угла поворота). Это значит, что составные импульсы нельзя просто так вставлять в импульсные последовательности на место их аналогов без тщательного анализа задачи. Эффективный пример этого можно найти в работе [8].
На результаты таких последовательностей оказывает влияние и ряд экспериментальных факторов. Использование составных импульсов снижает зависимость эксперимента от параметров датчика, но повышает зависимость от качества других блоков спектрометра. Для корректного их применения необходимо тщательно контролировать синхронность и величину фазовых сдвигов. Большинство спектрометров можно легко запрограммировать на генерацию составных импульсов, но соответствующие им реальные процессы останутся окутанными дымкой не-
0,258,0,58,0,758, Вд0,258,0,58,0,758, Вд0,25В,0,5В,0,75В, В,0,25В,0,5В,0,75В, В,00,258,00,258,0,258,0,58,0,258,0,58,0,758,0,758,расстройкарасстройкарасстройкарасстройка
0,258,0,58,0,758, Вд
0,258,0,58,0,758, Вд
0,25В,0,5В,0,75В, В,
0,25В,0,5В,0,75В, В,
00,258,
00,258,
0,258,0,58,
0,258,0,58,
0,758,
0,758,
расстройка
расстройка
расстройка
расстройка
Рис. 7.8. Сравнение составного п-импульса GROPE-16 (вверху) с обычным л-им-пульсом (внизу). Для того чтобы смоделировать влияние неоднородности поляBv зависимость амплитуды сигнала от расстройки изображена в обоих случаяхпри оптимальном угле поворота (слева) и при угле, превышающем оптимальныйна 20% (справа).
известности. Более длинные последовательности помимо проблемы синхронности фазовых сдвигов будут страдать и от «затухания импульса», поскольку передатчик, предназначенный для создания импульсов длительностью порядка 20 мкс, при попытках генерации длинных импульсов начинает выдавать ложные сигналы (например, продолжительность GROPE-16 составляет 160 мкс при длительности обычного л/2-импульса 10 мкс).
Именно по этой причине эффективность использования ■ составных импульсов нужно проверять на каждом конкретном спектрометре. Во многих экспериментах при попытках использования составных импульсов можно получить совершенно неожиданные результаты. Например, может возрасти точность измерений. Поэтому перед их использованием требуется независимая проверка, результат которой должен ясно свидетельствовать об их корректности. Подходящий тест для составного л-импульса таков:
л
П — — Выборка ...
где П- составной импульс. Эффективность инверсии намагниченности можно проверить, определив ее зависимость от величины отклонения от резонанса или длительности импульса на образце, дающем спектр с единственным сигналом. Для предотвращения дополнительных эффектов отклонения от резонанса при определении зависимости эффективности инверсии от частоты П-импульса частота л/2-импульса должна быть строго резонансной. На рис. 7.8 показаны результаты сравнения обычного л-импульса с GROPE-16 на спектрометре с частотой 500 МГц при амплитуде радиочастотного поля BY, равной 30 кГц.
Широкополосная развязка
Во многих экспериментах необходимо полностью освободиться от спин-спинового взаимодействия между двумя ядрами с помощью широкополосного облучения второго ядра (т. е. не находящегося под наблюдением). Чаще всего это протоны, но иногда бывает удобно развязаться и от других активных с точки зрения ЯМР ядер с высоким природным содержанием, таких, как 31Р или 19Р. Широкополосная развязка традиционно состоит из облучения большой мощности и фазовой модуляции радиочастоты для создания «боковых полос», распределенных по всему интересующему нас диапазону. Различные схемы модуляции, в том числе и самая первая случайная или шумовая модуляция, разрабатывались эмпирическим путем. Схема шумовой модуляции послужила причиной широкого распространения термина «шумовая протонная развязка» или PND (proton-noise-decoupling) для обозначения широкополосной развязки вообще. Этот термин не совсем корректен, поскольку современные спектрометры почти не используют такой метод.
Ни один из эмпирически найденных методов нельзя считать полностью удовлетворительным. Две основные проблемы таковы: 1) необходимость использования достаточно высоких напряженностей поля В2 и, следовательно, высоких мощностей радиочастотных сигналов, нагревающих образец; 2) недостаточная эффективность развязки, приводящая к потере разрешения. Обе проблемы еще более осложняются на сильнопольных спектрометрах, где требуется более широкая полоса облучения. Уширение линий, обусловленное недостаточно эффективной развязкой и приводящее к снижению чувствительности, не рефокусируется с помощью спинового эха и поэтому особенно вредно для использующих его экспериментов (см. гл. 10).
За последние годы в области широкополосной развязки были сделаны очень важные разработки, позволившие решить многие из этих проблем. Для начала попробуем разобраться, почему непрерывная развязка высокой мощности работает недостаточно хорошо. Очень интересный способ решения вопроса-это вообразить себе цепь л-им- пульсов на частоте ядра, от которого нужно развязаться (пусть это будут протоны при наблюдении 13С):
1Н: л — т — л — т — л — т — л — т — л — т — л — т — ...
Каждый раз, воздействуя импульсом на протоны, мы изменяем направление прецессии компонент мультиплета 13С (рис. 7.9). Следовательно, в середине каждого интервала т они будут оказываться на одной оси, и, производя выборку в эти моменты, мы получим спектр, не содержащий информации о спин-спиновом взаимодействии, т. е. развязанный от протонов. Мы уже знаем, почему цепь л-импульсов будет очень чувствительна как к ошибкам в длительности импульсов, так и к наклону оси поворота намагниченности - ведь с каждым импульсом эти ошибки будут накапливаться (см. эксперимент Карра - Парселла в гл. 4). Поэтому в том, что это не самый лучший метод широкополосной развязки, нет ничего удивительного. Если представить себе такую цепь с задержками т, сжатыми до нуля, то она будет эквивалентна непрерывному облучению, и ее несостоятельность можно будет показать с помощью тех же аргументов.
Рис. 7.9. Широкополосная развязка с помощью серии л-импульсов.
Предложенная модель развязки как цепи л-импульсов позволяет нам провести ее дальнейшее улучшение. Возможно, замена неидеального л-импульса на его составной аналог позволит настолько снизить влияние неоднородности поля В2 и отклонения от резонансов, что развязка окажется эффективной. В этом направлении было проведено много исследований, идея которых состояла в использовании исходного составного л-импульса с систематической перестановкой его компонент и фаз [9]. В качестве основы для такой последовательности можно использовать упоминавшиеся ранее составные л-импульсы, однако особенно удобным оказался составной импульс ■
достоинство которого состоит в том, что он не использует 90°-фазовые сдвиги и поэтому может быть реализован на существующих фазовых модуляторах канала развязки. Для удобства описания последовательностей развязки, использующих только 180^-фазовые сдвиги, мы несколько модифицируем принятые ранее правила записи. Продолжительность импульса будет по-прежнему обозначаться кратной л/2-им- пульсу, а фазовому сдвигу будет соответствовать черточка над символом. Так как 90°-сдвиги уже не нужны, то отпадает необходимость в использовании X и Y, достаточно будет только цифры, обозначающей длительность. Таким образом, указанный составной импульс запишется как 123 (соответствующая ему последовательность носит сокращенное имя WALTZ, см. гл. 4). В качестве основы последовательностей развязки можно использовать и другие составные импульсы, которые, возможно, дадут еще лучший результат, но модификация 123, названная WALTZ-16 [10], полностью решает все проблемы, связанные с неточностью калибровки поля В2, и представляется самой предпочтительной для практического использования. WALTZ-16 можно записать в виде
• QQQQ ...
Перестановки фаз импульсов должны производиться без задержек, а
Q = 342312423
Эта последовательность легко реализуется при помощи современных аппаратурных средств и, вероятно, станет стандартной методикой развязки на спектрометрах, которые будут выпускаться после 1984 г. На рис. 7.10 приводится сравнение эффективности развязки WALTZ-16 с более старой схемой модуляции (прямоугольная волна с разверткой по частоте).
Использование для развязки составных импульсов в значительной степени решает проблему нагревания образца даже на спектрометрах с частотой 500 МГц. В спектрах, полученных в условиях широкополосной развязки, становятся возможными измерения с высоким разрешением, поскольку ширина линии может достигать 0,25 Гц и менее;
WALTZ-16WALTZ-16О О UО О U-3-2-10123расстройка, кГц-3-2-10123расстройка, кГц-3-2-10123расстройка, кГц-3-2-10123расстройка, кГц
WALTZ-16
WALTZ-16
О О U
О О U
-3-2-10123
расстройка, кГц
-3-2-10123
расстройка, кГц
-3-2-10123
расстройка, кГц
-3-2-10123
расстройка, кГц
прямоугольная Волна
Рис. 7.10. Сравнение результатов широкополосной развязки с применением методики WALTZ-16 и с помощью обычно используемой в продающихся приборах схемы модуляции (прямоугольная волна с разверткой по частоте). Наблюдается углеродный сигнал бензола при различном отклонении частоты развязки от частоты сигнала протонов. Напряженность поля в обоих случаях одинакова.
Ширина линии в спектрах WALTZ-16 не превышает 0,3 Гц.
соответствующее ей увеличение Т2 во временной области может быть очень полезно в экспериментах по спиновому эху. Наконец, становится значительно более реальной широкополосная развязка и от других ядер, например от 31Р при наблюдении 'Н. Ширина полосы эффективной развязки для WALTZ-16 при использовании поля с амплитудой В2 составляет около 1В2. Мощности порядка 5 кГц легко получаются без привлечения очень высоких мощностей радиочастотного сигнала, но это, конечно, зависит от датчика и частоты ядер. На спектрометрах со средней напряженностью поля (250 МГц) это позволяет, например, получать спектры 13С в диапазоне 160 м. д. или спектры 19Г в диапазоне 40 м. д. с вполне эффективной развязкой и узкими линиями. Если допускается большее остаточное уширение линий, то можно использовать другие последовательности, дающие еще более широкую полосу развязки (например, GARP-1 [11] имеет полосу эффективной развязки шириной около 5B2Y
Релаксация и повторение прохождений
Введение
В экспериментах, где требуется усреднение многих прохождений, связь между двумя параметрами релаксации Тх и Т2, идеальной длительностью импульса а и частотой повторения прохождений Т, довольно сложна. Однако часто можно сделать некоторые упрощающие предположения, позволяющие подобрать оптимальные параметры эксперимента, при условии, что мы уже знаем величины Т2 и Т2. Измерить на практике величину Т2 довольно трудно, но на концентрированных образцах по методике, описанной в разд. 7.5.2, можно приближенно измерить величину 7], которая даст верхнюю границу Т2. В этом разделе мы рассмотрим те факторы, которые необходимо учитывать при выборе
параметров эксперимента. Заметьте, что нашей основной целью будет получение максимальной чувствительности при минимальных ложных сигналах, а не количественное измерение интенсивностей, для которого требуется установление равновесных, а не стационарных условий (разд. 7.6).
Длительность импульсаи частота повторения прохождений
Во многих экспериментах длительность импульса определяется не соображениями релаксации, а, например, необходимостью выполнения определенных типов переноса поляризации (см. гл. 8). В этом случае частота повторения прохождений - единственный произвольный параметр. Однако в обычных одномерных спектрах мы можем произвольным образом выбирать и длительности импульса и частоту повторения прохождений, причем оба этих параметра будут оказывать значительное влияние на результаты эксперимента. Чтобы разобраться в этом, мы должны рассмотреть два взаимосвязанных явления - поведение z-намагниченности и поведение намагниченности в плоскости х — у. Относительная скорость восстановления z-намагниченности (по сравнению с частотой повторения прохождений) будет определять амплитуду регистрируемого сигнала. Если же мы повторяем импульсы настолько часто, что поперечная намагниченность к следующему импульсу полностью не исчезает, то картина значительно усложняется. Для начала легче вообще исключить из рассмотрения поперечную намагниченность, т. е. предположить, что Г2 « 7], и заниматься только z-компонентой. Но, к сожалению, такое предположение слишком далеко от реальности, и позже мы будем вынуждены рассмотреть ситуацию, когда оно не работает.
Воздействие л/2-импульса на образец, находящийся в состоянии теплового равновесия, даст нам максимальный сигнал ЯМР, поскольку при этом вся намагниченность переводится в поперечную плоскость. Однако при усреднении многих прохождений такая длительность импульса-не самый лучший вариант, поскольку z-намагниченность не будет каждый раз успевать восстанавливаться в достаточной степени, если, конечно, промежуток между импульсами Тг не будет во много раз превышать Tv Низкая частота повторения прохождений не эффективна, и поэтому такая ситуация редко встречается на практике, за исключением экспериментов по измерению 7], где необходимо регистрировать именно равновесную намагниченность. Гораздо лучше сделать задержку между прохождениями равной времени выборки, которое определяется требованиями к разрешению, и подобрать такую длительность импульса а, чтобы максимизировать создающуюся в стационарном состоянии z-намагниченность. Точная величина а зависит от отклонения частоты сигнала от резонансной [12], но можно взять некую среднюю оптимальную величину аЕ (угол Эрнста), определяющуюся выражением
cosaE = <? T'*Tv (7.7)
В условиях Т* ~ Т2 « Тг и 7] (= Л,) > Т2 эта длительность импульса будет наилучшей. Именно в таких условиях и регистрируется на практике большинство протонных спектров (хотя при количественных измерениях мы можем склоняться к выбору более коротких импульсов). Но при наблюдении гетероядер, где требования к разрешению могут быть ниже, At короче, и Т2 уменьшено за счет неполной развязки, или в двумерных экспериментах, где время выборки всегда имеет величину порядка Т^, такие условия используются редко.
Если наш эксперимент подразумевает обязательное использование тг/2-импульсов (или в какой-либо последовательности нам необходимо полностью устранить z-намагниченность), то, очевидно, приведенная выше формула не может быть использована для определения оптимальной длительности импульса. В этом случае мы должны найти компромисс между повышением чувствительности за счет увеличения числа прохождений в заданный промежуток времени и ее понижением за счет уменьшения z-намагниченности в стационарном состоянии. В предположении полного затухания поперечной намагниченности в промежутках между прохождениями можно показать, что оптимальная частота повторения прохождений задается формулой Тг = 1,27 7] [13]. В этом случае мы получим отношение сигнал/шум, составляющее. 80% от аналогичного эксперимента с большей частотой повторения прохождений и углом Эрнста для импульса, если бы он был возможен. Для многих экспериментов, включающих устранение z-намагниченности с помощью последовательности импульсов, где поперечная намагниченность действительно затухает между прохождениями или где описанные выше эффекты не влияют на результат, лучшим выбором частоты повторения прохождений будет 1,37].
Но предполагавшиеся выше условия выполняются далеко не всегда. Гораздо вероятнее, что наше Т* будет значительно меньше Т2, в свою очередь Т2 может быть меньше 7], и, будучи ограничены во времени, мы заинтересованы в таком времени выборки, чтобы получить спектр с плохим разрешением, но без потери сигналов (т. е. At = Т*). Почти все двумерные эксперименты и многие одномерные эксперименты по наблюдению гетероядер производятся в этих условиях. Повторение прохождений с ТГ < Т2 приводит к появлению стационарного эха [14], поскольку существующая к моменту следующего импульса поперечная намагниченность рефокусируется во время прохождения. Анализ такой ситуации слишком сложен, чтобы приводить его здесь (см. работы [14, 15]). На практике можно получить следующие результаты.
В одномерных спектрах, полученных в таком режиме, фазы и интенсивности сигналов оказываются зависящими от отклонения их частоты от резонансной, если, конечно, а не равен углу Эрнста. Однако такой угол не будет оптимальным с точки зрения чувствительности; предпочтительнее импульсы большей длительности. В экстремальном
случае, когда Тг = Т£ и Т£ « Т2, TY (например, при плохой однородности постоянного поля), оптимальная длительность импульса становится независимой от Tv [15] и составляет около 0,4л. На практике использование фазовых циклов типа процедуры CYCLOPS для подавления ложных сигналов при квадратурном детектировании позволяет в значительной степени снизить эффекты стационарного эха в одномерных спектрах. Их можно снизить еще больше с помощью периодических случайных изменений Тг [14]. В двумерных экспериментах по переносу когерентности (см. гл. 8 и 9) наличие к началу следующего прохождения остаточной поперечной намагниченности или других видов когерентности может привести к появлению ложных сигналов, поскольку импульсы этого прохождения произведут дополнительный перенос остаточной намагниченности. В этих случаях задержки между прохождениями должны быть больше, чем это требуется из соображений чувствительности. Величина Тг порядка ЗТг обеспечит достаточное затухание всех видов когерентности. ■
Методы быстрого определения TY
Все приведенные выше рассуждения подразумевают, что у нас уже есть какие-то предположения о величинах Tt в нашем образце. Если он достаточно концентрированный и дает заметный сигнал с одного прохождения, то для приближенной оценки 7^ можно использовать метод инверсии - восстановления:
z-Намагниченность в конце задержки т определяется формулой
(7.8)(7.8)М2 = М0(1—2е т/Т|)
(7.8)
(7.8)
Интенсивность регистрируемого сигнала проходит через нуль при
(7.9)
^null^nullЕсли вы выполняете серию экспериментов с различными т, начиная с очень небольшого значения для подбора параметров коррекции фазы (заметьте, что на этом этапе сигналы будут отрицательными) и заканчивая на спектре с нулевой интенсивностью интересующего сигнала (рис. 7.11), то TY можно получить из формулы
^null
^null
(7.Ю)
Такая оценка будет довольно грубой, но ее вполне достаточно для выбора частоты повторения прохождений и для других подобных задач. Наиболее вероятный источник ошибок состоит в слишком частом повто-
Рис. 7.11. Определение приближенных величин Ту методом инверсии - восстановления. Величины т соответствуют нулевой интенсивности помеченных стрелками сигналов; отвечающие им величины Ту составляют 0,3 с (средний спектр) и 1,0 с (верхний спектр).
рении эксперимента, в результате чего не все ядра будут успевать полностью отрелаксировать, и мы получим заниженные величины для больших Ту. Реальные образцы обязательно имеют различные величины 7j, из которых следует выбрать некоторую компромиссную, поэтому ошибки в их измерениях скорее всего не будут иметь серьезного значения.
Однако сложность состоит в том, что оптимизация параметров регистрации спектра наиболее важна именно для разбавленных образцов, где Ту определить совсем не просто. Если проводить описанные выше эксперименты с усреднением, то между прохождениями необходимо делать задержки порядка 57/, что сразу делает эксперимент недопустимо долгим. В такой ситуации нужно уметь интуитивно оценивать возможные величины Ту для соединений и ядер, с которыми вы работаете. Необходимый для этого опыт легко приобрести, измеряя все возможные Ту в каждом удобном случае. Конечно, в литературе есть большие таблицы Ту, но они не очень полезны для практических целей, поскольку содержат данные, полученные в необычных условиях (необычных с точки зрения повседневной спектроскопии; например, в обез- гаженных образцах). Величины протонных Ту в молекулах среднего размера составляют обычно 1 или 2 с, хотя есть множество отклонений как в ту, так и в другую сторону. Другие ядра со спином 1/2 могут иметь чрезвычайно малые скорости релаксации, особенно этим отличаются четвертичные углероды, а также ядра 29Si и 15N в самом различном окружении. Для ядер 15N, не связанных с протонами, обычные величины Ту составляют несколько минут даже в необезгаженных образцах. Квадрупольные ядра (спин > 1/2) эффективно релаксируют за счет взаимодействия с градиентами локального электрического поля, их величины Ту почти всегда попадают в диапазон от микросекунды до сотен миллисекунд.
Количественное измерение интенсивностей
Введение
Интегрирование спектров с целью получения информации о площадях пиков-одна из самых обычных процедур протонной спектроскопии ЯМР. Ее точность вполне достаточна для определения числа протонов, дающих вклад в какой-либо пик. Было бы очень заманчиво использовать эту процедуру для других задач, требующих определения относительных количеств каких-либо соединений в растворе, например для экспериментов по кинетике или для количественного анализа смесей. Но если точность в 10-15%, вполне достаточная для определения числа протонов, достигается довольно легко, то точность, требующаяся для других количественных применений (допустим, лучше 1-2%), может оказаться недостижимой. В этом разделе мы коротко рассмотрим те причины, которые затрудняют использование спектроскопии ЯМР и особенно фурье-спектроскопии ЯМР для строгого количественного анализа. Эта тема подробно излагается в других руководствах по практическому ЯМР, но она настолько важна, а ожидания химиков настолько преувеличены, что, пожалуй, имеет смысл изложить здесь некоторые наиболее существенные моменты.
Как сделать интенсивность сигналовпропорциональной числу ядер
В предыдущем разделе, где мы оптимизировали эксперимент по чувствительности, для повышения скорости регистрации спектра мы использовали режим, в котором z-намагниченность возвращалась в некоторое стационарное состояние, отличное от равновесного. Однако такой режим совершенно не подходит для количественных измерений, поскольку интенсивность сигнала зависит от величины Тх, и, если только все Tt не окажутся одинаковыми, измеренные интенсивности будут содержать ошибки. В принципе, знание величин Тх измеряемых пиков позволяет скорректировать интенсивности, но достаточно точное измерение 1\ сложнее, чем простая регистрация спектра без насыщения, поэтому такой способ нельзя считать практичным. Однако полезно приближенно оценить величины Т^ по методу, описанному в разд. 7.5.3, для того чтобы выбрать правильную частоту повторения прохождений и избежать насыщения.
Чтобы получить представление о том, насколько трудно добиться возвращения z-намагниченности всех ядер в состояние теплового равновесия, рассмотрим несколько особых случаев. Как уже упоминалось ранее, протонные Tt составляют 1 или 2 с, но при выборе Тг мы должны учесть самое большое Tt во всей молекуле. Пусть оно оказалось равным 3 с. Если мы используем импульс длительностью а и повторяем его через каждые Тг с, то в системе установится стационарная z-намаг-
ниченность Mz, определяющаяся формулой
(7-11)(7-11)/ l-e"Tr!Ti \
(7-11)
(7-11)
М Мо I z \1—е rr/ricosa/
где Мо-равновесная намагниченность. Здесь предполагается, что поперечная намагниченность успевает полностью исчезнуть между прохождениями; в количественных экспериментах это обычно реализуется. Для случая a = л/2 выражение упрощается до вида
Mz = Мо(1 -е"гг/г1) (7.12)
Будем считать, что наша стационарная намагниченность не должна отличаться от равновесной более чем на 1% (т. е. должна составлять 0,99Мо). Это значит, что для ^ = 3 с и л/2-импульса Тг должно составлять 14 с! Для более коротких импульсов ситуация слегка упрощается: при использовании л/4-импульса тем же требованиям удовлетворяет задержка в 10 с, однако дополнительные прохождения в сэкономленное время не компенсируют потери чувствительности из-за уменьшения длительности импульса, поэтому при недостаточной чувствительности такой режим не подойдет. Разумнее использовать л/2-импульс и задержку как минимум в 57], чтобы ошибки из-за насыщения не превышали 1%. Регистрация спектра в таком режиме может потребовать довольно большого времени. Например, обычное 7] ядер 13С составляет 10-30 с, что требует задержки между прохождениями в несколько минут. В этом случае очень полезно для сокращения 7] использовать релаксационные реагенты, такие, как ацетилацетонат хрома(Ш).
Дополнительные проблемы возникают при использовании широкополосной развязки от протонов при наблюдении гетероядер. Так как развязка насыщает протонные переходы, то она может сопровождаться появлением ЯЭО (гл. 5), который значительно изменяет интенсивности сигналов независимо от эффектов насыщения. Например, максимальный ЯЭО на ядре 13С составляет 200% (эта величина выражает усиление сигнала, т. е. интенсивность сигнала с ЯЭО может быть в 3 раза больше, чем без него). Эффект такой величины довольно часто реализуется на протонированных углеродах, в то время как интенсивность сигналов четвертичных углеродов может увеличиваться лишь слегка или вовсе не увеличиваться. В результате, сколько бы усилий мы ни тратили на предотвращение насыщения, все количественные измерения теряют смысл.
К счастью, ЯЭО не возникает моментально при включении де- каплера, для его создания требуется время, сравнимое с Т\ ядра 13С, поэтому мы можем подавить ЯЭО, выключая декаплер между прохождениями на достаточно большое время (эксперимент с обратной прерываемой развязкой, рис. 7.12). Под словами «достаточно большое время» подразумевается промежуток, большой по сравнению с Тх ядра 13С. В любом случае мы не должны повторять импульсы чаще, чем через 5ТХ, а продолжительность времени выборки едва ли составит такую
включенвключен
включен
включен
'н-декаплер
выключен
релаксациярелаксациявыборкавыборка
релаксация
релаксация
выборка
выборка
Рис. 7.12. Схема эксперимента с обратной прерываемой развязкой.
величину, поэтому использование обратной прерываемой развязки не вызывает никаких затруднений. Релаксационные реагенты помимо сокращения 1\ способствуют и подавлению ЯЭО, поэтому при использовании широкополосной развязки их применение еще более желательно. Важно помнить, что при отсутствии ЯЭО и низкой частоте повторения прохождений, неизбежных в количественных гетероядерных экспериментах, реальное отношение сигнал/шум может оказаться значительно ниже величины, ожидавшейся для данной концентрации образца. Это очень осложняет эксперимент, поскольку высокое отношение сигнал/шум, как мы вскоре увидим,-необходимое условие для точных количественных измерений.
Регистрация спектра
Обеспечив пропорциональность сигналов относительному количеству создающих их ядер, мы тем самым проделали только одну часть количественного анализа. Некорректные выполнение оцифровки данных, производящееся в фурье-спектрометрах, и выбор областей оцифрованного спектра вносят дополнительные ошибки в величины интенсивностей. Точность интегрирования зависит также и от отношения сигнал/шум, что кажется вполне очевидным, но на практике мы часто об этом забываем. И наконец, сами величины интегралов часто выглядят случайными. Этот вопрос подробно обсуждался в связи с измерением ЯЭО [16], и здесь мы только подытожим основные выводы.
Мы не должны забывать, что обычный сигнал спектра ЯМР довольно узок и может быть представленным всего лишь парой точек. Величины интегралов обычно вычисляются по правилу трапеции, поэтому при недостаточной оцифровке мы получим неточные величины. Более точный способ оценки площади под сигналом состоит в итерационной подгонке теоретической линии к точкам экспериментального спектра, но мы остановимся только на простом численном интегрировании как на самом распространенном методе. Однако требования к оцифровке не так высоки. Если на ширину линии на полувысоте приходится более трех точек, то возникающие из-за этого ошибки составят не более 1%. Реальная ширина линии в протонном ЯМР может изначально составлять 0,5 Гц и увеличиваться при оптимальной фильтрации до 1,0 Гц, поэтому цифрового разрешения 0,2 Гц на точку должно
вполне хватать. Эта величина чуть меньше цифрового разрешения в спектрах с полным диапазоном (обычно 0,3-0,4 Гц), но все же она легко достижима. Недостаточная оцифровка гораздо чаще используется при наблюдении гетероядер, поэтому при выполнении количественного эксперимента необходимо или увеличить число точек в спектре, или уширить линии с помощью подходящей взвешивающей функции.
Следующий фактор, который мы должны рассмотреть,— это ширина диапазона интегрирования. С точки зрения идеальной лоренцевой линии ответ очень прост: для получения 99% точности следует брать интеграл в диапазоне 20 ширин линий в обе стороны от сигнала, т. е. как минимум 20 Гц по обе стороны линии для предыдущего примера. Однако на практике при этом возникает ряд проблем. Каждая линия будет иметь боковые полосы от вращения и, возможно, 13С-сателлиты, для того чтобы сравнение различных интегралов имело смысл, они должны или всегда включаться в диапазон интегрирования, или всегда исключаться из него. Боковые полосы первого порядка, вероятнее всего, будут попадать внутрь 20-Гц диапазона, поэтому их имеет смысл включать. К боковым полосам более высоких порядков и сателлитам следует подходить более осторожно. Лучше их, конечно, включить, но если рядом находятся другие сигналы, крылья или сателлиты которых попадают в диапазон интегрирования, то цх лучше исключить. Важно быть в курсе таких проблем и в каждом конкретном случае находить способ для их решения.
Процесс оцифровки спектра и способ вычисления интегралов находятся полностью под нашим контролем, поэтому систематические ошибки, производимые этими операциями, можно уменьшить до приемлемого уровня. Но остаются еще случайные ошибки, обусловленные шумом в спектре, которые можно уменьшить только тремя способами-сделать образец более концентрированным, купить спектрометр с более сильным магнитом или провести более длительное накопление. Первые два способа обычно оказываются неприемлемыми, и мы можем только увеличивать время накопления до получения подходящего отношения сигнал/шум. Однако в этом случае отношение сигнал/шум растет пропорционально квадратному корню из числа прохождений, поэтому на этот процесс не имеет смысла тратить более нескольких часов. Шумовая ошибка в величинах интегралов зависит не только от отношения сигнал/шум, но и от способа оцифровки спектра. Выше мы показали, что правильный выбор некоторых параметров снижает систематические ошибки до 1%. Аналогично можно показать, что измеряемая величина интеграла совпадает с его истинным значением с точностью + 1% и вероятностью 99% при отношении сигнал/шум для интегрируемого пика около 250:1 (определение величины см. в гл. 3). Такая чувствительность получается без особых усилий при наблюдении протонов, но для других ядер она может оказаться очень трудно достижимой. В качестве примера на рис. 7.13 приведен пик с отношением сигнал/шум около 250:1.
Рис. 7.13. Вид резонансной линии при отношении сигнал/шум, равном 250:1.Рис. 7.13. Вид резонансной линии при отношении сигнал/шум, равном 250:1.
Рис. 7.13. Вид резонансной линии при отношении сигнал/шум, равном 250:1.
Рис. 7.13. Вид резонансной линии при отношении сигнал/шум, равном 250:1.
Другие аппаратурные трудности
Систематические ошибки в измерении интегралов могут возникать по целому ряду других аппаратурных причин. Одна из важнейших-это невозможность точной настройки фазы на сигнал поглощения в полном диапазоне спектра, полученного преобразованием Фурье. Пики, включающие дисперсионную составляющую, будут, очевидно, иметь меньшую интенсивность, поскольку интеграл дисперсионного сигнала равен нулю. Само по себе это явление не вносит большой ошибки, поскольку снижение интенсивности не настолько велико, чтобы заметно повлиять на отношение сигнал/шум. Ошибки возникают из-за различия фазовых сдвигов сигналов, поэтому наиболее важна именно частотно-зависимая часть коррекции фазы. В спектре с хорошим отношением сигнал/шум при помощи обычной двухпараметровой коррекции (гл. 4) можно визуально настроить фазу с точностью до нескольких градусов, но только при выполнении предположения о линейной зависимости фазы от частоты. Если же это предположение не выполняется, то перед интегрированием фазу каждого сигнала нужно настраивать отдельно. Изменение фазы сигнала на 5° приводит к изменению интеграла на 1%. При очень прецизионных измерениях можно пользоваться специальными процедурами, позволяющими настроить фазу с высокой точностью [17], однако они нужны только на том уровне точности, когда обычное числовое интегрирование уже не подходит, и требуются итерационные процедуры обработки полной формы линии.
Еще один источник обычных ошибок интегрирования-это состояние базовой линии спектра. По целому ряду аппаратурных причин даже при полном отсутствии шума базовая линия спектра (т. е. интенсивность точек в тех местах, где нет сигналов) не будет не только нулевой, но даже
Рис. 7.14. Искажение базовой линии довольно часто наблюдается тогда, когда в спектрах присутствует относительно широкий и интенсивный пик. Левый спектр был получен при включении приемника в середине задержки между импульсом и выборкой, правый-при использовании схемы, описанной в тексте. Масштаб обоих спектров по вертикали одинаковый.
постоянной во всем спектре. Основная причина искривления базовой линии заключается в том, что полосовой фильтр, включенный между приемником и АЦП, способен возбуждаться проходящими через него сигналами ЯМР.
Правильный подбор задержек между импульсом, включением приемника и началом оцифровки позволяет в значительной степени снизить влияние фильтра. Обычно независимо от требований базовой линии (с целью минимизации фазовой коррекции первого порядка) задержка между импульсом и регистрацией первой точки должна быть равна обратной величине скорости выборки (1/2Ж в обозначениях, принятых в гл. 2). При этом тип искажений базовой линии зависит от момента включения приемника. Как было показано [18], включение приемника после завершения 0,6 задержки придает искажениям базовой линии вид постоянного смещения от нуля (рис. 7.14). Установка момента включения приемника не всегда производится автоматически, поэтому имеет смысл проверить ее правильность.
Но, как бы мы ни исправляли базовую линию, она все же оказывает влияние на величину интегралов, поэтому процедуры интегрирования всегда сопряжены с какой-либо ее коррекцией, которая может быть как автоматической, так и управляемой оператором [в форме установки параметров «отклонение» („offset” или „drift”) и «наклон» („bias” или „slope”)]. В пакеты программного обеспечения многих спектрометров включаются также более сложные процедуры исправления базовой линии, которые позволяют оператору вычитать различные функции из спектра с целью его сглаживания. По мнению автора, наилучшие результаты удается получить с помощью простого четырехчленного полинома с ручной, а не автоматической настройкой коэффициентов. Такая процедура предпочтительнее использования коррекции, автоматически производящейся при интегрировании.
И наконец, сравнивая интегралы пиков в различных частях спектра, мы делаем предположение о линейности всей цепи событий от импульса до оцифровки данных. Мы считаем, что импульс в одинаковой степени возбуждает сигналы всего спектрального диапазона (это вполне справедливо для л/2-импульса при ширине диапазона, значительно меньшей
напряженности поля 5t) и что все каскады приемника одинаково усиливают разные частоты. Последнее предположение кажется довольно сомнительным, если учесть, что приемник обычно состоит из предусилителя, смесителя, усилителя промежуточной частоты, еще одного смесителя, усилителя звуковой частоты, настраивающегося фильтра звуковых частот и АЦП. Фильтр звуковых частот, использование которого необходимо для повышения чувствительности,-самый первый кандидат на роль создателя нелинейности в спектральном диапазоне. Вместо теоретического разбора этого вопроса для конкретного спектрометра лучше проделать экспериментальный тест, состоящий в регистрации спектров образца с единственной линией, помещая ее в разные места спектрального окна. Такой эксперимент не эквивалентен регистрации спектра с фиксированной несущей частотой и набором линий в разных местах спектрального окна, но он все же позволяет оценить величину возникающих при этом ошибок.
Мораль этого раздела состоит в том, что в фурье-спектроскопии ЯМР существует множество факторов, влияющих на точность количественных измерений, и, несмотря на то что ошибки каждого из них можно снизить до 1% или около того, суммарная ошибка все же остается значительной. Вообще, ко всем измерениям, точность которых якобы превышает несколько процентов, лучше подходить скептически, если, конечно, вам не станет ясно, что все описанные выше факторы были учтены.
Селективное возбуждение и подавление
Введение
В некоторых обстоятельствах бывает полезно возбудить сигналы только части спектрального диапазона, оставив остальные невозбужденными. В зависимости от соотношения частей диапазона, подвергшихся и неподвергшихся воздействию, мы можем говорить о селективном или «скроенном» („tailored”) возбуждении или, наоборот, подавлении пиков. При подавлении пиков наиболее частая задача состоит в устранении одного интенсивного сигнала с целью обойти трудности, связанные с большим динамическим диапазоном (см. гл. 3). В качестве примеров использования селективного возбуждения можно назвать эксперименты по нестационарному ЯЭО и SPI и процедуры по выделению небольших частей сложного спектра. Это очень большая тема, и, чтобы избежать излишнего затягивания, мы рассмотрим несколько методов, использующихся для решения часто встречающихся задач.
Подавление пиков
Подавление пиков предварительным насыщением. Обзор литературы по подавлению пиков содержал бы огромный список методов, поскольку эта область очень популярна среди экспериментаторов. Но, к счастью, это тот самый редкий случай, когда мы можем однозначно утверждать, что один из методов - предварительное насыщение-самый лучший. Однако нужно сразу добавить, что это верно только тогда, когда подавляемый пик не участвует в химическом обмене с другими интересующими нас сигналами. Предварительное насыщение в отсутствие химического обмена-лучший метод понижения интенсивности сигналов в том смысле, что оно сочетает в себе возможность значительного подавления сигнала с минимальным возмущением оставшейся части спектра. Нас интересуют два критерия: насколько мы можем ослабить мешающий сигнал и что при этом произойдет с остальными пиками.
Предварительное насыщение представляет собой облучение подавляемого сигнала слабым радиочастотным полем, достаточно долгое для устранения разности заселенностей по соответствующему переходу. Чтобы близкие к подавляемому сигналы не испытывали сдвигов Блоха - Зигерта, непосредственно перед импульсами и выборкой данных облучение выключается (рис. 7.15). Обычно проблемы динамического диапазона возникают в протонных спектрах, и облучение удобно осуществлять с помощью декаплера. Оптимизация эксперимента состоит из подбора напряженности поля и длительности облучения. Напряженность поля В2 должна быть такой, чтобы «фактор насыщения» В2ТгТ2 (В2 в герцах) оказался сравнительно большим (например, > 100), а облучение должно быть достаточно длительным, чтобы насыщение успело установиться (например, в несколько раз больше Т2\
Подавление пиков необходимо чаще всего в водных растворах, поскольку остаточные сигналы воды велики, а многие вещества биологического происхождения растворимы только в воде, имеют высокую молекулярную массу и доступны в небольших количествах, так что подавляемый пик-это обычно HDO. Его времена Т\ и Т2 (сильно зависящие, однако, от растворенного вещества) могут составлять 5 и 1 с, поэтому включения поля В2 напряженностью 20 Гц на 2-3 с должно быть достаточно. Эти параметры легко подобрать экспериментальным
Включен
декаплердекаплервыключенвыключенселективное насыщение
декаплер
декаплер
выключен
выключен
передатчик
Рис. 7.15. Схема эксперимента по подавлению пиков с помощью предваритель-ного насыщения.
путем и без знания характеристик релаксации, поскольку образец - очевидно, довольно концентрированный, и предварительные эксперименты не потребуют много времени. Задача подбора параметров заключается в снижении напряженности поля для повышения селективности и сокращении времени облучения для увеличения частоты повторения прохождений при сохранении приемлемого подавления. Хотя основная цель подавления сигналов-это уменьшение динамического диапазона, оно требуется только при отношении интенсивностей, большем чем несколько тысяч к одному (для АЦП с длиной слова 12 бит). Подавление для улучшения общего вида спектра полезно и при меньших отношениях интенсивностей (рис. 7.16). Подавление интенсивного пика может облегчить наблюдение его слабых соседей и снизить искажения базовой линии.
При проведении двумерных экспериментов, как, например, COSY (гл. 8), насыщающее поле желательно выключать перед выполнением последовательности (л/2 — tv — л/2— Выборка). Однако это может привести к недостаточному восстановлению намагниченности растворителя за время tv В этом случае насыщающее поле следует оставлять до начала интервала ?2, т. е. до выборки данных. Наличие поля В2 во время
■—।—,—।—,—।—,—।—।—।—।—।—।—।—।—।—.—।—.—।—।—।—।—।—।— 5,4 5,2 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 3,8 3,6 3,4 3,2
м.Э.
Рис. 7.16. Подавление сигнала HDO с помощью предварительного насыщения.Часть нижнего спектра в середине усилена в 8 раз. Пик НЕЮ подавлен на верхнемспектре.
промежутка ц может вызвать в преобразованном спектре сдвиги Блоха-Зигерта только по оси v15 что нарушит его симметрию. Например, упоминавшееся выше поле с амплитудой 20 Гц вызовет заметные сдвиги сигналов в диапазоне в несколько сотен герц. Таким образом, этот эффект может создавать серьезные осложнения.
Схема предварительного насыщения перестает работать, когда облучаемый сигнал участвует в химическом обмене с другими интересующими нас ядрами, на которые таким образом будет переноситься насыщение. Эта проблема часто возникает при подавлении сигналов воды в водных растворах. Протоны воды неизбежно будут обмениваться с такими функциональными группами, как ОН и NH. Кроме того, если нам нужны именно их сигналы, то мы не можем использовать в качестве растворителя дейтерированную воду. В результате предварительное насыщение неприменимо именно там, где оно больше всего нужно. В такой ситуации, очень часто встречающейся в биологических экспериментах, необходимо применять другие методы, не использующие облучение сигнала воды.
Подавление пиков «скроенным» возбуждением. Существует множество схем «скроенного» возбуждения, которые «раскрывают» частотное распределение возбуждающего импульса таким образом, чтобы исключить воздействие на некоторую спектральную область. В общем случае они состоят из замены жесткого неселективного импульса группой слабых импульсов или последовательностью жестких импульсов, производящих аналогичный эффект (один из видов составных импульсов). Наиболее распространенный метод «мягкого импульса»-это редфилдовский 2-1-4-«скроенный» импульс [19]. Но при всей эффективности его можно применять только на спектрометрах, позволяющих производить длительные слабые импульсы, что часто оказывается недоступным. Кроме того, при необходимости значительного подавления пиков он очень чувствителен к выбору параметров. В последние годы был предложен целый ряд жестких составных импульсов для достижения того же эффекта. Эти методы имеют более широкую область применения, поэтому мы ограничимся их кратким описанием.
Последовательность
/л\ /л\
— I — т — I I Выборка ...
\2/х \2/-х
известна под названием «прыжок-возврат» („jump and return”, J R) [20]. Она вполне понятна и послужила прародителем целого семейства экспериментов. Если частоту передатчика настроить точно на подавляемый пик, то во время задержки т он будет оставаться постоянным во вращающейся системе координат, и второй импульс вернет его на ось г. Остальные же пики во время задержки т будут прецессировать, и их намагниченность частично, а может быть, и полностью, не подвергнется воздействию второго импульса (рис. 7.17). Очевидно, что любой сигнал, успевший за время т совершить прецессию точно на л, 2л... (т. е. линии на
Рис. 7.17. Воздействие двух импульсов «прыжок-возврат» на систему из двух линий, одна из которых находится точно в резонансе, другая смещена по частоте на 1/4 т.
частотах 1/2т, 1/т Гц... от опорной), также будет подавлен, а сигналы в диапазоне от 0 до 1/2т будут возбуждаться в неодинаковой степени с максимумом на частоте 1/4т. Поэтому т подбирается таким образом, чтобы поместить интересующий нас спектральный диапазон в область максимального возбуждения.
Недостатки этого эксперимента, общие для всех экспериментов такого типа, сразу понятны. Неравное возбуждение частей спектра делает невозможным количественное сравнение интенсивностей сигналов. Вероятно, это неизбежная плата за возможность не возмущать сигнал растворителя. Кроме того, ширина полосы «нулевого возмущения» передатчика сравнительно невелика. Если сигнал растворителя широк, или имеет боковые полосы, или частота передатчика неправильно настроена, то подавление растворителя будет неполным.
Мы можем построить последовательность с лучшими характеристиками. Например, можно расширить нулевую полосу передатчика, добавив в последовательность новые импульсы с длительностями, определенными из коэффициентов биномиального разложения [21]. Используя введенное ранее сокращенное обозначение, мы можем записать последовательность «прыжок-возврат» как 1Т. Тогдадругие представители этой серии будут выглядеть как 121, 1331, 14641 и т. д. (подразумевается, что все импульсы разделены задержками т). При этом импульс «1» не обязательно имеет длительность л/2; важно, чтобы сохранялось правильное соотношение длительностей импульсов в последовательности. Имеет смысл только суммарный угол поворота всех импульсов, который определяет эффективный угол поворота намагниченности сигналов, находящихся на расстоянии 1/2т от резонанса. Обычно он выбирается л/2 или меньше. Таким образом, обычный «прыжок - возврат» оказывается нетипичным представителем серии,
поскольку его эффективный угол на указанных частотах составляет л (т. е. нулевое возбуждение).
Наилучший компромисс между сложностью последовательности и ее эффективностью-это, наверное, последовательность 1331. При ее выполнении экспериментатор может выбрать суммарный угол л/4 и подобрать т исходя из величины спектрального диапазона. Например, для наблюдения большинства нормальных протонных спектров области максимального возбуждения следует поместить на расстоянии + 4 м. д. от сигнала воды. Тогда на спектрометре с частотой 500 МГц задержка т будет составлять около 250 мкс. Поскольку длительность импульса «1» должна составлять 1/8 от л/4, он может оказаться слишком коротким для его практического выполнения. Выход состоит в ослаблении поля Вх с помощью аттенюатора до такой величины, чтобы получить разумную длительность. Если длительность л/4-импульса составляет 4 мкс без аттенюатора, то длительность «1»-импульса будет 0,5 мкс. Для большинства спектрометров лучше всего увеличить ее как минимум до 2-3 мкс с помощью аттенюатора в 12-15 дБ, что позволит избежать нежелательных эффектов от его плохой формы. Некоторые спектрометры позволяют автоматически подключать аттенюатор, в остальных же необходимо использовать внешнее устройство, подключаемое к выходу передатчика. При использовании последнего способа имейте в виду, что аттенюатор следует включать между передатчиком и предусилителем, а не между предусилителем и датчиком, поскольку это приведет к ослаблению наблюдаемых сигналов ЯМР.
Импульс 133Т позволяет получать спектры с понижением интенсивности сигнала растворителя в несколько тысяч раз, сравнимым
—I'1'111'111'1'1'1'1'1'Г"
5,45,2 5,0 4,8 4,6 4,4д4,2 4,0 3,8 3,6 3,4 3,2
Рис. 7.18. Подавление сигнала растворителя с помощью импульса 1331 (спектр с неподавленным сигналом приведен на рис. 7.16). Обратите внимание на то, что единственный сигнал слева от растворителя имеет обратную фазу.
с результатами эксперимента с предварительным насыщением. Фаза спектра сильно зависит от частоты сигналов, но зависимость носит приблизительно линейный характер, и ее можно скомпенсировать обычным путем. Кроме того, сигналы, находящиеся по разные стороны от опорной частоты, имеют противоположные фазы, поэтому, если у вас нет специальной процедуры фазовой коррекции, одна половина спектра окажется перевернутой (рис. 7.18).
Селективное возбуждение
Селективное возбуждение мягкими импульсами. Наиболее прямой способ возбуждения ограниченной спектральной области-это снижение амплитуды поля Bv Каким же образом амплитуда поля связана с шириной полосы эффективного возбуждения импульса? Заметьте, мы хотим перейти от зависимости амплитуды радиочастотного поля от времени к ее зависимости от частоты, т. е. перейти от временного представления к частотному. При условии линейности спиновой системы (т.е. при условии равенства отклика на комбинацию возбуждений сумме откликов на отдельные возбуждения) это можно сделать, подействовав преобразованием Фурье на функцию во временной области. Фурье-образ прямоугольного импульса (прямоугольник - хорошее приближение огибающей импульса, получающегося при включении и последующем выключении передатчика) - это бесконечная функция (sinx)/x или sincx (см. гл. 2, рис. 2.16).
Кривая sincx, соответствующая импульсу длительностью т, проходит через нуль каждые 2/т Гц; область равного возбуждения находится внутри первой пары нулей, допустим, в области ±0,2/т от центральной частоты. Однако с точки зрения селективности (т.е. отсутствия возбуждения прочих сигналов) активную область следует распространить на большие расстояния, возможно, на ± 10/т от центральной частоты, поскольку заметное возбуждение наблюдается не только внутри первой пары нулей. Таким образом, чтобы избежать воздействия на сигналы, не входящие в область 200 Гц, мы должны использовать импульс длительностью как минимум 50 мс; при этом следует выбрать такую напряженность поля, чтобы получить нужный угол поворота (например, 5 Гц для л/2-импульса). Учтите, что селективность такого эксперимента будет намного ниже величины, ожидавшейся на основании измерений только напряженности поля; объясняется это формой импульса. Но при своей недостаточной селективности импульс длительностью 50 мс пригоден для создания равномерного возбуждения лишь в узком диапазоне порядка ±4 Гц вокруг резонансной частоты.
Такие мягкие прямоугольные импульсы, несмотря на их очевидные недостатки, находят широкое применение. Если они нужны на протонной частоте, например для описанного в гл. 6 эксперимента SPI или для инверсии сигналов при измерении нестационарного ЯЭО (гл. 5),
> _ _. 1 1 1J . jLJUL^iuJL
Рис. 7.19. Зависимость возбуждения, создаваемого одинаковыми прямоугольным (внизу) и гауссовым (вверху) импульсами, от расстройки. Длительность импульсов 80 мс, расстройка увеличивается с шагом 2,5 Гц.
то в качестве источника облучения можно использовать декаплер: настройка его на нужные длительности импульса и напряженности поля обычно не вызывает затруднений. Если прибор позволяет управлять амплитудой радиочастотного сигнала во время самого импульса, то можно получить результаты с большей селективностью за счет выбора подходящей формы импульса. Придав огибающей импульса гауссову форму, мы устраняем боковые лепестки, присущие частотной характеристике прямоугольного импульса, и обеспечиваем быстрый и плавный спад возбуждения при удалении частоты от резонанса [22]. Это очень похоже на устранение «виглей» с помощью аподизации усеченных данных (гл. 2). На рис. 7.19 сравниваются зависимости эффективности возбуждения от отклонения от резонанса для прямоугольного и гауссова импульсов эквивалентной длительности.
Селективное возбуждение с помощью DANTE. Почти все спектрометры имеют стандартный источник облучения с настраиваемой мощностью, который может работать на частоте протонов в течение большого промежутка времени (декаплер). Однако такой же источник, работающий на частоте других ядер, встречается гораздо реже. Конечно, мы можем попытаться использовать для этого широкополосный передатчик, понизив его выходную мощность, но конструкция импульсных усилителей часто не позволяет им работать дольше нескольких сотен микросекунд, и включение на более длительное время приводит к выходу из строя. Поэтому при необходимости создания селективного импульса на частоте гетероядра (например, при выполнении переноса поляризации с 31Р) необходимо пользоваться другими методами. Это, например, последовательность DANTE (Delays Alternating with Nutations for Tailored Excitation-чередование задержек и нутаций для «скроенного» возбуждения) [23], состоящая из т жестких импульсов, имеющих
очень малый угол поворота, постоянную фазу и одинаковые интервалы между собой:
а — т — а — т — а — т — а - т — а — с — ...
Действие этой последовательности на спиновую систему можно проанализировать аналогично прямоугольному импульсу, выполнив преобразование Фурье всей цепи или рассмотрев ее с точки зрения векторной модели. В последнем случае сигнал, находящийся точно на частоте передатчика, будет постоянным во вращающейся системе координат в интервале т. Малые импульсы будут суммироваться, и общий угол поворота всей последовательности составит та. Остальные резонансы в промежутках между импульсами будут прецессировать и, таким образом, окажутся менее возбужденными, если, конечно, не будут успевать сделать целое число поворотов. Следовательно, частотная характеристика возбуждения будет иметь лепестки через каждые 1/т Гц;
I I I I I 1 I1 I1 34323028262422201816
Рис. 7.20. Спектр 13С холестерилацетата без развязки от протонов очень сложен даже на частоте 125 МГц (средний спектр); использование описанной в тексте последовательности DANTE позволяет извлекать из него отдельные мультиплеты (два верхних спектра).
более детальный анализ показывает, что каждый лепесток имеет форму функции sine Л".
Селективность облучения внутри каждого лепестка определяется полной длительностью последовательности тт; расстояние между нулями на кривой sincx составляет приблизительно 2/тт. Следовательно, нужно выбирать такую величину а, чтобы она составляла незначительную часть от требуемой длительности импульса, а тт оставался малым в сравнении с временем релаксации. Короткие импульсы не очень удобны, избежать их использования можно с помощью деления выходной мощности передатчика. Величина т подбирается так, чтобы лепестки частотной характеристики не попали на те пики, которые не следует возбуждать. Частота передатчика настраивается на интересующий нас диапазон.
Последовательность DANTE можно использовать во всех экспериментах, где требуется селективное возбуждение. На рис. 7.20 приведен пример разделения с ее помощью сложных спектров 13С на отдельные сигналы. Во время генерирования DANTE включается широкополосная развязка от протонов, тит выбраны таким образом, чтобы последовательность в сумме была эквивалентна л/2-импульсу. Во время выборки декаплер выключается, что позволяет регистрировать мультиплетную структуру сигналов.
Несколько тестов для спектрометра
Описанные в гл. 3 тесты на чувствительность, форму линии и разрешение служат основными критериями качества спектрометра, и именно на них тратится значительная часть времени при покупке нового прибора. Однако круг различных производителей спектрометров не так широк. Даже если вам покажется, что тот или иной прибор имеет самые хорошие характеристики, то в бол'се реальных условиях окажется, что между ним и остальными приборами нет существенных различий. Но затраты на покупку современного спектрометра ЯМР довольно велики даже для крупных промышленных концернов, поэтому имеет смысл упомянуть несколько менее очевидных тестов, позволяющих более детально оценить качество прибора. Эти тесты нельзя назвать стандартными, поэтому при сравнении спектрометров вы должны точно определить свои намерения и убедиться, что тесты на разных приборах производятся в строго одинаковых условиях.
Не все из этих тестов предназначены для количественного определения характеристик спектрометра. Оценить количественно такие важные показатели, как, например, кратковременную стабильность отношения поле/частота или однородность поля BY, может быть очень непросто, в то время как качественное сравнение сделать довольно легко. Оценка других качеств прибора, таких, как стиль программного обеспечения,-дело чисто субъективное, но не менее важное. При покупке прибора труднее всего решить, какие же задачи вы собираетесь решать
с его помощью. В университетах обычный ответ на этот вопрос-«все», но этот ответ не самый лучший. В промышленности круг задач может быть гораздо более определенным.
Относительная важность различных качеств спектрометра определяется предполагаемыми задачами. Например, если вы собираетесь регистрировать только рутинные протонные спектры, то все обычные тесты и все тесты из этой главы можно не проводить. Приборы всех четырех основных производителей (фирмы JEOL, Bruker, Ge NMR Instruments и Varian) имеют вполне пригодные для этой цели характеристики. Лучше обратите внимание на пакеты программного обеспечения: насколько быстро, легко и удобно с ними работать? Сможет ли неспециалист овладеть ими за час или два? В какой степени возможна автоматизация операций? Отвечает ди требованиям документация? (часто основной недостаток состоит именно в этом). Это наиболее важные вопросы, на которые вы должны получить ответ. Однако их очень трудно или даже невозможно выяснить во время короткой демонстрации спектрометра. Лучше всего обсудить их со сторонними пользователями приборов. Конечно, все они будут жаловаться и критиковать производителей; но, возможно, пользователи одних приборов будут настроены заметно критичнее, чем пользователи других.
Если ваш прибор будет использоваться в нерутинном режиме, где потребуется предельная чувствительность, разрешение или еще что- нибудь, то вам необходим совершенно иной подход к его оценке. Программное обеспечение сохраняет всю свою значимость, но некоторое неудобство работы с ним вполне можно будет допустить. Ключевым его достоинством становится гибкость. Для многих экспериментов из оставшейся части этой книги необходимо надежно контролировать импульсную последовательность в микросекундном масштабе времени. Для двумерных экспериментов важно наличие мощных вычислительных средств, позволяющих максимально свободно проводить обработку данных. К сожалению, большинство современных спектрометров не обладает этими свойствами в достаточной мере, и фирмы продолжают совершенствовать программное обеспечение своих приборов; поэтому такие свойства необходимо тщательно анализировать при покупке.
Даже если программные средства прибора обеспечивают превосходное управление экспериментом, то проверьте, дают ли конкретные эксперименты требующиеся результаты. Такие характеристики прибора, как стабильность, постоянство отношения поле/частота, диапазон и точность фазовых сдвигов, диапазон и воспроизводимость длительности импульсов, форма импульса, однородность поля Bv, не так легко оттестировать, однако они могут полностью испортить результаты многоимпульсных экспериментов. Приводящиеся далее тесты позволяют получить хотя бы качественную информацию о некоторых из них.
Измерьте длительность л-импульса и затем повторите измерения с другими фазами импульса (их должно быть как минимум 4, а можно и больше): полученные величины не должны различаться. Проанализируйте форму остаточного сигнала л-импульса, она характеризует однородность поля Вх. Проверьте, точно ли кратным длительностям л-импульса (т.е. 2л-, Зл-импульсам и т.д.) соответствуют точки нулевой интенсивности сигналов. Если это не так, значит, передатчик плохой и не может генерировать длительные импульсы. Если последний тест прошел, то сравните длительность л-импульса с его длительностью при понижении выходной мощности передатчика на 12 дБ. Она должна увеличиться ровно в 4 раза; другие соотношения могут свидетельствовать о плохой форме импульса (но убедитесь, что делитель точно откалиброван).
Чувствительный тест сразу на все характеристики спектрометра-это разностная спектроскопия. Попробуйте зарегистрировать два прохождения одного и того же спектра, содержащего единственную линию, и вычтите их друг из друга (убедитесь, что задержка между прохождениями обеспечивает полную релаксацию). Амплитуда остаточного пика будет определяться кратковременной стабильностью (см. гл. 5). Проделайте это несколько раз, чтобы получить диапазон возможных величин. Выполните этот эксперимент, поменяв фазу передатчика и заменив вычитание сложением. Должен получиться тот же результат; изменившийся результат свидетельствует о плохой отработке фазовых сдвигов.
Отличные от 180° фазовые сдвиги проверить сложнее; на спектрометрах недавнего выпуска, позволяющих создавать небольшие фазовые сдвиги, попробуйте провести с различными ср эксперимент:
/л\
1-1 Выборка ...
\2/х \2/ф
Амплитуда сигнала должна быть пропорциональна sin ср. Фазовые сдвиги в канале декаплера можно проверить с помощью модифицированного варианта калибровки длительности импульса на «других ядрах» (разд. 7.2.3):
13С:~ Выборка ...
iH:
\2/х\2/ф
При точной калибровке длительности протонного л/2-импульса интенсивность компонент дублета 13С должна быть пропорциональна cos ср. Дальнейшую проверку фазовых сдвигов и общей стабильности спектрометра можно проделать с помощью эксперимента по многоквантовой фильтрации максимально возможного порядка (не обяза-
тельно двумерного, см. гл. 8, разд. 8.4.3 и последнюю часть разд. 8.5.1). Проанализируйте степень подавления нежелательных пиков и степень возбуждения желательных.
Двумерная спектроскопия (гл. 8-10) в общем случае очень чувствительна к дефектам спектрометра. Выполните эксперимент COSY (гл. 8) на концентрированном образце, где обычный шум пренебрежимо мал. Проанализируйте величины «шума по tvw (гл. 8, разд. 8.3.6), которые очень чувствительны к качеству спектрометра, но убедитесь, что все условия проведения эксперимента (ширины спектров, углы импульсов, задержки, режимы обработки данных и функции окна) одинаковы на сравниваемых спектрометрах и спектры не «симметризованы» (разд. 8.3.6). Особенно чувствительна к прибору /-спектроскопия (гл. 10); зарегистрируйте J-спектр без использования EXORCYCLE и посмотрите, на что похожи ложные пики [24, 25].
Попробуйте, наконец, провести эксперименты того типа, которые вы собираетесь выполнить на этом приборе. Сначала испытайте простые образцы, свойства которых вам уже известны, а затем сложные, которые вы еще никогда не исследовали. Попробуйте очень разбавленные и очень концентрированные образцы (не удивляйтесь, дефекты электроники приемника могут проявиться как раз на интенсивных сигналах). Посмотрите, нет ли в спектре выбросов на частоте передатчика, других выбросов, квадратурных пиков и т. д. Получите спектр без использования фазового цикла CYCLOPS и посмотрите, насколько он ухудшился. Попробуйте зарегистрировать спектр одновременно с выполнением серьезной вычислительной задачи (например, двумерного преобразования Фурье); часто компьютер или система его дисков могут наводить помехи в радиочастотном канале спектрометра.
Литература
Giinther Н., Wesener J.R., J. Mag. Res., 62, 158 (1985).
Thomas D. M., Bendall M. R., Pegg D. T, Doddrell D. M., Field J., J. Mag. Res., 42, 298 (1981).
Freeman R„ Kempsell S.P., Levitt M.H., J. Mag. Res., 38, 453-479 (1980).
Levitt M.H., Ernst R.R., J. Mag. Res., 55, 247-254 (1983).
Shako A. J., Freeman R., J. Mag. Res., 55, 487-493 (1983).
Shako A. J., Bauer C.J., Freeman R., J. Mag. Res., 60, 479-485 (1984).
Levitt M.H., Freeman R., J. Mag. Res., 43, 65 (1981).
Levitt M.H., Ernst R.R., Mol. Phys., 50, 1109-1124 (1983).
Waugh J.S., J. Mag. Res., 50, 30-49 (1982).
Shako A.J., Keeler J., Freeman R., J. Mag. Res., 53, 313-340 (1983).
Shako A.J., Barker P.B., Freeman R., J. Mag. Res., 64, 547-552 (1985).
Ernst R.R., Anderson W.A., Rev. Sei. Inst., 37, 93-102 (1966). Это первая работа, предлагающая использовать метод Фурье в спектроскопии ЯМР.
Waugh J.S., J. Mol. Spec., 35, 298-305 (1970).
Freeman R„ Hill H.D. W, J. Mag. Res., 4, 366-383 (1971).
Waldstein P., Wallace WE., Rev. Sci. Inst., 42, 437-440 (1971).
Weiss G.H., Ferretti J. A., J. Mag. Res., 55, 397-407 (1983).
Herring F.G., Phillips P.S., J. Mag. Res., 59, 489-496 (1984) и ссылки в этой работе.
18. Hoult D.L, Chen C.-N., Eden H., Eden M„ J. Mag. Res., 51, 110-117 (1983).
19. Redfield A.G., in: NMR-Basic Principles and Progress (Diehl P., Pluck E., Kos- feld R., eds.), 13, 137-152, Springer-Verlag, 1976.
Plateau P., Gueron M., J. Amer. Chem. Soc., 104, 7310-7311 (1982).
Hore P.J., J. Mag. Res., 55, 283-300 (1983).
Bauer C. J., Freeman R„ Frenkiel T, Keeler J., Shako A. J., J. Mag. Res., 442-457 (1984).
Morris G.A., Freeman R., J. Mag. Res., 29, 433-462 (1978).
Bodenhausen G., Freeman R„ Niedermayer R„ Turner D. L., J. Mag. Res., 133-164 (1977).
Bodenhausen G., Freeman R., Turner D.L., J. Mag. Res., 27, 511 (1977).
58,
26,
Глава 8
Двумерная корреляционнаяспектроскопия ЯМР. Корреляцияза счет гомоядерноговзаимодействия
Введение
С помощью какого из двух основных типов экспериментов рассматривать предмет двумерной спектроскопии? Мне было трудно выбрать между /-разрешенной спектроскопией и корреляционной. /-Спектры, описанные в гл. 10, могут быть поняты до конца (для систем первого порядка) при использовании нашей графической векторной модели, и с этой точки зрения начать можно было бы с них. Однако эти эксперименты достаточно ограниченны по числу приложений, и у неискушенного читателя может возникнуть ощущение того, что достижение даже не очень значительных результатов с использованием этой техники потребует больших усилий. В то же время гомоядерные корреляционные спектры различных типов настолько полезны, что, очевидно, не придется разочароваться, если начать именно с них. С этой точки зрения они, по-видимому, будут полезны в качестве вводных примеров. К сожалению, нам, возможно, не удастся до конца постичь всей глубины этих экспериментов без анализа поведения макроскопической намагниченности. При этом возникает опасность напустить туману и окончательно запутать вопрос о том, что же все-таки происходит в двумерных экспериментах. Как видно из названия этой главы, я в конце концов сделал выбор в пользу корреляционной спектроскопии, надеясь на то, что возникающая при этом нестрогость описания экспериментов в достаточной мере компенсируется тем, что уже в самое ближайшее время нам удастся познакомиться с реальными химическими приложениями.
Имея это в виду, я начинаю с объяснения меченых частот, которые являются основой двумерных ЯМР-экспериментов. До конца это можно осознать с привлечением понятия макроскопической намагниченности. В дальнейшем я попрошу вас принять как факт, без перепроверки, интересный результат, проявляющийся при действии второго радиочастотного импульса на систему, которая к этому моменту уже имеет определенную величину поперечной намагниченности. Это даст нам возможность непосредственно приступить к рассмотрению прикладных аспектов. В гл. 6 мы уже сталкивались с частными проявлениями этого явления, поэтому нам не составит большого труда сделать здесь некоторое обобщение. Несколько позже мы опять вернемся к вопросу
о том, что происходит во время второго импульса и постараемся прочувствовать концепцию когерентности и переноса когерентности. Однако до этого нам предстоит обсудить множество технических вопросов, связанных с концепцией двумерного эксперимента. Части этого раздела будут иметь аналогии с заключительными частями разд. 4.3 гл. 4. Ознакомление с некоторыми разделами настоящей главы можно перенести на более позднее время, когда понимание этого материала окажется необходимым. В этой главе технические детали обсуждаются подробнее, чем в остальных главах, потому что большая часть из них имеет общий характер для всех двумерных экспериментов. Основной эксперимент, на котором построено содержание этой главы, имеет множество разновидностей. В следующем разделе приводится обсуждение тех из них, которые, на мой взгляд, наиболее полезны. В заключение рассматриваются еще два корреляционных эксперимента, которые дают несколько иную информацию.
Меченые частоты
Хотелось бы, чтобы вы представили себе следующий эксперимент. На первый взгляд он может показаться не очень серьезным, но на самом деле иллюстрирует основу техники, имеющей чрезвычайно важное значение для спектроскопии ЯМР. Возьмем образец, спектр ЯМР которого характеризуется только одной резонансной линией, например раствор хлороформа в дейтерированном растворителе при наблюдении протонов. Линия имеет химический сдвиг v. Проследим за превращением этой линии во вращающейся системе координат после (л/2)х-им- пульса, так же как мы делали много раз раньше. Для простоты будем полностью пренебрегать эффектами продольной релаксации, но учитывать поперечную релаксацию, которая определяет форму линии сигнала ЯМР. На рис. 8.1 изображена линия, которая в течение определенного времени прецессировала на частоте v (в Гц). Это время обозначим через tv исходя из соображений, которые станут понятными в дальнейшем (эту переменную не следует путать с Т,-временем продольной релаксации). В конце интервала tT прикладывается второй (л/2)х-импульс и производится регистрация сигнала ЯМР в форме сигнала ССИ. Что же при этом происходит?
Лучший способ ответить на этот вопрос-проследить за проекциями
Рис. 8.1. Амплитудная модуляция сигнала ЯМР может быть следствием варьирования интервала между двумя импульсами.
компонент намагниченности на осях х и у. В течение интервала времени tx вектор намагниченности совершил прецессию на угол 2nvzr Если длина вектора равна М, то из простых тригонометрических соотношений (см. рис. 8.1) следует, что его компонента вдоль оси у равна Mcos2Ttvz1, а компонента вдоль оси х равна М sin2ztvz1. Величина М в свою очередь связана с начальной намагниченностью Мо соотношением
М = Moe-'i/r2 (8.1)
которое следует из определения Т2 (правильнее было бы писать Т?, однако я опускаю индекс «*» из соображений удобства набора текста).
Второй импульс, обозначенный (тг/2)„ поворачивает ^-компоненту намагниченности дополнительно на угол 90°, переводя ее по направлению оси z, в то время как х-компонента остается без изменения. Таким образом, величина намагниченности, определяющая амплитуду сигнала ЯМР, составит Msin2TtvZ1. При этом наблюдается совершенно нормальный спектр, за исключением того, что он имеет определенное отклонение по амплитуде.
Теперь представим себе, что произойдет, если мы проведем серию экспериментов с различными значениями z1( например начинающимися с нуля и монотонно возрастающими до нескольких секунд, т. е. проведем дискретную выборку интервалов tx. Если мы возьмем данные из каждого эксперимента и преобразуем их в спектр, то для каждого эксперимента получим пик, причем амплитуда пиков будет изменяться как функция zv Действительно, она будет синусоидально осциллировать с частотой v, и величина поперечной намагниченности в конце интервала tx составит Afsin2nvz1. Рис. 8.2 точно иллюстрирует этот эксперимент или по крайней мере несколько начальных значений tx (на нем изображены протонные спектры хлороформа на частоте 500 МГц!). В этом эксперименте v составляет 80 Гц и интервал между значениями tx принят равным 1 мс.
Помня о том, что данные спектра ЯМР состоят из дискретного набора чисел, представим себе, что будем выбирать по одной точке из каждого спектра, причем выбранная точка должна соответствовать максимуму сигнала хлороформа. Если предположить, что система ЯМР-стабилизации нашего спектрометра работает нормально, это всегда будет одна и та же точка. Что же мы получим, записав эти точки как функцию zt? Просто график амплитуды сигнала, которая осциллирует с частотой v и затухает экспоненциально с постоянной времени Т2, как это изображено на рис. 8.3. Я надеюсь, вы сразу увидите, что этот график выглядит как некий ССИ. Конечно же, так оно и есть-это синусоидальная осцилляция, экспоненциально затухающая, и мы оцифровали ее, выбирая значения tx с некоторым шагом. Действительно, это ССИ, но не существующий в «реальном времени» как сигнал, который мы регистрируем в обычном ЯМР-эксперименте. Он генерируется точка за точкой как функция переменной tx. Чтобы подчеркнуть это, мы назовем такой график интерферограммой.
Рис. 8.2. Результат использования последовательности, изображенной на рис. 8.1, с различными t^
Рис. 8.3. Изменение амплитуды сигнала в спектре, представленном на рис. 8.2. Приведено сечение параллельно оси ^; секущая плоскость проходит через
вершины пиков.
Сейчас мы отчетливо представляем себе, что если провести фурье- преобразование такого набора данных, то получится частотный спектр, содержащий лоренцеву линию с шириной 1/лТ2 и частотой v. Другими словами, то же самое мы уже получили из «обычного» ССИ, составляющего основу этого эксперимента. Большей общности, чем при преобразовании только точек, соответствующих максимумам сигнала хлороформа, мы добьемся при фурье-преобразовании каждого столбца точек, взятого из полного набора ССИ. Это равнозначно двумерной обработке нашего набора данных, т. е. вместо функции одной временной переменной, как в случае простого ССИ, это будет функция двух переменных JUi» <2)- Первый временной параметр tt соответствует интервалу между двумя импульсами (это первое время в эксперименте, следовательно, zt), а второй параметр является «реальным временем», в течение которого производится выборка данных. Двумерное преобразование Фурье переводит наши данные в двумерный спектр частот /(vi> v2), и сейчас нам следует проработать вопрос о том, какую смысловую нагрузку несут переменные vt и v2.
Очевидно, что v2 является мерой химического сдвига v сигнала и, как мне кажется, легко видеть, что переменная vt также определяет химический сдвиг сигнала v, поскольку полученная нами интерферограмма имеет осцилляции с частотой v. Итак, мы получили квадратный спектр с двумя ортогональными осями и с сигналом, имеющим в частотном представлении максимум в точке с координатами (v, v), т. е. на диагонали (рис. 8.4). Сечением этого спектра через его центр в направлении осей v2 или v2 является лоренцева линия с шириной 1/яТ2. Это наш первый двумерный ЯМР-эксперимент. Я могу согласиться, что он не слишком впечатляющий, поскольку не содержит никакой дополнительной информации по сравнению с обычным спектром. Однако он имеет все необходимые элементы прототипа двумерного эксперимента (рис. 8.5), в котором сигнал модулируется как функция переменной tY и затем регистрируется как функция Z2. Все двумерные эксперименты
Рис. 8.4. Результат преобразования по второй координате-двумерный сигнал поглощения. Альтернативное контурное представление (справа) обсуждается ниже в тексте.
Рис. 8.5. «Прототип» двумерного эксперимента.
осуществляются таким образом. Я хочу особо выделить эту мысль, чтобы обратить внимание на то, что идея, лежащая в основе двумерной спектроскопии, на самом деле исключительно проста. Композиция некоторого «нечто» и некоторого «нечто другое» на рис. 8.5 может быть сложным делом, но концепция модуляции намагниченности перед ее регистрацией проста.
Причина, по которой выбранный нами эксперимент выглядит недостаточно впечатляюще, заключается в том, что намагниченность претерпевает одинаковую модуляцию как в течение времени tY, так и в течение времени /2 (прецессия на собственной ларморовой частоте). Более интересны такие эксперименты, в которых в обоих временных интервалах происходят различные процессы. В общем мы стараемся проводить двумерные эксперименты таким образом, чтобы намагниченность, которая совершала эволюцию с какой-то частотой за время tY (т. е. была «помечена» этой частотой), прецессировала с другой (отличной от первой) частотой в течение времени /2. Последняя частота в экспериментах всех типов будет описывать и химические сдвиги, и константы спин-спинового взаимодействия. Это приводит к сигналам при (v2, v2) с различающимися v, и v2, т.е. к недиагональным или кросс-пикам. Для того чтобы понять, как интерпретировать эксперимент, нам нужно знать, что представляют собой частотные оси (в нашем примере они обе являются протонными химическими сдвигами, но могут быть и сдвигами разных ядер или константами спин-спинового взаимодействия и химическими сдвигами и т. д.). Важно также знать, как связаны намагниченности в период tY и /2, или, другими словами, что приводит к появлению кросс-пиков.
Когда мы проводим двумерный эксперимент, нам необходимо задать диапазон изменения tY и величину приращения между отдельными значениями (инкремент) tY. Более подробно этот вопрос мы обсудим ниже, но сейчас я хотел бы отметить, что оцифровка интервалов tY полностью аналогична оцифровке обычных ССИ. Таким образом мы используем понятие ширины спектральной полосы (которая определяется диапазоном ожидаемых частотных модуляций в течение времени rj для того, чтобы определить инкремент tY в соответствии с критерием Найквиста. Мы также используем понятие цифрового разрешения для определения общего объема выборки данных по этой временной координате. При этом мы сразу сталкиваемся с серьезными практическими проблемами. Вспомним пример из гл. 2, в котором мы оцифровывали протонный спектр с рабочей частотой 500 МГц, занимающий область химических сдвигов Юм.д. Для того чтобы получить цифровое разрешение 0,2 Гц на точку, необходимо использовать время выборки
данных 5 с и объем памяти, достаточный для хранения 50000 действительных чисел (или 25000 комплексных чисел при использовании квадратурного детектирования). Все эти параметры являются практически достижимыми для спектрометров, оснащенных современными системами обработки данных. Если мы попытаемся провести описанный выше двумерный эксперимент с использованием такой же полосы частот и такого же цифрового разрешения в обоих измерениях, то для этого потребуется 50 ОСЮ слов для представления переменной t2 и дважды по 25 000 слов для t^ что в целом составит 2 500 000 000 слов! Общее время такого эксперимента можно оценить следующим образом: это 7,5 с (средняя величина ^ плюс время выборки данных по /2), повторенное 25 000 раз, и все это помножено на 8 (из-за технических ограничений это, по-видимому, минимальное число прохождений для каждого значения <!, как мы увидим в дальнейшем). Это составит 17 суток! Очевидно, нам необходимо уточнить наши представления об оцифровке спектров, когда мы приступаем к двумерным ЯМР-экспериментам.
Чтобы не показалось, что двумерная спектроскопия несет с собой только одни бесконечные технические проблемы, мы сейчас перейдем к рассмотрению таких ситуаций, когда эти эксперименты оказываются в высшей степени информативными. Действительно, определенные трудности возникают при обработке двумерных массивов данных. Накопив определенный запас энергии и энтузиазма, мы вернемся к рассмотрению этих проблем.
Эксперимент Джинера
Введение
Та последовательность, которую мы сейчас изучали, фактически являющаяся первым двумерным ЯМР-экспериментом, предложена Джи- нером в 1971 г. Ее полезность станет очевидной, когда мы рассмотрим, что произойдет при действии второго импульса на систему, которая имеет гомоядерную спин-спиновую связь. Однако перед тем, как перейти к этому вопросу, я хочу обратиться к эксперименту, который, хотя и является в высшей степени непрактичным, очевидно, мог бы оказаться полезным, если бы его можно было бы реализовать. В дальнейшем станет ясно, что основные недостатки этого вымышленного эксперимента не характерны для эксперимента Джинера, в то время как информационная емкость каждого из них сравнима.
Двумерный эксперимент.
Непрерывная развертка-преобразование Фурье
Гомоядерная развязка является старым и очень информативным экспериментом. Как известно, она позволяет определить, какие группы ядер в молекуле связаны спин-спиновым взаимодействием, что в свою
очередь часто подтверждает или опровергает гипотезы о ее строении. Подтверждение спин-спинового взаимодействия с помощью этого эксперимента принято считать более «солидным» доказательством типа структуры, чем простое рассмотрение данных по химическим сдвигам и константам спин-спинового взаимодействия, причем мнение это достаточно распространено. Оно основано на нашей уверенности в том, что, например, в протонных спектрах большие константы будут редко наблюдаться между ядрами, разделенными более чем тремя связями. В сравнении с этим информация, полученная из величин химических сдвигов, может оказаться в существенной степени неоднозначной, поскольку сдвиги подвержены влиянию большого числа факторов, и мы не знаем точно их действие. Поэтому опасно опираться только на данные по химическим сдвигам при определении структуры. Назначение этой книги состоит в том, чтобы в ряде случаев нам избавиться от необходимости так поступать.
При определении характера спин-спиновой связи с помощью гомо- ядерной развязки возникают некоторые проблемы. Если мы имеем дело со сложным спектром, то может оказаться неочевидным, облучение каких сигналов будет наиболее информативным. При этом мы можем потратить массу времени на проведение тех экспериментов, которые окажутся совершенно неинформативными. Даже если мы знаем, какие сигналы следует облучить, не всегда в спектре, имеющем сильное перекрывание сигналов, можно провести облучение с необходимой селективностью. Из-за сложного характера мультиплетности результат развязки может быть замаскированным и не замеченным. Для решения последней проблемы предложен метод разностной развязки, но сам этот метод имеет ряд недостатков, в особенности из-за эффектов, возникающих при сдвигах Блоха-Зигерта.
Тот эксперимент со спиновой развязкой, который мы хотели бы провести, выглядит следующим образом. Пусть спектрометр в автоматическом режиме делает дискретную развертку частоты развязки при прохождении через интересующую нас область частот. Пусть для каждого значения частоты развязка осуществляется абсолютно селективно, а результат ее однозначно проявляется в какой-то области спектра, ^се эти эксперименты соберем в одном месте, для того чтобы могла быть непосредственно отображена полная структура спиновой связи. Пусть эксперимент проходит быстро и с высокой чувствительностью.
На практике к этому эксперименту наиболее близко можно было бы подойти, по-видимому, реализовав серию экспериментов с разностной развязкой (это был бы эксперимент INDOR с фурье-преобразованием) при очень низком уровне мощности декаплера, что и обеспечит высокую селективность. Не вдаваясь в детали, положим, что отклики проявляются для связанных спин-спиновым взаимодействием протонов, причем в тех случаях, когда облучению подвергаются их партнеры по спиновой связи. Было бы непросто изобразить такую серию спектров достаточно информативным путем, но, не заостряя на этом внимания, перейдем
к более фундаментальной проблеме. Этот эксперимент привел бы к двумерному спектру, но реально он является спектром непрерывной развертки по одной координате. Частота развязки варьируется в спектре тем же самым способом, что и частота передатчика в спектрометрах старого типа. Ценой этого будет низкая скорость сбора информации. Время, которое потребуется для перевода частоты развязки из одного края спектра в другой, будет зависеть от того, насколько грубо или тонко нам нужно делать приращения к частоте, другими словами, от разрешения по этой координате. Это аналогично требованию малой скорости прохождения для получения высокого разрешения на спектрометре с непрерывной разверткой. Даже без учета других его практических недостатков это был бы по сути малоэффективный эксперимент, поскольку измерения проводятся в частотной области. Вот если бы использовать преимущества метода фурье-преобразования по второй координате!
. 8.3.3. Перенос намагниченности
Несомненно, вы не удивитесь, когда узнаете, что последовательность Джинера обладает именно этими преимуществами перед вымышленным двумерным спектром, полученным с помощью сочетания непрерывной развертки и преобразования Фурье. Причина этого заключается в том, что в системе, содержащей связанные спин-спиновым взаимодействием ядра, второй импульс такого эксперимента приводит к перераспределению намагниченности, причем намагниченность, соответствующая какому-то одному переходу в течение времени ц, перераспределяется между всеми другими, с которыми этот переход связан. Как сказано во введении, я хотел бы обсудить механизм этого явления позднее, и надеюсь, что вы пока примете на веру то, что это действительно так. В гл. 6 мы уже рассматривали эксперименты по переносу намагниченности (SPI, DEPT, INEPT), которые, однако, значительно проще для понимания, потому что эти системы являются гетероядерными (что позволяет независимо рассматривать действие импульсов на ядра разного типа), а также из-за того, что мы выбрали специальное расположение компонент мультиплета, для которых осуществляется перенос намагниченности. В общем виде гомоядерный эксперимент, к рассмотрению которого мы сейчас приступаем, несколько труднее визуализировать. Тем не менее нам необходимо выяснить, что стоит за словами «всеми другими, с которыми этот переход связан». Итак, я напомню вам диаграмму энергетических уровней системы АХ, к которой мы уже не раз обращались в других главах (рис. 8.6).
Эта система описывает четыре перехода, и соответственно в спектре ЯМР проявляются четыре линии. Каждый из переходов, например Ап соответствует определенной линии в спектре, например линии на частоте vA + (1/2) JAX, что следует из основных свойств систем первого порядка. Если второй импульс в эксперименте Джинера соответствует к/2, то та
Рис. 8.6. Энергетические уровни для системы АХ.
часть намагниченности, которая соответствует переходу А,, преобразуется в намагниченность всех других переходов, т. е. А2, X, и Х2. Некоторая доля намагниченности сохранится также и за переходом А,. Таким же образом перераспределятся компоненты для всех других переходов. Это означает, что линия, регистрируемая в течение времени z2, может содержать компоненты своей амплитудной модуляции с частотами, соответствующими положению всех остальных линий по координате Z,. Это приведет к появлению кросс-пиков с этими линиями в двумерном спектре. Не очень просто понять, как все одновременно смешивается со всем, однако легко себе представить получающийся спектр (рис. 8.7).
—I1111г6,86,76,66,56,46,3
М.д.
Рис. 8.7. Эксперимент Джинера, проведенный на системе АХ (Р-хлоракриловая , кислота).
Сигналы, находящиеся на диагонали спектра, соответствуют тем компонентам намагниченности, которые имеют ту же частоту как в течение tL, так и в течение 12. Это та часть намагниченности, которая совсем не перенесена действием второго импульса. Итак, глядя на сигналы, находящиеся на диагонали, мы обнаружим, что это нормальный спектр системы. В нашем случае-только два дублета. Вне диагонали мы видим сигналы кросс-пиков между всеми линиями, которые могут принадлежать как одному и тому же мультиплету (сигналы, расположенные по квадрату около диагонали), так и разным мультиплетам, связанным спин-спиновым взаимодействием (группы из четырех линий вдали от диагонали). Следует отметить, что, поскольку намагниченность переносится между переходами в обоих направлениях, кросс-пик при (v15 v2) имеет симметрично расположенного партнера при (v2, vj. Корреляции между переходами, принадлежащими одному мультиплету, могут вызвать определенные неудобства, и ниже мы увидим, что их можно устранить. Важными корреляциями являются те, которые принадлежат переходам из разных мультиплетов. Они необходимы для выявления характера спин-спиновых связей. В нашем простом примере имеется только одна спиновая система, поэтому «все коррелирует со всем». В более сложных системах мы можем непосредственно проследить путь передачи спин-спинового взаимодействия через недиагональные пики. Это происходит благодаря тому, что спин-спиновое взаимодействие между протонами открывает тот путь, по которому может переноситься намагниченность при действии второго импульса.
Два реальных примера
Сейчас мы приступим к рассмотрению содержащего массу интересных деталей вопроса о том, как мы проводим этот эксперимент и в чем собственно состоят его достоинства и недостатки. Однако, для того чтобы возбудить ваш аппетит, перед тем, как, перейти к разделам, содержащим больше технических вопросов (они будут следовать ниже), мне представляется целесообразным обратиться к двум реальным задачам для того, чтобы вы могли убедиться, насколько легко можно сделать спектральное отнесение на основе эксперимента Джинера. Первая из них относительно проста и могла бы быть решена более традиционными средствами, в то время как вторая лет десять назад представляла бы серьезную проблему. Сейчас она может быть решена за вечер. Перед тем как обращаться к спектрам, следует прояснить еще два вопроса. Первый касается названия метода, который я до сих пор называл экспериментом Джинера. В литературе иногда используют это обозначение, но значительно чаще встречается термин COSY (от англ. Correlation Spectroscop Y-корреляционная спектроскопия). Практически все методы используют какого-либо типа корреляцию, поэтому термин COSY (часто в сочетании с модифицирующими дополнительными терминами), к сожалению, используют также и для обозначения разно-
образных родственных методов, что может приводить к недоразумениям. Итак, термином COSY я буду пользоваться для обозначения гомоядерной корреляции через спин-спиновое взаимодействие, осуществляемой с помощью эксперимента Джинера.
Второй важный вопрос заключается в том, как правильно представлять результаты эксперимента COSY. Двумерный спектр можно представить как совокупность одномерных спектров (строк), смещенных относительно друг друга. Такое представление используется до сих пор для того, чтобы подчеркнуть природу данных. Но по мере того как растет сложность спектра, оно оказывается излишне громоздким, и интерпретация спектра может приводить к недоразумениям. Значительно более ясное представление о соотношении между диагональными и недиагональными сигналами мы получим, если будем использовать контурную форму записи, точно таким же образом, как изображается на картах форма горного массива. В качестве иллюстрации на рис. 8.8 показаны в форме контурного представления те же самые данные, что и на рис. 8.7. Достаточно реальное представление о спектре можно получить, прописав только один нижний контур (что, кстати, и быстрее), а не несколько уровней, как изображено на рисунке. При этом представление об относительной высоте пика в той или иной степени можно составить по его величине (площади контура). Для работы со спектром COSY полезно иметь под рукой график обычного спектра, что позволит легче идентифицировать сигналы на диагонали. Для того
-6,3-6,4У6,6-67-6»м.8-6,3-6,4У6,6-67-6»м.86,86,76,66,56,4^3..к8.6,86,76,66,56,4^3..к8.Рис. 8.8. Это альтернативное контурное представление двумерного спектра, в общем, более удобно.Рис. 8.8. Это альтернативное контурное представление двумерного спектра, в общем, более удобно.
-6,3
-6,4
У
6,6
-67
-6»
м.8
-6,3
-6,4
У
6,6
-67
-6»
м.8
6,86,76,66,56,4^3..
к8.
6,86,76,66,56,4^3..
к8.
Рис. 8.8. Это альтернативное контурное представление двумерного спектра, в общем, более удобно.
Рис. 8.8. Это альтернативное контурное представление двумерного спектра, в общем, более удобно.
чтобы связать контуры диагональной части двумерного спектра с сигналами в обычном спектре, требуется некий навык, который, однако, легко приобретается в практической работе.
Теперь о примерах. В обоих случаях у нас были предварительные соображения о структуре соединений, и цель детального отнесения сигналов в спектре состояла в проверке того, насколько спектр согласуется с этой структурой. Это, действительно, достаточно распространенный случай, потому что, даже если проводить полный структурный анализ «с нуля», т. е. не располагая предварительной информацией, многие заключения о структуре фрагментов молекулы могут быть получены на основании простых спектров ЯМР (или, конечно, с помощью других спектральных методов). Гипотезы о взаимном расположении фрагментов молекулы могут быть затем проверены с помощью более детальной интерпретации спектров. Возможности отнесения с помощью двумерных ЯМР-экспериментов делают стадию такой проверки значительно более строгой.
Первое вещество (1) является природным соединением. Оно выделено из бобов [1] и представляет интерес, поскольку его структура
он он
' 1
похожа на структуру других соединений-ингибиторов гликозидазы. Обычный протонный спектр приведен на рис. 8.9, а контурное представление спектра COSY-на рис. 8.10. Сначала следует уделить некоторое
Рис. 8.9. Протонный спектр соединения 1 (500 МГц, D2O).
1—1—I—1—I—'—I—1—I—1—I—' 1 Т"’—I 1 I 1—I—1—I—'—Г”’—I—'—I—1—(—'—I—1—г 4,24,05,65,65,45,25,02,82,82,42,22,01,81,61,41,2
М. 0.
Рис. 8.10. Полный спектр COSY соединения 1.
время сопоставлению групп сигналов в одномерном спектре с диагональной частью спектра COSY для того, чтобы сориентироваться в последнем. Отметим, что двумерные эксперименты обычно проводятся со значительно худшим, чем в одномерных спектрах, цифровым разрешением, и поэтому не все элементы тонкой структуры, проявляющейся в обычных спектрах, могут быть идентифицированы в контурном представлении COSY. Однако, изучив вопрос более детально, мы увидим, что лишь в редких случаях это может вызвать неудобства.
При интерпретации спектров наиболее важный вопрос состоит в том, чтобы идентифицировать сигналы, отнесение которых однозначно. Примером этого может быть аномерный протон Н, в кольце глюкозы, 18-75
Рис. 8.11. Слабопольная часть спектра, приведенного на рис. 8.10. Показана схема отнесения взаимодействующих протонов в кольце глюкозы.
v2
которому, несомненно, принадлежит дублет в слабом поле. Таким образом, мы имеем опорную точку для определения партнеров по спин-спиновому взаимодействию, что в данном примере позволит нам полностью отнести сигналы этого кольца. Рис. 8.11 иллюстрирует схему отслеживания спин-спиновых взаимодействий, стартующую от аномерного протона к его единственному кросс-пику, а затем снова на диагональ для определения сигнала, соответствующего протону Н'2, после чего к другому кросс-пику и т. д. Необходимо отметить, что кросс-пики хорошо разрешены, несмотря на то что в обычном спектре даже на частоте 500 МГц наблюдается сильное перекрывание сигналов в области
м.а.
Рис. 8.12. Сильнопольная часть спектра, приведенного на рис. 8.10. Попытайтесь сделать отнесение сигналов другого кольца, не обращаясь к рис. 8.9-8.11. Стартовой точкой может быть любой из помеченных на рисунке протонов Н2.
резонанса протонов глюкозного кольца. Это происходит из-за того, что положение кросс-пика определяется двумя химическими сдвигами, и вероятность их полного совпадения соответственно падает. Случайно оказалось так, что в данном спектре мы можем идентифицировать мультиплеты, соответствующие каждому протону, путем тщательного изучения растяжек одномерного спектра. Если бы спектр был настолько сложен, что этого уже нельзя было сделать, то вместо идентификации сигналов по одномерному спектру нам часто приходилось бы ставить перед собой лишь задачу идентификации кросс-пиков. Для этого потребуется совершенно новый взгляд на расшифровку спектра, но этот
подход к установлению структуры является абсолютно правильным.
Хорошей стартовой точкой для отнесения сигналов другого кольца может служить любой из двух сильнопольных мультиплетов, которые должны принадлежать протонам Н2а или Н2е (а-аксиальный, е-экваториальный). Только эти два протона не находятся по соседству с гетероатомами. Отметим, что, хотя мы по-прежнему используем химические сдвиги для облегчения отнесения, реально мы пользуемся только большими эффектами, как в данном случае, а не какими-то малозначащими несущественными деталями. Например, нам не потребуется использовать предположение о том, находится ли слабопольный протон вблизи азота или кислорода. Отнесение сигналов этого кольца я оставляю
м.а.
V2
Рис. 8.13. Спектр COSY соединения 1, оптимизированный для регистрации дальних констант.
в качестве упражнения; растяжка соответствующей части спектра приведена на рис. 8.12.
Убедившись в том, что оба кольца предполагаемой структуры согласуются со спектром, нам остается определить лишь место сочленения колец. Одномерный спектр не содержит каких-либо конкретных указаний на это, но замечательное свойство эксперимента COSY состоит в том, что он позволяет нам непосредственно определить место сочленения. Это связано с возможностью регистрировать кросс-пики, вызываемые малыми константами, которые меньше наблюдаемой ширины линии и вследствие этого не проявляются в одномерном спектре. В протонном спектре константы через четыре и пять связей часто попадают в диапазон от 0,1 до 0,5 Гц. Хорошо известно, что геометрические факторы могут сделать эти константы значительно большими по величине, как, например, при расположении протонов по правилу W. Для того чтобы зарегистрировать кросс-пики, сопряженные с малыми константами, необходимо выполнить некоторые условия. Это будет обсуждаться ниже в разд. 8.4.2, однако существенным является то, что времена регистрации данных в обоих измерениях должны быть достаточно большими (обычный фактор контроля разрешения). На рис. 8.13 для того же диапазона, что и на рис. 8.11, приведен спектр COSY, оптимизированный для регистрации дальних констант. Теперь аномерный протон Н) имеет большое число кросс-пиков с другими протонами глюкозного кольца. Но весьма важно то, что он также имеет кросс-пик с протоном Н4 другого кольца (отмечен стрелкой на рис. 8.13). Он появляется благодаря существованию неразрешенной в спектре константы через четыре связи между этими протонами и однозначно указывает на место сочленения колец.
Во втором примере уровень сложности на порядок выше. Соединение 2 имеет молекулярную массу около 1000. Но для современных возможностей двумерной спектроскопии даже такая задача остается доста-
. 2
точно простой. Использование спектра COSY (рис. 8.14а и 8.146) в деталях подобно тому, как это делалось в предыдущем примере, и я предоставляю читателю возможность убедиться самому в сог-
5,55,04,55,55,04,53,о2,52,01,53,о2,52,01,5Рис. 8.14а. Полный спектр COSY соединения 2.Рис. 8.14а. Полный спектр COSY соединения 2.
5,55,04,5
5,55,04,5
3,о2,52,01,5
3,о2,52,01,5
Рис. 8.14а. Полный спектр COSY соединения 2.
Рис. 8.14а. Полный спектр COSY соединения 2.
ласованности отнесения, приведенного в подписи к рисунку (рис. 8.15). В связи с этим примером я хотел бы обратить внимание на то, что важно не забывать традиционные методы, которые по-прежнему могут оказаться весьма эффективными. Настолько легко поддаться очарованию открывающимися возможностями двумерной спектроскопии ЯМР, что о простых путях решения проблемы можно забыть.
Изучение всего протонного спектра соединения 2 (рис. 8.15) хорошо иллюстрирует это положение. В этом примере сигналы занимают более обширную область, чем в предыдущем случае, и некоторые из стоящих в стороне сигналов выглядят весьма привлекательно в качестве возможной опорной точки для отнесения. Например, таковы дублеты А,
—।—■—।—'—।—■—।—•—i—1—।—-—।—■—।—-—।—■—।—■—।—1—।—■—1—1—Г" 6,05,85,65,45,25,04,84,64,44,24,03,83,63,4
м.8.
Рис. 8.146. Слабопольная часть спектра, приведенного на рис. 8.14а.
В и С в слабом поле, которые могут быть отнесены к амидным NH-протонам. В принципе, можно было бы провести эксперимент COSY так, чтобы включить все сигналы спектра, но при этом возникнут определенные проблемы. При этом либо придется выполнять эксперимент с очень низким цифровым разрешением, что в этом случае никак нельзя считать приемлемым, либо он займет много времени и в ходе него возникнет громоздкий массив данных. От мощности имеющегося в распоряжении компьютера зависит, составит или не составит проблему размер массива данных; однако большое время регистрации спектра-это фундаментальное препятствие. Эксперимент COSY может быть быстрее и проще проведен, если предварительно выполнить несколько
простых экспериментов двойного резонанса для того, чтобы идентифицировать ближайшее окружение слабопольных протонов (рис. 8.16). Имея в виду эту возможность, я мог бы проделать то же самое с двумя дублетами метильных групп в сильном поле, сделав диапазон частот для двумерного эксперимента еще уже. Однако в определенный момент у меня были некоторые соображения для того, чтобы оставить эти сигналы в двумерном спектре, а исключение области NH-протонов уже уменьшило размер эксперимента до такого уровня, который, по моему
Рис. 8.15. Протонный спектр соединения 2 (500 МГц, пиридин-(/5). Отнесение сигналов (обозначения атомов и групп см. на схеме соединения 2): А, кольцо A NH; В, кольцо В NH; С, Ala (фрагмент D) NH; F, А3; G, А4; Н, В3; /, В4; J, Glu (фрагмент Е) а-протон; К, А,; L, Ala (фрагмент D) а-протон; М, В2; N, А2; О, А6; Р, Ala (фрагмент С) а-протон; Q, А6; R, В5; S, В6; Т, В3; U, А5; И, В6; W и X Glu (фрагмент Е) СН2; СН3, Ala (фрагмент С) Me; СН3, Ala (фрагмент D) Me.
.облучение С
.облучение В
облучение А
мольный
J.K
PhCH2
Н
5, 00
Рис. 8.16. Спектры двойного резонанса соединения 2.
5,305,20
опыту, мог бы быть проведен достаточно легко. Поэтому я не провел этих развязок.
Детали эксперимента COSY
Введение. Сейчас у нас есть некоторое представление о том, насколько полезным инструментом при отнесении сигналов может служить эксперимент COSY, и я намерен приступить к более углубленному изучению вопросов о том, как проводится эксперимент COSY, как возникают разнообразные артефакты и как они могут быть устранены, какие есть методы представления данных и как на практике подобрать подходящие экспериментальные параметры. Этот раздел посвящен в основном техническим вопросам и будет более интересен тем, кто самостоятельно выполняет на спектрометре эксперимент COSY или аналогичные эксперименты. Если у вас нет технических наклонностей или вас вовсе не интересуют вопросы о том, как работать на спектрометре, я рекомендую опустить большую часть этого раздела, за исключением параграфов «Фазовые соотношения в фазочувствительном COSY» и «Цифровое разрешение и времена выборки данных». Многие из обсуждаемых здесь вопросов полностью или частично касаются не только COSY, но и всех двумерных экспериментов, и в оставшихся
которой вы можете, по-видимому, столкнуться при использовании этой техники для произвольных ядер со спином 1/2, представляют широкие спектральные диапазоны, которые могут потребоваться. Как следствие этого, в некоторых случаях возникают большие массивы данных. Для квадрупольных ядер времена релаксации не должны быть настолько короткими, чтобы совсем исчезло спин-спиновое взаимодействие. Однако константы, хотя бы частично разрешенные в одномерном спектре, могут все-таки приводить к появлению кросс-пиков.
Этот эксперимент нашел свои наиболее интересные приложения при исследовании спектров ядер таких элементов, которые образуют многоядерные кластерные соединения. COSY зарекомендовал себя идеальным методом для установления сложных структур в этой области. Например, COSY использован в спектроскопии ИВ [26] и 183W [27]. Некоторые другие методы корреляционной спектроскопии (см. разд. 8.5) также использовались для 183W [28].
Эксперименты, родственные COSY
COSY-45
Варьирование длительности второго импульса эксперимента COSY, т. е. использование последовательности
л
к — а
21-
с переменной а, приводит к изменению относительных интенсивностей кросс-пиков и близких к диагонали пиков. В частности, можно показать с использованием подхода, основанного на каскадах импульсов, или с помощью формального квантовомеханического описания, что соотношение интенсивностей при переносе когерентности между прямо и косвенно связанными переходами определяется как ctg2(a/2). Прямо связанные переходы в системе АХ-это пара переходов, таких, как Aj и Х1; имеющих общий уровень энергии. Косвенно связанные переходы могут возникать в более сложных спиновых системах и являются непараллельными переходами, не имеющими общего энергетического
уровня. Задавая а равной л/4, мы получим соотношение порядка 6. Интенсивности пиков, соответствующих переносу между параллельными переходами, также понижаются на определенную величину.
Это и есть популярный эксперимент COSY-45, который имеет два преимущества перед основным COSY. Понижение интенсивности переноса между параллельными переходами упрощает вид спектра вблизи диагонали из-за уменьшения кросс-пиков внутри мультиплетов. В сложном спектре это может сделать возможной идентификацию корреляций, которые в противном случае были бы скрыты в нагромождении пиков вблизи диагонали. Благодаря тому, что межмультиплетный перенос ограничивается в основном непосредственно связанными переходами, возникает возможность определения относительных знаков констант спин-спинового взаимодействия в системах из трех и более спинов по некоторой аналогии с одномерным экспериментом спин-тиклинг. Этот последний тип информации используется при определении структуры лишь в особых случаях. По этой причине, а также учитывая то, что данный вопрос подробно обсуждается в книге [5] (разд. 2.3.4), я не буду в дальнейшем развивать эту тему.
На рис. 8.34 показаны спектры COSY и COSY-45 2,3-дибромпропионовой кислоты (оба в форме магнитуды). Видно, что в нижнем спектре исчезли некоторые компоненты кросс-пиков и корреляции внутри мультиплетов. Однако эта иллюстрация, по-видимому, несколько обманчива. Важно помнить, что эти корреляции не устраняются полностью, а лишь уменьшаются в некоторое число раз. В более сложных случаях может оказаться невозможным так определить нижний контурный уровень, чтобы исключить все ослабленные корреляции, поэтому не получается столь хорошее упрощение диагональной части спектра. Сопоставление рис. 8.35 (COSY-45) и рис. 8.10 (COSY-90 того же соединения) отчетливо указывает на то, что при этом следует ожидать. Для рутинных спектров COSY-45 запись с фильтром типа эха при магни- тудном представлении тем не менее в целом является предпочтительной. Однако при этом происходит некоторая потеря чувствительности по сравнению с COSY-90. Этот метод нельзя использовать в фазочувствительном варианте из-за того, что сигналы возникают не только за счет амплитудной модуляции. Из новых экспериментов, в которых могут быть получены фазочувствительные данные, стоит посмотреть Е. COSY [9].
Определение малых констант
Небольшие константы, значительно меньшие ширины линии, также дают кросс-пики в эксперименте COSY, хотя и с низкой интенсивностью. Для протонных спектров это означает, что часто возможно идентифицировать константы через 4 и 5 связей, лежащие обычно в диапазоне 0,1-0,5 Гц и, следовательно, неразрешимые в рядовых одномерных экспериментах. Спектроскописты считают эту возможность весьма при- 21*
1 I I111111г
4,54/1 4,3 4,2 4,14,0 3,93,8 373,6
м.Э.
4. Спектры COSY-90 и COSY-45 2,3-дибромпропионовой кислотние спектра COSY-45.
—f—.—।—।—।—.—।—.—।—.—।—।—।—।—।—।—।—।—।—I—।—।—।—,।।।—।—।—,—।—।—г
4,44,24,03,03,03,43,23,02,02,62,42,22,01,01,61,4
м.а.
Рис. 8.35. Спектр COSY-45 соединения 1.
влекательной, так как кажется, что это позволяет расширить границы измерения. Но как химики мы должны быть более осторожны в суждениях. Несомненно, бывают случаи, когда полезно определить очень небольшие константы, как, например, для соединения 1 из разд. 8.3.4. Тем не менее встречаются и такие ситуации, когда проявление в спектрах всех дальних корреляций становится очень нежелательным. В частности, в спектрах молекул с жестким или напряженным углеродным скелетом, а также в спектрах полиненасыщенных соединений иногда может показаться, что все коррелируют со всем, и информация о структуре из подобных спектров извлекается с трудом. В настоящее время един-
ственным способом ослабить возникающие за счет малых констант корреляции является работа с низким цифровым разрешением и короткими временами регистрации. Однако эти корреляции могут быть особо выделены в описанном ниже случае.
Мы уже обсуждали главные факторы, определяющие интенсивность кросс-пиков, обусловленных малыми константами. Кратко напомню, что эти факторы определяются как степень ослабления противофазных пиков, и соотношение между переносом когерентности и поперечной релаксацией представляется выражением (8.3). Это выражение действительно описывает спад огибающей ССИ для сигнала, соответствующего переносу когерентности по обеим координатам. Он достигает максимума для значения времени Zmax, определяемого соотношением
^тах = arctg (tcJT2) (8.4)
Для очень небольших значений J (JT2 « 1) оно хорошо аппроксимируется как zmax = Т2. Таким образом, чтобы предотвратить потерю сигнала, вызванного малыми константами, нам необходимо иметь времена выборки по каждой из координат, значительно превышающие Т2; это условие не выполняется для рутинных экспериментов COSY.
В экспериментах с фильтром типа эха при магнитудном представлении данных для получения формы линии, похожей на сигнал поглощения, нам требуется так подобрать функцию окна, чтобы она напоминала сигнал эха, т. е. была симметрична относительно центральной точки времени выборки. Для того чтобы максимум этой функции соответствовал максимуму сигнала переноса когерентности, нам потребуется время регистрации порядка 2Т2 по обеим координатам. Это временное ограничение неизбежно, однако можно избежать необходимости хранения и обработки очень больших массивов данных, которые могут при этом возникнуть. Это достигается введением двух дополнительных задержек фиксированной длины в интервалы tx и z2, в таком случае последовательность приобретает вид
тс
- — А — z, — а — А — z2 2
При этом смягчается требование к временам выборки до At t ~ ~ 2Т2 — 2А, т. е., если для регистрации данных потребуется одно и то же общее время, для оцифровки нужно будет меньше точек. Как и в COSY-45, при необходимости а может принимать значение, меньшее чем тс/2. Однако это может оказаться нецелесообразным, поскольку так или иначе могут возникать проблемы, связанные с чувствительностью. Мы уже видели пример спектра, полученного таким образом (рис. 8.13). В этом случае А было выбрано равным 0,25 с. Для типичного диапазона протонных Т2 от 0,2 до 0,6 с подходящие значения А лежат в интервале 0,05-0,45 с в предположении, что для времени регистрации использовано значение 0,3 с. В экспериментах этого типа может уменьшаться
интенсивность корреляций, обусловленных большими по величине константами, если выражение J (Т2 — А) принимает значение, близкое к целочисленному (т. е. J ~ 7 или 14 Гц для приведенных выше параметров); таким образом, для того чтобы избежать недоразумений, хорошо было бы иметь обычный спектр COSY.
Многоквантовая фильтрация
Если мы добавим дополнительный л/2-импульс непосредственно в конце последовательности COSY следующим образом:
у 9 / \ 9 / \ 9 / \2/<р \^/ф \2J х
то в таком случае многоквантовая когерентность, которая, как оказывается, возникает перед третьим импульсом, может быть опять переведена в наблюдаемую намагниченность (см. параграф «Еще раз о переносе намагниченности» в разд. 8.3.5). При этом в идеале третий импульс должен следовать сразу за вторым, однако на практике может быть использована задержка до нескольких микросекунд для фазового сдвига. Как обсуждалось выше, задание подходящего фазового цикла может затем разделить сигналы, возникающие от многоквантовой когерентности различных порядков. Так, например, двухквантовая когерентность в 2 раза более чувствительна к изменению фазы в возбуждающей ее последовательности, чем одноквантовая. Поэтому, если мы смещаем фазу ф первых двух импульсов (в общем случае всех импульсов до того момента, как возникла когерентность) на 90°, фаза того регистрируемого сигнала, который прошел через состояние двухквантовой когерентности, инвертируется. Тогда инвертирование фазы приемника (т. е. вычитание 90°-эксперимента из О°-эксперимента) выделяет компоненту, прошедшую через состояние двухквантовой когерентности.
Правило для выделения ^-квантовой когерентности заключается в том, чтобы шагами изменять фазу возбуждающих импульсов в следующей последовательности: 0, 180/р, 2 х 180/р...(2р — 1) х 180/р, альтернируя фазу приемника по мере движения [10]. Эта процедура также позволяет детектировать когерентности порядка p(2m + 1), m = 0, 1, 2 ... Однако в общем когерентности более высокого порядка возбуждаются с низкой интенсивностью. Многоквантовые когерентности модулируются как функция tY обычным образом, поэтому результирующий спектр оказывается похожим на нормальный COSY, но испытавшим воздействие многоквантовой фильтрации. Квадратурное детектирование по координате vt в этих экспериментах может осуществляться с помощью любого из обсуждавшихся выше методов, если вы не забыли, что для получения необходимого сдвига фазы на 90° в р-квантовой когерентности вам нужно сместить фазу возбуждающей последовательности на 90/р градусов. Отметим, что многоквантовая фильтрация может по-
требовать фазовых сдвигов, не кратных 90°; спектрометры, созданные примерно после 1983-1984 гг., как правило, обеспечивают это.
Существуют две совершенно ясные причины, побуждающие к проведению многоквантовой фильтрации: упрощение спектра й усовершенствование фазочувствительного эксперимента COSY. Упрощение спектра, возникающее за счет многоквантовой когерентности, может достигаться только в связанных многоспиновых системах; р-квантовая когерентность может возникать только между по крайней мере р-ядрами со спином 1/2. Следовательно, в двухквантовом эксперименте устраняются синглеты (например, сигналы растворителя), в то время как обычные корреляции сохраняются. Трехквантовый эксперимент устраняет дополнительно системы АХ и АВ и так далее для более высоких порядков (однако чувствительность быстро падает при переходе к более высоким порядкам). Устранение пиков осуществляется только за счет вычитания сигналов, поэтому на практике в лучшем случае, вероятно, можно ожидать ослабления их интенсивностей в несколько сот раз. При этом также не возникает облегчения по отношению к динамическому диапазону-АЦП по-прежнему должен быть в состоянии оцифровать весь диапазон амплитуд имеющихся сигналов. На рис. 8.36 сопоставлены спектры трипептида Gly-Tyr-Gly с двух- и трехквантовой фильтрацией. Трехквантовые эксперименты и эксперименты более высокого порядка, очевидно, не имеют столь общего характера, как основной COSY. Необходимо заранее знать типы имеющихся спиновых систем и в соответствии с этим выбирать тип эксперимента.
Второе важное свойство эксперимента с двухквантовой фильтрацией в его фазочувствительном варианте заключается в том, что в отличие от фазочувствительного COSY фаза как диагональных, так и кросс-пиков
Рис. 8.36. Спектры COSY с двух- и трехквантовой фильтрацией для трипептида Gly-Tyr-Gly.
1 111 1 1 1 1 1—I—I—I1 1—г 1 1 I 1 1 1 I 1 I 1 I 1 I ТГ
163,63,4 У 3,0м8 2,62,62,4 3,83,6443,23,02,62,62,4
Рис. 8.37. Сравнение нормального фазочувствительного COSY (слева, те же самые данные, что и на рис. 8.27) с DQF COSY (справа). Сильное упрощение вида диагональной части последнего с лихвой компенсирует потерю чувствительности в этом эксперименте (см. текст).
может быть настроена на чистое поглощение. Фактически для систем, содержащих более двух спинов, диагональные пики все же будут иметь вклад дисперсионной компоненты; тем не менее на практике улучшение весьма значительно. Это устраняет единственный недостаток фазочувствительного COSY. За это приходится расплачиваться двукратным понижением чувствительности, которая определяется как отношение сигнала к тепловому шуму. В разд. 8.3.5 мы уже видели, что, по крайней мере при наблюдении протонов, помехи при детектировании чаще определяются уровнем шума по tv а не теплового шума. Поскольку синглеты, вызывающие самый значительный шум по tv устраняются в эксперименте с двухквантовой фильтрацией, можно добиться эффективного улучшения по сравнению с таким же нефильтрованным спектром. В настоящее время фазочувствительный COSY с двухквантовым фильтром (DQF-COSY), по-видимому, является лучшим методом для отнесения констант. Сравните два спектра на рис. 8.37 и вы увидите, насколько понятнее становится диагональная часть в спектре DQF-COSY.
Эстафетный перенос когерентности
Достаточно общая проблема при отнесении протонных спектров состоит в идентификации линейных цепей спинов, т. е. таких последовательностей СН—СН—СН—СН ..., которые могут возникать в поли- замещенных соединениях или олефинах. Отнесение с использованием COSY должно быть простым, однако иногда может возникнуть неопре-
деленность. Рассмотрим, например, только три спина, расположенные в ряд. Они образовали бы систему АМХ, в которой JAM и JMX были бы вицинальными константами, a JAX-нулевой (для насыщенных соединений). Соответствующий спектр COSY имел бы кросс-пики между А и М и между М и X, но не между А и X. Такая картина не содержит прямых указаний на то, что А и X являются составными частями одной и той же спиновой системы, поскольку тот же результат был бы получен для двух двухспиновых систем АМ и М'А, если бы М и М' имели одинаковый сдвиг. В сложном случае (особенно в спектрах белков, где эта проблема возникает часто) из исследования одномерного спектра иногда нельзя определить, имеется ли перекрывание сигналов в некоторой заданной области спектра.
В эксперименте по эстафетному переносу когерентности (RCT, от англ. Relayed Coherence Transfer) эта проблема решается путем передачи намагниченности, перенесенной от А к М в нормальном эксперименте COSY, к следующим ядрам, связанным с М. Это достигается простым добавлением третьего л/2-импульса для того, чтобы вызвать другое распределение когерентности, поэтому основная последовательность будет иметь вид
л л л
2 “ ~ 2 ” h “ 2 ~ ?2'
При этом возникает проблема, что делать с интервалом ь. В идеале можно было бы представить проведение трехмерного эксперимента, в котором этот интервал изменялся бы с определенным шагом независимо от tv После трехмерного преобразования мы получили бы массив данных, в котором амплитуда представляется как функция трех частот. Эта идея не имеет практической ценности, потому что выполнение такого эксперимента потребовало бы много времени. Кроме того, трудно найти достаточно информативный способ представления данных такого типа. Обычно применяется другой способ. Значение Ь принимается равным такому вычисленному значению, которое обеспечивает максимальный перенос когерентности от А к X через М. Существует и третий метод, получивший название «аккордеон-спектроскопия», в котором, по существу, трехмерный эксперимент сводится к двум измерениям за счет того, что h представляется как функция (см. работу [11]), но мы не будем его здесь рассматривать. Для того чтобы сделать результат эстафетного переноса не зависящим от разностей химических сдвигов, необходимо поместить л-импульс в середине интервала Г?. Тогда последовательность будет выглядеть следующим образом:
ллл
--Г ---Т-Л-Т---Г2 222
Для системы АМХ, в которой JAX = 0, количество намагниченности,
перенесенное от А к X при использовании этой последовательности, пропорционально
sin (2тг Jamt) sin (2я7мхт) (8.5)
поэтому оптимальное значение т можно выбрать, если удается оценить величину константы спин-спинового взаимодействия. В системах со свободным вращением вицинальные константы обычно близки к 7 Гц. Тогда оптимальное значение г составляет примерно 35 мс. Для других систем г сложным образом зависит от типа констант и их значений; обширные таблицы оптимальных значений т для разнообразных фрагментов приводятся в работе [29].
Очевидно, ,что этот эксперимент не имеет общего характера, поскольку требует некоторых предварительных знаний о спиновой системе и возможных значениях констант спин-спинового взаимодействия. Однако в сочетании с COSY он может часто использоваться для устранения неоднозначностей. На рис. 8.38а и 8.386 сравниваются спектры COSY и RCT для соединения 6. Одномерный протонный спектр и спектр COSY
<2
Рис. 8.38а. Протонный и COSY-спектры соединения 6.
' । ■1 ' • I ■ ■ 1 1 । 15,55,0«,5' । ■1 ' • I ■ ■ 1 1 । 15,55,0«,5' 1 1 1 ■ T-1 '■■!■'■ r T~i «,0 „3,53,02,5M.O.' 1 1 1 ■ T-1 '■■!■'■ r T~i «,0 „3,53,02,5M.O.Рис. 8.386. Спектр RCT соединения 6. В некоторых случаях помечены дополнительные эстафетные пики.Рис. 8.386. Спектр RCT соединения 6. В некоторых случаях помечены дополнительные эстафетные пики.
' । ■1 ' • I ■ ■ 1 1 । 1
5,55,0«,5
' । ■1 ' • I ■ ■ 1 1 । 1
5,55,0«,5
' 1 1 1 ■ T-1 '■■!■'■ r T~i «,0 „3,53,02,5
M.O.
' 1 1 1 ■ T-1 '■■!■'■ r T~i «,0 „3,53,02,5
M.O.
Рис. 8.386. Спектр RCT соединения 6. В некоторых случаях помечены дополнительные эстафетные пики.
Рис. 8.386. Спектр RCT соединения 6. В некоторых случаях помечены дополнительные эстафетные пики.
представлены на рис. 8.38а, а спектр RCT, на котором помечены дополнительные корреляции,-на рис. 8.386. Хотя т подобрано для регистрации небольших констант углеводного цикла, эстафетный перенос когерентности можно все-таки видеть и для других резонансных сигналов. Этот подход широко используется в спектроскопии ЯМР белков. Составляющие их спектры спиновые системы аминокислотных остатков известны, но часто сложность спектра такова, что даже кросс-пики могут недостаточно разрешаться. Использование эксперимента RCT позволяет определить связи между сигналами Р-протонов аминокислотных остатков и соответствующих протонов NH-групп даже тогда, когда не разрешаются сигналы а-протонов [12]. При работе с малыми молекулами более полезным, по-видимому, является гетеро- ядерный вариант эксперимента RCT (см. гл. 9).
Другие эксперименты по гомоядерной корреляции
INADEQUATE
Введение. Это, пожалуй, одна из наиболее ужасных аббревиатур (от англ. Incredible Natural Abundance DoublE QUAntum Transfer Experiment-эксперимент с невероятным двухквантовым переносом намагниченности на природном содержании) в этой книге. Один из видов этого эксперимента до сих пор служит наиболее совершенным средством для установления строения скелета органических молекул. К сожалению, он также одновременно является и одним из наименее чувствительных из имеющихся экспериментов. По этой причине мы рассмотрим его лишь очень кратко. Исторически данный метод возник из идеи, связанной с измерением углерод-углеродных констант спин-спинового/взаимодей- ствия на природном содержании, однако сформировавшие его концепции имеют значительно более общий смысл. Я намерен подойти к эксперименту INADEQUATE с другой стороны, на базе того, что мы уже знаем о COSY, а затем вернуться к первоначальному эксперименту. При этом станет ясно, что мы уже изучили его принципы.
Самое большее, для чего мы до сих пор использовали двухквантовую когерентность, которая может быть получена в конце основной последовательности COSY,-так это преобразование ее опять в одноквантовую когерентность. Это приводит к эксперименту DQF - COSY, в котором единственная роль, отводимая двухквантовой когерентности, состоит в том, чтобы отличать ядра, не имеющие констант, от тех, которые их имеют. Все интересное, что происходит в DQF-COSY в период эволюции tv совершается с одноквантовой намагниченностью; следовательно, в этом смысле можно лишь подразумевать, что это двухквантовый эксперимент. Используя ту же последовательность импульсов, мы могли бы провести реальный двухквантовый эксперимент, фиксируя интервалы между первыми двумя импульсами и помещая интервал Ц между двумя следующими импульсами таким образом:
С использованием подходящего фазового цикла, выделяющего сигналы, которые возникли благодаря двухквантовой когерентности, мы получим, что именно частоты двухквантовых переходов будут совершать эволюцию в течение периода tv Для оптимального эксперимента нам нужно выбрать такое значение т, чтобы создать максимальную двухквантовую когерентность. Мы также поместим л-импульс в центре интервала 2т для того, чтобы возбуждение не зависело от химических сдвигов:
ккк
2222
Это основная двумерная последовательность INADEQUATE. Как и в случае COSY, я сначала собираюсь обсудить получаемые при этом результаты и лишь затем сравнительно кратко обратиться к техническим деталям проведения эксперимента.
Двумерные спектры INADEQUATE. Частоты двухквантовых переходов, совершающие эволюцию в течение периода tt этого эксперимента, являются просто суммой химических сдвигов (относительно частоты передатчика) для тех пар ядер, которые участвуют в формировании двухквантовой когерентности. Пики в двумерном спектре, соответствующие двум ядрам со сдвигами vA и vB, имеют координаты ((vA + vB), X), где X-частота одноквантовой когерентности, в которую переводится намагниченность действием последнего импульса. Как мы вскоре увиДйм, для сильных ядер, например 1Н, это может приводить к некоторому усложнению; данный эксперимент изобретен и продемонстрирован для ядер 13С [3]. Преимущество рассеянных ядер, таких, как углерод, состоит в том, что в конечном спектре заметную интенсивность имеют только сигналы от двухспиновых систем АВ или АХ. Они возникают благодаря тому, что 0,01% молекул вещества содержит два атома 13С. Значительно более интенсивные сигналы от одиночных атомов 13С устраняются за счет двухквантовой фильтрации, а сигналы от молекул с тремя атомами 13С (трехспиновые системы) имеют пренебрежимо малую интенсивность. Можно так подобрать значение т,
V1V1Рис. 8.39. Схематический двумерный спектр INADEQUATE для последовательности систем АХ. Те части спектра, которые расположены снаружи от заштрихованных линий, не могут содержать сигналов.
V1
V1
что будут наблюдаться только сигналы от атомов, связанных большими по величине прямыми константами. Таким образом, для каждой частоты по vx, по которой наблюдается сигнал, можно выделить прямую, параллельную v2, на которой будут находиться компоненты систем АВ или АХ для пары связанных атомов 13С, т. е. в двумерном спектре возникнут дублеты при ((vA + vB), vA) и ((vA + vB), vB). Центр между каждой парой сигналов попадает в точку ((vA + vB), (vA + vB)/2), поэтому эти точки лежат на линии, имеющей коэффициент наклона, равный 2 (рис. 8.39). Этот факт можно использовать для того, чтобы отличить истинные сигналы от артефактов.
Поясним это на примере соединения 7 (рис. 8.40). Поскольку каждый
—юо—юо--80--80--60--60--40--20--40--20- 0- 0п11Г—I1111]1111111Г—■11111I I11Г1501401301201101000080706050403020м. 0.п11Г—I1111]1111111Г—■11111I I11Г1501401301201101000080706050403020м. 0.Рис. 8.40. Двумерный спектр INADEQUATE 13С лимонена (7). Время регистрации по tx составляло 30 мс (256 инкрементов при спектральной полосе 9 кГц; 128 прохождений на инкремент). Остаточные одноквантовые сигналы видны на линии v, = 0. Поскольку т было подобрано для средней по величине константы С—С между алифатическими углеродами, два корреляционных пика за счет взаимодействия через двойную связь имели низкую интенсивность и не проявились на графике.'Рис. 8.40. Двумерный спектр INADEQUATE 13С лимонена (7). Время регистрации по tx составляло 30 мс (256 инкрементов при спектральной полосе 9 кГц; 128 прохождений на инкремент). Остаточные одноквантовые сигналы видны на линии v, = 0. Поскольку т было подобрано для средней по величине константы С—С между алифатическими углеродами, два корреляционных пика за счет взаимодействия через двойную связь имели низкую интенсивность и не проявились на графике.'-20 м.6.-20 м.6.
—юо
—юо
--80
--80
--60
--60
--40
--20
--40
--20
- 0
- 0
п11Г—I1111]1111111Г—■11111I I11Г
1501401301201101000080706050403020
м. 0.
п11Г—I1111]1111111Г—■11111I I11Г
1501401301201101000080706050403020
м. 0.
Рис. 8.40. Двумерный спектр INADEQUATE 13С лимонена (7). Время регистрации по tx составляло 30 мс (256 инкрементов при спектральной полосе 9 кГц; 128 прохождений на инкремент). Остаточные одноквантовые сигналы видны на линии v, = 0. Поскольку т было подобрано для средней по величине константы С—С между алифатическими углеродами, два корреляционных пика за счет взаимодействия через двойную связь имели низкую интенсивность и не проявились на графике.'
Рис. 8.40. Двумерный спектр INADEQUATE 13С лимонена (7). Время регистрации по tx составляло 30 мс (256 инкрементов при спектральной полосе 9 кГц; 128 прохождений на инкремент). Остаточные одноквантовые сигналы видны на линии v, = 0. Поскольку т было подобрано для средней по величине константы С—С между алифатическими углеродами, два корреляционных пика за счет взаимодействия через двойную связь имели низкую интенсивность и не проявились на графике.'
-20 м.6.
-20 м.6.
неконцевой атом углерода связан с двумя или более партнерами, в принципе может быть восстановлен весь скелет молекулы (если только нет разрывов в углеродной цепи, как во фрагментах С—X—С). Начиная, как обычно, с наиболее легко относимого сигнала, мы проходим по линии, соответствующей его химическому сдвигу на оси v2 и параллельной v1; до тех пор, пока не обнаружим сигнал. Двигаясь далее параллельно v2, мы определим одного из его партнеров по спин-спиновому взаимодействию. Стартуя опять с этого сигнала и повторяя то же самое, мы, очевидно, определим очередного партнера по спин-спиновому взаимодействию. Этот метод открывает феноменальные возможности, но одновременно имеет исключительно низкую чувствительность. Его недостаток состоит в том, что мы пытаемся наблюдать сигналы, интенсивность которых равна интенсивности 13С-сателлитов от сигналов 13С, т. е. возникающих лишь от одной из 10000 молекул. Это исключает возможность использования эксперимента для большинства реальных задач, однако он может найти применение в биохимических исследованиях с соединениями, меченными по 13С.
Если мы проделаем то же самое для такого сильного ядра, как 3Н, то проблема чувствительности исчезает, но вместо нее возникают другие сложности [14]. Выбор задержки т в случае 13С прост: для систем АХ ее оптимальное значение составляет 1/4.7 (для сильносвязанных систем нужны несколько различающиеся значения, см. книгу [5]). Диапазон значений J для прямых углерод-углеродных констант относительно невелик (примерно 35—55 Гц). Для протонов, напротив, зависимость т от J оказывается более сложной из-за того, что часто приходится иметь дело со сложными спиновыми системами, да и диапазон изменения констант спин-спинового взаимодействия оказывается шире (для сравнения, скажем, от 2 до 20 Гц). Другая проблема для систем, содержащих более двух спинов, состоит в том, что двухквантовая когерентность при действии последнего импульса может перераспределяться по всем переходам в спиновой системе; это усложняет интерпретацию каждой строки по v1; соответствующей сигналам от пары связанных ядер. К счастью, этот недостаток может быть частично устранен в результате того, что последний импульс задается равным Зл/4, а не л/2, что по аналогии с COSY-45 ограничивает большую часть перераспределения теми переходами, в которых участвующие ядра непосредственно формируют двухквантовую когерентность [14] (здесь термин «непосредственно» используется в прямом смысле, безотносительно связи между переходами). На рис. 8.41 представлен протонный двумерный спектр INADEQUATE 2,3-дибромпропионовой кислоты с завершающими импульсами л/2 и Зл/4.
Преимущество этого эксперимента по сравнению с COSY заключается в том, что в нем отсутствуют диагональные пики. Поэтому для очень сложных задач можно с помощью двумерного спектра INADEQUATE определить те корреляции, которые трудно найти в спектре COSY, когда соответствующий кросс-пик расположен близко
- О- ОНиНи200100 О -100-200200100 О -100-200-300-300-200-200.-100.-100-юо-юоГцГцсчитывающий импульс — ^считывающий импульс - ^^
- О
- О
Ни
Ни
200100 О -100-200
200100 О -100-200
-300
-300
-200
-200
.-100
.-100
-юо
-юо
Гц
Гц
-'МО
>200
J, >100
i-ioo
Гц
ГцГц
Рис. 8.41. Двумерные спектры INADEQUATE ‘Н 2,3-дибромпропионовой кислоты с варьированием угла последнего (или «считывающего») импульса. Пики, возникающие в результате нежелательного переноса намагниченности к «пассивным» спинам, помечены стрелками на левом спектре.
к диагонали. Неудобство заключается в меньшей общности. Для этого метода невозможно задать оптимальное значение т, подходящее для всех возможных величин констант и типов расположения ядер. В настоящее время уже есть ряд примеров, демонстрирующих полезность этого метода для анализа спектров ЯМР белков [15], но пока еще рано делать вывод о том, что окажется важнее-преимущества или недостатки. Для спектроскопии ЯМР малых молекул этот эксперимент определенно не является экспериментом первой необходимости, однако его можно рассматривать как альтернативу в тех случаях, когда COSY или его модификации не дают ответа на поставленный вопрос.
Детали двумерной последовательности INADEQUATE. При задании параметров для этого эксперимента мы сталкиваемся с обычными проблемами двумерной спектроскопии: выбором ширины спектральной полосы, параметров оцифровки и фазового цикла. В литературе имеется целый ряд подходов к их решению. Метод активно использовался в нескольких исследовательских группах, а детали его выполнения сильно меняются в зависимости от возможностей и конструкции спектрометра, которые существенно изменялись. Я собираюсь рассматривать его так же, как это было сделано для DQF-COSY и COSY, но для полноты упомяну некоторые другие возможности, с которыми вы можете столкнуться.
Создавая фазовый цикл, мы должны иметь в виду двухквантовую фильтрацию, подавление артефактов и квадратурное детектирование по
22-75
vv Двухквантовая фильтрация может достигаться точно так же, как и для DQF-COSY. Мы используем тот факт, что сдвиг на 90° фазы возбуждающей части последовательности (первые три импульса) инвертирует сигналы, возникающие за счет двухквантовой когерентности. Однако в литературе чаще используется циклирование фазы последнего импульса, по-видимому, с целью достижения удобства при программировании. Сдвиг по фазе этого импульса на 90° смещает фазу сигнала, который прошел через двухквантовую когерентность, на 270°. Это можно понять, если представить себе, что мы имеем сдвиг на 90° относительно возбуждающей последовательности (что приводит к фазовому смещению на 180°) плюс прямой 90°-сдвиг возникшей одноквантовой когерентности. Если мы будем менять фазу последнего импульса по кругу в последовательности х, у, —х, — у, то фазу приемника следует менять в противоположном направлении (т. е. х, —у, — х, у) для того, чтобы следовать за двухквантовым сигналом. Для подавления артефактов к этому четырехшаговому циклу можно добавить процедуру CYCLOPS. Полезным может оказаться и смена фазы л-импульса. Имеются также дополнительные возможности, описанные в работе [16]. В общем, размер реально необходимого фазового цикла лучше определять экспериментально для данного спектрометра, потому что никто не хочет без реальной необходимости увеличивать число прохождений на каждом шаге по ^.
Квадратурное детектирование по Vj требует, как обычно, сдвига на 90° фазы регистрируемого сигнала. Для сигналов, возникающих за счет двухквантовой когерентности, это требует сдвига на 45° фазы возбуждающих импульсов. На современных спектрометрах это можно сделать непосредственно. Однако в то время, когда метод INADEQUATE только разрабатывался, спектрометры не были приспособлены для таких фазовых сдвигов, поэтому были разработаны два косвенных способа. Первый состоит в использовании так называемого составного z-импульса [17], т. е. последовательности
где нет задержки между импульсами, а ф обозначает угол импульса, соответствующий желаемому фазовому сдвигу (т. е. л/4 в нашем случае). Для намагниченности в плоскости х — у эта последовательность будет совершать поворот намагниченности по оси z на угол ф (рис. 8.42). То, что произойдет в реальном эксперименте, будет сильно зависеть от качества спектрометра. Для выявления мнимой части эксперимента с квадратурным детектированием мы расположим эту группу импульсов непосредственно после третьего импульса последовательности
Рис. 8.42. Составной z-импульс.
INADEQUATE [18] и, опустив взаимно погашающую пару импульсов (л/2), и (л/2)_х, получим
Существует еще возможность использовать фильтр типа эха. Она основана на зависимости интенсивности сигналов типа эха и анти-эха от длительности последнего импульса. Здесь слишком сложно дать полное обоснование такого эксперимента. Упомянем только, что задание последнего импульса равным 2л/3, по существу, устраняет компоненту анти-эха, не требуя дополнительных экспериментов со сдвигом фазы [19].
Выбор цифрового разрешения может быть сделан обычным путем. Для этого необходимо стремиться сохранить время регистрации данных по г2 по крайней мере равным Т^, чтобы избежать потери чувствительности. Время регистрации данных по tx может быть очень коротким. На первый взгляд может показаться, что полоса спектра по v, должна быть в 2 раза больше, чем по v2, из-за того, что двухквантовые частоты являются суммой химических сдвигов. Но в действительности, если мы будем считать обе спектральные полосы равными, то, хотя и произойдет отражение двухквантовых частот, это не приведет к неоднозначностям (рис. 8.43). Последовательность связей углеродных атомов скелета выявляется так же, как уже описано выше, а при определенных обстоятельствах чувствительность для одинакового времени эксперимента улучшается в ^/2 раз [20].
Исходный эксперимент INADEQUATE. Наконец, мы подошли к тому, с чего началось измерение углерод-углеродных констант спин- спинового взаимодействия. Строго говоря, этот предмет не совсем подходит для главы, посвященной гомоядерной корреляции. Но он столь тесно связан с описанными выше экспериментами, что было бы неразумно его от них отрывать. Углерод-углеродные взаимодействия проявляются в спектрах 13С как 13С-сателлиты линий. Сателлиты, обусловленные прямыми константами, находятся на расстоянии 15-25 Гц от линий и, конечно, имеют амплитуду, составляющую 0,55% 22*
Рис. 8.43. Схематическое представление двумерного спектра INADEQUATE, такое, как на рис. 8.39, но с заведомым отражением по vP Это не вносит никакой неоднозначности.
от основного сигнала. Константы через две и три связи, имеющие значения 0-15 Гц, проявляются в виде сателлитов на расстоянии 0-7 Гц от основной линии. Для реальных форм линий, полученных на сверхпроводящих магнитах, это означает, что сателлиты от прямых констант должны непосредственно легко наблюдаться, а сателлиты от дальних констант могут потеряться на крыльях линии. Трудности могут возникать не только при плохой форме линии, но также из-за боковых полос от вращения, имеющих обычно интенсивность порядка 0,1-1%, и, конечно, из-за примесей. Чтобы надежно обнаруживать линии сателлитов, весьма полезно устранить из спектра основной сигнал вместе с боковыми полосами от вращения, а также вообще все сигналы, кроме сателлитов.
Как мы уже знаем сейчас, этого можно достигнуть с помощью двухквантовой фильтрации. Если мы не будем проводить изменений tv в двумерном INADEQUATE (т. е. фиксируем tv = 0), то получим последовательность
представляющую собой одномерный эксперимент с двухквантовой фильтрацией. Использование уже описанного циклирования фазы (конечно, без компоненты квадратурного детектирования по ZJ приводит к спектру, в котором подавляются все сигналы, возникающие от несвязанных ядер. В то же время сигналы спиновых систем АВ или АХ останутся в спектре, хотя и без какого-либо улучшения чувствительности, поскольку мы по-прежнему наблюдаем сигналы от 0,01% ядер. Компоненты дублетов проявляются в виде характерных линий с противоположными фазами (рис. 8.44). Для достижения успеха в этом эксперименте требуются большое количество вещества и столь же высокая стабильность работы спектрометра, как в экспериментах с ЯЭО, а также правильный выбор частоты повторения и т. Последние два условия широко обсуждаются в книге Бакса [5] (гл. 5), поэтому я не буду здесь их рассматривать. ,
—' 4cnexmp X111111'1'1'4020 О -20-40Гц—' 4cnexmp X111111'1'1'4020 О -20-40ГцРис. 8.44. Часть одномерного спектра INADEQUATE 13С для атома углерода, связанного с двумя другими; можно различить две разные прямые константы. Хорошо виден небольшой остаточный сигнал от основной (нерасщепленной) линии; он не попадает точно на центр дублетов вследствие изотопного сдвига при замещении 12С на 13С.
—' 4cnexmp X
111111'1'1'
4020 О -20-40
Гц
—' 4cnexmp X
111111'1'1'
4020 О -20-40
Гц
Вследствие ограничений по чувствительности и из-за специфичности информации, получаемой из спектра INADEQUATE, маловероятно, что этот эксперимент станет широко использоваться в его первоначальной форме. Однако идея использования двухквантового фильтра (или фильтра более высокого порядка) в одномерном спектре для разделения сигналов, представляющих интерес, от основных интенсивных сигналов имеет много возможных приложений, в частности в биохимии. Одним из очевидных примеров было бы прослеживание дважды меченных по 13С метаболитов непосредственно в биологической системе. Такой эксперимент следовало бы сравнить с методом обратного переноса поляризации, уже рассмотренным в гл. 6, и с методиками разностного спинового эха в гл. 10.
NOESY или обменная спектроскопия
Введение. Если вы вернетесь назад и снова посмотрите на рис. 8.1, то поймете, что существует еще одна получаемая при действии последовательности COSY компонента намагниченности, которую мы до сих пор полностью игнорировали. Это часть поперечной намагниченности, возвращенная к направлению оси z при действии второго импульса. Отметим, что та намагниченность также модулируется как функция tv т. е. она представляет собой частоту, меченную точно так же, как и намагниченность в плоскости х — у. Конечно, в COSY эта компонента не генерирует сигналов, поэтому нам даже не следует беспокоиться о том, чтобы устранить ее при циклировании фазы. Однако, поскольку она была вовлечена в некий физический процесс, мы можем провести двумерный эксперимент, который позволит его зарегистрировать. Для этого нужно возвратить намагниченность в плоскость х — у и про- детектировать возникающий сигнал. Можно представить себе по крайней мере два информативных взаимодействия, в которые может быть вовлечена z-компонента меченой частоты: химический обмен с другим ядром и ядерный эффект Оверхаузера.
Результат химического обмена, возможно, легче представить. Если мы выжидаем время после второго импульса, используя последовательность
л л л
2 ” ” 2 ~ Тт ~ 2 ” ?2
называемую NOESY, в таком случае при наличии обмена то ядро, z-намагниченность которого модулируется при одном химическом сдвиге в течение tv может мигрировать к другому положению за период тт, называемый временем смешивания. Следовательно, оно имеет другой химический сдвиг в течение периода /2, и результирующий спектр будет похож на спектр COSY, а кросс-пики будут наблюдаться между обменивающимися положениями. Этот эксперимент, применяемый для обнаружения химического обмена, представляет собой двумерный аналог обычного эксперимента по переносу намагниченности и для сложных систем должен обладать обычными преимуществами двумерных спектров. Однако, как мы увидим дальше, он имеет целый ряд технических недостатков.
Ядерный эффект Оверхаузера (ЯЭО) также приводит к тому, что изменения в z-намагниченности одного ядра приводят к изменению z-намагниченности другого. Поэтому пары ядер, которые показывали бы ЯЭО в одномерном спектре, могут иметь кросс-пики в данном двумерном эксперименте. В методе обычного равновесного ЯЭО, который рассмотрен в гл. 5, изменение z-намагниченности, используемое нами, представляет собой насыщение (т. е. устранение) ее, но при этом любое нарушение теплового равновесия также может воздействовать на заселенности соседних ядер. NOESY является двумерным аналогом неравновесного ЯЭО, рассмотренного в гл. 5 (разд. 5.2.4).
Итак, эксперимент NOESY позволяет определять пути химического обмена и устанавливать пространственную структуру быстро и с хорошим разрешением, что характерно для двумерного метода. Таким, образом, он кажется весьма привлекательным. Я не хотел бы показаться слишком пессимистичным, но все же должен указать вам на ряд основных трудностей, связанных с его применением. Очевидно, что обменные и ЯЭО-взаимодействия здесь невозможно различить. Но тот же недостаток свойствен и обычным одномерным методам, поэтому нет причины на этом основании избегать использования NOESY. Обычно из химии известно, могут ли протекать обменные процессы в данном соединении, что позволяет правильно интерпретировать спектр NOESY. В стадии развития находятся различные эксперименты, в том числе так называемая zz-спектроскопия [21], которая позволит отличить обмен от ЯЭО. Но она пока не находит широкого применения. Две существенно более серьезные трудности возникают при выборе задержки тт и из-за возможного присутствия перекрывающихся кросс-пиков, обусловленных спин-спиновой связью.
Выбор тт. Задержка тт должна выбираться таким образом, чтобы происходил максимальный обмен или сформировался максимальный ЯЭО перед тем, как конечный импульс прикладывается к z-намагниченности. Это потребовало бы знания значений времен 7] вовлеченных во взаимодействие ядер, а также скорости обмена или формирования ЯЭО. Если мы знаем только один из этих двух параметров, то нам трудно начать эксперимент без предварительных допущений. Здесь существует четкая разница между возможным диапазоном тт для определения обмена и для ЯЭО (в последующем изложении я подразумеваю, что вам известны динамические эффекты в спектрах ЯМР; см., например, гл. 8 в книге Гюнтера [22]).
Конечно, химический обмен может происходить фактически с любыми скоростями. Очевидно, что с помощью NOESY можно изучать область медленного обмена. Основываясь на разности химических сдвигов обменивающихся ядер, мы можем оценить верхнюю границу его скорости. Для двухпозиционного обмена с равными заселенностями и разностью их химических сдвигов Ду при коалесценции сигналов константа скорости процесса кс равна тсДу/^/2. Поэтому при медленном обмене в нашем случае скорость обмена к должна быть заведомо меньше, чем кс. В то же время к не должна быть намного меньше 1/7]. В противном случае частотно-меченая z-намагниченность исчезнет до того, как произойдет миграция. Диапазон значений к, для которых имеет смысл эксперимент NOESY, лежит между этими двумя границами. Чаще всего полезно использовать одномерный вариант намагниченности или NOESY в области довольно медленного обмена, где к не слишком сильно отличается от 1/7], поскольку именно в этой области не существует других методов получения сведений о химическом обмене. В этом случае оптимальное значение тт для обнаружения обмена, протекающего со скоростью к между равнозаселенными положениями, зависит от к 7] и медленно изменяется от значения 0,5/к при /с = 1/7] до 1,5//с при к = 10/7]. Обычно к точно не известна, поэтому вполне разумно для грубой оценки тт принять его равным 1//с.
На практике бывает необходимо выполнить несколько экспериментов, используя различные оценки для к. Даже такой требующий значительного времени эксперимент все же дает только качественную информацию о путях обмена, поскольку пока нет простого метода количественного расчета констант скоростей из получаемых данных. Обе эти проблемы (определение тт и количественный расчет констант) могут быть решены при использовании метода «аккордеон-спектроскопии» [11], в котором тт устанавливается пропорциональной времени ^. В нем трехмерный спектр можно эффективно представить в виде двумерного. При этом по координате vt расположены линии, формы которых зависят от величины к. Расчет констант скорости из такого спектра требует количественного анализа формы линии этих сигналов. Программы такого анализа пока еще не очень широко доступны, поэтому я не буду дальше продолжать его обсуждение. Вполне возможно, что
в будущем такие эксперименты найдут более широкое применение.
В противоположность химическому обмену формирование ЯЭО сдерживается скоростью продольной релаксации. Многие обстоятельства могут сделать формирование ЯЭО более медленным, чем 1/7], но ничто не может заставить его возникать быстрее. Это означает, что, выбрав тт примерно равным 1/7], мы с большой вероятностью сможем наблюдать кросс-пики ЯЭО между соседними ядрами. Ядерные эффекты Оверхаузера между более удаленными ядрами формируются медленнее, поэтому для их регистрации нужны большие времена смешивания. Но конкурирующая продольная релаксация приводит к тому, что кросспики в этом случае будут очень слабыми. Конечно, в одномерных экспериментах такие ЯЭО тоже очень слабые, но в эксперименте NOESY используется стационарная, а не равновесная намагниченность, поэтому трудности дополнительно возрастают. Кроме того, при спин-спиновом взаимодействии могут возникнуть артефакты, очень запутывающие картину двумерного спектра и затрудняющие идентификацию истинных кросс-пиков ЯЭО. И наконец, еще раз отмечу, что не существует простого способа получения количественных результатов в данном эксперименте. Мы имеем только указание на присутствие ЯЭО, но не надежное измерение его величины. Существование этих неблагоприятных факторов объясняет, почему NOESY мало используется при изучении небольших молекул. Однако при исследованиях белков этот метод приобрел большое значение. Причина в том, что большие молекулы белков совершают беспорядочные движения в растворе относительно медленно. В связи с этим в таких системах вклад в быструю диполь- дипольную релаксацию дает процесс Ид (см. гл. 5). В них ЯЭО оказываются большими и отрицательными, и они быстро устанавливаются. Примеры использования метода NOESY для отнесения сигналов в спектрах белков приведены в работах [23, 24].
Трудности, обусловленные спин-спиновым взаимодействием. Не удивило ли вас то, что последовательность NOESY отличается от использованной для метода DQF-COSY только введением интервала тт. Это означает, что в эксперименте могут присутствовать различные сигналы переноса когерентности, и, как обычно, нужная компонента выделяется при помощи фазового цикла. Легко видеть, что фаза сигналов, возникающих от намагниченности, ориентированной вдоль оси z в течение времени тт, не зависит от фазы первых двух импульсов, но следует за фазой третьего. Поэтому большую часть нежелательных сигналов можно подавить либо совместным циклированием фазы первых двух импульсов в последовательности х, у, —х, —у при постоянной фазе приемника, либо совместным циклированием фаз последнего импульса и приемника. Квадратурное детектирование можно провести обычными способами-фазочувствительным или с фильтром типа эха. Однако, к сожалению, существует перенос когерентности, приводящей к сигналам с точно таким же фазовым поведением, как и желаемая z-компонента.
Эта часть проходит через нуль-квантовую когерентность. Это значит, что в спектре NOESY для нашего соединения на кросс-пики, обусловленные ЯЭО или обменом, накладывается спектр COSY с нуль-квантовой фильтрацией, причем циклирование фазы не может препятствовать этому. Очевидно, что для связанных систем эта проблема неразрешима. Она сродни эффектам SPT, возникающим в одномерных экспериментах по ЯЭО, но в двумерном эксперименте трудно или невозможно различать реальные и нуль-квантовые кросс-пики.
Было предложено несколько решений этой проблемы, но ни одно из них нельзя считать полностью удовлетворительным. Простейший прием сводится к варьированию интервала тт случайным образом при переходе от одного прохождения к другому. Интенсивность кросс-пиков, обусловленных ЯЭО или обменом, медленно изменяется с изменением тт, тогда как пики переноса когерентности модулируются с нуль-квантовыми частотами, которые равны разностям химических сдвигов связанных ядер. Таким образом, по крайней мере некоторые из нуль-квантовых сигналов изменяются так же быстро, как и тт. Поэтому при благоприятном стечении обстоятельств они должны усредняться и исчезать после некоторого числа прохождений. Наилучший способ реализации этой идеи-введение л-импульса в тт:
л л л
- - <1 - - - Т; - < - Л - т- - - - Z2 2 2 2
Теперь тт равняется т; + 2т- (использованное здесь обозначение взято из работы [25]). Т; и т; можно изменять, в то время как тт сохраняется постоянным. Тогда обменные или ЯЭО-пики не изменяются от прохождения к прохождению, а нуль-квантовые пики модулируются как функция только т,, поскольку все эффекты в оставшейся части тт рефокусируются. Можно менять т, случайным образом, но все же при использовании этого способа приходится полагаться на удачу, и надежное подавление можно получить лишь при большом числе прохождений. Существует и другой метод, когда вычисляется оптимальный набор значений т, для каждого числа прохождений, который также зависит от диапазона подавляемых нуль-квантовых частот, т. е. от разностей химических сдвигов между парами взаимодействующих ядер. Оказывается, что самый лучший результат дает комбинация вычисленных и случайных переменных при пошаговом изменении т; как функции ^. Тогда т; выражается следующим образом:
Ч = < + х<1 + Trandom (8.6)
В работе [25] содержатся таблицы и формулы для определения наилучших значений т,? для разных сочетаний диапазонов химических сдвигов и числа прохождений на каждое значение tv
Даже при использовании этого тщательно разработанного метода подавление нуль-квантовых компонент при малом числе прохождений на каждое значение tv оказывается весьма слабым, особенно в том
случае, если велик диапазон разностей химических сдвигов. Но поскольку эксперимент NOESY всегда имеет низкую чувствительность, как правило, при накоплении сигнала используется большое число прохождений. Если на каждом шаге по tv используется больше 10 прохождений, то подавление нуль-квантовых пиков становится вполне достаточным для типичных диапазонов химических сдвигов. Ко всему этому нужно добавить, что тт должно быть порядка Tv Поэтому очевидно, что эксперимент NOESY требует больших затрат времени.
Рис. 8.45. Отслеживание пути химического обмена во флуктуирующем металлоорганическом соединении.
111 "| рI 1111111 и11 ч " 1. pi ।11 IIIи ।5,04,54,03.8302,52,01,5111 "| рI 1111111 и11 ч " 1. pi ।11 IIIи ।5,04,54,03.8302,52,01,5Рис. 8.46. Спектр NOESY производного пенициллина (8). Метильная группа, обращенная под плоскость молекулы, показывает в спектре кросс-пик с одним из p-протонов (Н5) лактамного цикла. При облучении этого метила на лактамном протоне проявляется равновесный ЯЭО, составляющий 15%. Напротив, метильная группа, расположенная над плоскостью молекулы, обнаруживает корреляцию с протоном Н3.
111 "| рI 1111111 и11 ч " 1. pi ।11 IIIи ।
5,04,54,03.8302,52,01,5
111 "| рI 1111111 и11 ч " 1. pi ।11 IIIи ।
5,04,54,03.8302,52,01,5
Примеры. Несмотря на все сказанное в двух предыдущих разделах, в действительности эксперименты NOESY все же можно проводить! Я склонен думать, что обнаружение химического обмена с практической точки зрения представляет собой наиболее важное применение этого метода для небольших молекул. В качестве примера на рис. 8.45 приведен спектр NOESY для стереохимически нежесткого металлоорганического соединения, на котором можно проследить механизм обмена. Пример обнаружения ЯЭО дан на рис. 8.46. Это спектр NOESY соединения 8, которое является производным пенициллина. Времена релаксации протонов 7] в его обезгаженном растворе в D2O изменяются
1 \ Me1 \ Me
1 \ Me
1 \ Me
в широком диапазоне от 0,4 до 2 с, поэтому для параметра тт было выбрано промежуточное значение 1 с. Тем не менее кросс-пики проявляются в местах, ожидаемых для измерений равновесного ЯЭО. В этом случае не возникает трудностей, связанных со спин-спиновым взаимодействием, и мы вполне уверены, что кросс-пики возникают как следствие эффекта Оверхаузера.
Литература
Evans S. R„ Hayman A. R., Fellows L. E„ Shing T. К. M„ Derome A. E., Fleet G. W. J., Tet. Lett., 26, 1465-1468 (1985).
States D.J., Habekorn R.A., Ruben D.J., J. Mag. Res., 48, 286-292 (1982).
Keeler J., Neuhaus D., J. Mag. Res., 63, 454-472 (1985).
Marion D., Wuthrich K., Biochem. Biophys. Res. Comm., 113, 967-974 (198 3).
Бакс Э. Двумерный ядерный магнитный резонанс в жидкости. Пер. с англ,-Новосибирск: Наука, Сибирское отделение, 1989.
Levitt М.Н., Bodenhausen G„ Ernst R.R., J. Mag. Res., 58, 462-474 (1984).
Mehlkopf A.F., Korbee D., Ttggelman T.A., Freeman R., J. Mag. Res., 58, 315-323 (1984).
Nagayama K., Kumar A., Wiithrich K„ Ernst R.R., J. Mag. Res., 40, 321 (1980).
Griesinger C. W, Sorensen O. W., Ernst R. R., J. Amer. Chem. Soc., 107, 6394-6396 (1985).■
Piantini U„ Sorensen O. W, Ernst R. R., J. Amer. Chem. Soc., 104, 6800-6801 (1982).
Bodenhausen G„ Ernst R.R., J. Amer. Chem. Soc., 104, 1304-1309 (1982).
Wagner G., J. Mag. Res., 55, 151-156 (1983).
Bax A., Freeman R„ Frenkiei T.A., J. Amer. Chem. Soc., 103, 2102-2104 (1981).
Mareci TH., Freeman R„ J. Mag. Res., 51, 531-535 (1983).
Boyd J., Dobson C.M., Redfield C„ J. Mag. Res., 55, 170-176 (1983).
Bax A., Freeman R„ Kempsell S.P., J. Amer. Chem. Soc., 102, 4849-4851 (1980).
Freeman R., Frenkiei T.A., Levitt M.H., J. Mag. Res., 44, 409 (1981).
Bax A., Freeman R„ Frenkiei T.A., Levitt M.H., J. Mag. Res., 43, 478 (1981).
Mareci TH., Freeman R., J. Mag. Res., 48, 158 (1982).
Turner D.L., J. Mag. Res., 58, 500-501 (1984).
Wagner G., Bodenhausen G., Miiller N„ Rance M., Sorensen 0. W„ Ernst R.R., Wiithrich K., J. Amer. Chem. Soc., 107, 6440-6446 (1985).
Гюнтер X. Введение в курс спектроскопии ЯМР. Пер. с англ.-М.: Мир, 1984.
Wagner G., Kumar A., Wuthrich К., Eur. J. Biochem., 114, 375 (1981).
Wuthrich К., Billeter M., Braun W, J. Mol. Biol., 180, 715-740 (1984).
Rance M„ Bodenhausen G„ Wagner G„ Wiithrich K., Ernst R. R., J. Mag. Res., 62, 497-510 (1985).
Venable T.L., Hutton W. C., Grimes R.N., J. Amer. Chem. Soc., 106, 29-37 (1984).
Brevard C., Schimpe R., Tourne G., Tourne С. M., J. Amer. Chem. Soc., 105, 7059-7063 (1983).
Finke R. G., Rapko B., Saxton R. J., Domaille P. J., J. Amer. Chem. Soc., 108, 2947-2960 (1986).
Bax A., Drobny G., J. Mag. Res., 61, 306-320 (1985).
Глава 9
Гетероядерная корреляционнаяспектроскопия
Введение
При создании эксперимента INEPT на основе SPI в гл. 6 мы должны были тщательно исключить влияние химических сдвигов спинов S с помощью спинового эха. Если уберем эхо и сделаем варьируемым интервал между оставшимися импульсами, то получим '
S:S:I:I:л л
S:
S:
I:
I:
2 ” Z1 - 2
^ Выборка (/2)„.
Ясно, что этот эксперимент может также приводить к переносу поляризации, но степень переноса будет зависеть от специфического расположения векторов намагниченности, относящихся к компонентам мультиплета, во время второго импульса. Оно в свою очередь зависит от резонансных частот сигналов S и длительности tY. Таким образом, мы имеем основу для двумерного эксперимента: амплитуда сигнала I, детектируемая в течение времени /2, будет модулироваться как функция tY на резонансных частотах спинов S. Приведенная выше схема составляет фундамент гетероядерной корреляционной спектроскопии. Другой путь рассмотрения этой последовательности состоит в сравнении с COSY. Единственная разница заключается в том, что перенос когерентности после второго импульса распространен на другое ядро с помощью одновременного импульса на частоте этого ядра. Таким образом, видно, что все эксперименты в гл. 6, 8 (исключая NOESY) и 9 основаны на одном и том же явлении: переносе когерентности между взаимодействующими спинами, который проще всего можно понять в контексте SPI.
Так как все основы для понимания двумерного ЯМР изложены в предыдущей главе, то здесь у нас остается относительно простая задача-изучить несколько технических деталей гетероядерного эксперимента и сделать обзор некоторых его вариантов. Простейший вид гетероядерной корреляции, описанный в следующем разделе, и COSY (предпочтительно в форме фазочувствительного DQF - COSY) представляют собой два главных метода двумерного ЯМР, к которым вы должны обращаться в первую очередь, берясь за решение проблемы. Все
другие эксперименты более специфичны и приспособлены к частным ситуациям, поэтому лучше всего держать их в резерве до тех пор, пока анализ сколько-нибудь не продвинется.
Довольно странно, что, несмотря на популярность игры по изобретению сокращений, не возникло согласия по поводу того, как называть гетероядерную корреляционную спектроскопию. Полное название произносить очень неудобно, и авторы обычно прибегают к некоторой сокращенной версии. Часто ее называют H-X-COSY. Но тогда возникает путаница, если другое ядро не протон, так же как и в случае, когда говорят просто COSY. Для ясности и краткости в дальнейшем я буду называть этот эксперимент в его оригинальной форме HSC (от англ. Heteronuclear Shift Correlation). Не сомневаюсь, что читатели с большими творческими способностями придумают свое собственное, более запоминающееся обозначение.
Детали HSC
Устранение различных КССВ
Введение. На рис. 9.1 показано, что получается в результате применения основной последовательности HSC для системы АХ. Сигналы в каждом измерении связаны кросс-пиками. Точно так же как и в фазочувствительном COSY, компоненты оказываются в противофазе. Очень часто координата спектра vt как бы воспроизводит протонные химические сдвиги, a v2 содержит сдвиги гетероядра, например углерода. Ясно, что поставленный таким образом эксперимент не удовлетворяет полностью тем требованиям, которые мы предъявляем к спектрам этих
-7,6•7,7-7,8"7,9ЦО-МЦ2-7,6•7,7-7,8"7,9ЦО-МЦ2Л("оЛ("о м.а.166.(1165,0 м.а.166.(1165,0
-7,6
•7,7
-7,8
"7,9
ЦО
-М
Ц2
-7,6
•7,7
-7,8
"7,9
ЦО
-М
Ц2
Л("о
Л("о
м.а.
166.(1165,0
м.а.
166.(1165,0
Рис. 9.1. Основной тип эксперимента по гетероядерной корреляции 1Н-13С для системы АХ (муравьиная кислота, квадратурное детектирование по Vj с помощью метода TPPI). Обе координаты, как 1Н, так и 13С, содержат дублеты в противофазах (положительные и отрицательные контуры показаны красным и черным цветом). Сечение параллельно v2 показано над контурным представлением.
ядер по одной из двух координат. Например, во время регистрации гетероядра применяется широкополосная протонная развязка; следовательно, мы не наблюдаем структуру мультиплетов, обусловленную взаимодействием с протонами. В то же время координата vt содержит частоты протонных линий, вызванных спин-спиновым взаимодействием с гетероядром, например 13С-сателлиты протонных линий при наблюдении углерода. Поэтому для упрощения интерпретации и получения оптимальной чувствительности в эксперименте желательно устранить гетероядерное взаимодействие по обеим координатам. Однако мы должны соблюдать осторожность, чтобы не разрушить также и сам эксперимент, который непосредственно зависит от наличия взаимодействия.
Устранение взаимодействия по v2. Для того чтобы иметь возможность включить широкополосную развязку в течение времени /2, мы должны получить компоненты детектируемого ядра в одной фазе. Возникает та же проблема, что и при развязке в INEPT, и, как обычно, она решается путем введения задержки после конечных импульсов последовательности. Эта задержка, обозначаемая Д2 в терминах HSC, играет ту же роль, что и задержка А в INEPT. В действительности это и есть та же самая задержка, поэтому ее можно выбирать на основании критериев, рассмотренных в гл. 6. Единственная разница состоит в том, что если двумерный эксперимент предназначен для представления спектра в виде магнитуды, то нам не нужно заботиться о фазовых изменениях, обусловленных химическими сдвигами, в течение этого интервала. Таким образом, нет нужды помещать л-импульс в центр Д2 с целью создания спинового эха для экспериментов в режиме магнитуды спектра. Фазовые изменения следует принимать во внимание, если используется фазочувствительное детектированйе.
Устранение взаимодействия по v2. Для получения по координате vt спектра, «развязанного» от гетероядра, требуется довольно тонкий подход. Чтобы понять почему, представьте сначала, что у нас есть истинная широкополосная развязка от ядра I. Если ее применять на всем протяжении /1; то эксперимент не получится совсем, потому что компоненты мультиплета, обусловленные гетероядерным взаимодействием, никогда не будут иметь противофазу, необходимую для переноса поляризации. В действительности мы хотим сделать так, чтобы гетероядерное взаимодействие не модулировало сигнал в течение tv но хотели бы все же получать с помощью этого взаимодействия линии в противофазе, что необходимо для переноса поляризации. Этого можно добиться подавлением спин-спинового взаимодействия в течение tY и установкой другой задержки At между концом tY и стадией переноса поляризации, во время которой развязка выключается. В результате мы получим полную последовательность HSC для экспериментов в режиме магнитуды спектра (рис. 9.2, последовательность Л).
Дело выглядит так, как будто бы вы получили пирожное, но с условием, что откусывать от него можно только в течение времени tY.
п2п2t, > ♦- Л, -> | <- Д2 —» J раэбяакаt, > ♦- Л, -> | <- Д2 —» J раэбяакаА<Н:А<Н:развязкаразвязкаЬыборкаЬыборка
п2
п2
t, > ♦- Л, -> | <- Д2 —» J раэбяака
t, > ♦- Л, -> | <- Д2 —» J раэбяака
А
<Н:
А
<Н:
развязка
развязка
Ьыборка
Ьыборка
Б
uc, J развязка [_"5*Ьыборка
В
.п*п, Ьыборка
2
Рис. 9.2. Улучшенные схемы последовательностей HSC: А-с гетероядерной развязкой по Vj и v2; 5-то же самое, но с рефокусировкой во время задержек Д для фазочувствительных экспериментов; В-устранение необходимости точной широкополосной углеродной развязки с помощью тг-импульса по 13С в середине tP
Постоянные задержки, такие, как At, не влияют на амплитудную модуляцию сигнала, но обеспечивают появление частотно-зависимых сдвигов фаз в vt. Еще раз отмечу, что это не влияет на эксперимент в режиме магнитуды спектра. Но необходимо исключить такие сдвиги фаз, если применяется фазочувствительный вариант со спиновым эхом (рис. 9.2, последовательность Б).
Практические трудности при реализации последней последовательности возникают в связи с необходимостью осуществлять широкополосную развязку от ядра X, что трудно или даже невозможно на современных спектрометрах. К счастью, поскольку tv изменяется дискретными шагами, вместо развязки можно просто воздействовать одиночным л-импульсом на ядро I в центре ^. Как и в гипотетической схеме широкополосной развязки, описанной в гл. 7 (разд. 7.4), при этом направление прецессии компонент мультиплета меняется на противоположное, а поэтому спин-спиновое взаимодействие исчезает к концу tv. Для достижения развязки достаточно только одного импульса, поэтому не происходит накопления ошибок, что препятствует применению тако-
■7,6
-7.7
-7,8 чм
■7,9
-6Р
■V
Рис. 9.3. Эксперимент HSC с ге-тероядерной развязкой по обеимкоординатам (снова муравьинаякислота).Рис. 9.3. Эксперимент HSC с ге-тероядерной развязкой по обеимкоординатам (снова муравьинаякислота).8,2м.д.
Рис. 9.3. Эксперимент HSC с ге-тероядерной развязкой по обеимкоординатам (снова муравьинаякислота).
Рис. 9.3. Эксперимент HSC с ге-тероядерной развязкой по обеимкоординатам (снова муравьинаякислота).
167,0 J^O«40
ч,(”е)
го подхода при обычной широкополосной развязке. Однако и здесь часто используют составной импульс. В таком случае оптимальной схемой для фазочувствительного HSC с развязкой по координатам Vj и v2 была бы последовательность В на рис. 9.2.
Задержка (l/2)At в этой последовательности эквивалентна т в INEPT, и, следовательно, она должна иметь длительность 1/4J (т.е. А£ = 1/2J). Весь диапазон прямых КССВ протонов и углерода составляет 125-210 Гц. Однако в большинстве случаев при записи С—Н-корреля- ционных спектров можно принять, что эта константа составляет около 130-150 Гц. Тогда Д£ будет равно 3-4 мс, При необходимости значение Д2 можно использовать для редактирования, но обычно оно устанавливается равным 0,3/J (2-2,5 мс для Н—С-корреляции) для того, чтобы правильно воспроизводить интенсивности для групп IS, IS2 и IS3. В этом случае для системы АХ получается спектр, приведенный на рис. 9.3.
Другие экспериментальные аспекты
Фазовый цикл. При создании фазового цикла для HSC самой важной проблемой является исключение аксиальных пиков и квадратурное детектирование по vr Фазовое альтернирование конечного импульса по спину S и приемника позволяет исключить аксиальные ники. Такая же процедура используется для устранения собственной намагниченности ядра I в эксперименте INEPT. При этом необходимо, чтобы квадратурное детектирование проводилось в фазочувствительном режиме с помощью процедуры RuSH или TPPI, выбор которой зависит от особенностей конструкции вашего спектрометра. Однако в литературе часто встречаются примеры создания эксперимента по правилам эха в режиме магнитуды спектра. Для этого случая конечный п/2-импульс по спину S сдвигается на 90° одновременно со сдвигом приемника на —90°. Базовый фазовый цикл, таким образом, имеет четыре шага, или две пары из двух шагов, каждая в фазочувствительной форме.
При необходимости этот четырехшаговый цикл может быть рас-
ширен с помощью последовательности CYCLOPS. В этом случае происходит циклирование фазы всех импульсов и приемника с шагом в 90°, а также фазовое альтернирование всех л-импульсов.
Время регистрации и частота повторения. Поскольку данный эксперимент включает гетероядерное детектирование, потребуется тщательная оптимизация всех временных параметров для обеспечения приемлемой чувствительности. Изложенные здесь принципы уже обсуждались в гл. 7 (разд. 7.5.2) и 8 (разд. 8.3.5). Так как эта последовательность включает перенос поляризации, то частоту повторения определяют времена 7] ядер S (обычно протонов). Для релаксации ядер S между прохождениями должен быть оставлен период около 1,37]. Заметим, что это-время между прохождениями, а не общая скорость повторения, включающая время регистрации, потому что широкополосная развязка от S включается в течение времени t2.
Время регистрации по t2 должно быть по крайней мере равно среднему Т^ для ядер I. Данное условие легко выполнимо, так как это время не является критическим для общего времени эксперимента. При этом время регистрации по zt может быть очень коротким. В отличие от COSY, где нам следовало быть весьма аккуратными, чтобы избежать уменьшения сигнала при подавлении противофазных пиков, сигналы в HSC находятся в фазе. Таким образом, необходимо только, чтобы Л(1 было достаточно большим для получения нужного нам разрешения по этой координате. При рутинном использовании HSC мы просто хотим скоррелировать протонные сдвиги с их гетероядерными партнерами-ядрами X; следовательно, по координате vt допустимо цифровое разрешение в 10 Гц на точку или более, соответствующее А, = 100 мс или меньше. Если же по vt необходимо получить высокое разрешение, то в таком случае следует увеличить время Я, . Однако при этом чувствительность эксперимента быстро понижается. В гл. 10 (разд. 10.4.3) для такого случая описан альтернативный подход. Идеальный, хотя и трудно выполнимый на практике, способ достижения высокого разрешения по координате протонов состоит в том, чтобы эту координату сделать v2, т.е. выполнить эксперимент «наоборот» [1].
Если эксперимент HSC содержит небольшое число инкрементов по zt и частота повторения оптимизирована для протонных времен 7], то чувствительность этого эксперимента очень высока. Однако, поскольку чувствительность зависит от огромного числа факторов, ее довольно трудно точно предсказать. Я нашел следующее исключительно полезное правило. Определим возможное число прохождений на каждый инкремент z15 задавая общее время эксперимента и требуемое число инкрементов. Затем получим спектр INEPT с этим числом прохождений, т. е. выполним эксперимент с Zj = 0. Тогда если в спектре проявляется большинство ожидаемых резонансных сигналов даже с плохим отношением сигнал/шум, то двумерный корреляционный эксперимент несомненно будет иметь подходящую чувствительность при условии, что
мы правильно подобрали А(1 и взвешивающие функции. Гетероядерная корреляционная спектроскопия имеет шанс на успех даже тогда, когда в эксперименте с /t = О сигналы не видны. Мы не должны забывать, что все прохождения дают вклад в конечные сигналы.
Использование HSC
Необходимость применения HSC для решения химических проблем вполне очевидна. Метод HSC позволяет идентифицировать спин-спи- новую связь в гетероядерных системах. Здесь мне бы хотелось это продемонстрировать, а также показать некоторые значительные преимущества двумерного варианта. Первое преимущество -скорость. На рис. 9.4 представлены протонный и углеродный спектры соединения 1,
1
Рис. 9.4. Протонный и углеродный спектры соединения 1. Углеродный спектр зарегистрирован с использованием DEPT (400 прохождений). На рис. 9.5 использован тот же образец для эксперимента HSC.
Ml
Рис. 9.5. Спектр HSC соединения 1 (128 инкрементов по Zt для времени регистрации по этой координате в 76 мс; 192 прохождения на инкремент). Приведено отнесение протонов, полученное с использованием COSY в предыдущей главе. В содержащей много сигналов центральной области непросто определить протонные сдвиги по контурному представлению. Однако их легко измерить при исследовании вертикальных сечений спектра. Отнесение Н4 и Н* может быть .обратным.
которое мы уже широко исследовали в гл. 8, а на рис. 9.5-спектр HSC.
После того как отнесены сигналы в протонном спектре, упражнение по отнесению углеродных резонансных сигналов является тривиальным. Получение той же самой информации с помощью селективной гетеро- ядерной развязки в этом случае, весьма вероятно, было бы невозможным из-за сильного перекрывания сигналов в протонном спектре. Но, даже если такие селективные развязки возможны, выполнение более чем двух или трех подобных экспериментов чрезвычайно утомительно по сравнению с регистрацией HSC.
Эксперимент HSC может показаться очень простым, но при наличии сильной связи между протонами [7] возникают серьезные осложнения. В слабосвязанных системах наблюдаются только кросс-пики между протонами и непосредственно связанными с ними гетероядерными партнерами. Однако при наличии сильной связи намагниченность может переноситься через систему, приводя к непрямым корреляциям. Следовательно, в системе типа НА — СА — Св — Нв протон НА может давать кросс-пик с Св, если он сильно связан с Нв. На практике подобная ситуация распознается без труда. При этом необходимо учитывать следующий нюанс: именно 13С-сателлиты должны проявлять сильную связь. Система, в которой наблюдается первый порядок для 12С-изото- померов, может иметь сильносвязанные 13С-сателлиты, потому что относительные химические сдвиги протонов в этих системах могут заметно различаться. Противоположное (т.е. слабая связь 13С-сателли-
тов при наличии сильной связи у соответствующих 12С-изотопомеров) также иногда бывает верным.
Второе преимущество составляет тип распределения информации. Обычные гетероядра, такие, как 13С и 31Р, имеют диапазон химических сдвигов как в герцах, так и в миллионных долях, намного больший, чем протоны. Часто их спектры состоят из наборов одиночных линий, поскольку отсутствует гомоядерная связь, что обусловлено либо низким изотопным содержанием партнеров по гомоядерному взаимодействию, либо наличием в молекуле только одного гетероядра с высоким содержанием, а также благодаря широкополосной развязке от протонов. Совместное действие этих двух факторов приводит к тому, что эффективная протяженность гетероядерного спектра намного больше, чем протонного. Даже для сравнительно больших молекул в спектре редко возникает перекрывание резонансных сигналов. В спектре HSC информация о частотах протонов передается на резонансной частоте гетероядра, что делает возможным использование различия в свойствах гетероядер для анализа сложных протонных спектров. При отсутствии сильной связи протонов и при условии, что по Vj достигается достаточное цифровое разрешение, эту идею можно реализовать весьма просто. Сечение спектра HSC параллельно vt на частоте, соответствующей химическому сдвигу ядра X, дает в итоге положение протонов, связанных с этим ядром. Действительно, выводить на график только отдельные сечения часто бывает полезнее, чем расписывать полное контурное представление.
Рис. 9.6 и 9.7 помогают проиллюстрировать эффективность этой методики. На рис. 9.6 представлена ароматическая область протонного спектра на рабочей частоте 500 МГц иридиевого комплекса, который является интермедиатом каталитического гидрирования. Наша цель состояла в отнесении всех резонансных сигналов. С помощью экспе-
Рис. 9.6. Протонный спектр иридиевого комплекса.
Рис. 9.7. Сечения спектра 1H-3lP-HSC иридиевого комплекса, показанного на рис. 9.6, параллельно vP Отдельные сечения приведены в виде сигналов поглощения, хотя и не проводилось фазочувствительного эксперимента.
риментов ЯЭО мы смогли определить расположение лигандов вокруг иридия [2]. Связи между протонами были легко определены с использованием COSY. Оставалось найти опорные точки для отнесения. На рис. 9.7 показаны сечения спектра ХН — 3LP-HSC на частотах химических сдвигов каждого атома фосфора. Таким способом были однозначно отнесены орто-протоны фенильных колец. Особенно стоит отметить протон Н15 который был идентифицирован с помощью данной методики, хотя в одномерном протонном спектре область, где наблюдается резонанс этого протона, выглядит совершенно неподдающейся интерпретации. На рис. 9.7 также видны небольшие отклики на некоторых других протонах фенильных колец, связанных с фосфором. Они появляются благодаря переносу поляризации за счет дальних протон-фос- форных констант, даже несмотря на то, что задержки At и А2 выбраны в соответствии с величиной константы через три связи с орто-протонами.
Этот пример также иллюстрирует третье преимущество -мощность метода. Ясно, что по стандартам двумерного ЯМР это было «простое» соединение. Как только эксперимент закончен, последующее отнесение является минутным делом. Нет больших трудностей в распространении методики на более сложные задачи, чем эта. Важная особенность заключается в преимуществе совместного использования COSY и HSC, поскольку это позволяет проследить всю структуру молекулы. Начиная с некоторого легко относимого резонансного сигнала, скажем в углеродном спектре, соответствующий протонный сдвиг может быть идеи-
тифицирован из HSC. Тогда COSY позволяет локализовать соседние протоны, с помощью которых в свою очередь можно провести дальнейшее отнесение углеродных сигналов. Для проведения анализа протонного спектра вовсе не нужно, чтобы он имел простую структуру, так как можно локализовать полученные кросс-пики. Пример такого подхода к отнесению безнадежно неразрешенного протонного спектра описан в работе [3]. Некоторые другие методики (например, INADEQUATE или RCT) также дают возможность определить углеродный скелет молекулы. Но совместное использование COSY и HSC наиболее практично. Для реальных задач, когда доступно только ограниченное количество вещества, такое сочетание является лучшим способом их решения.
Эксперименты, родственные HSC
Широкополосная гомоядерная развязка -по Vj в эксперименте HSC
В типичном спектре HSC с довольно низким разрешением по v, наличие гомоядерного протон-протонного взаимодействия является неблагоприятным фактором. Зачастую отдельные линии не разрешаются из-за ограничений оцифровки, и тогда гомоядерное взаимодействие ведет к уширению резонансных сигналов и понижению чувствительности. Для задач с низким разрешением в работе [4] предложен такой вариант эксперимента, который с учетом определенных ограничений позволяет исключить большую часть гомоядерных взаимодействий по Vp
Способ, которым это достигается, состоит в следующем. Допустим, что на 13С-сателлиты линий протонного спектра можно воздействовать селективным л-импульсом, не затрагивая остальные резонансные сигналь!. Пусть протон, присоединенный к 13С, одновременно взаимодействует с другими протонами, связанными с соседними 12 С-атомами. Поэтому, используя такой «полуселективный» импульс, можно инвертировать состояние протона при 13С, не воздействуя на его партнеров по спин- спиновому взаимодействию. В гл. 4 уже было показано, почему гомоядерное взаимодействие обычно не рефокусируется л-импульсами. Причина в том, что оба ядра, вовлеченные в спин-спиновое взаимодействие, инвертировали свои спиновые состояния в результате смены направлений прецессии компонент мультиплета после импульса. Однако этот гипотетический «полуселективный» импульс не инвертирует вектор намагниченности ядра, присоединенного к 12С. Следовательно, поместив его в центре Zt в эксперименте HSC, можно рефокусировать гомоядерное взаимодействие. Исключение, конечно, составят геминальные взаимодействия, поскольку в этом случае оба протона присоединены к 13С.
Остается найти способ инвертирования 13С-сателлитов без воздей-
ствия на другие сигналы. Таким свойством обладает приведенная ниже последовательность, называемая «билинейным оператором поворота»
[5]:■
, (А 11 (А
*Н:-- -
Действие его на протоны, связанные с 13С, и другие («дальние») протоны показано на рис. 9.8. В гл. 10 (разд. 10.2.2) описана последовательность TANGO, которая аналогичным образом действует я/2-импульсом на прямо связанные ядра и я-импульсом на дальние ядра одного и того же типа. Помещая билинейный оператор поворота на место я-импульса по 13С в центре tv последовательности HSC (рис. 9.9), мы получим спектр без гомоядерного взаимодействия по vt (рис. 9.10). Отметим, что в этом спектре еще проявляются геминальные взаимодействия. При этом резонансные сигналы ядер, не вовлеченных в геминальные взаимодействия, стали синглетами по координате vv
Для успешного осуществления данного эксперимента необходимо, чтобы величины гомоядерных и гетероядерных КССВ существенно различались. В работе [4] выдвигается условие, определяющее успех эксперимента. Оно заключается в том, что общая ширина протонных
Рис. 9.8. «Билинейный оператор поворота»; последовательность селективной инверсии для протонов, связанных с гетероядром.'Рис. 9.8. «Билинейный оператор поворота»; последовательность селективной инверсии для протонов, связанных с гетероядром.'
Рис. 9.8. «Билинейный оператор поворота»; последовательность селективной инверсии для протонов, связанных с гетероядром.'
Рис. 9.8. «Билинейный оператор поворота»; последовательность селективной инверсии для протонов, связанных с гетероядром.'
'н: '2^2\2'z 2/'н: '2^2\2'z 2/— "У- 2/”(2)” ^ — д’ — ^ — Д2— развязка
'н: '2^2\2'z 2/
'н: '2^2\2'z 2/
7 выворха
Рис. 9.9. Эксперимент HSC с широкополосной гомоядерной развязкой по коор-динате vP
Рис. 9.10. Спектр HSC (вверху справа), полученный с использованием последовательности, приведенной на рис. 9.9, вместе с протонным и COSY-спектрами того же соединения.
мультиплетов должна быть по крайней мере в 5 раз меньше, чем величина гетероядерной константы. Для прямых констант Н—С это означает, что ширина протонных мультиплетов не должна превышать 25-30 Гц. В то же время диапазон гетероядерных констант должен быть небольшим, поскольку задержка между импульсами в билинейном операторе поворота не должна отклоняться слишком сильно от величины 1/2J. Ошибки в этой задержке, возникающие из-за таких отклонений, приводят к артефактам, которые можно уменьшить с помощью одновременного поворота фазы всех протонных импульсов билинейной последовательности с шагом в 90° при постоянной фазе приемника [6]. Последнее ограничение заключается в том, что поперечные времена релаксации для протонов не должны быть слишком короткими во избежание потери сигнала в течение дополнительного интервала 1/J, помещенного в tt.
Дальние константы 13С—1Н.Последовательность COLO С
Поскольку последовательность HSC содержит фиксированные задержки, определяемые величиной гетероядерного взаимодействия, в случае малых КССВ чувствительность падает за счет поперечной релаксации. Потеря чувствительности возникает при попытке скоррелировать протоны и углероды, связанные спин-спиновым взаимодействием через две или три связи, например в тех случаях, когда нет взаимо-
Ai
'и. 5 (1 п (1 (Ai-fi>— ” д2 развязна
' 22;22
13С:ЛП
"2
Рис. 9.11. Последовательность COLOC. Интервал tv содержащий в центре я-им-пульс, помещается внутрь интервала Др
действий через одну связь, как в примере 1Н-31Р, описанном в разд. 9.2.3. И вот наступает момент, когда задержка Aj больше, чем (1/2)Л(1; тогда стоит использовать модифицированную последовательность, известную как COLOC [8]. Для типичного значения Л( , равного 100 мс, этот момент будет достигнут, когда JHx упадет ниже 20 Гц. Задержки А, и Д2 являются неизбежными, но последовательность COLOC экономит на общей длительности эксперимента за счет включения интервала tv внутрь интервала Дх (рис. 9.11).
Интересно отметить, что последовательность COLOC без дополнительных модификаций дает спектры с широкополосной гомоядерной развязкой по координате Vj. Так как интервал между первым импульсом и шагом переноса поляризации фиксирован, то гомоядерные взаимодействия не подвергаются действию мобильного я-импульса в этом интервале и не модулируют сигнал как функцию tv В то же время на химические сдвиги влияет положение я-импульса, поскольку они рефокусируются за время tt и затем совершают эволюцию в оставшейся части времени Ar Координата vx спектра COLOC содержит, таким образом, только протонные химические сдвиги. При этом наблюдаются корреляции между взаимодействующими ядрами, как и для эксперимента HSC. Однако нужно помнить, что, хотя задержки А, и Д2 определяются в соответствии с величинами интересующих нас малых констант, в спектре могут присутствовать корреляции, обусловленные большими константами. Значения задержек А, определенные для дальних констант, могут оказаться кратными величинам, соответствующим большим константам, что позволяет наблюдать оба типа корреляций. Если это вам мешает, то в эксперимент может быть встроен низкочастотный J-фильтр, упоминаемый в следующем разделе.
Эстафетный перенос когерентности
Введение
Постоянная цель исследований в области спектроскопии ЯМР-найти метод, который позволит провести прямое определение скелета органической молекулы в единичном эксперименте. Двумерный вариант последовательности 13C-13C-INADEQUATE, который мы рассмотрели
в гл. 8, довольно близко подходит к решению данной задачи, однако ценой крайне низкой чувствительности. На другом конце шкалы последовательностей, который ближе к реальной жизни, мы приходим к совместному использованию COSY и HSC. Но это, конечно, два эксперимента, а не один. Где-то между этими крайними точками лежат различные методы эстафетного переноса когерентности (RCT, от англ. Relayed Coherence Transfer). Они имеют существенно более низкую чувствительность, чем HSC, но все же гораздо большую, чем двумерный INADEQUATE, и несут похожую, хотя и не идентичную, информацию.
Эстафетные методики, как правило, основаны на комбинации двух шагов переноса когерентности. Один из них используется для модулирования сигналов и генерации координаты tv Другой остается фиксированным и служит для того, чтобы передавать сигнал в наиболее интересную точку. Например, самая обычная схема состоит в переносе намагниченности от одного протона к другому, а затем на гетероядро, связанное со вторым протоном. В результате исходный протон может быть скоррелирован не только с тем гетероядром, с которым он прямо связан, но и с соседним. Таким образом, возникает требуемая информация о скелете молекулы. Существенную проблему методик этого типа составляет отсутствие общности, потому что при наличии разнообразных спиновых систем и широкого диапазона возможных значений протон-протонных констант оказывается невозможным оптимизировать схему эксперимента. Поэтому к таким экспериментам не стоит обращаться вначале, когда вы беретесь за решение задачи; их можно использовать тогда, когда другие подходы оказались бесплодными.
Эстафета Н—Н—С
Эстафетный Н—Н—С-эксперимент может быть построен на основе HSC [9], как показано на рис. 9.12. Первый шаг-удалить импульс по углероду в конце периода tx, ограничивая таким способом перенос намагниченности к протонам. Для того чтобы сделать возможной передачу к углероду намагниченности, перенесенной между протонами, необходимо выждать, чтобы приняли одинаковую фазу те компоненты мультиплета, которые обусловлены гомоядерным взаимодействием и в данный момент находятся в противофазе. Это происходит в течение периода тт, в котором создается спиновое эхо для исключения влияния химических сдвигов (рис. 9.12, последовательность 5). Теперь мы возвращаемся в состояние, подобное HSC, и, как обычно, должны выждать время Aj для того, чтобы компоненты мультиплета, обусловленные гетероядерным взаимодействием, стали противофазными перед тем, как завершить перенос намагниченности с помощью импульсов по протонам и углероду. Задержка Д2 выполняет ту же функцию, что и в последовательности HSC. Последняя модификация состоит в том, чтобы поместить протонные и углеродные л-импульсы в центры задержек Aj и Д2. Это необходимо, как и раньше, для фазочувствительных спектров,
АА1Н:”С:1Н:”С:развязкаЬыборкаразвязкаЬыборкаББ
А
А
1Н:
”С:
1Н:
”С:
развязка
Ьыборка
развязка
Ьыборка
Б
Б
Ь: * « #1Ь: * « #1°C:°C:!L«-Ilet4i)—> г, «_ 1Тт±4|)п*_Д; ^ ^развязка
Ь: * « #1
Ь: * « #1
°C:
°C:
222222
я«- 5j->2«-52 -»я*- 52 —>Ьыбор«а
2 222
Рис. 9.12. Построение эстафетного Н-Н-С-эксперимента на основе HSC: Анормальный HSC; Б- добавление второго шага протон-протонного переноса перед гетероядерным переносом; 8-оптимальная последовательность (см. текст).
поскольку такая процедура и в случае эстафетного эксперимента оптимизирует процесс переноса намагниченности [9]. На протоны действуют два последовательных я-импульса, которые оказывается возможным слить в один. Он помещается посередине между второй парой протонных л/2-импульсов (вообще-то я бы рекомендовал не беспокоиться по поводу этих деталей!). Последовательность В (см. рис. 9.12) оптимальна для эстафетного Н—Н—С-эксперимента.
Камнем преткновения в этом эксперименте является интервал тт, который должен регулироваться в соответствии с типом протонной спиновой системы и величинами КССВ. В литературе проанализированы некоторые детали этой проблемы. Например, работа [10] включает графики зависимости эффективности переноса намагниченности от величины т для различных спиновых систем. Отметим, что в этой статье используется обозначение т, относящееся к общему времени смешивания, которое в наших обозначениях соответствовало бы т„ + Ар В отсутствие точной оценки значения тт (ясно, что, строго говоря, этого нельзя сделать для неизвестной структуры) выбирается величина, равная примерно 1/5JHh- Типичные значения протон-протонных констант составляют около 7 Гц. Следовательно, значение т„ надо устанавливать равным примерно 28 мс. Несогласованность величины тт с требованиями спиновой системы может приводить к очень сильному ослаблению сигналов переноса намагниченности в эстафетных экспериментах.
В самом лучшем эксперименте RCT чувствительность, вероятно, в 4 раза меньше, чем при использовании HSC.
Использование RCT
На рис. 9.13 приведен пример использования эстафеты Н—Н—С. Здесь сравниваются схематические спектры HSC и RCT для фрагмента типа НА—СА—Св—Нв. В спектре HSC кросс-пики появляются при химических сдвигах (НА, СА) и (Нв, Св). В эстафетном спектре Н-Н-С эти пики еще присутствуют, однако они скомбинированы с другими при (НА, Св) и (Нв, СА), возникающими в результате косвенного переноса намагниченности. Таким образом, углеродный скелет молекулы может быть прослежен через вицинальные протон-протонные взаимодействия. На рис. 9.14 приведен реальный эстафетный спектр Н-Н-С для соединения 2.
То, что непосредственно связанные атомы все еще дают кросс-пики в спектрах переноса когерентности по типу эстафеты, весьма неудобно. Поэтому был предложен метод [11], ослабляющий кросс-пики между «соседями». Он основан на использовании разницы между величинами прямых и дальних углерод-протонных КССВ. Этот «низкочастотный J-фильтр», в принципе хотя и привлекателен, однако содержит практически неудобный длинный фазовый цикл, увеличивающий минимальное число прохождений на каждый инкремент tt до уровня, который во многих случаях может оказаться неприемлемым.
Было предложено множество разнообразных экспериментов по эстафетному переносу когерентности: Н-С-С [12], Н-Х-Н [13] (к сожалению, обозначенный термином HERPECS) и С-Н-Н [14]. Очевидно, что применение этих методов зависит от конкретных обстоятельств. Например, эстафета Н-С-С сходна с INADEQUATE и требует, чтобы в молекуле находились рядом два атома 13С. Следовательно, для необогащенных систем этот метод очень мало чувствителен. Однако в этом отношении он немного лучше, чем INADEQUATE,
Рис. 9.13. Схематическое представление спектра HSC (слева) и эстафетного спектра Н-Н-С (справа).
CgClCgCgClCg135130125 120115110105100 95м.8.135130125 120115110105100 95м.8.si 5^4 S3 W 5 SO 49 4,8 4,7 46 45 M.8.si 5^4 S3 W 5 SO 49 4,8 4,7 46 45 M.8.I 1 I 1 Ir-|—г I I130 120 110 100 M.8.I 1 I 1 Ir-|—г I I130 120 110 100 M.8.HSCIHSCIII-4,4-4,6-4,8-5,0-5,2-5,4—5,6-4,4-4,6-4,8-5,0-5,2-5,4—5,6130 120 11O 100м.8.130 120 11O 100м.8.
CgClCg
CgClCg
135130125 120115110105100 95
м.8.
135130125 120115110105100 95
м.8.
si 5^4 S3 W 5 SO 49 4,8 4,7 46 45 M.8.
si 5^4 S3 W 5 SO 49 4,8 4,7 46 45 M.8.
I 1 I 1 Ir-|—г I I
130 120 110 100 M.8.
I 1 I 1 Ir-|—г I I
130 120 110 100 M.8.
HSC
I
HSC
I
I
I
-4,4
-4,6
-4,8
-5,0
-5,2
-5,4
—5,6
-4,4
-4,6
-4,8
-5,0
-5,2
-5,4
—5,6
130 120 11O 100м.8.
130 120 11O 100м.8.
Рис. 9.14. Эстафетный спектр H-H-C для соединения 2. Прямые корреляции помечены N (для «соседей»), а эстафетные корреляции-R (для «дальних»). Отметим, как заметно изменяется интенсивность пиков вплоть до того, что в одном случае “N’’-пик полностью отсутствует. Такие изменения амплитуды сигнала являются основным слабым местом в данном эксперименте.
и может быть оптимизирован для определения четвертичных углеродов. Эстафета Н-Х-Н основана на регистрации протонов и является потенциально чувствительным экспериментом, который может заполнить пустоты в сетке взаимодействий при корреляции протонов через общее гетероядро. Он имеет то преимущество, что вообще не требует измерений на гетероядрах, и должен быть весьма практичным для ядер с большим естественным содержанием, таких, как 31Р.
Литература
Neuhaus D., Keeler J., Freeman R., J. Mag. Res., 61, 553-558 (1985).
Alcock N. W„ Brown J. M„ Derome A. E., Lucy A. R., J. Chern. Soc. Chern. Com- mun., 575-578 (1985).
Bhacca N. S., Balandrin M. F„ Kinghorn A. D„ Frenkiel T. A., Freeman R„ Morris G.A., J. Amer. Chem. Soc., 105, 2538-2544 (1983).
Bax A., J. Mag. Res., 53, 517-520 (1983).
Garbow J.R., Weitekamp D.P.. Pines A., Chem. Phys. Lett., 93, 504 (1982).
Bolton P.H., Wilde J. A., J. Mag. Res., 59, 343-346 (1984).
Morris G.A., Smith К.Ц J. Mag. Res., 65, 506-509 (1985).
Kessler H,, Griesinger C., Zarbock J., Loosli H. R., J. Mag. Res., 57, 331-336 (1984).
Kessler H., Bernd M., Kogler FL, Zarbock J., Sorensen O. W., Badenhausen G„ Ernst R.R., J. Amer. Chem. Soc., 105, 6944-6952 (1983).
Sarkar S.K., Вах A., J. Mag. Res., 63, 512-523 (1985).
Kogler Н., Sorensen О. W„ Badenhausen G„ Ernst R.R., J. Mag. Res., 55, 157-163 (1983).
Kessler H., Bermel W, Griesinger C., J. Mag. Res., 62, 573-579 (1985).
DelsucM.A., Guittet E., Troitin N., Lallemand J. ¥., J. Mag. Res., 56, 163-166 (1984); Neuhaus D., Wider G., Wagner G., Wuthrich K., J. Mag. Res., 57, 164-168 (1984).
Field L.D., Messerie B.A., J. Mag. Res., 62, 453-460 (1985).
Глава 10
Спиновое эхо и J-спектроскопия
Введение
Теперь мы рассмотрим эксперименты, которые включают спиновое эхо, такие, как INEPT, INADEQUATE и RCT. Во всех этих примерах эхо используется не для того, чтобы добавить что-либо новое к эксперименту. Оно устраняет влияние химического сдвига. Есть еще один класс экспериментов, в которых эхо непосредственно определяет получаемый результат. Они объединены здесь под общим названием «J-спектроскопия», подчеркивающим тот факт, что влияние структуры мультиплета на вид окончательного спектра представляет главную особенность этих экспериментов. J-Спектроскопии было уделено большое внимание на раннем этапе развития двумерного ЯМР, и ее теоретические и практические аспекты были весьма подробно проанализированы. Однако вследствие различных обстоятельств большинство из этих экспериментов не имеет столь общего применения, как корреляции химических сдвигов, рассмотренные нами в двух предыдущих главах. По этой причине и из-за доступности обширной литературы я не буду излагать этот вопрос детально, а просто представлю короткий обзор основных экспериментов по спиновому эху и некоторых их приложений.
Гетероядерная J-модуляция и спиновое эхо
Введение
Обсуждение вопроса удобно начинать с рассмотрения именно этого эксперимента, потому что его легко понять, используя векторную модель во вращающейся системе координат. В гл. 4 (разд. 4.4.4) я отметил, что если вы выполняете эксперимент по спиновому эху в гетеро- ядерной системе, то у вас есть право выбора, рефокусировать ли гетероядерное взаимодействие или нет, поскольку вы можете действовать л-импульсом на второе ядро, а можете и не действовать. Если вы выбираете метод, основанный на использовании л-импульса в соответствии с последовательностью
Y:л (.Развязка...)
Рис. 10.1. Последовательность спинового эха для гетероядерной системы АХ.
где X-наблюдаемое ядро (например, 13С), a Y-другое ядро (например, 1Н), то в таком случае эхо не рефокусирует константу спин-спинового взаимодействия. Широкополосная развязка от Y по желанию может быть включена или выключена во время регистрации, а подходящим образом подобрав т, можно получить интересные эффекты, зависящие от величины константы спин-спинового взаимодействия между X и Y. Это довольно легко понять на основе векторной модели во вращающейся системе координат.
Рис. 10.1 показывает результаты действия этой последовательности для групп XY и XY2 в предположении, что X и Y имеют спины 1/2 (например, ядро 13С и протоны метановой и метиленовой групп) и т равно 1/2J. Для группы XY сигнал X является дублетом, и, следовательно, если мы совместим опорную частоту с его центром, то увидим две компоненты, сдвинутые на + J/2 Гц во вращающейся системе координат. Через промежуток времени, равный 1/2J, они повернутся на угол + 1/2J х J/2, т. е. на 1/4 оборота, и будут направлены вдоль осей ±х. В течение второй половины последовательности они продолжают движение в том же самом направлении, так как л-импульс по ядру Y обменивает все а- и P-состояния; в то же время импульс лу по ядру X меняет местами две компоненты, поэтому к началу периода регистрации они обе выстраиваются вдоль оси — у. Теперь мы можем спокойно включить широкополосную развязку по Y и регистрировать спектр на ядре X, который содержит синглет. В результате при обычной коррекции фазы сигналы, ориентированные в начальный момент вдоль положительного направления оси +у, дадут синглет с перевернутой фазой.
Для группы XY2 сигнал X представляет собой триплет (рис. 10.2). Если мы совместим опорную частоту с центром триплета, то в таком случае одна линия остается в покое вдоль оси +у, тогда как крайние компоненты мультиплета поворачиваются в противоположных направлениях на угол +J. Поскольку они двигаются вдвое быстрее, чем дублетные компоненты, в момент действия л-импульса они совместятся друг с другом и направлением оси — у и возвратятся в исходное состояние вдоль оси +у к началу регистрации. Таким образом, полученный развязанный сигнал имеет фазу, противоположную той, которая была получена для группы XY. Следовательно, эксперимент позволяет различать число протонов, присоединенных к ядру X, и в этом смысле
—ЬыОорко(рсмбйвка)—ЬыОорко(рсмбйвка)£ (Н
—ЬыОорко
(рсмбйвка)
—ЬыОорко
(рсмбйвка)
Рис. 10.2. Та же последовательность, что и на рис. 10.1, но только для системы
Рис. 10.3. Альтернативный «метод переключаемого декаплера» для осуществления гетероядерной J-модуляции спинового эха.Рис. 10.3. Альтернативный «метод переключаемого декаплера» для осуществления гетероядерной J-модуляции спинового эха..ах2.
Рис. 10.3. Альтернативный «метод переключаемого декаплера» для осуществления гетероядерной J-модуляции спинового эха.
Рис. 10.3. Альтернативный «метод переключаемого декаплера» для осуществления гетероядерной J-модуляции спинового эха.
конкурирует с внерезонансной развязкой и методами редактирования спектров. Если мы повторим эту процедуру для групп X (т. е. четвертичного углерода) и XY3 (т. е. метила), то оказывается, что эксперимент для группы X приводит к той же самой фазе, что и в случае группы XY2, а для группы XY3-KaK в случае XY. В общем, все сигналы от ядер, прямо связанных с четным числом протонов, имеют фазу, противоположную по отношению ко всем сигналам ядер X, имеющих нечетное число непосредственно связанных протонов.
Интересно, что тот же самый эксперимент можно провести без применения импульса по ядру Y. Достаточно только включить на некоторое время декаплер, как показано на рис. 10.3. Так как развязка, по существу, «замораживает» компоненты мультиплета, где бы они ни находились во вращающейся системе координат в момент ее включения, то, установив т = 1/J и включив декаплер одновременно с л-импульсом по X, мы получим желаемый результат. Тот же эффект достигается выключением декаплера в течение первой части эха, включением его во время второго интервала т и в период регистрации. Описанные два эксперимента одинаковы только тогда, когда нужны развязанные сигналы. Если развязка не используется во время регистрации, то первый эксперимент приводит к экзотическим результатам [1].
Все эти последовательности дают спектры, в которых сигналы групп с четным и нечетным числом протонов различаются по фазе (рис. 10.4). Поскольку в эксперименте по J-модулированному спиновому эху регистрация происходит с широкополосной развязкой, получаемые
Рис. 10.4. Нормальный спектр ЯМР 13С (внизу, часть спектра холестерилацетата) и спектр J-модулированного эха (вверху, метод переключаемого декаплера при т = 1/J). Фаза спектра приведена к такому виду, что сигналы групп СН2 и четвертичных углеродов положительны, а групп СН3 и СН отрицательны.
в этом случае разрешение и чувствительность значительно выше, чем при использовании внерезонансной развязки. В то же время он менее информативен, поскольку группы X и XY2 неразличимы, так же как и группы XY и XY3. Надо иметь в виду, что доведенная до конца расшифровка спектра должна давать лучшие результаты, чем любой из этих двух методов; она позволяет различить все типы групп, но требует больше внимания к экспериментальным деталям. Эксперимент с J-модуляцией, выполненный с помощью переключения декаплера (такие эксперименты менее трудоемки из-за того, что не требуют проведения калибровки амплитуды импульса декаплера), иногда может быть полезным для быстрого отнесения. Прежде всего его следует использовать, когда спектр с внерезонансной развязкой оказывается слишком перегруженным сигналами или зашумленным и кажется, что постановка эксперимента DEPT требует слишком много хлопот.
Большая проблема для эксперимента по J-модулированному спиновому эху заключается в том, что задержка т зависит от значения J. В реальных ситуациях мы встречаемся с широким диапазоном величин J, который, например, для прямых углерод-протонных констант составляет примерно 125-210 Гц. Любое отклонение от условия т = 1/J (или 1/2J) ведет к понижению амплитуды детектируемых сигналов. В крайней ситуации, когда т = 1/2J для эксперимента с переключением декаплера (или 1/4J для импульсного эксперимента), сигналы всех ядер, за исключением тех, которые не имеют связанных с ними протонов, оказываются
Рис. 10.5. Нулевое условие (т = 1/4 J) для взаимодействующих ядер в эксперименте по гетероядерному J-модулированному спиновому эху.
I—I—1—1—I—I—I—I—I—Г—I1Г" Г" I11—I—I—I—I—I—I—I—г-1—I—I1—I—I—I—г-
7060S0<03020
м.З.
Рис. 10.6. Идентификация четвертичных углеродов с использованием нулевого условия (тот же пример, что и на рис. 10.4). Обнуление сигналов протонированных углеродов зависит от точности задания задержки т, поэтому, если есть разброс в значениях констант спин-спинового взаимодействия, некоторые сигналы устраняются не до конца.
нулевыми (рис. 10.5 и 10.6). Эта зависимость амплитуды сигналов от длительности т дает нам ключ к тому, как обобщить эксперимент. К этому я еще вернусь.
Разностное спиновое эхо
Фазовое поведение J-модулированного эха может быть использовано как основа для простой техники расшифровки спектров. Рассмотрим специфический пример-вещество, содержащее единственную метку 13С. Мы выполним эксперимент по J-модулированному эху наоборот, используя развязку по углероду и наблюдение протонов. Использование широкополосной развязки по углероду является характерной чертой методов с составными импульсами, описанными в гл. 7. Если ваш
спектрометр не дает таких возможностей, то для эха можно использовать импульсный метод, и в получаемом протонном спектре будет наблюдаться взаимодействие с 13С. В данном случае мы должны рассмотреть только группы «X» (т.е. протоны, присоединенные к 12С) и группы «XV» (т.е. протоны, присоединенные к метке 13С). Если мы принимаем, что протон-протонные константы настолько меньше, чем углерод-протонные, что их влияние пренебрежимо мало в течение интервала т, равного 1/7Сн, то анализ проводится точно так же, как и раньше. Положим, что мы выполняем два эксперимента:
1Н:^^ — т — лу — т — Выборка ...
13С:Развязка ...
и
Н:— т — лу — т — Выборка ...
13С:Развязка ...
Первый из них ведет к нормальному спектру, поскольку взаимодействие углерод-протон рефокусируется вместе со всеми другими. Однако во втором эксперименте включение развязки в течение второй половины последовательности останавливает рефокусировку взаимодействия. Таким образом, сигналы от протонов, связанных с меткой 13С (и только эти протоны), инвертируются во втором эксперименте. Вычитание двух спектров усиливает сигналы протонов, присоединенных к метке, и погашает сигналы всех других (рис. 10.7). Так же как и в случае разностных экспериментов, уровень погашения будет зависеть от многих аспектов конструкции спектрометра. Практически мы можем ожидать понижения амплитуды нежелательных пиков в несколько сот раз.
Достоинство этого эксперимента заключается в том, что он соединяет в себе селективную природу метки 13С с чувствительностью протонного детектирования. В противоположность обращенному DEPT (гл. 6) мы должны иметь полную чувствительность по протонам. Потеря сигнала происходит только через механизм поперечной релаксации в течение эха. Обращенный DEPT переносит углеродные заселенности к протонам, понижая таким образом чувствительность в 1,3-4 раза; частота повторения также определяется значениями Т^ для углеродов. В то же время эксперимент по обратному переносу поляризации дает много лучшее подавление сигналов протонов, присоединенных к 12С, так как они могут быть насыщены при широкополосном облучении между прохождениями. Поскольку технические требования этих двух конкурирующих экспериментов довольно различны, имеет смысл рассмотреть оба эксперимента при планировании действий по решению проблемы метки. Примеры использования разностного спинового эха даны в работе [2].
150100 SO О -50-100 -ISOГц150100 SO О -50-100 -ISOГцРис. 10.7. Принцип разностного спинового эха (протонный спектр муравьиной кислоты, обогащенной по 13С на 60%; импульсный метод был использован таким образом, чтобы была видна линия от необогащенного соединения). Получены два спектра: один с использованием л-импульса по 13С (вверху слева) и другой без этого импульса (внизу слева). В разностном спектре (справа) сигналы, обусловленные спин-спиновым взаимодействием, рефокусируются, а сигналы ядер, не имеющих констант, исчезают.Рис. 10.7. Принцип разностного спинового эха (протонный спектр муравьиной кислоты, обогащенной по 13С на 60%; импульсный метод был использован таким образом, чтобы была видна линия от необогащенного соединения). Получены два спектра: один с использованием л-импульса по 13С (вверху слева) и другой без этого импульса (внизу слева). В разностном спектре (справа) сигналы, обусловленные спин-спиновым взаимодействием, рефокусируются, а сигналы ядер, не имеющих констант, исчезают.I , • • • • I I I I I J I 11*
150100 SO О -50-100 -ISO
Гц
150100 SO О -50-100 -ISO
Гц
Рис. 10.7. Принцип разностного спинового эха (протонный спектр муравьиной кислоты, обогащенной по 13С на 60%; импульсный метод был использован таким образом, чтобы была видна линия от необогащенного соединения). Получены два спектра: один с использованием л-импульса по 13С (вверху слева) и другой без этого импульса (внизу слева). В разностном спектре (справа) сигналы, обусловленные спин-спиновым взаимодействием, рефокусируются, а сигналы ядер, не имеющих констант, исчезают.
Рис. 10.7. Принцип разностного спинового эха (протонный спектр муравьиной кислоты, обогащенной по 13С на 60%; импульсный метод был использован таким образом, чтобы была видна линия от необогащенного соединения). Получены два спектра: один с использованием л-импульса по 13С (вверху слева) и другой без этого импульса (внизу слева). В разностном спектре (справа) сигналы, обусловленные спин-спиновым взаимодействием, рефокусируются, а сигналы ядер, не имеющих констант, исчезают.
ISO 100500-50-100 -150
Гц
Для многих случаев простое разностное спиновое эхо, возможно, будет давать недостаточное подавление сигналов протонов, не связанных с меткой. К счастью, эксперимент можно улучшить, если заменить л/2-импульс последовательностью, известной как TANGO [3]. Эта последовательность для селективного возбуждения действует по-разному на ядра разного типа в соответствии с тем, связаны они с гетероядром или нет, действуя как л/2-импульс на связанные ядра и как л-импульс в противном случае. Это достигается с помощью спинового эха:
На рис. 10.8 показано действие этой последовательности при т, равном 1/2^сн- Сравним эту последовательность с «билинейным оператором поворота», введенным в гл. 9 (разд. 9.3.1). Последовательность TANGO сама по себе обычно не дает адекватного подавления сигналов протонов, не связанных с меткой, но в сочетании с разностным спиновым эхом получаемые результаты сравнимы с достигаемыми при использовании обращенного DEPT, но при этом с лучшей чувствительностью. В этом
Рис. 10.8. Последовательность TANGO для селективного возбуждения ядер, имеющих гетероядерную константу.
Рис. 10.9. Селективное детектирование протонов, присоединенных к метке 13С, с помощью разностного спинового эха; начальный тг/2-импульс заменен последовательностью TANGO. Во время регистрации применяется широкополосная развязка по 13С. Подавление сигналов от необогащенных молекул подобно тому, что получается при использовании обращенного DEPT, но чувствительность значительно выше. Это тот же самый образец, который использовался для рис. 6.19, однако эксперимент был проведен спустя некоторое время; в слабопольной области относительно основного сигнала видны некоторые сигналы от продуктов разложения вещества, содержащего изотопную метку.
можно убедиться, сравнив рис. 10.9, демонстрирующий спектр, полученный при сочетании TANGO и разностного спинового эха, с рис. 6.19 в гл. 6, на котором для того же самого соединения изображен эксперимент обращенного DEPT.
Гетероядерный J-спектр
Введение
Рассмотрим последовательность J-модулированного эха с применением импульсного метода, однако в то же время вместо тщательно определенного интервала г мы будем использовать произвольный интервал tjl. Ниже я буду повсюду говорить о наблюдении связанных спин-спиновым взаимодействием ядер *Н и 13С, но, конечно, это может быть любая пара ядер: . 13С: ^ - у - л,, - у- Выборка ...
‘Н: тг Развязка ...
Исследуя рис. 10.10, мы можем проследить за поведением дублета. В течение данной последовательности каждая компонента отклоняется на угол тгТ^. Поскольку мы собираемся включить развязку во время регистрации, главный интерес представляет результирующая этих компонент. Проецируя их на оси х и j, мы получим величину М cos ^Jt J вдоль оси у, в то время как проекции компонент вдоль оси х направлены в противоположные стороны и взаимно погашаются. Таким образом, к началу регистрации детектируемый вектор намагниченности всегда направлен вдоль оси +у, т. е. он имеет постоянную фазу, не зависящую от Однако его амплитуда подвержена модуляции, характер которой определяется величиной константы спин-спинового взаимодействия.
Рис. 10.10. Амплитудная модуляция сигнала углерода группы СН-основа ге- тероядерной J-спектроскопии.
Отметим, что эта чисто амплитудная модуляция возникает как результат симметричного расположения компонент дублета, которое в свою очередь обусловлено тем, что спиновая система имеет первый порядок. В более сложном случае, включающем взаимодействия как между протонами, так и между протонами и углеродом, в системе может встретиться порядок, отличный от первого. Тогда предположение, что мультиплеты должны быть симметричными относительно их центров, оказывается несостоятельным. Это может привести к заметному усложнению вида спектра. Я буду везде подразумевать взаимодействия исключительно первого порядка; более детальный анализ данного вопроса представлен в работе [4].
Если проследить за применением показанной выше последовательности к группам СН2 и СН3, то можно убедиться, что в основном линии показывают амплитудную модуляцию в течение ?г, степень которой зависит от их положения относительно центра мультиплета. Это означает, что если мы выполняем двумерный эксперимент с варьируемыми ?!, то координата Vj будет содержать только мультиплетную структуру, в то время как v2 будет содержать только химические сдвиги, так как регистрация происходит с широкополосной развязкой. Это и есть J-спектр; он соответствует протонно-связанному углеродному спектру, в котором мультиплетные структуры разных сигналов разошлись в пространстве и стали направленными по второй координате. Тот же самый эксперимент может быть выполнен с использованием переключения декаплера вместо тг-импульса на протонах, как описано выше для одномерного J-модулированного эха (эксперимент с «переключаемым декаплером»). В этом случае из-за того, что J-модуляция происходит только в течение половины tv, расстояния между линиями по этой координате уменьшаются вдвое. В зависимости от обстоятельств это можно рассматривать и как полезное, и как нежелательное свойство.
Примеры гетероядерных J-спектров
Существуют две до некоторой степени крайние ситуации, когда выгодно применять гетероядерный J-спектр: стремление либо к очень высокому, либо к очень низкому разрешению по координате v^ В первом случае эксперимент используется в качестве средства разделения мультиплетов, которые перекрывались бы в обычном спектре; он также имеет то преимущество, что устраняет неоднородность за счет спинового эха. Во втором случае это скорость и высокая чувствительность при определении мультиплетности интересующих нас сигналов. Для большинства структурных проблем применяется быстрый эксперимент с низким разрешением, но я буду обсуждать оба. '
Эксперимент с высоким разрешением по координате vr Так же как и в эксперименте с высоким разрешением, в J-спектре можно наблюдать мультиплеты с естественными ширинами линий. Это происходит из-за
того, что огибающая сигнала в течение tv определяется истинным значением Тг, а не Г?, когда спиновое эхо устраняет неоднородность магнитного поля. (Как и обычно в случае спинового эха, ограничения возникают вследствие диффузии внутри образца.) Однако использованию этой особенности могут мешать другие практические трудности. Если наблюдаются истинные ширины линий, то потребуется тонкая оцифровка по координате vt, поскольку значения Тг для углеродов могут быть большими, зачастую достигая 10 с и выше.
Идеальными были бы времена регистрации, в несколько раз большие, чем величины Т2, однако при этом потребуется много инкрементов по ц при небольшой ширине спектра по этой координате. Самыми широкими мультиплетами у протонно-связанных углеродов являются квартеты, возникающие для метильных групп. Имея в виду, что прямая КССВ не превышает 200 Гц, нам может потребоваться оцифровать диапазон спектра в 600 Гц (для эксперимента с импульсами по протонам). Это означает, что инкремент по tY должен быть около 0,8 мс. Чтобы получить время регистрации по tx хотя бы 10 с, мы должны, таким образом, сделать более тысячи прохождений. Это редко удается, так как частота повторения эксперимента определяется временами Тх для 13С и поэтому оказывается достаточно малой. Чувствительность также будет низкой, поскольку многие эксперименты необходимо проводить с большими значениями А, ; следовательно, время регистрации по v2 должно быть не меньше чем Т^, даже если меньшие значения давали бы приемлемое разрешение по этой координате. Одновременное выполнение двух этих условий приводит к очень большим массивам данных.
Может показаться, что вариант эксперимента с переключаемым декаплером уменьшает проблему оцифровки по vt (фактически вдвое) из-за того, что в этом методе диапазон спектра вдвое уже. Однако при этом желаемое нами разрешение, а также расстояние между линиями также будут вдвое меньше, что, напротив, создает проблему для получения высокого разрешения. Для описанных ниже экспериментов с низким разрешением уменьшение диапазона спектра оказывается полезным. Кроме того, есть и другие преимущества использования метода переключаемого декаплера перед импульсным, которые мы обсудим в разд. 10.3.3.
Приняв во внимание все эти соображения и имея известное терпение, при необходимости, если того потребует эксперимент, можно получить довольно высокое разрешение в J-спектре. Хотя массив данных может иметь большой объем, нужно всего лишь, чтобы было место для его хранения, так как его обработка, как правило, не вызывает серьезных проблем, поскольку можно не выполнять полное двумерное преобразование. Вместо этого достаточно преобразовать только по координате v2 и затем для преобразования по v2 выбирать единичные столбцы, соответствующие интересующим нас химическим сдвигам. Эти сечения могут быть дополнены нулями и преобразованы с большим числом точек как обычные одномерные спектры. На рис. 10.11 показаны выде-
^Д^1рН>-»вГч^Д^1рН>-»вГчm.>(cHu>.»W-W ГцШIHllUK^^bl.tjrum.>(cHu>.»W-W ГцШIHllUK^^bl.tjruСе। ’/(СНМвв ГцСе। ’/(СНМвв ГцAruwmiyj-icrqAruwmiyj-icrqРис. 10.11. Сечения через координату v, гетероядерного J-спектра металлоорганического соединения с высоким разрешением по vt. В принципе таким образом могут быть получены естественные ширины линий.Рис. 10.11. Сечения через координату v, гетероядерного J-спектра металлоорганического соединения с высоким разрешением по vt. В принципе таким образом могут быть получены естественные ширины линий.
^Д^1рН>-»вГч
^Д^1рН>-»вГч
m.>(cHu>.»W-W Гц
ШIHllUK^^bl.tjru
m.>(cHu>.»W-W Гц
ШIHllUK^^bl.tjru
Се
। ’/(СНМвв Гц
Се
। ’/(СНМвв Гц
Aruwmiyj-icrq
Aruwmiyj-icrq
Рис. 10.11. Сечения через координату v, гетероядерного J-спектра металлоорганического соединения с высоким разрешением по vt. В принципе таким образом могут быть получены естественные ширины линий.
Рис. 10.11. Сечения через координату v, гетероядерного J-спектра металлоорганического соединения с высоким разрешением по vt. В принципе таким образом могут быть получены естественные ширины линий.
ленные таким образом сечения из J-спектра металлоорганического соединения. Отметим, что, хотя сам двумерный спектр следует представлять в виде магнитуды (ограничения, определяющие этот выбор, мы обсудим ниже в разд. 10.3.3), отдельные сечения могут быть настроены по фазе на сигнал чистого поглощения.
Основным неблагоприятным фактором для получения высокораз- решенных гетероядерных констант с помощью J-спектра является относительно большая ширина спектра, которая определяется наличием больших по величине прямых констант. Если вас в этой ситуации в первую очередь интересует тонкая мультиплетная структура, обусловленная дальними константами (т. е. константами через две и три связи в спектре 13С), то для этого случая предложен хороший альтернативный подход [15]. Замена п-импульса в центре периода г, «билинейным оператором поворота», уже рассмотренным в гл. 9 (разд. 9.3.1), устраняет J-модуляцию, вызванную большими прямыми константами за счет рефокусировки соответствующих компонент мультиплетов. Малые константы при этом не подвергаются воздействию и поэтому модулируют сигнал как функцию ^. Эта процедура понижает требуемый диапазон спектра до ширины мультиплета, обусловленной дальними константами, и делает возможной тонкую оцифровку по координате vP
Эксперимент с низким разрешением по координате vP Традиционной проблемой в спектроскопии ЯМР 13С является определение числа протонов, связанных с каждым атомом углерода. Мы рассмотрим сейчас два способа, альтернативных традиционному методу внерезо- нансной развязки: редактирование спектра посредством переноса поля-
ризации и применение J-модуллрованного спинового эха. Используя J-спектр, можно заполнить пробел между неполной информацией, предоставляемой одномерным экспериментом по спиновому эху, и полной, оцененной экспериментально с использованием процедуры редактирования на основе J-спектра. Когда структуры 13С-мультиплетов присутствуют на координате v^ очевидно, что там содержится вся желаемая информация. Но если речь идет о сравнении данного эксперимента с конкурирующими методами, то сделать это нужно быстро и с высокой чувствительностью. Для этого требуется определить, каково минимально приемлемое число инкрементов по Zt, при котором еще не происходит потери разрешения.
Для данного эксперимента с низким разрешением мы, естественно, выбрали метод с переключением декаплера, который обеспечивает минимальную ширину спектра по vt и более удобен в работе. Обсуждая вопрос о цифровом разрешении в гл. 8 (разд. 8.3.5), мы убедились в том, что для получения эффективной ширины линии 5v нам нужно время регистрации l/5v. Теперь, если минимальное значение прямой угле- род-протонной константы будет около 130 Гц, в эксперименте с переключением декаплера расстояние между линиями уменьшается до 65 Гц.
ввгг28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 , м.а.28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 , м.а.Рис. 10.12. J-Спектр с низким разрешением по vt обеспечивает быстрое определение мультиплетности (часть спектра 13С холестерилацетата, экспериментальные условия описаны в тексте). Спектр 1Н с широкополосной развязкой (Л) приведен над контурным представлением J-спектра (5), а спектр с внерезонансной развязкой (В) можно сравнить с вертикальными сечениями через vt (Г). Сечения 1-4 позволяют очень хорошо определить мультиплетности, а в сечениях 5 и 6 отчетливо обнаруживается недостаточное разрешение по v2. Вследствие перекрывания триплета и квартета в двумерном эксперименте на этих срезах картина выглядит запутанной. Ее можно исправить, если несколько увеличить время регистрации по v2 или даже просто дополнить нулями по этой координате.Рис. 10.12. J-Спектр с низким разрешением по vt обеспечивает быстрое определение мультиплетности (часть спектра 13С холестерилацетата, экспериментальные условия описаны в тексте). Спектр 1Н с широкополосной развязкой (Л) приведен над контурным представлением J-спектра (5), а спектр с внерезонансной развязкой (В) можно сравнить с вертикальными сечениями через vt (Г). Сечения 1-4 позволяют очень хорошо определить мультиплетности, а в сечениях 5 и 6 отчетливо обнаруживается недостаточное разрешение по v2. Вследствие перекрывания триплета и квартета в двумерном эксперименте на этих срезах картина выглядит запутанной. Ее можно исправить, если несколько увеличить время регистрации по v2 или даже просто дополнить нулями по этой координате.
в
в
г
г
28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 , м.а.
28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 , м.а.
Рис. 10.12. J-Спектр с низким разрешением по vt обеспечивает быстрое определение мультиплетности (часть спектра 13С холестерилацетата, экспериментальные условия описаны в тексте). Спектр 1Н с широкополосной развязкой (Л) приведен над контурным представлением J-спектра (5), а спектр с внерезонансной развязкой (В) можно сравнить с вертикальными сечениями через vt (Г). Сечения 1-4 позволяют очень хорошо определить мультиплетности, а в сечениях 5 и 6 отчетливо обнаруживается недостаточное разрешение по v2. Вследствие перекрывания триплета и квартета в двумерном эксперименте на этих срезах картина выглядит запутанной. Ее можно исправить, если несколько увеличить время регистрации по v2 или даже просто дополнить нулями по этой координате.
Рис. 10.12. J-Спектр с низким разрешением по vt обеспечивает быстрое определение мультиплетности (часть спектра 13С холестерилацетата, экспериментальные условия описаны в тексте). Спектр 1Н с широкополосной развязкой (Л) приведен над контурным представлением J-спектра (5), а спектр с внерезонансной развязкой (В) можно сравнить с вертикальными сечениями через vt (Г). Сечения 1-4 позволяют очень хорошо определить мультиплетности, а в сечениях 5 и 6 отчетливо обнаруживается недостаточное разрешение по v2. Вследствие перекрывания триплета и квартета в двумерном эксперименте на этих срезах картина выглядит запутанной. Ее можно исправить, если несколько увеличить время регистрации по v2 или даже просто дополнить нулями по этой координате.
Максимально приемлемая ширина линии, не приводящая к неразрешенным линиям, должна быть меньше этого расстояния, скажем 40 Гц. Из этого вытекает время регистрации по v^ равное 25 мс. Диапазон спектра составляет 300 Гц, следовательно, нам нужно около 15 инкрементов. В этом случае во избежание искажений формы пиков сильно усеченный сигнал по этой координате должен быть умножен на тщательно подобранную взвешивающую функцию. На рис. 10.12 показан спектр, полученный в точно таких условиях. Общее время регистрации составило 30 мин, что сравнимо со временем, необходимым для получения спектра с внерезонансной развязкой с приемлемым отношением сигнал/шум.
Существует возможность еще более понизить число инкрементов по tv используя иной подход к обработке данных. Как было показано выше, можно увеличить эффективную ширину линии 5уэФФ при действии взвешивающей функции таким образом, чтобы Л(1 было примерно l/Sv^ (ЗГ^). Если этого не сделать, то можно показать, что эффективная
сн*сн^сн*сн^сн2сн2
сн*сн^
сн*сн^
сн2
сн2
ДААААШААДАЛДЛАААДЛ
6328 II 412520719151819ЮМ131617
Рис. 10.13. J-Спектроскопия только с 5 инкрементами по ^ с использованиемспециальной обработки данных (см. текст). Для этого соединения при редакти-ровании спектра был получен ошибочный результат (верхние спектры) из-забольшой константы ‘J^ для С20 (помечена стрелкой). Однако J-спектр даетвполне однозначный ответ.
ширина линии составит примерно 0,6/Л(1, однако сигналы исказятся при усечении. Возникающие при этом «вигли» можно удалить другими средствами помимо аподизации. В частности, можно использовать тот факт, что нам известна форма искажения, определяемая малостью значения Лг . Перспективным методом обработки таких сильно усеченных данных является метод максимальной энтропии [5] (гл. 2); в нем делаются определенные предположения о форме спектра, который следует восстановить. Недавно предложен новый вариант этого метода [6], предъявляющий намного меньше требований по вычислительным затратам (метод впервые использован в радиоастрономии). В этом случае для определения истинного положения пиков применяется итерационная процедура. На рис. 10.13 показано определение мультиплет- ности этим методом с использованием только 5 инкрементов по tx в J-спектре.
Экспериментальные аспекты
EXORCYCLE и составные л-импульсы. Оказывается, что больше всего ущерб качеству J-спектров наносит искажение каждого из импульсов по наблюдаемому ядру, но особенно это касается л-импульса. Детальный анализ этой проблемы приведен в работе [7]; я же просто покажу связь наиболее очевидных проблем и существующих стандартных решений.
Представим, что л/2-импульс в начале последовательности немного короче своей номинальной длительности, что может возникнуть либо из-за его неправильной калибровки, либо вследствие неоднородности В1, неизбежной в определенных частях образца. При этом небольшая часть намагниченности останется направленной вдоль оси z к началу tv По-видимому, л-импульс будет тоже короче номинальной длительности, поэтому вместо безобидного инвертирования этой намагниченности он будет переводить некоторую ее часть в плоскость х — у. Здесь она будет совершать прецессию в течение второй половины tx с частотой, определяемой как химическими сдвигами 13С, так и углерод-протонными константами в импульсном варианте эксперимента. После двумерного преобразования появляются дополнительные пики. Поскольку они совершали эволюцию на частоте, определяемой как химическими сдвигами, так и константами, почти наверняка они будут отражаться по координате vt.
Более глубокий анализ обнаруживает другие нежелательные аспекты использования неидеальных л-импульсов. В гетероядерном эксперименте с импульсом по протонам несовершенство этого импульса также вызывает появление в спектре дополнительных пиков между истинными компонентами мультиплета [8]. В гомоядерном J-спектре (см. следующий раздел) существует даже больше оснований для беспокойства. Предположим, что л-импульс был слишком длинным. Тогда мы можем мысленно выделить в эксперименте ту его часть, которая соответствует
действию номинального по длительности л-импульса, а остальная часть в этом случае будет состоять из последовательности л/2 — zt/2 — а — — tJI-Выборка, где а-избыточная часть «длинного» л-импульса. С точностью до несущественных деталей задания временных интервалов это представляет собой последовательность переноса когерентности, точно такую же, как в COSY. Мы ожидаем, что протонная намагниченность, совершающая эволюцию в течение первой половины tx с протонными химическими сдвигами и константами, будет переноситься и детектироваться как модуляция намагниченности других взаимодействующих протонов в течение /2. В узком диапазоне координаты vt химические сдвиги будут отражаться много раз, приводя к дополнительным пикам в непредсказуемых местах. Весьма вероятно, что действие л-импульсов будет сопровождаться инверсией намагниченности (гл. 4), и возникнут связанные с этим проблемы. В гетероядерном эксперименте проблем с протонными л-импульсами избежать просто, выбрав вариант эксперимента с переключаемым декаплером. В гомо- ядерной J-спектроскопии (разд. 10.4) такой возможности нет.
Чтобы избежать появления дополнительных пиков в J-спектрах, совершенно необходимо использовать подходящее циклирование фазы. Циклирование л-импульса по 13С в последовательности х, у, — х, —у с инверсией фазы приемника с шагом в 90° по фазе импульса устраняет много проблем. Эта процедура известна как EXORCYCLE [9] (из-за того, что некоторые из дополнительных пиков в J-спектрах называются по-разному: и как «фантомы», и как «призраки»). Она может быть скомбинирована обычным образом с CYCLOPS при одновременных шагах поворота всех фаз в 13С и фазы приемника. Проблемы протонного л-импульса лучше всего решать в гетероядерном случае, используя метод переключаемого декаплера, как упомянуто выше. Для гомоядерной J-спектроскопии рекомендуется использовать составной л-импульс (л/2)хлу (л/2), (гл. 7).
Распознавание знака и форма линии. Распознавание знаков частот по Vj в J-спектре часто не является столь проблематичным, как в экспериментах с переносом когерентности. Для случаев чисто первого порядка, которые мы обсудили, или всегда для экспериментов с низким разрешением мультиплетность сигналов симметрична относительно vt = 0, так что можно использовать отражение относительно этой линии. Результирующий спектр может быть скорректирован по фазе в спектр чистого поглощения, поэтому нет нужды использовать необычные взвешивающие функции. Однако спектр поглощения возникает из-за наложения симметрично расположенных пар линий с нежелательной фазоскрученной формой, и любое отклонение от точной симметрии относительно линии vt = 0 будет искажать его.
В этом случае (т. е. для систем, не имеющих чисто первого порядка) или просто для того, чтобы восстановить определенные области мультиплетов по v15 комбинирование подходящих квадрантов преобразо-
ванных данных позволяет провести распознавание знаков частот по V, [10]. Поскольку индивидуальная компонента мультиплета (а не результирующая пары компонент) претерпевает фазовую модуляцию в течение tx, линии в таком случае имеют форму со скрученными фазами, так же как и для линий эхо-селекции в экспериментах по переносу когерентности (гл. 8). Вычисление магнитуды и сильное улучшение разрешения (с присущими им недостатками) становятся, таким образом, необходимыми для того, чтобы сделать форму линии похожей на сигнал поглощения. Однако даже это не фатально, потому что отдельные сечения спектра по столбцам могут быть еще приведены к правильному виду поглощения. В случае систем непервого порядка для получения данных также необходимо использовать метод переключаемого декаплера. В методе протонного импульса оказывается недействительным предположение о том, что тг-импульс на протонах обменивает метки всех состояний, что приводит к таким линиям по V,, которые не отражают мультиплетную структуру одномерного спектра.
Для большего удобства в работе и получения наилучшего разрешения существуют методы, в которых распознавание знака по v, возможно при использовании представления спектров в форме сигналов чистого поглощения как для импульсного метода, так и для метода переключаемого декаплера [10, И]. Поскольку только последний корректно воспроизводит мультиплетную структуру систем непервого порядка, очевидно, что ему должно отдаваться предпочтение. Необходимое распознавание знака достигается сложением двух экспериментов с использованием обеих возможностей для переключаемого декаплера (т. е. выключение либо в течение первой половины tx, либо в течение второй половины). Знаки частот по vt противоположны в этих двух экспериментах, поэтому перед сложением необходимо перевернуть координату V, одного из них. В известном смысле это вызывает обращение скрученной фазы и устранение дисперсионных компонент. Хотя этот метод был предложен в 1979 г., оказывается, что вплоть до середины 1984 г. в литературе не было сообщений о его применении к реальным задачам. Точное и детальное изучение углерод-протонных констант проводится редко, поэтому создание новых и совершенствование имеющихся способов решения этой задачи не слишком актуальны .
Гомоядерный J-спектр
Введение
Если последовательность спинового эха используется при наличии гомоядерной связи, то автоматически возникает J-модуляция детекти-
ГцГц
Гц
Гц
Рис. 10.14. Сравнение гомоядерного (а) и гетероядерного (б) J-спектров систем А3Х. В случае гомоядерного спектра константа проявляется по обеим координатам, поэтому мультиплет имеет наклон 45°.
руемого сигнала как функция zt, поскольку гомоядерные константы не рефокусируются. Двумерный эксперимент, выполненный при варьировании Zj, таким образом, ведет к разделению мультиплетных структур по v1( как и в гетероядерном случае. Существует, однако, важная разница: взаимодействия присутствуют еще и в течение z2. В гетероядерном эксперименте мы устраняем их за счет широкополосной развязки, но ясно, что это невозможно для гомоядерных констант. В результате мультиплеты лежат не на линии, параллельной координате vt, а на наклоненной к ней под углом 45°. Для иллюстрации этого случая на рис. 10.14 сравнивается гетероядерный J-спектр метильной группы с гомоядерным спектром Х-части протонной системы А3Х в одном масштабе как по vt, так и но v2. На практике обычно масштаб изображения по координате v2 бывает намного мельче, чем для v2, потому что спектр должен включать весь диапазон химических сдвигов, а не только ширину одного мультиплета; поэтому наклон будет менее явно выражен (рис. 10.15).
Как мы увидим позднее, поворот мультиплетных структур в некоторых случаях может быть сопряжен с определенными проблемами. Однако сначала рассмотрим вопрос о том, с какой целью мы хотим получить гомоядерный J-спектр. Сугубо умозрительно преимущества этого метода таковы: разделение перекрывающихся мультиплетов при их развороте на вторую координату, возможное улучшение ширины линии по Vj из-за устранения неоднородности поля и возможность отличить гомоядерные константы, которые проявляются по координате v2, от гетероядерных, которые в рамках этого эксперимента выступают подобно химическим сдвигам и проявляются только по координате v2. Имея в виду первые два связанных друг с другом аспекта, необходимо помнить, что эксперимент работает нормально только для систем чисто первого порядка. При наличии сильной связи появляются дополнительные линии. Это означает, что эффективное дополнительное разре-
i1 i1 i1 i1 i 1 i1 i1 iг।14,4V4,048 46^ д44 42 40 2,8i1 i1 i1 i1 i 1 i1 i1 iг।14,4V4,048 46^ д44 42 40 2,8Рис. 10.15. Гомоядерный J-спектр все того же соединения 1 из гл. 8 (только часть спектра, нормальный одномерный спектр приведен над контурными представлениями). Время регистрации по J-координате было около 2,5 с. Контурное представление такого спектра не является идеальным. При высоком пороговом значении интенсивности в контурном представлении хорошо разрешаются детали интенсивных пиков, но пропадают некоторые резонансные сигналы (слева). Если же понизить пороговое значение при построении контурного спектра, то его интерпретация становится неоднозначной (справа).Рис. 10.15. Гомоядерный J-спектр все того же соединения 1 из гл. 8 (только часть спектра, нормальный одномерный спектр приведен над контурными представлениями). Время регистрации по J-координате было около 2,5 с. Контурное представление такого спектра не является идеальным. При высоком пороговом значении интенсивности в контурном представлении хорошо разрешаются детали интенсивных пиков, но пропадают некоторые резонансные сигналы (слева). Если же понизить пороговое значение при построении контурного спектра, то его интерпретация становится неоднозначной (справа).
i1 i1 i1 i1 i 1 i1 i1 iг।1
4,4V4,048 46^ д44 42 40 2,8
i1 i1 i1 i1 i 1 i1 i1 iг।1
4,4V4,048 46^ д44 42 40 2,8
Рис. 10.15. Гомоядерный J-спектр все того же соединения 1 из гл. 8 (только часть спектра, нормальный одномерный спектр приведен над контурными представлениями). Время регистрации по J-координате было около 2,5 с. Контурное представление такого спектра не является идеальным. При высоком пороговом значении интенсивности в контурном представлении хорошо разрешаются детали интенсивных пиков, но пропадают некоторые резонансные сигналы (слева). Если же понизить пороговое значение при построении контурного спектра, то его интерпретация становится неоднозначной (справа).
Рис. 10.15. Гомоядерный J-спектр все того же соединения 1 из гл. 8 (только часть спектра, нормальный одномерный спектр приведен над контурными представлениями). Время регистрации по J-координате было около 2,5 с. Контурное представление такого спектра не является идеальным. При высоком пороговом значении интенсивности в контурном представлении хорошо разрешаются детали интенсивных пиков, но пропадают некоторые резонансные сигналы (слева). Если же понизить пороговое значение при построении контурного спектра, то его интерпретация становится неоднозначной (справа).
шение мультиплетной структуры может быть получено только для довольно ограниченного случая перекрывания большого числа сигналов, которые тем не менее должны быть мультиплетами первого порядка. В тех случаях, когда эти условия выполняются, полученный J-спектр может оказаться достаточно информативным, но необходимо учитывать при этом некоторые осложнения, обсуждаемые дальше.
Наклон J-спектров
Наиболее интересная информация заключена в J-спектре по координате Vj. Хорошо бы иметь возможность, как и в гетероядерном эксперименте, в сечениях параллельно Vj обнаружить все компоненты мультиплета. К сожалению, из-за поворота на 45° мы в действительности находим, что они содержат только одиночные линии. Каждый столбец, несущий сигнал по v15 содержит одну компоненту мультиплета. Другой недостаток гомоядерного J-спектра обнаруживается, если представить себе его проекцию на координату v2 параллельно vlt т. е. просуммировав столбцы массива данных. В гетероядерном экспери-
менте такие столбцы либо содержат все компоненты мультиплета в тех случаях, когда они находятся при соответствующей сигналу частоте по координате v2, либо они не содержат ничего (кроме шума). Следовательно, проецирование на v2 восстанавливает одномерный спектр детектируемого ядра без каких-либо констант. Напротив, проекция гомо- ядерного эксперимента на v2 параллельно vt просто дает вам нормальный спектр со всеми константами. Тем не менее открывается захватывающая перспектива получения спектра с широкополосной гомоядерной развязкой. Это достигается при проецировании вдоль линии, наклоненной к оси v2 под углом 45°, что заставляет все компоненты мультиплета выстраиваться вдоль одного направления (это действительно так) и, таким образом, приводит к спектру, содержащему просто одиночную линию на месте каждого химического сдвига. К сожалению, если двумерный массив данных сохраняет свою фазовую информацию, то свойство соотношения Фурье (теорема о сечениях и проекциях) показывает, что фактически сигналы не будут наблюдаться при проецировании J-спектра под углом 45°. Это происходит из-за того, что положительные и отрицательные части фазоскрученных линий при точной ориентации вдоль направления, наклоненного под углом 45°, взаимно погашаются при суммировании. Проецирование спектра в виде магнитуды обходит эту проблему, но мы будем иметь все обычные неудобства магнитудных спектров, связанные с широкими линиями и необходимостью сильного улучшения разрешения.
Даже для магнитудных спектров проекция под углом 45° может оказаться полезной. Получение проекций и сечений, которые также могут оказаться полезными для выделения сложных мультиплетов, значительно упрощается с помощью специального приема: повороту подвергается весь массив данных. Это влечет за собой перемещение каждой заполненной строки в большей или меньшей степени в зависимости от ее частоты по v, и ведет к представлению, похожему на гетероядерный J-спектр. Вычисляется магнитудный спектр, тогда сечения параллельно vt содержат мультиплеты, а проекция на координату v2 выглядит как спектр с широкополосной гомоядерной развязкой; это показано на рис. 10.16. Во всем этом деле разочаровывает следующее: прилагая значительные усилия при проведении эксперимента, который должен увеличить разрешение, мы затем ухудшаем его снова, проводя вычисление магнитуды.
В настоящее время не существует способа полностью избежать этого. Если главный интерес представляет разрешение единичных мультиплетов, то отдельные столбцы из повернутого массива данных могут быть изучены без вычисления магнитуды. Однако даже тогда в отличие от гетероядерного случая они не имеют вида истинного поглощения: линии обнаруживают сильное искажение у основания, возникающее при повороте, который смешивает дисперсионные компоненты (рис. 10.17). Поскольку рефокусирующее влияние на ширину линии на практике часто невелико, основное преимущество состоит просто в разделении пере-
нормальный спектрнормальный спектрсильноесильное—।'1'1'1'11111111г™4,44,24,03,83,63,43,23,02,8М. Э.—।'1'1'1'11111111г™4,44,24,03,83,63,43,23,02,8М. Э.Рис. 10.16. Наклоненное представление спектра, данного на рис. 10.15, с проекцией на координату v2 (в форме магнитуды). Оно похоже на спектр с широкополосной гомоядерной развязкой, однако это справедливо только для слабосвязанных систем. При наличии сильного спин-спинового взаимодействия на половине расстояния между сигналами сильносвязанных ядер появляются дополнительные пики, которые отмечены стрелками на этом спектре.Рис. 10.16. Наклоненное представление спектра, данного на рис. 10.15, с проекцией на координату v2 (в форме магнитуды). Оно похоже на спектр с широкополосной гомоядерной развязкой, однако это справедливо только для слабосвязанных систем. При наличии сильного спин-спинового взаимодействия на половине расстояния между сигналами сильносвязанных ядер появляются дополнительные пики, которые отмечены стрелками на этом спектре.
нормальный спектр
нормальный спектр
сильное
сильное
—।'1'1'1'11111111г™
4,44,24,03,83,63,43,23,02,8
М. Э.
—।'1'1'1'11111111г™
4,44,24,03,83,63,43,23,02,8
М. Э.
Рис. 10.16. Наклоненное представление спектра, данного на рис. 10.15, с проекцией на координату v2 (в форме магнитуды). Оно похоже на спектр с широкополосной гомоядерной развязкой, однако это справедливо только для слабосвязанных систем. При наличии сильного спин-спинового взаимодействия на половине расстояния между сигналами сильносвязанных ядер появляются дополнительные пики, которые отмечены стрелками на этом спектре.
Рис. 10.16. Наклоненное представление спектра, данного на рис. 10.15, с проекцией на координату v2 (в форме магнитуды). Оно похоже на спектр с широкополосной гомоядерной развязкой, однако это справедливо только для слабосвязанных систем. При наличии сильного спин-спинового взаимодействия на половине расстояния между сигналами сильносвязанных ядер появляются дополнительные пики, которые отмечены стрелками на этом спектре.
крывающихся мультиплетов. Если же вас интересует проекция, то в этом случае требуется особое внимание уделить подбору взвешивающей функции по каждой координате. Но как ни старайся, очень узких линий получить все-таки не удается. Представление гомоядерного J-спектра с фазой, соответствующей сигналу чистого поглощения, было бы весьма привлекательным для каждой из двух поставленных задач, но пока еще не существует полностью удовлетворительного решения. Известна последовательность, позволяющая получить фазу чистого поглощения для двухспиновой системы [12], но для систем, состоящих из большего числа спинов, снова возникает вклад дисперсии. Также предложен вычислительный метод [13], родственный используемому для обработки сильно усеченных данных, который упомянут в разд. 10.3.2, но он, кажется, требует большого объема вычислений и, по моим сведениям, в настоящее время не может быть реализован в подходящей форме в системах обработки данных, которыми оснащены компьютеры спектрометров.
5 Рис. 10.17. Вертикальные сечения из наклоненного гомоядерного J-спектра можно представить в виде сигналов, близких по форме к сигналам поглощения (Л), но форма линии в таких спектрах сильно искажается. На рисунке для сравнения представлены два сечения из массива данных рис. 10.16: с вычисле- 5 нием и без вычисления магнитуды (5) вместе с тем же мультиплетом из нормального одномерного спектра (В), обработанного эквивалентной взвешивающей функцией.
В заключение можно сказать, что гомоядерный J-спектр полезен только с учетом ряда ограничений. Мы должны иметь взаимодействие чисто первого порядка и удовлетвориться либо тем разрешением, которого можно достичь в режиме магнитуды, либо пойти на сильное искажение формы линий. В таком случае мы получаем возможность применить данный эксперимент для разделения перекрывающихся мультиплетов, а при использовании проекций получить положения центров мультиплетов. Если присутствует гетероядерное взаимодействие, то оно также проявится на проекции, поэтому эксперимент может быть использован для идентификации гетероядерных констант.
Непрямой J-спектр
В последний раз вернувшись к идее разделения перекрывающихся мультиплетов, мы рассмотрим эксперимент, который находится на стыке гетеро- и гомоядерной J-спектроскопии, причем в экспериментальном аспекте он очень близок к гетероядерной корреляционной спектроскопии (гл. 9). Этот метод решает проблему полностью перекрывающихся мультиплетов, перекрывание которых, очевидно, сохранится и в гомоядерном J-спектре. Он позволяет перенести гомоядерную мультиплетную структуру на химические сдвиги соседних гетероядер.
В действительности идея довольно проста. Гетероядерный корреляционный эксперимент в принципе уже содержит тонкую структуру по Vj вследствие гомоядерных взаимодействий между ядрами, от которых переносится намагниченность. Эту структуру не просто разглядеть
1Н:— *— 5 —> п *— 5 -X- ^1 —> 7 *— _I —>!L 4— Д2 —>ра»8я»ка
2222122
^С:пЦВыборка
2
Рис. 10.18. Последовательность для непрямого J-спектра. Сравним с последовательностью HSC: для устранения различий химических сдвигов по координате V] в середину интервала tY помещается л-импульс по *Н. При этом рефокусируется и гетероядерное взаимодействие, в связи с чем отпадает необходимость импульса по 13С. В интервал At необходимо встроить л-импульсы по обоим ядрам, но в интервале Д2 они необязательны.
в экспериментальном спектре, поскольку сложно оцифровать v2 достаточно тонко из-за того, что эта координата включает весь диапазон химических сдвигов для протонов-до 10 м. д. Если химические сдвиги убрать с этой координаты, что в принципе можно сделать с помощью спинового эха, то только ширина самого широкого мультиплета из тех, которые нужно охарактеризовать, будет определять диапазон частот по v15 что уже делает возможным достижение высокого разрешения. Таким образом, последовательность нормальной корреляции химических сдвигов модифицируется просто добавлением протонного л-импульса в центре периода эволюции (рис. 10.18), при этом убираются химические сдвиги с координаты vP Эксперимент подробно описан в работе [14]. Этот эксперимент имеет те же ограничения, что и гомоядерная J-спектроскопия, но характеризуется более низкой чувствительностью из-за того, что детектируется гетероядро, поэтому пользоваться им следует только в самых крайних случаях-при полном перекрывании сигналов в нормальном J-спектре. На рис. 10.19 показаны результаты,
Рис. 10.19. Примерно «эквивалентные» области непрямого (а) и гомоядерного (б) J-спектров глюкозы. Отметим, что порядок протонных и углеродных сдвигов неодинаков.Рис. 10.19. Примерно «эквивалентные» области непрямого (а) и гомоядерного (б) J-спектров глюкозы. Отметим, что порядок протонных и углеродных сдвигов неодинаков.55аа
Рис. 10.19. Примерно «эквивалентные» области непрямого (а) и гомоядерного (б) J-спектров глюкозы. Отметим, что порядок протонных и углеродных сдвигов неодинаков.
Рис. 10.19. Примерно «эквивалентные» области непрямого (а) и гомоядерного (б) J-спектров глюкозы. Отметим, что порядок протонных и углеродных сдвигов неодинаков.
5
5
а
а
полученные для образца глюкозы в D2O. Нормальный протонный спектр (вверху справа) плохо разрешен из-за довольно большой ширины линии и в силу того, что вещество существует в виде смеси аномеров. Протонный J-спектр немного лучше, но мультиплеты все еще трудно идентифицировать. Но уже в непрямом J-спектре мультиплетная структура хорошо просматривается.
Литература
I. Levitt М.Н., Badenhausen G., Ernst R.R., J. Mag. Res., 53, 443-461 (1983).
Freeman R., Mareci TH., Morris G. A., J. Mag. Res., 42, 341-345 (1981); Dod- drellD.M., Reid D.G., Williams D.H., J. Mag. Res., 56, 279-287 (1984); Dod- drell D. M„ Williams D. H„ Reid D. G„ Fox K., Waring M. J., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 218-220 (1983).
Wimperis S.C., Freeman R„ J. Mag. Res., 58, 348-353 (1984).
Bodenhausen G., Freeman R., Morris G. A., Turner D.L., J. Mag. Res., 28, 17-28 (1977).
Hore P.J., J. Mag. Res., 62, 561-567 (1985).
Keeler J„ J. Mag. Res., 56, 463-470 (1984).
Bodenhausen G„ Freeman R., Niedermayer R., Turner D. L., J. Mag. Res., 26, 133-164 (1977).
Freeman R„ Keeler J., J. Mag. Res., 43, 483-486 (1982).
Bodenhausen G„ Freeman R„ Turner D. L., J. Mag. Res., 27, 511 (1977).
Freeman R., Kempsell S.P., Levitt M.H., J. Mag. Res., 34, 663-667 (1979).
Bachmann P., Aue W.P., Muller L., Ernst R.R., J. Mag. Res., 28, 29-39 (1977).
Williamson M.P., J. Mag. Res., 55, 471-474 (1983).
Shako A. J., Keeler J„ Freeman R., J. Mag. Res., 56, 294-313 (1984).
Morris G.A., J. Mag. Res., 44, 277-284 (1981).
Bax A„ J. Mag. Res., 52, 330-334 (1983).
Предметный указатель
Акриловая кислота 181, 182
Аксиальные пики 282, 283
Алгоритм быстрого фурье-преоб
разования Кули и Тьюки 31
Аморфные стеклообразные растворы 153
Амплитуда сигнала 287
спинового эха 230
шума 93
Амплитудная модуляция 376
Ампула для регистрации спектров
ЯМР 60
Аналого-цифровой преобразователь (АЦП) 22, 32, 92
-разрешение 32, 92
Аподизация 44
Аттенюатор 251
Ацетилацетонат хрома (III) 133, 241
Билинейный оператор поворота 360
Боковые полосы 66, 67, 71, 78, 232
трет-Бутильная группа 186
Взвешивающие функции 46, 49, 243
«Витли» 41, 44, 50, 253
Возбуждение образца 28
Вращательный момент 103
Вращающаяся система координат 101
Времена выборки данных 298
-ожидания 154
Временное представление 29
Время регистрации 34, 41, 354
смешивания 342, 364
Выборка 197, 206, 212, 368, 373
-данных 33, 136
Выбор растворителя 55
Гауссово псевдо-эхо 291
Гауссовы линии 48
Геминальные взаимодействия 359
Гетероядерная корреляционная спектроскопия 18, 349
многоквантовая когерентность 205
-J-модуляция 368
Гетероядерный J-спектр 376
ЯЭО 186, 187
Гиромагнитное отношение 99
Гомоядерная развязка 16
Гомоядерный J-спектр 384
Гравитационное поле 99
Z-Градиенты 77
Датчики ЯМР 23, 86
настройка 88
селективно-настроенные 87
широкополосные 87
—с помощью моста 90
направленного ответвителя 91
Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР 260
спектроскопия ЯМР 302
Двумерные спектры
INADEQUATE 334-337
эксперименты 18
Двумерный эксперимент NOESY 165
ЯМР-эксперимент 264-266
Двухквантовая когерентность 306
Дейтериевая стабилизация (лок) 72
Дейтерированная вода 249
Дейтерированные ЯМР-раствори- тели 56
протонные спектры 59
Декаплер 64
Детектирование сигнала 33
Дефекты формы линии 76
2,3-Дибромпропионовая кислота 308
Динамический диапазон 92, 93
Диполь-дипольное взаимодействие 132, 152
сила 154
Дискретная выборка интервалов 262
орто-Дихлорбензол (ODCB) 64, 65 Длительность импульса 218, 236
Дополнение нулями 43
Естественная ширина линий 139, 377
Задержка 202, 353
выборки данных 128
Избыточная намагниченность 100
Измерение ЯЭО 167-
Изохроматы 134
Импульс 103
Импульсная фурье-спектроскопия ЯМР 31
Импульсный фурье-спектрометр ЯМР 22
ЯМР 27, 142
Импульсы на частоте наблюдае-
26-75
мых ядер 219
Инверсия заселенностей 166
INEPT с рефокусировкой 196
Интенсивность сигнала 83, 199
Интерферограмма 262
Использование ЯЭО 179
Исходная намагниченность ядра 194.
Исходный эксперимент INADEQUATE 339
Калибровка длительности импульса декаплера 222
Квадратурное детектирование 117, 119, 121
по V] 284
Квадрупольные ядра 212
Когерентность 305
Комплексный спектр 119
Константа активная 309
пассивная 309
Константы спин-спинового взаимодействия (КССВ) 16, 111, 129, 223, 313
Контроль ширины полосы 36
Коррекция фазы 126
Коэффициент усиления 198
Критерии разрешения 63
чувствительности 81
Критерий Найквиста 36, 118, 302
Кросс-пики 265, 275, 277, 296, 310, 342
идентификация 275
интенсивность 300
исчезновение 314
Кросс-релаксация 151, 174
Лабораторная система координат 112
р-Лактам 185
Ложные сигналы 36
Локальное поле на ядре 153
электрическое поле 239
Лоренцева форма линии 31
Магнитные диполи 152
Магнитуда спектра 289, 353
Магнитудные спектры 320, 387
Максимальный ЯЭО 158, 199
Матрица плотности 143
Межъядерные расстояния 158, 162, 182
Мезаконовая кислота 179
Метод «аккордеон-спектроскопия» 330, 343
CAT 25
DANTE 138
WALTZ 138
инверсии-восстановления 132, 238
максимальной энтропии (МЕМ) 51, 53
непрерывной развертки 24, 27
переключаемого декаплера 370, 377
разностных спектров 168
Редфилда 125
RuSH 285, 292, 294
ТРИ 125, 287, 292, 294
Эрнста-Бэйна 307
ЯМР с непрерывной разверткой 34
Методы Фурье 18
Меченые частоты 261
Многоимпульсные эксперименты 227
Многоквантовая когерентность 97, 105, 306
фильтрация 21, 207, 327
Мост Уинстона 90
Мощность радиочастотного поля при гетероядерной развязке 225
при гомоядерной развязке 224
сигнала 73
Наклон /спектров 386 z-Намагниченность 230, 238, 240, 342•
Намагниченность образца 103
объемная 102
Напряженность поля 77, 218
Настройка колоколов 26
разрешения 63, 74
без лока 80
шиммов по ССИ 79
Насыщение 73
перехода 146
Непрерывная развертка 266
Непрямой и гомоядерный /спектры глюкозы 390
/спектр 389
Непрямые корреляции 356
Низкочастотный /-фильтр 362
Обменная спектроскопия 341
«Обращенные» эксперименты 213
Обращенный DEPT 214, 373, 374
Обрезание 34, 44
Объемная намагниченность 143
Объем образца 60
Одноквантовая когерентность 305
Опорная частота 112, 114
Определение траектории когерентности 144
Осцилляции (биения) 31
Отношение поле/частота 63, 68, 178
сигнал/шум 25, 26, 38, 46, 65, 81,
20, 244, 300
Отражение в двух измерениях 317
Отраженные пики 122
Перенос когерентности 97, 105, 306
намагниченности 268, 305
поляризации 18, 199
Переходы
параллельные 296
прогрессивно связанные 296
регрессивно связанные 296
связанные 296
Петля обратной связи 178
Пиковая интенсивность шума 82, 83
Повторение прохождений 235
частота 236
Подавление пиков 247
предварительным насыщением 247
«скроенным» возбуждением 249
Подспектры групп СН, СН2 и СН3 208
Подход Белла-Сондерса 179
Поликристаллические порошки 153
Полное сопротивление цепи 90
Полный процесс редактирования спектров в эксперименте DEPT 209
Полосовой фильтр 38, 245
Последовательное насыщение линий 181
Последовательности WALTZ и WALTZ-16 234
Последовательность COLOC 361
CYCLOPS 289
DANTE 253
DEPT 205, 206
GROPE-16 230
HSC 350
MLEV 138
«прыжок-возврат» 249, 250
SPI 140, 223 ■
TANGO 374, 375
UPT 212
Преимущество Фелгетта 28
Преобразование лоренцевой формы линии в гауссову 48
Фурье 29, 51
Прерываемая развязка 168
Приготовление образца 54, 62, 167
Протонные спектры хлороформа 262
Протонный декаплер 222
- спектр 312
— муравьиной кислоты 374
— иридиевого комплекса 357
холестерилацетата 14
Процедура CYCLOPS 283, 303
EXORCYCLE 382
Пути релаксации 147
Равновесная намагниченность 241
Радиочастотное поле 100
Развязка 197, 206, 212, 368, 373
с разделением времени 224
Разностная спектроскопия ЯЭО 168
оптимальные условия 173
Разностное спиновое эхо 372
Разностный перенос поляризации 192
Разрешение 48
Распознавание знака 383
отраженных пиков 50
Регистрация спектра 242
Редактирование спектров 203, 207, 208
точность 209
Резонансная частота контура 90
Релаксационные процессы 73
Релаксация 128, 235
поперечная 129, 134
продольная 130, 131, 261, 282
через диполь-дипольное взаимодействие 154
Сдвиги Блоха-Зигерта 169, 224, 225, 267
Селективная инверсия заселенности (SPI) 190
Селективное возбуждение 246, 252
мягкими импульсами 252
с помощью DANTE 253
Селективность 175
Селективный перенос заселенности (SPT) 175, 190
Сигнал дисперсии 39
поглощения 39
ЯМР 142
Сигналы ССИ 303
Сильнопольная часть спектра 275
Симметризация 318
Синусоидальная осцилляция 262
Систематические ошибки 243
Скорость развертки 26
релаксации 156
Слабопольная часть спектра 274
Смешение (конволюция) фурье-образов 44
Согласованный фильтр 46, 47
Составной z-импульс 338, 339
Составные импульсы 228, 232
л-импульсы 382
Спад свободной индукции (ССИ) 29, 104
Спектральная плотность 155
ширина 142
Спектр COSY 273, 276, 278, 294, 314, 319
13С холестерилацетата 254
INEPT 354
HSC 356-358, 361
J-модулированного эха 371
непрерывной развертки по одной координате 268
NOESY производного пенициллина 347
J-Спектроскопия 18
Спектр RCT 332
Спектры двойного резонанса 281 - COSY-45 и COSY-90 323-325 - INEPT 196, 198 — характеристики 198 - хлороформа 197
Спиновое эхо 130, 135, 136, 368
Спин-спиновое взаимодействие 270, 274
Среднеквадратичная амплитуда шума 82■
Стационарная система координат 107
Стационарное эхо 237
Суммарный перенос намагниченности 192
Схема обратного эксперимента DEPT 215
резонансного контура датчика ЯМР 89
эксперимента разностной спектроскопии ЯЭО 169
Теорема о сечениях и проекциях 387
о максимальной мощности 88
о центральном пределе 120
Теория поглощения Блоха 98
фазовых циклов 117
Тест ASTM 81
Тесты для спектрометра 255
Треугольник Паскаля 313
Трехспиновый эффект 164
Триплет 369
Угол Эрнста 236
Уровни энергии 105 - заселенность 105, 150
Усиление в канале лока 73
Условие Бакса 301
предельного сужения 156
Усреднение сигналов 25
Устранение артефактов по v2 283 - взаимодействия по vt 351 по v2 351 -
Уширение несимметричное 77
симметричное 77
Фаза 40, 50, 113
в двух измерениях 292
канала стабилизации 178
относительная 116
приемника лока 73
Фазовая информация 308
когерентность 143, 305
Фазовые квадранты 292
ошибки 110, 126,127, 295
циклы 122, 353
Фазовый цикл CYCLOPS 122
четырехшаговый 124
Фазочувствительный COSY с двухквантовым фильтром (DQF-COSY) 329
детектор 114
спектр COSY 296, 309
Фильтр типа синусоидально-колоколообразного окна 290
Фильтры типа эха и анти-эха 288
Форма импульса 252
линии 48, 383
с перекрученной фазой 289
Формализм мультипликативных операторов 144
Фурье-спектроскопия ЯМР 41
Цитраконовая кислота 179
Цифровое разрешение 41, 42, 298
Частота декаплера 181
ларморовой прецессии 100, 147, 190
Найквиста 34, 35, 51
повторения 354
Частотное представление 29
Частотные метки 97
Чувствительность 46, 186
высокая 219
максимальная 80
низкая 221
оптимальная 202
Шиммирование 69
Шиммы 69
теплые 70
Ширина импульса 29
линии 47
развертки 34
Широкополосная развязка 203, 232, 354
гомоядерная 359, 387
Шкала мощности в децибелах 218
Шум 24
белый 37
в двух измерениях 316
оцифровки 93
по tv 316.
Шумовая модуляция 232, 233
протонная развязка (PND) 232
Эксперимент COSY 97, 270, 271, 277, 279, 281, 287, 294, 300
COSY-45 322
для квадратурного детектирования 119
Джинера 266, 268, 269
FOCSY 318
HSC 353, 354
INADEQUATE 333
INDOR с фурье-преобразованием 267
INEPT 193
Карра-Парселла 137
Карра-Парселла-Мейбума- Джилла fCPMG) 138
NOESY 342, 346
POMMIE 207
с обратной прерываемой развязкой 241
SPI для хлороформа 193
Эксперименты DEPT+и DEPT+ + 210■
Электрический диполь 152
Эстафета Н-Н-С 363
Эстафетный перенос когерентности (RCT) 329, 330, 362
спектр Н-Н-С 365, 366
Н-Н-С-эксперимент 364
Эффективное поле 108
Эхо переноса намагниченности 289
Ядерный эффект Оверхаузера (ЯЭО) 17, 63, 133, 145, 160, 342
в двухспиновых системах 160
в реальных системах 160
в системе из нескольких ядер 162
неравновесный 165
отрицательный 163
положительный 163
Ядра 98
отличные от протонов 62, 320
ЯМР с непрерывной разверткой 114
Оглавление
Предисловие редактора перевода: 5
Предисловие автора 7
Предисловие 11
Введение 12
Глава 1. О чем эта книга 14
Введение 14
Что вам нужно знать 16
Что вы найдете в этой книге 17
у1.4. Что можно сделать с помощью ЯМР 19
Маленькая прогулка вокруг спектрометра ЯМР 21
Литература 23
Глава 2. Некоторые вопросы импульсного ЯМР 24
Введение 24
Настройка колоколов 26
Импульсный ЯМР 27
Введение 27
Возбуждение образца 28
Время и частота 29
Практическое выполнение импульсного ЯМР 31
Введение . . . • 31
Детектирование и регистрация 32
Преобразование 38
Практические аспекты фурье-спектроскопииЯМР 41
У 2.5.1. Введение 41
Цифровое разрешение и время регистрации 41
Обрезание и аподизация 44
Взвешивающие функции 46
Распознавание отраженных пиков...' 50
Преобразование Фурье-не единственный способ 51
Литература 53
Глава 3. Основные экспериментальные методы 54
Введение 54
Приготовление образцов 54
Введение . . 54
Выбор растворителя 55
Ампула для регистрации спектровЯМР 60
Объем образца 60
Приготовление образца 62
Ядра, отличные от протонов 62
Настройка разрешения 63
Введение 63
Критерии разрешения 63
Факторы, влияющие на разрешение 67
Шиммирование 69
Достижение максимальной чувствительности 80
Введение 80
Критерии чувствительности 81
Факторы, влияющие на чувствительность 86
•Литература 96
Глава 4. Импульсная спектроскопия ЯМР 97
Введение 97
Составные части эксперимента■ 98
Введение 98
Ядра 98
Радиочастотноеполе 100
Вращающаясясистема координат 101
Импульс! 103
Векторы и уровни энергии 105
Реальный эксперимент 106
4.3.2. Когда импульс не попадает в резонанс 1064.3.2. Когда импульс не попадает в резонанс 106Введение 106
4.3.2. Когда импульс не попадает в резонанс 106
4.3.2. Когда импульс не попадает в резонанс 106
Когда детектируется несколько частот одновременно . . . . НО
Оси и фазы 112
Квадратурное детектирование 117
Фазовые ошибки и коррекция фазы 126
>#4.4.Релаксация 128
V4.4.1.Введение 128
v4.4.2.Двигаясь к равновесию 130
Релаксация в плоскости х — у 133
4.5. Импульсный ЯМР 142Литература 1444.5. Импульсный ЯМР 142Литература 144Спиновое эхо 135
4.5. Импульсный ЯМР 142
Литература 144
4.5. Импульсный ЯМР 142
Литература 144
Глава 5. Ядерный эффект Оверхаузера 145
Введение 145
Происхождение ядерного эффекта Оверхаузера 146
Введение 146
Пути релаксации 147
Причины релаксации 152
ЯЭО и межъядерные расстояния 158
Неравновесный ЯЭО 165
Измерение ЯЭО 167
Введение 167
Приготовление образца 167
Метод разностных спектров 168
Некоторые замечания о дейтериевойстабилизации177
Ч./5.4. Использование ЯЭО 179
Очень простой случай 179
Проверкатрехспинового уравнения 181
Реальнаязадача 183
Гетероядерный ЯЭО 186
Литература 187
Глава 6. Перенос поляризации и редактирование спектров 188
■ 6.2. Селективный перенос заселенности 1906.3. INEPT 193■ 6.2. Селективный перенос заселенности 1906.3. INEPT 193Введение 188
■ 6.2. Селективный перенос заселенности 190
6.3. INEPT 193
■ 6.2. Селективный перенос заселенности 190
6.3. INEPT 193
х^ 6.3.1. Введение 193
Характеристики спектров INEPT.' 198
Задержка 202
6.4.1. Введение 2056.4.1. Введение 2056.4. DEPT 205
6.4.1. Введение 205
6.4.1. Введение 205
Последовательность DEPT как многоквантовый фильтр . .206
Редактирование спектров с помощью DEPT 207
DEPT для спектров без развязки".210
Квадрупольные ядра 212
«Обращенные» эксперименты 213
Литература 216
Глава 7. Дополнительные сведения об экспериментальных методах . . .217
Введение 217
Длительность импульса и напряженность поля 218
Введение: шкала мощности в децибелах 218
Импульсы на частоте наблюдаемых ядер 219
Импульсы на других ядрах 222
Мощность радиочастотного поля при гомоядерной развязке 224
Мощность радиочастотного поля при гетероядерной развязке 225
Уменьшение неидеальности импульсов 227
Введение 227
Составные импульсы 228
Широкополосная развязка 232
Релаксация и повторение прохождений 235
Введение 235
Длительность импульса и частота повторения прохождений 236
Методы быстрого определения Г] 238
\/7.6. Количественное измерение интенсивностей ..240
V 7.6.1. Введение 240
х 7.6.2. Как сделать интенсивность сигналов пропорциональной числу ядер 240
Регистрация спектра 242
v 7.6.4. Другие аппаратурные трудности 244
Селективное возбуждение и подавление 246
Введение ■ 246
Подавление пиков 247
Селективное возбуждение 252
Несколько тестов для спектрометра 255
Литература 258
Глава 8. Двумерная корреляционная спектроскопия ЯМР. Корреляция за счет гомоядерноговзаимодействия 260
(/8.1.Введение 260
V8.2.Меченые частоты 261
V8.3.Эксперимент Джинера 266
Введение 266
Двумерный эксперимент. Непрерывная развертка-преобразование Фурье 266
Перенос намагниченности 268
Два реальных примера 270
Детали эксперимента COSY 281
Работа с COSY 307
Эксперименты, родственные COSY 322
COSY-45 322
Определение малых констант 323
Многоквантовая фильтрация 327
Эстафетный перенос когерентности 329
Другие эксперименты по гомоядерной корреляции 333
INADEQUATE 333
NOESY или обменная спектроскопия 341
Литература 348
Глава 9. Гетероядерная корреляционная спектроскопия 349
Введение 349
Детали HSC 350
Устранение различных КССВ 350
Другие экспериментальные аспекты 353
Использование HSC 355
Эксперименты, родственные HSC 359
Широкополосная гомоядерная развязка по Vj в эксперименте HSC 359
Дальние константы 13С-*Н. Последовательность COLOC 361
Эстафетный перенос когерентности 362
Введение 362
Эстафета Н-Н-С 363
Использование RCT 365
Литература 366
Глава 10. Спиновое эхо н /-спектроскопия 368
Введение 368
Гетероядерная J-модуляция и спиновое эхо 368
Введение 368
Разностное спиновое эхо 372
Гетероядерный /-спектр 376
Введение 376
Примеры гетероядерных /-спектров 377
Экспериментальные аспекты 382
Гомоядерный /-спектр 384
Введение 384
Наклон /-спектров 386
Непрямой /-спектр . . 389
Литература 391
Предметный указатель 392
Modern NMR TechniquesforChemistry Research
Andrew E. DeromeThe Dyson Perrins Laboratory,University of Oxford, UK
Pergamon Press
Oxford • New York ■ Beijing • FrankfurtSao Paulo Sydney Tokyo Toronto
Э. Дероум
СовременныеметодыЯМРдля химическихисследований
Перевод с английскогоЮ. М. Дёминаиканд. хим. наук В. А. Чертковапод редакциейд-ра хим. наук, проф. Ю.А. Устынюка
Москва «Мир» 1992
ББК 24.5
Д36 УДК 541.1
Дероум Э.
Д36 Современные методы ЯМР для химических исследований: . Пер. с англ.-М.: Мир, 1992.-403 с., ил.
ISBN 5-03-001750-х
Монография английского ученого представляет собой руководство по ЯМР, доступное по уровню изложения исследователю, не имеющему специальной подготовки по спектроскопии. В ней наряду с изложением основ стандартных методов ЯМР (импульсный ЯМР и фурье-преобразование сигналов свободной прецессии, методы подготовки образцов, выбор растворителя и т. д.) рассматриваются новые методики одномерной (ядерный эффект Оверхаузера и т.п.) и двумерной спектроскопии ЯМР. Изложение материала имеет ярко выраженную практическую направленность, приведены многочисленные примеры решения структурных химических задач.
Для химиков-исследователей, преподавателей и студентов старших курсов химических вузов.
ББК 24.5ББК 24.51708000000-241 Д66-91
ББК 24.5
ББК 24.5
041 (01)-92
Редакция литературы по химии
ISBN 5-03-001750-х (русск.)© 1987 Pergamon Books Ltd.
ISBN 0-08-032513-0 (англ.)© перевод на русский язык,
Дёмин Ю. М., Чертков В. А., 1992