Предисловие

Как и хроматография на бумаге, хроматография в тонких слоях получила наибольшее развитие в области биохимических исследований, что придает книге Шталя определенную окраску. Однако автор находит место и для описания приемов разделения смесей неорганических веществ.

Следует надеяться, что предлагаемая вниманию читателя книга будет способствовать еще большему внедрению этого чувствительного и универсального метода анализа в практику наших научно-исследовательских лабораторий. ■

К. Чмутов

ПРЕДИСЛОВИЕ К НЕМЕЦКОМУ ИЗДАНИЮ

За несколько последних лет хроматография в тонких слоях завоевала такую популярность, что возникла необходимость в обобщении всего появив- - шегося до настоящего времени разрозненного опытного материала в виде отдельной монографии и ознакомлении с ним широких кругов исследователей. Этим методом можно анализировать органические и неорганические вещества в количествах от 10"® до 10"6 г. Одному человеку трудно приобрести сведения и опыт лабораторной работы для составления руководства к практическим исследованиям, которое бы оказало существенную помощь как начинающему, так и специалисту. Поэтому для данной цели объединилась группа ученых различных стран, попытавшихся решить задачу наилучшцм образом. При нынешнем состоянии хроматографии в тонких слоях казалось весьма важным, чтобы авторский коллектив использовал свои еще не опубликованные оригинальные работы.

Поскольку метод находит многочисленное применение в различных областях естествознания и медицины, мы отказались от краткого изложения способов получения веществ, понятных только узким специалистам. Краткие вводные замечания о химии и номенклатуре разделяемых групп веществ и соответствующие литературные ссылки облегчают освоение материала. Учитывая конечный результат, пришлось подробнее остановиться на процессах обогащения, в которых часто бывает необходимость. Иногда возникала необходимость по-новому расположить материал — обычно расположение должно быть в соответствии с излагаемым методом анализа. Так, например, специальная часть начинается с анализа липоидов и кончается гидрофильными соединениями. Объем отдельных глав^определяется современным уровнем знаний в данной области.'

В общей части, в особенности в случае приборов, когда методика работы и обращение с ними известны, не приводится подробных обзоров, часто усложняющих изложение. В виде рабочих инструкций приводятся только испытанные, и оправдавшие себя методы, которые могут быть без труда освоены начинающим. Изложению теоретических основ хроматографических процессов посвящена специальная глава, позволяющая перейти от чисто эмпирического и интуитивного подхода к математическому описанию процесса и обработке результатов.;,

К пожеланию о том, чтобы данное руководство оказало столь же полезную помощь в лаборатории, как это уже можно утверждать в отношении метода, я присоединяю мою искреннюю благодарность всем помогавшим мне в работе.

Саарбрюкея, лето 1962 г.

-Эгон Шталъ

ОБЩАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 1

ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ ХРОМАТОГРАФИИв тонких слоях

' .9. Штадъ.

С первого взгляда кажется удивительным, что принцип хроматографии и тонких слоях, описанный впервые около 25 лет назад, стал широко известным лишь 3 года назад, а сейчас признан yate незаменимым. Краткий обзор истории развития метода представляет поэтому не только простой интерес, но и позволяет также понять основные закономерности, лежащие в основе метода. Первые публикации относятся к периоду большого успеха колоночной хроматографии Цвета. В это время начинают работать над созданием «микрохроматографии», пытаясь уменьшить диаметр колонки до 1 мм^ Затруднения того времени Цехмейстер характеризовал в 1938 г. следующими словами [741: «Основная задача микрохроматографии заключается не в создании аппаратуры (имеется в виду колоночная хроматография), а в безупречной идентификации адсорбированных веществ». Решение этой задачи привело к переходу от «закрытых» к «открытым» колонкам, т. е. к тонким разделительным слдям. Это положение, сформулированное несколько лет назад, уже позволяет понять простоту метода и широкие возможности его применения [56]. -

В статье «Капельно-хроматографический метод анализа и его применение в фармацевтике» Измайлов и Шрайбер [20] в 1938 г. описали основы метода и использовали его для разделения экстрактов лекарственных растений (тинктуры русской фармакологии VII).

Они замешивали сорбент (главным образом окись алюминий) на воде в виде пасты, которую намазывали слоем толщиной в 2 мм на предметные стекла. В случае более толстых слоев наблюдалось обраэ<Хвание трещин, а получение более тонких слоев, по их мнению, создает технические затруднения. На середину высушенного слоя наносят каплю исследуемой спиртовой вытяжки растения. Часто уже при кольцеобразном расширении появляются красивые зоны; при их отсутствии для проявления добавляют по каплям немного спирта, пока, зоны не перестанут расплываться. Авторы сравнили затем полученные ими кольцевые хроматограммы с соответствующими колоночными хроматограммами (рис. 1, ср. с рис. 20) и указали на преимущество их нового метода. - . '

Работа русских исследователей заканчивается следующим выводом:

«Разработан метод хроматографического адсорбционного анализа, основанный на разделении веществ в тонком слое адсорбента на эоны, при применении одной капли вещества. ■

Результаты, полученные предложенным методом, качественно совпадают с результатами, полученными обычным методом адсорбционной хроматографии. Метод позволяет получить удовлетворительные результаты при затрате одной капли исследуемого вещества, очень небольших количеств адсорбента и за минимальное время. .

Метод можно использовать для анализа фармацевтических препаратов и их идентификации, а также для предварительной оценки сорбента и растворителя. Новым методом было изучено 16 фармацевтических препаратов».

Ссылаясь на реферат этой статьи, Кроуве [9] в 1941 г. сообщил, что в своей лаборатории он уже в течение некоторого времени использует сорбент в тонких слоях в чашках Петри и на таких незакрепленных слоях получил аналогичное разделение. Здесь, разумеется, мы имеем дело только с опытами, предшествовавшими колоночной хроматографии.

Мы можем уже теперь различать два метода: по одному из них работают с прочно закрепленными разделительными слоями, а по другому — со свободно насыпанными слоями, со всеми вытекающими отсюда недостатками . В усовершенствованном виде метод описан в 1947 г. Вилльямсом [70]. Он защищает свободный слой, накладывая стеклянную покровную пластинку с отверстием в центре, через которое и растворитель.

Рис. 1. Сравнение окраски флуоресценции колоночной хроматограммы на окиси алюминия (Z) настойки белладонны с окраской капельной хроматограммы (ZZ)) перед проявлением (а) и после проявлении (б) спиртом (по Измайлову и Шрайбер [20]).Рис. 1. Сравнение окраски флуоресценции колоночной хроматограммы на окиси алюминия (Z) настойки белладонны с окраской капельной хроматограммы (ZZ)) перед проявлением (а) и после проявлении (б) спиртом (по Измайлову и Шрайбер [20]).При решении задачи разделения аминокислот и их производных Мартин и Синдж [32] ряд лет шли другим путем. Используя распределительную аппаратуру, они разработали распределительную хроматографию. Для этог» они закрепляли одну из фаз (неподвижную фазу) на носителе, например порошкообразном силикагеле, и затем заполняли им колонку. В качестве- «растворителя», называемого в данном случае подвижной фазой, использовали, например, хлороформ.

Рис. 1. Сравнение окраски флуоресценции колоночной хроматограммы на окиси алюминия (Z) настойки белладонны с окраской капельной хроматограммы (ZZ)) перед проявлением (а) и после проявлении (б) спиртом (по Измайлову и Шрайбер [20]).

Рис. 1. Сравнение окраски флуоресценции колоночной хроматограммы на окиси алюминия (Z) настойки белладонны с окраской капельной хроматограммы (ZZ)) перед проявлением (а) и после проявлении (б) спиртом (по Измайлову и Шрайбер [20]).

Чтобы иметь возможность осуществить свою распределительную хроматографию в микромасштабе, они перешли к фильтровальной бумаге, т. е. к открытой колонке (Консден, Гордон, Мартин [8], 1944 г.). Их результаты в области разделения аминокислот получили всеобщее признание, и метод, был широко подхвачен другими исследователями. Начал развиваться метод хроматографии на бумаге. К 1956 г. было опубликовано свыше 10 тысяч работ, в которых описывалось применение этого «универсальйого метода» [15]. Понятно, что под впечатлением этих успехов, все время пытались обойти трудности, изменяя пропитку, используя новые комбинации растворителей, применяя обращение фаз и химически обрабатывая целлюлозное волокно. Пытаясь исключить все адсорбционные эффекты, большие надежды возлагали на бумагу со стеклянным волокном.

Аналогично приемам адсорбционной хроматографии пытались наносить на фильтровальную бумагу, а позже на бумагу со стеклянной тканью -дву-

окись кремния и окись алюминия. Кирхнер (1950 г.) [25] одним из первых пошел по этому пути. Не ясно, почему он вместе с Миллером обратился к работе 1948 г. Майнхарда и Холла [34], в которой метод Измайлова — Шрайбер фигурирует под названием «поверхностная хроматография» (Surface Chromatography). Ло-видимому, уже тогда их не удовлетворили результаты, полученные с бумагой, на которую был нанесен силикагель. Безусловно, Кирхнер и Миллер первые более подробно занялись" рассматриваемым методом, в частности разделением производных терпенов на тонких слоях сорбентов, и опубликовали свои результаты в многочисленных работах [26, 36—

38]. Они дали толчок к применению метода под названием «метод хроматографических полос» (Chromatostrip-technique) для разделения производных терпенов, после чего в этой области появилось большое число публикаций. Один из авторов (Рай- цема, 1954 г. [50, 51]) применял вместо узких стеклянных полос более широкие пластинки (12,5 X 17,8 см) и сумел благодаря этому, как и в случае хроматографии на бумаге, разделить параллельно несколько смесей веществ. Удивительно, что практически все авторы вновь забывали этот метод. Это, по-видимому, связано с тем, что как раз при разделении эфирных масел результаты наименее удовлетворительны, что обусловлено незнанием основных факторов, вызывающих сильный разброс величин Rf . Возможно, это объясняется также тем, что к этому времени в США для этой цели стали уже использовать газовую хроматографию. Как будет видно,

1903'1930323436 38■Годы1903'1930323436 38■ГодыР и с, 2. Число появляющихся еже- 1 годно с 1903 по 1938 г. публикаций, в которых приводятся данные по колоночной хроматографии.Р и с, 2. Число появляющихся еже- 1 годно с 1903 по 1938 г. публикаций, в которых приводятся данные по колоночной хроматографии.возможность широкого применения, универсальность и другие многочисленные преимущества остались незамеченными, что отчетливо следует из сводки ежегодно публикуемых работ, посвященных этому вопросу.

1903'1930323436 38

■Годы

1903'1930323436 38

■Годы

Р и с, 2. Число появляющихся еже- 1 годно с 1903 по 1938 г. публикаций, в которых приводятся данные по колоночной хроматографии.

Р и с, 2. Число появляющихся еже- 1 годно с 1903 по 1938 г. публикаций, в которых приводятся данные по колоночной хроматографии.

Аналогичную картину развития мы наблюдаем, и в случае колоночной хроматографии Цвета (рис. 2); прошло свыше 20 лет, пока работами Рихарда Куна не было доказано значение этого метода. Еще более длинный «инкубационный период» имела хроматография на бумаге. Уже в 1906 г. появилась книга Гоппельсредера [14] «К изучению капиллярного анализа, основанного на адсорбционных и капиллярных явлениях». Лишь полвека спустя Консден, Гордон, Мартин и Синдж создали из этого полезный метод.

Я уже свыше 10 лет интересовался проблемой разделения содержимого растительной клетки и занимался поисками метода, пригодного для этого. Содержимое исследуемых растительных железистых волосков в соответствии с их объемом составляет менее 0,1 цг, и поэтому я сразу мог констатировать, что ни один из тогдашних хроматографических методов не позволяет добиться желательного результата. Микрофотография показала, что железистый волосок меньше отдельного зернышка разделительного слоя или волокна целлюлозы бумаги. Чтобы продвинуться вперед, я перешел к открытым колонкам из тонкоизмельченного материала и стал использовать известные палочки и желобки из окиси магния. Полученные результаты оказались достаточно хорошими, но адсорбционная активность была слишком мала.

В то время в моей лаборатории Генсхирт начал работать над методом «хроматографических полос» и использовал его. для разделения эфирных масел. Это не облегчило решения стоявшей тогда передо мной задачи. Дальнейшие- опыты с прессованными слоями силикагеля, волокнистым или сплавленным стеклом, пластинками из глины, алюминиевой фольгой, подвергнутой анодному окислению, привели лишь к частичному успеху. Лучше других оказались тонкие слои, полученные из тонкоиэмельченного геля кремневой кислоты. Так я сумел постепенно установить факторы, влияющие на эффективность метода и определить возможности его применения, что было мной изложено в 1956 г. в небольшом сообщении [55]. И эта работа, как и работы моих предшественников, осталась незамеченной. Тогдашнее состояние вопроса лучше всего характеризует мнение, что этот метод представляет собой «обычное хроматографическое баловство». .

Убежденный в противоположном, я искал убедительных доводов, согласно которым этот метод можно было бы противопоставить обычно используемым. В соответствии с этим мне казались существенными следующие моменты:

стандартизация метода (толщина слоя, размеры, методика приготовления, разделительные камеры);'

изготовление соответствующей вспомогательной аппаратуры, обеспечивающей рациональное проведение работы;..

' создание разнообразных сорбентов . в виде веществ постоянного состава;

4) определение области применения метода. .

В результате этих усилий на Выставке химической аппаратуры (АСНЕМА) 1958 г. было представлено основное оборудование для хроматографии в тонких слоях [56]. Интерес со стороны промышленных лабораторий был велик. Особенное впечатление производила быстрота анализа и прекрасное разделение на тонких слоях силикагеля Г. Лишь с этого времени хроматография в тонких слоях получила всеобщее признание и распространение. В 1961— 1962 гг. появились первые более полные обзоры, в которых были рассмотрены прежние результаты анализа [2, 12, 21, 42, 45, 54, 59, 61, 67, 69, 73].

ГЛАВА 2

АППАРАТУРА ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИИВ ТОНКИХ СЛОЯХ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ

Э. ШтаМ

I НАНЕСЕНИЕ ТОНКИХ РАЗДЕЛИТЕЛЬНЫХ СЛОЕВ НА ПЛАСТИНКИ

'• Для нанесения на пластинки тонких порошков твердых веществ или Их суспензий в виде тонких слоев существует ряд возможностей. Такие методы существуют давно, например в промышленности лаков и пленок; различные методы можно подразделить в зависимости от способа нанесения слоя.

Намазывание: 1. С помощью подвижного устройства для нанесения на неподвижную пластинку. 2. С помощью неподвижного устройства для нанесения путем перемещения пластинки.

Б. Поливка суспензией или насыпка твердых веществ на пластинку с применением вспомогательной разравнивающей пластинки.

Погружение пластинки в суспензию.

Г. Опрыскивание разбавленной суспензией (метод пульверизации).

Вначале работы велись по методу Б [20]. Поскольку в этом методе не нужен прибор, метод иногда применяют и в настоящее время, однако он не обеспечивает получения тонких и равномерных Слоев. Это же относится к методам В и Г. Миллер и Кирхнер [38] описали в 1954 г. неподвижное устройство для протягивания узких стеклянных полос, напоминающее по форме воронку (метод А. 2). Наносимая масса вытекает из выходной щели регулируемой ширины на протягиваемую полосу. В конце работы приводится метод изготовления, эскизы и фотографии. В несколько видоизмененном виде зто приспособление было использовано в 1961 г. для получения «хроматографических полос» [1].

Недавно Уодиш [73] описал работающее по такому же принципу (А.2) приспособление, предложенноеМуттером и Хофштеттером и выпускаемое фирмой «Camag». Приспособление пригодно для пластинок шириной 9,5 и 10 см. На пластинки наиболее распространенного в настоящее время размера 20 х X 20 см зтим приспособлением слои наносить нельзя. Изготовителем подчеркивается возможность регулирования йысоты выходной щели. Нет смысла подробно останавливаться на этом приспособлении, поскольку до настоящего времени оно использовалось редко. Неубедительным является довод, что можно применять пластинки различной толщины. Это возможно и с автоматом для намазывания тонких слоев, кратко описанным в 1958 г. [56] (рис. 3). Согласно этой конструкции, пластинки осторожно протаскивают под прибором для нанесения слоя и перемещают с помощью небольшого конвейера. Прибор приводится в действие электромотором и позволяет за 1 час равномерно покрыть более тысячи пластинок. Опыт показал, однако, что, как правило, достаточно уложить в ряд пластинки одинаковой толщины и за один ход намазать их с помощью приспособления для нанесения тонких слоев. Правда, ойисанное впервые в 1956 г. устройство (метод А.1.) было пригодно только для слоев шириной 5 см. Дальнейшее усовершенствование этого принципа привело к прибору, позволяющему намазывать тонкие слои

Р и с. 3. Автомат для нанесения слоев [56].Р и с. 3. Автомат для нанесения слоев [56].Слева магазин со стеклянными пластинками, ниже транспортер с приводом. В правой части шаблон для нанесения с приспособлением для точного регулирования толщины слоя. Масса для нанесения подается в воронку; мешалка уменьшает седиментацию.Слева магазин со стеклянными пластинками, ниже транспортер с приводом. В правой части шаблон для нанесения с приспособлением для точного регулирования толщины слоя. Масса для нанесения подается в воронку; мешалка уменьшает седиментацию.шириной 20 см . В первые годы отказывались от возможности регулирования ширины выходной щели, поскольку полагали, что при этом потребители будут работать с различной толщиной слоя. При разработке метода оказалось необходимым начать с проверенной стандартной толщины слоя.

Р и с. 3. Автомат для нанесения слоев [56].

Р и с. 3. Автомат для нанесения слоев [56].

Слева магазин со стеклянными пластинками, ниже транспортер с приводом. В правой части шаблон для нанесения с приспособлением для точного регулирования толщины слоя. Масса для нанесения подается в воронку; мешалка уменьшает седиментацию.

Слева магазин со стеклянными пластинками, ниже транспортер с приводом. В правой части шаблон для нанесения с приспособлением для точного регулирования толщины слоя. Масса для нанесения подается в воронку; мешалка уменьшает седиментацию.

Согласно многочисленным опытам по аналитическому применению, наиболее целесообразной оказалась толщина слоя в 150—250 ц, соответствующая толщине бумаг, обычно используемых в методе хроматографии на бумаге. Однако иногда необходимы более толстые слои, например для микропрепаратив- ного разделения с последующим выделением отдельных компонентов. Поэтому устройство для нанесения слоев фирмы «Desaga» с 1962 г. снабжено выходной щелью с максимальной шириной 2 мм. Толщину слоя на этом приборе можно легко регулировать (см. рис. 5).

В случае сильно разбавленных суспензий для нанесения нельзя получить слои толще 1 мм. В лаборатории авто

ра для микропрепаративного разделения использовали слои толщиной 500 и 750 ц на пластинках шириной 20 см и длиной 40 см. Вещество (до 500 мг) наносили в виде полосы.

ПРИБОР ДЛЯ НАНЕСЕНИЯ ТОНКИХ СЛОЕВ

Всеобщее распространение получило устройство для нанесения тонких Шталем, и поэтому его следует описатьВсеобщее распространение получило устройство для нанесения тонких Шталем, и поэтому его следует описатьсорбционных слоев, разработанное подробнее. Прибор состоит из двух частей: рабочего шаблона, на котором укладывают в ряд пластинки, и собственно устройства для нанесения, содержащего жидкую массу, равномерно наносимую в виде тонкого слоя. Принцип работы ясен из рис. 4.

Всеобщее распространение получило устройство для нанесения тонких Шталем, и поэтому его следует описать

Всеобщее распространение получило устройство для нанесения тонких Шталем, и поэтому его следует описать

Устройство для нанесения тонких слоев весом почти 2 кг состоит из

Рис. 4.

а — принцип работы прибора для нанесения тонких слоев; б — рабочий шаблон со стеклянными пластинками, частично намазанными (точками показана сорбционная масса).

латунного блока, покрытого слоем твердого хрома, в котором укреплена имеющая с одной стороны щель втулка, содержащая наносимую массу.

Рукояткой втулку можно повернуть на 180°. Этот механизм со втулкой позволяет перемешивать сорбент с водой и предотвращает преждевременное вытекание готовой массы. Емкость сосуда составляет 150 мл, что достаточно для намазывания не менее 10 пластинок (20 X 20 см при толщине слоя 250-р). '

Методика работы

Рабочий шаблон. Изготовленный из цветной пластмассы рабочий шаблон длиной 112 см и шириной 22 см помещают на прочный стол так, чтобы длинная упорная кромка находилась ближе к работающему. Короткая кромка находится справа. Полосы пористой резины, приклеенные к нижней поверхности шаблона, предотвращают скольжение. После этого помещают 5 квадратных одинаковой толщины, стеклянных пластинок 20 X X 20 см, или 10 пластинок 10 X 20 см, или 2 большие пластинки 40 X 20 см. Тщательно очищенные, обезжиренные стеклянные пластинки должны быть плотно прижаты друг

Рис. 5. Прибор для нанесения тонких слоев регулируемой толщины 0 — 2 дм* -(фирма «Desaga», Гейдельберг)..

к другу и к упорной кромке. В правом и левом концах уложенных в ряд пластинок помещают по пластинке размером 5 X 20 см (начальная и конечная пластинки).

Установка прибора для нанесения слоя. Пустой прибор вначале устанавливают на начальную пластинку. Выгравированная красная стрелка указывает направо, в направлении перемещения прибора. Своей йаправляющей прибор плотно прилегает к рабочему шаблону. Вначале делают несколько равномерных не слишком медленных и не слишком быстрых движений прибора. При этом лучше находиться у середины шаблона, держа прибор обеими руками н перемещая его без нажима от начальной пластинки до конечной. Собственно процесс нанесения слоя для ряда пластинок длиной в 1 м должен составлять 5—6 сек. Таким способом проверяют, состоит ли весь ряд из пластинок одинаковой толщины (при перемещении прибора не должно происходить толчков).

Установка толщины слоя. В новой модели прибора для нанесения тонких слоев фирмы «Desaga» (рис. 5) очень просто и остроумно решена задача регулирования толщины слоя. Ослабляют два установочных винта на передней стороне прибора и, перемещая переднюю пластинку вправо или влево, подымают ее или опускают. Неподвижная маркировочная линия указывает на подвижной шкале установленную толщину слоя. Максимальная ширина выходной щели составляет 2 мм, позволяя; таким образом, равномерно насыпать на пластинки свободные слои из обычно применяемых в колоночной хроматографии крупнозернистых сорбентов.,

Заполнение прибора и намазывание пластинок. При заполнении рукоятка рычага должна быть установлена в направлении красной стрелки, выгравированной на верхней стороне прибора. После этого загружают воду и сорбент, новоротом рычага на 90°- закрывают и перемешивают содержимое, встряхивая весь прибор. Формовочную Массу можно также перемешивать в фарфоровой ступке Для размельчения отдельных кусочков массы и удаления пузырьков воздуха, после чего загрузить в прибор. Затем помещают , прибор на начальную пластинку шаблона и поворачивают правой рукой рычаг на 180°; левой рукой прижимают прибор к пластинке и ожидают, пока масса не появится из выходной щели. В это время можно смочить поверхность стекла справа от прибора влажным пальцем, чем достигается лучшее скольжение прибора, который затем перемещают

2 Заказ № 734

описанным методом над пластинками, расположенными в ряд, до конечной пластинки и возвращают рукоятку рычага в исходное положение. При необходимости обработать за один рабочий ход 10 пластинок (20 X 20 см') применяют второй рабочий шаблон. Прибор заполняют удвоенным количеством массы и намазывают первый ряд до конечной пластинки, после чего подымают конечную пластинку с находящимся на ней прибором, помещают ее как Начальную на второй шаблон и обрабатывают следующие пластинки. Процесс от перемешивания массы до окончания обработки пластинок должен длиться не более 5 мин.

Очистка и хранение прибора для нанесения тонких слоев. Сразу после нанесения слоя прибор промывают сильной струей воды для удаления оставшейся массы. Ослабив навинтную крышку втулки, вытаскивают последнюю из металлического блока.

Рис. 6. Простое и аккуратное нанесение слоя на пять пластинок на лабораторном месте. Слева — разделительная камера с хроматограммой, за ней подставка из легкого металла для сушки.

Таким образом можно провести тщательную очистку специальной щеточкой. Особенно следует обратить внимание на хорошее состояние граней выходной щели: они должны быть зеркально гладкими и не должны иметь бороздок. Поэтому чисткой и хранением прибора должен заниматься тот же персонал, который на нем работает.-

В нашей лаборатории эти приборы используются уже годами без признаков износа;

с" их помощью приготовлено свыше 15 000 пластин для хроматографии в тонких слоях.

Для полноты следует отметить, что в некоторых работах были описаны «устройства для нанесения тонких слоев», в основе которых лежит анало-

гичный принцип [3, 10, 11, 29, 46, 53]. Их создавали для облегчения процесса нанесения слоя, однако они давали менее равномерные слои по сравнению с оригинальным прибором. С помощью этих вспомогательных средств были проведены предварительные опыты, приведшие к созданию современного прибора для нанесения тонких слоев.

И. СУШКА, ХРАНЕНИЕ И ПЕРЕНОСКА ПЛАСТИНОК С ТОНКИМИ СЛОЯМИ

В большинстве случаев сорбент наносят на пластинки в виде водных суспензий, после чего воду следует удалить (6—8 мл с пластинки размером

Р и с. ' 7. Процесс сушки свежеприготовленных слоев силикагеля Г при различных 'условиях [63].' •■

без вентилятора, 22°;вентилятор, 22°;сушильный шкаф, 110°. Стрелки указывают стадию сушки, при которой слой перестает быть прозрачным и становится белым.

20 X 20 см\ Этот процесс носит название сушки. Можно установить следующие стадии удаления воды:

вначале поверхность слоя обладает водным блеском;

через несколько минут блеск исчезает и слой становится матовым;

после упарки примерно 50% воды слой перестает быть прозрачным и становится совершенно белым.

На рис. 7 приведены кинетические кривые сушки слоя силикагеля Г. Видно, что сушка занимает немало времени. Вначале основную часть воды удаляют в токе воздуха (предварительная сушка), после чего пластинки окончательно сушат при повышенной температуре. При предварительной сушке свеженамазанные пластинки оставляют на шаблоне. Для создания холодных или теплых потоков воздуха со ступенчатой регулировкой температуры применяют калориферный вентилятор «Астрон 2000», широко используемый в лаборатории (рис. 8) ."

Сушку завершают при повышенной температуре. Как правило, пластинки с тонкими слоями достаточно нагревать в вертикальном, положении в течение 30 мин при 110°. Для этого лучше всего воспользоваться прямоугольным воздушным сушильным шкафом шириной не менее 42 см с вентилятором. Для получения очень активных слоев пластинки с силикагелем и окисью алюминия нагревают 3—4 час при 150°.

Интенсивная сушка целесообразна лишь в случае нанесения проб веществ в соответствующим образом осушенной атмосфере при работе с абсолютно сухими разделяющими жидкостями. Это обычно необходимо только в случае анализа методом хроматографии в тонких слоях смесей углеводородов. На очень активных адсорбентах велика опасность разложения веществ.

Соображения об оптимальном периоде сушки и оптимальной температуре сушки связаны друг с другом. В случае хроматографического анализа полярных веществ, например аминокислот, совершенно отказываются от предварительной и горячей воздушной сушки и пластинки просто оставляют на , 12 час при комнатной температуре. Такие пластинки обнаруживают хорошее прилипание слоя и обеспечивают более воспроизводимые результаты анали

Р и с. 8. Калориферный вентилятор «Астрой 2000» для быстрой предварительной сушки слоев (вид сзади).Р и с. 8. Калориферный вентилятор «Астрой 2000» для быстрой предварительной сушки слоев (вид сзади).за по сравнению с активированными пластинками (см. разд. 19. II. 1).

Р и с. 8. Калориферный вентилятор «Астрой 2000» для быстрой предварительной сушки слоев (вид сзади).

Р и с. 8. Калориферный вентилятор «Астрой 2000» для быстрой предварительной сушки слоев (вид сзади).

Поскольку за один рабочий ход в большинстве случаев намазывают 5 или 10 пластинок (20 X 20 см), были изготовлены удобные и компактные подставки для сушки из легкого металла (см. рис. 30), в которых пластинки располагаются горизонтально. Если подставку перевернуть, то пластинки устанавливаются вертикально, что важно для беспрепятственного удаления влажного воздуха. '

Методика работы '

После нанесения слоя пластинки оставляют на шаблоне, на который направляют с помощью вентилятора (рис. 8) поток холодного или теплого воздуха. Примерно через 5 мин пластинки перемещают в направлении, в котором произво-

дили нанесение, слоем наверх до упора в направляющих пазах подставки для сушки. В таком положении их еще на несколько минут ста-

вят у вентилятора, после чего подставку перево- 1 рачивают, чтобы пластинки стали вертикально. Подставку для сушки с пластинками помещают в сушильный шкаф, предварительно нагретый до 110°. Желательно в первые 10 мин

сушки несколько раз открывать дверцу сушильного шкафа для удаления влажного воздуха. Еще лучше применять сушильный шкаф с циркуляцией* И подводом свежего воз-; духа. Горячую подставку вынимают из шкафа и после-предварительного охлаждения (2—3 мин) переворачивают в исходное положение и помещают в вакуум-эксикатор с пяти- окисью фосфора или силикагелем. Для выравнивания давления кран эксикатора следует открыть; полезно надеть на него короткую осушительную трубку.

Во всех случаях разделительные слои следует защищать от паров лабораторной атмосферы. Для хранения 10 пластинок достаточен эксикатор. Для хранения большего числа сухих пластинок пригодны герметичные переносные ящики (емкостью 22 пластинки 20 X 20 см) или соответствующие шкафы. '

ПОДГОТОВКА ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ПЛАСТИНОК С ТОНКИМИ СЛОЯМИ

Проверка высушенных слоев. При осмотре на просвет слои должны быть равномерными, без полос и неровностей. При освещении поверхность слоя должна выглядеть ровной и не должна содержать крупных частиц. При испытании на прочность Сцепления проводят пальцем по слою, который при этом не должен отрываться от пластинки. Пластинки с тонкими слоями, имеющие изъяны на рабочей поверхности, следует использовать для предварительных опытов. . '

Окаймление тонких слоев. Край, образуемый опорной поверхностью прибора для нанесения слоя (примерно 2—5 мм), несколько тоньше. Желательно его удалить. Его аккуратно снимают, например, большим пальцем правой руки, используя в качестве направляющего ноготь ' указательного

пластинкапластинкаР к с. 9. Простейший самодельный кро- .мочный скребок из упругого материала, 'например из лезвия безопасной бритвы "- (ширина кромки 7 мм).Р к с. 9. Простейший самодельный кро- .мочный скребок из упругого материала, 'например из лезвия безопасной бритвы "- (ширина кромки 7 мм).Рис. 10. Количественное нанесение пробы на тонкослойную пластинку при создании инертной атмосферы и защите от УФ-излучения.Слева камера для нанесения пробы фирмы «Desaga» (по Халпаапу [16]), справа микрошприц «Agla» в держателе.*Рис. 10. Количественное нанесение пробы на тонкослойную пластинку при создании инертной атмосферы и защите от УФ-излучения.Слева камера для нанесения пробы фирмы «Desaga» (по Халпаапу [16]), справа микрошприц «Agla» в держателе.*

пластинка

пластинка

Р к с. 9. Простейший самодельный кро- .мочный скребок из упругого материала, 'например из лезвия безопасной бритвы "- (ширина кромки 7 мм).

Р к с. 9. Простейший самодельный кро- .мочный скребок из упругого материала, 'например из лезвия безопасной бритвы "- (ширина кромки 7 мм).

Рис. 10. Количественное нанесение пробы на тонкослойную пластинку при создании инертной атмосферы и защите от УФ-излучения.

Слева камера для нанесения пробы фирмы «Desaga» (по Халпаапу [16]), справа микрошприц «Agla» в держателе.*

Рис. 10. Количественное нанесение пробы на тонкослойную пластинку при создании инертной атмосферы и защите от УФ-излучения.

Слева камера для нанесения пробы фирмы «Desaga» (по Халпаапу [16]), справа микрошприц «Agla» в держателе.*

пальца. Это можно легко осуществить также с помощью простого присцрсобг

ления, показанного на рис. 9.

Маркировка и надпись на слое. Для этого используют острый твердый карандаш или иглу для препарирования. Слой слегка удаляется и делается

надпись; чтобы избежать повреждения остальной части слоя, используют плоский шаблон для надписей из прозрачного плексигласа. На верхнем крае шаблона выгравирован масштаб, позволяющий удобнее производить отметку точек старта на равном расстоянии. Далее на расстоянии 15 мм выгравирована поперечная линия А, а на расстоянии еще 100 мм — втора!я линия Б.

Шаблон накладывают на пластинку и затем передвигают так, чтобы линия А на нем совпадала с нижним краем

стеклянной пластинки. По масштабу тонким уколом отмечают места последующего нанесёния смеси веществ (точки старта). Расстояние точек от края

пластинки должно составлять 15 мм

и между собой 10—20 мм. После этого перемещают шаблон до второй нанесенной поперечной линии. Не следует проводить поперечную линию как «фронтальную». Лучше, как и внизу, сделать на райном расстоянии отметки «точек, ограничивакицих фронт». Вверху, в случае необходимости, указывают раз

деляемую смесь иди делают соответствующую пометку. Целесообразно также на каждой пластанке указать растворитель и реактив для опрыскивания, для чего преимущественно используют свободную треть слоя. ,

г. Приборы для точечного нанесения веществ. Даже при неколичественном анализе рекомендуется использовать градуированные микропипетки. Для точечного нанесения особенно хороши специальные пипетки емкостью 10 ад3 с делениями через 1 лл*8. Точность калибровки у различных фирм- изготовителей довольно сильно

отличается, и поэтому при количественном анализе рекомендуется Повторная калибровка. За один прием наносят максимум 5 .мм3 вещества. При большем количе- ёхве пробы проводят нанесение в одну и ту же точку несколько

раз. При работе с водными растворами между отдельными впусками производят сушку слоя холодным или теплым поярком воздуха.

Очистку пипетки легче всего провести следующим образом: соединяют пипетку со шлангом водоструйного наноса и короткое время просасывают соответствующий растворитель, например воду, метанол, ацетон и затем воздух. Если пипетка набита, то загрязнение высасывают через ее кончик. '

Более точное нанесение очень небольших количеств жидкости можно осуществить микрометрическим шприцем. Наиболее известной моделью является английский микрошприц «Agla».B США для нанесения используют микро шприцы фирмы «Hamilton» . Микрометрическое дозирующее устройство № 550 работает по этому же принципу. При этом рекомендуется использовать специальный штатив (рис. 10).

Примечание. Необходимо следить, чтобы наносились только прозрачные растворы, а не суспензии кристаллов. Кристаллы растворяются в растворителе очень медленно, что может привести к образованию длинных хвостов. Такую же опасность при нанесении пробы может представить кристаллизация веществ в точке старта.

д. Нанесение в виде полосы больших количеств вещества для микропре- паративной хроматографии в тонких слоях. Для получения «штриховой

■||||||^^

Рис. И. Сравнение эффективности разделения при различных способах нанесения пробы для случая «штриховой хроматограммы».

а — напрыскано; б — точечное нанесение.

хроматограммы» растворенную смесь веществ до настоящего времени наносили на линию старта в виде близко расположенных точек. Эта методика требует много времени и определенной сноровки. Часто при этом слой повреждается и, кроме того, эти начальные полосы слишком широки. После проведения хроматографического анализа получают соответственно широкие, часто неравномерные, полосы. Это затрудняет, а иногда делает невозможным соскабливание необходимого соединения.

Указанные затруднения легко преодолеть при нанесении разделяемого раствора в виде полосы с помощью специального прибора [52]. В нашей лаборатории для этого используют так называемый пистолет-микрошприц *** с отверстиями 0,1—0,25 мм. Для работы пистолета-шприца вместо сжатого воздуха выгодно использовать инертный газ, например углекислый газ или азот. Необходимо предварительно точно отрегулировать давление, чтобы его как раз хватило для распыления жидкости. При слишком высоком давлении выдувается слой сорбента.

Пластинку на линии старта покрывают двумя толстыми стеклянными пластинами так, чтобы образовалась щель шириной 2 мм; с расстояния 1 см над этой щелью производят опрыскивание из пистолета. После удаления покровных пластин проводят хроматографический анализ [63].

струкции камеры на величину Rj трехцветной эталонной смеси.струкции камеры на величину Rj трехцветной эталонной смеси.а — без камеры; б —■ лотковая камера без полного насыщения; б — лотковая камера с насыщением; а — С-камера. О масляный желтый; ® Судан красный G; финдофенол.а — без камеры; б —■ лотковая камера без полного насыщения; б — лотковая камера с насыщением; а — С-камера. О масляный желтый; ® Судан красный G; финдофенол.

струкции камеры на величину Rj трехцветной эталонной смеси.

струкции камеры на величину Rj трехцветной эталонной смеси.

а — без камеры; б —■ лотковая камера без полного насыщения; б — лотковая камера с насыщением; а — С-камера. О масляный желтый; ® Судан красный G; финдофенол.

а — без камеры; б —■ лотковая камера без полного насыщения; б — лотковая камера с насыщением; а — С-камера. О масляный желтый; ® Судан красный G; финдофенол.

Этим методом можно также дезактивировать стартовую полосу предварительным опрыскиванием водой, для уменьшения превращений на активных сорбентах.

РАЗДЕЛИТЕЛЬНЫЕ КАМЕРЫ И НАСЫЩЕНИЕ АТМОСФЕРЫ В НИХ

Переход от колоночной хроматографии Цвета к открытым разделительным слоям привел к созданию различных систем камер. Поскольку результат разделения, а также значение Rf, являющееся относительной величиной, зависят от конструкции и величины камеры, этот вопрос, которому обычно уделяют мало внимания, требует подробного рассмотрения.

Применяемые до сих пор устройства в основном близки по конструкции к камерам, используемым в хроматографии на бумаге, и отличаются от них только размером. Для более удобного обозрения их можно в зависимости от методов анализа, используемых в настоящее время, подразделить на:

камеры для восходящего разделения;

камеры для нисходящего разделения;

камеры для горизонтального разделения;

камеры для электрофореза в тонких слоях (ионофореза в тонких слоях).

Для методов 1—3 в качестве конструкционного материала камер предпочитают стекло или иногда сталь марки V2A или, лучше, марки V4A. Камеры из пластмасс могут быть использованы лишь в некоторых случаях (метод 4) из-за неустойчивости по отношению к органическим растворителям. При применяемых в настоящее время разделительных камерах особое внимание следует уде- , лить насыщенйю атмосферы камеры [60]. Существующие здесь зависимости можно наблюдать, проведя следующие 4 опыта.

На 4 пластинки, полученные стандартным методом из силцкагеля Г (10 X 20 еж), наносят на расстоянии 1 см от края эталонную смесь из трех красителей (см. стр. 36).

первую пластинку ставят в плоскую чашку, в которую налит метилен- хлорид слоем 0,5 см;'

со следующими двумя пластинками повторяют опыт в лотковой камере фирмы «Desaga» (21 X 21 X 9 см), причем один раз без специального насыщения камеры, только с закрытой крьйпкой, а второй раз

в камере, выстланной фильтровальной бумагой и предварительно ополоснутой метиленхлоридом;

с последней пластинкой проводят опыт в разделительной С-камере. Йа рис. 1,2 представлены результаты этих опытов.

Легко видеть, что в описанных опытах путь, пройденный веществом, зависит от количества протекшего растворителя. В опыте а) испаряетс!я так много вещества, что фронт метиленхлорида подымается на расстояние, равное лишь 1 см. Поскольку метиленхлорид непрерывно подается, все три красителя через короткое время находятся в области фронта. В опыте б) эффект испарения уменьшен и растворитель проходит через 60 мин путь, равный 10 см. В С-камере [опыт г)] эффект испарения еще в большей степени подав-

лен благодаря уменьшению объема камеры; время опыта составляет только 21 мин, и количество протекшего растворителя меньше, и поэтому окрашенные вещества находятся соответственно ниже. Для обычных камер отношение площади испарения (cat2) к объему камеры (см3) составляет характерную величину, например 1 : 10, 1 : 50 и т. д.

НАСЫЩЕНИЕ КАМЕРЫ II КРАЕВЫЕ ЭФФЕКТЫ

При переходе от разделительных слоев шириной в 1—2 см к стандартному формату (10 X 20 и 20 X 20 см) наблюдается, что одни и те же вещества, находящиеся у края пластинки для ХТС, движутся быстрее находящихся посередине (рис. 13). Эти нежелательные краевые явления наблюдаются

' * * » е е ♦ ♦ е • е

* # » » # *

Рис. 13. «Краевые эффекты» при тонкослойной хроматографии в лотковой камере без полного насыщения.

Растворитель хлороформ + 5% метапола [60].

в нормальных камерах в случае адсорбционной ХТС, в особенности при использовании растворителей, составленных из сильно отличающихся по полярности веществ. Как показал Шталь, этот эффект объясняется недостаточным насыщением камер, а также тем, что стеклянные пластинки образуют перегородки в разделительных камерах; поэтому растворитель с края испаряется сильнее. Это происходит также, вероятно, потому, что в случае смесей, состоящих, например, из гексана и этилацетата или из хлороформа и метанола, в результате эффекта испарения с края происходит изменение концентраций в сторону увеличения концентрации более полярного растворителя. В первой смеси менее полярный гексан адсорбируется слабее и поэтому испаряется быстрее, чем более полярный этилацетат. Кроме того, следует учесть различную упругость паров компонентов растворителя.

Далее, следует отметить, что различные величины R# на одних и тех же пластинках для ХТС могут быть вызваны также различиями в толщине разделительных слоев. Влияние толщины слоя на величины Rf уже отмечалось с 1956 г. и наблюдалось в случае толщин слоя менее 150 ц. Браннер с сотрудниками подробно исследовал факторы, влияющие на величину Rf [7].

Для устранения краевых эффектов необходимо равномерное насыщение камеры парами растворителя перед хроматографическим разделением. В случае обычных камер (1 : 10—1 : 50) такое насыщение камер может быть достигнуто следующим образом.

Гладкую обезжиренную фильтровальную бумагу размером 15 X 40 см, сложенную в виде буквы U, помещают в стеклянный лоток и смачйвают предварительно залитым растворителем. Пропитанную таким образом бумагу прижимают к стенке камеры. В большинстве случаев она прилипает плотно.

Для лучшей фиксации можно поместить в камеру упругое кольцо из тонкой стальной проволоки, которое прижимает бумагу. Перед тем как вставить пластинку, фильтровальную бумагу еще раз смачивают растворителем, наклоняя камеру. ' . .

Описанная операция носит название насыщения камеры. Насыщение камеры, во всяком случае, не соответствует «климатизации», как ее обычно называют в методе хроматографии на бумаге. Только при распределительной

Рис. 14. Сравнение величин R, эталонной смеси при применении лотковой камеры с насыщением (KS) и без насыщения (NS) в зависимости от высоты подъема фронта растворителя.'

Слой силикагеля Г, бекаол..

ХТС и при распределительной ХТС с обращенными фазами насыщение камеры соответствует в значительной степени «климатизации» в том смысле, как это понимается в хроматографии на бумаге. -

Описанные вначале опыты («б» и «в») показывают, что при работе с насыщением камеры время работы значительно сокращается. Если исследовать зависимость величины R; от пройденного расстояния, то можно обнаружить, что при нормальном насыщении существует сильная зависимость величины R} от высоты подъема (рис. 14). Только при работе с насыщением камеры / или при применении специально разработанных для ХТС разделительных V камер (С- и БН-камеры) можно говорить о истинных значениях величин Rf. Тем не менее по возможности следует подбирать одинаковые пройденные пути и приводить отклонения для длины разделительного слоя, равной 10 см (стр.: 49). Приведенные выше соображения показывают, насколько важно строго следить за состоянием насыщения в камере для получения хорошего разделения и сравнимых результатов.к

ИЗГОТОВЛЕНИЕ КАМЕР

■(Температура, освещение, защита от окисления)

Как правило, работают при комнатной температуре (18—23°). Результат разделения в случае адсорбционной хроматографии (в отличие от распределительной хроматографии) мало зависит от температуры. Следует обратить - внимание на то, чтобы не происходило одностороннего нагревания раздели-

тельной камеры. Уже незначительная разница температур внутри камеры (в результате освещения или из-за сквозняка) может вызвать нежелательное «искривление» фронта растворителе.

Чаще всего работают при рассеянном дневном освещении, всегда избегая солнечного света. Удобнее всего оклеить окно комнаты прозрачной пленкой, не пропускающей ультрафиолетового света. В случае светочувствительных веществ камеру покрывают черным картонным колпаком или оклеивают ее черной фольгой из пластмассы (например, декофиксом). Чтобы иметь возможность наблюдать фронт растворителя, оставляют на расстоянии 12 см от дна небольшое окошечко. В случае особо светочувствительных веществ пробу наносят в темном помещении при красном или зеленом свете.

В случае соединений, чувствительных к действию кислорода, во время нанесения может произойти разложение, если вещества находятся на активном слое без растворителя. В этом случае необходимо поступить следующим образом. Пластинки для ХТС помещают в соответствующей величины разделительную камеру и накрывают ее стеклянной пластинкой с отверстием, в которое вставляют шланг и пропускают углекислый газ или азот. При нанесении пробы покровную пластинку отодвигают так, чтобы пипеткой можно было достать предварительно маркированные точки старта. Известной защиты от автоокисления можно достигнуть предварительным увлажнением или опрыскиванием водой зоны старта (стр. 23).

Халпаап [161 разработал сосуд из плексигласа для нанесения пробы, в котором предусмотрена защита от ультрафиолетового облучения, а также имеется приспособление для создания защитной атмосферы (рис. 10). Осуществить защиту от окисления в процессе снятия хроматограммы проще всего, заполнив камеру углекислым газом. Если имеют дело с основными веществами (окись алюминия, основные растворители), то камеру предварительно продувают азотом и открывают крышку только на короткое время установки пластинки для ХТС..

КАМЕРЫ ДЛЯ ВОСХОДЯЩЕГО ХРОМАТОГРАФИРОВАНИЯ

Прямоугольные камеры

Современные стандартные прямоугольные стеклянные сосуды в большинстве случаев имеют недостаточно отшлифованные края и поэтому их невозможно герметично закрыть. Этот и другие недостатки устранены в специально изготавливаемой для этой цели фирмой «Desaga» камере (21 X 21 X х9сж)с широкими утолщенными краями и плоско пришлифованной стеклянной крышкой. Объем этой камеры составляет около 4 л.

Методика работы •

В предварительно тщательно очищенную и высушенную камеру наливают 80— 100 мл применяемого растворителя. Затем камеру устилают фильтровальной бумагой, как описано на стр. 24. Для экономии растворителя можно положить на дно камеры две стеклянные пластинки (толщиной 0,5—0,8 см, длиной 20 см и шириной 2,5 см) (рис. 15, б). Следует обратить внимание на то, чтобы пластинки для ХТС при помещении их в камеру были равномерно погружены в растворитель. Две пластинки (20X 20 еле) можно поместить в виде буквы V; с помощью стойки из стали марки V2A можно поместить в камеру до 5 пластинок. При этом расстояние между пластинками должно составлять не менее 0,5 см. Важно, чтобы на непокрытую сорбентом заднюю сторону пластинки был помещен кусок фильтровальной бумаги, смоченной растворителем (насыщение камеры). Ее следует погрузить в растворитель. Для бокового крепления пяти пластинок Бреннер и Нидервизер [6] предлагают простой держатель, который легко можно изготовить самостоятельно из стеклянной палочки, придав ей волнообразную форму.

ааРис. 15. Разделительные камеры и насыщение.Рис. 15. Разделительные камеры и насыщение.а — лотковая камера с нормальным насыщением (NS). <Исходящие из сорбционного слоя стрелки должны символизировать испарение растворителя, а точки изображают плотность пара.); б — лотковая камера, насыщенная путем пропитки обклеивающей фильтровальной бумаги (KS); в — уменьшение объема в С-камере.а — лотковая камера с нормальным насыщением (NS). <Исходящие из сорбционного слоя стрелки должны символизировать испарение растворителя, а точки изображают плотность пара.); б — лотковая камера, насыщенная путем пропитки обклеивающей фильтровальной бумаги (KS); в — уменьшение объема в С-камере.

а

а

Рис. 15. Разделительные камеры и насыщение.

Рис. 15. Разделительные камеры и насыщение.

а — лотковая камера с нормальным насыщением (NS). <Исходящие из сорбционного слоя стрелки должны символизировать испарение растворителя, а точки изображают плотность пара.); б — лотковая камера, насыщенная путем пропитки обклеивающей фильтровальной бумаги (KS); в — уменьшение объема в С-камере.

а — лотковая камера с нормальным насыщением (NS). <Исходящие из сорбционного слоя стрелки должны символизировать испарение растворителя, а точки изображают плотность пара.); б — лотковая камера, насыщенная путем пропитки обклеивающей фильтровальной бумаги (KS); в — уменьшение объема в С-камере.

В случае пластинок для ХТС шириной 5 и 10 еле можно также использовать цилиндрические стеклянные стаканы с пришлифованными пробками или достаточно большие стеклянные банки. '

С-камера [63]

При стандартных опытах, в особенности для количественных определений, микропрепаративных работ, а также для определения, величины Rf 20—35 веществ наиболее удобными оказались пластинки шириной 40 см (высота

Рис. 16. С-камера с тонкослойной хроматограммой [63].Рис. 16. С-камера с тонкослойной хроматограммой [63].

Рис. 16. С-камера с тонкослойной хроматограммой [63].

Рис. 16. С-камера с тонкослойной хроматограммой [63].

20 см). Однако разделительных камер для пластинок такой величины нет в продаже.

Необходимого уменьшения объема камер проще всего достигнуть, используя пластинку для ХТС в качестве задней стенки камеры. Покровное стекло такого же размера (пластина на раме) с боковыми приклеенными стеклянными полосами (шириной 0,5 см и толщиной 0,3 см) служит в этом случае в качестве передней стенки (рис. 15, в и 16). Обе пластины прижимаются друг к ДРУгу двумя боковыми зажимами. Эта разделительная С-камера устанавливается затем в лотке, заполненном растворителем. Лоток камеры состоит из двух вставленных одна в другую гильз, изготовленных из стали марки

U4A. Внешняя гильза снабжена щелями разных размеров и обеспечивает таким образом установку Пластинок различной ширины. Лоток длиной ,2В см пригоден для установки пластинок шириной 10 и 20 см, а лоток длиной 40 см пригоден для пластинок шириной 20 и 40 см. , ■

В случае С-камер, а также БН-камер не требуемся специальное насыщение камеры. Кроме того, экономия растворителя весьма велика: для С-камеры длиной 20 см требуется 15 мл, для камеры длиною 40 см —30 мл. В заключение следует отметить, что при использовании таких камер процесс разделения можно снимать на кинопленку.

Методика работы

Перед нанесением пробы с пластинок для ХТС с обеих сторон скребком (рис. 9) удаляют слой шириной 7—10 мм. Необходимо) чтобы на краях пластинки не осталось никаких частичек, так как в противном случае невозможно хорошее уплотнение. После нанесения пробы накладывают покровные стекла, снабженные справа и слева двумя широкими зажимами. Полученную таким образом «камеру» вставляют в кольцеобразный лоток, заполненный растворителем, Для вертикальной установки стеклянной камеры в конец кольцеобразного лотка вставляют вилкообразный держатель. После этого осторожным вращением и вытягиванием внешней гильзы щель лотка сужают так, чтобы стеклянная камера была плотно закреплена в нем.

Для очистки лотковых С-камер внешнюю гильзу снимают. После этого растворитель легко вылить.

УСТРОЙСТВА ДЛЯ НИСХОДЯЩЕГО ХРОМАТОГРАФИРОВАНИЯ

Следует предупредить, что этот метод не имеет никаких преимуществ в отношении эффективности разделения и времени анализа по сравнению с восходящим методом. Кроме того, возни-

Полоска Фильтровальной бумагиПолоска Фильтровальной бумаги- —Пластинка дляХТС- —Пластинка дляХТСРис. 17. Большая пробирка с боковым отводом для нисходящего хроматографирования на узких тонкослойных пластинках (по Стенли , и Ваниру). "Рис. 17. Большая пробирка с боковым отводом для нисходящего хроматографирования на узких тонкослойных пластинках (по Стенли , и Ваниру). "кают определенные затруднения при создании рациональной конструкции прибора.

Полоска Фильтровальной бумаги

Полоска Фильтровальной бумаги

- —Пластинка дляХТС

- —Пластинка дляХТС

Рис. 17. Большая пробирка с боковым отводом для нисходящего хроматографирования на узких тонкослойных пластинках (по Стенли , и Ваниру). "

Рис. 17. Большая пробирка с боковым отводом для нисходящего хроматографирования на узких тонкослойных пластинках (по Стенли , и Ваниру). "

Приспособление для узких пластинок («Chromatostrips») было описано Стенли

Рис. 18. Стойка для промывки тонкослойных пластинок по Стенли ^сотрудниками.Рис. 18. Стойка для промывки тонкослойных пластинок по Стенли ^сотрудниками.Растворитель находится в ванне (наверху) и подводится к тонкослойным пластинкам с помощью фильтровальной бумаги. Скоба прижимает бумагу к пластинкам.

Рис. 18. Стойка для промывки тонкослойных пластинок по Стенли ^сотрудниками.

Рис. 18. Стойка для промывки тонкослойных пластинок по Стенли ^сотрудниками.

и Ваниром [661. Детали видны из рис. 17. В случае наиболее распространенных в настоящее время широких пластинок для ХТС удачным решением проблемы является помещаемый над пластинкой лоток с полосой филь-

тровальной бумаги. Для этого можно использовать описанное Стенли, Вани- ром и Джентили [65] приспособление для предварительного промывания сорбционных слоев (рис. 18). Находящийся в лотке растворитель движется через полоску фильтровальной бумаги и попадает па сорбционный слой. Скорость подачи растворителя можно регулировать толщиной и сортом фильтровальной бумаги. Для уменьшения испарения растворителя описанное устройство необходимо поместить в герметичный сосуд. В период издания настоящей книги были описаны и другие устройства для нисходящего хроматографирования [4].

УСТРОЙСТВА ДЛЯ ГОРИЗОНТАЛЬНОГО ХРОМАТОГРАФИРОВАНИЯ

В то время как в случае адсорбционных слоев, прочно пристающих к пластинкам, можно работать, используя описанный метод, в случае свободно насыпанных на пластинку разделительных слоев требуется горизонтальное или близкое к горизонтальному положение пластинки. В зависимости от способа подачи растворителя и способа нанесения пробы, следует различать следующие методы:

Название метода

Подача растворителя

Зоны после разделения

а

Круговой метод (круговая хроматография)

Точечная (в центре)

Кольцевые

б

Горизонтальный метод (закрытые или открытые камеры)

В виде полосы

В виде пятен или полос в зависимости от способа нанесения пробы

в

Проточный метод

В виде полосы

В виде пятен или полос в зависимости от способа нанесения пробы

Круговой метод

В простейшей форме круговая хроматография была использована Измайловым и Шрайбер еще в 1938 г. Они наносили на слой каплю исследуемой жидкости и затем добавляли в центр по каплям растворитель. Так были получены первые круговые хроматограммы (см. рис. 1). Точно так же без камеры работали по этому методу Майнхард и Холл . Весьма удобна сконструированная ими пипетка для растворителя (рис. 19). Эту пипетку устанавливают в центре, куда предварительно была нанесена в виде капли исследуемая проба. Как' показал в 1958 г. Шталь, микрокруговой метод пригоден для быстрого подбора необходимого растворителя (рис. 20). Вследствие быстрого испарения получают, однако, круговую хроматограмму размером только в 1—2 см. При использовании кругового

Р и с. 19. Самостоятельно устанавливаемая пипетка для получения круговых хроматограмм (по Майнхарду и Холлу [34]).

метода следует работать в замкнутых камерах, насыщенных парами растворителя. Для сорбентов, прочно пристающих к пластинке, пригодны две просто

ГокеанГокеанБензолБензолХлороформХлороформЧетыреххлористыйЧетыреххлористыйМетилен- хлоридМетилен- хлоридРис. 20. Хроматограммы двух различных смесей красителей, по-Рис. 20. Хроматограммы двух различных смесей красителей, по-лученные микрокруговым мето-дом [56].Для разделения больших количеств используют метод б с предварительной «колонкой». Здесь разделительный слой расположен сверху,лученные микрокруговым мето-дом [56].Для разделения больших количеств используют метод б с предварительной «колонкой». Здесь разделительный слой расположен сверху,ОпорОпорСтартСтартПластинка для ХТС (слоем вниз)Пластинка для ХТС (слоем вниз)

Гокеан

Гокеан

Бензол

Бензол

Хлороформ

Хлороформ

Четыреххлористый

Четыреххлористый

Метилен- хлорид

Метилен- хлорид

Рис. 20. Хроматограммы двух различных смесей красителей, по-

Рис. 20. Хроматограммы двух различных смесей красителей, по-

лученные микрокруговым мето-дом [56].

Для разделения больших количеств используют метод б с предварительной «колонкой». Здесь разделительный слой расположен сверху,

лученные микрокруговым мето-дом [56].

Для разделения больших количеств используют метод б с предварительной «колонкой». Здесь разделительный слой расположен сверху,

Опор

Опор

Старт

Старт

Пластинка для ХТС (слоем вниз)

Пластинка для ХТС (слоем вниз)

изготавливаемые камеры (рис. 21). Оба приспособления (а и б) обеспечивают хорошее насыщение камеры и являются, таким образом, типичными предшественниками С- и БН-камер.

Метод а можно описать следующим образом. Накладывают пришлифованную стеклянную пластинку 1 со слоем 2, обращенным внутрь, на чашку Петри соответствующего диаметра, содержащую растворитель (7).Контакт

между растворителем и слоем осуществляется тампоном ваты, свернутым в виде фитиля (5). Разделяемую смесь наносят на расстоянии 1 см от этого отверстия (4). Для сравнения можно также наносить ряд веществ па один и тот же слой.

Р и с. 21. Схематическое изображение двух устройств для хроматографии в тонких слоях при

использовании кругового метода.

а — для большого числа смесей веществ (до 8); 6—для одной смеси, с небольшой колонкой для предварительного разделения. 1 — пластинка 20 X 20 см; 2 — сорбционный слой; 3—отверстие диаметром 2 лгм; 4—место нанесения пробы; 5 — ватный фитиль; 6 — чашка Петри; 7—растворитель; 8 — ватный тампон, 9 — приклеенная полоска стекла [57].

а растворитель (7) подается с помощью

ватного тампона (S) через форколонку (3) в слой (2). Вещество предварительно наносится па непокрытую слоем сторону форколопкп ^у Для уменьшения чрезмерного испарения кругообразного расширяющегося пятна растворителя необходимо закрыть слой. Для этого используют вторую пластинку размером 20 X 20 см без отверстия; по краям пластинки приклеены стеклянные полосы шириной 5 мм и толщиной 3 », образующие нечто вроде рамы (9).

Метод горизонтальных закрытых камер

Только что описанный круговой метод редко используется при ХТС. Эта методика проста и дает тонкое разделение, однако визуальное определе-

растворителя. Полоса толстого стекла или стеклянный стержень, обмотанный несколько раз фильтровальной бумагой, используется для подачи растворителя к слою. Стеклянная палочка или трубочка образует вторую опору. Такое или сходное устройство обеспечивает хорошее насыщение камеры. Для свободно насыпанных слоев подобная конструкция описана Мистряковым [391.

Проточный метод (БН-калгера)

Если при обычной длине пути в 10—18 см пятна веществ лежат слишком близко друг к другу, то требуемая степень разделения может быть достигнута при удлинении «разделительной дорожки». Простейшее решение этой

Рис. 23. БН-камера (по Бреннеру и Нидервизеру).Рис. 23. БН-камера (по Бреннеру и Нидервизеру).1 — пластинка со слоем; 2 — покровная пластинка; 3 — полоса фильтровальной бумаги; 4,— лоток с растворителем; 5 — зажим (схематично); 6 — пробковое кольцо в качестве основания камеры.1 — пластинка со слоем; 2 — покровная пластинка; 3 — полоса фильтровальной бумаги; 4,— лоток с растворителем; 5 — зажим (схематично); 6 — пробковое кольцо в качестве основания камеры.

Рис. 23. БН-камера (по Бреннеру и Нидервизеру).

Рис. 23. БН-камера (по Бреннеру и Нидервизеру).

1 — пластинка со слоем; 2 — покровная пластинка; 3 — полоса фильтровальной бумаги; 4,— лоток с растворителем; 5 — зажим (схематично); 6 — пробковое кольцо в качестве основания камеры.

1 — пластинка со слоем; 2 — покровная пластинка; 3 — полоса фильтровальной бумаги; 4,— лоток с растворителем; 5 — зажим (схематично); 6 — пробковое кольцо в качестве основания камеры.

задачи обеспечивает описанный Бреннером и Нидервизером [6] проточный метод. Количество протекшего раствора при этом удается увеличить благодаря тому, что после прохождения определенного пути в закрытой камерезадачи обеспечивает описанный Бреннером и Нидервизером [6] проточный метод. Количество протекшего раствора при этом удается увеличить благодаря тому, что после прохождения определенного пути в закрытой камереРис. 24. БН-камера (по Бреннеру и Нидервизеру).Рис. 24. БН-камера (по Бреннеру и Нидервизеру).а — размеры полосы фильтровальной бумаги и линии сгиба; б.— полоса фильтровальной бумаги, монтированная на покровной пластинке; в — готовое устройство. Обозначения 1—в те же, что на рис. 23; 7 — боковой зажим (схематически); 8 — наклеенные с боков стеклянные полоски; 9 — трубочки для выравнивания даа — размеры полосы фильтровальной бумаги и линии сгиба; б.— полоса фильтровальной бумаги, монтированная на покровной пластинке; в — готовое устройство. Обозначения 1—в те же, что на рис. 23; 7 — боковой зажим (схематически); 8 — наклеенные с боков стеклянные полоски; 9 — трубочки для выравнивания давления в лотке.вления в лотке.

задачи обеспечивает описанный Бреннером и Нидервизером [6] проточный метод. Количество протекшего раствора при этом удается увеличить благодаря тому, что после прохождения определенного пути в закрытой камере

задачи обеспечивает описанный Бреннером и Нидервизером [6] проточный метод. Количество протекшего раствора при этом удается увеличить благодаря тому, что после прохождения определенного пути в закрытой камере

Рис. 24. БН-камера (по Бреннеру и Нидервизеру).

Рис. 24. БН-камера (по Бреннеру и Нидервизеру).

а — размеры полосы фильтровальной бумаги и линии сгиба; б.— полоса фильтровальной бумаги, монтированная на покровной пластинке; в — готовое устройство. Обозначения 1—в те же, что на рис. 23; 7 — боковой зажим (схематически); 8 — наклеенные с боков стеклянные полоски; 9 — трубочки для выравнивания да

а — размеры полосы фильтровальной бумаги и линии сгиба; б.— полоса фильтровальной бумаги, монтированная на покровной пластинке; в — готовое устройство. Обозначения 1—в те же, что на рис. 23; 7 — боковой зажим (схематически); 8 — наклеенные с боков стеклянные полоски; 9 — трубочки для выравнивания да

вления в лотке.

вления в лотке.

(Г: 0,1) переходят к открытой камере (1 : со). В незакрытой области растворитель испаряется и таким образом осуществляется непрерывный подвод (рис. 23).

Устройство БН-камеры напоминает устройство С-камеры, применяемой при восходящем методе. Здесь также необходимо покровное стекло с двумя боковыми приклеенными стеклянными полосками, причем края пластинки для ХТС шириной 6 мм не ( должны содержать слоя сорбента. Скрепление осуществляется прочными зажимами. Небольшой лоток, изготовленный из нержавеющей сталд, имеет плоско отшлифованные края и служит для хранения растворителя. Последний поступает через полосу фильтровальной бумаги на разделительный слой, проходит его до конца пластинки и там испаряется. В результате непрерывно подается подвижная фаза и образуется проточная хроматограмма. При сильных изменениях комнатной температуры иногда можно наблюдать конденсацию растворителя на покровной пластинке. В этом случае ее нагревают ладонью руки.

Методика работы ' ;

Подготовка пластинок для ХТС (20 X 20 см) осуществляется так же, как в случае С-камер. Затем нарезают обезжиренную фильтровальную бумагу (например, ватман № 1) по размеру, показанному на рис. 24, а, складывают один раз по линии cd и кладут поверхностью abed на переднюю часть покровного стекла (рис. 24,6). Полоса бумаги не должна касаться боковых краев покровной пластинки, и расстояние ab от переднего края пластинки должно составлять только 1—3 мм (точка старта 15 мм от края). Предварительно фиксируют это положение. Затем пластинку для ХТС (с нанесенной пробой) прикладывают к покровной пластинке. Тонкослойная и покровная пластинки прижимаются друг к другу сильными зажимами. После этого удаляют зажим, служивший для фиксации бумажной полосы, и сгибают бумажную полосу по линии ef (рис. 24, 6). Все устройство, согласно рис. 24, в, прочно соединяют с лотком двумя другими зажимами. Через полиэтиленовую трубочку лоток заполняют растворителем (15 ± 5 мл). Легким покачиванием достигают равномерного смачивания полосы бумаги. Затем БН-камеру помещают на пробковое кольцо (рис. 24, 6). -

В случае проточной хроматографии иногда целесообразно добавить в растворитель окрашенную или флуоресцирующую эталонную смесь для контроля хода процесса.

КАМЕРЫ ДЛЯ ЭЛЕКТРО- ИЛИ ИОНОФОРЕЗА В ТОНКИХ СОРБЦИОННЫХ СЛОЯХ -

С 1946 г. Консден, Гордон и Мартин использовали силикагель в качестве носителя для электрофоретического разделения аминокислот и пептидов. После того как получение тонких слоев мелкозернистых сорбционных материалов перестало быть трудной задачей, этот метод был подхвачен Хонегге- ром (тонкослойный ионофорез [19]), с одной стороны, и Пастуска и Тринк- сом (тонкослойный электрофорез [43, 44])— с другой. Оказалось, что тонкие чисто органические мелкозернистые сорбционные слои превосходят применявшиеся до сих пор слои из целлюлозной бумаги (разд. 19 VI). На рис. 25 показано не совсем удовлетворительное, однако просто изготавливаемое устройство для тонкослойного электрофореза с градиентом напряжения 20 в/см. Более высоким требованиям удовлетворяет устройство, описанное

Рис. 25. Устройство для тонкослойного электрофореза (по Пастуска и Тринксу).

1 — пластинка со слоем; 2 “ покровная пластинка; 3 — полоски фильтровальной бумаги; 4 — электроды; 5 — миллиамперметр.. --

Хонеггером. Готовят слой из обычного сорбента с размером зерен 250 ц. При изготовлении наносимой массы можно сразу вместо воды применять буферный раствор. Перед употреблением слои должны быть равномерно увлажнены. Для этого слои опрыскивают буферным раствором, пока они не станут прозрачными (влажный блеск поверхности). На влажном слое отмечают точку старта на расстоянии 5—10 см от анодного края и наносят смесь веществ (13—17). На рис. 26 схематически изображено устройство, описанное Хонеггером.-■'.

Подставкой (I) служит отполированный металлический блок (40 X 40 см), охлаждаемый проточной водой, проходящей через каналы внутри блока.

Блок для изоляции покрыт полиэтиленовой пленкой толщиной 0,2 мм. На середину блока помещают увлажненную пластинку для ХТС (2). Слева и справа помещают стеклянные пластинки одинаковой толщины (5 X 20 см') (3) и на каждую из них накладывают полосы фильтровальной бумаги размером 8X19 см, смоченные буферным раствором (4). Бумажные полосы должны быть строго одинаковыми по размеру, с помощью ручного валика их прочно прижимают к пластинкам (3). С каждой стороны (анодная и катодная сторона) они должны покрывать пластинки для ХТС на расстоянии 0,5—1 см. Их другие концы лежат на полиэтиленовой пленке. Прохождение тока между

Рис. 26. Устройство для тонкослойного ионофореза (по Хонеггеру).

Подробности в тексте. •

электродным сосудом (5) и проводящими полосками (4) обеспечивается целлофановым рукавом, содержащим марлю, увлажненную буферным раствором (6). Над пластинками (4, 2, 4) помещают раму из плексигласа (иногда с наклеенной крышкой) с поперечными планками (7 шириной 10 мм и 8 шириной 7 мм1). Эти поперечные планки прижимают места стыков и обеспечивают таким образом хороший контакт. Все устройство покрывают стеклянной пластинкой размером примерно 35 X 25 см. , ■

При разделении аминов и аминокислот Хонеггер работал с напряжением 440 или 460 в (19,6 или 12,6 ма) и в случае необходимости пропускал ток в течение часа. После сушки пластинок можно осуществить распределительно- или адсорбционнохроматографическое разделение (разд. 19, VI). После этого вещества на хроматограмме можно обнаружить обычными индикаторами.

ПРИСПОСОБЛЕНИЕ ДЛЯ ОПРЫСКИВАНИЯ И ВЕНТИЛЯЦИИ ,

. Особым преимуществом неорганических разделительных слоев является возможность обнаружения веществ путем опрыскивания агрессивными реактивами. Небольшие размеры хроматограммы требуют тонкого диспергирования наносимого реактива. С помощью оцрыскивателей, которые используют в хроматографии на бумаге, этого обычно нельзя достичь. Поэтому целесообразно применять пульверизаторы высокого давления с тонкими соплами. Из многочисленных опрыскивателей лучше всего зарекомендовало себя устройство из двух деталей с сосудом для жидкости емкостью 10 мл (рис. 27). При этом можно контролировать количество реактива для опрыскивания,

Если отсутствует компрессор, то применяют баллон с сжатым воздухом с вентилем тонкой регулировки. Сжатый воздух, освобожденный от масла, легче всего получить, применяя высокопроизводительный мембранный насос (рис. 28). Другие возможности описаны в гл. 23.

Рис. 27. Прибор для опрыскивания из двух частей, использующий сжатый воздух (фирма «Desaga»).Рис. 27. Прибор для опрыскивания из двух частей, использующий сжатый воздух (фирма «Desaga»).Рис. 28. Мембранный насос для создания давления воздуха, очищенного от масла (насаживается на универсальный мотор «Мультификс»).Рис. 28. Мембранный насос для создания давления воздуха, очищенного от масла (насаживается на универсальный мотор «Мультификс»).

Рис. 27. Прибор для опрыскивания из двух частей, использующий сжатый воздух (фирма «Desaga»).

Рис. 27. Прибор для опрыскивания из двух частей, использующий сжатый воздух (фирма «Desaga»).

Рис. 28. Мембранный насос для создания давления воздуха, очищенного от масла (насаживается на универсальный мотор «Мультификс»).

Рис. 28. Мембранный насос для создания давления воздуха, очищенного от масла (насаживается на универсальный мотор «Мультификс»).

Очистка опрыскивателя. При применении реактивов для опрыскивания, содержащих хлориды сурьмы, опрыскиватель промывают хлороформом или четыреххлористым углеродом, после чего на несколько часов помещают

Рис. 29. Кабина для опрыскивания из тровидура, смонтированная в вытяжном шкафу. а — вид спереди (заштрихована стойка для установки хроматограммы); б — вид сбоку (разрез). Дополнительно показано приспособление для опрыскивания под давлением воздуха.Рис. 29. Кабина для опрыскивания из тровидура, смонтированная в вытяжном шкафу. а — вид спереди (заштрихована стойка для установки хроматограммы); б — вид сбоку (разрез). Дополнительно показано приспособление для опрыскивания под давлением воздуха.

Рис. 29. Кабина для опрыскивания из тровидура, смонтированная в вытяжном шкафу. а — вид спереди (заштрихована стойка для установки хроматограммы); б — вид сбоку (разрез). Дополнительно показано приспособление для опрыскивания под давлением воздуха.

Рис. 29. Кабина для опрыскивания из тровидура, смонтированная в вытяжном шкафу. а — вид спереди (заштрихована стойка для установки хроматограммы); б — вид сбоку (разрез). Дополнительно показано приспособление для опрыскивания под давлением воздуха.

в царскую водку (широкогорлая склянка с пришлифованной пробкой). Осадки растворяют в 20 %-ном едком натре.

Образование тумана агрессивных реактивов требует хорошей вентиляции. Часто возникающие при этом трудности могут быть преодолены следующим образом.

а. Если имеется большой шкаф с плохой тягой, от которого идет большое число вытяжных коробов, то подключают кабину для опрыскивания, сваренную из кислотоупорной пластмассы, к одному из них, закрыв все остальные

короба (рис. 29). В кабину помещают стойки из. пластмассы, на которые ставят пластинки.

, б. Если тяга вообще отсутствует, то за окно выставляют трубу из пластмассы диаметром около 25—30 см и монтируют в ней кислотоупорный и взрывобезопасный вентилятор. К этой трубе затем подключают кабину для опрыскивания..

СТАНДАРТНЫЕ УСЛОВИЯ ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИИ В ТОНКИХ СЛОЯХ I

. Стандартизация хроматографии в тонких слоях чрезвычайно важна. Ниже приведены проверенные и оправдавшие себя стандартные условия.

Формат пластинки: 200 X 200 мм, 100 X 200 мм (для предварительных опытов) , 400. X 200 мм (стандартные опыты, микропрепаратив- ное разделение).'

- Толщина сорбционного ел о я (при нанесении слоя, перед сушкой) 250 р для аналитических целей; 500 р и 750 ц для. специальных задач и для микропрепаративного разделения.

. Сушка слоя:

:Предварительная сушка с помощью вентилятора 10 мин, сушка горячим

' воздухом в вертикальном положении 30 мин при 110°.

Хранение:. - . >‘

Для защиты от паров лабораторной атмосферы хранить над силикагелем в герметичном ящике.,'

Точка старта:-

15 мм от нижнего Края (расстояние пятен друг от друга 10 или 15 о).

Длина пути пр од в и жени я пятна:

,100 мм (старт — фронт).

Разделительные камеры:

а) Камеры с тщательно пришлифованными стеклянными крышками и насыщением атмосферы камеры; б) С-камеры; БН-камеры.

Глубина погружения слоя в растворитель: около ■ 5 мм.

Сорбенты:

Стандартизованные сорбенты, разработанные для определенной методики (см. стр. 39).

Эталонные вещества:

Применяют имеющийся обычно в продаже 2—3 чистых хорошо окрашенных или флуоресцирующих вещества, которые хорошо разделяются в области величины 7? у 0,2—0,8, например эталонная смесь трех красителей (масляный желтый, судан красный G, индофенол). (Проверенные «методики рабо' ты» на предыдущих и последующих страницах выделены мелким шрифтом).

VII. ОСНОВНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИИ В ТОНКИХ СЛОЯХ

Для потребностей современных лабораторий составлен необходимый основной набор рабочих приспособлений для хроматографии в тонких слоях, не принадлежащий к обычному оборудованию . Этот набор позволяет использовать метод непосредственно, избегая тяжелого и дорогостоящего пути самостоятельного изготовления приборов. Такой набор обеспечивает также стандартизацию метода, что весьма важно при проведении анализов.

Набор № 600 (рис. 30), изготавливаемый фирмой «Desaga», состоит из следующих частей:

— приспособление для нанесения тонких слоев марки DS 200/0 — 2 с регулировкой толщины слоя;

— рабочий шаблон из пластмассы длиной 1,1 л, например для 5 пластинок размером 200 X 200 мм;

Рис. 30. Основное оборудование для тонкослойной хроматографии. Цифры относятся к отдельным деталям, перечисленным в тексте.

3—10 стеклянных пластинок-носителей (200 X 200 мм) одинаковой толщины, а также начальная и конечная пластины (50 X 200 мм);

— прямоугольная стеклянная камера с утолщенными краями и пришлифованной стеклянной крышкой;

шаблон для надписей из плексигласа с выгравированным масштабом, линией старта и линией фронта;

стойка для сушки из легкого металла для 10 пластинок размером 200 X 200 мм или 20 пластинок размером 200 X 100 мм;

две специальные градуированные пипетки каждая емкостью 10 жл3;

склянка с эталонной смесью (масляный желтый, суДан красный G и индофенол) для определения активности силикагеля и окиси алюминия, а также для первых хроматографических опытов;

банка с 500 г силикагеля Г для ХТС по Шталю фирмы «Merck».

ДОПОЛНЕНИЕ К ОСНОВНОМУ НАБОРУ

Специальный опрыскиватель (из двух частей), подключаемый к источнику сжатого воздуха, со шлифом NS24, емкостью 10 мл (рис. 27) или с колбой Эрленмепера емкостью 50 мл.

С-камера по Шталю для пластинок 10 X 20 и 20 X 20 см, а также для пластинок шириной 20 и 40 см (состоит из лотка с держателем, покровной пластинки с припаянной стеклянной полоской и двух зажимов).

БН-камера по Бреннеру и Нидервизеру для пластинок размером 20 X X 20 см, состоящая из лотков из стали марки V2A, покровной пластинки и зажимов.

Вакуум-эксикатор модель «Новус» с краном (диаметр 30 см) для хранения стойки с пластинками.

Для лабораторий, которые лишь изредка применяют метод ХТС, этой же фирмой разработан «малый набор» для ХТС.

ГЛАВА 3

СОРБЕНТЫ ДЛЯ ХТС

Д. Валъди

Под сорбентами подразумевают все твердые вещества, используемые в колоночной хроматографии для заполнения разделительных трубок. Наряду с собственно адсорбентами, играющими активную роль в разделительном процессе, к сорбентам относят инертные носители, а также химически реагирующие обменники.

Часто бывает трудно определить, сводится процесс разделения веществ к обменному действию, адсорбции или распределению, и во многих случаях эти эффекты взаимно налагаются. Не следует ограничиваться также рас- и смотрением только одних сорбентов, не обращая внимания при этом на физико-химические свойства разделяемых веществ и растворителей для хроматографического разделения [68].

На рис. 31 показано, как взаимосвязаны сорбент, разделяемые вещества и растворитель, т. е. какое влиянии оказывают эти факторы друг на друга, что обозначено двухконечными стрелками. Действие, с одной стороны, движущей силы (например, капиллярных сил или силы тяжести), перемещающей избыток растворителя вперед, а с другой стороны, взаимодействие сил этих трех факторов приводят к тому, что каждое из соединений'перемещается с характерной для него скоростью.

При выборе сорбентов на практике исходят из свойств разделяемых веществ. Вначале рассматривают растворимость хроматографически разделяемых веществ, т. е. устанавливают, обладают ли они гидрофильными (растворимы в воде) или гидрофобными (растворимы в жирах) свойствами, которые в основном определяются числом и природой функциональных групп (С/О- индекс).

После этого определяют, какими свойствами — основными, кислыми или нейтральными — обладает соединение и не существует ли амфотерный ион. Наконец, следует проверить, может ли соединение химически реагировать с сорбентом (или растворителем) и возможны ли химические изменения соединения под действием сорбента или связующего материала.

Учитывая сказанное выше, разработаны три сорбента: силикагель Г по Шталю для хроматографии в тонких слоях , окись алюминия Г по Шталю для хроматографии в тонких слоях *, кизельгур Г по Шталю для хроматографии в тонких слоях *.

■ Силикагель Г, согласно прописи на стр. 39, образует прочно прилипающий высокоактивный кислый слой носителя. Этот слой пригоден в первую очередь для разделения не слишком гидрофильных, нейтральных и кислых веществ. При соответствующем выборе растворителя (см. стр. 139) можно

хроматографически разделить также и основные соединения (например, алкалоиды), а также гидрофильные соединения.

Наряду с выбором растворителя (кислые или основные добавки) имеется возможность воздействовать на сорбент режимом сушки (воздушносухие слои,

Рис. 31. Взаимное влияние «вап-дер-ваальсовых» сил в хроматографической среде (ср. схему на рис. 69).

А — адсорбент; Р — растворитель; С — соединение (вещество).

более длительное время экспонированные на воздухе, активные слои), а также с помощью специальных добавок (см. стр. 45).

Окись алюминия Г образует прочно прилипающий активный слабоосновной слой носителя, пригодный в первую очередь для разделения нейтральных

Разделяли смесь 4 жирорастворимых красителей с использованием бензола в качестве растворителя. Силикагель г обнаруживает наибольшую активность и дает наилучшие результаты разделения.

и основных соединений (см. алкалоиды, гл. 14). Свойства этого сорбента можно также изменить соответствующим подбором растворителя, сушкой и добавлением определенных веществ, после чего он, естественно, может быть использован для разделения разных соединений.

В настоящее время фирмы «Fluka» (Швейцария) и «Woelm» [72] готовят окись алюминия и другие сорбенты для хроматографии в тонких слоях, облададйцие значительно меньшим средним размером частиц и соответственно большим временем прохождения разделяемых веществ.

Кизельгур Г дает практически неактивный нейтральный прочно прилипающий слой носителя, предназначенный в первую очередь для четкого разделения сильно гидрофильных соединений, а также амфотерных ионов. Для разделения триглицеридов, кетокислот, лактонов, жирных оксикислот Кауфман с сотрудниками [22, 23] разработали в настоящее время кизельгур Г, пропитанный высококипящими нефтяными фракциями. Для разделения антиокислителей Майер [35] применил смесь силикагеля Г и кизельгура Г (2 + 1 или 25 + 5).

Нам удалось разделить ряд трудно разделяемых классов соединений, например барбитуровых кислот, сахаров и красящих веществ, на смеси силикагеля Г и окиси алюминия Г (1 + 1).

ДРУГИЕ СВОЙСТВА СОРБЕНТОВ

Активность силикагеля Г и окиси алюминия Г в первую очередь зависит от активной поверхности частиц, т. е. зернения) и от диаметра пор, возникающих при образовании силикагеля. Чем меньше частицы, тем больше активная поверхность. Как уже известно на примере колоночной хроматографии, скорость продвижения фронта является функцией размеров частиц. Мелкие частицы требуют длительного времени разделения, крупные частицы более короткого, однако при этом наблюдается худшее разделение. Стандартизация < сорбентов является весьма труднойзадачей^Лоэтому следует считать, что все 'без исключения значения Rf являются лищьориентировочйыми (применение эталонной смеси, см. стр. Зб).'

' При разделении на указанных выше сорбентах следует, далее, учитывать, что имеется еще связующий материал, который может оказать влияние на разделительные свойства. Имеется в виду сульфат кальция, который, например, прочно удерживает на линии старта ионы фосфорной кислоты. В таких случаях приготовляют слои, не содержащие гипса, или пользуются органическим связующим.1

Приготовление масс из силикагеля Г, окиси алюминия Г и кизельгура Г фирмы «Merck» для 5 пластинок размером 20 X 20 см при толщине слоя 250 р.1

25,0 г адсорбента насыпают в сухую фарфоровую ступку диаметром примерно 10 см. При медленном перемешивании добавляют вначале 35 мл дистиллированной воды и растирают до образования однородной массы, не содержащей пузырьков воздуха и комков. Только после этого добавляют еще 15 мл дистиллированной воды также при перемешивании. Суммарное время перемешивания не должно превосходить 100 сек. Затем быстро заполняют суспензией цилиндр и проводят операцию нанесения слоя.

Можно также сорбент вместе с двойным по весу количеством воды загрузить в цилиндр для нанесения слоя, закрыть цилиндр путем поворота на 90° гильзы и тщательно взболтать массу.-

ДРУГИЕ СОРБЕНТЫ И КОМБИНАЦИИ СОРБЕНТОВ

Существует ряд веществ, описанных, например, в главе о витаминах, которые на высокоактивных адсорбентах претерпевают химические превращения. Поэтому для витамина А рекомендуют силикагель Г, пропитанный парафиновым маслом [71], или смесь силикагеля Г с фосфатом кальция (1 + 1). Для каротиноидов пригодна смесь гидроокиси кальция и силикагеля (6 + + 1), вторичный фосфат магния или чистая гидроокись кальция [71]..

Для неорганической ХТС необходим силикагель , очищенный от железа (см. гл. 22). Хессе с сотрудниками [18] предложил в качестве сорбентов соединения на базе гидроокиси железа, а также угли.

Среди органических сорбентов следует назвать целлюлозные порошки

фирмы «Macherey,

Nagel d Со» (Дюрен).

а) Сорта без добавки гипса

Емкость,

MN 300

Обычная целлюлоза

MN 300 Ас

Ацетилированнан целлюлоза (около 10%)

—

MN 300 СМ

Карбоксиметилцеллюлоза

-0,7

MN 300 Р

Фосфорилированная целлюлоза

-0,7

MN 300 DEAE

Диэтиламиноэтилцеллюлоза

-0,7

MN 300 ECTEOLA

Анионный обменник б) Сорта с добавкой гипса

-0,35

MN 300 G

Обычнан целлюлоза

—

MN 300 G/Ac

Ацетилированная целлюлоза, (около < 10%)

—

MN 300 G/CM

Карбоксиметилцеллюлоза

-0,7

MN 300 G/P

Фосфорилированная целлюлоза

-0,7

MN 300 G/DEAE

Диэтиламиноэтилцеллюлоза

-0,7

MN 300 G/ECTEOLA

Анионный обменник

-0,35

Методика работы

При приготовлении, разделительных слоев используют прибор, описанный на стр. 16. Перед нанесением следует тщательно очистить стеклянную пластинку. Весьма полезна промывка пластинок концентрированным раствором соды с последующим ополаскиванием дистиллированной водой. Для получения совершенно гладких слоев целесообразно перемешивать суспензию электрической мешалкой в течение примерно 1 мин.

Ниже следуют проверенные, однако не обязательные указания в отношении операции смешения для нанесения слоя на 5 стеклянных пластинок размером 200 X 200 см, а также указания в отношении температуры и времени сушки.

MN 300 или MN 300 G (обычная целлюлоза, сорт 300 G с добавлением гипса)

15 г порошка + 90 мл диет. воды. Сушка намазанных пластинок 10 мин при 105°.

MN 300 Ас или MN 300 G/Ac (ацетилированная целлюлоза, сорт 300 G/Ac с добавкой гипса)

10 г порошка + смесь из 50 г метанола и 5 мл диет. воды. Сушка намазанных пластинок 5—10 мин при 60°.

Целлюлозные ионные обменники:

MN 300 G/СМ (карбоксиметилцеллюлоза с добавкой гипса)

15 г порошка+90 мл диет. воды. Сушка намазанных пластинок 40 -и им при 50°.

MN 300 G/Р (фосфорилированная целлюлоза с добавкой гипса)

15 г порошка + 70 мл- диет. воды. Сушка намазанных пластинок при 50° 40 мин. Для получения совершенно гладких слоев при использовании этого порошка смесь необходимо интенсивно перемешивать с водой примерно 5 мин электрической мешалкой.

MN 300 G/DEAE (диэтиламиноэтилцеллюлоза с добавкой гипса)

10 г порошка + 90 мл диет. воды. Сушка намазанных пластинок 40 мин при 50°.

MN 300 G/ECTEOLA (анионный обменник с добавкой гипса)

10 г порошка + 95 мл диет. воды. Сушка намазанных пластинок 40 мин при 50°.

Целлюлозные ионообменники не образуют идеального сплошного слоя без добавки гипса. Поэтому рекомендуется к ионообменным порошкам добавлять небольшое количество обычного целлюлозного порошка MN 300.

Сорбенты, используемые для ХТС

Сорбент

Свойства/

Разделяемые классы веществ

кислотность

активность

разделительное действие

Силикагель

Кислый

Активный

Адсорбция,

Практически

Окись алюми-

Основная

Активная

распределение (обмен)

Адсорбция,

все

Главным обра-

НИЯ

Кизельгур

Нейтральный

Неактивный

распределение

(обмен)

Распределение

зом основания+ стероиды

Сахара, лекар-

втор-Фосфат магния

Трисиликат

магния '

Гидроокись

Основная

Слабо активный

Слабо активный

Слабо ак-

Адсорбция

»

»

ственные вещества, триглицери- цы, высшие жирные кислоты

Каротиноиды

Токоферол "

кальция

Фосфат кальция

Слабо основной

тивная

Слабо ак

тивный

»

-

Сульфат кальция (24]

Силикагель -|-

Кислый -|-

Слабо активный

Активный

»

Распределение

Для жирных кислот и глицеридов подвергают гидрофобиза- ции

Красящие ве-

окись алюминии

(1+1)

Гидроокись же-

основная

Активная

(обмен)

Адсорбция

щества, барбитуровые кислоты

Полярные вё-

леза

Угли

Порошок цел-

Практически

Активные

Неактивный

>

' Распределение

щества

Неполярные вещества

Красящие ве-

люлозы

Полиамид

нейтральный

Нейтральный

Неактивный

(обмен)

(Обмен?)

щества, аминокислоты

Флавоны

Полиакрилнит-

Нейтральный

Неактивный

(Обмен, рас-

Антоцианы и

рил [4] Обменник *,

Кислый+

Неактивный

пределение?)

Обмен (распре-

ДР-

Нуклеиновые

щелочной

деление) ;

КИСЛОТЫ

* Автор не сообщает, какой обменник. — Прим: реб.

MN 300 СМ (карбоксиметилцеллюлоза).

-8 г порошка MN 300 CM + 2 г порошка MN 300 + 60 мл дне.

.воды, Сушка намазанных пластинок 40 мин при 50®.■

MN 300 Р (фосфорилированная целлюлоза)

12 а порошка MN 300 Р + 3 а порошка MN 300 + 70 мл диет, воды. Сушка намазанных пластинок при 50° 40 мин. Для получения совершенно гладких слоев при использовании этого порошка смесь необходимо интенсивно перемешивать с водой примерно 5 мин электрической мешалкой.(

MN 300 DEAE (диэтиламиноэтилцеллюлоза)

’8 ^ порошка MN 300 DEAE + 2 а порошка MN 300 + 90 мл

диет. воды. Сушка намазанных пластинок 40 мин при 50°.

MN 300 ECTEOLA (анионный обменник) '

8 а порошка MN 300 ECTEOLA + 2а порошка MN 300 + 95 мл диет. воды. Сушка намазанных пластинок 40 мин при 50°.

Фирма «Ехсогпа» (Майнц) выпускает целлюлозный порошок с добавкой гипса для «аналитической хроматографии», который обычно можно использовать для ХТС.

Слои из полиамида * и полиакрилнитрила применяли для разделения флавонглюкозидов и антиокислителей [4, 10, 11, 13]. Для хроматографического разделения нуклеиновых кислот Рандерат ]47, 48] рекомендует наряду с обычными сорбентами применение обменников, в особенности слоев ECTEOLA.

Все до сих пор предложенные сорбенты для ХТС приведены в Табл. 1. Для большинства разделений достаточно применение силикагеля Г или окиси алюминия Г,''

ХРАНЕНИЕ И ОБРАБОТКА СОРБЕНТОВ

Крупнозернистый силикагель известен в качестве осушителя, т. е. он поглощает влагу из воздуха, поэтому его обычно хранят в закрытых склянках. Силикагель Г, окись алюминия Г и кизельгур Г содержат еще несколько частей гипса, который также поглощает воду, в результате чего теряет свои связующие свойства. Поэтому склянки, с исходными материалами следует всегда держать закупоренными. Сорбенты, связующие вещества в йоторых частично разрушаются под действием влаги воздуха, образуют слои, хуже цристающие к пластинкам.-'

Важно, чтобы слои предварительно высушивались и затем уже активировались (стр. 19). Если слои нагревать при 100° без предварительной сушки, могут возникнуть трещины и щели. При более продолжительном нагревании при температуре свыше 125° возникает опасность, что гипс слишком обезводится и его связующая способность уменьшится. Во всех случаях активные сорбционные слои следует предохранять от влаги и паров, находящихся в лабораторной атмосфере, поскольку в противном случае слои постепенно теряют активность. Поэтому пластинки необходимо хранить в герметичном сосуде над хорошим осушителем.1

ГЛАВА 4

СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ

Э. Шталь

' 1. ПРОТОЧНЫЙ МЕТОД, МНОГОКРАТНОЕ ХРОМАТОГРАФИРОВАНИЕ,СТУПЕНЧАТЫЙ МЕТОД

Если величины Rf разделяемых веществ после обычного однократного прохождения растворителя лежат в области значений меньших 0,5 и при этом обнаруживается начало разделения, то можно либо перейти к проточной

Рис. 33. Ступенчатый метод разделения веществ, содержащих подофилум, на слое .• силикагеля Г [64].''

Растворитель 1-я ступень: хлороформ + Ю% метанола, 2-я ступень: хлороформ + 35% ацетона. 1 — а-пелтатин-р-глюкозид; 2 — подофилотонсинглюкозид; з — р-пелтатин-р-Ь-глюнозид; * —4'-диметилподофилотоксин; 5 —а-пелтатин; в — подофилотоксин; 7 —р-пелтатин; в —1-де- зоксиподофилотоксин. В случае чистых веществ наносили по 1,0 цз, в случае подОфилинов и лекарственных веществ — по 0,5 мм» 10%-ной спиртовой вытяжни. Обнаружение: смесь серная кислота — ангидрид уксусной кислоты (1 + 3), 15 мин, 100°. Пунктиром обозначены зоны, которые реагируют дополнительно с диавониевыми солями.

хроматографии в БН-камере (стр. 31), либо провести повторное хроматографирование после предварительного испарения растворителя. В большинстве случаев при малых временах анализа процесс можно повторить несколько раз. Ступенчатый метод применяют в случая^, когда при использовании одного растворителя часть веществ не может быть разделена и обычно сжата в области низких (0—0,2) или высоких (0,8—1) значений R#. В этом случае отыскивают растворитель, в котором неразделенные вещества обнаруживают хорошее различие в величинах Rf. Тогда можно провести разделение, применяя последовательно вначале один, а затем другой растворитель. Два примера пояснят сказанное: а) имеется смесь лигнанов и их глюкозидов (вещества, содержащие Podophyllum). На ступени 1 (расстояние старт — фронт 6 см) разделяются глюкозиды, а аглюконы находятся вместе в области фронта растворителя. Их разделяют затем с менее подярным растворителем на ступе-

Рис. 34. Тонкослойные хроматограммы в форме клиновидных полос. Разделение происходит в виде отдельных полос, и только в случае больших количеств (середина) наблюдается А-образное искривление.Рис. 34. Тонкослойные хроматограммы в форме клиновидных полос. Разделение происходит в виде отдельных полос, и только в случае больших количеств (середина) наблюдается А-образное искривление.Рис. 35. Шаблоны из плексигласа (толщина 2—3 мм) для разметки контура.Выпиливают заштрихованные пятиугольники.Рис. 35. Шаблоны из плексигласа (толщина 2—3 мм) для разметки контура.Выпиливают заштрихованные пятиугольники.

Рис. 34. Тонкослойные хроматограммы в форме клиновидных полос. Разделение происходит в виде отдельных полос, и только в случае больших количеств (середина) наблюдается А-образное искривление.

Рис. 34. Тонкослойные хроматограммы в форме клиновидных полос. Разделение происходит в виде отдельных полос, и только в случае больших количеств (середина) наблюдается А-образное искривление.

Рис. 35. Шаблоны из плексигласа (толщина 2—3 мм) для разметки контура.

Выпиливают заштрихованные пятиугольники.

Рис. 35. Шаблоны из плексигласа (толщина 2—3 мм) для разметки контура.

Выпиливают заштрихованные пятиугольники.

ни 2 (расстояние старт — фронт 12 см) [64]. (рис. 33); б) смесь каротинов ф-каротин, ликопин, кантаксантин и биксин) разделяют хлороформом уже на небольшом расстоянии, но p-каротин и ликопин находятся вместе в области фронта. Опыт прерывают после прохождения расстояния в 5 см (ступень 1) и проводят хроматографическое разделение, используя гексан. На этой ступени (расстояние старт — фронт 10 см) оба каротиновых углеводорода разделяются [601.

МЕТОД КЛИНОВИДНЫХ ПОЛОС

В хроматографии на бумаге лучшее разделение дает предложенный первоначально Райнделем и Хоппе [49] и получивший широкое распространение благодаря работам Матиаса [33] «метод клиновидных полос». При нарезании бумаги в виде язычков вещества вынуждены перемещаться в виде полос. Перенос этого метода на тонкие сорбционные слои не вызывает затруднений.

При этом необходимо только узким металлическим шпателем прочертить в слое граничные линии шириной 0,5—1 л1м [57].

Были проверены различные формы язычков и их расстояния друг от друга. Изображенные на рис. 34 и 35 формы дали наилучшие результаты. Вырезание пятиугольников облегчается применением шаблона из плексигласа (рис. 35). Его кладут близко к нижнему краю пластинки для ХТС и очерчивают пятиугольник, затем из верхних углов проводят продольные линии, применяя для этого шаблон для надписей. Пробу наносят в узкой части язычка. Вследствие сужения полосы в месте, где подается растворитель, время хроматографирования увеличивается.

ДВУМЕРНОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ, МЕТОД РРР

Двумерный метод является ценным вспомогательным средством для разделения многокомпонентных смесей. Вначале проводят разделение в направлении 1, а затем, повернув пластинку для ХТС на 90°, в направлении 2. Однако это имеет смысл, только если эффект разделения в направлении 2 отличен от эффекта разделения в направлении 1. Только в этом случае имеются оптимальные условия применения этого метода. Рис. 131, 149 и 168 хорошо поясняют суть данного метода. Используя только что изложенные соображения, Кауфману с сотрудниками [22], осуществившими комбинацию адсорбци-

онной ХТС (в направлении 1) и распределительной ХТС (в направлении 2), и Хонеггеру, осуществившему комбинацию электрофореза в ТС (в направлении 1) и адсорбционной или распределительной ХТС (в направлении 2), удалось значительно обогатить метод двумерной ХТС (см. гл. 19, VI).

В противоположность этому, в случае метода РРР (разделение — реакция — разделение) в обоих направлениях разделение проводят при точно одинаковых условиях (например, одинаковые растворители). Поэтому соединения, не разлагающиеся при разделении, должны лежать на одной линии, а именно на диагонали между направлением 1 и 2. Таким способом можно просто установить, происходит ли в данном растворителе изменение какого- либо вещества смеси. Если на основании хроматографического разделения в направлении 1 предположить протекание реакции, приводящей к структурным изменениям одного или нескольких компонентов, то, проводя разделение с этим же растворителем в направлении 2, можно твердо установить, идет эта реакция или нет. Этот простой метод позволяет быстро определить изменение отдельных компонентов смеси под действием излучения (у-, рентгеновские, УФ-лучи), газов и температуры. Итак, дело касается вопросов, представляющих весьма большой интерес (защита от излучения, фотохимия, испытание на стабильность). Этот уже давно известный в хроматографии на бумаге метод РРР был успешно использован при изучении дезактивации перетрина (рис. 149) [601.

' 4. ИЗМЕНЕНИЕ РАЗДЕЛИТЕЛЬНОЙ СПОСОБНОСТИ СЛОЯ (см. «Сорбенты», стр. 37—42)

Опыты по адсорбционной хроматографии с «основными», «нейтральными» и «кислыми» окислами алюминия и аналогичные опыты по хроматографии на бумаге (буферирование или пропитка бумаги) можно перенести на ХТС. Чаще всего применяемые в ХТС слои силикагеля Г являются слабокислыми. Слои окиси алюминия Г, наоборот, дают основную реакцию. Смешивая оба адсорбента (1 + 1, весовые части), можно получить, согласно В альди, иногда весьма удобные нейтральные слои. Точно так же получают сильно'кислые или основные слои. Для приготовления массы берут адсорбент и вместо воды, например, 0,1—0,5 н. щавелевую кислоту или 0,1—0,5 н. раствор едкого кали. Аналогичным образом получают забуференные слои, используя соответствующие буферные растворы.

«Кислые» слои силикагеля Г успешно применяют для разделения соединений с кислой реакцией (фенолы, кислоты), а основные слои — для алкалоидов и аминов. Последовательное применение подобных слоев позволяет установить реакцию неизвестного соединения. Если вещества образуют соли с пропиточным раствором, то последние, как правило, не перемещаются в слабо полярном растворителе или, во всяком случае, перемещаются медленнее, чем свободные основания или фенолы [58].

Для специальных задач может оказаться полезной пропитка бисульфитом (задержка альдегидов), солями ртути (аддукты), борной кислотой (комплексообразование) или мочевиной (соединения включения, клатраты).

Гидрофобизация. При хроматографировании липидов в тонких слоях, так, же как и в хроматографии на бумаге, оказалась удобной методика «обращения фаз». При этом сорбционный слой гидрофобизуют неполярным липофильным «маслом» и в качестве подвижной фазы выбирают несмешивающий- ся или плохо смешивающийся полярный растворитель. Значение величины R} для гомологических рядов (например, убихиноны С5— С50) на таких слоях закономерно уменьшается с увеличением числа атомов углерода. В зависимости от «летучести» можно говорить о временной или постоянной пропитке. Мангольд [30, 31], Винтерштейн [71], а также Кауфман [23] предпо-

читают постоянную тидрофобизацию. Для этого хорошо высушенные пла стинки для XTG погружают в 5—10%-ный раствор пропитывающего веществ (стеклянная фотографическая кювета) и затем удаляют легко летучий раство ритель (т. киц. 40—60°). При пропитке следует обратить внимание на то чтобы пластинки и пропиточный раствор имели одинаковую температуру чтобы пластинки были длительное время погружены и чтобы время окунанш было примерно одинаковым. Гидрофобизованные силиконовым маслом ил1 парафином пластинки можно хранить длительное время. До настоящей времени были использованы следующие гидрофобизующие вещества.

Силиконовое масло 10с St (фирма «Dow Corning», США), 5% в эфире Силиконовое масло 50с St и 1,5с St (фирма «Wacker Chemie», Мюнхен 22), 7 % в петролейном эфире.

Жидкий парафин для ИК - спектроскопии (фирма «Merck», Дармштадт), 5—10% в петролейном эфире.

Ундекан (для временной гидрофобизации), 15% в петролейном эфире.

Тетрадекан = станд. фракция нефти с т. кип. 240—250° (фирма «Halter- mann», Гамбург), 5% в цетролейном эфире.,

Силиконизация и закрепление слоя описано Кауфманом [23]. Пластинку для ХТС помещают в вакуум-эксикатор, Содержащий 3—5 мл дихлордиме- тилсилана (в бюксе), и выдерживают под вакуумом 300 мм рт. ст. в течение 15—30 мин. После этого пластинки 30 мин выдерживают на воздухе. Сили- конизованные слои можно использовать так же, как и в хроматографии на бумаге. Избыток реактива смывают водой.

■ЛИТЕРАТУРА к гл. 1—4

Applewljite Т. И., Diamond М. J., Goldblatt L. A., J. Am. Oil Chern. Soc., 38, 609 (1961).■1

Baehler В., Schweiz. Apotheker Ztg., 99, 543 (1961).

Barbier M., Jager H., Tobias H., Wyss E., Helv. Chim. Acta, 42, 2440 (1959).:,

BirkoferL., Kaiser Ch., Meyer-Stoll H.-A., Su p p an F., Z. Natur- forsch., 17b, 352 (1962).,

Bolliger A., Bolliger J. E., The Roy. Austr. Chern. Inst. Proc. Feb., 1962, p. 78.

Brenner M., Niederwieser A., Experientia (Basel), 17, 237 (1961).

Brenner M., Niederwieser A., Pataki G., Fahmy A. R., Expe- rientia (Basel), 18, 101 (1962).

С о n s d e n R., Gordon A. H., Martin A. I. P., Biochem. J., 38, 224 (1944),.

Crowe M. O’L., Anal. Chern., 13, 845 (1941).

Davidek J., Davidkova E., Pharmazie, 16, 352 (1961)..

Davidek J., Prochazka Z., Collection Czechoslov* Chern. Commun., 26» 2947 (1961)..

D e m о 1 e E., J. Chromatogr., 6, 2 (1961).

Egger K., Z. analyt. Chern., 182, 161 (1961).•,

Goppelsroeder F., Anregungen zum Studium der auf Capillaritats- und Adsor- ptionserscheinungen beruhenden Capillaranalyse, Basel, Verlag Helbing und Lichten- hahn, 1906.

H a i s I. M., M a с e k K., Handbuch der Papierchromatographie, Bd. I,u. II, Jena, VEB Fischer Verlag. 1958 u. 1960.

Halpaap H., частное сообщение.

H a u s s e r H., Mitt.-Bl. Ges. Dtsch. Chern. Lebensmittelchem. gerichtl. chem.,

194 (1959).-

Hesse G., AlexanderM., Vortragsreferat «Journee internationale d’Etude des Methodes de separation immediate et de Chromatographie», 13, 14, 15 Juni 1961, Paris.

Honegger C. G., Helv. Chim. Acta, 44, 173 (1961).-

Измайлов H. А., Шрайбер M. С., Фарм., 3, 1 (1938).

Jensen A., Tidsskr. Kjemi, Bergvesen Met., 1, 14 (1961).

Kaufmann H. P., M a k u s Z., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 62, 1014 (1960).

Kaufmann H. P., M a k u s Z., К h о e T. H., Fette, Seifen, Anstrichmittel,

689, 807, 828 (1961).-

Kaufmann Н. Р., К hoe Т. Н., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 64, 81 (1962).

Kirchner I. G., Keller G. I., J. Am. Chern. Soc., 72, 1867 (1950),

Kirchner I. G., Miller J. M., Keller G. I„ Anal. Chern., 23, 420 (1951).

L a g о n i H., Wortmann A., Milchwiss., 10, 360 (1955).

L a g о n i ■ H., Wortmann A., Milchwiss., 11, 206 (1956).

Maehata G., Mikrochim. Acta, Heft 1, 79 (I960).

M a n g о 1 d H. K., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 61, 877 (1959).

M a n g о 1 d H. K., J. Am. Oil Chemists Soc., 38, 708 (1961). ,

M a r t i n A. I. P., Synge R. L. M., Biochem. J., 35, 91 u. 1358 (1941).

Matthias W., Naturwiss., 41, 18 (1954).

Meinhard J. E., H a 1 1 N. F., Anal. Chern., 21, 185 (1949).

M e у e r H., Dent. Lebensm.-Rundschau Heft, 7, 170 (1961).

M i 11 e r J. M., К i r c h n e r J. G., Ch. A., 24, 1480 (1952).

M i 1 1 e r J. M., Kirchner J. G., Anal. Chern., 25, 1107 (1953).

M i 11 e r J. M., Kirchner J. G. Anal. Chern., 26, 2002 (1954).

Mistryukov E. A., Collection Czechoslov. Chern. Commun., 26, 2071 (1961). ■ 40. M о 11 i e r M., Mitt. Gebiete Lebensm. u. Hyg., 47, 372 (1956).

Mot tier M., Mitt. Gebiete Lebensm. u. Hyg., 49, 453 (1958).

Neubern-de Toledo T. A., W a s i с к у R., Correio do Mundo Farmaceutico (Brasilien), 1961.

■ 43. Pastuska G., Trinks H., Chemiker-Ztg., 85, 535 (1961).

Pastuska G., Trinks H., Chemiker-Ztg., 86, 135 (1962).

Peereboom J. W. C., Chern. Weekblad, 49, 625 (1961).

7 46. Prochazka 2., Chern. Listy, 55, 974 (1961).

Randerath K., Angew. Chern., 73, 436 (1961).

Randerath K., J. Chromatogr., 6, 365 (1961).

R e i n d e 1 F., H o p p e W., Naturwiss., 40, 245 (1953).

Reitsema R. H., J. Am. Pharm. Assoc., 43, 414 (1954).

Reitsema R. H., Anal. Chern., 26, 960 (1954).

R i 11 e r F. J., M e у e r G. M., Nature, 193, 941 (1962).

RSCO Review, 3, 18 (1961).

S c h о r n P. J., Glas-Instr.-Tech., 5, 43 (1961).

S t a h 1 E., Pharmazie, 11, 633 (1956).

Stahl E., Chemiker.-Ztg., 82, 323 (1958).

Stahl E., Parfiimerie u. Kosmetik,. 39, 564 (1958).

Stahl E., Arch. Pharmaz., 292, 411 (1959).

Stahl E., Pharmaz. Rundsch., 1, Nr. 2, 1 (1959).

S t a h 1 E., Arch. Pharmaz., 293, 531 (1960).

Stahl E., Z. analyt. Chern., 181, 303 (1961).

S t a h 1 E., Angew. Chern., 73, 646 (1961).

S t a h 1 E., неопубликованные данные.

Stahl E., Kaltenbach U., J. Chromatogr., 5, 458 (1961).

S t a n 1 e у W. L., V a n n i e r S. H., G e n t i 1 i B., J. Assoc. Offic. Agr. Chemists, 40, 282 (1957).

S t a n 1 e у W. L., V a n n i e r S. H., J. Assoc. Offic. Agr. Chemists, 40, 582 (1957).

Teijgeler C. A., Pharmac. Weekblad, 97, 43 (1962).

U m 1 a n d F., Kirchner K., Z. anorg. Chern., 280, 211 (1955).

Wagner H., Mitt. Gebiete Lebensm. u. Hyg., 51, 416 (I960).

Williams T. L, Introduction to chromatography, Glasgow, Blackie & Son, 1947.

W interstein A., Studer A., Riiegg R., Chem. Her., 93, 2951 (1960).

W о e 1 m M., Mitteilungen AL, 10 (1961).'

W о 1 1 ish E. G., Schmall M., Hawrylyshyn M., Anal. Chem., 33, 1138 (1961).

Zechmeister L., C h о 1 n о к у L. v о n, Die chromatographischy Adsorptions- analyse, 2. Aufl., Wien, Springer Verlag, 1938.

ДОКУМЕНТАЦИЯ ПРИ ХРОМАТОГРАФИИВ ТОНКИХ СЛОЯХ

X. Генсхирт,

Хроматограммы в тонких слоях в противоположность хроматограммам на бумаге чувствительны к механическим повреждениям, и окрашенные пятна выцветают обычно быстрее, чем на бумажных хроматограммах. Поэтому, а также потому что стеклянные пластинки могут быть использованы повторно, не рекомендуется хранение готовых тонкослойных хроматограмм. Оно описано в конце этого раздела лишь для отдельных случаев при препаративной хроматографии. Установление положения пятна на хррматограм- ме, как при хроматографии на бумаге, путем определения значения величины Rf, не является достаточным. Значения Rf в случае ХТС представляют собой лишь ориентировочные величины, которые передают относительное положение пятна внутри хроматограммы. При ХТС условия опыта должны быть указаны возможно точнее. Для этого целесообразно пользоваться бланком, который приведен на рис. 36.

Все значения Rf в этой книге умножены на коэффициент 100. При стандартной длине пути, равной 100 мм, это сразу дает расстояние стартовой точки до середины пятна (зоны) в миллиметрах. Если, однако, в некоторых случаях при разделении сложных смесей веществ и оказывается необходимым использование всей длины пластинки, то обычно предпочитают использовать расстояние 100 мм. Согласно опыту, при больших расстояниях пятна с большими значениями Rf смещены в сторону фронта растворителя. Если приводятся значенця Rf, то небольшие различия в этих величинах не позволяют установить, действительно ли вещества смеси разделяются. Если получаются резкие пятна, то это^принято указывать поперечной чертой. Если четкое разделение невозможно, то приводимые величины берутся в скобки.

При проведении серии хроматографических разделений рекомендуют в качестве веществ сравнения использовать эталонные вещества для определения положения пятна — метод, который уже известен в хроматографии на бумаге сахаров. При этом пользуются величиной Rst, определяемой следующим образом:-

^ Расстояние анализируемого вещества от стартаst Расстояние пятна стандарта от старта "

Если в качестве вещества сравнения используют одно из веществ разделяемой смеси, то получаемые при этом значения Rst являются более воспроизводимыми, чем величины Rf.■

Наряду с этим наиболее распространенным способом документации при хроматографии в тонких слоях в отличие от хроматографии на бумаге благодаря формату пластинок имеется возможность графического изображения данных или получения фотокопий.

Простейшим и наиболее, распространенным методом является снятие хроматограмм на кальку (рис. 37). Пятна, которые обнаруживаются только в УФ-свете, накалывают с помощью иглы и затем переносят на кальку. Пятна веществ можно планиметрировать и изображать в виде соответствующих прямоугольников одинаковой ширины, получая таким образом полуколи- чественные данные [34, 35, 26] (см. рис. 37). Если два или несколько боль-

ших пятен лежат близко друг к другу, то масштаб изображения следует увеличить, чтобы сохранить длину основной линии и иметь возможность изобразить пятна разделенными.

Если хроматограммы в тонких слоях дают контрастные пятна, то можно использовать метод рефлексного копирования, применив, например, копировальное устройство фирмы «Agfa» [31], чтобы получить черно-белое изображение хроматограммы (рис. 37). При этом способе в процессе проявления,

Тонкослойная хроматограмма №

Класс веществ:

Литература::—

Слой сорбента:■■.

Толщина слоя: Размер пластинки: .

Приготовление и сушка:..:

Разделительная камера: Метод разделения:

Состояние насыщения камеры:.—

Расстояние старт — фронт: Время анализа:

Растворитель:

Раствор пробы (растворитель и концентрация):

Количество пробы:

Примечания:,

Дата: ■

Вещество

RyX XI00

RyX хЮО

RyX Х100

Границы определения

Способ обнаружения

1

2

3'

4

Рис. 36. Схема бланка для регистрации необходимых данных тонкослойной ■ хроматограммы.

длящегося несколько секунд, негативный слой автоматически переходит в так называемый переходный слой, образуя позитивное изображение [14]. При применении этого метода важен выбор реактива для опрыскивания, поскольку прямой контакт хроматограммы и копировальной бумаги заставляет избегать применения агрессивных реагентов. Иногда удается избежать порчи копировальной бумаги, приложив прозрачную пластмассовую пленку. Ряд авторов также указывает на такую возможность [10, 13].

Для фотографического воспроизведения хроматограмм, подвергнутых опрыскиванию агрессивными реактивами, и хроматограмм, пятна которых 4 Заказ №734

могут быть локализованы только в УФ-свете по собственной флуоресценции или на флуоресцирующих пластинках по гашению флуоресценции, следует применять обычную пересъемку.

Чтобы избежать дополнительного увеличения, применяют в качестве съемочного аппарата зеркальный фотоаппарат с насадочными линзами. Черно-белые фотографии контрастных хроматограмм лучше всего получать, применяя съемку на просвет. Таким образом, например, были сфотографированы пятна липидов, окрашенные хлоридом сурьмы [15]. При этом часто выступают дефекты слоя. Пластинки с дефектами слоя можно фотографировать при комбинированном освещении. Для контрастных хроматограмм применяют только верхнее освещение. Источники света в этом случае следует разместить с двух сторон, причем угол падения должен составлять 45°. Для черно-белой съемки пятен с собственной флуоресценцией применяют источники УФ-света в области длин волн вблизи 254 лц, аналогично описываемому ниже, и работают с верхним светом. Пленка: Agfa AGP или JFF. Чтобы исключить рассеянный и отраженный свет, перед объективом

Рис. 37. Способы документации тонкослойных хроматограмм. а — снятая на кальку хроматограмма (снова переносится на обычную бумагу); б — документация с помощью приспособления «копирапид»; в — документация путем планиметрирования в форме прямоугольников соответствующей величины. Пример: разделение бромсодержащих снотворных смесью циклогексан — хлороформ — пиридин (20 + 60 +' 5) на пластинках с силикагелем Г. С — старт, Ф — фронт. 1 — адалин; 2 — абазин; з — бромурал.

помещают ультрафиолетовый и желтый фильтр средней плотности. Для съемки темных пятен на светящемся слое (стр. 61) используется аналогичный метод [8].

Для цветной съемки хроматограмм в тонких слоях пригодна пленка Agfacolor СТ 18 [6]. С позитивных диафильмов на цветной обратимой бумаге можно получить отпечатки (Agfa-CT-копии) в любом числе. В качестве источника света для цветной съемки исполь- зуют осветитель с газоразрядной импульсной лампой. Для съемок пятен флуоресцирующих веществ в качестве источников света применяют ртутные вакуумные лампы (Гереус) с ультрафиолетовым фильтром UG 5 и областью длин волн вблизи 254 мц. Перед объективом фотоаппарата следует установить комбинацию фильтров WG 2 (2 мм), GG 13 (5 мм) и GG 3 (4 мм) (фирма «Schott»), чтобы отфильтровать рассеянное и отраженное ультрафиолетовое излучение. Точные указания об устройстве фотоаппарата и источниках света можно найти в оригинальной работе [6].

Как уже упоминалось выше, оригинальную хроматограмму можно сохранять после специальной обработки. Хроматограммы аминокислот были законсервированы Баролье [2] путем заливки слоя 4%-ным раствором коллодия, к которому добавлено 7,5% глицерина. Адсорбционный слой может быть снят с пластинки в виде пленки.

На хроматограмму размером 20 х 20 см после окрашивания осторожно наливают 50 мл указанного выше раствора. Во избежание утечки хроматограмму обрамляют тесьмой из лейкопластыря шириной 1 см. После сушки коллодийную пленку разрезают вдоль полоски лейкопластыря. Хроматограмму затем легко снимают с пластинки в виде упругой пленки. Для окончательного хранения эту пленку наклеивают на лист бумаги с помощью прозрачной пластмассовой .ленты.

Пленки коллодия обладают свойством скручиваться и склеиваться, поэтому для консервирования лучше применять водную эмульсию полимера (эфира полиакриловой кислоты, поливинилиденхлорида и поливинилпропио- ната), напыляемую на готовую хроматограмму [20]. Подобная эмульсия имеется в продаже под названием неатан (фирма «Merck», Дармштадт). Для лучшего распыления удобнее эту эмульсию разбавить метанолом. -

На высушенную тонкослойную хроматограмму размером 20 х 20 см напыляют 10 мл смеси неатан — метанол (5 + 5) до полного смачивания хроматограммц. После этого пластинки сушат на воздухе и снимают слой одним из следующих способов.

Готовую хроматограмму, покрывают тонкой прозрачной клейкой пленкой (тезафильм), погружают на короткое время в воду и осторожно отделяют слой от пластинки. .

Окантовывают края хроматограммы тонкой клейкой лентой, погружают пластинку на короткое время в воду и осторожно отделяют слой. -

На короткое время погружают хроматограмму в воду и отделяют слой ножом или шпателем.

После окончательной сушки на воздухе хроматограммы наклеивают на картон и в таком виде сохраняют.

КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ХРОМАТОГРАММВ ТОНКИХ СЛОЯХ ,

X. Тенехирт

Условием успешных количественных хроматограмм является стандартизация метода ХТС путем использования сорбентов с определенным размером частиц и определенной степени чистоты, а также воспроизводимой толщины слоя. В остальном требуется выполнение тех же предварительных условий, что и в случае хроматографии на бумаге. Для нанесения пробы следует применять соответствующее приспособление, а именно калиброванный стеклянный капилляр или стеклянный поршневой шприц с микрометрической подачей (см. стр. 21). .

Исследование ошибок, происходящих при нанесении пробы с применением подобных стеклянных поршневых шприцев, было проведено с растворами эфиров бензойной кислоты [7]. При нанесении 0,05 мл раствора, содержащего около 60 Це вещества, относительное стандартное отклонение составлялось 1,2%. Сюда включена ошибка спектрофотометрического определения.

Следует ли наносить пробу в виде пятна или полосы, зависит в основном от наносимого объема раствора. При пользовании вспомогательным шаблоном (ср. стр. 22) сравнительно просто нанести пробу определенного объема в виде полосы, не повредив поверхности силикагеля.

Для количественного определения веществ, разделенных методом ХТС, в настоящее время имеются следующие методы, приведенные в табл. 2 и 3.

Таблица 2

Методы количественной оценки хроматограмм в тонких слоях без экстракции разделенных веществ

Методы I группы

Исследуемый класс соединений

Использованное количество, ца®

Ошибка, %

Литература

1. Визуальное сравнение окрашенных пятен с пятнами эталонных веществ 3

Витамины D

0,1—1

Полуколич.

16

Алкалоидыспо

рыньи ряда клавинов

0,1—30

Полуколич.

18

Ретинен

0,05—0,1 ,

_ Около ±30 в

40

Слабо полярные стероиды

0,1—150

Полуколич.

5

Продолжение табл. 2

Методы I группы

Исследуемый класс соединений

Использованное количество, цг^

Ошибка, %

Литература

Антиокислители

(З-бутил-4-оксианизол)

20—150

Около ±5

32

2а. Получение фотокопий и измерение площадей пятен

Токоферолы

10—60

Около ±5

33

Синтетические алифатические содержащие азот, фосфор и серу липиды

10—130 на каждый класс веществ

Около ^5

22

26. Слой делают прозрачным. Получение светокопии и ее спектрофотометрическое определение

Содержание менто- фурана в масле перечной мнты

5—15

Около ^5

12

3. Фотоденситометри- ческое определение

Моно-, ди- и триглицериды

2—10

Около ±5

27а

Продукты разложения глицеридов и альдегидов

2—30

Около J;5

27

Эфиры холестерина

5—10

(±1,5)-(±5)

41

Модельные смеси синтетических алифатических азотсодержащих липидов

5—35

Около ±8

22

4. Радиоавтографи- ческое определение меченых веществ

Липиды

Следы

—

21

а Здесь приведены лишь отдельные работы в качестве примеров возможности определения.

® Если не привйено других данны^д-о указанные числа относятся к количеству отдельных

>чности определения приводятся приблизительные зна->чности определения приводятся приблизительные зна-компонентов в смеси. '*

>чности определения приводятся приблизительные зна-

>чности определения приводятся приблизительные зна-

в При отсутствии в работе дан1 чения.

Таблица 3

Методы количественной оценки хроматограмм в тонких слоях с экстракцией разделенных веществ

Методы II группы

Исследуемый класс ,соединений

Использованное количество а> цг

Ошибка, %

Литература

1а. Взвешивание после локализации по собственной флуоресценции в УФ-свете .

Нейтральные липиды из Faeces и Faecalithen

20 000—50 000 на пластинку

Полуколич.

39

16. УФ-Спектрофото- метрическое определение после локализации по собственной флуоресценции в УФ-свете

Алкалоиды рау- вольфии '■

50—70

±(3)-(5)

30

1в. Колориметрическое определение после локализации по собственной флоуресценции в УФ-свете ■

Алкалоиды спорыньи

100—2000

±(0,5)-^4)

19 ■

2а. Взвешивание после локализации в УФ- свете на флуоресцирующих пластинках

а- й Р-5-Холе- станол

10 000 на пластинку

Около -£10 6

4

26. УФ-Спектрофото- метрическое определение после локализации на флуоресцирующих пластинках

Эфир п-оксибен- зойной кислоты

20—70 ■

±(3)-(5)

Ср. табл. 5

[7]

Дифенил (в цитрусовых и изделиях из них)

2—120

17

2в. Колориметрическое определение после локализации на флуоресцирующихплас

тинках

Гидрокортизон и гидрокортизонацетат .

10—100

±(2)-(16)

8'

<

За. Окраска радиоактивных веществ и измерение счетчиком Гейгера .

Меченые производные липидов

0,1—100

Около ±5

21, 24

36. Локализации обработкой парами нода, колориметрическое определение железного комплекса гидроксамовой кислоты

Эфиры жирных кислот и оксикислот, а также моно-, ди- и триглицериды

100—1000

±5

37

Продолжение табл. 3

Методы II группы

Исследуемый класс соединений

Использованное количество а, цг

Ошибка, %

Литература

Зв. Окраска бромтимоловым синим и колориметрическое о пределение после экстракции антроном

Гликолипоидная часть липоидов мозга

10—40

±8 '

17

Зг. Окраска бромтимоловым синим и колориметрическое определение; определение содержания фосфора после озолении

Плазма-фосфоли- поиды

0,2—25Р

±0,01Р

11

Сфингомиелин из липоидов мозга

10—50

—

17

4а. УФ-Спектрофото- метрическое определение после локализации с помощью направляющей хроматограммы

Фолликулярные гормоны

Около 5

±10

36

46. Колориметрическое определение после локализации с помощью направляющей хроматограммы

Сахара

50

Около ±5

25

4в. Колориметрическое определение после локализации опрыскиванием водой и нагревания с серной кислотой■

Желчные кислоты

10—60

±(1,5)—(3,0)

9

а Если не приведено других данных, то указанные числа относятся к количеству отдельных компонентов в смеси..-

® При отсутствии в работе данных о точности определения приводятся приблизительные значения.

I. ОПРЕДЕЛЕНИЕ Н^МсСТРАКЦИИ РАЗДЕЛЕННЫХ ВЕЩЕСТВ

I ГРУППЫ)

. ВИЗУАЛЬНЫЙ МЕТОД СРАВНЕНИЯ

В этом случае на место старта попеременно наносят равные количества анализируемого раствора и прстепенно увеличивающиеся количества эталонного раствора определяемого компонента известной концентрации и проводят хроматографическое разделение. После этого сравнивают величину

окрашенных или флуоресцирующих (использование УФ-лампы) пятен. Пятно эталонного раствора, по своей величине совпадающее с пятном анализируемого раствора, дает искомый результат. Большинство проведенных таким образом определений носит полуколичественный характер (ср. табл. 2).

Этот- метод, которым на бумаге при соответствующих условиях можно получить довольно точные данные [38], в случае ХТС приводит к неудовлетворительным результатам. Как показывает рис. 38, при хроматографии в тонких слоях в отличие от хроматографии на бумаге лишь в сравнительно узкой области концентраций имеется визуально различимая зависимость

Рис. 38. Зависимость площади пятна от количества наносимой пробы (алкалоида) при постоянной длине пути.

I — разделение на бумаге, пропитанной формамидом; II — разделение на слое силикагеля Г. Точки символизируют число молекул [35].-

между' нанесенным количеством вещества и площадью пятна. Этот метод может быть использован при быстром изменении окраски пятен или при наличии столь малых количеств веществ, что при их определении другими методами нельзя ожидать воспроизводимых результатов.

ФОТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Хроматограммы в тонких слоях, дающие при окраске в результате опрыскивания контрастные пятна с неизменяющейся (по крайней мере во время опыта) окраской, можно объективно оценить способом «Agfa-Copyrapid». Полученные при этом темные пятна планими^друют и оценивают, используя калибровочную кривую, построенную т|ри использовании различных количеств анализируемого вещества. Этот метод был использован Зеэром [32] для определения в продажном загрязненном З-бутил-4-оксианизоле биологически активного вещества и для количественного анализа токоферола [331 (ср. табл. 2). Из этих исследований вытекает, что для каждой тонкослойной хроматограммы необходимо строить свою калибровочную кривую,^поскольку часто обнаруживается некоторое различие в толщине слоя (см. рис. 39).

С учетом этого в данных опытах было получено совпадение результатов с точностью ± 5%, когда в предварительных опытах количество анализируемого компонента было подобрано так, что определяемая величина находилась в оптимальной области калибровочной кривой.

Рассмотрим проведение такого анализа на примере определения чистоты 3-бутил- 4-оксианизола. 6 пятен непрерывно увеличивающихся количеств чистого соединения и между этими пятнами еще 6 пятен постоянного количества анализируемого вещества

наносятся на линию старта тонкослойной пластинки, разделяются растворителем и окрашиваются раствором фосфорномолибденовой кислоты. После приготовления фотокопии способом Agfa-Copirapid темные пятна планиметри-

руются. Из полученных при планиметрировании шести значений площадей пятен анализируемого вещества вычисляется среднее значение. По величинам пятен чистого вещества строится калибровочная кривая. По этой кривой определяется абсолютное количество анализируемого вещества.

Пурди и Тратер [281 обработали имеющиеся в литературе [3, 33, 3561 и собственные данные и нашли зависимость между величиной пятна, полученной планиметрированием, и нанесенным количеством вещества. Приведены графический и расчетный методы количественного определения, показывающие, что существует прямая пропорциональность между логарифмом количества вещества в граммах и корнем квадратным из величины пятна в мм2.

Для количественной оценки хроматограмм в тонких слоях использовался также так называемый метод фотопринта. После разделения пятна окрашивали и затем делали прозрачным сорбционный слой, обработав его со-

j-бутип-Ц-оксианизола, ргj-бутип-Ц-оксианизола, ргРис. 39. Зависимость площади пятна от нанесенного количества (З-бутил-4-оксианизола) на двух пластинках силикагеля (по Зегеру).Рис. 39. Зависимость площади пятна от нанесенного количества (З-бутил-4-оксианизола) на двух пластинках силикагеля (по Зегеру).готовили светокопию, которуюготовили светокопию, которуюответствующим растворителем. После этого

j-бутип-Ц-оксианизола, рг

j-бутип-Ц-оксианизола, рг

Рис. 39. Зависимость площади пятна от нанесенного количества (З-бутил-4-оксианизола) на двух пластинках силикагеля (по Зегеру).

Рис. 39. Зависимость площади пятна от нанесенного количества (З-бутил-4-оксианизола) на двух пластинках силикагеля (по Зегеру).

готовили светокопию, которую

готовили светокопию, которую

разрезали на соответствующие полоски и промеряли спектрофотометром. В этом методе, кроме наличия контрастных полос и постоянства в процессе анализа окраски пятен, предполагается также, что прозрачность сорбционных слоев может быть достигнута без повреждения пятен. Поэтому этот вид количественной оценки хроматограмм имеет ограниченное применение. Он был использован Хефенделем [12] для определения содержания ментофу- рана в масле перечной мяты. И в этом методе желательно для каждой хроматограммы строить отдельную калибровочную кривую.

ФОТОДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОСЛЕ ОКРАСКИ

Прайвет и Бланк [27] переводили смеси насыщенных и ненасыщенных глицеридов с помощью реакций окисления и расщепления в вещества различной полярности, разделяли их хроматографически на пластинках с силикагелем Г и после обугливания серной кислотой количественно определяли денситометрически (см. рис. 40 уабл. 2). В другой работе эти авторы вместе с Лундбергом [27а] разделяли главным образом насыщенные моно-, дии триглицериды и определяли их денситометрически (см. табл. 2). При этом моно-, ди- и триглицериды подвергались хроматографическому разделению с помощью соответствующего растворителя, состоявшего из эфира и скелли- зольва в различных соотношениях.

Методика. После проявления пластинки сушили при комнатной температуре, опрыскивали 50%-ным водным раствором серной кислоты и нагревали. Образовавшиеся

пятна промеряли денситометром [фирма «Photovolt» 52-С и 521 А (рис. 40)] с устройством для полуавтоматической съемки кривых. Ширина щели денситометра составляла 1X5 или 1 X 7,5 льи. Промеры проводили по всей длине хроматограммы через каждый 1 лг!и. Фильтры не применяли. Погрешности, обусловленные фоном, были невелики. В определенной области была обнаружена линейная зависимость между количеством

Рис. 40. Денситометр фирмы «Photovolt».

вещества и площадью пятна. Разумеется, площади пятен (при постоянной величине пробы) глицеридов с одинаковым или почти одинаковым числом углеродных атомов, но различной структуры не во всех случаях одинаково велики. Поэтому оказалось необходимым для каждого глицерида построить вначале соответствующую калибровочную кривую (рис. 41). '

В том случае, если, как в описанной работе, «фон» не вызывает сильных помех и в определенной области имеется хорошо воспроизводимая зависи-

Количество пробырг

Рис. 41. Зависимость площади пятна от количества наносимой пробы для различных глицеридов жирных кислот (по Прайвету с сотрудниками [27а]).

• триолеин; О трипальмитин; Д дипальмитин; х монопайьмитин.

наличии соответствующего измерительного прибора быстро получают количественные результаты. Так, после обработки соответствующими реактивами были денситометрически промерены тонкослойные хроматограммы синтети-

ческой смеси азот-фосфор- и серусодержащих алифатических липидов [22]. Модельные смеси насыщенных липидов с аминами, амидами и нитрилами в количествах от 5 до 35 рг на каждый класс соединений были проанализированы с погрешностью ±8% (ср. табл. 2). Можно также получить фотокопии таких хроматограмм и использовать метод нахождения площадей пятен, описанный на стр. 57. При работе с количествами, равными 30—130 цг на каж- ' дый класс соединений, ошибка анализа составляет ±5%.

Цолнером и сотрудниками [41] методом ХТС на силикагеле эфиры холестерина были разделены на пять основных фракций, окрашены треххлористой сурьмой и определены фотометрически с использованием различных приборов (прибор, используемый при электрофорезе, фирмы «Bender и Hobein», прибор для промеров хроматограмм к фотометру фирмы «Eppendorf» и самодельное устройство к прибору DUG 4700 фирмы «Beckman)». Согласно сообщению Шталя с сотрудниками [35а], для количественной оценки тонкослойных хроматограмм пригоден двухлучевой саморегистрирующий и интегрирующий денситометр марки «Chromoscan» после переделки его на формат пластинок Юх 20 см.-

РАДИОАВТОГРАФИЧЕСКИЙ МЕТОД

Меченые липиды (см. стр. 77) после разделения на отдельные классы определяются радиоавтографически [21] (ср. стр. 73). Для этого фотографические пленки накладывают в темной комнате на хроматограммы и через соответствующее время проявляют и фиксируют. Затем пленки промеряют денситометрически.'

• II. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАЗДЕЛЕННЫХ ВЕЩЕСТВ ПОСЛЕ ЭКСТРАКЦИИ (МЕТОДЫ II ГРУППЫ)

Способ оценки хроматограмм в тонких слоях, состоящий в опрыскивании окрашивающим реактивом с последующей экстракцией окрашенных веществ и фотометрическим определением, часто вызывает трудности, как и в случае хроматографии на бумаге. Соотношение концентраций реактива и определяемого вещества различно в центре и у края хроматографического пятна, поэтому ход реакции может быть различным. Часто также образующиеся окрашенные вещества экстрагируются значительно труднее, чем сами разделенные вещества. Кроме того, сам слой часто также окрашивается реактивом, вследствие чего возникает необходимость учета фона. Наоборот, локализация путем окраски разделенных веществ может применяться без огово- .рок, если на последующее количественное определение, например методом газовой хроматографии (ср. стр. 63), используемый для опрыскивания реактив не влияет.’

Если, однако, можно локализовать разделенные вещества без их дальнейшего превращения, например по их собственной флуоресценции или по поглощению в ультрафиолете на пластинках, покрытых флуоресцирующим составом, и если после экстракции вещества имеются в количествах, достаточных для применения физико-химических методов определения, то эту возможность обычно следует использовать.■

Во многих случаях после экстракции проводят фотометрическое определение в ультрафиолетовой области или, после окраски, в видимой области, как это показано на рис. 42 на примере кислот желчи. Вначале целесообразно определить холостую пробу путем обработки выбранного сорбента экстрагентом. Такие опыты описаны, например, для силикагеля Г в каче-

стве сорбента и метанола в качестве экстрагирующего веществу при количественном определении в УФ-области [7]. При экстракции силикагеля возникают трудности с применением гидрофильных экстрагентов. Силикагель в виде коллоида переходит в раствор, однако во многих случаях его

Рис. 42. Спектрофотометрическое определение желчных кислот после экстракции разбавленной серной кислотой, которая одновременно служит реактивом.

а — спектры холевой (), дезоксихолевой (—) и хенодезоксихолевой (—•—) кислот

после разделения и окраски; б — зависимость поглощения от количества анализируемой пробы; х холевая кислота (386 му.), о дезоксихолевая кислота (386 му.), • хенодезоксихолевая кислота (381 мц).

можно отделить фильтрованием раствора через кизельгур. Далее следует иметь в виду, что связующий материал, сульфат кальция, почти количественно растворяется в воде.

После этих предварительных исследований следует определить, извлекается ли определяемое вещество выбранным экстрагентом полностью. Для

Таблица 4

Применение этанола в качестве экстрагента для извлечения гидрокортизонового спирта и гидрокортизонацетата с пластинок со слоем силикагеля Г

Нанесенное количество, ЦЗ

Экстрагированное количество, ЦЗ

Стандартное отклонение о, отн. %

Гидрокортизоновый спирт

100

99,1

1,4

Гидрокортизонацетат . . .

100

101,2

1,4

Относительно колориметрического определения после экстракции см. стр. 62.

а — стандартное отклонение;

■/ — отклонение отдельного изме-

а-100 / 3/2рения от среднего значения;

аотн=-д^- у ^1 /V —число измерений (в данном случае 10);

MW — среднее значение.

этого пробы вещества наносят на пластинку, покрытую соответствующим сорбентом. Проведя сушку в условиях, соответствующих условиям проведения собственно хроматографического разделения, экстрагируют вещество и определяют экстрагированное количество, затем вычисляют ошибку, возникающую при повторении опыта (см. табл. 4).

В общем при надлежащем выборе экстрагента около 95% нанесенной пробы экстрагируется вновь. Следует только избегать длительной выдержки пластинок с нанесенной пробой перед разделением, поскольку при зтом из-за весьма большой поверхности соприкосновения анализируемогб вещества и сорбента под действием воздуха может произойти изменение анализируемой пробы.

Если после разделения и экстракции получают в ультрафиолетовой области завышенные значения или разброс при определении холостых проб, то следует иметь в виду, что зто может быть связано с недостаточным удалением компонентов растворителя, поглощающих в УФ-области.

ЛОКАЛИЗАЦИЯ ПО СОБСТВЕННОЙ ОКРАСКЕ

ИЛИ СОБСТВЕННОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ОПРЕДЕЛЯЕМОГО ВЕЩЕСТВА

Если разделенные вещества обладают собственной окраской или флуоресцируют при облучении УФ-светом, то после хроматографического разделения их можно просто обнаружить.'

При работе с флуоресцирующими веществами следует по возможности всегда приводить длину волны возбуждающего излучения.

Таким образом, были проанализированы модельные смеси резерпина и ресцинамина [30] (ср. табл. 3). После локализации с применением УФ-света (254 или 366 лр) алкалоидные пятна и находящиеся на той же высоте пустые зоны сорбента соответствующей величины (холостые пробы) были соскоблены с пластинки, экстрагированы-и определены методом УФ-спектрофотометрии. Таким же способом были проанализированы экстракты Secale cornutum, содержащие алкалоид спорыньи [19]. После экстракции и добавки окрашивающего реактива алкалоиды определяли фотометрически в видимой области. Аналогичным образом в полумикроопытах (20—50 мг^ количественно определены липиды из фекалий и фекальных камней [39]. Липиды были локализованы после разделения на пластинках с силикагелем по их собственной флуоресценции в ультрафиолетовом свете и экстрагированы. Остатки после экстракции были взвешены (см. табл. 3).

ПРИМЕНЕНИЕ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ СЛОЕВ

В большинстве случаев после разделения в тонких слоях вещества нельзя обнаружить без дальнейшей обработки. Поскольку, однако, многие органические вещества поглощают в ультрафиолетовой области, существует возможность или опрыснуть хроматограммы специальными растворами органических флуоресцирующих красок, переходящих в возбужденное состояние под действием УФ-света, или предварительно смешать сорбент с неорганическими флуоресцирующими веществами. В обоих случаях поглощающие УФ-излучение органические вещества можно определить в виде темных пятен, гасящих флуоресценцию на флуоресцирующем фоне. В то время как опрыскивание должно производиться весьма равномерно для обеспечения чувствительности определения, добавление неорганических флуоресцирующих красок к сорбенту — очень простая операция, причем при экстракции идентифицируемых разделенных органических веществ осложнений не возникает [17а]. Весьма удобно перед перемешиванием наносимой массы добавление к сорбенту 2—5% светящегося вещества «ZS-супер» (фирма «Riedel

de Наел») [7]. После локализации вещества, поглощающие в ультрафиолете, можно экстрагировать и определить, например, спектрофотометрически. Подробно эта возможность локализации с последующим спектрофотометрическим определением экстрагированных компонентов в УФ-области была проверена на модельной смеси метилового и пропилового эфиров и-оксибен- зойной кислоты [7]. В качестве коэффициентов поглощения можно подставить удельное поглощение анализируемого вещества в максимуме поглощения. Можно показать экспериментально, что ошибка меньше в том случае, когда на каждой пластинке одновременно с пробой хроматографируется эталонное количество анализируемого вещества; при этом неизвестная концентрация пробы может быть рассчитана по измеренной величине поглощения (табл. 5).

,Таблица 5

Количественный анализ смеси метилового н пропилового эфиров - n-оксибензойной кислоты после разделения методом ХТС

Проба содержала около 50 цг каждого из веществ

Определение по постоянным коэффициентам поглощения. В среднем извлечено, %

Стандартное отклонение, аотн’ %

Определение с использо- . ванием эталонных количеств отдельных компонентов, которые хро- матографи- .

руются ’ одновременно

с пробой.

В среднем извлечено, %

Стандартное отклонение, аотн’ %

Метиловый эфир . . . .

96,0 ■

±6,7

100,4

±3,2

Пропиловый эфир . . .

93,6

±5,7

98,0

±4,8

_ п-100 а°тн- MW_ п-100 а°тн- MWа — стандартное отклонение;

_ п-100 а°тн- MW

_ п-100 а°тн- MW

/ — отклонение отдельного измерения от среднего значения;

N — число измерений (в данном случае 14);

MW — среднее значение.

Методика. 22 г силикагеля Г фирмы «Merck» смешали с 0,5 г светящегося вещества ZS-супер» и нанесли обычным способом на пластинки (стр. 16). Нанесли в виде пятен пробы (50 цз) из метанольных растворов разделяемых смесей эфиров и отдельных компонентов. После разделения отметили иглой адсорбционные пятна, локализуемые при облучении коротковолновым УФ-светом (254 лц). Эти пятна и находящиеся на одной с ними высоте равновеликие «пятна» в области свободного силикагеля, используемые для холостых промеров, соскоблили лезвием безопасной бритвы и перенесли в маленькие пробирки (G5) по Горбаху, после чего несколько раз обработали порциями экстрагента (метанол) по 2 мл, используя магнитную мешалку. Экстракты профильтровали с помощью устройства Горбаха через стеклянные фильтрующие таблетки G4, применяя небольшой вакуум, и собрали в мерные колббчки емкостью 10 мл. После заполнения мерных колбочек экстрагентом провели измерения спектрофотометром в области макси-' мума поглощения, учитывая значения для холостых проб.

Аналогичным образом можно осуществить фотометрическое определение и в видимой области, после разделения соответствующим проявителем, локализации в УФ-свете и экстракции. Этот метод был использован при анализе смесей гидрокортизонового спирта и гидрокортизонацетата. Окраску прово-

дили после экстракции 3,3'-дианизил-5ис-4,4'-(3,5-дифенил) тетразолиумхло- ридом [8] в основных растворах. Измерения осуществляли при 520 Л1р (ср. табл. 3). : , .

При обстоятельном исследовании разделения стероидов на свободно насыпанных слоях окиси алюминия или силикагеля с добавкой флуоресцирующего вещества, но без связующего материала были также проведены количественные определения [4]. На почти горизонтальной пластинке, помещенной в хроматографическую камеру, вещества были разделены и затем локализованы в УФ-свете, экстрагированы и взвешены (ср. табл. 2 и стр. 256). Поскольку свободно насыпанные слои сорбента весьма чувствительны к толчкам и их опрыскивание реактивами можно проводить только во влажном состоянии, применение свободных слоев' не рекомендуется.

ОКРАСКА РАЗДЕЛЕННЫХ ВЕЩЕСТВ ПЕРЕД ЭКСТРАКЦИЕЙ

Как уже упоминалось, нецелесообразно проводить окрашивание разделенных веществ на хроматограмме, после чего окрашенные вещества экстрагировать и фотометрировать. Тем не менее этот метод был использован Бар- ролье [2] при количественном разделении аминокислот по Бреннеру и Нидер- визеру [3], причем, по-видимоМу, с успехом. Данные о воспроизводимости этого метода анализа не приведены,

В отдельных случаях для локализации разделенных веществ можно использовать такие реактивы, которые не мешают последующему применению (после экстракции пятен) второй цветной реакции, необходимой для колориметрического определения. Для второй цветной реакции применяют другой реактив, действующий на другую функциональную группу определяемого соединения. Так можно разделять эфиры жирных кислот, локализовать их парами иода и после проявления количественно определить колориметрически, переведя эфиры в окрашенные железные комплексы гидроксамовых кислот [37] (см. стр. 159). Воспроизводимость метода была проверена на смеси метиловых эфиров пальмитиновой, 6-оксистеариновой и 9, 10-диоксистеариновой кислот. При применении 100—1000 рг отдельных компонентов, наносимых на линию старта в виде полос, стандартное отклонение для 10 определений составляло 4—7%. Этим же методом были проанализированы смеси моно-, ди- и триглицеридов [37] (ср. табл. 3). Гликолипо- идные фракции липоидов мозга были окрашены аммиачным раствором бромтимолового и определены колориметрически после экстракции антронсерной кислотой [17] (ср. табл. 3). Для получения воспроизводимых результатов при работе с небольшими количествами растворителя была использована стандартная микропосуда для ультрамикроанализа фирмы «Beckman Instruments» [29]. Фракции липидов человеческой плазмы [11] и сфингомиелиновые компоненты липоидов мозга [17] были окрашены на хроматограмме аммиачным раствором бромтимолового Синего и озолены, и затем в их зоне колориметрически определено содержание фосфора (ср. табл. 3). При анализе липидных фракций плазмы Габерман и сотрудники обнаружили от 88 ■ до 102% суммарного фосфора. Определяемые количества: 0,2—25 цг фосфора на пятно при ошибке определения 0,1 цг Р. Холостое значение для 1 см? силикагеля составляет 0,05—0,1 рг фосфора.

Был описан также газохроматографический промер окрашенной хроматограммы. Комбинируя хроматографию в тонких слоях и газовую хроматографию, удалось разделить и количественно определить смеси метиловых эфиров насыщенных и ненасыщенных жирных кислот [23] (см. стр. 179 и табл. 3).

При обработке тонкослойных хроматограмм радиоактивных веществ также можно провести вначале окраску этих веществ и после экстракции измерить интенсивность излучения счетчиком Гейгера — Мюллера. Этим мето-

дом были проанализированы смеси липидов [21, 24]. Количества 0,1— 100 цг отдельных липидов определяют этим методом с точностью ±5% (ср. табл. 3). Если необходимо определить еще меньшие количества, следует применить радио автографический промер непосредственно на хроматограмме (см. гл. «Метод радиоактивных изотопов»), .

ДРУГИЕ МЕТОДЫ ЛОКАЛИЗАЦИИ РАЗДЕЛЕННЫХ ВЕЩЕСТВ

Простейшим образом можно осуществить анализ кислот желчи (ср. табл. 3). После разделения хроматограмму опрыскивают водой, в результате чего плохо смачиваемые пятна желчных кислот становятся видимыми. Для количественного определения экстрагируют 65%-ной серной кислотой, являющейся одновременно и окрашивающим реактивом, после нагревания спек- трофотометрируют [9] (см. стр. 60).

Как и в случае хроматографии на бумаге, при ХТС можно локализовать разделенные вещества с помощью так называемой «направляющей» хроматограммы. При этом рядом с пятном анализируемой смеси наносят пятно эталонной смеси анализируемых веществ. После разделения закрывают анализируемую хроматограмму, а направляющую хроматограмму окрашивают. На высоте пятен окрашенных эталонных веществ в анализируемой хроматограмме отмечают соответствующие площади и после экстракции проводят количественное определение. Этот метод может быть использован только в том случае, когда качественный состав анализируемого раствора и эталонной смеси одинаков, поскольку находящиеся в анализируемом растворе сопутствующие и балластные вещества могут при определенных условиях значительно изменить значения R} определяемых веществ..

Кроме того, следует отобрать равномерно покрытые пластинки и выполнить все предварительные условия, обеспечивающие постоянную скорость движения фронта растворителя (см. стр. 35). Этот метод был использован для разделения и количественного определения эстрона, 17р-эстрадиола и 16а, 1?Р-эстриола [36] (ср. табл. 3 и стр. 258). Чтобы уменьшить попадание окрашивающего реактива (12%-ной треххлористой сурьмы) на закрытую хроматограмму, не проводят опрыскивание, а наносят раствор реактива на пресс- папье, покрытое фильтровальной бумагой, и накатывают его на направляющую хроматограмму. С анализируемой хроматограммы соскабливают зоны при соответствующих значениях Rt, экстрагируют и проводят количественное определение методом УФ-спектрофотометрии..

Направляющие хроматограммы были также использованы для количественного анализа сахаров [25] (см. табл. 3 и разд. 21,4). Поскольку при этом пластинки готовились вручную и поэтому не были выполнены указанные выше условия, этот метод должен быть, плохо воспроизводимым. Так же на силикагелевых пластинках, изготовленных вручную с использованием в качестве связующего вещества крахмала из природной смеси, был выделен ипомеа- марон, локализован с помощью направляющей хроматограммы, экстрагирован и после окрашивания 2,4-динитрофенилгидразином определен колориметрически [1].

. Перечисленные ниже вещества могут быть обнаружены на тонкослойных хроматограммах биологическими методами. '

Бактериостатические и бактерицидные соединения (см. разд. 15, I, 4).

Инсектициды (см. разд. 17, II, 4).-

Гемолизуемые соединения (см. разд. 18, VI).

Горечи (см. разд. 18, VI).

Далее следует указать на описанное Велером [1а] устройство для обнаружения в результате прямой возгонки из слоя и сублимации на вторую пла- 'стинку.

В заключение следует еще упомянуть применявшуюся Гейнсом и Грютц- махером [12а] комбинацию хроматографии в тонких слоях и масс-спектрометрии. При этом соскобленные с хроматограммы пробы конденсированных ароматических и гетероциклических соединений стероидов и производных сахаров и аминокислот в маленьких стеклянных капиллярах непосредственно вводили в масс-спектрометр. В применяемом интервале температур 150— 200° эти соединения возгоняются прямо в электронном пучке.

ЛИТЕРАТУРА к гл. 5 и 6

1. Akazawa T., W a d a K., Agr. Biol. Chem. (Japan), 25, 30 (1961). la. В a e h 1 e r "’‘

2.

3.

4.

Br., Helv. Chim. Acta, 45, 309 (1962).

r J., Naturwiss., 48, 404 (1961).

Brenner M., Niederwieser N., Experientia (Basel), 16, 378 (1960).

Cerny V., J о ska J., L abler L., Collection Czechoslov. Chem. Commun.,

Barrolie

5.

26, 1658 (1961).

Dam M. J. D., van, KI e u v e r G. J. d e, H e u s J. G. d e, J. Chromatogr.,

6.

7.

8.

9.

10. И.

12.

4, 26 (1960).

Eggers G a n s h i G a n s h i G a n s h i Getz J.

J.

Phot, und Wiss., 10, 40 (1961).

rt H., Morianz K., Arch. Pharm., 293/65, 1065 (1960).

rt H., Morianz К., неопубликованные данные.

rtH., Koss F. W., M о r i a n z K., Arzneimittel-Forsch., 10, 943 (1960).

R. H., Lawson D. D., J. Chromatogr., 7, 266 (1962). Habermann E., В an d 11 о w G., К rus che B., Klin. Wschr., 39,816 (1961). Hefendehl F. W., Planta med., 8, 65 (1960).

12a. Hey ns K., Griitzmacher H. F., Angew. Chern., 74, 387 (1962). Hilton J., Hall W. B., J. Chromatogr., 7, 266 (1962).

Hornung W., Handbuch der Agfa-Photopapiere, Dusseldorf, Karl Knapp Verlag, 1955.

Huhnstock K., Weicker H., Klin. Wschr., 38, 1249 (1960).

J a n e c k e H., Maa s-G о e b e 1 s I., Z. analyt. Chern., 178, 161 (1960). Jatzkewitz H., Hoppe Seyler’s Z. physiol. Chem., 326, 61 (1961).

17a. Kirchner J. G., Miller J. M., R i c e. R. G., J. Agr. Food Chem., 2, 1031

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

(1954).

Klavehn M., Rochelmeyer H., Deut. Apotheker Ztg., 101, 477 (1961).

К 1 a v e h n M. I' ’'~- .- - -

20.

21.

22.

23.

24.

101, 75 (1961). Lichtenb

e r H. H. H. H.

It V V Al V * UI C j, С A He^ 1УСЦ1. Л j^V 1НСЛС1 1J ug • ) IVlj *• • (luu^)iH., Rochelmeyer, S e у f г i e d J., Deut. Apotheker Ztg.,

ger W., Z. analyt. Chem., 185, 111 (1962).

” Fette, Seifen, Anstrichmittel, 61, 877 (1959).

Kammereck R., J. Am. Oil Chemists’ Soc., в печати.

25.

26.

27.

Mangold Mangold Mangold M a. n g о 1 d posium II, в Pastuska G., Z. analyt. Chem., 179, 427 (1961).

K., K., K., K.,

печати.

Kammereck R., Chern, and Ind., 1961, 1032.

Kammereck R., Malins D. C., Microchem. J., Sym-

Petrowitz H. J., Materialpriifung, 2, 309 (1960). Privett O. S., В 1 a n k M. L., J. Lipid Research, 2, 37 (1961).

27a. Privett O. S., В 1 a n k M. L., Lundberg W. O., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 38, 312 (1961).

P u r d у J., Truter E. V., Chem. and Ind., 1962, Heft 11, 506.

S a n z M. C., Beckman report, 1, 4 (1900).

~~ Schlemmer F., Link E., Pharmaz. Ztg., 104, 1349 (1959). Seher A., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 61, 345 (1959).

30.

31.

32.

33.

34.

35.

A., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 61, 345 (1959).

A., Nahrung, 4, 466 (1960).

A., Mikrochim. Acta (Wien), 1961, 308 [2].

E., Chemiker-Ztg., 82, 323 (1958).'

E., Naturwiss., 47, 114 (1960).

E., Mitarb., частное сообщение.

E., Z. analyt. Chem., 181, 303 (1961).

Struck H., Mikrochim. Acta (Wien), 1961, 634 [4].

V i о q u e E., H о 1 m a n R. T., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 39, 63 (1962).

Waldi D., Chromatographie, S. 67, E. Merck, Darmstadt, 1959.

Williams J. A., Sharma A., Morris L. J., H о 1 man R. T., Proc., Soc. Exptl. Biol. Med., 105, 192 (1960).

Winterstein A., Hegedus B., Hoppe Seyler’s Z. physiol. Chem., 321, 97 (1960).

Z 6 11 n e r N., Wolfram G., A m i n G., Klin. Wschr., 40, 273 (1962).

S e h e r S e h e r Stahl Stahl

35a. Stahl

356. Stahl

36.

37.

38.

39.

40.

41.

5 Заказ № 734

ГЛ AB A 7.

МЕТОД РАДИОАКТИВНЫХ ИЗОТОПОВ

. Xi Мангол-ьд

Особое преимущество применения радиоизотопов в химических исследованиях известно: это большая чувствительность обнаружения радиоактивных элементов, на которую не влияет природа их химической связи.

В последние годы хроматографические методы были использованы для разделения и выделения радиоактивных элементов, весьма близких по химическим свойствам [17]. Эти методы неоднократно использовались также для фракционирования меченых органических веществ. В обзорной работе Роше, Лисицкого и Михеля [44] показано, как важно использовать в различных хроматографических методах изотопы, в особенности при биохимических исследованиях. Многие авторы описали специальное биохимическое применение разных радио хроматографических методов [2, 14]. Особенное впечатление производят исследования Кальвина [13] по ассимиляции радиоактивного углекислого газа и анализ методом хроматографии на бумаге меченых первичных продуктов фотосинтеза в водорослях и других зеленых растениях. С тех пор как Финк, Дент и Финк [16] описали фотографический способ локализации радиоактивных веществ на бумажной хроматограмме, радио автография стала незаменимым вспомогательным средством при исследованиях механизма фотосинтеза [5, 6, 13] и других проблем биохимии.

Пригодна ли ХТС для разделения веществ, меченных изотопами? Автор считает, что ХТС в ближайшие годы вытеснит другие радиохроматографические методы. Следующие преимущества ХТС обосновывают зто предположение.

Методы ХТС отличаются от других микропрепаративных методов большой емкостью разделительного слоя. На одной пластинке (20 X 20 слг) можно легко разделить несколько миллиграммов смеси и выделить радиоактивные соединения в количествах, достаточных для большинства дальнейших измерений.

Если использовать ХТС в качестве аналитического метода, то можно указать и на другие преимущества.

В противоположность всем методам колоночной хроматографии при ХТС, так же как и при хроматографии на бумаге, весь путь, на котором происходит разделение, лежит открытым, и поэтому почти все вещества (за исключением легко летучих) могут быть обнаружены.

Фракционирование методом ХТС в большинстве случаев значительно более четкое, чем при колоночной хроматографии и хроматографии на бумаге.

Чувствительность обнаружения выше, чем в случае хроматографии на бумаге, поскольку разделяемые вещества концентрируются в значительно меньших пятнах. Поэтому на тонкослойных хроматограммах могут быть обнаружены также значительно менее активные вещества и избтопы с меньшей энергией излучения. Эффект самопоглощения в адсорбционном слое, по-видимому, играет небольшую роль.

Метод весьма прост, и большинство разделений требует менее одного часа.

Эти преимущества ХТС особенно ценны при работе с очень «горячими» и короткоживущими изотопами.•.

При химических и биологических исследованиях используются почти исключительно долгоживущие радиоизотопы, испускающие главным образом мягкие Р-лучи. Особенно. важен радиоуглерод С14 (период полураспада 5568 лет, максимальная энергия 0,155 Мэв) и радиоактивный водород Н3 (тритий) (период полураспада 12,2 года, максимальная энергия 0,018 Мэв). Часто прйменяют также радиофосфор Р32 (14,3 дня, 1,701 Мэв), радиосеру S35 (87,1 дня, 0,167 Мэв) и радиоиод I131 (80,4 дня, 0,608 Мэв (Р)).

РАЗДЕЛИТЕЛЬНЫЕ СЛОИ, РАСТВОРИТЕЛИ И ХИМИЧЕСКИЕМЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ

Приведенные в специальной главе этой книги условия разделения пригодны и в случае различных классов соединений, меченных радиоизотопами. Фракционирование может быть осуществлено методом адсорбции или распределения на слоях адсорбентов, методом распределения в обращенных фазах на гидрофобизованных слоях, методом ионного обмена, методом тонкослойного ионофореза и при сочетании тонкослойного ионофореза с ХТС; растворители во всех случаях также аналогичны.

В случае хроматограмм в тонких слоях, содержащих радиоактивные вещества, для обнаружения также применимы химические реактивы. Наряду с этим следует использовать различные радиометрические методы для обнаружения и количественного определения меченых соединений. Одну и ту же хроматограмму всегда необходимо исследовать и химическим, и радиометрическим методом, чтобы иметь представление о химической и радиохимической чистоте анализируемых веществ.

МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ РАДИОАКТИВНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ-

Для определения радиоактивных веществ на пластинках, покрытых слоем, лучше всего использовать радиоавтографию. Возможно обнаружение счетчиком Гейгера — Мюллера, но оно требует больше времени, значительно менее точно и поэтому сейчас используется редко. Это же относится к пропорциональным счетчикам...

РАДИОАВТОГРАФИЯ

Фотографические эмульсии чернеют под действием а-, §- и у-лучей. Для фотографического обнаружения радиоактивных веществ к высушенной хроматограмме прижимают рентгеновскую, пленку и хранят этот «сэндвич» завернутым в черную материю в темноте . Следует обратить внимание на то, что небольшие количества некоторых из содержащихся в растворителе реактивов могут остаться в слое и обусловить ложную картину на пленке. Поэтому растворитель необходимо всегда тщательно удалять, перед тем как привести хроматограмму в соприкосновение с пленкой.

При обработке большого числа хроматограмм в тонких слоях пластинки рекомендуется пометить светящейся краской, хорошо регистрируемой рентгеновской пленкой.

Чаще всего используют пленку «No-Screen Medical X-Ray Safety Film» . Эмульсия этой пленки достаточно чувствительна, и разрешающая способ

ность [49] удовлетворяет требованиям, предъявляемым к ХТС. Подходящие пленки изготавливаются также и другими фирмами . Для проявления пленок используют проявитель «Supermix» фирмы «General Electric» или другие проявители рентгеновских пленок (см. примечания 1 и 2). Работают в темноте или при красном свете. Время проявления зависит от температуры и возраста проявителя. При 20° оно составляет 3—6 лшн. Фиксаж для рентгеновской пленки также производится указанными фирмами . Пленки фиксируются от 20 до 30 мин, затем промываются проточной водой 0,5— 1 час. ' ■

Время экспозиции определяется активностью разделяемых веществ, видом и энергией излучения изотопа, используемого для метки, и требуемым результатом. Достаточного почернения пленок достигают, если за время экспозиции на 1 ел2 попадает 1—10 миллионов [3-частиц (в зависимости от изотопа) [23, 71]. При работе с радиоактивным углеродом следует принять в качестве эмпирического правила, что количества вещества, которые на счетчиках Гейгера — Мюллера дают удвоенное значение фона, вызовут значительное почернение рентгеновской пленки при более чем двухдневной экспозиции. В случае бумажных хроматограмм обнаружение радиоактивйых углеродных соединений с помощью рентгеновских пленок является в 10—100 раз менее чувствительным.

Обычно одинаковые хроматограммы с соединениями, меченными С14, приводят в контакт с рентгеновской пленкой на 1, 2, 4 и 8 дней. Так получают радиоавтографы, которые довольно правильно передают количественное соотношение компонентов разделенной смеси веществ, а также радиоавтографы, на которых пятна от основных компонентов переэкспонированы; небольшие загрязнения при этом отчетливо выявляются. Таким образом получают полную картину качественного состава хроматографируемой смеси.

При необходимости проводить экспонирование в течение нескольких недель хроматограмму в тонких слоях с пленкой хранят в холодильном шкафу. .

Тонкослойные хроматограммы веществ, меченных тритием, экспонируют обычно более одной недели, в то время как соединения, содержащие Р32 и I131, дают хорошие радиоавтографы часто за ЗОлшн и в большинстве случаев менее чем за 6 час.

Часто необходимо обнаружить на хроматограммах соединения, содержащие различные радиоизотопы, а также дважды меченные вещества [5, 27]. Это легко осуществить методом радиоавтографии, если два изотопных элемента значительно отличаются по периоду полураспада или по жесткости P-из л учения.

Хроматограмма, содержащая соединения, меченные С14 и S36, приводится в соприкосновение с рентгеновской пленкой сразу же и несколько месяцев спустя. Первый радиоавтограф обнаруживает почернение, вызванное излучением обоих изотопов, а второй радиоавтограф имеет только пятна, вызванные радиоактивным углеродом, поскольку изотоп серы полностью распался. Как правило, второй радиоавтограф следует снимать по прошествии 5—10- кратного времени полураспада короткоживущего изотопа.

Метод, основанный на использовании различия в энергии излучения, можно пояснить классическим примером, заимствованным из работы Бенсона и Кальвина [5]. На бумажную хроматограмму, содержащую вещества,

меченные С14 и Р32, помещают две рентгеновские пленки одна на другую. После проявления пленка, соприкасавшаяся с хроматограммой, обнаруживает почернение, вызванное С14 и Р32. Поскольку p-излучение радиоуглерода обладает слабой энергией и не проникает через первую пленку, на второй ] пленке видны пятна, которые следует отнести к жесткому излучению радиофосфора.

Аналогичным образом можно обнаружить I131 одновременно с S35 или С14 [27, 28, 63, 65]. Алюминиевая фольга толщиной <0,1 .о экранирует мягкое излучение радиоактивной серы и углерода, в то время как излучение радиойода с большой энергией легко проходит через тонкие слои алюминия. Радиоавтографы хроматограмм на бумаге и хроматограмм в тонких слоях могут быть количественно промерены фотоденситометрически или по величине пятна. Возможности этого метода анализа будут нами рассмотрены ниже.

Здесь следует указать, что нерадиоактивные соединения могут быть обнаружены на хроматограмме радиоавтографически после нейтронной актива-, ции или в виде меченых производных. Эти опыты подробнее рассмотрены в разделе «Анализ с применением радиоизотопов».

СЧЕТНЫЕ ТРУБКИ И СЦИНТИЛЛЯЦИОННЫЕ СЧЕТЧИКИ

Устройства для количественной оценки хроматограмм на бумаге радиоактивных веществ счетными трубками Гейгера — Мюллера, пропорциональными проточными счетчиками и сцинтилляционными счетчиками описаны неоднократно. В продаже имеются приборы для обнаружения радиоактивного излучения с приспособлением для автоматического перемещения

Рис. 43. Разделение методом ХТС двух тритированных по Вильцбаху стероидов [51]. Сорбент силикагель Г (толщина слоя 0,9 мм); растворитель циклогексан — этилацетат (60 + 40); время анализа 40 ^мин; проба — 8 мг реакционной смеси. Распределение активности измерялось непосредственно на пластинке с помощью, специальной счетной трубки. Зоны, содержащие активность, соскабливали и экстрагировали.

бумажных полос или 2-мерных хроматограмм и для регистрации результатов измерения. Почиари и Росси [42] в обзорной статье описали наиболее известные из этих приборов. Менее подробное рассмотрение можно найти в различных учебниках [19, 26, 49].

Соответствующие приборы для применения в ХТС еще не известны, хотя уже многие исследовательские группы занимаются вопросом прямого количественного расчета радиохроматограмм в тонких слоях.

Шульце и Венцель [51] сконструировали счетную трубку для измерения активности соединений, меченных тритием, на пластинках для ХТС. На рис. 43 показана кривая, зарегистрированная этим прибором.

Количественное определение по таким кривым недостаточно точно. В настоящее время чаще предпочитают экстрагировать радиоактивные вещества с сорбента и затем уже измерять активность обычными счетчиками. Если разные фракции содержат различные количества носителя (что, как правило, имеет место при биологических исследованиях), то обязательно следует проводить измерения жидкостным сцинтилляционным счетчиком, чтобы исключить самопоглощение.

Некоторые растворы, применяемые в сцинтилляционных счетчиках, пригодны, согласно Снайдеру и Стефенсу [53], в качестве растворителей. Это облегчает количественный промер радиохроматограмм в тонких слоях. Два часто применяемых «коктейля» имеют следующий состав:

5 г 2,5-дифенил оксазола («РРО») в качестве первичного светящегося вещества и 0,3 г-диметил- 1,4-бис [2(5-фенилоксааол)бензола] («диметил-РОРОР») в качестве вторичного светящегося вещества, растворенные в 1 л толуола;

104 г нафталина, 6,5 г РРО и 0,130 г РОРОР, растворенные в смеси 5 мл толуола, 500 мл диоксана и 300 мл метанола..

Чтобы избежать образования осадка в сцинтилляционном растворе, измерение проводят при +10°.

Согласно Снайдеру и Стефенсу [53], активность меченых соединений можно определить и без предварительного элюирования с силикагеля Г. Соскабливают адсорбированные радиоактивные вещества с силикагелем Г с пластинки и промеряют суспензию, для получения которой адсорбент энергично встряхивают с гелем, полученным в результате гомогенизации 4% «кабосила» с указанным выше раствором а) [раствор в)]. Благодаря этому активность желатиноподобного препарата измеряется в сцинтилляционном счетчике с большей эффективностью счета. Количество силикагеля до 100 лг (соответствующее примерно 10 ел2 разделительного слоя) на 15 лл сцинтилляционного геля в случае веществ, меченных С14, не обнаруживает само поглощения..

5 г РРО, 0,3 г диметил-РОРОР и 40 г кабосила, растворенные в 1 л толуола.

Разработанный Снайдером и Стефенсом метод, по мнению автора, превосходит другие радиометрические методы определения.

Непосредственное определение активности на разделительных слоях вследствие сильного самопоглощения излучения, а также вследствие «мягкости» подкладки (стекло) нечувствительно и непригодно в качестве количественного метода.

Степень элюирования каждый раз неопределенна.

Количественные измерения радиоавтографов на фотоденситометре занимают много времени. Вещества, присутствующие в небольших количествах, трудно определить на радиоавтографах наряду с главными компонентами анализируемой смеси, поскольку излучение основных компонентов приводит к переэкспонированию материала пленки, прежде чем удается обнаружить излучёние побочных продуктов. Фотоденситометрический или планиметрический промер радиоавтографов совершенно непригоден, если разные радиоактивные фракции разбавлены различными количествами носителя.

ПОЛУЧЕНИЕ ВЕЩЕСТВ, МЕЧЕННЫХ РАДИОИЗОТОПАМИ

Используя химические синтезы, удается пометить молекулы соединений в одном или нескольких местах. Прописи для получения радиоактивных органических веществ можно найти во многих руководствах [2, 14, 66], в первую очередь в монографии Меррея и Вильямса [41]..

Неспецифически, или «равномерно», меченные вещества получаются при биологическом синтезе [2, 14, 74]. Для получения углеводов, меченных С14, экспонируют, например, листья растения Саппа indica на 10—20 час для ассимиляции радиоактивного углекислого газа [2, 14]. Аналогичным фотосинтезом можно получить «горячий» крахмал из листьев табака [14, 34]. Радиоактивные пептиды или аминокислоты, получают из дрожжей Torula utilis [25], но чаще Из водорослей, например Chlorella vulgaris [33] или Chlorella pyrenoidosa [46], которые в течение многих дней ассимилировали радиоактивный углекислый газ. В питательной среде, обедненной азотом, последний вид водоросли вырабатывает прежде всего липиды; поэтому этот организм представляет собой превосходный объект для получения радиоактивных жиров и жирных кислот [36]. Грибковая плесень Phycomyces blakesleeanus также применяется для получения жирных кислот, меченных С14 [8]. «Горячие» нуклеиновые кислоты, нуклеотиды и нуклеозиды получают из Torula utilis [25]. Соя также пригодна для биосинтеза моченых природных веществ [15].

Многие специфические меченые соединения имеются в продаже. В продаже имеются также радиоактивные дрожжи и водоросли, а также протеиновые гидролизаты и экстракты сахаридов и липидов из этих организмов. Брошюра, изданная международной Комиссией по атомйой энергии, содержит список имеющихся в продаже препаратов, их удельные активности, а также адреса изготовителей [25]. ■

Продажные радиоактивные препараты часто бывают весьма загрязнены и могут быть использованы для химических и биохимических исследований только после тщательной очистки<

Часто классические методы очистки сырых продуктов синтеза являются неудовлетворительными, если их приходится применять к небольшим количествам радиоактивных препаратов. В связи с этим следует указать на предложенный Рапортом и Лернером [43] критерий эффективности фракционной кристаллизации: перекристаллизацию загрязненного соединения, часто приводящую к большим потерям, обычно проводят до тех пор, пока некоторые физические константы основной фракции не перестанут измеряться. Указанные авторы рекомендуют проводить фракционную кристаллизацию так, чтобы только 1—5% вещества оставалось в маточном растворе. Путем сравнения результатов анализа остатка с результатами анализа основной фракции получают более полное представление в отношении успеха операции очистки по сравнению с до сих пор использованными критериями. 1

ХТС особенно пригодна для очистки радиоактивных соединений. Это препаративное использование метода будет более подробно описано в специальном разделе.

Вильцбах [69] предложил изящный метод метки тритием органических соединений. Вещество вместе с газообразным тритием запаивают в стеклянный сосуд и оставляют на много дней и даже недель. При этом часть атомов Н молекулы, подлежащей метке, замещаются атомами Н3. Одновременно, однако, всегда протекают побочные химические реакции. Ненасыщенные соединения частично или полностью гидрируются. Метод Вильцбаха подробно описан в недавно вышедшей монографии [50]. Многие фирмы производят меченые вещества этим способом [25].

Затруднения при осуществлении метода Вильцбаха состоят в выделении тритированных веществ, а также в очистке их от соединений, возникающих в результате распада при длительном радиолизе. Шульце и Венцель [51] указали, что для этих задач можно с успехом использовать хроматографию в тонких слоях. Примеры очистки соединений, меченных тритием, приведены в следующем разделе (см. также рис. 43). - '

ВЫДЕЛЕНИЕ РАДИОАКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ МЕТОДОМ ХТС

В большинстве случаев для радиохимических исследований необходимо лишь несколько миллиграмм меченого соединения. Такие небольшие количества легко выделить методом ХТС. Мангольд, Камерек и Малина [39] использовали ХТС для анализа и очистки липидов, меченных С14, Н3 и I131. На рис. 44 показан радиоавтограф тонкослойной хроматограммы имеющихся в продаже различных жирных кислот, меченных в карбоксильной группе.

Каждый такой препарат содержит большое число примесей. Удивительно, что большинство этих соединений — промежуточных продуктов синтеза — сильно полярны. Это облегчает выделение чистых кислот методом хроматографии в тонких слоях.

Подходящий растворитель для элюирования разделенных хроматографически радиоактивных соединений находят, проводя хроматографический анализ рассматриваемых соединений в различных полярных растворителях. Растворитель, уносящий соединение в зону фронта, пригоден для выщелачивания, сорбент соскабливают с пластинки и элюируют не менее чем тремя порциями растворителя. Прозрачные растворы по мере надобности декантируют и фильтруют через небольшой стеклянный фильтр. Применение фильтровальной бумаги в большинстве случаев приводит к потерям.

В качестве примера опишем здесь очистку стеариновой кислоты, меченной тритием. Этот продажный препарат содержит не менее 7 примесей [39].

мг стеариновой кислоты-9,10-Н3 нанесли в виде ряда точек на пластинку 20 X 20 см, покрытую слоем силикагеля, и хроматографировали смесью петролейного эфира (60—70°), диэтилового эфира и ледяной уксусной кислоты (80 + 20 + 1) в течение часа. Разделенные вещества перевели в видимую форму действием паров иода. После этого радиоактивную стеариновую кислоту вместе с сорбентом соскребли с пластинки и элюировали тремя порциями по 10 мл смеси диэтилового эфира, метанола и ледяной уксусной кислоты (80 + 20 + 1). Объединенные элюаты профильтровали и упарили. Выход 2 мг (45%).

Если очищаемые вещества загрязнены соединениями с весьма близкой полярностью, от которых они плохо отделяются, то для их отделения с успехом можно использовать ХТС соответствующих производных. Кислоты, например, можно очистить в виде метиловых эфиров, а спирты и амины — в виде ацетилпроизводных. Такие производные также легче элюируются, чем исходные полярные продукты.

На рис. 45 приведены фотоденситометрические кривые радиоавтографа тонкослойной хроматограммы трипальмитина, меченного С14, до и после очистки [39]. ч

В этих опытах установлено, что для хроматографического разделения веществ, содержащих сложнезфирные группы, выгодно использовать сорбционные слои, дезактивированные в результате экспозиции на воздухе в течение не менее одного дня. Свежий и высокоактивный силикагель в процессе хроматографического разделения эфирных соединений гидролизуется менее чем на 2%.

мг трипальмитин а- 1-С+ были разделены в течение одного часа на пластинке размером 20 X 20 см, покрытой слоем силикагеля Г, с помощью смеси, состоявшей из петролейного эфира (т. кип. 60—70°), диэтилового эфира и ледяной уксусной кислоты (90+ 10+ 1). Триглицерид локализовали радиоавтографически, затем элюировали тремя порциями по 10 мл смеси диэтилового эфира и метанола (90 + 10), и элюаты профильтровали через небольшой стеклянный фильтр. Фильтрат затем упарили до небольшого объема и дважды хроматографировали. Выход 3,8 мг (48%).

Если необходимо очистить количество в несколько грамм, то выгоднее использовать колоночную хроматографию. На рйс. 46 показан радиоавтограф тонкослойной хроматограммы меченого триолеинд (глицерилтридииодо- 9, 10-1131-стеарат) до и после очистки методом колоночной хроматографии.

В числе других примесей продажный препарат содержит иодированные моно- и диолеины, соответствующие ацетильные соединения, а также иодированную олеиновую кислоту и немного метилолеата [61]. Этот продукт,

Рис. 44. Радиоавтография тонкослойной хроматограммы меченых жирных кислот. Сорбент силикагель Г. Растворитель петролейпый эфир (т. кип. 60—70°) — диэтиловый эфир — ледяная уксусная кислота (90 + 10 -|- 1); время анализа 40 мин, пленка фирмы «Eastman Kodak», а — лауриновая кислота-1-СДЦ б—миристиновая кислота-1-С11; в — пальмитиновая кпслота-1-С1т; г — стеариновая кислота-1-С14; д — олеиновая кислота -1-С14; с — линолевая кислота-1-Cl-i; ж — линоленовая кислота-1-СЫ.Рис. 44. Радиоавтография тонкослойной хроматограммы меченых жирных кислот. Сорбент силикагель Г. Растворитель петролейпый эфир (т. кип. 60—70°) — диэтиловый эфир — ледяная уксусная кислота (90 + 10 -|- 1); время анализа 40 мин, пленка фирмы «Eastman Kodak», а — лауриновая кислота-1-СДЦ б—миристиновая кислота-1-С11; в — пальмитиновая кпслота-1-С1т; г — стеариновая кислота-1-С14; д — олеиновая кислота -1-С14; с — линолевая кислота-1-Cl-i; ж — линоленовая кислота-1-СЫ.Рис. 45. Очистка радиоактивного трипальмитина методом ХТС [39]. Денси- тометрические кривые радиоавтографов тонкослойных хроматограмм продажного (— —) и очищенного () трипальмитина.Рис. 45. Очистка радиоактивного трипальмитина методом ХТС [39]. Денси- тометрические кривые радиоавтографов тонкослойных хроматограмм продажного (— —) и очищенного () трипальмитина.

Рис. 44. Радиоавтография тонкослойной хроматограммы меченых жирных кислот. Сорбент силикагель Г. Растворитель петролейпый эфир (т. кип. 60—70°) — диэтиловый эфир — ледяная уксусная кислота (90 + 10 -|- 1); время анализа 40 мин, пленка фирмы «Eastman Kodak», а — лауриновая кислота-1-СДЦ б—миристиновая кислота-1-С11; в — пальмитиновая кпслота-1-С1т; г — стеариновая кислота-1-С14; д — олеиновая кислота -1-С14; с — линолевая кислота-1-Cl-i; ж — линоленовая кислота-1-СЫ.

Рис. 44. Радиоавтография тонкослойной хроматограммы меченых жирных кислот. Сорбент силикагель Г. Растворитель петролейпый эфир (т. кип. 60—70°) — диэтиловый эфир — ледяная уксусная кислота (90 + 10 -|- 1); время анализа 40 мин, пленка фирмы «Eastman Kodak», а — лауриновая кислота-1-СДЦ б—миристиновая кислота-1-С11; в — пальмитиновая кпслота-1-С1т; г — стеариновая кислота-1-С14; д — олеиновая кислота -1-С14; с — линолевая кислота-1-Cl-i; ж — линоленовая кислота-1-СЫ.

Рис. 45. Очистка радиоактивного трипальмитина методом ХТС [39]. Денси- тометрические кривые радиоавтографов тонкослойных хроматограмм продажного (— —) и очищенного () трипальмитина.

Рис. 45. Очистка радиоактивного трипальмитина методом ХТС [39]. Денси- тометрические кривые радиоавтографов тонкослойных хроматограмм продажного (— —) и очищенного () трипальмитина.

так же как и растительное масло, меченное радиоиодом, используется в клинике для пробы на поглощение «жира».

На рис. 43 показано разделение на силикагеле Г меченных тритием- стероидов, осуществленное Шульце и Венцелем [51]. Авторы определяли

Р и с. 46. Радиоавтограф тонкослойной хроматограммыпродажного (я) и очищенного (б) «радиойодированноготриолеина» [61].

распределение активности специальной счетной трубкой прямо на пластинке, соскабливали затем зону, содержавшую активность, и элюировали отдельные вещества. Однородность веществ, очищенных методом ХТС, обязательно следует доказать другим методом. Вещества, выделенные методом адсорбционной ХТС, следует всегда анализировать методом распределительной ХТС, хроматографии на бумаге или газовой хроматографии.

АНАЛИЗ С ПРИМЕНЕНИЕМ РАДИОИЗОТОПОВ

/

В зависимости от способа применения радиоактивного вещества различают следующие радиохимические методы анализа [2, 10, 11, 26, 49]: индикаторный анализ,'

метод изотопного разбавления, активационный анализ и1■

метод радиоактивных реактивов...

Эти методы особенно часто используют в комбинации с хроматографией на бумаге; до настоящего времени известно лишь небольшое число примеров применения их в ХТС.

ИНДИКАТОРНЫЙ АНАЛИЗ

Этот метод пригоден для проверки четкости хроматографического разделения и часто использовался при хроматографии на бумаге (см. [63, 65]).

Туна, Камерек и Мангольд [62], применив индикаторный анализ, показали, что фракции природных липидов, разделенные методом ХТС, не загрязняют друг друга. Небольшие количества «горячего» трипальмитина были смешаны с жиром печени акулы и затем разделены методом адсорбционной' ХТС. Радиоавтограф хроматограммы показал, что вся радиоактивность находится во фракции триглицеридов. Весьма близкие по структуре к триглицеридам алкоксидиглицериды не были ими загрязнены (см. рис. 72, стр. 152).

МЕТОДЫ ИЗОТОПНОГО РАЗБАВЛЕНИЯ

Этот метод используется в особенности в биохимии для количественного анализа небольших количеств соединений, которые другими методами определяются очень неточно. Анализируемое вещество необходимо пометить и его активность должна быть известна. Взвешенное количество радиоактивного соединения смешивают с анализируемым веществом и затем выделяют определяемое вещество в чистом виде. Зная количество ^М^ и активность (А2) добавленного вещества и удельную активность (А3) выделенного соединения, можно рассчитать исходное количество анализируемого вещества по следующей формуле:

Добавленное количество радиоактивного вещества обычно настолько мало, что им можно пренебречь по сравнению с количеством вещеотва, находящимся в «холодной» форме. Это означает, что отношение активностей добавленного и выделенного веществ дает долю выделенного вещества, и, таким образом, можно легко рассчитать количество определяемо го вещества.

Метод изотопного разбавления пригоден для количественного определения веществ, выделяемых методом ХТС, лишь с небольшими выходами.

При обращенном методе изотопного разбавления радиоактивное анализируемое вещество разбавляется известным количеством определяемого «холодного» соединения." -

'3. АКТИВАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ■,

Некоторые элементы могут быть переведены в радиоактивные изотопы облучением нейтронами в реакторе, циклотроне или в генераторе ван де Граафа и затем обнаружены радиометрическими методами. Этим методом на бумажных хроматограммах были обнаружены в числе прочих фосфор

[59], сера [59] и хлорсодержащие [71] соединения. Для количественного определения следов какого-нибудь соединения известное количество этого соединения облучают на этой же хроматограмме.

Применение активационного анализа в ХТС еще не известно. Поскольку кальций и сера активируются нейтронами, применение гипса в качестве связующего для разделительных слоев исключено. Из этих же соображений вместо стеклянных пластинок следует применять пластмассовые.

МЕТОД РАДИОАКТИВНЫХ РЕАКТИВОВ .

Когда классические методы определения непригодны вследствие слишком малого количества анализируемого вещества или вследствие слишком малой концентрации определяемого вещества в смеси, можно выйти из затруднения, используя метод радиоактивных реактивов. Даже в случае неприменимости метода изотопного разбавления из-за того, что определяемые вещества нельзя получить в радиоактивной форме, можно воспользоваться методом радиоактивных реактивов.

Принцип метода радиоактивных реактивов состоит в том, что неактивный элемент, радикал или молекула взаимодействуют с радиоактивным реактивом и поэтому могут быть обнаружены и количественно определены радиометрическими методами в виде «горячих» соединений.

Анализ может быть осуществлен следующими способами. .

Фракционирование перед введением радиоактивной метки. Полученные при разделении неактивной анализируемой пробы фракции переводят радиоактивными реактивами в вещества, которые могут быть определены радиометрически. Например, аминокислоты на бумажных хроматограммах локализуют реакцией с иодистым метилом СН31131 [71] или ацетатом меди Сп64(СН3СОО)2 [68]. Применяют также бромистый метил СН3Вг82 [70]. Многие ненасыщенные соединения обнаруживают по реакции присоединения радио- иода [12]. '

Этот способ до настоящего времени не был использован дЛя ХТС.

Разделение радиоактивных производных. 1 виг или меньшее количество смеси соединений вначале обрабатывают радиоактивным реактивом и «горячие» производные затем подвергают фракционированию. В качестве радиоактивных реактивов для метки неактивных окси- и аминосоединений рекомендуется 3-хлоранизоилхлорид-3-С136 [54], 4-иодбензоилхлорид-1131 [57] и особенно ацетангидрид-1-С14 или -2-Н3 [3, 7, 24, 29, 38, 39, 67]. Методика ацетилирования стеринов и алифатических липидов приведена на стр. 77. Кислоты могут быть обработаны 4-хлоранилином-С136 [55] или диазометаном, меченным С14, C14H2N2 [4, 37, 39, 47, 48, 52, 58]; тритированный диазометан применять не следует [4, 32]. Методика этерифицирования высших жирных кислот радиоактивным диазометаном приведена на стр. 77.

Автором, [38] описана схема анализа радиоактивно меченных производных липидов методами ХТС, колоночной хроматографии и хроматографии на бумаге. Смеси жирных спиртов, моно- и диглицеридов и других ацетилируемых липидов обрабатывают радиоактивным ацетангидридом и ацетильные производные фракционируют на отдельные классы соединений методом адсорбционной хроматографии на пластинах или на колонках с силикагелем. Количественное соотношение классов ацетилированных липидов определяют, проводя радиометрию элюатов. Каждую такую группу соединений можно подвергнуть дальнейшему разделению на силиконизованной бумаге. Количественный промер хроматограммы на бумаге радиоактивных производных липидов осуществляют проточным пропорциональным счетчиком, снабженным приспособлениями для автоматического перемещения полос бумаги и регистрации результатов измерений.

Мангольд, Камерек и Малинз [39] анализировали подобным образом жирные кислоты, выделенные из касторового масла. Кислоты обрабатывают радиоактивным диазометаном. Адсорбционная ХТС была использована для отделения метиловых эфиров обычных жирных кислот от метиловых эфиров моноокси- и диоксикислот (рис. 47).

Три класса метиловых эфиров элюируют и, измеряя интенсивность их излучения, определяют количественные соотношения. Смесь эфиров неоки- сленных кислот повторно фракционируют методом хроматографии на бумаге с обращенной фазой, и количественно определяют состав путем регистрации радиоактивности полос бумаги в проточном пропорциональном счетчике. Соотношение моноокси- и диоксикислот лучше определять с помощью «горячих» ацетилированных кислот или эфиров. Небольшие количества жирных

Р и с. 47. Радиоавтограф тонкослойной хроматограммы метиловых-С14 эфиров из касторового масла [39].

Сорбентсиликатель Г; растворитель петролейный эфир (т. кип. 60—70°) — диэтиловый эфир — ледяная уксусная кислота (70+ 30 + 2); время анализа 40 мин; пленка фирмы «Eastman Kodak».

а — эфиры обычных жирных кислот; б — эфиры монооксикислот; в — эфиры диоксикислот.

диоксикислот можно пометить двумя радиоактивными ацетильными группа- мн на молекулу. Это означает удвоение удельной активности, благодаря чему можно достигнуть более точных результатов измерений.

Принципиально анализы такого рода могут быть осуществлены со всеми классами соединений, содержащими активные группы (см., например, [3, 29, 48, 67]).

Метиловые эфиры кислот и ацетильные производные спиртов и аминов являются менее полярными по сравнению с исходными анализируемыми веществами, поэтому их легче количественно элюировать с сорбента.

Фракционирование после добавления радиоактивного производного к смеси немеченых производных. Анализируемое вещество обрабатывают нерадиоактивным реактивом и к смеси производных добавляют небольшое количество меченого производного определяемого соединения. Количество этого вещества в исходном материале можно рассчитать после выделения и определения активности смеси неактивного и активного производного, используя уравнение, выведенное для метода изотопного разбавления (стр. 74) [48, 54, 55].

Этот способ до настоящего времени не был использован в сочетании с ХТС.

Разделение после добавления неактивного производного к смеси меченых определяемых соединений. Этот метод представляет собой обращение метода изотопного разбавления. Производное определяемого вещества выделяется радиохимически чистым, из его активности и активности добавленного производного можно рассчитать концентрацию неизвестного вещества в нс-

ходной пробе. Этот метод был разработан уже в 1946 г. [27] и оказался весьма подходящим для анализа протеиновых гидролизатов [60].-

Применение с использованием в качестве метода разделения ХТС пока не описано.

Применение двух радиоактивных изотопов. Анализируемый материал обрабатывают радиоактивным реактивом. К продуктам реакции добавляют затем определяемое вещество в виде соединения, химически идентичного производному, находящемуся в смеси, но меченного другим изотопом. После фракционирования смеси по результатам независимых измерений интенсивности излучения обоих радиоактивных изотопов в одной фракции и измерения суммарной радиоактивности этой фракции рассчитывают эффективность разделения и первоначально имевшееся количество определяемого вещества. Этот способ был разработан для анализа протеиновых гидролизатов. В качестве радиоактивных реактивов использовались меченный I131 иодфенилсуль- фонилхлорид и меченный S35 n-иодфенилсульфонилхлорид (I131 и 835-пипсил- хлорид) [27, 28, 63—6 4], а также меченный Н3 и С14 ацетангидрид [3, 67].

Вероятно, и этот аналитический прием можно с успехом комбинировать с разделительным методом хроматографии в тонких слоях.

VI. СПОСОБЫ ВВЕДЕНИЯ РАДИОАКТИВНОЙ МЕТКИ

Приводимые прописи пригодны для введения радиоактивной метки в небольшие количества неактивных кислот и спиртов с помощью «горячего» этерифицирования. Кислоты обрабатывают радиоактивным диазометаном, а спирты — радиоактивным ацетангидридом.

ЭТЕРИФИЦИРОВАНИЕ КИСЛОТ ДИАЗОМЕТАНОМ CMH2N2

Радиоактивный диазометан может быть получен из нитрозометил-С14- мочевины [52]. Чаще, однако, используют более устойчивый п-толилсульфо- нилметил-С14-нитрозамид [4, 37, 58] (радиоактивный «диазалд»). Пропись получения этого соединения из метил-С14-амина приведена СтоллОм с сотрудниками [58] (см. также [9]). Радиоактивный диазалд имеется в продаже .

Для получения и перегонки радиоактивного диазометана используют реакционный сосуд с припаянным боковым отростком [47] или газовый микрогенератор [45].

Методика работы

Раствор 10 мг (0,05 ммоля^ га-толилсульфонилметил-С14-нитрозамида удельной активностью около 0,6 мкюриЧммолъ в 2 мл диэтилового эфира обрабатывают 2 мл охлажденного до 0° раствора 0,1 г гидроокиси натрия и смеси этанола с водой (10+1) и нагревают на водяной бане при 60—70° в токе азота. Перегнанный диазометан улавливают в две последовательно соединенные ловушки, содержащие каждая 1-2 мл охлажденного льдом диэтилового эфира. Оба эфирных раствора диазометана объединяют и сразу же используют для этерификации жирных кислот в смеси диэтилового эфира и метанола (9 + 1) [39, 47, 58].

Диазометан лепр образует полиэтилен и соединения еще неизвестного строения [40]. Чистые метиловые эфиры можно отделить от этих побочных продуктов методом адсорбционной ХТС [62].

В некоторых случаях предпочитают количественно восстанавливать кислоты или эфиры до спиртов с литийалюминийгидридом, а спирты затем метить ацетангидридом. -

АЦЕТИЛИРОВАНИЕ СПИРТОВ АЦЕТАНГИДРИДОМ, (СМН3СО)2О ИЛИ (СЩСО)2О'

Реакцию ацетилирования особенно легко осуществить. Ацетангидрид, меченный С14 или Н3, поставляется рядом фирм [25].

Методика работы"

10—20 лег липидов, содержащих амино- или спиртовые группы, запаивают с 20%-ным избытком раствора ацетангидрида-1-С14 удельной активностью 0,6 мкюри/ммоль в пиридине (1 + 10) в стеклянной трубочке 5/150 мм. Эту трубочку нагревают на водяной бане 30—60 мин при 100°. После охлаждения трубочку вскрывают и разбавляют реакционную смесь 10 мл 1 н. серной кислоты. Ацетилированные липиды промывают до нейтральной реакции несколькими порциями диэтилового эфира и Сушат над безводным сульфатом натрия [7, 24, 38].

Соединения, содержащие эфирные группы, например моно- и диглицериды, подвержены в небольшой мере ацетолизу, и поэтому описанный метод ацетилирования в случае таких соединений следует применять с осторожностью. Реакция с радиоактивным кетеном может дать более чистые продукты ацетилирования [1].'.

Прибор для мягкого ацетилирования аминокислот описан Уайтхедом [67]..

VII. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ХТС В ХИМИЧЕСКИХ И БИОХИМИЧЕСКИХИССЛЕДОВАНИЯХ С ПРИМЕНЕНИЕМ РАДИОИЗОТОПОВ

Махадеван и Лундберг [35] использовали радиоавтографию хроматограмм в тонких слоях для установления чистоты синтетически полученных холе- стерилолеатов-С14. Другие примеры применения ХТС в синтетических работах с радиоизотопами уже упоминались [39, 51].

Во многих лабораториях при биогенетических исследованиях с радиоактивным углеродом применяют ХТС. Гризбах с сотрудниками [20—22] исследовали образование изофлавонов в различных растениях с помощью радиоактивно меченных исходных веществ. Они использовали хроматографию на бумаге и двумерную ХТС для разделения и обнаружения методом радиоавтографии изофлавона, биоханина А и формононетина, а также промежуточных продуктов. Кратцл и Пушман [30] впрыснули кониферин-З-С14 в ветви березы и выделили методом ХТС два радиоактивных продукта, которые образовались в растении в результате метоксилирования. Кратцл [31] описал применение радиоавтографии хроматограмм в тонких слоях в обзорной работе по биогенезу лигнина. .

Фулько и Мид [18] применяли ХТС при исследовании образования оксикислот в мозгу крысы. Штейн и Штейн [56] исследовали этим же методом внедрение радиоактивных жирных кислот в кожное сало крысы. В этой связи следует отметить две недавно появившиеся публикации Допешваркара и Мида, рассмотренные в главе «Алифатические липиды».

Винтерштейн, Штудер и Рузгг [72] выделили пз природных веществ ряд каротиноидных альдегидов. В некоторых случаях удалось получить однородные каротиноидные фракции, используя только ХТС в микропрепаративном масштабе. В обзорной работе Винтерштейн [73] подчеркнул, что только благодаря существенному улучшению методики, в особенности благодаря использованию ХТС по Шталю и применению радиоактивных производных, могли быть достигнуты эти новые успехи.

ЛИТЕРАТУРА

Alderhout J. J. Н., К о с h G. К., Aten А. Н. W., jr., Rec. trav. chim., 76, 7/2 (1957).

Aranoff S., Techniques 'of Radiobiochemistry, Ames, The Iowa State University Press 1956

A v i v i P., S i m p s о n S. A., Tait J. F., W h i t e h e a d J. K., 2nd Radioisotope Conference, Vol. I, p. 313, London, Butterworth’s Scientific Publications, 1954.1■

Baumgartner W. E., Lazer L. S., Da 1 zie 1 A. M., Cardinal E. V., Varner E. L., J. Agr. Food Chem., 7, 422 (1959).

В e n s о n A. A., Calvin M., Cold Spring Harbor Symposia Quant. Biol., 13, 6 (1948).

В ens о n A. A., Bassham J. A., Calvin M., Goodale T. C., Haas V. A., Stepka W., J. Am. Chem. Soc., 72, 1710 (1950).

Berliner D. L., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 94, 126 (1957).

Bernhard K., R о th 1 in M., Vuilleumier J. P., Wyss R., Helv. Chim. Acta, 41, 1017 (1958).

В о e r T h. J. de, Backer H. J., Org, Syntheses, 34, 96 (1954).

Bro da E., Schonfeld T., in Handbuch der mikrochemischen Methoden Band II, S. 130, herausgegeben von F. Hecht und M. K. Z a c h e r 1, Wien, Springer-Verlag, 1955.

В г о d a E., Schonfeld T., Die technischen Anwendungen der Radioaktivi- tat, Berlin, VEB-Verlag Technik; Munchen, Porta-Verlag, 1957.

Budzynski A. Z., Zubrzycki Z. J., Campbell I. G., Nature, 182, 178 (1958)..

Calvin M., Nobel-Verlag, 1961, s. Angew. Chem., 74, 165 (1962).

Calvin M., Heidelberger Ch., Reid J. С., T о 1 bert В. M., Y a n k- w i c h P. E., Isotopic Carbon, New York, John Wiley and Sons, Inc.: London, Chapman and Hall, Ltd., 1949.

C h о rn e у W., Scully N. J., Mason L. H., Dutton H. J., готовится

к печати.

Fink R. M., Dent С. E., Fink, K., Nature, 160, 801 (1947).

F i n s t о n H. L., Miskel J., Ann. Rev. Nuclear ScL, 5, 269 (1955).

Fulco A. J., Mead J. F., J. Biol. Chem., 236, 2416 (1961).

Glasstone S., Sourcebook on Atomic Energy, 2nd ed., Princeton — Toronto — London — New York, D. van Nostrand Company, Inc., 1958.

Grisebach H., Doerr N., Z. Naturforsch., 15b, 284 (1960).

Grisebach H., Patschke L., Chem. Ber., 93, 2326 (1960).

Grisebach H., Brandner G., Z. Naturforsch., 16b, 2 (1961).

H e r z R. H., Nucleonics, 9, 24 (1951). •

H о 1 1 a n d e г V. P., V i n e с о u r J., Anal. Chem., 30, 1429 (1958).

International Directory of Radioisotopes, Vol. I and II/ The International Atomic Energy Agency, Wien, 1959.

К a m e n M. D., Isotopic Tracers in Biology, 3rd ed., New York, Academic Press Inc., Publishers, 1957.

К e s t о n A. S., Udenfriend S., C a n n an R. K., J. Am. Chem. Soc., 68, 1390 (1946).'

К e s t о n A. S., L e v у M., J. Am. Chem. Soc., 72, 748 (1950).

К liman B., Peterson R. E., J. Biol., 235, 1639 (I960).

Kratzl K., Puschmann G., Holzforschung, 14, 1 (1960).

Kratzl K., Holz, Roh- und Werkstoff, 19, 219 (1961).,

L e i t c h L., G a g n о n P. E., C a m b г о n A., Can. J. Research, 28B, 256 (1950).

Liebster J., DobiaSova M., Kopoldova J., Eki J., Collection Czechoslov. Chem. Commun., 26, 1700 (1961).

Livingstone L. G., Medes G., J. Gen. Physiol., 31, 75 (1947).

Mahadevan V., Lundberg W. O., J. Lipid Res., 3, 106 (1962).

Mangold H. K., Schlen k H., J. Biol. Chem., 229, 731 (1957).'

Mangold H. K., Geller man J. L., Schlenk H., Federation Proc., 17, 268 (1958)..

M a n g о 1 d H. K., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 61, 877 (1959).

Mangold H. K., Kammereck R., Malins D. C., Microchem. J., Sympo- . sium, Vol. II (im Druck).

Morrison W. R., Lawrie T. D, V., Blades J., Chem. and Ind., 1961, 1534.

Murray A. Ill, Williams D. L., Organic Sytheses with Isotopes, Vols. I and II, New York — London, Interscience Publishers, Inc., 1958.

Pocchiari F., Rossi C., J. Chromatog., 5, 377 (1961).

R a p p о r t M. M., Lerner B., J. Biol. Chem., 232, 63 (1958).

44. R о c h e J.,Lissitzky S., M i c h e 1 R., in Chromatographie en chimie orga- nique et biologique, Vol. I,.p. 321, sous la direction de E. Lederer, Paris, Masson et Cie Editeurs, 1959.

45.

46.

47.

48.

Roper R., Ma T. S., Microchem. J., 1, 245 (1957).

Schieler L., M с С 1 u r e L. E., Dunn M. S., J. Biol. Chem., 203, 1039 (1953).

Schlenk H., G e 11 e r m a n J. L., Anal. Chem., 32, 1412 (1960).

Schlenk rissette 547 (1960).

H., Ge 11 er man J. L., Anal. Chem., 32, 1412 (I960).

H., Mangold H. K., G e 11 e r m a n J. L., L i n к W. E., M о rR. A., Holman R. T., Hayes H., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 37,

49. S с h m е i s

er K., Radioaktive Isotope, ihre Herstellung und Anwendung, Berlin — Gottingen — Heidelberg, Springer-Verlag, 1957.

50. S c h u 1 z e E., Wenzel M., Tritium-Markierung. Herstellung, Messung und Anwendung nach Wilzbach 3H-markierter Verbindungen, Berlin, Walter de Gruyter Verlag, 1962.

51. Schulze E., Wenzel M., частное сообщение, 1961.

С м и p н о в Б. П., Попова P. А., Нисканен P. А., Биохим., 25, 368 (1960).

Snyder F., Stephens N., Oak Ridge Institute of Nuclear Studies Report Nr. (1962), Anal. Biochem., в печати.

sen P., Anal. Chem., 27, 388 (1955).

" Anal. Chem., 28, 1318 (1956).■

in O., Biochim. et Biophys. Acta, 51, 555 (1961).

Hickey F. C., Fish W. A., J. Am. Chem. Soc., 76, 5174

41

54. S

55. S

56. S

57. S

о о t t

r r e о

e n e n i n к e

(1954).

58. Stoll

sen P.,

Y., Ste

s W. M.,

A., Rut

s c h m a n n

Acta, 39, 993 (1956).

S t r i с к land E. H., Bens

Thompson E. О. P., Th о scher Naturstoffe, Band XII, S.

J., Wartburg A. v., R e n 4 J., Helv. Chim.

on A. A., Arch. Biochem. Biophys., 88, 344 (I960), m p s о n A. R., in Fortschritte der Chemie organi- 297, herausgegeben von L. Zechmeister. Wien,

Springer-Verlag, 1955.■

~N., Mangold H. К., M о s s e r D., Lancet, в печати.

" Kammereck R., Mangold H. К., неопубликованные данные.

’ S., J. Biol. Chem., 187, 65 (1950).

61. Tun

62. Tun

63. Ude

64. Ude

65. Ude

a a n n n

N., f r i f r i

e e

n d

n d

S., Velick S. F.

187, 65 (1950).

J. Biol. Chem., 190, 733 (1951).

... _ friend S., Clark T. C., Titus E., Experientia, 8, 379 (1952),

66. W e у g a n d F., Simon H., in Methoden Дет organischen Chemie, Band 1V/2, S. 539, herausgegeben von E. M ii 11 e r, 4. Aufl. Stuttgart, Georg Thieme Verlag, 1955.

67.

68.

Whitehead J. K., Biochem. J., 68, 662 (1958).

Wieland T., Schmeiser K., Fischer E., Maier-Leibnitz H.,

69.

70.

71.

Naturwiss., 36, 280 (1949).

7/11. Lach К. E., J. Am. Chem. Soc., 79, 1013 (1957).'

— ••’ m F. P. W., J. Chem. Soc., Suppl., 1949, 416.

m F. P. W., Harrison A., Bridges R, G., Analyst, 77,

W i 1 z b a

Winter Winter 19 (1952).

i n i n

g h a

g h a

72. Winter

73. Winter

s t s t

e e

i n

i n

A., Studer A., Riiegg R., Chem. Ber., 93, 2951 (1960).

, Angew. Chem., 72, 902 (1960).

74. Woodruff N. H., Fowler E. E., Nucleonics, 7, 26 (1950).

A

ГЛАВА 8

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ХРОМАТОГРАФИИВ ТОНКИХ СЛОЯХ '

М* Бреннер, А. Нидервизер, Г. Патаки и Р. Вебер

Во всех хроматографических процессах разделения основной принцип один и тот же. Подвижная фаза движется сквозь неподвижную фазу, и при этом разделяемые компоненты перемещаются с различной скоростью в направлении движения потока. В зависимости от метода рабрты различают элю- ционную хроматографию, вытеснительную хроматографию и фронтальный анализ [1]. . .

Хроматография в тонких слоях в обычной форме ее осуществления принадлежит к первому из рассматриваемых в этой главе вариантов. В идеальном случае ее можно описать следующим образом: в процессе разделения неизменное количество данного вещества под действием потока подвижной фазы движется независимо от сопутствующих веществ вдоль неподвижной фазы. В процессе этого движения вещество непрерывно распределяется между двумя фазами. Между попаданием молекулы в подвижную фазу и последующим выходом из нее протекает некоторое время. Сумма этих интервалов времени составляет определенную долю времени хроматографического процесса, которую мы обозначим как время пребывания этой молекулы в подвижной фазе. Определенное таким образом время пребывания колеблется для одинаковых молекул около некоторого среднего значения, которое определяется их физическими свойствами и условиями опыта. Перемещение вперед с потоком наступает только тогда, когда молекула находится в потоке, и поэтому это происходит скачкообразно. Скорость в направлении потока также колеблется около некоторого.среднего значения, которое одинаково для всех частиц и соответствует скорости перемещения растворителя.

Различные скорости перемещения веществ обусловлены только различием во времени пребывания. Путем умножения средней скорости на среднее время пребывания получают различные отрезки пути, которые отдельные вещества проходят во время хроматографического процесса. Таким образом, речь идет о средних значениях; колебание около средних значений является результатом наложения колебаний скоростей продольного перемещения молекул и колебаний во времени пребывания.

Отсюда следует, что не все молекулы вещества S пройдут в направлении Потока одинаковый путь. Их совокупность образует на хроматограмме зону (которая называется также полосой) с максимальной концентрацией вещества в середине зоны или, при осложнениях *, зону с несимметричным распределением вещества. Если имеется также возможность расширения в направлении, перпендикулярном потоку (хроматография на бумаге или хроматография в тонких слоях), то в результате дополнительной поперечной диффузии зоны превращаются в «пятна». Возможность поперечной диффузии проявляется тем отчетливее, чем более длительное время осуществляется хро-

■ * Например: зависимость сродства вещества к неподвижной фазе от концентрации, перегрузка хроматограммы, неисправность в конструкции или работе хроматографического устройства. .

6 Заказ № 734 '

матографический процесс: зоны или пятна с увеличением времени опыта становятся более диффузными. Расширение наступает также в том случае, когда отношение количества вещества к количеству неподвижной фазы невелико. Оно качественно не зависит от емкости неподвижной фазы .

Физико-математическое рассмотрение этих процессов приводит в зависимости от подхода к различным общим теориям хроматографии, которые, хотя имеют различную форму, родственны друг другу и в своей основе применимы к любому хроматографическому методу, следовательно, и к хроматографии в тонких слоях. В разделе I мы даем краткое изложение способа рассмотрения, основанного на наглядной модели хроматографического процесса. Несмотря на наглядность в нем отсутствуют априорные положения (например, теоретические тарелки); этот способ в той мере, в какой адсорбционные и распределительные явления не зависят от концентрации, нашел безупречное математическое выражение. Мы увидим ниже, какое распределение вещества имеет место в движущейся зоне, каким образом скорость движения или значения Rj зависят от коэффициентов распределения или адсорбции и почему происходит деформация зоны.

В разделе II будет рассмотрена эмпирически найденная зависимость между хроматографическим поведением (значение Ду) и химическим строением. Задачей данного исследования является рациональное описание этой зависимости, которая в принципе может служить (сравнение величин Ду) для решения вопросов строения вещества. Установление теоретической зависимости между химическим строением и коэффициентом распределения, значение которого обычно позволяет предсказать хроматографическое поведение, является задачей, которая еще ждет своего разрешения и здесь не может быть обсуждена более подробно.

В разделе III мы подробно рассмотрим особенности хроматографии в тонких слоях.

ОБЩАЯ ТЕОРИЯ ХРОМАТОГРАФИИ

Хроматография является непрерывным процессом. Для теоретического рассмотрения его обычно разбивают на ряд периодических, следующих друг за другом единичных процессов.

Рис. 48. Противоточное распределение (Крег) на 201 пробирке при различных коэффициентах распределения и отношении фаз, равном 1.

со — исходная концентрация в пробирке № 1; сг — концентрация в пробирке № г через200 ступеней распределения (биномиальное распределение). (Из книги LinskensH. F.,Papierchromatographle in der Botanlk, S. 4, Berlin, 1959.)

По-видимому, особенно наглядна картина, предложенная Мартином и Синджем, которые мысленно разделили хроматографическую колонку на отрезки, так называемые теоретические тарелки, и затем описали получение хроматограммы как биномиальное распределение [3]. Аналогия в отношении противоточного распределения Крега [4] кажется полной. Она наблюдается до того момента, когда при дальнейшей обработке следует сделать предельный переход от биномиального распределения к распределению Пуассона. Читатель, не подготовленный в области физико-математических наук, понимает этот результат только в той мере, что при этом возникают зоны веществ, которые перемещаются. Распределение вещества внутри

765 д.321765 д.321О ДО 80120160200О ДО 80120160200К—'/зК—'/зНомер торелки, ГНомер торелки, Г

7

6

5 д

.3

2

1

7

6

5 д

.3

2

1

О ДО 80120160200

О ДО 80120160200

К—'/з

К—'/з

Номер торелки, Г

Номер торелки, Г

Рис. 49. Непрерывное распределение (Мартин — Синдж) на 201 «теоретической тарелке»при различных коэффициентах распределения и отношении фаз, равном 1. (из книгиLinskens Н. Г., Papierchromatographie in der Botanik, 8. 4, Berlin, 1959.)co— исходная концентрация на тарелке М Ь; сг— концентрация на тарелке № г принахождении фронта растворителя на тарелке М 201; ср. формулу (9) при р = К/(1 ++ К) и п = 201 (распределение Пуассона).

зоны получается, однйко, совсем иным, чем в приборе Крега. Это видно сразу при сравнении рис. 48 и 49. Согласно другим авторам [5—17], проявление хроматограммы может быть описано чисто математически.

Авторы этого раздела считают, что для исследователей-практиков хроматографическое разделение следует продемонстрировать на модели, в основе которой лежит непрерывный процесс. В этом смысле данные рассуждения примыкают к соображениям, развитым Сигнером в Институте органической химии Бернского университета, где построен лабораторный прибор для непрерывного многократного распределения веществ между двумя несмеши- вающимися жидкостями [18].

ПЕРВЫЙ ОСНОВНОЙ ОПЫТ

При предварительном отказе от всяких внешних аналогий для хроматографии следует вначале рассмотреть лоток (объемом ут), заполненный жидкостью, например водой, с двумя отверстиями для ввода и вывода и приспособлением для энергичного перемешивания (рис. 50, а). Если теперь необходимо заменить воду в лотке окрашенной жидкостью, например чернилами, то быстрее всего это можно осуществить, опорожнив лоток и затем заполнив его чернилами. Для достижения этого конечного состояния необходим объем vm чернил. Возможен также другой способ: чернила длительное время вводят через подводящее отверстие и одновременно с другого конца отводят воду и разбавленные чернила. Каждый понимает, что при таком способе необходимо больше чернил для заполнения лотка. Что же произойдет, если лоток, согласно рис. 50, бив, разделить на камеры одной,

двумя или большим числом перегородок с отверстиями? Опыт приводит к следующему выводу: необходимый для достижения конечного состояния объем чернил будет уменьшаться с ростом числа камер. При очень большом числе камер он стремится к величине ут, которая сравнима с объемом камеры; единственной возможностью для перемешивания в направлении потока является перемешивание в результате продольной диффузии. Рассматривая математически процесс как задачу перемешивания, можно написать ,:

у

I п' п 'п z -

(1)

Здесь cn(F) — концентрация раствора, вытекающего из лотка с п камерами, как функция уже протекшего объема V; с — концентрация исходного

Рис. 50. Перемешивание растворителя и вытесняющего раствора в лотках с постоянным объемом ут и различным числом камер п [18].

раствора; п — число камер; V — объем, вытекший с момента начала опыта; ут — общий объем жидкости в лотке.

При п > 25 можно использовать значительно более удобную приближен- nylo формулу (1а):

МП=1{1 + 2ф[(£-1)у5Г]},(la)

где величина

Ф Г Г—1) Уп 1 = Ф (и) С ф(-и)= -Ф(и) L х ит У J

соответствует известному, часто приводимому в таблицах интегралу ошибок:

Ф (и) =—\ е 2 dx.

На рис. 51 приведены рассчитанные концентрационные кривые сп (F) как функции У/ут при различном числе камер п. Из рисунка видно, что для вытеснения воды из лотка в случае 5 камер теоретически необходимо примерно 3, в случае 25 камер — примерно 1,6, а в случае 125 камер — примерно 1,3 объема vm чернил.

При выводе формулы (1) предполагалось, что перемешивание входящего

Рис. 51. Повышение концентрации раствора, вытекающего из лотков с 1, 5, 25 и 125 камерами [18].

Сплошные кривые рассчитаны по формуле (1) или (1а); кривые с крестиками и кружками — экспериментальные данные (см. текст).

мгновенно, так что в каждой камере всегда имеет место однородная концентрация, и что выходящий из камеры раствор имеет эту концентрацию. Достижимы ли эти идеальные соотношения на практике? Как будет обстоять дело, если указанные предположения практически не выполняются? Сигнер , нашел следующий ответ: лоток с 29 камерами дает на выходе экспериментальную концентрационную кривую (например, определенную колориметрически), которая на рис. 51 для первого случая (оптимальные скорости потока и перемешивания) изображена кружками, а для второго случая (скорость потока та же, однако 4-кратная по сравнению с прежней скорость перемешивания) — крестиками. Кривая, изображенная кружками, соответствует теоретической концентрационной кривой при п = 30 ± 2; таким образом, требуемые математиками при анализе идеальные соотношения в первом случае довольно хорошо осуществляются. Во втором случае это, очевидно, не имеет места. Кривая, изображенная крестиками, как видно, соответствует лотку, разделенному на 13 ±2 камеры. Этот последний результат можно выразить двумя способами:

эффективность лотка составляет 45 ± 7 %;

лоток работает с п' = 13 ± 2 идеальными эффективными камерами.

На рис. 52 несколько подробнее изображена зависимость эффективности от условий опыта. Из этого рисунка и из экспериментальных кривых на рис. 51 мы можем сделать следующие выводы.

Положенное в основу расчета предположение об идеальном перемешивании внутри камеры практически осуществляется (эффективность 100%), если соотношение скорости потока и и скорости перемешивания со пра

вильно.

Неидеальное перемешивание камеры при слишком малых значениях со и слишком больших значениях и или вследствие турбулентности (большие со, большие ы) уменьшает эффективное число камер.

Смешение содержимого соседних камер при слишком малых значениях и (продольная диффузия), слишком больших значениях и и слишком больших значениях со (турбулентность) также уменьшает эффективное число камер.

Величина отверстий между камерами, очевидно, также является важным параметром.

Эти данные можно обобщить таким образом, что c(F) — изменение концентрации раствора, выходящего из лотка,— зависит единственно от того, насколько эффективно может быть уменьшено перемешивание по всему лотку. Кривая повышения концентрации вытесняющего раствора (чернил^) на выходе тем круче, чем больше создано камер, и при данном числе камер

Рис. 52. Эффективность лотка с 29 камерами (ут = 550 мл, диаметр отверстий в стенках камер 2 мм, заполнение — 7,5%-ны^-раствор бензоата аммония, протекающая вода) при различных скоростях потока и скорости перемешивания со [18].

Изменение концентрации вытекающего раствора прослеживали по изменению коэффициента преломления.

тем более полога, чем сильнее проявляются случайные , препятствующие перемешиванию внутри камер факторы1, продольная диффузия и турбулентность . Эффективное число камер п , таким образом, является чисто расчетной величиной, которая может быть определена по положению кривой с (F) при графическом изображении согласно рис. 51. Система из п сконструированных камер ведет себя при неидеалъных условиях так, как если бы она состояла из п' идеально работающих камер, причем п меньше п.

В нашем мысленном эксперименте возьмем теперь вертикально установленную стеклянную трубку, заполненную стеклянными бусами или другим инертным материалом и водой. Будем сверху подавать чернила и следить за повышением концентрации чернил на выходе. Это повышение концентрации, при прочих равных условиях, будет тем более резким, чем мельче наполнитель и чем равномернее его упаковка; из крутизны кривой можно определить эффективное число камер п , или «число теоретических тарелок». Последнее устройство соответствует устройству при так называе-

мом хроматографическом фронтальном анализе [1] с тем отличием, что наш наполнитель не адсорбирует чернила. Качественно для нашей кривой вымывания * это различие не имеет значения; к количественному влиянию адсорбции мы ниже- еще вернемся.

ВТОРОЙ ОСНОВНОЙ опыт

Аппаратура, изображенная на рис. 50, может быть использована: для следующего эксперимента. Пронумеруем камеры слева направо цифрами 1, 2... г ... п; заполнив камеру № 1 чернилами, а остальные камеры водой, будем пропускать в камеру № 1 воду и следить за изменением концентрации на выходе из камеры п. Поскольку в камерах от № 2 до № п, как и в предыдущем опыте, вода вытесняется чернилами, мы можем вначале ожидать точно такого же повышения концентрации, как и в предыдущем опыте. Так как, однако, не чернила, а вода подается в камеру № 1, концентрация чернил на выходе после достижения максимума должна постепенно > падать, пока в конце концов не будет вытекать одна вода. Весьма вероятно предположение, что повышение и понижение концентрации должно происходить по закону зеркального изображения. В случае большого числа камер это действительно реализуется на практике.

Математическое выражение для сп (F) дается здесь как частный случай общей математической теории противоточной экстракции [21]; и здесь предполагается мгновенное перемешивание в каждой камере. Для лотка с га камерами (пронумерованными от 1 до га) формула (40) Хадвигера в наших обозначениях имеет следующий вид *:

/ v \

'^F) = C»A-A(tlj!’(2)

гдесо=— — начальная концентрация в камере № И; Мо — количество

п

вещества, введенное в камеру № 1; V — протекший с начала опыта объем жидкости; vm — общий объем жидкости в лотке.

cn(F) подчиняется распределению Пуассона. Эта функция для лотков 1000

с 1, 5, 10, 20 и 29 камерами при vm = 1000 мл и со = 1 г на -^— мл изображена на рис. 53. Видно, что распределение вещества на выходе при увеличении числа камер принимает форму .симметричной полосы с концентрационным максимумом в середине.

Такие с(И)-кривые действительно могут быть получены экспериментально. Так же как и в первом основном опыте, эффективное число камер га' зависит от условий работы аппарата. В случае вертикальной заполненной инертным наполнителем и водой «хроматографической колонки» это означает, что при загрузке небольшим количеством чернил с последующим вымыванием водой получают типичную элюционную хроматографическую кривую в отсутствие адсорбционных или распределительных процессов. Достаточно, чтобы перемешивание веществ вдоль колонки было резко уменьшено благодаря наличию наполнителя. Из хода концентрационной кривой элюата или

Рис. 53. Элюционные кривые по уравнению (2) при различном числе камер п [22]. Объем жидкости в лотке ет= 1 л; количество вещества в камере М 1 в начале опыта 1 г; начальная концентрация в камере № 1/Со = п г/л. Площади под кривыми соответствуют введенному количе

ству вещества, т. е. \ Cn(V) dV = 1. Максимумы расположены при V„„„„ = rm. Сравните ве

личины максимумов с соответствующими начальными концентрациями со. Разбавление значительно м увеличивается с увеличением п. Однако это увеличение меньше одновременного увеличения со- Поэтому с увеличением п максимумы становятся выше, а кривые соответственно круче.

путем сравнения ширины эоны чернил на старте и на выходе иэ колонки можно рассчитать «число теоретических тарелок» (см. ниже), которое представляет для нашей колонки степень уменьшения перемешивания. Это число теоретических (тарелок, очевидно, не имеет физического смысла.

МОДЕЛЬ

Какую роль играет присутствие неподвижной фазы, которая может в соответствии с коэффициентами распределения или адсорбции обратимо поглощать растворенное вещество? Снова рассмотрим лоток Сигнера. Внесем теперь небольшое изменение, состоящее в том, что изготовим лоток несколько более глубоким и полученный таким образом.дополнительный' объем vs используем для введения жидкой или твердой неподвижной фазы (рис. 54). Объем vm первоначально имевшейся жидкой фазы, который теперь обозначим как подвижную фазу, остается при этом неизменным; это предположение, так же как и увеличение объема лотка, имеет своей целью только упростить математическое рассмотрение эффектов распределения или адсорбции. .

В уравнении (2) с^ при данном п является функцией величины F/vm, причем V и гт представляют собой количества, относящиеся к одной и той же фазе. V — объем, вытекший из. лотка к моменту наблюдения J a vm — объем жидкости в лотке. Отношение этих двух величин в каждый отдельный момент определяет положение концентрационного максимума. Если V 5g 0"""п~\) Гт' т0 максимУм находится еще в лотке, если У больше, максимум покинул лоток.

Если теперь vm, который мы принимаем постоянным, привести в соприкосновение с неподвижной фазой объемом vs, так что растворенное в объе-

ме vm вещество до установления распределительного или адсорбционного равновесия может переходить в неподвижную фазу и обратно в vm, это будет равносильно эффективному увеличению vm, поскольку неподвижная фаза до некоторой степени представляет собой резервуар для вещества. Поэтому вместо vm в формулу (2) следует подставить исправленную величину 11

Ут + тг^б *’ ** или Vm—*i а вместо со — исправленную величину сор *.. лр

Тогда получают уравнение (3).

/ V

V \П ^е \ пр

сп (7) = сор -^

Ко

ПРИ

ит пр

и

("-!)!

п

(3)

Сравнение выражений (3) и (2) показывает, что единственное существенное влияние неподвижной фазы в лотке Сигнера состоит в том, что соответ-

Рис. 54. Усовершенствованный по сравнению с приведенным'на рис. 50, в лоток с дополнительным объемом о8 для неподвижной " фазы.Пунктирная линия обозначает границу раздела фаз. Соседние камеры сообщаются только в области г>т; если ks представляет собой твердую фазу, нижние мешалки отсутствуют.Рис. 54. Усовершенствованный по сравнению с приведенным'на рис. 50, в лоток с дополнительным объемом о8 для неподвижной " фазы.Пунктирная линия обозначает границу раздела фаз. Соседние камеры сообщаются только в области г>т; если ks представляет собой твердую фазу, нижние мешалки отсутствуют.

Рис. 54. Усовершенствованный по сравнению с приведенным'на рис. 50, в лоток с дополнительным объемом о8 для неподвижной " фазы.

Пунктирная линия обозначает границу раздела фаз. Соседние камеры сообщаются только в области г>т; если ks представляет собой твердую фазу, нижние мешалки отсутствуют.

Рис. 54. Усовершенствованный по сравнению с приведенным'на рис. 50, в лоток с дополнительным объемом о8 для неподвижной " фазы.

Пунктирная линия обозначает границу раздела фаз. Соседние камеры сообщаются только в области г>т; если ks представляет собой твердую фазу, нижние мешалки отсутствуют.

отсюда следует:отсюда следует:p+g=i;p+g=i;Р/УтqKР/УтqKР-А_=К1g еР-А_=К1g е

отсюда следует:

отсюда следует:

p+g=i;

p+g=i;

Р/УтqK

Р/УтqK

Р-А_=К1

g е

Р-А_=К1

g е

ствующее максимуму концентрации распределяющегося вещества отношение У/vm. (см. выше) уменьшается до (V/vm) р, причем в соответствии с К и q,

Р i + Kq и Ут+ к и®

*♦ Поправку APm — "j^us получаем из условия равенства количеств вещества, находящихся в подвижной и неподвижной фазах при данных значениях К и и8; условием является соотношение = К.

так что при постоянстве всех прочих параметров только К определяет положение центра зоны вещества.

Поэтому два различных вещества, одновременно введенных в камеру № 1, можно отделить друг от друга, если их коэффициенты распределения или адсорбции достаточно отличаются и если отношение фаз q выбрано правильно. Это предположение было подтверждено экспериментально. При этом также можно установить условия опыта, при которых эффективное число камер (га') почти соответствует числу созданных камер (га) (рис. 55) [22].

Если п' < га, что может быть результатом неполного установления равновесия между двумя фазами, должно получиться (также на основании

Рис. 55. Разделение 200 „иг бензамида и 200 лег никотинамида в лотке с 29 камерами [18]. Подвижная фаза этилацетат; скорость потока 60 мл/час; отверстие для перетока 2 мм; неподвижная фаза вода; скорость перемешивания 25 об/мин; от = 580 мл; р и 1; Кбен8а^Ида = 3,59; -^никотинамида^ 0,216. По точкам построена экспериментальная кривая, другие кривые построены по уравнению (3) для 5 и 29 эффективных камер.Рис. 55. Разделение 200 „иг бензамида и 200 лег никотинамида в лотке с 29 камерами [18]. Подвижная фаза этилацетат; скорость потока 60 мл/час; отверстие для перетока 2 мм; неподвижная фаза вода; скорость перемешивания 25 об/мин; от = 580 мл; р и 1; Кбен8а^Ида = 3,59; -^никотинамида^ 0,216. По точкам построена экспериментальная кривая, другие кривые построены по уравнению (3) для 5 и 29 эффективных камер.

Рис. 55. Разделение 200 „иг бензамида и 200 лег никотинамида в лотке с 29 камерами [18]. Подвижная фаза этилацетат; скорость потока 60 мл/час; отверстие для перетока 2 мм; неподвижная фаза вода; скорость перемешивания 25 об/мин; от = 580 мл; р и 1; Кбен8а^Ида = 3,59; -^никотинамида^ 0,216. По точкам построена экспериментальная кривая, другие кривые построены по уравнению (3) для 5 и 29 эффективных камер.

Рис. 55. Разделение 200 „иг бензамида и 200 лег никотинамида в лотке с 29 камерами [18]. Подвижная фаза этилацетат; скорость потока 60 мл/час; отверстие для перетока 2 мм; неподвижная фаза вода; скорость перемешивания 25 об/мин; от = 580 мл; р и 1; Кбен8а^Ида = 3,59; -^никотинамида^ 0,216. По точкам построена экспериментальная кривая, другие кривые построены по уравнению (3) для 5 и 29 эффективных камер.

аналогии с первым основным опытом) при практически неизменном положении максимума более пологое распределение. Сравните, например, кривые для 5 и 29 камер на рис. 55 . Более размытое распределение вещества означает более широкие полосы веществ и, следовательно, уменьшение разделительной способности.

К наглядному рассмотрению разделительной способности приводит следующее рассуждение. Дифференцируя функцию (3) по V, находят максимум сп (У) при] V j ^= = п — 1 (ср. рис. 53; Имакс = ~^— —^ при р = 1). Это является ожидаемым или средним значением М распределения Пуассона .(3). Среднее отклонение от М в случае распределения Пуассона а = У М, в данном случае а = У п — 1. С ростом ожидаемого значения пуассоновское распределение становится все более симметричным. Оно приближается при этом к нормальному распределению (колоколообразная кривая по Гауссу) и при М г 30 может быть аппроксимировано этой кривой . Подставляем М = п — 1, а= У п—1 ив качестве переменной V / ~ в общую форму нормальной функции и получаем

[(У^Н-1)]2(4)

МБ*МБ*соР2 (п-1)‘' ’

МБ*

МБ*

V 2л (п—

Переменная в уравнении (4) является отношением объемов. Это уравнение становится

|2; с V в качестве переменной полу-|2; с V в качестве переменной полу-более наглядным, если экспоненту разложить по чаем

|2; с V в качестве переменной полу-

|2; с V в качестве переменной полу-

илиилисп(У^-—^=-е /2 л (п — 1)сп(У^-—^=-е /2 л (п — 1)^-1)(Ж^-1)(Ж(5)*(5)*сп(Е)^-=^= ’]Л2л(п-1)сп(Е)^-=^= ’]Л2л(п-1)^ ^макс^2 2е «-I v макс^ ^макс^2 2е «-I v макс(5а)*(5а)*

или

или

сп(У^-—^=-е /2 л (п — 1)

сп(У^-—^=-е /2 л (п — 1)

^-1)(Ж

^-1)(Ж

(5)*

(5)*

сп(Е)^-=^= ’]Л2л(п-1)

сп(Е)^-=^= ’]Л2л(п-1)

^ ^макс^2 2

е «-I v макс

^ ^макс^2 2

е «-I v макс

(5а)*

(5а)*

В выражении (5а) мы имеем нормальное распределение со средним значением

(6)(6)(7)*,**(7)*,**v _1 ут

(6)

(6)

(7)*,**

(7)*,**

* макс —~"

и средним отклонением

п р '

Обе величины выражены в единицах объема.

Ордината для 7макс имеет значение

—, или 0,3989-—ХС-тг, или 0,3989-^

/2л(п—1)Уп—1о

На рис. 56 представлена функция (5а) для А-лейцина (А) и А-валина (В), когда имеется 29 эффективных камер общим объемом 950 мл, с н-бутанолом в качестве подвижной фазы и водой в качестве неподвижной фазы; отношение фаз р равно 5. Разделение, как всегда при разделении фракций А и В, является неполным. Насколько оно является неполным и на каком этапе можно остановиться, чтобы простейшим образом выразить разделительную способность?

Для рассмотрения этого вопроса измерим сначала отрезок ординаты Рмакс в — ^макс 4 (рис. 56) в единицах суммы (oA + пв) = 2; подставим, таким образом, Рмакс в— — ^макс А = ^' Величина Z может быть вычислена по двум кривым на’рис. 56 или, лучше, из соотношений (6) и (7) по следующей формуле:

7 —VКа + Кв+2КхКв67 —VКа + Кв+2КхКв6(8)***(8)***

7 —

VКа + Кв+2КхКв6

7 —

VКа + Кв+2КхКв6

(8)***

(8)***

где Аа> Кв. „ -

Z, как мы сейчас увидим, является мерой’разделительной способности. Обычно, если Z г 3,5, разделение фракций|А и В практически полное. В нашем случае (рис. 56) Z равно 1,55. Анализ, справедливый для всех значений Z, даёт следующую зависимость между Z и разделительной способностью. •

Если мы отделяем фракцию А в момент времени, когда протек объем Ут, Гт — Гмакс А4'2<7д = Умакс д ^ 14" ^j ^ , или•

^Т —^макс В — 2ав = УМакс В ^ 1 — у^ ^ >

т. е. собираем вытекающий раствор после Ут в отдельный сосуд (и если кривые рис. 56 точно передают изменение концентрации, площади под кривыми точно соответствуют1 распределению вещества в выходящем растворе), то фракция А количественно равна фракции В и загрязнение фракции А фракцией В (горизонтально заштрихованный участок площади) равно по величине загрязнению фракции В фракцией А (вертикально заштрихованный участок площади). Это вытекает из особого свойства нормального распределе-

Р и с. 56. Ориентировочные кривые (Гаусс) изменения концентрации лейцина (А) и валина (В) в вытекающем растворе в случае ло#ка Сигнера с 29 камерами.

Мд Лей = 10° -^l ^0 Вал = 10° -“^ подвижная фаза н-бутанол; vm=0,75 л; неподвижная фаза водй; Vs —0,15 л; р=5; п = 29; Кде^ =0,18; КВал=0,07; У^акс В Умакс = 1,55 (Од+Ов ), Z = 1,55; VT= 1,976 л; до VT— фракция лейцина, после Vr—фракция валина. Если бы кривые описывали эффективное распределение концентрации, то в области под кривой А находилось^бы 100% лейцина и в области под кривой В 100% валина. В лейциновой фракции находилось бы 93,9% лейцина + 6,1% валина, а в валиновой фракции —93,9% валина + 6,1% лейцина. В действительности количество веществ и их отношение в вытекающем растворе до и после Уу различны: в лейциновой фракции находится 92,0 мг лейцина и 3,1 мг валина, в валиновой фракций 96,9 яг валина и 8,0 яг лейцина (планиметрический расчет площадей пуассоновских кривых на рис. 57;

разделение фракций при V^.

ния: если отрезок абсциссы от Умакс д до начала вертикально заштрихованного участка составляет величину, равную Z од-единиц, а отрезок от горизонтально заштрихованного участка до Гмакс в составляет величину, равную Z ов-единиц, то на горизонтально заштрихованную часть площади приходится доля / (Z) = 100 [0,5 — Ф (Z)] в процентах от всей площади В и точно так же на вертикально заштрихованную часть — доля / (Z) = = 100 [0,5 — Ф (Z)] в процентах от всей площади А. Незаштрихованные участки содержат, таким образом, по 100 — / (Z) = 100 [0,5 + Ф (Z)] процентов площади А или В. Ф (Z) представляет собой интеграл ошибок (см. табл. 6). При Z = 1,55 (рис. 56) / (Z) = = 6,1% и 100 — / (Z) = 93,9%. Мы можем теперь, естественно, разделить фракции при Ут и удовлетвориться возможностью грубо оценить степень разделения, используя значение / (Z). Метод прост и нагляден; ошибка (см. подпись к рис. 56) тем меньше, чем больше п, и имеет тем меньшее значение, чем больше величина Z.

С другой стороны, мы можем попытаться разделить фракции в момент, когда в обеих фракциях будет содержаться одинаковое количество вещества (при равной величине проб А и В) и затем сравнить оцененную с помощью / (Z) разделительную способность с фактической разделительной способностью. На рис. 57 показано, как в действительности выглядит разделение лейцина и валина при проведении опыта в условиях, соот-

ветствующих рис. 56; для сравнения нанесены кривые рис. 56 ♦. Отклонение от идеального распределёйия, согласно рис. 56, связано с тем, что мы при аппроксимации функции (3) функцией (5а) заменили несимметричное распределение симметричным. Очевидно,

Р7и с. 57. Сравнение действительной (Пуассон) и аппроксимативной (Гаусс —)

кривых изменения концентрации лейцина (Л) и валина (В) в вытекающем растворе в слу-чае лотка Сигнера с 29 камерами. Условия опыта те же, что на рцс. 56. До Vt, испр —фракция лейцина, после Ут, испр — фракция валина; Гт, испр = 2,022 л (о расчетеУт, испр см. текст).'

Вытекший объем

Состав фракций, мг

определено по / (Z)

определено планиметрически

лейцин

валин

лейцин

валин

Д° VT, испр (лейциновая фракция)

93,9

6,1

92,6

3,9

После VT „„„„(валиновая „Л 1 Исир

фракция)

6,1

93,9

7,4

96,1

Д° ^т,опт а (лейциновая фракция)

93,9

6,1

94,7

5,3

После VTi опт (валиновая фракция)

6,1

93,9

5,3

94, 7

а Оптимальное значение vT Испр (одинаковое количество вещества в обеих фракциях), определенное планиметрически и равное 2,083 л,

для достижения желательного состава фракций (% В во фракции А = % А во фракции В) фракцию В следует отделить после прохождения объема Ут + ДУ = Ут> испр- Поправку ДУ можно оценить в случае большого числа камер (п > 100) :

■ ду^макс А + ^макс ВZ2

2' 4(п— 1)’

При небольшом числе камер такой расчет является грубым. В нашем случае (га = 29} разделение при приближенно рассчитанной величине Ут, испр все же лучше, чем разделение при Ут- Первая величина имеет преимущество равного распределения вещества между фракциями А и В. Если впрочем площади под кривыми Пуассона А и В при значении Ут, Испр перекрываются точно так же, как и площади под кривыми Гаусса А и В при Ут, то функция / (Z) передает степень разделения, правда не очень точно, однако лучше, чем в случае разделения фракций при Ут (СР- подпись к рис. 57).

На величину Z в качестве меры, определяющей расстояние между полосами двух веществ, и ее расчет не влияет различие между функциями (3) и (5а). Обозначим Z как параметр разделения, а / (Z) как степень перекрывания полос. Зная Ут, испр и используя формулу (8), можно с помощью / (Z) с хорошим приближением предсказать разделительную способность лотка с га камерами для данной смеси А + В. Заметим, что величина Z при данной разнице Ад — Ав тем больше, чем меньше Ад и отношение фаз р. В табл. 6 показана зависимость параметра разделения Z [расчет по формуле (8)] от р, а также зависимость между величиной Z и степенью перекрывания фракций / (Z) (% В во фракции А и % А во фракции В) на примере разделения лейцина и валина.

Таблица 6*

Расчетная зависимость между отношением фаз Q,параметром разделения Z и степенью перекрыванияфракций /(Z) на примере разделения лейцина и валинав смеси «-бутанол — вода

.Ср. рис. 56 га = 29; АЛей==0,18; АВал = 0,07;

разделение фракций при Ут, испр (СР- текст)

р

Z

Ф (Z) а

7(2)6

12

1,05

0,3539.

14,6

5

1,55

0,4392

6,1

1

2,12

0,4828

1,7

0,2

2,28

0,4887

1,1

z ■

а Интеграл ошибок Ф(2) =—-1 - \ e-1/2T2dt. Таблицы в «Hand- .У 2л J

book of Chemistry and Physics» ([19] стр. 210—213) и «Biochemisches

Taschenbuch» ([20] стр. 1199).''

6 7(Z) = 100' [0,5 —Ф(2)]%.

* Следует сравнить несколько отличный метод рассмотрения

глюкауфа в изложении А. Кейлеманса [23].

На рис. 55 приведено изменение концентрации на выходе из последней камеры лотка. Таким образом, здесь мы имеем «алюционную кривую»; расчет величины с осуществляют по формуле (3), подставляя переменную V и параметры Мо, п, р и »т. Полагая величину (и — 1)! в знаменателе постоянной, мы концентрируем свое внимание на изменении концентраций в вытекающем из камеры № п растворе.

В хроматографической практике не всегда представляют интерес только кривые элюции. В частности, при хроматографии в тонких слоях и хроматографии на бумаге процесс прерывают, когда фронт растворителя достиг конца слоя или бумажной полосы. Несмотря на то что слой и бумага в начале хроматографического разделения, как правило, не на всю длину заполнены

жидкой фазой (см. разд. III), такое устройство во многих отношениях можно сравнить с аппаратом Сигнера, который остановлен в тот момент, когда основное количество подвижной фазы из камеры № 1 достигает в виде фронта камеры № п. Тогда протекший объем равен

Где находится теперь вещество? Ответ мы найдем, если обратимся теперь к выражению (3), определяя не величину сп {F), а величину Су^, причем переменная г (номер камеры) меняется от 1 до п, a У= рт — ^? = ym^zl_ постоянная величина. Изменяем соответственно выражение (3) и получаем после алгебраических упрощений формулы для изменения концентрации в подвижной фазе:

Су (г) = сор У ’^' (СР- Рис-49>

для распределения вещества в подвижной фазе

Су (г).^=MQ-pСу (г).^=MQ-pt(„-l)p1'-le-[("-l)p](г-1)!t(„-l)p1'-le-[("-l)p](г-1)!(9а>(9а>

Су (г).^=MQ-p

Су (г).^=MQ-p

t(„-l)p1'-le-[("-l)p](г-1)!

t(„-l)p1'-le-[("-l)p](г-1)!

(9а>

(9а>

и для распределения вещества в лотке

МИг) = >.(р + 9)-“^^^(96>

В случае неидеальных условий работы следует, очевидно, в формуле (96) заменить п (число сконструированных камер) величиной п (эффективным числом камер).

При т — 1 = (м — 1) р величина Му (г) достигает максимального значения , а именно в камере № г = (п—1)р + 1 = пр + q = гмакс. Величины (гмакс—1) и кп—1) можно рассматривать как длины пути вещества и фронта. Их отношение обозначено через В}, причем видно, что Rf = р.

Аппроксимирование (96) распределением Гаусса возможно, только если (г — 1) ^ 30, причем оно имеет смысл лишь в случае лотка с очень большим числом камер. Ниже мы к этому еще вернемся. ■

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ КОЛОНКА

Сравнение с моделью

Хроматографическая колонка, «закрытая» или «открытая» (см. гл. А стр. 11), может рассматриваться как лоток Сигнера с п'эффективными камерами. Величина п' может быть определена из распределения вещества, получаемого при хроматографическом разделении. Значение величины п' отражает процессы перемешивания внутри колонки. В табл. 7 сопоставлены параметры, определяющие п' для лотка Сигнера, с соответствующими параметрами хроматографической колонки.

Условия перемешивания и продольном и поперечном направлениях и эффективное число камер в модели (лоток Сигнера) и в хроматографической колонке

Модель

Хроматографическая колонка

Эффект

Изменение п' (увеличение или постоянство +; уменьшение —)

Стенки камер

Набивка колонки

Уменьшают перемешивание в продольном направлении

+

Камеры

Промежутки между зернами

Содействуют перемешиванию в поперечном направлении

+

Мешалка

Конвекция и диффузия в промежутках, каскадные колонкиа

Содействуют перемешиванию в поперечном направлении

+

Отверстия в стенках камеры

Промежутки между зернами

Содействуют продольному переносу

±

Подвижная фаза

Поток жидкости

Продольный перенос, выравнивание концентрации и межфазовое равновесие в поперечном направлении

а) Оптимальная скорость

Минимальные помехи

±.

б) Слишком большая скорость

Недостаточное перемешивание и неполное установление равновесия в поперечном направлении, турбулентность

—

в) Слишком малая скорость -

Становится заметной прот дольная диффузия

—

Оптимальная скорость перемешивания

Набивка достаточно мелкозернистая и равномерная

Равномерное * перемешивание в поперечном направлении

±

Слишком большая скорость перемешивания (турбулентность) '

Неравномерная набивка

Неравномерное распределение в поперечном направлении, помехи в продольном направлении

—-

Слишком малая -скорость перемешивания

Набивка слишком, крупнозернистая

Недостаточное перемешивание и неполное установление равновесия в поперечном направлении

—

а Ср. сноску 1 на стр. 101.

Различная поглотительная способность неподвижных колоночных набивок по отношению к различным веществам приводит, как и в случае лотка, к тому, что для элюирования этих веществ требуются различные объемы подвижной фазы. Эти объемы, которые .для данной колонки при данных условиях являются специфичными для веществ, называют удерживаемыми объемами. Это понятие особенно часто используется в газовой хроматографии. Удерживаемый объем в лотке Сигнера является не чем иным, как уже знакомой нам величиной FMaKC. Она выражается формулой (6):

Гмакс = (п-1)-5-. . (6)

В случае хроматографической колонки с большим числом п удерживаемый объем FH определяется соотношением (6а):

Vr-^. (6а)

Величина 'су обозначает постоянный объем подвижной фазы внутри данной колонки, т. е. разность объемов колонки и неподвижной набивки. Вперемен- ном множителе проявляется различие в способности неподвижных фаз поглощать вещество. Как р, так и р' изменяются в зависимости от вещества, подвижной и неподвижной фазы и отношения фаз в пределах от 0 до 1 . При таком методе рассмотрения безразлично, основано ли1 поглощение вещества на адсорбции (Фрейндлих), обогащении на поверхности раздела между жидкими фазами (Гиббс, Ленгмюр), распределении (Нернст) или на сочетании этих механизмов.

Роль хроматографической колонки при перемещении вещества с подвижной фазой сводится к суммарному воздействию ряда факторов: помех перемешиванию, перемешивания и поглотительной способности. Качественно (а при благоприятных условиях также количественно) эта картина соответствует переносу вещества в лотке Сигнера. Очевидно, имеет смысл использовать математические формулы, выведенные при рассмотрении лотка Сигнера, для решения определенных задач колоночной хроматографии. При этом оставим пока в силе важное предположение, что множитель —, не зависит от концентрации, и примем, как и в случае лотка, что движение подвижной фазы сквозь колонку происходит равномерно.

Практическое отличие от случая лотка состоит, очевидно, в том, что вещество приходится вводить в колонку так, что уже в начале хроматографического процесса существует какая-то ширина полосы. Если эта ширина не превосходит некоторого значения, то «стартовая полоса» исчезает в результате дисперсии при распределительном процессе. В качестве точки старта (камера № 1) можно рассматривать середину стартовой полосы. Мысленно можно перемещать все вещество начиная с этого места . Если рассматривают стартовую полосу уже как нормальное распределение с дисперсией, равной -^ от ее ширины, и если эта величина составляет не более чем -|-У п'р' (получение хроматограммы на отрезке, равном п' эффективных

камер) или 4—^-i/"_L_ (злюционная кривая, снятая на выходе из колонки ° у р' V пр'

с п' эффективными камерами), то «конечная полоса» всего лишь на 10% шире, чем в нормальном случае; этот расчет справедлив для величин п', при которых Vп’р' < п' *. |'-

Получение хроматограммы

Под получением хроматограммы понимают формирование распределения вещества внутри хроматографической колонки. Хроматографический процесс прекращают, как только фронт подвижной фазы прошел всю длину хроматографической колоки (У ~ гр, ср. стр. 97).

Этот случай представляет интерес для практика, в частности с точки зрения хроматографии в тонких слоях и хроматографии на бумаге. Чтобы рассмотреть его в представлениях нашей модели, разделим мысленно длину колонки на п секций и пронумеруем их от 1 до и' текущим номером г. Теперь принципиально применима формула (96), причем, основываясь на том, что опытная установка такого рода обладает высокой эффективностью разделения, мы должны сделать вывод о достаточно высоком значении п . Поэтому аппроксимирование злюционной кривой распределением Гаусса является законным. С ожидаемым значением М = п’р' и средним отклонением о = Vnp' из формулы (96) [причем вместо (и' — 1) для упрощения подставляем п'] получаем для количества вещества в секции № г выражение (10).

(г-п'р')«

Му (г) «= г °. . е 2п'Р' .(10)

1 х ’ V2яп'р'4 '

Вспомним теперь, что п’р* = гмакс — положение максимума вещества в полосе . Ее видимая ширина составляет примерно 4а= 4 )Лп’р' секции колонки, поскольку область М 2b 2а охватывает примерно 95% общей площади под кривой Гаусса ♦***. Как и в случае элюционной кривой (5а), степень разделения двух веществ А и В можно записать в виде отношения

7 гмаксА гмакс В.

' В результате подстановки получаемv

Z = yiv /’А —Рв0^

или, поскольку р' = Rf,

гДе R)x > ^/в"_ ‘

Положив видимую ширину полосы равной 4а и пренебрегая шириной полосы в начале хроматографического процесса, в случае смеси А + В можно ожидать появления двух дискретных полос при 2 г 2. Если, с другой стороны, вещества А и В появляются на выходе разделенными, то можно рассчитать по формуле (11а) при 2=2 число теоретических тарелок п*.■

При хроматографировании перемещается не только вещество, но и фронт; п' при этом непрерывно увеличивается и ширина полосы растет

пропорционально VnP'- Одновременно ордината при гмакс уменьшается в 1/]/ п'р' раз . Такое уменьшение Мгмакс рано или поздно обусловливает предал возможного определения вещества на хроматограмме, поэтому хроматографическую колонку нельзя безгранично удлинять. Другие соотношения имеют место при увеличении м', если фактическое расстояние между стартом и фронтом остается при этом неизменным. Этот случай осуществляется, например, при хроматографии в тонких слоях с использованием разных адсорбционных слоев или при хроматографии на бумаге с использованием разной бумаги. Ширина полосы, естественно, по-прежнему остается функцией "\Г п'. Однако отношение У^' : п* уменьшается с ростом п', так что полосы фактически получаются более резкими. Одновременно с этим, разумеется, увеличивается плотность вещества в полосе.

При обычном проведении хроматографического процесса на бумаге или в тонких слоях растворитель попадает на сухой носитель (см. разД. III). Это обусловливает вначале слишком медленное продвижение вещества. Однако, как только фронт в конце концов перегонит вещество, этот недостаток устраняется. Дальнейший процесс протекает, однако, не в соответствии с выражением (10), поскольку пройденное фронтом расстояние растет, как правило, не пропорционально величине t (ср. стр. 107). Поэтому число теоретических тарелок п’ на сантиметр пути меняется вдоль хроматограммы. Вот почему не следует ожидать количественного соответствия с формулой (10) и следствиями, вытекающими из нее .

Элюирование

Дополнительно к выводам о закономерностях элюирования, сделанным при рассмотрении лотка Сигнера, напрашивается упрощение формул (3) и (5а) путем использования величины- VR (удерживаемые объемы) и замены величины п — 1 на п'. Подставляя '

^7» UF TZр ~ р’ в’^7» UF TZр ~ р’ в’

^7» UF TZ

р ~ р’ в’

^7» UF TZ

р ~ р’ в’

(12)(12)получаем соотношение

(12)

(12)

где выражение в квадратных скобках может быть взято из таблицы ординат нормального распределения.

Почти симметричные злюционные кривые, требуемые теорией, получаются при газовой хроматографии [23], хроматографии аминокислот на ионных обменниках по методу Штейна и Мура [25], а также при фильтрации через гели [26, 27]. Симметрию можно ожидать, если реализуются условия, при которых величина р' не зависит от концентрации.

Для оценки разделительной способности по отношению к смеси двух веществ А и В используют следующее соотношение, которое, как и (11а), получено на основании предыдущих рассуждений ;

VR — VR

<13>

Определение числа теоретических тарелок и высоты теоретической тарелки,

Число теоретических тарелок п и длина L хроматографической колонки определяют величину Н = Ып'. Н соответствует длине отрезка колонки, действие которого, при разделении веществ равнозначно действию одной камеры. Обычно Н обозначают как высоту теоретической тарелки . Зная Н или п , можно в какой-то степени предсказать разделительную способность хроматографической колонки. Точно сделать это невозможно, так как п или Н зависит не только от условий работы колонки, но и от специфической для данного вещества скорости установления концентрационного равновесия между подвижной и неподвижной фазами. Таким образом, даже при заданных условиях работы, п' и Н не являются константами и поэтому для каждого вещества должны быть определены в отдельности. При близких значениях р' различия, разумеется, невелики, так что, например, для расчета разделительной способности можно воспользоваться общим значением для п'.

Величину п можно определить методом визуального сравнения элюцион- ной кривой с семейством расчетных кривых (см. рис. 53) или методом расчета, сравнивая пройденное расстояние и ширину полос одного из хроматографируемых веществ. Если пренебречь шириной стартовой полосы , то для расчета могут быть использованы:

формула (14) в случае распределения вещества на колонке после хроматографирования;'

формула (15) в случае концентрационного распределения в элюате.

н = -^см,(14)

где b — измеренная в сантиметрах ширина полосы и d — измеренное в сантиметрах расстояние, пройденное максимумом полосы.

"' = (4 Й)',(15)

где Ун — измеренный в миллилитрах удерживаемый объем и FB — измеренная в миллиметрах ширина полосы.

Численные коэффициенты в формулах (14) и (15) получены из произвольного, приведенного и обоснованного на стр. 98 определения видимой ширины полосы, где она приравнена 4-кратному значению величины о. Если злюционные кривые являются безупречно симметричными, то на хроматограммах нет никаких нарушений и область в 4а можно ограничить точками пересечения касательных к точкам перегиба с осью абсцисс. Очевидно, что расчет по формулам (14) или (15). при существующей неопределенности в отношении ширины полосы дает лишь оценочную величину п'. Подобную неопределенность можно, однако, в значительной мере исключить, если несколько усовершенствовать способ рассмотрения (ср. [23], стр. 113—114); при этом соображения, приведшие к формулам (14) и (15), в принципе не меняются. В качестве примера приведем вывод формулы (14).

******Рассмотрим хроматограмму. По формуле (10) путь, пройденный веществом от старта до максимума полосы, составляет п'р', путь, пройденный фронтом,— п' и среднее отклонение а от максимума полосы (= 1/4 ширины полосы, см. выше) — Уп'р' единиц г. Измеренный в единицах длины (сж) путь вещества равен d, путь, пройденный фронтом, —L, ширина полосы — Ъ

*

**

*

**

и высота теоретической тарейки — И. Тогда

6 4Vn'p' г , ы ,

-т- =; L = n Н ; р

.а пр' ’г

Аналогично получаем формулу (15).

Осложнения

Осложнения возникают, если один или несколько параметров уравнения (10) или (12) систематически изменяются в процессе хроматографического разделения. Часто причиной является перегрузка колонки веществом или изменение набивки и степени смачивания по длине колонки, изменения температуры, расслоение комбинированной жидкой фазы, изменения скорости протекания, неравномерность распределения вещества по сечению и зависимость поглотительной способности неподвижной фазы от концентрации. При тщательном проведении эксперимента и соответствующем выборе условий опыта можно исключить все упомянутые источники ошибок, кроме последнего. Постоянство же коэффициентов распределения и адсорбции (А') является идеальным случаем, который часто имеет место (особенно при адсорбции) лишь в области малых и очень малых концентраций. Для большинства веществ сродство к твердой неподвижной фазе уменьшается с ростом концентрации уже задолго до достижения состояния насыщения; изотермы адсорбции при этом обычно изогнуты в сторону оси концентрации. В случае распределительных изотерм возможно искривление в сторону как одной, так и другой оси. Это явление объясняется, как правило, процессами ассоциации. Так как константа распределения вещества в хроматографической колонке охватывает все значения между 0 и некоторым максимумом, искривление изотермы неизбежно. Если, например, 1/А' уменьшается с ростом концентрации, то максимум зоны имеет тенденцию перегонять фронт зоны, в результате чего образуется асимметричное распределение с резким фронтом и более или менее вытянутым хвостом. Последний возникает из-за того, что скорость перемещения в заднем конце зоны уменьшается с уменьшением концентрации в той же мере, что и К. Хвост кончается в том месте, где К' становится постоянным. Это, часто обременительное, явление имеет место в принципе только при изменении условий хроматографического разделения. Соответствующий градиент концентрации в подвижной фазе может, например, это все возрастающее влияние усилить до такой степени, что этот эффект будет в точности компенсировать уменьшение кривизны изотермы. Такая специальная методика носит название градиентного злюи- . рования [32].

ВЫВОДЫ И ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

Наша модель, лоток Сигнера, позволяет хорошо объяснить поведение , хроматографической колонки.

Скорость перемещения вещества оказывается наглядной функцией способности неподвижной фазы поглощать вещество, а также функцией соот-

ношения фаз и отношения между скоростью протекания растворителя и объемом растворителя, находящимся внутри хроматографической колонки.

Образование типичных полос с колоколообразным распределением вещества является следствием — при условии эффективного выравнивания концентрации по сечению — уменьшения перемешивания вдоль колонки. Случайные нарушения изменяют эту картину, в результате чего распределение вещества становится более пологим. При систематических нарушениях ' распределение становится асимметричным. .

Таким образом, на основе нашей модели Мы можем рассматривать хроматографию как комбинацию процессов перемешивания и имеем возможность предсказать поведение вещества в идеальном случае; при этом, однако, приходится ограничиться экспериментальной регистрацией осложнений, анализировать качественно их причины и создавать полузмпирическую теорию, подбирая соответствующее число теоретических тарелок п'. При зависимости степени поглощения от концентрации теория, вообще говоря, позволяет делать лишь количественные предсказания.

Рассмотрим теперь еще раз формулу (14) для определения числа теоретических тарелок. Поставив 6/2 — А, получим

Я = » = ^,(14а)

16d 4d ’'

где А — расстояние между максимумом полосы и ее передним или задним краем. Скорость перемещения со вещества при применении ранее использованных обозначений

о L d

Умножение обеих частей уравнения (14а) на удвоенную скорость перемещения го дает

2"ГЯ = ^Г'

Левая часть имеет размерность коэффициента диффузии и уравнение в целом напоминает уравнение диффузии Эйнштейна. Поэтому А можно рассматривать как положительное или отрицательное смещение вещества относительно максимума полосы, вызванное диффузией. В самом деле, расширение полосы при хроматографии можно рассматривать как диффузионную задачу [2, 33], причем такая трактовка ближе к физической реальности, чем рассмотренная нами выше модель. В случае газовой хроматографии удается, например, определенные осложнения (неравномерность упаковки, продольная диффузия, замедленное установление равновесия) рассматривать отдельно и учитывать вклад каждого из них в суммарный эффект, который можно непосредственно связать с величиной Н 111, 16, 23, 34—36] и таким образом дать Н молекулярно-кинетическую трактовку. Обсуждение всех точек зрения, существующих в этом отношении в хроматографии, выходит за рамки настоящей главы. Нам хотелось бы в заключение указать, что при проведении и анализе хроматографических процессов никоим образом не следует игнорировать фактор времени: он выступает не только в скорости перемещения вещества и фронта, но и в явлении расширения полосы. Формально простая связь между этими величинами существует только при равномерном движении растворителя.

П. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ПОВЕДЕНИЕ И ХИМИЧЕСКОЕ СТРОЕНИЕ

ВЛИЯНИЕ КОЭФФИЦИЕНТА РАСПРЕДЕЛЕНИЯ И ОТНОШЕНИЯ ФАЗ НА ВЕЛИЧИНУ Я/ И УДЕРЖИВАЕМЫЙ ОБЪЕМ ■

Согласно изложенному в предыдущей главе, хроматографическое поведение соединения в данной хроматографической системе целесообразнее всего описать с помощью величины Rf (получение хроматограммы) или удерживаемого объема VR (элюирование). Обе величины являются функциями распределительного (или адсорбционного) коэффициента К', причем в случае распределения между двумя жидкими фазами, согласно определяющим уравнениям на стр. 89 и обозначениям на стр. 97, справедливы следующие соотношения:

При этом практически важно, что для данной пары фаз в хроматографической колонке и в делительной воронке величина К' может иметь различные значения. Соотношения в хроматографической колонке вследствие возможного влияния твердой фазы («носителя») гораздо сложнее, чем в воронке [38] (ср. [39], стр. 10-11) [40].

Для случая адсорбции можно из адсорбционной изотермы Фрейндлиха и определений, приведенных на стр. 89 (при р' + д' = 1), вывести аналогичные соотношения, причем вместо отношения фаз q появляется функция соотношения между количеством сорбента н объемом подвижной фазы. В этом случае К' сильно завйсит от концентрации. Это, однако, ничего не меняет в отношении указанной аналогии.

Теперь p' — Rf (стр. 95), а также

[стр. 97 формула (6а)].'

Тогда

<16)

при получении хроматограммы и ,1=■ (17)

К \ ир уupх '

при элюировании.

Причем VR — т>р означает легко определяемый, например в газовой хроматографии, «кажущийся удерживаемый объем» .

■ 2. КАЧЕСТВЕННЫЕ ПРАВИЛА

При сравнении веществ известного строения часто на основании общепринятых правил растворимости можно сделать качественные предсказания о соотношении соответствующих величин К*. Согласно формулам (16) и (17), большим значениям К' соответствуют большие значения Rj или

меньшие удерживаемые объемы. В этом смысле можно иногда сделать полезные качественные прогнозы в отношении поведения веществ при распределительной хроматографии.

Адсорбционнохроматографическое поведение точно так же подчиняется определенным правилам. Полярные адсорбенты предпочтительно адсорбируют полярные вещества, и наоборот. Растворители так же адсорбируются и конкурируют с адсорбируемым веществом. Опыт йоказывает далее, что сродство к адсорбируемому веществу увеличивается с увеличением точек соприкосновения молекулы адсорбируемого вещества с адсорбентом.

3. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ СВЯЗЬ. СООТНОШЕНИЕ МАРТИНА

1g (^ —1) или 1g (Уд—Ур)1g (^ —1) или 1g (Уд—Ур)Количественная связь между строением и К' становится во многих слу

1g (^ —1) или 1g (Уд—Ур)

1g (^ —1) или 1g (Уд—Ур)

чаях явной, если построить график зависимости

для членов гомологических рядов от числа гомологических структурных элементов , (или соответствующего логарифма) [43]: часто точки лежат на одной прямой! Поведение других соединений данного ряда можно

предсказать путем интер- или экстраполяции.

Определение величины Rm

Линейная зависимость между 1g ^^ — 1^ и числом гомологических структурных элементов может быть понята на основании соображений, которые впервые были выдвинуты Мартином [39]. Коэффициент К' (распределение между двумя жидкими фазами или между жидкостью и газом) является

константой равновесия и как таковая, согласно легко получаемому термодинамическому соотношениюх

Лобр^фп^-ЛпЯ'] ,(18)

является мерой обратимой работы, которую необходимо затратить для перехода 1 моля вещества при постоянном объеме из неподвижной фазы с концентрацией c's в подвижную фазу с концентрацией с’т при абсолютной температуре Т. Если ограничиться распределением между жидкими фазами и обозначить обратимую работу для случая ст = c's = 1 молъ/л как \F, тогда \F=— RT In К'.(19)

Можно теперь подставить значение из (16) или (17) в формулу (19). Используя выражение (17), получаем результат, который здесь подробно не будем обсуждать, поскольку он представляет интерес только для случая элюирования . Используя выражение (16), получаем

A^ = R7b[e(-L-l)], или

'"(20)

A^ = 2,3Z?7’lg[e^-l)].

Формула (20) может быть применена к замещаемому веществу So. Запишем поэтому мысленно AEo вместо ^F. Введем теперь в So заместитель X. В результате свободная энергия перехода AEo изменится на величину NFx- Другой заместитель Y будет приводить к изменению на величину АЕу. Если теперь принять, что одновременное введение X и Y приводит к аддитивному изменению и что аддитивность в случае введения нескольких X (например, тХ) или Y (например, nY) сохраняется, то получим следующее общее выражение для энергии перехода производного от So:

W lg [ q ^ -1) ] = AF0 + m\Fx + n№ + ...(21)

Откуда после преобразования получим

18<^-0"2^ + ^ + Й&+---+1еТ<211>

ИЛИ

Rm = ^о + mGx + nG-x 4- ... 4- G(22)

при

Rm = ^("H1") [45, 54, 55]. (Таблица пересчета

Rf в Rm и наоборот находится в конце книги.)

Go= \FOI2,?>RT Постоянная основной группы S* [54, 55]

Gy = \Fy(2^RT Постоянная груяпа ц(ц = Х, Y...)* [54, 55] G = lgl/pОсновная постоянная **

Применение величины Rm ,

Согласно формуле (22), величина Rm является линейной функцией числа одинаковых групп при постоянном числе остальных групп. Вклад определенной группы в величину Rm данного соединения должен быть поэтому независимым от молекулярного остатка и от положения этой группы в молекуле. Это, конечно, справедливо только приближенно. Поскольку отдельные группы влияют друг на друга, имеют место отклонения от этого. Хорошего согласия с формулой (22) можно ожидать, собственно говоря, только в гомологических рядах и только в той мере, в какой пространственное расположение гомологических структурных элементов обеспечивает одинаковую возможность сольватации, причем одновременно остаток молекулы в каждом члене ряда остается одинаковым. Таким образом, под гомологическим рядом в узком смысле слова подразумевается ряд нормальных карбоновых кислот, спиртов, сложных эфиров, аминов, аминокислот и т. д.; точно так же образуют гомологический ряд бензол, толуол, этилбензол, но не бензол, толуол и ксилол [56]. Щавелевая, малоновая, янтарная кислоты и т. д., согласно упомянутому критерию, также не образуют гомологического ряда, поскольку изменяется не только длина цепи, но и взаимодействие карбоксильных групп. В пределах подобных ограничений, как указывалось выше ***, требуемая, согласно (22), аддитивность часто подтверждалась экспериментально. При систематической обработке по формуле (22) можно ।

Если, например, So — бензол и X — С1 и в соответствии с этим производное представляет собой хлорбензол, то основной группой является бензол или фенил. Бензол и фенил поэтому не отличаются друг от друга.

* Отношение фаз q в случае хроматографии на бумаге или ХТС зависит, кроме • растворителя, также от бумаги или слоя. Поэтому величина G носит название постоянной бумаги или постоянной слоя [56].

** См. сноску 2 на стр. 104.

определить эмпирические константы, знание которых позволяет рассчитать величины Rт или Rf. Райхл [55], Парди [46] и Мур и Бейкер [57] обнаружили очень хорошее совпадение между рассчитанными и найденными значениями/?/. Шаузр и Булирш [58—60], введя некоторые практические оговорки, определили из обратной функции (22) вид и число функциональных групп в неизвестном соединении с известным значением Rf. -

Все константы в формуле (22) зависят от используемой «хроматографической системы» . Изменение системы связано, таким образом, с изменением величины Rm. Эта величина \Rm может быть разной в случае изомерных или эпимерных соединений. Мацек [61] показал на девяти примерах, что ^Rm для резерпоидов нормального ряда в системе формамид/форм- амид — формиат аммония на бумаге имеет значение 0,71—0,86; в случае резерпоидов изомерного ряда зта величина составляет &,38—0,48, и поэтому ее можно йспользоватв для определения строения (эпимерия у углеводородного атома № 3). Относительное постоянство величины R т внутри стерического ряда соответствует предположениям, положенным в основу вывода формулы (22); они выполняются тем лучше, чем отчетливее влияние, оказываемое эпимерией на форму молекулы. '

Изомерные соединения, т. е. соединения с идентичными структурными элементами,часто могут быть разделены хроматографически. Это не противоречит формуле (22), а, наоборот, является выражением различных взаимодействий со средой, которыми пренебрегают при выводе формулы (22). Теоретически это можно будет учесть только тогда, когда будет накоплено больше сведений в отношении взаимодействия со средой и взаимного влияния одинаковых, но различным образом расположенных структурных элементов. Эмпирическое изучение этой проблемы, однако, возможно уже сегодня; можно ввести в формулу (22) экспериментально определяемые константы изомерии и обобщить таким образом имеющийся материал [62].

Наконец, зависимость, выраженная формулой (22), позволяет прозталони- ровать материал слоя или бумагу различного качества, руководствуясь постоянными слоя или бумаги. Таким образом удается расчетным образом подобрать стандартные значения Rf [56, 63].

Исключения

Имеются случаи, где зависимость (22) странным образом не выполняется. Как указывалось, величина Rm иногда изменяется внутри гомологического ряда пропорционально логарифму числа гомологических структурных зле- ментов. Таким образом, влияние, приходящееся на один структурный зле- мент, падает с ростом молекулярного веса. Нам хотелось бы рассмотреть справедливость утверждения, согласно которому в таких случаях дело идет скорее не о распределительной, а об адсорбционной хроматографии и поэтому использование формулы (22), вероятно, ведет к ошибкам. В нашей лаборатории мы среди 20 исследованных примеров до сих пор обнаружили только один случай, который описывается б илогарифмической • зависимостью: зто случай с ДНФ-аминами (Cj — С5) на силикагеле Г, с бензолом в качестве растворителя. С другой стороны, всюду, где из химических соображений можно предположить распределительную хроматографию, удалось подтвердить зависимость (22). Это удалось, однако, лишь после того, как было установлено, что на хроматограммах в тонких слоях часто происходит разделение растворителя вследствие различной адсорбции его отдельных ком-

понентов (фронтальный анализ) и величины Rf не следует относить к переднему фронту растворителя. Впрочем, при учете этих обстоятельств и те примеры, в которых мы думали найти зависимости для Ra [62], могут быть сведены к чистой зависимости для Rm, согласно (22) [56].

Таким образом, прежде чем теоретически обработать величины Rf, следует, безусловно, иметь отчетливое представление о надежности экспериментальных данных. Особенно в случае более старых литературных данных это часто бывает невозможным. Поэтому к выводам, основанным на интерпретации литературного опытного материала , следует относиться с опреде- .ленной осторожностью. На задаче определения величин Rf мы остановимся .подробнее в следующем разделе.

Ш. ОСОБЕННОСТИ ХРОМАТОГРАФИИ В ТОНКИХ СЛОЯХ -

Хроматографический процесс может соответствовать разделительному процессу в лотке Сигнера лишь в том случае, когда условия опыта принципиально идентичны. При хроматографии в тонких слоях, в ее обычной ■форме, это предположение не выполняется: в начале опыта «колонка» не содержит растворителя и имеется возможность размытия вещества в результате поперечной диффузии. При теоретическом рассмотрении этим различием не следует пренебрегать. Аналогичная проблема возникает, естественно, и при хроматографии на бумаге. Излагаемый ниже анализ основан поэтому на опытах, проведенных обоими методами. Параллельно с этим имеются различия между хроматографией в тонких слоях и хроматографией на бумаге. Кратко коснемся также этого вопроса и в заключение укажем на практически важную связь между хроматографией в тонких слоях и колоночной хроматографией.■

СХОДСТВО С ХРОМАТОГРАФИЕЙ НА БУМАГЕа) Движение растворителя, распределение растворителя,*величины Rf и Rm

а) ОДНОКОМПОНЕНТНЫЙ РАСТВОРИТЕЛЬ

В разделе, относящемся к растворению хроматограммы (разд. I, стр. 98— 99), уже упоминалось, что движение растворителя и вещества при хроматографии в тонких слоях или при хроматографии на бумаге протекает во времени иначе, чем в лотке Сигнера. Причина заключается в том, что слой является сухим. Мы обнаруживаем в этом случае особую временную зависимость для движения фронта растворителя, изменяющееся распределение растворителя вдоль пути и в результате этого неравномерные относительные скорости перемещения хроматографируемых веществ. Последнее обстоятельство означает, что величины R^ меняются во время хроматографического процесса.

Движение фронта растворителя. Временная зависимость движения фронта растворителя определяется для данной хроматографической системы хроматографическим методом (восходящий, горизонтальный, нисходящий). Для ■случая горизонтальной и восходящей хроматографии на бумаге между пройденным фронтом путем z/и необходимым для этого временем t для короткого начального периода существует относительно простая зависимость: (z/)2 = a+6t,■

где а и b — константы [14, 65—68]. Мы смогли подтвердить эту зависимость на силикагеле (покрытые пластинки) в случае восходящего и горизонтального метода (см. рис. 58, а и б).

Из практики вытекает, что формулы, в которых предполагается равномерное движение фронта растворителя, неприменимы для определения числа теоретических тарелок при имеющихся в настоящее времй методах хроматографии в тонких слоях. Высота теоретической тарелки непостоянна. Она

Рис. 58. Скорости движения фронта растворителя при 20° на слоях с воздушиосухим силикагелем Г при горизонтальном (покровные пластинки [64], рис. 58, а) и восходящем (разделительная камера фирмы «Desaga», насыщение камеры, рис. 58, б) методах. Уменьшение скорости движения в случае горизонтальной методики следует, по-видимому, отнести на счет тормозящего эффекта фильтровальной бумаги, служащей в качестве мостика для подвода жидкости, а: 1 —диэтиловый эфир; 2 —диэтиловый эфир — уксусная кислота (95 + 5); з — этилацетат; 4 — бензол; 5 — четыреххлористый углерод; 6 — „-бутанол; б: 1 — диэтиловый эфир —■ уксусная кислота (95 + 5); 2 — четыреххлористый углерод; 3 — фенол — вода (75 г + 25/г).

Увеличивается при увеличении пройденного пути. Поэтому эффективность разделения наиболее высока в начале процесса. В этой связи следует еще раз напомнить, что расширение пятна в процессе движения вещества пропорционально Vt (см. разд. I, стр. 102).

Профиль растворителя. Как движение фронта растворителя, так и распределение растворителя вдоль пути зависят от хроматографической методики [67,68]. Гиддингс с сотрудниками [68] использовали для такого распределения название «профиль растворителя». Они исследовали некоторые профили при горизонтальной хроматографии на бумаге с радиальным и односторонним распространением растворителя. В этой связи особенно интересно одностороннее распространение, когда растворитель движется перпендикулярно линии старта. На рис. 59 для этого случая приведены кривые, соответствующие различным интервалам времени. Интересно и важно, что следующие друг за другом в течение хроматографического процесса профили могут быть сведены к общему, характерному для данной хроматографической системы , основному профилю. Для этого заменяют расстояние z из рис. 59 приведенным расстоянием zlzf. Здесь z обозначает расстояние- от линии старта (линия погружения) до наблюдаемой точки, a Zf — расстояние от линии погружения до фронта растворителя (рис. 60).

Из рис. 60 видно, что для каждой из наблюдаемых степеней смачивания бумаги имеется зона, которая, хотя и меняет при проявлении свое место, сохраняет, однако, свое положение относительно фронта. Вещество с любым

данным значением R}, которое начинает движение с общей линии старта одновременно с растворителем, будет обнаруживать в течение всего времени хроматографического процесса одинаковое отношение фаз р. Вещества с различными значениями Я/ попадают в зависимости от формы основного профиля на места с различным отношением фаз. Если линия старта растворителя (линия погружения) и линия старта вещества не совпадают (что обычно при проведении хроматографии на бумаге и хроматографии в тонких слоях),

Рис. 59. Распределение растворителя (профиль) в зависимости от времени и расстояния между линией старта (линия погружения) и точкой наблюдения (по Гиддингсу и др. [68]).Вода, ватман 3 мм.Рис. 59. Распределение растворителя (профиль) в зависимости от времени и расстояния между линией старта (линия погружения) и точкой наблюдения (по Гиддингсу и др. [68]).Вода, ватман 3 мм.2 ^f2 ^fРис. 60. Приведенное распределение растворителя (основной профиль) (по Гиддингсу и др. [68]).н-Бутанол, насыщенный водой, ватман 3 мм. Z^: О 40,5 см; х 30,0 см; △ 21,0 см.Рис. 60. Приведенное распределение растворителя (основной профиль) (по Гиддингсу и др. [68]).н-Бутанол, насыщенный водой, ватман 3 мм. Z^: О 40,5 см; х 30,0 см; △ 21,0 см.

Рис. 59. Распределение растворителя (профиль) в зависимости от времени и расстояния между линией старта (линия погружения) и точкой наблюдения (по Гиддингсу и др. [68]).

Вода, ватман 3 мм.

Рис. 59. Распределение растворителя (профиль) в зависимости от времени и расстояния между линией старта (линия погружения) и точкой наблюдения (по Гиддингсу и др. [68]).

Вода, ватман 3 мм.

2 ^f

2 ^f

Рис. 60. Приведенное распределение растворителя (основной профиль) (по Гиддингсу и др. [68]).

н-Бутанол, насыщенный водой, ватман 3 мм. Z^: О 40,5 см; х 30,0 см; △ 21,0 см.

Рис. 60. Приведенное распределение растворителя (основной профиль) (по Гиддингсу и др. [68]).

н-Бутанол, насыщенный водой, ватман 3 мм. Z^: О 40,5 см; х 30,0 см; △ 21,0 см.

то величина q для данного вещества в процессе хроматографического разделения не является более константой: в зависимости от расстояния между линией погружения и линией старта, формы основного профиля и природы вещества величина р быстрее или медленнее увеличивается от 0 донекото- рого постоянного конечного значения.

Скорость движения растворителя за фронтом; истинные и наблюдаемые значения Rf. Итак, вдоль основного профиля меняется не только отношение фаз р, но и в зависимости от р — локальная скорость растворителя. Произведение обеих величин, т. е. пропитка растворителем сечения, перпендикулярного направлению движения, уменьшается с увеличением отношения z : z/ [68]. Поэтому отношение фаз р и скорость движения растворителя даже в том случае, когда они в данном месте или в данный момент изменяются в противоположных направлениях, не просто обратно пропорциональны друг другу. Вследствие этого на измеряемую обычным методом величину Я/Набл какого-либо вещества сложным образом влияет ряд параметров. Было обнаружено, что Я/набл всегда меньше «истинной» величины Rt, определенной на основании выбранной модели (аппарат Сигнера) и положенной в основу соотношения (22), выведенного в разд. II. Разницатсоставляет приблизительно 10—20%.*

Чтобы это понять, необходимо рассмотреть элементарный'отрезок ds, пройденный пятном вещества при его движении; сумма таких отрезков составляет суммарный путь s, пройденный пятном вещества. Тогда

V ds^/набл —~~ ,(23)

—

причем s0 представляет собой расстояние между линией старта растворителя и точкой ■старта пятна вещества, z^ — суммарный путь, пройденный растворителем от старта до

фронта. Согласно, разд. I (стр. 95), величина Bf определена как отношение р двух расстояний ; если разделить оба расстояния на прошедшее с начала опыта время, то Вр выразится как отношение двух скоростей. Если теперь это отношение скоростей во время движения вещества непостоянно, то выражение, отнесенное к элементарному пути ds,. все еще соответствует указанному определению величины ,

_ Скорость движения вещества в данный момент / .......... . -

' Скорость движения растворителя в месте расположения пятна

Согласно разд. II (стр. 103), справедливо соотношение Bf = "у^^- [ср. формулу (16)].. Вследствие зависимости от величины q запишем это соотношение в следующей форме: Bf внутр= ^^,^7- " Rf внутр обозначает «внутреннюю» величину Л/ , определяемую, величинами К' и Q, в момент наблюдения. Очевидно, величина Bf ВНуТр и определенная, в разд. I величина Bf тождественны. Поэтому справедливо определение

Скорость движении вещества в данный момент/внутр Скорость движения растворителя в местерасположения пятна

Если вещество находится в точке z за фронтом, uz — скорость его движения в точке с и Vf — скорость движения растворителя в точке z, то можно написать

uz=vz-Rf внутр z*_(24}

vz отличается от скорости движения фронта растворителя Vf. Согласно Гиддингсу,

• .^^“Wp(25>

где -^— локальныйгде -^— локальныйкоэффициент, зависящий от положения; его численное значение-

где -^— локальный

где -^— локальный

всегда меньше 1. Из рис. 59 видно, что W представляет собой локальное распределение- растворителя. А т— переменный коэффициент пропорциональности, связывающий величину смачивания растворителем в любом месте хроматограммы со скоростью движения фронта vf, таким образом, смачивание растворителем в точке z представляет собой произведение AzVf. Гиддингс рассчитал величину А длн случая приведенного профиля на

в формулу (24), получимв формулу (24), получимА2 О “2=Р1 у^'ЛА2 О “2=Р1 у^'Л/ внутр, Z,/ внутр, Z,(26}(26}(27>(27>рис. 60 и привел численные значения величины для значений— отО до 1 (ср. рис. 4 в работе Гиддингса [68]; верхняя кривая с индексом с = 0). Подставив выражение (25}

в формулу (24), получим

в формулу (24), получим

А2 О “2=Р1 у^'Л

А2 О “2=Р1 у^'Л

/ внутр, Z,

/ внутр, Z,

(26}

(26}

(27>

(27>

и, умножив на dt,

dSZ"уу Rf внутр, z,c^z/-

Весь пройденный веществом путь s выражается, таким образом, интегралом .Фронт •

растворителя-

s= \Л/ внутр, z"dzf.(28}

Стартоваяточкавещества

Расстояние, пройденное растворителем от места старта вещества до фронта, равно

Фронт растворителяdzf —• zf —— Sq,Стартовая точка-

вещества

и, согласно выражению (23),.

’ Фронт растворителя

СAz тал

\w л у внутр, Z

г

■Стартовая точка

(29)*(29)*пвещества

(29)*

(29)*

•■ ^/набл-

Важно представить себе значение интегрируемой функции (29). При перемещении фронта на dz^ в точке z происходит перемещение растворителя на

^»zf [(ср. (25)] и, следовательно, перемещение пятна вещества на

■Д/ внутр, z ^Д ^z/ lcP- (27)].

Скорость движения фронтаСкорость движения фронтаyfyfСогласно выражению (26), интегрируемая функция соответствует отношению иг Скорость движения вещества в данный момент

Скорость движения фронта

Скорость движения фронта

yf

yf

Численное значение этого отношения — кроме таких постоянных, как К', и характеристик используемой хроматографической системы — определяется свойствами профиля в точке z.

В момент, когда движущийся фронт растворителя проходит точку старта пятна вещества, вследствие того что Qz = 0 и R/ внутр, 2 = 0, скорость движения вещества иг = 0. Непосредственно вслед за этим вещество приходит в движение (pz> 0, Лувнутр, z > 0). При иг > 0 и uz/vf > 0. Если мы проследим теперь за численным значением uz/vf при непрерывно увеличивающемся zy, то обнаружим, что его начальный рост постепенно затухает. В конце концов достигается конечное значение, которое при дальнейшей подаче растворителя остается постоянным. Это объясняется следующим.

При Zj в качестве единицы пути в процессе подачи растворителя линейный масштаб изменяется, подобно тому как изменялся бы масштаб, изготовленный из резины, длиной zy при растягивании со скоростью ир Метка, нанесенная в любом месте, изменяет при этом свое абсолютное (но не относительное) положение. Если положение метки опре

,1 z

делено заданным отношением z[zp то скорость перемещения метки составляет —• ир Пятно вещества, находящееся на этом же месте, будет двигаться, согласно выражению (26), со скоростью.

nAZ nА2 та- Z

Д/ внутр, z - у/- Если теперь уу Ду внутр, г

Поэтому абсолютное перемещение пятна вещества отличается от абсолютного перемещения рассматриваемой в данный момент метки (положение z/zy в Приведенном профиле). Пятно движется медленнее и находится поэтому в точке с меньшим значением z/zp Если это меньшее значение все же отличается от теперь уже истинного нового значения

^-•R^ внутр, z, то имеет место дальнейшее перемещение; это продолжается до достижения состояния

конечн. звачконечн. звач/внутр, Z «г ) wz уконечн. знач

конечн. звач

конечн. звач

Нанесенная в точке (z/zy) конечн. знач метка перемещается с той же скоростью, что и пятно вещества, которое больше не меняет своего положения в приведенном профиле. Определяемый величиной (z/zf) конечн. знач профиль в окрестности пятна вещества

остается постоянным, так же как и интегрируемая функция (29) и отношение скоростей uxJvj. Таким образом, достигнуто стационарное состояние.

Рассмотрим теперь еще раз уравнение (29). С увеличением интегрируемой функции от 0 до ^yyZ" Rf внутр’z ^ конеч. знач получаем

Ит Л/ набл= Г'-А- Rf внутр, z•(30)

г^т\ “zУконечн. знач

Как показал Гиддингс, на практике это конечное значение в большинстве случаев почти достигается при обычных условиях хроматографирования (расстояние линия погружения — старт <С расстояние старт — фронт растворителя). Если имеется возможность численно рассчитать величину (^^—^конечн. знач. то получают стационарное, истинное

значение Rf.

Rf ист — И/ внутр, конечн. знач —Rf ист — И/ внутр, конечн. знач —(31)(31)lim Rf набл

Rf ист — И/ внутр, конечн. знач —

Rf ист — И/ внутр, конечн. знач —

(31)

(31)

7 Az X

V Wz Уконечн. знач

или, проще,или, проще,Я/истЯ/истRfnaGaRfnaGa(32)(32)

или, проще,

или, проще,

Я/ист

Я/ист

RfnaGa

RfnaGa

(32)

(32)

к/набл

где

V wУд/набл Wz Уконечн. знач

Разумеется, каждое значение Лу внутр, z является «истинным» значением Л^. Величина R# Внутр. конечн. [определение (31)] имеет, однако, преимущество перед величиной Лу ист, ввиду того что она связана с отношением фаз Q, которое примерно одинаково для всех веществ, движущихся стационарно в средней области профиля (рис. 60). Если

конечн. знач можно определить в этой области , то величина Лу ист, согласно фор” z

муле (31), является основой, позволяющей с хорошим приближением провести количественное сравнение хроматографического поведения многих веществ. Ниже мы еще встретимся с эмпирическим соотношением, подобным соотношению (31) или (32).

Для непосредственного сравнения различие между 2?/набл и истинным значением Rf не,играет роли. Если необходимо, однако, установить зависимость между хроматографическим поведением и химическим строением (см. разд. II), то наблюдаемые величины Rf не являются надежной мерой коэффициента распределения^' и отношения фаз q и, следовательно, в формулу (16) их следует подставлять с осторожностью (см. ниже). Поэтому удивительно, что наблюдаемые при хроматографии на бумаге величины Rj (Rf набл) во многих случаях удовлетворяют зависимости Мартина дляДт . Согласно нашим данным, это справедливо также в отношении 7?/Набл на тонкослойных хроматограммах аминокислот (см. рис. 61) [56].

величина почти постоянна.величина почти постоянна.Чем объясняется это расхождение между теорией и практикой? Первое объяснение можно найти, сравнивая величины 2?/Набл, которые, согласно формуле (22), дают пригодные значения Rm, с величинами Rf набл. не удовлетворяющими соотношению (22). Справедливо правило, согласно которому при использовании соотношения (22) должно соблюдаться неравенство 0,1 < Rf набл < 0,7 [69]. Это как раз та область, в которой приведенный профиль растворителя является до известной степени горизонтальным (см., например, рис. 60). Предварительные исследования авторов, по-видимому,

величина почти постоянна.

величина почти постоянна.

Рис. 61. Линейная зависимость между Лт и числом СН2-групп в ряду «-аминокислот С2 — С8. Прямые регрессии являются расчетными [56].Рис. 61. Линейная зависимость между Лт и числом СН2-групп в ряду «-аминокислот С2 — С8. Прямые регрессии являются расчетными [56].Ометанол — вода 1 70 + 30; силикагель Г, А этанол — вода I восходящий метод (отно- 4- н-пропанол — I сительно методики см. водаJ [71])Каждая точка соответствует среднему значению из 18 наблюдений; 6 аминокислот хроматографировались каждая 2 раза на одной пластинке (любая последовательность) и опыт повторялся 9 раз. Добавление 2-, 4-, 8- или 16%-ной ледяной уксусной кислоты не оказывает влияния на линейность, но изменяет наклон и положение прямых.Ометанол — вода 1 70 + 30; силикагель Г, А этанол — вода I восходящий метод (отно- 4- н-пропанол — I сительно методики см. водаJ [71])Каждая точка соответствует среднему значению из 18 наблюдений; 6 аминокислот хроматографировались каждая 2 раза на одной пластинке (любая последовательность) и опыт повторялся 9 раз. Добавление 2-, 4-, 8- или 16%-ной ледяной уксусной кислоты не оказывает влияния на линейность, но изменяет наклон и положение прямых.

Рис. 61. Линейная зависимость между Лт и числом СН2-групп в ряду «-аминокислот С2 — С8. Прямые регрессии являются расчетными [56].

Рис. 61. Линейная зависимость между Лт и числом СН2-групп в ряду «-аминокислот С2 — С8. Прямые регрессии являются расчетными [56].

Ометанол — вода 1 70 + 30; силикагель Г, А этанол — вода I восходящий метод (отно- 4- н-пропанол — I сительно методики см. водаJ [71])

Каждая точка соответствует среднему значению из 18 наблюдений; 6 аминокислот хроматографировались каждая 2 раза на одной пластинке (любая последовательность) и опыт повторялся 9 раз. Добавление 2-, 4-, 8- или 16%-ной ледяной уксусной кислоты не оказывает влияния на линейность, но изменяет наклон и положение прямых.

Ометанол — вода 1 70 + 30; силикагель Г, А этанол — вода I восходящий метод (отно- 4- н-пропанол — I сительно методики см. водаJ [71])

Каждая точка соответствует среднему значению из 18 наблюдений; 6 аминокислот хроматографировались каждая 2 раза на одной пластинке (любая последовательность) и опыт повторялся 9 раз. Добавление 2-, 4-, 8- или 16%-ной ледяной уксусной кислоты не оказывает влияния на линейность, но изменяет наклон и положение прямых.

подтверждают то, что такой профиль образуется на слоях силикагеля при горизонтальном и вертикальном методах [56, 70]. Вещества, движущиеся в «горизонтальной» области профиля, попадают примерно на одно и то же отношение фаз q. Таким образом, выполняется основная предпосылка применимости соотношения (22). Дальнейшее объяснение дает следующее наблюдение. Если после прохождения пути в 10—15 см воспрепятствовать дальнейшему продвижению растворителя на слое силикагеля путем проведения разделительной черты, то поток растворителя прекращается не сразу. Профиль не исчезает даже через 24 час (восходящий метод), однако в значительной мере выравнивается. Все Rf Набл увеличиваются при этом с одинаковым коэффициентом (около 1,1) и стремятся, таким образом, к конечному значению [72]. Идеальное конечное значение было бы достигнуто при полном исчезновении профиля и, очевидно, являлось бы истинной величиной Rf согласно определению (16) (р всюду одинаково).

СВЯЗЬ Rm набл е Rm И Rm* АДДИТИВНОСТЬ Rm набл* ЕСЛИ ПрИНЯТЬ, ЧТО В об- ласти значений R} от 0,1 до 0,7 величины R^ в особенности вычисленные по отдельным наблюдаемым Я/Набл средние значения Rf, удовлетворяют зависимости

Rj набл^ = Rf ист, ,(33)* и если подставить постоянное значение коэффициента £ между 1,1 и 1,2, то можно показать, что соотношение

Rm набл — lg ( =1

''^/набл позволяет получить расчетное уравнение

X ист У которое довольно хорошо передает закон аддитивности и поэтому во многих случаях является практически пригодным [56].

Из формулы (21а), учитывая соотношение (33) и добавляя к обеим частям 1g |, получаем

<Я/наблЕ > 2,ЗЛТ+ 2.3ЛТg Q ’

где,

IgEC^-J—-^-IgC 'е)(34)

^■“/наблънабл ^1

И

ig (gJО^ф‘)+s(35)

* Обращает на себя внимание формальное соответствие с теоретически обоснованным соотношением (32). Эмпирический коэффициент £ соответствует также количественно почти постоянному в средней области профиля коэффициенту 1/^)в/ набл.

8 Заказ № 734

ИЛИИЛИRm — -Ятнабл + б, Rm— Rm + lg £ lcP- (22)].

ИЛИ

ИЛИ

б представляет собой ошибку, которую мы допускаем при замене левой части уравнения (216) легко вычисляемой величиной 1g 1\ Величину б,

^/набл '

являющуюся функцией £ и Д/Набл, следует определить из рис. 62 как разность между R^ и Rm набЛ для наиболее неблагоприятного случая £ = 1,2; R'm и 7?твабл изображены в виде полос для учета разброса при экспериментальном определении величин R}. Стандартное отклонение от R/ набл составляет в случае хроматограмм в тонких слоях и на бумаге

Рис. 62. Сравнение Ятнабл с «теоретической» величиной Я^ при различных значениях Яунабл с учетом ошибок измерения [56].См. текст и формулы (216), (34), (35).Рис. 62. Сравнение Ятнабл с «теоретической» величиной Я^ при различных значениях Яунабл с учетом ошибок измерения [56].См. текст и формулы (216), (34), (35).Число СНг- группЧисло СНг- группРис. 63. Сравнение рассчитанных №т набл) и визуально определенных прямых регрессии (Я^) для гомологического ряда а-аминокислот С2 -С8 [56].Эспериментальныё данные рис.67. Растворитель этанол — вода;R , дm набл.;т-Рис. 63. Сравнение рассчитанных №т набл) и визуально определенных прямых регрессии (Я^) для гомологического ряда а-аминокислот С2 -С8 [56].Эспериментальныё данные рис.67. Растворитель этанол — вода;R , дm набл.;т-тНабЛ 18(«/набл±3»я/набл ‘) '

Рис. 62. Сравнение Ятнабл с «теоретической» величиной Я^ при различных значениях Яунабл с учетом ошибок измерения [56].

См. текст и формулы (216), (34), (35).

Рис. 62. Сравнение Ятнабл с «теоретической» величиной Я^ при различных значениях Яунабл с учетом ошибок измерения [56].

См. текст и формулы (216), (34), (35).

Число СНг- групп

Число СНг- групп

Рис. 63. Сравнение рассчитанных №т набл) и визуально определенных прямых регрессии (Я^) для гомологического ряда а-аминокислот С2 -С8 [56].

Эспериментальныё данные рис.67. Растворитель этанол — вода;R , дm набл.;

т-

Рис. 63. Сравнение рассчитанных №т набл) и визуально определенных прямых регрессии (Я^) для гомологического ряда а-аминокислот С2 -С8 [56].

Эспериментальныё данные рис.67. Растворитель этанол — вода;R , дm набл.;

т-

Лт=1ё / —।—£ \ -

\ Rf набл±у 3sR/ набл

^=1, 2.

в среднем sR,набл = 0,0037 (18 отдельных значений); взятое выборочно среднее значение попадаете большой вероятностью в область Rf набл ± 0,011 [71].

Как видно, в пределах ошибки опыта величины Rm и R тиабл при 0,1 < К/набл < 0,3, совпадают, б увеличивается равномерно до Rf набл = = 0,6 и затем резко при R/ набл > 0,7. В области 0,1 <; К/набл < 0,6 величина Rm набл фактически представляет собой приближенное значение Rm- Применимость этой величины видна из рис. 63, где значения среднего примера рис. 61 еще раз сопоставлены (правда, в несколько другом масштабе) с соответствующими величинами R'm (£ = 1,2) и для всех величин

Р и с. 64. Величина Rm надл не является аддитивной, поскольку Rj набл, несмотря на разделение растворителя, обычно относят к переднему фронту [56,^70]..Р и с. 64. Величина Rm надл не является аддитивной, поскольку Rj набл, несмотря на разделение растворителя, обычно относят к переднему фронту [56,^70]..о — гомологический ряд а-аминокислот (глицин — а-аминокаприловая кислота); метанол!— вода — аммиак 34% (70 + 30 + *); силикагель Г; восходящий метод [71]; 6 — гомологический ряд К-2,4-динитрофениламивокислот (глицин-а-аминокаприловая кислота) в 4 многокомпонентныхо — гомологический ряд а-аминокислот (глицин — а-аминокаприловая кислота); метанол!— вода — аммиак 34% (70 + 30 + *); силикагель Г; восходящий метод [71]; 6 — гомологический ряд К-2,4-динитрофениламивокислот (глицин-а-аминокаприловая кислота) в 4 многокомпонентныхСиликагель Г, горизонтальный метод (закрытая пластинка) [64], ср. [71].Силикагель Г, горизонтальный метод (закрытая пластинка) [64], ср. [71].

Р и с. 64. Величина Rm надл не является аддитивной, поскольку Rj набл, несмотря на разделение растворителя, обычно относят к переднему фронту [56,^70]..

Р и с. 64. Величина Rm надл не является аддитивной, поскольку Rj набл, несмотря на разделение растворителя, обычно относят к переднему фронту [56,^70]..

о — гомологический ряд а-аминокислот (глицин — а-аминокаприловая кислота); метанол!— вода — аммиак 34% (70 + 30 + *); силикагель Г; восходящий метод [71]; 6 — гомологический ряд К-2,4-динитрофениламивокислот (глицин-а-аминокаприловая кислота) в 4 многокомпонентных

о — гомологический ряд а-аминокислот (глицин — а-аминокаприловая кислота); метанол!— вода — аммиак 34% (70 + 30 + *); силикагель Г; восходящий метод [71]; 6 — гомологический ряд К-2,4-динитрофениламивокислот (глицин-а-аминокаприловая кислота) в 4 многокомпонентных

Силикагель Г, горизонтальный метод (закрытая пластинка) [64], ср. [71].

Силикагель Г, горизонтальный метод (закрытая пластинка) [64], ср. [71].

ошибка измерения изображена равной ±3 sRm. Аппроксимирование R'm с помощью Я щ набл удовлетворительное в отношении аддитивности и весьма хорошее в отношении наклона регрессионных прямых; вертикальное смещение 6 незначительно. Таким образом, наш анализ показывает, что J? nt набл в пределах необходимой экспериментальной точности для средних значений Rf является аддитивной величиной, которая может быть заменена величинами Rm или R'm. Это подтверждают соответствующие эмпирические данные.

Можно было бы думать при сравнении J? m набл с Rm на рис. 63, что всегда возможно осуществить замену 1g (=—1) величиной lg(= —

R/ наблR/ набл

—У и определить, в случае надобности, лучшие значения £ (лучшая линей-

растворителях

+ хлороформ — этилацетат — ледяная уксусная кислота (80 + 20 + 1);

О хлороформ — метанол — ледяная уксусная кислота (95 + 5 + 1);

д толуол — ледяная уксусная кислота (90 + 10);

• Диэтиловый эфир — ледяная уксусная кислота (95 + 5).

ность), т. е. как можно лучше использовать соотношения (22) и (216). Мы считаем это ввиду принятых нами допущений (горизонтальный профиль, R/ наблI = ^/ист) неверным. Приведенное выше исследование преследовало единственную цель защитить эмпирически полученные значения Rm от критики строгой теории. Соотношение Мартина (22) в хроматографии в тонких слоях вряд ли удастся использовать в такой же степени, как в газовой хроматографии; было бы, однако, неправильным совершенно отказаться от возможностей, вытекающих из действительной аддитивности Дтнабл- . '

Эта аддитивность при известных условиях обнаруживается там, где ее совсем не ожидают. В случае примеров, приведенных на рис. 64, а и 64, б, величины Л m набл Для членов гомологических рядов лежат определенно не на прямых. Причина этого заключается не в несостоятельности теории,

а в неучете осложнений, возникающих в результате хроматографического разделения применяемых комбинированных растворителей (фронтальный анализ). Обычно измеряемые величины Rj (Rf Набл) не удовлетворяют больше предположению [ср. формулу (33)1

Я/ист = 112Я/набл.-

У) МНОГОКОМПОНЕНТНЫЙ РАСТВОРИТЕЛЬ; ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕРАСТВОРИТЕЛЯ

Комбинированные растворители при попадании на сухой адсорбент(актив- ный тонкий слой или заполненная хроматографическая колонка) частично разделяются на составляющие компоненты. Это явление хорошо известно ; соответствующий процесс лежит в основе специальной хроматографической аналитической методики, созданной Тизелиусом и получившей название «фронтальный анализ» [75—78].

Несколько фронтов растворителя. Разделение основано на том, что компоненты в соответствии с их адсорбционными коэффициентами и концентрациями постепенно поглощаются адсорбентом из движущегося растворителя. Таким образом, фронт изменяет свой состав. Через некоторое время — иногда очень быстро — полностью исчезает один компонент (задний фронт), затем второй (второй задний фронт) и т. д. до тех пор, пока не останется только последний компонент, который движется дальше не изменяясь (передний фронт). Из сосуда с растворителем непрерывно подается свежий растворитель. От линии погружения до заднего фронта, который в свою очередь движется, смоченный адсорбент находится в равновесии с растворителем постоянного состава. Далее, до второго заднего фронта следует зона, которая находится в равновесии с растворителем, содержащим на один компонент меньше, и т. д. Растворитель из п компонентов образует, таким образом, как правило, п различных зон, которые отделены друг от друга (п — 1) фронтами. Обозначим их, начиная спереди, а-, £-, у-, ... со-фронтами. Если aZf, Hf, ^z# и т. д. представляют собой пути, пройденные соответствующими фронтами к моменту наблюдения, a -др и т. д. — их скорости перемещения, то упрощенно можно записать

d^z<daZf.

Т =или.

d^ZfdaZf

•^Г = к^^Г’ или ^f-kr«zf.

k6, kv, кю — коэффициенты замедления, которые при умножении на скорость перемещения со-фронта дают скорости остальных фронтов.

Растворитель, состоящий из двух компонентов, взаимодействие которых незначительно, можно рассматривать как идеальный раствор одного компонента в другом. В этом случае состав целесообразно выражать через концентрацию см в молярных процентах. Зависимость между концентрацией см (сильнее) сорбирующегося компонента, его адсорбционным коэффициентом и коэффициентом к^ можно вывести из изотермы адсорбции Фрейндлиха [70]:

^С-^— i)=«-Ug^.(36)

где х и $ — константы; х содержит адсорбционный коэффициент Фрейндлиха и отношение фаз. В системе бензол — пиридин (область концентраций 1—42 мол.% пиридина) и толуол — ледяная уксусная кислота (область концентраций 2—32 мол.% ледяной уксусной кислоты) мы смогли экспериментально подтвердить зависимость (36) [70].

При применении горизонтальных воздупшосухих слоев (относительная влажность воздуха 40%) силикагеля Г толщиной 0,3 мм получены следующие значения констант при 20°:'

-.х С

Бензол—пиридин0,65 0,84

Толуол—ледяная уксусная кислота 0,910,82

При см = 5 мол.% к^ = 0,32 (толуол — ледяная уксусная кислота) или 0,47 (бензол — пиридин). Таким образом, компонент растворителя (даже при небольшом процентном содержании) при соответствующем соотношении полярностей может оказывать существенное влияние на p-фронт, обусловливая высокое значение к^. Если компоненты отличаются по полярности менее сильно, чем в приведенных выше примерах (как в проявителе спирт — вода), то значения к^ становятся еще значительно больше.

• Образованные в результате разделения фронты только в редких случаях заметны непосредственно (рис. 65), однако могут быть легко обнаружены,

ot- Фронт

ДНФ-н-Амиламин фДНФ-н-Пропиламин •ДНФ-н-Амиламин фДНФ-н-Пропиламин •

ДНФ-н-Амиламин ф

ДНФ-н-Пропиламин •

ДНФ-н-Амиламин ф

ДНФ-н-Пропиламин •

д. фронту-Фронтд. фронту-Фронт

д. фронт

у-Фронт

д. фронт

у-Фронт

2,4-Динитрофенол ДНФ-а-Аминомосля- ная кислота ДНФ-Аланин

ДНФ-Гпицин Ди - ДНФ-гистидин

'. «Линия погружения

Рис. 65. Разделение проявителя при горизонтальном тонкослойном хроматографировании (покрытые пластинки [64]) смеси 2,4-динитрофенола и некоторых 2,4-динитро- фенильных производных ДНФ-соединений в хлороформе — метаноле — уксусной кислоте (95 + 5 + 1) [70]. .

Нанесено несколько проб смеси веществ на непрерывно увеличивающемся расстоянии от линии погружения. Точки старта лежат, таким образом, на прямой, проходящей из левого нижнего угла в правый верхний, а-, 0- и у-фроиты видны при освещении УФ-светом. Зоны, разделенные фронтами, обнаруживают различный состав проявителя; чистый хлороформ между а- и 0-фронтом (а-зона), хлороформ — метанол между 0- и у-фронтом (0-зона), хлороформ — метанол — ледяная уксусная кислота между у-фронтом и линией погружения (у-зона).

если подробнее рассмотреть хроматографическое поведение соответствующих веществ и их смесей.

Растворитель хлороформ — метанол — ледяная уксусная кислота (95 + 5 + 1) образует на силикагеле один а-, один р- и один у-фронт. В соответствии с этим на хроматограмме в этом растворителе образуется одна а-зона (СНС13), одна p-зона (СНС13 — СН3ОН) и одна у-зона (СНС13 — СН3ОН — — СН3СООН) (95 + 5 + 1). Путь, пройденный каким-либо веществом при хроматографическом разделении, зависит от того, с какой зоны оно начало свое движение, как быстро и как долго оно двигалось с этой зоной и не тормозилось ли оно при своем движении одной или несколькими зонами. На рис. 65 приведены некоторые примеры. При подобранной точке стар

та и подобранном составе хроматографической смеси веществ последовательность разделения растворителя выявляется особенно четко.

Полярные вещества (динитрофенол, ДНФ-аминокислоты) практически приходят в движение лишь тогда, когда у-фронт настигает данную точку старта. Таким образом, они движутся почти исключительно в у-зоне; поэтому их величины Яу набЛ имеет смысл отнести к какому-либо расстоянию точка старта — у-фронт (эталонный путь). Мы обозначаем такие величины как ^Rf набл- Если стартовые точки лежат на наклонной прямой (наклонная линия старта), то конечные точки, определяемые для каждого вещества произведением V7?/Ha6n X эталонный путь, также должны лежать на наклонной прямой (соединительная прямая) . В точке пересечения наклонной линии старта с соединительной прямой пройденный путь равен нулю. Эта точка должна лежать на фронте у-зоны; она определяет положение у-фрон- та. В самом деле на рис. 65 у-фронт приблизительно проходит через точку пересечения 6 кривых: наклонной линии старта, соединительной прямой пятен ДНФ-гистидина, соединительной кривой пятен ДНФ-глицина и т. д.

Менее полярные вещества (ДНФ-амины) приходят в движение, уже когда a-фронт достигает точки старта. Поскольку эти пятна двигаются исключительно в a-зоне, обе соединительные прямые с хорошим приближением сходятся в точке пересечения наклонной линии старта и a-фронта (рис. 65). При этом при нахождении обычным способом величин Н} в качестве эталонного пути допускается использование расстояния точка старта —а-фронт. Мы обозначаем такое значение Н} через “Яунабл и придерживаемся этого обозначения и дальше, когда выбор расстояния до a-фронта в качестве эталонного расстояния является уже неверным. Растворителем в a-зоне хроматограммы, приведенной на рис. 65, является чистый хлороформ. Это легко доказать, проводя хроматографическое разделение ДНФ-амиламина и ДНФ-пропиламина с чистым хлороформом в качестве растворителя: величины Rf набл идентичны величинам “7?/Набл, полученным в описанных выше опытах.

(3-Фронт на рис. 65 не играет роли, поскольку все содержащиеся в смеси вещества двигаются либо впереди, либо позади (3-зоны. Точка старта внутри этой зоны не настигается у-фронтом; поэтому полярные соединения просто остаются на месте. То же справедливо для полярных соединений с точками старта между (3- и а-фронтами.

Из сказанного выше следует, что обычные измерения величин Яу при использовании расстояния точка старта — a-фронт в качестве эталонного пути могут привести к значениям Ду, не имеющим физического смысла. Таким образом, неправильно относить движение вещества к а-фронту и характеризовать величиной “ДуНабл, если вещество движется не с а-зо- ной . Правильным эталонным расстоянием для измерения величин R, является расстояние между точкой "старта и (3-фронтом или точкой старта и у-фронтом, если вещество движется в [3- или в у-зоне. Предпосылкой пригодности измеренных таким образом значений Rf (мы обозначаем их, как уже указывалось, через рДуНабл или тДунабл) является условие, чтобы вещества во время всего процесса хроматографического разделения двигались практически только в рассматриваемой зоне.

Резкие фронты образуются прежде всего в том случае, когда выравнивание концентраций в паровой фазе так или иначе уменьшается. Это в первую очередь справедливо для покрытых пластинок, поэтому они были использованы в опыте, приведенном на рис. 65. Если работать, используя в разделительной камере восходящую методику, фронты размываются тем сильнее, чем больший объем занимает газовое пространство. С увеличением газового пространства увеличивается, естественно, запас растворителя в паровой фазе, способствующий выравниванию концентрации. При больших запасах пара определяется только состав растворителя за со-фронтом и при теоретическом анализе используется только величина “Я/ набл- -

Аддитивность величин ^Rm и 'Rm. Рассмотрим данные, представленные на рис. 64, а и б, с этой новой точки зрения. Точки, соединенные кривыми,

Рис. 66. Величина Нт аддитивна, так как при определении величины Rf надл учтено разделение растворителя (см. текст) [56, 70].

а — условия опыта соответствуют рис. 64, а; растворитель из 3 компонентов, наблюдаются только фронты а и у; Rf набл = ^Rf набл- 6 — условия опыта соответствуют рис. 64, 6; растворитель из 2 компонентов: оба фронта наблюдаются. Rf набл “PRf набл; растворитель из 3 компонентов; все фронты наблюдаются, Rf набл = ’vRfHa6a. ~

должны лежать на прямых. Они не лежат на прямых, поскольку величины й/набл, лежащие в основе расчета Rm, были условно отнесены к а-фронту. Однако еСЛИ Вместо аД/набл ПОДСТаВИТЬ Величину РД/набл или У^/набл> т0 получим

1) ИЛИ Y/?m = lg<- ^1Y

набл 7V Я/набл7

Если нанести полученные результаты на график в ■ зависимости от числа СН2-групп, то оказывается, что в интервале от 1 до 6 СН2-групп точки лежат

на прямой (рис. 66, а и б) [56, 70]. Отклонение для соединения с 7 СН2-группами следует приписать ненадежности определения Rf в области Rf ~ 1.

При условии правильно найденной величины Rf Набл соотношение Мартина (22) применимо также в определенных случаях при разделении комбинированного растворителя. _ ■ ■

Если подставить, согласно (33), ШД/Иабл£ = ш-^/ист, то часто можно заметить, что величина | близка к 1. Величины ^Rf иабл примерно до значений 0,95 дают аддитивные величины BRm. Очевидно, наблюдавшееся в случае a-фронта раннее уменьшение отношения фаз в данном случае начинается лишь в непосредственной близости к фронту.

Допустимое и недопустимое использование измеренных обычным образом величин Rf. Вернемся еще раз к рис. 65. Если измерить для находящихся в у-зоне пятен величины aRf Иабл, то можно заметить, что они изменяются с изменением отношения линия погружения — точка старта: линия

а'd

Рис. 67. Разделение растворителя из 2 компонентов. Пятно вещества движется за p-фронтом (а) или перед p-фронтом (б) [70].

погружения — а-фронт. Весьма полезно подробнее рассмотреть эту зависимость и связь между aRf иабл и отнесенной к истинному фронту величиной Rf. Наиболее наглядны эти соотношения в случае разделения растворителя, состоящего только из двух компонентов.1 На рис. 67, а и б схематически изображены соответствующие хроматограммы. На рис. 67, а пятно вещества в момент наблюдения движется позади, а на рис. 67, б — впереди р-фронта.

Если обозначить расстояние линия погружения — старт через s0, расстояние старт — a-фронт через А, расстояние старт — p-фронт через В и расстояние старт — средняя точка- пятна через С, то, согласно рис. 67, а [70], весь путь растворителя azy = zf = А 4-8ь; путь, пройденный р-фронтом, ^Zf = k6Zf = В + s0; далее, аб

Я/набл А ВkB"zf — so , ап _ k6'zf—so 6d/07Х

"r"—— —И ■“/набл — „„ -“/набл, (б/)

л/набл —у

aRf иабл достигает своего максимального значения при s0 = 0. Таким образом, “Я/иабл не может превысить величину

Rf макс = k^Rf иабл-(37 а)

^Rf набл при Данном Pz/ практически не зависит от s0. Правда, и здесь необходимо вести расчет по локальным, изменяющимся степеням пропитки (ср. рис. 59 и 60). Возможно, однако, что отношение фаз вблизи линии разделения менее сильно изменяется, чем вблизи а-фропта.

Любое различие между “Я/набл и “Л/макс можно наглядно выразить в виде отношения этих двух величин. Оно равно '

■—s0 .■

Rfмакс^p Я?набл

В результате преобразования получаем

. набл

макс s0/ЧЯ\

Я у набл1

,нмакс

Согласно выражению (38), отношение “Л/Набл : “Л/Макс является функцией параметра к& и неременных solzf. На рис. 68 это изображено графически, причем “Л/набл отложено непосредственно в процентах от "Л/макс- Практически важной является область абсцисс от 5 до 20 (длина пути 18— 4 см при s0 = 1 см).

Таблица 8

Неточность при измерении и сравнении двух средних (из 8 отдельных измерений) значений Я/ (см. текст)

(X р8

Kf набл

Возможная процентная ошибка а

0,022-100

* СГ5/о

набл

ORf набл 8

Возможная процентная ошибка а ± 0,022-100

°Rf набл

0,9

2,5

' 0,5

4,5

0,8

2,8

0,4

5,6

0,7

3,2•

0,3

7,5

0,6

‘3,8

0,2

11,3

а При сравнении табличных значений с значениями, взятыми из рис. 68, следует обратить внимание на то, что аЯ/набл всегда меньше hg. z

Первое следствие из рис. 68. Процентное изменение “Лунабл при переходе от значения абсциссы 5,2 к значению 9,1 (рис. 68) при Ар.> 0,5 лежит в пределах ошибки измерения (табл. 8) и поэтому им можно пренебречь. Если

расширить область абсцисс от 5,2 до 20, то это справедливо еще при /гр > 0,9. По другую сторону указанной границы величина "В, набл заметно зависит от отношения линия погружения — старт: линия погружения — сс-фронт.

Р и с. 68. Зависимость 'Ор набл от отношения расстояний линия погружения — старт: линия погружения — фронт (s0 : zy) при разделении растворителя (2 компонента) и движении вещества за Р-фронтом [70].

к^ представляет собой отношение скоростей движения а-и р-фронта.

Второе следствие из рис. 68. В области абсцисс 5,2—9,1 при ?Сц> 0,85 величины °Я/пабл и aRf макс в пределах ошибки опыта совпадают (ошибка

измерений > При

2%) и не зависят от s0 : Zf.

aR fields“Kf макс И aRf макс = ^p 9 ^f набл(37a)

справедливо

также приближение

Если теперь

6ВПЮ6Л-^Н/ИСТ,(стр. 120)

тогда

"S/набл^ у % ист-(39)

или

“Л/наблё' ^%ист.(39а)

В отличие от | д' относится к хроматографической системе с разделяющимся растворителем [70]. Причисленном значении V, находящемся в интервале 1—1,2, из соотношения (39а) можно получить те же выводы, что и из

соотношения (33). Действительно, следует предположить, что аддитивность величин Rm на рис. 61 или рис. 63 объясняется фактической правильностью соотношения (39а).

Использованный в этих экспериментах растворитель, несомненно, также подвергается разделению. Хотя p-фронты не заметны, их можно обнаружить методом, иллюстрированным рис. 65. Они лежат вследствие близости свойств спирта и воды вблизи а-фронта. Для смеси метанол — вода (70 + 30), например для Ар, было получено значение 0,95 [56]. Упомянутая в подписи к рис. 61 добавка ледяной уксусной кислоты, без сомнения, вызывает образование незаметного у-фронта, который также должен соответствовать высокому значению Av.

Обратимся в заключение к изображенному на рис. 67, б случаю.

“R/набл = ^ (см- СТР‘ ^20) и, следовательно, также

-Rf наблВ = Rf ист-(33)

В процессе хроматографического разделения отношение s0 : z/ уменьшается, при этом возможны три случая.'

(3-Фронт не может догнать пятно, поскольку

^пятна ZZp-фронта (^ СКОРОСТЬ),

Я/ набл 2> ку.

Наблюдаемая в случае комбинированного растворителя величина “R/набл в течение всего опыта остается равной величине R/набл, которую находят, когда вещество хроматографируется только быстро перемещающимся компонентом растворителя.

Пятно перемещается на постоянном расстоянии от [3-фронта, поскольку

Ипятна = ^-фронта,Rf набл = ку.

Как и выше, нет отличия от хроматографического разделения в чистом компоненте данного растворителя.

Расстояние между пятном и [3-фронтом уменьшается, поскольку

Ипятна < Му-фронта,

R/набл < ку

и фронт догоняет пятно, когда

ку— “Я/ набл

Относительная скорость перемещения пятна -Ли5™_ изменяется. В предель- ма-фронта

ном случае она соответствует относительной скорости перемещения [3-фронта (PRy = 1); обычно она меньше (6R# < 1). Так или иначе при наблюдении после окончания опыта уже нельзя легко подобрать для пятна разумную величину R}.

Практические правила. Резюмируя, можно сказать следующее относительно определения значения Rf в случае разделения комбинированного растворителя [70]. Вещества, движущиеся перед [3-фронтом, не подвергаются влиянию процесса разделения растворителя. Величину aRf набл определяют обычным способом. Величина aRm является аддитивной.

При движении веществ за p-фронтом следует различать несколько случаев.

к6 > 0,85. Можно пренебречь p-фронтом и определять величину “й/набл обычным способом. Величина aRm является аддитивной.

«Нижняя граница» < к6 < 0,85, причем нижнее значение должно лежать между 0,2 и 0,4. Если движение вещества начинается лишь после того, как P-фронт перейдет точку старта, следует определять ^Д/Набл? величина РДт является аддитивной. Если, однако, заметное движение начинается уже раньше, то никакое разумное измерение величины Rf невозможно.

кв < меньше «нижней границы». В этом случае можно хорошо определить величину РД/набл> однако соответствующая величина Rm не является аддитивной. ,

Если, кроме p-фронта, имеется еще и у-фронт, то соотношения не являются наглядными; на опыте придерживаются при этом правил 1—3.

Если пятна движутся за ю-фронтом, то справедливы правила 1—3 с кЙ вместо кв; поэтому вначале следует определить кЙ июД/набл- Соотношения являются справедливыми в той мере, в какой состав проявителя соответствует его составу в сосуде, содержащем растворитель.

б) Количественная оценка хроматограмм в тонких слоях

Количественный расчет колоночных хроматограмм не вызывает затруднений. Если при разделении веществ на хроматографической колонке в любой момент удается измерить без ошибок концентрацию веществ в элюате, достаточно построить графические зависимости концентраций от объемов и пропланиметрировать полученные кривые. В случае кривых Гаусса планиметрирование можно заменить двумя измерениями длины. Площадь F равна '

F — wi/2h • Чг ^"^2 = W1/^-1,0645,

где h — высота пика концентрационной кривой; wi/2 — ширина кривой, измеренная на половине высоты. Площади под кривыми пропорциональны количеству вещества. '

В случае хроматографии в тонких слоях и хроматографии на бумаге положение оказывается более сложным. Можно, конечно, разделить хроматограмму на сегменты, каждый из которых промыть растворителем, определить концентрацию отдельных злюатов и дальше поступить, как описано выше. Если имеются окрашенные пятна, то методика упрощается, поскольку вместо сегментов можно элюировать отдельные пятна. Неокра- йтенные вещества прежде всего следует сделать видимыми. Если этот процесс выявления вещества связан с химическими реакциями, которые приводят к колориметрируемому окрашенному веществу, то необходимы уже особые предосторожности, чтобы гарантировать стехиометрические или по крайней мере пропорциональные превращения *. Все зто является чрезвычайно утомительным и нё идет ни в какое сравнение с изяществом качественного анализа методами хроматографии в тонких слоях и хроматографии на бумаге. Часто поэтому предпочитают измерять пятна «in situ», т. е. по возможности связывают их величину и интенсивность с количеством вещества.

Нам хотелось бы предпослать применяемым здесь методам краткое теоретическое рассмотрение этого вопроса. При этом предположим — что само собой разумеется только для окрашенных веществ — пропорциональность

. * См., например, [79].

между интенсивностью окраски и количеством вещества. В идеальном случае пятна веществ на бумажных и тонкослойных хроматограммах имеют эллиптическую форму [80]. Распределение вещества меняется не только (как в случае элюатов колоночной хроматографии) в направлении потока, но и перпендикулярно ему. Это основано на возможности протекания поперечной диффузии, отсутствующей в «закрытых» колонках.

При этом целесообразно исходить из идеализированного представления о распределении плотности окраски внутри пятна и рассчитать, каких результатов можно ожидать при определении концентрации по интенсивности окраски и при определении по площади пятна. Отклонения реально наблюдаемого по сравнению с идеализированными предположениями можно иногда легко обнаружить и затем учесть при оценке надежности метода измерения.

Предположим, что для случая тонкослойных и бумажных хроматограмм при условии точечного нанесения пробы и эллиптической формы пятна [80]:

оптически измеряемое поглощение пропорционально плотности вещества в пятне;

распределение плотности веществу Y вдоль осей эллипса хиу является гауссовским:1

«ау2

V = ke 2^ и ^ = ке2ои ;

время t в параметрах.

сг^У 2ZM,

Dx — «коэффициент диффузии» в направлении ж;

.oy = V2Dyt ,

Dg — «коэффициент диффузии» в направлении у для сравниваемых пятен одинаково.'

Денситометрия. Денситометры имеют измерительную щель или измерит тельную точку. Важно, чтобы измеряемая плотность окраски в области этого отверстия была не слишком неравномерной. Для денситометрии пятен веществ на хроматограммах имеется точечный измерительный элемент (например, очень маленький кружок). Если вести эту точку вдоль одной из осей эллипса пятна, то расчет показывает, что при строгом выполнении требований 1—3 площадь получающейся кривой поглощения пропорциональна количеству вещества.

Если необходимо сравнивать пятна с различными временами разделения, то требование 3 (см. выше) уже больше не выполняется. В случае эллиптических пятен можно ожидать пропорциональности между количеством вещества и выражением ; Fx и Fu -- площади под кривыми ^макс

поглощения, полученными при промере пятен вдоль осей эллипса, а ЕмаКс — поглощение в общей вершине кривых (средняя точка эллипса). ■

В некоторых встречающихся на практике случаях пятна имеют не эллиптическую форму. Несмотря на это, указанная пропорциональность может существовать, если соответствующим образом выбрать линии промера. В случае часто встречающихся серпообразных пятен целесообразно выбрать ось симметрии. Совершенно неравномерные пятна лучше, пожалуй, измерить, используя измерительную щель, длина которой должна примерно соответствовать диаметру пятна; требуется тщательная калибровка. Ее следует провести во всем исследуемом интервале концентраций.

Измерение площади пятна. Визуально определяемый непосредственно или после фотографической репродукции край пятна соответствует, очевидно,

переходу от уже более не определяемой к еще заметной небольшой, всюду одинаковой плотности окраски. Площадь определенного таким образом «эллипса» пропорциональна при условии выполнения требований 1—3 (см. выше) логарифму количества вещества [80]; коэффициент пропорциональности представляет собой константу для данного вещества и данной хроматографической системы при постоянных времени и температуре. С точки зрения измерительной техники проще всего и практически наиболее целесообразно [80] использовать в качестве меры площади эллипса произведение осей. В случае неравномерных пятен подобные измерения представляют собой большой произвол. В таких случаях особенно важно применять калибровку и учитывать ошибки измерения.

Опыт показал, что в широкой области логарифм количества вещества пропорционален корню квадратному из площади пятна [83]. Практически площадь пятна увеличивается с ростом количества вещества быстрее, чем требует теория. Это отклонение объясняется, без сомнения, запаздыванием установления концентрационного равновесия между подвижной и неподвижной фазами: чем больше количество вещества, тем, очевидно, длительнее это запаздывание (пока все количество вещества в точке старта не придет в движение). Измерение площади пятен по сравнению с денситометрией имеет, пожалуй, то преимущество, что при окрашивании хроматограммы можно обойтись воспроизводимостью окраски только на границе пятна, где избыток реактива наибольший.

Следует подчеркнуть, что изложение в данном разделе ограничено положениями, справедливость которых связана с неоднократно упоминаемыми предположениями. На практике в каждом случае необходима критическая проверка. Упоминавшаяся статья Гиддингса [80] содержит литературный обзор опытных данных по измерению площади пятен на бумажных хроматограммах. Результаты из области хроматографии в тонких слоях описаны в гл. 6, стр. 52 (см. также [83]).

РАЗЛИЧИЕ МЕЖДУ ХРОМАТОГРАФИЕЙ В ТОНКИХ СЛОЯХИ ХРОМАТОГРАФИЕЙ НА БУМАГЕ

Практические преимущества хроматографии в тонких слоях силикагеля известны. Они обусловлены главным образом — это касается хроматографического процесса разделения — меньшим расширением пятен веществ (см. рис. 39, 159, 160). В результате этого:

уменьшается минимально определяемое количество хроматографируемых веществ;

становится возможным осуществить разделение на меньшем расстоянии;

как следствие б), время, необходимое для хроматографического анализа, значительно сокращается.

Можно было бы искать причину более слабой тенденции к расширению пятен в принципиальном различии между силикагелем и целлюлозой. Специально полученный порошок целлюлозы дает, однако, тонкие слои,

свойства которых ближе к свойствам тонких слоев силикагеля, чем к свойствам фильтровальной бумаги. Это заставляет предположить, что отличие силикагеля от бумаги носит скорее количественный, чем качественный характер. Согласно нащим представлениям, Особенности фильтровальной бумаги в первую очередь следует объяснять их волокнистой структурой. Хорошо известно, что вдоль поверхности раздела возможно быстрое перемещение вещества. Действующей силой является изменение поверхностного натяжения. В противоположность порошкам волокна обладают продольными сплошными поверхностями, вдоль которых может происходить распространение пятна. Под действием диффузии преодолевается лишь пространство между волокнами. В случае порошков диффузия является единственным возможным механизмом расширения пятна. В случае порошкообразных веществ, обладающих большой удельной поверхностью, рассматриваемое явление может осложняться повышенной поглотительной способностью.

Предположение, согласно которому различие состоит в том, что хроматография в тонких слоях основана на адсорбции, а хроматография на бумаге — скорее на распределении между жидкими фазами, кажется нам маловероятным. Согласно нашим опытам, преимущества хроматографии в тонких слоях сохраняются при переходе от растворителей, способствующих адсорбции, к растворителям, для которых можно предположить распределительный механизм.

СВЯЗЬ С КОЛОНОЧНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ

Известно, что по поведению вещества при хроматографии на бумаге можно составить примерную картину его поведения на целлюлозных колонках . Первым, легко выполнимым условием является выбор сравнимых отношений количества вещества и количества бумаги или целлюлозного порошка. Вторым, труднее реализуемым условием надежного сравнения является одинаковая скорость движения и одинаковое распределение подвижной фазы вдоль разделительного слоя . Это условие наверняка не выцолняется, если, как обычно, применять колонку, предварительно пропитанную растворителем [79]. В принципе то же самое относится к попыткам в целях увеличения пропускной способности по веществу перейти от тонких слоев к колонкам с силикагелем. В последнее время разработан, однако, вариант колоночной хроматографии [81], позволяющий считать более или менее выполненным также и второе из упомянутых условий. Это! вариант характеризуется тем, что растворитель, как и в случае горизонтальных тонких слоев [64], проникает в силикагель исключительно под действием капиллярных сил после полного смачивания, как и в случае проточной методики [64] с закрытыми пластинками. Затем он перемещается дальше вследствие испарения в конце колонки. Как показывает практика, во многих случаях, согласно Дану и Фуксу [81], величины Ду для закрытых нластинок сравнимы с величинами для колонки. Поэтому зависимости на колонке должны быть особенно близки к зависимостям на закрытых пластинках, поскольку и в том и в другом случае понятие насыщение камеры не имеет смысла.

ДОПОЛНЕНИЕ. ВЫТЕСНЕНИЕ И ИОННЫЙ ОБМЕН НА ХРОМАТОГРАММАХ " ‘В тонких слоях

Вещества с близкими значениями Дп поглощение которых основано на одинаковом механизме, оказывают влияние друг на друга при распределении между подвижной и неподвижной фазами. При этом наблюдаются явле-

128’•Обгцая часть. <"^ ния вытеснения, которые особенно отчетливо выступают при хроматографировании вещества А в постепенно возрастающем количестве с добавкой одного и того же количества сопутствующего вещества В (Ду, А С Ду, в). При этом пятно А, увеличивается и вытесняет собой пятно В, причем измеряемое значение R} (Rf Набл) сопутствующего вещества постоянно увеличивается. -.’-

Силикагель в ограниченной степени обладает свойствами ионообменника, что будет рассмотрено подробнее в главе, посвященной неорганической хроматографии в тонких слоях. При хроматографическом разделений солеобразных органических соединений ионообменные свойства проявляются прежде всего в том, что соли часто расщепляются на кислоты и основания, которые затем перемещаются независимо друг от друга. Разбавление растворителем, естественно, способствует этой диссоциации. Поэтому для гидрохлоридов наблюдают значения Rf, равные значениям Ду для свободных оснований. То же самое справедливо для щелочных солей карбоновых кислот; Например, цезиевая соль 2, 4-динитрофенилглццина в кислых, нейтральных или основных растворителях дает точно такое же пятно, как и свободный 2,4-динитрофенилгдицин, плюс пятно цезия на точке старта (обнаружено методом радиоавтографии Cs134) [70].

Соли поливалентных кислот или оснований дают вследствие возможности частичного расщепления несколько пятен; это последнее явление (сложные пятна) в прицципе наблюдается в том случае, когда вещество встречается в нескольких формах (различная степень ионизации, образование комплекса, таутомерия). Этот вопрос подробно рассмотрен Йегером, Рамелем и Шиндлером [82], а также ;Келлером и Гиддийгсом [13].'.

ОБОЗНАЧЕНИЯ

А — расстояние старт— а-фронт;

АОбр — обратимая работа;

-^—коэффициент пропорциональности между локальной скоростью растворителя и скоростью ■ фронта;.

а, b— коэффициенты;

R — расстояние старт — р-фронт;

Ъ—ширина полос;

С — расстояние старт — центр пятна; '

с — концентрация; .

с — используемый Гиддингсом параметр распределения;

см — концентрация в мол. %;

су(г) — концентрация в камере № г после прохождения постоянного оъема V = ит — ~-;

с0 — исходная концентрация в пробирке (тарелке, - камере) № 1;

сг — концентрация в пробирке (тарелке, камере) № г;‘

с (V) — концентрация раствора, вытекающего из ^отка Сигнера, после прохождения объема F,

сп (V)—c(V) при числе камер п;

с'т — произвольная концентрация в подвижной фазе:

Сд — произвольная концентрация в неподвижной фазе;

Dx—коэффициент диффузии в направлении ж;

Dv — коэффициент диффузии в направлении у; d—путь, пройденный максимумом полосы;

ЕмаКс— поглощение окрашенного пятна в максимуме; F — площадь под кривой c(F) (Гаусс);

РХЛ„

„ f — площади под кривой поглощения;

/ (z) — степень перекрывания;

G, Go, Gy— константы соотношения Мартина;

Н — высота теоретической тарелки = ВЭТТ (высота, эквивалентная теоретической тарелке);

h—высота вершины кривой c(F) (Гаусс);

К — коэффициент распределения или адсорбции, не зависящий от концентрации (последний ■ можно рассматривать как не зависящий от концентрации только в случае очень малых концентраций);.

К' — К при известном точном механизме распределения (хроматографическая колонка);

Ар, k4, kto—коэффициенты замедления;

' L — длина хроматографической колонки;

М— среднее (ожидаемое) распределение Пуассона;

Мо — навеска вещества;

Мг макс — количество вещества на участке колонки с наибольшей плотностью вещества;

Му (г)— количество вещества в камере № г (лоток Сигнера) после прохождения объема F;

п — число камер;

п' — эффективное число камер;

р—доля общего количества вещества, находящаяся в подвижной фазе камеры (теоретической тарелки, отрезка колонки);

р' — р в случае неизвестного точно механизма распределения (хроматографическая колонка);

q— доля общего количества вещества, находящаяся в неподвижной фазе камеры (теоретической тарелки, отрезка колонки);

R— газовая постоянная;

Ra—величина Rm при ассоциации;

R/ — определение см. стр. 13;

R/ набл — условно измеренная величина Rf /Путь, пройденный веществом А .

V Путь, пройденный фронтом / ’

Rf набл — среднее значение из отдельных величин Rf набл;

■Rf внутр — «внутреннее» значение Rf,

Rf внутр., конечн. знач — конечное значение переменной величины Rf внутр!

Rf ист — Rf внутр, конечн. знач!

9 Заказ .№ 734

“7?/набл, РД/набл "Я/набл — условно измеренная величина Rb отнесен. ная к а-, 0- и ©-фронтам; '

“Я/набл, ЭЛ/ набл • • • “Rf набл — среднее значение из отдельных величин а7?/набл, ^Rf набл, • Rf набл>,

■ aRt мякг. — верхняя граница “7?/набл при исчезающем з0;

SRfист, yRfист ••• 0Rfист — истинные значения R}, отнесенные к 0-, у- й ©-фронтам;

Rm= 1g (’Rm набл Rm ИЗ Rf набл,

Rm — среднее значение из отдельных значений Rm; 7?m=7?m + lg|;

aRm, ^Rm • • • ^Rm—рассчитанное из aRb sRf... “7?/значение 7?m;

r — номер камеры (тарелки, сегмента);

гмакс—г с максимальной плотностью вещества;

So— замещаемое вещество;

з — путь, пройденный веществом;

з0 — расстояние линия погружения — старт;

sRf набл — стандартное отклонение от 7?/Набл;

sRm — стандартное отклонение от Rm;

'Т— абсолютная температура в °К;

t — время; и — скорость протекания;

иг — скорость пятна в точке z;

У— объем, протекший с начала опыта;

У в—ширина полосы в единицах объема;

Уд — удерживаемой объем (хроматографическая ■ колонка);

Уг—объем при фракционировании (описывается с (У) по Гауссу);'

Ут, нспр—исправленное значение Уг;

Гмакс —объем, протекший (лоток Сигнера) до максимума концентрации, идентичный удерживаемому объему;-

vp — объем растворителя внутри хроматографической колонки;

Vf — скорость фронта растворителя;

vm — общий объем подвижной фазы в лотке Сигнера; '

vs — общий объем неподвижной фазы в лотке Сигнера; .-■

иг — скорость растворителя в точке z;

wi/2— ширина кривой Гаусса на половине высоты вершины;

Z —параметр разделения;-.

z— расстояние от линии старта растворителя до наблюдаемой точки вдоль пути растворителя;

zy — путь, пройденный фронтом растворителя;

®Zp Szp ... ®Zp — путь, пройденный а-, 0- и ©-фронтом; -а-, 0-, Y- • • • ©-Фронт—обозначение фронтов при разделении раство-рителя;

Д— половина видимой ширины полосы;

'Д/1— обратимая работа (энергия перехода) при

стандартных условиях;'1

Д/’о — Д/1 для замещаемого вещества So;■

Д^х, Д^¥ — изменение энергии перехода вследствие введения заместителей (X, Y ...) в Se;

Д/’р. — изменение свободной энергии перехода AFa вследствие введения заместителя р в замещаемое вещество So;

AG — свободная энтальпия при переходе вещества из жидкой в газовую фазу;

ARm— изменение Rm при изменении хроматографи- -ческой системы;4

Дут, ДР — объемная поправка;"

, б—ошибка в определении R^, обусловленная применением Я/набл!-

С, х— коэффициенты;

■| — поправочный коэффициент для Я/набл!

^ — ^ при разделении растворителя; р — отношение фаз;

q' — изменяющееся отношение фаз;

2 = ^вещество А 4“ ^вещество В> о — среднее отклонение от нормальной функции - распределения (стандартное отклонение);

т— независимая переменная в нормальной функции распределения;*

Ф (и) — интеграл ошибок;

Y — плотность вещества; ю — скорость перемешивания; ю—скорость движения.

ЛИТЕРАТУРА

М а г t i n A. J. Р., Endeavour, 6, 21 (1947).

Giddings J. С., J. Chromatog., 2, 48 (1959).

M a r t i n A. J. P., Synge R. L. M., Biochem. J., 35, 1358 (1941).

Weissberger A., Technique of organic chemistry, Vol. 3, p. 529—311, Interscience Publishers Inc., 1950.

W i 1 s о n J. N., J. Am. Chem. Soc., 62, 1583 (1940).

W a u 1 t D. d e, J. Am. Chem. Soc., 65, 532 (1943).

Gliickauf E., Disc. Faraday Soc., 7, 12 (1949).•.

S m i t W. M., Disc. Faraday Soc., 7, 38 (1949).

Gliickauf Ё., Trans. Faraday Soc., 51, 34 (1955).

Gliickauf E., Trans. Faraday Soc., 51, 1540 (1955).1

-■-9*

Deem ter J. J. van, Zuiderweg F. J., Klinkenberg A., Chem. Eng. Sci., 5, 271 (1956).

G i d d i n g s J.C., J. Chromatog., 2, 44 (1959).

К e 11 e rR.A.,Giddings J. C., J. Chromatog.,3,205(1960).

R u о f fA. L., G i d d i n g s J. C., J. Chromatog.,3, 438(1960).

В о g u eD.C.,Anal. Chem., 32, 1777. (1960).

Hamilton P. B., Bogue D. C., A n d e r s о n R. A., Anal. Chem., 32, 1782

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.

(1960).

Giddings J. C., J. Chromatog., 5, 46 (1961).

Signer R., Allemann K., Kohli E., Lehmann W., M e у e r H., Ritschard W., Dechema-Monograph., 27, 32—44 (1956).

Handbook of Chemistry and Physics, 38. Aufl. Cleveland, Ohio, Chemical Rubber Publishing Co., 1956—1957.

Biochemisches Taschenbuch, Berlin — Gottingen — Heidelberg, Springer, 1956.

Hadwiger H., Experientia, 9, 391 (1953).

Meyer H., Diss., Universitat Bern, 1956.

Кейлеманс А., Хроматография газов, Издатинлит, 1959.

Hecker E., Verteilungsverfahren im Laboratorium, S. 87. Weinheim, Verlag Che-

25.

26.

mie, 1955.

Spackman D. H., Stein W. H., Moore S., Anal. Chem., 30, 1190 (1958).

Stepanov V., Handschuh Г , ‘’" ‘ . " 'T " '.1 ..

626 (1961).

В e n n i c h

Wieland

Claesson

H a g d a h 1

H a g d a h 1

Alm R. S., (1952).

К a u m a n

Khan M.

D., Anderer F. A., Z. Naturforsch., 166,

H., Biochim. et Biophys. Acta, 51, 265 (1961).

Th., Merz H., Chem. Ber., 85, 731 (1952).

S., Arkiv Kemi Mineral. Geol., A24, 16 (1947).

L., Acta Chem. Scand., 2, 574 (1948).

L., Sci. Tools, 1, 21 (1954).

Williams R. J. P., Tiselius A., Acta Chem. Scand., 6, 826

W. G., Bak A., Nature, 182, 743 (1958).

A., Nature, 186, 800 (1960).

Kieselbach R., Anal. Chem., 32, 880 (1960).

Giddings J. C., J. Chromatog., 5, 61 (1961).

Pohloudek-Fabini R., W о 11 m a n n, Pharmazie, 15, 590 (1960). Moore S., S t e i n W. H., Ann. N>Y. Acad. Sci., 49, 265 (1948).

Martin A. J. P., Biochem. Soc. Symposia (Cambridge, Engl.), 3, 4 (1950). Martin A. J. P., Ann. Rev. Biochem., 19, 518—520 (1950).

Kovats E., Helv. Chim. Acta, 41, 1915, 1928 (1958).

Shriner R. L., F u s о n R. С., C u r t i n D. Y., The Systematic identification of organic compounds, 4ed., New York, John Wiley and Sons Inc., 1956, Chap. 6.

—._F r a n c J., J о к 1 J., J. Chromatog., 2, 423 (1959) и более ранние работы.

Kovats Е., Helv. Chim. Acta, 42, 2709 (1959).

Bate-Smith E. C., W e s t a 11 R. G., Biochim. et Biophys. Acta, 4, 427 (1950).

38.

39.

40.

41.

42.

43.

Pardee A. B., J. Biol. Chem., 190, 757 (1951).

Gasparic J., V e с e r a M., Collection Czechosl. Chem. Commun., 24, 1822 (1959).

R о u x D. G., Evelyn S. R., J. Chromatog., 1, 537 (1958).

Grebenovsky E., Z. anal. Chem., 185, 290 (1962).

J a m e s A. T., Martin A. J. P., Biochem. J., 50, 679 (1959).

Ray N. H., J. Appl. Chem., 4, 21 (1954).

J a m e s A. T., Biochem. J., 52, 242 (1952).

, 52, 242 (1952).

Kovats E., Z. anal. Chem., 181, 351 (1961).

French D., Wild G. M., J. Am. Chem. Soc., 75, 2612 (1953).

R e i c h 1 E. R., Monatsh. Chem., 86, 69 (1955).

‘~*Basel,1962.

P a t a к i G., Diss., Universitat

Moore T. B., Baker C. G.,

Schauer H. K., Bulirsch

59. Schauer H. K., Bulirsch

J. Chromatog., 1, 512 (1958).

R., Z. Naturforsch., 10b, 683 (1955).

R., Naturwiss, 43, 34 (1956).

R., Z. Naturforsch., 13b, 327 (1958).

60. Schauer H. K., Bulirsch

K., Experientia, 17, 162 (1961).

Pataki G., Helv. Chim. Acta, 44, 1420 (1961).

Pataki G., Helv. Chim. Acta, в печати.

M а с e к

В r e n n e

В r e n n e

В r e n n e

Muller

r M.

r M.

i M., Niederwieser A., Experientia, 17, 237 (1961).

R. H., Clegg D. L., Anal. Chem., 23, 296 (1951).

Kowkabaly G. M., Cassidy H. G., Anal. Chem., 22, 817 (1950).

Wood S. E., Strain H. H., Anal. Chem., 26, 260 (1954).

G i d d i n g s J. C., S t e w a r t G. H., Ruoff A. L., J. Chromatog., 3, 239

r M

69. Franc J., J о к 1 J., Collection Czechoslov. Chem. Commun., 21, 1161 (1956).

70. Niederwieser A., Diss., Universitat Basel, 1962.

Brenner М., Niederwieser A., Pataki G., Fahmy, A. R., Ехре- rientia, 18, 101 (1962).■

Brenner M., Niederwieser A., Experientia, 16, 378 (1960).

Boman H. G., Nature, 170, 703 (1952).

Bungenberg de Jong H.‘ G., H о о g e v e e n J. Th., Proc. Acad. Sci. (Amsterdam), Series В 64, 1, 18, 167, 183 (1961); 63, 228, 243, 383 (1960).

Tiselius A., Arkiv Kemi, Mineral. Geol., 14 B, Nr. 22 (1940).

Claesson S., Arkiv Kemi, Mineral. Geol., 23 A, Nr. 1 (1946).

Claesson S., Arkiv Kemi, Mineral. Geol., 24 A, Nr. 7 (1947).

Griffiths J., J ames D., Phillips C., Analyst, 77, 897 (1952).

Brenner M., Vetterli A., Helv. Chim. Acta, 40, 943—949 (1957).

Calvin J., Giddings J. С., К e 11 e r Roy A., J. Chromatog., 2, 626 (1959).

Dahn H., Fuchs H., Helv. Chim. Acta, 45, 261 (1962).

J a g e r H., R a m e 1 A., Schindler O., Helv. Chim. Acta, 40, 1310 (1957).

3. Purdy S. J., Truter E. V., Chern, and Ind., 1962, 506.

СПЕЦИАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 9

ВВЕДЕНИЕ

Э* Шталь

При работе со смесями веществ весьма важно применение соответствующих методов разделения и обнаружения. Простейший и чаще всего используемый метод разделения основан на различии растворимости веществ в жидкостях. Так, например, неизвестная многокомпонентная смесь веществ может быть легко разделена на липофильную и гидрофильную части. Используя другие методы разделения, делят смесь на группы веществ, т. е. на смеси

I Разделяемая смесь

Рис. 69. Схема зависимости трех основных параметров хроматографического процесса, рассмотренная на примере адсорбционной хроматографии {124].

Объяснения см. в тексте.

с довольно близким составом. В настоящее время, прежде чем перейти к длительным и требующим затрат методам, часто для дальнейшего разделения используют хроматографию.

В качестве быстрого метода, сначала для ориентации и затем уже для точного анализа, все чаще используют хроматографию в тонких слоях (ХТС). Благодаря возможности изменения как разделительных слоев, так и растворителей в этом случае удается исключительно быстро решать многие задачи разделения. Следует, однако, отчетливо представлять себе, что и этот метод никоим образом не является универсальным. При наличии сложных смесей в идеальном случае — исходя из пространственных- соображений — на одной хроматограмме можно обнаружить максимум 20 пятен веществ. Поэтому в случае сложных смесей целесообразно проводить предварительное ^фракционирование. '

Казалось целесообразным последующие специальные разделы расположить в соответствии с Липофильным и гидрофильным характером групп

веществ, т. е. начать с липидов и-закончить данную книгу рассмотрением гидрофильных соединений .

Внутри групп веществ в большинстве случаев рассматриваются вначале менее полярные соединения, а затем более полярные. Этот принцип расположения непосредственно вытекает из метода. Вспомним здесь наглядно представленную на рис. 69 зависимость между тремя основными параметрами хроматографического процесса. Это схематическое изображение базируется в первую очередь на опытных данных адсорбционной хроматографии, которые могут быть сформулированы следующим образом.

.1. РАЗДЕЛЯЕМАЯ СМЕСЬ

Насыщенные углеводороды либо совсем не адсорбируются, либо адсорбируются в очень малой степени и поэтому движутся в слое наиболее быстро. Ненасыщенные углеводороды адсорбируются тем сильнее, чем больше в них содержится двойных связей и чем больше имеется при этом сопряженных связей.-

В этом случае для разделения следует использовать наиболее активный ' адсорбент и малополярный растворитель. Другой возможностью является «обращение фаз», при этом неподвижная фаза пропитывается липидом и в качестве подвижной фазы используется гидрофильный растворитель.

Если вводят в углеводород функциональные группы, то адсорбционное сродство повышается в следующем порядке:

—СН3, —О—алкил, >С=О, —NH2, —ОН, —СООН

На слоях силикагеля или окиси алюминия при применении в качестве растворителя, например, бензола простые или сложные эфиры располагаются в верхней части хроматограммы, кетоны и альдегиды примерно в середине, спирты ниже, а кислоты остаются в точке старта. Таким образом, последовательность разделения соответствует полярности соединений. Органические кислоты и сильные основания можно хроматографировать либо в виде их . менее полярных производных, либо применяя кислые или основные растворители.--

РАСТВОРИТЕЛЬ

. Растворители можно расположить по их «элюирующему» действию в так называемые элюотропные ряды [128]. И здесь, очевидно, имеется непосред-

' ственная зависимость между полярностью и элюирующим действием. В качестве отправной точки для оценки полярности можно использовать величину диэлектрической проницаемости и поэтому она также приведена в табл. 9.

СОРБЕНТ'

В принципе и сорбенты можно расположить в ряд, причем различают сорбенты с высокой адсорбционной активностью и сорбенты с незначительной активностью. Подробности приведены в разделе «сорбенты» (стр. 37).

Для начинающего существующие здесь зависимости легко понять из изображенной схемы, которая может оказаться полезной в той или другой форме: при этом надо себе представить, что заштрихованный треугольник

.Таблица 9

Элюотропный ряд

7•

Растворительа

Температура кипении (при 760 мм pm. cm.)

**С

Диэлектрическая проницаемость е (20°)

н-Гексан

68,7

1,890

Гептан

98,4

1,924

Циклогексан

81,4

2,023 —

Четыреххлористый углерод . . .

76,8

2,238

Бензол

80,1

. 2,284

Хлороформ

61,3

4,806^

Диэтиловый эфир

34,6

4,34 .

Этилацетат . . .

77,1

6,026

Пиридин .. .

115,3

12,3 6

Ацетон

56,5

20,7 6

Этанол

78,5

24,306

Метанол .. . .

64,6

33,62

Вода

100

80,37

а О других растворителях см. Blochem. Taschenbuch, Springer-Ver- lag, Berlin — Gottingen — Heidelberg, 1956; Handbook of Chemistry and Physics, Chemical Rubber Publishing Co., Cleveland, Ohio, 1959.

6 При 25°. '

ГЛАВА 10

АЛИФАТИЧЕСКИЕ ЛИПИДЫ

X. Мамгол/ьд

I. ВВЕДЕНИЕ

НЕЙТРАЛЬНЫЕ ЛИПИДЫ И ПРОДУКТЫ ИХ ГИДРОЛИЗА

Углеводороды с длинной цепью, спирты, альдегиды и кислоты широко распространены в растительном и животном царстве.■

Н3С—(СН2)Я—СН3Н3С—(СН2)Я—СН3Углеводород Н1Н3С-(СН2)Ж„-С< ' ХОАльдегидУглеводород Н1Н3С-(СН2)Ж„-С< ' ХОАльдегидН3С—(СН2)Ж—СН3ОНСпирт,0Н3С-(СН2)Ж,„-С< хонКислотаН3С—(СН2)Ж—СН3ОНСпирт,0Н3С-(СН2)Ж,„-С< хонКислотаж, х' • • • >8ж, х' • • • >8

Н3С—(СН2)Я—СН3

Н3С—(СН2)Я—СН3

Углеводород Н1

Н3С-(СН2)Ж„-С< ' ХО

Альдегид

Углеводород Н1

Н3С-(СН2)Ж„-С< ' ХО

Альдегид

Н3С—(СН2)Ж—СН3ОНСпирт

,0

Н3С-(СН2)Ж,„-С< хон

Кислота

Н3С—(СН2)Ж—СН3ОНСпирт

,0

Н3С-(СН2)Ж,„-С< хон

Кислота

ж, х' • • • >8

ж, х' • • • >8

В каждом из этих 4 классов липидов содержатся насыщенные и одно- и многократно ненасыщенные вещества с прямой и разветвленной цепью. Известны также бифункциональные соединения, например эпокси- и оксикислоты.

Спирты, альдегиды и кислоты встречаются в природе в основном в связанном виде. Спирты образуют с кислотами воски (сложные эфиры):

Н

Н3С-(СН2)Я-С—О-С-(СН2)Я,-СН3.

Н II

О■

Сложный эфир

Особенно широко распространены соединения алифатических спиртов, альдегидов и кислот с глицерином. Спирт и глицерин образуют эфир. Альдегиды образуют с глицерином полуацетали или виниловые эфиры, а кис

лоты -г моноглицериды, диглицериды и триглицериды:лоты -г моноглицериды, диглицериды и триглицериды:н нН2С—О—С—С—(СН2)Я—сн3 | н ннс—онН2С—онПростой эфир глицеринаН2С"—О—с—(СН2)Я—сн3L 0нс₽ — онн нН2С—О—С—С—(СН2)Я—сн3 | н ннс—онН2С—онПростой эфир глицеринаН2С"—О—с—(СН2)Я—сн3L 0нс₽ — онН2С“'—он а-МоноглицеридН2С“'—он а-МоноглицеридН2с—О— С—(СН2)Ж—сн3НС—О— с—(сн2)ж,—сн3Н2с—О— С—(СН2)Ж—сн3НС—О— с—(сн2)ж,—сн3н2с—о—с=сн(сн2) ,—сн3 | нНС—онН2С—ОН■Простой виниловый эфир'Н2С—О—С—(СН2)Ж—сн3II о НС—О—С—(СН2)Ж,—сн3I оН2С—он а,Р-Диглицерйдн2с—о—с=сн(сн2) ,—сн3 | нНС—онН2С—ОН■Простой виниловый эфир'Н2С—О—С—(СН2)Ж—сн3II о НС—О—С—(СН2)Ж,—сн3I оН2С—он а,Р-Диглицерйд

лоты -г моноглицериды, диглицериды и триглицериды:

лоты -г моноглицериды, диглицериды и триглицериды:

н н

Н2С—О—С—С—(СН2)Я—сн3 | н н

нс—он

Н2С—он

Простой эфир глицерина

Н2С"—О—с—(СН2)Я—сн3

L 0

нс₽ — он

н н

Н2С—О—С—С—(СН2)Я—сн3 | н н

нс—он

Н2С—он

Простой эфир глицерина

Н2С"—О—с—(СН2)Я—сн3

L 0

нс₽ — он

Н2С“'—он а-Моноглицерид

Н2С“'—он а-Моноглицерид

Н2с—О— С—(СН2)Ж—сн3

НС—О— с—(сн2)ж,—сн3

Н2с—О— С—(СН2)Ж—сн3

НС—О— с—(сн2)ж,—сн3

н2с—о—с=сн(сн2) ,—сн3 | н

НС—он

Н2С—ОН■

Простой виниловый эфир'

Н2С—О—С—(СН2)Ж—сн3

II о НС—О—С—(СН2)Ж,—сн3

I о

Н2С—он а,Р-Диглицерйд

н2с—о—с=сн(сн2) ,—сн3 | н

НС—он

Н2С—ОН■

Простой виниловый эфир'

Н2С—О—С—(СН2)Ж—сн3

II о НС—О—С—(СН2)Ж,—сн3

I о

Н2С—он а,Р-Диглицерйд

Н2С—О —С—(СН^—СН3

О

Триглицерид

Простые эфиры глицерина, виниловые эфиры и моноглицериды могут находиться в а- и p-форме. Диглицериды могут быть построены симметрично (а, а') или асимметрично (а, р).

Простые и виниловые эфиры глицерина в природе встречаются в этери- фицированном виде, как алкоксидиглицериды и «альдегидогенные триглицериды» (нейтральные плазмалогены). Триглицериды кислот с длинными цепями являются основной составной частью жиров и масел — они являются «жирами» в узком смысле этого слова.

ФОСФОЛИПИДЫ, СУЛЬФОЛИПИДЫ И ГЛИКОЛИПИДЫ

В фосфолипидах одна из гидроксильных групп глицерина этерифициро- вана фосфорилхолином, фосфорилэтаноламином или фосфорилсерином. Эта- ноламинфосфолипиды существуют в следующих трех формах:

Н НН2с—О—С—С—(СН2)Ж—сн3 | н нНС—О —С—(СН2)Я—сн3Н НН2с—О—С—С—(СН2)Ж—сн3 | н нНС—О —С—(СН2)Я—сн3Н2С—РАН2С—РАН2С—О—С = С—(СН2)Ж—сн3 | н ннс—О—С—(СН2)Я,—сн3II оН2С—РАН2С—О—С = С—(СН2)Ж—сн3 | н ннс—О—С—(СН2)Я,—сн3II оН2С—РА

Н Н

Н2с—О—С—С—(СН2)Ж—сн3 | н н

НС—О —С—(СН2)Я—сн3

Н Н

Н2с—О—С—С—(СН2)Ж—сн3 | н н

НС—О —С—(СН2)Я—сн3

Н2С—РА

Н2С—РА

Н2С—О—С = С—(СН2)Ж—сн3 | н н

нс—О—С—(СН2)Я,—сн3

II о

Н2С—РА

Н2С—О—С = С—(СН2)Ж—сн3 | н н

нс—О—С—(СН2)Я,—сн3

II о

Н2С—РА

АлкоксимоноглицеридфосфатидАлкоксимоноглицеридфосфатидВиниловый эфир моноглицеридфосфатида

Алкоксимоноглицеридфосфатид

Алкоксимоноглицеридфосфатид

Н2С—О—С—(СН2)Ж—СН3

НС—О—С—(СН2)Я, — сн3

Н2С—РА

Диглицеридфосфатид (коламин-кефалин) РА — фосфорилэтаноламин:

О tн н

— О— Р—о—с—с—nh2|н н

0-

Следует принять; что и холинфосфолипиды, и серинфосфолипиды могут находиться в форме алкоксимоноглицеридов, виниловых эфиров, моноглицеридов и диглицеридов.

Глицерилфосфорилхолин, глицерилфосфорилэтаноламин и глицерилфос- форилсерин, которые этерифицированы только одним кислотным остатком и благодаря этому содержат свободную гидроксильную группу, носят название лизосоединений. В качестве примера приведем лизолецитин

Н2С —О —С—(СН2)Ж —СН3

НС —ОН

О

t НН /снз

Н2С—О —Р—О —С—С — N+Z-CH, I Н н \ =

Лизолецитин

Фосфатидные кислоты образуют группу фосфолипидов, не содержащих основания. Они встречаются в природе, по-видимому, в виде продуктов

гидролиза холин-, этаноламин- и серинфосфатидов: Н2С—О — С-(СН2)Ж—СН3

НС-О —С —(СН2)Ж—сн3-

■Н2СО—Рг>0

\ 0_

а-Фосфатидная кислота .■

Фосфатидилглицерин, кардиолипин и фосфо инозит также не содержат оснований:' '

Н2С— О-С—(СН2)Ж-СН3 н2с—он

НС — О — С—(СН2)Ж- — СН3 НС—ОН

о

о

Н2С— оН2С— орроосн2сн2Н3С—(СН2)Ж—С—О -СН2Н3С—(СН2)Ж—С—О -СН2ооо—Фосфатидилглицерино—ФосфатидилглицеринН2С-О — С—(CH2V— снэН2С-О — С—(CH2V— снэоо

Н2С— о

Н2С— о

р

р

о

о

сн2

сн2

Н3С—(СН2)Ж—С—О -СН2

Н3С—(СН2)Ж—С—О -СН2

о

о

о—

Фосфатидилглицерин

о—

Фосфатидилглицерин

Н2С-О — С—(CH2V— снэ

Н2С-О — С—(CH2V— снэ

о

о

Н3С - (СН2)Ж- — с — о — снН3С - (СН2)Ж- — с — о — снНС—О—С—(СН2)Х—сн3НС—О—С—(СН2)Х—сн3

Н3С - (СН2)Ж- — с — о — сн

Н3С - (СН2)Ж- — с — о — сн

НС—О—С—(СН2)Х—сн3

НС—О—С—(СН2)Х—сн3

н н н

Н2с—О —Р —О—С —С—С—О —Р —о—сн2

Н2С—О —С—(СН2)Ж —СН3Н2С—О —С—(СН2)Ж —СН3КардиолипинКардиолипин•| Н | Н Iо- он о-

Н2С—О —С—(СН2)Ж —СН3

Н2С—О —С—(СН2)Ж —СН3

Кардиолипин

Кардиолипин

НС—О —С—(СН2)Ж-—СН3

II

О оононо

t/X1"

Н2С —ОРо/0Н..( —о —Р —OR)

.in<Lh^~

Фосфатидилинозит и дифосфоинозит

Сфингомиелины—другая группа фосфолипидов—построены из многоатом- . ного аминоспирта, например сфингозина, фосфорилхолина и жирной кислоты: HN—С —(СН2)Ж—СН3

Н

Н3С—(СН2)12 — С = С — С—С—СН2

Н Н | Н |

ОН О

о Ч- Р—О~

НН/СНз

6—C-C--N+^CH3 Сфингомиелин Н Н СН3

Гликолипиды, например цереброзиды и ганглиозиды, содержат сфингозин и сахар:

.HN —С —(СН2)Ж —СН3

Н

н3с—(сн2)12-с=с—с—с-сн2Н Н I Н Iон I

■О —Глюкоза

■Цереброзид

HN—С—(СН2)Ж —СН3

о

■ Н■

Н3С-(СН2)12—С=С—С—С —сн2 .

Н Н I Н■

он

Галактоза

Глюкоза — Нейраминокислота

Гексозамин

Ганглиозид

Строение различных сульфолипидов еще не выяснено. Были предложены следующие формулы:-

HN—С—(сНг)^—СН3

О Н Н3С—(СН2)12—С=С—С—С—СН2

■о о

Глюкоза — S — 0“

О

ЦереброзидсульфатО!

t

Н2С—О — Галактоза—S—О-

I4

НС—ОНО( —О—С —(СН2)Ж-— СН3)

Н2с- О - С- (СН2)Ж - сн3

Растительный сульфолипид

СТАРЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА ЛИПИДОВ

Исключительно сложный состав природных смесей липидов делал безнадежной задачу количественного разделения групп этих соединений или отдельных соединений в таких смесях химическими методами. Примерно 10 лет назад для химической характеристики смесей липидов приводились суммарные дацные, как, например, кислотные числа, числа омыления, иодные, родановые и диеновые числа. Определение количества «неомыляемых» после щелочного гидролиза было стандартным методом при анализе

жиров. Фосфолипиды и сульфолипиды количественно анализировались после озоления в виде неорганических фосфатов и сульфатов. Эти методы дополнялись цветными реакциями для определения «веществ, сопутствующих жирам», например липохромов, стеринов и смоляных кислот.

Физические методы для характеристики липидов включают определение температур плавления и затвердевания, плотности, твердости, вязкости, поверхностного натяжения, растворимости, температуры воспламенения. Эти классические методы анализа жиров подробно описаны Хилдичем [33] и Кауфманом [56].

В последние годы разработаны многочисленные методы фракционирования смесей липидов. Особенно пригодными оказались фракционная кристаллизация при низких температурах и фракционирование с помощью соединений включения мочевины, например для разделения насыщенных и ненасыщенных жирных кислот и их эфиров. Для выделения метиловых эфиров жирных кислот с одинаковой длиной цепи была использована вакуумная дистилляция, а молекулярную дистилляцию применяли для разделения моно-, ди-и триглицеридов. Противоточное распределение между двумя жидкими растворителями использовалось для фракционирования жирных кислот в соответствии с длиной цепи или в соответствии со степенью ненасыщенности, а также для разделения моно-, ди- и триглицеридов и фосфолипидов. Разделение нейтральных и кислых липидов осуществляли диализом через каучуковые мембраны.

Применение этих методов разделения обычно требует количеств от 1 до 100 г липида. В большинстве случаев эти методы позволяют достигнуть лишь обогащения компонентом или осуществить полуколичественное фракционирование. Для определения эффективности фракционирования использовали УФ- и ИК-спектроскопию.

4,'НОВЫЕ МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ ЛИПИДОВ

В настоящее время хроматографические методы в значительной степени вытеснили все другие методы]фракционирования липидов в аналитическом и микропрепаративном масштабе. Для разделения сложных смесей липидов на отдельные классы соединений использовали адсорбционную и распределительную хроматографию на колонках с силикагелем, на целлюлозных фильтрах, импрегнированных силикагелем, и на бумаге из стекловолокна. Распределительная хроматография с обращенными фазами использовалась для разделения членов винилогомологического ряда на гидрофобизованной колонке или на гидрофобизованной бумаге. Газовую хроматографию использовали в виде распределительно-хроматографического варианта в первую очередь для разделения метиловых эфиров жирных кислот. Разделение смеси липидов по степени ненасыщенности можно осуществить путем хроматографического разделения на силикагеле комплексных ртутноацетатных соединений ненасыщенных липидов. Для выделения кислот и для фракционирования сильно полярных липидов была использована ионообменная колоночная и ионообменная бумажная хроматография. Методом хроматографии на колонках с мочевиной или на бумаге, пропитанной мочевиной, можно отделить жирные кислоты с прямой цепью от кислот с разветвленной цепью. Эффект разделения основан на образовании соединений включения неразветвленных жирных кислот с мочевиной. Различные хроматографические методы разделения липидов описаны в многочисленных обзорах [23, 86, 96, 100].

Каждый из этих принципов хроматографического разделения может быть перенесен на хроматографию в тонких слоях. ХТС позволяет достигнуть значительно лучшего разделения за более короткое время, и поэтому этот метод

стал незаменимым в лабораториях, в которых исследуют липиды. Большие преимущества хроматографии в тонких слоях могут быть использованы полностью лишь в том ■ случае, если этот метод комбинируется с другими методами. В особенности рекомендуется последовательно применять к одной и той же смеси адсорбционную ХТС и распределительную хроматографию, а также ХТС с обращенными фазами, бумажную хроматографию и газовую хроматографию. Группы соединений, которые нельзя фракционировать адсорбционным методом, следует разделять методом распределительной хроматографии, и наоборот.

Методом ХТС можно осуществить следующие виды фракционирования липидов: разделение на классы соединений, фракционирование винилогомологических рядов, разделение по степени ненасыщенности, разделение цис- и тпранс-изомеров и изомеров положения.

ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА

Лучшие методы разделения не достигают цели, если анализируемый материал испорчен в результате несоответствующей обработки. Поэтому здесь подробно описаны некоторые методы выделения липидов из растительных и животных материалов и правила обращения с экстрактами.

Получение волокнистой массы и экстракция

Проблема экстракции липидов сегодня снова является предметом подробных исследований. Приводимые ниже, проверенные в течение многих лет стандартные методы после создания ХТС были во многих лабораториях проверены методом Шталя. Теперь известно, что эти методы приводят к ошибочным результатам и имеют ряд других недостатков [103, 129]. До настоящего времени, однако, не опубликовано лучших прописей.

Выделение растительных липидов. Растительные масла получают из семян и фруктов после измельчения на прессах или терках и последующей экстракции растворителями.

Чтобы избежать выделения масла в процессе измельчения, в результате чего образуется паста, при работе с сильно маслянистыми частями растения целесообразно предварительно отжать основную часть масла. Остаток затем измельчают и прессуют. Соответствующие прессы и мельницы описаны в учебниках по химическим методам, там же можно найти адреса поставщиков этих приборов [56, 115]. В лаборатории простая кофейная мельница (а при работе с очень мягкими частями растений кухонный смеситель) выполняет эту задачу не хуже, чем дорогие специальные машины. Применяется также истирание пробы в ступке с морским песком.

Мацерирование продукта после прессования горячими растворителями и окончательная экстракция в аппарате Сокслета или аналогичном приборе дает в остатке липиды. Экстракторы и их применение описаны в многочисленных руководствах [14, 49, 56].

Измельченную растительную пробу или остаток после прессования экстрагируют безводными растворителями, как правило гексаном, петролей- ным эфиром с температурой кипения 60—70° или бензолом, в течение 4— 6 час на водяной бане; пригоден также хлороформ, четыреххлористый углерод, трихлорэтилен и диэтиловый эфир. В некоторых случаях для выделения растительных липидов используют этанол [121], «-пропанол и изопропанол [51, 144], а также насыщенный водой м-бутанол [90]. Иногда целесообразно провести экстракцию последовательно двумя или тремя растворителями различной полярности, например диэтиловым эфиром, бензолом и петро- 10 Заказ № 734

лейным эфиром. Для защиты ненасыщенных липидов экстракцию следует проводить в атмосфере азота.'

Кейтс [51] показал, что алифатические простые и сложные эфиры и кетоны активируют фермент фосфатидазу С. Этот фермент гидролизует фосфолипиды, и поэтому, согласно Кейтсу, для экстракции растительных липидов следует использовать не диэтиловый эфир, ацетон и этил ацетат, а н-пропанол или изопропанол.

Полученные таким образом липиды Содержат часто также свободные аминокислоты и пептиды, сахар и другие гидрофильные природные вещества, которые попадают в экстракт при добавлении веществ, способствующих растворению, например лецитинов. Отделение этих примесей затруднительно. Для отделения липидов от нелипидов пригодна хроматография на колонках с целлюлозой по Леа и Родесу [70] и препаративная хроматография на бумаге с применением растворителей, описанных Вестлеем, Вреном и Митчеллом [139]. Рекомендуется противоточное распределение [9, 53, 105].

Методы выделения липидов и прописи очистки липидного экстракта особенно тщательно разработаны для животных тканей. Подробно описанные в следующем разделе методы обработки животных проб применимы также и к растительным пробам. '

Выделение животных липидов. Подробное описание методов экстракции липидов из человеческого и животного организмов дано Сперри [121] и Энтен- маном [19]. Следует рекомендовать изучение этих работ, в особенности критического исследования Энтенмана.

При обработке органов животных следует обратить внимание на следующие 8 основных правил.

Все операции (гомогенизация, экстракция и т. д.) всегда проводят в атмосфере азота, чтобы избежать автоокисления ненасыщенных липидов. .

Применяют только очищенный и свежеперегнанный растворитель. Метанол и этанол для удаления альдегидов перегоняют над едким кали. Особенно важно, чтобы применялся только свежеперегнанный хлороформ. Диэтиловый эфир освобождают от перекисей дистилляцией над гидроксиламином или сульфатом железа (II) и хранят над железной или натриевой проволокой. Хлороформ и диэтиловый эфир лучше всего хранить во взрыво- безойасном холодильнике. Петролейный эфир следует перегонять над концентрированной серной кислотой.

Исследуемое животное вскрывают сразу после умерщвления.

Сразу гомогенизуют анализируемый орган.

Следует придерживаться предписанного соотношения массы, полученной при измельчении органов, и экстрагирующего раствора.

Растворы, содержащие липиды, нагревают только в случае крайней необходимости. ■

Из липидных экстрактов удаляют все нелипиды без потерь липидов.

Экстрагированный материал хранят в условиях, которые могут вызвать лишь минимальное изменение липида, т. е. по возможности хранят липиды в растворах в петролейном эфире, в атмосфере азота в холодильнике.

Сперри [121], так же как и Энтенман [19], описывает приборы для гомогенизации ткани и приводит адреса поставщиков этих приборов. Наиболее известен гомогенизатор по Поттеру и Эльвейему [106], обеспечивающий полное измельчение тканей. Этот прибор состоит из пестика, пришлифованного к толстостенной пробирке так, что остается щель менее 1 мм. Ткань, подлежащую измельчению, помещают в виде суспензии в пробирку, затем вводят пестик и с помощью электромотора осуществляют вращение с большой скоростью. Ткань между пестиком и стеклянной стенкой полностью измельчается.

Экстракция липидов по Блуру [4]. К 1 ч. гомогенизата ткани добавляют 20—30 ч. смеси этанола с диэтил оным эфиром (3 + 1) и оставляют на 12 час при комнатной температуре в атмосфере азота. Липидный экстракт отфильтровывают от выпавшего белка, концентрируют в вакууме в атмосфере азота при температуре ниже 50° (упаривают не полностью) и повторно экстрагируют липиды тремя порциями петролейного эфира. Продукт, нерастворимый в петролейном эфире, отбрасывают. Раствор липидов в петролей- ном эфире Сушат безводным сульфатом натрия. '.

Для полного выделения липидов из довольно жирной ткани гомогенизат следует ■ слегка нагреть в смеси этанола с эфиром. Липиды мозга экстрагируются смесью Блура, не полностью.

Экстракция липидов по Фольху, Асколи, Леесу, Миту и ле Барону [21]. Этот метод дает особенно хорошие выходы' в случае таких сложных липидов, как протеолипиды и ганглиозиды, которые не могут быть выделены полностью методом Блура. ,

Масса из тканей экстрагируется 20 ч. смеси хлороформа с метанолом (2+1) при ' комнатной температуре. Нелипиды отделяют, по Фольху с сотрудниками [22], диффузионным методом, описанным ниже.

Небольшой стеклянный стакан ставят на дно стеклянного стакана 10-кратной емкости, почти целиком заполненного дистиллированной водой. Затем с помощью пипетки небольшой погруженный стакан на 2/3 заполняют хлороформ-метанольным экстрактом. При стоянии в течение 12 час метанол и другие примеси, растворимые в воде, диффундируют из липидного экстракта в воду. Очищенные таким образом липиды остаются в хлороформе и в хлопьевидном слое на границе раздела обеих жидкостей. Водный раствор затем возможно быстрее сливают сифоном. При этом следует обратить внимание на то, чтобы упомянутый хлопьевидный слой не перемешался. Меньший стакан затем вновь заполняют таким количеством метанола, которое находилось в нем первоначально. При перемешивании метанола со слоем хлороформа хдопья переходят в райтвор.

Для выделения протеолипидов, фосфатидолипопептидов, ганглиозидов, сульфидов и трифосфоинозитов подробно разработаны более совершенные методы [72, 73].

В редких случаях скелеты животных целиком растворяют кипячением в этаноле, содержащем соляную кислоту. Этот метод имеет преимущество, заключающееся в том, что ткань тщательно измельчается и липиды при этом могут быть легко экстрагированы. Этот метод, однако, часто приводит к слишком грубым изменениям липидов и поэтому не рекомендуется.

Омыление и этерификация\

Растительные или животные ткани, богатые жирами, можно также. растворить в щелочи, чтобы гидролизовать содержащиеся в них липиды. Одиако обычно вначале все липиды выделяют одним из вышеописанных методов и затем подвергают гидролитическому расщеплению.'

Классы соединений изолируют хроматографическими методами, например методом ХТС, и после щелочного гидролиза определяют состав жирных кислот, а также долю нейтральных веществ. Большинство липидов можно элюировать с силикагеля Г диэтиловым эфиром или смесью эфир — метанол ■ (9 + 1). Для выделения фосфолипидов применяют смеси хлороформа и метанола .'

Щелочной гидролиз («омыление») - жировых веществ дает растворимые в воде щелочные соли жирных кислот этих липидов и неомыляемые нейтральные соединения, например углеводороды, спирты и альдегиды. Неомыляемые вещества удаляют из щелочной водно-спиртовой фазы неполярными растворителями, затем жирные кислоты выделяют в свободном состоянии путем подкисления водно-спиртового раствора их солей и также экстрагируют органическими растворителями.

Щелочной гидролиз липидов. Растворяют 1 вес. ч. емкого кали в .1 вес. ч. дистиллированной воды и после охлаждения разбавляют этот концентрированный раствор 3—4 ч. метанола. Омыляемую пробу липида обрабатывают 10-кратным количеством раствора гидроокиси калия и оставляют на 12 час при комнатной температуре. Это «холодное ■ омыление» следует особенно рекомендовать, если имеют дело с липидами, содержащими витамины, или с производными сопряженно ненасыщенных жирных кислот. Чаще всего проводят нагревание с обратным холодильником в течение 1—12 час в токе азота. Продолжительность кипячения зависит от природы омыляемых липидов. Если имеют дёЛо

с очень трудно гидролизуемыми липидами, то можно добавить 10—20% толуола или ксилола и таким образом повысить температуру омыляемой смеси.

Для контроля реакции гидролиза лучше всего использовать адсорбционную ХТС; с интервалами в полчаса наносят небольшие пробы реакционной смеси на узкие пластинки с силикагелем Г и разделяют смесью петролейный эфир (т. кип. 60—70°) — диэтиловый эфир — ледяная уксусная кислота (70 + 30 + 2). В начале омыления на хроматограмме прежде всего видны пятна менее полярных веществ, расположенные над пятнами жирных кислот. После полного омыления видны только пятна кислот (выше неполярные углеводороды и ниже сильно полярные соединения — одно- и многоатомные спирты).

После окончания омыления большую часть метанола упаривают в вакууме при температуре ниже 50° и водный остаток разбавляют двойным объемом воды. При этом в присутствии повышенных количеств неомыляемых веществ происходит помутнение раствора. Неомыляемые вещества затем несколько раз экстрагируют диэтиловым эфиром порциями, равными половине объема раствора. Эмульсии могут быть разрушены добавкой спирта или путем многократного охлаждения до 55° и последующего нагревания. Полнота экстракции проверяется методом адсорбционной ХТС. Объединенные эфирные вытяжки промывают дистиллированной, прокипяченной в токе азота и вновь охлажденной водой до нейтральной реакции. После сушки раствора и упарки эфира неомыляемую липидную фракцию сплавляют в атмосфере азота или растворяют в соответствующем растворителе и хранят в холодильнике. -

Освобожденный от нейтральных веществ водный раствор калийных солей высших кислот подкисляют затем 5 н. серной кислотой под слоем эфира. Выделенные таким образом свободные жирные кислоты экстрагируют большим числом порций диэтилового эфира. Объединенные вытяжки жирных кислот промывают дистиллированной прокипяченной водой и затем сушат безводным сульфатом натрия. Эфир отгоняют и жирные кислоты сплавляют в атмосфере азота или растворяют в петролейном эфире и хранят в холодильнике.

До последнего времени обычно было принято омылять жиры водноспиртовым раствором едкого кали или этанольным раствором алкоголята калия. В настоящее время вместо этанола применяют метанол. Это объясняется тем, что жирные кислоты в большинстве случаев анализируются газохроматографически в виде метиловых эфиров, а небольшие количества этиловых эфиров, которые могут образоваться при применении этанола, мешают газохроматографическому определению метиловых эфиров жирных кислот с нечетным числом атомов углерода и разветвленной цепью.

Этерификация жирных кислот. Особенно пригодными оказались три метода: .

реакция жирных кислот с диазометаном, который получается из N-нитрозометилмочевины [114] или из и-толилсульфонилметилнитроз- амида [5];

обработка жирных кислот 2,2-диметоксипропаном в метаноле и водной соляной кислотой 11131;

этерификация кислот метанолом в присутствии концентрированной серной кислоты или бортрифторида [91].

Жирные кислоты глицеридов или других липидов могут быть без предварительного омыления переведены в- метиловые эфиры следующими методами:

переэтерификация липидов метанолом в эфире в присутствии едкого кали [68]; '

алкоголиз липидов метанольным раствором соляной кислоты [126].

Каждый из этих методов подробно описан в доступных оригинальных работах и во многих учебниках. Методика этерификации небольших количеств жирных кислот диазометаном приведена на стр. 77 этой книги. В этой же главе можно найти пропись для ацетилирования липидов, содержащих спиртовые и аминогруппы (см. стр. 78).

. Здесь следует подчеркнуть, что метиловые эфиры жирных кислот перед газохроматографическим анализом всегда следует подвергать очистке методом ХТС. В качестве растворителя оказалась пригодной смесь петролейного эфира (т. кип. 60—70°) с диэтиловым эфиром (19 + 1) в качестве сорбента —

силикагель Г. После разделения эфиры сразу экстрагируют смесью петролей- ного эфира с диэтиловым эфиром (1 + 1) [129].

Липиды, содержащие ацетилпроизводные окси- и аминогрупп, также следует очищать методом ХТС [80].

И. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ЛИПИДОВ

РАЗДЕЛЕНИЕ ЛИПИДОВ НА ОТДЕЛЬНЫЕ КЛАССЫ СОЕДИНЕНИЙ

Около 20 лет назад Траппе [128 и др. работы] показал, что липиды можно элюировать с адсорбционных колонн в виде отдельных классов соединений последовательным применением ряда растворителей различной полярности. Он расположил различные полярные растворители по их элюирующему действию в ряд и назвал эту серию «элюотропным рядом растворителей». Ряд Траппе и аналогичные ряды, предложенные другими авторами, приведены на стр. 139.

Шредер [1201 обнаружил, что вместо ряда индивидуальных растворителей лучше применять смеси петролейного и диэтилового эфира в различных соотношениях. Мид и Филрап [20, 88, 89], а также Хирш и Аренс [34] описали тщательно разработанную методику адсорбционнохроматографического разделения сложных смесей липидов на колонках с силикагелем при использовании этих двух растворителей. Оба метода были позднее проверены в различных лабораториях и в настоящее время используются в качестве стандартных методов анализа липидных экстрактов человека и животных [86, 96].

После создания Шталем [122—124] ХТС многие авторы [46, 80, 137] применяли новый метод для липидов и обнаружили, что он исключительно пригоден для разделения соединений этой группы природных веществ. В обзорных работах Виоке [130] и Морриса [96] описаны первоначальные исследования по ХТС липидов.

За последние несколько лет методы ХТС и газовой хроматографии почти полностью вытеснили другие хроматографические методы разделения липидов.

■ Жиры, масла, воски и другие нейтральные липиды в большинстве случаев разделяют на классы соединений методом адсорбционной ХТС на силикагеле Г. В качестве растворителя, как правило, применяют смеси петролейного и диэтилового эфиров. Для разделения сильно полярных липидов на слоях силикагеля Г используют спиртовые и водные растворители, поэтому фракционирование подобных соединений на отдельные классы часто происходит по механизму распределения, а не адсорбции. В некоторых случаях для разделения липидов на отдельные классы соединений применяют обращенные фазы на гидрофобизованном силикагеле Г (см. рис. 88).

а) Нейтральные липиды и продукты их гидролиза

Углеводороды с длинной цепью, спирты, альдегиды, кислоты, моноглицериды, диглицериды, триглицериды и аналогичные липиды можно разделять методом адсорбционной ХТС на классы соединений, обладающих различной полярностью, в зависимости от природы и числа функциональных групп в них. Большие различия в длине цепи и степени ненасыщенности компонентов данного класса соединений в редких случаях могут приводить к дополнительному фракционированию внутри этого класса соединений. Подобное дополнительное фракционирование выражено, однако, не столь отчетливо, чтобы это могло осложнить разделение на отдельные классы соединений.

На рис. 70 схематическипоказано разделение отдельных типичных липидов на классы соединений. Как и следовало ожидать, разделение различных типов соединений происходит в соответствии с правилами, сформулированными Брокманом и Фольперсом [6]: углеводороды не адсорбируются, эфиры адсорбируются слабо, альдегиды находятся впереди спиртов и кислот—

Рис. 70. Разделение нейтральных липидов и продуктов их гидролиза методом адсорбционной ХТС на силикагеле Г [76].

Растворитель петролейный эфир,(т. кип. 60—70°)—диэтиловый эфир — ледяная уксусная кислота (90 + 10 + 1); время анализа 40 мин, реактив для опрыскивания 2',7'-дихлорфлуоресцеин в этаноле; пробы по 20 да каждая. 1 — октадецен-9; 2 — олеиловый спирт; 3 — олеиловый альдегид; 4 — олеиновая кислота; 5 — метилолеат, 6 — холестерилолеат; 7 — моноолеин; 8 — диолеин; 9—триолеин; 10—трилинолеин; 11—трилиноленин; 12—трикапроин (о) и тристеарин (В); 13 — холестерин; 14 — селахиловый спирт; 15 — селахилдиолеин; 16 — олеилолеат; и — дио- леиллетицин.1

соединения с короткими цепями адсорбируются сильнее соединений с длинными цепями, а ненасыщенные сильнее насыщенных (см. стр. 138). На рис. 70 в качестве примера приведена степень дополнительного фракционирования внутри класса триглицеридов. ■

■ Условия разделения

Сорбент. Чаще других сорбентов для фракционирования липидов применяют силикагель. Врен [145] описал свойства и преимущества этого сорбента. На пластинке размером 20 X 20 см с нанесенным на нее силикагелем Г можно разделить 10—20 мг сложной смеси липидов. При необходимости фракционирования лишь небольшого числа веществ, сильно отличающихся по полярности, можно наносить на стандартную пласгинку до 50 мй вещества. Окись алюминия применяют редко, поскольку липиды на ней гидролизуются [128] и изомеризуются [119]. Для разделения методрмХТС можно также использовать «флорисил»— синтетический силикат Магния, часто применяемый в колоночной хроматографии липидов [8]. Весьма подходящ™ адсорбентом для липидов является также вторичный фосфат магния (см. стр. 219). Для разделения липидов на классы соединений Катен [52] пр™енял сахар. Этот адсорбент обладает хорошими разделительными свойствами, однако емкость его мала. Его хорошая растворимость в воде облегчает извлечение адсорбированных липофильных веществ. Поэтому следует изучить пр™ен™ость сахара для ХТС линидов. . - - Растворитель. Выбор р астворителя определяется полярностью компонентов Смеси липидов и необход™ым аффектом разделения. Перечень растворителей для разделения нейтральных липидов методом ХТС приведен в табл. 10. Для разделения углеводородов, сложных а лк ил эфиров, стерилэфиров и полиенол- эфиров на классы соединений особенно пригодны смеси петролейного эфира

Таблица 10

Растворители для разделен®! нейтральных липидов и их продуктов гидролиза методом адсорбционной ХТС на силикагеле Г

Растворитель

Соотношение объемов

Литература

Петролейный эфир а — бензол

95+5

85

Четыреххлористый углерод

■ -—

47, 58

Гексан — тетралин 6

3+1

59

1+1 -

59

Петролейный эфир — диэтиловый эфир .

95+5

26, 81, 84

90+10

2, 76, 95

80+20

26, 83, 93

70+30

2, 47, 109

.50+50

2, 108

Петролейный эфир — диэтиловый эфир — ледяная уксус-

аая кислота

90+10+1

77, 81,97

80+20+1

84, 140

70+30+2

81, 84, 103

Бензол — диэтиловый эфир

50+50

2

Дихлорэтан

—

47, 58

Хлороформ

47, 103

Диэтиловый эфир

47,58

Диизопропиловый эфир

58, 59’

Хлороформ — ледяная уксусная кислота

24+1

47

Диизопропиловый эфир — ледяная уксусная кислота . .

100+1,5

58, 59

Бензол — метанол

85+15

2

и — Пропанол — конц. гидроокись аммония

2+1.

Хлороформ — бензол

3+2

37, 137, 147

Четыреххлористый углерод в

—

1.

а В большинстве случаев петролейный эфир с температурой кипения 60—70°, т. е. главным образом генсан.- +

® Для дополнительного фракционирования холестериновых эфиров высших жирйых кислот.

в Применяется в ступенчатом методе.,

с 1—5% бензола или диэтилового эфира [26, 75, 80, 81]. При применении такого растворителя соединения, содержащие одну или несколько свободных функциональных групп? задерживаются на старте.:

Для фракционировайия спиртов и альдегидов, моно-, ди- И триглицеридов применяют смеси петродейного эфира и 10—50% диэтилового эфира [81, 95,. 108, 109 и др.]. Некоторые полярные липиды движутся в подобных растворителях вблизи фронта, и их трудно отделить друг от друга. При хроматографическом разделении в тонких слоях смесей липидов, содержащих7 свободные жирные кислоты, следует применять упомянутый выше растворитель с добавкой 1—2% ледяной уксусной кислоты для снижения образования полос и хвостов, вызываемых жирными кислотами [76, 81, 95, 140]. •

Поскольку большинство природных смесей липидов содержат вещества, сильно отличающиеся по полярности, часто бывает невозможно достигнуть полного разделения на классы соединений, используя один растворитель.

Более полную картину состава сложной Смеси липидов получают, проводя хроматографическое разделение при использовании двух или трех

— Тригтщериды— Жирные кислоты— Тригтщериды— Жирные кислоты

— Тригтщериды

— Жирные кислоты

— Тригтщериды

— Жирные кислоты

растворителей различной полярности. Эти же растворители могут быть использованы в ступенчатом методе на одной и той же хроматограмме; точно так же лучшего разделения достигают, используя двумерную ХТС [58].

— Углеводороды

»- Эфиры стеринов

/ Витамин А (ифир)

- Длкоксидиглицериды

з; ♦$6 , г a »

Рис. 71. Тонкослоёная хроматограмма жира морских животных. '

Сорбент силикагель Г; растворитель петролейный эфир (т. кип. 6U — 70°) — диэтиловый эфир — ледяная уксусная кислота (90 -|- ID -i- 1); время анализа 1 час; обнаружение: обугливание хромовой смесью при нагревании; пробы по 200 — 300 рг. 1 — Squalus acaniMas, жир печени; 2 — Hyciroiagus colliri, жир печени; 3 — Cetorkmus maxiwus, жир печени; 1 —G’afeor/iinus gaieus, жир печени;

5 — Physeter macrocephalus; 6 — Kngraulis mordax; 7 — Tliunmts thynnus; 8 — (Jnocrlivnchus gorbuscha, икра; 9 — Gadus morrhua, жир печени.

Можно также проводить ХТС, используя растворитель с постепенно увеличивающейся полярностью для разделения классов липидов, значительно отличающихся по полярности *.

Р и с. 72. Доказательство эффективности разделения методом ХТС [129].

Сорбент силикагель Г; растворитель петролейный эфир (т. кип. 60—70°) — диэтиловый эфир — ледяная уксусная кислота (80 -|- 20 -Ь 1); время анализа 1 час; индикатор а — пары иода; б — радиоавтографин; пробы примерно по 200 рг природного липида. 1 — холестерилпальмитат-1-СИ, трипальмитии-1-Ci4 и пальмитиновая кпслота-1-С14; 2 —жир, отлагающийся в организме человека, и трипальмитии-1-CU; 3 — жир печени акулы и трипальмитии-1-CU; 4 — липидный экстракт склеротической аорты человека и холсстерилиальмитат-1-С14.

Хроматографический анализ растительных и животных восков особенно хорошо удается на силикагеле Г при использовании растворителя, представляющего собой смесь петролейного и диэтилового эфиров 95 + 5. Наиболее

часто для разделения липидов методом ХТС применяют растворитель петролейный эфир — диэтиловый эфир — ледяная уксусная кислота 90+10 + 1. Этот растворитель особенно пригоден для хроматографического разделения животных жиров (рис. 71 и 73). Растительные жиры, часто содержащие эпокси- и оксисоединения и поэтому являющиеся более полярными по сравнению с большинством животных жиров, как правило, следует хроматографировать смесью петролейный эфир — диэтиловый эфир — ледяная уксусная

ВВfulfil *: г' т П-Тfulfil *: г' т П-ТТримацериды |gi■IJ+^ - I < ■ ++||1:№йёд;‘ ;: г t/ Триглицериды * эпоксикислот♦ Жирные кислотыX * Триглицериды*“ рксикислот»#Тримацериды |gi■IJ+^ - I < ■ ++||1:№йёд;‘ ;: г t/ Триглицериды * эпоксикислот♦ Жирные кислотыX * Триглицериды*“ рксикислот»#

В

В

fulfil *

: г' т П-Т

fulfil *

: г' т П-Т

Тримацериды |gi■IJ+^ - I < ■ ++||1:№йёд;‘ ;: г

t/ Триглицериды * эпоксикислот

♦ Жирные кислоты

X * Триглицериды

*“ рксикислот

»#

Тримацериды |gi■IJ+^ - I < ■ ++||1:№йёд;‘ ;: г

t/ Триглицериды * эпоксикислот

♦ Жирные кислоты

X * Триглицериды

*“ рксикислот

»#

Р и с. ТЛ. Тонкослойная хроматограмма липидов тканей человека [129]. 1—выворотка; 2 — костный мозг; з ~ • печень; 4 — ночки; 5—жир, отлагающийся в организме; 6" -селезенка; 7 —склеротическая аорта (пробы но 300 ц-г). Стандартные слои силикагеля Г; растворитель петролейный эфир (т. кин. 60—70°)—диэ- тиловый эфир — ледяная уксусная кислота (90 +1 и 4- 1); время анализа 1 час; обнаружение: обугливание хромовой смесью (реактив ^р 34) при нагревании.Р и с. ТЛ. Тонкослойная хроматограмма липидов тканей человека [129]. 1—выворотка; 2 — костный мозг; з ~ • печень; 4 — ночки; 5—жир, отлагающийся в организме; 6" -селезенка; 7 —склеротическая аорта (пробы но 300 ц-г). Стандартные слои силикагеля Г; растворитель петролейный эфир (т. кин. 60—70°)—диэ- тиловый эфир — ледяная уксусная кислота (90 +1 и 4- 1); время анализа 1 час; обнаружение: обугливание хромовой смесью (реактив ^р 34) при нагревании.

Р и с. ТЛ. Тонкослойная хроматограмма липидов тканей человека [129]. 1—выворотка; 2 — костный мозг; з ~ • печень; 4 — ночки; 5—жир, отлагающийся в организме; 6" -селезенка; 7 —склеротическая аорта (пробы но 300 ц-г). Стандартные слои силикагеля Г; растворитель петролейный эфир (т. кин. 60—70°)—диэ- тиловый эфир — ледяная уксусная кислота (90 +

1 и 4- 1); время анализа 1 час; обнаружение: обугливание хромовой смесью (реактив ^р 34) при нагревании.

Р и с. ТЛ. Тонкослойная хроматограмма липидов тканей человека [129]. 1—выворотка; 2 — костный мозг; з ~ • печень; 4 — ночки; 5—жир, отлагающийся в организме; 6" -селезенка; 7 —склеротическая аорта (пробы но 300 ц-г). Стандартные слои силикагеля Г; растворитель петролейный эфир (т. кин. 60—70°)—диэ- тиловый эфир — ледяная уксусная кислота (90 +

1 и 4- 1); время анализа 1 час; обнаружение: обугливание хромовой смесью (реактив ^р 34) при нагревании.

Р и с. 74. Тонкослойная хроматограмма маселразличных семян [97].

— Olea еигораыц 2 — Malope trifida; 3 — Vernonia anthel- mintica; 1 — Artemisia absinthium; 5 — Ceiba pentandra;

— Ccphal octo ton cordo/anus; 7 — Dimorphotheca auranti- aca; 8 — Onguekoa Gore; .9 — Ricinus communis (пробы но 200 11з). Стандартные слои силикагеля Г; растворитель петролейный эфир (т. кип. 60 — 70°) — диэтпловый эфир — ледяная уксусная кислота (70 Д- 30 + 2); время анализа 1 час; обнаружение; обугливание хромовой смесью при нагревании.

кислота 80 + 20 + 1 или 70 + 3 0+ 2 (рис. 74). Последний растворитель пригоден также для ХТС спиртов и диолов «неомыляемых» растительных и животных жиров и для ХТС жирных кислот, эпо

кси-, окси- и диоксикислот и их метиловых эфиров.

Метод обнаружения. Почти все индикаторы, применяемые при хроматографии липидов на бумаге 154, 78], можно использовать также для обнаружения липидов на разделительных пластинках. Кроме того, при опрыскивании можно применять реагенты для обугливания всех органических

веществ.

Нейтральные липиды можно сделать видимыми на пластинке, применяя пары иода [80, 81], 2', 7'-дихлорфлуоресцеин [76] или родамин В [58, 135], а также хромовую смесь [85, 129].

Иод окрашивает все ненасыщенные липиды и некоторые азотсодержащие насыщенные липиды в темно-коричневый цвет на светло-желтом или белом фоне. Действием паров иода можно обнаружить менее 1 цз простого ненасыщенного соединения; большинство насыщенных липидов окрашиваются слабо. На воздухе коричневые пятна исчезают через несколько минут. Их можно, однако, получить вновь, действуя парами иода.

Почти все липиды обнаруживаются в УФ-свете (270 жц) в виде светлозеленых флуоресцирующих пятен на темно-фиолетовом фоне после опрыскивания хроматограммы 0,2%-ным спиртовым раствором 2', 7'-дихлор- флуоресцеипа. Этим реактивом можно обнаружить 1 — 5 цз соединения. Опрыскивание 0,05%-ным раствором родамина В в 96%-ном этаноле также применяют для обнаружения липидов в УФ-свете. Как правило, 1 цз лини-

да надежно определяется в виде темно-фиолетового пятна на розово-красном фоне. -

Хромовая смесь особенно пригодна для озоления всех нелетучих органических соединений при нагревании над электрической плиткой (рис. 71). Меньше 1 рг липида можно обнаружить при озолении в виде серого или черного пятна на белом фоне. Окраска зависит от степени нагревания: холестерин и холестериновый эфир, например, окрашиваются вначале в красный цвет, затем в коричневый и наконец в черный; витамин А и его эфиры окрашиваются вначале в голубой цвет, а при более высокой температуре в серый и наконец в черный.

На одну и ту же хроматограмму можно последовательно нанести иод, 2', 7'-дихлорфлуоресцеин и хромовую смесь. Обработка тремя индикаторами повышает вероятность того, что все вещества на тонкослойной хроматограмме будут открыты.

Реже применяемыми реактивами для опрыскивания (гл. 23) являются растворы бромтимолового синего, фосфомолибденовой кислоты, треххлористой сурьмы, пятихлористой сурьмы, а-циклодекстрина с парами иода,, флуоресцеина с парами брома и гидроксиламина с хлоридом трехвалентного железа. Липиды, которые благодаря наличию системы сопряженных двойных связей поглощают УФ-свет, можно обнаружить в УФ-свете на слоях силикагеля Г, содержащих флуоресцирующие вещества. Гидроксил- или аминосодержащие липиды следует хроматографировать в виде меченых радиоактивных ацетильных производных, жирные кислоты — в виде радиоактивных метиловых эфиров. Радиоактивные производные липидов локализуют методом радиоавтографии (см. стр. 67).

Большинство индикаторных реакций для липидов на тонкослойных хроматограммах примерно в 10—100 раз чувствительнее, чем йа бумажных хроматограммах. Некоторые из упомянутых выше реактивов для обнаружения, как, например, 2', 7'-дихлорфлуоресцеин и родамин В, не вызывают химического изменения липидов, что позволяет выделять последние методом ХТС.

Применение и результаты

Жиры, масла, воски. Мангольд и Малина [81 ] применяли адсорбционную ХТС для разделения растительных жиров и восков, рыбьего жира, а также продуктов их гидролиза — жирных кислот и «неомыляемых»— на отдельные классы соединений. Две типичные хроматограммы изображены на рис. 71 и 74.

Особенно следует отметить, что методом ХТС удается анализировать такие близкие в химическом отношении классы липидов, как сложные алкилэфиры, стерилзфиры, полиенолэфиры, и обнаружить их раздельно. Можно разделить даже алкоксидиглицериды и триглицериды. Такого четкого фракционирования нельзя достигнуть даже с большими количествами исследуемого материала методом колоночной или бумажной хроматографии или каким-либо другим методом. Поскольку ХТС требует лишь части того количества вещества, которое необходимо для получения колоночной хроматограммы, рассматриваемый метод весьма пригоден для микробиологических и энтомологических исследований. Патель, Хайдак и Ловелл [102] сообщили об анализе методом ХТС маточного корма пчел. Для разделения липофильных веществ бактерий и вирусов также следует применять метод ХТС.

Чтобы проверить, действительно ли разделение методом ХТС является полным, и убедиться, что различные классы соединений не загрязняют друг друга, Туна, Камерек и Мангольд [129] применили радиоактивно меченные соединения. Радиоактивный трипальмитин-1-С14 хроматографировался в сме-

■си с липидами жировых отложений человека и жиром печени акулы; к Липид- ' ному экстракту известковых отложений человеческой аорты был добавлен холестерилпальмитат-1-С14. Хроматограмму сначала обработали парами иода (рис. 72, а), а затем определили на ней распределение радиоактивности. На рис. 72, а приведена фотография хроматограммы, обработанной парами иода, а на рис. 72, б — радиоавтограф.■

Легко заметить, что как на хроматограмме жира человека, так и на хроматограмме рыбьего жира вся радиоактивность содержится во фракций триглицеридов. Таким образом, пятна выше триглицеридных пятен не являются результатом дополнительного фракционирования триглицеридов. На хроматограмме липидного экстракта человеческой аорты радиоактивно только пятно холестеринового эфира..

Эти результаты показывают, что взаимное загрязнение различных липидных фракций, вообще говдря, минимально. Особенно обращает на себя внимание тот факт, что даже алкоксидиглицериды, которые по химическому строению и физическим свойствам столь близки к триглицеридам, не загрязнены ими. Диацетилглицериновые эфиры и ■ диацетилмоноглицериды также разделяются методом ХТС [80]. Однако значительно более полярные не- этерифицированные простые моноэфиры глицерина и соответствующие им моноглицериды разделяются неполностью.

Исключительно высокая четкость разделения позволяет выделить методами ХТС группы липидов из какого-либо экстракта и определить состав жирных кислот. Малинз фракционировал жир печени акулы методом ХТС и выделил триглицеридную и алкоксидиглицеридную фракции. Он омылил оба класса липидов, выделил смесь жирных кислот и анализировал ее после •этерификации методом газовой хроматографии. Мангольд и Туна [82], так же как и Туна, Камерек и Мангольд [129], определяли состав жирных кислот холестериновых - эфиров, триглицеридов и фосфолипидов из липидного экстракта человеческих тканей.

ХТС оказалась особенно ценной для стандартных анализов липидов ■сывороток и органов человека и животных. Байкер первым применил этот метод для анализа липидов сывороток человека [137—138]. На стр. 255 = описано также применение этого метода Цольнером с сотрудниками [146— 148]. Вильямс, Шарма, Морис и Хольман [140] исследовали липиды из ■содержимого человеческой слепой кишки и сравнили их состав с составом липидов стула. Многие исследовательские коллективы обнаружили, что липидные экстракты тканей человека и животных содержат ряд артефактов, например метиловые эфиры жирных кислот [12, 103, 104, 129] и в некоторых случаях тримерные альдегиды (1,3,5-триоксан) [129]. Многие классы соединений, которые не могут быть обнаружены другими методами, были найдены методом ХТС в тканях человека. К этим веществам относятся алкоксидиглицериды и небольшие количества «альдегидогенных триглицеридов», которые, по-видимому, находятся во всех человеческих органах, и сте- рины, менее полярные, чем холестерин, которые были найдены в аорта человека [129]. На рис. 73 приведенахроматограмма липидных экстрактов тканей человека.

Усовершенствованный Хиршем и Аренсом [34] метод хроматографического фракционирования сложных липидных экстрактов на колонках с силикагелем, по мнению этих авторов, не пригоден для разделения алкоксидиглицеридов и триглицеридов. Однако анализ методом ХТС фракций элюата таких колонн доказывает отчетливое фракционирование этих двух, классов липидов. На рис. 75 приведена хроматограмма фракций «триглицеридного» элюата из человеческого жира. На пластинке видно обогащение двух менее полярных классов липидов в первых фракциях триглицеридного элюата, однако оно отсутствует на соответствующей весовой кривой.

Клинически-медицинское применение ХТС подробно описано в другом месте (см. гл. 16). В этой связи следует, однако, указать на появившуюся во время издания книги интересную работу Хонеггера [154] по хроматографическому исследованию липидов, выделенных из тканей мозга больных склерозом и здоровых людей.

Допешваркар и Мид [18а] описали опыты, указывающие на то, что метиловые эфиры высших жирных кислот встречаются в качестве природной составной части животных тканей и не обязательно представляют собой артефакты, возникающие при экстракции липидов метанольными смесями. Эти авторы показали также, что метиловый эфир как таковой (не подвергнутый гидролизу) может быть абсорбирован животной тканью [18а, б]. Интересен следующий опыт: они скармливали радиоактивный метилэлаидат-1-С14

Р и с. 75. Тонкослойная хроматограмма первых фракций элюата жира, отлагающегосяв организме человека, фракционированного на колонке [129].

Обращает па себя внимание обогащение двух классов липидов впереди триглицеридной фракции.

морским свинкам. Через 4 часа животных умерщвляли и липиды из крови, печени, почек, легких, сердца, селезенки и жира экстрагировали по методу Фольха, Лееса и Слоан-Стенли [22]. Методом колоночной хроматографии на силикагеле были выделены холестериновые эфиры, триглицериды, стерины и фосфолипиды и измерена их радиоактивность. Почти вся активность была

Таблица 11

Поглощение элаидиновой кислоты в теле животного

(исследование элюата колонки с силикагелем методом ХТС [18а])

Элюирующий раствор

Идентифицировано методом ХТС

Удельная радиоактивность, нл1тг. в сек/мг

2% диэтилового эфира

Холестериновые эфиры

0,5

в пентане

Метиловые эфиры высших

708

жирных кислот

5% дпэтилового эфира

Триглицериды

4,1

в пентане

20% диэтилового эфира

Стерины

0,4

в пентане

Метанол

Фосфолипиды

3

Холестериновые и метиловые эфиры были разделены методом ХТС на силикагеле Г. Растворитель — смесь гексана и диэтилового эфира (98,5+1,5).

найдена во фракции холестериновых эфиров. Методом ХТС можно было показать, что «холестериновые эфиры» содержат радиоактивный метилэлаи- дат, причем именно он и является «горячим». Этот результат наглядно виден из табл. 11, заимствованной из работы указанных авторов.

На рис. 76 приведена весовая кривая распределения в элюате колоночной хроматограммы жира печени акулы. Чистота отдельных фракций элюата определялась методом ХТС.

Рис. 76. Анализ фракций элюата, полученного при разделении на хроматографической колонке жира печени Hydrolagus colliei (ср. с рис. 71).

1 — алкоксидлглицериды; 2 — триглицериды.

Применение ХТС для контроля эффективности колоночно-хроматографического разделения описывалось неоднократно [2, 35, 92, 129].

Тонкослойная хроматограмма необычных жиров семян приведена на рис. 74. Следует отметить отделение триглицеридов обычных жирных кислот от триглицеридов эпокси- и (или) оксикислот

Моррис и Мангольд [97] применяли ХТС для определения носителя цветных реакций, применяемых в анализе жиров, как, например, реакции Гальфена.

Нельсон [99] применял ХТС в комбинации с адсорбционной хроматографией на колонках с силикагелем для анализа липидов пшеницы. Он применял газовую хроматографию для определения кислотного состава триглицеридной фракции липидов пшеницы. Янистин [41] исследовал неомыляемую фракцию из метанольных экстрактов проросшей пшеницы.

Прайвет, Бланк и Лундберг [109] описали фотоденситометрический метод количественного анализа смесей, содержащих моно-, ди- и триглице-

риды. На рис. 77 приведена типичная кривая, полученная на искусственной смеси моно-, ди- и трипальмитина. -

Симметричные (а, а') и асимметричные (а, р) моноглицериды, после расщепления последних иодной кислотой или ацетатом свинца (IV), могут быть разделены на гликольальдегидэфиры и количественно определены [108]. Симметричные и асимметричные диглицериды непосредственно отделяются

Рис. 77. Денситометрическая кривая тонкослойной хроматограммы ( моно-, ди- и трипальмитина >i [109].Сорбент силикагель Г; растворитель петролейный вфир (т. кип. 40—60°)—диэтиловый'эфир (70+30); время анализа 40 мин; обнаружение: обугливание 50%-ной серной кислотой при нагревании.Рис. 77. Денситометрическая кривая тонкослойной хроматограммы ( моно-, ди- и трипальмитина >i [109].Сорбент силикагель Г; растворитель петролейный вфир (т. кип. 40—60°)—диэтиловый'эфир (70+30); время анализа 40 мин; обнаружение: обугливание 50%-ной серной кислотой при нагревании.Рис. 78. Денситометрическая кривая тонкослойной хроматограммы 1,2-дипаль- митина и 1,3-дипальмитина [109].Условия разделения те же, что иа рис. 77.Рис. 78. Денситометрическая кривая тонкослойной хроматограммы 1,2-дипаль- митина и 1,3-дипальмитина [109].Условия разделения те же, что иа рис. 77.

Рис. 77. Денситометрическая кривая тонкослойной хроматограммы ( моно-, ди- и трипальмитина >i [109].

Сорбент силикагель Г; растворитель петролейный вфир (т. кип. 40—60°)—диэтиловый'эфир (70+30); время анализа 40 мин; обнаружение: обугливание 50%-ной серной кислотой при нагревании.

Рис. 77. Денситометрическая кривая тонкослойной хроматограммы ( моно-, ди- и трипальмитина >i [109].

Сорбент силикагель Г; растворитель петролейный вфир (т. кип. 40—60°)—диэтиловый'эфир (70+30); время анализа 40 мин; обнаружение: обугливание 50%-ной серной кислотой при нагревании.

Рис. 78. Денситометрическая кривая тонкослойной хроматограммы 1,2-дипаль- митина и 1,3-дипальмитина [109].

Условия разделения те же, что иа рис. 77.

Рис. 78. Денситометрическая кривая тонкослойной хроматограммы 1,2-дипаль- митина и 1,3-дипальмитина [109].

Условия разделения те же, что иа рис. 77.

друг от друга (рис. 78); однако а- и p-моноглицериды не разделяются. Гофман [36] осуществил разделение а- и Р-моноглицеридов на слоях гидро- ксилапатита.

Фотоденситометрический метод еще позволяет определить 0,1% триглицерида в моноглицериде (рис. 79).

Р и'_с. 79. Денситометрическая кривая тонкослойной хроматограммы монопальмитина,содержащего 0,1% трипальмитина [109].

Условия разделения те же, что на рис. 77,

Последние из названных авторов переводят липиды в видимое состояние путем обугливания полуконцентрированной серной кислотой. Хроматограммы были промерены фотоденситометром, изображенным на стр. 58. Для каждого класса соединений необходимо построить отдельную калибровочную кривую. Соединения одного класса липидов, отличающиеся степенью ненасыщенности, дают различные калибровочные кривые. Это означает, что природные смеси могут быть количественно проанализированы этим методом только после предварительного гидрирования. Описанный Фиоке и Холь-

маном [134] метод определения эфиров по реакции с гидроксамовой кислотой в значительной мере не зависит от степени насыщенности этерифициро- ванных кислот.

0) Жирные кислоты и простейшие производные жирных кислот. Неоднократно описано применение ХТС для отделения обычных жирных кислот и их метиловых эфиров от эпокси-, окси- и кетокислот и их метиловых эфиров.

Рис. 80. Тонкослойная хроматограмма (копия-на рефлексной фотобумаге) природных жирных эпокси- и оксикислот и их метиловых эфиров [95].

Сорбент силикагель Г; растворитель петролейный эфир (т. кип. 60—70°) —диэтиловый эфир (9 + 1> для эфиров; петролейный эфир (т. кип. 60—-70°) — диэтиловый эфир — ледяная уксусная кислота (90 4* Ю + 1) для кислот; время анализа 40 мин; обнаружение: обугливание 50%-ной серной кислотой при нагревании; пробы по 50 цг. 1 — пальмитиновая и олеиновая кислоты; 2 — цис-9,10- эпоксистеариновая кислота; 3—^ис-12,13-эпоксиолеиновая кислота; 4—^ис, цис,-9,10; 12,13-диэпо- ксистеариновая кислота с двумя примесями; 5 — 12-оксиолеиновая кислота; 6 — трео-12,13-дио- ксиолеиновая кислота; 7 — трео-12, хлор-13-оксиолеиновая и трео-13-хлор-12-оксиолеиновая кислоты; 8—кислоты из Artemisia absynthium.

Мангольд и Малинз [81] отделяли неокисленные кислоты от окси- и диоксикислот касторового масла на пластинках с силикагелем Г, а для отделения неокисленных кислот от кетокислот ойтицикового масла использовали окись алюминия. Эти три типа кислот касторового масла были количественно проанализированы методом радиоактивных реактивов (см. стр. 75) в комбинации с ХТС в виде меченых метиловых эфиров [84]. Эфиры неокисленных кислот были элюированы и затем фракционированы методом газовой хроматографии [81] и хроматографии на бумаге [84]. Таким образом в касторовом масле была впервые обнаружена линоленовая кислота.

Фиоке и Хольман [134] определили количественное соотношение метиловых эфиров неокисленных кислот и моно- и диоксикислот касторового масла гидроксамовым методом после разделения методом ХТС (см. стр. 54).

Моррис, Хольман и Фонтель в нескольких работах [93—95] сообщали о применении ХТС для анализа эпокси- и оксикислот в масле семян. Эти исследования привели к обнаружению двух изомерных оксикислот, а именно 9-окси-транс-10-1{ис-12- и 13-окси-цыс-9-щр«нс-11-октадекадиеновых кислот.

Моррис, Хольман и Фонтель [93] нашли методом ХТС по крайней мере по три различных эпоксикислоты в шести маслах семян. На рис. 80 приведены 2 хроматограммы кислот из этих масел и их метиловых эфиров.

Фиоке, Моррис и Хольман [132] обнаружили щр«нс-9,10-эпоксиолеино- вую кислоту в побочном продукте производства оливкового масла. Шаль- варджан, Моррис и Хольман [11], а также Допешваркар и Мид [18] и Фуль- ко и Мид [25] использовали метод ХТС в опытах по физиологии питания для обнаружения замещенных жирных кислот.

Некоторые из описанных Хольманом с сотрудниками результатов разделения были затем подтверждены Кауфманом и Макусом [58] на модельных смесях. Аплеуайт, Дайэмонд и Гольдблат [2] также описали анализ методом ХТС эпокси- и оксикислот.

Моррис, Хольман и Фонтель [94] смогли показать методом ХТС, что метиловые эфиры трижды сопряженноненасыщенных жирных кислот в газохроматографическом процессе изомеризуются, а эфиры смежноненасыщенных оксикислот дегидратируются. Ненасыщенные гидроперекиси из метиловых эфиров — первичные продукты автоокисления — также дегидратируются в газохроматографическом процессе и мешают, таким образом, определению эфиров более ненасыщенных кислот.

Моррис, Хейс и Хольман [92] использовали метод ХТС для наблюдения за процессом препаративного разделения эпоксикислот.

Адсорбционная ХТС в особенности пригодна для контроля синтезов. Поскольку все виды адсорбционной хроматографии делят липиды в первую очередь на классы соединений, нет необходимости разрабатывать синтез с чистой кислотой, например, с олеиновой Кислотой. Гругер, Малинз и Гауг- литц [29] применили метод ХТС для проверки чистоты ацетилированных моно- и диглицеридов, полученных из жира сельди и лосося. Гауглитц и Малинз [26] использовали метод ХТС для анализа промежуточных продуктов, получающихся при синтезе альдегидов из рыбьего жира. Эти авторы конденсировали метиловые эфиры кислот, полученных из рыбьего жира. Они восстанавливали полученные таким образом ацилоины в диолы и расщепляли последние до альдегидов. Гауглитц и Малинз показали, что смеси метиловых эфиров, а также ацилоинов и альдегидов при адсорбционной ХТС благодаря большим различиям в длине цепи и степени ненасыщенности обнаруживают отчетливое дополнительное фракционирование (рис. 81). Сильно полярные диолы не обнаруживают этого дополнительного фракционирования.

Применение метода ХТС для анализа промежуточных и конечных продуктов химических синтезов липидов упоминалось также и другими авторами [69, 74, 133]. Анализ методом ХТС во многих случаях облегчает понимание механизма препаративных методов и позволяет правильно оценить чистоту конечных продуктов органических синтезов. ХТС часто используют для дополнительной проверки эффективности «проверенных» методов очистки. Аплеуайт, Дайэмонд и Гольдблат [2] обнаружили, что каталитическая (никель Ренея) изомеризация метил-12-оксиолеата (метилрицинолеат) в метил-12-кетостеарат приводит к образованию в качестве побочных продуктов метилстеарата, метил-12-оксистеарата и по крайней мере еще одного не идентифицированного соединения. Восстановление метил-9-окси-10,12-окта- декадионата (метилдиморфекулата) водородом на двуокиси платины, согласно Аплеуайту, Дайэмонду и Гольдблату [2], дает в результате реакций гидрогенолиза, изомеризации и восстановления наряду с желательным

9-оксистеаратом, также стеарат и кетостеарат. Упомянутые авторы использовали всегда три индикатора: флуоресцирующий минерал в адсорбционном слое для обнаружения с помощью УФ-лампы сопряженноненасыщенных соединений и бромфлуоресцеиновую пробу для обнаружения соединений с изолированными двойными связями, 2',7'-дихлорфлуоресцеин был использован для обнаружения в УФ-свете всех липидов, как насыщенных, так и ненасыщенных. Поскольку адсорбционная ХТС не позволяет отделить друг от друга насыщенные и ненасыщенные соединения определенного класса, для обнаружения насыщенных и ненасыщенных липидов, находящихся

Фронт

Дикетоны= =

Эфиры■■

Ацилоины

Кислотыivy;

Продукты окисления •** '"-s

12 3 45 6

Рис. 81. Тонкослойная хроматограмма промежуточных продуктов одного из синтезовальдегидов [26].

Сорбент силикагельТ; растворитель петролейный эфир (т. кип. 40—60°)—диэтиловый эфир (904-10);время анализа 30 мин; индикатор пары иода; пробы примерно по 100 цг. 1 — метиллиноленат,2 — линоленоин, сырой продукт; 3 — очищенный линоленоин; 4 — метиловые эфиры кислот изрыбьего жира; 5 — ацилоины из рыбьего жира, сырой продукт; о—очищенные ацилоины из рыбьегожира. Обратите внимание на дополнительное фракционирование метиловых эфиров и ацилоиновиз рыбьего жира.

рядом, при изучении реакции гидрирования помогает применение специфичных индикаторов. Ван Денен и сотрудники [150, 153] использовали метод ХТС в качестве вспомогательного средства для контроля синтезов лецитинов, де Хасс и ван Денен [152] следили за ферментативным гидролизом этих соединений, также используя метод ХТС. '

Результаты классических методов органического анализа также следует проверить современными методами разделения. Моррис [98] анализировал моноацетилрициниловый спирт — недавно найденное привлекающее вещество насекомых — методом ХТС и показал, что «чисто сгорающий» и имеющий резкую температуру плавления синтетический препарат представлял собой эквимолярную смесь рицинилового спирта с его моно- и диацетилпроиз- водными. Этот пример отчетливо показывает, что при некоторых обстоятельствах результаты элементарного анализа смеси соединений могут соответствовать суммарной формуле какого-либо из компонентов.

Мангольд и Каммерек [85] описали условия разделения методом ХТС смесей технически важных липидов, например условия отделения первичных, вторичных и третичных аминов от четвертичных аммонийных оснований, амидов и нитрилов (рис. 82).

Сильно полярные липиды, например алкилсульфаты и алкилсульфонаты, алкилфосфаты и алкилфосфонаты, и другие моющие вещества были хроматографированы упомянутыми выше авторами на смеси из 9 ч. силикагеля Г и 1 ч. сульфата аммония с растворителем из хлороформа и метанола, растворенного в разбавленной серной кислоте. Метод ХТС должен значительно облегчить сложный до сих пор анализ моющих веществ.

Подробное изучение механизма автоокисления ненасыщенных липидов побудило Прайвета [107] использовать также ХТС для этой цели. Обычно принято считать, что гидроперекиси представляют собой первичные про- 11 Заказ № 734

дукты автоокисления. Прайвет, в содружестве с Бланком [110], сумел показать методом ХТС, что при автоокислении метиллинолеата образуются неизвестные продукты, прежде чем удается обнаружить гидроперекись. Это означает, что следует пересмотреть современное представление об инициировании автоокисления ненасыщенных соединений. Прайвет и Бланк разработали также новое фундаментальное представление о роли металлов при автоокислении липидов и о действии антиокислителей и синергистов. Следует указать на недавно появившиеся публикации Рихе и сотрудников [161], а также Фиоке и Хольмана [164].

Образующиеся в- результате окисления жирных высыхающих масел олифы и лаки содержат кислород в форме различных функциональных групп.

Рис. 82. Тонкослойная хроматограмма технически важных производных жирных кислот [85].

Сорбент силикагель Г; растворитель хлороформ — 1 н. гидроокись аммония (10 4- 1) с метанолом (97 + 3); время анализа 40 мин; обнаружение: обугливание хромовой смесью при нагревании; пробы примерно по 40 цг. 1 —триалкиламин; 2 — ацетилированный N-2-этоксиамид; 3 — ацетилированный первичный амин; 4 — диалкиламин; 5 — амид; 6 — ^лкилдиметиламин; 7 — оксиэтил- амид; 8 — алкиламин.

Фрейтас [24] восстанавливал такие пленки литийалюминийгидридом и анализировал образующиеся спиртовые соединения методом ХТС. И в этой области исследования жиров применение ХТС за короткое время привело коновым многообещающим результатам.

Фосфолипиды, сульфолипиды и гликолипиды

Различные более старые методы хроматографического фракционирования этих групп веществ описаны Ханааном [32]. Сильно полярные природные липиды и синтетические вещества с аналогичными свойствами разделяются методом ХТС на классы соединений. Фракционирование таких соединений осуществляют как адсорбционным, так и распределительным методом. Особенно хорошее разделение было достигнуто при применении дезактивированных слоев (для подавления адсорбционных эффектов, ведущих к образованию хвостов). Силикагель, не содержащий гипса (см. примечание на стр. 40), оказался при этом более подходящим, чем силикагель Г.

Плазмалогены не полностью отделяются от соответствующих диэфирных соединений. Подобные альдегидогенные фосфолипиды несколько менее полярны, чем диэфирфосфолипиды и поэтому на тонкослойных хроматограммах всегда обогащаются в верхнем крае фосфатидных пятен. О хроматографическом поведении очень сложно построенных липидов пока мало данных. Следует ожидать, что интенсивное применение метода ХТС поможет выяснить строение этих соединений.

'>3*56?'>3*56?Рис. 83. Тонкослойная хроматограмма полярных липидов [135, 136].Рис. 83. Тонкослойная хроматограмма полярных липидов [135, 136].Фосфолипиды наносят на пластинки в большинстве случаев в виде 0,1 или 1%-ных растворов в хлороформе или в смеси хлороформа с метанолом (1 + 1).

'>3*56?

'>3*56?

Рис. 83. Тонкослойная хроматограмма полярных липидов [135, 136].

Рис. 83. Тонкослойная хроматограмма полярных липидов [135, 136].

Условия разделения

Сорбент. Различные классы фосфолипидов, сульфолипидов и гликолипидов фракционируют методом ХТС на силикагеле Н или силикагеле Г. Распределительная ХТС на «мокром» силикагеле Г приводит, согласно Шаль- варджану [11], к более четкому разделению, чем хроматография на высушенных и активированных слоях этого адсорбента. Добавка сульфата аммония позволяет также получить дезактивированные слои. Методом распределительной ХТС на одной пластинке можно разделить максимум 10 мг липидов, т. е. значительно меньше, чем методом адсорбционной хроматографии.

Для приготовления пластинки с силикагелем Г, содержащим сульфат аммония, используют тонкую суспензию, состоящую из 25 г силикагеля Г и раствора 2,5 г сульфата аммония в 60 мл воды. Слой следует наносить быстро, поскольку эта смесь затвердевает быстрее, чем обычная чисто водная суспензия. Пластинки вначале сушат на воздухе и затем при 120°. Скипский, Петерсон и Барклай [163] рекомендуют добавлять к силикагелю Г вместо сульфата аммония немного ацетата или карбоната натрия.

Для разделения методом распределительной хроматографии фосфатидов и других полярных липидов могут быть пригодны также порошки целлюлозы (см. стр. 40). Весьма перспективно также применение ионообменных слоев (см. стр. 40).

Сорбент силикагель Г; растворитель хлороформ —метанол — вода (65 4- 25 + 4); время анализа2 час; реактивы для опрыскивания: родамин Вв этаноле и раствор Драгендорфа; пробы по50—100 цг. 1 — лизолецитин; 2 — сфингомиелин;з — лецитин; 4 — коламин-цефалин; 5 — церебро-зид; 6 — кардиолипин; 7 — модельная смесь сое-динений 1—6.Сорбент силикагель Г; растворитель хлороформ —метанол — вода (65 4- 25 + 4); время анализа2 час; реактивы для опрыскивания: родамин Вв этаноле и раствор Драгендорфа; пробы по50—100 цг. 1 — лизолецитин; 2 — сфингомиелин;з — лецитин; 4 — коламин-цефалин; 5 — церебро-зид; 6 — кардиолипин; 7 — модельная смесь сое-динений 1—6.Растворитель. Для проведения анализа фосфолипидов методом ХТС в качестве растворителя применяют смеси хлороформа и метанола с небольшим количеством воды. Эти растворы применяются в течение многих лет для разделения фосфолипидов на пропитанной кремнекислотой целлюлозной бумаге [87], на бумаге из стеклянного волокна [31] и колонках с силикагелем- [71].

Сорбент силикагель Г; растворитель хлороформ —метанол — вода (65 4- 25 + 4); время анализа2 час; реактивы для опрыскивания: родамин Вв этаноле и раствор Драгендорфа; пробы по50—100 цг. 1 — лизолецитин; 2 — сфингомиелин;з — лецитин; 4 — коламин-цефалин; 5 — церебро-зид; 6 — кардиолипин; 7 — модельная смесь сое-динений 1—6.

Сорбент силикагель Г; растворитель хлороформ —метанол — вода (65 4- 25 + 4); время анализа2 час; реактивы для опрыскивания: родамин Вв этаноле и раствор Драгендорфа; пробы по50—100 цг. 1 — лизолецитин; 2 — сфингомиелин;з — лецитин; 4 — коламин-цефалин; 5 — церебро-зид; 6 — кардиолипин; 7 — модельная смесь сое-динений 1—6.

Вагнер [135] и Вагнер, Хорхаммер и Вольф [136] рекомендуют для разделения эфиров фосфатов на классы соединений растворитель в виде смеси хлороформа, метанола и воды (65 + 25 + 4). На рис. 83 приведена полученная этими авторами хроматограмма (см. также табл. 13).

Шлеммер [116] использовал также смесь хлороформа — метанола — воды в соотношениях 75 + 22 + 3 или 65 + 30 + 5.

Дайн, Вайкер, Шмид и Танхаузер [15, 138] предпочитают водно-амми- ачные смеси хлороформа с метанолом 1 + 3 или 3 + 1, при концентрации гидроокиси аммония 40 мл на литр. Яцкевич, которыйпервый исполь-

зовал метод ХТС для разделения фосфолипидов, сульфолипидов и гликолипидов [46, 47], рекомендует применение аммиачного раствора «-пропанола; Яцкевич и Мел [47 ] применяли три последовательных растворителя в ступенчатой методике. Состав этих растворителей и других растворителей для разделения сильно полярных липидов приведен в табл. 12.

■ Таблица 12

Растворители для разделения сильно полярных липидов на силикагеле Г

Растворитель

Соотношение объемов

Литература

Хлороформ — метанол — вода

75+22+3

116

i

65+30+5

116

65+25+4

30, 135, 136

60+35+8

135, 136

Бензол—1 н. гидроокись аммония

10+1

85

Щелочной раствор хлороформа и метанола а (40 .мл конц.

3+1

15, 36

(14 н.) гидроокиси аммония на литр)

1+3

15, 36

Кислый раствор хлороформа и метанола 6

97+3

85

Метанол, содержащий 5% 0,1 н. серной кислоты . . .

4+1

85

Ацетон — конц. (14. н.) гидроокись аммония

10+1

85

н-Пропанол— вода

7+3

67

н-Пропанол—12 я. гидроокись аммония

4+1

46, 47

н-Пропанол— конц. (14 н.) гидроокись аммония . . . .

7+3

47

н-Пропанол—12 н. гидроокись аммония

4+1

47, 48

этиленхлорид — метанол

49+1

хлороформ—ледяная уксусная кислота (96%) . . . .

95+5

н-Бутанол — пиридин — вода

3+2+1

63

а Такой растворитель готовят следующим образом: хлороформ смешивают с нормальным раствором гидроокиси аммония в соотношении 10-j-l и используют смесь из 87 об. ч. этого раствора с 3 ч. метанола [85].

б Силикагель Г, содержащий 5% сульфата аммония (см. стр. 163).

Метод обнаружения. Для обнаружения разделенных классов фосфолипидов в большинстве случаев служат реактивы для опрыскивания, применяемые обычно в хроматографии на бумаге: раствор нингидрина для аминфос- фатидов [136], реактив Драгендорфа для фосфатидов, содержащих холин [136], и реактив молибдат аммония — хлорная кислота для фосфолипидов [136]. В качестве универсальных индикаторов для липидов используют спиртовый раствор родамина В [136], слегка подщелоченный раствор бромтимолового синего [47] и пары иода. Фосфолипиды и большинство других органических соединений можно обуглить, опрыскивая хроматограммы полуконцентрированной серной кислотой или хромовой смесью и затем нагревая; при этом получают черные пятна. Применение этого и других реактивов для опрыскивания описано подробно в специальной главе этой книги (см. главу 23).

Следует настоятельно рекомендовать последовательное опрыскивание одной и той же хроматограммы несколькими реактивами, чтобы ни одно вещество не осталось необнаруженным. Это видно из табл. 13, которая заимствована из работы Вагнера, Хорхаммера и Вольфа [136].

Особенно важно обнаружение органических соединений способом обугливания (см. рис. 71. 73, 74).

Вещество

Величина

Нингид-рин

Таблица 13 [136]

РеактивДраген-дорфа

Молибдатаммония—хлорнаякислота

0—0,10 0,21^0,037 0,39+0,055 0,29+0,055 0,57+0,075 0,78+0,075 0,92+0,0150—0,10 0,21^0,037 0,39+0,055 0,29+0,055 0,57+0,075 0,78+0,075 0,92+0,015Рис. 84. Тонкослойная хроматограмма сфинголипидов [136].Рис. 84. Тонкослойная хроматограмма сфинголипидов [136].Сорбент силикагель Г; растворитель хлороформ — метанол — вода (60 + 35 + 8); время анализа 2 час; реактивы Для опрыскивания: раствор дифениламина, реактив Драгендорфа для обнаружения сфингомиелина; пробы по 50-— 100 цг. 1 — смесь сфинголипидов из бычьего мозга; 2 — неэтерифицированные цереброзиды; 3 — сернокислые эфиры цереброзидов; 4 — сфингомиелин; 5 —ганглиозиды (аб^гд).Сорбент силикагель Г; растворитель хлороформ — метанол — вода (60 + 35 + 8); время анализа 2 час; реактивы Для опрыскивания: раствор дифениламина, реактив Драгендорфа для обнаружения сфингомиелина; пробы по 50-— 100 цг. 1 — смесь сфинголипидов из бычьего мозга; 2 — неэтерифицированные цереброзиды; 3 — сернокислые эфиры цереброзидов; 4 — сфингомиелин; 5 —ганглиозиды (аб^гд).

0—0,10 0,21^0,037 0,39+0,055 0,29+0,055 0,57+0,075 0,78+0,075 0,92+0,015

0—0,10 0,21^0,037 0,39+0,055 0,29+0,055 0,57+0,075 0,78+0,075 0,92+0,015

Рис. 84. Тонкослойная хроматограмма сфинголипидов [136].

Рис. 84. Тонкослойная хроматограмма сфинголипидов [136].

Сорбент силикагель Г; растворитель хлороформ — метанол — вода (60 + 35 + 8); время анализа 2 час; реактивы Для опрыскивания: раствор дифениламина, реактив Драгендорфа для обнаружения сфингомиелина; пробы по 50-— 100 цг. 1 — смесь сфинголипидов из бычьего мозга; 2 — неэтерифицированные цереброзиды; 3 — сернокислые эфиры цереброзидов; 4 — сфингомиелин; 5 —ганглиозиды (аб^гд).

Сорбент силикагель Г; растворитель хлороформ — метанол — вода (60 + 35 + 8); время анализа 2 час; реактивы Для опрыскивания: раствор дифениламина, реактив Драгендорфа для обнаружения сфингомиелина; пробы по 50-— 100 цг. 1 — смесь сфинголипидов из бычьего мозга; 2 — неэтерифицированные цереброзиды; 3 — сернокислые эфиры цереброзидов; 4 — сфингомиелин; 5 —ганглиозиды (аб^гд).

Аминокислоты . .

Лизолецитин . .

Лецитин

Сфингомиэлин . .

Коламин-цефалин

Цереброзиды . . .

Кардиолипин . .

+ положительная реакция; — реакция отсутствует.

Применение и результаты

Яцкевичу [46] удалось осуществить методом ХТС на силикагеле Г разделение цереброзидов и отделение их сернокислых эфиров типа цереброна от эфиров типа керазина. Этим методом он проанализировал цереброзидные сернокислые эфиры, выделенные из мозга нормальных людей и из патологи

ческих мозгов, и нашел, что они, невидимому, являются идентичными. Вагнер, Хорхаммер и Вольф [136] через некоторое время подтвердили методом ХТС, что все цереброзиды, включая нервоны, содержатся в нормальном мозге в виде их сернокислых эфиров. Рис. 84 показывает, что как этерифицированные, так и неэтерифицированные цереброзидные фракции разделяются на силикагеле Г при применении в качестве растворителя смеси хлороформ — метанол — вода (60 + 35 + 8) на три зоны.

Кочетков, Жукова и Глуходед [65] также описали анализ цереброзидов методом ХТС.

Габерман, Бандтлоу и Круше [30] использовали предложенный Вагнером, Хорхаммером и Вольфом [136] растворитель для разделения фосфолипидов сыворотки крови человека методом ХТС и затем для колориметрического определения отдельных фракций после озоления в виде фосфатов. Яцкевич [48] разработал метод количественного определения различных сфинголипидов. О количественном определении лецитина и коламин-цефалина методом ХТС кратко сообщает Вагнер [166].

ХТС с большим успехом была использована для выделения и определения строения ганглиозидов. Вагнер, Хорхам-

мер и Вольф [136] разделяли на силикагеле Г ганглиозидную фракцию из мозга крупного рогатого скота на два основных компонента и три другие зоны меньшей интенсивности. Авторы считают доказанным, что два основных компонента (рис. 84, а и б) идентичны двум ганглиозидам, которые выделили раньше Кун [66] и Кленк и Гиелен [63]. Кун, Вигандт и Эгге [67 ] и Кленк и Гиелен [64] вскоре затем смогли обнаружить методом ХТС четыре ганглиозида, выделить их и установить их строение. Использованные Куном и сотрудниками, а также. Кленком и сотрудниками растворители приведены в табл. 12. Там приведены также и другие растворители для разделения более простых сфинголипидов и сложных гликолипидов.

Применение хроматографии в тонких слояхдля определения строения липидов

Прайвет и Бланк [108] описали остроумный метод анализа насыщенных и ненасыщенных а- и p-моноглицеридов. Этот «метод хроматографии в тонких

Рис. 85. Тонкослойная хроматограмма смеси ганглиозидов (1) и индивидуальных ганглиозидов (2—а) из мозга человека [64].Пробы примерно по 50 ца; слой силикагеля Г; растворитель н-бутанол — пиридин — вода (3 + 2 + 1), время анализа 2,5—3 час; реактив для опрыскивания: реактив Биалса.Рис. 85. Тонкослойная хроматограмма смеси ганглиозидов (1) и индивидуальных ганглиозидов (2—а) из мозга человека [64].Пробы примерно по 50 ца; слой силикагеля Г; растворитель н-бутанол — пиридин — вода (3 + 2 + 1), время анализа 2,5—3 час; реактив для опрыскивания: реактив Биалса.

Рис. 85. Тонкослойная хроматограмма смеси ганглиозидов (1) и индивидуальных ганглиозидов (2—а) из мозга человека [64].

Пробы примерно по 50 ца; слой силикагеля Г; растворитель н-бутанол — пиридин — вода (3 + 2 + 1), время анализа 2,5—3 час; реактив для опрыскивания: реактив Биалса.

Рис. 85. Тонкослойная хроматограмма смеси ганглиозидов (1) и индивидуальных ганглиозидов (2—а) из мозга человека [64].

Пробы примерно по 50 ца; слой силикагеля Г; растворитель н-бутанол — пиридин — вода (3 + 2 + 1), время анализа 2,5—3 час; реактив для опрыскивания: реактив Биалса.

слоях с использованием восстановительного озонирования» позволяет количественно определять следующие четыре типа моноглицеридов (I—IV):

S -U

S и

IIIIIIIV

S—насыщенная жирная кислота,

U—ненасыщенная жирная кислота.

Эти моноглицериды разделяются методом ХТС или другим каким-либо методом. Прайвет и Бланк фракционировали, как упоминалось выше, вначале а- и p-моноглицериды после отщепления гликолей в виде гликольальде- гидэфиров и неизменяемых p-моноглицеридов. Ненасыщенные гликольаль- дегидэфиры и моноглицериды переводят затем путем восстановительного озонирования в альдегидные фрагменты:

Восстановительное озонированиеВосстановительное озонирование /Н

Восстановительное озонирование

Восстановительное озонирование

" о — С -(СИ2)Ж —^\q о

+ Альдегиды с короткой цепью

Эти «альдегидные ядра» более полярны, чем не меняющиеся под действием озона гликольальдегидэфиры и моноглицериды насыщенных кислот. Поэтому эти группы веществ легко разделить методом адсорбционной ХТС (рис. 86).

Прайвету и Бланку [108] удалось количественно определить методом ХТС с использованием восстановительного озонирования шесть из семи

1,3-диолеина,1,3-диолеина,кослойнойкослойнойхроматограммыхроматограммыкривая тонкослойной хроматограммы монопальмитина и моноолеина после восстановительного озонолиза [108].Сорбент силикагель Г; растворитель петролейный эфир (т. кип. 40—60°) — диэтиловый эфир (1 + 9); время анализа 40 мин; обнаружение: обугливание 50%-ной серной кислотой прикривая тонкослойной хроматограммы монопальмитина и моноолеина после восстановительного озонолиза [108].Сорбент силикагель Г; растворитель петролейный эфир (т. кип. 40—60°) — диэтиловый эфир (1 + 9); время анализа 40 мин; обнаружение: обугливание 50%-ной серной кислотой при1,2-диастеарина и 1,3-дистеарина после восстановительного озонолиза [108].1,2-диастеарина и 1,3-дистеарина после восстановительного озонолиза [108].Сорбент силикагель Г; растворитель петролейный эфир (т. кип. 40—60°) — диэтиловый эфир (3 + 2); время анализа 40 мин; обнаружение: обугливание 50%-ной серной кислотой при нагревании. «Альдегидные ядра»: А—из 1,3-диолеина; В—из 1,2-дистеарина; С —из 1,3-дистеарина.Сорбент силикагель Г; растворитель петролейный эфир (т. кип. 40—60°) — диэтиловый эфир (3 + 2); время анализа 40 мин; обнаружение: обугливание 50%-ной серной кислотой при нагревании. «Альдегидные ядра»: А—из 1,3-диолеина; В—из 1,2-дистеарина; С —из 1,3-дистеарина.нагревании. «Альдегидные А —из моноолеина; В —гиз пальмитина.

1,3-диолеина,

1,3-диолеина,

кослойной

кослойной

хроматограммы

хроматограммы

кривая тонкослойной хроматограммы монопальмитина и моноолеина после восстановительного озонолиза [108].

Сорбент силикагель Г; растворитель петролейный эфир (т. кип. 40—60°) — диэтиловый эфир (1 + 9); время анализа 40 мин; обнаружение: обугливание 50%-ной серной кислотой при

кривая тонкослойной хроматограммы монопальмитина и моноолеина после восстановительного озонолиза [108].

Сорбент силикагель Г; растворитель петролейный эфир (т. кип. 40—60°) — диэтиловый эфир (1 + 9); время анализа 40 мин; обнаружение: обугливание 50%-ной серной кислотой при

1,2-диастеарина и 1,3-дистеарина после восстановительного озонолиза [108].

1,2-диастеарина и 1,3-дистеарина после восстановительного озонолиза [108].

Сорбент силикагель Г; растворитель петролейный эфир (т. кип. 40—60°) — диэтиловый эфир (3 + 2); время анализа 40 мин; обнаружение: обугливание 50%-ной серной кислотой при нагревании. «Альдегидные ядра»: А—из 1,3-диолеина; В—из 1,2-дистеарина; С —из 1,3-дистеарина.

Сорбент силикагель Г; растворитель петролейный эфир (т. кип. 40—60°) — диэтиловый эфир (3 + 2); время анализа 40 мин; обнаружение: обугливание 50%-ной серной кислотой при нагревании. «Альдегидные ядра»: А—из 1,3-диолеина; В—из 1,2-дистеарина; С —из 1,3-дистеарина.

ядра»: моноядра»: моновозможных диглицеридов и четыре из шести возможных триглицеридов. На рис. 87 приведены результаты анализа смеси 1,3-диолеина, 1,2-дистеари- на и 1,3-дистеарина.

ядра»: моно

ядра»: моно

«Альдегидные ядра» из моно-, ди- и триглицеридов дают одинаковые калибровочные кривые с насыщенными моно-, ди- и триглицеридами при учете поправки на потерю углерода в результате озонолиза. Это облегчает количественный анализ сложных смесей, содержащих насыщенные глицериды и глицериды ненасыщенных кислот, сильно отличающихся степенью ненасыщенности (см. стр. 57).

Прайвет и Бланк [111] использовали свой метод также для количественного определения четырех типов лецитинов:

SSPCSSPCи

S

S

PC

S

S

PC

S

PC

ииPCииPCS — насыщенная жирная кислота,U — ненасыщенная жирная кислота,PC — фосфорилхолин.

и

и

PC

и

и

PC

Полученные из лецитина при восстановительном озонолизе «альдегидные ядра» отделяют друг от друга методом ХТС на силиконизованном силикагеле Г [76]. На рис. 88 приведены фотоденситометрические кривые тонкослойных хроматограмм «альдегидных ядер» из яичного лецитина, лецитинов

спинного мозга крупного рогатого скота и лецитинов сои и пшеницы.

Прайвету и Никелю [112] удалось показать методом ХТС, что озонирование метил олеата, метилэлаидата и других цис- или транс-ненасыщенных эфиров жирных кислот приводит к образованию двух изомерных озонидов.

Рис. 88. Денситометрическая кривая «альдегидных ядер» из природных смесей лецитинов [111].

Сорбент силикон на силикагеле Г; растворитель ледяная уксусная кислота — вода (4 + 1); время анализа 1,5 час; обнаружение: обугливание 50%-ной серной кислотой при нагревании, а — лецитины из куриного яйца; б — лецитины из спинного мозга крупного рогатого скота; в — лецитины из сои; а —лецитины из пшеницы. I — насыщенные лецитины; II —«альдегидные ядра» из насыщенно(а)-ненасыщенных(^) лецитинов; III — «альдегидные ядра» из яасыщенно(р)-ненасыщен- яых (а) лецитинов (а); IV — «альдегидные ядра» из лецитинов, содержащих две ненасыщенные кислоты.

Озонирование ненасыщенных липидов всегда контролируется в Институте Хормеля методом ХТС; «переозонирование» легко доказать этим же хроматографическим методом. . '

ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ ВИНИЛОГОМОЛОГИЧЕСКИХ РЯДОВ

Летучие соединения гомологического ряда фракционируют в виде их производных методом адсорбционной ХТС. Соединения с длинной цепью — «липиды»— в большинстве случаев разделяют методом распределительной ХТС с обращенными фазами в соответствии с длиной цепи и числом двойных связей.

Методы разделения соединений с короткими цепями

Летучие альдегиды и метилкетоны встречаются в качестве продуктов ферментативного и автоокислительного разложения липидов в жирах и маслах и частично обусловливают их запах и вкус. Следы спиртов и кислот, даже аминов и меркаптанов, в первую очередь содержатся в рыбьем жире. Небольшие количества этих дурно пахнущих соединений очень трудно обнаружить химически и идентифицировать. Метод ХТС представляется идеальным для анализа этих нежелательных сопутствующих жирам веществ, в особенности в комбинации с газовой хроматографией.

В первую очередь метод ХТС пригоден для анализа осколков, получающихся при определении химического строения ненасыщенных липидов. Восстановительное озонирование ненасыщенных жирных кислот дает альдегиды и ®-альдегидокислоты с короткой цепью. Оба класса соединений можно разделить методом ХТС в виде производных в соответствии с длиной цепи. Этим же методом легко идентифицируют кислотные остатки, образующиеся при окислительном расщеплении ненасыщенных липидов.

Соединения с короткой цепью какого-либо гомологического ряда отделяют друг от друга в виде нелетучих производных методом адсорбционной ХТС. На

О О О о и

О

о12

1О

0

СМ

123 '»56'?8

Рис. 89. Разделение производных соединений с короткой цепью одногогомологического ряда методом адсорбционной ХТС на силикагеле Г.

Растворитель петролейный эфир (т. кип. 60—70°) — диэтиловый эфир (7 + 3); время анализа 40 мин; индикатор — 1 % флуоресцирующего вещества в разделительном слое, УФ-свет; пробы по 5 рг; 2,4-динитрофенилпроизводные следующих аминов: 1 — метиламин; 2 — этиламин; з — пропиламин; 4 — бутиламин; 5 —■ амиламин; 6 — гексиламин; 7 — гептиламин; 8 — октиламин.

рис. 89 в качестве примера показано разделение на силикагеле Г динитро- фенилпроизводных первичных аминов с числом углеродных агомов 1—8.

Спирты можно фракционировать в виде 3,5-динитробензоатов, а легколетучие альдегиды и кетоны — в виде 2,4-динитрофенилгидразонов. Кислоты разделяют в виде анилидов или N-метиланилидов. 3,5-Динитробензоаты из меркаптанов с длиной цепи Ct— С6 также анализируют методом адсорбционной ХТС.

Условия разделения

Сорбент. Силикагель Г и окись алюминия Г применяют для разделения методом ХТС производных соединений с короткой цепью.

Растворитель. В качестве растворителей применяют смеси гексана или петролейного эфира (т. кип. 60—70°) с диэтиловым эфиром или этилацетатом.

Метод обнаружения. Поскольку ароматические производные либо окрашены в интенсивный желтый цвет, либо сильно поглощают УФ-свет, то, для того чтобы обнаружить пятна, не требуется никаких реактивов для опрыскивания. Лучше всего применять силикагель Г, содержащий 0,5 —2% флуоресцирующей добавки, и локализовать соединения, используя УФ- лампу. Нелетучие органические примеси можно обнаружить в виде серых или черных пятен после опрыскивания хроматограммы хромовой смесью и нагревания. В большинстве случаев сами производные очень трудно озолять: например, 2,4-динитрофенилгидразоны альдегидов и кетонов окрашиваются при нагревании с хромовой смесью, но при охлаждении, как и прежде, их можно обнаружить в виде желтых пятен.

Анализ методом ХТС производных короткоцепочечных соединений какого-либо гомологического ряда удовлетворителен только при длине цепи до

С6 или С7. Ступенчатая или двумерная ХТС дает несколько лучшие результаты. Производные соединений с 10 и большим числом атомов углерода разделяются только на классы.

ХТС алифатических соединений с короткой цепью и их производных описана в других главах.

Методы, разделения соединений с длинной цепью

Смеси алифатических соединений с длинной цепью какого-либо винилогомологического ряда фракционируют методом распределительной ХТС с обращенной фазой.

Применение метода «обращенной фазы» предполагает, что анализируемые винилогомологи совершенно не содержат веществ других классов соединений. Только в очень редких случаях и только методом распределительной хроматографии можно разделить сложные смеси соединений, отличающихся как по природе, так и по числу функциональных групп, а также по длине цепи и степени ненасыщенности. Поэтому последовательное применение адсорбционной и распределительной ХТС с обращенной фазой является идеальной комбинацией при разделении сложных смесей липидов: группы соединений, не отделяющиеся друг от друга адсорбционной ХТС, разделяются затем методом распределительной хроматографии. Газовая хроматография служит для определения состава жирных кислот из липидов, выделяемых методом адсорбционной и распределительной ХТС с обращенной фазой.

Применение этих трех хроматографических методов в комбинации позволяет осуществить «трехмерный анализ липидов» [129]. Еще раз кратко сформулируем принцип такого анализа.

Сложные смеси липидов предварительно разделяют методом адсорбционной ХТС на силикагеле Г на классы соединений, например холестериновые эфиры, триглицериды, кислоты.

Каждый из этих классов соединений разделяют методом распределительной ХТС на гидрофобизованных носителях на индивидуальные соединения, например трипалъмитин, олеодипалъмитин, пальмитодиолеин и триолеин.

Отдельные соединения гидролизуют и их конституционные жирные кислоты идентифицируют- и количественно определяют (после омыления и метилирования') в виде метиловых эфиров методом газовой хроматографии.

На рис. 90 показано разделение метиловых эфиров высших жирных кислот методом распределительной ХТС с обращенной фазой. Для гидрофоби- зации пластинок, покрытых слоем силикагеля Г, использовали силикон.

Из этого рисунка видно, что методом распределительной ХТС с обращенной фазой удается разделить соединения с одинаковой длиной цепи и одного типа, например метиловые эфиры ненасыщенных С18-кислот, по степени ненасыщенности. Многократно ненасыщенные липиды одного класса продвигаются дальше, чем однократно ненасыщенные или насыщенные соединения с такой же длиной цепи. Этим методом можно разделить и отдельные члены гомологического ряда: насыщенные метиловые эфиры разделяются в соответствии с длиной цепи. Величины Rf падают с ростом длины цепи. Интересно, что величины Rf при распределительной ХТС с обращенной фазой более воспроизводимы, чем при адсорбционной ХТС.

Как и в случае других распределительных методов — противоточного распределения [1], распределительной хроматографии с обращенной фазой на колонках [118] или на пропитанной бумаге [117] — при ХТС на гидрофобизованных слоях определенные насыщенные и Ненасыщенные соединения перемещаются в виде одного пятна. Например, одно пятно образуют метил- олеат (С18, одна двойная связь) и метилпальмитат (С18, насыщенное соедине-

ние), а также метиллинолеат (С18, две двойные связи) и метилмиристат (Ctд, насыщенное соединение). Триолеин и трипальмитин, трилинолеин и тримиристин и пары соответствующих свободных кислот или альдегидов также являются «критическими партнерами» [78]. Как правило, липиды определенного класса соединений, имеющих две метиленовые группы и одну

I 2345 678910

Рис. 90. Фракционирование класса липидов методом распределительной ХТС -с обращением фаз [76].

Сорбент силикон на силикагеле Г; растворитель ацетонитрил —ледяная уксусная кислота —вода (70 + 10 + 25); время анализа 40 лшн; обнаружение: пары иода (), затем а-циклодекстрин-

иод (); пробы по 20 ца. 1 — метиллаурат;' 2 — метилмиристат; з — метилпальмитат;

— метилстеарат; 5 — метиловые эфиры насыщенных кислот; 6 — метиловые эфиры кислот Cis из рыбьего жира; 7 — метиловые эфиры ненасыщенных кислот Cis; 8 — метилолеат; 9 — метиллинолеат; 10 — метиллиноленат.'

двойную связь, движутся совместно. Большинство критических партнеров можно разделить методом низкотемпературной хроматографии [57, 117] или методом хроматографии с перекисным растворителем [79]. Эти специальные методы описаны ниже.

Условия разделения

Сорбент. Для гидрофобизации пластинок с силикагелем Г автор рекомендует силиконовое масло, применяемое в хроматографии липидов на бумаге, «Dow Corning 200 Fluid» (см. стр. 46). Вместо него в качестве гидрофобных пропиточных средств можно использовать некоторые углеводороды, например ундекан [58], тетрадекан [62] или сквалан [10], или смесь высокомолекулярных парафинов [142].

Высокомолекулярные гидрофобизующие пропитки, согласно опыту автора, превосходят легколетучие углеводороды. Слои, пропитанные силиконом, парафином или скваланом, не меняют своих свойств в течение нескольких недель; в противоположность этому при пропитке ундеканом содержание неподвижной фазы разделительных слоев непрерывно уменьшается, результат разделения является всегда неопределенным, и поэтому пластинки следует всегда держать в атмосфере, насыщенной ундеканом. Пропись для пропитки пластинок, покрытых слоем силикагеля Г или кизельгура Г, приведена на стр. 45. Там же приведены адреса поставщиков соответствующих силиконовых и парафиновых препаратов.

Недавно в продаже появились мелкозернистые полиэтиленовые и полиамидные порошки для ХТС (см. стр. 42). Эти пластмассы очень хорошо зарекомендовали себя при фракционировании на колонках жирных кйс- лот [28] и жирорастворимых витаминов [143]. Некоторые работы по применению полиамидного порошка для хроматографии в тонких слоях уже

опубликованы [16, 17]. Другие пластмассы, например тефлон [3], должны оказаться пригодными для разделения липидов методом распределительной ХТС с обращенными фазами.

Растворитель. Поведение класса липидов на адсорбционных слоях позволяет судить о их полярности и облегчает, таким образом, выбор соответствующего растворителя для фракционирования этих соединений методом распределительной ХТС с обращенными фазами.

Большинство смесей растворителей, применяемых при хроматографии липидов на бумаге, пригодны также для ХТС на гидрофобизованных слоях [58, 76]. Триглицериды и менее полярные липиды (см. рис. 70) обычно можно разделить в соответствии с длиной цепи и степенью ненасыщенности, применяя ледяную уксусную кислоту или ацетонитрил, которые содержат до 10% воды. Хорошими растворителями для фракционирования слабо полярных классов липидов являются также смеси хлороформ — метанол с 5% воды и смеси ацетона или метилэтилкетона с ацетонитрилом. Для разделения полярных липидов в соответствии с длиной цепи и степенью ненасыщенности пригодна смесь: ледяная уксусная кислота — ацетонитрил, а также смеси ледяной уксусной кислоты и ацетонитрила или тетрагидрофурана с 10— 50% воды. Сильно полярные липиды, например алкилсульфаты или четвертичные аммонийные основания, фракционируют на целлюлозе с водным этанолом в качестве растворителя.

Малинз и Мангольд [76] использовали смесь ледяной уксусной кислоты с водой (17+3) для разделения высших жирных кислот на силиконизованном силикагеле Г. Эти же авторы провели хроматографическое разделение метиловых эфиров высших жирных кислот на силиконе в качестве неподвижной фазы, применяя в качестве растворителя смесь ацетонитрил — ледяная уксусная кислота — вода (70 + 10 + 25). Хакрабарти [10] нашел, что этот растворитель может быть также использован при пропитке силикагеля Г скваланом вместо силиконового масла.

Кауфман и Макус [58] работали с силикагелем Г, пропитанным ундеканом. Они применяли в качестве растворителя для разделения высших жирных кислот смеси ледяная уксусная кислота — вода (24 + 1) и ледяная уксусная кислота — ацетонитрил (1 + 1). Эти же авторы разделяли жирные спирты на силикагеле Г, пропитанном ундеканом, применяя смесь ледяной уксусной кислоты с ацетонитрилом (1+3), и жирные эпокси- и эписульфидокислоты, применяя смесь ледяной уксусной кислоты с водой (4 + 1).

Кауфман и Макус [58] сообщили также о разделении диглицеридов и триглицеридов методом распределительной ХТС с обращенными фазами. Смесь хлороформ — метанол — вода (5 + 15 + 1) использовалась для фракционирования диглицеридов, смесь ацетон — ацетонитрил (7 + 3) использовалась для разделения синтетических триглицеридов на силикагеле, пропитанном ундеканом.

Кауфман и его сотрудники перешли затем к использованию высокомолекулярных гидрофобизующих пропиток. Вместо ундекана они использовали тетрадекан [62]. В дальнейшем они применяли для пропитки нефтяную фракцию (т. кип. 240 — 250°) и затем перешли в основном на силиконовое масло [61]. Кауфман, Макус и Дейке [59], используя двумерную ХТС, смогли разделить 15 холестериновых эфиров (см. стр. 257). Кауфман, Макус и Дас [61] разделяли на пропитанном кизельгуре Г смеси синтетических триглицеридов, а также фракции триглицеридов, выделенных из природных жиров и масел. Растворителями служили смеси ацетон — ацетонитрил (4 + 1), метанол — ацетонитрил — пропионитрил (10 + 8 + 3). Кауфман и Дас [156] сообщили о разделении триглицеридов методом ХТС на гидрофобизо- ванном кизельгуре Г в работе, появившейся во время издания настоящей

Таблица 14

Растворители для распределительной ХТС с обращенными фазами

Растворитель а

Соотношение объемов

Неподвижная фаза

Фракционируемый класс липидов

Литература

Метанол

—

Парафин 6

Каротинали

142 (см. также стр. 220)

Ледяная уксусная

кислота — вода . . . .

24+1

Ундекан 6

Жирные кислоты

58

3+1

Силикон 6

Жирные кислоты и их метиловые эфиры

76

Ь17+3

»

Жирные кислоты и их метиловые эфиры, «альдегидные ядра» из лецитиновд

76

111

Ледяная уксусная

17+3

Сквалан 6

Жирные кислоты и их метиловые эфиры

10

кислота — ацетонитрил Ледяная уксусная

1 + 1

Ундекан б,в

Жирные кислоты

58,60

кислота — ацетонит-

рил — вода

2+14+5

Силикон 6

Метиловые эфиры высших жирных кислот

76

2+14+5

Сквалан 6

То же

10

Ацетон — этанол —

129

вода

6+1+3

Полиэтиленг

»»

Ледяная уксусная кислота — муравьиная

кислота — водае . . .

2+2+1

Силикон 6

Жирные кислоты насыщенные/ненасы- щенные

76

Ледяная уксусная кислота — надуксусная

кислота — вода . . . .

15+2+3

»

То же

76

Метилэтил кетон—

ацетонитрил

7+3

Парафин б

Холестериновые эфиры высших жирных кислот

59

Ледяная уксусная

кислота — вода . . . .

4+1

Ундеканв

Жирные кетокислоты, лактоны

62

Ледяная уксусная

4+1

Парафинв

Жирные кетокислоты, лактоны

62

кислота—вода . . . .

9+1

Тетрадеканв

Жирные оксикислоты

62

3+1

Парафин в

То же

62

Хлороформ — метанол—

вода

5+15+1

Ундекан б

Диглицериды

58

Метанол — ацетонитрил

Метанол — ацетонит-

5+4

Силикон в

Триглицериды

61

рил — пропионитрил

10+8+3

»

61

Продолжение табл. 14

Растворитель а

Соотношениеобъемов

Неподвижнаяфаза

ФракционируемыйЛитера-

класс липидовтура

Ацетон — ацетонит-рил

4+1

7+3

Парафинв Ундекан

60,61

58

а Все растворители следует насытить неподвижной фазой (гидрофобизующим средством), б На силикагеле Г.

в На кизельгуре Г.

г Непосредственно на стеклянной пластинке.

д Разделение на классы соединений.

е Хроматографическое разделение при 4—6°.■

книги. Следует указать также на две другие публикации по гидрированию и бромированию ненасыщенных липидов на пластинках, покрытых слоем, а также по разделению «критических» смесей жирных кислот и «критических» смесей триглицеридов после химических реакций [158]. Кауфман и Коэ [158] описывают применение гипса в качестве адсорбента для пластинок.

Критические партнеры можно разделить методом низкотемпературной хроматографии или хроматографии с использованием перекисных растворителей. Оба эти метода будут описаны подробно в следующих разделах. Третий метод основан на образовании продуктов присоединения ацетата ртути к ненасыщенным липидам (см. стр. 175—179).

Шленк с сотрудниками [117], а вскоре затем Кауфман и Мор [57] показали, что критические пары насыщенных и ненасыщенных липидов могут быть отделены друг от друга низкотемпературной хроматографией на сили- конизованной или пропитанной ундеканом бумаге. Малинз и Мангольд [76] использовали этот метод для фракционирования на силиконизованном силикагеле смеси пальмитиновой и олеиновой кислот. Смесь ледяная уксусная кислота — муравьиная кислота — вода (2+2+1) отделяет в течение примерно 8 час при 4—6° олеиновую кислоту (7?/ 0,10) от пальмитиновой, которая остается на точке старта.

Для разделения критических пар насыщенных и ненасыщенных липидов и на силиконизованной бумаге могут быть, согласно Мангольду, Гелерману и Шленку [79], использованы перекисные растворители. Этот метод был использован многократно [7, 80, 85]. Малинз и Мангольд [76] описали метод ХТС с окислительными растворителями: в водном растворителе следует заменить 1 ч. воды пергидролем, в уксуснокислом — 1ч. кислоты надуксусной кислотой. Эти растворители окисляют все ненасыщенные липиды в процессе хроматографического разделения; сильно полярные продукты реакции вымываются фронтом одновременно, а насыщенные липиды движутся, не претерпевая изменений, и в полезной области хроматограммы отделяются друг от друга. Типичными перекисными растворителями являются смеси: ледяная уксусная кислота — надуксусная кислота — вода (15 + 2 + 3) и ледяная уксусная кислота — вода — перекись водорода (17 + 1 + 2).

Для разделения методом распределительной ХТС с обращенными фазами требуется обычно 3—4 часа; быстрее движется только растворитель, содержащий ацетонитрил.

В табл. 14 приведена сводка растворителей, используемых для ХТС с обращенными фазами.

Метод обнаружения. Для обнаружения ненасыщенных липидов на гидрофобизованных пластинках могут быть использованы пары иода [80]. Большинство органических веществ обнаруживаются на силиконизованных слоях силикагеля Г способом озоления хромовой смесью [111]. Кауфман с сотрудниками [58, 59] предпочитают в качестве реактива для опрыскивания родамин В и спиртовый раствор фосфорномолибденовой кислоты.

2', 7'-Дихлорфлуоресцеин, часто применяемый для обнаружения липидов на адсорбционных слоях, не пригоден в случае гидрофобизованных пластинок [76].

Применение и результаты

На рис. 90 (6) в качестве примера показано применение гидрофобизованных слоев для разделения жирных кислот из рыбьего жира в виде их метиловых эфиров. Идентичность различных эфиров была доказана одновременным хроматографированием известных эталонных веществ и с помощью УФ-спектров полиеновых эфиров, подвергнутых изомеризации щелочью. Выделено неизвестное соединение, которое нельзя было идентифицировать ни методом щелочной изомеризации, ни методом газовой хроматографии [76].

Кауфман, Макус и Коэ [60] фракционировали методом распределительной XTG с обращенной фазой триглицериды льняного масла, а также соевого масла и суррогата масла какао. Кауфман, Макус и Дас [61] сообщили о разделении триглицеридов маисового масла. Эти же авторы фракционировали методом обращенной фазы также триглицеридные фракции подсолнечного, кунжутного и оливкового масел, свиного и говяжьего сала. В каждом случае получалось несколько резко ограниченных пятен более простых смесей триглицеридов. Маисовое масло, например, было разделено на 8 триглицеридных фракций, льняное масло дало даже 10 пятен.

В связи с этим следует указать также на работы Винтерштейна с сотрудниками [141, 142] по разделению каротиналей (см. стр. 220).

РАЗДЕЛЕНИЕ ЛИПИДОВ В СООТВЕТСТВИИСО СТЕПЕНЬЮ НЕНАСЫЩЕННОСТИ

Методом адсорбционной хроматографии липиды разделяют прежде всего на классы соединений. Распределительная хроматография с обращенной фазой позволяет фракционировать смеси веществ одного класса в соответствии с длиной цепи и степенью ненасыщенности. Границы возможного применения последнего метода определяются тем обстоятельством, что соединения, имеющие одну двойную связь и две метиленовые группы, например метил олеат и метилпальмитат, движутся совместно. В определенных случаях подобные «критические партнеры» могут быть отделены друг от друга методом низкотемпературной хроматографии. Смеси насыщенных и ненасыщенных липидов одного класса можно разделить также путем образования производных ненасыщенных компонентов. Проще всего окислить все ненасыщенные липиды. В качестве примера можно привести отмеченное на стр. 174 окисление ненасыщенных липидов перекисными растворителями в процессе хроматографического разделения. Этот метод является количественным, но имеет недостаток, заключающийся в том, что ненасыщенные соединения не могут быть регенерированы из продуктов окисления.

Имеются также опыты по получению таких производных ненасыщенных липидов, которые можно вновь подвергнуть расщеплению. Особенно легко получить ацетоксимеркуриметоксипроизводные [13] — продукты присоединения, образующиеся в результате реакции ненасыщенных соединений со

слабым уксуснокислым раствором ацетата ртути в метаноле:

н н

н н

— с=с

Hg(CH3COO)21I

СНдОН||

ОСН3 HgOCOCH3

Эта реакция присоединения протекает при комнатной температуре с количественным выходом [43]. ^мс-Соединения реагируют в 10—20 раз

Рис. 91. Тонкослойная хроматограмма продуктов присоединения ацетата ртути на силикагеле Г [83].

Растворитель: I —петролейный эфир (т. кип. 60—70°) —диэтиловый эфир (4 + 1); И —н-про- панол —ледяная уксусная кислота (100 + 1); время анализа: I 1,5—2 час; ИЗ—4 час; обнаружение: s-дифенилкарбазон в этаноле и затем пары иода; пробы: по 20 цг метиловых эфиров, 50—100 цг продуктов присоединения. 1 — метилстеарат; 2 — метилолеат; 3 — мётиллинолеат; 4 — метилли- ноленат; 5—10 — продукты присоединения ацетата ртути к метиловым эфирам кислот Cie из CMorella pyrenoidosa (5), метиловым эфирам кислот Cis из CMorella (6), метиловым эфирам суммы кислот из CMorella (7), метилолеату (8), метиллинолеату (9), метиллиноленату (70);

II — ацетат ртути.

быстрее, чем соответствующие транс-изомеры [43]. Ненасыщенные соединения могут быть регенерированы путем реакции аддуктов с соляной кислотой, не ^вызывающей ^мс-транс-изомеризации или смещения двойных связей [42, 45].

Инуйе с сотрудниками разделяли методом хроматографии на бумаге продукты присоединения ацетата ртути к метиловым эфирам высших жирных кислот [38], а также продукты присоединения к лецитинам [39] и триглицеридам [40, 101]. Кауфман и Поллерберг [55] фракционировали также на бумаге аддукты аллиловых эфиров жирных кислот с очень длинной цепью.

Янцен и Андреас [42, 44] и Янцен, Андреас, Моргенштерн и Рот [45] отделяли метиловые эфиры насыщенных жирных кислот от продуктов присоединения ацетата ртути к метиловым эфирам ненасыщенных жирных кислот методом адсорбционной хроматографии на колонках с силикагелем. Эти же авторы показали, что продукты присоединения ацетата ртути к эфирам ненасыщенных кислот независимо от длины цепи разделяются строго в соответствии со степенью ненасыщенности (или в соответствии с числом ацето- ксимеркуриметоксигрупп, приходящихся на молекулу).

Напрашивается применение этого метода фракционирования также в случае покрытых слоем пластинок. На рис. 91 схематически показана возможность применения метода XTG к продуктам присоединения ацетата ртути.

Даже смеси различных классов липидов можно разделить методом ХТС в виде продуктов присоединения ацетата ртути в соответствии со степенью ненасыщенности, однако при условии, что соединения не слишком различаются по полярности. Например, углеводороды, эфиры восков и ацетаты спиртов настолько слабо полярны, что хроматографическое поведение их продуктов присоединения целиком определяется числом ацетоксимеркуриметоксигрупп, приходящихся на молекулу. Поэтому продукты присоединения ацетата ртути к октадецену-9, цетил олеату и олеилацетату перемещаются не разделяясь, точно так же как продукты присоединения к октадекадиену-9,12, цетиллинолеату и линолеилацетату.

Получение продуктов присоединения ацетата ртути

Оправдала себя следующая методика Янцена и Андреаса [43 , 44].

Реактив представляет собой раствор 14 г ацетата ртути (II) в 250 мл метанола, содержащего 2,5 мл воды и 1 мл ледяной уксусной кислоты. Для обработки липидов с небольшим иодным числом 40 мл этого раствора смешивают с 1 г пробы. Для липидов с иодным числом, превышающим 100, применяют 0,4 X и. ч. мл раствора реагента на 1 г пробы. Реакционную смесь хранят в склянке с атмосферой азота в темноте.

Если все ненасыщенные соединения находятся в ^wc-форме, то реакция протекает до конца при комнатной температуре в течение 12 час; для реакции транс-соединений требуется не менее 2 дней.

После окончания реакции большую часть метанола упаривают при температуре ниже 30° в вакууме. Остаток растворяют в 10—20 мл хлороформа, несколько раз промывают водой для удаления избытка ацетата ртути и сушат хлороформный раствор продуктов присоединения безводным сульфатом натрия.

Леннартц разработал усовершенствованную методику. Она описана подробно Гольдфайном и Блохом [27].

Большей частью продукты присоединения ацетата ртути к ненасыщенным липидам представляют собой прозрачные бесцветные масла. Для разделения методом ХТС их наносят в виде растворов в хдороформе.

Условия разделения .

Сорбент. Для фракционирования продуктов присоединения ацетата ртути к липидам, содержащим до трех двойных связей, весьма пригоден

Рис. 92. Тонкослойная хроматограмма продуктов присоединения ацетата ртути к метиловым эфирам жирных кислот из водоросли Chlorella pyrenoidosa (ср. рис. 91 и 93).

силикагель Г [83]. Другие адсорбенты еще не испробованы. Весьма желательно подобрать разделительные слои, обеспечивающие также фракционирование продуктов присоединения более ненасыщенных липидов. .

Продукты присоединения в большинстве случаев подвергаются хроматографическому разделению в препаративном масштабе: на стандартной пластинке 20 X 20 см разделяют до 10 мг этих соединений (см. рис. 92).

12 Заказ № 734•

Растворитель. Петролейный эфир (60—70°)— диэтиловый эфир (4 + 1) за 1,5—2 часа отделяет метиловые эфиры насыщенных жирных кислот от ^продуктов присоединения ацетата ртути к эфирам ненасыщенных кислот. За это время фронт достигает высоты 15—18 см. Второй растворитель — смесь н-пропанола и ледяной уксусной кислоты (100 + 1)— служит для фракционирования продуктов присоединения к ненасыщенным эфирам. За 3—4 часа он перемещается на 12—14 см.

Насыщенные и ненасыщенные углеводороды, эфиры восков, ацетаты спиртов, нитрилы и другие слабо полярные липиды, а также удивительным образом и спирты, моноглицериды и даже жирные кислоты при этих же условиях фракционируются в виде продуктов присоединения.

Метод обнаружения. Продукты присоединения к ненасыщенным липидам можно обнаружить в виде пятен, окрашенных от фиолетового до пурпурного цвета на светло-розовом фоне при опрыскивании 0,1%-ным раствором s-дифенилкарбазона в 96%-ном этаноле. Насыщенные эфиры локализуют 2', 7"-дихлорфлуоресцеином или парами иода (реактивы № 42 и № 72).

Ацетоксимеркуриметоксисоединения моноенов (АЯу 85), диенов (двойное пятно, hR) 55 и 45) и триенов UiRj 15) четко отделяются друг от друга — длина цепи различных эфиров не оказывает никакого влияния на хроматографическое поведение продуктов присоединения. Приведенные здесь величины R) хорошо воспроизводятся; по-видимому, при хроматографии со смесью н-пропанол — ледяная уксусная кислота процесс распределения преобладает над адсорбционными эффектами.

Насыщенные эфиры с различной длиной цепи располагаются между двумя фронтами растворителей.

е) Обработка продуктов присоединения

Силикагель Г соскребают с пластинки для ХТС с тремя группами адсорбированных продуктов присоединения в виде полос шириной 2—3 см. Каждую из трех фракций встряхивают в пробирке с 10 мл метанола и 0,5 мл концентрированной соляной кислоты в атмосфере азота. После непродолжительного стояния адсорбент оседает и почти прозрачный раствор декантируют и фильтруют. Осадок повторно обрабатывают смесью метанола с соляной кислотой. Объединенные фильтраты фракций разбавляют 25 мл воды, экстрагируют один раз порцией 25 мл и затем четыре раза порциями по 10 мл диэтилового эфира. Эфирные вытяжки сушат сульфатом натрия. После декантации растворитель отгоняют и получают группы соединений с одной, двумя и тремя двойными связями и более ненасыщенные липиды. Насыщенные липиды элюируют смесью петролейного эфира и диэтилового эфира (1 + 1) или диэтиловым эфиром.

г) Применение и результаты

Разделение продуктов присоединения ацетата ртути к липидам методом ХТС использовали прежде всего для смесей метиловых эфиров [83]. Этот метод идеально дополняет газовую хроматографию: сложные смеси эфиров высших жирных кислот, не разделяемые газохроматографически, можно предварительно разделить методом ХТС продукты присоединения ацетата ртути. Степень чистоты групп эфиров насыщенных кислот, а также кислот с двумя и тремя двойными связями превышает 98%. Каждая группа в отдельности была разделена методом газовой хроматографии в соответствии с длиной цепи. Газовая хроматография таких групп эфиров облегчает идентификацию отдельных компонентов и позволяет также обнаружить следы эфиров, которые не были обнаружены при хроматографировании общей пробы. Рис. 93 схематически иллюстрирует принцип описанного здесь метода.

С 18'1

IМоноены

\С,6;1

Рис. 93. Схема газохроматографического анализа метиловых эфиров жирных кислот после предварительного разделения методом ХТС продуктов присоединения ацетата ртути (см. рис. 92) [83].

Комбинированное применение методов ХТС и газовой хроматографии приводит к более надежному количественному анализу, чем при использовании только метода газовой хроматографии (см. также [155]).

РАЗДЕЛЕНИЕ ^ЯС-ТРЛЯС-ИЗОМЕРОВ

Как показали Моррис, Хольман и Фонтел [93], методом ХТС на силикагеле Г в редких случаях удается фракционировать эфиры цис-транс-изомерных жирных кислот.

Недавно стал известен общий метод разделения ци.с-транс-изомеров липидов: ненасыщенные соединения образуют с ионами серебра комплексы, имеющие различную растворимость.

Никольс [160] еще в 1952 г. указал на то, что метилолеат (^цс-октадеценоат) и метилэлаидат (транс-октадеценоат) можно разделить способом распределения между двумя несмешивающимися жидкостями, содержащими небольшое количество нитрата серебра. Датмон, Шолфилд и Джонс [151] несколько лет спустя осуществили такое разделение.

Заслуга де Ври [165] состоит в том, что он впервые показал, что цис-транс-изоттеры разделяются также на слоях силикагеля, пропитанных нитратом серебра. Он осуществил фракционирование смеси метилстеарата, метилэлаидата и метилолеата и смеси элаидодипальмитина и олеодинальмитина на колонках с силикагелем Г, содержавшим нитрат серебра. Далее, ему удалось показать, что метиловые эфиры кислот различной степени насыщения, например метилолеат, метиллинолеат и метиллиноленат, также разделяются в виде комплексов с ионами серебра. Четко можно разделить также тристеарин, олеодипальмитин, стеародиолеин и триолеин.

Моррис [159] использовал этот принцип для фракционирования метиловых эфиров кислот с одной и несколькими двойными связями. Он отделял также олефиновые эфиры от эфиров с одной тройной связью, цис-транс- Изомеры метилолеата и метилэлаидата, а также соответствующие эпокси- и оксиэфиры были хорошо разделены на слоях силикагеля Г, пропитанного

нитратом серебра. В качестве растворителя применяли смесь петролейный эфир (т. кип. 60—70°) — диэтиловый эфир (60 + 40), для обнаружения использовали 2',7'-дихлорфлуоресцеин (реактив № 42).

Моррис [159] продемонстрировал дальше, что трео- и эритро-формы насыщенных диоксиэфиров можно разделить в виде боратных комплексов на слоях силикагеля Г, пропитанного водным раствором борной кислоты. Этот же автор совместно наносил раствор нитрата серебра и борной кислоты на пластинки, покрытые силикагелем Г, и фракционировал насыщенные и ненасыщенные трео- и эритро-диоксиэфиры. Смесь петролейный эфир (т. кип. 60—70°) — диэтиловый эфир (40 + 60) использовалась в качестве растворителя, а 2',7'-дихлорфлуоресцеин — в качестве индикатора.

Баррет, Даллас и Падли [149] сообщили о фракционировании синтетической смеси триглицеридов, а также свиного сала, масла какао, масла хлопкового семени и других жиров и масел методом ХТС на слое силикагеля Г, пропитанного нитратом серебра.

ВЫВОДЫ

ХТС применяется при исследовании липидов в первую очередь в виде адсорбционного метода для разделения сложных смесей на классы соединений. При использовании этого изящного метода один сотрудник в течение 1 дня может легко фракционировать в десять раз больше проб, чем при использовании колоночной хроматографии в течение недели. Разделение методом ХТС является значительно более четким, чем разделение методом колоночной хроматографии. Для количественного анализа разделяемых липидов существует уже много методов [84, 108, 109, 134, 140] (см. также стр. 52). Отдельные классы липидов могут быть элюированы и выделены. Путем омыления этих липидов легко выделить жирные кислоты и затем провести их фракционирование и количественное определение в виде метиловых эфиров методом газовой хроматографии [76, 77, 82, 129].

Метод адсорбционной ХТС может быть дополнен методом распределительной ХТС на дезактивированных, содержащих воду адсорбентах и методом распределительной ХТС с обращенными фазами на гидрофобизованных слоях: распределительная ХТС на дезактивированных адсорбентах позволяет разделять сильно полярные липиды (см. стр. 163). Методом распределительной ХТС с обращенными фазами можно фракционировать соединения одного класса липидов (см. стр. 170—175).

Фракционирование липидов по степени ненасыщенности методом ХТС продуктов присоединения ацетата ртути представляет собой дальнейшее усовершенствование метода. Таким образом удается разделять цис-транс- изомеры (см. стр. 175—180).

Большие преимущества метода ХТС: простота, быстрота, четкость разделения, чувствительность метода обнаружения разделяемых веществ и высокая емкость слоев полностью используются только в случае сочетания различных вариантов ХТС. В первую очередь следует последовательно применять адсорбционную ХТС и распределительную ХТС с обращенными фазами: смеси липидов, не разделяющиеся на адсорбентах, можно разделить распределительным методом, и наоборот.

ХТС липидов на ионообменниках еще пока не описана. Можно полагать, что ионообменная ХТС может оказаться весьма полезной при фракционировании сильно полярных липидов. Для осуществления подобных разделений, вероятно, пригоден ионофорез в тонких слоях и хроматография и ионо- форез в тонких слоях (см. стр. 32). Перспективна также хроматография на тонких слоях мочевины или других веществ, способных образовать соединения включения. Вероятно, на слоях мочевины можно отделить неразвет-

вленные липиды от многократно разветвленных, а также насыщенные от ненасыщенных.

Вещество, оказавшееся однородным после применения различных методов хроматографического разделения, можно рассматривать как «хроматографически чистое». На рис. 44 приведен радиоавтограф тонкослойной хроматограммы меченых жирных кислот. Фирма-изготовитель указала, что «чистота» каждой такой кислоты была подтверждена методом газовой хроматографии. Рис. 44 показывает, однако, что эти продажные препараты, все без исключения, представляют собой смеси. Почти все загрязнения — промежуточные продукты синтеза этих кислот — более полярны, чем сами жирные кислоты. Они, по-видимому, застревают в газохроматографической колонке и не регистрируются в элюате.

То обстоятельство, что при XTG весь разделительный путь расположен открыто, представляет особое преимущество метода. В противоположность всем колоночнохроматографическим методам ни одно вещество не может ускользнуть от наблюдения, даже если оно является летучим. Было показано, что смеси летучих веществ (и даже газы) могут быть фракционированы методом XTG в форме производных (см. стр. 168—170).

Махадеван [75] исследовал окисляемость ненасыщенных липидов в процессе хроматографического разделения в тонких адсорбционных слоях. Однако даже самыми чувствительными химическими методами он не смог доказать автоокисления жирных кислот с несколькими двойными связями и их холестериновых эфиров в процессе разделения методом XTG. Напротив, он обнаружил, что метод XTG весьма пригоден для быстрой чистки автоокис- ляющихся липидов.

Легко также показать методом двумерной XTG, что при нормальных условиях автоокисление в процессе хроматографического разделения не оказывает влияния. Если разделить сильно ненасыщенные нейтральные липиды методом двумерной хроматографии, используя один и тот же растворитель, то разделенные вещества лежат на одной диагонали [84]. Полярные продукты окисления, перемещающиеся очень медленно, можно обнаружить только после того, как пластинка, обработанная в одном направлении, хроматографируется затем не менее 10 мин в другом направлении. %,- ,

При выделении липидов методом XTG весьма важно как можно быстрее соскрести еще влажный адсорбент и сразу же элюировать. Автоокисление наступает быстро, если хроматограмма не содержит защитной пленки растворителя. Поэтому ненасыщенные липиды на гидрофобизованных слоях значительно более устойчивы, чем на сухих адсорбционных слоях.

Пригодные для липидов растворители выбирают, проводя хроматографическое разделение этих веществ при использовании нескольких полярных растворителей. Растворитель, который перемещает данный класс липидов вблизи фронта, следует применить в качестве элюирующего вещества (см. стр. 138). Для элюирования нейтральных липидов наиболее пригоден диэтиловый эфир, иногда с добавкой 10—20% метанола. Сильно полярные липиды имеют склонность образовывать трудно растворимые соли и комплексы с ионами кальция адсорбента, к которому в качестве связующего добавлен гипс. Однако, применяя специальные растворители, можно количественно элюировать и такие классы соединений, как, например, фосфолипиды [111]. Сильно полярные липиды Чс1сто имеет смысл подвергнуть хроматографическому разделению в форме слабо полярных производных, которые элюируются затем без затруднений [80, 84].

В случае разделения метиловых эфиров высших жирных кислот методом газовой хроматографии часто, руководствуясь только удерживаемыми объемами, «идентифицируют» вещества как эфиры разветвленных жирных кислот. В действительности, однако, эти вещества являются альдегидами

содержащимися в животных тканях в свободном состоянии или в виде альдегидогенных липидов наряду с эфирными липидами или альдегиддиметилацеталями, которые образуются из альдегидов в процессе этерификации жирных кислот смесью метанола с соляной кислотой. Метод адсорбционной ХТС позволяет легко доказать присутствие таких загрязнений в метиловых эфирах и выделить чистые эфиры перед газохроматографическим анализом [129]. По мнению автора, предварительная очистка анализируемого материала методом адсорбционной хроматографии является необходимым условием каждого газохроматографического анализа. Только это условие обеспечивает разделение методом газовой хроматографии действительно одного класса соединений.

Метод ХТС оправдал себя также при анализе и очистке радиоактивно меченных липидов. Некоторые типичные примеры применения метода рассмотрены на стр. 72.

Отделение методом ХТС алициклических жирных примесей рассмотрено в ряде разделов настоящей книги. Особенно следует отметить значение метода для химии стеринов (стр. 251), каротинов (стр. 218), жирорастворимых витаминов (стр. 213—236), терпенов и смол (стр. 186—211).

ЛИТЕРАТУРА

Ahrens Е. Н., jr., Craig L. С., J. Biol. Chern., 195, 299 (1952).

Applewhite T. H., Diamond M. J., Goldblatt L. A., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 38, 609 (1961).

A r c u s A. C., Dunckley G. G., J. Chromatog., 5, 272 (1961).

Bloor W. R., J. Biol. Chem., 77, 53 (1928).

Boer Th. J. d e, В a ck e r H. J., in Organic Syntheses, Vol. 34, p. 96, W. S. J о h ns о n, Editor, New York, John Wiley and Sons, Inc., London, Chapman and Hall., Ltd., 1954.

Brockmann H., Volpers F., Chem. Ber., 82, 95 (1949).

Buchanan M. A., Anal. Chem., 31, 1616 (1959).

Carroll К. K., J. Lipid Res., 2, 135 (1961).

C a r t e r H. E., M с C 1 u e r R. H., S 1 i f e r E. D., J. Am. Chem. Soc., 78, 3735 (1956).

Chakrabarty M., частное сообщение, 1961.

Chalvardjian A., M о rris L. J., H о 1 man R. T., J. Nutrition, 76 52 (1962).

Chalvardjian А., частное сообщение, 1961.

Chatt J., Chem. Revs., 48, 7 (1951).

C r a i g L.C., Craig D., in Technique of Organic Chemistry, Vol. Ill, p. 171, A. Weissberger, Editor, New York, Interscience Publishers Inc., 1950.

Dain J.A., Weicker H., Schmidt G.,Thannhauser S. J., in Symposium on Sphingolipidoses and Allied Diseases, p. 289, Academic Press, New York, 1961.

D avi de k J., Davidekova E., Pharmazie, 16, 352 (1951).

Davidek J., Pokorny J., Z. Lebensm.-Untersuch. und -Forsch., 115, 113 (1961).

Dhopeshwarkar G. A., M e a d J. F., J. Am. Oil Chemists’ Soc. 38, 297 (1961).

18a. Dhopeshwarkar G. A., Mead J. F., J. Lipid Res., 3, 238 (1962).

Dhopeshwarkar G. A., Mead J. F., Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 109, 425 (1962).

Entenman C., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 83, 534 (1961).

Fillerup D. L., M e a d J. F., Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 38, 574 (1953).

F о 1 c h J., A s с о 1 i I., L e e s M., Meath J. А., В a г о n F. N. 1 e, J. Biol. Chem., 191, 833 (1951).

F о 1 c h J., L e e s M., Sloan-Stanley G. H., J. Biol. Chem., 226, 497 (1957).

Font ell K., Holman R. T., Lambertsen G., J. Lipid Res., 1, 391 (1960).

F r e i t a s A. d e, Thesis, Univ, of Minnesota, 1962.

Fulco A. J., Mead J. F., J. Biol. Chem., 236, 2416 (1961).

G a u g 1 i t z E. J., jr., M a 1 i n s D. C., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 37, 425 (1960).

Gold fine H„ Bloch K., J. Biol. Chem., 236, 2596 (1961).

Green Т., Howitt F. О., Preston R., Chem. and Ind., 1955, 591.

G r u g e r E. H., jr., Malins D. C., G a u g 1 i t z E. J., jr., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 37, 214 (1960).

Habermann E., Bandtlow G., Krusche B., Klin. Wschr., 39, 816 (1961).

Hamilton J. G., M u 1 d г e у J. E., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 38, 582 (1961).

H a n a h a n D. J., Lipide Chemistry, New York — London, John Wiley and Sons, Inc., 1960.

Hilditch T. P., The Chemical Constitution on Natural Fats, 3rd Edition, Lon

don, Chapman and Hall, Ltd., 1956.

34. H i r s c h J., Ahrens E. H., jr., J. Biol. Cbem., 233, 311 (1958). — — •'j , Federation Proc., 20, 269 (1961).

35.

Hirsch

Hofmann A. F., J. Lipid Res., 3, 391 (1962).

Huhnstock K., Weicker H., Klin. Wschr., 38, 1249 (1960).

Y., Noda M., Hirayama O., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 32, 132

38.

Inouye (1955).

40.

41.

42.

43.

44.

I n

I.n

J J J J

a a a

45. J

46.

47.

48.

49.

50.

51.

52.

53.

о u у e о u у e

n n n

a n a n

i s t у t z e n t z e n t z e n t z e n

Y., Noda M., Arch. Biochem. Biophys., 76, 271 (1958).

Y., Noda M., J. Agr. Chem. Soc. Japan, 33, 452 (1959).

n H., Parfumerie und Kosmetik, 41, 371 (1960).

E., Andreas H., Angew. Chem., 70, 656 (1958).

E., Andreas H., Chem. Ber., 92, 1427 (1959).

E., Andreas H., Chem. Ber., 94, 628 (1961).

E., Andreas H., Morgenstern K., Roth W., Fette, Seifen,

Anstrichmittel, 63, 685 (1961).

Jatzkewitz H., Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem., 320, 134 (1960).

* tzkewit "’ 1 ",

J J J

a a ii

t z к e w i t

z z

b e r m a n n

H., Mehl E., Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem., 320, 251 (1960).

H., Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem., 326, 61 (1961).

O., in Methoden der organischen Chemie, Bd. I.", ~, '

gegeben von E. M ii 1 1 e r, 4. Aufl., Stuttgart, Georg Kammereck R., неопубликованные данные.

к ■" ~1 ™"' ■"

Thieme

1/1, S. 223, heraus-

Verlag, 1958.

К

К

54. К

55.

К

a a a a a

t e s M., Can. J. Biochem. and Physiol., 35, 127

then H., Arch. Mikrobiol., 14, 602 (1949).

u ffm an n T., Kodding R., Z. Naturforsch.,

(1957).

12, 735

.„...(1957).

ii f m a n n H. P., Nitsch W. H., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 56, 154 (1954).

u f m a n n H. P., Pollerberg J., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 59, 815

56.

57.

58.

59.

(1957).

К a u f m Gottingen К a u f m К a u f m К a u f m

a n n H. P. (Herausgeber), Analyse der Fette und Fettprodukte, Berlin — — Heidelberg, Springer-Verlag, 1958.

a n n a n n a n n

60.

63, 235 (1961). Kaufmann

H. H. H.

P., M о h r E., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 60, 165 (1958).

" " 1Z., Fette, Sei fen Anstrichmittel, 62, 1014 (I960).

Z., D e i c k e ~~

P

M a к u s

P., M a к u s

F., Fette, Seifen, Anstrichmittel,

63, 689 (1961).

Kaufmann807 (1961).

Kaufmann

К 1 e n к E., G

H.

H.

P., M a к u s

P., M a к u s

Z., Khoe T.

Z., Das B.,

H., Fette, Seifen, Anstrichmittel,

Fette, Seifen, Anstrichmittel, 63,

,Y., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 63, 828 (1961).

,1 e n W., Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem., 323, 126 (1961).

К 1 e n к E., G i e 1 e n W., Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem., 326, 144 (19 61).

Кочетков H. К., Жукова И. Г., Глухо дед И. С., ДАН СССР, 139,

H.i e

P., S u Ko

66.

67.

68.

69.

70.

71.

605 (1961).

Kuhn

R.

Kuhn R

Kurz

Naturwiss., 46, 43 (1959).

. Wiegandt H., Egge H., Angew. Chem., 73, 580 (1961).

H., Fette und Seifen, 44, 144 (1937).

Lawson D. D., Getz H. R., Chem. and Ind., 1961, 1404.

Lea С. Н., Rhodes D. N., Biochem. J., 54, 467 (1953).

Lea С. H., Rhodes D. N., Stoll R. D., Biochem. J., 60, 353 (1955).

"F. N. Ie, Rothleder E. E., in Biochemistry of Lipids, p. 1, G. P o

p j a k, Editor, New York — Oxford — London — Paris, Pergamon Press, 1960.

73. Lees M., F о 1 ch J., Sloan-Stanley G.H., Carr S., J. Neurochem., 4,

72. Baron

9 (1959).

Mahadevan V., Lundberg W. O., J. Lipid Res., 3, 106 (1962).

Mahadevan, частное сообщение, 1961.

M a 1 i n s D.C., Mangold H. K., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 37, 576 (1960).

Malins D. C., Chem. and Ind., 1960, 1359.

M a n g о 1 d H. K., Lamp B. G., S c h 1 e n k H., J. Am. Chem. Soc., 77, 6070 (1955).

M a n g о 1 d H. K., Gellerman J. L., S c h 1 e n k H. Federation Proc., 17,

268 (1958).

80.81.82.83.84.80.81.82.83.84.85.86.85.86.87.87.Mangold Mangold Mangold MangoldMangold Mangold Mangold MangoldH. K., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 61, 877 (1959).

80.

81.

82.

83.

84.

80.

81.

82.

83.

84.

85.

86.

85.

86.

87.

87.

Mangold Mangold Mangold Mangold

Mangold Mangold Mangold Mangold

H. K., Malins D. C., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 37, 383 (1960).

H. K., Tuna N., Federation Proc., 20, 268 (1961).

H. K., Kammereck R., Chem. and Ind., 1961, 1032.

Mangold H. K., Kammereck R., Malins D. C., Proceedings — 1961 International Symposium on Microchemical Techniques. Microchem. J., Symposium Vol. II, 1962.

York — Paris, Pergamon Press, 1963.Marinetti G. V., E r b 1 a n d J., К о c h e n J., Federation Proc., 16, 837York — Paris, Pergamon Press, 1963.Marinetti G. V., E r b 1 a n d J., К о c h e n J., Federation Proc., 16, 837Mangold H. K., Kammereck R., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 39, 201 (1962). Mangold H. K., in Progress in the Chemistry of Fats and other Lipids, R. T. Holman., W. O. Lundberg, T. Malkin, Editors, London — New

York — Paris, Pergamon Press, 1963.

Marinetti G. V., E r b 1 a n d J., К о c h e n J., Federation Proc., 16, 837

York — Paris, Pergamon Press, 1963.

Marinetti G. V., E r b 1 a n d J., К о c h e n J., Federation Proc., 16, 837

(1957).

Mead J. F., F i 1 1 e r u p D. L., Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 86, 449 (1954).

Mead J. F„ F i 1 1 e r u p D. L„ J. Biol. Chem., 227, 1009 (1957).

M e c h a m D. K., Mohammad A., Cereal Chem., 32, 405 (1955).

Metcalfe L. D., Schmitz A. A., Anal. Chem., 33, 363 (1961).

Morris L. J., Hayes H., Holman R. T., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 38, 316 (1961).

Morris L. J., Holman R. T., Font ell K., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 37, 323 (1960).

M о r r i sL.J.,H о 1 m a n R. T.,F о n t e 1 1 K., J. Lipid Res., 1, 412 (1960).

MorrisL.J.,Holman R. T.,F о n t e 11 K., J. Lipid. Res., 2, 68 (1961).

MorrisL.J.,in Chromatography,p. 428. E. Heftman n, Editor, New York,

Reinhold Publishers, 1961.

Morris L. J., Mangold H. К., неопубликованные данные.

Morris L. J., частное сообщение, 1961.

Nelson J., Thesis, Univ, of Minnesota, 1961.

Noda M., J. Agr. Chem. Soc. Japan, 33, 417 (1959).

Noda M., Hirayama O., Y u.k a g a k u, 10, 24 (1961).

Patel N. G., H a у d a k M. H., L о v e 11 R., Nature 191, 362 (1961).

Peifer J. J., Mikrochim. Acta, 1962, 529.

Peifer J. J., M u e s i n g R. A., jr., Janssen F. W., J. Am. Oil Chemists’ Soc., в печати.

Polonovski J., Douste-Blazy L., in Proceedings of the 2nd International Conference on Biochemical Ptoblems of Lipids, p. 64, G. P о p j a k, E. 1 e Breton, editors, New York — London, Interscience Publishers Inc. and Butterworth Scientific Publications, 1956.

Potter V. R., Elvehjem C. A., J. Biol. Chem., 114, 495 (1936).

Privett O. S., in Proceedings of the Flavor Chemistry Symposium, p. 147, Camden, New Jersey, Campbell Soup Company, 1961.

Privett O.S., Blank M. L., J. Lipid. Res., 2, 37 (1961).

Privett O. S., В 1 a n k M. L., Lundberg W. O., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 38, 312 (1961).

Privett O. S., В 1 a n k M. L., J. Am. Oil. Chemists’ Soc., в печати.

Privett O. S., Blank M. L., частное сообщение, 1961.

Privett О. S., Nickell Ch., J. Am. Oil Chemists’ Soc., в печати.

Radin N. S., H a j r a A. K., A k a h о r i Y., J. Lipid Res., 1, 250 (1960).

Roper R., M a T. S., Microchem. J., 1, 245 (1957).

Rumpf H., Lange Th., Stroh W., in Methoden der organischen Chemie, Bd. 1/2, S. 3, herausgegeben von E. Muller, 4. Aufl., Stuttgart, Georg Thieme, 1959.

Schlemmer W., Boll. Soc. ital. Biol. Sperm., 37, 134 (1961).

Schlenk H., G e 1 1 e r m a n J. L., T i 11 о ts о n J. A., Mangold H. K., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 34, 377 (1957).

Schlenk H., G e 1 1 e r m a n J. L., J. Am. Oil. Chemists’ Soc., 38, 555 (1961).

Schmid M. E., В о 11 i g e r H. R., Helv. Chim. Acta, 37, 884 (1954).

Schroeder W. A., Ann. N. Y. Acad. Sci., 49, 204 (1948).

Sperry W. M., in Methods of Biochemical Analysis, Vol. II, p. 83, D. G 1 i c k, editor, New York, Interscience Publishers Inc., 1955.

Stahl E„ Chemiker Ztg., 82, 323 (1958).

Stahl E., Parfumerie und Kosmetik, 39, 564 (1958).

Stahl E., Pharm. Rdsch., 1, Nr. 2 (1959).

Stein Y., Stein O., Blochim. Biophys. Acta, 54, 555 (1962),

S t о f f e 1 W.,Chu F., Ahrens E. H., ir., Anal. Chem., 31, 307 (1959).

Strickland E. H., Benson A. A., Arch. Biochem. Biophys., 88, 344 (1960).

Trappe W., Biochem. Z., 305, 150 (1940).

Tuna N., Kammereck R., M a n g о 1 d H. К., неопубликованные данные.

Vioque E., Grasas у Aceites (Seville, Spain), 11, 223 (1960).

Vioque E., частное сообщение, 1961.

V i о q u е Е., М о г г i s L. J., Н о 1 m a n R. Т., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 38, 489 (1961).

Vioque E., Holman R. T., Anal. Chern., 33, 1444 (1961).

Vioque E., Holman R. T., J. Am. Oil Chemists’ Soc., 39, 63 (1962).

Wagner H., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 62, 1115 (1960).

Wagner H., Horhammer L., W о 1 ff P., Biochem. Z., 334, 175 (1961).

Weicker H., Klin. Wschr., 37, 763 (1959).

Weicker H., Dain J. A., Schmidt G., Thannhauser S. J., Federation Proc., 19, 219 (1960).

Westley J., W r e n J. J., M i t c h e 1 1 H. K., J. Biol. Chem., 229, 131 (1957).

Williams J. A., Sharma A., Morris L. J., Holman R. T., Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 105, 192 (1960).

Winterstein A., H e g e d ii s B., Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem., 321, 97 (1960).'

Winterstein A., Studer A., R ii e g g R., Chem. Ber., 93, 2951 (1960).

W i s s O., G 1 о о r U., Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem., 310, 260 (1958).

Wren J. J., M i t c h e 1 1 H. K., J. Biol. Chem., 234, 2823 (1959).

Wren J. J., J. Chromatog., 4, 173 (1960).

Z 6 1 1 n e r N., К i r s c h K., Amin G., Verb, dtsch. Ges. inn. Med., 66, 677 (I960).'

Zolin er N., Wolfram G., Klin. Wschr., 39, 817 (1961).

Z 6 11 n e r N., W о 1 f r a m G., A m i n G., Klin. Wschr., 40, 273 (1962).

Литература, появившаяся во время издания книги:

Barrett С. В., Dallas М. S. J., Pad ley F. В., Chem. and Ind., 1962, 1050.

D e e n e n L. L. M. v a n, G i e r J. de, H a a s G. H. d e, Koninkl. Ned. Akad. Wetenschap. Proc. Ser., В 64, 528 (1961).

Dutton H. J.,Scholfield C. R., Jones E. P., Chem. and Ind. 1961, 1874.

Haas G. H. d e, D e e n e n L. L. M. v a n, Rec. trav. chim., 80, 951 (1961).

Haas G. H. d e, D e e n e n L. L. M. v a n, Koninkl. Ned. Akad. Wetenschap., Proc. Ser., C 64, 592 (1961).-

Honegger C. G., Helv. Chim. Acta, 45, 281 (1962).

Jensen R. G., S a in p u g n a J., J. Dairy Sci., 45, 435 (1962).

Kaufmann H. P., D a s B., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 64, 214 (1962).

Kaufmann H. P., M a k u s Z., Khoe T. H., Fette, Seifen, Anstrichmittel.

1 (1962).

Kaufmann H. P.\ К h о e T. H., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 64, 81 (1962).

Morris L. J., Chem. and Ind., 1962, 1238.

Nichols P. L., jr., J. Am. Chem. Sos., 74, 1091 (1952.)

Rieche A., Schulz M., Seyfarth H. E., Gottschalk G., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 64, 198 (1962).

RybickaS. M., Chem. and Ind., 1962, 308.

S k i p s k i V. P., Peterson R. P., Barclay M., J. Lipid Res., в печати.

Vioque E., Holman R. T., Arch. Biochem. Biophys., в печати.

Vries В. d e, Chem. and Ind., 1962, 1049.

Wagner H., Fette, Seifen, Anstrichmittel, 63, 1119 (1961).

ГЛАВА 11

ПРОИЗВОДНЫЕ ТЕРПЕНОВ, ЭФИРНЫЕ МАСЛА,БАЛЬЗАМЫ И СМОЛЫ

Шталв и X. Йорк

В данной главе будут рассмотрены возможности разделения липофильных природных смесей, составные части которых формально можно вывести из изопрена и, следовательно, «изопренового правила» Ружички [58]. Рассматриваемые здесь углеводороды и их производные, согласно Валаху [81], делят на следующие группы:

Гемитерпены С5Н8 Монотерпены С10Н16

и производные и производные,

Отгоняются с водяным паром; ос-

т. кип. 140 —180°

■ новные составные части эфирных

Сесквитерпены С15Н24 т. кип. выше 200°

и производные,

масел, включая фенилпропановые ядра

Не отгоняются или слабо отгоняются с водяным паром; составные части бальзамов, смол, восков, каучукаНе отгоняются или слабо отгоняются с водяным паром; составные части бальзамов, смол, восков, каучукаДитерпены С20Н32и производные,

Не отгоняются или слабо отгоняются с водяным паром; составные части бальзамов, смол, восков, каучука

Не отгоняются или слабо отгоняются с водяным паром; составные части бальзамов, смол, восков, каучука

т. кип. 300°

Тритерпены С30Н48и производные

Политерпены (С10Н16)ж и производные

После гемитерпеновых производных следует поставить важную группу природных соединений С9, которые формально можно рассматривать как фенил пропанпроизводные.

Многочисленные соединения каждой группы отличаются друг от друга видом циклизации (соединения с открытой цепью, моно-, бициклические и т. д.), числом и положением двойных связей, центрами асимметрии и природой и числом функциональных групп. Поэтому целесообразно осуществить дополнительную разбивку внутри терпеновых групп нефункциональным группам, расположив их в ряд с увеличивающейся полярностью: углеводороды, сложные эфиры, альдегиды, кетоны, спирты, кислоты.

Структурные различия, а также физические и химические свойства терпен- и фенилпропанпроизводных, встречающихся в эфирных маслах, рассмотрены в капитальных трудах Гильдемайстера-Гофмана [14], Грюнера [17], Симонсена [60], Каррера [31] и Морица [42]. О сескви- и дитерпенах сообщает Хааген-Смит [20]. Подробный обзор тритерпеновых соединений дают Штейнер и Хольтцем [72], а также Джонс и Халсолл [29].

ОТДЕЛЕНИЕ СМЕСЕЙ ЛИПОФИЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ,ОТГОНЯЮЩИХСЯ С ВОДЯНЫМ ПАРОМ

Во многих случаях требуется выделить из реакционной смеси или из растительного и животного материала терпены и их производные и лишь затем подвергнуть их разделению. Как указывалось вначале, эти вещества Ся — С15 отгоняются с водяным паром, и поэтому таким способом их можно

Рис. 94. Прибор «Карлсруэ» для определения небольших количеств липидов, отгоняющихся с водяным паром [69].1 — нормальный шлиф 29; 2 — вертикальная трубка; 3 — отверстие для промывки;4 — холодильник; 5 — трубка для выравнивания давления с градуировкой на 1 мл;6 — измерительный капилляр с делениями 1/200; 7 — оливка; 5 — 3-ходовой кран;9 — сливная трубка; 10 — отросток для заполнения; 11 — микроколбочка для гравиметрического определения уловленного липида; 12 — уровень воды в колбе.Рис. 94. Прибор «Карлсруэ» для определения небольших количеств липидов, отгоняющихся с водяным паром [69].1 — нормальный шлиф 29; 2 — вертикальная трубка; 3 — отверстие для промывки;4 — холодильник; 5 — трубка для выравнивания давления с градуировкой на 1 мл;6 — измерительный капилляр с делениями 1/200; 7 — оливка; 5 — 3-ходовой кран;9 — сливная трубка; 10 — отросток для заполнения; 11 — микроколбочка для гравиметрического определения уловленного липида; 12 — уровень воды в колбе.отделить в соответствующем приборе [18, 42а]. Для определения небольших количеств (1—1000 мг^ таких смесей оказалось удобным использовать прибор «Карлсруэ» (рис. 94). После перегонки с водяным паром можно отделить липофильные компоненты от воды в микроколбочке для взвешивания и затем осуществить дальнейшее исследование. Дополнительно можно, правда менее точно, провести волюмометрическое исследование. Подробности могут быть заимствованы из оригинальной работы [69].

Рис. 94. Прибор «Карлсруэ» для определения небольших количеств липидов, отгоняющихся с водяным паром [69].

1 — нормальный шлиф 29; 2 — вертикальная трубка; 3 — отверстие для промывки;

4 — холодильник; 5 — трубка для выравнивания давления с градуировкой на 1 мл;

6 — измерительный капилляр с делениями 1/200; 7 — оливка; 5 — 3-ходовой кран;

9 — сливная трубка; 10 — отросток для заполнения; 11 — микроколбочка для гравиметрического определения уловленного липида; 12 — уровень воды в колбе.

Рис. 94. Прибор «Карлсруэ» для определения небольших количеств липидов, отгоняющихся с водяным паром [69].

1 — нормальный шлиф 29; 2 — вертикальная трубка; 3 — отверстие для промывки;

4 — холодильник; 5 — трубка для выравнивания давления с градуировкой на 1 мл;

6 — измерительный капилляр с делениями 1/200; 7 — оливка; 5 — 3-ходовой кран;

9 — сливная трубка; 10 — отросток для заполнения; 11 — микроколбочка для гравиметрического определения уловленного липида; 12 — уровень воды в колбе.

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕРАЗДЕЛЕНИЕ СМЕСЕЙЛИПОФИЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ,ОТГОНЯЮЩИХСЯ С ВОДЯНЫМ ПАРОМ

Довольно обширный опытный материал о колоночной хроматографии смесей терпенов был собран Риганезисом [55]. В большинстве случаев в качестве сорбента использовали окись алюминия различной степени активности, а также гель кремневой кислоты. Адсорбционнохроматографическое разделение рассматриваемых смесей может быть успешным только в том случае, когда отдельные компоненты этих веществ значительно отличаются по полярности. Отправной точкой для определения полярности может служить величина диэлектрической проницаемости. Следует, однако, отметить, что лишь для немногих соединений этого класса веществ значения диэлектрической проницаемости приведены в литературе, а некоторые старые данные следует использовать лишь с оговоркой. Значения диэлектрической проницаемости семи ис

следованных монотерпеновых углеводородов лежат между 2,24 и 2,76, и понятно, что эта группа без труда может быть отделена от более полярных веществ. Поэтому в специальной части, там, где это возможно, приведены величины диэлектрических проницаемостей. На основании большого опытного материала было показано, что методом адсорбционной хроматографии (ХТС на силикагеле Г) нельзя разделить большое число соединений одной «группы полярности» . Так, например, терпеновые и сесквитерпеновые спирты при применении бензола или хлороформа в качестве растворителя обладают практически одинаковой величиной Rf. Лишь в отдельных случаях, применяя смеси растворителей, удается разделить некоторые соединения такой группы. Указанные трудности возникают при простых анализах некоторых смесей, содержащих лишь одно соединение из названной выше группы. Комбинируя различные хроматографические разделительные методы,

можно, однако, преодолеть указанные затруднения. Соответствующие опыты показали, что плохо разделяемые методом адсорбционной хроматографии группы полярности можно легко разделить при определенных условиях методом распределительной хроматографии в газовой фазе [68]. Если имеется около 1 г смеси, то лучше всего проводить разделение на фракции (группы полярности) на колонках с силикагелем или с окисью алюминия и затем исследовать их методом газовой хроматографии. В обоих случаях фракции проверяют методом ХТС. Для установления принадлежности к данной группе можно использовать, кроме величин R^ также и цветные реакции. Миллер и Кирхнер показали, что для идентификации функциональных групп можно проводить превращения, например дегидратацию, окисление, восстановление, омыление, непосредственно в тонких слоях. Следует, однако, всегда дополнительно охарактеризовать соединения одним из проверенных микрометодов (производные, температуры кипения, вращение плоскости поляризации, УФ- и ИК-спектры).

МОНО- И СЕСКВИТЕРПЕНОВЫЕ УГЛЕВОДОРОДЫ

Как уже указывалось, значение диэлектрической проницаемости является отправной точкой для характеристики адсорбционного сродства разделяемых веществ, причем значения этой величины для группы монотерпенов

■Таблица 15

Величины hRj (Я/Х100) некоторых моно- и сесквитерпенов по Миллеру и Кирхнеру [39]

1а

RyXlOO

па

Ша

1Уа

Монотерпены

/г-Цимол (е=2,24)

38

41

62

69

Лимонен (е=2,3)

41

55

54

59

Терпинолен

64

67

60

65

Р-Пинен

80

75

80

85

а-Пинен (е=2,7)

83

85

84

90

Камфен (е = 2,33)

84

76

79

80

Сесквитерпены

а-Кариофиллен

50

35

47

33

Р-Кариофиллен

62

60

52

65

у-Кариофиллен

80

82

87

90

Цедрен

82

80

83

85

а Растворители: I—гексан; II—2,2-диМетилбутан; III—циклогексан; IV—метилциклогексан.

Приведенные значения hRy следует использовать с оговоркой, поскольку при их определении были лишь частично известны факторы, оказывающие влияние на их величину. Требуется их новое определение. В качестве цветного вещества сравнения пригоден имеющийся в продаже азулен (гваязулен фирмы «Dragoco», Хольцминден, Везер).

ческой проницаемости (б = 1,844—2,023). Кроме того, требуются высокоактивные слои силикагеля. Для дальнейшей активации поело обычной сушки в вакуум-эксикаторе при давлении 3 мм рт. ст. их следует хранить над пятиокисью фосфора. Поскольку Миллер и Кирхнер работали с узкими полосками и толстыми слоями, опасность дезактивации под действием влаги воздуха при нанесении была не столь велика, как в случае рекомендуемых в настоящее время больших пластинок с тонкими слоями. Особо следует указать на возможность разложения или перегруппировок веществ на высокоактивных слоях.

При применении более полярных растворителей, например бензола (е = = 2,284) или хлороформа (е = 4,806), моно- и сесквитерпены обнаруживают неразделенными в верхней области хроматограммы (hRу 80—100). Согласно «овременному опыту, смеси этой группы выгоднее разделять методом газовой хроматографии [68].

Обнаружение можно осуществить серной кислотой иногда с добавкой альдегида, пробой с бромфлуоресцеином (реактив № 101А), а также хлористой сурьмой (V) (реактив № 13).

Низкомолекулярные летучие олефины. В связи с терпеновыми углеводородами следует отметить работу Прея, Бергера и Бербалка [49] по разделению ненасыщенных низкомолекулярных олефинов. Рассмотренный как здесь, так и в главе о липидах (стр. 175) метод ХТС, касающийся продуктов присоединения ацетата ртути, можно также с успехом перенести на производные терпенов.

Поскольку первые члены гомологического ряда алкенов до бутилена газообразны, а следующие легколетучи, их подвергают хроматографическому разделению в форме нелетучих ртутных соединений. Наиболее стабильными являются продукты присоединения ацетата ртути.

Получение. Газообразные олефины пропускают через 1%-ный метанольный раствор ацетата ртути; жидкие олефины вводят непосредственно. Реакция протекает количественно и почти мгновенно. Этот метанольный раствор может быть непосредственно использован для хроматографического разделения. Наносят 5—10 цг каждого продукта присоединения.

Разделение. На полученных стандартным методом (стр. 35) слоях силикагеля Г производят разделение продуктов присоединения ацетата ртути к олефинам, используя растворитель, состоящий из н-пропанола, триэтиламина и воды (50 + 25 + 25). Получены следующие величины HRf. этилен 7, пропилен 13, бутилен-1 17, амилен-2 22, амилен-1 29, гексен-1 31 (время опыта 90 мин).

Обнаружение. Хроматограмму опрыскивают 2%-ным спиртовым раствором дифенилкарбазида и затем в течение короткого времени нагревают в сушильном шкафу при 80°. Продукты присоединения окрашиваются в сине-фиолетовый цвет.

ОКИСИ И ПЕРЕКИСИ

Окиси и перекиси могут встречаться в многочисленных эфирных маслах. Наиболее известными примерами являются 1,8-цинеол (эвкалиптол) и получающийся фотосинтетически из а-терпинена пероксид-аскаридол. Последнее соединение является главной составной частью ядовитого масла цитварного семени. На слое силикагеля Г при применении бензола два названных соединения не разделяются (АД/ 13 и 15), однако полностью разделяются при применении хлороформа: аскаридол 63; 1,8-цинеол 54. С реактивом хлорида сурьмы получают окрашивание в серый цвет. Для обнаружения перекисей проба с иодистым калием, уксусной кислотой и крахмалом (реактив № 85) часто более пригодна, чем проба с роданидом железа (II) [65].

Для отделения и обнаружения ментофурана в эфирных маслах проводят хроматографическое разделение на слоях силикагеля Г петролейным эфиром или, лучше, гексаном, одновременно нанося в качестве эталонного вещества гваязулен (см. Терпены, стр. 188) [64]. Оба пятна лежат примерно на одной высоте. Для обнаружения можно, как и в случае азулена, использовать реактив ЕР (№ 47).

СЛОЖНЫЕ ЭФИРЫ ТЕРПЕНОВЫХ СПИРТОВ

Наряду с терпеновыми спиртами в эфирных маслах часто встречаются также соответствующие сложные эфиры. Чаще всего это ацетаты, реже формиаты, пропионаты, бутираты и сложные эфиры валериановой и высших кислот.

Согласно данным опытов более чем с 20 различными сложными эфирами, на слоях силикагеля Г при использовании бензола, хлороформа и подобных растворителей значения R} для сложных эфиров лежат значительно выше значений R, для соответствующих спиртов. Наибольшая разница значений R^ наблюдается при применении лотковых камер без специального насыщения (NS). В лотковых камерах с насыщением атмосферы (KS) при применении хлороформа значения R^ для сложных эфиров примерно в 2,5 раза выше, чем соответствующие значения для спиртов (табл. 16). Интересно отметить, что ацетаты перемещаются медленнее соответствующих формиатов, пропионатов и бутиратов и поэтому могут быть легко отделены от последних.

Таблица 16

Разделение сложных эфиров терпеновых спиртовна слоях силикагеля Г

В^хЮО

ЭфирыЭфирыбензол, KS хлороформ, KSбензол, KS хлороформ, KSАцетаты (9 различных)Формиаты, пропионаты, бутираты (11 различных)Спирты (см. табл. 20)Масляный желтый, Судан красный, индофенол (эталонные вещества) . . . .Ацетаты (9 различных)Формиаты, пропионаты, бутираты (11 различных)Спирты (см. табл. 20)Масляный желтый, Судан красный, индофенол (эталонные вещества) . . . .25—3342—47(линалилформиат37)5—825—3342—47(линалилформиат37)5—840; 15; 540; 15; 563—6571—7426—33(линалол 38)73; 63; 5863—6571—7426—33(линалол 38)73; 63; 58

Эфиры

Эфиры

бензол, KS хлороформ, KS

бензол, KS хлороформ, KS

Ацетаты (9 различных)

Формиаты, пропионаты, бутираты (11 различных)

Спирты (см. табл. 20)

Масляный желтый, Судан красный, индофенол (эталонные вещества) . . . .

Ацетаты (9 различных)

Формиаты, пропионаты, бутираты (11 различных)

Спирты (см. табл. 20)

Масляный желтый, Судан красный, индофенол (эталонные вещества) . . . .

25—33

42—47(линалилформиат37)

5—8

25—33

42—47(линалилформиат37)

5—8

40; 15; 5

40; 15; 5

63—65

71—74

26—33

(линалол 38)

73; 63; 58

63—65

71—74

26—33

(линалол 38)

73; 63; 58

Остается еще проверить, можно ли методом ХТС разделить соответствующие гидроксамовые кислоты.

Обнаружение

а. Реакция обменного разложения. При определении в каждом конкретном случае наличия сложного эфира, кроме указанных выше способов, можно воспользоваться еще следующими.

Омыление спиртовым раствором едкого кали; образуется свободный спирт и калийная соль кислоты.

Обработка литийалюминийгидридом; получаются терпеновый спирт и кислота, восстанавливающаяся до соответствующего спирта. Это восстановление может быть осуществлено непосредственно на слое [39]. При этом на точку старта наносят сначала сложный эфир, а затем одну каплю 10 %-него раствора ЫА1Н4 в диэтиловом эфире. Затем проводят хроматографическое разделение. Пятно сложного эфира больше не появляется, вместо него образуется пятно в области спиртов.

Демоле [7] описал следующий опыт, который при соответствующем навыке хорошо воспроизводится.

После разделения освобожденный от растворителя слой опрыскивают водой до прозрачного состояния; затем слой покрывают свежепропитанной гидроксиламином, еще влажной фильтровальной бумагой, которую плотно прижимают стеклянной пластинкой. Закрытую пластинку со слоем помещают на нагревательную поверхность с температурой 35—45°. Эфиры испаряются и превращаются на бумаге в гидроксаматы калия. Через 15—30 мин гидроксаматы обнаруживают на бумаге при опрыскивании 5%-ным раствором хлорида железа(Ш) в 0,5 н. соляной кислоте. Для пропитки фильтровальной бумаги применяют смесь 3,5 г солянокислого гидроксиламина в 50 мл воды и 16 г едкого кали в 50 мл метанола.

Цветная реакция. Для обнаружения сложных эфиров можно с успехом применять все цветные реакции, описанные для терпеновых спиртов (стр. 196), а также реактив фосфорномолибденовой кислоты. Чувствительность обнаружения и цвета примерно одинаковы. Различия в окраске эфиров уксусной, муравьиной, пропионовой и масляной кислот не наблюдалось.

АЛЬДЕГИДЫ И КЕТОНЫ

Наряду с терпеновыми спиртами в эфирных маслах обнаруживают многочисленные альдегиды и кетоны, отличающиеся характерным запахом. Некоторые из них легко получаются синтетически и в настоящее время часто применяются в промышленности душистых веществ. В качестве хорошо известных примеров можно назвать коричный альдегид с типичным запахом корицы, ванилин с запахом ванили и карвон с запахом тмина. Как видно из приведенных в табл. 24 работ по альдегидам и кетонам, их часто разделяли в форме легкодоступных 2,4-динитрофенилгидразонов (2,4-ДНФГ) на тонких сорбционных слоях.

Уже в 1952 г. Оноэ [45] применял для этого силикагелевые слои толщиной 60 ц, высушенные при 60°, и использовал в качестве связующего 2,5%-ный водный раствор поливинилового спирта. Наряду с четырнадцатью гидразонами альдегидов жирного ряда (С2 — С10) хроматографировались акролеин, кротоновый альдегид и цитраль бензолом, насыщенным водой.

Донт и Руи [9] разделяли ряд 2,4-дигидрофенилгидразонов по стандартному методу на слоях силикагеля Г и относили получаемые значения к значению для эталона, в качестве которого применяли краситель масляный желтый (величины RB, см. стр. 196). В качестве растворителя они использовали: А) смесь бензола с легким бензином (т. кип. 60—80°) (75 + 25) и В) более полярную смесь бензол — этиловый эфир уксусной кислоты (95 + 5).

При применении двумерной методики можно, используя растворитель А в одном и растворитель В в другом направлении, разделить смеси ванилина, вератрового альдегида и этилванилина (табл. 17).

На рис. 95 этими же авторами показано, что 2,4-ДНФГ алифатических альдегидов можно разделить в соответствии с длиной цепи, применяя растворитель А.

Петрович [48] использовал для разделения некоторых оксиальдегидов приготовленные «вручную» более толстые слои силикагеля Г, не сообщив более подробно условия опыта. Длина разделительного слоя составляла 12 см, а растворителем служила смесь бензол +5% метанола. Приводятся следующие значения величины Rf. протокатеховый альдегид 0,06; сиреневый альдегид 0,14; п-оксибензальдегид 0,17; ванилин 0,27; вератровый альдегид 0,45; о-ванилин 0,53; анисовый альдегид 0,65; салициловый альдегид 0,91.

Сравнение (при стандартных условиях) остальных альдегидов и кетонов можно сделать по данным, приведенным в табл. 18.

Величины Rf и обнаружение альдегидов и кетоновВеличины Rf и обнаружение альдегидов и кетоновВеличины Rb 2,4-ДНФГ ароматических альдегидов [9]

Величины Rf и обнаружение альдегидов и кетонов

Величины Rf и обнаружение альдегидов и кетонов

Соединение

Величина RB а

Соединение

Величина RB а

А

В

А

в

Ванилин

0,06

0,17

Коричный альдегид

0,83

1,04

Вератровый альдегид

0,0

0,45

Бензальдегид . . . .

1,06

1,03

Этилванилин

0,0

Полосы

а- и р-Ионон . . . .

1,40

1,14

Салициловый альдегид

0,50

0,85

Анисовый альдегид

—

0,88

а Слой силикагеля Г; А: бензол — легкий бензин (75+25), В: бензол — этиловый эфир .уксус

ной кислоты (95+5); лотковая камера, насыщенная.

Соединение

RyXlOO

Цветная реакция (5 цг) с

бензола

хлороформ а

2,4-ДНФГ

о-дианизидином

Ванилин

5

29

Оранжевый

Желтовато-оранже-

вый

2,4,5-Триметоксибен-

зальдегид

6

39

Оранжево-ко-

Оранжевый

ричневый

Фурфурол

10

50

Оранжевый

Фиолетовый

Цитраль

10

56

Желтый

Желтовато-корич-

не вый

Анисовый альдегид

13

55

Оранжевый

Желтый

Пиперональ

14

55

»

Коричный альдегид

15

60

»

Оранжево-коричне-

ВЫЙ

Бензальдегид . . . .

25

59

Желтый

—

Куминовый альдегид

25

65

Оранжевый

Желтый

Пиперитон

8

43

—

Фенхон

9

42

—

Карвон

10

56

Оранжево-

При количест-

желтый

I вах 20—50 цг от

Метилгептенон . . .

13

56

Желтый

серого до корич-

Метилгексилкетон . .

14

57

»

невого цвета

Метилнонилкетон . .

16

57

»

Ментон

20

.60

—

Масляный желтый . .

38

75 .

Судан красный G . .

13

65

Индофенол

5

58

Таблица 18

а Слой силикагеля Г толщиной 250 ц; лотковая камера с насыщением.

При применении силикагеля Г и хлороформа значения hR, часто встречающихся альдегидов и кетонов лежат между 55 и 65. В этой области [63—65] могут также лежать ацетаты терпеновых спиртов (табл. 16). Дальнейшую идентификацию альдегидов и кетонов в эфирных маслах можно осуществить, используя метод РРР (см. стр. 44). При этом хроматографируют смесь в направлении 1, применяя хлороформ, затем, после покрытия остальной части хроматограммы, проводят опрыскивание (заштрихованное поле на рис. 149) 0,5%-ным раствором 2,4-динитрофенилгидразина в метаноле, к которому добавлен 1% 25%-ной соляной кислоты. Альдегиды и кетоны

Рис. 95. Величины Кв 2,4-динитрофенилгидразонов алифатических альдегидов в зависимости от длины цепи [9].

Растворитель: х бензол — легкий бензин (75 + 25), О бензол—этиловый эфир уксусной кислоты (95 + 5).

реагируют на слое, давая желто-оранжевое окрашивание. Через 10—15 мин проводят хроматографическое разделение в направлении 2, применяя бензол. При этом некоторые 2,4-динитрофенилгидразоны разделяются, однако не все. При решении некоторых специальных задач разделения следует подумать об использовании «реакционных слоев», которые, например, легко приготовить, добавляя бисульфит натрия в наносимую массу.

Обнаружение. Для обнаружения на хроматограммах альдегидов и кетонов чаще всего используют кислый раствор 2,4-динитрофенилгидразина (реактив № 53). Вскоре при комнатной температуре образуются соответствующие гидразоны в виде окрашенных пятен. Нециклические альдегиды и кетоны в большинстве случаев дают желтую, а циклические — оранжевую и оранжево-коричневую окраску. Чувствительность обнаружения различна. В большинстве случаев весьма отчетливые пятна получают уже при количествах 1 — 5 рг. В случае ментона, фенхона и пиперитона необходимо наносить большие количества. К сожалению, следует отметить, что при применении этого реактива ряд соединений, не содержащих альдегидной и кетонной групп, дает окраску от желтой до оранжевой, например оксифенилпропан- производные азарон, апиол, миристицин и т. д.

Фосфорномолибденовая кислота — не очень чувствительный реактив на альдегиды и кетоны (5 рг). Не вызывает осложнений опрыскивание после применения 2,4-динитрофенилгидразина хорошо зарекомендовавшим себя реактивом, состоящим из смеси хлоридов сурьмы(Ш) и (V).

Для обнаружения альдегидов пригоден насыщенный раствор о-дианизи- дина в ледяной уксусной кислоте, использованный Васики и Феденом [82]. При этом альдегиды, в особенности фурфурол, уже на холоду обнаруживают 13 Заказ №734

указанные в табл. 18 окраски. При нагревании окраска усиливается и слой темнеет. Приведенные в табл. 18 кетоны реагируют лишь при наличии больших количеств. И этот реактив не является специфичным; окрашивание наблюдается, например, в случае аскаридола, 1,8-цинеола, оксифенилпропановых ядер и некоторых терпенов.

"5. МОНО- И СЕСКВИТЕРПЕНОВЫЕ СПИРТЫ

При хроматографировании хлороформом на слоях силикагеля Г, полученных стандартным методом, большое число спиртов этой группы обнаруживают примерно одинаковые значения R^. В основном можно отделить фракцию спиртов С10 от фракции С15. Поэтому внутри данной группы не удалось обнаружить различия в величинах Rf.

Таблица 19

Адсорбционнохроматографическое разделение терпеновых спиртов на слое силикагеля Г с применением хлороформа

Число исследованных спиртов

НуХЮО

NSa

KSa

С-камера

И терпеновых спиртов

30—45

25—35

20—25

5 сесквитерпеновых спиртов

45—55

35—40

25—30

а Лотковая камера (NS — без насыщения; KS — с дополнительным насыщением).

Пример разделения стереоизомерных ментолов [16, 25, 47] показывает, что, несмотря на определенные ограничения, некоторые задачи в этой области могут быть решены.

Рис. 96. Структурные формулы стереоизомерных ментолов. I — ментол; II — веоментол; III — изоментол; IV — веоизоментол (см. текст).

Уже в 1957 г. Ито [25] обнаружил, что на слоях силикагеля Г эпимерные ментолы с аксиальными (а) ОН-группами отчетливо отделяются от аналогичных соединений с экваториальными (а) ОН-группами. Ито использовал в качестве растворителя смесь гексан —этилацетат (85 + 15). Петрович [47]

рекомендует смесь бензол — метанол (95 + 5). При стандартных условиях на слоях силикагеля Г нами получены следующие значения Rf. Эти результаты были подтверждены в работе Графа и Хоппе [16]. Со смесью анисовый

Величина Я/Х100

Хлороформ а

Гексан — этилацетат (90 + Ю) ®

Ментол (I)

32

47

Изоментол (III) . .

29

41

Неоментол (II) . . .

40

64

Неоизоментол (IV)

36

68

а Лотковая камера с насыщением (KS).

® Лотковая камера без насыщения (NS).

альдегид — серная кислота (реактив № 96) получается сине-фиолетовая окраска, хлоридами сурьмы(Ш) и (V) (реактивы № 11 и 13) ментол окрашивается в коричнево-серый цвет, неоментол — в серо-зеленый.

Поэтому при решении специальных задач, кроме хлороформа, использовали ряд близких к хлороформу изоэлюотропных смесей растворителей, величины диэлектрической проницаемости которых лежат примерно между 3 и 5. При этом соответствующие эфиры и углеводороды движутся в области фронта. При применении менее полярных растворителей, например бензола (б = 2,24), спирты движутся слишком медленно (С-камера, hRf = 10—15; лотковая камера KS 5—10).

Таблица 20

Разделение спиртов на слое силикагеля Г, пропитанного парафином,с испбльзованием 70%-ного метанола

Число атомов углерода

Спирты

RyX100a

20

Фитол, изофитол

2—5

15

Фарнезол, неролидол, цедрол, гвайол, элемол (hRf 25)

17—20

10

Гераниол, нерол, линалоол, ментол, терпинеол, фенхол, борнеол, изоборнеол, куминовый спирт (hRf 50) . . .

42—48

9

Коричный спирт

55

1 Выделены из

7

Бензиловый спирт

59

5

Фурфуриловый спирт

63

Г смеси

а Величины Ry уменьшаются с увеличением числа атомов углерода, и поэтому их значения следует рассматривать лишь как ориентировочные.

Обращение фаз. Путем пропитки слоев силикагеля парафином или силиконовым маслом и применения соответствующих гидрофильных расстворителей («обращение фаз») удается достичь хорошего разделения спиртов на группы с равным числом атомов углерода (табл. 20). Трудный в микромасштабе вопрос о проверке наличия геми-, моно-, сескви- или дитерпеновых спиртов может быть при этом решен легче, чем при применении непропитанного слоя. Необходимым условием, однако, является наличие в исследуемой смеси только спиртов. Терпеновые углеводороды при этих условиях образуют длинную полосу. Фенольные эфиры обнаруживают почти «обратные» величины R, по сравнению с величинами на непропитанных слоях силикагеля Г, т. е. сафрол лежит ниже спиртов С15, эвгенол — в области спиртов С10 — С7 и между обеими группами лежат исследуемые альдегиды.

Следует предположить, что при разделении на слоях силикагеля Г, пропитанных липофильными веществами, наряду с процессом распределения значительную роль играет адсорбция на силикагеле. При применении в качестве носителя неактивного кизельгура Г и при прочих равных условиях обнаруживают, что спирты располагаются в верхней области хроматограммы неразделенными QiRj 80).

Метод. Пластинку с высушенным и охлажденным до комнатной температуры слоем силикагеля Г помещают на 1 мин в 5%-ный раствор парафина или силиконового масла DC 550 в петролейном эфире (см. стр. 45) и после 15-минутного упаривания петро- лейного эфира (т. кип. 40—60°) применяют в горизонтальном положении.

В качестве растворителя рекомендуется смесь 70 мд метанола и 30 .ил дистиллированной воды, насыщенная жидким парафином или силиконовым маслом DC 550.

Приведенные в табл. 20 величины h,H j получены в С-камере длиной 40 см. Наносили пробы (5 щ) всех веществ и смеси спиртов с различным числом атомов углерода.

Другая возможность идентификации спиртов и фенолов требует их обработки 3,5-динитробензоилхлоридом (получение см. разд. 17, И, За) и разделения методом ХТС образующихся динитробензоатов (ДНБ). Донт и Руи [10] показали, что перечисленные ниже ДНБ можно разделить на слоях силикагеля Г со смесью бензол — петролейный эфир (50 + 50). В качестве эталонного вещества был выбран масляный желтый (я-диметиламиноазобен- зол) и получены величины RB\

D Путь, пройденный исследуемым веществом 1ЛВ — 7=1 *

Путь, пройденный эталонным веществом

Динитробензоаты спиртов дают следующие значения RH: ДНБ фурфурилового спирта 0,71; ДНБ бензилового спирта 0,76; ДНБ мальтола 0,92; ДНБ гераниола 1,26; ДНБ цитронеллола 1,69.

ДНБ ментола и изоментола можно разделить при стандартных условиях на слоях силикагеля Г при длине пути 15 см, применяя смесь петролейный бензин (т. кип. 105 — 120°) — изопропиловый эфир (95 + 5) [16].

Фенолы: ДНБ эвгенола 0,55; ДНБ изоэвгенола — 0,56; ДНБ тимола — 1,42. Для обнаружения опрыскивают 1%-ным раствором нафтиламина в этаноле; возникают пятна желтого и оранжевого цвета.

Обнаружение. Весьма чувствительный, однако, неспецифический метод перевода разделяемых веществ в видимое состояние состоит в использовании реактивафосфорномолибденовой кислоты (реактив № 120). Уже при наличии количеств 0,05—1 цз после опрыскивания и нагревания на слоях силикагеля можно обнаружить голубые пятна. Несколько менее чувствителен реактив из хлоридов сурьмы(Ш) и (V) (реактивы № 11, 13). При применении этого реактива хроматограмму, как перед нагреванием, так и после нагревания, следует рассматривать в дневном свете, а также в длинноволновой ультрафиолетовой области. Без нагревания реагируют с образованием от серой до фиолетовой окраски следующие из исследованных спиртов (5 цз): гера-

ниол, нерол, линалоол, терпинеол, неролидол, фарнезол, гвайол и фитол. После нагревания эти спирты в большинстве случаев окрашиваются в коричневый цвет. Остальные спирты (табл. 20) окрашиваются в коричневый цвет лишь при нагревании. В длинноволновом ультрафиолетовом свете почти все спирты и их эфиры — в противоположность фенольным эфирам — обнаруживают коричнево-красную флуоресценцию.

Большую чувствительность обнаружения и определенные различия в окраске наблюдают при применении смеси анисовый альдегид — серная кислота (реактив № 96). При нагревании следующие вещества дают окрашивание от синего до фиолетового: ментол, гвайол, фитол; фиолетово-серое: гераниол, нерол, неролидол, фарнезол; фиолетово-красное: цитронеллол, терпинеол, цедрол; серое: коричный спирт, линалоол; розово-красное: кумино- вый спирт; особенно поразительна коричневая, переходящая через некоторое время в зеленую окраска борнеола, изоборнеола и фенхола.

6. ПРОИЗВОДНЫЕ ФЕНИЛПРОПАНА И ФЕНОЛА

В этой группе представляет интерес в первую очередь разделение окси- фенилпропанпроизводных, используемых в медицине и промышленности душистых веществ. Подобные соединения являются причиной использования

Рис. 97. Разделение оксифенилпропанпроизводных (по 4 рг) на слоях силикагеля Г с бензолом.

С-камера; длина пути 10 см; время анализа 35 лшн; реактив для опрыскивания: раствор фосфор- номолибденовой кислоты (реактив № 120а), Т — эталонная смесь фирмы <<Desaga»; 1 — сафрол; 2 — метилкавикол: 3 — миристицин; 4 — алиол; 5 — эвгенолметиловый эфир; 6 — азарон;

7 — аллилтетраметоксибензол; 8 — элемицин; 9 — пирокатехин; G — смесь (по 2 цг).

ряда растений или получаемых из них эфирных масел: в качестве аптекарских товаров можно упомянуть гвоздику, ямайский перец, анис, фенхель, петрушку, укроп, аир и сассафрас. Хроматографического разделения ряда подобных соединений можно достичь на пластинках со слоем силикагеля Г толщиной 250 ц, полученных стандартным методом, с бензолом в качестве растворителя. На рис. 97 приведена тонкослойная хроматограмма важнейших фенольных эфиров этой группы.

Поскольку при адсорбционнохроматографическом разделении состояние насыщения и форма камеры оказывают существенное влияние на величину Rj, эти значения приведены в табл. 21 как для С-камер, так и для лотковых камер (с насыщением и без насыщения камеры). В остальном соблюдены обычные стандартные условия (стр. 35).

Фенол- и оксифенилпропанпроизводные, (Слой силикагеля Г, стандартная

Соединение

Д/Х100

Цветные

лотковая камера

С-камера

Смесь хлоридов сурьмы (III)

с насыщением

без насыщения

при комнатной температуре

Сафрол .

57

90

89

Изосафрол

57

90

89

Серо-фиолетовый

Анетол . . .

56

87

83

—

Метилхавикол

55

85

80

—

Миристицин

46

70

61

Свет ло-коричн евый

Изомиристицин (транс1) . .

46

70

61

—

Диметильный эфир резорцина

40

72

56

С еро-коричневый

Апиол .

35

58

45

Светло-коричневый

Изоапиол (транс1)

35

58

45

Фиолетовый

Диметиловый эфир гидрохи-

нона

31

■ 54

45

—

Карвакрол

25

. 47

33

—

Тимол .

23

47

33

—

Диэтиловый эфир пирока-

техина

22

47

32

Гваякол

18

40

27

Серый

Эвгенол

18

40

27

Фиолетово-коричневый

Метиловый эфир эвгенола

15

31

22

Фиолетово-зеленый

Метиловый эфир изоэвгенола

15

31

22

—

Вератрол

13

29

17

Аллилтетраметоксибензол

И

20

12

—

Фенол

10

19

13

—

Изоазарон (транс1)

10

20

13

Серый

Элемицин

8

И

7

Серо-фиолетовый

Пирокатехин

0

0

0

—

Г омопирокатехин

0

0

2

Коричнево-серый

Резорцин

0

0

0

—

Гидрохинон

0

0

0

—

Масляный желтый . . . .

32

60

53

Судан красный G

10

24

17

Индофенол

3

10

8

а 10 лин до 100-105°.

® Перед нагреванием цветная реакция отсутствует.

Время разделения для пути в 10 см; лотковая камера с насыщением 50 мин, без насыщения

величины Rf и цветные реакции методика, растворитель — бецзол)

реакции

Смесь анисового альдегида с серной кислотой (реактив № 96), после нагревания

и (V) 1 + 1 (реактивы № 11, 13)

после нагревания а

УФ-флуоресценция через 24 часа

Серо-фиолетовый

Сине-фиолетовый

Фиолетово-серый Оливково-зелено-серый Серо-коричневый

Коричнево-фиолетовый Коричнево-зеленый Оливково-серый

Коричнево-фиолетовый

Коричнево-красный (светлая кайма)

Фиолетово-серый (светлая кайма)

Фиолетово-розовый

Розовый

Темный (красноватая

кайма)

Коричнево-фиолетовый

Темный

»

»

Синевато-зелено-серый

Серо-фиолетовый

Серо-красный (синяя кайма) Фиолетово-серый Коричнево-зелено-серый

Серо-коричневый

Красный

Фиолетово-серый

Сине-фиолетовый

От желто-зеленого до коричневого

От красного до коричневого

Синевато-красный

»

Красный

Красно-фиолетовый

Бледно-фиолетово-серый

Светло-красный, красновато-коричневый

Красный

Синева то-серый Серо-черный Коричнево-серый Коричнево-фиолетовый

Фиолетовый

Сине-черный Оливково-зеленый Серо-коричневый Серо-зеленый Коричнево-черный

Бледно-красновато-лиловый

Коричневый

»

Желто-коричневый

Темный

Темный

Фиолетово-серый

Бежевый (зеленоватая кайма)

Красновато-коричневатый (светлая кайма)

Темный

»

» »

Коричневый (светлая кайма)

Темный

»

Темно-фиолетовый

Темный

»

Коричнево-серый

Грязно-зеленый

Коричневый (голубоватая кайма)

Темно-фиолетовый

Бледно-красновато-лиловый Бежево-коричневый Красно-оранжевый Красновато-лиловый Темно-фиолетовый

Красный

)>

Красновато-оранжевый Коричнево-серый

35 лшн, С-камера 40 мин.

Для перевода в видимое состояние приведенных в табл. 21 веществ можно воспользоваться различными реактивами для опрыскивания. При применении фосфорномолибденовой кислоты (реактив № 120а) все соединения окрашиваются при нагревании в синий цвет (рис. 97). Наибольшего различия в окраске достигают при применении смеси хлоридов сурьмы (III) и (V) (1 + 1, реактивы №11, 13) или смеси анисового альдегида с серной кислотой (реактив № 96). Добавка раствора хлорида сурьмы (V) к раствору хлорида сурьмы(Ш), с одной стороны, приводит к усилению окраски, с другой стороны, однако, имеет тот недостаток, что окрашенные пятна вначале не обнаруживают флуоресценции в длинноволновом ультрафиолетовом свете; она появляется только через сутки. Некоторые соединения можно отличить по различной окраске флуоресценции; в качестве примера можно указать на уже отмеченные раньше метиловый эфир эвгенола с зеленоватожелтой флуоресценцией и метиловый эфир изоэвгенола (цис-транс-смесъ1) с красновато-коричневой флуоресценцией. При пользовании реактивом хлорида сурьмы(Ш) флуоресценция наступает сразу же после нагревания [651.

В общем в отношении упомянутых цветных реакций следует заметить, что они зависят от количества вещества и реактива, а также от температуры и длительности нагревания. Часто опрыскивают слишком малым количеством реактива; для пластинки 20 X 20 см следует использовать 10—15 мл. Для выяснения наличия соединения со свободной фенольной группой можно провести опрыскивание щелочным раствором диазониевой соли (реактивы № 37, 61). Фенолы, так же как и некоторые другие соединения, например азулен, сочетаются и образуют окрашенные продукты.

Можно также синтезировать 3,5-динитробензоаты и подвергнуть эти эфиры разделению методом ХТС (см. стр. 196). Дальнейшую помощь при обнаружении фенолов, дающих кислую реакцию, оказывает хроматографическое разделение на слоях силикагеля, подвергнутых щелочной обработке. В противоположность фенольным эфирам с нейтральной реакцией, фенолы обнаруживают, вероятно вследствие образования фенолятов, отчетливое уменьшение величин Rj. На более кислых слоях наблюдают повышение величин Rj по сравнению с нейтральными слоями [661.

При разделении и идентифицировании фенилпропан- и фенолпроизводных при указанных условиях справедливы следующие эмпирические правила:

На адсорбционное сродство оказывают сильное влияние свободные фенольные группы. При применении бензола монофенолы перемещаются по пластинке, но дифенолы уже задерживаются на точке старта.

Фенольные эфиры обнаруживают значительно меньшее адсорбционное сродство, чем соответствующие фенолы. С увеличением числа метоксильных групп величина hR уменьшается (анетол, 1 ОСН3, hRу 83; метиловый эфир эвгенола, 2ОСН3, hRj 22; азарон, 3 ОСН3, hRj 13).

При экранировании двух фенольных оксигрупп метиленовым мостиком их влияние на величину Rj значительно повышается (пирокатехин hRj 0, сафрол hRj 89).

Введение алифатической боковой цепи (метил-, этил-, алил-,пропенил- группы) в ядро лишь незначительно изменяет адсорбционное сродство и тем самым величину Rj.

При смежном расположении функциональных групп адсорбционное сродство каждой отдельной группы уменьшается и, таким образом, повышается величина Rj соединения.

Применение. Метод ХТС является способом быстрого установления богатых биологически активными веществами «химических пород» в случае

лекарственных растений, содержащих оксифенилпропановые ядра. Например, было обнаружено, что эфирные масла различных «хромосомных пород» аира (A corns calamus L) сильно отличаются по своему составу (рис. 99) [87].

Рис. 98. Сравнение методом ХТС 22 различных масел петрушки на тонкослойной пластинке шириной 40 см.

Зоны верхнего ряда — миристицин, среднего — апиол, нижнего — аллилтетраметоксибензол; слева и справа — эталонные смеси фирмы «Desaga». Слой силикагеля Г; С-камера; растворитель: трихлорэтилен — хлороформ (90 + 10); длина пути 12 см.

Исследования эфирных масел семян петрушки семнадцати различных происхождений показало, что можно различать составные части трех пород: мири- стициновой, апиоловой, тетраметоксибензольной.

На рис. 98 приведена тонкослойная хроматограмма различных масел петрушки, полученная в С-камере шириной 40 см. Точно такие же различия

Рис. 99. Схематическое изображение различий эфирных масел из листьев (а) и корневищ (б) различных видов аира. '

2п — диплоидные; Зп — триплоидные; 4п — тетраплоидные растения различного происхождения; н — нижняя, в — верхняя половина листа. Слой силикагеля Г; растворитель бензол; лотковая камера, нормальное насыщение; обнаружение реактивом№ И, пробы по 400 цг. ns геранилацетат;

• к? изоэвгенолметиловый эфир; ng азарон; О масляный желтый; 0 судан красный G-.

были выявлены при разделении методом ХТС экстрактов ряда других растений, содержащих в качестве главных биологически активных веществ фенол- или фенилпропанпроизводные. Следует отметить часто наблюдаемые количественные и качественные различия между эфирными маслами, выделенными из разных частей растения, например из корня, корневища и листа (рис. 99).

' 7. ДИТЕРПЕНОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ

О разделении 4 дитерпеновых производных сообщили Демоле и Ледерер [8]. Они проводили хроматографическое разделение на слоях силикагеля, приготовленных в принципе по методу Райцема [52], со смесью н-гексан — этиловый эфир уксусной кислоты (85 + 15). Приводимые ниже величины Rf X 100, заимствованные из схематического рисунка, следует рассматривать лишь как ориентировочные: фитол 68, иэофитол 56, гераниллиналол 46, фитилацетат 36 (?) Для обнаружения пятен хроматограммы опрыскивают водным раствором перманганата калия (0,25—0,5%-ным). После сушки на красно-фиолетовом фоне появляются желтые пятна. Указанные соединения лучше открывать смесью анисовый альдегид — серная кислота (реактив № 96) или хлоридом сурьмы(Ш) (реактив № 11).

ТРИТЕРПЕНЫ И ПРОИЗВОДНЫЕ

По разделению методом хроматографии на бумаге часто встречающихся в растительном царстве смесей тритерпенов имеется сравнительно мало работ [77]. Чеше с сотрудниками подробно изучили методом ХТС тритерпеновые кислоты и ряд нейтральных тритерпеновых производных [77]. Используя уже простейшие смеси растворителей, например бензол и метиленхлорид, получают в случае нейтральных тритерпеноидов очень хорошее разделение на слоях силикагеля Г. Для разделения тритерпеновых кислот следует, по-видимому, применять более полярные растворители, например смесь дииэо- пропиловый эфир — ацетон (75 + 30). В случае некоторых кислот имеет место образование хвоста, которое в большинстве случаев можно устранить добавкой пиридина или, лучше, диэтиламина.

Таблица 22

Величины Rf тритерпеновых кислот на слоях силикагеля Г [77]

Кислота

В/Х100

Кислота

RfXiOti

1а

па

1а

IIя

Ацетилурзоловая . . .

76

Хинная

55

Урзоловая

68

50

Мастикадиеноновая

47

Олеаноловая*

68

50

Изомастикадиеноновая

47

Бетулиновая

68

Гваяволовая . . . .

35

Олеаноновая

68

Байогенин

31

Сиарезиноловая . . . .

66

Акантоловая . . . .

29

Мороловая

59

Медикагеновая . . .

29в

35

Бредемоловая

596

Махаэриновая . . . .

23в

25

Эммоловая

59

Кохаловая ....

№

45

а Растворители: I — диизопропиловый’эфир — ацетон (75 + 30); II — этилацетат— метанол — диэтиламин (70+20+15).

® Образование хвоста.'

В отношении приведенных «величин Rf» следует заметить, что слои наносились с помощью шпателя, поэтому они неравномерны по толщине, кроме того, отсутствуют данные о конструкции камеры и об условиях ее насыщения. Рекомендуется проводить хроматографирование с эталонным веществом (олеаноловой кислотой). В случае нейтральных тритерпеноидов можно при этом применять трехцветную эталонную смесь фирмы «Desaga».

Из данных табл. 22 следует, что изомерные олеаноловая, урзоловая и бутилиновая кислоты не разделяются в указанных условиях. Однако их удается разделить на анионообменной бумаге другим растворителем, например смесью метилциклогексан — хлороформ (80 + 20), насыщенной 99%-ной муравьиной кислотой [77]. Получаемые пятна вытянуты в длину. Вполне вероятно, что результат разделения можно улучшить, применяя тонкозернистые обменные слои.

.Таблица 23

Величины Rj нейтральных тритерпеноидов на слоях силикагеля Г [77]

Тритерпеноид

RjX 100

1Па

IVs

va

Р-Амирин

38

12

Р-Амиринацетат

45

а-Амиренон

31

Ланостерин

75

40

14

Цигидроланостеринацетат ...

43

Метиловый эфир урзоловой кислоты,

ацетат

77

26

Метиловый эфир олеаноловой кислоты,

ацетат

77

24

Метиловый эфир урзоновой кислоты . . .

85

51

Растворитель!3

Метиловый эфир кратеголовой кислоты,

моноацетат

40

13

80

Метиловый эфир кратеголовой кислоты,

диацетат

72

37

92

Метиловый эфир дегидрократеголовой кисло-

ты, диацетат

69

39

Метиловый эфир 11-кетократеголовой кис-

лоты, моноацетат

77

Метиловый эфир акантоловой кислоты,

моноацетат

73

Метиловый эфир эхиноцистовой кислоты

59

15

Диметиловый эфир эммоловой кислоты

73

3 Растворители: I —см. табл. 22; III — диизопропиловый эфир; IV — метиленхлорид; V—бензол.

Обнаружение. В качестве реактива для опрыскивания особенно пригодна хлорсульфоновая кислота (реактив № 33) [77], позволяющая обнаружить еще 0,02 цг олеаноловой кислоты. Кроме того, применяют также смеси хлоридов сурьмы(Ш) и (V) (реактивы № 11, 13) и четыреххлористое олово (реактив № 156). В большинстве случаев при этом возникают окрашенные зоны, от красновато-фиолетовых до коричневых.

Применение. Слои силикагеля Г применяли для разделения тритерпеновых кислот из Bredemeyera floribunda Вильда [76] и диоксикислот и их эфиров из Crataegus oxyacantha L [76а]. Томас и Мюллер [74] контролировали этим методом процесс очистки метиловых эфиров тритерпеновых кислот из Commiphora glandulosaHSKHpa. Они работали на слоях силикагеля Г и применяли в качестве растворителя смесь хлороформ — этиловый эфир уксусной кислоты (80 + 20), а для обнаружения использовали концентрированную

Разделение эфирных масел и производных терпенов методом ХТС(период от 1938 г. до середины 1962 г.)

Год

Автор

Литературная ссылка

Использовано для разделения

1938

Измайлов и Шрайбер

24

Настойка перечной мяты и корицы

1951

Кирхнер, Миллер и Келлер

32

Величины Rj 14 производных терпенов, разделение простых смесей

1952

Миллер и Кирхнер

38

Фракции, полученные на колонках

1952

Оноэ

45

2,4-Динитрофенилгидразоны

1953

Фукуши

12

Азулены

1953

Генсхирт

13

Эфирные масла Aristolochia clematitis L

1953

Лаба и Монт

34

2,4-Динитрофенилгидразоны и 3,5-динит- робензоаты

1953

Миллер и Кирхнер

39

Величины Rf 38 производных терпенов в различных растворителях

1954

Грюнер и Шпайх

17

Эфирные масла Arnica montana и тритерпены

1954

Ито, Вакаматзу и Ка- вахара

26

Японское масло перечной мяты и его составные части

1954

Райцема

52

Величины Rt терпеновых производных эфирных масел, содержащих карвон

1954

Райцема

53

Эфирные масла из видов Mentha

1955

Брайан

4

Круговая хроматограмма масел Eucalyptus на слоях магнезии

1955

Ковеней, Метьюз и

Пиккеринг

5

Эфирные масла Strobilanthopsis llnifolia

1955

Гогроф

15

Сесквитерпены Pogostemon Patschuli

1955

Кайзер

30

Эфирные масла и смолы породы Grindelia

1955

де Надаль

43

Терпены, сесквитерпены и терпеноиды

1955

Ригби и Бетюн

56

Фракции масла хмеля (цветная таблица 22 хроматограмм)

1955

Вагнер

80

Некоторые летучие фенолы

1955

Уотерспун и Бедукьян

85

Определение окисленных соединений в эфирных маслах

1956

Демоль

6

Жасминовое масло, отделение от изофитола

1956

Луйендийк

36

Эфирные масла некоторых Umbelliferen

1956

Шпигельберг

61

Эфирное масло шалфея

1956

Шпрехер

62

Эфирное масло (метилнонилкетон) Ruta graveolens

1956

Шталь

63

Эфирные масла, проазулены и производные хамазулена

1957

Фридман, Монт, Тро- паревски

И

Многочисленные эфирные масла и чистые вещества

1957

Ито

25

Разделение ментола, неоментола, изоментола, неоизоментола

1957

Райцема, Крамер и фасе

54

Изменение эфирного масла в органах некоторых растений

1957

Стенли и Ванир

70

Цитрусовые масла

1957

Стенли с сотрудниками

71

Кумарин цитрусовых масел, дифенил

Год

Автор

Литературная ссылка

Использовано для разделения

1958

Демоль и Ледерер

8

Жасминовое масло, дитерпеновые производные

1958

Клор-Майнхардт

33

Эфирные масла прививок Petroselinum и Levisticum

1958

Навс

44

Эфирные масла

1958

Прайор и Брайан

50

Масла Eucalyptus на магнезии

1958

Шталь

65

Аирные масла, валериановое масло, перекиси и т. д.

‘ 1958

Шталь

64

Возможные добавки в промышленности душистых веществ; эфирные масла, смолы, бальзамы

1959

Шталь

66

Фенолы и простые эфиры на «кислых» и «основных» слоях

1959

Винклер и Лунау

84

Эфирные масла Curcuma xanthorriza и С. Tonga

1960

Бризкорн и Венгер

3

Эфирное масло шалфея

1960

Хефендель

21

Масло перечной мяты; количественное определение ментофурана

1960

Петрович

48

Изомеры ментола (см. Ито, 1957)

1960

Шталь

67

Пиретрины

1960

Шталь и Тренхойзер

68

Оксифенил пропанпроизводные, терпены (комбинация с газовой хроматографией)

1960

Чеше и Сен-Гупта

76

Тритерпеновые кислоты

1960

Чеше, Ламперт и

Снатцке

77

Тритерпеновые кислоты и нейтральные тритерпеноиды, величины Rj

1960

Венгер

83

Масло далматского и испанского шалфея (методы ХТС и газовой хроматографии)

1960

Вульф и Шталь

86

Эфирные масла пород Calmus

1961

Аказава и Вада

1

Ипомеамароны из батата, пораженного грибом

1961

Батайл с сотрудниками

2

Биосинтез составных частей масла перечной мяты

1961

Брискорн, Клингер и Полониус

2

P-Ситостерин, урзоловая кислота

1961

Донт и де Рой

9

2,4-Динитрофенилгидразоны

1961

Доит и де Рой

10

3,5-Динитробензоаты

1961

Хорхаммер, Вагнер и Лей

22

Олеаноловые кислоты, Р-ситостерин корня Radix Panax Ginseng

1961

Джасперсен-Шиб

28

Масла Mentha, компоненты

1961

Нойберн де Толедо и Уасики

44а

Некоторые эфирные масла

1961

Парис и Годов

46

Различные эфирные масла (сравнение с хроматографией на бумаге)

1961

Занини, Даль Поццо и Данси

87

Эфирное масло Pint pumilionis

1962

Граф и Хоппе

16

Изомеры ментола

1962

Габель, Мюллер и

Шокнехт

12а

Определение тимола и карвакрола

1962

Шанц

59

21 эфирное масло

серную кислоту. Хунек [23] выделял тритерпены из коры Sorbus torminalis на слоях волокнистого глинозема со смесью эфир — этанол (98 + 2). Другие применения указаны в табл. 24.

ПОЛИТЕРПЕНЫ

Возможности разделения методом ХТС смесей политерпенов, в особенности каротинов и каротиноидов, а также убихинонов, описаны в следующей главе.

ЭФИРНЫЕ МАСЛА(Природные смеси производных терпенов)

Эфирные масла представляют собой отгоняющиеся с водяным паром смеси природных липофильных веществ из растений, отличающихся особым запахом. С точки зрения физиологии растений мы имеем дело с выделениями, образующимися в особых клетках, например в железистых волосках губоцветных и сложноцветных или в протоках зонтичных. Во многих промышленных производствах занимаются разведением этих растений с целью получения эфирных масел. Довольно дорогой метод выделения обусловливает относительно высокую цену и является причиной многочисленных фальсификаций. Для обнаружения подобных фальсификаций наряду с анализом по запаху и установлением физических констант представляют интерес простые и доступные методы, которые могут быть использованы для определения состава эфирных масел .

Еще в самых первых опытах по микроаналитической характеристике эфирных масел методами ХТС и газовой хроматографии необходимо обратить внимание на следующее.

Имеющиеся в продаже эфирные масла почти во всех случаях следует подвергнуть ректификации, чтобы они соответствовали требованиям в отношении запаха и вкуса. При этом часто удаляются низко- и высококипящие фракции. Особую ценность представляют эфирные масла, очищенные от терпенов и сесквитерпенов. Нередко смешивают эфирные масла различного качества.

Состав эфирных масел зависит от большого числа факторов:

от ботанической однородности использованного растительного материала («химические породы»);

от использованной части растения (например, стебель, лист, корень и т. д.), от места произрастания, климата, урожая и способа хранения материала;

от метода выделения и использованных условий.

Только комбинация нескольких аналитических методов позволяет с уверенностью идентифицировать и количественно определить отдельные компоненты.

Нам пришлось бы выйти за рамки настоящей главы, если бы мы захотели рассмотреть все приведенные в табл. 24 работы. Кроме того, это вряд ли имело бы смысл, поскольку в большинстве случаев там рассматриваются отдельные частные задачи. Из новых работ (см. табл. 24) следует выделить исследование масел Mentha, проведенное Джесперсен-Шибом [28]. Оно подтвердило опыт, указывающий на то, что практически в случае любого эфирного масла приходится проводить подробное исследование, позволяю-

щее получить общие выводы, которые могут быть использованы в дальнейшем. Для большинства масел такие подробные микроаналитические исследования пока еще отсутствуют. Это объясняется тем, что работа с чистыми эталонными веществами часто вызывает большие затруднения. Поэтому в каждом отдельном случае стремятся получить данные о главных составных частях и характерных сопутствующих компонентах, а также об их количественном соотношении. При этом существенную помощь может оказать изложенное в предыдущих разделах.

СМОЛЫ И БАЛЬЗАМЫ

Природные смолы и бальзамы, так же как эфирные масла, являются продуктами выделения растений. В большинстве случаев они образуются в ткани коры под действием внешних раздражений, например при повреждениях. В противоположность эфирным маслам эти смеси веществ не перегоняются с водяным паром или перегоняются в очень небольшой степени. Смолы представляют собой твердые хрупкие и аморфные массы с окраской от желтой до коричневой, размягчающиеся лишь при повышенной температуре и не имеющие определенной точки плавления. В воде они не растворимы, в спирте растворимы лишь частично, а лучше всего растворяются в хлороформе или этиловом эфире уксусной кислоты. В то время как смолы содержат лишь небольшие количества эфирных масел, бальзамы содержат их в больших количествах и поэтому в большинстве случаев являются вязкими.

В случае смол и бальзамов мы имеем дело со сложными, весьма трудно анализируемыми смесями производных терпенов в широком смысле слова. Поэтому понятно, что ни одна из до сих пор существующих классификаций не является удовлетворительной — ни ботаническая, ни химическая, предложенная Чирком [78]. Согласно последней, различают эфирные смолы, резиноловые смоляные кислоты и ка'учукообразные, или цветные, смолы.

Имеются 'также опыты, в которых пытались охарактеризовать смолы и бальзамы хроматографически. Ротенхаймер [57] и Шток [73] применяли капиллярный анализ, Валентин [79] — хроматографию на колонках с окисью алюминия, Милз и Вернер [40, 41], а также Роулингз и Вернер [51] — метод обращения фаз на бумаге. При этом был достигнут лишь частичный успех и ни один из этих методов не нашел сколько-нибудь значительного применения на практике. Несколько лет назад были проведены первые опыты по разделению смол и бальзамов методом ХТС, которые показали, что таким образом может быть достигнут лучший эффект разделения [64, 66а]. Дальнейшее развитие этих исследований на большом числе лекарственных материалов подтвердило эти данные.

Условия разделения. Было проведено хроматографическое разделение в стандартных условиях на слоях силикагеля Г толщиной 250 ц и установлено, что при применении С-камер (стр. 27) достигается значительно лучшее разделение, чем при применении лотковых камер. В случае смол и бальзамов вместо круглых пятен получают узкие эллиптические, а иногда полосообразные зоны (рис. 100).

В качестве растворителя наиболее пригоден бензол с добавкой 5% метанола в случае как лотковых, так и С-камер. Для получения хорошего распределения на пути в 10 см обычно двукратно^хроматографируют, т. е. про- пускаютрастворитель два раза (рис. 100). Ни с одной другой из испробованных смесей не было достигнуто такое же хорошее разделение даже при двукратном хроматографировании. Это справедливо также для опытов с «обращенными фазами» на слоях силикагеля Г, пропитанных парафином.

Для сравнительных исследований смол и бальзамов лучше всего готовить 3,0%-ный раствор в этилацетате или в хлороформе и наносить 1 мм?

(= 30 [1г). В каждом случае, одновременно с эталонной смесью красителей следует хроматографировать также аутентичную пробу с такой же концентрацией.

Обнаружение. Для перевода в видимое состояние компонентов смолы или бальзама лучше всего использовать хлорид сурьмы (III) (реактив №11).

Рис. 100. Сравнение методом ХТС наиболее важных смол и бальзамов на тонкослойной пластинке шириной 40 см (подробности в тексте).

— сиамская бензойная смола; 2 — суматрская бензойная смола; з — стиракс; 4 — перуанский бальзам; 5 — перуген; 6 — толуанский бальзам; 7.— асафетида; 8 — гальбан; 9 — мирра; 10 — ладан; 11 — мастике; 12 — даммара; 13 — терпертин; 14 — колофониум; 15 — канадский бальзам; 16 — искусственный канадский бальзам; 17 — сандарак; 18 — копайский бальзам;

19 — гуммигут.

При добавлении раствора хлорида сурьмы (V) к реактиву № 11 окраска становится более интенсивной, однако происходит нежелательное ослабление флуоресценции.

Рис. 101. Снятая в УФ-свете тонкослойная хроматограмма смол и бальзамов.

Условия разделения и обозначения те же, что и на рис. 100.

До и после опрыскивания хроматограмму рассматривают при дневном и в длинноволновом УФ-свете и маркируют зоны: лишь затем проводят нагревание, примерно в течение 10 мин до 110°. На рис. 100 приведена тонкослойная хроматограмма некоторых смол и бальзамов, сфотографированная в видимом свете после нагревания. Зоны в большинстве случаев коричневые, фиолетовые или серые. В особенности поразительны желтые пятна искусственного перуанского бальзама (перугена). Большинство смол и бальзамов можно различать по числу, величине и окраске зон. Для дальнейшей идентификации хроматограмму рассматривают в длинноволновом

УФ-свете. При этом, как видно из рис. 101, многие зоны флуоресцируют. На практике этим и другими способами можно хорошо отличить сиамскую и суматрскую бензойную смолу.

Для перевода в окрашенное состояние можно использовать и ряд других реактивов, однако они менее чувствительны, чем предложенный. Были использованы, например, проба Хальфена — Хикса, реакция Ноллера, «природный реактив» (№ 55) и концентрированные кислоты с добавкой альдегида.

Примечание

Полученные хроматограммы смол и бальзамов позволяют сделать оценку продуктов, поставляемых немецкой торговлей аптекарскими товарами за последние 5 лет. В большинстве случаев существует 5—10 различных сортов. Утверждение о подлинной аутентичности материала практически может быть сделано только тогда, когда точно известен весь путь продажного продукта, вплоть до исходного растения. При сравнении следует учесть, что метод выделения, разбивка на «сорта», возраст пробы и многое другое может оказывать влияние на состав. Эти вопросы могут быть изучены методом ХТС.

На основании полученных хроматограмм можно, например, установить, что старое деление смол по Чиршу является неудовлетворительным.

В настоящее время в числе прочих описан метод ХТС для анализа гидролизатов искусственных смол [37а]. Продукты расщепления можно разделить на слоях силикагеля Г, используя смесь метанол — ледяная уксусная кислота (904-10).

ЛИ Е РА Т У Р А

Akazawa Т., Wada К., Agr. Biol. Chern. Japan, 25, 30 (1961).

В a t a i 1 e J., Mitarb., Biochim. Biophys. Acta, 51, 538 und 545 (1961).

Brieskorn Ch.. Klinger H., Polonius W., Arch. Pharm., 294, 389 (1961).

3a. Brieskorn Ch., Wenger E., Arch. Pharm., 293, 21 (1960).

В г у a n t L. H., Nature, 175, 556 (1955).

Coveney R. D., Matthews W. S. A., Pi ckering G. B., Colonial Plant and Animal Prods. (Gt. Brit.), 5, 150 (1955).

D e m о 1 e E., Compt. rend., 243, 1883 (1956).

D e m о 1 e E., Theses de Doctorat, Paris, Ser. A. n° 844, № d’Ordre 870 (1958).

Demole E., Lederer E., Bull. soc. Chim. France, 1958, 1128.

D h о n t J. H., Rooy C. d e, Analyst, 86, 74 (1961).

D h о n t J. H., Rooy C. d e, Analyst, 86, 527 (1961).

F rm у d an B. J., M о n te s A. L., Troparevski A., Anales asoc. quim. (arg.), 45, 248, 257, 261 (1957).

Fukushi S., О b a t a Y., J. Agr. Chem. Soc. Japan, 27, 353 (1953); Ch. A., 50, 15027 (1956).

12a. Gabel E., Muller К. H., Schoknecht I., Dtsch. Apotheker Ztg., 102, 293 (1962).

Gan shirt H., Pharm. Ind., 15, 177 (1953).

Gildemeister E., Hoffmann Fr., Die atherischen Ole. Berlin, Akademie- ' Verlag, 1956—1962.'

Gogrof G., Pharmazie, 12, 38 (1957).

Graf E., Hoppe W., Dtsch. Apotheker Ztg., 102, 393 (1962).

G r u n e r S., Spaich W., Arch. Pharm., 287, 243 (1954).

G s t i r n e r F., Priifung und Verarbeitung von Arzneidrogen, Bd. I, Berlin — Gottingen — Heidelberg: Springer, 1955.

Guenther E., The Essential Oils, New York, D. van Nostrand Companv 1952— 1955.

H a a g e n-S m i t A. G., in L. Zechmeister, Fortschritte der Chemie orga- nischer Naturstoffe, Bd. XII. Wien, Springer, 1955.

Hefendehl F., W. Planta Med., 8, 65 (I960).

Horhammer L., W a g n e r H., Lay B., Pharm. Ztg., 106, 1308 (1961).

H u n e c k S., J. Chromatog., 7, 561 (1962).

Измайлов H. А., Шрайбер M. С.,, Фарм. № 3, 1 (1938).

Ito M., J. Chem. Soc. Japan, Pure Chem. Sect., 78, 172 (1957); Ch Z., 42. 11595

(1957).,

14 Заказ № 734

Ito М., Wakamatsu Sh., Kawahara H., J. Chem. Soc. Japan, Pure Chem. Sect., 75, 413 (1954); Ch. A., 48, 13172 (1954); Schimmel Ber., 1956 91.

Janistyn H., Parfumerie und Kosmetik, 41, 371 (1960).

Jaspersen-Schib R., Pharm. Acta Helv., 36, 141 (1961).

Jones E. R. H., Halsall T. G., inL. Zechmeister, Fortschritte der Chemie organischer Naturstoffe, Bd. XII, Wien, Springer, 1955.

Kaiser H.-H., Diss., Karlsruhe, 1955.

К a r r e r W., Konstitution und Vorkommen der organischen Pflanzenstoffe, Basel — Stuttgart, Birkhauser, 1958.

Kirchner J. G., M i 11 e r J. M., Keller G. I., Anal. Chem., 23, 420 (1951).

К 1 о h r-M e i n h a r d t R., Planta Med;, 6, 203, 208 (1958).

L a b a t J., M о n t e s A. L., Anales asoc. quim. arg., 41, 166 (1953).

L u о m s W. D., Biochem. Biophys. Acta, 51, 538 (1961).

Luyendijk E. N., Diss., Leiden, 1956.

M a r b e t R., Saucy G., Chimia, 14, 362 (1960).

37a. Meckel L., M i 1 s t e r H., Krause U., Textil-Praxis, 16, 1032 (1961).

M i11 er J. M., Kirchner J.G., Anal. Chem., 24, 1480 (1952).

M i11 er J. M., К i r c h n e r J.G., Anal. Chem., 25, 1107 (1953).

M i11 s J. S., Werner A. E.,Nature, 169, 1064 (1952).

M i11 sJ. S.. Werner A. E.,J. Chem. Soc., 1955, 3132.

Moritz O., in R u h 1 a n d W., Handbuch der Pflanzenphysiologie Bd. X, Berlin — Gottingen — Heidelberg, Springer, 1958.

42a. Moritz O., in P a e c h К., T г а с e у M. V., Moderne Methoden der Pflanzenana- lyse, Bd. Ill, Berlin — Gottingen — Heidelberg, Springer, 1955.

N a d a 1 G. N. d e, Am. Perf. Ess. Oil. Rev., 65, Nr. 6, 17 (1955).

Naves Y.-R., France et ses parfums 1, 10 (1958); 2, 18 (1959); nach M. R. P a r i s, M. G о d о n.

44a. Neubern de Toledo T. A., Was icky R., Tribuna Farm. Nr., 7, 44 (1961).

Onoe K., J. Chem. Soc. Japan, Pure Chem. Sect., 73, 337 (1952).

P a r i s M. R., Go don M., Ann. pharm. frang., 19, 86 (1961).

Petrowitz H. J., Angew. Chem., 72, 921 (I960).

Petrowitz H. J., Z. analyt. Chem., 183, 432 (1961)..

Prey A., Berger A., В e r b a 1 к H., Z. analyt. Chem., 185, 113 (1962).

Pryor L. D., Bryant L. H., Proc. Linnean Soc. N.S. Males, 83,55(1958).

Ra w 1 i n g sF. I. G., Werner A. E., Endeavour,13, 140 (1954).

Re i t s e m aR. H., Anal. Chem., 26, 960 (1954).

Re i t s e m aR. H., J. Am. Pharm. Assoc. Pract. Pharm.Ed. Sci. Ed.,43,414(1954).

ReitsemaR. H., Cramer F. J., F a s s W. E., Agr. and Food Chem., 5, 779 (1957).

R i g a n e s i s M. D., Essenze deriv. agrumari, 26, 29 (1956).

Rigby F. L., Bethune J. L., Proceedings of Amer. Soc. of Brewing Chemists, p. 174 (1955).

Rothenheimer C., Pharm. Ztg., 74, 712 (1929).

Ruzicka L., Experientia, 9, 357 (1953).

S c h a n t z M. v., Farmaseuttinen Aikakauslehti, 2, 52 (1962).

S i m о n s e n J. L., The Terpenes, Bd. I — V, Cambridge, University Press, 1953— 1957..

Spiegelberg Ch., Diss., Berlin, 1956.

Sprecher E., Diss., Karlsruhe, 1956.

Stahl E., Pharmazie, 11, 633 (1956).

Stahl E., Parfumerie und Kosmetik, 39, 564 (1958).

Stahl E., Chem. Ztg., 82, 323 (1958).

Stahl E., Arch. Pharm., 292, 411 (1959).

66a. Stahl E., Pharmaz. Rundschau 1, Heft 2, 1 (1959).

Stahl E., Arch. Pharm., 293, 531 (1960).

Stah 1 E., Trennheuser L., Arch. Pharm , 293, 826 (1960).

Stahl E., Mikrochim. Acta, 40, 367 (1953).

Stanley W. L., V a n n i e r S. H., J. Am. Chem. Soc., 79, 3488 (1957).

Stanley W. L., V a n n i e r S. H., G e n t i 1 i B., J. Ass. Offic. Agr. Chemists, 40, 282 (1957).

Steiner M., H о 1 t z e m H., in P a e c h K., Tracey M. V., Moderne Methoden der Pflanzenanalyse, Bd. Ill, Berlin — Gottingen — Heidelberg, Springer, 1955.

S t о с к E., in D i e t e r i c h K., Stock E., Analyse der Harze, Balsame und Gummiharze, 2. Aufl., Berlin, Springer, 1930.

T h о m a s A. F., M ii 1 1 e r J. M., Experientia, 16, 62 (1960).

Trennheuser L., Diss., Saarbriicken, 1962.

T s c h e s c h e R., Sen Gupta A. K., Chem. Ber., 93, 1903 (1960).

76a. Tschesche Й., Pop pel G., Chem. Ber., 92, 320 (1959).

Tschesche R., Lambert F., Sn atz ке G., J. Chromatog., 5, 217 (1961).

Ts chi г ch A., Die Harze, Leipzig, Borntrager, 1933/36.

V a 1 e n t i n H., Chromatographische Adsorptionsanalyse in der Pharmazie I, Pharm.

Ztg., 80, 469 (1935).

Wagner G., Pharmazie, 10, 302 (1955).

Wallach 0., Terpene und Campher, 2. Aufl., Leipzig, 1914.

Was icky R., Fehden O., Mikrochim. Acta. 1, 55 (1937).

Wenger E., Diss., Tubingen, 1960.

Winkler W., Lun an E., Pharm. Ztg., 104, 1407 (1959).

Wotherspoon P. A., Bedoukian P. Z., Am. Perfumer Essent. Oil Ref.,

Nr. 5, 17 (1955).

Wulff H. D., Stahl E., Naturwiss., 47, 114 (1960).

Z a n i n i 0., Dal Pozzo A., D a n s i A., Boll. Chim. Farm., 100, 83 (1961).

ГЛАВА 12

ВИТАМИНЫ

X. Боллигер

ВВЕДЕНИЕ

Многие витамины можно определить биологическими методами. Однако в отношении точности, экономии времени и расходов эти методы оставляют желать лучшего. Поэтому для определения все чаще применяют физикохимические методы, например колориметрию, спектрофотометрию и т. д. Это требует, однако, чтобы витамины, экстрагированные из питательных веществ, фармацевтических препаратов и из растительных и животных материалов, перед определением были освобождены от сопутствующих веществ, мешающих анализу. В качестве методов очистки оправдали себя колоночная хроматография (адсорбция, распределение, ионный обмен) и особенно хроматография на бумаге (адсорбция, распределение) и электрофорез, описанные в соответствующих руководствах [23, 34, 65].

Указанные методы очистки и анализа дополняются методами ХТС; преимущество последних заключается в экономии времени и отчасти в большей чувствительности. Благодаря разнообразным возможностям эти методы используются также для решения других задач, например при исследовании стабильности природных и синтетических витаминов и изучении химических реакций.

Ниже мы опишем новые возможности определения витаминов с использованием метода ХТС .

И. МЕТОДЫ РАБОТЫ (ОБЩИЕ ПРИЕМЫ)

Методы переработки для выделения подвергаемых хроматографическому разделению экстрактов определяются свойствами исходного материала, формой применения и количеством находящихся в нем витаминов. В природных продуктах витамины находятся не в свободном состоянии, а каким-то образом связаны. Искусственно полученные препараты для стабилизации часто заключают в желатину. Из однородных проб (раствор, порошок) витамины известным способом экстрагируют непосредственно или после гидролиза. Полученные таким образом экстракты после концентрирования и дальнейшей очистки (например, методом вымораживания или колоночной хроматографии) наносят на пластинки для ХТС и подвергают одно- или двумерному хроматографированию, используя соответствующие растворители. Обнаружение витаминов на пластинке осуществляют либо при рассматривании в свете с различной длиной волны, либо при опрыскивании соответствующими реактивами . Для количественных расчетов целесообразно проводить сравнение со стандартом, прошедшим стадии хроматографического разделения, элюирования и последующего физико-химического определения. Для определения витаминов можно использовать также биоавтографию, т. е.

микробиологический метод, который был, например, описан Мартином [34] для хроматографии на бумаге витамина В.

Источниками ошибок, на которые следует обратить внимание, являются: чувствительность некоторых витаминов к кислороду воздуха (прежде всего витамины A, D, Е, К и С), свету (витамин A, D, Е, К, В, В2, В6 и С), активным адсорбентам (витамины A, D и К), теплу и растворителям (в особенности витамин D). Вызванные при этом эффекты можно легко установить методом ХТС и, приняв специальные меры предосторожности, уменьшить или исключить. '

Согласно нашим данным, анализ витаминов целесообразно проводить в помещениях с постоянной температурой (20—23°) и при мягком свете. Лучшую защиту от света обеспечивает прозрачная, поглощающая коротковолновую часть света пленка увекс , которой заклеивают окна. При ярком солнечном свете дополнительно устанавливают жалюзи. Далее, следует применять только чистые, дважды перегнанные растворители. Продажный абсолютный этиловый спирт и чистый петролейный эфир содержат, например, еще следы загрязнений, которые при обработке проб концентрируются. Эти примеси флуоресцируют на слое адсорбента, окрашиваются и поэтому мешают определению.

При хроматографии в тонких слоях работают стандартным методом (стр. 35). К адсорбенту добавляют 2% светящегося вещества «ZS-супер» , вследствие чего слои в УФ-свете в области 254 лф флуоресцируют. Пластинки с нанесенными на них слоями должны обладать одинаковой активностью, должны иметь слой одинаковой толщины и одинакового состава, поскольку уже небольшое различие слоев может привести к искажению и смещению пятен. Аналогичные эффекты могут быть вызваны также сопутствующими веществами или слишком концентрированными растворами, вследствие перегрузки слоев. Для соблюдения стандартных условий камеры, оклеенные фильтровальной бумагой (насыщение камеры), для каждого хроматографического анализа насыщаются свежим растворителем. Поскольку величины Ду, которые следует рассматривать как ориентировочные, могут сильно колебаться, в экстракт для сравнения необходимо добавить чистый витамин. Перед опрыскиванием хроматограммы рассматривают в коротковолновом УФ-свете (254 жц) на поглощение, в длинноволновом УФ-свете (365 жц) на флуоресценцию и с помощью лампы дневного света для установления собственной окраски.

Если экстракты наряду с жирами и другими сопутствующими веществами содержат лишь небольшие количества витаминов, разделение удается осуществить при нанесении относительно больших количеств экстракта (0,1—1 мл?) в виде полос (стр. 22) на более толстых слоях (0,4—3 мм\ Эти слои можно получить очень равномерными, используя приспособление для нанесения слоев с регулируемой толщиной (см., например, раздел «Витамин D»).

Оказалось выгодным выделить из витаминного комплекса водорастворимую и жирорастворимую части, благодаря чему одновременно достигают очистки. В этом случае при хроматографическом разделении носитель не перегружен и обе группы витаминов можно без потерь разделить на пластинке за более короткое время.

Ш. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ЖИРОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ

При разделении этих сильно липофильных веществ метод ХТС оказывает исключительную помощь и, по-видимому, превосходит в этом случае метод

хроматографии на бумаге. В короткое время можно хроматографировать относительно большие количества экстракта и перевести вещества в видимую форму, обрабатывая агрессивными специфическими реактивами. При проведении хроматографического разделения следует иметь в виду, что предварительно очищенные экстракты часто еще содержат жиры и масла,, затрудняющие интерпретацию, поскольку они флуоресцируют в УФ-свете и легко окрашиваются. Далее, каротиноиды и витамины A, D и К на сухих активных слоях не являются стабильными, и поэтому с ними следует обращаться осторожно при нанесении пробы и соскребании зоны для количественного определения, иными словами, они должны лишь короткое время находиться на носителе. Скорость разложения витамина на пластинке можно, например, проследить, нанося по каплям все увеличивающееся со временем количество его и проводя хроматографическое разделение.

1. СМЕСИ ЖИРОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ

Смеси жирорастворимых витаминов можно разделить в различных системах в зависимости от конкретной аналитической задачи. На силикагеле Г («Merck») со смесью циклогексан — эфир (80 + 20) и на окиси алюминия

Рис. 102. Разделение жирорастворимых витаминов на силикагеле Г (с добавкой флуоресцирующего вещества) со смесью циклогексан — эфир (80 + 20).

Снято в коротковолновом УФ-свете; время анализа 60 мин. 1 — 20 цг полностью пгранс-вита- мина А (спирта); 2 — 20 цг витамина D2; з — 30 цг dZ-n-токоферола; 4 — 20 цг полностью транс- витамина А (ацетата); 5 — 30 цг витамина Ki, 6 —20 цг полностью транс-витамина А (пальмитата);

7 — 20 цг полностью транс-|3-каротина; 8 — вещества и количества 1—7.

(фирма «Fluka» или «Merck») с бензолом возможно разделение различных витаминов при времени анализа 60 мин (см. табл. 26 и рис. 102). Используя смесь циклогексан — эфир, можно, варьируя отношения в смеси, достигнуть

новых эффектов разделения. Лежащие близко друг к другу пятна витамина А (спирта) и витамина D на пластинках с силикагелем при использовании смеси циклогексан — этилацетат (80 + 20) или (70 + 30) отдаляются друг от друга, а вещества с более высокими значениями Rf перемещаются совместно. Это разделение удается также на более толстых слоях (0,4—3,0 мм) и с большими количествами витамина или экстракта (0,1—1,0 мл). В качестве других растворителей можно использовать петролейный эфир и хлороформ. Известные из области колоночной хроматографии носители, например фосфат кальция, а также слои силикагеля, пропитанные парафиновым маслом (обращенные фазы), пригодны при использовании подходящих растворителей.

Таблица 25

Цветные реакции жирорастворимых витаминов с хлорной и серной кислотами на слоях окиси алюминия [3,7]

Витамин

Окраска

70%-ная хлорная кислота

98%-ная серная кислота

А

Фиолетовая

Сине-фиолетовая

d2

Оранжево-коричневая

Оранжево-красная

Е

Коричневая

Коричневая

Ki

Желто-коричневая

Желто-коричневая

к2

» '

»

К3

»

Провитамины А

Синяя

Синяя

Таблица 26

Ориентировочные величины R^ X 100 и непосредственное обнаружение жирорастворимых витаминов на слоях с добавкой флуоресцирующего вещества Сорбенты: силикагель Г фирмы «Merck», окись алюминия фирмы «Пика»

Витамин

ДуХЮО

Окраска

минимально обнаруживаемое количество, цг

на силикагеле со смесью

циклогексан— эфир

(80+20)

на окиси алюминия с бензолом

УФ-свет (254 мр,)

УФ-свет (365 лер)

дневой свет

Р-Каротин

84

89

Темная

Темная

Оранже-

0,03—0,04

вая

Витамин А, спирт . . .

10

16

»

Желто-

—

зеленая

Витамин А, ацетат . .

45

72

Желтая

0,2/0,03

Витамин А, пальмитат

72

84

»

»

Витамин D2 или D3 . .

15

22

»

—

0,5

а-Токоферол

32

53

»

—

10

а-Токоферол, ацетат . .

40

71

»

—

—

10

Витамин Kj

61

79

»

Темная

Желтая

0,5/1/20

Растворимые в жирах биологически активные вещества в малых количествах можно обнаружить при освещении по собственной окраске (каротиноиды), по поглощению или флуоресценции (см. табл. 26). Эти данные представляют большую ценность при последующем элюировании и количествен-

ном определении. Чтобы избежать фотохимического разложения, облучение УФ-светом должно быть кратковременным.

Следы витаминов можно открыть, используя фосфорномолибденовую кислоту (реактив № 1206) и получая серовато-голубые пятна, а также обрабатывая хлором с реактивом о-толидин — иодид калия (реактив № 32) и получая белые пятна на серовато-голубом фоне. Ниже будут указаны наиболее выгодные, специфические вещества для обнаружения.

Различные биологически активные вещества можно окрасить индивидуально, как это, например, показали Генсхирт и Мальцахер [15] для водорастворимых витаминов (стр. 236) и Блатна и Давидек для жирорастворимых витаминов [3, 7] (см., например, табл. 25, заимствованную из оригинальных работ [3, 7]).

Используя описанную выше методику, можно качественно и отчасти количественно определить жирорастворимые витамины в сложных препаратах.

КАРОТИНОИДЫ (ПРОВИТАМИНЫ А)

Из трех перечисленных основных групп этого класса природных соединений можно получить другие каротиноиды по реакциям дегидрирования, циклизации, ароматизации и введения кислородных функций или окислительного расщепления.

А + В + АУликопинА + В + С - Y- каротинС + В + С = р - каротинА + В + АУликопинА + В + С - Y- каротинС + В + С = р - каротин

А + В + АУликопин

А + В + С - Y- каротин

С + В + С = р - каротин

А + В + АУликопин

А + В + С - Y- каротин

С + В + С = р - каротин

Каротиноиды широко распространены в растительном и животном мире и представляют собой красящие вещества, от желтого до ярко-красного цвета, принадлежащие к классу терпенов. В настоящее время известно примерно 100 таких соединений. Их можно подразделить на чисто углеводородные соединения — каротины — и кислородсодержащие производные (спирты, альдегиды, карбоновые кислоты, эпоксиды); часто встречаются также цис- m/шнс-изомеры. Некоторые каротиноиды следует рассматривать как провитамины А (например, Р-каротин, криптоксантин, торулародин, эхиненон и апокаротиналь и т. д.), поскольку они в человеческом и животном организме переходят в витамин А.

Метод ХТС может сыграть здесь большую службу при идентификации и определении. Методом ХТС можно легко, анализировать синтетические каротиноидные препараты, но при анализе природных экстрактов оказалось полезным предварительно отделить сопутствующие вещества, например методом колоночной хроматографии, и дальше исследовать отдельные фракции.

Поскольку каротиноиды на сухом слое подвергаются быстрому изменению, их следует хроматографировать сразу же после нанесения; для безопасности можно наносить пробу в атмосфере COg. Кроме того, чтобы избежать превращений, следует пользоваться свежеприготовленными растворами каротиноидов или проводить сравнительное исследование [53].

Условия разделения и результаты

Еще Мотье [38] на свободных слоях окиси алюминия, используя бензол выделял каротиноиды моркови. Шталь [52] хроматографировал Р-каротин на силикагеле Г с бензолом (Rf X 100 S 99); он продемонстрировал также применение «ступенчатой методики», используя растворители с различной элюирующей способностью. С хлороформом (1 ступень) и затем с гексаном (2 ступень) удалось отделить.биксин и кантаксантин от p-каротина и ликопина. Согласно Зеэру [49], p-каротин перемещается на активированном силикагеле Г с хлороформом дальше, чем различные токоферолы (Rf X 100 ~ ~ 80).

Монтаг [37а] кратко описал возможность применения метода ХТС для обнаружения в продуктах питания некоторых искусственных и природных жирных красящих веществ, например биксина, норбиксина, каротина, капсантина и корцина. На слоях силикагеля Г, полученных стандартным методом, он осуществлял разделение тремя различными растворителями.

Для разделения различных каротиноидов Демоле [9, 10] использовал слои силикагеля с рисовым крахмалом в качестве связующего и проводил разделение смесью н-гексан — эфир (30 + 70). Излер с сотрудниками [28] применял гидроокись кальция + силикагель Г (6 + 1). Используя в качестве растворителя смесь петролейный эфир — бензол (98 + 2), они разделяли каротиноидные углеводороды, применяя бензол — каротиноидные кетоны, а используя смесь бензол — метанол (98 + 2) — гидроксилированные каротиноиды. На активированных слоях силикагеля Г при разделении смесью петролейный эфир (т. кип. 90—110°) — бензол (50 + 50) различные каротиноиды перемещаются с разной скоростью (см. табл. 27).

Шталь, Болигер и Ленерт [53] нашли, что, используя только один адсорбент и один растворитель, нельзя разделить встречающиеся смеси каротиноидов. Применяя слои гидроокиси кальция, фосфата магния и силикагеля Г и соответствующие растворители, удалось разделить группы каротиноидов на отдельные соединения (почти тридцать различных производных, см. таблицу 27). Для проверки этой схемы анализа одновременно хроматографировались неизвестные растительные экстракты, содержащие каротин, которые можно было непосредственно или косвенно проанализировать количественно. Нанесение осуществляли в виде полос на слои толщиной 0,5 мм (длина разделительного слоя 10—12 см, время анализа около 15 мин). По-видимому, целесообразно по приведенной схеме провести классификацию еще большего числа каротиноидов и другие группы расположить в таком же порядке. Во всех опытах при применении С-камер были достигнуты лучшие результаты по сравнению с до сих пор применяемыми стеклянными лотками. Эта система разделительной камеры делает излишним насыщение атмосферы камеры и позволяет на пластинке шириной 40 см параллельно анализировать более 30 смесей, чтобы сравнить их.

Для разделения и определения каротиноидных альдегидов в растениях, микроорганизмах и животных тканях Винтерштейн и др. [67—69] применяли в качестве сорбента смесь гидроокись кальция — силикагель Г (80 + 20), а в качестве растворителя,— как правило, смесь петролейный эфир — бензол (50 + 50). Содержание бензола в определенных случаях менялось, иногда добавляли 1 % метанола. Часто применяли также пластинки со слоем силикагеля, пропитанным парафиновым маслом (активированный слой окунался в раствор 5% парафинового масла в петролейном эфире и сушился); затем осуществлялось разделение метанолом, насыщенным парафиновым маслом.

Таблица 27

Ориентировочные значения R^ х 100 различных каротиноидов

Разделяемая система

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Каротиноидные . углеводороды а-Каротин Р-Каротин 7,7 '-Дигидро-р-каро- тин

15,15' - Дегидро-р-ка- ротин

у-Каротин

Ликопин 3,4-Дегидроликопин 3,4,3' ,4 '-бис- Дегидроликопин . . . .

Торулин

Кислородсодержащие каротиноиды

Р-Апо-12'-кароти- наль

Р-Апо-8'-каротиналь Р-Апо-8' - ликопина ль Р-Апо-Ю'-кароти- наль

Ликопиналь . . . .

Кроцетиндиальде- гид

Метиловый эфир то- руларгодина . . .

Метилбиксин . . . . Кантаксантин . . . Криптоксантин . . . Ксантофилл . . . . Антераксантин . . Зеаксантин . , . . Виолаксантин . . . Капсантин Капсорубин . . . . Биксин Азафрин Эхиненон Родоксантин , , . . Метиловый эфир р-апо-8 '-каротиновой кислоты . . .

Изозеаксантин . . .

96

38

17

51

63

88

84

82

74 40—50 10—20

43

34

82

16

74

55

57

94

82

70

74

15

0

10

26

84 69

55

а а

0

0

0

75

75

75

65

56

51

0

0—7

97

У

0

70

64

58

53

43

7,5

83

13

0

100

(98)

94

81

63

54

10—11

*

100

100

97

90

75

35

,32

24

21

16

13,5

5,5

2,0

Продолжение табл. 27

Разделяемая система

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Масляный желтый

35»

32

94

95

100

Индофенол . . . .

—

—

—

—

—

10

3

58

86

100

Судан красный . .

Слой (0,25

мм)

—

—

—

—

0

Ра

8

створи

68 телъ

90

100

1. Силикагель (с рисовым крахмалом),

н-гексан-

- эфир (30 + 70) [9,

10]

Гидроокись кальция—силикагель Г (6+1),

Гидроокись кальция — силикагель Г (6 + 1),

Гидроокись кальция — силикагель Г (6 + 1),

Силикагель Г,

Гидроокись кальция,

Силикагель Г,

emop-Фосфат магния,

втор-Фосфат магнии,

Силикагель Г,

петролейный эфир— бензол (98 + 2) [28]

бензол [28]

бензол—метанол (98 + 2) [28]

петролейный эфир (т. кип. 90—110°) — бензол (50 + 50)

смесь углеводородов — метиленхлорид

(95 + 5)

ундекан — метиленхлорид (80 + 20)

четыреххлористый углерод

бёнзол

метиленхлорид — этилацетат (80 + 20)

6—10. Групповое разделение по Шталю, Боллигеру и Ленерту [53].

а Образование полосы (хвоста).

Следует еще отметить своеобразные адсорбционные свойства каротиноидных альдегидов [67, 681. Адсорбционное сродство на непропитанных слоях является функцией не числа двойных связей, как, например, в случае углеводородов, а скорее строения. Ретинен (витамин Аь альдегид) с пятью сопряженными двойными связями значительно сильнее адсорбируется, чем Р-апо-8'-каротиналь с девятью двойными связями. Сравнительная хроматограмма синтетически полученных альдегидов (рис. 103) показывает, что альдегиды С4о, С35, С3о и С25 адсорбируются значительно слабее альдегидов С37, С32, С27, в которых одной двойной связью меньше. Величины адсорбционного сродства в этом случае зависят от того, находится в «-положении к альдегидной группе метильная группа или атом водорода. Наоборот, в случае слоев силикагеля, пропитанных парафиновым маслом, величины R/ X 100 каротиноидных альдегидов увеличиваются в соответствии с тем, что можно было ожидать исходя из теории:

Альдегид С40 С37 С35 С32 С30 С27 С25 С2о

Ориентировочное значение Я/Х100 28 34 38 47 49 63 69 85

Наличие р-апо-8'-каротиналя и р~апо-8'-каротиновой кислоты, являющихся красящими элементами яичного желтка, было доказано Томменом [561 также методом ХТС. Встречающийся у многих птиц в красных перьях кан- таксантин [63] также был отчетливо идентифицирован этими авторами [57] в органах семейства фламинговых. В этом случае оказалось, что кантаксан- тин находится прежде всего в печени и, в меньших количествах, в сердце и почках. Этим же методом Томену [58] удалось обнаружить и определить в соке и кожуре свежих апельсинов наряду с цитраурином Р-апо-10'-каро- тиналь, ^-апо-2'-каротиналь и прежде всего р-апо-8'-каротиналь.

Гудвин [17] использовал метод ХТС для исследования биогенеза каротиноидов в микроорганизмах и бактериях. Девис, Гудвин и Мерчер [8] смогли обнаружить этим методом ликоперсен в Rhodospirillum rubrum. Гроб и др. [21, 22] иАйхенбергер и Гроб [13] провели аналогичные исследования с растениями и грибами. Было изучено образование и превращение каротиноидов в листьях, цветах и плодах (ср. рис. 104) и доказано наличие природного лико- персена в Neurospora crassa.

Рис. 103. Хроматограмма ряда p-апокаротиналя (С25 — С40) на силикагеле Г, при использовании смеси петролейный эфир — бензол (40 -р 60) [29].

Метод ХТС пригоден также для определения г^нс-транс-изомерных соединений. На активных слоях силикагеля Г при разделении метанолом полностью транс-р-каротин, например, остается на точке старта, a 15,15'-z{uc-p- каротин перемещается (7?/ X 100 ^ 65). Образование полос определенно указывает на изомеризацию в процессе хроматографического разделения.

Рис. 104. Разделение экстракта из зеленых листьев клена ^Acer platanoid.es) на силикагеле Г со смесью петролейный эфир (т. кип. 50—70°) — бензол — этанол (100 + 20 4- 7) [21].

Вторичный фосфат магния в качестве сорбента (пластинки приготовлены по Шталю) и смесь петролейный эфир (т. кип. 30—45°) — эфир (95 + 5) в качестве растворителя пригодны для разделения полностью транс- и 15,15'- г{ис-р-апо-8'-каротиналей (С3о)(7?/ X 100^ 65 и 88). Продукты разложения, которые могут возникнуть во время пребывания вещества на сухом слое, адсорбируются сильнее. транс-Кантаксантин, 15,15'-г{ис-кантаксантин,

эхиненон и p-каротин можно разделить на силикагеле Г, используя смесь метиленхлорид — эфир (90 + 10)(/?/ X 100 56, 48, 80 и 90). Для каждой смеси изомеров следует подыскать подходящую систему для разделения, поскольку не существует общих правил выбора системы.

Обнаружение и возможность количественного определения

Даже небольшие количества пигментов можно обнаружить при дневном свете при наличии собственной интенсивной окраски ив УФ-свете при 254 .иц и 365 л<р в виде темных адсорбционных пятен (см. табл. 26). В случае веществ, окрашенных в желтый и оранжевый цвет, на хроматограмме можно обнаружить 0,1 рг, а в случае интенсивно окрашенных в красный цвет каротиноидов — до 0,01 рг. Путем опрыскивания смесью парафиновое масло — гептан можно сделать окраску более интенсивной и прочной [53]. Определенные продукты разложения при освещении кварцевой лампой флуоресцируют. Обычно применяемые для опрыскивания растворы, например хлорид сурьмы (III) (реактивы № 11, 12), хлорид сурьмы (V) (реактивы № 13; 20% в хлороформе) и концентрированная серная кислота дают небольшую чувствительность обнаружения. Они обладают, однако, тем преимуществом, что каротиноиды окрашиваются при этом по-разному.

Для идентифицирования каротиноидных альдегидов хроматограмму опрыскивают спиртовым раствором роданина (реактив № 130), а затем концентрированным водным раствором аммиака или едкого натра, после чего сушат. Благодаря характерной интенсивной окраске продуктов конденсации, можно, например, обнаружить ретинен в количествах 0,02—0,03 рг в виде красновато-оранжевых пятен. Так удалось доказать наличие р-апо-8'-каро- тиналя в слизистой оболочке кишок и ретинена в экстрактах глаза [69].

Для количественного определения можно проводить сравнение с хроматографическим анализом стандартной серии или же соскабливать сорбент сразу после разделения (иногда в атмосфере СО2 [53]), элюировать, центрифугировать и затем измерять на спектрофотометре.

3. ВИТАМИН А

Витамин А Витамин Aj

Витамин А встречается в организмах человека и животных преимущественно в виде свободного спирта или эфира жирной кислоты. В растительном мире он встречается в виде провитамина (каротиноиды) и витамина А, альдегида (ретинен). Последний был обнаружен В интерштейном и др. [67—69] методом ХТС и рассмотрен в разделе, посвященном каротиноидам. Под названием «витамин А» подразумевается полностью транс-форма или витамин А, представляющий собой также физиологически наиболее активное соединение группы витамина А. К настоящему времени многие из теоретически возможных цис-транс-изомеров витамина А4 найдены в природе или синтезированы в лаборатории. 13-г{ыс-витамин А был найден в качестве постоянного спутника витамина А1? например, в рыбьем жире, где его содержание может дойти до 35% от общего содержания витамина А. В этих маслах содержится также витамин А2, имеющий дополнительную двойную связь в замещенном кольце циклогексена. Для исследования методом ХТС эти соединения витамина А следует вначале выделить из природных и фармацев-

тических объектов или кормовых веществ и подвергнуть экстракты предварительной очистке.

Условия разделения и результаты

Витамин А (спирт, ацетат, пальмитат)- и другие производные можно быстро разделить, используя различные системы (см. табл. 28). Этисоеди-

Таблица 28

Ориентировочные значения R^ х 100 различных соединений витамина А

Стандартные условия (время опыта около 60 мин, длина пути 18 см')

Соединение витамина А

Окись алюминия

Силикагель Г

Силикагель г + втор-фосфат кальция 1 + 1

Силикагель Г, пропитанный парафиновым маслом

бензол

'циклогексан—этилацетат (90 + 10)

циклогексан—эфир (80+20)

циклогексан—эфир (85 + 15)

ацетон— вода (90 + 10)

полностью транс-Витамин А, спирт . . . .

полностью транс-Вита,-

16

11

10

10

97

мин А, ацетат . . . полностью транс-Вита-

72

46

45

45

79

мин А, пальмитат . .

84

69

72

66

10

Ангидровитамин А . . 13-^мс-Витамин А, аце-

—

73

75

75

—

тат

—

—

-А-

50

—

Ретровитамин А, ацетат 13-^мс-Витамин А, паль-

—

—

45

—

митат

—

—

—

64—66

—

нения чувствительны и малостабильны на сухих слоях. Наряду с ангидровитамином А быстро образуются многие продукты разложения, которые удерживаются на сорбенте сильнее. Поэтому важно, чтобы сразу же после нанесения раствора витамина А пластинки были помещены в разделительную камеру и хроматографированы. Рассматриваемый метод оказался весьма полезным для определения витаминов А в фармацевтических препаратах, кормовых веществах и продуктах питания.

Отличного разделения синтетически полученных изомеров витамина А достигли недавно Планта и др. [42]. На слои активированного силикагеля Г [51] наносили 0,4 рг вещества и в течение 60л<№ хроматографировали смесью петролейный эфир (т. кип. 30—45°) — метилгептенон (11 + 2) или (11 + 3) (см. также рис. 105—107). Этот метод должен быть в особенности пригоден для исследования природных концентратов витаминов А и А2 и родопсина различных живых организмов. Изомеры с заторможенной г{ыс-двойной связью (11-г{ые и 11,13-ды-г{ыс) перемещаются значительно быстрее, чем незаторможенные г{ис-формы (ср. рис. 105 и 106). Соединения витамина А2 движутся медленнее соответствующих изомеров витамина А (см. рис. 107). Неудовлет-

ворительно только отделение полностью транс- от 9-г{ис-соединений, а также АЛ-цис- от 13-г{ис-соединений.

Обнаружение и возможности количественного определения

При оценке хроматограмм их прежде всего рассматривают в УФ-свете. Многие соединения витамина А обнаруживают при 365 лщ желто-зеленую флуоресценцию (порог чувствительности 0,03 цг), исключая, однако, ангидровитамин А, витамин А альдегид и производные витамина А2, которые наблюдаются в виде коричневатых пятен. При 254 з<ц эти вещества можно обнаружить в количествах до 0,2 иг в виде пятен на слоях с флуоресцирующей добавкой. Витамин А под действием фосфорномолибденовой кислоты (реактив № 1206) окрашивается в серовато-синий цвет, под действием хлорида сурьмы (III) (8ЬС13-реактив по Карру — Прайсу, № 11, 12) — в голубой цвет и под действием концентрированной серной кислоты — вначале в темносиний цвет (минимально определяемое количество, 0,1—0,3 цг). Стабилен только комплекс с фосфорномолибденовой кислотой. Окрашенный в интенсивно желтый цвет витамин А альдегид (ретинен) на силикагеле Г при действии SbCl3 дает грязновато-коричневую окраску. Более специфичен реактив роданина (реактив № 130) [68, 69]. Полуколичественную оценку осуществляют, используя метод сравнения. Пока еще не достигнуто безупречное количественное определение вследствие исключительно легкого разложения соединений витамина А на активных сорбентах.

Методом ХТС с применением универсальных реактивов можно идентифицировать наряду с витамином А также й другие витамины и сопутствующие вещества (например, масла, антиокислители, синергисты и т. д.), что оказалось очень полезным при исследовании продуктов, содержащих витамин А.

Брюгеман, Краус иТьюз [5, 59] выдвинули предположение, что не хлорид сурьмы (III), а находящиеся .в нем следы хлорида сурьмы (V) вызывают при взаимодействии с витамином А голубую окраску. Мы проверили его в наших опытах следующим образом. На активированный силикагель Г наносили хлороформные растворы, содержавшие 20% чистого SbCl3 и 8ЬС15 и разделяли эфиром, после чего опрыскивали 0,5%-ным раствором витамина А пальмитата в хлороформе. Оба соединения сурьмы дали пятна голубого цвета. В случае SbCl3 получились равномерно окрашенные пятна (7?/ X 100^ 46), а в случае 8ЬС15 образовалась зона из трех пятен (7?/ X 100 ^ 0, 15, 31) (см. рис. 108). Таким образом было доказано, что как при действии SbCl3, так и при действии SbCl 5 витамин А окрашивается в голубой цвет. .

4. ВИТАМИНЫ D

Витамин D3 (Холикальциферол)Витамин D3 (Холикальциферол)

Витамин D3 (Холикальциферол)

Витамин D3 (Холикальциферол)

Витамин В2 (Кальциферол, эргокальциферол)

СН3

Н3С | Сн3\/\/\/

R = i|

1СН3

Рис. 105. Разделение 6 изомеров витамина А (спирта) на силикагеле Г смесью петролейный эфир (т. кип. 30—45°) — метилгептенон (11 + 2).

Рис. 106. Разделение 5 изомеров витамина А2 (спирта) на силикагеле Г смесью петролейный эфир (т. кип. 30—45°) — метилгептенон (11 + 3).

Рис. 107. Разделение заторможенных и транс-изомеров витаминов А и А2 (спиртов) на силикагеле Г смесью петролейный эфир (т. кип. 30— 45°) — метилгептенон (11-|-22).

Витамины D принадлежат к группе стеринов. В растительном и животном- мире они образуются при облучении в качестве промежуточных продуктов. Биологически наиболее активные витамины D2 и D3, мало отличаю

щиеся по химическому строению, в небольших количествах встречаются в организме человека и животных. В большом количестве витамин D3 содержится в жире печени и в жире потрохов различных рыб. Оба витамина представляют собой весьма чувствительные вещества. Трудность при определении их физикохимическими методами заключается прежде всего в наличии мешающих сопутствующих им веществ. Известно много методов определения обоих витаминов; описано^ также разделение этих витаминов на бумаге [23, 65]. В качестве недостатков всех до сих пор применявшихся методов можно отметить их трудоемкость, частично неполное разделение и нестабильность соединений на носителях. Методом ХТС можно оценить пригодность существующих в настоящее время аналитических методов и выяснить отношение витамина D к различным воздействиям.

Рис. 108. Хроматограмма 8ЬС13 и 8ЬС13 (см. текст).

— SbClg; 2 — SbCl5.

я) Условия разделения- и результаты

Янеке и Маас-Гебельсом [301 опубликовано полезное исследование витамина D методом ХТС. Они работали с силикагелем Г фирмы «Merck», используя в качестве растворителей гексан, гексан — этйлацетат (90 + 10) и хлороформ (см. табл. 29). В результате удалось достигнуть отличного отделения витаминов D2 и D3 от других стеринов, продуктов расщепления и каротиноидов. Последние перемещаются с фронтом растворителя. Исследование методом

Таблица 29

Ориентировочные величины R^ х 100 для витаминов D и некоторых стеринов в различных разделительных системах

Слои получены стандартным методом, длина пути 12—16 см

Соединение

Силикагель Г

Окись алюминия

Силикагель Г, пропитанный парафиновым маслом

гексан- этил- ацетат (90+10) [30]

хлороформ [30]

цикло- гексан- эфир (50+50)

циклогексан этилацетат

(90 + 10)

бензол

ацетон— вода (80+20)

Витамин D2

13

43

40

15

22

57

Витамин D3

13

43

40

15

22

54

Превитамин D2

21

53

50

23

30

54

Превитамин D3

Эргостерин(провита-

21

53

50

23

30

50

мин D2) .' .

7-Дегидрохолестерин (про-

9

33

30

—

—

60

витамин D3)

—

33

—

—

—

—

Холестерин

9

35

30

—

—

45

15 Заказ № 734

Рис. 109. Хроматограмма чистого витамина D2 до и после нагревания в хлороформном растворе. Снята в УФ-свете (254 жр).1 — 400 цг витамина D2 (кристаллического необработанного);2 — 400 цг витамина D2 (кристаллического, после 5-часового нагревания при 60° в хлороформном растворе в отсутствие света и воздуха).Рис. 109. Хроматограмма чистого витамина D2 до и после нагревания в хлороформном растворе. Снята в УФ-свете (254 жр).1 — 400 цг витамина D2 (кристаллического необработанного);2 — 400 цг витамина D2 (кристаллического, после 5-часового нагревания при 60° в хлороформном растворе в отсутствие света и воздуха).<5%60° ^85%”<5%60° ^85%”RR

Рис. 109. Хроматограмма чистого витамина D2 до и после нагревания в хлороформном растворе. Снята в УФ-свете (254 жр).

1 — 400 цг витамина D2 (кристаллического необработанного);

2 — 400 цг витамина D2 (кристаллического, после 5-часового нагревания при 60° в хлороформном растворе в отсутствие света и воздуха).

Рис. 109. Хроматограмма чистого витамина D2 до и после нагревания в хлороформном растворе. Снята в УФ-свете (254 жр).

1 — 400 цг витамина D2 (кристаллического необработанного);

2 — 400 цг витамина D2 (кристаллического, после 5-часового нагревания при 60° в хлороформном растворе в отсутствие света и воздуха).

<5%

60° ^85%”

<5%

60° ^85%”

R

R

ХТС процессов, самопроизвольно протекающих при химическом определении витамина D, привело к интересным результатам. При щелочном омылении и хроматографическом разделении на активных адсорбентах, например на флоридиновой земле, суперфильтроле и окиси алюминия (щелочной), образуются многочисленные продукты превращения, которые, однако, не удается однозначно идентифицировать. Выбор используемого для очистки адсорбента имеет исключительное значение; не рекомендуется энергичной омыление [601.

На пропитанном силикагеле Г (слой погружается в раствор 5% парафинового масла в петролейном эфире и затем сушится) с применением смеси ацетон — вода (80 + 20) разделяют витамины D2 и D3 (см. табл. 29). При решении многих задач оказалось целесообразным использовать, более толстые слои силикагеля (толщиной 0,4—3,0 мм, получены стандартным методом с применением прибора, позволяющего регулировать толщину) и растворитель циклогексан— эфир (50 + 50). Так можно отделить сопутствующие вещества, продукты расщепления, а также другие витамины; причем дополнительное преимущество заключается в том, что в этом случае можно наносить большие количества экстракта (0,1—1 мл). Все встречающиеся на практике смеси витамина D с витамином А эфиром при этом разделяются. При нанесении пробы в виде полосы можно, например, идентифицировать и определить менее 400 ИЕ * витамина D в 100 000 ИЕ и более витамина А. Эта система пригодна как для проверки на чистоту, так и для открытия и определения витаминов D.

Методом ХТС можно легко проследить термическую изомеризацию, открытую Фелюцом идр. [61]. Если, например, проводить умеренный нагрев в темноте в атмосфере азота в бензольном или хлороформном растворе, витамины D при 60° переходят примерно на 15% в превитамины D, а остаток остается неизменным (см. рис. 109). Превитамин D при этих условиях в свою очередь переходит в витамин D. Отношение витамин D : превитамин D при равновесии и скорость установления этого равновесия зависят от температуры. Так, например, превращение витамина D3 в превитамин D3 протекает в этаноле при 20° значительно медленнее, и равновесная смесь содержит только 7 % пре- витамина D3 [24]. Витамины D2 и D3 ведут себя при этом одинаково. В кристалле содержится продолговатая молекула формы I (стр. 223) [6]. Для объяснения термической изомеризации в растворе следует принять существование равновесия формы I с цис-формой (II) [26].

■ Изомеризацию витаминов D2 и D3 в провитамины D2 и D3 можно наблюдать также при щелочном омылении (при этом в очень небольшой степени происходит разложение) и при хранении препаратов витамина D.

Витамины D и превитамины D на сухих слоях силикагеля нестабильны. При выдерживании нанесенного на активный слой соединения перед хроматографированием в течение одной минуты на пластинке уже можно определить небольшие количества сильнее адсорбирующихся продуктов разложения. При разделении никаких изменений не происходит. Поэтому для надежности идентификации и определения важно, чтобы сразу же после нанесения пробы витамина пластинка была помещена в разделительную камеру и хроматографирована, а зоны витамина D или превитамина D непосредственно после локализации соскоблены с пластинки и элюированы хлороформом. Таким образом были количественно проанализированы 24 пробы витаминов (колориметрическое или спектрофотометрическое определение).

Биологическая активность превитаминов D значительно ниже биологической активности соответствующих витаминов D (около 40%) [50]; правда, вследствие взаимного превращения абсолютная активность может быть определена только приблизительно. Согласно Ханевальду и др. [24], активность чистого превитамина D3 составляет 35% антирахитной активности чистого витамина D3. Этот результат объясняется кинетическим превращением пре^ витамин D3 витамин D3; наблюдавшаяся активность объясняется образовавшимся в испытуемом животном витамином D3. В наших собственных опытах найдено, что активность превитамина D2 после очистки методом ХТС равна 56% активности чистого витамина ,D2.

При экстракции витаминов D следует избегать омыления, и нагревание раствора в процессе анализа должно быть по возможности непродолжительным и умеренным. Из смесей биологически активное вещество лучше всего извлекать хлороформом или, после мягкой обработки (вода — аммиак), петролейным эфиром (т. кип. 30—45°). Затем этот экстракт можно сконцентрировать в вакуумном вращающемся испарителе при 40—50°, причем изомеризуется лишь 1—2% имеющегося витамина.

Если подвергнуть растворы витамина D действию света и воздуха, то наряду с упоминавшимися продуктами изомеризации образуются и другие соединения. Кристаллический витамин D в листом состоянии более стабилен. Даже после 24-часового действия света и воздуха при 45° методом ХТС нельзя обнаружить никаких химических изменений. В холодном темном месте в атмосфере инертного газа чистый витамин D сохраняется в течение нескольких лет.

Обнаружение и возможности определения

Янеке и Маас-Гебельс [30] получают видимые пятна витамина D путем опрыскивания раствором фосфорномолибденовой кислоты (реактив № 121) с последующим нагреванием (20 мин^ при 70° (витамины D2 и D3 образуют желто-коричневые пятна, предел чувствительности 1,0—0,2 цг), причем другие стерины окрашиваются по-разному. Для обнаружения рекомендуют также SbCl3 (реактив № И). Полуколичественное определение небольших количеств витамина D путем визуального сравнения еще заметных пятен (0,1—0,2 цг) со стандартной серией, согласно нашим опытам, затруднительно. Жирная часть и продукты разложения витамина А перемещаются с такой же скоростью, реагируют с теми же реактивами для опрыскивания и поэтому мешают определению.

Для идентификации витаминов D можно рассматривать флуоресцирующий слой в коротковолновом УФ-свете (в виде темного пятна обнаруживается 0,5 цг) и проводить опрыскивание различными цветными реактивами

15*

(см. табл. 30). Витамины D2 и D3 можно отличить (если они присутствуют в количествах не менее 30 цг), применяя концентрированную серную кислоту,

• I -•

8 ;'* .;'"27

Количество витамина Т)г,ИЕ(1ИЕ=0025рг)

Рис. 110. Предел обнаружения витамина D на пластинке после опрыскивания SbCl3 и нагревания (определено в длинноволновом УФ-свете).

.поскольку при этом возникают соответственно коричневые и зеленоватыепятна. Наиболее чувствительно обнаружение с применением SbCl3 при

Таблица 30

Обнаружение витамина D реактивами для опрыскивания иа слоях силикагеля Г

Перевод в видимое состояние

Окраска пятен витаминов Dg И Dg

Примерное минимально обнаруживаемое количество

реактив

степень опрыскивания

обработка или промер через

в длинноволновом УФ-свете (флуоресценция)

при дневном свете

цг

ИЕ

SbCl3 (№ 11)

Сильно

5 мин, 120°

Оранжевая

Серо-синяя

0,025

1

SbCl5 (№ 13,

Слабо

1 мин

—

Оранжево-

0,3

12

в хлороформе)

красная

5 мин, 120°

Оранжевая

—

0,3

12

H2SO4 конц.

»

3 мин

—

В2 коричне-

вая

|30

1200

D3 зеленая

Умеренно

5 мин, 120°

Оранжевая

Серо-сияяя

0,3

12

Фосфорно-

»

20 мин, 70°

—

Серо-корич-

0,2

8

вольфрамовая

невая

кислота

(№ 121)

Фосфорномо- либденовая

»

1 мин

—

Серо-синяя

0,3

12

кислота

(№ 1206)

Трихлор-

»

5 мин, 120°

Синеватая

—

0,1—0,2

4—8

уксусная кислота (№ 143, 1%)

Трифтор-

»

5 мин, 120°

—

0,1—0,2

4—8

уксусная кислота (№ 144)

нагревании до 120° (0,025 цг; см. табл. 30 и рис. 110). Превитамины D ведут себя точно так же, как соответствующие изомеры витамина D, но другие стерины различными реактивами окрашиваются по-разному.

Таким способом можно идентифицировать витамин D во многих препаратах и после элюирования определить колориметрически или спектрофото- . метрически [31].

Определение витамина D в различных препаратах

После многочисленных опытов нам удалось разработать относительно простой метод определения витамина D в концентратах масла и применяемых препаратах, который описан здесь лишь кратко . Методика специфична, чувствительна и хорошо воспроизводится. Витамин D при этом почти не изменяется, и двукратный анализ можно осуществить за 3—6 час (в зависимости от способа получения экстракта).

SbGls+Maa)?®SbGls+Maa)?®Рис. 111. Хроматограмма поливитаминного драже.Пробы по 0,5 мл экстракта (около 800 ИЕ витамина D2); снято после соскабливания полосы витамина D (слева). Чистый витамин Dg хроматографирован на направляющей хроматограмме (справа) один и с экстрактом. 1 — экстракт; 2 — витамин Ог-стандарт (50—100 цг).Рис. 111. Хроматограмма поливитаминного драже.Пробы по 0,5 мл экстракта (около 800 ИЕ витамина D2); снято после соскабливания полосы витамина D (слева). Чистый витамин Dg хроматографирован на направляющей хроматограмме (справа) один и с экстрактом. 1 — экстракт; 2 — витамин Ог-стандарт (50—100 цг).

SbGls+Maa)?®

SbGls+Maa)?®

Рис. 111. Хроматограмма поливитаминного драже.

Пробы по 0,5 мл экстракта (около 800 ИЕ витамина D2); снято после соскабливания полосы витамина D (слева). Чистый витамин Dg хроматографирован на направляющей хроматограмме (справа) один и с экстрактом. 1 — экстракт; 2 — витамин Ог-стандарт (50—100 цг).

Рис. 111. Хроматограмма поливитаминного драже.

Пробы по 0,5 мл экстракта (около 800 ИЕ витамина D2); снято после соскабливания полосы витамина D (слева). Чистый витамин Dg хроматографирован на направляющей хроматограмме (справа) один и с экстрактом. 1 — экстракт; 2 — витамин Ог-стандарт (50—100 цг).

В зависимости от состава пробы витамин D экстрагируют и концентрируют сразу же или после мягкой обработки водой и аммиаком и (или) вымораживания жиров. Количества 0,1 —1,0 мл экстракта, после нанесения в виде полос на слои силикагеля Г толщиной 0,4—3,0 мм хроматографируют смесью циклогексан — эфир (50 + 50). После локализации полосы витамина D соскабливают шпателем непосредственно в хроматографическую колонку, элюируют хлороформом и отгоняют при 40° в вакуумном вращающемся испарителе. Остаток,, содержащий витамин D, растворяют в соответствующем количестве хлороформа, обрабатывают по известной методике [60] реактивом SbCl3 в ацетилхлориде и проводят колориметрическое измерение. Можно также осуществить спектрофлуорометрическое определение [31].

В каждом отдельном случае следует специально проверить метод обработки пробы для выделения экстракта, подвергаемого хроматографическому разделению. Для двукратного определения окраски в оптимсльной области измерения колориметра достаточно количество экстракта, содержащее не менее 800 ИЕ (= 20 цг) витамина D. В качестве растворителя для цветной

реакции служит хлороформ. Реактив SbCl3 в ацетилхлориде (3 лм) следует добавить к раствору, содержащему витамин D (2 мл, содержащие 200—400 ИЕ) в специально подобранной кювете размером 2 см, перемешать и полученный окрашенный комплекс промерить через 15—45 сек после добавления (максимум интенсивности) на спектрофотометре «Спектроник 20» при 500.иц одновременно с холостой пробой. Расчет проводят, используя свежеприготовленный и непосредственно определяемый стандартный раствор витамина П2 или D3.

Ошибки, возникающие из-за неотделенных продуктов разложения витамина А, мешающих цветной реакции, исключают, добавляя вещество, стабилизующее окраску. Содержащиеся следы жира реагируют лишь через минуту и при нашем методе работы не измеряются.

Этим методом анализировались масло- и порошкообразные концентраты, содержащие только витамин D или наряду с ним витамин А, поливитаминное драже, шоколад, атакже диэтические средства для похудания (100 ИЕ D2/25a). Результаты хорошо совпадают со сравнительными биологическими измерениями. При анализе раствора экстракта, содержащего около 800 ИЕ витамина D, можно рассчитывать на стандартное отклонение, равное примерно 2,8% (ср. пример и рис. 111).

Пример анализах

Поливитаминное драже150 ИЕ D2

Биологически найдено:152 ИЕ D2

После экстракции, анализа методом ХТС и колориметрического изме

рения найдено:

166/164/164/156/ А

161/170/166/168/ । ИЕ D

155/164/166/168/ (

160)

5. ТОКОФЕРОЛЫ (ВИТАМИН Е)

Строение известных в настоящее время встречающихся в природе токоферолов [1]:

СН3

ТокоферолаТокоферолаYб ЛеYб ЛеR=—(СНг—СН2— СН2—СН)3—СН3 Токол

Токоферол

а

Токоферол

а

Y

б Л

е

Y

б Л

е

сн3

R = —(СН2—СН2—СН=С)3-СН3Токотриен ол

Химическое название

5,7,8-триметилтокол

5,8-диметилтокол

7,8-диметилтокол

5,7-диметилтокол8-метилтокол7-метилтокол

5,7,8-триметилтокотриено л

5,8-диметилтокотриенол (5-метилтокол, синтезирован)

Токоферолы широко распространены в природе. Они являются оптически активными производными 6-хроманола, которые отличаются числом

и положением метильных заместителей, а также, как недавно обнаружено [19, 20, 37], терпеновой боковой цепью. В то время как встречающиеся в природе токоферолы являются стерически однородными, синтетические препараты в зависимости от метода приготовления состоят из более или менее сложных смесей диа-стереоизомеров.

Биологические функции токоферолов весьма разнообразны. Наиболее активным является а-токоферол, встречающийся в природе наиболее часто.

Стабильность токоферолов можно повысить этерификацией фенольных гидроксильных групп. Поэтому для многих целей часто используют эфиры (уксусной, янтарной кислоты и т. д.).

Определение токоферолов является сложным, поскольку нужно экстрагировать без потерь материал, чувствительный к окислению, а также ввиду того что сопутствующие вещества мешают колориметрическому определению [12]. Для устранения сопутствующих веществ и артефактов [4] можно использовать как хроматографию на бумаге, так и метод ХТС.

Условия разделения и результаты

Рис. 112. Разделение токоферолов и родственных соединений (по 50 ре) на силикагеле Г смесью бензол — метанол (98 + 2).Высота подъема 18 см; время анализа 50 мин (ср. табл. 31).Рис. 112. Разделение токоферолов и родственных соединений (по 50 ре) на силикагеле Г смесью бензол — метанол (98 + 2).Высота подъема 18 см; время анализа 50 мин (ср. табл. 31).При определении антиокислителей на слоях силикагеля Г с толуолом, бензолом и хлороформом в качестве растворителей Зеэр [47] отделил а-токо- ферол методом одно- и двумерной хроматографии. Этот же автор [48, 49] смог определить различные токоферолы на силикагеле Г фирмы «Merck», используя хлороформ, и на окиси алюминия фирмы «Fluka», используя бензол (см. табл. 31). Применение этой методики в случае природных концентратов витамина Е дало возможность не только хорошо разделить а-, р- +у-,6-токоферолы, но и одновременно отделить сопутствующие вещества, содержащиеся в неомыляемых масел и жиров или в молекулярных дистиллятах. Содержание а-токофе- рола определяли после опрыскивания методом планиметрирования, пятен.

Рис. 112. Разделение токоферолов и родственных соединений (по 50 ре) на силикагеле Г смесью бензол — метанол (98 + 2).

Высота подъема 18 см; время анализа 50 мин (ср. табл. 31).

Рис. 112. Разделение токоферолов и родственных соединений (по 50 ре) на силикагеле Г смесью бензол — метанол (98 + 2).

Высота подъема 18 см; время анализа 50 мин (ср. табл. 31).

Токоферолы перемещаются по-разному на силикагеле Г при использовании смеси бензол — метанол (98 + 2) и на вторичном фосфате магния при использовании смеси петролейный эфир (т. кип. 30—45°) — эфир (85 + 15) (см. табл. 31 и рис. 112). Эти системы оказались пригодными для анализа

природных концентратов и экстрактов, а также для исследования продуктов окисления и разложения. Оптимальное разделение критических партнеров, например |3- и у-токоферолов, было достигнуто с использованием метода клиновидных полос. а-Токоферол и его эфиры можно успешно анализировать на силикагелевых пластинках с использованием смеси циклогексан — эфир (80 + 20); согласно Вальди [66], пригодна также смесь циклогексан — хлороформ — ледяная уксусная кислота (60 + 30 + 10). На более толстые слои (0,4—3,0 мм) можно наносить 10—20 цг, и при этом образуются компактные пятна.

По-видимому, различные токоферолы можно также выделить методом распределительной хроматографии на пропитанных слоях или провести одно- или двумерное разделение их нитрозопроизводных, как это делают в случае хроматографии на бумаге [36].

Таблица 31

Ориентировочные величины Rf X 100 различных токоферолов

Время опыта 45 тин; путь, пройденный фронтом, 12—18 ст

Слой (стандартный метод)

Силикагель Г

Окись алюминия

Силикагель Г

втпор-Фосфат магния

Силикагель Г

Растворитель

хлороформ

бензол •

бензол—

петролейный эфир (т. кип.

циклогек-

[48, 49]

[48, 49]

метанол (98+2)

30—45°)—

Эфир (85 + 15)

сан—эфир (80+20)

Токол

19

—

28

—

а-Токоферол

58

56

65

86

32

Р-Токоферол

35

34

51

76

30

у-Токоферол

37

31

48

71

26

^-Токоферол

49

48

59

82

29

д-Токоферол

23

21

32

61

21

ц-Токоферол

32

28

41

—

23

е-Токоферол

32

30

46

—

26

5-Метилтокол

27

24

40

—

26

а-Токоферол, ацетат

—

71

—

—

40

а-Токоферол, сукцинат

—

—

—

—

30—40 (хвост)

а-Токоферол, фосфат

—

—•

—

—

0

Обнаружение и возможности количественного определения

Зеэр [47—49] использовал для окрашивания а-токоферола и ацетата а-токоферола 1%-ный раствор 2,6-дихлорхинонхлоримида в этаноле (соответственно желтовато-коричневая и розовая окраска). С сульфатом церия(1У) (реактив № 25) ^-токоферол дает коричневые, а у-токоферол — голубые пятна. Ацетат а-токоферола окрашивается этим реактивом после 10-минутного нагревания при 120° в розовый цвет и в УФ-свете дает яркую светлую флуоресценцию. Свободные токоферолы дают с фосфорномолибденовой кислотой (реактив № 1206) уже на холоду серовато-голубые пятна, причем вначале появляется a-соединение. Эфиры реагируют лишь после более продолжительного нагревания при 110° и слабее. После обработки пластинок (спустя 2—3 мин после опрыскивания) парами аммиака фон светлеет и все соединения принимают равномерную серовато-голубую окраску (минимально определяемое количество 1 цг, (а при нагревании — 0,5 цг). Для грубого количественного определения Зеэр [48, 49] одновременно хроматографировал растворы чистого а-токоферола различной концентрации (10, 20, 40 и 60 цг) и после перевода в видимое состояние проводил сравнение площадей пятен, определяемых планиметрически.

Красный комплекс, получающийся при действии реактива дипиридила железа (обнаруживается 0,5 цг а-токоферола; другие токоферолы реагируют с различной скоростью и интенсивностью), может быть использован для количественного определения, для чего его экстрагируют водой и фото- метрируют. Токоферолы различают с помощью реактива хлорида сурьмы (V) (№ 13, в хлороформе), поскольку окраска зависит от положения и числа

метильных групп в хромановом ядре и от природы боковых цепей (см. табл. 32). Цветные комплексы SbCl5 нестабильны.

Таблица 32

Окраска токоферолов при умеренном опрыскивании сухих слоев раствором хлоридасурьмы (V)

Промер примерно через 3 мин; минимально определяемое количество около 2 рг,оптимальный интервал 20—50 рг

Токоферол (d- или dl- форма)

Цветная реакция с SbClg на

силикагеле

окиси алюминия

emop-фосфате магния

а

Оранжево-красный

Оранжево-розовый

Оранжево-розовый

р

Светло-коричневый

Коричневый

Желто-коричневый

Y

Зеленый

Зеленый

Лиловый

Оранжево-желтый

Бежевый

Оранжевый

6

Красновато-коричневый

Фиолетовый

Фиолетовый

Л

Ржаво-коричневый

Лиловый

»

В

Коричневый

Оливково-коричневый

Коричневый•

5-Метилтокаль

Лиловато-серый

Лиловато-серый

—

Токол

»

—

—

На слоях силикагеля с добавкой флуоресцирующего вещества «ZS-супер» в коротковолновом УФ-свете еще можно обнаружить в виде темных пятен 10 цг токоферола. Так же как в случае хроматографии на бумаге [62], к силикагелю можно добавить флуоресцеин (0,02%), что позволяет обнаружить токоферол в виде фиолетовых пятен на флуоресцирующем фоне в УФ-свете (предел определения около 0,2 рг) и в виде красноватых пятен при дневном свете (предел определения 2 рг).

6. ВИТАМИНЫ К И УБИХИНОНЫ6. ВИТАМИНЫ К И УБИХИНОНЫR= — СН2 — СП = С—(СН2— СН2—СН= С)6 — сн3R= — НR= — СН2 — СП = С—(СН2— СН2—СН= С)6 — сн3R= — НДля количественного определения лучше всего локализовать пятна в УФ-свете, элюировать и измерить колориметрически цветной комплекс с дипиридилом железа, как в соответствующем хроматографическом методе на бумаге [62]. Таким образом, было определено содержание а-токоферола в различных применяемых препаратах и природных концентратах. Для определения меньших количеств витамина (минимально 0,01 рг/лм) можно, использовать также спектрофлуорометрические методы [11].

6. ВИТАМИНЫ К И УБИХИНОНЫ

6. ВИТАМИНЫ К И УБИХИНОНЫ

R= — СН2 — СП = С—(СН2— СН2—СН= С)6 — сн3

R= — Н

R= — СН2 — СП = С—(СН2— СН2—СН= С)6 — сн3

R= — Н

Витамин Ki

Витамин Kaas)

Витамин К3 (менадион)

* В скобках указано число атомов углерода в боковой цепи.

Витамины Kt и К2 широко распространены в природе. Известны различные витамины К2, отличающиеся числом изопреновых звеньев в боковой цепи. Синтетически полученный витамин К3 в кишечнике человека и животного претерпевает превращения, приобретает полиизопреноидную боковую цепь и обнаруживает при этом полную биологическую активность витамина К. Для определения необходимо осторожно обработать и выделить чувствительные витамины К. Для разделения используют колоночную хроматографию и хроматографию на бумаге [23, 65]. В последнее время используют также метод ХТС, требующий меньшей затраты времени.

Условия разделения и результаты

Витамины К можно хроматографировать в различных системах (ср. табл. 26 и рис. 102). На силикагеле Г со смесью циклогексан — эфир (80 + 20) витамин К3 (Ду X 100 ~ 38) отделяется от витамина Kt и К2(35) (7?/ X 100 ~ 61). Эту систему можно использовать для идентификации витаминов К в применяемых препаратах. Как и другие витамины, растворимые в жирах, эти соединения малостабильны на активном слое и требуют соответствующего обращения.

Глур [16] хроматографировал витамины Kt и К2 с боковыми цепями различной длины и родственные бензохиноны на пропитанном силикагеле Г (пластинки погружали в раствор 5% парафинового масла в петролейном эфире и затем высушивали), используя смесь ацетон — вода (95 + 5)

Таблица 33

Ориентировочные величины Ry, х 100 убихинонов в различных разделительных системах

Длина пути 10—16 см

Силикагель Г, пропитанный ' парафиновым маслом

Силикагель Г — кизельгур Г (1 + 1), пропитанные парафиновым маслом

Убихиноны

ацетон — вода (95 + 5) [16]

ацетон — вода, насыщенная парафиновым маслом (90 + 10) [64]

смесь метанол — изопропанол (90 + + 10), насыщенная парафиновым маслом [53]

(5)

—

—

90

(Ю)

—

—

85

(15)

—

—

78

(20)

—

—

68

(25)

—

—

60

(30)

74

71

44

(35)

69

63

35

(40)

63

55

25

(45).

52

42

14

(50)

43

31

8

(см. рис. 113 и табл. 33). Гомологические ряды при этом закономерно разделяются, в то время как витамины К1т К2(3о) и убихинон (45) располагаются на одинаковой высоте. Этим методом удалось обнаружить в бациллах туберкулеза витамин К2 (45) и в гомогенате печени крыс 90% убихинона (45) наряду с убихиноном (50) и (40). Биллетер и др. [2] использовали метод

ХТС также при изучении превращения витаминов}К2(3о) и К2(10) в витамин К2(2о) в организмах птиц и млекопитающих.

О

II

Н3СО -||ZX||- СН3 сн3сн3

Н3СО Jj4J-CH2-CH = C-(CH2-CH2-CH = C)x-CH3 убихиноны: х=0-9

ОН3с х/ОН3с х/сн3сн3СНзСНзСН2 - СН= С - (СН2 - СН2 - СН= С)8 - сн3СН2 - СН= С - (СН2 - СН2 - СН= С)8 - сн3пластохинон (45)пластохинон (45)

О

Н3с х/

О

Н3с х/

сн3

сн3

СНз

СНз

СН2 - СН= С - (СН2 - СН2 - СН= С)8 - сн3

СН2 - СН= С - (СН2 - СН2 - СН= С)8 - сн3

пластохинон (45)

пластохинон (45)

На смешанных слоях удается разделение убихинонов (5) — (50) (рис. 114). Вагнер и др. [64] также сообщили о разделении различных убихинонов (см. табл. 33).

Рис. 114. Разделение убихинонов (5) — (50) на смешанных слоях, пропитанных парафиновым маслом (ср. табл. 33) [53]. Т — эталонная смесь фирмы «Desaga»; G — смесь убихинонов. Пробы по 2 цг каждого вещества; обнаружение фосфорномолибденовой кислотой (реактив М 120 б).Рис. 114. Разделение убихинонов (5) — (50) на смешанных слоях, пропитанных парафиновым маслом (ср. табл. 33) [53]. Т — эталонная смесь фирмы «Desaga»; G — смесь убихинонов. Пробы по 2 цг каждого вещества; обнаружение фосфорномолибденовой кислотой (реактив М 120 б).Для обнаружения убихинонов в биологических объектах (например, убихинона (50) в сердечных мышцах крупного рогатого скота) Вагнер и др. [64]

Рис. 114. Разделение убихинонов (5) — (50) на смешанных слоях, пропитанных парафиновым маслом (ср. табл. 33) [53]. Т — эталонная смесь фирмы «Desaga»; G — смесь убихинонов. Пробы по 2 цг каждого вещества; обнаружение фосфорномолибденовой кислотой (реактив М 120 б).

Рис. 114. Разделение убихинонов (5) — (50) на смешанных слоях, пропитанных парафиновым маслом (ср. табл. 33) [53]. Т — эталонная смесь фирмы «Desaga»; G — смесь убихинонов. Пробы по 2 цг каждого вещества; обнаружение фосфорномолибденовой кислотой (реактив М 120 б).

Рис. 113. Разделение витаминов К, и К2, а также родственных бензохинонов (см. текст) [44].

Время анализа 1 час; пластинки после нагревания при 130° опрыскивали серной кислотой; пробы по 20 цг. 1 — убихинон (30) х = 5;

2 — убихинон (35) х = 6; 3 — убихинон (40) х = 7; 4 — убихинон (45) х = 8; 5 — убихинон (50)х=9; б—пластохинон (45); 7— витамин Кг (30)1 8 —витамин К2(35>; 9 — витамин К2(45);

10 — витамин Ki.

применили комбинированную методику, по которой вначале отделяют липоиды от убихинонов (7?/ X 100 ^ 86) на силикагеле Г, используя смесь бензол — хлороформ (50 + 50) и затем убихиноны подвергают специальному анализу.

Обнаружение и возможности определения

Витамины К можно обнаружить в коротковолновом УФ-свете на слоях, пропитанных флуоресцирующим индикатором, в виде темных абсорбцион-

ных пятен (минимально определяемое количество 0,5 рг). После 10-минутного облучения на небольшом расстоянии кварцевой лампой пятна обнаруживают желтую флуоресценцию (минимально определяемое количество 0,3 цг витамина KJ. При опрыскивании горячих пластинок концентрированной серной кислотой витамины К и убихиноны окрашиваются в фиолетовый цвет (около 3 цг) [16]. Также неспецифичным, однако более чувствительным реактивом является фосфорномолибденовая кислота (реактив №1206). Витамины К могут быть также идентифицированы с помощью диэтилдитиокарбамата натрия [27], ксантанового водорода [46] и 2,4-динит- рофенилгидразина. Убихиноны обнаруживаются на пропитанных слоях в УФ-свете в виде коричневых фулоресцирующих пятен. Их можно также обнаружить SbCl3 (реактив №11, в хлороформе) с последующей сушкой в течение 10 мин при 110° в виде серо-фиолетовых пятен или родамином (реактив № 129) в УФ-свете в виде фиолетовых флуоресцирующих пятен [64]. Для количественного определения витаминов К и убихинонов можно использовать сравнительный метод.

IV. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ

Здесь также применяют ХТС в качестве аналитического метода, который отличается простотой осуществления и экономией времени. Метод используют во многих лабораториях, хотя по этому поводу опубликовано мало работ [15, 39, 40]. Витамины, растворимые в воде, можно разделить с помощью предложенных систем, правда, как указывалось выше, величины Rf могут несколько колебаться.

Растворимость биологически активных веществ весьма различна. Знание этой величины играет большую роль как при экстракции, так и при нанесении и разделении. Водорастворимые витамины на высушенном слое силикагеля значительно стабильнее жирорастворимых витаминов, что облегчает нанесение и количественное определение.

СМЕСИ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ

Различные витамины группы В и витамин С были разделены Генсхиртом и Мальзахером [15] методом одномерной хроматографии на слое силикагеля Г с 2% флуоресцирующего индикатора «ZS-супер», приготовленном по методу Шталя. Наилучшиб результаты получены со смесью растворителей ледяная уксусная кислота — ацетон — метанол — бензол (5 + 5 + 20 + 70) (см. табл. 34). Метод был разработан для комбинаций витаминов (группа В 1—10 цг и витамин С 5—30 цг), имеющихся в фармацевтике. Этот метод обычно применим для наносимого количества смеси 50—100 цг. Для точного определения всех компонентов необходимо из каждой пробы нанести на пластинку по два пятна. Высушенные хроматограммы (длина пути 19 см) рассматривают в длинноволновом УФ-свете, где рибофлавин можно определить по желтой флуоресценции на темном фоне. В коротковолновом УФ-свете можно обнаружить витамин В^ витамин С и амид никотиновой кислоты в виде темных пятен, витамин В2 — в виде желтоватого, а витамин В6 — в виде темно-синего пятна на светлом флуоресцирующем слое. Для идентификации биотина одну хроматограмму закрывают, а другую обрабатывают иодоплатинатом (реактив № 76), причем биотин обнаруживается в виде белого пятна на розовом фоне. При этом витамин Bt окрашивается в серый цвет, амид никотиновой кислоты — в светло-желтый и витамин С — в желтый.

Таблица 34

Ориентировочные величины Rf х 100 и непосредственное обнаружение водорастворимых витаминов с использованием различных источников освещения на слоях силикагеля с флуоресцирующей добавкой

Витамин

Я^хЮО

Окраска

Приблизительные границы определения, Ц5

ледяная уксусная кислота — ацетон — метанол —

бензол (5 + 5+

+20+70) [15]

вода

в УФ-свете (254 л4ц)

в УФ-свете (365 мр>

при дневном свете

Bj (Тиамин-HCl и

HNO3)

0

5

Фиолетовая

—

—

2

В2 (Рибофлавин)

Bg (Пиродоксоль-

35

38—45

Желтая

Желтая

Желтая

0,1/0,01/ 0,3

НС1)

Никотиновая

15

52

Темносиняя

Темносиняя

—

3/10

кислота

Амид никотиновой

75

78

Темная

—

3

кислоты

Пантотеновая кис-

65

49

»

—

3

лота (Na- и Са-соль)

В12 (Цианокобал-

57

89

—

—

—

амин)

0

22

Темная

Фиолетовая

Красная

1/0,5 /0,3

Фолиевая кислота

0

0

»

Темносиняя

Желтая

2/2/2

Биотин

С (1-Аскорбиповая

80

70

—

—

—

—

кислота)

30

96

Темносиняя

—

—

3

Для обнаружения витамина В6 и пантотеновой кислоты нижнюю часть второй, до этого времени защищенной хроматограммы опрыскивают дихлор- хинонхлоримидом (реактив № 41 0,1%) и обрабатывают парами аммиака, в результате витамин В6 окрашивается в голубой цвет. Затем 0,5 час нагревают при 160°, опрыскивают верхнюю часть полосы нингидрином (реактив № 108; 0,5% в этаноле). После повторного кратковременного нагревания до 160° появляется пантотеновая кислота в виде фиолетового пятна.

На таком же слое силикагеля возможно частичное разделение этих биологически активных веществ при разделении водой (ср. рис. 115). Этот растворитель передвигается примерно с такой же скоростью, что и упомянутые выше (см. рис. 116), и к тому же позволяет осуществить хроматографический анализ сразу после нанесения водного экстракта. В табл. 34 представлены сравнительные результаты прямой идентификации водорастворимых витаминов с помощью света различных длин волн и приблизительные пределы обнаружения их на необработанной реактивом хроматограмме. Эти соединения можно обнаружить так же, как упомянуто выше, реактивами для опрыскивания, в частности после обработки хлором, раствором о-толидин — иодид

Время, минВремя, минРис. 116. Скорости перемещения различных растворителей на слое силикагеля (толщина —0,25 мм) при 20—23° [39].1 — вода- 2 — Циклогексан — эфир (80 + 20); 3 — ледяная уксусная кислота — ацетон — метанол — бензол (5 + 5 Н- 20 + 70)[15]; 4 — пиридин — ледяная уксусная кислота —вода (10 + 1 + 40); 5 — м-пропанол — 10%-ный аммиак (95 + 5).Рис. 116. Скорости перемещения различных растворителей на слое силикагеля (толщина —0,25 мм) при 20—23° [39].1 — вода- 2 — Циклогексан — эфир (80 + 20); 3 — ледяная уксусная кислота — ацетон — метанол — бензол (5 + 5 Н- 20 + 70)[15]; 4 — пиридин — ледяная уксусная кислота —вода (10 + 1 + 40); 5 — м-пропанол — 10%-ный аммиак (95 + 5).

Время, мин

Время, мин

Рис. 116. Скорости перемещения различных растворителей на слое силикагеля (толщина —0,25 мм) при 20—23° [39].

1 — вода- 2 — Циклогексан — эфир (80 + 20); 3 — ледяная уксусная кислота — ацетон — метанол — бензол (5 + 5 Н- 20 + 70)[15]; 4 — пиридин — ледяная уксусная кислота —

вода (10 + 1 + 40); 5 — м-пропанол — 10%-ный аммиак (95 + 5).

Рис. 116. Скорости перемещения различных растворителей на слое силикагеля (толщина —0,25 мм) при 20—23° [39].

1 — вода- 2 — Циклогексан — эфир (80 + 20); 3 — ледяная уксусная кислота — ацетон — метанол — бензол (5 + 5 Н- 20 + 70)[15]; 4 — пиридин — ледяная уксусная кислота —

вода (10 + 1 + 40); 5 — м-пропанол — 10%-ный аммиак (95 + 5).

■ Аскорбиновая кислота ।

Никотиноваякислбта

Як Пиридоксол ■В Амид никотиновой ” кислоты

. Рибофлавин

1|||В1(ЙЙ^^

4g* - Тиамин ; S

Рис. 115. Одномерная хроматограмма водорастворимых витаминов.

Разделение водой на слое силикагель + флуоресцентный индикатор (время анализа около 40 мин); снято в коротковолновом УФ-свете. 1 — 30 цг тиамина ■ HG1; 2 — 3 цг рибофлавина- 3 — 30 да пиридоксола - HG1; 4 — 30 цг никотиновой кислоты: 6 — 30 цг амида никотиновой кислоты; 6 —30 цг 1-аскорбиновой кислоты; 7—10 цг цианокобаламина; 8 —вещества и количества 1—7.

калия (реактив № 32), которым большинство витаминов окрашиваются уже при малых концентрациях: В17 В6, пантотеновая кислота и биотин — в голубой цвет, В2 — в оливково-зеленый, никотиновая кислота, амид никотиновой кислоты и фолиевая кислота — в серый, В12 — в фиолетовый (вита-

мин С не реагирует; аммиак и сода мешают определению). Следует еще отметить, что при наличии больших количеств витаминов В 2 и В6 образуются хвосты.

Прочно адсорбирующиеся на силикагеле вещества — витамин Bj и фолиевую кислоту — можно идентифицировать при последующем хроматографировании в другом направлении, используя соответствующий растворитель.

Используя обе системы, можно быстро обнаружить перечисленные соединения в фармацевтических препаратах и природных экстрактах. Как видно из других примеров, известные витамины можно при этом определить визуально, путем сравнения со стандартной серией.

Некоторые возможности разделения и селективного определения отдельных водорастворимых витаминов будут рассмотрены в следующих разделах.

ТИАМИН (ВИТАМИН Bj)

nA-ch2 — н3с —nh2.hci . NnA-ch2 — н3с —nh2.hci . NNп— СН3СН2—СН2ОНNп— СН3СН2—СН2ОНG1-Тиамин-гидрохлоридG1-Тиамин-гидрохлорид

nA-ch2 — н3с —nh2.hci . N

nA-ch2 — н3с —nh2.hci . N

Nп— СН3

СН2—СН2ОН

Nп— СН3

СН2—СН2ОН

G1-

Тиамин-гидрохлорид

G1-

Тиамин-гидрохлорид

В природных продуктах тиамин содержится в свободной форме (моно-, дии триэфиры фосфорной кислоты), в форме тиаминдисульфида, а иногда также в соединении с другими серусодержащими веществами; для фармацевтических препаратов он используется в виде гидрохлорида, мононитрата и эфира пирофосфорной кислоты (кокарбоксилаза). Из большинства проб витамин Bi экстрагируется водой. Следует иметь в виду, что переработку нужно проводить в области значений pH 4—6, чтобы не разрушить чувствительные производные тиамина. '

Условия разделения и резулътати

Тогда как тиамин перемещается на пластинках силикагеля растворителями ледяная уксусная кислота — ацетон — метанол — бензол (5 + 5 + + 20 + 70) [15] и вода очень медленно, тиамин-гидрохлорид и тиаминмононитрат (Ку X 100 56, более компактные пятна) отделяются смесью пиридин — ледяная уксусная кислота — вода (10 + 1 + 40) (pH 5,8) от кокарбоксилазы (ТБ X 100 ^ 33, образование зоны). Аналогичные результаты получил Штрохекер [55] на таких же слоях, используя смесь 20%-ный раствор мочевины — 85%-ная муравьиная кислота — н-пропанол (14-2+ 3).

Хорошее разделение всех соединений тиамина (даже в больших количествах и в присутствии многих примесей) обещает хроматография на слоях ионообменников [43] и электрофорез в тонких слоях, которые оказались пригодными в случае фенолов, фенолкарбоновых кислот [41] и аминокислот [25].

Обнаружение и возможности определения

Флуоресцирующий фиолетовым светом тиамин обнаруживается на слое в коротковолновом УФ-свете в количестве, превышающем 2 рг. Более чувствительным и специфичным реактивом является свежеприготовленный гексацианоферрат (III) калия (реактив № 81); при освещении кварцевой лампой (365 жц) еще можно обнаружить 0,03 рг окисленного тиамина (тиохрома) в виде светло-голубой флуоресценции. Тиамин окрашивается также иодоплатинатом (реактив № 76) (серая или коричневая окраска на слое, содержащем пиридин) и другими реактивами [65].

Количественное определение образовавшегося тиохрома можно осуществить непосредственно на хроматограмме путем сравнения со стандартной серией тиамина (0,03—2,0 цг), а также путем элюирования изобутанолом и измерения флуоресценции.

РИБОФЛАВИН (ВИТАМИН В2)

О N ||

ПзЬ I И I NH Рибофлавин

НзС-^ /^ /=О N N

СН2 — СНОН-СНОН — СНОП — СН2ОН

Кроме свободной формы, рибофлавин встречается большей частью в виде рибофлавин-5'-фосфорнокислого эфира (флавинмононуклеотид) и фермента ri-аминокислого оксида (флавинадениндинуклеотид). Рибофлавин трудно растворим в воде. Для количественного определения его можно экстрагировать, например, смесью пиридин — ледяная уксусная кислота — вода (10 + 1 + 40).

Условия разделения и результаты

На пластинках с силикагелем со смесью пиридин — ледяная уксусная кислота — вода (10 + 1 + 40) была определена величина Rt X 100 для рибофлавина (82) и для рибофлавин-5'-фосфата натрия (45). В малых количествах оба соединения можно также разделить водой (Rt X 100 ^ 40 и 28) и смесью ледяная уксусная кислота — ацетон — метанол — бензол (5 + 5 + 20 + 70) 115] (Rt X 100^ 35 и 0) и отделить от побочных продуктов и продуктов разложения. Для разделения можно также использовать хроматографию на слоях ионообменников [43] и электрофорез в тонком слое [25, 41]»

Обнаружение и возможности определения

Окрашенные в желтый цвет флавины при освещении кварцевой лампой дают интенсивную желтоватую флуоресценцию. На слое при освещении УФ-светом с длиной волны 365 жц еще можно обнаружить 0,01 рг рибофлавина, при длине волны 254 мр — 0,1 рг, а при дневном свете — 0,3 рг. Используя визуальный метод сравнения, можно сделать полуколичествен- ную оценку, а наиболее перспективным является колориметрическое и флуорометрическое определение после соскабливания и экстракции пятен.

ВИТАМИН В6

R

|ПиридоксолН=—СН2ОН

НО—СН2ОН-

I ।2Пиридоксаль R = — CHO

^СПиридоксамин R — —CH2NH2•

Витамин В6 находится во всех растительных и животных клетках в трех формах: пиридоксол (пиридоксин), пиридоксаль и пиридоксамин, которые в живых организмах большей частью связаны в виде 5-эфира фосфорной кислоты в белке и там легко переходят друг в друга.

Условия разделения и результаты

Прекрасное разделение этих трех производных витамина В6 описано Нюрнбергом [40]. С помощью «ступенчатого» метода, предложенного Шталем [52], на воздушносухом слое в камере с насыщением разделяют сначала чистым ацетоном (длина пути 14 см) и после его испарения при слабом нагре-

вании смесью ацетон — диоксан — 25%-ный аммиак (45 + 45 + 10) в том же направлении (длина пути 14 см). Снятие хрЬматограммы длится 1,5—2 час и пятна с 2—3 рг вещества можно точно определить по окраске. В то время как пиридоксол • НС1 и пиридоксамин- 2НС1 после растворения в горячем метаноле можно нанести на пластинку, присутствующий в виде «внутреннего полуацеталя» также растворимый пиридоксаль неустойчив. Он склонен к образованию ацеталя и дает на хроматограмме два (или три) пятна. Если, например, такой раствор в метаноле нагревать в течение часа на водяной бане, то пиридоксаль количественно переходит в пиридоксаль-метилацеталь, который легко отделить от других компонентов витамина В6.

ОНО —СН3

II

НС — ОНС — о

III

НО — /X- СН2СНзОН ко —^Хл— сн2

■* НС —

NN

Пиридоксаль («внутренний полуацеталь»)Пиридоксаль (метилацеталь)

Оставшийся без изменения пиридоксаль можно обнаружить только после нанесения водного раствора, что, однако, не рекомендуется вследствие трудностей при нанесении и малой интенсивности окраски пятен. Хорошего разделения достигают на активированном слое силикагеля, используя в качестве растворителя воду или 0,2%-ный раствор аммиака (компактные пятна), причем пиридоксол • НС1, пиридоксаль-5'-фосфат, пиридоксамин- •2НС1 и пиридоксаль-этилацеталь-НС1 (по 2—3 цг) разделяются за короткое время (см. табл. 35).

Таблица 35

Величины R^ X Ю0 соединений группы В6 на силикагеле Г

Соединение

Растворитель

ацстон- диоксан — 25%-ный аммиак (45+45+10) [40]

0,2%-ный аммиак

вода

Пиридоксол-НС1 . . .

30

53

52

Пиридоксамин•2Н С1

60

16

19

Пиридоксаль-5 '-фосфат

—

75

64

Пиридоксаль(соотв.

изомеры)

-60

—

—

Пиридоксаль-метилацеталь

-66

45

Пиридоксаль-этилацеталь-НС1

—

44

36

Обнаружение и возможности определения.

На сухих слоях силикагеля с флуоресцирующей добавкой в УФ-свете видна темно-синяя первичная флуоресценция, позволяющая определить

16 Заказ № 734

при длине волны 254 .ир еще 3 цг, а при 365 жр — 10 рг пиридоксола и пири- доксамина. После опрыскивания 0,4%-ным раствором 2,6-дибромхинонхлор- имида в метаноле (реактив № 40) или 0,1%-ным раствором 2,6-дихлорхинон- хлоримида в этаноле (реактив № 41) и последующей обработки парами аммиака все соединения витамина В6 окрашиваются в голубоватый цвет (граница определения 0,1 рг), причем пиридоксаль дает наиболее слабую окраску (0,5—1 рг). Можно также применять для обнаружения более распространенные цветные реактивы [23, 65]. Используя концентрационные серии чистых веществ, можно оценить содержание различных компонентов В6.

Определение витамина В6 в поливитаминах

После экстракции водой из фармацевтических препаратов эти соединения можно разделить и количественно определить, используя в качестве растворителя воду или 0,2%-ный аммиак. Э. Нюрнберг [40] предложил для пиридоксаля следующий способ: пробу (содержащую 10 рг пиридоксаля-НС1) нагревают с абсолютным метанолом в течение часа и получают при этом пиридок- саль-метилацеталь; метанол удаляют при пониженном давлении, а осадок растворяют в 50 мл воды. 5 мл этого раствора смешивают с 5 мл буфера pH 1 и 2%-ным водным раствором тетрафенилбората натрия и оставляют на 12 час. Выпавшие кристаллы пиридоксаль-метилацетальтетрафенил- бората отсасывают, растворяют в 50 мл ацетона и наносят на воздушносухой слой силикагеля рядом с аналогично обработанным чистым пиридоксалем (ряд с различной степенью разбавления). Затем хроматографируют смесью хлороформ — этанол (99 + 1) и после опрыскивания проводят количественное определение (R} X 100 ^ 40—50).

НИКОТИНОВАЯ КИСЛОТА И АМИД НИКОТИНОВОЙ КИСЛОТЫ /\—R Никотиновая кислота R =—СООН

у Амид никотиновой кислоты R =—CONH2 N

Оба соединения широко распространены в природе. Свободная кислота обладает такими же свойствами витаминов, как и амид. В организме кислота переходит в амид, последний в связанном состоянии является составной частью важнейших ферментов.

Условия разделения и результаты

Нюрнберг [39] описал простой метод выделения никотиновой кислоты и амида никотиновой кислоты из различных фармацевтических препаратов на воздушносухом слое силикагеля Г без насыщения камеры с использованием свежеприготовленной смеси н-пропанол — 10%-ный аммиак (95+5). В этой системе фронт растворителя примерно за 60 мин поднимается на 8 см, ориентировочная величина Rj X 100 составляет для никотиновой кислоты 35 и для амида никотиновой кислоты 60—70, и оба пиридиновых соединения можно после опрыскивания точно идентифицировать и определить количественно.

Оба витамина можно разделить и количественно определить, используя несколько быстрее перемещающийся растворитель (см. табл. 36 и рис. 115) на активированных слоях силикагеля.

Таблица 36

Величины В? X 100 для никотиновой кислоты и амида никотиновой кислоты

Слой

Воздушносухой слой силикагеля

Активированный слой силикагеля

Растворитель

н-пропанол — 10%-ный аммиак (95+5) [39]

ледяная уксусная кислота — метанол — бензол (5+5+20+70) [15]

вода

Никотиновая кислота

Амид НИКОТИНОВОЙ кис-

35

75

78 .

лоты

60—70 ■

65

49

Обнаружение и возможности количественного определения

Оба производных пиридина еще в количестве 3 рг каждого локализуются в коротковолновом УФ-свете на флуоресцирующей пластинке в виде темных абсорбционных пятен. Более специфичное и чувствительное определение по Нюрнбергу заключается в удалении паров пиридина при опрыскивании воздушносухого слоя раствором и-аминобензойной кислоты с последующей обработкой парами хлорциана (реактив № 88). Максимальное окрашивание достигается примерно через 6 мин. Амид никотиновой кислоты окрашивается в оранжево-красный, а никотиновая кислота — в красный цвет. В случае никотиновой кислоты при нормальной толщине слоя (—0,25 мм) еще можно определить 0,1 рг вещества.

Возможна полуколичественная визуальная оценка путем сравнения с концентрационной серией чистого вещества [39]. Определение можно также осуществить с хлорцианом или бромцианом после соскабливания и элюирования необработанных пятен [54].

ПАНТОТЕНОВАЯ КИСЛОТА И ПАНТЕНОЛ

СН3О

III

НОН2С—С—СНОН—СО—NH— СН2— СН2 — RПантотеновая кислота R =—С — ОН

(2Н3ПантенолR= —СН2ОН

■ Пантотеновая кислота широко распространена в растительном и животном мире и встречается как в свободном состоянии, так и в виде соединений, из которых наиболее известным является кофермент А.' Соответствующий пантотеновой кислоте спирт, пантенол, лучше всасывается организмом и переходит в пантотеновую кислоту.

Условия разделения и результаты

Предложенная Генсхиртом и Мальзахером [15] смесь ледяная уксусная кислота — ацетон — метанол — бензол (5 + 5 + 20 + 70) позволяет осуществить хроматографический анализ и идентификацию на слоях силикагеля пантотеновой кислоты (соответственно ее Na- или Са-соли) и пантенола (величина Rt X 100 для обоих веществ о^ 57). При использовании в качестве 16*

растворителя воды пантотеновая кислота и пантенол перемещаются с различной скоростью (В/ X 100 ^ 89 и 67), причем отделяются также от продуктов расщепления, р-аланина и аминопропанола. В качестве растворителя пригоден также абсолютный этанол (Я/ X 10040 и 65).

Обнаружение и возможности определения

Пантотеновая кислота и пантенол расщепляются на пластинках при нагревании в течение 30 мин при 160°. После опрыскивания 0,5%-ным раствором нингидрина в этаноле (реактив № 108) и повторного кратковременного нагревания до 160° [15] образующийся р-аланин приобретает фиолетовую окраску, а аминопропанол — винно-красную. Количественное расщепление достигается также при обработке 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты и сушкой в течение 10 мин при 110° (минимально определяемое количество 2 цз).

Этими методами можно быстро и специфично обнаружить пантотеновую кислоту (соответственно ее соли) и пантенол наряду с продуктами расщепления в различных фармацевтических и косметических препаратах. Витамины и образующиеся при разложении вещества определяются путем сравнения со стандартными сериями чистых веществ. Окрашенный нингидрин- ный комплекс можно колориметрически измерить после соскабливания пятен, элюирования 96%-ным этанолом и стабилизации раствором нитрата меди.

ЦИАНКОБАЛАМИН (ВИТАМИН В12)

Цианкобаламин— биологическое вещество из группы кобаламина, носящее название витамина В12,— широко распространен в природе. По сравнению с другими витаминами В витамин В12 всюду присутствует в значительно меньших количествах.

Условия разделения и результаты

При использовании смеси Генсхирта и Мальзахера [15] на силикагеле цианкобаламин остается в точке старта (см. табл. 34), а водой перемещается (^ X 100 ^ 22).

Обнаружение и возможности определения

Для идентификации относительно больших количеств цианкобаламина можно рассматривать хроматограмму при различном освещении. При дневном свете по красной окраске можно определить еще 0,3 рг, в УФ-свете при длине волны 365 жц — 0,5 рг и при длине волны 254 жц — 1 рг в виде темных пятен на флуоресцирующем фоне. После хлорирования и опрыскивания раствором о-толидин — иодид калия (реактив № 32) можно еще обнаружить даже 0,2 цз в виде фиолетовых пятен. Для микроопределения следует также использовать биоавтографию.

ФОЛИЕВАЯ КИСЛОТА

N N

h2n ~СООН

N L ^—СН2 —NH—СО —NH —СИ—СН2—СН2—СООН

। N

ОН

Фолиевая кислота

Фолиевая (птероилглутаминовая) кислота всюду распространена в природе в очень небольших количествах в свободном состоянии и в виде соединений, в которых пептидоподобный остаток глутаминовой кислоты соединен с птероиловым скелетом фолиевой кислоты. В животном организме фолиевая кислота под действием фермента переходит из этих производных в свободное состояние. В воде и органических растворителях кислота малорастворима, но хорошо растворяется в щелочах и карбонатах щелочных металлов с образованием солей.

Условия разделения и результаты

Нейтральный растворитель очень медленно перемещает фолиевую кислоту на пластинке силикагеля (см. табл. 34). Скорость перемещения значительно увеличивается при использовании 1%-или 10 %-ного раствора аммиака (Я/ X 100 ^ 95 и 85 соответственно). При испытании чистого витамина возможно отделение сопутствующих веществ в виде голубоватой флуоресценции (обнаруживается в длинноволновом УФ-свете).

Обнаружение и возможности определения

При дневном свете можно обнаружить 2 цг желтой фолиевой кислоты, такое же количество в УФ-свете в виде абсорбционных пятен и после обработки хлором и опрыскивания смесью о-толидин — иодат калия (реактив № 32) — 0,5 цг в виде серого пятна. Этой, цветной реакции мешает, однако, обработка пластинки аммиаком, поэтому было бы очень желательно использовать более подходящий растворитель. Обнаружение можно осуществить и с помощью других реактивов [65]. Для определения пригодны также чувствительные биоавтографические методы.

БИОТИН

О

II.

HN NH

СН2 — СН2—СН2 — СН2—СО ОН SБиотин

Этот витамин встречается в очень малых концентрациях, вероятно, во всех живых клетках, где он существует в свободном состоянии и в виде действующих как коферменты соединений. Биотин малорастворим в органических растворителях и воде, но хорошо растворяется в разбавленных щелочах.

Условия разделения и результаты •

Согласно табл. 34, биотин отделяется от других водорастворимых витаминов при хроматографировании на силикагеле Г смесью ледяная уксусная кислота — ацетон — метанол — бензол (5 + 5 + 20 + 70) [15] или водой (Rf X 10080 и 70 соответственно).

Обнаружение и возможности определения

Реактивом № 76 еще можно обнаружить 5—10 рг биотина в виде белых пятен на розовом фоне, а раствором о-толидин — иодид калия после хлориро

вания (реактив № 32) X- 0,2 рг биотина в виде голубых пятен. Меньшие количества можно обнаружить и определить микробиологически.

АСКОРБИНОВАЯ КИСЛОТА (ВИТАМИН С)

С=О

НО —С.

IIО

но —СI,„

।Z (+ )-аскорбшювая кислота

Н-С1

I

НО —С —н

I сн2он

I (+)-Аскорбиновая кислота является распространенным во всех клетках биологически активным веществом. В растениях аскорбиновая кислота также существует в виде белкового соединения «аскорбигена», от которого легко отщепляется путем гидролиза. Для фармацевтических целей ее используют в виде солей и эфиров. Будучи сильным восстановителем, аскорбиновая кислота нестабильна и может обратимо переходить, с отщеплением водорода (уже под действием воздуха), в дегидроаскорбиновую кислоту. Поэтому в процессе экстракции рекомендуется применять защитную атмосферу (N2, СО2),

Условия разделения и результаты

Аскорбиновую кислоту и ее производные можно частично разделить на активированном слое силикагеля, применяя различные растворители. Опубликованные ориентировочные величины Rf х 100 приведены в табл. 37.

Таблица 37

Величины Rj X 100 производных аскорбиновой кислоты на силикагеле Г

Растворитель

ледяная уксусная кислота — ацетон — метанол — бензол (5 + 5+20 + 70)

[15]

вода

этанол

Z-Аскорбиновая кис-

лота (Na- и Са-соль) Изоаскорбиновая

30

96

22

кислота

35

96

29

Аскорбилпальмитат

85

0

55

Штрогеккер [55] перевел аскорбиновую кислоту в динитрофенилгидразон- производное и осуществил хроматографическое разделение на воздушносухом слое силикагеля Г, используя смесь хлороформ — этилацетат (50 + 50) (Я, х 100 ^ 25).

Обнаружение и возможности определения

По собственному поглощению на пластинке в коротковолновом УФ-свете можно определить 3 р,г кислоты, которая после непродолжительного нагревания до 120° при 365 л;.р флуоресцирует голубоватым светом. Нижний предел чувствительности с иодоплатинатом (желтоватое пятно на розовом фоне), фосфорномолибденовой кислотой (серо-синее пятно) и смесью молибдат аммония — цитратный буфер (голубое пятно) — величина того же порядка, а щелочной раствор нитрата серебра (реактив № 137) (серо-черное пятно) является менее чувствительным. В качестве специфичных растворов для опрыскивания упоминаются также какотелин и хлорид титана (II), дающие фиолетовое и соответственно оранжевое окрашивание [34].

Эти методы применяют для быстрой и селективной идентификации аскорбиновой кислоты в смеси витаминов. Количественное определение, как и в случае хроматографии на бумаге [34], следует проводить титрометрически или фотометрически после локализации пятна (непосредственной или с использованием метода направлябощей полосы), соскабливания и элюирования. Таким способом Штрогеккер [55] определил аскорбиновую кислоту в продуктах питания в смеси с растворимыми углеводами, соскабливая окрашенные в кирпично-красный цвет пятна динитрофенилгидразона аскорбиновой кислоты , элюируя 85 %-ным раствором серной кислоты, фильтруя и фотометр ируя.

ЛИТЕРАТУРА

Bacharach A. L., Green J., Chern, and Ind., 1961, 2135.

В i 1 1 e t e r M., Martins C., Biochem. Z., 334, 304 (1961).

В lattn a J., Davidek J., Experientia, 17, 474 (1961).

В о о t h V. H,, Analyt. Chern., 33, 1224 (1961).

Briiggemann J., Krauss W., Ti ews J., Chern. Ber., 85, 315 (1952).

Crowfoot C., D u n i t z J. D., Nature, 162, 608 (1948).

Davidek J., В 1 a t t n a J., J. Chromatog., 7, 204 (1962).

D a v i e s В. H., Goodwin T. W., M e r c h e r E. I., Biochem. J., 81, 40 p. (1961).,

D e m о 1 e E., J. Chromatog., 1, 24 (1958).

Demole E., Chromatog. Rev., 1, 1 (1959).

Duggan D. E., Arch. Biochem. Biophys., 84, 116 (1959).

E d w i n E. E., D i p 1 о c k A. T., Buny an J., G r e e n J., Biochem. J., 75, 450 (1960).■

Eichenberger W., Grob E. C., Helv. Chim. Acta, 45, 974 (1962).

Fо n t e 1 1 K., Holman R. T., L a m b e r t s e nG.,J. Lipid Res., 1, 391 (1960).

Ga n s h i r tH., Malzacher A., Naturwiss., 47,279(1960).

G1 о о r U.,частное сообщение.

Gо о d w i nT. W., (Англин), частное сообщение.

Green J., J. Sci. Food Agric., 9, 801 (1958).

Green J., M с Ha 1 e D.,MarcinkiewiczS.,Mamalis P., Watt P. R., J. Chem. Soc., 1959, 3362.

Green J., M a ma 1 i s P.,Marcinkiewicz S., M с H a 1 e D., Chem. and Ind., 1960, 73.

Grob E. C., Eichenberger W., Pflugshaupt R. P., Chimia, 15, 565 (1961).

G г о Ъ E. С., В о s c h e t t i A., Chimia, 16, 15 (1962).

Хроматография на бумаге, под ред. И. М. Хайса и К. Мацека, Издатинлит, 1962.

Н anewajd К. Н., R а р р о 1 d М. Р., R о Ъ о г g h J. R., Rec. trav. chim., 80, 1003 (1961).

Honegger C. G., Helv. Chim. Acta, 44, 173 (1961).

Inhoffen H. H., Angew. Chem., 72, 875 (1960).

Irreverre F., S u 1 1 i v a n M. X., Science, 94, 497 (1941).

Isler O., Mitarh., частное сообщение.

Isler О., Riiegg R., Sc hud el P., Chimia, 15, 208 (1961).

J ane cke H., Maas-Goebels I., Z. anal. Chem., 178, 161 (1960).

Jones S. W., Chem. Eng. News. 38, Nr. 39, 57 (1960).

Lagoni H., Wortmann A., Milchwiss., 10, 360 (1955).

Lagoni Н., Wortmann A., Milchwiss., 11, 206 (1956).

L i n s к е n s H. F., Papierchromatographie in der Botanik, 2. Aufl., Berlin — Gottingen — Heidelberg, Springer-Verlag, 1959.

M a n g о 1 d H. К., M a 1 i n s D. C., J. Am. Oil Chem. Soc., 37, 383 (1960).

Marcinkiewicz S., G r e e n J., Analyst, 84, 304 (1959).

McHale D., Green J., Marcinkiewicz S., Chem. and Ind., 1961, 555.

37a. Montag A., Z. Lebensmitt.-Untersuch., 116, 413 (1962).

M о t ti e r M., Mitt. Gebiete Lebensm. und Hyg., 43, 118 (1952).

NurnbergE.,Dtsch.Apoth.Ztg., 101, 142(1961).

N urn bergE.,Dtsch.Apoth.Ztg., 101, 268(1961).

PastuskaG.,T r i nк s H.,Chemiker Ztg.,85, 535(1961).

P 1 a n t a C.v.,S c h wi e t e rU., C h о p ar d-d i t-j e an L., R u e g g R.,

Kofler M., Isler O., Helv. Chim. Acta, 45, 517 (1962).

Randerath K., Angew. Chem., 73, 436 (1961).

Ruegg R., Isler O., Planta Med., 9, 386 (1962).

S a th e V., Dave J. B., Ramakrishnan С. V., Nature, 177, 276 (1956).

Schilling K., Dam H., Acta Chem. Scand., 12, 347 (1958).

Seher A., Fette und Seifen, Anstrichmittel, 61, 345 (1959).

Seher A., Nahrung, 4, 466 (1960).

Seher A., Mikrochim. Acta, 1961, 308.

Shaw H. W. C., J e f f e r i e s J. P., Holt T. E., Analyst, 82, 2 (1957).

Stahl E., Chemiker Ztg., 82, 323 (1958).

Stahl E., Arch. Pharm., 292/64, 411 (1959).

Stahl E., Bolliger H. R., Lehnert L., Vortrag fiber Dunnschicht-Chro- matographie, Symposium uber Caroline und Carotinoide der Dtsch. Ges. f. Ernahrung in Mainz (Oktober 1961).

Strohecker R., Vitaminanalysen, E. Merck AG, Darmstadt (1960).

Strohecker R., E. Merck AG, Darmstadt, частное сообщение.

Thommen H., Chimia, 15, 433 (1961).

Thommen H., частное сообщение.

Thommen H., Naturwiss., в печати.

Tiews J., Vitamine und Hormone, 8, 185, 297 (1959).

z. B. United States Pharmacopeia XVI, 910 (1960).

V e 11 u z L., A m i a r d G., Petit A., Bull. soc. chim. France, 1949, 501.

Vitamin E-Panel, Analyst, 84, 356 (1959).

V б 1 к e r O., Naturwiss., 48, 58 (1961).

Wagner H., Horhammer L., D e n g 1 e r B., J. Chromatog., 7, 211 (1962).

W a 1 d i D., Chromatographie, E. Merck AG, Darmstadt (1959).

W a 1 d i D., частное сообщение.

Winterstein A., Studer A., Ruegg R., Chem. Ber., 93, 2951 (1960).

Winterstein A., H e g e d u s B., Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem., 321, 97 (1960).

Winterstein A., H e g e d u s B., Chimia, 14, 18 (1960).

ГЛАВА 13

СТЕРОИДЫ

Стерины, производные прегнана, андростана, эстрана,желчные кислоты и сердечные глюкозиды

Д. Валъди

ОБЩЕЕ ВВЕДЕНИЕ

СТРУКТУРНЫЕ РАЗЛИЧИЯ И НОМЕНКЛАТУРА

Вещества рассматриваемых здесь классов относятся к соединениям с основным скелетом в виде циклопентано-пергидрофенантреновой системы.

12 18 17

Основной скелет стероидов •

Основной скелет стероидов состоит из трех шестичленных колец А, В, С и пятичленного кольца D. Атомы углерода обозначаются арабскими цифрами в приведенной выше последовательности. При атомах С10 иС13 в большинстве случаев расположены метильные группы. У важных в терапевтическом отношении стероидов предпочтительными для функциональных групп (—ОН, = О) положениями являются положения С3, Си и С17, причем в^С17 часто имеется боковая цепь.

В результате соединения колец А, В, С, D возможно образование ряда стероизомерных соединений [15, 23, 40, 42].

Условились обозначать, что метильная группа (С19) у Gto всегда изображается выступающей вперед из плоскости чертежа и таким образом находится в p-положении. Дополнительно Прелог и сотрудники [56, 57] показали, что абсолютная конфигурация фактически совпадает с ранее предложенной. Если водород у С5 также поместить в p-положение (обозначается сплошной линией), то это будет означать, что кольца А и В соединены друг с другом в цuc-положении. Если соответствующий водород у С5 расположен в «-положении (обозначается прерывистой линией или пунктиром), то имеет место соединение колец А и В в транс-положении. Практически в случае всех стероидов ВС - и DC-кольца соединены в транс-положении, за исключением карденолидов и буфадиенолидов (кольца ВС-цис^.

Боковая цепь у С17 природных стероидов находится обычно в р-положе- нии. Водород у С14 находится в «-положении. '

Атомы углерода шестичленных колец не лежат в одной плоскости, как, например, у бензола, а несколько смещены в противоположные стороны относительно этой плоскости (рис. 117). Поэтому возможно образование формы «ванны» или «кресла». В случае стероидов в основном встречается форма «кресла», как это схематически показано на рис. 118.

Бартону и Моррисону [7] удалось показать, что большое значение имеет «конформация» заместителя, т. е. находится ли он в плоскости кольца или расположен перпендикулярно к ней. Так, например/ группа ОН при С3

может лежать в плоскости кольца (экваториально, по-английски equatorial), или перпендикулярно к нему (аксиально; axial). Функциональные группы, лежащие в плоскости кольца (э), не только более полярны, но и более реакционноспособны (например, легче этерифицируются и омыляются).

Рис. 117. Пространственное строение скелета андростана^(по Физеру) [15].Рис. 117. Пространственное строение скелета андростана^(по Физеру) [15].

Рис. 117. Пространственное строение скелета андростана^(по Физеру) [15].

Рис. 117. Пространственное строение скелета андростана^(по Физеру) [15].

Вследствие различной возможности соединения колец (цис- или транссоединение) и различной конформации в случае холестанола, например, существует 4 соединения, которые отличаются друг от друга полярностью

Рис. 118. 4 возможных холестанола.

Согласно Черни, Йоска и Лаблеру [12], 5а-холестан-3а-ол перемещается на слоях окиси алюминия при использовании смеси бензол — эфир (7 + 3), быстрее всех, затем следует 5р-холестан-3а-ол, затем — 5|3-холестан-3|3-ол и, наконец, 5а-холестан-3р-ол (наиболее полярное соединение — медленнее .других).

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ПОВЕДЕНИЕ [1, И, 53, 70]

Характер основного скелета обусловливает слабую полярность стероидов. Полярность зависит, однако, от числа функциональных групп или от

С/О-индекса (отношение числа атомов углерода к числу атомов кислорода). Стероиды с длинными углеводородными боковыми цепями, например стерины или эфиры жирных кислот и холестерина, являются особенно липофильными и перемещаются наиболее быстро. Их разделяют поэтому гидрофобными растворителями. Полярность функциональных групп увеличивается в следующем порядке: CH = CH, ОСН3, COOR, С = О, СНО, ОН, СООН. Стероиды с большим числом ОН- или СООН-групп гидрофильны, в особенности этерифицированные в положении С3 сахаром или сахарной кислотой, о которых известно, что они сильно полярны и растворимы в воде. В этой форме или в виде сульфоэфиров стероиды выделяются из биологических объектов [70, стр. 414].

После ферментативного расщепления или кислотного гидролиза стероидные вещества экстрагируют из водных растворов органическими растворителями (см. стр. 270) и разделяют затем методом адсорбционной ХТС.

Негер [53, стр. 150] подробно изучал побочные реакции, протекающие на различных адсорбентах, в особенности на активной окиси алюминия (основной).

Обычно при малых временах анализа на слоях силикагеля не протекают побочные реакции. В отдельных случаях группы ОН, находящиеся по соседству с другими функциональными группами, защищают ацетилированием, если возникает опасность перегруппировки. В большинстве случаев биолога не интересует природа обнаруженного им метаболита; обычно он исследует качественно и количественно, не имеет ли место в условиях опыта изменение в одном из направлений. ■

В соответствии с увеличением полярных свойств мы рассмотрим в настоящей главе:

Стерины и их эфирыстероидыС27—С29

Прогестерон и гормоны надпочечника (кортикостероиды) стероидыС21

Андростерон, тестостерон и их производные . стероидыС19

ЭстрогеныстероидыС18

Желчные кислотыстероидыС24

СТЕРИНЫ

Раньше стерины в зависимости от их нахождения в природе делили на зоо- и фитостерины. Формально их можно разделить на [54]:

Монооксистерины: С27-стерины, например холестерин; С28-стерины, например эргостерин; С29-стерины, например стигмастерин;

Ди- и триоксистерины: например холестантриол.

Основным веществом является холестан:

Холестан

Как видно из рис. 118, холестан с группой ОН в положении 3 может находиться в 4 стерических формах, которые можно отделить друг от друга хроматографически (см. стр. 250 и 252).

1. УСЛОВИЯ РАЗДЕЛЕНИЯ, ОБНАРУЖЕНИЕ И ВЕЛИЧИНЫ hR{

Мы разделяли различные стерины, используя найденные нами и приведенные в литературе раствортели. В табл. 38 приведены величины Rf{hRf),

Таблица 38

Разделение стеринов на слое силикагеля Г при стандартных условиях

Соединение

Окраска флуоресценции (реактив № 123)

^ХЮО в растворителе

I

И

III

IV

V

VI

VII Jviii

IX

X

Холестерилацетат

От розовой до ржаво-красной

100

90

79

86

70

71

69

70

61

45

Эпигидрохолестерин (эпихоле- станол)

Желтая

78

60

43

45

34

31

26

25

23

Копростерин (копростанол)

»

72

56

49

38

31

26

25

22

18

2

Холестерин

От розовой до ржаво-красной

65

48

35

25

22

21

19

15

13

0

Р-Ситостерин

То же

63

45

35

25

20

20

12

13

И

2

Дегидрохоле

стерин

Сине-фиолетовая

—

45

31

25

—

—

—

—Г-

—

—

Дигидрохолестерин (холеста- нол)

Бледно-фиолетовая

58

45

36

23

17

19

15

13

и

2

Диэлектрическая проницаемость

I — Хлороформ — ацетон (90-|—10) [89]

6,75

II — Бензол — этилацетат (60-J-30) [13]

3,5

Ill—Циклогексан — этилацетат (70 + 30) [5]

3,3

IV — Хлороформ [73]

5,0

V — Бензол — этилацетат (90 +10) [13]

2,6

VI —Толуол — этилацетат (90 + 10) [13]

2,7

VII — Циклогексан — этилацетат (85 + 15) [5]

2,65

VIII — Циклогексан — хлороформ (50 + 50) [89]

3,6

IX — Бензол — хлороформ (40 + 60) [90]

4,0

X — Циклогексан — хлороформ (70 + 30) [89]

3,0

полученные при стандартных условиях. Растворители расположены в порядке уменьшения полярности. Уменьшение полярности не всегда соответствует уменьшению рассчитанной диэлектрической проницаемости. Величины Rf уменьшаются в этом же направлении, так что получается ряд элюирующей способности для этих растворителей. Величины R} не всегда совпадают с величинами, приведенными в литературе. Это, по-видимому, обусловлено несколько другими условиями опыта, например большей или меньшей активностью слоев.

Табл. 38 показывает, что величины Rj уменьшаются с увеличением гидро- ' фобных свойств растворителя. Эта закономерность выполняется, за исключением растворителей III и IV в случае холестерилацетата. Некоторые из приведенных в литературе величины hR^ (Rf X 100) лежат значительно выше, чем полученные в наших Опытах. Так, например, Дам нашел для холестерина в растворителе II hRf, равную 72, в растворителе V — 39 (22), в растворителе VI — 40 (21). Поскольку зависимость выполняется не очень хорошо, следует предположить, что слои, на которых мы работали, значительно более активны. Наши слои были подвергнуты предварительной сушке на воздухе в течение 2 час и затем активированы в течение 1 час при 110—120°.

Поэтому на практике рекомендуется совместно хроматографировать холестерин и холестер ин-ацетат в качестве стандарта и отнести к полученным величинам значения, приводимые в литературе.

Найденная Висом и сотрудниками [5] при несколько других условиях величина hRf для копростерина в случае растворителя III, равная 16 (49), лежит слишком низко. Сравнение невозможно, поскольку в этой работе отсутствуют данные о величине hRf для холестерина.

Последние четыре соединения из приведенных в табл. 38 нельзя непосредственно разделить, используя применяемые в настоящее время сорбционные слои и растворители, однако цветные реакции обнаруживают различие, благодаря чему идентификация становится возможной (окраска см. стр. 269).

Используя растворитель I, Брискорн с сотрудниками [10] сумели методом ХТС обнаружить в листьях Salvia triloba т Pints malus p-ситостерин. Обнаружение можно осуществить хлоридом сурьмы (реактив № 11) или методом ИК-спектров. Хорхаммер, Вагнер и Лай [25], используя метод ХТС, нашли в корне жень-шеня наряду с олеаноловой кислотой р-ситостерин.

Таблица 38а

Величины hRf других стеринов

Соединение

ЯуХЮО

Растворитель

Метод-

Литература

Холестанон

86

VII

Частично измененные стан-

5

Копростанон

71

VII

дартные условия То же

5

4-Холестенон

63

VII

» »

5

5-Холе стен-3р-7а-дио л . . .

21

II

Стандартные условия

13

5-Холестен-Зр-25-диол . . .

41

II

То же

13

26-Нор-5-холестен-3[$- ол-25-он

63

II

» »

13

Зр-Ацетокси-26-нор-5-холе- стен-25-он

74

V

» »

13

3[$-Ацетокси-5-холестен- 7-он

93

V

» »

13

2. ХОЛЕСТЕРИН И ХОЛЕСТЕРИНОВЫЕ ЭФИРЫ

Холестерин и холестериновые эфиры в больших количествах содержатся в органах и внутритканевых жидкостях человека и животных. Общее количество холестерина в организме человека составляет около 200—250 г.

Холестерин является относительно стабильным соединением. При гидрировании двойной связи С516 получается копростерин, который в небольших количествах содержится, например, в кале.

Группа ОН у Cg может быть этерифицирована стеариновой, пальмитиновой, олеиновой, линолевой, архидоновой и другими высшими жирными кислотами.

Холестерин (5-холестен-Зр-ол, холестерол)Холестерин (5-холестен-Зр-ол, холестерол)

Холестерин (5-холестен-Зр-ол, холестерол)

Холестерин (5-холестен-Зр-ол, холестерол)

Отношение холестерин /холестериновые эфиры

Знание отношения количеств холестерина и холестериновых эфиров в органах и внутритканевых жидкостях организма важно для медицинского диагноза определенных болезней и может быть определено различными методами. Для сыворотки обычно принято отношение 1 : 3,5, т. е. 70—75% холестерина связано в виде эфиров. Поскольку холестерин примерно на 75%

Рис. 119. Липиды сыворотки, экстрагированные непосредственно (а) и после кислого, гидролиза (б) и разделенные на слоях силикагеля Г смесью циклогексан — хлороформ (50 + 50).Обнаружение!) реактив №123 и затем реактив № 120 в (Е. Merck AG).Рис. 119. Липиды сыворотки, экстрагированные непосредственно (а) и после кислого, гидролиза (б) и разделенные на слоях силикагеля Г смесью циклогексан — хлороформ (50 + 50).Обнаружение!) реактив №123 и затем реактив № 120 в (Е. Merck AG).

Рис. 119. Липиды сыворотки, экстрагированные непосредственно (а) и после кислого, гидролиза (б) и разделенные на слоях силикагеля Г смесью циклогексан — хлороформ (50 + 50).

Обнаружение!) реактив №123 и затем реактив № 120 в (Е. Merck AG).

Рис. 119. Липиды сыворотки, экстрагированные непосредственно (а) и после кислого, гидролиза (б) и разделенные на слоях силикагеля Г смесью циклогексан — хлороформ (50 + 50).

Обнаружение!) реактив №123 и затем реактив № 120 в (Е. Merck AG).

связан с плазмопротеином, возникает известная трудность количественного определения холестерина и холестериновых эфиров.

Эти эфиры расщепляются при кипячении с разбавленной соляной кислотой в течение 30 мин только примерно на 20%.

Как видно из рис. 119, при кислом гидролизе в различных количествах могут образовываться продукты распада, например эфир линолевой кислоты или 3-холестерил- хлорид.

При подобных количественных методах определения чрезвычайно важен выбор соответствующего способа экстракции и в дальнейшем знание оптимальных условий омыления. При разработке соответствующих методов весьма полезна ХТС.

Описанные в литературе методы экстракции дают различное содержание холестериновых эфиров, которое легко можно определить методом ХТС. Из табл. 39 далее видно, что при фотометрическом определении (общее содержание холестерина и холестериновых эфиров) также получают отличное значение.

Таблица 39

Сравнение различных методов определения холестерина и его эфиров

Цольнер [93] Экстракция, ХТС

Шмидт фон Элмендорф [71]

Экстракция ХТС

Сирси и Берквист [63] Фотометрия

Экстракция после кислого гидролиза, ХТС*

са

Da

С

D

С

D

С

Холестерин . .

48

82

48

92

52

70

62

Холестериновые эфиры '

278

375

213

350

219

295

168

Суммарный холестерин . . . .

206

298

169

297

178

240

159

Холестерин: суммарный холестерин

1 : 4,3

1 : 3,6

1 : 3,5

1 : 3,2

1 : 3,4

1 : 3,4

1 : 2,6

Холестерин: холестериновые эфиры

1 : 5,7

1 : 4,5

1 : 4,4

■ 1 : 3,5

1 : 4,2

1 : 4,2

1 : 2,7

Эфирный индекс

76,5

72,5

71,5

69,0

70,5

70,5

61

а Сыворотка собак С и D, величины приведены в мг на 100 г сыворотки.

Величины, приведенные в табл. 39, получены следующим образом. 2 лм сыворотки собаки экстрагируют по Цольнеру и Киршу [93] смесью хлороформ — метанол и упаренную вытяжку доводят хлороформом до объема 5 мл. Из этой же сыворотки экстрагируют по 2 мл (3 пробы) по Шмидту фон Элмендорфу [71] смесью хлороформ — этанол — эфир (3 + 1 + 1) и упаренный экстракт также доводят хлороформом до объема 5 мл. Общее содержание холестерина и холестериновых эфиров определяют в 3 следующих пробах по Сирси и Берквисту [63].

Для гидролиза 2 мл сыворотки в течение 25 мин кипятят с 30 мл 10%-ной соляной кислоты с обратным холодильником и после охлаждения экстрагируют 3 раза 50 мл этилацетата. Высушенный над сульфатом натрия экстракт упаривают и остаток разбавляют 5 мл хлороформа.

Для сравнительного определения холестерина на пластинку с силикагелем Г наносят по 20 цл экстракта одновременно с постепенно увеличивающимся количеством 0,01%-ного стандартного раствора холестерина. В качестве растворителя используют хлороформ. Для определения эфиров холестерина наносят по 10 цл экстракта и постепенно возрастающее количество 0,1%-ного стандартного раствора эфира холестерина.

В качестве растворителя используют смесь бензол — хлороформ (95 + 5) или циклогексан — хлороформ (50 + 50).

Обнаружение осуществляют фосфорной кислотой (реактив № 123) с дополнительной обработкой фосфорномолибденовой кислотой (реактив № 120в) (см. рис. 120).

На рис. 119, а показано разделение липидов сыворотки при экстракции по Шмидту фон Элмендорфу [71]. Полярные липиды, остающиеся на точке

Рис. 120. Разделение холестериновых эфиров аорты человека (выделены методом колоночной хроматографии) на слое силикагеля Г смесью четыреххлористый углерод — хлороформ (96 + 4).Обнаружение: реактив № 123, затем реактив № 120 в. Холестериновый эфир: 1 — жирной кислоты с одной двойной связью; 2 — кислоты с двумя двойными связями; 3 — кислоты с тремя двойными связями и т. д.Рис. 120. Разделение холестериновых эфиров аорты человека (выделены методом колоночной хроматографии) на слое силикагеля Г смесью четыреххлористый углерод — хлороформ (96 + 4).Обнаружение: реактив № 123, затем реактив № 120 в. Холестериновый эфир: 1 — жирной кислоты с одной двойной связью; 2 — кислоты с двумя двойными связями; 3 — кислоты с тремя двойными связями и т. д.

Рис. 120. Разделение холестериновых эфиров аорты человека (выделены методом колоночной хроматографии) на слое силикагеля Г смесью четыреххлористый углерод — хлороформ (96 + 4).

Обнаружение: реактив № 123, затем реактив № 120 в. Холестериновый эфир: 1 — жирной кислоты с одной двойной связью; 2 — кислоты с двумя двойными связями; 3 — кислоты с тремя двойными связями и т. д.

Рис. 120. Разделение холестериновых эфиров аорты человека (выделены методом колоночной хроматографии) на слое силикагеля Г смесью четыреххлористый углерод — хлороформ (96 + 4).

Обнаружение: реактив № 123, затем реактив № 120 в. Холестериновый эфир: 1 — жирной кислоты с одной двойной связью; 2 — кислоты с двумя двойными связями; 3 — кислоты с тремя двойными связями и т. д.

старта, можно разделить по Габерману, Бандлоу и Круше [19J на диглицериды, кефалин, лецитинплазмалоген, сфингомиелин и лецитин. Более высокие значения холестериновых эфиров при экстракции по Цольнеру и Киршу [93] были подтверждены другими определениями. Не удалось получить сравнительных величин по методу, предложенному Дамом [13, 13а], при непосредственном нанесении 3—10 цл сыворотки на пластинки с силикагелем.

Разделение фракции холестериновых эфиров

Дальнейший успех принесло разделение методом ХТС содержащейся в сыворотке фракции холестериновых эфиров. Байкер [90] впервые описал подобное разделение, используя четыреххлористый углерод на пластинах

Рис. 121. Разделение холестериновых эфиров на слое силикагеля Г, пропитанного парафиновым маслом, по описанному Кауфманом с сотрудниками [38] методу обращенных фаз со смесью метилэтилкетон — ацетонитрил (70-|-30). -

Обнаружение: реактив № 123, затем реактив № 120 в.

с силикагелем Г. Согласно нашим собственным опытам, разделение пяти различных компонентов становится более воспроизводимым, если к четыреххлористому углероду добавить 4—5% хлороформа (рис. 120). В особенности рекомендуется хорошее насыщение камеры парами растворителя. '

Количественный расчет результатов разделенияхолестериновых эфиров

Цольнер с сотрудниками [95, 96], занимавшиеся разделением методом ХТС холестериновых эфиров, пытались идентифицировать отдельные пятна и осуществить количественное определение. В своих ранних публикациях авторы [94] наносили для этого на пластинки с силикагелем Г 0,04 мл сыворотки в виде полосы шириной 1см и трижды хроматографировали четыреххлористым углеродом. Зоны были соскоблены, и холестерин определен по Заку и др. [92]. В более поздней работе [96] вещества наносили на более узкие и более тонкие слои. Растворителем служил петролейный эфир

(т. кип. 50—70°), к которому добавляли 1% изопропилового спирта. Окрашенная хлоридом сурьмы хроматограмма непосредственно фотометр провалясь с помощью прибора, используемого для промера электрофоретических полос. Полученные значения приведены в первой графе табл. 40 и сравниваются с данными других методов.

Таблица 40

Процентное содержание холестериновых эфиров в нормальной сыворотке человека (сравнение различных методов определения)

Холестериновый эфир

ХТС по L [94]

"ольнеру [96]

Колоночная хроматография по Аренсу и др. 1[2]

Хроматография по

Клейну и Янссену [39]

Стеариновой кислоты

Пальмитиновой кислоты

} 9

14,1

10,1

6,3

Олеиновой кислоты

Пальмитолеиновой кислоты

j 25

22,9

18,1

22,2

Линолевой кислоты

56

48,5

62

60

Архидоновой кислоты . . . .

8,5

12,9

6

10,5

Докозапентаеновой кислоты

1,5

1,6

1

—

г) Двумерная XT С холестериновых эфировДвумерное разделение модельных смесей холестериновых эфиров описано Кауфманом, Макусом и Дайке [38]. На слое силикагеля Г вначале в напраг) Двумерная XT С холестериновых эфировДвумерное разделение модельных смесей холестериновых эфиров описано Кауфманом, Макусом и Дайке [38]. На слое силикагеля Г вначале в напра70 мл кетона смешивают с 30 мл ацетонитрила, 80 мл этой смеси насыщают парафиновым маслом и после отделения избыточного парафина добавляют оставшиеся 20 мл смеси.70 мл кетона смешивают с 30 мл ацетонитрила, 80 мл этой смеси насыщают парафиновым маслом и после отделения избыточного парафина добавляют оставшиеся 20 мл смеси.РРи с. 122. Схема двумерной тонкослойнойи с. 122. Схема двумерной тонкослойной

г) Двумерная XT С холестериновых эфиров

Двумерное разделение модельных смесей холестериновых эфиров описано Кауфманом, Макусом и Дайке [38]. На слое силикагеля Г вначале в напра

г) Двумерная XT С холестериновых эфиров

Двумерное разделение модельных смесей холестериновых эфиров описано Кауфманом, Макусом и Дайке [38]. На слое силикагеля Г вначале в напра

70 мл кетона смешивают с 30 мл ацетонитрила, 80 мл этой смеси насыщают парафиновым маслом и после отделения избыточного парафина добавляют оставшиеся 20 мл смеси.

70 мл кетона смешивают с 30 мл ацетонитрила, 80 мл этой смеси насыщают парафиновым маслом и после отделения избыточного парафина добавляют оставшиеся 20 мл смеси.

Р

Р

и с. 122. Схема двумерной тонкослойной

и с. 122. Схема двумерной тонкослойной

влении 1 проводят адсорбционнохроматографическое разделение, а затем, после пропитки,— распределительнохроматографическое разделение в направлении 2, применяя метод обращения фаз. Можно надеяться, что этот метод разделения будет использован для анализа природных смесей холестериновых эфиров и таким образом будет осуществлена дальнейшая дифференциация этих соединений.

Смесь холестериновых эфиров вначале разделяют смесью тетралин — гексан (25 + 75) и растворитель затем полностью удаляют в вакуумном шкафу (5 мм рт. ст.) при 110° в течение 45 мин. Для охлаждения пластинки помещают в эксикатор над Р2О6. Затем правой стороной В (см. рис. 122) пластинку осторожно погружают в смесь петролейный эфир — парафин (95 + 5). Петролейный эфир удаляют с помощью фена на холоду в течение 5 мин. В направлении 2 хроматографируют смесью метил этилкетон — ацетонитрил (70 + +30). Растворитель должен быть на 80% насыщен парафиновым маслом, поэтому

хроматограммы холестериновых эфиров (поКауфману с сотрудниками [38]).

Подробности см. в тексте.

Таблица 41

Величины Rj, х 100 различных эфиров холестерина по Кауфману [38]

Номер на рис. 122

Холестериновый эфир

Растворительа

Номер на рис. 122

Холестериновый эфир

Растворитель а

I

II

Ш

I

II

III

1

Холестерин

2

2

64

9 ■

Лаурат . . .

43

58

33

2

Формиат . .

—

30

60

10

Миристат . .

45

59

29

3 '

Ацетат . . .

10

16

58

11

Пальмитат

48

62

25

4

Пропионат

25

25

55

12

Стеарат . . .

50

64

23

5

Бутират . .

20

30

52

13

Линоленат

26

42

39

6

Капронат . .

30

40

47

14

Линолеат . .

32

48

33

7

Каприлат . .

36

47

42

15

Олеат . . . .

40

55

28

8

Капринат . .

40

54

38

а Растворители: I — тетралин — гексан (25+75); II — тетралин — гексан (50+50); III—метил- этилкетон — ацетонитрил (70+30), на 80% насыщенный парафиновым маслом.

По Кауфману [38] можно обнаружить холестериновые эфиры фосфорно- молибденовой кислотой (реактив № 120а). Кроме того, рекомендуют треххлористую сурьму (реактив № 12), родамин В (реактив № 129), фосфорновольфрамовую кислоту (реактив № 121), фосфорную кислоту (реактив № 123), смесь ванилин — серная кислота (реактив № 151) и пятихлористую сурьму (реактив № 13).

д) Определение кислот холестериновых эфиров(гцелочное омыление')

Для точной идентификации кислой части фракции холестериновых эфиров проводят щелочное омыление и выделяют жирные кислоты для дальнейшего их разделения.

Экстракт, полученный из 1 г органа или 1 мл сыворотки по Блуру (см. стр. 147), Шмидту фон Элмендорфу [71] или Цольнеру и Киршу [93], упаривают досуха, пропуская азот, затем обрабатывают 1 мл 2 н. раствора КОН в метаноле и при дальнейшем пропускании азота в течение 2 час кипятят на водяной бане. Щелочную смесь подкисляют 2 мл 2 н. серной кислоты, и жирные кислоты трижды экстрагируют 2 мл петролейного эфира (т. кип, 60—80°). Объединенные экстракты сушат безводным сульфатом натрия, фильтрат осторожно упаривают и остаток растворяют в определенном объеме хлороформа.

Выделенные таким образом жирные кислоты можно затем разделить методом, приведенным в главе, посвященной липидам.

Разработкой метода ХТС для разделения холестериновых эфиров арахидоновой кислоты занимались Махадеван и сотрудники [43].

Для полноты здесь следует указать относящиеся сюда работы по хроматографии на бумаге Лабаррера с сотрудниками [41], Михалика [48—50], Кауфмана с сотрудниками [28—37], Боллигера с сотрудниками [9], Зоти с сотрудниками [97], Мартина [45], Пирибума с сотрудниками [55], а также Свартаута с сотрудниками [80]. Необходимо еще установить, обеспечивают ли лучшее разделение слои из порошков целлюлозы по сравнению с бумагой. О возможности колоночнохроматографического разделения сообщают Шон и Гей [72].

III. СТЕРОИДЫ С21, С19 и С18Систематика

Основные ядра стероидов C2i

Прегнановые соединения (прогестероны) и кортикостероиды

СН3СН3СН2■ СН2IIСН3СН3СН2■ СН2II5а-Прегнан (транс-форма)» аллопрегнан5₽-Прегнан (цис-форма)5а-Прегнан (транс-форма)» аллопрегнан5₽-Прегнан (цис-форма)

СН3СН3

СН2■ СН2

II

СН3СН3

СН2■ СН2

II

5а-Прегнан (транс-форма)» аллопрегнан5₽-Прегнан (цис-форма)

5а-Прегнан (транс-форма)» аллопрегнан5₽-Прегнан (цис-форма)

Основные ядра стероидов С^

Андростановые соединения

5а-Андростан50-Андростан,этиохолан,тестан5а-Андростан50-Андростан,этиохолан,тестан

5а-Андростан50-Андростан,этиохолан,тестан

5а-Андростан50-Андростан,этиохолан,тестан

Основное ядро стероидов С18

ЭстранЭстран

Эстран

Эстран

Примеры:

Стероиды С21(нумерация соответствует табл. 42)

Аллопрегнан-За, 20а-диол

Прегван-За, 20а-диол

17*

• Прегненолон

Кортикостероиды

О

СН2ОН io

№ 22 I

СН2ОН

о

Дезоксикортикостерон, кортексонДезоксикортикостерон, кортексонКортизол, гидрокортизонКортизол, гидрокортизон

Дезоксикортикостерон, кортексон

Дезоксикортикостерон, кортексон

Кортизол, гидрокортизон

Кортизол, гидрокортизон

СН2ОН

о

Преднизон

№ 38СН2ОН

Кортизон

СН2ОН

№41 О I

Н-> II соО СН I

Альдостерон

№,39СН2ОН

9°, ОН но\/\/к

Преднизолон

Этиохолан-3,17-днонЭтиохолан-3,17-днон

Этиохолан-3,17-днон

Этиохолан-3,17-днон

Стероиды Су

Андростан-3,17-дион

Тестостерон

№ 25О

Андреностерон

№ 20№ 20Стероиды С]8 (эстрогены)Стероиды С]8 (эстрогены)№ 6 Эстрон Ri7=O, Rie=H№ 21 Эстрадиол Ri7=0H, Rie=HN« 37 Эстриол R17=OH, Rie=OH№ 6 Эстрон Ri7=O, Rie=H№ 21 Эстрадиол Ri7=0H, Rie=HN« 37 Эстриол R17=OH, Rie=OHВещество с эстрогенным действием

№ 20

№ 20

Стероиды С]8 (эстрогены)

Стероиды С]8 (эстрогены)

№ 6 Эстрон Ri7=O, Rie=H

№ 21 Эстрадиол Ri7=0H, Rie=H

N« 37 Эстриол R17=OH, Rie=OH

№ 6 Эстрон Ri7=O, Rie=H

№ 21 Эстрадиол Ri7=0H, Rie=H

N« 37 Эстриол R17=OH, Rie=OH

ононQJK

он

он

/ Z\Z

' III

azw

Диэтилстильбоэстрол, эстромон

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ПОВЕДЕНИЕ СТЕРОИДОВНА СЛОЯХ СИЛИКАГЕЛЯ Г

(Рассмотрение данных табл. 42 и сравнение с величинами Rj,полученными в хроматографии на бумаге)

На стр. 250 уже было рассмотрено поведение стероидов при распределительной хроматографии на бумаге с использованием различных систем, а также при адсорбционно-хроматографическом разделении на различных сорбентах в колонках. Используя данные табл. 42, следует вывести закономерности, наблюдаемые в тонкослойной хроматографии.

Стероиды ведут себя на слоях силикагеля Г так же, как и в случае других хроматографических методов, т. е. слабополярные соединения перемещаются, как и следовало ожидать, более быстро.

Наибольшие значения Rj показывают дикетоны (табл. 42, № 2, 3 и 4). Последовательность в ряду растворителей I—VI обычно соблюдается, трансФормы (№ 2, андростан-3,17-дион) значительно гидрофобнее г^мс-форм (№ 4, этиохолан-3,17-дион). На фильтровальной бумаге прогестерон (№ 3) перемещается в случае A-системы Буша быстрее (hRj = 77) по сравнению с обоими дионами № 2 и 4, которые находятся на одинаковой высоте с hRj=7Q. Из табл. 42 отчетливо вытекает, что 4-адростен-3,17-дион (№ 9) более гидрофилен, чем соединения № 2 и 4, в случае системы Буша № 9 расположен при kRt = 54.

4-Андростен-3,17-дион (№ 9) имеет сопряженную двойную связь. Подобные соединения обнаруживают и на фильтровальной бумаге меньшие значения Rj по сравнению со стероидом с изолированной двойной связью (№ 3). Как на бумаге, так и на слоях силикагеля Г разделение насыщенных стероидов и стероидов с одной двойной связью фактически нельзя осуществить. Так, например, 5-андростен-За-ол-17-он (№ 15) и андростан-За-ол-17-он (№ 17) практически всеми растворителями перемещаются с одинаковой скоростью. Экваториальная группа ОН этихолан-За-ол-17-она (№ 23) является сильнополярной, и поэтому это соединение отстает от названных выше.

Стероид (курсивом даны эфиры)

О

о о в

ь

уХ100 в растворителе

Фосфорная кислота (реактив № 123)

Ледяная уксусная кислота — серная кислота (реактив № 63)

Трихлорид сурьмы (реактив № 12)

Ванилинсерная кислота (реактив

В

о

№ 151)

в

О S

УФ

ДС

УФ

ДС

УФ

ДС

ДС

X

у

>

>

t>

>

1

Тестостеронпропио-

наш

—

31

65

72

75

83

86

<80

<80

сл-з, ж

з-сер

с ор

т-сер,

с п-кр

св-г

т-з

кор

2

Андростан-3,17-дион

2

30

62

72

72

80

82

<80

<80

бл-ф

ж-кор

св-г, 3

сер-з

С Ф

св-г, 3

ор-ж

3

Прогестерой

2

28

59

71

68

77

80

<80

<80

бл-г, ф

сл-ж

с ж

с в-ж

св-з, г

сл-ж,

ор-кор

кор

4

Э тиохолан-3,17-дион

2

17

59

69

70

79

75

<80

<80

кор-ж

ж-кор

т-ж

ж-з

сл-ф

—

т-кор

5

1-Д егиЭротестосте-

ронпропионат

—

18

58

68

70

75

73

<80

<80

кр-кор

св-кр

с кор-ф

ор-кр

с ж-кор

р

кр-ф

6

Эстрон

2

13

56

58

63

72

65

<80

<80

с ор

кр

с ж-ор

кк

сл бл-ф

р

ф

7

6-Хлор-6-дегидро-

17а-оксипрогестеронаце-

тат

—

20

55

70

75

75

75

<80

<80

Т-3, г

т-з

т-з, г

т-г, кор

с ж-з

3, г

п-ф

8

Холестерин

1

25

52

69

67

—

73

<80

<80

с кк

сер

с ор-кр

р-кр

С ф-г

ф-г

п-ф

9

4-Андростен-3,17-дион

2

18

50

69

65

70

70

<80

<80

т-сер-з

з, г

с кр

т-кор-кр

бл-ф

—

кор-кр

10

Дегидротестостерон

2

19

48

68

67

67

68

<80

<80

т-з, г

т-з, г

рк

т-сер-з

сл-бл-з

—

беж

И

Этиохолан-ЗР-ол-17-он

2

16

48

55

53

66

68

<80

<80

бл-ж-з

сл-ж-кор

т-сер-з

з-кор

бл-ф

св-г

т-з, г

12

Прегненолон . . , .

2

17

41

52

58

66

66

<80

<80

С Ф

ж-кор

с Ф

ф

т-сер-г

сер-г

ф

13

4-Прегнен-За-ол-20-он

2

18

40

49

60

65

67

<80

<80

ф

св-ф, 3

бл-ф

кор-сер

с кор-кр

сер-г

т-ф

14

Прегнан-3,20-дион-

21-ол

3

18

37

53

59

62

66

<80

<80

беж

сл-ж

ж-з

ж-з

бл-ф

—

ж-кор

15

5-Андростен-За-ол-17-

он (дегидроандростерон)

2

16

37

48

54

55

63

<80

<80

с ор

кор-ф

п, ж-ор

ф-кр

р

п

кр-ф

16

Дегидроэпиандросте-

Величины hR^ стероидов в различных растворителях и цветные реакции [89]

Таблица 42

рон

2

13

36

48

53

55

56

<80

<80

с ф

св-ф

п, ж-ор

ф-кр

р-кр

п

кр-ф

17

Андростан-За-ол-17-он (андростерон)

2

14

34

46

52

53

65

<80

<80

ж-кор

св-беж

т-з, сер

кр-кор

С кр-ф

з-сер

ф

18

17а-Оксипрогестерон

3

И

31

47

60

54

64

<80

<80

т-кор-ж

беж

с ф-г

г

С ф-кр

ж-з

кк

19

17а-Метилтестостерон

2

12

30

46

50

54

69

<80

<80

бл-ж-кор

ж-кор

с ж-кор

кор

с п-кр

п

кор-кр

20

Эстромон (не стероид)

2

4

28

45

45

54

31

<80

<80

т-г

т-кор-ф

кор-ф

кр-ф

п

т-ф-кор

г

21

Эстрадиол

2

5

32

35

47

45

56

<80

<80

с ж

ж-ор

с 3

св-кр

св-ж-кор

с св-кр

3

22

11-Дезоксикортико- стерон

3

15

28

45

52

55

70

<80

<80

т-з-сер

т-сер-кор

с кк

т-сер-г

т-кор

кор-кр

кр-ф

23

Этиохолан-За-ол-17-он

2

9

27

38

45

50

60

<80

<80

сл-з-сер

сл-св-сер

т-кор

бл-кор-

бл-ф

св-г

сер

кр

24

6-Дегидро-17а-окси- прогестерон

2

12

27

42

59

59

66

<80

<80

с ж-з

ж-кор

св-з-кор

сер-з

с кр-кор

сер

кк

25

4-Андростен-3,11,17-

трион

3

19

26

60

56

58

78

<80

<80

сл-з-сер

бл~св-сер

бл-з-ж

св-ж-сер

с л бл-ф

—

беж

26

Тестостерон . . . .

2

15

26

45

48

50

66

<80

<80

т-з-г

т-з-г

с ж-ор

сер-кор

с ж-кор

г

кор-кр

27

Аллопрегнан-3а,-20а-

ДИОЛ

2

10

22

39

44

46

62

71

<80

бл-р

слбл-кр

сл бл-ж

сл кор-кр

бл-ф

св-сер-г

св-з-г

28

Прегнан-За, 20а-диол

2

5

12

24

34

35

61

65

75

бл-сер-з

сл св-сер

с ж-з

св-кор-

б л-ж-з

св-сер

п

сер

29

Кортизонацетат . . .

—

—

10

30

44

58

60

55

68

Ф

ж-кор

бл-ф

св-кор

бл-з

—

кор-кр

30

Преднизонацетат , . .

—

—

8

29

42

54

56

55

70

т-кор

кор

т-кор-кр

кор-ф

бл-ф

—

кор-кр

31

16-Метилен-1-дегидро- 110, 17а-диоксипроге- стерон

4

5

18

34

45

42

43

35

кр-кор

р-кр

кр-кор

р-кр

кр-ф

ф-г

кр-ф

32

Гидрокортизонацетат

—

—

4

20

36

45

55

44

38

ж-кор

з-сер

с з-ж

ж-сер

бл-ж

ж-кор

кор-кр

33

Преднизолонацетат

—

—

—

15

30

38

49

36

29

з-сер

кор

т-кор-кр

кор-ф

кор

ф-кор

з-сер

34

Кортизон

5

—

—

10

20

23

31

20

15

сл-ф

св-ж

сл-ж

св-з

сл-з-г

—

св-кор-

кр

Продолжение табл. 42

Стероид (курсивом даны эфиры)"

О § <0

I

8уХ100 в растворителе

Фосфорная кислота (реактив № 123)

Ледяная уксусная кислота — серная кислота (реактив

Трихлорид сурьмы (реактив к» 12)

Ванилинсерная кислота (реактив

33)

У, £

о R

S F

УЧ

м

н

>

>

>

>

УФ

ДС

УФ

ДС

УФ

ДС

№ 151) ДС

35

Преднизон

5

—

—

8

17

18

18

16

12

т-кор

т-беж

т-кор

ф-кор

св-кор

св-беж

св-кор

36

Дексаметазон . . . .

5

—

—

6

И

8

16

10

10

т-кор

кор

т-кор

т-г-з

св-кор

св-беж

св-з

37

Эстриол

3

—

—

4

9

15

17

13

19

с ор

кр-кор

с ф-кр

кк

сл бл-ф

СВ-3

т-ф

38

Гидрокортизон . . .

5

—

•—

3

6

8

23

8

11

ж-кор

ж-кор

т-кор

св-кор

св-кор

—

св-кор- кр

39

40

Преднизолон . . . . 16-Метиленпреднизо-

5

—

—

—

4

5

14

8

8

ж-кор

кор

т-кор

кор

с ж-кор

св-кор

т-з

лон

5

—

•—

—

3

12

17

8

И

кор-кр

кр-кор

т-кор

кр-кор

кор

кор-ф

кр-ф

41

Алдостерон

5

6

25

12

20

22

С 3

ж-кор

т-кор

кор

бл-з .

3

Пояснения к табл. 42. Активные слои силикагеля Г готовились стандартным методом, приведенные величины hR. являются средними из многих опытов. .

Растворители: I — хлороформ; II — хлороформ — этилацетат (80+20); III — хлороформ — ацетон (90+10); IV — хлороформ — ацетон (80+20); V — циклогексан — хлороформ—ледяная уксусная кислота (70+20 + 10); VI — метиленхлорид — ацетон (80+20); VII — хлороформ — ледяная уксусная кислота (904+ 10); VIII — метиленхлорид — ледяная уксусная кислота (90+10).

Окраска: ДС — дневной свет; т — темная; св —светлая; с — светящаяся; бл — бледная; сл —слабая; г — голубая; б — бежевая; кор — коричневая; ж —желтая; з — зеленая; сер —серая; кр —красная; рк — ржаво-красная; р —розовая; кк — кирпично-красная; ор — оранжевая; п — пурпурная; ф — фиолетовая.

В то время как экваториальная группа ОН при С3 в случае этиохолан-За- ол-17-она (№ 23) придает сильнополярные свойства молекуле по сравнению с этиохолан-Зр-17-оном (№ 11) с аксиальной группой ОН, стероиды № 15 и 16 вследствие незначительных различий в величине Rf разделяются с трудом. При разделении методом хроматографии на бумаге стероиды № 15 и 16 располагаются на одинаковой высоте (hRf = 42). Андростерон (№ 17), наоборот, расположен на фильтровальной бумаге в случае A-системы Буша выше (hRf = 57).

Не считая холестерина (№ 8), который в некоторых растворителях перемещается быстрее, эстрон (№ 6) — наиболее гидрофобный стероид с одной группой ОН. Здесь мы имеем дело с фенольной группой ОН, не обладающей такими сильными гидрофильными свойствами, как спиртовая группа ОН.

Эстрадиол (№ 21) имеет две группы ОН: одну фенольную и одну спиртовую, и интересно, что эстромон (диэтилстильбоэстрол, № 20) ведет себя в хроматографическом отношении подобно эстрадиолу.

Прегнан-3,20-дион-21-ол (№ 14) является наиболее быстро перемещающимся из приведенных в табл. 42 стероидов с 3 кислородными атомами, затем следует 17а-оксипрогестерон (№ 18). Различие в полярности стероидов № 14 и 18 обусловлено сопряженной двойной связью.

Дезоксикортикостерон (№ 22) является следующим, приведенным в таблице стероидом с тремя атомами кислорода. Он более гидрофилен, чем прегнан-3, 20-дион-21-ол (№ 14), однако лишь незначительно гидрофильнее 17а-оксипрогестерона (№ 18).

Определенная последовательность стероидов № 22 , 23 и 25 (все с 3 атомами кислорода) не может быть установлена растворителем II. При рассмотрении других растворителей приходят к следующей последовательности: № 25 (3 кетогруппы), затем № 22 и наконец № 24.

В случае A-системы Буша адреностерон (№ 25) расположен на бумаге (hRf = 11) еще ниже, чем тестостерон (hRf = 19). Метилтестостерон (№ 19) лежит, как и на фильтровальной бумаге, выше тестостерона (№ 26). Для стероидов № 14, 18, 22 и 24 возможны водородные связи, и поэтому соответствующие молекулы не обнаруживают сильных гидрофильных свойств. В случае В-системы Буша дезоксикортикостерон (№ 22, hRf = 36) расположен на фильтровальной бумаге значительно ниже прегнандиола (№ 28, hRf= 50). Аллопрегнандиол (№ 27) и прегнандиол (№ 28) хорошо разделяются на слоях силикагеля Г. На обнаружении методом ХТС этих двух стероидов в моче основано описанное в гл. 16 определение раннего периода беременности.

Значительно гидрофильнее и соответственно медленнее перемещаются стероиды с 5 атомами кислорода в молекуле, например кортизон и кортизол. Эти соединения умеренной полярности обычно хорошо разделяются растворителями V—VII.

Алдостерон (№ 41) в хлороформном растворе изменяется через несколько часов. В растворителях, к которым добавлена ледяная уксусная кислота, соединение № 41 обнаруживает особенно высокие значения Rf, превышающие значения для кортизона (№ 34). На бумаге стероид № 41 с В*, С* и Е2В* перемещается не так быстро, как стероид № 34. В В5 он расположен над кортизолом (№ 38), в С перемещается одинаково со стероидом № 38, а в Е2В остается на месте.

Эстриол (№ 37) расположен на слое силикагеля Г между кортизоном (№ 34) и кортизолом (№ 38).

ПРОВЕДЕННЫЕ РАНЕЕ РАБОТЫ ПО ПРИМЕНЕНИЮ МЕТОДА ХТСДЛЯ ‘РАЗДЕЛЕНИЯ СТЕРОИДОВ

В некоторых случаях удалось разделить кортикостероиды, а также и менее полярные стероиды путем повторного (многократного) хроматографирования неполярными растворителями [58, 89].

Вместо чистых стероидов, которые или слишком полярны, или слишком чувствительны к окислению, можно хроматографировать соответствующие липофильные эфиры: ацетаты, формиаты, бензоаты и т . д.

Для получения ацетата 20 цг стероида растворяют в пиридине и добавляют одну каплю ангидрида уксусной кислоты. Через 12 час избыток растворителя удаляют в вакууме при слабом нагревании.

Мангольд [44] предложил переводить ненасыщенные стероиды и ненасыщенные жирные кислоты в продукты присоединения ацетата ртути и затем разделять их методом ХТС. С получением других производных и методами работы со стероидами, в частности с выделением их из биологических материалов, можно познакомиться по работам Смита [70] и Ганча [23].

За это время опубликованы различные работы по разделению стероидов методом ХТС. При сравнении величин R^ которые следует рассматривать лишь как ориентировочные, можно заметить, что использованные методы частично отличаются от приведенных в настоящей книге, и поэтому величины R? лишь при определенных условиях совпадают с величинами, приведенными в табл. 42.

Барбье с сотрудниками [5], которые наряду с различными стеринами хроматографировали также стероиды, применяли, например, водную суспензию (1:3), и слои поэтому должны были быть значительно более тонкими. Растворители и величины Rf указаны в табл. 43. Длина пути составляла 14 см. Для обнаружения применяли реактивы № 12, 52 и 120.

Как нам удалось установить в случае других классов соединений, величины Rf, а также последовательность отдельных соединений на тонком незакрепленном слое сильно отличаются от величин Rf и последовательности на прочно связанном тонком слое (см. также стр. 12). По сравнению с многими преимуществами, которыми обладают прочно закрепленные слои (также и те, в которых не используется гипс ), меньшие времена анализа в случае незакрепленных слоев не имеют большого значения. Первые результаты разделения стероидов на незакрепленных слоях, полученные Ахремом и Кузнецовой [3, 4], приведены в табл. 43. Наряду с концентрированной серной кислотой для обнаружения были использованы также реактивы № 12, 52 и 120.

На незакрепленных слоях, состоящих в основном из окиси алюминия, проводили хроматографическое разделение Черни, Йоска и Лаблер [12], а также Германек, Шварц и Чекан [24].

Черни с сотрудниками [12] разделяли стерины, стероиды (прегнановые и андростановые соединения) и генины, используя растворители: гексан — бензол (70 + 30), бензол, бензол — эфир (70 + 30), эфир, эфир — этанол (98+ 2 или 96 + 4). В соответствии с увеличением полярных свойств растворителя для слабополярных стеринов используют первые из перечисленных растворителей, а для полярных стероидов — последние. Для обнаружения наряду с серной кислотой применяется реактив Драгендорфа (реактив № 60) и морин (реактив № 90е).

Растворители, использованные Германеком с сотрудниками [24], представляют собой смеси петролейный эфир — бензол и бензол — этанол различного состава. Для обнаружения стероидов применяют треххлористую

Таблица 43

Дополнительная сводка литературных данных по величинам hR^

п/п

Соединение

ДуХ xioo

Растворитель а

Метод

Литература

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

14-Этиен-ЗР-ол-17Р-метиловый эфир карбоновой кислоты-3-ацетат

8,14-Эти ен-Зр-ол-17-метиловый эфир карбоновой кислоты-3-ацетат

Этиан-ЗР-ол-17р-метиловый эфир карбоновой кислоты-3-ацетат . .

Этиан-Зр, 14р-диол-17р-метило- вый эфир карбоновой кислоты-3- ацетат

14,15-а-Этиан-ЗР-ол-17р-метило- вый эфир карбоновой кислоты-3- ацетат

8, 14-а-Этиан-Зр-о л-17р-мети ло вый эфир карбоновой кислоты-3-ацетат

Этиан-Зр, 15о-диол-17р-метило- вый эфир карбоновой кислоты-3- ацетат

Этиан-Зр, 12р-диол-17Р-метило- вый эфир карбоновой кислоты . .

Этиан-Зр, 12р-диол-17р-метило- вый эфир карбоновой кислоты-3- ацетат

Этиан-Зр, 12Р-диол-17Р-метило- вый эфир карбоновой кислоты- 3,12-диацетат

Этиан-Зр, 12р, 14Р-триолметило- вый эфир карбоновой кислоты- 3,12-диацетат

Этиая-Зр, 14р-диол-12-он-17р-ме- тиловый эфир карбоновой кислоты- 3-ацетат

Этиан-Зр-ол-12-он-17р-метиловый эфир карбоновой кислоты-3-ацетат

Этиан-Зр, 12р-диол-11-он-17р-ме- тиловый эфир карбоновой кислоты- 3,12-диацетат ..

Прегнан-За-о л-11,20-дион-З-ацетат

Этиан-За-ол-11-он-17р-метиловый эфир карбоновой кислоты-3-ацетат

Этиан-За-Нр-диол-17р-метиловый

47

47

47

22

23

18

16

54

8

40

52

42

41

48

32

43

58

I

I

I

I

I

I

I

II III

III

III

III

IV

III

III

III

III

Измененные стандартные условия

То же

»»

» »

» »

» »

» »

»»

» »

» »

» »

» »

» »

» »

» »

» »

5

эфир карбоновой кислоты-3-ацетат

52

III

» »

18

19

5-Андростен-Зр-ол-17-он . . . . 5-Аядростея-Зр-ол-17-он-3-ацетат

28

59

V

V

Незакрепленные слои

Продолжение табл. 43

п/п

Соединение

В гХ

Х100

Растворитель3

Метод

Литература

20

17а-Этинил-5-андростен-Зр,17р-

ДИОЛ

35

V

Незакрепленные слои

21

17а-Этинил-5-андростен-Зр,17Р- диол-3-ацетат

55

V

'»

>>

22

17а-Этинил-5-андростен-Зр,17р- диол-3,17-диацетат

75

V

)>

23

17а- Дибромэтинил-5-андростен- 5р-бром-3р, бр, 17[3-триол-3,17-ди-

ацетат

27

V

»

з,

4

24

5,6а-Оксидоандростан-3[3-ол-17- он-3-ацетат

34

V

»

»

66

VI

»

25

5,бр-Оксидоандростан-Зр-ол-17- он,3-ацетат

38

V

»

»

59

VI

»

26

5,6а-Оксидо-17а-этиниландростан-

3р,17р-диол-3-ацетат

80

VI

»

»

27

5,бр-Оксидо-17а-этиниландро- . стан-Зр, 17р-диол-3-ацетат . . . .

69

VI

»

>**

28

Кортизон

78

V

»

>>

29

17а-Этинил-4-андростен-17р-ол-3- он-17-ацетат

51

V

>>

86

VII

»

30

17а-Дибромацетил-4-андростен-

17Р-ол-3-он-17-ацетат

39

V

>>

75

VII

.>>

31 ■

17а-Ацетил-4-андростен-17р-ол-3-

он-17-ацетат

35

V

68

VII

32

4-Андростен-3,17-дион

34

V

»

65

VII

»

>>

а Растворители: I — циклогексан — этилацетат (854-15); II — н-гексан—этилацетат (254-75); III — циклогексан — этилацетат (704-30); IV — циклогексан — этилацетат (754-35); V — циклогексан — этилацетат (674-33); VI — циклогексан — этилацетат (50-|-50); VII — циклогексан — этилацетат (404-60).

сурьму (реактив № 12). Разделение и количественное определение эстрона, 17р-эстрадиола и 16а, 17р~эстрадиола описал Штрук [79]. Согласно стандартному методу, разделение осуществляют смесью бензол — этанол (90 + 10) (эстрон, Rf 0,51, эстрадиол Rf 0,30 и эстриол R( 0,11) и определяют спектрофотометрически при 242 лр после экстракции пятен 0,5 н. водно-спиртовым (80%) раствором NaOH. В дальнейшем анализом экстроге- нов методом ХТС занимался также Барбье с сотрудниками [6].

■ Бейлевельд [8] использовал метод ХТС для определения чистоты стероидов и для исследования соответствующих препаратов. Прекрасные результаты разделения документально подтверждены семью фотографиями. Матис с сотрудниками [461 показали, что можно разделять кортикостероиды также

на слоях сульфата кальция (гипса). Метод ХТС Егер с сотрудниками [26а] используют для изучения превращений, а Данненберг и Нейман [14] — для исследования диено-бензойной перегруппировки стероидов. Верли [90а] использовал наряду с хроматографией на бумаге также метод ХТС в качестве вспомогательного средства для идентификации.

В общем оказалось, что при исследовании стероидов все научно-исследовательские группы с наибольшим успехом применяли метод ХТС.

ОБНАРУЖЕНИЕ РАЗДЕЛЕННЫХ СТЕРОИДОВ РЕАКТИВАМИДЛЯ ОПРЫСКИВАНИЯ

Часть стероидных соединений можно открыть уже по цветным реакциям. Накопленный в настоящее время опыт, во всяком случае, не столь велик, чтобы имелась возможность уже по окраске определить строение, как это, например, можно делать в случае сердечных глюкозидов, посредством реакции со смесью хлорамин — трихлоруксусная кислота (стр. 277).

Имеется ряд указаний на то, что как раз на слоях силикагеля можно осуществить специфические и селективные цветные реакции. Сибликова и Хайс [64] исследовали цветные реакции 85 различных стероидов на фильтровальной бумаге. Ваксмут и Кекховен [88] также занимались цветными реакциями стероидов. Для обнаружения стероидов на неорганических тонкослойных пластинках в первую очередь пригодны: фосфорная кислота (реактив № 123), ангидрид уксусной кислоты — серная кислота (реактив № 63), треххлористая сурьма (реактив № 12) и ванилин — серная кислота (реактив № 151). ■

Нашими собственными опытами установлено, что для обнаружения всех стероидов особенно специфичной является 15%-ная фосфорная кислота, предложенная впервые Негером и Ветштейном [52, 531 для бумаги. Для опрыскивания тонкослойной хроматограммы выгоднее использовать 30— 40%-ную о-фосфорную кислоту. Опрыскивание обычно проводят до тех пор, пока слой не оказывается равномерно смоченным. Зоны липидов можно уже обнаружить непосредственно в виде беловатых «жирных пятен». После 7—15-минутного нагревания при ПО—120° стероиды интенсивно флуоресцируют в УФ-свете (365 жц). Окраска вначале слабая, затем постепенно усиливается; поэтому необходимо снять кинетическую кривую увеличения интенсивности окраски в процессе нагревания. Примерно через 8 мин, пластинки рассматривают при дневном свете и под аналитической кварцевой лампой, после чего нагревают еще 7 мин при 110°. Более длительное нагревание невыгодно.

Холестерин и его эфиры, которые при первом нагревании имеют в длинноволновом УФ-свете розово-красную окраску, становятся позже ржавокрасными.

Эстрогены в УФ-свете вначале становятся желтыми, затем оранжевыми и наконец оранжево-красными. Ярко-фиолетовую окраску имеют прегненолон и дегидроандростерон. Тестостерон и дигидротестостерон окрашены при дневном свете в темно-серо-синий цвет. Вначале окраска сзетло-синяя, при дальнейшем нагревании переходит в темно-зеленовато-синюю и затем темно-серо-синюю. При слишком длительном нагревании пятна становятся серо-черными. Такие соединения, как прегнандиол, аллопрегнандиол и прогестерон, обнаруживают в УФ-свете слабую флуоресценцию. Алдостерон, наоборот, флуоресцирует ярко-зеленым светом.

Указанные цвета устойчивы лишь непродолжительное время. Слои, опрыснутые фосфорной или серной кислотой, поглощают воду из воздуха, так что пятна постепенно расплываются. Поэтому слои сразу покрывают второй стеклянной пластинкой и таким образом достигают большей|устой- чивости окраски. Для документации рекомендуется цветная фотография.

Стероиды, которые фосфорной кислотой (7 мин, 100°) открываются не очень отчетливо, можно обнаружить в виде темно-синих пятен при последующем слабом опрыскивании свежеприготовленным 1,5%-ным спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты (реактив № 120 в) и 3-минутном нагревании. Уже при использовании одной фосфорномолибденовой кислоты можно получить цветную реакцию, однако лучше предварительно обработать пластинку фосфорной кислотой.

Другим специфичным реактивом для обнаружения стероидов является усовершенствованный реактив Либермана — Бурхарда (№ 63). После интенсивного опрыскивания слоя хроматограмму нагревают в течение 15—20 мин при 110°. Во время нагревания наблюдают окраску как при дневном свете, так и в длинноволновом УФ-свете.

Треххлористая сурьма (реактив № 12) не дает со стероидами характерных различий в окраске. После опрыскивания и нагревания в течение 15— 20 мин появляются пятна, дающие неспецифическую флуоресценцию в УФ- свете.

Для идентификации можно прежде всего использовать реактив № 151, ванилин — серная кислота. Реактив должен быть свежеприготовленным, и его следует наносить на слой в не слишком больших количествах. При нагревании в течение 5—10 мин при 110° появляются окрашенные пятна стероидов, которые в УФ-свете не дают флуоресценции. Если покрыть хроматограмму второй стеклянной пластинкой, окрашенные пятна сохраняются продолжительное время.

СПЕЦИАЛЬНОЕ ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ХТС В ХИМИИ СТЕРОИДОВ

Определение стабильности при хранениипроизводных эстрена в таблетках

Исследованием производных эстрена занимались Фокенс и Полдерман [16]. Соединения 17|3-окси-4-эстрена, имеющие различные заместители в положении 17а, проверялись на стабильность. Большие различия в стабильности могут быть выравнены путем добавки антиокислителей (EDTA).

Разделение осуществляли стандартным методом смесью н-гептан — ацетон (50 + 25) и обнаруживали стероиды в виде флуоресцирующих пятен, опрыскивая треххлористой сурьмой (реактив № 12), причем были получены следующие величины RfX 100:

17а-этинил-4-эстрен-17|3-ол48

17а-метил-4-эстрен-17|3-ол50

17а-этил-4-эстрен-17|3-ол57

17а-пропил-4-эстрен-17|3-ол57

17а-аллил-4-эстрен-17|3-ол59

Экспресс-анализ для контроля, ферментативныхпревращений стероидов

При ферментативных синтезах стероидов, например при введении гидроксильных групп в стероидный скелет с помощью культуры соответствующих микроорганизмов, чрезвычайно важен контроль реакции. Необходимо определить наличие нежелательных побочных реакций и точно установить конечную точку желаемой реакции. Метц [47] описал стандартный контроль подобных растворов культур. В промышленности 200 мл 0,05%-ной суспензии экстрагируют хлороформом и полученный экстракт исследуют методом ХТС. В лабораторных опытах с небольшими количествами из пробы в 2 мл суспензии можно получить достаточное количество стероидов для идентификации.

Для этого экстракт вначале наносят на язычок фильтровальной бумаги и с его кончика переносят на слой силикагеля.

Метц разделял стероиды на слоях силикагеля, используя смесь хлороформ — ацетон или хлороформ — этилацетат. В качестве реактивов для обнаружения он предложил фосфорную кислоту (реактив № 123), ванилин и фосфорную кислоту (реактив № 149), анисовый альдегид и серную кислоту (реактив № 9) и треххлористую сурьму (реактив № 12). Для количественных сравнительных определений используется хлорная кислота (2%-ный водный раствор; после опрыскивания нагревают в течение 10 мин при 150°), а в случае восстанавливаемых стероидов 2,3,5-трифенилтетразолийхлорид (реактив № 145).

Обнаружение стероидов в моче человека

В разделе, посвященном медицине (гл. 16), описана проба на ранний период беременности, основанная на обнаружении прегнан-3а,20а-диола и аллопрегнан-3а,20а-диола в моче.

Проба может быть положительной также и в том случае, когда исследуемый больной принимает гестаген или когда почки вследствие перегрузки вынуждены работать с большим напряжением (Стресс). В этих случаях методом ХТС можно обнаружить и другие стероиды, например прегнантриол. При нормальной беременности такие стероиды почти не появляются в моче. Появление больших количеств прегнантриола в моче является указанием, что имеет место адреногенитальный синдром. Старка с сотрудниками [75] осуществили эту пробу на свободных слоях окиси алюминия. В случае синдрома Кашинга выделяется пониженное количество 17-кетостероидов, которые были разделены Райзертом с сотрудниками [611 на слоях силикагеля Г длиной 50 см.

80% стероидов мочи находится в виде глюкуронидов, а остаток — в виде сульфата (эстрон) пли в свободном состоянии. Кислотный гидролиз имеет перед ферментативным преимущество, заключающееся в большей скорости расщепления. Однако в случае чувствительных стероидов кислоты могут вызвать химические изменения. Для выделения кортикостероидов необходима специальная защита, поскольку возможны изменения окислительного типа в боковой цепи 17 и даже отщепление, боковой цепи, приводящее к образованию андрогенов (17-кетостероидов). Гестагены (производные прогестерона) в общем несколько более стабильны, как показывает проба на раннюю стадию беременности. Во всех случаях выгоднее проводить гидролиз по возможности в мягких условиях, в атмосфере азота. .

ЖЕЛЧНЫЕ КИСЛОТЫ

Подобно кортикостероидам желчные кислоты хроматографируются в соответствии с их полярностью. Если желчная кислота связана с аминокислотой пептидной связью, как, например, таурохолевая или гликохолевая кислота, то следует использовать растворитель, содержащий сильно гидрофильный компонент, например метанол или воду.

Холевая кислота, R7=OH Дезоксихолевая кислота, R7—НХолевая кислота, R7=OH Дезоксихолевая кислота, R7—НДегидрохолевая кислотаДегидрохолевая кислота

Холевая кислота, R7=OH Дезоксихолевая кислота, R7—Н

Холевая кислота, R7=OH Дезоксихолевая кислота, R7—Н

Дегидрохолевая кислота

Дегидрохолевая кислота

Генсхирт, Косс и Морианц [17] впервые разделили различные желчные кислоты на слоях силикагеля, используя растворители: толуол — ледяная уксусная кислота — вода (табл. 44а № IX и X) и бутанол — ледяная уксусная кислота — вода (XI) (рис. 124 и 125). Отдельные пятна количественно определяли фотометрически.

Таблица 44а

Разделение желчных кислот на силикагеле Г с различными растворителями

Желчная кислота

ВуХ

100 в рстворителеа

1—(

НН

н

+

+

£

+

5

у

й

1. Холевая

0

0

0

0

0

12

13

55

21

53

73

2. Дезоксихолевая . .

12

16

13

25

25

54

70

85

38

65

81

3. Дегидрохолевая . .

4. 3,12-Диацетоксихо-

14

21

70

65

65

78

90

97

37

65

70

лановая

5. За-Окси-(7,8)-11,12-

19

25

—

66

—

—

—

—

20

—

75

холадиеновая . . .

6. За-Окси-(8,14)-11,12-

28

33

—

78

—

—

—

—

38

—

77

холадиеновая . . ,

22