ПРЕДИСЛОВИЕ РЕДАКТОРОВ ПЕРЕВОДА

Стероиды — обширный класс органических соединений, значение которых в биохимии, медицине, фармацевтической промышленности и ряде других областей особенно возросло за последние десятилетия. Этому в немалой степени способствовали успехи аналитической химии. «Наука движется толчками, в зависимости от успехов, делаемых методикой,— отмечал великий русский ученый И. П. Павлов,— с каждым шагом методики вперед мы как бы поднимаемся ступенью выше, с которой открывается нам более широкий горизонт с невидимыми раньше предметами».

Специалист по биохимическому анализу или по анализу лекарственных препаратов, как правило, должен давать одновременно ответ на два вопроса, а именно: присутствует ли данное соединение в анализируемой пробе и в какой концентрации. Следовательно, аналитикам предстояло решить очень трудные задачи, поскольку стероиды одни из самых сложных по строению (а иногда и лабильных) соединений, обладающие значительной реакционной активностью, а также близкими физическими и химическими свойствами у многих представителей этого класса. Трудность заключалась не только в разработке метода определения сложных соединений в сложных по составу объектах, но и в том, что концентрации этих соединений зачастую чрезвычайно низки. Таким образом, ясно, что количественный анализ стероидов в разнообразных объектах — чрезвычайно сложная и практически важная область, имеющая свои особенности. Ей посвящена обширнейшая литература: только в данной книге библиография превышает 2,5 тыс. наименований, а это далеко не все, что опубликовано в мире.

Необходимо отметить, что в анализе стероидов находят применение самые различные аналитические методы: хроматографические (включая газовую, жидкостную, колоночную и тонкослойную хроматографию), спектральные, электрохимические, иммунохимические и традиционные (весовые и титриметрические). Из всего нами сказанного вытекает, что перед автором книги проф. Ш. Гёрёгом — известным венгерским ученым в области аналитической и физической химии биологически активных соединений — стояла на редкость сложная задача, и приятно признать, что он вполне с ней справился, творчески обобщив огромный опыт, накопленный сотнями исследователей.

6 Предисловие редакторов перевода

Отметим, что монография Ш. Гёрёга является одной из первых в мировой литературе, где с единых позиций рассмотрены все аспекты количественного анализа стероидов. Книгу отличает критический характер изложения: автор не только систематизирует известный материал, но (и это, по-видимому, главное) и критически его оценивает и творчески обобщает. Вообще монография написана по хорошо продуманному плану, а ее отдельные разделы содержат четкие рекомендации по преимущественному применению того или иного метода в зависимости от объекта исследований и задачи определения. Она содержит многочисленные таблицы, которые служат удобным справочным материалом.

Рассматривая перспективы развития аналитической химии стероидов, нам хотелось бы подчеркнуть важную роль гибридных методов, в которых первыми выступают методы разделения, в особенности хроматографические. Особый интерес представляет использование высокоэффективной хроматографии на кварцевых колонках с привитыми неподвижными жидкими фазами, а также применение тонкослойной хроматографии, в том числе метода с принудительным потоком подвижной фазы под давлением и цилиндрической хроматографии на стержнях с последующим сканированием полученных хроматограмм пламенно-ионизационным детектором.

Книга профессора Гёрёга, по нашему мнению, несомненно будет стимулировать дальнейшее развитие количественных методов анализа стероидов в наиболее перспективных направлениях.

И. В. Торгов

В. Г. Березкин.

ПРЕДИСЛОВИЕ К РУССКОМУ ИЗДАНИЮ

С большой радостью я воспринял предложение издательства «Мир» о переводе на русский язык моей книги «Количественный анализ стероидов», которое я рассматриваю как большую честь для себя. Приятно сознавать, что теперь мой труд найдет путь к тысячам советских специалистов, занимающихся данным предметом. Я надеюсь, что книга будет полезна моим новым читателям в их работе в биохимических, клинических, фармацевтических и заводских лабораториях в разных уголках Советского Союза.

В моей монографии проанализирована литература вплоть до 1982 г., и поэтому читатель может получить достаточно полное представление о современном состоянии этой стремительно развивающейся области.

Мне хотелось бы выразить искреннюю благодарность кандидатам хим. наук Е. Н. Дороховой и Г. В. Прохоровой за квалифицированный перевод книги на русский язык; я очень признателен также глубокоуважаемому профессору И. В. Тор- гову и моему коллеге и другу профессору В. Г. Березкину за тщательную работу по редактированию рукописи.

Будапешт, июль 1984 Ш. Гёрёг

ПРЕДИСЛОВИЕ

Пять лет спустя после выхода в свет нашей книги «Анализ стероидных гормональных препаратов» (S. Gorog, Gy. Szasz, Akademiai Kiado, Budapest—Elsevier, Amsterdam, 1978) я написал еще одну книгу об анализе стероидов. Она охватывает более широкий круг вопросов, нежели предыдущая, которая была почти целиком посвящена фармацевтическим аспектам аналитической химии стероидных гормонов.

Помимо гормонов в настоящей книге рассматривается определение других важных групп стероидов (стеринов, витаминов D, желчных кислот, сердечных гликозидов, сапогенинов и др.), но главная ее особенность заключается в том, что в ней нашли отражение проблемы биоклинического анализа. Следует отметить, что в книге обсуждаются только вопросы количественного определения, а задачи, связанные с идентификацией и установлением структуры, исключены.

Работая над первой книгой, я понял, что различные аспекты анализа стероидов более взаимосвязаны, чем я раньше предполагал, и выделение только области анализа лекарственных препаратов во многих случаях представляется искусственным. Некоторые рецензенты первой книги, оказывается, придерживались того же мнения, упрекая нас в пренебрежении стандартными биоклиническими методами. Это была одна из причин, побудивших меня написать новую книгу, в которую пришлось внести существенные изменения в связи с тем, что в настоящее время еще нет издания, в котором была бы сделана попытка обобщить все методы и сформулировать задачи как биоклинического, так и серийного анализа продукции фармацевтической промышленности, выпускающей стероиды. Своей книгой я пытался заполнить этот пробел, однако подробное рассмотрение столь обширной области в одной книге, конечно, невозможно, поэтому она не претендует на большее, нежели обзор современного состояния аналитической химии стероидов. Более детальное обсуждение читатель может найти в специальных монографиях и примерно в 2500 ссылках на литературу. Более подробно содержание книги обсуждается в разд. 1.3.

Предполагается, что читатель этой книги знаком с основами химии стероидов и принципами методов, используемых для их анализа. Поэтому химия стероидов различных классов

обсуждается лишь кратко в начале каждой главы и излагаются только существенные особенности используемых аналитических методов, если они упоминаются впервые (главным образом в гл. 2).

Материал книги расположен в соответствии с основными классами стероидов: отдельные главы посвящены анализу половых гормонов, кортикостероидов, стеринов, витаминов D, желчных кислот, сердечных гликозидов, сапогенинов и разных других стероидов. Так же построена каждая глава: в первом разделе кратко излагаются основы химии рассматриваемых групп стероидов, во втором — даются подробные указания к применению спектроскопических, хроматографических и других методов, а в третьем разделе излагаются основные проблемы, возникающие при анализе тех же групп стероидов, и пути их решения при помощи методов, описанных во втором. Такое расположение материала облегчает пользование книгой тем читателям, которые в большей степени интересуются методами, а не проблемами анализа, и наоборот. Такой порядок изложения, несомненно, приводит к повторам, однако я старался свести этот недостаток к минимуму.

Я надеюсь, что книга будет полезна читателям, занимающимся определениями стероидов в биологических, клинических, промышленных и фармацевтических объектах.

Будапешт, сентябрь 1982 щ Гёрёг

I

ВВЕДЕНИЕ

ПРОБЛЕМЫ И ТЕНДЕНЦИИ РАЗВИТИЯ

СОВРЕМЕННОЙ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ СТЕРОИДОВ

В настоящее время можно выделить три направления развития аналитической химии стероидов:

определение стероидов в биологических (клинических) объектах;

анализ лекарственных препаратов и промежуточных продуктов их производства (контроль продукции фармацевтической промышленности);

теоретические и практические аспекты структурной химии стероидов.

В классический период развития аналитической химии стероидов (около 30 лет назад или даже несколько раньше) эти направления не были разграничены столь четко, как сейчас: часто в них использовались одни и те же или сходные методы, С тех пор каждое направление развивалось разными путями, и в настоящее время в большинстве случаев их можно рассматривать как самостоятельные области со своими проблемами и методами. Даже если во всех трех областях используется один и тот же метод, подход к нему до некоторой степени отличается. Это можно проиллюстрировать на примере метода газовой хроматографии. Главным направлением в развитии био- клинического анализа было внедрение высокочувствительных (детектор электронного захвата, ДЭЗ) методов с высокой разрешающей способностью, позволяющих разделить и определить (с. помощью капиллярных колонок) 20—30 стероидов. В серийном фармацевтическом анализе стероидов обычно используются пламенно-ионизационный детектор и насадочные колонки, однако если здесь основное внимание обращается на правильность и воспроизводимость метода, то при установлении структуры компонентов сложной смеси стероидов методом газовой хроматографии хроматографирование лишь предшествует непосредственному масс-спектрометрическому исследованию.

Далее сделана попытка выделить и обсудить основные тенденции в современном анализе стероидов.

Существенно возросли требования к избирательности методов. С этой позиции рассмотрены многие используемые раньше стандартные методы, и селективность их признана недостаточно высокой. Далее, можно утверждать, что возможности повышения избирательности за счет новых химических ре-

акций, селективных с классической точки зрения, почти исчерпаны. Однако чрезвычайно высокая избирательность ферментативных реакций и реакций связывания белка (особенно иммунных) открыла новые перспективы повышения селективности анализа.

Другой путь повышения избирательности заключается в широком использовании хроматографических методов. С введением высокоэффективной жидкостной хроматографии значение классической газовой хроматографии несколько снизилось, но это компенсировалось широким распространением высокоизбирательных и чувствительных методов капиллярной хроматографии и разнообразных методов, основанных на сочетании газовой хроматографии и масс-спектрометрии (ГХ—МС). Пока пути повышения селективности хроматографических методов не будут переведены с эмпирической на теоретическую основу, установление соотношения между структурой стероидов и их подвижностью при хроматографии останется важной задачей аналитических исследований. Это справедливо не только для газовой хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), но также для колоночной и тонкослойной хроматографии, применение которых перед количественным определением может значительно повысить избирательность ВЭЖХ.

Упомянув о сочетании аналитических методов, мы тем самым затронули другой важный вопрос, касающийся времени и оборудования, необходимых для работы разными методами. При определении микрокомпонентов в сложных биологических объектах очень часто приходится пользоваться чрезвычайно длительными и трудоемкими методиками, включающими многократное разделение методами колоночной и (или) тонкослойной хроматографии или несколько стадий очистки. Однако основная тенденция направлена на сокращение времени подготовки пробы путем применения по возможности селективных методов. В качестве примера можно упомянуть о развитии тех радиоиммунных методов анализа, в которых благодаря повышенной избирательности антисывороток удалось исключить предварительное хроматографирование. Одним из главных направлений в серийном анализе стероидов является автоматизация сложных аналитических процессов с тем, чтобы удовлетворить постоянно растущую потребность в увеличении числа анализов в клинических условиях и в расшифровке формул стероидов. Для достижения более высокой избирательности и повышения надежности обычно приходится прибегать к усложнению и удорожанию методов. Поэтому здесь следует соблюдать известный компромисс, характер которого определяется поставленной задачей. Например, при серийных определениях

стероидов в моче или плазме во многих случаях после одной экстракции растворителем (или часто даже минуя эту процедуру) можно применять быстрые методы, дающие ценные данные для диагностики, дажё если известно, что эти данные завышены из-за недостаточной специфичности метода. Однако, если требуется знать точное содержание стероидов, следует провести более сложную подготовку пробы.

Другое важное требование, которое следует принимать во внимание при разработке избирательных методик анализа стероидов,— это чувствительность метода. При контроле продуктов фармацевтической промышленности требования к чувствительности определения стероидов, как правило, не очень высоки: можно пользоваться даже наименее чувствительными спектрофотометрическими и колориметрическими методами. В некоторых случаях (например, при определении эстрогенов в противозачаточных таблетках, фторкортикоидов в мазях, следовых количеств примесей в выпускаемых промышленностью стероидах и т. д.) нужны более чувствительные методы — флуориметрия, газовая хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография и т. п., но следует заметить, что даже для таких целей достаточно чувствительности пламенноионизационного детектора.

Что же касается биоклинического анализа, то для решения большинства задач, и особенно для определения метаболитов в моче, когда в анализируемой пробе содержатся микрограм- мовые или даже нанограммовые количества стероидов, достаточно указанной выше чувствительности. Однако во многих случаях, и в первую очередь при определении активности гормонов в крови, где в сравнительно небольшом объеме пробы содержатся пикограммовые количества стероидов, необходимы более чувствительные методы, например радиоиммуноанализ, газовая хроматография с детектором электронного захвата или масс-фрагментография.

ЛИТЕРАТУРА ПО АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ

СТЕРОИДОВ

Синтетической органической химии, теоретическим, биохимическим и другим аспектам химии стероидов посвящено большое число книг, знакомство с которыми очень полезно даже для тех, кто интересуется только анализом стероидов. Классический труд «Стероиды» М. Физер и Л. Физера [6] до сих пор остается источником фундаментальных представлений о химии стероидов. Из других книг по химии стероидов, охватывающих основные реакции стероидов и, кроме того, представляющих аналитический интерес, в первую очередь можно реко-

мендовать «Реакции стероидов» и «Органические реакции в химии стероидов» под редакцией соответственно Дьераши [4] и Фрида и Эдвардса [7], а также «Механизмы реакций стероидов» Кирка и Хартшорна [13], в которой рассматриваются теоретические аспекты, и серию «Терпеноиды и стероиды» под редакцией Овертона [15], посвященную современному развитию химии стероидов.

Среди большого числа книг по биохимии и фармакологии фундаментальное значение имеют «Биохимия стероидов» Хефт- манна [9] и «Биохимия и фармакология стероидов» Бриггса и Бразертона [2].

Много книг посвящено аналитической химии стероидов. «Физические свойства стероидных гормонов» под редакцией Энгеля [5] и «Хроматография стероидов» Нейера [14] являются важными классическими литературными источниками, а «Колориметрический и флуориметрический анализ стероидов» Бартоша и Пезе [1] и «Хроматография стероидов» Хефтманна [11] охватывают литературу по соответствующим областям вплоть до 1976 г. Монографии «Анализ стероидных гормонов» под редакцией Карстенсена [3], «Современные методы анализа стероидов» под редакцией Хефтманна [10] и «Успехи аналитической химии стероидов» под редакцией Гёрёга [8а] посвящены избранным разделам структурной химии и биомедицинскому анализу стероидов.

Единственными монографиями, цель которых дать общую картину состояния биоклинического и фармацевтического анализа стероидов, до сих пор остаются соответственно классическая книга «Анализ стероидных гормонов» под редакцией Джэйла [12] и недавно опубликованный «Анализ стероидных гормональных препаратов» Гёрёга и Шаца [8].

В дополнение к этим представляющим общий интерес работам во введениях к отдельным главам и разделам настоящей книги приведены ссылки на несколько трудов и отдельных глав из книг, посвященных более узким областям аналитической методологии или анализу отдельных групп стероидов.

Ниже обсуждается информация, полученная из различных научных журналов. Обзор литературы по анализу стероидов — нелегкое дело по нескольким причинам. К ним относятся, во- первых, большое число публикаций, так как в последние годы ежегодно выходит около 300—400 статей, посвященных непосредственно анализу стероидов, и примерно такое же количество работ, не относящихся к анализу стероидов, но содержащих важную информацию по аналитической мётодологии и результатам, и, во-вторых, то, что подавляющее большинство статей опубликовано не в аналитических журналах, а разбросано по многочисленным другим журналам.

Время от времени в основных аналитических журналах (Analytical Chemistry, The Analyst, Analytica Chimica Acta, Zeit- schrift tor analytische Chemie и Analytical Letters) публикуются статьи общего характера. В качестве важнейшего литературного источника по фармацевтическому анализу стероидов можно указать журнал Journal of Pharmaceutical Sciences, полезную информацию можно также получить в перечисленных выше журналах и в Journal of the Association of Official Analytical Chemists, Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Токио), Annales Pharmaceutiques Francaises, Die Pharmazie и др.

Очень важное значение имеет журнал Journal of Chromatography, в котором публикуются статьи по всем вопросам анализа стероидов с использованием хроматографических методов. Ценную информацию можно получить также в журналах Journal of Chromatographic Sciences и Chromatographia.

Наиболее ценная информация по биохимическому анализу стероидов публикуется в журналах Steroids, Journal of Steroid Biochemistry, Analytical Biochemistry, Biochemical Journal и Journal of Biological Chemistry. Эндокринологические и клинические аспекты анализа стероидов рассматриваются в основном в журналах Journal of Endocrinology, Acta Endocrinologica, Clinical Chemistry, Clinica Chimica Acta и др. Аналитические статьи, посвященные отдельным группам стероидов, можно найти в специальных журналах, например Lipids и Journal of Lipid Research, которые публикуют работы по стеринам, желчным кислотам и т. п.

СОДЕРЖАНИЕ КНИГИ

Цель этой книги — дать обзор методов количественного определения стероидов, обратив особое внимание на достижения последнего десятилетия. Поэтому в книге не рассматриваются вопросы, связанные с установлением структуры стероидов, а. методы, используемые главным образом для определения структуры, например ИК-спектроскопия и ЯМР, а также масс-спек? трометрия, обсуждаются только в аспекте аналитического применения. Хроматография также рассматривается только с точки зрения применения в количественном анализе, при этом обращается внимание на те методы, которые позволяют непосредственно получить результаты: газовую хроматографию, высокоэффективную жидкостную хроматографию и тонкослойную денситометрию. Очень кратко обсуждаются теоретические и практические аспекты хроматографических методов разделения (связь удерживания при хроматографировании со структурой и составом растворителя, методы качественного детектирования): колоночная и тонкослойная хроматография рассматри-

ваются как подготовительные этапы для последующего количественного анализа.

Основной упор делается на обзор методов количественного определения всех важных групп стероидов. Из аналитических методов — классических, спектроскопических, хроматографических и радиоаналитических — обсуждаются только те, которые имеют наибольшее значение; биологические и некоторые слишком специальные биохимические методы исключены.

Из практических задач выделены две основные: определение стероидов в биологических объектах и анализ продукции фармацевтической промышленности. Последнему вопросу в книге уделяется более пристальное внимание, чем в имеющейся литературе, поскольку автор обладает гораздо большим личным опытом в области анализа лекарственных веществ.

Большинство работ, которые легли в основу книги, опубликованы в последние десять, лет. За исключением нескольких методов, имеющих особое значение, более старые методы упоминаются лишь кратко, в основном в таблицах. Вследствие этого большинство ранних публикаций было исключено и в основу отбора положен принцип приводить лишь те работы, в которых описаны усовершенствованные методики, все еще находящие применение, или (в ряде исключительных случаев) работы, которые послужили важными вехами в развитии аналитической химии стероидов.

Еще труднее было отобрать публикации из числа вышедших в последние десять лет, поскольку объем книги не позволяет полностью включить литературу даже этого периода. Особенно трудно бктло сделать выбор в тех случаях, когда за короткий отрезок времени по какой-либо одной проблеме было опубликовано большое число зачастую очень сходных методик. Несмотря на все старания автора отобрать наиболее важные и современные работы, полностью избежать субъективности ему, по-види- мому, не удалось.

Рамки настоящей книги позволили лишь только наметить возможности применения различных аналитических методов для определения стероидов, а также дать лишь общий подход к решению основных задач анализа стероидов; таким образом, ее нельзя рассматривать в качестве лабораторного руководства. В ней не приводятся аналитические методики, за исключением кратких описаний в ограниченном числе случаев, которые, можно надеяться, помогут читателю получить общую картину возможностей различных методов. Во всех случаях, когда необходимо воспроизвести цитируемые методики, следует обращаться к оригинальным работам.

ЛИТЕРАТУРА

Bartos L, Pesez M. Colorimetric and Fluorimetric Analysis of Steroids. Academic Press, London, New York, San Francisco, 1976.

Briggs M. H., Brotherton V. Steroid Biochemistry and Pharmacology. Academic Press, London, New York, 1970.

Carstensen H. (Editor Steroid Hormone Analysis. Marcel Dekker, New York, 1967.

Djerassi C. (Editor). Steroid Reactions. Holden-Day, San-Francisco, 1963.

Engel L. L. (Editor). Physical Properties of the Steroid Hormones. Pergamon Press, Oxford, London, New York, Paris, 1963.

Физер Л., Физер M. Стероиды.— M.: Мир, 1964.

Fried J., Edwards J. A. (Editors). Organic Reactions in Steroid Chemistry. Van Nostrand Reinhold, New York, 1972.

Gorog S., Szasz Gy. Analysis of Steroid Hormone Drugs. Akademiai Kiado, Budapest, Elsevier, Amsterdam, 1978.

8a. Gorog S. (Editor). Advances in Steroid Analysis. Akademiai Kiado, Budapest, Elsevier, Amsterdam, 1982.

Heftmann E. Steroid Biochemistry. Academic Press, New York, London, 1970.

Heftmann E. (Editor). Modern Methods of Steroid Analysis, Academic Press, New York, London, 1973.

Heftmann E. Chromatography of Steroids. Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, 1976.

Jayle M. F. (Editor). Analyse des Steroids Hormonaux. Masson, Paris, 1962.

Kirk D. N., Hartshorn M. P. Steroid Reaction Mechanisms. Elsevier, Amsterdam, London, New York, 1968.

Neher R. Steroid Chromatography. Elsevier, Amsterdam, 2nd Edition, 1964.

Overton К H. (Editor). Terpenoids and steroids. The Chemical Society, London, 1971.

2

ПОЛОВЫЕ ГОРМОНЫ И РОДСТВЕННЫЕ СОЕДИНЕНИЯ

ОСНОВЫ ХИМИИ ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ

В этой главе рассматривается анализ половых гормонов, выделяемых семенниками (андрогены), яичниками (эстрогены) и желтым телом (Corpus luteum) (гестогены), а также продуктов их метаболизма, синтетических стероидных производных и их аналогов. Кроме того, в ней содержатся сведения по анализу анаболических стероидов, родственных андрогенам, и некоторых синтетических производных, не являющихся половыми гормонами, но по структуре очень близких к половым гормонам (т. е. спиронолактоны).

Эти стероиды можно охарактеризовать по их скелету: андростановому (андрогены и некоторые анаболические средства), эстрановому (эстрогены, содержащие ароматическое кольцо А, синтетические прогестогены и анаболические средства, 19-нор- стеронды) или прегнановому (гестогены). Кольца А и В могут •быть в ^цс-сочленении (5Р-стероиды) или транс-сочленении (5а-стероиды) однако, как правило, такой вид изомерии не осуществляется, так как у большинства производных в положении А4 или А5 имеется двойная связь. В молекулах природных гормонов кольца В и С, а также С и D находятся в транс-со- членении.

Наиболее характерными заместителями являются кетогруппы в положении 3 (насыщенные или чаще 4-ен-З-кетогруппы, а иногда 1,4- или 4,6-диен-З-кетогруппы), 17- и 20-оксигруппы (свободные или этерифицированные), оксигруппы при С-3, С-11 и С-17, метильные группы при С-6 и С-17, этильная группа при С-17, двойные связи (А1, А4, А5), ароматическое кольцо А И т. д.

Стероидные гормоны образуются в организме млекопитающих в результате ряда ферментативных реакций, в которых исходным веществом является холестерин. Этот процесс с указанием некоторых основных промежуточных соединений изображен уравнениями (2.1).

Активные гормоны метаболируются путем насыщения А4- двойной связи, гидроксилирования, восстановления 3- и 20-кетогрупп, окисления 17-оксигрупп и образования по оксигруппам водорастворимых конъюгатов, в основном сульфатов и глюкуронидов, и в меньшей степени фосфатов.

2 Заказ № 182

(2.1)(2.1)За—ОН—5аН 3J3— ОН—5аН За—ОН—5^НЗа—ОН—5аН 3J3— ОН—5аН За—ОН—5^Нандростерон эпиандростерон этиохоланопонандростерон эпиандростерон этиохоланопонОНОНсульфат ВегиВроэпиандростеронасульфат ВегиВроэпиандростеронаRi=O— аиилJ} эфиры нандролонаr2=hJRi=H1} норэтандролонR2=CiH,JЗ-ВезоксоRi=O— аиилJ} эфиры нандролонаr2=hJRi=H1} норэтандролонR2=CiH,JЗ-ВезоксоRt = Н* этилэстренолR2=C2H5Rt = Н* этилэстренолR2=C2H5

(2.1)

(2.1)

За—ОН—5аН 3J3— ОН—5аН За—ОН—5^Н

За—ОН—5аН 3J3— ОН—5аН За—ОН—5^Н

андростерон эпиандростерон этиохоланопон

андростерон эпиандростерон этиохоланопон

ОН

ОН

сульфат ВегиВроэпиандростерона

сульфат ВегиВроэпиандростерона

Ri=O— аиилJ

} эфиры нандролона

r2=hJ

Ri=H1

} норэтандролон

R2=CiH,J

З-Везоксо

Ri=O— аиилJ

} эфиры нандролона

r2=hJ

Ri=H1

} норэтандролон

R2=CiH,J

З-Везоксо

Rt = Н* этилэстренол

R2=C2H5

Rt = Н* этилэстренол

R2=C2H5

Главным андрогенным гормоном является тестостерон, а его активным метаболитом — 4,5-насыщенное производное, т. е. 5а-дигидротестостерон. Важные промежуточные продукты

дезактивации — андростерон, эпиандростерон и этиохоланолон — вместе с дегидроэпиандростероном относятся к 11-дезокси-17- кетостероидам.

Во избежание быстрой дезактивации путем окисления 17-оксигруппы тестостерон в медицине используется либо в форме эфира, либо в форме 17а-метильного производного. В связи с разнообразным применением в медицине следует упомянуть об их влиянии на нарушенное функционирование семенников и раковые образования молочной железы. Они также обладают анаболическим действием, но для медицинских целей получены синтетические стероиды с высоким соотношением анаболической и андрогенной активностей. Некоторые из них, например метандриол и метандиенон, близки по структуре к природным андрогенам, а другие, например эфиры нандролона, норэтандролон, этилэстренол и т. п., являются 19-норстероидами.

Главным процессом метаболизма основных эстрогенов (17£-эстрадиола и эстрона) является гидроксилирование, обычно по С-16; при этом образуются конъюгаты эстриола (главным образом эстриол- 16а-глюкуронид), которые в больших количествах содержатся в моче беременных. Эстрон и эстрадиол, особенно эфиры последнего, 3-бензоатный, 17-про- пионатный, 3,17-дипропионатный и т. п., используются при лечении нарушений, связанных с пониженным выделением эстрогенов яичниками (нарушение менструального цикла, расстройства менопаузы) и во многих других случаях. Стоит упомянуть, что смесь конъюгатов стероидов, полученная из мочи жеребых кобыл, которая помимо перечисленных выше эстрогенов содержит производные с ненасыщенной связью в кольце 5, например эквилин (7-дегидроэстрон) и эквиленин (6,8-бисдегидро- эстрон), до сих пор находит применение в терапии.

Из синтетических производных наибольшее значение имеют 17-этинилпроизводные (этинилэстрадиол и его 3-метиловый эфир местранол), которые используются в основном в качестве эстрогенных составляющих противозачаточных таблеток.

Основными метаболитами прогестерона и 17а-оксипрогесте- рона являются 5р-прегнан-3а,20а-диол и 5р-прегнан-3а,17а, 20а-триол соответственно, которые выводятся из организма главным образом в виде 3-глюкуронидов.

Из природных прогестогенов в терапии до сих пор широко используется прогестерон, тогда как 17а-оксипрогестерон вытеснен его эфирами; в основном они применяются при лечении нарушений менструального цикла и других гинекологических заболеваний, а также при сохранении беременности.

Из многочисленных синтетических гестогенов некоторые близки по структуре к прогестерону (ацетат медроксипрогестерона, ацетат мегестрола, ацетат хлормадинона), другие более или менее отличаются от него (этистерон, димэтистерон, аллил- эстренол и т. п.).

сн3сн3ди ацетат этинодиолади ацетат этинодиола

сн3

сн3

ди ацетат этинодиола

ди ацетат этинодиола

Другую важную группу синтетических гестогенов составляют 17а-этинил-17-окси-19-норстероиды, которые используют в качестве гестогенных компонентов противозачаточных таблеток.

R—CHj, J - норэтистерон

R—СНз, ^5(Ю-норэт инод реп

R=C2H5, J - норгестрел

R=CHj, 3-дезоксо,-d-линоэстренол

Подавляющее большинство стероидных гормонов, используемых в медицине и ветеринарной практике, являются синтетическими продуктами, не встречающимися в природе; даже природные стероиды обычно синтезируются фармацевтической промышленностью. Исходными веществами для промышленного синтеза (или точнее полусинтеза) половых гормонов обычно служат диосгенин или другие сапогенины (см. с. 468), которые превращают в гормоны путем химических реакций, а также ситостерин или другие стерины (см. с. 281), которые превращают в ключевое соединение 4-андростен-3,17-дион путем микробиологического окисления. Следует заметить, что все важные стероидные гормоны также получены синтетически, а некоторые методики синтеза служат для получения эстрогенов и 19-нор- стероидов в промышленном масштабе.

МЕТОДЫ АНАЛИЗА ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ [302а]

МЕТОДЫ УФ-СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ, ОСНОВАННЫЕ НА СОБСТВЕННОМ ПОГЛОЩЕНИИ

Сведения об ультрафиолетовых спектрах стероидных гормонов собраны в нескольких книгах, атласах спектров и обзорных статьях. Наиболее важные из них опубликованы Дорфманом [199], Дужа и др. [203] и Нойдертом и Рёпке [586]. По вопросам применения УФ-спектрофотометрии в количественном анализе можно обращаться к монографии Гёрёга и Шаца [312].

Наиболее характерными стероидными гормонами, которые обладают собственным поглощением, используемым в количественном анализе, являются аф-ненасыщенные кетоны, сопряженные диены и соединения, содержащие фенольное кольцо Д.

аф-Ненасыщенные кетоны

Наиболее часто встречающиеся сопряженные кетогруппы — это А4-3-кето- и А^-З-кетогруппы с максимумом поглощения в этанольной среде соответственно при 240 и 244 нм и молярным коэффициентом поглощения примерно 17 000. На рис. 2.1 представлены два характерных спектра поглощения, а также спектр менее важного А4’6-3-кетопроизводного.

Как показано на рис. 2.1, спектры А4-3-кето- и А^-З-кето- стероидов имеют большое сходство; единственное существенное их отличие состоит в наличии плеча в спектре последнего в об-

ласти 266 нм. Это позволяет проводить их одновременное определение в соизмеримых количествах в бинарных смесях методом отношений оптических плотностей [404, 676]. Менсе сложный случай представляет одновременное определение А4-3-кето- и А4’6-3-кетостероидов по их поглощению при 238 и 280 нм. При больших длинах волн можно определять следовые коли-

Рис. 2.1. УФ-Спектры ненасыщенных 3-кетостероидов в метаноле.

1 — содержащих А4-3-кето- группу (метилтестостерон: 17а-метил - 17-окси-4-андро- стен-3-он); 2 — содержащих А1’4-3-кетогруппу (метанди- енон: 17а-метил-17-окси-1,4- андростадиен-3-он); 3— содержащих А4’6-3-кетогруппу (ацетат мегестрола: ацетат 6-метил- 17а-окси-4,6-прегна- диен-3,20-диона).

чества продуктов разложения типа А4’6-3-кетосоединений в спиронолактонах [509].

Помимо простых случаев анализа промышленных кетостероидов в массе продукта непосредственное спектрофотометрическое измерение возможно только при анализе некоторых не слишком сложных лекарственных дозированных форм (см. различные фармакопеи), проб воздуха [200] и т. п. Однако, как правило, спектрофотометрическое определение осложняется мешающим влиянием сопутствующих компонентов или основы образца. В таких случаях следует пользоваться методами измерения при разных длинах волн, избирательной экстракцией, хроматографическими методами разделения или, возможно, методом с применением борогидрида натрия.

Измерение при разных длинах волн и расчет результатов с помощью ортогональных функций были использованы Амером и сотр. [29] для определения гидрокортизона и преднизолона в различных лекарственных препаратах в присутствии неомицина, фенилэфрина и т. п., а Михайлова и сотр. [553] применили метод отношения оптических плотностей для определения кетостероидов в реакционных смесях.

Что касается экстрационных методов, то заслуживает упоминания интересная методика, предложенная Ивашкивом [405], для контроля процесса 16а-гидроксилирования 9-фторгидрокор- тизона микробиологическим методом. Раствор (из ферментера) экстрагируют этилацетатом, затем проводят реэкстракцию 3 %-ным водным раствором тетрабората натрия. При этом 16а, 17а-диол в виде боратного комплекса переходит в водный слой, в котором его можно определить по полосе поглощения ненасыщенной кетогруппы.

Спектрофотометрические методы имеют еще большее значе-. ние после проведения предварительного хроматографического разделения. Спектрофотометрия в УФ-области — идеальный способ контроля за выходом конъюгатов кетостероидов при элюировании и для их определения после разделения на хроматографической колонке [108, 109, 246, 319, 320]. Реже спектрофотометрические методы определения применяются после разделения методом тонкослойной хроматографии и элюирования пятна; в этих случаях обычно проводят колориметрическое измерение.

Для определения А4- и А^-З-кетостероидов в растворах при ферментации [300], масляных препаратах для инъекций, мазях [295] и низкодозированных. таблетках [302] Гёрёг предложил дифференциальный спектрофотометрический метод, основанный на восстановлении этих производных борогидридами щелочных металлов до соответствующих спектрально неактивных 3-оксипроизводных.

(2.2)(2.2)

(2.2)

(2.2)

Если в кювету сравнения поместить раствор восстановленного А4-3-кетостероида (1 мг кетостероида и 0,1 г борогидрида натрия растворяют в 10 мл метанола и через 15 мин разбавляют метанолом до 100 мл), а в рабочую кювету — раствор невосстановленного соединения с той же концентрацией, то разность оптических плотностей при 240 нм отвечает содержанию ненасыщенного кетона. Конечно, этот метод дает приемлемые результаты, только если сопутствующие компоненты и неизвестные примеси, дающие фоновое излучение, нс реагируют с боро- гидридом натрия и, следовательно, дифференциальный спектр •смеси при длинах волн выше 230 нм идентичен истинному спектру чистого кетостероида. Это иллюстрируется рис. 2.2, на котором представлены спектры метанольного экстракта масляного препарата для инъекций, содержащего прогестерон и бензоат

эстрадиола; кривая 1 — это суммарный спектр двух стероидов, бензилового спирта (в качестве стабилизирующего агента) и небольшого количества масла, соэкстрагирующегося с исследуемыми компонентами. Кривая 2 представляет дифференциальный спектр, почти идентичный спектру прогестерона, что указывает на устранение влияния поглощения всех других компонентов.

Рис. 2.2. УФ-Спектры метанольных экстрактов масляных препаратов для инъекций, содержащих прогестерон и бензоат эстрадиола [295].

1 — спектр, полученный сразу после экстракции; 2 — дифференциальный спектр (раствора невосстановленного соединения относительно восстановленного борогидридом натрия); 3 — спектр раствора восстановленного соединения.

Применив этот метод для определения халцинонида (21- хлор-9-фтор-4-прегнан-11а, 16а, 17-триол-З,20-дион-16,17-ацетонид) в мазях, Киршбаум [459] обнаружил, что восстановление протекает полностью только при использовании свежего боро- гидрида натрия. Это объясняется ингибирующим действием метабората натрия (продукта разложения борогидрида натрия), но его можно устранить, вводя в реакционную смесь пропилен- гликоль, который связывает метаборат натрия в комплекс; в результате достоверность определения увеличивается.

Д^-З-Кетоны в описанных условиях восстанавливаются очень медленно. При определении преднизолона в мазях Гёрёг [295] предложил длительное кипячение с щелочным этанольным раствором борогидрида натрия. Для этих целей более удобной оказалась модифицированная методика, описанная Хафезом и сотр. [144]. Авторы заменили в реакционной смеси метанол тетрагидрофураном и борогидрид натрия борогидридом лития и обнаружили, что в этих условиях даже Д(1’4)-3-кетостероиды восстанавливаются за 10 мин при комнатной температуре. Кода

и Тималло [160] использовали этот вариант борогидридного метода для определения ацетонида флуоцинолона в кожных мазях.

Спектрально неактивные в этой области А5<10>-3-кетоны спектрофотометрически можно определять, измеряя поглощение соответствующего А4-3-кетона, поскольку первые можно легко перевести в последний путем кислотного или щелочного катализа [реакция (2.3)]. Определение норэтинодрела обычно проводят после выдерживания реакционной смеси в течение 1 ч [764] или кипячения в течение 5 мин [61] с 0,5 М соляной кислотой. Гёрёг [296, 302] обнаружил, что каталитическое действие гидроксид-иона в этой реакции примерно в 300 раз эффективнее, чем иона водорода. Поэтому при комнатной температуре даже при 0,01 М концентрации гидроксида натрия в течение 1 ч происходит количественное превращение, что позволяет проводить избирательное определение норэтинодрела в отдельных противозачаточных таблетках методом дифференциальной спектрофотометрии [302].

3,5-Диены3,5-Диены

3,5-Диены

3,5-Диены

Как видно из рис. 2.3, незамещенные 3-алкоксипроизводные (енольная форма простых эфиров) и 3-ацилоксипроизводные (енольная форма сложных эфиров) обладают высоким свето- поглощением.

алкил —Оалкил —Оенольная форма простого эфираенольная форма простого эфира

алкил —О

алкил —О

енольная форма простого эфира

енольная форма простого эфира

Поскольку все они являются производными Д4-3-кетонов [реакция (2.4)], а последние в свою очередь — продуктами разложения енольных простых и сложных эфиров, А4-3-кетоны могут оказаться потенциальными примесями. Это осложняет определение енольных форм эфиров, потому что все эти соединения имеют весьма схожие спектры (см. рис. 2.1 и 2.2). Пеннер и

Рис. 2.3. УФ-Спектры 3,5-диенов в метаноле.— незамещенные 3,5-диены (ацетат 17а-этинил-3,5-эстрадиен- 17-ола);— простые эфиры енола (ацетат 17а-этинил-3-циклопентилокси-3,5-эст- радиен-17-ола (ацетат хингестанола);— сложные эфиры енола (диацетат 17а-этинил-3,5-эстрадиен-3,17-диола).Рис. 2.3. УФ-Спектры 3,5-диенов в метаноле.— незамещенные 3,5-диены (ацетат 17а-этинил-3,5-эстрадиен- 17-ола);— простые эфиры енола (ацетат 17а-этинил-3-циклопентилокси-3,5-эст- радиен-17-ола (ацетат хингестанола);— сложные эфиры енола (диацетат 17а-этинил-3,5-эстрадиен-3,17-диола).

Рис. 2.3. УФ-Спектры 3,5-диенов в метаноле.

— незамещенные 3,5-диены (ацетат 17а-этинил-3,5-эстрадиен- 17-ола);

— простые эфиры енола (ацетат 17а-этинил-3-циклопентилокси-3,5-эст- радиен-17-ола (ацетат хингестанола);

— сложные эфиры енола (диацетат 17а-этинил-3,5-эстрадиен-3,17-диола).

Рис. 2.3. УФ-Спектры 3,5-диенов в метаноле.

— незамещенные 3,5-диены (ацетат 17а-этинил-3,5-эстрадиен- 17-ола);

— простые эфиры енола (ацетат 17а-этинил-3-циклопентилокси-3,5-эст- радиен-17-ола (ацетат хингестанола);

— сложные эфиры енола (диацетат 17а-этинил-3,5-эстрадиен-3,17-диола).

сотр. [621] решили проблему селективного определения 3,5-дие- нового енольного простого эфира (ацетат хингестанола) в присутствии продукта его разложения типа А4-3-кетона путем избирательного восстановления последнего борогидридом натрия перед спектрофотометрическим измерением. Как видно из реакции (2.4), А4-3-окси-, а также ацилоксипроизводные можно превратить в 3,5-диены путем катализируемого кислотами удаления воды или карбоновых кислот, и, следовательно, по поглощению образующихся 3,5-диенов можно определить эти спектрально-неактивные производные. Используя соляную кислоту в качестве катализатора, можно определить диацетат этинодиола [304, 783е] даже в отдельных таблетках [302].

Из З-а-эпимеров вода удаляется примерно в пять раз быстрее, чем из Зр-эпимеров. На этом основан дифференциальный кинетический метод Чизера и Гёрёга [171].

Фенольное кольцо А

На рис. 2.4 представлены четыре характеристических спектра эстрогенов, содержащих фенольное кольцо А (в форме свободного фенола, фенолят-иона, простого эфира и сложного

эфира). Эти спектры очень характеристичны, но из-за несколько низкой интенсивности поглощения к использованию УФ-спектрофотометрии для количественных определений нужно подходить с большой осторожностью, поскольку возможности непосредственного измерения без предварительного разделения или введения поправки на поглоще-

Рис. 2.4. УФ-Спектры стероидов, содержащих фенольное кольцо А [(растворитель — смесь метанола с водой (4 : 1)].Рис. 2.4. УФ-Спектры стероидов, содержащих фенольное кольцо А [(растворитель — смесь метанола с водой (4 : 1)].1 — этинилэстрадиол; 2 — этинил- эстрадиол в 0,2 М NaOH; 5 — эти- нилэстрадиол-3-метиловый эфир (местранол);4 — дипропионатэстрадиола.рогенов, проблемы,1 — этинилэстрадиол; 2 — этинил- эстрадиол в 0,2 М NaOH; 5 — эти- нилэстрадиол-3-метиловый эфир (местранол);4 — дипропионатэстрадиола.рогенов, проблемы,ние фона очень ограниченны.

Рис. 2.4. УФ-Спектры стероидов, содержащих фенольное кольцо А [(растворитель — смесь метанола с водой (4 : 1)].

Рис. 2.4. УФ-Спектры стероидов, содержащих фенольное кольцо А [(растворитель — смесь метанола с водой (4 : 1)].

1 — этинилэстрадиол; 2 — этинил- эстрадиол в 0,2 М NaOH; 5 — эти- нилэстрадиол-3-метиловый эфир (местранол);4 — дипропионат

эстрадиола.

рогенов, проблемы,

1 — этинилэстрадиол; 2 — этинил- эстрадиол в 0,2 М NaOH; 5 — эти- нилэстрадиол-3-метиловый эфир (местранол);4 — дипропионат

эстрадиола.

рогенов, проблемы,

Приведем один из многочисленных примеров, когда УФ-спектрофотометрию использовали для количественного определения после хроматографического разде- ления. Так, Шрёдер и др. [697] проводили разделение эстрона, эстрадиола, эквилина и эквиленина на пластинке, покрытой силикагелем, после кислотного гидролиза их сульфатов и экстракции свободного фенола хлороформом. Первые три соединения экстрагируют 1 %-ным водным раствором гидроксида натрия и измеряют поглощение их ионных форм при 296 нм, а присутствующий в низких концентрациях эквиленин экстрагируют метанолом и измеряют его поглощение при 231 нм, когда чувствительность измерения намного

выше.выше.В некоторых методиках, пред

выше.

выше.

ложенных для определения эст-

фона, были ре-фона, были ре-связанные с поглощениемсвязанные с поглощениемшены с привлечением В большинстве

фона, были ре-

фона, были ре-

связанные с поглощением

связанные с поглощением

химических или математических методов.химических или математических методов.малых колималых колииз них описываетсяиз них описываетсяопределениеопределениечеств эстрогенов в присутствии больших количеств кетостероидов, когда малоинтенсивные полосы кетостероидов, обусловленные п—л*-переходами, мешают определению. Для анализа противозачаточных таблеток, в которых соотношение кетостероидов и эстрогенов не очень велико, достаточно использовать один из вариантов метода базисной линии, как это сделали Кий [447] и Шрофф и Гродски [718]. В последней работе авторы повысили избирательность измерения, применив селективную экстракцию эстрогенов метилциклогексаном. Бруннер и Кунц [108, 109] описали метод определения местранола в различных смесях, сочетающий разделение колоночной хромато-

химических или математических методов.

химических или математических методов.

малых коли

малых коли

из них описывается

из них описывается

определение

определение

графией и УФ-спектрофотометрическое измерение с поправкой на поглощение холостого раствора.

При определении примесей эстрогенов в 19-норстероидах отношение кетостероид/эстроген обычно составляет от 100 до 10 000. Столь малые количества эстрогенов нельзя определить даже с помощью метода базисной линии, поскольку поглощение фона больше поглощения определяемых компонентов. Для решения этой проблемы Легран и др. [494] восстанавливали кетогруппу кетостероидов борогидридом калия в щелочном растворе метанола, что привело к почти полному устранению поглощения фона. Остаточное поглощение фона можно легко учесть, используя метод базисной линии. Этот метод позволяет определить до 0,01 % эстрогенов в 19-норстероидах. По сути дела тот же метод использован в работе Бестоу [61] и рекомендован Британской фармакопеей [101в] для определения местра- нола в противозачаточных таблетках. Гёрёг и Чизер [303] упростили этот метод, заменив борогидрид калия борогидридом натрия и исключив гидроксид натрия, что позволило сократить время реакции с 6,5—18 ч до 15 мин.

Наличие батохромных и гиперхромных сдвигов в спектрах чистых эстрогенов в щелочной среде (около 0,2 М гидроксида натрия; см. рис. 2.4) открывает новые возможности для их селективного определения. Селективность и чувствительность измерения поглощения щелочных растворов эстрогенов относительно раствора холостого опыта увеличиваются по сравнению с селективностью и чувствительностью измерения поглощения нейтрального раствора, на чем в фармакологии основано несколько методик определения стероидов [256, 464, 697].

Избирательность измерения можно увеличить еще больше, поместив в кювету сравнения раствор исследуемого материала в недиссоциированной форме с такой же концентрацией. В этом варианте дифференциального спектрофотометрического метода устраняется мешающее влияние поглощающих неионизирован- ных веществ. Метод, рекомендуемый фармакопеей XX США [7836] для определения валерата эстрадиола в масляных препаратах для инъекций в отсутствие кетостероидов, можно использовать для анализа препаратов для инъекций с высоким содержанием стероида (выше 10 мг/мл) [412], если в кювету сравнения помещать кислый (0,02 М), а в рабочую кювету — сильнощелочной (0,6 М) раствор. Гёрёг [301] повысил избирательность этого метода, используя раствор с pH 9 (боратный буфер) в качестве раствора сравнения (фенольная оксигруппа еще не ионизирована), создавая в растворе пробы 0,2 М концентрацию щелочи и предварительно восстанавливая кетосте- роиды борогидридом натрия. В этом варианте удалось полностью устранить мешающее влияние примесей, поглощение

которых изменяется как в интервалах pH 2—9, так и при концентрации щелочи 0,2—0,6 М; окисление А4-3-кетонов кислородом воздуха в щелочной среде также нс оказывает мешающего влияния. Измерение разности оптических плотностей при 300 нм позволяет проводить количественный анализ низкодозирован- ных препаратов для инъекций даже в присутствии больших количеств кетостероидов.

При помощи дифференциального спектрофотометрического метода, проводимого в щелочной среде, можно определять свободные эстрогены и их сложные эфиры (последние в щелочной среде быстро гидролизуются). Простые эфиры, конечно, не вступают в реакцию, но их фенольные производные реакционноспособны, что позволяет селективно определять их примеси.

о I СН3

Как видно из уравнения (2.5), в метанольной среде в присутствии соляной кислоты 10|3-окси-4-ен-3-кетоны (примеси 19-нор-4-ен-3-кетонов) можно количественно перевести в соответствующее фенольное производное простого эфира. С помощью этой реакции и вышеупомянутого спектрофотометрического метода определения стероидов фенольного типа Гёрёг и сотр. [314] определили следовые количества таких веществ.

УФ-СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ

И КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ,

ОСНОВАННЫЕ НА ХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХ

Этим методам анализа стероидных гормонов посвящено несколько сотен статей. В ранний период развития химии стероидов (до распространения хроматографических методов, особенно газовой хроматографии) они (вместе с флуориметрией) были единственными достаточно чувствительными и селективными методами определения стероидов. С введением в аналитическую химию стероидов более селективных и чувствительных газохроматографических, радиоаналитических и других методов значение колориметрических методов несколько упало, но они до сих пор главенствуют в фармацевтическом анализе стероидов и сохраняют до некоторой степени свое значение в биоклиническом анализе.

Наиболее полный современный обзор этой области дан в прекрасной монографии Бартоша и Пезе [60]. Применение

колориметрического метода в фармацевтике кратко изложено в монографии Гёрёга и Шаца [312а]; кроме того, ему посвящены отдельные главы во многих монографиях по фармацевтическому анализу или анализу стероидов, из которых следует упомянуть обзор Какача и Вейделека [438].

Большинство статей по применению колориметрических методов анализа половых гормонов посвящено определению соединений, содержащих кетогруппы или фенольное кольцо А.

Определение кетостероидов

Некоторые (амины, гидразины и производные гидразидов) из реагентов, используемых для колориметрического определения кетостероидов, содержат —NH2-rpynny, реагирующую с карбонильной группой с образованием продуктов конденсации типа =C=N—.

Другая часть колориметрических методов основана на реакциях активной метиленовой группы, расположенной рядом с кетогруппой, с реагентами типа ароматических ди- и тринитропроизводных (диэтилоксалата, 2,6-ди-трет-бутил-п-крезола и т. п.).

Имеется еще несколько реагентов, используемых в других (иногда нс совсем ясных) реакциях.

Наиболее важные методы приведены в табл. 2.1.

Подробное обсуждение всех методов, перечисленных в табл. 2.1, вышло бы за рамки этой книги. Поэтому здесь будут обсуждаться только два важнейших метода: метод с использованием гидразида изоникотиновой кислоты (ГИН) и метод Циммермана (с использованием 1,3-динитробензола).

При обработке ненасыщенных кетостероидов с помощью ГИН Эрколи и др. [223] наблюдали возникновение желтой окраски, которую Умбергср [782] использовал в аналитических целях. Этот метод основан на реакции конденсации между кетогруппой и гидразидной группой реагента (0,05 %) в метаноле, содержащем 0,007 М соляной кислоты.

гин

(2.6)

Таблица 2.1. Фотометрические методы определения кетостероидов

Автор

Год

Другие источники

Объект

Реагент

Положение кетогруппы

Максимум поглощения, нм

Молярный коэффициент поглощения

Пезе и Бартош

1963

[394, 395]

Стандарты

Реагенты на

СО-группу

Оксалат /г-диме-

Ненасыщенная

420—450

6 500—8 000

[625]

Шульц и др. [701]

1964

[783е]

Лекарственные

тиламиноанилина

4-Аминоантипирин

3-кетогруппа А4-3-Кетогруппа

354—376

8 500—15 000

Кимура и др. [455]

1967

[592, 627]

препараты

Стандарты

4-Нитрофенилгид-

А1’4-3-Кетогруппа А4-б-3-Кетогруппа

3-Кетогруппа,

379—394

384—392

520

37 600

Мак-Кинли и Дев

1957

[193, 195,

Лекарственные

разин, диметил- формамид, NaOH 2,4-Динитрофе-

А4-3-кетогруппа, А4>б-3-кетогруппа Насыщенные и не

540

570 370—410

44 500

57 300

22 000—50 000

лин [541]

Вудсон [839]

1971

333, 370, 383а, 623, 658] [288, 807]

препараты

Таблетки

нилгидразин

2,4-Динитрофе-

насыщенные кетогруппы

А^-З-Кетогруппа,

480

51600

Умбергер [782]

1955

См. ниже

Лекарственные

нилгидразин, NaOH

Гидразид изони

11-, 20-кетогруппы

А4-3-Кетогруппа

380—405

12 000—16 000

Толбот и др. [756]

1955

[116, 255,

препараты

Биологические

котиновой кислоты, НС1 Тиосемикарбазид

А4-3-Кетогруппа,

299—325

34 000—39 000

Стенлейк и Уиль

1957

751]

[543]

объекты

Таблетки

Реактив Т Жи

А^-З-кетогруппа, 17-, 20-кетогруппы А4-3-Кетогруппа

269—274

282—283

25 000—28 000

23 600

ямс [744]

Коэн и Калужнер

1957

[760]

Моча

рара

Реагенты на группу СН2—С = 0 3,5-Динитробен-

17-Кетогруппа

550

7 500

[162]

зойная кислота, кон

Автор

Год

Другие источники

Объект

Реагент

Положение кетогруппы

Максимум поглощения, мм

Молярный коэффициент поглощения

Пезе и Бартош [626]

1964

Стандарты

1,3,5-Тринитро- бензол, NaOH

Насыщенные и ненасыщенные кетогруппы

475

7 000—14 000

Шульц и Диас [699]

1964

[60а]

Таблетки

Пикриновая кислота, NaOH

А4>6-3-Кетогруппа

490—497

9700 (ацетат хлормади- нона)

Смит и др. [738]

1970

[551, 715]

Таблетки

Тетразолиевый синий

А4-3-Кетогруппа

530

6 000—8 000

Шульц и др. [700]

1964

[41, 59, 702]

Лекарственные препараты

2,6-Д и- трет-бутил- п-крезол, N(CH3)4OH

А4-3-Кетогруппа

620 (прогестерон)

485 (ацетат кортизона) 289—324

9400

8200

Гёрёг [298]

1970

[299]

Лекарственные препараты

Диэтилоксалат, трет-бутилат натрия

А4-3-Кетогруппа, 17-, 20-кетогруппа

5 000—15 000

Абельсон и Бонди [2]

1956

[170, 492, 550]

Биологические объекты

трет-Бутилат калия, кислород воздуха

А4-3-Кетогруипа

385

5 000—10 000

Фейми и др. [228, 229]

1974

1976

Масляные растворы для инъекций

Пикриновая кислота, H2SO4

А4-3-Кетогруппа (тестостерон и его эфиры)

640

21 200—

22 000

Пезе и Бартош [628]

1964

Стандарты

Тиамин, НС1

А5<10>-3-Кетогруппа

600

36 000—

40 000

Заказ № 182

Максимум поглощения протонированной желтой формы продукта конденсации А4-3-кетостероидов лежит около 380 нм (s~ 11 ООО—12 000). При комнатной температуре реакция заканчивается через 20 мин. Более низкой реакционной способностью обладают А^-З-кетоны. По методике Рида и Уолтерса [657] необходимо нагревание в течение 1 ч при 50 °C. Как сообщали Кавина и др. [137], другая возможность заключается в использовании более концентрированного реагента (0,8 %-ный ГИН примерно в 0,1 М соляной кислоте) при комнатной температуре и продолжительности реакции 2—3 ч. Максимум поглощения Д4>6-3-кетонов и А1’4-3-кетонов находится между 405 и 415 нм, молярный коэффициент поглощения равен 16 500—18 500. Различие в реакционной способности Д4-3-кето- и А^-З-кетостерои- дов позволяет проводить обнаружение и даже полуколичествен- ное определение [632] первых в присутствии последних.

Преимущество метода с использованием ГИН заключается в том, что окраска мало зависит от замены растворителя. Введение этанола [479, 480, 782] или еще лучше хлороформа [1016, 782, 845, 846, 849] в реакционную смесь позволяет без затруднений анализировать масляные препараты для инъекций без предварительной экстракции. Лишь в случае низкодозированных препаратов для инъекций рекомендуется хроматографическое отделение кетостероидов от масла на колонке, заполненной фло- рисилом [782].

Помимо анализа различных препаратов для инъекций метод с использованием ГИН был с успехом применен By [845, 846] для определения прогестинов в противозачаточных таблетках. Недавно [849] описана методика анализа отдельной таблетки, согласно которой для отделения прогестина от основы таблетки целесообразно хроматографирование на микроколонке; таким образом можно свести к минимуму объем элюента (хлороформа), что позволяет определить в одной таблетке до 0,35 мг норэтистерона.

Метод с использованием ГИН легко поддается автоматизации; эта возможность была реализована для анализа таблеток [40, 219а, 677, 768] и препаратов для инъекций [768].

ГИН-Метод в настоящее время является самым распространенным стандартным методом определения кетостероидов в готовых лекарственных формах. Помимо анализа готовых лекарственных форм он применяется и для анализа стероидов в массе фабричного продукта [783к]. Для решения более сложных задач (разделение и количественная оценка содержания компонентов в смесях или получение достоверных данных в присутствии продуктов разложения) его часто применяют в сочетании с бумажной [664], колоночной [318, 319, 320] и тонкослойной [78, 79, 138, 139] хроматографией и элюированием пятна.

Хотя ГИН-метод находит применение главным образом в фармакологии, Мацуи и Такахаши [530] использовали его для определения кетостероидов в биологических объектах, а именно для контроля за ферментативным превращением тестостерона и его конъюгатов в соответствующие 4,5-дигидропроизводные, не реагирующие с ГИН.

В то время как главной областью применения ГИН-метода является фармацевтический анализ, другой метод, выбранный для подробного обсуждения — реакция Циммермана,— в настоящее время используется почти исключительно в клиническом анализе для определения 17-кетостероидов в моче.

17-Кетостероид реагирует по своей активной метиленовой группе при С-16. Образующийся на первой стадии реакции бесцветный промежуточный продукт дегидрируется под действием 1,3-динитробензола в окрашенный мезомерный анион, изображенный на схеме (2.7) [259, 457].

Необходимым условием протекания реакции является удобное стерическое расположение кетогруппы по соседству с метиленовой группой. Так, например, 3-кетостероиды (в том числе А4-3-кетостероиды) и 21-незамещенные 20-кетостероиды дают положительную реакцию, тогда как А1’4-3-кетостероиды (не имеющие активной метиленовой группы) и стерически экранированные 6-, 7-, 11- и 12-кетостероиды не вступают в нее.

Из огромного количества статей, опубликованных после появления методики Циммермана [865] в 1935 г., подавляющее большинство посвящено выбору оптимальных условий реакции для определения 17-кетостероидов. Всестороннее обсуждение результатов работ, начиная с раннего периода, имеется в монографиях Циммермана [866], Джэйла [417] и Какача и Вейде- 3*

лека [437]. В настоящей книге обсуждаются лишь наиболее важные результаты и некоторые новые тенденции.

Основные цели оптимизации условий заключаются в стабилизации интенсивности окраски и характера спектра и в повышении чувствительности и правильности метода.

Максимум поглощения дегидроэпиандростерона в различных реакционных условиях находится около 520 нм. Молярный коэффициент поглощения в первоначальной методике (реакция в этаноле в смеси с 1,3-динитробензолом и водным раствором гидроксида калия) составляет около 15 000. Введение пиридина в реакционную смесь [60а, 640, 831] повышает его до 21 000. Во многих случаях, даже в современных автоматических методах, приходится использовать условия, при которых чувствительность гораздо ниже.

Основные трудности связаны с тем,, что для полного протекания реакции (2.7) необходима сильнощелочная среда, а в таких условиях окраска недостаточно устойчива. Было предпринято несколько попыток решить эту задачу, в частности используя органические основания типа гидроксида бензилтриметил- аммония [60а, 154] или соответствующего метоксипроизводного [89] вместо гидроксида калия или экстракцией окрашенного продукта реакции органическими растворителями типа эфира, хлороформа и т. п. [120, 169].

По-видимому, наиболее существенным практическим усовершенствованием реакции Циммермана за последнее время было предложенное Эпштейном [222] и использованное другими авторами [214, 240, 241, 242, 481, 823] введение водных растворов. (Интересно отметить, что довольно долго бытовало убеждение, что даже небольшие количества воды оказывают неблагоприятное воздействие на развитие окраски. Например, Кэллоу и др. [121], методика которых длительное время была стандартной, предписывали абсолютный этанол в качестве реакционной среды, а это привело к проблемам, связанным с устойчивостью щелочного реагента, добавление которого часто вызывало опалесценцию раствора.) По методике с использованием водных растворов для приготовления реагента из 1,3-динитробензола в качестве растворителя берут 5 %-ный водный раствор детергента гиамина 1622 (хлорид диизобутилфенокси- этоксиэтилдиметилбензиламмония). Как только раствор, содержащий пробу, и этот реагент сильно подщелачивают 10 М водным раствором гидроксида калия, быстро развивается окраска по реакции Циммермана и продукт сразу же осаждается из раствора совместно с большей частью избытка реагента, вследствие чего удается избежать его разложения. Реакция протекает 15 мин при комнатной температуре, после чего можно проводить измерения. Для этого мутный раствор разбавляют

таким же объемом 2,5 %-ного раствора гиамина 1622 с целью солюбилизации осадка или проводят экстракцию окрашенного продукта эфиром из сильнощелочного раствора.

Существенным недостатком всех вариантов метода Циммермана является заметное поглощение холостой пробы и появление фона в спектре, обусловленные присутствием посторонних компонентов. Частично их влияние можно уменьшить, используя особо чистые реагенты и растворители (это не необходимо при проведении водного варианта метода). При анализе биологических объектов помимо фона в спектре следует еще учитывать поглощение матрицы. Поэтому часто прибегают к алгебраическим поправкам. Наиболее известна поправка Аллена, для получения которой измеряют оптическую плотность в максимуме и при двух других длинах волн, а затем по уравнению (2.8) вычисляют исправленную оптическую плотность для исследуемого и холостого растворов:

А —А^А + л + ^Л, —Д,

А испр — X2 (

где X — длина волны в максимуме поглощения, а А обычно составляет 60 нм. Фелдкамп и др. [243] тщательно исследовали обоснованность введения такой поправки и пришли к выводу, что ею можно успешно пользоваться, только если спектры стандартного раствора и пробы различаются не очень сильно.

Наконец, остается упомянуть, что оба варианта метода Циммермана, водный и неводный, могут быть автоматизированы [214, 481, 565, 566, 650, 861].

Фенольное кольцо А

В табл. 2.2 приведены некоторые из многочисленных методов колориметрического определения эстрогенов, основанных на реакциях фенольного кольца А.

Эти прямые более или менее стехиометрические, но в основном не очень чувствительные методы имеют ограниченное применение, и их практическое значение обычно исчерпывается анализом лекарственных препаратов.

Гораздо большее значение как в фармацевтике, так и в биомедицине имеют нестехиометрические, но очень чувствительные методики, основанные на реакциях с реагентами, содержащими большие количества сильных кислот, в основном серной кислоты.

Самый простой реагент — это сама серная кислота. Она используется главным образом для идентификации стероидных гормонов (и не только эстрогенов, но и стероидов других классов). Это очень важный способ их качественного анализа,

Таблица 2.2. Фотометрические методы определения фенольного кольца А эстрогенов *

Автор

Год

0) S S к

>>о

^ S

Объект

Реагент

Максимум поглощения, нм

8, область подчинения закону Бера

Механизм реакции

Урбани и др. [784]

1968

[785, 786]

Лекарственные препараты

Диазотированный 4-ами- но-6-хлор-лгбензолди- сульфонамид

500

8 050

Азосочетание

Элдеви и др. [219]

1975

Таблетки

Диазотированный 5-хлор-2,4-динитроани- лин

450

11300

Азосочетание

Белал и Элненау [69]

1977

Таблетки

Диазотированный сульфатиазол

450

5—50 мкг/мл

Азосочетание

Ширзат и Шах [714]

1976

Таблетки

Диазотированный 3-нитроанилин

450

0—20 мкг/мл

Азосочетание

Мерле и Тендер [574]

1976

Эстрадиол в массе продукта

Диазотированная сульфаниловая кислота

—

Азосочетание (механизм спорный)

Ии и Джексон [856]

1976

Общее содержание эстрогенов в моче

З-Метил-2-бензотиазоли- нонгидразон — Се (IV)

530

11 200

Окислительное сочетание по С-4

Рао и др. [653а]

1979

Таблетки

Диазотированная фенил- гидразин-4-сульфокис- лота

347

1—10 мкг/мл

Азосочетание

Автор

Год

^1

Объект

Реагент

Максимум поглощения, нм

8, область подчинения закону Бера

Механизм реакции

Хассан и Заки [349]

1976

Содержание эстрогенов в массе продукта

16 М НМО3

385—430

10—50

мкг/мл

Нитрование ароматического кольца

Корани и др. [476]

1977

Таблетки

Na3[Co(NO2)6]

366(СНС13)

436 (водн. NaOH)

10—60

мкг/мл

Нитрование ароматического кольца

Сьёстром и Ни- кёнен [730]

1957

[368]

Лекарственные препараты

Молибдовольфрамо- фосфат

760

2200

Восстановление реагента до синего комплекса

Бейнс [58]

1950

Эквилин, эквиленин в масляных растворах для инъекций

Хлоримид 2,6-дибромхи- нона

530

Эквилин: 4900/эквиле- нин: 12 000

Образование индофенолового красителя

Хюттенраух и Кейнер [396]

1965

[485]

Местранол

SbCl3/AcOH

570

4—14 мкг/мл

—

Бекер и Эхингер [65]

1963

[66]

Таблетки

A1C13/CH3NO2

540

0—20 мкг/мл

—

* За исключением методов с использованием реагентов, содержащих сильные кислоты.

Рис. 2.5. Спектры активных компонентов противозачаточных таблеток в смеси серной кислоты и этанола в соотношении 65 :35 (по объему) [752].Рис. 2.5. Спектры активных компонентов противозачаточных таблеток в смеси серной кислоты и этанола в соотношении 65 :35 (по объему) [752].1 — этинилэстрадиол (2 мкг/мл); 2— норгестрел (10 мкг/мл); 3— экстракт из таблеток.1 — этинилэстрадиол (2 мкг/мл); 2— норгестрел (10 мкг/мл); 3— экстракт из таблеток.

Рис. 2.5. Спектры активных компонентов противозачаточных таблеток в смеси серной кислоты и этанола в соотношении 65 :35 (по объему) [752].

Рис. 2.5. Спектры активных компонентов противозачаточных таблеток в смеси серной кислоты и этанола в соотношении 65 :35 (по объему) [752].

1 — этинилэстрадиол (2 мкг/мл); 2— норгестрел (10 мкг/мл); 3— экстракт из таблеток.

1 — этинилэстрадиол (2 мкг/мл); 2— норгестрел (10 мкг/мл); 3— экстракт из таблеток.

поскольку он часто позволяет обнаруживать большие различия между близкими по структуре стероидами, УФ-спектры которых в этаноле практически не отличаются. Обсуждение связи между спектром и структурой выходит за рамки настоящей книги, поэтому здесь перечислены лишь

основные литературные источники [72, 734, 735, 737, 860].

С точки зрения количественного анализа гораздо более важны методы, в которых используется разбавленная серная кислота; в качестве разбавителей обычно применяется этанол или метанол. Главная область применения этих реагентов — фармацевтика, поскольку их высокая чувствительность позволяет проводить анализ низкодозирован- ных таблеток, содержание эти- нилэстрадиола и местранола в которых нельзя определять менее чувствительными УФ-спек- трофотометрическими методами. Серная кислота в сочетании с этанолом была использована рядом авторов для указанной выше цели [272, 367, 715, 747, 752], а также при контроле ферментации [564]. На рис. 2.5 представлены спектры этинилэстра- диола и норгестрела в смеси серная кислота—этанол в соотношении 65:35 (по объему).

взятые из статьи Шабо [752]. Спектры снимали через 20 мин после начала реакции при комнатной температуре; по утвер

ждению автора, они сохраняются неизменными в течение нескольких часов. Очевидно, различия между спектрами делают возможным одновременное определение обоих стероидов, что было использовано при анализе отдельных противозачаточных таблеток. Интересно отметить, что данные Шабо [752] и Хассана и др. [348] относительно устойчивости окраски находятся в противоречии с мнением авторов, которые утверждают, что окраска, полученная с помощью реагента серная кислота — этанол, неустойчива. Вероятно, устойчивость окраски сильно зависит от чистоты этанола и серной кислоты, используемых в ана

лизе.

Для автоматического определения этинилэстрадиола в таблетках Бейер [74] предложил использовать смесь серной кислоты и этанола в соотношении 9 : 1 (по объему).

Вероятно, наиболее широко распространенным реагентом для определения этинилэстрадиола и местранола в таблетках является смесь серная кислота—метанол в соотношении 7 : 3 (по объему), предложенная Цилифонисом, Хафезом и др. [143, 780]. Этот реагент, принятый среди прочих [164, 317, 763, 847, 848] фармакопеей США [783г], обеспечивает устойчивую и очень интенсивную окраску для двух упомянутых выше соединений (^макс = 540 нм, е =34 000) с необычайно высокой избирательностью. Эстрон, эстрадиол и т. п., не содержащие 17-этиниль- ной группы, не дают такой окраски, что указывает на необходимость наличия в молекуле стероида одновременно фенольного кольца А и 17-этинил-17-оксигруппы. В первоначальном варианте методики окраска проявлялась в процессе экстракции эстрогенов и самого реагента из их раствора в петролейном эфире. В современном варианте этого метода By [847, 848] и Грэхем [317] предложили определять этинилэстрадиол [847] и местранол [317, 848] в противозачаточных таблетках после отделения эстрогенов от гестогенных компонентов и мешающих наполнителей методом распределительной хроматографии на колонке; окраска появлялась при экстракции непосредственно из элюатов.

Несмотря на удовлетворительные чувствительность и селективность реакции с участием реагентов, содержащих разбавленную этанолом или метанолом серную кислоту, и на простоту методики, в биомедицине гораздо чаще применяются более длительные двухстадийные реакции, обладающие еще большей чувствительностью и селективностью, с участием реагентов, содержащих серную кислоту, воду и добавки. Одно время эти реакции лежали в основе стандартных методик фармацевтического анализа. На первой стадии этих методик, основанных на классической методике Кобера [470], эстроген нагревают примерно с 65 %-ной (по объему) серной кислотой, содержащей немного фенола, до образования желтого продукта Р-макс~450— 500 нм). На второй стадии смесь разбавляют водой до 40— 50 %-ной концентрации серной кислоты и снова нагревают. При этом окраска переходит в розовую (лМанс~505— 555 нм). Для разных эстрогенов молярный коэффициент поглощения составляет от 40 000 до 50 000.

Со времени выхода статьи Кобера появилось большое число публикаций по оптимизации условий этой реакции, применению таких методик в различных областях анализа стероидов и механизму реакций. Монографии Какача и Вейделека [437, 438] и Бартоша и Незе [60] можно рекомендовать в качестве литера-

турных источников. В настоящей книге приведены ссылки только на те статьи, в которых описаны наиболее существенные видоизменения первоначальной методики и приведены способы, до сих пор остающиеся стандартными.

Вместо самого фенола на первой стадии реакции были опробованы и его производные. Из них в настоящее время повсеместно применяется гидрохинон, а методики Болда [63], Брауна [106, 107] и Нокке [594], в которых рекомендуется этот реагент, считаются стандартными. Состав реагента Брауна зависит от определяемого эстрогена. Он содержит 2 г гидрохинона на 100 мл разбавленной серной кислоты, 66 %-ной (по объему) для эстрона, 60 %-ной для p-эстрадиола и 76 %-ной для эстриола. Определяемый эстроген обрабатывают 3 мл соответствующего реагента при 100 °C в течение 20 мин, охлаждают, разбавляют водой (0,5 мл в случае эстрона, 0,2 мл в случае 0-эстрадиола и 1 мл для эстриола) и нагревают еще 10 мин. По уравнению Аллена [28], вычисляют исправленную оптическую плотность [см. уравнение (2.8)]. Длины волн соответственно равны 480, 513 и 546 нм.

По существу такая же методика предложена Нокке [594], только концентрации и время реакции несколько изменены. Помимо очень широкого применения в биомедицине эти методы использовались для определения эстрогенов в лекарственных препаратах [224, 461, 570, 719].

Другим важным вариантом метода Кобера является методика Хенни [327], предложившего реагент, состоящий из серной кислоты, воды, фенола и сульфата железа(III). Присутствие иона железа(III) в реакционной смеси повышает скорость развития окраски, стабилизирует окраску и, следовательно, улучшает достоверность метода. Кроме чисто фармацевтического применения [95, 739] путем изменения условий реакции можно решать чрезвычайно сложные задачи. К последним относятся селективное определение а-эстрадиола в присутствии больших количеств р-эстрадиола [327, 328], селективное определение эквилина [783в] и др.

Важная область применения описанного выше варианта реакции Кобера — это анализ конъюгатов эстрогенов и приготовленных из них лекарственных препаратов. По методу, рекомендуемому фармакопеей XX США [783в], привлечение экстракции и хроматографии и использование обоих реагентов Кобера позволяют определять натриевые соли сульфата эстрона и сульфата эквилина и общее содержание связанных эстрогенов. Грэхем [316], Карол и др. [131] и Кариньян и Лодж [129] опубликовали новые варианты этой методики, для того чтобы упростить процесс и повысить достоверность. Разработанные ими методики, более, пожалуй, пригодные в лабораторных условиях,

подробно здесь не обсуждаются, поскольку недавно опубликовано несколько простых газохроматографических и ВЭЖХ-ме- тодов, позволяющих избирательно определять все компоненты (см. разд. 2.2.11 и 2.2.12).

Большинство работников клинических лабораторий, определяющих эстрогены в моче и т. п. колориметрическим методом, пользуются реакцией Кобера в варианте Иттриха. Главное отличие первоначальной методики Иттриха [400], в основе которой лежит метод Брауна [106, 107], состоит в том, что вместо второго нагревания окрашенный продукт экстрагируют хлороформом, содержащим 2 % n-нитрофенола, что существенно повышает избирательность метода и стабилизирует окраску. (Другим важным преимуществом экстракции является возможность проведения очень чувствительных флуориметрических измерений; это будет обсуждаться в следующем разделе.)

Во втором варианте метода Иттриха [401] хлороформ заменен 1,1,2,2-тетрабромэтаном, обладающим, как оказалось, более высокой экстракционной способностью. Ниже дано краткое его описание.

К пробе, содержащей до 10 мкг эстрогена, добавляют 1 мл 65 %-ной (по объему) серной кислоты с 2 % гидрохинона п оставляют на 40 мин при 100 °C. После охлаждения смесь разбавляют 1,5 мл воды, снова охлаждают и затем экстрагируют 2 мл тетрабромэтана, содержащего 1 % (по объему) этанола и 2 % (масса/объем) n-нитрофенола. Измеряют оптические плотности при 510, 543 и 576 нм и вычисляют исправленную оптическую плотность по уравнению Аллена [см. уравнение (2.8)]. Молярный коэффициент поглощения близок к полученному по методике Кобера—Брауна.

Ватанабе и др. [822] сообщили о любопытном побочном явлении, наблюдавшемся ими при использовании этого метода. В моче беременных было обнаружено чрезвычайно низкое содержание эстриола, если больные принимали гидрохлортиа- зид. Причина заключалась в том, что образующийся при приеме этого лекарственного препарата формальдегид взаимодействует € фенольным кольцом А, образуя сополимер.

Другой вариант метода Иттриха, также используемый в настоящее время, предложил Бредшоу [97]. Он заменил воду на стадии разбавления 2 М водным раствором трихлоруксусной кислоты и тем самым улучшил экстракцию хлороформом (без добавления n-нитрофенола) окрашенного продукта. Экстракцию можно проводить также тетрахлоридом углерода [11].

Оба варианта метода Кобера (методики Брауна и Иттриха) используются в полуавтоматических или полностью автоматизированных установках во многих лабораториях в основном для определения общего содержания эстрогенов в моче [64, 680].

Выяснение механизма реакции Кобера и других реакций, в которых эстрогены обрабатываются концентрированными минеральными кислотами, являлось и является до настоящего времени предметом многих исследований. Даже простое перечисление статей, посвященных этому вопросу, вышло бы за рамки книги. На основании классических [92, 436] и современных [423, 454, 558—560, 607] исследований можно утверждать, что сильные кислоты дают окрашенные продукты с теми эстрогенами, которые кроме фенольного кольца А содержат кислородную функциональную группу при Ci7. Основная роль кислоты заключается в дегидратации молекулы с образованием двойной связи (связей), которая мигрирует к фенольному кольцу А. В ходе этого процесса метильная группа при Ci3 мигрирует в положение Ср, и, кроме того, происходит сульфирование фенольного кольца А (при С2). Окраска образующихся продуктов может возникать вследствие протонирования в сильнокислой среде, что приводит к образованию ионов карбония, способных к резонансу.

Вторая стадия реакции Кобера носит окислительно-восстановительный характер [63, 106, 594]; в результате удлинения л-электронной системы в спектре окрашенного комплекса наблюдается батохромный сдвиг.

Другие классы стероидов

В табл. 2.3 приведены основные характеристики нескольких колориметрических методов, в основе которых лежит взаимодействие не с кетогруппой и фенольным кольцом Л, а с другими функциональными группами.

Следует заметить, что реагенты, содержащие концентрированную серную кислоту, которые в предыдущем разделе этой главы рассматривались как реагенты на фенолсодержащие стероиды, нашли широкое применение также для анализа не содержащих фенол стероидов. В настоящее время эти методы все еще используются для определения производных, для которых не найдено более селективных реакций.

Типичными примерами служат прегнандиол и прегнантриол. Для определения прегнандиола Клоппер и др. [465] предложили реагент, содержащий 0,1 % (масса/объем) сульфита натрия

S я

от

го

ф S

5 8 у 5 ° 5 $ Л $ ° « к U* § ф i Z g^K СУ DD Q C^Z

S л су

Ф

К g S 3 §

си СУ

о CD СУ

ю О О

М Ф

S И

X СП

6 § <и

2-Р§

8 У ^ ьл

1“^

1 = "В ° 5 ® з

« и а хо

СО

СО к о

S

S КС

в dag Хнояве кинэнныгоп Ч1ЭВ1Г9О ‘3

Й о о CO —

е; ио ^

2 , 2 g $ и О я к - та О S ^ к к

о ио ю

1

О Ю

Ю (М

2§i

СО S

S

ф 3 о.

о

3

CU СО =t

су

О

СУ У О £

ф S я

ф У

5 3

О Ё

S

LQ 'о

ф

3 к

1 3

а”

«5 с

§ О S

3 CD

MS

$ СО О § я GO X?Z

Я S

3 су S et

OU

5x SU

у ‘5

S =

S S С( S

S к +

о

о S

КС

о~

Z^ bhZ

<О

is о Е § д

е

5 s

о

ф

¥ о

<м

я к

3 к

& о

О Kt

*& s

О u

3

& о О к( ^s

си

О о

СУ к

S

S

СП

8

ц о

6)

6)

со

О)

о о <

S КС >>

S

0 21

00

s я гф

6 м

СУ

5 =

CD CD £2.

& s

Си СП

о

< S

гоа

Таблица 2.3. Фотометрические методы определения некоторых функциональных групп стероидов

Продолжение табл. 2.3

А

втор

Год

Функциональная группа

Реагенты

Образец

Максимум поглощения, нм

О5 8 = >.

° о Го

Механизм реакции

Чепези [755]

и Гёрёг

1974

17а-Этинил-17- гидроксильна я

трет-Бутил ат натрия, диэтилокса- лат

Содержание ме- странола, этинил- эстрадиола, диацетата этинодиола и др. в массе продукта

294

10600—

10 800

Дезэтинилирование, образование 16-глиоксалил-17- кетона

Пезе и [624]

Бартош

1960

Гидроксильная

3,5-Динитробензо- илхлорид/пипера- зин

Стандарты

510

7000—

8000

Этерификация

Мишина [592]

i и др.

1965

А5-3-Гидроксильная

СгО3, п-нитрофе- нилгидразин + + NaOH

Дегидроэпиандростерон в моче

590

26 000

Окисление до А4- 3,6-диона, образование гидразона

Форист [258]

и Тил

1958

Сложноэфирная

NH2OH, Fe(C104)3

Стандарты

530

800—

1200

Образование гид- роксамата Fe(III)

Баггет 1

1 Др. [51]

1955

Гидроксильная

Уксусный ангидрид, nh2oh, FeCl3

Моча

527—560

0,12—1,2

мкэкв/мл

Ацетилирование, образование гид- роксамата Fe(III)

Л to А

Ф X g д о <5 s Д о S

Д ф Я О ДфД я Д ф Ф to *<§ё§ 8 я 1 я Ц д Д= g

ХЗ Ох

о П) о ж О\ ж ф д ^1 К О ро со О ^ о to tr to о ~ Д ж о н о § to ^ ^ ^ о

SК Ф

д

5 to о х я Д я о 6

5 н J 23^* g 3 S * » ® о

О & 00 со ~ ^ to 5х to О

s g5 s а £ ю о д ф о\ to ^о

х о 5 н о 2 ю Д я о 2 Н S д о 5 Е о Д Г X Дс

й 5 5 ^5 S512 ® Я ^ Д О Я Я фХ? я X? g н я о ^х ^ ю я ю ю

a2°2S^2£$ М2К о я о я w о озо2х^охд^яо^

53^Н^О\ФДД_Ы SЮДДдй Ф ЯП^ЯфО^2^Дф5Х

йя^яёнфя^^дto 25 Д д о о д д д

1кй£|я5«§| 1 ^^"^^^н-о^оо^ о-а^-д

“- gg|s%§«ii § ?о!з1з^я°=^£13я1Хп§о^§х§15 н Й^н|Н ^ГНП Ri W-H=iiigH 35 2 to to д о ЯSX О О Д X ti 12 хОЖО О О ЯО

Й 'l^gll^So” к'ёоя2^й^^я£о^§ёра w3§^ =g| t|?^^==^=я^^s = e£gg§^sl^2^- ! sя = ^§^

^5 §gs§£§S®я ^ а §=-^ S ^ 5 §2 ^ ^g| § ё « «"g 5 x^il ?

§gog’wgsggо g -g 3 5 s £ s q § О X я oog ь О §= 52 о § о-

1«ss^ggggs1»^• |§й®§2м^^^р^§§я“^я§я:

^»|$Р§5^^s§2£§|^§я^яо_о^»„§$

sS3m"gg-g®2 « Ь—g^§ssgtoS^^_;

»ю§оне®5§owMg^373gg сл 2 о §^“S2e2»“ss2g§

н§ДьЭ^фюоs 2 Д g Д а Д оq

“о\ооя^2яои^фно^ §2§5£ох^ ~ фоЕ^^я^ф^И $

>s^3 = ie§ l^is^j^s^®* 3ggp^-?^os^ ? 5sy$#”s^n^^E R^'-res^Siro о g ^ ° S у WS St to®

goSgqgxSsSE^H= ss=gb-gy 2§ga ^§^g-gH8

o^2oto^^^02"'to§^S5у^е^® £>ею °| g ё ° я g о §“

g?”?»?'?^5? toS иМ 222 ^ ¥? ? Оё^ ?c??s®eE^‘!?5§§^

около 284 нм, а максимум спектра испускания лежит в области 310—327 нм. Интенсивность этого флуоресцентного излучения в УФ-области гораздо ниже интенсивности флуоресценции под действием кислот в видимой области: хотя имеется сообщение о том, что нижний предел обнаружения эстрадиола достигает 0,01 мкг/мл [98], но он в 100—1000 раз выше, чем это необходимо для количественных определений. (Интересно отметить, что относительная интенсивность флуоресценции эстрона по крайней мере в десять раз ниже, чем у 17-оксипроизводных, вследствие исчезновения 17-кетогруппы.)

Недостатки этого метода вытекают из относительно низкой интенсивности флуоресценции и малых длин волн возбуждения и испускания. При сравнительно высокой концентрации пробы часто возникает флуоресцирующий фон, а сопутствующие вещества, поглощающие УФ-излучение, могут вызвать тушение флуоресценции. С другой стороны, преимуществом метода является его необычайная простота, а все трудности, связанные с использованием сильнокислых реагентов, можно устранить.

Джеймс успешно применил этот метод для определения ме- странола в противозачаточных таблетках [411] и валерата эстрадиола в масляных препаратах для инъекций [412]. Прогестогены не мешают в первом случае (за исключением ацетата хлормадинона с максимумом поглощения при 284 нм), но в последнем случае необходимо хроматографическое отделение активного начала на колонке. При анализе таблеток на содержание этинилэстрадиола методом, рекомендованным британской фармакопеей 1980 [101в], влияние флуоресцирующего фона устраняют путем измерения разности между флуоресценцией нейтральных и щелочных экстрактов из таблеток, так как в щелочной среде происходит тушение флуоресценции.

Кроме перечисленных выше и других [202, 435, 665] примеров применения собственной флуоресценции в фармацевтике можно еще привести работу Брамхолла и Бриттена [98] по определению эстрогенов в моче. Это определение можно проводить после ферментативного гидролиза, экстракции эфиром и промывания экстракта раствором карбоната натрия с pH 10,5. Если эстрадиол и эстрон проэкстрагировать из гидролизата смесью бензола и петролейного эфира (1:1), измерение флуоресценции последующего эфирного экстракта будет характеризовать содержание эстриола.

Методы, основанные на флуоресценции, вызванной кислотами

Появление окраски при взаимодействии стероидов с сильными кислотами обычно сопровождается флуоресценцией, и это явление начиная с тридцатых годов используется для качествен-

кого и количественного анализа. Обзор результатов раннего периода и корреляций между флуоресценцией и структурой был сделан Голдцихером [286].

Флуоресценция под действием кислот применяется в основном для определения эстрогенов. Хотя помимо реагентов, содержащих серную кислоту, успешно используются и другие реагенты (фосфорная,соляная, муравьиная кислоты и др.), с помощью которых во многих случаях удается добиться поразительно селективных определений (например, Боскотт [92] определил а-эстрадиол в присутствии большого избытка р-эстра- диола при помощи 90 %-ной муравьиной кислоты в качестве флуорогенного реагента), в настоящее время почти исключительно применяются реагенты типа реагента Кобера, содержащие серную кислоту (см. разд. 2.2.2), для определения эстрогенов в жидкостях организма и смеси серной кислоты со спиртом для фармацевтического анализа.

Разработанный Иттрихом [400, 401] вариант метода Кобера—Брауна [106, 107] с применением реагента, состоящего из серной кислоты и гидрохинона, и экстракции флуоресцирующих продуктов наиболее удобен для определения общего содержания эстрогенов в моче. Вся методика легко поддает^ автоматизации, и в последние несколько лет фактически только такие методы и публикуются.

Например, Фрай и др. [267] предложили автоматический вариант метода Хёнеля и Джонса [329], в котором рекомендуется использовать в качестве флуорогенного реагента 63 %-ную (по объему) серную кислоту [содержащую 2 % (масса/объем) гидрохинона] и в качестве экстрагента (после разбавления реакционной смеси водой) 0,9 М раствор трихлоруксусной кислоты в дихлорэтане. Длины волн возбуждения и излучения составляли 520 и 550 нм соответственно. Гутт-Кусьё и др. [289а] определяли общее содержание эстрогенов в сыворотке крови беременных в непрерывном анализаторе после ферментативного гидролиза и ионообменной очистки, используя раствор нитрофенола в хлороформе для экстракции флуоресцирующих ве- ществ. Глюкоза и, по всей вероятности, другие альдегиды, присутствующие в моче, мешают определению. Их влияние можно уменьшить разбавлением проб перед анализом или устранить полностью либо путем разделения методом ионообменной колоночной хроматографии, либо путем восстановления альдегидной группы борогидридом натрия. Эта стадия включена в большинство методик, разработанных другими исследователями, для автоматического определения эстрогенов в моче [64, 124, 330, 393, 568, 573, 745]. Различие между описанными выше и некоторыми другими не упомянутыми здесь методиками заключается главным образом в способе предварительной обработки

4 Заказ № 182

пробы и составе экстрагента. Конечно, эти методы позволяют определить лишь общее содержание эстрогенов, но если экстрагировать эстрон и эстрадиол из водного раствора смесью гексана и бензола (1:1), то можно селективно определить оставшийся эстриол. Этот прием использован, например, в работах Миклоши и сотр. [554] и Мессери с сотр. [545а] при определении эстриола в сыворотке крови и моче беременных. Высокая чувствительность метода Иттриха позволяет определять до 3-Ю-10 г эстриола, и, следовательно, весь анализ можно выполнить всего лишь из 0,2 мл сыворотки.

Кинетика образования флуоресцирующих продуктов типа реагентов Кобера из различных эстрогенов исследована Фаулером и др. [260г] с целью разработки непрерывного кинетического метода их определения в моче беременных.

Наиболее уязвимой стадией автоматических методов Кобера— Иттриха является разделение фаз. Чтобы исключить ее, Левер и сотр. [498], Литтл и сотр. [506], Хэммонд и сотр. [336] и Дар- хэм [201] при автоматическом определении эстрогенов в моче использовали целиком водную систему, исключив вообще органический растворитель (даже стандартный раствор эстриола вводят в реакционную смесь в виде натриевой соли в 0,1 М гидроксиде натрия). Пробу нагревали с реагентом, состоящим из серной кислоты, гидрохинона и сульфата железа(II); при последующем разбавлении раствора водным реагентом, содержащим хлоральгидрат и трихлоруксусную кислоту, возникала флуоресценция.

Благодаря высокой чувствительности метода, основанного на флуоресценции в кислой среде, его обычно с успехом применяют для определения эстрогенов в низкодозированных лекарственных формах, в основном этинилэстрадиола и местрадиола в противозачаточных таблетках. Высокая чувствительность играет особенно важную роль при анализе отдельных таблеток, причем в большинстве случаев определение автоматизировано. Для анализа таблеток на содержание эфиров эстрогена Вебер и сотр. [824] в качестве флуорогенного реагента предложили концентрированную серную кислоту, а для определения этинилэстрадиола Миллер и Дьюджид [555] и Хираи с сотр. [371 al рекомендуют смесь серной кислоты и этанола (7:3), Хоури и Кали [453] — 90 %-ную серную кислоту, фармакопея XX США — смесь серной кислоты и воды (3:1), а Джеймс [413] — реагент Либермана—Бурхарда (см. разд. 4.2.1). Некоторые авторы определяли местранол с помощью смеси серной кислоты и метанола, например, Комер и др. [164] использовали смесь (7:3), а Темплтон и др. [763] и Мариани и Мариани-Ви- кари [525] — смесь (1:1). Смесь серной и уксусной кислот (3:1) применяли Пастор и др. [614], а об использовании

реагента Кобера для этой цели сообщали Шрофф и Гутман 1719].

Методом флуоресценции в кислой среде можно также определить различные неэстрогенные половые гормоны. Из многочисленных работ, касающихся этого вопроса, следует упомянуть четыре.

Тишлер и др. [774] определяли метандиенон в таблетках по флуоресценции (возбуждение при 280 нм, испускание при 345 нм), возникающей при обработке 2 мл метанольного экстракта из одной таблетки, содержащей 0,2 мг активного вещества, 5 мл концентрированной соляной кислоты при 100 °C в течение 20 мин. Как было установлено [773], механизм возникновения флуоресценции в этом случае аналогичен механизму возникновения флуоресценции при реакции метилтестосгерона с 80 %-ной фосфорной кислотой и трихлоруксусной кислотой, описанной Ньяу [593].

Эти методы не обладают высокой чувствительностью. Однако, для того чтобы добиться необычайно высокой чувствительности определения прогестерона, надо, следуя рекомендациям Таучстоуна и Муравека [775], перед обработкой серной кислотой нагреть его с 2 М метанольным раствором гидроксида калия с целью превращения в 6-кетопроизводное [492].

Флуориметрия играет важную роль при определении метаболитов спиронолактона. В организме спиронолактон распадается с отщеплением тиоуксусной кислоты и частичным раскрытием лактонного кольца.

канреноевая кислота

Одновременное определение обоих метаболитов — важная задача [746а]. Она была решена с помощью метода флуориметрии 4*

ааЭлектрон- ный интеграторЭлектрон- ный интеграторСамописецСамописецФлуориметр 436/525 нмФлуориметр 436/525 нмббЭССЭССАвтоматический пробоотборникАвтоматический пробоотборникВодаq мл/мин □ WВоздухВодаq мл/мин □ WВоздухБуфер (рню)Буфер (рню)На промыва - q кие пробыНа промыва - q кие пробы0,420,237Л80,420,237Л8ДихлорэтанДихлорэтанг^ШПг*ОССг^ШПг*ОСС65°/о H2S0465°/о H2S04о--D--И--П-S-о--D--И--П-S-0,58 0,321,850,58 0,321,85ДесДесВоздух СбросВоздух СбросОСС о 2 тгт_ И Проба u/ZZr3 I 1н. НС1ОСС о 2 тгт_ И Проба u/ZZr3 I 1н. НС1ДихлорэтанДихлорэтан10 ч10 чПромывание пробыПромывание пробы55На определение канреноевойНа определение канреноевойI кислоты 1фсI кислоты 1фсСбросСбросО^—ИЗ0'47 -~|□ Стандартные шланги0 Красные кислотоустойчивые шланги (Red AcidfLeac)О^—ИЗ0'47 -~|□ Стандартные шланги0 Красные кислотоустойчивые шланги (Red AcidfLeac)□ мл/мин□ После определения канренона□ мл/мин□ После определения канренонаЭлектрон- ный интеграторЭлектрон- ный интеграторСамописецСамописецIВоздухг65% H2SQ4рIВоздухг65% H2SQ4рОССОСС1,851,85q^Z В^- 0^21<~~i °'52q^Z В^- 0^21<~~i °'52СбросСбросФСФССбросСбросФлуориметр 436/525 нмФлуориметр 436/525 нмДССДССI ВоздухСбросI ВоздухСброс0,700,70ФСФСп^-п^-□ Стандартные шланги

а

а

Электрон- ный интегратор

Электрон- ный интегратор

Самописец

Самописец

Флуориметр 436/525 нм

Флуориметр 436/525 нм

б

б

ЭСС

ЭСС

Автоматический пробоотборник

Автоматический пробоотборник

Вода

q мл/мин □ W

Воздух

Вода

q мл/мин □ W

Воздух

Буфер (рню)

Буфер (рню)

На промыва - q кие пробы

На промыва - q кие пробы

0,42

0,23

7Л8

0,42

0,23

7Л8

Дихлорэтан

Дихлорэтан

г^ШПг*

ОСС

г^ШПг*

ОСС

65°/о H2S04

65°/о H2S04

о-

-D-

-И-

-П

-S-

о-

-D-

-И-

-П

-S-

0,58 0,32

1,85

0,58 0,32

1,85

Дес

Дес

Воздух Сброс

Воздух Сброс

ОСС о 2 тгт_ И Проба u/ZZr3 I 1н. НС1

ОСС о 2 тгт_ И Проба u/ZZr3 I 1н. НС1

Дихлорэтан

Дихлорэтан

10 ч

10 ч

Промывание пробы

Промывание пробы

5

5

На определение канреноевой

На определение канреноевой

I кислоты 1фс

I кислоты 1фс

Сброс

Сброс

О^—

ИЗ0'47 -~|

□ Стандартные шланги

0 Красные кислотоустойчивые шланги (Red AcidfLeac)

О^—

ИЗ0'47 -~|

□ Стандартные шланги

0 Красные кислотоустойчивые шланги (Red AcidfLeac)

□ мл/мин

□ После определения канренона

□ мл/мин

□ После определения канренона

Электрон- ный интегратор

Электрон- ный интегратор

Самописец

Самописец

I

Воздухг

65% H2SQ4р

I

Воздухг

65% H2SQ4р

ОСС

ОСС

1,85

1,85

q^Z В^- 0^21

<~~i °'52

q^Z В^- 0^21

<~~i °'52

Сброс

Сброс

ФС

ФС

Сброс

Сброс

Флуориметр 436/525 нм

Флуориметр 436/525 нм

ДСС

ДСС

I Воздух

Сброс

I Воздух

Сброс

0,70

0,70

ФС

ФС

п^-

п^-

0 Красные кислотоустойчивые шланги (Red Acid flex)

□□Рис. 2.6. Схема непрерывного автоматического определения канренона (а) и канреноевой кислоты (6) [585].

□

□

ОСС — одинарная смесительная спираль; ДСС — двойная смесительная спираль; ЭСС — экстракционная смесительная спираль; ФС — фазовые сепараторы; I, II, III — стеклянные соединители.

в сернокислой среде [280, 683, 684]. Недавно Нойберт и Кох [585] описали автоматизированный вариант этого метода. Канренон экстрагируют из пробы сыворотки при pH 9 дихлор-

этаном, обрабатывают 65 %-ной серной кислотой, а сернокислотный слой подают в проточную кювету флуориметра. Канре- ноевую кислоту, остающуюся в водной фазе после экстракции дихлорэтаном, определяют аналогичным образом, превращая: ее в канренон в присутствии соляной кислоты в качестве катализатора. Весь процесс автоматизирован, как показано на рис. 2.6.

Определение стероидов другими флуориметрическими методами

При обработке спиртовыми растворами гидроксида натрия А4-3-кетоны сильно флуоресцируют как в растворах, так и на хроматограммах [1, 3]; это легло в основу метода их чувствительного определения и избирательного обнаружения. Чрезвычайно чувствительный вариант такого метода описан Капланом и др. [441], проводившими реакцию на поверхности шариков из гидроксида лития и измерявшими флуоресценцию с помощью вращающегося держателя шариков.

Дансилирование дансилхлоридом открывает прекрасную возможность получения флуоресцирующего производного по фенольной оксигруппе эстрогена.

Реакцию дансилирования можно проводить в различных растворителях, например в ацетонитриле или ацетоне, в присутствии водного раствора гидроксида натрия или карбоната натрия. Дансилированные производные можно экстрагировать гексаном, диэтиловым эфиром и т. п. Флуоресценцию измеряют или непосредственно в хлороформном растворе (возбуждение при 346—366 нм, испускание при 502—525 нм), или проводят разделение экстракта методом тонкослойной хроматографии и измеряют флуоресценцию индивидуальных эстрогенов после элюирования пятна. При анализе готовых лекарственных форм Фишман [251] использовал прямой метод, а в методиках Эрля и Фогта [601], Эртеля и Пензеса [603], Бежей и Боша [76] и Двира и Чейена [206] предусмотрена стадия разделения методом тонкослойной хроматографии. Эти методы очень чувствительны, поскольку позволяют легко определять субмикрограм- тиовые количества эстрогенов. Еще выше чувствительность определений, основанных на применении производных 1-этокси- 4- (дихлор-гажж-триазинил) нафталина [152].

Пезе и Бартош [627] сообщили о флуориметрическом варианте колориметрического метода определения кетостероидов с использованием щелочного 2,6-ди-трет-бутил-и-крезола (см. разд. 2.2.2); в той же статье описано определение А5(10)-3-кето- стероидов по тушению ими флуоресценции пиронина.

Хорикава и др. [380] предложили новый метод определения А4-3-кетостероидов, основанный на флуоресценции (возбуждение при 380 нм, испускание при 495 нм), возникающей при обработке изоникотиноилгидразона кетостероида хлоридом алюминия.

Определение стероидов (дигидротестостерона и эстрадиола) флуоресцентно-иммунными методами описано в работе Экеке и Эксли [218]. В этом методе, который представляет собой нерадиоактивный вариант радиоиммуного метода (разд. 2.2.13), вместо радиоактивной метки используется флуоресцентная метка (4-метилумбеллиферон-З-уксусная кислота) и определение проводится флуориметрически после разделения свободного и связанного в флуоресцирующий комплекс стероида методом двойных антител.

ИНФРАКРАСНАЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ

В классический период развития химии стероидов инфракрасная спектроскопия была наиболее мощным средством установления структуры стероидных соединений и даже в наши дни остается одним из наиболее важных методов в этой области. Почти все публикации, касающиеся теоретических и практиче- юких аспектов синтетической химии стероидов, содержат ценные

ИК-спектроскопические данные. В атласах спектров и исчерпывающих монографиях по ИК-спектроскопии приводится масса сведений о стероидах, однако здесь будут обсуждаться лишь те из них, которые представляют особый интерес для рассматриваемых классов стероидов [136, 196, 418, 663].

Наряду с применением ИК-спектроскопии для идентификации стероидов и установления их структуры этот метод имеет важное значение для распознавания полиморфных модификаций, часто встречающихся у стероидных гормонов [484, 544, 645].

По сравнению с этими областями ИК-спектрофотометрия как метод количественного анализа стероидов имеет меньшее значение. Тем не менее по этому вопросу опубликовано большое количество статей, начиная с раннего периода развития анализа стероидов [132, 611] и до последнего времени [148].

Большим преимуществом . ИК-спектрофотометрии по сравнению с УФ-спектрофотометрией является то, что спектры даже в наименьшей степени замещенных производных относительно богаты характерными полосами поглощения, что позволяет анализировать даже сложные смеси стероидов без какого-либо предварительного разделения. Однако метод ИК-спектрофотометрии имеет и определенные недостатки. Чувствительность его чрезвычайно мала: значения молярных коэффициентов поглощения полос, наиболее часто используемых в количественном анализе стероидов, составляют всего 50—300. Кроме того, из-за отсутствия полностью прозрачных растворителей толщина кюветы должна быть гораздо меньше, чем при УФ-спектрофото- метрических измерениях (обычно она не превышает 0,5 мм). Это значит, что концентрация измеряемого раствора в большинстве случаев должна составлять несколько процентов. При таких высоких концентрациях часто происходят внутримолекулярные взаимодействия, и поэтому всегда следует тщательно проверять подчиняемость закону Бера.

Другая трудность заключается в том, что оптические плотности, на определении которых основаны количественные измерения, нельзя измерить непосредственно; их можно оценить по спектрам, используя метод базисной линии. Поэтому методы ИК-спектрофотометрии характеризуются меньшей правильностью и более низкой воспроизводимостью, чем методы УФ-спектрофотометрии.

Хотя спектры твердых веществ, полученные методами ИК- спектрофотометрии на таблетках из бромида калия [351, 352, 674] и тонких поверхностных пленках [362], а также методом инфракрасной отражательной спектроскопии [75], нашли применение в количественном анализе, в большинстве случаев рекомендуется использовать спектры растворов.

Таблица 2.4. Определение некоторых стероидов в лекарственных препаратах методом ИК-спектроскопий

Автор

Год

Стероид

go

5 3 7

5 X S

Функциональная группа

Максимальная концентрация градуировочного графика, мг/мл

Растворитель

Толщина слоя, мм

Хаттен и др. [148]

1976

Ацетат хлормадинона

1732

v(C=O) на я)

(сложноэфир-

10

СНС13

0,5

Димэтистерон

1658

v(C = O) па)

(А4-3-кетогруп-

5

СНС13

0,5

Диацетат этинодиола

1735

v(C = O) ная)

(сложноэфир-

6

СНС13

0,5

Ацетат мегестрола

1650

v(C=O) группа)

(А4’6-3-кето-

5

СНС13

0,5

Норэтистерон

1660

v(C=O) группа)

(А4-3-кето-

5

СНС13

0,5

Ацетат норэтистерона

1663

v(C = O) па)

(А4-3-кетогруп-

8

СНС13

0,5

Норэтинодрел

1715

v(C=O)

(3-кетогруппа)

7

СНС13

0,5

с/-Ыоргестрол

1662

v(C = O) па)

(А4-3-кетогруп-

5

СНС13

0,5

Белломонте [70]

1971

Линоэстренол

ИЗО

v(C—О)

(17-ОН)

60

СС14

0,5

Автор

Год

Стероид

2 .

§§- Ч и 1 Oss

Функциональная группа

Максимальная концентрация градуировочного графика, мг/мл

Растворитель

Толщина слоя, мм

Сильвестри [726]

1971

Метандиенон

1660

v(C=O) (А1»4-3-кето- группа)

14

Клофибрейт

0,5

Павельчик, Мар- цинек и др. [523, 620]

1973

Метилтестостерон

1662

v(C = O) (А4-3-кетогруп- па)

25

СНОз

0,2

1976

Прогестерон

1662

v(C = O) (А4-3-кето- группа)

25

СНС13

0,2

Местранол

1502

3308

Ароматическое кольцо Л v(C—Н) ~ (17-этиниль- ная)

50

50

СНС13

СНС13

0,2

0,2

Ито, Амакасу [399]

1957

Бензоат эстрадиола

1748

v(C = O) (сложноэфир- ная)

2

CS2

1

1064

v(C—О) (17-ОН)

2

CS2

1

Этистерон

1667

v(C = O) (А4-3-кетогруп- па)

2

СНС13

1

3333

v(C—Н) (17-этиниль- ная)

2

CHCh

5

Фармакопея

XX США

1980

Параметазон

1656

v(C = O) (А^-З-кето- группа)

3

CHCI3

1

Наиболее употребительным растворителем является хлороформ, однако описано также применение тетрахлорида углерода и дисульфида углерода. В ближней инфракрасной области можно использовать и другие растворители, например пиридин. В частности, Кабасакальян и др. [434] применяли этот растворитель при определении числа гидроксильных групп в молекуле стероида по интенсивности полосы колебания О—Н. Что касается этой полосы, особого внимания заслуживает работа Бирмингема и др. [80], в которой сообщается об исследовании области частот О—Н для качественного и количественного анализа; авторы работали на ИК-спектрофотометре с кварцевой оптикой с более высокой разрешающей способностью, чем у обычных ИК-спектрофотометров.

Однако чаще всего используются не колебания v(O—Н), а колебания v(C=O) (кетоны и сложные эфиры), v(C—О) (спирты и сложные эфиры), ароматического кольца и др. Несмотря на многочисленные сообщения об успешном применении ИК-спектрофотометрии для количественного анализа смесей стероидов и главным образом лекарственных препаратов [70, 148, 399, 523, 618, 620, 678, 726], перечисленные выше трудности не позволяют рекомендовать этот метод в качестве стандартного ни в одной из областей аналитической химии стероидов.

В табл. 2.4 приведены примеры практического использования ИК-спектрофотометрии для количественного анализа различных лекарственных форм.

ЯМР-СПЕКТРОСКОПИЯ

ЯМР-Спектроскопия служит в основном для установления структуры соединений, однако в литературе имеются сведения об использовании метода в количественном анализе органических веществ [445]. Это относится и к химии стероидов: наряду с широким применением ЯМР-спектроскопии для решения структурных задач [77, 135, 371, 376], ее иногда используют и в аналитических целях.

ЯМР-Спектроскопия обладает исключительно высокой избирательностью, но очень низкой чувствительностью, поэтому для выполнения определений требуется по меньшей мере несколько миллиграммов вещества. Этот недостаток, конечно, не позволяет использовать его в количественном биоклиническом анализе, но не исключает его применения в фармацевтическом анализе стероидов.

Например, Авдович и др. [44] определяли содержание ме- странола в массе фабричного продукта, регистрируя его спектр

в дейтеропиридине (дифенилуксусная кислота применялась, в качестве внутреннего стандарта) и измеряя интенсивность линии протонов метокси- (3,67 м. д.) и этинильной (3,20 м. д.) групп. Та или другая из этих групп отсутствует в потенциальных примесях местранола (эстроне и этинилэстрадиоле), поэтому метод достаточно селективен. Те же авторы [45] предложили определять Д^-З-кетостероиды в лекарственных препаратах по линии С-1 протона.

Описанные выше и аналогичные им методики можно рассматривать в качестве оригинального практического приложения ЯМР-спектроскопии в довольно узкой области анализа стероидов. ЯМР-Спектроскопия никогда не заменит существующие стандартные методы, однако в отдельных случаях уникальная селективность этого метода облегчает решение гораздо более сложных задач. В качестве примера можно привести методику одновременного определения изомеров эстрадиол-3-мети- лового эфира, предложенную Хойером и сотр. [384]. При гидрировании тем или иным способом 3-метокси-1,3,5(10),8,9-эстра- тетраен-17р-ола(1) по Д8-двойной связи продукт реакции может содержать небольшие количества исходного вещества, три изомера метилового эфира эстрадиола [«природного» 3-метокси- 8рН,9аН-1,3,5(10) -эстратриен-17Р-ола (II), 3-метокси-8аН,9аН- 1,3,5( 10)-эстратриен/17р-ола(Ш) и 3-метокси-8рН,9рН-1,3,5- (10)-эстратриен-17р-ола(IV) ] и З-метокси-1,3,5(10),6,8(9)- эстрапентаен-17Р-ола(V). На химический сдвиг ангулярной 13- метильной группы влияет наличие протонов в положениях 8 и 9, а также их конфигурация; следовательно, возможно одновременное определение этих соединений.

Как видно из табл. 2.5, химические сдвиги 13-метильных групп соединений I, II, III + IV и V в дейтеробензоле в качестве Таблица 2.5. Химические сдвиги 13-метильной группы в спектрах продуктов восстановления 3-метокси -1,3,5 (10) ,8 (9) -эстратетраен-17р-ола в различных растворителях [384]

Растворитель

6, м. д. *

I

п

ш

IV

V

CDC13

0,78

0,77

0,85

0,85

0,69

c5d5n

0,99

0,95

1,05

1,04

0,88

C6D6

0,78

0,71

0,81

0,81

0,66

* Обозначения I—V см. в тексте.

растворителя достаточно хорошо разрешены (спектры сняты на приборе, работающем на частоте 100 МГц); следовательно, их можно избирательно определить по соответствующей интегральной интенсивности. Что касается соединений III и IV, то можно определить лишь их сумму, но сами изомеры можно разделить методами газовой хроматографии.

ПОЛЯРОГРАФИЯ

Об использовании полярографии для определения стероидных гормонов сообщалось еще в конце 1930 г. [9, 217, 836]. Впоследствии появились публикации, посвященные описанию оптимальных условий определения различных классов стероидов и применению полярографии для определения стероидов в биологических жидкостях и лекарственных препаратах. Отличный обзор достижений за первые 15 лет можно найти в монографиях Бржезины и Зумана [100], а также Кольтгофа и Лингейна [474]. Позднее полярографический метод был вытеснен из биохимического анализа более чувствительными методами, но он до сих пор остается еще довольно важным в фармацевтическом анализе.

Из функциональных групп, наиболее часто встречающихся в стероидных гормонах, только кетогруппа способна непосредственно восстанавливаться на капающем ртутном электроде. Изолированные кетогруппы восстанавливаются при слишком больших отрицательных потенциалах, чтобы их волны можно было использовать для количественного определения: потенциалы полуволн лежат в интервале от —2,28 до —2,76 В [432]. Хотя стероидные кетоны под действием реактива Т Жирара (хлорид бетаингидразида) легко превращаются в соответствующие гидразоны, образующие четырехэлектронные волны с Е^ от —1,3 до —1,4 В [99, 217], этот метод, по-видимому, больше не применяется. Вероятно, единственный класс кетостероидов, для которого полярография используется до сих пор, это а,0-нена- сыщенные 3-кетостероиды. В основном благодаря работам Ка- басакальяна и сотр. [430—433] и других авторов [517, 869] были решены теоретические и практические вопросы восстановления ненасыщенных кетостероидов на капающем ртутном электроде, и полярографический метод нашел широкое применение.

Судя по трем приведенным ниже примерам, взятым из работы Хрди [385], потенциалы полуволн 3-кетогруппы зависят от положения двойной связи.

Е1/2=-1,О6В

Разность потенциалов полуволн, например А4-3-кетонов и А^-З-кетонов, достаточна велика, что позволяет проводить их раздельное определение [430].

Более поздние данные по зависимости потенциалов полуволн «от структурных особенностей, в том числе дальних взаимодействий и стерических затруднений, суммированы в работе Зу- мана [868].

Полярографическое восстановление ненасыщенных 3-кетогрупп протекает с участием одного электрона и приводит к образованию пинакона [431, 517].

он онон он(2.П)(2.П)

он он

он он

(2.П)

(2.П)

При использовании классической полярографии для количественного определения наиболее надежные результаты получены в основном в смесях (1:1) воды и органического растворителя (метанол, этанол и т. д.), забуференных до pH 5—6 [192, 385, 430, 431, 869], но описано применение фонов с более высокими значениями pH, что способствует увеличению селективности методов [271, 385, 869].

Большим достоинством полярографических методов при анализе лекарственных препаратов является то, что твердый наполнитель обычно не мешает определению (так же как и

силикагель при разделении анализируемых стероидов методом ТСХ [331]), поэтому анализ можно выполнять в суспензии, что облегчает подготовку пробы. Однако классические методы, оптимальный рабочий интервал концентраций которых составляет 10—3—5. io-3 М, недостаточно чувствительны для анализа низ- кодозированных препаратов, и правильность оценки высот полярографических волн неудовлетворительна.

-ДО-1,5-2.0Потенциал отн. Ag/AgCi, 8-ДО-1,5-2.0Потенциал отн. Ag/AgCi, 8Избежать этих недостатков при анализе кетостероидов помогло введение новых полярографических методов: полярогра-

-ДО-1,5-2.0

Потенциал отн. Ag/AgCi, 8

-ДО-1,5-2.0

Потенциал отн. Ag/AgCi, 8

Рис. 2.7. Дифференциальная импульсная полярограмма 40 %-ного метанольного раствора, содержащего 20 мкг/мл норэтистерона, на фоне 0,04 М бромида тетраметиламмония [608].

фии в неводных апротонных растворителях [838], переменнотоковой полярографии [742, 838] и метода полярографии по второй гармонике [354].

Один из современных полярографических методов, дифференциальная импульсная полярография, в 10—100 раз чувствительнее классических методов, и оценку высоты полярографических пиков в дифференциальной импульсной полярографии можно провести гораздо точнее, чем полярографических волн. На рис. 2.7 представлены типичная дифференциальная импульсная и классическая полярограммы, а в табл. 2.6 приведены сведения о некоторых дифференциальных импульсных полярографических методах.

Помимо ненасыщенных кетостероидов полярографически можно также определять эстрогены, если превратить их фенольное кольцо А в легко восстанавливаемое нитрозопроизводное [366, 696]. Однако вряд ли этот метод найдет широкое применение.

Другим любопытным примером полярографического анализа, основанного на предварительной дериватизации; служит определение линоэстренола, описанное Ван Беннекомом и сотр, [788]. Как следует из уравнения 2.12, полярографически неактивный линоэстренол под действием 60—80 %-ной (по объему)

« 5 S

58

о о

о о

LO CM

S

S

=5 О И л Ч СУ

я я р о я £ «=;

КЗ S о о

3

S

о

7

о

т§ Ю

ts S

о о

J 5

-2

LTD

о

7

о

5 5

5

3 о t* о

$

X СУ

СУ Ом

«Я

Я£

g°

я

О о

Г Си_г

° о °

m go, ф

3^^

5=1

CD 5 3

СО см

СО

О

5

ф"

Ф н

95 i - СУ VN

о ^ -&1Л

1 Я c^ 5 СУ Cl H Ф

(T) ^

О 5 95 КЗ 3 S 5 су • • ’Ф-ч

5S

СУ Ом*^ Н Ф •• (?)•

о*

95 3

су .. *&*-< ^мсо"

1 я Ом

О

g &

СТ) 'б4

С ф

с

X

3 к и ф m

СУ

ф *з

СО

со о и ф

о

ф

5 й

о *9* у су Ф Ом

О О о, р < к И *3 СУ О

с ф s »s и о

Е

о

§ g

Я §

СУ ХО

СУ

5

К =5

ХО сУ ф

Н t(

5

>>

О

5

3

m

ф Ои р 5 ф

СУ

S 5

5 ><

ХО Си СУ СУ

Н 5

5 5

Ф 4 XO

95 5

5

Ф tQ 5

5

5

*=(

3

о со

Ом

5

я

и

5 О Ou

5

СП

О С

л 5 sg. | s §s 9 Й «8 ® g о Й

СУ ф О g§g« ^§g ° ё й к 3*00 о С 5 Р Р

Ф 5" су + су С*? §

Ю ® 2 § 5 Ом , О ф t=;

н В

5 О

4

о

1^

3

су 5 см я

Ф Ф о м и ф

t-м 5

о И

5 О ф S Л н о ф о у н о ° о cis

Н Ф ф См

су О ^ 5

5 О' о о

Ом Ом ф ф

5 5

Ф m Ом §

Я Ч о

ф >> о- с

с 3

о

СУ

о

о

00 о

S о

о

О к

со СМ

Св 5 ч to cd Н

о

<

00

СО

3

95

о

р КЗ

5

5

сУ ,—,

КЗ СО

< см

5

5 5

5 LO1 О CM i^^i

5

су о Г(Ю IX 22.

5

5 ф

СУ

CZ7

ci

*=(

5

5

£о су ю CZL

серной кислоты превращается в полярографически активное Д16-20-кетопроизводное, которое можно полярографировать в режиме дифференциальной импульсной полярографии после разбавления метанолом до концентрации около 1 мг/100 мл; потенциал пика находится при —0,66 В.

Следует отметить, что, согласно данным Зумана [868], на потенциал полуволны кетогруппы могут существенно влиять галогены в соседнем с ней положении, причем восстановительное отщепление самих галогенов может служить основой количественных определений [23, 354].

Совсем недавно Хейнеман и сотр. [358, 359] предложили вольтамперометрический иммунный метод определения эстриола. Он основан на том же принципе, что и радиоиммунный метод анализа, но вместо радиоактивной используется электроак- тивная метка. При определении эстриола меткой служит эстриол-4-меркуриацетат; определение основано на конкурентном равновесии между ним и немеченным эстриолом за активные центры на антителах, связывающих эстриол. Преимущество этого метода состоит в том, что не нужно разделять соединение-метку в свободном и связанном состояниях, так как потенциал полуволны связанного соединения лежит в более отрицательной области, чем потенциал полуволны свободного соединения.

ТИТРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Молекулы стероидных гормонов и промежуточных продуктов их производства, как правило, не содержат функциональных групп, которые можно было бы использовать для титриметрического определения. Все же титрование в неводных средах позволяет определять практически все функциональные группы в стероидах, однако относительно большой размер пробы, требуемой для анализа, исключает его из числа методов биоклинического анализа, а в большинстве случаев и фармацевтического анализа. Основное применение титриметрия находит при определении содержания стероидных гормонов

*

Я S Ф я

со эК я о \О Я

О в*

1=( я о о

8

•я, »s

яё я я»яя

$^«Sstss°Н*11'

яя ££2 я § 22я н оо оg

0303 5®5Sо я я о я ^

2 з 3 2 2S 2

«Я ®^ОЯОgя CD О gg g

CQ CQ®H ti^hE< H SC Ню H

н я 03 а

,s

§ О55^1 gl о s^g|

2 55 х =S £z|Kz|x= О§| z

о -- -«Ssx—.$X-Ss8«oARg^

о о оо и о Ш оЪ" О U 6 О О о ^ о D< 2 i £0 о

я

ф

я ф CU

6

6 В

я я я

+щ н Я►г1

яН

оg s g1 III1

^&§5§£z

щ«УоУZ+

я й: ф а О

8 ^8 уI § § I о

®g ? 2 к

_XX X®М 47гX

— -гг? n Й ЙУ О w

ии 2Ч Ч Чгь §</"tn

(JЕЕООО^£от^OZ

к я

2

5g я Е

я

>> е

2S।।л

° Я 3ОоЯоя

яЯ ®®

«” " « gЛЛо«g

вв g а. $ >>>.>>-"XS8 в“

1 %М<-£ £ S S§ S0s»5 is

Kt о U

—<ОООCD OJ ОО

00

О ООО ООООООО

,—( w—( W41—Ч 1—Ч1—ч1—ч1—ЧЧЧ1—ч

а о

я <

5 Заказ М

Кг—1г—1Я

О1СО^со, Я

=7»- £2U& С£

_g£i.s Ss$°?*g _

S^u^w U Sa ^я <£L u£ia EZL ti^ZL » 182

Таблица 2.7. Некоторые титриметрические методы определения стероидных гормонов

Продолжение табл. 2.7

»д

Д

Он

д

д

ф _

»д

3

у 3S

® 3

о

§ 2

о

о ч

Д э$

Д о

си д

е д^-&

6 л

д £

»Д

3

СТ) у

д

о

i< »д я 3

у ДОнэД

О g

Он g^ Д

О.^

к Н СП я

д ч

*д я д

О® 3 m

д

н

ЕЕ ОО су су

ZZ д д o'o'

и Е

д

o'

< О СУ X

= Е

52 О*<

О со с

N

S

сч о o'

< Н t^ СП

S

сч о о"

О

н

д

сч о о”

_ о

и Е

д

о”

Е д о”

5

1 1

Е И

Е

Е О

СУ г

Е О

<

Е

д , д Д Ч< Ч 5 ян я Д -в4^^ Я фСП^ и ч

о OCL - з 2 5 н с s н су ' ' я су д + ” д s^d 2 д с£ ес

Д д СУ го о о.

Е О

СУ

Z д

о”

1

5 и

<5#

5 ЙО о S

S У Mg

Ch<®

s о д су

СП

О

Е

О

LO

Е

Он о" ?

о д л

СП

LO

Е

си

о

т S о д л

СП

су ес о И

ч о д д

СП

я н о

о д д

к я д

>» ф ^д

е

я я су су д д д д Ч Ч д Д д д Д Д

спел

д су д д ч Д д Д

СП

д Я су

Д Q

® Д

-у- д СП ^

О Д су

<3~

Д

Он О Д Д

Д О

ч д д СУ

СЧ

о

3 «^ д

3 яь>.

я ^со

о . » 2 д ^-< ° д ^ д СП ^

3 д д о Он ф

ф 3 д со су си

3 к д о си

3 д со су си

Он о

е

д о

д к ^ i§ gs «1 Ч 3

ч о ч о

СУ

О

е( О

CD О

о

8

О CD О

Й о

о

fe

CD

О

S

2

8

О

О

SS .сч о i^s

д Ф о

5 FT

= СЧ

Е 1

г—1$ф Ф СЧ Q. S СО :^

cL к

д

Он

М СО* д (^ EZL

Он о. д д

д д я а я

су су д сч g

S 00 SCD ^сУ О ^су О

сГ 00

, &

1 со су

Ж

< 3 О

Хг-,

X 00 со . 00 е^

<

3 О

Хг-,

X к со

. 00

в массе продукта, а также в промежуточных продуктах их производства, но даже и здесь титриметрия играет гораздо меньшую роль, чем при анализе других лекарственных препаратов.

В табл. 2.7 перечислены некоторые титриметрические методы определения стероидных гормонов и промежуточных продуктов их производства.

Из методов, приведенных в табл. 2.7, особое значение имеет определение этинильной группы [101в, 293, 732]. Этот метод, основанный на титровании стандартным раствором гидроксида натрия азотной кислоты, выделяющейся при реакции этинил- стероидов с нитратом серебра, является стандартным и рекомендуется фармакопеями разных стран для определения эти- нилстероидов в массе продукта.

(2.13)

Заслуживает упоминания также метод Гёрёга и сотр. [310], предназначенный для определения аллилэстренола. Он основан на титровании уксусной кислоты, образующейся при реакции метанола и ацетата ртути(II) по двойной связи стероида; этот метод достаточно селективен при определении изолированных А4- и 17-аллильных двойных связей, причем другие двойные связи не мешают анализу.

5*

ГРАВИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

В классический период развития аналитической химии стероидных гормонов гравиметрические методы принадлежали к стандартным методам. Значение их, конечно, постепенно уменьшалось в связи с трудоемкостью и необходимостью большого количества вещества для анализа. Однако благодаря высокой достоверности они до сих пор находят применение, в основном для определения прогестерона и сложных эфиров тестостерона в лекарственных формах [632а]. Подробное обсуждение классических методов можно найти в обзоре Фориста и Джонсона [256] и монографиях Гёрёга и Шаца [3126].

В основе определения прогестерона обычно лежит реакция с динитрофенилгидразином в кислой среде, приводящая к образованию 3,20-бисфенилгидразона, малорастворимого в смеси этанола с водой [161, 463, 538].

Для надежного определения сложных эфиров тестостерона (главным образом в масляных растворах) служит реакция образования семикарбазона по 3-кетогруппе под действием ацетата семикарбазида в смеси метанола с водой [520].

КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Хотя колоночную хроматографию нельзя рассматривать как прямой метод количественного анализа стероидов (высокоэффективная жидкостная колоночная хроматография подробно разбирается в разд. 2.2.12), она кратко обсуждается в этой книге не только потому, что является надежным орудием в руках органиков и биохимиков, но и потому, что ее значение как метода отделения, фракционирования, разделения и очистки стероидов перед последующей стадией аналитического определения нисколько не уменьшилось. Более того, в результате усовершенствования техники набивки колонок возможности колоночной хроматографии в настоящее время гораздо шире, чем в классический период развития химии и анализа стероидов.

Из монографий, содержащих важные сведения по этому вопросу, можно указать книгу Нейера [583], в которой обобщены классические методы, а наиболее исчерпывающий обзор современных методов можно найти в книгах Хефтманна [355, 808] и в главе, написанной Прохазкой для монографии, изданной Дейлем, Мачеком и Янаком [646].

В этой главе колоночная хроматография неоднократно упоминалась как важная стадия сложных аналитических определений половых гормонов, предшествующая измерению методами спектрофотометрии [108, 109, 246], колориметрии [317, 782, 783,

847—849], флуориметрии [412, 855], газовой хроматографии [6, 16, 21, 46, 48, 68, 73, 90, 96, 213, 264, 275, 291, 357, 410, 482, 488, 552, 567, 596, 668, 670, 691, 770, 771] или высокоэффективной жидкостной хроматографии [671], радиоиммунными [67, 182, 326, 612, 638, 654, 687, 813] и другими радиоактивными [186, 187, 230, 250, 490, 529], ферментативными [14, 344], масс- спектрометрическими методами [731] и т. д.

В большинстве упомянутых публикаций колоночная хроматография использована для определения стероидов в сложных биологических объектах, но она широко применяется и для разделения стероидов в лекарственных препаратах [108, 109, 246, 317, 412, 668, 782, 783в, 847—849].

Поскольку стероиды — это соединения средней полярности, для их разделения применяется широкий круг адсорбентов и систем растворителей.

Все адсорбенты, предложенные в классический период развития хроматографии стероидов, такие, как силикагель [90, 275, 357], кизельгур [57а, 825], оксид алюминия [21, 187, 357, 410, 612, 681, 771] и силикат магния (флорисил [233, 482, 670, 782] ), используются и до сих пор. Чтобы добиться разделения родственных стероидов или выделения всех стероидов из сложных смесей, адсорбенты часто пропитывают солями серебра. Например, Пеннер и сотр. [621] для выделения хингестанола и продуктов его разложения из сезамового масла в качестве адсорбента использовали флорисил, обработанный аммиачным раствором нитрата серебра, и в качестве элюента этанольный раствор хлорида аммония.

Ионообменная хроматография пригодна не только для разделения кислых стероидов, как, например, эстрогенов [6] и их производных [529, 567, 855], она широко применяется для выделения (или, как часто говорят, экстракции) нейтральных стероидов из биологических проб [48, 213, 291, 596, 691]. Для этих целей почти всегда используется стиролдивинилбензольная смола амберлит XAD-2. Например, Эггер и др. [213] выделяли стероиды, содержащиеся в моче, непосредственно после их ферментативного гидролиза на колонке размером 600x20 мм, заполненной XAD-2 и промытой 5 %-ным водным раствором хлорида натрия. Стероиды вымывали из колонки метанолом; полученный раствор пригоден для установления профиля концентраций стероидов методом капиллярной газовой хроматографии.

Наиболее важным моментом в развитии колоночной хроматографии стероидов в последнее десятилетие следует считать введение гель-проникающей хроматографии, которая сейчас чаще всего применяется при подготовке биологических проб для количественного анализа методами газовой хроматографии,

радиоиммунными методами и др. Первоначально использовали (а часто используют и сейчас) полидекстрановые гели, например сефадекс G-25 [357, 770] и G-10 [329а], но впоследствии было найдено, что путем уменьшения их полярности, например

Рис. 2.8. Разделение эстрогенов методом гель-хроматографии на колонке размером 30 смХ1 см, заполненной 4 г сефадекса LH-20, элюированием смесью циклогексан—хлороформ—метанол (8:1:1) [505].

1 — эстрон; 2— эстрадиол; 3—16-кетоэстрадиол; 4—16-эпиэстриол; 5 — эстриол; 6—1,3,5(10)-эстратриен-3,6а,17р-триол; 7— 6-кетоэстриол; 8— 1,3,5 (10)-эстратриен-3,15а, 16а, 17р-тетраол. *

связывая свободные оксигруппы сефадекса G-25 с образованием оксипропилпроизводных, можно добиться лучших результатов. Для разделения и очистки стероидов разной полярности чаще всего применяют сефадекс LH-20 [16, 68, 96, 182, 246, 279а, 285, 326, 3386, 552, 596, 638, 654, 687, 770, 832а].

Сефадекс LH-20 особенно удобен при разделении стероидов с близкой полярностью. На рис. 2.8 приведен характерный пример — кривая элюирования восьми эстрогенов, взятая из статьи Лисбоа и Страсснера [505].

Для разделения менее полярных стероидов в последние годы все шире и шире используются оксиалкоксипропилпроизводные сефадекса LH-20 (липидекс) [14, 48, 230, 731, 813, 854]. На рис. 2.9 показано разделение стероидов на короткой колонке, заполненной липидексом.

Половые гормоны и родственные соединения 71

В отдельных случаях с особой целью были получены специальные производные сефадекса LH-20. Аксельсон и Сьявалл [46, 48] описали избирательную сорбцию слабоосновных меток- симов стероидов на сульфоэтил-ЬН-20 и разделение стероидов на нейтральную и фенольную фракции на триэтиламиноокси- пропилоксилалкил-сефадексе LH-20.

’ ' I-’ ■ ' М ’ ’ 1 1 Г1 1 '' ' Г '-r I I | » ■ I -г-г-К) 15202530 35объем элюирования, мл’ ' I-’ ■ ' М ’ ’ 1 1 Г1 1 '' ' Г '-r I I | » ■ I -г-г-К) 15202530 35объем элюирования, млАндростендион В Прогестерон В 20р-Дигидропрогестерон В Дегидроэпиандростерон Лиг идротестостерон Тестостерон 17а - Оксипрогестерон 17а-Оксипрегненолон Эстрон Эстрадиол-пр Кортизол

’ ' I-’ ■ ' М ’ ’ 1 1 Г1 1 '' ' Г '-r I I | » ■ I -г-г-

К) 15202530 35

объем элюирования, мл

’ ' I-’ ■ ' М ’ ’ 1 1 Г1 1 '' ' Г '-r I I | » ■ I -г-г-

К) 15202530 35

объем элюирования, мл

Рис. 2.9. Разделение стероидов на небольшой колонке (8 см X 0,4 см) с липидек- сом [230].Рис. 2.9. Разделение стероидов на небольшой колонке (8 см X 0,4 см) с липидек- сом [230].05

Рис. 2.9. Разделение стероидов на небольшой колонке (8 см X 0,4 см) с липидек- сом [230].

Рис. 2.9. Разделение стероидов на небольшой колонке (8 см X 0,4 см) с липидек- сом [230].

Гексан: хлороформ90:10*' 80:20*150:5б1( 40:60

Столь же общеупотребительным является диэтиламиноэтиль- ное производное сефадекса (DEAE-сефадекс) для разделения кислых стероидов [91, 575, 854].

Недавно группой исследователей под руководством Адлерк- ройца [260а, 2606, 260в, 415а] показана возможность комбинированного использования нейтральной и ионообменной колонок, заполненных сефадексом. При установлении профиля концентрации стероидов, содержащихся в моче (в основном эстрогенов), они применяли сефадекс G-25 для разделения стероидов и сефадекс LH-20, а также ОН-- и ОАс~-формы DEAE-сефа- декса А-25 в качестве анионообменника для очистки и фракционирования стероидов; кроме того, описано применение колонки с липидексом 5000 для очистки триметилсилилированных стероидов перед их количественным определением методом газожидкостной хроматографии.

Наиболее важными причинами необычайно быстрого распространения и высокой популярности в аналитической химии стероидов колонок, заполненных сефадексом, являются низкие и воспроизводимые значения холостых опытов, хорошая воспроизводимость объемов элюирования и высокий процент выделения [230].

Распределительная жидкость-жидкостная хроматография использовалась уже в ранний период развития хроматографии стероидов и все еще применяется в настоящее время, особенно

в фармацевтике. В качестве неподвижной фазы на носителях диатомитах (в основном целите 545) служат различные полярные растворители, как, например, вода, водный раствор гидроксида натрия, формамид, этиленгликоль, ацетонитрил и т. п., а подвижной фазы — несмешивающиеся с ними неполярные растворители [36, 67, 108, 109, 249, 250, 264, 318—320, 668, 847, 849]. В качестве примера можно упомянуть колонку, заполненную целитом и с ацетонитрилом в качестве подвижной фазы, описанную Грэхемом и др. [319, 320]. Получены параметры удерживания 44 стероидов при элюировании ^-гептаном и хлороформом [319]; эту систему успешно применяли для решения различных задач разделения, в том числе разделения эфиров тестостерона и свободного тестостерона [320] с последующим количественным анализом элюатов методами УФ-спектрофотометрии или колориметрии. К одному из последних достижений в распределительной колоночной хроматографии стероидов относится разработка химически связанной обращенной фазы с группами Cis(Sep-Pak) (Хейккинен и др. [357а]) для экстракции эстрогенов мочи и (Шеклтон и др. [710а]) извлечения других стероидов. Из специальных хроматографических методов отметим гель-фильтрацию для определения свободных прогестерона, тестостерона и эстрадиола в плазме [249, 322]. Введение многоколоночных и многодетекторных систем [809, 810], автоматизация и применение ЭВМ [111, 475] значительно повысили роль колоночной хроматографии в анализе многочисленных многокомпонентных смесей стероидов.

ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Прежде чем обсуждать применение тонкослойной хроматографии (ТСХ) в количественном анализе половых стероидов, следует сказать несколько слов о бумажной хроматографии. В пятидесятых годах этот метод произвел переворот в анализе стероидов. Фактически были решены все задачи разделения и идентификации и многие задачи количественного определения, что нашло отражение в нескольких прекрасных обзорах; здесь даны ссылки лишь на наиболее важные из них [117, 198, 582, 583]. Несмотря на большие достижения в начале шестидесятых годов бумажную хроматографию из анализа стероидов начала вытеснять ТСХ (в основном благодаря универсальности и большой скорости выполнения), и в настоящее время бумажная хроматография используется лишь в отдельных лабораториях, главным образом для разделения наиболее полярных стероидов. Например, методом бумажной хроматографии до сих пор довольно часто анализируют конъюгаты стероидов; в этой [533, 534, 694] и других областях [134, 496] и сейчас иногда по-

являются публикации. Несмотря на все сказанное, ниже будет обсуждаться лишь метод ТСХ как наиболее употребительный.

Громадное число книг, глав монографий, обзоров и фундаментальных статей посвящено теории и практике ТСХ стероидных гормонов. Из них следует выделить монографии Хефт- манна [355], Лисбоа [502, 503] и Нейера [583, 584].

Проблемы разделения и обнаружения

Для разделения стероидов половых гормонов наиболее широко применяются слои силикагеля в сочетании с различными системами растворителей. В табл. 2.8, взятой из статьи Хары и Мибе [342], приведены значения hRF 36 применяемых в фармацевтике, в основном синтетических, стероидных гормонов (среди них семь кортикостероидов) для 11 различных хроматографических систем.

Хроматография на силикагеле с использованием систем растворителей, подобных приведенным в табл. 2.8, пригодна для разделения на 'индивидуальные компоненты таких групп стероидов, как, например, производные андростана [451], эстрана [754], оксимов и лактамов [729] и т. п. Для решения более сложных задач часто рекомендуют другие хроматографические системы. Например, Сиу [386, 387] разделял эстрогены на слое полиамида, Тиншерт и Трагер [772] описали разделение андростерона, эпиандростерона и дегидроэпиандростерона на целлюлозе, пропитанной 1,2-пропандиолом; трудно разделяемые пары конских эстрогенов типа а- и p-дигидроэквилинов и т. п. были разделены Кариньяном и др. [126, 128] методом распределительной хроматографии на пластинах с носителями (силикагель— гидроксид натрия или кизельгур — гидроксид натрия), пропитанными формамидом (в качестве неподвижной фазы); в качестве подвижной фазы предложены смеси хлороформ— трихлорэтилен (4:1) и ксилол—диэтиламин (200:1).

Стероиды, адсорбирующиеся на поверхности полярного адсорбента, например силикагеля, чувствительны к кислороду воздуха. Это приводит к осложнениям, особенно при разделении и последующем определении следов эстрогенов. В таких случаях используют слои, пропитанные аскорбиновой кислотой. Поскольку многие методы проявления непригодны в присутствии аскорбиновой кислоты, положение пятен определяют при

Таблица 2.8. Разделение стероидов, используемых в фармацевтике, методом ТСХ (значения hRF) [342]

Растворитель

Стероид

Силикагель

Оксид алюминия

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

н

3-ОН- 17р-Валероилокси-Э-1,3,5 (10) -

75

77

77

70

64

60

53

52

61

60

триен

3-Метокси- 17р-ОН-17-Этин-Э-1,3,5-

71

72

76

66

61

52

57

57

60

64

(10) -триен

3-ОН-Э-1,3,5 (10) -триен-17-он

66

67

67

60

58

39

32

31

51

50

З-Бензоилокси- 17Р-ОН-Э-1,3,5 (10) -

62

61

59

56

56

46

44

49

53

63

триен

3,17Р-Ди-ОН-17-Этин-Э-1,3,5(10)-

68

68

72

51

51

26

22

18

40

28

триен

3,17р-Ди-ОН-Э-1,3,5 (10) -триен

59

59

55

39

42

17

18

19

41

43

3,16а,17₽-Три-ОН-Э-1,3,5(10) -триен

21

16

7

5

8

8

3

18

6

9

17Р-Ацетокси-4-С1-А-4-ен-3-он

71

68

72

72

69

55

66

58

67

68

17Р-Ацетокси-А-4-ен-3-он

64

62

59

68

66

53

50

45

59

65

17Р-Энантокси-А-4-ен-3-он

74

67

70

64

69

68

67

52

67

68

17Р-Пропионилокси-А-4-ен-3-он

67

61

69

64

66

66

57

49

64

67

17Р-ОН-17-ЕЬЭ-4-ен

74

66

73

64

60

68

66

71

61

76

17Р-Фенилпропионилокси-Э-4-ен-3-он

69

68

63

58

62

57

56

52

60

74

17Р- (2-Фурилпропионилокси) -Э-4-ен-

69

68

63

58

62

57

56

52

60

74

3-он

173-ОН- 17^Ме-5а-А-3-он

60

57

56

56

55

46

40

43

50

59

17р-ОН-5а-А-3-он

59

53

56

53

50

46

35

41

46

56

17р-ОН-17-Этин-А-4-ен-3-он

53

55

50

52

53

39

32

25

51

60

17р-ОН-17-ЕЬЭ-4-ен-3-он

53

46

35

52

52

27

29

31

48

52

Растворитель

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

н

17Р-ОН-2-ОН-метилен- 17-Ме-5а-а- А-З-он

43

54

13

46

34

46

29

33

54

2

17р-ОН-А-4-ен-3-он

45

41

32

36

41

22

25

20

47

43

17Р-ОН-17-Ме-Э-4-ен-3-он

51

39

38

35

47

26

29

22

50

51

17Р-ОН-Э-4-ен-3-он

41

36

39

34

36

21

28

14

39

49

17Р-ОН-17-Ме-А-1,4-диен-3-он

40

.50

31

27

36

15

26

15

23

39

14а-ОН-А-4-ен-3,17-дион

34

31

12

20

32

9 -

14

7

12

34

бр, 17р-Ди-ОН-А-4-ен-З-он

29

25

17

13

18

6

9

5

7

16

14а, 17р-Ди-ОН-А-4-ен-3-он

18

16

7

9

9

5

6

3

5

14

Р-4-ен-3,20-дион

62

59

58

61

60

59

66

39

60

70

17а-ОН-21-Ацетокси-Р-4-ен-З,11,20- трион

67

63

68

67

63

61

67

44

61

72

11Р,17а-Ди-ОН-21-ацетокси-Р-4-ен- 3,20-дион

49

41

23

19

44

18

22

43

12

33

58

17а,21-Ди-ОН-Р-4-ен-3,11,20-трион

33

22

8

8

17

13

7

19

11

6

19

17а,21 - Ди-ОН-Р-1,4-диен-3,11,20- трион

35

19

14

5

15

3

5

16

7

3

17

11р,17а,21-Три-ОН-Р-4-ен-3,20-дион

27

18

8

4

10

5

3

11

6

3

10

11р,17а,21-Три-ОН-бр-Ме-Р-1,4- диен-3,20-дион

26

17

7

2

9

4

2

11

2

1

9

ПР,17а,21-Три-ОН-Р-1,4-диен-3,20- дион

24

15

6

2

9

3

2

11

1

1

9

Стероид

Силикагель

Оксид алюминия

Обозначения. 1: гексан—эти л ацетат (2:8); 2: бензол—этил ацетат (3:7); 3: эфир; 4: бензол—ацетон (4:1); 5: хлороформ—ацетон (3:1); 6: бензол—метанол (9: 1); 7: хлороформ—метанол (97:3); 8: хлороформ—уксусная кислота (3 : 1); 9: петролейный эфир (т. кип. 100—120 °C) — бензол—уксусная кислота—вода (67:33:85:15); 10: бензол—ацетон (4: 1); 11: бензол—метанол (9:1).

А — андростан, Э — эстран, Р — прегнан, С1 — хлор, ОН — окси, Me — метил, Et— этил, Этин — этинил.

помощи радиоактивных добавок [572] или путем опрыскивания пластинки реагентом, разрушающим аскорбиновую кислоту, например серной кислотой или перйодатом натрия [276].

Метод ТСХ, обычно используемый для разделения родственных веществ, с успехом применяется и для разделения трудно разделяемых пар стероидов. Например, Эгерт [211] предложил методику многократного элюирования.

Используя обычные ТСХ системы [оксид алюминия или силикагель и смеси петролейный эфир—диэтиловый эфир (6:4), толуол—этил ацетат (9:1), бензол—этанол (98:2) и т. n.J и проводя последовательно от 2 до 10 элюирований, можно успешно разделять пары изомеров, например 5а- и 5р-прегнан- 3,20-дионы, 5а-прегнан-3а,20а-диол и его 20£-изомер и т. д.' Для тех же целей ряд авторов, в том числе Лисбоа и Гофман [504а] и Кавина с сотр. [140], рекомендовали использовать восходящую и двумерную хроматографию соответственно.

Особого упоминания заслуживает работа Хары [339], поскольку в ней обсуждается взаимосвязь между подвижностями веществ при хроматографировании методами ВЭЖХ и ТСХ; при решении конкретных задач эта корреляция помогает подобрать систему для хроматографирования методом ВЭЖХ путем ее предварительного исследования методом ТСХ. Изучение поведения разных стероидов на силикагелевых пластинках и колонках с разными бинарными смесями растворителей позволило вывести следующую зависимость между значением Rf (в ТСХ) и коэффициентом емкости k' (в ВЭЖХ):

const • xRP = ,, \ , - (2.15} F kf + 1

Найдено, что при данных условиях константа приближается к 1,5.

Для проявления пятен стероидов на пластинках в ТСХ предложено большое число различных проявителей. Наиболее употребительны серная кислота (разбавленная до той или иной степени водой или спиртами, иногда в сочетании с альдегидами, например, ванилином), фосфорная кислота, соляная кислота, хлорид сурьмы(III) и пары иода. Сведения о чувствительности и избирательности этих реагентов можно найти в приведенных выше монографиях. Для решения специальных задач иногда рекомендуются другие реагенты, например хлорид цинка в метаноле [527], гистохимические реагенты [787], молибдованадо- фосфорная кислота [705], хлорид олова (II)—монохлоруксусная кислота—хлороформ [473], молибдофосфорная кислота (в тесте на беременность, основанном на обнаружении прегнандиола в моче [248]), хлорамин Т—серная кислота [55а] и т. д.

Количественный анализ методом элюирования пятна

Стероиды, элюированные из ТСХ-пластинок, можно количественно определить методами колориметрии, флуориметрии, газовой хроматографии, масс-спектрометрии, радиохимии и др. Многие из методов, обсуждаемых в соответствующих разделах этой главы, включают разделение или стадию (часто, стадии) очистки методом ТСХ в процессе подготовки пробы для последующего количественного анализа.

Хотя количественная тонкослойная хроматография требует особого мастерства и опыта и является довольно трудоемким и длительным процессом, она повышает селективность последующего количественного метода определения столь значительно, что стадия ТСХ в настоящее время составляет неотъемлемую часть некоторых сложных методик анализа стероидов.

Основные проблемы заключаются в следующем: а) определение положения пятен для последующего вымывания; б) сведение к минимуму потерь, связанных с необратимой адсорбцией или разрушением в процессе хроматографирования или элюирования; в) оценка полноты выделения на заключительных стадиях.

Первое систематическое изучение возможности применения ТСХ для количественного анализа стероидных гормонов было проведено Мэтьюсом и др. [531] уже в 1962 г. С тех пор в этой области проводятся и публикуются серьезные исследования как теоретического, так и практического характера, обзор которых дан в монографиях, перечисленных во введении к этому разделу, а также в других книгах.

При анализе биохимических образцов положение пятен чаще всего устанавливают при помощи радиоактивных меток, используя авторадиографию или прямое сканирование. Важное преимущество этого метода состоит в том, что он позволяет одновременно оценивать полноту выделения стероидов. Для обнаружения пятен при анализе стероидов, поглощающих УФ-излучение, обычно применяют другой прием, который основан на появлении темных пятен при облучении УФ-светом (254 нм) пластинки, покрытой тонким флуоресцирующим слоем. Некоторые методы обнаружения пятен связаны с применением либо неразрушающих стероиды реагентов, например паров иода, либо разрушающих реагентов, либо более заметных красителей, наносимых на край пластинки. Для извлечения стероидов из соскобленных с пластинок зон предложены самые разные растворители и их смеси, причем выбор диктуется полярностью исследуемых стероидов.

Из множества примеров применения метода элюирования пятна в аналитической химии стероидов упомянем лишь некоторые наиболее характерные (в дополнение к разобранным в других разделах этой главы).

Уол и сотр. [821] определяли ацетат тренболона (ацетат 17р-окси-4,9,11-эстратриен-З-она) и этинилэстрадиол в корме для свиней, разделяя экстракт методом ТСХ с последующим элюированием компонентов хлороформом, газохроматографическим разделением и количественным определением. Тренболон и его ацетат определяли также Эрле и др. [600] после хроматографирования на силикагеле с помощью системы хлороформ— этилацетат (2:1). Положение пятен определяли визуально в УФ-свете при 366 нм после выдерживания пластинки в парах концентрированной соляной кислоты. Возникающую при этом флуоресценцию можно использовать для полуколичественного определения нанограммовых количеств. Для количественного определения пятна элюируют эфиром, выпаривают досуха и обрабатывают 50 %-ной фосфорной кислотой в метаноле. Флуоресценцию измеряют при 498 нм (возбуждение при 365 нм).

Для определения прегнандиола и прегнантриола в моче Бабьюк и сотр. [50] предложили следующую методику. После ферментативного гидролиза и экстракции хлороформом пробу мочи помещают на пластинку, покрытую силикагелем, устанавливают положение соответствующих зон, опрыскивая край полоски смесью серной кислоты с этанолом, и экстрагируют пятна смесью хлороформа с этанолом (17:3). После выпаривания экстрактов индивидуальные стероиды определяют либо колориметрически с серной кислотой (длина волны 425 и 435 нм соответственно), либо методом газовой хроматографии в виде их триметилсилиловых эфиров.

Особого упоминания заслуживает комбинированный ТСХ — фотометрический метод Хакла [332] определения дегидроэпиандростерона в моче, поскольку в этом случае образование производных (реакция 17-кетогруппы с 2,4-динитрофенилгидрази- ном) проводится до хроматографирования. Образующиеся гидразоны хорошо разделяются на силикагелевой пластинке смесью хлороформа с ацетоном (95:5), и после экстракции метанолом динитрофенилгидразон дегидроэпиандростерона можно непосредственно определить спектрофотометрически.

Тонкослойную хроматографию применяют также при разделении следов примесей в лекарственных веществах для последующего масс-спектрометрического анализа; это было сделано Лоджем и Тофтом [510] при установлении профиля концентраций примесей в норэтистероне и его ацетате.

Количественные методы in situ

Если требования к точности определения позволяют использовать полуколичественные методы, интенсивность пятен часто оценивают визуально путем сравнения со стандартными пятнами или рассчитывают концентрацию компонента по минимальному объему раствора сравнения, которым нужно обработать слой для получения заметного пятна [126].

Гораздо более важной задачей является количественное определение стероидов в тонких слоях in situ. Попытки создания денситометрических методов, не требующих элюирования пятен, предпринимались с первых шагов применения ТСХ в анализе стероидов. Денситометры старых конструкций не обеспечивали требуемой чувствительности и достаточной воспроизводимости, поэтому денситометрия тонких слоев не могла в то время конкурировать с другими количественными хроматографическими методами (ТСХ с элюированием пятна, газовой хроматографией).

Значительные успехи в совершенствовании аппаратуры в последние несколько лет отразились и на развитии денситометрических методов; наиболее существенными достижениями следует считать следующие:

повышение чувствительности почти на два порядка (в случае высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) почти на три порядка);

вследствие этого для анализа достаточно очень небольших количеств веществ, благодаря чему легко получить линейные градуировочные графики в нанограммовой области;

стероиды, поглощающие свет в УФ-области, можно определить прямым сканированием на УФ-спектроденситометре без предварительной дериватизации или проявления. Как было показано Ярком и сотр. [415] и Уортманом и сотр. [841], оптимальная концентрация даже сравнительно слабо поглощающих УФ-излучение эстрогенов составляет около 100 нг при измерении при 280 нм;

возможность использования спектров отражения пятен [24, 742а]. Это ставит тонкослойную спектроденситометрию в один ряд с газовой хроматографией (с пламенно-ионизационным детектированием) и высокоэффективной жидкостной хроматографией. Большим достоинством этого метода является высокая скорость сканирования, вследствие чего на одном денситометре можно успеть количественно оценить хроматограммы, получаемые одновременно несколькими сотрудниками.

Благодаря перечисленным выше достоинствам денситометрия хроматограмм все шире применяется в анализе стероидов,

главным образом в фармацевтике, и до некоторой степени в биологии. В будущем можно ожидать расширения области применения этого метода, в основном в сочетании со сканированием в УФ-области без дериватизации.

Правда, сейчас в основе большинства используемых на практике методов лежат химические реакции. В одной группе методов после разделения стероидов предусматривается опрыскивание подходящими реагентами; при этом образуются флуоресцирующие или окрашенные производные. Например, Амин и др. [31] испытывали устойчивость энантата дегидроэпиандростерона, измеряя отражение при 550 нм, после опрыскивания пластинки 5 %-ной серной кислотой в метаноле и нагревания при 120°С в течение 10 мин. Путем опрыскивания реагентом, состоящим из серной кислоты и метанола, можно определить этинилэстрадиол в противозачаточных таблетках [32] либо по отражению при 530 нм, либо по флуоресценции (возбуждение при 365 нм, испускание при 560 нм). Возбуждение светом с той же длиной волны вызывает флуоресценцию гестогенного компонента пилюль (D-норгестрел) при 485 нм. Аналогичным образом проводят одновременное определение спиронолактона и канренона [798]. Альберс и Лисбоа [24] обнаружили, что вместо опрыскивания серной кислотой лучше пропитывать пластинку гидросульфатом аммония. Для денситометрического определения оксистероидов в лекарственных формах Винтер- штейгер [835а] успешно применял реагент, состоящий из нафтохинона, сульфокислоты и хлорной кислоты. Проведение измерения при 420 нм позволяет определить такие малые количества эстриола, как 30 нг. Для денситометрического определения различных стероидных гормонов Трубников [778а] использовал в качестве опрыскивающего реагента молибдофосфорную кислоту.

Сегура и Готто [707] предложили метод обнаружения и количественного определения некоторых органических соединений (в том числе стероидов) по флуоресценции, вызываемой нагреванием пластинок в течение нескольких часов при 120—130° в атмосфере аммиака, образующегося in situ при разложении карбоната аммония. Хотя механизм реакции не выяснен, метод Сегуры и Готто оказался очень ценным, так как воспроизводимость методик с использованием газообразного реагента выше, чем методик, в которых рекомендуются обычные опрыскивающие реагенты. Леви и Рейсфельд [499] существенно повысили чувствительность этого метода, предложив измерять непосредственно флуоресценцию пятна без сканирования. Линейный градуировочный график получается в 5—250 нг интервале содержания тестостерона (возбуждение при 405 нм, испускание при 470 нм). Аналогичные результаты получены Сегурой и Наварро

[707а], использовавшими для получения высокоустойчивых флуорофоров соли цирконила.

Другой любопытный метод возбуждения флуоресценции на пластинках заключается в получении триметилсилильных производных (см. разд. 2.2.11), разделении их на пластинке, покрытой оксидом алюминия, и превращении в флуорофоры нагреванием до 170—180°С. Как показали Хук [390] и Эгг с сотр. [212] при определении тестостерона в моче и прогестерона в плазме крови, таким путем можно обнаружить около 10 нг 4-ен-З-кетостероидов.

В приведенных примерах флуоресценцию вызывают на пластинке, но разделяют не исходные стероиды, а их производные, полученные до нанесения на пластинку. К достоинствам этих и некоторых других обсуждаемых ниже методов относится то, что в них исключено возникновение ошибок, связанных с неравномерным распределением опрыскивающего реагента. Следует, однако, заметить, что один из основных источников ошибок, заключающийся в изменении толщины слоя вдоль пластинки, остается прежним.

Другие методы, включающие разделение предварительно полученных производных, основаны на классической реакции кетостероидов с 2,4-динитрофенилгидразоном [466, 776] с последующим измерением ослабления излучения при 370 нм, а также на дансилировании этинилэстрадиола и измерении флуоресценции продукта. На основе этих реакций Каммерль и Мучлер [440] разработали унифицированный тест для таблеток с низким содержанием стероидов.

Кроме того, метод дансилирования применяли для определения эстриола в лекарственных формах [184] и эстрогенов в моче [815].

Вызывает интерес метод определения эстрогенов, разработанный Вейссом с сотр. [827, 828, 830]. Он основан на реакции азосочетания фенольного кольца А (см. разд. 2.2.2) с реагентом прочный темно-синий R. Поскольку для протекания реакции необходимо наличие свободной фенольной оксигруппы, этот метод применим для прямого определения свободного эстриола [830] или метаболитов, например его 16-глюкуронида [828], в моче. Одна из употребительных хроматографических систем для разделения азокрасителей состоит из силикагеля и смеси хлороформ—метанол—муравьиная кислота (100 : 25 : 2 : : 1,5). Сканирование хроматограмм при 520 нм позволяет определить эстриол и его соединения в количествах порядка 10 нг. Эстриол-З-сульфат перед азосочетанием предварительно гидролизуют [827]. Этот метод был использован Уортбергом и др. [840] для определения остаточного эстрогена в мясе.

6 Заказ № 182

ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Первые статьи, посвященные систематическому применению газовой хроматографии в анализе стероидов, опубликованы в 1960 г. [792, 796]. В «героический период» газовой хроматографии в аналитической химии стероидов, который продолжался примерно 3—4 года, были решены почти все теоретические и практические проблемы в этой области (в основном благодаря пионерским работам Е. Хорнинга, У. Ван-ден-Хойвеля, X. Вотица и других). Без преувеличения можно утверждать, что примерно 80 % всего, что мы сейчас знаем о газовой хроматографии стероидов на насадочных колонках, было уже известно в 1964 г. Благодаря этим достижениям газовая хроматография быстро заняла место стандартного метода в биоклиническом анализе, а также (в меньшей степени) в фармацевтическом анализе стероидов.

Стремительное развитие газохроматографических методов анализа стероидов и полученные с их помощью ценные результаты нашли отражение в большом количестве специальных монографий [216, 321, 501, 639, 695, 842] и обширных главах, посвященных этому вопросу, в книгах общего характера [157, 312в, 355, 467, 583]. Число публикаций так велико (гораздо больше тысячи), что в рамках этой книги безнадежно пытаться рассмотреть все (даже очень важные) работы. Поэтому здесь будут лишь кратко даны фундаментальные сведения по газовой хроматографии, причем упор будет сделан на освещение тех областей, где в последние годы были достигнуты значительные успехи (использование капиллярных колонок, новые методы дериватизации и новые практические приложения). Многочисленные работы по корреляции между структурой и временем удерживания стероидов не будут даже упомянуты.

Насадочные колонки

Как следует из литературы, в газовой хроматографии стероидов почти всегда применяется стеклянная аппаратура. Любопытно отметить все же, что иногда появляются статьи, в которых сообщается об успешном использовании металлических колонок [153, 273].

Как можно видеть из публикаций, новых твердых носителей практически не предлагается. Носитель должен быть, по возможности инертным, тогда можно избежать разложения и необратимой адсорбции стероидов. В анализе стероидов используются исключительно белые диатомитовые земли, которые промывают кислотами и затем силанизируют (диметилдихлор-

силаном); в настоящее время они вполне доступны, и большинство хроматографистов отдают предпочтение именно им (используют в основном газохром Q, а также хромосорб G или W, анахром Q и т. д.). Ромэн и сотр. [667] обнаружили, что многие выпускаемые промышленностью промытые кислотой и силани- зированные диатомиты (фирмы не указывались) при определении этерифицированных эстрогенов не обеспечивают хорошего разделения и способны к значительной необратимой адсорбции. Поэтому для решения сложных задач рекомендуется использовать прокаленный диатомит без промывки его кислотами, но просеянный и повторно силанизированный или промытый кислотами и затем силанизированный.

Сказанное в предыдущем абзаце справедливо и в отношении неподвижных фаз, т. е., за небольшим исключением, для анализа стероидов используются те же фазы, что и двадцать лет назад, когда газовая хроматография стероидов только начала развиваться. Наибольшее применение нашли силоксаны. Почти половина всех работ посвящена использованию неполярных ди- метилсилоксанов (в основном SE-30, а также OV-1 и 101). Эти фазы пригодны для разделения стероидов по молекулярным массам или по различному строению (разделение пространственных изомеров); разделение, однако, бывает неудовлетворительным, если различия в размере или строении молекул незначительны, как, например, у окси- и кетосоединений, у насыщенных и ненасыщенных стероидов и т. д. Это иллюстрируется табл. 2.9; данные взяты из статей Ван-ден-Хойвеля и Хорнинга [793] и Намбары с сотр. [581].

Предварительным триметилсилилированием можно значительно повысить способность к разделению плохо разделяемых эпимеров 3-оксипроизводных. Например, времена удерживания андростерона и его Зр-оксиэпимера на колонке, заполненной смесью SE-30 и адипината тетраметилбутандиола, при 228°С равны 5,04 и 5,2 мин соответственно, а времена удерживания триметилсилильных (ТМС) производных тех же эпимеров при 205°С — соответственно 6,7 и 8,9 мин [637].

Большим достоинством ранее упоминавшихся диметилсилок- санов являются их высокая термическая устойчивость и как следствие незначительные потери жидкой фазы из колонки даже при такой высокой температуре, как 300°С. На колонках, заполненных OV-17, у которого метильные группы частично замещены фенильными, можно получить несколько более высокую избирательность при той же термической устойчивости, поэтому их часто используют в анализе стероидов. Из всех неподвижных фаз на основе силоксанов наиболее высокой избирательностью обладают фазы, состоящие из метилтрифторпропильного (QF-1,OV-210), метилфенилцианпропильного

Таблица 2.9. Газохроматографическое разделение стероидов на неселективной стационарной фазе SE-30 а

Номер

Стероид

Относительное время удерживания

1

50-Андростан- 17-он

0,18

2

50-Андростан-3,17-дион

0,39

3

4-Андростен-3,17-дион

0,48

4

170-Окси-4-андростен-3-он (тестостерон)

0,49

5

4-Андростен-3,11,17-трион

0,57

6

50-Андростан-30,170-диол

0,38

7

50-Андростан-За, 170-диол

0,37

8

30-Окси-50-андростан- 17-он

0,37

9

За-Окси-50-андростан- 17-он

0,36

10

17а-Метил-5-андростен-30,170-диол (метандриол)

0,4!

11

5-Андростен-30,170-диол

0,37

12

30-Окси-5-андростен- 17-он

0,36

13

4-Эстрен-3,17-дион

0,37

14

З-Окси-1,3,5 (10) -эстратриен- 17-он (эстрон)

0,46

15

1,3,5 (10) -Эстратриен-3,170-диол (эстрадиол)

0,48

16

З-Окси-1,3,5 (10) 6,8-эстрапентаен-17-он (эквиленин)

0,61

17

50-Прегнан-3,20-дион ^А]В-цис^

0,60

18

5а-Прегнан-3,20-дион (А!В-транс)

0,66

19

4-Прегнен-3,20-дион (прогестерон)

0,78

20

30-Окси-5-андростен- 17-он (дегидроэпиандростерон) (C/D-транс)

0,414

21

30-Окси-13а,5-андростен-17-он (CID-цис)

0,348

а Времена удерживания измерены относительно холестана. Для соединений 1—19: колонка (180 смХ4 мм) заполнена 1 %-ным SE-30, нанесенным на газохром Р (100— 120 меш) при 21 ГС; время удерживания холестана 13,5 мин [793]. Для соединений 20—21: колонка (300 смХЗ мм) заполнена 1,5 %-ным SE-30, нанесенным на хромосорб W (60— 80 меш) при 240°С; время удерживания холестана 19,8 мин [581].

(OV-225) и метил-Р-цианэтильного (ХЕ-60, AN-600) произвол- ных; в этих случаях термическая устойчивость до некоторой степени принесена в жертву,

так как перечисленные ранее неподвижные фазы нельзя использовать при температуре выше 250— 275°С. Что касается неподвижных фаз типа OV, то наиболее употребительной является OV-225, а в тех случаях, когда требуется разделить оксисоединения и соответствующие кетоны (кетоны элюируются с большими временами удерживания), очень популярна QF-1. Применяются также полиэфирные фазы (в основном неопентилгликольсукци н а т, НПГС), главным образом при разделении насыщенных и ненасыщенных (например, 5,6-дигидро- и А5-) производных. Из всех неподвижных фаз, используемых в анализе стероидов, термическая устойчивость этих весьма избирательных фаз наихудшая.

Смеси упомянутых выше неподвижных фаз, находившие широкое применение в ранний период развития газохроматограф ического анализа стероидов, в настоя-

Рис. 2.10. Газохроматографическое разделение тестостерона, эстрадиола и их. эфиров после триметилсилилирования на. колонке размером 1 мХЗ,2 мм из нержавеющей стали, заполненной 2 %-ным: дексилом 400, нанесенным на анахром? ABS (90—100 меш) [температура: испарение при 260°С, колонка программируется на 250—320°С (5°С/мин)] [273].Рис. 2.10. Газохроматографическое разделение тестостерона, эстрадиола и их. эфиров после триметилсилилирования на. колонке размером 1 мХЗ,2 мм из нержавеющей стали, заполненной 2 %-ным: дексилом 400, нанесенным на анахром? ABS (90—100 меш) [температура: испарение при 260°С, колонка программируется на 250—320°С (5°С/мин)] [273].1 — эстрадиол (10 мкг); 2 — тестостерон (8,2 мкг); 3 — пропионат тестостерона (8 мкг); 4 — изокапронат тестостерона (16,2 мкг); 5 — бензоат эстрадиола (0,4 мкг); 6 — фенилпропионат эстрадиола (1,6 мкг); 7— фенилпропионат тестостерона (16 мкг).1 — эстрадиол (10 мкг); 2 — тестостерон (8,2 мкг); 3 — пропионат тестостерона (8 мкг); 4 — изокапронат тестостерона (16,2 мкг); 5 — бензоат эстрадиола (0,4 мкг); 6 — фенилпропионат эстрадиола (1,6 мкг); 7— фенилпропионат тестостерона (16 мкг).щее время встречаются лишь изредка; например, Томсова и др. [774а] разделили 24 стероидных метаболита на колонке, содержащей 9 частей OV-1 (1 %) и 1 часть OV-22S (3 % ) на носителе газохром Q.

Рис. 2.10. Газохроматографическое разделение тестостерона, эстрадиола и их. эфиров после триметилсилилирования на. колонке размером 1 мХЗ,2 мм из нержавеющей стали, заполненной 2 %-ным: дексилом 400, нанесенным на анахром? ABS (90—100 меш) [температура: испарение при 260°С, колонка программируется на 250—320°С (5°С/мин)] [273].

Рис. 2.10. Газохроматографическое разделение тестостерона, эстрадиола и их. эфиров после триметилсилилирования на. колонке размером 1 мХЗ,2 мм из нержавеющей стали, заполненной 2 %-ным: дексилом 400, нанесенным на анахром? ABS (90—100 меш) [температура: испарение при 260°С, колонка программируется на 250—320°С (5°С/мин)] [273].

1 — эстрадиол (10 мкг); 2 — тестостерон (8,2 мкг); 3 — пропионат тестостерона (8 мкг); 4 — изокапронат тестостерона (16,2 мкг); 5 — бензоат эстрадиола (0,4 мкг); 6 — фенилпропионат эстрадиола (1,6 мкг); 7— фенилпропионат тестостерона (16 мкг).

1 — эстрадиол (10 мкг); 2 — тестостерон (8,2 мкг); 3 — пропионат тестостерона (8 мкг); 4 — изокапронат тестостерона (16,2 мкг); 5 — бензоат эстрадиола (0,4 мкг); 6 — фенилпропионат эстрадиола (1,6 мкг); 7— фенилпропионат тестостерона (16 мкг).

Из неподвижных фаз, не относящихся к силоксанам или полиэфирам, возрастающее значение в анализе стероидов приобретают сополимеры на основе карборана и метилсилоксана типа дексила [300, 400, 410]. Эти сополимеры несколько более полярны, чем метилсилоксаны, обладают чрезвычайно высокой

термической устойчивостью и могут быть использованы для разделения наименее летучих стероидов с большими молекулярными массами. На рис. 2.10 из статьи Газдага и др. [273] представлены результаты разделения тестостерона, эстрадиола и пяти их эфиров (последние входят в состав масляных растворов для инъекций).

Кирк и Шоу [458] рекомендуют жидкие кристаллы эфира холестерина в качестве неподвижных фаз для разделения эпимеров стероидов. Позже Цилински и др. [864] предложили новые нематические жидкие кристаллы (М,Ы-бис(п-метоксибен- зилиден)-а,а,-би-п-толуидин] с необычно высокой разрешающей способностью, на которых можно, например, разделить четыре эпимера За/р-окси-5а/|3-андростан-17-она за 15 мин при 230°С (см. также разд. 4.2.7 и рис. 4.4).

Капиллярные колонки

В начале семидесятых годов было предложено использовать капиллярные колонки (открытые трубчатые колонки) в газохроматографическом анализе стероидов [25, 323, 597, 598, 804, 818, 819]. Разделяющая способность этих колонок гораздо выше, чем насадочных колонок: если число теоретических тарелок для насадочных колонок, обычно используемых в анализе стероидов, колеблется между 2000 и 4000, то для капиллярных колонок легко получить значения 50 000—100 000 и даже выше. В отличие от хроматографии на насадочных колонках в капиллярной хроматографии за одно хроматографирование можно разделить и количественно определить до 20—30 стероидов, поэтому этот метод чрезвычайно полезен при оценке профиля концентраций стероидов в моче и крови. Высокая эффективность капиллярных колонок позволяет упростить подготовку проб, так как в этом случае нет необходимости в тщательной предварительной очистке, как при работе с насадочными колонками. Однако при использовании этого метода в повседневной работе в любой лаборатории возникают серьезные трудности, связанные с подготовкой подходящих стеклянных капилляров, травлением и силилированием их стенок для получения инертных поверхностей [47], на которых даже при длительной работе при высоких температурах сохранялся бы равномерный слой неподвижной фазы, а также проблемы, связанные с введением пробы, детектированием и т. п. Для ознакомления с различными приемами, используемыми при решении этих задач, следует обратиться к работам, упомянутым ранее.

За последние несколько лет был опубликован ряд статей, посвященных применению капиллярной колоночной хроматографии в клиническом и биохимическом анализе стероидов. Основные результаты некоторых работ приведены в табл. 2.10.

о

^§ ЧК(4gg с[4

XX- S ч &ХXУ

1=1ЧЕеч5е°ос*

в

5

CDЯ, ■Q. о£ 1

н2°? я со 1

ф® £ я ^

О02.-°? 5Я ® С

15 5ьС 5 g ।।§ g" ggs I

СУQ ЮК Е( и Я.

Я Я Q Щ СУ Ч §< . CD Я -О

£§£|§§вв£§в£§

ЦЗ СУ СО о СУ tl со

о § 0.0 С ”

ООО OU3 ОО

|g gg g Bggg

О

я я д и •£ ca я to я tn я co я co

CD О CD О CD O CD О CD О CD О CD О В ЯЧ( я к( У к( я У У У У я у я М- я У Я Я Я Я К Я У У У У Я я я ОО ОО ОО ОО ОО ОО ОО О У СУ Я СУ У СУ Я СУ У СУ Я СУ Я СУ О.

CD CD ф ффф <D ф ЯН ЯН ЯН Ун Я Н £ У н ЯН h

Ч о ^ о ^ о ч Q ч О § 4 Q ^ и q § я CD я Я ^ Я CD я _ 00 я Я CD о 00 Дй3 Д^гДй3 Д£3Д^С Д^й£й^с С су я С су я К cl я О о. я О су я СсуяСсуясоя

О. л S

н У л ” 2 я 0.0-0

§u =

Я § оОО0^0О

Г^.0—0° Яо Я°

яо ® о wtoо Уо

с кяо я оо ую 2со 5ю

-- Я5ri ^ СЧ Я04 СУ04 204

®USU®U I I S О|g|и Iи

о о Ю О О Ю о ОСЧ00У04СО

Ю СО СЧ —* СЧ п СО П п СЧпП 04 СЧСЧ

о Е со с ¥ <я ф

К о

1У 1>>стз л11Ю

2О о™ 2оич§22^ 8

Тсо у^Тсо о •।7 i

О ОО

ц

1 g

о. 1

н су S 2

£ о 5

я 2

ЮСОЮю 04 У4

СОСОСЧУ04СЧСЧ СЧсо

ооооооо оо

ст?

s s ч

Ч

о LTD ОООIriою— о

04СОЮ1СЧСЧ04 04 СЧ

о со

ч о

ОЮН Усососососо

ООО ОООООО

о

02 <

сусу,—।

22сууя1су

1S'СОЯ13о °ЯО к;

®-G-^coсуяЕ у*я к;

gУ—1 О riНCD Я

^5 - О 5Я 1—-5§ СУ СУПУ о i(D

:(D’S- СУО4 О)УУнООУу СОЯ Я

mCEsswHlt=(zLXL2ЭяU3L1<u

Продолжение табл. 2.10

Автор

Год

Размеры колонки

Неподвижная фаза

Температура и скорость нагревания

Образец

Производное

Внутренний стандарт

Детектор

длина, м

внутр, диаметр, мм

Эдмондс И Брукс [209]

1976

50

0,5

OV-1/си- ланокса

230—240°С

Искусственная смесь

тмс

—

мс

Матьесен и Стейб [532]

1977

15

OV-101 и т. п.

250°С

Искусственная смесь

—

—

ПИД, мс

Людвиг и др. [513]

1977

20

0,3

SE-30

120—300°С, 2°С/мин

Профиль концентраций стероидов в плазме

тмс

—

ПИД, мс

Фэнтл и Грей [232]

1977

20

0,3

OV-101

Разные программы

Профиль концентраций стероидов в моче

тмс

Бутират холестерина

ПИД

Холсбер и Кнорр [377]

1977

30

OV-101

200—240°С, ГС/мин

17-Оксипрегнено- лон в моче

мо-тмс

Андростендиол

ПИД, мс

Эггер и др. [213]

1978

25

0,3

SE-30

6 мин при 150°С, 2°С/мин до 300°С, 15 мин при 300°С

Профиль концентраций стероидов в моче

тмс- енол, тмс- простой эфир

С-20,22,24,32

ПИД, мс

Дюрбек и др. [204]

1978

40

SE-54

30—200°С, быстрое нагревание; 200— 260°С, 2,5°С/мин

Метаболиты ме- тандиенона в моче

ТМС

ПИД, мс

Автор

Год

Р азмеры колонки

Неподвижная фаза

Температура и скорость нагревания

Образец

Произ

водное

Внутренний стандарт

Детектор

длина, м

внутр, диаметр, мм

Лойниссен и др. [497]

1978

30

0,25

SE-30

250°С

Профиль концентраций стероидов в моче

МО-ТМС

С-24, С-32

ПИД, мс

Людвиг-Кён и др. [514, 515]

1978

1979

24

SE-30

150—300°С, 2°С/мин

Профиль концентраций стероидов в плазме

тмс, мо-тмс

—

ПИД, мс

Тэйлор и др. [762]

1979

20

OV-101

—

Профиль концентраций стероидов в моче

мо-тмс

Андростандиол, бутират холестерина

ПИД, мс

Ярвенпёё и др. [4156]

1980

25

—

OV-101

—

Метаболиты эстрогена

тмс, ацетониды цис- гликолей

—

мс

Мадани и Чам- баз [519а]

1981

25

0,25

Химически связанные полиси - локсаны

180—300°С, 2°С/мин

Профиль концентраций стероидов в моче

МО-ТМС

Бутират холестерина

ПИД

Пфейфер и Спителлер [631а]

1981

25

0,3

OV-101

150—300°С, 2°С/мин

Профиль концентраций стероидов в моче

МО-ТМС тмс- енол

Эйкозанол—гекса- декандиол; эпи- этиохоланолон

ПИД, мс

a SCOT (support-coated open tubular columns) — капиллярная колонка co стенками, покрытыми пористым носителем.

БХБХВремя, минВремя, минРис. 2.11. Профиль концентраций метаболитов стероидов, содержащихся в моче взрослого самца, установленный методом капиллярной газовой хроматографии (метоксим—триметилсилиловые эфиры). Параметры колонки и условия хроматографирования см. в табл. 2.10 [630].Рис. 2.11. Профиль концентраций метаболитов стероидов, содержащихся в моче взрослого самца, установленный методом капиллярной газовой хроматографии (метоксим—триметилсилиловые эфиры). Параметры колонки и условия хроматографирования см. в табл. 2.10 [630].

БХ

БХ

Время, мин

Время, мин

Рис. 2.11. Профиль концентраций метаболитов стероидов, содержащихся в моче взрослого самца, установленный методом капиллярной газовой хроматографии (метоксим—триметилсилиловые эфиры). Параметры колонки и условия хроматографирования см. в табл. 2.10 [630].

Рис. 2.11. Профиль концентраций метаболитов стероидов, содержащихся в моче взрослого самца, установленный методом капиллярной газовой хроматографии (метоксим—триметилсилиловые эфиры). Параметры колонки и условия хроматографирования см. в табл. 2.10 [630].

Ан — андростерон

Эт — этиохоланолон

ДГЭА — дегидроэпиандростерон 11-ОАн— llp-оксиандростерон 11-ОЭт — 11р-оксиэтиохоланолон

ПД — прегнандиол

ПТ — прегнантриол

АТ — андростентриол

ТГК — тетрагидрокортизон

ТДК — тетрагидро-11-дегидрокортикостерон

ТГС — тетрагидрокортикостерон а-ТГКС — алло-тетрагидрокортико- стерон

ТТЛ — тетрагидрокортизол

<х-ТГЛ — алло-тетрагидрокортизол

Ко — кортолон

P-Ко — р-кортолон

Кор — кортол

БХ — бутират холестерина

За-окси-5а-андростан-17-он За-окси-5р-андростан-17-он Зр-окси-5-андростен- 17-он За, 11 р-диокси-5а-андростан-17-он За, 11 р-диокси-5р-андростан-17-он 5р-прегнан-3а,20а-диол 5р-прегнан-3а,17а,20а-триол 5-андростен-Зр, 16а, 17р-триол За, 17а,21-триокси-5р-прегнан-11,20- дион

За,21-диокси-5Р-прегнан-11,20-дион

За,11р,21-триокси-5р-прегнан-20-он За, 11 р,21 -триокси-5а-прегнан-20-он

За, 11 р, 17а,21 -тетраокси-5р-прегнан- 20-он

За, 11Р, 17а,21 -тетраокси-5а-прегнан- 20-он

За, 17а,20а,21 -тетраокси-5р-прегнан- 11-он

За, 17а,20р,21 -тетраокси-5р-прегнан- 11-он

За, 11 р, 17а,20а,21 -пентаокси-5р-пре- гнан (внутренний стандарт)

Данные табл. 2.10 показывают, что предпочтение отдается в основном неполярным неподвижным фазам и что дериватиза- ция стероидов (главным образом триметилсилилирование и ме- токситриметилсилилирование) и программирование температуры практически неизбежны. На рис. 2.11 представлена типичная хроматограмма, заимствованная из статьи Пфаффенбер- гера и Хорнинга [630].

Детекторы

В большинстве статей, опубликованных в первые годы развития газохроматографического анализа стероидов, сообщалось об использовании аргонового ионизационного детектора. Затем этот детектор был вытеснен пламенно-ионизационным детектором (ПИД), который в настоящее время является наиболее широко распространенным в анализе стероидов. К достоинствам ПИД относятся линейная зависимость отклика от концентрации в широком диапазоне концентраций и высокая чувствительность, дающая возможность определять нанограммовые количества вещества. ПИД — это универсальный детектор, и все стероиды дают сходные отклики. Однако оценить процентное содержание отдельных стероидов по нормированным площадям пиков на хроматограмме многокомпонентной смеси можно лишь в первом приближении. Для получения более точных результатов следует построить градуировочные графики для каждого компонента, учитывая различия в относительных мольных

Таблица 2.11. Значения относительных мольных чувствительностей

ПИД ItFm^ [210]

Стероид

Сп

°п

rF М

Эстрон

18

2

0,278

Эстрадиол

18

2

0,274

4а-Андростен-3,17-дион

19

2

0,352

5а-Андростан

19

0

0,381

Прогестерон

21

2

0,425

5а-Прегнан

21

0

0,502

Метиловый эфир литохолевой кис

25

3

0,652

лоты

5а-Холестан-3-он

27

1

0,828

5а-Холестан

28

0

0,868

ЗР-Бутокси-5-а-холестан (внутренний

31

1

1,0006

стандарт)

а г^лг=0,0571(Сп — 0,499-Оп) — 0,697, где Сп и Оп— число атомов углерода и кислорода в каждой молекуле.

б Относительное значение, принятое за исходное.

чувствительностях. Эта проблема тщательно исследована Эдвардсом [210]. Было установлено, что мольная чувствительность пропорциональна числу атомов углерода в молекуле стероида; при этом следует иметь в виду, что два атома кислорода почти уничтожают сигнал от одного атома углерода. Атомы водорода, серы и хлора не влияют на сигнал. Более подробные сведения приведены в табл. 2.11.

Что касается селективных пламенно-ионизационных детекторов, то, с помощью чувствительного на азот детектора можно обнаруживать оксимные производные [748, 749], а детектор, чувствительный на фосфор, можно рекомендовать для детектирования диметилфосфиновых [407, 408, 816] и диметилтиофос- .финовых эфиров стероидов по оксигруппам [407, 409, 817].

Гораздо более широкое применение находят детекторы электронного захвата (ДЭЗ). Современные модели этого детектора с 63N в качестве источника радиоактивного излучения можно использовать при температурах вплоть до 350°С, что позволяет анализировать даже малолетучие стероиды. Благодаря чрезвычайно высокой чувствительности (возможно определение пикограммовых количеств веществ) ДЭЗ применяются главным образом в тех случаях, когда чувствительности ПИД не хватает для решения поставленной задачи. Однако в отличие от ПИД они не являются универсальными, так как высокой чувствительности можно добиться только для стероидов, содержащих специфические группы или системы связей. Хотя способность некоторых стероидных соединений (в основном ненасыщенных кетонов) к захвату электронов довольно велика и их можно определить без предварительной дериватизации [611, 656, 709, 807а], в большинстве случаев для обеспечения удовлетворительной чувствительности при использовании ДЭЗ в молекулу вводят галогенсодержащие группы. Исчерпывающие сведения о чувствительности к электронному захвату различных производных 17а-ацетоксипрогестерона содержатся в обзоре Коши [477]. Наиболее высокая относительная чувствительность характерна для хлорпроизводных (хлорацетатов [491, 552, 797]) и хлорметилсилиловых эфиров [208, 226], однако чаще все-таки

применяют производные перфторкарбоновой кислоты [96, 155, 179, 235, 238, 794 и др.] из-за их превосходных хроматографических характеристик. Наличие нескольких атомов фтора в молекуле позволяет также достигнуть высокой чувствительности.

Если ПИД находят применение и в фармацевтическом, и в биоклиническом анализе стероидов, ДЭЗ используется исключительно в последней области [96, 235, 238, 482, 552, 580, 596, 750 и др.].

При хроматографировании меченых стероидов часто нужно измерять отношения количества меченого стероида к его общему содержанию для каждого пика. В этих случаях элюент перед введением в ПИД разделяют на потоки, причем большую часть направляют в детектор радиоактивности. Поскольку измерение радиоактивности затруднительно проводить при высокой температуре элюента в колонке, сначала «ловят» индивидуальные пики в жидкостных ловушках [166, 589], на микроколонках [589] или тонкослойных пластинках [183]. Непрерывный контроль возможен только в том случае, если выходящие из колонок стероиды сжигаются; при этом 14С и 3Н превращаются в диоксид углерода и молекулярный водород соответственно [166, 504, 693, 727, 867].

Следует упомянуть, что при помощи детектора постоянной скорости рекомбинации можно обнаружить до 50 пг трифторацетата тестостерона [88].

Во многих случаях в качестве детектора используется масс- спектрометр. Если требуется идентифицировать неизвестные стероиды в биологических объектах, то газовую хроматограмму обычно регистрируют по общему ионному току, а сканирование идет по индивидуальным пикам масс-спектрограммы. Однако здесь эти методы обсуждаться не будут, так как применению масс-спектрометрии для количественного анализа сложных смесей стероидов посвящен разд. 2.2.15.

Проблемы дериватизации

В большинстве случаев стероиды хроматографируют в виде подходящих производных. Преимущества этого метода заключаются в следующем:

Путем дериватизации можно повысить термическую устойчивость стероидов. Чувствительность к нагреванию, являющаяся основной проблемой при анализе кортикостероидов, будет рассматриваться в разд. 3.2.10; половые гормоны и их промежуточные продукты обычно достаточно устойчивы, чтобы их можно было хроматографировать при 200—250°С. Некоторые производные, склонные к разложению, можно хроматографировать, используя эмалированный испаритель-дозатор или, что

еще лучше, вводя пробу непосредственно в колонку. Кроме того, твердый носитель должен быть достаточно инертным и содержать не менее 1 % неподвижной фазы (третичные оксипроизводные и т. п.). Конечно, есть ряд соединений, которые разрушаются даже при тщательном соблюдении этих условий (спиронолактон, диацетат этиндиола и др.).

Дериватизация позволяет значительно снизить необратимую адсорбцию. Это очень важный момент даже при хроматографировании половых гормонов. Как показано в предыдущем разделе, подавляющее большинство половых гормонов можно хроматографировать без предварительной дериватизации, и,, как правило, в фармацевтическом анализе ее не проводят (см. табл. 2.13), однако в биоклиническом анализе перед хроматографированием почти всегда предварительно получают производные тех же стероидов . Необходимость дериватизации вызвана тем, что при фармацевтическом анализе в хроматограф вводят «макропробы», составляющие несколько микрограммов, тогда как в биомедицине размер пробы гораздо меньше — в интервале нанограммовых или пикограммовых количеств. В этом интервале концентраций необратимая адсорбция стероидов с полярными группами (окси-, кетогруппы) на активных центрах колонки приводит к серьезным относительным потерям (пики могут полностью исчезнуть). Эту проблему можно разрешить, уменьшив полярность стероидов при помощи подходящей реакции дериватизации.

Дериватизация во многих случаях позволяет увеличить летучесть стероида и, следовательно, уменьшить его время удерживания. Это не является общим правилом, но им можно руководствоваться главным образом при хроматографировании неполярных производных полярных стероидов на полярных неподвижных фазах. На неполярных силоксановых фазах разделение контролируется в основном молекулярной массой, поэтому большинство производных с более высокой молекулярной массой элюируется позже, чем исходные стероиды. Это иллюстрируется данными табл. 2.12, где приведены относительные времена удерживания недериватизованного, ацетилированного, триметилсилилированного и трифтор ацетилированного 5а-анд- ростан-3р,17р-диола на трех неподвижных фазах с возрастающей полярностью; данные взяты из работы Хартмана и Во- тица [346].

Таблица 2.12. Сравнение характеристик удерживания производных 5а-андростан-3|3,17|3-диола на различных неподвижных фазах [346] а

Неподвижная фаза

Недериватизо- ванное соединение

Ацетильное производное

Трифтор ацетильное производное

ТМС-эфир

SE-30 (3 %)

1,00

1,69

0,61

1,17

ХВ-60 (3 %)

1,00

1,17

—

0,35

NOS (3 %) (неопентилгликоль- сукцинат)

1,00

0,90

0,17

0,18

а Времена удерживания производных отнесены ко времени удерживания недерива- тизованного соединения.

Для улучшения газохроматографических свойств стероидов реакция силилирования впервые была предложена Луукайненом и сотр. [519] еще в 1961 г., и с тех пор ее применению посвящаются многочисленные публикации [5, 6, 10, 16, 17, 21, 39, 46, 48, 54, 68, 73, 85, 90, 153, 177, 179, 183, 209, 213, 232, 244, 264, 275, 284, 291, 345, 357, 377, 410, 443, 448, 486, 504, 513, 536, 540, 549, 563, 579, 580, 629, 630, 633, 643, 667, 670, 691, 693, 710, 770, 771, 778, 793, 864].

Ниже приведены формулы наиболее распространенных си- лилирующих агентов:

ОСНзIIF3C—C=N—Si — СНзСНз due (триметилсилил)- триф торац етамид (БСТФА)ОСНзIIF3C—C=N—Si — СНзСНз due (триметилсилил)- триф торац етамид (БСТФА)О СНзII /F3C—C-N-Si-СНзСНз СНзМ-метил-Ы-триметил- силилтрифтораиетамид (МСТфА^О СНзII /F3C—C-N-Si-СНзСНз СНзМ-метил-Ы-триметил- силилтрифтораиетамид (МСТфА^

ОСНз

II

F3C—C=N—Si — СНз

СНз due (триметилсилил)- триф торац етамид (БСТФА)

ОСНз

II

F3C—C=N—Si — СНз

СНз due (триметилсилил)- триф торац етамид (БСТФА)

О СНз

II /

F3C—C-N-Si-СНз

СНз СНз

М-метил-Ы-триметил- силилтрифтораиетамид (МСТфА^

О СНз

II /

F3C—C-N-Si-СНз

СНз СНз

М-метил-Ы-триметил- силилтрифтораиетамид (МСТфА^

СНзI /С2Н5Н3С—Si—NI хс2н5СНзI /С2Н5Н3С—Si—NI хс2н5СНзтриметилсилилЗиэтиламин (тмсдэа)СНзтриметилсилилЗиэтиламин (тмсдэа)СНз /=NНзС—Si—NСНзтриметилсилилимидазол (ТМСИМ)СНз /=NНзС—Si—NСНзтриметилсилилимидазол (ТМСИМ)

СНз

I /С2Н5

Н3С—Si—N

I хс2н5

СНз

I /С2Н5

Н3С—Si—N

I хс2н5

СНз

триметилсилилЗиэтиламин (тмсдэа)

СНз

триметилсилилЗиэтиламин (тмсдэа)

СНз /=N

НзС—Si—N

СНз

триметилсилилимидазол (ТМСИМ)

СНз /=N

НзС—Si—N

СНз

триметилсилилимидазол (ТМСИМ)

СНз

СНзСНз

НзС—Si —СНз

СНз

ОСНз

НзС—Si—NH—Si—СНз

Н3С—Si—С1

НзС—С =N—Si—СНз

11

СНзСНз

СНз

СНз

гексаметипЗисилазан

Триметилзслорсилан

due (триметилсилип) ацетамид

(ГМДС)

(ТМХС)

(БСД)

СНз

НзС—Si—СНз

Все эти агенты образуют триметилсилильные производные. Побочные продукты реакций являются более летучими соединениями, чем стероиды, и, следовательно, не мешают анализу. Существуют многочисленные варианты практического применения силилирующих агентов. Для решения конкретной задачи аналитик имеет возможность выбрать оптимальные условия проведения реакции: использовать один реагент или комбинацию реагентов, варьировать растворители или вообще обойтись

без них, подобрать необходимую температуру (от комнатной до 150°С) и время (от нескольких минут вплоть до выдерживания в течение ночи). В качестве первого реагента для силилирова- ния оксигрупп стероидов была предложена смесь ГМДС и ТМХС в тетрагидрофуране [519]. Этот агент часто используют и сейчас [10, 21, 580], если для силилирования нужных оксигрупп нет стерических затруднений. Типичная методика приведена в работе Адлеркройца [10]. Пробу растворяют в 1 мл свежеперегнанного пиридина, добавляют 100 мкл ГМДС и 10 мкл ТМХС и оставляют смесь в закрытом сосуде на ночь. Пиридин удаляют выпариванием в токе азота при 45°С. После удаления нерастворимого хлорида аммония, образующегося из ГМДС в процессе реакции, проводят газохроматографическое определение, используя в качестве растворителя я-гексан.

Для силилирования наименее реакционноспособных оксигрупп (lip-OH и 17а-ОН в производных прегнана) необходимы более жесткие условия. В этих случаях наиболее часто используются БСА, БСТФА, ТМСИМ [39, 135, 209, 273, 291, 536, 778], являющиеся очень активными агентами, особенно в сочетании с небольшими количествами ТМХС.

Газдаг и др. [273] обрабатывали эстрогены, растворенные в 1 мл ацетонитрила, 1 мл смеси БСТФА и пиридина (1:1) при комнатной температуре в течение 15 мин, и проводили газохроматографическое определение непосредственно в этом растворе. Готелли и др. [291] при силилировании эстриола с помощью БСА в качестве растворителя использовали диметил- формамид при 70°С. Кюльпман и Бройер [488] применяли МСТФА для силилирования 17-кетостероидов и прегнандиола, содержащихся в моче; Людвиг-Кён и др. с помощью этого реагента устанавливали профили концентраций стероидов плазмы крови [514, 515].

Можно привести несколько примеров использования комбинаций БСА или БСТФА с ТМХС [54, 2S4, 549, 670]. Для установления профиля концентраций стероидов в моче Менье [549] наряду с другими использовал реагент Чамбаза и Хорнинга [146], являющийся смесью ТМСИМ, БСА и ТМХС. При 80°С реакция протекает за ночь.

Если вместо смеси ТМХС и ГМДС использовать триметил- бромсилан, то силилируются даже менее реакционноспособные оксигруппы. Более того, происходит енолизация кетогрупп с образованием триметилсилиловых эфиров енольных форм. Такая же побочная реакция имеет место и при силилировании оксигрупп кетостероидов наиболее реакционноспособными силили- рующими агентами. В этом кроется одна из причин превращения кетогрупй в метоксимные перед силилированием (см. последующую часть этого раздела). Как показали Чамбаз и др.

7 Заказ № 182

[145], используя МСТФА и ацетат калия, можно количественно получить триметилсилиловые эфиры енольной формы. Это лучший способ одновременной дериватизации по окси- и кетогруппам: Эггер и др. [213] использовали его для силилирования стероидов, содержащихся в моче, перед их разделением методом капиллярной газовой хроматографии. Если пробу нагревать в запаянном капилляре со смесью МСТФА и пиридина (1:1) в присутствии нескольких кристаллов безводного ацетата натрия при 60°С в течение 24 ч, то все окси- и кетогруппы, за исключением lip-ОН- и 11-кетогруппы, реагируют количественно.

Тот же принцип использовали Донике и Циммерман [19ба] для получения производных по 3-кетогруппе тестостерона и превращения их в триметилсилиловый, триэтилсилиловый и трет-бутилдиметилсилиловый эфиры енольной формы.

Помимо триметилсилильных производных в особых случаях используются также и другие силиловые эфиры. Миязаки и др. [563] определяли число оксигрупп в молекуле стероида, сравнивая результаты хромато-масс-спектрометрического сканирования триметилсилилированных, диметилсилилированных и диме- тил-^-пропилсилилированных производных. Одной из причин поиска новых силильных производных является стремление улучшить параметры удерживания и фрагментационные характеристики для масс-спектрального анализа. Гарвей [345] проводит сравнение характеристик четырнадцати замещенных силиловых эфиров. Ценными свойствами обладают трет-бутилдиметилси- лиловые эфиры, синтезированные с помощью трет-бутилдиме- тилсилилимидазола (предложен Келли и Тейлором [449] и введен в практику Блэром и Филлипоу [86], Куильямом и сотр. [648] и Симарком и сотр. [706]); эти соединения в 104 раз устойчивее к гидролизу, чем триметилсилильные производные. Наличие чрезвычайно интенсивного пика (М — 57)+ в их масс- спектрах позволило существенно повысить чувствительность масс-фрагментографического определения.

К недостаткам дериватизации в трет-бутилдиметилсилиль- ' ные производные следует отнести невозможность силилирования стерически затрудненных оксигрупп. Легче образуются аллилдиметилсилильные производные [634], но в процессе их получения появляются побочные продукты — производные аллил- силоксана [85].

Последовательно замещая один из атомов водорода силили- рующего агента на атом галогена, можно легко получить гало- генметилдиметилсилильные производные [208]. Хотя триметилсилиловые эфиры остаются соединениями с наиболее благоприятными хроматографическими параметрами, галогензаме- щенные производные имеют особые преимущества. Хлорметил-

диметилсилильные производные играют исключительно важную роль в хромато-масс-спектрометрических (ХМС) исследованиях [104, 147]. Введение атома галогена в силильную группу позволяет весьма сильно повысить чувствительность и количественно определять стероиды, используя ДЭЗ. Наиболее высокой чувствительности удается добиться с иодметилдиметилсилильным производным, которое успешно использовали Сайме и Томас [750] для определения дегидроэпиандростерона в плазме. Исключительно ценные с точки зрения детектирования электронного захвата и возможности привлечения масс-спектрометрии свойства проявляют пентафторфенилдиметилсилильные производные [571], а также кетальные производные, которые получают при взаимодействии оксигрупп стероида с трифтор- трихлорацетоном или тетрафтор дихлор ацетоном и метилировании промежуточного гемикеталя диазометаном [686]. Достоинством предложенных Гарвеем [345а] диметоксиметилсилиловых простых эфиров является их устойчивость к гидролизу.

Новую реакцию дериватизации по аксиальным оксигруппам предложили Деннин и Шуллер [179]. Она начинается с образования пропенилового эфира (из ацетона через гемикеталь), затем эфир ацилируют с помощью гептафтормасляного ангидрида. Активность электронного захвата у этих производных на один- два порядка выше, чем у гептафторбутиратов, но процесс сопровождается побочными реакциями.

Одним из методов дериватизации служит метилирование фенольных оксигрупп. Адлеркройц и сотр. [13, 410, 770, 771] 7*

используют обычно этот метод для получения производных эстрадиола и эстриола. З-Метиловые эфиры, полученные при помощи диметилсульфата, можно очистить на колонке, триметил- силилировать спиртовые оксигруппы и разделить полученные соединения методом газовой хроматографии. Милнер и Табер [557] предложили быстрый метод метилирования эстриола непосредственно в колонке при помощи гидроксида тетраметиламмония. Другим методом метилирования является метилирование с фазовым переносом ионной пары. Дэлей и сотр. [175], описавшие этот метод, предлагают встряхивать щелочной раствор эстрогенов с раствором метилиодида и гидроксида тетрагексиламмо- ния в дихлорметане в течение 10 мин. При этом происходит метилирование фенольных оксигрупп, а также 17-оксигрупп эстриола, которые могут быть обнаружены в органической фазе.

Метилирование всех оксигрупп (в том числе глюкуронидной части конъюгатов) проводят метилиодидом в присутствии карбаниона метилсульфинилметида [см. уравнение (2.18)]. Этот метод использован Томпсоном и др. [766, 767] для определения глюкуронидов эстрогенов.

(2.18)(2.18)

(2.18)

(2.18)

При реакции вицинальных цис-диолов с ацетоном образуются ацетониды, которые можно хроматографировать. Адлеркройц с сотр. [19] и Яковицкий с сотр. [410] применяли эту реакцию для разделения и определения эстриола, эпиэстриола и 16-эпиэстриола.

Интересным методом дериватизации Зр-оксигруппы является ее ферментативное превращение в 3-кетогруппу. Этот прием широко используется в анализе стеринов (см. разд. 4.2.9), но, как было найдено Смитом и др. [733], кроме ранее используемой холестериноксидазы лучше использовать Зр-оксистероид- оксидазу, получаемую из Brevibacterium sterollcum; этот фермент пригоден для быстрой трансформации и других Зр-окси- стероидов.

Одной из первых реакций дериватизации в газовой хроматографии стероидов [843] было ацетилирование оксигрупп. Благодаря простоте ГХ иногда используют и в настоящее время [94, 235, 448, 567, 643]. В качестве реагента обычно применяется смесь уксусного ангидрида и пиридина, но имеются сведения также об использовании ацетилхлорида [94]. Кроме того, ацетилирование имеет важное значение для предварительной очистки соединений, которые сами не ацетилируются; примером служит удаление примесей при определении прогестерона в крови, описанное Фехером и др. [238].

Из всех методов дериватизации оксигрупп стероидов наибольшее значение имеют методы с использованием галоген- замещенных карбоновых кислот. С самого начала в газовой хроматографии стероидов нашли применение трифторацетаты, отличавшиеся высокой летучестью [73, 88, 794]. Их используют при решении сложных задач; так, например, Эрсон и сотр. [215] описали хроматографирование глюкуронида андростерона в виде тристрифторацетильного производного метилового эфира. Обычно эти производные определяют при помощи ДЭЗ. Предел обнаружения может быть существенно снижен путем увеличения числа атомов фтора в карбоновой кислоте, поэтому нашли применение такие производные, как пентафторпропио- наты [96], гептафторбутираты [73, 156, 180, 191, 235, 238, 535, 659], гексадекафторнонаноаты и эйкозафторундеканоаты [460, 468]. Из эфиров, содержащих атомы галогенов, используются монохлорацетаты [491, 552, 797] и хлордифторацетаты [180, 637]. Трифторацетаты элюируются со всех неподвижных фаз раньше исходных оксисоединений и соответствующих кетонов, но в случае других производных ситуация не столь ясна и скорость элюирования сильно зависит от типа неподвижной фазы.

Из перечисленных выше производных предпочтение обычно отдают гептафторбутиратам (ГФБ). Преимуществом этих производных перед ранее применявшимися триметилсилиловыми эфирами является более высокая устойчивость к атмосферной влаге. Реакцию этерификации обычно проводят при 20—70°С в избытке гептафтормасляного ангидрида, разбавленного

каким-либо растворителем, например бензолом и тетрагидрофураном; рекомендованы также гептафторбутирилхлорид [637] и М-гептафторбутирилимидазол [382]; кроме того, описано газофазное гептафторбутирилирование эстрогенов, адсорбированных на сетках из нержавеющей стали, парами гептафтормасляного ангидрида [659].

В обычных экспериментальных условиях кетогруппы образуют гептафторбутираты енольных форм (по крайней мере частично). Как и в случае триметилсилиловых енольных эфиров, этого можно избежать, если предварительно защитить кетогруппы, превратив их в метоксимы. Метоксимы гептафторбутиратов успешно применяются для установления профиля концентраций стероидов, хотя и не столь широко, как метоксимы триметилсилильных производных [535]. Другая возможность заключается в количественном ацилировании енольной формы. Такой прием особенно удобен в случае А4-3-кетостероидов, так как он позволяет защитить эту группировку и в то же время использовать ДЭЗ для детектирования соединений, вообще не содержащих спиртовых оксигрупп, например прогестерона [238]. Единственный недостаток этой реакции — одновременное образование двух продуктов: 3-гептафторбутирильного производного 2,4-диена и 3,5-диена; их можно легко разделить на различных неподвижных фазах. Дево и Хорнинг, первыми описавшие эту реакцию [191], сообщали, что 2,4- и 3,5-диены элюируются с временами удерживания 26,8 и 29,7 мин соответственно (1 % SE-30, 205°С). В присутствии катализатора основного характера (пиридина) 2,4-диен становится главным продуктом реакции, тогда как в отсутствие его преобладает 3,5-диен.

Дериватизации кетогрупп половых гормонов не придают такого большого значения, как дериватизации оксигрупп, поскольку кетогруппы обычно не влияют на термическую устойчивость стероидов, а необратимая адсорбция в этом случае не столь сильна, как при наличии оксигрупп. Поэтому в фармацевтическом анализе стероидов дериватизации кетогрупп не проводится. Этот прием часто применяют в биоклиническом анализе в сочетании с силилированием или ацилированием по оксигруппам с тем, чтобы защитить кетогруппы от действия силилирующих и ацилирующих агентов и улучшить параметры хроматографирования. При газохроматографическом анализе кортикостероидов дериватизации 20-кетогруппы практически неизбежна (см. разд. 3.2.6), поэтому при установлении профиля концентрации стероидов при совместном присутствии половых гормонов и кортикостероидов почти всегда проводится защита кетогрупп [46, 177, 377, 596, 629, 630, 710, 818].

Как видно из уравнения (2.19), реакции дериватизации кетогрупп стероидов заключаются в конденсации с производными гидроксиламина.

(2.19)(2.19)

(2.19)

(2.19)

В качестве R в молекуле реагента могут быть метильная [метоксимные (МО) производные] [21, 46, 48, 90, 177, 213, 377, 504, 540, 596, 629, 630, 693, 710, 818], бутильная, изоамиль- ная [55], триметилсилильная [103], бензильная [189, 190], пентафторфенильная [478, 499а, 580, 825а] или 2-хлорэтильная [579] группы. Производные с двумя последними группировками обладают способностью к электронному захвату и могут быть определены при помощи ДЭЗ. Неблагоприятная особенность у образовавшихся О-замещенных оксимов 4-ен-З-кетонов состоит в том, что образуются их сын- и а^тц-изомеры, которые разделяются на различных стационарных фазах [383]. Другое осложнение состоит в том, что при использовании колонок со старой насадкой или при наличии в исследуемом растворе следов соляной кислоты оксимы подвергаются перегруппировке Бекмана с образованием нитрилов [765].

Из многочисленных производных гидроксиламина, похоже, используются только метоксимы, в основном в форме двойного метоксим-триметилсилильного (МО-ТМС) производного. Методика Пфаффенбергера и Хорнинга [629, 630] заключается в превращении всех кетогрупп стероидов, содержащихся в моче (за исключением нереакционноспособной 11-кетогруппы), в метоксимные производные с последующим триметилсилилирова- нием всех оксигрупп и хроматографированием на капиллярных колонках после соответствующей обработки пробы, включающей ферментативный гидролиз соединений и стадии экстрак-

I।I—I0 24 6Время, минI।I—I0 24 6Время, минции. Выпаренный экстракт растворяют в 100 мкл 10 %-ного (масса/объем) гидрохлорида метоксиамина в пиридине; После 15 мин выдерживания при 70°С раствор выпаривают досуха в токе азота. Добавляют 100 мкл N-триметилсилилимидазола

I।I—I

0 24 6

Время, мин

I।I—I

0 24 6

Время, мин

Рис. 2.12. Газохроматографическое разделение продуктов восстановления ацетата норэтистерона после обработки соляной кислотой [см. уравнение (2.20)] на колонке 4 % UCCW-982 при температуре 220 °C [311].

1 — 17а-этинил-3,5-эстрадиен- 17-ол (побочный продукт, образующийся при обработке соляной кислотой); 2 — ацетат 17а- этинил-3,5-эсТрадиен-17-ола;

3—17-ацетат 17а-этинилэст- ран-Зр, 17-диола.

и нагревают раствор при 100°С в течение 2 ч. Полученный раствор можно использовать непосредственно для газохроматографического определения. Такая хроматограмма представлена на рис. 2.11.

Из других методов с дериватизацией следует упомянуть * предложенную Намбарой [578] методику отделения А5-3-окси- стероидов от их насыщенных аналогов путем превращения первых в 5,6-эпоксиды под действием ж-хлорнадбензойной кислоты с последующим триметилсилилированием. Тот же прием использован для селективной дериватизации эквилина [669, 717]. Особенно трудной задачей является отделение А4-3-оксистерои- дов от их насыщенных аналогов, так как первые разрушаются в условиях газохроматографирования [236, 842а]. Гёрёг и др. [311] решили задачу одновременного определения этих соединений в продуктах восстановления 4-ен-З-кетостероидов, превращая А4-3-оксипроизводные в 3,5-диены путем селективной

дегидратации, катализируемой кислотами [реакция (2.20)]. Как видно из рис. 2.12, 3,5-диен легко отделяется от нереакцион- носпособного насыщенного производного.

Превращение на колонке неустойчивых 3-метокси-2,5(10)- диенов в устойчивые 3-метокси-3,5-диены описано Гёрёгом и Лауко [309].

Наконец, следует упомянуть статьи Адхикари и Харкнесса [7, 8] и Менгера с сотр. [542]. В первой из них предлагается хроматографировать стероиды после удаления всех функциональных групп, во второй — пиролитическое газохроматогра- фирование стероидов.

Подготовка проб для количественного анализа

При контроле чистоты стероидов в массе фабричного продукта пробу, растворенную в подходящем растворителе, сразу вводят в газовый хроматограф. При анализе лекарственных дозированных форм для получения исследуемого раствора обычно достаточно простой экстракции. Подготовка же раствора при анализе биологических образцов требует гораздо больших затрат времени и труда, чем само хроматографирование. Хотя задача газохроматографического разделения глюкуронидов была решена путем получения и хроматографирования триметилсилильного производного метилового эфира глюкуронида [406, 789], его ацетильного [185] или трифтораце- тильного производного [215], а также перметилированного метилового эфира глюкуронида [767], эти конъюгаты в большинстве случаев подвергаются ферментативному гидролизу (реже разложению под действием кислот или растворителей [497]). Последующая обработка может включать несколько экстракций и разделение или очистку методами тонкослойной и (или)

колоночной хроматографии до, а иногда после реакции дерива- тизации. Число стадий очистки можно существенно сократить, если использовать капиллярную колоночную газовую хроматографию. Некоторые особенности методов ТСХ и колоночной хроматографии разбираются в разд. 2.2.9 и 2.2.10, а комбинированные методы — в разд. 2.2.3.

Что касается собственно количественных определений, то в предыдущей части этой главы уже кратко обсуждались факторы, влияющие на количественную оценку газовых хроматограмм стероидов. Для детального ознакомления с этими вопросами можно обратиться к общеизвестным монографиям, упомянутым на с. 82. В последние годы при анализе смесей с небольшим числом компонентов общепринятым становится использование в качестве внутренних стандартов соединений, близких по структуре к стероидам. Для установления хроматографического профиля концентраций нескольких компонентов часто применяют два внутренних стандарта; один — с малым временем удерживания, который вымывается до стероида, а другой — с большим временем удерживания, выходящий после последнего пика стероида.

Практическое применение

Газовая хроматография, особенно в сочетании с масс-спектрометрией [194, 487], широко используется для контроля чистоты стероидных гормонов в массе продукта и для анализа полученных из них лекарственных препаратов. В последнем случае газовая хроматография иногда включается в фармакопеи. В табл. 2.13 приведены некоторые методы анализа лекарственных препаратов, содержащих половые гормоны.

Газовая хроматография является идеальным инструментом для надежного анализа препаратов стероидных гормонов, как показали Хафез и сотр. [143] для хинэстрола, Амин и сотр. [33] для миболерона (7а, 17а-диметил- 19-нортестостерон), Ишихара и Сугимото [ 398] для сульфата дегидроэпиандростерона и Роман и сотр. [668] для эфиров эстрадиола.

Еще более важную роль играет газовая хроматография при определении половых гормонов в биологических объектах. Даже простое перечисление громадного числа статей в этой области вывело бы нас за рамки книги. Большая часть работ относится к определению стероидов в моче [5, 6, 10, 16, 17, 21, 39, 54, 58а, 68, 94, 153, 177, 213, 232, 236, 237, 239, 244, 275, 284, 357, 377, 443, 448, 486, 549, 557, 567, 629, 630, 633, 643, 648, 670, 685, 710, 767, 770, 778, 790] и в крови [16, 17, 46, 48, 88, 90, 235, 238, 409, 443, 513, 580, 596, 691, 750, 817], но имеются

также сведения об определении стероидов в фекалиях [743а] и различных тканях [291, 410, 482, 504, 552, 589, 642, 693, 835].

Во многих случаях определяют общий профиль концентраций стероидов, тогда как в других случаях интерес представляют отдельные фракции, например эстрогены [5, 6, 13, 17, 175, 410, 419, 422, 670, 766, 790], 17-кетостероиды [21, 153, 488, 685] и т. д. Несколько статей посвящено определению отдельных стероидов, например эстриола [94, 284, 291, 357, 643, 767, 770, 771], прегнандиола и триола [94, 486, 488, 633], прогестерона [86, 238, 835], дегидроэпиандростерона [235, 536, 580, 589, 691, 750], лекарственных препаратов и их метаболитов [236, 237, 443, 552, 648, 675, 876] и т. д.

В качестве отдельных нетипичных примеров можно упомянуть определение эстрадиола в пище животных [96] и (как курьез) определение метилтестостерона и метандриола в воздухе фармацевтических производств [225], а также определение местранола и этинилэстрадиола в листьях, почве и воде [606].

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Когда в начале 70-х годов высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) была введена в анализ стероидов [364, 389, 725], газохроматографический анализ уже имел десятилетнюю историю и сотни публикаций, а многие методики вошли в повседневную практику в биомедицине и фармацевтике. Несмотря на это, ВЭЖХ быстро завоевала популярность и сейчас является одним из самых ценных аналитических методов разделения и количественного определения стероидов.

ГЖХ и ВЭЖХ имеют много общего (оба метода характеризуются высокой разрешающей способностью и многосторонними возможностями для количественных определений), оба метода нашли широкое практическое применение для анализа стероидов, и если в некоторых областях предпочтение отдается ВЭЖХ, тогда как в других ГЖХ сохранила свои позиции, то причину следует искать в достоинствах и недостатках ВЭЖХ.

Можно отметить следующие преимущества ВЭЖХ перед ГЖХ:

ВЭЖХ обычно проводят при температуре окружающей среды, поэтому она применима во всех областях химии стероидов, даже когда из-за низкой летучести и термической неустойчивости некоторых стероидов (конъюгатов, сердечных гликозидов, кортикостероидов и т. п.) газовую хроматографию нельзя использовать вообще или только после длительных и трудоемких операций дериватизации.

Хотя ВЭЖХ обладает обычно более низкой разрешающей способностью, чем ГЖХ (особенно в ее капиллярном

Таблица 2.13. Примеры газохроматографических методов определения стероидных гормональных препаратов

Автор

Год

Активный ингредиент

Лекарственная форма

Тэлмедж и др. [757]

1965

Этинилэстрадиол

Таблетки, масляные препараты для инъекций

Франс и Нокс [261]

1966

Этинилэстрадиол, ацетат мегестрола

Таблетки

Боутон и др. [95]

1966

Этинилэстрадиол

Таблетки

Шульц [698]

1965

Местранол

Таблетки

Шрофф и Гродски [718]

1967

Местранол

Таблетки

Темплтон и др. [763]

1968

Местранол

Таблетки

Хафез и др. [143]

1968

Хинэстрол

Таблетки

Бруши и др. [ПО]

1966

Метилтестостерон

Таблетки

Шрофф и Хьютман [720]

1968

Ацетат анагестона

Таблетки

Лодж [508]

1970

Норэтистерон

Таблетки

Моретти и др. [570]

1969

Эфиры эстрадиола

Масляные препараты для инъекций

Кавина и др. [141]

1970

Андрогены, гесто- гены, эстрогены

Масляные препараты для инъекций

Амормино и др. [34, 35]

1968

Эфиры тестостерона

Масляные препараты для инъекций

Карханис и Анфинсен [444]

Шредер и др. [717]

1970

Эстрон

Мазь

1972

Лошадиные эстрогены

в виде сульфатов

Таблетки

Хольх [314]

1972

Пропионат тестостерона

Масляные препараты для инъекций

Местрис и др. [547]

1972

Эфиры тестостерона

Масляные препараты для инъекций

Местрис и др. [546, 859]

1972

Эфиры тестостерона, прогестерон, бензоат эстрадиола, этинилэстрадиол и т. д.

Таблетки, масляные препараты для инъекций, мыльца

Юзеф и Местрис [859а]

1973

Прогестерон, тестостерон, энантаты эстрадиола

Масляные препараты для инъекций; свечи Таблетки

Роман и др. [669]

1975

Эстрогены в виде сульфатов

а Доверительная вероятность 95 %.

Неподвижная фаза

Температура колонки, °C

Производное

Внутренний стандарт

Относительное стандартное отклонение, ± %

SE-30 + эпон

1001

240

Ацетильное

Эстрон

1

SE-30

223

—

5а-Холестан, прогесте-

—

SE-30 QF-1 ХЕ-60 W-98

OV-17 или SE-30 SE-30 DEGS

QF-1 SE-30

260

221

195

205

253

250

215

200

190

тмс

тмс

Эстрон

Эстрон

5а-Холестан н-Доктриаконтан

Ацетат тестостерона

Местранол

Ацетат прегнанолона

5а-Холестан

8,6

2

1,2

0,63

1,6

2,6

1,19

JXR или OF-1

250

тмс

5а-Холестан-3-ол

1,14

SE-30

200—265 (програм.)

—

5а-Андростан

—

OV-1

254

—

Эквилин

1,1

UCCW-982

OV-1

230—260

230—250

Гидролиз, эпоксидирование

Прогестерон

4,1—6,8

1,01 а

SE-30

250

Переэтерификация

5а-Холестан, тестостерон

1,0—3,5

SE-30

220 или 250 или 175—240 (програм.)

ТМС

(в некоторых случаях)

5а-Холестан, тестостерон

—

SE-30

DEGS, OV-17

250 или 260

235—250 (програм.)

ТМС

(в случае эстрогенов)

Гидролиз, эпоксидирование, ТМС

Холестанон, пропионат тестостерона и т. п.

Ацетат холестерина

Около 2

0,6—6,2

Автор

Год

Активный ингредиент

Лекарственная форма

Бишара и др. [81]

1975

Циклопентиловый эфир этинил- эстриола-3

Таблетки

Джонсон и др. [421]

1975

Эстрогены в виде сульфатов

Таблетки, препараты для инъекций Ветеринарные мази

Мэджин [521]

1975

Станозолол

Ф. XX США [783а]

1980

Циклопентилпро- пионат эстрадиола

Масляные препараты для инъекций

Ф. XX США [783к]

1980

Циклопентилпро- пионат тестостерона

Масляные препараты для инъекции

NF XIV [7646]

1975

Оксандролон

Таблетки

Б. Ф. 1973

1973

Этилэстренол

Таблетки

Аддендум [102а, 1026]

1975

Станолон

Таблетки

Мак-Эрлейн и др. [540]

1977

Конъюгаты эстрогенов

Таблетки, препараты для инъекций

Семенов и Попов [708]

1977

Деканоат нандро- лона

Масляные препараты для инъекций

Моретти и др. [569]

1977

Местранол, нор-

Q пг тл Л О О

Таблетки

Газдаг и др. [273]

1977

1 ср он

Эфиры тестостерона и эстрадиола

Масляные препараты для инъекций

Риц и Валаш [662]

1978

Линоэстренол

Таблетки

Павельчик и Опилевич [619]

1978

Прогестерон, тестостерон, метил- тестостерон и др.

Различные лекарственные формы

Кариньян и др. [127]

1978

Экуол в конъюгатах эстрогенов

Таблетки

Гёрёг и др. [310]

1979

Аллилэстренол

Таблетки

Цариньян и Лодж [129а]

1979

Норэтандролон

Таблетки

Половые гормоны и родственные соединения 111

Продолжение табл. 2.13

Неподвижная фаза

Температура колонки, °C

Производное

Внутренний стандарт

Относительное стандартное отклонение, ± %

UCW-98

225

тмс

н-Тетратриаконтан

0,8

DEGS

195

Гидролиз, ТМС

Тестостерон

—

SE-30

300

—

Метиландростанолон

0,33

Фторсиликон

220

ТМС

Гептилат холестерина

—

Фторсиликон

260

—

Каприлат холестерина

—

OV-1

250

—

н-Октакозан

OV-17

200

—

Арахидиловый спирт

—

OV-17

230

—

Тестостерон

———

OV-225

225

Ферментативный гидролиз, мо-тмс

Этинилэстрадиол

0,4

SE-30

230

—

Пропионат тестостерона

2,4

ХЕ-60

220

—-

Пропионат тестостерона

0,44—2,06

Дексил-400

250—320 (програм.)

тмс

Местранол

0,97—1,55

OV-1

212

—

З-Этиохоланолон

1,1

SE-30

230—290 (програм.)

Аминофеназон

1,43—5,0

OV-225

225

тмс

Этинилэстрадиол

—

OV-101

220

—

Дегидроэпиандростерон

1,5

OV-17

260

Диэтилстильбэстрол

1,4

варианте), большая универсальность ВЭЖХ позволяет подобрать хроматографические системы для разделения любых стероидов, включая некоторые трудные для газовой хроматографии пары (эпимеры, производные с разной степенью ненасыщенности и т. д.).

Ее гораздо легче использовать для препаративного разделения стероидов [56, 2726, 281, 282, 343]. ВЭЖХ также применима при разделении и идентификации метаболитов [397а].

Основными недостатками ВЭЖХ являются следующие:

Минимальное количество даже интенсивно поглощающих в УФ-области стероидов (4-ен-З-кетоны и т. п.), которое можно определить с достаточной точностью, составляет около 5 нг [688]. Это означает, что чувствительность определения с использованием УФ-детектора примерно равна чувствительности определения с помощью пламенно-ионизационного детектора в газохроматографическом методе; чувствительности же, которую обеспечивает детектор электронного захвата, достигнуть не

удается. Поэтому ВЭЖХ нельзя применять для решения тех биомедицинских задач, где такая чувствительность абсолютно необходима.

Для слабопоглощающих в УФ-области веществ приходится проводить детектирование в коротковолновой области; это налагает ограничения на выбор элюента, вынуждает пользоваться детектором с очень высоким коэффициентом преломления или даже синтезировать производные.

Несколько более высокая стоимость аппаратуры и реактивов.

Как следует из сказанного выше, ВЭЖХ предоставляет уникальные возможности для разделения и количественного определения конъюгатов и некоторых чувствительных к нагреванию производных половых гормонов и родственных им стероидов, например диацетата этинодиола [306], спиронолактона [176] и т. п. В некоторых статьях ВЭЖХ рекомендуется для определения других групп половых гормонов, причем этот метод рассматривается как один из возможных, а в ряде случаев— предпочтительных. Например, прогестерон в масляных препаратах для инъекций можно без труда определить как методом ВЭЖХ [123, 456], так и методом ГЖХ [546, 619, 859].

Почти во всех фундаментальных монографиях, посвященных ВЭЖХ, приводятся примеры из области стероидов; наиболее исчерпывающие сведения можно найти в книге Хефт- манна [355].

Хроматографические системы

В методе ВЭЖХ с самого начала использовали твердые носители с нанесенной жидкой неподвижной фазой, например, диоксид кремния марки зипакс, покрытый р^'-диоксидипропио- нитрилом (подвижной фазой служат гептан или смеси гептана с тетрагидрофураном), диатомиты (анахром АВ), полимеры (CTFE-2300) и диоксид кремния марки зипакс, покрытый жидкой ионообменной смолой амберлит LA-I или тридеканонитри- лом [252] (элюентом служит вода [725]) и т. п. Теория разделения стероидов с помощью подобных жидкость-жидкостных распределительных систем разработана довольно основательно, и носители, покрытые на 20—60 % неподвижными фазами типа р,р'-диоксидипропионитрила, карбовакса 400 [814] и формамида [221], обладают высокой покрывающей способностью, однако в настоящее время почти исключительно используются адсорбционные носители или системы с обращенной химически связанной неподвижной фазой.

носителя перечисленыносителя перечисленыНекоторые адсорбционно-хроматографические методы с при-

носителя перечислены

носителя перечислены

менением кремнезема в качестве в табл. 2.14.

1

Рис. 2.13. Адсорбционное хроматографическое разделение ацетата тестостерона (/), 1,4-прегнадиен- 3,20-диона (2) и тестостерона (5) ВЭЖХ на колонке (15 см X 4,6 мм), заполненной лихросорбом SI-60, элюентом изооктан—дихлорметан—2-про- панол—вода (80: 10 : 10 : :0,25); УФ-детектор на 236 нм [287].Рис. 2.13. Адсорбционное хроматографическое разделение ацетата тестостерона (/), 1,4-прегнадиен- 3,20-диона (2) и тестостерона (5) ВЭЖХ на колонке (15 см X 4,6 мм), заполненной лихросорбом SI-60, элюентом изооктан—дихлорметан—2-про- панол—вода (80: 10 : 10 : :0,25); УФ-детектор на 236 нм [287].

Рис. 2.13. Адсорбционное хроматографическое разделение ацетата тестостерона (/), 1,4-прегнадиен- 3,20-диона (2) и тестостерона (5) ВЭЖХ на колонке (15 см X 4,6 мм), заполненной лихросорбом SI-60, элюентом изооктан—дихлорметан—2-про- панол—вода (80: 10 : 10 : :0,25); УФ-детектор на 236 нм [287].

Рис. 2.13. Адсорбционное хроматографическое разделение ацетата тестостерона (/), 1,4-прегнадиен- 3,20-диона (2) и тестостерона (5) ВЭЖХ на колонке (15 см X 4,6 мм), заполненной лихросорбом SI-60, элюентом изооктан—дихлорметан—2-про- панол—вода (80: 10 : 10 : :0,25); УФ-детектор на 236 нм [287].

На рис. 2.13, заимствованном из статьи Джоннета и Рокка [287], представлены результаты разделения трех производных методом адсорбционной хроматографии; в статье подчеркивается важность добавления к растворителю определенного количества воды.

Распределительная хроматография с химически связанными неподвижными фазами и непосредственное элюирование используются редко. Можно привести единичный пример из статьи Камерони и сотр. [123], которые использовали колонки, заполненные амино-SIL-X-I и циано-SIL-X-I, и смесь гексана и 2-пропанола (9:1) для разделения и количественного определения прогестерона в масляных препаратах для инъекций. Рус [672] предложил колонку, заполненную пермафазой ЕТН, и смеси гептана и 2-пропанола для разделения эстрогенов

8 Заказ № 182

Таблица 2.14. Адсорбционные методы ВЭЖХ разделения несвязанных половых гормонов на различных колонках с носителями на основе диоксида кремния

Автор

Год

Разделяемые соединения

Объект

Носитель

Элюент

Детектирование

Дериватива- ция

Хьютман и

Шрофф [391]

1975

Син- и бшп/-оксимы 17- ацетата норэтистерона

В массе лекарственного вещества

Пеллосил

Не приводится

УФ, 254 нм

—

Баттерфильд и др. [119]

1975

Метандростенолон и родственные соединения

В массе лекарственного вещества

Лихросорб SI-60

3 %-ный раствор дихлорэтана и 15 %-ный раствор 2-пропанола в гексане

УФ, 254 нм

Джоннет и Рокка [287]

1976

Тестостерон и его ацетаты, 1,4-прегнадиен-З, 20-дион

Смесь стандартов

Партисил-5, лихросорб SI-60

Изооктан—СН2С12— пропанол—Н2О

УФ, 236 нм

—

Уильямсон [833]

1976

Канренон

Готовые лекарственные формы

Сил-Х

4 %-ный раствор пропанола в гексане

УФ, 254 нм

—

Сатьясваруп и др. [688]

1977

Андрогены

Биологические объекты

Порасил

СНС1з — изооктан (6 : 4)

УФ, РИ

—

Хара и Хайаши [341]

1977

43 стероида

Стандарты

Корасил II

Смеси гексана и.этилацетата

УФ, 254 нм, РИ

—

Долфин и Пер- гэйнд [197]

1977

Эстрогены

Моча

Партисил-5

5 %-ный раствор этанола в гексане

УФ, 280 нм

—

Хара и др. [340]

1978

Моно- и бифункциональные стероиды

Стандарты

Вакогель LC-10H

Различные бинарные системы

РИ

—

Хара и Накахата [343]

1978

Различные стероиды

Искусственные смеси

Вакогели разных марок

Смеси гексана и этилацетата

УФ, 254 нм

—

Рус [673]

1978

Эстрогены

Готовые лекарственные формы

Лихросорб SI-60

20 %-ный раствор гептана в СНС13

Флуоресценция

+

Хьюгс и др. [392]

1978

Местранол и примеси в нем

В массе лекарственного вещества

Порасил

0,2 %-ный раствор метанола в СН2С12

УФ

—

Хорикава и др. [381]

1979

4-Ен-З-кетостероиды

Смеси стандартов

Зорбакссил Хитачигель ЗОН (полимер)

1,4 %-ный раствор воды, 2,4 %-ный раствор этанола в СН2С12; гексан— метанол (5: 95)

УФ + флуоресценция

+

Нойрат и др. [587]

1979

Канренон

Сыворотка, моча

Лихросорб SI-100

Хлороформ—гексан (1:1 или 11:9)

УФ, 283 нм

—

Шейх и др. [711]

1979

Тестостерон и метаболиты

Инкубационные смеси in vitro

Партисил-10

Гексан—тетрагидрофуран—2-пропанол (16:3: 1)

УФ, 254 нм

—

Делёф и др. [174]

1979

Канренон

Плазма

Лихросорб SI-100

Г ексан—н-пропанол— уксусная кислота (81 : 18: 1)

УФ, 283 нм

—

Роман и др. [668]

1979

Син- и акг«-дифенило- ксигидразоны энантата тестостерона

Равновесные смеси'

Зорбакссил

Пентан—эфир—концентрированный аммиак (50:50: 1)

УФ, 254 нм

—

Хантер и др. [393а]

Лин и др. [500а]

Кавасаки и др. [445а]

1979

1980

1980

Андрогены

Продукты восстановления прогестерона

Кетостероиды

Стандарты

Стандарты

Моча, сыворотка

Партисил-5

Партисил-5

Хитачигель 3042

СН2С12—ацетонитрил— 2-пропанол (89,5 : 10 : 0,5)

0,25 %-ный раствор этанола в СН2С12 или гексан—метанол—этанол (96 : 3 : 1)

СН2С12—этанол—Н2О (400 : 1 : 2) и т. п.

УФ, 254 нм

УФ, РИ

Флуоресценция

8*

в недериватизированной и в дериватизированной формах. Баттерфильд и сотр. [118] разделяли эстрогены лошади на такой же колонке, используя 2 %-ный раствор тетрагидрофурана в гексане в качестве элюента.

Гораздо чаще при анализе половых гормонов используют обращенные химически связанные неподвижные фазы, эти си-

з

2+3

Рис. 2.14. Разделение стероидов методом ВЭЖХ с обращенной фазой [588]. 1 — 17а-окси-20а-дигидропрогестерон; 2 — тестостерон; 3 — андростерон; 4 — 17а-оксипрогестерон; 5 — 20а-дигидропрогестерон; 6 — прогестерон.

Колонки: а — зорбакс ODS (25 смХ4 мм); б —нуклеосил 5Ci8; в — гиперсил ODS. Элюент смесь ацетонитрила (32—100 %) с водой; соотношение меняется по экспоненциальному зокону. УФ-детектор на 240 нм, температура 45°С.

стемы можно считать самыми распространенными в ВЭЖХ для такого рода определений. В табл. 2.15 приведены сведения о важнейших методах, а на рис. 2.14 — типичные хроматограммы, заимствованные из статьи Найса и О’Хары [588], иллюстрирующие важность выбора оптимальных систем.

Как уже упоминалось, в анализе стероидных половых гормонов ВЭЖХ применяется главным образом для разделения и количественного определения их конъюгатов (глюкурюнидов, сульфатов, фосфатов), поскольку эти производные нельзя разделять методом газовой хроматографии.

Данные табл. 2.16 показывают, что вещества кислотного характера можно разделить на разного рода ионообменных ко-

Половые гормоны и родственные соединения 117

лонках или методом хроматографии ионных пар; кроме того, х успешно используется также распределительная хроматография с обращенной фазой.

На рис. 2.15, взятом из статьи Ван-дер-Вала и Хубера [801], приведен уникальный пример применения анионообменной колонки, заполненной целлюлозой, в ВЭЖХ стероидов.

Рис. 2.15. Разделение конъюгатов стероидов методами ВЭЖХ на ионообменной колонке.

— глюкуронид тестостерона; 2 — глюкуронид эстрона; 3 — сульфат тестостерона; 4— 3-сульфат эстриола: 5 —1 сульфат эстрона; 6 — 3-сульфат 17а-эстрадиола; 7— 3-сульфат Па- дигидроэквилина; 8 — сульфат эквиленина; 9— 3-сульфат Па-дигидроэквиленина.

Колонка размером 10 смХ4 мм, заполненная смесью целлюлозы ECTEOLA В-300 и диатомита (5: 1); элюент 0,025 М перхлорат+0,01 М фосфат в воде (pH 6,8), УФ-детектор на 220 нм, температура 70°С.

В большинстве случаев изократическое элюирование позволяет получить удовлетворительные результаты при ВЭЖХ половых гормонов. Градиентное элюирование и составные колонки [220, 731а] используются сравнительно редко.

Детекторы

Большинство половых стероидных гормонов обладает достаточно интенсивным поглощением в УФ-области, что позволяет проводить их определение с помощью УФ-детекторов. Как видно из данных табл. 2.14—2.16, соединения с 4-ен-З-кето- или 1,4-диен-З-кетогруппировками можно определять с довольно высокой чувствительностью по поглощению при 240 нм. Поскольку поглощение при 254 нм (т. е. не в максимуме полосы) все же достаточно высокое, широко используется УФ-детектор с ртутной лампой, дающей единичную длину волны. Эта длина волны не подходит для контроля содержания эстрогенов: их поглощение детектируется либо в длинноволновой области по малоинтенсивной полосе при 280 нм, либо в коротковолновой области по интенсивной полосе в интервале 210—220 нм.

Таблица 2.15. Разделение несвязанных половых гормонов методами ВЭЖХ с обращенной фазой с использованием химически связанных неподвижных фаз

Автор

Год

Разделяемые соединения

Объект

Фитцпатрик и Сиггиа [254]

1973

Оксистероиды

Смесь стандартов

Лефосс и др. [489]

1976

Андростерон, эпиандростерон; дегидроэпиандростерон, этиохоланолон

Смесь стандартов

Карч и др. [442]

1976

Андрогены, прогестогены

Смесь стандартов

Керавис и др.

[450]

Черне и Капи- тано [779]

1977

Эстрогены, андрогены

Смесь стандартов

1977

Эстрогены

Смесь стандартов

Сатьясваруп и др. [688]

1977

Эстрогены

Смесь стандартов

Хара и Хайяши [341]

1977

43 стероида

Стандарты

Фархи и Мондер [234]

1978

Карбоксильные производные

Смесь стандартов

Гёрёг и др. [306, 311]

1978

1979

Диацетаты и 17-моноацетаты а- и р-этино- диола

В массе продукта

Бэйли и Бриттен

1973

Ацетат хлормадинона

Таблетки

Хьютман и

Шрофф [391]

1975

Оксим ацетата норэтистерона

Таблетки

Гёрёг и Хереньи [307]

1977

Этинилэстрадиол, диацетат этинодиола

Таблетки

Хелбо и Томсен [361]

1978

Норэтистерон, местра- нол

Таблетки

Бэгон и Хэммонд [52]

1978

Этинилэстрадиол

Таблетки

Дас Гупта и Ге- накар [176] Кинг и др. [456]

1978

Спиронолактон

Таблетки

1974

Прогестерон

Масляные препараты для инъекций

Юнге и Брауэр [428]

1979

16а- и p-эпимеры 9-F- 11 Р-окси- 16-метил-1,4- андростадиен-3,17-диона

Продукты разложения фосфата дексаметазона в лекарственных дозированных формах

О’Харе и др. [604]

1976

Андрогены, прогестогены, кортикостероиды

Культура монослоя те- стикул и надпочечников

Шмидт и др. [692]

1978

Эстрогены

Моча

Носитель

Элюент

Детектирование

Дери- вати- зация

Пермафаз ODS

Смеси СНзОН и Н2О

УФ, 230, 254 нм

+

Микропак СН

Смеси СНзОН и Н2О

РИ

—

SI-100-C18

Смеси СНзОН и Н2О

РИ, УФ, 254 нм

—

ц-Бондапак Cis

Смеси СНзОН и Н2О

РИ

—

ц-Бондапак Ci8

СНзОН—Н2О (1:1) с 2 % AgNO3

УФ, 280 нм

—

ц-Бондапак Cis

Н2О—ацетонитрил (3 : 2)

РИ, УФ

—

ц-Бондапак Cis

Смеси СНзОН—Н2О и ацетонитрил—Н2О

РИ, УФ, 254 нм

—

Зорбакс ODS

Смеси СНзОН и Н2О

УФ, 254 нм

+

ц-Бондапак Cis

СНзОН—Н2О (4:1)

УФ, 210 нм

—

Пермафаз ODS

СН3ОН-Н2О (28:72)

УФ, 254 нм

—

Пермафаз ODS

СНзОН—Н2О (1:1)

УФ, 254 нм

—

ц-Бондапак Cis

СНзОН—Н2О

УФ, 280 нм

220 нм

—

Лихросорб RP-8

СНзОН—фосфатный буфер (pH 7) (3 : 1)

УФ, 280 нм

—

Сферисорб S 5-ODS

Смеси СНзОН и Н2О

УФ, 212 нм

—

ц-Бондапак CN

С2Н5ОН—Н2О (4:6)

УФ, 254 нм

—

Пермафаз ODS

2-Пропанол—Н2О (18:82)

УФ, 254 нм

—

ц-Бондапак Cis

СНзОН—Н2О (1:1)

УФ, 240 нм

—

ц-Бондапак Ci8

Ацетонитрил—Н2О, СНзОН—Н2О, градиентное элюирование диоксан—Н2О

УФ или жидкостная сцинтилляция

—

С18

СНзОН—Н2О (6:4), уксусная кислота, pH 3,9

Флуоресценция

+

Автор

Год

Разделяемые соединения

Объект

Готе ли и др. [290]

1978

Эстриол

Моча

Дюрбек и др. [205, 265, 266]

1978

Анаболические стероиды и их метаболиты

Моча

Холдер и др. [375]

1979

Тренболон и его ацетат

Корма для животных; моча

Хаттори и др. [350]

1979

Дексаметазон

Мазь

Кокран и др. [159]

1979

Тестостерон

Биологические объекты

Кокран и др. [158]

1979

14 стероидов семенников

Семенники

Кариньян и Лодж [129а]

1979

Норэтандролон

Таблетка

Кариньян и др. [129в]

1980

Эфиры эстрадиола

Масляные препараты для инъекций

Кариньян и др. [129г]

1980

Эфиры тестостерона

Масляные препараты для инъекций

Цилифонис и Хафез [780а]

1980

Хинэстрол

Таблетка

Глюк и Шек [2796]

1980

Этинилэстрадиол и норэтистерон

Капсулы

Рус [673а]

1980

Эстрогены

Лекарственные препараты

Маури и Сиггиа [573а]

1980

Эстрогены

Моча

Кариньян и др. [129а]

1981

Тестолактон и примеси

Лекарственные препараты

Продолжение табл. 2.15

Носитель

Элюент

Детектирование

Дери- вати- зация

ц-Бондапак Ci8

Ацетонитрил—фосфатный буфер (pH 4,4) (22: 78)

УФ

—

Нуклеозил-CN Нуклеозил-С18

Градиентное элюирование СНзОН—Н2О

УФ, 254 нм

—

ц-Бондапак Ci8

СНзОН—Н2О (3:1)

УФ, 345 нм

—

ц-Бондапак Ci8

СНзОН—Н2О

УФ, 254 нм

—

ц-Бондапак Ci8

Ацетонитрил—Н2О (4:6)

УФ, 240 нм

—

ц-Бондапак Ci8

или партисил 10 ODS

СНзОН—Н2О (7:3) или ацетонитрил—Н2О (4:6)

Жидкостной сцинтилляционный

—

RP-18

СНзОН—Н2О (70:30)

УФ, 240 нм

—

RP-8

Ацетонитрил—Н2О (70 : 30)

УФ, 280 нм

—

RP-8

СН3ОН—тетрагидрофуран—Н2О (57: 11 : 32)

УФ

—

Зорбакс ODS

Ацетонитрил—Н2О (8:2)

УФ, 281 нм

—

Сферисорб ODS

Ацетонитрил—тетрагидрофуран—Н2О

УФ, 280 нм

—

ц-Бондапак С[8 и т. п.

Ацетонитрил—Н2О (32:68) или (70:30)

УФ, 254 нм

—

Связанный пирролидон на SI-60

СН3ОН-Н2О (1:1)

УФ, 280 нм

—

RP-8

СНзОН—Н2О

УФ

—

Таблица 2.16. Разделение конъюгатов стероидов методом ВЭЖХ

Автор

Год

Разделяемые соединения

Объект

Ван-дер-Вал и Ху-

1974

* Глюкурониды эстроге-

Смесь стандартов

бер [800]

нов

Ван-дер-Вал и Ху-

1977

Глюкурониды, сульфа-

Смесь стандартов; моча

бер [802]

ты и фосфаты эстроге-

нов

Ван-дер-Вал и Ху-

1977

Глюкурониды и сульфа-

Смесь стандартов

бер [801]

ты стероидов

Ван-дер-Вал

1978

Глюкурониды, сульфаты

Смесь стандартов

и Хубер [803]

и фосфаты стероидов

Ван-дер-Вал [799]

1977

Профиль концентраций

Моча

конъюгатов эстрогенов

Фрэнсон и др.

1976

Сульфаты эстрогенов

Смесь стандартов

[262]

Германсон [365]

1978

Глюкурониды эстроге

Смесь стандартов

нов

Керавис и др.

1977

Сульфаты и глюкуро

Смесь стандартов

[450]

ниды эстрогенов

Мюсе и др. [576]

1978

Сульфаты и глюкуро

Плазма

ниды эстрогенов

Хедли и др. [353]

1979

Метаболиты 17Р-эстра-

Ткани

диола

Диксон и др.

1979

Сульфаты, глюкурониды

Моча

[189а]

эстрогенов

Носитель

Элюент

Детектирование

Дери- вати- зация

Анионообменная целлюлоза

Ацетатный буфер (pH 4,5—5); 0,05— 0,5 М NaCl

УФ

—

Анионообменная целлюлоза

Фосфатный буфер (pH 6,8—8,5), 0,01— 0,25 М NaClO4

УФ, флуоресценция

+

Анионообменная целлюлоза с диатомитами

Фосфатный буфер (pH 6,8—8,5), 0,01— 0,25 М NaClO4

УФ

—

Ci, Cis силикагели и т. п.

Буферные смеси вода— спирты, вода—ацетонитрил

УФ

—

Анионообменная целлюлоза с диатомитами (5:1)

Буферированные фосфатами растворы NaClO4 (pH 5—8)

Флуоресценция

+

Лихросфер SI-100 с нанесенным водным бромидом аммония

СН2С12—пентанол или СНС1з—бутанол

УФ, 254 нм

—

Лихросорб RP-2 или RP-18 с нанесенным пентанолом

Растворители для ион- парной хроматографии

УФ, 254 нм

—

ц-Бондапак С]8

Различные смеси воды и метанола

РИ

—

Партисил SAX, ионооб- менник

0,1 М NaCl (pH 4,5)

УФ, 254 нм, радиоактивность

—

Лихросорб Ci

10—100 %-ный раствор СНзОН в 0,01 М водном ацетате аммония

Радиоактивность

—

Гиперсил ODS

Растворитель для ион- парной хроматографии

УФ

—

Стероиды, содержащие изолированные хромофоры в молекуле (кетогруппы, двойные связи и т. п.), можно определять по поглощению в коротковолновой обла-Стероиды, содержащие изолированные хромофоры в молекуле (кетогруппы, двойные связи и т. п.), можно определять по поглощению в коротковолновой обла-Рис. 2.16. Разделение эпимеров диацетатов а- и р-этинодиола методом ВЭЖХ на колонке размером 30 смХ4 мм с р- бондапаком Cis при элюировании смесью метанол—вода (4:1); УФ- детектор на 210 нм.Рис. 2.16. Разделение эпимеров диацетатов а- и р-этинодиола методом ВЭЖХ на колонке размером 30 смХ4 мм с р- бондапаком Cis при элюировании смесью метанол—вода (4:1); УФ- детектор на 210 нм.

Стероиды, содержащие изолированные хромофоры в молекуле (кетогруппы, двойные связи и т. п.), можно определять по поглощению в коротковолновой обла-

Стероиды, содержащие изолированные хромофоры в молекуле (кетогруппы, двойные связи и т. п.), можно определять по поглощению в коротковолновой обла-

Рис. 2.16. Разделение эпимеров диацетатов а- и р-этинодиола методом ВЭЖХ на колонке размером 30 смХ4 мм с р- бондапаком Cis при элюировании смесью метанол—вода (4:1); УФ- детектор на 210 нм.

Рис. 2.16. Разделение эпимеров диацетатов а- и р-этинодиола методом ВЭЖХ на колонке размером 30 смХ4 мм с р- бондапаком Cis при элюировании смесью метанол—вода (4:1); УФ- детектор на 210 нм.

сти, но с ограниченной чувствительностью. В качестве примера на рис. 2.16 приведены результаты разделения и определения диацетатов а- и р-этинодиола, полученные Гёрёгом и Хереньи [306].

Реже используется малочувствительный рефрактометрический детектор (РФ). Его применение ограничивается теми случаями, когда детектирование в УФ- области невозможно из-за отсутствия соответствующих хромофоров или когда имеется достаточное количество пробы, а в задачу входит лишь получение общего отклика от всех стероидов (отклики от разных стероидов почти одинаковы).

Эстрогены можно детектировать при помощи электрохимического детектора, используя анодное окисление фенольного кольца А [261а, 3716, 713а]. Для кате- холэстрогенов можно достигнуть предела обнаружения, равного 1 нг [7136, 713г].

Хотя возможность возбуждения некоторых эстрогенов в длинноволновой области позволяет детектировать их (с помощью флуориметрических детекторов) без дериватизации [105а, 761а], в большинстве случаев применение этих детекторов связано с необходимостью получения производных (дериватизацией), поэтому эти методы будут обсуждаться, в следующем разделе.

Методы дериватизации

Целью дериватизации в газохроматографическом анализе стероидных гормонов является (среди прочих) улучшение разделения, тогда как единственная цель дериватизации в высокоэффективной жидкостной хроматографии заключается во введении хромофоров или люминофоров в молекулу этих соединений; тем самым повышаются селективность обнаружения и особешю чувствительность количественного определения. Хотя этому вопросу посвящено огромное число работ, можно

утверждать, что дериватизации в ВЭЖХ имеет гораздо меньшее значение, чем в газохроматографическом анализе стероидных гормонов.

В большинстве случаев дериватизацию проводят перед введением в колонку, т. е. дериватизации подвергается разделяемая смесь и фактически разделяют производные [253, 254, 364, 671, 673, 692]. Однако описана также дериватизация разделенных компонентов, которую проводят в элюате после выхода его из колонки перед флуориметрическим детектированием [381, 382].

Первой для разделения и количественного определения методом ВЭЖХ была использована классическая колориметрическая реакция получения производных кетостероидов — их 2,4-динитрофенилгидразонов (работа Генри и сотр. [364]). Затем Фитцпатрик и др. [253] применили этот метод для определения андростерона и родственных веществ, а Рус [671] — для определения конъюгатов и этерифицированных эстрогенов в лекарственных формах. Хотя при анализе хроматограмм с помощью одноволнового УФ-детектора (при 254 нм) существенно повышается чувствительность [364], измерение в более длинноволновой области селективнее (например, при 365 нм [671]). Повышение чувствительности позволяет снизить предел обнаружения до 1 нг. Разделение динитрофенилпроизводных проходит почти так же, как и разделение исходных стероидов, что характерно и для других производных, описанных в этом разделе. Используя n-нитрофенилгидразин в качестве реагента для дериватизации и электрохимический детектор, Шимада и др. [71 Зв] добились еще более высокой чувствительности (200 пг).

На распределительных хроматографических колонках [253, 364, 671] для динитрофенилгидразонов индивидуальных стероидов (в том числе 4-ен-З-кетостероидов) получены хроматограммы с единичными симметричными пиками. Однако при использовании для разделения адсорбционных хроматографических колонок и различных элюентов эти пики расщепляются на два, соответствующие син- и анга-изомерам динитрофенилгидразонов 4-ен-З-кетонов [308]. На рис. 2.17 это явление иллюстрируется на примере соответствующих производных прогестерона .

Кавасаки и др. [445а] описали дериватизацию кетостероидов дансилгидразином для их флуориметрического обнаружения (возбуждение при 350 нм, испускание при 505 нм).

Другой функциональной группой, удобной для дериватиза- ции в методе ВЭЖХ, является оксигруппа. Фитцпатрик и Сиг-

Время, минВремя, минРис. 2.17. Разделение син- и анти-изомеров бис(динитрофе- нилгидразонов) прогестерона методом ВЭЖХ на колонке с партисилом PXS-10 при элюировании смесью циклогексан— дихлорметан (2 : 3); УФ-детек- тор на 254 нм [308].Рис. 2.17. Разделение син- и анти-изомеров бис(динитрофе- нилгидразонов) прогестерона методом ВЭЖХ на колонке с партисилом PXS-10 при элюировании смесью циклогексан— дихлорметан (2 : 3); УФ-детек- тор на 254 нм [308].гиа [254] предложили метод бензоилирования бензоилхлоридом в пиридине с последующим разделением бензоатов стероидов экстракцией эфиром после разрушения избытка реагента. Благодаря интенсивной полосе поглощения при 230 нм чувствительность обнаружения этих бензоатов, а также их разделение достаточно удовлетворительные. Например, за 12 мин можно разделить прегненолон и ал- лопрегнанолон в виде их бензоатов на колонках с обращенной фазой (пермафаза ODS) путем вымывания смесью метанола и воды (2: 1). Несмотря на эти достоинства, бензоилирование, по-видимому, не получит широкого распространения в ВЭЖХ стероидных гормонов. То же справедливо и в отношении других возможных способов деривати- зации при проведении ВЭЖХ стероидных гормонов, таких, как образование 2,6-динитрофенилгидразона пирувоилового эфира или п-иодбен- золсульфонилового эфира [671]. Однако следует заметить, что п-нитро- бензоилирование, также упоминаемое в статье Фитцпатрика и Сиггиа [254], оказалось чрезвычайно полезным в ВЭЖХ сердечных гликозидов (см. разд. 7.2.7).

Время, мин

Время, мин

Рис. 2.17. Разделение син- и анти-изомеров бис(динитрофе- нилгидразонов) прогестерона методом ВЭЖХ на колонке с партисилом PXS-10 при элюировании смесью циклогексан— дихлорметан (2 : 3); УФ-детек- тор на 254 нм [308].

Рис. 2.17. Разделение син- и анти-изомеров бис(динитрофе- нилгидразонов) прогестерона методом ВЭЖХ на колонке с партисилом PXS-10 при элюировании смесью циклогексан— дихлорметан (2 : 3); УФ-детек- тор на 254 нм [308].

Росс [673, 673в] и Шмидт с сотр. [692] почти одновременно опубликовали метод определения эстрогенов с использованием ВЭЖХ, основанный на образовании дансилпро-

изводных (см. разд. 2.2.10) и отличающийся высокими селективностью и чувствительностью. Дан- силхлорид в ацетоне в присутствии водного карбоната натрия легко дансилирует фенольную группу эстрогенов, причем данси- лированные эстрогены можно вводить в хроматограф после экстракции [673] их из реакционной смеси или без экстракции

. Разделение дансилированных эстрогенов и отделение их от других недансилированных стероидов проходят одинаково эффективно как на силикагеле [673], так и на распределительных колонках с обращенной фазой [692]. Даже при расшифровке хроматограммы с помощью УФ-детектора при 350 нм чувствительность обнаружения гораздо выше, чем для исходных стероидов, а использование флуоресцентных детекторов (возбуждение при 350 нм, испускание при 540 нм) позволяет снизить предел обнаружения до 10 пг. Благодаря реакции дансилирова- ния этот метод можно использовать для решения сложных задач анализа эстрогенов: для определения эстрогенов в лекарственных формах, например этинилэстрадиола в противозачаточных таблетках [673], и обнаружения эстриола в моче беременных [692].

Недавно Гото и сотр. [288а] предложили очень реакционноспособный и высокочувствительный дериватизационный агент (4-диметил амино-1 -нафтоилнитрил), позволяющий с помощью флуоресцентного детектора обнаруживать до 200 пг оксистероидов.

Фархи и Мондер [234] описали метод определения насыщенных 21-оевых кислот (метаболитов кортикостероидов) и других карбоновых кислот стероидов с помощью УФ-детектора, настроенного на 254 нм, после превращения . этих кислот в n-бромфенациловые эфиры; последние интенсивно поглощают свет при этой длине волны, и их легко разделить на распределительной колонке с обращенной фазой.

но*но*п-6ромфенациловый эфир кортоловой кислотып-6ромфенациловый эфир кортоловой кислоты

но*

но*

п-6ромфенациловый эфир кортоловой кислоты

п-6ромфенациловый эфир кортоловой кислоты

Помимо рассмотренных методов предварительной деривати- зации для ВЭЖХ стероидных гормонов предложены также два метода дериватизации после пропускания через колонку. Ван- дер-Вал и Хубер [799, 802] использовали реакцию Кобера [470]

Элюат из колонкиЭлюат из колонкиНасос.Насос.ÔÔТройникТройник.ВоздухРеагентКобера.ВоздухРеагентКобера

Элюат из колонки

Элюат из колонки

Насос.

Насос.

Г”

Г”

Тройник

Тройник

.ВоздухРеагентКобера

.ВоздухРеагентКобера

(Реакцион^-

। ный

1 Кран1 Кран। сосуд ^ мл

1 Кран

1 Кран

Уксусная ‘кислота

.2 мл Сброса

Сброс после -<- барботера

ФлуориметрФлуориметр

Флуориметр

Флуориметр

Рис. 2.18. Схема детектора с газовым сегментным проточным реакторам для установления профиля концентраций конъюгатов эстрогена [799, 802].

в варианте Скрамовски—Хаберле [728] (см. разд. 2.2.2) для установления профиля концентрации конъюгатов эстрогенов в моче беременных женщин. Высокая чувствительность флуориметрического детектирования позволяет, минуя какое- либо предварительное концентрирование, количественно определять минимальные содержания компонентов, что невозможно- при УФ-детектировании, основанном на собственном поглощении. Несмотря на ряд сложностей [смешивание элюента после выхода из колонки с реагентом Кобера, содержащим 85 % (по объему) серной кислоты, проведение реакции при 130°С, разбавление смеси уксусной кислотой, использование газового (сегментного) проточного реактора во избежание размывания пика и т. д.], были получены хорошие результаты. Схема после- колоночного реактора и детектора приведена на рис. 2.18.

Конъюгаты разделяли на колонке, заполненной анионЬоб- менной целлюлозой, а для детектирования использовали флуориметр (возбуждение при 535 нм, испускание при 561 нм).

Хорикава и сотр. [381] применяли в качестве послеколо- ночного метода дериватизации свой ранее опубликованный флуориметрический метод [380] (см. разд. 2.2.3), основанный на реакции Д4-3-кетостероидов с гидразидом изоникотиновой кислоты и образовании комплекса между получающимся гидразоном и хлоридом алюминия. Чувствительность флуоримет- рического обнаружения в этом случае не превышает чувствительности УФ-детектирования, но дериватизация приводит к повышению селективности, что может пригодиться при анализе сложных биологических объектов.

Хотя цель дериватизации при проведении высокоэффективной жидкостной хроматографии состоит почти исключительно в повышении чувствительности обнаружения, стоит упомянуть о работе Руса и Медвика [6736], где 17-кетогруппу эстрогенов восстанавливали борогидридом натрия до хроматографирования с целью улучшить их разделение.

Практическое применение

В последнее десятилетие было предложено много разнообразных хроматографических систем, с помощью которых сейчас можно решить практически все задачи разделения и количественного определения. Вероятно, в этом причина относительно небольшого числа публикаций, посвященных применению ВЭЖХ для контроля за чистотой лекарственных препаратов в массе фабричного продукта. Такие исследования проводятся в ряде лабораторий, но опубликовано очень мало результатов. Однако даже эти разрозненные сведения дают представления о важности метода при установлении профиля концентраций примесей в стероидных лекарственных препаратах, например в метанд- ростенолоне [119], местраноле [392] и т. п. Помимо достоинств, о которых упоминалось во введении к этой главе, особое преимущество метода ВЭЖХ заключается в возможности сканировать хроматограммы при различных длинах волн на УФ-детекторе с перестраиваемой длиной волны и делать важные заключения о структуре отдельных примесей по изменению площади индивидуальных пиков. Особенно полезен метод ВЭЖХ для разделения и количественного определения изомерных пар [356]. В качестве наиболее важных примеров можно назвать разделение смесей A/В фгс-транс-эпимеров [356], определение примеси За-изомера в диацетате Зр-этинодиола [306], распознавание позиционных изомеров (определение примеси норэтистерона в норэтинодреле и наоборот [308]), определение примеси 7р-тиоацетильного эпимера в спиронолактоне [308] и разделение сан- и анга-изомеров [308, 391, 616а, 666].

9 Заказ № 182

Возрастающая роль метода ВЭЖХ в количественном анализе готовых лекарственных форм нашла отражение в росте числа методик, рекомендуемых в фармакопеях (например, для определения 21 стероида в массе продукта и 31 стероида в виде готовых лекарственных форм в фармакопее XX США [783] ).

Что касается применения в биомедицине, то ряд задач, в основном касающихся анализа стероидов, содержащихся в моче, уже решен. Разработка методов дериватизации и привлечение чувствительных, главным образом флуоресцентных, детекторов, конечно, приведет к возрастанию роли ВЭЖХ в тех областях биомедицинского анализа, где чувствительность этого метода пока недостаточна.

Наконец, следует заметить, что в последние несколько лет возросла роль высокоэффективной жидкостной хроматографии как метода предварительного разделения. Например, Герман- сон [365а] описал газохроматографическое определение глюкуронидов стероидов после разделения ВЭЖХ. Шёнёсхофер и др. [696а] сообщили об использовании ВЭЖХ для предварительной очистки при радиоиммунном определении прегненолона и 17-оксипрегненолона.

РАДИОИММУННЫЙ

И ДРУГИЕ РАДИОИЗОТОПНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА

Методы с использованием стероидов, меченных радиоизотопами, находят широкое применение для определения стероидных гормонов в биологических объектах. Такое положение существовало уже 20—25 лет назад, но недавно роль радиоизотопных методов возросла благодаря развитию и быстрому распространению методов связывания белка (в основном радиоиммунных). Это привело одновременно к снижению роли «классических» радиоизотопных методов. Поэтому огромный материал, опубликованный по этим вопросам, будет обсуждаться очень кратко и больше внимания будет уделено современным методам.

Метод радиоактивных индикаторов

Контроль за полнотой разделения и экстракции — область, в которой метод с использованием меченых стероидов до сих пор остается незаменимым. Из многочисленных работ, посвященных этому вопросу, здесь будет представлено лишь несколько типичных примеров. Фейркло и др. [230] исследовали разделение стероидов на колонках, заполненных липидексом. Степень разделения контролировалась по радиоактивности

фракций с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. Стероидами, применяемыми в этих исследованиях, были [ 1 а,2а-3Н] -прогестерон, [4-14С] -тестостерон, [4- 14С] -дегидроэпиандростерон, [6,7-3Н]-эстрон и т. п., а радиоактивность колебалась в интервале 10—58 Ки/ммоль.

Хороший пример применения радиоизотопов для исследования метаболизма приведен в статье Матсуи и др. [529]. Авторы изучали продукты обмена тестостерона и 17-сульфата тестостерона, выделяющиеся с желчью у крысы, с помощью 4-14С- и 7-3Н-производных соответственно. Гидроксилированные и конъюгированные продукты обмена разделяли методом колоночной хроматографии на сефадексе LH-20 и амберлите XAD-2. После сольволиза полученных конъюгатов свободные стероиды разделяли методом ТСХ; продукты обмена определяли при помощи автосканирующего устройства и измеряли активность на жидкостном сцинтилляционном счетчике после элюирования из соскобленных пятен. Если стероид, который необходимо определить в сложных биологических образцах, имеется в меченой форме, его нужно добавить к экстракту, чтобы затем обнаружить фракцию, содержащую искомый стероид, и количественно определить его каким-либо аналитическим методом.

При анализе сложных биологических объектов в несколько стадий экстракции и колоночной или тонкослойной хроматографии необходимо контролировать полноту выделения на каждой стадии и для всего разделения в целом как в процессе разработки методики, так и при серийных определениях. Легче всего это сделать, добавляя к пробе меченое производное определяемого стероида и прослеживая его путь через все стадии разделения. При помощи поправочного коэффициента, полученного тем же способом, можно учесть потери в процессе отделения и очистки. Например, Лауд и сотр. [490] определили За,17а,20а-триокси-5р-прегнан-11-он в моче методами газовой хроматографии и двойного изотопного разбавления. Аналитическому измерению предшествовали стадии ферментативного гидролиза, экстракции эфиром, промывания экстрактов 0,1 М раствором гидроксида натрия и водой, хроматографирования на колонке и две стадии очистки методом бумажной хроматографии. Предварительно необходимо синтезировать меченные тритием производные стероидов (восстановлением тритированным борогидридом натрия соответствующих 20-кетопроизводных с последующим разделением эпимеров методом колоночной хроматографии). Добавляя это производное в качестве радиоактивного индикатора к пробе до экстракции, можно установить положение стероида на хроматограммах и внести поправку на потери в процессе работы.

Метод двойного изотопного разбавления

Это один из наиболее эффективных методов определения стероидов в биологических объектах. Самое большое достоинство его — высокая специфичность. Однако чувствительность этого метода гораздо ниже чувствительности вытеснивших его методов, которые будут обсуждаться ниже. Недостаточно высокая чувствительность, а также длительность и трудоемкость операций значительно снижают значение метода двойного изотопного разбавления, в связи с чем новые публикации появляются нечасто.

Принцип этого метода заключается в следующем. Если требуется определить стероиды А, Б и В, то к пробе добавляют меченые А, Б и В (или смесь разделяют на фракции методами тонкослойной или колоночной хроматографии и добавляют индивидуальные радиоактивные индикаторы к соответствующим фракциям). Затем пробу или фракции обрабатывают меченым реагентом, который вводит в молекулу (молекулы) вторую радиоактивную метку. После хроматографического разделения де- риватизированных стероидов в соответствующих фракциях подсчитывают радиоактивные сигналы от обоих видов меток и по соотношению двух радиоактивностей рассчитывают концентрацию каждого стероида (при помощи соотношений, полученных на стандартных образцах).

В исчерпывающем обзоре Фишман [250] рассмотрел применение метода двойного изотопного разбавления для определения эстрогенов в моче. В большинстве опубликованных методик в качестве радиоактивных индикаторов рекомендуются тритированные эстрогены, а в качестве реакции дериватиза- ции — ацетилирование 14С-уксусным ангидридом. Аналогичная методика предложена для определения За,17а,20а-триокси- 5р-прегнан-1 Пона в моче [490]. Тритированное производное (см. выше) добавляют к экстракту и проводят реакцию ацетилирования во фракции, полученной при разделении на колонке или на бумаге, с помощью 14С-уксусного ангидрида; раствор после ацетилирования очищают методом ТСХ. Зону, содержащую соответствующую фракцию, помечают при помощи красителя, элюируют стероид и определяют соотношение 3Н/14С на жидко» стном сцинтилляционном счетчике.

Метод конкурирующего связывания белка

Методы, основанные на конкуренции между мечеными и немечеными молекулами стероида за активные центры белка, бо-

лее чувствительны и менее трудоемки, чем «классические» радиоизотопные методы, и в то же время достаточно специфичны. Особенно высокими специфичностью и чувствительностью отличаются те методы, в которых связывание белка происходит не в результате простой адсорбции, а в результате взаимодействия антитело—антиген. Этим (радиоиммунным) методам обычно отдается предпочтение перед методами конкурирующего связывания белка во всех случаях, когда удается получить достаточно селективную антисыворотку. Поэтому метод конкурирующего связывания белка имеет первостепенное значение в тех ситуациях, когда неприменимы радиоиммунные методы, т. е. при анализе витаминов D и их гидроксилированных метаболитов. Вот почему более подробно этот метод обсуждается в разд. 5.2.10, а здесь приведены лишь отдельные примеры его использования, которые можно рассматривать как дополнительные методы определения (помимо радиоиммунных).

Хорган и Райли [379] описали метод определения тестостерона в плазме, в котором в качестве источника белка используется сыворотка крови женщин на поздней стадии беременности. Для контроля за полнотой разделения на колонке с обращенной фазой (целит 545, покрытый 1,2-этандиолом) использовали тритированный тестостерон, он же служил для конкуренции с тестостероном пробы плазмы, а также со стандартным тестостероном при построении градуировочной кривой (зависимость соотношения связанной и свободной радиоактивности от концентрации тестостерона). При pH 7,4 равновесие устанавливается в течение ночи; свободный и связанный тестостерон разделяли центрифугированием после осаждения комплекса белка сульфатом аммония. Радиоактивность измеряли в надосадочной жидкости на сцинтилляционном счетчике.

Аналогичную методику предложили Дессиприс и др. [186, 187]. Ее особенностью является то, что для проверки полноты выделения на стадиях экстракции и хроматографической очистки к раствору добавляли тритированный эпитестостерон; его поведение в процессе определения, в том числе и при хроматографировании на оксиде алюминия, аналогично поведению тестостерона, но способность к связыванию белка, используемого в методе, ничтожна, поэтому он не мешает конкуренции между тестостероном и тритированным тестостероном.

По методике Юлеша и др. [429], тестостерон в сыворотке крови определяют после экстракции, двух разделений методом ТСХ и хроматографирования на флорисиле; в качестве связывающего белка использована сыворотка крови женщин на поздней стадии беременности. Свободный 3Н-тестостерон в отличие от связанного адсорбируется на флорисиле.

Сравнение метода конкурирующего связывания белка и радиоиммунного метода при определении прогестерона в плазме, проведенное в работах [62, 820], позволило сделать заключение, что оба метода одинаково эффективны. Заслуживает упоминания работа Батры [62], разделившего свободный и связанный белком тестостерон путем адсорбции первого на ротационном фильтре дискового типа из нитрата целлюлозы и определения несвязанного меченого тестостерона в фильтрате. Вайхенберг с сотр. [820] обнаружили, что надежные достоверные результаты в обоих методах можно получить только в том случае, если перед измерением активности провести разделение методом ТСХ.

Аналогичные методики предложены для определения субна- нограммовых количеств других стероидных гормонов: этинил- эстрадиола [806], 17-оксипрогестерона [758] и т. п.

Радиоиммунный метод

Радиоиммунный анализ (РИА) тесно связан с методом конкурирующего связывания белка и может считаться его вариантом. В этом методе определение основано на взаимодействии стероид—белок, являющемся взаимодействием типа антиген— антитело, что приводит к значительному улучшению селективности. Сами стероиды не иммуногенны и способны вырабатывать антисыворотку, содержащую специфические антитела, только если связаны ковалентной связью с крупной молекулой белка. Эти антитела способны более или менее избирательно связывать стероид из комплекса с белком, использованного для иммунизации животных, в организме которых вырабатывается антисыворотка. Конкуренция между определяемым стероидом и его меченым аналогом и лежит в основе определения. Теоретические и практические основы этого метода были разработаны более десяти лет назад, но в повседневном клиническом и биохимическом анализе РИА начал широко применяться только в последние пять лет благодаря тому, что несколько предприятий изготовили коммерчески доступные меченые стероиды и антисыворотки, освободив тем самым аналитиков от очень сложной, длительной и трудоемкой работы по получению их в лабораторных условиях, которую им приходилось проделывать в начале развития этого метода.

Важность методов РИА стероидов нашло отражение в том, что, несмотря на короткий срок, прошедший с начала распрост-

ранения этого метода на химию стероидов, уже опубликованы монографии, посвященные этому вопросу [122, 324, 418а], а в общих монографиях имеются специальные главы, как, например, в книге под редакцией Пастернака [613]. Из нескольких обзорных статей упомянем лишь самую последнюю, написанную Праттом [644], в которой приведено не менее 266 ссылок на статьи, посвященные методам РИА стероидов.

Далее рассмотрим главные особенности метода в последовательности, отвечающей основным стадиям анализа.

Получение антисыворотки, содержащей специфические антитела. Хотя в настоящее время их в большом ассортименте изготовляет промышленность, а теоретические аспекты этой проблемы выходят за рамки данной книги, все же этот вопрос следует кратко обсудить, поскольку дальнейшее развитие метода, т. е. повышение его специфичности, тесно связано с этой стадией [71, 227].

Первый шаг в получении антисыворотки состоит в подготовке иммуногенного комплекса стероид—белок, для чего надо синтезировать производные стероидов, которые подвергаются ковалентному связыванию с белком. В большинстве случаев в качестве мостиков используют бифункциональную молекулу. В случае 3- или 17-оксигрупп обычно получают гемисукцинаты [483, 713], а 3-, 17- или 20-кетоны превращают в О-карбокси- метоксимы [57, 67, 151, 167, 168, 335, 338, 414, 687, 689, 716, 769, 813]. Эстрогены с фенольной группой можно перевести в З-О-карбоксиметиловые эфиры [654] и т. п. Более высокой избирательности можно добиться, если присоединить мостиковую молекулу к углеродному атому скелета, не содержащего первоначально никакой функциональной группы (О-карбокси- метоксимы 6- или 7-кетопроизводных 4-ен-З-кетонов или эстрогенов [37, 182, 263, 335, 654, 858], 11-сукциноилоксипроизвод- ные тестостерона и прогестерона [67, 335, 493, 538, 704] или О-карбоксиметиловые эфиры, например в положении 19 [655]).

конъюгат эстрадиол-17-1 емисукцината с БСА

конъюгат тестостерон-З-О-карбоксиметоксима с БСА

Для эстрогенов недавно открыты новые возможности, заключающиеся в связывании их с белком через 6-сукцинилоксимостик [581в], образовании метиленового мостика при С-2 или С-4 путем реакции Манниха с формальдегидом [581а, б, 599а], а также в использовании других реакций, например диазосочетания или нитрования ароматического кольца [581а, б, 599а].

Свободные карбоксильные группы этих производных сочетают с аминогруппой белка-носителя [в большинстве случаев с Е-аминогруппой лизина в бычьем сывороточном альбумине (БСА)] стандартными методами химии пептидов.

Полученный таким образом комплекс стероид—белок вводят (вместе с различными адъювантами) в организм подходящих животных (чаще всего кроликов) для получения антисыворотки, содержащей специфические антитела. Специфичность какой-либо антисыворотки можно охарактеризовать данными о перекрестном взаимодействии с родственными соединениями. Например, если антисыворотка для определения тестостерона выработана при помощи З-О-карбоксиметоксима, перекрестное взаимодействие с эпитестостероном составляет 0,3 %, а для 5а- дигидротестостерона эта величина достигает 65 % [369], однако если для иммунизации применить бр-карбоксиметиловое производное тестостерона, то последнюю величину можно понизить до 0,8 % [781].

Получение меченых стероидов. В настоящее время выпускается большое число меченых стероидов, пригодных непо-

средственно для радиоиммунных определений, в основном стероиды, меченные тритием, большое достоинство которых состоит в том, что одно и то же производное можно использовать и для контроля за полнотой отделения стероида, и для радиоиммунного определения. Кроме того, возможно использование 1251-меченых производных [122, 207, 335, 414, 439, 500, 590, 704, 813]. Дериватизация играет первостепенную роль в области анализа сердечных гликозидов, поэтому она будет рассмотрена в разд. 7.2.8. Достоинства и возможности этой реакции для РИА прогестерона обсуждаются Алленом и Ред- шоу [27].

Следует заметить, что один из самых современных методов в аналитической химии стероидов, иммуноферментный анализ, тесно связан с радиоиммунным анализом, но только стероиды мечены ферментами. Однако этот метод будет рассмотрен в разделе, посвященном ферментным методам (разд. 2.2.14), поскольку в нем используется радиоактивность.

Подготовка пробы к анализу. Если в анализируемом образце определяется небольшое число стероидов, то растворенную пробу можно исследовать методом РИА без предварительного разделения, как, например, при определении эстриол-16а- глюкуронида в моче беременных [495], прогестерона в плазме кобыл [528] и т. п. Однако гораздо более типична ситуация, когда пробу нужно по крайней мере депротеинизировать метанолом или этанолом или экстрагировать эфиром или другим растворителем .

Наиболее важный вопрос при подготовке проб для РИА состоит в том, нужна ли или не нужна стадия хроматографирования. На этот вопрос нельзя дать однозначного ответа. В серийном клиническом анализе, где важную роль играют продолжительность анализа и возможность автоматизации, стадию хроматографирования по возможности опускают. Это тесно связано со специфичностью антисыворотки. Если антисыворотка достаточно специфична, проблем не возникает, но в присутствии стероидов или других веществ, способных до некоторой степени к перекрестному взаимодействию, исключить хроматографирование можно только в ущерб специфичности метода. Поэтому стадия тонкослойной или колоночной хроматографии часто предшествует РИА (даже во многих недавно опубликованных методиках), но общая тенденция — это разработка методов без стадии хроматографирования.

В сомнительных случаях следует провести и хроматографический, и нехроматографический варианты анализа, чтобы проверить правильность определения, как это сделали Канлуан и сотр. [440а] при определении левовращающего норгестрела в плазме. Ими было показано, что при прямом анализе экстрактов петролейным или диэтиловым эфиром результаты на 18 и 37 % выше действительных значений, полученных после хроматографирования.

Инкубирование анализируемой пробы с антисывороткой и меченым стероидом в буферной среде. Равновесие между меченым и немеченым стероидами на поверхности антитела устанавливается в буферном растворе (pH обычно между 7 и 8,5) при температуре от 4 до 37°С. В последнем случае равновесие достигается через 1 ч, тогда как при 4°С необходим несколько более длительный инкубационный период. Наиболее оптимальными являются следующие условия: выдерживание в течение ночи при 4°С или 1—2 ч при 37°С . Поскольку константа устойчивости комплекса стероид—белок зависит от температуры, то, конечно, и чувствительность метода изменяется с изменением температуры. Это создает сложные проблемы, особенно в случае иодированных производных, константы устойчивости которых для меченого и немеченого стероидов различаются. Детальное обсуждение этой проблемы можно найти в статьях Коллинза и др. [163] и Хэммонда и др. [335].

Другой важный момент состоит в том, что при анализе совершенно необходимо пользоваться инертными поверхностями. На рис. 2.19, взятом из статьи Фенимора и др. [245], представлена типичная кривая, полученная при анализе прогестерона (зависимость процента связанного меченого стероида от количества добавленного стероида) с использованием стеклянной посуды, дезактивированной классическим способом сили- лирования в жидкой фазе или парами гексаметилдисилазана в газовой фазе. Характер другой кривой, полученной с использованием необработанной посуды, показывает, что измерение распределения радиоактивности не применимо в аналитических целях вследствие конкуренции между стеклом и антителом за меченый и немеченый прогестерон.

Отделение комплекса стероид—антитело от свободного стероида и измерение радиоактивности. Построение стандартной кривой зависимости процента меченого стероида, связанного с антителом, от концентрации немеченого стероида и определение неизвестной концентрации стероида основано на распределении радиоактивного стероида между антителом и жид-

кой фазой. Поэтому перед измерением необходимо разделить свободный и связанный стероиды.

Чаще всего для разделения в реакционную смесь добавляют древесный уголь, покрытый декстраном. Он связывает свободный стероид, который можно удалить из смеси центрифугиро-

1 — стеклянная посуда, силилированная растворителем; 2 — стеклянная посуда, силилированная паровой фазой; 3 — несилилированная посуда.

ванием, а в надосадочной жидкости, содержащей связанный с антителом стероид, можно измерить радиоактивность на жидкостном сцинтилляционном счетчике, если меткой служил тритий, и на счетчике гамма-излучения, если в качестве радиоактивного индикатора был использован стероид, меченный 1251. Обычно отношение декстрана к древесному углю составляет 1 : 10. Происхождение древесного угля не имеет значения (было испытано 8 разных сортов [363]). Если покрытый декстраном древесный уголь достаточно быстро смешать с раствором при низкой температуре, то ни один из этих факторов существенно не повлияет на равновесие между стероидом, связанным с антителом, и свободным стероидом.

Следует заметить, что иногда для связывания свободного стероида применяются другие адсорбенты, например амберлит или флорисил при определении тестостерона в сыворотке [832] и древесный уголь, покрытый флорисилом, при определении эстрадиола, прогестерона и тестостерона в плазме [403].

Для разделения свободного и связанного стероидов разработаны и другие методы; некоторые из них иногда используются и сейчас, но ни один из этих методов не может сравниться с методом, основанным на применении древесного угля, покрытого декстраном.

Другой принцип положен в основу метода, в котором белки, в том числе связанные со стероидом, осаждаются неорганическими солями. В этом случае в надосадочной жидкости, в которой измеряется радиоактивность, содержатся свободные стероиды. Например, Меткалф [548] определял сульфат дегидроэпиандростерона после гидролиза, экстракции выделившегося дегидроэпиандростерона хлороформом и выпаривания растворителя, стандартным методом РИА, используя имеющуюся в продаже антисыворотку и дегидроэпиандростерон, меченый тритием. Белок осаждается при добавлении сульфата аммония, а в надосадочной жидкости измеряют свободный стероид сцинтилляционным методом. При определении тестостерона в плазме [38] и прогестерона [690] для осаждения комплекса стероид—антитело успешно применяли полиэтиленгликоль.

Для осаждения комплекса стероид—антитело есть и другой прием — метод двойных антител. Например, при определении тестостерона и 5а-дигидротестостерона использовали кроличьи антитела. Эти антитела (содержащие связанную с ними фракцию стероидов) осаждали вторым антителом, выделенным из организма коз, иммунизированных глобулином кроликов [507].

Особого внимания заслуживают твердофазные методы РИА, поскольку роль их в ближайшем будущем, вероятно, возрастет. В этих методах антитело связывают полимерами или даже стенками пробирки, используемой в анализе, и в надосадочной жидкости можно сразу измерять радиоактивность. В качестве примера можно упомянуть метод Лейтинена и Адлеркройца [495], предложенный для определения эстриол-16а-глюкуро- нида в моче и плазме беременных. В этом методе антисыворотку получали из организма овец, иммунизируя их комплексом эстриол-1 ба-глюкуронид—тироглобулин (полученным ковалентным связыванием карбоксильной группы глюкуроновой кислоты с тироглобулином). Соответствующая фракция полученной таким способом антисыворотки была иммобилизована на CNBr-активированной сефарозе. Образовавшуюся суспензию выдерживали до установления равновесия с пробами разбавленной мочи или плазмы, содержащими тритированный стероид, и после центрифугирования в надосадочной жидкости измеряли активность несвязанной фракции.

В табл. 2.17 приведены некоторые практические примеры применения метода РИА для определения половых гормонов в жидкостях организма.

>>

>>

о

ж ^

r”b ^ г’Ь ^5 ^

>>

>>

>>

>>

>>

гЗ

К(К(К[К(К(

к(

|=[

г^

S

So

Е(Е(Е[ К(С(

к(

Г4

г^

t^

ж я о S S

X 3 ж »Ж

О

>>

X

X ЕМИ Е X Я £ X X

Ж ж о S S

О

ж Ж ж о S S 03

X

Таблица 2.17. Определение половых гормонов радиоиммунным методом

Продолжение табл. 2.17

Автор

Год

Стероид

Объект

Хроматография

Метка

Метод разделения связанной и несвязанной фракций

Лидтке и др. [500]

1978

Эстриол

Сыворотка

—

125J

Полиоксиэтиленгликоль

Фотерби и др. [260]

Абриу и др. [326]

1979

Норэтистерон

Плазма

—

Зн

ДДУ

1978

5а-Андростан-За, 170- и 30,170-диолы

Сыворотка

Сефадекс LH-20

Зн

ДДУ

Боарер и Хаттер- сли [87]

1978

Прогестерон, эстрадиол

Плазма

—

Зн

Диск из древесного угля и агар- Q ГО О

Вииникка [813]

1978

13-Этил-11-метилен-18, 19-динор-17а-прегн-4-ен- 20-ин-17-ол

Сыворотка

Липидекс 5000

125J

al apa

ДДУ

Лангер и др. [493]

1978

Прогестерон

Плазма

—

3Н

ДДУ

Яноскова и др. [414]

1978

Тестостерон

Сыворотка

—

125 J

Метод двойных антител

Дворак и др. [207]

1978

Тестостерон

Плазма

—

3Н, 1261

ДДУ

Керр и др. [452]

1977

Эстриол-1 ба-глюкуро- нид

Плазма

—

3Н

ДДУ

Фингерова [247]

1978

Эстриол-1 ба-глюкуро- нид

Моча

—

3Н

ДДУ

Карлстром и Сколдефорс [130]

1977

Эстрон

Сыворотка

—

Зн

ДДУ

Фрейман и др.

1977

Эстрадиол

Плазма

—

Зн

ДДУ

[263]

Ден и др. [182]

1977

Эстетрол

Плазма

Сефадекс LH-20

Зн

ДДУ

Сато и Осава [687]

1977

Этиохоланолон

Сыворотка

Сефадекс LH-20

Зн

ДДУ

Корпешо и ’др. [168]

1977

Тестостерон и три его продукта восстановления

Плазма

тех

3Н

ДДУ

Лейтинен и Ад- леркройц [495]

1977

Эстриол-16-глюкуронид

Моча, плазма

—

Зн

Иммобилизованные антитела

Автор

Год

Стероид

Объект

Хроматография

Метка

Метод разделения связанной и несвязанной фракций

Матьё и др. [528]

1977

Прогестерон

Плазма

—

Зн

ДДУ

Пирк [638]

1977

Андрост-5-ен-Зр, 170-диол

Плазма

тех

Зн

ДДУ

Хопкинсон и др. [378]

1977

5а-Андростан-30, 170-диол

Плазма

Сефадекс LH-20

Зн

ДДУ

Танемори и др.

1977

2О0-Оксипрегн-4-ен-3-он

Сыворотка

Сефадекс LH-20

Зн

Сульфат аммония

[759]

Шелдон и Коп-

1977

Тестостерон

Сыворотка

—

Зн

ДДУ

пенгер [712]

Зн

ДДУ

Паркер и др. [612]

1977

Андрост-4-ен-3,17-дион

Сыворотка

Оксид алюминия

Пу и др. [647]

1978

Конъюгаты тестостерона и дигидротестостерона

Сыворотка

тех

Зн

ДДУ

Иттрих [403а]

1978

Эстрадиол, тестостерон, прогестерон

Плазма

—

Зн

Древесный уголь на силикагеле или флорисиле

Джавад и др. [416]

1979

Эстриол

Моча

—

Метод двойных антител

Тресгер и Тамм [707]

Нумазава и др. [599а]

1979

Глюкуронид тестосте-

Моча, плазма

—

Зн

Оксиапатит

1979

Эстриол-16- и 17-глюку- ронид

Плазма

—

Зн

Иммобилизованные антитела

Намбара и др. [581в]

1980

Сульфат эстрона

—

—

Зн

Сульфат аммония

Канлуан и др. [440а]

1981

Лево-норгестрел

Плазма

Целит

Зн

ДДУ

а

ДДУ—декстран, нанесенный на древесный уголь.

Помимо хроматографических разделений, проводимых в некоторых случаях для улучшения избирательности метода, с той же целью иногда проводят химические реакции. Например, Хэмпл и сотр. [337, 338] определяли анаболические стероиды в плазме или моче, обрабатывая экстракт смесью уксусного ангидрида с пиридином для переведения тестостерона и дигидротестостерона в 17-ацетильные производные, что исключает их перекрестное взаимодействие с используемой антисывороткой. Чаще конъюгаты переводят в исходные стероиды до РИА. Поскольку для прямого определения глюкуронидов [452, 495, 844] существуют достаточно специфичные антисыворотки, вырабатываемые в организме иммунизированных животных против комплекса конъюгат—белок, то сульфаты обычно анализируют так же, как свободные стероиды, после их сольволиза [43, 151, 548, 647, 713]. Если пробу проэкстрагировать до и после реакции, то свободный и конъюгированный стероиды можно определить одновременно. Если для определения глюкуронида нет специфической антисыворотки, то можно применить описанный выше принцип (ферментативный анализ с использованием глюкуронидазы), как это, например, было сделано Деном и сотр. [182] при радиоиммунном определении свободного и связанного эстетрола в плазме или Карлстромом и сотр. [130] при определении общего содержания эстрона в сыворотке крови человека. Стоит упомянуть, что различная растворимость свободных стероидов и их сульфатов, а также способность последних к сольволизу используются для последующего разделения нейтральной фракции путем обработки ее смесью хлорсульфоновой кислоты с пиридином; образующиеся сульфаты отделяются от оксистероидов [483].

Чувствительность РИА стероидов зависит от многих факторов (сродства антитела к определяемому стероиду, неспецифического связывания, создающего фон, температуры инкубационного периода, природы и специфичности радиоактивной метки). Рассмотрение теоретических аспектов этих проблем вышло бы далеко за рамки настоящей книги. Что касается практического аспекта, то можно утверждать, что в большинстве достаточно хороших аналитических методов для определения требуется лишь несколько десятых миллилитра пробы или даже меньше. Открываемый минимум при таком объеме составляет от 1 до 50 пг, а градуировочный график обычно линеен в области 10—1000 пг.

Воспроизводимость радиоиммунных методов обычно удовлетворяет требованиям серийного клинического анализа: относительное стандартное отклонение составляет от 5 до 15 %. Что касается правильности, то во многих цитируемых здесь статьях сообщается о хорошем совпадении результатов РИА и других

методов (главным образом методов конкурирующего связывания белка, двойного изотопного разбавления, флуориметрии и газовой хроматографии). Эти вопросы подробно разбираются Холлом [334] и Чеканом [142].

При публикации современных методик стало общепринятым приводить результаты обработки данных с помощью вычислительной техники. Автоматизация всей методики, включающей длительный инкубационный период и центрифугирование, не простая задача, чем объясняется очень ограниченное число сведений, имеющихся в литературе по этому вопросу. Хэммонд, Вико и др. [335, 812] приспособили клинический автоматический анализатор системы «Олли 3000» для автоматизации операции добавления антисыворотки, индикатора и древесного угля, обработанного декстраном, после инкубационного периода и для отбора соответствующей аликвотной части из надосадочной жидкости для измерения радиоактивности. Система позволяет подготовить для измерения 96 проб за 3 ч.

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ

Ферментативные реакции широко используются в анализе половых гормонов. Значительная часть сложных аналитических методов определения их в биологических объектах включает по крайней мере одну стадию с участием ферментов—ферментативный гидролиз конъюгатов под действием полученных из сока улитки Helix pomatia или чистых p-глюкуронидазы и арилсульфатазы. Более подробно эти вопросы обсуждаются в разд. 2.3.3. Помимо этих общеупотребительных реакций, цель которых подготовить пробу для определения свободных стероидов, известно большое число методов, в которых в результате ферментативной реакции получаются хромофоры или флуорофоры, служащие для конечного аналитического измерения.

Колориметрические и флуориметрические методы

Почти все методы, включающие колориметрические или флуориметрические измерения, основаны на ферментативных реакциях с участием стероидов, содержащих окси- или кетогруппы,— ферментативном окислении оксигрупп или восстановлении кетогрупп. Хотя эти методы обладают более высокой избирательностью, чем классические колориметрические и флуориметрические методы, они не играют такой же важной роли в анализе половых гормонов, как при определении холестерина и желчных кислот. Поэтому более подробно реакции, включенные в эту книгу, обсуждаются в разд. 4.2.9 и 6.2.7.

Ю Заказ № 182

В табл. 2.18 приведены некоторые из этих методов (дополненные методами газовой хроматографии и методами, сочетающими бумажную хроматографию и радиоанализ).

Из методов, приведенных в табл. 2.18, особого внимания заслуживают методы [14, 344, 591], основанные на циклической ферментной системе [616]. В этих методах ферментативная окислительно-восстановительная реакция сочетается с другой

g

Глюкоза-6-фосфат-дегиЗрогеназа

Эстрадиол-дегидрогеназа (эстрон-эстрадиол- трансгидрогеиаза)

Рис. 2.20. Схема реакций циклической ферментной системы при определении эстрона и эстрадиола в моче и плазме [591].

ферментативной окислительно-восстановительной реакцией, образуя циклическую ферментную систему, так что концентрация хромофора или флуорофора зависит не только от концентрации определяемого стероида, но и от времени реакции. При оптимальных экспериментальных условиях можно добиться значительного выигрыша в чувствительности (более чем в 104 раз) и определять пикограммовые количества. Чувствительность ферментативных реакций в этом методе сравнима с чувствительностью радиоиммунных методов анализа. На рис. 2.20, заимствованном из статьи Николаса и сотр. [591], представлена циклическая ферментная система, используемая для определения суммарного содержания эстрона и эстрадиола в плазме и моче.

Если нужно определить только эстрадиол, можно воспользоваться той же реакцией, но блокировать эстрон реакцией с гидразином.

Новым интересным приемом в области ферментативного анализа стероидов является сочетание этого метода с тонкослойной хроматографией, предложенное Ямагучи и др. [853а— 853в]. Ферментативную реакцию проводили на пластинке, а для количественного определения использовали денситометрическое сканирование. Таким путем были определены За-оксистероиды; опрыскивание проводилось реагентом, содержащим За-оксисте-

Я 4 S

в

тЛ , О65S3

6 ৫ §« i§I■«1

soв S з в 5 з S'яс ° и С

g ЯВgSsgSsoa.~о о s5

<DУ CDCD CD□ SДС ЙЯ

о Око Е 4о У Н2 CDоиУ h04

о5 2я 2§ s6-1яs о

65 О65654S44SO5-!4Й мCD

в?*=¥“®§°е“*°S“s

g-Иg-S'*’®g-§«*&яg.§§«8

osфО 2 CD О 05 s Йд о О

3 •<3s 3 £3 3 55 m U5

я As sя О g« о £я s оwо о £о

5§5$eg»eg»й»В£egi5s

В У

д

Vso&Ef“2“2 gК“®„

§SBО flgggо&5® 2

■esoKS оSO®03.

005 §%§pg«SBco g

52 Я 4Яо CO CяЯгf2

5IfsРi=®SflgбI®^

о 8 4 g & о и Se-KS&K@o8o§ о 8

5 Д О) е

Оооо§

°О ОнОм мCDо°О

5Я 5+ я2-2§|52.2И

В 400.0 2S8 s

К Мt Сн00 s00 04 Ьн00 О’—•Ьнсо д

О

gi §as§।§s1

2g Sg»&c<mй

СТ) 4 и tx иCD< SСТ)осооСТ)С

g

^^о^ОООЮ00Оhw

223°^06 006060606

Таблица 2.18. Некоторые ферментативные методы определения половых гор

д о и о 3

хоо00аS00Сио4s ,^та®(е(SS4XSSоSмо м4^S УCD ИО CD м мхоSтам моо о4Я сТ S ио txgoM г—1 0^си s 4 ОЯ г-н Он иоSо „ М ^-нта ”таХ£04 та<хО 06Х1£13 иS ОбЗю 1X2°хоо00аS00Сио4s ,^та®(е(SS4XSSоSмо м4^S УCD ИО CD м мхоSтам моо о4Я сТ S ио txgoM г—1 0^си s 4 ОЯ г-н Он иоSо „ М ^-нта ”таХ£04 та<хО 06Х1£13 иS ОбЗю 1X2°

хо

о

00

а

S

00

Си

о

4

s ,^

та

®(

е(

S

S

4

X

S

S

о

S

м

о м

4

^

S У

CD И

О CD м м

хо

S

та

м м

о

о о

4

Я сТ S ио txgo

M г—1 0^

си s 4 О

Я г-н Он ио

S

о „ М ^-н

та ”

та

Х£0

4 та

<х

О 06

Х1£1

3 и

S Об

Зю 1X2°

хо

о

00

а

S

00

Си

о

4

s ,^

та

®(

е(

S

S

4

X

S

S

о

S

м

о м

4

^

S У

CD И

О CD м м

хо

S

та

м м

о

о о

4

Я сТ S ио txgo

M г—1 0^

си s 4 О

Я г-н Он ио

S

о „ М ^-н

та ”

та

Х£0

4 та

<х

О 06

Х1£1

3 и

S Об

Зю 1X2°

роид—оксидазу, диафор азу, НАД и хлорид 2-п-иодфенил-З-п- нитрофенил-5-фенилтетразолия. Образующийся из последнего соединения формазан сканировали денситометрически при 500 нм [8536, 853в]. Аналогично определяли Зр-оксистероиды при помощи Зр-оксистероид—оксидазы; колориметрическим реагентом служила смесь 4-аминоантипирин—фенол (см. с. 307) [853а].

Радиоферментные методы

Ниже кратко обсуждаются два характерных примера ферментативных методов с использованием радиоизотопов.

Пол и Аксельрод [617] определяли катехолэстрогены (2-оксиэстрон и 2-оксиэстрадиол) в тканях. Экстракты подвергали ферментативному О-метилированию; ферментом служила катехол-О-метилтрансфераза, а донором меченого метила 3H-S- аденозилметионин. Образующееся монометильное производное можно выделить из смеси методом тонкослойной хроматографии и после извлечения из зоны количественно измерить на сцинтилляционном счетчике. Ферментативная реакция чрезвычайно селективна, что позволяет проводить определение даже в присутствии родственных веществ, например эстрона и эстрадиола.

Де Греве и сотр. [178] гидроксилировали 16-тритированный прогестерон или прегненолон по С-16, отгоняли 16а-гидрокси- лазу из инкубационной смеси и измеряли активность 3Н2О на жидкостном сцинтилляционном счетчике, определяя таким образом и активность 16а-гидроксилазы.

Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный метод анализа является одной из разновидностей метода конкурирующего связывания белка и тесно связан с радиоиммунным анализом. Он рассматривается здесь, а не в разд. 2.2.13, потому что в нем не используются радиоизотопы (в этом его главное достоинство), а определение основано на ферментативной реакции.

Основное отличие этого метода от РИА состоит в том, что для выработки антисыворотки получают комплекс стероид— белок, связанный ковалентной связью, и конкуренция за активные центры антител происходит между комплексом , белок— определяемый стероид и комплексом фермент—стероид; в результате при изменении концентрации стероида меняется активность фермента, что можно количественно измерить при помощи какой-либо подходящей ферментативной реакции.

Применению этого метода в аналитической химии стероидов посвящено множество публикаций, например для определения эстрадиола [4, 599], эстриола [472, 561, 609], общего содержания эстрогенов [93, 338а], тестостерона [93, 3836, 651—653, 761, 857] и прогестерона [425—427] в плазме и сыворотке. Чаще всего рекомендуется пероксидаза хрена [93, 425—427, 599, 651, 652, 653, 857], но описано также применение P-D-ra- лактозидазы [4, 3836], глюкоамилазы [761] и щелочной фосфатазы [561]. Для связывания стероидов с ферментами используются те же реакции, что и для образования комплексов белок—стероид в радиоиммунном анализе, т. е. сочетание посредством О-карбоксиметоксима 6-кетопроизводных эстрогенов и такого же производного А4-3-кетостероидов по С-3, или соединение через гемисукцинат (в качестве мостика) с 11а-оксипро- изводным последних стероидов. Конъюгаты обычно очищают диализом и хроматографированием на сефадексе G-25.

Эти комплексы служат иммуногенами при выработке антисыворотки в организме животных. Большинство методов, используемых в анализе стероидных гормонов, связано с образованием гетерогенных систем , т. е. ферментативную активность определяют после отделения комплекса стероид—фермент (остающегося в растворе) от комплекса стероид—фермент—антитело. В большинстве случаев антитела иммобилизуют, связывая их ковалентной связью с CNBr-активированной сефарозой [4, 425—427, 857], целлюлозой [425—427, 651, 652, 663] или частичками п-акриламинового стекла [599], которые затем отделяют центрифугированием и измеряют активность фермента в надосадочной жидкости или осадке. Джойс и сотр. [427] установили, что гораздо большей чувствительности можно добиться, используя микрокристаллическую целлюлозу, а не сефарозу. Еще одним приемом иммобилизации является связывание антител стенками полистирольной пробирки [93]. Возможны и другие варианты, основанные на отделении комплекса антиген—антитело методом двойных антител [561, 761] или на использовании полиэтиленгликоля [609].

В методе конкурирующего связывания белка можно использовать тот же комплекс фермент—стероид, что и при выработке антисыворотки (гомологичные системы), или другой комплекс (гетерологичные системы). Преимущество первых — более высокая избирательность, тогда как вторые обеспечивают лучшую чувствительность [93].

После разделения фаз измеряют активность фермента, которая пропорциональна концентрации стероида; при этом

широкое применение нашли спектрофотометрические и флуори- метрические методы. В методах с использованием пероксидазы различные органические восстановители подвергают ферментативному окислению пероксидом водорода с образованием хромофоров или флуорофоров, концентрация которых пропорциональна концентрации фермента (катализатора). Такими системами являются 5-аминосалициловая кислота и пероксид водорода (спектрофотометрирование при 490 нм) [651—653], о-фенилендиамин и пероксид водорода (492 нм) [93, 425—427] и 4-окси-З-метоксифенилуксусная кислота и пероксид водорода (флуориметрический контроль при 420 нм, возбуждение при 390 нм) [599]. При использовании p-D-галактозидазы измеряют поглощение о-нитрофенола, образующегося при ферментативной реакции из о-нитрофенил-р-П-галактозида, при 405 нм в щелочной среде [4, 3836]. Реакции с использованием глюкоамилазы можно контролировать флуориметрически по глюкозе, образующейся из амилозы А [761]. На поглощении при 500 нм хинониминового красителя, образующегося из 4-аминоантипи- рина, пероксида водорода и фенола в присутствии пероксидазы (фенол получается из фенилфосфата при действии щелочной фосфатазы), основаны методы определения последней [561].

В качестве примера широко используемых гетерогенных методов на рис. 2.21 приведена схема методов определения прогестерона в плазме, разработанного Джойсом и сотр. [426].

Кроме рассмотренных до сих пор гетерогенных систем Йорде и сотр. [857] предложили системы другого типа с использованием комплекса антитело—фермент и иммобилизованного антигена. Тестостерон 3-о-карбоксиметоксим связывается с CNBr- активированной сефарозой через желатиновый мостик. Связывание антитела с этим иммобилизованным антигеном конкурентно ингибируется определяемым тестостероном. Комплекс связанного антигена с антителом метят с помощью пероксидазы на двух последующих стадиях. Определение основано на измерении активности связанной пероксидазы (о-дианизидин и пероксид водорода, 400 нм), которая обратно пропорциональна концентрации тестостерона в пробе.

Коэн и сотр. [471, 472] предложили гомогенный метод определения эстриола, основанный на циклической ферментной системе; эстриол участвует в образовании соединения, в котором он посредством 6-карбоксиметоксима ковалентно связан с нико- тинамид-6- (2-аминоэтиламино) пуриндинуклеотидом (эстриол— АЭНАД):

Эстриол—АЭНАД + этанол алкогольдегидрогеназа^ (2.22) —эстриол—АЭНАДН + Н+ + уксусный альдегид

Эстриол—АЭНАДН + оксалилацетат ^w™22££^_ —^эстриол—АЭНАД + малат

Рис. 2.21. Схема определения прогестерона в плазме методом иммунофер- ментного анализа по Джойсу и др. [426].

После проведенного цикла количество малата измеряют путем флуориметрирования НАДФН, образующейся в следующей индикаторной реакции:

малат + НАДФ+ ма-™лфермент пируват+СО2+НАДФН+Н+ (2.23)

Образование малата специфически ингибируется антисывороткой к эстриолу, а это ингибирующее действие подавляется определяемым эстриолом в конкурирующей реакции за антисыворотку между эстриол—АЭНАД и свободным эстриолом. Большим достоинством этого и аналогичных гомогенных методов является исключение операции разделения фаз.

Если сравнивать иммуноферментный метод анализа стероидных гормонов и метод РИА, то можно сказать, что как по специфичности, так и по чувствительности в оптимальных вариан-

тах (порядка 10 пг в одной пробирке) оба метода равноценны. Хотя продолжительность анализа этим методом несколько больше, его роль в ближайшем будущем несомненно возрастет, особенно в лабораториях, где недоступно сравнительно дорогое оборудование, необходимое для РИА [805].

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ И РОДСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ

Общие вопросы

Масс-спектрометрия — один из важнейших методов идентификации стероидов и установления их структуры. Даже поверхностный обзор огромного материала по фрагментированию стероидов и взаимосвязи спектров и структуры вышел бы далеко за рамки этой книги, поэтому здесь будут указаны лишь наиболее важные работы, посвященные этому вопросу [105, 112— 114, 795, 863].

Особенно эффективна масс-спектрометрия в сочетании с газовой хроматографией (хромато-масс-спектрометрия, ХМС), поскольку высокая разрешающая способность газовой хроматографии (особенно капиллярной газовой хроматографии) и высокая селективность масс-спектрометрии создают уникальные возможности для качественного и количественного анализа сложных биологических объектов. Очень часто (помимо обычного количественного анализа при помощи ПИД и ДЭЗ) газовые хроматограммы сканируют по общему ионному току, причем масс-спектрометр служит очень чувствительным газо- хроматографическим детектором. Скоростные сканирующие устройства в современных масс-спектрометрах позволяют одновременно регистрировать масс-спектры индивидуальных пиков. Примерами тому могут служить многие практические приложения газовой хроматографии, описанные в разд. 2.2.11.

В большинстве случаев стероиды в биологических объектах перед газохроматографическим анализом дериватизируют, даже если газовый хроматограф объединен с масс-спектрометром; так же поступают и при прямом масс-спектрометрическом анализе. Как уже указывалось в разд. 2.2.11, чаще всего для дериватизации используют реакции триметилсилилирования, ацетилирования или гептафторбутирилирования оксигрупп и образования метоксимов кетогрупп. Фрагментационные характеристики этих производных тщательно изучены [605, 795].

Приемы дериватизации в масс-спектрометрии и ХМС несколько отличаются от методов дериватизации в газовой хроматографии, где целями ее являются повышение летучести и термической устойчивости, улучшение разделения и возможность использования специфических и чувствительных детекторов.

Относительная интенсивностьОтносительная интенсивность

Относительная интенсивность

Относительная интенсивность

т/е

Рис. 2.22. Масс-спектры бис (триалкилсилиловых) эфиров 5р-прегнан-За,20а- диола [649].

Увеличение летучести имеет огромное значение и в рассматриваемом методе. Вспомним, например, что в персилилирован- ной форме можно исследовать такие полярные производные, как глюкурониды эстрадиола [743] и тестостерона [420] (последние распадаются на фрагменты путем химической ионизации при действии паров пиридина). Заслуживает внимания новая точка зрения, согласно которой получение производных с большой молекулярной массой невыгодно, особенно если используется масс-спектрометр с узким интервалом масс. Производные, дающие богатые линиями спектры, используются для установления структуры исходных стероидов, но для целей количественного анализа более пригодны производные, дающие молекулярные ионы с высокой интенсивностью сигнала, или близкие к ним фрагменты, как это будет показано ниже. Например, как уже упоминалось (на с. 100), если одну из метильных групп в триметилсилилированных производных заменить трет-бутильной или изопропильной группой, фрагментация проходит гораздо менее интенсивно и получаются богатые линиями ионы (М-трет-Ви) + или (М-цзо-Рг) + [86, 247а, 272а, 449, 564а, 635, 635а, 648, 649, 706]. Это иллюстрируется рис. 2.22, взятым из статьи Куильяма и Вестмора [649]. Следует заметить, что многообещающие свойства этих новых производных еще не нашли применения в количественном анализе: в примерах из табл. 2.9 силилирование проведено при помощи триметилсилильной группы.

Специальные проблемы дериватизации стероидов для ХМС рассмотрены в обзоре Брукса и др. [102а].

Масс-фрагментография [10а, 16а]

Масс-спектрометрия может быть использована непосредственно для количественного анализа. Снедден и Паркер [740] описали определение эстрона, эстрадиола, эстриола и прогестерона в тканях яичников человека путем введения высушенных тканей непосредственно в масс-спектрометр и измерения пиков их молекулярных ионов при разрешении 10 000. Градуировочный график (нижняя граница 1 нг) можно построить, вводя пробы плазмы мужчины с известным содержанием перечисленных выше женских гормонов.

Однако в большинстве случаев количественное масс-спектрометрическое определение стероидных гормонов в биологических объектах проводят методом масс-фрагментографии (табл. 2.19).

Биологические объекты в этом специальном варианте метода ХМС обрабатываются так же, как и в других количественных методах (проводят стадии гидролиза, экстракции и хроматографической очистки). Перед введением полученного раствора

в газовый хроматограф стероиды обычно дериватизируют. Для анализа используют не газовую хроматограмму (общий ионный ток), а характерный и достаточно интенсивный пик иона в масс- спектре анализируемого производного. Обычно это пик молекулярного иона. Если анализ газовой хроматограммы основан на этом единственном ионе, то в качестве внутреннего стандарта для количественного определения можно использовать только соединения с таким же отношением mje. Ими могут быть эпимеры [537, 556] или другие изомеры [181] определяемых соединений при условии, что они хорошо разделяются на газохроматографической колонке.

При использовании приборов с многоканальным ионным детектором (МИД), позволяющим одновременно регистрировать по крайней мере два пика, открываются гораздо более широкие возможности для выбора внутренних стандартов. Это обычно дейтерированные (иногда тритированные) или ^-производные определяемых стероидов, так что отношение т/е для них на 2—8 единиц больше, чем у природных стероидов. В этом случае хроматографические пики определяемых стероидов и меченных изотопом внутренних стандартов разделяются плохо или не разделяются совсем, но избирательность здесь обеспечивается благодаря раздельной регистрации пиков. Иллюстрацией этому служит рис. 2.23, на котором приведены спектры гептафторбутирильного производного прогестерона, [4-14С]-проге- стерона и очищенного экстракта сыворотки с добавленным внутренним стандартом, полученные Бъёркемом и сотр. [82] при помощи МИД.

Концентрацию прогестерона в пробе рассчитывают по отношению высот пиков на развертке при m/е, равном 510 и 512, при помощи стандартной кривой. На рис. 2.24, заимствованном из той же статьи, можно видеть стандартную кривую. Небольшой фон на кривой 1 вызван вкладом меченого прогестерона при регистрации спектра при т/е = 510, а отклонение от линейности объясняется вкладом немеченого прогестерона в спектр, записанный при т/е = 512. Кривая 2 представляет собой скорректированный градуировочный график.

Введение метки 14С и гептафторбутирилирование (в случае кортикостероидов образование МО-ТМС-производных) было также использовано Сикманом [721] в масс-фрагментографиче- ском анализе различных стероидных гормонов.

Избирательность методов с МИД можно повысить, используя в качестве внутреннего стандарта изотоп (Бъёркем вводил [4-14С]-прогестерон, содержащий 5% немеченого прогестерона),

Таблица 2.19. Масс-фрагментографические методы определения половых гормонов в биологических объектах

Автор

Год

Определяемое соединение

Объект

Адлеркройц и др. [15, 18, 19, 22]

1973—1976

11 эстрогенов

Желчные кислоты, моча, плазма, фекалии

Адлеркройц и др. [20]

1974

Эстриол

Плазма

Уилсон и др. [834]

1977

Эстрадиол

Плазма

Миязаки и др. [562]

1977

Эстрон, эстрадиол, эстриол

Стандарты

Сикман и др. [742]

1978

Эстрадиол

Сыворотка крови

Бъёркем и др. [83]

1975

Эстриол

Моча

Кнаппен и др. [469]

1979

Эстрадиол

Плазма

Заменчик и др. [862]

1978

Эстрадиол

Сыворотка

Сикман и др. [723]

1978

Этинилэстр адиол

Плазма

Штурм и Штёлер [746]

1976

8 стероидов

Яичники

Бъёркем и др. [82]

1975

Прогестерон

Сыворотка крови

Винклер и др. [835]

1977

Прогестерон

Ткани

Деннин и др. [181]

1974

Прогестерон, тестостерон

Плазма

Адлеркройц, Мартин и др. [12, 526]

1973

1977

Ацетат мегестрола

Плазма

Кук [165]

1974

Норэтистерон

Плазма

Вестергаард и др. [811]

1975

Тестостерон

Плазма

Баба и др. [49, 49а, 7136]

1979

1980

Тестостерон

Плазма, моча

Бъёркем и др. [84]

1975

Тестостерон

Сыворотка крови

Сикман и др. [722]

1976

Тестостерон, 5а- дигидротестосте- рон

Плазма

Миллингтон и др. [556]

1975

С19-стероиды

Ткани

Мэйнард и др. [537]

1977

Дегидроэпиандростерон, 5-андро- стен-3,17-диол

Ткани

Гаскелл и др. [272а]

1980

Тестостерон, дегидроэпиандро-

Слюна

Филлипоу и Фриц [635а]

1980

L1 срин

Ацетат медроксипрогестерона

Плазма

Производное

Неподвижная фаза для ГЖХ

Внутренний стандарт (ВС)

Обнаруженные ионы (в среднем), mje

тмс

QF-1, SE-30

[2Н9]-ТМС-производные

342 (М) эстрон

351 (М) ВС и т. д.

3,16,17-ТМС

QF-1

[2Н27]-ТМС-эстриол

504 (М)

3,17-ТМС

OV-17

Дегидроэквиленин, [2,4-2Н2]-эстрадиол

416 (М); 412 (М) ВС, 418 (М)/ВС

50—50%

ТМС-[2Н9]-ТМС

OV-101

Интенсивная метка дублетов

Молекулярные ионы

ГФБ

OV-1

[4-14С]-эстрадиол и т. п.

664 (М); 666 (М) ВС

3,16,17-ТМС

SE-30

[2,4-2Н2]-эстриол

504 (М); 506 (М) ВС

3,17-ГФБ

OV-1

[2,4,6,6,7,15,16,17-2Н8]-

эстрадиол

664 (М); 672 (М) ВС

3,17-ТМС

OV-1

[2,4,16,16-2Н4]-эстрадиол

416 (М); 420 (М) ВС

3-ГФБ

OV-101 (капиллярная)

[6,7-3Н2]-этинилэстрадиол

474 (М-18), 478 (М-18) ВС

ТМС

Дексил-300

Внешние стандарты

Молекулярные ионы и т. п.

3-ГФБ

SE-30

[4-14С]-Прогестерон

510 (М); 512 (М) ВС

—

Дексил-300

14С-Прогестерон

315 (М+1); 317(М+1)

ВС

3-ГФБ, 17-ГФБ- ацетонид

SE-30

4-Этил-4-андростен-3,17- дион; 4-метил-19-норте-

Arn/XAiTAn АТТ

510 (М) прогест.-ВС;

526 (М) тестост.-ВС

Метоксим

OV-210

ClOLlcpOH

Ацетат медроксипрогестерона

310 (М); 312 (М) ВС

Меток- сим—ТМС

OV-17

[20,21-13С2-7-2Н]-Норэти-

стерон

274 (М—15); 287 (М—15) ВС

3,17-ТФА

OV-1

2Н3-Тестостерон

480 (М); 486 (М) ВС

3,17-ТФА

OV-1

2Нз-Тестостерон, тесто- лтопни

480 (М); 486 (М) ВС

3,17-ТМС

SE-30

с 1 срин

[4-14С]-Тестостерон

504 (М); 506 (М) ВС

3,17-ГФБ

Дексил 300

[1,2-3Н2]-Тестостерон, [4-14С]-5а-Дигидроте- стостерон

680 (М); 684 (М) ВС

681 (М); 683 (М) ВС

ТМС

OV-17

Эпимеры

Молекулярные ионы и т. п.

ТМС

OV-17

За-ОН-5-Андростен- 17-он, 5а-андростан- За, 17а-диол

360 (М), DEA-BC

434 (М); 436 (М) ВС

/п^^т-Бутил- диметилсилиль- ное + МО

OV-1,

OV-17, Поли S179

Эпитестостерон

(М-С4Н9) и т. п.

Енол-ТФА

OV-101

Ацетат [2Нз]-медрокси- прогестерона

482 (М); 485 (М) ВС

Рис. 2.23. Запись отклика МИД на содержание гептафторбутиратов енольной: формы прогестерона [82].

а — гептафторбутирилокси-3,5-прегнадиен-20-он; б —то же производное [4-14С]- прогестерона; в — очищенный экстракт сыворотки после добавления [4- 14С]- прогестерона и гептафторбутирилирования. Количества введенных стандартов около 1,8 нг. Колонка размером 2 ммХ2 м с 1,5 % SE-30 при температуре 230 °C; энергия электрона 20 эВ.

улучшая разрешающую способность прибора и выбирая внутренний стандарт, масса которого отличается от массы немеченого соединения более Адлеркройц и сотр. [12, пердейтерированных триметилсилильных групп» увеличивая тем самым молекулярную массу на 9, 18 и 27 единиц соответственно.

Чувствительность масс- фрагментограф и ч е с к и х

методов сока, что измерить граммовметодов сока, что измерить граммовнастолько вы- позволяет легко несколько наносвободных гор-

методов сока, что измерить граммов

методов сока, что измерить граммов

монов. Более того, во многих случаях область определяемых количеств можно снизить до пикограммовых, следовательно, для определения обычно хватает 1 мл крови. Благодаря необычайно высокой селективности масс-фрагментогра- фия считается наиболее эффективным и надежным методом определения низких концентраций стероидов в биологических образцах. Хотя высокая

Рис.Рис.Число нмолей прогестерона в 1л сыворотки2.24. Стандартные кривые масс-фраг-Число нмолей прогестерона в 1л сыворотки2.24. Стандартные кривые масс-фраг-ментографического определения прогестерона в сыворотке крови [82].ментографического определения прогестерона в сыворотке крови [82].1 — нескорректированная кривая; 2 — скорректированная кривая. Экспериментальные условия см. в табл. 2.19.1 — нескорректированная кривая; 2 — скорректированная кривая. Экспериментальные условия см. в табл. 2.19.стоимость аппаратуры не позволяет внедрить этот метод в практику серийного анализа, во многих лабораториях масс-фрагмен- тометрию часто используют как арбитражный метод проверки достоверного серийного (в основном РИА) метода [49, 82—84, 526, 537, 834, 835, 862].

Рис.

Рис.

Число нмолей прогестерона в 1л сыворотки

2.24. Стандартные кривые масс-фраг-

Число нмолей прогестерона в 1л сыворотки

2.24. Стандартные кривые масс-фраг-

ментографического определения прогестерона в сыворотке крови [82].

ментографического определения прогестерона в сыворотке крови [82].

1 — нескорректированная кривая; 2 — скорректированная кривая. Экспериментальные условия см. в табл. 2.19.

1 — нескорректированная кривая; 2 — скорректированная кривая. Экспериментальные условия см. в табл. 2.19.

Другой важной областью применения раздельной регистрации пиков и ионов методом ХМС является измерение скоростей выделения и метаболизма стероидов после введения в организм дейтерированных стероидов. В качестве примера приведем работу Джонсона и сотр. [419а], вводивших в организм 7,7-2Н2-прегненолон и измерявших его гидрированные метаболиты в моче после ферментативного гидролиза, очистки методом ТСХ и превращения в пентафторпропионильное производное.

ДРУГИЕ МЕТОДЫ

Для идентификации и характеристики стероидов широкое распространение получил метод измерения вращения плоскости поляризации света. Изучение дисперсии оптического вращения (ДОВ) и регистрация спектров кругового дихроизма (КД) являются ценными методами установления их структуры. Измерение вращения плоскости поляризации в максимуме кривых Коттона (или вблизи них) используется для количественного определения некоторых стероидов. Хассан [347] описал определение нескольких половых гормонов и анализ их смесей (тестостерон—эстрон, тестостерон—прогестерон и т. п.). При анализе этих смесей вращение плоскости поляризации измеряли при двух подходящих длинах волн и рассчитывали обе концентрации при помощи системы уравнений.

В ряде статей Гергели и сотр. [277—279] сообщали об использовании метода ДОВ для решения различных аналитических задач, например прямого определения ряда стероидных гормонов в масляных препаратах для инъекций [277],, определения до 0,1 % примеси эстрона в этинил эстрадиоле [278] и определения эстрона методом дифференциальной спектрополяримет- рии, основанном на восстановлении 17-кетогрупп борогидридом натрия, и измерении уменьшения вращения плоскости поляризации [279]. Что касается аналитического применения спектроскопии КД, то необходимо упомянуть о работе Потапова и сотр. [641], которые проанализировали бинарные смеси 17а-ацетокси- 6-метилен-4-прегнен-3,20-диона и 17а-ацетокси-6-метил-4,6-пре- гнадиен-3,20-диона.

Вей и Альмирец [826] применяли спин-иммунный анализ для определения субмикрограммовых количеств прогестерона. В этом методе, тесно связанным с методом РИА, вместо радио- метки используется ЭПР-активная спин-метка.

Наконец, в качестве любопытных примеров можно привести статью Лю-Йен-Бауэра и Вайнфорднера [516], в которой сооб-. щается об обнаружении стероидов по фосфоресценции, и статью Амера и сотр. [30], в которой описано определение этинил- эстрадиола путем комплексообразования с кобальтинитритом натрия и измерения количества непрореагировавшего реагента методом атомно-абсорбционной спектроскопии.

2.3. ЗАДАЧИ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ

КОНТРОЛЬ ЧИСТОТЫ ГОРМОНОВ

Традиционный путь оценки чистоты стероидных гормонов в массе фабричного продукта заключается в определении активного компонента титриметрическим, гравиметрическим, спектрофотометрическим или каким-либо другим методом и в установлении профиля концентраций примесей независимым хроматографическим методом (обычно методом тонкослойной хроматографии) и измерении некоторых физико-химических констант, например температуры плавления, вращения плоскости поляризации света и т. п. В последнее время благодаря применению современных хроматографических методов, количественной тонкослойной хроматографии, газовой хроматографии и особенно высокоэффективной жидкостной хроматографии стало возможным оценивать профиль концентрации примесей и содержание активного компонента одним и тем же методом.

Несмотря на большую достоверность результатов, гравиметрия из-за длительности и трудоемкости операций не используется больше для анализа лекарственных препаратов, применение титриметрии также ограничено практически одной функциональной группой — определением этинилстероидов методом аргенто-ацидиметрического титрования [101а, 293, 732].

Чаще всего для количественного анализа стероидных гормонов в массе продукта используется УФ-спектрофотометрия, что нашло отражение в фармакопеях разных стран. Большинство андрогенных, анаболических и гестогенных гормонов представляют собой ненасыщенные 3-кетопроизводные с интенсивными полосами поглощения при 240 нм, что широко используется для их количественного определения. Селективность этих методов, как правило, невысока, поскольку большинство загрязнений обладает той же системой связей с той же полосой поглощения. Для повышения надежности метода часто привлекают количественную тонкослойную хроматографию с элюированием пятна, анализируя пробу и стандартный образец параллельно на одной и той же пластинке.

Характеристическая полоса поглощения эстрогенов около 280 нм также часто используется для количественного определения, однако из-за низкой интенсивности этой полосы следует проявлять еще большую осторожность в отношении надежности результатов. Например, при определении примесей эстрогенов в кетостероидах кетогруппы последних следует предварительна восстановить борогидридом натрия [61, 303, 494].

И Заказ № 182

Колориметрические методы, применяемые в фармацевтическом анализе стероидов, главным образом для анализа готовых лекарственных форм, иногда также используют для анализа гормонов в массе фабричного продукта (ГИН-метод для ненасыщенных кетостероидов, разные варианты методик с использованием более или менее концентрированных минеральных кислот в качестве реагентов на эстрогены и другие стероиды и т. п.). Поскольку селективность колориметрических методов обычно не намного выше, чем у простых УФ-спектрофотометри- ческих методов, а затраты времени (как и число источников ошибок) гораздо больше, значение этих методов для анализа гормонов в массе фабричного продукта по меньшей мере сомнительно.

Самым популярным методом оценки числа примесей и их содержания является тонкослойная хроматография. На одну пластинку, как правило, наносят 50—250 мкг пробы. Содержание отдельных примесей обычно не позволяет проводить элюирование пятна с последующим колориметрическим или другим методом детектирования для их прямого определения. Обычно проводят полуколичественное определение путем визуального сравнения пятен от примесей с пятнами от стандартных веществ. Следует заметить, что возможности количественного метода ТСХ in situ в этой области не используются.

Газовая хроматография — полезный метод как количественного определения гормонов в массе фабричного продукта, так и для оценки их чистоты. В первом случае необходимо подобрать подходящий внутренний стандарт, тогда как во втором (включая метод ХМС) основное внимание нужно обратить на решение вопроса, указывает ли маленький пик на хроматограмме на наличие примеси или он относится к продукту разложения соединения или (в случае предварительной деривати- зации) к побочному продукту реакции дериватизации.

Идеальным методом анализа гормонов в массе фабричного продукта оказалась высокоэффективная жидкостная хроматография. Если имеется подходящий внутренний стандарт, анализ может быть выполнен с высокой селективностью. Выбрав по крайней мере две хроматографические системы (желательно адсорбционную и распределительную колонки с подходящими элюентами), можно установить профиль концентраций примесей [119, 311, 392]. Кроме того, изменения высоты пика при изменении длины волны сканирования могут дать полезную информацию для решения вопроса о структуре примесе-й; можно также использовать соответствующие фракции элюата для последующей расшифровки спектроскопических данных о структуре.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ

В ГОТОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМАХ [3026, 3126]

В терапии половые гормоны используются практически во всех лекарственных формах — таблетках, масляных, водносус- пендированных или эмульсионных препаратах для инъекций, капсулах, мазях и т. д. Содержание активного ингредиента обычно составляет несколько миллиграммов в таблетке или несколько миллилитров в жидкой форме, но эстрогены часто содержатся в таблетках в микрограммовых количествах. Очень часто используются комбинации (в основном гестоген—эстроген или андроген—эстроген).

Обычно экстракцию активного вещества из таблетки проводят этанолом или метанолом или реже другими растворителями. Для низкодозированных форм полярных стероидов (например, эстрогенов со свободной 3-оксигруппой) экстракция такого типа часто оказывается неудовлетворительной. В таких случаях рекомендуется растворить растворимую часть основы таблетки в воде и экстрагировать стероиды хлороформом или другими растворителями, несмешивающимися с водой. В предельном случае можно с помощью ферментативного гидролиза растворить даже крахмал таблетки [525].

Масляные препараты для инъекций в некоторых случаях можно анализировать сразу после разбавления их хлороформом или другими растворителями. Однако по большей части стероиды следует отделить от основной массы масла. Это чаще всего достигается экстракцией из масляного раствора метанолом или водным раствором этанола после разбавления алифатическим углеводородом. Для экстракции свободных эстрогенов также используют водные растворы гидроксида натрия.

В большинстве случаев полученные таким путем экстракты можно сразу использовать для количественного определения. Однако довольно часто избирательность количественного аналитического метода недостаточна и, следовательно, в методику приходится вводить дополнительные стадии колоночной (желательно распределительной [108, 109, 317, 319, 320, 783в, 847— 849]) или тонкослойной хроматографии.

Что касается аналитических методов, то, очевидно, наиболее распространены спектрофотометрия и колориметрия. Андрогенные и гестогенные гормоны с 4-ен-З-кетогруппой определяют в таблетке по их поглощению в максимуме при 240 нм. При очень низком содержании стероида в таблетках или анализе масляных препаратов для инъекций определению мешает поглощение фона. Его влияние можно устранить, используя метод с применением борогидрида натрия [144, 295, 302, 459].

При УФ-спектрофотометрическом анализе препаратов эстрогена возникают более серьезные проблемы в связи с низкой интенсивностью полос поглощения при 280 нм и малым содержанием активного вещества. Однако эти проблемы решаются методами хроматографического разделения [108, 109, 697], селективной экстракции [718], различными математическими методами [61, 101а, 303, 447, 494, 718] , уменьшением фона путем восстановления сопутствующих кетостероидов борогидридом натрия [101в, 296, 303, 491] и (при определении эстрогенов со свободными фенольными оксигруппами) при помощи дифференциального спектрофотометрического метода, основанного на измерении поглощения стероидов в щелочной и нейтральной средах [301, 412, 7836]. Тем не менее можно утверждать, что УФ-спектрофотометрия в анализе эстрогенных препаратов не имеет столь важного значения, как в анализе 4-ен-З-кетосте- роидов.

Гораздо более широкое применение для анализа всех видов препаратов стероидных гормонов находит колориметрия, основанная на проведении подходящей химической реакции. 4-Ен- 3-кето- и 1,4-диен-4-кетостероиды чаще всего определяют методом с использованием гидразида изоникотиновой кислоты. Универсальность этого метода (его можно использовать и в спиртовой, и в хлороформной среде) позволяет применять его для анализа различных препаратов, в том числе масляных препаратов, даже в присутствии эстрогенов [78, 79, 1016, 137—139, 219а, 479, 480, 677, 768, 782, 845, 846, 849].

Для определения эстрогенов в лекарственных готовых формах чаще всего используют реагенты с высокой концентрацией серной кислоты. Из этих реагентов Кобера наиболее употребительна смесь серная кислота—метанол, предложенная Цилифо- нисом и Хафезом [143, 144, 317, 763, 780, 783г, 847, 848]. В качестве примера кратко изложим методику By [847], предназначенную для определения этинилэстрадиола в противозачаточных таблетках. В этом случае (поскольку хромогенная реакция недостаточно селективна) необходимо отделение этинилэстрадиола от гестогенного компонента на хроматографической колонке. Разделение проводят на колонке (250x25 мм), содержащей (начиная со дна) прокладку из стеклянной ваты, 5 г безводного сульфата натрия, смесь 3 г целита и 3 мл 10 %-ного раствора гидроксида натрия. Сверху помещают часть измельченной таблетки, содержащей около 40 мкг этинилэстрадиола, растертой с 3 мл хлороформа и 2 мл воды и смешанной с 4,5 г целита. Затем гестогенный компонент и другие мешающие вещества элюируют из колонки, промывая ее 25 мл изооктана и 55 мл смеси хлороформа и изооктана (1:9). Этинилэстра- диол, остающийся в щелочном слое — ловушке, элюируют из

колонки 50 мл хлороформа, а затем 25 мл изооктана. Смесь энергично встряхивают в делительной воронке емкостью 250 мл с 10 мл реагента серная кислота—метанол в соотношении 7:3 (по объему) в течение 4 мин. Измеряют поглощение нижнего слоя при 537 нм относительно реагента, рассчитывают содержание этинилэстрадиола, пользуясь данными по поглощению стандарта, проведенного параллельно через все стадии определения.

Ценным методом анализа стероидных гормональных препаратов является также флуориметрия. Этим методом в основном анализируют препараты с низкой дозировкой эстрогена, чтобы использовать главное его достоинство — высокую чувствительность. Хотя можно измерять и собственную флуоресценцию [101а, 202, 411, 412, 435, 665], в большинстве методов используются реагенты с высокой концентрацией сильной кислоты, особенно при анализе противозачаточных пилюль, содержащих этинилэстрадиол или местранол [413, 453, 525, 555, 614, 719, 763, 783ж, 824].

Одной из причин сохранившейся до сих пор популярности колориметрии и флуориметрии в анализе стероидных гормональных препаратов является возможность автоматизации. Это очень важно, так как контроль партий низкодозированных таблеток с примерно одинаковым содержанием стероида вручную чрезвычайно трудоемкий процесс.

На рис. 2.25, взятом из статьи Ангермана и сотр. [40], представлена схема анализа таблеток с содержанием 250 мкг норгестрела и 50 мкг этинилэстрадиола в одной таблетке с использованием автоанализатора фирмы «Текникон». Отдельная таблетка измельчается и экстрагируется на установке «Солйд- преп»; поток, содержащий этанольный экстракт таблеток, непрерывно фильтруется и разделяется на два потока. В одном потоке (рис. 2.25, а) определяют этинилэстрадиол флуоримет- рически после смешивания с 94 %-ной серной кислотой, а в другом определяют норгестрел методом с использованием ГИН. За 1 ч этим методом можно определить оба компонента в 15 отдельных таблетках.

Некоторые таблетки, содержащие андрогены или гестогены с А4-3-кетогруппами, анализировали методом дифференциальной импульсной полярографии [125, 149, 150, 608, 850]. Достоинством этого не очень распространенного метода является то, что нет необходимости в предварительном удалении основы таблетки из исследуемого раствора.

Хотя при помощи рассмотренных методов можно проанализировать практически все формы стероидных гормональных препаратов, они имеют один общий недостаток: определение ведется по самой устойчивой части молекулы (4-ен-З-кетогруппе,

Дозирующий насос

„ 10.056 с д

, 2 ——;Воздух

л 50,073 Проба.подаваемая -

насосом 1

6 —2^5_ГИН

8 _7 0J10

W 9 -J—°:?10 ^Охлаждающая вода

J2 21 0,056 Из колориметра

Колориметр Самописец (светофильтр 420 нм)Колориметр Самописец (светофильтр 420 нм)(546/580 нм)(546/580 нм)Рис. 2.25. Схема непрерывного определения норгестрела и этинилэстрадиола в отдельной таблетке с использованием автоанализатора [40].Рис. 2.25. Схема непрерывного определения норгестрела и этинилэстрадиола в отдельной таблетке с использованием автоанализатора [40].6

Колориметр Самописец (светофильтр 420 нм)

Колориметр Самописец (светофильтр 420 нм)

(546/580 нм)

(546/580 нм)

Рис. 2.25. Схема непрерывного определения норгестрела и этинилэстрадиола в отдельной таблетке с использованием автоанализатора [40].

Рис. 2.25. Схема непрерывного определения норгестрела и этинилэстрадиола в отдельной таблетке с использованием автоанализатора [40].

а —экстракция таблетки и флуориметрическое определение этинилэстрадиола; б — колориметрическое определение норгестрела с помощью ГИН. Цифрами на схеме обозначены места пересечения шлангов.

ароматическому кольцу Л); следовательно, в большинстве случаев, эти методы непригодны при оценке устойчивости препаратов.

В таких случаях следует повысить избирательность колориметрического или флуориметрического методов путем предварительного разделения методами тонкослойной хроматографии или, что более предпочтительно, газовой или высокоэффективной жидкостной хроматографии. Многие практические примеры применения этих методов анализа стероидных гормональных готовых лекарственных форм можно найти в табл. 2.13—2.15.

Еще одним преимуществом газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографий является возможность проведения разделения и количественного определения нескольких компонентов в сложных препаратах за один-единственный хроматографический цикл (см., например, рис. 2.10).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ

И ИХ МЕТАБОЛИТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

Общие вопросы

Определение стероидных гормонов и конъюгатов в биологических объектах — несомненно наиболее тщательно изученная область анализа стероидов. Это объясняется важностью знания концентраций индивидуальных стероидов в различных биологических объектах при изучении их биосинтеза и метаболизма, а также непрерывно возрастающим вниманием к изменениям концентраций определенных стероидов или профиля концентрации стероидов вследствие заболеваний или других нарушений в организме. Благодаря огромному значению этих данных для диагностики анализ стероидных гормонов в биологических объектах стал одним из самых распространенных клинических серийных тестов.

Чаще всего на содержание стероидов исследуются моча и плазма или сыворотка крови, но имеется много сведений и об анализе других объектов, например тканей, фекалий, амниотических жидкостей и т. п.

Подавляющее большинство стероидов в моче и их значительная часть в крови находятся в виде конъюгатов, поэтому возможны различные подходы к задаче их обнаружения:

определение только свободного стероида;

определение стероида в свободном и связанном состоянии по отдельности после соответствующего разделения;

определение суммарного содержания свободной и связанной форм стероида после переведения последнего в свободный стероид.

Решение сложных проблем (а) и (б) стало возможным только благодаря введению изощренных методов разделения (в основном хроматографических). В общем можно утверждать, что если в фармацевтическом анализе стероидов большая часть работы приходится на само количественное определение, то в биоклиническом анализе стероидов основное время и труд уходят на процессы разделения и очистки.

Экстракция

В этом разделе термин «экстракция» используется в классическом смысле, поскольку обсуждаться будет только экстракция растворителями; выделение стероидов из растворов методами колоночной хроматографии, главным образом на смоле марки XAD, часто трактуемое в литературе как экстракция, будут обсуждаться в следующем разделе.

Большинство аналитических методов определения стероидных гормонов в биологических объектах включает по крайней мере одну стадию экстракции. Эта стадия проводится либо непосредственно с депротеинизированной пробой, либо чаще всего после расщепления конъюгатов. Обычно для экстракции стероидов с последующим анализом методами ГЖХ, ВЭЖХ, МС, РИА и др. используют диэтиловый эфир [20, 54, 57, 90, 197, 236, 237, 239, 338, 469, 591, 604, 617, 685, 750].

Если цель анализа заключается в определении нейтральных стероидов, эфирные экстракты часто промывают 0,1—2,5 М водным раствором гидроксида натрия для удаления мешающих веществ кислотного характера.

Если же цель анализа — определение эстрогенов, их экстрагируют из эфирного раствора. Например, при определении эстриола в моче эфирный раствор обрабатывают 1 М раствором гидроксида натрия, pH экстракта понижают при помощи гидрокарбоната натрия и экстрагируют эстриол толуолом для последующего газохроматографического определения [557].

Используются также и другие органические растворители:, дихлорметан [88, 266, 589, 629, 723, 724], хлороформ [567, 790], дихлорэтан [778], трихлорэтилен [153], толуол [486], этилацетат [68, 94, 264, 275, 713] и смеси растворителей, например этил ацетат—гексан—этанол (7:2:1) [5, 6], диэтиловый эфир— хлороформ (4:1) [653] и т. п.

Конъюгаты экстрагируют более полярными растворителями или смесями растворителей либо уменьшают их растворимость в водной фазе, добавляя большие количества солей типа сульфата аммония [615].

Следует заметить, что многие методики включают более одной стадии экстракции. Например, после выпаривания досуха

эфирного экстракта остаток часто распределяют между 70 %- ным метанолом и гексаном [750] или между этанолом и петро- лейным эфиром [90] с тем, чтобы отделить холестерин и другие липиды, переходящие в углеводородную фазу, от более полярных стероидов, остающихся в спиртовой фазе.

Хроматографическое разделение и очистка экстрактов

Избирательность количественного измерения на заключительной стадии анализа часто недостаточно высока для селективного определения малых количеств стероидов в биологических образцах с использованием только стадий экстракции. В таких случаях в методики включают стадии разделения и очистки методами колоночной и(или) тонкослойной хроматографии.

Почти все методы колоночной хроматографии, описанные в разд. 2.2.9, широко применяются для анализа биологических объектов (за исключением распределительной жидкостной хроматографии, которая в настоящее время используется в основном в фармацевтике). Для прямого выделения стероидов («экстракции») из разбавленных биологических жидкостей часто применяют колонку, заполненную амберлитом XAD-2; для этой же цели используется кизельгур [825]. Для очистки экстрактов обычно служат колонки с силикагелем и оксидом алюминия, а для фракционирования стероидов в основном используются различные сефадексы (главным образом LH-20). Следует заметить, что колоночная хроматография имеет значение для разделения и очистки не только природных стероидов, но и их производных. Например, Адлеркройц и Шауман [21] перед стадиями силилирования и газохроматографического количественного определения проводили очистку стероидов на колонке, заполненной оксидом алюминия, после их превращения в мето- ксимы. Бауман и Нони [96] очищали пентафторпропионат эстрадиола перед газохроматографическим анализом на колонке, заполненной силикагелем.

При подготовке проб для определения стероидных гормонов в биологических объектах по меньшей мере такую же важную роль, как и колоночная хроматография, играет тонкослойная хроматография. Ее часто используют для удаления примесей из пробы и фракционирования на индивидуальные соединения или зоны, пригодные для последующего анализа. Эта стадия часто сочетается с разделением на хроматографической колонке, как это показано на следующем примере, включающем три стадии хроматографирования в тонком слое: две — для очистки свободных стероидов и третья — для очистки их моно-

хлорацетатов. Микан [552] описал газохроматографический метод определения насыщенных метаболитов прогестерона в мышечной оболочке матки человека. После экстракции и разделения на «свободную» и «сульфатную» фракции путем другой, жидкость-жидкостной, экстракции сульфатную фракцию очищают на колонке, заполненной LH-20 [хлороформ—метанол (1:1) с добавкой 0,1 ммоля хлорида натрия]. После отщепления сульфогрупп полученные свободные стероиды хроматографируют на пластинке, покрытой силикагелем, используя смесь хлороформ—ацетон (9:1) для отделения монооксипрегнановой фракции (Rf 0,52—0,57). При дальнейшем хроматографировании этой фракции [гексан—этилацетат (3:1)] с тремя обнаруживающими агентами происходит разделение эпимеров З-оксипрегнан-20-она. Окончательную очистку фракций перед анализом проводят после перевода в монохлорацетаты.

В приведенном выше примере, и вообще в большинстве случаев, когда анализу предшествуют стадии экстракции и хроматографирования, необходимо контролировать полноту разделения на этих стадиях, используя меченые стероиды в качестве радиоактивных индикаторов.

Расщепление конъюгатов

Если целью анализа не является определение индивидуальных конъюгатов (и при этом имеется достаточно избирательный метод, обычно ВЭЖХ), конъюгаты следует перевести в свободные стероиды отщеплением сульфогруппы или глюкуронидной группировки. Это обязательный этап анализа стероидов, содержащихся в моче, но его часто включают и в схемы анализа проб сыворотки или плазмы крови.

В зависимости от поставленной задачи расщепление можно проводить непосредственно в разбавленной пробе или после экстракции растворителем. Очень часто после разделения на колонке или в тонком слое конъюгаты подвергают гидролизу. В этих случаях можно получить количественные результаты для индивидуальных конъюгатов, или по крайней мере для их фракций, не прибегая к селективным методам определения.

В настоящее время из различных способов расщепления конъюгатов стероидов чаще всего используют ферментативный гидролиз. Ферментами в этих реакциях служат арилсульфатаза для расщепления 3-сульфатов эстрогенов, стероидная сульфатаза для 3-сульфатов других стероидов и p-глюкуронидаза для глюкуронидов различных стероидов. Наиболее подходящим источником всех трех ферментов является сок улитки Helix ро- matia. Полученные из нее очищенные экстракты чаще всего используют при анализе стероидов в моче [6, 21, 54, 486].

Обычно гидролиз проводят при pH 4,5—5,0 (ацетатный буфер), температуре около 37°С и времени реакции 12—48 ч. Другой широко используемой комбинацией ферментов для гидролиза стероидов, содержащихся в моче [213, 629, 685, 856] и плазме [596, 691], служит глюсулаза (смесь арилсульфатазы и Р-глю- куронидазы) при аналогичных условиях. Если сульфаты отсутствуют, отделены или селективно разложены, часто используют одну р-глюкуронидазу [68, 90, 488, 542].

Основной причиной вытеснения классических методов расщепления (включающих использование концентрированных минеральных кислот при повышенной температуре) ферментативными методами является разложение в жестких условиях многих стероидов. Сейчас классические методы используют только для расщепления конъюгатов эстрогенов, которые достаточно устойчивы, чтобы сохранить свою структуру при такой обработке [767, 848]. Например, Милнер и Табер [557] в начале определения эстриола в моче беременных разбавляют 1—2 мл пробы до 6 мл водой, добавляют 0,9 мл концентрированной соляной кислоты и нагревают раствор в автоклаве в течение 15 мин при 0,105 МПа. Вейс [829] показал, что даже в этих случаях правильность анализа можно улучшить, если разбавить пробу мочи водой (1 :50) и очистить ее на сефадексе или осадить конъюгаты добавлением сульфата аммония с тем, чтобы понизить концентрацию компонентов мочи, мешающих определению в сильнокислой среде. Хроматографическая очистка пробы полезна также при ферментативном анализе, так как при этом можно удалить ферменты-ингибиторы [315, 615].

Следует заметить, что в некоторых случаях для полного гидролиза требуются гораздо более мягкие условия. Например, сульфат дегидроэпиандростерона полностью гидролизуется при кипячении в течение 4 ч в ацетатном буферном водном растворе (pH 4,5) [548]. Более распространенным приемом расщепления сульфатов является сольволиз в этилацетатных растворах [43, 68, 488, 713 и т. д.]. В этом растворителе, являющемся хорошим экстрагентом для сульфатов стероидов, последние подвергаются сольволитическому разложению (при 45°С в течение'15 ч [650]), ускоряемому при введении в раствор следовых количеств минеральных кислот. Например, в методе радиоиммунного определения дегидроэпиандростерона и прегненолона, предложенном Асо и сотр. [43], разбавленную плазму, из которой предварительно удалены свободные стероиды экстракцией эфиром, смешивают с насыщенным раствором хлорида натрия и дважды экстрагируют этилацетатом порциями по

6 мл. При добавлении к экстракту 1 капли концентрированной соляной кислоты сольволиз при комнатной температуре проходит за 1 ч.

Сочетание ферментативных и сольволитических методов разложения с хроматографическими разделениями позволяет решать сложные задачи. В качестве примера приведем метод газохроматографического определения Кюльпмана и Бройера [488], которые предварительно разделяли нейтральные стероиды, содержащиеся в моче, в виде глюкуронидов и сульфатов на колонке, заполненной амберлитом XAD-2, а затем первые подвергали ферментативному гидролизу (при помощи глюкуронидазы), а вторые разлагали сольволитически в этилацетате.

Спектроскопические методы количественного анализа

В анализе биологических объектов методы, основанные на поглощении в УФ- и ИК-областях, а также на флуоресценции, не играют заметной роли. До сих пор находят применение колориметрия и флуориметрия (хотя их значение существенно уменьшилось в связи с возрастанием роли хроматографических и радиоаналитических методов), так как эти методы не требуют дорогого оборудования, могут быть использованы даже в плохо оснащенных лабораториях и из всех инструментальных методов их легче всего автоматизировать. Поэтому большинство методов колориметрического и флуориметрического определения стероидных гормонов в биологических объектах (главным образом в моче), о которых сообщалось в печати, являются автоматическими или по крайней мере полуавтоматическими. В последних вручную проводятся операции ферментативного, гидролитического или сольволитического расщепления и экстракция.

В основном эти методы используются в двух областях — для определения 17-кетостероидов и эстрогенов в моче.

Для колориметрического определения 17-кетостероидов в моче применяются водные [214, 240—242, 481, 823] и неводные [214, 565, 566, 650, 861] варианты метода Циммермана с использованием 1,3-динитробензола.

Общее содержание эстрогенов и эстриола обычно определяют колориметрически или даже чаще флуориметрически методом Кобера или Иттриха—Кобера в различных вариантах. В ряде методик конъюгаты эстрогенов предварительно гидролизуют (обычно гидролиз катализируется кислотами), но во многих случаях сразу действуют сильнокислотными реагентами, как, например, в методике полуавтоматического флуориметри-

ческого определения общего содержания эстрогенов в моче беременных, предложенной Фраем и сотр. [267]. Авторы подобрали оптимальный состав реагента (см. разд. 2.2.2) таким образом, чтобы максимальная флуоресценция приходилась на эстриол-16а-глюкуронид, являющийся основным эстрогенным компонентом мочи беременных. При полной автоматизации методики можно проанализировать от 20 [336] до 30 [267] проб в 1 ч.

При сочетании колориметрических или флуориметрических измерений с ферментативными реакциями чувствительность и избирательность этих методов определения половых гормонов в биологических объектах повышаются (см. табл. 2.18).

Хроматографические методы количественного анализа

Из всех хроматографических методов анализа стероидных гормонов в биологических объектах наиболее широко несомненно используется газовая хроматография, и ее значение не уменьшилось при введении высокоэффективной жидкостной хроматографии. Это находит отражение в большом числе недавно опубликованных статей (см. с. 106—107).

Основное преимущество газохроматографических методов по сравнению со спектроскопическими состоит в более высокой чувствительности. Так, например, при помощи детектора электронного захвата можно определять пикограммовые количества стероидов не только в моче, но и в сыворотке. Другим важным преимуществом этих методов является возможность определения не только отдельных стероидов или суммарного содержания группы стероидов, но также одновременного определения родственных стероидов и (особенно с использованием капиллярных колонок) установления профиля концентраций стероидов в разных биологических объектах (см. табл. 2.10).

Поэтому газовая хроматография в настоящее время является незаменимым средством при биохимических исследованиях стероидов и в серийных клинических анализах. Следует, однако, заметить, что, несмотря на большую разрешающую способность газохроматографических колонок, в целом газохрома- тографическому анализу биологических образцов предшествует по меньшей мере столь же длительная подготовительная работа, как и в спектроскопических методах, т. е. расщепление конъюгатов, экстракция и очень часто разделение на колонке или в тонком слое. Эти стадии и стадию дериватизации, которую приходится проводить в большинстве случаев (часто при этом требуются такие стадии, как выпаривание досуха), очень трудно автоматизировать, поэтому автоматизация сложных газохроматографических методов обычно ограничивается лишь

заключительной стадией газохроматографического определения при помощи различных автоанализаторов. Даже в этих случаях скорость анализа не превышает 1—3 проб в 1 ч из-за довольно большой длительности анализа, которая колеблется от 20 до 60 мин в зависимости от количества определяемых компонентов.

Большое преимущество газовой хроматографии перед любым другим методом состоит в том, что ее легко комбинировать с масс-спектрометрией. Это важно не только с точки зрения возможности непосредственной идентификации пиков на хроматограммах сложных биологических смесей, но также и с точки зрения требований количественного анализа, поскольку масс- фрагментографию можно считать наиболее чувствительным и селективным методом анализа стероидов.

Достоинства и недостатки высокоэффективной жидкостной хроматографии в сравнении с газовой хроматографией обсуждаются в разд. 2.2.12. Можно утверждать, что в области анализа половых гормонов ВЭЖХ несомненно предпочтительнее только для тех конъюгатов, которые трудно анализировать газохроматографически (см. табл. 2.16). В ряде других областей, где чувствительность не столь важна (анализ стероидов в моче), преимущества и недостатки газовой хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии компенсируются, и в ближайшем будущем можно ожидать возрастания роли ВЭЖХ в этих областях.

Следует также ожидать расширения применения тонкослойной денситометрии; сейчас ее использование в анализе половых гормонов в биологических объектах, похоже, ограничивается лишь несколькими примерами [24, 212, 390, 827, 828, 830, 840, 853 (а—в)].

Радиоаналитические количественные методы

Если спектроскопические методы определения стероидных гормонов в биологических объектах не обладают высокими избирательностью и чувствительностью, но позволяют выполнять анализ сотен образцов в день, то газовая хроматография, являясь высокоизбирательным и чувствительным методом (особенно в сочетании с масс-спектрометрией), дает по крайней мере на порядок меньше анализов в день. Образовавшаяся брешь заполнена современными радиоаналитическими методами, в основном радиоиммунными, поскольку чувствительность их достаточно высока, чтобы решать сложные задачи; селективность же метода РИА также высока, если использовать достаточно специфическую антисыворотку. В то же время по числу анализируемых проб в день радиоаналитические методы сравнимы со

спектроскопическими. С этой точки зрения несомненно перспективны нехроматографические поддающиеся автоматизации твердофазные методы.

Поскольку единственной областью применения РИА стероидных гормонов является определение их в биоклинических объектах, все, сказанное в разд. 2.2.13 о практическом использовании метода, и примеры, приведенные в табл. 2.17, относятся также к предмету этого раздела.

Некоторые схемы сложных аналитических методик

Как уже неоднократно отмечалось в этой главе, способ подготовки пробы для определения стероидных гормонов в биологических объектах существенно зависит от поставленной задачи. Начав со случаев, когда пробу мочи или плазмы можно анализировать без какой-либо предварительной обработки (в основном методами РИА), и продолжив рассмотрение некоторых методов газовой хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и других методов, в которых подготовка пробы ограничивается одной стадией экстракции, можно перейти к обсуждению сложных подготовительных операций, включающих стадии экстракции в сочетании с хроматографическими стадиями, которые могут занять несколько дней.

Теперь приведем схемы четырех сложных методик с колориметрическим, флуориметрическим, газохроматографическим и масс-фрагментографическим окончаниями.

Первым опишем полуавтоматический колориметрический метод Рейдмакера и сотр. [650] для определения суммарного содержания в моче 11-дезокси-17-кетостероидов (дегидроэпиандростерона, андростерона, этиохоланолона) с использованием реакции Циммермана (см. 35—37) на стадии количественного определения (рис. 2.26).

В качестве второго примера приведем метод флуориметри- ческого определения общего содержания эстриола в плазме беременных (10—25 мкг/100 мл), описанный Миклоши и сотр. [554] (рис. 2.27). В этом случае для количественной оценки использован флуориметрический вариант метода Кобера—Итт- риха (см. с. 49).

Следующий пример (Тикканен и Адлеркройц [770]) также относится к определению эстриола, на этот раз в моче беременных, но целью анализа является определение содержания каждого из четырех основных конъюгатов. На заключительной стадии проводится газохроматографическое измерение всех конъюгатов в виде производных эстриола, метилированных по фенольной оксигруппе и силилированных по 16- и 17-оксигруппам, поэтому перед ферментативным расщеплением и дериватиза-

цией конъюгаты следует разделить хроматографически (рис. 2.28).

В последнем примере, взятом из статьи Адлеркройца и др. [19], демонстрируется решение действительно очень трудной

Рис. 2.26. Схема определения 11 -дезокси- 17-кетостероидов в моче по методу Рейдмакера и сотр. [650].

задачи одновременного определения одиннадцати эстрогенов (в том числе минорных компонентов) в плазме, моче и желчи методом масс-фрагментографии (рис. 2.29).

Наряду с несколькими экстракционными, хроматографическими и ферментативными стадиями эта сложная методика включает две химические реакции, необходимые для разделения фракций эстрогенов. О селективном образовании ацетони-

дов из 16,17-цис-диолов уже упоминалось на с. 100, а разделение эстрогенов при помощи реактива Т Жирара является примером

Рис. 2.27. Схема определения общего содержания эстриола в плазме беременных по методу Миклоши и сотр. [554].

использования классического метода Кароля и Ротандаро [113] (селективное взаимодействие 17-кетоэстрогенов с реактивом Т Жирара с образованием водорастворимых триметилглицил- гидразонов, из которых после отделения от 17-оксиэстрогенов кетостероиды легко выделить снова).

12 Заказ № 182

Рис. 2.28. Схема определения индивидуальных конъюгатов эстриолов в моче беременных, взятая из статьи Тикканена и Адлеркройца [770].

Э3 — эстриол; С — сульфат; Гл — глюкуронид.

15а-Оксиэстрон

Рис. 2.29. Схема определения 11 эстрогенов в биологических жидкостях, взятая из статьи Адлеркройца и сотр. [19].

12*

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ

И АНАБОЛИЧЕСКИХ АГЕНТОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

Некоторые эстрогенные, гестогенные и анаболические стероиды широко используются в приготовлении корма для скота в качестве регуляторов роста и стимуляторов увеличения привеса, поэтому определение этих стероидов в корме для животных и их остатков в тканях животных и молоке является важной задачей. Поскольку в большинстве случаев содержание стероидов в различных образцах находится на уровне нескольких частей на миллиард, во внимание принимаются только самые чувствительные методы, и для успешного анализа часто необходимы предварительные операции экстракции и очистки. Обзор работ в этой области сделан Райаном [679].

Для анализа мяса и мясных продуктов пробы готовят так же, как для анализа тканей человека и подопытных животных. Используют длительное экстрагирование в аппарате Сокслета дихлорметаном или хлороформом, а также другими растворителями— этилацетатом, этанолом и т. п.— с последующей очисткой методами колоночной или тонкослойной хроматографии, как это описано в предыдущем разделе.

Из-за низкого содержания компонентов и большого числа анализируемых проб для серийных анализов могут быть использованы только очень чувствительные и недорогие методы. Так, метод Кобера в варианте Иттриха с флуориметрическим измерением на конечной стадии с успехом применялся для определения эстрогенов в молоке после гидролиза, экстракции растворителями и очистки на колонке с оксидом алюминия [402]. ТСХ-флуориметрический метод определения тренболона и его ацетатов (анаболические стероиды) описан на с. 78 [600].

Широко применяется и радиоиммунный анализ, например при определении ацетата тренболона в тканях [360, 372].

Из многочисленных примеров использования газовой хроматографии (например, [96, 375, 821]) на рис. 2.30 [482] приведена в качестве типичной схема определения ацетата ме- ленгестрола (ацетат 17-окси-6-метил-16-метилен-4,6-прегнадиен- 3,20-диона) в тканях быка.

Наконец, следует упомянуть статью Холдера и сотр. [375]. Авторы сравнивали результаты определения тренболона и его ацетатов в корме для скота методом газовой хроматографии в виде пентафторпропионатов с использованием ДЭЗ и методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Сканирование хроматограмм в максимуме поглощения стероидов в длинноволновой области (345 нм) является довольно избирательным и чувствительным приемом, позволяющим проводить

Рис. 2.30. Схема определения ацетата меленгестрола в тканях и жире быка по методу Кржемински и сотр. [482].

определение с пределом обнаружения до 0,5 млн-1. Чувствительность газохроматографического метода оказалась выше, но серьезные осложнения, связанные с наличием фона, не позволили полностью использовать это преимущество, даже если подвергнуть бензольные растворы дополнительной экстракции и хроматографированию на колонке, заполненной силикагелем. Поэтому метод ВЭЖХ с соответствующей предварительной стадией очистки является предпочтительным.

ЛИТЕРАТУРА

Abelson D., Bondy P. К. Arch. Biochem. Biophys., 1955, v. 57, p. 208,

Abelson D., Bondy P. K. Anal. Chem., 1956, v. 28, p. 1922.

Abelson D., Bondy P. K. J. Chromat., 1961, v. 5, p. 332.

Abuknesha R., Exley D. In Pal S. B. (Editor). Enzyme Labelled Immunoassay of Hormones and Drugs. De Gruyter, Berlin, New York, 1978, p. 139.

Adessi G. L., Eichenberger D., Tran Quang Nhuan, Jayle M. F. Clin. Chim. Acta, 1974, v. 55, p. 323.

Adessi G. L., Eichenberger D., Tran Quang Nhuan, Jayle N. F. Steroids, 1975, v. 25, p. 553.

Adhikary P. M., Harkness R. A., Biochem. J., 1967, v. 105, p. 40P.

Adhikary P. M., Harkness R. A. Anal. Chem., 1969, v. 41, p. 470.

Adkins A., Cox F. W. J. Am. Chem. Soc., 1938, v. 60, p. 1151.

Adlercreutz H. In Breuer H., Hamel D., Kriiskemper H. L. (Editors). Methods of Hormone Analysis. Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1975.

10a. Adlercreutz H. In Quayle A. (Editor). Advances in Mass Spectrometry. Vol. 8, Heyden, London, 1980, pp. 1165—1179.

Adlercreutz H., Diczfalusy E., Engstrom L. J. Endocrinol., 1960, v. 66, p. 80.

Adlercreutz H., Ervast H. S. Acta Endocrinol. (Suppl.), 1973, v. 177, p. 32.

Adlercreutz H., Ervast H. S., Tenhunen A., Tikkanen M. J. Acta Endocrinol., 1973, v. 73, p. 543.

Adlercreutz H., Harkonen M. Proc. Internat. Congr. Clinical Chemistry, Mexico, 1978.

Adlercreutz H., Hunneman D. H. J. Steroid Biochem., 1973, v. 4, p. 233.

Adlercreutz H., Janne O., Laatikainen T., Lindstrom B., Luukkainen T., Vihko R. Bull. Swiss Acad. Med. Sci., 1969, v. 24, p. 328.

16a. Adlercreutz H., Jdrvenpdd P. In Klopper A., Lertier L., Van der Molen J. H., Sciarra F. (Editors). Research on Steroids, Vol. 8, Academic Press, London, New York, San Francisco, 1979, pp. 109—118.

Adlercreutz H., Harkonen M. J. Steroid Biochem., 1980, v. 13, p. 507.

Adlercreutz H., Luukkainen T. Z. Klin. Chem. Klin. Biochem., 1971, v. 9, p. 421.

Adlercreutz H., Martin F. Acta Endocrinol., 1976, v. 83, p. 410.

Adlercreutz H., Martin F., Wahlroos O, Soini E. J. Steroid Biochem., 1975, v. 6, p. 247.

Adlercreutz H., Nylander P.y Hunneman D. H. Biomed. Mass Spectrom., 1974, v. 1, p. 332.

Adlercreutz H., Schauman К. O. In Breuer H., Hamel D., Kriiskem- • per H. L. (Editors). Methods of Hormone Analysis. Georg Thieme Ver- lag, Stuttgart, 1975.

Adlercreutz H., Tikkanen M. J., Hunneman D. H. J. Steroid Biochem., 1974, v. 5, p. 211.

Alary J., Cantin D., Coeur A. Bull. Soc. Chim. Franc., 1977, p. 649.

Albers H. K., Lisboa В. P. In Frigerio A., Renoz L. (Editors). Recent Developments in Chromatography and Electrophoresis, Elsevier, Amsterdam. Vol. IX, 1979, p. 255.

Alexander G., Rutten G. A. F. M. Chromatographia, 1973, v. 6, p. 231.

Allen L, Geddes E. T. J. Pharm. Pharmacol., 1957, v. 40, p. 99'0.

Allen R. M., Redshaw M. R. Steroids, 1978, v. 32, p. 467.

Allen W. M. J. Clin. Endocrinol., 1950, v. 10, p. 71.

Amer M. M., Hassan S. M., Kheir A. B., Mostafa A. A. Pharmazie, 1978, v. 33, p. 344.

Amer М. М., Walash М. 1., Haroun I. A., Ashour F. М. J. Pharm. Belg.r 1978, v. 33, р. 297.

Amin М., Seeger A., Prezewowsky К., Fuchs Р. Pharm. Acta Helv., 1974^ v. 49, p. 117.

Amin M., Hassenbach M. Analyst, 1979, v. 104, p. 407.

Amin. M. L, Koshy К. T., Bryan J. T. J. Pharm. Sci., 1976, v. 65, p. 1777.

Amormino V., Bellomonte G., Carelli G., Cingolani E. Ahn. 1st. Sup.. Sanita, 1968, v. 4, p. 108.

Amormino V., Bellomonte G., Cingolani E. Ann. 1st. Sup. Sanita, 1968^ v. 4, p. 65.

Anderson D. C., Hopper B. R., Lasley B. L., Yen S. S. C. Steroids, 1976,. v. 28, p. 179.

Anderson D. W., Goebbelsmann U. Clin. Chern., 1976, v. 22, p. 611.

Anderson P. H., Fukushima K., Schiller H. S. Clin. Chern., 1975, v. 21 r p. 708.

Anderson R. A., Defaye G., Madani C., Chambaz E. M., Brooks C. J. W. J. Chromat., 1974, v. 99, p. 485.

Angermann B., Sonderdruck Nr. 952, Technicon Symposium, 1971.

Ansari S., Khan R. A. J. Pharm. Pharmacol., 1960, v. 12, p. 122.

Aringer L., Eneroth P., Gustafsson J. A. Steroids, 1971, v. 17, p. 377.

Aso T., Aedo A. R., Cekan S. Z. J. Steroid Biochem., 1977, v. 8, p. 1105.

Avdovich H. W., Bowron M., Lodge B. A. J. Pharm. Sci., 1970, v. 59, p. 1821.

Avdovich H. W., Hanbury P., Lodge B. A. J. Pharm. Sci., 1970, v. 59,. p. 1164.

Axelson M., Sjovall J. J. Chromat., 1976, v. 126, p. 705.

Axelson M. J. Steroid Biochem., 1977, v. 8, p. 693.

Axelson M., Sjovall J. J. Steroid Biochem., 1977, v. 8, p. 683.

Baba S., Shinohara Y., Kasuya Y. J. Chromat., 1979, v. 162, p. 529.

49a. Baba S., Shinohara Y., Kasuya Y. J. Clin. Endocrin. Metab., 1980, v. 50,. p. 889.

Babjuk L, Starka L., Tuckova M., Jirkalova V. Ergeb. Exp. Med., 1975,. v. 20, p. 74.

Baggett B., Engel L.L., Fielding L. L. J.Biol.Chern., 1955, v.87, p. 213..

BagonK. R., Hammond E. W. Analyst,1978,v. 103, p. 156.

Bailey F., Brittain P. N. J. Chromat., 1973, v. 83, p. 431.

BaileyE., FenoughtyM., Chapman J. R.J. Chromat., 1974, v.96, p. 33.

BaillieT. A., BrooksС. J. W., HorningE. C.Anal. Letters,1972, v. 5,

p. 351.

55a. Bajaj K. L., Ahuja K. L. J. Chromat., 1979, v. 172, p. 417.

Baker D. R., Henry R. A., Williams R. C., Hudson D. R. J. Chromat,. 1973, v. 83, p. 233.

Ball P., Emons G., Haupt O., Hoppen H. O., Knuppen R. Steroids, 1978, v. 31, p. 249.

57a. Bamberg E., Mosti E., El Din Hassan N., Stokl W., Choi H. S. Clin. Chim. Acta, 1980, v. 108, p. 479.

Banes D. J. Am. Pharm. Ass., Sci. Ed., 1950, v. 39, p. 37.

58a. Barron J. L., Maxwell L, Millar R. P. S. Afr. Med. J., 1979, v. 56, p. 761.

Bartos J. Ann. Pharm. Franc., 1959, v. 17, p. 141.

Bartos L, Pesez M. Colorimetric and Fluorimetric Analysis of Steroids^ Academic Press, London, New York, San Francisco, (a), 1976, p. 21.

Bastow R. A. J. Pharm. Pharmacol., 1967, v. 19, p. 41.

Batra S. J. Steroid. Biochem., 1976, v. 7, p. 131.

Bauld W. S. Biochem. J., 1954, v. 56, p. 426.

Beastall G. H., McVeigh S. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 70, p. 343.

Becker A., Ehringer F. Z. Anal. Chern., 1963, v. 198, p. 162.

Becker A., Kathriner A. Z. Anal. Chern., 1961, v. 183, p. 356.

Bedolla-Tovar FL, Rahman S. A., Cekan ,S. Z., Diczfalusy E. J. Steroid. Biochem., 1978, v. 9, p. 561.

Begue R. L, Brun L M., Morlniere M., Padleu P. J. Steroid. Biochem., 1977, v. 8, p. 737.

*69. Belal S., Elnenaey E. A. Pharmazie, 1977, v. 32, p. 125.

Bellomonte G. Ann. 1st. Super. Sanita, 1971, v. 7, p. 102.

Bermudez J. A., Coronado V., Mijares A. J. Steroid. Biochem., 1975, v. 6, p. 283.

Bernstein S., Lenhard R. H. J. Org. Chern., 1954, v. 19, p. 1269.

Berthou F., Plcart D., Bardou L., Floch H. H. J. Chromat., 1976, v. 118, p. 135.

Beyer W. F. J. Pharm. Sci, 1968, v. 57, p. 1415.

Beyermann K., Roder E. Z. Anal. Chern., 1968, v. 230, p. 347.

Bezelj M., Bosch M. W. Z. Klin. Chern. Klin. Biochem., 1975, v. 13, p. 381.

Bhacca N. S., Williams D. H. Applications of NMR Spectroscopy in Organic Chemistry. Holden-Day, San Francisco, 1964.

Bican-Fister T. J. Chromat., 1966, v. 22, p. 465.

Bican-Fister T. J. Pharm. Sci., 1968, v. 57, p. 169.

30. Birmingham M. K., Traikov FL, Ward P. J. Steroids, 1963, v. 1, p. 463.

-81. Bishara R. FL, Rutherford B. S., Dinner A. J. Pharm. Sci., 1975, v. 64, p. 1210.

Bjorkhem L, Blomstrand R., Lantto O. Clin. Chim. Acta, 1975, v. 65, p. 343.

Bjorkhem L, Blomstrand R., Svensson L., Tietz F., Carlstrom K. Clin. Chim. Acta, 1975, v. 62, p. 385.

Bjorkhem L, Lantto0.,Svensson L. Clin. Chim.Acta,1975,v.60,p.59.

Blair 1.A., PhillipouG.J. Chromat. Sci., 1977, v.15, p.478.

Blair I.A., PhillipouG.J. Chromat. Sci., 1978, v.16, p.201.

Boar erC. D. H, Hattersley I. L P. Med. Lab.Sci., 1978,v.35,p.379.

Bogdarln Y. A. Probl. Endokrinol, 1978, v. 24, p. 48.

Bonglovannl A. M., Eberlein W. R., Thomas P. Z. J. Clin. Endocrinol Metal., 1957, v. 17, p. 331.

Bonglovannl A. M., Parks L S., Ranke M., Kirkland R., Vaidya V., Te- rore A. J. Steroid. Biochem., 1974, v. 5, p. 467.

Boreham D. R., Vose C. W., Palmer R. F., Brooks C. J. W., Balasubra- manian V. J. Chromat, 1978, v. 153, p. 63.

Boscott R. L Nature, 1949, v. 164, p. 140.

Bosch A. M. G., Van Hell H., Brands J., Schuurs A. H. W. M. In Pal S. B. (Editor). Enzyme Labelled Immunoassay of Hormones and Drugs. De Gruyter, Berlin, New York, 1978, p. 175.

Bottema J. K, Beiderock W. J. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 68, p. 199.

Boughton 0. D., Bryant R., Ludwig W. J., Timma D. L. J. Pharm. Sci., 1966, v. 55, p. 951.

Bowman M. C., Nony C. R. J. Chromat. Sci., 1977, v. 15, p. 160.

Bradshaw L. Nature, 1961, v. 190, p. 809.

Э8. Bramhall L, Britten A. Z. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 68, p. 203.

Brezina M., Volke L, Volkova V. Coll. Czech. Chern. Comm., 1954, v. 19, p. 894.

Brezina M., Zuman P. Die Polarographic in der Medizin, Biochemie und Pharmazie. Akademische Verlagsgesellschaft, Leipzig, 1956, pp. 399—414.

British Pharmacopoeia 1980, HM Stationary Office, London, a) V. I, p. 310, б) V. II, p. 641, в) V. II, p. 768.

British Pharmacopoeia 1973. Addendum 1975, HM Stationary Office, London, a) p. 18, 6) p. 39.

102a. Brooks C. J. W., Cole W. J., McIntyre H. B., Smith A. G. Lipids, 1980, v. 15, p. 745.

Brooks C. J. W., Harvey D. J. Steroids, 1970, v. 15, p. 283.

Brooks С. J. W., Middletich В. S. Anal. Letters, 1972, v. 5, р. 611.

Brooks С. J. W., Middletich В. S. In Heftmann E. (Editor). Modern Methods of Steroid Analysis, Academic Press, New York, London, 1973, pp. 140—188.

105a. Brooks M. A., Dixon R. J. Chromat., 1980, v. 182, p. 387.

Brown J. B. J. Endocrinol., 1952, v. 8, p. 196.

Brown J. B. Biochem. J., 1955, v. 60, p. 185.

Brunner Ch. A. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1971, v. 54, p. 590.

Brunner Ch. A., Kunze F. M. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1970, v. 53, p. 234.

Brushi F. Bull. Chim. Farm., 1966, v. 105, p. 237.

Buckle J. W., Jack P. M. B., Nathanielsz P. W. J. Physiol., 1974, p. 242, p. 56 P.

Budzikiewicz H. In Waller R. G. (Editor), Biochemical Applications of Mass Spectrometry, Wiley-Interscience, New York, London, Sydney, Toronto, 1972, pp. 251—290.

Budzikiewicz H., Djerassi C., Williams D. H. Structure Elucidation of Natural Products by Mass Spectrometry. V. II, Holden-Day, San Francisco, 1964.

Budzikiewicz FL, Djerassi C., Williams D. H. Mass Spectrometry of Organic Compounds, Holden Day, San Francisco, 1967.

Bunter B., Sliwinski A. Endocrinol., 1975, v. 66, p. 24.

Bush I. E. Fed. Proc., 1953, v. 12, p. 186.

Bush I. E. The Chromatography of Steroids. Pergamon Press, Oxford, 1961.

Butterfield A. G., Lodge B. A., Pound N. J. J. Chromat. Sci., 1973, v. 11, p. 401.

Butterfield A. G., Lodge B. A., Pound N. J., Sears R. W. J. Pharm. Sci., 1975, v. 64, p. 441.

Cahen R. I., Salter W. T. J. Biol. Chem., 1944, v. 152, p. 489.

Callow N. H., Callow R. K., Emmens C. W. Biochem. J., 1938, v. 32, p. 1312.

Cameron E. H. D., Hillier S. G., Griffiths K. (Editors). Steroid Immunoassay. Alpha Omega Publ., Cardiff, 1975.

Gameroni R., Gamberini G., Ferioli V., Barnabei M. T., Cop pi G. Far- maco, Ed. Pr., 1978, v. 33, p. 291.

Campbell D. G., Gardner G. Clin. Chim. Acta, 1971, v. 32, p. 153.

Cantin D., Alary J., Coeur A. J. Pharm. Belg., 1977, v. 32, p. 255.

Carignan G., Lanouette M., Lodge B. A. J. Chromat, 1977, v. 135, p. 523.

Carignan G., Curran N. M., Lodge B. A., McErlane К. M. Can. J. Pharm. Sci., 1978, v. 13, p. 73.

Carignan G., Lanouette M., Lodge B. A. Can. J. Pharm. Sci., 1977, v. 12, p. 106.

Carignan G., Lodge B. A. Can. J. Pharm. Sci., 1976, v. 11, p. 76.

129a. Carignan G., Lodge B. A. J. Chromat., 1979, v. 179, p. 184.

Carignan G., Lodge B. A. J. Pharm. Sci., 1980, v. 69, p. 1453.

129b. Carignan G., Lodge B. A., Skakum W. Can. J. Pharm. Sci., 1980, v. 15, p. 10.

129r. Carignan G., Lodge B. A., Skakum W. J. Pharm. Sci., 1980, v. 69, p. 1214. 129д. Carignan G., Lodge B. A., Skakum W. J. Chromat., 1981, v. 206, p. 174. 130. Carlstrom C., Skoldefors H. J. Steroid. Biochem., 1977, v. 8, p. 1127.

Carol I., Kunze F. M., Banes D., Graham J. H. J. Pharm. Sci., 1961, v. 50, p. 550.

Carol J., Molitor J. C., Haenni E. 0. J. Am. Pharm. Ass., Sci. Ed., 1948, v. 37, p. 173.

Carol J., Rotondaro F. A. J. Am. Pharm. Ass., Sci. Ed., 1946, v. 35, p. 176.

Carstensen H., Backstroem T. J. Steroid. Biochem., 1976, v. 7, p. 145.

Caspi Е., Scrimshaw G. F. In Carstensen H. (Editor), Steroid Hormone Analysis. Marcel Dekker, New York, 1967, pp. 55—92.

Caspi E., Wittstruck Th. In Carstensen H. (Editor). Steroid Hormone Analysis. Marcel Dekker, New York, 1967, pp. 93—133.

Cavina G., Cingolani E., Amormino V., Giraldez H. Farmaco Ed. Pr., 1962, v. 17, p. 393.

Cavina G„ cingolani E., Giraldez H. Farmaco Ed. Pr., 1962, v. 17, p. 49.

Cavina G., Moretti G. J. Chromat., 1966, v. 22, p. 41.

Cavina G., Moretti G., Petrella M. J. Chromat., 1975, v. 103, p. 368.

Cavina G., Moretti G., Siniscalchi P. J. Chromat., 1970, v.'47, p. 186.

Cekan S. Z. J. Steroid Biochem., 1979, v. 11, p. 135.

Chafetz L., Boudjouk M. G., Tsilifonis D. C., Foo Song Hom. J. Pharm. Sci., 1968, v. 57, p. 1000.

Chafetz L., Tsilifonis D. C., Riedl J. M. J. Pharm. Sci., 1972, v. 61, p. 148.

Chambaz E. M., Defaye G., Madani C. Anal. Chern., 1973, v. 45, p. 1090.

Chambaz E. M., Horning E. C. Anal. Letters, 1968, v. 1, p. 201.

Chapman J. R., Bailey E. Anal. Chern., 1973, v. 45, p. 1636.

Chatten L. G., Triggs E. I., Glowach S. J. J. Pharm. Belg., 1976, v. 31, p. 63.

Chatten L. G., Yadav R. N., Madan D. K. Pharm. Acta Helv., 1976, v. 51, p. 381.

Chatten L. G., Yadav R. N., Binnington S., Moskalyk R. E. Analyst, 1977, v. 102, p. 323.

Chattoraj S. C., Fanous A. S., Cecchini D., Lowe E. W. Steroids, 1978, v. 31, p. 375.

Chayen R., Gould S., Harell A., Stead С. V. Anal. Biochem., 1971, v. 39, p. 533.

Chevins R., Launay J. M., Julien R., Dreux C. Clin. Chim. Acta, 1974, v. 55, p. 333.

Chissel J. F. J. Pharm. Pharmacol., 1964, v. 16, p. 490.

Clark S. J., Wotiz H. H. Steroids, 1963, v. 2, p. 56. .

Clark S. J., Wotiz H. H. Steroids, 1963, v. 2, p. 535.

Clark S. J., Wotiz H. H. In Heitmann E. (Editor). Modern Methods of Steroid Analysis. Academic Press, New York, London, 1973, pp. 72—102.

Cochran R. C., Ewing L. L. J. Chromat., 1979, v. 173, p. 175.

Cochran R. C., Darney K. J., Ewing L. L. J. Chromat., 1979, v. 173, p. 349.

Coda L., Timallo L. Bull. Chim. Farm., 1976, v. 115, p. 515.

Cohen H., Bates R. W. J. Am. Pharm. Ass., Sci. Ed., 1951, v. 40, p. 35.

Cohen S., Raluszyner A. Anal. Chern., 1957, v. 29, p. 161.

Collins W. P., Hennam J. F., Tyler J. P. P., Barnard G. J. R. In Pasternak C. A. (Editor). Radioimmunoassay in Clinical Biochemistry. Heyden and Sun, London, New York, Rheine, 1975, p. 153.

Comer J. P., Hartsaw P„ Stevenson С. E. J. Pharm. Sci., 1968, v. 57, p. 147.

Cook С. E., Odiorne T. J., Dickey M. C., Twine M.E.,Pellizzari E. D.,

Wall M. E., Bressler R. Life Sci., 1974, v. 15, p. 1621.

Cooke B. A. Anal. Biochem., 1969, v. 32, p. 198.

Corker C. S., Davidson D. W. J. Steroid Biochem., 1978,v.9,p. 373.

Corpechot C., Eychenne B., Robel P. Steroids, 1977,v.29,p.503.

Crepy O., Jayle M. F. Ann. Biol. Clin., 1953, v. 11, p. 233.

Cross J. M., Eisen H., Kedersha R. G. Anal. Chern., 1952, v. 24, p. 1049.

Csizer E., Gorog S. Anal. Chim. Acta, 1976, v. 86, p. 217.

Csizer E., Gorog S., Szen T. Microchim. Acta, 1970, p. 996.

Csizer E., Gorog S., Gyenes I. Acta Chim. Hung., 1972, v. 73, p. 175.

Dahldf C. G., Lundborg P., Persson B. A., Regardh C. G. Drug Metab. Disp., 1979, v. 7, p. 103.

Daley L D., Rosenfeld J. М., Young Lai E. V. Steroids, 1976, v. 27, p. 481.

Das Gupta V., Ghenakar A. G. J. Pharm. Sci., 1978, v. 67, p. 889.

Deelder R. S., Ramaekers J. J. M., Van den Berg J. H. M., Wetzels M. L. J. Chromat, 1976, v. 119, p. 99.

De Graeve L, Kremers P., Gielen L E. Eur. J. Biochem., 1977, v. 74, p. 561.

Dehennin L., Scholler R. J. Chromat., 1975, v. Ill, p. 238.

Dehennin L., Reiffsteck A., Scholler R. J. Chromat. Sci., 1972, v. 10, p. 224.

Dehennin L„ Reiffsteck A., Scholler R. J. Steroid Biochem., 1974, v. 5, p. 81-o

Den K., Matsumoto H., Masuda T., Okado T., Yoshida T., Tagaki S.r Kokubu T., Kambegawa A. Horumon To Rinsho, 1977, v. 25, p. 465.

Derks H. J. G. M., Muskiet F. A. J., Drayer N. M. Anal. Biochem., 1976, v. 73, p. 391.

DertingerG.,Scholz H. Dt. Apoth. Ztg., 1973, v. 113, p.1735.

DesfossesB.,Condom R„ Emiliozzi R. J. Chromat., 1968, v. 38,p.290.

DessyprisA.,Adlercreutz FL. J. Steroid Biochem., 1972,v. 3, p.19.

DessyprisA.,Reponen A., Karonen S. L., Adlercreutz H.J. Steroid.Bio

chem., 1972, v. 3, p. 943.

187a. De Soto Perera M. A., Curran D. J. Anal. Chim. Acta, 1980, v. 119, p. 263.

Detter F.. Kingmiiller V. Clin. Chim. Acta, 1967, v. 15, p. 581.

Decaux P. G., Horning M. G., Hill R. M., Horning E. C. Anal. Biochem., 1971, v. 41, p. 70.

189a. Dixon P. F., Lukha P., Scott N. R. Proc. Anal. Div. Chern. Soc., 1979, v. 16, p. 302.

Devaux P. G., Horning M. G., Horning E. C. Anal. Letters, 1971, v. 4, p. 151.

Devaux P. G., Horning E. C. Anal. Letters, 1969, v. 2, p. 637.

Deys H. P., Pinxerten J. A. C. Pharm. Weekblad, 1958, v. 93, p. 760.

Diding E. Svensk Farm. Tidskr., 1952, v. 56, p. 3.

Diding E., Sandstrom H., Ostelius L, Karlen B. Acta Pharm. Suec., 1976, v. 13, p. 55.

Djerassi C., Ryan E. J. Am. Chern. Soc., 1949, v. 71, p. 1000.

Dobriner K-, Katzellenbogen E. R., Iones R. N. Infrared Absorption Spectra of Steroids. V. I. Wiley-Interscience, New York, 1953.

Dolphin R. J., Pergande P. J. J. Chromat, 1977, v. 143, p. 267.

Dominguez О. V. Paper Chromatography. In Carstensen H. (Editor). Steroid Hormone Analysis. Marcel Dekker, New York, 1967, pp. 135—318.

198a. Donike M., Zimmermann J. J. Chromat., 1980, v. 202, p. 483.

Dorfman L. Chern. Rev., 1953, v. 53, p. 47.

Дозорова И. И., Чистотинова Л. Т., Либерман Е. В. Хим. фарм. ж., 1977, т. II, с. 129.

Durham В. Н. Med. Lab. Sci., 1978, v. 3 5, p. 321.

Dusinsky G., Radejova E. Farm. Obz., 1977, v. 46, p. 225.

Dusza J. P., Heller M., Bernstein S. In Engel L. L. (Editor). Physical Properties of Steroid Hormones. Pergamon Press, Oxford, London, New York, Paris, 1963, pp. 69—287.

Durbeck H. W., Bilker L, Scheulen S., Telin B. In Schomburg G., Rohr- schneider L. (Editors). Chromatography, Elsevier, Amsterdam, 1978, p. 143.

Durbeck H. W., Frischkorn C. G. B., Frischkorn H. E. Deutsche Z. Sportmed., 1978, v. 29, p. 97.

Dvir R., Chayen R. J. Chromat., 1969, v. 45, p. 76.

Dvorak Р., Hampl R., Lukesova S., Kozak L, Chropova NL, Starka I. Radiochem., Radioanal. Lett., 1978, v. 34, p. 295.

Eaborn C., Holder С. A., Walton D. R. M., Thomas B. S. J. Chem. Soc., 1969, p. 2502.

Edmonds C. G., Brooks C. J. W. J. Chromat., 1976, v. 116, p. 173.

Edwards R. W. H. J. Chromat., 1978, v. 153, p. 1.

Egert D. J. Chromat., 1977, v. 135, p. 481.

Egg D., Loewit K, Rumpl E. Endokrinologie, 1975, v. 65, p. 7.

Egger H. J., Reiner J., Spiteller G. J. Chromat. Biomed. Appl., 1978, v. 145, p. 359.

Egloff M., Degrelle H., Jayle NL F. Clin. Chim. Acta, 1975, v. 59, p. 147.

Ehrsson H., Walle T., Wikstrom S. J. Chromat., 1974, v. 101, p. 206.

Eik-Nes К. B., Horning E. C. Gas Phase Chromatography of Steroids. Springer Verlag, Berlin, 1968.

Eisenbrand J., Richer H. Z. Physiol. Chem., 1939, v. 260, p. 83.

Ekeke G. I., Exley D. In Pal S. B. (Editor), Enzyme Labelled Immunoassay of Hormones and Drugs. De Gruyter. Berlin, New York, 1978, p. 195.

Eldawy NL A., Tawfik A. S., Elshabouri S. R. J. Pharm. Sci., 1975, v. 64, p. 1221.

219a. Elsayed NL A., Alioke O. A. Acta Pharm. Yugoslav., 1979, v. 29, p. 145.

Engelhardt H. Z. Anal. Chem., 1975, v. 277, p. 267.

Engelhardt H., Asshauer L, Neue U., Weigand N. Anal. Chem., 1974, v. 46, p. 336.

Epstein E. Clin. Chim. Acta, 1962, v. 7, p. 735.

Ercoli A., De Giuseppe L, De Ruggieri P. Farm. Sci. e Tec. (Pavia), 1952, v. 7, p. 170.

Ercoli A., Vitali R., Gardi R. Steroids, 1964, v. 3, p. 479.

Ермакова В. К, Дозорова И. И., Шашкина Л. Ф. Хим. фарм. ж., 1977, т. II, с. 132.

Exley D., Dutton A. Steroids, 1969, v. 14, р. 575.

Exley D. In Pasternak C. A. (Editor). Radioimmunoassay in Clinical Biochemistry. Heyden and Son, London, New York, Rheine, 1975, p. 141.

Fahmy E., Yassa D. A., Wahba N. Analyst, 1974, v. 99, p. 759.

Fahmy E., Yassa D. A., Wahba N. Analyst, 1976, v. 101, p. 616.

Fairclough R. L, Rabjohns M. A., Peterson A. J. J. Chromat., 1977, v. 133, p. 412.

Fates H. NL, Luukkainen T. Anal. Chem., 1965, v. 37, p. 955.

Fantl V., Gray С. H. Clin. Chim. Acta, 1977, v. 79, p. 237.

Faredin L, Toth I. Acta Med. Acad. Sci. Hung., 1964, v. 20, p. 193.

Farhi R. L., Monder C. Anal. Biochem., 1978, v. 90, p. 58.

Feher T., Bodrogi L, Feher K. G., Poteczin Ё. Chromatographia, 1977, v. 10, p. 86.

Feher T., Bodrogi L. Acta Pharm. Hung., 1976, v. 46, p. 73.

.237.FeherT.,Bodrogi L., Vdradi A. J. Chromat., 1976, v. 123, p.460.

FeherT.,FeherK. G., Bodrogi L. J. Chromat., 1975, v. Ill,p. 125.

FeherT.,SdrfyE. Acta Pharm. Hung., 1974, v. 44, p. 168.

FeldkampC. S.,Epstein E., Thibert R. J., Zak B. Clin. Chem.,1975,v. 21,

p. 1023.

Feldkamp C. S., Epstein E., Thibert R. L, Zak B. Microchem. J., 1976, v. 21, p. 45.

. Feldkamp C. S., Epstein E., Thibert R. J., Zak B. Mikrochem. J., 1975, v. 20, p. 523.

Feldkamp C. S., Watkins R. E., Thibert R. L, Epstein E., Zak B. Mikrochem. J., 1977, v. 22, p. 201.

.244. Feis J. P., Dehennin L., Scholler R. J. Steroid Biochem., 1975, v. 6, p. 1201.

Fenimore D. С., Davis С. М., Whitford J. Н., Harrington С. Л. Anal. Chem., 1976, v. 48, р/$289.

Fernandez A. A., Noceda V. Т. J. Pharm. Sci., 1969, v. 58, p. 740.

Fingerova H. Radiochem. Radioanal. Lett., 1978, v. 34, p. 261.

247a. Finlay E. M. H., Gaskell S. J. Clin. Chem., 1981, v. 27, p. 1165.

Fischer P. Schweiz. Apoth. Ztg., 1973, v. Ill, p. 703.

Fisher R. A., Anderson D. C., Burke C. W. Steroids, 1974, v. 24, p. 809.

Fishmann J. In Feftmann E. (Editor). Modern Methods of Steroid Analysis. Academic Press, New York, London, 1973, pp. 399—417.

Fishman S. J.Pharm. Sci., 1975, v. 64, p. 674.

Fitzpatrick F.A. Clin. Chem., 1973, v. 19, p. 1293.

Fitzpatrick F.A., Siggia S., Dingman J. Anal. Chem.,1972, v. 44, p. 2211.

Fitzpatrick F.A., Siggia S. Anal. Chem., 1973, v. 45,p.2310.

Forist A. A. Anal. Chem., 1959, v. 31, p. 913.

Forist A. A., Johnson J. L. Steroids. In Higuchi T., Brochmann-Hanssen E. (Editors). Pharmaceutical Analysis. Interscience. New York, London, 1961, pp. 69—136.

Forist A. A., Judy R. W. Anal. Letters, 1974, v. 7, p. 419.

Forist A. A., Theal S. J. Pharm. Sci., 1958, v. 47, p. 520.

Foster R., Mackie R. K. Tetrahedron, 1963, v. 19, p. 691.

Fotherby K-> Warren R. J., Shrimanker K, Siekmann L., Siekmann A., Breuer H. J. Steroid Biochem., 1979, v. 10, p. 121.

260a. Fotsis T., Adlercreutz H., Jarvenpaa P., Setchell K. D. R., Axelson M., Sjovall J. J. Steroid Biochem., 1981, v. 14, p. 457.

2606. Fotsis T., Jarvenpda P., Adlercreutz H., J. Clin. Endocrin. Metab., 1980, v. 51, p. 148.

260b. Fotsis T., Jarvenpaa P., Adlercreutz H. Steroid Biochem., 1980, v. 12, p. 503.

260r. Fowler R. T., Lever M., Munster D. J., Brown J. D. Clin. Chim. Acta, 1980, v. 103, p. 175.

France J. T., Knox B. S. J. Gas. Chromat., 1966, v. 4, p. 1973.

261a. Frank J. Chimia, 1981, v. 35, p. 24.

Fransson B., Wahlund K. G., Johansson I. M., Schill G. J. Chromat, 1976, v. 125, p. 327.

Freymann E., Hubl W., Buchner M., Bellee H. Zentralbl. Gynaekol., 1977, v. 99, p. 321.

Friedrich E., Siekmann L., Schindler A. E. Clin. Chim. Acta, 1974, v. 56, p. 127.

Frischkorn C. G. B., Ddrbeck H. W. Z. Anal. Chem., 1978, v. 290, p. 160.

Frischkorn C. G. B., Frischkorn H. E. J. Chromat., 1978, v. 151, p. 331.

Frye R., Fong P. F., Johnson G. F., Rock R. C. Clin. Chem., 1977, v. 23, p. 1819.

Gajewska M., Giewartowska M. Farm. Polska, 1971, v. 27, p. 163.

Gajewska M., Lugowska E., Tomaszewska E. Chem. Anal. (Warsaw), 1975, v. 20, p. 615.

Gajewska M., Plosso H. Farm. Polska, 1971, v. 27, p. 41.

Gantes P., Juhdsz J. P. Ann. Pharm. Franc., 1966, v. 24, p. 687.

Garatt D. C. The Quantitative Analysis of Drugs. Chapman and Hall, London, 1964, p. 583.

272a. Gaskell S. J., Pike A. W., Griffiths К Steroids, 1980, v. 36, p. 219.

2726. Gasparrini F., Cacchi S„ Caglioti L., Misiti D., Giovannoli M. J. Chromat., 1980, v. 194, p. 239.

Gazdag M„ Szepesi G., Nyiredy Sz. Z. Anal. Chem., 1977, v. 288, p. 281.

Gelbke H. P., Loffler H., Knuppen R. Acta Endocrinol., 1976, v. 82, p. 36.

Gelbke H. P., Knuppen R. J. Steroid Biochem., 1974, v. 5, p. 1.

Gelbke H. P., Stubenrauch G. J. Chromat., 1976, v. 120, p. 239.

Gergely Л., Szasz Gy., Nagy J. Magy. Kem. Foly., 1976, v. 82, p. 363.

Gergely A., Szasz Gy., Spdnyik I. Acta Pharm. Hung., 1976, v. 46, p. 254.

Gergely A., Szasz Gy. Magy. Kem. Foly., 1978, v. 84, p. 141.

279a. Gips H., Korte K., Meinecke B., Bailer P. J. Chromat., 1980, v. 193, p. 322.

2796. Gluck J. A. P., Shek E. J. Chromat. Sci., 1980, v. 18, p. 631.

Gochman N., Gantt C. L. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1962, v. 135, p. 312.

Godbille E., Devaux P. J. Chromat. Sci., 1974, v. 12, p. 564.

Godbille E., Devaux P. J. Chromat., 1976, v. 122, p. 317.

Goertz G. R., Crepy О. C., Judas О. E., Longchampt J. E., Jayle M. F. Clin. Chim. Acta, 1974, v. 51, p. 277.

Gold M., Mathew G. Clin. Biochem., 1977, v. 10, p. 191.

Golder W. A., Sippel IF. G. J. Chromat., 1976, v. 123, p. 293.

Goldzieher J. W. Fluorescence Spectra. In Engel L. L. (Editor). Physical Properties of Steroid Hormones. Pergamon, Oxford, London, New York, Paris, 1963, pp. 288—320.

Gonnet C., Rocca J. L. J. Chromat., 1976, v. 120, p. 419.

Gornall A. G., MacDonald M. P. J. Biol. Chern., 1953, v. 201, p. 279.

288a. Goto J., Komatsu S., Goto N., Nambara T. Chern. Pharm. Bulk, 1981, v. 29, p. 899.

Goutte-Coussieu C., Habrioux G., Eichenberger D., Jayle M. F. Clin. Chern., 1979, v. 25, p. 230.

289a. Goutte-Coussieu C., Sanchez D., Adessi G., Jayle M. F. Clin. Chern., 1980, v. 26, p. 190.

Gotelli G. R., Wall J. H., Kabra P. M., Marton L. J. Clin. Chern., 1978, v. 24, p. 2132.

Gotelli G. R., Kabra P. M., Marton L. J. Clin. Chern., 1977, v. 23, p. 165.

Gorog S.ActaChim.Hung.,1966, v.47,p.1.

Gorog S.ActaChim.Hung.,1966, v.47,p.7.

Gorog S.ActaChim.Hung.,1967, v.51,p.221.

Gorog S.J. Pharm. Sci., 1968, v. 57,p. 1737.

Gorog S.ActaChim.Hung.,1969, v.61,p.341.

Gorog S. J. Pharm. Pharmacol., 1969, v. 21, p. 468.

Gorog S. Anal. Chern., 1970, v. 42, p. 560.

Gorog S. Analyst, 1971, v. 96, p. 437.

Gorog S. Steroids, 1968, v. 11, p. 93.

Gorog S. Analyst, 1976, v. 101, p. 512.

Gorog S. Zbl. Pharm., 1977, v. 116, p. 259.

302a. Gorog S. CRC Crit. Rev. Anal. Chern., 1980, v. 9, p. 333.

3026. Gorog S. Z. Anal. Chern., 1981, v. 309, p. 97.

Gorog S., Csizer E. Acta Chim. Hung., 1970, v. 65, p. 41.

Gorog S., Csizer Ё. Z. Anal. Chern., 1971, v. 254, p. 119.

Gorog S., Foldes V. Acta Chim. Hung., 1966, v. 48, p. 249.

Gorog S., Herenyi B. J. Chromat., 1978, v. 152, p. 240.

Gorog S., Herenyi B. Abstr. Papers. ISM Conference. Davos, 1977, p. 142.

Gorog S., Herenyi В. Неопубликованные результаты.

Gorog S., Lauko A. J. Chromat, 1976, v. 118, p. 411.

Gorog S., Lauko A., Sziklay Zs. Analyst, 1978, v. 104, p. 196.

Gorog S., Lauko A., Herenyi B., Czira G., Csizer Ё., Tuba Z. Acta Chim. Hung., 1979, v. 100, p. 377.

Gorog S., Szdcz Gy. Analysis of Steroid Hormone Drugs. Akademiai Kiado, Budapest, Elsevier, Amsterdam, 1978: a) pp. 181—194; 6) pp. 274— 394; в) pp. 137—172.

Gorog S., Tomcsanyi L. Acta Chim. Hung., 1966, v. 47, p. 121.

Gorog S., Toth E., Torley J. Chern. Anal. (Warsaw), 1972, v. 17, p. 263.

Graef V., Fuchs M. Z. Klin. Chern. Klin. Biochem., 1975, v. 13, p. 163.

Graham J. H. J. Pharm. Sci., 1965, v. 54, p. 1665.

GrahamJ. Н. J. Ass. Off.Anal.Chem., 1975,v.58, p. 202.

GrahamJ. H. J. Ass. Off.Anal.Chem., 1977,v.60, p. 338.

GrahamR. E., Kenner С.T. J.Pharm. Sci.,1973, v. 62, p. 1845.

GrahamR. E., Biehl E.R., Kenner С. T.J.Pharm. Sci., 1979, v. 68,

p. 871.

Grant J. K. (Editor). The Gas-Liquid Chromatography of Steroids. Cambridge University Press, 1967.

Greenstein B. D., Puig-Duran E., Franklin M. Steroids, 1977, v. 30, p. 331.

Grob K., Grob J. J. Chromat. Sci., 1969, v. 7, p. 584.

Gupta D. (Editor). Radioimmunoassay of Steroid Hormones. Verlag Chemie, Weinheim, 1975.

Gupta D., McCafferty E. Steroids, 1966, v. 8, p. 451.

Habrioux G., Desfosses B„ Condom R., Faure B., Jayle M. F. Steroids, 1978, v. 32, p. 61.

Haenni E. U. J. Am. Pharm. Ass., Sci. Ed., 1950, v. 39, p. 544.

Haenni E. 0., Carol J., Banes D. J. Am. Pharm. Ass., Sci. Ed., 1953, v. 42, p. 162.

Hdhnel R., Jones H. Clin. Chim. Acta, 1967, v. 16, p. 185.

329a. Haigh W. G., Hofman L. F., Barron E. J. Clin. Chem., 1980, v. 26, p. 309.

Hainsworth I. R., Hall P. E. Clin. Chim. Acta, 19 71, v. 35, p. 201.

Hakl J. J. J. Electroanaol. Chem., 1966, v. 11, p. 31.

Hakl J. J. Chromat., 1977, v. 143, p. 317.

Hakl J. J. Chromat., Biomed. Appl., 1977, v. 1, p. 317.

Hall P. E. J. Steroid Biochem., 1979, v. 11, p. 113.

Hammond G. L, Viinikka L., Vihko R. Clin. Chem., 1977, v. 23, p. 1250.

Hammond J. E., Phillips J. C., Savory J. Clin. Chem., 1978, v. 24, p. 631.

Hampl R., Picha J., Chundela B., Stranska L, Starka L. Radiochem. Radio- anal. Lett., 1978, v. 34, p. 301.

Hampl R., Picha J., Chundela B., Starka L. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1978, v. 16, p. 279.

338a. Hannak D., Gotze M. A., Kattermann R. Z. Anal. Chem., 1980, v. 301, p. 131.

3386. Hanukoglu I., Jefcoate C. R. J. Chromat., 1980, v. 190, p. 256.

Hara S. J. Chromat., 1977, v. 137, p. 41.

Hara S., Fujii Y., Hirasawa M., Miyamoto S. J. Chromat., 1978, v. 149, p. 143.

Hara S„ Hayashi S. J. Chromat., 1977, v. 142, p. 689.

Hara S., Mibe K. Chem. Pharm. Bull., 1975, v. 23, p. 2850.

Hara S., Nakahata M. J. Liquid Chromat., 1978, v. 1, p. 43.

Hdrkonen M., Adlercreutz H., Gfoman E. V. Steroid. Biochem., 1974, v. 5, p. 717.

HarveyD.J.J. Chromat.,1978, v. 147,p.291.

345a.HarveyD.J.J. Chromat.,1980, v. 196,p.156.

Hartman I. S., Wotiz H.H. Biochim.Biophys.Acta, 1964, v. 90, p. 334.

HassanS.S.M. Z. Anal.Chem., 1974,v.269,p.363.

Hassan S. S. M., Abdel Fattah M. M., Zaki M. T. M. Z. Anal. Chem., 1976, v. 281, p. 371.

Hassan S. S. M., Zaki M. T. M. Taianta, 1976, v.23,p.546.

Hattori T., Washio Y., Kamiya N., Itoh Y., InoueM.J.Pharm.Soc. Japan,

1979, v. 99, p. 537.

Hayden A. L. J. Pharm. Sci., 1962, v. 51, p. 617.

Hayden A. L., Sammul 0. R. J. Am. Pharm. Ass.,Sci., Ed.,1960,v.49,

p. 484.

Headley S. K., Slikker W., Hill D. E. Teratology, 1979, p. 19, p. 30A.

Heasman M. J., Wood A. J. J. Pharm. Pharmacol., 1971, v. 23, p. 176S.

Heftmann Е. Chromatography of Steroids. Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, 1976, pp. 29—44, 83—86, 91—92, 96—98.

Heftmann E. J. Liquid Chromat., 1979, v. 2, p. 1137.

Heikkila L, Adlercreutz H. J. Steroid. Biochem., 1970, v. 1, p. 243.

357a. Heikkinen R., Fotsis T., Adlercreutz H. Clin. Chern., 1981, v. 27, p. 1186.

Heineman W. R., Anderson C. W., Halsall H. B. .Science, 1979, v. 204, p. 865.

Heineman W. R., Halsall H. B., Anderson C. W. Abstr., Papers Am. Chern. Soc. 177 Meet. Pt. 1 Anal. 176, 1979.

Heizman R. L, Oettel G., Hoffmann B. J. Endocrinol., 1976, v. 69, p. 10.

Helboe P., Thomsen M. Arch. Pharm. Chern. Sci. Ed., ,1978, v. 6, p. 57.

Heller K., Wagner U. Z. Anal. Chern., 1959, v. 167, p. 90.

Henderson G. D., Chesworth J. M. Lab. Pract, 1977, v. 26, p. 866.

Henry R. A., Schmit J. A., Dieckman J. F. J. Chromat. Sci., 1971, v. 9, p. 513.

Hermansson J. J. Chormat., 1978, v. 152, p. 437.

365a. Hermansson J. J. Chromat, 1980, v. 194, p. 80.

Heusgham C. J. Pharm. Belg., 1950, v. 5, p. 3.

Heusgham C., Jehoite J. M. J. Pharm. Belg., 1957, v. 12, p. 418.

Heusgham C., Vliers M. J. Pharm. Belg., 1950, v. 5, p. 276.

Hillier S. G., Brownsey B. G., Cameron E. H. D. Steroids, 1972, v. 21, p. 735.

Hilmer P. E„ Hess W. C. Anal. Chern., 1949, v. 21, p. 822.

Hinckley С. C. In Heftmann E. (Editor). Modern Methods of Steroid Analysis. Academic Press, New York, London, 1973, pp. 265—291.

371a. Hirai S., Hussain A., Babhair S. J. Pharm. Sci., 1980, v. 69, p. 857.

3716. Hiroshima 0., Ikenoya S., Ohmae M., Kawabe K. Chern. Pharm. Bull., 1980, v. 28, p. 2512.

Hoffmann B., Oettel G. Steroids, 1976, v. 27, p. 509.

Hofmann H. Ergeb. Exp. Med., 1975, v. 20, p. 62.

Holch K. Dansk Tidskr. Farm., 1972, v. 46, p. 169.

Holder C. L., Blakemore W. M., Bowman M. C. J. Chromat. Sci., 1979, v. 17, p. 91.

Hollis D. P. In Heftmann E. (Editor). Modern Methods of Steroid Analysis. Academic Press, New York, London, 1973, pp. 245—264.

Holsboer F., Knorr D. J. Steroid Biochem., 1977, v. 8, p. 1197.

Hopkinson C. N. R., Park В. K., Johnson M. W., Sturm G., Steinbach K., Hirschhaeuser C. J. Steroid Biochem., 1977, v. 8, p. 1253.

Horgan E. D., Riley W. J. Clin. Chern., 1974, v. 20, p. 430.

Horikawa R., Tanimura T., Tamura Z. Anal. Biochem., 1978, v. 85, p. 105.

Horikawa R., Tanimura T., Tamura Z. J. Chromat, 1979, v. 168, p. 526.

Horning M. G., Moss A. M., Boucher E. A., Horning E. C. Anal. Letters, 1968, v. 1, p. 311.

Horning M. G., Moss A. M., Horning E. C. Anal. Biochem., 1968, v. 22,' p. 284.

383a. Hosongadi B. D., Farias С. M. Ind. J. Pharm. Sci., 1980, v. 42, p. 124.

3836. Hosoda H., Yoshida H., Sakai Y., Miyairi S., Nambara T. Chern. Pharm.

Bulk, 1980, v. 28, p. 3035.

Hoyer G. A., Junghans K-, Cleve G. Berichte, 1974, v. 107, p. 363.

Hrdy 0. Coll. Czech. Chern. Comm., 1962, v. 27, p. 2447.

Hsiu H. C. Japan Analyst, 1974, v. 23, p. 1266.

Hsiu H. C. Japan Analyst, 1976, v. 25, p. 302.

Huber J. F. K., Alderlieste E. T., Harren H., Poppe H. Anal. Chern., 1973, v. 45, p. 1337.

Huber J. F. K., Huisman J. A. R. J., Meijers С. A. M. J. Chromat., 1971, v. 62, p. 79.

Huck H. J. Chromat.’, 1975, v. 110, p. 125.

Huettemann R. Е., Shroff А. Р. J. Chromat Sci., 1975, v. 13, р. 357.

Hughes Е. W., Lanouette M., Lodge В. A. Can. J. Pharm. Sci., 1978, v. 13, p. 102.

Hull M. G. R., Braunsberg Н.» Irving D. Clin. Chim. Acta, 1975, v. 58, p. 71.

393a. Hunter I. R., Walden M. R., Heftmann E. J. Chromat, 1979, v. 176, p. 485.

Huttenrauch R. Z. Physiol. Chem., 1961, v. 326, p. 166.

Hiittenrauch R. Arch. Pharm., 1962, v. 295, p. 721.

Huttenrauch R., Reiner I. Pharmazie, 1965, v. 20, p. 242.

Ilea S., Dodica C., lovanovici Z. Z. Klin. Chem. Llib. Biochem., 1970, v. 8, p. 577.

397a. Isaaks J. T., McDermott I. R., Coffey D. S. Steroids, 1979, v. 33, p. 639.

Ishinara T., Sugimoto I. Drug Develop. Ind. Pharm., 1979, v. 5, p. 263.

Ito A., Amakasu 0. J. Pharm. Soc. Japan, 1957, v. 77, p. 1083.

Ittrich G. Z. Physiol. Chem., 1958, v. 312, p. 1.

Ittrich G. Acta Endocrinol., 1960, v. 35, p. 34.

Ittrich G. Z. Physiol. Chem., 1960, v. 320, p. 103.

Ittrich G. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1977, v. 15, p. 629.

403a. Ittrich G. Endokrinologie, 1978, v. 72, p. 339.

Ivashkiv E. Biotechn. Bioeng., 1961, v. 13, p. 561.

Ivashkiv E. Appl. Microbiol., 1970, v. 20, p. 251.

Jaakonmaki P. I., Yar ger R. A., Horning E. C. Biochim. Biophys. Acta, 1967, v. 137, p. 216.

Jacob R., Vogt W., Rnedel M. Ann. Chem., 1979, p. 878.

Jacob R., Vogt W., Fischer L, Rnedel M. Tetrahedron Letters, 1975, p. 1927.

Jacob R., Vogt W. J. Chromat., 1978, v. 150, p. 339.

Jakowicki J., Ervast H. S., Adlercreutz H. J. Steroid. Biochem., 1973, v. 4, p. 181.

James T. J. Pharm. Sci., 1970, v. 59, p. 1648.

James T. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1971, v. 54, p. 1192.

James T. J. Pharm. Sci., 1972, v. 61, p. 1306.

Janouskova M., Fingerova H., Talas M. Radiochem. Radioanal. Lett, 1978, v. 34, p. 289.

J arc H., Ruttner O., Rrocza W. J. Chromat, 1977, v. 134, p. 351.

415a. Jdrvenpad P., Fotsis T., Adlercreutz H. J. Steroid. Biochem., 1979, v. 11, p. 1583.

4156. Jarvenpdd P., Rosunen T., Fotsis T., Adlercreutz H. J. Steroid. Biochem., 1980, v. 13, p. 345.

Jawad M. J., Wilson E. A., Rincaid H. L. Clin. Chem., 1979, v. 25, p. 99.

Jayle M. F. Analyse des Steroides Hormonaux. Masson, Paris, 1962, pp. 4—17, 25—39.

Jayle M. F. Analyse des Steroides Hormonaux. V. III. Masson, Paris, 1965.

418a. Jeff coate S. L. (Editor). Recent Advances in Steroid Radioimmunoassay/ Proceedings of the Symposium on Radioimmunoassay and Related Procedures in Medicine. Berlin, 1977, IAEA Vienna, 1978.

Joe H. T., Leach C. S., Lassiter С. B. Chromatographia, 1978, v. 11, p. 671.

419a. Johnson D. W., Phillipou G., Blair I. A., Seamark R. F. Experientia, 1979, v. 35, p. 1261.

Johnson L. P., Subba Rao S. C., Fenselau C. Anal. Chem., 1978, v. 50, p. 2022.

Johnson R. N., Masserano R. P., Haring R., Rho В. T., Shilling G. J. Pharm. Sci., 1975, v. 6 4, p. 1007.

Johnson R. N., Masserano R. P., Rho В. T., Adams W. P. J. Pharm. Set, 1978, v. 67, p. 1218.

13 Заказ № 182

Jones Н. A., Hahnel R. Steroids, 1969, v. 13, p. 693.

Joyce B. G., Fahmy D. J. Endocrinol., 1975, v. 65, p. 43 P.

Joyce B. G., Read G. F., Fahmy D. R. J. Endocrinol., 1976, v. 71, p. 53 P.

Joyce B. G., Read G. F., Fahmy D. R. Steroids, 1977, v. 29, p. 761.

Joyce B. G., Turkes A., Ozoran A., Read G. F., Fahmy D. R. In Pal S. B. (Editors). Enzyme Labelled Immunoassay of Hormones and Drugs. De Gruyter, Berlin, New York, 1978, p. 247.

Juenge E. C., Brower J. F. J. Pharm. Sci., 1979, v. 68, p. 551.

Julesz M., Toth I., Faredin I. Acta Med. Acad. Sci. Hung., 1972, v. 29, p. 167.

Kabasakalian P„ DeLorenzo S., McGlotten J. J. Anal. Chern., 1956, v. 28, p. 1669.

Kabasakalian P., McGlotten J. J. Am. Chern. Soc., 1956, v. 78, p. 8032.

Kabasakalian P., McGlotten J. Anal. Chern., 1959, v. 31, p. 1091.

Kabasakalian P., McGlotten J. Anal. Chern., 1962, v. 34, p. 1440.

Kabasakalian P., Townley E. R., Yudis M. D. Anal. Chern., 1959, v. 31, p. 375.

Kadin H., Ugolini M. S., Roberts H. R. J. Pharm. Sci., 1964, v. 53, p. 13.

Kdgi H., Miescher K. Helv. Chim. Acta, 1939, v. 22, p. 683.

Kakac B., Vejdelek Z. J. Handbuch der Kolorimetrie. VEB Gustav Fischer Verlag. Jena, V. II, 1963, pp. 848—850, 896—897.

Kakac B., Vejdelek Z. J. Handbuch der Photometrischen Analyse Orga- nischer Verbindungen. Verlag Chemie, Weinheim, 1974.

Kallner A., Lantto O. Clin. Chim. Acta, 1977, v. 79, p. 325.

Kammerl E., Mutschler E. Pharm. Acta Helv., 1975, v. 50, p. 269.

440a. Kanluan T., Masironi B., Cekan S. Z. Clin. Chim. Acta, 1981, v. 109, p. 169.

Kaplan H. G., Капу L., Abraham R. Clin. Chim. Acta, 1974, v. 51, p. 113.

Karch K-, Sebastian I., Haldsz I., Engelhardt H. J. Chromat., 1976, v. 122, p. 171.

Karim A., Hribar J., Aksamit IF., Doherty M., Chinn L. J. Drug Metab. Disp., 1975, v. 3, p. 467.

Karkhanis P. P., Anfinsen J. R. J. Pharm. Sci., 1970, v. 59, p. 535.

Kasler F. Quantitative Analysis by NMR Spectroscopy. Academic Press, London, New York, San Francisco, 1973.

Казаринов H. А., Дзюба H. П. Мед. пром. СССР, 1965, т. 19, с. 47.

Keay G. R. Analyst, 1968, v. 93, р. 28.

Kecskes L., Tenyi I., Nemeth L., Juricskay Sc., Temesi M. Endokrinologie, 1975, v. 66, p. 94.

Kelly R. IF., Taylor P. L. Anal. Chern., 1976, v. 48, p. 465.

Ker avis G., Lafosse M., Durand M. H. Chromatographia, 1977, v. 10, p. 678.

Kerebel A., Morfin R. F., Berthou F. L., Picart D., Bardou L. G.,* Floch H. H. J. Chromat., 1977, v. 140, p. 229.

Ketr E., Park В. K-, Dean P. D. G. Clin. Chim. Acta, 1977, v. 77, p. 77.

Khoury A. J., Cali L. J. J. Pharm. Sci., 1967, v. 56, p. 1485.

Kimura M., Kawata M., Akiyama K-, Harita K., Miura T. Chern. Pharm. Bull., 1973, v. 21, p. 1720, 1741.

Kimura M., Nishina T., Sakamoto T. Chern. Pharm. Bull., 1967, v. 15, p. 454.

King R. H., Grady L. T., Reamer J. T. J. Pharm. Sci., 1974, v. 63, p. 1591..

Kirk D. N., Hartshorn M. P. Steroid Reaction Mechanisms, Elsevier, Amsterdam, London, New York, 1968, p. 182.

Kirk D. N., Shaw P. M. J. Chern. Soc., 1971, p. 3979.

Kirschbaum J. J. Pharm. Sci., 1978, v. 67, p. 275.

Kirschner M. A., Taylor J. P. Anal. Biochem., 1969, v. 30, p. 346.

Kitazawa Т., Naito М., Yoshida F. J. Pharm. Soc. Japan, 1960, v. 80, p. 116.

Kitazawa T., Naito M., Yoshida F., Maruyama M. J. Pharm. Soc. Japan, 1961, v. 81, p. 496.

Klein D. N., Weiner N., Gordon S.M.Anal. Chern., 1948, v. 20,p.174.

Klein S., James A. E., TuckermanM.M. J. Am. Pharm. Ass., Sci.Ed.,

1960, v. 49, p. 314.

Klopper A., Michie E. A., Brown J.B.J. Endocrinol., 1955, v. 12,p.209.

Knapstein P., Trieber L. R., TouchstoneJ. C. Steroids, 1968, v. 11,p.915.

Knights B. A. In Carstensen H. (Editor). Steroid Hormone Analysis. Marcel Dekker, New York, 1967, pp. 367—406.

Ignore D. W. R., Kirschner M. A., Taylor J. P. J. Clin. Endocrinol., 1970, v. 31, p. 409.

Knuppen R., Haupt O., Schramm W., Hoppen H. O. J. Steroid Biochem., 1979, v. 11, p. 153.

Kober S. Biochem. Z., 1931, v. 239, p. 209.

Kohen F., Hollander Z., Boguslaski R. C. J. Steroid Biochem., 1979, v. 11, p. 161.

Kohen F., Hollander Z., Yeager F. N., Carrico R. J., Boguslaski R. C. In Pal B. S. (Editor). Enzyme Labelled Immunoassay of Hormones and Drugs. De Gruyter, Berlin, New York, 1978, p. 67.

Kohli J. C., Arora A. K. Ann. Chim., 1977, v. 2, p. 67.

Kolthoff I. M., Lingane J. J. Polarography, Interscience, New York, London, 1952, pp. 666—675.

Kopp R. H., Schmermund J. T. Clin. Chern., 1976, v. 22, p. 1187.

Korany M. A., Abdel Salam M., Wahbi A. M. Analyst, 1977, v. 102, p. 683.

Koshy К. T. J. Chromat., 1976, v. 126, p. 641.

Koshy К. T., Kaiser D. G., VanDerSilk A. L. J. Chromat. Sci., 1975, v. 13, p. 97, 3299.

Коваленко Л. И. Фармация,1967,т. 16, с. 51.

Коваленко Л. И. Фармация,1968,т. 17, с. 36.

Krushaar L. A., Epstein Е.,Zak В. Clin. Chern., 1966,v.12,р.282.

Krzeminski L. F., Geng S.,CoxB. L. J. Ass. Off.Anal.Chern.,1976,

v. 59, p. 507.

Kuhinsky S., Mirrasoul M., Bennett G. Clin. Biochem., 1977, v. 10, p. 52.

Kuhnert-Brandstotter M., Winkler H. Sci.Pharm., 1976,v. 44, p.177,

191.

Kurasawa Y., Takada A., Ueda T. Chern.Pharm. Bull.(Tokyo), 1976,

v. 24, p. 1268.

Kuschak D., Sturm G. J. Clin. Chern. Clin.Biochem., 1976, v. 14, p.375.

Kutner A., Smolinska J., Cieslik W. Chern.Anal., 1978, v.23, p. 727.

Kutpmann W. R., Breuer H. J. Clin. Chern. Clin. Biochem., 1977, v. 15, p. 225.

Lafosse M., Keravis G., Durand M. H. J. Chromat., 1976, v. 118, p. 283.

Lahoud H. J., Luttrell В. M., Steinbeck A. W. Steroids, 1976, v. 27, p. 211.

Landowne R. A., Lipsky S. R. Anal. Chern., 1963, v. 35, p. 532.

Langenbach R. J., Knoche H. W. Steroids, 1968, v. 11, p. 123.

Langer L., Veleminsky J., Hampl R., Starka L., Holan J. Radiochem. Radioanal. Lett., 1978, v. 34, p. 267.

Legrand M., Delaroff V., Smolik R. J. Pharm. Pharmacol., 1958, v. 10, p. 683.

Lehtinen T., Adlercreutz H. J. Steroid Biochem., 1977, v. 8, p. 99.

Leone R. M. J. Chromat., 1977, v. 135, p. 527.

Leunissen W. J. J., Thijssen J. H. FL J. Chromat., Biomed. AppL, 1978, v. 146, p. 365.

Lever M., Powell J. C., Peace S. M. Biochem. Med., 1973, v. 8, p. 188.

Levi S., Reisfeld R. Anal. Chim. Acta, 1978, v. 97, p. 343.

499a. Lewis C. J., Vose C. W. Anal. Proc., 1981, p. 253.

Liedtke R. L, Greaves J. P., Batjer J. D., Bushby B. Clin. Chern., 1978, v. 24, p. 1100.

500a. Lin L T., Hermann E., Hunter I. R. J. Chromat., 1980, v. 190, p. 169.

Lipsett M. B. (Editor). Gas Chromatography of Steroids in Biological Fluids. Plenum Press, New York, 1965.

Lisboa В. P. Methods EnzymoL, 1969, v. 15, p. 3.

Lisboa В. P. Steroids. In Macek K. (Editor). Pharmaceutical Applications of Thin-layer and Paper Chromatography. Elsevier, Amsterdam, 1972, pp. 275—348.

Lisboa В. P., Schneider H. T., Breuer H. Acta Endocrinol., 1976, v. 82, p. 57.

504a. Lisboa В. P., Hoffmann U. J. Chromat., 1975, v. 115, p. 177.

Lisboa В. P., Strassner M. J. Chromat., 1975, v. Ill, p. 159.

Little A. L, Aulton K, Payne R. B. Clin. Chim. Acta, 1975, v. 65, p. 167.

Llewelyn D. E. H., Hillier S. G., Read G. F. Steroids, 1976, v. 28, p. 339.

Lodge B. A. Can. J. Pharm. Sci., 1970, v. 5, p. 74.

Lodge B. A., Lanouette M. Can. J. Pharm. Sci., 19 79, v. 14, p. 5 3.

Lodge B. A., Toft P. Can. J. Pharm. Sci., 1979, v. 9, p. 41.

Lovelock J. E., Simmonds P. G., Van den Heuvel IF. J. A. Nature, 1963, v. 197, p. 249.

Lotscher K., Kern H. Chimia, 1973, v. 27, p. 348.

5L3. Ludwig H., Reiner J., Spiteller G. Berichte, 1977, v. 110, p. 217.

Ludwig-Kohn H., Messing E., Spiteller G. J. Chromat., Biomed. Appl., 1979, v. 162, p. 573.

Ludwig-Kohn H., Spiteller G., Matthaei D., Scheier G. J. Chromat, Biomed. Appl., 1978, v. 146, p. 381.

Lue Yen Bower E., Winefordner J. D. Anal. Chim. Acta, 1978, v. 101, p. 319.

Lund H. Acta Chern. Scand., 1957, v. 11, p. 283.

Lutoslawska G., Sawicka T. Farm. Polska, 1976, v. 32, p. 743.

Luukkainen T., Van den Heuvel W. J. A., Haahti E. O. A., Horning E. C. Biochem. Biophys. Acta, 1961, v. 52, p. 599.

519a. Madani C., Chambaz E. M. J. Am. Oil. Chern. Soc., 1981, v. 58, p. 63.

Madigan J. J., Zenno E. E., Pheasant R. Anal. Chern., 1951, v. 23, p. 1691.

Magin D. F. J. Chromat., 1975, v. 115, p. 687.

Manila H, Kambegawa A. Nippon Naibumpi Gakkai Zasshi, 1978, v. 54, p. 11.

Marciniec B. Acta Pol. Pharm., 1976, v. 33, p. 725.

Marian M., Matkovics B. Z. Anal. Chern. 1974, v. 272, p. 37.

Mariani A., Mariani-Vicari C. Zbl. Pharm., 1972, v. Ill, p. 19.

Martin F., Adlercreutz H. In Carattini, Sand Berendes H. (Editors). Pharmacology of Steroid Contraceptive Drugs. Raven Press, New York, 1977, pp. 99—105.

Martin J. L., Duncombe R. E., Shaw W. H. C. Analyst, 1975, v. 100, p. 243.

Mathieu H. P., Mathieu-Nast C., Vrignaud C. Steroids, 1977, v. 30, p. 33.

Matsui M., Hakozaki M., Kinuyama Y. J. Chromat., 1975, v. 115, p. 625.

Matsui M., Takahashi M. Anal. Biochem., 1976, v. 75,. p. 441.

Matthews J. S., Pereda A. L. V., Aguilera A. P. J. Chromat., 1962, v. 9, p. 331.

Mathiesen U., Staib W. Chromatographia, 1977, v. 10, p. 70.

Mattox V. R., Goodrich J. E., Litwiller R. D. J. Chromat., 1975, v. 108, p. 23.

Mattox V. R., Litwiller R. D., Goodrich J. E. J. Chromat., 1975, v. 109, p. 129.

Майте В. F., Майте G. М., Durand L, Padieu Р. J. Chromat., 1971, v. 58, р. 277.

Maynard Р. V. J. Endocrinol., 1977, v. 73, р. 16 Р.

Maynard Р. V., Pike A. W., Weston A., Griffiths К. Europ. J. Cancer, 1977, v. 13, p. 971.

Mazella P. P., Ma T. S. Microchim. Acta, 1968, p. 253.

Mdzor L. Acta Chim. Hung., 1976, v. 89, p. 289.

McErlane К. M., Curran N. M. J. Pharm. Sci., 1977, v. 66, p. 523.

McKinley W. P., Devlin D. F. Can. J. Biochem. Physiol., 1957, v. 35, p. 669.

Menger F. M., Hopkins J. J., Cox G. S., Maloney M. J., Bayer F. L. Anal. Chem., 1978, v. 50, p. 1135.

Menini E., Norymberski J. K- Biochem. J., 1964, v. 93, p. 11.

Mesley R. J. Spectrochim. Acta, 1966, v. 22, p. 889.

Mesley R. J., Johnson C. A. J. Pharm. Pharmacol., 1965, v. 17, p. 329. 545a. Messerl G., Longo G., Pedone L. Clin. Chem., 1979, v. 25, p. 1663.

Mestres R., Berges J. L. Trav. Soc. Pharm. Montpellier, 1972, v. 32, p. 313.

Mestres R., Youssef A. F., Berges J. L. Trav. Soc. Pharm. Montpellier, 1972, v. 32, p. 331.

Metcalf M. G. Steroids, 1976, v. 28, p. 311.

Meunier J. C. Agressologie, 1976, v. 17, p. 251.

Meyer A. S. J. Org. Chem., 1955, v. 20, p. 1240.

Meyer A. S., Lindberg M. C. Anal. Chem., 1955, v. 27, p. 813.

Mickan H. Steroids, 1976, v. 27, p. 65.

Михайлова Л. H., Кадатский Г. M., Гриненко Г. С. Химико-фармацевт. ж, 1975, т. 9, с. 58.

Miklosi S., Biggs J. S. G., Selvage N., Canning J., Lythal G. Steroids, 1975, v. 26, p. 671.

Miller J. FL McB., Duguid P. Proc. Anal. Div. Chem. Soc., 1976, v. 13, p. 9.

Millington D. S., Buoy M. E., Brooks G., Harper M. E., Griffiths K. Biomed. Mass Spectrum., 1975, v. 2, p. 219.

Millner S. N., Taber C. A. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 71, p. 67.

Miura M., Kimura M. Chem. Pharm. Bull., 1978, v. 26, p. 171.

Miura T., Takagi H., Harita K., Kimura M. Chem. Pharm. Bull., 1979, v. 27, p. 452.

Miura T., Takagi H, Kimura M. Chem. Pharm. Bull., 1979, v. 27, p. 783.

Miyai K-, Ishibashi K., Ogihara T., Tanizawa O., Nishi K., Kawashima M., Kumahara Y. In Pal S. B. (Editor). Enzyme Labelled Immunoassay of Hormones and Drugs. De Gruyter, Berlin, New York, 1978, p. 287.

Miyazaki H., Ishibashi M., Itoh M. J. Chromat., 1977, v. 135, p. 109.

Miyazaki H, Ishibashi M., Itoh M., Nambara T. Chem. Pharm. Bull., 1975, v. 23, p. 3033.

Mizsei A., Szabo A. Biotechn. Bioeng., 1961, v. 3, p. 21, 119.

564a. Moneti G., Pazzagli M., Fiorelli G., Serio M. Ann. Chim., 1979, v. 69, p. 499.

Moore J. W. Clin. Chim. Acta, 1972, v. 39, p. 532.

Moore J. W. Clin. Chem., 1973, v. 19, p. 706.

Moore J. W., Cooper W. Clin. Chim. Acta, 1974, v. 56, p. 215.

Moore R. A., Ryan M., Penfold W. A. F. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 67, p. 1.

Moretti G., Cavina G., Chiappetta G., Fattori L, Pompi V. Boll. Chim. Pharm., 1977, v. 116, p. 463.

Moretti G., Cavina G., Sardi di Valverde J. J. Chromat., 1969, v. 40, p. 410.

Morgan E. D., Poole C. F. J. Chromat., 1974, v. 89, p. 225.

Morreal С. Е., Dao Т. L. Steroids, 1975, v. 25, р. 421.

Moscrop К. Н., Antcliff А. С., Braunsberg Н., lames V. Н. Т., Goudie L Н., Burnett D. Clin. Chim. Acta, 1974, v. 56, p. 265.

573a. Mourey T. H., Siggia S. Anal. Chern., 1980, v. 52, p. 881.

MohrleH., Tenczer J. Pharm. Acta Helv., 1976, v. 51, p. 219.

MuseyP.I.,Collins D. C., Preedy J. R. K. Steroids, 1977, v. 29,p.657.

MuseyP.L,Collins D. C., Preedy J. R. K. Steroids, 1978, v. 31,p.573.

MullerJ.R.,Robinette J. A., Yannone M. E. J. Steroid Biochem., 1972,

v. 3, p. 735.

Nambara T. J. Chromat., 1972, v. 64, p. 239.

Nambara T., Iwata T., Kigasawa K. J. Chromat., 1976, v. 118, p. 12 7.

Nambara T., Kigasawa K-, Iwata T., Ibuki M. J. Chromat., 1975, v. 114, p. 81.

Nambara T., Kudo T., Hosoda H., Yamanouchi K., Goya S. J. Chromat.,. 1967, v. 31, p. 538.

581a. Nambara T., Numazawa M., Tanaka T., Ohkubo T. J. Steroid Biochem., 1978, v. 9, p. 785.

5816. Nambara T., Numazawa M., Tanaka T., Ohkubo T. J. Pharm. Dyn., 1978, v. 1, p. 55.

581b. Nambara T., Shimada K., Ohta H. J. Steroid Biochem., 1980, v. 13, p. 1075.

Neher R. Chromatographic Mobilities. In Engel L. L. (Editor). Physical Properties of Steroid Hormones. Pergamon Press, Oxford, 1963.

Neher R. Steroid Chromatography. Elsevier, Amsterdam, 1964, pp. 280— 315.

Neher R. TLC of Steroids and Related Compounds. In Stahl E. (Editor). Thin-Layer Chromatography. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1969, pp. 133—155.

Neubert P., Koch K. J. Pharm. Set, 1977, v. 66, p. 1131.

NeudertW., Ropke H. Atlas of Steroid Spectra.Springer,Berlin, 1965.

NeurathG. B., Ambrosium D. J. Chromat., 1979,v. 163, p.230.

Nice E.C., O’Hare M. J. J. Chromat., 1978, v. 166, p. 263.

Nice E.,Williams K. Anal. Biochem., 1974, v. 59, p.399.

Nicklin M. G., Hewitt J. W., Watson D. J. Clin. Pathol., 1976, v. 29, p. 561.

Nicolas J. C., Boussioux A. M., Descomps B., Crastes de Paulet A. Clin. Chim. Acta, 1979, v. 92, p. 1.

Nishina T., Sakai Y., Kimura M. Chern. Pharm. Bull., 1965, v. 13, p. 414.

Njau E. J. Pharm. Sci., 1977, v. 66, p. 1478.

Nocke W. Biochem. J., 1961, v. 78, p. 593.

Norymberski J. K., Stoddart N., Wolstenholme J. B. Biochem. J., 1975, v. 145, p. 47.

Novotny M., Maskarinec M. P., Steverink A. T. G., Farlow R. Anal.. Chern., 1976, v. 48, p. 468.

Novotny M., Zlatkis A. J. Chromat., 1971, v. 56, p. 353.

Novotny M., Zlatkis A. J. Chromat. Sci., 1970, v. 8, p. 346.

Numazawa M., Haryu A., Kurosaka K, Nambara T. FEBS Lett., 1977, v. 79, p. 396.

599a. Numazawa M., Tanaka T., Nambara T. Clin. Chim. Acta, 1979, v. 91, p. 169.

Oehrle K.L.,Vogt K., Hoffmann B. J.Chromat., 1975, v.114,p.244.

Oehrle K.L.,Vogt K. Acta Endocrinol.,1976, v. 82, Suppl., p. 202,61.

Oertel G.W.,Eik-Nes К. B. Anal. Chern.,1959, v. 31, p. 98.

Oertel G.W.,Penzes L. P. Z. Anal. Chern., 1970, v. 252, p.306.

O’Hare M. L, Nice E. C., Magee-Brown R., Bullman H. J. Chromat, 1976, v. 125, p. 357.

Okerholm R. A., Clark S. J., Wotiz H. H. Anal. Biochem. 1971, v. 44, p. 1.

Okuno L, Higgins W. Н. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 1977, v. 18, p. 428.

Oliver R. W. A., Jensen S. R., Crossley G. Clin. Chern., 1976, v. 22, p. 679.

Opheim L. N. Anal. Chim. Acta, 1977, v. 89, p. 225.

Osterman T. M., Juntunen K. 0., Gothoni G. D. Clin. Chern., 1979, v. 25, p. 716.

Pang S., Hotchkiss J., Drash A. L, Levine L. S., New M. I. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1977, v. 45, p. 1003.

Papineau-Couture G., Burley E. A. J. Am. Pharm. Ass., Sci. Ed., 1950, v. 39, p. 683.

Parker L. N., Grover P. K., Odell W. D. Steroids, 1977, v. 29, p. 715.

Pasternak C. A. (Editor). Radioimmunoassay in Clinical Biochemistry. Heyden and Son. London, New York, Rheine, 1975, pp. 139—183.

Pastor J., Pauli A., Papoccia N. Trav. Soc. Pharm. Montpellier, 1973, v. 33, p. 411.

Pasqualini J. R. Analysis and Identification of Steroid Conjugates. In Carstensen H. (Editor). Steroid Hormone Analysis. Marcel Dekker, New York, v. 1, 1967, pp. 407—456.

Passonneau J. V., Lowry О. H. In Bergmayer H. U. (Editor). Grund- lagen der enzymatischen Analyse. Verlag Chemie, Weinheim, New York, 1977, p. 89—90.

616a. Patthy M., Tomori Ё. J. Chromat., 1980, v. 191, p. 145.

Paul S. M., Axelrod J. Life Sciences, 1977, v. 21,p. 493.

PawelczykE.,MarciniecB., PlutaI. Acta Pol.Pharm.,1972,v.29,

p. 375.

PawelczykE.,OpielewiczM. Farm.Polska, 1978,v. 34, p.531.

PawelczykE.,Pluta L,MarciniecB. Acta Pol.Pharm.,1973,v.30,

p. 289.

Penner M. H., Tsilifonis D. C., Chafetz L. J. Pharm. Sci.„ 1971, v. 60, p. 1388.

Pesez M. Bull. Soc. Chim. Franc., 1957, p. 414.

Pesez M. J. Pharm. Pharmacol., 1959, v. 11, p. 475.

Pesez M., Bartos J. Taianta, 1960, v. 5, p. 216.

Pesez M., Bartos J. Taianta, 1963, v. 10, p. 69.

Pesez M., Bartos J. Ann. Pharm. Franc., 1964, v. 22, p. 541.

Pesez M., Bartos J. Taianta, 1969, v. 16, p. 331.

Pesez M., Bartos J. Bull. Soc. Chim. Franc., 1964, p. 912.

Pfaffenberger C. D., Horning E. C. J. Chromat., 1975, v. 112, p. 581.

Pfaffenberger C. D., Horning E. C. Anal. Biochem., 1977, v. 80, p. 329.

Pfaffenberger C. D., Malinak L. R., Horning E. C. J. Chromat., 1978, v. 158, p. 313.

631a. Pfeifer P., Spiteller G. J. Chromat. Biomed. Appl., 1981, v. 223, p. 21.

Pharmacopoeia Helvetica VI. Verlag Eidgenossische Drucksachen und Materialzentrale. Bern, 1971, pp. 455, 1228.

632a. Pharmacopoeia of Japan VIII. English Edition, Society of Japan Pharmacopoeia, 1973, p. 418.

Philips J. C., Hammond J. E., Savory J. Clin. Chern., 1977, v. 23, p. 1136.

PhillipouG. J. Chromat., 1976, v. 129, p. 384.

PhillipouG.,Bigham D. A., Seamark R. F. Steroids, 1975,v.26, p. 516.

635a.PhillipouG.,Frith R. G. Clin. Chim. Acta, 1980, v.103,p.129.

Pierce A.E.Silylation of Organic Compounds. PierceCo.,Rockfort,Ill.,

1968.

Pinelli A., Nair P. P. J. Chromat., 1969, v. 43, p. 223.

Pirke К. M. Steroids, 1977, v. 30, p. 53.

Polvani F., Surace M., Luisi M. (Editors). Gas Chromatographic Determination of Hormonal Steroids, Academic Press, New York, London, 1967.

Pontius D. J. Anal. Chern., 1962, v. 34, p. 168.

Потапов В. M., Демьянович В. М., Раковская Р. С., Гриненко Г. С. Кадацкий Г. М. Ж- аналит. химии, 1978, т. 33, с. 534.

Poteczin Е., Feher Т., Kiss С., Gy dry G. Endokrinologie, 1975, v. 64, p. 151.

Pranskevich С. A., Lozak С. M. Clin. Chern., 1978, v. 24, p. 1044.

Pratt J. J. Clin. Chern., 1978, v. 24, p. 1869.

Pratt J. J., Woldring M. G. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 68, p. 87.

Prochdzka Z. In Deyl H., Macek K-, Janak J. (Editors). Liquid Column Chromatography. Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, 1975, pp. 593— 622.

Puah С. M., Kjeld J. M., Joplin G. F. J. Chromat., 1978, v. 145, p. 247.

Quilliam M. A., Templeton J. F., Westmore J. B. Steroids, 1977, v. 29, p. 613.

Quilliam M. A., Westmore J. B. Steroids, 1977, v. 29, p. 579.

Rademaker B., Jongejan-Timmer A., Poortman J.. Thijssen J. H. H. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 70, p. 349.

Rajkowski К. M., Cittanova N., Desfosses B., Urios P., Jayle M. F. In Pal S. B. (Editor). Enzyme Labelled Immunoassay of Hormones and Drugs. De Gruyter, Berlin, New York, 1978, p. 311.

Rajkowski К. M., Cittanova N., Desfosses B., Jayle M. F. Steroids, 1977, v. 29, p. 701.

Rajkowski К. M., Cittanova N., Urias P., Jayle M. F. Steroids, 1977, v. 30, p. 129.

653a. Rao G. R., Sivaramakrishnan M. V., Srivastava С. M. R. Ind. J. Pharm. Sci., 1979, v. 41, p. 233.

Rao P. N., Moore P. H. Steroids, 1977, v. 29, p. 461.

Rao P. N., Moore P. H., Peterson D. M., Tcholakian R. K. J. Steroid. Biochem., 1978, v. 9, p. 539.

Rapp J. P., Eik-Nes К. B. J. Gas. Chromat., 1965, v. 3, p. 235.

Reed S. R., Walters S. M. Anal. Letters, 1970, v. 3, p. 585.

Reich H., Crane K. F., Sanfilippo S. J. J. Org. Chern., 1953, v. 18, p. 822.

Rigby F. L., Karavolas H. J., Norgard D. W., Wolf R. C. Steroids, 1970, v. 16, p. 703.

RizkM.,Vallon J. J.,Babinand A. Anal.Chim.Acta,1973,v.65,p.220.

RizkM.,Vallon J. J.,Babinand A. Anal.Chim.Acta,1974,v.70,p.457.

RizkM.,Walash M. I.Pharmazie, 1978, v.33, p.521.

RobertsG., Gallagher B. S., Jones R. N. InfraredAbsorption Spectra

of Steroids, V. II. Interscience, New York, 1958.

RobertsH.R., Florey K. J. Pharm. Sci., 1962, v. 51, p. 794.

RobertsH.R., Siino M. R. J. Pharm. Sci., 1963, v. 52, p. 370.

RomanR.,Yates С. H., Millar J. F. J. Pharm. Sci., 1979, v.68,p.736. •

RomanR.,Yates С. H., Millar J. F. J. Chromat. Sci., 1977, v.15,p.555.

RomanR.,Yates С. H., Millar J. F., O’Neill 3., Zweig J. S.J.Pharm.

Sci., 1979, v. 68, p. 733.

Roman R., Yates С. H., Millar J. F., Van den Heuvel W. J. A. Can. J. Pharm. Sci., 1975, v. 10, p. 12.

Ronco G., Desmet G., Bezoc J. F. Clin. Chim. Acta, 1977, v. 81, p. 119.

RoosR.W.J.Chromat. Sci., 1976, v. 14, p. 505.

RoosR.W.J.Pharm. Sci., 1974, v. 63, p. 594.

RoosR.W.J.Pharm. Sci., 1978, v. 67, p. 1735.

673a.RoosR.W.J.Assoc. Off. Anal. Chern., 1980, v. 63, p. 80.

6736. Roos R. W., Medwick T. J. Chromat. Sci., 1979, v. 17, p. 624.

673b. Roos R. W., Medwick T. J. Chromat. Sci., 1980, v. 18, p. 626.

Rosenkrcntz H., Potvin P., Skogstrom P. J. Am. Chern. Soc., 1958, v. 77, p. 2737.

Rossi Е., Pascale A., Negrini Р., Frigerio A., Castegnaro Е. J. Chromat., 1979, v. 169, р. 416.

Rossler Н., Bruckner К. Naturwissensch., 1961, v. 48, р. 695.

Russo-Alesi F. М. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1968, v. 153, p. 511.

Ryan J. A., Cali L. J., McGonigle E. Anal. Chim. Acta, 1971, v. 54, p. 105.

Ryan J. J. J. Chromat., 1976, v. 127, p. 53.

Ryan M., Gray В. C. Clin. Chim. Acta, 1975, v. 60, p. 197.

Ruback G. J. Chromat., 1976, v. 116, p. 207.

Sachs L. Nature, 1964, v. 201, p. 296.

Sadee W., Dagjioglu M., Riegelman S. J. Pharm. Sci., 1972, v. 61, p. 1126.

Sadee W., Riegelman S., Johnson L. F. Steroids, 19 71, v. 17, p. 595.

Sanghvi A., Wight C., Serenko A., Balachandran R. Clin. Chim. Acta, 1974, v. 56, p. 49.

Sarfaty G. A., Fates H. M. Anal. Chern., 1970, v. 42, p. 288.

Sato K., Ohsawa N. Steroids, 1977, v. 29, p. 295.

Satyaswaroop P. Gm Lopez de la Osa Em Gurpide E. Steroids, 1977, v. 30, p. 139.

Saxena B. N., Shrimanker Km Fotherby K. J. Steroid Biochem., 1977, v. 8, p. 1117.

Schiller H. S., Hasselbrack R„ Riggs R. S., Brammal M. A. Clin. Chern., 1976, v. 22, p. 1659.

Schindler A. Em Gnad Km Walk T. Clin. Chim. Acta, 1975, v. 64, p. 287.

Schmidt G. J., Vandemark F. L, Slawin W. Anal. Biochem., 1978, v. 91, p. 636.

Schneider H. T., Lisboa В. P., Breuer H. Z. Anal. Chern., 1976, v. 279, p. 161.

Schneider J. J. J. Chromat., 1971, v. 54, p. 97.

Scholler R., Jayle M. F. (Editors). Gas Chromatography of Hormonal Steroids. Gordon and Breach-Dunod, New York, Paris, 1968.

Scholler Rm Wohnlich Jm Jayle M. F. In Jayle M. F. (Editor). Analyse des Steroids Hormonaux. Masson, Paris, v. II, 1963, p. 368.

696a. Schoneshdfer M., Maxeiner Jm Fenner A. J. Chromat. Biomed. AppL, 1981, v. 224, p. 229.

Schroeder Im Lopez-Sanchez Gm Medina-Acevedo J. См M. del Carmen Espinosa. J. Chromat. Sci., 1975, v. 13, p. 37.

697a. Schulten H. R., Muller R., O’Brien R. EM Tzodikov N. Z. Anal. Chern., 1980, v. 302, p. 387.

Schulz E. P. J. Pharm. Sci., 1965, v. 54, p. 144.

Schulz E. P., Diaz M. A. J. Pharm. Sci., 1964, v. 53, p. 1115.

Schulz E. P., Diaz M. A., Guerrero L. M. J. Pharm. Sci., 1964, v. 53, p. 1119.

Schulz E. P., Diaz M. A., Lopez G., Guerrero L. M., Barrara FL, Pe- reda A. L., Aguilera A. Anal. Chern., 1964, v. 36, p. 1624.

Schulz E. P., Neuss J. D. Anal. Chern., 1957, v. 29, p. 1662.

Schwarz V., Trojanek J. Coll. Czech. Chern. Comm., 1961, v. 26, p. 117.

Scott J. Z, Stanczyk F. Z., Goebelsmann U., Mishell D. R. Steroids, 1978, v. 31, p. 393.

Scott R. Mm Sawyer R. T. Microchem., 1975, v. 20, p. 309.

Seamark R. F., Phillipou G., McIntosh J. E. A. J. Steroid. Biochem., 1977, v. 8, p. 885.

Segura R., Golto A. M. J. Chromat., 1974, v. 99, p. 64 3.

707a. Segura R., Navarro X. J. Chromat., 1981, v. 217, p. 329.

Семенов В. А., Попов Д. M. Хим. фарм. ж., 1977, т. II, с. 136.

Seth J. J. Chromat., 1968, v. 38, р. 139.

Shackleton С. Н. L., Honour J. W. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 69, p. 267.

710а. Shackleton С. Н. L, Whitney J. О. Clin. Chim. Acta, 1980, v. 107, p. 231; 1981, v. 223, p. 33.

Shaikh B., Hallmark M. R., Issaq H. J., Risser N. H, Kawalek J. C. J. Liquid Chromat., 1979, v. 2, p. 943.

Sheldon P. E., Coppenger C. J. Steroids, 1977, v. 30, p. 149.

Shibusawa H., Sano Y., Yamamoto T., Kambegawa A., Ohkawa T., Satoh N., Okinaga S., Arai K. Endocrinol. Jpn., 1978, v. 25, p. 185.

713a. Shimada K., Tanaka T., Nambara T. J. Chromat., 1979, v. 178, p. 350..

7136. Shimada K., Tanaka T., Nambara T. J. Chromat. Biomed. Appl., 1981, v. 223, p. 33.

713b.Shimada K., Tanaka T., Nambara T. Anal. Letters, 1980,v.13,p. 1129.

713r.Shinohara Y., Baba S.,Kasuya Y. J. Clin. Endocrin. Metab.,1980, v.51,.

p. 1459.

Shirsat L. S., Shah M.H. Bull. Haffkine Inst., 1976, v. 4,p.115.

Short P. M., Rhodes С.T. Steroids, 1970, v. 16, p. 217.

Shrimanker K., Saxena B. N., Fotherby K. J. Steroid Biochem., 1978,. v. 9, p. 359.

Shroeder I., Medina-Acevedo J. C., Lopez-Sanchez G. J. Chromat. Sci., 1972, v. 10, p. 183.

Shroff A. P., Grodsky J. J. Pharm. Sci., 1967, v. 56, p. 460.

Shroff A. P., Huettemann R. E. J. Pharm. Sci., 1967, v. 56, p. 654.

Shroff A. P., Huettemann R. E. J. Pharm. Sci., 1968, v. 57, p. 882.

Siekmann L. J. Steroid Biochem., 1979, v. 11, p. 117.

Siekmann L., Martin S., Siekmann A., Breuer H. Acta Endocr., 1976, v. 82, p. 65.

Siekmann L.,Siekmann A., Breuer H.Z. Anal.Chern.,1978, v. 290,

p. 159.

Siekmann L.,Siekmann A., Breuer H.Z. Anal.Chern.,1978, v. 290,

p. 122.

Siggia S., Dishman R. A. Anal. Chem., 1970, v. 42, p. 1223.

Silvestri S. Farmaco, Ed. Pr., 1971, v. 26, p. 288.

Simpson T. H., Wright R. S. Steroids, 1978, v. 31, p. 691.

Skramovsky V., Haeberle P. Clin. Chim. Acta, 1968, v. 22, p. 161.

Singh H., Paul D., Raj Bhardwaj T., Bhutani К. K., Ram J. J. Chromat., 1977, v. 137, p. 202.

Sjostrom E., Nykdnen L. J. Am. Pharm. Ass., Sci. Ed., 1957, v. 46, p. 321.

Sjovall J., Axelson M. J. Steroid Biochem., 1979, v. 11, p. 129.

731a. Slikker W., Lipe G. W., Newport G. D. J. Chromat. Biomed. Appl., 1981, v. 224, p. 205.

Smed-Nielsen L. Arch. Pharm. Chem., 1969, v. 76, p. 965.

Smith A. G., Joannou G. E., Mak M., Uwajima T., Terada O., Brooks C. J. W. J. Chromat., 1978, v. 152, p. 467.

Smith L. L. In Engel L. L. (Editor). Physical Properties of Steroid Hormones. Pergamon Press, Oxford, London, New York, Paris, 1963, pp. 321 — 448.

SmithL.L. Steroids,1963, v. 1, p. 544.

SmithL.L., Foell T.Anal. Chem., 1959,v. 31, p.102.

SmithL.L., MullerW. H. J. Org. Chem., 1958,v. 23,p.960.

SmithR.V., HassalT. H., Liu S. C. J.Ass Off.Anal.Chem.,1970, v. 53,

p. 1089.

Snair D. W., Swinghammer L. A. J. Pharm. Pharmacol., 1961, v. 13. p. 148.

Snedden W., Parker R. B. Biomed. Mass Spectrom., 1976, v. 3, p. 295.

Solomon-Ionescu L, Russu C., Enache S. Pharm. Zentralhalle, 1965, v. 104, p. 242.

Spahr J. L., Knevel A. M. J. Pharm. Sci., 1966, v. 55, p. 1020.

742а. Sperandeo F„ Pedrozzini S., De Marchi G., Marre E. Bull. Chim. Farm., 1979, v. 118, p. 200.

Spiegelhalder B., Rohle G., Siekmann L, Breuer H. J. Steroid Biochem., 1976, v. 7, p. 749.

743a. Steele J. W., Schlunegger U. P. Can. J. Pharm. Sci., 1979, v. 14, p. 50.

Stenlake J. B., Williams W. D. J. Pharm. Pharmacol., 1957, v. 9, p. 908.

Straw R. F., Hanson F. W. J. Med., 1975, v. 6, p. 369.

Sturm G., Stabler E. Z. Anal. Chern., 1976, v. 279, p. 164.

746a. Stilber W., Mutscheler E., Steinbach D. Arch. Pharm., 1981, v. 314, p. 148.

Swendsen R., Nedergaard M. Farm. Tidende, 1964, v. 42, p. 749.

Swan D. F. K. Column, 1971, v. 13, p. 12.

Swan D. F. K. Column., 1972, v. 14, p. 9.

Symes E. K-, Thomas B. S. J. Chromat., 1976, v. 116, p. 163.

Szabo A. Magyar Kern. Lapja, 1963, v. 9, p. 613.

Szabo A. Acta Pharm. Hung., 1977, v. 47, p. 24.

Szabolcs L. Acta Pharm. Hung., 1972, v. 42, p. 68.

Szdcz Gy., Bududri-Bdrany Zc. Acta Pharm. Hung., 1974, v. 44, p. 233.

Szepesi G., Gorog S. Analyst, 1974, v. 99, p. 218.

Talbot N. B., Ulick S., Koupreianow A., Zygmuntowich A. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1955, v. 15, p. 301.

Talmage L M., Penner M. H., Geller M. J. Pharm. Sci., 1965, v. 54, p. 1194.

Tan S. Y., Murphy В. E. P. Steroids, 1975, v. 25, p. 283.

Tanemori K., Horiuchi Y., Shinobara T., Ozaki H., Yoshida T., Takagi S., Kambegawa A., Kokubu T. Horumon To Rinsho, 1977, v. 25, p. 303.

Tansey R. P., Cross J. M. J. Am. Pharm. Ass., Sci. Ed., 1950, v. 39, p. 660.

Tateishi K., Yamamoto H., Ogihara T., Hayashi C. Steroids, 1977, v. 30, p. 25.

761a. Tateishi K., Hamaoka T., Hayashi C., Goto J., Ikegawa S., Nambara T. Steroids, 1980, v. 36, p. 283.

7616. Taylor J. T., Knotts J. G., Schmidt G. J. Clin. Chern., 1980, v. 26, p. 130.

Taylor N. F., Shackleton С. H. L. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1979, v. 49, p. 78.

Templton R. J., Arnett W. A., Jakovljevic I. M. J. Pharm. Sci., 1968, v. 57, p. 1168.

The National Formulary XIV, American Pharmaceutical Association, Washington, 1975. a) p. 493, 6) p. 503.

Thenot J. P., Horning E. C. Anal. Letters, 1971, v. 4, p. 683.

Thompson R. M. J. Steroid Biochem., 1976, v. 7, p. 845.

Thompson R. M., Oei T. O. Clin. Chern., 1977, v. 23, p. 1135.

ThorntonL.K.FDA DrugAutoanalysis Manual, Method No. 22, 1972.

Thun R.,Jutz G., FrickerC. Schweiz. Arch. Tierheilkd., 1978, v.120,

p. 205.

TikkanenM.J.,AdlercreutzH. J. Steroid Biochem., 1972, v. 3, p.807.

TikkanenM.L,AdlercreutzH. Acta Endocrinol., 1973, v. 73, p. 555.

Tinschert K., Trager L. J. Chromat., 1978, v. 152, p. 447.

Tishler F., Brody S. M. J. Pharm. Sci., 1964, v. 53, p. 161.

Tishler F., Sheth P. B., Giaimo M. B., Mader W. J. J. Pharm. Sci., 1962, v. 51, p. 1175.

774a. Tomsova Z., Gregorova L, Horky K. J. Chromat., 1980, v. 200, p. 221.

Touchstone J. C., Murawec T. Anal. Chern., 1960, v. 32, p. 822.

Treiber L. R. J. Chromat., 1976, v. 123, p. 23.

Tresguerres J. A. F., Tamm J. J. Steroid Biochem., 1979, v. 11, p. 143.

Trocha P., D’Amato N. A. Clin. Chern., 1978, v. 24, p. 193.

778a. Трубников В. И. Фармация, 1980, т. 29, с. 40.

Tscherne R. J., Capitano G. J. Chromat., 1977, v. 136, p. 337.

Tsilifonis D. C., Chafetz L. J. Pharm. Sci., 1967, v. 56, p. 625.

780a. Tsilifonis D. C., Chafetz L. J. Pharm. Sci., 1980, v. 69, p. 1461.

Tyler J. P. P., Hennam J. F., Newton J. R„ Collins W. R. Steroids, 1973, p. 22, p. 871.

Umberger E. J. Anal. Chern., 1955, v. 27, p. 768.

United States Pharmacopoeia XX, USP Convention Inc., Rockville, Md., 1980. a)p.296, 6)p. 297, в) p. 299, r) p.307, д)p.313, e) p. 326,

ж) p. 556,з) p. 569, и) p. 587, к) p. 741, л)p. 773,m)p. 774.

UrbdnyiT.,MollicaJ. A. J. Pharm. Sci., 1968, v. 57,p.1257.

UrbdnyiT.,Rehm C.R. J. Pharm. Sci., 1966, v.55, p. 501.

Urbdnyi T., Pagliery M., Rehm C. R. Anal. Chern., 1967, v. 39, p. 1656.

Valle L. B. S., Oliviera-Filho R. M. J. Chromat., 1975, v. 105, p. 201.

Van Bennekom W. P., Reeuwijk H. J. E. M., Schute J. B. Anal. Chim. Acta, 1975, v. 74, p. 387.

Van den Heuvel W. J. A. J. Chromat., 1967, v. 28, p. 406.

Van den Heuvel W. J. A. Can. J. Pharm. Sci., 1975, v. 10, p. 8.

Van den Heuvel W. J. A. J. Chromat., 1967, v. 27, p. 85.

Van den Heuvel W. J. A., Horning E. C. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1960, v. 3, p. 33, 356.

Van den Heuvel W. J. A., Horning E. C. Biochim. Biophys. Acta, 1962, v. 64, p. 416.

Van den Heuvel W. J. A., Sjovall J., Horning E. C. Biochim. Biophys. Acta, 1961, v. 48, p. 596.

Van den Heuvel W. J. A., Smith J. L„ Albers-Schonberg G., Plazonnet B., Belanger P. In Heftmann E. (Editor). Modern Methods of Steroid Analysis. Academic Press, New York, London, 1973, pp. 199—219.

Van den Heuvel W. L A., Sweeley С. C., Horning E. C. J. Am. Chern. Soc., I960, v. 82, p. 3481.

Van der Molen H. J., Groen D. In Grant J. K. (Editor). The Gas Liquid Chromatography of Steroids. Cambridge University Press, 1967, p. 155.

Van der Merwe P. J., Muller D. G., Clark E. C. J. Chromat., 1979, v. 171, p. 519.

Van der Wal Sj. Ph. D. Thesis. Amsterdam, 1977.

VanderWalSj.,HuberJ. F. K. J. Chromat., 1974, v. 102, p. 353.

VanderWalSj.,HuberJ. F. K. J. Chromat., 1977, v. 135, p. 287.

VanderWalSj.,HuberJ. F. K. J. Chromat., 1977, v. 135, p. 305.

VanderWalSj.,HuberJ. F. K. J. Chromat., 1978, v. 149, p. 431.

VanHout P.,SzafranecJ., Pfaffenberger C. D., Horning E. C. J.Chro

mat., 1974, v. 99, p. 103.

Van Weeman В. K., Bosch A. E. G., Dawson E. C., Schuurs H. W. M. J. Steroid Biochem., 1979, v. II, p. 147.

Varma P., Curry C., Croecker G., Titus Dillon P., Ahluwalia B. Clin. Chim. Acta, 1975, v. 53, p. 363.

Veitch F. P., Milone H. S. J. Biol. Chern., 1945, v. 158, p. 61.

807a. Vessman J. J. Chromat., 1980, v. 184, p. 313.

Vester gaard P. In Heftmann E. (Editor). Modern Methods of Steroid Analysis. Academic Press, New York, London, 1973, pp. 1—35.

Vestergaard P., Bachman A. Clin. Chern., 1975, v. 21, p. 1270.

Vestergaard P., Sayegh J. F., Mowat J. H., Hemmingsen L. Estimation after Multi-Column Liquid Chromatography of Common Urinary Neutral Steroids with an Application to the Assay of Plasma 17-Oxosteroids. Acta Endocrinol., Suppl. 217, Vol. 88, 1978.

Vestergaard P., Sayegh J. F., Mowat J. H. Clin. Chim. Acta, 1975, v. 62, p. 163.

Vihko R., Hammond G. L. J. Steroid Biochem., 1979, v. II, p. 125.

Viinikka L. J. Steroid Biochem., 1978, v. 9, p. 979.

Viricel М., Lemar М. J. Chromat., 1976, v. 116, р. 343.

Vogt К., Oehrle К. L. Arch. Lebensmittelhyg., 1977, v. 28, p. 44.

Vogt W., Fisher I., Knedel M. Z. Anal. Chern., 1973, v. 267, p. 28.

Vogt W., Jacob K-, Fischer L, Knedel M. Z. Anal. Chem., 1976, v. 279, p. 158.

Vollmin J. A. Chromatographia, 1970, v. 3, p. 233, 238.

Vollmin J. A., Curtins H. Ch. Z. Klin. Chem. Klin. Biochem., 1971, v. 9, p. 43.

Waichenberg B. L., Sugawara S. H., Mesquita С. H., Lerario А. С.» Wachslicht H., Pieroni R. R., Mattar E. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 68, p. 67.

Wal J. M., Peter an J. C., Bories G. J. Chromat., 1977, v. 136, p. 165.

Watanabe F., Nakahara M., Tsubota N., Tsukuda K., Saiki K., Ito M. Clin. Chim. A?ta, 1978, v. 88, p. 21.

Watkins R.> Feldkamp C. S., Epstein E., Thibert R. J., Zak B. Microchem. J., 1976, v. 21, p. 466.

Weber D. J., Mitchner FL, Kaldy L., Yasaki K. J. Pharm. Sci., 1971, v. 60, p. 467.

Wehner R., Handke A. Clin. Chim. Acta, 1979, v. 93, p. 429.

825a. Wehner R., Handke A. J. Chromat., 1979, v. 177, p. 237.

Wei R., Almirez R. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1975, v. 62, p. 510,

Weiss P. A. M., Esterbauer H., Scherr F. Endokrinologei, 1975, v. 65, p. 249.

Weiss P. A. M., Winter R., Scherr F., Bayer H. Geburtsh. Frauenheilk., 1976, v. 36, p. 256.

Weiss P. A. M. Z. Klin. Chem. Klin. Biochem., 1974, v. 12, p. 279.

Weiss P. A. M., Esterbauer H., Scherr F. Geburtsh. Frauenheilk., 1975, v. 35, p. 476.

Wendland W., Lohmann К Biochem. Z., 1957, v. 328, p. 420.

Wiedemann M., Wirtz A., Karl J. H., Raith L. Z. Anal. Chem., 1974, v. 272, p. 195.

832a. Williams M. C., Goldzieher J. W. Steroids, 1980, v. 36, p. 255.

Williamson D. E. J. Pharm. Sci., 1976, v. 65, p. 138.

Wilson D. W., John В. M., Groom G. V., Pierrepoint C. G., Griffiths K. J. Endocrinol., 1977, v. 74, p. 503.

Winkler W. V., Strong J. M., Finley R. A. Steroids, 1977, v. 29, p. 739. 835a. Wintersteiger R. Microchim. Acta, 1982, p. 279.

Wolfe J. K> Hershberg E. B., Fieser L. F. J. Biol. Chem., 1940, v. 136, p. 663.

Wolfmm R. Aertzl. Lab., 1974, v. 20, p. 335.

Woodson A. L., Smith D. E. Anal. Chem., 1970, v. 42, p. 242.

Woodson A. L. J. Pharm. Sci., 1971, v. 60, p. 1538.

Wortbetg B., Wolter R., Chulamorakot T. J. Chromat., 1978, v. 156, p. 205.

Wortmann W., Wortmann B., Schnabel C., Touchstone J. C. J. Chromat. Sci., 1974, p. 12, p. 377.

Wotiz H. H., Clark S. J. Gas Chromatography in the Analysis of Steroid Hormones. Plenum Press, New York, 1966: a) p. 77—85.

Wotiz H. H., Martin H. F. Anal. Biochem., 1962, v. 3, p. 97.

Wright K., Collins D. C., Musey P. I., Preedy J. R. K. Steroids, 1978, v. 31, p. 407.

WuJ.Y. P. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1970, v.53, p. 831.

WuJ.Y. P. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1971, v.54, p. 617. -

WuJ.Y. P. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1974,v. 57, p. 747.

WuJ.Y. P. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1975,v. 58, p. 75.

WuJ.Y. P. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1977,v. 60, p. 922.

Yadau R. N., Teare F. W. J. Pharm. Sci., 1978, v. 67, p. 436.

Yamaguchi Y., Hayashi C. Rinsho Kagaku, 1977, v. 5, p. 140.

Yamaguchi Y., Hayashi C., Kumahara Y. Clin. Chern., 1976, v. 22, p. 1066.

Yamaguchi Y., Tateishi K., Hayashi C. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 66, p. 449.

853a. Yamaguchi Y. J. Chromat. Biomed. Appl., 1979, v. 163, p. 253.

8536. Yamaguchi Y. Clin. Chern., 1980, v. 26, p. 491.

853b. Yamaguchi Y., Hayashi C„ Miyai K. J. Chromat., Biomed. Appl. 1980, v. 182, p. 430.

Yamamoto Y., Osawa Y., Kirdani R. Y., Sandberg A. A. Steroids, 1978, v. 31, p. 233.

Yapo E. A., Barthelemy-Clauey A., Racadot A., Mizon J. J. Chromat., Biomed. Appl., 1978, v. 145, p. 478.

Yee H. Y., Jackson B. Anal. Chern., 1976, v. 48, p. 1704.

Yorde D. E., Plata P. E., Sasse E. A. In Pal S. B. (Editor). Enzyme Labelled Immunoassay of Hormones and Drugs. De Gruyter, Berlin, New York, 1978, p. 360.

Yoshizawa I., Ryoko O., Nakagawa A. Chern. Pharm. Bull., 1977, v. 25, p. 2137.

Yousseff A. F., Mestres R., Berges J. L. Trav. Soc. Pharm. Montpellier, 1972, v. 32, p. 343.

859a. Yousseff A. F., Mestres R. Trav. Soc. Pharm. Montpellier, 1973, v. 33, p. 35.

Zaffaroni A. Rec. Progr. Hormone Res., 1953, v. 8, p. 51.

Zak B., Epstein E. Chern. Anal., 1963, v. 52, p. 45.

Zamencik J., Armstrong D. T., Green K. Clin. Chern., 1978, v. 24, p. 627.

Zaretskii V. 1. Mass Spectrometry of Steroids. Wiley, New York, Toronto, 1976.

Zielinski W. L., Johnston K., Muschik G. M. Anal. Chern., 1976, v. 48, p. 907.

Zimmerman W. Z. Physiol. Chern., 1935, v. 233, p. 257.

Zimmerman W. Chemische Bestimmungsmethoden von Steroidhormonen in Korperfliissigkeiten. Springer, Berlin, Heidelberg, Gottingen, 1955, pp. 53—57, 63—75.

Zaleski F. R., Loh A., Carlo F. J. D. J. Pharm. Sci., 1978, v. 67, p. 1138.

Zaman P. Taianta, 1965, v. 12, p. 1337.

Zaman P., Tenygl J., Brezina M. Coil Czech. Chern. Comm., 1954, v. 19, p. 46.

3

КОРТИКОСТЕРОИДЫ

ОСНОВЫ ХИМИИ КОРТИКОСТЕРОИДОВ

Гл. 3 посвящена анализу гормонов, выделяемых корой надпочечников, их синтетических производных и метаболитов.

Как и половые гормоны (см. с. 18), кортикостероиды образуются в организме из холестерина в серии каталитических реакций, промежуточным продуктом в которых является прогестерон.

Как видно из схемы (3.1), общими структурными элементами кортикостероидов являются прегнановый скелет, А4-3-кето- и 20-кетогруппы, оксигруппа при С-21, в большинстве соединений оксигруппа при С-11 (в некоторых случаях она заменена кетогруппой), а в глюкокортикоидах еще одна оксигруппа при С-17. 17-Дезоксипроизводные составляют группу минералокортикостероидов, главная функция которых заключается в регулировании процессов метаболизма под действием электролитов и воды, в то время как глюкурониды влияют на метаболизм с участием углеводов.

Метаболизм кортикостероидов включает совместное восстановление 3-кетогруппы и А4-двойной связи с образованием «тетрагидропроизводных», которые могут существовать в четырех изомерных формах (За, 5а; Зр, 5а; За, 5Р; Зр, 5р). Как в 5р-, так и в 5а(алло)-изомерах 3-оксигруппа находится преимущественно в а-конфигурации.

На последующей стадии метаболизма происходит восстановление 20-кетогруппы с образованием двух изомеров (например, а- и Р-кортола в случае гидрокортизона). Все упомянутые (а также неупомянутые) метаболиты выводятся из организма в виде глюкуронидов или сульфатов (преимущественно по 3- и (или) 21-оксигруппам) или подвергаются дальнейшему превращению с образованием 17-кетостероидов с отщеплением боковой 17-цепи (производные андростерона и этиохоланолона).

тетрагийрокортизолтетрагийрокортизолр-кортолр-кортол

тетрагийрокортизол

тетрагийрокортизол

р-кортол

р-кортол

Рамки этого небольшого раздела не позволяют даже очертить обширную область терапии, в которой применяются кортикостероиды. Их используют при нарушениях функции коры надпочечников, в качестве противовоспалительных средств (в виде инъекций, таблеток и препаратов для наружного применения), а также при лечении аллергических и ряда других заболеваний. Из природных кортикостероидов в терапии находят применение дезоксикортикостерон и особенно гидрокортизон и его 11-кетоаналог (кортизон). В настоящее время в терапии, как правило, используются синтетические кортикостероиды. Можно назвать следующие важнейшие структурные изменения, вносимые в молекулы стероидов с целью усиления терапевтического эффекта и расширения области применения:

введение двойной связи в положение А1 с образованием преднизолона и преднизона из гидрокортизона и кортизона;

введение галогенов, в основном фтора, в положения 6 и (или) 9, а иногда и в другие положения; так, например, фтор- кортизон является 9-фторпроизводным гидрокортизона;

введение метильной группы в положение 6 или 16 и оксигруппы в положение 16; например, медрол представляет собой ба-метильное производное преднизолона;

комбинированное введение указанных функциональных групп, приводящее к получению большого числа новых очень эффективных лекарственных препаратов: дексаметазона и бетаметазона (соответственно 16а- и 1бр-метильные производные 9-фторпреднизолона), флуметазона (6а,9-дифтор-16а-метилпред- низолон), триамцинолона (9-фтор-16а-оксипреднизолон), флюо- цинолона (6а,9-дифтор-16а-оксипреднизолон), флюокортолона (А1-6а-фтор-16а-метильное производное кортикостерона) и бек- лометазона (9-хлор-1бр-метильное производное преднизолона);

применение как природных, так и синтетических кортикостероидов в терапии в форме сложных эфиров, в основном по 21-оксигруппе, а иногда по 16- или 17-оксигруппе. Что касается этих эфиров, то особенно важны водорастворимые натриевые соли их 21 -фосфатов или гемисукцинатов. Водорастворимые производные можно также получить замещением 21-оксигруппы на аминопроизводные. Например, деперзолон есть не что иное, как гидрохлорид 21-N-(N-метилпиперазинил)преднизолон.

16а, 17а-Диоксикортикостероиды (триамцинолон, флюоци- нолон и т. п.) часто используются в форме циклических кеталей, образующихся при взаимодействии с ацетоном и другими кетонами.

Кортикостероиды (даже встречающиеся в природе) получают в промышленном масштабе полусинтетически, в основном из стероидов растительного происхождения (сапогенинов, стери- нов) химическими и микробиологическими методами.

* Об изомерных формах см. с. 236.

14 Заказ № 182

МЕТОДЫ АНАЛИЗА КОРТИКОСТЕРОИДОВ

УФ-СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ

И КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ, ОСНОВАННЫЕ НА ХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХ

В этом разделе обсуждаются спектрофотометрические и колориметрические методы, основанные на реакциях а-кетольной С-17 боковой цепи кортикостероидов. Реакционноспособность С-17 боковой цепи создаст разнообразные возможности для анализа. Кроме того, эта весьма чувствительная часть молекулы легко подвергается действию окислителей, кислот и оснований, что можно использовать для разработки селективных методов [128]. Методы определения ненасыщенной 3-кетогруппы, изложенные в разделе, посвященном их применению в анализе половых гормонов (разд. 2.2.2), иногда используются и для определения кортикостероидов (в основном ГИН-метод), но они малоизбирательны.

Методы с использованием солей тетразолия

Этот метод, впервые использованный для прямого колориметрического определения кортикостероидов Ченом и сотр. [63] и Мадером и Буком [191], сейчас является важнейшим фотометрическим методом анализа кортикостероидных лекарственных препаратов, сохранившим в то же время свое прежнее значение в анализе биологических объектов.

Механизм реакции между кортикостероидами и бесцветными тетразолиевыми солями с образованием формазанов исследован Гёрёгом и Хорватом [115], Грэхемом и сотр. [121 —123, 125, 126, 226]! и Мёрле и Шиттенхельмом [213, 214].

Ниже представлена реакция между С-17 боковой цепью кортикостероидов и хлоридом трифенилтетразолия с образованием спектрофотометрически активного формазана. Молярный ко-

эффициент поглощения в максимуме (при 485 нм) равен примерно 16 200.

Если использовать димерную форму тетразолиевого синего (ТС) [хлорид (3,3'-3,3'-диметокси-4,4'-дифенилен)бис(2,5'-дифе- нил-2Н-тетразолия)], то в принципе могут образоваться два окрашенных продукта восстановления: красный моноформазан, МФ (ХмаКс=525 нм; 8 = 24 000) и синий диформазан, ДФ (^макс ~590 нм; 8=42 000). Однако в действительности константа равновесия

=0.021 (3.3)

имеет очень малую величину [115]. Это означает, что в обычных аналитических условиях фактически существует лишь красная форма, а синий диформазан образуется только при повышенной температуре или в присутствии избытка стероида, например если тетразолиевый синий используется в качестве обнаруживающего реагента в тонкослойной или бумажной хроматографии.

На практике нашли применение оба реагента (и тетразолиевый синий, и хлорид трифенилтетразолия). Преимущество тетразолиевого синего состоит в его несколько более высокой чувствительности, но эта цветная реакция имеет повышенную чувствительность к свету [122] и чистоте реагента [174]. Основным же недостатком реакции с солями трифенилтетразолия является влияние кислорода воздуха, вследствие чего ее следует проводить в атмосфере азота [158].

Подбору оптимальных условий и практическому применению этого метода посвящены многочисленные статьи и несколько обзоров, из которых здесь будут упомянуты лишь самые последние [29, 116, 221, 306а].

14*

Несмотря на то что некоторые восстановители, не относящиеся к стероидам, дают положительную реакцию [128], в которую А4-3-кетогруппа кортикостероидов вносит свой, хотя и небольшой, вклад [205] (в более жестких условиях эту же реакцию можно использовать для количественного определения данной группы [268, 278] ), метод с использованием солей тетра- золия пригоден для решения ряда практических задач как в фармацевтическом, так и в биологическом анализе.

На реакционную способность боковой цепи влияют некоторые структурные особенности молекулы стероида. 21-Эфиры кортикостероидов реагируют медленно и их нужно сначала подвергнуть гидролизу в щелочной среде [131, 274а]. (21-Фосфаты можно определить только после ферментативного гидролиза [302].) 11-Кетопроизводные более реакционноспособны, чем соответствующие 11|3-оксисоединения [125, 131]. Стерические Hpe^ пятствия у молекул 16-замещенных производных также могут привести к уменьшению реакционной способности [125].

Для того чтобы повысить активность более инертных производных, нужно заменить этанол, обычно используемый в качестве растворителя хлороформом [15] или еще лучше дихлор- метаном. С помощью последнего Грэхем и сотр. [121, 123, 124) сумели при комнатной температуре определить мало реакционноспособные производные типа эфиров бетаметазона, которые обычным методом можно анализировать только при повышенной температуре.

Интересно заметить, что если наличие или отсутствие 17-оксигруппы незначительно влияет на реакционную способность, то в случае триамцинолона, содержащего 16а,17а-диоксигруппи- ровки, интенсивность окраски, образующейся в результате реакции с тетразолиевым синим, в два раза больше, чем в случае 16-дезоксипроизводного [15, 125]. Вероятно, это связано с D-ro- моперегруппировкой кольца D первоначально образующегося 21-альдегида [115].

Эти методы определения кортикостероидов рекомендованы. практически всеми фармакопеями (за основу обычно принимают методики Джонсона и сотр. [158] и Кунца и Дэвиса [174], принятые британской фармакопеей [39] и фармакопеей США [299в] соответственно). Кроме того, следует упомянуть, что метод определения кортикостероидов в лекарственных готовых формах с использованием тетразолиевого синего в ряде лабораторий автоматизирован [31, 32, 43] (см., например, разд. 3.3.2).

За последние несколько лет Грэхем и сотр. тщательно исследовали кинетику реакции с участием тетразолиевого синего и влияние на константу скорости (псевдопервого порядка) таких факторов, как температура [226], pH [126] и диэлектрическая проницаемость растворителя [121].

Опираясь на результаты этих исследований, Отейза и сотр. [225] и Куппарис с сотр. [171а] разработали кинетические методы определения гидрокортизона и фторкортикостероидов (соответственно) в кожных мазях. В основе этих методов лежит автоматическая регистрация первого линейного участка кинетических кривых на спектрофотометрической установке с остановленной струей и линейная зависимость наклона этих кривых от концентрации кортикостероидов. Эти методы позволили сократить время реакции с 90 мин (в равновесных методах) до 30—90 с. Лэндис [175а] предложил проточно-инжекционный метод с продолжительностью реакции 30 с, основанной на взаимодействии между кортикостероидами и тетразолиевым синим в спирали длиной 3 м при нагревании до 55°С, который позволяет анализировать 100 проб в час.

Метод Портера—Зильбера

Портер и Зильбер [232] первыми сообщили о появлении желтой окраски при взаимодействии глюкокортикоидов с фе- нилгидразином в сильнокислой среде (минералокортикосте- роиды, не содержащие 17-оксигруппу, в эту реакцию не вступают). Роль 17-оксигруппы ясна из приведенного ниже механизма реакции: на первой стадии происходит катализируемое кислотой внутримолекулярное окисление-восстановление с потерей 17-оксигруппы и образованием 21-альдегида; последний вступает в реакцию конденсации с фенилгидразином, который находится в сильнокислом растворе в виде окрашенного катиона фенилгидразония в енольной форме [25, 178].

(3.4)(3.4)

(3.4)

(3.4)

Если основной областью применения тетр азолиевого метода является серийный фармацевтический анализ, то метод Портера—Зильбера (за исключением чрезвычайно редких случаев

применения в этой области [116]) всегда используется для •определения глюкокортикоидов в моче и до сих пор остается важнейшим методом анализа биологических объектов.

Хотя при определении конъюгатов в моче метод Портера— Зильбера можно использовать непосредственно без разложения конъюгатов, их обычно гидролизуют в присутствии ^-глюкуронидазы [94—96, 132, 258, 271а], чтобы получить экстрагируемые свободные кортикостероиды. Экстракция дихлорметаном [94— 96, 300] очень важна, так как позволяет удалить нестероидные хромогенные примеси. Эти примеси можно предварительно экстрагировать петролейным эфиром до экстракции дихлорметаном [90а, 300]. Ферментативный гидролиз и жидкостную экстракцию можно заменить обработкой пробы мочи каолином с последующим связыванием стероидов на колонке, заполненной смолой XAD-2 [14].

Что касается собственно колориметрической реакции, то авторы первоначального варианта методики использовали в качестве растворителя для фенилгидразина (65 мг/100 мл) смесь метанола с водой в соотношении 62:38 (по объему) и проводили реакцию в течение 20 мин при 60 °C, смешивая 8 мл реагента с 1 мл метанольного раствора кортикостероидов [232]. Позднее метанол был заменен этанолом [271] и несколько снижена концентрация серной кислоты (в большинстве методик, рекомендуемых для серийного анализа).

Оптимальная длина волны при измерении около 410 нм. Надежность метода можно повысить, вводя поправку Аллена [14, 94, 300] [см. уравнение (2.8)]. Молярный коэффициент поглощения окрашенного соединения равен примерно 28 000. Хотя на практике различные варианты метода дают несколько меньшие значения, чувствительность его достаточно высока, чтобы провести определение глюкокортикоидов в нескольких миллилитрах мочи.

Упомянем, что Хэдд [132] предложил использовать тетра- тидрокортизон-З-Р-П-глюкуронид для проверки правильности этого метода при определении конъюгатов кортикостероидов в моче.

Для повышения чувствительности и устойчивости окраски Сангви и сотр. [257, 258] предложили использовать в качестве реагента 4-гидразинбензолсульфокислоту. При взаимодействии с этой кислотой в смеси 85 %-ной фосфорной кислоты и воды в соотношении 4:6 (по объему) при нагревании до 100°С в течение 1 ч 17-оксикортикостероиды образуют желтые продукты (Хмакс = 355 нм). Благодаря увеличению чувствительности (е = = 32 000) метод можно использовать для определения 17-окси- кортикостероидов не только в моче [258], но и в плазме (2 мл), как это описано Хэддом [133].

Наконец, остается упомянуть, что определениям по методу Портера—Зильбера мешают различные лекарственные препараты или их метаболиты: карбамазепин [13], эритромицин, феназопиридин, манделат метенамина [95], ацетилспирамицин, лейкомицин, триацетилолеандромицин, рифампицин и хлорпромазин [94]. Автор этих последних статей Фуруйя предложил устранять мешающее влияние этих веществ путем обработки пробы гидросульфитом натрия после ферментативного гидролиза до экстракции дихлорметаном.

Другие методы

Важное значение имеют также методы, основанные на реакциях боковой цепи кортикостероидов, которые можно считать вариантами двух основных методов фотометрического анализа кортикостероидов — тетр азол иевого и Портера—Зильбера. Лью- барт и Мэттокс [177] предложили проводить окисление боковой цепи (как 17-окси-, так и 17-дезоксипроизводных) ацетатом меди(11) до 20-кето-21 -альдегида, который вступает в реакцию конденсации с фенилгидразином в более мягких условиях (без нагревания), чем рекомендуемые в первоначальной методике Портера—Зильбера. Хотя метод Льюбарта—Мэттокса был разработан для анализа биологических объектов, в дальнейшем принцип, положенный в его основу, был использован главным образом для анализа лекарственных препаратов, как это показано в табл. 3.1.

Приведенные в таблице данные показывают, что селективность методов анализа можно обеспечить правильным выбором реагента и условий реакции. Например, при проведении реакции Портера—Зильбера в жестких условиях 21-эфиры кортикостероидов подвергаются гидролизу, и, таким образом, можно- определить суммарное содержание эфира и свободного спирта. Однако на основе вышеописанного принципа возможно селективное определение даже 0,1 % 21-оксигруппы в присутствии эфиров [118]. Если в качестве окислителя использовать ацетат ртути (II), то можно избирательно определить 21-амино- кортикостероиды, поскольку этот реагент не взаимодействует с 21-оксикортикостероидами [117].

Для одновременного определения 17-валерата бетаметазона и продуктов его расщепления разработан дифференциальный кинетический метод [134в], основанный на разной скорости

Таблица 3.1. Фотометрическое определение кортикостероидов, основанное на окислении С-17 боковой цепи до глиоксаля

Автор

Год

Стероиды

Образец

Окислитель

Конденсирующий агент

Длина волны, нм

е

Хафез и др. [59]

1974

Бензоат бетаметазона

Препараты для наружного исследования

Ацетат Си (II)

Хлорид фенилгидрази- ния+Н25О4

425

Хафез, Цилифонис

158]

1977

Гидрокортизон, ацетонид триамцинолона и т. п.

Лекарственные дозированные формы

Ацетат Си(II)

Хлорид фенилгидрази- ния

352—370

17 000—20 500

Гёрёг и Чепези [ИЗ]

1972

21 -Оксикортикостероиды

В массе фабричного продукта

Ацетат Си (II)

4,5-Диметил-о-фенилен- диамин, НС1

351

12 500—12 700

Чепези и Гёрёг (284]

1975

Преднизолон, ацетонид триамцинолона

Лекарственные дозированные формы

Ацетат Си (II)

4,5-Диметил-о-фенилен- диамин, НС1

349—351

11800—12 600

Гёрёг и Чепези (117]

1972

21 -Аминокортикостероиды (деперзолон)

Лекарственные дозированные формы

Хлорид Hg(II) + + ЭДТА

4,5-Диметил-о-фенилен- диамин, НС1

351

12 500

Токунага и сотр. (291]

1976

17 -Дезоксикортикостероиды

В массе фабричного продукта

Ацетат Си (II)

Пиррол, НС1

570

29 700—42 600

Токунага и сотр. [292]

1977

17-Оксикортикостероиды

В массе фабричного продукта, таблетки

Ацетат Си (II)

Пиррол, НС1

590—600

26 600—35 000

Бундгаард и Хан-

•сен [43а, 1346]

1978, 1981

Различные кортикостероиды

В массе фабричного продукта, таблетки

Ацетат Си (II)

Гидразон 3-метил-бенз- тиазол-2-она

394—400

22 900—23 700

конденсации 20-кето-21-альдегидов с гидразоном 3-метилбенз- тиазол-2-она, в котором использованы условия фотометрической методики Бундгаарда и Хансена [43а, 134а] (см. табл. 3.1).

Колориметрический метод определения кортикостероидов, основанный на отщеплении боковой цепи при действии сильных окислителей и измерении количеств образующихся при этом формальдегида или 17-кетогруппы (методом Циммермана, см. разд. 2.2.2), используется в качестве стандартного метода оценки содержания метаболитов кортикостероидов (формальдегидогенных или 17-кетогенных стероидов) в моче. Для ознакомления с этим вопросом можно обратиться к монографии Джейла [156].

В качестве окислителя чаще всего применяют висмутат натрия [220]. Для устранения мешающего влияния других кето- групп их (а также 20-кетогруппы) можно восстановить боро- гидридом натрия с последующим окислением образовавшихся вицинальных диолов висмутатом натрия [10] или иодной кислотой [90] до 17-кетонов. В настоящее время публикации по этому вопросу появляются редко. Однако заслуживающим внимания исключением является недавно вышедшая статья Сен- сиола и сотр. [265]. Авторы сообщают об определении метаболитов кислотного характера в моче человека (20-кето-21-карбо- новые кислоты). Эти метаболиты разделяют на смоле XAD-2 и жидкостной экстракцией, восстанавливают (20-кетогруппы) борогидридом натрия, а затем окисляют иодной кислотой. Как показано на схеме (3.5), 17-кетогруппа (которую можно определить методом Циммермана) селективно образуется из 17-ок

сипроизводных.

соонсоон

II

(3.5)(3.5)

(3.5)

(3.5)

Другой классический метод колориметрического определения кортикостероидов заключается в их обработке концентрированными минеральными кислотами. Концентрированная серная

кислота и различные реагенты на ее основе, описанные в разд. 2.2.2 в основном как реагенты для определения эстрогенов (серная кислота, разбавленная различными растворителями, реагенты типа реагента Кобера), успешно используются также и в анализе кортикостероидов. В качестве исчерпывающего литературного источника по этому вопросу рекомендуем

Рис. 3.1. Спектры поглощения кортикостероидов в концентрированной соляной кислоте после нагревания при 80 °C в течение 30 мин [283].

1 — 17,21-диокси-4-прегнен-3,20-дион; 2 — 11а, 17,21-триокси-4-прегнен-3,20- дион; 3— 1 ip, 17,21 -триокси-4-прегнен-3,20-дион (гидрокортизон); 4— 17,21-ди- окси-4-прегнен-3,11,20-трион (кортизон).

монографию Какача и Вейделека [163]. Здесь же упомянем лишь редко используемый хромогенный реагент — соляную кислоту. Рис. 3.1, взятый из статей Шабо и Мицеи [283], иллюстрирует удивительную специфичность этого реагента. Из четырех стероидов, отличающихся только заместителями при С-11, 1 ф-оксипроизводное (гидрокортизон) обладает специфической полосой поглощения при 465 нм (е^ 10000); производные, нс имеющие 11-заместителя или содержащие lla-окси- или 11-кетогруппу, нс поглощают свет при этой длине волны. В спектрах 17-дезоксипроизводных характерная полоса 110-оксигруппы смещена к 365 нм, а у А^производных (напри- мер, у преднизолона) она появляется при 540 нм.

Риу-Лакоста и Виль [244], нагревая кортикостероиды с реагентом, содержащим уксусную кислоту, серную кислоту и дифениламин (или N-метилдифениламин), получили продукты, спектры которых отличаются необычно длинноволновым максимумом. Положение полосы поглощения (600—650 нм) и скорость реакции зависят от характера заместителя, особенно при С-11.

Для анализа кортикостероидов также применяется 2,4-ди- нитрофенилгидразин с последующей обработкой полученных

производных гидроксидом натрия. Эта реакция характеризуется чрезвычайно высокой чувствительностью, (молярный коэффициент поглощения при определении преднизона равен 51600 при 480 нм [318]).

3.2.2. ФЛУОРИМЕТРИЯ3.2.2. ФЛУОРИМЕТРИЯНаконец, следует упомянуть о необычайно избирательном методе Гёрёга и Туба [120], предназначенном для определения 21-хлор- или 21-бром- и активных 21-сульфонилоксикортикосте- роидов. Если эти стероиды нагреть с пиридином, а получившееся производное 21-пиридиния перевести в щелочной среде в желтый енолят [см. реакцию (3.6)], то молярный коэффициент поглощения при 415 нм достигает 21 000.

3.2.2. ФЛУОРИМЕТРИЯ

3.2.2. ФЛУОРИМЕТРИЯ

Интенсивность флуоресценции, вызываемой кислотами, у кортикостероидов обычно меньше, чем у эстрогенов, тем не менее этот метод повсеместно используется для их определения в биологических образцах (но не в фармацевтическом анализе). Обзоры литературных данных, полученных в этой области за ранние годы, сделаны Голдцихером [107], Джейлом [156а] и Зильбером [270].

Обычно в качестве флуорогенных реагентов используют смеси серной кислоты и органических растворителей в различных соотношениях. Связь между структурой и интенсивностью флуоресценции при действии наиболее часто применяемого реагента [смеси серной кислоты и метанола в соотношении 3: 1 (по объему)] изучена Мондером и Кендэллом [209]. Некоторые результаты их исследований приведены в табл. 3.2, из которой -следует, что этот реагент полезен при определении гидрокортизона и кортикостерона — двух основных кортикостероидов, содержащихся в плазме и моче. Кроме того, необходимо отметить, что помимо 4-ен-З-кетогруппы в появлении флуоресценции важную роль играет 11-оксигруппа, тогда как 17-оксигруппа таким свойством не обладает, а 21-оксигруппу можно заменить альдегидной или карбоксильной группой без существенного ослабления интенсивности флуоресценции. Наиболее интенсивная

флуоресценция наблюдается у 17р-карбоксипроизводного. Заслуживает внимания и тот факт, что введение альдегидной группы в положение 18 почти полностью гасит флуоресценцию, а Д^двойная связь полностью подавляет ее. Чувствительность этих методов определения гидрокортизона и кортикостерона составляет порядка 10—100 нг/мл реагента. Флуоресценция развивается полностью за 5—10 мин, и ее интенсивность обычно не меняется по крайней мере в течение 1 ч. Поскольку в литературе имеются сообщения об изменении интенсивности неспецифической флуоресценции во времени, было предпринято несколько попыток улучшить селективность метода выбором соответствующего инкубационного периода [270], но ни одна из них, по-видимому, не привела к решению проблемы, вследствие чего приходится прибегать к жидкостной экстракции или хроматографической очистке.

Таблица 3.2. Интенсивность флуоресценции кортикостероидов относительно гидрокортизонаа

СтероидСтероидИнтенсивность флуоресценции

Стероид

Стероид

1003753169 0,234111026 0,21 001003753169 0,234111026 0,21 00ip, 17а,21-Триокси-4-прегнен-3,20-дион (гидрокортизон)

100

37

53

169 0,23

411

10

26 0,21 0

0

100

37

53

169 0,23

411

10

26 0,21 0

0

а, 17 а,21 -Триокси-4-прегнен-3,20-дион 11р,17а,20а,21-Тетраокси-4-прегнен-3-он

11 р,21 -Диокси-4-прегнен-3,20-дион (кортикостерон)

17а,21-Диокси-4-прегнен-3,20-дион (вещество S Рейхштейна) ПР,17а-Диокси-3-кето-4-андростен-17-карбоновая кислота Гидрат 11р,17а-диокси-3,20-дикето-4-прегнен-21-аля

110,17а-Диокси-3,20-дикето-4-прегнен-21-карбоновая кислота

11Р,17а-Диокси-3,20-дикето-4-прегнен-18-аль (альдостерон)

11Р, 17а,21 -Триокси-1,4-прегнадиен-3,20-дион (преднизолон) 17а,21-Диокси-5а-прегнан-3,11,20-трион

Условия*. 1 мкг кортикостероида реагирует с 2 мл смеси серной кислоты и этанола в соотношении 3:1 (по объему) при комнатной температуре в течение 10 мин. Возбуждение при 470 нм, испускание при 520—530 нм [209].

Для экстракции пробы обычно применяют дихлорметан. В этом случае флуориметрический анализ можно проводить, экстрагируя флуорофор из органического слоя реагентом, состоящим из серной кислоты и этанола. Для того чтобы значительно повысить избирательность определения, пробу следует лроэкстрагировать эфиром до экстракции дихлорметаном и промыть дихлорметановый экстракт 0,1 М гидроксидом натрия для уменьшения неспецифической флуоресценции. Из большинства «ускоренных методик» [105, 199, 219, 239] эти и дру-

гие (в основном хроматографические [146]) стадии очистки чаще всего исключены, но последние исследования (например, Бутте и сотр. [48, 49]) показали, что ускоренные методики дают существенно завышенные результаты. Особого внимания заслуживают систематические исследования Радо и сотрудников, показавших, что некоторые синтетические лекарственные препараты, например карбамазепин [235], бенциклан [236], имипрамин* и тримипрамин [237], окспренолол и пропранолол * [238], интенсивно флуоресцируют и, следовательно, мешают флуориметрическому определению кортикостероидов в плазме и моче по широко известной методике Мэттиньи [199]. Аналогичное действие оказывают спиронолактоны и их метаболиты [204].

Если целью анализа является не только определение общего содержания кортикостероидов, но также индивидуальных концентраций гидрокортизона и кортикостерона, часто применяют экстракцию смесью воды и тетрахлорида углерода. Например, по последнему варианту этого метода, предложенному Пейнтером и др. [227], остаток после выпаривания дихлорметанового экстракта растворяют в водном этаноле, промывают гексаном и экстрагируют тетрахлоридом углерода. Кортикостерон можно определить непосредственно в органической фазе, а гидрокортизон нужно сначала экстрагировать из водной фазы дихлорметаном. Путем добавления к пробе меченного тритием кортикостерона и меченного 14С гидрокортизона с последующим измерением на сцинтилляционном счетчике были внесены поправки на взаимное загрязнение экстрактов из-за неполной экстракции. В этом методе неспецифическая флуоресценция была учтена путем использования в качестве холостого раствора аликвотной части дихлорметанового экстракта, проведенного через все стадии определения, после гашения флуоресценции кортикостероидов путем превращения их в 3-оксимы.

Как видно из табл. 3.2, альдостерон при действии реагента серная кислота—этанол флуоресцирует очень слабо. Чтобы сделать возможным определение этого кортикостероида, Вигхэм [311] окислил его 19-альдегидную группу в карбоксильную реагентом Бенедикта [сульфат меди(II)—цитрат натрия—карбонат натрия]. В этой форме альдостерон проявляет флуоресценцию, позволяющую проводить его определение в моче. Флуоресцентную реакцию проводят в две стадии; желтый продукт, полученный при нагревании пробы с 85?/0-ной (по объему) серной кислотой, переводят в красный продукт (возбуждение при 586 нм, излучение при 610 нм) путем добавления метанольного

раствора хлорида железа (III), что значительно улучшает избирательность метода.

Из флуориметрических методов, не связанных с вызываемой кислотами флуоресценцией, привлекает внимание методика Токунаги и сотр. [2926]. По этой методике 20-кето-21-альдегидная группа, полученная окислением а-кетольной боковой цепи ацетатом меди (II), конденсируется с пирролом с образованием сильного флуорофора (возбуждение при 594 нм, испускание при 617 нм; линейная зависимость от концентрации наблюдается в области нанограммовых концентраций).

ПОЛЯРОГРАФИЯ

Проблемы и возможности полярографического анализа как природных и синтетических кортикостероидов, так и андрогенов и гестогенов очень схожи, поскольку все они содержат одни и тс же полярографически активные центры, а именно 4-ен-З-ке- то- или 1,4-диен-З-кетогруппы. Поэтому общие положения, изложенные во введении к разд. 2.2.6, справедливы и для анализа стероидных гормонов этого класса.

Если нс считать раннего периода, полярография применяется почти исключительно для анализа лекарственных дозированных форм. Описан ряд случаев применения даже классической полярографии в определении преднизолона и преднизона в таблетках [81], гидрокортизона в мазях [98] и т. п. Введение современных методов создало новые возможности использования полярографии в анализе кортикостероидов (персменнотоковая полярография [319], полярография по второй гармонике [138], использование апротонных растворителей [319]).

Наиболее важным этапом развития следует, вероятно, считать введение дифференциальной импульсной полярографии. Повышенная чувствительность этого метода (область определяемых концентраций 5—40 мкг/мл [154, 321]) позволяет анализировать низкодозированные препараты с высокой степенью точности. Существенным достоинством метода является то, что он требует меньших затрат труда, нежели спектрофотометрические, колориметрические и т. п. методы, так как при анализе таблеток преднизона и преднизолона [321] и некоторых других не нужно отделять основу таблеток, а при определении гидрокортизона в некоторых мазях и кремах не требуется проведения экстракции [154]. Однако мази, содержащие декамин или полиэтиленгликоль, нельзя анализировать без предварительного разделения, поскольку эти поверхностно-активные вещества полностью ингибируют восстановление гидрокортизона. В серии недавно опубликованных статей Де Бойер и сотрудники подробно рассмотрели практические [71 (а—в)] и теоретические

[71, 71г] вопросы определения кортикостероидов в чистых соединениях [71а] и сложных [71в] растворах, мазях и кремах методом дифференциальной импульсной полярографии. Определение ацетонида флуоцинолона в аналогичных лекарственных формах описали Люнг и Там [1766]. Следует заметить, что эти методы нс позволяют оценить стабильность препарата, так как возможное разрушение кортикостероидов по С-17 боковой цепи не влияет на пик, обусловленный восстановлением А4-3- кетогруппы.

Рис. 3.2. Дифференциальная импульсная полярограмма дексаметазона (10-4 М) (растворитель 0,03 М гидроксид тетраметиламмония в метаноле, амплитуда импульса 100 мВ, период капания 2 с) [71].

Кроме процесса восстановления, приводящего к образованию димерного пинакона [см. реакцию (2.11)], Де Бойер и сотр. [71] наблюдали небольшой пик, отвечающий частичному восстановлению А1’4-3-кетостероидов до мономерного спирта. По наблюдениям тех же авторов, кортикостероиды, содержащие оксигруппы как в 17-, так и 21-положениях, дают интенсивные пики около 2,0 В, соответствующие восстановлению 20-кетог группы. Все три пика можно видеть на полярограмме дексаметазона (рис. 3.2).

Стоит упомянуть также, что полярографический пик флу- рандренолона (16,17-ацетонид 6а-фтор-11 р, 16а, 17,21 -тетраок- си-4-прегнен-З,20-диона), который используется для определения его в мазях по методу, предложенному Хисманом и Вудом [ 138], соответствует восстановительному элиминированию фтора. Это, вероятно, обусловлено соседством с А4-3-кетогруп- пой, так как ничего подобного не наблюдается для дексаметазона, содержащего атом фтора в положении 9, т. е. изолированного от ненасыщенной кетогруппы [71, 71г].

КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Колоночная хроматография является важным методом разделения и очистки кортикостероидов в биохимическом и фармацевтическом анализе, а также, как и в случае анализа половых гормонов, при подготовке проб (см. разд. 2.2.9) [139, 218, 234]. Стадия хроматографирования на колонке часто предшествует определению спектрофотометрическими, газохроматографичс- скими, радиоиммунными и другими методами.

Как правило, кортикостероиды — более полярные соединения, чем половые гормоны, но различие в полярности нс очень велико, поэтому для их разделения используют колонки с теми же наполнителями, но с более полярными элюентами. До сих пор находят применение «классические» адсорбенты типа силикагеля, оксида алюминия и флорисила [87, 296], но роль их уменьшилась по крайней мерс в биологическом анализе. Кавина и сотр. [56] описали интересный случай применения колонки длиной 30—100 см с внутренним диаметром 2 мм, заполненной силикагелем. Используя градиентное элюирование смесью хлороформа с метанолом, удалось удовлетворительно разделить восемь кортикостероидов. Этот метод был использован для разделения компонентов экстрактов коры надпочечников перед идентификацией и количественным определением их методом ТСХ [52].

Из разнообразных колоночных распределительных хроматографических систем [72, 129] отмстим систему Грэхема и др. [129], которые выделяли кортикостероиды на колонке с системой ацетонитрил—диатомит, а менее полярные компоненты и продукты их разложения элюировали я-гептаном. Кортикостероиды (вместе с ацетонитрилом) вымывали затем хлороформом и определяли колориметрически.

Очень часто проводят хроматографирование на колонке, заполненной амберлитом XAD-2, в основном для «экстракции» кортикостероидов. Целью се может быть простое отделение стероида от неорганических солей, мочевины и других компонентов, как, например, в методе Скандрстта и др. [260], в котором после элюирования стероидов с колонки, заполненной смолой XAD-2, метанолом необходимы стадии жидкостной экстракции, хроматографирования на колонке (с сефадексом LH-20) и ТСХ (в полиамидном слое), прежде чем определять альдостерон и его тетрагидропроизводнос в моче или плазме методом РИА или газохроматографически. (Для аналитических целей служит только смола XAD-2, см. рис. 3.3.) В ряде случаев хроматографирование на XAD-2 можно использовать также для простого фракционирования, как, например, в методе Миябо и Корнела

15 Заказ № 182

Доза Зля приема альдостерона и рн]-альдостерона

Пропускание мочи через амберлит

ХАВ-2

Жидкость-жидкостная экстракция (хлороформ / вода)/

У / / Хроматографирование на DEAE-сефадексе

Амберлит ХАВ-2Амберлит ХАВ-2Распределительная хроматография (система Е)

Амберлит ХАВ-2

Амберлит ХАВ-2

Ионообменная хроматография (система Р)Ионообменная хроматография (система Р)-> Альдостерон- 18}3-глюкозидуронобая кислота18р-глюкозидуроновой кислоты из мочи-> Альдостерон- 18}3-глюкозидуронобая кислота18р-глюкозидуроновой кислоты из мочичелочелоАмберлит ХАВ-2

Ионообменная хроматография (система Р)

Ионообменная хроматография (система Р)

-> Альдостерон- 18}3-глюкозидуронобая кислота

18р-глюкозидуроновой кислоты из мочи

-> Альдостерон- 18}3-глюкозидуронобая кислота

18р-глюкозидуроновой кислоты из мочи

чело

чело

Рис. 3.3. Выделение альдостерон-

века [53].

Заштрихованы зоны, содержащие альдостерон-18р-глюкозидуроновую кислоту (альдо-180-ГК). НС— нейтральные соединения; С — сульфаты; система Е*: целит—1,2-дихлорэтан—2-метилпропан-2-ол—вода—уксусная кислота (3:1: :3 : 1); система Р: целит—аликват—0,2 М водный KCL

[206], которые выделили фракцию метаболитов гидрокортизона в форме сульфатов перед последующим разделением на индивидуальные конъюгаты методами бумажной хроматографии и высоковольтного электрофореза на бумаге.

Из полидекстрановых гелей для разделения кортикостероидов перед определением довольно часто используется сефадекс LH-20. Из многочисленных примеров упомянем отделение гидрокортизона и эстрадиола от мешающих стероидов (в каче-

стве элюента смесь бензол—метанол (17 : 3), определение методом конкурирующего связывания белка [282]), разделение вещества S Рейхштейна и альдостерона (в качестве элюента смесь дихлорметан—ацетон (8:2), определение методом РИА [273]), автоматическое многоколоночное разделение кортикостероидов плазмы [272], отделение гидрокортизона, содержащегося в моче, на колонке, заполненной липидексом 5000, с последующим определением методом РИА (в качестве элюента смесь петролейный эфир — хлороформ (1:1) [11]) и т. д.

Наконец, на рис. 3.3, взятом из статьи Карпентера и Мэттокса [53], представлена схема сложного процесса разделения, включающая не менее шести стадий хроматографирования на колонке. Целью этой работы было выделение ранее неизвестного метаболита альдостерона для последующей идентификации (было доказано, что это был lSP-D-глюкуронид).

БУМАЖНАЯ И ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Бумажная хроматография

Данная глава является единственной, в которой бумажная хроматография выделена в отдельный подраздел. Причина в том, что сейчас в хроматографии стероидных гормонов бумажная хроматография сохранила большее значение в области кортикостероидов (и особенно их конъюгатов), чем в области стероидов с менее полярными группами. В дополнение к обсуждению во введении к разд. 2.2.10 (включая ссылки на фундаментальные монографии и главы, посвященные этому вопросу) следует упомянуть недавно опубликованный обзор Мэттокса и Литвиллера [203], в котором табулированы данные о подвижностях на бумаге 61 производного ди-, три и тетраоксипрегнанов в нескольких классических системах растворителей типа систем Заффарони и Буша. (Первые использовали сильнополярные, малолетучие неподвижные фазы, например гликоль и формамид, и гексан, бензол и т. п. в качестве подвижной фазы, а вторые — те же подвижные фазы в сочетании с летучими неподвижными фазами, например смесями вода—метанол или этанолом и т. п.) Мэттокс и др. [200—202] изучили большое число жидких ионообменников с целью использования их для разделения конъюгатов кортикостероидов кислого характера. Один из методов заключается во введении ионообменника (органические амины и их соли) в подвижную фазу для увеличения растворимости стероидов [200, 201], а в другом методе [202] вышеупомянутые соли, например аликват (хлорид метилтрика- приламмония), используют в качестве неподвижной фазы 15 *

в сочетании с водными растворами хлорида калия в качестве подвижной фазы.

Ряд других методов с использованием бумажной хроматографии находит применение в сложных аналитических методиках для очистки или разделения кортикостероидов перед последующей идентификацией и количественным определением [53, 67, 73, 88, 170, 206, 261, 276, 316а].

Разделение методом ТСХ и проблемы детектирования

Несмотря на преимущества бумажной хроматографии для анализа кортикостероидов, тонкослойная хроматография потеснила ее даже здесь, главным образом благодаря своей скорости и универсальности. В качестве основных литературных источников можно пользоваться теми же книгами, которые рекомендованы для изучения анализа половых гормонов, а большинство положений разд. 2.2.10 применимо и к кортикостероидам.

Адсорбентом чаще всего служит силикагель, а употребляемые системы растворителей несколько более полярны, чем при разделении половых гормонов. В табл. 3.3, составленной по характеристикам удерживания, заимствованным из статей Лисбоа [182] и Бэйли и сотр. [23], приведены некоторые характерные примеры разделения природных кортикостероидов и синтетических лекарственных препаратов на этом адсорбенте. (Данные об удерживании восьми кортикостероидов на силикагеле и оксиде алюминия содержатся также в табл. 2.8.)

Фундаментальные сведения о разделении кортикостероидов методом ТСХ на силикагелевых пластинках приводятся в основном в публикациях Лисбоа [181—183]. Из многочисленных более поздних примеров применения ТСХ назовем исследования разделений методом двумерной хроматографии [277], разделение А4- и А^-З-кетостероидов из растворов при ферментации [8] и контроль стабильности кортикостероидов в лекарственных дозированных формах [176] и биологических объектах [190].

Из других адсорбентов, реже используемых в ТСХ для разделения кортикостероидов, следует упомянуть о применении полиамидных слоев (вместо колонки, заполненной сефадексом LH-20 [259]) и поливинилпирролидонового слоя [194].

Поскольку из всех групп стероидов кортикостероиды наиболее чувствительны к окислению, следует принимать во внимание возможность их разложения вследствие окисления, в частности если действию кислорода воздуха подвергаются небольшие количества вещества в течение длительного времени (например, при авторадиографии). Такое разложение можно

Таблица 3.3. Разделение некоторых адренокортикоидов и родственных лекарственных препаратов (значения ^F) с помощью ТСХ на силикагеле [23, 182]

Стероид

Элюент

1

2

3

4

5

6

21-ОН-Р-4-ен-3,20-дион (дезоксикортикостерон)

40

62

55

55

21-ОН-Р-4-ен-3,20-дион-21-Ас (ацетат дезоксикортикостерона)

70

11р,21 -Ди-ОН-Р-4-ен-З,20-дион (кортикостерон)

22

31

37

38

11а,21-Ди-ОН-Р-4-ен-3^0-дион

13

20

22

26

17,21 -Ди-ОН-Р-4-ен-З,20-дион (вещество S Рейхштейна)

38

41

57

49

21-ОН-Р-4-ен-3,11,20-трион

21

49

37

42

17,21-Ди-ОН-Р-4-ен-3,11,20-трион

(кортизон)

17,21-Ди-ОН-Р-4-ен-3,11,20-трион-21-

Ас (ацетат кортизона)

21

34

41

43

97

46

11 р, 17,21 -Три-ОН-Р-4-ен-3,20-дион (гидрокортизон)

28

18

44

37

58

9

ПР, 17,21-Три-Он-Р-4-ен-3,20-дион-21-

Ас (ацетат гидрокортизона)

90

32

Па, 17,21-Три-ОН-Р-4-ен-3,20-дион

16

11

28

25

17,20р,21-Три-ОН-Р-4-ен-3,11-дион

9

16

20

25

11р,21-Ди-ОН-3,20-дикето-Р-4-ен- 18-аль (альдостерон)

16

26

26

32

11Р,17,21-Три-ОН-Р-1,4-диен-3,20-дион (преднизолон)

47

7

Продолжение табл. 3.3

Элюент

Стероид

1

2

3

4

5

6

11Р, 17,21 -Три-ОН-Р-1,4-диен-3,20-

дион-21-Ас (ацетат преднизолона)

82

27

17,21-Ди-ОН-Р-1,4-диен-3,11,20-трион (преднизон)

68

18

17,21-Ди-ОН-Р-1,4-диен-3,11,20-трион-

21-Ас (ацетат преднизона)

94

39

9-Р-11р,17,21-Три-ОН-Р-4-ен-3,20-

дион-21-Ас (ацетат фторкортизона)

94

36

9-Р-16а-Ме-11р,17,21-Три-ОН-Р-1,4-

диен-3,20-дион (дексаметазон)

61

9

9-Р-1бр-Ме-11р,17,21-Три-ОН-Р-1,4-

диен-3,20-дион (бетаметазон)

62

10

9-Р-16Р-Ме-ПР,17,21-Три-ОН-Р-1,4- диен-3,20-дион-17-валерат (валерат бетаметазона)

32

9-Р-11р,16а,17,21-Тетра-ОН-Р-1,4-

диен-3,20-дион (триамцинолон)

37

5

9-F-11 р, 16а, 17,21 -Тетра-ОН-Р-1,4- диен-3,20-дион-16,21 -ди-Ас (диацетат триамцинолона)

82

38

9-Р-11р,16а,17,21-Тетра-ОН-Р-1,4-

диен-3,20-дион- 16,17-ацетонид (ацетонид триамцинолона)

29

Обозначения. 1: циклогексан—этилацетат-—этанол (9:9:2); 2: хлороформ—этанол (9:1); 3: этилацетат—гексан—уксусная кислота—этанол (144:27:20:9); 4: бензол—этанол (4:1); 5: дихлорметан—диоксан—вода (2:1:1) (нижняя фаза); 6: дихлорэтан- метанол—вода (95 : 5 : 0,2); Р — прегнан; F — фтор; ОН — окси; Ас — ацетат; Me — метил.

предотвратить с помощью антиоксидантов, например путем обработки слоя насыщенным этанольным раствором аскорбиновой кислоты [93].

Для проявления пятен можно использовать опрыскивающие реагенты, обычно применяемые в анализе стероидов и перечисленные в разд. 2.2.10, но чаще всего таким реагентом для кортикостероидов (специфичным для восстановления боковой цепи) служит тетразолиевый синий (или другие тетразолиевые реагенты), чувствительность которых можно повысить введением их в слой [308] (химизм реакции обсуждается в разд. 3.2.1).

Количественный анализ

Определение кортикостероидов после разделения методами ТСХ и элюирования пятен — очень широко распространенный прием в фармацевтическом анализе стероидов. В качестве примера можно привести метод УФ-спектрофотометрического определения на основе светопоглощения А4-3-кетогруппой при 240 нм, опубликованный Мачиочи и Фиотеком [189]. Авторы определяли гидрокортизон в мази, содержащей хлорамфеникол и метилпарабен, после их разделения методами ТСХ на силикагеле (дихлорметан—бутанол—ацетон в соотношении 254 : 30 : : 14) и элюирования пятен метанолом. Проведение реакции с тетразолиевым синим после ТСХ-разделения и элюирования пятна — один из стандартных методов в фармакопее XX США [299г]. Предварительное разделение методом ТСХ значительно повышает селективность реакции с тетразолиевым синим и позволяет использовать его для изучения устойчивости и определения главных компонентов в присутствии родственных стероидов, как, например, при определении ацетонида флурандренолона (16,17-ацетонида 6а-фтор-110,16а, 17,21-тетраокси-4-прегнен-3,20- диона). Бишара и Яковлевич [33] проверяли этим способом чистоту последнего. Хроматографирование и многократное элюирование проводили на пластинке, покрытой силикагелем с добавкой флуоресцентного индикатора; при облучении коротковолновым УФ-излучением по гашению флуоресценции было проведено полуколичественное определение посторонних родственных стероидов (путем визуального сравнения с соответствующими стандартными препаратами). Основное пятно элюировали этанолом и проводили в элюате реакцию с тетразолиевым синим.

Разделение и очистка методом ТСХ перед определением играет важную роль и при анализе биологических объектов. Стадия ТСХ либо является частью сложного подготовительного процесса, либо (в небольшом числе случаев) методика определения достаточно специфична, чтобы ограничиться только одним (или несколькими) разделением в тонких слоях. Примером

может служить определение кортикостероидов в плазме по методу Сейбла-Эмплиса и др. [254], по которому дихлорметановый экстракт из плазмы крови подвергают ТСХ с многократным элюированием, а пятно кортикостерона (после проявления парами иода) элюируют метанолом и количественно определяют флуориметрически.

Важной областью применения тонкослойной хроматографии является очистка пробы для последующего РИА или другого варианта метода конкурирующего связывания белка [141, 144, 233]. Специальные проблемы подготовки пробы и источники ошибок разобраны в обзоре Глейспаха [104].

Существуют разные возможности для прямого сканирования in situ тонкослойных хроматограмм кортикостероидов. Первая из них заключается в измерении ослабления интенсивности полосы поглощения при 240 нм ненасыщенной 3-кетогруппы [183а]. Таким путем Каммерль и Мучлер [164] провели определение преднизолона в отдельной таблетке. Тот же прием был успешно использован Поляковым и сотр. [231а] для определения гидрокортизона в сыворотке. Гудел [109] показал, что при исследовании ацетонида флюоцинолона лучше использовать более тонкий слой, чем обычно (0,14 мм), так как при этом можно уменьшить интерференцию, вызываемую поглощением силикагеля G при сканировании в относительно коротковолновой области (238 нм).

Другой возможностью использования полосы поглощения при 240 нм является сканирование хроматограмм, основанное на гашении флуоресценции при 254 нм на пластинке, покрытой силикагелем F-254. Сравнивая точность этого метода и УФ- спектрофотометрического метода (с элюированием пятна), Ма- чиочи и Фиотек [189] пришли к выводу, что стандартное отклонение первого метода гораздо выше.

Сканирование хроматограмм можно проводить и в видимой области спектра, если проявлять пятна соответствующим опрыскивающим реагентом. Таким реагентом может быть тетразолие- вый синий [134, 183а] или смесь серная кислота—этанол [212].* В последнем случае содержание преднизолона в плазме можно определить, нанося экстракт непосредственно на пластинку. Хаф и сотр. [151] разработали метод ТСХ с денситометриче- ским детектированием для определения ацетата гидрокортизона в мазях, используя для опрыскивания п-толуолсульфокис- лоту и сканируя хроматограммы при 404 нм. Функ и сотр. [93а] добились исключительно высоких чувствительности (до 2,5 пг) и селективности при определении гидрокортизона в сыворотке, используя предварительную дериватизацию дансилгид- разином и измеряя флуоресценцию (возбуждение при 365 нм, излучение при 460 нм).

ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Термическая неустойчивость С-17-боковой цепи

Общие вопросы газохроматографического анализа стероидных гормонов обсуждались в разд. 2.2.11 (см. также приведенные в нем ссылки на работы, в которых содержатся важные сведения по применению этого метода для определения кортикостероидов). Однако следует подчеркнуть, что общие положения, обсуждавшиеся в разд. 2.2.11, только частично справедливы для обнаружения кортикостероидов. Причина здесь в том, что если большинство других стероидных гормонов можно хроматографировать без дериватизации, а целью дериватизации является обычно улучшение селективности, повышение чувствительности и уменьшение потерь, то надежное газохроматографическое определение кортикостероидов возможно только в виде производных. Из-за термической неустойчивости кортикостероидов [обусловленной наличием 17- и (или) 21-оксигрупп в 20-кетопрегнановой боковой цепи, в целом устойчивой] дери- ватизация является главной проблемой газовой хроматографии кортикостероидов.

Основной путь разрушения стероидов с диоксиацетоновой боковой цепью состоит в раскрытии 17—20-связи и образовании 17-кетопроизводных [19, 20, 111], но следует принимать во внимание и другие реакции (например, образование D-гомопроиз- водных [251]).

Несмотря на то что эти проблемы решаются путем дериватизации (описанной в следующем разделе) и для газохроматографического анализа кортикостероидов разработаны довольно надежные методы, многие аналитики все же считают газохроматографические методы громоздкими и недостаточно точными и отдают предпочтение высокоэффективной жидкостной хроматографии. О существовании такого предпочтения свидетельствуют следующие факты:

Газовая хроматография, по-видимому, не нашла применения в анализе лекарственных дозированных форм кортикостероидов, где требования к воспроизводимости и точности выше, чем в биологическом анализе стероидов .

После введения высокоэффективной жидкостной хромато-

графин в анализ стероидов в отличие от ситуации, сложившейся в анализе других групп стероидных гормонов, число статей, посвященных газохроматографическому анализу кортикостероидов, значительно снизилось, в то же время огромное количество статей публикуется по ВЭЖХ в биохимическом анализе кортикостероидов.

Тем нс менее газовая хроматография кортикостероидов все еще играет важную роль в анализе биологических объектов при установлении профиля концентрации стероидов (см. разд. 2.2.11) и при определении низких концентраций отдельных кортикостероидов, когда необходима (например, при определении альдостерона) более высокая чувствительность, которую обеспечивает газовая хроматография (особенно с детектором электронного захвата). Другая причина важности газохроматографических исследований кортикостероидов состоит в возможности использования высокоизбирательного и чувствительного метода хромато-масс-спсктромстрии.

Методы дериватизации

На схемах (3.7) — (3.12) представлена серия реакций, использованных Мейсоном и Фрезером [195] для дериватизации кортикостероидов плазмы.

Дезоксикортикостерон (ДОК) и кортизон, нс содержащие 17-оксигрупп, становятся термически устойчивыми в результате превращения в 21-гептафторбутираты [реакции (3.7) и (3.8)]. В указанных условиях [реакция протекает за 30 мин при 60 °C в смеси гептафтормасляного ангидрида и бензола в соотношении 1 : 1 (по объему)] образуется также гептафторбутират енольной формы А4-3-кстогруппы (см. разд. 2.2.11), что позволяет определять эти производные с высокой чувствительностью при помощи детектора электронного захвата (1,44 пг ДОК и 2,50 пг кортикостерона дают пик высотой 1 см при максимальной чувствительности детектора). 17-Дезоксипроизводные иногда анализируют газохроматографически в форме 21-ацста- тов [82, 267].

О

кортикостерон

CjF7

Окислительные реакции (3.9) и (3.10) напоминают процессы, происходящие при термическом разложении 17,21-диоксикортикостероидов в испарителе, т. е. образование 17-кетопроизводных (следует заметить, что раньше самопроизвольное разрушение недериватизированной боковой цепи более или менее успешно использовалось в газовой хроматографии для количественного определения [111, 188]). Термически устойчивые производные переводят в гептафторбутираты енольной формы с целью повышения чувствительности, так как в этом случае можно

использовать ДЭЗ. Окислительное отщепление боковой цепи обычно проводят с помощью висмутата натрия [19, 20, 305].

Как следует из схем (3.11) и (3.12), иодная кислота окисляет 18-оксидезоксикортикостерон и альдостерон до устойчивых лактона и гемикетальлактона соответственно . Эта реакция лежит в основе многочисленных газохроматографических методов [195, 228, 293, 315].

Превращение 17-оксикортикостероидов в 17-кетопроизводные можно осуществить восстановлением 20-кетогруппы боро- гидридом натрия с последующим окислением образующегося гликоля иодной кислотой (см. разд. 3.2.1). Оксигруппы продуктов реакции формилируют [193], ацетилируют [69] или пропио- нилируют [83].

Другим путем защиты С-17 боковой цепи от термического разложения является триметилсилилирование. Этот способ де- риватизации применяется чаще, чем описанные до сих пор методы. Доказано, что в ряде случаев триметилсилилирование оксигрупп в молекуле кортикостероидов предотвращает их разложение [250], о чем недавно сообщалось в литературе [79, 103]. При этом в обычных условиях силилирования получаются (17) ,21 -бис (триметилсилилированные) производные. В более жестких условиях силилирования (щелочной катализ) происходит енолизация 20-кетогруппы с образованием 17,20,21-трис(три- метилсилилокси)-20(21)-прегнена [60, 61], что обеспечивает более надежную защиту боковой цепи.

Чаще всего для защиты боковой цепи кортикостероидов необходима двойная дериватизация: образование метоксима по 20-кетогруппе с последующим силилированием 17- и 20-окси- групп. Этот метод предложен Гардинером и Хорнингом [99] и Харой с сотр. [135]:

БСА.ТМХСБСА.ТМХСCH2-O-St(CH3)3С=М-О-СНзCH2-O-St(CH3)3С=М-О-СНз(3.13)(3.13)БСА — бис(триметилсилил) ацетамид ТМС — тетраметилхлорсиланБСА — бис(триметилсилил) ацетамид ТМС — тетраметилхлорсилан

БСА.ТМХС

БСА.ТМХС

CH2-O-St(CH3)3

С=М-О-СНз

CH2-O-St(CH3)3

С=М-О-СНз

(3.13)

(3.13)

БСА — бис(триметилсилил) ацетамид ТМС — тетраметилхлорсилан

БСА — бис(триметилсилил) ацетамид ТМС — тетраметилхлорсилан

Он до сих пор находит широкое применение [36, 152, 196, 203а, 256, 285]. Двойная дериватизация особенно полезна при установлении профиля концентраций стероидов в биологических объектах методом капиллярной колоночной хроматографии. Много сведений о кортикостероидах можно найти в разд. 2.2.11; там же приводится подробное описание процесса дериватиза- ции.

I1JII

506070ВО90

Время, мин

Рис. 3.4. Газохроматографическое разделение изомеров 18-окситетрагидро- дезоксикортикостерона (3,18,21-триоксипрегнан-20-она) в виде МО-ТМС-про- изводных на колонке со стеклянными капиллярами размером 45 мх0,25 мм с нанесенным SE-30 при 260 °C [36].

1 — За,5а; 2 — 30,5а; 3 — За,50; 4 — 30,50.

Возможности капиллярной газовой хроматографии для разделения МО-ТМС-производных показаны на рис. 3.4 на примере разделения четырех изомеров 18-окситетрагидродезоксикорти - костерона, проведенного Бурно и сотр. [36].

Дерке и сотр. [77] определяли скорость образования гидрокортизона, улавливая отдельные тритированные кортикостероиды и измеряя их радиоактивность на сцинтилляционном счетчике. При этом соединение по боковой цепи превращали в бу- тилоксим-ТМС-производное.

Для защиты боковой цепи кортикостероидов предложены и некоторые другие производные, но большинство из них не нашло широкого применения. В качестве примера приведем метод Брукса и сотр. [24, 41, 42], основанный на применении метан- или бутанборной, кислоты для получения высокоустойчивых 17,21-циклических* боратов. Тот же принцип был недавно использован Гэскеллом и Бруксом [101] для дериватизации аль-

достерона с образованием 20,21-циклических боратов. Реакция протекает мгновенно при комнатной температуре при смешивании альдостерона с 1,1 моля соответствующей борной кислоты в пиридине или этилацетате. Это производное находит широкое применение при исследованиях методом хромато-масс-спектро- метрии. Уравнение (3.14) описывает реакцию дериватизации ацеталь-гемикетальной таутомерной формы альдостерона.

Для газохроматографического разделения кортикостероидов после дериватизации, проведенной тем или иным способом, почти всегда используются силоксановые неподвижные фазы (обычно неполярные метилсилоксаны). Хартер и Ван Ри [152] для разделения МО-ТМС-производных стероидов (в том числе кортикостероидов) методом капиллярной газовой хроматографии предложили использовать смешанные бинарные фазы (OV-225 + OV-275). Ни одна неподвижная фаза не обеспечивает разделения всех стероидов, служащих стандартами при исследованиях, например тетрагидрокортизола (За,11р,21-триокси- 5₽-прегнан-20-он) и а-кортолона (За,17а,20а,21-тетраокси-5Р- прегнан-11-он), но смеси неподвижных фаз позволяют это сделать.

Подготовка пробы при определении кортикостероидов в сложных биологических смесях методами газовой хроматографии обычно включает предварительное разделение или очистку на колонке или в тонких слоях. С той же целью иногда проводятся химические реакции. Например, Мэтин и Амос [196] удаляли гидрокортизон из преднизолона, используя способность гидрокортизона к взаимодействию с реактивом Жирара (реактив Т) с образованием водорастворимого производного.

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Среди стероидов первыми методом ВЭЖХ были проанализированы кортикостероиды [140, 269]. С тех пор ВЭЖХ стала одним из наиболее ценных методов разделения и определения кортикостероидов. Обзор литературы по этому ; вопросу недавно опубликован Фицпатриком [91].

Одной из возможных причин вытеснения 1газовой хроматографии методом ВЭЖХ в ана

лизе кортикостероидов является, вероятно, чувствительность С-17 боковой цепи к нагреванию (см. предыдущий раздел). Кроме того, метод ВЭЖХ позволяет проводить определение всех кортикостероидов с довольно высокой чувствительностью по интенсивной полосе поглощения в УФ-области спектра (за исключением, конечно, 4,5-насыщенных метаболитов). Высокая чувствительность ВЭЖХ позволяет решать почти все задачи, которые могут

0 2^ 68/00 2^ 68/0Время, минВремя, минРис. 3.5. Разделение методом ВЭЖХ ацетата галопре- дона (2-бром-6р,9-дифтор-1 lp,17,21-тpиoкcи-l,4-пpeгнa- диeн-3,20-диoн- 17,21 -диацетат) (пик/) и ба-фторэпимера (пик 2) на колонке размером 25 смХ4 мм, заполненной лихросорбом SI-100 (5мк),при элюировании 0,22 %-ным метанолом в насыщенном водой дихлорметане со скоростью 4,5 мл/мин и детектированием на УФ-детекторе (254 нм) [294].

0 2^ 68/0

0 2^ 68/0

Время, мин

Время, мин

встать перед аналитиками в области фармацевтики и биомедицины, поэтому уже в первые несколько лет после введения этого метода был опубликован огромный материал о практическом применении его в обеих областях ([21, 22, 140, 175, 208, 224] и [172, 320] соответственно). В табл. 3.4 и 3.5 приведены сведения о применении ВЭЖХ для решения различных задач фармацевтического и биологического анализа.

Достоинство метода ВЭЖХ состоит в возможности разделения изомеров. Примерами могут служить разделение 6₽- и 6а- фторэпимеров ацетата галопредона, описанное Тоскано и сотр. [294] (рис. 3.5), и разделение 17- и 21-валератов бетаметазона, проведенное Бургесом [44] (рис. 3.6), с использованием адсорбционной и распределительной (с обращенной фазой) систем соответственно. Особый интерес представляет работа Уикби,

Рис. 3.6. Разделение методом ВЭЖХ 17-валерата бетаметазона (/) и 21-вале- рата бетаметазона (2) на колонке размером 20 смХ Х4,6 мм, заполненной сфе- рисорбом ODS (10 мк), при элюировании 37,5 %-ным раствором этанола в воде при 60 °C со скоростью 2 мл/мин и детектировании на УФ-детекторе (240 нм) [44].Рис. 3.6. Разделение методом ВЭЖХ 17-валерата бетаметазона (/) и 21-вале- рата бетаметазона (2) на колонке размером 20 смХ Х4,6 мм, заполненной сфе- рисорбом ODS (10 мк), при элюировании 37,5 %-ным раствором этанола в воде при 60 °C со скоростью 2 мл/мин и детектировании на УФ-детекторе (240 нм) [44].Рота и др. [252а, 312, 313], в которой обсуждаются практические и теоретические аспекты разделения эпимерных циклических ацеталей 16а,17а-диоксикортикостероидов.

Рис. 3.6. Разделение методом ВЭЖХ 17-валерата бетаметазона (/) и 21-вале- рата бетаметазона (2) на колонке размером 20 смХ Х4,6 мм, заполненной сфе- рисорбом ODS (10 мк), при элюировании 37,5 %-ным раствором этанола в воде при 60 °C со скоростью 2 мл/мин и детектировании на УФ-детекторе (240 нм) [44].

Рис. 3.6. Разделение методом ВЭЖХ 17-валерата бетаметазона (/) и 21-вале- рата бетаметазона (2) на колонке размером 20 смХ Х4,6 мм, заполненной сфе- рисорбом ODS (10 мк), при элюировании 37,5 %-ным раствором этанола в воде при 60 °C со скоростью 2 мл/мин и детектировании на УФ-детекторе (240 нм) [44].

Что касается хроматографических систем для разделения, то широкое применение нашли как адсорбционные хроматографические системы (в основном силикагелевые носители с малым размером частиц), так и распределительные системы с обращенной фазой [в большинстве случаев силикагель с привитыми молекулами С^ (октадецилсульфат)]. Кавина и др. [57] и Таймс [298] опубликовали большое число характеристик удерживания на различных обращенных фазах и в разных адсорбционных системах соответственно. Рассмотрение этих и других литературных данных позволяет сделать вывод о том, что практически все кортикостероиды, присутствующие совместно в биологических объектах или лекарственных препаратах, можно разделить на адсорбционных или распределительных обращенно-фазных системах, если подобрать соответствующие носители и элюенты. Адсорбционная хроматография оказалась более популярной при анализе биологических образцов [304], а в фармацевтическом анализе кортикостероидов чаще используются системы с обращенными фазами.

Для анализа хроматограмм почти исключительно применяются УФ-детекторы. Как видно из табл. 3.4 и 3.5, во всех случаях можно измерять по

глощение на спектрофотометрическом УФ-детекторе при 240 нм, но значения оптических плотностей при 240 и 254 нм достаточно близки, чтобы, не жертвуя чувствительностью, использовать детектор, настроенный на определенную длину волны; большинство исследователей пользуются этим приемом. Преимущество обнаружения и количественного определения по одной и той же хромофорной группе состоит в том, что чувствительность для разных кортикостероидов почти одинакова. Интервал определяемых концентраций по градуировочному графику составляет 10—100 нг в пробе, а предел обнаружения — примерно 1 нг.

16 Заказ № 182

Таблица 3.4. Определение кортикостероидов в готовых лекарственных формах методом ВЭЖХ

Автор

Год

Определяемые соединения

Образец

рНоситель

Элюент

Длина волны УФ-детектора, нм

Бэйли и Бриттен [21]

1972

Ацетонид флюоцинолона и его ацетат

Мазь, крем

Ь Пермафаза ODS

Вода—метанол (8 : 2) или (7 : 3)

254

Моллика и Штруц [208]

1972

Пивалат флуметазона

Крем

|3ипакс с нанесенным ₽,₽'-ок- 6сидипропионитрилом

5 % этилацетата, 0,2 % ацетонитрила в гексане

Не указана

Гаэтани и Лаурери [97]

1974

Ацетонид триамцинолона, дексаметазон

Крем, таблетка

I Силикагель

Этанол—дихлорметан (1 :19)

254

Хиггинс [143]

1975

Ацетонид триамцино-

Основа таблетки

| Силикагель (зипакс)

Дихлорметан

254

лона

Гордон и Вуд [НО]

1976

Ацетонид триамцино-

Крем, суспензия

1 Сферисорб S10 ODS

Метанол—вода (56 : 44)

254

лона

hr

Корпи и др. [171]

1976

Гидрокортизон и его фосфат

Препарат для инъекций

g-Бондапак Ci8

Метанол—вода (42 : 50) с 2,2X ХЮ-4 М формиата тетрапен-

254

тилаМмония

Амин и Шнейдер [7]

1978

Бутиловый эфир 11-

Эмульсия, мазь,

^Зипакс ЕТН, пермафаза

Метанол—вода (3 : 7)

254

окси-3,20-дикето-1,4- прегнадиен-21 -кислоты и родственные производ-

свечи

ИЛИ

Аптон и др. [301]

1978

Натриевая соль фосфата

Препарат для

|ц-Бондапак Ci8

Метанол—0,09 М водный раствор КН2РО4

254

бетаметазона

инъекций

Абдо и др. [1]

1978

Ацетат флудрокорти-

Таблеткаа

| ц-Бондапак Ci8

Ацетонитрил—вода (1:1)

254

Бургес [44, 45]

1978

Бетаметазон, бекломе- тазон, клобетазон и эфиры

Крем, мазь, таблетка, препарат . для инъекций

! Сферисорб ODS или гиперсил iODS

Метанол—вода (57,5 : 42,5) или (45 : 55) (pH 5) при 60 °C

236—240

Кавина и др. [57]

1978

Ацетонид флюоциноло

Мази

Биосил А, пермафаза ODS

СН2С12—метанол—вода

254

на, триамцинолона и т. п.

(97 : 1 : 2) и т. п., вода—метанол (80 : 20—50 : 50)

Мэджерс и Джонсон [192]

Мюллер и Штюбер [216]

1978

Ацетонид флюоцинолона

Крем

Микропак TSK 1000Н поли- стирольный гель

Тетрагидрофуран

254

1978

Преднизолон

Мазь

Нуклеосил 10 Ci8

Метанол—вода—диоксан (28: 11 : 1)

240

Эст и Абдо [16]

1979

Ацетат флудрокортизона

Таблетка

ц-Бондапак Ci8

Ацетонитрил—вода (40 : 60)

254

Смит и Хоффман [275]

1979

Гидрокортизон, метил

Лиофилизирован

Сферисорб 5 ODS

Ацетонитрил—вода—уксусная кислота (35 : 65 : 2) или (40 : 60 : 2)

242

преднизолон и их ге- мисукцинаты

ный препарат для инъекций

Силикагель в виде шариков

Фармакопея XX США

1980

Ацетонид и гексацето

Крем, суспензия

Хлороформ—2-пропанол

254

[2996]

нид триамцинолона

ц-Бондапак Ci8

( 1U . 1)

Гупта [130]

1979

Преднизолон, преднизон

Таблетки, растворы

0,01 М КН2РО4—метанол (1:1)

254

Ли-Ван-По и др. [183в]

1979

17-Валерат бетаметазона

Мазь

Сферисорб

Этилацетат—хлороформ— метанол (71 : 28 : 1)

260

16*

Таблица 3.5. Определение кортикостероидов в биологических объектах методом ВЭЖХ

Автор

Год

Стероид

Биологический объект

Носитель

Элюент

Длина волны УФ-детектора, нм

Трефц и др. [295]

1975

Гидрокортизон

Плазма

Зорбакссил

Дихлорметан—этанол—вода (242 : 5 : 3)

239

Мацузава и др. [198]

1977

Гидрокортизон

Сыворотка крови

Силикагель

Дихлорметан—метанол—этанол— вода (963: 5 : 20 : 12)

254

Шведт и др. [263]

1977

Гидрокортизон

Моча

Зорбакссил или нуклео- сил 50-5

Хлороформ—метанол—вода (97,8 : 2 : 0,2) _

254

Ван-ден-Берг и др. [303]

1977

Гидрокортизон

Плазма крови

Нуклеосил NO2

Дихлорметан—2-пропанол—вода (97,5 : 2,3 : 0,2)

240

Скотт и Диксон [264]

1979

Гидрокортизон

Плазма крови

' Гиперсил ODS

Метанол—вода (45 : 55)

239

Хессе и др. [142]

1974

Гидрокортизон, кортикостерон

Сыворотка крови

Сферосил ХОА 400

Нижняя фаза смеси дихлорметан— этанол—вода (94,8 : 3,5 : 1,7)

240

Ишии и др. [153]

1978

Гидрокортизон, кортизон, кортикостерон

Сыворотка крови

Микроколонка (145Х Х0,5 мм), заполненная силикагелем Джаско SS-05

Насыщенный водой дихлорметан— метанол (97: 3)

240

Сайто и др. [255]

1977

Гидрокортизон, кортизон, альдостерон (18-ОН) - ДОК и т. п.

Плазма крови -

Пермафаза ЕТН

Градиентное (линейное) элюирование гексан->хлороформ

РИА

Роуз и Джаско [248]

1979

Гидрокортизон, преднизолон, преднизон

Плазма крови, слюна, моча

Зорбакссил

Дихлорметан—метанол

240, 280

Рирдон и др. [241]

1979

Гидрокортизон, вещество S Рейх- штейн а

Сыворотка крови

ц-Бондапак Cie

Метанол—вода (6 : 4)

254

Гарг и др. [100]

1977

Гидрокортизон, метилпреднизолон

Плазма

ц-Бондапак Cie

Метанол—вода—уксусная кислота (53 : 42 : 5)

254

АвторГодОпределяемые соединенияОбразецКиршбаум и др. [166а]Страуд и др. [2796]Ли и др. [176а]Гань и др. [97а]Гань и Лодж [976]Ван-Дейм [302а]198019801980198019801980ХальцинонидНатриевая соль фосфата преднизолонаАцетат гидрокортизона Ацетат гидрокортизона (4-левомицитин) Натриевая соль фосфата дексаметазонаАцетаты кортикостероидовМазь, крем РастворМазь, крем Суспензия, мазьРастворыТаблетка, суспензия, мазь, кремАвторГодОпределяемые соединенияОбразецКиршбаум и др. [166а]Страуд и др. [2796]Ли и др. [176а]Гань и др. [97а]Гань и Лодж [976]Ван-Дейм [302а]198019801980198019801980ХальцинонидНатриевая соль фосфата преднизолонаАцетат гидрокортизона Ацетат гидрокортизона (4-левомицитин) Натриевая соль фосфата дексаметазонаАцетаты кортикостероидовМазь, крем РастворМазь, крем Суспензия, мазьРастворыТаблетка, суспензия, мазь, крем♦ Контроль за скоростью растворения.♦ Контроль за скоростью растворения.'НосительЭлюентДлина волны УФ-детектора, нм‘Колонки, заполненные С)8Ацетонитрил—вода (6 : 4)239, 254Партисил 10 SAXБуферный раствор (pH 5,2) — метанол (9:1)254ц-Бондапак Ci8Метанол—вода (7 : 3)240RP-2Буферный раствор (pH 5) — метанол (58 : 42)242 (274)ц-Бондапак Ci80,07 М КН2РО4—тетрагидрофуран—метанол254I ц-Бондапак Ci8Смеси ацетонитрила и воды240'НосительЭлюентДлина волны УФ-детектора, нм‘Колонки, заполненные С)8Ацетонитрил—вода (6 : 4)239, 254Партисил 10 SAXБуферный раствор (pH 5,2) — метанол (9:1)254ц-Бондапак Ci8Метанол—вода (7 : 3)240RP-2Буферный раствор (pH 5) — метанол (58 : 42)242 (274)ц-Бондапак Ci80,07 М КН2РО4—тетрагидрофуран—метанол254I ц-Бондапак Ci8Смеси ацетонитрила и воды240

Автор

Год

Определяемые соединения

Образец

Киршбаум и др. [166а]

Страуд и др. [2796]

Ли и др. [176а]

Гань и др. [97а]

Гань и Лодж [976]

Ван-Дейм [302а]

1980

1980

1980

1980

1980

1980

Хальцинонид

Натриевая соль фосфата преднизолона

Ацетат гидрокортизона Ацетат гидрокортизона (4-левомицитин) Натриевая соль фосфата дексаметазона

Ацетаты кортикостероидов

Мазь, крем Раствор

Мазь, крем Суспензия, мазь

Растворы

Таблетка, суспензия, мазь, крем

Автор

Год

Определяемые соединения

Образец

Киршбаум и др. [166а]

Страуд и др. [2796]

Ли и др. [176а]

Гань и др. [97а]

Гань и Лодж [976]

Ван-Дейм [302а]

1980

1980

1980

1980

1980

1980

Хальцинонид

Натриевая соль фосфата преднизолона

Ацетат гидрокортизона Ацетат гидрокортизона (4-левомицитин) Натриевая соль фосфата дексаметазона

Ацетаты кортикостероидов

Мазь, крем Раствор

Мазь, крем Суспензия, мазь

Растворы

Таблетка, суспензия, мазь, крем

♦ Контроль за скоростью растворения.

♦ Контроль за скоростью растворения.

'Носитель

Элюент

Длина волны УФ-детектора, нм

‘Колонки, заполненные С)8

Ацетонитрил—вода (6 : 4)

239, 254

Партисил 10 SAX

Буферный раствор (pH 5,2) — метанол (9:1)

254

ц-Бондапак Ci8

Метанол—вода (7 : 3)

240

RP-2

Буферный раствор (pH 5) — метанол (58 : 42)

242 (274)

ц-Бондапак Ci8

0,07 М КН2РО4—тетрагидрофуран—метанол

254

I ц-Бондапак Ci8

Смеси ацетонитрила и воды

240

'Носитель

Элюент

Длина волны УФ-детектора, нм

‘Колонки, заполненные С)8

Ацетонитрил—вода (6 : 4)

239, 254

Партисил 10 SAX

Буферный раствор (pH 5,2) — метанол (9:1)

254

ц-Бондапак Ci8

Метанол—вода (7 : 3)

240

RP-2

Буферный раствор (pH 5) — метанол (58 : 42)

242 (274)

ц-Бондапак Ci8

0,07 М КН2РО4—тетрагидрофуран—метанол

254

I ц-Бондапак Ci8

Смеси ацетонитрила и воды

240

Автор

Год

Стероид

Биологический объект

Бютте и др. [50, 51]

1979

Гидрокортизон, флуокортолон

Сыворотка крови

Шёнёсхофер и Дульче [262]

1979

Гидрокортизон и другие стероиды коры надпочечников и гонад

Сыворотка крови, моча

Хольбе и др. [145, 247]

1976

1979

6|3-Оксигидрокор- тизон

Моча

Де-Фриз и др. [80]

1977

Альдостерон

Моча

Чен и др. [62]

1977

18-Оксидезокси- кортикостерон, кортикостерон

Экстракты коры надпочечников

Лу и др. [185]

1977

Преднизолон

Плазма

Л у и др. [186]

1977

Преднизолон, преднизон, дексаметазон

Плазма

Де-Паолис и др. [76]

1977

Дексаметазон

Молоко

Цой и Эшли [297]

1978

Дексаметазон

Плазма крови, моча

Кржемински и др. [172]

1972

Метилпреднизолон

Молоко

Рябов и Гудат [242]

1977

Натриевая соль сукцината метилпреднизолона

Сыворотка крови

Смит [274]

1979

Метилпреднизолон, гидрокортизон и их гемисук- цинаты

Сыворотка крови*

Кавина и др. [55]

1979

Природные кортикостероиды

Экстракты коры надпочечников

Кабра и др. [161]

1979

Гидрокортизон

Сыворотка крови

Фрей и др. [92а]

1979

Глюкокортикоиды

Плазма крови

Носитель

Элюент

Длина волны УФ-детектора, нм

Лихросорб SI-60

Дихлорметан—метанол—вода (100:2:0,1)

240

Лихросорб DIOL

Градиентное элюирование гексан-> гексан-диоксан (1:1)

254+РИА

Силикагель

Гексан—дихлорметан—этанол—вода

240

Микропак SI-10

Хлороформ (наполовину насыщенный водой)—метанол (98,5: 1,5)

254

Бондапак/фенил/пора- сил В

Ацетонитрил—вода (7 : 3)

244 или 254

Лихросорб SI-60

Г ексан—дихлорметан—этанол— уксусная кислота (63,8 : 30 : 6 : 0,2)

254

Лихросорб SI-60

Г ексан—дихлорметан—этанол— уксусная кислота (65,8 : 30 : 4 : 0,2) или (66,3:30:3,5:0,2)

254

Партисил ODS

Вода—ацетонитрил (77 : 23)

254

Микропак SI-5

Дихлорметан— 1 -бутанол—вода (94,7 : 5 : 0,3)

240

Зипакс с нанесенным углеводородным полимером

Вода—метанол (3:1)

254

ODS Sil-X-1

Метанол—вода (4 : 6)

254

Сферисорб ODS

Ацетонитрил—уксусная кислота— вода (35 : 65 : 2 или 30 : 70 : 2)

254

Лихросорб DIOL или SI-100

Градиентное элюирование смесью метанол—хлороформ

254

ц-Бондапак Cis

Фосфатный буфер—ацетонитрил (7:3)

254

Силикагель

Дихлорметан—тетрагидрофуран— метанол—уксусная кислота (96,85 : 1 : 2,1 : 0,05)

254

Автор

Год

Стероид

Биологический объект

Носитель

Элюент

Длина волны УФ-детектора, нм

Гёль и др. [106а]

1979

Гидрокортизон в форме дансил- гидразона

Плазма крови

Лихросорб SI 60

Дихлорэтан—бутанол—вода (91 : 8,5 : 0,5)

Флуориметри- ческое детектирование

Петерсен и др. [229а]

1980

Бетаметазон, его ацетат, гидрокортизон

Плазма крови, моча

RP-8

Метанол—вода (6 : 4)

240, 254

Скотт и др. [264а]

1980

Преднизолон, преднизон, гидрокортизон

Плазма крови

Силикагель, партисил

Дихлорметан—этанол—вода

239

Прайс-Джонс и Васс [234а]

1980

Преднизолон

Синовиальная жидкость

Сферисорб 5-ODS

Метанол—уксусная кислота—вода (53 : 5 : 42)

254

О’Хейр и др. [223а]

1980

18-Гидроксилированные производные

Ткань опухоли коры надпочечника

Обращенные фазы и обычные системы фаз

240, 254

Агабейоглу и др. [1а]

1980

Преднизолон, преднизон, гидрокортизон

Плазма крови

Силикагель

Гексан—дихлорметан—этанол— уксусная кислота (68,8 : 25 : 6 : 0,2)

254

Де-Фриз и др. [80а]

1980

Гидрокортизон, вещество S Рейх- штейна

Плазма крови

Силикагель

Хлороформ—изооктан—метанол— вода (48,5 : 48,5 : 2,9 : 0,12) или (71 : 25 : 3,75 : 0,25)

254

Баллерини и др. [24а]

1980

Гидрокортизон, кортизон, альдостерон и т. п.

Экстракты коры надпочечников

Лихросорб SI-100

Лихросорб RP-8

Градиентное элюирование смесями хлороформ—метанол, ацетонитрил— вода

242

Шёнёсхофер, Джастер и др. [155а, 262а, б]

1980

Гидрокортизон, альдостерон и т. д.

Моча

Лихросорб DIOL

Градиентное элюирование смесью гексан—2-пропанол (3:1)

254 РИА

Мунсон и Вильсон [214а]

1981

Ципионат гидрокортизона

Суспензия

|л-Бондапак Ci8

Ацетонитрил—вода (1:1)

254

Роччи и Джаско [245а]

1981

Преднизолон, преднизон и их метаболиты

Моча

Зорбакссил

Гептан—дихлорметан—этанол— уксусная кислота (38 : 18:5: 1)

254

Рис. 3.7. Определение ацетонида триамцинолона в фармацевтическом креме методом ВЭЖХ на колонке размером 25 смХ5 мм, заполненной сферисорбом S10 ODS, при элюировании смесью метанол—вода (56 : : 44) со скоростью 1,3— 1,5 мл/мин и детектировании на УФ-детекторе (254 нм) [НО].Рис. 3.7. Определение ацетонида триамцинолона в фармацевтическом креме методом ВЭЖХ на колонке размером 25 смХ5 мм, заполненной сферисорбом S10 ODS, при элюировании смесью метанол—вода (56 : : 44) со скоростью 1,3— 1,5 мл/мин и детектировании на УФ-детекторе (254 нм) [НО].1 — ацетонид триамцинолона; 2 — преднизолон (внутренний стандарт); 3 — ме- тил-/г-оксибензоат; 4 — про- пил-п-оксибензоат.1 — ацетонид триамцинолона; 2 — преднизолон (внутренний стандарт); 3 — ме- тил-/г-оксибензоат; 4 — про- пил-п-оксибензоат.

Рис. 3.7. Определение ацетонида триамцинолона в фармацевтическом креме методом ВЭЖХ на колонке размером 25 смХ5 мм, заполненной сферисорбом S10 ODS, при элюировании смесью метанол—вода (56 : : 44) со скоростью 1,3— 1,5 мл/мин и детектировании на УФ-детекторе (254 нм) [НО].

Рис. 3.7. Определение ацетонида триамцинолона в фармацевтическом креме методом ВЭЖХ на колонке размером 25 смХ5 мм, заполненной сферисорбом S10 ODS, при элюировании смесью метанол—вода (56 : : 44) со скоростью 1,3— 1,5 мл/мин и детектировании на УФ-детекторе (254 нм) [НО].

1 — ацетонид триамцинолона; 2 — преднизолон (внутренний стандарт); 3 — ме- тил-/г-оксибензоат; 4 — про- пил-п-оксибензоат.

1 — ацетонид триамцинолона; 2 — преднизолон (внутренний стандарт); 3 — ме- тил-/г-оксибензоат; 4 — про- пил-п-оксибензоат.

На практике в большинстве случаев такая чувствительность достаточно высока, чтобы обойтись без дериватизации.

Недавно Хорикава и сотр. [149]

предложили проводить дериватизацию кортикостероидов после выхода с колонки с образованием комплексов алюминия с гидразоном 3-изоникоти- новой кислоты. Кортикостероиды детектируют по флуоресценции этих комплексов, что приводит к повышению избирательности (но не чувствительности) метода.

Кроме того, недавно Кавасаки и сотр. [166] и Гейл с сотр. [106а] описали метод доколоночной дериватизации для определения гидрокортизона в плазме и моче методом ВЭЖХ в виде дансилгидразона с последующим флуориметрическим детектированием (возбуждение при 350 нм, испускание при 505 нм) с пределом обнаружения 0,2 нг. Такой же чувствительности добились Готелли и сотр. [ 110а], используя флуориметрический детектор (возбуждение при 366 нм, испускание при 488 нм) и доколоночную дериватизацию (смесью серной кислоты и этанола в соотношении 7:3).

Любопытный метод дериватизации предлагают Деккер и Бейнен [71д].

Для того чтобы полнее отделить преднизолон от продукта его окислительного отщепления, 21-альдегида преднизолона, последний переводят в суль- .

фит добавлением сульфита натрия к элюенту при хроматографировании с обращенной фазой.

Следует упомянуть, что ВЭЖХ начали применять для пред

варительного фракционирования при последующем определении методом РИА [47, 155а, 255, 262, 262,а—в]. Высокая селективность обоих методов и большая чувствительность РИА позво

лили создать гибридный метод, замечательный с обеих точек

зрения.

Что касается использования ВЭЖХ в фармацевтическом анализе кортикостероидов, то весьма вероятно, что он станет

частью теста для контроля за чистотой новых лекарственных препаратов, как это показано, например, Тоскано и др. [294] для ацетата галопредона (17,21-диацетата 2-бром-бр,9-дифтор-

*0,08

* 0,07

~1О,об

0,05

0.0^

0,03

Время, минВремя, минРис. 3.8. Определение гидрокортизона в плазме человека методом ВЭЖХ на колонке размером 20 см X 4,6 мм, заполненной нуклеосилом NO2, при элюировании смесью дихлорметан—пропан-2-ол—вода (97,5 : 2,3 : 0,2) со скоростью 1,15 мл/мин и детектировании на УФ-детекторе (240 нм) [303].Рис. 3.8. Определение гидрокортизона в плазме человека методом ВЭЖХ на колонке размером 20 см X 4,6 мм, заполненной нуклеосилом NO2, при элюировании смесью дихлорметан—пропан-2-ол—вода (97,5 : 2,3 : 0,2) со скоростью 1,15 мл/мин и детектировании на УФ-детекторе (240 нм) [303].0,020,02

Время, мин

Время, мин

Рис. 3.8. Определение гидрокортизона в плазме человека методом ВЭЖХ на колонке размером 20 см X 4,6 мм, заполненной нуклеосилом NO2, при элюировании смесью дихлорметан—пропан-2-ол—вода (97,5 : 2,3 : 0,2) со скоростью 1,15 мл/мин и детектировании на УФ-детекторе (240 нм) [303].

Рис. 3.8. Определение гидрокортизона в плазме человека методом ВЭЖХ на колонке размером 20 см X 4,6 мм, заполненной нуклеосилом NO2, при элюировании смесью дихлорметан—пропан-2-ол—вода (97,5 : 2,3 : 0,2) со скоростью 1,15 мл/мин и детектировании на УФ-детекторе (240 нм) [303].

0,02

0,02

1 — гидрокортизон; 2 — 86 нг преднизолона (внутренний стандарт).

11р, 17,21-триокси-1,4-прегнадиен-3,20-диона). Однако главной областью применения метода ВЭЖХ является анализ низкодо- зированных мазей и кремов (см. табл. 3.4), которые трудно анализировать любым другим методом. В большинстве случаев при правильном выборе хроматографических систем их селективность позволяет проводить анализ после простого растворения пробы или экстракции, минуя трудоемкие этапы очистки. На рис. 3.7 представлены две хроматограммы, полученные Гордоном и Вудом [НО] в процессе определения ацетонида триамцинолона в мази. В этом примере пробу экстрагировали изооктаном и метанолом и последний вводили непосредственно в хроматограф.

ВЭЖХ — идеальное средство контроля устойчивости кортикостероидных лекарственных препаратов и установления пути их разложения. В качестве примеров упомянем исследования, проведенные Корнейо и др. [67а] и Хансеном и Бундгаардом [134а] по гидрокортизону, Деккером и Бейненом [71д] — по преднизолону, Штраудом и др. [2796] — по натриевой соли фосфата преднизолона, Киршбаумом и др. [166а] — по халци- нониду и Ли-Ван-По и др. [183в] — по 17-валерату бетаметазона.

Были сделаны попытки автоматизировать анализ лекарственных дозированных форм методом ВЭЖХ [30], а также описано использование этого метода для определения скорости растворения таблеток кортикостероидов [906].

За исключением особых случаев подготовка проб для анализа кортикостероидов методом ВЭЖХ в плазме и моче также гораздо проще, чем в других методах. Обычно достаточно промыть экстракт гидроксидом натрия, выпарить его досуха и растворить сухой остаток в элюенте. В качестве примера на рис. 3.8 приведена хроматограмма, взятая из работы Ван-ден- Берга и сотр. [303].

Целью анализа в этом случае было определение гидрокортизона в плазме. Как видно из рисунка, пик гидрокортизона достаточно далеко отстоит от пиков других компонентов крови и внутреннего стандарта — преднизолона (так же, как и в предыдущем примере на рис. 3.7 и во многих других случаях).

Метод ВЭЖХ обычно используют для определения свободных кортикостероидов. Если целью анализа является определение общей концентрации, то, конечно, предварительно следует провести гидролиз конъюгатов, как, например, при определении альдостерона в моче, описанном де-Фризом и др. [80].

РАДИОИММУННЫЙ

И ДРУГИЕ РАДИОИЗОТОПНЫЕ МЕТОДЫ

Обсуждение, приведенное во введении к разд. 2.2.13, почти - полностью можно отнести к использованию радиоизотопных методов для анализа кортикостероидов в биологических объектах.

Меченые кортикостероиды обычно применяют для контроля полноты экстракции и разделения на отдельных этапах сложных аналитических методик в анализе биологических образцов [88], а также лекарственных дозированных форм, например мазей и масляных растворов [1].

Метод двойного изотопного разбавления раньше был очень популярен в этой области, но в последние годы сообщения о его применении, так же как и для анализа подовых гормонов,

поступают редко. Прекрасный обзор, посвященный этому и родственным методам, .был опубликован Бойзеном и сотр. [35]. В нем рассматривается использование стероидов, меченных тритием и 14С, в качестве радиоактивных индикаторов и образование n-иодбензолсульфонатов, содержащих либо 35S, либо 1251. В недавно опубликованной статье Мацумото и сотр. [197] описали определение кортикостероидов в плаценте человека с применением тритированных индикаторов и 355-тиосемикарбазида для получения радиоактивных производных по 3-кетогруппе.

Метод конкурирующего связывания белка

Хотя, по литературным данным, радиоиммунный анализ в области кортикостероидов обладает более высокой избирательностью и лучшей чувствительностью, методы конкурирующего связывания белка также нашли широкое применение и применяются до настоящего времени. Большинство опубликованных статей посвящено анализу гидрокортизона в моче [74, 92] и крови [27, 28, 68, 70, 74, 157, 169, 215, 217, 222, 245], но описаны также методы анализа других кортикостероидов, например кортикостерона [139а, 157, 167, 169, 279], дезоксикортикостерона [157, 169], преднизолона [288, 316] и т. д.

В качестве связывающего белка обычно используют богатые транскортином сыворотки, получаемые из разных источников. Специфичность сильно зависит от источника получения сыворотки. Например, Мэрфи [215] обнаружил, что транскортин лошадей обладает низким сродством к прогестерону; следовательно, при использовании этого связывающего белка мешающее влияние прогестерона ничтожно. При использовании менее избирательных белков мешающего влияния менее полярных стероидов можно избежать путем проведения предварительной экстракции тетрахлоридом углерода [70, 157, 160]. Кортикостероиды обычно экстрагируют дихлорметаном, а во многих случаях анализ можно провести прямо в биологической пробе. Очевидно, что предварительное хроматографирование повышает избирательность метода, но этот прием в повседневной работе используется редко [169, 316]. Хроматографирование, конечно, неизбежно при определении большого числа компонентов. Например, Колановски [169] определял гидрокортизон, его 11-дезоксианалог и кортикостерон в плазме и моче после экстракции дихлорметаном и разделения методом ТСХ с последующим анализом отдельных фракций методом конкурирующего связывания белка.

Для разделения свободного и связанного кортикостероидов чаще всего используют древесный уголь с нанесенным декстра-

ном, но имеются также сообщения о применении хроматографии на сефадексе [27] или флорисиле [215]. Заслуживает внимания любопытный подход к этой проблеме Мюллера и др. [217]: авторы проводили все стадии анализа (т. е. отделение гидрокортизона от сыворотки, его выделение из комплекса с белком, взаимодействие до установления равновесия со связывающим белком транскортином и разделение связанного и несвязанного гидрокортизона) на колонке, заполненной сефадексом G-10, облегчив тем самым автоматизацию метода.

По методике Тана и др. [286], при определении гидрокортизона в амниотических жидкостях для повышения избирательности проводят экстракцию этилацетатом и хроматографирование на сефадексе LH-20, а процент выделения на этих этапах устанавливают при помощи тритированного гидрокортизона. Стероидом-индикатором, конкурирующим с гидрокортизоном за активные центры белка транскортина плазмы человека, служит тритированный кортикостерон (в присутствии 10—14 нг гидрокортизона степень его связывания изменяется на 50 %). Равновесие устанавливается за 1 ч при 0 °C, после чего добавляют древесный уголь с нанесенным декстраном и разделяют свободный и связанный кортикостерон центрифугированием; в полученной надосадочной жидкости измеряют радиоактивность.

Из статей, цитированных в этом разделе, особого внимания заслуживают те, в которых проводится сравнение метода конкурирующего связывания белка и метода радиоиммунного анализа [74, 157, 288].

Радиоиммунный анализ

Как и в случае половых гормонов (см. разд. 2.2.13), РИА становится одним из важнейших микрометодов определения кортикостероидов в биологических объектах.

Основные положения упомянутого выше раздела почти полностью справедливы и для кортикостероидов, поэтому, не об-- суждая ряд методик, опубликованных между 1977 и 1980 гг. (табл. 3.6), остановимся здесь лишь на некоторых специальных вопросах.

Данные табл. 3.6 показывают, что, несмотря на преимущества 1251, отмеченные работающими с ним исследователями [2, 108], тритированные индикаторы, судя по недавно опубликованным работам, применяются шире (даже шире, чем в области половых гормонов), главным образом благодаря меньшему перекрестному взаимодействию. Последнее утверждение, однако, нс бесспорно [240]. Вообще говоря, преимущество методов с использованием в качестве метки 1251, а не 3Н, связано с преиму-

Таблица 3.6. Определение кортикостероидов радиоиммунными методамиТаблица 3.6. Определение кортикостероидов радиоиммунными методами

Таблица 3.6. Определение кортикостероидов радиоиммунными методами

Таблица 3.6. Определение кортикостероидов радиоиммунными методами

Продолжение табл. 3.6

Автор

Год

Стероид

Образец

Условия хроматографирования

2 «

Я 2

Разделение фракций связанного и несвязанного стероидов

Пратт и др. [233]

1977

Тетрагидроальдостерон

Моча

тех

3Н

ДДУ

Делассаль и др. [72]

1977

Тетрагидроальдостерон

Моча

Целит

3Н

ДДУ

Хильфенхаус [144]

1977

Альдостерон

Моча, плазма

тех

3Н

ДДУ

Хабл и др. [150]

1978

11-Дезоксигидрокортизон

Плазма

—

3Н

ДДУ

Парк [229]

1978

60-Оксигидрокортизон

Моча

—

Зн

ДДУ

Ден и др. [75]

1978

18-0кси-11-дезоксикортикостерон

Плазма

Силикагель, сефадекс

LH-20

Зн

ДДУ

Кано и др. [165]

1978

Бетаметазон

Плазма

—

Зн

ДДУ

Сулон и Спарано [280]

1978

18-0кси-11 -дезоксикортикостерон

Плазма

—

Зн

ДДУ

Уилл и др. [314]

1977

Тетрагидрокортизон, тетрагидрокортизол

Моча

—

Зн

ДДУ

Риад-Фахми и др. [243]

1979

Гидрокортизон

Плазма

*—

I25J

Иммоболизован- ные антитела

Уонг и др. [317]

1979

Гидрокортизон

Сыворотка крови

—

I25J

Метод двойных антител

Уолш и др. [310]

1979

Альдостерон

Моча

вэжх

Зн

ДДУ

Шёнёсхофер и др. [2626]

1980

Гидрокортизон

Моча

I25J

Зн’

Иммобилизованные антитела, древесный уголь

роглобулином бычьей сыворотки) [279а]. 17 Заказ № 182

2 2 я ^ Е 1

X 2

о §^ я я

X

§в

53

о ^

S S

Е S

8

я

2 2

а

a ё и D3 я S CD s

S

S►6*

S л S

S

3- 8

я S

X о S X

п

щ Дс

о л S

х

S

cd

X о S к

S

X

S

я CD X

я я я о

я

CD о я я

я о я

я

я о £

о

X

X

X о S я я CD X

яя

я я CD о X я

CD я X я я я

я я ■о я S CD

g о ^ я о

о о я

о

X о

X о я ^ 5

о я

я

CD яз о я я

CD я

X о

X

X о S я я CD X о о я

я о я о я я W

3

я

я

CD

о\ О

£

я о

о

о я

я я 5

я

о я я

я

X о

о

я

CD

■о

я

я я я о

о

я о ^ CD я я я

Е CD я я я

я W

я

CD я я я о

я

о я

я CD я CD я я

о яз

о

X о Яс

я яз

о я о я

я -

я

X я S я

X я CD

CD я X я я я

Я

я

о

£ я о

я

X

я

я

X

я

CD я

я я X

я "О о я я я я CD S

CD о я

о W я я я

я я >4 о

ио ?

я

я

S о

о

я CD я

о я

о о о

я я

я

CD я

CD

я

S я

я "О я S

я S я

CD

о я о S

CD

X о

о о я о я я о S

Я

я я я я я я

о я

>4

я

я -о о я о >4 я

о

я CD я CD я я CD

X о ■о о Е

5 я

я яз я

CD я

о

я

я

о

CD ■о о я

5=1 я

о я

я CD >4

CD я я

о

>4 я я х о

X О

я

я

о

о

я я о Яс

я

■о о

я я

я

>4 о я о 5=1 я я о

я CD я я

я я >4 о

я CD X

я я я

£ я=

я

о я я

я я

я

я

S о

Я

я я

Я=

Яя

CD"О

X я CD

я

х Я я

о

я я я о

X я я я

я

Я

X

X 5

X я

о X о я S

о X о я S

я я я о

CD "О

о я

я я

я

Я

СО

я

я

я £

я

5 Е CD

я ■о

я я £

CD я

X о

S я

X о

S я я CD X

я

to

я

я я я я CD я

Я

о я яз

CD я CD я CD я я я

w CD 1 ^

® я ^ я £ CD я я

я о

CD я

CD

со

я яз

я я CD я CD я

я £ CD

я CD я я

я

о

я

я

о CD я я я CD я я я

я я я

W

Я

х

я о

■о о

X

CD

о я

я

я

°8 § ° о Q

я= я

^ я

Е я

о X о я

CD S я

X я я я

я X

я яз

о я W я о я я £ X

я

х Я я CD

яяXяояз

S CD

о X о Яс

о

X о 2

о

я я

я

CD я я я о Яс

я я

о я яз я я

я

>4 CD я

Я

£

Е CD я я

о ^ я £ X

CD я я CD S

X

Е

CD

CD Я

Я я

QD s

я

Я я о

W о

я

я

я о я я

о

я

я я я я я

CD я я я о

я Do я

я

О s

CD ।—

X Я

Do -5

CD

я CD я

о CD я я я CD я я

я я W о я о я

X

X

CD

to

Я Я CD Я- я я

я

£ я=

S о

я я я о

X

3 о я я

X

я

яяя

я

я

-о

CD

о

я

о ^ я о

Я CD я я

я о

о я

CD я CD я

я -

to X !— ро А .3

X я я я

я "О я S CD

X

CD я CD X

я я я о

я я

я о я о я

X

Я

я

я я я о

я яз я я CD я я

X

я CD о о X о я я g о

я

я

я

X

о

я я W я я

о

£

я я я

S

я CD S

о

я CD

я

>4 я я W о я о я

я "О я

о я

я CD я

я я

о

о

я

Е я

о -о S о я о

X■оо

я

я

я о я

я

о

CD я

я

X

я CD X о я о

я

X о CD

я

я

■о я

я

о я

о

CD

я

я

я я W о я о я

о

о я

о я >4 о я

я

я

о

я

я

я

CD

я ■о о я

я

я

я

я я S я

я ■и я

Е CD я я

я о я

CD я о

о о

я я

я

о я

ояя

я я о S

to

CD

я о я о я

я £

CD -

CD ।

>о

я я

X

X

я я я я я я

я я о я

to

о я я я 3=4 о

я ■о о о я CD S

Я я

я

я

CD

я я я

я

я 3=4 -а о X о

Яс ?

я

X

я

я я я

-О я

я я

я о я

я

яя

CD

я я я

X о я

X

о X о я S CD н о X о я ^ я £ CD

о ■о S о я о я

я я

О н-ГО «о

X о £ я я CD X о £

я X о я

я CD "О CD

Е

о

я я я я

я я я

я S CD я я 3

о я

я

о я

я о

я

tos

х 5 я я я я

о о

я £

я о я о я я W

CD S £ CD

я

я о о я CD я я CD CD

я я ч я я я я я я о я я

я

CD

я

О

о

Ф "О

О

ю СП

у-лактона альдостерона с З-О-карбоксиметоксимом альбумина бычьей сыворотки, а экстрагированный из плазмы альдостерон окислить в лактон иодной кислотой в этаноле до инкубирования с антисывороткой [9, 281] [см. схему (3.12)].

Рис. 3.9. Стандартные кривые радиоиммунного определения альдостерона.

I — антисыворотка против альдостерон-З-О-карбоксиметоксим-белкового комплекса; 2—антисыворотка против альдостерон-18,21-дисукцинат-белкового комплекса [141].

Интересный подход к улучшению избирательности радиоиммунного определения преднизолона в плазме предложен Лу и сотр. [187]. Мешающее влияние эндогенного гидрокортизона

Таблица 3.7. Степень перекрестного взаимодействия некоторых стероидов с двумя разными альдостеронными антисыворотками [141]

—.——

18,21-Дисук

З-О-Карбокси-

Стероид

цинат альдо

метоксим -

стерона

альдостерона

Гидрокортизон (кортизол)

<0,01

0,06

<0,01

0,06

<0,01

1,00

0,20

<0,01

<0,01

<0,01

<0,01

<0,1

<0,1

<0,1

<0,1

<0,1

7,0

7,0

- <0,1

<0 1

Кортизон Кортикостерон

Дезоксикортизол Дезоксикортикостерон

Зр,5а-Тетрагидроальдостерон Зр,5р-Тетрагидроальдостерон Тетрагидрокортизол

Тетрагидрокортизон Тетрагидродезоксикортизол Тетрагидродезоксикортикостерон

<0J

<0,1

устраняли путем обработки пробы реактивом Т Жирара (хлорид бетаингидразида), который практически избирательно реагирует с 3-кетогруппой гидрокортизона, образуя водорастворимое производное, легко отделяемое от непрореагировавшего преднизолона экстракцией до радиоиммунного определения.

На заключительной стадии определения отделяют свободные кортикостероиды от связанных с антителом с помощью древесного угля, покрытого декстраном, но возможны и другие способы, в том числе разделение на стенках пробирок с привитым антителом [137].

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ

Фотометрические и флуориметрические методы

Ферментативные фотометрические и флуориметрические методы определения кортикостероидов основаны на окислении- восстановлении оксикетонных систем, и в частности на восстановлении 20-кетогруппы [3, 4, 5, 136, 137] в присутствии (ЗР)20сс-оксистероид—дегидрогеназы. Во всех случаях контроль за реакцией осуществляется при помощи системы НАД(Ф)— НАДН. При этом для измерений используют либо уменьшение концентрации НАДН (спектрофотометрия при 340 нм [3—5]), либо разложение НАДН под действием соляной кислоты и превращение НАД в флуоресцирующее производное путем обработки 6,6 М гидроксидом натрия при 60°С [136, 137]. Для определения 1 ip-оксикортикостероидов предложен [46] также флуориметрический метод, основанный на превращении 11р-ок- систероид—НАД (Ф) -оксидоредуктазных систем.

Этими методами можно также решать задачи, связанные с определением гидрокортизона и родственных соединений в плазме [46, 136, 137] и моче [3—5]. Для улучшения избирательности в некоторых случаях применяют также колоночную хроматографию на сефадексе LH-20 [136, 137] или ТСХ [46].

Иммуноферментный анализ

Как и в анализе половых гормонов, для анализа кортикостероидов наряду с РИА стал применяться иммуноферментный анализ. Основные положения разд. 2.2.14 справедливы и для этой области.

Почти все цитируемые ниже работы относятся к определению гидрокортизона в крови [12, 106, 146, 159, 168, 207] , для

чего используют как ферментные системы, уже описанные в разд. 2.2.14 (пероксидаза— о-фенилендиамин—Н2О2 [159], щелочная фосфатаза — фенилфосфат — 4-аминоантипирин — КзРе(СМ)6 [168, 207, 223], p-D-галактозидаза — о-нитрофенилф- D-галактопиранозид [65, 106, 149в, 149г]), так и другие системы. Аракава и сотр. [12] использовали аналогичную систему (пероксидаза — меченый гидрокортизон), но определение активности фермента проводили по люминесценции, возникающей при реакции пероксида водорода с люминолом. Хольдер [146] связывал глюкозоксидазу с 21-гемисукцинатной цепью гидрокортизона и измерял активность фермента по окраске (^макс = =415 нм), развивающейся при взаимодействии пероксида водорода, являющегося побочным продуктом окисления глюкозы, с 2,2'-азино-бис (З-этилбензтиазолин-6-сульфо) кислотой.

Фермент-метку обычно вводят в стероид, используя 21-геми- сукцинатную или З-О-карбоксиметильную части молекулы, но заслуживает упоминания также реакция гидрокортизона с щелочной фосфатазой, протекающая с участием 21-аминогруппы [168].

Для разделения фаз используются как иммобилизованное антитело (на сефарозе [12] или целлюлозе [159]), так и метод двойных антител [146, 207].

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ И РОДСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ

Масс-спектрометрия — ценный метод установления структуры кортикостероидов, так же как и других групп стероидных гормонов. Помимо общих литературных источников, приведенных в разд. 2.2.15, привлекает внимание ряд статей, посвященных специально фрагментации недериватизованных кортикостероидов, в основном синтетических аналогов, опубликованных не так давно Тофтом и др. [184, 289, 290].

Очевидно, что при масс-спектроскопической идентификации кортикостероидов после газохроматографического разделения в ионизационную камеру масс-спектрометра вводят дериватизо- ванные соединения. Для дериватизации в большинстве случаев используются 20-метоксим-(11,17)21-триметилсилильные производные (МО-ТМС-производные) [84, 1836, 230, 231, 285] , но предложены и другие соединения, в первую очередь циклические бораты (см. разд. 3.2.6), фрагментационные характеристики которых были тщательно изучены.

Для масс-фрагментографического количественного анализа кортикостероидов почти исключительно получают МО-ТМС- производные. Газохроматографическое разделение можно про-

водить на насадочных колонках, но в последнее время все чаще и чаще используют капиллярную хроматографию в сочетании с масс-спектрометрией (с одно- или многоканальным детектированием). Количественную оценку проводят по молекулярным пикам и (или) по интенсивным пикам с m/е для фрагмента М—31, которые характерны для отщепления метоксигруппы от метоксимной группировки.

Хонор, Шеклетон и др. [147, 148, 226] определяли различные кортикостероиды и метаболиты в моче на ионселективной регистрирующей аппаратуре, используя для их оценки пики фрагментов М+ и [М — 31]+. При определении аллотетрагидроальдостерона (содержащего За-оксигруппу) в качестве внутреннего стандарта было взято эпимерное 3(3-оксипроизводное [147]. При исследовании метаболитов 18-оксикортикостерона в моче проводили их отделение на смоле XAD-2 и фракционирование на колонке, заполненной сефадексом LH-20 с последующим анализом МО-ТМС-производных методом хромато-масс-спектромет- рии. Внутренним стандартом при определении главного метаболита, За 18,21-триокси-50-прегнан-11,20-диона, служил его 30- эпимер [266]. Аналогичные стадии очистки и фракционирования были выполнены при определении глюкуронида тетрагидроальдостерона в моче после ферментативного гидролиза; причем внутренним стандартом служило 30-окси-5-а-соединение [148].

При определении гидрокортизона в плазме Бъёркем и сотр. [34] использовали в качестве внутреннего стандарта [4-14С]-гид- рокортизон. После экстракции дихлорметаном обе кетогруппы превращали в метоксимные и триметилсилилировали все три оксигруппы. Количество гидрокортизона в плазме рассчитывали по отношению площадей пиков гидрокортизона и его 14С-про- изводного, детектирование которых проводили одновременно с многоканальным детектированием с использованием ионов с т/е 605 и 607, что соответствует фрагментам М— 31. Мэтин и Амос [196] разработали метод определения преднизона и преднизолона в' плазме человека, сочетая газовую хроматографию с ионизационной (химической) масс-спектрометрией. Сканирование проводили при т/е 561, 635 и 667, что соответствует (М + 1) пикам МО-ТМС-производных преднизона, преднизолона и клопреднола (внутреннего стандарта) соответственно.

В последние несколько лет методом масс-фрагментографии был определен ряд других кортикостероидов, в том числе За,21-диокси-50-прегнан-2О-он и 5-прегнен-30,2Оа-диол (метаболиты дезоксикортикостерона и прегненолона соответственно) [246] и различные 6-гидроксилированные кортикостероиды мочи [78, 79]. В последнем случае селективность метода была существенно улучшена путем сочетания высокоэффективной жидкостной хроматографии с ГХ-МС.

Особый интерес представляет метод масс-фрагментографиче- ского определения преднимустина в плазме, предложенный Як- хаммером и сотр. [155]. Было обнаружено, что этот препарат (хлорамбуциловый эфир преднизолона) не годится для масс- фрагментографического анализа ни сам по себе, ни в дериватизованной форме. Поэтому его подвергли переэтерификации метанолом с образованием хлорамбуцилметилового эфира, масс-фрагментографическое определение которого послужило основой для косвенного определения преднимустина с дейтерированным хлорамбуцилметиловым эфиром в качестве внутреннего стандарта.

3.2.11. ДРУГИЕ МЕТОДЫ

Косвенный гравиметрический метод определения 21-амино- кортикостероидов, описанный Гёрёгом и др. [119], основан на взвешивании стехиометрического количества каломели, образующейся при окислении этих производных хлоридом ртути(II) (стр. 215).

Солиман и Белэл [278а] разработали два метода косвенного титриметрического определения способной к восстановлению а-кетольной боковой цепи кортикостероидов. По первому методу 21-оксигруппу окисляют до альдегида щелочным раствором тетраиодмеркурата(II) калия и образовавшуюся металлическую ртуть определяют иодометрически. По второму методу боковую цепь окисляют щелочным раствором купритартрата калия до 20-кето-21-карбоновой кислоты и образовавшийся ок-

сид меди(1) определяют перманганатометрически. Обычно используемый классический метод, основанный на щелочном гидролизе и обратном титровании избытка щелочи, не применим для определения 21-эфиров кортикостероидов, поскольку в кипящей щелочи боковая цепь разрушается с образованием кислых продуктов. Гёрёг [ИЗ] проводил это определение, используя в качестве реагента смесь гидроксида натрия и борогидрида натрия. В этом случае перед гидролизом 21-эфира происходит восстановление 20-кетогруппы с образованием 20-оксипроизводного, нечувствительного к воздействию атмосферного кислорода или щелочи. В результате можно без затруднений провести гидролиз и обратное титрование с индикатором феноловым красным.

ЯМР-Спектроскопия впервые была применена Авдовичем и др. [17] в анализе кортикостероидных лекарственных препаратов в массе фабричного продукта, а также в виде таблеток и препаратов для инъекций. Были изучены 1,4-диен-З-кетопроиз- водные, причем в зависимости от присутствия мешающих для анализа веществ использовали сигналы протонов при С-1, С-2 или С-4. Вычисления проводили на основе сигналов внутренних стандартов (фумаровая кислота, гидрохлорид триэтиламина).

Наряду с другими лекарственными препаратами Боуэр и Вайнфорднер [37] описали фосфоресцентные характеристики локортена (6,9-дифтор-16-метилпреднизолон), пригодные для его обнаружения и определения.

Метод определения свободных гидрокортизона и альдостерона в крови по скорости диализа их меченных тритием производных описан Россом [252].

3.3. ПРОБЛЕМЫ В АНАЛИЗЕ КОРТИКОСТЕРОИДОВ

КОНТРОЛЬ ЧИСТОТЫ КОРТИКОСТЕРОИДОВ

В МАССЕ ФАБРИЧНОГО ПРОДУКТА

В общих чертах вопросы контроля чистоты стероидных гормональных препаратов в массе продукта рассмотрены в разд. 2.3.1. Установленные там положения с некоторыми видоизменениями применимы и для кортикостероидов. Главное различие между ними заключается в том, что газовая хроматография не применяется совсем, а из нехроматографических методов анализа применимы практически только УФ-спектрофотометрия и колориметрический метод с использованием солей тетразолия.

Чаще всего методы анализа кортикостероидов в массе фабричного продукта основаны либо на спектрофотометрическом измерении производных 3-кетогруппы по поглощению при

240 нм, либо на определении боковой цепи методами с использованием солей тетразолия. Ни один из них не обладает достаточной специфичностью: первый не позволяет фиксировать случайные разрушения боковой цепи, и ни одним из них нельзя обнаружить присутствие, например, примесей А4-3-кетосоедине- ний в Д^-З-кетонах и т. п. Для повышения селективности этих методов применяют различные хроматографические и экстракционные методы. Фармакопея США после элюирования главного пятна предписывает проводить ТСХ разделение и колориметрическое определение с помощью тетразолиевого синего [299г]. Селективность УФ-спектрофотометрического анализа кортикостероид-21 -фосфатов повышают, проводя определение в дихлорметановом растворе, полученном экстракцией раствора фосфата после ферментативного гидролиза [299а]. Другие колориметрические методы, описанные в разд. 3.2.1, применяют главным образом для анализа лекарственных дозированных форм, но в нескольких исключительных случаях и для анализа в массе фабричного продукта. Так, например, для анализа тебутата преднизолона применяют такие реагенты, как смесь серной кислоты и метанола (измеряют поглощение при 550 нм) [298а], а для определения примеси свободного гидрокортизона в ацетате гидрокортизона применяют реагент Гёрёга и Чепези [118], который представляет собой смесь хлорида меди(П) и 4,5-диметил-о-фенилендиамина.

При анализе любым из этих методов контроль чистоты лекарственного препарата в массе фабричного продукта можно дополнить количественной оценкой его чистоты методом тонкослойной хроматографии. В дополнение к работам, цитируемым в разд. 2.2.10 и 3.2.5, следует упомянуть статью Вандерхаге и Хебиуса [306], где описаны пять подвижных фаз [хлороформ, толуол—хлороформ (3 : 1), циклогексан—этилацетат—вода (25 : 75 : 1), дихлорметандиэтиловый эфир—метанол—вода (77 : 15 : 8 : 1,2) и дихлорэтан—метанол—вода (95 : 5 : 0,2)], пригодных в сочетании с серной кислотой в качестве опрыскивающего реагента для разделения наиболее фармацевтически важ-* ных кортикостероидов.

Из современных методов наиболее эффективным для одновременного анализа и контроля чистоты является высокоэффективная жидкостная хроматография. Это нашло отражение в том, что этот сравнительно новый метод уже появился в фар- макопеях в качестве метода анализа, например гексацетонида триамцинолона [2996]. По-видимому, в ближайшее время в этой области следует ожидать больших достижений.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОРТИКОСТЕРОИДОВ В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМАХ

Экстракция кортикостероидов из таблеток не вызывает затруднений. Обычно для этого применяют метанол или этанол или проводят жидкость-жидкостную экстракцию с помощью воды и хлороформа.

Экстракцию хлороформом или дихлорметаном обычно проводят из водных суспензий, также поступают (после ферментативного гидролиза) с водными растворами 21-фосфатов кортикостероидов.

Более сложно проводить экстракцию кортикостероидов (главным образом фторпроизводных в низкодозированных формах) из мазей и кремов. Если для экстракции использовать метанол или этанол, неполярные наполнители не растворяются, что затрудняет количественное извлечение кортикостероида. Другая проблема заключается в том, что экстракт содержит много компонентов, мешающих определению кортикостероида. Поэтому рекомендуется проводить хроматографическое разделение на колонках, как, например, в работе Грэхема и др. [129]. Колоночная хроматография пригодна также для отделения кортикостероидов от энтеросептола [127] или антибиотиков [38] в препаратах местного действия. В отдельных случаях удобнее пользоваться менее трудоемко?! процедурой, которая состоит в распределении мази или крема между неполярными и умеренно полярными органическими растворителями, причем в первый перейдет большая часть наполнителей, а во второй — кортикостероид. В табл. 3.8, взятой из статьи [86], приведены некоторые пригодные для этой цели сочетания пар растворителей.

Из систем растворителей, приведенных в табл. 3.8, успешно используется пара ацетонитрил—гексан. Ацетонитрильную фазу можно вводить непосредственно в высокоэффективный жидкостный хроматограф или анализировать колориметрическим методом, используя реакцию с солями тетразолия или с гидразидом изоникотиновой кислоты [85].

Ранее уже упоминались важнейшие методы определения кортикостероидов в дозированных формах. Наиболее распространенным является колориметрический метод с использованием хлорида трифенилтетразолия или даже чаще тетразолиевого синего. Многие работы, цитируемые в разд. 3.2.1, посвящены анализу дозированных лекарственных форм. Анализ таблеток с помощью тетразолиевого синего часто выполняют на автоматических или полуавтоматических анализаторах. На рис. 3.10 показана схема метода Броуэра [43] для полуавтоматического анализа таблеток преднизолона и преднизона.

Таблица 3.8. Распределение кортикостероидов между несмешивающимися растворителями [86]

Более полярный растворитель

Менее полярный растворитель

Стероид

Коэффициент распределения (менее полярный растворитель) (более полярный растворитель)

Ацетонитрил

Гексан

Ацетонид триамцинолона

Пентанонид триамцинолона

Преднизолон

6,5 • 10"3

8,8 • 10"3

11 • ю-3

Нитрометан

Гексан

Пентанонид триамцинолона

3,5 • 10‘3

Нитрометан

Циклогексан

Ацетонид триамцино

лона

17-Валерат бетаметазона

7,4 • Ю4

6,5 • 10-"

Диметилсульфоксид

Гексан

Ацетонид триамцинолона 17-Валерат бетаметазона

Преднизолон

2,1 • 10 3

1,9 • 10 3

8,4 • IO'4

Диметилсульфоксид

Циклогексан

Пентанонид триамцинолона

7,4 • 10’3

В этом методе экстракцию таблетки выполняют вручную, используя в качестве экстрагента 50 %-ный (по объему) водный раствор этанола. Затем этот раствор экстрагируют сегментированным воздухом хлороформом в двойном смесителе автоанализатора, а экстракт смешивают с сегментированными тетразолиевым синим и гидроксидом тетраметиламмония. В реакционной спирали происходит реакция, и в проточной кювете колориметра измеряют поглощение формазана при 525 нм. Для анализа дозированных форм иногда используют и другие спектрофотометрические и колориметрические методы, основанные на химических реакциях.

Спектрофотометрический метод анализа по поглощению при 240 нм пригоден только для относительно простых по составу таблеток. В более сложных случаях (например, при определении кортикостероидов в мазях и кремах в присутствии спектрофотометрически активных антибиотиков и наполнителей) можно применять дифференциальный спектрофотометрический метод с использованием борогидрида натрия [64, 112] или метод, основанный на вычитании спектра поглощения мешающих веществ [6] с помощью программ ЭВМ [162].

В этой области также быстро возрастает роль высокоэффективной жидкостной хроматографии, о чем свидетельствует до-

вольно большое число статей, опубликованных за последние годы (см. табл. 3.4 и 3.5). Причина здесь кроется в том, что в ВЭЖХ нет необходимости в длительной подготовке пробы,

ООООООо Оо ООООООО.Промывка.Воздух.Промывка.Воздух| Верхний । уровень| Верхний । уровеньПробоотборникСкорость (в час) 30:3/лПробоотборникСкорость (в час) 30:3/л330,80 Т0,80 Т2Х-Смеситель (внутр, диаметр2,4 мм)2Х-Смеситель (внутр, диаметр2,4 мм)2Х-Смеситель (внутр диаметр2Д мм)2Х-Смеситель (внутр диаметр2Д мм)4466880.72 Si0.72 Si1^^-снс131^^-снс13СбросСбросД2^—Реагент гтмаД2^—Реагент гтма10,10,1111121213131Д1ДS^L^L- ТетразолиевыйсинийS^L^L- Тетразолиевыйсиний0,90 RA0,90 RAДД_£— Воздух 1,74 RAДД_£— Воздух 1,74 RAПилений I Скорость хуровень Q подачи,мл/мин_0,72 Si

ООО

ООО

о О

о О

ООО

ООО

.Промывка

.Воздух

.Промывка

.Воздух

| Верхний । уровень

| Верхний । уровень

Пробоотборник

Скорость (в час) 30:3/л

Пробоотборник

Скорость (в час) 30:3/л

3

3

0,80 Т

0,80 Т

2Х-Смеситель (внутр, диаметр

2,4 мм)

2Х-Смеситель (внутр, диаметр

2,4 мм)

2Х-Смеситель (внутр диаметр

2Д мм)

2Х-Смеситель (внутр диаметр

2Д мм)

4

4

6

6

8

8

0.72 Si

0.72 Si

1^^-снс13

1^^-снс13

Сброс

Сброс

Д2^—Реагент гтма

Д2^—Реагент гтма

10,

10,

11

11

12

12

13

13

1Д

1Д

S^L^L- Тетразолиевыйсиний

S^L^L- Тетразолиевыйсиний

0,90 RA

0,90 RA

ДД_£— Воздух 1,74 RA

ДД_£— Воздух 1,74 RA

Дозирующий насос

Проточная кювета (15 мм, 525 нм)Проточная кювета (15 мм, 525 нм)Колориметр Самописец,Колориметр Самописец,

Проточная кювета (15 мм, 525 нм)

Проточная кювета (15 мм, 525 нм)

Колориметр Самописец,

Колориметр Самописец,

Рис. 3.10. Схема непрерывного полуавтоматического определения преднизолона и преднизона [43].

Все соединительные шланги кислоустойчивые [сделаны из асидфлекса (Acidflex)]; используются полиэтиленовые трубки диаметром 0,034"; Si — силоксановая резина, RA— красные кислотоустойчивые шланги (red Acidflex); Т — тайгон; S — сольвафлекс (Solvaflex); А — асидфлекс (Acidflex).

а это делает ее идеальным методом проверки устойчивости пре паратов.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОРТИКОСТЕРОИДОВ И ИХ МЕТАБОЛИТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ

Подготовка образцов для количественного анализа

Большинство общих положений, рассмотренных в разд. 2.3.3 для половых гормонов, с минимальными видоизменениями пригодны и для кортикостероидов, и поэтому здесь будет дано лишь краткое обсуждение этого вопроса.

Наиболее часто изучаемыми биологическими жидкостями являются моча и кровь. В моче кортикостероиды и их восстановленные метаболиты присутствуют главным образом в виде конъюгатов (в основном в виде глюкуронидов). Поэтому в большинстве случаев определение кортикостероидов в моче начинают с гидролиза конъюгатов, чтобы получить количественные данные об общем содержании кортикостероидов. Расщепление конъюгатов проводят с помощью катализируемого кислотами гидролиза (обычно к 2 мл мочи прибавляют 0,1 мл концентрированной соляной кислоты и выдерживают при комнатной температуре 18 ч [310] или подкисляют пробу до pH 1 серной кислотой и выдерживают при комнатной температуре 20 ч [141] ) или с помощью ферментативного гидролиза под действием Р-глюкуронидазы, например при pH 5 и 42°С или при pH 7 и 37°С [132] в течение 16—18 ч [258]. В отличие от анализа мочи целью анализа крови в большинстве работ является определение свободных кортикостероидов, поэтому в большинстве методов определения кортикостероидов в плазме или сыворотке крови стадию гидролиза не включают.

Для экстракции кортикостероидов чаще всего применяют дихлорметан и реже хлороформ. Из полученных экстрактов кислотные примеси обычно удаляют промыванием 0,1 М раствором гидроксида натрия. Достаточно широко используемый метод повышения селективности экстракции заключается во введении стадии предварительной экстракции для удаления непо-* лярных стероидов и других липидов, способных экстрагироваться вместе с кортикостероидами дихлорметаном. Для этой цели пригодны различные насыщенные углеводороды.

Во многих случаях для достижения требуемой селективности необходимы также стадии хроматографической очистки или разделения, но ими пользуются довольно редко. Колоночную, тонкослойную или бумажную хроматографию применяют в тех случаях, когда метод количественного определения недостаточно специфичен, а также если цель анализа состоит в определении минорных компонентов или если специфичность метода и надежность результатов более важны, чем затрачиваемое на

выполнение анализа время. Другая причина применения хроматографии для очистки пробы (главным образом на колонках с сефадексом LH-20 и амберлитом XAD-2) перед ферментативным гидролизом — это желательность удаления эндогенных ингибиторов р-глюкоронидазы [132].

Количественное определение

Методы, основанные на измерении собственного поглощения, не играют заметной роли при определении кортикостероидов в биологических образцах. Среди фотометрических методов, основанных на химических реакциях для определения кортикостероидов в моче [14, 94—96, 132, 232, 258, 271], до сих пор широко используется классический метод Портера—Зильбера [232]. Кроме того, находят применение и методы, основанные на тех же принципах, но с использованием модифицированных реагентов [133, 257, 258].

Из колориметрических методов метод с использованием солей тетразолия и методы, основанные на окислительном отщеплении боковой цепи с образованием формальдегида или 17-ке- тостероидов, которые можно легко определить, стали первыми стандартными методами определения кортикостероидов в биологических образцах. Они до сих пор применяются в некоторых лабораториях, но работы, в которых публикуются результаты их новых применений, теперь появляются редко [89, 265].

Чувствительность методов, основанных на измерении индуцируемой кислотами флуоресценции, значительно выше чувствительности колориметрических методов, но селективность почти такая же. Эти методы находят и сейчас довольно широкое применение.

Можно сказать, что колориметрические и флуориметрические методы являются простыми, быстрыми и пригодными для применения в недостаточно хорошо оснащенных лабораториях. Однако в первоначальном виде их селективность спорна. Для того чтобы значительно повысить селективность, нужно проводить предварительное хроматографическое разделение анализируемой пробы.

В результате тщательных исследований найдены подходящие производные для газохроматографического изучения кортикостероидов, так что эта проблема, по-видимому, решена. Тем не менее, газовая хроматография играет меньшую роль в определении кортикостероидов в биологических образцах, чем в определении стероидов других классов. Применение газовой хроматографии необходимо при установлении профиля концентраций стероидов, включающем дериватизацию (главным образом образование метоксим-триметилсилильных производных) и

хроматографию стероидов (в частности, кортикостероидов), содержащихся в крови и моче, и при газовой хроматографии — массспектрометрии кортикостероидов обычно в виде производных. Задача определения индивидуальных кортикостероидов также решена, но из-за необходимости проведения утомительных стадий дериватизации метод, по-видимому, имеет значение только в случае малого содержания компонентов, когда высокая чувствительность газовой хроматографии является большим преимуществом (например, при определении альдостерона [195] и 18-окси-(11-дезокси)кортикостерона [195, 228, 256, 293, 315]).

Практически все проблемы определения кортикостероидов в биологических объектах можно решить довольно просто с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, ввиду чего важность этого метода в данной области быстро растет. Это можно видеть по многочисленным новым публикациям, цитируемым в табл. 3.5.

В табл. 3.6 приведены данные, взятые из работ, посвященных применению радиоиммунного анализа для определения кортикостероидов в биологических объектах, за 1977—1980 гг. Большое число статей, опубликованных за этот период, а также в более ранние годы, свидетельствует о том, что РИА и родственные методы (метод конкурирующего связывания белка и иммуноферментный анализ) относятся к наиболее важным методам анализа биологических объектов. Их популярность объясняется высокой чувствительностью и (особенно в сочетании с предварительным хроматографическим разделением) селективностью, в результате чего РИА стал, по-видимому, наиболее распространенным методом серийных клинических определений кортикостероидов.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОРТИКОСТЕРОИДОВ

В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

Задача анализа кортикостероидов в пищевых продуктах в основном сводится к их определению в молоке. Этому вопросу посвящен недавно опубликованный обзор Райана [253].

Поскольку из природных кортикостероидов в молоке в относительно высоких концентрациях содержатся 17-оксипроизводные (гидрокортизон и кортизон), для их определения можно применять метод Портера—Зильбера (разд. 3.2.1). Методы Муни и Пасарелы [210], а также Труксеса и др. [296], основанные на этой реакции, позволяют снизить предел обнаружения до 10 нг/мл. В первом случае подготовка пробы включает три стадии экстракции с последующим разделением методом ТСХ и элюированием пятна [210], во второй методике хлоро-

формный экстракт подвергают хроматографическому разделению на колонке с флорисилом [296].

* В последние годы в этой области находит применение и высокоэффективная жидкостная хроматография. Кржеминский и др. [172] определяли до 5 нг/мл метилпреднизолона. Для того чтобы добиться такой высокой чувствительности, нужны очень чувствительный УФ-детектор (254 нм; 0,005 единиц оптической плотности на всю шкалу), эффективное концентрирование и очистка пробы, основанные на экстракции 200 мл молока этилацетатом и жидкость-жидкостной экстракции с участием ацетонитрила и гексана, а затем дихлорметана и воды. Аналогичный метод определения дексаметазона в молоке опубликован де-Паолисом и сотр. [76]. В этом методе вслед за стадией экстракции этилацетатом для удаления липидов проводят экс- стракцию смесью гексан—ацетонитрил. После упаривания ацетонитрила остаток растворяют в метаноле, содержащем ацетонид триамцинолона, используемый в качестве внутреннего стандарта. Детали хроматографирования для всех методов можно найти в табл. 3.5.

ЛИТЕРАТУРА

Abdou Н. М„ Ast Т. М., Cioffi F. J. J. Pharm. Sci., 1978, v. 67, p. 1397. la. Agabeyoglu I. T., Wagner J. G., Kay D. R. Res. Commun. Chem. Pathol.

Pharmacol., 1980, v. 28, p. 163.

Al-Dujaili E. A. S., Edwards C. R. W. J. Endocrinol., 1978, v. 77, p. 13 P.

Allner R. Med. Lab., 1977, v. 30, p. 59.

Allner R., Eggstein M., Kujawski H. Klin. Wochenschr., 1975, v. 53, p. 876.

Allner R., Zies H. Arztl. Lab., 1976, v. 22, p. 33.

Amer M. M., Hassan S. M., Kheir A., About A., Mostafa A. A. Pharmazie, 1978, v. 33, p. 344.

Amin M., Schneider P. W. Analyst, 1978, v. 103, p. 1076.

Андреев Л. В., Кощенко К. А. Ж. аналит. химии, 1976, т. 31, с. 343.

Antunes J. R., Dale S. L., Melby J. C. Steroids, 1976, v. 28, p. 621.

Appleby J. L., Norymberski J. K. Biochem. J., 1955, v. 60, p. 460.

Apter D., Janne O., Vihho R. Clin. Chim. Acta, 1975, v. 63, p. 139.

Arakawa H„ Madea M., Tsuji A. Bunseki Kagaku, 1977, v. 26, p. 322; Anal. Biochem., 1979, v. 97, p. 248.

Arisue K., Katayama У., Ogawa Z., Hayashi C., Miyata M., Shimada K., Nambara T. Chem. Pharm. Bull., 1976, v. 24, p. 3093.

Ariyoshi Y., Osawa Z. Clin. Chem., 1976, v. 22, p. 232.

Ascione P., Fogelin C. J. Pharm. Sci., 1963, v. 52, p. 709.

Ast T. M., Abdou H. M. J. Pharm. Sci., 1979, v. 68, p. 42!.

Audouich H. W., Hanbury P., Lodge B. A. J. Pharm. Sci., 1970, v. 59, p. 1164.

Axelson M. Anal. Biochem., 1978, v. 86, p. 133.

Bailey E. J. Endocrinol., 1964, v. 28, p. 131.

Bailey E. In Grant J. K. (Editor). The Gas-Liquid Chromatography of Steroids, Cambridge University Press, 1976, p. 138.

Bailey F., Brittain P. N. J. Pharm. Pharmacol., 1972, v. 24, p. 425.

Bailey F., Brittain P. N. J. Chromat, 1973, v. 83, p. 431.

Bailey K, By A. W., Lodge B. A. J. Chromat., 1978, v. 166, p. 299.

Baillie T. A., Brooks C. J. W., Middletich B. S. Anal. Chem., 1972, v. 44, p. 30.

24a. Ballerini R., Chinol M., Ghelardoni M. J. Chromat, 1980, v. 193, p. 413. 25. Barton D. H. R., McMorris T. C., Segovia R. J. Chem. Soc., 1961, p. 2027. 26. Batterbee H. D., Farrar G. E., Braley J. K. J. Appl. Physiol., 1977, v. 42, p. 643.

Baum С. K., Tudor R., Landon J. Clin. Chim. Acta, 1974, v. 55, p. 147.

Baumann G., Rappaport G., Lemarchand В. T., Felber J. P. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1975, v. 40, p. 462.

Bauwens J. P., Logghe G. N. Pharm. Weekblad, 1976, v. Ill, p. 633.

BeyerW.F., Gleason D. D. J. Pharm. Sci., 1975,v. 64,p. 1557.

BeyerW.F. J. Pharm. Sci., 1966, v. 55, p. 200.

BeyerW.F., Smith E, W. J. Pharm. Sci., 1970, v.59, p.248.

Bishara R. H., Jakovljevic I. M. J. Pharm. Sci., 1970, v. 59, p. 124.

Bjorkhem L, Blomstrand R., Lantto O., Loef A., Svensson L. Clin. Chim. Acta, 1974, v. 56, p. 241.

Bojesen E., Buus O., Svendsen R., Thuneberg L. In Carstensen H. (Editor). Steroid Hormone Analysis, Marcel Dekker, New York, 1968, pp. 2— 53.

Bournot P„ Prost M., Майте B. F. J. Chromat., 1975, v. 112, p. 617.

Bower E. L. Y., Winefordner J. D. Anal. Chim. Acta, 1978, v. 101, p. 319.

Bracey A., Garett L., Weiss P. J. J. Pharm. Sci., 1966, v. 55, p. 1113.

British Pharmacopoeia 1980, HM. Stationary Office, London, 1980, p. 44.

Brock P., Eldred E. W., Woiszwillo J. E., Doran M., Schoemaker H. J. Clin. Chem., 1978, v. 24, p. 1595.

Brooks C. J. W., Middletich B. S., Harvey D. J. Org. Mass Spectrom., 1971, v. 5, p. 1429.

Brooks C. J. W., Harvey D. J. J. Chromat., 1971, v. 54, p. 193.

Brower J. F. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1977, v. 60, p. 27.

43a. Bundgaard H. Arch. Pharm. Chem. Sci. Ed., 1978, v. 6, p. 127.

Burgess C. Perkin Elmer Anal. News, 1977, v. 14, p. 1.

Burgess C. J. Chromat., 1978, v. 149, p. 233.

Burton A. F. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1974, v. 39, p. 950.

Butler J., Fanti V„ Lim С. K. In Dixon P. F., Gray С. H., Lim С. K., Stoll M. S. (Editors). High Pressure Liquid Chromatography in Clinical Chemistry, Academic Press, London, New York, San Francisco, 1976, p. 59.

Butte J. C., Kakihana R., Noble E. P. Steroids, 1978, v. 32, p. 607.

Butte J. C., Noble E. P. Acta Endocrinol., 1969, v. 61, p. 678.

Butte W. J. High Res. Chromat, 1979, v. 2, p. 74.

Butte W., Schruba K, Hartmann F. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1979, v. 17, p. 145.

Cantafora A., Cavina G., Moretti G. Farmaco, Ed. Prat., 1974, v. 29, p. 35.

Carpenter P. C., Mattox V. R. Biochem. J., 1976, v. 157, p. 1.

Carr P J., Millar R. P., Crowley H. Ann. Clin. Biochem., 1977, v. 14, p. 207.

Cavina G., Moretti G., Alimenti R., Gallinella B. J. Chromat., 1979, v. 175, p. 125.

Cavina G., Moretti G., Cantafora A. J. Chromat., 1973, v. 80, p. 89.

Cavina G., Moretti G., Gallinella B., Alimenti R., Barichiesi' R. Boll. Chim. Farm., 1978, v. 117, p. 534.

Chafetz L., Tsilifonis D. C. J. Pharm. Sci., 1977, v. 66, p. 1145.

Chafetz L., Tsilifonis D. C„ Moran C. J. Pharm. Sci., 1974, v. 63, p. 1771.

Chambaz E. M., Def aye G., Madani C. Anal. Chem., 1973, v. 45, p. 1090.

ChambazЕ. М., Madani С.,Ros A. J. Steroid Biochem., 1972, v. 3, p. 741.

ChanT.H., Moreland M.,Hum W. T., Birmingham M.K.J. Steroid

Biochem., 1977, v. 8, p. 243.

ChenC.,Wheeler J., TewellH. E. J. Lab. Clin. Med., 1953,v.42, p. 479.

CodaL.,Timallo L. Boll. Chim. Farm., 1976, v. 115, p. 515.

Comoglio S., Selada F. J. Immunol. Methods, 1976, v. 10, p. 161.

Connolly T. M., Vecsei P. Clin. Chern., 1978, v. 24, p. 1468.

Connolly T. M., Vecsei P., Haack D., Kohl К H., Abdelhamid S., Am- menii A. Klin. Wochensch., 1978, v. 56, p. 173.

67a. Cornejo J., Hermosin M. C., White J. L., Peck G. E., Hem S. L. J. Pharm. Sci., 1980, v. 69, p. 945.

Cox R. A., Gocken M. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1973, v. 37, p. 670.

Craig A., Chamberlian J. Ann. Clin. Biochem., 1972, v. 9, p. 88.

Daugherty P., Jones K., Bacchus H. Clin. Res., 1978, v. 26, p. 105A.

De Boer H. S., Den Hartigh J., Ploegmakers H. H. J. L., Van Oort W.

J. Anal. Chim. Acta, 1978, v. 102, p. 141.

71a. De Boer H. S., Lansaat P. H., Kooistra K. R., Van Oort W. J. Anal. Chim. Acta, 1979, v. Ill, p. 275.

De Boer H. S., Lansaat P. H., Van Oort W. J. Anal. Chim. Acta, 1979, v. 108, p. 389.

71b. De Boer H. S., Lansaat P. H., Van Oort W. J. Anal. Chim. Acta, 1980, v. 116, p. 69.

71r. De Boer H. S., Van Oort W. J., Zuman P. Anal. Chim. Acta, 1980, v. 120, p. 31.

71 д. Dekker D., Beijnen J. H. J. Chromat., 1980, v. 193, p. 480.

Delassalle A., Cesselin F., Carayon A., Legrand S., Antreassian J., Lago- guey A., Lergand J. C., Desgrez P. Steroids, 1977, v. 29, p. 725.

De Man A. J. M., Benraad T. J. Clin. Chim. Acta, 1977, v. 79, p. 489.

Demers M. L., Derek D. D. Clin. Biochem., 1977, v. 10, p. 104.

Den K., Honda M., Kambegawa A., Tomita M., Tochigi B., Yoshida T., Takagi S. Endocrinol. Jpn., 1978, v. 25, p. 171.

DePaolis A. M., Schnabel G., Katz 8. E., Rosen J. D. J. Ass. Off. Anal. Chern., 1977, v. 60, p. 212.

Derks H. J. G. M., Muskiet F. A. J., Wolthers B. G., Thijssen J. H. H. Clin. Chern., 1977, v. 23, p. 518.

Derks H. J. G. M., Dray er N. M. Steroids, 1978, v. 31, p. 9.

Derks H. J. G. M., Dray er N. M. Steroids, 1978, v. 31, p. 289.

DeVries С. P., Popp-Snijders C., DeKieviet W., Akkerman-Faber A. C.

J. Chromat., Biomed. Appl., 1977, v. 143, p. 624.

80a. DeVries С. P., Lomecky-Janousek M., Popp-Snijders C. J. Chromat.,-1980, v. 183, p. 87.

Deys H. P., Pinxerten J. A. C. Pharm. Weekblad. 1958, v. 93, p. 760.

Diedrichsen G., Sinterhauf K., Wolff H. P., Lomer D. J. Steroid Biochem., 1977, v. 8, p. 631.

Edwards R. W. H. Acta Endocrinol., 1975, v. 80, Suppl. p. 199, 253.

Egger H. J., Reiner J., Spiteller G., Hdfele R. J. Chromat., Biomed. Appl., 1978, v. 145, p. 359.

Fairbrother J. E. In Reid E. (Editor). Methodological Developments in Biochemistry. Longman, London, v. 5, 1974, p. 141.

Fairbrother J. E., Siam A. Proc. Anal. Div. Chern. Soc., 1978, v. 15, p. 243.

Faredin L, Toth I. ActaMed.Acad. Sci. Hung.,1964,v. 20, p.185.

Feher T.,Koref O., Tanko L,Bodrogi L.,PoteczinE.Arzneim.Forsch.,

1975, v. 25, p. 1314.

FeinsteinW., Sciarra J.J. J.Pharm. Sci.,1975,v.64,p. 1050.

Few J. D.J. Endocrinol.,1961,v. 22, p. 31.

18 Заказ № 182

90а. Fidanza A., Floridi S., Lenti L. Boll. Soc. Itai. Biol. Sper., 1980, v. 56, p. 14.Finlay G., Jefferies J. P., Sharma S. P. J. Pharm. Pharmacol., 1979, v. 31, p. 634.Fitzpatrick F. A. Adv. Chromat., 1978, v. 16, p. 16.Fonzo D., Lauro L., Dogliotti L., Paschero G. Minerva Med., 1974, v. 65, p. 1749.92a. Frey F. J., Frey В. M., Benet L. Z. Clin. Chem., 1979, v. 25, p. 1944.Frgacic S., Kniewald Z. J. Chromat., 1974, v. 94, p. 291.93a. Funk W., Kerler R., Boll E., Dammann V. J. Chromat., 1981, v.p. 349.Furuya E. Am. J. Clin. Pathol., 1975, v. 64, p. 315.Furuya E. Clin. Chem., 1977, v. 23, p. 2136.Furuya E., Graef V., Nishikaze 0. Anal. Biochem., 1978, v. 90, p.Gaetani E., Laureri C. F. Farmaco, 1974, v. 29, p. 110.97a. Gagne D., Lauriault G., Lebelle M. J., Lodge B. A. Can. J. Pharm, 1980, v. 15, p. 12.Gagne D., Lodge B. A. J. Chromat., 1980, v. 193, p. 160.Gantes P., Juhdsz J. P. Ann. Pharm. Franc., 1966, v. 24, p. 687.Gardiner W. L., Horning E. C. Biochim. Biophys. Acta, 1966, v.p. 524.90а. Fidanza A., Floridi S., Lenti L. Boll. Soc. Itai. Biol. Sper., 1980, v. 56, p. 14.Finlay G., Jefferies J. P., Sharma S. P. J. Pharm. Pharmacol., 1979, v. 31, p. 634.Fitzpatrick F. A. Adv. Chromat., 1978, v. 16, p. 16.Fonzo D., Lauro L., Dogliotti L., Paschero G. Minerva Med., 1974, v. 65, p. 1749.92a. Frey F. J., Frey В. M., Benet L. Z. Clin. Chem., 1979, v. 25, p. 1944.Frgacic S., Kniewald Z. J. Chromat., 1974, v. 94, p. 291.93a. Funk W., Kerler R., Boll E., Dammann V. J. Chromat., 1981, v.p. 349.Furuya E. Am. J. Clin. Pathol., 1975, v. 64, p. 315.Furuya E. Clin. Chem., 1977, v. 23, p. 2136.Furuya E., Graef V., Nishikaze 0. Anal. Biochem., 1978, v. 90, p.Gaetani E., Laureri C. F. Farmaco, 1974, v. 29, p. 110.97a. Gagne D., Lauriault G., Lebelle M. J., Lodge B. A. Can. J. Pharm, 1980, v. 15, p. 12.Gagne D., Lodge B. A. J. Chromat., 1980, v. 193, p. 160.Gantes P., Juhdsz J. P. Ann. Pharm. Franc., 1966, v. 24, p. 687.Gardiner W. L., Horning E. C. Biochim. Biophys. Acta, 1966, v.p. 524.644.

90а. Fidanza A., Floridi S., Lenti L. Boll. Soc. Itai. Biol. Sper., 1980, v. 56, p. 14.

Finlay G., Jefferies J. P., Sharma S. P. J. Pharm. Pharmacol., 1979, v. 31, p. 634.

Fitzpatrick F. A. Adv. Chromat., 1978, v. 16, p. 16.

Fonzo D., Lauro L., Dogliotti L., Paschero G. Minerva Med., 1974, v. 65, p. 1749.

92a. Frey F. J., Frey В. M., Benet L. Z. Clin. Chem., 1979, v. 25, p. 1944.

Frgacic S., Kniewald Z. J. Chromat., 1974, v. 94, p. 291.

93a. Funk W., Kerler R., Boll E., Dammann V. J. Chromat., 1981, v.

p. 349.

Furuya E. Am. J. Clin. Pathol., 1975, v. 64, p. 315.

Furuya E. Clin. Chem., 1977, v. 23, p. 2136.

Furuya E., Graef V., Nishikaze 0. Anal. Biochem., 1978, v. 90, p.

Gaetani E., Laureri C. F. Farmaco, 1974, v. 29, p. 110.

97a. Gagne D., Lauriault G., Lebelle M. J., Lodge B. A. Can. J. Pharm, 1980, v. 15, p. 12.

Gagne D., Lodge B. A. J. Chromat., 1980, v. 193, p. 160.

Gantes P., Juhdsz J. P. Ann. Pharm. Franc., 1966, v. 24, p. 687.

Gardiner W. L., Horning E. C. Biochim. Biophys. Acta, 1966, v.

p. 524.

90а. Fidanza A., Floridi S., Lenti L. Boll. Soc. Itai. Biol. Sper., 1980, v. 56, p. 14.

Finlay G., Jefferies J. P., Sharma S. P. J. Pharm. Pharmacol., 1979, v. 31, p. 634.

Fitzpatrick F. A. Adv. Chromat., 1978, v. 16, p. 16.

Fonzo D., Lauro L., Dogliotti L., Paschero G. Minerva Med., 1974, v. 65, p. 1749.

92a. Frey F. J., Frey В. M., Benet L. Z. Clin. Chem., 1979, v. 25, p. 1944.

Frgacic S., Kniewald Z. J. Chromat., 1974, v. 94, p. 291.

93a. Funk W., Kerler R., Boll E., Dammann V. J. Chromat., 1981, v.

p. 349.

Furuya E. Am. J. Clin. Pathol., 1975, v. 64, p. 315.

Furuya E. Clin. Chem., 1977, v. 23, p. 2136.

Furuya E., Graef V., Nishikaze 0. Anal. Biochem., 1978, v. 90, p.

Gaetani E., Laureri C. F. Farmaco, 1974, v. 29, p. 110.

97a. Gagne D., Lauriault G., Lebelle M. J., Lodge B. A. Can. J. Pharm, 1980, v. 15, p. 12.

Gagne D., Lodge B. A. J. Chromat., 1980, v. 193, p. 160.

Gantes P., Juhdsz J. P. Ann. Pharm. Franc., 1966, v. 24, p. 687.

Gardiner W. L., Horning E. C. Biochim. Biophys. Acta, 1966, v.

p. 524.

Sci.,

155,

Garg D. C., Ayres J. IF., Wagner J. G. Res. Comm. Chem. Pathol. Pharmacol., 1977, v. 18, p. 137.

Gaskell S. J., Brooks C. J. W. J. Chromat., 1978, v. 158, p. 331.

Gijzen A.H.J. J. Mol. Med., 1977, v. 2,p. 99.

GleispachH.Ergeb. Exp. Med., 1975, v.20, p.55.

GleispachH.Chromatographia, 1977, v.10, p.40.

Glick D., Von Redlich D., Levine S. Endocrinology, 1964, v. 74, p. 653.

Gnemmi E., O’Sullivan M. L, Chieregatti G„ Simmons M., Simmonds A., Bridges J. W., Marks V. In Pal S. B. (Editor). Enzyme Labelled Immunoassay of Hormones and Drugs. De Gruyter, Berlin, New York, 1978, p. 29.

106a. Goehl T. J., Sundaresan G. M., Prasad V. K. J. Pharm. Sci., 1979, v. 68, p. 1374.

Goldzieher J. W. Fluorescence Spectra. In Engel L. L. (Editor). Physical Properties of the Steroid Hormones. Pergamon, Oxford, London, New York, Paris, 1963, pp. 288—320.

Gomez-Sanchez C., Milewich L., Holland О. B. J. Lab. Clin. Med., 1977, v. 89, p. 902.

Goodall R. R. J. Chromat., 1975, v. 103, p. 265.

Gordon G., Wood P. R. Analyst, 1976, v. 101, p. 876.

110a. Gotelli G. R., Wall J. H., Kabra P. M., Marton L. J. Clin. Chem., 1981, v. 27, p. 441.

Gottfried H. Steroids, 1965, v. 5, p. 385.

Gorog S. J. Pharm. Sci., 1968, v. 57, p. 1737.

Gorag S. J. Pharm. Pharmacol., 1969, v. 21, p. 46S.

Gorog S., Hajos Gy. J. Chromat., 1969, v. 43, p. 541.

Gorog S., Horvath P. Analyst, 1978, v. 103, p. 346.

Gorog S., Szasz Gy. Analysis of Steroid Hormone Drugs. Akademiai Kiado, Budapest: Elsevier, Amsterdam, 1978, pp. 330—347, 385—391.

Gorog S., Szepesi G. Analyst, 1972, v. 97, p. 519.

Gorog S., Szepesi G. Anal. Chem., 1972, v. 44, p. 1079.

Gorog S., Tuba Z., Egyed I. Analyst, 1969, v. 94, p. 1044.

Gorog S., Tuba Z. Analyst, 1972, v. 97, p. 523.

Graham R. E., Biehl E. R., Kenner С. T. J. Pharm. Sci., 1976, v. 65, p. 1048.

Graham R. E., Biehl E. R., Kenner С. T. J. Pharm. Sci., 1977, v. 66, p. 965.

Graham R. E., Biehl E. R., Kenner С. T. J. Pharm. Set, 1978, v. 67, p. 360.

Graham R. E., Biehl E. R., Kenner С. T. J. Pharm. Sci., 1978, v. 67, p. 792.

Graham R. E., Biehl E. R., Kenner С. T., Luttrell G. H., Middleton D. L. J. Pharm. Sci., 1975, v. 64, p. 226.

Graham R. E., Kenner С. T. J. Pharm. Sci., 1973, v. 62, p. 103.

Graham R. E., Kenner С. T., Biehl E. R. J. Pharm. Sci., 1975, v. 64, p. 1013.

Graham R. E., Williams P. A., Kenner С. T. J. Pharm. Sci., 1970, v. 59, p. 1152.

Graham R. E., Williams P. A., Kenner С. T. J. Pharm. Sci., 1970, v. 59, p. 1472.

Gupta V. D. J. Pharm. Sci., 1979, v. 68, p. 908.

Guttmann D. E. J. Pharm. Sci., 1966, v. 55, p. 919.

Hadd H. E. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1977, v. 45, p. 1128.

Hadd H. E. Biochem. Med., 1975, v. 13, p. 353.

Hamman B. L., Martin M. M. Anal. Biochem., 1967, v. 20, p. 423.

134a. Hansen J., Bundgaard H. Arch. Pharm. Chemi, Sci. Ed., 1980, v. 8, p. 91.

1346. Hansen J., Bundgaard H. Arch. Pharm. Chemi, Sci. Ed., 1981, v. 9, p. 34.

134в. Hansen J., Bundgaard H. Internal. J. Pharm., 1981, v. 8, p. 121.

Hara S., Watabe T„ Ike Y. Chern. Pharm. Bull., 1966, v. 14, p. 1311.

Hlirkonen M., Adlercreutz H. J. Steroid Biochem., 1974, v. 5, p. 527.

Harkonen M., Adlercreutz H., Groman E. V. J. Steroid Biochem., 1974, v. 5, p. 717.

Heasman M. J., Wood A. J. J. Pharm. Pharmacol., 1971, v. 23, p. 176 S.

Heitmann E. Chromatography of Steroids. Elsevier, Amsterdam, 1976, pp. 96—106.

139a. Henning S. J. Steroids, 1980, v. 35, p. 673.

Henry R. A., Schmidt J. A., Dieckman J. F. J. Chromat. Sci., 1971, v. 9, P. 513.

Herkner E., Nowotny P., Waldhausl W. J. Chromat., Biomed. Appl., 1978, v. 146, p. 273.

Hesse C., Pietrzik K., Hotzel D. Z. Klin. Chern. Klin. Biochem., 1974, v 12, p. 193.

Higgins J. W. J. Chromat., 1975, v. 115, p. 232.

Hilfenhaus M. J. Steroid Biochem., 1977, v. 8, p. 847.

Holhe R., Hovermann W., Roots I., Hildebrandt A. G. Arch. Pharmacol., 1967, v. 293, Suppl. R61.

Holder G. In Pal S. B. (Editor). Enzyme Labelled Immunoassay of Hormones and Drugs. De Gruyter, Berlin, New York, 1978, p. 221.

Honour J. W., Milla P., Dillon M., Shackleton С. H. L. Acta Endocrinol., 1975, v. 80, Suppl. J99, p. 217.

Honour J. W., Shackleton С. H. J. J. Steroid Biochem., 1977, v. 8, p. 299.

Horikawa R., Tanimura T., Tamura Z. J. Chromat., 1979, v. 168, p. 526. 149a. Hosoda H., Miyairi S., Nambara T. Chern. Pharm. Bull., 1980, v. 28, p. 1924.

1496. Hosoda H.. Miyairi S., Kobayashi N., Nambara T. Chern. Pharm. Bull., 1980, v. 28, p. 3369.

149в. Hosoda H., Kawamura N., Nambara T. Chern. Pharm. Bull., 1981, v. 29, p. 1969.

149r. Hosoda H., Sakai Y., Nambara T. Chern. Pharm. Bull., 1981. v. 29, p. 170.

Hubl W.. Buchner M., Haussig K., Rohde W., Stahl F. Endokrinologie, 1978, v. 71, p. 60.

Hu^ F. A., Herberts J. С. M., Span M. A. Pharm. Weekblad, 1979, v. 114, p. 660.

Hurter Р., Van Ree T. J. Chromat., 1979, v. 169, p. 93.

Ishii D., Hibi K., Asai K-, Nagaya M., Mochizuki K> Mochida Y. J. Chromat., 1978, v. 156, p. 173.

Jacobsen E., Korvald B. Anal. Chim. Acta, 1978, v. 99, p. 255.

Jakhammer T., Olsson A., Svensson L. Acta Pharm. Suec., 1977, v. 14, p. 485.

155a. J aster H. J., Dulce H. J. Acta Endocrinol., 1980, v. 94, p. 145.

Jayle M. F. Analyse des Steroides Homonaux. Masson, Paris, 1962, v. II, pp. 156—169; a) pp. 119—126.

Jiang N. S., Machacek D., Wadel О. P. Clin. Chern., 1975, v. 21, p. 387, 158. Johnson C. A., King R., Vickers C. Analyst, 1960, v. 85, p. 714.

Joyce B. G., Turkes A., Ozoran A., Read G. F., Fahmy D. R. In Pal S. B. (Editor). Enzyme Labelled Immunoassay of Hormones and Drugs. De Gruyter, Berlin, New York, 1978, p. 247.

Juselius R. E., Barnhart F. Clin. Chern., 1974, v. 20, p. 1470.

Kabra P. M., Tzai L. L, Marton L. J. Clin. Chern., 1979, v. 25, p. 1293.

Kakac B., Rejholec V. Cesk. Farm., 1977, v. 26, p. 124.

Kakac B., Vejdelek Z. Handbuch der Kolorimetrie. V. II. Gustav Fischer Verlag, Jena, 1963.

Kammerl E., Mutschler E. Pharm. Acta Helv., 1975, v. 50, p. 269.

Kano T., Mizuchi A., Miyachi Y. Nippon Naibumpi Gakkai Zasshi, 1978, v. 54, p. 654.

Kawasaki T., Maeda M., Tsuji A. J. Chromat., 1979, v. 163, p. 143.

166a. Kirschbaum J., Poet R., Bush K* Petrie G. J. Chromat., 1980, v. 190, p. 481.

Kley H. K., Herberg L., Kriiskemper H. L. J. Steroid Biochem., 1976, v. 7, p. 381.

Kobayashi Y., Ogihara T., Amitani K., Watanabe F., Kiguchi T., Ninomiya L, Kymahara I. Steroids, 1978, v. 32, p. 137.

Kolanowski J. J. Steroid Biochem., 1974, v. 5, p. 55.

Kornel L., Miyabo S., Saito Z. J. Chromat., 1975, v. Ill, p. 200.

Korpi J., Wittmer D. P., Sandmann B. J., Haney W. G. J. Pharm. ScL, 1976, v. 65, p. 1087.

171a. Koupparis M. A., Walczak К. M., Malmstadt H. V. J. Pharm. Sci., 1979, v. 68, p. 1479.

Krzeminski L. F., Cox B. L., Perrel P. N., Schiltz R. A. J. Agricult. Food. Chern., 1972, v. 20, p. 970.

Kumar M. S., Safa A. M., Deodhar S. D. Clin. Chern., 1976, v. 22, p. 1845.

Kunze F. M., Davis S. J. J. Pharm. Sci., 1964, v. 53, p. 1170, 1259.

Landgraf W. C., Jenning E. C. J. Pharm. Sci., 1973, v. 62, p. 278.

175a. Landis J. B. Anal. Chim. Acta, 1980, v. 114, p. 114.

Lanouette M., Lodge B. A. J. Chromat., 1976, v. 129, p. 475.

176a. Lea A. R., Kennedy J. M., Low G. К. C. J. Chromat., 1980, v. 198, p. 41.

1766. Leung С. P., Tam S. Y. K. Analyst, 1981, v. 106, p. 100.

Lewbart M. L., Mattox V. R. Anal. Chern., 1961, v. 33, p. 559.

Lewbart M. L., Mattox V. R. J.Org. Chern., 1964, v. 29, p. 513,521.

Lijnen P., Amery A. Bull. Soc.Chim. Belg., 1978, v. 87, p. 15.

Lijnen P., Amery A., Fagard R.Arch. Int. Physiol. Biochim., 1978,v. 86,

p/205.

Lisboa В. P. Acta Endocrinol., 1963, v. 43, p. 47.

Lisboa В. P. Steroids, 1966, v. 7, p. 41.

Lisboa В. P. J. Chromat., 1969, v. 39, p. 173.

183a. Lisboa В. P., Strassner M., Tresguerres J. A. F. In Frigerio A., McCamish M. (Editors). Recent Developments in Chromatography and Electrophoresis, v. 10. Elsevier, Amsterdam, 1980, p. 155.

Lisboa В. Р., Halket J. М. In Frigerio A., McCamish M. (Editors). Recent Developments in Mass Spectroscopy in Biochemistry and Medicine, v. 6. Elsevier, Amsterdam, 1980, p. 129.

183b. Li Wan Po A., Irwin W. J., Yip Y. W. J. Chromat., 1979, v. 176, p. 399, 184.LodgeB.A.,Toft P. J.Pharm. Pharmacol., 1971, v. 23, p. 196.

LooJ.С.K.,Butterfield A. G., Moffatt J., Jordan N. J. Chromat.,Bio

med. Appl. 1977, v. 143, p. 275.

LooJ.С.K.,Jordan N.J. Chromat. Biomed. Appl., 1977, v. 143, p.314.

LooJ.С.K.,Vilim A.B., Jordan N., Moffatt J. J. Pharm. Sci.,1976,

v. 65, p. 461.

Luetscher J. A., Gould G. R. J. Chromat., 1964, v. 13, p. 350.

Macioci F., Fiotek C. Boll. Chim. Farm., 1975, v. 114, p. 468.

MacKichan J. J., Jusko W. J. J. Pharm. Sci., 1979, v. 68, p. 623.

MaderW.J.,Buck A.H. Anal. Chern., 1952, v. 24, p. 666.

MajorsR.E.,JohnsonE. L. J. Chromat., 1978, v. 167, p. 17.

MakinH.L. J., Trafford D. J. FL Clin. Chim. Acta, 1971, v32,p.299.

MarcosJ.M.,MorenoJ. Pla Delfina J. M. Cienc. Ind. Farm.,1977,v.9,

p. 92.

Mason P. A., Fraser R. J. Endocrinol., 1975, v. 64, p. 277.

Matin S. B., Amos B. J. Pharm. Sci., 1978, v. 67, p. 923.

Matsumoto IL, Kunugi A., Nagase Y. Chern. Pharm. Bull., 1978, v. 26r p. 1473.

Matsuzawa T., Kato M., Sekiguchi M., Ishiguro I. Rinsho Kagaku, 1977r v. 5, p. 239.

Mattingly D. J. Clin. Path., 1962, v. 15, p. 374.

Mattox V. R., Goodrich J. E., Litwiller R. D. J. Chromat., 1975, v. 108, p. 23.

Mattox V. R., Litwiller R. D., Goodrich J. E. J. Chromat., 1975, v. 109, p. 129.

Mattox V. R., Litwiller R. D., Goodrich J. E., Tan W. C. J. Chromat., 1976, v. 120, p. 435.

Mattox V. R., Litwiller R. D. Steroids, 1979, v. 34, p. 227.

203a. Maunie B. F., Millot C., Mesnier D., Patouraux D., Doumas J., Tomori E, J. Chromat., 1979, v. 186, p. 581.

Metcalf M. G. Brit. Med. J., 1964, v. 2, p. 1201.

Meyer A. S., Lindberg M. C. Anal. Chern., 1955, v. 27, p. 813.

Miyabo S., Kornel L. J. Steroid Biochem., 1974, v. 5, p. 233.

Miyai K., Ishibashi K., Ogihara T., Tanizawa O., Nishi K., Kawashima M., Kumahara Y. In Pal S. B. (Editor). Enzyme Labelled Immunoassay of Hormones and Drugs, De Gruyter, Berlin, New York, 1978, p. 287.

Mollica J. A., Strusz R. F. J. Pharm. Sci., 1972, v. 61, p. 444.

Monder C., Kendall J. Anal. Biochem., 1975, v. 68, p. 248.

Mooney R. P., Pasarela N. R. J. Agr. Food Chern., 1966, v. 14, p. 12.

Morris R. Ann. Clin. Biochem., 1978, v. 15, p. 178.

Morrison P. J., Bradbrook I. D., Rogers H. J. Brit. J. Clin. Pharmacol., 1977, v. 4, p. 597.

Mohrle H., Schittenhelm D. Pharm. Ztg., 1967, v. 112, p. 1400.

Mohrle FL, Schittenhelm D. Arch. Pharm., 1970, v. 303, p. 771.

214a. Munson J. W., Wilson T. D. J. Pharm. Sci., 1981, v. 70, p. 177.

Murphy В. E.P. J. Clin. Endocrinol.Metab., 1975, v. 41, p. 1050.

Muller К. H.,Stuber B. Pharm. ActaHelv., 1978, v. 53, p. 124.

Muller O. A.,Braun J., Frohlich R.,Scriba P. C. Z. Klin. Chern.Klin,

Biochem., 1974, v. 12, p. 276.

Neher R. Steroid Chromatography. Elsevier, Amsterdam, 1964, pp. 280— 315.

Nordstrom C. G., Peltola O. Scand. J. Rheumat., 1974, v. 3, p. 143.

Norymberski J. K-, Stubbs R. D., West H. F. Lancet, 1953, v. 264, p. 1276.

Occhipinti В„ Rigamonti G., Galati M. Farmaco, Ed. Pr., 1974, v. 29, p. 611.

Oelgaard K., Madsen S. Clin. Biochem., 1976, v. 9, p. 265.

Ogihara T., Miyai K., Nishi K., Ishibashi K., Kumahara Y. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1977, v. 44, p. 91.

223a. O’Hare M. J., Nice E. С., Capp M. J. Chromat., 1980, v. 198, p. 23.

Olson M. C. J. Pharm. Sci., 1973, v. 62, p. 2001.

Oteiza R. M., Krottinger D. L., McCracken M. S., Malmstadt H. V. Anal. Chem., 1977, v. 49, p. 1586.

Oteiza R. M., Wooten R. S., Kenner С. T., Graham R. E., Biehl E. R. J. Pharm. Sci., 1977, v. 66, p. 1385.

Painter K., Shaw S. M., Russel H. T. Biochem. Med., 1974, v. 9, p. 184.

Palem-Vliers M., Sulon J. J. Steroid Biochem., 1978, v. 9, p. 239.

Park В. K. J. Steroid Biochem., 1978, v. 9, p. 963.

229a. Petersen M. C., Nation R. L., Ashley J. J. J. Chromat., 1980, v. 183, p. 131.

Pfaffenberger C. D., Horning E. C. J. Chromat., 1975, v. 112, p. 581.

Pfaffenberger C. D., Horning E. C. Anal. Biochem., 1977, v. 80, p. 329.

231a. Поляков П. M., Гизатулин 3. Я., Панин Л. Е. Проблемы эндокринологии, 1981, т. 27, с. 74.

Porter С. С., Silber R. Н. J. Biol. Chem., 1950, v. 185, р. 201.

Pratt J. H, Holbrook M. M., Dale S. L, Melby J. C. J. Steroid Biochem., 1977, v. 8, p. 677.

Prochazka Z. In Deyl Z., Macek K., Janak J. (Editors). Liquid Column Chromatography. Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, 1975, pp. 593— 622.

234a. Pryce Jones R. H., Vass S. W. J. Pharm. Pharmacol., 1980, v. 32, p. 99 P.

RadoJ.P. Horm. Metab. Res., 1973, v. 5, p. 63.

RadoJ.P. Int. J. Clin. Pharmacol., 1976, v. 14, p. 186.

RadoJ.P., Simon T., Juhos J., Tako O. Endokrinologie, 1974, v. 64, p. 22.

RadoJ.P., Vegh L. Int. J. Clin. Pharmacol., 1977, v.15,p.5.

Ratiff C. R., Hall F. F. Clin. Chem., 1973, v. 19, p. 1400.

Read G. F.,Fahmy D.R„Walker R. F. Endocrinol., 1977, v. 73,p.57 P.

Reardon G.E., CaldarellaA. M., Canalis E. Clin. Chem., 1979, v. 25, p. 122.

Riabov D. K-, Gudat J.C.Clin. Chem., 1977, v. 23, p. 1145.

Riad-FahmyD., ReadG.F., Gaskell S. J., Dyas J., HindawiR.Clin.

Chem., 1979, v. 25, p. 665.

Rioux-Lacoste C., Viel C. Ann. Pharm. Franc., 1975, v. 33, p. 163.

Robin P., Predine J., Milgrom E. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1978, v. 46, p. 277.

245a.Rocci M.L.,Jusko W. J. J. Chromat.Biomed. Appl., 1981,v.224,p. 221.

RomanoffL.P., Brodie H. J. J. Steroid Biochem., 1976, v.7,p. 289.

Roots L,Holbe R., Hovermann W.,Nigam S., HeinemeyerG.,Hildebrandt A.G.Eur. J. Clin. Pharmacol.,1979, v. 16, p. 63.

Rose J. Q., Jusko W. F. J. Chromat. Biomed. Appl., 1979, v. 162, p. 273.'

Rosenblum C., Meriwether H. T. J. Radioanal. Chem., 1968, v. 1, p. 163.

Rosenfeld R. S. Steroids, 1964, v. 4, p. 14 7.

Rosenfeld R. S., Lebau M. C., Jandorek R. D., Salumaa T. J. Chromat, 1962, v. 8, p. 355.

Ross И A. Experientia, 1978, v. 34, p. 538.

252a. Roth G., Wikby A., Nilson L., Thalen A. J. Pharm. Sci., 1980, v. 69, p. 766.

Ryan J. J. J. Chromat., 1976, v. 127, p. 53.

Sable-Amplis R., Agid R., Abadie D. J. Chromat., 1974, v. 94, p. 287.

Saito H, Hashiba T., Miyamoto M., Takeda R. Nippon Naibumpi Gakkai Zasshi, 1977, v. 53, p. 765.

Salmenpera M., Kahri A. I. Acta Endocrinol., 1976, v. 83, p. 781.

Sanghvi A., Taddeini L., Wight C. Anal. Chem., 1973, v. 45, p. 207.

Sanghvi A., Wight C., Parikh B., Desai H. Am. J. Clin. Path., 1973, v. 60, p. 684.

Scandrett М. S., Ross E. J. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 72, p. 165.

Scandrett M. S., Wilson M., Ross E. J. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 72, p. 97, 261. Schoneshofer M. J. Steroid Biochem., 1977, v. 8, p. 995.

Schoneshofer M., Dulce H. F. J. Chromat., Biomed. Appt, 1979, v. 164^ p. 17.

262a. Schoneshofer M., Jaster H. J., Fenner A. Z. Anal. Chern., 1980, v. 301, p. 130.

2626. Schoneshofer M., Fenner A., Altinok G., Dulce H. J. Clin. Chim. Acta, 1980, v. 106, p. 63.

262b. Schoneshofer M., Skobolo R.» Dulce H. J. J. Chromat., Biomed. Appt, 1981, v. 222, p. 478.

Schwedt G., Bussemas H. H., Lippmann Ch. J. Chromat, Biomed. Appl., 1977, v. 143, p. 259.

Scott N. R., Dixon P. F. J. Chromat., Biomed. Appl., 1979, v. 164, p. 29. 264a. Scott N. R., Chakraborty J., Marks V. Anal. Biochem., 1980, v. 108, p. 266.

Senciall I. R., Riley C., Rahal S., Dey A. C., Harding C. A., Acharya M. Clin. Biochem., 1977, v. 10, p. 32.

Schackleton С. H. L., Honour J. W. J. Steroid Biochem., 1977, v. 8, p. 199.

Sharama D. P., Venkitasubramanian T. A. Biochem. Med., 1974, v. 11, p. 103.

Short P. M., Rhodes С. T. Steroids, 1970, v. 16, p. 217.

Siggia S., Dishman R. A. Anal. Chern., 1970, v. 42, p. 1223.

Silber R. H. Fluorimetric Analysis of Corticoids. In Glick (Editor). Methods of Biochemical Analysis. Interscience, New York, London, Sydney, v. 14, 1966, pp. 63—78.

Silber R. H., Porter С. C. J. Biol. Chern., 1954, v. 210, p. 923.

271a. Simon M., Babich Armstrong M. Clin. Chim. Acta, 1980, v. 103, p. 101.

Sippet W. G., Lehmann P., Hollmann G. J. Chromat., 1975, v. 108, p. 305.

Sippel W. G., Putz G., Scheuerecker M. J. Chromat., 1978, v. 146, p. 333.

Smith M. D. J. Chromat., Biomed. Appl., 1979, v. 164, p. 129.

274a. Smith M. D. J. Pharm. Sci., 1980, v. 69, p. 960.

Smith M. D., Hoffman D. J. J. Chromat, 1979, v. 168, p. 163.

Smith P., Hall С. J. Ann. Clin. Biochem., 1976, v. 13, p. 454.

Smith P., Hall C. J. J. Chromat., 1974, v. 101, p. 202.

Smith R. V., Hassal T. H., Liu S. C. J. Ass. Off. Anal. Chern., 1970r v. 53, p. 1089.

278a. Soliman R., Belal S. Pharmazie, 1980, v. 35, p. 153.

Sparagana M., Kucera L. Biochem. Med., 1974, v. 9, p. 363.

279a. Stalla G., Giesemann G., Muller O. A., Wood W. G., Scriba P. C. Z. Anat Chern., 1980, v. 301, p. 129.

2796. Stroud N., Richardson N. E., Davies D. J. G., Norton D. A. Analyst, 1980, v. 105, p. 455.

Sulon J„ Sparano F. J. Steroid Biochem., 1978, v. 9, p. 253.

Sulon J. Palem-Vliers M., Genard P., Cittanova N., Desfosses B. Clin, Chim. Acta, 1976, v. 72, p. 2 75.

Sybulski S., Maughan G. B. Am. J. Obstet. Gyn., 1975, v. 121, p. 32, 283. Szabo A., Mizcei A. Steroids, 1970, v. 15, p. 513.

Szepesi G., Gorok S. Boll. Chim. Farm., 1975, v. 114, p. 98.

Tan E. M. L., Pearce P. H., Runkis J. O., Au D. C., Abbott F. S. Can, J. Pharm. Sci., 1978, v. 13, p. 101.

Tan S. Y., Gewolb I. H., Hobbins J. C. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1976, v. 43, p. 412.

7. Tan S. Y., Noth R., Mulrow P. J. Clin. Chern., 1978, v. 24, p. 1531.

Tembo A. V., Ayres J. W7., Sakmar E., Hallmark M. R., Wagner J. G- Steroids, 1977, v. 29, p. 679.

Toft P., Lodge B. A. Can. Spectr., 1970, v. 15, p. 137.

90. Toft Р., Lodge В. A., Simard М. В. Can. J. Pharm. Sci., 1972, v. 7, р. 53.

Tokunaga Н., Kimura Т., Kawamura J. Вunseki Kagaku, 1976, v. 25, p. 392.

Tokunaga H., Kimura T., Kawamura I. Вunseki Kagaku, 1977, v. 26, p. 154.

292a. Tokunaga H., Kimura T., Kawamura J. Yakugaku Zasshi, 1979, v. 99, p. 800.

2926. Tokunaga H., Kimura T., Kawamura I. Yakugaku Zasshi, 1980, v. 100, p. 200.

Tomsoud Z., Gregorovd K., Horky, Duorakoud J. J. Chroma!., Biomed. Appl., 1978, v. 145, p. 131.

Toscano L., Guadagnini G., Grisanti G. Arzneim. Forsch., 1977, v. 27, p. 1636.

Trefz F. K., Byrd D. J., Kochen W. J. Chroma!., 1975, v. 107, p. 181.

Trucksess M. W., Donoso L, Craig G. J. Ass. Off. Anal. Chern., 1969, v. 52, p. 932.

Tsuei S. E., Ashley J. J. J. Chroma!., Biomed. Appl., 1978, v. 145, p. 213.

Tymes N. W. J. Chroma!. Sci., 1977, v. 15, p. 151.

298a. Unifed Slates Pharmacopoeia XIX, USP Convention Inc., Rockville, Md., a) 1975, p. 402.

United Slates Pharmacopoeia XX, USP Convention Inc., Rockville, Md., 1980, a) p. 652, 6) p. 814, в) p. 916, r) p. 927.

Uppal S. S., Osaki S. Clin.-Chern., 1978, v. 24, p. 994.

Upton L. M., Townley E. R., Sancilio F. D. J. Pharm. Sci., 1978, v. 67, p. 913.

VanDame H.C.J. Ass. Off.Anal. Chern., 1974, v. 57, p. 731.

302a.VanDame H.C.J. Ass. Off.Anal. Chern., 1980, v. 63, p. 1184.

Vanden BergJ.H. M., MolCh. R., Deelder R. S., Thijssen J.H. H.

Clin. Chim. Acfa, 1977, v. 78, p. 165.

Van den Berg J. H. M., Milley J., Vonk N., Deelder R. S. J. Chroma!., 1977, v. 132, p. 421.

Vandenheuuel F. A. J. Chroma!., 1977, v. 133, p. 107.

Vanderhaeghe H., Hoebius J. J. Pharm. Belg., 1976, v. 31, p. 25.

306a. Vee man G. E. Farm. Weekblad, 1981, v. 116, p. 109.

Vecsei P., Gless К H. Aldosferon-Radioimmunoassay. Ferdinand Enke Verlag, S!u!!gar!, 1975.

Vecsei P., Kemeny V., Gorgenyi A. J. Chroma!., 1964, v. 14, p. 506.

Walker R. F., Riad-Fahmy D., Read G. F. Clin. Chern., 1978, v. 2 4, p. 1460.

Walsh P. R., Wang M. C., TurnerE. A. Clin. Chern.,1979, v.25, s.1226.

Whigham W. R. Clin.Chern., 1976,v. 22, p. 369.

Wikby A., Nilsson L., Hallsas G. J. Chroma!., 1978, v. 157, p. 51.

Wikby A., Thalen A.,Oresten G.J. Chroma!., 1978,v.157,p. 65.

Will FL, Aderjan R.,Winkler T.,Репке В., VecseiP.Ac!aEndocrinol.,

1977, v. 86, p. 369.

Wilson A., Mason P. A., Fraser R. J. Endocrinol., 1976,v. 68,p.24P.

Wilson C. G., Sendagire R., May C. S., Paterson J.W.Brit.J:Clin.

Pharmacol., 1975, v. 2, p. 321.

316a.Witzgall H., Hassan-Ali S. J. Chroma!., 1980, v. 198,p.70.

Wong P. Y., Mee A. V., Ho F. F. K. Clin. Chern., 1979,v.25, p.914.

Woodson A. L. J. Pharm. Sci., 1971, v. 60, p. 1538.

Woodson A. L., Smith D. E. Anal. Chern., 1970, v. 42, p. 242.

Wortmann W., Schnabel C., Touchstone J. C. J. Chroma!., 1973, v. 84, p. 396.

Yadau R. N., Teare F. W. J. Pharm. Sci., 1978, v. 67, p. 436.

321a. Yanagihashi K., Mizuchi A., Yotsumoto H., Miyashi Y. Clin. Chern., 1980, v. 26, p. 1301.

4

ХОЛЕСТЕРИН И РОДСТВЕННЫЕ СТЕРИНЫ

ОСНОВЫ ХИМИИ СТЕРИНОВ

Большинство стеринов можно охарактеризовать как соединения со стероидным скелетом, несущим ангулярные метильные группы в положениях 10 и 13, боковую цепь из 8—10 углеродных атомов в положении 17, двойную связь между С5 и Сб и оксигруппу при С3. Наиболее важным представителем этого класса соединений является холестерин, содержащий в положении 17 холестанового скелета 2-(6-метилгептильную) группу.

Другие алкильные группы могут находиться при С-4, С-14 (4,4,14а-триметилхолестан, т. е. л аностан) и С-24. В этом случае при С-24 возникает новый центр асимметрии и образуются два ряда производных (24R и 24S) [(245)-24-метилхолестан, т. е. эргостан, (24R)-24-этилхолестан, т. е. стигмастан]. В 5,6-на- сыщенных производных (станолы) водород в положении 5 имеет а- или 0-конфигурацию (ряды холестана и копростана). Кроме А5-положения двойные связи могут находиться в А7-, А8-, А22-, А24-, А24(28)-положениях и т. д. При наличии двойных связей в боковой цепи наблюдается геометрическая изомерия и образуются производные Е- и Z-рядов. В молекулах стеринов могут быть дополнительные оксигруппы в различных положениях, например 1, 4, 7, 25, 26 и т. д. Ниже приведены формулы наиболее важных стеринов:

Фитостерины

ситостерин(5-стигмастен-ЗР-ол)ситостерин(5-стигмастен-ЗР-ол)стигм астерии (5,22-стигмастадиен-30-ол)стигм астерии (5,22-стигмастадиен-30-ол)

ситостерин

(5-стигмастен-ЗР-ол)

ситостерин

(5-стигмастен-ЗР-ол)

стигм астерии (5,22-стигмастадиен-30-ол)

стигм астерии (5,22-стигмастадиен-30-ол)

Микостерины

эргостеринфукостерин

(5,7,22-эргостатриен-Зр-ол)[5,24 (28) -стигмастадиен-Зр-ол]

Зоостерины

Стерины, синтезированные в организмах растений или животных из уксусной кислоты, классифицируют соответственно на фитостерины (микостерины) и зоостерины.

Стерины составляют менее полярную группу стероидов. Они растворяются в неполярных растворителях (углеводороды), которые не растворяют стероиды других классов, и поэтому содержатся в липидных фракциях животного и растительного происхождения.

Наиболее важный представитель стеринов — это холестерин, являющийся одной из главных составных частей тканей и крови животных (частично этерифицированный жирными кислотами и связанный белками). Определение сывороточного холестерина относится к обычным серийным клиническим тестам. В больших

количествах холестерин используют в фармацевтической и парфюмерной промышленности в качестве эмульгатора. Для промышленных целей его получают главным образом из спинного мозга крупного рогатого скота, свиней и т. д., где он находится в свободном состоянии, и шерстяного воска, где он иногда содержится вместе с ланостерином, часто в этерифицированном состоянии.

Экстрагированный из дрожжей эргостерин применяют в качестве исходного сырья для синтеза витамина Г>2, для синтеза же витамина Оз используют 7-дегидрохолестерин, получаемый из холестерина.

Наиболее важным стерином растений (и водорослей) является ситостерин, которому сопутствует множество других сте- ринов.

Стерины всегда были важным исходным материалом для получения стероидных гормонов. Отщепление боковой цепи химическими методами экономично лишь в том случае, когда она содержит двойную связь (например, стигмастерин). В последние годы разработан микробиологический метод отщепления боковой цепи, и поэтому стерины (в основном ситостерин) стали наиболее важным промышленным сырьем для получения различного рода стероидных гормонов.

МЕТОДЫ АНАЛИЗА СТЕРИНОВ

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ

И КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Из всех важнейших стеринов только стерины, содержащие А5’7-сопряженную двойную связь (эргостерин и 7-дегидрохолестерин), можно определять по их собственному поглощению. Максимум поглощения эргостерина, типичного ^z/c-диена, наблюдается при 282 нм и характеризуется молярным коэффициентом поглощения 12150, а второстепенные максимумы лежат при 271,5 и 293,5 нм [261].

Максимумы поглощения стеринов с изолированной двойной связью лежат при <210 нм, что не позволяет использовать их для количественного определения. В последнее время важность этих полос поглощения возросла, поскольку они стали основой обнаружения и количественного определения стеринов после разделения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Фотометрические методы определения стеринов основаны почти исключительно на использовании химических реакций. Меньшая часть этих методов включает стехиометрическое окисление оксигруппы стеринов и колориметрическое определение

продуктов окисления. В методе, разработанном Нишиной и сотр. [200, 201], в качестве окислителя используют оксид хрома (VI) и измеряют при 595 нм поглощение образовавшегося А4-3,6- диона после реакции с n-нитрофенилгидразином и омыления в среде диметилформамида. Значительно более важны методы, разработанные в последнее время и основанные на ферментативном окислении и последующем колориметрическом определении образующегося пероксида водорода. Эти методы обсуждаются отдельно в разд. 4.2.9.

Из классических колориметрических методов определения стеринов (главным образом холестерина) наиболее важным является, несомненно, метод Либермана—Бурхарда. Обсуждение многочисленных работ, посвященных превращению первоначальной методики качественного обнаружения [38, 168] в надежный метод количественного определения и его применению для решения различных задач, можно найти в монографиях [20, 55, 133, 155] и обзорных статьях [179, 304]. Здесь будут рассмотрены только наиболее важные особенности этого метода.

Анализ основан на измерении интенсивности зеленовато-голубой окраски, возникающей после обработки холестерина смесью уксусного ангидрида и серной кислоты в соотношении от 20 : 1 до 5 : 1. Во многих работах сообщается, что этот реагент разбавляют различными растворителями (главным образом хлороформом и уксусной кислотой). Для приготовления реагента Абеля и сотр. [1, 2], наиболее часто используемой модификации реагента Либермана—Бурхарда, 1 объем концентрированной серной кислоты смешивают с 20 объемами уксусного ангидрида, охлажденного ниже 10°С, и затем к смеси, охлажденной в течение 9 мин, добавляют 10 объемов ледяной уксусной кислоты. Такой реагент пригоден для работы в течение 1 ч. Определяемый стерин растворяют непосредственно в этом реагенте. Скорость развития окраски и ее устойчивость зависят от температуры. Упомянутые выше исследователи [1, 2] указывают, что продолжительность реакции составляет 30— 35 мин при 25°С. Хуанг и сотр. [117] получили устойчивый реа-- гент (при хранении в холодильнике пригодный в течение месяца), готовя 2 %-ный раствор сульфата натрия в смеси уксусного ангидрида, уксусной и серной кислот в соотношении 6:3:1 (по объему). Этот реагент до сих пор находит широкое применение.

Окрашенный продукт характеризуется двумя максимумами поглощения при 420 и 620 нм, причем последний используется в большинстве аналитических методов, несмотря на то что известно, что поглощение при меньшей длине волны более стабильно [138]. Чувствительность этого метода довольно низкая, так как, согласно данным по поглощению, приводимым раз-

ными авторами, молярный коэффициент поглощения для холестерина лежит в интервале 1800—2000. Для эфиров холестерина чувствительность несколько выше.

Селективность реакции обсуждалась многими авторами, но наиболее полно она изучена Куком [56]. Кук установил, что в данном случае содержание серной кислоты в реагенте намного ниже, чем в реагенте для колориметрического определения стероидных гормонов. Благодаря этому большинство стероидных гормонов не образует с реагентом характерно окрашенного продукта и не мешает определению холестерина. Хотя развитие окраски обусловлено наличием в молекуле Р, у-нена- сыщенной оксигруппы, А5-3-оксистероиды, не имеющие углеродной боковой цепи при С-17, положительной реакции не дают. Положение и интенсивность полос практически не зависят от природы боковых цепей при С-17 в случае А5-30-оксистеринов, и поэтому этот метод ни в коем случае не пригоден для прямого анализа смеси стеринов растительного происхождения. Интенсивность окраски А5>7-3-оксистеринов почти в 4 раза выше интенсивности окраски холестерина, и, что даже более интересно, она развивается почти мгновенно, тогда как в идентичных экспериментальных условиях для развития окраски в присутствии холестерина требуется около получаса. Это явление было использовано для одновременного определения холестерина и 7-дегидрохолестерина по измерению поглощения при 620 нм через 1,5 и 33 мин с момента начала реакции [184].

Селективность и устойчивость окраски можно повысить введением в реагент ароматических сульфокислот. Из многочисленных модификаций этого метода следует упомянуть метод Уотсона [292] с использованием 2,5-диметилбензолсульфокис- лоты, на который часто ссылаются.

Очень важной особенностью специфичности этого метода является то, что на возникновение и развитие окраски не влияет присутствие дигитонина, поэтому его можно непосредственно применять для количественного определения свободных стеринов, выделенных из сложных биологических систем в форме нерастворимых дигитонидов (см. разд. 4.2.3 и 4.3.2), на чем основаны классические методики Шенхаймера—Сперри [255] и Сперри—Вебба [267].

Изучению механизма реакции Либермана—Бурхарда посвящено много статей. В основном благодаря работам Брискорна и сотр. [29—32] установлено, что при этом образуется ряд окрашенных продуктов, спектральные характеристики которых можно получить после разделения методом колоночной хроматографии на сефадексе LH-20 [30]. Первая стадия реакции заключается в дегидратации с образованием 3,5-диенов с последующей окислительной ди- и тримеризацией последних до высоко

сопряженных производных. Роль серной кислоты не ограничивается только дегидратирующим и окислительным действием — она сульфирует продукты реакции, затрудняя тем самым их экстракцию и изучение структуры.

Из других колориметрических методов с методом Либермана—Бурхарда по важности сравним только метод Златкиса— Зака и др. [302—304, 308]. В качестве реагентов в многочисленных модификациях первоначальной методики служит смесь уксусной кислоты, серной кислоты и хлорида железа (III). Обычно соотношение серной и уксусной кислот в конечной реакционной смеси составляет 40:60 (по объему), а концентрация железа приблизительно 10 мг в 100 мл. Почти мгновенно возникает красная окраска, а максимум поглощения наблюдается при 560 нм. Молярные коэффициенты поглощения холестерина и его эфиров идентичны. Главное преимущество этого метода по сравнению с методом Либермана—Бурхарда заключается втом> что его чувствительность приблизительно в 8 раз выше. Такая же окраска возникает в присутствии и других А5-3-оксистерои- дов, более того наблюдаются помехи со стороны ряда других веществ, находящихся в биологических системах. Поэтому к результатам, полученным методом Златкиса—Зака для сложных биологических систем, следует относиться с осторожностью. Для устранения этих затруднений рекомендуются очистка анализируемого образца на ионообменной смоле дауэкс 1-Х8 и экстракция смесью хлороформа с метанолом (2:1) [264]. Парэк и др. [212, 213] предложили реагент, содержащий ацетат железа (III), сульфат железа(II) и уранилацетат. Поскольку в первоначально предложенном реагенте присутствовал только хлорид железа(III), ожидалось, что последний реагент будет более специфичен, что, однако, недавно было подвергнуто сомнению [10].

При использовании железосодержащих реагентов для определения холестерина в плазме, консервированной азидом натрия, получаются заниженные результаты [139].

Следует упомянуть о применении реагента Чугаева (хлорид* цинка и ацетилхлорид в уксусной кислоте). В присутствии холестерина и его эфиров возникает красно-розовая окраска, максимум поглощения наблюдается при 526 нм. По чувствительности относительно холестерина реагент Чугаева занимает промежуточное положение между двумя обсужденными выше (е^8800), причем в присутствии эфиров холестерина окраска менее интенсивна. В силу ряда технических трудностей этот метод не получил такого же широкого распространения для количественного определения стеринов, как методы, описанные выше. Недавно реакция Чугаева была подвергнута новой проверке в работе Холодовой и др. [140].

Для количественного колориметрического определения сте- ринов описаны и другие реагенты [20, 55, 133, 154], но большинство из них уже не применяется. Во многих работах, посвященных колориметрическому определению стеринов, в последнее время описываются варианты методов Либермана—Бурхарда, Златкиса и Зака [304, 308] или колориметрический вариант ферментативного метода, обсуждаемого в разд. 4.2.9. Одна из редких попыток предложить новый реагент описана в работе Джунгриса и Раппа [131], которые использовали реагент, содержащий 20 мл хлорида сурьмы(V) и 5 г хлорида сурьмы(III) в 100 мл хлороформа и образующий окрашенное соединение с максимумом поглощения при 470 нм.

ФЛУОРИМЕТРИЯ

Когда с целью колориметрического определения (обсуждавшегося в предыдущем разделе) холестерин обрабатывают реагентами, содержащими большие количества серной кислоты, образование окрашенных соединений обычно сопровождается флуоресценцией, которая может стать основой более чувствительного метода определения, чем колориметрический метод.

Альберс и Лоури [5], например, превращали холестерин, содержащийся в экстрактах тканей, в флуоресцирующее производное путем обработки его реагентом, подобным реагенту Либермана—Бурхарда [экстракт обрабатывали 6 мкл серной кислоты после растворения в 150 мкл смеси 1,1,2-трихлорэтана и уксусного ангидрида (5:1)]. Холестерин и его эфиры дают очень близкие по интенсивности, чрезвычайно устойчивые сигналы, если измерение основано на регистрации красной флуоресценции, возбуждаемой линией ртутной лампы при 546 нм. Этим методом можно определять очень небольшие количества холестерина (до 0,1 мкг). Подобные методы описаны и другими авторами [43, 181, 294] и обсуждены в обзорах Бартоша и Пезе [20] и Элевича [74].

Недавно Майески и др. [174] описали флуориметрический вариант реакции Сальковского, в котором смешивают равные объемы концентрированной серной кислоты и раствора определяемого холестерина в дихлорметане, энергично встряхивают и измеряют флуоресценцию сернокислого слоя при 450 нм, используя источник возбуждения с длиной волны 415 нм. Эфиры холестерина перед выполнением анализа омыляют. Этот метод имеет значительно более низкую чувствительность, чем метод Альберса—Лоури, но все же он пригоден для определения холестерина в 250 мкл сыворотки крови.

Применение реагента, содержащего смесь хлорида железа (III) и серной кислоты (растворенных в этилацетате),

позволило разработать чувствительный метод определения ОД — 5 мкг холестерина, описанный Баджио и др. [14]. Его успешно применяли для определения холестерина в липопротеиновой фракции, полученной электрофорезом на геле агарозы.

Флуориметрический вариант ферментативного определения холестерина описан в разд. 4.2.9.

МЕТОДЫ ОСАЖДЕНИЯ В ВИДЕ ДИГИТОНИДОВ

Ранние наблюдения Виндауса [296] об образовании нерастворимого молекулярного комплекса (1:1) между холестерином и дигитонином послужили основой для разработки одного из ставших классическим методов анализа стероидов.

R = ксилоза— (галактоза) 2— (глюкоза) 2—

Позже было установлено, что стерины, содержащие свободные Зр-оксигруппы и А5-двойные связи или 5а-водород, также дают реакцию с дигитонином, тогда как другие стерины, главным образом За-оксипроизводные, нс вступают в нес, и поэтому этот метод имеет важное значение для определения конфигурации 3-оксигруппы [102].

Реакцию с дигитонином можно использовать для количественного определения только стеринов (другие Зр-окси'стсроиды нс образуют достаточно нерастворимых соединений, которые можно было бы определять на основе этой реакции). Образование комплекса между стсринами и дигитонином можно различными способами использовать для количественного определения стеринов или их разделения при определении другими аналитическими методами. (Несмотря на то, что другие сапонины, например гитонин [61], образуют даже менее растворимые молекулярные комплексы, чем дигитонин, а также на то, что описано образование осадка с алкалоидом томатином [256], дигитонин остается единственным реагентом, до сих пор сохраняющим значение в анализе стеринов.)

Если для выполнения анализа располагать по крайней мере 10—20 мг стерина, гравиметрический метод обеспечивает по-

лучение надежных результатов. Для уменьшения потерь из-за неполноты осаждения образец, растворенный в 10 мл этанола, обрабатывают при 70°С небольшим избытком дигитонина, растворенного в смеси 12 мл этанола и 5 мл воды. Для ускорения осаждения к реакционной смеси можно добавить хлорид алюминия [36]. После стояния в течение 2 ч осадок отфильтровывают и высушивают при 105°С. Гравиметрический фактор имеет небольшую величину (0,239 для холестерина), что благоприятствует анализу. Если присутствуют также эфиры сте- ринов с жирными кислотами, перед выполнением анализа необходимо провести их омыление (например, нагревая в течение^3 4 ПРИ в присутствии 1 % гидроксида калия)

Осаждение и выделение осадков стеринов находят широкое применение при их удалении из сложных смесей. В неомыляемых фракциях липидов растительного или животного происхождения стерины содержатся в таком большом избытке, что их необходимо удалить перед проведением анализа, чтобы можно было определять содержание минорных компонентов в фильтрате. Из многочисленных примеров следует упомянуть определение витамина D3 в жире печени трески методом колориметрии [4] или газовой хроматографии [22], где осаждение стеринов в форме дигитонидов является важной стадией предварительной подготовки пробы перед определением витамина D, поскольку последний не осаждается дигитонином. Для тех же целей можно использовать метод колоночной хроматографии на целите, модифицированном дигитонином, так как такие колонки селективно поглощают стерины [150, 210].

Комплексы стеринов с дигитонином и томатином, что очень важно, легко разлагаются при обработке кислотами, пиридином и т. п. Поскольку образующиеся при этом дигитонин и томатин не мешают применению метода Либермана—Бурхарда, то осадок можно прямо проанализировать с помощью этого метода. Такой принцип, впервые использованный Шенхаймером и Сперри [225], в последнее десятилетие нашел широкое применение. Здесь уместно процитировать только несколько публикаций [12, 85, 118, 132, 267]. Главным достоинством введения этой стадии в методику Либермана—Бурхарда является повышение ее селективности. Модифицированные методы обычно заключаются в экстракционном отделении стеринов от биологической матрицы подходящим растворителем, осаждении комплекса, отделении его центрифугированием и использовании осадка по методу Либермана—Бурхарда.

Гарно [93а] описал способ фракционирования дигитонидов стеринов с помощью тонкослойной и колоночной хроматографии на силикагеле, а Эл-Олеми и Штос [75] сообщили

19 Заказ № 182

о возможности их разложения и хроматографического разделения на компоненты на сефадексе LH-20.

Используя зависимость скорости осаждения дигитонидов стеринов от таких структурных особенностей, как степень ненасыщенности, конфигурация при С-5 и С-17 и длина боковой цепи при С-17 [102, 103, 113], Попов [230] разработал методику фракционированного осаждения, пригодную для разделения различных классов стеринов, содержащихся в морских беспозвоночных, что облегчает их дальнейшее изучение комбини- рованым методом газовой хроматографии — масс-спектрометрии.

Для полноты картины следует кратко упомянуть о таких ранних методах, как, например, метод, основанный на окислении выделенного комплекса [270], количественный метод, основанный на ингибировании холестерином гемолиза красных кровяных телец, вызываемого дигитонином [166], и нефелометрический метод определения холестерина в виде дигитонида [227]. С помощью автоанализатора «Техникой» [171] был автоматизирован турбидиметрический метод определения холестерина.

ЭЛЕКТРОАНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Стерины полярографически не активны; в период развития классической полярографии предпринимались попытки превратить их в соединения, способные восстанавливаться на капающем ртутном электроде [28]. Гершберг и сотр. [106, 107] превращали А5-3-оксистероиды (в том числе стерины) в А4-3-ке- топроизводные окислением по Оппенауэру, которые после превращения в производные Т Жирара можно определять полярографически. Другая возможность заключается в образовании 3,5-динитробензоатов и полярографическом определении по восстановлению нитрогрупп [28].

Моравек [185, 186] описал способ осциллополярографиче- ского определения холестерина и его эфиров жирных кислот-. Определение этих соединений основано на их способности адсорбироваться на поверхности ртутного электрода, в результате чего на осциллополярограмме наблюдается максимум, высота которого пропорциональна концентрации холестерина или его эфиров. Чувствительность данного метода при определении эфиров намного выше.

Хотя описанные выше методы можно успешно использовать для решения таких практических задач, как определение сывороточного холестерина, вызывают интерес недавно разработанные методы, Bi которых полярографическому определению предшествует ферментативное окисление холестерина. Эти ме-

тоды будут рассмотрены отдельно в разд. 4.2.9; там же будут обсуждаться возможности разработки холестеринселективного электрода.

КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Большая часть методов количественного анализа стеринов начинается с фракционирования образца с помощью колоночной хроматографии. Цель этой стадии заключается либо в отделении фракции стеринов от других липидов, присутствующих в образце, либо в разделении стеринов для того, чтобы повысить селективность последующего определения. Фракционирование на этой стадии полезно даже в том случае, если анализ проводят такими высокоселективными методами, как высокоэффективная жидкостная хроматография или газовая хроматография, поскольку без предварительного фракционирования хроматограммы сложной смеси стеринов были бы слишком трудными для расшифровки.

Обычно посвященные хроматографии монографии содержат обширные данные по практике и применению колоночной хроматографии для разделения стеринов [63, 104, 146, 194]. Мы рассмотрим только несколько характерных примеров.

Отделение стеринов от других липидов описано в работах Хирша и Аренса [109] и Кэролла [44, 45]. Эти исследователи использовали колонки с силикагелем и флорисилом соответственно и градиентное элюирование с помощью растворителей, начиная с углеводородов и кончая метанолом или смесью уксусной кислоты и диэтилового эфира. Стерины относятся к наименее полярным компонентам липидов. Эфиры холестерина элюируются в первых фракциях, а свободный холестерин вымывается после триглицеридов.

Из адсорбентов для разделения стеринов чаще всего используют силикагель [49, 89, 144, 157, 159, 165], оксид алюминия [77, 78, 215, 217, 230] или (если предполагается провести разделение в соответствии со степенью ненасыщенности) те же адсорбенты, модифицированные нитратрм серебра [64, 164, 207, 214, 230, 291, 307]. Возрастает значение гель-хроматографии на сефадексе LH-20 [48, 75, 76, 79, 80, 288] или его оксиал- коксипропилпроизводном (липидексе) [218]. Применяются также жидкостная распределительная хроматография с использованием в качестве твердого носителя целита 545 и различные системы растворителей с прямыми и обращенными фазами [39, 40, 193]. Несколько примеров из большого числа всевозможных хроматографических методов разделения стеринов приведено в табл. 4.1.

Таблица 4.1. Некоторые методы разделения стеринов с помощью колоночной хроматографии

Автор

Год

Разделяемые материалы

Колонка

Элюент

Метод определения

Франц [89]

1963

Свободные стерины

Смесь силикагеля и хай- фло-сюперселя (2 : 4)

Бензол

Колориметрия

Попов и сотр. [230]

1976

Стерины морских организмов

Оксид алюминия, брок- ман III

30 % AgNO3 на оксиде алюминия

Гексан—диэтиловый эфир (94 : 6)->(91 : 9) Г ексан->гексан—диэтиловый эфир (10 : 3)

ГЖХ; ГЖХ—МС

ГЖХ; ГЖХ—МС

Нордби и Наги [207]

1973

Стерины апельсинового сока

25 % AgNO3 на силикагеле

Гекса н->эфир

тех, гжх

Паттерсон и др. [218]

1975