МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ, ЭКСПРЕССИЯ И РЕГУЛЯЦИЯ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ ГЕНОВ

ВВЕДЕНИЕ

Молекулярное клонирование создало предпосылки для изучения практически любой части любого генома и позволило решить очень серьезные проблемы, связанные со сложностью геномов эукариот и трудностью их генетического анализа. Сейчас мы можем получать в чистом виде нужные нам фрагменты ДНК самых разных геномов в количестве достаточном для их исчерпывающего химического анализа, причем применение эндонуклеаз рестрикции и методов определения нуклеотидных последовательностей делает эту работу почти рутинной. Локализация перекрывающихся участков клонированных сегментов ДНК уже позволила установить нуклеотидные последовательности областей генома млекопитающих длиной более 150 т. п. н. И хотя геномы эукариот имеют огромные размеры и чрезвычайно сложное строение (табл. III. 1), детальное изучение их молекулярной организации уже не представляется невозможным; теперь это в основном вопрос времени и средств. На расшифровку последовательности генома фага X длиной 50 т. п. н. потребовалось около пяти человеко-лет. Благодаря использованию усовершенствованных методов секвенирования ДНК удалось достичь больших успехов в определении нуклеотидной последовательности хромосомы Е. coli, состоящей из четырех миллионов пар оснований, а сейчас проводится исследование короткой хромосомы человека, которая по длине только в десять раз больше хромосомы Е. сок

Зная нуклеотидную последовательность того или иного гена и примыкающих к нему сегментов ДНК, мы еще ничего не можем сказать о том, как работает этот ген, как осуществляется регуляция его экспрессии при развитии и дифференцировке или при ответе на изменения окружающей среды. Нуклеотидная последовательность сама по себе не говорит ни о способе координации генной экспрессии, обеспечивающей сложное физиологическое равновесие, характерное для клеток здорового организма, ни

о том, каким образом продукт поврежденного гена или изменение скорости экспрессии гена нарушают нормальное функционирование организма или приводят к тому или иному заболеванию. Для того чтобы ответить на все эти вопросы, необходимы специальные биологические исследования. И в этом случае мощным инструментом оказывается технология рекомбинантных ДНК. Если клонированные гены ввести в клетки при помощи трансфекции или

Таблица 111.1. Размер некоторых эукариотических геномов

ОрганизмПримерный размер

Гаплоидное

гаплоидного генома.

число

П.Н.

хромосом

Дрожжи (Saccharomices cerevisiae)

1,35 IO7

16

Миксомицеты (Dictyoste- lium discoides)

7-107

7

Трипаносома (Trypanosoma brucei)

8-107

Неизвестно

Нематода (Caenorhabditis elegans)

8-107

11/12

Шелкопряд (Bombyx mori)

5-10B

28

Плодовая мушка (Drosophila melanogaster)

1,65-10®

4

Морской еж (Strongylocen- trotus purpuratus)

8-10®

21

Шпорцевая лягушка (Xe- nopus laevis)

3 109

18

Протей (Necturus maculo- sis)

5-IO10

19

Курица (Gallus domesticus)

1,2-109

39

Мышь (Mus musculus)

3 109

20

Корова (Bovis domesticus)

3,1 ■ 109

60

Человек (Homo sapiens)

2,9-109

23

Кукуруза (Zea mays)

5 109

10

Лук (Allium сера)

1,5- IO10

8

Арабидопсис (Arabidopsis thaliana)

7 107

5

E.coliE.colipoll+1 -*^^^*poll+1 -*^^^*Разное расстояниеРазное расстояние+ 1 —+ 1 —

E.coli

E.coli

poll+1 -*

^^^*

poll+1 -*

^^^*

Разное расстояние

Разное расстояние

+ 1 —

+ 1 —

Таблица III.2. Вставочные последовательности в некоторых генах

Продукт гена

Организм

Экзоны

суммарная

длина, п.н.

Интроны

число

суммарная длина, п.н.

Аденозиндезаминаза

Человек

1500

11

30000

Аполипопротеин В

«

14000

28

29000

Р-Глобин

Мышь

432

2

762

Цитохром b

Дрожжи

2200

6

5100

Дигидрофолатредуктаза

(митохондрии) Мышь

568

5

31 500

Эритропоэтин

Человек

582

4

1562

Фактор VIII

«

9000

25

177000

Фиброин (шелк)

Шелкопряд

18000

1

970

Гипоксантин-фосфорибо-

Мышь

1307

8

32000

зилтрансфераза а-Интерферон

Человек

600

0

0

Рецептор липополипроте-

«

5100

17

40000

ина низкой плотности Фазеолин

Фасоль

1263

5

515

Тиреоглобулин

Человек

8500

>40

100000

трнКТуг

Дрожжи

76

1

14

Субъединица уриказы

Соя

300

7

4500

Вителлогенин

Шпорцевая

6300

33

20000

Зеин

лягушка

Кукуруза

700

0

0

Точка Регуляторный инициации участок +транскрипции г "ft-Г-—

-35 -10

РИС. 111.3.

Схематическое изображение элементов, ответственных за регуляцию инициации транскрипции, осуществляемой с помощью РНК-полимеразы Е.соН (гл. 3) и трех эукариотических РНК-полимераз. РНК-полимераза I (poll) транскрибирует гены рибосомных РНК. Ее работа зависит от двух элементов, один из которых находится в окрестности точки инициации транскрипции (нуклеотид + 1), а другой- на расстоянии от нескольких сотен до нескольких тысяч пар нуклеотидов до транскрибируемого гена. РНК-полимераза II (polll) транскрибирует гены, кодирующие полипептиды и некоторые РНК. Ее работа зависит от нескольких сложно организованных регуляторных элементов, одни из которых находятся на расстоянии не далее 100 нуклеотидов от точки инициации транскрипции, а другие-на расстоянии от 300 до 20000 п.н. слева от этой точки; в некоторых случаях важные регуляторные элементы находятся также в самом транскрибируемом гене или за ним (заметим, что интроны и один иэ экзонов расположены так же, как на рис. Ш.1.). РНК-полимераза III (pollll) транскрибирует гены, кодирующие транспортные РНК, 5S-pPHK и другие низкомолекулярные РНК.

ментов. К элементам первого типа относятся последовательности, которые задают начало транскрипции; характерной особенностью промоторов Е. coli является наличие двух участков ДНК, которые расположены на расстоянии примерно 10 и 35 пар оснований от точки начала транскрипции. Элементы второго типа задают конец гена или группы генов и обусловливают терминацию транскрипции. И наконец, существуют последовательности ДНК, примыкающие к промотору, перекрывающиеся с ним или располагающиеся сразу после него, которые узнаются специфическими эффекторами - репрессорами, активаторами и антитерминаторами,- регулирующими транскрипцию. Влияние всех этих регуляторных последовательностей на экспрессию соседствующих с ними кодирующих областей зависит от их взаимодействий с белками.

Последовательности ДНК, ответственные за регуляцию экспрессии эукариотических генов, находятся в разных местах молекулы, на различных расстояниях и по разные стороны от сайтов начала и конца транскрипции. Более того, три РНК-полимеразы, I, II и III, транскрибируют три разных класса генов, и для каждого класса характерны свои специфические способы регуляции транскрипции и свои сигналы терминации. Молекулярно-генетические и биохимические исследования позволили установить механизмы регуляции транскрипции и создали предпосылки для выяснения природы дифференциальной экспрессии генов. Итак, регуляторные последовательности состоят из сложных наборов относительно коротких последовательностей ДНК. С каждой такой последовательностью связывается специфический белок, фактор транскрипции. Например, гены, которые транскрибируются только в лимфоидных клетках, содержат набор последовательностей, узнаваемых факторами транскрипции, характерными только для лимфоидных клеток. Аналогично этому гены, экспрессируемые в строго определенное время или при определенных условиях окружающей среды, содержат регуляторные элементы, взаимодействующие с соответствующими белками, которые присутствуют в клетке или активируются именно в это время или при данных условиях. Таким образом, регуляция транскрипции каждого гена определяется специфическим набором расположенных особым образом элементов, наличием соответствующих факторов транскрипции и белковых факторов, влияющих на инициацию транскрипции. Связывание различных факторов транскрипции с регуляторными последовательностями приводит либо к сборке транскрипционного комплекса, включающего соответствующую РНК-полимеразу, либо к активации такого комплекса, либо и к тому, и к другому.

Замечательной особенностью этих механизмов является их универсальность. Удивительно, что со

ответствующие факторы транскрипции из таких разных источников, как дрожжи, Drosophila и млекопитающие, оказались взаимозаменяемыми. Так, фактор транскрипции дрожжей и Drosophila может взаимодействовать с регуляторными элементами и с белками транскрипционного комплекса млекопитающих так же, как и соответствующий фактор млекопитающих. Часто наблюдается и обратное. Отсюда можно сделать вывод, что структура специфических молекул в ходе эволюции в основном сохраняется.

Механизм терминации транскрипции уникален для каждой из трех РНК-полимераз; каждый фермент узнает определенную последовательность на конце транскрипционной единицы или вблизи него. Эти последовательности тоже взаимодействуют со специфическими белками-факторами терминации. Регуляция терминации зависит от расположения указанных последовательностей ДНК и от образования мультибелковых комплексов, которые содействуют терминации транскрипции и модификации конца молекулы РНК.

На экспрессию некоторых генов влияют эпигенетические факторы, которые изменяют способность гена к экспрессии, не затрагивая базовой нуклеотидной последовательности. Одна из установленных форм эпигенетического изменения связана со степенью метилирования остатков цитозина в последовательностях 5'-CG, фланкирующих 5'-область гена. Повышение степени метилирования в этом участке коррелирует с уменьшением или полным подавлением экспрессии соседнего гена, а понижение с повышением уровня экспрессии. На экспрессию генов могут влиять и структурные изменения в самом хроматине, которые до сих пор слабо изучены; при этом высокий уровень экспрессии, по-видимому, наблюдается только в «развернутых» участках хроматина.

Все эти весьма неожиданные свойства эукариотических генов послужили поводом к дискуссии о том, что же такое единица наследственности-ген. Ни одно из нескольких предложенных определений нельзя признать полностью удовлетворительным или пригодным для любого гена. Исходя из целей, поставленных в этой книге, мы выбрали молекулярное определение гена (рис. III.4): эукариотический ген- это совокупность сегментов ДНК, составляющих экспрессируемую единицу, которая дает начало одному или нескольким специфическим функциональным продуктам-молекулам РНК либо полипептидам. Сегментами гена являются: 1) транскрибируемая область (единица транскрипции), которая включает кодирующие последовательности, вставочные последовательности, любые 5'-лидерные и З'-трейлерные последовательности, находящиеся по краям кодирующих последовательностей, и любые

+ ^ tИнтроны

*" Й Й п «Н~

5-<рланки- -1Единица транскрипции_3-фланки- рующий участокрующии участок

Транскрипция

5-лидернаяпоследовательность5-лидернаяпоследовательность3-трейлерная последовательность

5-лидерная

последовательность

5-лидерная

последовательность

РНК-транскрипт q

РИС. 111.4.

Сегменты ДНК, составляющие ген: 1) единица транскрипции, которая содержит 5'-лидерный и З'-трейлер- ный сегменты, а также интроны; 2) регуляторные элементы, которые могут находиться вне единицы транскрипции ипи внутри нее. Гены принято изображать слева направо в направлении транскрипции. Цепь ДНК. имеющая ту же последовательность, что и матричная РНК, называется значащей, и ее 5'-конец изображают

слева, а З'-конец- справа. Для удобства часто указывают только одну эту цепь. Цепь ДНК, комплементарная матричной РНК, называется незначащей или матричной. Названия «5'- и З'-фланкирующие последовательности» относятся к участкам, предшествующим транскрибируемым областям или располагающимся сразу за ними соответственно.

регуляторные элементы, содержащиеся в единице транскрипции; 2) фланкирующие единицу транскрипции регуляторные последовательности, необходимые для специфической экспрессии.

У прокариот основным способом регуляции экспрессии гена является, по-видимому, включение выключение транскрипции, хотя в некоторых случаях вступают в действие другие механизмы, например аттенуация, терминация, антитерминация, контроль трансляции и регуляция метаболизма матричных РНК и белков. Подобно этому элементы, осуществляющие включение и выключение транскрипции, играют решающую роль в регуляции экспрессии генов также у эукариот. От сплайсинга, особенно от его способа, зависит, какие именно образуются матричные РНК и соответственно кодируемые ими белки. Кроме того, имеются данные о регуляции при помощи аттенуации или терминации транскрипции, а также указания на то, что трансляция и метаболизм РНК тоже подвержены регуляции в процессе синтеза белков. Уникальные свойства эукариотических клеток и структура их генов и геномов обеспечивают дополнительные возможности для контроля передачи генетической информации. Например, полный транскрипт гена остается нефункциональным до тех пор, пока не будут правильно вырезаны входящие в него интроны. Далее транскрипты предшественники матричных РНК- должны быть модифицированы на 5'- и З'-концах, а сами матричные РНК должны перейти из ядра в цитоплазму, прежде чем они смогут участвовать в трансляции. В принципе регуляция может осуществляться на каждом из этих этапов.

СТРОЕНИЕ ГЕНОМА ЭУКАРИОТ

Точно так же. как различается строение эукариотических генов и генов прокариот, различается и организация геномов этих двух типов организмов. В бактериальном геноме гены почти непрерывно следуют один за другим по всей длине молекулы ДНК, а в некоторых случаях даже перекрываются. Гены, кодирующие ферменты одного метаболического пути. или ферменты, активности которых так или иначе связаны между собой, часто образуют одну единицу транскрипции. Это способствует наиболее эффективному использованию нуклеотидной последовательности ДНК. Но, по-видимому, для эволюции эукариот принцип экономии был не столь важен, как для эволюции прокариот. Не говоря уже о том, что большую часть ДНК занимают интроны, эукариотические гены разделены длинными некоди- руюшими участками. Как мы уже упоминали, большое число генов в одной единице транскрипции встречается редко.

При обсуждении организации эукариотического генома нельзя не отметить тот основополагающий факт, что сама ДНК распределена по нескольким хромосомам. Клеточные хромосомы, вероятно, всегда содержат линейную дуплексную ДНК, хотя вдоль линейного остова встречаются двухцепочечные петли. Каждая хромосома в интерфазе содержит одну двойную спираль ДНК, как и каждая из двух сестринских хроматид метафазной хромосомы. Геномы многих вирусов эукариот, а также хромосомы хлоропластов и многих митохондрий представлены кольцевой ДНК.

Хромосомные карты

В распределении генов по хромосомам не было обнаружено очевидных закономерностей. Об этом свидетельствовали еще данные по детальному картированию генов D. melanogaster генетическими и цитогенетическими методами. Впрочем, эти карты были получены лишь для небольшой части всей ДНК, а генетические карты геномов млекопитающих были изучены еще меньше. К 1973 г. на аутосомных хромосомах человека было локализовано всего около 60 генов, а к 1981 г,-уже 400. В настоящее время благодаря простоте получения фрагментов клонированной ДНК их число превысило 1000 (табл. III.3). Однако даже с построением весьма протяженных карт никакой системы в расположении генов выявлено не было. Родственные гены или гены, представленные несколькими копиями, могут находиться рядом, а могут быть разбросаны по разным хромосомам. Например, гены, кодирующие актин сердечной и скелетной мышц человека, на-

Таблица II 1.3. Локализация некоторых генов в хромосомах человека

Гены

Хромосома

Кнастер генов а-глобинов

16

Кластер генов Р-глобинов Гены иммуноглобулина

11

к (легкая цепь)

2

X (легкая цепь)

22

Тяжелая цепь

14

Псевдогены

Гомологи вирусных онкогенов

9, 32, 15, 18

CSLS

22

c-mos

8

c-mvb

6

c-Ha-ras-1

11

c-fes

15

Ген S-аденозилмоноцистеингидролазы

20

Ген аденозиндезаминазы

Гены интерферонов

20

а-Кластср

9

Р-Кластер

9

Y

12

Кластер генов гормона роста

17

Ген пролактина

6

Гены главного комплекса гистосовмести-

■6

мости (I. И. Ill)

Гены тяжелых цепей саркомерного мио-

17

зина

Ген тимидинкиназы

17

Ген галактокиназы

17

Ген инсулина

11

Ген паратиреоидного гормона Ген фактора роста нервной ткани,

11

1

Р-субъединица

(-ф^ ^а2 фа1 «2«1

[8

Хромосома 16

а-Глобиновый локус

1^/32 £Gy Ay Зрр1 8/3

Хромосома 11

B-Глобиновый локус РИС. 111.5.

Кластеры генов а- и р-глобинов человека. В обоих кластерах присутствуют псевдогены (ч*)-

ходятся в 15-й и 1-й хромосомах соответственно. Далее, гены, кодирующие пять различных типов Р-глобина человека, тандемно расположены в 11-й хромосоме, а гены, кодирующие ct-глобины, сгруппированы в 16-й хромосоме. Все эти гены родственны друг другу, и для образования глобинов, входящих в состав гемоглобина, требуются полипептиды обоих типов (рис. III.5).

Клонируемые сегменты часто содержат не только определенный ген, но и протяженные участки примыкающей к нему ДНК. Если использовать в качестве зондов однокопийные фланкирующие фрагменты ДНК, то из геномной библиотеки можно выделить перекрывающиеся фрагменты. Это позволяет охватить протяженные области хромосомы и получить их детальные карты. В этих картах содержится информация и о структуре генов, и о их функции. Так, например, в виде перекрывающихся фрагментов был представлен сегмент ДНК человека размером 65 т. п. н„ включающий пять генов Р-глобина человека, что позволило определить его нуклеотидную последовательность и локализовать кодирующие, регуляторные и вставочные последовательности.

Для анализа различий нуклеотидных последовательностей аллелей чрезвычайно полезны карты сайтов эндонуклеаз рестрикции. Например, используя в качестве зонда для гибридизации клонированный фрагмент из кластера Р-глобиновых генов человека, при помощи эндонуклеазного расщепления и ДНК-блоттинга можно исследовать структуру р-глобиновой области из разных источников (рис. 111.6). Если размер фрагмента генома, который гибридизуется с зондом, различен, это означает, что различна и последовательность нуклеотидов в данном сайте рестрикции или между двумя сайтами вследствие делении либо инсерции; отсутствие гиб- ридизующегося фрагмента означает, что делегирована целая область. Такие изменения, или поли-

ДНК с нормальным р-глобиновым геном

D ♦

CTGAG GACTC

н-Зонд—I

ДНК с мутантным р-глобиновым геном, ответственным за серповидно-клеточную анемию

(CTGTGГ

(GA АС

।Зонд1

Эндонуклеаза Ddel

Электрофорез и блоттинг

Гибридизация

с зондом

201 п.н.

175п.н.

376 П.н.

РИС. 111.6.

Идентификация мутации в р-глобиновом гене, ответственной за серповидно-клеточную анемию, при помощи зндонуклеазного расщепления Изображены нормальная и мутантная ДНК. Замена той пары оснований, которая обусловливает данное заболевание, приводит к разрушению сайта узнавания для рестриктазы Dde\. После расщепления с помощью Dde\, гель-злектрофо- реза и ДНК-блоттинга с радиоактивным зондом, комплементарным данному участку р-глобинового гена, нормальная ДНК дает две полосы, а мутантная-одну.

морфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ), даже если они не отражаются на фенотипе целого организма, служат генетическими маркерами, не менее полезными, чем классические маркеры, использующиеся для генетического анализа больших семей и популяций человека. Этот подход применялся при изучении наследования гемоглобинопатий и других генетических заболеваний. Более того, наборы полиморфных фрагментов рестрикции из разных частей данной хромосомы могут использоваться в качестве маркеров для анализа обычного генетического сцепления, что позволит конструировать генетические карты даже в отсутствие традиционных фенотипических маркеров. Такой подход применялся для установления порядка расположения нескольких генов на коротком плече 11-й хромосомы человека: центромера каталаза-паратиреоидный гормон- е-глобин- Р-глобин- инсулин пепсиноген.

Одно из удивительных открытий, сделанных в ходе этих исследований,- очень высокая частота раз

личий нуклеотидных последовательностей у разных индивидов. Классический генетический анализ мутаций по определению имел дело с изменениями генома, приводящими к явным фенотипическим изменениям. Казалось разумным предположить, что геномы нормальных особей (или особей «дикого типа») очень мало отличаются друг от друга. Это упрощенное представление часто подкреплялось ссылками на доминантные и рецессивные аллели, что подразумевало существование всего двух или очень небольшого числа аллелей одного гена. В действительности же полиморфизм длины рестрикционных фрагментов- частое явление как в кодирующих, так и в некодирующих областях, что указывает на большое разнообразие геномов у различных особей одного вида без заметных фенотипических проявлений. Небольшие различия, обусловленные полиморфизмом, не исключены, но большинство из них скорее всего несущественны.

Размеры эукариотических геномов

Молекулярный анализ геномов эукариот объясняет также тот кажущийся парадокс, что эукариотические геномы содержат гораздо больше ДНК, чем это представляется необходимым. По оценкам, сделанным более 20 лет назад, если бы эукариоты содержали 100000 генов, то при среднем размере кодирующего участка гена 1200 п.н. геном должен был бы содержать всего лишь ~ 12-107 п. н. Размер генома некоторых грибов действительно не превы-

шает указанной величины, но в основном геномы млекопитающих и растений содержат в 20-50 раз больше ДНК (табл. III.1). Существование «избыточной» ДНК отчасти можно объяснить тем, что в геноме имеются вставочные последовательности (табл. III.2) и протяженные участки ДНК между генами

Большой размер генома эукариот может объясняться и тем, что некоторые гены встречаются в геноме много раз. Существование большого числа копий отдельных генов свойственно не только эукариотам: так, Е. coli содержит примерно семь генов рибосомной РНК, что можно объяснить необходимостью быстрого синтеза большого числа рибосом. Той же цели может служить и наличие множественных копий одного гена у эукариот; например, у млекопитающих имеется несколько сотен генов рибосомной ДНК. Свой вклад в «избыточную» ДНК вносят также нефункциональные копии генов. Эти дополнительные копии называются псевдогенами и обычно не способны к передаче полезной информации из-за делеций или других изменений в их последовательности. Число псевдогенов конкретного гена очень сильно варьирует от особи к особи. Таким образом, в геноме эукариот ген может быть представлен в единственном числе или являться частью множества повторяющихся последовательностей, собранных вместе или разобщенных. Повторяющиеся последовательности могут содержать либо несколько близкородственных функциональных генов, которые, однако, экспрессируются на разных стадиях развития или в разных тканях (клетках), либо псевдогены, либо и то и другое (рис. III.5).

Большой размер эукариотических геномов обусловлен также наличием в них множества повторяющихся последовательностей ДНК с неизвестными функциями. На их долю приходится обычно 10%, а в некоторых случаях почти 50% генома. Более 15 лет назад при помощи кинетического анализа реассоциации денатурированной эукариотической ДНК было показано, что значительная часть ДНК ренатурирует гораздо быстрее, чем можно было бы ожидать для уникальных последовательностей ДНК. Высокая скорость реассоциации говорит о том, что такие геномы содержат фрагменты, повторяющиеся от сотен тысяч до миллионов раз. В настоящее время с помощью молекулярного клонирования и секвенирования подтверждено существование таких последовательностей ДНК с большим числом повторов, которые, подобно повторяющимся генам, могут располагаться либо тандемно, либо изолированно друг от друга среди неродственных геномных локусов.

Связь между специфическимипоследовательностями ДНК иморфологией хромосомы

Как показал молекулярный анализ, определенные типы последовательностей ДНК коррелируют с некоторыми отличительными морфологическими признаками хромосом. Участки хромосом, называемые ядрышковыми организаторами, несут гены рибосомной РНК. Области теломер и центромер большей части эукариотических хромосом содержат тандемно повторяющиеся нуклеотидные последовательности. Хотя на долю этих повторяющихся последовательностей часто приходится 10 и более процентов всей геномной ДНК, их функция до конца не выяснена. Возможно, что такие последовательности несущественны для функции центромеры, поскольку они отсутствуют в хромосомах дрожжей (Saccharomyces cerevisiae), где центромеры нормально функционируют и в митозе, и в мейозе.

ПЕРЕСТРОЙКИ

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК

Расположение генов и большей части других последовательностей в хромосоме остается практически постоянным, и это создает основу для построения хромосомных карт. Генетическая информация может перераспределяться между гомологичными хромосомами при реципрокном кроссин- говере в мейозе и в митозе. Однако, несмотря на то что при этом возникают новые комбинации аллелей, порядок расположения последовательностей ДНК не меняется. И в самом деле, многие связи между генами значительно старше, чем отдельные виды, и гены, являющиеся синтенными (т. е находящимися на одной хромосоме) у одних млекопитающих, часто остаются синтенными даже у млекопитающих разных отрядов. Тем не менее стабильность, лежащая в основе организации генома, сочетается со способностью к перераспределению генетической информации. Перестройки могут происходить случайно, часто приводя к вредным мутациям. Но некоторые перестройки - нормальный процесс, изменяющий экспрессию гена упорядоченным и запрограммированным способом.

Хромосомные аберрации, например разрыв хромосомы, транслокация частей одной хромосомы в другую, негомологичную хромосому или образование дицентрических и ацентрических хромосом, известны давно. На молекулярном уровне все эти морфологические изменения проявляются в изменении строения ДНК. Генетическую информацию о ферментативном аппарате, ответственном за перестройки генов, содержат все организмы (разд.

2.4). Процессы перестройки включают в себя: 1) нереципрокный и неаллельный кроссинговер и конверсию генов; 2) транспозицию фрагментов ДНК из одного локуса генома в другой; 3) образование дополнительных копий последовательностей ДНК, которые располагаются либо тандемно, либо в разных участках генома; этот процесс называется амплификацией; 4) делецию участков ДНК; 5) негомологичную рекомбинацию. Изменчивость организации генома-одно из важнейших открытий молекулярной генетики, особенно ценное ввиду того, что перестройки последовательностей ДНК относятся к очень редким событиям. В значительной мере это открытие стало возможным благодаря точности методов молекулярной генетики в сочетании с высокой избирательностью методов классического генетического анализа.

Случайные перестройки генома

Непрограммируемые перестройки обычно происходят в случайный момент времени и/или в случайном месте и часто приводят к вредным мутациям. Однако они могут также вызывать и, возможно, вызывали в прошлом мутации, позволяющие организму по-новому реагировать на условия окружающей среды, способствуя таким образом эволюционным изменениям. Конечно, для того чтобы случайные перестройки имели эволюционное значение, они должны происходить в линиях зародышевых клеток или их предшественников; подобные процессы, протекающие в отдельной соматической клетке, могут не иметь никаких последствий для целого организма. Если же соматическая клетка является стволовой, то случайные перестройки могут воспрепятствовать появлению функционально активного дифференцированного потомства; кроме того, изменение может быть онкогенным, т. е. приводить к образованию опухоли.

Особенно сильно поражает воображение один из видов случайных геномных перестроек-перемещение фрагментов ДНК из одного места генома в другое. О «прыгающих генах» много говорилось даже в газетах и журналах. Предположение о существовании мобильных элементов генома было высказано в середине 1940-х гг. исходя из результатов опытов по генетике и цитогенетике кукурузы. Спустя 20 лет ученые, занимающиеся исследованием бактерий, получили экспериментальные данные, подтверждающие это предположение: определенные фрагменты ДНК действительно перемещаются. В конце концов было установлено, что как в эукариотических, так и в прокариотических геномах существует много типов мобильных элементов. С помощью молекулярного клонирования удалось определить структуру многих мобильных элементов

и попытаться расшифровать реальные механизмы их перемещения из одного места генома в другое. Мобильные элементы-это генетические «нарушители спокойствия», вызывающие разнообразные мутации у про- и эукариот. Если они внедряются в кодирующую последовательность гена, то ген утрачивает свою функцию. Если перемещенный элемент окажется рядом с геном, то экспрессия этого гена может изменяться неоднозначным образом. Многие мутации, весьма полезные для изучения генетики D. melanogaster в начале века, на самом деле были связаны с внедрением мобильных элементов в гены.

Программируемые перестройки

Известно, что экспрессия генов может существенным образом зависеть от тех изменений, которые происходят во фланкирующих участках. В со-

В-клетках

vi Jk. с Сплайсинг

S—5S—S

N Н2 <ХХХ)ЙООООО©©0©0@0-соонV; Jk с

РИС. 111.7.

Перестройки, приводящие к образованию генов, кодирующих различные антитела. Эти перестройки осуществляются в В-лимфоцитах путем соединения сегментов ДНК, далеко отстоящих друг от друга в ДНК клеток зародышевой линии и различных соматических клеток. В качестве примера рассмотрено образование гена легкой цепи иммуноглобулина из трех сегментов ДНК (V, J и С), которые вместе кодируют данный полипептид. Каждый из множества сегментов V и J генома соединяется с единственным сегментом С. Гены иммуноглобулинов отличаются друг от друга сегментами V и J. В данном примере с С соединены V; и Jk. Разнообразие белковых антител отчасти обусловливается различием аминокислот, кодируемых разными Vs и Js (вариабельная область).

седстве с одними последовательностями ген может «молчать», а при изменениях в них-экспрессироваться. Такие перестройки используются организмами для регуляции экспрессии генов, что создает необходимые условия для выполнения дифференцированными клетками специфических функций. Таким образом, существуют генетические программы. которые вызывают перестройки в особых сегментах ДНК в определенное время и в определенных клетках.

Задолго до того, как появилась возможность исследовать гены и геномы на молекулярном уровне, генетики высказывали предположение, что некоторые загадочные биологические явления можно объяснить специфическими перестройками генов. Одно из таких явлений - наличие разных типов жгутиков у разных особей Salmonella typhimurium. Другое, еще более замечательнее явление- необычайное разнообразие антител, которые могут вырабатываться у млекопитающих. Как показал молекулярный анализ, в основе всех этих явлений лежат программируемые перестройки последовательностей ДНК (пример с иммуноглобулином схематически представлен на рис. III.7). В обоих случаях реорганизация генома предпринимается для защиты организма от опасности. Меняя жгутики, Salmonella отражает иммунологическую «атаку» организма хозяина Создавая новые антитела, организм защищается от действия чужеродных агентов.

ЭВОЛЮЦИОННЫЕ АСПЕКТЫ

История эволюции организмов записана в их геномах. Мутации и перестройки обусловливают

Приматы Пшеница Дрожжи

Приматы Пшеница Дрожжи

Приматы Пшеница Дрожжи

Приматы Пшеница Дрожжи

Приматы Пшеница Дрожжи

РИС. III.I

Аминокислотные последовательности цитохромов с у дрожжей, пшеницы и приматов сходны (эти последо- тельности следует читать в каждой строке слева на-

генетические изменения, лежащие в основе эволюционного процесса. В прошлом эволюционные связи можно было изучать только по фенотипическим признакам организма, которые были связаны с генетической информацией, записанной в его геноме. Так, вначале изучение эволюционных связей основывалось на анатомическом исследовании ископаемых остатков, а также на сравнительной анатомии, физиологии и эмбриологии современных видов. В середине нашего столетия появился новый метод изучения эволюционных взаимосвязей на уровне фенотипа-сравнительная химия белков. Как оказалось, строение некоторых белков у многх организмов в высшей степени консервативно. Это помогло выявить многие недостающие эволюционные связи, что было невозможно при изучении ископаемых остатков. Например, цитохром с содержится в митохондриях и животных, и растений. Он играет ключевую роль в процессах дыхания и поэтому должен был появиться в числе первых среди белков. В ходе эволюции цитохром с изменился очень мало (рис. III.8); так, у цитохромов с дрожжей и человека различаются только 35 из 104 аминокислотных остатков (не считая дополнительных аминокислот на N-конце молекулы цитохрома с дрожжей).

Для изучения эволюционных связей между близкородственными видами цитохром с и другие высококонсервативные белки не очень полезны, поскольку их структура у таких видов может различаться слишком мало. Однако некоторые белки эволюционировали более быстрыми темпами. Один из таких белков-карбоангидраза; ее строение у приматов различается достаточно сильно для построения филогенетического древа. Метод построения

NHZ- ala ser phe ser glu ala

NH2- thr glu phe

cys ser gly cys his thr val cys ala gly cys his thr val cys leu gly cys his thr val

gly arg lys thr gly gin ala glV ar9 gin ser gly thr thr gly arg his ser gly gin ala

gly glu asp thr leu met glu glu glu asn thr leu tyr asp asp glu asn asn met ser glu

phe val gly lie lys lys lys phe pro gly leu lys lys pro Phe gly gly leu lys lys glu

NHy gly asp pro pro gly asn lys ala gly ser glu lys gly gly asp ala gly ala glu lys gly gly pro gly tyr ser ala gly tyr ser glu gly tyr ser tyr leu glu asn tyr leu leu asn tyr leu thr asn glu glu arg ala gin asp arg ala lys asp arg asn

val glu lys pro asp ala ala lys lys

lys his lys gly his lys pro his lys

tyr thr ala tyr ser ala tyr thr asp

pro lys lys pro lys lys pro lys lys

asp leu ile asp leu ile asp leu ile

gly lys lys gly ala lys gly ala thr

thr gly gin gly val gly

ile phe ile ile phe lys leu phe lys

his his his

pro asn leu pro asn leu pro asn leu

ala asn lys ala asn lys ala asn ile

tyr tyr tyr

ala ala thr

asn lys gly asn lys ala lys lys asn

met lys thr lys thr arg

gly leu phe gly leu phe gly ile phe

ile ile trp val glu trp val leu trp

Ileproglythrlysmetile

ileproglythrlysmetval

ileproglythrlysmetala

tyr|eulyslysalathrasnglu-<

tyr|eulyslyealathrserser-(

tyrleulyslysalacysglu-COC

право). Одинаковые аминокислоты у всех трех видов выделены цветом. Вероятность того, что подобное сходство является случайным, очень мала.

основан на наблюдении, что число различающихся аминокислот у этих белков примерно пропорционально времени, прошедшему с момента дивергенции двух организмов от общего предшественника, определенному исходя из палеонтологических данных.

В заключение необходимо отметить, что все методы эволюционного анализа, основанные на изучении фенотипа, по существу относятся к непрямым методам: ведь в основе появления новых фенотипических признаков в ходе эволюции лежат изменения именно генов и геномов. И хотя изучение древних видов продолжает основываться на исследовании морфологических особенностей ископаемых остатков, для установления связей между современными видами чаще всего сравнивают строение ДНК. Таким образом, технология рекомбинантной ДНК уже внесла большой вклад в развитие эволюционной биологии и, по-видимому, будет применяться в этой области все более широко.

Сравнительнаямолекулярная генетика

Ценность сравнения нуклеотидных последовательностей ДНК для изучения эволюционных связей стала очевидной еще до появления методов клонирования и секвенирования фрагментов ДНК, и были разработаны методы оценки степени родства разных геномов. К числу этих методов относится сравнение стабильности дуплексной ДНК, состоящей из цепей ДНК двух разных видов (гетеродуплекс), со стабильностью двух цепочечной ДНК, в которой обе цепи принадлежат одному виду (гомодуплекс). На рис. Ш.9 представлены результаты таких опытов с ДНК из нескольких видов Drosophila. Подобные данные дают представление о средней дивергенции между двумя ДНК. Они менее информативны, чем данные сравнительной анатомии и белковой химии. Однако прямое сравнение нуклеотидных последовательностей основного объекта эволюции, ДНК, позволяет гораздо глубже проникнуть в тайны эволюционного процесса, а кроме того, освещает те его стороны, которые прежде не поддавались изучению. Более того, технически гораздо проще клонировать и секвенировать группу гомологичных генов, чем выделять их белковые продукты и определять их аминокислотную последовательность.

Анализ нуклеотидных последовательностей кодирующих участков ДНК более информативен, чем определение аминокислотной последовательности полипептидов, поскольку из-за вырожденности генетического кода изменение нуклеотидной последовательности гена может не сопровождаться изменениями аминокислотной последовательности соответствующего белка. И даже если известно, что

Температура,°C

РИС. 111.9.

Кривые плавления дуплексных ДНК. В одном дуплексе обе цепи принадлежат Drosophila melanogaster, в двух других одна из цепей принадлежит D. melanogaster, а другая D.simulans или D.funebris. Уменьшение температуры плавления (Гт) на 1 градус у гетеродуплекса по сравнению с гомодуплексом соответствует примерно 1 % несовпадающих пар оснований. Из рисунка видно, что ДНК D. melanogaster значительно ближе к ДНК D.simulans, чем к ДНК D.funebris. [С. О. Laird, B.J. McCarthy, Genetics 60 (1968), р. 303.]

произошла замена какой-либо аминокислоты, нельзя определить число измененных нуклеотидных пар; можно лишь оценить минимальное число изменений пар оснований, необходимое для замены одной аминокислоты на другую. Например, при замене аланина на валин в цитохроме с в положении 11 (рис. III.8) может быть изменено одно (например, GCU на GUU) или два (например, GCU на GUA) основания.

Особое преимущество, которое дает определение нуклеотидной последовательности ДНК, состоит в возможности сравнительного анализа некодирующих областей, включая регуляторные последовательности. Это очень важно, поскольку помогает объяснить тот давно известный факт, что эволюция белков и морфологическая эволюция идут в разных группах организмов с совершенно разной скоростью. Важные фенотипические изменения могут зависеть не только от структуры белка, но и, например, от относительного содержания индивидуальных белков или от времени экспрессии гена. Сравнивая нуклеотидные последовательности регуляторных элементов или «соседей по геному», можно выяснить роль регуляции работы генов в эволюции видов. Различия между последовательностями мо-

гут касаться одной-единственной пары оснований, но могут быть обусловлены также геномными перестройками и транспозицией мобильных элементов

Особенно полезным для изучения эволюционных взаимосвязей оказалось определение нуклеотидных последовательностей рибосомных РНК. в частности 16S 18S-PHK малых рибосомных субъединиц. Поскольку рибосомы в большом количестве присутствуют во всех организмах, можно выделить функциональные РНК и секвенировать их после синтеза ДНК-копий с помощью обратной транскриптазы. Хотя функции РНК малой субъединицы у всех живых организмов одинаковы, степень консервативности разных ее сегментов неодинакова. Наиболее консервативные участки можно использовать для сравнения организмов с отдаленным родством, а быстроэволюционирующие сегменты - близкородственных видов. Таким образом, сравнительный анализ всех видов можно проводить, используя всего один тип молекул с высококонсервативной функцией. Так были исследованы представители практически всех таксономических групп, что позволило получить детальную картину филогенетических взаимоотношений и по-новому взглянуть на процесс эволюции.

Эволюционная история генов

До сих пор, говоря об эволюции, мы имели в виду эволюцию различных видов. Но в молекуле ДНК записана и другая история история происхождения генов как таковых. Во многих случаях два (или более) родственных гена (или последовательности ДНК) в пределах отдельных видов образуются из одной последовательности-предшественника. Предположим, что сегмент ДНК был амплифици- рован (в результате случайных событий), а для выполнения полезной функции достаточно одной его копии. В этом случае дополнительные копии будут свободны от тех ограничений, которые налагаются на число мутаций в функциональном гене. Мутации в дополнительных копиях могут приводить к появлению новых функций, которые в свою очередь могут сохраниться при отборе. С другой стороны, эти копии могут попасть под контроль новых или измененных регуляторных сигналов и экспрессироваться на разных этапах развития или в особым образом дифференцированных тканях. Кроме того, дополнительные копии, в которых произошли вредные мутации, могут сохраниться в качестве псевдогенов. Все эти три возможности иллюстрирует семейство глобиновых генов (рис. III.5).

Некоторые гены образуются в результате соединения копий кодирующих последовательностей (т. е. экзонов) Иногда при этом происходит тандемная

амплификация одного из экзонов, что приводит к множественным повторам соответствующих пептидных фрагментов в кодируемом белке (рис. 111.10). Гены могут иметь мозаичное строение, т. е, состоять из перемешанных копий отдельных экзонов различных генов (рис. III. 11). Так, экзоны, происходящие от общего предшественника, иногда встречаются в составе явно неродственных генов. Одинаковые экзоны, входящие в кодирующие последовательности разных белков, тю-видимому, кодируют полипептидные домены, которые обусловливают одинаковое строение или одинаковые функциональные свойства этих белков, например особый тип вторичной структуры или способность связываться со специфическими лигандами (скажем, с АТР).

Высказывалась интересная гипотеза о том, что соединение экзонов между собой при их амплификации и перемешивании происходит вследствие рекомбинаций в интронах, благодаря чему кодирующие участки генов остаются интактными. Эта гипотеза предполагает, что интроны являются древними структурами, которые присутствовали в самых ранних генах и клетках и были утрачены в ходе эволюции прокариот. Согласно другой гипотезе, интроны, напротив, представляют собой вставки (инсерции) в ранее существовавшие кодирующие области при помощи механизма, более присущего эукариотам, чем прокариотам. Правда, с инсерционной моделью связаны некоторые проблемы, не возникающие в том случае, если принимается гипотеза о древнем происхождении интронов В частности, встает вопрос о том, каковы последствия мутаций, вызванных широко распространенными случайными вставками некодирующих сегментов ДНК, и вопрос о необходимости одновременной эволюции механизма сплайсинга. С другой стороны, если интроны присутствовали в самых ранних геномах, то и сплайсинг тоже должен быть очень древним процессом. Данные о том, что некоторые интроны катализи-

Экзон Интрон

| Амплификация

| Амплификация

РИС. Ш.10.

Некоторые гены эволюционировали путем тандемной амплификации одного-единственного экзона. В качестве примера можно привести гены коллагена и а-фето протеина млекопитающих (разд 9.4.а).

Глава 8

СТРУКТУРА И РЕГУЛИРУЕМАЯ

ЭКСПРЕССИЯ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ ГЕНОВ

Успехи молекулярной биологии в пятидесятых- шестидесятых годах породили у большинства ученых уверенность в том, что прокариотические и эукариотические гены имеют по существу одинаковое строение и одинаковый механизм экспрессии. Было уже ясно, что оба типа организмов имеют одинаковый генетический код и используют РНК- полимеразу для транскрипции, а мРНК, рибосомы и тРНК-для трансляции своих генетических сообщений. Но даже скудная информация о работе эукариотических генов, накопленная к 70-м годам, указывала на то, что эукариоты используют более сложные, а возможно, и совершенно иные механизмы экспрессии и регуляции. Например, было показано, что эукариотические мРНК отличаются от прокариотических необычными модификациями 5'-концов: вместо трифосфатной группы, связанной с первым нуклеотидом на концах цепей, они содержат так называемые кэп-структуры. Более того, эукариотические мРНК имеют длинные полиаде- нилатные последовательности на З'-концах. Кроме данных об этих структурных особенностях имелись указания и на коренные различия механизма биогенеза РНК у организмов двух типов. Например, для синтеза различных типов РНК эукариотические клетки используют три разных вида РНК-полимеразы, а прокариотические - только один. Более того, лишь 5% РНК, синтезированной в ядре, переходит в цитоплазму. Особенно удивительным казалось существование очень длинных молекул ядерных РНК, содержащих те же самые нуклеотидные последовательности и имеющих такие же модификации 5'- и З'-концов, что и меньшие по размеру цитоплазматические мРНК.

Предположения, возникшие в связи с этими неожиданными открытиями, было трудно оценить, не имея надежной информации о строении генов и не располагая методами изучения их экспрессии. Но с разработкой методов молекулярного клонирования и изучением на их основе структуры и функции многих эукариотических генов удалось выявить новые неожиданные особенности строения эукариотических генов и их регуляции. В данной главе мы расскажем об этих открытиях и их значении для понимания сложных свойств эукариотических организмов.

Основную информацию о строении гена полу

чают при помощи молекулярного клонирования и секвенирования ДНК. Однако для идентификации нуклеотидных последовательностей, ответственных за правильную экспрессию и регуляцию генов, используется другой подход, так называемая обратная генетика. В ней применяются клонированные гены в качестве субстратов для конструирования in vitro измененных генов, функцию которых можно изучать как in vitro, так и in vivo (разд. 7.6).

К наиболее полезным для анализа модификациям в структуре гена относятся: замена одного нуклеотида или группы нуклеотидов, делеции или вставки нескольких нуклеотидов или протяженных участков ДНК и перестройки внутри гена. Ниже мы обсудим, каким образом эти модификации используются для идентификации регуляторных последовательностей, которые обеспечивают правильную экспрессию гена и отвечают за его тканеспецифичную и зависящую от времени регуляцию. Кроме того, изучение новых генов, образующихся при слиянии частей различных генов, очень облегчает идентификацию последовательностей, ответственных за правильную экспрессию. Например, слияние промотора SV40 и различных его производных с последовательностями, кодирующими легко идентифицируемые бактериальные или эукариотические клеточные белки, позволяет выяснить, какие последовательности промотора обеспечивают правильную инициацию, эффективность и регуляцию транскрипции гена SV40. Аналогичные химерные гены, содержащие, например, промоторы генов инсулина или эластазы, слитые с областью, кодирующей Т-антиген SV40, позволяют идентифицировать элементы, ограничивающие экспрессию генов инсулина или эластазы исключительно (3-клетками островков Лангерганса или ацинарными клетками соответственно. Для применения методов обратной генетики необходимо, чтобы существовал один или лучше несколько способов определения фенотипического проявления измененного гена. Соответствующие бесклеточные системы, с помощью которых можно определять эффективность транскрипции нормальных и модифицированных генов, а также изучать процессинг или трансляцию РНК, дают прекрасную возможность для анализа функции генов и последствий отдельных изменений в них. Трансфицируя нормальные и модифицированные гены с помощью

подходящих векторов в культивируемые клетки, можно установить последовательности генов, которые нужны для экспрессии и регуляции трансфицированных генов в их собственных клетках или в родственны клетках хозяина in vivo, например генов иммуноглобулина в лимфоидных клетках, а генов глобина в предшественниках эритроцитов. Вводя гены дикого типа, а также измененные гены в соматические или половые клетки либо в эмбрионы на очень ранних стадиях развития, получают трансгенные растения и животные, содержащие эти гены во всех соматических клетках и клетках зародышевой линии. Трансгенные организмы особенно ценны для идентификации структурных элементов, участвующих в тканеспецифичной экспрессии гена в процессе развития

Гены, выбранные нами в качестве иллюстрации, происходят из разных эукариотических организмов. Большой интерес представляют гены дрожжей, в основном Saccharomyces cerevisiae. Во-первых, они обладают некоторыми свойствами, характерными для генов бактерий, растений, беспозвоночных и позвоночных. Во-вторых, связывающиеся с дрожжевой ДНК белки, ответственные за многие процес- ■ сы регуляции транскрипции у дрожжей, могут быть заменены белками других организмов или работают совместно с соответствующими сигналами и белками из других организмов, в том числе млекопитающих В-третьих, глубокое изучение генетики дрожжей и замена нормальных генов модифицированными (разд. 5.6.в) увеличивают возможности обратной генетики. Широко представлены в данной главе и гены вирусов млекопитающих, поскольку по своим структурным и функциональным характеристикам они часто коррелируют с генами своих хозяев. Действительно, многие неизвестные ранее особенности строения и регуляции эукариотических генов были выявлены при изучении именно вирусных геномов. В данной главе рассмотрены также некоторые гены растений, беспозвоночных (морского ежа и Drosophila) и позвоночных (амфибий, птиц и млекопитающих, включая приматов), поскольку это помогает понять сложные процессы развития многоклеточных организмов.

СРАВНЕНИЕ СТРУКТУРНЫХОСОБЕННОСТЕЙ

ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ ИЭУКАРИОТИЧЕСКИХ ГЕНОВ

Прокариотические гены

5'-концы генов прокариот, кодирующих тот или иной белок или стабильные РНК-продукты, имеют характерную организацию регуляторных элементов.

К этим элементам относятся промоторные последовательности, с которыми связывается РНК-полимераза, и последовательности, влияющие на скорость инициации транскрипции благодаря связыванию со специфическими белками, репрессорами или активаторами (рис. 8.1 и разд. 3.2.в). Все гены прокариот транскрибируются с помощью единственной РНК-полимеразы, которая при своем функционировании связывается с сигма(о)-факто- рами, поэтому организация разных промоторов у прокариот одинакова (рис. 3.8). Все последовательности, входящие в регуляторную область, располагаются в основном на расстоянии 50-75 пар оснований до точки инициации транскрипции и лишь иногда элементы, ответственные за позитивную или негативную регуляцию, находятся еще дальше от этой точки либо в пределах транскрибируемого участка или даже за его З'-концом.

Нуклеотидные последовательности, ответственные за терминацию транскрипции и высвобождение транскрипта, располагаются на З'-конце гена. Участок ДНК между сайтами, в которых начинается и кончается транскрипция, называется единицей транскрипции. Большая часть белок-кодирующих генов содержит различное число нуклеотидов, предшествующих белок-кодирующей последовательности (5'-лидер) или следующих за ней (З'-трей- лер). В некоторых случаях в 5'-лидерную область входят последовательности, обеспечивающие дополнительный контроль транскрипции и трансляции (в разд. 3.11.г и 3.11.е обсуждаются аттенуация и регуляция трансляции соответственно). Нуклеотидные последовательности белок-кодирующих генов, как правило, коллинеарны последовательностям соответствующих мРНК, а последовательности РНК-генов коллинеарны последовательностям рРНК и тРНК, которые они кодируют; исключение составляют ген тимидилатсинтетазы фага Т4 и ген тРНК$сг у штаммов Acanthamoeba, каждый из которых содержит интрон.

Моноцистронные единицы транскрипции содержат последовательность, кодирующую только один белок или стабильную РНК (рис. 8.1, Л). Однако единицы транскрипции прокариот, как правило, являются полицистронными и содержат последовательности. кодирующие не один, а несколько типов белков или РНК (рис. 8.КБ-и В). Обычно все кодирующие сегменты в полицистронной единице транскрипции имеют общие 5'- и З'-регуляторные последовательности, что обеспечивает координированную регуляцию и экспрессию множественных генов. Последовательности, кодирующие один или несколько полипептидов, транслируются без какой бы то ни было модификации или процессинга РНК. Напротив, последовательности, кодирующие многочисленные РНК, например три вида рРНК или множест-

упоминалось, гены прокариот обычно организованы в опероны, и их экспрессия опосредуется полици- стронными мРНК (разд. 3.11.6). В отличие от этого, в эукариотических клетках образуются мРНК, кодирующие только один белок. Даже если ген кодирует не один вид мРНК, как при альтернативных способах удаления интронов (разд. 8.5), каждая зрелая мРНК имеет только одну транслируемую кодирующую последовательность. Несмотря на то что гены 5S-pPHK располагаются тандемно, каждый ген транскрибируется со своего собственного промотора с образованием РНК, имеющей только одну последовательность 5S-pPHK на молекулу. Напротив, транскрипты кластеров генов 18S-, 5,88- и 288-рРНК, образующиеся с помощью РНК-полимеразы I, представляют собой длинные молекулы, содержащие каждую из последовательностей рРНК и промежуточные последовательности, а зрелые молекулы рРНК меньшего размера образуются при посттранскрипционном расщеплении.

Определение эукариотического гена. Хотя строение прокариотических и эукариотических генов в принципе одинаково, молекулярные детали их структуры существенно различаются. Новое определение эукариотического гена, возможно, поможет обобщить существо этих различий. Следует признать, что ни одно конкретное определение эукариотического гена не может полностью удовлетворить всех и быть приемлемым во всех случаях. Определение, предложенное нами, основывается на молекулярном строении генов, выполняющих разнообразные функции в разных эукариотических организмах. Оно учитывает особенности местоположения и типов элементов последовательности ДНК, влияющих на экспрессию гена, а также то, что изменение фенотипических признаков обусловлено изменением как кодирующих последовательностей, так и регуляторных элементов.

Мы определяем ген как совокупность сегментов ДНК, которые вместе составляют экспрессируемую единицу, обусловливающую образование специфического функционального продукта-либо молекулы РНК, либо полипептида. К сегментам ДНК, составляющим ген, относятся:

Единица транскрипции, которая представляет собой протяженный участок ДНК, кодирующий последовательность первичного транскрипта; в нее входят а) последовательность, кодирующая либо зрелую РНК, либо белковый продукт; б) интроны; в) 5'-лидерная и З'-трейлерная последовательности, которые присутствуют в зрелых мРНК, а также промежуточные последовательности (спейсеры), которые удаляются в ходе процессинга первичных транскриптов генов, кодирующих РНК.

Минимальные последовательности, необходимые для начала правильной транскрипции (промо

тор) и для образования правильного З'-конца зрелой РНК.

Последовательности, регулирующие частоту инициации транскрипции: к ним относятся последовательности, ответственные за индуцибельность и репрессию транскрипции, а также клеточную, тканевую и временную специфичность транскрипции. Эти области так разнообразны по строению, положению и функциям, что для них трудно найти одно простое и емкое название. К их числу относятся энхансеры и сайленсеры- последовательности, которые оказывают дистанционное влияние на инициацию транскрипции независимо от своей ориентации относительно точки начала транскрипции (разд. 8.2.в и 8.3.г).

В наше определение гена не включены ни последовательности ДНК, которые влияют на пространственную конфигурацию гена в хроматине, ни последовательности, которые регулируют его топологию. Не вошли сюда и последовательности ДНК, которые кодируют белки или РНК, влияющие на экспрессию отдельных единиц транскрипции.

На рис. 8.3 представлены основные структурные особенности эукариотического гена, кодирующего белок. Начало гена на этом рисунке находится слева, а конец- справа в соответствии с общепринятым соглашением, по которому транскрипция идет слева направо. Это означает, что у цепи ДНК, имеющей ту же последовательность, что и РНК- транскрипт, т. е. у значащей цепи (верхней на рисунке), левый конец 5', а правый - 3'. Служащая матрицей при транскрипции незначащая цепь (нижняя на рисунке) имеет противоположное направление. Для удобства обычно изображают только значащую цепь. Положение первого нуклеотида транскрипта обозначают числом +1, а нуклеотидов, расположенных справа (downstream) от него (т. е. внутри единицы транскрипции), большими положительными числами (например, + 16). Нуклеотиды, находящиеся слева (upstream) от +1 (нетранскрибируемые последовательности), обозначаются отрицательными числами (например, —25).

Корреляцию между строением генов эукариот и их экспрессией и регуляцией удобно проследить на примере отдельных генов в связи с работой РНК-полимеразы, инициирующей их экспрессию. Мы обсудим по очереди особенности строения генов классов I (разд. 8.2), II (разд. 8.3) и III (разд. 8.4); свойства соответствующих РНК-полимераз; механизмы регуляции транскрипции указанных генов. Затем мы рассмотрим процессинг первичных РНК-транскриптов, в частности сплайсинг, с образованием зрелых мРНК, рРНК и тРНК (разд. 8.5). В разд. 8.6 мы остановимся на некоторых элементах последовательностей, которые помогают белковым факторам транскрипции узнавать специфические последова-

Начало РНК (+1)Начало РНК (+1)Интрон!Интрон!Интрон 2 Интрон 3 Конец мРНКИнтрон 2 Интрон 3 Конец мРНК5'3'5'3'Левые IрегуляторныеэлементыЛевые Iрегуляторныеэлементы5-лидерная5-лидернаяпоследова-последова-Экзон 2 / Экзон 3Экзон 2 / Экзон 3ВнутренниеВнутренниетельность регуляторные элементытельность регуляторные элементыЗ-трейлерная последовательностьЗ-трейлерная последовательностьЭкзон 4Экзон 4пЗ' "О 5'пЗ' "О 5'ПравыерегуляторныеэлементыПравыерегуляторныеэлементыРИС. 8.3.

Начало РНК (+1)

Начало РНК (+1)

Интрон!

Интрон!

Интрон 2 Интрон 3 Конец мРНК

Интрон 2 Интрон 3 Конец мРНК

5'

3'

5'

3'

Левые Iрегуляторныеэлементы

Левые Iрегуляторныеэлементы

5-лидерная

5-лидерная

последова-

последова-

Экзон 2 / Экзон 3

Экзон 2 / Экзон 3

Внутренние

Внутренние

тельность регуляторные элементы

тельность регуляторные элементы

З-трейлерная последовательность

З-трейлерная последовательность

Экзон 4

Экзон 4

пЗ' "О 5'

пЗ' "О 5'

Правыерегуляторныеэлементы

Правыерегуляторныеэлементы

Структурные особенности типичного эукариотического гена, кодирующего белок. Единица транскрипции-это сегмент от точки инициации транскрипции (+1) до области ее окончания. Последняя находится за тем сайтом, который соответствует концу последовательности зрелой мРНК, но сама транскрипция редко заканчивается в каком-то специфическом сайте. Последовательности, необходимые для инициации транскрипции.

Единица транскрипцииЕдиница транскрипции/А-

Единица транскрипции

Единица транскрипции

обычно располагаются левее сайта + 1 на участке длиной до 100 п. н„ но могут находиться и за сотни и даже тысячи пар оснований. Кроме промотора и левых регуляторных элементов, у многих генов есть регуляторные последовательности, находящиеся внутри интронов или за З'-концом зрелой мРНК. Разные регуляторные элементы на рисунке выделены по-разному, чтобы проиллюстрировать их взаимное расположение.

тельности ДНК и взаимодействовать с ними, а также друг с другом. В конце главы рассматриваются более общие механизмы регуляции (такие, например, которые влияют на время жизни мРНК), а также способы влияния модификаций ДНК или хроматина, в котором упакованы гены, на экспрессию больших областей генома (разд. 8.7).

СТРОЕНИЕ ГЕНОВ КЛАССА IИ ИХ ЭКСПРЕССИЯ

Почти половина общей транскрипционной активности в большинстве эукариотических клеток приходится на долю генов класса I, транскрибируемых с участием РНК-полимеразы I. Единственным продуктом этого процесса является предшественник рибосомной РНК (про-рРНК), который подвергается последовательному процессингу с образованием зрелых 5,8S-, 18S- и 28S-pPHK. Четвертый тип рРНК, 5S-pPHK, кодируется генами класса III (разд 8.4). Число генов, кодирующих рРНК, колеблется от сотен до нескольких тысяч в зависимости от вида эукариот (разд. 9.2.а-в). Они находятся в одной или нескольких хромосомах в областях с характерной морфологией, названных ядрышковыми организаторами (рис. 1.8). Во время интерфазы эти участки объединяются в ядрышки-структуры, в которых идет активная транскрипция генов рРНК, процессинг про-рРНК и сборка рибосом.

Гены рРНК практически всех эукариот построены в виде длинных повторов типа «голова к хвосту» (разд. 9.2.а). На электронных микрофотографиях фрагмента ДНК ядрышек в момент транскрипции видны несколько кластеров генов рРНК (рис. 8.4).

Единицы транскрипции

У всех видов каждая единица транскрипции рРНК кодирует 18S- 5,8S- и 28S-pPHK, перечисленные в порядке их расположения, начиная с 5'-конца (рис. 8.5). Три рРНК-кодирующие последовательно-

РИС. 8.4.

Электронная микрофотография, иллюстрирующая транскрипцию рДНК ооцитов Xenopus. Протяженные нити-это рДНК, а перистые структуры-синтезируемые про-рРНК. Стрелки указывают направление транскрипции. Самые короткие транскрипты находятся на 5'-кон- цах единиц транскрипции, а самые длинные - на З'-кон- цах. Обратите внимание на отсутствие транскриптов в области между кластерами синтезирующихся про- рРНК. Вначале полагали, что это нетранскрибируемые спейсерные участки, но позже установили, что эти участки тоже транскрибируются, но транскрипты слишком коротки для того, чтобы их можно было увидеть. [Фотография любезно предоставлена О. L. Miller, Jr. Из работы О. L Miller, Jr., В. R. Beatty, Science 164 (1969), р. 955.]

Кластер Межгенный Кластер 1Иежгенный Кластер рРНК-генов спейсер р РНК-генов спейсер рРНК-генов

/\

/\

/\

IGS /5 ETS 1855'1TS 5,85 3'ITS28S S ETSIGS

7I11H-fЙ—

2300 n.H.156П.Н.4200 П.Н.

p«Единица транскрипции npo-pPHK J

РИС. 8.5.

Организация кластеров рРНК-генов эукариот. А. Каждый кластер рРНК-генов длиной от 8 до 14 т.п.н. (в зависимости от вида) отделен от других кластеров межгенными спейсерами (IGS), длина которых у разных видов сильно различается, но в пределах одного вида относительно постоянна. 6. Каждый кластер рРНК-генов составляет отдельную единицу транскрипции, состоящую из 5'-внешнего транскрибируемого спейсера (5'-ETS), последовательности, кодирующей 18S-pPHK,

сти фланкируются и разграничиваются промежуточными транскрибируемыми сегментами. Они называются соответственно внешними (5'- и З'-ETS) и внутренними (5'- и З'-ITS) транскрибируемыми спейсерами. Область между тандемно повторяющимися единицами транскрипции протяженностью от нескольких т. п. н. до почти 30 т. п. н. первоначально называлась нетранскрибируемым спейсером (NTS). Поскольку. как теперь стало известно, подобные спейсеры на самом деле транскрибируются и транскрипция в этих областях, возможно, является особенностью регуляции экспрессии рДНК (разд. 8.2.в), применительно к ним стали использовать более подходящее название- межгенные спейсеры (IGS).

Размеры и нуклеотидная последовательность областей, кодирующих рРНК, весьма незначительно варьируют среди широкого круга эукариот, при этом оценку степени гомологии нуклеотидных последовательностей рРНК можно использовать при определении их эволюционного родства. Напротив, длина ITS изменяется в широких пределах в зависимости от вида; соответственно изменяется и размер единиц транскрипции (рис. 8.6). Так, единица транскрипции рДНК в ДНК человека имеет размер около

5 -внутреннего транскрибируемого спейсера (5'-ITS), последовательности, кодирующей 5,8S-pPHK, З'-внут- реннего транскрибируемого спейсера (З'-ITS), последовательности, кодирующей 28S-pPHK, и З'-ETS. Каждый кластер рРНК-генов фланкируют одинаковые межгенные регуляторные последовательности. Единица транскрипции про-рРНК начинается от места соединения IGS с б'-ETS и кончается в разных сайтах IGS за последовательностью, кодирующей 28S-pPHK.

14 т. п. н., приближаясь к самой длинной из известных, а соответствующая единица транскрипции у S. cerevisiae- одина из самых маленьких, между 6 и 7 т. п. н. Примерно половина областей рДНК Drosophila. кодирующих 28S-pPHK, имеет вставки различных размеров; они не являются интронами, и единицы транскрипции с такими вставками не транскрибируются. Последовательности, кодирующие 28S-pPHK у Tetrahymena и у некоторых других видов, прерываются интронами размером 400-1000 п. н., которые вырезаются из транскриптов про- рРНК перед дальнейшим процессингом, приводящим к образованию трех зрелых рРНК (разд. 8.5.6).

Во время транскрипции новообразованная про-РНК остается постоянно связанной с соответствующими рибосомными белками и метилируется по специфическим основаниям и рибозным остаткам (рис. 8.7). После завершения транскрипции нуклеазы ядрышка расщепляют про-рРНК рибону- клеопротеидного комплекса сначала на 5'-конце 5,8S-pPHK, а затем на 5'-конце 18S-pPHK и З'-конце 28S-pPHK соответственно. В результате последовательных расщеплений под действием эндонуклеазы образуются три зрелые рРНК.

ЧеловекЧеловекX. laevisX. laevisЕдиница транскрипции, ~8 т.п.н.Единица транскрипции, ~8 т.п.н.DrosophilaDrosophilaВставкиВставкиЕдиница транскрипции,7-Вт.п.н.•-]Единица транскрипции,7-Вт.п.н.•-]S.cerevisiaeS.cerevisiae]-. Единица транскрипции, ~7т.п.н. ——|]-. Единица транскрипции, ~7т.п.н. ——|РИС. 8.6.

Человек

Человек

X. laevis

X. laevis

Единица транскрипции, ~8 т.п.н.

Единица транскрипции, ~8 т.п.н.

Drosophila

Drosophila

Вставки

Вставки

Единица транскрипции,7-Вт.п.н.•-]

Единица транскрипции,7-Вт.п.н.•-]

S.cerevisiae

S.cerevisiae

]-. Единица транскрипции, ~7т.п.н. ——|

]-. Единица транскрипции, ~7т.п.н. ——|

Взаимное расположение и размеры различных сегментов в составе кластеров рРНК-генов. Числа под каждым сегментом указывают примерную длину сегментов в тысячах пар нуклеотидов. Некоторые последовательности кодирующие 26S-pPHK Drosophila, содержат вставку длиной 0,5- 6 т.п.н., отсутствующую в зрелой 265-рРНК.

Сегменты РНК, соответствующие транскрибированным спейсерам, быстро разрушаются и не накапливаются. Расщепление, вероятно, происходит с очень высокой специфичностью, поскольку отсутствуют какие-либо указания на то, что для образования 5'- и З'-концов зрелых рРНК требуются экзонуклеазы Как полагают, на одной из ранних стадий процессинга функционирует малый рибонуклеопротеид ядрышка, содержащий U3-PHK (иЗ-мяРНП). 5'-концевая последовательность 5,88-рРНК может спариваться с внутренними последовательностями 28S-pPHK. Реакции расщепления в области между сегментами, кодирующими 5,8S- и 28S-pPHK, вероятно, происходят уже после образования нуклеотидных пар.

Аппарат транскрипции

РНК-полимеразы были выделены из широкого крута клеток стандартными методами фракционирования и очистки белков. В отличие от РНК-полимераз II и III, которые находятся в нуклеоплазме,

РНК-полимераза I связана с ядрышками, откуда ее и выделяют. Транскрипцию кластера генов рРНК катализирует только РНК-полимераза I. Специфичность РНК-полимеразы I по отношению к генам рРНК определяют по отсутствию чувствительности фермента и синтеза рРНК к ингибитору а-аманити- ну (разд. 8.1.6).

Мол. масса РНК-полимеразы I, независимо от источника, составляет 500-600 кДа. Все ферменты содержат от 9 до 14 различных полипептидных субъединиц в зависимости от происхождения, а также методов и аналитических процедур, использованных при их очистке. Обычно ферменты содержат две большие полипептидные субъединицы мол. массой более 100 кДа каждая. Большие субъединицы РНК-полимеразы I имеют участки, гомологичные участкам соответствующих двух больших субъединиц РНК-полимераз II и III и дают перекрестную реакцию с некоторыми антителами к этим полимеразам. Интересно, что у больших субъединиц РНК-полимеразы I и двух больших субъединиц РНК-полимеразы Е, colt также встречаются гомологичные участки. Размер других субъединиц варьирует от 15 до 50 кДа. Три полипептида меньшего размера есть у всех трех РНК-полимераз, два других-только у РНК-полимераз I и III. а остальные у разных ферментов разные. Функции ни одной из этих субъединиц пока не установлены. Вероятно, изолированная РНК-полимераза I представляет со-

1BS5,8S28S1BS5,8S28SETSETSITS ITSITS ITS18S18Sзавершеназавершена28S28S5,8S5,8S28S28S40S40SСубъединица рибосом!Субъединица рибосом!Субъединица рибосомыСубъединица рибосомы

1BS5,8S28S

1BS5,8S28S

ETS

ETS

ITS ITS

ITS ITS

18S

18S

завершена

завершена

28S

28S

5,8S

5,8S

28S

28S

40S

40S

Субъединица рибосом!

Субъединица рибосом!

Субъединица рибосомы

Субъединица рибосомы

РИС. 8.7.

Схематическое представление процессинга про-рРНК с образованием зрелых рРНК-ком- понентов рибосом. Метилирование и связывание с рибосомными белками про-рРНК

происходят непосредственно во время транскрипции. Расщепление начинается на 5'-кон- це 5,8S-pPHK и далее происходит в местах соединений 18S- и 28S-pPHK со спейсерами. Сайты расщепления показаны стрелками, направленными вверх и пронумерованными в соответствии с предполагаемой очередностью расщепления. Сборка рибосомы завершается связыванием соответствующих рибосомных белков.

бой минимальную структуру, необходимую для транскрипции кластера генов рРНК, поскольку для точной и эффективной инициации и терминации транскрипции кластера генов рРНК нужны специфические вспомогательные белки (разд. 8.2.в). Действуют ли эти белки независимо или при своем функционировании временно связываются с полимеразой, неизвестно. Имеются убедительные данные о том, что РНК-полимераза I существует в активной и неактивной формах; различие между ними заключается либо в обратимой ковалентной модификации одной из известных субъединиц, либо во временном присоединении и удалении субъединицы, необходимой для эффективной транскрипции рРНК (напомним о роли о-фактора в функционировании РНК-полимеразы Е. coir, разд. 3.2.6). Клетки, в которых не транскрибируется кластер генов рРНК, содержат только неактивную форму РНК-полимеразы I. но после реинициации синтеза рРНК в них вновь появляется активная форма фермента, свя

занная с ДНК. У простейшего Acanthamoeba castella- nii, например, активный фермент обнаруживается в растущих трофозоитах, но не в нерастущих цистах.

Области регуляции транскрипции РДНК

Механизм и регуляцию транскрипции рДНК изучали с помощью разных экспериментальных подходов. Во-первых, сравнивали последовательности ДНК клонированных рРНК-генов из одного и того же генома и из геномов родственных и неродственных видов; это позволило выявить встречающиеся на определенных расстояниях от единицы транскрипции характерные нуклеотидные последовательности. Во-вторых, оценивали эффективность транскрипции генов рРНК дикого типа и структурно измененных клонированных генов рРНК с использованием зависимых от матрицы клеточных эк-

страктов или частично очищенных препаратов РНК- полимеразы и очищенных факторов транскрипции; в результате удалось идентифицировать последовательности. которые влияют на транскрипцию in vitro. И наконец, выводы, сделанные на основании опытов in vitro, получили подтверждение при исследовании транскрипции генов после трансфекции или микроинъекции модифицированных рДНК в подходящие клетки.

Одной из удивительных особенностей сигналов инициации транскрипции в генах, кодирующих рРНК, является их видоспецифичность. Так, в клеточных экстрактах человека может осуществляться транскрипция клонированных генов рРНК человека, ноне рДНК мыши, крысы, дрожжей, Drosophila или Xenopus. Точно так же клеточные экстракты мыши непригодны для транскрипции генов рРНК человека. Но, как это ни удивительно, рДНК Xenopus транскрибируется полимеразной системой мыши, и наоборот. Даже гены рРНК двух близкородственных видов Drosophila (D. meianogaster и D. cirilis) различаются по специфичности комплексов транскрипции в отношении их собственных рДНК. Указанная специфичность обусловлена неконсерватив- ностью последовательности ДНК, находящейся у начала единиц транскрипции в генах рРНК человека, мыши, Xenopus. Drosophila и дрожжей. Иная картина наблюдается для генов класса II и класса III; в этом случае гены данного класса даже у отдаленных видов имеют высококонсервативные или одинаковые элементы в областях регуляции транскрипции. Более того, системы РНК-полимераз II

и III, выделенные из одних видов, могут транскрибировать соответствующие гены из других, неродственных, видов (разд. 8.3 и 8.4).

Строение областей регуляции транскрипции рДНК у разных видов в общих чертах сходно, однако существуют и ощутимые различия как между самими регуляторными элементами, так и между их взаимным расположением. Впрочем, в свете наших сегодняшних знаний эти различия скорее кажущиеся. Несмотря на значительные различия сигналов транскрипции указанных ДНК, структурные особенности и активность комплексов, осуществляющих инициацию, элонгацию и терминацию транскрипции про-рРНК, по-видимому, сходны.

Млекопитающие. В регуляции транскрипции РДНК млекопитающих участвуют два сегмента в составе IGS размером около 30 т. п. н. (рис. 8.8). Один сегмент, находящийся между парами оснований —45 и +20 в рДНК человека и между парами оснований —39 и + 9 в рДНК мыши, включает сайт инициации транскрипции ( + 1). Удаление этого сегмента или его частей, замена следующих друг за другом коротких последовательных участков чужеродными олигонуклеотидами примерно той же длины (линкерные вставки) или замена пар оснований в определенных положениях приводят к прекращению транскрипции рДНК или резкому снижению ее эффективности. С учетом расположения и способности обеспечивать правильную транскрипцию (хотя и на низком уровне, <5%) соответствующая последовательность названа кор-промотором.

РИС. 8.8.

Влияние линкерных вставок на 5'-конце рДНК человека на транскрипцию in vitro. Исследовалась способность рДНК со вставками в разных местах к транскрипции в клеточных экстрактах человека. Влияние вставок в

области от — 164 до + 33 пары оснований на эффективность транскрипции иллюстрируется с помощью гистограммы. [М. М. Haltiner et al.. Mol. Cell. Biol. 6 (1986), p. 227.)

Второй сегмент, куда входят последовательности между парами оснований —156 и —107, значительно повышает уровень транскрипции с кор-промотора как in vitro, так и in vivo. Об этом четко свидетельствуют результаты опытов по трансфекции и инъекции модифицированных рДНК в подходящие клетки. Делеции и вставки линкеров, нарушающие последовательность оснований в этой области, приводят к уменьшению уровня транскрипции рДНК до 100 раз. Применение более точных методов исследования, чем те, которые использовались для получения данных, представленных на рис. 8.8, помогло установить, что упомянутая последовательность простирается до основания —186. Хотя нуклеотидная последовательность, расположенная между этим регуляторным элементом (upstream control element, UCE) и кор-промотором, по-видимому, не является существенной, изменение ее длины или взаимной ориентации указанных элементов уменьшает уровень транскрипции. Это наводит на мысль, что обе регуляторные последовательности работают согласованно, обеспечивая эффективную транскрипцию с участием РНК-полимеразы I. UCE, вероятно, состоит из более мелких элементов, выполняющих различные функции.

Каким же образом эти две регуляторные области выполняют свою функцию? Ключом к разгадке послужило обнаружение стабильных комплексов рДНК. Если к соответствующей системе транскрип

ции in vitro добавить одновременно две рДНК, кодирующие две разные рРНК, то образуются обе рРНК (рис. 8.9). Однако если одну рДНК добавить даже всего на несколько минут раньше, чем другую, то транскрибируется только первая ДНК независимо от того, какая именно рДНК-матрица добавлена первой. Такого предпочтения нет, если у ранее добавленной ДНК отсутствует область регуляции транскрипции рДНК или же если UCE инактивирован путем делеций или замен единичных пар оснований. Отсюда следует, что рДНК взаимодействует с одним или несколькими факторами, находящимися в экстракте, вследствие чего они становятся недоступными для другой рДНК даже после повторных циклов транскрипции. Это подтверждают опыты по разделению клеточных экстрактов на фракции, соответствующие различным белковым факторам, которые сами по себе ни по отдельности, ни даже все вместе не стимулируют синтез про- рРНК, но зато помогают активной форме РНК-полимеразы инициировать транскрипцию рДНК.

Поиск факторов транскрипции и их выделение из клеток человека и мыши основывается на двух аналитических подходах, обусловленных: 1) способностью белковых факторов восстанавливать транскрипционную активность экстрактов, истощенных по факторам транскрипции; 2) способностью таких факторов оставлять «отпечаток» (футпринт) на последовательности ДНК, с которой они связываются. Метод отпечатков (футпринтинг)-это универсаль-

РИС. 8.9.

| рРНК2 |

|рРНК1 |

IрРНК1 |

|рРНК2 |

Транскрипция рДНК происходит с образованием стабильных комплексов. рДНК1 и рДНК2- разные, но одинаково эффективно трансбирующиеся матрицы, на которых in vitro синтезируются рРНК. Если эти рДНК введены в систему транскрипции одновременно, то обе рРНК образуются примерно в равных количествах. Од-

нако если одна из рДНК введена раньше другой, то транскрибируется преимущественно рДНК, введенная первой. Если в первой рДНК имеются мутации в области промотора, то транскрипция второй рДНК не подавляется.

Значащая цепь

РИС. 8.10.

Гидролиз рДНК млекопитающих, связанной с фактором транскрипции UBF-1, под действием ДНКазы I (футпринтинг). Для определения характера связывания UBF-1 со значащей и матричной цепями использовали соответственно сегмент промотора рДНК человека размером 297 п.н. (между парами оснований —199 и +78, меченный 5'-32Р по остатку —199) и сегмент размером 525 п. н. (между парами оснований — 500

ный способ, позволяющий выявить присоединение специфического белка к ДНК путем сравнения набора фрагментов, образующихся после расщепления ДНКазой I связанной с белком и свободной ДНК (рис 8.10). Если белок защищает ДНК от действия ДНКазы, то его положение на молекуле ДНК можно установить по отсутствию характерных фрагментов.

Достаточно полная картина процесса инициации транскрипции рДНК была получена в результате проведения опытов с системами транскрипции человека и грызунов как in vitro, так и in vivo. В обоих случаях в основе опыта лежит узнавание специфическими факторами транскрипции элементов, примыкающих к кор-промотору. Клеточные экстракты человека содержат два белка, UBF-1 и SL-1, которые совместно с РНК-полимеразой I катализируют транскрипцию с промотора гена рРНК человека. Оба белка получены в почти гомогенном состоянии, исследован механизм их действия. UBF-1 самостоятельно связывается с З'-областью UCE (последовательность между парами оснований —75 и —115) и экранирует ее (рис. 8.10 и 8.11). Связавшийся с ДНК UBF-1 контактирует также с участком кор-

Матричная цепь

UBF

4 5 6

и +24, меченный по остатку +24). Дорожки 1, 3, 4 и 6-продукты гидролиза, полученные в отсутствие UBF-1, дорожки 2 и 5- продукты гидролиза, образующиеся в присутствии очищенного UBF-1 в насыщающих концентрациях. Нечувствительные к действию нуклеазы области отмечены квадратными скобками, а сайты эффективного расщепления-звездочками. [S. Р. Bell et al., Science, 241 (1988), p. 1192.] промотора в окрестности -21-й пары оснований. SL-1 самостоятельно не связывается с промоторной областью гена рРНК. Однако при одновременном присутствии UBF-1 и SL-1 участок, защищенный от ДНКазы, удлиняется до — 165-й пары оснований. SL-1 способствует также связыванию UBF-1 с кор- промотором, расширяя область связывания вплоть до пары +1. Таким образом, SL-1 и UBF-1 совместно образуют область контакта ДНК с белком, охватывающую кор и UCE. Связывается ли непосредственно SL-1 с ДНК в присутствии UBF-1 или же придает UBF-1 способность узнавать дополнительный участок ДНК, неизвестно. Мутационные изменения, затрагивающие UCE, блокируют связывание UBF-1 даже в присутствии SL-1. Мутации в кор-промоторе такого эффекта не дают, но нарушают способность факторов SL-1 и UBF-1 активировать транскрипцию с участием РНК-полимеразы I.

Все эти данные говорят о том, что в результате взаимодействия между SL-1 и UBF-1 образуется комплекс, который связывается с двумя промотор- ными элементами рДНК, облегчая таким образом связывание РНК-полимеразы I (рис. 8.12). Частично очищенный фактор транскрипции с промотора гена

Матричная цепь

РИС. 8.11.

Влияние SL-1 на связывание UBF-1 с премоторным участком рДНК. Тот же самый фрагмент длиной 525 п. н. с меткой на конце, который представлен на рис. 8.10, расщепляли ДНКазой I в присутствии в реакционной смеси UBF-1 и SL-1 либо по отдельности, либо вместе. Знаки «+» и «—» означают наличие или отсутствие указанных факторов соответственно. Два знака «+» указывают на то, что данный фактор присутствует в удвоенной концентрации. Слева показано относительное положение элементов промотора. Защищенные участки отмечены квадратными скобками, а сайты эффективного расщепления-звездочками. Если в реакционной смеси присутствуют оба белка, то различия между электрофореграммами выражены сильнее, а защищенная область простирается на довольно большое расстояние в глубь UCE.

рРНК мыши (называемый TIF-1B или фактором D) связывается с аналогичным участком кор-промотора примерно между парами оснований —40 и —15. Каковы взаимоотношения этого фактора с UBF-1 и каким образом его присоединение активирует транскрипцию с участием РНК-полимеразы I, неясно.

Последовательности, находящиеся левее, перед -165-й парой оснований, также играют важную роль в активации транскрипции. Поскольку функция этих последовательностей тесно связана с терминацией транскрипции рДНК, мы отложим обсуждение этого вопроса до разд. 8.2.г.

Как мы уже отмечали, транскрипция может идти только при условии, что рДНК и комплекс транскрипции происходят из одного и того же или из близкородственных видов. Так, экстракты из клеток грызунов не катализируют транскрипцию рДНК приматов, и наоборот. Природу этой видовой специфичности можно понять, если сконструировать

гибридные области регуляции транскрипции, в которых кор-промотор рДНК мыши соединен с UCE человека или кор-промотор человека соединен с UCE мыши, и исследовать транскрипцию этих ДНК с использованием экстрактов приматов (рис. 8.13). Поскольку промотор мыши не связывается с белками UBF-1/SL-1, его неспособность участвовать в транскрипции легко объяснима. Гибридный промотор, составленный из UCE мыши и кор-промотора человека, неактивен по той же причине. Однако промотор, построенный из регуляторного элемента человека и кор-элемента мыши, также не транскрибируется РНК-полимеразой I приматов, хотя метод отпечатков показывает, что факторы UBF-1/SL-1 человека связываются с UCE. Следовательно, несмотря на то что связывание UBF-1 и SL-1 с UCE необходимо для активации транскрипции в системе транскрипции приматов, указанные факторы, присоединившись к ДНК, не могут стимулировать транскрипцию, если UCE связан с чужеродным кор- промотором. Для того чтобы SL-1 мог содействовать связыванию РНК-полимеразы I и/или инициации транскрипции, он, вероятно, должен соединиться со своей собственной видоспецифичной последо-

UBF-1UBF-1

Предполагаемая схема взаимодействия белков UBF-1 и SL-1 с элементами промотора рДНК при активации и транскрипции с участием РНК-полимеразы I. UBF-1 и SL-1 связываются как с кором, так и с UCE и, по-видимому, взаимодействуют друг с другом, либо активируя при этом РНК-полимеразу I, либо облегчая ее связывание.

ЭффективностьтранскрипцииЭффективностьтранскрипции++

Эффективностьтранскрипции

Эффективностьтранскрипции

+

+

Связывание

UBF-1.SL-I +

РИС. 8.13.

Транскрипция, в отличие от связывания UBF-1 и SL-1, осуществляется только в том случае, если UCE и коровая последовательность промотора происходят от одного вида. Эффективность транскрипции с промоторов рДНК человека (Ни) и мыши (Мо) и с каждого из гибридных промоторов исследовали, трансфицируя плазмиду, содержащую промотор, в культуры клеток

приматов или мышей и определяя количество синтезируемых рРНК. Эффективность транскрипции выражали в процентах от эффективности транскрипции при нормальном расположении сегментов. Связывание ДНК оценивали при помощи метода отпечатков, как показано на рис. 8.10.

вательностью кор-промотора. Условие правильного сочетания UCE и кор-промотора для связывания факторов транскрипции, по-видимому, и определяет видовую специфичность транскрипции.

Drosophila. Как мы уже упоминали, гены рРНК у D. melanogaster и D. virilis не являются взаимозаменяемыми при использовании их в качестве матриц с перекрестными системами транскрипции ни in vitro, ни in vivo. Более того, последовательности, расположенные непосредственно перед точкой инициации транскрипции (т.е. в IGS), негомологичны (или степень их гомологии невелика). Тем не менее структура этой области у обоих видов сходна: и в том, и в другом случаях в ней содержатся от пяти до двенадцати повторов сегментов длиной примерно 240 п. н. оснований и они находятся непосредственно перед парой +1. У разных особей данного вида повторы имеют почти одинаковые нуклеотидные последовательности, однако у представителей разных видов они различаются.

Исследования ядерных и цитоплазматических транскриптов генов рРНК Drosophila обоих видов привели к следующим выводам. Как показал анализ генов с делециями в регуляторных элементах, аналогичных описанным для промотора рДНК млекопитающих, кор-промотор занимает участок между парами нуклеотидов — 43 и + 20. Каждый из упомянутых повторов размером 240 п. н. в IGS также

может в какой-то степени стимулировать транскрипцию, которая начинается через несколько пар за его З'-концом и заканчивается примерно через 175 п. н. внутри соседнего повтора размером 240 п. н. Однако более чем в 95% случаев транскрипция начинается в области, находящейся сразу же за последним из повторов (у пары + 1) и охватывает всю единицу транскрипции. Поскольку короткие транскрипты встречаются редко, а в цитоплазматической РНК вообще отсутствуют, их функция остается неясной. Но определенная организация и стабильное сохранение повторов в геноме двух вышеупомянутых видов Drosophila, как и наличие их в генах рРНК Xenopus, говорит о том, что присутствие кластера промоторов и терминаторов в IGS перед «истинным» промотором имеет какое-то значение для регуляции эффективности транскрипции рДНК.

Xenopus. Типичный порядок расположения новых повторов в IGS, разделяющем единицы транскрипции у Xenopus laevis, показан на рис. 8.14. Для инициации правильной транскрипции рДНК необходим кор-промотор, занимающий участок между парами —147 и +4. В зависимости от того, какая именно из многочисленных областей межгенных спейсеров рассматривается, последовательность кор-промотора размером 150 п.н. повторяется внутри спейсера от двух до шести раз. Эти

I6SI6SСпейсерный промоторСпейсерный промоторУчасток 0 Участок 1Участок 0 Участок 1T2T2Т128S|Т128S|Повторы из60/81 п.н.Повторы из60/81 п.н.Спейсерный Повторы изСпейсерный Повторы изпромоторпромотор60/81 п.н.60/81 п.н.Промотор генаПромотор гена5'ETS5'ETS5F5F-4000-4000-3000-3000-2000-2000-1000-1000РИС. 8.14.

I6S

I6S

Спейсерный промотор

Спейсерный промотор

Участок 0 Участок 1

Участок 0 Участок 1

T2

T2

Т1

28S|

Т1

28S|

Повторы из60/81 п.н.

Повторы из60/81 п.н.

Спейсерный Повторы из

Спейсерный Повторы из

промотор

промотор

60/81 п.н.

60/81 п.н.

Промотор гена

Промотор гена

5'ETS

5'ETS

5F

5F

-4000

-4000

-3000

-3000

-2000

-2000

-1000

-1000

Типичный межгенный спейсер рДНК X. laevis (IGS-область, расположенная между З'-концом последовательности, кодирующей 28S-pPHK, и сайтом, в котором начинается транскрипция про-рРНК в начале 5'-ETS). Овалами со стрелками обозначены спейсерные промоторы; участки, выделенные черным цветом, гомопо- повторы разделяются областями из чередующихся повторов размером 60 и 81 п. н. Интересно, что каждый из повторов имеет общую последовательность длиной примерно 40 п. н. с кор-промотором и его копиями в IGS. В крайней левой части межгенного спейсера расположены еще два типа повторяющихся элементов (область 0 и область 1). отличающихся от последовательностей размером 60 и 81 п. н. Спейсеры, разделяющие единицы транскрипции рДНК, различаются в основном числом и расположением различных повторов (разд. 9.2.а).

Функциональная роль разных повторов до конца не выяснена. Некоторую ясность в этот вопрос внесли опыты по транскрипции рДНК с участием РНК-полимеразы I и необходимых факторов in vitro, а также эксперименты in vivo, в которых подходящие матрицы клонированных рДНК вводили в яйцеклетки Xenopus. Были установлены следующие факты: 1. Элемент размером 150 п.н., который примыкает к точке начала транскрипции, скорее всего, ответствен за инициацию транскрипции рДНК, поскольку он присутствует в данной области рДНК у всех видов. 2. Повторы длиной 150 п.н., расположенные слева, стимулируют инициацию транскрипции внутри спейсера, но эта транскрипция не распространяется на внутреннюю область единицы транскрипции. 3. Последовательности размером 40 п. н, которые характерны для кор-промотора длиной 150 п.н. и встречаются в повторах 60/81, вероятно, не функционируют как промоторы. По-видимому, они повышают эффективность инициации транскрипции, при этом эффект не зависит от ориентации данных последовательностей относительно кор-промотора, а также от расстояния между ними и кор-промотором (см. разд. 8.3.г, в котором обсуждаются энхансеры). 4. Множественность энхансеров обусловлена повто-

гичные повторы из 60/81 п. н. Символами Т1 и Т2 отмечены неэффективный и эффективный терминаторы транскрипции соответственно. Функции участков, обозначенных цифрами 0 и 1, неизвестны. [По данным работы Р. Leibhart, R. К. Reeder, Cell 45 (1986), р. 431 ]

рами 60/81 п.н., которые оказывают разное влияние на эффективность инициации транскрипции с участием кор-промотора в зависимости от своего числа и расположения. Функция областей 0 и 1 неясна. Итак, транскрипция рДНК Xenopus, по-видимому, регулируется кластером промоторов/энхан- серов. расположенным в области межгенного спейсера.

Дрожжи. Гены рРНК дрожжей тоже организованы как тандемные единицы транскрипции, кодирующие 18S-, 5,88- и 258-последовательности. разделенные межгенными спейсерами. Своеобразие генных кластеров дрожжей заключается в том, что они содержат ген 58-рРНК, относящийся к генам класса III. который присутствует в каждом из повторов рДНК (разд. 9.5.6); однако этот ген транскрибируется с противоположной цепи ДНК и не РНК-полимеразой I, а РНК-полимеразой III (разд. 8.4).

Последовательности, влияющие на экспрессию единицы транскрипции рДНК дрожжей, выявлены как в опытах с системами транскрипции in vitro, так и в опытах по трансформации дрожжевых клеток плазмидами, содержащими ген псевдо-рРНК. Одна из таких единиц транскрипции гена псевдо-рРНК была сконструирована путем замещения большей части единицы транскрипции рДНК фрагментом ДНК бактериофага Т7. Последовательность ДНК фага Т7 располагалась в гибридной молекуле на 130 п.н. правее точки начала транскрипции про-рРНК и на 500 п. н. левее конца последовательности, кодирующей 25S-pPHK (рис. 8.15). Этот ген псевдо-рРНК был встроен в плазмиду, несущую ARS и центромеру, которая сохранялась в виде самореплицирую- щейся плазмиды в трансформированных клетках дрожжей (разд. 5.6.6). Транскрипты этих химерных единиц транскрипции можно было отличить от

Активатортранскрипции

25855185-ДНК(рагаТ7(600п.н.)255

^—яК-немеев(—^

+1+1

+1

+1

Р-1GS (2 т. п. н.)

РИС. 8.15.

Рекомбинантный ген псевдо-рРНК, сконструированный для идентификации сигналов транскрипции в рРНК-ге- нах дрожжей. Рекомбинантный ген псевдо-рРНК состоит из сегмента ДНК IGS длиной 2 т. п.н., 5'-коди- рующего участка 18S-pPHK длиной 130 п.н., сегмента ДНК фага Т7 длиной 600 п.н., 600 п. н.-сегмента, содержащего 500 п. н. последовательности, кодирующей 25S-pPHK, З'-фланкирующего сегмента длиной 100 п.н.

Указано также положение 55-рДНК в IGS, хотя это и несущественно для данного опыта. Гибридный ген, содержащий предполагаемый активатор транскрипции длиной 190 п.н. на 5'-конце межгенного спейсера или не содержащий его. включали непосредственно в хромосому дрожжей или вводили в клетку в составе реплицирующейся плазмиды. За транскрипцией гена следили по образованию Т7-подобной рРНК.

транскриптов генов эндогенной рРНК дрожжей по наличию последовательностей ДНК фага Т7.

Благодаря использованию производных гена псевдо-рРНК, имеющих делении и перестройки в 1GS, были выявлены три отдельные области в составе межгенного спейсера. которые влияют на скорость и точность инициации транскрипции. Во-первых, последовательность между парами оснований -149 и +15 способна самостоятельно поддерживать (хотя и на низком уровне) транскрипцию псевдо-рРНК. Особенно важен для эффективной инициации транскрипции участок между парами оснований — 149 и —133. Во-вторых, область между парами оснований —210 и —2230 отвечает за то, что инициация транскрипции осуществляется в правильном сайте, и одновременно увеличивает ее эффективность примерно в два раза. В-третьих, добавление участка длиной 190 п.н., охватывающего последовательность от —2230 до —2420 на 5'-конце IGS (рис 8.15), повышает эффективность инициации транскрипции в правильном сайте примерно в десять раз. В то же время, как и в случае последовательностей 60/81 в IGS Xenopus, этот элемент функционирует в любой ориентации, т. е. его стимулирующий эффект не зависит от его ориентации относительно точки начала транскрипции. Отсюда следует, что сегмент размером 190 п.н. действует как энхансер.

Транскрипты, соответствующие межгенному спейсеру, не обнаруживаются in vivo, и, казалось бы, левый элемент размером 190 п. н. на 5'-конце IGS не стимулирует инициацию транскрипции. Но опыты по транскрипции in vitro с экстрактами дрожжей ясно показали, что синтез новых молекул РНК инициируется внутри указанного элемента. Последовательность, необходимая для активации синтеза РНК в этой области, находится в составе сегмента размером 22 п.н. (пары от —32 до —11), расположенного

перед эктопической (смещенной) точкой начала транскрипции. Так, у дрожжей транскрипция кластера генов рРНК может инициироваться на 2 т. п. н. левее зрелого 5'-конца про-рРНК. Однако образование транскриптов, инициированное на 5'-конце IGS, вероятно, завершается недалеко от начала последовательности про-рРНК, а правильные 5'-концы про-рРНК, по всей видимости, получаются при реинициации транскрипции. Напомним, что у Drosophila и Xenopus транскрипция также начинается и заканчивается внутри областей межгенных спейсеров генов рРНК. Как именно терминации в этой области влияют на инициацию транскрипции, мы обсудим в следующем разделе.

Терминация транскрипции рДНК

з*з*Поскольку про-рРНК-транскрипты заканчиваются последовательностью, находящейся на З'-кон- це 28S-pPHK или рядом с ним, раньше полагали, что эта концевая последовательность и представляет собой терминатор транскрипции с участием РНК-полимеразы I. Но последующие эксперименты по изучению транскрипции in vitro специально сконструированных генов рРНК показали, что транскрипция проходит З'-конец зрелой 28S-pPHK, заканчиваясь далеко за ним. Транскрипция у Xenopus охватывает всю область межгенного спейсера, заканчиваясь в сайте, находящемся примерно на 200 п. н. левее кор-промотора следующей, 35S-npo- рРНК; зрелый З'-конец образуется в результате эндонуклеазного расщепления РНК в сайте, находящемся сразу же за концом последовательности, кодирующей 28S-pPHK. У дрожжей терминация транскрипции, инициированной с кор-промотора, происходит в межгенном спейсере за геном 5S- рРНК, не доходя примерно 300 п. н. до начала следующей последовательности про-рРНК.

з*

з*

У мышей транскрипция рДНК заканчивается между 550 и 600 п. н. за З'-концом последовательности 28S-pPHK. Сигналом к терминации транскрипции с участием РНК-полимеразы I в этой системе служит высококонсервативная последовательность значащей цепи длиной 18 п. н. (5'-AGGTCGACCA- GatNTCCG-З'. так называемый Sail-бокс), которой обычно предшествует один или несколько пиримидиновых кластеров. Восемь таких повторов встречаются в области между 500 и 1200 п.н., считая от З'-конца 288-рДНК (рис. 8.16), но обычно терминация происходит внутри Т-участков, предшествующих первому Sail-боксу. Консервативная последовательность из 18 п. н. может сама вызывать терминацию транскрипции, но более эффективная и точная терминация осуществляется в том случае, когда как перед ней, так и после нее имеются Т-богатые участки. Небольшие делеции, вставки и замены пар оснований внутри сегмента размером 18 п.н. или инверсия этого сегмента приводят к утрате его способности терминировать транскрипцию. Отчасти похожий порядок расположения консервативных повторов (5'-GGGTTGACCA-3'), по-видимому, служит сигналом терминации транскрипции при синтезе про-рРНК человека. Консервативные повторяющиеся последовательности (5'-GACTTGC-3', которым предшествуют Т-повторы) встречаются в

областях межгенных спейсеров у Xenopus, при этом терминация чаще всего осуществляется в повторе, находящемся в З'-концевом участке спейсера сразу перед промотором.

Вначале имелись лишь косвенные данные о том, что терминация в указанных выше сайтах происходит при связывании неких белков со специфическими последовательностями ДНК. Эти данные получили подтверждение после того, как в экстрактах ядер были обнаружены белковые факторы, связывающиеся с терминирующей последовательностью размером 18 п.н. Связывание белков-лигандов с терминирующей последовательностью идентифицировали по защите 5'-меченого фрагмента, содержащего эту сигнальную последовательность, от расщепления экзонуклеазой III (рис. 8.17). Расщепление происходило только до тех пор, пока фермент не встречал на своем пути связанный белок. Напомним, что экзонуклеаза III расщепляет фрагменты двухцепочечной ДНК, начиная с З'-концов (табл. 4.1). В результате образуются цепи ДНК с мечеными 5'-концами, причем их длина определяется тем, в каком месте связанный белок останавливает экзонуклеазное расщепление. Поскольку 5'-конец каждой цепи фрагмента можно пометить независимо, нетрудно установить границы защищенного участка. В опытах такого рода с сегментами, содержа-

CTCTGCGGGC TTTCCCGTCG CACGCCCGCTCGCTCGCAC6CGACCGTGTC GCCGCCCGGG CGTCACGGGGGCGGTCGCCT CGGCCCCCGCGGGGTGCCC

GAACGACCGT gtggtggttg ggggggggatCGTCTTCTCCTCCGTCTCCC GAGGACGGTT cgtttctcttTCCCCTTCCG TCGCTCTCCTT6G6TGTGGG

AGCCTCGTGC CGTCGCGACC GCGGCCTGCC6TC6CCTGCCGCCGCAGCCC CTTGCCCTCC GGCCTTGGCCAAGCCGGA6G GCGGAGGAGGGGGATCGGCG

GC6GCGGCGA CCGCGGCGCG GTGACGCACG6TGGGATCCCCATCCTCGGC GCGTCCGTC6 GG6AC6GCCGGTTGGAGG6GC6G6AGGGGTTTTTCCCGTG

AACGCCGCGT TCGGCGCCAG GCCTCTGGCG GCCGGGGGG CGCTCTCTCC GCCCGAGCAT_CCCCACTCCC_GCCCCTCCTC_TTCGCGCGCC GCGGCG6CGA CGTGCGTACG AGGGGAGGAT GTCGCGGTGTGGAGGCGGAGAGGGTCCGGC GCGGCGCCTC TTCCATTTTTTCCCCCCCAA CTTCGGAGCTCGACCA6TAC

TCCGGGCGAC ACITTGTTTT ТТТТТТТТССCCCGATGCTGGAGGTCGACC A iTGTCCGA AAGTGTCCCCCCCCCCCCCC CCCCCCGGCGCGGAGCGGCG

2

GGGCCACTCT GGACTCTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTAAATTCCT

GACCAGTACT CCGGGTGGTA CTTTGTCTTT TTCTGAAAAT CCCAGAGGTC 4

TTCTCTTTTTTTTTTTTT TTTG6TGTGC ctctttttga CTTATATACA

TCCGGGCGAC ACTTTGTTTT ПТТТТТТП TCCACCGATG ATGGAGGTCG

GCG6GCTCAC TCTGGACTCT TTTTTTTTTT tttttttttt TTTAAATTTC

РИС. 8.16.

Нуклеотидная последовательность терминирующей области рДНК мыши длиной 1168 нуклеотидов, начинающаяся с первой позиции справа от З'-конца гена зрелой 28S-pPHK. З'-транскрибируемый спейсер (565 п. н.) выделен серым цветом. Цветными прямоугольниками с номерами указаны элементы длиной 18 п. н.

GGAACCTTTA GGTCGACCAG TTGTCC6TCT ТТТАСТССТТ CATATAGGTC 3~

GACCAGATAT CCGAAAGTCC ТСТСТТТССС ТТТАСТСТТС CCCACAGC6A

5

TGTAAATAGT GTGTACGTTT АТАТАСТ AGGAG6AGGT CGACCAGTAC

6

АССАСАТСТС CGAAAGT6TC CCGTCCCCCC ССТССССССС CCGCGACGCG

7

TGGAACCTTA AGGTCGAC

8

(содержащие сайты для Sa/I), находящиеся в межгенном спейсере сразу за сайтами терминации. Пунктиром выделены богатые пиримидинами участки длиной не менее десяти нуклеотидов с содержанием пиримидинов 80%. [Crummt et al.. Cell 43 (1985), p. 801.]

5

Нг

3'

5'

РасщеплениерестриктазойHin dill

Расщепление рестриктазой \ EcoKY

D 5'

Мечение 5-конца при помощи киназы и ■уир-АТР; расщепление рестриктазой

Есо RI

3'

Мечение 5-конца при помощи киназы и y32P-ATP; расщепление рестриктазой Мл dill

3'

5'

Инкубирование с ДНК-связывающими белками, расщепление экзонуклеазой III, денатурация,электрофорез и радиоавтография

РИС. 8.17.РИС. 8.17.

РИС. 8.17.

РИС. 8.17.

■•Экзонуклеаза ДНК-связываю- щий белок

Изучение связывания белка с помощью защиты ДНК от расщепления под действием экзонуклеазы III. Рестрикционный фрагмент ДНК известной длины метили 32Р по 5'-концу. После инкубации меченых фрагментов с клетками, ядерными экстрактами или очищенными ДНК-связывающими белками предполагаемые образовавшиеся комплексы расщепляли экзонуклеазой III в условиях, при которых обеспечивалась стабильность

щими две предполагаемые терминирующие последовательности (Sail-боксы и окружающие их последовательности, находящиеся между парами оснований 583 и 665 за З'-концом 28S-pPHK), картина распределения экзонуклеазных фрагментов изменялась после предварительной инкубации препарата с ядерным экстрактом (рис. 8.18). Это изменение свидетельствовало о том, что с Sail-боксом связан какой-то белок (или белки). Изменения в пределах одного из консервативных участков Sail-бокса или изменение расстояния между двумя наиболее кон

комплексов. Далее проводили денатурацию, гель-злек- трофорез и радиоавтографию и по положению полос определяли размер недеградированной (защищенной) части цепи и, таким образом, устанавливали внешние границы сайта связывания белка. В приведенном примере белок связывается ближе к EcoRI-сайту, чем к сайту HindWY.

сервативными участками мешают связыванию белков и нарушают терминацию. Более того, при включении в единицу транскрипции синтетических олигонуклеотидов, соответствующих консенсусной последовательности Sail-бокса. увеличивается эффективность терминации транскрипции с участием РНК- полимеразы I in vitro. Белок, связывающийся с Sail- боксом, получен в чистом виде, хотя механизм его действия до сих пор не установлен.

РИС. 8.18.Связывание ядерного фактора терминации с Sall-боксами. А. Фрагмент ДНК длиной 378 п.н., содержащий два Sail-бокса за участком, кодирующим 28S-pPHK мыши, метили с 5'-конца либо значащей, либо матрич-РИС. 8.18.Связывание ядерного фактора терминации с Sall-боксами. А. Фрагмент ДНК длиной 378 п.н., содержащий два Sail-бокса за участком, кодирующим 28S-pPHK мыши, метили с 5'-конца либо значащей, либо матрич-

РИС. 8.18.

Связывание ядерного фактора терминации с Sall-боксами. А. Фрагмент ДНК длиной 378 п.н., содержащий два Sail-бокса за участком, кодирующим 28S-pPHK мыши, метили с 5'-конца либо значащей, либо матрич-

РИС. 8.18.

Связывание ядерного фактора терминации с Sall-боксами. А. Фрагмент ДНК длиной 378 п.н., содержащий два Sail-бокса за участком, кодирующим 28S-pPHK мыши, метили с 5'-конца либо значащей, либо матрич-

8а/-6оксSal- бокс

JL

4[1i^ 378 п-н-

((СО338л.н.

( О283 п.н.

((<(.0161 п.н.

(* (< О 106 п.н.

ной цепи. Меченый фрагмент расщепляли экзонуклеазой III, взятой в избытке, в присутствии или в отсутствие клеточных фракций: экстракта S-100 (в котором не содержится активный фактор терминации) или ядерного экстракта (который стимулирует терминацию транскрипции в Sail-боксе или соседних последовательностях). После расщепления оставшуюся ДНК денатурировали и проводили электрофорез и радиоавтографию. Б Исходный меченый (звездочки) фрагмент и предполагаемые продукты расщепления экзонуклеазой III. образующиеся при связывании фактора терминации с Sall-боксом. Длина меченых фрагментов определяется тем, в каких местах связывается фактор терминации, блокирующий расщепление ДНК экзонуклеазой III. [I. Grummt et al.. Cell 45 (1986), p. 837. Электрофореграмма представлена I. Grummt.]

д. Сопряжение терминации иинициации транскрипции

Необычным свойством терминирующих последовательностей является то. что они часто располагаются непосредственно перед промоторами следующего гена рРНК (рис. 8.19). Такие терминирующие последовательности обнаружены вблизи пары оснований —170, считая от точки начала транскрипции рДНК мыши, вблизи пары оснований — 185 в левой регуляторной области рДНК человека и около пары оснований —200 перед единицей транскрипции рДНК Xenopus. Удивительно, что де- леция этих терминирующих последовательностей или изменения в них заметно уменьшает эффективность транскрипции, которая начинается в точке +1, находящейся под контролем следующего кор- промотора. Вначале полагали, что фактор терминации как-то взаимодействует с фактором инициации или с РНК-полимеразой I или же что активация

происходит при благоприятной локализации фермента в близкорасположенных сайтах рядом с рДНК-промотором. Однако по другой версии терминация препятствует разрушению работающей полимеразой комплексов транскрипции, сборка которых осуществляется около следующего промотора.

В транскрипции генов рРНК многое остается загадочным, в частности, неясно, каким образом координируется экспрессия генов, кодирующих рРНК, 5S-pPHK и рибосомные белки. Особенно интригующей представляется механистическая и регуляторная роль (если она есть) различных промо- торных, энхансерных и терминирующих последовательностей в составе области межгенного спейсе- ра, которая ранее считалась «молчащей». Полученные данные ставят также вопрос о том, характерна ли координированная терминация и инициация транскрипции для экспрессии генов классов 11 и III. С биохимической точки зрения важно выделить

28S-pPHKТ, - т8Ш = ■ >>>■28S-pPHKТ, - т8Ш = ■ >>>■>30т.п.н.>30т.п.н.Промоторы IGSПромоторы IGSСайт процессинга про-рРНКСайт процессинга про-рРНК565 п.н.565 п.н.т 5-ETS 185-рРНКЖХVH«№т 5-ETS 185-рРНКЖХVH«№3-конец про-рРНК3-конец про-рРНКРИС. 8.19.

28S-pPHKТ, - т8

Ш = ■ >>>■

28S-pPHKТ, - т8

Ш = ■ >>>■

>30т.п.н.

>30т.п.н.

Промоторы IGS

Промоторы IGS

Сайт процессинга про-рРНК

Сайт процессинга про-рРНК

565 п.н.

565 п.н.

т 5-ETS 185-рРНК

ЖХVH«№

т 5-ETS 185-рРНК

ЖХVH«№

3-конец про-рРНК

3-конец про-рРНК

Промоторы межгенного спейсера (IGS) и терминаторы (Т) кластера генов рРНК мыши. Транскрипция последовательности, кодирующей 28S-pPHK, заканчивается внутри кластера терминаторов (Т1-Т8); получившийся транскрипт подвергается процессингу с образованием

З'-конца зрелой 28S-pPHK. Транскрипция начинается с промоторов IGS, а заканчивается в терминаторе, находящемся непосредственно перед промотором единицы транскрипции, расположенной справа. [I. Grummt et al.. Cell 47 (1986), p. 901.]

и охарактеризовать взаимодействующие со специфическими последовательностями ДНК факторы транскрипции и терминации, ассоциированные с РНК- полимеразой I. Это поможет понять молекулярную основу их функционирования и взаимодействия.

СТРОЕНИЕ И ЭКСПРЕССИЯГЕНОВ КЛАССА II

а. Общие положения

Свойства РНК, кодируемых генами класса II. Гены класса II кодируют все цитоплазматические мРНК и все, за исключением одной (U6), U-PHK, входящие в состав мяРНП. Все транскрипты генов класса II имеют характерные группировки (кэпы) на 5'-конце 7-метилгуанозин (в мРНК) и 2,2,7-триметил- гуанозин (в U-PHK). В обоих случаях метилированный гуанозин кэпа связан с первым нуклеотидом транскрипта трифосфатным мостиком между соответствующими 5'-группами (рис. 3.53). Почти у всех мРНК сразу за кодирующей последовательностью находится полиаденилатный хвост разной длины. poly(A); он не кодируется генами, с которых транскрибированы мРНК, а присоединяется в ходе отдельной посттранскрипционной реакции. У дрожжей и других низших эукариот длина ро!у(А)-хвостов варьирует от 75 до 125 остатков. Ядерные мРНК большинства позвоночных имеют ро!у(А)-хвосты длиной от 200 до 300 нуклеотидов, а ро!у(А)-участки цитоплазматических мРНК меньше по размеру и имеют разную длину у разных мРНК. Многие гистоновые мРНК и U-PHK, напротив, не содержат ро!у(А)-хвостов. В разд. 8.3.в мы обсудим способы образования 5'-кэпов, З'-концов и ро!у(А)-хвостов у всех этих РНК. Некоторые мРНК содержат М6-метилированные остатки аденина, а все U-PHK отличаются тем, что имеют большое количество разным образом модифицированных остатков ура

цила. Возможно, эти модификации осуществляются котранскрипционно или посттранскрипционно, однако их физиологическая роль неясна.

За редким исключением, мРНК и U-PHK образуются из первичных транскриптов, длина и последовательность которых коллинеарны ДНК, с которой они транскрибированы. Помимо кэпирования и расщепления на З'-конце, за которыми следует полиаденилирование, важнейшей стадией процессинга, необходимой для образования мРНК, является сплайсинг. Про-U-PHK ввиду отсутствия интронов сплайсингу не подвергается, но и в этом случае для образования зрелых З'-концов должно произойти эндо- и экзонуклеолитическое расщепление первичных транскриптов.

Уровни регуляции экспрессии генов класса 11. Фенотип дифференцированной клетки в большой степени определяется количеством и разнообразием содержащихся в ней белков, что обычно связано с разнообразием синтезируемых мРНК. Поэтому основным механизмом создания разных фенотипов является дифференциальная экспрессия генов класса II. Эта принципиальная связь между экспрессией гена и фенотипом была установлена при помощи сравнительного анализа белков и мРНК на разных стадиях развития в разных дифференцированных тканях одного и того же организма и даже в одинаковых клетках в разных физиологических состояниях.

В принципе (и. возможно, в действительности) регуляция экспрессии гена может происходить на любой стадии биогенеза мРНК или во время трансляции мРНК при синтезе белка. Множество фактов указывает на то, что количество мРНК зависит прежде всего от частоты инициации транскрипции. Этот процесс регулируется в основном с помощью взаимодействий между специфическими элементами последовательностей, которые находятся в сайте инициации, но часто располагаются и на различных

расстояниях от него (*/ис-элементы), и набором специфических белков, многие из которых связываются со специфическими последовательностями ДНК (транс-действующие факторы транскрипции). Таким образом, как временная, так и тканевая специфичность регуляции транскрипции определяется наличием и концентрацией различных транс-действующих факторов. Второй наиболее существенный фактор регуляции количества мРНК (разд. 8.5)-скорость и механизм сплайсинга про-мРНК. Как показано в разд. 8.7, экспрессия по крайней мере некоторых генов может регулироваться также дифференциальным разрушением мРНК. Регуляция транспорта мРНК из ядра в цитоплазму, в места трансляции, вероятно, также может влиять на экспрессию генов, кодирующих белки, но данных в пользу этой гипотезы очень мало. Кроме того, регулируется и процесс трансляции мРНК (убедительные данные на этот счет представлены в разд. 8.7). Свой вклад в регуляцию содержания белка вносит избирательная деградация белков, однако неясно, в какой степени. Если бы время жизни белков влияло на равновесные концентрации ключевых компонентов комплекса транскрипции (например, транс-действующих факторов транскрипции), это могло бы иметь огромное значение для регуляции биогенеза мРНК.

Аппарат транскрипции

РНК-полимераза II. Гены класса И транскрибируются в ядре с участием РНК-полимеразы И. Этот фермент выделен из широкого круга организмов, включая дрожжи. Physarum, AspergiULs, Acanthamoe- Ьа, высшие растения, насекомых, Xenopus и млекопитающих. Субъединичное строение ферментов из разных организмов весьма сходно и часто не различается, если судить по физическим критерям (рис. 8.20). По-видимому, число субъединиц равно девяти или десяти. Все ферменты имеют две большие субъединицы. Одна из них мол. массой примерно 220 кДа является самым крупным из всех полипептидов, входящих в состав РНК-полимераз трех типов. Другая имеет мол. массу около 140 кДа. Еще три субъединицы меньшего размера одинаковы у всех трех РНК-полимераз; остальные четыре или пять субъединиц характерны только для РНК-полимеразы II. Структурное и химическое сходство двух самых крупных субъединиц всех трех эукариотических РНК-полимераз, на которое раньше указывали перекрестные иммунологические реакции и наличие общих пептидов, теперь установлено путем сравнения кодирующих последовательностей их клонированных генов. Более того, аминокислотные последовательности двух самых больших субъединиц в каждой из трех эукариотических РНК-полиме-

РИС. 8.20.

Белковые компоненты ядерных РНК-полимераз млекопитающих. Очищенные препараты РНК-полимеразы I (о), РНК-полимеразы II (б) и РНК-полимеразы III (в) подвергали электрофорезу в ПААГ в денатурирующих условиях. Полосы соответствуют отдельным полипептидам. которые входят в состав соответствующих РНК- полимераз. (Фотография предоставлена R. Young.)

раз на удивление близки к аминокислотным последовательностям двух больших субъединиц РНК- полимеразы Е. coli.

Из трех РНК-полимераз эукариот наиболее чувствительна к а-аманитину РНК-полимераза II. Токсин не мешает инициации синтеза цепей ДНК, но блокирует их элонгацию. Участок связывания а-аманитина, по-видимому, локализован на самой большой субъединице. Во всяком случае, мутации, обусловливающие устойчивость Drosophila и S. сеге- visiae к а-аманитину, картируются в гене, кодирующем субъединицу размером 220 кДа. Самая крупная субъединица РНК-полимеразы II является также объектом физиологического фосфорилирования-дефосфорилирования и имеет множество сайтов, в которых эти реакции протекают. Высокофосфори- лированная субъединица, обнаруженная в составе РНК-полимеразы II, участвующей в транскрипции in vivo, значительно более активна, чем нефосфори- лированный фермент, использующийся в опытах in vitro совместно с основным промотором поздней области генома аденовируса.

Гены, кодирующие самую большую субъединицу РНК-полимеразы II дрожжей, Drosophila и мле-

копитающих, кодируют С-концевые полипептидные домены, содержащие множественные тандемные повторы гептапептида Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser. Число повторов варьирует от 26 (дрожжи) до 52 (мышь). Эта повторяющаяся последовательность уникальна и важна для активности РНК-полимеразы. Опыты с генами дрожжей по изменению этой последовательности показывают, что субъединицы, имеющие менее 12 или 13 таких повторов, не функциональны in vivo. Возможно, повышенное содержание серинов и треонинов в этой области создает условия для фосфорилирования, о котором шла речь, но точная роль повторяющейся гептамерной последовательности неизвестна.

Факторы транскрипции. РНК-полимераза II, как и другие РНК-полимеразы (разд. 8.2 и 8.4), нуждается во вспомогательных белках для формирования функционального комплекса транскрипции. Многие из них являются ДНК-связывающими белками, узнающими один или несколько элементов, вместе составляющих промотор гена. Некоторые факторы транскрипции, вероятно, участвуют в белок-белко- вом взаимодействии с другими факторами и, таким образом, изменяют сродство и специфичность их связывания. Взаимодействуя с различными элементами последовательностей ДНК и друг с другом, разные факторы транскрипции формируют сложные белко ые комплексы, которые регулируют способность РНК-полимеразы II инициировать транскрипцию. Большая часть комплексов положительно влияе на транскрипцию, усиливая ее инициацию, но известны и такие, которые осуществляют отрицательную регуляцию и, таким образом, выступают в роли репрессоров. Существуют даже факторы, которые стимулируют транскрипцию одного гена, одновременно подавляя транскрипцию другого. Многие факторы специфичны для определенных клеток или тканей либо действуют только на определенных этапах развития, что обеспечивает дифференциальную транскрипцию генов в разных тканях или в разное время. Образно говоря, РНК-полимераза II представляет собой инструмент транскрипции, а взаимодействие факторов с регуляторными сигнальными последовательностями ДНК и друг с другом определяет, в каком месте и с какой скоростью этот инструмент будет работать.

Число белковых факторов, которые относят к т/юнс-действующим, все возрастает, хотя не все они до конца охарактеризованы. Функционирование любого отдельного фактора зависит от типов и организации определенных участков ДНК -z/кс-элемен- гов, входящих в состав регуляторной области гена. Эта зависимость очень сложна. Так, некоторые факторы транскрипции связываются не с одним типом элементов ДНК, а отдельные последовательности ДНК могут связывать факторы нескольких

видов. Более того, тандемно расположенные или перекрывающиеся элементы часто образуют дополнительные сайты связывания, не представленные ни в одном из отдельно взятых элементов, или облегчают связывание какого-то одного фактора по сравнению с другим. Реальная сложность этих взаимодействий наряду с отсутствием многих деталей не позволяет всесторонне обсуждать этот важный вопрос. Более того, для систематизации факторов транскрипции используются разные и часто не связанные друг с другом подходы. Как правило, в основу классификации положены типы тканей или клеток, вырабатывающих факторы транскрипции, основные характеристики связывающих их последовательностей или просто вкусы исследователя. Поэтому мы ограничимся описанием характерных i/wc-действующих элементов некоторых регуляторных областей в модельных системах (разд. 8.3.г-з) и тех факторов, взаимодействие которых с этими областями наиболее полно изучено. Ниже, в разд. 8.6, мы более подробно обсудим особенности строения некоторых факторов транскрипции поли- пептидной природы, обеспечивающие их способность взаимодействовать с ДНК и активировать транскрипцию.

Созревание мРНК и U-PHK

Кэширование. Все мРНК клеток эукариот и вирусов, за исключением мРНК пикорнавирусов, имеют на 5'-конце кэпы. Кэп-структуры как в ядерных, так и в цитоплазматических транскриптах РНК-полимеразы II ассоциированы со специфическими кэп- связывающими белками, однако роль кэпов и связанных с ними белков в метаболизме мРНК неясна. Тем не менее установлено, что кэп-структура специфически взаимодействует с факторами инициации трансляции при сборке трансляционного комплекса.

Кэпирование про-мРНК на 5'-конце транскриптов РНК-полимеразы II осуществляется сразу же после инициации; даже самые короткие из проанализированных цепочек РНК оказались кэпированны- ми. Одним из субстратов фермента гуанилилтранс- феразы, катализирующего кэпирование, является GTP, другим - дифосфорилированный конец, образующийся при отщеплении крайнего фосфата от три- фосфатной группы первого нуклеотида синтезируемой РНК (рис. 8.21). В реакции кэпирования крайний фосфат трифосфатной группы синтезируемой про- мРНК замешается на остаток гуанилила из молекулы GTP. Про-мРНК, имеющая на 5'-конце только монофосфат, не вступает в реакцию. Таким образом, кэп помечает первый нуклеотид, с которого начинается транскрипция. Присоединенный остаток гуанина метилируется в положении 7 пуринового кольца под

О онО оно оно онО=Р-О-\О' \про-мРНКО=Р-О-\О' \про-мРНКО=Р-О~.Гуанозин-7- ।Q- \метилтрансфераза! SAMхТпро-мРНК7-метил-гуанозиновый кэпО=Р-О~.Гуанозин-7- ।Q- \метилтрансфераза! SAMхТпро-мРНК7-метил-гуанозиновый кэп2-0-метил - I трансфераза ’ SAM

О он

О он

о он

о он

О=Р-О-\

О' \

про-мРНК

О=Р-О-\

О' \

про-мРНК

О=Р-О~.

Гуанозин-7- ।Q- \

метилтрансфераза! SAMх

Тпро-мРНК

7-метил-гуанозиновый кэп

О=Р-О~.

Гуанозин-7- ।Q- \

метилтрансфераза! SAMх

Тпро-мРНК

7-метил-гуанозиновый кэп

2-0-метильные заместители у нуклеотидов +1или +1 и +2 про-мРНК

действием гуанозил-7-метилтрансферазы; 2'-гидро- ксильные группы первого и второго нуклеотидов в синтезируемой РНК метилируются позже при участии 2'-О-метилтрансферазы. Сам 7-метил-СТР не является субстратом в реакции кэпирования. U-PHK предположительно кэпируются сходным образом, но в этом случае последующее метилирование приводит к образованию 2,2,7-триметилгуано- зиновых кэпов, а также 2'-О-метилзамещенных групп в нескольких первых нуклеотидах транскрипта. Поскольку про-мРНК-транскрипты, синтезированные в клеточных экстрактах или с участием очищенной РНК-полимеразы II, кэпируются правильно, ответственные за это ферментативные активности, по-видимому. связаны с самой полимеразой. Реакции инициации транскрипции и кэпирования под действием РНК-полимеразы II, вероятно, строго сопряжены, так как ядерные транскрипты, образованные при участии РНК-полимеразы III,

РИС. 8.21.

Образование 5'-кзп-структур эукариотических мРНК. После отщепления концевого фосфата 5'-трифосфатного конца синтезированной про-мРНК гуани- лилтрансфераза присоединяет гуанильный остаток гуанозинтрифосфата к ди- фосфорилированному концу про-мРНК, в результате чего образуется предшественник 5'-кзпа. Специфические метил- трансферазы, использующие S-адено- зилметионин (SAM), метилируют гуанозиновый кзп в положении 7 и 2'-гидро-

ксильные группы первого и второго остатков рибозы про-мРНК.

которые имеют на конце трифосфат (например, U6-PHK, 5S-pPHK и про-тРНК), не кэпируются. Поэтому возникает вопрос, что же определяет разные виды кэпов у про-мРНК и npo-U-PHK?

Роль кэпов в синтезе и созревании первичных транскриптов с образованием мРНК не выяснена. В частности, спорными являются данные об участии кэпов в сплайсинге. Вопрос об участии кэпов в образовании ядерных рибонуклеопротеиновых комплексов (яРНП), в составе которых мРНК транспортируются из ядра в цитоплазму, или в сборке цитоплазматических рибонуклеопротеиновых частиц (цРНП) остается невыясненным. Имеются указания на то, что кэпы и связанные с ними белки защищают мРНК от расщепления со стороны 5'-концов. Однако более вероятно, что кэпы необходимы для присоединения рибосом к мРНК перед инициацией трансляции. Один из факторов инициации, eIF-4E, выполняет специфическую функцию узнавания кэпа при

ассоциации 408-субъединицы рибосомы с 5'-концом мРНК (разд. 3.8.6). Отсутствие структуры кэпа у РНК, функциональных в других отношениях, делает невозможной их трансляцию. Единственным известным исключением из правила, согласно которому кэп необходим для трансляции, являются пикор- навирусы (например, полиовирус), геномная РНК которых функционирует в качестве мРНК всех кодируемых вирусом белков. Более того, клетки, инфицированные полиовирусом, прекращают синтез собственных белков, поскольку кодируемый вирусом белок инактивирует клеточный кэп-связываю- щий белок.

Полиаденилирование и терминация транскрипции. Транскрипция многих генов белков эукариот заканчивается далеко за сайтом, в котором происходит расщепление РНК с образованием З'-конца зрелой РНК. Терминация осуществляется во множественных сайтах последовательности ДНК протяженностью в сотни, а иногда и тысячи пар нуклеотидов. Например, находящаяся за сайтом полиаденилирования область, в которой заканчивается транскрипция гена р-глобина позвоночных, имеет длину более чем 1 т. п. н. Аналогичным образом, транскрипция первого из двух тандемно расположенных генов а-глобина млекопитающих заканчивается в разделяющей эти два гена промежуточной области размером почти 2 т. п. н. Еще более ярким примером служит транскрипция поздней области генома аденовирусов. В этом случае непрерывная транскрипция области, содержащей пять участков полиаденилирования, заканчивается только в конце вирусной ДНК.

Некоторые гены белков эукариот, напротив, имеют четко определенные сигналы терминации транскрипции. В гене гастрина человека, например, сигнал терминации находится на 192 п. н. правее сайта полиаденилирования мРНК гастрина. Эта последовательность, которая останавливает транскрипцию как in vivo, так и in vitro, богата остатками Т: 5'-ТдА2Т5АТ4АТ4АТ5-3'. Транскрипция ДНК заканчивается как раз перед этой сигнальной последовательностью, в каком бы месте ДНК она ни находилась. Такая же последовательность- с небольшими отличиями найдена и в друз их генах позвоночных как до, так и после единицы транскрипции. Этот предполагаемый сигнал терминации, а также некоторые Т-богатые последовательности в генах дрожжей, 5'-CAATCTTG-3' и 5'-Т5АТА-3', напоминают p-зависимые сигналы терминации у Е. coli (разд З.8.Г.).

Транскрипция обычно не останавливается в сайтах полиаденилирования. З'-полиаденилированные концы должны образоваться позже при эндонукле- азном расщеплении и последующем присоединении остатков адениловой кислоты к З'-гидроксильной

группе, образовавшейся в сайте расщепления. Сайт расщепления-полиаденилирования образуют две довольно близко расположенные друг к другу последовательности. Одна из них-фактически неизменная последовательность ААТААА, находящаяся на 10-30 п. н. левее динуклеотида С А, локализованного в сайте, где часто осуществляется расщепление и полиаденилирование, или вблизи него. Замена Т на G в последовательности ААТААА заметно понижает эффективность полиаденилирования, хотя небольшое количество образовавшихся концов поли- аденилируется. Мутация, состоящая в замене последнего А на G в последовательности ААТААА на конце гена а-глобина человека, нарушает синтез нормальной а-глобиновой мРНК. Эти и другие экспериментальные данные указывают на то, что последовательность ААТААА совершенно необходима. Однако эти последовательности присутствуют также в кодирующих областях многих генов в сайтах, где полиаденилирование не происходит, поэтому для запуска реакций, ведущих к расщеплению и полиаденилированию, необходима вторая последовательность. Положение второго сигнала определяли, исследуя влияние на полиаденилирование делеций вблизи сайта полиаденилирования. Полученные данные показали, что точная последовательность и положение нужного сигнала зависят от конкретного гена. Наиболее вероятный сигнал(ы) во многих генах белков позвоночных - сегмент, богатый GT или Т, 5'-YGTGTGYY-3' (Y-любой пиримидин), находящийся правее сайта расщепления в интервале примерно из 25 п.н., за которым на разном расстоянии часто встречаются короткие Т-повторы (рис. 8.22).

В некоторых случаях даже подлинные сайты полиаденилирования не функционируют. При процессинге поздних мРНК аденовируса 2 используется лишь какой-то один из пяти возможных сайтов полиаденилирования первичного транскрипта (рис. 8.23). Относительное содержание разных поздних мРНК аденовируса 2 отражает частоту, с которой происходит расщепление и полиаденилирование первичного транскрипта в разных сайтах. В данном случае соотношение количеств различных мРНК. образованных из общего транскрипта, изменяется в ходе инфекции, из чего следует, что выбор сайта полиаденилирования регулируется. Вторым примером может служить переключение клеток с синтеза мембраносвязанных цепей иммуноглобулина на образование соответствующих секретируемых форм (рис. 10.72). Различие между двумя этими формами касается тяжелых цепей иммуноглобулина. В этих случаях полиаденилирование по первой сигнальной паре последовательностей в про-мРНК, которое необходимо для образования мРНК, кодирующей секретируемую цепь иммуноглобулина, подавляет-

Ген а-глобина человека Ген [Ь-глобина человека HLA-ген человека Ген a-IFN человекаГен y-IFN человекаГен гормона роста человекаГен препроинсулина человекаГен металлотионеина мышиРанняя область генома SV40Поздняя область генома SV40Ad12ElaAd2 L2 HSV-1 ТК ASV A-MuLVГен а-глобина человека Ген [Ь-глобина человека HLA-ген человека Ген a-IFN человекаГен y-IFN человекаГен гормона роста человекаГен препроинсулина человекаГен металлотионеина мышиРанняя область генома SV40Поздняя область генома SV40Ad12ElaAd2 L2 HSV-1 ТК ASV A-MuLV

Ген а-глобина человека Ген [Ь-глобина человека HLA-ген человека Ген a-IFN человека

Ген y-IFN человека

Ген гормона роста человека

Ген препроинсулина человека

Ген металлотионеина мыши

Ранняя область генома SV40

Поздняя область генома SV40

Ad12Ela

Ad2 L2 HSV-1 ТК ASV A-MuLV

Ген а-глобина человека Ген [Ь-глобина человека HLA-ген человека Ген a-IFN человека

Ген y-IFN человека

Ген гормона роста человека

Ген препроинсулина человека

Ген металлотионеина мыши

Ранняя область генома SV40

Поздняя область генома SV40

Ad12Ela

Ad2 L2 HSV-1 ТК ASV A-MuLV

TCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCAGCCTGTGTGTGCCTGGGTTCTCTCTGTCCCGGAATGTGCCAACAATGGA

CTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAATGATGTATTTAAATTATTTCTGAATATTTTACTAAAAAGGGAAT

AGACAAAATAAATGGAACACATGAGAACCTTCMGAGTCCATGTGTTTCTTGTGCTGATTTGTTGCAGGGG

TTTTTCATTAAATTTTTACTATACAAAATTTCTTGTGTTTGTTTATTTTTTAAGATTAAATGCCAAGCCTGACTGTA ♦

TATATGAATAAAGTGTAAGTTCACAACTACTTATGCTGTGTTGGACTTTTTCTAAGTGAGACCTGGAGTGAAAGAAC

TGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGT

AGATGGAATAAAGCCCTTGAACCAGCCCTGCTGTGCCGTCTGTGTGTCTTGGGGGCCCTGGGCCAAGCCCCACTTCC

GTTAATAATAAAAGCCTGTTTGAGTCTAACTCTGGTTTCTTGGTGTGGTTTGGCAATAAGAAACTGGGGTGACTTGA

TTCACAAATAAAOCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTG agctgcaataaacaagttaacaaAacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggtttt

atgtataataaaactggtttcggttgaagtgtcttgttaatgtttgtttgggcgtggttaaacagggatataaagct

aatcaaaataaaaagtctggagtctcacgctcgcttggtcctgtaactattttgtagaatggaagacatcaactttg gacggcaataaaaagacagaataaamgcacgggtgttgggtcgtttgttcataaacgcggggttcggtcccagggc CGATACAATAAACGCCATTTGACCATTCACCAcAtGGTGTGTGCACCTGGGTTCATGGCTGGACCGTCGAT ГСССТ gtatccaataaaccctcttgc^gttgcatccgacttgtggtctcgctgttccttgggagggtctcctctgagtgcgt

РИС. 8.22.

Нуклеотидные последовательности 3 концов значащих цепей ДНК, кодирующих разные мРНК млекопитающих и вирусов эукариот. Подчеркнуты инвариантные олигонуклеотиды ААТААА и GT-богатые участки. Стрелками указаны сайты полиаденилирования. HLA-один из генов, кодирующих главный антиген гистосовместимости; a-IFN и y-IFN - а- и у-интерфероны соответственно; Ad12 Е1А и Ad2 L2-трансформирующий белок Е1А

аденовируса 12 и структурный белок аденовируса 2 соответственно; HSV-1 ТК-ген тимидинкиназы вируса герпеса типа 1; ASV- провирусная последовательность, кодирующая З'-конец РНК вируса саркомы птиц; A-MuLV-провирусная последовательность, кодирующая вирус лейкоза мышей Абельсона. [I. McLauchlan et al.. Nucleic Acids Res. 13 (1985), p. 1347.]

I1111111111

0102030405060708090100

Первичный транскрипт

Разные мРНК, образовавшиеся нз первичного транскрипта

©•— •

РИС. 8.23.

Разные полиаденилированные мРНК аденовируса, образовавшиеся из одного первичного транскрипта. Числа вверху-длина ДНК в процентах. Представленный на рисунке первичный транскрипт поздней области начинает синтезироваться с главного промотора поздней области (примерно 19%), кзпируется и продолжает

синтезироваться до конца ДНК. Образовавшиеся про- мРНК расщепляются по одному из указанных сайтов, и к ним добавляются poly (А)-хвосты (волнистые черные линии). Участки, которые удаляются при сплайсинге каждой полиаденилированной формы, показаны пунктирными линиями.

ся. Вместо этого мРНК процессируется в следующем сайте полиаденилирования; в результате образуется про-мРНК, которая после сплайсинга может превращаться в мРНК, кодирующую мембраносвязанные цепи иммуноглобулина. Таким образом, переключение от образования мембраносвязанных цепей иммуноглобулина на продуцирование секретируемых цепей происходит при помощи регулируемого использования сайта полиаденилирования. Механизм дифференциальной регуляции реакции полиаденилирования в этих двух примерах, так же как и во многих других, неизвестен.

Последовательность ААТААА участвует также в терминации транскрипции. В частности, эта последовательность на З'-конце главной кодирующей последовательности Р-глобина мыши необходима

ААТАААААТАААПреждевременная терминацияПреждевременная терминациядля терминации транскрипции, которая происходит примерно через 1,5 т. п. н. Более того, те же делеции и замены оснований, которые блокируют правильное полиаденилирование, снижают эффективность последующей терминации. Из этого следует, что.

ААТААА

ААТААА

Преждевременная терминация

Преждевременная терминация

для того чтобы транскрипция могла закончиться в соответствующей области, должно предварительно произойти узнавание сайта полиаденилирования. Одно из объяснений сопряжения полиаденилирования и терминации транскрипции состоит в том, что, возможно, транскрибирующий комплекс РНК-полимеразы II приобретает способность к осуществлению терминации только после транскрипции сигнала полиаденилирования. Это условие могло бы выполняться, если бы комплекс транскрипции включал фактор, подавляющий нежелательную терминацию при прохождении матрицы и утрачивающий свои антитерминаторные свойства после прохождения сигнала полиаденилирования (рис. 8.24). В соответствии с данной гипотезой, если комплекс транскрипции РНК-полимеразы II утрачивает этот фак-

тор. то он «сходит» с матрицы в Т-богатых последовательностях, с которыми встречается позже. На такую мысль наводили результаты опытов с очищенной РНК-полимеразой II in vitro, в которых было показано, что транскрипция различных ДНК-матриц часто заканчивается в Т-богатых участках внутри генов. С другой стороны, расщепление транскрипта в сигнале полиаденилирования

РИС. 8.24.

Сопряжение полиаденилирования и терминации транскрипции. А. Транскрипция под действием РНК-полимеразы II (polll) предположительно прекращается раньше времени в Т-богатых участках (на рисунке они обозначены буквой Т), расположенных в нескольких местах единицы транскрипции. Б. Возможно, связывание РНК-полимеразы с фактором антитерминации (at) ингибирует терминацию в Т-богатых последовательно

стях, и фермент получает возможность транскрибировать весь ген. Согласно данной модели, фактор at отделяется от полимеразы в сигнале полиаденилирования, и транскрипция продолжается до тех пор, пока фермент не закончит транскрипцию в неспецифических Т-богатых терминирующих последовательностях. [J. Logan et al.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), p. 8306.]

могло бы позволить РНК-экзонуклеазе или р-по- добному белку «захватить» полимеразу и индуцировать терминацию в расположенных правее Т-бо- гатых последовательностях (рис. 3.12).

Расщепление и полиаденилирование осуществляются в разнообразных клеточных экстрактах, которые содержат РНК-субстраты, имеющие соответствующие сигнальные последовательности. Изучение таких систем in vitro прояснило некоторые аспекты реакций расщепления и полиаденилирования. Оказалось, в частности, что расщепление и полиаденилирование могут протекать независимо друг от друга. В присутствии аналогов АТР (например, кордицепина, являющегося З'-дезоксиаденозинтри- фосфатом) расщепление осуществляется в правильном сайте, но полиаденилирования не происходит. Может осуществляться полиаденилирование З'-гид- роксильных концов РНК, перед которыми находится последовательность AAUAAA. Фракционирование экстрактов клеток HeLa, в которых может протекать расщепление и полиаденилирование РНК-субстратов, позволяет получить несколько белковых фракций, которые в совокупности способны катализировать реакции расщепления и полиаденилирования. Одним из компонентов является ро1у(А)-полимераза, второй компонент содержит одну или несколько малых ядерных рибонуклеопро- теидных частиц (мяРНП). а третий представляет собой белок (64 кДа), который связывается с участком, содержащим последовательность AAUAAA. Для сопряженного расщепления и полиаденилирования необходимы все три компонента, хотя poly(A)- полимераза способна одна полиаденилировать цепи РНК, расщепленные правильно. Механизм этого процесса до сих пор не выяснен; не исключено, что редкие Ull-мяРНП в соединении с белком размером 64 кДа и, возможно, другими мяРНП образуют комплекс, который расщепляет последовательность AAUAAA или соседнюю с ней последовательность РНК и дает возможность ро1у(А)-полимеразе полиаденилировать З'-конец. Предположение об участии мяРНП основано на том, что в иммунопреципитатах, полученных с антителами к мяРНП, обнаруживаются фрагменты, содержащие AAUAAA: кроме того, антитела к мяРНП ингибируют полиаденилирование in vitro. Роль мяРНП в полиаденилировании согласуется с участием некоторых мяРНП в процессинге РНК: и7-мяРНП в образовании З'-концов гистоновых мРНК (см. ниже в этом разделе), иЗ-мяРНП-в получении правильного З'-конца 28S-pPHK (разд. 8.2.г), a U1-, U5- и и4/иб-мяРНП-в сплайсинге про-мРНК (разд. 8.5.Г).

Поскольку в генах дрожжей и, возможно, в генах некоторых других низших эукариот сигнальная последовательность А АТА А А отсутствует, образова

ние полиаденилированных мРНК у этих организмов может быть сопряжено с терминацией. Не исключено, что последовательности типа 5'-Т5АТАТ, которые стимулируют терминацию транскрипции, способствуют образованию З'-конца для полиаденилирования. С другой стороны. З'-конец может образовываться в результате эндонуклеазного расщепления протяженных транскриптов, за которым следует полиаденилирование под действием ро1у(А)-полиме- разы. Участвуют ли мяРНП в расщеплении транскриптов у дрожжей, неясно.

Созревание гистоновых мРНК, не имеющих poly ( А )-хвостов. Многие гистоновые мРНК не по- лиаденилируются, хотя мРНК, кодирующие некоторые гистоны дрожжей и Tetrahymena, а также те гистоны млекопитающих, экспрессия которых не зависит от регуляции клеточного цикла, имеют ро1у(А)-хвосты. Гистоновые мРНК в ооцитах амфибии имеют короткие ро1у(А)-хвосты. но в процессе развития организма они заменяются неполиаде- нилированными гистоновыми мРНК.

Все неполиаденилированные гистоновые мРНК любых организмов имеют зрелый З'-конец с характерной структурой. Вблизи конца кодирующей области находится терминальный палиндром, который может образовывать двухцепочечный стебель из 6 п. н. с петлей, содержащей четыре нуклеотида (рис. 8.25). За ним на расстоянии от 13 до 17 нуклеотидов следует богатая пуринами каноническая последовательность. В гистоновых мРНК морского ежа данная последовательность абсолютно консервативна (5'-CAAGAAAGA-3'), а в гистоновых

зрелой мРНК

РИС. 8.25.

Структура З'-конца гистоновых мРНК. Эти концы имеют специфическую нуклеотидную последовательность, образующую стебель из шести пар нуклеотидов и петлю из четырех нуклеотидов. На расстоянии примерно 15 нуклеотидов от этой шпильки находится высокоспецифическая последовательность, богатая пуринами. З'-конец зрелых гистоновых мРНК образуется в результате эндонуклеазного расщепления участка между шпилькой и этой последовательностью.

мРНК позвоночных она менее консервативна (каноническая последовательность: 5'-PuAAAGAGCUG- 3'). Нуклеотид, оказывающийся на З'-конце зрелой гистоновой мРНК, располагается между шпилькой и участком, богатым пуринами. Данные опытов по изучению образования правильных З'-концов ряда мутантных РНК свидетельствуют о том, что замены, препятствующие формированию дуплексного стебля, блокируют нормальный процессинг, тогда как замены пар оснований, которые не нарушают способность РНК к образованию шпильки, не влияют на образование З'-конца. Точно так же мутации в последовательности, богатой пуринами, или даже небольшие изменения расстояния между ней и палиндромом в значительной степени подавляют З'-процессинг. Итак, для образования правильного З'-конца необходимы две близкорасположенные области, одна из которых находится перед сайтом расщепления, а другая за ним. Неожиданным оказалось то, что процессинг на З'-концах гистоновых мРНК с кэпированными 5'-концами осуществляется легче, чем процессинг мРНК без кэпов.

Как показало изучение З'-эндонуклеазного расщепления гистоновых мРНК морского ежа и млекопитающих in vitro и in vivo, для образования правильных З'-концов нужны относительно редкие мяРНП, содержащие U7-PHK. Изменяя нуклеотидную последовательность РНК Ш-мяРНП, установили, какие именно нуклеотиды важны для расщеп

и их связывание с и7-мяРНК. Спаривание нуклеотиднойи их связывание с и7-мяРНК. Спаривание нуклеотиднойпоследоватепьности вблизи 5'-конца U7-mhPHK и распоследоватепьности вблизи 5'-конца U7-mhPHK и расположенной справа от шпильки богатой пуринами последовательности гистоновой мРНК происходит на весьма протяженном участке. З'-конец зрелой гистоновой мРНК образуется при зндонуклеазном расщеп-

и их связывание с и7-мяРНК. Спаривание нуклеотидной

и их связывание с и7-мяРНК. Спаривание нуклеотидной

последоватепьности вблизи 5'-конца U7-mhPHK и рас

последоватепьности вблизи 5'-конца U7-mhPHK и рас

ления гистоновой мРНК у З'-конца; эти нуклеотиды находятся вблизи 5'-конца U7-PHK. Для процессинга, помимо 1)7-мяРНП, необходим также другой, пока не охарактеризованный фактор. Этот фактор, нечувствительный к действию нуклеазы (и поэтому, по всей видимости, не относящийся к мяРНП), связывается с петлей шпилечной структуры и способствует взаимодействию между 1)7-мяРНП и богатой пуринами консервативной последовательностью, находящейся за зрелым З’-концом. Сравнение последовательностей гистоновой про-мРНК и U7-PHK наводит на мысль, что участок, изобилующий пуринами, спаривается с богатой пиримидинами последовательностью длиной 10 нуклеотидов, которая находится между 10-м и 20-м нуклеотидами, считая от 5'-конца U7-PHK (рис. 8.26). Как осуществляется расщепление, приводящее к появлению З'-концов, и как оно регулируется, неизвестно.

Ооразование З'-концов U-PHK. Все U-PHK, синтезированные при участии РНК-полимеразы II, лишены ро1у(А)-хвостов. Их З'-гидроксильные концы образуются по крайней мере в две стадии. На первой в результате терминации транскрипции или при расщеплении длинного транскрипта образуется предшественник U-PHK с небольшой добавочной З'-последовательностью; затем этот предшествен-

1П-МяРНК 3' -GAUUUUCUCGACAUUGUGNNpppG ческая последо- °AAAGAGCUG-3 'Триметил

вательность А

3 'GAUUUUCUCGACAUUGUGNN hH2A AUUAAAUGAGCUGUUGUG-3 '

3'GAUUUUCUCGACAUUGUGNN hH2B AAAGAAAGAGCUGGUGC-3'

3'GAUUUUCUCGACAUUGUGNN hH3 AACGAAAGUAGCUGUG-3■

3'GAUUUUCUCGACAUUGUGNN hH4 GGUGGUAACACUGGGA-3'

3'GAUUUUCUCGACAUUGUGNN hH4 CUGAGGAGUUGGACACUU-3'

3'GAUUUUCUCGACAUUGUGNN mH2B AAAAUUGGAGCUUUAAU-3'

3'GAUUUUCUCGACAUUGUGNN mH3 AAAAAAAGAACUGUGCGC-3'

3'GAUUUUCUCGACAUUGUGNN mH3CAAAGAUGCUUGAAGU-3'

3'GAUUUUCUCGACAUUGUGNN mH3 GGAAAGAGCUGUUU-3'

3'GAUUUUCUCGACAUUGUGNN mH4 UGAAGGUGGUAACACUGA-3' в указанной позиции В правой части рисунка

показаны нуклеотиды З'-концов разных гистоновых

мРНК человека (h) и мыши (т), спаривающиеся с

5'-концом и7-мяРНК. Наверху приведена аналогичная картина для канонической последовательности. [К. L Mowry, J.A Steiz, Trends Biochem. Sci. 13 (1988), p. 447.]

ник укорачивается, возможно под действием экзонуклеазы, и формируется зрелый З'-конец. Определяя эффективность образования правильного З'-конца при различных структурных модификациях в генах U1- и 1)2-мяРНК, обнаружили важную для этого процесса короткую консервативную последовательность на значащей цепи, GTTTN0_3AAAPuNNAGA (Pu- любой пурин, N- любое основание). Эта последовательность расположена на расстоянии от 9 до 19 нуклеотидов за зрелыми концами U1-, U2- и НЗ-мяРНК, выделенных из разных источников. Наличие инвертированного повтора, который может образовывать шпильку в про-мяРНК, по-видимому, необязательно. За что именно отвечает упомянутая последовательность в предшественнике мяРНК-терминацию транскрипции или эндонуклеазное расщепление - неизвестно.

Для образования З'-концов U-PHK несущественны ни кодирующая U-PHK последовательность, ни триметилгуанозиновый кэп, однако -ив этом заключается любопытная особенность биогенеза U-PHK-правильные З'-концы образуются только в том случае, если транскрипция РНК инициируется с промоторов U-PHK. Если промотор U-PHK заменить на промотор мРНК, то процесс образования правильного З'-конца нарушается. Более того, транскрипты, синтезированные с промоторов генов мяРНК, не полиаденилируются даже тогда, когда матрицы содержат подлинный сигнал полиаденилирования. Наоборот, транскрипты, синтезированные с промоторов мРНК, полиаденилируются в соответствующих сайтах даже тогда, когда имеется вставка в последовательности U-PHK, подвергающейся процессингу. Это говорит о том, что, возможно, специфические ферменты процессинга или факторы терминации транскрипции связываются с комплексами транскрипции в тот момент, когда они инициируют транскрипцию с промоторов генов мРНК или U-PHK. Подобным же образом в комплексы транскрипции генов мРНК и U-PHK, вероятно, входят разные метилазы кэпирования.

Регулируемая экспрессия вирусных генов

Многие методы и подходы, с помощью которых сформировались основные представления о регуляции экспрессии клеточных генов, были заимствованы из области изучения регуляции транскрипции у вирусов. Насколько известно, клетки и ДНК-содержащие вирусы регулируют содержание мРНК главным образом путем изменения частоты и места инициации транскрипции с участием РНК-полимеразы И. Более того, регуляция транскрипции вирусных генов, как и клеточных генов,

зависит от специфических взаимодействий между сложно организованными уис-действующими элементами и большим набором транс-действующих факторов транскрипции. Некоторые вирусы кодируют также необычные факторы транскрипции, координирующие экспрессию групп вирусных генов или влияющие на транскрипцию отдельных клеточных генов. В действительности взаимодействие вирусных и клеточных транс-действующих факторов может по-разному влиять на транскрипцию клеточных и вирусных генов и даже оказывать положительное влияние на одни и отрицательное-на другие гены.

В основе регуляции экспрессии генов вирусов млекопитающих лежат те же принципы, что и в основе регуляции экспрессии клеточных генов. Как и промоторы большей части эукариотических генов класса II, промоторы вирусов состоят из «проксимальных» регуляторных элементов, как правило, входящих в последовательность, непосредственно окружающую точку начала транскрипции и простирающуюся до пары оснований- 100, и «дистальных» регуляторных элементов, чаще всего расположенных между парами оснований — 100 и — 300, которые обеспечивают экспрессию гена, специфичную для данной ткани или данной стадии развития организма (рис. 8.27). Регуляторные последовательности, находящиеся внутри единицы транскрипции или за ней, насколько известно, не входят в состав вирусных промоторов.

Здесь мы детально рассмотрим две системы транскрипции вирусов, которые были и остаются наиболее информативными: 1) транскрипция ранней области генома SV40 и 2) транскрипция гена тими- динкиназы вируса герпеса (HSTK).

Транскрипция ранней области генома SV40. Основные особенности инфекционного цикла SV40 в разных хозяевах суммированы в разд. 5.7.6. Расположение последовательностей, кодирующих мРНК и белки, а также областей регуляции транскрипции и репликации, показано на физической карте генома SV40 (рис. 5.34). Ранняя область занимает около половины кольцевого генома длиной 5243 п.н. При транскрипции этой области вскоре после заражения синтезируется одна-единственная про-мРНК. Последующий дифференциальный сплайсинг транскрипта дает две мРНК примерно равной длины, кодирующие два родственных, но разных белка: большой и малый Т-антигены. Большой Т-антиген (Tag) необходим для репликации вирусной ДНК и для регуляции транскрипции ранней и поздней областей, тогда как функция малого Т-антигена (tag) в жизненном цикле вируса остается невыясненной. Параллельное увеличение содержания Tag и числа дочерних молекул вирусных ДНК активирует транскрипцию поздней области. Дифференциальный

Регуляторные элементыБазальный промотор ;Регуляторные элементыБазальный промотор ;(специфичны для определенных генов и(одинаковый у многих геновтипов клеток)и типов клеток)(специфичны для определенных генов и(одинаковый у многих геновтипов клеток)и типов клеток)РИС. 8.27.

Регуляторные элементыБазальный промотор ;

Регуляторные элементыБазальный промотор ;

(специфичны для определенных генов и(одинаковый у многих генов

типов клеток)и типов клеток)

(специфичны для определенных генов и(одинаковый у многих генов

типов клеток)и типов клеток)

Элементы, характерные для промоторов генов класса II. Два (или несколько больше) специфических элемента, которые находятся на участке примерно 100 п.н. левее точки начала транскрипции (+ 1) ипи иногда заходят за эту точку, составляют так называемый базальный про

мотор. Между парами оснований —400 и —100 находятся дополнительные регуляторные элементы, функционирование которых обычно зависит от типа ткани и стадии развития.

сплайсинг первичного транскрипта поздней области приводит к появлению двух классов поздних мРНК, кодирующих три структурных белка (VP1, VP2, VP3), входящих в состав капсида вируса.

Таким образом, вирусный геном содержит две противоположно ориентированные и регулируемые во времени единицы транскрипции, на каждую из которых приходится примерно половина последовательности ДНК. Мы подробно рассмотрим участок длиной примерно 300 п.н., разделяющий два сайта начала транскрипции. Внутри его рассеяны унс-действующие сигнальные последовательности, которые ответственны за регуляцию транскрипции ранней и поздней областей, а также репликации. Они были идентифицированы при изучении влияния разнообразных модификаций (например, делеций, инсерций, замен пар оснований и перестроек) участка длиной 300 п. н. на транскрипцию и репликацию как in vitro, так и in vivo. Эти опыты, в которых исследовались взаимодействия между факторами транскрипции, репликации и специфическими последовательностями ДНК, помогли прояснить некоторые тонкие детали процесса размножения SV40, а также основные свойства регуляции транскрипции у эукариот.

Организация i/ис-действующих сигналов регуляции репликации и транскрипции SV40 схематически показана на рис. 8.28 и более детально на рис. 8.29. Транскрипция противоположно ориентированных ранней и поздней областей инициируется в позициях, указанных стрелками. Репликация, которую мы рассмотрим в первую очередь, начинается внутри палиндромной последовательности протяженностью 27 п. н., обозначенной как ori. Делеции, вставки или замены пар оснований в палиндромной последовательности блокируют инициацию репликации. Для того чтобы в ori началась эффективная репликация, необходима также целостность прилегающего АТ-участка из 17 пар оснований. Положительное влияние на функцию ori оказывают и повторы из 21/22 п.н. вблизи АТ-участка со стороны 4-158

поздней области, хотя они и не являются существенными. Как мы увидим позже, эти GC-богатые повторы из 21/22 п.н. и соседствующая с ними АТ-последовательность являются важными компонентами сигналов транскрипции ранней области. Их роль в усилении репликации может быть связана с той функцией, которую они выполняют в регуляции транскрипции.

Для того чтобы репликация началась, с ori должен связаться кодируемый SV40 белок Tag. Как показали исследования, Tag связывается также с последовательностями, примыкающими к ori. Эти последовательности впервые были идентифицированы как области, которые не расщепляются под действием ДНКазы I после связывания с ними Tag. При низких начальных концентрациях Tag, вскоре после заражения, белок преимущественно связывается с последовательностью, кодирующей 5'-конец ранней про-мРНК (сайт Tl). С увеличением содержания Tag начинается его связывание с ori (сайт Т2). Мутации в сайте Т1, препятствующие присоединению Tag, слабо влияют на репликацию. Всевозможные изменения палиндромной последовательности, напротив, не только предотвращают связывание Tag с ori, но и блокируют репликацию. (Мутации как в сайте Т1, так и в сайте Т2 также нарушают репрессию транскрипции ранней области под действием Tag.)

Связанный в сайте Т2 Tag работает как АТР-за- висимая геликаза, которая в комплексе с клеточной ДНК-праймазой и ДНК-полимеразой (а возможно, и с другими белками) способствует инициации синтеза новых цепей ДНК. Не исключено, что АТ- и GC-богатые элементы влияют на репликацию сами по себе благодаря своей близости к стартовой точке; с другой стороны, их влияние может быть связано с тем, что повышение частоты инициации транскрипции в этой области содействует началу репликации.

Каждый из сайтов связывания Tag содержит по крайней мере две копии пентануклеотидной канони-

РИС. 8.28.

Положение и организация промоторов ранней и поздней областей генома SV40. В верхней части рисунка изображена геномная ДНК SV40 с указанием последовательностей, ответственных за регуляцию репликации, а также транскрипции ранней и поздней областей. Стрелками показаны направления транскрипции ранней и поздней областей и сайты, в которых она начинается.

В нижней части рисунка указаны сайт начала репликации ДНК (ori), два элемента базального промотора (АТ-бокс и повторы из 21/22 п.н.), а также тандемные повторы длиной 72 п.н. в составе энхансера. Т,, Т2 и Т3-места связывания Т-антигена; по своему сродству к антигену они убывают в следующем порядке: L >Т2»Т3.

ческой последовательности 5'-GAGGC-3'. Очевидно, остатки G в этой последовательности участвуют во взаимодействии с Tag, поскольку присоединение Tag защищает их от метилирования под действием диметилсульфата. Мутационный анализ наиболее важных нуклеотидов в сайте Т1 показывает, что сигнал связывания Tag имеет длину 17 п. н. и содержит две пентануклеотидные последовательности, разделенные АТ-участком длиной не более 6 7 пар нуклеотидов. Такая организация сайтов связывания, как полагают, позволяет димеру Tag реагировать с двумя соответствующим образом ориентированными пентануклеотидными последовательностями.

Теперь мы вернемся к рассмотрению различных элементов последовательности, которые влияют на инициацию транскрипции ранней области (рис. 8.28 и 8.29). Один из этих элементов, в составе базального промотора, ассоциирован с тем же АТ-участком из 17 пар оснований, который необходим для функционирования on. Мутационные изменения или даже делеции всего этого участка слабо влияют на частоту инициации транскрипции ранней области, но нарушают точность инициации, приводя к образованию мРНК с разными кэпированными 5'-конца- ми. Таким образом, ТАТА-подобная последовательность нужна для того, чтобы инициация осуще

ствлялась в ограниченном числе сайтов, но она не оказывает существенного влияния на скорость гранскрипции. В отличие от этого во многих эукариотических генах несколько более короткая ТАТА- подобная последовательность (ТАТААА), расположенная в области примерно от —25 до —35 пары оснований, совершенно необходима для инициации транскрипции. С другой стороны, известны эукариотические промоторы, у которых отсутствует последовательность. сколько-нибудь напоминающая последовательность ТАТА (например, промотор поздней области генома SV40).

Промотор ранней области генома SV40 содержит также три прямых GC-богатых повтора размером 21/22 п.н., которые дополняют функцию ori. Они находятся между парами нуклеотидов —45 и — ПО в области сайтов инициации транскрипции ранних РНК (рис. 8.28 и 8.29). Каждый из повторов длиной 21/22 п.н. содержит две копии последова-

5-GGGCGG-3' тельности из шести пар нуклеотидов уСССССС5- Деления всего участка ДНК SV40 протяженностью 65 п. н. блокирует транскрипцию как in vitro, так и in vivo, даже если окружающие последовательности сохраняются. Тем не менее даже одна копия повторяющегося элемента длиной 21/22 п.н.

может поддерживать (правда, на невысоком уровне) транскрипцию ранней области, а для обеспечения максимальных скоростей транскрипции достаточно двух копий. Опыты по изучению муиционных изменений каждого основания в повторяющемся сегменте из 2I пары оснований ясно показали, что упомянутая выше гексамерная последовательность является функционально важным элементом. Имеет ли столь большой избыток GC-элементов в регуляторной области SV40 физиологическое значение, неизвестно.

GC-богатый повтор, аналогичный присутствующему в ДНК SV40, встречается во многих других клеточных и вирусных регуляторных областях, включая области регуляции генов HIV-1, тимидин- киназы вируса герпеса, дигидрофолатредуктазы, ме- таллотионеина-1л, гидроксиметилглутарил-СоА - редуктазы и гипоксантин-гуанин фосфорибозил- трансферазы. Этот элемент функционирует как сайт связывания специфического фактора транскрипции Spl, который в больших количествах содержится в клетках многих типов и рассматривается в данном разделе ниже.

Наличие элементов размером 21/22 п. н. является необходимым, но не достаточным условием активации транскрипции. Кроме них нужны еше последовательности, расположенные в пределах и по соседству с двумя копиями последовательности из 72 п. н., находящейся между парами оснований — НО и —300 (рис. 8.29). Некоторые штаммы SV40 имеют только одну копию сегмента длиной 72 п. н. и фланкирующей ее последовательности (рис. 8.29), и этого достаточно для нормальной транскрипции.

Мутационный анализ сегмента длиной 72 п. н. и последовательности, фланкирующей его слева, показал, что эта область протяженностью примерно 90 п. н. состоит из субэлементов нескольких разных типов (рис. 8.29). Как правило, по отдельности эти субэлементы-слабые стимуляторы, но, действуя вместе в разных сочетаниях, они обеспечивают высокий уровень транскрипции.

Для эффективной транскрипции ранней области необходимы GC-богатые элементы размером 21/22 п. н. и левый сегмент длиной приблизительно 90 п. и., однако их ориентация относительно друг друга и сайтов начала транскрипции несущественна. Так, весь повтор из 21/22 п. н. может быть инвертирован без снижения эффективности транскрипции. Точно так же левый элемент размером 72 п. н. стимулирует правильную инициацию транскрипции, находясь в любой ориентации. В то же время, в отличие от повтора из 21/22 п. и., который функционирует только в том случае, когда он находится на своем обычном месте, положение сегмента из 72 п. н. не играет роли. Транскрипция ранней области начинается в правильном месте с нормальной эффективностью, даже если этот сегмент перемещен в интрон ранней области или на сотни и даже тысячи пар оснований вправо или влево от единицы транскрипции и находится в любой ориентации. Однако важно отметить, что сам по себе элемент из 72 п. н. не стимулирует транскрипцию, как и в том случае, если он и элемент из 21/22 п. н. содержатся в разных молекулах ДНК.

Несмотря на то что элементы размером 72 п. н. и 21/22 п. н. эффективно функционируют, даже если

IВ

Регуляторные элементы

72п.н

178 250

GT GT ТС ТС SphSph GC GC GC GC GC GC

ВВ Ш ВВ Ш ВЩ] В Ё Е И 0 [г] ш {тага] octa

107

179

103

РИС. 8.29.РИС. 8.29.octa ТАТА GC Рocta ТАТА GC Р

РИС. 8.29.

РИС. 8.29.

octa ТАТА GC Р

octa ТАТА GC Р

КI+I1 :5'-tCCCCAG-3'

GTИ: 5'-GCTGTGGAATGT-3'

GTI: 5'-GGTGTGGAAAGT-3*

SphII: 5'-AAGTATGCA-3'

SphI:5'-AAGCATGCA-3'

Элементы базального промотора и энхансера ранней области генома SV40. Показаны сами элементы, а также

их расположение в пределах базального промотора и энхансера. Числа под изображением молекулы ДНК-

это расстояние в парах нуклеотидов от точки начала

: 5-ATGCAAAG-3'

: б'-ТАТТТАТ-З"

: 5' ССбССС-З'

: б'-ТТАЬТСА-З'

транскрипции (оп). Сегменту длиной 72 п.н. соответствуют два набора чисел; это означает, что данный сегмент тандемно повторяется. А и В домены энхансера, которые, по-видимому. функционируют кооперативно.

они разделены сотнями и тысячами пар оснований, в том случае, когда они находятся на близком расстоянии друг от друга, существуют положения, в которых их действие оптимально. Так, если эти повторы разделены короткими сегментами ДНК, соответствующими по длине какому-то числу полных витков спирали ДНК (на один виток приходится 10 п. н.), то активность транскрипции изменяется незначительно. Если же разделяющие участки соответствуют по длине нечетному числу полувитков спирали (например, 5 или 15 п. н ), то активность транскрипции понижается (рис. 8.30). Влияние вставок между повторами размером 21/22 п. н. и АТ-бо- гатым сегментом длиной 17 п. н. зависит от их длины; наблюдаемые эффекты весьма сложны и различаются для разных сайтов инициации транскрипции. Эти данные свидетельствуют о том, что эффективность транскрипции зависит от стереоспецифических соответствий между повторяющимися последовательностями длиной 21/22 п.н., элементами в составе сегмента размером 72 п. н. и другими последовательностями, расположенными вблизи сайта инициации транскрипции. Соблюдение этих соответствий необходимо для присоединения специфических белков к различным элементам; взаимодействия между белками важны для инициации транскрипции и зависят от их правильной взаимной пространственной ориентации.

Энхансеры. Сегмент ДНК SV40 размером 72 п. н. повышает также эффективность транскрипции других генов. Например, ген Р-глобина млекопитающих в составе плазмиды, который обычно не транскрибируется после трансфекции в культивируемые фибробласты, активируется, если к нему в любой ориентации и на любом расстоянии присоединен

сегмент из 72 п. н. Благодаря своей способности стимулировать транскрипцию, находящуюся под контролем разных регуляторных элементов, независимо от расстояния и ориентации относительно точек инициации этот элемент получил название энхансера транскрипции. Обнаруженные впервые в геноме SV40 энхансеры с очень близкими свойствами, но с разными последовательностями являются, как теперь установлено, важными компонентами сигналов регуляции транскрипции многих генов класса II всех исследованных эукариотических организмов (разд. 8-З.д-з). Энхансеры встречаются также в регуляторных областях генов рРНК, транскрибируемых РНК-полимеразой I (разд 8.2). Существование энхансеров, часто находящихся на расстоянии в тысячи пар оснований справа или слева от точки инициации транскрипции, усложняет идентификацию промоторных элементов гена.

Обычно энхансеры совершенно разных генов класса II взаимозаменяемы. В качестве примера можно привести энхансеры регуляторных областей вируса лейкоза мышей и SV40. Более того, энхансер SV40 может функционировать в самых разных дифференцированных тканях млекопитающих; он также стимулирует транскрипцию у амфибий, в клетках растений и даже у дрожжей S. pombe. Энхансер часто обусловливает временную и клеточную специфичность активации транскрипции гена. Например, как мы увидим позже, при обсуждении регуляции транскрипции клеточных генов, энхансеры, ассоциированные с некоторыми генами, оказываются активными только на определенных стадиях развития (разд. 8.3.Д и ж). Кроме того, энхансер, необходимый для транскрипции вируса полиомы, не может функционировать в недифференцированных эмбриональных

РИС. 8.30.РИС. 8.30.Относительная Размер эффективность вставки, транскрипциип.н.ОтносительнаяРазмер эффективность вставки, транскрипции п.н.(Т)®100012555101315462123230100100-49690450151055415171121219Относительная Размер эффективность вставки, транскрипциип.н.ОтносительнаяРазмер эффективность вставки, транскрипции п.н.(Т)®100012555101315462123230100100-49690450151055415171121219

РИС. 8.30.

РИС. 8.30.

Относительная Размер эффективность вставки, транскрипциип.н.

Относительная

Размер эффективность вставки, транскрипции п.н.(Т)®

1000

125

5510

1315

4621

2323

0100100

-49690

45015

10554

151711

21219

Относительная Размер эффективность вставки, транскрипциип.н.

Относительная

Размер эффективность вставки, транскрипции п.н.(Т)®

1000

125

5510

1315

4621

2323

0100100

-49690

45015

10554

151711

21219

Оптимальное расстояние между регуляторными элементами промотора ранней области генома SV40. В одну из позиций, указанных стрелками, встраивали сегменты ДНК разной длины и наблюдали за ходом

транскрипции, начинающейся в точках 1 и 2. Внизу указана эффективность транскрипции при разных модификациях промотора в процентах от эффективности транскрипции при немодифицированном промоторе.

стволовых клетках, но активируется после дифференцировки, а энхансеры некоторых генов действуют только в присутствии индукторов (разд. 8.3.е).

Можно предположить, что функция энхансеров состоит в увеличении частоты инициации транскрипции с участием РНК-полимеразы И. На это указывают результаты опытов по включению меченых предшественников в ген-специфичную РНК в изолированных ядрах, в которых РНК продолжают синтезировать только те молекулы полимеразы, которые уже участвуют в транскрипции. В опытах, о которых идет речь, трансдуцированный ген Р-гло- бина, «сшитый» с энхансером SV40, продуцировал больше Р-глобинспецифичной РНК, чем ген, у которого энхансер отсутствовал.

Энхансер - это наиболее сложный элемент, участвующий в регуляции транскрипции SV40 (рис. 8.29). Он состоит из нескольких различающихся коротких элементов, расположенных в пределах повтора длиной 72 п. н., и примыкающего к нему слева участка из 25 п. н. Каждый элемент сам по себе обладает очень низкой энхансерной активностью. Точная идентификация элементов энхансера осложняется тем, что их активность можно оценить только по их влиянию на транскрипцию у определенного хозяина и в отдельном опыте. Некоторые элементы вносят примерно одинаковый вклад в общую активность энхансера независимо от хозяина или системы транскрипции, а другие функционируют только в определенных клетках. Кроме того, мутации в каком-нибудь из этих элементов обычно понижают активность энхансера в 5- 10 раз, в то время как при делении всего энхансера эффективность транскрипции уменьшается в сотни раз. Это говорит о том, что энхансер включает большое число сигнальных последовательностей и каждая из них вносит вклад в его суммарную функциональную активность. Не исключено, что степень и характер этой избыточности имеют реальное физиологическое значение, которое пока не удалось установить.

Три элемента энхансера, Р, Sph и октамер (octa), образуют один домен (А), а спаренные GT- и ТС-элементы- второй (В). Эти домены могут быть инвертированы относительно друг друга или могут находиться один от другого на расстоянии до 100 п. н. без заметного снижения активности энхансера. Однако делеции в Sph или в октамере А-доме- на либо GT- и ТС-элементах В-домена снижают активность энхансера, причем степень этого снижения зависит от того, в каких именно клетках измеряется активность транскрипции. Элемент Р несуществен для функционирования энхансера, но в его присутствии транскрипция становится чувствительной к стимуляции форболовыми эфирами-веществами, активирующими клеточную протеинки- назу.

Элемент Sph состоит из тандемно повторяющихся последовательностей длиной 9 п. н.: 5'-AAGcATGCA-3'. Свое название этот элемент получил благодаря наличию сайта рестрикции для Sphl в одном из повторов. При соединении двух Sph-повторов длиной 9 п.н. образуется октамерная последовательность (5'-ATGCAAAG-3'). Составные Sph-октамерные элементы обеспечивают функционирование энхансера в самых разных клетках, включая лимфоциты. При изменении участков двух Sph-элементов, не входящих в состав октамера, подавляется активность энхансера в фибробластах или эпителиальных клетках, но его активность в лимфоцитах остается на прежнем уровне. Если же мутационные изменения затрагивают октамер, то подавляется активность энхансера в лимфоидных клетках, а способность энхансера активировать транскрипцию в других клетках не меняется. Следовательно, эти элементы регулируют как тканеспецифичную, так и тканенеспецифичную транскрипцию.

Левее в энхансере находятся два ТС-повтора, 5'-TCCCCAG-3', и GT-богатая повторяющаяся последовательность, 5'-GgTGTGGAtTGT-3'. Влияние GT-I и GT-II на активность энхансера проявляется в тех же самых клетках, что и влияние элементов Sph. Мутации в любом из GT-элементов или в ТС-П, а также вставки между ними уменьшают активность энхансера; это наводит на мысль о кооперативности обоих элементов. Области перекрывания GT- и ТС-элементов и их варианты с небольшими отклонениями иногда называют кором энхансера (5'-GTGGtttG-3'). поскольку они встречаются во многих вирусных и клеточных энхансерах. Однако сам по себе кор не может служить энхансером.

Любопытной особенностью некоторых элементов энхансера является то, что по отдельности или даже попарно они не обладают энхансерной активностью, в то время как их мультимеры активны. Например, тетрамеры, состоящие из спаренных GT-элементов, почти так же активны, как весь энхансер. Мультимеризация октамера приводит к образованию структуры, которая может заменять иммуноглобулиновый энхансер в лимфоидных клетках, но эта структура неактивна в фибробластах. Кор-мультимеры тоже могут функционировать в качестве энхансера.

Каждый из указанных элементов энхансера SV40 наряду с другими i/ис-действующими регуляторными последовательностями представляет собой сайт связывания одного или нескольких факторов транскрипции. По-видимому, все белки, связывающиеся с ДНК, и вспомогательные белки, участвующие в белок-белковых взаимодействиях, формируют комплекс, который активирует РНК-полимеразу II с тем, чтобы она могла инициировать транскрип-

цию. Состав и строение таких комплексов транскрипции, вероятно, не являются строго фиксированными, поскольку сочетания элементов, неактивные сами по себе, становятся активными после мульти- меризации. Кроме того, мутации, препятствующие соединению фактора транскрипции с каким-либо элементом, уменьшают активность энхансера, но редко полностью блокируют его работу. Очевидно, для того чтобы понять, как образуется комплекс транскрипции и как он функционирует в процессе инициации транскрипции, мы должны идентифицировать и охарактеризовать различные транс-действующие факторы транскрипции, а также изучить их взаимодействие с различными элементами и друг с другом.

По шпептидные факторы транскрипции. Большое число факторов, предположительно участвующих в транскрипции ранней области SV40, было выделено из клеточных экстрактов, способных осуществлять транскрипцию с промотора ранней области. Для их идентификации, очистки и изучения применялись разные методы. Некоторые факторы специфически связываются с конкретным элементом, о чем свидетельствует их способность защищать определенные основания в этом элементе от расщепления ДНКазой I (футпринтинг; разд. 8.2.в), а также уменьшение электрофоретической подвижности ДНК, содержащих такой элемент, при связывании его с белком (смещение полосы). Имеются данные о восстановлении транскрипционной активности в экстрактах, обедненных определенными факторами, при добавлении последних, а также об отсутствии такого восстановления в том случае, когда сайты связывания разрушены. Это указывает на то, что связывание данных факторов активирует транскрипцию. Клонированы и секвенированы гены, кодирующие некоторые факторы транскрипции. Их экспрессия в Е. coli и способность синтезированных продуктов активировать транскрипцию in vitro позволяют идентифицировать важные домены белков.

Кроме факторов, необходимых для функционирования энхансеров и различающихся для разных генов, в транскрипции большинства клеточных и вирусных генов класса II участвуют дополнительные белки, которые помогают «направлять» РНК- полимеразу II к соответствующим сайтам инициации. Вопрос о том, находятся ли эти белки среди субъединиц, которые обычно бывают связаны с РНК-полимеразой И, или они относятся к числу вспомогательных факторов транскрипции, которые присоединяются и отсоединяются во время инициации, пока не решен. Относительная эффективность формирования комплекса инициации и его стабильность зависят от присутствия ТАТА-подобной последовательности в окрестности пары оснований

— 25, а также от последовательности, в которуювстроен ТАТА-бокс, простирающейся от -40-й до+ 10-й пары оснований. У млекопитающих широкораспространен белок, обозначаемый TF1ID и на-зываемый «фактором связывания последовательно-сти ТАТА». Он связывается с АТ-богатой областьюпромотора SV40, о чем свидетельствует его способ-ность защищать элемент АТ от расщепления ДНКа-зой I (рис. 8.31). К этому исходному комплексуприсоединяется второй фактор, ТЕПА, который ста-билизирует связь TF11D с последовательностьюТАТА. Далее к комплексу ДНК-TFIID-TFIIA по-следовательно присоединяются фактор TFI1B иРНК-полимераза II. Связывание еще двух вспомо-гательных факторов, TFIIE и TFIIF, завершаетформирование комплекса преинициации. В присут-ствии четырех рибонуклеозидтрифосфатов этот

-50 -30 -ю +10 +30

^ Этап 1^ Этап 1

^ Этап 1

^ Этап 1

^ Этап 5^ Этап 5РИС. 8.31.Сборка комплекса транскрипции из отдельных факторов транскрипции (TFIIA, В, D, Е, F) и РНК-полимеразы II. Установлено, что сначала фактор TFIID связывается с ТАТА-боксом, а затем присоединяются TFIIA и TFIIB (в какой именно последовательности до конца неизвестно). Участок связывания включает сайт инициации транскрипции и прилегающие области (они указаны числами в верхней части рисунка). [S. Buratowski et al.. Cell 56 (1989), p. 549.]РИС. 8.31.Сборка комплекса транскрипции из отдельных факторов транскрипции (TFIIA, В, D, Е, F) и РНК-полимеразы II. Установлено, что сначала фактор TFIID связывается с ТАТА-боксом, а затем присоединяются TFIIA и TFIIB (в какой именно последовательности до конца неизвестно). Участок связывания включает сайт инициации транскрипции и прилегающие области (они указаны числами в верхней части рисунка). [S. Buratowski et al.. Cell 56 (1989), p. 549.]

^ Этап 5

^ Этап 5

РИС. 8.31.

Сборка комплекса транскрипции из отдельных факторов транскрипции (TFIIA, В, D, Е, F) и РНК-полимеразы II. Установлено, что сначала фактор TFIID связывается с ТАТА-боксом, а затем присоединяются TFIIA и TFIIB (в какой именно последовательности до конца неизвестно). Участок связывания включает сайт инициации транскрипции и прилегающие области (они указаны числами в верхней части рисунка). [S. Buratowski et al.. Cell 56 (1989), p. 549.]

РИС. 8.31.

Сборка комплекса транскрипции из отдельных факторов транскрипции (TFIIA, В, D, Е, F) и РНК-полимеразы II. Установлено, что сначала фактор TFIID связывается с ТАТА-боксом, а затем присоединяются TFIIA и TFIIB (в какой именно последовательности до конца неизвестно). Участок связывания включает сайт инициации транскрипции и прилегающие области (они указаны числами в верхней части рисунка). [S. Buratowski et al.. Cell 56 (1989), p. 549.]

комплекс осуществляет инициацию и элонгацию транскрипции. TFllA. TFIIB, TF1IE и TFIIF. а также РНК-полимераза II не связываются с данной областью промотора в отсутствие TFIID; однако эти белки, возможно, контактируют с соседними последовательностями ДНК. Так. после формирования комплекса преинициации и начала транскрипции область, защищенная от расщепления ДНКазой, расширяется до —45- +30 пар оснований.

Факторы, подобные белкам TFIID и TFIIA млекопитающих, идентифицированы у дрожжей. Фактор связывания ТАТА, напоминающий соответствующие факторы млекопитающих и дрожжей, выделен также из Drosophila. Замечательно, что белки TFIID и TFIIA из дрожжей могут заменять аналогичные белки млекопитающих при сборке комплекса транскрипции, который обеспечивает инициацию в правильных сайтах. Эта взаимозаменяемость факторов транскрипции (при незначительном изменении эффективности или специфичности транскрипции) у совершенно неродственных организмов присуща аппаратам транскрипции всех эукариот Очевидно, структура и функция белков, входящих в состав многокомпонентных комплексов, в процессе эволюции не изменились.

Для оптимальной транскрипции кроме белков, составляющих описанный комплекс преинициации, необходим фактор транскрипции Spl, который связывается с GC-богатыми элементами размером 21/22 п. н., а также ряд других факторов транскрипции (рис. 8.32). Эти дополнительные факторы зависят от типа клеток и условий, в которых происходит экспресс я промотора ранней области SV40.

Фактор транскрипции Spl в виде мономера связывается в области, охватывающей три GC-богатых повтора из 21/22 п. н. Для этого связывания, которое осуществляется в отсутствие других белков или нуклеозидтрифосфатов, нужна только гексамерная последовательность. При связывании Spl с промотором ранней области гексамерные последователь-

ности 5-GGGCGG-3', присутствующие в каждом повторе, оказываются защищенными от расщепления ДНКазой I, а остатки G не метилируются диметилсульфатом (рис. 8.33). Контакты между Spl и GC-повтором ограничиваются большим желобком молекулы ДНК и остатками G матричной цепи. Сродство Spl к гексамерным повторам неодинаково, возможно из-за различий в их расположении и последовательности (рис. 8.33). Элиминация данной области или мутационные изменения специфических гексамерных последовательностей приводят к изменению как связывания Spl, так и эффективности транскрипции. Таким образом, присоединение Spl к этому элементу последовательности имеет важное значение для транскрипции.

Если принять во внимание частоту, с которой встречаются сайты связывания Spl в генах млекопитающих, то относительная избыточность Spl не кажется удивительной. Например, в одной клетке HeLa (часто используемая линия клеток, полученная из опухоли шейки матки человека) содержится от 5000 до 10 000 молекул Spl. Благодаря высокой концентрации Spl удается получать этот белок в почти гомогенном виде, а также клонировать кодирующую его ДНК. Размер белковой молекулы, оцененный исходя из нуклеотидной последовательности клонированной ДНК, равен 80 кДа. хотя выделенный белок Spl имеет эффективную мол. массу 90 100 кДа. Возможно, это связано с гликозилированием Spl in vivo, хотя для ядерных белков такая модификация не характерна. Мутационный анализ различных участков последовательности, кодирующей Spl, показал, что один из доменов этого белка необходим для присоединения к ДНК, а другие для активации транскрипции (рис. 8.34). Домен связывания ДНК находится вблизи С-конца и имеет три участка. Каждый участок содержит расположенные определенным образом остатки цистеина и гистидина, которые образуют хелатную связь с Zn2 + (так называемые «цинковые пальцы»; разд. 8.7.а). Изме-

К°Р тс-п.т

„R Sph Sph

АР5NF-кВ SphSph

C/EBP otf‘1

OTF-2

Sp1 Spl Spl Spl Spl Sp1 ТП1П-(ТН1АГВ,Е,Е)

ТП1П-(ТП1А,ВЕ,Е)

РИС. .32.

Факторы транскрипции и сайты их связывания в промоторе ранней области генома SV40. Разные регуляторные элементы выделены разными цветами и квадратными скобками. Внизу указаны белки, связывающиеся с родственными последовательностями. Комп-

леке транскрипции, состоящий из указанных на рисунке факторов, занимает АТ-участок, ori и область начала транскрипции. Представлены Т-антигены, расположенные под двумя сайтами наиболее прочного связывания.

Взаимодействие фактора транскрипции Sp1 с ОС-богатыми кластерами повторов из 21 '22 п. н. Сегменты ДНК, содержащие повторы из 21/22 п. н., инкубировали с очищенным белком Sp1 и затем обрабатывали диметилсульфатом. Остатки G в трех GC-богатых кластерах (они окрашены наиболее интенсивно) оказываются

полностью защищенными от метилирования. Остатки гуанина (д), содержащиеся в следующем по интенсивности окраски сегменте, были защищены частично, а остатки в бледно окрашенных сегментах не защищены совсем. Все защищенные остатки G находятся в одной цепи ДНК.

нения в последовательности отдельных пальцев или в их числе и расположении уменьшают эффективность связывания и активации транскрипции. Кроме домена связывания ДНК, для оптимальной активации транскрипции нужны два участка, богатых глутамином, которые находятся в N-концевой части полипептида, и короткие последовательности, фланкирующие цинковые пальцы (рис. 8.34). Роль участков, богатых серином и треонином, пока не установлена.

Элемент, находящийся у З'-концов обоих повторов размером 72 п. н. (обозначенный на рис. 8.29 буквой Р), служит сайтом связывания белка, названного API (рис. 8.32). Какую роль играет связывание API с этой последовательностью, неясно, поскольку мутации в P-элементе, ингибирующие присоединение API, не влияют на активность энхансера; об этом свидетельствуют результаты исследования транскрипции in vivo. Возможно, взаимодействие

API с ДНК необходимо для транскрипции ранней области SV40 только в определенных условиях, например в отсутствие других факторов связывания энхансера или при определенных внешних воздействиях.

API принадлежит к семейству близкородственных белков с мол. массой примерно 40 кДа, специфически связывающихся с канонической последовательностью 5'-TGANTCA-3' (N- любое основание). У млекопитающих белки типа API кодируются множественными генами; некоторые из них клонированы. Расшифровка аминокислотных последовательностей некоторых API-белков показывает, что ДНК-связывающие домены этих белков сохранились в процессе эволюции, в то время как другие участки претерпели изменения. Интерес к физиологической роли API усилился после того, как были сделаны два открытия. Во-первых, у трансформирующего вируса кур был обнаружен онкоген v-jun,

Домены, богатые глутаминомДомены, богатые глутаминомДНК-связывающнйдоменДНК-связывающнйдомен

Домены, богатые глутамином

Домены, богатые глутамином

ДНК-связывающнй

домен

ДНК-связывающнй

домен

РИС. 8.34.

Структурные домены белка Sp1. Схема построена исходя из данных о нуклеотидной последовательности кодирующего данный белок участка ДНК. ДНК-связы- вающий домен включает три цинковых пальца, расположенных вблизи С-конца белковой молекулы. Два глутамин-богатых домена вблизи N-конца и два корот-

ких участка, фланкирующих цинковые пальцы, необходимы для активации транскрипции. Домены, богатые серином/треонином, несущественны для связывания ДНК или для активации, но, возможно, влияют на один или на оба этих процесса, поскольку содержат сайты, по которым может происходить модификация белка.

кодирующий API-подобный белок. Клеточная копия v-jun, c-Jun, относится к семейству генов API. Вероятно, каждый из API-подобных белков играет свою регуляторную роль, которая может зависеть от того, в каком окружении находится родственная связывающая последовательность в регуляторной области гена. Во-вторых, было показано, что у дрожжей содержится ген, белковый продукт которого, GCN4, гомологичен белкам семейства API млекопитающих. Так же как белок связывания ТАТА из дрожжей может заменять свой аналог TFIID у млекопитающих, GCN4 может активировать гены млекопитающих, которые зависят от API, а белок API из млекопитающих может заменять GCN4 при транскрипции дрожжевых генов, которым необходим этот фактор. Помимо гена GCN4 дрожжи содержат также дополнительные гены, кодирующие семейство API-подобных белков. Их характеристики и способность активировать транскрипцию в настоящее время изучаются.

Сами по себе API-белки плохо связываются с узнаваемым ими элементом. Чтобы связывание было прочным, API должен соединиться с другим белком, Fos. Особенности строения белков Fos и API и их взаимодействие друг с другом, благодаря которому они могут влиять на эффективность транскрипции, мы рассмотрим в разд. 8.6.6.

Повторяющиеся элементы последовательности Sph (рис. 8.29), ответственные за функционирование энхансера в нелимфоидных клетках (например, клетках HeLa), влияют на активность энхансера, связываясь с каким-то не охарактеризованным пока белком. Мутации в элементе Sph приводят к параллельному уменьшению активности энхансера и бе- локсвязывающей способности. Интересно, что белок, присоединяющийся к элементу Sph, отсутствует в лимфоидных клетках, в которых этот элемент не участвует в функционировании энхансера, а тот же самый частично очищенный белок связывается также с элементом GTII, неродственным Sph и расположенным левее его. Влияет ли эта двойная специфичность (и если да, то каким образом) на активность энхансера, неясно. Таким образом, обнаруживается одна странная, но характерная особенность некоторых факторов транскрипции: способность связывать два разных и неродственных элемента последовательности.

Как мы уже отмечали, при перекрывании элементов Sph образуется октамерная последовательность 5'-ATGCAAAG-3', целостность которой важна для функционирования энхансера в лимфоидных тканях. Такая последовательность-иногда с незначительными изменениями часто встречается в области регуляции транскрипции широкого круга генов у самых разных организмов. Ее функционирование опосредуется связыванием с белками двух

классов, OTF-1 и OTF-2. Эти ДНК-связывающие белки узнают каноническую последовательность 5'-ATGCAAAT-3' или близкородственные последовательности, как правило находящиеся в окружении других 1/ис-действующих элементов. Белок OTF-1 (мол. масса примерно 90 кДа, в литературе известен под разными названиями) распространен очень широко и участвует в активации транскрипции ряда клеточных и вирусных промоторов. В то же время OTF-2 (мол. масса примерно 60 кДа) присутствует только в клетках лимфоидного происхождения, где взаимодействует с октамерными элементами в областях энхансеров-промоторов генов иммуноглобулинов и других, специфичных для лимфоидной ткани генов, стимулируя их транскрипцию (разд. 8.3.д). Поскольку функционирование энхансера SV40 в нелимфоидных клетках опосредуется Sph-связываю- щим белком, OTF-1 и последовательность, с которой он связывается, не обязательны. В лимфоцитах же, у которых фактор связывания Sph отсутствует, для транскрипции с промотора ранней области генома SV40 необходимо связывание OTF-2 с октамерной последовательностью.

Несмотря на то что нуклеотидные последовательности элементов TC-I и ТС-И идентичны, белок АР2 связывается только с ТС-И. Мутационные изменения в ТС-И блокируют связывание АР2 и понижают активность энхансера. Соседние элементы ТС-И и GT-I вместе образуют кор, который является сайтом связывания фактора транскрипции АРЗ, а в клетках печени-фактора С/ЕВР (рис. 8.32). Мутационные изменения в нуклеотидной последовательности кора тоже блокируют связывание АРЗ и нарушают работу энхансера. Необходимо ли для функционирования энхансера присоединение обоих факторов, АР2 и АРЗ, или каждый из них может самостоятельно активировать транскрипцию в зависимости от типа клеток или физиологического статуса, неясно. Частично очищенные факторы транскрипции АР2 и АРЗ способны к связыванию специфических последовательностей и могут активировать транскрипцию с промоторов, содержащих родственные элементы.

В различных клеточных экстрактах обнаружены белки, принадлежащие к семейству GT-связы- вающих белков. Они были идентифицированы по своей способности связываться с элементом GT-II и с прилегающими последовательностями (5'-CTGTGGAATGT-3'). Эти белковые факторы отличаются друг от друга клеточной специфичностью и сайтами связывания, которые были выявлены при помощи метода отпечатков с использованием ДНКазы I и защиты от метилирования, а также при изучении влияния мутаций в последовательности на связывание. Один из этих факторов, АР5, присутствует в клетках HeLa, но не в лимфоцитах. Воз-

можно, именно этим объясняется, почему интактная последовательность элемента GT-1I необходима для функционирования энхансера в клетках HeLa, но не в лимфоцитах. Второй фактор, АР4, связывается с последовательностью 5'-CAGCTGTGG-3', которая перекрывается с элементом GT-П. Роль АР4 в функционировании энхансера неясна. Хотя последовательности GT-I и GT-I1 имеют 10 одинаковых пар оснований из 12. они связываются с разными белками. АРЗ, ядерный фактор клеток HeLa, присоединяется к GT-1, но не к GT-1I. Мутации в GT-1, мешающие связыванию АРЗ, приводят к понижению активности энхансера.

Природа надмолекулярного комплекса, образующегося при соединении разнообразных белковых факторов с соответствующими участками, и его роль в стимуляции ранней транскрипции у SV40 в настоящее время до конца не установлены. Тем не менее изучение этой системы уже внесло значительный вклад в выяснение механизмов регуляции транскрипции, поскольку она представляет собой хорошую модель для детального исследования процессов трансактивации и дифференциальной экспрессии генов.

Т-антиген: .многоцелевой регулятор тринскрнп- ции. После трансляции в цитоплазме одной из двух ранних мРНК образовавшийся Tag транспортируется в ядро, где стимулирует инициацию репликации вирусной ДНК. а также участвует в репрессии и активации ранней и поздней областей транскрипции соответственно. Эту важную регуляторную роль Tag выполняет в комплексе со специфическими последовательностями ДНК и с другими белками.

Tag связывается с ДНК SV40 в трех сайтах, обозначенных на рис. 8.28 как Т1, Т2 и ТЗ. Сайт Т1. обладающий наибольшим сродством к Tag, находится на участке ДНК, который кодирует 5'-не- транслируемую последовательность ранних транскриптов. Т2, обладающий меньшим сродством к Tag, охватывает палиндром длиной 27 п. н. в ori. ТЗ обладает самым низким сродством к Tag и состоит из GC-богатых повторов длиной 22 п. н„ примыкающих к блоку АТ. По-видимому, главными детерминантами связывания белка с этими сайтами являются средний и С-концевой домены Tag, поскольку N-конец для этого процесса несуществен. Вместе с тем фосфорилирование и олигомеризация полипептида Tag влияют на связывание, хотя механизм этого влияния неясен.

В опытах in vivo и in vitro показано, что связывание Tag с сайтами Т1 и Т2 блокирует инициацию транскрипции в большинстве сайтов инициации транскрипции ранней области, расположенных правее. Вероятнее всего, присоединение Tag к этим сайтам мешает сборке комплекса преинициации на участке от —45 до +30 пары оснований (рис. 8.31).

Кроме того, возможно, что Tag влияет на экспрессию, инициируемую в расположенных справа сайтах, связываясь с API и таким образом мешая взаимодействию фактора транскрипции с родственной ему последовательностью энхансера. Взаимодействие Tag и API может влиять и на транскрипцию клеточных генов, для которой необходим API.

Транскрипция ранних мРНК начинается от сайтов, находящихся в ori, в отсутствие Tag (предранние мРНК). Синтез задержанных ранних РНК инициируется левее, в месте соединения АТ-элемента с GC-богатым повтором длиной 22 п. н. (или рядом с ним). Любопытно, что, когда Tag связан с сайтами Т1 и Т2. транскрипция предранних мРНК блокируется, зато транскрипция задержанных ранних мРНК активируется. Транскрипция с этих расположенных левее сайтов зависит от целостности сайтов связывания Spl, но. что удивительно, мало изменяется при делециях последовательностей энхансера. Более того, мутации в Tag или в ori, которые блокируют репликацию, но не влияют на транскрипцию пред- ранней мРНК, предотвращают переход транскрипции к более далеким сайтам инициации. Каковы физиологические последствия сдвига точек инициации транскрипции неясно; возможно, они связаны со сниженной эффективностью трансляции при синтезе Tag на более длинной мРНК.

Что же происходит при реализации этой сложной стратегической программы транскрипции? Сразу после заражения Tag начинает образовываться с большой скоростью; его накопление в клетке приводит к усилению репликации ДНК и к образованию большого числа матриц для транскрипции. Скорость накопления Tag регулируется связыванием его с сайтами Т1 и Т2 и, возможно, взаимодействием между Tag и API. С началом репликации ДНК общая скорость транскрипции ранней области уменьшается; число транскриптов, образованных при участии сайтов инициации транскрипции, расположенных слева, в 5-10 раз превышает число транскриптов, образованных при участии сайтов, расположенных справа. Но поскольку трансляция более длинных мРНК неэффективна, накопление Tag снижается еще больше. Наряду с понижением эффективности транскрипции ранней области происходит усиление транскрипции поздней области, в результате чего транскриптов поздней области образуется в 20 раз больше, чем ранней; заметим, что мРНК поздней области необходимы для синтеза белков капсида вириона. Таким образом, сложное взаимодействие вирусных и клеточных факторов транскрипции обеспечивает упорядоченное и эффективное развитие инфекционного процесса.

Транскрипция поздней области протекает в направлении, противоположном направлению транскрипции ранней области. Инициация осуществляет-

ся в разных сайтах, главным образом в GC-богатых повторах и в энхансере. Относите зьно малоизученный промо гор поздней области не имеет ТАТА-по- добной последовательности, но содержит сайты связывания Spl и до сих пор не охарактеризованные области в энхансере. Механизм активации транскрипции поздней области под действием Tag неизвестен. Существует точка зрения, что активация результат белок-белкового взаимодействия, а не связывания с ДНК. Возможно, взаимодействие Tag с API или с другим, пока неизвестным фактором транскрипции обусловливает активацию транскрипции поздней области.

Промотор гена тимидинкиназы вируса герпеса. Как мы уже отмечали, ранняя область генома SV40 транскрибируется сразу после заражения, при этом никакие вирусные белки не требуются. В то же время для транскрипции генов предранних белков (IEP) вируса герпеса (HSV) необходим фактор транскрипции, кодируемый вирусом и входящий в состав инфицирующего вириона. IEP-это регуляторные белки, которые активируют транскрипцию нескольких задержанных ранних генов, имеющих отношение к репликации ДНК. Транскрипцию поздних генов, многие из которых кодируют структурные белки вириона, IEP могут активировать только после начала репликации.

Для оптимальной транскрипции гена тимидинкиназы (ТК) HSV, одного из задержанных ранних генов, необходим один из пяти 1ЕР, а именно IEP3, представляющий собой высокомолекулярный (примерно 175 кДа) фосфорилированный белок. Об этом свидетельствует тот факт, что уровень экспрессии гена ТК, трансфицированного в клетки, в которых может экспрессироваться ген IEP3, в 10-100 раз выше, чем в клетках, где IEP3 отсутствует. Таким образом, промотор гена ТК HSV-это еще одна удобная модельная система для анализа взаимодействия клеточных и вирусных факторов в регуляции транскрипции вирусных генов.

Элементы промотора ТК-гена HSV были идентифицированы при помощи мутаций (делеций и замен), систематически вносимых в участок длиной

100п. н„ расположенный непосредственно перед точкой начала транскрипции. Способность измененных промоторов к активации транскрипции исследовали в опытах по введению их в ооциты Xenopus (разд. 7.7.6), при трансфекции клеток млекопитающих в культуре, а также путем измерений эффективности транскрипции в экстрактах из неинфи- цированных клеток. Между парой оснований —105 и сайтом кэпирования идентифицировано четыре существенных участка (рис. 8.35). Один из них, расположенный вблизи точки начала транскрипции, представляет собой вездесущую ТАТА-подобную последовательность; три других расположены дальше от этой точки и простираются примерно до — 105-й пары оснований. Дистальные последовательности состоят из трех элементов; два из них представляют собой GC-богатые гексануклеотиды, сходные с обнаруженными в 21/22 п. н.-повторах промотора ранней области SV40. Между ними находится последовательность, содержащая элемент 5'-ССААТ-3'.

Изменение гомологии ТАТА нарушает точность и эффективность инициации транскрипции, тогда как модификации трех дистальных элементов приводят к более серьезным нарушениям процесса транскрипции. Следует отметить, что мутации в левом GC-элементе, GC-II, подавляют транскрипцию в большей степени, чем аналогичные мутации в GC-I; кроме того, делеция GC-I не так заметно отражается на активности транскрипции, как делеция GC-I1. При замене GC-I сегментом, содержащим GC-II и ССААТ (пары оснований примерно от — 75 до —105) в противоположной ориентации, образуется даже более активный промотор. Возможно, различие в активности двух GC-элементов связано с тем, что GC-II находится ближе к последовательности ССААТ; впрочем, локальные различия в последовательностях, окружающих GC-элементы, также могут играть роль.

Фракционирование белков, участвующих в синтезе мРНК ТК in vitro, показало, что для осуществления транскрипции необходимы по крайней мере два фактора (рис. 8.36). Один из них, Spl,

-106 -97 , ।।

-88 -81

II

-55-47

I1

-28 -21

II

+1

1 ( ACCCCGCCCA (

(lCATTGGc(

fG GGGcbGCG^

ГCATATTAAf

, (TOCGGCGCGT (

(agtaaccg(

(СССС6СС6С(

(gtataatt(

GC-II

ССААТ- бокс

GC-I

TATA- бокс

5'

д'

РИС. 8.35.

Элементы, существенные для транскрипционной активности промотора гена тимидинкиназы вируса герпеса I. Кроме последовательности ТАТА, расположенной примерно на 25 п. н. левее начальной точки (+1), для

функционирования промотора HSV-ТК необходим ССААТ-бокс матричной цепи, фланкированный GC-богатыми последовательностями с взаимно противоположной ориентацией.

Sp1Sp1CTFCTFРИС. 8.36.

Sp1

Sp1

CTF

CTF

Элементы промотора гена тимидинкиназы вируса герпеса I ТАТА-бокс, два GC-гексануклеОтида с взаимно противоположной ориентацией (стрелки) и ССААТ-бокс. Сайты связывания Sp1 отмечены двумя стрелками.

Жирная стрелка указывает на то, что Sp1 связывается с дистальным GC-злементом более прочно. CTF-фактор транскрипции, связывающийся с ССААТ; стрелкой показан сайт его прочного связывания.

связывается как с GC-I, так и с GC-II, другой, СТР,- с элементом ССААТ, о чем свидетельствуют данные, полученные методом отпечатков с использованием ДНКазы I. Как и ожидалось, внесение мутаций в GC- или ССААТ-элементы подавляет примерно в одинаковой степени как связывание соответствующих факторов, так и транскрипцию. Инициация транскрипции гена ТК скорее всего зависит также от белков, которые группируются вокруг последовательности ТАТА между парами оснований — 40 и +35. Таким образом, как и в случае промотора ранней области генома SV40, для инициации транскрипции с участием ТАТА-блока необходимо несколько факторов транскрипции. Взаимодействуют ли (и каким образом) факторы Sp 1 и CTF друг с другом и как они влияют на активность и образование комплекса преинициации, неизвестно.

Во всех проведенных к настоящему времени опытах промотор ТК исследовали в отсутствие IEP3. Участвуют ли какие-то другие элементы в активации транскрипции под действием этого белка? По-видимому, на этот вопрос следует ответить отрицательно, поскольку опыты по трансфекции с использованием таких же мутантов, как и при идентификации элементов промотора, показывают, что для активации транскрипции с участием IEP3 in vivo нужна только область между парой оснований —105 и сайтом кэпирования. IEP3 не связывается с ДНК в этой области; возможно, он активирует транскрипцию с помощью белок-белковых взаимодействий. Природа этих взаимодействий и механизм их влияния на инициацию транскрипции неизвестны. IEP3 может стабилизировать уже сформированные комплексы или участвовать в активации комплекса транскрипции.

Многие промоторы клеток эукариот и вирусов

содержат в одной из двух цепей ДНК на расстоянии примерно 80-120 п. н. до точек начала транскрипции ССААТ-элемент. Целостность этой последовательности и окружающих ее нуклеотидов совершенно необходима для функционирования промотора. Имеются убедительные данные о том, что ССААТ является частью элемента, который активирует транскрипцию, выполняя роль сайта связывания для одного из факторов транскрипции. С другой стороны, известно, что с ССААТ связываются несколько (по крайней мере три) разных белков. Некоторые из них были обнаружены в различных клетках млекопитающих; при этом использовались методы отпечатков с применением ДНКазы I, опыты по защите от метилирования, данные об уменьшении подвижности связанной ДНК в геле и опыты по конкурентному связыванию. Так, белок CTF, связывающийся с последовательностью ССААТ в промоторе ТК, принадлежит к семейству ССААТ-свя- зывающих белков CTF/NF-1, которые активируют также промоторы а-глобина и вируса саркомы мышей. Другой белок, присутствующий в клетках печени млекопитающих, связывается с коровой последовательностью энхансера SV40 и ССААТ. Клетки HeLa содержат два разных ССААТ-связывающих белка, СР-1 и СР-2, которые по своему сродству к промотору явно отличаются друг от друга, а также от CTF, присутствующего в тех же клетках. Совершенно очевидно, что существуют и другие белки, связывающиеся с ССААТ. На это указывают многочисленные данные о том, что ССААТ является важным элементом различных регуляторных последовательностей, в том числе промоторов, которые работают на разных стадиях развития.

Генетическое происхождение различных ССААТ-

связывающих белков неизвестно. Возможно, некоторые из них являются продуктами отдельных генов, однако три формы СТР в клетках HeLa кодируются разными мРНК, транскрибируемыми с одного гена и образующимися в результате дифференциального сплайсинга транскрипта (разд. 8.5.е). Дифференциальный сплайсинг приводит к образованию различных форм одного фактора транскрипции; по-видимому, эти формы связываются с одним и тем же элементом, но выполняют разные регуляторные функции. У дрожжей тоже есть ССААТ-элементы и родственные им белки. Один из таких белков, димер, состоящий из двух разных субъединиц (НАР2 и НАРЗ), активирует транскрипцию гена, кодирующего изо-2-цитохром с. Комплекс НАР2/НАРЗ при связывании с последовательностью ССААТ в промоторе гена цитохрома с дрожжей контактирует с ДНК таким же образом, как и белок млекопитающих СР-1. Более того, мутации в элементе ССААТ влияют на связывание обоих белков одинаковым образом. Удивительно, что компоненты СР-1 и НАР2/НАРЗ в функциональном отношении взаимозаменяемы. Так. комплексы, состоящие из компонентов НАР2 или НАРЗ и СР-1, сохраняют способность связываться с ССААТ и активировать транскрипцию. Это еще раз показывает, что белки, участвующие в регуляции транскрипции, не изменяются в ходе эволюции.

Регуляция генов, специфичнаяв отношении типа клеток

и стадии развития

Многоклеточные растения и животные состоят из самых разных клеток, имеющих характерную морфологию и выполняющих специализированные функции. Эта специализация возникает на разных стадиях эмбрионального развития. Она поддерживается автономно либо проявляется в ответ на специфические межклеточные контакты или внеклеточные стимулы. Так или иначе, фенотипическое разнообразие клеток обусловливается дифференциальным характером экспрессии генов, приводящим к накоплению и распространению различных генных продуктов. Одна из ключевых проблем биологии развития заключается в следующем: каков механизм дифференциальной экспрессии генов в клетках, содержащих по существу одинаковый геном? Мы знаем, что установление и поддержание дифференцированного состояния осуществляются, в частности, путем регуляции транскрипции. Так. в клетках одного типа транскрипция определенных генов регулируется совершенно одинаковым специфическим образом на протяжении всей жизни организма, начиная с эмбрионального уровня (разд. 8.3.ж). Гены,

активно транскрибирующиеся в одних клетках (например, в клетках мозга или в лимфоцитах), совсем не транскрибируются в других. Более того, возможно, что транскрипция различных генов инициируется в клетках или тканях разных типов в ответ на одни и те же сигналы. Не исключено также, что один и тот же сигнал может инициировать транскрипцию одних генов и подавлять транскрипцию других. В этом разделе мы рассмотрим примеры дифференциальной регуляции транскрипции, обусловливающей тканеспецифичную экспрессию и экспрессию, специфичную для определенной стадии развития.

Иммуноглобулиновые гены: цис-элементы. Отличительным свойством генов иммуноглобулинов (Ig) и рецепторов Т-клеток (TCR) является то, что их уис-действующие регуляторные элементы далеко отстоят друг от друга в геноме клеток зародышевой линии и сближаются в результате рекомбинации на определенных стадиях развития лимфоидных клеток (разд. Ю.б.в). Такие перестройки приводят к перемещению сигналов транскрипции, находящихся на 5'-концах каждого гена Ig, к элементам энхансера, расположенным в интронах, в случае генов как тяжелых (IgH), так и легких (IgL) цепей Ig (рис. 10.67 и 10.68). Аналогичные перестройки приводят к сближению в процессе онтогенеза Т-клеток соответствующих промоторов и энхансеров, которые регулируют транскрипцию генов, кодирующих две по- липептидные цепи TCR (рис. 10.74). Таким образом, специфичность экспрессии генов Ig и TCR регулируется с помощью двух механизмов. Один из них определяет, когда и в каких клетках должны произойти перестройки; этот этап является важной предпосылкой активации транскрипции. Второй механизм зависит от взаимодействий между перестроенными элементами и факторами транскрипции, доступность и активность которых дифференциально регулируются в ходе созревания В- и Т-клеток. Здесь мы остановимся на втором способе регуляции генов IgH и IgL(x) в В-клетках. Мы рассмотрим природу и организацию элементов, участвующих в регуляции транскрипции генов Ig, факторы транскрипции, которые связываются с этими элементами, и те молекулярные особенности, которые обусловливают способность факторов активировать транскрипцию. Аналогичные элементы и факторы участвуют в регуляции транскрипции генов а- и р-цепей TCR в Т-клетках.

Несколько специфических элементов образуют так называемый базальный промотор гена IgH (рис. 8.37). Это ТАТА-подобная последовательность, находящаяся на расстоянии 20 30 п.н. от точки начала транскрипции, консервативная окта- мерная последовательность (octa) 5'-ATGCAAAT-3', расположенная еще примерно на 30- 60 п. н. левее, и каноническая гептамерная последовательность

От *100 От-60 до -120 до -90От *100 От-60 до -120 до -90От -25 +1 до-30От -25 +1 до-30От -60От -25 +1

От *100 От-60 до -120 до -90

От *100 От-60 до -120 до -90

От -25 +1 до-30

От -25 +1 до-30

до -90до -30

РИС. 8.37.

Элементы, участвующие в регуляции транскрипции генов тяжелой и легкой (и) цепей иммуноглобулина. IgH-промотор состоит из ТАТА-бокса, октамерной (octa) и гептамерной (hepta) последовательностей слева от точки начала транскрипции и энхансера (Ен), находящегося в интроне между вариабельным (VDJ)

и константным (Сн) участками. Промотор гена IgL(x) содержит ТАТА-бОкс и имеющую противоположную ориентацию октамерную последовательность перед точкой начала транскрипции, а также энхансер Еу в интроне между вариабельным (VJ) и константным (Ск) участками.

(hepta) 5'-CTCATGA-3', находящаяся примерно на 25 и. н. левее октамера. Наиболее важным для транскрипции и клеточной специфичности среди элементов базального промотора является октамер. Его делеция приводит к полной утрате промотором транскрипционной активности, а встраивание ок- тамерного сегмента в промотор, обычно не участвующий в транскрипции в лимфоцитах, инициирует транскрипцию в В-клетках. Делеция гептамера примерно в пять раз снижает уровень экспрессии гена IgH; однако его роль в проявлении В-клеточной специфичности не установлена. Базальный промотор гена IgL(x) сходен с промотором IgH по расположению ТАТА-подобной и октамерной последовательностей. но октамерная последовательность в промоторе гена IgL(x) имеет противоположную ориентацию. Все промоторы гена IgL(x) содержат также консервативный 15-нуклеотидный элемент вблизи пары оснований —100. Для транскрипции гена IgL(x) необходимы ТАТА-подобная и октамерная последовательности, роль же 15-нуклеотид- ного элемента неясна, поскольку, как показывают разные исследования, его делеция не нарушает транскрипцию.

Для оптимальной транскрипции генов IgH и IgL(x) необходима также целостность соответствующих энхансеров. Энхансер IgH целиком находится внутри интрона, который расположен перед крайним слева экзоном, кодирующим константную область IgH (рис. 10.67 и 10.68). В гене IgL(x) обнаружены два энхансера: один внутри интрона перед константной областью, а другой за З'-концом единицы транскрипции (на расстоянии 9 т. п. н.). Свойства этих энхансеров типичны для регулятор

ных элементов данного класса. Каждый из них может находиться в любой ориентации, на разных расстояниях и в разных положениях относительно точки начала транскрипции и каждый может активировать транскрипцию гетерологичных промоторов. Важной особенностью энхансеров IgH и IgL является то, что они проявляют активность преимущественно в В-лимфоцитах. Энхансер IgH, по- видимому, активен на всех стадиях развития В-клет- ки и, следовательно, проявляет клеточную специфичность, но не специфичность к какой-то определенной стадии. Энхансеры IgL, вероятно, обладают специфичностью обоих типов, поскольку для инициации транскрипции генов IgL необходима индукция, перед которой происходит перестройка генов.

Первые данные о том, что энхансеры содержат дискретные элементы, которые служат сайтами связывания белков, были получены при идентификации последовательностей, защищаемых in vivo от метилирования под действием диметилсульфата. Эти опыты основываются на том, что если белки in vivo связываются с каким-то участком ДНК, то этот участок экранируется от химических агентов. Поскольку в В-клетках экранированными оказываются в основном последовательности, входящие в состав экспрессируемых генов, можно сделать вывод, что связанные белки представляют собой факторы транскрипции, обладающие клеточной специфичностью. Четыре защищенных участка в энхансере IgH и три-в энхансере IgL(x) обозначены на рис. 8.38 как элементы Ен и Ек соответственно; каждый из них представляет собой определенный вариант канонической последовательности 5'-CAGGTGGC-3'. Энхансер IgH содержит также три повтора коровой

LVJ

'SL^J

zB У РИС. 8.38.

Элементы, из которых состоят энхансеры генов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина. Интроны выделены точками. Элементы энхансера гена тяжелой цепи обозначены символами Еи 1-4 и Сн 1-3; последние пред-

последователыюсти (Сн 1 - 3), которая была описана при рассмотрении энхансера ранней области SV40 (рис. 8.29), и октамерную последовательность, идентичную последовательности, обнаруженной в базальном промоторе. В области энхансера есть также последовательности, ответственные за ингибирование транскрипции в клетках нелимфоидной ткани; на это указывают данные о том, что некоторые делении в области энхансера сопровождаются усилением транскрипции в фибробластах, в то время как в лимфоцитах активность энхансера практически не изменяется. В регуляции дифференциальной экспрессии, вероятно, участвуют так называемые сайленсеры. их свойства пока изучены слабо.

Результаты исследований влияния различных мутаций на активность энхансера IgH показывают, что октамер-это единственный элемент, по-настоящему необходимый для специфической активации транскрипции в В-клетках. Отдельные элементы Ен и Сн, по-видимому. не играют существенной роли в функционировании энхансера. Впрочем, не исключено. что такой вывод не совсем справедлив, поскольку одновременные изменения в октамере и в определенных элементах Ен приводят к более значительному нарушению функций энхансера, чем изменения в каком-то одном из этих элементов. Более того, мультимеры, состоящие только из элементов Ен или Сн, обеспечивают избирательную активность энхансера в В-лимфоцитах. Следует помнить, что на нынешнем этапе изучения энхансеров IgH активность транскрипции часто определяют в опытах по транзиенгной трансфекции, условия которых, возможно, не соответствуют нормальным условиям функционирования этих элементов. Поэтому, вероятно преждевременно говорить о том, что те или иные участки выполняют какие-то специализированные функции.

Энхансер IgL(x) содержит два типа элементов Один из них, Ек(рис. 8.38), был идентифицирован в опытах по защите от метилирования

ставляют собой кор-последовательности, обнаруженные во многих вирусных энхансерах (разд. 8.3.г). Элементы энхансера легкой цепи (х) обозначены символами иВ и Ех 1-3.

in vivo. Другой, так называемый элемент В (5'-GGAAAGTCCCC-3'), является сайтом связывания ядерного белка В-лимфоцитов (NF-xB). По-видимому, активность энхансера зависит в основном от элемента В, хотя какой-то вклад вносит и последовательность Ек2. Важной особенностью экспрессии гена IgL(x) является то, чго она индуцируется под действием бактериального липополисахарида, циклогексимида и форболовых эфиров; при внесении мутаций в элемент В это свойство утрачивается. Таким образом, последовательность В является ключевым элементом, от которого зависит как активность энхансера, так и индуцибельность транскрипции гена IgL(x). Интересно, что элемент В встречается также в промоторах и энхансерах, функционирующих в нелимфоидных тканях, причем в некоторых случаях эти промоторы индуцируются теми же самыми соединениями, которые активируют экспрессию гена IgL(x) в лимфоцитах. Возможно, это обусловлено свойствами NF-xB.

В транскрипции, специфичной для В-лимфоци- тов, участвуют все проксимальные промоторы и энхансеры иммуноглобулиновых генов. Наиболее важными детерминантами этой клеточной специфичности как в базальном промоторе, так и в энхансере генов IgH являются октамерные последовательности. Клетки, у которых отсутствует специфичный для В-клеток белок, связывающийся с октамерной последовательностью, не могут использовать ни промотор IgH, ни его энхансер. Аналогично, В-кле- точная специфичность энхансера IgL(x) зависит от последовательности базального промотора, а его активация, специфичная для поздних стадий развития В-клеток от взаимодействия элемента хВ с белком NF-xB.

Гены иммуноглобулинов: транс-действующие факторы. Мы уже говорили, что для сборки комплекса транскрипции вблизи последовательности ТАТА и точки инициации транскрипции необходимы белковые факторы. Помимо этих факторов для активации базальных промоторов IgH и IgL(x)

нужен лимфоцит-специфичный белок, который связывается с октамером. Напомним, что существуют два типа таких белков: один (OTF-1) присутствует в большинстве клеток млекопитающих, а другой (OTF-2) только в лимфоцитах (разд. 8.3.г). Последний играет важную роль в активации тканеспецифичной транскрипции с базальных промоторов IgH и IgL(x) в лимфоцитах. Белки обоих типов связываются с октамерной последовательностью примерно с одинаковой эффективностью и защищают от расщепления ДНКазой I и от метилирования диметилсульфатом одни и те же остатки. Поскольку в лимфоцитах присутствуют факторы транскрипции обоих типов (и OTF-1, и OTF-2), неудивительно, что в них могут экспрессироваться разнообразные гены, промоторы которых содержат октамерный элемент. Однако, как это ни парадоксально, промоторы IgH и IgL(x) не функционируют в клетках, содержащих OTF-1 и не содержащих OTF-2. Возможно, это связано с тем, что для начала транскрипции достаточно присоединения к октамерному элементу Ig фактора OTF-2 и недостаточно присоединения одного только OTF-1. Вероятно, для инициации транскрипции под действием OTF-1 последний должен связаться с одним или несколькими вспомогательными факторами, соединенными в свою очередь с соседними элементами. Например, в промоторе ранних генов SV40 и других промоторах рядом с октамерной последовательностью находятся элементы, являющиеся сайтами связывания некоторых факторов транскрипции. Не исключено также, что расстояние между последовательностью ТАТА и октамером в базальных промоторах Ig отличается от соответствующего расстояния в промоторах, работающих в самых разных клетках.

Клонированы кДНК, кодирующие как OTF-1, так и OTF-2. При помощи РНК-блоттинга клеточных мРНК с использованием кДНК в качестве зондов было показано, что экспрессия генов OTF-1 действительно происходит в самых разных клетках, а генов OTF-2-на всех стадиях развития лимфоцитов. Если фибробласты трансформировать плазмидами, кодирующими белок OTF-2, то клетки приобретают также способность к экспрессии гена IgH. введенного совместно. В отсутствие плазмиды, кодирующей OTF-2, ген IgH не экспрессируется. Это указывает на то, что наличие OTF-2 совершенно необходимо для экспрессии гена IgH в нелимфоидных клетках. Кроме октамерной последовательности, OTF-2 связывается также с гептамерной последовательностью в базальном промоторе IgH. Возможно, именно это дополнительное взаимодействие ответственно за преимущественную экспрессию IgH по сравнению с IgL на ранних стадиях развития В-клеток.

Как показало определение нуклеотидных после

довательностей клонированных кДНК, кодирующих белки OTF-1 и OTF-2, аминокислотные последовательности их доменов, связывающихся с ДНК, почти одинаковы в отличие от последовательностей других участков этих белковых молекул. Возможно, существование таких различающихся участков и обусловливает способность этих белков взаимодействовать с факторами, специфичными в отношении определенных генов или клеток. Более того, зависимость сродства октамера к OTF-1 от фланкирующих его последовательностей предполагает, что OTF-1 обладает способностью оказывать разностороннее влияние на транскрипцию многих генов. Более подробно молекулярные особенности OTF-1 и OTF-2 и их связь с ДНК-белковыми взаимодействиями и способностью к активации транскрипции мы рассмотрим в разд. 8.6.

Три элемента Е в энхансере IgH взаимодействуют с разными ядерными белками, причем изменения нуклеотидной последовательности этих элементов блокируют связывание. Каков вклад указанных взаимодействий в активацию транскрипции, специфичную для клеток определенного типа, неясно, поскольку данные белки присутствуют во многих тканях. В целом имеющиеся данные указывают на то, что элементы Ен не оказывают прямого влияния на клеточную специфичность, а действуют на активность энхансера. Белки, связывающиеся с последовательностью Ен, связываются также и с другими промоторами, из чего следует, что их влияние на транскрипцию генов Ig носит количественный, а не качественный характер. Итак, можно сказать, что детерминантой лимфоидной специфичности энхансера IgH является октамерная последовательность.

Активация транскрипции генов IgL(x) опосредуется белками, которые связываются с элементами Е и В в энхансере. Эти белки, NF-xE2, NF-xE3 и NF-xB, были идентифицированы в ядерных экстрактах при помощи метода сдвига полосы (т. е. по их способности уменьшать электрофоретическую подвижность радиоактивно меченных коротких фрагментов ДНК, содержащих определенную последовательность; разд. 8.3.г). Возможно, к элементам Еу2 и Ек3 присоединяются те же самые белки, которые связываются с энхансером IgH и влияют на его активность. Поскольку сайт хВ энхансера в количественном отношении является самой важной детерминантой транскрипции IgL(x) и отвечает за индуцибельность, а также за тканеспецифичность экспрессии гена и специфичность ее к определенной стадии развития, мы остановимся на свойствах белка NF-xB и его взаимодействии с сайтом хВ.

Вначале белковые комплексы, взаимодействующие с элементом хВ, были обнаружены только в ядерных экстрактах зрелых В-лимфоцитов. Мутации в сайте хВ, которые блокировали экспрессию

и приводили к утрате индуцибельности генов IgL(x), подавляли связывание NF-xB. Таким образом, можно было предположить, что NF-xB скорее всего является обычным тканеспецифичным фактором транскрипции. Однако в этом пришлось усомниться, когда NF-xB обнаружили в экстрактах незрелых В-лимфоцитов, в которых их собственные гены IgL(x) не экспрессируются. Теперь мы знаем, что NF-xB присутствует в составе неактивного комплекса в цитозоле самых разных клеток. Когда такие клетки подвергаются действию соединений, индуцирующих экспрессию IgL(x) в В-клетках (например, липополисахаридов, циклогексимида и форболовых эфиров), этот комплекс разрушается и NF-xB появляется в ядре. По-видимому, NF-xB связан в цитозоле с лабильным белковым ингибитором (1-хВ). В самом деле, полностью активный NF-xB можно инактировать, смешав его с [-хВ. Механизм активации NF-xB под действием индукторов in vivo до конца не установлен. Вполне возможно, что циклогексимид блокирует синтез лабильного ингибитора, а липополисахарид и форболовые эфиры активируют ферменты, которые индуцируют модификации в I-хВ, вызывающие диссоциацию комплекса и поступление NF-xB в ядро.

NF-xB выделен в гомогенном виде из лимфоцитов быка и человека; по-видимому, он представляет собой гетеродимер, состоящий из полипептидов с мол. массой 50 и 65 кДа. За связывание с ДНК ответственна субъединица 50 кДа, а субъединица 65 кДа необходима для инактивации NF-xB под действием I-хВ. Независимо от типа клеток NF-xB связывается с канонической последовательностью 5'-GGGRtTYY£C-3' (где R и Y-пурин и пиримидин соответственно). Необычным свойством NF-xB является то, что его связывание с последовательностью хВ стимулируется нуклеозидтрифосфатами. Строение, функционирование и механизм образования NF-xB можно будет понять только после выделения гена, кодирующего этот белок.

Элемент хВ (иногда с небольшими изменениями) встречается во многих промоторах клеток млекопитающих и вирусов. Поэтому функциональное состояние NF-xB и его индуцибельность очень важны для экспрессии соответствующих промоторов. Например, взаимодействие Т-хелперных клеток с антигеном сопровождается активацией NF-xB, которая инициирует образование фактора роста IL2, а также рецептора IL2, необходимых для пролиферации Т-клеток при нормальном иммунном ответе. Усиленная транскрипция генов IL2 и рецептора IL2 опосредуется связыванием NF-xB с элементами хВ в соответствующих промоторах. Транскрипция генов вируса иммунодефицита человека типа 1 (HIV-I) зависит от связывания NF-xB с хВ-элементом в вирусном промоторе. Экспрессия и размножение

вируса, в частности стабильность латентного состояния, когда гены HIV-I не экспрессируются, вероятно, зависит от состояния NF-xB в клетке и, следовательно, от антигенной стимуляции таких латентно инфицированных клеток. Активация NF-xB может происходить не только в лимфоцитах, но и во многих других клетках при поступлении различных сигналов. Так, синтез Р-интерферона после заражения фибробластов вирусом индуцируется путем активации и связывания NF-xB, приводящих к инициации транскрипции.

Обратимая активация-инактивация NF-xB обеспечивает эффективную регуляцию клеточного ответа на разнообразные сигналы. Известные нам немногочисленные примеры активации NF-xB говорят о том, что мы пока далеки от полного понимания роли NF-xB как регулятора экспрессии различных генов.

Гены, экспрессирующиеся только в клетках печени. Клетки печени синтезируют многие ферменты и секретируют белки, не образующиеся в других клетках. Такая тканеспецифичность регулируется в основном на уровне инициации транскрипции. Здесь мы рассмотрим механизм этой регуляции на примере двух генов, один из которых кодирует альбумин (ALB'y а другой-а-фетопротеин (AFPY Эти гены образуют небольшое семейство эволюционно родственных генов. Они дивергировали от 300 до 500 млн. лет назад, оставшись тем не менее тесно сцепленными, и имеют одинаковую организацию в геноме как человека, так и мыши (разд. 9.4.а). В процессе эмбрионального развития оба гена экспрессируются в висцеральной эндодерме на стадии желточного мешка, в печени и в желудочно-кишечном тракте плода. На протяжении всего развития плода уровень экспрессии генов ALB и AFP в печени и в кишечнике остается примерно одинаковым, но вскоре после рождения экспрессия гена AFP в этих органах прекращается, а содержание ЛГР-мРНК уменьшается в 10000 раз за три-четыре недели. С другой стороны, уровень экспрессии гена ALB и содержание ЛСУ-мРНК в печени остаются высокими на протяжении всей жизни взрослого организма, а уменьшаются только в кишечнике. Каков механизм тканеспецифичной транскрипции этих двух генов и чем объясняется резкое различие в их транскрипции после рождения?

Гены ALB и AFP мыши расположены тандемно; расстояние между ними составляет 15 т. п. н. (рис. 8.39). Каждый ген длиной от 20 до 22 т. п. н. состоит в основном из интронов и содержит 15 относительно коротких экзонов. Исследовалась экспрессия этих генов в культуре клеток с подходящими маркерными генами (например, с генами хлорам- фениколацетилтрансферазы [CAT] и гормонов роста) с присоединенными к ним регуляторными

РИС. 8.39.РИС. 8.39.Взаимное расположение и организация генов альбумина (ALB) и а-фетопротеина (AFP) млекопитающих. Экзоны, которые по своим размерам пренебрежимо малы по сравнению с целыми генами, представлены

РИС. 8.39.

РИС. 8.39.

в виде поперечных черных линий внутри интронов, выделенных точками. Указаны промотор и энхансер, а также сайты инициации транскрипции (волнистые стрелки у первых экзонов).

областями ALB и AFP (как дикого типа, так и избирательно модифицированными). Это позволило определить положение i/мс-действующих последовательностей, ответственных за специфичную к клеткам печени транскрипцию и раздельную регуляцию двух генов в процессе развития.

Для тканеспецифичной экспрессии генов ALB и AFP необходимы только последовательности, находящиеся в пределах участка длиной 150 п. н. перед точками инициации транскрипции. В то же время последовательности, находящиеся левее, вызывают усиление транскрипции гена AFP в 20-50 раз. Эта дистальная область содержит три разных энхансер- ных элемента на расстоянии 6,5, 5 и 2,5 т. п. н. от 5'-конца гена (рис. 8.39). Опыты с трансгенными мышами, имеющими различные модифицированные формы промотора AFP, тоже свидетельствовали о необходимости 5'-проксимальных и дисталь

ных элементов для эффективной тканеспецифичной транскрипции в нужное время. Сравнительный анализ с использованием трансгенных мышей, содержащих ген ALB, фланкированный участками ДНК различной длины, показал, что кроме 5'-прокси- мальной последовательности для обеспечения нормального уровня транскрипции необходим элемент, находящийся на 9-12 т. п. н. левее гена ALB, а также три энхансера AFP правее гена ALB.

Сайт-специфический мутагенез области, примыкающей слева к гену ALB крысы, и определение влияния мутаций на эффективность транскрипции позволили выявить шесть консервативных последовательностей, которые входят в базальный промотор и обусловливают его тканеспецифичность (рис. 8.40). Базальный промотор составляют два элемента: последовательность ТАТА, задающая точку начала транскрипции, но не влияющая на

DEII1

-180-170-160-150-140-130-120-110-100

।।।।i।iI।

Крыса : GGGAGCTTCAGATGGCAAACATACGCAAGGGATTTAGTTAAACAACTTTTTTTTTTCTTTTTGGCAAGGATGGTATG-ATTTTGTAATG Мышь : AACAGCTCCAGATGGCAAACATACGCAAGGGATTTAGTCA ААСААCTTTTTGGCAAAGATGGTATG-ATTTTGTAATG Человек : AACAgtT СС AG ATGGTA А Ат АтАСАС A AGGGATTTAGTC А ААСААTTTTTTGGCAAGAAT ATTATGA ATTTTGT ААтС

ссаат

-90-80-70-60-50-40-30-20-10

11111ill।

Крыса•- GGGT AGGAACC A ATG АААТ GAAAGGTT - AGTC FGGTT AATG АТСТАС AGTTATTGGTTAGAGAAGTATAT Т AG AGCGAG - - ТТТ: - СТС

Мышь : GGGTAGGAACCAATGAAATGCGAGGTA-AGTAVgGTTAATGATCTACAGTTATTGGTTAAAGAAGTATATTAI GCGAGTCTTT- -СТ- Человек : GGTTGGCAGCCAATGAAAT tCAAAGATGAGTCTAGTTAAtAATCTAC# TTATTGGTTAAAGAAGTATATTAGTGCTAA- -ТТТСССТС

+1

I

крыса : Т - - - GCACACAG АССАССТ - МЫШЬ : - - - -GCACACAGАТСАССТ- Человек : CGTTTGTCCTAGCTTTTCTC

РИС. 8.40. .

Сравнение регуляторных элементов, ответственных за специфичность промотора альбуминового гена млекопитающих в отношении клеток печени. Элементы расположены так, чтобы совпали их сайты инициации транскрипции, служащие точкой отсчета. Пунктиром выде

лены промежутки, введенные для того, чтобы выстроить совпадающие участки друг под другом. Пояснения, касающиеся роли последовательностей, выделенных разным цветом, даны в тексте.

частоту инициации транскрипции, и элемент ССААТ, повреждение которого заметно уменьшает эффективность транскрипции во всех исследованных клетках. Специфичность в отношении клеток печени зависит от четырех вспомогательных последовательностей: элемента РЕ, расположенного между элементами ТАТА и ССААТ, и трех дистальных элементов, DEI, DEII и DEIII. Наиболее серьезные изменения специфичности промотора ALB в клетках печени происходят при модификации РЕ. Другим важным элементом, определяющим тканеспецифич- ность транскрипции, является DEI. Модификации DEII или DEIII приводят лишь к умеренному уменьшению эффективности тканеспецифичной транскрипции, тогда как удаление сразу обоих элементов сопровождается снижением активности промотора в 25 раз.

Каждый из уис-элементов содержит сайт связывания какого-то специфического фактора транскрипции (рис. 8.41). Последовательность, входящая в PE-элемент мыши, 5'-GTTAATGATCTAC-3', родственна последовательности, общей для многих генов, экспрессирующихся только в клетках печени (табл. 8.1). Эта последовательность служит сайтом связывания для белка HNF-1, присутствующего искючительно в клетках печени. Очищенный HNF-1 (88 кДа) связывается и «оставляет отпечатки» в PE-области промотора ALB, а также связывается

Стимулирующее действие „ , указанного элемента 3-4Х

с гомологичной последовательностью гена AFP. Более того, различные гены, специфичные для клеток печени, и промотор вируса гепатита, которые содержат несколько модифицированный элемент РЕ, также связывают HNF-1. Таким образом, участие РЕ в тканеспецифичной экспрессии гена ALB определяется присутствием в соответствующих клетках его лиганда, HNF-1. Другие регуляторные элементы промотора ALB, ССААТ и ТАТА, активируют транскрипцию при связывании узнающих их белков (разд. 8.3.г); однако ни ТАТА-, ни ССААТ- связывающие белки не являются специфичными для клеток печени. Белки, связывающиеся с DEI и DEI1, С/ЕВР и NF-1 соответственно, участвуют в активации различных клеточных и вирусных промоторов и тоже присутствуют не только в клетках печени (разд. 8.3.г).

4х 15х4х 15хATACGCAAGGGATTTAGTTAAACAACTTTTTTTTTTCTTTTTGGCAAGGATGGTATGATTTTGTAATGGGGTIIII-160-140-120-100ATACGCAAGGGATTTAGTTAAACAACTTTTTTTTTTCTTTTTGGCAAGGATGGTATGATTTTGTAATGGGGTIIII-160-140-120-100Как объяснить участие широко распространенных белков, связывающихся с ДНК, в специфичной для клеток печени экспрессии промоторов гена ALB! Возможно, в основе этого феномена лежат особенности присоединения неспецифических факторов, а именно - их связывание по соседству с белком HNF-1, специфичным для клеток печени. Другое возможное объяснение заключается в том, что DE-связывающие белки являются гепатоцитспеци- фичными факторами транскрипции, относящимися к семействам С/ЕВР и NF-1. Напомним в связи

4х 15х

4х 15х

ATACGCAAGGGATTTAGTTAAACAACTTTTTTTTTTCTTTTTGGCAAGGATGGTATGATTTTGTAATGGGGT

IIII

-160-140-120-100

ATACGCAAGGGATTTAGTTAAACAACTTTTTTTTTTCTTTTTGGCAAGGATGGTATGATTTTGTAATGGGGT

IIII

-160-140-120-100

CTF/NFI

50x50x100x

50x

50x

PETATA

I1I1I1

AGGAACCAATGAAATGAAAGGTTAGTGTGGTTAATGATCTACAGTTATTGGTTAGAGAAGTATATTAGAGCGAGTTTCTCTGCACACAG IIIII

-80-60-40-20+1

NF-Y

HNF-I

РИС. 8.41.

Влияние разных элементов и соответствующих белков на активность промотора альбуминового гена млекопитающих, определяющего специфическую транскрипцию в клетках печени. Представлены все элементы

и соответствующие белки, связывающиеся с наиболее важными из них. Вклад каждого элемента в тканеспецифичную экспрессию (он указан над элементами) определяли при помощи делеционного анализа.

Пара основанийПара основанийТаблица 8.1. Распределение сайтов связывания HNF-1 в генах, экспрессирующихся в клетках печени 11

Пара оснований

Пара оснований

а-Цепь фибриногена

Крыса

G G Т G

ATGATTAAC

—47

P-Цепь фибриногена

»

G Т С А

ААТАТТААС

-84

Альбумин

»

G Т Т А

ATGATCTAC

-53

Альбумин

Человек

G Т Т А

АТААТСТАС

-51

а-Фетопротеин

Крыса

G Т Т А

CTAGTTAAC

— 49

а-Фетопротеин

»

G Т Т А

ATTATTGGC

-115

а-Фетопротеин

Человек

G Т Т А

CTAGTTAAC

—47

а-Фетопротеин

»

G Т Т А

ATTATTGGC

-118

Транстиретин

Крыса

G Т Т А

СТТАТТСТС

-116

Транстиретин

Человек

G Т Т А

СТТАТТСТС

-116

а1-Антитрипсин

Мышь

G Т Т А

АТ- А Т Т С А Т

-63

а, -Антитрипсин

Человек

G Т Т А

АТ- А Т Т С А С

-63

Про-S 1 вируса

гепатита

»

G Т Т А

АТСАТТАСТ

-75

Каноническая последователь-

ность 21

G Т Т А

А Т N А Т Т А А С

Белок

Вид

Последовательность

° G. Courtois et al., Proc. Nat. Acad. Sei. 85 (1988), p. 7937.

2* Приведена общая для всех представленных промоторов последовательность из 13 п. н., начинающаяся с указанной пары оснований перед точкой начала транскрипции. Палиндромная последовательность высококонсервативна; исключением является пара оснований в центре.

с этим, что существуют как широко распространенные, так и тканеспецифичные формы белков ОТЕ.

Итак, экспрессия гена ALB регулируется относительно небольшой последовательностью в пределах участка из 150 п. н., непосредственно примыкающего к сайту начала транскрипции. Эта область содержит множество сайтов связывания специфических белков; одни из них обусловливают тканеспецифич- ность экспрессии промотора, а другие регулируют уровень экспрессии. Как именно этот комплекс связанных белков влияет на скорость транскрипции, неизвестно. Неясно также, каким образом энхансеры, находящиеся примерно на 10 т. п. н. левее и более чем на 30 т. п. н. правее сайта инициации транскрипции, активируют базальный промотор.

При помощи аналогичных экспериментальных подходов идентифицирован единственный элемент, ответственный за тканеспецифичную транскрипцию промотора AFP в клетках печени. Этот элемент находится в пределах сайта связывания HNF-1 между парами оснований —61 и —48. Высокий уровень экспрессии в трансфицированных клетках печени и у трансгенных мышей обеспечивают также три отдельных энхансерных элемента, находящихся на значительном расстоянии от базального промотора. При этом необходимы все три элемента, поскольку каждый из них вносит свой вклад в общую активность. Размер элементов варьирует от 200 до 300 п. н.; каждый из них содержит как одинаковые, так и уникальные последовательности. Некоторые

из этих элементов (или элементы, сходные с ними) встречаются в других клеточных и вирусных энхансерах. Идентификация энхансерных элементов еще не завершена, но уже можно сказать, что одни из них присутствуют в большом количестве, а другие весьма немногочисленны и обеспечивают позитивную и негативную регуляцию транскрипции.

Почему прекращается синтез AFP после рождения животного? Для ответа на этот вопрос проводили опыты с трансгенными мышами, несущими различные структурные варианты генов ALB и AFP. Например, у трансгенных мышей экспрессия искусственного гена, содержащего три ЛЕР-энхансера, соединенных с геном ALB и его базальным промотором, не прекращалась сразу после рождения. Трансгены, в которых >4 LZl-энхансер был присоединен слева к гену AFP, содержащему собственный 5'-пограничный участок размером всего 1 т. п. н., нормально экспрессировались в процессе развития плода и переставали экспрессироваться вскоре после рождения. Эти данные говорят о том, что информация о регуляции экспрессии AFP, специфичной в отношении определенной стадии развития, содержится либо в участке, примыкающем к базальному промотору слева, либо внутри промотора, либо внутри самой единицы транскрипции.

Согласованность действия фактора тканеспецифичной транскрипции и неспецифических факторов. Наиболее важным в регуляции экспрессии генов, о которых шла речь выше, является взаимодействие

между i/uc-элементами последовательностей и /пранс-действующими белками ядерной транскрипции. Это взаимодействие лежит в основе механизма транскрипции многих, а возможно и всех генов. Можно было бы предположить, что в каждой конкретной ткани и на каждой стадии развития используется один или несколько уникальных факторов транскрипции, взаимодействующих с соответствующим числом специфических элементов, что и обусловливает характерные особенности процесса транскрипции. На самом же деле элементы, отвечающие за специфическую транскрипцию эукариотических генов, состоят из относительно небольшого числа последовательностей и набора широко распространенных белковых факторов транскрипции, которые встречаются в самых разных тканях и функционируют на многих стадиях развития. Указанные последовательности находятся в пределах участка размером от 100 до 400 п. н., примыкающего непосредственно к точке инициации транскрипции со стороны 5'-конца, в дистальных элементах энхансера, а чаще одновременно в обоих местах. Обычно основными для транскрипции являются один или, возможно, два фактора транскрипции, присутствие которых характерно только для определенной ткани или стадии развития. Но именно сочетанное взаимодействие таких уникальных и других, неспецифических, белков и сайтов их связывания обусловливает дифференциальную экспрессию генов. Элементы хВ и октамерные последовательности генов IgL(x) есть во многих промоторах, но присутствие OTF-2 и индуцибельная активация NF-xB именно в лимфоцитах обеспечивает специфическую экспрессию промоторов генов Ig. Функционирование промотора гена ALB зависит от взаимодействий между несколькими часто встречающимися последовательностями и не менее широко распространенными факторами транскрипции, однако специфичность транскрипции в клетках печени определяется связыванием фактора транскрипции HNF-1, специфичного именно для этих клеток. Следует добавить, что экспрессия многих других генов тоже зависит от связывания некоего белка

транскрипции, который присутствует или активируется в определенных клетках, на определенной стадии развития или в определенной фазе клеточного цикла.

Индукция ирепрессия транскрипции

Уровень транскрипции отдельных генов часто меняется под действием внешних сигналов. Так, в зависимости от содержания питательных веществ (например, источников углерода, азота и энергии) и взаимодействия с различными гормонами, при вирусной инфекции или воздействии металлов, света, высокой температуры и радиации транскрипция специфических генов или групп генов может либо индуцироваться, либо подавляться. Во многих случаях повышение или понижение эффективности транскрипции происходит в ответ на изменения доступности необходимых факторов транскрипции или их способности связываться со специфическими регуляторными элементами. Рассмотрим несколько примеров, иллюстрирующих этот механизм регуляции транскрипции.

Регуляция транскрипции дрожжевых GAL-генов. На рис. 8.42 представлены метаболические пути утилизации галактозы у S. cerevisiae и гены, контролирующие этот процесс. Ген GALI кодирует пермеазу, необходимую для поглощения внеклеточной галактозы. GAL1 кодирует галактокиназу, которая катализирует превращение галактозы в галактозо-1-фосфат, a GALT-галактозо-1-фосфат-уридилтрансфе- разу, катализирующую образование уридиндифосфогалактозы (UDPGal) из галактозо-1-фосфата и уридиндифосфоглюкозы (UDPG). Эпимераза, способствующая регенерации UDPG из UDPGal, кодируется геном GAL10. Гены GALI, GALT и GAL10 все расположены на хромосоме И, а ген СЛГ2-на хромосоме ХИ (рис. 8.43). Эти четыре гена, которые транскрибируются раздельно с индивидуальных промоторов, не экспрессируются в клетках, растущих на среде без галактозы. При выращивании в присутствии галактозы уровень их экспрессии

GAL2

GAL1

GAL7

ПермеазаКиназаТрансфераза

Галактоза ►Галактоза ►Галактозо-1-Р —► Глюкозо-1-Р

ОпГШп-внутр.

РИС. 8.42.

Метаболические пути утилизации галактозы у S. сеге- visiae. Утилизацию галактозы, добавленной в питательную среду, контролируют четыре гена (цветные прямоугольники). Над (или под) обозначениями генов приведены тривиальные названия кодируемых ими ферментов. UDPG и UDPGal-уридиндифосфоглюкоза и уридиндифосфогалактоза соответственно.

► Гликолиз

UDPG

Эпимераза

■ GAL 10

UDPGal

GAL7

GAL10

GAL2

GAL1

II

XVI

GAL80

ХШ

Индуктор

белок GAL80

GAL4

* Белок

GAL4

C-AL4

GAL80

Галактоза

РИС. 8.43.

Компоненты регуляторной системы бАЕ-генов. Показано положение в хромосомах относительно центромер (О) четырех генов кодирующих ферменты GAL, и двух генов, кодирующих регуляторные белки GAL4 и GAL80.

Внутриклеточная галактоза превращается в индуктор (не идентифицирован), который вызывает диссоциацию транскрипционно неактивного комплекса GAL4 GAL80 [М. Johnston, Microbiol. Rev 51 (1987), р. 458 ]

согласованно возрастает примерно в 1000 раз.

Индукция и репрессия ферментов GAL регулируется на уровне инициации транскрипции под действием неизвестного индуктора, образующегося из галактозы, и белков, кодируемых двумя несцеплен- ными генами, GAL4 и GALS0 (рис. 8.43) Мутации в гене GAL4 блокируют в присутствии галактозы индукцию транскрипции генов GALI, GAL2, GALI и GAL10; это наводит на мысль, что GAL4 кодирует какой-то положительный регулятор этих генов. Многие мутации в GAL80 приводят к тому, что транскрипция генов GALL GAL2, GAL7 и GAL10 становится конститутивной (т. е. независимой от индуктора), а в результате некоторых мутаций транскрипция генов GAL становится неиндуцибель- ной. Такое явление можно объяснить тем, что индуктор нейтрализует ингибирующее действие продукта гена GAL80 на активацию транскрипции, опосредованную геном GAL4. Если это так, то активация транскрипции генов GAL под действием белка гена GAL4 может блокироваться при его связывании с белком гена GAL80. Индуктор либо вызывает диссоциацию неактивного комплекса, либо препятствует его образованию. Ключом к расшифровке работы этой регуляторной системы служит изучение белка GAL4 и его взаимодействий с промоторами генов GAL, с аппаратом транскрипции и с белком GAL80.

Для САЕ4-зависимой активации транскрипции

генов GAL необходимы специфические последовательности промоторов GALL, GAL2-, GAL7-, GAL10- и GAL 80-гено в Подобные i/uc-регулятор- ныс элементы обозначают UAS (upstream activating sequences), это общее обозначение, которое используют применительно к таким элементам в генах дрожжей. Они напоминают энхансеры тем. что их функция не зависит от ориентации и относительно мало зависит от расстояния до точки начала транскрипции. Элемент UASCXL был впервые обнаружен в сегменте ДНК между генами GALI и GAL10 по способности обеспечивать 6АЕ4-зависимую активацию транскрипции с промотора GALL Делецион- ный анализ этой области показал, что важными элементами являются многочисленные копии па- линдромной последовательности длиной 17 п. н. (рис. 8.44). В пределах участка длиной 200 400 п. н. перед генами GALI, GAL2, GAL7, GAL10 и GAL80 находятся от одного до четырех таких элементов, хотя для максимальной активации достаточно двух Высокий уровень САЕ4-зависимой экспрессии обеспечивает любая из последовательностей UASc?lf или синтетический олигонуклеотид, содержащий упомянутую выше каноническую последовательность, если они помещены перед различными базальными промоторами дрожжей.

GAL4 кодирует белок мол. массой 100 кДа, который присутствует в очень низких концентрациях

Каноническая последовательность UASGjSL

5'-CGGA^GACAGTC§TCCG-3'

3'-G0Ct£cTGTCAGgAGGC-5'

РИС. 8.44.

Локализация последовательностей UAS (см. текст) в промоторах генов GAL . Показаны ТАТА-бокс, сайты инициации транскрипции (волнистые стрелки) и элементы UAS. Внизу приведена каноническая последовательность для 13 элементов UASCXL. [М. Johnston, Microbiol. Rev. 51 (1987), р. 458.]

как в индуцированных, так и в неиндуцированных клетках. Белок, образующийся в результате экспрессии гена, клонированного в Е. соН или в дрожжевых клетках, специфически связывается с элементом UAS^l и защищает его палиндромную последовательность из 17 п. н. как от действия ДНКазы I, так и от метилирования диметилсульфатом. Учитывая, что последовательность LJASg^l имеет ось симметрии 2-го порядка, можно предположить, что белок GAL4 связывается с ней в форме димера. В результате анализа аминокислотной последовательности GAL4 и его мутантных форм были идентифицированы белковые домены, обусловливающие связывание с UASg^l, активацию транскрипции и взаимодействие с белком GAL80 (рис. 8.45).

За специфическое узнавание элемента UASghl и связывание с ним ответствен участок белковой молекулы между аминокислотными остатками 10 и 51, однако сам по себе этот участок не может активировать транскрипцию. Расположение остатков цистеина и других аминокислот на участке между аминокислотами 10 и 32 такое же, как у цинковых пальцев других ДНК-связывающих белков

(рис. 8.45, Б) (разд. 8.6.а). В данном случае цинковый палец может как стабилизировать комплекс белка и ДНК, так и обеспечивать специфичность связывания ДНК, поскольку способность белка узнавать элемент UASGhl определяется восемнадцатью аминокислотами по соседству с цинковым пальцем. За активацию транскрипции отвечают два участка, один из которых примыкает к домену связывания ДНК, а другой находится в пределах сегмента из 120 аминокислот на С-конце (рис. 8.45, А). Хотя последний участок и необходим для активации транскрипции, речь идет не о какой-то специфической последовательности. Активация транскрипции обусловлена высокой плотностью кислых аминокислотных остатков в этой области, что свойственно также другим белкам-активаторам транскрипции (например, репрессору фага X и активатору транскрипции дрожжей GCN4 [разд. 8.6.6]). Факторы транскрипции с повышенным содержанием кислых аминокислот в упомянутых участках являются наиболее эффективными активаторами. Более того, белки, содержащие САЕ4-участок активации транскрипции, связанный с чужеродными ДНК-связы- вающими доменами, активируют транскрипцию с промоторов, содержащих элементы, которые соответствуют ДНК-связывающему домену.

Каков механизм активации транскрипции с участием связанного белка GAL4- неизвестно. Возможно, на сборку активного комплекса инициации в сайте начала транскрипции влияют кислые домены белка GAL4, расположенные вблизи ТАТА. Такое влияние может быть опосредовано либо самим ТАТА-связывающим белком, либо другими белками комплекса. Об этом свидетельствует тот факт, что GAL4 изменяет полученный с использованием ДНКазы I отпечаток, характерный для сайта начала транскрипции при сборке на нем комплекса транскрипции дрожжей (рис. 8.46). Если UAScat встраивается в регуляторный участок промотора млекопитающих (например, промотора вируса рака молочной железы мышей), то транскрипция с этого промотора активируется в присутствии GAL4 in vivo. Аналогично, включение GAScar недалеко от ТАТА-блока (в пределах 50 п. н.) промотора аденовируса Е4 приводит к тому, что этот промотор становится чувствительным к активации под действием GAL4 in vitro. В обоих случаях активация транскрипции под действием GAL4 синергична с активацией, обусловленной связыванием факторов транскрипции млекопитающих с родственными им сайтами в этих промоторах. Видоизмененные формы белка GAL4, которые могут связываться с UASghl, но неспособны активировать транскрипцию, не стимулируют гетерологичные промоторы. Эти данные говорят о том, что белок GAL4 может взаимодействовать с белками транскрипции млекопитающих.

Связывание ДНК

Активация транскрипции

148 196

766681

856 681

Взаимодействие с GALB0

IIIIIIIIII

О100200300400500600700800900

N-конецАминокислоты GAL4С-коиец

А

рЦистеиновый цинковый палец»|<—Домен,ответственный за специфичность»-|

1020304050

AlitysAipll Су Ar I ulyilyiliulyiCyiSirlyiGlulyiProlyiCv AlilyiCylliulyiAinAinTrpGluCyiArgTyrSirProlysThrlyiArgSirPriliuThrArg

Б

РИС. 8.45.

Функциональные домены белка GAL4. А Домены, ответственные за связывание ДНК, активацию транскрипции и взаимодействие с GAL80 а полипептидной цепи из 881 аминокислоты. Числа по краям прямоугольников-номера аминокислот, начиная с N-конца. Б. Ами- повышая эффективность транскрипции, и еще раз подтверждают универсальность механизмов активации.

Свою регуляторную функцию белок GAL80 выполняет, взаимодействуя с белком GAL4. О наличии такого взаимодействия свидетельствует копреципитация этих белков с антителами к GAL4. Кроме того, хотя сам GAL80 не связывается с последова тельностью UASC4t, он связывается с комплексом GAL4-UASGv4L и изменяет его электрофоретическую подвижность. Для взаимодействия с белком GAL80 нужно всего 25 аминокислот на С-конце молекулы GAL4. В самом деле, синтез пептида, содержащего только эту последовательность, вызывает конститутивную экспрессию генов GAL в клетках дрожжей, очевидно, благодаря тому что этот пептид связывает белок GAL80 и высвобождает транскрипцион- но активный GAL4. С другой стороны, если даже белок GAL4, лишенный С-концевой последовательности, образуется в избытке, для синтеза белков GAL все равно необходим индуктор избыток дефектного белка неспособен вызвать диссоциацию комплекса GAL80 с интактным белком GAL4.

Вероятно, белок GAL80 блокирует активацию

нокислотные последовательности домена, связывающегося с ДНК (один из цинковых пальцев, обогащенный остатками цистеина; разд. 8.6.в), и домена, ответственного за специфическое связывание с иА8ал|-. [М. Johnston, Microbiol. Rev. 61 (1887), р. 458.]

транскрипции, опосредованную GAL4, препятствуя необходимому взаимодействию между GAL4 и комплексом транскрипции, а не связыванию GAL4 с UASg,|L. Тот факт, что GAL4 связывается с последовательностью иА8СЛ1 в отсутствие индуктора, объясняет, почему in vivo «отпечаток» этой последовательности одинаков и в присутствии, и в отсутствие индуктора. Предполагают, что неиденти- фицировенный пока индуктор, образующийся из галактозы, связывается с белком GAL80 и вызывает диссоциацию его комплекса с GAL4. Распад комплекса GAL4-GJL80 приводит к обнажению домена активации GAL4, стимулируя таким образом транс крипцию. Этот механизм индукции отличается от механизма, используемого для регуляции оперонов lac и gal Е. coll, когда связывание индуктора предотвращает связывание репрессора с его оператором в ДНК (разд. 3.11.в и г).

Экспрессия генов GAL регулируется также с помощью других используемых клеткой сахаров. Так, дрожжи S. cerevisiae, растущие на глюкозе, в присутствии галактозы не синтезируют белки GAL. Более того, добавление глюкозы к клеткам, растущим на галактозе, вызывает быстрое подавле

GAL80

GAL 4

Катаболитная;(((О

репрессия (f1Q

UAS6ALТАТА

белок катаболитной репрессии

РИС. 8.46.

Модель регуляции транскрипции геное GAL при участии GAL4-GAL80. Когда GAL4 связан с GAL80, он не стимулирует сборку (или функционирование) комплекса транскрипции на ТАТА. В присутствии индуктора GAL80 отделяется от GAL4, и последний получает возможность взаимодействовать с комплексом транскрипции (или активировать его). В присутствии глюкозы белок катаболитной репрессии (CRP) связывается с GAL4, и его соединение с UAS,M, становится невозможным.

[М. Johnston, Microbiol. Rev. 61 (1987), р. 458.]

ние экспрессии генов GAL. Природа репрессора генов GAL, образующегося из глюкозы, неизвестна, идентифицированы лишь некоторые сайты, на которые он действует. Один из них содержит t/нс-элемен- ты, находящиеся между UASGXt и ТАТА-элементом правда, неясно, каким образом этот участок проявляет свою ингибирующую активность. Поскольку ДНКазный «отпечаток», характерный для элемента UASGXI., исчезает при выращивании клеток на глюкозе, вполне возможно, что катаболитная репрессия опосредуется белком (CRP), который препятствует связыванию GAL4 с UASG/U.

Транскрипция, регулируемая стероидными гормонами. Многие особенности развития и физиологии позвоночных зависят от разнообразных стероидных и сходных с ними по своему действию гормонов.

Минерало- и глюкокортикоиды надпочечников участвуют в регуляции метаболизма гликогена и солевого обмена, опосредуют реакции на стресс, регулируют рост и дифференцировку многих клеток и тканей. Регуляция половой дифференцировки эмбриона, развития вторичных половых признаков и полового поведения осуществляется с помощью половых стероидов: эстрогенов, прогестерона и тестостерона. Для нормального развития костей необходим стероидоподобный витамин D. Ретиноевая кислота, которая по своему строению напоминает стероиды, является ключевым морфогеном и регулятором дифференцировки в процессе эмбриогенеза. Гормон щитовидной железы трииодтиронин, имеющий совершенно иное строение, чем стероиды, осуществляет свою регуляторную функцию, связываясь с рецептором, сходным с рецепторами для стероидов.

Все эти гормоны оказывают свое физиологическое действие, проникая в клетки и связываясь с соответствующими внутриклеточными рецепторами. Свободные рецепторы локализованы в различных клеточных структурах. Так, рецептор глюкокортикоидного гормона находится главным образом в цитоплазме, а после связывания лиганда перемещается к ядру. Рецепторы эстрогенов и прогестерона локализованы преимущественно в ядре, а рецептор гормона щитовидной железы - исключительно в ядре. Несмотря на разную локализацию, все рецепторы при связывании лигандов претерпевают структурные изменения, способствующие присоединению лиганд-рецепторного комплекса к специфическим участкам ДНК, называемым гормон- акцепторными элементами (hormone response elements, HRE). HRE обладают свойствами энхансеров, поскольку могут влиять на активность промоторов. с которыми они ассоциированы, независимо от местоположения и ориентации. Следовательно, HRE- это индуцибельные энхансеры, поскольку они регулируют транскрипцию, только будучи связанными с функциональным гормон-рецепторным комплексом.

Каковы структурные особенности рецепторов и их модифицированных, связанных с лигандами форм и каким образом рецепторы узнают соответствующие HRE? Другой важнейший вопрос-как связывание лиганд-рецепторного комплекса с HRE влияет на транскрипцию? Современные, хотя и неполные, представления об этом базируются на нескольких экспериментальных подходах, которые сформировались благодаря возможности получать клонированные и секвенированные кДНК, кодирующие рецепторы. Исходя из нуклеотидных последовательностей соответствующих секвенированных кДНК была определена аминокислотная последовательность рецепторов. Их сравнение выявило оди-

наковые и различающиеся области, что в свою очередь помогло идентифицировать функционально важные части рецептора. И все же наиболее значимым и продуктивным подходом к изучению взаимосвязи структуры и функции рецепторов оказался анализ влияния мутационных изменений к ДНК рецепторов на рецепторные свойства последних. Аналогичные подходы применялись при исследовании гормон-акцепорных промоторов, что помогло определить и полностью охарактеризовать HRE. Были созданы химерные гены, кодирующие гибридные рецепторы, и это еще раз убедительно показало, что рецепторные функции выполняют специфические участки белковых молекул и даже определенные аминокислоты.

Как сравнение аминокислотных последовательностей, так и мутационный анализ гормон-акцеп- торных промоторов выявили необходимые для гормональной регуляции короткие палиндромные последовательности, находящиеся на разном расстоянии перед сайтом начала транскрипции. Гены, транскрипция которых регулируется одними и теми

GRE

MMTV - 134 TGGTTTGGTATCAAATGTТCTGATCTG hGH + 87 CCTTTGGGCACAATGTGTCCTGAGGGG hMIIIA - 268 GCACCCGGTACACTGTGTCCTCCCGCT

TO - 439 ctcatatgcacagcgagttctagtgag

TAT -2420 TACGCAGGACTTGTTTGTTCTAGTCTT

Каноническая GGTACANNNTGTTCT последовательность

ERE

X.vit - 338 AAAGTCAGGTCACAGTGACCTGATCA

Овальбумин - 173 T TATTCAGGTAACAATGTGT T T T CTG

Каноническая GGTCANNNTG*CC последовательностьт

TRETRErGH - 185 GTAAGATCAGGGACGTGACCGCAGG

TRE

TRE

- 108 ♦ 113 - 242 - 413 -2446- 108 ♦ 113 - 242 - 413 -2446- 315- 199- 315- 199- 161- 161Каноническая последовательность

- 108 ♦ 113 - 242 - 413 -2446

- 108 ♦ 113 - 242 - 413 -2446

- 315

- 199

- 315

- 199

- 161

- 161

GATCANNNNNNTGACCGATCANNNNNNTGACCРИС. 8.47.

GATCANNNNNNTGACC

GATCANNNNNNTGACC

Нуклеотидные последовательности некоторых гормон- акцепторных элементов (HRE). Числа у начала и конца каждой из последовательностей-это номера нуклеотидов относительно сайта инициации транскрипции. N-любой из четырех нуклеотидов; противоположно направленные стрелки над каноническими последовательностями указывают, что последние имеют ось симметрии 2-го порядка (черные кружки). Представлены глюкокортикоид-акцепторные элементы (GRE) вируса рака молочной железы мышей (MMTV), генов гормона роста (hGH) и металлотионеина (ЬМТПА) челоеека, генов тирозиноксидазы (ТО) и тироэинаминотрансфе- раэы (ТАТ), а также эстроген-акцепторные элементы (ERE) генов вителлогенина Xenopus (X. vit.) и овальбумина курицы (овальбумин). Тиреоид-акцепторный элемент (ТНЕ)-это энхансер гена гормона роста крыс (rGH).

же гормонами, имеют либо сходные, либо одинаковые HRE. Связывание рецепторов с генетически идентифицированными HRE было продемонстрировано также с помощью метода отпечатков в опытах с очищенными рецепторами глюкокортикоидов, эстрогенов, прогестерона и гормона щитовидной железы. Несмотря на разную локализацию в промоторе, все HRE имеют сходные последовательности: они состоят из различного числа неспецифических пар оснований, фланкированных пятью парами специфических оснований палиндрома, и содержат от 12 до 16 п. н. (рис. 8.47). Именно благодаря сходству последовательностей HRE эстроген-акцептор- ный элемент можно превратить в глюкокортикоид- акцепторный, заменив всего две пары оснований в палиндроме. Наличие у HRE оси симметрии 2-го порядка предполагает, что они связываются с рецепторами, находящимися в форме димеров.

Анализ аминокислотных последовательностей рецепторов эстрогенов и глюкокортикоидов, установленных по данным о нуклеотидных последовательностях соответствующих к ДНК, показал, что вблизи центра каждого рецептора находится высококонсервативный короткий участок (область С на рис. 8.48). По данным скрининга продуктов расщепления геномной ДНК при помощи олигонуклео- тидных зондов, синтезированных на основе этой консервативной последовательности, подобная область характерна для большого семейства генов, очевидно кодирующих другие рецепторы. Неудивительно, что с помощью тех же самых зондов были выделены к ДНК еще некоторых рецепторов; это указывает на важность данного домена для функционирования рецепторов. Белки, кодируемые некоторыми из этих кДНК, только предположительно можно отнести к рецепторам, поскольку их лиганды или HRE неизвестны. Отдельные гены рецепторов стероидов клонированы, частично секвенированы и отнесены к соответствующим хромосомам (рис. 8.48).

Сравнение аминокислотных последовательностей разных рецепторов выявило несколько участков с той или иной степенью взаимной гомологии. На рис. 8.48 они обозначены A/В, С, D, Е и F. Участок A/В имеет самую низкую степень гомологии у разных рецепторов и даже у одинаковых рецепторов из разных видов. Последовательности участка С, напротив, во всех рецепторах высококонсервативны и, как показал дальнейший анализ, представляют собой сайты связывания ДНК, т. е. выполняют функцию, присущую всем рецепторам. Участки D и F различаются как по длине, так и по аминокислотной последовательности в разных рецепторах и даже в одинаковых рецепторах неродственных видов. Делеционный анализ этих участков показал, что они несущественны для функциониро-

РИС. 8.48.Функциональные домены рецепторов стероидных и тиреоидных гормонов. На верхней диаграмме показаны белковые домены типичного рецептора. Обозначения: hER- рецептор эстрогена человека; МОЯ - рецептор глюкокортикоидного гормона человека; hMR-рецептор минералокортикоидного гормона человека; МАЯ-рецептор андрогена человека; hVitD3 рецептор витамина D3 человека; hRARa-рецептор a-ретиноевой кислоты человека; hTRa- рецептор a-тиреоидного гормона. Различные домены обозначены буквами A/В, С, D, Е и F, начиная с N-конца белковой молекулы. Домен С любого рецептора содержит 66 или 68 аминокислот; размеры других доменов неодинаковы и могут быть определены из цифр, приведенных на рисунке.РИС. 8.48.Функциональные домены рецепторов стероидных и тиреоидных гормонов. На верхней диаграмме показаны белковые домены типичного рецептора. Обозначения: hER- рецептор эстрогена человека; МОЯ - рецептор глюкокортикоидного гормона человека; hMR-рецептор минералокортикоидного гормона человека; МАЯ-рецептор андрогена человека; hVitD3 рецептор витамина D3 человека; hRARa-рецептор a-ретиноевой кислоты человека; hTRa- рецептор a-тиреоидного гормона. Различные домены обозначены буквами A/В, С, D, Е и F, начиная с N-конца белковой молекулы. Домен С любого рецептора содержит 66 или 68 аминокислот; размеры других доменов неодинаковы и могут быть определены из цифр, приведенных на рисунке.вания рецептора. Несмотря на то что участки Е у разных рецепторов отличаются друг от друга, их последовательности в рецепторах эстрогенов человека и курицы на удивление сходны. Это позволяет предположить, что Е относится к доменам связывания лиганда. Гипотезы относительно роли участков Е и С вначале основывались только на результатах сравнения аминокислотных последовательностей, но более детальный анализ подтвердил их правильность

РИС. 8.48.

Функциональные домены рецепторов стероидных и тиреоидных гормонов. На верхней диаграмме показаны белковые домены типичного рецептора. Обозначения: hER- рецептор эстрогена человека; МОЯ - рецептор глюкокортикоидного гормона человека; hMR-рецептор минералокортикоидного гормона человека; МАЯ-рецептор андрогена человека; hVitD3 рецептор витамина D3 человека; hRARa-рецептор a-ретиноевой кислоты человека; hTRa- рецептор a-тиреоидного гормона. Различные домены обозначены буквами A/В, С, D, Е и F, начиная с N-конца белковой молекулы. Домен С любого рецептора содержит 66 или 68 аминокислот; размеры других доменов неодинаковы и могут быть определены из цифр, приведенных на рисунке.

РИС. 8.48.

Функциональные домены рецепторов стероидных и тиреоидных гормонов. На верхней диаграмме показаны белковые домены типичного рецептора. Обозначения: hER- рецептор эстрогена человека; МОЯ - рецептор глюкокортикоидного гормона человека; hMR-рецептор минералокортикоидного гормона человека; МАЯ-рецептор андрогена человека; hVitD3 рецептор витамина D3 человека; hRARa-рецептор a-ретиноевой кислоты человека; hTRa- рецептор a-тиреоидного гормона. Различные домены обозначены буквами A/В, С, D, Е и F, начиная с N-конца белковой молекулы. Домен С любого рецептора содержит 66 или 68 аминокислот; размеры других доменов неодинаковы и могут быть определены из цифр, приведенных на рисунке.

Участок из 66- 68 аминокислот, присутствующий во всех рецепторах (область С), отвечает за связывание родственных HRE. Мутации, затрагивающие

эту область, не мешают связыванию с гормоном, но препятствуют связыванию с HRE. Более того, укороченные рецепторы, лишенные областей A/В, D, Е и F, все еще связываются с родственными HRE, хотя и неспособны регулировать транскрипцию. Наиболее убедительно автономность действия участка С при связывании ДНК была продемонстрирована в опытах, где область С из глюкокортикоидного рецептора заменяла соответствующую область в другом рецепторе (например, рецепторе эстрогена). Химерный рецептор активировал гены, чувствительные к глюкокортикоидам, в присутствии эстрогенов (рис. 8.49). Интересно, что интактные рецепторы не присоединяются к своим HRE в отсутствие соответствующих лигандов, но могут присоединяться к ним, если удалить домен связывания лиганда. Отсюда следует, что домен связывания ДНК у рецептора неспособен к взаимодействию с HRE, если молекула содержит незанятый домен связывания лиганда; но присоединение лиганда или удаление его связывающего домена каким-то образом обеспечивает взаимодействие области связывания с HRE.

C6R Ы egr

ER Q /В || D |[ F |

I обмен

1 С-доменамн

GR(ER)

Активирует эстроген

чувствительные промо

торы в присутствии глюкокортикоидных гормонов

ER (GR) | A/В

Активирует глюкокор тикоидчувствительные промоторы вприсутствнм эстрогена

E«RE«R=gr=grРИС. 8.49.

E«R

E«R

=gr

=gr

Образование химерных рецепторов стероидных гормонов. Обмен сегментами, кодирующими С-домены, между кДНК рецептора глюкокортикоидного гормона (GR) и кДНК рецептора эстрогена (ER) приводит к образованию двух химерных рецепторов: GR (ER)-рецептора глюкокортикоидного гормона с ДНК-связывающим доменом рецептора эстрогена и ER (GR)-рецептора эстрогена с ДНК-связывающим доменом рецептора глюкокортикоидного гормона. Трансфекция данных кДНК в соответствующие клетки приводила к результатам, описанным на рисунке.

Исследование областей С многих рецепторов выявило характерное расположение остатков цистеина, гидрофобных и основных аминокислот, при котором они образуют два цинковых пальца (рис. 8.50). В очищенном глюкокортикоидном рецепторе с этой областью связаны два иона цинка. Для связывания с ДНК важны все четыре остатка цистеина, участвующих в образовании цинкового пальца, следовательно, каждый ион цинка координационно связан с четырьмя остатками цистеина, а не с остатками цистеина и гистидина, как в некоторых других факторах транскрипции (разд. 8.6.а). Об автономном характере участка С свидетельствует и то, что кодирующая его последовательность отделена от последовательностей, кодирующих области A/В и D, интронами; интересно, что цинковые пальцы кодируются разными экзонами.

Для специфичного связывания с HRE необходимы оба цинковых пальца. Однако если у разных рецепторов произвести взаимную замену любых цинковых пальцев, то химерные рецепторы будут иметь специфичность по отношению к гену-мишени, присущую цинковому пальцу I рецептора. Мутации, затрагивающие последовательность, которая находится перед цинковым пальцем I, или сам этот палец не влияют на специфичность связывания ДНК рецептором. Однако некоторые изменения последовательности, примыкающей к последнему цистеиновому остатку цинкового пальца 1 рецептора эстрогенов, нарушают связывание этого рецептора с эстроген-акцепторным элементом, и он приобретает способность связываться с глюкокортикоид-

©Y ®

S®

®G

У Щ V®W

NS

РА YFI147РА YFI147|Специфическое связывание ДНК1 [■|Специфическое связывание ДНК1 [■Неспецифическое связывание ДНК 1Неспецифическое связывание ДНК 1| Кор

РА YF

I

147

РА YF

I

147

|Специфическое связывание ДНК1 [■

|Специфическое связывание ДНК1 [■

Неспецифическое связывание ДНК 1

Неспецифическое связывание ДНК 1

РИС. 8.50.

Цинковые пальцы ДНК-связывающего домена рецептора эстрогена человека. Аминокислотные последовательности ДНК-связывающего домена (кора) и прилегающих участков представлены с использованием однобуквенных обозначений аминокислот (рис. 1.24).

акцепторным элементом. Таким образом, дифференциальное узнавание рецептором эстрогена эстро- ген-акцепторного, но не глюкокортикоид-акцептор- ного элемента, палиндромные последовательности которых различаются только двумя парами оснований, в значительной мере определяется тремя аминокислотами цинкового пальца I рецептора эстрогена. Следовательно, специфические взаимодействия между рецептором и соответствующим HRE, по-видимому, зависят от порядка расположения остатков гидрофобных аминокислот в цинковом пальце I. Кроме того, в стабилизацию комплекса вносит вклад взаимодействие между скелетом молекулы ДНК и цинковым пальцем II, а также основными аминокислотами.

Палиндромный характер HRE предполагает, что рецепторы связываются с этим элементом в димерной форме. Димеризация рецепторов происходит при участии двух рецепторных доменов. Более сильное взаимодействие, возникающее после присоединения лиганда, осуществляется при участии последовательностей из области Е. В более слабых взаимодействиях участвуют последовательности цинкового пальца II. Очевидно, прочность и специфичность связывания рецептора в форме димера выше, чем в форме мономера. Механизм индуцированной гормоном димеризации неизвестен, но не исключено, что он является частью того же самого процесса, который позволяет рецептору, уже связанному с гормоном, присоединяться к своему HRE. И димеризация, и связывание HRE, вероятно, происходят после конформационного изменения рецептора, ин-

,, Участок,ответственный,

II— за ядерную —I

локализацию

Основные аминокислоты выделены цветом, а наиболее высококонсервативные аминокислоты всех рецепторов заключены в кружки. Предполагают, что область между остатками аминокислот 252 и 262 детерминирует локализацию рецептора в ядре.

дуцированного присоединением гормона. Имеются также указания на то, что в некоторых случаях связывание гормона вызывает диссоциацию ингибитора, который предотвращает спонтанную димеризацию рецептора.

Связывание гормона нужно как для специфического и эффективного присоединения рецепторов к соответствующим HRE, так и для регуляции транскрипции генов. Необходимым условием связывания гормона с рецептором является целостность области Е, поскольку делеции, вставки или замены оснований в гене белка Е предотвращают связывание. Интересно, что способность рецептора связывать лиганд сохраняется и в отсутствие областей A/В, С и D, вероятно, потому, что Е может связывать лиганд независимо от остальной части молекулы белка. Об этой независимости области Е свидетельствуют также результаты опытов по ее замене у разных рецепторов, аналогичных опытам по замене доменов связывания ДНК (рис. 8.49). Так, если область Е рецептора эстрогенов заменить на область Е рецептора глюкокортикоидов, то химер- | ный рецептор будет активировать транскрипцию I экстроген-акцепторных генов в ответ на действие глюкокортикоидов, а не эстрогенов.

Интактные рецепторы, не связанные с гормоном, не присоединяются к соответствующим HRE, однако рецепторы, у которых область Е делегирована, легко присоединяются к своим HRE в отсутствие гормона. Отсюда следует, что структурные изменения, сопровождающие связывание гормона, либо демаскируют, либо активируют ДНК-связывающий домен рецептора, возможно, стимулируя димеризацию последнего. Структурные изменения, индуцированные в глюкокортикоидных рецепторах при связывании гормона, служат также сигналом к переносу комплекса лиганд-рецептор из цитоплазмы в ядро. Кроме того, доменсвязывающий лиганд участвует в активации транскрипции под действием рецепторов после присоединения к соответствующим HRE. Так, у дрожжей, синтезирующих химерный белок, который состоит из домена связывания гормона глюкокортикоидного рецептора и домена связывания UASg^l белка GAL4 дрожжей, экспрессия генов GAL индуцируется при добавлении глюкокортикоидов. Поскольку связывание только одного указанного домена белка GAL4 с UASg^l не активирует транскрипцию, полученный результат означает, что область Е. связанная с гормоном, может активировать транскрипцию в дрожжах.

Действие антигормонов - соединений, которые нарушают физиологический ответ на действие гормонов,- вероятно, связано с тем что они соединяются с рецептором, не вызывая при этом структурных изменений, необходимых для димеризации, для взаимодействия с HRE или для влияния на транс

крипцию гормон-акцепторных генов.

В результате связывания активированных гор- мон-рецепторных комплексов с соответствующими HRE осуществляется регуляция транскрипции, которая в зависимости от промотора, вероятно, состоит в активации или ингибировании инициации этого процесса. Один из подходов к изучению механизма активации или подавления транскрипции при связывании рецептора заключается в идентификации областей рецептора, ответственных за влияние на транскрипцию. В этом случае тоже применяли подход, основанный на внесении мутаций в кДНК, кодирующие рецепторы стероидов, гормонов щитовидной железы, витамина D3 и ретиноида, и на сопоставлении их с изменениями в регуляции транскрипции с участием соответствующих HRE. Предпосылкой регуляции транскрипции является связывание с ДНК комплекса рецептор-гормон, поэтому возникает вопрос: какие именно структуры рецептора опосредуют регуляторный эффект? Результаты исследований в целом свидетельствуют о том, что в регуляции участвуют многие области рецептора, причем наиболее важны области A/В и Е. Однако относительная значимость этих двух областей варьирует у разных рецепторов и среди разных промоторов, содержащих одинаковые HRE. Например. если область Е рецептора эстрогена удалена, то рецептор сохраняет способность связываться с ДНК, но не может нормально активировать транскрипцию с некоторых промоторов, чувствительных к эстрогенам. В то же время, несмотря на то, что делеции в областях Е некоторых рецепторов препятствуют связыванию с гормоном, не мешая при этом связыванию с ДНК, их влияние на активацию транскрипции носит разный характер в зависимости от промотора, а в ряде случаев и от клеток, в которых исследуется действие рецептора. Мутации в области A/В уменьшают эффективность активации транскрипции с участием связанного рецептора, но степень этого уменьшения зависит от рецептора и гена- мишени. Так. рецептор эстрогенов, целиком утративший область A/В, все еще связывается с эстро- ген-акцепторным элементом двух исследованных промоторов, но в одном случае эффективность активации транскрипции почти нормальная, а в другом активации вообще не происходит.

Влияние областей A/В и Е на активацию транскрипции четко продемонстрировано в опытах с использованием химерных рецепторов, содержащих только домены связывания регуляторного белка GAL4, сшитые либо с доменом A/В, либо с доменом Е некоторых стероидных рецепторов. Когда химерные гены, кодирующие такие белки и содержащие области либо А/В-СЛЕ4, либо Е-6ЛЕ4, переносятся в клетки млекопитающих вместе с геном-маркером (с геном Р-галактозидазы), промотор которого со-

UASqal GALIUASqal GALIр-Галактозидазар-ГалактозидазаГен р-галактозидазы экспрессируется только в присутствии галактозыГен р-галактозидазы экспрессируется только в присутствии галактозыББERE GAL1ERE GAL1р-Галактозидазар-ГалактозидазаГен fl-галактозидазы не экспрессируется в присутствии галактозы или эстрогенаГен fl-галактозидазы не экспрессируется в присутствии галактозы или эстрогенаPGK Рецептор эстрогенаPGK Рецептор эстрогенар-Галактозидазар-ГалактозидазаГен р-галактозидазы экспрессируется в присутствии эстрогена, но не в его отсутствиеГен р-галактозидазы экспрессируется в присутствии эстрогена, но не в его отсутствиеРИС. 8.51.Рецептор человека может активировать транскрипцию генов у S. cerevisiae. А. Ген Р-галактозидазы, находящийся под контролем промотора GAL 1. Трансфекция этого гена в дрожжевые клетки приводит к тому, что последние приобретают способность к индуцибельной экспрессии Р-галактозидазного гена. Б. Элемент UASCj1l GAL 1 -промотора заменен эстро- ген-акцепторным элементом (ERE). Трансфекция этого гена в дрожжевые клетки не приводит к экспрессии р-галактозидазного гена ни при добавлении эстрогена, ни при добавлении галактозы. В. Одновременная трансфекция гена, изображенного на рисунке 8.51, Б, и гена, кодирующего рецептор эстрогена человека, транскрипция которого находится под контролем промотора гена глицерофосфаткиназы дрожжей (GPK), приводит к зстрогензависи- мой экспрессии гена Р-галактозидазы.РИС. 8.51.Рецептор человека может активировать транскрипцию генов у S. cerevisiae. А. Ген Р-галактозидазы, находящийся под контролем промотора GAL 1. Трансфекция этого гена в дрожжевые клетки приводит к тому, что последние приобретают способность к индуцибельной экспрессии Р-галактозидазного гена. Б. Элемент UASCj1l GAL 1 -промотора заменен эстро- ген-акцепторным элементом (ERE). Трансфекция этого гена в дрожжевые клетки не приводит к экспрессии р-галактозидазного гена ни при добавлении эстрогена, ни при добавлении галактозы. В. Одновременная трансфекция гена, изображенного на рисунке 8.51, Б, и гена, кодирующего рецептор эстрогена человека, транскрипция которого находится под контролем промотора гена глицерофосфаткиназы дрожжей (GPK), приводит к зстрогензависи- мой экспрессии гена Р-галактозидазы.держит UASgxl вблизи ТАТА-блока, транскрипция гена Р-галактозидазы активируется. Мутации в областях A/В или Е, подавляющие транскрипционную активность рецептора, предотвращают и активацию под действием химерных белков. Следовательно, вполне вероятно, что если область A/В или Е связывается вблизи промотора млекопитающих, то она активирует транскрипцию.

UASqal GALI

UASqal GALI

р-Галактозидаза

р-Галактозидаза

Ген р-галактозидазы экспрессируется только в присутствии галактозы

Ген р-галактозидазы экспрессируется только в присутствии галактозы

Б

Б

ERE GAL1

ERE GAL1

р-Галактозидаза

р-Галактозидаза

Ген fl-галактозидазы не экспрессируется в присутствии галактозы или эстрогена

Ген fl-галактозидазы не экспрессируется в присутствии галактозы или эстрогена

PGK Рецептор эстрогена

PGK Рецептор эстрогена

р-Галактозидаза

р-Галактозидаза

Ген р-галактозидазы экспрессируется в присутствии эстрогена, но не в его отсутствие

Ген р-галактозидазы экспрессируется в присутствии эстрогена, но не в его отсутствие

РИС. 8.51.

Рецептор человека может активировать транскрипцию генов у S. cerevisiae. А. Ген Р-галактозидазы, находящийся под контролем промотора GAL 1. Трансфекция этого гена в дрожжевые клетки приводит к тому, что последние приобретают способность к индуцибельной экспрессии Р-галактозидазного гена. Б. Элемент UASCj1l GAL 1 -промотора заменен эстро- ген-акцепторным элементом (ERE). Трансфекция этого гена в дрожжевые клетки не приводит к экспрессии р-галактозидазного гена ни при добавлении эстрогена, ни при добавлении галактозы. В. Одновременная трансфекция гена, изображенного на рисунке 8.51, Б, и гена, кодирующего рецептор эстрогена человека, транскрипция которого находится под контролем промотора гена глицерофосфаткиназы дрожжей (GPK), приводит к зстрогензависи- мой экспрессии гена Р-галактозидазы.

РИС. 8.51.

Рецептор человека может активировать транскрипцию генов у S. cerevisiae. А. Ген Р-галактозидазы, находящийся под контролем промотора GAL 1. Трансфекция этого гена в дрожжевые клетки приводит к тому, что последние приобретают способность к индуцибельной экспрессии Р-галактозидазного гена. Б. Элемент UASCj1l GAL 1 -промотора заменен эстро- ген-акцепторным элементом (ERE). Трансфекция этого гена в дрожжевые клетки не приводит к экспрессии р-галактозидазного гена ни при добавлении эстрогена, ни при добавлении галактозы. В. Одновременная трансфекция гена, изображенного на рисунке 8.51, Б, и гена, кодирующего рецептор эстрогена человека, транскрипция которого находится под контролем промотора гена глицерофосфаткиназы дрожжей (GPK), приводит к зстрогензависи- мой экспрессии гена Р-галактозидазы.

Домены стероидных рецепторов, участвующие в активации транскрипции, могут трансактивиро- вать также промоторы дрожжей. Если промотор GAL1, включающий UASGXL, сшить с последовательностью, кодирующей Р-галактозидазу, то при добавлении галактозы в дрожжевых клетках индуцируется синтез Р-галактозидазы (рис. 8.51, Л). Заменив UASG^L на эстроген-акцепторный элемент, можно проверить, способен ли рецептор эстрогенов активировать комплекс транскрипции дрожжей и является ли такая активация эстрогензависи- мой. Оказалось, что Р-галактозидаза в этом случае не синтезируется даже в присутствии эстрогенов, поскольку отсутствует рецептор последних (рис. 8.51,5). Однако, когда в результате экспрессии соответствующей кДНК в клетках, у которых между промотором GAL1 и геном Р-галактозидазы находится эстроген-акцепторный элемент, синтезируется функциональный рецептор эстрогенов, транскрипция целиком зависит от наличия эстрогенов и не зависит от добавления галактозы (рис. 8.51, By Таким образом, совершенно очевидно, что рецептор эстрогенов может взаимодействовать

с комплексом транскрипции дрожжей и влиять на него.

На рис. 8.52 представлена модель, иллюстрирующая различные структурные особенности рецепторов гормонов и предположительный механизм их участия в активации транскрипции. Согласно этой модели, свободный рецептор может находиться в двух формах. В одной из них (I) домен Е свободен и не участвует ни в каких взаимодействиях. Вторая форма (И) представляет собой комплекс, состоящий из рецептора и ингибитора. Предполагается, что формы I и II не могут связываться с HRE. Присоединение гормона к рецептору, находящемуся в форме I, приводит к изменению конформации домена Е, димеризации рецептора (форма III) и его кооперативному связыванию с HRE (форма IV). Если же гормон соединяется с рецептором, находящимся в форме II, то белок-ингибитор отделяется от рецептора, последний димеризуется (форма III) и связывается с HRE. Данная модель предполагает, что димер образуется в результате взаимодействий между двумя связанными с лигандами доменами Е и двумя ДНК-связывающими доменами С.

Обсуждая вопрос о том, как именно гормоны влияют на транскрипцию с участием гормончувствительных промоторов, необходимо помнить, что HRE-это не единственный регуляторный элемент в данных промоторах. Большая часть таких промоторов содержит много разных регуляторных последовательностей, которые связывают разные факторы транскрипции. Так, если глюкокортикоид- или

РИС. 8.52.Модель индуцируемой гормонами димеризации стероидных рецепторов и их связывания со стероид-ак- цепторными элементами. I-мономерная форма рецептора стероидных гормонов с доменами активации транскрипции (A/В), связывания ДНК (С) и связывания стероидных гормонов (Е). Неактивный цитоплазматический комплекс, форма II, предположительно образуется при связывании рецептора стероидных гормонов с ингибитором; природа этого связывания неизвестна. Связывание гормона (Н) с доменом Е индуцирует димеризацию рецептора, происходящую при участииРИС. 8.52.Модель индуцируемой гормонами димеризации стероидных рецепторов и их связывания со стероид-ак- цепторными элементами. I-мономерная форма рецептора стероидных гормонов с доменами активации транскрипции (A/В), связывания ДНК (С) и связывания стероидных гормонов (Е). Неактивный цитоплазматический комплекс, форма II, предположительно образуется при связывании рецептора стероидных гормонов с ингибитором; природа этого связывания неизвестна. Связывание гормона (Н) с доменом Е индуцирует димеризацию рецептора, происходящую при участиисильных взаимодействий между доменами связывания гормона и более слабых взаимодействий между ДНК- связывающими доменами. Связывание же гормона с неактивной формой II приводит к отделению ингибитора и последующей димеризации. Форма III может проникать в ядро и связываться с родственным гор- мон-акцепторным элементом. Разнонаправленные стрелки на ДНК указывают, что сайт связывания имеет ось симметрии 2-го порядка. [S. Green, Р. Chambon, Trends Genet. 4 (1988), р. 309.]сильных взаимодействий между доменами связывания гормона и более слабых взаимодействий между ДНК- связывающими доменами. Связывание же гормона с неактивной формой II приводит к отделению ингибитора и последующей димеризации. Форма III может проникать в ядро и связываться с родственным гор- мон-акцепторным элементом. Разнонаправленные стрелки на ДНК указывают, что сайт связывания имеет ось симметрии 2-го порядка. [S. Green, Р. Chambon, Trends Genet. 4 (1988), р. 309.]эстроген-акцепторный элемент включить в промотор, в норме не активируемый ни одним из этих гормонов, то промотор приобретает чувствительность к стероиду в присутствии соответствующего рецептора. Вообще говоря, активация транскрипции синергична, и эффективность транскрипции зависит от характера соседних элементов и их положения относительно HRE.

РИС. 8.52.

Модель индуцируемой гормонами димеризации стероидных рецепторов и их связывания со стероид-ак- цепторными элементами. I-мономерная форма рецептора стероидных гормонов с доменами активации транскрипции (A/В), связывания ДНК (С) и связывания стероидных гормонов (Е). Неактивный цитоплазматический комплекс, форма II, предположительно образуется при связывании рецептора стероидных гормонов с ингибитором; природа этого связывания неизвестна. Связывание гормона (Н) с доменом Е индуцирует димеризацию рецептора, происходящую при участии

РИС. 8.52.

Модель индуцируемой гормонами димеризации стероидных рецепторов и их связывания со стероид-ак- цепторными элементами. I-мономерная форма рецептора стероидных гормонов с доменами активации транскрипции (A/В), связывания ДНК (С) и связывания стероидных гормонов (Е). Неактивный цитоплазматический комплекс, форма II, предположительно образуется при связывании рецептора стероидных гормонов с ингибитором; природа этого связывания неизвестна. Связывание гормона (Н) с доменом Е индуцирует димеризацию рецептора, происходящую при участии

сильных взаимодействий между доменами связывания гормона и более слабых взаимодействий между ДНК- связывающими доменами. Связывание же гормона с неактивной формой II приводит к отделению ингибитора и последующей димеризации. Форма III может проникать в ядро и связываться с родственным гор- мон-акцепторным элементом. Разнонаправленные стрелки на ДНК указывают, что сайт связывания имеет ось симметрии 2-го порядка. [S. Green, Р. Chambon, Trends Genet. 4 (1988), р. 309.]

сильных взаимодействий между доменами связывания гормона и более слабых взаимодействий между ДНК- связывающими доменами. Связывание же гормона с неактивной формой II приводит к отделению ингибитора и последующей димеризации. Форма III может проникать в ядро и связываться с родственным гор- мон-акцепторным элементом. Разнонаправленные стрелки на ДНК указывают, что сайт связывания имеет ось симметрии 2-го порядка. [S. Green, Р. Chambon, Trends Genet. 4 (1988), р. 309.]

До сих пор мы говорили в основном о таких случах, когда связывание рецепторов с соответствующими HRE активирует транскрипцию, однако в некоторых ситуациях при таком связывании транскрипция, напротив, подавляется. Например,

промотор гена пролактина содержит многочисленные сайты связывания гормон-рецепторных комплексов, но присоединение таких комплексов не стабилизирует, а подавляет транскрипцию. Последовательности элементов, опосредующих ингибирующее действие глюкокортикоидов, отличаются от последовательностей элементов, активирующих транскрипцию. Следовательно, ДНК-связывающий домен глюкокортикоидного рецептора может соединяться с глюкокортикоид-акцепторными элементами, опосредующими как ингибирующий, так и активирующий эффекты. Анализ имеющихся данных показывает, что связывание гормон-рецепторного

комплекса с элементом, отвечающим за негативную регуляцию, мешает связыванию других активирующих факторов транскрипции.

Регуляция генов GAL дрожжей и генов млекопитающих, транскрипция которых регулируется стероидами, во многом сходна. Гены GAL не транскрибируются до тех пор, пока к элементам UASGXL не присоединится белок GAL4. Аналогично, для транскрипции генов, индуцируемых гормонами, необходимо, чтобы с соответствующим HRE связался рецептор. В обоих случаях связывание активатора транскрипции с ДНК осуществляется с помощью индуктора; для рецептора это соответствующий гормон, а для GAL4 некое вещество, производное галактозы. Кроме того, у дрожжей связывание активатора с промотором блокируется в отсутствие индуктора путем присоединения GAL80 к GAL4, а у млекопитающих путем связывания ингибитора с доменом Е рецептора. Важное различие двух индуцибельных систем заключается в том, что компонентами позитивного и негативного контроля СЛЕ-системы являются разные полипептиды (белки GAL4 и GAL80), а соответствующие компоненты регуляции гормончувствительных генов принадлежат одному и тому же белку- рецептору. Как именно активируется комплекс транскрипции в обеих системах- неизвестно; установлено лишь, что домены активации и в том, и в другом случаях содержат кластеры кислых аминокислот, состав и последовательность которых до конца не установлены. Не менее удивительным является тот факт, что домены активации у дрожжей и млекопитающих взаимозаменяемы.

Регуляция гена ^-интерферона. Интерфероны (IFN)-3TO секретируемые видоспецицичные полипептиды, которые защищают клетки от вирусной инфекции. IFN присутствуют в лейкоцитах (а), фибробластах (Р) и в клетках иммунной системы (у) позвоночных. В нормальных фибробластах они не обнаруживаются, однако в течение 4-8 ч после вирусной инфекции или при обработке некоторых клеток двухцепочечной РНК в них начинается синтез больших количеств мРНК IFN-Р; по-видимому, такие двухцепочечные РНК образуются при размножении вируса. Подобное накопление мРНК IFN-р обусловлено в значительной мере усилением транскрипции, индуцируемым вирусной инфекцией.

Последовательности, ответственные за регуляцию транскрипции гена IFN-Р, находятся между парами оснований —204 и +1 (рис. 8.53). Вездесущий ТАТА-блок локализован, как обычно, вблизи пары —25, а элементы, определяющие индуцибель- ность IFN-P (IRE),-между парами —200 и —37. IRE состоит из пяти субэлементов, два из которых отвечают за негативную регуляцию (NRD1 и NRD2), а три опосредуют индуцированную активацию транскрипции (PRD I, II и III). Отметим, что NRD1 перекрывается с PRDII, a NRD2 либо граничит с PRDIII, либо перекрывается с ним. Элементы NRD1 и NRD2 были идентифицированы с помощью опытов по мутационным изменениям их последовательностей, в результате которых наблюдалось уменьшение роли индукции или необходимость в ней вообще отпадала (например, транскрипция гена INF-Р становилась конститутивной). С другой стороны, мутационные изменения в любом из трех элементов PRD блокировали активацию транскрипции под действием вируса. Таким образом, регуляция экспрессии гена IFN-Р может быть как позитивной, так и негативной.

Опыты по защите от метилирования in vivo показывают, что в неинфицированных клетках оба NRD-элемента защищены, но после инфицирования или индукции приобретают способность к метилированию. Напротив, три PRD-элемента легко метилируются в неинфицированных клетках, а после заражения становятся полностью защищенными от метилирования. Это говорит о том, что указанные элементы по-разному связываются с ядерными факторами: те, которые участвуют в репрессии транскрипции, связываются в неиндуцированном состоянии, а медиаторы индуцированного ответа-после индукции (рис. 8.54).

NRD2 PRDHINRD2 PRDHIPRDI PRDH NRD1 ТАТАPRDI PRDH NRD1 ТАТАРИС. 8.53.Организация регуляторных элементов промотора IFN-p.NRD1 и МВО2-злементы негативного контроля, PRDI,РИС. 8.53.Организация регуляторных элементов промотора IFN-p.NRD1 и МВО2-злементы негативного контроля, PRDI,PRDII и PRDIII-элементы позитивного контроля, + 1-сайт инициации транскрипции.PRDII и PRDIII-элементы позитивного контроля, + 1-сайт инициации транскрипции.Ядерные экстракты из инфицированных или индуцированных клеток содержат разные белки, связывающиеся с каждым из элементов PRD. По всей вероятности, в неиндуцированных экстрактах эти белки присутствуют в неактивной форме, поскольку для индукции транскрипции гена IFN-0 не требуется синтез новых белков. PRDII содержит последовательность, очень напоминающую сайт хВ в энхансере IgL(x), и, как и ожидалось, связывает NF-xB. Мутации, блокирующие связывание NF-xB с PRDII, ослабляют и индуцибельную активацию

NRD2 PRDHI

NRD2 PRDHI

PRDI PRDH NRD1 ТАТА

PRDI PRDH NRD1 ТАТА

РИС. 8.53.

Организация регуляторных элементов промотора IFN-p.

NRD1 и МВО2-злементы негативного контроля, PRDI,

РИС. 8.53.

Организация регуляторных элементов промотора IFN-p.

NRD1 и МВО2-злементы негативного контроля, PRDI,

PRDII и PRDIII-элементы позитивного контроля, + 1-сайт инициации транскрипции.

PRDII и PRDIII-элементы позитивного контроля, + 1-сайт инициации транскрипции.

РИС. 8.54. .Сайты связывания регуляторных белков в промоторе гена IFN-p. По-видимому, в неиндуцированном состоянии с NRD1- и НВО2-сайтами связываются регуляторные белки, которые перекрывают PRDII- и PRDIII-сайтыРИС. 8.54. .Сайты связывания регуляторных белков в промоторе гена IFN-p. По-видимому, в неиндуцированном состоянии с NRD1- и НВО2-сайтами связываются регуляторные белки, которые перекрывают PRDII- и PRDIII-сайтысоответственно. После индукции NRD-связывающиеся белки отделяются, три PRD-сайта занимают соответствующие белки, и происходит активация транскрипции.соответственно. После индукции NRD-связывающиеся белки отделяются, три PRD-сайта занимают соответствующие белки, и происходит активация транскрипции.промотора. Напомним, что NF-xB-это широко распространенный белок, присутствующий главным образом в цитоплазме в виде неактивного комплекса, но способный активироваться под действием ряда факторов, в том числе под действием вирусной инфекции. Таким образом, активация NF-xB при заражении вирусом, вероятно, играет важную роль в индукции транскрипции гена IFN-p. Ни индуци- бельные факторы, которые присоединяются к PRDIII и PRDI, ни белки, связывающиеся с элементами NRD, пока не идентифицированы. Весьма правдоподобная, но пока окончательно не принятая модель регуляции гена IFN-P предполагает, что связывание факторов NRD мешает связыванию белков PRDII и PRDIII с родственными им последовательностями, поддерживая таким образом неактивное состояние промотора (рис. 8.54). Вероятно, при индукции инактивируются факторы NRD и происходит их отделение от соответствующих сайтов связывания, не исключено также, что белки NRD вытесняются при связывании активированных белков PRD.

РИС. 8.54. .

Сайты связывания регуляторных белков в промоторе гена IFN-p. По-видимому, в неиндуцированном состоянии с NRD1- и НВО2-сайтами связываются регуляторные белки, которые перекрывают PRDII- и PRDIII-сайты

РИС. 8.54. .

Сайты связывания регуляторных белков в промоторе гена IFN-p. По-видимому, в неиндуцированном состоянии с NRD1- и НВО2-сайтами связываются регуляторные белки, которые перекрывают PRDII- и PRDIII-сайты

соответственно. После индукции NRD-связывающиеся белки отделяются, три PRD-сайта занимают соответствующие белки, и происходит активация транскрипции.

соответственно. После индукции NRD-связывающиеся белки отделяются, три PRD-сайта занимают соответствующие белки, и происходит активация транскрипции.

Регуляция транскрипции под действием тепла, света и металлов. Тепловой шок и другие стрессовые воздействия инициируют типичную физиологическую реакцию, названную ответом на тепловой шок. Такой ответ может давать любой эукариотический и прокариотический организм. Как правило, при этом синтез нормальных белков мгновенно прекращается, и начинают синтезироваться специфические белки теплового шока (HSP). По-видимо- му подобная реакция необходима для выживания организма в изменившихся условиях, поскольку мутации, блокирующие ее у дрожжей, легальны. Механизм индукции генов теплового шока у Drosophila,

X enopus, дрожжей и млекопитающих в высшей степени консервативен. Например, транскрипция гена HSP70 Drosophila (кодирующего белок теплового шока с мол. массой 70 кДа) при введении в клетки Xenopus, мыши и обезьяны активируется под действием тепла так же эффективно, как и транскрипция эндогенных генов теплового шока.

Синтез HSP зависит от активации транскрипции генов теплового шока. Индукция происходит безотлагательно. при этом в течение часа теплового воздействия количество мРНК возрастает с менее чем одной молекулы на клетку до тысяч молекул. Некоторые гены теплового шока регулируются в процессе развития и не нуждаются для активации своей транскрипции в тепловом шоке. Клонирование и секвенирование генов теплового шока из разных организмов позволило выявить основные особенности транскрипционного ответа на это воздействие. Как правило, промоторы, осуществляющие регуляцию транскрипции в ответ на тепловой шок, состоят из нескольких повторов относительно короткой последовательности (элементы теплового шока-HSE), рассеянных внутри области протяженностью 200 п. н. перед ТАТА. Эта каноническая последовательность, обнаруженная в регуляторных областях многих промоторов теплового шока у разных организмов, имеет вид 5'-CNGAANTTCNG-3', где N-любое из четырех оснований. HSE-элементы, помещенные перед ТАТА-блоком гетерологичных промоторов (например, промотора гена ТК вируса герпеса или промотора гена Р-глобина), обусловливают чувствительность транскрипции с этих промоторов к тепловой индукции.

Как и в случае i/uc-элементов в других промоторах, HSE являются сайтами связывания регуляторных белков - факторов транскрипции генов теплового шока (HSTF). HSTF из разных видов сходны по своим физическим и функциональным свойствам; так, HSTF Drosophila и дрожжей имеют одинаковые размеры и одинаково связываются с ДНК. Данные многих опытов свидетельствуют о том, что HSTF прочно связаны с HSE во время (но не до начала) теплового шока. Следовательно, HSTF в нормальных клетках присутствуют в неактивном состоянии, а тепловой шок стимулирует их присоединение к HSE всех промоторов, индуцируемых теплом. Клонирован ген, кодирующий HSTF дрожжей, что открывает пути к анализу его связывания с HSE и изучению механизма активации транскрипции с участием различных промоторов теплового шока.

Высшие растения имеют множество фоторецепторов, которые опосредуют их реакцию на свет. Свет разных длин волн служит регуляторным сигналом сложных процессов развития и контроля за развитием. Идея о том, что одной из функций фоторецепторов является активация или репрессия экспрессии генов, не нова. Экспериментальные подтверждения этому дали недавние исследования с использованием молекулярно-генетических подходов, проведенные для идентификации регуляторных элементов промоторов генов растений. Исследовалась индуцированная светом активация ядерного гена, кодирующего малую субъединицу рибозо-1,5-бисфосфат-карбоксилазы (rbcS) (рис. 6.36). Для определения активности промотора использовали участок 5'-последовательности гена размером 1 т. п. н., сшитый с геном хлорамфеникол-ацетилтрансфера- зы. Этот химерный ген, а также другие гены с различными перестройками и делециями вводили в клетки табака при помощи трансформации Ti-плазмидой (разд. 5.8.в). Функционирование промотора изучали в каллюсах табака, выдержанных на свету и в темноте. Низкая эффективность транскрипции с промотора rbcS связана с последовательностью, расположенной в пределах 90 п. н. перед ТАТА-блоком, а для достижения максимальной эффективности транскрипции, активируемой светом, необходим набор энхансеров, находящихся левее, между парами оснований —975 и —90. Укорочение энхансерных последовательностей сопровождается постепенным снижением эффективности световой индукции. Аналогичная структура из ТАТА-проксимального элемента световой чувствительности и левого энхансера присутствует в промоторе гена, кодирующего связанный с хлорофиллом белок, который аккумулирует световую энергию и активируется под действием света. В обоих случаях описаны специфические элементы, ответственные за световую чувстви

тельность, но не идентифицированы факторы транскрипции, с которыми они взаимодействуют. Более того, неизвестен и механизм передачи светового сигнала от фоторецепторов к регуляторному аппарату транскрипции.

Точно так же как живые организмы реагируют на тепло, свет и некоторые другие физические факторы (например, на действие радиации) путем изменения характера транскрипции определенных генов, они реагируют и на действие металлов с помощью гомеостатических реакций. Одни металлы токсичны (например, кадмий и ртуть), другие являются необходимыми компонентами пищи, но ядовиты в высоких концентрациях (например, медь и цинк). Главная роль в ответе на действие металлов принадлежит активации транскрипции генов металлотионеи- на. Эти гены кодируют небольшие полипептиды, богатые цистеином, которые связывают как необходимые для организма, так и токсичные тяжелые металлы.

У млекопитающих разных видов имеется несколько различающихся, но близких по строению генов металлотионеина, которые располагаются один за другим на одной и той же хромосоме и имеют одинаковое расположение экзонов и интронов. Те же самые тяжелые металлы, которые связываются с белком, вызывают преходящую индукцию транскрипции гена металлотионеина, лежащую в основе механизма защиты клеток от токсического действия металлов. Индуцибельный ответ на действие металлов характерен для всех клеток, причем активируется каждый из нескольких разных генов металлотионеина, которые могут присутствовать в одном организме. Гены млекопитающих, кодирующие металлотионеины, индуцируются также при стрессе и под действием некоторых ядовитых веществ, при этом индукция опосредуется высвобождением глюкокортикоидов.

У S. cerevisiae имеется всего один ген металлотионеина. Он не является жизненно необходимым, но защищает дрожжи от токсического действия меди. Исследование промотора позволило идентифицировать два чувствительных к меди элемента, находящихся между парами —200 и —100, и обычный ТАТА-блок вблизи пары —30, считая от точки начала транскрипции (рис. 8.55, А). Эти два элемента, которые активируются медью (UASCu), расположены перед промотором и представлены несовершенными повторами длиной от 32 до 34 п. н. Они являются сайтами связывания фактора медь-инду- цируемой транскрипции (CITF). Фактор CITF, ген которого (АСЕ-1) удалось клонировать, секвениро- вать и экспрессировать, присоединяется к UASCll только в комплексе с медью. Домены связывания меди и ДНК у CITF локализованы на N-конце молекулы белка. Зависимость связывания белка с

А.Промотор гена металлотионеина S.cerevisiae

-250-200-150-100-50+1

1А1л-зависимыи комплекс транскрипции

Промотор гена металлотионеина Ид человека

-250-200-150-100-50

IIIII

■НЖЖ1МН

MRE MRE MRE MRF

BLEВЕЕ GC ТАТЬ

АР1

АР2

АР1

АР2

Sp1

О

ТАТА-зависимый комплекс транскрипции

РИС. 8.55.

Организация регуляторных элементов промотора гена металлотионеина дрожжей и млекопитающих. А. Промотор гена металлотионеина S. cerevisiae-. кроме ТАТА- бокса для индуцируемой медью транскрипции необходимы проксимальный и дистальный элементы (UASCu и dUASCu соответственно). Элемент ТАТА детерминирует сборку комплекса транскрипции, а два UASCu-3ne- мента связывают фактор транскрипции CITE. Б. Промотор гена металлотионеина 11А человека: фоновая активность этого промотора, т. е. активность в отсутствие

металлов, зависит от ТАТА-бокса и комплекса транскрипции (белка Sp1, связанного с GC-богатым гекса- мерным элементом, и факторов транскрипции АР1 и АР2, связанных с двумя энхансерами фоновой активности [BLE]). Для индуцируемой металлами транскрипции необходим кластер металлозависимых элементов (MRE), которые активируются белком MRE-BP. Ответ на глюкокортикоиды зависит от связывания рецептора глюкокортикоида (GR) с глюкокортикоид-акцепторным элементом (GRE).

UASCu от меди можно объяснить тем, что форми- . рование правильного домена связывания индуци- | руется только в том случае, когда несколько ионов меди соединяются при помощи хелатных связей с остатками цистеина, расположенными в этой части белковой молекулы. Интересно, что С-концевая половина CITF имеет четко выраженный кислый характер, что присуще и другим факторам активации транскрипции (разд. 8.6.6).

Регуляторные элементы, контролирующие транскрипцию промотора металлотионеина II человека были идентифицированы при помощи мутационного анализа и исследования транскрипции с

модифицированных промоторов in vivo (рис. 8.55,5). Перед точкой начала транскрипции в пределах участка размером 175 п. н. находятся элементы, необходимые для обеспечения фонового уровня транскрипции (т. е. транскрипции в отсутствие индуктора); к ним относятся элементы ТАТА и GC, а также два энхансера фонового уровня (BLE). Помимо фактора связывания ТАТА и вспомогательных факторов транскрипции, которые присоединяются к ТАТА-блоку и соседним последовательностям, для фоновой транскрипции необходимы фактор Spl, связывающийся с элементом GC, и факторы API и АР2, связывающиеся с BLE. Для

индукции транскрипции под действием металлов необходимы, кроме того, металл-акцепторные элементы (MRE) и белок, присоединение которого к MRE зависит от присутствия металлов. Таким образом, фактором, ответственным за регуляцию транскрипционной активности промоторов, является концентрация координационно связанного с ионами металла фактора связывания MRE, зависящая от концентрации свободного металла. Транскрипционный ответ на действие глюкокортикоидов, не зависящий от металлов-индукторов, обусловливается присоединением глюкокортикоидного рецептора в комплексе с лигандом к глюкокортикоид-ак- цепториому элементу промотора.

ж. Транскрипционная регуляцияморфогенеза

Из всего сказанного выше можно сделать вывод, что регуляция транскрипции опосредуется связыванием варьирующего числа разнообразных факторов транскрипции со специфическими родственными им элементами промоторов и энхансеров. По-видимо- му, эффективность инициации транскрипции зависит от взаимодействий между этими связанными с ДНК белками (и, возможно, другими связанными с ними белками) и одним или более компонентами основного аппарата транскрипции, хотя детали этой регуляции на молекулярном уровне неизвестны. Согласно этой модели, уровень экспрессии гена зависит от доступности, концентрации и активности одного или нескольких факторов, участвующих в его транскрипции. Такой механизм в значительной степени объясняет широкое разнообразие фенотипов дифференцированных клеток и тканей и их способность реагировать на изменения окружающей среды. Тот же самый принцип, вероятно, используется также при регуляции упорядоченного во времени и пространстве эмбрионального развития. Следовательно, сложная временная и пространственная картина экспрессии при эмбриогенезе создается в результате координированного взаимодействия как повсеместно присутствующих, так и ограниченных определенными структурами специфических факторов транскрипции.

Более детальное обсуждение вопроса о роли регуляторов транскрипции как детерминант эмбрионального развития выходит за рамки данного раздела. Здесь мы лишь попытаемся показать, как с помощью факторов транскрипции создается иерархический каскад экспрессии генов, реализующийся во времени и пространстве в зависимости от того, когда и где возникает инициация этого каскада.

Наиболее детально разработанной моделью, позволяющей анализировать молекулярные процессы, регулирующие ранние стадии эмбрионального раз

Время.мин0-15Время.мин0-15Деление ядерДеление ядер15-1815-18Образование полюсных клетокОбразование полюсных клеток60-9060-90Синцитиальная бластодермаСинцитиальная бластодерма90-15090-150Клеточная бластодермаКлеточная бластодермаРИС. 8.56.Морфологические изменения яйца Drosophila вплоть до образования клеточной бластодермы. Свежеотложенное яйцо содержит одно ядро, которое делится в течение первого часа с образованием большого числа произвольно распределенных ядер (ядра синцития). Примерно к 90 мин многие ядра мигрируют к наружной оболочке яйца, и у заднего его полюса начинается дифференцировка полюсных клеток. Миграция ядер продолжается примерно еще час, после чего образуется клеточная бластодерма.РИС. 8.56.Морфологические изменения яйца Drosophila вплоть до образования клеточной бластодермы. Свежеотложенное яйцо содержит одно ядро, которое делится в течение первого часа с образованием большого числа произвольно распределенных ядер (ядра синцития). Примерно к 90 мин многие ядра мигрируют к наружной оболочке яйца, и у заднего его полюса начинается дифференцировка полюсных клеток. Миграция ядер продолжается примерно еще час, после чего образуется клеточная бластодерма.150-195150-195вития, является Drosophila. Это насекомое относится к метамерным организмам (т. е. его тело построено из серийно повторяющихся сегментов, каждый из которых дифференцируется в отдельные структуры и формы согласно положению, занимаемому в организме). Образование и последовательная дифференциация таких сегментов в ходе эмбриогенеза зависят прежде всего от дробления эмбриона на повторяющиеся единицы и далее от определения путей их дифференцировки. Эмбриогенез начинается с быстрых делений ядра, за которыми следует миграция ядер к наружной оболочке яйца, после чего вокруг

Время.мин

0-15

Время.мин

0-15

Деление ядер

Деление ядер

15-18

15-18

Образование полюсных клеток

Образование полюсных клеток

60-90

60-90

Синцитиальная бластодерма

Синцитиальная бластодерма

90-150

90-150

Клеточная бластодерма

Клеточная бластодерма

РИС. 8.56.

Морфологические изменения яйца Drosophila вплоть до образования клеточной бластодермы. Свежеотложенное яйцо содержит одно ядро, которое делится в течение первого часа с образованием большого числа произвольно распределенных ядер (ядра синцития). Примерно к 90 мин многие ядра мигрируют к наружной оболочке яйца, и у заднего его полюса начинается дифференцировка полюсных клеток. Миграция ядер продолжается примерно еще час, после чего образуется клеточная бластодерма.

РИС. 8.56.

Морфологические изменения яйца Drosophila вплоть до образования клеточной бластодермы. Свежеотложенное яйцо содержит одно ядро, которое делится в течение первого часа с образованием большого числа произвольно распределенных ядер (ядра синцития). Примерно к 90 мин многие ядра мигрируют к наружной оболочке яйца, и у заднего его полюса начинается дифференцировка полюсных клеток. Миграция ядер продолжается примерно еще час, после чего образуется клеточная бластодерма.

150-195

150-195

каждого ядра образуется мембрана. В результате формируется клеточная бластодерма (рис. 8.56). Однако рамки для последующего воплощения плана развития тела и участь каждой клетки устанавливаются еще до образования клеточной структуры бластодермы. Это отличает эмбриогенез Drosophila от эмбриогенеза млекопитающих, у которых план строения тела и дифференцированные структуры на стадии многоклеточного бластоциста еще не определены

Основными детерминантами формирования передне-задней конфигурации эмбриона являются продукты генов bicoid (bed) и nanos (nos). Транскрипция гена bed осуществляется в специализированных клетках яичника, которые группируются вокруг одного полюса развивающегося ооцита. мРНК гена bed переходит в ооцит и захватывается тем его концом, который должен стать передним полюсом эмбриона. Продукты группы генов nos локализуются у заднего полюса яйца. Ко времени откладывания яйца оно уже оказывается поляризованным как на молекулярном, так и на морфологическом уровне (рис. 8.57). Во время трансляции мРНК гена bed образующиеся белки диффундируют от переднего полюса и постепенно распределяются по яйцу примерно до его середины. Одновременно белки-продукты мРНК гена nos- перемещаются к переднему полюсу Итак, еще до формирования клеточной структуры два разных продукта материнских мРНК неравномерно распределяются вдоль будущей передне-задней оси эмбриона.

Результатом перекрывания градиентов продуктов генов bed и nos является локальная активация группы генов, названных генами gap, которые отвечают за образование семи исходных сегментов эмбриона. Три главных члена группы генов дар, hunchback (hb), kruppel (Кг) и knirps (kni), также экспрессируются в определенных сегментах эмбриона. Экспрессия гена hb происходит только в двух областях одна находится в задней четверти яйца, а другая простирается от переднего полюса почти до середины яйца. Ген Кг сначала экспрессируется в одной широкой зоне в середине эмбриона, а продукт гена kni появляется как спереди, так и сзади от этой зоны. Изучение мутантов, не способных синтезировать продукты генов bed и nos, показывает, что экспрессия этих трех генов регулируется продуктами генов bed и nos и что пространственная локализация продуктов генов дар определяется относительными концентрациями продуктов генов bed и nos вдоль передне-задней оси.

Белок гена bed действует как позитивный регулятор экспрессии hb, вызывая накопление hb у переднего конца эмбриона. Продукт гена nos, по-видимо- му, ингибирует активность белка hb. Более того, продукты генов bed и nos блокируют экспрессию

гена Кг в передней и задней областях эмбриона соответственно, поэтому мРНК гена Кг накапливается в центральной части эмбриона (рис. 8.57). Со временем границы транскрипционных областей генов дар сужаются, поскольку их продукты влияют на транскрипцию генов друг друга: так, продукт гена Кг ингибирует транскрипцию гена hb, а продукты генов kni и hb подавляют экспрессию гена Кг. Следовательно, формирование областей стабильной экспрессии генов дар происходит в два этапа. Сначала экспрессия генов дар дифференциально регулируется при помощи распределения материнских детерминант, а позже она регулируется взаимной репрессией.

Пространственная локализация продуктов генов дар опосредует специфическую локальную регуляцию следующей группы генов в иерархическом ряду, генов класса pair rule. Их преходящая экспрессия происходит в семи или восьми транскрипционных областях. Процесс периодической смены профилей экспрессии приводит к локальной экспрессии генов полярности сегмента; некоторые из этих генов (juslu terazu [//z], even skipped [cue] и engrailed [eng]) участвуют в дальнейшем дроблении сегментов на отделы (рис. 8.57). Гены каждого класса явно находятся под воздействием генов, функционирующих на более ранних стадиях, и некоторых генов своего класса. Так, смена стадий формирования тела Drosophila в процессе эмбриогенеза определяется иерархической регуляцией, при которой продукты материнских генов действуют на функционирование впервые экспрессирующихся генов зиготы, продукты которых влияют как на синтез друг друга, так и на функционирование групп генов, экспрессирующихся впоследствии взаимозависимым образом. Результатом этой системы взаимодействий является то, что ко времени завершения формирования клеточного строения эмбриона, когда все клетки кажутся морфологически одинаковыми, участь клеток, находящихся в разных частях эмбриона, оказывается уже предрешенной, поскольку в них экспрессируются разные комбинации генов класса pair rule и генов полярности сегмента. Различные сочетания продуктов этих генов в каждом сегменте определяют экспрессию гомеотических генов ultrabithorax (ubx) и antennapedia (antp), которые регулируют более поздние стадии развития и дифференцировки тканей мухи. Гомеотические гены-это гены, мутации в которых трансформируют одну часть взрослого организма в другую, совершенно не похожую, структуру. Например, гомеотическая мутация Antenna pedia превращает усик на голове мухи в ногу нормального строения. Следовательно, один из продуктов гена Antp, по-видимому, детерминирует путь развития определенных клеток.

Каким образом возник и утвердился такой

gap-гены (зигота)

Материнские гены

kruppel

even skipped

Гены класса pair rule, экспрессирующиеся в первую очередь

Гены класса pair rule, экспрессирующиеся во вторую очередь

tushiterazu

Образование клеточной структуры

иерархический каскад пространственно заданной экспрессии генов, в особенности на стадии, когда эмбрион содержит только неизолированные ядра? Детальная картина этого процесса пока не установлена, но уже ясно, что дифференциальная экспрессия генов на ранних стадиях эмбрионального развития отчасти связана с регуляцией транскрипции. Клонирование и секвенирование генов, которые транскрибируются на разных иерархических уровнях, показывают, что некоторые из них кодируют связывающиеся со специфическими последовательностями ДНК белки, которые либо активируют, либо ингибируют транскрипцию генов своего класса или генов, стоящих ниже в иерархическом ряду.

Как мы уже упоминали, индуцированные в зиготе транскрипты гена lib концентрируются на самом краю передней части яйца-в области с наиболее высоким содержанием белка гена bed. Поскольку у большинства мутантов по гену bed ген hb не экспрессируется, предполагалось, что продукт bed нужен для активации транскрипции hb. Возможность проверить эту гипотезу появилась после того, как был клонирован ген bed и получен его белковый продукт, а также клонирован ген hb и идентифицирована область регуляции его транскрипции. Оказалось, что белок bed связывается с разным сродством со многими элементами промотора гена hb вблизи точки начала его транскрипции (рис. 8.58). Каноническая последовательность трех сайтов сильного

РИС. 8.57.

Экспрессия генов на ранних этапах развития Drosophila. Схематически представлена временная и пространственная экспрессия некоторых генов, ответственных за организацию эмбриона Drosophila вдоль передне-задней оси в первые три часа после оплодотворения. Формирование клеточной структуры эмбриона происходит по мере экспрессии генов antennapedia и ultrabithorax Экспрессия gap-генов hunchback, кгирре! и knirps зависит от содержания продуктов материнских генов в яйце (например, bicoid и па nos) и происходит в соответствии с градиентом концентрации мРНК и белка гена bicoid. Эта концентрация уменьшается в направлении от переднего полюса яйца к заднему. Экспрессия зависит также от влияния продуктов gap-генов на синтез друг друга. К тому времени, когда устанавливается определенная картина экспрессии генов hunchback, кгирре! и knirps. начинают экспрессироваться некоторые гены класса pair rule-hairy и runt. Сначала зоны их экспрессии разделяются нечетко, а затем образуются строго чередующиеся полосы. Несколько позже экспрессируются другие гены класса pair rule- evenskipped и fushi terazu, каждый в виде семи чередующихся полос. Этот набор продуктов ранних генов индуцирует экспрессию гена engrailed и синтез продуктов генов antennapedia и ultrabithorax, главным образом в двух зонах в передней части яйца.

связывания, которые расположены с интервалом 100 п.н. между парами оснований —293 и —55, вероятно, имеет вид 5'-ТСТААТСС-3'. Участие белка bed в регуляции транскрипции с промотора hb было продемонстрировано в опытах in vivo. Так, инъекция в ранний эмбрион Drosophila химерного гена, содержащего промотор hb, сшитый с кодирующей областью хлорамфеникол-ацетилтрансферазы, вызывает экспрессию гена в эмбрионах дикого типа, но не в мутантных по bed самках. С помощью последовательных делеций элементов промотора hb удалось установить, что участок между парами оснований — 300 и +1 всецело определяет АсгУ-зави- симую и специфичную для данной области экспрессию. Этот участок содержит три близко расположенные копии сайтов сильного связывания белка bed. Два других, более слабых сайта связывания bed находятся левее, вблизи пары —2300. Эти сайты стимулируют образование hb-мРНК большего размера.

Когда при помощи трансформации с использованием Р-элемента (разд. 10.2.6) в эмбрионы были введены химерные гены, содержащие последовательности сильного связывания белка bed. сшитые с кодирующей Р-галактозидазу последовательностью, оказалось, что ген ji-галактозидазы экспрессируется в области, занимающей почти всю переднюю половину эмбриона. В тех случаях, когда для активации промотора маркерного гена использовались последовательности слабого связывания bed, экспрессия ограничивалась первой передней четвертью эмбриона. Отсюда следует, что промотор hb может реагировать на градиент bed двумя способами с образованием мРНК двух видов.

ДНК-связывающий домен белка bed представляет собой последовательность из 60 аминокислот и называется гомеодоменом, поскольку кодирующая его область была впервые обнаружена в гомеотиче- ских генах Drosophila. Этот домен (разд. 8.6.а) встречается в белках, кодируемых большой группой регуляторных генов в геномах как беспозвоночных, так и позвоночных. Указанные гены почти всегда присутствуют в регуляторах транскрипции. Гомеодомены кодируются многими генами Drosophila из уже упоминавшихся в связи с регуляторной иерархией. Некоторые кодируемые ими белки содержат цинковые пальцы и, возможно, именно поэтому могут связываться с различными последовательностями ДНК.

з. Регуляция транскрипции геновU-PHK

Богатые урацилом малые ядерные РНК (U-мяРНК) у всех организмов кодируются семейством активно экспрессирующихся многокопийных

В 1 2

А 123

2900 нуклеотидов

3200 нуклеотидов

-293 А1С СТ 6 А С С А А С GT А АТ С СС С А Т

—~163

А2TTGTTTCT GCTCTA АТСС А6АА

АЗ ~77CCTCTGCC С АТСТ А АТ С СС Т Т 6 А55

— 2343“2321

BlATTAATTCATGCT А АТ СТО A TGA

-2293-2211

В2С А Т А АТ С А С С Т ТТ А АТ С С С A А 6 Т

Каноническая тгтаатгс последовательность v п

РИС. 8.58.

Регуляторные элементы промотора гена hunchback (hb) Drosophila. Участок из первых 300 п. н. слева от единицы транскрипции содержит три близкорасположенных сайта прочного связывания белка bed (А1, А2 и АЗ; выделены цветом). Они существенны для транскрипции мРНК длиной 2900 нуклеотидов, на которой синтези-

генов (разд. 9.2.д). В ядре клеток позвоночных присутствует по меньшей мере 200 000 каждого из основных типов U-PHK-транскриптов (Ui, U2, U4, U5 и U6). Они являются компонентами мяРНП, участвующих в процессинге про-мРНК (разд. 8.5.г). Другие U-PHK, U3 и Ш,-это компоненты присутствующих в меньшем количестве мяРНП, которые, вероятно, участвуют в процессинге про-рРНК и образовании З'-концов гистоновых мРНК соответственно (разд. 8.3.в). Транскрипцию генов U1-, U2-, U4- и U5-PHK, судя по ее чувствительности к а-ама- нитину, катализирует РНК-полимераза II (разд. 8.1.6). Кроме того, исходные U-PHK-транскрипты содержат 7-метилгуанозиновый кэп, который затем превращается в 2,2,7-триметилгуанозиновый кэп, характерный для U-PHK. Ген U6-PHK, напротив, транскрибируется с участием РНК-полимеразы III, а зрелая РНК не имеет кэпа. Тем не менее определенные свойства промотора гена U6-PHK совпадают со свойствами промоторов типичных генов класса II (разд. 8.4.6). Например, область перед сайтом начала транскрипции гена U6-PHK содержит GC-блоки, октамер и ТАТА-блок регуляторные элементы, характерные для промоторов, распознаваемых РНК-полимеразой II. Универсальность

руется белок hb. Два сайта слабого связывания bed (В1 и В2) находятся примерно на 2300 нуклеотидов левее точки начала транскрипции (они тоже выделены цветом). В1 и В2 стимулируют образование мРНК длиной 3200 нуклеотидов (после сплайсинга).

сигналов транскрипции иллюстрирует еше и тот факт, что промотор U6-PHK Xenopus tropicalis распознается в ооцитах Xenopus как РНК-полимеразой И, так и РНК-полимеразой III. А всего лишь несколько небольших изменений в последовательности длиной 50 п. н. перед точкой начала транскрипции гена U2-PHK превращают промотор, исходно распознаваемый РНК-полимеразой II, в промотор, распознаваемый РНК-полимеразой III. Таким образом, граница между промоторами классов II и III оказывается весьма нечеткой.

Все регуляторные элементы промоторов генов U-РНК, транскрибируемых обычно РНК-полимеразой II, организованы одинаково (рис. 8.59, Л). Каждый содержит по крайней мере два элемента, ответственных за активность промотора. Один, проксимальный элемент (PSE), входящий в состав базального промотора, находится между парами оснований — 70 и —40, другой, дистальный (DSE),-между парами —300 и —200. Ни один из этих элементов в отдельности не способен стимулировать транскрипцию генов U-PHK. PSE необходим для транскрипции РНК-генов и определяет точку ее начала. DSE функционирует в любой ориентации и может

А. Регуляторные элементы промоторов U1-,U2- 114-и U5-PHKА. Регуляторные элементы промоторов U1-,U2- 114-и U5-PHKIDSE1IDSE1-300- 200-100+1Б. Регуляторные элементы промотора U6-PHK-300- 200-100+1Б. Регуляторные элементы промотора U6-PHKРИС. 8.59.

А. Регуляторные элементы промоторов U1-,U2- 114-и U5-PHK

А. Регуляторные элементы промоторов U1-,U2- 114-и U5-PHK

IDSE1

IDSE1

-300- 200-100+1

Б. Регуляторные элементы промотора U6-PHK

-300- 200-100+1

Б. Регуляторные элементы промотора U6-PHK

Элементы регуляции транскрипции с промоторов U-PHK. А. Транскрипцию генов, находящихся под контролем промоторов U1-, U2-, U4- и U5-PHK, катализирует РНК-полимераза II. ТАТА-бокс в этих промоторах отсутствует, зато есть важные проксимальный (PSE) и дистальный (DSE) элементы. Последний содержит GC-богатый сайт связывания Sp1 и октамерный элемент

(octa), характерный для промоторов иммуноглобулиновых генов. Б. Транскрипция с промотора U6-PHK осуществляется при участии РНК-полимеразы III. Этот промотор содержит ТАТА-бокс, а также проксимальный (PSE) и дистальный (DSE) элементы; последний содержит GC-богатый участок и октамерный элемент.

находиться на разном расстоянии до промотора. Следовательно, он обладает свойствами обычного энхансера.

Хотя элемент PSE определяет точку начала транскрипции при синтезе U-PHK, у него отсутствует необходимый для узнавания ТАТА-блок. Более того, за исключением промотора гена U6 (рис. 8.59,Б), последовательности всех PSE одинаковы и характерны только для главных промоторов генов U-PHK. Последовательность PSE и белки, опосредующие участие PSE в транскрипции, до сих пор неизвестны. Напротив, последовательность DSE и белки, отвечающие за его энхансерную функцию, охарактеризованы. Выявлено два типа последовательностей: GC-блок 5'-GGGCGG-3' и октамер 5'-ATGCAAAT-3'. Мутации в любой из этих последовательностей инактивируют энхансер; следовательно, они должны быть функционально взаимозависимы. GC-блок связывает белок Spl, а октамер присоединяет широко распространенный белок ОТЕ-1. Применение метода отпечатков с использованием ДНКазы I и мутационный анализ GC-блока октамерной последовательности промоторов генов U-PHK показали, что ключевыми являются те же самые основания, которые входят в промоторы генов мРНК. Некоторые DSE связывают также белки API и АР2.

Все регуляторные последовательности, необхо

димые для транскрипции гена U6-PHK, находятся перед кодирующей последовательностью, несмотря на то что транскрипцию гена катализирует РНК-полимераза III (разд. 8.4.6). Не менее удивителен и тот факт, что транскрипционный аппарат РНК-полимеразы III использует те же i/ис-последовательно- сти, что и факторы транскрипции, которые функционируют с РНК-полимеразой II (рис. 8.59,Б). Итак, промотор гена U6-PHK сходен с промоторами генов U1-, U2-, U4- и U5-PHK в том отношении, что содержит элемент PSE вблизи точки начала транскрипции и элемент DSE между парами —300 и — 200, в который входят GC-гексануклеотид и две октамерные последовательности. Однако промотор гена Об-РНК содержит вблизи точки начала транскрипции также и ТАТА-блок, а элемент PSE этого промотора отличается от PSE промоторов генов U1-. U2-, U4- и U5-PHK. Каким образом РНК-полимераза III использует эти регуляторные цис-последовательности для активации транскрипции гена U6-PHK- неясно.

Любопытным свойством промоторов генов U-PHK является то, что, когда они слиты с кодирующей областью гена мРНК, соответствующие транскрипты не полиаденилируются на З'-концах (разд. 8.3.в). Аналогично, З'-концы U-PHK, транскрибированных с участием промоторов генов мРНК, не процессируются надлежащим образом. Следова-

тельно, можно предположить, что механизм инициации транскрипции и события, которые обусловливают созревание З'-концов мРНК и U-PHK, каким-то образом координированы. Другой парадокс заключается в том. что DSE промоторов U-PHK не стимулируют транскрипцию ни с основного промотора гена ТК, ни с промотора глобинового гена, хотя в случае гетерологичных промоторов энхансеры действуют эффективно в обоих случаях. Из этого следует, что факторы транскрипции, связанные с DSE, не могут взаимодействовать с ТАТА-ассоциированными комплексами или активировать их. Вероятно, комплекс транскрипции, ассоциированный с элементом PSE, отличается от комплекса, связанного с ТАТА-блоком, и эти комплексы не являются взаимозаменяемыми. Комплекс, находящийся в стартовой точке транскрипции, может влиять на процессы, происходящие на З'-конце единицы транскрипции.

СТРУКТУРА И ЭКСПРЕССИЯГЕНОВ КЛАССА III

Основные свойства

РНК, кодируемые генами класса III. Продуктами генов класса III являются низкомолекулярные РНК, которые участвуют в синтезе белков (тРНК и 5S-pPHK). их внутриклеточном транспорте (7SL-PHK) и в посттранскрипционном процессинге (U6-PHK). Гены класса III кодируют также некоторые другие РНК с неустановленными физиологическими функциями (7SK-PHK и Alu-PHK). Геном аденовирусов содержит два гена класса III-VA1 и VA2; их РНК-продукты (длиной 157 и 140 нуклеотидов соответственно) переключают аппарат транскрипции инфицированных клеток на эффективный синтез структурных вирусных белков. При экспрессии генов класса III, входящих в состав генома герпесвируса Эпштейна-Барр, также образуются две низкомолекулярные РНК, EBERI и EBERII (длиной 166 и 172 нуклеотида соответственно).

Гены класса III делятся на две группы. В первую из них входят гены, кодирующие 5S-pPHK, 7SL-, 7SK-, U6- и VA-РНК, причем первичные транскрипты имеют такую же длину, что и зрелые функциональные РНК, т.е. процессинг транскриптов в данном случае не нужен. 5'-трифосфатная концевая группа, которая образуется при инициации транскрипции, становится 5'-концом, а последний из транскрибированных остатков - З'-концом зрелой РНК. Ко второй группе генов класса III относятся гены, кодирующие тРНК, зрелые формы которых образуются в результате отщепления нуклеотидов как с 5'-, так и с З'-концов первичных транскриптов

под действием специфических эндонуклеаз. З'-кон- цевая CCA-последовательность, необходимая для функционирования всех тРНК, не закодирована в соответствующем гене, а присоединяется при участии особого фермента. Поскольку некоторые гены тРНК содержат интрон, для получения зрелых тРНК- продуктов этих генов- необходим сплайсинг (разд. 8.5).

Сигналы транскрипции генов класса III. Сигналы инициации и терминации транскрипции генов класса III высококонсервативны у таких разных эукариотических организмов, как дрожжи, Drosophila, Xenopus и млекопитающие. По этой причине гены тРНК, 5S-pPHK и других низкомолекулярных клеточных и вирусных РНК из разных источников правильно транскрибируются гетерологичными системами транскрипции.

Отличительным свойством последовательностей, ответственных за регуляцию инициации транскрипции многих генов класса III, является то, что они локализованы внутри кодирующей области. Эти внутренние регуляторные участки (ICR) немного различаются у разных генов класса III, но в целом они на удивление сходны между собой. У некоторых генов класса III в пределах участка из 30 п. н. перед точкой инициации транскрипции находятся дополнительные регуляторные последовательности. Другие гены класса III (например, гены U6-PHK и 7SK- РНК млекопитающих) не содержат ICR и имеют только 5'-регуляторные последовательности, которые целиком находятся перед точкой инициации транскрипции. Все нуклеотидные последовательности, определяющие точку терминации транскрипции на З'-конце генов класса III, сходны между собой есть лишь небольшие различия, которые влияют на эффективность терминации.

Транскрипционный комплекс с участием РНК-полимеразы III. РНК-полимераза III, которая содержится в нуклеоплазме эукариотических клеток, была выделена из самых разных организмов: дрожжей, насекомых, амфибий, растений и некоторых млекопитающих. В случае дрожжей, Xenopus и млекопитающих получены практически гомогенные формы фермента. Все эти ферменты имеют большую мол. массу, ~ 650 к Да, и содержат от 10 до 15 субъединиц в зависимости от источника и метода выделения. Две субъединицы имеют мол. массу в пределах от 140 до 170 кДа, а их аминокислотные последовательности сходны с последовательностями соответствующих больших субъединиц РНК-полимераз I и II, а также Р- и Р'-субъединиц РНК-полимеразы Е. coli. Остальные субъединицы, по-видимому, присутствуют в эквимолярных количествах, а их размер колеблется от 10 до 90 кДа. Субъединица с мол. массой ~ 90 кДа, вероятно, имеется только в РНК- полимеразе III, а три субъединицы меньшего раз-

мера сходны с субъединицами соответствующих размеров очищенных РНК-полимераз I и И, если судить по гомологии аминокислотных последовательностей и перекрестным иммунологическим реакциям.

Для точной и эффективной транскрипции генов класса III при участии препаратов очищенной РНК- полимеразы III нужны еще некоторые белки. Конкретный набор необходимых факторов транскрипции варьирует среди различных генов класса III и зависит от локализации и типа элементов, ответственных за регуляцию транскрипционной активности генов. В большинстве случаев необходимые факторы транскрипции относятся к уникальным факторам, характерным только для экспрессии генов класса III. Но некоторые гены класса III, зависящие от 5'-регуляторных элементов (например, гены гРНК и малых ядерных и цитоплазматических РНК), нуждаются в дополнительных факторах транскрипции, вероятно родственных тем белкам, которые, как полагали ранее, специфичны в отношении транскрипционных комплексов с участием РНК-полимеразы II (разд. 8.3.з). Терминация транскрипции генов 5S-pPHK, по-видимому, опосредуется только РНК-полимеразой III, хотя для других генов класса III, возможно, необходимы связанные с ней факторы транскрипции.

Активность

Последовательности,регулирующие инициациютранскрипции

Внутренние регуляторные последовательности генов 5S-pPHK Xenopus. Клонированная ДНК Xenopus, содержащая участок, кодирующий 5S-pPHK, и фланкирующие его 5'- и З'-последовательности, правильно транскрибируется после введения в ядра ооцитов Xenopus или после инкубации с нефракцио- нированными экстрактами ооцитов. При этом образуется в основном 5S-pPHK длиной 120 нуклеотидов. Это ключевое открытие позволило проанализировать с помощью обратной генетики, какие структуры необходимы для точной и эффективной транскрипции.

1 11CR1 11CRс4IIIII+ 1+40+ 80+ 120РИС. 8.60.1Ген 5S"PPHK ! 1Влияние делеций в гене 5S-pPHK и вблизи него наIинициацию транскрипции. +1 и + 120- сайты инициа-iции и терминации транскрипции соответственно. Де-]с4IIIII+ 1+40+ 80+ 120РИС. 8.60.1Ген 5S"PPHK ! 1Влияние делеций в гене 5S-pPHK и вблизи него наIинициацию транскрипции. +1 и + 120- сайты инициа-iции и терминации транскрипции соответственно. Де-]леции, представленные прямыми линиями, начинающимися с 5'- или З'-конца клонированного гена, получены путем мутагенеза in vitro и повторного клонирования. Транскрипционную активность каждого мутантного гена определяли с использованием ядер ооцитов Хе-леции, представленные прямыми линиями, начинающимися с 5'- или З'-конца клонированного гена, получены путем мутагенеза in vitro и повторного клонирования. Транскрипционную активность каждого мутантного гена определяли с использованием ядер ооцитов Хе-АктивностьАктивностьnopus или бесклеточных экстрактов.nopus или бесклеточных экстрактов.Определение активности транскрипции генов 5S- рРНК с делециями разной длины на 5'-конце показало, что последовательность, фланкирующая 5'-ко- нец единицы транскрипции, и последовательность, занимающая более первой трети кодирующей области, несущественны для правильной инициации транскрипции (рис. 8.60). В результате транскрипции таких укороченных генов образуются РНК длиной примерно 120 нуклеотидов; из-за делеций транскрипция в таких условиях начинается с плазмидной последовательности, сшитой с 5'-концом оставшейся части кодирующей последовательности. Аналогично, точная и по существу столь же эффективная инициация транскрипции осуществляется при удалении З'-фланкирующей последовательности и одной трети кодирующей области со стороны З'-кон- ца. Однако, если удалить примерно 50 п. н. и более на 5'-конце или более 30 п. н. на З'-конце кодирующей области, то транскрипции не происходит. В результате этого эксперимента, впервые продемонстрировавшего наличие внутригенного сигнала транс-

1 11CR

1 11CR

с4

IIIII

+ 1+40+ 80+ 120

РИС. 8.60.1Ген 5S"PPHK ! 1

Влияние делеций в гене 5S-pPHK и вблизи него наI

инициацию транскрипции. +1 и + 120- сайты инициа-i

ции и терминации транскрипции соответственно. Де-]

с4

IIIII

+ 1+40+ 80+ 120

РИС. 8.60.1Ген 5S"PPHK ! 1

Влияние делеций в гене 5S-pPHK и вблизи него наI

инициацию транскрипции. +1 и + 120- сайты инициа-i

ции и терминации транскрипции соответственно. Де-]

леции, представленные прямыми линиями, начинающимися с 5'- или З'-конца клонированного гена, получены путем мутагенеза in vitro и повторного клонирования. Транскрипционную активность каждого мутантного гена определяли с использованием ядер ооцитов Хе-

леции, представленные прямыми линиями, начинающимися с 5'- или З'-конца клонированного гена, получены путем мутагенеза in vitro и повторного клонирования. Транскрипционную активность каждого мутантного гена определяли с использованием ядер ооцитов Хе-

Активность

Активность

nopus или бесклеточных экстрактов.

nopus или бесклеточных экстрактов.

। ICR 1। ICR 1Промежуточный A-бокссегмент С-боксПромежуточный A-бокссегмент С-боксРИС. 8.61.

। ICR 1

। ICR 1

Промежуточный A-бокссегмент С-бокс

Промежуточный A-бокссегмент С-бокс

Структура внутренней регуляторной области (ICR) гена 5S-pPHK X. faevis. Эта область содержит A-бокс, промежуточный сегмент и С-бокс. Они выделены более темным цветом, чем кодирующая часть гена 5S-pPHK. крипции, было установлено, что внутренняя регуляторная область (ICR) гена 5S-pPHK Xenopus находится примерно между парами оснований +50 и +90. В самом деле, оказалось, что клонированный сегмент 5S-pPHK, находящийся между парами оснований + 41 и +87, обеспечивает транскрипцию с участием РНК-полимеразы III in vitro, при этом инициация осуществляется в точке, расположенной примерно на 50 п. н. левее места соединения вектора и клонированного сегмента.

Более детально структура ICR указанного гена была изучена путем внесения небольших делеций. последующих вставок вместо этих делеций или замен специфических пар оснований и исследования их влияния на транскрипцию in vitro и in vivo. Эти опыты показали, что ICR состоит из трех функционально различающихся областей (рис. 8.61). Одна из них охватывает участок от +50-Й до +64-Й пары оснований и по своей последовательности и функции сходна с так называемым A-блоком, который, как теперь известно, присутствует в ICR всех генов класса III. Вторая область простирается от +80-Й до +90-Й пары оснований и присуща только ICR генов 5S-pPHK (С-белок). В функционировании ICR участвует также сегмент между парами оснований + 67 и +72. Изменения в этой области слабо влияют на транскрипцию; более серьезные последствия имеет изменение расстояния между А- и С-блоками. Таким образом, для регуляции инициации транскрипции необходимы и достаточны последовательности, находящиеся в пределах кодирующей области генов 5S-pPHK Xenopus. Вопрос о том, как

именно эти сигналы выполняют данную функцию, рассматривается в разд. 8.4.в.

Широкая распространенность внутренних регуляторных областей генов класса III. Мутационный анализ, аналогичный упомянутому выше, позволил идентифицировать ICR в генах 5S-pPHK и тРНК всех исследованных эукариот. Например, было показано, что линкерные вставки в ген 5S-pPHK Drosophila между парами +46 и +65, а также между парами +76 и +98 подавляют его транскрипцию; напротив, вставки между парами +3 и + 20 лишь незначительно уменьшают активность транскрипции. ICR примерно с такими же границами обнаружены в генах 5S-pPHK Bombyx, Neurospora и Saccha- romyces.

Подобные исследования с модифицированными генами тРНК и использованием систем транскрипции in vitro или ооцитов Xenopus помогли установить, что для транскрипции этих генов также нужны ICR. Нуклеотидные последовательности на 5'- и З'-концах кодирующей последовательности несущественны для инициации транскрипции. При помощи делеций и линкерных вставок идентифицированы две существенные области, положение которых мало различается у генов разных тРНК независимо от вида (рис. 8.62). Одна из них, A-бокс, локализована в области примерно от +10 до +20 пар оснований, а другая, В-бокс,- между парами оснований + 50 и +65. Нуклеотидные последовательности А- и В-боксов варьируют, а их каноническими последовательностями являются соответственно 5'-TGGCNNAGTGG-3' и 5'-GGTCGANNC-3'. Нуклеотидная последовательность участка между А- и В-боксами несущественна, важна лишь его длина. Если расстояние между боксами становится меньше 25 или больше ~60 пар оснований, то активность транскрипции снижается, а если это расстояние превышает 100 пар оснований или если А- и В-боксы

ICR

А-боксА-боксобласть (ICR) гена тРНК. В-боксов, которое в разных + 1 - сайт инициации транобласть (ICR) гена тРНК. В-боксов, которое в разных + 1 - сайт инициации тран

А-бокс

А-бокс

область (ICR) гена тРНК. В-боксов, которое в разных + 1 - сайт инициации тран

область (ICR) гена тРНК. В-боксов, которое в разных + 1 - сайт инициации тран

РИС. 8.62.

Внутренняя регуляторная Показано положение А- и тРНК слегка различается.

скрипции. Такое же попарное расположение А- и В-бок-

В-бокс

+ 50+6S от +70

до +90

сов характерно для генов VA-PHK, EBER-PHK и 7SL-PHK. Канонические последовательности А- и В-боксов имеют вид S'-TGGCNNAGTGG-З' и 5'-GGTTCGANNC-3' соответственно (N-любой нуклеотид).

РИС. 8.63.Внутренняя регуляторная область (ICR) гена TPHKLeu Xenopus laevis. Представлена нуклеотидная последовательность гена TPHKLeu размером 100 п.н. Под ней в схематическом виде изображена зрелая тРНК длинойРИС. 8.63.Внутренняя регуляторная область (ICR) гена TPHKLeu Xenopus laevis. Представлена нуклеотидная последовательность гена TPHKLeu размером 100 п.н. Под ней в схематическом виде изображена зрелая тРНК длиной83 п. н. и указаны разные ее участки (см. также рис. 3.29). А- и В-боксы выделены цветом. [G. Galli et al.. Nature 294 (1981), p. 626.]83 п. н. и указаны разные ее участки (см. также рис. 3.29). А- и В-боксы выделены цветом. [G. Galli et al.. Nature 294 (1981), p. 626.]сливаются то транскрипция полностью блокируется. Аналогичная конструкция, состоящая из двух частей, А- и В-боксов, встречается в кодирующих областях генов 7SL-PHK и четырех генов низкомолекулярных РНК в геномах аденовируса и вируса Эпштейна Барр.

РИС. 8.63.

Внутренняя регуляторная область (ICR) гена TPHKLeu Xenopus laevis. Представлена нуклеотидная последовательность гена TPHKLeu размером 100 п.н. Под ней в схематическом виде изображена зрелая тРНК длиной

РИС. 8.63.

Внутренняя регуляторная область (ICR) гена TPHKLeu Xenopus laevis. Представлена нуклеотидная последовательность гена TPHKLeu размером 100 п.н. Под ней в схематическом виде изображена зрелая тРНК длиной

83 п. н. и указаны разные ее участки (см. также рис. 3.29). А- и В-боксы выделены цветом. [G. Galli et al.. Nature 294 (1981), p. 626.]

83 п. н. и указаны разные ее участки (см. также рис. 3.29). А- и В-боксы выделены цветом. [G. Galli et al.. Nature 294 (1981), p. 626.]

Нуклеотидные последовательности А- и В-боксов не только существенны для транскрипции, но и необходимы для формирования вторичной структуры тРНК; A-бокс кодирует часть D-стебля и петли, а В-бокс-ТуиС-петлю и стебель (рис. 8.63). Участие обеих последовательностей в транскрипции генов тРНК и формировании правильной структуры молекул тРНК, которые нужны для синтеза белка,

интересно с точки зрения эволюции этих генов. В самом деле, если пару оснований CG в позиции 56 гена tPHKtyr заменить на пару GC, что означает замену С на G в TyUG-петле, то соответствующий ген не будет транскрибироваться.

Взаимозаменяемость A-боксов из разных внутренних регуляторных областей. Идентичны ли функции, выполняемые одинаковыми ICR-элементами разных генов класса III? Что касается А-бокса в ICR генов 5S-pPHK и тРНК, то да. Так, рекомбинанты, построенные путем замены первых 20 пар оснований ICR гена 5S-pPHK A-боксом ICR гена тРНК, активно транскрибируются (рис. 8.64). Такой же результат дает замена A-бокса тРНК на первые

нA-бокс тРНК1нA-бокс тРНК1

н

A-бокс тРНК1

н

A-бокс тРНК1

Транскрипционнаяактивность

РИС. 8.64.РИС. 8.64.

РИС. 8.64.

РИС. 8.64.

Взаимозаменяемость последовательностей, ответственных за регуляцию транскрипции генов 5S-pPHK и тРНК. Рекомбинантные ДНК клонировали в плазмидных векторах и определяли их транскрипционную активность после инъекции в ядра ооцитов X. laevis. Сегмент гена тРНКРго получен из нематоды С. elegans, а сегмент гена SS-pPHK-из X. borealis. Векторные последовательности, а также Mncflll-сайт, по которому соединены оба регуляторных сегмента, выделены двумя разными от

тенками серого цвета и стрелкой с буквой Н соответственно. Когда гибридная регуляторная область функционирует нормально, инициация транскрипции происходит примерно на 50 п.н. левее A-бокса гена тРНКРго. Поскольку обычно транскрипция тРНК-гена начинается примерно на 10 п. н. левее A-бокса, свой вклад в локализацию сайта инициации должен вносить и С-бокс гена 5S-pPHK.

20 пар оснований ICR гена 5S-pPHK. Эти данные свидетельствуют о том, что хотя ICR разных генов класса III различаются, они, по всей вероятности, представляют собой разновидности одного регуляторного элемента.

Влияние последовательностей, находящихся слева от точки инициации транскрипции (левых последовательностей), на регуляцию транскрипции некоторых генов класса III. Исходя из того факта, что присутствия ICR достаточно для инициации транскрипции генов 5S-pPHK ооцитов Xenopus, было высказано предположение, что по тому же принципу организованы все гены класса III. Однако это предположение оказалось не совсем верным. Для транскрипции генов других 5S-pPHK (например, из Xenopus [соматических], Bombyx, Drosophila, Neurospora, Saccharomyces и некоторых видов млекопитающих) необходима последовательность, находящаяся слева от точки инициации транскрипции. Так, делеция или замена последовательностей между парами —34 и — 11 в гене 5S-pPHK Bombyx mori и между парами — 39 и —26 в гене 5S-pPHK Drosophila приводит к блокированию их транскрипции. Для точной и эффективной инициации транскрипции большинства генов тРНК всех исследованных видов (за исключением Xenopus) тоже нужны левые 5'-последова- тельности, которые, по-видимому, характерны для данного вида, а не для гена. Так, левые 5'-участки генов многих тРНК и генов 5S-pPHK Bombyx гомологичны. К другим генам класса III, которым для точной и эффективной транскрипции нужны одновременно и левые 5'-последовательности, и элемент ICR, относятся гены вирусных VA- и EBER-PHK и ген 7SL-PHK.

Регуляция транскрипции некоторых генов класса III при помощи одних только левых последовательностей. Как это ни удивительно, но сделанный вначале вывод о том, что ICR являются единственными детерминантами регуляции транскрипции с участием РНК-полимеразы III, нашел свое неожиданное продолжение в случае генов 7SK-, U6-PHK и некоторых низкомолекулярных РНК (EBER) в геноме вируса Эпштейна-Барр: для их транскрипции используются только последовательности, находящиеся перед кодирующими областями. Кодирующая область гена U6-PHK содержит A-бокс, характерный для генов тРНК и для 5'-области ICR гена 5S-pPHK, но мутации, затрагивающие этот сегмент, или его полное удаление не влияют на транскрипцию, стимулированную левой 5'-последовательно- стью. В гене 7SK-PHK аналог A-бокса полностью отсутствует, поэтому неудивительно, что ген, полученный при слиянии сегмента из 243 п. н. левой последовательности гена 7SK-PHK (пары оснований от —245 до — 3) с совершенно неродственной последовательностью, транскрибируется с участием

РНК-полимеразы III in vitro и in vivo столь же эффективно, как и сам ген 7SK-PHK; аналогичные опыты с левыми последовательностями гена U6-PHK дают такой же результат. С другой стороны, для оптимальной транскрипции EBER-генов нужны как А- и В-боксы ICR, так и некоторые 5'-элементы, характерные для промоторов-энхансеров РНК-полимеразы II.

Если удалить последовательности между парами оснований —37 и — 3 левого элемента гена 7SK-PHK, то способность к транскрипции утрачивается (рис. 8.65). Показано также, что левая часть гена U6-PHK длиной не менее 79 п. н. необходима для активации транскрипции соседней последовательности in vitro. В обоих случаях для поддержания нормального уровня транскрипции in vivo нужны последовательности, находящиеся еще левее, между парами оснований —243 и —37 в 5'-фланкирующей последовательности гена 7SK-PHK и между парами оснований —315 и —79 в 5'-фланкирующей последовательности гена U6-PHK (разд. 8.3.ж). Интересно, что 5'-фланкирующие последовательности генов U6- и 7SK-PHK функционально взаимозаменяемы. Однако 5'-фланкирующая последовательность гена 7SL-PHK, для транскрипции которого нужны как внутренние, так и 5'-фланкирующие последовательности, не может заменить соответствующую область 78К-гена даже несмотря на то, что транскрипцию обоих генов катализирует РНК-полимераза III.

Весьма интересной особенностью левых областей генов U6- и 7SK-PHK является то, что они содержат последовательности, характерные для многих генов класса II (рис. 8.65). Так, у обоих генов между парами оснований —29 и —24 находится ТАТА-бокс. необходимый для эффективной инициации транскрипции. Более того, промоторы генов U6- и 7SK-PHK и промоторы генов других U-PHK содержат сходные элементы между парами —40 и — 50. Кроме того, в пределах нескольких сотен пар оснований левее промоторов генов U6- и 7SK-PHK встречаются элементы, характерные для промоторов и энхансеров генов класса II (разд. 8.3.з); в качестве примера можно привести GC-бокс (5'- GGGCGG-3 ) и октамер (5'-ATGCAAAT-3'). Насколько необходимы проксимальные и дистальные элементы промоторов и какова их физиологическая роль-неизвестно. Непонятно также, имеет ли какое-либо значение удивительное сходство между левыми регуляторными последовательностями промоторов генов U6- и 7SK-PHK. Вызывает интерес и высокая гомологичность между регуляторными последовательностями, находящимися левее гена U6-PHK, который относится к классу III, и регуляторными последовательностями генов, кодирующих РНК от U1 до U5 и относящихся к генам класса II

CTGCAGTАТТТAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAATCAA -243

(100%)

GTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTT I -154 (63%)

AGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTACGATAAGCAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGACTTCC1T III

-59-45-37

(25,3%)(24%)(21%)

CAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTCG III I I

-26-15-8-3 +1

(<1%)(<1%)(<1%) (<1%)

РИС. 8.65.

Нуклеотидная последовательность участка, фланкирующего ген 7SK-PHK с Б'-конца и начинающегося от пары оснований — 243. Депеции в этом участке получали при помощи эндонуклеазы Ва/ЗУ. Положение концевых нуклеотидов делетированных участков (считая с

(разд 8.3.з). Возможно, существуют факторы транскрипции, взаимодействующие с одинаковыми для генов классов II и III регуляторными последовательностями и осуществляющие совместную регуляцию разных наборов генов.

Еще одним указанием на физиологическую связь между сигналами транскрипции, осуществляемой с помощью РНК-полимераз II и III, служит тот факт, что в ДНК, кодирующей нетранслируемую лидерную последовательность гена класса И (гена с-тус), находится промотор для РНК-полимеразы III. Более того, сигнальные последовательности промоторов для обеих РНК-полимераз (И и III) инициируют транскрипцию, начинающуюся в одном и том же сайте. Однако транскрипция с участием РНК-полимеразы III прекращается в конце первого экзона, в то время как транскрипция, катализируемая РНК-полимеразой И, идет до конца. Первый экзон гена с-тус содержит A-бокс, но не содержит В-бокса, а кроме того, у него есть левые 5-последовательности, напоминающие те, которые необходимы для транскрипции генов 5S-pPHK и тРНК Bombyx mori. Контролируется ли транскрипция с-тус в клеточном цикле транскрипционными сигналами от обеих РНК-полимераз (II и III), пока неясно; неизвестна также и роль преждевременной терминации транскрипции, катализируемой РНК- полимеразой III.

Влияние факторов транскрипции на инициацию транскрипции

с участием РНК-полимеразы III

Для инициации транскрипции при участии РНК-полимеразы III нужны дополнительные белки,

Б'-конца) отмечено отрицательными числами. Так, мутант — 243 содержит 243 п. н. левее сайта инициации транскрипции (+1), а мутант -154- только 154 п.н. Числа в скобках-относительная эффективность транскрипции. [S. Murphy et al.. Cell 51 (1987), p. 81.]

три из которых уже идентифицированы. Для транскрипции всех генов класса III, зависящей от ICR, требуются факторы TFIIIB и TFIIIC (последний, как теперь известно, представляет собой смесь TFIIIC-1 и TFIIIC-2). TFIIIA нужен исключительно для транскрипции генов 5S-pPHK. Данные факторы транскрипции встречаются у всех эукариот; ни один из них не проявляет сколько-нибудь заметной видовой специфичности. Так, гены 5S-pPHK человека после введения в ядра ооцитов Xenopus транскрибируются столь же эффективно и точно, как и гены Xenopus; подобно этому, в клеточных экстрактах человека, содержащих РНК-полимеразу III и необходимые факторы, одинаково хорошо транскрибируются обе 5S-pPHK. Вначале к регуляторным участкам присоединяется не сама РНК-полимераза III, а вспомогательные факторы, которые формируют стабильные комплексы преинициации. О существовании таких комплексов свидетельствуют результаты, полученные в опытах по конкуренции матриц (см. разд. 8.2.в) и по связыванию с нитроцеллюлозными фильтрами, а также данные, полученные с помощью метода отпечатков и других методов.

Взаимодействие TFIIIB и TFIIIC с А- и В-бокса- ми. Опыты по конкуренции матриц помогли выявить некоторые особенности формирования комплекса между TFIIIB и TFIIIC, с одной стороны, и А- и В-боксами генов класса III-с другой. При совместной инкубации генов тРНК и VAI-РНК в системе транскрипции in vitro образуются оба РНК-продукта (рис. 8.66). Однако если перед добавлением РНК-полимеразы III одну из ДНК преинку- бировать с TFIIIB и TFIIIC, то при последующем добавлении второго гена будет преимущественно

12345Компоненты первой инкубационнойсмесиГенУА!ГенУАТГен тРНКГен VA1Ген VA1Ген тРНКTFIIIBТПП СTFIIIB, TFIIICTFIIIB,TFIIICTFIIIB,TFIIIC12345Компоненты первой инкубационнойсмесиГенУА!ГенУАТГен тРНКГен VA1Ген VA1Ген тРНКTFIIIBТПП СTFIIIB, TFIIICTFIIIB,TFIIICTFIIIB,TFIIICКомпоненты второй инкубационнойpollllГен тРНК pollllГен VA1 pollllГен тРНК TFIIICГен тРНК TFIIIBсмесиrNTPrNTPrNTPpollll rNTPpolHI rNTPКомпоненты второй инкубационнойpollllГен тРНК pollllГен VA1 pollllГен тРНК TFIIICГен тРНК TFIIIBсмесиrNTPrNTPrNTPpollll rNTPpolHI rNTPРИС. 8.66.

12345

Компоненты первой инкубационной

смеси

ГенУА!ГенУАТГен тРНКГен VA1Ген VA1

Ген тРНКTFIIIBТПП С

TFIIIB, TFIIICTFIIIB,TFIIICTFIIIB,TFIIIC

12345

Компоненты первой инкубационной

смеси

ГенУА!ГенУАТГен тРНКГен VA1Ген VA1

Ген тРНКTFIIIBТПП С

TFIIIB, TFIIICTFIIIB,TFIIICTFIIIB,TFIIIC

Компоненты второй инкубационной

pollll

Ген тРНК pollll

Ген VA1 pollll

Ген тРНК TFIIIC

Ген тРНК TFIIIB

смеси

rNTP

rNTP

rNTP

pollll rNTP

polHI rNTP

Компоненты второй инкубационной

pollll

Ген тРНК pollll

Ген VA1 pollll

Ген тРНК TFIIIC

Ген тРНК TFIIIB

смеси

rNTP

rNTP

rNTP

pollll rNTP

polHI rNTP

Образование стабильных комплексов между факторами транскрипции и регуляторными участками генов класса III. Преинкубация гена тРНК или VA-РНК с TFIIIB и TFIIIC приводит к тому, что при добавлении рибонуклеозидтрифосфатов (rNTP) и РНК-полимеразы III (pollll) начинается их транскрипция. Однако если пре- инкубировать один из генов-либо ген VA1-PHK транскрибироваться первая матрица (сравните дорожки 1 и 3 на рис. 8.66). Такая предпочтительная транскрипция указывает на то, что факторы образуют прочный комплекс с первым геном и поэтому не могут участвовать в транскрипции гена, добавленного позже. Отметим также, что не безразлично, какой из факторов инкубировали с матрицей первым (сравните дорожки 4 и 5 на рис. 8.66). Из полученных данных следует, что TFIIIC может образовывать комплекс с VA-ДНК самостоятельно. Более того, хотя бы один, а возможно, и оба фактора, по-видимому, остаются связанными с матрицей даже после многих циклов транскрипции.

Поскольку связывание TFIIIC блокирует расщепление в сайте рестрикции, находящемся в В-бок- се VA-ДНК, вероятно, в этом месте или рядом с ним имеется сайт связывания TFIIIC. Опыты с применением метода отпечатков отдельно с TFIIIC-1 и TFIIIC-2 показывают, что TFIIIC-1, в отличие от TFIIIC-2, не может самостоятельно образовывать прочную связь с ДНК. TFIIIC-2 защищает З'-часть

(дорожка 2), либо ген тРНК (дорожка 3)-со смесью TFIIIB и TFIIIC, а затем добавить другой ген вместе с полимеразой и субстрвтами, то транскрибироваться будет только проинкубированный РНК-ген. TFIIIC может образовывать комплекс преинициации с геном VA1- РНК (или геном тРНК) в отсутствие TFIIIB (дорожки 4 и 5). [А. В. Lasser et al.. Science 222 (1983), p. 740.]

регуляторной области, включая В-бокс, а связывание TFIIIC-1 расширяет «отпечаток» в 5'-направле- нии за рамки A-бокса к сайту начала транскрипции. Для формирования прочного комплекса с В- и A-боксами генов тРНК необходимы как TFIIIB, так и TFIIIC. При этом оба белка TFIIIC сначала взаимодействуют с В-боксом с образованием комплекса, стабильность которого зависит от специфической последовательности В-бокса, а затем происходит связывание TFIIIB, в результате чего стабилизируется комплекс преинициации. С этим комплексом, по-видимому, и взаимодействует РНК-полимераза III, инициируя транскрипцию в нужном месте. Возможно, связывание РНК-полимеразы III происходит исключительно за счет белок-белковых взаимодействий, путем образования специфических контактов с участками ICR или за счет взаимодействия с факторами транскрипции, связанными с регуляторными элементами слева от точки начала транскрипции.

Один из результатов, полученных в опытах in

vitro, подтверждается тем фактом, что ген тРНК, находясь в структуре хроматина, может правильно транскрибироваться под действием одной лишь РНК-полимеразы III, без добавления TFIIIB и TFIHC. В той же самой реакционной смеси ген VA-РНК, присутствующий в виде свободной ДНК, не транскрибируется до тех пор, пока не будут добавлены два необходимых фактора транскрипции. Следовательно, в хроматине белки TFIIIB и TF1IIC, по всей видимости, связаны с 1CR в стабильный комплекс, а удаление гистонов с ДНК приводит к отщеплению факторов транскрипции.

Комплексы преинициации, содержащие гены 5S-PHK и факторы транскрипции. Описанные выше методы использовали для изучения роли факторов транскрипции в активации инициации транскрипции генов 5S-pPHK. Было показано, что для инициации процесса необходимы специфические факторы и упорядоченность в их связывании (рис. 8.67). TFIIIA в отсутствие других факторов образует нестабильный комплекс с ICR. TFIIIC сам по себе не присоединяется к ICR, однако он связывается с комплексом TFIIIA -5S-pPHK и в значительной мере стабилизирует его. Сколько TF1 ПС-факторов нужно для этой стабилизации-один или оба-неясно. Последовательности, ответственные за взаимодействие TFIIIA с 58-ДНК, находятся в С-боксе между парами оснований +80 и +90, хотя в связывании участвуют также нуклеотиды между парами оснований + 50 и +64 (A-бокс). Стабилизация комплекса TFIIIA- 5S-pPHК под действием TFIIIC, по-види- мому, достигается благодаря взаимодействиям между двумя факторами транскрипции и контактам между TFIIIC и A-боксами. TFI1IB сам по себе не присоединяется к свободной 58-рДНК и не меняет отпечаток, получающийся при связывании ДНК с TFIIIA и TFIIIC. Тем не менее TFIIIB необходим для транскрипции, катализируемой РНК-полимера- зой III. Вероятно, он участвует в образовании муль- тибелкового комплекса, с которым ассоциируется РНК-полимераза III перед началом транскрипции. Поскольку TFIIIA является единственным фактором транскрипции, способным самостоятельно узнавать и связывать ICR 58-рДНК, было очень важно изучить механизм и специфичность его связывания

Молекулярное строение ТЕША. TFIIIA Xenopus является цинксодержащим металлопротеином с мол массой 40 кДа. Его аминокислотная последовательность, состоящая из 344 остатков, была определена из данных о нуклеотидной последовательности соответствующей кДНК. Клонированный ген белка TFIIIA Xenopus имеет длину 11 т. п. н. и содержит восемь интронов. Примерно две трети аминокислот TFIIIA со стороны N-конца (остатки 13-276) образуют девять копий несовершенного no

ICRss-днк

TFIIIA

ICR-TFIIIA

Нестабильный комплекс

TFIIIC

^TFIIIA

ICR |^TFIIIC

Стабильный комплекс

TFIIIB

РИС. 8.67.

Упорядоченное связывание факторов транскрипции с внутренней регуляторной областью (ICR) гена 5S-pPHK. Возможно, связывание TFIIIB и РНК-полимеразы III (pollll) на самом деле осуществляется одновременно, а не так, как это показано на рисунке. Как видно из рисунка, комплекс преинициации сохраняется на протяжении всего цикла транскрипции.

втора, состоящего примерно из 30 аминокислот, при этом каждая копия обязательно содержит два остатка цистеина и гистидина (рис. 8.68). Участки гена TFIIIA, кодирующие повторы из 30 аминокислот, разделены интронами. Весь С-концевой домен не содержит никаких повторов и кодируется одним экзоном.

По данным атомной абсорбционной спектроскопии, с молекулой очищенного белка связано девять (+ один) атомов цинка. Детальный рентгенострук-

Каноническая последовательности т G Е кКаноническая последовательности т G Е к8813132323262630302233556688992772771 MG1 MGЕ К АЕ К Аввк кк к1338133868689999NN130130160189160189215215247247ОРЕОРЕ312312A G - О О -A G - О О -ЕЕЕЕККSS^¥I С S FA DC G А А ¥N К NWK L О 1А Н L С 1К Н37Р FР С К ЕЕ G С Е К G FT S L Н Н L T •R Н S L •Т н67N FT С D SDG С D L R FT T К A N М К •К Н F N RF Н98V YV С Н FENC G К A FК К Н N Q L К •VH О F •S Н129Р YЕ С Р НЕ G С D К R ГS L Р S R L К •R Н Е К ‘V Н159- YР с к к0 D S С S F VG К T W Т L ¥ LК Н V А ЕС н188L АV с - -D VC N R К FR Н К D Y L R •D Н Q К 1т к214V ¥L С Р RDGC D R S ¥T Т A F N L R •S Н 1 О SF Н246Р FV С Е НA G C G К С FА М К К S L Е •R Н S V •V н276К ЕК С Р RР К R S L A SR L Т G Y I Р РК S К Е КN А311Е КT D S LV К N К Р S GTETNGSLVL D К L Т1 Q344^¥I С S FA DC G А А ¥N К NWK L О 1А Н L С 1К Н37Р FР С К ЕЕ G С Е К G FT S L Н Н L T •R Н S L •Т н67N FT С D SDG С D L R FT T К A N М К •К Н F N RF Н98V YV С Н FENC G К A FК К Н N Q L К •VH О F •S Н129Р YЕ С Р НЕ G С D К R ГS L Р S R L К •R Н Е К ‘V Н159- YР с к к0 D S С S F VG К T W Т L ¥ LК Н V А ЕС н188L АV с - -D VC N R К FR Н К D Y L R •D Н Q К 1т к214V ¥L С Р RDGC D R S ¥T Т A F N L R •S Н 1 О SF Н246Р FV С Е НA G C G К С FА М К К S L Е •R Н S V •V н276К ЕК С Р RР К R S L A SR L Т G Y I Р РК S К Е КN А311Е КT D S LV К N К Р S GTETNGSLVL D К L Т1 Q344ННR НR НВ KR F ТВ KR F ТG СG СккР V V ¥ КР V V ¥ КRR1212G ЕG ЕККККG ЕG ЕССR ТR ТК ЕК ЕЕ ОЕ ОRRR КR КV SV SG ТG ТI КО ОI КО ОРИС. 8.68.

Каноническая последовательности т G Е к

Каноническая последовательности т G Е к

8

8

13

13

23

23

26

26

30

30

2

2

3

3

5

5

6

6

8

8

9

9

277

277

1 MG

1 MG

Е К А

Е К А

в

в

к к

к к

13

38

13

38

68

68

99

99

N

N

130

130

160

189

160

189

215

215

247

247

ОРЕ

ОРЕ

312

312

A G - О О -

A G - О О -

Е

Е

Е

Е

К

К

S

S

^¥

I С S F

A DC G А А ¥

N К NWK L О 1

А Н L С 1

К Н

37

Р F

Р С К Е

Е G С Е К G F

T S L Н Н L T •

R Н S L •

Т н

67

N F

T С D S

DG С D L R F

T T К A N М К •

К Н F N R

F Н

98

V Y

V С Н F

ENC G К A F

К К Н N Q L К •

VH О F •

S Н

129

Р Y

Е С Р Н

Е G С D К R Г

S L Р S R L К •

R Н Е К ‘

V Н

159

- Y

Р с к к

0 D S С S F V

G К T W Т L ¥ L

К Н V А Е

С н

188

L А

V с - -

D VC N R К F

R Н К D Y L R •

D Н Q К 1

т к

214

V ¥

L С Р R

DGC D R S ¥

T Т A F N L R •

S Н 1 О S

F Н

246

Р F

V С Е Н

A G C G К С F

А М К К S L Е •

R Н S V •

V н

276

К Е

К С Р R

Р К R S L A S

R L Т G Y I Р Р

К S К Е К

N А

311

Е К

T D S L

V К N К Р S G

TETNGSLV

L D К L Т

1 Q

344

^¥

I С S F

A DC G А А ¥

N К NWK L О 1

А Н L С 1

К Н

37

Р F

Р С К Е

Е G С Е К G F

T S L Н Н L T •

R Н S L •

Т н

67

N F

T С D S

DG С D L R F

T T К A N М К •

К Н F N R

F Н

98

V Y

V С Н F

ENC G К A F

К К Н N Q L К •

VH О F •

S Н

129

Р Y

Е С Р Н

Е G С D К R Г

S L Р S R L К •

R Н Е К ‘

V Н

159

- Y

Р с к к

0 D S С S F V

G К T W Т L ¥ L

К Н V А Е

С н

188

L А

V с - -

D VC N R К F

R Н К D Y L R •

D Н Q К 1

т к

214

V ¥

L С Р R

DGC D R S ¥

T Т A F N L R •

S Н 1 О S

F Н

246

Р F

V С Е Н

A G C G К С F

А М К К S L Е •

R Н S V •

V н

276

К Е

К С Р R

Р К R S L A S

R L Т G Y I Р Р

К S К Е К

N А

311

Е К

T D S L

V К N К Р S G

TETNGSLV

L D К L Т

1 Q

344

Н

Н

R Н

R Н

В KR F Т

В KR F Т

G С

G С

к

к

Р V V ¥ К

Р V V ¥ К

R

R

12

12

G Е

G Е

К

К

К

К

G Е

G Е

С

С

R Т

R Т

К Е

К Е

Е О

Е О

R

R

R К

R К

V S

V S

G Т

G Т

I К

О О

I К

О О

Аминокислотная последовательность фактора ТЕША из X. laevis (использовано однобуквенное обозначение аминокислот; см. рис. 1.24). Последовательность расположена на рисунке таким образом, чтобы выделить повторяющиеся элементы. Молекула состоит из следующих сегментов: N-концевого участка (остатки 1-12), девяти повторов (остатки 13 276), богатого лизином участка вблизи С-конца и короткого концевого участка. Вверху представлена каноническая последовательность-пронумерованные от 1 до 30 обозначения, заключенные в кружки,- которая иллюстрирует характерные особенности типичного повтора. Конечная точка

турный анализ с высоким разрешением показал, что каждый такой атом образует хелатные связи с парами цистеиновых и гистидиновых остатков, находящимися в одном из повторов (рис. 8.69). Наибольшее предпочтение отдается структурной модели TFIIIA, в соответствии с которой белок имеет девять цинковых пальцев, в каждом из которых атом цинка координационно связан с четырьмя аминокислотными остатками (два остатка цистеина и два-гистидина) (рис. 8.69). Участки между этими спаренными остатками цистеина и гистидина всегда содержат фенилаланин (или тирозин) и лейцин (или метионин) и разное число основных аминокислот (рис. 8.68 и 8.69). Перед каждым цинковым пальцем обязательно находится остаток тирозина или фенилаланина, а между двумя цистеинами обычно расположен кислый остаток. Основные и другие остатки, входящие в состав пальцев, образуют ДНК-связывающий участок TFIIIA.

По-видимому, TFIIIA связывается с последовательностью длиной примерно 50 п. н.. входящей в ICR гена 5S-pPHK, при этом каждый из девяти цинковых пальцев контактирует с участком длиной ~ 5 п. н. Как показали опыты по определению чувствительности ДНК в составе ДНК-белкового комплекса к действию диметилсульфата и микро

каждой единицы выбрана произвольно после ИЗО. Наиболее высококонсервативные остатки выделены цветом. Предполагается, что С8, С13. Н26 и НЗО связывают ион Zn2+. Гидрофобные остатки Y6, F7 и L23, вероятно, образуют внутренний каркас предполагаемой мультидоменной структуры. Звездочками (*) отмечены позиции, в которых иногда в норме присутствуют вставки, а черточками в повторах-пропуски аминокислот на рисунке. Точками отмечены вариабельные участки последовательности. [J. Miller et al., EMBO J. 4 (1985), p. 1609.]

кокковой нуклеазы, контакты между TFIIIA и ДНК осуществляются через каждые 5 п. н., что равно половине витка спирали. Однако, за исключением возможной периодичности в расположении остатков гуанина, в ICR нет никаких явных повторов, которые могли бы формировать одинаковые сайты связывания для каждого из девяти пальцев. В настоящее время принята модель связывания, предполагающая, что TFIIIA взаимодействует с кластерами гуанина, располагаясь вдоль одной стороны двойной спирали (рис. 8.70). Существование таких множественных контактов позволяет объяснить стабильность комплекса TFIIIA-TF1IIC-ICR и сохранение его целостности при многократных циклах транскрипции, во время которых РНК-полимераза перемещается вдоль ДНК, отсоединяя последовательно один или несколько пальцев. Некоторые факторы транскрипции, осуществляемой с помощью РНК-полимеразы II, для связывания с родственными регуляторными последовательностями тоже используют цинковые пальцы (разд. 8.3.д и е; 8.6.а).

Был проведен неполный протеолиз белка TFIIIA и определена активность его укороченных форм разной длины. Оказалось, что область, отвечающая за активацию транскрипции генов 5S-pPHK, состоит

РИС. 8.69.Цинковые пальцы: укладка линейных повторяющихся доменов белкового фактора ТЕША. В основе каждого пальца лежит тетраэдрическая структура, образуемая связанными с ионами цинка лигандами. Указаны только важные для образования структуры остатки. Цветными кружками обозначены консервативные аминокислоты цистеин (С) и гистидин (Н), связанные с ионом цинка; отрицательно заряженный аспарагин 11 (D) и три гидрофобные группы. Черные кружки-это боковые группы, по-видимому взаимодействующие с ДНК. Согласно модели, ион цинка сближает концы каждого повтора способствуя формированию ДНК-связывающей петли, или «пальца», с участием центральных остатков 14-25. [J. Miller et al.. EMBO. J. 4 (1985) p. 1609.]РИС. 8.69.Цинковые пальцы: укладка линейных повторяющихся доменов белкового фактора ТЕША. В основе каждого пальца лежит тетраэдрическая структура, образуемая связанными с ионами цинка лигандами. Указаны только важные для образования структуры остатки. Цветными кружками обозначены консервативные аминокислоты цистеин (С) и гистидин (Н), связанные с ионом цинка; отрицательно заряженный аспарагин 11 (D) и три гидрофобные группы. Черные кружки-это боковые группы, по-видимому взаимодействующие с ДНК. Согласно модели, ион цинка сближает концы каждого повтора способствуя формированию ДНК-связывающей петли, или «пальца», с участием центральных остатков 14-25. [J. Miller et al.. EMBO. J. 4 (1985) p. 1609.]примерно из 20 аминокислот, расположенных вблизи С-конца белковой молекулы; эта область не участвует в связывании TFIIIA с ICR. Остальная часть белковой молекулы, составляющая 75% ее длины и содержащая девять цинковых пальцев и N-конец, отвечает за прочное связывание с ICR; эта область неспособна активировать транскрипцию. Модель, обобщающая все эти положения, представлена на рис. 8.71.

РИС. 8.69.

Цинковые пальцы: укладка линейных повторяющихся доменов белкового фактора ТЕША. В основе каждого пальца лежит тетраэдрическая структура, образуемая связанными с ионами цинка лигандами. Указаны только важные для образования структуры остатки. Цветными кружками обозначены консервативные аминокислоты цистеин (С) и гистидин (Н), связанные с ионом цинка; отрицательно заряженный аспарагин 11 (D) и три гидрофобные группы. Черные кружки-это боковые группы, по-видимому взаимодействующие с ДНК. Согласно модели, ион цинка сближает концы каждого повтора способствуя формированию ДНК-связывающей петли, или «пальца», с участием центральных остатков 14-25. [J. Miller et al.. EMBO. J. 4 (1985) p. 1609.]

РИС. 8.69.

Цинковые пальцы: укладка линейных повторяющихся доменов белкового фактора ТЕША. В основе каждого пальца лежит тетраэдрическая структура, образуемая связанными с ионами цинка лигандами. Указаны только важные для образования структуры остатки. Цветными кружками обозначены консервативные аминокислоты цистеин (С) и гистидин (Н), связанные с ионом цинка; отрицательно заряженный аспарагин 11 (D) и три гидрофобные группы. Черные кружки-это боковые группы, по-видимому взаимодействующие с ДНК. Согласно модели, ион цинка сближает концы каждого повтора способствуя формированию ДНК-связывающей петли, или «пальца», с участием центральных остатков 14-25. [J. Miller et al.. EMBO. J. 4 (1985) p. 1609.]

Свой вклад в связывание вносят все цинковые пальцы, но в первую очередь два N-концевых паль-

ца, взаимодействующих с С-боксом.

ОстальныеОстальныепальцы контактируют

Остальные

Остальные

с A-боксом ис A-боксом иучасткомучасткомв условиях, нев условиях, нессТЕША сТЕША сцинковых пальцевцинковых пальцевБепковая цепь располагаетсяБепковая цепь располагаетсяты, отделены друг от друга десятью парами нукпеоти- дов, при этом каждые два соседних пальца подходят к М7-атомам остатков гузнинз с резных сторон. [L. Fairall et al., J. Mol. Biol. 192 (1986), p. 577.]ты, отделены друг от друга десятью парами нукпеоти- дов, при этом каждые два соседних пальца подходят к М7-атомам остатков гузнинз с резных сторон. [L. Fairall et al., J. Mol. Biol. 192 (1986), p. 577.]РИС. 8.70.

с A-боксом и

с A-боксом и

участком

участком

в условиях, не

в условиях, не

с

с

ТЕША с

ТЕША с

цинковых пальцев

цинковых пальцев

Бепковая цепь располагается

Бепковая цепь располагается

ты, отделены друг от друга десятью парами нукпеоти- дов, при этом каждые два соседних пальца подходят к М7-атомам остатков гузнинз с резных сторон. [L. Fairall et al., J. Mol. Biol. 192 (1986), p. 577.]

ты, отделены друг от друга десятью парами нукпеоти- дов, при этом каждые два соседних пальца подходят к М7-атомам остатков гузнинз с резных сторон. [L. Fairall et al., J. Mol. Biol. 192 (1986), p. 577.]

Модель взаимодействия двойной спиралью ДНК

no одну сторону спирали ДНК, з пальцы укладываются в большую бороздку поочередно «спереди» и «сзади». Пальцы, образующие структурно эквивалентные контак-

между двумя боксами; вклад последних в энергию взаимодействия менее существен (рис. 8.61). Какие именно аминокислоты отвечают за узнавание различных элементов ICR, точно неизвестно.

Участок вблизи С-конца может активировать транскрипцию, либо влияя прямо на РНК-полимеразу III, либо взаимодействуя с TFIIIB и/или TFIIIC. Известно, что TFIIIB и TFIIIC стабилизируют связывание TFIIIA с ICR, однако участвуют ли эти факторы также и в активации инициации транскрипции под действием полимеразы, неясно. Тот факт, что TFIIIB и TFIIIC могут стимулировать транскрипцию всех других генов класса III, позволяет предположить, что они принимают непосредственное участие в инициации транскрипции, катализируемой РНК-полимеразой III.

Остается ли стабильным комплекс, образующийся в результате взаимодействия трех факторов транскрипции с ICR, во время перемещения РНК- полимеразы III в процессе транскрипции последовательности, находящейся за регуляторной областью? Чтобы ответить на этот вопрос, изучали транскрипцию гена 58-рРНК, сшитого с бактериальным промотором таким образом, чтобы последовательность 58-рДНК могла транскрибироваться in vitro с помощью очищенных препаратов бактериальной РНК-полимеразы. Было показано, что в условиях,

при которых РНК-полимераза III правильно транскрибирует ген 5S-pPHK, бактериальная полимераза также эффективно транскрибирует этот ген как в присутствии, так и в отсутствие трех факторов транскрипции. После транскрипции с помощью бактериальной РНК-полимеразы 58-рРНК нормально синтезируется в присутствии одной только РНК-полимеразы III. Это говорит о том, что комплекс преинициации, содержащий 58-рДНК, TFIIIA, TFIIIB и TFIIIC, не разрушается во время транскрипции с участием бактериальной РНК-полимеразы. Существенно, что транскрипция, катализируемая бактериальной РНК-полимеразой, протекала

обеспечивающих повторную сборку

РИС. 8.71.Структура фактора транскрипции ТЕША и его взаимодействие с внутренней регуляторной областью (ICR) гена 5S-pPHK. Элемент ICR, находящийся между парами оснований + 50 и + 90, изображен вместе с 5'-концом значащей цепи. N-конец белковой цепи-располагается на рисунке справа, а С-конец-слева. Об ее ориентации относительно ДНК см. в тексте. У М-конца располагаются девять повторяющихся единиц (остаткиРИС. 8.71.Структура фактора транскрипции ТЕША и его взаимодействие с внутренней регуляторной областью (ICR) гена 5S-pPHK. Элемент ICR, находящийся между парами оснований + 50 и + 90, изображен вместе с 5'-концом значащей цепи. N-конец белковой цепи-располагается на рисунке справа, а С-конец-слева. Об ее ориентации относительно ДНК см. в тексте. У М-конца располагаются девять повторяющихся единиц (остатки1 -276)-цинковых пальцев, взаимодействующих с ICR. На эту часть белковой молекулы приходится 30 кДа. Остатки 277-344 охватывают богатую лизином область и С-концевой участок. Вместе они образуют домен с массой 10 кДа. Цинковые пальцы располагаются относительно молекулы ДНК так, как это представлено на рис. 8.70. [J. Miller et al., EMBO J. 4 (1985), p. 1609]1 -276)-цинковых пальцев, взаимодействующих с ICR. На эту часть белковой молекулы приходится 30 кДа. Остатки 277-344 охватывают богатую лизином область и С-концевой участок. Вместе они образуют домен с массой 10 кДа. Цинковые пальцы располагаются относительно молекулы ДНК так, как это представлено на рис. 8.70. [J. Miller et al., EMBO J. 4 (1985), p. 1609]комплекса преинициации в случае его диссоциации. Если бы комплекс диссоциировал, то из-за невозможности его повторного образования до или после добавления РНК-полимеразы III синтез 5S-pPHK не осуществился бы. Хотя это до сих пор и не доказано, считается, что комплекс 58-рДНК с факторами транскрипции также не разрушается при повторных циклах транскрипции с участием РНК-полимеразы III. Благодаря тому, что область контактирования домена из девяти повторяющихся цинковых пальцев с ICR-последовательностью из 50 п. н. (рис. 8.71) достаточно протяженна, одни ДНК-белковые связи в ходе транскрипции разрушаются, а другие восстанавливаются.

РИС. 8.71.

Структура фактора транскрипции ТЕША и его взаимодействие с внутренней регуляторной областью (ICR) гена 5S-pPHK. Элемент ICR, находящийся между парами оснований + 50 и + 90, изображен вместе с 5'-концом значащей цепи. N-конец белковой цепи-располагается на рисунке справа, а С-конец-слева. Об ее ориентации относительно ДНК см. в тексте. У М-конца располагаются девять повторяющихся единиц (остатки

РИС. 8.71.

Структура фактора транскрипции ТЕША и его взаимодействие с внутренней регуляторной областью (ICR) гена 5S-pPHK. Элемент ICR, находящийся между парами оснований + 50 и + 90, изображен вместе с 5'-концом значащей цепи. N-конец белковой цепи-располагается на рисунке справа, а С-конец-слева. Об ее ориентации относительно ДНК см. в тексте. У М-конца располагаются девять повторяющихся единиц (остатки

1 -276)-цинковых пальцев, взаимодействующих с ICR. На эту часть белковой молекулы приходится 30 кДа. Остатки 277-344 охватывают богатую лизином область и С-концевой участок. Вместе они образуют домен с массой 10 кДа. Цинковые пальцы располагаются относительно молекулы ДНК так, как это представлено на рис. 8.70. [J. Miller et al., EMBO J. 4 (1985), p. 1609]

1 -276)-цинковых пальцев, взаимодействующих с ICR. На эту часть белковой молекулы приходится 30 кДа. Остатки 277-344 охватывают богатую лизином область и С-концевой участок. Вместе они образуют домен с массой 10 кДа. Цинковые пальцы располагаются относительно молекулы ДНК так, как это представлено на рис. 8.70. [J. Miller et al., EMBO J. 4 (1985), p. 1609]

Иная картина наблюдается при репликации ДНК. входящей в комплекс. Эти данные были получены при введении области ori репликации ДНК SV40 в плазмиду, содержащую ген 58-рРНК. После сборки комплекса преинициации, аналогичного рассмотренному выше, добавляли компоненты, необходимые для репликации плазмиды in vitro, а после репликации ДНК-РНК-полимеразу III и проверяли, синтезируется ли 58-рРНК. В этом случае 58-рРНК синтезировалась только при добавлении трех факторов транкрипции, когда мог вновь образоваться комплекс преинициации. Более того, при расщеплении реплицированной ДНК под действием ДНКазы 1 образовывались такие же продукты, что и при расщеплении свободной ДНК; следовательно, ТЕША и TFIIIC не были связаны с ДНК. Очевидно, комплекс 58-рРНК с тремя фак

торами транскрипции разрушается во время репликации, но не во время транскрипции ДНК. Нестабильность комплекса при репликации ДНК может объясняться тем, что для успешной работы комплекса репликации должно произойти расплетание протяженных участков двойной спирали.

Терминация транскрипции

с участием РНК-полимеразы III

В отличие от инициации транскрипции, для которой необходимы сложные регуляторные последовательности, а также- помимо самой полимеразы определенные белки, для терминации транскрипции нужен только сам фермент и кластер дезоксиадени- латных остатков на матричной цепи. Терминация in vitro осуществляется правильно в присутствии вы- сокоочищенной РНК-полимеразы III и двухцепочечной ДНК-матрицы. Точная и эффективная терминация происходит даже при транскрипции генов класса III, у которых нет ICR; таким образом, взаимодействие матрицы с ТЕША, TFII1B или TFIIIC никак не влияет на процесс терминации. Для идентификации сигнала терминации использовались специально сконструированные транскрипционные матрицы клонированных ДНК. Как показали эти опыты, в терминации участвует кластер из дезокси- аденилатных остатков и определенные фланкирующие его последовательности (табл. 8.2). Например, если четыре дезоксиаденилатных остатка матричной цепи фланкированы остатками дезокситимидиловой

Таблица 8.2. Сайты терминации транскрипции при участии РНК-полимеразы III11

Сайты эффективной терминации•

Xenopus borealis (гены соматических клеток)

Xenopus borealis (гены ооцитов, тип I)

Xenopus borealis (гены ооцитов, тип 3) Аденовирус VAI tPHKa1j Bombyx то i

Саиты относительно неэффективной терминации

Xenopus laevis (гены ооцитов, тип I)

Сайты неэффективной терминации

Xenopus laevis (гены ооцитов, гип 2)

Xenopus laevis (псевдоген ооцитов)

5-TAGGCTTTTGCACT-3'- TAGGCTTTTAGACT- TAGTCTTTTTCCAGGCTCCTTTTGGCTT- ACGATTTTGTTAT- TAGGCTTTTCAAAG5-TAGGCTTTTGCACT-3'- TAGGCTTTTAGACT- TAGTCTTTTTCCAGGCTCCTTTTGGCTT- ACGATTTTGTTAT- TAGGCTTTTCAAAG- TAGGCTTTCCAAAG-AGAAGTTTTCAAAG- TAGGCTTTCCAAAG-AGAAGTTTTCAAAG11 Сайты терминации для РНК-полимеразы 111 находятся на 3 конце последовательности, кодирующей 5S-pPHK за З'-конЦом последовательности, кодирующей 1 РНК. Как правило, терминация происходит в пределах кластера Т (подчеркнут), а не у какого-то определенного остатка Т. Сайты относительно неэффективной ерминации содержат короткие A-повторы, расположенные перед кластерами Т или за ними. Транскрипт 5S-pPHK не подвергается процессии! у на З'-конце, но у транскриптов тРНК-генов нуклеотиды с З'-конца должны быть удалены, чтобы произошло присоеди- неше З'-САА-копца и образовались зрелые тРНК. [D. F. Bogen- bagen D. D. Brown, Cell 24. (1981), p. 261].

5-TAGGCTTTTGCACT-3'

- TAGGCTTTTAGACT

- TAGTCTTTTTCCAG

GCTCCTTTTGGCTT

- ACGATTTTGTTAT

- TAGGCTTTTCAAAG

5-TAGGCTTTTGCACT-3'

- TAGGCTTTTAGACT

- TAGTCTTTTTCCAG

GCTCCTTTTGGCTT

- ACGATTTTGTTAT

- TAGGCTTTTCAAAG

- TAGGCTTTCCAAAG

-AGAAGTTTTCAAAG

- TAGGCTTTCCAAAG

-AGAAGTTTTCAAAG

кислоты, то терминация происходит неэффективно, в отличие от того случая, когда с одной стороны дезоксиаденилатного кластера находится динуклеотид CG, а с другой GC (5'-GCAAAAGC-3'). Последнее имеет место в случае гена 5S-pPHK соматических клеток Xenopus borealis. Мутации, приводящие к изменению числа аденилатных остатков в кластере, уменьшают эффективность терминации. Синтез РНК прекращается при спаривании остатка уридиловой кислоты с одним из дезоксиаденилат- ных остатков. Ни отдаленные последовательности, ни вторичная структура РНК, по-видимому, на терминацию не влияют. Если в клонированном гене делегирован З'-конец гена 5S-pPHK, то транскрипция продолжается до тех пор, пока РНК-полимераза III не дойдет до соответствующего случайного сигнала во фланкирующей вектор последовательности. А если аденилатный кластер ввести в произвольное место матричной цепи какого-либо гена класса III, то терминация часто осуществляется в этом модифицированном сайте.

Регуляция экспрессии генов5S-pPHK

в процессе развития организма

Два вида генов 5S-pPHK Xenopus. Существенные изменения в экспрессии генов 5S-pPHK наблюдаются в процессе дифференцировки и развития Xenopus (табл. 8.3). На ранних этапах оогенеза происходят быстрый рост ооцитов и синтез большого количества 5S-pPHK, необходимой для удовлетворения потребности в рибосомах в ходе раннего эмбриогенеза. В зрелом яйце, напротив, никакие РНК не синтезируются. Синтез всех РНК, в том числе и 5S-pPHK, возобновляется на стадии бластулы (4000 клеток) или чуть раньше и продолжается затем при жизни взрослого организма.

Два разных набора генов 5S-pPHK экспрессируются на нескольких стадиях развития. Одни экспрессируются почти исключительно на стадии ооцита (гены 5S-pPHK ооцита), вторые- как в ооцитах, так и в соматических клетках развивающегося эмбриона, а также в тканях взрослого организма (гены соматической SS-рРНК). Таким образом, несмотря на примерно одинаковое число транскриптов ооци- тарной и соматической 5S-pPHK в бластуле, на стадии головастика и последующих стадиях более 98% 5S-pPHK относятся к соматическому типу. Эта Таблица 83. Изменение соотношения между ооцитарной и соматической 5S-pPHK и содержание ТЕША в клетках в процессе развития Xenopus11

Стадия развития

П реобладающий тип синтезируемой 5S-pPHK

Число молекул TFII1A на ген 5S-pPHK

Незрелый ооцит j рост

Ооцитарная

5-Ю7

Зрелый ооцит [мейоз I

»

5- I06

Hi

Эи

^оплодотворенное яйцо

мейоз II

оплодотворение - деление клетки лбрион на стадии

РНК не синтезируется

4- I05

бластулы (4000 клеток)

I деление клетки

1 дифференцировка Эмбрион на стадии

Поровну

10

гаструлы

деление клетки

. дифференцировка

Соматическая

2

Плавающий головастик

»

0,4

11 W. М. Wormington et al., Cold Spring Harbor Symposium 47 (1982), p. 879.

разница в экспрессии становится особенно впечатляющей, если учесть, что в геноме X enopus содержится около 20000 генов 5S-pPHK ооцита и только около 400 генов соматической 5S-pPHK (разд. 9.2.6). Чем же объясняется преимущественная экспрессия генов 5S-pPHK ооцита в ооцитах и их репрессия в соматических клетках? Каким образом гены соматической 5S-pPHK «одерживают верх» и становятся почти единственной матрицей для синтеза 5S-pPHK в соматических клетках? Теперь мы знаем, что дифференциальное функционирование генов опосредуется регуляцией транскрипции, причем эта регуляция, по-видимому, зависит от нескольких параметров. К ним относятся: меняющееся в процессе развития содержание факторов транскрипции (особенно TFIIIA, но, возможно, и других), разная стабильность комплексов ооцитарных и соматических генов с этими факторами, структура хроматина, в который упакованы 58-рДНК обоих типов, время репликации 58-рДНК каждого типа в течение S-фазы.

Дифференциальная экспресеия генов in vitro. Несмотря на упомянутые выше количественные различия, в структурном отношении гены ооцитарной и соматической 58-рРНК различаются мало. Эти различия затрагивают главным образом от трех до шести пар оснований (в зависимости от вида) в последовательности, находящейся вблизи 5'-конца ICR (рис. 8.72). Транскрипция клонированных генов соматической 58-рРНК примерно в пять раз более эффективна, чем транскрипция клонированных генов ооцитарной 58-рРНК при использовании и тех и других в качестве матриц либо с экстрактами соматических клеток или ооцитов, либо с очищенной РНК-полимеразой III в присутствии TFIIIA, TFIIIB и TFI1IC. Это не очень большое различие

Ген 5’

клеток , зо соматических GCCTACGGCCACACCACCCTGAAAGTGCCC ооцитов Т

60 соматических GATCTCGTCTGATCTCGGA AGCC A A GCAGG ооцитов A G ТА

90 соматических GTTСGGGCCTGGTTAGTACTTGGATGGGAG ооцитов С

120 соматическихдСССССТСССААТАССАССТСТССТАСССТТ ооцитов G

РИС. 8.72.

Нуклеотидные последовательности соматических и ооцитарных генов 5S-pPHK X. laevis. Приведены только первые 120 нуклеотидов значащих цепей с указанием оснований, разных в генах двух типов. Закрашенные прямоугольники внутренняя регуляторная область. [P.J. Ford, R. D. Brown, Cell 8 (1976), р. 485.]

в эффективности транскрипции, вероятно, отражает несколько более высокое сродство TFIIIA к ICR соматических генов. Но, поскольку в клетках число генов ооцитарной 58-рРНК в 50 раз превышает число генов соматической 58-рРНК, кажется маловероятным, что несколько более высокое сродство TFIIIA к ICR генов соматических клеток может объяснить дифференциальную экспрессию, наблюдаемую in vivo.

После того как было показано, что картина дифференциальной экспрессии генов может быть воспроизведена с использованием очищенного хроматина в качестве матрицы для РНК-полимеразы III. появилась возможность исследовать регулятор экспрессии in vitro. Неоплодотворенные яйца или клетки на ранних стадиях развития бластулы вообще не синтезируют РНК, а хроматин, выделенный из таких клеток, не поддерживает синтез 58-рРНК при инкубации с РНК-полимеразой III. Напротив, при транскрипции хроматина, выделенного из ооцитов, образуются 58-рРНК в основном ооцитарного типа, тогда как при транскрипции в тех же условиях хроматина из соматических клеток преимущественно соматическая 58-рРНК. Для синтеза ооцитарной или соматической 58-рРНК при использовании соответственно хроматина ооцитов или хроматина соматических клеток в качестве матриц необходимо добавить лишь РНК-полимеразу III. Таким образом, гены в хроматине, вероятно, ассоциированы с тремя факторами транскрипции, образуя комплекс преинициации. Но даже при добавлении этих факторов вместе с полимеразой ооцитарные гены не транскрибируются в хроматине соматических клеток. Однако если хроматин соматических клеток вначале экстрагировать 0,6 М NaCl, а затем добавить три фактора транскрипции вместе с полимеразой, то может произойти транскрипция генов ооцитарной 58-рРНК в составе хроматина соматических клеток. Добавление соли не влияет на транскрипцию генов соматической 5S-PHK, для которой по-прежнему требуется только РНК-полимераза III. Этот феномен можно объяснить, в частности, тем, что гены ооцитов в репрессированном хроматине не содержат требуемых факторов транскрипции и невосприимчивы к факторам, добавленным извне, или тем, что в репрессированном хроматине имеется потенциально активный комплекс, но он недоступен для полимеразы. Возможно, разрушение хроматиновой структуры при солевой экстракции «раскрывает» хроматин или удаляет какие-то белки, и в результате гены ооцитов ассоциируют с добавленными факторами и РНК-полимеразой III и восстанавливают свою транскрипционную активность.

Гистоны нуклеосом Н2А. Н2В. НЗ и Н4 не отщепляются при солевой экстракции, однако такая обработка приводит к эффективному удалению ги-

стона Н1 из хроматина. Возможно, именно гистон Н1 поддерживает гены 5S-pPHK ооцитов в репрессированном состоянии в хроматине соматических клеток и при его удалении гены ооцитарной 5S-pPHK становятся способными к транскрипции. Об этом свидетельствует тот факт, что добавление гистона Н1 к хроматину соматических клеток, истощенному по гистону Н1, блокирует транскрипцию генов 5S-pPHK ооцитов. Следовательно, дифференциальная экспрессия генов 5S-pPHK в соматических клетках зависит от опосредованного гистоном Ш уплотнения хроматина, содержащего гены 5S-pPHK ооцитов.

Ответ на вопрос о том, каким образом гистон Н1 ограничивает связывание факторов транскрипции с ICR, дают результаты анализа конкурентного связывания нуклеосом (октамеров гистонов) и ТЕША. Эксперименты с использованием метода отпечатков показывают, что кор нуклеосомы связан с 5'-концом гена 5S-pPHK. включая две трети длины ICR (рис. 8.73). Тем не менее ТЕША связывается со свободной частью ICR и, возможно, вытесняет нуклеосому из комплекса с 5'-концом регуляторной области Этого, вероятно, достаточно для того, чтобы TFIIIB, TFIIIC и РНК-полимераза Ш связались с геном, и в надлежащем сайте началась транскрипция. Поскольку гистон Н1 связан с ну

] Н2А Н2В Н4 из | НЗ Н4 Н2В Н2А | Нукпеоммныи -1-6-5-4-3-2-1 0 1 2 3 4 5 6 1

IICR1

;;;L , I— , I, 8

-ВО -60 - 40 - 20 -120 406080100 120

РИС. 8.73.

Конкуренция TFIIIA с нуклеосомами за связывание с ICR 5'-рДНК. А. Ген 5S-pPHK X. laevis (выделен цветом) и фланкирующие его последовательности; указано положение ICR. Вверху представлены восемь гистонов, связывающихся с геном и фланкирующей его последовательностью. Б. Схематическое представление накручивания ДНК на нуклеосомный кор (не показан). Поскольку гистон Н1 связывается с ДНК на входе ее в нуклеосому и на выходе из нее, можно ожидать, что его связывание препятствует присоединению TFIIIA к ICR. [D. Rhodes, EMBO J. 4 (1985), р. 3473.)

клеосомами на входе ДНК в октамер и на выходе из него (рис. 1.17), его присутствие в хроматине, вероятно, препятствует связыванию TFIIIA и, таким образом, блокирует доступ TFIIIC, TFIIIB и РНК-полимеразы III к матрице.

Переключение экспрессии генов 5S-pPHK в процессе развития Xenopus. Если присоединение гистона Н1 к ооцитарным генам обусловливает дифференциальную экспрессию в дифференцированных соматических клетках, возникает вопрос: когда и каким образом в процессе развития осуществляется переход от экспрессии преимущественно ооцитарных генов к экспрессии почти исключительно соматических генов? В созревающих ооцитах параллельно с активацией генов ооцитарной 5S-pPHK синтезируется большое количество TFIIIA (табл. 8.3). Это не удивительно, потому что TFIIIA необходим для транскрипции. TFIIIA не только связывается с генами 5S-pPHK, но и образует 78-рибонуклеопро- теидную частицу с новосинтезированной 5S-pPHK. По-видимому, эти частицы являются формой хранения 5S-pPHK до ее последующего включения в рибосомы в оогенезе. При образовании таких частиц 58-рРНК конкурирует со своими собственными генами за связывание TFIIIA, участвуя таким образом в регуляции синтеза РНК по типу обратной связи.

После начального всплеска синтеза TFIIIA скорость его образования снижается и продолжает уменьшаться после оплодотворения и начала эмбриогенеза. Постепенное подавление экспрессии гена 58-рРНК ооцитов после стадии средней бластулы коррелирует с дальнейшим понижением внутриклеточной концентрации TFIIIA (табл. 8.3). Итак, незрелые ооциты содержат большой избыток TFIIIA по сравнению с общим числом генов 58-рРНК и синтезируют большое количество 58-рРНК ооци- тарного типа; в соматических клетках на каждые 2-3 гена 58-рРНК приходится всего одна молекула TFIIIA. На конкуренцию между генами 58-рРНК ооцитарного и соматического типов за связывание TFIIIA сильно влияет более высокая нестабильность комплексов транскрипции генов 58-рРНК ооцитов в оплодотворенных яйцах; подобный феномен наблюдается также в экстрактах ранних бластул. В результате комплексы транскрипции генов ооцитарной 58-рРНК разрушаются, в то время как аналогичные комплексы генов соматической 58-рРНК преимущественно остаются. Снижение скорости синтеза TFIIIA по мере развития эмбриона и связывание его с 58-рРНК ограничивают участие TFIIIA в образовании комплекса транскрипции. Большая лабильность комплекса транскрипции в случае генов ооцитарной 58-рРНК наряду с предпочтительным связыванием TFIIIA и TFIIIC с генами соматической 58-рРНК приводит к постоянному оттоку факторов

транскрипции от генов ооцитарной 5S-pPHK к генам соматической 5S-pPHK. Поскольку гены ооцитарной 5S-pPHK теряют факторы транскрипции, данная область, вероятно, «выключается» в результате уплотнения хроматина с участием гистона Ш.

Но каким образом это состояние преимущественной активации генов соматической 5S-pPHK поддерживается во время репликации ДНК при последовательных делениях клетки? При репликации комплексы транскрипции разрушаются, и для возобновления транскрипции они должны образоваться вновь. Интересно, что в соматических клетках Xenopus гены соматической 5S-pPHK реплицируются во время первой четверти S-фазы, а гены ооцитарной 5S-pPHK на более поздних стадиях в S-фазе. Благодаря такой поэтапной репликации хромосомы гены соматической 5S-pPHK могут повторно образовывать функциональные комплексы транскрипции. не конкурируя с ооцитарными генами.

Наши представления о регуляции генов 5S-pPHK Xenopus в процессе развития весьма неполны. Тем не менее можно выделить некоторые характерные моменты: 1) гиперпродуцирование TF1IIA в течение оогенеза, позволяющее генам 5S-pPHK обоих типов экспрессироваться пропорционально их количеству; 2) прекращение образования ТЕША в процессе созревания яйца и на последующих стадиях эмбриогенеза и весьма низкое его содержание в соматических клетках; 3) влияние содержания ТЕША на взаимодействие ТЕША с 5S-pPHK в процессе развития; 4) преимущественное разрушение комплексов транскрипции генов ооцитарной 5S-pPHK и преимущественное накопление-за счет конкуренции - комплексов транскрипции генов соматической 5S-pPHK; 5) преимущественная конденсация хроматина, содержащего «пустые» гены ооцитарной 5S-pPHK, при помощи гистона Н1; 6) более ранняя репликация генов соматической 5S-pPHK во время S-фазы, что позволяет повторно образовываться в первую очередь комплексам транскрипции генов соматической 5S-pPHK. Дополнительная регуляция может состоять: 1) в дифференциальной регуляции экспрессии гена ТЕША на ранних стадиях оогенеза и на поздних стадиях эмбриогенеза и в соматических клетках; 2) в наличии функционально активных TFIIIC и TFIIIB; 3) во влиянии факторов транскрипции, которые реагируют с регуляторными последовательностями, расположенными перед генами.

ИНТРОНЫ

Кодирующие последовательности эукариотических генов (экзоны) часто перемежаются некодирующими (интронами). Это поразительное открытие поставило перед учеными несколько вопросов. 1. Где, когда и как появились интроны в генах, какую

роль они сыграли в биологической эволюции? 2. Каким образом первичные транскрипты таких мозаичных генов превращаются в матричные РНК, у которых интроны отсутствуют? 3. Какое значение имеет сплайсинг (а также его механизм) для регуляции экспрессии генов? 4. Какую функцию (если она существует) выполняют интроны в мириадах операций, совершаемых в современных геномах? Например, являются ли интроны рудиментом истории эволюции генов или они играют важную роль в жизни сегодняшних организмов? Некоторые аспекты первого из перечисленных вопросов обсуждаются во введении к части Ш и в гл. 9. Мы же здесь ограничимся рассмотрением того, что мы знаем о строении интронов, механизме их удаления в процессе биогенеза зрелых функциональных РНК и о роли сплайсинга в экспрессии эукариотических генов.

Частота встречаемости интронов

Частота, с которой встречаются прерывистые гены, заметно варьирует у разных видов эукариот. Наиболее обильно они представлены в геномах растений и животных, а также в геномах инфицирующих их вирусов. У беспозвоночных (например, у Drosophila, нематоды и морского ежа) интроны встречаются реже. Однако некоторые гены, ответственные за регуляцию морфогенеза у Drosophila (например, группы ultrabithorax и antennapedia), имеют сложную картину чередования экзонов и интронов. В большей части ядерных генов S. cerevi- siae (за исключением генов актина и некоторых генов тРНК) интроны отсутствуют, но зато прерывистые гены в изобилии имеются у их дальнего родственника S. pombe. Интроны, редко встречающиеся в ядерных генах S. cerevisiae. широко представлены в митохондриальных генах данного организма. Сразу после обнаружения интронов полагали, что они присутствуют только в эукариотических генах. Однако позже интрон был выявлен в прокариотическом гене тимидилатсинтетазы бактериофага Т4, а затем- в гене tPHKs" и в гене высокомолекулярной рРНК Archaebacteria. Поэтому мы не удивимся, если при более полном исследовании геномов прокариот обнаружатся новые гены с интронами.

Интроны присутствуют в ядерных генах, кодирующих мРНК. рРНК (правда, пока они обнаружены только в генах высокомолекулярных рРНК низших эукариот) и отдельные типы тРНК. Прерывистые гены часто встречаются в генах хлоропластов и митохондрий, которые кодируют информационные, рибосомные и транспортные РНК этих органелл. В то же время среди генов млекопитающих, которые почти всегда содержат интроны, встречаются исключения. Так, в большинстве генов,

кодирующих пять гистонов, интроны отсутствуют; это же относится и к генам двух семейств, кодирующим а- и Р-интерфероны. Напротив, единственный ген у-интерферона содержит множество интронов (рис. 8.2). Не обнаружены интроны в генах 5,88- и 58-рРНК, а также ни в одном из генов U-PHK, 7SL-PHK и 7SK-PHK.

Различные виды интронов

Все интроны транскрибируются в составе РНК- предшественника и впоследствии удаляются в процессе разрыва-воссоединения, который называется сплайсингом. Особенности строения интронов и соответствующие механизмы сплайсинга лежат в основе классификации этих элементов (табл. 8.4).

Интроны генов ядерных мРНК. Первыми были обнаружены интроны в ядерных генах, кодирующих белки. Их размер варьирует от 100 п. н. до 10 т. п. н. и более. Интроны соответствующих генов позвоночных одного вида могут отличаться друг от друга по величине и нуклеотидной последовательности в такой же степени, как два интрона из неродственных генов. Размеры экзонов в основном группируются вблизи величин 52, 140, 223 и 299 п. н„ причем преобладают экзоны последней группы. В то же время известны экзоны длиной всего от 15 до 30 п. н. и, напротив, в несколько сотен или тысяч пар оснований. Наиболее характерной отличительной чертой всех интронов является наличие специфических последовательностей вблизи их 5'- (левой, или донорной) и 3'- (правой, или акцепторной) концов (т е. на стыках интронов и экзонов, или в сайтах сплайсинга).

Нуклеотидные последовательности в местах соединения экзонов и интронов весьма консервативны и практически одинаковы во всех генах ядерных мРНК почти у всех изученных видов (табл. 8.4). 5'-сайт сплайсинга чаще всего фланкирует последовательность CRG (где R пурин), а З'-сайт всего один остаток G. Тем не менее последовательности, фланкирующие интроны извне, могут значительно варьировать, а мутации в них никогда не предотвращают сплайсинг, хотя и могут влиять на его скорость. Нуклеотидные последовательности, фланкирующие интроны изнутри, отличаются большим постоянством. Первыми двумя нуклеотидами на 5'-конце интрона в РНК почти всегда являются GU (исключение, GC, встречается всего в двух случаях); следующие четыре нуклеотида могут немного варьировать, но, по-видимому, канонической является последовательность gAGU. Замена остатка G или U в месте сочленения обычно блокирует сплайсинг, а замены соседних оснований влияют на сплайсинг по-разному. Указанные шесть нуклеотидов на 5'- конце интрона и определяют специфическую функцию 5'-сайта сплайсинга. Даже криптические (скрытые) сайты сплайсинга (разд. 8.5.е), которые используются только иногда или в тех случаях, когда основные сайты повреждены или пропущены, содержат элемент GU на 5'-конце вырезаемой последовательности. На З'-конце интрона всегда находится пара AG. перед которой в интронах млекопитающих чаще всего находится богатый пиримидином участок (Y„NYAG). Мутации, приводящие к замене константных А и G на другие основания, также блокируют сплайсинг в этом сайте.

Тип интрона5'-сайтВблизиЗ'-сайтсплайсингаЗ'-сайтасплайсингасплайсингаЯдерная про-мРНК(суммарная)Ядерная про-мРНК(дрожжи)тРНКГруппа I (ядерная рРНК, митохондриальная мРНКCRGIGUAAGUAY„AG1N1GUAUGUUACUAAC Y.AG 1NN{NN|NШfiiТип интрона5'-сайтВблизиЗ'-сайтсплайсингаЗ'-сайтасплайсингасплайсингаЯдерная про-мРНК(суммарная)Ядерная про-мРНК(дрожжи)тРНКГруппа I (ядерная рРНК, митохондриальная мРНКCRGIGUAAGUAY„AG1N1GUAUGUUACUAAC Y.AG 1NN{NN|NШfiiТаблица 8.4. Канонические последовательности вблизи сайтов сплайсинга разного типа 11Таблица 8.4. Канонические последовательности вблизи сайтов сплайсинга разного типа 11Группа II (митохондриальнаяIGUGCGУ„АЩмРНК)мРНК хлоропластов (Euglena)IGUGSGY„Ac iГруппа II (митохондриальнаяIGUGCGУ„АЩмРНК)мРНК хлоропластов (Euglena)IGUGSGY„Ac iи рРНК)и рРНК)11 Представлены последовательности РНК. ¥ пиримидин, и число пиримидинов, R пурин. Инвариантные основания подчеркнуты; стрелками показаны сайты сплайсинга. [Т. Cech, Cell 44 (1986), р. 207.]11 Представлены последовательности РНК. ¥ пиримидин, и число пиримидинов, R пурин. Инвариантные основания подчеркнуты; стрелками показаны сайты сплайсинга. [Т. Cech, Cell 44 (1986), р. 207.]Остаток А вблизи З'-конца интрона играет важ-

Тип интрона

5'-сайтВблизиЗ'-сайт

сплайсингаЗ'-сайтасплайсинга

сплайсинга

Ядерная про-мРНК

(суммарная)

Ядерная про-мРНК

(дрожжи)

тРНК

Группа I (ядерная рРНК, митохондриальная мРНК

CRGIGUAAGUAY„AG1N

1GUAUGUUACUAAC Y.AG 1N

N{NN|N

Шfii

Тип интрона

5'-сайтВблизиЗ'-сайт

сплайсингаЗ'-сайтасплайсинга

сплайсинга

Ядерная про-мРНК

(суммарная)

Ядерная про-мРНК

(дрожжи)

тРНК

Группа I (ядерная рРНК, митохондриальная мРНК

CRGIGUAAGUAY„AG1N

1GUAUGUUACUAAC Y.AG 1N

N{NN|N

Шfii

Таблица 8.4. Канонические последовательности вблизи сайтов сплайсинга разного типа 11

Таблица 8.4. Канонические последовательности вблизи сайтов сплайсинга разного типа 11

Группа II (митохондриальная

IGUGCGУ„АЩ

мРНК)

мРНК хлоропластов (Euglena)

IGUGSGY„Ac i

Группа II (митохондриальная

IGUGCGУ„АЩ

мРНК)

мРНК хлоропластов (Euglena)

IGUGSGY„Ac i

и рРНК)

и рРНК)

11 Представлены последовательности РНК. ¥ пиримидин, и число пиримидинов, R пурин. Инвариантные основания подчеркнуты; стрелками показаны сайты сплайсинга. [Т. Cech, Cell 44 (1986), р. 207.]

11 Представлены последовательности РНК. ¥ пиримидин, и число пиримидинов, R пурин. Инвариантные основания подчеркнуты; стрелками показаны сайты сплайсинга. [Т. Cech, Cell 44 (1986), р. 207.]

ную роль в сплайсинге ядерных про-мРНК (разд. 8.5.г). В интронах млекопитающих этот остаток не находится в фиксированном положении или в какой-либо определенной последовательности, поскольку его роль, вероятно, может играть любой из нескольких остатков А, расположенных на участке от 18 до 37 нуклеотида перед З'-сайтом сплайсинга. Однако мутации, которые затрагивают соседствующие с указанным остатком аденина последовательности, приводят к существенному уменьшению эффективности сплайсинга in vitro; следовательно, хотя этот остаток и не принадлежит какой-то определенной последовательности, его окружение влияет на сплайсинг. Что касается ядерных про-РНК дрожжей, то, напротив, в этом случае активный остаток А входит в состав специфической гептануклеотид- ной последовательности 5'-UACUAAC-3', расположенной между 6 и 69 нуклеотидами, считая от З'-конца сайта сплайсинга.

Наличие канонической последовательности в сайте сплайсинга не всегда означает, что данный интрон может быть удален. Иногда одна или обе указанные последовательности сайтов сплайсинга находятся в интронах и экзонах в положениях, по которым сплайсинг не происходит. Однако при некоторых условиях такие криптические сайты все- таки функционируют (например, когда подлинные сайты изменены или отсутствуют).

Иногда интроны имеют несколько 5'- или З'-сай- тов сплайсинга, и тогда возможен альтернативный сплайсинг. Например, в ранней области генома SV40 содержатся два интрона, имеющих один и тот же 3'-, но разные 5'-сайты сплайсинга, в результате чего из одного и того же первичного транскрипта образуются две разные мРНК. В некоторых случаях выбор сайта сплайсинга зависит от стадии развития или типа ткани (разд. 8.5.е). Имеющиеся сайты могут и не использоваться. Например, геномы ретровирусов образуются из транскриптов провирусной ДНК без участия сплайсинга, однако для образования мРНК, кодирующих определенные вирусные белки, сплайсинг необходим. В этом случае, вероятно, одни и те же транскрипты либо подвергаются сплайсингу, либо остаются интактными.

Как мы уже говорили, в интронах могут содержаться разные генетические элементы, например энхансеры, другие гены, возможно, сигналы репликации и упаковки хромосомы или последовательности, необходимые для упаковки про-мРНК в рибо- нуклеопротеидные частицы.

Интроны в генах тРНК. Размер интронов в генах тРНК колеблется от 14 до примерно 60 нуклеотидов, но они локализуются всегда в одном и том же месте: через один нуклеотид от З'-конца антикодона (рис. 8.74). Как правило, если ген данной

тРНК имеет интрон, то все другие гены в пределах вида, кодирующие эту тРНК, тоже содержат такой интрон. Однако у генов, кодирующих разные тРНК, внутренние и фланговые участки интронов заметно различаются. Принимая во внимание ту роль, которую играют внутригенные участки в регуляции транскрипции генов тРНК с участием РНК-полимеразы III (разд. 8.4.6), можно задать вопрос: не влияют ли интроны в генах некоторых тРНК на их транскрипцию? Установлено, что удаление интрона гена супрессора тРНКТуг при помощи направленного мутагенеза не влияет на способность к экспрессии при введении в клетки. И все же, несмотря на то что эта тРНК транскрибируется и процессируется нормально, остаток U в антикодоне не модифицируется, как обычно, с образованием у. Является ли это указанием на роль интронов в посттранскрипционной модификации тРНК или мы имеем дело с уникальным свойством тРНКТуг неясно.

Особые типы интронов: группа I. Гены ядерных рРНК некоторых низших эукариот (например, Tetrahymena thermophila и Physarum polycephalum) содержат особые интроны и имеют уникальный механизм сплайсинга. Эти интроны, названные интронами группы I, встречаются также в генах рРНК митохондрий, хлоропластов, дрожжей и грибов, в некоторых митохондриальных генах мРНК дрожжей и грибов и тРНК хлоропластов высших растений. К этой же группе относится и необычный интрон в гене тимидилатсинтетазы фага Т4. Подобные интроны обнаружены во многих генах, но ни один из них не был выявлен в генах позвоночных.

Хотя интроны группы I отличаются друг от друга по размеру-интрон про-рРНК Tetrahymena состоит примерно из 400 остатков, а длина некоторых интронов митохондриальных мРНК превышает тысячу нуклеотидов,- они имеют ряд общих свойств. 1. Они сами катализируют свой сплайсинг, который может протекать in vitro в отсутствие каких бы то ни было белков. 2. Информация, необходимая для сплайсинга, содержится во множестве относительно коротких внутренних последовательностей внутри интрона, которые обеспечивают укладку молекулы с образованием характерной пространственной структуры. 3. Сплайсинг инициируется свободным гуанозином или любым из его 5'-фосфорилированных производных. 4. Конечными продуктами сплайсинга являются рРНК и линейная РНК, размер которых несколько меньше, чем размер интрона.

Основные особенности строения всех интронов класса I определяются четырьмя нуклеотидными последовательностями длиной примерно 10 нуклеотидов каждая (табл. 8.5). Относительное расположение этих элементов в интроне рРНК Tetrahymena и в интроне гена цитохрома b митохондрий из

дрожжей, а также способ их спаривания показаны на рис. 8.75. Предполагается, что в результате внутримолекулярного спаривания нуклеотидов интрон приобретает конфигурацию, благоприятную для автокаталитического сплайсинга (разд. 8.5.в). Как хи

мические модификации, так и направленные замены в конкретных сайтах внутри этих консервативных спаренных последовательностей приводят к полной или частичной утрате способности к сплайсингу. Сходные последовательности, обладающие способ-

Про-тРНК1|е

6'

gu<3acucg' g aw UUA

и А

и

Про-тПНК

Туг

U U

G

G

U U

G

А А

U А

CCG

U

А А

A3' C c A 5’c-g U-A C-G U-G C-G G-C G-C

Антикодон

G

CCCGC WWi

С и

U

С

U

U

А

G С

А

C-G A-U A—U G-C

С

U

А А G-C6

Антикодон U —А A-U А 1

U ии А

С А

С и

А

РИС. 8.74.

Расположение интронов в тРНК и места их сочленений. Представлены три тРНК, имеющие структуру клеверного листа, построенную исходя из предположения максимального внутримолекулярного спаривания оснований. Интроны выделены серым цветом, а антикодоны-розовым. Места сочленений после сплайсинга указаны стрелками.

А3' С С А G-C C-G U-A C-G G-C U-U G-C I САССС

WW6

U-Z C-G

с

и

и

и

А

А

С

G-C u-g\ cga G-C А «А _ А дА

С

и

U-GA-UU-GA-U"б-СС U

A-U к-и

C-G U—А

U —А C-G G-C G-C U и

U

Б

UUUCC6GA

II I I I I IcCAA"AGACCU

С А

Uu

А А

С

Про-тРНК^и

G G

U

и

;cGaGccGG

А3' С С А 5'g-c G-C U-A U-A G-C U-G U-A

UUCUC

U

А

I AGGC Си A G

Антикодон

и

А AG AG

C.G„

/ / A

и/ / G C-G Au/ C-G CG U~A AU g-cxaua A-UCgA

6. U-A c'/6U

АА

С-6 А ■ U

-U

G-C

и

А

А U

В

U

U

А

G

С

А А

U

са</а

G А

U U

Таблица 8.5. Консервативные элементы, присутствующие во многих интронах группы 111

Элемент

Синоним

Каноническая

последовательность

Комплемен- гарность

9R'

E

He консервативен

Eokc9R

A

P

AUGCUGGAAA

В

В

Q

AAUCAGCAGG

A

Eokc9L

R

UCAGAGACUACA

Бокс2

Бокс9К

E'

He консервативен

9R'

Бокс2

S

AAGAUAUAGUCC

Eokc9L

11 Подчеркнута та часть канонической последовательности, которая предположительно участвует в образовании нуклеотидных пар. [Т Cech, Int. Rev. of Cytology 93 (1985), p. 3.]

ностью к такому же внутримолекулярному спа ри- ванию, обнаружены в интроне группы I гена цито- хромоксидазы дрожжевых митохондрий. И в этом случае мутации, затрагивающие нуклеотиды, которые участвуют в образовании вторичной структуры, тоже препятствуют сплайсингу и экспрессии оксидазного гена. Дальнейшие пояснения, касающиеся структурных особенностей интронов группы I, будут даны при обсуждении механизма сплайсинга (разд. 8.5.в).

Особые типы интронов: группа II. Интроны группы II распространены менее широко, чем интроны группы I. Они обнаружены в двух митохондриальных генах дрожжей, кодирующих одну из субъединиц цитохромоксидазы и цитохром Ь; интересно, что в этих генах присутствуют также интроны группы I. Интроны группы П не содержат канонических

последовательностей, характерных для интронов группы I, но они тоже имеют специфическую вторичную структуру, образующуюся благодаря внутримолекулярному спариванию оснований. Интроны группы II также подвергаются самосплайсингу in vitro, но в этом случае реакция инициируется не экзогенным гуанозином, а остатком, входящим в состав самого интрона. Третье ключевое отличие интронов группы II от интронов группы I заключается в структуре вырезанного интрона Если при сплайсинге в случае интронов группы I образуются промежуточные кольцевые формы и линейные конечные продукты, то интроны группы II. высвобожденные в результате сплайсинга, представляют собой лассоподобные структуры, в которых 5'-кон- цевой фосфат РНК интрона соединен фосфодиэфир- ной связью с 2'-гидроксильной группой внутреннего нуклеотида (рис. 8.76).

Интроны, вырезаемые при помощи автокаталитического сплайсинга

Самосплайсиш - это поразительный феномен, но, как показали дальнейшие исследования, не менее поразителен его механизм. Изучение этого механизма помогло понять, почему для сплайсинга ядер- ных про-мРНК нужны вспомогательные белки и особые рибонуклеопротеиды (мяРНП). Самосплай- синг - это упорядоченный процесс, состоящий из последовательных автокаталитических реакций фос- фодиэфирного обмена (трансэтерификации); РНК функционирует в нем как некий фермент рибозим, создавая необходимые внутримолекулярные усло-

РИС. 8.75.

Б. Интрон гена цитохрома Ь из дрожжевых клеток Бокс 9

Организация консервативных последовательностей митохондриальных и ядерных интронов класса I. Интроны выделены точками, а на участках, отвечающих экзонам, точек нет. Одинаково окрашенные участки внутри каждого интрона взаимно комплементарны и, как полагают, могут образовывать нуклеотидные пары (рис. 8.77). А.

Области взаимодействия, выявленные путем прямого биохимического анализа и компьютерной обработки данных о последовательности вырезанной РНК. Б. Области взаимодействия, предполагаемые исходя из филогенетических и генетических данных. [Т. Cech, Inti. Rev. Cytol. 93 (1985), p. 3.]

РИС. 8.76.

Образование 2'.5'-фосфодиэфирных связей между нуклеотидами, расположенными на значительном расстоянии друг от друга вдоль цепи. При связывании 5'-фосфатной группы с 2'-гидроксильной группой нуклеотида находящегося внутри цепи, образуется структура типа лассо.

вия и поставляя реакционные группы для целой серии упорядоченных специфических реакций трансэтерификации.

Самосплайсинг интронов группы I. Сплайсинг интрона про-рРНК Tetrahymena, прототипа интрона группы I, осуществляется при участии последовательных реакций трансэтерификации, в которых акты фосфодиэфирного обмена не сопровождаются гидролизом. Во все акты трансэтерификации, за исключением инициации с участием свободного гуанозина или его нуклеотида, вовлечены реакционные группы, содержащиеся в самом интроне. Более того, специфичность этих актов определяется пространственной организацией интрона, которая зависит от внутримолекулярного спаривания удаленных друг от друга консервативных последовательностей интрона (рис. 8.75 и 8.77).

Первой стадией в каскаде реакций сплайсинга является присоединение к интрону гуанозина (рис 8.78). Далее неподеленная пара электронов З'-гидроксильной группы связанного гуанозина атакует фосфатную группу в месте 5'-сочленения интрона с экзоном ( — UpA —), что приводит к нуклеофильному расщеплению молекулы РНК (рис. 8.79). Образовавшаяся в сайте расщепления (конец 5'-эк- зона) З'-гидроксильная группа реагирует с фосфатной группой в месте З'-сочленений интрона и экзона, далее происходит лигирование двух участков экзона с высвобождением линейного интрона длиной 413 нуклеотидов. Затем этот линейный интрон претерпевает две последовательные реакции внутримолекулярной трансэтерификации, которые сопровождаются гидролизом, приводящим к отщеплению сначала 15, а затем четырех нуклеотидов с образованием процессированного интрона. Следует отметить, что вся реакция идет почти без затрат энергии; разрушение одной диэфирной связи компенсируется

одновременным образованием другой такой же связи.

Гуанозин или одно из его 5'-фосфорилированных производных инициирует реакцию сплайсинга специфическим образом. Если происходит модификация 2'- или З'-гидроксильных групп или нарушается способность остатка гуанозина к связыванию с остатками цитозина, то эффективность инициации сплайсинга снижается. Очевидно, что спаривание гуанозина с комплементарным остатком интрона необходимо для правильной ориентации З'-гидроксильной группы гуанозина относительно фосфатной группы в 5'-сочленении.

Для того чтобы могло произойти лигирование двух экзонов после расщепления цепи при участии гуанозина, два экзон-интронных сочленения должны сблизиться. Такому сближению способствует изгибание интрона, при котором места двух сочленений оказываются расположенными поблизости один от другого, по-видимому, около сайта связывания гуанозина. Можно предположить, что интрон содержит последовательность, которая способна спариваться с последовательностями экзона в местах двух сочленений (рис. 8.80). Наличие такой «внутренней направляющей последовательности» могло бы создать условия для реакции З'-гидроксильной группы, образовавшейся при расщеплении 5'-экзон-ин- тронного сочленения, с фосфатной группой, находящейся в З'-сайте сплайсинга. Этот сайт образуют остаток G, которым заканчивается интрон, и соседние нуклеотиды. В высвободившемся линейном интроне происходят конформационные изменения, которые, как полагают, облегчают циклизацию этого элемента, сопровождающуюся отщеплением коротких олигонуклеотидов (рис. 8.81).

Возможно, такой механизм самосплайсинга, который реализуется в случае интрона гена рРНК Tetrahymena, характерен и для других интронов группы 1. Все они содержат четыре одинаковые консервативные последовательности, обозначаемые А, В, 9L и 2, а также две неконсервативные, но комплементарные последовательности, обозначаемые 9R и 9R' (табл. 8.5 и рис. 8.75). Эти шесть элементов всегда расположены в интроне в одном и том же порядке: 5'-9R'-A-B-9L-9R-2-3'. Кроме того, большинство интронов группы I содержат последовательность, которая функционирует как некий внутренний «гид». Как известно, мутации, блокирующие сплайсинг, встречаются в ряде генов мРНК и рРНК митохондрий. Такие мутации, как правило, мешают спариванию оснований. Например, способность к сплайсингу, утраченную в результате изменений в одной из двух последовательностей, 9R или 9R', можно восстановить, индуцировав компенсирующие изменения в другой последовательности. Каталитические или ферментоподобные свойства

РИС. 8.77.

Пространственная организация интрона рРНК Tetrahymena. Представленная структура имеет минимальную свободную энергию, рассчитанную при помощи компьютера. Окрашенными прямоугольниками выделены консервативные последовательности интронов как ядерных, так и митохондриальных рРНК, указанные на рис. 8.75. Спаривание участков 9R и 9R' предположительно способствует образованию трехмерной структуры. [Т. Cech, Inti. Rev. Cytol. 93 (1985), p. 3.]

<j\A/-

a,<\cuuugaga"/

GG ACUCU\

c c

A U

Б A

267

G'

Уи/

6 G

U

С

U G

А С G 6

C <

9R'

Is'g-a-c-c-g-uc-a'

БоксЭК '

5’

с и G G

G IG । U |С

G

А А А G 6

и

и и с и

G G С G

U

С С G С А

c a -a g и и

сн„онсн„онО I снО I снО ОН I О = Р-О"О ОН I О = Р-О"

сн„он

сн„он

О I сн

О I сн

О ОН I О = Р-О"

О ОН I О = Р-О"

РИС. 8.78.

Сайт связывания гуанозина в интроне тРНК Tetrahymena. Интрон (выделен точками) содержит остаток адениловой кислоты в месте 5'-сочленения, а экзон (без точек) - остаток уридиловой кислоты в месте З'-сочле- нения. В представленном на рисунке связывании гуанозина при помощи водородных связей могут участвовать различные основания, сахара или фосфаты, пространственно сближающиеся при образовании вторичной и третичной структуры. Стрелкой показана нуклеофильная атака З'-гидроксила рибозы на фосфатную группу в 5'-сайте сплайсинга. По-видимому, эта реакция трансэтерификации является началом самосплайсинга РНК. [В. L. Bass, Т. Cech, Nature 308 (1984), р. 820.]

РИС. 8.80.

«Внутренняя направляющая последовательность» в интроне (она имеет более интенсивную окраску) сближает два экзон-интронных сочленения. Интрон на рисунке выделен точками. Обратите внимание на спаривание внутренней последовательности с последовательностями экзонов вблизи 5'- и З'-сайтов сплайсинга.

Линейный интрон

Изменение конформации

Гидролиз

Линейный интрон

РИС. 8.81

Самосплайсинг интронов группы I на примере интрона рРНК Tetrahymena thermophila. Интроны выделены точ

ками, а важные реакционные группы-серым цветом. В изолированном виде получены все указанные соединения, кроме первого продукта расщепления, заключенного в квадратные скобки. Числа-длина сегментов РНК.

Альтернативное внутримолекулярное спаривание выре

занного интрона инициирует отщепление от него олигонуклеотидов и циклизацию. После вырезания линейный интрон претерпевает конформационные изменения, обусловленные изменениями в картине внутримолекулярного спаривания. Так, спаривание тринуклеотида GGG (он выделен цветом) с тринуклеотидом UUU, по-видимому, индуцирует расщепление связи AU при участии З'-гидроксильной группы концевого остатка G.

интронов, выщепляющихся путем самосплайсинга, рассматриваются более подробно в разд. 8.5.г.

Сплайсинг in vivo в случае некоторых интронов группы I генов про-мРНК митохондрий дрожжей зависит от консервативных последовательностей, которые участвуют в сплайсинге про-рРНК Tetra- hymena; аналогичны и продукты сплайсинга. Однако in vitro эти про-мРНК к самосплайсингу неспособны. Выщепление интронов в этом случае зависит от трш/с-действующих белков, которые кодируются внутренними последовательностями тех же самых или родственных генов и, как правило, имеют общую рамку считывания для экзонов и интронов (разд. 9.7.а). Такие белки, названные матуразами, относятся к короткоживущим и, вероятно, помогают укладке интрона про-мРНК с образованием структуры, облегчающей сплайсинг под действием РНК. Это объясняет, почему нонсенс-мутации или мутации со сдвигом рамки в интроне, кодирующем матуразу, предотвращают сплайсинг в случае этого интрона, а также в случае интронов группы I в других митохондриальных генах. Данная модель дает также рациональный ответ на вопрос, почему супрессорные мутации или мутации, компенсирующие сдвиг рамки, которые приводят к восстановлению синтеза матуразы, восстанавливают также правильный сплайсинг. Таким образом, правильная укладка некоторых интронов группы I, вероятно, происходит спонтанно с образованием структуры, стабильной in vitro; в то же время образование и/или стабилизация каталитически активной структуры других интронов могут происходить только при участии белков. Играет ли какую-нибудь роль в укладке интрона белок-белковые взаимодействия - неизвестно.

Еи#е один тип самосплайсинга. Интроны группы II про-мРНК митохондрий дрожжей также имеют консервативные последовательности, а возможно, и специфическую вторичную структуру, но она отличается от структуры интронов группы I. Интроны этого типа также способны к самовырезанию, но об особенностях их вторичной и третичной структуры и соответственно о молекулярных деталях сплайсинга известно меньше. Очевидны две особенности механизма сплайсинга: 1) в отличие от самосплайсинга интронов группы I для сплайсинга интронов группы II не нужен нуклеозид-инициатор; 2) в результате сплайсинга образуется структура типа лассо (рис. 8.76).

Каким образом интрон группы II вырезает сам себя и чем обусловлено образование нового РНК- продукта, имеющего форму лассо? Как и в случае интронов группы 1, этот процесс, по-видимому, протекает при участии трансэтерификации; на первой стадии происходит расщепление 5'-сайта сплайсинга, а на второй - расщепление З'-сайта сплайсин

га и лигирование двух экзонов. Однако природа атакующего нуклеофила совершенно иная: это не гуанозин, как в случае интронов группы I, а 2'-ги- дроксильная группа нуклеотида, находящегося где- то внутри самого интрона (рис. 8.82). Лассоподоб- ная структура возникает при образовании новой 2', 5'-фосфодиэфирной связи в средней части последовательности РНК.

Трехмерная структура интрона, формирующаяся либо спонтанно, либо при участии белков, должна быть такой, чтобы обеспечивалось сближение 2'-гидроксильной группы и 5'-сайта сплайсинга, необходимое для активации трансэтерификации. Выбор подлежащих расщеплению межнуклеотидных связей, вероятно, определяется последовательно-

РИС. 8.82.

Сплайсинг интронов группы II. 2'-гидроксильная группа остатка А осуществляет нуклеофильную атаку на остаток G и инициирует расщепление в 5'-сайте сплайсинга. Далее З'-гидроксильная группа 5'-экзона вступает в реакцию с фосфатной группой З'-экзона, завершая процесс сплайсинга с высвобождением молекулы РНК, имеющей форму лассо.

стью GUGCG на 5'-конце интрона, специфичной для интронов группы II, и последовательностью YAU на З'-конце интрона (табл. 8.4). Как показано в разд. 8.5.г, этот механизм сплайсинга очень напоминает таковой в случае ядерных про-мРНК. Обязательное участие в процессе тронс-активных рибо- нуклеопротеидных частиц может быть связано с необходимостью более сложной и специфической укладки про-мРНК разных видов, обеспечивающих сплайсинг в нужном месте.

Сплайсинг ядерной про-мРНК

Основную информацию о механизме сплайсинга ядерной про-мРНК удалось получить благодаря тому, что в распоряжении исследователей имелись клонированные прерывистые гены. Особенно полезным оказалось изучение модифицированных форм этих генов. При установлении структурных особенностей, необходимых для успешного сплайсинга, используют также специально сконструированные элементы, состоящие из соединенных специфических последовательностей экзонов и интронов. Но самым информативным оказался биохимический подход с использованием клеточных экстрактов, обеспечивающих сплайсинг, и последующей очисткой компонентов аппарата сплайсинга. Особенно важную роль сыграло применение кэпированных РНК- субстратов, полученных в результате транскрипции специальным образом сконструированных ДНК- матриц, встроенных справа от промотора фага SP6, при помощи специфической РНК-полимеразы SP6 (рис. 6.23).

Общие свойства. Сплайсинг ядерных про-мРНК осуществляется в ядре, возможно, одновременно с транскрипцией для одних генов и лишь после завершения транскрипции для других. Есть свидетельства в пользу того, что на этот процесс влияет кэпирование 5'-конца транскрипта, хотя неясно, почему в полиаденилировании РНК явно нет необходимости. Главная проблема, и концептуальная, и практическая, состоит в том, каким образом происходит сплайсинг про-мРНК с множественными интронами в результате которого соседние экзоны соединяются друг с другом. Поскольку известно, что 5'-сайт сплайсинга одного интрона может присоединяться к З'-сайту сплайсинга другого, важно понять, каким образом это предотвращается в процессе нормального вырезания интронов и как стимулируется при альтернативных способах сплайсинга (разд. 8.5.е).

Последовательность этапов сплайсинга. Сначала мы рассмотрим реакции расщепления и лигирования Первым этапом сплайсинга является сборка комплекса сплайсинга. Самые ранние продукты, обнаруживаемые в процессе сплайсинга in vitro,

образуются в результате точного расщепления в 5'-сайте сплайсинга; один из них содержит 5'-экзон, а другой-интрон и З'-экзон (рис. 8.83). Поскольку никакие молекулы РНК с изменениями в З'-сайте сплайсинга, кроме конечного продукта сплайсинга, не выявлены, расщепление в 5'-сайте должно предшествовать расщеплению в З'-сайте. В ходе реакции накапливаются два продукта: правильно лигированные экзоны и свободный целый интрон. Как продукт начального расщепления, так и вырезанный интрон содержат структуры типа лассо, аналогичные описанным выше структурам митохондриальных интронов самосплайсинга группы II (рис. 8.83). Сначала вывод о лассообразности структуры интрона был сделан на основании данных об аномальной электрофоретической подвижности вырезанного интрона, о блокировании обратной транскрипции последовательности за точкой, находящейся у З'-конца интрона, и об устойчивости интрона к полному расщеплению под действием некоторых рибонуклеаз. Позже существование этой структуры было подтверждено при выделении разветвленных нуклеотидных структур. Точка ветвления всегда содержала 5'-фосфат концевого гуанозина интрона, присоединенного диэфирной связью к 2'-гидрок- сильной группе остатка аденозина, независимо от последовательности вырезанного интрона. Тем самым наконец-то получил объяснение удивительный факт существования ядерных РНК с разветвлениями, отходящими от 2'-гидроксильных групп остатков адениловой кислоты.

Сп шйсинг про-мРНК в сплайсингосомах. В общих чертах сплайсинг ядерных про-мРНК и сплайсинг РНК, содержащих интроны группы II, приводят к одинаковому результату: вырезанию интрона в форме лассо и лигированию двух экзонов. Отличие, однако, состоит в том, что для сплайсинга ядерных про-мРНК требуется множество ядерных факторов-белков и рибонуклеопротеидных комплексов (мяРНП). Комплекс, состоящий из множества субъединиц, который катализирует сплайсинг, называют сплайсингосомой. Сплайсингосома, упорядоченная сборка которой осуществляется на интроне перед расщеплением в 5'-сайте сплайсинга, состоит из интрона, связанного по меньшей мере с пятью разными мяРНП и некоторыми вспомогательными белками, обычно не связанными с этими мяРНП. Сплайсингосомы образуются путем спаривания молекул РНК, присоединения белков к РНК и связывания этих белков друг с другом.

мя-РНП. Установлению роли мяРНП-частиц в ядерном сплайсинге предшествовали их идентификация и изучение свойств. После усовершенствования методов фракционирования благодаря получению антител к уникальному триметилгуанозиновому кэпу мяРНК они были выделены в достаточно

Расщепление в з'-сайте сплайсинга и лигирование экзонов ,

РИС. 8.83.

Сплайсинг интронов ядерных про-мРНК (интроны на рисунке выделены точками). Сначала происходит расщепление в 5'-сай- те сплайсинга с последующим образованием 5', 2'-фосфодиэфирной связи, а затем расщепление в З'-сайте сплайсинга и лигирование концов экзона.

чистом виде, а благодаря использованию антител, присутствующих в сыворотке людей с различными аутоимунными заболеваниями, были получены и индивидуальные мяРНП. мяРНП сплайсингосом млекопитающих содержат U1-, U2-, U4-, U5- и U6-PHK (табл. 8.6). Эти РНК называются U-PHK из-за необычайно большого содержания урацила и его модифицированных форм. U1-, U2- и U5-PHK входят в состав особой мяРНП: U4- и U6-PHK, эффективно спаривающиеся друг с другом, являются составной частью другой мяРНП. мяРНП, содержащие U3-PHK, участвуют в процессинге

Таблица 8.6. Размеры U-PHK

Размер в нуклеотидах

U-PHK дрожжи 11 млекопитающие

ы

568

164

U2

1175

187

из

—

217

U4

160

145

U5

214

116

U6

112

106

U7

—

65

ин

—

131

11 Прочерки означают, что соответствующие данные отсутствуют.

про-рРНК в ядрышке (разд. 8.2.г), мяРНП, содержащие U7-PHK-B образовании З'-концов гистоновых мРНК (разд. 8.3.в), а U11-PHK вовлечена в полиаденилирование мРНК (разд. 8.3.в). В ядрах клеток млекопитающих присутствуют и другие мяРНП, но их строение и функции неизвестны.

Нуклеотидные последовательности всех соответствующих U-PHK позвоночных, исследованных к настоящему времени, совпадают примерно на 95%. Совпадают даже нуклеотидные последовательности UI-РНК человека и Drosophila. мяРНП, содержащие сходные низкомолекулярные РНК, богатые урацилом, встречаются также у тараканов, морского ежа, Tetrahymena, Dictyostelium, дрожжей и у динофлагеллят. U-PHK даже таких неродственных видов имеют гомологичные области, несмотря на то, что значительная часть их последовательностей уникальна для каждого вида. Чрезвычайная консервативность данных молекул и их участие в специфических стадиях процессинга РНК показывают, что сплайсинг- очень древний процесс, вероятно возникший на заре эволюции.

Все мяРНП, входящие в состав сплайсингосом (U1-, U2-, U5- и Н4/иб-мяРНП), содержат одинаковый набор из семи белков (табл. 8.7), a U1-, U2- и П5-мяРНП-еще и несколько белков других типов. Аутоиммунные сыворотки, используемые обычно

Таблица 8.7. Белки, входящие в состав мяРНП млекопитающих 11

ВеткимяРНП. содержащие Мол. масса. кДа

указанные С-РНК

UI U2 IB U5 U4/U6

В, В', D. D'_ Е.

+

+ -

+

+ 28; 29; 16; 15,5: 12;

F, G

11; 9

70К, А, С

+

70; 34; 22

А', В"

+

33; 28

25К IBP

+

25; 100 или 70

(34К, 74К, 59К

+

34; 74; 59

ЗОК, 13К, 125К)

+

30; 13; 125

11 Белковые компоненты мяРНП

от U7 до U11 не идентифипиро-

ваны из-за их низкого содержания. Белки обозначены буквами или числами, отвечающими их кажущейся мол массе. Мол. масса белков, входящих в состав U1-, U2-, U5- и U4/U6-mhPHH, рассчитана исходя из их аминокислотного состава, который был определен на основании данных о нуклеотидных последовательностях клонированных кДНК.

для выделения и классификации мяРНП, часто бывают специфичны к одному или нескольким белкам частицы. ПЗ-мяРНП, которая участвует в процессинге рРНК. содержит по крайней мере шесть белков, не представленных в мяРНП. участвующих в сплайсинге. Белки более редких U7- и Ull-РНП изучены хуже.

Взаилюдейстбие м.чРНП с интроном. Первые соображения о способе участия мяРНП в сплайсинге можно было высказать после того, как обнаружилось что нуклеотидная последовательность на 5'-конце UI-РНК комплементарна канонической последовательности в S'-сайтах сплайсинга всех интронов (рис. 8.84). Кроме того, UI-мяРНП специфически связывается с 5'-сочленением in vitro, защищая

РИС. 8.84.

Связывание U1-PHK с последовательностями в местах экзон интронных сочленений в мРНК. Показано спаривание последовательности в месте сочленений интрона (выделен точками) с экзоном в двух мРНК аденовируса Е1 с 5'-концом U1-PHK.

при этом последовательность интрона примерно из 17 нуклеотидов в 5'-сайте сплайсинга от растепления РНКазой; РНК при этом связывании не модифицируется и не разрушается. и2-мяРНП связывается с областью из 40 нуклеотидов, которая содержит нуклеотид А, участвующий в образовании разветвленной лассообразной структуры, и защищает ее. Молекулярный механизм связывания П2-мяРНП с этой областью интронов млекопитающих не вполне ясен, поскольку последовательность не является высококонсервативной. Однако у дрожжей, где последовательность, содержащая остаток А, высококонсервативна, комплементарность между 5'-кон- цом U2-PHK и последовательностью интрона установлена при помощи генетических экспериментов со всей очевидностью. Участок примерно из 15 нуклеотидов на З'-конце интрона связывается с US-мяРНП. Однако, возможно, в физиологических условиях этот сайт связывается и активируется комплексом US-мяРНП и и4/иб-мяРНП. Для связывания как U2-, так и US-мяРНП с соответствующими последовательностями-мишенями нужны вспомогательные белки. Один из них (AF) соединяется с З'-сочле- нением интрона (участок, богатый AG и пиримидинами) и способствует связыванию и2-мяРНП по соседству. Для связывания комплекса U4/U6- и US-мяРНП также требуется белок, который стабилизирует его прикрепление к З'-сочленению интрона. В образовании этих комплексов, по-видимому, играют роль белок-белковые и РНК-белковые взаимодействия.

Окончательный вывод об участии U1- и U2- мяРНП в сплайсинге был сделан после того, как было показано, что иммунопреципитация U1- и и2-мяРПН из экстрактов, катализирующих сплайсинг про-мРНК, при взаимодействии с соответствующими антителами ингибирует сплайсинг. Более того, способность фракционированных определенным образом экстрактов катализировать сплайсинг зависит от добавления U1- и Ш-мяРНП. Аналогично, при проведении сплайсинга в реакционную смесь необходимо добавлять эндогенные мяРНП, если собственные мяРНП экстрактов разрушены направленным расщеплением под действием эндонуклеазы (РНКазы Н) с использованием коротких олигодезоксинуклеотидов, комплементарных каждой из U-PHK.

Сборка сп.шйсингосом. Сплайсинг осуществляется в сплайсингосомах. Рассмотрим поэтому их структуру, сборку и механизм действия. Сплайсин- госомы, выделенные из реакционной смеси в условиях, когда стадия расщепления заблокирована, представляют собой частицы в форме эллипса размером примерно 25 х 50 мкм (рис. 8.85). В этих частицах интрон связан с U1-, U2-, U4/U6- и US-мяРНП одновременно. Функционально актив-

РИС. 8.85.Электронная микрофотография сплайсингосом. [Я. Reed et al.. Cell 53 (1988), p. 949, с любезного разрешения J. Griffith.]РИС. 8.85.Электронная микрофотография сплайсингосом. [Я. Reed et al.. Cell 53 (1988), p. 949, с любезного разрешения J. Griffith.]ные сплайсингосомы содержат и другие белки, в частности те. которые участвуют во взаимодействии мяРНП с сайтами-мишенями или обычно связаны с ядерной про-мРНК.

РИС. 8.85.

Электронная микрофотография сплайсингосом. [Я. Reed et al.. Cell 53 (1988), p. 949, с любезного разрешения J. Griffith.]

РИС. 8.85.

Электронная микрофотография сплайсингосом. [Я. Reed et al.. Cell 53 (1988), p. 949, с любезного разрешения J. Griffith.]

Для присоединения мяРНП к интрону, по-види- мому, необходима лишь очень небольшая часть экзона. Как видно из рис. 8.86, на котором представлена сборка сплайсингосомы, с 5'-сайтом сплайсинга сначала связывается U1-мяРНП независимо от присутствия функциональных сайтов связывания U2- и и5-мяРНП; но этого недостаточно для последующего расщепления в 5'-сайте сплайсинга. Затем присоединяются U2-, U5- и и4/иб-мяРНП, для чего требуется АТР. Вероятно, присоединение П2-мяРНП к соответствующему сайту в интроне осуществляется путем образования нуклеотидных пар; однако включение в сплайсингосому комплекса, содержащего U4/U6- и и5-мяРНП, зависит от взаимодействий между мяРНП. По сходной схеме происходит сборка сплайсингосомы при сплайсинге про-мРНК дрожжей. Судьба сплайсингосомы после лигирования экзонов неясна, но отдельные мяРНП или их комплексы, вероятно, повторно используются для сплайсинга других интронов, в то время как РНК интрона разрушается. Описанная последовательность реакций представляет лишь один из возможных вариантов сборки сплайсингосомы. Для того чтобы однозначно установить эту последователь

ность, необходимо исследовать взаимоотношения между предшественником и продуктом. В данной модели не объясняется также, каким образом расщепляется З'-сайт сплайсинга, как происходит лигирование и от чего зависит правильное соединение экзона.

Самосплайсинг и сплайсинг с участием сплайсингосом. Конечный результат сплайсинга в случае интронов группы II и в случае интронов про-мРНК одинаков: интрон вырезается, а два фланкирующих его экзона соединяются. Более того, одинаков и химизм этих двух процессов. В обоих случаях 2'-ги- дроксильная группа в составе интрона выступает в роли нуклеофила, способствуя расщеплению 5'-сайта сплайсинга, а З'-гидроксильная группа левого экзона является нуклеофилом, расщепляющим З'-сайт сплайсинга с образованием связи между экзонами. Ключевое различие состоит в том, что в случае по крайней мере некоторых интронов группы II может происходить самосплайсинг in vitro, а для сплайсинга ядерных про-мРНК необходим сложный комплекс нескольких мяРНП и вспомогательных белков. Даже в случае интронов группы II для сплайсинга in vitro необходимы матуразы, хотя вполне вероятно, что и нуклеотиды, и каталитические центры, участвующие в автокаталитическом сплайсинге и в сплайсинге, опосредованном матура- зами, одинаковы. Если для автокаталитического сплайсинга нужна особая укладка ДНК. то матуразы, вероятно, необходимы для складывания или стабилизации структуры, которая может подвергаться правильным последовательным актам транс-

UI-мяРНПUI-мяРНПЛигированные экзоныЛигированные экзоныИнтрон в форме лассоИнтрон в форме лассоРИС. 8.86.Упорядоченная сборка сплайсинго- сомы в процессе сплайсинга про- мРНК. Что происходит со сплайсин- госомой после лигирования двух экзонов и высвобождения интрона в форме лассо (петли), на рисунке не показано.РИС. 8.86.Упорядоченная сборка сплайсинго- сомы в процессе сплайсинга про- мРНК. Что происходит со сплайсин- госомой после лигирования двух экзонов и высвобождения интрона в форме лассо (петли), на рисунке не показано.U2.AF U2-MflPHnU2.AF U2-MflPHnU4/U6 иб-мяРНПU4/U6 иб-мяРНПэтерификации. Таким образом, единственное, чем, возможно, отличается сплайсинг с участием матураз от автокаталитического сплайсинга,- это способ образования каталитически активной конформации интрона

UI-мяРНП

UI-мяРНП

Лигированные экзоны

Лигированные экзоны

Интрон в форме лассо

Интрон в форме лассо

РИС. 8.86.

Упорядоченная сборка сплайсинго- сомы в процессе сплайсинга про- мРНК. Что происходит со сплайсин- госомой после лигирования двух экзонов и высвобождения интрона в форме лассо (петли), на рисунке не показано.

РИС. 8.86.

Упорядоченная сборка сплайсинго- сомы в процессе сплайсинга про- мРНК. Что происходит со сплайсин- госомой после лигирования двух экзонов и высвобождения интрона в форме лассо (петли), на рисунке не показано.

U2.AF U2-MflPHn

U2.AF U2-MflPHn

U4/U6 иб-мяРНП

U4/U6 иб-мяРНП

Вероятно, то же самое справедливо для сплайсинга с участием сплайсингосом. Возможно, мяРНП и ассоциированные с ними факторы создают что-то вроде «каркаса», на котором интрон «крепится» таким образом, что два его конца и нуклеотидный остаток из точки разветвления оказываются рядом друг с другом и могут активироваться. В этом смысле роль сплайсингосомы в случае ядерных про-мРНК аналогична роли матураз при сплайсинге некоторых интронов группы II. Возникает интересный вопрос: почему для укладки интронов ядерных про-мРНК необходим такой сложный комплекс мяРНП, если для сплайсинга некоторых интронов группы II достаточно одного белка-матуразы? По-видимому, это связано со сложностью феномена сплайсинга. Все митохондриальные интроны группы II похожи друг на друга; каждый из них содержит несколько высококонсервативных участков, и,

возможно, для образования и поддержания активной конформации интрона в этом случае нужен всего один или два белка. Но размеры и последовательности интронов ядерных про-мРНК необычайно разнообразны, очень велико и число разных интронов. Это создает дополнительные проблемы. Никакой отдельный белок, по-видимому, не способен придать всем интронам каталитически активную форму. Однако не исключено, что высококонсервативные мяРНП. которые могут спариваться всего с двумя или тремя консервативными последовательностями во всех интронах, а также связываться друг с другом, способны придать любому интрону конформацию, благоприятную для протекания двух реакций трансэтерификации, катализируемых РНК.

Транс-сплайсинг. До сих пор, говоря о сплайсинге, мы рассматривали внутримолекулярные, или цпс-реакции. А существует ли межмолекулярный, или т/юнс-сплайсинг? Иными словами, может ли происходить лигирование двух экзонов, находящихся в разных молекулах РНК, с одновременным удалением фланкирующих их интронов? Принци-

пиальная возможность межмолекулярного сплайсинга действительно продемонстрирована в опытах in vitro со специально сконструированными РНК- субстратами. Более того, как оказалось, транссплайсинг является важным этапом внутриклеточного образования всех мРНК у Trypanosoma и трех из четырех мРНК активных генов у С. elegans. В каждом случае сайты сочленений относятся к каноническому типу: GU в 5'-сочленении и AG в

Экзон 1Интрон Экзон 2

5'.сайт сплайсинга5-сайт сплайсинга

Б

РИС. 8.87.

Транс-сплайсинг мРНК in vitro. А. Сплайсинг с участием экзонов, находящихся в разных молекулах РНК, исследовали в экстракте, катализирующем сплайсинг про- мРНК. Одна РНК состоит из экзона и интрона, соединенных в 5'-сайте сплайсинга, а другая иэ экзона и интрона, соединенных в З'-сайте сплайсинга. Комплементарные участки этих РНК спарены. Вырезанные интроны имеют структуру типа лассо. Б. Две разные мРНК, интроны которых комплементарны почти по всей своей длине, использовались в качестве субстратов для сплайсинга in vitro. Ad это 5'- и З'-экэоны в мРНК аденовируса 2, GI-5'- и З'-экзоны в глобиновой мРНК. Интроны выделены точками. Внизу приведены четыре возможных продукта сплайсинга; два из них образовались в результате транс-сплайсинга, а два-в результате цис-сплайсинга. В рамки заключены основные продукты сплайсинга.

З'-сочленении. Более того, в качестве продукта образуется разветвленная структура.

Для демонстрации транс-сплайсинга in vitro были разработаны два экспериментальных подхода. В первом случае 5'-экзон и сегмент фланкирующего его интрона находятся на одной РНК, а З'-экзон и связанный с ним интрон- на второй (рис. 8.87,Л). Эти РНК удерживаются вместе благодаря комплементарному спариванию двух сегментов интронов. Эффективность правильного соединения экзонов и удаления сегментов интронов в клеточных экстрактах составляет примерно 15% от эффективности, наблюдаемой в том случае, когда интроны находятся в одной и той же молекуле РНК. Итак, ни наличие вторичной структуры, ни ковалентные разрывы в интроне не препятствуют сплайсингу. Второй эксперимент также основан на комплементар- ности последовательностей в двух интронах, что позволяет соединить соответствующие РНК (рис. 8.87,Б). В этом случае могут образоваться четыре продукта сплайсинга: два в результате транс-сплайсинга и два в результате цнс-сплайсинга. При сплайсинге in vitro такого субстрата получаются 5'-адено-адено-3'- (транс-сплайсинг) и 5'-глобин- адено-3'- (цис-сплайсинг)-продукты. Продукты дис- сплайсинга 5'-адено-глобин-3' и транс-сплайсинга 5'-глобин-глобин-3' тоже образуются, но в меньших количествах, вероятно, из-за близости стебля из спаренных оснований к точке разветвления интрона.

С помощью транс-сплайсинга образуются функциональная актиновая мРНК и некоторые другие мРНК в клетках С. elegans. В случае актина кэп и первые 22 нуклеотида на 5'-коннах актиновых мРНК, специфичных для мышечной ткани, образуются из 5'-конца РНК длиной 100 нуклеотидов, транскрибированной с повтора 58-рДНК, локализованного на другой хромосоме. Однако лучше всего изучен транс-сплайсинг при образовании мРНК Trypanosoma (разд. Ю.б.г). У всех мРНК Trypanosoma перед непрерывной кодирующей последовательностью находится одинаковая нетранслируемая 5'-последовательность из 35 нуклеотидов. Эти 5'-ми- ни-экзоны образуются из 5'-концевого участка РНК длиной 137 нуклеотидов, который транскрибируется с сотен тандемных копий соответствующего сегмента длиной 137 п. н. геномной ДНК (рис. 8.88). В ходе транс-сплайсинга 5'-мини-экзон длиной 35 нуклеотидов от одной РНК соединяется с кодирующим белок экзоном другой РНК. Сначала при соединении двух экзонов образуется разветвленная молекула РНК. На следующей стадии З'-сайт сплайсинга расщепляется, и два экзона соединяются. Затем разветвленный сегмент, содержащий «интронные» последовательности от двух отдельных РНК, расщепляется под действием особой дебранчинг-гидро- лазы, и интроны, которые принадлежали двум раз-

Мини-экзонный повтор

РИС. 8.88.

Транс-сплайсинг мРНК Trypanosoma. 5'-мини-экэоны происходят из коротких мРНК, транскрибированных с тандемно повторяющихся единиц транскрипции, которые располагаются в виде кластеров в специфических областях хромосомы. Эти транскрипты длиной 137 нуклеотидов состоят из 5'-мини-экзона длиной 35 нуклеотидов и интрона (выделен точками). Кодирующие белок экзоны, транскрибированные с соответствующих генов, подвергаются транс-сплайсингу, как это показано на рисунке.

ным РНК, разделяются. Особого внимания заслуживают следующие факты: 1) последовательность, находящаяся непосредственно за мини-экзоном у Trypanosoma, соответствует канонической последовательности 5'-сайта сплайсинга (GUAUGA); 2) подобным образом, последовательность интрона в месте соединения с кодирующим экзоном аналогична последовательностям З'-сайта сплайсинга ([C/U]nNNAG); 3) в интроне имеется точка ветвления, что указывает на идентичность механизмов цис- и транс-сплайсинга. Как образуется комплекс сплайсинга из двух отдельных РНК-неясно.

Сплайсинг тРНК

Механизм удаления интронов в тРНК лучше всего изучен у дрожжей, но некоторая информация получена в опытах с другими низшими эукариотами и растениями. Известны и выделены в высокоочи- щенном виде все ферменты сплайсинга, охарактеризованы все промежуточные формы (рис. 8.89,Л). Специфическая тРНК-эндонуклеаза расщепляет про-тРНК в 5'-сочленении интрона с образованием циклического 2',3'-фосфодиэфира на конце 5'-поло- вины тРНК. Тот же фермент расщепляет другое сочленение интрона с образованием 5'-гидроксиль-

ной группы на конце З'-половины тРНК. Эти реакции напоминают расщепление под действием некоторых РНКаз. Циклический фосфодиэфир на конце 5'-экзона затем отщепляется с образованием 2'-фос- фомоноэфира под действием циклической фосфодиэстеразы. После фосфорилирования 5'-гидрок- сильного конца З'-экзон аденилируется при помощи тРНК-специфичной лигазы; последняя реакция аналогична реакциям, катализируемым ДНК-лигазой (разд. 2.1.д). После лигирования активированных концов двух частей молекулы образуется необычная 2'-фосфат-3',5'-фосфодиэфирная связь, и затем при отщеплении 2'-фосфата под действием фосфатазы получается зрелая молекула тРНК. Заметим, что фосфат, участвующий в образовании новой диэфир- ной связи, до этого входил в состав АТР-особенность, отличающая сплайсинг тРНК у дрожжей от аналогичного процесса у позвоночных (рис. 8.89,5). В данной цепи реакций первоначальное эндонукле- азное расщепление приводит к образованию 5'-гид- роксильного и З'-фосфомоноэфирного концов, причем последний превращается в циклический 2',3'-фосфодиэфир под действием АТР-зависимой циклазы. Затем тРНК-специфичная лигаза соединяет обе части без дополнительной активации концов.

При фракционировании системы сплайсинга

РИС. 8.89.

Сплайсинг тРНК. А. Сплайсинг у дрожжей протекает с участием трех белков: эндонуклеазы, которая расщепляет про-тРНК в обоих сайтах сплайсинга с образованием указанных концов; полифункционального белка, катализирующего все остальные реакции, кроме фос- фатаэной; 2'-фосфатаэы. В этом случае в месте сочленения обоих экзонов находится фосфатная группа, ко-

дрожжей получены высокоочищенные препараты двух ферментов. Один из них катализирует эндо- нуклеазное расщепление на границах интрона; второй проявляет активность циклической фосфодиэстеразы и киназы и способен катализировать аденилирование и лигирование, причем все эти активности принадлежат одной полипептидной цепи. Оба фермента проявляют высокую специфичность в отношении данных реакций сплайсинга тРНК, однако они неспецифически действуют на любые тРНК-ин- троны и соединяют два участка любых тРНК. И действительно, из частей молекул, принадлежащих разным тРНК, были сконструированы весьма интересные гибриды.

торая до этого была концевым фосфатом АТР. Б У позвоночных три указанные реакции катализируют отдельные ферменты, при этом каждый фермент участвует только в сплайсинге тРНК. Отметим, что фосфат в месте соединения двух экзонов ранее находился в месте сочленения экзона и интрона.

Альтернативный сплайсинг:множественные белки одного гена

При сплайсинге большей части про-мРНК каждый интрон вырезается в соответствующих 5'- и З'-сайтах сплайсинга. В результате все экзоны и порядок их расположения в транскрипте сохраняются в зрелой мРНК и образуют непрерывную последовательность (конститутивный сплайсинг). Однако сплайсинг некоторых про-мРНК протекает по-разному с образованием семейства близких по строению мРНК, каждая из которых состоит из специфического набора экзонов и кодирует одну из изоформ белков одного семейства. Такой способ

процессинга РНК называется альтернативным сплайсингом. Растет число генов из разных организмов, от Drosophila до человека и их вирусов, о которых известно, что при созревании их про- мРНК используется альтернативный сплайсинг. Эти гены кодируют многие белки, в том числе некоторые белки, участвующие в формировании цитоскелета, мышечном сокращении, сборке мембранных рецепторов, пептидных гормонов, в промежуточном метаболизме и транспозиции ДНК.

Альтернативный сплайсинг позволяет получать разные продукты от одного-единственного гена без изменения его геномной организации. Он представляет собой эффективный способ продуцирования мРНК, кодирующих структурно родственные белки, в которых одинаковые аминокислотные последовательности определяются общими экзонами, а индивидуальные последовательности-экзонами, участвующими в альтернативном сплайсинге. В некоторых случаях разные мРНК при альтернативном сплайсинге образуются одновременно, при этом отдельные изоформы белка могут выполнять как одинаковые, так и разные функции. Все четыре изоформы основного белка миелина являются компонентами миелиновых оболочек нейронов центральной нервной системы; иммуноглобулины представлены двумя изоформами - мембраносвязанной и секретируемой (разд. 10.6.в). Сплайсинг некоторых транскриптов генов в разных тканях протекает по-разному; например, при экспрессии единственного гена кальцитонина в щитовидной железе синтезируется кальцитонин, а в мозгу его изоформа- белок, родственный кальцитонину; при этом каждый белок синтезируется на своей собственной мРНК, образующейся в результате дифференциального сплайсинга. В некоторых системах генов (в качестве примера можно привести ген тропонина Т млекопитающих и комплекс ultrabithorax у Drosophila) относительное содержание и типы мРНК, образующихся в результате альтернативного сплайсинга, регулируются в процессе развития. Альтернативный сплайсинг играет важную роль в становлении пола во время эмбриогенеза Drosophila. Так, разная активность регуляторных генов у самцов и самок обусловлена в большей степени специфическими половыми различиями в сплайсинге РНК, которые ведут к образованию функционально разных транскриптов у разных полов. Более того, отдельные гены в этой регуляторной иерархии не только самостоятельно контролируют свою активность на уровне сплайсинга, но и определяют способ сплайсинга транскриптов, функционирующих позднее на следующих этапах.

Типы альтернативного сплайсинга. Различают три основных типа альтернативного сплайсинга (рис 8.90). Сплайсинг типа 1 основывается на

использовании разных промоторов для образования родственных про-мРНК с неодинаковыми 5'-прокси- мальными областями разной длины. Представителями генов, сплайсинг которых осуществляется по этому типу, являются ген а-амилазы мыши (разд. 9.3.6) и ген легкой цепи миозина (MLC) позвоночных. Ген MLC транскрибируется с двух промоторов, находящихся на расстоянии около 10 т.п.н. друг от друга (рис. 8.91). Более длинная про-мРНК содержит все экзоны, а более короткая лишена первого экзона. При альтернативном сплайсинге образуются две мРНК примерно одинакового размера; обе они имеют пять З'-проксимальных конститутивных экзонов, но различаются своими 5'-экзо- нами. При сплайсинге более длинной про-мРНК экзон 1 присоединяется к экзону 4, «игнорируя» З'-сайты сплайсинга экзонов 2 и 3. Напротив, при сплайсинге более короткой про-мРНК соединяются экзоны 2, 3 и 5, а экзоны 3 и 4- нет. Анализ нуклеотидных последовательностей показал, что З'-сайт сплайсинга, фланкирующий экзон 2, поврежден, чем и объясняется невозможность соединения экзонов 1 и 2. Невозможность соединения экзонов 1 и 3, а также экзонов 3 и 4 объясняется иными причинами, которые обсуждаются ниже в этом разделе.

В альтернативном сплайсинге типа II участвуют про-мРНК, имеющие неодинаковые З'-проксималь- ные последовательности различной длины, что, как правило, является результатом полиаденилирования транскрипта в разных местах (рис. 8.90). При альтернативном сплайсинге, основанном на использовании пяти разных сайтов полиаденилирования, образуются пять разных групп поздних мРНК аденовируса 2. Таким же способом образуются два вида мРНК тяжелой цепи иммуноглобулина (разд. Ю.б.в). Один и тот же ген кальцитонина млекопитающих кодирует две мРНК (рис. 8.92). Одна получается из более короткой про-мРНК, а другая кодирует пептид, родственный кальцитонину. Все четыре экзона в более короткой про-мРНК кальцитонина сохраняются. Более длинная про-мРНК содержит два добавочных экзона, 5 и 6, которые остаются в гене кальцитонина после сплайсинга соответствующей мРНК, а экзон 4 утрачивается. З'-сайт сплайсинга интрона 4 лучше всего подходит для соединения с 5'-сайтом сплайсинга третьего интрона. В данном случае характер сплайсинга определяют разные тканеспецифичные сигналы полиаденилирования.

При альтернативном сплайсинге типа III, наиболее разнообразном и загадочном, из одинаковых про-мРНК образуются разные функциональные мРНК (рис. 8.90). В про-мРНК присутствуют все потенциальные экзоны, и при сплайсинге между ними делается выбор. Ярким примером сплайсинга

Альтернативные промоторы

Альтернативные сайты полиаденн- лирования

Кассетный сплайсинг

6

Взаимоисключаю /^/\/щий сплайсинг

Внутренний акцепторный сайтВнутренний акцепторный сайтВнутренний донорный сайтВнутренний донорный сайтИнтрон не вырезанИнтрон не вырезан

Внутренний акцепторный сайт

Внутренний акцепторный сайт

Внутренний донорный сайт

Внутренний донорный сайт

Интрон не вырезан

Интрон не вырезан

РИС. 8.90.

Типы альтернативного сплайсинга про-мРНК. Пунктирными прямыми разного цвета, соединяющими экзоны, представлены разные способы сплайсинга в зависимости от того, имеют ли про-РН К разные 5'-концы, разные З'-концы или одинаковые 5'- и З'-концы.

а- и P-типов, который характерен для многих генов (см. рис. 8.90), служит сплайсинг гена тропонина Т скелетной мышцы (рис. 8.93). мРНК тропонина Т а- и p-групп содержат либо экзон 16, либо экзон 17 соответственно. Это является результатом взаимо

исключающего лигирования экзонов 15, 16 и 18 или 15, 17 и 18. Выбор экзона зависит от стадии развития организма. Так, экзон 16 присутствует в мРНК мышечного тропонина Т у взрослых особей, а экзон 17 используется в мРНК как взрослого

MLC1 ТАТА

MLC3TATA

мРНК

РИС. 8.91.

MLC1 ®J 4 5 6 Т 8?'^'\\Х/

MLC3

мРНК, полученные при альтернативном сплайсинге про-мРНК, которые синтезировались с разных сайтов инициации транскрипции. В верхней части рисунка представлен ген легкой цепи миозина (MLC1) с девятью экзонами; интроны выделены точками. Стрелки указы

вают на разные сайты инициации транскрипции. При сплайсинге этих двух первичных транскриптов образуются мРНК, содержащие как одинаковые, так и разные экзоны.

ТАТАААТАААААТААА

ген H-i<2»34^^ei®B i-8

мРНКкалъцитонина /

(клеткищитовид- fg^TL^Yo ной железы)

РИС. 8.92.

мРНК CGRP (мозг)мРНК CGRP (мозг)IТАТАААТААА —iНФ^Н^^Ж^^Н^МФ^IТАТАААТААА —iНФ^Н^^Ж^^Н^МФ^45 6 7 856 16 16 145 6 7 856 16 16 1РИС. 8.93.Разные мРНК тропонина Т, полученные при альтернативном сплайсинге про-мРНК с одинаковыми 5'- и 3-концами. В верхней части рисунка представлен ген тропонина скелетных мышц Экзоны пронумерованы, а интроны выделены точками; указаны также сигналы инициации транскрипции и полиаденилирования-ТАТА и ААТААА соответственно. При альтернативном включении экзонов 16(a) или 17 (Р) образуются две группы мРНК. Каждая иэ них состоит иэ 32 мРНК. различающихся по тому, какие из экзонов 4-8 сохранились в молекуле после сплайсинга.РИС. 8.93.Разные мРНК тропонина Т, полученные при альтернативном сплайсинге про-мРНК с одинаковыми 5'- и 3-концами. В верхней части рисунка представлен ген тропонина скелетных мышц Экзоны пронумерованы, а интроны выделены точками; указаны также сигналы инициации транскрипции и полиаденилирования-ТАТА и ААТААА соответственно. При альтернативном включении экзонов 16(a) или 17 (Р) образуются две группы мРНК. Каждая иэ них состоит иэ 32 мРНК. различающихся по тому, какие из экзонов 4-8 сохранились в молекуле после сплайсинга.55555 65 65 665 665 665 6655555615 676 7Б 15615 676 7Б 1Разные,мРНК @1Т2 зРазные,мРНК @1Т2 зfeWvfeWvмРНК, полученные при альтернативном сплайсинге про-мРНК с разными полиаденилированными 3-концами. Показаны экзоны гена кальцитонина (пронумерованы) и интроны (выделены точками), ТАТА-бокс промотора и сигналы полиаденилирования (ААТААА). Две разные мРНК, одна иэ которых кодирует кальцитонин, а другая-родственный ему белок (CORP), образуются иэ транскриптов, которые полиаденилируются в первом или втором сайте полиаденилирования соответственно.

мРНК CGRP (мозг)

мРНК CGRP (мозг)

IТАТАААТААА —i

НФ^Н^^Ж^^Н^МФ^

IТАТАААТААА —i

НФ^Н^^Ж^^Н^МФ^

45 6 7 8

56 1

6 1

6 1

45 6 7 8

56 1

6 1

6 1

РИС. 8.93.

Разные мРНК тропонина Т, полученные при альтернативном сплайсинге про-мРНК с одинаковыми 5'- и 3-концами. В верхней части рисунка представлен ген тропонина скелетных мышц Экзоны пронумерованы, а интроны выделены точками; указаны также сигналы инициации транскрипции и полиаденилирования-ТАТА и ААТААА соответственно. При альтернативном включении экзонов 16(a) или 17 (Р) образуются две группы мРНК. Каждая иэ них состоит иэ 32 мРНК. различающихся по тому, какие из экзонов 4-8 сохранились в молекуле после сплайсинга.

РИС. 8.93.

Разные мРНК тропонина Т, полученные при альтернативном сплайсинге про-мРНК с одинаковыми 5'- и 3-концами. В верхней части рисунка представлен ген тропонина скелетных мышц Экзоны пронумерованы, а интроны выделены точками; указаны также сигналы инициации транскрипции и полиаденилирования-ТАТА и ААТААА соответственно. При альтернативном включении экзонов 16(a) или 17 (Р) образуются две группы мРНК. Каждая иэ них состоит иэ 32 мРНК. различающихся по тому, какие из экзонов 4-8 сохранились в молекуле после сплайсинга.

5

5

5

5

5 6

5 6

5 6

6

5 6

6

5 6

6

5 6

6

5

5

5

5

561

5 67

6 7

Б 1

561

5 67

6 7

Б 1

Разные,

мРНК @1Т2 з

Разные,

мРНК @1Т2 з

feWv

feWv

организма, так и эмбриона. В а- и Р-группах представлены все 32 возможных варианта альтернативного сплайсинга с участием экзонов с 4 по 8-от полного исключения до сохранения всех пяти экзонов в зрелых мРНК.

В некоторых случаях при сплайсинге используются 5'- и З'-сайты сплайсинга, находящиеся внутри экзонов или интронов. Так, несмотря на то, что подлинный 5'-сайт сплайсинга обычно сшивается с нормальным З'-сайтом, находящимся в конце данного интрона, в сплайсинге может участвовать и З'-сайт, расположенный внутри интрона, что приводит к удлинению следующего экзона (рис. 8.90, В). С другой стороны, «задействование» альтернативного сайта, расположенного в следующем экзоне, ведет к укорочению этого экзона. Аналогичные результаты получаются при использовании альтернативных 5'-сайтов сплайсинга внутри интронов или экзонов (рис. 8.90, Г}. Такие криптические сайты могут участвовать в сплайсинге, только если при этом получаются соответствующие рамки считывания. Этот последний способ альтернативного сплайсинга используется вирусами SV40 и полиомы для образования множества мРНК из тран-

SV40

скрипта ранней области (рис. 8.94). Существование такого типа сплайсинга вносит неразбериху в вопрос о различии кодирующих свойств экзонов и интронов.

Особенно интересным примером тканеспецифичного альтернативного сплайсинга является сплайсинг гена, кодирующего транспозазу Р-элемента Drosophila (разд. 10.2.6). В этом случае неспособность к удалению интрона, содержащего кодон терминации трансляции, блокирует экспрессию гена транспозазы в соматических клетках. Экспрессия гена транспозазы в клетках зародышевой линии происходит потому, что в них интрон удаляется, в результате чего рамка считывания увеличивается до размеров экзона, необходимого для синтеза активной транспозазы.

тТ-интронтТ-интронПолиомавирусПолиомавирусРИС. 8.94.Образование множества мРНК из транскрипта ранней области геномов SV40 и вируса полиомы при альтернативном сплайсинге. А. Положение большого (Т) и малого (t) интронов в 5'-про- ксимальной части ранней области генома SV40. Ниже представлены две мРНК, полученные в результате альтернативного сплайсинга, которые кодируют Т- и t-белки. Звездочкой отмечено положение терминирующего кодона, который отсутствует в T-мРНК, но есть в t-мРНК. Б. В ранней области генома вируса полиомы имеются три перекрывающихся интрона. При альтернативном сплайсинге один из них удаляется и образуется одна из трех ранних мРНК; на рисунке показано, какие экзоны при этом остаются в молекулах мРНК.РИС. 8.94.Образование множества мРНК из транскрипта ранней области геномов SV40 и вируса полиомы при альтернативном сплайсинге. А. Положение большого (Т) и малого (t) интронов в 5'-про- ксимальной части ранней области генома SV40. Ниже представлены две мРНК, полученные в результате альтернативного сплайсинга, которые кодируют Т- и t-белки. Звездочкой отмечено положение терминирующего кодона, который отсутствует в T-мРНК, но есть в t-мРНК. Б. В ранней области генома вируса полиомы имеются три перекрывающихся интрона. При альтернативном сплайсинге один из них удаляется и образуется одна из трех ранних мРНК; на рисунке показано, какие экзоны при этом остаются в молекулах мРНК.Ярким примером дифференциального сплайсинга служит сплайсинг РНК-генов ретровируса. Геном интегрированного провируса транскрибируется с образованием полной копии геномной РНК вируса, которая в конечном счете и упаковывается в вирион; никакого сплайсинга РНК не происходит (разд. 5.7.г). Тот же самый полноразмерный транскрипт представляет собой мРНК, кодирующую белок кора и обратную транскриптазу, а кроме того, он является про-мРНК, которая подвергается сплайсингу с

тТ-интрон

тТ-интрон

Полиомавирус

Полиомавирус

РИС. 8.94.

Образование множества мРНК из транскрипта ранней области геномов SV40 и вируса полиомы при альтернативном сплайсинге. А. Положение большого (Т) и малого (t) интронов в 5'-про- ксимальной части ранней области генома SV40. Ниже представлены две мРНК, полученные в результате альтернативного сплайсинга, которые кодируют Т- и t-белки. Звездочкой отмечено положение терминирующего кодона, который отсутствует в T-мРНК, но есть в t-мРНК. Б. В ранней области генома вируса полиомы имеются три перекрывающихся интрона. При альтернативном сплайсинге один из них удаляется и образуется одна из трех ранних мРНК; на рисунке показано, какие экзоны при этом остаются в молекулах мРНК.

РИС. 8.94.

Образование множества мРНК из транскрипта ранней области геномов SV40 и вируса полиомы при альтернативном сплайсинге. А. Положение большого (Т) и малого (t) интронов в 5'-про- ксимальной части ранней области генома SV40. Ниже представлены две мРНК, полученные в результате альтернативного сплайсинга, которые кодируют Т- и t-белки. Звездочкой отмечено положение терминирующего кодона, который отсутствует в T-мРНК, но есть в t-мРНК. Б. В ранней области генома вируса полиомы имеются три перекрывающихся интрона. При альтернативном сплайсинге один из них удаляется и образуется одна из трех ранних мРНК; на рисунке показано, какие экзоны при этом остаются в молекулах мРНК.

образованием мРНК, кодирующей белок оболочки вируса. В случае вирусов Т-клеточного лейкоза и иммунодефицита человека благодаря разным способам сплайсинга первичного транскрипта образуется целый набор мРНК, каждая из которых кодирует особый белок, необходимый для размножения вируса и развития инфекционного процесса (рис. IV.6).

Выбор сайта сплайсинга. Самой большой загадкой как конститутивного, так и альтернативного сплайсинга про-мРНК является механизм выбора пар соединяемых сегментов. Все объяснения можно разбить на две группы. Одни считают, что основная роль принадлежит структурным элементам самой про-мРНК или промежуточных продуктов, образующихся в процессе сплайсинга; они названы yuc-факторами. Другие - что основную роль играют транс-факторы, белки или другие РНК, которые влияют на выбор интронов, подлежащих удалению при сплайсинге. Использование сайтов сплайсинга почти наверняка носит иерархический характер, и эта иерархия, возможно, отражает относительное конкурентное преимущество наиболее предпочтительных 5'- и З'-сайтов сплайсинга в процессе образования сплайсингосом. При сплайсинге мРНК антигенов SV40 выбор между двумя путями альтернативного сплайсинга определяется выбором точки разветвления в интроне. Имеется несколько убедительных примеров, когда мутации в одном сайте сплайсинга приводили к тому, что вместо него начинал функционировать другой, обычно не использующийся сайт Есть все основания полагать, что шранс-факторы также влияют на характер сплайсинга, особенно в тех случаях, когда предположительно одинаковые про-мРНК подвергаются альтернативному сплайсингу, зависящему от физиологических условий или от типа ткани. Возможно, на характер сплайсинга влияют особые мяРНП или подобные матуразам белки, синтез или функционирование которых зависит от типа ткани или стадии развития организма. Ответ на некоторые из этих вопросов мы сможем получить в ближайшие несколько лет.

НОВЫЕ СТРУКТУРНЫЕЭЛЕМЕНТЫ В ФАКТОРАХТРАНСКРИПЦИИ

Факторы транскрипции должны выполнять по крайней мере две важные функции: связываться со специфическими последовательностями ДНК и влиять на инициацию транскрипции. Опыты с разнообразными белками, связывающимися с ДНК, показали, что специфичность связывания определяется кооперативными аддитивными взаимодейст

виями между какими-то областями ДНК и участками белковой молекулы с характерной структурой. Один из таких участков благодаря особой аминокислотной последовательности обеспечивает взаимодействие с ДНК, зависящее не от нуклеотидной последовательности этой молекулы, а от ее структурных особенностей (например, связывание может происходить с сахарофосфатным остовом В-спира- ли). Специфичность связывания обычно обусловливается неким структурным элементом, обеспечивающим взаимодействие между боковыми группами определенных аминокислот и парами оснований в главном желобке сайта связывания ДНК с помощью водородных связей и вандерваальсовых сил. Установлены два вида участков и аминокислоты, ответственные в некоторых случаях за сильное специфическое взаимодействие: при связывании белка-репрессора и белка Сго фага X и при связывании белка-репрессора trp и белка CAP E.coli. Вряд ли можно предположить, что стерические факторы определяют специфические ДНК-белковые взаимодействия подобно тому, как это происходит при образовании пурин-пиримидиновых пар в нуклеиновых кислотах. В самом деле, изучение упомянутых ранее ДНК-белковых взаимодействии свидетельствует о том, что отдельная аминокислота может образовывать связи с разными основаниями, а отдельное основание-с разными аминокислотами.

Но одного только связывания факторов транскрипции с ДНК еще недостаточно для регуляции транскрипции, хотя оно и необходимо. Белок должен иметь также регуляторный домен. Связывающий и регуляторный домены могут быть частью одного и того же белка или принадлежать разным белкам. Эти два белка, взаимодействуя друг с другом, обеспечивают образование функционального, промоторспецифичного фактора регуляции транскрипции.

Изучение факторов транскрипции эукариот еще только начинается. Тем не менее уже определены некоторые структурные домены, создающие пространственный каркас, который обеспечивает специфические взаимодействия аминокислот с парами оснований. В каждом белке имеются два домена, один из которых отвечает за связывание ДНК, а второй-за регуляцию транскрипции. Домены не являются взаимозависимыми; можно соединить домен связывания ДНК и регуляторный домен из разных белков и образовать факторы транскрипции со свойствами, характерными для каждого домена. Более того, если связывающаяся с белком последовательность располагается вблизи ТАТА-блока, то такие химерные белки могут присоединяться к ДНК и регулировать транскрипцию у целого ряда эукариот (например, дрожжей, Drosophila, лягушек и млекопитающих).

Домены связывания ДНК

Спиралъ-петля-спиралъ. Наиболее полно охарактеризованным структурным ДНК-связывающим элементом является спираль-петля-спираль, впервые обнаруженный в белке Сто и белке-репрессоре фага X. Благодаря этому элементу белок а2 дрожжей МАТ, подавляющий транскрипцию генов, которые участвуют в определении типа спаривания (разд. 10.6.6), может связывать специфические последовательности нескольких промоторов.

Характерной особенностью структуры спираль- петля-спираль, определяющей ее взаимодействие с ДНК, является не аминокислотная последовательность, а геометрия: две а-спирали, разделенные петлей из нескольких аминокислот. Исходя из данных рентгеноструктурного анализа некоторых белков и их комплексов с ДНК была построена модель, объясняющая специфичность связывания белков с ДНК. Как показывают структурные данные, и Сго, и репрессор образуют димеры; при этом димеризация является результатом взаимодействий между антипараллельными Р3-слоями белка Сго и между а5-спиралями репрессора (рис. 8.95). Участки ДНК, с которыми связываются Сго и репрессор, имеют ось симметрии 2-го порядка, благодаря чему эле-

белок Сго Репрессор фага ^ РИС. 8.95.

Димеры, которые образуют молекулы белка Сго и репрессора фага X (вид вдоль оси симметрии 2-го порядка). Белок Сго состоит из трех а-спиралей (цилиндры) и одного трехцепочечного антипараллельного P-слоя (стрелки). Репрессор фага X состоит из пяти а-спиралей, а p-слой у него отсутствует. Взаимодействие между субъединицами осуществляется в этом случае за счет контактирования пятых а-спиралей, а связывание с ДНК-при участии а2- и аЗ-спиралей (они выделены серым цветом). [Y. Takeda et al.. Science 221 (1983), p. 1020.]

менты спираль-петля-спираль обоих мономеров связываются с половинами симметричной структуры бок о бок, стабилизируя таким образом всю систему (рис. 8.96). Наиболее важными детерминантами, обеспечивающими специфичность связывания, являются взаимодействия между аминокислотами одной из спиралей мономера-«узнающей спирали» (аЗ-спираль в белках Сго и репрессоре) с участком из шести оснований в главной бороздке. Вторая по ходу цепи спираль (а2-спираль в каждом белке) обеспечивает взаимодействие с сахарофос- фатным скелетом и, возможно, с основаниями, примыкающими к узнающей последовательности, стабилизируя таким образом комплекс ДНК с белком. В пользу такой модели говорят результаты опытов, в которых изменяли специфичность связывания ДНК путем замены аЗ-спирали на спираль, принадлежащую белку с другой специфичностью связывания. Идентификация аминокислот, ответственных за узнавание и стабилизацию, основывается на мутационных изменениях ключевых остатков в каждом домене.

Гомеодомены. Обнаруживается все больше генов, участвующих в регуляции развития различных эукариот, которые содержат специфическую последовательность из 180 п.н. в белок-кодирующей области. Эта последовательность называется гомеобоксом, поскольку впервые она была обнаружена в гомеотических генах Drosophila. Экспрессия этих генов, детерминирующих сегменты, из которых впоследствии развиваются голова, грудь и брюшко, происходит после экспрессии материнских генов, генов зиготы и сегментации, но предшествует дифференциации отдельных типов клеток внутри каждого сегмента (разд. 8.3.ж). Со времени своего обнаружения гомеобокс был найден во многих других генах Drosophila, в частности в тех, которые определяют пути дифференцировки клеток на стадии раннего эмбриона. Почти все содержащие гомеобокс гены Drosophila экспрессируются в особой группе эмбриональных клеток, и каждый тип клеток содержит уникальную комбинацию продуктов генов, имеющих гомеобокс. Определенные гены, содержащие гомеобокс, по-видимому, кодируют факторы регуляции транскрипции, которые влияют на экспрессию других генов с гомеобоксами, а также на синтез нерегуляторных структурных белков. Вслед за генами Drosophila гомеобоксы были обнаружены в генах, участвующих в регуляции процессов развития или аналогичных процессов у червей, лягушек, мышей и человека. Вероятно, эти гены можно рассматривать как гены, определяющие родословную клетки. Так, ранний эмбрион еще до образования отдельных органов делится в результате экспрессии гена, содержащего гомеобокс, на переднюю и заднюю половины, имеющие разные пути

РИС. 8.96.Связывание ДНК с белками, которые содержат структурный элемент «спираль-петля-спираль». Домены, принимающие участие в связывании ДНК, изображены в виде больших серых кругов. Узнающая аЗ-спиральРИС. 8.96.Связывание ДНК с белками, которые содержат структурный элемент «спираль-петля-спираль». Домены, принимающие участие в связывании ДНК, изображены в виде больших серых кругов. Узнающая аЗ-спиральи стабилизирующая а2-спираль выделены цветом. А- вид сбоку, Б-вид спереди. [D. К. Ohlendorf, W. F. Anderson, B.W. Mathews, J. Mol. Evol. 19 (1983), p. 109.]и стабилизирующая а2-спираль выделены цветом. А- вид сбоку, Б-вид спереди. [D. К. Ohlendorf, W. F. Anderson, B.W. Mathews, J. Mol. Evol. 19 (1983), p. 109.]развития. Где бы ни находился гомеобокс из 180 п.н., он кодирует гомеодомен из 60 аминокислот, который, как теперь известно, является ДНК-свя- зывающим элементом у белков этого класса. Помимо той особенности, что они почти всегда находятся в определенном месте белковой молекулы, гомеодомены обладают еще одним, по-видимому, наиболее замечательным свойством-они образуют элемент типа спираль-петля-спираль. Наличие такой структуры в пептиде, содержащем гомеодомен, было показано с помощью рентгеноструктурного анализа.

РИС. 8.96.

Связывание ДНК с белками, которые содержат структурный элемент «спираль-петля-спираль». Домены, принимающие участие в связывании ДНК, изображены в виде больших серых кругов. Узнающая аЗ-спираль

РИС. 8.96.

Связывание ДНК с белками, которые содержат структурный элемент «спираль-петля-спираль». Домены, принимающие участие в связывании ДНК, изображены в виде больших серых кругов. Узнающая аЗ-спираль

и стабилизирующая а2-спираль выделены цветом. А- вид сбоку, Б-вид спереди. [D. К. Ohlendorf, W. F. Anderson, B.W. Mathews, J. Mol. Evol. 19 (1983), p. 109.]

и стабилизирующая а2-спираль выделены цветом. А- вид сбоку, Б-вид спереди. [D. К. Ohlendorf, W. F. Anderson, B.W. Mathews, J. Mol. Evol. 19 (1983), p. 109.]

Анализ аминокислотной последовательности многих гомеобелков свидетельствует о том, что гомеобелки позвоночных и Drosophila в чем-то сходны, но в чем-то и различаются. Сходство заключается в высоком содержании основных аминокислот (около 30% остатков представлено аргинином

или лизином), что согласуется с их ДНК-связы- вающей способностью. Но гомеодомены позвоночных имеют некоторые отличительные особенности (рис. 8.97). Большинство из них содержат консервативную N-концевую последовательность Met-Ser- Ser-Leu-Tyr-Tyr-одна из аминокислот-Asn, за которой идет вариабельный участок, имеющий, однако, гомологичные сегменты, характерные для гомеобелков разных классов (при этом либо степень их гомологии мала, либо сами сегменты непротяженные). Сразу перед гомеодоменом находится консервативный пентапептид Ile-Tyr-Pro-Trp-Met, а за доменом-С-концевая последовательность, богатая кислыми аминокислотами.

Имеются данны о том, что гомеодомен необходим для проявления соответствующими белками ДНК-связывающей активности. Так, точечные му-

ИнтронИнтрон[MSSLYY-N [Вариабельный участок[MSSLYY-N [Вариабельный участокГомеодоменГомеодоменIYPWM гомеопептидIYPWM гомеопептид123а-Спирали123а-СпиралиКислый конецКислый конец

Интрон

Интрон

[MSSLYY-N [Вариабельный участок

[MSSLYY-N [Вариабельный участок

Гомеодомен

Гомеодомен

IYPWM гомеопептид

IYPWM гомеопептид

123

а-Спирали

123

а-Спирали

Кислый конец

Кислый конец

Консервативный М-конец

Arg Lys Arg Gly Arg Gin Thr Tyr Thr Arg Tyr Gin Thr Leu Glu Leu Glu Lys Gly Phe

2140

His Phe Asn Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg He Glu He Ala His Ala Leu Cys Leu

Thr Glu Arg Gin Jie Lys He Trp Phe Gin Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Glu Asn РИС 8.97.

Особенности строения белков, содержащих гомеодомены. В верхней части рисунка представлены основные структурные элементы таких белков. Многие из них имеют характерную N-концевую последовательность, содержащую метионин (М), серин (S), лейцин (L), тирозин (Y), какую-нибудь одну из аминокислот ( ) и аспарагин (N). Далее находится участок, длина и аминокислотная последовательность которого варьируют, а за ним короткий инвариантный участок из пяти аминокислот: изолейцина (I), тирозина (Y), пролина (Р), триптофана (W) и метионина (М). Гомеодомен тации и мутации со сдвигом рамки в гомеодомене полностью подавляют ДНК-связывающую активность белков, в то время как мутации в других участках белка дают менее выраженные эффекты. При замене гомеодоменов связывающая способность нового белка соответствует связывающей способности белка, откуда произошел этот гомеодомен. Участки ДНК, с которыми связываются гомеобелки, обычно не имеют оси симметрии 2-го порядка, поэтому можно предположить, что связываются только мономеры. Важным свойством некоторых гомеобелков является их способность связывать неодинаковые, но родственные последовательности ДНК, хотя и с разной эффективностью. Возможно, такая специфичность связывания позволяет регулировать транскрипцию нескольких видов генов с помощью одного гомеобелка.

Детали специфического связывания с ДНК белков, имеющих гомеодомены, неизвестны. Широко распространено мнение, что специфичность определяется организацией аминокислот в пределах самого элемента спираль-петля-спираль и вокруг него. Вероятно, на связывание влияют и другие консервативные особенности белков, но это влияние, по-видимому, невелико. Не исключено, что способность данных белков связывать ДНК и/или

с ярко выраженными основными свойствами, состоящий из 60 аминокислот, расположен вблизи кислого (богатого остатками глутаминовой кислоты) С-конца молекулы. Он может образовывать три а-спирали, из которых формируется ДНК-связывающий элемент спираль- петля-спираль. В нижней части рисунка приведена аминокислотная последовательность гомеодомена белка, кодируемого геном antennapedia Drosophila. Основные аминокислоты выделены цветом. [C.V. Е. Wright et al.. Trends Biochem. Sci. 14 (1989), p. 52; W. J. Gehring, Sci. American 253 (October 1985), p. 153.]

регулировать транскрипцию опосредуется действием небольших молекул. Еще более вероятно, что у этих белков есть участки, которые позволяют им взаимодействовать с другими белками с образованием функционально активного белкового комплекса. Связанные с ДНК гомеобелки влияют на транскрипцию со своих промоторов-мишеней неизвестным пока способом. Возможно, в этом принимают участие кислые С-концы и N-концевые вариабельные области, богатые пролином и глутамином (разд. 8.6.6).

P0U-домены. Некоторые факторы транскрипции, принимающие участие в специфичной для данной ткани или стадии развития регуляции, имеют сложную регуляторную область примерно из 160 аминокислот, куда входит характерный гомеодомен. Эта область высококонсервативна в факторе транскрипции (Pit-1), необходимом для активации транскрипции генов пролактина и гормона роста у крыс, в двух белках, связывающих октамерную последовательность, как широко распространенном, так и лимфоидспецифичном: OTF-1 и OTF-2, а также в транскрипционном регуляторе развития нейронов у C.elegans (Unc-86). Сокращение POU относится к белкам, в которых эта регуляторная область была впервые найдена.

Oct-1

POU-домен

I1

Oct-2Oct-2line-86 ||100 аминокислотPiH|~]I1line-86 ||100 аминокислотPiH|~]I1POU-Sp homeoPOU-Sp homeo

Oct-2

Oct-2

line-86 ||

100 аминокислот

PiH|~]I1

line-86 ||

100 аминокислот

PiH|~]I1

POU-Sp homeo

POU-Sp homeo

РИС. 8.98.

Положение и организация POU-доменов некоторых факторов транскрипции. POU-Sp - POU-специфичный домен, homeo - гомеодомен. Представлены следующие факторы транскрипции: белки, связывающие октамеры, Oct-1 (OTF-1) и Oct-2 (OTF-2), фактор транскрипции, кодируемый геном Unc-86 С. elegans; гипофиз-спе- цифичный фактор транскрипции Pit-1. Размер POU-доменов во всех белках примерно одинаков, но в разных белках они находятся на разном расстоянии от концов молекулы.

Положение и размер двух консервативных участков, которые вместе составляют POU-домен в четырех упомянутых выше белках, показаны на рис. 8.98, а степень гомологии последовательностей этих доменов-на рис. 8.99. Последовательности трех гомеодоменов близкородственны и, как в случае других гомеобелков, могут образовывать структуру спираль-петля-спираль. Узнающей спирали этого элемента, вероятно, соответствует высококон

сервативная С-концевая треть гомеодомена, названная областью WFC из-за присутствия в ней остатков триптофана (W), фенилаланина (F) и цистеина (С). Этот вывод можно сделать исходя из того, что изменения в области WFC нарушают связывание обоих белков OTF с октамерной последовательностью. Связываются ли эти белки с соответствующими последовательностями ДНК при участии структуры спираль-петля-спираль гомеодомена и

Рои-специфичный домен

Pit I к S К L V t Е R I D MB s Р Е I Я t LE6F АнЕГ К V Я RI KL G V ТОТ N V 6 Е A LA Av И G S ЕГ SO ТТ I С RF Е N L 6 LSFK Н ACKL К A I L Ь KWLt ЕА Е Q V

Oct 1 D TP s LEEPSDLEELEQF АКТЕ К QR R I К L G F T GOT V OL A MOKL V О H DFSftTT IS R FEA L II LSF К HMC К LKF L LEKWL H DA IN L

Oct-2 PPSHPEEPSSLEELEQFAKTFKeRRlKLGFTeGDVGLAMGKLVeWDFSGTTlSRFEALWLSFKNMCKLKPL LEKWLHCAt T M

КаноНИEE P ■ DELEQFA..FK.RRIKLG.Te..V6.A6 • ■ F8 QT TI . R F E • L - LS F К N . С К L К ■ • L . KWL ■ ■ A E • •

ческая

РОи-гомеодомен

ЯК R К R RTT I SIAAKBALERMFGeHSKFSGRElKRK KKRTSIETHI AVAL EKSFlthaKPTSEElЯК R К R RTT I SIAAKBALERMFGeHSKFSGRElKRK KKRTSIETHI AVAL EKSFlthaKPTSEElКН » к ART S1 ETHVl A I EKS FL A N QKPT s EEI L LКН » к ART S1 ETHVl A I EKS FL A N QKPT s EEI L L

ЯК R К R RTT I SIAAKBALERMFGeHSKFSGREl

KRK KKRTSIETHI AVAL EKSFlthaKPTSEEl

ЯК R К R RTT I SIAAKBALERMFGeHSKFSGREl

KRK KKRTSIETHI AVAL EKSFlthaKPTSEEl

КН » к ART S1 ETHVl A I EKS FL A N QKPT s EEI L L

КН » к ART S1 ETHVl A I EKS FL A N QKPT s EEI L L

Pit CA LVE КV GAW- E

Oct-1 SS DSSLsS PS ALUS -OIEGL-S

Oct-2 Sv 1SSLS S FNQLSSPSLGF DG IP G

МЯМ A EELHLEKEVV KVWFCNRR 4 R I KR VKT S LHQS

TMIAiqiNMEKEVI RVWFCH Я Я ftKE К R I Н F PS SGG

IА Е ft L и М ЕК Е V I RV WFCN Я RQ К EKR I Н р CS Аа Р

-•ALE.-•ALE.

-•ALE.

-•ALE.

мнони- R- R к . AT . I . . .

четкая nocneaosa льность

РИС. 8.99.

Гомологичность POU-доменов некоторых факторов транскрипции. Представлены аминокислотные последовательности POU-доменов факторов транскрипции Pit-1, Oct-1 (OTF-1) и Oct-2 (OTF-2) с использованием однобуквенных обозначений аминокислот (рис. 1.24). Последовательности расположены относительно друг друга таким образом, чтобы число совпадений было максимальным. Цветом выделены те случаи, когда одинаковые аминокислоты встречаются в данной позиции не менее чем у двух белков. Представлена также каноническая последовательность для тех позиций, в кото-

. F. . - . КР- S . El . .-A-.L.-EKEV. RVWF CNRRQ.EKR - • ■

—WFC—

9-КЯ9-КЯрых у всех трех белков находятся одинаковые аминокислоты. В эту последовательность не включены аминокислоты, имеющие разную структуру, но близкий заряд, а также разные аминокислоты, близкие по структуре. WFC- высококонсервативная последовательность на С-конце, содержащая аминокислоты триптофан (W), фенилаланин (F) и цистеин (С). Как отмечалось в тексте, этот участок существен для проявления активности факторов транскрипции, содержащих POU-домены.

9-КЯ

9-КЯ

какова роль POU-специфичного домена в этом связывании и/или регуляции транскрипции неясно. Полагают, что POU-специфичная область обеспечивает взаимодействие этих белков с другими белками, при котором изменяется их регуляторный эффект.

Цинковые пальцы. Исследование аминокислотной последовательности TFIIIA, одного из факторов транскрипции 58-рРНК-генов, показало, что в домене связывания ДНК присутствуют так называемые цинковые пальцы (разд. 8.4.в). С тех пор было обнаружено множество белков, содержащих аналогичные последовательности, которые могут образовывать хелатные связи с ионом цинка. Различное число цинковых пальцев содержится в белке GAL4 дрожжей (разд. 8.3.е), в факторе Spl млекопитающих (разд. 8.3.г) и в рецепторах стероидных гормонов (разд. 8.3.е). У Drosophila белок, который содержит несколько таких пальцев, кодируется (разд. 8-З.ж) дар-геном hunchback. Белок млекопитающих, индуцируемый стеролом, который регулирует работу генов, участвующих в биосинтезе стерола, и гена, кодирующего рецептор липопротеина низкой плотности, содержит шесть цинковых пальцев, которые связываются со стерол-акцепторными элементами в промоторах этих генов. Корреляция между способностью к регуляции транскрипции и наличием цинковых пальцев становится настолько очевидной, что обнаружение таких структурных элементов в белке, кодируемом неким геном, может служить основанием для того, чтобы говорить о регуляторной роли продукта этого гена в транскрипции.

Известны по крайней мере три типа цинковых пальцев. Они различаются числом и локализацией остатков цистеина и гистидина, координационно связанных с атомом цинка. Основное структурное свойство одного из типов цинковых пальцев (тип TFIIIA) наличие петли, образующейся при координационном связывании атома цинка с парами остатков цистеина и гистидина, разделенных 12 аминокислотами (рис. 8.69). Цинковые пальцы второго типа характеризуются тем, что в координационном связывании участвует разное число остатков цистеина. Например, цинковый палец GAL4 содержит шесть цистеиновых остатков, из которых только четыре связаны с атомом цинка; цинковые пальцы ДНК-связывающих доменов в рецепторах стероидных гормонов содержат четыре цистеина. У цинковых пальцев третьего типа в связывании с атомом цинка участвуют три остатка цистеина и один - гистидина. Но не исключено, что для образования цинкового пальца подходит любая комбинация остатков цистеина и гистидина. Вероятно, с этими остатками могут связываться и атомы других металлов, а когда имеется более четырех потенциаль

ных сайтов координационного связывания, металлы образуют координационные связи с альтернативными парами сайтов.

Для изучения структуры цинковых пальцев использовали разные физические методы, в частности метод кругового дихроизма и ЯМР; исследовали также трехмерную структуру пептида, содержащего один цинковый палец. Было показано, что атом цинка погружен в глубь молекулы и находится в окружении а-спиралей и других спиральных структур, связанных друг с другом при помощи Р-слоев (рис. 8.100).

Фактор TFIIIA может связываться с внутренней регуляторной областью гена 5S-pPHK только при наличии интактных цинковых пальцев, а для связывания Spl с соответствующей последовательностью ДНК необходимо, чтобы в белковой молекуле присутствовал цинк. Далее, мутации в областях, прилегающих к цинковому пальцу в белке GAL4 или к пальцу в рецепторе кортикостероидного гормона, блокируют их связывание с соответствующими последовательностями-мишенями. Наличие у цинковых пальцев ДНК-связывающей способности подтверждается двумя фактами: 1) укороченные белки TFIIIA или Spl, содержащие только сами пальцы, сохраняют способность специфически связываться с ДНК; 2) при замене цинковых пальцев

РИС. 100.

Модель цинкового пальца, построенная с помощью компьютерной графики по данным ЯМР. Углеродный скелет представлен в виде трубки. Атом цинка (шар) соединен при помощи координационных связей с двумя остатками цистеина и двумя остатками гистидина. Показаны также остатки фенилаланина и лейцина. [М. Lee et al Science 245 (1989), р. 635. Фотография предоставлена М. Е. Pique, Р. Е. Wright.]

c-junс :

, Участок, Основный богатый участок лейцином

Связывание ДНК

с (os

Участок, Основный богатый участок лейцином

СвязываниеДНК

РИС. 8.101.

Положение и организация элементов, получивших название «лейциновая молния», в факторах транскрипции млекопитающих и дрожжей. Основой элемента является а-спираль, в которой каждый седьмой остаток представлен лейцином (рис. 8.103). Еще один компонент-участок с ярко выраженными основными свойствами, ответственный за связывание белка с ДНК.

6CN4

, Участок, Основный богатый участок лейцином

Связывание ДНК

лейцина в пределах относительно протяженного а-спирального участка (рис. 8.102). Если мы посмотрим на а-спираль с торца, то она будет иметь

эстрогена на соответствующие цинковые пальцы рецептора кортикостероидного гормона образуется гибридный рецептор, который соединяется с элементом, чувствительным к кортикоиду, а не с сайтом связывания эстрогенового рецептора.

Механизм связывания цинковых пальцев с ДНК до конца не выяснен. Известно, что связывание происходит по главной бороздке ДНК, но остатки, которые определяют специфичность и прочность связывания, пока не установлены. В некоторых случаях за специфичность ответственны аминокислотные остатки пальца, образующие петлю. В рецепторе экстрогена определяющую роль в специфичности связывания ДНК играет один из двух пальцев; более того, некоторые остатки, влияющие на специфичность связывания, находятся у основания пальца (разд. 8.3.е). Так, единственный цинковый палец в белке GAL4 можно заменить на палец, кодируемый чужеродным геном, и модифицированный белок все равно будет связываться с UASgal. Итак, цинковые пальцы образуют структуру типа петли, что обеспечивает специфичность взаимодействия отдельных остатков с соответствующими сайтами связывания ДНК. Возможно, пальцы участвуют и в неспецифических взаимодействиях, стабилизирующих ДНК-белковый комплекс, т.е. играют роль, аналогичную роли второй спирали в элементе спираль-виток-спираль.

«Лейциновые молнии». Некоторые факторы транскрипции, в частности С/ЕВР, ДНК-связываю- щие регуляторы транскрипции млекопитающих семейства APl-Jun и родственные GCN4 факторы транскрипции дрожжей, содержат одинаковый структурный элемент, состоящий из двух компонентов и названный «лейциновой молнией» (рис. 8101). Такой структурный элемент несут и некоторые факторы транскрипции млекопитающих, в основном кодируемые генами с-тус и c-fos, хотя сами эти факторы не связываются с ДНК.

Характерной особенностью лейциновой молнии

вид кольца, от которого отходят боковые группы

аминокислот, при этом остатки лейцина окажутся с каждым новым витком на одной и той же стороне спирали. На противоположной же стороне спирали обнаружится необычно много отрицательно заря-

GRNА

РИС. 8.102.

Представление а-спиральных участков в лейциновых молниях в виде колец. Рисунок иллюстрирует положение остатков лейцина (L) в лейциновых молниях следующих белков: белка, связывающего энхансер (С/ЕВР); белка тус (с-тус) мыши; белка, кодируемого вирусным онкогеном v-jun; белка GCN4 дрожжей. Приведены также другие аминокислотные остатки, входящие в состав а-спирального участка лейциновой молнии. Номера аминокислот возрастают по мере их уда-

ления от читателя.ления от читателя.является периодичность в расположении остатков

ления от читателя.

ления от читателя.

c-jun c-fos 6CN4c-jun c-fos 6CN4

c-jun c-fos 6CN4

c-jun c-fos 6CN4

Основный доменЛейцин-богатый участок

II I 'I

Е SQ Е RI К AERKRMRNRIAAS К С R КRK LE R I A R L Е Е К V К T LKAQNSELASTANМLRЕQVAQI SP Е Е ЕЕKRRI RRERNKHAAA К С R N R R R Е LT D Т L Q А Е Т D<1 L ED Е К S A L QTЕ I A N L L КЕ КЕ К L VPESSDPAALKRARNTEAARRSRARKLQRMKQLEDKVEELLSKNYHbENEVARLKKLVGER

РИС. 8.103.

Аминокислотные последовательности некоторых основных доменов и лейцин-богатых участков лейциновых молний. Связывание ДНК с белками, содержащими лейциновые молнии, осуществляется при участии ос-

женных остатков. Возможно, образование ионных пар, а также стэкинг-взаимодействие между гидрофобными остатками стабилизирует эти длинные спирали. Важной особенностью лейциновой молнии является наличие обогащенной основными аминокислотами последовательности, соседствующей с лейциновой спиралью (рис. 8. Ю! и 8. ЮЗ).

Белки с лейциновой молнией могут образовывать как гомо-, так и гетеродимеры. Это происходит благодаря гидрофобным взаимодействиям между остатками, располагающимися на поверхности параллельных друг другу спиралей (рис. 8.104). Специфичность при связывании ДНК, по-видимому, обусловливается взаимодействием между соответствующими нуклеотидными последовательностями и аминокислотами, находящимися в пределах основных доменов и по соседству с ними.

Белки, содержащие лейциновую молнию, всегда связываются с ДНК в виде димеров. Образование такого димера является необходимой предпосылкой эффективного связывания. Если способность к образованию димера нарушена вследствие мутаций, изменяющих аминокислотную последовательность лейциновой молнии или ее вторичную структуру, то связывания ДНК не происходит, даже если основный домен остается интактным. Мутации в основной области тоже блокируют связывание ДНК, но на способность белка к димеризации они не влияют. Таким образом, специфичность связывания данных белков с ДНК определяется сочетанием двух структурных особенностей: лейциновая молния обеспечивает димеризацию, а основный домен участвует в образовании ДНК-связывающего элемента. Однако основный домен может функционировать только при условии димеризации, хотя димеризация не зависит от основного домена.

Факторы транскрипции GCN4 и С/ЕВР связываются с ДНК только в виде гомодимеров; напротив, гомодимеры факторов транскрипции семейства APl-Jun связываются с ДНК плохо. В то же время фактор APl-Jun образуют гетеродимеры с белками класса fos, которые связываются с ДНК значительно более эффективно. Белки fos не образуют гомодимеры и не присоединяются к ДНК, хотя они

новного домена, находящегося слева от лейцин-бога- того участка Основные аминокислоты выделены цветом.

содержат характерную лейциновую молнию и основные домены. Неспособность fos к связыванию с ДНК, вероятно, объясняется тем, что данный белок не может образовывать гомодимеры, поэтому его способность образовывать гетеродимеры с другими факторами кажется особенно загадочной.

Зависящее от димеризации связывание ДНК, по-видимому, становится возможным благодаря сближению основных доменов двух белков, соединяющихся при помощи лейциновой молнии (рис.

РИС. 8.104.

Схематическое изображение винтообразной структуры лейциновой молнии (вид сверху и сбоку). Параллельные спирали представлены в виде цилиндров; направле ние белковой цепи показано стрелками. Серые кружки остатки лейцина, цветные-остатки гидрофобных аминокислот. [По рис. 4 из работы Т. G. Oas et al., Biochemystry 29 (1990), p. 2891. Рисунок любезно предоставлен P.S. Kim до публикации]

РИС. 8.105.

Связывание димеров факторов транскрипции, содержащих лейциновые молнии, с родственными последовательностями ДНК при помощи основных доменов. Согласно модели, димерная структура стабилизируется за счет взаимодействий между остатками лейцина и гидрофобными остатками. Симметрично расположенные основные домены белкового димера связываются с соответствующим сайтом в молекуле ДНК, обладающим осью симметрии 2-го порядка. [W. Н. Landschulz el al.. Science 243 (1989), p. 1689.]

8.105). Следовательно, белки с лейциновой молнией связываются с ДНК кооперативно, особенно если участок связывания имеет ось симметрии 2-го порядка. В этом случае каждый основный домен связывается с половиной сайта. Гетеродимеры тоже должны связываться с такими палиндромными сайтами кооперативно, но при этом одна из субъединиц будет оказывать влияние на специфичность или стабильность взаимодействий. Гетеродимеры югут также специфически связываться с двумя или несколькими участками. Это позволяет им по-разному взаимодействовать с близкородственными последовательностями или регулировать транскрипцию с промоторов, имеющих разное устройство некоторых сигнальных последовательностей. Совершенно очевидно, что регуляция транскрипции опосредуется сложными взаимодействиями между белками и соответствующими последовательностями ДНК, и существование гетеродимерных факторов переводит регуляцию транскрипции на новый, более высокий уровень.

Домены регуляции транскрипции

Связывание со специфической последовательностью ДНК - только одна из двух важных функций белков регуляции транскрипции. Кроме этого, связавши ся белки должны вступить во взаимодействие

с комплексом транскрипции, с тем чтобы инициировать или подавить процесс. Теперь мы знаем, что каждая из этих функций-связывания и регуляции- может быть соотнесена с определенными белковыми доменами. Каков бы ни был фактор транскрипции, домен связывания у него относительно невелик, но высокоспецифичен; более того, домен связывания функционирует автономно, т. е. узнает и связывает родственную последовательность даже в отсутствие остальной части белковой молекулы (разд. 8.3 и 8.6.а). Напротив, домены, ответственные за регуляцию транскрипции, менее автономны и относительно неспецифичны. Они могут регулировать транскрипцию с участием широкого круга промоторов при условии, что регуляторные домены связываются вблизи последовательности ТАТА. Таким образом, гибридные белки, содержащие регуляторную область одного фактора транскрипции и домен связывания ДНК-другого, будут регулировать транскрипцию с промоторов, которые содержат последовательность связывания второго фактора. Это происходит даже в том случае, когда регуляторный домен и комплекс транскрипции происходят из разных источников. Здесь мы рассмотрим свойства различных регуляторных доменов и возможные механизмы их действия.

Активация транскрипции на расстоянии за счет изгибания ДНК. Описывая различные эукариотические промоторы (разд. 8.2-8.4), мы подчеркивали, что транскрипция чаще всего регулируется при участии z/ис-последовательностей, расположенных на значительных расстояниях от сайтов инициации транскрипции. Поскольку мы предположили также, что транскрипция регулируется белками, связывающимися с этими удаленными сайтами, нам следует разобраться, как регуляторные домены этих белков влияют на активность комплекса транскрипции. Имеется множество экспериментальных данных, указывающих на наличие белок-белковых взаимодействий между регуляторными доменами факторов транскрипции и компонентами комплекса транскрипции (рис. 8.106). Такие взаимодействия между белками, связанными с участками ДНК, находящимися на значительном расстоянии друг от друга, могут реализоваться, если молекула ДНК образует петлю, сближающую сайты связывания. Возможно, регуляция работы сложных промоторов, с которыми могут связываться разные белки, осуществляется за счет самых разнообразных взаимодействий между этими белками.

Первые экспериментальные данные об образовании петель в ДНК были получены в опытах по изучению систем транскрипции прокариот. В этом случае активаторы обычно присоединяются вблизи сайта связывания РНК-полимеразы, и аминокислоты, находящиеся с одной стороны домена активации

РИС. 8.106.

Связывание нескольких белковых молекул с дистальными энхансерами индуцирует сборку комплексов транскрипции вблизи ТАТА-бокса. При этом взаимодействие дистальных белков, которые на рисунке расположены справа от сайта инициации транскрипции, с белками, находящимися слева от этого сайта, становится возможным благодаря изгибанию молекулы ДНК.

регуляторного белка, взаимодействуют со связанной полимеразой. Мутации, затрагивающие эти аминокислоты, обычно блокируют активацию транскрипции, не влияя на связывание с ДНК. Есть также четкие указания на то, что образование петель в ДНК создает условия для таких белок-белковых взаимодействий и в том случае, когда сайты связывания находятся довольно далеко друг от друга. Неудивительно поэтому, что гибкость молекулы ДНК и топологические ограничения сильно влияют на эффективность взаимодействия связанных белков, если они находятся на небольшом расстоянии друг от друга, но они менее важны, если эти белки отстоят на тысячи пар нуклеотидов.

Кислые домены активации. Мы уже отмечали,

что специфичность связывания ДНК может обеспечиваться использованием нескольких различающихся структурных элементов (разд 8.6.а). В каждом случае аминокислотные последовательности, ответственные за специфическое взаимодействие этих элементов с соответствующими парами оснований ДНК, относительно инвариантны, и даже небольшие изменения в них влияют на эффективность связывания. В отличие от этого, белковые домены, участвующие в активации транскрипции, более вариабельны и в том. что касается их границ, и в том, что касается аминокислотных последовательностей. Мутационный анализ белка GAL4 показал, что домены активации локализованы в двух областях: между остатками 148 и 238 вблизи N-конца и остатками 768 и 881 на С-конце (рис. 8.45). Наиболее характерным свойством этих доменов является их обогащенность отрицательно заряженными аминокислотами: их суммарный заряд составляет —7 и —9 соответственно. Любой из этих доменов может активировать транскрипцию, если его слить с доменом связывания ДНК GAL4; более того, каждый из доменов активирует транскрипцию, если соединить его с любой связывающей последовательностью, которая обеспечивает близкое расположение домена GAL4 и промоторного элемента ТАТА.

Активатор транскрипции дрожжей GCN4 осуществляет положительную регуляцию экспрессии генов, участвующих в биосинтезе аминокислот; он близкородствен и взаимозаменяем с факторами семейства APl-Jun млекопитающих (разд. 8.7.г). GCN4 имеет всего один домен активации, состоящий из 88 аминокислот с общим зарядом —16 и расположенный в центральной части последовательности из 281 аминокислоты. Рецепторы кортикостероидных гормонов гоже имеют кислые домены активации. У рецептора крысы есть всего один кластер отрицательно заряженных аминокислот вблизи N-конца. рецептор человека содержит еще один кислый домен на С-конце. Регулятор транскрипции Drosophila, кодируемый геном bed, тоже содержит кислый домен активации (разд. 8.3.ж). что говорит об универсальности этого свойства. Активаторы транскрипции, не связывающиеся с ДНК [например, VP16, ассоциированный с вирусом простого герпеса фактор транскрипции, инициирующий экспрессию вирусных генов после заражения (разд. 8.3.г), и Ela, активатор транскрипции при аденовирусной инфекции], тоже имеют кислые домены активации. Хотя сами по себе эти белки не активируют транскрипцию, при слиянии их кислых доменов с доменами связывания ДНК образуются белки, активирующие соответствующие промоторы.

Тот факт, что домены активации имеют кислот-

ные свойства, становится понятным, если учесть, что при повышении суммарного отрицательного заряда одного из таких доменов наблюдается пропорциональное усиление активации. В самом деле, транскрипцию генов GAL могут активировать даже сегменты белков E.coli, просто обогащенные кислыми аминокислотами, если соединить их с доменом связывания ДНК GAL4. Например, белок GAL80 можно превратить из ингибитора зависящей от GAL4 транскрипции в активатор, если соединить его с каким-либо кислым сегментом белка E.coli. В этом случае активацию обеспечивает сегмент £ coli, а домен активации GAL4 блокируется в результате ассоциации его с GAL80.

Хотя активация транскрипции не зависит от наличия конкретной аминокислотной последовательности, по-видимому, для нее более предпочтительны последовательности, которые могут образовывать алифатические а-спирали. В таких спиралях вдоль одной их стороны располагаются отрицательно заряженные остатки, а вдоль другой- гидрофобные, как в лейциновых молниях (разд. 8.6.а). Например, синтетический пептид из 15 аминокислот, способный принять спиральную конфигурацию с описанными свойствами, активирует транскрипцию при слиянии его с соответствующим доменом связывания ДНК в отличие от пептида, состоящего из тех же самых аминокислот, соединенных в произвольном порядке.

Пока остается нерешенным главный вопрос: каков механизм влияния кислых доменов активации на транскрипцию? Поскольку уже упоминавшиеся домены активации функционируют в самых разных гетерологичных системах (например, в клетках Drosophila, растений, дрожжей и млекопитающих), они, по-видимому. взаимодействуют с каким-то одним компонентом комплекса транскрипции. Так, активация могла бы происходить в результате связывания кислых доменов с основными гистонами в нуклеосомах, которое влияет на поведение кислых доменов при их взаимодействии с промоторами. Не исключено также, что домены активации контактируют с основным доменом РНК-полимеразы II или одного из белков комплекса транскрипции и стимулируют сборку этого комплекса или повышают его активность. Полученный с помощью ДНКазы I «отпечаток» транскрипционного комплекса в области ТАТА-блока изменяется, когда по соседству связываются факторы транскрипции млекопитающих. Аналогичные изменения в «отпечатке» наблюдаются в том случае, когда рядом с ТАТА-блоком находится последовательность UASgal, а ДНК-связывающий домен GAL4 присоединяется к встроенному в ДНК синтетическому сегменту.

Независимо от того, на какой компонент комп

лекса транскрипции влияет локальное связывание белков с кислыми доменами, можно сказать, что в основе этого взаимодействия, по-видимому, лежат электростатические эффекты, а не стереоспецифические или комплементарные взаимодействия. Поскольку факторы транскрипции из дрожжей или млекопитающих работают так же хорошо с чужеродными комплексами транскрипции, не исключено, что такая относительная нетребовательность к аминокислотной последовательности выработалась в процессе эволюции. Эффективность транскрипции прямо пропорциональна суммарному отрицательному заряду, и, изменяя этот заряд, можно модулировать регуляторный ответ. Суммарный отрицательный заряд домена активации изменяется, например, при амидировании остатков глутаминовой или аспарагиновой кислоты.

Другие домены активации. Функциональные домены активации некоторых факторов не содержат четко выраженных кластеров кислых аминокислот. Например, у Spl они обогащены глутамином, а также серином и треонином. Каким образом эти домены активируют транскрипцию-неясно. Возможно, какую-то роль играет фосфорилирование и дефосфорилирование гидроксильных групп серина, в результате которого изменяется содержание кислых остатков. Кроме того, увеличивать или уменьшать отрицательный заряд может обратимое амидирование и дезамидирование остатков глутамина. Недавно было показано, что Spl и другие факторы транскрипции могут гликозилироваться; это приводит к изменению их заряда и тем самым-к изменению эффективности транскрипции.

ГЛОБАЛЬНЫЕ МЕХАНИЗМЫРЕГУЛЯЦИИЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ

До сих пор. рассматривая экспрессию генов, мы ограничивались вопросами регуляции транскрипции отдельных генов и процессинга транскриптов с образованием зрелых молекул РНК. Скорость, время и место протекания этих процессов регулируются белками, которые узнают относительно короткие специфические участки молекулы ДНК и/или характерные элементы других белков, связываются с ними и опосредуют инициацию и терминацию транскрипции, а также процессинг. От присутствия и функционального состояния этих белков часто и зависит экспрессия генов. Однако имеются четкие данные о том, что на экспрессию генов, в частности на их транскрипцию, могут влиять обратимые изменения в структуре ДНК. Это могут быть, например, изменения степени сверхспиральности ДНК, т. е. ее топологии, а следова-

тельно, изменения конформации (переход от В- к Z- или другим формам) (разд. 1.1.в). Регуляция может осуществляться и путем изменения состояния хроматина, в частности изменения упаковки нуклеосом (разд. 1.1.ж). Это создает еще один уровень регуляции экспрессии. Как правило, активация транскрипции коррелирует с переходом высококонден- сированных форм хроматина в менее плотно упакованные «открытые» формы. Активность транскрипции зависит также от степени метилирования ци-

5'-CG-3' тозина в динуклеотидных парах основании ^, у. Подавление транскрипции часто бывает связано с гиперметилированием ДНК, а активация-с гипометилированием.

Здесь мы остановимся на некоторых из упомянутых модификаций и рассмотрим их влияние на экспрессию генов. Поскольку данные регуляторные механизмы не являются ген-специфичными, а влияют на экспрессию многих генов, мы назовем их глобальными. Для иллюстрации участия нетранскрипционных механизмов в регуляции содержания мРНК мы приведем два примера. В одном случае речь идет о посттранскрипционном избирательном разрушении мРНК, в другом- о новом способе регуляции синтеза дрожжевого фактора транскрипции на уровне трансляции.

Упаковка ДНК

Основной структурной единицей хроматина эукариот является нуклеосома-сверхспиральный сегмент ДНК длиной 145 п. н., намотанный с образованием двух левых витков на гистоновый октамер. Последний состоит из четырех белков, Н2А, Н2В, НЗ и Н4, каждый из которых представлен в октамере дважды (разд. 1.1.ж). Нуклеосомы образуют фибриллы диаметром 10 нм при участии гистона Н1, который связывается с ДНК на входе в нуклеосому и на выходе из нее (рис. 1.17). Далее эти фибриллы толщиной 10 нм скручиваются в спираль из шести нуклеосом на виток с образованием соленоида диаметром 30 нм (рис. 1.18). При конденсации спиралей диаметром 30 нм образуются еще более сложные структуры, однако детали их строения неизвестны.

Электронно-микроскопические данные свидетельствуют о том, что хроматин эукариот состоит из отдельных участков-петель, или доменов, длиной примерно 30-300 т. п. н., прикрепленных к белковому матриксу (рис. 8.107). Каждая петля, по-ви- димому, имеет одну точку начала репликации и функционирует как отдельная система. Петли являются автономными сверхспиральными единицами, их топология не зависит от состояния соседних петель. Возможно, это определяется тем, что концы

всех петель жестко закреплены в матриксе. Каждая петля содержит множество единиц транскрипции, но функционирование всех их, по-видимому, координируется, т. е. вся петля находится либо в активном, либо в неактивном состоянии.

Репрессированный хроматин. Большая часть генов многоклеточных организмов эукариот экспрессируется только на определенных стадиях развития и/или только в определенных тканях. Это означает, что клетки должны располагать эффективными средствами подавления транскрипции всех генов, кроме тех, которые функционируют в клетках данного вида. Репрессия больших групп генов в принципе может осуществляться путем ограничения доступности необходимых факторов транскрипции, но, по-видимому, такой механизм маловероятен. Об этом свидетельствует тот факт, что гены, обычно не экспрессирующиеся в клетках определенного типа, могут экспрессироваться при введении их в клетки путем трансфекции. Например, гены глобина после трансфекции в фибробласты экспрессируются в 1000 раз эффективнее, чем эндогенные глобиновые гены в составе хромосом; более того, это различие сохраняется при последовательных клеточных делениях даже несмотря на то, что трансфицированные гены встраиваются в хромосомы. Как правило (хотя и не всегда), активность транскрипции генов, переданных путем трансфекции, бывает на порядок выше, чем у соответствующих эндогенных генов. Этот феномен объясняют тем, что репрессия происходит в результате изоляции молчащих генов в хроматиновых структурах более высокого порядка, из-за чего они становятся недоступными для комплексов транскрипции.

Поскольку мы не располагаем детальной информацией о таких высокоупорядоченных хроматиновых структурах, мы не можем описать процесс перехода репрессированного хроматина в экспрессирующийся. Один из подходов к решению этой проблемы мог бы состоять в установлении корреляции между периодом клеточного цикла, когда происходит репликация конкретного гена, и его способностью участвовать в транскрипции. Вездесущие гены «домашнего хозяйства», экспрессирующиеся во всех тканях (например, гены дигидрофо- латредуктазы, цитоплазматического актина и глю- козо-6-фосфат-дегидрогеназы) реплицируются в первой половине S-фазы, а неэкспрессируемые гены, как правило, реплицируются позднее. Более того, гены имеют тенденцию к ранней репликации в тех тканях, где они экспрессируются, и к поздней - в тех тканях, где они молчат. Аналогичным образом, у млекопитающих неактивная Х-хромосома реплицируется позже, чем транскрипционно активная. Такая закономерность говорит о том, что при ранней репликации во время S-фазы ДНК, вероятно,

РИС. 8107.Хроматин эукариот состоит из петель разной длины, концы которых прикреплены к белковому матриксу. На микрофотографии слева представлена метафаэная хромосома, из которой выходят нити хроматина. Видны петли, которые образуют эти нити, но места их присоединения к хромосоме не различаются. [W. С. Earnshaw, U.K. Laemmli, J. Cell Biol. 96 (1983), p. 84.] На электронной микрофотографии справа показаны хромосомы,РИС. 8107.Хроматин эукариот состоит из петель разной длины, концы которых прикреплены к белковому матриксу. На микрофотографии слева представлена метафаэная хромосома, из которой выходят нити хроматина. Видны петли, которые образуют эти нити, но места их присоединения к хромосоме не различаются. [W. С. Earnshaw, U.K. Laemmli, J. Cell Biol. 96 (1983), p. 84.] На электронной микрофотографии справа показаны хромосомы,обработанные декстрансульфатом и гепарином, очищенные и расправленные на подложке при помощи цитохрома. Обратите внимание, что концы петли, по-видимому, выходят из соседних точек белкового матрикса (внизу) [J. Я. Paulson, U.K. Laemmli, Cell 12 (1977), p. 817. Оба снимка любезно предоставлены U. К. Laemmli.]обработанные декстрансульфатом и гепарином, очищенные и расправленные на подложке при помощи цитохрома. Обратите внимание, что концы петли, по-видимому, выходят из соседних точек белкового матрикса (внизу) [J. Я. Paulson, U.K. Laemmli, Cell 12 (1977), p. 817. Оба снимка любезно предоставлены U. К. Laemmli.]переходит в состояние, в котором она более доступна для комплекса транскрипции или способна к более эффективному связыванию важных факторов транскрипции

РИС. 8107.

Хроматин эукариот состоит из петель разной длины, концы которых прикреплены к белковому матриксу. На микрофотографии слева представлена метафаэная хромосома, из которой выходят нити хроматина. Видны петли, которые образуют эти нити, но места их присоединения к хромосоме не различаются. [W. С. Earnshaw, U.K. Laemmli, J. Cell Biol. 96 (1983), p. 84.] На электронной микрофотографии справа показаны хромосомы,

РИС. 8107.

Хроматин эукариот состоит из петель разной длины, концы которых прикреплены к белковому матриксу. На микрофотографии слева представлена метафаэная хромосома, из которой выходят нити хроматина. Видны петли, которые образуют эти нити, но места их присоединения к хромосоме не различаются. [W. С. Earnshaw, U.K. Laemmli, J. Cell Biol. 96 (1983), p. 84.] На электронной микрофотографии справа показаны хромосомы,

обработанные декстрансульфатом и гепарином, очищенные и расправленные на подложке при помощи цитохрома. Обратите внимание, что концы петли, по-видимому, выходят из соседних точек белкового матрикса (внизу) [J. Я. Paulson, U.K. Laemmli, Cell 12 (1977), p. 817. Оба снимка любезно предоставлены U. К. Laemmli.]

обработанные декстрансульфатом и гепарином, очищенные и расправленные на подложке при помощи цитохрома. Обратите внимание, что концы петли, по-видимому, выходят из соседних точек белкового матрикса (внизу) [J. Я. Paulson, U.K. Laemmli, Cell 12 (1977), p. 817. Оба снимка любезно предоставлены U. К. Laemmli.]

Чувствительность к действию нуклеаз. Судя по более высокой чувствительности к растеплению под действием ДНКазы I или микрококковой нуклеазы, транскрипционно активные области хроматина упакованы менее плотно, чем области, содержащие неактивные гены. Такая чувствительность к нуклеазам часто распространяется на сегменты длиной несколько тысяч пар оснований, фланкирующие единицу транскрипции. Структурные особенности, лежащие в основе этой чувствительности, не установлены, но данные биохимических исследований свидетельствуют о том, что нуклеосомы, содержащие активные гены, характеризуются низким содержанием гистона Н1, обогащены ацетилирован

ными и убиквитинсодержащими гистонами и связаны с определенными белками, имеющими четко выраженные кислотные свойства (HMG-белками). Эти модификации, вероятно, влияют на связывание гистонов с ДНК и способствуют нерегулярному распределению нуклеосом, вследствие чего ДНК становится более чувствительной к нуклеазному расщеплению. Так, нормальное чередование сайтов нуклеазного расщепления генов, кодирующих белки теплового шока, меняется после тепловой индукции. Аналогичное изменение профиля нуклеазного расщепления наблюдается в случае овальбуминовых генов в клетках яйцевода (но не печени) и генов IgL(x) лимфоцитов после их перехода в транскрипционно активную форму.

Гиперчувствительность к действию нуклеазы. Помимо упомянутых участков нуклеазной чувствительности активно транскрибируемые гены со-

держат гиперчувствительные сайты, которые находятся в пределах единиц транскрипции и вблизи них. В очищенной ДНК такие сайты гиперчувствительности к ДНКазе I отсутствуют. Сайты гиперчувствительности обычно располагаются непосредственно перед точкой начала транскрипции гена, но иногда они встречаются внутри единицы транскрипции или на ее З'-конце; напомним, что в этих местах могут находиться энхансер и терминатор транскрипции. Более того, в некоторых генах сайты гиперчувствительности к ДНКазе I находятся на значительных расстояниях слева от сайта кэпирования (например, на несколько тысяч пар оснований левее кластера генов овальбумина птиц и более чем на 20 т. п. н. левее гена Р-глобина человека). В большинстве случаев сайты гиперчувствительности к действию ДНКазы I присутствуют только в ДНК тканей или клеток, в которых либо происходит, либо запрограммирована экспрессия определенного гена. Например, сайт гиперчувствительности на 5'-конце гена препроинсулина обнаружен в панкреатических Р-островковых клетках поджелудочной железы и отсутствует в клетках печени. Аналогично, сайты гиперчувствительности имеются в перестроенных иммуноглобулиновых генах В-клеток, но отсутствуют в генах клеток некроветворных тканей.

Области, разделяющие нуклеосомы. Сайты гиперчувствительности к нуклеазам, вероятно, находятся в областях, разделяющих нуклеосомы. Впервые на это обратили внимание, когда обнаружилась зависимость между положениями сайтов гиперчувствительности и не содержащей нуклеосом областью в геноме SV40. Такая область видна на электронно-микроскопических фотографиях очищенных мини-хромосом SV40 (рис. 8.108). Она охватывает участок между точкой начала транскрипции ранних генов и 5'-концом энхансера. Если этот сегмент длиной 400 п. н. транслоцировать в другие области генома SV40 или в чужеродные плазмидные ДНК, то в последних появляются области, не содержащие нуклеосом, и сайты гиперчувствительности к ДНКазе I. Отсюда можно сделать вывод, что оба эти свойства, по-видимому, обусловливаются особенностями нуклеотидной последовательности данного участка ДНК. В то же время на гиперчувствительность межнуклеосомной области к действию нуклеаз, вероятно, влияют негистоновые белки, связанные с этой областью,- возможно, белки, взаимодействующие с Z-ДНК (разд. 8.7.6), и факторы транскрипции, ассоциированные с энхансером (разд. 8.3.г).

Такие же сайты гиперчувствительности и свободные от нуклеосом области имеются в энхансерах генов IgH и IgL(x) (разд. 8.3.д), а также в UAS-noc- ледовательностях, ассоциированных с 5'-концом генов GAL и металлотионеина (разд. 8.3.е). Сайты

РИС. 8.108.

Мини-хромосомы SV40, выделенные из ядер зараженных клеток, окрашенные водным раствором уранилацетата и сфотографированные при помощи электронного микроскопа в темном поле. Четко видно, что в минихромосомах имеется участок ДНК, свободный от нуклеосом. [S. Saragosti, G. Moyne, М. Yaniv, Cell 20 (1980), р. 65. Фотографии любезно предоставлены М. Yaniv.]

гиперчувствительности к нуклеазному расщеплению появляются в глюкокортикоид-акцепторном элементе (разд. 8.3.е) через несколько минут после введения в клетки глюкокортикоида и исчезают вскоре после удаления гормона. Возможно, сайты гиперчувствительности к ДНКазе I связаны также с активацией транскрипции генов рРНК, поскольку такие сайты встречаются как перед точками инициации транскрипции, так и по краям спейсеров рРНК-генов. Гиперчувствительность к нуклеазе стала своего рода маркером областей регуляции транскрипции.

Поскольку положение областей регуляции транскрипции согласуется с положением как сайтов гиперчувствительности, так и областей, свободных от нуклеосом, можно предположить, что все эти элементы взаимосвязаны. Возможно, присоединение факторов транскрипции к соответствующим последовательностям приводит к вытеснению нуклеосом или изменяет их упаковку, при этом образуются свободные от нуклеосом участки, которые можно визуализировать, или даже менее заметные нарушения, обеспечивающие нуклеазное расщепление. Если, однако, плотноупакованные нуклеосомы стабилизированы. например, гистоном Н1 или путем образования структур более высокого порядка, то доступ белков транскрипции к сигнальным последовательностям затрудняется, и транскрипция блокируется.

Структурные особенности активного и репрессированного хроматина и механизм регуляции его перехода из одной формы в другую во многом

остаются невыясненными. Нам известно только, что участки хроматина могут находиться в конденсированном, не экспрессируемом состоянии в течение многих раундов репликации и переходить в менее конденсированное, способное к экспрессии состояние под действием специфических экзогенных и эндогенных стимулов. Как происходит активация участков хроматина- при помощи белков позитивного контроля или в результате удаления белков- репрессоров, а возможно, при участии и того и другого еще предстоит определить.

Топология и конформация ДНК

Значение сверхспиральности для регуляции транскрипции. Имеются достоверные данные о том, что экспрессия прокариотических генов зависит от состояния сверхспиральности ДНК. Факторы, влияющие на этот параметр, мутации или ингибиторы топоизомераз - активируют транскрипцию одних генов и одновременно подавляют транскрипцию других. Поскольку связывание белков со сверхспиральной ДНК с отрицательными сверхвитками энергетически выгодно, по-видимому, изменения состояния сверхспиральности ДНК сказываются на способности РНК-полимеразы или белковых активаторов и репрессоров связываться с регуляторными последовательностями. Изменения в состоянии или степени сверхспиральности могут отразиться и на способности ДНК образовывать петли и, таким образом, на возможности факторов транскрипции, связанных с отдаленными друг от друга участками ДНК, взаимодействовать между собой.

Как указывалось в разд. 8.7.а, у эукариот хроматин представляет собой систему петель разной длины, прикрепленных к белковому матриксу (рис. 8.107). Возможно, такая конфигурация обеспечивает независимость плотности сверхвитков в каждой петле от торсионного состояния соседних петель. Интересно, что ДНК-топоизомераза II, фермент, ответственный за релаксацию сверхспиральной ДНК (разд. 2.1.е),-это один из основных белков хромосомного остова, к которому и прикреплены петли. Более того, сайты гиперчуветви гельности к ДНКазе I, сходные с участками регуляции транскрипции, часто проявляют чувствительность к нуклеазам, специфически расщепляющим одноцепочечные ДНК; это наводит на мысль, что данные области находятся в доменах с отрицательной сверхспирализацией. Далее, топоизомераза I. по-ви- димому, связывается с сайтами гиперчувствительности к нуклеазам. Влияние на транскрипцию (как положительное, так и отрицательное) соединений, интеркалирующих в ДНК или ингибирующих активность топоизомераз и в обоих случаях изменяющих степень сверхспиральности ДНК, тоже го

ворит о том, что топология ДНК важный фактор регуляции транскрипции. Тем не менее у мутантов дрожжей, не имеющих ДНК-топоизомеразы I или II, транскрипция не нарушена. Это означает, что для транскрипции достаточно одной из этих двух эукариотических ДНК-топоизомераз.

Большинство данных, указывающих на влияние топоизомераз на топологию ДНК в процессе регуляции транскрипции у эукариот, носят косвенный характер и неполны. Прямые доказательства того, что изменения в плотности сверхвигков в хромосомных петлях влияют на активность транскрипции целой области или генов, расположенных в этой области, фактически отсутствуют.

В- и Z-ДНК и их транскрипция. ДНК может иметь как правоспиральную (В), так и левоспиральную (Z) конформацию (разд. 1.1.в и рис. 1.8). Соотношение между этими двумя формами зависит от нуклеотидной последовательности ДНК и степени ее сверхспиральности, а также от ионной силы раствора, температуры и содержания ионов металлов. При определенных условиях право- и левоспиральные участки могут чередоваться, а последовательности в местах сочленений или рядом с этими местами обладать необычными свойствами субстратов для различных ферментов.

Образование Z-ДНК in vitro было подтверждено при помощи нескольких физических методов, но существование такой структуры in vivo до недавнего времени подвергалось сомнению. Теперь эти формы обнаружены как в про-, так и в эукариотических генах. Как и ожидалось, содержание Z-ДНК in vivo сильно зависит от степени сверхспиральности ДНК. Ее образование облегчается также в тех участках, где пурины и пиримидины чередуются. Таковы, например, повторы d(CA)n • d(GT)n в середине молекул. Образованию Z-формы способствует и метилирование остатков С в местах чередования С и G (т. е. 5'-CGCGCG-3'). Имеются также данные о том, что последовательности, способные принимать Z-конформацию, соответствуют сайтам гиперчувствительности к нуклеазе, находящимся в области регуляции транскрипции некоторых генов.

Идентифицированы и очищены белки, специфичные для Z-ДНК. Например, некоторые из этих белков связываются с энхансером промотора ранней области генома SV40. И все же, несмотря на существование Z-ДНК-сегментов в области регуляции транскрипции или по соседству с ней и белков, узнающих Z-ДНК, вопрос об участии этой формы ДНК в регуляции транскрипции пока остается открытым. Известно об одном случае участия белка, связывающего Z-ДНК, в рекомбинации ДНК, но и здесь конкретный механизм влияния ДНК-связывающего белка и конформации на рекомбинацию остается неясным.

Метилирование ДНК

Установлено, что экспрессия генов позвоночных коррелирует со степенью метилирования специфических остатков цитозина внутри регуляторных областей генов и вокруг них. За исключением всего нескольких важных случаев, при наличии метилированных групп (гиперметилированне) эффективность генной экспрессии уменьшается, а часто экспрессии вообще не происходит. И наоборот, активное состояние генов обычно сочетается с отсутствием метилирования или понижением степени метилирования (гнпометилирование) в тех же самых сайтах.

Одним из загадочных аспектов метилирования является то, что это состояние сохраняется в ряду многих поколений клеток. Так, гены, экспрессирующиеся тканеспецифичным образом, остаются гиперметилированными на протяжении всего периода эмбрионального развития во всех соматических тканях, за исключением одной, в которой данный ген экспрессируется. И наоборот, области, содержащие гены «домашнего хозяйства», которые экспрессируются в процессе развития во всех тканях, остаются гипометилированными. Более того, переданные путем трансфекции неметилированные гены обычно экспрессируются нерегулярно даже после интеграции в хромосомы и последовательных клеточных делений. Переданные путем трансфекции метилированные ДНК, напротив, неспособны к преходящей экспрессии или к экспрессии после интеграции в хромосому. Замечательно, что интегрированные неметилированные ДНК остаются не- метилированными и экспрессируются во многих поколениях клеток даже тогда, когда соответствующие клеточные гены метилированы и не экспрессируются.

Еще одно указание на связь между метилированием и экспрессией получено в опытах с ретровирусом мышей. Этот вирус не может размножаться и экспрессировать свои гены в эмбриональных клетках мыши. Однако в том случае, когда эмбриональные клетки инфицируются после индукции их дифференцировки, происходят и размножение вируса, и экспрессия его генов. Одно из существенных различий между этими клеточными системами заключается в том, что интегрированная ДНК провируса в недифференцированных клетках подвергается метилированию и в дальнейшем сохраняет это состояние, тогда как в индуцированных клетках ДНК вируса не метилируется. Существование обратной связи между активностью генов и состоянием их метилирования и сохранение их статуса в определенных тканях и на определенных стадиях развития в значительной степени стимулировало исследование механизма генной регуляции.

Метилирование специфических остатков цитозина. Как правило, метилирование происходит по положению 5 остатков цитозина (5-теС) в динуклеотиде 5'-CG-3'. (У высших растений иногда метилируется крайний 5'-цитозин в тринуклеотиде 5'-CNG-3', где N-любой нуклеотид.) Напомним, что у позвоночных динуклеотид CG встречается с частотой примерно в пять раз меньшей, чем это следует из нуклеотидного состава ДНК (разд. 1.1). Так, при случайном распределении оснований и GC-содержании ДНК млекопитающих 40% частота, с которой встречаются CG-динуклеотиды, должна быть равна примерно 0,04-такой же величине, как и для динуклеотидов GC. Однако в действительности она составляет 0,008.

По-видимому, пониженное содержание динуклеотидов CG и высокая частота их метилирования взаимосвязаны. Возможно, такая корреляция является следствием спонтанного дезаминирования остатков цитозина в ДНК. Это дезаминирование легко обращается при помощи механизма репарации, узнающего остатки урацила (разд. 2.3.а). Однако при дезаминировании 5-теС образуется Т, который нельзя превратить в С, поэтому несущественные CG-динуклеотиды, подвергшиеся метилированию, могут элиминироваться. Тот факт, что последовательности, содержащие метилированные динуклеотиды CG в регуляторных областях, сохраняются, вероятно, объясняется их особой ролью в экспрессии генов.

У позвоночных метилированы от 50 до 90% остатков С в динуклеотидах CG. Однако этот процент неодинаков для разных тканей, разных стадий развития и разных участков ДНК. Общую степень метилирования можно оценить, определив соотношение между 5-теС и общим содержанием остатков цитозина. Однако большую ценность представляют данные о метилировании специфических участков ДНК. Их можно получить, используя две рестриктазы, которые различаются по своей способности расщеплять ДНК в зависимости от того, какой остаток содержит сайт расщепления: С или 5-теС (разд. 4.2.д). Например, последовательность 5'-CCGG-3' расщепляется обеими эндонуклеазами, Hpall и Mspl, но 5'-CmeCGG-3'- только эндонуклеазой Mspl. Наоборот, Hpall расщепляет ДНК в сайте 5'-meCCGG-3', a Mspl-нет. Сравнивая рестриктные карты различных участков ДНК, полученные с помощью Hpall и Mspl, можно идентифицировать сайты метилирования. Содержащие 5-теС CG-динуклеотиды, которые не входят в состав сайта рестрикции или которые не удается выявить при помощи имеющихся эндонуклеазных пар-изошизомеров, можно идентифицировать путем прямого секвенирования геномной ДНК с использованием химических реагентов, не расщепля-

ющих ДНК в 5-шеС-содержащих сайтах. В этом случае при расщеплении ДНК по остаткам цитозина и анализе «лестницы» фрагментов на радиоавтографе обнаруживается выпадение «ступеньки» в позиции, где цитозин метилирован (разд. 7.2.в).

Механизмы метилирования de novo, сохранения метилированного состояния и элиминации остатков теС. Поскольку для разных тканей и разных стадий развития характерны разные схемы метилирования, возникает следующий вопрос: как эти схемы организуются, сохраняются и изменяются в процессе развития клетки? Сам процесс метилирования и сохранения метилирования-это одна сторона проблемы, элиминация остатков теС- другая. Метилирование de novo происходит по двум динуклеотидам CG в противоположных цепях, а для поддержания метилированного состояния необходимо метилирование одного из двух CG-динуклеотидов в полуметилированных последовательностях (рис. 8.109). При метилировании de novo появляются новые схемы метилирования, а процесс сохранения метилированного состояния заключается в модификации новосинтезированных цепей ДНК, обеспечивающей наследование потомками родительской схемы метилирования.

Поддержание метилированного состояния и метилирование ДНК de novo. При репликации полностью метилированной ДНК образуется полуметилированная форма с неметилированной новосинтеэированной цепью. Метилаэы, поддерживающие метилированное состояние, быстро метилируют неметилированные остатки С, расположенные напротив метилированных С, и полностью восстанавливают метилированное состояние ДНК. Пунктирная стрелка с надписью «деметилирование» показывает гипотетический путь полной элиминации метильных групп, хотя механизм этой реакции неизвестен. Предполагается, что существуют de novo-метилаэы, которые и метилируют неметилированную ДНК в клетках. Известно, что все метилаэы используют в качестве донора метильной группы S-аденоэилметионин.

Радиактивно меченный дезоксинуклеозид

СА

Уменьшение плотности раствора CsCI

РИС. 8.110.

Интенсивное деметилирование ДНК может происходить и в отсутствие синтеза новой ДНК. С помощью гексаметиленбисацетамида была индуцирована дифференцировка лейкозных клеток мыши, синхронизированных в фазе G1 клеточного цикла. Через 16 ч были добавлены 5-бромдеэоксиуридин и 5-фтордеэоксиури- дин. 5-бромдезоксиуридин фосфорилируется с образованием соответствующего деэоксинуклеоэидтрифосфа- та и включается в синтезируемую цепь ДНК. В результате плотность новосинтеэированной ДНК оказывается выше (в одной из ее цепей содержится тяжелый нуклеозид), чем нереплицированной (ни одна из ее цепей бром дезокси нуклеозид не содержит). Через 1 ч добавляли меченые деэоксицитидин (С, левая часть рисунка) или дезоксиаденозин (А, правая часть рисунка). Оба этих нуклеотида включаются в новосинтеэированную ДНК как в индуцированных (два верхних графика), так и в неиндуцированных (два нижних графика) клетках. Однако в индуцированных клетках, которые истощены по 5-теС, в ДНК включается только меченый С. Следовательно, С может заменять 5-теС в ДНК при помощи механизма, отличного от синтеза ДНК. [A. Razin et al.. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 83 (1986), p. 2827.]

Механизм специфической или общей элиминации теС неизвестен, предложены только разные его модели. Одна из них предполагает прямую замену метилированных остатков С неметилированными. Эту гипотезу подтверждает тот факт, что дифференцировка in vitro некоторых лейкозных клеток, индуцированная химическими реагентами, сопровождается массовым деметилированием теС. При этом в клеточную ДНК включается меченый дезоксицитидин, но не дезоксиаденозин (рис. 8.110). Согласно второй модели, связывание белков, специфичных для определенных тканей или стадий развития, с последовательностью, содержащей сайт метилирования, блокирует работу метилаэы, поддерживающей метилированное состояние, и после цикла репликации этот сайт становится полностью неметилированным. Согласно третьей модели, ме-

тилирование происходит в определенных CG-сайтах в высококонденсированном хроматине, стабилизируя таким образом транскрнпционно неактивную форму ДНК, и элиминация теС происходит после релаксации ДНК с переходом ее в активное состояние.

Изучение ферментов, ответственных за метилирование ДНК, только начинается. Очищены некоторые метилтрансферазы ДНК млекопитающих, клонирован и секвенирован ген. кодирующий одну из них. Мол. масса этих ферментов лежит в диапазоне от 135 до 175 кДа. Роль донора метильной группы выполняет S-аденозилметионин. Выделенные ферменты метилируют полуметилированную ДНК с гораздо большей эффективностью, чем неметилированную. Следовательно, они относятся к метилазам, поддерживающим метилированное состояние. В опытах с использованием в качестве субстрата части промотора гена р-глобина мыши показано, что очищенная ДНК-метилтрансфераза млекопитающих имеет сложную субстратную специфичность. Указанная часть промотора содержит десять CG-динуклеотидов на участке длиной 368 п. н. Из них метилируются лишь пять или шесть динуклеотидов, которые группируются на участке из 29 п. н„ находящемся примерно на 100 п. н. левее точки начала транскрипции, причем они метилируются в разной степени и с разной скоростью. По-видимому, на характер метилирования влияют последовательности, окружающие динуклеотиды CG, a in vivo-еще и состояние хроматина. Никакие другие факторы, особенно регулирующие метилирование и деметилирование, пока не обнаружены.

Метилирование и экспрессия гена. Многочисленные опыты с вирусными геномами, а также с геномами эукариот невирусной природы тоже свидетельствуют о том, что гиперметилирование коррелирует с ингибированием или инактивацией промоторов, тогда как промоторы, активно участвующие в транскрипции, часто бывают гипометилиро- ваны или не метилированы вообще. Эту корреляцию иллюстрируют опыты с клетками, трансформированными аденовирусом 12. ДНК аденовируса 12 не метилирована; после проникновения в клетки хомяка она встраивается в клеточные хромосомы, и одни ее гены экспрессируются, а другие-нет. Как правило (хотя и не всегда), неэкспрессируемые гены находятся в метилированном состоянии, а экспрессируемые остаются неметилированными. Детальное исследование области Е2А аденовируса показало, что в линии НЕ1 трансформированных клеток она нормально транскрибируется и транслируется, при этом ни одна из 14 последовательностей 5'-CCGG-3' области Е2А не метилирована (табл. 8.8). Однако в линиях трансформированных клеток НЕ2 и НЕЗ ген Е2А не экспрессируется, и все 14 CG-динуклео-

Таблица 8.8. Экспрессия и метилирование аденовирусного гена Е2А в трансформированных клетках

ЛинияПрисутствиеЭкспрес-Метили-Метилирова-

клетокинтактногосия генарованиениевсех13СС

промотораЕ2А14 сайтовмежду парами

Е2А °5'-CCGG-3'2) нуклеотидов

+ 24 и —1603)

НЕ1++--

НЕ2+-++

НЕЗ+-++

” Образование Е2А-мРНК и белка.

2> 5-теС определяли при помощи дифференциального расщепления эндонуклеазами НраИ и MspL

3) 5-теС во всех CG-динуклеотидах определяли при помощи секвенирования ДНК.

тидов метилированы. Используя уже упоминавшийся метод секвенирования геномной ДНК, можно «просмотреть» все CG-динуклеотиды промотора Е2А независимо от того, входят ли они в Hpatt- сайты. В линии клеток НЕ1, где промотор Е2А активен, 13 CG-динуклеотидов между парами оснований + 24 и —160 находятся в неметилирован- ном состоянии. В линиях клеток НЕ2 и НЕЗ тот же промотор неактивен, а те же самые CG-последовательности обеих цепей метилированы. Таким образом, для участка промотора Е2А длиной примерно 180 п. н. имеет место упомянутая выше корреляция.

Метилирование гена Е2А in vitro метилазой НраП почти всегда приводит к ингибированию транскрипционной активности при транзиентной трансфекции или стабильной трансформации. Напротив, неметилированный промотор функционально активен в обоих случаях (рис. 8.111). Более того, у интегрированной ДНК сохраняется характер метилирования, свойственный ДНК, передаваемой путем трансфекции. Аналогично, метилирование in vitro при участии разных CG-специфичных метилаз приводит к репрессии промоторов генов аденовируса Е1А, а-глобина, тимидинкиназы, аденинфос- форибозилтрансферазы и IgL(x). Сайты метилирования, сопряженные с инактивацией, локализованы в основном в области промоторов, но происходит и избирательное метилирование более далеких регуляторных последовательностей. Активность по- луметилированной ДНК промотора Е2А, полученной путем гибридизации неметилированных одиночных цепей с олигонуклеотидами, содержащими метилированные последовательности 5'-CCGG-3', заметно снижается, но полностью не утрачивается.

Нередко корреляция между метилированием и репрессией оказывается более сложной, чем та, о которой мы говорили выше. В качестве примера рассмотрим метилирование участка ДНК человека

CAT6CAT6МетипазаИран.МетипазаИран.

CAT

6

CAT

6

Метипаза

Иран.

Метипаза

Иран.

ПромоторЕ2Аь-of

Трансформацияклеток хомякаТрансформацияклеток хомякаКлеточные клоны 123Клеточные клоны 123Клонирование клетокКлонирование клеток

Трансформацияклеток хомяка

Трансформацияклеток хомяка

Клеточные клоны 123

Клеточные клоны 123

Клонирование клеток

Клонирование клеток

Клеточные клоны123

III

III

Экспрессия +++

CAT

Метилирование_промотора

РИС. 8.111.

Промоторы, метилированные in vitro, остаются метилированными и неактивными in vivo. ДНК, содержащую промотор аденовируса Е2А, к которому пришита последовательность, кодирующая хлорамфеникол-ацетил- трансферазу (CAT), метилировали in vitro при помощи очищенной метилаэы Нра\\. После введения метили

+

рованных и неметилированных ДНК в клетки хомяка исследовали экспрессию гена CAT и состояние метилирования промотора в независимых клонах. Знаки « + » или «—» означают соответственно присутствие или отсутствие как метильных групп, так и экспрессии CAT.

размером 30 т.п.н., содержащего гены у-, 8- и Р-глобина (рис. 111.5), в клетках, в которых экспрессировался тот или другой из указанных генов. Этот участок содержит 17 сайтов узнавания для эндонуклеаз рестрикции, активность которых зависит от состояния метилирования динуклеотида CG: Hpall, Hhal, Xhol и Sall (разд. 4.2.в и д). Продукты расщепления геномной ДНК из разных клеток ана- ли ировали при помощи ДНК-блоттинга с использованием соответствующих зондов. Полученные данные свидетельствуют о том. что область генов у-глобина практически не метилирована в линии лейкозных клеток, в которых экспрессируются гены у-глобина, и гипометилирована в предшественниках эритроцитов из средней части печени плода, где происходит наиболее активная экспрессия генов у-глобина плода человека. Сайты, соседствующие с другими глобиновыми генами, метилированы в большей степени. Напротив, весь кластер глобиновых генов печени, лимфоцитов, спермы взрослого человека и клеток мозга плода гиперметилирован. Еще более сложная картина возникает при анализе различий между индивидуальными сайтами расщепления. Так, некоторые сайты остаются неметили- рованными даже в печени взрослого человека, тогда I как другие метилированы по крайней мере в некоторых предшественниках эритроцитов печени плода В плаценте, где глобиновые гены не экспрессируются, весь кластер этих генов гипометилирован. [Эти результаты говорят о том, что гипометили

рование коррелирует с экспрессией генов и, возможно, даже совершенно необходимо для нее, но само по себе не является решающим фактором.

Корреляция между ингибированием транскрипции и метилированием соответствующих регуляторных областей выявлена для многих генов, но все же не для всех. Ингибирование транскрипции может происходить в результате нарушения связывания факторов транскрипции при наличии остатков 5-шеС. Например, метилирование CG-динуклеотидов в промоторе ингибирует связывание главного фактора поздней транскрипции аденовируса и транскрипцию in vitro. Метилирование другого динуклеотида CG, расположенного на несколько оснований правее, на транскрипцию не влияет. Связывание соответствующих факторов транскрипции с промоторами генов аденовируса Е2 и тирозинаминотрансферазы млекопитающих также блокируется при метилировании CG-динуклеотидов в сайтах связывания факторов транскрипции. Присутствующий во многих индуцибельных и тканеспецифичных генах сАМР-чувствительный элемент (CRE) содержит CG-динуклеотид (5'-TGACGTCA- 3'). Метилирование промоторов, транскрипционная активность которых зависит от одного или пары CRE, всегда блокирует связывание фактора транскрипции CRE и предотвращает транскрипцию соответствующих генов как in vitro, так и in vivo. Все эти наблюдения говорят о том, что метилирование CG-динуклеотидов в участках связывания факторов

транскрипции может блокировать их связывание и подавлять функцию промотора.

Исключением из этого правила является метилирование динуклеотида CG в сайте связывания Spl, 5'-GGGCGG-3' (разд. 8.3.г). Ни связывание Sp 1, ни Spl-зависимая транскрипция как in vitro, так и in vivo при метилировании не подавляются. Эта особенность Spl-сайтов, вероятно, определяется характером связывания белка и ДНК. Не исключено, что она сформировалась в процессе отбора, поскольку Spl участвует в транскрипции многих важных и повсеместно экспрессирующихся генов.

Еще одним указанием на участие метилирования в регуляции экспрессии специфических генов служат результаты опытов с 5-азацитидином (5-azaC). Этот аналог цитидина, содержащий атом азота вместо атома углерода в положении 5 пиримидинового кольца, может включаться в ДНК во время репликации, но не может метилироваться. Инкубация клеток с 5-azaC сопровождается массовой элиминацией остатков 5-шеС. Механизм этого процесса пока неясен, но, судя по некоторым данным, остатки 5-azaC в ДНК ингибируют метилтрансферазу ДНК. Массовая элиминация теС часто бывает временной, но в некоторых типах клеток отдельные гены все время остаются гипометилированными.

Наиболее замечательным свойством 5-azaC является его способность влиять на фенотип определенных клеток; в частности, он может изменять состояние дифференцировки и влиять на индукцию экспрессии специфических генов. В тех случаях, когда репрессия эндогенных или переданных путем трансфекции генов обусловливается их гиперметилированием, обработка клеток 5-azaC может приводить или к временной, или к стабильной дерепрессии. По-видимому, транскрипционно активными становятся именно те гены, которые переходят в стабильное гипометилированное состояние. Тем не менее некоторые гены, деметилирующиеся в присутствии 5-azaC, не активируются или активируются только после дополнительной обработки. Таким образом, несмотря на то что 5-azaC вызывает временную массовую элиминацию остатков теС генома, неясно, оказывает ли это изменение прямое влияние на процесс активации. Не исключено, что элиминация остатков теС может происходить после событий, непосредственно участвующих в активации экспрессии определенных генов.

Представлению о том, что метилированные CG-динуклеотиды играют решающую роль в регуляции транскрипции, противоречат данные об отсутствии теС в некоторых эукариотических геномах. Так, теС не обнаружены в геномах дрожжей и других грибов, а также у беспозвоночных, таких как Drosophila и нематода C.elegans. При этом у данных организмов имеются сложно организован

ные хромосомы, и экспрессия их генов зависит от стадии развития организма и от внешних факторов. Таким образом, вопрос о роли метилирования ДНК у позвоночных остается нерешенным.

Неметилированные кластеры CG. Большинство CG-динуклеотидов в ДНК позвоночных находится в метилированном состоянии, однако в геноме встречаются и кластеры неметилированных CG Так, примерно 1% фрагментов ДНК позвоночных образующихся после расщепления ее эндонуклеазой Hpall - ферментом, который разрезает неметилированные последовательности 5'-CCGG-3', составляют низкомолекулярные фрагменты средней длины 120 п.н., называемые мелкими ZfpaII-фрагментами (HTF-от англ. Hpall tiny fragments).

Блот-гибридизация продуктов расщепления геномной ДНК с HTF-зондом показала, что большинство гибридизовавшихся фрагментов находятся в «островках» с неметилированными CG-динуклео- гидами длиной 1-2 т.п.н. Всего, по-видимому, имеется около 30000 таких островков, расположенных в среднем на расстоянии 100 т.п.н. друг от друга. Такие кластеры неметилированных CG называются CG- или HTF-островками. Их общими свойствами являются: 1) более высокое, чем в остальной ДНК, среднее GC-содержание; 2) частота встречаемости CG-динуклеотидов, соответсвующая GC-содержанию в островке; 3) отсутствие метильных групп в большинстве CG-динуклеотидов.

Около 70% CG-островков связаны с генами «домашнего хозяйства», остальные встречаются в тканеспецифичных генах (табл. 8.9). Примеры генов, не содержащих CG-островков, приведены в табл. 8.10. CG-островки, как правило, находятся в тех областях, где начинается транскрипция (рис. 8.112). Так, почти у всех (а возможно, и у всех генов домашнего хозяйства, транскрибируемых РНК-по- лимеразой И) на 5'-концах имеются CG-островки Длина CG-островков примерно одинакова во всех генах, независимо от их размеров (рис. 8.113). Островки могут частично перекрываться с транскрибируемым участком, обычно с первым экзоном или интроном.

Ни происхождение CG-островков, ни их функции пока неизвестны, хотя уже высказано множество интересных гипотез. Например, можно предположить, что изобилие динуклеотидов CG в местах начала транскрипции многих генов есть результат их защищенности от метилирования благодаря связыванию с факторами транскрипции. CG-динуклеотиды в других частях генома не защищены и могут утрачиваться при метилировании и дезаминировании с превращением в TG, что объясняет их повышенную концентрацию на 5'-концах генов. Согласно этой гипотезе, островки не обязательно выполняют какую-то специальную функцию: их метилирование

Таблица 8.9. Гены, ассоциированные с CG-островками п

Ген

Вид

Гены ферментов метаболических путей

Гипоксантин-гуанозин - фосфорибозил-

трансфераза

Мышь, человек

Аденин-фосфоробозилтрансфераза

Мышь, хомяк

Дигидрофолатредуктаза

Мышь, человек

Глюкозо-6-фосфат~ дегидрогеназа

Человек

Гидроксиметилглутарил-СоА-

редуктаза

»

Глицеральдегид-З-фосфат-

дегидрогеназа

Курица

Триозофосфатизомераза

Человек

Аденозиндезаминаза

»

Фосфоглицераткиназа

»

Индуцибельные клеточные гены

Металлотионеин I

Мышь

Супероксиддисмутаза

Человек

Тепловой шок

»

Клеточные копии вирусных онкогенов

С-1П/1

»

отус

Человек, мышь

t-src

Курица

c-fos

Мышь

c-Ha-ras

Человек

Гены структурных клеточных белков

Белок рибосом L-30

Мышь

Белок рибосом L-32

»

Р-Актин

Крыса

Р-Тубулин

Крыса, человек

Белок гистосовместимости

класса I

Человек, мышь

Гены тканеспецифичных белков

а2(1;-коллаген

Курица

Ретинолсвязывающий белок

Человек

а-Глобин

Человек, коза

Thy-I

Человек, мышь

Белок гистосовместимости класса И

Человек

” Этот неполный перечень включает гены, секвепированные с их

непосредственным окружением, в которых обнаружены HTF-no-

добны: области. Гены гипоксантин-гуанозин фосфорибозилтранс-

феразы и глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы сцеплены с Х-хромо-

сомой, при этом в неактивной Х-хромосоме островки метилиро-

ваны 5'-конец гена глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы не идентн-

фицирован но в гене есть HFT-подобные i

последовательности

вблизи З'-конца. [A. Bird, Nature 321 (1986), р.

209.]

предотвращается только потому, что они связаны с одним или несколькими белками. По другой гипотезе, кластеры неметилированных CG образуются благодаря особенностям строения хроматина, обеспечивающим возможность взаимодействия CG-богатых участков с элементами комплекса транскрипции. Это означает, что метилирование исключает связывание белковых факторов с неактивными островками, а связывание белковых факторов исключает метилирование активных островков. Обе гипотезы предполагают, что CG-островки играют

Таблица 8.10. Гены, в которых не обнаружены CG-островки п

Ген

Вид

Семейство р-глобиновых генов

Ген плацентарного лактогена

Ген фактора роста нервной ткани

Гены u-амилазы I и II

Гены гормона роста

Ген инсулина

Ген а-интерферона

Ген фибриногена

Ген 8-кристаллина

Ген миоглобина

Человек, мышь, кролик, коза Человек

»

Мышь

» » »

Крыса Мышь Тюлень

” В этот неполный перечень входят секвенированные гены с низким содержанием островков CG как в самом гене, так и во фланкирующих его последовательностях. [A. Bird, Nature 321 (1986), р. 209J

важную роль в экспрессии соответствующих генов. Скрупулезной проверки этих гипотез не проводилось, однако имеются некоторые факты в их поддержку. При трансфекции в клетки генов, содержащих CG-островки, те CG-нуклеотиды, которые находятся в островках, остаются неметилирован- ными, в отличие от динуклеотидов CG, находящихся во фланкирующих ген участках. Более того, если CG-динуклеотиды островков предварительно метилировать in vitro, а затем ввести в клетки путем трансфекции, то экспрессия генов нарушится, а островки останутся метилированными и в дальнейшем.

Как мы уже говорили, CG-островки обнаружены в генах, экспрессия которых происходит тканеспецифичным образом (табл. 8.9). Более того, эти области ДНК остаются неметилированными как в тех клетках, где ген экспрессируется, так и в тех, где он молчит. Это подкрепляет предположение, что одного только присутствия неметилированных кластеров CG в премоторной области гена недостаточно для его транскрипции в соответствующих клетках. Для дифференциальной экспрессии генов в различных тканях необходимы тканеспецифичные факторы позитивного контроля или факторы негативного контроля, связывающиеся с 5-шеС.

Метилирование и процессы развития. Связь метилирования с важнейшими процессами развития у млекопитающих иллюстрируют два поразительных феномена: инактивация Х-хромосомы у самок и дифференциальный импринтинг аутосом, полученных от отца и матери.

У плацентарных млекопитающих инактивация одной из двух хромосом в клетках самок обеспечивает эквивалентное распределение информации, содержащейся в Х-хромосоме, у ХХ-самок. Инактивация Х-хромосомы осуществляется в три этапа на

I'll'l IIIIIIIIIIII1IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIH 1

I2

I6

РИС. 8.112.

Распределение метилированных и неметилированных динуклеотидов CpG в модельном гене позвоночных. Такой ген содержит экзоны (выделены цветом), интроны (выделены точками) и промотор слева от сайта инициации транскрипции (верхняя часть рисунка). Вертикальные линии под изображением гена указывают положение CpG в самом гене и во фланкирующих его последовательностях. Метилированным CpG соответствуют цветные линии, а неметилированным- черные.

Кластер неметилированных CpG находится в области промотора, а островок CpG-на Б'-конце. Положение всех CpG можно установить методом секвенирования. С помощью эндонуклеаз рестрикции удается локализовать лишь некоторые из этих островков, поскольку не все CpG-содержащие последовательности можно расщепить известными ферментами. [А. Р. Bird, Trends Genet. 3 (1987) р. 342.]

CG-ди нуклеотидыCG-ди нуклеотидыобычно находятся вне этой об-обычно находятся вне этой об-нывныв

CG-ди нуклеотиды

CG-ди нуклеотиды

обычно находятся вне этой об-

обычно находятся вне этой об-

ныв

ныв

ранних стадиях эмбриогенеза (рис. 8.114). Сначала из двух Х-хромосом выбирается одна, предназначенная для инактивации. Затем инактивация распространяется на всю хромосому. Наконец, модифицированное состояние стабилизируется, так что выбранная хромосома остается неактивной в последующих поколениях клеток. Инактивация хромо-

Шесть генов млекопитающих со сходной локализацией и размерами CG-островков. На рисунке показаны промоторы, сайты инициации транскрипции (волнистые стрелки), экзоны (цветные полосы) и интроны (выделены точками). Цветным прямоугольником указаны области, в которых CG-динуклеотиды обычно не метили- рованы-так называемые CG-островки. Метилирован-

сомы происходит не одновременно во всех эмбриональных клетках. Примерно на четвертый день после имплантации зародыша Х-хромосома, полученная от отца, избирательно инактивируется в клетках, участвующих в формировании неэмбриональных тканей. Через шесть дней внутриматочного развития одна из двух Х-хромосом, выбранная

ласти. dhfr-ген дигидрофолатредуктазы мыши; hprt- гвн гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы мыши; гАу-1-ген поверхностного гликопротеина мыши thy-1; гр!- ген рибосомного белка мыши L-32, aprt- ген аде- нинфосфорибозилтрансферазы мыши. [A. Bird, Trends Genet. 3 (1987), р. 342.]

Пара Х-хромосом в эмбрионе женского пола до имплантацииПара Х-хромосом в эмбрионе женского пола до имплантацииСлучайный выбор одной хромосомы для первичного акта инактивации

Пара Х-хромосом в эмбрионе женского пола до имплантации

Пара Х-хромосом в эмбрионе женского пола до имплантации

I

Молчащие гены

Ранний постимплантационный эмбрионРанний постимплантационный эмбрионЭкспрессируюЭкспрессирующиеся геныщиеся геныМетилирование в течение нескольких дней

Ранний постимплантационный эмбрион

Ранний постимплантационный эмбрион

Экспрессирую

Экспрессирую

щиеся гены

щиеся гены

^5-Азацитидин

Экспрессирую

щиеся гены

РИС. 8.114.

Инактивация одной из двух Х-хромосом у млекопитающих. В тканях эмбриона до его имплантации обе хромосомы активны и не метилированы. После имплантации экспрессия генов одной из двух хромосом прекращается, в то время как другая хромосома остается транскрипционно активной. По-видимому, инактивация предшествует интенсивному метилированию, которое происходит несколько позже. Обработка клеток, содержащих активную и неактивную хромосомы, азацитиди ном приводит к интенсивной элиминации остатков 5-теС из неактивной хромосомы и к активации экспрессии ее генов.

случайно, инактивируется во всех клетках, предназначенных для плода. Таким образом, плод женского пола развивается как мозаичный организм, в клетках которого экспрессируются либо отцовские, либо материнские Х-хромосомы. У анеуплоидных особей, имеющих более двух Х-хро- мосом, инактивируются все Х-хромосомы, кроме одной.

Инактивированная Х-хромосома в интерфазных ядрах имеет вид высококонденсированной гетерохроматиновой структуры (тельце Барра). В отличие от активной гомологичной хромосомы, неактивная Х-хромосома реплицируется в конце S-фазы. Почти все гены, кодируемые неактивной Х-хромосомой, теряют способность к экспрессии. Неактивное состояние очень стабильно, и только в редких случаях происходит реактивация отдельных областей. При нормальном развитии реактивация осуществляется только в зародышевых клетках непосредственно перед мейозом. Однако активацию генов Х-хро- мосомы можно индуцировать, обработав клетки 5-azaC (рис. 8.114). Это означает, что инактивация Х-хромосомы может обусловливаться метилированием ДНК. Об этом свидетельствуют некоторые косвенные данные, однако прямые доказательства того, что метилирование ДНК является причиной, а не следствием инактивации, отсутствуют.

Одно из косвенных доказательств основано на том, что трансформировать клетки мыши с фенотипом hprt~ к фенотипу hprt* может только ДНК. hprt-ген которой находится в активной Х-хромосоме (аХ). Однако после обработки 5-azaC ДНК из прежде неактивной Х-хромосомы (IX) приобретает способность трансформировать клетки hprt~ в hprt*. Еще одна группа данных в пользу упомянутой гипотезы была получена при исследовании сайтов метилирования гена hprt в аХ- и iX-хромосомах. В целом профиль метилирования CG-содержащих последовательностей в гене hprt аХ-хромосомы сходен во всех тканях и характерен для других генов «домашнего хозяйства» в аХ-хро- мосоме и в аутосомах. Так, сайты, которые находятся в области, окружающей первый экзон гена hprt, в аХ-хромосоме полностью неметилироваиы. Напротив, те же сайты в iX-хромосоме почти целиком метилированы. После обработки клеток 5-azaC профиль метилирования iX-хромосомы становится похожим на профиль метилирования аХ-хромосо- мы. Однако исследование кинетики инактивации Х-хромосомы и изменения профиля метилирования гена hprt на определенных стадиях постимплантационного развития показало, что эти два процесса не коррелируют. Специфические сайты гена hprt не метилируются в большинстве эмбриональных клеток в течение нескольких дней после инактивации Х-хромосомы. Следовательно, метилирование, по-

видимому, не определяет выбор хромосомы для инактивации и не является причиной прогрессирующей инактивации хромосомы на ранних стадиях (рис. 8.114), а служит вторичным механизмом поддержания неактивного состояния.

Геномный импринтинг означает дифференциальную модификацию материнского и отцовского генетического материала, входящего в зиготу, которая опосредует дифференциальную экспрессию родительских аллелей в процессе развития и у взрослых особей. У мышей характерная модификация материнского и отцовского геномов, а также, вероятно, специфических генов необходима для нормального развития эмбриона и плода.

Природа изменений импринтинга, а также механизмы их возникновения, сохранения и исчезновения неизвестны. Интересно, однако, что содержание 5-теС в ДНК сперматозоида и ДНК яйцеклетки различно. Это наводит на мысль, что половые различия в степени метилирования ДНК, проявляющиеся при гаметогенезе, могут вносить вклад в процесс импринтинга. С этим согласуются данные о том, что экспрессия и метилирование трансгенов зависят от пола родителя-донора. Так, трансген, находящийся под контролем вирусного промотора, экспрессируется, если он получен от отца, но только в тканях сердца; если же этот ген получен от матери, он остается молчащим во всех тканях (табл. 8.11). Определение относительной чувствительности трансгенов к расщеплению эндонуклеазами Hpall и MspI в сайтах 5'-CCGG-3' показало, что между экспрессией трансгена и степенью его метилирования существует четкая связь. Если трансген унаследован от отца, то он гипометилирован и экспрессируется, а если от матери, то гиперметилирован и молчит.

Импринтинг устанавливается во время гаметогенеза или до него и стабильно сохраняется при делении соматической клетки во многих поколениях. Он исчезает в линии зародышевых клеток,

Таблица 8.11. Зависимость активности трансгена и степени его метилирования от источника трансгена 11

Родитель, от которого получен трансген

Число мышей с указанными свойствами

ген экспрессируется

ген не экспрессируется

метилирование

гипо

гипер

Мать

0

42

0

59

Отец

20

0

50

0

11 Ход эксперимента описан в тексте. Число животных использованных при определении экспрессии и степени метилирования ДНК, различалось. [J. L. Swain et al. Cell 50 (1987), p. 719.]

чтобы снова дифференциальным образом восстановиться в сперматозоиде и яйцеклетке (рис. 8.115). Геном яйцеклетки в значительной степени гипометилирован, а геном сперматозоида относительно гиперметилирован. Во время предимплантацион- ного состояния зародыша оба этих набора хромосом частично деметилируются, затем, в процессе развития плода, родительские хромосомы интенсивно, но дифференцированно метилируются. О механизмах, последствиях и регуляции процесса метилирования-деметилирования у двух полов ничего не известно. Возможно, в этом случае метилирование тоже представляет собой некий вторичный процесс по отношению к более ранней стадии импринтинга и служит только способом стабилизации конкретного состояния.

Регулируемая утилизация мРНК

О механизмах, регулирующих стабильность мРНК и ее способность к трансляции, известно сравнительно мало, хотя оба они существенным образом влияют на экспрессию генов. Важность процессов, при помощи которых осуществляется это влияние, иллюстрируется несколькими хорошо изученными примерами.

Влияние концевых последовательностей на стабильность мРНК. Стабильность эукариотических мРНК в значительной степени зависит от наличия особых последовательностей в нетранслируемых участках мРНК. Так, poly(A) в комплексе с белком увеличивает стабильность мРНК, защищая ее 3'- концы от экзонуклеазного расщепления. Мутации в сигнальной последовательности, блокирующие полиаденилирование (разд. 8.3.в). приводят к образованию очень нестабильных транскриптов. Кроме того, удаление ро1у(А)-хвоста у зрелых мРНК сопровождается их быстрой деградацией после введения в ооциты Xenopus или в клетки млекопитающих, а восстановление этих хвостов восстанавливает и стабильность, характерную для мРНК. Имеются данные о том, что последовательные циклы трансляции мРНК сопровождаются постепенным укорочением ро1у(А)-хвостов, так что на каком-то этапе З'-концы мРНК становятся чувствительными к экзонуклеазному расщеплению. Таким образом, способность мРНК к трансляции, вероятно. коррелирует с ее стабильностью. Стабильность гистоновых мРНК, у которых ро1у(А)-хвосты, как правило, отсутствуют, обусловливается образованием на их З'-концах структур типа шпильки (разд. 8.3.В).

Недавно в З'-нетранслируемых участках некоторых эукариотических мРНК была обнаружена специфическая последовательность, способствующая их деградации. Эта последовательность,

СпермачозоидСпермачозоидЯйцеклеткаЯйцеклеткаОтцовским 'отпечатокОтцовским 'отпечатокМатеринским отпечаток"Материнским отпечаток"Два уровня дифференциального импринтинга?Два уровня дифференциального импринтинга?Отец матьОтец матьОплодотворениеОплодотворениеГаметогенезСтирание следов импринтингаГаметогенезСтирание следов импринтинга'Лреимлантацня «Деметилиро- I вание'Лреимлантацня «Деметилиро- I ваниеБластоцистаБластоцистаЛиния \ зародышевых \ клетокМетилирование de novo непроисходитЛиния \ зародышевых \ клетокМетилирование de novo непроисходит/ Метилирование х, / de novo Оплодотворенное яйцо на стадии, предшествующей/ Метилирование х, / de novo Оплодотворенное яйцо на стадии, предшествующейгаструлегаструленеэмбриональные ткани Низкая степень метилированиянеэмбриональные ткани Низкая степень метилированияВзрослая особьВзрослая особьРИС. 8.115.Модель дифференциального метилирования хромосом в гаметах и соматических клетках в процессе развития млекопитающих. Степень метилирования ДНК на разных стадиях развития изображена при помощи разных цветовых оттенков: чем интенсивнее цвет, тем она выше. Р и М- мужское и женское начало соответственно Однородная окраска сегментов Р и М не означает, что каждый из них одинаково гипер- или гипо- метилирован. ДНК клеток, которым суждено стать клетками зародышевой линии, в основном не метилирована, но в ходе гаметогенеза ядерная ДНК сперматозоидов и яйцеклеток метилируется, хотя и по-разному. В результате оплодотворенное яйцо содержит ДНК двух типов: у одной ДНК степень метилирования характерна для сперматозоидов, у другой-для яйцеклеток. На этапах предимплантации и имплантации метильные группы в ДНК как отцовского, так и материнского происхождения утрачиваются, а при дальнейшем развитии оплодотворенного яйца до стадий плода и взрослой особи происходит специфическое метилирование хромосом, унаследованных от отца и матери. [М. Monk, Genes and Devel. 2 (1988), p. 921.]РИС. 8.115.Модель дифференциального метилирования хромосом в гаметах и соматических клетках в процессе развития млекопитающих. Степень метилирования ДНК на разных стадиях развития изображена при помощи разных цветовых оттенков: чем интенсивнее цвет, тем она выше. Р и М- мужское и женское начало соответственно Однородная окраска сегментов Р и М не означает, что каждый из них одинаково гипер- или гипо- метилирован. ДНК клеток, которым суждено стать клетками зародышевой линии, в основном не метилирована, но в ходе гаметогенеза ядерная ДНК сперматозоидов и яйцеклеток метилируется, хотя и по-разному. В результате оплодотворенное яйцо содержит ДНК двух типов: у одной ДНК степень метилирования характерна для сперматозоидов, у другой-для яйцеклеток. На этапах предимплантации и имплантации метильные группы в ДНК как отцовского, так и материнского происхождения утрачиваются, а при дальнейшем развитии оплодотворенного яйца до стадий плода и взрослой особи происходит специфическое метилирование хромосом, унаследованных от отца и матери. [М. Monk, Genes and Devel. 2 (1988), p. 921.]5-AUUUA-3', встречается многократно перед сигналом полиаденилирования некоторых короткоживущих мРНК (рис. 8.116). К последним относится ряд мРНК, кодирующих клеточные белки, которые регулируют рост и дифференцировку клеток, а также мРНК, транскрибируемые с нормальных вариантов некоторых клеточных и вирусных онкогенов. Для всех этих мРНК характерна относительная

Спермачозоид

Спермачозоид

Яйцеклетка

Яйцеклетка

Отцовским 'отпечаток

Отцовским 'отпечаток

Материнским отпечаток"

Материнским отпечаток"

Два уровня дифференциального импринтинга?

Два уровня дифференциального импринтинга?

Отец мать

Отец мать

Оплодотворение

Оплодотворение

Гаметогенез

Стирание следов импринтинга

Гаметогенез

Стирание следов импринтинга

'Лреимлантацня «Деметилиро- I вание

'Лреимлантацня «Деметилиро- I вание

Бластоциста

Бластоциста

Линия \ зародышевых \ клеток

Метилирование de novo непроисходит

Линия \ зародышевых \ клеток

Метилирование de novo непроисходит

/ Метилирование х, / de novo Оплодотворенное яйцо на стадии, предшествующей

/ Метилирование х, / de novo Оплодотворенное яйцо на стадии, предшествующей

гаструле

гаструле

неэмбриональные ткани Низкая степень метилирования

неэмбриональные ткани Низкая степень метилирования

Взрослая особь

Взрослая особь

РИС. 8.115.

Модель дифференциального метилирования хромосом в гаметах и соматических клетках в процессе развития млекопитающих. Степень метилирования ДНК на разных стадиях развития изображена при помощи разных цветовых оттенков: чем интенсивнее цвет, тем она выше. Р и М- мужское и женское начало соответственно Однородная окраска сегментов Р и М не означает, что каждый из них одинаково гипер- или гипо- метилирован. ДНК клеток, которым суждено стать клетками зародышевой линии, в основном не метилирована, но в ходе гаметогенеза ядерная ДНК сперматозоидов и яйцеклеток метилируется, хотя и по-разному. В результате оплодотворенное яйцо содержит ДНК двух типов: у одной ДНК степень метилирования характерна для сперматозоидов, у другой-для яйцеклеток. На этапах предимплантации и имплантации метильные группы в ДНК как отцовского, так и материнского происхождения утрачиваются, а при дальнейшем развитии оплодотворенного яйца до стадий плода и взрослой особи происходит специфическое метилирование хромосом, унаследованных от отца и матери. [М. Monk, Genes and Devel. 2 (1988), p. 921.]

РИС. 8.115.

Модель дифференциального метилирования хромосом в гаметах и соматических клетках в процессе развития млекопитающих. Степень метилирования ДНК на разных стадиях развития изображена при помощи разных цветовых оттенков: чем интенсивнее цвет, тем она выше. Р и М- мужское и женское начало соответственно Однородная окраска сегментов Р и М не означает, что каждый из них одинаково гипер- или гипо- метилирован. ДНК клеток, которым суждено стать клетками зародышевой линии, в основном не метилирована, но в ходе гаметогенеза ядерная ДНК сперматозоидов и яйцеклеток метилируется, хотя и по-разному. В результате оплодотворенное яйцо содержит ДНК двух типов: у одной ДНК степень метилирования характерна для сперматозоидов, у другой-для яйцеклеток. На этапах предимплантации и имплантации метильные группы в ДНК как отцовского, так и материнского происхождения утрачиваются, а при дальнейшем развитии оплодотворенного яйца до стадий плода и взрослой особи происходит специфическое метилирование хромосом, унаследованных от отца и матери. [М. Monk, Genes and Devel. 2 (1988), p. 921.]

метаболическая нестабильность, вследствие чего кодируемые ими белки оказывают свое физиологическое действие сравнительно недолго.

Деления AU-богатого участка нормального клеточного гена c-fos повышает равновесную концентрацию соответствующей мРНК и превращает его в онкоген. И наоборот, вирусный онкоген v-fos можно превратить в неонкогенный, заменив его

GM-CSFIFNaIFNB IFNy IL1 IL2 fos mycРИС. 8.116.GM-CSFIFNaIFNB IFNy IL1 IL2 fos mycРИС. 8.116.

GM-CSF

IFNa

IFNB IFNy IL1 IL2 fos myc

РИС. 8.116.

GM-CSF

IFNa

IFNB IFNy IL1 IL2 fos myc

РИС. 8.116.

UAAUAUUUAUAUAUUUAUAUUUUUAAAAUAUUUAUUUAUUUAUUUAUUUAA

UAUUUAUUUAUUUAA

UUUUGAAAUUUUUAUUAAAUUAUGAGUUAUUUUUAUUUAUUUAAAUUUUAUUUUGGAAAA UAUUUAUUAAUAUUUAACAUUAUUUAUAU

UUAUUUUUUAAUUAUUAUUUAUAUAUGUAUUUAUAAAUAUAUUUAAGAUAAUUAUAAUAU UAUUUAUUUAAAUAUUUAAAUUUUAUAUUUAU

GUUUUUAAUUUAUUUAUUAAGAUGGAUUCUCAGAUAUUUAUAUUUUUAUUUUAUUUUUUU UAAUUUUUUUUAUUUAAGUACAUUUUGCUUUUUAAAGUUGAUUUUUUUCUAUUGUUUUUA

В З'-нетранслируемом участке некоторых мРНК лим- фокинов и ядерных факторов транскрипции человека часто встречаются AU-богатые последовательности, способствующие деградации этих мРНК. В некоторых мРНК последовательности AUUUA (подчеркнуты) перекрываются (черта сверху). Представленные мРНК че

ловека кодируют следующие белки: GM-CSF один из колонийстимулирующих факторов; IFNa, IFNp и IFNy- различные классы интерферонов; IL1 и IL2-интерлейкины; fos и тус-белки c-fos и с-тус человека соответственно. [G. Shaw, R. Kamen, Cell 46 (1986), р. 659.]

З'-конец соответствующим участком неонкогенного гена c-jos. Вероятно, способность индуцировать образование опухолей обусловлена повышением содержания продукта трансляции долгоживущих мРНК. Еще одно подтверждение дестабилизирующего влияния AU-богатого участка получено в опытах, в которых стабильные мРНК, например Р-гло- биновая мРНК, становятся нестабильными после включения в их З'-концевые участки одного или нескольких AU-богатых повторов (рис. 8.117).

Каким образом AU-богатые последовательности дестабилизируют мРНК-неизвестно. Возможно, с этими последовательностями связывается какой- то белок, в результате чего они становятся чувствительными к экзонуклеазному расщеплению. Есть, однако, указания на то, что AU-богатые последовательности оказывают свое действие, увеличивая скорость укорочения ро1у(А)-хвостов.

Данные о влиянии 5'-нетранслируемых последовательностей на стабильность мРНК весьма фрагментарны. Равновесное содержание гистоновых мРНК и синтез большинства гистоновых белков тесно связаны с синтезом ДНК во время S-фазы клеточного цикла. В конце S-фазы содержание гистоновых мРНК уменьшается. Эта избирательная дестабилизация, следующая за прекращением синтеза ДНК, является посттранскрипционной и в случае гистона НЗ опосредуется участком 5'-нетранслируе- мой области мРНК. Механизм дифференциальной дестабилизации гистоновой мРНК неизвестен, но, возможно, какую-то роль здесь играет белок, который

образуется только после окончания синтеза ДНК.

Регу гяция стабильности мРНК рецептора трансферрина, опосредуемая же севом. Ярким примером регулируемой деградации мРНК является опосредованная железом регуляция содержания мРНК рецептора трансферрина (TfR). В пролиферирующих клетках млекопитающих железо влияет на синтез по крайней мере двух белков, играющих ключевую роль в его метаболизме. Поглощение железа клеткой зависит в первую очередь от белка TfR. Синтез этого белка подавляется при избытке железа и стимулируется при его недостатке (табл. 8.12). Ферритин-это белок, участвующий в запасании железа внутри клетки. При поступлении железа в клетку в достаточном количестве он образуется с более высокой скоростью, чем при недостаточном. Образование обоих упомянутых белков регулируется с помощью железа, однако механизмы регуляции различаются. В первом случае регуляция состоит в изменении скорости разрушения TfR-мРНК, а во втором-в изменении скорости трансляции ферритиновой мРНК. Несмотря на различие этих двух процессов регуляции, в них участвуют общие регуляторные элементы. Мы рассмотрим вначале опосредованную железом регуляцию содержания TfR-мРНК, а затем регуляцию трансляции ферритиновой мРНК.

КодирующаяПромотор последовательностьI64КодирующаяПромотор последовательностьI643-UTR3-UTRНестабильнаямРИКНестабильнаямРИКеДИЩОТС ГенИ-ИИфГшШтШ СеДИЩОТС ГенИ-ИИфГшШтШ ССтабильная МРНК ^-глобинаСтабильная МРНК ^-глобина»Л. ГС тс tcaca"g"»Л. ГС тс tcaca"g"Нестабильна.^ ^ _ _ ^^n^JU^^ jl-глобинаНестабильна.^ ^ _ _ ^^n^JU^^ jl-глобинаРИС. 8.117.AUUUA-последовательности в З'-нетранслиру- емых участках мРНК способствуют их быстрой деградации. мРНК, содержащие одну или несколько таких последовательностей, быстро разрушаются. Об этом свидетельствуют результаты опыта, в котором последовательность AUUUA из очень нестабильной мРНК Р-интерферона человека (h-IFN-P) встраивали в З'-концевую область стабильной мРНК Р-глобина. Полученная гибридная мРНК р-глобина оказывалась такой же нестабильной, как и мРНК IFN-p. Бледно окрашенные участки-это экзоны, а участки, выделенные точками,- интроны. Дестабилизирующая последовательность РНК и кодирующий ее сегмент гена выделены одинаковым цветом. Пунктирные линии в мРНК-вырезанные интроны.РИС. 8.117.AUUUA-последовательности в З'-нетранслиру- емых участках мРНК способствуют их быстрой деградации. мРНК, содержащие одну или несколько таких последовательностей, быстро разрушаются. Об этом свидетельствуют результаты опыта, в котором последовательность AUUUA из очень нестабильной мРНК Р-интерферона человека (h-IFN-P) встраивали в З'-концевую область стабильной мРНК Р-глобина. Полученная гибридная мРНК р-глобина оказывалась такой же нестабильной, как и мРНК IFN-p. Бледно окрашенные участки-это экзоны, а участки, выделенные точками,- интроны. Дестабилизирующая последовательность РНК и кодирующий ее сегмент гена выделены одинаковым цветом. Пунктирные линии в мРНК-вырезанные интроны.После трансфекции в клетки млекопитающих клонированной кДНК TfR, сшитой с промотором SV40, содержание TfR-мРНК регулируется железом, хотя транскрипция находится под контролем про-

Кодирующая

Промотор последовательность

I64

Кодирующая

Промотор последовательность

I64

3-UTR

3-UTR

НестабильнаямРИК

НестабильнаямРИК

еДИЩОТС ГенИ-ИИф

ГшШтШ С

еДИЩОТС ГенИ-ИИф

ГшШтШ С

Стабильная МРНК ^-глобина

Стабильная МРНК ^-глобина

»Л. ГС тс tcaca"g"

»Л. ГС тс tcaca"g"

Нестабильна.^ ^ _ _ ^^n^JU^^ jl-глобина

Нестабильна.^ ^ _ _ ^^n^JU^^ jl-глобина

РИС. 8.117.

AUUUA-последовательности в З'-нетранслиру- емых участках мРНК способствуют их быстрой деградации. мРНК, содержащие одну или несколько таких последовательностей, быстро разрушаются. Об этом свидетельствуют результаты опыта, в котором последовательность AUUUA из очень нестабильной мРНК Р-интерферона человека (h-IFN-P) встраивали в З'-концевую область стабильной мРНК Р-глобина. Полученная гибридная мРНК р-глобина оказывалась такой же нестабильной, как и мРНК IFN-p. Бледно окрашенные участки-это экзоны, а участки, выделенные точками,- интроны. Дестабилизирующая последовательность РНК и кодирующий ее сегмент гена выделены одинаковым цветом. Пунктирные линии в мРНК-вырезанные интроны.

РИС. 8.117.

AUUUA-последовательности в З'-нетранслиру- емых участках мРНК способствуют их быстрой деградации. мРНК, содержащие одну или несколько таких последовательностей, быстро разрушаются. Об этом свидетельствуют результаты опыта, в котором последовательность AUUUA из очень нестабильной мРНК Р-интерферона человека (h-IFN-P) встраивали в З'-концевую область стабильной мРНК Р-глобина. Полученная гибридная мРНК р-глобина оказывалась такой же нестабильной, как и мРНК IFN-p. Бледно окрашенные участки-это экзоны, а участки, выделенные точками,- интроны. Дестабилизирующая последовательность РНК и кодирующий ее сегмент гена выделены одинаковым цветом. Пунктирные линии в мРНК-вырезанные интроны.

Таблица 8.12. Регуляция синтеза белков-рецептора трансферрина и ферритина- при участии железа

Условия

Рецептор трансферрина

Ферритин

белок

мРНК

бело

кмРНК

Дефицит

железа

т

Т

1

Не меняется

Достаточное количество железа

1

1

т

Не меняется

мотора SV40, который на железо не реагирует. Деления нетранслируемого участка на З'-конце кДНК приводит к тому, что содержание мРНК перестает зависеть от железа. Более того, если нетранслируемый участок З'-конца гена TfR ввести в нетранслируемые области на З'-концах разных кДНК, то содержание их мРНК будет изменяться под влиянием железа. Таким образом, наличие нетранслируемого участка на З'-конце TfR-мРНК является необходимым и достаточным условием для регуляции стабильности этой мРНК под действием железа.

Чувствительный к железу элемент TfR-мРНК (1RE) занимает примерно треть (680 нуклеотидов)

З'-нетранслируемого участка. Он имеет специфическую нуклеотидную последовательность, образующую пять сходных по структуре шпилек (рис. 8.118). Все шпильки содержат следующие элементы: I) петлю CAGA/VGN; 2) верхний стебель из пяти пар оснований; 3) неспаренный остаток С на расстоянии пяти пар оснований от 5'-конца петли; 4) нижний стебель разной длины. Этот характерный структурный домен встречается в нетранслируемой З'-обла- сти TfR-мРНК всех видов, имеющих данный ген. Ни одна из петель по отдельности, ни первые две или последние три петли вместе не обеспечивают опосредованную железом регуляцию содержания TfR-мРНК. Для этого необходимы кооперативные взаимодействия нескольких таких структур.

Шпильки с петлями в мРНК Н-цепи ферритина и рецептора трансферрина. Левая шпилька находится в 5'-нетранслируемой области (б'-UTR) мРНК Н-цепи ферритина человека, а остальные пять (А- Е) расположены одна за другой в З'-нетранслируемой областиШпильки с петлями в мРНК Н-цепи ферритина и рецептора трансферрина. Левая шпилька находится в 5'-нетранслируемой области (б'-UTR) мРНК Н-цепи ферритина человека, а остальные пять (А- Е) расположены одна за другой в З'-нетранслируемой области(З'-UTR) мРНК рецептора трансферрина человека (TfR). Области, необходимые для проявления регуляторной активности,- пять остатков, образующих петлю, и неспаренный остаток цитозина в стебле,- выделены более темным цветом(З'-UTR) мРНК рецептора трансферрина человека (TfR). Области, необходимые для проявления регуляторной активности,- пять остатков, образующих петлю, и неспаренный остаток цитозина в стебле,- выделены более темным цветомЭкстракты цитозоля клеток, выращенных при дефиците железа, содержат белок, специфически связывающийся с IRE (IRE-BP). При избытке железа содержание функционально активного IRE-BP уменьшается. Согласно одной из гипотетических моделей регуляции IRE-зависимой деградации TfR-мРНК под действием железа, связывание IRE-BP (или его комплекса с другими белками) с кластером шпилек защищает IRE или примыкающие к нему участки от действия эндонуклеазы (рис. 8.119). Полагают, что первоначальное эндо- нуклеазное расщепление приводит к быстрому экзонуклеазному расщеплению остальной части мо-

Шпильки с петлями в мРНК Н-цепи ферритина и рецептора трансферрина. Левая шпилька находится в 5'-нетранслируемой области (б'-UTR) мРНК Н-цепи ферритина человека, а остальные пять (А- Е) расположены одна за другой в З'-нетранслируемой области

Шпильки с петлями в мРНК Н-цепи ферритина и рецептора трансферрина. Левая шпилька находится в 5'-нетранслируемой области (б'-UTR) мРНК Н-цепи ферритина человека, а остальные пять (А- Е) расположены одна за другой в З'-нетранслируемой области

(З'-UTR) мРНК рецептора трансферрина человека (TfR). Области, необходимые для проявления регуляторной активности,- пять остатков, образующих петлю, и неспаренный остаток цитозина в стебле,- выделены более темным цветом

(З'-UTR) мРНК рецептора трансферрина человека (TfR). Области, необходимые для проявления регуляторной активности,- пять остатков, образующих петлю, и неспаренный остаток цитозина в стебле,- выделены более темным цветом

РИС. 8.119.Атомы железа регулируют образование рецептора трансферрина (TfR), влияя на стабильность мРНК TfR. Эта стабильность определяется тем, связывается ли специфический белок, чувствительный к железу (IRE-BP), с пятью шпильками в З'-нетранслируемой области (З'-UTR). Доступность или активность IRE-BP зависитРИС. 8.119.Атомы железа регулируют образование рецептора трансферрина (TfR), влияя на стабильность мРНК TfR. Эта стабильность определяется тем, связывается ли специфический белок, чувствительный к железу (IRE-BP), с пятью шпильками в З'-нетранслируемой области (З'-UTR). Доступность или активность IRE-BP зависитот концентрации трехвалентного железа. При избытке железа способность IRE-BP связываться с IRE подавляется и З'-UTR расщепляется под действием РНК-эндонуклеазы. При недостатке же железа IRE-BP связывается с IRE и защищает З'-UTR от зндонуклеазного расщепления.от концентрации трехвалентного железа. При избытке железа способность IRE-BP связываться с IRE подавляется и З'-UTR расщепляется под действием РНК-эндонуклеазы. При недостатке же железа IRE-BP связывается с IRE и защищает З'-UTR от зндонуклеазного расщепления.лекулы мРНК. Регуляция по этой схеме поддерживает синтез TfR в том случае, когда клетки вынуждены ограничиваться тем небольшим количеством железа, которое имеется в среде.

РИС. 8.119.

Атомы железа регулируют образование рецептора трансферрина (TfR), влияя на стабильность мРНК TfR. Эта стабильность определяется тем, связывается ли специфический белок, чувствительный к железу (IRE-BP), с пятью шпильками в З'-нетранслируемой области (З'-UTR). Доступность или активность IRE-BP зависит

РИС. 8.119.

Атомы железа регулируют образование рецептора трансферрина (TfR), влияя на стабильность мРНК TfR. Эта стабильность определяется тем, связывается ли специфический белок, чувствительный к железу (IRE-BP), с пятью шпильками в З'-нетранслируемой области (З'-UTR). Доступность или активность IRE-BP зависит

от концентрации трехвалентного железа. При избытке железа способность IRE-BP связываться с IRE подавляется и З'-UTR расщепляется под действием РНК-эндонуклеазы. При недостатке же железа IRE-BP связывается с IRE и защищает З'-UTR от зндонуклеазного расщепления.

от концентрации трехвалентного железа. При избытке железа способность IRE-BP связываться с IRE подавляется и З'-UTR расщепляется под действием РНК-эндонуклеазы. При недостатке же железа IRE-BP связывается с IRE и защищает З'-UTR от зндонуклеазного расщепления.

Изучение очищенного IRE-BP показывает, что для его связывания с TfR-мРНК необходима свободная сульфгидрильная группа. Это наводит на мысль, что при высоких концентрациях железа облегчается образование дисульфидной или неактивной формы IRE-BP, а при низких-восстановление дисульфидных групп белка до свободных сульфгидрильных групп и переход белка в активное состояние (рис. 8.120). Таким образом, скорость деградации TfR-мРНК должна зависеть от количества IRE-BP, связанного с IRE, которое в свою очередь определяется регулируемой железом степенью окисления остатков цистеина IRE-BP. Внутриклеточная концентрация железа играет роль своеобразного «сульфгидрильного выключателя», который определяет, будет ли IRE-BP связываться с TfR-мРНК и защищать ее от деградации.

Регуляция трансляции ферритиновой мРНК с помощью железа. Синтез ферритина в клетках млекопитающих регулируется с помощью железа пост- транскрипционно. Транскрипция гена ферритина, как и стабильность соответствующей мРНК, не зависит от концентрации железа; в этом случае объектом регуляции является трансляция мРНК (табл. 8.12). С помощью делеционного анализа была идентифицирована последовательность длиной 43 п.н. внутри 5'-нетранслируемой лидерной области ферритиновой мРНК, которая и участвовала в регуляции синтеза ферритина с помощью железа.

Компьютерная модель вторичной структуры этой области содержит одну шпилечную структуру, очень похожую на каноническую шпильку в IRE TfP- мРНК (рис. 8.118). И в самом деле, оказалось, что гены, экспрессия которых в норме не регулируется железом, приобретают способность к такой регуляции при введении в их 5'-лидерные области синтетического олигонуклеотида, способного образовать аналогичную структуру, или при введении любой из шпилек, принадлежащих IRE TfR. Каждая из этих шпилечных структур обеспечивает столь же

Неактивен

Регуляторная активность IRE-BP определяется степенью окисления сульфгидрильных групп белка. Свободные сульфгидрильные группы (SH) в IRE-BP-состояние при недостатке железа- необходимы для связывания IRE-BP со шпильками. При избытке железа сульфгидрильные группы находятся в окисленной форме (S—S), IRE-BP не может связаться со шпильками, и мРНК TfP разрушается.

эффективную регуляцию трансляции под действием железа, как и 5'-шпилька гена ферритина. Следовательно, и в этом случае наличие шпилечной структуры совершенно необходимо для регуляции трансляции с помощью железа.

С 5'-концевой шпилькой ферритиновой мРНК связывается тот же самый белок, который присоединяется к IRE TfR-мРНК, хотя в этом случае шпилька всего одна. Возможно (но это еще предстоит доказать), IRE-BP регулирует трансляцию, блокируя доступ рибосом к началу последовательности, кодирующей ферритин. Таким образом, в отличие от синтеза ферритина содержание ферритиновой мРНК не зависит от концентрации железа. Таким способом клетки выключают синтез ферритина в условиях недостатка железа, при этом стабильность ферритиновой мРНК позволяет клеткам быстро реагировать на увеличение концентрации железа.

Регуляция стабильности мРНК в процессе трансляции. Образование а- и р-тубулинов, двух важнейших компонентов микротрубочек, регулируется у сложных эукариот двумя способами. Один из них заключается в регуляции транскрипции семейства множественных генов, кодирующих обе субъединицы (разд. 9.3.6), другой- в регуляции содержания гетеродимеров тубулина (аР), которые в большинстве животных клеток влияют на стабильность тубулиновых мРНК.

Сигнальная последовательность, ответственная за индуцируемую тубулином нестабильность тубулиновых мРНК, формируется из первых четырех кодонов кодирующей последовательности. Изменения. затрагивающие любые другие участки мРНК,

не влияют на время ее жизни, тогда как модификации нуклеотидной последовательности, приводящие к изменению N-концевой последовательности Met-Arg-Glu-Ile (MREI), стабилизируют мРНК. Замены в этих четырех кодонах, не приводящие к изменению указанной аминокислотной последовательности, не влияют и на стабильность тубулиновой мРНК. Более того, последовательность, кодирующая MREI, должна находиться на М-конце; если она локализована во внутренней части молекулы, то мРНК не дестабилизируется. Далее, за MREI-кодонами должен располагаться протяженный участок РНК, кодирующий полипептид, достаточно длинный для того, чтобы MREI-часть выступала из рибосомы.

Согласно одной из моделей, по мере накопления тубулиновых гетеродимеров они сами или какой-то ассоциированный с ними фактор связываются с N-концевым тетрапептидом синтезируемого тубулина сразу после его выхода из рибосомы (рис. 8.121). Это может блокировать трансляцию, позволяя эндонуклеазе расщеплять мРНК и инициировать ее разрушение. Природа взаимодействия белка с тетрапептидом и механизм деструкции мРНК во многом остаются неизвестными. Как бы то ни было, этот механизм по типу обратной связи позволяет белку регулировать время жизни своей собственной мРНК.

Трансляционная регуляция общего фактора транскрипции. Многие гены S. cerevisiae, кодирующие ферменты, которые участвуют в биосинтезе нескольких аминокислот, находятся под единым контролем. Так, при росте дрожжевых клеток в среде, лишенной любой из десяти аминокислот, наблю-

11

РИС. 8.121.

Модель регуляции стабильности мРНК Р-тубулина. На рисунке изображены последовательные стадии трансляции Р-тубулиновой мРНК (от 5'-кэпа слева к poly (А)-хвосту на З’-конце). Растущая полипептидная цепь представлена в виде нитки бус. С терминальной последовательностью MREI (метионин, аргинин, глутамин, изолейцин) синтезируемого полипептида по выходе его из рибосомы связываются свободные а-

и р-субъединицы тубулина. Это активирует эндонуклеазу, которая расщепляет мРНК, блокирует образование белковых цепей, синтез которых уже начался, и запускает разрушение остальной мРНК. Происхождение эндонуклеазы-свободной или связанной с рибосомами-неизвестно. [Т. J. Yen et al.. Nature 334 (1988), p. 500.J

РИС. 8.122.

Открытые рамки считывания (ORF) в гене дсп4 S. cerevistae + 1 сайт инициации транскрипции, +1534 сайт терминации. Белок GCN4 кодируется последовательностью, начинающейся в точке АТС (+ 591) и заканчивающейся в точке TGA. Четыре открытые рамки считывания в 5'-не транслируемой области мРНК GCN4 выделены тем же цветом, что и область, кодирующая GCN4, ниже приведены их нуклеотидные последовательности.

дастся стимуляция транскрипции вплоть до 30 генов, участвующих в биосинтезе соответствующих аминокислот Клонирование и секвенирование многих генов, работа которых зависит от содержания в среде аминокислот, показывает, что эти гены регулируются при участии короткой нуклеотидной последовательности. Часто эта последовательность повторяется несколько раз в любой ориентации в промоторной области совместно регулируемых генов. По своей локализации и функциям эти элементы напоминают элементы UASGXL, о которых шла речь в разд. 8.3.е. Их каноническая последовательность имеет вид 5'-RRTGACTCATTT-3', где R любой из двух пуринов. Инвариантный сегмент, TGACTC, является сайтом связывания фактора позитивной регуляции GCN4 Напомним, что GCN4 высокогомологичен фактору транскрипции млекопитающих API и его онкогенному двойнику Jun и что оба они связывают одну и ту же гексамерную последовательность (разд. 8.3.г и 8.6.а). Неспеци- фичсская регуляция зависит от содержания GCN4, его связывания с TGACTC-сайтом и активации комплекса транскрипции. Два последних свойства уже обсуждались в разд. 8.3 и 8.6. Здесь мы рассмотрим регуляцию образования GCN4.

Принципиальным моментом в синтезе GCN4 является новый способ его трансляционного контроля, который основывается на особенностях строения мРНК GCN4. Кодирующая GCN4 последовательность начинается примерно на 600 нуклеотидов правее 5'-копца мРНК. Необычно длинная 5'-лидерная последовательность отличается от последовательностей большинства дрожжевых мРНК тем, что содержит четыре короткие открытые рамки считывания (ORF), каждая из которых имеет инициирующий и терминирующий кодоны (рис. 8.122). Такие левые AUG-кодоны обычно блокируют инициацию трансляции более удаленных инициирующих кодонов (разд. 3.8). Необычная особенность синтеза GCN4 заключается в том, что его блокирование может зависеть от аминокислотного дефицита.

Делеционный анализ этой области показал, что аминокислоты, кодируемые четырьмя левыми ORF, несущественны ни для проявления функции GCN4 in vivo, ни для трансляции последовательности, кодирующей GCN4, как in vitro, так и in vivo. Однако элиминация четырех левых AUG или их модификация с образованием других кодонов приводит к тому, что происходящего в норме усиления синтеза GCN4 в ответ на аминокислотное голодание не происходит. Интересно, что четыре ORF неэквивалентны. поскольку их последовательная элиминация, начиная с ORF4, приводит к постепенной утрате способности репрессировать трансляцию GCN4 при достаточном содержании аминокислот.

Опосредованная аминокислотами регуляция синтеза GCN4 зависит от сложных взаимодействий между продуктами по крайней мере трех генов дсп и десяти или более генов gcd. Для усиления синтеза GCN4 при аминокислотном дефиците нужны белки

gcd-Гены

GCD-мРНК

ГенуслА

GCN4-MPHK

БелкиGCD

дсп-Гены

GCN-mPHK

Пути биосинтеза аминокислот

БелкиGCN | vX Белки GCN4

РИС. 8.123.

Синтез белка GCN4 регулируется продуктами генов gcd и дсп. Перемещению рибосомы и прохождению каждой открытой рамки считывания в GCN4-MPHK препятствуют белки GCD. Их блокирующий эффект снимается белками GCN1, GCN2 и GCN3, которые ингибируют трансляцию GCD-mPHK

GCN1, GCN2 и GCN3. Образование GCN4 при достаточном количестве аминокислот блокируется белками GCD. Разные последствия мутаций в генах gcd и дсп показывают, что белки GCD усиливают влияние AUG-кодонов в лидерных последовательностях как негативных регуляторов трансляции GCN4, а белки GCN участвуют в позитивной регуляции синтеза GCN4 в противовес негативному влиянию на эти AUG-кодоны белков GCD (рис. 8.123).

Каким именно образом белки GCD и GCN осуществляют совместную регуляцию снабжения аминокислотами, преобразуют сигнал об их наличии и либо игнорируют, либо стимулируют комплекс трансляции, неизвестно. Скорее всего эти регуляторные сигналы влияют на способность 408-субъединицы рибосомы проходить лидерные инициирующие кодоны. Рибосомы эукариот в отличие от рибосом прокариот обычно начинают трансляцию в первом AUG правее 5'-кэпа (разд. 3.8). Когда они

доходят до терминирующего кодона, трансляция прекращается, а реинициация в следующем AUG- кодоне происходит неэффективно. Множественные, последовательно расположенные инициирующие и терминирующие кодоны типа тех, которые встречаются в лидерной последовательности мРНК GCN4, являются серьезным препятствием для трансляции последовательности. кодирующей GCN4; четыре последовательных сайта инициации- терминации на относительно небольшом участке позволяют осуществлять эффективную репрессию трансляции GCN4. Возможно, белки GCD действуют на определенные компоненты комплекса трансляции, еще сильнее уменьшая вероятность реинициации. Белки GCN, вероятно, являются антагонистами белков GCD и вызывают противоположные изменения, которые повышают способность рибосом реинициировать трансляцию после терминации. Как белки GCN «узнают» о содержании аминокислот, неизвестно.

Глава 9

МОЛЕКУЛЯРНАЯ СТРУКТУРА ГЕНОМОВ ЭУКАРИОТ

АРХИТЕКТУРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ

Исследуя молекулярную структуру геномов, мы ставим перед собой цель ответить на два вопроса: в какой мере организация носителя генетической информации влияет на его экспрессию и в конечном счете на основные биологические феномены-развитие организма, дифференцировку и генетические аномалии? Что может сказать эта организация об эволюции геномов и целых организмов?

Говоря об организации, мы имеем в виду три ее уровня. Первый уровень-это отдельные гены и соответствующие регуляторные элементы; об этом шла речь в гл. 8. Здесь в результате изучения структуры и функций генов удалось установить наиболее важные факты и некоторые общие принципы. Второй уровень - предмет обсуждения данной главы-это число генов и других сегментов ДНК и их взаимное расположение. Здесь получено довольно много данных, но общие принципы организации геномов окончательно не выяснены. Впрочем, установлен один интересный факт: протяженные GC- и АТ-богатые последовательности (изохоры), обнаруженные у теплокровных животных, находятся в R- и G-областях хромосом соответственно. Лишь в очень немногих случаях относительное расположение генов подчиняется определенной закономерности. В качестве примера можно привести полицистронные опероны, характерные для прокариот и нетипичные для эукариот. Имеющиеся данные позволяют высказать предположение о значительной свободе в организации генетической информации, хотя реальная картина может оказаться несколько иной. Третий уровень относится к структуре хроматина и к ее влиянию на линейную организацию и экспрессию генов. Связь между экспрессией генов и структурой хроматина очевидна. но о ее механизме известно очень мало (разд. 8.7.а).

В этой главе, остановившись вначале на некоторых терминах и эволюционных вопросах, мы рассмотрим организацию различных генов и других сегментов ДНК в хромосомах. Вопрос одновременно и сложный, и слишком упрощенный. Каждый сегмент ДНК независимо от того, является он геном или нет, обладает интересными специфическими свойствами. Кроме того, геном каждого вида уникален, хотя и имеет общие черты с геномами других

видов. Мы остановимся на таких отличительных особенностях и приведем соответствующие примеры. Конечно, эти примеры дают лишь слабое представление о существующем в природе разнообразии, поскольку сейчас исследована небольшая часть сегментов ДНК.

а. Классификация сегментов ДНК

Гены. Мы рассматриваем ген как молекулярную структуру. Ген эукариот-это совокупность сегментов ДНК, образующих экспрессирующуюся единицу. В результате экспрессии образуются один или несколько функциональных генных продуктов - РНК или полипептидов. Каждый ген содержит один или несколько сегментов ДНК, ответственных за регуляцию транскрипции и, следовательно, за регуляцию экспрессии гена. Кодирующие области- это сегменты ДНК, которые кодируют какой-либо полипептид или функциональную РНК либо их составляющие. Те сегменты ДНК, с которых не транскрибируется никакой генный продукт, называются некодирующими. Одни некодирующие области (например, регуляторные сигналы, фланкирующие кодоны, или вставочные последовательности, прерывающие ген) являются составными частями генов. Другие участки, имеющие отношение к репликации ДНК или выполняющие какие-то пока неизвестные функции, находятся между генами.

Псевдогены. Псевдогены-это участки генома, близкие в структурном отношении специфическим функционально активным генам, но не являющиеся их аллельными формами и не кодирующие никаких функциональных генных продуктов. У некоторых псевдогенов в регуляторной или кодирующей области или в них обоих имеются мутации. Другие псевдогены имеют дефектные стоп-кодоны или содержат лишь часть кодирующей и регуляторной областей. Таким образом, псевдогены могут быть молчащими или с них могут транскрибироваться и даже транслироваться дефектные полипептиды. Как правило, псевдогены бывают тесно сцеплены с соответствующими функциональными генами и фланкированы последовательностями, гомологичными последовательностям, которые фланкируют функциональный ген. Обычно такие псевдогены содержат интроны и, по-видимому, образовались в результате многократных тандемных повторений (реитераций) сегментов ДНК.

Прямые повторы5-AAGAGNNNNNAAGAGNNNNNNNNAAGAGNNNNNNNAAGAG-3 3'-TTCTCNNNNNTTCTCNNNNNNNNTTCTCNNNNNNNTTCTC-5'Прямые повторы5-AAGAGNNNNNAAGAGNNNNNNNNAAGAGNNNNNNNAAGAG-3 3'-TTCTCNNNNNTTCTCNNNNNNNNTTCTCNNNNNNNTTCTC-5'Тандемные прямые повторы

Прямые повторы

5-AAGAGNNNNNAAGAGNNNNNNNNAAGAGNNNNNNNAAGAG-3 3'-TTCTCNNNNNTTCTCNNNNNNNNTTCTCNNNNNNNTTCTC-5'

Прямые повторы

5-AAGAGNNNNNAAGAGNNNNNNNNAAGAGNNNNNNNAAGAG-3 3'-TTCTCNNNNNTTCTCNNNNNNNNTTCTCNNNNNNNTTCTC-5'

5'-AAGAGAAGAGAAGAGAAGAG-3 з'-ттстсттстсттстсттстс-5'

РИС. 9.1.

Некоторые типы нуклеотидных последовательностей (N-любой нуклеотид). Для образования петли на конце шпильки необходимо не менее трех-четырех нуклеотидов.

Обратные повторы

N NN NGGссGG3'3'ШпилькаспетлейШпилькаспетлейШпилькаШпилькаNNCTGGAC-3'NNGACCTG-5'NNCTGGAC-3'NNGACCTG-5'5-GTCCAGN З'-CAGGTCN5-GTCCAGN З'-CAGGTCNG GG G

N N

N N

G

G

с

с

G

G

3'

3'

Шпилькаспетлей

Шпилькаспетлей

Шпилька

Шпилька

NNCTGGAC-3'

NNGACCTG-5'

NNCTGGAC-3'

NNGACCTG-5'

5-GTCCAGN З'-CAGGTCN

5-GTCCAGN З'-CAGGTCN

G G

G G

Палиндром

5'-GAATTC-3*

3-CTTAAG-5'

Истинный (симметричный) палиндром

5-GTCAATGAAGTAACTG-3'

3'-CAGTTACTTCATTGAC-5'

Процессированные псевдогены - это подкласс псевдогенов с определенной локализацией и структурой. Как правило, они не сцеплены с соответствующим функционально активным геном, а рассеяны по всему геному, в том числе и по разным хромосомам. По своей структуре они больше похожи на ДНК-копии мРНК, чем на гены. Например, процессированные псевдогены обычно не содержат вставочных последовательностей, которые имеются в функционально активных генах, а последовательности, фланкирующие процессированный ген с 5'- и З'-концов, как правило, отличаются от последовательностей, фланкирующих активные гены, и представлены ро!у(А)-хвостом на З'-конце. Вероятно, процессированные псевдогены образовались в результате обратной транскрипции и транспозиции (разд. 10.4).

Некоторые особые типы последовательностей. В предыдущих главах мы ввели термины, необходимые для описания некоторых особых нуклеотидных последовательностей. Рассмотрим их еще раз, поскольку они понадобятся нам в дальнейшем при обсуждении структуры эукариотических геномов (рис. 9.1).

Повторяющиеся последовательности, ориентированные в одинаковом направлении в молекуле

ДНК, называются прямыми повторами или последовательностями, расположенными «голова-к-хвос- ту». Такие прямые повторы могут входить в состав непрерывных (тандемных) повторов или быть разделенными какими-то другими последовательностями. Размер повторяющейся единицы варьирует от двух до тысяч пар оснований.

Повторяющиеся последовательности, ориентированные в противоположных направлениях, называются обратными (инвертированными) повторами (или повторами с осью симметрии 2-го порядка или повторами, расположенными «голова-к-голове» либо «хвост-к-хвосту»). Если инвертированный повтор присутствует в одной из цепей двухцепочечной ДНК, то такой же повтор, но имеющий противоположное направление, есть и в комплементарной цепи. Одноцепочечная ДНК или РНК, содержащие обратные повторы, разделенные тремя-четырьмя основаниями, могут образовать внутримолекулярную двух цепочечную структуру. Если расстояние между обратными повторами достаточно велико, то при образовании дуплекса (ствола) может сформироваться одноцепочечная петля; такая структура называется «петля на стебле» (stem-and-loop). Если же повторы разделены небольшим числом нуклеотидов, то одиночная цепь ДНК образует двухцепочечную структуру, называемую шпилькой (hairpin).

Иногда обратные повторы находятся в пределах одной структурной единицы (это могут быть, например. сайты узнавания для рестриктирующих эндонуклеаз, представленные на рис. 4.7); тогда соответствующая последовательность называется палиндромом. Такие палиндромы отличаются от истинных (симметричных) палиндромов, у которых последовательность нуклеотидов читается одинаково в направлениях 5 -» 3' и 3' -» 5'. В двойной спирали ДНК каждому истинному палиндрому в одной цепи всегда соответствует комплементарный истинный палиндром в другой.

б. Повторяемостьпоследовательностей ДНК

Значительную часть большинства эукариотических геномов составляют последовательности, повторяющиеся в неизменной или несколько модифицированной форме. Число таких копий варьирует от

двух до нескольких миллионов. Ген и родственные ему псевдогены образуют семейство повторяющихся последовательностей. В данном случае семейство содержит как кодирующие, так и некодирующие элементы. Другие семейства, например повторяющиеся гистоновые гены, состоят преимущественно из кодирующих элементов. Такие семейства, как сателлитные ДНК, содержат исключительно некодирующие единицы. Наличие повторяющихся последовательностей в геноме характерно не только для эукариот. У таких прокариот, как Е. coll и S. typhimurium, имеются короткие (от 20 до 40 п.н.) палиндромные последовательности, повторяющиеся в межгенных промежутках 500 и более раз, причем на их долю приходится 0.5% всего генома. Роль этих повторов до конца не установлена; возможно, они служат сайтами узнавания для ДНК-гиразы, которая обладает высоким сродством к ним. Кроме того, ДНК прокариот содержит повторяющиеся единицы длиной несколько тысяч пар оснований; одни из них являются генами рибосомной РНК, а другие-мобильными элементами (разд. 10.2.а). Неравный кроссинговер между этими повторами, а также между случайными очень короткими дуплицированными участками способствует образованию тандемных повторов и делеций. В отличие от прокариот, у многих эукариот на долю повторов приходится 50 и даже более процентов генома, и не исключено, что на самом деле в геноме эукариот содержится очень мало уникальных сегментов. Важно различать уникальный сегмент (или последовательность) ДНК и уникальный ген. Специфический функционально активный ген, представленный в гаплоидном геноме в единственном числе и потому уникальный, может входить в семейство повторяющихся последовательностей, которое содержит родственные ему гены и псевдогены.

Одни повторяющиеся последовательности представляют собой непрерывные блоки тандемно повторенных единиц (рис. 9.1). Члены других семейств образуют кластеры прямых или обратных повторяющихся единиц, разделенных другими последовательностями. Члены некоторых семейств рассеяны по геному и разным хромосомам, иногда диспергированы и сами тандемные повторы.

Вариабельность членов семейств повторяющихся последовательностей. Нуклеотидные последовательности членов данного семейства повторов могут быть как идентичными, так и различаться по одной и более парам оснований. В последнем случае говорят о полиморфных последовательностях. В некоторых семействах такая дивергенция последовательностей весьма значительна. Применительно к более или менее сходным между собой членам семейств используют термины «подсемейства» и «надсемейства». Степень дивергенции членов разных

семейств можно определить с помощью четырех методов, расположенных в порядке увеличения точности оценки: 1) сравнение карт рестрикции; 2) определение способности членов разных семейств к гибридизации; 3) измерение температуры плавления гибридных дуплексов, которые образуют между собой члены семейств; 4) сравнение нуклеотидных последовательностей. В жестких условиях отжига (относительно высокая температура около 65 °C - и низкая ионная сила - примерно 0,45М NaCl) дуплексы обычно образуются только между сегментами ДНК, комплементарными не менее чем на 85%. При понижении температуры и увеличении ионной силы отжигаются сегменты с меньшей гомологией. Стабильность образующихся гетеродуплексов оценивается путем измерения их температуры плавления (разд. 1.1.е). Как правило, понижение температуры плавления на 1 С соответствует 1% неспарившихся оснований.

Если последовательности в дуплексе идентичны, то он называется гомологичным. Однако термин «гомологичные» часто используется применительно к сходным, но не идентичным сегментам ДНК. Часто для указания степени идентичности последовательностей применяют качественный показатель (например, высокая гомология означает высокую степень сходства). Количественная оценка гомологии применима в тех случаях, когда известны нуклеотидные последовательности. Так. говорят, что два сегмента ДНК гомологичны на 70% (имеют 70%-ное сходство), если 70% пар оснований (или нуклеотидных остатков) у них идентичны и коллинеарны. Такой подход вытекает из определения гомологичности хромосом, однако он отличается от принятого в биологической литературе по эволюции. Там гомология, как правило, означает, что морфологические структуры или последовательности имеют общего предка, и процентная гомология теряет смысл. Хотя последовательности ДНК, гомологичные на 70 и даже на 30%, скорее всего происходят от общей предковой последовательности ДНК, они могут быть и неродственными. Таким образом, термин «процентная гомология», используемый в молекулярно-генетической литературе и в данной книге, двусмыслен. Термин «процент сходства», которым мы также пользуемся, однозначен, но встречается в литературе довольно редко.

Размер семейств повторяющихся последовательностей. Число членов семейств у разных эукариот колеблется от двух по миллионов; неодинаково и число копий в геномах разных видов. Число копий-это весьма информативный параметр, однако многие семейства описаны лишь как семейства с большим, средним или малым числом повторов. Исторически такая классификация связана с ис-

пользованием для этих целей кинетики реассоциации и показателя Cot (разд. 7.5.в). Например, для ДНК млекопитающих с большим числом повторов (105 копий и более) Cot равно 0,1, для ДНК со средним числом повторов (102 105 копий) Cot лежит в диапазоне от 0,1 до 100, а для ДНК с малым числом повторов (менее 100 копий) Cot превышает 100.

Консенсусные (канонические) последовательности. Если семейство повторяющихся последовательностей состоит из многих членов, каждый из которых отличается от других лишь несколькими нуклеотидами, то удобно построить некую усредненную консенсусную (каноническую) последовательность. В такой последовательности представлены те основания, которые чаще всего встречаются в данной позиции во всех членах семейства, и она не обязательно идентична последовательности каждого индивидуального члена. Консенсусные последовательности получают двумя способами. Во-первых. иногда удается выделить и проанализировать большую популяцию повторяющихся последовательностей, не содержащую ни одной неродственной последовательности. Поскольку методы секвенирования не позволяют выявить очень малый процент различий в каждой позиции, даже если каждая молекула ДНК в популяции отличается от всех других несколькими нуклеотидами, в итоге получается уникальная последовательность (разд. 7.2). Во-вторых, можно сравнить последовательности нескольких клонированных членов семейства и определить, какие нуклеотиды встречаются в каждом сайте наиболее часто.

Если результаты секвенирования отсутствуют, то в семейство включают все последовательности, которые гибридизуются в жестких условиях друг с другом или с одним из клонированных членов семейства. Вообще говоря, это означает, что идентифицируются только последовательности, которые отличаются от консенсусной не более чем на 15 20%, а остальные членами данного семейства не считаются. При идентификации семейств повторяющихся последовательностей с помощью кинетики ренагурации не учитываются также слишком короткие для ренатурации последовательности. Например. таким способом не выявляются последовательности 5'-АСТ(А или Т)„ТА, находящиеся перед генами тРНК (разд. 9.2). Нередко последовательности, идентичные по результатам секвенирования на 30 - Б0%, не гибридизуются друг с другом и не попадают в одно семейство или надсемейство.

в. Эволюционный аспектповторяемости последовательностей

Роль амплификации последовательностей ДНК в эволюции генома. Сходные последовательности в пределах одного генома в принципе могут возникать как независимо, так и при копировании исходной уникальной последовательности ДНК-после- довательности-«родоначальника». Вероятность того, что две сходные последовательности возникли независимо, тем меньше, чем больше их сходство и длина. Нет сомнений, что именно увеличение числа предковых последовательностей привело к появлению семейств сходных последовательностей, которые составляют значительную часть современных геномов. Увеличение числа копий сегментов ДНК в ходе эволюции или в процессе эксперимента называется амплификацией. За амплификацию последовательностей в составе кластеров или последовательностей, рассеянных по новым геномным локусам, отвечают разные механизмы (гл. 10). Если основная последовательность удовлетворяет физиологические потребности организма, то образование дополнительных ее копий в геноме не приводит к особым преимуществам подразумевается, что все эти копии, кроме одной, не содержат мутаций, включая нуклеотидные замены, делеции и вставки. Одна измененная копия может быть нефункциональной или выполнять какие-то новые функции либо служить регуляторным элементом. Если такие измененные последовательности окажутся полезными, то они сохранятся под давлением отбора. В противном случае эти последовательности следует отнести к псевдогенам. Таким образом, амплификация ДНК создает основу для эволюции.

Интересно сравнить отдельные гены и мульти- генные семейства для разных видов, а также для разных индивидов одного вида. Анализ различий в нуклеотидных последовательностях, числе копий, вставочных последовательностях и организации генов может стать важным дополнением к традиционным эволюционным исследованиям. В качестве примера рассмотрим мультигенное семейство у позвоночных, которое содержит гены гормона роста и пролактина. Это надсемейство - хорошая иллюстрация связи между структурой генов и эволюционными взаимоотношениями в пределах вида и между видами.

Надсемейство генов гормона роста у позвоночных. Гормон роста и пролактин (которые у млекопитающих выполняют иные, чем у других позвоночных, функции) различаются приблизительно по 65% позициям, однако их молекулы имеют примерно одинаковый размер (190 199 аминокислот в зависимости от вида), а в некоторых положениях у них находятся одинаковые аминокислотные остат-

ки. В генах этих гормонов в одинаковых сайтах присутствуют по четыре интрона, которые, однако, существенно различаются по длине и по фланкирующим их последовательностям. Каждый из генов экспрессируется в клетках гипофиза определенного типа, причем процесс находится под контролем разных регуляторных элементов. В гаплоидном геноме большинства позвоночных имеется только по одному гену пролактина и гормона роста. У плацентарных же млекопитающих присутствует по крайней мере еще один член данного семейства - ген плацентарного лактогена, а возможно, и другие, менее сходные гены. В генах гормона роста и плацентарного лактогена интроны находятся в одинаковых областях, а кодирующие последовательности сходны примерно на 92% (по данным об аминокислотных последовательностях сходство составляет 85%). Интроны высокогомологичны; 5'- фланкирующие участки гомологичны по меньшей мере по 500 п.н., а З'-фланкирующие последовательности различаются больше. Это весьма интересно, поскольку гормон роста и плацентарный лактоген синтезируются в разных тканях: в передней доле гипофиза и в плаценте соответственно, и их экспрессия контролируется независимо.

Поскольку отдаленно родственные гены плацентарного лактогена и гормона роста есть у всех позвоночных, не исключено, что их общий предок дуплицировался еще до появления амфибий и рыб.

которые дивергировали 400 млн. лет назад (рис. 9 2), и далее два гена эволюционировали у каждого вида независимо. Гены, эволюционирующие таким способом, называются паралогичными. Как именно произошла дупликация-с образованием сцепленных генов или рассеянных по всему геному копий- неизвестно. У современных приматов гены гормона роста и плацентарного лактогена диспергированы. Например, у человека ген плацентарного лактогена локализован в хромосоме 6, а ген гормона роста в хромосоме 17. Помимо паралогичных существуют ортологичные гены, т. е. структурно и функционально гомологичные гены у разных видов. Например, гены гормона роста у всех позвоночных ортоло- гичны; кодирующие участки этих генов у курицы, человека, быка и крысы гомологичны на 75%.

Ген плацентарного лактогена есть у всех млекопитающих, но у других позвоночных он отсутствует, поэтому можно предположить, что дупликация гена гормона роста произошла до появления большинства видов млекопитающих, т. е. 85100 млн. лет назад. Эти паралогичные гены эволюционировали вместе, оставаясь сцепленными. Кроме того, у приматов имеется множество сцепленных генов как гормона роста, так и плацентарного лактогена: например, у человека в хромосоме 17 локализованы два гена гормона роста и три гена плацентарного лактогена. Это свидетельствует о дополнительной амплификации генов, которая про-

Уникальный предковый генс четырьмя интронами

■м

I Дупликация >400 млн. лет назад

Позвоночные

Гормон ростаПролактин

I Дупликация >85 млн. лет назад

Плацентарные млекопитающие

Гормонроста Плацентарный лактоген

Дополнительные реитерации, >60 млн. лет назад

Приматы

Гормонроста Плацентарный лактоген Гормонроста Плацентарный лактоген

—Примерно 50т.п.н.

РИС. 9.2.

Схематическое представление эволюции мультигвнного семейства генов гормона роста человека. Вариабельность размера интронов не учитывалась. [G.S. Barsh, Р. Н. Seeburg, R. Е. Gelinas, Nucleic Acid Res. 11 (1983), p. 3939.)

Экзон гена сигнального^пептида

Амплификация экзона А

РИС. 9.3.

Схематическое представление эволюции гена гормона роста и родственных генов, которая включает тандемное повторение предкового экзона, перестановку экзонов и утрату интрона. [A. Barta et al.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), p. 4367.]

изошла до обособления приматов, около 60 млн. лет назад. Можно, конечно, предположить, что близкие по своей организации гены возникли независимо, но это крайне маловероятно, если учесть, насколько сходны между собой гены в пределах надсемейства.

Роль повторов и перераспределений экзонов в эволюции гена гормона роста. Структура гена гормона роста (и других генов этого надсемейства) свидетельствует об амплификации экзонов. При клонировании и секвенировании гена гормона роста крысы было обнаружено пять экзонов (рис. 9.3). Первый и часть второго экзона кодируют сигнальную поли- пептидную последовательность (разд. 3.10.6). Сходство второго, четвертого и пятого экзонов свидетельствует о том, что все они образовались в результате четырехкратной тандемной амплификации предкового экзона (экзон 5 содержит две копии гомологичных последовательностей). Экзон 3 отличается от других и, вероятно, появился при перераспределении экзонов - вставки копии одного из экзонов другого гена. Действительно, пептид, кодируемый экзоном 3, не стимулирует рост, хотя и обладает противоинсулиновой активностью, в то время как гормон роста обладает обеими этими активностями.

Молекулярные часы. Детальное сравнение структуры генов в надсемействе генов гормона роста освещает еще один аспект молекулярной эволюции, в которой предполагается, что мутации накапливаются с более или менее постоянной скоростью. Исходя из этого, сходство современных родственных кодирующих последовательностей, выраженное в процентах, характеризует: 1) время с момента дивергенции генов от единого предкового гена; 2)

скорость накопления мутаций в генах; 3) скорость фиксации мутаций в популяции. Эти соображения применимы как к ортологичным, так и к пара- логичным генам. С такой общей гипотезой согласуются данные по многим белковым последовательностям. Однако эволюционные «часы» идут для различных белков с разной скоростью, и связано это в основном с различиями в скорости фиксации мутаций. За единицу скорости эволюции принимается время (исчисляемое миллионами лет), за которое две кодирующие последовательности дивергируют на 1% (эта единица обозначается UEP, от англ, unit evolutionary period). UEP равно 15 для умеренно консервативного цитохрома с и 400-для высококонсервативного гистона Н4. UEP определяют, оценивая дивергенцию (в %) ортоло- гичных кодирующих последовательностей у двух видов в разные моменты времени от начала дивергенции этих видов, определяемого по палеонтологической летописи.

UEP для гормона роста и плацентарного лактогена у человека и крысы составляет примерно 4,5. Сравнивая нуклеотидные последовательности генов гормона роста и плацентарного лактогена человека и используя это значение UEP, можно проверить гипотезу часов. Дивергенция указанных генов составляет 10%, откуда следует, что для амплификации и появления гена плацентарного лактогена потребовалось примерно 45 млн. лет (10-4,5). Это весьма неожиданный результат, поскольку согласно палеонтологическим данным дивергенция млекопитающих произошла 85-100 млн. лет назад. Можно было бы объяснить такое несоответствие тем, что дупликация у каждого вида млекопитающих протекала независимо, но это крайне маловероятно.

Можно также предположить, что UEP для генов плацентарного лактогена и гормона роста человека различаются. Но есть еще одно объяснение-неадекватность простой «модели часов»: в ходе эволюции происходят не только накопление и фиксация точковых мутаций, но и другие события, а независимая эволюция двух генов ограничивается еще какими-то механизмами. Здесь необходимо учесть два принципиальных факта. Во-первых, гены гормона роста и плацентарного лактогена человека гораздо ближе по своей организации ортологичным генам крысы и быка. Во-вторых, интроны генов гормона роста и плацентарного лактогена человека близки друг другу почти в такой же степени, как кодирующие последовательности этих генов, в то время как обычно аналогичные интроны в паралогичных генах существенно различаются по длине и нуклеотидным последовательностям. Очевидно, что эволюция паралогичных генов не зависит от так называемой согласованной эволюции, или гомогенизации. Это отмечается и в других мультигенных семействах (например, семействах глобиновых генов; разд. 9.3.6) и в диспергированных повторяющихся последовательностях (разд. 9.5.д).

Какие процессы могут отвечать за гомогенизацию структуры пары родственных, но различающихся генов? Здесь может быть несколько альтернатив. Во-первых, неравный кроссинговер, который обеспечил гомогенизацию генов рРНК по крайней мере в нескольких геномах (разд. 9.2.а). Во-вторых, новые делеции в генах, происходящие вслед за амплификациями. В-третьих, генная конверсия (разд. 2.4). Что касается отдельных однородных семейств генов, то пока трудно отдать предпочтение какой-то из этих альтернатив. Тем не менее ясно, что в молекулярную эволюцию вносят вклад несколько разных процессов. Несомненно, на ход эволюционных часов влияют как рекомбинационные события, так и мутации.

Эволюция интронов. Являются ли интроны столь же древними, как первичные кодирующие участки, или же они появились в ходе последующей эволюции? В семействе генов гормона роста и в других мультигенных семействах положение и число интронов одинаково как для пара-, так и для орто- логичных генов, хотя их длина и нуклеотидная последовательность варьируют. Это согласуется с предположением, что участки, прерывающие гены, имеют столь же древнее происхождение, как и большинство самих предковых генов, но они сравнительно независимы от давления отбора. Об этом свидетельствуют, например, данные о структуре генов инсулина млекопитающих. Как правило, в гаплоидном геноме позвоночных присутствует единственный ген инсулина с двумя интронами. Однако у некоторых грызунов имеется второй

функционально активный ген инсулина с единственным интроном. Проще предположить, что второй ген появился в результате случайной дупликации исходного гена и потери интрона, чем считать, что в предковом гене у всех позвоночных имелся только один интрон.

Такие же доводы можно привести и в случае семейства глобиновых генов, которое описано ниже. У растений в генах леггемоглобина имеются три интрона, два из которых расположены так же, как интроны в генах гемоглобина позвоночных. Положение интронов в глобиновых генах иллюстрирует еще одну общую закономерность: экзоны часто кодируют определенные структурные и функциональные домены белков. Все эти факты свидетельствуют о том, что интроны присутствовали уже в самых первых генах. Однако наличие интронов на ранних этапах эволюции не означает, что они не могли внедряться в уже существующие кодирующие области. Возможно, именно таков механизм появления некоторых интронов в генах семейства сериновых протеаз (например, тромбина, трипсина и химотрипсина). Недавние эксперименты позволили построить модели встраивания интронов. Так, интроны I и II групп внедряются в сайты-мишени с помощью генной конверсии или обратного са- мосплайсинга. Конверсия генов I группы зависит от белков, которые кодируются интроном.

ГЕНЫ, КОДИРУЮЩИЕ РНК

В трансляции мРНК и процессинге РНК-предшественников участвует широкий спектр молекул РНК, и многие из них требуются в относительно больших количествах. В отличие от генов, кодирующих белки, где каждый транскрипт в результате многократной трансляции дает множество генных продуктов, транскрипт РНК-гена дает только одну копию конечного РНК-продукта. Спрос на РНК часто удовлетворяется за счет огромного избытка генов.

а. Гены 18S-, 5,85- и 285-рРНК

Многие данные о генах рибосомных РНК (рДНК) были получены еще до появления методов рекомбинантных ДНК, поскольку рРНК, выделяемые из очищенных рибосом, не содержат примесей и могут использоваться в качестве зондов для гибридизации без предварительного клонирования. Кроме того, среднее GC-содержание рДНК обычно выше, чем генома в целом, и в большинстве эукариотических геномов рибосомные гены присутствуют в виде протяженных тандемных повторов. Это значит, что высокомолекулярные ДНК, содержащие большое число копий рРНК-генов, имеют

относительно высокую по сравнению с остальной геномной ДНК плавучую плотность и поэтому их можно выделить в виде отдельной фракции при равновесном центрифугировании суммарной ДНК в градиенте плотности (изопикническое центрифугирование; рис. 9.4). С помощью различных методов, в частности метода гибридизации in situ с радиоактивными рРНК-зондами, было установлено, что рДНК локализуется в определенном месте хромосомы-так называемом районе ядрышкового организатора. Здесь происходят транскрипция рДНК и процессинг предшественников рРНК (разд. 8.2).

В отличие от генов рРНК, которые у большинства эукариот присутствуют в виде сотен копий, гены рибосомных белков низкокопийные. Геномные клоны и кДНК, кодирующие рибосомные белки, выделены из нескольких видов, в частности из Drosophila, Xenopus, клеток мыши и человека. В геноме содержится от 1 до 10 функционально активных генов для каждого рибосомного белка; обнаружены также процессированные псевдогены.

Сцепление генов трех рРНК в пределах одной транскрипционной единицы. Как правило, кодирующие области генов 18S-, 5,8S- и 28S-pPHK эукариот сгруппированы в указанном порядке в одну транскрипционную единицу (разд. 8.2). Все три РНК образуются из длинного транскрипта-предшественника в результате процессинга, включающего расщепление РНК эндонуклеазами и метилирование как нуклеотидов, так и 2'-гидроксильных групп. Полная транскрипционная единица содержит два некодирующих спейсера (называемых внутренними

РИС. 9.4.

Равновесное центрифугирование суммарной геномной ДНК Xenopus. ДНК центрифугировали с высокой скоростью в растворе с градиентом плотности CsCI. По окончании центрифугирования разные ДНК концентрировались в виде полос, положение которых соответствовало их плавучей плотности. Поскольку плотность ДНК-дуплекса пропорциональна его GC-содержанию, длинные повторы, обогащенные GC-парами, существенно отличались по этому показателю от большей части генома и концентрировались в отдельных «сателлитных» полосах. [D. D. Brown, С. S. Weber, J. Mol. Bio 34 (1968). р. 681.]

транскрибируемыми спейсерами, ITS), которые разделяют три кодирующие области, а также имеет некодирующие участки перед первым геном 18S- рРНК и за последним геном 28S-pPHK (эти участки называются внешними транскрибируемыми спейсерами, ETS). У эукариот длина и нуклеотидная последовательность рРНК варьируют весьма незначительно, так что межвидовые различия по размеру транскрипционной единицы (табл. 9.1) обусловливаются различиями в длине спейсерных участков. Сегменты ДНК по обе стороны от сайта инициации транскрипции на 5'-конце ETS существенны для транскрипции ДНК при участии РНК-полимеразы I. В отличие от кодирующих областей, сходных между собой, для этих последовательностей характерно сильное видовое различие. Возможно, такие различия связаны с видоспецифичной активностью РНК- полимеразы I, которой для взаимодействия с этими последовательностями необходимы видоспецифичные факторы транскрипции (разд. 8.2.в).

Тандемное расположение генов рРНК. Число копий рДНК у многих организмов было определено в экспериментах по гибридизации в условиях насыщения, с использованием в качестве зонда чистой рРНК (табл. 9.1). В большинстве случаев копии РДНК в хромосоме организованы в виде тандемного повтора, образующего протяженный кластер. Эти кластеры часто локализованны в нескольких хромосомах. Единицы транскрипции рДНК в пределах этих кластеров разделены межгенными спейсерами, или IGS (рис. 9.5). Длина каждого IGS варьирует от 2 т.п.н. у дрожжей до 30 т.п.н. у млекопитающих, соответственно варьирует и общая длина повторяющейся единицы, включая единицу транскрипции и IGS. Нуклеотидные последовательности самих IGS также весьма сильно различаются от вида к виду (разд. 8.2).

Неравный кроссинговер между тандемными повторами рДНК. Число копий рДНК может варьировать и в пределах вида. В геноме человека рДНК обнаружена в пяти хромосомных локусах, при этом каждый из них содержит разное число копий рДНК, а кроме того, число копий на хромосому неодинаково у разных индивидов. У некоторых организмов даже соматические клетки в течение жизни особи сильно различаются по числу копий рДНК. Таким образом, увеличение и уменьшение числа копий характерны для рДНК в такой же степени, как и для других длинных тандемных повторов (разд. 9.4.В). В основе динамичности геномов могут лежать несколько механизмов; с помощью одного из них - неравной гомологичной рекомбинации между тандемными повторами-можно объяснить и изменение числа копий рДНК, и другие замечательные ее свойства. Так, например, установлено, что нуклеотидные последовательности всех рДНК

Таблица 9.1. Локализация, число копий иразмеры генов рРНКВидНомер хромосомы, в которой локализован геиПримерное число копий (на гаплоидный геиом)Примерный размер единицы транскрипции, т.п. и.С. elegans1556D. discoides42S. cerevisiae121007T. pyriformis1D. melanogasterX, Y2008X. laevis(В одной из хромосом)6008G. domesticus20010,5M musculus1115, 18. 191001312, 16, 18H. sapiens13. 14, 15, 21. 22150-20014Z. mays63000-9000Таблица 9.1. Локализация, число копий иразмеры генов рРНКВидНомер хромосомы, в которой локализован геиПримерное число копий (на гаплоидный геиом)Примерный размер единицы транскрипции, т.п. и.С. elegans1556D. discoides42S. cerevisiae121007T. pyriformis1D. melanogasterX, Y2008X. laevis(В одной из хромосом)6008G. domesticus20010,5M musculus1115, 18. 191001312, 16, 18H. sapiens13. 14, 15, 21. 22150-20014Z. mays63000-9000*• В двух разных иибредных линиях.*• В двух разных иибредных линиях.человека на удивление сходны, несмотря на то что кластеры тандемных повторов находятся в разных хромосомах. Если бы рДНК в каждой хромосоме были никак не связаны друг с другом, то в результате накопления случайных мутаций они со временем дивергировали бы, причем особенно сильно в области IGS. Единообразие повторов рДНК человека говорит о том, что они как-то связаны между собой. К образованию общего пула всех рДНК-копий приводят неравные гомологичные рекомбинации между повторами рДНК из разных хромосом, а также между неаллельными повторами сестринских хроматид. Но эти же процессы приводят и к изменению числа копий рДНК в кластерах.

Таблица 9.1. Локализация, число копий и

размеры генов рРНК

Вид

Номер хромосомы, в которой локализован геи

Примерное число копий (на гаплоидный геиом)

Примерный размер единицы транскрипции, т.п. и.

С. elegans

1

55

6

D. discoides

42

S. cerevisiae

12

100

7

T. pyriformis

1

D. melanogaster

X, Y

200

8

X. laevis

(В одной из хромосом)

600

8

G. domesticus

200

10,5

M musculus11

15, 18. 19

100

13

12, 16, 18

H. sapiens

13. 14, 15, 21. 22

150-200

14

Z. mays

6

3000-9000

Таблица 9.1. Локализация, число копий и

размеры генов рРНК

Вид

Номер хромосомы, в которой локализован геи

Примерное число копий (на гаплоидный геиом)

Примерный размер единицы транскрипции, т.п. и.

С. elegans

1

55

6

D. discoides

42

S. cerevisiae

12

100

7

T. pyriformis

1

D. melanogaster

X, Y

200

8

X. laevis

(В одной из хромосом)

600

8

G. domesticus

200

10,5

M musculus11

15, 18. 19

100

13

12, 16, 18

H. sapiens

13. 14, 15, 21. 22

150-200

14

Z. mays

6

3000-9000

*• В двух разных иибредных линиях.

*• В двух разных иибредных линиях.

Кроссинговер между рДНК проще изучать у дрожжей, чем у млекопитающих. Если рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую маркерные гены дрожжей, ввести путем трансфекции в дрожжевые клетки, то некоторые из них включат маркерные гены в хромосомную ДНК (разд. 5.6.в). Трансформация происходит в результате рекомбинации между маркерными генами и гомологичными геномными сегментами. Плазмида, несущая и ген рДНК, и ген LEU2, рекомбинирует в основном с геномной рДНК благодаря присутствию последней в большом числе копий (рис. 9.6). Такие трансформанты содержат кластер тандемных повторов рДНК, прерываемых в одном месте геном LEU2, по

185 5,8S 28S18S 5,8S 28S18S 5,8$ 288■—।ейtea- teeIGS EIS ITS ITS EIS IGS ETS ITS ITS ETS IGS ETS ITS ITS ETS 185 5,8S 28S18S 5,8S 28S18S 5,8$ 288■—।ейtea- teeIGS EIS ITS ITS EIS IGS ETS ITS ITS ETS IGS ETS ITS ITS ETSРИС. 9.5.РИС. 9.5.Организация рибосомных ДНК. Единицы транскрипции рДНК обычно образуют кластеры из длинных тандемных повторов. Представлены кодирующие области для 18S-, 5,85- и 28S-pPHK. а также три типа спейсеров:

185 5,8S 28S18S 5,8S 28S18S 5,8$ 288

■—।ейtea- tee

IGS EIS ITS ITS EIS IGS ETS ITS ITS ETS IGS ETS ITS ITS ETS

185 5,8S 28S18S 5,8S 28S18S 5,8$ 288

■—।ейtea- tee

IGS EIS ITS ITS EIS IGS ETS ITS ITS ETS IGS ETS ITS ITS ETS

РИС. 9.5.

РИС. 9.5.

которому их можно, отбирать. При спаривании трансформантов с клетками дикого типа образуются диплоидные дрожжевые клетки, у которых можно индуцировать мейоз и споруляцию. Продукты мейо- за представлены в спорах в виде четырех отдельных гаплоидных клеток, или тетрад. Эти клетки можно разделить, вырастить и проанализировать. Результаты показывают, что неравный кроссинговер происходит между цепями ДНК сестринских хроматид во время мейоза. Из рис. 9.6 видно, что число копий рДНК, образующихся в результате кроссинговера, в пределах одного рД НК-кластера варьирует (рис. 9.6).

Дивергенция в области IGS. Структура IGS весьма сложна и неодинакова у разных видов как по нуклеотидной последовательности, так и по организации (разд. 8.2.в). Этим IGS существенно отличается от высококонсервативных кодирующих областей рДНК. Общей особенностью всех IGS является то, что они обычно содержат прямые тандемные повторы, правда различающиеся по нуклеотидным последовательностям у разных организмов. За исключением млекопитающих, эти последовательности обычно сходны с теми, которые окружают сайты начала транскрипции, т. е. сигнальные последовательности для РНК-полимеразы I. Некоторые из них служат «минорными» сайтами инициации транскрипции и ответственны за присутствие небольших количеств РНК, гомологичных IGS. Иногда такие

внешний транскрибируемый спейсер (ETS), внутренний транскрибируемый спейсер (ITS) и межгенный спейсер (IGS).

pBR322pBR3221.Трансфекц,ия клеток leu 22.Отбор клеток LEU* *1.Трансфекц,ия клеток leu 22.Отбор клеток LEU* *рДНК Рекомбинантная плазмидарДНК Рекомбинантная плазмидаББФенотипФенотипLEU2LEU2[■ Ранк(-РДНК ^£О2|-₽^-^рДНК |рДНК gКластер рДНК в геноме клеток LEU*[■ Ранк(-РДНК ^£О2|-₽^-^рДНК |рДНК gКластер рДНК в геноме клеток LEU*Дрожжевые клеткиДрожжевые клеткиLEU2LEU2Пары сестринских хроматид, которые образуются в диплондеПары сестринских хроматид, которые образуются в диплондеМейозМейозЧетыре колонии гаплоидных клетокЧетыре колонии гаплоидных клеток22Число копий LEU2 ОЧисло копий LEU2 О1111РИС. 9.6. Тип РАНК А А

pBR322

pBR322

1.Трансфекц,ия клеток leu 2

2.Отбор клеток LEU* *

1.Трансфекц,ия клеток leu 2

2.Отбор клеток LEU* *

рДНК Рекомбинантная плазмида

рДНК Рекомбинантная плазмида

Б

Б

Фенотип

Фенотип

LEU2

LEU2

[■ Ранк(-РДНК ^£О2|-₽^-^рДНК |рДНК g

Кластер рДНК в геноме клеток LEU*

[■ Ранк(-РДНК ^£О2|-₽^-^рДНК |рДНК g

Кластер рДНК в геноме клеток LEU*

Дрожжевые клетки

Дрожжевые клетки

LEU2

LEU2

Пары сестринских хроматид, которые образуются в диплонде

Пары сестринских хроматид, которые образуются в диплонде

Мейоз

Мейоз

Четыре колонии гаплоидных клеток

Четыре колонии гаплоидных клеток

2

2

Число копий LEU2 О

Число копий LEU2 О

1

1

1

1

Неравный кроссинговер между единицами рДНК у дрожжей. А. Дрожжевые клетки 1еи2" трансфицировали плазмидой, содержащей дрожжевую рДНК и ген LEU2. Отбирали трансформанты LELT. Блот-гибридизация обработанной эндонуклеазой хромосомной ДНК показала, что вся рекомбинантная плазмида встроена в геномную повторяющуюся единицу рДНК. Б. Гаплоидные дрожжевые клетки, трансформированные так, как описано выше, скрещивали со штаммом дикого типа, содержащим ген LEU2. Эти два штамма различаются тем, что в соответствующих повторах рДНК (поперечные черточки на хромосомах) присутствуют различные сайты для рестриктаз. У диплоидов индуцировали мейоз

и споруляцию, а у отдельных гаплоидных клеток в тетрадах (производные одной диплоидной клетки) определяли потребность в лейцине (фенотип LEU), наличие

WT WT

последовательности LEU2 (с помощью ДНК-блоттинга) и родительский тип рДНК (тип А или дикий) с помощью анализа рестрицированных повторов рДНК. Клетки leu" содержались почти в 10% тетрад. ДНК из клеток leu не гибридизовалась с Lfi/2-зондом. Одна из клеток LEU* в таких тетрадах содержала в два раза больше ДНК LEU2, чем исходная гаплоидная клетка. Таким образом, происходил частый кроссинговер. Как клетки !еи", так и клетки с двойной дозой LEU2-nocne- довательностей содержали рДНК типа А, что указывает на рекомбинацию сестринских хроматид. Споры, содержащие рДНК как типа А, так и дикого типа в тетрадах, встречались редко. Таким образом, кроссинговер

между сестринскими хроматидами происходит гораздо чаще, чем между гомологичными хромосомами. [Т. Peters, Cell 19 (1980), р. 765.]

последовательности содержат энхансеры экспрессии рДНК. Повсеместное присутствие в IGS тандемных повторов наводит на мысль, что они дают какие-то преимущества при транскрипции рДНК.

Разное число актов кроссинговера, происходящих между тандемно повторяющимися единицами в IGS, приводит к различиям в числе самих этих единиц, а также в числе полноразмерных рДНК. Таким образом, IGS эволюционирует как согласованно с рДНК-единицей, в которую он входит, так и независимо от нее. Кроме того, в результате кроссинговера общая длина повторов рДНК варьирует от одного близкородственного вида к другому и даже в пределах одного вида.

Гены 5S-pPHK

Гены 5S-pPHK, как правило, сцеплены с генами 18S-, 5,8S- и 28S-pPHK; исключения обнаружены только среди грибов и простейших. Поскольку гены 5S-pPHK транскрибирует РНК-полимераза III, часть их внутренних кодирующих последовательностей функционирует как регуляторный элемент (разд. 8.4.6). Гены 5S-pPHK, длина которой составляет 120 нуклеотидов, не прерываются никакими интронами.

Тандемное повторение генов 5$-рРНК. Как и кластеры генов других рРНК, гены 5S-pPHK у многих эукариот многократно повторяются и образуют семейства длинных тандемных повторов (табл. 9.2). Так, при изопикническом центрифугировании ДНК Xenopus 58-рДНК концентрируется в отдельной полосе, хотя на ее долю приходится менее I % геномной ДНК. На электронных микрофотографиях частично денатурированных тандемных повторов 58-рДНК обнаруживаются легкоплавкие АТ-богатые участки, чередующиеся с GC-богатыми сегментами. Кодирующий участок длиной 120 п. н.- это и есть GC-богатый сегмент, на долю которого приходится менее 20% всего повтора; остальная его

часть представлена АТ-богатым нетранскрибируе- мым спейсером. Вывод о вариабельности генов 5S-pPHK можно сделать исходя из данных о гетерогенности 58-рДНК, очищенной с помощью центрифугирования в градиенте плотности, а также из того, что их кривая плавления состоит из нескольких компонент. Число копий генов 5S-pPHK в различных геномах определяли методом гибридизации с очищенной 5S-pPHK в условиях насыщения.

У D. melanogaster примерно 160 генов 5S-pPHK собраны в тандемный повтор в хромосоме 2. Каждая повторяющаяся единица содержит упомянутый выше кодирующий участок длиной 120 п. н., транскрибируемый спейсер длиной примерно 15 п. н. на З'-конце транскрипционной единицы и нетранскри- бируемый спейсер длиной 250 п. н. (рис. 9.7). По- видимому, все 160 повторяющихся единиц образуют единый, ничем не прерываемый кластер. Свыше 20 тандемных повторов было клонировано в виде одного сегмента длиной более 8 т. п. н. АТ-богатый участок в спейсере содержит внутренний повтор и имеет разную длину (примерно + 5 п. н.).

Организация генов 5S-pPHK Xenopus. В отличие от D. melanogaster и других организмов, для которых характерна относительно простая организация генов 5S-pPHK, каждый из видов Xenopus (а также других амфибий и рыб) имеет два семейства генов 5S-pPHK (разд. 8.4.д; табл. 9.2; рис. 9.7). Одно из семейств содержит тысячи генных копий, которые экспрессируются только в оогенезе. Другое семейство состоит из гораздо меньшего числа генов, экспрессирующихся как в ооцитах, так и в соматических клетках на разных стадиях развития. Каждое семейство имеет уникальную кодирующую последовательность. но в пределах семейства кодирующие последовательности гомогенны. Оба семейства представляют собой тандемные повторы. Повторяющаяся единица генов 5S-pPHK соматических клеток устроена довольно просто: она содержит

Таблица 9.2. Локализация, число копий и размер повторяющейся единицы генов 5S-pPHK

Вид

Локализация на хромосоме

Примерное число копий (на гаплоидный геном)

Примерный размер повторяющейся единицы, включая 1GS, п.н.

S. cerevisiae

Хромосома 12

150

D. melanogaster

Полоса 56EF хромосомы 2R

160

375 ± 5

X. laevis

Теломерные участки многих

400-в соматических клетках

850-900

(или всех) хромосом

20000-в ооцитах

600- 1000

X. borealis

700- в соматических клетках

9000-в ооцитах

850-900 1000-2000

H. sapiens

Хромосома 1

2000

DrosophilaDrosophilaКодирующий участокКодирующий участокТранскрибируемый спейсер

Drosophila

Drosophila

Кодирующий участок

Кодирующий участок

L-Нетранскрибируемый спейсерL-Нетранскрибируемый спейсерXenopus borealis-.семейство из соматических клетокXenopus borealis-.семейство из соматических клетокGC-богатый спейсер, фиксированная длина, нет внутренних повторовGC-богатый спейсер, фиксированная длина, нет внутренних повторовXenopus boreal is: семейство из ооцитовПсевдоген

L-Нетранскрибируемый спейсер

L-Нетранскрибируемый спейсер

Xenopus borealis-.семейство из соматических клеток

Xenopus borealis-.семейство из соматических клеток

GC-богатый спейсер, фиксированная длина, нет внутренних повторов

GC-богатый спейсер, фиксированная длина, нет внутренних повторов

■■ в-ее-тЯ—«№

*-АТ-6огатый спейсер, варьирующая

длина,внутренние повторы

100 п.и.

РИС. 9.7.

Структура некоторых повторяющихся единиц 55-рДНК. В ооцитах X. borealis эти единицы содержат несколько генов и псевдогенов (их число варьирует), разделенных спейсерами длиной около 80 п. н. Сами единицы тоже разделены спейсерами разной длины, обогащенными АТ-ларами. Такой спейсер содержит множественные тандемные повторы единицы длиной 21 п. н. (5'-

CGTCGCGTCGI I I I lGTCGCG-З'), а его длина зависит от числа копий этой единицы. Расщепление 55-рДНК эндонуклеазой Hha\, узнающей сайт GCGC, облегчает анализ структуры, поскольку при этом образуются отдельные фрагменты длиной 21 п. н. В клетке обнаружено несколько транскриптов псевдогена, который отличается от функционального гена по 15 позициям.

К центромереК центромере

К центромере

К центромере

длинный спейсер и короткую транскрипционную единицу. Однако у ооцитов эта единица имеет более сложную структуру, неодинаковую даже у родственных видов.

Сцепление всех четырех геноврРНК у дрожжей

Отличительная особенность генов рРНК некоторых простейших и грибов, в частности дрожжей 5. cerevisiae, состоит в том, что все рибосомные гены, в том числе и гены 5S-pPHK, сцеплены и находятся в одной повторяющейся единице (рис. 9.8). Однако гены 5S-pPHK транскрибируются с цепи ДНК, комплементарной той, на которой синтезируется длинный предшественник 18S-, 5,8S- и 28S-pPHK. При этом используются две разные РНК-полимеразы: длинный полицистронный транскрипт образуется при участии РНК-полимеразы I, a 5S-pPHK-

25S 5S18S 5,8S25S

(—н—।—ан

роГш

pollIIIIII456789"т.п.н.pollIIIIII456789"т.п.н.I I I I 0125

poll

IIIIII

456789"

т.п.н.

poll

IIIIII

456789"

т.п.н.

РНК-полимеразы III. У другого вида дрожжей, Shizosaccharomyces cerevisiae, и у грибов Neurospora crassa гены 5S-pPHK не входят в состав единого тандемного повтора, а рассеяны по всему геному. Как показывают результаты генетического картирования, большинство, если не все, повторяющиеся единицы рДНК S. cerevisiae находятся в одном тандемном кластере в хромосоме 12. Известна карта этой области: -U RA4-pPHK-PEP3-GAL2-ASP5-WHT- ромера. (Ориентация единиц рДНК относительно центромеры показана на рис. 9.8.)

Гены, кодирующие тРНК

Структура генов тРНК. Гены тРНК, как и гены 5S-pPHK, транскрибируются с помощью РНК-полимеразы III, при этом промотор тоже располагается внутри кодирующей последовательности (разд. 8.4.6). Одни гены тРНК содержат интроны,

РИС. 9.8.

Повторяющаяся единица в дрожжевой рДНК. Стрелки показывают направление транскрипции.

другие нет. И прерывистые, и непрерывные гены могут быть даже у одного и того же вида, например у D.melanogaster и Xenopus. Как правило, интроны генов тРНК короткие, не более 45 п. н., и всегда находятся с З'-стороны от антикодоновой последовательности.

Повторение и разные способы организации генов тРНК. Гены тРНК в эукариотических геномах, как и гены рРНК, обычно присутствуют в большом числе копий (табл. 9.3). Но в отличие от рДНК с их строго упорядоченной организацией гены тРНК кажутся расположенными беспорядочно. Они могут как соседствовать друг с другом, так и нет. Мно- гокопийные гены одной тРНК могут находиться в одном кластере или в разных. Например, при гибридизации in situ тРНК с хромосомами D.tnela- nogaster обнаруживается около 50 различных локусов, в которых группируются гены. Данный локус может содержать гены разных тРНК (рис. 9.9). При том, что гены той или иной тРНК могут находиться в разных кластерах, некоторые гены, кодирующие одинаковые тРНК, локализуются в одном тандемном повторе. Иными словами, организация генов тРНК весьма разнообразна.

Специфические повторяющиеся последовательности ДНК, расположенные перед генами тРНК. Функциональные гены тРНК фланкируются самыми разными последовательностями, но среди них часто встречаются и специфические повторы. Функциональная роль самих повторяющихся единиц пока неясна. У Drosophila, дрожжей и других организмов в предшествующем генам тРНК участке длиной 100 п. н. часто обнаруживается последовательность 5'-АСТ(А или Т)„ТА (п = 0 — 5). В геноме дрожжей примерно 30 раз встречается специфическая последовательность длиной 340 п. н., называемая сигма-

Таблица 9.3. Число копий и распределение генов тРНК

Вид

Образуют кластеры (с) или диспергированы (d)

Примерное общее число копий (на гаплоидный геном)

S. cerevisiae

d

360

Tetrahytnena pyroformis

800

D. melanogaster

c,d

800 (~ 12 каждой тРНК) u

X. laevis

c,d

7000 (~200 каждой тРНК)

Rattus norvegicus

c,d

6500 (~ 100 каждой тРНК)

H. sapiens

c,d

1300 (10-20 каждой тРНК)

11 Известно, что некоторые из этих генов являются псевдогенами

РИС. 9.9.

Примерная организация кластера тРНК-генов в хромосомной области 42А Drosophila. Стрелки указывают направление транскрипции. [Р. Н. Yen, N. Davidson, Cell 22 (1980), р. 137.]

последовательностью. Она всегда располагается на расстоянии не более 18 п. н. от начала тРНК-гена и может находиться в любой из двух возможных ориентаций относительно направления транскрипции. Однако большинство генов тРНК у дрожжей не сцеплены с сигма-последовательностью, а аллели гена тирозиновой тРНК, соседствующие с этой последовательностью, по своим фенотипическим проявлениям не отличаются от аллелей, не связанных с ней. Сигма-последовательность представляет собой копию длинного концевого повтора (LTR), обнаруженного на концах дрожжевого ретротранспозона ТуЗ (разд. 10.3). Такие «соло»-ЬТК являются остатками ретротранспозонов, а локализация сигма-последовательности именно перед генами тРНК свидетельствует о сайт-специфичности вставок ТуЗ.

Гены малых ядерныхи цитоплазматических РНК

Все эукариотические клетки содержат множество коротких стабильных молекул РНК, большинство которых в составе нуклеопротеидных частиц (нуклеосом) присутствуют в ядре или в цитоплазме. Некоторые из малых ядерных РНК (мяРНК) играют ключевую роль в процессинге первичных транскриптов с образованием зрелых мРНК и рРНК (разд. 8.5). Функции малых цитоплазматических РНК (мцРНК), за исключением 7SL-PHK сигнал- распознающих частиц, неизвестны (разд. 3.10.6).

Название 11ОрганизмДлина РНК в нуклеотидахКодирующие геныпримерное число копни функциональш геновдиспергированы (d)>ix или собраны в кластеры (с)полимеразаU1Все многоклеточные16430 (человек)5 (курица)10 (мышь)500 (Xenopus')1-2 (Phaseolus vulgaris)3-4 (Drosophila)с сс (голова-к-голове) с (тандем)dIIU2То же188-18920-40 (человек) 10 (мышь) 500 (Xenopus)(морской еж)5 (Drosophila)с (тандем)с (тандем) с (тандем) c,dиизВсе многоклеточные (ядрышки)2166 (мышь)c,dIIU4Все многоклеточные142-1464 (Drosophila)2 (курица)d сIIU5То же116-118XenopusТандемIIU6»107-108200 (мышь)3 (Drosophila)dсIIIIIIU7Морской еж585сII4,58,Грызуны98-99104 (крыса)dIIIНазвание 11ОрганизмДлина РНК в нуклеотидахКодирующие геныпримерное число копни функциональш геновдиспергированы (d)>ix или собраны в кластеры (с)полимеразаU1Все многоклеточные16430 (человек)5 (курица)10 (мышь)500 (Xenopus')1-2 (Phaseolus vulgaris)3-4 (Drosophila)с сс (голова-к-голове) с (тандем)dIIU2То же188-18920-40 (человек) 10 (мышь) 500 (Xenopus)(морской еж)5 (Drosophila)с (тандем)с (тандем) с (тандем) c,dиизВсе многоклеточные (ядрышки)2166 (мышь)c,dIIU4Все многоклеточные142-1464 (Drosophila)2 (курица)d сIIU5То же116-118XenopusТандемIIU6»107-108200 (мышь)3 (Drosophila)dсIIIIIIU7Морской еж585сII4,58,Грызуны98-99104 (крыса)dIIIТаблица 9.4. Гены некоторых мяРНК у многоклеточныхТаблица 9.4. Гены некоторых мяРНК у многоклеточных11 У Xenopus имеется не менее двух классов генов VI: около 500 генов класса I повторены тандемно и экспрессируются на ранних этапах эмбриогенеза, а малочисленные гены класса II диспергированы и экспрессируются в ооцитах. У дрожжей последовательности, гомологичные U4 и U6, содержатся в одном гене.11 У Xenopus имеется не менее двух классов генов VI: около 500 генов класса I повторены тандемно и экспрессируются на ранних этапах эмбриогенеза, а малочисленные гены класса II диспергированы и экспрессируются в ооцитах. У дрожжей последовательности, гомологичные U4 и U6, содержатся в одном гене.Множественные гены и псевдогены мяРНК. В геноме многоклеточных организмов присутствует множество сегментов ДНК, которые гибридизуются с U1-, U2-, U3-, U4-, U5-, U6- и П7-мяРНК или с соответствующими кДНК (табл. 9.4). Одни такие сегменты диспергированы, а другие сгруппированы (обычно в тандемные повторы). Как и в случае генов 5S-pPHK, соответствующий кодирующий участок может входить в состав длинного сегмента ДНК, который образует повторяющуюся единицу. Как правило (хотя и не всегда), функциональные гены организованы в кластеры, а псевдогены диспергированы. Кодирующие последовательности функциональных генов комплементарны последовательностям соответствующих мяРНК. Функциональные гены данной мяРНК обычно имеют сходные последовательности, фланкирующие кодирующий участок и содержащие регуляторы транскрипции (разд. 8.3). У псевдогенов, которые образовались из мяРНК в результате крупных делеций, вставок или точковых мутаций, фланкирующие последовательности в значительной степени различаются. Характер расположения и число генов и псевдогенов варьируют от одной мяРНК к другой и от вида к виду. Гены не столь многочисленных мяРНК, например U11-мяРНК, пока не исследованы. За

Название 11

Организм

Длина РНК в нуклеотидах

Кодирующие гены

примерное число копни функциональш генов

диспергированы (d)

>ix или собраны в кластеры (с)

полимераза

U1

Все многоклеточные

164

30 (человек)

5 (курица)

10 (мышь)

500 (Xenopus')

1-2 (Phaseolus vulgaris)

3-4 (Drosophila)

с с

с (голова-к-голове) с (тандем)

d

II

U2

То же

188-189

20-40 (человек) 10 (мышь) 500 (Xenopus)

(морской еж)

5 (Drosophila)

с (тандем)

с (тандем) с (тандем) c,d

и

из

Все многоклеточные (ядрышки)

216

6 (мышь)

c,d

II

U4

Все многоклеточные

142-146

4 (Drosophila)

2 (курица)

d с

II

U5

То же

116-118

Xenopus

Тандем

II

U6

»

107-108

200 (мышь)

3 (Drosophila)

d

с

III

III

U7

Морской еж

58

5

с

II

4,58,

Грызуны

98-99

104 (крыса)

d

III

Название 11

Организм

Длина РНК в нуклеотидах

Кодирующие гены

примерное число копни функциональш генов

диспергированы (d)

>ix или собраны в кластеры (с)

полимераза

U1

Все многоклеточные

164

30 (человек)

5 (курица)

10 (мышь)

500 (Xenopus')

1-2 (Phaseolus vulgaris)

3-4 (Drosophila)

с с

с (голова-к-голове) с (тандем)

d

II

U2

То же

188-189

20-40 (человек) 10 (мышь) 500 (Xenopus)

(морской еж)

5 (Drosophila)

с (тандем)

с (тандем) с (тандем) c,d

и

из

Все многоклеточные (ядрышки)

216

6 (мышь)

c,d

II

U4

Все многоклеточные

142-146

4 (Drosophila)

2 (курица)

d с

II

U5

То же

116-118

Xenopus

Тандем

II

U6

»

107-108

200 (мышь)

3 (Drosophila)

d

с

III

III

U7

Морской еж

58

5

с

II

4,58,

Грызуны

98-99

104 (крыса)

d

III

Таблица 9.4. Гены некоторых мяРНК у многоклеточных

Таблица 9.4. Гены некоторых мяРНК у многоклеточных

11 У Xenopus имеется не менее двух классов генов VI: около 500 генов класса I повторены тандемно и экспрессируются на ранних этапах эмбриогенеза, а малочисленные гены класса II диспергированы и экспрессируются в ооцитах. У дрожжей последовательности, гомологичные U4 и U6, содержатся в одном гене.

11 У Xenopus имеется не менее двух классов генов VI: около 500 генов класса I повторены тандемно и экспрессируются на ранних этапах эмбриогенеза, а малочисленные гены класса II диспергированы и экспрессируются в ооцитах. У дрожжей последовательности, гомологичные U4 и U6, содержатся в одном гене.

метим, что у дрожжей имеется только по одной копии гена каждой из таких мяРНК и ни одного псевдогена. Как у дрожжей, так и у многоклеточных эукариот мяРНК участвуют в процессинге первичных транскриптов и в образовании функциональных РНК (разд. 8.5).

В качестве примера, иллюстрирующего сложную организацию семейств рассматриваемых последовательностей, можно привести U1-семейство ДНК человека. Оно содержит примерно 30 копий мяРНК- генов, организованных в тандемные повторы, и находится на коротком плече хромосомы 1. Каждый функциональный ген в повторе входит в состав повторяющейся единицы длиной не менее 44 т. п. н. Псевдогены располагаются в различных локусах генома и встречаются в 10 раз чаше, чем соответствующие гены.

Гены мцРНК. В переносе новосинтезированных секретируемых и связанных с мембранами полипептидов через липидный бислой эндоплазматического ретикулума участвуют сигналраспознающие частицы, основным компонентом которых является 7SL-PHK. Нуклеотидные последовательности 7SL-PHK у грызунов и приматов практически одинаковы, а у дрозофилы эта РНК на 64% гомологична соответствующей РНК человека. В геноме чело-

Таблица 9.5. Гены некоторых мцРНК

РНК

ОрганизмПример- Число копий

РНК-по- лнмераза

ная длина РНК в нуклеотидах

функциональных генов (на гаплоидный геном)

7SL

Позвоночные, 300 беспозвоночные254

3-4 (человек)

2 (Drosophila)

1 (S. pombe)

III

7SK

Позвоночные 330

< 10 (человек)

III

4,58

Грызуны90-94

850 (мышь)

690 (крыса)

III

века обнаружено три гена 7SL-PHK и несколько сотен псевдогенов (табл. 9.5), а кроме того, примерно 10б рассеянных по геному последовательностей, почти наполовину гомологичных последовательности 7SL-PHK. Половина этих последовательностей представляет собой комбинацию 5'- и З'-концов с делегированной центральной частью и называется Alu-последовательиостью (разд. 9.5.в). Сходная картина наблюдается у грызунов.

Функции других мцРНК не установлены; известно, что большинство этих РНК ассоциированы с крупными семействами последовательностей, содержащими как гены, так и псевдогены.

ГЕНЫ, КОДИРУЮЩИЕ БЕЛКИ

Некоторые общие замечания

Гены, кодирующие белки, как правило, содержат кодирующие области (экзоны), прерываемые одним или более интронами. Однако некоторые гены (например, гистоновые или кодирующие интерфероны) не имеют вставочных последовательностей. Число таких последовательностей сильно варьирует от гена к гену, а количество ДНК, приходящееся на долю интронов, во много раз превышает количество ДНК кодирующих областей (табл. III.2)-у некоторых организмов в десятки раз. Как правило, нуклеотидные последовательности аналогичных экзонов, относящихся к паралогичным генам в данном геноме или к ортологичным генам в геноме разных видов, более консервативны, чем нуклеотидные последовательности соответствующих интронов. Положение интронов, как правило, фиксировано, а по длине и составу они варьируют.

Все известные гены, кодирующие белки, транскрибируются РНК-полимеразой II и поэтому часто имеют сходные промоторы и сигналы полиаденилирования. Но многие такие гены связаны с более специфичными регуляторными последовательностями, которые опосредуют действие гормональ

ных, средовых или онтогенетических факторов (разд. 8.3).

В отличие от генов, кодирующих РНК, поли- пептидные гены представлены в геноме в единственном числе, однако при этом геном часто содержит сегменты, гомологичные данному специфическому гену. Таким образом, однокопийный ген может входить в состав семейства близкородственных последовательностей (например, в семейство генов гормона роста). Члены такого семейства могут кодировать незначительно различающиеся белки (например, изозимы). Однако они могут иметь разные регуляторные сигналы, ответственные за экспрессию генов в разных тканях или на разных стадиях развития (как в случае генов гормона роста или плацентарного лактогена). (Напомним, что согласно определению гена, принятому в данной книге, ген включает регуляторные элементы, не входящие в единицу транскрипции.) Равным образом членами семейства могут быть и псевдогены. Условились, что два неаллельных гена считаются идентичными, если они кодируют фактически одинаковые белки и находятся под общим контролем. Близкородственные гены считаются членами одного мультигенного семейства, даже если они неидентичны (табл. 9.6).

Однокопийные гены могут также принадлежать большому семейству отдаленно родственных последовательностей. Несмотря на структурное сходство, гены такого надсемейства кодируют совершенно разные белки (как, например, уже упомянутые гены пролактина и гормона роста). Распределение отдельных генов по надсемействам не всегда удается провести вполне четко. Часто сходство нуклеотидных последовательностей членов варьи-

Таблица 9.6. Некоторые семейства родственных генов и белков

В высшей степени гомологичные по структуре и функциям р-Глобины а-Глобины

Актины

Тубулины

Зеины

Гормон роста / Плацентарный лактоген

Рецепторы стероидных гормонов

О псины

Родственные, но различающиеся по структуре и функциям а-Глобины /Р-Глобины

Пролактин/Гормон роста

Сывороточный альбумин / а-Фетопротеин а-Интерфероны / Р-Интерфероны

РНК-полимеразы

Отдаленно родственные

Гаптоглобин 'Сывороточные протеазы (химотрипсин) Антитромбин III/Овальбумин/Ангиотензиноген Церулоплазмин/Фактор V/Фактор VIII

рует от 95% и более до 50% и менее. В жестких условиях отжига дуплексы образуют только сегменты ДНК с гомологией не менее 80%, поэтому неблизкородственные семейства можно сравнивать, лишь зная их нуклеотидную последовательность. Более того, сходство между двумя белками не находится в простой зависимости от процентного сходства между соответствующими генами. Вследствие вырожденности генетического кода значительные изменения в третьей позиции кодонов мало влияют на тип кодируемой аминокислоты, а такие же изменения в первой или во второй позициях приводят к существенным изменениям в структуре белка.

Помимо генов, принадлежащих мультигенным

семействам или надсемействам, имеются и уникальные гены (например, ген тиреоглобулина человека и ген актина дрожжей).

Примеры мультигенных семейств

Каждому мультигенному семейству генов, кодирующих белки, присущи особые свойства, характерные для данного вида (табл. 9.7). Мы рассмотрим здесь некоторые примеры, иллюстрирующие те механизмы, благодаря которым возникают различия в физиологических свойствах клеток и в тонко отлаженных клеточных процессах.

Таблица 9.7. Мультигенные семейства некоторых белков1'Семейство геновОрганизмПримерный размер семейства (число генов)Сцеплены (1) или диспергированы (d)ХарактеристикаКислая фосфатазаДрожжи> 41, dРегуляция генов осуществляется по- разному; например, один ген репрессируется Pi, второй им индуцируется. третий - конститутивныйа-АмилазаМышь>31В поджелудочной железе экспрессируется множество генов, в печени и слюнных железах-по одному. У мышей разных линий число генов панкреатической а-амилазы варьируетКрыса>99Панкреатическую а-амилазу кодируют четыре генаЯчмень> 7?Не менее трех функциональных геновКоллагеныЧеловек4dЧетыре гена, диспергированные по хромосомам 2. 7, 12 и 17, кодируют коллагены типа I (гетеродимер), типов II и III (гомодимеры)Тяжелая цепь миозинаКрыса> 10Не менее одного гена для каждого типа мышц и не менее одного немышечного генаОвальбуминКурица31Все три гена регулируются эстрогеном. функции двух генов неясныСывороточный альбуминМышь21Гены сывороточного альбумина и а-фетопротеинаВителлогенинЖаба4?Пары генов различаются на 20%; в пределах пар гены дивергировали на 5%. Все четыре гена экспрессируютсяРибулозо-1,5-бисфосфат - карбоксилазаТомат51, dЭкспрессируются в различных тканях на разных стадиях развития и в зависимости от освещенияЗеинКукуруза100d, 1Кодируют семейство запасных белков зернаТаблица 9.7. Мультигенные семейства некоторых белков1'Семейство геновОрганизмПримерный размер семейства (число генов)Сцеплены (1) или диспергированы (d)ХарактеристикаКислая фосфатазаДрожжи> 41, dРегуляция генов осуществляется по- разному; например, один ген репрессируется Pi, второй им индуцируется. третий - конститутивныйа-АмилазаМышь>31В поджелудочной железе экспрессируется множество генов, в печени и слюнных железах-по одному. У мышей разных линий число генов панкреатической а-амилазы варьируетКрыса>99Панкреатическую а-амилазу кодируют четыре генаЯчмень> 7?Не менее трех функциональных геновКоллагеныЧеловек4dЧетыре гена, диспергированные по хромосомам 2. 7, 12 и 17, кодируют коллагены типа I (гетеродимер), типов II и III (гомодимеры)Тяжелая цепь миозинаКрыса> 10Не менее одного гена для каждого типа мышц и не менее одного немышечного генаОвальбуминКурица31Все три гена регулируются эстрогеном. функции двух генов неясныСывороточный альбуминМышь21Гены сывороточного альбумина и а-фетопротеинаВителлогенинЖаба4?Пары генов различаются на 20%; в пределах пар гены дивергировали на 5%. Все четыре гена экспрессируютсяРибулозо-1,5-бисфосфат - карбоксилазаТомат51, dЭкспрессируются в различных тканях на разных стадиях развития и в зависимости от освещенияЗеинКукуруза100d, 1Кодируют семейство запасных белков зернаг Pi неорганический фосфат. В этой и последующих таблицах «сцеплены» означает, что один или несколько генов сгруппированы в одном локусе, а «диспергированы» что члены семейства генов находятся в разных локусах. В некоторых семействах имеются как сцепленные, так и диспергированные копии генов.г Pi неорганический фосфат. В этой и последующих таблицах «сцеплены» означает, что один или несколько генов сгруппированы в одном локусе, а «диспергированы» что члены семейства генов находятся в разных локусах. В некоторых семействах имеются как сцепленные, так и диспергированные копии генов.Актиновые гены: мультигенное консервативное семейство. Актин участвует в самых разных типах

Таблица 9.7. Мультигенные семейства некоторых белков1'

Семейство генов

Организм

Примерный размер семейства (число генов)

Сцеплены (1) или диспергированы (d)

Характеристика

Кислая фосфатаза

Дрожжи

> 4

1, d

Регуляция генов осуществляется по- разному; например, один ген репрессируется Pi, второй им индуцируется. третий - конститутивный

а-Амилаза

Мышь

>3

1

В поджелудочной железе экспрессируется множество генов, в печени и слюнных железах-по одному. У мышей разных линий число генов панкреатической а-амилазы варьирует

Крыса

>9

9

Панкреатическую а-амилазу кодируют четыре гена

Ячмень

> 7

?

Не менее трех функциональных генов

Коллагены

Человек

4

d

Четыре гена, диспергированные по хромосомам 2. 7, 12 и 17, кодируют коллагены типа I (гетеродимер), типов II и III (гомодимеры)

Тяжелая цепь миозина

Крыса

> 10

Не менее одного гена для каждого типа мышц и не менее одного немышечного гена

Овальбумин

Курица

3

1

Все три гена регулируются эстрогеном. функции двух генов неясны

Сывороточный альбумин

Мышь

2

1

Гены сывороточного альбумина и а-фетопротеина

Вителлогенин

Жаба

4

?

Пары генов различаются на 20%; в пределах пар гены дивергировали на 5%. Все четыре гена экспрессируются

Рибулозо-

1,5-бисфосфат - карбоксилаза

Томат

5

1, d

Экспрессируются в различных тканях на разных стадиях развития и в зависимости от освещения

Зеин

Кукуруза

100

d, 1

Кодируют семейство запасных белков зерна

Таблица 9.7. Мультигенные семейства некоторых белков1'

Семейство генов

Организм

Примерный размер семейства (число генов)

Сцеплены (1) или диспергированы (d)

Характеристика

Кислая фосфатаза

Дрожжи

> 4

1, d

Регуляция генов осуществляется по- разному; например, один ген репрессируется Pi, второй им индуцируется. третий - конститутивный

а-Амилаза

Мышь

>3

1

В поджелудочной железе экспрессируется множество генов, в печени и слюнных железах-по одному. У мышей разных линий число генов панкреатической а-амилазы варьирует

Крыса

>9

9

Панкреатическую а-амилазу кодируют четыре гена

Ячмень

> 7

?

Не менее трех функциональных генов

Коллагены

Человек

4

d

Четыре гена, диспергированные по хромосомам 2. 7, 12 и 17, кодируют коллагены типа I (гетеродимер), типов II и III (гомодимеры)

Тяжелая цепь миозина

Крыса

> 10

Не менее одного гена для каждого типа мышц и не менее одного немышечного гена

Овальбумин

Курица

3

1

Все три гена регулируются эстрогеном. функции двух генов неясны

Сывороточный альбумин

Мышь

2

1

Гены сывороточного альбумина и а-фетопротеина

Вителлогенин

Жаба

4

?

Пары генов различаются на 20%; в пределах пар гены дивергировали на 5%. Все четыре гена экспрессируются

Рибулозо-

1,5-бисфосфат - карбоксилаза

Томат

5

1, d

Экспрессируются в различных тканях на разных стадиях развития и в зависимости от освещения

Зеин

Кукуруза

100

d, 1

Кодируют семейство запасных белков зерна

г Pi неорганический фосфат. В этой и последующих таблицах «сцеплены» означает, что один или несколько генов сгруппированы в одном локусе, а «диспергированы» что члены семейства генов находятся в разных локусах. В некоторых семействах имеются как сцепленные, так и диспергированные копии генов.

г Pi неорганический фосфат. В этой и последующих таблицах «сцеплены» означает, что один или несколько генов сгруппированы в одном локусе, а «диспергированы» что члены семейства генов находятся в разных локусах. В некоторых семействах имеются как сцепленные, так и диспергированные копии генов.

клеточного движения, в частности он обеспечивает клеточную подвижность и мышечные сокращения. Соответственно у эукариот имеются несколько разных типов актина и кодирующих их генов. Одни из этих генов организованы в кластеры, другие диспергированы (табл. 9.8). Единственный известный организм, имеющий один актиновый ген,-дрожжи.

Цитоплазматические актины, обеспечивающие клеточную подвижность, сходны по структуре у всех эукариот; к этому же классу относятся и все актины беспозвоночных и растений. У Drosophila и большинства других беспозвоночных основная функция цитоплазматических актинов состоит в обеспечении мышечных сокращений; у позвоночных эту функцию выполняет особая группа а-актинов. У птиц и млекопитающих обнаружено шесть актиновых белков. Два а-актина скелетных и сердечной мышц участвуют в мышечном сокращении. Актины а и у присутствуют в гладких мышцах. В цитоплазме практически всех клеток млекопитающих и птиц содержатся Р- и у-актины.

Несмотря на структурные различия, все актины сходны по своей аминокислотной последовательности, за исключением Ь1Н2-концевых участков.

Таблица 9.8. Семейства актиновых генов

Организм

Число из- Число ге- Сцеплены Тип актн-

вестных белков

НОВ, вклю- (1) или чая леев- дисперги- догены” рованы (d)

на: мышечный (m) или цитоплазматический (с)

S. cerevisiae

1

1

С

Dictyostelium

> 2

171, d

С

С. elegans

41, d

с

Oxytricha

> 2

3

с

Соя

>2

с

Drosophila

3

6d

с

S. purpuratus

81, d

т, с

Курица

6

8-10d

т, с

Крыса

6

>8d

т, с

Человек

6

20-30d

т, с

11 Число функциональных генов для актинов разного типа можно оценить с помощью ДНК-зондов из З'-некодирующей области (см. текст). Сцепление устанавливают по наличию одного или нескольких генов в клонированном геномном сегменте. Нуклеотидные последовательности различных генов Dictyostelium различаются на 10%, не менее восьми из них экспрессируются; некоторые из этих генов могут кодировать одинаковые белки. Все четыре актиновых гена у нематоды С. elegans функциональные, три из них участвуют в мышечном сокращении. У Drosophila экспрессируются все шесть генов; один белок, несмотря на свое сходство с цитоплазматическим актином млекопитаюших, специфичен для мышечной ткани. У морского ежа 5. purpuratus не менее шести генов представляют собой различающиеся функциональные гены. Гибридизация соответствующих зондов с ДНК из гибридных соматических клеток человек мышь показывает, что три из генов это уникальные функциональные гены для а-актина, у-актина и а-актинов из сердечной и скелетных мышц, локализованные в хромосомах 7, 17, 15 и 1 соответственно.

Так, Р- и у-актины человека различаются всего по четырем аминокислотным остаткам. У большинства организмов гены, кодирующие различные актины, образуют мультигенные семейства, а кодирующие области этих генов гомологичны у разных видов. Например, аминокислотная последовательность а-актина скелетных мышц одинакова у курицы и млекопитающих, а актиновая мРНК, выделенная из вегетативных клеток Dictyostelium, служит также хорошим зондом при отборе клонированных актиновых генов дрожжей, кукурузы, сои и млекопитающих.

5'- и З'-фланкирующие последовательности актиновых генов дивергировали сильнее, чем кодирующие области. Однако гены одинаковых актинов, например гены Р-актинов млекопитающих, имеют у разных видов сходные фланкирующие последовательности, заметно отличающиеся от последовательностей, фланкирующих у этих же видов а-акти- новые гены. Фланкирующие последовательности некоторых актиновых генов часто оказываются настолько специфичными, что могут использоваться в качестве гибридизационных зондов для идентификации соответствующих генов и их транскриптов. Например, клонированные З'-концевые последовательности каждого из шести различающихся функциональных генов морского ежа можно использовать для исследования дифференциальной транскрипции соответствующих генов в процессе развития и дифференцировки. Таким образом, несмотря на близкое родство всех кодирующих областей актиновых генов и самих актинов, ген каждого из типов актина, по-видимому, связан со специфическими некодирующими последовательностями, вероятно выполняющими регуляторные функции. Таким образом, выявляются два важных в эволюционном отношении момента. Первый касается функциональных свойств генного продукта, второй-регуляции генной экспрессии в дифференцированных клетках.

Еще одна особенность мультигенного семейства актиновых генов состоит в вариабельности числа и положения интронов (рис. 9.10), обнаруживающейся при сравнении как паралогичных генов (например, генов р- и а-актинов скелетных мышц крысы), так и ортологичных актиновых генов растений и беспозвоночных. Это существенно отличается от обычной ситуации, характерной для большинства ортологичных генов и мультигенных семейств, где интроны располагаются одинаково. Представляется маловероятным, что в ходе эволюции актиновых генов в них встраивались новые интроны. Каждое такое событие приводило бы к смещению соседних последовательностей и к сдвигу рамки считывания. Можно предположить обратное: большинство актиновых генов содержали инт-

Число кодонов

100

200300

Дрожжи X—

Соевые бобы (2) —1

Кукуруза —3

Oxytrlcha

Dictyostelium (все) Drosophila (1) —X. Drosophila (2) Морской еж (2)

Мышцы морского еже (1) а-Актин курицы а-Актин скелетных мышц крысы

Человек, jl-актин крысы

Человек,а-актин сердечной мышцы

Человек, гладкие мышцы

РИС. 9.10.

Число и локализация интронов в кодирующих областях некоторых актиновых генов. Шкапа в верхней части рисунка проградуирована в числе кодонов. В круглых скобках указано число разных генов, имеющих такую

роны во всех тех положениях, где они находятся и в современных генах, но при эволюции разных таксонов утрачивались различные интроны. Согласно этой гипотезе, Dictyostelium и Oxytricha активно избавлялись от интронов, поскольку ни одного из них не осталось в кодирующих областях.

Актиновые гены в основном рассеяны по хромосомам. У мыши, например, гены а-актина скелетных мышц и сердечной мышцы локализованы в хромосомах 3 и 17 соответственно, а гены цитоплазматического Р-актина в хромосоме 5.

У большинства изученных организмов число актиновых генов, по-видимому, превышает число известных актиновых белков. Хотя не исключено, что какие-то из этих «экстра»-последовательностей кодируют не обнаруженные пока формы актина, большинство из них. вероятно, являются псевдогенами, в том числе процессированными. У человека по меньшей мере две из двадцати актиноподобных последовательностей представляют собой процессированные псевдогены Р-актина; они не содержат интронов и несут в кодирующих областях различные мутации. Все шесть актиновых генов Drosophila и шесть генов морского ежа функциональны и экспрессируются в соответствии со специфической программой развития данных организмов. Так, у Drosophila два гена цитоплазматических актинов экспрессируются на всех стадиях развития, два гена в основном в мышцах груди и конечностей. Как

организацию. В нетранслируемой 5'-лидерной последовательности (не представлена) у некоторых актиновых генов имеется дополнительный интрон.

правило, дифференциальная экспрессия генов находится под контролем регуляторных последовательностей, находящихся во фланкирующих участках некоторых актиновых генов.

Тубулиновые гены: мультигенное семейство, которое включает гены двух разных субъединиц гетеродимерного белка. Микротрубочки участвуют во многих процессах, протекающих во всех эукариотических клетках: мейозе, митозе, клеточном движении и секреции. Поэтому не удивительно, что структура тубулина - белка, из которого состоят микротрубочки, равно как и нуклеотидная последовательность гена, кодирующего тубулин, одинаковы у всех эукариот. кДНК, синтезированные на тубулиновой мРНК курицы, гибридизуются с тубулиновыми генами таких отдаленных организмов, как дрожжи и млекопитающие.

Тубулин это гетеродимер, состоящий из двух полипептидов: и и р. а- и Р-субъединицы содержат 450-451 и 445 аминокислотных остатка соответственно и гомологичны примерно на 40%. Гены обеих субъединиц относятся к одному мультигенному суперсемейству, хотя довольно сильно различаются и не гибридизуются.

Как правило, семейства тубулиновых генов у каждого вида эукариот кодируют разные изотипы а- и Р-субъединиц (табл. 9.9) Аминокислотные последовательности различных а- или Р-субъединиц, кодируемых этими генами, обычно различают-

Таблица 9.9. Семейства тубулиновых генов

Организм

Число известных функциональных генов

Примерное число псевдогенов для групп а ИЛИ р

Сцеплены (1) или диспергированы (d)

S. cerevisiae

2а, 1р

0

d

Chlamidomonas

2а, 2Р

0

d

Trypanosoma

Около 15а, 15Р

0

1 (тандем)

Drosophila

4а, 4р

0

d

Морской еж

2а, ЗР

10

1, d

Курица

2а, 7Р

< 5

d

Млекопитающие Около 5а, 5Р 15

Arabidopsis1 а (возможно, 4)

thaliana

d

ся лишь незначительно (менее чем на 10%), и различия касаются в основном карбоксильных концов молекул. По-видимому, вариации в структуре тубулинов связаны с тем, что немного различаются те микротрубочки, которые они образуют. Последние в свою очередь специфичны в отношении клеточных процессов, типов клеток и стадий развития. Таким образом, разные а- и р-изотипы могут соответствовать разным типам микротрубочек, выполняющих определенные функции, хотя такая специализация и не абсолютна. Дальнейшие изменения в структуре тубулина происходят уже после транскрипции и тоже способствуют функциональной специализации микротрубочек. О такой специализации свидетельствует высокая консервативность специфических изотипов у позвоночных. Например, у различных позвоночных преобладающий в нервной ткани Р-тубулин имеет на карбоксильном конце совершенно одинаковые последовательности.

В отличие от кодирующих последовательностей, 5'- и З'-фланкирующие участки тубулиновых генов а- и Р-мультигенных семейств значительно различаются. По-видимому, это связано с независимой регуляцией экспрессии. Например, один из генов а-ту- булина мышей экспрессируется только в семенниках. У Drosophila концентрапия мРНК, транскрибируемых с различных тубулиновых генов, неодинакова в разных тканях и на разных стадиях развития. Один из а-тубулиновых генов экспрессируется только у взрослых самцов дрозофилы, другой только в яичниках, а два экспрессируются постоянно. У дрожжей два гена а-тубулина, по-видимому, кодируют одинаковые в функциональном отношении полипептиды, хотя один из генов экспрессируется эффективнее другого. Единственный ген Р-ту- булина дрожжей существен для их роста. Оказалось, что дрожжевые клетки, у которых блокировано деление, несут мутацию в гене Р-тубулина (мутация cdc\

У большинства видов тубулиновые гены рассея

ны по геному. Например, у Drosophila все они хотя и локализованы в хромосоме 3, но расположены далеко друг от друга. Исключением из этого правила являются некоторые простейшие. У Tetrahy- тепа brucei примерно десять копий генов объединены в один тандемный повтор, в котором гены а- и Р-тубулинов чередуются между собой; у Leishma- nia enrietti гены а- и Р-тубулинов с таким же числом копий сгруппированы в два кластера.

Некоторые последовательности, гомологичные тубулиновым генам, представляют собой псевдогены; большинство из них процессировано. В качестве типичного примера можно привести процессированный псевдоген а-тубулина крысы (разд. 9.1.а; рис. 9.11). Установлена нуклеотидная последовательность функционального гена, в том числе его 5'- и З'-фланкирующих участков. Как любой типичный тубулиновый ген позвоночных, этот ген содержит три интрона (первый расположен непосредственно за инициирующим кодоном ATG), а инициирующий кодон и ТАТА-блок разделены участком длиной примерно 120 н.п. Нуклеотидная последовательность тубулиновой мРНК была установлена по клонированной кДНК; она начинается на расстоянии примерно 20 п. н. левее ТАТА-блока и занимает следующие 100 п. н. до инициирующего кодона АТС. Таким образом, эта последовательность идентична последовательности соответствующих экзонов после сплайсинга интронов. кДНК заканчивается ро1у(А)-участком, который начинается на расстоянии 16 п. н. за сигналом полиаденилирования. Процессированный ген, в отличие от функционального гена, более сходен с кДНК. На протяжении 99 п. н. с 5'-стороны от инициирующего кодона АТС (т. е. в 5'-лидерной последовательности) процессированный ген идентичен как функциональному гену, так и кДНК, а далее его гомология функциональному гену становится менее полной. З'-конец процессированного гена идентичен кДНК функционального гена, синтезированного от poly(A), и таким образом отличается от З'-фланкирующего участка функционального гена. Более того, в процессированном гене отсутствуют все интроны. Процессированный ген мог бы являться полной копией кДНК, если бы не некоторые модификации в кодирующей области, исключающие образование интактного а-тубулина. Эти модификации приводят к сдвигу рамок считывания и состоят во вставке двух остатков цитозина в экзон 2, делеции пяти нуклеотидных пар в экзоне 3 и вставке неродственного сегмента из ПО п.н. (на рис. 9.11 обозначенного Alu) в экзон 4 (Alu-последовательности рассматриваются в разд. 9.5.в). Процессированный ген а-тубулина фланкирован короткими прямыми повторами-это еще одна характерная черта всех процессированных псевдогенов. Такие прямые пов-

Ген

кДНК

5-фланкирующ.ий участок

ТАТАТАА-

Интрон 1 Интрон 2 Интрон 3

ТАА(Шп.н.)ААТААА

I

ТА А 73n.nA А АТ ААА

№

IV

сс

5 п.н.Делеция

AAAAAGAGATTTTTФланкирующий прямойповторAAAAAGAGATTTTTФланкирующий прямойповтор-А1ц --А1ц -

AAAAAGAGATTTTT

Фланкирующий прямойповтор

AAAAAGAGATTTTT

Фланкирующий прямойповтор

-А1ц -

-А1ц -

AAAAAGAGATTTTTФланкирующий прямойповтор

РИС. 9.11.

Структурные связи между геном а-тубулина, его мРНК (кДНК) и процессированным псевдогеном у крысы. Псевдоген имеет два дополнительных остатка цитозина.

делецию длиной 5 п. н. и вставку Alu-последовательности (разд. 9.5.в). [I. Lemishka. Р. A. Sharp. Nature 300 (1982), р. 330.)

торы-это сегменты ДНК, которые были встроены в новые локусы генома путем транспозиции. Они представляют собой реитерации (многократные повторения) последовательностей, ранее существовавших в месте вставки, и называются сайтами - мишенями дупликаций (разд. 10.1.6).

Суперсемейство глобиновых генов. Гемоглобины позвоночных - это гетеротетрамеры, содержащие по два а- и Р-полипептида. В геноме всех позвоночных содержится множество генов и псевдогенов а- и P-цепей- членов суперсемейства, которое включает кодирующие последовательности генов глобинов беспозвоночных, миоглобина позвоночных и леггемоглобина растений (рис. 9.12). Все эти белки содержат гем и обратимо связываются с кислородом.

Глобиновые мРНК и соответствующие гены были среди первых объектов, которые исследовались методами рекомбинантных ДНК. На долю гемоглобина приходится более 90% всех растворимых белков эритроцитов, а на долю глобиновой мРНК- большая часть мРНК ретикулоцитов и ядерных эритроцитов. Ни в каких других клетках глобиновые гены в заметном количестве не транскрибируются. Возможность получения относительно чистой глобиновой мРНК, наличие огромного числа уже из- веетных мутаций в генах глобина человека, а также обширные данные о свойствах глобиновых белков послужили стимулом к молекулярным исследованиям этих генов. Удалось получить первые данные об интронах в клеточных генах и о свойствах промоторов для РНК-полимеразы II. Была установлена нуклеотидная последовательность различных аллелей глобиновых генов у человека и других видов.

что послужило основой для создания многочисленных теорий эволюции глобинов.

Как правило, у млекопитающих имеется множество глобиновых генов и псевдогенов. У человека Р-глобиновые гены объединены в кластер длиной 65 т. п. н., расположенный в хромосоме 11, а а-гло- биновые гены в кластер длиной 25 т. п. н. в хромосоме 16 (рис. 9.12). Кластер Р-глобиновых генов содержит пять генов (е, °у, Ау, 8 и Р), а а-глобиновый кластер-три (£, at и а2). Оба кластера включают также по нескольку псевдогенов.

У человека и других млекопитающих различные глобиновые гены экспрессируются на разных стадиях развития организма (рис. 9.13). На очень ранних стадиях эмбриогенеза экспрессируются гены £ и е с образованием гемоглобина £2/е2. К десяти неделям беременности происходит активация а- и у-генов и синтезируется а2/у2-глобин, который циркулирует в крови плода до его рождения. Вскоре после рождения P-подобная у-цепь замещается Р-глобиновым полипептидом и образуется а2/Р2- глобин, который преобладает в течение всей дальнейшей жизни человека. У взрослых образуется также 8-глобин, однако он составляет лишь малую часть Р-глобиноподобных цепей. Два идентичных полипептида (а, и а2) кодируются двумя а-гло- биновыми генами. Гены с^ и а2 экспрессируются в одно и то же время, но а2-ген транскрибируется более эффективно и дает основную массу а-поли- пептидов. У многих видов, в том числе и у человека, расположение генов в а- и P-кластерах соответствует тому порядку, в котором они экспрессируются во время развития организма (на рис. 9.12 транскрипция осуществляется слева направо).

fi- ГЛОБИНЧеловекКоричневый лемурМышь (Hbbd)fi- ГЛОБИНЧеловекКоричневый лемурМышь (Hbbd)a Cl V СЗa Cl V СЗЛеггемоглобинЛеггемоглобинСояСояРИС. 9.12.Организация 0- и а-глобиноподобных генов некоторых позвоночных и генов леггемоглобина сои. Интроны на рисунке не указаны. Шкала в верхней части рисункаРИС. 9.12.Организация 0- и а-глобиноподобных генов некоторых позвоночных и генов леггемоглобина сои. Интроны на рисунке не указаны. Шкала в верхней части рисунка

fi- ГЛОБИНЧеловек

Коричневый лемур

Мышь (Hbbd)

fi- ГЛОБИНЧеловек

Коричневый лемур

Мышь (Hbbd)

a Cl V СЗ

a Cl V СЗ

Леггемоглобин

Леггемоглобин

Соя

Соя

РИС. 9.12.

Организация 0- и а-глобиноподобных генов некоторых позвоночных и генов леггемоглобина сои. Интроны на рисунке не указаны. Шкала в верхней части рисунка

РИС. 9.12.

Организация 0- и а-глобиноподобных генов некоторых позвоночных и генов леггемоглобина сои. Интроны на рисунке не указаны. Шкала в верхней части рисунка

О20406080100

I11111111П11

сН

не«<«н«н

£7 *8 0

।—чнккы

£уг phO РЫ тдД -*Р pldmaj £2dm,n

fс«еч€ннс—<е-8

О РН Л £

W№ [^^8

проградуирована в т. п. н. Транскрипция во всех случаях направлена слева направо. Функция гена а-61 человека неизвестна.

Обширные данные о генах и белках глобинового семейства позволяют детально проследить эволюцию глобиновых генов человека. Скорее всего у отдаленных предков современных животных существовал единственный «глобиновый» ген. Предполагается, что амплификация этого гена произошла более 400 млн. лет назад, хотя у круглоротых рыб имеется один глобиновый ген, а у челюстных рыб синтеризуются и а-, и P-цепи. У амфибий, например у Xenopus laevis, а- и Р-глобиновые гены тесно сцеплены в тандемном повторе. По-видимому, таким же образом они организованы и у рыб (рис. 9.12). Отметим, что у Xenopus имеются два разных кластера сцепленных глобиновых генов; это связано с тетраплоидией генома и самостоятельной эволюцией каждого из двух наборов хромосом. У птиц и млекопитающих а- и р-глобиновые гены не сцеплены. Обусловливается ли такая автономия разделением одного кластера генов, как это произошло у Xenopus, или независимой амплификацией отдельных генов после их транспозиции-неизвестно. Счи

тается, что гемоглобиновые гены птиц и млекопитающих начали эволюционировать независимо

о 010203040246

4 Недели беременности Рождение Возраст в месяцах

РИС. 9.13.

Экспрессия глобиновых генов на разных стадиях развития человека.

около 250-300 млн. лет; именно об этом свидетельствует палеонтологическая летопись.

Первая тандемная дупликация Р-глобинового гена скорее всего произошла 200 млн. лет назад, до появления современных млекопитающих. Затем ди- вергировали регуляторные элементы, так что один из p-генов стал экспрессироваться на ранних стадиях развития, а другой-на поздних. Последующие тандемные дупликации происходили по-разному у разных видов млекопитающих и привели к той сложной организации генов и псевдогенов, которую мы наблюдаем сегодня. У предков современных приматов оба р-глобиновых гена дуплицировались еще раз, хотя и не одновременно. В результате всех этих событий образовался кластер из четырех Р-гло- биноподобных генов, характерный для всех приматов; у человека в- и у-гены экспрессируются на ранних стадиях развития, а б- и p-гены - позже. Гены °у- и Ау-глобинов, характерные для обезьян Старого Света возникли в результате дупликации у-генов, происшедшей примерно 20-40 млн. лет назад. Аналогичные события привели к образованию кластера а-глобиновых генов.

Установлены полные нуклеотидные последовательности кластера Р-глобиновых генов человека, а также генов большинства р-глобиновых кластеров других видов. Это позволило сравнить филогенетическую картину, основанную на данных о числе копий генов и на палеонтологической летописи, с данными, основанными на гипотезе молекулярных часов (рис. 9.14). Согласие оказалось весьма приемлемым но более информативным было бы детальное сравнение. Например, время дивергенции ри б-генов по оценкам составляет примерно 40 млн. лет, что хорошо соответствует предполагаемому времени появления линии-предшественника обезьян Нового и Старого Света: 35-40 млн. лет. Сравнение же Ау- и су-генов показывает, что первые два экзона у них идентичны, а третьи дивергировали на 1,2%. Эта дупликация типична для всех обезьян Старого Света, т. е. последовательности должны были дивергировать по меньшей мере 6-10 млн. лет назад (рис. 9.14). Это сравнение наводит на мысль, что первые два экзона у Ау- и су-генов стали сходными совсем недавно. Указанное выше время их дивергенции, оцененное исходя из данных о нуклеотидной последовательности, на самом деле указывает на время гомогенизации, а не дупликации.

О структурном сходстве миоглобина и гемоглобина известно уже давно (рис. 9.15). Определение аминокислотной последовательности леггемоглоби- на показало, что она на 15% сходна с последовательностями указанных глобинов позвоночных, откуда можно сделать вывод, что все эти белки принадлежат к одному семейству. Сходство их структуры и функций позволяет высказать пред-

Эволюция семейства глобиновых генов. А. Калибровка эволюционных часов. Оценивалась дивергенция двух генов по тем сайтам, где произошли нуклеотидные замены; это приводит к появлению кодонов, детерминирующих новую аминокислоту. По оси ординат отложена средняя дивергенция в процентах, по оси абсцисс- время дивергенции, полученное из палеонтологической летописи. Проводились следующие сравнения: 1) 500 млн. лет назад-а- и Р-глобиновые гены у отдельных видов; 2) 270 млн. пет назад-а- и Р-глобиновые гены курицы с а- и Р-глобиновыми генами млекопитающих; 3) 85 млн. лет назад-а- и Р-глобиновые гены разных млекопитающих. Наклон прямой соответствует UEP около 10. Б. Эволюционное древо Р-глобиноподобных генов человека. Время дивергенции указанных пар глобиновых генов по тем сайтам, где произошли замены, рассчитано как дивергенция (в %), умноженная на UEP (10). Точки ветвлений указывают время начала дивергенции пар генов и эквивалентны или времени дупликации, или времени с момента последней гомогенизации этой пары. [С любезного разрешения A. Efstratiadis: из работы A. Efstratiadis et al.. Cell 21 (1980), p. 653.]

положение о существовании общего предка у генов, кодирующих данные белки. Раньше, когда гены глобинов не были клонированы и секвенированы, можно было думать о конвергентной эволюции этих генов, однако результаты секвенирования однозначно свидетельствуют о том. что они произошли от одного предкового гена Сходство распространяется не только на кодируемые этими генами полипеп-

РИС. 9.15.

Структура глобинов. А. Модели трехмерной структуры леггемоглобина (слева), Р-субъединицы гемоглобина (справа вверху') и миоглобина (справа внизу), построенные с помощью компьютера. (С любезного разрешения Richard Feldman.) Кольцо гема почти перпендикулярно плоскости рисунка. Б, Аминокислотные последовательности миоглобина (сперма кашалота), а- и р-глобинов (человек) и леггемоглобина (соя). Использованы однобуквенные обозначения аминокислот (рис. 1.24). Прочерк (—) означает, что аминокислота в данном сайте отсутствует. Аминокислоты, одинаковые для всех четырех полипептидов, заключены в рамки. Пунктирными рамками показаны неидентичные, но сходные аминокислоты (консервативные замены), например серин/треонин или валин/лейцин/изолейцин. Аминокислоты, одинаковые у а- и р-глобинов, выделены цветом. В конце указано общее число аминокислот в каждой последовательности.

Миоглобин «■Глобин В-Глобии

Леггемоглобин-а

M-lE V —l;S;

vh lit; v a F ;T;

E G EWQ L PAD К T N PEEKSA E К QDA L

V V

V V

LНVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKF

KAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSF Т ALWGKVNVD ЕVGGEALGRLLVVY SSSFEAFKANI PQYSVVFYTSI L ЕКА

Р Т Т К Т Y Р WTQR F PAAKDL

F F F

DRFKHLKTEA Р HF - D LS Н ESFGDLSTPD

S F L A NG V D Р —

Миоглобин а-Глобин (l-Глобин Леггемоглобин-а

Е М К A S Е о[Шк К gs aqIvIkg A VMG N Р KIVIK А т n р k!l:t g

н н н н

G V Т V L — T]A|L G A I L К К К G Н — Н Е А Е L К Р G К К V A- D'AjL TNAVAHVDD-MPNALSA g к к vl -g;a|f sdglAhldn-lkgtfat A E К L F A L[yjR DSAGQLKASGTVVADAA

L L

L L

AQS SDL SEL GSV

H H H H

ATKHK I P I KYLE AHKLRVOPVNFК C D К LH V D P E NF R AQKAVTDPQ—FV

Миоглобин F «-Глобин L Л-Глобин L Леггемоглобин-а v

I tS E a; I l|H V L H S R H PG N F G A D[A:Q G A M N К A L E L F RKDTAA L|SHC|L Г"- '~ "

L'GN VIL V- . - „ _ . . . ,„.,.,

VlK E A'ajLjK T I KAAVGDKWSD EILjS R AWE V A Y D E L A A AiIjK-|k

к

L|V T L A A H L P A E F TPAIVlH A SLDKFLASVSTVlLITs к

ViC V L A H H F G К E F T P P|vIq A AYQ К VV AG VAN а1Ца H К

Y К E L G Y QG-153

V R-141

YH-146

A-144

Б

тиды и длину кодирующих участков, но, что наиболее замечательно, на расположение интронов.

Все глобиновые и миоглобиновые гены позвоночных содержат по два интрона в одних и тех же позициях (рис. 9.16). Первый интрон находится вблизи ЗО-го кодона от МН2-конпа и всегда прерывает какой-либо кодон. Второй располагается между двумя кодонами, недалеко от 100-го кодона. Два из трех интронов гена леггемоглобина растений находятся примерно в тех же самых позициях, что интроны в глобиновых генах позвоночных, а третий-почти посередине кодирующей области.

Результаты анализа распределения интронов в глобиновых генах убедительно показывают, что разные экзоны кодируют уникальные структурнофункциональные полипептидные домены. В глобиновых субъединицах позвоночных обнаруживается несколько компактных областей, находящихся довольно далеко друг от друга. Две из них соответствуют экзонам 1 и 3 (на рис. 9.15 это остатки 1-30 и 105-146 Р-глобиновой цепи), а другая пара (остатки 40-60 и 70-100) не соответствует никаким

двум экзонам. Если бы экзоны действительно отвечали структурным доменам полипептида, то между генами этих компактных областей должны были бы располагаться интроны. Вскоре после того, как эта гипотеза была сформулирована, удалось определить структуру леггемоглобинового гена сои, и в предсказанной позиции действительно был обнаружен дополнительный интрон. Общий предок всех современных глобиновых генов, по всей вероятности, содержал не менее трех интронов. Наличие соответствия между доменами и экзонами вполне понятно, если вспомнить о функции глобинов. Например, участок между аминокислотами 65 и 96 связывает гем, а также содержит остатки, участвующие в формировании ар-глобинового димера. В то же время в экзоне 3 сгруппированы остатки, необходимые для образования тетрамера ct2p2.

Ответить на вопрос о существовании предкового гена до появления царств растений и животных довольно трудно. Гены леггемоглобина имеются лишь у ограниченного числа двудольных растений,

Parasponia andersonii (глобин небобового растения)Parasponia andersonii (глобин небобового растения)\^/161(CTCAAGATAATG АСАGAG GTCо(37 38 3976 77115 116\^/161(CTCAAGATAATG АСАGAG GTCо(37 38 3976 77115 116met thrmet thrglu valglu valleu lys ileleu lys ileЛег гемоглобин соиЛег гемоглобин соиМиоглобин тюленяМиоглобин тюленяНе arg leuНе arg leuglu pheglu pheа-Глобин человекаа-Глобин человекаlys leulys leufl-Глобин человекаfl-Глобин человекаglu arg metglu arg metGGTCTCGGTCTC29 30 31gly arg leu29 30 31gly arg leu104 105 arg leu104 105 arg leu146-8146-8РИС. 9.16.

Parasponia andersonii (глобин небобового растения)

Parasponia andersonii (глобин небобового растения)

\^/

161

(CTCAAGATA

ATG АСА

GAG GTC

о

(37 38 39

76 77

115 116

\^/

161

(CTCAAGATA

ATG АСА

GAG GTC

о

(37 38 39

76 77

115 116

met thr

met thr

glu val

glu val

leu lys ile

leu lys ile

Лег гемоглобин сои

Лег гемоглобин сои

Миоглобин тюленя

Миоглобин тюленя

Не arg leu

Не arg leu

glu phe

glu phe

а-Глобин человека

а-Глобин человека

lys leu

lys leu

fl-Глобин человека

fl-Глобин человека

glu arg met

glu arg met

GGTCTC

GGTCTC

29 30 31gly arg leu

29 30 31gly arg leu

104 105 arg leu

104 105 arg leu

146

-8

146

-8

Расположение интронов в генах глобинового надсемейства. Справа указано число аминокислот (кодонов) в каждом белке. Инициирующий кодон АТС не учитывается, поскольку метионин отщепляется от зрелого полипептида. Интроны изображены в виде тре-

угольников, внутри которых указаны их размеры. Приведены номера кодонов и соответствующих аминокислот, окружающих интроны (см. рис. 9.15,6). Заметьте, что первый интрон всегда прерывает кодон, а все стальные находятся между кодонами.

фиксирующих N2 в симбиозе с микроорганизмами, например с Rhizobium; такие растения могут быть и клубеньковыми, и не клубеньковыми. Они могут приобретать глобиновые гены путем горизонтального переноса из других геномов (например, в результате вирусной инфекции), а не в ходе вертикальной эволюции. У растений, как и у животных, амплификация предкового гена привела к образованию кластеров мультигенных семейств, содержащих функциональные гены и псевдогены (рис. 9.12). У животных дупликация, в результате которой появились паралогичные гены миоглобина и гемоглобина, произошла более 500 млн лет. назад, поскольку уже у круглоротых рыб, например у миноги, присутствуют оба гена.

Семейство а-амилазных генов: два гена из одной кодирующей последовательности. Клетки разных

линий содержат неодинаковое число функциональных генов панкреатической а-амилазы. У некоторых линий панкреатическую амилазу кодируют два практически одинаковых неаллельных гена, а третий ген экспрессируется в клетках слюнных желез и печени (табл. 9.7). Аминокислотные последовательности панкреатической амилазы и амилазы слюнных желез различаются на 12%; все три гена имеют одинаковые 5'-, но не З'-фланкирующие последовательности. Интроны существенно различаются как по длине, так и по нуклеотидной последовательности. Все гены локализованы в хромосоме 3. при этом, как показывают результаты исследования с помощью метода «прогулки по хромосоме», гены панкреатической амилазы и амилазы из слюнных желез находятся друг от друга на расстоянии всего 22 т.п.н. Мышиная ДНК содержит также сегменты,

гомологичные кодирующим областям а-амилазных генов; по крайней мере один из них представляет собой псевдоген, сцепленный с генным кластером в хромосоме 3.

Экспрессия уникального а-амилазного кодирующего участка в клетках околоушных слюнных желез и печени находится под контролем двух элементов, разделенных сегментом длиной примерно 3 т.п.н. (рис. 9.17). Уровень экспрессии этого участка, если последняя в обоих типах клеток находится под контролем ближайшего регуляторного элемента, одинаков и относительно низок. Но в околоушных железах у взрослых мышей дальний регуляторный элемент может активироваться, в результате чего транскриптов образуется почти в 30 раз больше. Именно этим объясняется высокое содержание ct-амилазы в клетках околоушных желез. Каждый регуляторный элемент сцеплен со своим ТАТА-блоком. Экзоны, находящиеся на 5'-конце первичного транскрипта, различаются; при последующем сплайсинге они унифицируются и оба содержат инициирующий кодон AUG. Таким образом, 5'-ли-

мРнк

AUGAUGГен а-амила- зы (Ату-1)Ген а-амила- зы (Ату-1)Транскрипция в клетках околоушной железыТранскрипция в клетках околоушной железыТАТА А АТАТА А АТАТАААТАТАААТранскрипция в клеткахI печени и околоушной железыТранскрипция в клеткахI печени и околоушной железыAUGAUG|Сплайсинг|Сплайсинг1 т.п.н.дос

AUG

AUG

Ген а-амила- зы (Ату-1)

Ген а-амила- зы (Ату-1)

Транскрипция в клетках околоушной железы

Транскрипция в клетках околоушной железы

ТАТА А А

ТАТА А А

ТАТААА

ТАТААА

Транскрипция в клетках

I печени и околоушной железы

Транскрипция в клетках

I печени и околоушной железы

AUG

AUG

|Сплайсинг

|Сплайсинг

Мрнк

РИС. 9.17.

Экспрессия кодирующего участка а-амилазного гена мышей (Ату-1) регулируется с помощью двух промоторов. При участии одного из них с относительно малой эффективностью образуются транскрипты в клетках печени и околоушных желез, другой специфически и с высокой эффективностью индуцирует синтез мРНК в клетках околоушных желез. [U. Schibler el al.. Cell 33 (1983). p. 501.J

дерные последовательности двух образующихся мРНК различаются. Экзон, который содержит сигнал инициации относительно малоэффективной транскрипции, входит в состав большого интрона, который при созревании специфичной для околоушных желез мРНК вырезается.

У крыс гены ct-амилазы в околоушных и поджелудочной железах, а также в печени различаются, при этом панкреатическую а-амилазу могут кодировать не менее четырех разных генов. Кроме того, имеются псевдогены и процессированные гены. Как и ген Ату-1 у мышей, крысиный ген, экспрессирующийся в слюнных железах, имеет два независимых промотора.

IFN-aIFN-PIFN уНазваниеЛейкоцитарныйФибробластныйИммунныйЧисло нсаллель- ных генов5 15> 21Псевдо- (или процессированные) гены> 3??Хромосомная локализация9р9р; 2; другие12(q24.1)ИнтроныНетНез3Гомология на уровне нуклеотидной последовательности генов INF-u (%)85 9550МачаГомология на уровне аминокислотной последовательности IFN-a (%)8030< 10Длина молекулы" (число аминокислот)155-166166146IFN-aIFN-PIFN уНазваниеЛейкоцитарныйФибробластныйИммунныйЧисло нсаллель- ных генов5 15> 21Псевдо- (или процессированные) гены> 3??Хромосомная локализация9р9р; 2; другие12(q24.1)ИнтроныНетНез3Гомология на уровне нуклеотидной последовательности генов INF-u (%)85 9550МачаГомология на уровне аминокислотной последовательности IFN-a (%)8030< 10Длина молекулы" (число аминокислот)155-166166146Таблица 9.10. Интерфероновые гены человекаТаблица 9.10. Интерфероновые гены человека11 Имеется в вид) длина молекул самих интерферонов. Соответствующие гены кодируют также сигнальные пептиды длиной 20 23 аминокислоты, которые удаляются во время трансляции.11 Имеется в вид) длина молекул самих интерферонов. Соответствующие гены кодируют также сигнальные пептиды длиной 20 23 аминокислоты, которые удаляются во время трансляции.Интерфероновые гены. В ответ на разнообразные внешние воздействия клетки многих позвоночных секретируют полипептиды, называемые интерферонами (IFN; табл. 9.10). Например, в результате вирусной инфекции и попадания в клетку двухцепочечной РНК в лейкоцитах индуцируется синтез интерферонов группы а, а в фибробластах интерферонов группы р. Каждая группа содержит различные структурные родственные белки. Совершенно другой белок, уникальный IFN-y, синтезируется в лимфоцитах при репликации ДНК, индуцированной митогенами. Все эти интерфероны в свою очередь вызывают различные клеточные ответы по-

IFN-a

IFN-P

IFN у

Название

Лейкоцитарный

Фибробластный

Иммунный

Число нсаллель- ных генов

5 15

> 2

1

Псевдо- (или процессированные) гены

> 3

?

?

Хромосомная локализация

9р

9р; 2; другие

12(q24.1)

Интроны

Нет

Нез

3

Гомология на уровне нуклеотидной последовательности генов INF-u (%)

85 95

50

Мача

Гомология на уровне аминокислотной последовательности IFN-a (%)

80

30

< 10

Длина молекулы" (число аминокислот)

155-166

166

146

IFN-a

IFN-P

IFN у

Название

Лейкоцитарный

Фибробластный

Иммунный

Число нсаллель- ных генов

5 15

> 2

1

Псевдо- (или процессированные) гены

> 3

?

?

Хромосомная локализация

9р

9р; 2; другие

12(q24.1)

Интроны

Нет

Нез

3

Гомология на уровне нуклеотидной последовательности генов INF-u (%)

85 95

50

Мача

Гомология на уровне аминокислотной последовательности IFN-a (%)

80

30

< 10

Длина молекулы" (число аминокислот)

155-166

166

146

Таблица 9.10. Интерфероновые гены человека

Таблица 9.10. Интерфероновые гены человека

11 Имеется в вид) длина молекул самих интерферонов. Соответствующие гены кодируют также сигнальные пептиды длиной 20 23 аминокислоты, которые удаляются во время трансляции.

11 Имеется в вид) длина молекул самих интерферонов. Соответствующие гены кодируют также сигнальные пептиды длиной 20 23 аминокислоты, которые удаляются во время трансляции.

давление вирусной инфекции, иммунные реакции, противоопухолевую активность.

Потенциальная значимость интерферонов как терапевтических средств для лечения вирусных инфекций и раковых заболеваний стимулировала их исследование. Сначала успехи были весьма скромными, поскольку активированные клетки продуцировали лишь небольшие количества белка. Проблему удалось решить благодаря применению методов рекомбинантных ДНК. Был получен хороший выход продукта в клетках E.coli с использованием клонированной кДНК. Однако само клонирование это сложная процедура, поскольку мРНК, как и полипептиды, не содержатся в клетках в достаточно большом количестве. Например, на долю мРНК у-интерферона в стимулированных лимфоцитах приходится всего 0,04% от полиаденилиро- ванных РНК. Для клонирования таких редких кДНК необходимы специальные методики. Суммарную РНК сначала фракционируют по размерам, а затем проверяют фракции на способность служить матрицами для синтеза IFN-y при введении в ооциты Xenopus laevis. Затем функционально активную фракцию используют для синтеза двухцепочечной кДНК с целью клонирования в плазмидном векторе. Образовавшиеся колонии подвергают дифференциальному скринингу (разд. 6.5.6). IFN-у-кодирую- щие последовательности были обнаружены в колониях, ДНК которых гибридизовалась с кДНК-зон- дами из стимулированных лимфоцитов и не гибридизовалась с ДНК нормальных лимфоцитов. Клонированную кДНК использовали затем в качестве зонда для выделения генов IFN-y. Таким способом можно получить полноразмерные кДНК различных интерферонов и определить аминокислотную последовательность данных белков, а также составить детальную картину организации этого интересного мультигенного семейства.

Среди клонированных сегментов ДНК человека, содержащих IFN-a-гены, некоторые несли более одного IFN-a-гена. Эти данные, а также обнаружение методом гибридизации in situ единственного IFN-a- локуса в геноме человека говорят о том, что гены, кодирующие интерфероны группы а, образуют единичный кластер. Генетический анализ показывает, что ближайшими соседями генов IFN-a на хромосоме 9 являются гены JFN-p. Единственный ген IFN-y расположен на другой хромосоме. Соседние гены сходны по своей структуре. Например, гены IFN-a и /FN-р, локализованные на хромосоме 9, имеют аналогичные кодирующие и 5'-фланкирую- щие последовательности, а кроме того, в них обоих отсутствуют интроны. В то же время ген IFN-y, расположенный на хромосоме 12, содержит три интрона и имеет весьма отдаленное сходство с генами IFN-a и /FN-Р; различаются и соответствую

щие полипептиды. Генные семейства интерферонов других млекопитающих обладают аналогичными свойствами.

Гистоновые гены:консервативность кодирующихп ос л едовател ьн осте й

и различия в организации

Общие свойства гистоновых генов. Первичная структура гистонов у самых разных эукариот высококонсервативна. Это неудивительно, поскольку гистоны играют ключевую роль в поддержании структуры хроматина (разд. 1.1.ж). И все же какие-то различия между гистонами существуют. Это касается прежде всего гистонов Шив наименьшей степени НЗ и Н4. На разных этапах развития организма, на разных стадиях клеточного цикла или в разных тканях у представителей одного вида могут синтезироваться немного различающиеся гистоны. Например, большинство гистоновых генов синтезируется в S-фазе клеточного цикла и, следовательно, параллельно репликации ДНК. Экспрессия других генов происходит с малой эффективностью в течение всего клеточного цикла. В отличие от аминокислотных последовательностей гистонов, достаточно консервативных у разных видов, число копий и организация гистоновых генов варьируют (рис. 9.18). Как и в случае тРНК-генов, это свидетельствует о том. что консервативность кодирующих последовательностей необязательно означает такую же консервативность числа копий генов или геномной организации.

Гены разных гистонов обычно сцеплены. Но, в отличие от генов рРНК, которые объединены по три гена в одной транскрипционной единице, все гистоновые гены транскрибируются по отдельности, часто с противоположных цепей ДНК. Кроме того, опять-таки в отличие от генов рРНК, гистоновые гены у разных видов и даже у разных индивидов одного вида распределены неодинаково. У одних видов они образуют тандемные повторы, а у птиц и млекопитающих рассеяны по всему геному. Большинство реплицирующихся гистоновых генов лишено интронов, а у мРНК отсутствуют 3'-ро1у(А)-концы.

Еще до появления методов рекомбинантных ДНК некоторую информацию об организации гистоновых генов удалось получить с помощью двух экспериментальных подходов. Первый из них позволил установить число копий и тандемную организацию гистоновых генов у морского ежа путем разделения сателлитных фракций гистоновых генов после центрифугирования суммарной ДНК в градиенте плотности. С помощью второго подхода

Вид

Группа гистоновых генов

Примерная длина кластера, т.п. и.

Примерное число копий

Дрожжи

Н2А Н2В

2

S.cerevisiae

нз-н?

6 и 13

2

Drosophila

нз-Н4-Н2А-Н2В-ТИ

5

100

Морской еж

нГ- Н4-Н2В-НЗ- Н2А

6-7

500(ранние)

5>purpuratus

(рассеянные, некоторые образуют пары)

Ю(поздние)

Тритон N.viridescens

Н4 Н2А Н2В НЗ Н1

9

700

Xenopus

НЗ-Н4-Н2А-Н2В-Н1В-НЗ-Н4

16

25

Й5-Н?-Н2А-Н2В

6

Курица

НЗ-Н2АН4-Н1-Н2А-Н2В

14

10

Н2А-Н4-Н2АН2В

>10

НЗ- Н4

>10

Н5 (экспрессируется в эритроцитах вместо геиа Н1)

1

Человек

НЗ-Н4-Н4-НЗ-Н2А-Н2В

20

10-20

Н4-НЗ-ЙП -Н2В* Н2А

15

5

Н2А-Н2ВН4

6

Неизвестно

РИС. 9.18.

Типичные примеры групп сцепленных гистоновых генов у различных видов. Отметим, что все группы в пределах вида одинаковы. У человека и, возможно, у некоторых других видов часть копий представлена псевдогенами. Направление транскрипции (там, где это известно) указано стрелкой над геном. [С. С. Hentschel, М. L. Birnstiel, Cell 25 (1981). р. 301.]

ранними и поздними гистоновыми генами. Их организация различается у разных видов; мы рассмотрим в качестве примера гены Strongylocentrotus purpuratus.

Геномные сегменты, содержащие ранние гистоновые гены, были клонированы из библиотеки EcoRI-фрагментов с использованием в качестве зонда суммарной гистоновой мРНК (рис. 9.19). Были получены два клонированных фрагмента, не гибри- дизующихся между собой. Как показало геномное картирование, они сцеплены и находятся друг от друга на расстоянии не более 7 т.п.н. Расположение всех пяти гистоновых генов в этих клонах определяли с помощью их гибридизации с выделенными методом электрофореза мРНК и последующего анализа образовавшихся гетеродуплексов под электронным микроскопом. Кроме того, индивидуальные мРНК отжигали с отдельными цепями клонированных фрагментов. Все РНК гибридизовались только с одной из двух цепей; это означает, что транскрипция соответствующих генов происходила в одном и том же направлении. Все эти данные получили подтверждение после определения нуклеотидных последовательностей; были установлены и точные размеры кодирующих участков и спейсе- ров. Несколько сотен сцепленных ранних гистоно-

удалось получить частично очищенную гистоновую мРНК из обогащенного препарата.

Клонирование гистоновых генов. В течение примерно первых десяти часов после оплодотворения яйцеклетка морского ежа претерпевает от 2-109 до 2-1010 делений, которые сопровождаются быстрой репликацией ДНК и синтезом гистонов. Около 30% синтезированных в это время белков представляют собой ядерные белки и в большом количестве присутствуют гистоновые мРНК. Все эти мРНК имеют одинаковый размер и коэффициент седиментации 9S. мРНК разных гистонов можно разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и затем идентифицировать по образованию соответствующих полипептидов в результате трансляции in vitro. Соответствующие мРНК морского ежа можно также использовать в качестве зондов для клонирования гистоновых генов растений, грибов и животных.

Гистоновые гены морского ежа. На самых ранних стадиях эмбриогенеза у морского ежа функционируют специфические гены, ответственные за быстрый синтез гистонов. После образования бластулы начинается экспрессия других гистоновых генов, ответственных за массовый синтез гистонов, необходимых для дальнейшего развития зародыша и взрослого ежа. Соответствующие гены называются

НЕЕ Е Н

Н1 Н4 Н2В КЗ Н2А

РИС. 9.19. —- —- — — —

Группа пяти сцепленных ранних гистоновых генов морского ежа (S. purpuratus). Из ЕсоR1 -геномной библиотеки были выделены два клонированных фрагмента (о) и (б), которые не гибридизуются с суммарной гистоновой мРНК, но гибридизуются друг с другом. Как фрагмент а, так и фрагмент б гибридизуются с уникальным фрагментом размером 7 т. п. н„ полученным при расщеплении геномной ДНК рестриктазой Hind\\\ (в). После обработки геномной ДНК двумя рестрикта- зами, fcoRI и HindWX, фрагмент длиной 7 т.п.н., гибри- дизующийся с фрагментом а или б, не выявлялся. Вместо этого со смесью фрагментов о и б гибридизовались два фрагмента, соответствующих по длине этим двум. Таким образом, два фрагмента, а и б, сцеплены между собой в пределах сегмента геномной ДНК длиной 7 т.п.н.

вых генов сгруппированы в длинные тандемные повторы.

В отличие от ранних генов, которые повторяются до 500 раз, поздние гистоновые гены повторяются всего около десяти раз. Поздние гены отличаются от ранних и по некоторым другим признакам. Во-первых, они никогда не бывают сцеплены в группы по пять генов и не образуют тандемных повторов. Некоторые гены, например НЗ и Н4, действительно соседствуют, располагаясь на расстоянии 1 т.п.н. друг от друга, но «одиночные» гены находятся на расстоянии не менее 6 т.п.н. от других гистоновых генов. Ни по своему расположению, ни по способности транскрибироваться в обоих направлениях поздние гены не имеют ничего общего с ранними. Кроме того, организация поздних генов варьирует от одного рода морских ежей к другому.

Клонированные родственные гены ранних и поздних гистонов не гибридизуются между собой в жестких условиях, хотя их генные продукты имеют сходную (или даже идентичную) структуру. Различия в кодирующих последовательностях говорят о том, что для одних и тех же аминокислот используются альтернативные кодоны. Еще больше различаются последовательности, фланкирующие родственные ранние и поздние гены; исключение составляют олигонуклеотиды, важные для транскрипции с участием РНК-полимеразы II.

Гистоновые гены у других видов. С помощью гибридизации in situ было показано, что все гистоновые гены Drosophila локализованы в одной области политенной хромосомы 2. Пять разных генов сцеплены в пределах одной единицы, повторяющейся примерно 100 раз; расположение генов и направление транскрипции существенно отличаются от таковых у морского ежа (рис. 9.18). Переключение синтеза гистонов на путь их образования в массовом количестве в ходе эмбриогенеза у Drosophila, как и у морского ежа, по-видимому, связано с экспрессией альтернативных генов, а не с модуляцией экспрессии одного и того же набора генов.

В ДНК дрожжей (S. cerevisiae) имеются две копии сегмента, содержащего по одному гену гистонов Н2А и Н2В, и две копии сегмента, содержащего по одному гену НЗ и Н4 (рис. 9.18). Гомологичные гены в каждой паре этих кластеров могут кодировать как слегка различающиеся (например, Н2А), так и одинаковые (например, НЗ) аминокислотные последовательности. Имеет ли такая вариабельность какое-либо функциональное значение-неясно. У дрожжей гистон (или ген) Н1 не был идентифицирован.

Организация гистоновых генов у позвоночных, как и у беспозвоночных, весьма разнообразна (рис. 9 18). Например, у Xenopus имеется несколько групп из пяти сцепленных гистоновых генов с разным их

расположением. По меньшей мере две такие группы отличаются тем, что у них имеются особые гены Н1. Эти гены гибридизуются со специфической мРНК ооцитов, с каждой из которых in vitro транслируется специфический белок Н1. Кроме того, в геноме Xenopus есть несколько тандемных повторов групп гистоновых генов, но в отличие от ранних гистоновых генов морского ежа соседние группы внутри тандемного повтора при эндонуклеазном расщеплении обнаруживают полиморфизм по сайтам рестрикции.

У тритона Notophthalmus viridescens имеются примерно 700 гистоновых генов, локализация которых. по крайней мере в некоторых аспектах, не соотносится с генной экспрессией. Гены пяти гистонов объединены в сегментах ДНК длиной 9 т.п.н., каждый из которых входит в состав длинных тандемных повторов неродственных последовательностей в одном из плечей хромосомы. Как правило, группы гистоновых генов разделены участками из тандемных повторов длиной от 50 до 100 т.п.н. Аналогичные тандемные повторы встречаются и в области центромер (разд. 9.4.в).

У теплокровных животных имеется относительно небольшое число гистоновых генов. Они не сгруппированы каким-то определенным образом, но часто соседствуют друг с другом.

ТАНДЕМНЫЕ ПОВТОРЫ:ХАРАКТЕРНАЯ ОСОБЕННОСТЬ

ВСЕХ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХГЕНОМОВ

Один из самых важных выводов, который можно сделать из результатов изучения геномной организации. состоит в том. что родственные последовательности ДНК часто образуют тандемные повторы. Иногда, например в случае генов рРНК или гистоновых генов, тандемно повторяются группы одинаковых генов. В других случаях в тандемы организуются такие родственные, но все же различающиеся гены, как члены мультигенных семейств глобиновых, овальбуминовых генов и генов гормона роста человека. Однако тандемные повторы встречаются не только в целых генах, они присутствуют также в их кодирующих и некодирующих участках.

Гены, состоящие из тандемныхповторов сегментов ДНК

Внутренние области некоторых кодирующих участков, по-видимому, состоят из тандемных, хотя и несколько различающихся повторов. Это наводит на мысль, что в эволюции генов участвовала амп-

лификация. Рассмотрим четыре примера, свидетельствующие о широкой распространенности повторов во внутренних областях кодирующих последовательностей.

Гены сывороточного альбумина и а-фетопротеина. У зародышей млекопитающих среди белков сыворотки крови преобладает а-фетопротеин, а после рождения основным белком становится сывороточный альбумин (разд. 8.3.д). Оба белка синтезируются в печени и каждый из них кодируется уникальным геном. У мышей эти два гена сцеплены с образованием тандема длиной 15 т. п. н.; тандем локализован в хромосоме 5, причем альбуминовый ген находится перед геном а-фетопротеина. Хотя эти гены значительно дивергировали и не гибриди- зуются, по своей структуре они достаточно сходны и можно предположить, что они образовались в результате тандемных реитераций и последующей дивергенции. Например, положение четырнадцати вставочных последовательностей и длины пятнадцати экзонов в обоих генах очень близки (структура гена а-фетопротеина показана на рис. 9.20,Л). У человека два упомянутых гена, сцепленных с третьим членом семейства [геном витамин D-связывающего плазматического белка-группоспецифичного компонента (Gc)], локализованы в длинном плече хромосомы 4.

Сывороточный альбумин и а-фетопротеин дают перекрестную иммунологическую реакцию. Они состоят примерно из 580 аминокислот и сходны по 35% из них. Оба они содержат по три домена (рис. 9.20,5), на удивление сходных по структуре, положению цистеиновых остатков и числу аминокислот между соседними цистеинами. Эти домены, по-ви- димому, представляют собой родственные полипептиды. О родстве свидетельствует анализ гена а-фетопротеина мышей. На рис. 9.20,Л сегменты ДНК, соответствующие трем доменам в белке, расположены один под другим. Видно, что число и положение вставочных последовательностей во всех доменах примерно одинаковы. Кроме того, кодирующие последовательности домена I на 39 и 35% гомологичны кодирующим последовательностям доменов II и III соответственно. Итак, ген а-фетопротеина содержит три тандемные копии сегмента ДНК. В ходе эволюции эти копии дивергировали, но и сейчас видно, что в их основе лежит одна предковая последовательность. Аналогичную структуру имеют и альбуминовые гены X.laevis, что подтверждает гипотезу существования общего предшественника у генов амфибий и млекопитающих. Однако у Xenopus а-фетопротеин отсутствует. В этом случае независимные реитерации привели к появлению дополнительных альбуминовых генов.

Гены, кодирующие рецептор липопротеина низкой

плотности. В крови позвоночных холестерол циркулирует в основном в виде липопротеина низкой плотности (ЛПНП), который представляет собой замкнутую мембранную структуру с интегральным белком апопротеином В и содержащимися внутри структуры молекулами эфира холестерола. ЛПНП связывается со специфическим рецептором, расположенным на цитоплазматической мембране разнообразных клеток, после чего происходит эндоцитоз. Далее рецептор отсоединяется от ЛПНП и возвращается в мембрану, а ЛПНП направляется к лизосомам, в которых апопротеин В деградирует. Высвободившийся холестерол вновь включается в мембрану. Кроме того, внутриклеточный холестерол регулирует скорость собственного биосинтеза, подавляя транскрипцию гена, кодирующего 3-гидро- кси-З-метил-глутарил-СоА-редуктазы. первого уникального фермента в этой биосинтетической цепи. Таким образом, рецептор ЛПНП выполняет две функции: он участвует в регуляции скорости образования холестерола и скорости его поступления из плазмы. Нарушения функционирования рецептора холестерола лежат в основе заболевания семейной гиперхолестеролемии (разд. 9.5.г).

Рецептор ЛПНП-сложный белок, состоящий из 839 аминокислот, которые образуют несколько доменов (рис. 9.21). Это домен, ответственный за связывание ЛПНП и выступающий из мембраны; еще один наружный домен с неизвестной функцией; небольшой высокогликолизированный домен, локализованный на поверхности мембраны; малый гидрофобный домен, пронизывающий мембрану; домен, выступающий в цитоплазму и необходимый для эндоцитоза.

У человека единственный ген рецептора ЛПНП имеет 18 экзонов, соответствующих нескольким белковым доменам (рис. 9.21). Экзон 1 кодирует сигнальную последовательность, которая удаляется в просвете эндоплазматического ретикулума. Экзоны 2-6 кодируют ЛПНП-связывающий домен и содержат семь тандемных повторов сегмента, кодирующего обогащенный цистеином белок длиной 40 аминокислот. Эти повторы различаются, но несомненно происходят от общего предка. Кроме того, эти семь родственных полипептидных последовательностей гомологичны также участку из 40 аминокислот, который повторяется несколько раз в одном из белков системы комплемента-факторе С9. Таким образом, в образовании ЛПНП-связывающего домена принимали участие как перестановки экзонов, так и амплификация. Эти два процесса играли важную роль и в образовании кодирующих последовательностей домена с неизвестной функцией в центре белка (экзоны 7-14). Каждый из экзонов 7, 8 и 14 кодирует полипептидные участки длиной 40 аминокислотных остатков, сходные по аминокис-

ИнтронИнтронРИС. 9.20.

Интрон

Интрон

А. Структура гена а-фетолротеина. Перевернутыми треугольниками отмечено положение интронов в гене а-фетопротеина мыши. Числа размеры экзонов (п н ). Весь ген разбит на три отрезка: I, II и III (см. текст). 14-й интрон расположен в 5-лидерной последовательности и не показан. Б. Схематическое представление а-фетопротеина мыши и сывороточного альбумина человека, иллюстрирующие их сходство. Три домена со сходной конфигурацией, отмеченные цифрами I, II и III, соответствуют трем сегментам гена, показанным на рис. А. Буква X обозначает позиции, в которых остатки цистеина встречаются только в молекуле сывороточного альбумина, но не а-фетопротеина. Указано число аминокислот между цистеиновыми остатками (оно не соответствует числу кружков, в виде которых представлена полипеп- тидная цепь); если цифры две, то это число у двух белков неодинаково. [M B. Gorin et al, J. Biol Chern. 256 (1981), p. 1954 ]

Домен с неизвестнойфункцией

Сигнальный Домен связывания ЛПНП ^^рЖ Гликозилиро- Домен,пронизываю- цитоплазмати-пептид™”Гомологичен С 9 фактора роставанный домен щии мем6рану_ческии домен

Номера экзонов

79

111214

И

РИС. 9.21.

Схематическое представление гена рецептора ЛПНП человека; показаны 18 экзонов и перечислены кодируемые ими функциональные домены. С9- один из белков системы комплемента, EGF-эпидермальный фактор роста. [М. Brown, J. Goldstein, Science 232 (1986), Р- 34.J

лотной последовательности с повторами в другом белке-эпидермальном факторе роста.

Гены «приклеивающих» белков дрозофилы. На личиночной стадии слюнные железы Drosophila экскретируют белки, с помощью которых куколка приклеивается к различным поверхностям. Используя мРНК одного из этих белков, sgs4, клонировали соответствующую кДНК и использовали ее как зонд для выделения гена Sgs4 из геномной библиотеки Drosophila. Вблизи 5'-конца кодирующей области гена Sgs4 находятся 19 прямых тандемных повторов последовательности длиной 21 п. н., которая кодирует семь аминокислот (рис. 9.22). Все вместе эти повторы составляют почти половину кодирующей области. Повторы несовершенны, т. е. гептапептидная единица также дивергировала. У нескольких линий Drosophila ген Sgs4 имеет другую длину вследствие изменения числа копий 21 п. н.- повтора. У одной такой линии число повторов равно 19, у других-22 и 27. Этот феномен может быть связан с неравным кроссинговером.

Коллагеновые гены. Коллаген - основной внеклеточный структурный белок позвоночных. Несмотря на разнообразие существующих форм коллагена, все они представляют собой тройные спирали, образованные тремя не обязательно одинаковыми по- липептидными цепями (рис. 1.30). Уникальной осо

бенностью коллагеновых пептидов является то, что у них каждой третьей аминокислотой является глицин (gly-X-Y); кроме того, они обогащены пролиновыми и лизиновыми остатками, многие из которых гидроксилированы (посттрансляционная модификация).

Гены, кодирующие а2(1)-коллагеновые полипептиды у курицы, мыши и человека, сходны между собой (рис. 9.23, Л). Как показывает электронномикроскопическое исследование коллагеновой мРНК курицы, гибридизованной с клонированными участками этого гена длиной 38 т. п. н.. коллагеновый ген имеет весьма необычную организацию. Он содержит не менее 52 экзонов, длина интронов варьирует от 80 п. н. до более чем 2 т. п. н. Однако длина всех экзонов кратна девяти нуклеотидам и составляет 54 или 108 п. н. (рис. 9.23, Б). Таким образом, каждый ген состоит из амплифицирован- ных единиц длиной 9 п. н„ чем и объясняется повторение в полипептидной цепи трипептида gly-X-Y.

Тандемные повторывне кодирующих областей

Тандемные повторы часто обнаруживаются между генами и в интронах и содержат от двух нуклеотидов и выше. Некоторые примеры такого рода приведены в табл. 9.11. Такие вездесущие повторы могут быть представлены различными последовательностями, например (CCG)„, (АТ)„ и (ТААССС)„, но мы сейчас не можем приписать большинству из них какие-либо функции. Среди наиболее простых повторяющихся единиц особенно интересна одна.

б Каноническая последовательность

acatgcaaaactgagccaccc thr cys lys thr glu pro pro

B Отдельные повторы

TGCTGTAAAACTGAACCACCG cys cys lys thr glu pro pro ACATGCAAAACTGА6ССАССС thr cys lys thr glu pro pro

acatgcagaactgagccacccthr cys arg thr glu pro pro

РИС. 9.22.

А. Структура гена Sgs4 Drosophila. Ген содержит 19 тандемных повторов единицы длиной 21 п.н. Б. Каноническая последовательность единицы длиной 21 п. н. В. Канонические последовательности нескольких повторов. [М.А. Т. Muskavetch, D.S. Hogness, Cell 29 (1982), р. 1041.]

12т.п.н.

1

99 45 99 54 108

д3-конец

Типичный экзонТипичный экзонGGT GAA CCA GGC ССТ GCT GGT GCC gly glu pro gly pro ale gly alaGGT GAA CCA GGC ССТ GCT GGT GCC gly glu pro gly pro ale gly ala

Типичный экзон

Типичный экзон

GGT GAA CCA GGC ССТ GCT GGT GCC gly glu pro gly pro ale gly ala

GGT GAA CCA GGC ССТ GCT GGT GCC gly glu pro gly pro ale gly ala

AAG GGA GAA AGT GGT AAC AAG GGT GAG CCTlye gly glu eer gly asn lye gly glu pro

6

РИС. 9.23.

А. Структура участка, кодирующего тройную спираль а2(1)-коллагена курицы. Участок разбит на два сегмента; экзоны изображены в виде цветных черточек, а интроны выделены точками. Указан размер некоторых

экзоное (в п. н.). [J. Wozney et al„ Nature 294 (1981), p. 129.] Б. Нуклеотидная последовательность одного экзона и кодируемый им полипептид.

ДНК-зонд с чередующейся последовательностью 5'-САСА... (или GT) гибридизуется со многими рестрикционными фрагментами ДНК всех эукариот, т. е. эта последовательность многократно повторяется в большинстве геномов. Возможно, она ответственна за образование Z-формы ДНК.

Связь с поли морфизмом Тандемные повторы, где бы они ни находились, как правило, связаны

Таблица 9.11. Некоторые тандемные повторы, диспергированные в геномах разных эукариот

Повтор

Организм

Локализация

5-CAAAGTTT-

-GAGTTTT

Xenopus

laevis Спейсер в генах

5S-PHK нз ооцитов

5-ACAGGGGT

-GTGGGG

• Человек

5'-конец инсулинового гена

5-СА

Многие риоты

эука- Многие геномные локусы и теломеры дрожжей

5'-GA

Многие риоты

эука- Спейсер между генами гистонов Н2А и HI у морского ежа

5-ТСТСС

Курица

Интрон в гене X в семействе овальбуминовых генов

5-GGAAG

»

2,5 т.п.н. с 5'-конца гена кональбумина

5'-GGAAA

Фазан

2,5 т. п. н. с 5'-конца гена кональбумина

5'-АТ

Многие риоты

эука- Множество локусов

с межвидовым полиморфизмом. Происхождение подобной вариабельности можно объяснить неравным кроссинговером между родственными неаллельными повторами или «проскальзыванием» при репликации (разд. 10.1 в). Спейсеры между генами рРНК ооцитов X. laevis и между тандемными транскрипционными единицами рРНК обычно содержат множество внутренних тандемных повторов (разд. 9.2); они ответственны за полиморфизм длины спей- серов. Изменение длины происходит в результате появления одной или нескольких лишних повторяющихся единиц или их утраты точно таким же способом, как это происходит при изменении числа копий тандемного повтора в гене Sgs4 у Drosophila.

Для экспрессии иммуноглобулиновых генов необходима значительная перестройка ДНК (разд. Ю.б.в). Рекомбинации, в результате которых становится возможным образование функционально активных тяжелых цепей, происходят в пределах специфических некодирующих последовательностей- «переключателей», которые содержат множество тандемно повторяющихся последовательностей 5'-(GAGCT)„GGGGT-3', где и = 1 - 5. Эти области генома также полиморфны.

Примерно на 500 п. н. левее 5'-конца гена инсулина человека находится тандемный повтор из единиц 5'-ACAGGGGTGTGGGG-3'. Данный сегмент присутствует не во всех геномах и отличается существенным полиморфизмом. Обнаружено множество разных аллелей этого локуса, и большинство

особей гетерозиготно по нему. Впервые такой полиморфизм проявился в изменчивости длины рестрикционных фрагментов, которые гибридизовались с клонированным ДНК-зондом из этой области. Он обусловливается различиями в числе повторяющихся единиц-от 26 до ~200, а также случайными изменениями в самих этих единицах. Какую функцию выполняет эта последовательность-неизвестно; вероятно, она не связана с локализацией ее вблизи инсулинового гена, поскольку по соседству с геном крысиного инсулина ни одной ее копии не обнаружено.

Мини-сателлиты. Предрасположенность тандемных повторов к полиморфизму наиболее ярко проявляется на примере так называемых мини-са-

а (AGGGCTGGAGGAGGGCTGGAGGAGGGCTGGAGG) |8

6 AGA6GTGG6CAGGTGG)2g

е (gggagg|gggcaggagg;

г

РИС. 9.24.

Если использовать в качестве зондов клонированные мини-сателлитные последовательности ДНК человека, то обнаружится полиморфизм рестрикционных фрагментов по длине. В верхней части рисунка приведены нуклеотидные последовательности трех родственных мини-сателлитов (о, б, е). Ниже приведены результаты блот-гибридизации клонированного зонда б с ДНК, обработанной эндонуклеазой Hinf\ (г). Четыре образца ДНК получены от членов одной семьи: отца (квадратик), матери (кружок) и их детей-однояйцовых близнецов (деа квадратика). Две последние дорожки соответствуют ДНК, взятой от неродственных индивидуумов мужского пола. Стрелками отмечены «родительские» сателлитные полосы на электрофореграммах ДНК близнецов. [A. Jeffreys et al.. Nature 316 (1985), p. 76; фотография любезно предоставлена A. Jeffreys.]

теллитных последовательностей. В геномах млекопитающих в разных местах расположено несколько таких относительно простых тандемных повторов разного типа (рис. 9.24). При блот-гибридизации зондов, содержащих сегменты мини-сателлитной ДНК, с рестрицированной геномной ДНК на электрофореграмме появляется несколько полос. Их распределение у разных особей данного вида различается, но для ДНК из разных тканей одного индивида остается одинаковым. Распределение полос наследуется по Менделю, причем можно соотнести их с тем или иным родителем. Количества ДНК, содержащегося в нескольких каплях крови, вполне достаточно для проведения блот-гибридизации, так что метод, основанный на использовании мини-сателлитной ДНК, можно применять в судебно-медицинской практике.

Тандемные повторы в областицентромер и теломер

Наибольшая концентрация тандемных повторов обычно наблюдается в области центромер и теломер в хромосомах животных и растений. Иногда в одном таком участке обнаруживаются сотни и даже тысячи копий какой-то одной единицы, и на их долю часто приходится значительная часть суммарной геномной ДНК (табл. 9.12). При денатурации суммарной ДНК с последующей реассоциацией эти последовательности составляют фракцию наиболее быстро ренатурирующей ДНК (т. е. для них характерны очень малые значения Cot). Как и другие длинные тандемные повторы, при равновесном центрифугировании в градиенте плотности эти элементы часто образуют отдельные «сателлитные зоны» (рис. 9.25). Все эти ДНК, включая и ДНК из зон, содержащих рДНК или повторяющиеся гистоновые гены, были названы сателлитными. Этот термин используется сейчас в основном в отношении

Таблица 9.12. Отношение центромерной сателлитной ДНК к суммарной геномной ДНК (%)

Вид”%

Geeareinus lateralis21

Drosophila melanogaster16

Mus musculus8

Rattus norvegicus1-3

Bovis domesticus> 23

Cercopithecus aethiops13-20

(африканская зеленая мартышка)

Homo sapiensВероятно.

около 5

” Приведены точные видовые названия, поскольку содержание сателлитных последовательностей варьирует от вида к виду даже в пределах одного рода.

Плавучая плотность,г/смз

РИС. 9.25.

Равновесное центрифугирование суммарной ДНК Drosophila в градиенте плотности CsCI (см. рис. 9.4); видны зоны разной плотности, соответствующие разным сателлитным последовательностям в области центромеры. Числа плавучая плотность (р). Для выделения сателлитных последовательностей IV, II и III (см. табл. 9.13) необходимо повторное центрифугирование. [S.A. Endow, M.L. Rolan, J.G. Gall, J. Mol. Biol. 96 (1975), p. 665.]

длинных тандемных повторов, расположенных в области центромер и теломер, независимо от того, образуют ли они дискретные зоны при центрифугировании в градиенте плотности.

У многих организмов имеется несколько разных сателлитных ДНК. Иногда (например, у Drosophila) они концентрируются в отдельных зонах при центрифугировании ДНК в градиенте плотности (рис. 9.25). У некоторых организмов центромерные и теломерные повторы вообще не обнаруживаются при центрифугировании. Такие крипти- ческие сателлитные ДНК либо находятся в составе основной зоны, либо в другом месте, но их количества недостаточно для образования дискретной зоны.

Разные сателлитные ДН К различаются по длине повторяющейся единицы и ее нуклеотидной последовательности. Длина этой единицы варьирует от двух пар нуклеотидов, как у сателлитной ДНК краба, где она представляет собой просто чередующийся динуклеотид из остатков А и Т, до нескольких тысяч нуклеотидных пар.

Общие свойства сателлитных ДНК из области центромер и теломер. РНК, гомологичная сателлитной ДНК, обнаруживается лишь в редких случаях. По-видимому, сателлитная ДНК не транскрибируется в сколько-нибудь заметных количествах и скорее всего ничего не кодирует. Как правило, центромеры и теломеры гетерохроматиновые, т. е. в отличие от слабо окрашенных эухроматиновых районов

хромосом очень интенсивно окрашиваются по Гимза (см. «С»-полосы на рис. 7.23). Таким образом, сателлитные ДНК входят в состав гетерохроматина, и эти два термина часто используются как синонимы, но как именно соотносятся между собой тандемные повторы и характер окрашивания, неясно. Другие области хромосом, в том числе и район ядрышкового организатора, содержащий повторы рДНК, также являются гетерохроматиновыми. К этой же категории относятся и другие, молчащие области хромосом, такие как инактивированная Х-хромосома. Сателлитная ДНК, находящаяся в области центромеры, реплицируется в S-фазе в числе последних, а в политенных хромосомах она часто оказывается недореплицированной по сравнению с другими участками ДНК.

Исследование сателлитных ДНК с помощью рестриктирующих эндонуклеаз. В исследовании природы сателлитных ДНК, как выделенных с помощью равновесного центрифугирования, так и криптических, большую роль сыграли опыты по эндонуклеазному расщеплению с последующей блот-гибридизацией. Значительно прояснили картину клонирование и секвенирование этих необычных геномных сегментов.

Если сайт для какой-то рестриктирующей эндонуклеазы находится в каждом из повторов тандемного кластера, то такой кластер расщепляется на фрагменты, длина которых равна длине повторяющейся единицы (рис. 9.26, Л). При гель-электрофо- резе суммарной геномной ДНК, окрашенной бромистым этидием, набор этих фрагментов одинаковой длины очень часто образует отдельную полосу. ДНК, элюированную из этой полосы, можно сразу подвергнуть предварительному секвенированию. Полученная таким образом каноническая консенсусная последовательность не обязательно соответствует последовательности любой из повторяющихся единиц, поскольку, как мы уже говорили, такие единицы в центромерных тандемных повторах редко бывают идентичными. Обычно они образуют семейство, члены которого отличаются друг от друга одним или более нуклеотидным остатком. Некоторые из них дивергировали в результате случайных нуклеотидных замен. Иногда нуклеотидные замены обнаруживаются сразу в нескольких или во всех единицах какой-то части кластера. Если часть кластера существенно отличается от сателлитной последовательности в целом, то говорят о субкластере или о сателлитном домене. Секвенирование клонированных сателлитных повторов, доменов и мономерных повторяющихся единиц показало, что то, что раньше представлялось совершенно гомогенной последовательностью, на самом деле есть совокупность в значительной степени различающихся единиц.

| Hinfl

I Электрофорез

359 п.н.359 п.н.

359 п.н.

359 п.н.

1077 п.н.

718 п.н.

359 п.н.

РИС. 9.26.Эндонуклеазное расщепление сателлитной последовательности III из области центромеры Drosophila. При электрофорезе рестриктов различных доменов (о, б, в, г) обнаруживаются разные фрагменты. А. Основная повторяющаяся единица имеет длину 359 п. н. и содержит один сайт для эндонуклеазы HinfX. При расщеплении с помощью HinfX большая часть сателлитных последовательностей превращается в набор фрагментов длиной 359 п. н. в количестве, достаточном для образования отдельной полосы на электрофореграмме, четко различимой на фоне других геномных фрагментов после окрашивания бромистым этидием. Б. В некотоРИС. 9.26.Эндонуклеазное расщепление сателлитной последовательности III из области центромеры Drosophila. При электрофорезе рестриктов различных доменов (о, б, в, г) обнаруживаются разные фрагменты. А. Основная повторяющаяся единица имеет длину 359 п. н. и содержит один сайт для эндонуклеазы HinfX. При расщеплении с помощью HinfX большая часть сателлитных последовательностей превращается в набор фрагментов длиной 359 п. н. в количестве, достаточном для образования отдельной полосы на электрофореграмме, четко различимой на фоне других геномных фрагментов после окрашивания бромистым этидием. Б. В некото

РИС. 9.26.

Эндонуклеазное расщепление сателлитной последовательности III из области центромеры Drosophila. При электрофорезе рестриктов различных доменов (о, б, в, г) обнаруживаются разные фрагменты. А. Основная повторяющаяся единица имеет длину 359 п. н. и содержит один сайт для эндонуклеазы HinfX. При расщеплении с помощью HinfX большая часть сателлитных последовательностей превращается в набор фрагментов длиной 359 п. н. в количестве, достаточном для образования отдельной полосы на электрофореграмме, четко различимой на фоне других геномных фрагментов после окрашивания бромистым этидием. Б. В некото

РИС. 9.26.

Эндонуклеазное расщепление сателлитной последовательности III из области центромеры Drosophila. При электрофорезе рестриктов различных доменов (о, б, в, г) обнаруживаются разные фрагменты. А. Основная повторяющаяся единица имеет длину 359 п. н. и содержит один сайт для эндонуклеазы HinfX. При расщеплении с помощью HinfX большая часть сателлитных последовательностей превращается в набор фрагментов длиной 359 п. н. в количестве, достаточном для образования отдельной полосы на электрофореграмме, четко различимой на фоне других геномных фрагментов после окрашивания бромистым этидием. Б. В некото

рых доменах сателлитной последовательности III у части повторяющихся единиц сайт для HinfX отсутствует. При расщеплении с помощью HinfX образуется «лестница» фрагментов ДНК длиной 359 п.н., 2 x 359 п.н. и т.д. В. В некоторых доменах сателлитной последовательности III повторяющиеся единицы содержат сайты для эндонуклеазы /УаеШ. При расщеплении с помощью А/аеШ образуется лестница фрагментов, длина которых кратна 359 п. н„ вплоть до 359 х 15 п. н. (не показаны). Г. В каждой повторяющейся единице сателлитной последовательности III содержатся сайты как для Hint так и для /УаеШ.

Отметим, что если те или иные модификации затрагивают эндонуклеазный сайт в повторяющейся единице, то продукты рестрикции будут представлены не только мономерной повторяющейся единицей, но и фрагментами, кратными двум, трем и г. д. «Лестница сегментов», которую получают при электрофорезе, как раз и свидетельствует о наличии сателлитной ДНК (рис. 9.26, Б).

Иногда повторяющаяся единица сателлитной

последовательности содержит сайты для нескольких рестриктаз. При расщеплении сателлитной ДНК любым из этих ферментов образуются повторяющиеся фрагменты одинакового размера. Однако при последовательном расщеплении разными ферментами сателлитов из одного и того же препарата ДНК могут получаться фрагменты разной длины. Таким образом, используя набор разных рестрик- тирующих ферментов, можно провести предвари-

тельный анализ сателлитных компонентов генома. Более детальные количественные данные можно получить, используя клонированные или даже не- клонированные сателлитные сегменты в качестве ДНК-зондов. Можно использовать также суммарную геномную ДНК или фракции, полученные при ее центрифугировании в градиенте плотности. Проводя гибридизацию этих зондов с хромосомами in situ, удается локализовать сателлитную центромерную и теломерную ДНК. Такой анализ довольно часто позволяет выявить множественные центромерные сателлиты, специфичные для определенного вида. Эта специфичность проявляется в длине повторов и их нуклеотидной последовательности.

Видоспецифичные сателлитные ДНК. Каждый вид имеет характерный набор центромерных сателлитных последовательностей, отличный от соответствующего набора даже у близкородственного вида данного рода. Этот факт, замечательный с точки зрения высокой консервативности последовательностей и геномной синтении, создает серьезные трудности при объяснении функций сателлитов. Чтобы проиллюстрировать возникающие здесь проблемы, рассмотрим сателлитные последовательности некоторых организмов.

Центромерные сателлитные последовательности у D.melanogaster. В ДНК D.melanogaster имеются четыре разные сателлитные последовательности (рис. 9.25 и табл. 9.13). Все вместе они составляют около 16% геномной ДНК. Сателлитная последовательность I содержит два простых близкородственных домена: один с пентамерной и другой-с гептамерной повторяющейся единицей. Почти 80% сателлитной последовательности II составляют тандемные декамерные повторы. Сателлитная последовательность IV, как и последовательность I, содержит пентамерный и гептамерный домены и, очевидно, родственна сателлитной последовательности 1. Сателлитная последовательность III имеет уникальную структуру. Она содержит повторяющуюся единицу длиной 359 п. и., и в большинстве таких единиц находится сайт для эндонуклеазы Hinfl (рис. 9.26, Л). Примерно 16000 повторов в составе сателлитной последовательности III полиморфны. Многие из них отличаются друг от друга и от канонической последовательности всего несколькими парами оснований. Об этом свидетельствуют результаты экспериментов по расщеплению сателлитной последовательности III или ее длинных клонированных сегментов рестриктазой HaelH. После разделения образовавшихся фрагментов с помощью гель-электрофореза получается «лестница» (рис. 926,5). Это значит, что многие единицы в тандемном повторе содержат сайт для НаеШ, но есть единицы, в которых он отсутствует. Клонирование длинных тандемных повторов сателлитной после

довательности III показало, что они содержат отдельные домены, по-видимому представляющие собой однородную сателлитную последовательность. Некоторые домены содержат в каждой повторяющейся единице сайты как для НаеШ. так и для Hinfl (рис. 9.26, Г). В других доменах в каждой единице присутствует Hinfl-cam, а сайты для НаеП! вообще отсутствуют (рис. 9.26,Л). Секвенирование клонированных повторяющихся единиц показывает, что члены семейства отличаются и по другим признакам. Например, один домен сателлитной последовательности III построен из тандемных повторов единицы, состоящей из 254 п. н. вместо обычных 359 п. н. Итак, одни центромерные сателлитные последовательности в ДНК Drosophila устроены довольно просто, а другие, например сателлитная последовательность III, имеют сложную структуру.

При отжиге in situ радиоактивных зондов сателлитных последовательностей 1 и IV с политенными хромосомами Drosophila гибридизация происходит со всеми центромерами (рис. 9.27). Однако ее эффективность у разных хромосом значительно различается, что свидетельствует о вариабельности числа повторяющихся единиц. Кроме того, каждая сателлитная последовательность гибридизуется с определенной областью центромеры, что говорит о специфичности ее локализации. Сателлитная последовательность III гибридизуется только с X- и Y-хромосомами. Таким образом, центромерные сателлитные последовательности локализуются каждая в определенной области. Более того, центромерные сателлитные последовательности Drosophila видоспецифичны. Об этом свидетельствует сравнение сателлитных последовательностей D. virilis и

Таблица 9.13. Содержание центромерных сателлитных ДНК у D. melanogaster и D. virilis

D. melanogaster

Сателлит % геном-повторяющаяся единица

ной ДНК

I

2

5 -[ААТАТ] ААТАТААТАТ и т.д.

1

5'-[ААТАТАТ] ААТАТАТААТ и т.д.

II

3

5'-[AATAACATAG] ААТААС и т д.

III

5

Повторяющиеся единицы длиной

254 и 359 п. н.

IV

4

5 -[AAGAG] AAGAGAA и т. д.

0,5

5-[AAGAGAG]AAGAGAG и т.д.

Сателлит

D. virilis

% геном-

повторяющаяся единица

ной ДНК

I

25

5'-[АСАААСТ]АСАААСТАС и т.д.

II

8

5-[АТАААСТ] АТАААСТАТАА и т.д.

III

8

5'-[АСАААТТ]АСАААТТАС и т.д.

IV

0.1

5'-[AATATAG]AATATAGAA и т.д.

РИС. 9.27.

Гибридизация in situ радиоактивных зондов центромерной сателлитной последовательности I (р = 1,672) Drosophila с митотическими хромосомами 3 (А) и Y (6). Внизу (рис. 6) показано положение сателлитных последовательностей I и IV (р = 1,705) на хромосоме 3. Относительное положение двух сателлитов на границе между центромерным гетерохроматином и эухромати- ном плеча 3R определяли с помощью электронной микроскопии отожженных препаратов. [D. М. Steffenson, R. Appels, W. J. Peacock, Chromosoma (Berl.), 82 (1979), p. 525 ]

D.melanogaster (табл. 9.13). Хотя эти мухи и относятся к одному роду, их центромерные сателлитные последовательности существенно различаются: с повторами D.melanogaster сходен лишь повтор 1с D.virilis. Заметим также, что три из сателлитных последовательностей D. uirilis настолько близки, что при гибридизации in situ их трудно различить. Сателлитные последовательности, которые не удается разделить по плавучей плотности, считаются доменами одного сателлита.

Сателлитные последовательности у быка и мыши. У быка известны восемь разных сателлитных последовательностей (рис. 9.28). Все вместе они составляют более 23% геномной ДНК и, судя по кинетике реассоциации, занимают промежуточное положение между высоко- и умеренноповторяющимися последовательностями (см. разд. 9.1.6). Повторяющиеся единицы представлены набором взаимосвязанных последовательностей. Секвенирование показало, что по меньшей мере пять из восьми сателлитов содержат одну или более одинаковых последовательностей, хотя и дивергиро- вавших настолько, что не гибридизуются между собой, а рестрикционный анализ не выявляет их родства. Длина повторяющейся единицы у большинства сателлитов быка превышает 1 т. п. н. Внутри этих длинных повторяющихся единиц имеются повторы, встречающиеся более часто.

Такие сложные структуры характерны не только для бычьей сателлитной ДНК. В сателлитах у других организмов, несмотря на их видоспецифичность, также имеются последовательности, встречающиеся относительно редко и более часто. Главный центромерный сателлит Mus musculus, например, имеет в своей основе повторяющуюся единицу длиной 234 п. н. В каждой из таких единиц имеется по

В

одному сайту для эндонуклеаз Sa«96I, EcoRII и ЛиаП. Секвенирование показывает, что повтор размером 234 п.н. в свою очередь содержит четыре (несовершенных) внутренних тандемных повтора длиной 58, 60, 58 и 58 п.н. Каждый из них можно разбить на два родственных, но различающихся сегмента длиной 28 и 30 п.н. соответственно. Эти сегменты также родственны и, возможно, образовались из одной нуклеотидной последовательности.

а-Сателлиты приматов. У приматов имеются сателлитные последовательности как с длинными, так и с короткими повторяющимися единицами. По крайней мере один класс центромерных сателлитов у каждого вида из числа исследованных содержит видоспецифичную повторяющуюся последовательность длиной примерно 170 п.н., называемую a-последовательностью (рис. 9.29). а-Сателлиты различных организмов не всегда гибридизуются между собой, но тем не менее они близкородственны, о чем свидетельствует их первичная структура. Например, повторяющаяся единица длиной 340 п. н. у бабуина и некоторые а-сателлиты человека представляют собой димеры повторяющейся единицы длиной 172 п.н., присутствующей в ДНК африканской зеленой мартышки. Эти два мономера, составляющие сателлитный димер у человека, отличаются друг от друга и от соответствующей последовательности у мартышки на 30%. У человека и бабуина эти последовательности также различаются. В а-сателлите бабуина один раз на каждые 343 п.н. встречается сайт для эндонуклеазы ВатШ, а в домене а-сателлита человека один раз на каждые 340 п.н.-сайт для эндонуклеазы EcoRL Наблюдается внутривидовая дивергенция повторяющихся единиц. Нуклеотидная последовательность клонированной повторяющейся единицы длиной 172 п.н. а-сателлита мартышки отличается от канонической последовательности в среднем на 3%. Отмечаются изменения двух типов. Первые, весьма редкие, затрагивают отдельные нуклеотидные пары и могут обусловливаться точковыми мутациями. Вторые

плавучая

ДЛИНАПОВТОРА, п.н.2350 'ДЛИНАПОВТОРА, п.н.2350 '38003800141314132600260013991399НеизвестнаНеизвестнаНеизвестнаНеизвестна1,720а0,1

ДЛИНА

ПОВТОРА, п.н.

2350 '

ДЛИНА

ПОВТОРА, п.н.

2350 '

3800

3800

1413

1413

2600

2600

1399

1399

НеизвестнаНеизвестна

НеизвестнаНеизвестна

1,720 Ь1,720 Ь1,7230,5(С ЮО

1,720 Ь

1,720 Ь

РИС. 9.28.

Сателлитные последовательности, выделенные при центрифугировании геномной ДНК быка в градиенте плотности. Гомологичные участки разных сателлитных последовательностей выделены одинаковым цветом. Сателлит с р = 1,711 (Ь) сходен с сателлитом с р = = 1,715, за исключением того, что ~ 60% повторяющихся единиц длиной 1399 п.н. прерываются участком длиной 1200 пар, частично гомологичных участку сателлита с р = 1,711 (а). Последовательности с р = = 1,723 и р = 1,709 не родственны никаким другим. Гомологичные участки сателлитов с р = 1,715 и р = = 1,711 (Ь) содержат несколько внутренних тандемных повторяющихся единиц длиной 31 п. н. Аналогично, гомологичные сегменты в длинных повторяющихся единицах с р = 1,706 и р = 1,711(a) содержат множественные внутренние тандемные повторы тех или иных вариантов одной последовательности длиной 23 п. н„ а повторяющаяся единица длиной 46 п. н. в последовательности с р = 1.720(b) есть не что иное, как димер того жв самого сегмента длиной 23 п. н.

касаются многих повторяющихся единиц; по-види- мому, такие изменения тоже исходно затрагивали отдельные пары оснований, но затем дивергиро- вавшие повторяющиеся единицы амплифицирова- лись. Например, многие мономерные единицы име

ют уникальный сайт для £coRI, а другие-специфические сайты для Нае III; в канонической последовательности оба они отсутствуют. Те повторяющиеся единицы, которые содержат сайты для Есо R1 или для НаеШ, обычно встречаются в разных тандемных повторах, называемых сателлитными доменами.

Бабуин (10%)Бабуин (10%)Африканская зеленая мартышка (13-207«)Африканская зеленая мартышка (13-207«)В некоторых а-сателлитных доменах человека длина повторов значительно превышает длину димеров, состоящих из двух единиц в 170 п.н. Оказалось, что эти домены являются пентамерами или даже додекамерами. Мономерные единицы в таких длинных повторах часто отличаются от канонической последовательности на 15% и более. Клонированные зонды, представляющие собой такие домены, не гибридизуются с другими доменами в жестких условиях. Используя эти специфические зонды и линии гибридных соматических клеток или гибридизацию in situ, удалось показать, что данные домены находятся в центромерах специфических хромосом. Например, домен, содержащий додека- мерный повтор, имеет длину 12 х 171, или примерно 2,1 т.п.н. (рис. 9.30). На каждые 2,1 т.п.н. приходится по одному сайту для Ват Н1 и P.vtI. Как показывают результаы опытов по гибридизации, имеется примерно 5000 додекамерных повторов и локализованы они в Х-хромосоме. В одной хромосоме могут находиться несколько разных доменов, но для каждой хромосомы характерны а-сател- литные домены определенной длины. Такая хромосомная специфичность встречается и у других приматов; по-видимому, это общее свойство сателлитных ДНК.

Бабуин (10%)

Бабуин (10%)

Африканская зеленая мартышка (13-207«)

Африканская зеленая мартышка (13-207«)

Человек (>1%)РИС. 9.29.Человек (>1%)РИС. 9.29.

Человек (>1%)

РИС. 9.29.

Человек (>1%)

РИС. 9.29.

ct-Сателлиты приматов и их содержание в геноме. Сателлиты африканской зеленой мартышки и бабуина- типичные представители видоспецифичных а-сателли- тов приматов. Приведенный здесь сателлит человека представляет собой один домен полного а-сателлита человека. На долю а-сателлитов может приходиться более 5% геномной ДНК человека, но этот домен составляет от геномной ДНК менее 1%.

-♦►171 п.н.-♦►171 п.н.РИС. 9.30.

-♦►

171 п.н.

-♦►

171 п.н.

Один из доменов а-сатеплита, локализованный в Х-хромосоме человека. Каждая повторяющаяся единица длиной 2,1 т. п. н. содержит по 12 копий а-сатвллит- ного мономера длиной 170 п. н. Эти 12 повторов диввр- гировали между собой на 10-20%, однако в пределах повторов более высокого порядка соответствующие

Возможные функции тандемныхповторов

Функции многих тандемных повторов, встречающихся в эукариотических геномах, пока не установлены. Конечно, здесь есть исключения-например, тандемные повторы некоторых генов, тандемные повторы внутри самих генов, специфические последовательности типа «переключателей», связанные с генами тяжелых цепей иммуноглобулина. Однако функции многих диспергированных тандемных повторов и огромных кластеров в районе центромер и теломер остаются загадкой. Возможно, мы просто не знаем, каковы эти функции, но не исключено, что некоторые последовательности ДНК вообще не выполняют никаких определенных функций. Тандемные повторы могут образовываться и элиминироваться благодаря таким процессам, как репликация и рекомбинация ДНК. Если появление и распространение этих повторов не нарушают работу важных кодирующих и регуляторных элементов, то повторы будут накапливаться и исчезать без всякого влияния со стороны естественного отбора. Полиморфизм некоторых тандемных повторов как раз и свидетельствует об этом. Тем не менее это положение представляется спорным, поскольку эволюция большинства геномов происходит под давлением естественного отбора. Геномы могут эволюционировать и в результате нейтральных изменений в структуре ДНК-мутаций, никак не влияющих на фенотип. Однако концепция нейтральной молекулярной эволюции применима в основном к изменениям на уровне единичных пар оснований или к небольшим делециям и реитерациям, а также к коротким диспергированным повторам с неясной пока функцией. Что касается сателлитных последовательностей в области центромер и теломер, на долю которых часто приходится весьма значительная часть суммарной геномной ДНК, то к ним применить теорию нейтральной эволюции труднее.

2,1т.п.н.

повторы (т. в. 1, 2, 3 и т.д.) весьма консервативны. Сайты для ватШ и Pst\ в пределах каждого 12-мера располагаются в одной и той жв мономерной единице. [J.S. Waya, Н. F. Willard, Nucleic Acid Res. 13 (1985), p. 2731.]

Широкая распространенность сателлитных последовательностей, их локализация и большой объем содержащейся в них ДНК наводят на мысль, что они выполняют какие-то важные функции. Для выяснения функций этих областей хромосом долгое время использовали цитогенетический анализ гетерохроматина, который обычно считают синонимом сателлитной ДНК. Рассматривались самые разные клеточные функции, прежде всего процессы, происходящие при митозе и в клетках зародышевой линии, в частности хромосомные перестройки, спаривание и расхождение хромосом и рекомбинация. Было высказано предположение, что сателлитные последовательности столь же важны для функционирования генома, как и остальная его часть. Однако, несмотря на огромное количество экспериментальных работ, окончательный вывод так и не был сделан. В настоящее время сателлитным последовательностям не приписывается никаких фенотипических эффектов и, следовательно, никаких функций. Об отсутствии у них таких функций свидетельствуют следующие факты. Функционально активные центромеры S.cerevisiae не содержат центромерных сателлитов (разд. 9.6). Мутанты Drosophila, у которых отсутствует большая часть или весь центромерный гетерохроматин, функционируют нормально. Значительная вариабельность нуклеотидной последовательности сателлитной ДНК даже у родственных видов наводит на мысль о ненужности этой ДНК вообще. Кроме того, недавно полученные данные показывают, что количество сателлитной ДНК в области центромеры и ее организация существенно различаются даже у особей одного вида. То же самое относится и к а-сателлитным последовательностям человека. Изменчивость минорных центромерных сателлитов характерна также для африканской зеленой мартышки. Эти данные позволяют предположить, что для функционирования центромер не важны ни число, ни точная нуклеотидная последовательность тандемных повторов.

Единственный факт, заслуживающий внимания с точки зрения роли центромерной сателлитной ДНК,-это ее широкая распространенность. Даже у размножающихся путем деления дрожжей Schizo- saccharomyces pombe, в отличие от почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae, имеются длинные тандемные повторы в области центромер. Как мы увидим ниже (разд. 9.4 д), те же самые процессы, которые приводят к изменению сателлитных последовательностей и к увеличению их числа в геноме, могут приводить и к их элиминации, однако этого не происходит. Возможно, тандемные повторы все же играют какую-то роль в функционировании центромер, которая не зависит от их конкретной нуклеотидной последовательности. Интересное и, по-ви- димому, имеющее отношение к обсуждаемому вопросу наблюдение сделано при исследовании хромосом кукурузы. В 23 нецентромерных областях этих хромосом были обнаружены гетерохроматиновые узелки, которые обладают одним замечательным свойством: в мейозе они могут образовывать дополнительные функционирующие центромеры. Узелковый гетерохроматин кукурузы, как и центромерный гетерохроматин, реплицируется в поздней S-фазе; узелки содержат длинные тандемные повторы последовательностей ДНК, которые отличаются от центромерных сателлитных последовательностей. Таким образом, для функционирования центромеры, по-видимому, важны тандемные повторы как таковые, а не их нуклеотидная последовательность.

д. Механизмы образования и эволюции тандемных повторов Реитерация последовательностей может происходить в результате общей рекомбинации между неаллельными гомологичными участками ДНК (разд. 2.4). Последовательные раунды такого неравного кроссинговера могут приводить к удлинению или укорочению длинных тандемных повторов. Вначале амплификация может захватывать довольно короткие гомологичные участки (рис. 9.31)-такие, как нонануклеотиды, встречающиеся с большой частотой в сателлитной ДНК мыши. Известная пластичность тандемных повторов в значительной степени обусловливается неравной гомологичной рекомбинацией, хотя нельзя исключить и такие механизмы, как генная конверсия или «проскальзывание» ДНК во время репликации.

Эволюция сателлитных ДНК. Сателлиты большинства классов ограничены по своей распространенности одним видом или группой близкородственных видов, это наводит на мысль, что они появились относительно недавно или изменялись в ходе эволюции значительно быстрее, чем все

остальные области генома. Эти изменения, приводящие к образованию видоспецифичных сателлитов, по-видимому, представляли собой последовательно сменяющие друг друга амплификации (и делеции) при помощи неравного кроссинговера и модификации нуклеотидных последовательностей (нуклеотидные замены, делеции и вставки) (рис. 9.32). Эта модель объясняет межвидовую изменчивость, наличие специфических внутривидовых доменов и полиморфизм в пределах современных видов. Наблюдаемые вариации будут зависеть от соотношения между частотой рекомбинационных событий и частотой изменений, фиксируемых в ходе естественного отбора или в результате генетического дрейфа (т. е. от вероятности фиксации). Эта модель объясняет также образование более длинных тандемных повторов из более коротких, однако она не отвечает на вопрос, почему при образовании сателлитов происходит амплификация лишь определенных последовательностей. Согласно одной широко обсуждавшейся гипотезе, у родственных видов имеется одинаковая специфическая библиотека последовательностей, способных амплифици- роваться с образованием сателлитной ДНК. Однако ни природа этой гипотетической библиотеки, ни типы хранящихся в ней последовательностей не описаны. Короче говоря, на вопрос о том, имеют ли разные сателлитные последовательности какие-либо общие свойства, мы не можем ответить более определенно, чем на вопрос о функции сателлитов. Амплифицироваться и даже сохранять стабильность в амплифицированных повторах при определенных условиях могут (разд. 10.8) самые разные геномные сегменты, в том числе и уникальные гены, но обычно амплифицированные последовательности бывают нестабильны. Сателлитные последовательности также нестабильны в том смысле, что для них характерна высокая изменчивость. Тем не менее локализация, распределение и количество тандемных повторов в геноме сохраняются. Какими особыми свойствами обладают центромеры и теломеры, благодаря которым в них образуются и сохраняются тандемные повторы с разной нуклеотидной последовательностью?

Эволюция тандемных повторов, входящих в кодирующие последовательности. В этой главе мы уже приводили несколько примеров существования тандемных повторов внутри генов. В одних из них, таких как рДНК, разные кодирующие сегменты идентичны. В других, например в глобиновых генах и в кластере генов гормона роста человека/плацен- тарного лактогена, некоторые кодирующие сегменты относятся к разным генам. В общих чертах механизм образования тандемных повторов путем амплификации сегментов с последующей мутацией одной копии гена и отбором считается установлен-

Гомологичные участкиГомологичные участкиКроссоверная точкаКроссоверная точка

Гомологичные участки

Гомологичные участки

Кроссоверная точка

Кроссоверная точка

TTAACAGGAtACCCGATCTAGCCGCAAGCATACTTGACCIA ATT GTCCTATGGGCTAGATCGGCGT TCGTATGAACTGGi

Репликация

TTAACAGGATACCCGATCTAgCCGGAAGCATACT т g а с с ААТТGTCCTATGGGCTAGATC GGCGT Т CGT ATGAACTGG

ttaacaggatacccgatcTagccgcaagcatacttgacgaattgtcctatgggctagAtcggcgttcgtatSAActgg

^Кроссинговер

ttaacaggat acccgatctagccgcaag atACCCGAT CT A GCCG C A A GCATACTTGACCQA ATTG ТС T A 1 GGGCTAGATCGGCOTTC T A T 66GCT A 6 AT C GGCG T T CGI AT 6AA CTgGI iC+

(TTAACAGCATACTTGACC0

(AATTGTC TATG mtg gQ

Репликация

ttaacagga(tacccg atcta g ccg c a a gcatacttgacctagccg caagca(tacttgaccQ AATTGTCCT ATGGGCTAGATCGGCGTTCGTATGAACTGGATCGGCGTT C G T AT G A A С T G g(]

TT AAC A. G GATACCCGATCTAGCCGCAA GGATACTTGACCTAGCCGCAAfGCAT A CTTG AC ср A A T T 6 t(c c tatg g gctagat c g gc g t t cctatg a act gg at c ggcgtt CGT ATGAACTGG^

(тт ААС AG CATACTTGACCQ (ААТТ П T C 6 T A 1 G A ACTC.gQ

(ttaacagcatacttgaccQ (AATTGT C G r * TGAACTGgO

РИС. 9.31.

Эволюция тандемных повторов в результате неравного кроссинговера. Рекомбинация может происходить между сегментами одной молекулы ДНК, между сестринскими хроматидами или между гомологичными хромосомами. На рисунке представлена рекомбинация между сестринскими хроматидами после первой репликации. Изображены две молекулы, образовавшиеся в результате кроссинговера, содержащие короткий гетеродуплексный участок, в котором одна цепь происходит от одной родительской молекулы, а другая-от другой. В этих участках возможно неправильное спаривание оснований, как это имеет место в одной из приведенных рекомбинантных молекул. Несмотря на сложность двух молекул, образовавшихся в результате

кроссинговера, каждую из четырех молекул, получив шихся после их репликации, можно представить так, как будто она образовалась в результате разрыва и вое соединения в одной кроссоверной точке рекомбини рующей молекулы. Эта точка для молекулы, отмеченной звездочкой, указана в исходной последовательности. Три другие молекулы могли бы образоваться при сме щении точки кроссовера в другие сайты гомологичного участка. Две более длинные молекулы содержат тандемные копии той части исходной последовательности, которая расположена между соответствующими кроссоверными точками. Две более короткие молекулы содержат делеции. [G. Р. Smith, Science 191 (1976), р. 528.]

нен

| Амплификация

i ( ( ( И

I Дивергенция в результате мутации

I (транзиции,трансверсии,делеции,инсерции)

РИС. 9.32.

М^#ЕН ~*^ И

I Амплификация

Возможные эволюционные изменения сателлитных ДНК за относительно непродолжительное время. Данная модель применима для образования как видоспе

цифичных сателлитов, так и сателлитных доменов в пределах вида. [Е. М. Southern, Nature 227 (1970), р. 794 ]

ным. В некоторых случаях, изучая детальную структуру повтора, удается проследить процесс реитерации на молекулярном уровне. В тех моделях, которые при этом были построены, считалось, что амплификация обычно происходит в результате неравного кроссинговера между членами семейств повторяющихся последовательностей, рассеянных по геному (рис. 9.33).

ПОВТОРЯЮЩИЕСЯПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ,

РАССЕЯННЫЕ ПО ВСЕМУ ГЕНОМУ

Как правило, члены мультигенных семейств, равно как и функциональные гены или процессированные псевдогены, многократно повторяются в не- сцепленных участках генома. Однако за немногими исключениями число копий таких последователь

ностей не превышает 50. Максимальное число копий-1000-известно для псевдогенов UI-РНК человека. Однако многие эукариотические ДНК содержат и другие, очень большие семейства повторяющихся последовательностей, члены которых рассеяны по геному в количестве 106 копий. Роль большинства таких последовательностей остается загадкой, хотя некоторые члены семейств могут быть функциональными генами.

Неравный кроссинговер между сестринскими хроматидамиНеравный кроссинговер между сестринскими хроматидамиРИС. 9.33.Схематическое представление эао- люции тандемных копий генов. Между двумя копиями диспергированной повторяющейся последовательности (черные полоски на одной из сестринских хроматид) происходит гомологичный, но неравный кроссинговер.РИС. 9.33.Схематическое представление эао- люции тандемных копий генов. Между двумя копиями диспергированной повторяющейся последовательности (черные полоски на одной из сестринских хроматид) происходит гомологичный, но неравный кроссинговер.Замечательное свойство этих семейств последовательностей состоит в их видовой изменчивости. Например, огромные семейства диспергированных последовательностей у грызунов и приматов различаются, хотя у разных видов все же встречаются родственные семейства. Кроме того, частота встречаемости повторов родственных семейств может различаться у разных видов в 10 и более раз. Такая сложная картина характерна для геномов растений,

Неравный кроссинговер между сестринскими хроматидами

Неравный кроссинговер между сестринскими хроматидами

РИС. 9.33.

Схематическое представление эао- люции тандемных копий генов. Между двумя копиями диспергированной повторяющейся последовательности (черные полоски на одной из сестринских хроматид) происходит гомологичный, но неравный кроссинговер.

РИС. 9.33.

Схематическое представление эао- люции тандемных копий генов. Между двумя копиями диспергированной повторяющейся последовательности (черные полоски на одной из сестринских хроматид) происходит гомологичный, но неравный кроссинговер.

многих беспозвоночных и позвоночных. Но пластичность диспергированных повторов не ограничивается только первичной структурой последовательностей и числом их копий. Многие рассеянные повторы представляют собой мобильные генетические элементы, локализация которых даже у близкородственных видов может не быть одинаковой. Более того, аллельные различия могут определяться наличием или отсутствием какого-либо повтора. Механизмы амплификации диспергированных повторов и их транспозиции в новые локусы генома обсуждаются в гл. 10. В этой главе мы остановимся на их общей организации, поскольку детальная картина вряд ли может быть получена.

Характер распределения повторов

Впервые диспергированные повторяющиеся последовательности были обнаружены при изучении кинетики реассоциации. Эти исследования показали, что высокоповторяющиеся последовательности часто бывают встроенными в другие последовательности ДНК.

А на шз кинетики ассоциации. На кривых реассоциации геномной ДНК повторяющимся последовательностям соответствуют участки с низким и средним значениями Cot, а уникальным- участок с высоким Cot (гл. 7.5.6). Если для определения доли реассоциированной ДНК используется гидро- ксилапатит, то двухцепочечными считаются как частично, так и полностью ренатурировавшие молекулы (рис. 9.34). В результате мы получаем кажущееся увеличение доли геномной ДНК, реассоциирующей при низких и средних значениях Cot, при увеличении длины фрагментов ДНК. Это происходит потому, что повторяющиеся последовательности, которые реассоциируют при относительно низких Cot, рассеяны по геному среди последовательностей с низким числом копий (рис. 9.35). В опытах, о которых идет речь, определяется зависимость доли ДНК, считающейся двухцепочечной по данным связывания с гидроксилапатитом, от длины фрагментов ДНК. Чтобы получить препараты молекул ДНК разной длины, суммарную ДНК фрагментируют случайным образом и затем разделяют по размерам центрифугированием в градиенте плотности. Фрагменты денатурируют и отжигают при фиксированных значениях Cot, слишком низких для реассоциации уникальных одно- копийных последовательностей.

Разные типы распреде юния повторов. Некоторые типичные кривые реассоциации показаны на рис. 9.36. Во всех трех случаях доля ДНК, связывающейся с гидроксилапатитом, возрастает с увеличением длины цепи, однако кривые существенно

Одноцепочечные молекулы проходят через колонкуОдноцепочечные молекулы проходят через колонкуСтепень реассоциацииСтепень реассоциацииЧастично и полностью двухцепочечные молекулы остаются в колонкеЧастично и полностью двухцепочечные молекулы остаются в колонкеКолонкас гидроксиапатитом, уравновешенная 0,12 М сроссратиым буферомКолонкас гидроксиапатитом, уравновешенная 0,12 М сроссратиым буферомКоличество ДНК,связанной с гидроксиапатитом

Одноцепочечные молекулы проходят через колонку

Одноцепочечные молекулы проходят через колонку

Степень реассоциации

Степень реассоциации

Частично и полностью двухцепочечные молекулы остаются в колонке

Частично и полностью двухцепочечные молекулы остаются в колонке

Колонкас гидроксиапатитом, уравновешенная 0,12 М сроссратиым буфером

Колонкас гидроксиапатитом, уравновешенная 0,12 М сроссратиым буфером

Суммарное количество ДНК

РИС. 9.34.

Определение степени реассоциации двнатурированной ДНК по связыванию с гидроксилапатитом Частично или полностью двухцепочечные молекулы связываются с гидроксилапатитом в 0,12 М фосфатном буфере, а одноцепочечные проходят свободно.

различаются по форме. Если длина фрагментов ДНК человека достигает ~ 2,2 т. п. н., то с гидроксилапатитом связывается в целом 60% геномной ДНК. Поскольку в геноме человека на долю последовательностей с умеренным и высоким числом повторов приходится лишь 20% (точка пересечения кривых с осью ординат на рис. 9.36), низкокопийные последовательности, как правило, должны фланкировать повторяющиеся сегменты. Излом кривой в точке ~2,2 т. п. н. действительно говорит о том. что в 60% ДНК человека повторяющиеся последовательности разделены относительно низкокопий- ными последовательностями со средней длиной 2,2 т. п. н. В отличие от этого соответствующая кривая для ДНК Drosophila изломов не имеет. Среднее расстояние между повторяющимися последовательностями у нее составляет не менее 12 т. п. н.,

Продукты реассоциации, связывающиеся с гидроксиапатитом

О

Увеличение длины цепи реассоциирующих Фрагментов

ООоООо

О

О

о

О

О

о

РИС. 9.35.

Доля геномной ДНК, реассоциирующей при средних значениях Cot, возрастает с увеличением длины цепи, если использовать для определения этой доли данные по связыванию ДНК с гидроксипап атитом.

Кривые реассоциации ДНК Drosophila, Xenopus и чеКривые реассоциации ДНК Drosophila, Xenopus и человека.ловека.ггээСгруппированные и смешанные повторы« «II«■ 1№Сгруппированные и смешанные повторы« «II«■ 1№Гнездовые повторыГнездовые повторыРИС. 9.37.Типы распределения повторяющихся последовательностей. Члены разных семейств выделены разным цветом.РИС. 9.37.Типы распределения повторяющихся последовательностей. Члены разных семейств выделены разным цветом.

Кривые реассоциации ДНК Drosophila, Xenopus и че

Кривые реассоциации ДНК Drosophila, Xenopus и че

ловека.

ловека.

г

г

э

э

Сгруппированные и смешанные повторы

« «II«■ 1№

Сгруппированные и смешанные повторы

« «II«■ 1№

Гнездовые повторы

Гнездовые повторы

РИС. 9.37.

Типы распределения повторяющихся последовательностей. Члены разных семейств выделены разным цветом.

РИС. 9.37.

Типы распределения повторяющихся последовательностей. Члены разных семейств выделены разным цветом.

а это самые длинные фрагменты, используемые в эксперименте. Электронно-микроскопическое исследование ренатурировавших молекул показывает, что длина большинства повторяющихся последовательностей в ДНК человека составляет около 300 п. н„ а в ДНК Drosophila- 5-6 т. п. н.

На рис. 9.37 представлены примеры распределения повторов. Повторы могут быть короткими (сотни пар нуклеотидов) или длинными (тысячи пар нуклеотидов), встречаться часто или редко (рис. а и б соответственно). По данным молекулярного клонирования, реально в геномах наблюдается смешанная картина: два распределения налагаются друг на друга (в). Различные повторяющиеся элементы могут также образовывать кластер или даже находиться один внутри другого (г, д). Члены семейства рассеянных повторов могут находиться в интронах, между генами, в составе сателлитной ДНК и даже в кодирующих и регуляторных участках генов, вызывая там мутации.

«Схлопывание» ДНК (fold-back). Доля ренатури- ровавшей ДНК увеличивается с ростом длины цепи

даже при очень низких концентрациях ДНК (т.е. при значениях Cot ~ 10“б). Такая реассоциация может быть только внутримолекулярной, откуда следует, что некоторые повторяющиеся последовательности в цепи ДНК имеют противоположную ориентацию (рис. 9.38). ДНК, ренатурировавшая в таких условиях, называется схлопнувшейся (snap- back или fold-back), и на электронных микрофотографиях в местах схлопывания видны характерные петли. Как показало молекулярное клонирование, члены семейств диспергированных повторов могут находиться в противоположных ориентациях даже в пределах относительно коротких сегментов ДНК.

Частые повторы

( 1 It U H Н~8

Одиночные цепи

((*С о

( f*( CW о

( (*( (*( о

( f*((*((♦( о

Отжиг Cot=10"6

РИС. 9.38.

«Схлопывание» ДНК.

Диспергированные повторыу беспозвоночных

Разнообразие в распределении повторов и в их количестве можно наглядно проиллюстрировать на примере различных беспозвоночных. Рассмотрим два из них-Drosophila и морского ежа.

Drosophila. На долю диспергированных повторов в геноме Drosophila приходится около 9%. тем не менее типичные высокоповторяющиеся последовательности пока не идентифицированы. Известно лишь, что имеются от 50 до 100 семейств, каждое из которых содержит от 10 до нескольких сотен членов. Многие из них представлены мобильными элементами длиной несколько т.п.н. (разд. 10.2 и 10.3). Некоторые из областей генома Drosophila содержат кластеры из членов нескольких разных семейств. Один такой кластер длиной 15 т.п.н. может содержать несколько копий членов семнадцати разных семейств. Составляющие кластера, по-видимому, перемешаны между собой. Такие беспорядочные кластеры обнаружены также в геноме у курицы и в некоторых участках генома морского ежа.

Морской еж. В геноме морского ежа имеется почти 1000 разных семейств диспергированных повторяющихся последовательностей, большинство из которых имеют длину 300 п. н. Размеры семейств

колеблются от 100 до 104 членов; всего в геноме насчитывается не менее 5 • 105 таких сегментов. Некоторые семейства состоят из весьма сходных по своей нуклеотидной последовательности членов, члены других семейств сильно различаются. Любое данное семейство можно встретить сразу у нескольких разных видов морских ежей, однако его содержание даже у близкородственных видов может различаться в 20 раз. При сравнении видов, принадлежащих разным отрядам, относительное число копий в различных семействах различается еще больше, хотя суммарная доля таких последовательностей в геноме остается на удивление постоянной. К тому же, хотя то или иное семейство можно идентифицировать у некоторых видов с помощью перекрестной гибридизации, часто такие семейства имеют видоспецифичную каноническую последовательность. Например, какая-то особенность последовательности ДНК, выявленная при расщеплении ДНК определенными эндонуклеазами, может быть характерна для всех членов семейства у одного вида, но нехарактерна для родственных ему видов.

Многие из повторяющихся последовательностей в геноме морского ежа транскрибируются в составе неродственных им протяженных транскрипционных единиц. Подобные транскрипты распространены в ядрах и содержат как уникальные последовательности, так и повторы. Таким образом, диспергиро- ванность распространяется и на ядерную РНК. В транскриптах, хотя обычно не в одной и той же молекуле РНК, бывают представлены обе цепи повторяющихся элементов ДНК.

Функции повторяющихся сегментов ДНК, а также их РНК-копий неизвестны. За исключением ооцитов морского ежа, транскрипты повторяющихся последовательностей обнаруживаются в основном в ядре, а в плазматических полиаденилирован- ных мРНК отсутствуют. Какие-либо данные о том, что повторяющиеся последовательности ассоциированы с функциональными мРНК, даже если это цитоплазматические РНК ооцитов, отсутствуют. Представляется маловероятным, что уже исследованные транскрипты кодируют какие-либо белки, поскольку во всех трех рамках считывания они прерываются терминирующими кодонами.

Многочисленные семействадиспергированных повторовв геномах млекопитающих

Классический анализ кинетики реассоциации показал, что для геномов человека и других млекопитающих характерно присутствие коротких, часто встречающихся повторов. Об этом же свидетельствуют те данные на молекулярном уровне, которые были получены с помощью рестрикцион-

Крысы(10® копий на геном")

GGGGCTGGGG ATTTAGCTCA G-TGGTAGAG Illi IIIIIII I IIIIIII GGGG GCGTAGCTCA GATGGTAGAG

CGCTTGCCTA GGAAGCGCAA GGCCCTGGGT НМ 11 И I I IН III 1111 CGCTCGCTTA GCATGCGAGA GGTACCGGGA

Аланиновая тРНК

TCGGTCCCCA GCTCCGAAAA АААААААААА

Ml I III II II I TCGATACCCG GCGCCTCCA

Мыши

(8x104 копии на геном)

GGGGCTGGAG I I GACGGGGGCTGGAG I I GACGAGATGGCTCA GTGGTTAAGA GCACCTGACTII НИ I ПИШИ |l UMAGGTGGCCGA GTGGTTAAG- GCGATGGACTAGATGGCTCA GTGGTTAAGA GCACCTGACTII НИ I ПИШИ |l UMAGGTGGCCGA GTGGTTAAG- GCGATGGACTGCTCTTCCGA AGGTCCTGAGTIII HI II II IIGCTCTTCCGA AGGTCCTGAGTIII HI II II IIGCTAA1CCAT TGTGCTCTGC ACGCGTGGGTGCTAA1CCAT TGTGCTCTGC ACGCGTGGGTTCAATTCCCA II I Illi I TCGAATCCCATCAATTCCCA II I Illi I TCGAATCCCAGCAACCACAT I I ITCCTCGTCGGCAACCACAT I I ITCCTCGTCGGGTGGCTCACGGTGGCTCAC

GGGGCTGGAG I I GACG

GGGGCTGGAG I I GACG

AGATGGCTCA GTGGTTAAGA GCACCTGACT

II НИ I ПИШИ |l UM

AGGTGGCCGA GTGGTTAAG- GCGATGGACT

AGATGGCTCA GTGGTTAAGA GCACCTGACT

II НИ I ПИШИ |l UM

AGGTGGCCGA GTGGTTAAG- GCGATGGACT

GCTCTTCCGA AGGTCCTGAGT

III HI II II II

GCTCTTCCGA AGGTCCTGAGT

III HI II II II

GCTAA1CCAT TGTGCTCTGC ACGCGTGGGT

GCTAA1CCAT TGTGCTCTGC ACGCGTGGGT

TCAATTCCCA II I Illi I TCGAATCCCA

TCAATTCCCA II I Illi I TCGAATCCCA

GCAACCACAT I I I

TCCTCGTCG

GCAACCACAT I I I

TCCTCGTCG

GGTGGCTCAC

GGTGGCTCAC

СериноваятРНК

РИС. 9.39.

Сходство нуклеотидных последовательностей членов семейства SINE и тРНК. [G. Я. Daniels, Р. L. Deininger, Nature 317 (1985), р. 819.]

ного анализа, клонирования и секвенирования. Из всех разнообразных семейств и подсемейств диспергированных повторов лишь немногие высоко- копийны и являются в геноме преобладающими. То или иное доминирующее семейство может составлять более 5% суммарной ДНК. а все вместе - более 20%. Члены некоторых из этих семейств имеют длину 100-500 п.н. и называются SINE-короткие диспергированные повторы (short interspersed repeats). Другие семейства представлены последовательностями длиной 6 т.п.н. и более, называемыми LINE-длинные диспергированные повторы (/ong interspersed repeats). Диспергированные повторы, напоминающие SINE, обнаружены у немлекопитающих, в том числе слизевиков, саранчи, иглокожих, рыб и амфибий. Они встречаются также у растений и беспозвоночных (разд. 10.3.е).

SINE. Сначала к SINE относили все короткие высокоповторяющиеся диспергированные' последовательности млекопитающих, основываясь просто

на их длине и распространенности. Позже в основу классификации было положено более существенное их свойство. По-видимому, последовательности SINE представляют собой процессированные псевдогены, происходящие от генов класса III, которые кодируют малые плазматические РНК, в частности тРНК (рис. 9.39) и 7SL-PHK (рис. 9.40), т. е. последовательности SINE гомологичны последовательностям таких РНК (и соответствующих генов). Как правило, SINE окружены прямыми повторами - сайтами-мишенями дупликаций (разд. 10.1.6) и содержат A-богатую З'-концевую последовательность.

SINE,грызуныSINE,грызуны7SL-PHK7SL-PHKи, человеки, человек500 п.н.500 п.н.РИС. 9.40.Сравнение 7SL-PHK и канонических последовательностей SINE типа I у грызунов и Alu у приматов; сходные области обозначены одинаковым образом. Ап- А-богатая последовательность на З'-конце одной из цепей каждой мономерной единицы (Тп- комплементарная последовательность). Гены 7SL-PHK человека имеют такую же структуру, как представленная здесь РНК. Центральная часть 7SL-PHK неродственна Alu- или SINE-последовательностям. [Е. Ullu, С. Tschudi, Nature 312 (1984), р. 171.]РИС. 9.40.Сравнение 7SL-PHK и канонических последовательностей SINE типа I у грызунов и Alu у приматов; сходные области обозначены одинаковым образом. Ап- А-богатая последовательность на З'-конце одной из цепей каждой мономерной единицы (Тп- комплементарная последовательность). Гены 7SL-PHK человека имеют такую же структуру, как представленная здесь РНК. Центральная часть 7SL-PHK неродственна Alu- или SINE-последовательностям. [Е. Ullu, С. Tschudi, Nature 312 (1984), р. 171.]Каждый вид (или отряд) имеет свой набор SINE-семейств. Для иллюстрации разнообразия и сложности таких последовательностей достаточно привести несколько примеров. Одно из наиболее изученных семейств SINE-это семейство Alu-последовательностей у приматов Старого Света, названное так потому, что все они содержат сайт для эндонуклеазы Л/и1. Alu-элементы фланкируют гены, они обнаружены в интронах, в сателлитной ДНК и в составе кластеров вместе с другими вставочными последовательностями. В пределах любого данного вида различия между Alu-последовательностями достигают 15%. Alu-последовательности

SINE,грызуны

SINE,грызуны

7SL-PHK

7SL-PHK

и, человек

и, человек

500 п.н.

500 п.н.

РИС. 9.40.

Сравнение 7SL-PHK и канонических последовательностей SINE типа I у грызунов и Alu у приматов; сходные области обозначены одинаковым образом. Ап- А-богатая последовательность на З'-конце одной из цепей каждой мономерной единицы (Тп- комплементарная последовательность). Гены 7SL-PHK человека имеют такую же структуру, как представленная здесь РНК. Центральная часть 7SL-PHK неродственна Alu- или SINE-последовательностям. [Е. Ullu, С. Tschudi, Nature 312 (1984), р. 171.]

РИС. 9.40.

Сравнение 7SL-PHK и канонических последовательностей SINE типа I у грызунов и Alu у приматов; сходные области обозначены одинаковым образом. Ап- А-богатая последовательность на З'-конце одной из цепей каждой мономерной единицы (Тп- комплементарная последовательность). Гены 7SL-PHK человека имеют такую же структуру, как представленная здесь РНК. Центральная часть 7SL-PHK неродственна Alu- или SINE-последовательностям. [Е. Ullu, С. Tschudi, Nature 312 (1984), р. 171.]

разных видов приматов Старого Света различаются примерно в такой же степени, как и Alu-последовательности у разных индивидов одного вида.

Типичная Alu-последовательность приматов представляет собой димер, состоящий из двух повторов длиной около 130 п.н., соединенных голова- к-хвосту (рис. 9.40). Мономерные единицы в составе димера неодинаковы: наиболее существенное различие между ними состоит в том, что во втором из них имеется дополнительный сегмент длиной 31 п.н. Каждый из мономеров (З'-конец верхней цепи ДНК на рис. 9.40) заканчивается ро!у(А)-хвостом разной длины. Alu-мономеры содержат последовательности, гомологичные 5'- и З'-концам 7SL-PHK; центральная часть 7SL-PHK длиной 155 п.н. в А1и-по- следовательности делегирована.

Впервые Alu-последовательности были выделены и клонированы (случайным образом) из ДНК человека (рис. 9.41), и исходя из этих данных была построена каноническая последовательность. Затем клонированные члены Alu-семейства использовали в качестве зондов для определения числа копий методом кинетики реассоциации. Было обнаружено 9-105 копий Alu-последовательностей на гаплоидный геном (или около 9% геномной ДНК человека). В среднем на каждые 5 т.п.н. генома человека и других приматов Старого Света приходится одна Alu-последовательность. С Alu-зондами гибридизу- ется ДНК более 90% рекомбинантных фагов, содержащих хромосомную ДНК человека, а большинство из клонированных сегментов длиной 15-20 т.п.н. содержит более одного члена Alu-семейства. Соседние Alu-последовательности могут располагаться друг относительно друга в любой ориентации, поэтому некоторые из них входят во фракцию «схлопнувшейся» геномной ДНК. Например, из восьми Alu-последовательностей в пределах сегмента ДНК длиной 65 т.п.н, которые входят в состав мультиген- ного семейства генов Р-глобина, пять ориентированы в одном направлении, а три - в другом (рис. 9.42).

Распространенность Alu-последовательностей кажется удивительной, если учесть, что в ДНК человека имеются только три функциональных гена 7SL-PHK. Более того, все Alu-последовательности приматов должны были возникнуть уже после появления в процессе эволюции большинства отрядов млекопитающих, поскольку SINE-семейство грызунов, гомологичное 7SL-PHK. существенно отличается от Alu-семейств приматов (рис. 9.40). Примерно 10s членов семейства типа I у грызунов имеют длину 130 п.н., что практически равно одному из двух соединенных голова-к-хвосту мономеров, типичных для Alu-последовательностей приматов. Другие представители SINE грызунов-семейства типа II и ID-гомологичны различным тРНК-генам (рис. 9.39).

Денатурация

Отжиг Cot-68

(

Фракционирование по размерам с помощью электрофореза

РИС. 9.41.

Выделение Alu-последовательностей человека. Суммарную ДНК человека фрагментировали до средней длины фрагментов 2 т. п. н„ денатурировали и проводили ренатурацию; Cot было равно 68, при этом последовательности с низким числом копий оставались од

ноцепочечными, а повторяющиеся последовательности со средним и высоким их числом образовывали дуплексы. При обработке дуплексов эндонуклеазой, специфичной к одноцепочечным участкам, оставались полностью двухцепочечные фрагменты. После разделения последних с помощью гель-электрофореза обнаружилось, что большую их часть составляют фрагменты длиной 300 п. н„ при расщеплении которых эндонуклеазой А!и\ образуются в основном фрагменты длиной 170 и 120 п.н. Репрезентативные члены Alu-семейства из фракции в 300 п. н. были клонированы с помощью Sam HI-линкеров и плазмиды pBR322. [Р. L. Deininger et al., J. Mol. Biol. 151 (1981), p. 17.]

Члены SINE-семейства и родительские гены класса III имеют гомологичные внутренние промоторы, А- и В-боксы, а SINE-единицы, которые содержатся в клонированных сегментах ДНК, часто транскрибируются in vitro при участии РНК-полимеразы III (рис. 9.43). Транскрипция начинается строго на 5'-конце единицы и заканчивается на первом участке из четырех или более остатков аденина в матричной цепи ДНК. Однако, несмотря

Q Alu-семейство □ Семейство LINE-IQ Alu-семейство □ Семейство LINE-IРИС. 9.42.Мультигенное семейство генов Р-глобина человека, состоящее из диспергированных повторов, которые принадлежат к разным семействам.РИС. 9.42.Мультигенное семейство генов Р-глобина человека, состоящее из диспергированных повторов, которые принадлежат к разным семействам.на то что многие SlNE-единицы эффективно транскрибируются in vitro, большинство из них не служат матрицей для РНК-полимеразы III in vivo. И все же в наиболее интересных моделях, рассматривающих амплификацию SINE-последовательностей и встраивание их в ДНК, предполагается, что происходит обратная транскрипция с участием РНК-полимеразы III (разд. 10.4).

Q Alu-семейство □ Семейство LINE-I

Q Alu-семейство □ Семейство LINE-I

РИС. 9.42.

Мультигенное семейство генов Р-глобина человека, состоящее из диспергированных повторов, которые принадлежат к разным семействам.

РИС. 9.42.

Мультигенное семейство генов Р-глобина человека, состоящее из диспергированных повторов, которые принадлежат к разным семействам.

SIN Е-последовательности транскрибируются также с помощью РНК-полимеразы II. Это происходит в том случае, когда они находятся в каком- либо интроне, в 5'-лидерной или З'-трейлерной последовательности неродственной транскрипционной единицы класса II. Поэтому гетерогенные ядерные РНК содержат в большом количестве диспергированные транскрипты SINE-последовательностей. В ходе процессинга первичных транскриптов с образованием мРНК SIN Е-последовательности обычно удаляются, в результате чего плазматическая РНК содержит их почти в десять раз меньше, чем ядерная.

LINE. Кроме многочисленных SINE-семейств, все геномы млекопитающих содержат одно крупное семейство LINE-последовательностей, а именно семейство LINE-1, члены которого могут достигать длины 6-7 т. п. н. (рис. 9.44). В некоторых геномах встречаются и другие семейства LINE, но их распространенность гораздо ниже. У разных млекопитающих все LINE-семейства родственны, но немного различаются: чем ближе виды, тем более они сходны.

А-бокс

GGCGTGGTGG

В-бокс

GTTCAAGAC

^■1

Многие члены семейства LINE-1 имеют длину меньше 6- 7 т. п. н. В таких укороченных сегментах обычно отсутствуют 5'-концевые последовательности (рис. 9.44), а иногда внутренние участки. Кроме того, не все члены семейства коллинеарны. Некоторые из них инвертированы или в них произошли какие-то перестройки. Как в геноме мыши, так и в геномах приматов укороченных членов семейства намного больше, чем полноразмерных. В результате число копий различных частей длинных LINE-1-последовательностей варьирует и увеличивается от левого конца к правому. Например, у человека содержится около 3,5-103 копий левого конца последовательностей и почти 105 копий правого конца.

Члены семейства LINE-1 фланкируют гены, они встречаются в интронах и сателлитной ДНК. Исследование членов LINE-1-семейства, содержащихся в клонированных геномных сегментах, а также гибридизация in situ LINE-1-зондов с интактными хромосомами показали, что они распределены по разным хромосомам. Носит ли это распределение случайный характер, неизвестно. Иногда LINE-1-последовательности образуют кластеры. Например, необычно много членов этого семейства содержится в сегменте ДНК человека размером 65 т. п. н., который содержит р-глобиновые гены (рис. 9.42).

LINE-1, как и SINE-последовательности, часто бывают окружены прямыми повторами, которые, вероятно, служат сайтами-мишенями дупликаций (разд. 10.1.6), а на З'-конце у них имеется А-богатый участок. Однако, в отличие от SINE, LlNE-1-еди- ницы, по-видимому, не являются псевдогенами обычных генов. Скорее всего некоторые наиболее длинные единицы LINE-1 предсталяют собой мо-

Фланкнрующая последовательность

■■М ШН!

РИС. 9.43.

Транскрипция in vitro SINE-последовательности с помощью РНК-полимеразы III (Pol III). В качестве примера рассмотрен типичный клонированный сегмент Alu-последовательности приматов. Представлен со

стоящий из двух частей регуляторный участок (А- и В-боксы; разд. 8.3), а также сайт инициации транскрипции, соответствующий началу повторяющейся единицы

Полноразмерный член семейства ИМЕ-1(~4-1о3копий на гаплоидный геном человека)

ККККСтоп-кодон ААТААА

5' ♦iI♦I 3'

. . - Открытые рамки считывания, — е»Г ИА-богатая одинаковые у веек млекопитающихТ богатая

РИС. 9.44.

Полноразмерный член семейства LINE-1 человека (вверху) аналогичен членам, обнаруженным у всех млекопитающих. Указано несколько характерных для приматов рестрикционных сайтов Например, Kpnl-фраг менты длиной 1,5 и 1.2 т п н. образующиеся после зндонуклеазного расщепления геномной ДНК, присутствуют в гидролизате в достаточно большом количестве, чтобы их можно было обнаружить после электрофореза и окрашивания геля бромистым этидием. Учас-

^

>;М-<сгатаяЛ |Т-6огвт«я()

ток. выделенный светло серым цветом, аналогичен у всех млекопитающих и содержит протяженные участки с открытыми рамками считывания (от 5'- к З'-концу, слева направо, верхняя цепь). 5 и З'-концевые участки у разных отрядов млекопитающих существенно раз личаются по длине и нуклеотидной последовательности и не содержат открытых рамок считывания. Большинство членов семейства укорочены с 5'-конца (нижняя часть рисунка).

бильные элементы, которые амплифицировались и встроились в новые геномные сайты в результате обратной транскрипции соответствующих РНК (разд. 10-З.е). Обратную транскриптазу может кодировать участок LINE-1-единицы размером 4 т. п. н.; у млекопитающих этот участок весьма консервативен и имеет в одной из цепей протяженную открытую рамку считывания (рис. 9.44). Укороченные единицы LINE-1 или единицы с перестройками могли произойти от неполных или аберрантных транскриптов, от обратных транскриптов или же появиться в результате рекомбинаций, сопряженных с инсерцией.

Последовательности LINE-1 транскрибируются РНК-полимеразой II вместе с геном, в некодирующий участок которого они встроены. В результате среди гетерогенных ядерных РНК встречается довольно много РНК, гомологичных обеим цепям последовательностей LINE-L В полиадснилирован- ной плазматической РНК дискретных транскриптов не обнаружено, как не обнаружено и соответствую

щих белков. Исключение составляют клетки тера- токарциномы человека и мышиных лимфоцитов, которые содержат полноразмерные транскрипты цепи с открытой рамкой считывания. Однако белков. кодируемых этими РНК, не обнаружено.

г. Функции диспергированныхповторов

Наличие огромного количества семейств повторяющихся последовательностей, разбросанных по десяткам и сотням тысяч локусов эукариотического генома, кажется необъяснимым. Например, на долю SINE- и LINE-последовательностей приходится не менее 10% геномной ДНК млекопитающих Какую роль могут играть столь многочисленные повторы помимо той, которую играют члены, содержащие функциональные гены? На этот счет есть две гипотезы. Первая предполагает, что повторяющиеся последовательности, их транскрипты или те и другие вместе участвуют в регуляции

генной экспрессии. Согласно второй гипотезе, большинство таких последовательностей вообще не выполняет никаких функций.

Семейства повторяющихся последовательностей как регуляторы экспрессии генов. Напомним, что в отличие от прокариот, у которых родственные гены, имеющие отношение к определенным метаболическим реакциям, обычно сцеплены и регулируются с помощью одного оперона (разд. 3.11), родственные эукариотические гены обычно диспергированы. Например, гены а- и Р-глобинов расположены на разных хромосомах, но должны экспрессироваться согласованно. Другими словами, весь набор диспергированных генов в конкретной ткани или на определенной стадии развития организма должен экспрессироваться одновременно. Такая координация возможна, если у всех членов генного кластера имеется общий регуляторный элемент. В таком случае включать или выключать весь набор генов может одна эффекторная молекула, взаимодействующая с одинаковыми диспергированными регуляторными элементами. Контроль за экспрессией генов может осуществляться на уровне ДНК путем регуляции транскрипции или же на уровне РНК. Например, в гетерогенной ядерной РНК, по-видимому, сохраняется картина распределения повторов, характерная для геномной ДНК, и тогда координация регуляции может осуществляться с помощью контроля созревания первичных транскриптов с образованием мРНК. В то же время копии повторяющихся последовательностей могут содержаться и в зрелых мРНК, и тогда регуляция генной экспрессии будет происходить на уровне трансляции.

Существуют ли какие-либо доказательства этой гипотезы и ее альтернативных вариантов? Известно, что некоторые семейства повторяющихся последовательностей участвуют в регуляции специфических групп генов. Как правило, члены этого семейства имеют длину не более 10 п. н., поэтому они исключаются из числа диспергированных последовательностей, идентифицируемых методом кинетики ре- натурации или легко выявляемых при клонировании. Например, некоторые наиболее распространенные из таких последовательностей входят в состав регуляторных участков, сцепленных с генами, которые транскрибируются с участием одной из РНК- полимераз; формально эти последовательности относятся к повторяющимся и диспергированным.

На недостаток аминокислот дрожжи отвечают экспрессией генов, детерминирующих их биосинтез. По крайней мере некоторые из этих генов содержат на 5'-конце последовательность 5'-TGACTC-3'. Она встречается один или несколько раз на участке 33-330 п. н. перед точкой инициации транскрипции в составе негомологичных во всем остальном пос

ледовательностей. Для экспрессии гена в ответ на дефицит аминокислоты необходимо и достаточно одной копии 5'-TGACTC-3', если только остальная часть контролирующих транскрипцию элементов интактна. Транскрипция стимулируется ДНК-свя- зывающим белком GCN4, который распознает указанный гексануклеотид (разд. 8.3.е). На 5'-фланки- рующем участке генов Drosophila, которые активируются при поышении температуры, находится другая короткая повторяющаяся последовательность, 5'-CTNGAANNTTCNAG-3'. По-видимому, она отстоит от точки начала транскрипции этих генов теплового шока на 150 п.н. и необходима для инициации ответа на повышение температуры как у Drosophila, так и у клеток млекопитающих в культуре. Кроме того, имеются некие сцепленные с интронами последовательности, существенные для правильного и эффективного сплайсинга. Эти последовательности содержат динуклеотиды 5'-GT-3' и 5'-AG-3'-два первых и два последних остатка в интронах эукариот (разд. 8.5.в). У дрожжей во всех известных интронах между 20-м и 55-м остатками слева от AG на З'-конце сайта сплайсинга присутствует последовательность 5'-ТАСТААС-3' (разд. 8.5.в). Например, в единственном интроне актинового гена дрожжей она находится от З'-сайта сплайсинга на расстоянии 47 нуклеотидов (рис. 9.10). Если эта последовательность у генов, клонированных в дрожжевом векторе, делегирована, то мРНК в дрожжевых клетках не образуется, поскольку соответствующие транскрипты не сплайсируются.

Известно ли что-либо о весьма многочисленных семействах, члены которых имеют длину, значительно превышающую 10 п. н., в том числе и о семействах SINE и LINE? Есть ли данные об их регуляторных функциях? У морского ежа и у Dic- tyostelium, например, в разных наборах транскриптов, образующихся в тканях зародыша и взрослой особи, встречаются разные повторяющиеся последовательности. Более того, семейства таких последовательностей, представленные в ядерных транскриптах, сильно различаются у дифференцированных клеток разного типа. Могут ли эти РНК участвовать в регуляции функциональных генов, экспрессирующихся во времени одинаковым образом? В транскриптах, выделенных из специализированных клеток млекопитающих, обнаружены SINE- последовательности. Семейство В2 этих последовательностей у мышей часто встречается в мРНК, присутствующих в повышенной концентрации в раковых клетках и в клетках мышиных эмбрионов на определенных стадиях развития. Такие последовательности обнаружены также в З'-трейлерных участках мРНК некоторых генов главного комплекса гистосовместимости мыши. Эти данные наводят на мысль, что повторяющиеся элементы выполняют

какую-то специфическую функцию, но, прежде чем утверждать это. нужно получить дополнительную информацию.

Семейства поторяющихся последовательностей как нефункциональные структуры. В разд. 9.4.г мы уже говорили о том, что некоторые геномные сегменты не выполняют никаких генетических функций. По-видимому, именно таковы псевдогены и процессированные гены. Если учесть, что многие диспергированные семейства содержат большое число таких генов, то можно сделать вывод о нефункционально- сти целых семейств. Такая ДНК получила название эгоистичной, поскольку вся ее деятельность направлена на собственные амплификацию и распространение в геноме. Возможные механизмы амплификации и распространения описаны в гл. 10. Здесь мы лишь отметим, что такие события отнюдь не безобидны; распространение повторов в геноме может приводить к инсерционным мутациям в регуляторных или кодирующих последовательностях. Кроме того, множественные диспергированные повторы могут благоприятствовать делециям функциональных сегментов в результате гомологичной рекомбинации. Таким образом, ничем не органиченная эгоистичность может иметь катастрофические последствия для функциональной части генома.

Alu-последовательности благоприятствуют де- лециям. Способность диспергированных повторов облегчать делегирование можно проиллюстрировать на примере гена рецептора ЛПНП человека (разд. 9.4.а). У гомозигот по мутантным генам рецептора ЛПНП в плазме накапливается холестерол, что приводит к раннему атеросклерозу и даже к инфарк-

Ген рецептора ЛПНП

5' Экзон 15 14 15

6 I—У/ - » I

Рестриктные карты

PvPvXXЕ5 КЕ5 КXXгенгенPvН Sp Ss PvPvН Sp Ss PvН Sp Sp К Pv Ss Ss PvН Sp Sp К Pv Ss Ss PvРИС. 9.45.

Pv

Pv

X

X

Е5 К

Е5 К

X

X

ген

ген

Pv

Н Sp Ss Pv

Pv

Н Sp Ss Pv

Н Sp Sp К Pv Ss Ss Pv

Н Sp Sp К Pv Ss Ss Pv

А. Делеционный мутант по гену рецептора ЛПНП, полученный в результате рекомбинации между Alu-nocne- доватепьностями. З'-участок нормального гена с экзонами изображен так же, как на рис. 9.21. Представлены Alu-последовательности в одном интроне и в З'-кон- цевом экзоне (экзон 18). Б. Рестриктная карта этого же участка нормального гена. В. Рестриктная карта кло

ту у детей. По оценкам, один мутантный аллель встречается у одного из 500 человек. У гетерозигот развивается более легкая форма семейной гиперхо- лестеролемии. Клонирование и сравнительный структурный анализ генов нескольких индивидуумов, страдающих этим заболеванием, показывает, что некоторые дефектные рецепторы кодируются генами с протяженными делециями. На участке ДНК длиной 45 т. п. н., содержащем ген рецептора ЛПНП, находится много Alu-последовательностей. Некоторые из них расположены в З'-половине гена, в частности три- в З'-нетранслируемой части последнего экзона. Два охарактеризованных и независимых делеционных мутанта, по-видимому, образовались в результате гомологичной рекомбинации между такими Alu-последовательностями (рис. 9.45). Как следствие экзоны, кодирующие часть рецептора, пронизывающую мебрану, а также его цитоплазматический участок, делегированы. Мутантные белки не встраиваются в мембрану, а выводятся из клетки.

д. Замечательное единообразиедиспергированных повторяющихсяпоследовательностей

Чем объясняется внутривидовая однородность членов семейств диспергированных последовательностей? Тандемные повторы, например кластеры рДНК в разных хромосомах, также имеют сходные последовательности. Один из возможных механизмов, обеспечивающих такую гомогенность,- реципрокный гомологичный кроссинговер между неал-

PvPv

Pv

Pv

XXгенгенX Е5 КX Е5 Кнированного мутантного гена. По отсутствию некоторых рестриктных сайтов можно сделать вывод, что концы делегированного участка находятся в Alu-поспедова- тельностях. Об этом же говорят результаты сравнения нуклеотидных последовательностей нормального и мутантного клонированных генов. [М.А. Lehrman et al.. Science 227 (1985), p. 140.]

X

X

ген

ген

X Е5 К

X Е5 К

дельными членами семейств; именно такой кроссин- говер происходит между единицами рДНК у дрожжей (разд. 9.2.а). Аналогичным образом можно объяснить и внутривидовую гомогенность других тандемных повторов, например центромерных сателлитных ДНК. Однако те способы гомогенизации, которые характерны для тандемных повторов, не могут реализовываться в случае диспергированных повторов без угрозы целостности уникальных последовательностей, окружающих эти повторы.

Возможные механизмы гомогенизации диспергированных повторов. Разумно предположить, что все члены гомологичных SINE- и LlNE-семейств у разных организмов произошли от обшей предковой последовательности. В каждой из эволюционных ветвей появлялись определенные варианты этих последовательностей, ставшие весьма многочисленными. Например, все Alu-последовательности приматов сходны между собой. У мыши нет таких димерных Alu-элементов, зато имеется много копий мономерных последовательностей, родственных Alu,- SINE типа I. И все же оба этих семейства, вероятно, образовались в процессе перестройки, амплификации и распространения по всему геному последовательностей, происшедших от предковых генов 7SL-PHK.

Представляется маловероятным, что внутривидовая гомогенизация этих семейств могла произойти в результате естественного отбора, действующего на каждого члена семейства по отдельности. Если множественные копии выполняют какие-то функции, то их изобилие могло бы минимизировать значимость любой единичной мутантной копии. Большинство диспергированных повторов отличается от видоспецифичной консенсусной последовательности по 5-15% позиций. Однако если большинство копий нефункциональны, то еше менее вероятно, что гомогенизация с образованием какой-либо видоспецифичной последовательности будет происходить под давлением отбора. Скорее всего каждая внутривидовая копия эволюционировала согласованно с другими копиями, так что все они оказались сходными.

Рассмотрим для примера SlNE-семейство. В какой-то момент времени, до появления позвоночных, произошли амплификация и распространение одного из модифицированных генов 7SL-PHK. Поэтому соответствующее SINE-семейство имеется у Хепо- риз но не у Drosophila, хотя гены 7SL-PHK есть у обоих видов. Семейство повторяющихся последовательностей образовалось у каждого вида позвоночных, но члены предкового семейства замещались одной видоспецифичной последовательностью, выступающей в роли новой последовательности-основателя. Все или большинство предковых копий у новых видов утратились, а семейство образовалось in

toto из этой последовательности-основателя. Если бы все это случилось одномоментно, то последствия были бы катастрофичными для гена. Однако вначале происходило длительное постепенное замещение существующих SINE-последовательностей последовательностью-основателем. Если допустить существование нейтрального отбора, то за 70 млн. лет, прошедших со времени дивергенции приматов и грызунов, при скорости замещения 0.01 за год могла бы осуществиться гомогенизация такого большого семейства, как Alu-семейство приматов.

Замещение могло происходить, например, в результате рекомбинации между неаллельными членами семейства повторяющихся последовательностей; при этом рекомбинировали бы только сами повторяющиеся элементы, но не фланкирующие их последовательности, что исключило бы слишком обширную перестройку. Кроссинговер не приведет к изменению фланкирующих последовательностей и будет нереципрокным, если разрыв цепи в промежуточном продукте и последующее воссоединение произойдут без изомеризации и если в результате репарации участка гетеродуплекса восстановится одна из кроссоверных копий (рис. 2.61 и 9.46). Такой же результат дает генная конверсия, происходящая в соответствии с моделью двухцепочечного разрыва (рис. 2.60 и 9.46). С помощью этих двух процессов отдельные участки гомологичных последовательностей или все они целиком могут стать идентичными (т. е. гомогенизироваться). Если в результате конверсии один из членов семейства приобретает какие-то преимущества над остальными членами, то он и становится последовательностью-основателем. Постепенно в результате конверсии отдельных генов происходит гомогенизация всего семейства. В рамках такой модели предполагается один источник направленных изменений. Элементами-основателями могут быть те локусы, которые наиболее активно транскрибируются в клетках зародышевой линии. Отметим, что ни два реципрокных кроссинго- вера в пределах повтора, ни одиночный кроссовер, образовавшийся после изомеризации, не приводит к конверсии (рис. 9.46).

Генная конверсия у дрожжей. У дрожжей, где генную конверсию можно изучать генетически, наблюдается направленность изменений. Одни локусы более эффективны как матрицы, чем другие. Причина этих различий неясна, но частота конверсий достаточно высока, так что даже при незначительном преимуществе с помощью одного такого локуса может произойти гомогенизация весьма многочисленного семейства. Прямые данные о превращении одного члена семейства в последовательность, сходную с другим членом, получены при изучении диспергированных повторов у дрожжей, называемых Ту-элементами (Ту-мобильный элемент,

без изомеризации с репарациейбез изомеризации с репарациейОдиночный реципрокный кроссинговерОдиночный реципрокный кроссинговерДвухцепочечный разрывДвухцепочечный разрывГенная конверсияГенная конверсияРИС. 9.46.Рекомбинация между неаллельными повторяющимися единицами (они выделены цветом разной интенсивности) в зависимости от механизма дает различныеРИС. 9.46.Рекомбинация между неаллельными повторяющимися единицами (они выделены цветом разной интенсивности) в зависимости от механизма дает различныеОдиночныйОдиночныйреципрокный кроссинговер сизомеризацнеиреципрокный кроссинговер сизомеризацнеиДва реципрокных кроссинговераДва реципрокных кроссинговерапродукты. Все перечисленные механизмы включают гомологичную рекомбинацию между самими повторяющимися единицами.продукты. Все перечисленные механизмы включают гомологичную рекомбинацию между самими повторяющимися единицами.описанный в разд. 10.3.б). Изменения во фланкирующих последовательностях у дрожжей легко выявить генетически по появлению мутаций в маркерных генах. Утрата Ту-элемента устанавливается по одновременной утрате встроенного в него важного гена URA 3 (рис. 9.47); у штамма, который использовался в данном опыте, функциональный ген URA3 отсутствовал. Как показали опыты с использованием специфических рестриктирующих эндонук

без изомеризации с репарацией

без изомеризации с репарацией

Одиночный реципрокный кроссинговер

Одиночный реципрокный кроссинговер

Двухцепочечный разрыв

Двухцепочечный разрыв

Генная конверсия

Генная конверсия

РИС. 9.46.

Рекомбинация между неаллельными повторяющимися единицами (они выделены цветом разной интенсивности) в зависимости от механизма дает различные

РИС. 9.46.

Рекомбинация между неаллельными повторяющимися единицами (они выделены цветом разной интенсивности) в зависимости от механизма дает различные

Одиночный

Одиночный

реципрокный кроссинговер сизомеризацнеи

реципрокный кроссинговер сизомеризацнеи

Два реципрокных кроссинговера

Два реципрокных кроссинговера

продукты. Все перечисленные механизмы включают гомологичную рекомбинацию между самими повторяющимися единицами.

продукты. Все перечисленные механизмы включают гомологичную рекомбинацию между самими повторяющимися единицами.

РИС. 9.47.Конверсия Ту-последовательностей у дрожжей. Последовательности Ту-это повторяющиеся диспергированные транспозируемые элементы в геноме дрожжей (разд. 10.3.6). Вертикальными стрелками указаны сайты для эндонуклеаз рестрикции, различные у разных элементов. Использовался штамм, обладающий следующими свойствами: нормальный ген URA3 делегирован; в Ту-элемент встроен другой ген URA3 с образованием клеток URA3V От одного и того же штамма URA3* были получены несколько игаЗ'-производных. Последовательность URA3 у них отсутствовала, хотя Ту-злемент остался на месте, судя по отсутствию изменений во фланкирующих его последовательностях. Утрата t/ЯАЗ-не единственное изменение в Ту-злемвнте. Изменилось и положение зндонуклеазных сайтов: оно стало таким же, как в Ту-элементах из других локусов генома.РИС. 9.47.Конверсия Ту-последовательностей у дрожжей. Последовательности Ту-это повторяющиеся диспергированные транспозируемые элементы в геноме дрожжей (разд. 10.3.6). Вертикальными стрелками указаны сайты для эндонуклеаз рестрикции, различные у разных элементов. Использовался штамм, обладающий следующими свойствами: нормальный ген URA3 делегирован; в Ту-элемент встроен другой ген URA3 с образованием клеток URA3V От одного и того же штамма URA3* были получены несколько игаЗ'-производных. Последовательность URA3 у них отсутствовала, хотя Ту-злемент остался на месте, судя по отсутствию изменений во фланкирующих его последовательностях. Утрата t/ЯАЗ-не единственное изменение в Ту-злемвнте. Изменилось и положение зндонуклеазных сайтов: оно стало таким же, как в Ту-элементах из других локусов генома.леаз, утрата гена URA3 сопровождалась конверсией Ту-последовательности с образованием модифицированной ее формы из другой геномной копии. Поскольку при конверсии такого типа утрачиваются протяженные последовательности ^URA3\ то скорее всего здесь происходит двухцепочечный разрыв, а не одиночный кроссинговер и репарация. Вероятность того, что в пределах Ту-последовательности происходят два реципрокных кроссинговера, тоже очень

РИС. 9.47.

Конверсия Ту-последовательностей у дрожжей. Последовательности Ту-это повторяющиеся диспергированные транспозируемые элементы в геноме дрожжей (разд. 10.3.6). Вертикальными стрелками указаны сайты для эндонуклеаз рестрикции, различные у разных элементов. Использовался штамм, обладающий следующими свойствами: нормальный ген URA3 делегирован; в Ту-элемент встроен другой ген URA3 с образованием клеток URA3V От одного и того же штамма URA3* были получены несколько игаЗ'-производных. Последовательность URA3 у них отсутствовала, хотя Ту-злемент остался на месте, судя по отсутствию изменений во фланкирующих его последовательностях. Утрата t/ЯАЗ-не единственное изменение в Ту-злемвнте. Изменилось и положение зндонуклеазных сайтов: оно стало таким же, как в Ту-элементах из других локусов генома.

РИС. 9.47.

Конверсия Ту-последовательностей у дрожжей. Последовательности Ту-это повторяющиеся диспергированные транспозируемые элементы в геноме дрожжей (разд. 10.3.6). Вертикальными стрелками указаны сайты для эндонуклеаз рестрикции, различные у разных элементов. Использовался штамм, обладающий следующими свойствами: нормальный ген URA3 делегирован; в Ту-элемент встроен другой ген URA3 с образованием клеток URA3V От одного и того же штамма URA3* были получены несколько игаЗ'-производных. Последовательность URA3 у них отсутствовала, хотя Ту-злемент остался на месте, судя по отсутствию изменений во фланкирующих его последовательностях. Утрата t/ЯАЗ-не единственное изменение в Ту-злемвнте. Изменилось и положение зндонуклеазных сайтов: оно стало таким же, как в Ту-элементах из других локусов генома.

мала, поскольку наблюдаемая частота замен в десять раз выше частоты даже одной реципрокной рекомбинации в отдельном локусе.

Помимо замен, обусловленных генной конверсией, гомогенизация, по-видимому, происходит также в результате делеций последовательностей-предшественников типа SINE и вставки новых копий. В противном случае копийность семейств диспергированных последовательностей у разных видов должна была бы оставаться относительно постоянной, а это не так. Например, у человека и шимпанзе число Alu-последовательностей равно соответственно 9-105 и 3-105. Четкие указания на наличие инсерций (и/или делеций) были получены после выявления аллелей отдельных генов, которые различаются по наличию последовательности SINE в одном из фланкирующих участков или в интроне. Возможные механизмы встраивания или делеций описаны в разд. 10.4.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИВ ОБЛАСТИ ЦЕНТРОМЕР

И ТЕЛОМЕР

Центромеры и теломеры наиболее четко выраженные морфологические структуры хромосом. Долгое время считалось, что их строение и функции связаны с какими-то особыми последовательностями ДНК. Однако удалось выявить лишь одну такую особенность на молекулярном уровне: при

сутствие в области центромер и теломер сателлитной ДНК; впрочем, о функциях этой ДНК ничего не известно. Изучение взаимосвязи структуры и функций стало возможным с появлением методов молекулярного клонирования, которые и помогут нам получить четкие данные на этот счет.

Последовательности в областицентромер

Строение центромер. У млекопитающих центромеры имеют сложную дискообразную структуру, называемую кииетохором. С каждой стороны хромосомы располагается по одному кинетохорному диску. Во время митоза микротрубочки фибрилл веретена прикрепляются непосредственно к плотному наружному слою кинетохора, связанному с петлями хроматина (рис. 9.48). Кинетохоры всех млекопитающих, по-видимому, сходны по своей структуре, поскольку все они образуют комплексы со специфическими антителами из сыворотки больных, страдающих редким аутоиммунным заболеванием системной склеродермой. С антителами взаимодействуют только кинетохоры митотических клеток, однако соответствующие комплексы образуются и в специфических участках интерфазных хромосом. Антитела не связываются с микротрубочками или с другими прикрепленными к ним белками.

ААРИС. 9.48.Прикрепление микротрубочек к центромерной области митотических хромосом. А. В клетках китайского хомячка микротрубочки присоединяются непосредственно к центромерным хроматиновым фибриллам (кинето- хору) (увеличение 40 000). [Н. Ris, Р. L. Witt, Chromosoma 82 (1981), р. 153.) Б. У дрожжей S. cerevisiae одиночные микротрубочки соединяют хромосомы с фибриллами веретена. Никакой напоминающей кинетохор структуры в месте прикрепления микротрубочек диаметром 20 нм к хроматиновым фибриллам (стрелки) не обнаружено (увеличение 48000). [J.B. Peterson, Н. Ris, J. Cell Science 22 (1976), р. 219.)РИС. 9.48.Прикрепление микротрубочек к центромерной области митотических хромосом. А. В клетках китайского хомячка микротрубочки присоединяются непосредственно к центромерным хроматиновым фибриллам (кинето- хору) (увеличение 40 000). [Н. Ris, Р. L. Witt, Chromosoma 82 (1981), р. 153.) Б. У дрожжей S. cerevisiae одиночные микротрубочки соединяют хромосомы с фибриллами веретена. Никакой напоминающей кинетохор структуры в месте прикрепления микротрубочек диаметром 20 нм к хроматиновым фибриллам (стрелки) не обнаружено (увеличение 48000). [J.B. Peterson, Н. Ris, J. Cell Science 22 (1976), р. 219.)Хромосомы дрожжей (5. cerevisiae) малы, и к

А

А

РИС. 9.48.

Прикрепление микротрубочек к центромерной области митотических хромосом. А. В клетках китайского хомячка микротрубочки присоединяются непосредственно к центромерным хроматиновым фибриллам (кинето- хору) (увеличение 40 000). [Н. Ris, Р. L. Witt, Chromosoma 82 (1981), р. 153.) Б. У дрожжей S. cerevisiae одиночные микротрубочки соединяют хромосомы с фибриллами веретена. Никакой напоминающей кинетохор структуры в месте прикрепления микротрубочек диаметром 20 нм к хроматиновым фибриллам (стрелки) не обнаружено (увеличение 48000). [J.B. Peterson, Н. Ris, J. Cell Science 22 (1976), р. 219.)

РИС. 9.48.

Прикрепление микротрубочек к центромерной области митотических хромосом. А. В клетках китайского хомячка микротрубочки присоединяются непосредственно к центромерным хроматиновым фибриллам (кинето- хору) (увеличение 40 000). [Н. Ris, Р. L. Witt, Chromosoma 82 (1981), р. 153.) Б. У дрожжей S. cerevisiae одиночные микротрубочки соединяют хромосомы с фибриллами веретена. Никакой напоминающей кинетохор структуры в месте прикрепления микротрубочек диаметром 20 нм к хроматиновым фибриллам (стрелки) не обнаружено (увеличение 48000). [J.B. Peterson, Н. Ris, J. Cell Science 22 (1976), р. 219.)

1,6 Т. П.Н-1,6 Т. П.Н-858 п.н.858 п.н.РИС. 9.49.

1,6 Т. П.Н-

1,6 Т. П.Н-

858 п.н.

858 п.н.

Получение из клонированного фрагмента дрожжевой ДНК CEN31 -сегмента. Сконструированный плазмидный вектор, содержащий дрожжевой ген TRPA и АЯ5-по- следовательность, использовали для создания геномной библиотеки. После трансфекции дрожжевых клеток mef14" и trpA " были отобраны колонии, растущие на среде без метионина и триптофана. Клетки из одной такой колонии содержали плазмиду с геном МЕТ34

в составе фрагмента дрожжевой ДНК длиной 5,2 т.п.н. (А), в котором присутствовала также функциональная центромера. Последующее субклонирование в векторе такого же типа (6, В, Г) позволило получить фрагмент ДНК размером 858 п.н., который все еще сохранял центромерную функцию, но не содержал гена МЕТ\4. Векторные последовательности выделены серым цветом.

каждой митотической центромере прикрепляется одна-единственная микротрубочка (у позвоночных это целые пучки микротрубочек). Среди известных эукариот только у S.cerevisiae не обнаружено центромерной сателлитной ДНК. Однако короткие сегменты ДНК (CEN) из центромер дрожжей все-таки выполняют функции как митотических, так и мейо- тических центромер в рекомбинантных векторах (разд. 5.6.6).

Клонирование дрожжевых СEN-областей. С помощью детального генетического картирования хромосом S. cerevisiae выявлены некоторые гены, расположенные очень близко к центромерам. Например, ген МЕТ 14, необходимый для биосинтеза метионина, тесно сцеплен с центромерой хромосомы 11 (С£А11). Такое сцепление позволило провести клонирование самой центромерной последовательности. С помощью дрожжевого синтетического плазмидного вектора была создана библиотека геномных последовательностей дрожжей, а затем выделена колония, содержащая плазмидный вектор с геном МЕТ 14 (рис. 9.49). По данным генетического анализа, эта плазмида, по-видимому, содержит также и функциональную центромеру, поскольку она стабильно сохраняется в дрожжевых клетках, число ее копий ограничивается одной плазмидой на клетку и она сегрегирует при митозе и мейозе как истинная «мини-хромосома». Путем

субклонирования выделен фрагмент ДНК длиной 858 п. н., выполняющий функции центромеры. Клонированы центромерные сегменты и других дрожжевых хромосом; нуклеотидные последовательности некоторых из них представлены на рис. 9.50. Минимальная длина сегмента, полностью сохраняющего центромерную функцию, составляет примерно 150 п. н.

Последовательности в области дрожжевых центромер. На рис. 9.50 суммированы общие и отличительные структурные особенности некоторых CEN- областей. Все фланкирующие последовательности центромер различаются. Несмотря на то что CEN- области не гибридизуются друг с другом в жестких условиях, они все же имеют два коротких гомологичных участка (элементы I и III на рис. 9.50). Элементы I и III разделены АТ-богатым элементом II. Делеция сегмента протяженностью от элемента I по элемент III включительно приводит к утрате плазмидой функций митотической и мейотической центромеры. Как показывают опыты по внесению специфических мутаций и делеций в эти сегменты, функционирование митотической центромеры зависит от целостности элемента III и в меньшей степени-от целостности элементов I и II, в то время как для функционирования мейотической центромеры необходимы все три элемента. Были проведены также эксперименты, в которых из хромосомы уда-

Элемент!Элемент!!Элемент III

CEN3 ATAAGTCACATGAT--»™^^ТДААД

CENA AAAGGTCACATGCt —-g^T—GTTTATGATTACCGAAACA- TAAAA CENb TTTCATCACGTGCT— 956^T—6T TTT TG TT TTCCGAA GATG TA A A A CEN11 ATAAGTCACATGAT---^^---GT ТС A T 6 AT TTCC GA ACGTATA A A A CENU GTTAG TC ACGTGCA--- 84th---GT ATTTGTC TT С CGAA A AG • TA A A A

РИС. 9.50.

Консервативные нуклеотидные последовательности некоторых С£А/-областей дрожжей. Высококонсервативные участки выделены цветными прямоугольниками.

ляли сегмент длиной 627 п. н., содержащий CEN3 (рис 9.51). Такая ацентрическая хромосома в дрожжевых кластерах нестабильна. Однако если сегмент длиной 627 п. н. инвертирован, то хромосома функционирует нормально. Самое удивительное, что CEN 3-область хромосомы 3 можно без каких-либо последствий полностью заменить клонированной CEN 11 -областью. Этот опыт показывает, что функциональные центромеры не обязательно хромосомоспецифичны. Более того, совершенно ясно, что спаривание гомологичных хромосом в мейозе зависит не от гомологичности центромер, а, вероятнее всего, от сходства плечей хромосом.

Точками обозначены пропущенные основания. Отметьте, что в элементе III имеется внутренний палиндром.

Участки хроматина дрожжей, содержащие элементы 1-Ш в СЕЛ-'-области, более устойчивы к действию ДНКазы I и микрококковой нуклеазы, чем окружающие их последовательности. Эта устойчивость сохраняется даже в том случае, когда CEN находится в мини-хромосомных векторах. Отсюда следует, то хроматин в этих участках имеет необычную структуру. Возможно, устойчивость к действию нуклеаз определяется связыванием с центромерой специфических белков, прикреплением ДНК к микротрубочкам или одновременно тем и другим. Недавно такие ДНК-связывающие белки были обнаружены в экстрактах дрожжевых клеток;

Хромосомаз дикого типа

Ацентрическая хромосома* ЦЯАЗ (CEN3 делетирован)

и™»-"*™»

I Нестабильная

Е при митозе

РИС. 9.51.

Влияние изменений CEN-последовательностей на функцию центромеры. Вверху представлена хромосома 3 дикого типа. Хромосомы, показанные ниже, получены путем сайт-специфической трансформации одной из двух хромосом 3s диплоидных клеток. Трансформированные дрожжевые колонии выделяли, используя селек

тивный маркер URA3. Заштрихованные участки последовательности, фланкирующие CEN3. которые использовали для гомологичной рекомбинации в трансформирующих векторах. Справа указаны фенотипы, соответствующие измененным хромосомам 3. [L. Clark, J. Carbon, Nature 305 (1983), р. 23.]

Место прикрепления микро-трубочки диаметром 20нм

220л. н.

Диаметр 15-20 нмДиаметр 15-20 нмУстойчива к нуклеазамУстойчива к нуклеазам160 п.н., диаметр 11 нм160 п.н., диаметр 11 нм

Диаметр 15-20 нм

Диаметр 15-20 нм

Устойчива к нуклеазам

Устойчива к нуклеазам

160 п.н., диаметр 11 нм

160 п.н., диаметр 11 нм

РИС. 9.52.

Модель структуры дрожжевой хромосомы, основанная на данных о строении CENA 1. Функциональные центромерные последовательности, содержащие элементы I, II и III (220 п. н.), фланкированы хроматином с типичными нуклеосомами. Эти последовательности связываются со

специфичными к центромерам ДНК-связывающими белками, что обеспечивает их защиту от действия ДНКаз. Микротрубочка прикрепляется к сердцевине центромеры (по-видимому, функциональному кинето- хору). [J.S. Bloom, J. Carbon, Cell 29 (1982), р. 305.]

для этого исследовали защиту ДНК от экзонуклеазы III. которая проявляется в изменении электрофоретической подвижности нуклеазных фрагментов ДНК в геле. На рис. 9.52 представлена одна из моделей структуры дрожжевых центромер. В этой модели С£7\/-область вместе с ДНК-связывающими белками образуют кинетохор, к которому прикрепляются микротрубочки на стадии подготовки к сегрегации. Эта модель иллюстрирует одну из возможных функций С£7У-последовательностей, но в ней не объясняется, как эти последовательности регулируют число копий мини-хромосом и хромосом. Возможно, репликация C£N-cerMeHTOB завершается только в анафазе митоза или анафазе II мейоза. Это означает, что последовательности, расположенные с одной или с обеих сторон от С£М-области, могут блокировать прохождение репликационной вилки до появления специфического сигнала, разрешающего окончание репликации в анафазе. В таком случае число хромосом не будет превышать одной на дочернюю клетку.

Последовательности в областителомер

Теломеры, концы эукариотических хромосом, являются также и концами линейного дуплекса ДНК. С этими структурами связаны две важные проблемы. Первая касается репликации: каким образом достраиваются 5'-концы хромосомного дуплекса, если ДНК-полимеразы не инициируют синтез новых цепей (разд. 2.1)? Как решается этот во

прос-так же, как и при репликации линейного дуплекса аденовирусов, или с помощью альтернативных механизмов? Вторая проблема связана со стабильностью концов ДНК в эукариотических клетках. Вообще говоря, если разрывы в ДНК не репарируются немедленно с помощью лигирования, то происходит деградация ДНК под действием эндонуклеаз или рекомбинация. Однако концы хромосом стабильны, а отдельные хромосомы в норме не соединяются конец-в-конец. По-видимому, теломеры обладают какими-то особыми молекулярными свойствами. Правильность такого предположения была подтверждена с помощью молекулярного клонирования. Многообещающим началом послужило обнаружение специфических свойств у простейших жгутиковых, в частности у Tetrahymena.

Клонирование теломерных последовательностей. У некоторых простейших геном зародышевой линии изолирован в микронуклеусе, а для экспрессии генов они формируют «соматический» макронуклеус. ДНК макронуклеуса содержит лишь часть микро- нуклеарных последовательностей; она фрагментирована, и в ней присутствует множество копий коротких линейных сегментов ДНК, каждый из которых содержит ограниченное число генов. В макронуклеусе у Tetrahymena короткие линейные дуплексы, содержащие гены рРНК, представлены в достаточном количестве, чтобы их можно было выделить и охарактеризовать, не прибегая к клонированию. На концах этих молекул имеется от 20 до 70 тандемных повторов гексануклеотидной последовательности 5'-ССССАА-3' (соответственно в другой

В

Трансфекция дрожжевых клеток 1еи2~, отбор клеток LEU2*

6TGGTGGGT

3'

Лигирование, трансфекция, , отбор клеток 5LEU2*

САССАСССА

РИС. 9.53.

Концы фрагментов макронуклеарной ДНК Tetrahymena (А) выполняют функции, аналогичные функциям теломер у дрожжей. Точками обозначены одноцепочечные разрывы. Концевые фрагменты рДНК. отщепленные с помощью рестриктирующих эндонуклеаз, пришивали к линейному челночному вектору дрожжи -Е coli. Линейные рекомбинантные молекулы трансфицировали в дрожжевые клетки, где происходила их репликация (5). Реплицированные линейные дуплексные молекулы выделяли (В) и использовали для создания вектора, предназначенного для клонирования дрожжевых теломер (Г). Фрагменты, получившиеся после расщепления рестриктирующей эндонуклеазой (НЕ), лигировали с фрагментами, образоваешимися при зндонуклеазном расщеплении всего дрожжевого генома. Из LEU2*-клеток, отобранных после трансфекции дрожжевых клеток

!еи2 этими рекомбинантными молекулами, были выделены стабильные, реплицирующиеся дуплексы (Д). Эти дуплексы содержали две дрожжевые теломеры, к одной из которых была присоединена теломера Tetrahymena, присутствовавшая в векторе (Г) Как показал последующий анализ после репликации молекулы Б в дрожжевых клетках последняя приобретала типичные дрожжевые теломеры (5) с концевыми повторами СПА, где л= 1, 2 или 3. На рисунке дрожжевые теломеры выделены более темным цветом чем теломеры Tetrahymena Заметим, что молекула Д может реплицироваться в отсутствие ARS последовательности, представленной в молекуле Б, по-видимому, потому, что эта последовательность присутствует в присоединенном сегменте дрожжевой теломеры.

цепи - 5'-TTGGGG-3') (рис. 9.53, Л). В определенных местах С-богатых сегментов встречаются одноцепочечные разрывы, а на концах молекул имеются шпильки с петлей. Таким образом, «концы» рДНК отличаются от нормальных концов ДНК. Эти структуры как раз и представляют собой функциональные теломеры и проявляют себя в этом качестве при введении в дрожжевые клетки в составе линейных векторов (рис. 9.53,5). Итак, линейные фрагменты ДНК, содержащие дрожжевые ARS (автономно реплицирующиеся последовательности) и концевые участки, происходящие от рДНК Tetrahymena, стабильно реплицируются в дрожжевых клетках. В отсутствие таких концов линейные фрагменты, как правило, оказываются крайне нестабильными.

Выделенные из дрожжей реплицированные линейные рекомбинантные молекулы (рис. 9.53,5) использовались в качестве векторов для клонирования самих теломер дрожжей. Один из необычных концов сначала удалили, расщепив дуплекс соответствующей рестриктирующей эндонуклеазой (рис. 9.53, /). К отрезанному концу пришили рестрици- рованную дрожжевую ДНК. После трансфекции были отобраны клетки, содержащие молекулы, которые реплицировались в дрожжевых клетках как стабильные линейные ДНК (рис. 9.53, Г). Функциональные дрожжевые теломеры, выделенные путем субклонирования, использовали для определения числа копий этих последовательностей в геноме дрожжей. Оказалось, что на гаплоидный геном приходится 30-40 таких копий - именно столько, сколько и должно быть при условии, что гомологичные сегменты находятся на каждом из концов всех 16 хромосом дрожжей.

Структура дрожжевой теломеры весьма сходна со структурой теломеры у Tetrahymena. Одна из цепей содержит тандемный повтор 5'-С„А-3' (п = 1, 2 или 3), в котором в определенном месте имеется одпоцепочечный разрыв. Как показали дополнительные эксперименты, похожие тандемные повторы содержатся в теломерах многих примитивных эукариот (например, у трипаносом имеется повтор 5'-СССТАА-3'). На самых концах хромосом, как правило, находятся очень короткие С- и А-богатые последовательности. У некоторых видов (например, S.cerevisiae) очень близко к концам располагаются другие тандемные повторы с более длинными повторяющимися единицами. Они могут участвовать в различных теломерных взаимодействиях, в частности в связывании теломер между собой и в присоединении теломеры к ядерной мембране. У дрожжей и жгутиковых найдены белки, которые связываются с теломерными повторами. Вероятно, эти белки стабилизируют концы хромосом, защищая ДНК от деградации и лигирования.

Элонгация теломер во время репликации. При репликации линейных ДНК, содержащих теломеры из Tetrahymena, в дрожжевых клетках концы ново- синтезированных молекул модифицируются (ср. рис. 9.53,5 и 5). После репликации они наращиваются приблизительно на 200 п. н. путем добавления тандемных повторов 5'-С„А-3', характерных для теломер дрожжей, но не для Tetrahymena. Кроме того, одноцепочечные разрывы в этих повторах располагаются так же, как в теломерах дрожжей, а не Tetrahymena. Аналогичные данные были получены и при исследовании структуры теломер некоторых других видов с использованием гетерологичных хозяйских клеток. Элонгация концов хромосом, по-видимому, является частью нормальной репликации. Так, у трипаносом клонированные теломерные зонды гибридизовались с рестрикционными фрагментами ДНК, выделенными на разных стадиях синхронизованной многократной репликации, начиная с одной клетки. В течение нескольких сотен генераций фрагменты, которые гибридизовались с зондом, увеличивались в длину на 7-10 п. н. за каждую генерацию (и соответственно утрачивали большую часть из добавленных пар оснований). Сходные данные были получены и для Tetrahymena.

Проблемы, связанные с загадочными свойствами теломер дрожжей и простейших жгутиковых, получили частичное разрешение с открытием фермента теломеразы-терминальной дезоксинуклеоти- дилтрансферазы. Этот фермент, выделенный из Tetrahymena, присоединяет повтор 5'-TTGGGG-3', последовательно по одному нуклеотиду, к З'-кон- цам специфических олигонуклеотидных праймеров (TTGGGG)„ (Tetrahутепа) и (TGTGTGGG),, (дрожжи). Таким образом, теломераза может строить теломеры, при этом родительская ДНК не используется в качестве матрицы (рис. 9.54). Теломераза-это крупный рибонуклеопротеиновый комплекс; для проявления ее ферментативной активности необходимы как РНК, так и белки. Теломеразная РНК содержит последовательность 5'-СААССССАА-3', которая, по-видимому, и служит матрицей для синтеза олигонуклеотида TTGGGG. Эти недавно полученные данные не проясняют механизма синтеза С-богатой теломерной цепи. Возможно, матрицей и затравкой здесь служат G-богатые повторы. Шпильки с петлями содержат G-богатый участок и стабилизируются благодаря необычным взаимодействиям между остатками гуанина.

Эти механизмы, открытые при изучении одноклеточных, вероятно, свойственны большинству эукариот. Клонирование и секвенирование теломерных последовательностей растения Arabidopsis и человека показывают, что они состоят из олигонуклеотидных повторов, очень близких повторам

(ААСССС)п

'А. (TTGGGG)n'А. (TTGGGG)nРаспрямление

'А. (TTGGGG)n

'А. (TTGGGG)n

З'-гидроксильного конца цепи,содержащей S’-(TTGGG)n-3'

(( Ц (( О5'

(I « « о5’(I « « о5’| (TTGGGG)n0| (TTGGGG)n0Терминальная теломерная нуклеотидил-трансфераза, dGTP,TTP

(I « « о5’

(I « « о5’

| (TTGGGG)n0

| (TTGGGG)n0

Праймаза, ДНК-полимераза, неполное лигирование, повторное "схлопывание"

РИС. 9.54.

Гипотетическая схема образования теломеры Tetrahymena. В верхней части рисунка представлено образование петли на конце цепи, содержащей последовательность 5'-(TTGGGG)n-3', и одноцепочечных разрывов в противоположной цепи, содержащей последовательность 5'-(ССССАА)п-3'. К З'-концу нижней цепи с помощью теломерной нуклеотидилтрансферазы (тело- изомеразы) присоединяются поспедоватепьно, по одному нуклеотиду, единицы 5'-TTGGGG-3'. Праймаза и ДНК-полимераза копируют 5'-(ТТСССС)п-3'-цепь с образованием новых 5-(ССССАА)п-3'-единиц. В результате неполного лигирования в С-богатой цепи остаются одноцепочечные разрывы. На З'-конце 5'-(TTGGGG)n-3'-uenn вновь образуется петля, стабилизируемая взаимодействиями между остатками гуанозина. [C.W. Greider, Е. Н. Blackburn, Cell 43 (1985), р. 405.]

жгутиковых и дрожжей. Теломераза обнаружена и в клетках человека.

Образование множественных теломер в макронуклеусах простейших. Рассмотрим еще раз структуру рДНК Tetrahymena. В диплоидной ДНК микронуклеуса Tetrahymena имеются всего два гена рДНК. В результате их амплификации в макронуклеусе образуются сотни линейных молекул, каждая из которых содержит рДНК и теломерную структуру. Однако в микронуклеусе рДНК не является теломерной. Кроме того, большинство линейных дуплексных ДНК длиной от 2 до 100 т. п. н.,

типичных для макронуклеуса Tetrahymena, имеют одинаковые концевые последовательности. Эти молекулы содержат кроме рДНК много других генов и образуются согласно общей программе фрагментации (и элиминации) ДНК, которая приводит к развитию соматического макронуклеуса. Подобная картина наблюдается у другого простейшего жгутикового. Oxytricha, за исключением того, что концевой теломерный повтор представляет собой последовательность 5'-ССССАААА-3', характерную для теломеры Oxytricha из хромосомы микронуклеуса. Например, ген макронуклеарного актина Oxytricha, содержащийся во фрагменте длиной 1,6 т. п. н., фланкирован четырьмя копиями последовательности 5'-ССССАААА-3' (или 5'-TTTTGGGG-3')- Как образовались такие концевые сегменты? У Tetrahymena в местах расщепления микронуклеарной ДНК, происходящего при формировании макронуклеар- ных фрагментов ДНК, находится консервативная последовательность длиной 15 п. н. (рис. 9.55). которая, по-видимому, содержит сайт для специфической эндонуклеазы. После (или в процессе) расщепления некоторые из окружающих этот сайт последовательностей ДНК удаляются, и, вероятно, с помощью терминальной нуклеотидилтрансферазы достраиваются 5'-ССССТТ-3'-концы-так, как это описано в предыдущем абзаце. Отметим, что мик- ронуклеарные предшественники фрагментов ДНК макронуклеуса как у Tetrahymena, так и у Oxytricha совсем не обязательно должны содержать фланкирующие 5'-СССС(А)„Т-3'-повторы. Итак, при образовании макронуклеарной ДНК происходят вырезание сегментов из ДНК микронуклеуса, утрата части некодирующей фланкирующей ДНК, присоединение олигонуклеотидных повторов, образование шпилек и, наконец, формирование функциональных теломер. Шпильки, вероятно, стабилизируют фрагменты ДНК, предотвращая их деградацию и неправильное сшивание с другими дуплексами.

Искусственные хромосомыдрожжей

В настоящее время в распоряжении исследователей имеются все сегменты ДНК. необходимые для конструирования функциональных дрожжевых хромосом. Клонированные фрагменты, содержащие ARS- последовательность для репликации, CEN-элемент для формирования центромеры и теломерные сегменты, можно сшить между собой in vitro в нужном порядке. Чтобы включить в хромосому один или несколько селективных маркерных генов, например LEU2 или HIS3, в линейный дуплекс можно встроить соответствующие сегменты ДНК (рис. 9.56). Если суммарная длина линейной ДНК составляет менее 20 т. п. н., то синтетические хромосомы

5 (3-конец э'( (ДНК5 (3-конец э'( (ДНКЪ' (Уконец3Д рДНКЪ' (Уконец3Д рДНКМикронуклеусМикронуклеусМакронуклеусМакронуклеусTTG6GG7TGGGG' 'GGG'ТТ> GGGДАССССTTG6GG7TGGGG' 'GGG'ТТ> GGGДАСССС120-420 п.н.,присое-диняющмеся к свободному концу дуплекса120-420 п.н.,присое-диняющмеся к свободному концу дуплексаРИС. 9.55.

5 (3-конец э'( (ДНК

5 (3-конец э'( (ДНК

Ъ' (Уконец

3Д рДНК

Ъ' (Уконец

3Д рДНК

Микронуклеус

Микронуклеус

Макронуклеус

Макронуклеус

TTG6GG7TGGGG' 'GGG'ТТ> GGG

ДАСССС

TTG6GG7TGGGG' 'GGG'ТТ> GGG

ДАСССС

120-420 п.н.,присое-

диняющмеся к свободному концу дуплекса

120-420 п.н.,присое-

диняющмеся к свободному концу дуплекса

З'-концевыв последовательности в микро- и макронук- леарной рДНК Tetrahymena. Фигурной скобкой обозначена последовательность длиной 15 п. н„ в которой происходит расщепление. В микронуклеарной ДНК, в

отличив от рДНК макронуклеуса, присутствует только одна копия последовательности 5'-ССССАА. [В. О. King, М.-С. Yeo, Cell 31 (1982), р. 177; М.-С. Yao, К. Zheng, С.-Н. Yao, Cell 48 (1987), р. 779.]

оказываются нестабильными во время митоза, и центромера не контролирует число копий. В результате в каждой клетке накапливается множество молекул. Если же длина ДНК превышает 50 т. п. н., то поддерживается стабильность хромосом, осуществляется контроль за числом их копий и происходит правильное расхождение хромосом. Молекулы длиной 150 т. п. н. ведут себя более или менее нормально как в митозе, так и в мейозе. Очевидно, для того чтобы хромосомы могли перемещаться при клеточном делении, их длина должна быть не меньше определенной величины. Такие искусственные хромосомы дрожжей используются в качестве векторов при клонировании очень длинных сегментов ДНК с целью картирования сложных эукариотических геномов.

ГЕНОМЫ ОРГАНЕЛЛЭУКАРИОТ: ДНК МИТОХОНДРИЙИ ХЛОРОПЛАСТОВ

Отличительная особенность клеток эукариот состоит в том, что часть генетической информации у них заключена в молекулах, находящихся вне хромосом, локализованных в ядре. Существуют два типа таких цитоплазматических ДНК: одни нахо

дятся в митохондриях эукариот, другие-в хлоропластах зеленых растений и водорослей. Как и все цитоплазматические элементы, они наследуются по материнской линии, а не по законам Менделя.

Большинство белков, из которых построены функциональные и структурные компоненты митохондрий и хлоропластов, кодируются хромосомной ДНК, синтезируются на рибосомах в цитоплазме и транспортируются в соответствующие органеллы (разд. ЗЛО.в). Однако несколько белков кодируются неядерной ДНК и синтезируются на особых рибосомах органелл. Таким образом, органеллы-это результат объединенных усилий двух геномов и двух трансляционных аппаратов. РНК-компоненты рибосом органелл, а также тРНК, использующиеся при трансляции, кодируются геномами митохондрий и хлоропластов.

2020HIS3, дрожжиHIS3, дрожжиТеломераТеломераPBR322PBR322ARS, дрожжиARS, дрожжиTRP1, дрожжиTRP1, дрожжиCEN 3, дрожжиCEN 3, дрожжиРИС. 9.56.Функциональная искусственная хромосома дрожжей. [A. W. Murray, J.W. Szostak, Nature 305 (1983), р. 189.]РИС. 9.56.Функциональная искусственная хромосома дрожжей. [A. W. Murray, J.W. Szostak, Nature 305 (1983), р. 189.]Очевидно, что взаимодействие между продуктами хромосомных, митохондриальных и хлоропластных генов обусловлено генетически. Например, мутации в митохондриальной ДНК у дрожжей и кукурузы могут супрессироваться хромосомными мутациями. Определенные виды мужской стерильности (образование стерильной пыльцы), широко распространенные у растений, вызваны мутациями в митохондриальной ДНК и наследуются не в соответствии

20

20

HIS3, дрожжи

HIS3, дрожжи

Теломера

Теломера

PBR322

PBR322

ARS, дрожжи

ARS, дрожжи

TRP1, дрожжи

TRP1, дрожжи

CEN 3, дрожжи

CEN 3, дрожжи

РИС. 9.56.

Функциональная искусственная хромосома дрожжей. [A. W. Murray, J.W. Szostak, Nature 305 (1983), р. 189.]

РИС. 9.56.

Функциональная искусственная хромосома дрожжей. [A. W. Murray, J.W. Szostak, Nature 305 (1983), р. 189.]

с законами Менделя, а по материнской линии. Фертильность таких растений может восстановиться в результате мутаций в хромосомных генах; разные виды мужской стерильности цитоплазматической природы отличаются друг от друга, поскольку фертильность восстанавливается в результате мутаций в разных хромосомных генах.

В табл. 9.14 перечислены некоторые компоненты митохондрий, кодируемые ядерными генами. Даже отдельные ферменты могут состоять из полипептидов, кодируемых двумя разными геномами. Более того, экспрессия некоторых митохондриальных генов зависит от активности продуктов ядерных генов (например, процессинг транскриптов дрожжевой митохондриальной ДНК с образованием функциональных мРНК). В табл. 9.14 приведены лишь общие данные; разные организмы имеют свои особенности. Ген, находящийся в митохондриальной ДНК у одного организма, может быть хромосомным у другого; иногда гены, кодирующие данный полипептид, содержатся в обоих геномах. Аналогичная картина наблюдается и в хлоропластах.

Геномы митохондрий

Многие митохондриальные геномы представляют собой замкнутые кольцевые сверхспиральные дуплексные ДНК. Большинство из них кодируют сходные функции. Но сделать еще какие-то обобщения относительно митохондриальных ДНК довольно трудно. Иногда даже близкородственные виды

Таблица 9.14. Геномный источник некоторых компонентов митохондрий1*

Хромосомы (ядро)

Митохондрии

Ферменты + факторы репликации

РНК-полимераза 4- факторы транскрипции

Ферменты сплайсинга РНК

Матуразы, участвующие

(дрожжи)

в сплайсинге (дрожжи)

Рибосомные белки

Один рибосомный белок

Аминоацил-тРНК- синте-

(дрожжи) тРНК

тазы

Факторы трансляции

рРНК

Субъединицы цитохром-

Субъединицы цитохром-

оксидазы

оксидазы

Субъединицы АТРазы

Субъединицы АТРазы

Субъединицы NADH-де-

Субъединицы NADH-де-

гидрогеназы

гидрогеназы

11 Распределение компонентов немного различается у разных организмов. Фермент дыхательной цепи NADH-дегидрогеназа известен также под названием комплекса I или NADH-убихинон оксидоредуктазы.

имеют совершенно разные рестриктные карты и лишь частично совпадающие нуклеотидные последовательности. Расположение гомологичных генов в кольцевой ДНК также различается. Иногда у отдельного растения присутствуют митохондриальные геномы разных размеров, при этом они представлены как линейными, так и кольцевыми молекулами. Митохондрии других организмов, включая некоторые грибы и простейшие, имеют линейные геномы.

Геномы митохондрий существенно различаются по размеру. У животных они относительно малы и обычно не превышают 20 т. п.н. Однако дрожжевые митохондриальные ДНК состоят из примерно 80 т. п. н., а длина митохондриальных ДНК растений варьирует от нескольких сотен до нескольких тысяч т. п. н. Все митохондриальные ДНК обладают весьма интересным свойством - они не метилированы. В очень крупных митохондриальных геномах подавляющую долю избыточной ДНК составляют некодирующие последовательности с неизвестной функцией. Напротив, митохондриальные ДНК млекопитающих организованы весьма рационально, и между генами почти нет промежутков.

Митохондриальная ДНК эволюционирует гораздо быстрее, чем ядерная, и мутации в ней происходят почти в десять раз чаще. В результате возникает широкий внутривидовой полиморфизм, и ощутимые изменения выявляются даже в пределах нескольких поколений. Благодаря высокой скорости мутирования полиморфизм эндонуклеазных сайтов становится очень удобным параметром при популяционно-генетических исследованиях растений и животных, в том числе и человека.

Митохондриальная ДНК млекопитающих. Нуклеотидная последовательность митохондриальной ДНК некоторых млекопитающих полностью установлена (рис. 9.57). Организация всех этих геномов близка к организации геномов Drosophila и Xenopus. Тем не менее одни локусы могут быть сходны на 20%, а другие-на 90%; значительные различия наблюдаются даже в пределах одной кодирующей области.

Нуклеотид, обозначенный на рис. 9.57 цифрой 1, указывает точку начала репликации митохондриальной ДНК и находится в области, существенной для регуляции экспрессии митохондриальных генов. Если двигаться от этого нуклеотида по часовой стрелке вдоль митохондриальной ДНК человека, то первым будет ген гРНК™'; далее идет ген РНК малой субъединицы митохондриальных рибосом-ген 12S-pPHK и т.д. Большинство генов, кодирующих РНК или белки, разделены одним или более тРНК-генами. Промежутки между генами, как правило, не превышают 25 п. н. и в большинстве

tRNAprctRNAthr OR1(H) cvtb/tRNAprctRNAthr OR1(H) cvtb/ND6ND616SrRNA16SrRNAND5ND5ND1ND116 569 п.н.16 569 п.н.tRNAhistRNAhisND4ND4ND4LND4LtRNAar9tRNAar9ROODROODtRNAsertRNAsertRNAleu tRNAser_tRNAleu tRNAser_lRNA,eulRNA,eutRNAlle tRNAR,n tRNAF"meltRNAlle tRNAR,n tRNAF"melND3 irna®1^ coinND3 irna®1^ coinATPase6ATPase6ATPaseBATPaseB| СОП tRNAasp tRNAWs| СОП tRNAasp tRNAWstRNA9’“tRNA9’“,tRNAphe 12SrRNA tRNAVBl,tRNAphe 12SrRNA tRNAVBl44ND2 tRNAtrp -tRNAala tRNAasn 'ORI(L) tRNAc*s tRNA*VrND2 tRNAtrp -tRNAala tRNAasn 'ORI(L) tRNAc*s tRNA*VrРИС. 9.57.

tRNAprc

tRNAthr OR1(H) cvtb/

tRNAprc

tRNAthr OR1(H) cvtb/

ND6

ND6

16SrRNA

16SrRNA

ND5

ND5

ND1

ND1

16 569 п.н.

16 569 п.н.

tRNAhis

tRNAhis

ND4

ND4

ND4L

ND4L

tRNAar9

tRNAar9

ROOD

ROOD

tRNAser

tRNAser

tRNAleu tRNAser_

tRNAleu tRNAser_

lRNA,eu

lRNA,eu

tRNAlle tRNAR,n tRNAF"mel

tRNAlle tRNAR,n tRNAF"mel

ND3 irna®1^ coin

ND3 irna®1^ coin

ATPase6

ATPase6

ATPaseB

ATPaseB

| СОП tRNAasp tRNAWs

| СОП tRNAasp tRNAWs

tRNA9’“

tRNA9’“

,tRNAphe 12SrRNA tRNAVBl

,tRNAphe 12SrRNA tRNAVBl

4

4

ND2 tRNAtrp -tRNAala tRNAasn 'ORI(L) tRNAc*s tRNA*Vr

ND2 tRNAtrp -tRNAala tRNAasn 'ORI(L) tRNAc*s tRNA*Vr

Митохондриальная ДНК человека. Гены, кодирующие белки, выделены темно-серым цветом; они кодируют три большие субъединицы цитохром с-оксидазы (COI, СОИ, СОШ), цитохром b (cyt6), субъединицы 6 и 8 АТРазного комплекса и субъединицы NADH-дегидро- геназного комплекса (ND). Гены, кодирующие различные рРНК, выделены светло-серым цветом, а гены тРНК- окрашенными полосками. Каждый ген имеет свое систематическое название, но для простоты здесь и на рис. 9.58 указаны только сокращенные обозначения соответствующих генных продуктов. Точками отмечена примерная локализация сайтов инициации транскрип

случаев составляют менее 3 п. и. Иногда (например, в случае генов тРНК изолейцина и тРНК глутамина, а также генов АТРазных субъединиц 6 и 8) гены перекрываются.

Транскрипция митохондриальной ДНК млекопитающих. В отличие от большинства эукариотических генов, каждый из которых представляет собой независимую транскрипционную единицу, обе цепи всего митохондриального генома транскрибируются с образованием одной молекулы РНК, начинающейся от сайта вблизи точки начала репликации тяжелой цепи ДНК-ORI-H (цепь называется тяжелой, поскольку при равновесном центрифугировании денатурированной ДНК в градиенте плотности CsCl она образует полосу с более высокой плотностью, чем другая, легкая цепь). Кроме того,

ции двух цепей. Отметим, что с Н-цепи как матрицы транскрибируются две РНК (по часовой стрелке). Из короткого РНК-транскрипта образуется рРНК, а из длинного-мРНК и большинство тРНК. На L-цепи образуется только один полноразмерный транскрипт. Ген 7S-PHK транскрибируется против часовой стрелки в непосредственной близости к сайту инициации. Возможно, эта РНК играет роль регулятора транскрипции или созревания. Участки, выделенные точками,- сайты инициации репликации ДНК. Маленькими стрелками обозначено 5'-» З'-направление смысловой цепи в различных генах.

образуются более короткие транскрипты Н-цепи, заканчивающиеся на З'-конце гена 16S-pPHK. Этих коротких транскриптов в десять раз больше, чем длинных: после процессинга из них образуются 12S-pPHK, 16S-pPHK, а также тРНКРЬе и TPHKVal. Изобилие этих транскриптов обеспечивает быстрое накопление рРНК. Из более длинных транскриптов Н-цепи и транскриптов L-цепи в результате процессинга образуются мРНК и другие тРНК. Функциональные РНК транскрибируются с обеих цепей, хотя одна из них, L-цепь, является основной матрицей и гибридизуется с большинством зрелых молекул РНК (рис. 9.57).

Цепи митохондриальной ДНК транскрибируются специфической митохондриальной РНК-полиме- разой, которая кодируется ядерной ДНК. Ни ме-

ханизм инициации транскрипции, ни механизм превращения очень длинных первичных транскриптов в отдельные молекулы РНК до конца не ясны. Установлено, что промоторы содержатся в сегментах ДНК длиной 40 п. н. или менее, обрамляющих сайты начала транскрипции. Они неодинаковы у разных видов млекопитающих; видоспецифичны и митохондриальные РНК-полимеразы. В современных моделях уникальная роль в созревании длинных молекул РНК отводится тРНК-кодирующим сегментам, которые фланкируют почти все гены. Дело в том, что молекулы тРНК в длинных транскриптах, по-видимому, образуют внутримолекулярные шпилечные структуры. Эти структуры распознаются специфическими рибонуклеазами, вероятно сходными с РНКазой Р E.coli; фермент разрезает их с обеих сторон, в результате чего образуются молекулы тРНК и рРНК или мРНК. И действительно, в митохондриях млекопитающих была выявлена РНКаза P-подобная активность. Процессированные транскрипты претерпевают затем обычные превращения (созревают): мРНК полиаденилируются, тРНК приобретают каноническую З'-концевую последовательность и 5'-ССА. Однако 5'-концы мРНК не кэпируются, что необычно для эукариот. Сплайсинга не происходит, поскольку ни один из генов не содержит вставочных последовательностей.

Транскрипты L-цепи существенны также для инициации синтеза ДНК в точке ORI-Н. По-видимому, некоторые из этих транскриптов разрезаются

в пределах участка длиной примерно 200 нуклеотидов, начиная от сайта инициации транскрипции. Эти короткие молекулы РНК служат затем затравкой при репликации ДНК.

Необычный трансляционный аппарат митохондрий м ккопитающих. Структура митохондриальных мРНК обладает особенностями, ставящими ряд проблем с точки зрения трансляции. В них отсутствуют не только типичные кэп-структуры. но и протяженные 5'-лидерные последовательности слева от инициирующих кодонов, так что рибосомы митохондрий должны узнавать и связывать мРНК каким-то другим способом. Еще одна особенность трансляции у митохондрий состоит в использовании необычных кодонов: инициирующими кодонами могут быть, помимо AUG, также и метиониновые кодоны AUA, AUU и AUC (табл. 9.15). Универсальные стоп-кодоны UAA и UAG используются и в митохондриях млекопитающих, однако еще один обычный стоп-кодон, UGA, кодирует триптофан. Универсальные аргининовые кодоны AGA и AGG служат стоп-кодонами и не кодируют никаких аминокислот.

Кодон АнтикодонКодон АнтикодонКодон АнтикодонКодон Антикодон^ Р- ААСUCUSa ser AGUUGGUAC ‘УГ AUGUGUACCUGC c's ACGUUG l6U MUUAA СтопUAGUGAUGG trP ACUсииSa leu GAUcueccu ccc CCA РГ° GGUCCGGAG his GUGCGUCGA аГ8 GGUCGG^ 9^ GUUAUU 4AUC "e UAGACUAGG thr UGUАСАACGAAU_„, _.asn UUGAACAGU.ACC SCrUCGAUUAUA mEtUACAUGAAA,„„,AAGU UAGA Стоп AGGGUUGUA Va* ^GUGGCUGCC । г'Г'х tGCA 3la CGUGCGCAUGAC aSP CUGGGUCGC i ccvGCA 8ly CCUGGGgag 9iu cuuКодон АнтикодонКодон АнтикодонКодон АнтикодонКодон Антикодон^ Р- ААСUCUSa ser AGUUGGUAC ‘УГ AUGUGUACCUGC c's ACGUUG l6U MUUAA СтопUAGUGAUGG trP ACUсииSa leu GAUcueccu ccc CCA РГ° GGUCCGGAG his GUGCGUCGA аГ8 GGUCGG^ 9^ GUUAUU 4AUC "e UAGACUAGG thr UGUАСАACGAAU_„, _.asn UUGAACAGU.ACC SCrUCGAUUAUA mEtUACAUGAAA,„„,AAGU UAGA Стоп AGGGUUGUA Va* ^GUGGCUGCC । г'Г'х tGCA 3la CGUGCGCAUGAC aSP CUGGGUCGC i ccvGCA 8ly CCUGGGgag 9iu cuuТаблица 9.15. Митохондриальные кодоны и антикодоны у человека11Таблица 9.15. Митохондриальные кодоны и антикодоны у человека11° Основания в кодонах перечислены в направлении 5'-» 3\ а антикодонов 3'-♦ 5'. У некоторых млекопитающих кодоны AUA, AUU и AUC могут быть инициирующими и узнаются N-формилметиониновой тРНК с антикодоном 3'-UAC-5'.° Основания в кодонах перечислены в направлении 5'-» 3\ а антикодонов 3'-♦ 5'. У некоторых млекопитающих кодоны AUA, AUU и AUC могут быть инициирующими и узнаются N-формилметиониновой тРНК с антикодоном 3'-UAC-5'.У некоторых митохондриальных генов на конце кодирующей последовательности вообще нет стоп- кодона. Примером может служить ген субъединицы 6 АТРазы. В этих случаях при процессинге транскрипта на конце остается или U, или UA. В результате последующего полиаденилирования на З'-конце мРНК образуется стоп-кодон UAA.

Кодон Антикодон

Кодон Антикодон

Кодон Антикодон

Кодон Антикодон

^ Р- ААС

UCU

Sa ser AGU

UGG

UAC ‘УГ AUG

UGUACC

UGC c's ACG

UUG l6U MU

UAA Стоп

UAG

UGA

UGG trP ACU

сии

Sa leu GAU

cue

ccu ccc CCA РГ° GGU

CCG

GAG his GUG

CGU

CGA аГ8 GGU

CGG

^ 9^ GUU

AUU 4

AUC "e UAG

ACU

AGG thr UGU

АСА

ACG

AAU_„, _

.asn UUG

AAC

AGU.

ACC SCrUCG

AUU

AUA mEtUAC

AUG

AAA,„„,

AAGU U

AGA Стоп AGG

GUU

GUA Va* ^

GUG

GCU

GCC । г'Г'х t

GCA 3la CGU

GCG

CAU

GAC aSP CUG

GGU

CGC i ccv

GCA 8ly CCU

GGG

gag 9iu cuu

Кодон Антикодон

Кодон Антикодон

Кодон Антикодон

Кодон Антикодон

^ Р- ААС

UCU

Sa ser AGU

UGG

UAC ‘УГ AUG

UGUACC

UGC c's ACG

UUG l6U MU

UAA Стоп

UAG

UGA

UGG trP ACU

сии

Sa leu GAU

cue

ccu ccc CCA РГ° GGU

CCG

GAG his GUG

CGU

CGA аГ8 GGU

CGG

^ 9^ GUU

AUU 4

AUC "e UAG

ACU

AGG thr UGU

АСА

ACG

AAU_„, _

.asn UUG

AAC

AGU.

ACC SCrUCG

AUU

AUA mEtUAC

AUG

AAA,„„,

AAGU U

AGA Стоп AGG

GUU

GUA Va* ^

GUG

GCU

GCC । г'Г'х t

GCA 3la CGU

GCG

CAU

GAC aSP CUG

GGU

CGC i ccv

GCA 8ly CCU

GGG

gag 9iu cuu

Таблица 9.15. Митохондриальные кодоны и антикодоны у человека11

Таблица 9.15. Митохондриальные кодоны и антикодоны у человека11

° Основания в кодонах перечислены в направлении 5'-» 3\ а антикодонов 3'-♦ 5'. У некоторых млекопитающих кодоны AUA, AUU и AUC могут быть инициирующими и узнаются N-формилметиониновой тРНК с антикодоном 3'-UAC-5'.

° Основания в кодонах перечислены в направлении 5'-» 3\ а антикодонов 3'-♦ 5'. У некоторых млекопитающих кодоны AUA, AUU и AUC могут быть инициирующими и узнаются N-формилметиониновой тРНК с антикодоном 3'-UAC-5'.

Необычному генетическому коду отвечает специфическое семейство тРНК. На генетической карте рис. 9.57 представлены все 22 митохондриальные тРНК человека, а в табл. 9.15-соответствующие антикодоны. В отличие от универсального кода, в котором для каждого из синонимичных кодонов используется своя тРНК, в митохондриях для двух или четырех таких кодонов используется одна тРНК. Каждая тРНК, связывающаяся с двумя синонимичными кодонами, использует для этого в одном из случаев образование пары G • U. У каждой тРНК, связывающейся с четырехчленным набором кодонов, на 5'-конце антикодонового участка находится урацил. При этом либо U спаривается с любым из четырех оснований, либо во взаимодействии кодон-актикодон участвуют только две пары оснований.

Дрожжевая митохондриальная ДНК. Несмотря на то что эта ДНК содержит примерно столько же генов, сколько митохондриальная ДНК человека, по своей длине она почти в пять раз больше - около 80 т. п. н. (рис. 9.58). Большая часть этой избыточной ДНК приходится на долю АТ-богатых участков с неизвестной функцией, а также последовательностей, которые прерывают кодирующие области и отсутствуют в митохондриальных ДНК млекопитающих. Различия в структуре митохондриальной ДНК у разных штаммов определяются в основном изменчивостью некодирующих участков. Однако неодинаковы и кодирующие участки, при том что функции соответствующих генных продуктов остаются практически одинаковыми.

Транскрипция и трансляция дрожжевой митохон

дриальной ДНК. Те ограничения, которые налагаются на размер митохондриального генома млекопитающих (а также плоских червей, морского ежа, насекомых и т.д.), у дрожжей отсутствуют. Эта свобода связана с меньшей специфичностью его структуры и функций. Гены тРНК не служат знаками пунктуации, разделяющими другие гены. Транскрипция начинается не с одного, а по меньшей мере с 19 разных промоторов; ее катализируют специфические митохондриальные РНК-полимеразы, кодируемые хромосомной ДНК. На 5'-конце каждой транскрипционной единицы находится короткая про- моторная последовательность (5'-A/TTATAAGTA-3'), простирающаяся от -9-го до + 1-го нуклеотида относительно точки инициации транскрипции (+1). В результате процессинга длинных транскриптов при участии эндонуклеазы образуются функциональные РНК. Генетический код дрожжевых митохондрий тоже отличается от универсального, но эти отличия все же меньше, чем у млекопитающих. Длина молекул рРНК также ближе к обычной: 3200 и 1660 нуклеотидов по сравнению с 1559 и 954 нуклеотидами у человека. Хотя кодирующие последовательности дрожжевой митохондриальной ДНК высокогомологичны соответствующим последовательностям у человека, дрожжевые мРНК имеют 5'-лидерную и З'-трейлерную последовательности, как и большинство мРНК (ср. гены цитохрома b у человека и дрожжей; рис. 9.59).

Тем не менее дрожжевой ДНК присущи некоторые особенности. Это единственная известная ДНК, у которой гены рРНК разделены неродственными генами. Далее, эта ДНК кодирует один ри-

РИС. 9.58.

Некоторые особенности митохондриальной ДНК дрожжей (S. cerevisiae). Гены, кодирующие белки, окрашены более интенсивно, а гены, кодирующие РНК,- светлее. Вставочные последовательности выделены точками (некоторые из них содержат открытые рамки считывания; часть их указана). Серым цветом выделены неохарак- теризованные области; некоторые из них содержат сайты начала репликации. Транскрипция в основном идет по часовой стрелке; единственное известное исключение-транскрипция генов тРНК, начинающаяся в районе двух часов (отмечена стрелкой).

РИС. 9.59.Гены цитохрома b и соответствующие мРНК у дрожжей и человека. Экзоны выделены цветом; интроны в дрожжевой ДНК выделены точками. [Р. Borst, L. A. Grivell, Nature 290 (1981). р. 443.]РИС. 9.59.Гены цитохрома b и соответствующие мРНК у дрожжей и человека. Экзоны выделены цветом; интроны в дрожжевой ДНК выделены точками. [Р. Borst, L. A. Grivell, Nature 290 (1981). р. 443.]ЧЕЛОВЕКГен cyt 6ЧЕЛОВЕКГен cyt 6

РИС. 9.59.

Гены цитохрома b и соответствующие мРНК у дрожжей и человека. Экзоны выделены цветом; интроны в дрожжевой ДНК выделены точками. [Р. Borst, L. A. Grivell, Nature 290 (1981). р. 443.]

РИС. 9.59.

Гены цитохрома b и соответствующие мРНК у дрожжей и человека. Экзоны выделены цветом; интроны в дрожжевой ДНК выделены точками. [Р. Borst, L. A. Grivell, Nature 290 (1981). р. 443.]

ЧЕЛОВЕК

Ген cyt 6

ЧЕЛОВЕК

Ген cyt 6

босомный белок (локус шт-1), а все другие рибосомные белки кодируются ядерной ДНК; у млекопитающих все рибосомные белки митохондрий кодируются ядерной ДНК. И наконец, в митохондриальной ДНК дрожжей впервые обнаружены кодирующие участки во вставочных последовательностях.

Гены, расположенные внутри интронов дрожжевой митохондриальной ДНК. В митохондриальной ДНК S.cerevisiae гены цитохрома b (cytb\ 21S-pPHK и субъединицы 1 цитохромоксидазы (СО-I) содержат интроны. Некоторые из этих интронов присутствуют не во всех дрожжевых штаммах. Другие существенны для жизнедеятельности дрожжевых клеток, поскольку в них картируются мутации, нарушающие функции дыхательной цепи. По данным

генетического анализа, вставочные последовательности, например, в гене cytb необходимы для син-

теза цитохрома Ь. Кроме того, некоторые мутации в интронах плейотропны: при их наличии не только ингибируется синтез цитохрома Ь, но и нарушается экспрессия СО-1. Это наводит на мысль, что данный интрон кодирует какой-то транс-белок, подтверждением этому служит обнаружение открытых рамок считывания во многих митохондриальных интронах. Некоторые мутации в интронах влияют на образование специфической вторичной структуры, необходимой для сплайсинга интронов (разд. 8.5.г).

Как показали результаты клонирования и секвенирования, у гена cytb имеются два интрона, 12 и 14, которые содержат протяженные открытые рамки считывания и могут кодировать белки (рис. 9.60). Созревание первичного транскрипта начинается с удаления II и соединения экзонов 1 и 2 (сплайсинг таких интронов группы II описан в разд. 8.5.в). Образовавшаяся РНК служит матрицей для синтеза матуразы 12-белка, участвующего в дальнейшем процессинге РНК. Последовательность, кодирующая матуразу 12, начинается в первом экзоне гена цитохрома b и распространяется на кодирующий участок интрона 12 с открытой рамкой. Матураза 12 участвует затем в вырезании области 12, разрушая таким образом свою собственную мРНК-уникальный регуляторный механизм! Генетические и моле-

т.п.н.

12345678

IIII11111

Е1 Е2 ЕЗ Е4 Е5 Е6

Продукт -

неизвестен "*

2-й сплайсинг

| Матураза 12

мРНК для цитохрома bмРНК для цитохрома b

мРНК для цитохрома b

мРНК для цитохрома b

РИС. 9.60.

Ген цитохрома b дрожжей. Экзоны выделены цветом, интроны-точками и серым цветом. Участки интронов, выделенные редкими точками, содержат последовательности, кодирующие матуразы 12 и 14 Детали сплайсинга неизвестны

I Дополнительный сплайсинг, I матураза 14

кулярные исследования показали также, что протяженная открытая рамка считывания интрона 14 кодирует матуразу, отличную от участвующей в сплайсинге 14. Матураза 14 ответственна за плейо- тропное действие упомянутых выше мутаций. Мутации в 14 cytb блокируют сплайсинг интрона в транскриптах гена СО-I. В свою очередь, первый интрон гена СО-I сам кодирует матуразу.

Интрон 218-рДНК не абсолютно необходим. Для сплайсинга не нужны ни этот сегмент длиной 1,1 т. п. н„ ни другие митохондриальные интроны. Тем не менее данный интрон был тщательно исследован, поскольку он обладает необычными свойствами. При спаривании дрожжевых штаммов, имеющих интрон в 218-рДНК (со+), со штаммами, у которых он отсутствует (со-), почти все дочерние митохондрии, включая и произошедшие от родительских митохондрий со-, оказываются со+. Это связано с тем, что копия интрона длиной 1,1 т. п. н. встраивается в со--218-рДНК. Встраивание происходит в строго определенном месте 218-рДНК в последовательности 5'-GATAACAG-3'. Если в этой последовательности-мишени возникают мутации, то встраивания не происходит. К такому же результату приводят и мутации в интроне 1,1 т. п. н., если при этом прерывается открытая рамка считывания длиной 235 кодонов. Этот интрон кодирует сайт-специфическую эндонуклеазу, необходимую для его встраивания в со--218-рДНК. Таким образом, он представляет собой некое подобие мобильного элемента (гл. 10). Изучая данную систему, можно составить представление о том, как «проникают» интроны в уже существующие гены.

Репликация митохондриальной ДНК. Клетки млекопитающих в культуре содержат тысячи молекул митохондриальной ДНК. Точное их число различается у разных организмов, и даже для клеток определенного типа, по-видимому, нельзя назвать их точной цифры. Хотя репликация митохондриальной ДНК не связана с клеточным циклом, обычно образуется достаточное количество новых молекул, чтобы снабдить ими все дочерние клетки.

Лучше всего изучен механизм репликации митохондриальной ДНК мышей (рис. 2.5). Напомним, что каждая из цепей этой дуплексной молекулы имеет свою точку начала репликации: Ori-H и Ori-L. В мышиных клетках (но не у всех особей) большинство митохондриальных ДНК содержат короткий сегмент реплицированной Н-цепи (550-650 т.п.н.) и так называемую D-петлю (от англ, displacement) в области Ori-H. Другая необычная особенность зрелых геномов состоит в наличии рассеянных по геному рибонуклеотидов вместо дезоксирибонуклеотидов. Возможно, эти нуклеотиды- остатки РНК-праймеров, необходимых для репликации ДНК, и рибонуклеотидных вставок, участвующих

в наращивании цепи. Но почему синтез митохондриальной ДНК столь некорректен? В дрожжевой митохондриальной ДНК, в отличие от ДНК млекопитающих, имеются семь или даже больше мест начала репликации, рассеянных по всему геному (рис. 9.58); каждое из таких мест содержит три коротких GC-богатых сегмента, разделенных двумя длинными участками, почти целиком состоящими из АТ-пар.

За одним исключением, о ферментах или белковых факторах, участвующих в репликации митохондриальных ДНК, ничего не известно. Установлено лишь, что из трех типичных эукариотических ДНК-полимераз в синтезе митохондриальных ДНК участвует у-полимераза.

Необычная митохондриальнаяДНК трипаносом

Отличительная особенность простейших из отряда так называемых кинетопластид, который включает и трипаносом, состоит в том, что в их единственной митохондрии имеется необычная дисковидная структура. Диски называются кинетоплас- тами и содержат тысячи кольцевых молекул ДНК. У Trypanosoma brucei 45 кольцевых молекул имеют длину примерно 21 т. п. н. (макси-кольца); длина остальных 5500 молекул-примерно 1 т. п. н. (мини-кольца). Кольцевые молекулы ДНК, соединяясь в так называемые катенаны, образуют переплетенную сеть (рис. 9.61). Это уникальное явление: никаких других примеров образования таких сетей неизвестно. Изолированные сети кинетопластов ДНК составляют около 10 мкм в диаметре, но внутри клетки они конденсируются с образованием дисков в десять раз меньшего размера. Такие диски всегда находятся в основании жгутика трипаносомы.

Мини-кольца одной сети часто различаются по

РИС. 9.61.

Кинетопласты трипаносомы (Crithidia fasciculate). На электронной микрофотографии видны катенаны из сцепленных мини- и макси-колец ДНК. Каждая петля - это мини-кольцо размером 2,5 т. п. н. [С любезного разрешения Р. Т. Englund; см. Р.Т. Englund, Ann. Rev. Biochem. 52 (1982), p. 701.]

своим нуклеотидным последовательностям, за исключением консервативного сегмента длиной несколько сотен пар оснований, но даже и этот сегмент не всегда идентичен у разных видов. Однако все известные мини-кольца непременно содержат в пределах упомянутого консервативного участка последовательность 5'-GGGGTTGGTGTAA-3', в которой, по-видимому, начинается репликация. Кроме того, вблизи консервативного участка молекула ДНК имеет искривленную форму (разд. 1.1.д). Функции мини-колец неизвестны. Был идентифицирован один непротяженный транскрипт длиной 240 нуклеотидов, но он содержит только короткие открытые рамки считывания неизвестного назначения, как и вся мини-кольцевая ДНК. Максикольца выполняют функции митохондриального генома, аналогичные уже описанным выше. В отличие от мини-колец, все макси-кольца в сети сходны. Как и дрожжевая митохондриальная ДНК, они сильно (на 80%) обогащены АТ-парами.

Репликация сложной сети кинетопластной ДНК происходит один раз за клеточное деление. Она начинается с расщепления катенанов и высвобождения мини-колец, вероятно, с помощью топоизомеразы II. Далее мини-кольца реплицируются с образованием свободных кольцевых дуплексов с пробелами в одной цепи, по которым происходит их присоединение к матриксу. Затем пробелы заполняются, и формируются замкнутые дуплексы. Наконец, матрикс делится пополам и две сети ДНК распределяются по дочерним клеткам. Макси-кольца остаются присоединенными к сети и, по-види- мому, реплицируются по механизму катящегося кольца. Новосинтезированные линейные молекулы отсоединяются от комплекса репликации и включаются в сеть в кольцевой форме.

Редактирование на уровне РНК. У кинетопластид обнаруживаются удивительные отклонения от универсального механизма передачи генетической информации. Некоторые макси-кольца кодируют последовательности, существенно отличающиеся от последовательностей соответствующих функциональных мРНК. Например, смысловая цепь гена СО-П Tbrucei содержит сегмент 5'-AAAGTAGAG- AACCTGGTAGGTGTAATGAAATAA-3', однако соответствующая последовательность СО-П-мРНК (полученная исходя из данных о последовательности кДНК) имеет вид 5'-AAAGUAGAUUGUAUA- CCUGGUAGGUGUAAUGAAAUAA-3' (в обоих случаях приведена лишь часть рамки считывания, начинающаяся с кодона 5'-ААА, отвечающего лизину). Выделенные жирным шрифтом остатки U были встроены в первичный транскрипт; связанный с этим сдвиг рамки считывания ( + 4) обеспечивает полную трансляцию РНК с образованием полипептида СО-П. Наличие такого редактирования

РНК означает, что ДНК не всегда служит единственным источником генетической информации. Уже сейчас известны три вида организмов, у которых правильная экспрессия пяти разных кинетопластид- ных митохондриальных генов связана с редактированием РНК. Кроме сдвига рамки считывания, некоторые вставки U приводят к появлению стартовых (AUG) или стоп-кодонов (UAA). В одном случае (ген СО-Ш Tbrucei) более 50% остатков мРНК представлены посттранскрипционно встроенными остатками урацила. У других кинетопластид в митохондриальных ДНК обнаружены последовательности, гомологичные кДНК СО-Ш Tbrucei, а не самому гену СО-Ш, обедненному остатками U.

Помимо вставок при редактировании РНК может происходить и вырезание остатков U. Возможно, в некоторых случаях функциональная РНК образуется в несколько этапов, с сайт-специфической инсерцией множества остатков U и последующим их вырезанием, за исключением остатков, необходимых для функционирования мРНК. Многие детали этого процесса остаются неясными. Например, неизвестно, где содержится информация о последовательности конечного продукта-мРНК и как узнается транскрипт, который подлежит редактированию. У одних видов мРНК, кодируемая данным геном, обязательно редактируется, у других остается интактной. Вероятно, процесс редактирования РНК каким-то образом регулируется. Так, у Tbrucei некоторые РНК (например, СО-П-РНК) подвергаются редактированию, если данный паразит обитает в организме насекомого-хозяина, и остаются интактными у паразитов, обнаруженных в крови млекопитающих. По-видимому, это связано с тем, что простейшие, живущие в организме насекомых, нуждаются для образования АТР в окислительном фосфорилировании, а в крови млекопитающих АТР образуется путем гликолиза.

Насколько универсален процесс редактирования РНК? Происходит ли он только в кинетопластидах и митохондриях? Результаты, полученные в двух проведенных недавно исследованиях, показывают, что редактирование РНК происходит у многих организмов и в ядерных транскриптах. Так, ген аполипопротеина у млекопитающих кодирует две мРНК, при этом в одной из них вместо кодируемого геномной ДНК остатка С появляется остаток U и соответственно возникает стоп-кодон. Далее, установлено, что две мРНК, кодируемые одним геном SV40, различаются тем, что в одной из них присутствуют два «лишних» остатка гуанина. Редактирование РНК не ограничивается вставкой или вырезанием U. Сходны ли механизмы, используемые у млекопитающих, с механизмами, действующими у кинетопластид, пока неясно.

ДНК хлоропластов

Геном хлоропластов в чем-то сходен с геномом митохондрий. ДНК представляет собой кольцевой дуплекс, содержащий какое-то количество (но далеко не все) генов, существенных для функционирования хлоропластов и поддержания их структуры. и имеет достаточно большую длину: как правило, 120-180 т. п. н. При этом каждый хлоропласт может содержать десятки копий хлоропластного генома. Полностью установлены последовательности ДНК хлоропластов у печеночников (моховидные), табака (двудольные) и риса (однодольные).

Структура хлоропластной ДНК. По данным рестрикционного картирования, структура ДНК хлоропластов, в отличие от митохондриальной ДНК, в пределах вида остается довольно консервативной. Так, хлоропластная ДНК шпината (рис. 9.62) имеет структуру, типичную для соответствующей ДНК всех покрытосеменных, как одно-, так и двудольных. В пределах сегмента длиной примерно 25 т. п. н. находятся четыре гена рРНК (16S, 238, 5S и 4,58), и этот сегмент повторен в обратной ориентации еще раз через 15 т. п. н. Локализованы и другие гены, в том числе ген большой субъединицы рибулозо-1,5-бисфосфат-карбоксилазы, rbcL (ген малой субъединицы находится в хромосоме),

ген компонента тилакоидной мембраны массой 32 кДа (фотоген 32, psb А, который экспрессируется только на свету) и гены нескольких субъединиц хлоропластной РНК-полимеразы (гро/ Всего хлоропластная ДНК кодирует примерно 100 полипептидов и 35 РНК (рРНК и тРНК). Продукты многих генов с открытой рамкой считывания уже идентифицированы. Единственное известное исключение из правил организации хлоропластной ДНК покрытосеменных-ДНК некоторых бобовых (например, гороха), у которых утрачена одна копия инвертированного повтора. Такой повтор присутствует даже в хлоропластной ДНК зеленой водоросли Chlamidomonas reinhardii, но не у Euglena. Последняя отличается тем, что у нее имеются три тандемных повторяющихся участка длиной 5,6 т. п. н., которые содержат гены рРНК. В отличие от ДНК митохондрий, в ДНК хлоропластов, по-видимому, используется универсальный генетический код. В ней содержится много генов тРНК, и в тех полипептидных генах, которые были исследованы, присутствует большинство универсальных кодонов.

Четкие данные о репликации хлоропластной ДНК или о локализации мест начала репликации пока отсутствуют.

РИС. 9.62.Диаграмма хлоропластной ДНК шпината с указанием локализации некоторых генов. Двунаправленные наружные стрелки отмечают инвертированные повторы, которые содержат гены рибосомных РНК. Маленькими стрелками указано направление транскрипции. Обозначения: Un- ген тРНК (соответствующая аминокислота обозначается одной буквой согласно общепринятому правилу), psa-ген компонента фотосистемы I; psb-ген компонента фотосистемы II; pet-гены полипептидов цитохромного комплекса; rbcL- ген большой субъединицы рибулозо-1,5-бисфосфат- карбоксила- зы/оксигеназы; atp-гены субъединиц Н + - АТРазного комплекса; гро-гены субъединиц РНК-полимеразы. Гены рибосомных белков не показаны. [С любезного разрешения W. Gruissem; из работ W. Gruissem, G. Zuwarski, EMBO J. 4 (1985), p. 1637; G. Sijben-Mijller et al.. Nucleic Acids Res. 14 (1986), p. 1029.]РИС. 9.62.Диаграмма хлоропластной ДНК шпината с указанием локализации некоторых генов. Двунаправленные наружные стрелки отмечают инвертированные повторы, которые содержат гены рибосомных РНК. Маленькими стрелками указано направление транскрипции. Обозначения: Un- ген тРНК (соответствующая аминокислота обозначается одной буквой согласно общепринятому правилу), psa-ген компонента фотосистемы I; psb-ген компонента фотосистемы II; pet-гены полипептидов цитохромного комплекса; rbcL- ген большой субъединицы рибулозо-1,5-бисфосфат- карбоксила- зы/оксигеназы; atp-гены субъединиц Н + - АТРазного комплекса; гро-гены субъединиц РНК-полимеразы. Гены рибосомных белков не показаны. [С любезного разрешения W. Gruissem; из работ W. Gruissem, G. Zuwarski, EMBO J. 4 (1985), p. 1637; G. Sijben-Mijller et al.. Nucleic Acids Res. 14 (1986), p. 1029.]Структура хлоропластных генов. Структура хлоропластных белков и соответствующих генов

РИС. 9.62.

Диаграмма хлоропластной ДНК шпината с указанием локализации некоторых генов. Двунаправленные наружные стрелки отмечают инвертированные повторы, которые содержат гены рибосомных РНК. Маленькими стрелками указано направление транскрипции. Обозначения: Un- ген тРНК (соответствующая аминокислота обозначается одной буквой согласно общепринятому правилу), psa-ген компонента фотосистемы I; psb-ген компонента фотосистемы II; pet-гены полипептидов цитохромного комплекса; rbcL- ген большой субъединицы рибулозо-1,5-бисфосфат- карбоксила- зы/оксигеназы; atp-гены субъединиц Н + - АТРазного комплекса; гро-гены субъединиц РНК-полимеразы. Гены рибосомных белков не показаны. [С любезного разрешения W. Gruissem; из работ W. Gruissem, G. Zuwarski, EMBO J. 4 (1985), p. 1637; G. Sijben-Mijller et al.. Nucleic Acids Res. 14 (1986), p. 1029.]

РИС. 9.62.

Диаграмма хлоропластной ДНК шпината с указанием локализации некоторых генов. Двунаправленные наружные стрелки отмечают инвертированные повторы, которые содержат гены рибосомных РНК. Маленькими стрелками указано направление транскрипции. Обозначения: Un- ген тРНК (соответствующая аминокислота обозначается одной буквой согласно общепринятому правилу), psa-ген компонента фотосистемы I; psb-ген компонента фотосистемы II; pet-гены полипептидов цитохромного комплекса; rbcL- ген большой субъединицы рибулозо-1,5-бисфосфат- карбоксила- зы/оксигеназы; atp-гены субъединиц Н + - АТРазного комплекса; гро-гены субъединиц РНК-полимеразы. Гены рибосомных белков не показаны. [С любезного разрешения W. Gruissem; из работ W. Gruissem, G. Zuwarski, EMBO J. 4 (1985), p. 1637; G. Sijben-Mijller et al.. Nucleic Acids Res. 14 (1986), p. 1029.]

у самых разных видов высококонсервативна. Скорость эволюции кодирующих последовательностей хлоропластных генов значительно ниже скорости эволюции ядерных генов.

В генах тРНК, рРНК и полипептидов разных видов содержатся интроны, однако картина их распределения неодинакова. Например, у Euglena в генах хлоропластных тРНК интроны отсутствуют, в отличие от соответствующих генов у многих организмов. У той же Euglena в полипептидных генах интроны имеются; в то же время многие из гомологичных мРНК цианобактерий и высших растений не нуждаются в сплайсинге. Даже среди высших растений одни полипептидные гены содержат интроны, а другие нет. В отличие от всех других исследованных организмов, у Chlamidomonas rein- hardii ген 23S-pPHK прерывистый. Пока никаких закономерностей в наличии или отсутствии интронов в генах хлоропластов ДНК не обнаружено.

Хлоропластные интроны, по-видимому, аналогичны или интронам группы I, или интронам группы II (разд. 8.5. в). Можно предположить, что при сплайсинге используются сходные механизмы. В большинстве хлоропластных интронов протяженные открытые рамки считывания отсутствуют. Впрочем, такая рамка длиной 509 кодонов обнаружена в интроне гена лизиновой тРНК в хлоропластах табака и в интроне гена 23S-pPHK у C.reinhardii. В соответствующих белковых продуктах имеются участки, гомологичные участкам ма- тураз, кодируемым митохондриальными интронами дрожжей. Таким образом, интроны как хлоропластных, так и митохондриальных ДНК могут содержать функциональные сегменты.

Некоторые мРНК у водорослей и высших растений образуются в результате транс-сплайсинга (разд. 8.5.г). Например, 5'-экзон гена, кодирующего рибосомный белок хлоропластов slz, транскрибируется с одной цепи ДНК, а два других экзона-с другой цепи, на расстоянии 30 т. п. н. от этого локуса. При транс-сплайсинге эти транскрипты соединяются в одну функциональную мРНК.

Происхождение ДНК органелл

Широко распространено мнение, что митохондрии и хлоропласты произошли от прокариотических эндосимбионтов, которые обитали в цитоплазме

предшественников эукариот. Такие функции прокариот, как аэробный метаболизм и фотосинтез, приобрели важное значение для их хозяев. Гены, ответственные за эти функции, и соответствующие им структуры сохранились и у современных организмов, а гены, кодирующие другие, несущественные для хозяев функции и структуры эндосимбионтов, в ходе эволюции были утрачены. Эту гипотезу подтверждают различные свойства экспрессии хлоропластных генов. Так, промоторы экспрессирующихся хлоропластных генов напоминают типичные -35- и —10-последовательности прокариотических промоторов (рис. 9.63). Кроме того, рибосомы хлоропластов очень сходны с рибосомами прокариот. Близки по размеру и последовательностям молекулы соответствующих рРНК, а некоторые рибосомные белки хлоропластов иммунологически родственны рибосомным специфическим белкам Е< coli. Трансляция на рибосомах хлоропластов подавляется хлорамфениколом, который оказывает такое же действие на трансляцию у прокариот. Сходство генной экспрессии у митохондрий и прокариот не столь очевидно. Трансляционный аппарат митохондрий, особенно у животных, имеет лишь отдаленное сходство с аппаратом современных прокариот. Тем не менее тщательный анализ митохондриальной рРНК у растений наводит на мысль о существовании у нее общего предка с рРНК пурпурных бактерий a-типа-группы, включающей таких известных симбионтов растений, как Agrobacteria и Rhizobacteria. Возможно, рибосомы и генетический код митохондрий произошли от какого-то вымершего (или неизвестного) прокариота.

РИС. 9.63.Промоторы, обеспечивающие транскрипцию хлоропластных генов шпината, и промоторы Е.соН. [W. Gruissem, G. Zuwarski, EMBO J. 4 (1985), p. 1637]РИС. 9.63.Промоторы, обеспечивающие транскрипцию хлоропластных генов шпината, и промоторы Е.соН. [W. Gruissem, G. Zuwarski, EMBO J. 4 (1985), p. 1637]-35 Консенсусная последовательность E.coli Ген тРНК™1 хлоропластов шпинатаrbcL psbA-35 Консенсусная последовательность E.coli Ген тРНК™1 хлоропластов шпинатаrbcL psbA-последовательность -10-последовательность-последовательность -10-последовательностьTCTTGАСАТTCTTGАСАТTATTGCTTAGGTTGCGCC 66ТТGАСАСTATTGCTTAGGTTGCGCC 66ТТGАСАСТАТААТТАТААТТАТААТТАТАСАТАТАСТТАТААТТАТАСАТАТАСТГены митохондрий и хлоропластов, участвующие в поддержании их структуры и функций, распределены между ядерной ДНК и ДНК органелл. Более того, у разных организмов одни и те же гены могут быть в одном случае цитоплазматическими, а в другом - ядерными. Например, ген, кодирующий субъединицу 9 митохондриального АТРазного комплекса, у S.cerevisiae находится в митохондриях, а у грибов и у человека-в ядре. Если следовать гипотезе эндосимбиоза буквально, то все важные в структурном и функциональном отношении гены митохондрий и хлоропластов должны оставаться в геноме органелл- потомке исходной прокариотической ДНК. Почему у современных организмов многие из этих генов обнаруживаются в ядерных хромосомах? Одно из объяснений, подкрепленное

РИС. 9.63.

Промоторы, обеспечивающие транскрипцию хлоропластных генов шпината, и промоторы Е.соН. [W. Gruissem, G. Zuwarski, EMBO J. 4 (1985), p. 1637]

РИС. 9.63.

Промоторы, обеспечивающие транскрипцию хлоропластных генов шпината, и промоторы Е.соН. [W. Gruissem, G. Zuwarski, EMBO J. 4 (1985), p. 1637]

-35 Консенсусная последовательность E.coli Ген тРНК™1 хлоропластов шпината

rbcL psbA

-35 Консенсусная последовательность E.coli Ген тРНК™1 хлоропластов шпината

rbcL psbA

-последовательность -10-последовательность

-последовательность -10-последовательность

TCTTGАСАТ

TCTTGАСАТ

TATTGCTTA

GGTTGCGCC 66ТТGАСАС

TATTGCTTA

GGTTGCGCC 66ТТGАСАС

ТАТААТ

ТАТААТ

ТАТААТ

ТАТАСАТАТАСТ

ТАТААТ

ТАТАСАТАТАСТ

РИС. 9.64.

Перенос сегментов ДНК из органелл в ядерную ДНК. Жирными стрелками указаны переносы, подтвержденные экспериментально, тонкими стрелками-гипотетические переносы. [Я. Lewin, Science 224 (1984), р. 970.]

экспериментальными данными, состоит в том, что последовательности ДНК все время «путешествуют» между органеллами и ядром, а также между геномами самих органелл (рис. 9.64).

Например, ключевой фермент фотосинтеза ри- булозо-1,5-бисфосфат- карбоксилаза/оксигеназа- это гетеромультимер, состоящий из восьми идентичных больших (L) и восьми идентичных малых (S) субъединиц. У фотосинтезирующих эукариот L- субъединицы кодируются геном rbc L в геноме хлоропластов (рис. 9.62), а S-субъединицы, как и боль

шинство хлоропластных белков,-в ядре (рис. 9.36). Однако у простейшего Cyanophora paradoxa обе субъединицы кодируются неядерным геномом, входящим в состав хлоропластоподобной структуры- цианелли, типичной для цианобактерий. Такая локализация согласуется с эндосимбиотическим происхождением хлоропластов эукариот. Предполагается, что у общего предка современных фотосинтезирующих эукариот сегмент ДНК. содержащий ген S, переместился из эндосимбионта или его производного в ядерную ДНК.

Представления о межгеномном обмене подтверждаются и тем фактом, что в ядерной ДНК шпината содержатся последовательности (в основном некодирующие), которые гибридизуются с клонированными зондами, представляющими почти весь хлоропластный геном, в том числе и с последовательностями гена rbcL. Последовательности, гомологичные rbcL и другим сегментам хлоропластной ДНК, обнаружены также в митохондриях некоторых растений. Вероятно, некоторые из них появились в результате относительно недавних перемещений, поскольку митохондриальная ДНК данного организма более сходна с хлоропластной ДНК организмов, относящихся к этому же виду, чем с хлоропластной ДНК других видов. Итак, сегменты хлоропластной ДНК могут перемещаться в ядро и в митохондрии. Имеется множество примеров переноса и митохондриальной ДНК. Гибридизация между митохондриальной и ядерной ДНК наблюдается у таких разных организмов, как дрожжи, саранча, морской еж и крыса. Следовательно, перестройки ДНК не ограничиваются ядерным геномом, и мембраны ядер и органелл не служат для них барьером. Однако механизм перемещения и интеграции ДНК органелл в новые геномы не установлен. В следующей главе мы остановимся на способах перестройки ядерных ДНК, и, возможно, это поможет нам найти ответ на интересующий нас вопрос.

Глава 10

РЕОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА

В предыдущей главе мы рассмотрели организацию современных геномов. Это рассмотрение показывает, насколько велика эволюционная роль перестроек и дупликаций последовательностей ДНК. Сравнивая разные геномы, можно сделать вывод, что для их реорганизации использовались несколько стратегий. Одна из них состояла в перемещении сегментов из исходного локуса в различные сайты. Другая-в дупликации сегментов в определенном локусе с последующими тандемными реитерациями (многократными амплификациями). Третья стратегия состояла в дупликации сегментов ДНК и перемещении их в отдаленные сайты в геноме с помощью процессов, в которых участвуют как сама ДНК, так и РНК-продукты и обратная транскриптаза. И наконец, копии каких-то значимых сегментов могли мутировать и адаптироваться к новым функциям. Результатами всех этих процессов являются увеличение размера генома и фенотипическое разнообразие, а в сочетании с естественным отбором эволюционная гибкость вида и его развитие.

В этой главе мы рассмотрим экспериментальные системы, как генетические, так и биохимические, которые помогают установить механизмы геномных перестроек. Выводы, следующие из этих экспериментальных наблюдений, совпадают с теми представлениями, которые можно получить, исследуя структуру ныне существующих геномов. Описанные здесь механизмы в меру их адекватности позволяют строить модели процессов, протекавших в ходе эволюции. Особого внимания заслуживает один из этих механизмов-обратная транскрипция, поскольку он играет важную роль в перестройке всех эукариотических геномов. Включение в геномы ДНК- копий молекул РНК создает основу замечательной пластичности геномов. Недавно получены данные о том, что обратная транскрипция, возможно, осуществляется и у прокариот. В полной мере значение этого процесса пока остается неясным.

Во всех случаях, о которых шла речь, изменяется положение какого-то сегмента ДНК относительно окружающих его последовательностей. Подобные события происходят повсеместно в разных вариантах, однако большинство из них наблюдается относительно редко. Многие геномные перестройки происходят в результате гомологичной рекомбинации между аллельными последовательностями и не затрагивают соседних сегментов ДНК. Вообще же

говоря, структура генома вполне стабильна. Это и не может быть иначе, поскольку необходимо поддерживать жизнеспособность особей и видов.

Многие геномные перестройки не запрограммированы, они не связаны с каким-то специфическим влиянием на экспрессию генов и в них есть элемент случайности. Случайными могут быть частота таких событий, сами сегменты ДНК или то и другое. Примерами таких довольно редких событий служит транспозиция последовательностей ДНК из одного геномного локуса в другой или дупликация и последующая амплификация сегментов ДНК. Однако сходные транспозиции и амплификации могут быть сопряжены также с неслучайными, запрограммированными изменениями. Такие запрограммированные события играют ключевую роль в регуляции экспрессии некоторых генов во время дифференцировки и развития определенных типов клеток.

ОБЩИЕ СВОЙСТВАНЕЗАПРОГРАММИРОВАННЫХ

ТРАНСПОЗИЦИЙ

Некоторые сегменты ДНК обладают способностью перемещаться в другие геномные локусы, иногда существенно изменяя экспрессию соседних генов. Такой эффект наблюдается, например, при встраивании мобильного сегмента в новый геномный локус, сопровождающемся изменением кодирующего участка или важного регуляторного элемента. В простейшем случае ген перестает экспрессироваться. Но нередко сами мобильные элементы содержат регуляторные элементы. В таких случаях экспрессия генов, соседствующих со вставкой, может претерпевать сложные изменения, в том числе с переходом на новые способы регуляции.

Различают несколько типов мобильных ДНК- элементов. Лучше всего группировать эти элементы в соответствии с механизмами их транспозиции. Однако механизм транспозиции многих эукариотических и прокариотических элементов пока до конца не установлен. Поэтому мы используем классификацию, основанную прежде всего на структурных особенностях элементов. Резонно предположить, что общие морфологические особенности определяют и общие механизмы транспозиции, однако так ли это на самом деле-пока неясно.

Различные типы мобильныхэлементов

Транспозирующиеся элементы. Первые мобильные элементы, исследованные на молекулярном уровне, происходили из геномов прокариот, а также их фагов и плазмид. Сейчас известно несколько разных типов таких элементов, но все они обладают двумя общими свойствами: во-первых, несут ген (или несколько генов), необходимый для транспозиции; во-вторых, на концах содержат специфические взаимно инвертированные повторяющиеся последовательности, также необходимые для транспозиции. Сами транспозирующиеся элементы не кодируют никаких существенных для организма функций, однако часто содержат специфические гены, например ген устойчивости к антибиотикам. Транспозиция этих элементов, как правило, сопровождается сильными мутагенными эффектами.

Мобильные элементы многих эукариот сходны со своими прокариотическими «родственниками» в том отношении, что для их транспозиции необходимы гены, содержащиеся в самих элементах, и специфические концевые последовательности. Если транспозиция протекает без участия обратной транскрипции, то мы будем относить их к транспози- рующимся элементам. К этому классу принадлежат контролирующие элементы кукурузы первые из обнаруженных мобильных единиц, а также некоторые элементы Drosophila. Сходные элементы имеются у других беспозвоночных и у некоторых цветковых растений, где они отвечают за пеструю раскраску лепестков.

Ретротранспозоны. Эукариотические мобильные элементы, транспозиция которых происходит при транскрипции или обратной транскрипции, называются ретротранспозонами. Они содержат центральный сегмент, кодирующий среди других белков обратную транскриптазу. У некоторых ретротранспозонов, называемых здесь транспозонами класса I, этот центральный сегмент окружен длинными концевыми повторами (LTR). У ретротранспозонов класса I на одном из концов имеются также короткие инвертированные повторы. По своей структуре, особенностям транскрипции и механизму транспозиции они напоминают ретровирусные провирусы. Отличие состоит в отсутствии жизнеспособных внеклеточных форм. Семейства ретротранспозонов обнаружены у разных беспозвоночных, в частности у дрожжей и Drosophila, а также у растений и некоторых млекопитающих.

Ретротранспозоны класса И не имеют концевых повторов, а один из концов часто бывает представлен АТ-богатой последовательностью. В этом отношении они не похожи на ретровирусные провирусы. Элементы класса II менее изучены, чем

элементы класса I. хотя они тоже широко распространены среди эукариот. Удивительно, что ни один из классов ретротранспозонов не имеет прокариотических партнеров.

Ретрогены. По геному перемешаются также разнообразные сегменты ДНК, не обладающие специфическими структурными и кодирующими свойствами транспозонов или ретротранспозонов. В отличие от мобильных элементов других классов, они весьма гетерогенны по размеру и структуре. У них нет концевых повторов, а на одном из концов часто присутствует АТ-богатая последовательность. К элементам этого класса, называемым ретрогенами, относятся процессированные псевдогены и SINE-no- следовательности; они обнаружены у различных эукариот, но особенно обильно представлены у млекопитающих. Транспозиция ретрогенов, по-видимо- му, происходит через образование РНК с последующей обратной транскрипцией. Однако этот процесс скорее всего пассивный в том смысле, что данные элементы не кодируют необходимых для транспозиции активностей (т. е. обратную транскриптазу).

Дупликация сайтов-мишеней

Независимо от типа мобильного элемента его встраивание в новый генетический локус обычно сопровождается дупликацией короткого участка ДНК в месте встраивания (в сайте-мишени). Эти дуплицированные сегменты фланкируют встроившийся элемент (рис. 10.1). Почти обязательная дупликация сайтов-мишеней указывает на то, что при различиях в механизме большинство вставок происходит с образованием в потенциальных сайтах-мишенях смещенных одноцепочечных разрывов, как это показано на рис. 10.1. Сайт-мишень в геноме, содержащий мобильный элемент, условно называют «заполненным», а не содержащий такового- «свободным».

Размер дуплицированных последовательностей для разных мобильных элементов различается. Для транспозонов и ретротранспозонов класса I, как правило, характерны дупликации сайтов-мишеней определенного размера. Например, встраивание транспозонов ТпЗ E.coli в новые локусы всегда сопровождается дупликацией участка размером 5 п. н.; встраивание так называемого Лс-элемента (активатора) у кукурузы приводит к дупликации участка размером 8 п. н., а ретротранспозона Drosophila, называемого gypsy,-4 п. н. В то же время при встраивании ретротранспозонов класса II и ретрогенов происходят дупликации участков разного размера. Например, встраивание F-элемента Drosophila- ретротранспозона класса II-приводит к дупликации участка длиной от 8 до 13 п. н. Такая

Сайт-мишень

5( ACGAT fGTCGCAGAG (TATGCO3"

3'( TGCTA (CMCGTC (ATACG Об’

Ступенчатые разрывы

Одноцепочечный Xразрыв "

5'(acgatO№cq,<^»gag(tatgc Q3"

3'(TGCTA (CAGCGT СТС 0(АТАС6 05"

Одноцепочечным разрыв

Сшивание 3-концов мобильного элемента с 5-концами цепей

5'(ACGAT_ Г( 6ТСВСА»АО*ТДЯ|СС Q3'

з' (TGCTA CAGCGTCTC (()(AT ACG О б'

Застраивание бреши ДНК-поли- меразой

Лигирование

5 (ACGATl gtcgcagag((GTCGCAGAG (TATGC О3

3-(тбстАи5дйй,тстс {(сТёЕёТХдНлтАСбОб'

Мобильный элемент

РИС. 10.1

Дупликация сайта-мишени после встраивания мобильного элемента. Вначале обе цепи ДНК расщепляются эндонуклеазой. Места расщеплений отстоят друг от друга на несколько пар оснований (в данном случае девять), в результате чего образуются ступенчатые разрезы. В рассматриваемом примере концы выступают в 5'-направлении. З'-концы мобильного элемента сшиваются с Б'-концами цепей в месте разрывов. Образовавшиеся бреши застраиваются, в результате чего появляются две копии сайта-мишени-по одной с каждой стороны вставки. Длина дуплицированного участка определяется расстоянием между одноцепочечными разрывами. Аналогичные процессы протекают и в том случае, когда после одноцепочечных разрывов образуются З'-выступы.

вариабельность или, напротив, неизменность размеров, вероятно, обусловливается специфичностью ферментов, катализирующих образование смещенных одноцепочечных разрывов в сайтах-мишенях. Неизменность размеров дуплицированных участков, характерная для транспозонов и ретротранспозонов класса 1, по-видимому, связана с тем, что ДНК разрезается специфическими эндонуклеазами, кодируемыми каждым из элементов.

Мобильные элементыкак диспергированныеповторяющиеся последовательности

Как правило, каждый тип мобильных элементов встречается в геноме многократно, т. е. элементы образуют семейства диспергированных повторяющихся последовательностей. Такие семейства благоприятствуют дальнейшим геномным перестрой

кам, создавая сайты для неаллельных гомологичных рекомбинаций, что приводит к делециям, дупликациям, инверсиям и транслокациям. Способность мобильных элементов облегчать перестройки подтверждается на примере ретротранспозона Ту класса I у дрожжей (разд. 10.3). Если такие перестройки происходят в единичных соматических клетках многоклеточного организма, то вероятность их влияния на функционирование соответствующего органа очень мала. Но в клетках зародышевой линии они могут вызывать серьезные мутационные изменения и хромосомные аберрации. Если такие перестройки фиксируются в популяции в результате естественного отбора или генетического дрейфа, то это имеет заметные эволюционные последствия.

Гомологичные рекомбинации между неаллельными диспергированными повторами в отдельных семействах часто привлекают для объяснения повторения сегментов ДНК (разд. 2.4.а). А некоторые различия между гомологичными локусами у разных млекопитающих (например, между локусами Р-гло- биноподобных генов) можно связать с делециями в прямых повторах. К геномным перестройкам приводят также неравный гомологичный кроссин- говер между диспергированными повторами в сестринских хроматидах или гомологичных хромосомах, внутрицепочечная рекомбинация и «проскальзывание с неправильным спариванием» (“"slipped misparing") (рис. 10.2). Молекулярно-генетический анализ, проведенный на Drosophila, показывает, что высокая частота неравного кроссинговера между определенными парами аллелей-это результат присутствия в каждом из членов пары мобильных элементов, находящихся в разных позициях. Реципрокная гомологичная рекомбинация между диспергированными повторяющимися последовательностями из разных хромосом может приводить и к крупным хромосомным перестройкам типа тех, что наблюдаются при цитогенетическом исследовании клеток млекопитающих.

Принимая во внимание высокую частоту диспергированных повторяющихся последовательностей в большинстве эукариотических геномов, можно только удивляться стабильности хромосом. Возможно, рекомбинация между этими сегментами эффективно подавляется с помощью какого-то неизвестного механизма. У дрожжей, где частоту таких рекомбинаций легко измерить генетическими методами, транслокация и другие перестройки отмечаются удивительно редко. Например, в клетках, содержащих две копии гена HI S3, расположенные на негомологичных хромосомах, реципрокный крос- синговер обеспечивает только примерно 10% рекомбинационных событий в данном гене, остальные приходятся на генную конверсию.

РИС. 10.2.

Делеции и амплификации в результате проскальзывания с неправильным спариванием (“slipped misparing") могут происходить в том случае, если неправильно спариваются два прямых повтора (прямоугольники) в дуплексной ДНК вблизи репликативной вилки. А. «Проскальзывание» матричной цепи и вырезание петли или репликация, минуя петлю, с последующей репарацией приводят к делеции. Б. Проскальзывание синтезируемой цепи и последующая репарация могут привести к амплификации.

ТРАНСПОЗИРУЮЩИЕСЯЭЛЕМЕНТЫ

а. Транспозирующиеся элементыпрокариот

О транспозирующихся элементах мы упоминали в гл. 5. когда рассматривали плазмидные векторы. R-плазмида, представленная на рис. 5.1, еще раз более детально, со всеми транспозирующимися элементами, изображена на рис. 10.3. Первые из них, обозначенные IS (от znsertion sequence- инсерционная последовательность), располагаются или изолированно (как IS2), или по концам более длинных единиц сложных транспозонов (например, IS 10, окружающие ТпЮ). Другие, транспозоны (например, ТпЗ), не связаны с IS-элементами. Все эти элементы содержат на обоих концах инвертированные повторы. Последние, а также один или более генов, содержащихся в самих мобильных элементах, необходимы для транспозиции. Кроме того, инсерция любого из данных транспозирующихся элементов обычно бывает связана с дупликациями сайтов-ми

шеней. имеющих специфическую для определенного элемента длину.

Инсерционные последовательности (IS). Такие IS-элементы, как IS1, IS2 и IS 10, имеют определенную длину и уникальную нуклеотидную последовательность (табл. 10.1). Их перемещения в новые геномные локусы часто приводят к мутациям, заключающимся в прерывании регуляторных и кодирующих участков. Частота транспозиций у разных элементов неодинакова и составляет 10-5-10-7 на поколение. При транспозиции IS в новое положение исходный IS-элемент остается на прежнем месте; таким образом, инсерция сопровождается точным синтезом второй копии и зависит от репликативных функций хозяина. Она не зависит от рекомбинационного аппарата Е. coli; не требуется также никакой гомологичности между IS и геномным сайтом-мишенью.

Длина и нуклеотидная последовательность разных IS-элементов E.coli неодинаковы (табл. 10.1) Однако на обоих концах каждого из них всегда имеются инвертированные повторы (иногда несовершенные) (рис. 10.4), которые необходимы для транспозиции. Нуклеотидные последовательности

РИС. 10.3.R-плазмида со всеми инсерционными последовательностями (IS) и транспозонами (Тп). Гены устойчивости к антибиотикам указаны в табл. 5.3.РИС. 10.3.R-плазмида со всеми инсерционными последовательностями (IS) и транспозонами (Тп). Гены устойчивости к антибиотикам указаны в табл. 5.3.этих повторов различны для разных IS и варьируют по длине от 10 до 40 п. н. Еще одна характерная особенность любого IS-размер дуплицированного участка в сайте-мишени (табл. 10.1). Большая часть ДНК в любом IS представлена одним или несколькими структурными генами и соответствующими регуляторными последовательностями. Их генный продукт- транспозаза- необходима для транспозиции. В отличие от транспозонов, IS обычно не содержат каких-либо генов, кроме нужных для

РИС. 10.3.

R-плазмида со всеми инсерционными последовательностями (IS) и транспозонами (Тп). Гены устойчивости к антибиотикам указаны в табл. 5.3.

РИС. 10.3.

R-плазмида со всеми инсерционными последовательностями (IS) и транспозонами (Тп). Гены устойчивости к антибиотикам указаны в табл. 5.3.

транспозиции.

IS-элементы не только ответственны за инсер- ционную инактивацию кодирующих и регуляторных последовательностей в сайте-мишени, но и связаны с разнообразными мутационными событиями. Например, один из IS может в 100-1000 раз повышать частоту делеций и инверсий в соседних участках генома. Более того, премоторные элементы внутри самих IS тоже могут влиять на экспрессию близлежащих генов.

Сложные транспозоны. Часто IS-элементы длиной примерно 1 т. п. н. входят в состав более сложных транспозонов (рис. 10.3 и 10.5; табл. 10.2). Их длина может достигать тысяч пар оснований, а центральные области могут содержать разнообразные гены, например гены устойчивости к антибио-

Таблица 10.1. Типичные IS-элементы Е.соН

IS1768239IS21327415IS414261811IS101329239IS1768239IS21327415IS414261811IS101329239Обычное местонахождение

IS1

768

23

9

IS2

1327

41

5

IS4

1426

18

11

IS10

1329

23

9

IS1

768

23

9

IS2

1327

41

5

IS4

1426

18

11

IS10

1329

23

9

Хромосома Е.соН, 4-19 копий; плазмида R6, две копии; Shigella dysenteria, > 40 копий

Хромосома Е.соН, 0-12 копий; R6, одна копия; F-плазмида, одна копия

Хромосома Е.соН, 1-2 копии

R-плазмиды

тикам. С обеих сторон эта центральная область фланкируется одинаковыми IS-элементами (от IS1 до IS 10)- IS-L и IS-R с левой и правой сторон соответственно. В различных сложных транспозонах взаимная ориентация IS-L и IS-R может быть как одинаковой, так и разной. Поскольку сами IS-элементы несут инвертированные концевые повторы, их содержат и транспозоны независимо от того, в прямой или обратной ориентации находятся фланкирующие IS.

Вся информация, необходимая для перемещения сложного транспозона, содержится в его IS-части; это та самая информация, которая используется IS-элементом как таковым,- инвертированные кон-

^"Левый"конец722 п.н."Правын"конец(GGTG A TGCT G <;сААСТТАС T|GATАТСA A SAAGTTGGA G ТС ATT ACC03'(ССАСТ ACG ACG GTTGAATG А СТАTAGT T АТТСААССТ СAtiTAAT GGQ ■з'5РИС. 10.4.дающие пары оснований выделены цветными прямоКонцевые инвертированные повторы у IS1. Несовпа- угольниками.^"Левый"конец722 п.н."Правын"конец(GGTG A TGCT G <;сААСТТАС T|GATАТСA A SAAGTTGGA G ТС ATT ACC03'(ССАСТ ACG ACG GTTGAATG А СТАTAGT T АТТСААССТ СAtiTAAT GGQ ■з'5РИС. 10.4.дающие пары оснований выделены цветными прямоКонцевые инвертированные повторы у IS1. Несовпа- угольниками.цевые повторы и один или несколько генов, кодирующих транспозазу. Требование обязательного наличия в транспозоне концевых повторов означает, что наружные части IS-L и TS-R должны быть идентичными, однако, поскольку для транспозиции достаточно одной копии структурных генов, эта идентичность может не распространяться на всю длину IS-L и IS-R. Один из элементов может быть поврежден в результате мутации, приводящей к частичной или полной утрате его функции. Так, у сложного транспозона Тп10 (рис. 10.5) транспозаза может кодироваться или IS10-L, или IS10-R, но IS10-R гораздо более эффективен. Кроме того, IS10-R может выступать в роли независимого IS-злемента, а ISlO-L-нет. По-видимому, за различия в активности соответствующих генных продуктов отвечают

^"Левый"конец722 п.н."Правын"конец

(GGTG A TGCT G <;сААСТТАС T|GATАТСA A SAAGTTGGA G ТС ATT ACC03'

(ССАСТ ACG ACG GTTGAATG А СТАTAGT T АТТСААССТ СAtiTAAT GGQ ■

з'5

РИС. 10.4.дающие пары оснований выделены цветными прямо

Концевые инвертированные повторы у IS1. Несовпа- угольниками.

^"Левый"конец722 п.н."Правын"конец

(GGTG A TGCT G <;сААСТТАС T|GATАТСA A SAAGTTGGA G ТС ATT ACC03'

(ССАСТ ACG ACG GTTGAATG А СТАTAGT T АТТСААССТ СAtiTAAT GGQ ■

з'5

РИС. 10.4.дающие пары оснований выделены цветными прямо

Концевые инвертированные повторы у IS1. Несовпа- угольниками.

ТранспозонРазмер, п.н.IS-концыОриентация ISДлина концевых инвертированных повторов, п.н.Длина дуплицированной мишени, п.и.Содержащиеся геныТпЗ4957Нет—385атркТп92638IS1Прямая239camRТпЮ9300IS10Обратная13299tetRТранспозонРазмер, п.н.IS-концыОриентация ISДлина концевых инвертированных повторов, п.н.Длина дуплицированной мишени, п.и.Содержащиеся геныТпЗ4957Нет—385атркТп92638IS1Прямая239camRТпЮ9300IS10Обратная13299tetRТаблица 10.2. Типичные транспозоны Е.соНТаблица 10.2. Типичные транспозоны Е.соНвесьма незначительные различия в последовательностях этих практически одинаковых ISlO-элементов. В некоторых сложных транспозонах один из IS-элементов полностью нефункционален (за исключением инвертированных концевых повторов).

Транспозон

Размер, п.н.

IS-концы

Ориентация IS

Длина концевых инвертированных повторов, п.н.

Длина дуплицированной мишени, п.и.

Содержащиеся гены

ТпЗ

4957

Нет

—

38

5

атрк

Тп9

2638

IS1

Прямая

23

9

camR

ТпЮ

9300

IS10

Обратная

1329

9

tetR

Транспозон

Размер, п.н.

IS-концы

Ориентация IS

Длина концевых инвертированных повторов, п.н.

Длина дуплицированной мишени, п.и.

Содержащиеся гены

ТпЗ

4957

Нет

—

38

5

атрк

Тп9

2638

IS1

Прямая

23

9

camR

ТпЮ

9300

IS10

Обратная

1329

9

tetR

Таблица 10.2. Типичные транспозоны Е.соН

Таблица 10.2. Типичные транспозоны Е.соН

Простые транспозоны. Некоторые транспозоны не связаны ни с какими IS-элементами (табл. 10.2): информация, необходимая для транспозиции, закодирована в них самих. В качестве примера можно привести транспозон ТпЗ (рис. 10.6), который содержит инвертированные концевые повторы длиной 38 п. н., IS-L и IS-R, необходимые для транспозиции. Между этими повторами находятся три гена: два из них кодируют транспозиционные белки (tnp А и tnp R), третий- р-лактамазу (ген атр). Кроме того, имеется некодирующий участок длиной 170 п.н., содержащий промоторы генов tnp А и tnpR, а также специфический участок, называемый res и тоже необходимый для транспозиции. Важное различие между IS-элементами и простыми транспозонами состоит в том, что последние содержат гены типа атр, не связанные с транспозицией.

Сайты-мишени. До сих пор, говоря о транспозиции у прокариот, мы рассматривали сами транс- позирующиеся элементы. Что же представляют собой те сегменты ДНК, в которые они встраиваются,-сайты-мишени? Одни транспозирующиеся элементы довольно разборчивы и охотнее встраиваются в короткие геномные сегменты, гомологичные концам самого элемента. Другие менее капризны и не отдают явного предпочтения никаким сайтам- мишеням, хотя наблюдается некоторая тенденция к встраиванию их в АТ-богатые участки. Некоторые элементы высокоспецифичны в отношении определенных палиндромных сайтов-мишеней (например,

РИС. 10.5.

Сложный транспозон ТпЮ имеет две копии IS10, фланкирующие центральный сегмент, который несет ген устойчивости к тетрациклину.

РИС. 10.6.

Простой транспозон ТпЗ. Стрелки указывают направление транскрипции трех генов.

IS5 предпочитает последовательность 5'-CTAG, а TnlO- 5'-GCTNAGC). Поскольку для каждого транс- позирующегося элемента характерен свой размер дуплицированного участка, расстояние между одноцепочечными разрывами в сайтах-мишенях, по-ви- димому, полностью или частично детерминируется самими элементами.

Бактериофаг Ми. Умеренный бактериофаг Е.соН, называемый Ми, по своему поведению сходен с транспозонами или IS-элементами. Геном Ми представляет собой дуплексную ДНК длиной около 39 т. п. н. с концевыми инвертированными (несовершенными) повторами длиной примерно 20 п.н., которые фланкированы сегментами ДНК Е.соН (рис. 10.7). После инфицирования Ми-ДНК встраивается в хромосому Е. coli; при этом в месте встраивания происходит дупликация участка длиной 5 п. н. и образуется стабильный лизоген. В результате индукции таких Mu-лизогенов может начаться репликация Mu-ДНК. Однако в отличие от событий, происходящих при индукции лизогенов фага X, реплицирующаяся ДНК бактериофага Ми остается встроенной в хромосому, а новые фаговые геномы образуются при репликации фаговой ДНК in situ. Эта новосинтезированная Ми-ДНК, не связанная со встроенной копией, внедряется в новые хромосомные локусы. В конце концов хозяйский геном разрушается, и Ми-ДНК, фланкированная с обоих концов фрагментами ДНК Е. coli, упаковывается в фаговые частицы.

Присутствие ДНК профага Ми в ДНК Е.соН порождает разнообразные перестройки, связанные с ее транспозицией. Они сходны с перестройками,

L1 И В

Репликативная транспозиция в другие геномные сайты, зависящая от функций генов А и В

РИС. 10.7.

Схематическое представление генома бактериофага Ми и его жизненного цикла (масштаб рисунка не выдержан). Указаны левые и правые концевые повторы (L1 и R1), а также гены, кодирующие транспозазу (Z1), и факторы, необходимые для репликации (б) Функции сегмента G описаны в разд. Ю.б.а.

индуцируемыми IS-элементами и транспозонами. Поскольку транспозиции Mu-ДНК происходят с относительно высокой частотой и их можно проводить в бесклеточных системах, фаг Ми используется для изучения механизмов бактериальной транспозиции на молекулярном уровне.

Механизмы транспозиции. Для объяснения транспозиции предложено много моделей, но все их можно разбить на два класса в соответствии с наблюдаемыми типами транспозиций (рис. 10.8). Для простоты рассмотрим транспозицию из одного генома в другой (например, из плазмиды в бактериальный геном или обратно). (Отметим, что интегрированная Mu-ДНК тоже может транспозиро- ваться в плазмидную ДНК.) Внутримолекулярная транспозиция протекает более сложно; мы вкратце остановимся на ней в конце этого раздела

В ходе транспозиции первого типа, называемой коинтеграционной, донорный геном, который несет транспозирующийся элемент, сливается с реципиен- тной молекулой ДНК. Образовавшийся коинтеграт содержит всю донорную и реципиентную ДНК, а также по одной копии транспозирующегося элемента в местах сочленения этих ДНК. Коинтеграция включает разрыв исходных фосфодиэфирных связей и образование новых, дупликацию всего элемента и дупликацию сайта-мишени. Коинтеграт может затем разрешаться (resolve) с образованием двух исходных ДНК, каждая из которых несет копию транспозированного элемента. При транспозиции путем коинтеграции используется не только информация, закодированная в самом элементе, но и

репликативные функции клетки. Этот механизм иногда называют репликативной транспозицией, поскольку происходит полная дупликация элемента.

Транспозиция второго типа называется простым встраиванием. Транспозирующийся элемент перемещается в новый геномный локус, при этом никаких других перестроек, кроме дупликации сайта-мишени, не происходит. Этот вид транспозиции иногда называют консерва тивным (или нсрепликативным), поскольку дупликации как таковой не происходит. Некоторые транспозирующиеся элементы, например ДНК фага Ми, участвуют как в коинтеграции, так и в простом встраивании.

Существует еще одна весьма привлекательная модель, согласно которой на основе общей промежуточной структуры осуществляется транспозиция любого из двух типов (рис. 10 9). В соответствии с этой моделью может происходить транспозиция ДНК фага Ми и других мобильных элементов. На рисунке, иллюстрирующем модель, и ДНК донора, и ДНК реципиента представлены в кольцевой форме, поскольку в экспериментах in vitro, поставленных для проверки справедливости данной модели, использовалась кольцевая плазмидная ДНК; мобильным элементом в донорной ДНК служила модифицированная ДНК фага Mu. In vivo доноры и реципиенты, например плазмиды и хромосомы E.coli, также находятся в кольцевой форме.

Согласно данной модели, транспозиция начинается с образования одноцепочечных разрывов в кольцевых донорной и реципиентной ДНК. У донора такие разрывы происходят с обоих З'-концов

РИС. 10.8.

Два возможных способа встраивания мобильного элемента в новый локус. Донор мобильного элемента и реципиент изображены в виде двух отдельных колец, хотя оба они могут находиться в одной и той же молекуле ДНК. Сам элемент (выделен цветом) изображен вместе с концевыми инвертированными повторами и дупликациями сайта-мишени (жирные концы стрелок). При первом способе образуется промежуточный коинтеграт с дупликацией мобильного элемента; последний затем диссоциирует на два продукта, каждый из которых содержит копию мобильного элемента. При втором способе-простом встраивании-мобильный элемент перемещается от донора к реципиенту без репликации. Кольцевая донорная ДНК утрачивает элемент, и его дальнейшая судьба неизвестна. Сайт-мишень реципиента дуплицируется независимо от способа встраивания.

элемента, у реципиента-в сайте-мишени с образованием 5'-выступов. Затем разрезанные концы мобильного элемента соединяются с концами реципиента, и образуется общий промежуточный продукт. Если в цепях, противоположных по отношению к разрезанным первоначально, никаких дополнительных разрывов не происходит, то имеет место простое встраивание В результате заполнения бреши и лигирования происходит дупликация сайта-

мишени. Таким способом может осуществляться нерепликативная транспозиция TnlO. Эту реакцию катализирует транспозаза TnlO, которая ускоряет разрезание на концах TnlO, а также, по-видимому, воссоединение разорванных концов. При репликативной транспозиции общий промежуточный продукт претерпевает совсем другие превращения. Заметим, что интермедиат по своей структуре аналогичен кольцевой ДНК с двумя репликативными вилками. Если репликация начинается в каждой вилке, то конечный продукт представляет собой коинтеграт-кольцо, содержащее и донорную, и ре- ципиентную ДНК, а также копии транспозирующе- гося элемента, реплицированные полуконсерватив- ным путем. При разрешении коинтеграта в конце концов осуществляется транспозиция новой копии мобильного элемента в другой сайт-мишень. Разрешение может происходить путем гомологичной рекомбинации между двумя копиями транспози- рующегося элемента с участием рекомбинационного аппарата E.coli. (рис. 10.10). Однако более эффективное разрешение наблюдается в том случае, если оно детерминируется самими транспозирующими элементами.

Транспозиция ТпЗ и родственных ему простых транспозонов происходит репликативным путем с образованием коинтеграта (рис. 10.10). Этот коинтеграт содержит прямые повторы ТпЗ и два сочленения между донорной и реципиентной ДНК. Для его образования нужна транспозаза продукт гена тр\л а также элементы IR-L и IR-R; необходим также репликативный аппарат клетки-хозяина. Разрешение включает внутримолекулярную сайт-спе- цифическую рекомбинацию между двумя res-сайтами двух ТпЗ-элементов (рис. 10.6) и протекает при участии продукта гена mpR- белка резолвазы. Если ген tnpR отсутствует, то разрешение может происходить при помощи рекомбинационного аппарата Е. coli, но со значительно меньшей эффективностью. Механизм действия ТпЗ-транспозазы неизвестен. Однако реакции, катализируемые очищенной резол- вазой. можно изучать в опытах in vitro. При этом субстрат-дуплексная ДНК-должен представлять собой кольцевую молекулу с отрицательными сверхвитками и содержать два res-сайта, ориентированных в коинтеграте одинаковым образом. Сайт-специфическая резолваза связывается с обоими res-сайтами и катализирует топоизомеразоподобный обмен цепей ДНК с последующим кроссин- говером и рекомбинацией. В реакции принимают участие четыре цепи ДНК, при этом разрываются и вновь образуются четыре фосфодиэфирные связи. Репликации ДНК не происходит. Отметим, что промоторы обоих генов- tnp А и tnp R- находятся в сайте res (рис. 10.6). При связывании резолвазы с res-сайтами экспрессия обоих генов подавляется

Мобильный элемент

Расщепление в местах соединения транспозона и исходной флан- у кирующей послеу довательности / (Айв) /

До

Реплика- / тивная / вилка г

Общий х-. промежуточный продукт

РИС. 10.9.

Репликативная и нерепликативная транспозиция на основе одной промежуточной структуры. Как донорная, так и реципиент- ная ДНК представлены в виде колец. Точками обозначены Б'-концы донорного элемента. Серыми прямоугольниками выделены сайты-мишени реципиента (дупликации сайтов-мишеней, окружающие донорный транспозон, для удобства не указаны). Первый этап состоит в образовании в донорной и реципиентной ДНК одноцепочечных разрывов с выступами. У донора они происходят с обоих З'-концов элемента, а у реципиента-в сайте-мишени с образованием одноцепочечных выступов определенной длины (см. рис. 10.1). На следующем этапе свободные Б'-концы реципиента лигируют со свободными З'-концами донора с образованием промежуточного продукта. [К. Mizuuchi, Cell 39 (1984), р. 395.]

А’

/Заполнение бреши, лигирование

i Репликация в двух репликативных вилках

( Простое )встраивание

Разрешение

Реципиент

Донор

Воссоединение, катализируемое транспозазой (tnpA)

оинтеграт Диссоциация, катализируемая резолвазой (tnpR)

РИС. 10.10.

Репликативная транспозиция ТпЗ путем образования и диссоциации коинтеграта. Показаны дупликации сайта-мишени только у донора.

Продукт

Донор

5'IS10 L1310IS10R3‘

( «tTCAGCG (- ^[~ J / /" I К" CAtTt»bt<5П

3' а:

^CCACTtAC

Гомология между 1S10-L и IStO-R способствует такому взаимному расположению тандемных повторов, при котором происходит их рекомбинация

5'

С

CACTCAGCGО

+

Неизвестные продукты

РИС. 10.11.

Гомологичная рекомбинация между дуплицированными сайтами-мишенями приводит к вырезанию мобильного элемента и восстановлению исходного сайта-мишени. Показана только одна цепь ДНК, в качестве примера взят ТпЮ.

и другие транспозиции ограничиваются.

Вырезание. Встраивание и вырезание мобильного элемента - совершенно разные процессы: точное вырезание элемента нс детерминируется им самим. Во многих случаях вырезание не сопровождается встраиванием: вырезанный элемент утрачивается и его судьба остается неизвестной. Вырезание, по-видимому, происходит в результате гомологичной рекомбинации между копиями сайта-мишени (рис. 10.11). При этом может элиминироваться весь элемент и один из фланкирующих его повторов с восстановлением исходного сайта-мишени. Таким образом, вырезание может исправлять мутации, обусловленные встраиванием. В некоторых случаях эти события зависят от продукта хозяйского гена гесХ. В других ситуациях ген гее А не нужен и частота вырезания зависит от других рекомбинационных и репарационных функций хозяина.

Связь между встраиванием мобильных элементов и мутациями. Нередко встраивание мобильного элемента в регуляторный или кодирующий участок приводит к подавлению экспрессии соответствующего гена, но, как правило, последствия оказываются более сложными (рис. 10 12). В некоторых случаях промотор, расположенный внутри самого элемента, индуцирует экспрессию соседнего, ранее молчавшего гена. Например, в модуле IS10-R транс

позона ТпЮ имеется сильный промотор, расположенный на расстоянии 100 п.н. от конца элемента; транскрипция начинается в направлении от элемента и распространяется на соседний участок ДНК (рис. 10.12, а). Если элемент встроен в один из генов полицистронного оперона, то эффекты оказываются другими. Например, встроенный элемент может влиять на экспрессию последующих генов, либо останавливая транскрипцию в сайте терминации, находящемся внутри его самого (рис. 10.12,6), либо подавляя трансляцию дистальных кодирующих последовательностей мРНК (рис. 10.12, в).

Когда один и тот же геном служит и донором, и реципиентом при образовании коинтеграта (внутримолекулярная транспозиция), способность мобильных элементов вызывать перестройки в соседних участках ДНК приводит к другим мутационным эффектам. Все происходящие при этом события, включая делеции и инверсии, связаны с соединением одного или двух концов мобильного элемента с новыми последовательностями ДНК (рис. 10.13); детали этих процессов до конца не установлены. Наконец, гомологичная рекомбинация между двумя идентичными мобильными элементами, находящимися в дуплексе ДНК в одной ориентации, приводит к делеции расположенных между ними последовательностей.

... Экспрессия происходит с низкой Эффективностью ' или вообще отсутствует... Экспрессия происходит с низкой Эффективностью ' или вообще отсутствует

... Экспрессия происходит с низкой Эффективностью ' или вообще отсутствует

... Экспрессия происходит с низкой Эффективностью ' или вообще отсутствует

Включение экспрессии соседних генов

Слабый промотор

Незанятый (z^x i

сайт(Ген

Незанятый сайтНезанятый сайт

Незанятый сайт

Незанятый сайт

Полярные транскрипционные эффекты в полицистронных оперонах

Включение полицистронного оперона

Полярные транскрипционные эффекты в полицистронном опероне

Незанятый сайт

Рибосомы

Белок

Обычно рибосомы отделяются,ие достигнув кодона AUG в гене 2, и трансляция прерывается. I рансляция, сопряженная с транскрипцией, также может прерываться

ных элементов.

Мобильный элемент

Инверсия с дупликацией

вставки

РИС. 10.13.

Перестройки в молекуле ДНК, связанные с наличием в ней мобильных элементов. [N. Kleckner, Алл. Rev. Gen. 15 (1981), р. 34.]

Р-элементы дрозофилы

Генетическая особенность некоторых линий D.melanogaster состоит в том, что для них характерен гибридный дисгенез. Как мы увидим далее, свойства систем с дисгенетическими признаками коррелируют с присутствием в них мобильных элементов. У дрозофилы известно несколько таких систем; одна из них-P-система-особенно хорошо охарактеризована как на генетическом, так и на молекулярном уровнях.

Транспозиция P-элементов. В геноме некоторых линий D.melanogaster диспергировано примерно 40 членов Р-семейства (в расчете на гаплоидный геном). В то же время у дрозофил других линий вообще нет P-элементов. Последовательность наиболее длинных P-элементов размером 2,9 т. п. н. высококонсервативна; длина других элементов варьирует от 0,5 до 2,9 т. п. н. и по сравнению с полноразмерным элементом длиной 2,9 т. п. н. в них имеются значительные делении. Во всех Р-эле- ментах, независимо от размера, есть концевые инвертированные повторы длиной 31 п. н.

Способность P-элементов к транспозициям проявляется несколькими способами. Во-первых, число копий P-элемента варьирует от одной линии мух к другой. Во-вторых, локализация P-элементов в геноме у разных линий неодинакова. Так, при расщеплении ДНК разных линий специфическими рестрик-

тазами и блот-гибридизации с использованием в качестве зонда P-элементов получаются разные профили. И наконец, четко показано, что встраивание и вырезание P-элементов в специфические локусы коррелируют соответственно с мутациями и реверсиями в определенных генах.

В геноме D. melanogaster имеется локус white, участвующий в детерминации цвета глаз насекомого. Как правило, мутанты по этому локусу имеют белые, а не красные глаза, как у обычных мух. ДНК-блоттинг с использованием в качестве зондов сегментов ДНК из области мутантного локуса white и локуса дикого типа показал, что одна группа мутаций while обусловлена встраиванием Р-элемен- та в этот локус (рис. 10.14). Данные о том, что P-элемент действительно ответствен за упомянутую мутацию, были получены при исследовании ДНК из мух-ревертантов с красными глазами. Между мутантной и ревертантной ДНК не было обнаружено никаких поддающихся идентификации различий, кроме того, что у ревертантов P-элемент был утрачен, но осталась единственная копия сайта-мишени (у мутантов эти копии находятся по обоим концам Р-элемента).

P-элементы встраиваются преимущественно в определенные сайты. Сравнение копий сайтов-мишеней в окрестности нескольких P-элементов позволило получить консенсусную последовательность такого сайта: 5'-GGCCAGAC. При встраивании P-элемента этот сайт-мишень длиной 8 п. н. дуплицируется.

Мобильные элементы других видов в D.melanogaster также варьируют по числу копий и тоже вызывают инсерционные мутации (разд. 10.3). Однако их структура и механизм транспозиции существенно отличаются от таковых для Р-элемента. Свойства P-элементов, в частности наличие концевых инвертированных повторов и генов, кодирующих один или несколько необходимых для транспозиции факторов, наводит на мысль об их сходстве с мобильными элементами бактерий. Более того, P-элемент, как и ТпЗ, может сам подавлять детерминируемые им процессы, в частности транспозицию, хотя это сложный процесс, который зависит и от других генетических факторов.

Гибридный дисгенез в линиях, содержащих Р-элементы. Экспрессия генов, кодируемых Р-элемента- ми, оказывает существенное влияние на клетки зародышевой линии мух-потомков от скрещивания самцов из линий, содержащих P-элемент (Р-линий), и самок из линий без Р-элемента (М-линий). Совокупность наблюдаемых эффектов и называют гибридным дисгенезом. Дисгенные мухи часто оказываются стерильными, а если они фертильны, то у их потомков обнаруживается множество мутаций и хромосомных аберраций, и эти признаки передают-

1 т п иНаправление транскрипции

., и примерное положение

кодирующего участка

Теломера «_ SSc X В Xh XhSm Н В ^центромера Дикий ти^ Сайтг^шень~ ———————Ц$

красные глазаМутации! fРеверсия

^^РалемрнтХВ Xh Xh Sm НВ4-4 р-элементг44- 4 4-4->—^8^^РалемрнтХВ Xh Xh Sm НВ4-4 р-элементг44- 4 4-4->—^8

^^РалемрнтХВ Xh Xh Sm НВ

4-4 р-элементг44- 4 4-4

->—^8

^^РалемрнтХВ Xh Xh Sm НВ

4-4 р-элементг44- 4 4-4

->—^8

Мутант, белые глаза Н S

РИС. 10.14.

Мутация «белые глаза» у Drosophila обусловливается встраиванием P-элемента в локус white Х-хромосомы. Для построения геномной карты данной области использовали перекрывающиеся клонированные сегменты охватывающие участок длиной более 25 т п. н., который содержит локус white дикого типа. Используя эти сегменты в качестве зондов, клонировали фрагменты, включающие гомологичные участки из рекомбинантной библиотеки, сконструированной из ДНК мутанта white, и построили карту мутантного локуса. Этот локус со

держит лишние 1,4 т. п. н. по сравнению с локусом дикого типа, которые гибридизуются с ДНК клонированного P-элемента. Аналогичным образом была построена карта мутантного локуса для ревертанта с красными глазами. У этого ревертанта P-элемент утрачен; осталась только одна копия сайта мишени размером 8 п. н„ которая в дуплицированном виде находилась на концах P-элемента. Таким образом, структура локуса white у ревертанта и дикого типа одинакова.

ся следующим поколениям. Кроме того, некоторые из мутаций у дисгенных мух довольно нестабильны и с высокой частотой ревергируют к дикому типу или к измененным аллелям Другая характерная особенность систем с дисгенными свойствами состоит в том, что в отличие от нормальных самцов Drosophila у дисгенных самцов наблюдается рекомбинация.

В основе гибридного дисгенеза лежит внедрение отцовских хромосом, несущих P-элементы, в яйцо М-линии. При скрещивании Р-самцов с Р-самками или М-самцов с Р-самками гибридного дисгенеза не наблюдается (рис. 10.15). Для его проявления необходимы как P-элементы, так и не содержащие этих элементов клетки М-линии. Согласно одной из моделей, присутствие P-элемента в материнских хромосомах приводит к подавлению транспозиции P-элемента и тем самым блокированию гибридного дисгенеза.

Высокая частота мутаций и реверсий у дисгенных мух в значительной степени обусловливается встраиванием и вырезанием P-элементов. Встраивание, по-видимому, происходит только в клетках зародышевой линии с частотой примерно одно встраивание на хромосому в одном поколении мух (эти оценки получены с помощью гибридизации in situ с политенными хромосомами). Как показывают результаты реверсии мутации в локусе white, вырезание происходит очень точно (рис. 10 14) Частоту этих событий можно оценить генетически исходя из частоты реверсий; они наблюдаются у каждых четырех из тысячи мух, т. е. эта частота

намного выше, чем у транспозонов бактерий. У недисгснных мух (например, в поколении от скрещивания Р-самцов и Р-самок) частота как инсер- ционных мутаций, так и реверсий значительно ниже

Для гибридного дисгенеза нужен полноразмерный P-элемент. В укороченных P-элементах последовательности. необходимые для транспозиции и вырезания, делегированы. Однако P-функции коротких элементов могут восполнять в одних и тех же клетках полноразмерные щранс-элементы. Рассмотрим, например, мутацию sn” в локусе singed, вызванную встраиванием короткого Р-элемента Мутантные мухи имеют необычные щетинки. С помощью генетических манипуляций можно получить мух, несущих мутацию sn", но не содержащих других P-элементов. При скрещивании таких самцов с самками из М-линии гибридного дисгенеза не наблюдается, и мутация sn” оказывается стабильной. Однако при введении в геном полноразмерного P-элемента эта мутация становится нестабильной. Таким образом, целый P-элемент обеспечивает вырезание, находясь в транс-положении по отношению к дефектному элементу (рис. 10.16).

Функции, кодируемые P-элементом. Фенотип особей с дисгенетичсскими признаками указывает, что P-элементы кодируют несколько факторов. Один или несколько из них ответственны за транспозицию (например, гранспозаза) и, следовательно, за повышение частоты встраивания (1), за вырезание (2) и стерильность (3), обусловленную в основном высокой скоростью мутирования. Транс- позазная активность, по-видимому, ограничивается

Нормальные мухиНормальные мухиМ-линия Р-линияМ-линия Р-линия

Нормальные мухи

Нормальные мухи

М-линия Р-линия

М-линия Р-линия

Гибридный дисгенез: стерильность, P-линияМ пиния высокаячастота .

г линиям-линия реверсии,мутации,

хромосомных аберраций

РИС. 10.15.

Гибридный дисгенез у Drosophila. Точки на хромосомах- Р-элементы.

клетками зародышевой линии. Кроме того, супрессия транспозиции и, следовательно, других фенотипических проявлений у Р-самок позволяет предполагать, что P-элементы кодируют и репрессию функций P-элементов. Поскольку в цитоплазме М-самок репрессор отсутствует, экспрессия генов P-элемента и гибридный дисгенез не блокируются.

Полноразмерный P-элемент содержит четыре открытые рамки считывания (экзона) в одной цепи ДНК (рис. 10.17). В соматических клетках дисгенных зародышей обнаруживаются два больших полиаде- нилированных транскрипта P-элемента, содержащих нуклеотидную последовательность указанной выше цепи. Синтез обеих РНК начинается вблизи 5'-конца смысловой цепи P-элемента. Синтез более короткой РНК длиной 2,5 т. п. н. заканчивается сразу за ро1у(А)-концом, на остатке 2700, а синтез более длинной РНК размером 3 т. п. н,-вблизи конца P-элемента, возможно во фланкирующих геномных последовательностях. Сплайсинг этих РНК проходит одинаково. Первые два интрона удаляются с образованием одной длинной открытой рамки считывания (ORF); четвертая ORF остается прер-

ванной и, по-видимому, не транслируется. Этот факт весьма удивителен, поскольку мутационный анализ полноразмерных P-элементов показал, что транспозазе необходимы все четыре ORF. Одно из объяснений может состоять в том, что сплайсинг этого последнего интрона с образованием мРНК, на которой синтезируется транспозаза, происходит только в клетках зародышевой линии. Такая «регуляторная» модель объясняет, почему транспозиции P-элемента происходят только в этих клетках.

Получить достаточное количество РНК из клеток зародышевой линии D. melanogaster для прямой проверки этой гипотезы невозможно. Поэтому были проведены опыты по схеме, представленной на рис. 10.16 (обратная генетика). В Р-элементы были внесены сайт-специфические мутации в места 5'- и З'-сочленений третьего и четвертого экзонов. В другом варианте был удален интрон между этими двумя экзонами. Мутантные элементы инъецировали в клетки мух, несущих мутацию sn" и не содержащих других P-элементов, и определяли стабильность мутации sn" у потомков этих мух. Если мутация оказывалась нестабильной, то это означало, что в клетках присутствует функциональный P-элемент. В соответствии с данной моделью Р-элементы, у которых мутация затрагивает одну пару оснований в любом из сочленений экзонов, не дестабилизируют sn”. Однако инъекция P-элемента, не содержащего интрона, дестабилизирует мутацию sn” точно так же, как дестабилизирует ее нормальный P-элемент. Более того, не содержащий интрона P-элемент даже облегчает транспозицию и вырезание в соматических клетках, что тоже свидетельствует об уникальной способности клеток зародышевой линии к специфическому сплайсингу. В соответствии с этим Р-РНК, содержащая интрон 3, обнаруживается во всех соматических клетках и на протяжении всего развития организма. Таким образом, регуляция транскрипции не отвечает за то, что транспозазная активность оказывается присущей только клеткам зародышевой линии. Вместо этого экспрессия соответствующих генов регулируется на уровне процессинга первичного транскрипта.

Соматические клетки D. melanogaster, которые содержат измененный P-элемент, лишенный третьего интрона, в отличие от клеток с нормальным P-элементом, синтезируют белок мол. массой 87 кДа. Судя по размеру, он кодируется полностью сплайсированной Р-РНК и, вероятно, является транспозазой. Другой, более короткий полипептид транслируется с Р-РНК, в которых интрон 3 сохранен, т.е. с РНК длиной 2,5 и 3 т. п. н. из соматических клеток. Соответствующий Р-кодируемый полипептид мол. массой 66 кДа, по-видимому, от-

Drosophila

ДНК

snw, дефектный Р- элемент

—Н8

Зародыш дрозофилы sri* Предшественники клеток зародышевой линии

Взрослые мухи.зи'*

Скрещивание с мухой из М-линии

Потомство с высокой частотой генотипа sn*

РИС. 10.16.

Все факторы, необходимые для транспозиции, кодирует один P-элемент размером 2,9 т. п.н. Слева представлена схема эксперимента, справа-два участка геномной ДНК, на которых разворачиваются все события. Полноразмерный P-элемент длиной 2,9 т. п. н. был клонирован в плазмиде pBR322 и инъецирован в эмбрион snw на очень ранних стадиях. Эмбрион не содержал никаких других P-элементов, кроме короткого дефектного элемента Р, детерминирующего мутацию snw. Развившиеся из этих зародышей взрослые мухи имели стабильный фенотип snw. Однако у потомков некоторых иэ них мутация snw оказалась нестабильной. Кроме того, геномная ДНК взрослых мух и их потомков содержала новый полноразмерный P-элемент. Таким образом, некоторые из инъецированных P-элементов встроились в ДНКклеток зародышевой линии, успешно реплицировались во время дифференцировки и развития и экспрессировались (в зародышевых клетках). Последовательности pBR322, которые были ковалентно связаны с P-элементом в инъецированной ДНК, в клетках потомков не обнаружены. Таким образом, встраивается P-элемент не путем неспецифической рекомбинации, а целиком переносится из вектора в геном Drosophila с помощью собственного аппарата транспозиции [А. С. Spradling, G. М. Rubin, Science 218 (1982), р. 341.]

ветствен за репрессию транспозиции, наблюдаемую в соматических клетках и Р-яйцах.Механизм встраивания и вырезания Р-элементов неизвестен. Помимо транспозазы, в этих процессах, по-видимому, участвует полипептид мол. массой примерно 65 кДа, который связывается с концевымиветствен за репрессию транспозиции, наблюдаемую в соматических клетках и Р-яйцах.Механизм встраивания и вырезания Р-элементов неизвестен. Помимо транспозазы, в этих процессах, по-видимому, участвует полипептид мол. массой примерно 65 кДа, который связывается с концевыми

ветствен за репрессию транспозиции, наблюдаемую в соматических клетках и Р-яйцах.

Механизм встраивания и вырезания Р-элементов неизвестен. Помимо транспозазы, в этих процессах, по-видимому, участвует полипептид мол. массой примерно 65 кДа, который связывается с концевыми

ветствен за репрессию транспозиции, наблюдаемую в соматических клетках и Р-яйцах.

Механизм встраивания и вырезания Р-элементов неизвестен. Помимо транспозазы, в этих процессах, по-видимому, участвует полипептид мол. массой примерно 65 кДа, который связывается с концевыми

повторами длиной 31 п.н. После вырезания Р-эле- мента остаются разные сайты-мишени. В одних случаях происходит полное вырезание Р-элемента и одной из копий сайта-мишени (рис. 10.14), в других эта вторая копия целиком или полностью остается, иногда остается даже часть Р-элемента.

2,9т.п.ц.

।1

Р-элемент

31 п.н.

31 П.Н. Интрон! Интрон 2 Интрон 3

А। Транскрипция,полиадени-

1 лирование, сплайсинг

poly (^)-РНК и белок в соматических клеткахpoly (^)-РНК и белок в соматических клеткахООООООООООСООСООЭООБелок мол. массой 66 к ДаООООООООООСООСООЭООБелок мол. массой 66 к Даpoly (А+)-РНК и белок в клетках зародышевой линииpoly (А+)-РНК и белок в клетках зародышевой линии

poly (^)-РНК и белок в соматических клетках

poly (^)-РНК и белок в соматических клетках

ООООООООООСООСООЭОО

Белок мол. массой 66 к Да

ООООООООООСООСООЭОО

Белок мол. массой 66 к Да

poly (А+)-РНК и белок в клетках зародышевой линии

poly (А+)-РНК и белок в клетках зародышевой линии

РИС. 10.17.

А. Структура полноразмерного Р-элемента, содержащего концевые инвертированные повторы длиной 31 п. н„ четыре экзона и три интрона. Б. Две полиаденилированные Р-РНК, обнаруженные в соматических клетках, и кодируемый ими белок мол. массой 66 кДа. Транскрипция начинается с 87-й пары оснований. В. Предполагаемая структура полиадени- лированной РНК, которая содержится только в клетках зародышевой линии и кодирует транспоэаэу мол. массой 87 кДа; все три интрона в этой РНК удалены при сплайсинге. [К. O'Hare, G. М. Rubin, Cell 34 (1983), р. 25; R. Е. Karess, G. М. Rubin, Cell 38 (1984), р. 135.]

сооостэоооооооооооосхэо

Белок мол. массой В7 кДа

Выводы. Описанные на рис. 10.16 эксперименты показывают, что P-элементы можно использовать в качестве векторов для введения в D. metanog as ter практически любого гена (часть IV). Кроме того, P-система интересна и с эволюционной точки зрения. Появление в геноме P-элемента может привести к репродуктивной изоляции популяций мух, занимающих одну экологическую нишу. Таким образом, P-элементы могут служить фактором видообразования, хотя, по-видимому, и не дают никаких селективных преимуществ, поскольку мухи М-линий в отсутствие P-элемента более жизнеспособны. Р-се- мейство-лишь одно из нескольких семейств мобильных элементов, обусловливающих гибридный дисгенез у Drosophila, так что эволюционный потенциал транспозирующихся элементов у этого организма весьма высок. В связи с этим важно отметить, что не все мобильные элементы обладают свойствами транспозирующихся. По меньшей мере один из них 1-элемент-относится к ретротранспозонам класса II (разд. Ю.З.е). У Drosophila имеются также транспозирующиеся элементы, близкие Р, но не связанные с гибридным дисгенезом (например, элемент, называемый hobo).

Контролирующие элементы у кукурузы

Мобильные генетические элементы впервые были обнаружены при генетических исследованиях кукурузы и получили название контролирующих элементов. Идентифицировано по меньшей мере три семейства контролирующих элементов, а последние данные позволяют предположить, что на самом деле их более двенадцати. Аналогичные элементы встречаются и у других видов растений. Члены каждого семейства могут быть подразделены на два класса: автономные элементы наследуются нестабильно и способны к независимому вырезанию и транспозиции; неавтономные элементы сами по себе стабильны и способны к транспозиции только в том случае, когда в какой-либо области генома присутствует автономный член того же семейства. Поскольку автономные элементы кукурузы детерминируют активности, необходимые для транспозиции, и обладают характерными структурными особенностями, мы объединим их в одну группу с транспозирующимися элементами прокариот и Р- элементом Drosophila. На самом деле функциональные различия автономных и неавтономных контролирующих элементов носят такой же характер, что и различия между полноразмерными и укороченными P-элементами. Тем не менее между этими двумя системами есть важные различия. Например, P-элементы функционируют только в клетках зародышевой линии, что проявляется при гибридном дисгенезе, а контролирующие элементы опосредуют

мутации как в соматических, так и в половых клетках. У кукурузы транспозиции происходят на определенных стадиях развития с определенной частотой; таким образом, их влияние на генную экспрессию носит регулярный, заданный во времени характер. И хотя эти эффекты накладываются на наследственную программу развития, определяемую геномом, нетрудно представить, как в ходе эволюции они стали играть существенную роль в развитии организма.

Генетическая система. Не зная об особенностях развития кукурузы, очень трудно разобраться, как с помощью одних только классических генетических и цитогенетических методов были открыты контролирующие элементы. Каждое зерно в початке кукурузы содержит зародыш и многоклеточный эндосперм, в котором имеется большое количество питательных веществ, используемых во время прорастания (рис. 10.18). Зародыш и эндосперм образуются в результате отдельных слияний гаплоидных ядер, но обычно содержат одинаковую генетическую информацию. Эти пары мужских и женских ядер являются сестринскими и образуются в результате митотических делений гаплоидных предшественников. Следовательно, мутации в клетках зародышевой линии, которые приводят к наблюдаемым фенотипическим изменениям в эндосперме, к счастью, сохраняются в зародыше зерна, что позволяет проводить дальнейшие исследования. Каждое из нескольких сотен зерен в початке представляет собой результат отдельного скрещивания, поэтому удается выявлять редкие мутации в клетках зародышевой линии.

Изучение мутации в соматических клетках также не вызывает затруднений. Из одиночных клеток-

РИС. 10.18.

Зерно кукурузы. Перикарпий (выделен черным цветом) образуется из материнских клеток, остальная часть имеет генетическую конституцию зародыша.

ЛокусМутантный фенотипФенотип дикого типаХромо- Кодируемая функциясомаСВ: (bronze)Бесцветный алейронПигментированный алейрон9Регуляция синтеза антоцианинаБледный алейронПигментированный алейрон9Гликозилирование антоцианина с помощью UDP-глюкоза: флавонол-3- О-гликозил-трансферазы№т (waxy)Отсутствие амилозы в эн- Наличие амилозы; после об- 9 Глюкозилтрансфераза, катализиру- досперме; после обработ- работки 12-КТ зерна ста-ющая синтез амилозыки раствором 12-К1 зерна новятся иссиня-черными становятся бледнокоричневымиSh 'shrunkenМорщинистые зерна, обра- Вздутые зерна9 Сахарозосинтетаза, катализирующаязующиеся вследствиесинтез крахмаладефицита крахмалаAdh\Отсутствие алкогольде-1Одна субъединица ал кого ль дегидрогидрогеназыгеназыЛокусМутантный фенотипФенотип дикого типаХромо- Кодируемая функциясомаСВ: (bronze)Бесцветный алейронПигментированный алейрон9Регуляция синтеза антоцианинаБледный алейронПигментированный алейрон9Гликозилирование антоцианина с помощью UDP-глюкоза: флавонол-3- О-гликозил-трансферазы№т (waxy)Отсутствие амилозы в эн- Наличие амилозы; после об- 9 Глюкозилтрансфераза, катализиру- досперме; после обработ- работки 12-КТ зерна ста-ющая синтез амилозыки раствором 12-К1 зерна новятся иссиня-черными становятся бледнокоричневымиSh 'shrunkenМорщинистые зерна, обра- Вздутые зерна9 Сахарозосинтетаза, катализирующаязующиеся вследствиесинтез крахмаладефицита крахмалаAdh\Отсутствие алкогольде-1Одна субъединица ал кого ль дегидрогидрогеназыгеназыТаблица 10.3. Некоторые мутации у кукурузы, использующиеся в генетических экспериментахТаблица 10.3. Некоторые мутации у кукурузы, использующиеся в генетических экспериментахпредшественников в процессе дифференцировки эндосперма образуются локальные клоны клеток, и мутация в единичной клетке на определенной стадии развития проявляется затем в группе клеток с мутантным фенотипом, расположенной в определенной области эндосперма. Многие фенотипические варианты с большей или меньшей жизнеспособностью. наблюдаемые визуально в эндосперме.

Локус

Мутантный фенотипФенотип дикого типаХромо- Кодируемая функция

сома

С

В: (bronze)

Бесцветный алейронПигментированный алейрон9Регуляция синтеза антоцианина

Бледный алейронПигментированный алейрон9Гликозилирование антоцианина с по

мощью UDP-глюкоза: флавонол-3- О-гликозил-трансферазы

№т (waxy)

Отсутствие амилозы в эн- Наличие амилозы; после об- 9 Глюкозилтрансфераза, катализиру- досперме; после обработ- работки 12-КТ зерна ста-ющая синтез амилозы

ки раствором 12-К1 зерна новятся иссиня-черными становятся бледнокоричневыми

Sh 'shrunken

Морщинистые зерна, обра- Вздутые зерна9 Сахарозосинтетаза, катализирующая

зующиеся вследствиесинтез крахмала

дефицита крахмала

Adh\

Отсутствие алкогольде-1Одна субъединица ал кого ль дегидрогидрогеназыгеназы

Локус

Мутантный фенотипФенотип дикого типаХромо- Кодируемая функция

сома

С

В: (bronze)

Бесцветный алейронПигментированный алейрон9Регуляция синтеза антоцианина

Бледный алейронПигментированный алейрон9Гликозилирование антоцианина с по

мощью UDP-глюкоза: флавонол-3- О-гликозил-трансферазы

№т (waxy)

Отсутствие амилозы в эн- Наличие амилозы; после об- 9 Глюкозилтрансфераза, катализиру- досперме; после обработ- работки 12-КТ зерна ста-ющая синтез амилозы

ки раствором 12-К1 зерна новятся иссиня-черными становятся бледнокоричневыми

Sh 'shrunken

Морщинистые зерна, обра- Вздутые зерна9 Сахарозосинтетаза, катализирующая

зующиеся вследствиесинтез крахмала

дефицита крахмала

Adh\

Отсутствие алкогольде-1Одна субъединица ал кого ль дегидрогидрогеназыгеназы

Таблица 10.3. Некоторые мутации у кукурузы, использующиеся в генетических экспериментах

Таблица 10.3. Некоторые мутации у кукурузы, использующиеся в генетических экспериментах

очень удобны для экспериментальных исследований (табл. 10.3). Рассмотрим, например, локус С. У растений, гомозиготных по рецессивной мутации в этом локусе, нарушен синтез пигмента антоцианина, поэтому зерна почти бесцветны (рис. 10.19, Л).

ААББРИС. 10.19.Фенотипические признаки, определяемые С- локусом. А. Початок с зернами дикого типа (пурпурного цвета) и мутантными зернами (бесцветными). Последние несут стабильную мутацию в гене С, детерминирующем синтез антоцианина. Б. Одни зерна бесцветны, другие имеют мозаичную окраску, обусловленную нестабильной мутацией в гене С, которая возникает при встраивании транспозирующегося элемента. Клоны клеток, из которых удален этот элемент, содержат функциональный ген и синтезируют антоцианин. Показаны зерна, в которых транспозирующийся элемент удален иэ С-локуса на ранних (F). средних (Г), и поздних (с малой частотой) стадиях развития зерен (Д'). (С любезного разрешения Nina Fedoroff.)РИС. 10.19.Фенотипические признаки, определяемые С- локусом. А. Початок с зернами дикого типа (пурпурного цвета) и мутантными зернами (бесцветными). Последние несут стабильную мутацию в гене С, детерминирующем синтез антоцианина. Б. Одни зерна бесцветны, другие имеют мозаичную окраску, обусловленную нестабильной мутацией в гене С, которая возникает при встраивании транспозирующегося элемента. Клоны клеток, из которых удален этот элемент, содержат функциональный ген и синтезируют антоцианин. Показаны зерна, в которых транспозирующийся элемент удален иэ С-локуса на ранних (F). средних (Г), и поздних (с малой частотой) стадиях развития зерен (Д'). (С любезного разрешения Nina Fedoroff.)Свойства контролирующих элементов, выявляемые с помощью генетических методов. У растений, гомозиготных по нестабильному рецессивному ал-

А

А

Б

Б

РИС. 10.19.

Фенотипические признаки, определяемые С- локусом. А. Початок с зернами дикого типа (пурпурного цвета) и мутантными зернами (бесцветными). Последние несут стабильную мутацию в гене С, детерминирующем синтез антоцианина. Б. Одни зерна бесцветны, другие имеют мозаичную окраску, обусловленную нестабильной мутацией в гене С, которая возникает при встраивании транспозирующегося элемента. Клоны клеток, из которых удален этот элемент, содержат функциональный ген и синтезируют антоцианин. Показаны зерна, в которых транспозирующийся элемент удален иэ С-локуса на ранних (F). средних (Г), и поздних (с малой частотой) стадиях развития зерен (Д'). (С любезного разрешения Nina Fedoroff.)

РИС. 10.19.

Фенотипические признаки, определяемые С- локусом. А. Початок с зернами дикого типа (пурпурного цвета) и мутантными зернами (бесцветными). Последние несут стабильную мутацию в гене С, детерминирующем синтез антоцианина. Б. Одни зерна бесцветны, другие имеют мозаичную окраску, обусловленную нестабильной мутацией в гене С, которая возникает при встраивании транспозирующегося элемента. Клоны клеток, из которых удален этот элемент, содержат функциональный ген и синтезируют антоцианин. Показаны зерна, в которых транспозирующийся элемент удален иэ С-локуса на ранних (F). средних (Г), и поздних (с малой частотой) стадиях развития зерен (Д'). (С любезного разрешения Nina Fedoroff.)

лелю локуса С, зерна имеют бледную окраску и покрыты сильно пигментированными пятнами (рис. 10.19, Б-Ду Каждое такое пятно-это клон клеток, произошедший из клетки, которая ревер- тировала к дикому типу с возобновлением синтеза антоцианина. Нестабильные рецессивные мутации обусловлены вставкой контролируюшего элемента, а реверсия произошла в результате последующих перестроек-таких, как вырезание элемента. Кроме этого, контролирующий элемент способствует делениям, дупликациям, инверсиям, транслокациям, хромосомным разрывам и воссоединениям, а также перестройкам в соседних хромосомных локусах. Все это напоминает перестройки в соседних последовательностях, связанные с образованием межмолекулярных коинтегратов бактериальными транспозонами. Однако сходны ли соответствующие механизмы у растений и бактерий-неясно.

Автономные контролирующие элементы вызывают нестабильные инсерционные мутации (рис. 10.20), неавтономные же, как правило, связаны со стабильными мутациями, которые, однако, становятся нестабильными, когда в какой-либо области генома присутствует автономный элемент того же семейства. Здесь имеет смысл вернуться к свойствам P-элементов D.melanogaster. полноразмерные Р-эле- менты можно считать автономными, поскольку они сами детерминируют собственную транспозицию

и вырезание, а укороченные, дефектные Р-элемен- ты- неавтономными, поскольку их способность к транспозиции реализуется только при наличии полноразмерных Р-элементов.

В одном из семейств контролирующих элементов, так называемом семействе Ac-Ds, автономным элементом подобного рода является Ас (от англ, activator-активатор), который обеспечивает транспозицию и вырезание не только самого себя, но и родственных неавтономных элементов, называемых Ds (от англ, dissociator-диссоциатор). ^-элементы нестабильны только при наличии в геноме одного или более /^-элементов. Кроме того, они образуются в результате каких-либо повреждений Ас- в соответствии с предположением об аналогии с P-элементами. Например, показано, что независимые мутантные линии с Ds-элементом в локусе & произошли от линий, несущих в этом же локусе элемент Ас (рис. 10.21). Они сохраняют мутантный фенотип Sz, но остаются стабильными до тех пор, пока в результате скрещивания в геном не будет встроен еще один /lc-элсмснт (точно так же остается стабильной мутация sn* у D. meianogaster в отсутствие в геноме полноразмерного Р-элемента).

При встраивании Ас- или Ds-элементов рядом с тем или иным геном наблюдается множество разных фенотипов. При этом может изменяться эффективность транскрипции, нарушаться регуля-

РИС. 10.20.

Семейства контролирующих элементов кукурузы содержат как автономные, так и неавтономные элементы. А. Встраивание неавтономных элементов в геном, не содержащий автономных элементов, приводит к стабильной мутации. При встраивании автономных эле

ментов возникают нестабильные мутации. Б. Инсерционные мутации, обусловленные неавтономными элементами, нестабильны, если в геноме находится автономный элемент этого же семейства.

Делеция в Ас

Фенотип

/^нестабильный

■^^^ стабильный

Встраивание АсВстраивание Ас

Встраивание Ас

Встраивание Ас

РИС. 10.21.

Ds-элементы появляются в результате мутаций Дс-элемента. Ds-элемент активируется, если в геном встраивается автономный Дс-элемент.

ция генной экспрессии, специфичной в отношении определенной стадии развития или типа ткани, синтезироваться мутантный белок. Определенные фенотипические особенности связаны также с нестабильностью участков, соседствующих с Ас- или DS-элементами в присутствии еще одного Лс-элс- мента в другом месте генома. Наиболее существенные из них-разрывы хромосом, приводящие к расщеплению и утрате ацентрических хромосомных фрагментов вместе со всеми кодируемыми ими функциями (рис. 10.22), а также появление дополнительных мутаций вблизи встроенного Ds-элемента. Любопытно, что эти события гораздо чаще происходят в окружении Ds-, чем Лс-элементов. Не все Ds-элементы, даже в присутствии Ас, дают весь спектр эффектов. Одни из них сопряжены с разрывами хромосом, другие вызывают такие разрывы значительно реже. Некоторые элементы утратили способность к транспозиции, но ревертируют и вызывают мутации в соседних локусах. Разнообразие свойств Ds-элементов связано с различиями в повреждениях Л (-элементов.

Изучение Ac-Ds-мутантов на мо окулярном уровне. Выделены клонированные сегменты ДНК, содержащие или Ас-, или Ds-элемент. Общий подход к изучению Лс-О5-мутантов можно проиллюстрировать на примере локуса waxy (табл. 10.3). Ген waxy дикого типа кодирует белок мол. массой 65 кДа, а производный белок мол. массой 58 кДа присутствует в гранулах крахмала. Из эндосперма была выделена poly (А)+-мРНК, которую использовали для получения плазмидных клонов, содержащих соответствующие к ДНК. Эти кДНК были подвергнуты скринингу с помощью гибридизационной селекции (рис. 6.26) для обнаружения тех из них, которые кодируют мРНК для белка мол. массой

65 кДа. Позитивные кДНК-клоны в свою очередь использовали для отбора гомологичных клонов из геномной библиотеки кукурузы. Пять таких клонированных геномных сегментов представлены на рис. 10.23. Первый произошел из локуса waxy дикого типа, второй получен из Лс-мутанта, третий (Ds-1)-из Ds-мутанта-производного мутанта Ас, и четвертый из ревертанта Ds-1-мутанта с диким фенотипом. Пятый сегмент получен из Ds-2-мутанта независимого происхождения. Лс-индуцированная мутация возникает в результате встраивания сегмента длиной 4,5 т. п. н. вблизи З'-конца транскрипционной единицы гена waxy; этот сегмент представляет собой сам Л (-элемент. У мутанта Ds-1, полученного из Лс-мутанта, имеется вставка точно в таком же месте, но с пропуском нескольких сотен' пар оснований. ДНК ревертанта дикого типа не содержит вставки и аналогична исходной ДНК дикого типа. Как показывает опыт изучения бактериальных транспозирующихся элементов и Р-эле- мента Drosophila, все эти свойства характерны для транспозирующейся единицы. Ds-1 также содержит вставку (2 т. п. н.) в транскрипционной единице waxy, но в другом месте. Электронно-микроскопическое исследование гетеродуплекса, образующегося из элементов Ds-2 и Ас, показывает, что Ds-1 содержит примерно по I т. п. н., соответствующих каждому из концов Ас, но не гибридизуется с его внутренним участком длиной 2,3 т. п. н. Некоторые Ds-единицы еще короче. Например, в 5'-лидерной последовательности мутантного локуса Adh I имеется Ds-вставка размером 405 п. н. (рис. 10.24). Таким образом, внутренняя часть Ds-элемента, по- видимому, в значительной степени варьирует.

Установлена нуклеотидная последовательность Лс-элемента (рис. 10.25). На концах сегмента дли-

Б

Генотип

С Bz Wx DS Центромера

Н™ f-

F4—НЧ——6

С bz WX

I Разрыв

1 хромосомы

С OS Bz Wx ^нт₽омеРа

|Разрыв

Фенотип

С, Bz, Wx

С, bz, wx

C Bz Wx

F (IIf- IH

F I114-4—4

Воссоединение

C Bz Wx

F-KПрофаза

F-F 4—I——8

C Bz Wx

Wx Bz Bz Wx

I • I IM-4

| Разрыв

Wx Bz Bz Wx,„

।( (- 0 Анафаза

( t *—о Телосраза

'Репликация,воссоединение'Репликация,воссоединениеПрофазаПрофаза

'Репликация,воссоединение

'Репликация,воссоединение

Профаза

Профаза

Wx Bz Bz

Wx Bz Bz

Непрерывные циклы разрывов-воссоединений

РИС. 10.22.

Хромосомный разрыв и перестройка, происходящие вблизи элементов семейства Ac-Ds. А. Один из гомологов хромосомы 9 содержит вставку Ds, расположенную ближе к центромере, чем локус waxy. Разрыв хромосомы в Ds-сайте приводит к тому, что дочерние клетки утрачивают ацентрический фрагмент, несущий доминантные локусы дикого типа С, Bz и Wx. Б. При встраивании Ds-злемента в сайт, расположенный от центромеры дальше, чем локус waxy, сестринские хро-

Wx

Wx

I

Непрерывные циклы разрывов-воссоединений

матиды после разрыва в Ds-сайте воссоединяются с образованием U-образного ацентрического фрагмента и U-образного дицентрического фрагмента, который может разворачиваться и разрываться при последующем митозе. Образовавшиеся концы могут вновь воссоединиться, и так далее до бесконечности, поддерживая нестабильное состояние. В области теломер воссоединения хромосом не происходит (разд. 9.6.6).

Фенотип

Генотип

РИС. 10.23.

Геномные клоны кукурузы, содержащие Ас- и Ds-мутации в локусв waxy.

РИС. 10.24.

Геномные клоны кукурузы, содержащие ген AdhA. Волнистая стрелка показывает направление транскрипции.

Сайт-мишень (8п.н.н.)

adh\

2т.п.н.

Уревертанта дупликация сайта-мишени сохраняется

РИС. 10.25.

Структура транспозирующегося Ас-злемента кукурузы размером 4,6 т. п. н. Показаны несовершенные концевые повторы длиной 11 п. н. Ниже представлены пять зкзо-

нов, кодирующих одну протяженную мРНК, и сама эта мРНК длиной 3,5 т.п.н.

ной 4,6 т. п. н. находятся концевые инвертированные повторы длиной 11 п. н. Вблизи обоих концов имеются еще несколько групп инвертированных повторов. Концевые повторы сохраняются и у Ds-элементов. Ас-элемент содержит пять открытых рамок считывания, которые могут кодировать полипептид. Делеции в нескольких экзонах приводят к тому, что элементы становятся неспособными к транспозиции. В тканях растений, кодирующих активный Ас-элемент, обнаружен Ас-транскрипт длиной 3,5 т. п. н., в котором отсутствуют четыре интрона. Вероятно, этот транскрипт представляет собой мРНК для Ас-транспозазы, а возможно, и других специфических факторов.

Встраивание Ds- и Ас-элементов сопровождается дупликацией сайта-мишени размером 8 п. н. При утрате элемента или реверсии дуплицированный участок обычно сохраняется. Например, у описанного ранее ревертанта мутанта Adhl дополнительная копия дуплицированного участка размером 8 п. н. остается как след предыдущей вставки (рис. 10.24). Нередко одна или обе оставшиеся копии оказываются слегка модифицированными в результате точковых мутаций или делеций пар оснований. Таким образом, вырезание происходит не совсем точно и не всегда приводит к реверсии на уровне фенотипа.

Механизмы встраивания и вырезания Ас- и 05-элементов неизвестны. Согласно молекулярногенетическим данным, возможно, происходит нерепликативное встраивание с вырезанием Ас- (или Ds-) элемента из одного сайта и встраиванием этого же сегмента ДНК в новое положение. Сохранение копий сайтов-мишений на месте вырезанной вставки говорит о сходстве механизма вырезания Ас- и Ds-элементов, с одной стороны, и Р-элемента-с другой.

Повторение последовательностей Ac-Ds. Субкло- нированные сегменты Ас- и Ds-элементов гибриди- зуются со многими фрагментами ДНК кукурузы, полученными при ее рестрикции. Всего в геномах некоторых линий встречается до 35 копий элемен-

тов. Однако профиль гибридизации весьма сложен и говорит о том, что существует множество разных типов Ds-элементов и, возможно, несколько видов Ас-элементов. Об этом разнообразии свидетельствует уже простое рассмотрение Ds-элементов; как мы говорили, они бывают длиной 4,1; 2,0 и 0,405 т. п. н. Кроме того, в результате инсерционной мутации, обусловленной встраиванием Ds-элемента в один из интронов гена сахарозосинтазы (локус shrunken, Sh, табл. 10.3), образуется сложный элемент длиной примерно 30 т. п. н., который содержит несколько копий Ds-элемента, а также другие, неродственные последовательности (рис. 10.26). На концах этого сложного элемента находятся несовершенные инвертированные Ds-повторы, каждый

Последовательности локуса Sh

1 Э0Т.П.Н.

РИС. 10.26.

Сложные Ds-вставки в гене сахарозосинтазы (S6) кукурузы. Структуру мутантного (S6-) и ревертантного (S6+) локусов определяли с помощью клонированных сегментов геномной ДНК. У мутанта Sh- данный гвн прерывается инвертированными дупликациями Ds-элемента, которые окружают какой-то неохарактеризован- ный сегмент ДНК, отличный от Ds. Участок длиной более 20 т. п. н. на 5'-концв гена дуплицирован; он состоит из части гена и части сложной вставки. У Sh+ -ревертанта вставка утрачена, но дупликация на 5'-конце сохраняется. [U. Courage-ТвЬЬе, Cell 34 (1983), р. 383.]

длиной более 3 т. п. н. Это не единственная особенность области мутантного локуса shrunken на хромосоме 9; на 5'-конце гена присутствует дуплицированная часть мутантного локуса. Этот дуплицированный участок содержит часть самого гена и часть последовательности Ds. Такая структура еще раз подтверждает справедливость выводов, которые можно сделать из результатов генетического анализа: присутствие Лс-йл-элементов создает предпосылки для последующих перестроек в соседних участках. Подобным же образом подтверждаются результаты генетических исследований, проведенных 30 лет назад, при молекулярном анализе ре- вертанта данного мутанта: у таких Sh+-ревертантов Ds-элемент сохраняется, поскольку частота хромосомных разрывов в локусе остается высокой. Таким образом, несмотря на то что клонированный ген ревертанта Sh+ утратил всю встроенную последовательность длиной 30 т. п. н. и по своей структуре очень близок к гену дикого типа, в нем частично сохранились дуплицированные участки самого гена и Ds-элемента. Уже первые результаты генетических исследований кукурузы содержали четкие указания на существование мобильных элементов и сложных молекулярных структур, связанных с контролирующими Лс-йл-элементами.

10.3. РЕТРОТРАНСПОЗОНЫ

Общие свойства ретротранспозонов класса I

Типичные ретротранспозоны класса I состоят из центрального сегмента длиной несколько т. п. н. и фланкирующих его LTR длиной от сотен до тысяч пар оснований (рис. 10.27). Несколько пар оснований в начале и в конце каждого LTR также представляют собой инвертированные друг относительно друга повторы. Встраивание ретротранспозона в новый локус ДНК сопровождается дупликацией сайта-мишени, причем размер дуплицированного участка (но не его последовательность) для данного элемента всегда одинаков. Эти ретротранспозоны, как и все мобильные элементы, образуют в геномах мультисемейства.

Как правило, ретротранспозоны класса I активно транскрибируются и транслируются, хотя в ходе развития и дифференцировки транскрипция обычно регулируется. Одни транскрипты намного короче полноразмерных элементов, другие начинаются в одном LTR и заканчиваются в другом, копируя весь элемент. Эти длинные транскрипты содержат на концах прямые повторы и являются промежуточными продуктами при транспозиции. По-видимому, они подвергаются обратной транскрипции аналогично транскрипции РНК ретровирусов, в резуль-

Дупликация сайта-мишениДупликация сайта-мишениЦентральный участокЦентральный участокНМLTR-RНМLTR-RРИС. 10.27.Типичный ретротранспозон класса I и его транскрипт.РИС. 10.27.Типичный ретротранспозон класса I и его транскрипт.тате которой образуется провирусная ДНК (разд. 2.2.а). Процесс обратной транскрипции ретротранспозонов в деталях не изучен. Ретротранспозоны кодируют несколько белков. Один из них-обратная транскриптаза, а другие вместе со специфическими транскриптами образуют внутриклеточные рибо- нуклеопротеидные частицы.

Дупликация сайта-мишени

Дупликация сайта-мишени

Центральный участок

Центральный участок

НМ

LTR-R

НМ

LTR-R

РИС. 10.27.

Типичный ретротранспозон класса I и его транскрипт.

РИС. 10.27.

Типичный ретротранспозон класса I и его транскрипт.

Ту-элементы дрожжей

Структура Ту-элементов. Ту-элементы имеют структуру, типичную для ретротранспозонов класса I (рис. 10.28). Их длина составляет примерно 5,9 т. п. н„ а центральная область, называемая Е, фланкирована длинными концевыми повторами размером 330 п. н., называемыми 8. На каждом из концов 8 в свою очередь находятся инвертированные повторы длиной всего 2 п. н. Другая структурная особенность- наличие прямых повторов размером 5 п. н. в местах соединения е с 8. Встраивание Ту-элемента всегда сопровождается дупликациями сайтов-мишеней размером 5 п. н.

Гаплоидный геном лабораторных штаммов S. cerevisiae содержит примерно 35 Ту-элементов, что составляет ~ 1% всего генома. У других штаммов дрожжей число копий Ту меньше. Помимо полноразмерных Ту-элементов, у S. cerevisiae имеется примерно 100 одиночных 8-сегментов, не имеющих отношения к Ту-элементам. Гибридизация клонированных Е-зондов с рестрицированной геномной ДНК из разных штаммов дрожжей говорит о том, что гомологичные сегменты различаются по числу копий и по размерам; это согласуется с представлением о нефиксированной локализации Ту-элементов.

Нуклеотидные последовательности копий Ту-элемента в одном геноме неодинаковы, хотя и достаточно близки, чтобы могла происходить их гибридизация друг с другом. Полиморфизм выявляется, например, при сравнении рестрикционных карт отдельных элементов. Однако два 8-сегмента, связанные с одним Ту-элементом, обычно оказываются

330 п.н.330 п.н.330 п.н.330 п.н.РИС. 10.28.Ретротранспозон Ту у дрожжей.РИС. 10.28.Ретротранспозон Ту у дрожжей.идентичными; этим они отличаются от IS-L и 1S-R у некоторых сложных бактериальных транспозонов.

330 п.н.

330 п.н.

330 п.н.

330 п.н.

РИС. 10.28.

Ретротранспозон Ту у дрожжей.

РИС. 10.28.

Ретротранспозон Ту у дрожжей.

Перемещения Ту-элементов. Способность Ту- элементов перемещаться из одного геномного локуса в другой была продемонстрирована неоднократно. Во-первых, разные штаммы существенно различаются по размерам и числу копий рестрикционных фрагментов, которые гибридизуются с Ту-последовательностями. Во-вторых, по данным молекулярного клонирования, аллели одного и того же локуса у различных штаммов дрожжей отличаются друг от друга наличием или отсутствием Ту-элементов. Фактически Ту-элемент был открыт благодаря тому, что супрессор тирозиновой тРНК дрожжей гибридизовался с разными по размеру fro RI-фрагментами ДНК из двух разных штаммов. Клонирование этих фрагментов показало, что те их участки, которые непосредственно примыкают к гену тРНК, идентичны, чего нельзя сказать о более отдаленной области, расположенной левее (рис. 10.29). Эти различия обусловлены тем, что в штамме 2 содержится Ту-элемент. Еще одна особенность штамма 2- дупликация сайта-мишени: с обеих сторон Ту-элемента находится пентануклеотид 5'-GAAAC. В обоих штаммах имеются несколько одиночных 6-сегментов, локализованных в одинаковых сайтах.

В-третьих, были получены прямые данные о мобильности Ту-элементов. Опыты состояли в сле-

5'-6АААС З'-CTTTG5'-6АААС З'-CTTTGРИС. 10.29.Одни и те же локусы у двух штаммов дрожжей различаются тем, что в одном из них (штамм 2) присутствует Ту-злемент. [J. R. Cameron, Е. Y. Loh, R.W. Davis, Cell 16 (1979), р. 739;РИС. 10.29.Одни и те же локусы у двух штаммов дрожжей различаются тем, что в одном из них (штамм 2) присутствует Ту-злемент. [J. R. Cameron, Е. Y. Loh, R.W. Davis, Cell 16 (1979), р. 739;J. Gafner, P. Philippsen, Nature 286 (1980), p. 414.]2Т.П.Н.J. Gafner, P. Philippsen, Nature 286 (1980), p. 414.]2Т.П.Н.дуюшем. Одну колонию дрожжей разделили на пять частей и культивировали в течение месяца, ежедневно перенося небольшие инокуляты на свежую среду. Через месяц провели блот-гибридизацию ДНК из

5'-6АААС З'-CTTTG

5'-6АААС З'-CTTTG

РИС. 10.29.

Одни и те же локусы у двух штаммов дрожжей различаются тем, что в одном из них (штамм 2) присутствует Ту-злемент. [J. R. Cameron, Е. Y. Loh, R.W. Davis, Cell 16 (1979), р. 739;

РИС. 10.29.

Одни и те же локусы у двух штаммов дрожжей различаются тем, что в одном из них (штамм 2) присутствует Ту-злемент. [J. R. Cameron, Е. Y. Loh, R.W. Davis, Cell 16 (1979), р. 739;

J. Gafner, P. Philippsen, Nature 286 (1980), p. 414.]2Т.П.Н.

J. Gafner, P. Philippsen, Nature 286 (1980), p. 414.]2Т.П.Н.

каждой культуры с клонированной ДНК Ту (а). В двух из пяти образцов на электрофореграмме обнаружилась новая полоса, отсутствующая в случае исходной ДНК. В свою очередь новые полосы, присутствующие у этих двух ДНК, тоже различались. Таким образом было продемонстрировано перемещение Ту-элемента.

И наконец, выявление мутаций, обусловленных транспозицией Ту-элемента, окончательно показало, что транспозиция действительно происходит. Такие события наблюдались неоднократно, хотя Ту-элемент перемещается в какой-то определенный локус лишь в одной из 10® клеток. Некоторые инсерционные Ту-мутации прерывают кодирующие области, но в большинстве случаев они обусловливаются встраиванием Ту-элемента в почему-то предпочитаемый им 5'-регуляторный участок соответствующей транскрипционной единицы. Эти мутации приводят к разным фенотипическим эффектам. В некоторых случаях прекращается транскрипция генов, соседствующих со вставкой, при этом Ту-элемент может находиться в любой ориентации (рис. 10.30). В других случаях, напротив, наблюдается 50-кратное увеличение синтеза мРНК и продукта гена, примыкающего к вставке. В «сверхпродуцентах» Ту-элемент всегда оказывается встроенным так, что транскрибируется в направ-

лении, противоположном направлению транскрипции соседнего гена (рис. 10.30). Сверхпродукция за-

ВырезаниеВырезание

Вырезание

Вырезание

РИС. 10.30.

Встраивание Ту-злемента в промотор гена HIS4 приводит к появлению мутанта his4. В результате вырезания Ту-злемента с сохранением части одного из 5-сегментов происходит частичная инверсия к HIS41. [Р. J. Farabough. G. R. Fink, Nature 286 (1980), р. 352.]

висит от транскрипции Ту и наблюдается лишь в гаплоидных клетках, поскольку в диплоидных дрожжевых клетках Ту транскрибируется неэффективно (разд. 17.5.6). Более того, влияние, которое оказывает встраивание Ту на соседние гены, неодинаково для разных Ту-элементов и в некоторых случаях вообще отсутствует.

Все эти различия зависят - по крайней мере отчасти- от присутствия на 5'-конце Ту сегмента ДНК размером ~ 600 п. н. Замена одной пары оснований в этом сегменте-CG на ТА-заметно уменьшает активацию соседнего гена. По-видимому, эта активация опосредуется каким-то /лрснс-действующим белковым фактором, который кодируется клеткой- хозяином и связывается с регуляторным участком. Кроме того, влияние Ту на экспрессию соседних генов супрессируется не менее чем тремя другими несцепленными между собой мутациями, названными spt (от англ, suppressor of Ту-супрессор Ту). Продукты генов SPT необходимы для транскрипции Ту.

Транскрипция Ту-элемента. В гаплоидных дрожжевых клетках обычно содержится огромное количество транскриптов Ту; на их долю приходится от 5 до 10% полиаденилированной РНК. Основная их масса-это молекулы размером 5,7 т.н., почти равные по длине целому элементу. Нуклеотидные последовательности индивидуальных клонированных Ту-кДНК различаются очень мало, т. е., по- видимому, большинство Ту-элементов транскрибируются одинаково.

5'-конец транскрипта длиной 5,7 т.н. находится на расстоянии 245 п. н. от начала левого 5-сегмента, и транскрипт охватывает остальные его 95 нуклеотидов, весь Е-сегмент и второй 5, заканчиваясь на расстоянии примерно 40 п. н. от конца

правого 8-сегмента (рис. 10.31). Завершается транскрипт poly (А)-хвостом, не кодируемым Ту-элемен- том. Все эти структурные особенности наводят на ряд интересных идей, которые можно применить к другим ретротранспозонам класса Тик ретровирусам.

Во-первых, несмотря на то что Ту-транскрипты не содержат участков, соответствующих началу и концу Ту-ДНК, в них представлена нуклеотидная последовательность всего элемента. Объясняется это тем, что пропущенные участки правого 8-сегмента транскрибируются с левого 8, и наоборот. Отметим также, что участок длиной примерно 50 нуклеотидов в транскрипте дуплицирован. Первые 50 нуклеотидов на 5'-конце РНК идентичны последним 50 нуклеотидам на правом конце, перед poly (А)- хвостом. Таким образом, на обоих концах транскрипта имеются прямые повторы длиной 50 п. н. Если предположить, что промотор, ответственный за регуляцию транскрипции Ту-элемента, находится внутри самого элемента (это согласуется с тем фактом, что все Ту-элементы транскрибируются одинаково, независимо от окружения), то можно ожидать, что инициаторами транскрипции могут быть оба 8-сегмента ввиду их идентичности. Однако никаких транскриптов, начинающихся с дистального 6-сегмента, не обнаружено. Далее, если дистальный 8-сегмент ответствен за терминацию транскрипции, полиаденилирование или оба этих процесса, то почему транскрипция не заканчивается в гомологичных последовательностях, находящихся на 50 п. н. правее сайта инициации? Эти загадки напоминают нам о том, что регуляция транскрипции осуществляется на многих уровнях. О некоторых из них мы что-то знаем, о других даже не догадываемся. В одном из способов для регуляции

OR г A- leu asn asn lys his asp leu his leu arg pro glu thr tyr stop UUG A AC A AU AAGCACGACCUU CAUCUUAGGCCAGAA ACUUACUGAA

ORF B- thr lie ser thr thr *e lie leu gly gin lys leu thr glu

РИС. 10.31.

Транскрипция и трансляция Ту-злемента. Среди транскриптов Ту-злемента в дрожжевых клетках в наибольшем количестве присутствует РНК длиной 5,7 т.н. Этот транскрипт содержит две перекрывающиеся открытые рамки считывания в одной цели: ORF А и ORF В.

транскрипции Ту-элементов используется локус типа спаривания (разд. 10.6.6): для диплоидов, гетерозиготных по а и а, характерен низкий по сравнению с гаплоидами уровень транскрипции Ту-элементов. Для транскрипции Ту необходимы также продукты генов SPT.

Трансляция Ту. Установлена нуклеотидная последовательность нескольких Ту-элементов. Та цепь ДНК, которая отвечает транскрипту длиной 5,7 т.н., имеет две длинные открытые рамки считывания, при этом 3'-конец первой рамки (ORF А) перекрывается с 5'-концом второй (ORF В) на участке длиной примерно 40 нуклеотидов (это число варьирует у разных Ту), а считывание триплетов в ORF А и ORF В происходит с использованием разных рамок (рис. 10.31). Несмотря на обилие Ту-транскриптов, их трансляция в дрожжевых клетках протекает с очень низкой эффективностью. Однако если в клетку вводится плазмидный вектор, тоже содержащий Ту и обеспечивающий образование большого числа его копий, то Ту-полипеп- тиды синтезируются в большом количестве. Рамка ORF А длиной 1,3 т.н. транслируется с образованием полипептида мол. массой 55 кДа. Удивительно, что наряду с этим продуктом на уровне 5% синтезируется также полипептид мол. массой примерно 190 кДа, транслирующийся с обеих открытых рамок. Для завершения синтеза этого длинного полипептида во время трансляции происходит сдвиг

Представлены сами эти рамки и область их перекрывания. В 5'- и З'-направлениях от этой области ORF А и ORF В соответственно не прерываются. [R.T. Elder et al.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), p. 2432; G. Mellor et al.. Nature 313 (1985), p. 243.)

рамки считывания-как мы уже говорили, рамки не совпадают. Этот сдвиг осуществляется в том месте, где рамки перекрываются. Длинный полипептид подвергается протеолизу с образованием нескольких белков. Один из них, по-видимому, соответствует продукту ORFA. С-концевая часть второго белка-продукта трансляции ORFB является обратной транкриптазой. Отметим, что альтернативный механизм образования мРНК, способной транслироваться в полипептид ORFB, мог бы реализовываться через сплайсинг первой рамки. Удивительно, что Ту не использует этот широко распространенный механизм, а прибегает к необычному способу-сдвигу рамки считывания.

Продукт ORF В Ту-элемента отчасти гомологичен полипептидам, кодируемым ретровирусными генами pol (табл. 10.4). У ретровирусов эти гены кодируют несколько ферментов, в том числе протеазу, эндонуклеазу, называемую также интегразой, и обратную транскриптазу (RT). Если в дрожжевых клетках Ту-элемент эффективно транскрибируется и транслируется, то в клеточных экстрактах обнаруживается активная обратная транскриптаза, а в частично очищенных фракциях таких экстрактов при добавлении дезоксинуклеозидтрифосфатов и Mg2 + синтезируется Ту-ДНК. Внесение мутации в ORF В приводит к утрате ферментативной активности, показывая еще раз, что обратная транскриптаза кодируется Ту-элементом. Клетки, в которых

РетровирусыВирус саркомы РаусаВирус лейкоза мышейМолониV RL Р Q GM L Р Q G F■ 24■ 25 ■CM LI L LН YMDDL L L А А ТQ Y V D DL L L А А ТРетротранспозоны класса /Ту (ORF В)RР Р Р Н L■ 52Т I СL F V D DМ V L F S КCopiaRL Р QG 1- 58Y V LL Y V D DV V I А Т GIAPVL Р Q GM25I L LL YMD DI L L С Н КРетротранспозоны класса IIFGI Р Q G S20 •TVSТ F A D DТ A I L S RGV Р Q G S24К F NA Y A D DF F L I INLINE-1 (человек)GТ R QG С34 ■К L SL F A D DМ 1 V Y L ЕРетровирусыВирус саркомы РаусаВирус лейкоза мышейМолониV RL Р Q GM L Р Q G F■ 24■ 25 ■CM LI L LН YMDDL L L А А ТQ Y V D DL L L А А ТРетротранспозоны класса /Ту (ORF В)RР Р Р Н L■ 52Т I СL F V D DМ V L F S КCopiaRL Р QG 1- 58Y V LL Y V D DV V I А Т GIAPVL Р Q GM25I L LL YMD DI L L С Н КРетротранспозоны класса IIFGI Р Q G S20 •TVSТ F A D DТ A I L S RGV Р Q G S24К F NA Y A D DF F L I INLINE-1 (человек)GТ R QG С34 ■К L SL F A D DМ 1 V Y L ЕТаблица 10.4. Сходные участки в некоторых ретровирусных и ретротранспозонных полипептидах1*Таблица 10.4. Сходные участки в некоторых ретровирусных и ретротранспозонных полипептидах1*4 Показаны только два из нескольких сходных участков каждого элемента. Известно, что у ретровирусов они входят в состав генов рок кодирующих обратную транскриптазу; по-видимому, это относится и к ретротранспозонам. Аминокислоты, выделенные жирным шрифтом, в большинстве случаев идентичны или очень сходны. Замены сходных в химическом отношении аминокислот (например, фенилаланина на тирозин или лейцина на изолейцин) называются консервативными. Указано число аминокислот, разделяющих два полипептидных участка.4 Показаны только два из нескольких сходных участков каждого элемента. Известно, что у ретровирусов они входят в состав генов рок кодирующих обратную транскриптазу; по-видимому, это относится и к ретротранспозонам. Аминокислоты, выделенные жирным шрифтом, в большинстве случаев идентичны или очень сходны. Замены сходных в химическом отношении аминокислот (например, фенилаланина на тирозин или лейцина на изолейцин) называются консервативными. Указано число аминокислот, разделяющих два полипептидных участка.обнаруживается обратная транскриптаза, содержат также белок мол. массой 90 кДа, связывающийся с антителами к синтезированному химическим путем нонапептиду, структура которого получена исходя из данных о нуклеотидной последовательности ORFB. При очистке этот белок выделяется вместе с обратной транскриптазой. Заметим, что помимо белка мол. массой 90 кДа в результате посттрансляционного протеолиза другого, более высокомолекулярного белка мол. массой 190 кДа, синтезируемого со сдвигом рамки считывания, образуются и несколько других ORFB-белков. Один из них- протеаза, отвечающая за посттрансляционный процессинг, а другой, вероятно, интеграза, необходимая для транспозиции.

Ретровирусы

Вирус саркомы Рауса

Вирус лейкоза мышей

Молони

V R

L Р Q GM L Р Q G F

■ 24

■ 25 ■

CM L

I L L

Н YMDDL L L А А Т

Q Y V D D

L L L А А Т

Ретротранспозоны класса /

Ту (ORF В)

R

Р Р Р Н L

■ 52

Т I С

L F V D D

М V L F S К

Copia

R

L Р QG 1

- 58

Y V L

L Y V D D

V V I А Т G

IAP

V

L Р Q GM

25

I L L

L YMD D

I L L С Н К

Ретротранспозоны класса II

F

G

I Р Q G S

20 •

TVS

Т F A D D

Т A I L S R

G

V Р Q G S

24

К F N

A Y A D D

F F L I IN

LINE-1 (человек)

G

Т R QG С

34 ■

К L S

L F A D D

М 1 V Y L Е

Ретровирусы

Вирус саркомы Рауса

Вирус лейкоза мышей

Молони

V R

L Р Q GM L Р Q G F

■ 24

■ 25 ■

CM L

I L L

Н YMDDL L L А А Т

Q Y V D D

L L L А А Т

Ретротранспозоны класса /

Ту (ORF В)

R

Р Р Р Н L

■ 52

Т I С

L F V D D

М V L F S К

Copia

R

L Р QG 1

- 58

Y V L

L Y V D D

V V I А Т G

IAP

V

L Р Q GM

25

I L L

L YMD D

I L L С Н К

Ретротранспозоны класса II

F

G

I Р Q G S

20 •

TVS

Т F A D D

Т A I L S R

G

V Р Q G S

24

К F N

A Y A D D

F F L I IN

LINE-1 (человек)

G

Т R QG С

34 ■

К L S

L F A D D

М 1 V Y L Е

Таблица 10.4. Сходные участки в некоторых ретровирусных и ретротранспозонных полипептидах1*

Таблица 10.4. Сходные участки в некоторых ретровирусных и ретротранспозонных полипептидах1*

4 Показаны только два из нескольких сходных участков каждого элемента. Известно, что у ретровирусов они входят в состав генов рок кодирующих обратную транскриптазу; по-видимому, это относится и к ретротранспозонам. Аминокислоты, выделенные жирным шрифтом, в большинстве случаев идентичны или очень сходны. Замены сходных в химическом отношении аминокислот (например, фенилаланина на тирозин или лейцина на изолейцин) называются консервативными. Указано число аминокислот, разделяющих два полипептидных участка.

4 Показаны только два из нескольких сходных участков каждого элемента. Известно, что у ретровирусов они входят в состав генов рок кодирующих обратную транскриптазу; по-видимому, это относится и к ретротранспозонам. Аминокислоты, выделенные жирным шрифтом, в большинстве случаев идентичны или очень сходны. Замены сходных в химическом отношении аминокислот (например, фенилаланина на тирозин или лейцина на изолейцин) называются консервативными. Указано число аминокислот, разделяющих два полипептидных участка.

Появление активной обратной транскриптазы Ту-элемента в дрожжевых клетках сопровождается образованием цитоплазматических частиц. Эти вирусоподобные частицы диаметром 60 нм содержат фермент Ту-РНК, а некоторые из них-полноразмерный линейный дуплексный Ту-элемент. Основной структурный белок этих частиц представлен полипептидом мол. массой 48 к Да, образующимся в результате протеолиза продукта ORFA. Таким образом, рамка ORFA аналогична гену дад ретровирусов. Однако, в отличие от ретровирусов, Ту- элементы не детерминируют образование инфекционных частиц.

В нормальных дрожжевых клетках ни обратная

транскриптаза, ни Ту-частицы не обнаруживаются, несмотря на присутствие примерно 35 Ту-элементов и большого количества полиаденилированной Ту- РНК. Эксперименты, описанные в предыдущих параграфах, удалось провести благодаря тому, что были сконструированы специальные плазмиды, обеспечивающие эффективную транскрипцию и трансляцию встроенных в них Ту-элементов (такая плазмида описывается в следующем разделе). Большинство хромосомных Ту-элементов. по-видимому, дефектны или репрессированы. Они не обеспечивают образование измеримых количеств обратной транскриптазы или цитоплазматических частиц и, в отличие от плазмидных Ту, почти не способны к транспозиции. Однако их транспозиционная активность повышается в тех случаях, когда происходит эффективная экспрессия функционального Ту- при наличии мультикопийных плазмид с Ту-эле- ментами или Ту-элементов, транскрибирующихся с индуцибельного гетерологичного промотора (см. ниже).

РНК как промежуточное звено при транспозиции Ту. Перенос Ту-элемента происходит с помощью обратной транскрипции РНК-копии Ту по существу таким же способом, каким синтезируется ретровирусная ДНК на ретровирусной геномной РНК. Подтверждение этому было получено с помощью следующих прямых опытов (рис. 10.32).

В дрожжевые клетки hLs3 были введены сразу

два плазмидных вектора. Один из них содержал Ту-элемент и служил донором ретротранспозона, другой являлся реципиентом и содержал ген hisl с делетированным промотором. Многие ревертанты HIS +, выделенные из такой популяции дрожжей, содержали Ту-элемент, транспозированный в 5'- фланкирующий участок мутантного гена hisl в плазмиде-мишени.

Донор Ту-элемента для этих экспериментов был модифицирован: первые 243 п. н. с 5'-конца 8 уда-

лены, а Ту-промотор заменен промотором, активирующимся в присутствии галактозы (промотор дрожжей СЛЫ; разд. 8.3.е). В этих условиях транскрипция Ту-элемента начинается с правильного сайта (пара оснований 245; рис. 10.31) с образованием полноразмерной Ту-РНК, но скорость процесса необычайно высока. Транспозированные в плазмиды-мишени Ту-элементы содержат два полноразмерных фланкирующих 8-повтора, хотя у донора Ту отсутствовал 5'-конец 8-сегмента. Из всех этих наблюдений можно сделать два вывода. Во- первых, в отличие от ситуации с транспозирующи- мися элементами, для транспозиции не нужен полноразмерный 5'-8. Во-вторых, укороченный Ту-эле- мент восстанавливается с образованием полноразмерного Ту, т. е. 3'-8 должен служить матрицей для реконструкции утраченных частей 5'-8. При этом в качестве посредника может использоваться соответствующая РНК, поскольку в доноре имеется по меньшей мере одна копия необходимых последовательностей. Этот механизм фактически идентичен механизму обратной транскрипции ретровирусной РНК (рис. 2.41).

/ Отбор клеток HISS*, I выделение плазмиды/ Отбор клеток HISS*, I выделение плазмидыПолноразмерный 6Полноразмерный 6РИС. 10.32.Опыты, иллюстрирующие участие РНК в транспозиции Ту-злемента. В дрожжевые клетки his3" были введены две плазмиды. Донорная плазмида содержала Ту-зле- мент, в котором отсутствовали первые 243 пары оснований с 5'-конца 5-сегмента, а Ту-промотор замещен неродственным промотором, и при этом синтезировался нормальный Ту-транскрипт (рис. 10.31). Кроме того, в центральную часть е-сегмента Ту-злемента был встроен дрожжевой интрон (выделен точками) и примыкающие к нему экзонные последовательности (выделены черным). Плазмида-мишень содержала ген HIS3 без промотора, центромерную область хромосомы 4 (для обеспечения стабильности) и ARS (для репликации). Из клеточной популяции были выделены колонии HIS3*, а из них-плазмида-мишень. Ту-элемент был транспозирован из донора в 5'-фланкирующий участок гена his3 и восполнил функции отсутствующего промотора (ориентация встроенного Ту неизвестна). Транспозированный Ту-элемент содержит два полных 5-сегмента, интрон удален при сплайсинге. [J. D. Воске et al., Cell 40 (1985), р. 491.]РИС. 10.32.Опыты, иллюстрирующие участие РНК в транспозиции Ту-злемента. В дрожжевые клетки his3" были введены две плазмиды. Донорная плазмида содержала Ту-зле- мент, в котором отсутствовали первые 243 пары оснований с 5'-конца 5-сегмента, а Ту-промотор замещен неродственным промотором, и при этом синтезировался нормальный Ту-транскрипт (рис. 10.31). Кроме того, в центральную часть е-сегмента Ту-злемента был встроен дрожжевой интрон (выделен точками) и примыкающие к нему экзонные последовательности (выделены черным). Плазмида-мишень содержала ген HIS3 без промотора, центромерную область хромосомы 4 (для обеспечения стабильности) и ARS (для репликации). Из клеточной популяции были выделены колонии HIS3*, а из них-плазмида-мишень. Ту-элемент был транспозирован из донора в 5'-фланкирующий участок гена his3 и восполнил функции отсутствующего промотора (ориентация встроенного Ту неизвестна). Транспозированный Ту-элемент содержит два полных 5-сегмента, интрон удален при сплайсинге. [J. D. Воске et al., Cell 40 (1985), р. 491.]Участие РНК-посредника в транспозиции Ту- элемента получило еще более убедительное подтверждение в опытах с использованием повторно модифицированного донора Ту. В его центральный участок е был встроен интрон из неродственного дрожжевого гена вместе с короткими участками фланкирующих его экзонов. Обычно Ту-элементы не содержат интронов. Не содержал интрона и

/ Отбор клеток HISS*, I выделение плазмиды

/ Отбор клеток HISS*, I выделение плазмиды

Полноразмерный 6

Полноразмерный 6

РИС. 10.32.

Опыты, иллюстрирующие участие РНК в транспозиции Ту-злемента. В дрожжевые клетки his3" были введены две плазмиды. Донорная плазмида содержала Ту-зле- мент, в котором отсутствовали первые 243 пары оснований с 5'-конца 5-сегмента, а Ту-промотор замещен неродственным промотором, и при этом синтезировался нормальный Ту-транскрипт (рис. 10.31). Кроме того, в центральную часть е-сегмента Ту-злемента был встроен дрожжевой интрон (выделен точками) и примыкающие к нему экзонные последовательности (выделены черным). Плазмида-мишень содержала ген HIS3 без промотора, центромерную область хромосомы 4 (для обеспечения стабильности) и ARS (для репликации). Из клеточной популяции были выделены колонии HIS3*, а из них-плазмида-мишень. Ту-элемент был транспозирован из донора в 5'-фланкирующий участок гена his3 и восполнил функции отсутствующего промотора (ориентация встроенного Ту неизвестна). Транспозированный Ту-элемент содержит два полных 5-сегмента, интрон удален при сплайсинге. [J. D. Воске et al., Cell 40 (1985), р. 491.]

РИС. 10.32.

Опыты, иллюстрирующие участие РНК в транспозиции Ту-злемента. В дрожжевые клетки his3" были введены две плазмиды. Донорная плазмида содержала Ту-зле- мент, в котором отсутствовали первые 243 пары оснований с 5'-конца 5-сегмента, а Ту-промотор замещен неродственным промотором, и при этом синтезировался нормальный Ту-транскрипт (рис. 10.31). Кроме того, в центральную часть е-сегмента Ту-злемента был встроен дрожжевой интрон (выделен точками) и примыкающие к нему экзонные последовательности (выделены черным). Плазмида-мишень содержала ген HIS3 без промотора, центромерную область хромосомы 4 (для обеспечения стабильности) и ARS (для репликации). Из клеточной популяции были выделены колонии HIS3*, а из них-плазмида-мишень. Ту-элемент был транспозирован из донора в 5'-фланкирующий участок гена his3 и восполнил функции отсутствующего промотора (ориентация встроенного Ту неизвестна). Транспозированный Ту-элемент содержит два полных 5-сегмента, интрон удален при сплайсинге. [J. D. Воске et al., Cell 40 (1985), р. 491.]

Ту-элемент, транспозированный в плазмиду. Он был вырезан при сплайсинге, а в плазмиде остались фланкирующие его экзоны, чужеродные для Ту-эле- мента. Поскольку такой сплайсинг происходит только на уровне РНК, стала ясна роль РНК и обратной транскрипции в транспозиции Ту. Наличие чужеродных экзонов с убедительностью показывает, что Ту это элемент, транспозированный именно из донорной плазмиды, а не какой-нибудь другой Ту-элемент из геномной ДНК. Участие Ту-тран- скриптов в транспозиции подтверждается также тем, что мутанты spt3 не могут транспозировать хромосомные Ту-элементы, но транспозируют Ту- элементы плазмидного происхождения, находящиеся под транскрипционным контролем не-Ту-индуци- бельного промотора. Недавно опыты по транспозиции были проведены с использованием бесклеточной системы, которая содержала очищенные Ту-час- тицы и соответствующую ДНК-мишень. По-види- мому, линейная дуплексная Ту-ДНК. синтезируемая с помощью обратной транскриптазы и обнаруженная внутри частиц, служит прямым предшественником транспозированного элемента. Данные о том, что и другие ретротранспозоны класса 1 перемещаются подобным образом, будут приведены в следующем разделе.

Вырезания и другие перестройки, связанные с Ту-элементом. Как и транспозирующиеся элементы бактерий. Ту вырезается случайным образом: это событие происходит примерно в одной клетке из 10s-106 в одном поколении. У мутантов his 4 вырезание сопровождается по крайней мере частичной реверсией к фенотипу HIS4+ (рис. 10.30). При этом в молекуле остается «инсерционный след» в виде одиночного 8-сегмента, фланкированного такими же повторами размером 5 п. н., которые выявляются у мутанта. Скорее всего такое вырезание происходит при гомологичной реципрокной рекомбинации прямых повторов 8-сегментов, фланкирующих Ту-элемент (рис. 10.33, Л). Можно также предположить, что многие одиночные 8-сегменты появились в результате подобного вырезания полноразмерных Ту-элементов. Второй продукт вырезания кольцевой Ту-элемент с одним 8-сегментом - скорее всего утрачивается. Подобные реципрокные рекомбинации в принципе могут происходить и между дуплицированными сайтами-мишенями длиной 5 п. н., однако в действительности никаких событий, восстанавливающих сайты-мишени, не наблюдалось.

Геномные перестройки другого рода возникают в результате рекомбинаций между диспергированными Ту-элементами или одиночными 8-сегментами. В одних случаях мы видим лишь генетические последствия таких перестроек, другие описаны на молекулярном уровне. Перестройки с участием двух любых Ту-элементов встречаются в 1% клеток,

подвергающихся мейозу; в делящихся гаплоидных клетках рекомбинация между этими же Ту-элементами происходит лишь с частотой 10-1. Делеции возникают в результате реципрокных рекомбинаций между Ту-элементами и одиночными 8-сегментами, находящимися в одинаковой ориентации на одной и той же хромосоме (рис. 10.33, Б); в локусе дикого типа, представленном на рис. 10.29, они происходят с частотой Ю-1. В результате реципрокных рекомбинаций между противоположно ориентированными Ту-элементами, находящимися на одной и той же хромосоме (рис. 10.33, В), возникают инверсии; если же Ту-элементы локализованы в разных хромосомах, то происходят хромосомные транслокации (рис. 10.33, Г). Если между Ту-элементами, расположенными в разных локусах гомологичных хромосом диплоидного организма, происходит неравный кроссинговер, то в одной из хромосом появляется делеция, а в другой происходит дупликация (рис. 10.33, Д). Отметим, что если центромеры расположены по разные стороны от точки кроссовера, то в результате перестроек, показанных на рис. 10.33, Г и Д, образуются дицентрические и ацентрические хромосомы. Наконец, генная конверсия между двумя Ту-элементами может приводить к изменениям нуклеотидной последовательности самого элемента, не затрагивающим фланкирующие его участки (рис. 10.33. £).

Copia-подобные элементыдрозофилы

Вся совокупность семейств ретротранспозонов класса I D.melanogaster была объединена в группу copia-подобных элементов. Copia-подобные элементы, ретротранспозоны класса II и транспозирующиеся элементы типа Р вместе создают характерную для генома D.melanogaster картину чередования повторов (разд. 9.5.а).

Группа copia. Название элементу-прототипу было дано исходя из свойств многокопийной РНК, гибрид и зующейся с неким семейством диспергированных повторяющихся последовательностей ДНК. У D.melanogaster можно обнаружить 20 отдельных copia-подобных семейств, что составляет 10% всего генома (по 5-100 членов в каждом семействе). Некоторые наиболее полно описанные семейства представлены на рис. 10.34. Как и Ту-элемент, члены этих семейств состоят из нескольких тысяч пар оснований и содержат прямые концевые повторы длиной несколько сотен пар оснований. У всех членов одного семейства LTR идентичны, а для разных семейств они различаются. Концы каждого LTR представлены короткими инвертированными друг относительно друга повторами. В отличие от Ту-элементов, отдельные копии LTR, аналогичные

6. Реципрокная рекомбинация между двумя Ту-элементами, находящимися в одной хромосоме и имеющими одинаковую ориентацию

ABCDЕ

L-LM ^ 1;^ № В

Г. Реципрокная рекомбинация междуТу-элемеитами, находящимися внегомологичных хромосомахГ. Реципрокная рекомбинация междуТу-элемеитами, находящимися внегомологичных хромосомах

Г. Реципрокная рекомбинация междуТу-элемеитами, находящимися внегомологичных хромосомах

Г. Реципрокная рекомбинация междуТу-элемеитами, находящимися внегомологичных хромосомах

В. Реципрокная рекомбинация между двумя Ту-элементами, находящимися в одной хромосоме и имеющими противоположную ориентацию

ADCBе

G^^H^^^^Q

Д.Неравный кроссинговер между двумя неаллельными Ту-элементами,находящимися в гомологичных хромосомахД.Неравный кроссинговер между двумя неаллельными Ту-элементами,находящимися в гомологичных хромосомах

Д.Неравный кроссинговер между двумя неаллельными Ту-элементами,находящимися в гомологичных хромосомах

Д.Неравный кроссинговер между двумя неаллельными Ту-элементами,находящимися в гомологичных хромосомах

Е. Генная конверсия

G^ И 11^ t^ 11

■ill им

I

R-4^^ I F I Г ^ II

1? .Ш Li™

РИС. 10.33.

В результате рекомбинаций между Ту-злементами и последовательностями 6 происходят различные хромосомные перестройки. А, В, С, D, Е и F- генетические маркеры геномной ДНК дрожжей. А. Делеция Ту с сохранением одного 5 в результате гомологичной реципрокной рекомбинации между фланкирующими 6. Б. Делеция в результате гомологичной реципрокной рекомбинации между двумя Ту-злементами, расположенными в одной хромосоме и имеющими одинаковую ориентацию. В. Инверсия в результате гомологичной реципрокной рекомбинации между двумя Ту-злементами, находящимися в одной хромосоме и имеющими противоположную ориентацию. Г. Реципрокная рекомбинация между двумя Ту-злементами, находящимися в негомологичных хромосомах. Д. Неравный кроссин- говер в результате рекомбинации между двумя неаллельными Ту-злементвми, находящимися в гомологичных хромосомах. Е. Гомогенизация Ту-злементов. расположенных на негомологичных хромосомах, в результате генной конверсии. (См. также рис. 9.47.)

одиночным 8, встречаются редко. Встраивание copia-элемента в новый геномный локус сопровождается дупликацией сайта-мишени, при этом нуклеотидная последовательность дуплицированного участка варьирует. Члены разных copia-подобных семейств не гибридизуются между собой и не обнаруживают заметного сходства. Что касается членов одного семейства, то они все-таки гибридизуются, но часто характеризуются полиморфизмом, обусловленным дивергенцией последовательностей и де- лециями. У других представителей рода Drosophila, например у D.simulans, имеются другие copia-no- добные семейства. Одни из них обнаруживают ограниченную гомологию с членами соответствующих

семейств D.melanogaster, другие, по-видимому, видоспецифичны.

Транспозиция. Положение ретротранспозонов одного семейства в геноме у разных линий D. mela- nogaster неодинаково, о чем убедительно свидетельствуют результаты опытов по гибридизации in situ. Рис. 10.35 иллюстрирует гибридизацию одного из членов семейства 412 с гомологичными хромосомами мухи-потомка от скрещивания двух линий D.melanogaster. В том месте, где политенные хромосомы разделены, четко видны члены семейства 412, имеющие разную локализацию (темные полосы). Об изменчивости положения членов семейства у разных линий свидетельствуют и результаты рестрикционного анализа, аналогичного описанному для Ту-элементов. Изменения как локализации, так и числа копий элементов наблюдаются при росте клеток Drosophila в культуре: число копий возрастает до пяти раз по сравнению с таковым в ДНК самих мух. Частота перемещений отдельных copia-подобных элементов в культуре клеток может достигать 10-3-10-4 на одно поколение; это значительно меньше, чем в ДНК клеток самих мух. На самом деле постоянство общего числа элементов в геноме организмов поражает. Не исключено, что в поддержании этого постоянства участвуют какие- то активные процессы.

Copia-подобные элементы при встраивании в гены тоже вызывают мутации. Многие из них изучены на молекулярном уровне. Например, показано, что встраивание copia в локус white приводит к изменению цвета глаз у мух-они становятся абрикосовыми (и,а) или белыми. Как мы уже отмечали, говоря о встраивании Ту-элементов. получающиеся мутантные фенотипы могут различаться. Более того, иногда на инсерционный эффект налагается эффект несцепленных генов Drosophila; воз-

РИС. 10.35.Гибридизация in situ одного из ретротранспозонов семейства 412 с политенной хромосомой Drosophila- потомка от скрещивания мух двух разных линий. Четко видна разная локализация членов семейства 412 в двухРИС. 10.35.Гибридизация in situ одного из ретротранспозонов семейства 412 с политенной хромосомой Drosophila- потомка от скрещивания мух двух разных линий. Четко видна разная локализация членов семейства 412 в двуххроматидах в асинаптической области хромосомы 2 (черные зерна серебра). [С любезного разрешения G. Rubin, Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol. 45 (1980), p. 620.]хроматидах в асинаптической области хромосомы 2 (черные зерна серебра). [С любезного разрешения G. Rubin, Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol. 45 (1980), p. 620.]можно, это связано с тем, что последние участвуют в регуляции функций, кодируемых самим элементом. Мутации, вызываемые copia-подобными элементами, могут ревертировать при вырезании элемента в процессе гомологичной рекомбинации между двумя LTR, причем один LTR и дупликация сайта-мишени размером 5 п. н. остаются. Однако в отличие от Ту такие события, по-видимому, происходят редко, поскольку в геноме обнаруживается очень мало одиночных LTR.

РИС. 10.35.

Гибридизация in situ одного из ретротранспозонов семейства 412 с политенной хромосомой Drosophila- потомка от скрещивания мух двух разных линий. Четко видна разная локализация членов семейства 412 в двух

РИС. 10.35.

Гибридизация in situ одного из ретротранспозонов семейства 412 с политенной хромосомой Drosophila- потомка от скрещивания мух двух разных линий. Четко видна разная локализация членов семейства 412 в двух

хроматидах в асинаптической области хромосомы 2 (черные зерна серебра). [С любезного разрешения G. Rubin, Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol. 45 (1980), p. 620.]

хроматидах в асинаптической области хромосомы 2 (черные зерна серебра). [С любезного разрешения G. Rubin, Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol. 45 (1980), p. 620.]

Транскрипция элементов copia. На долю транскриптов, гомологичных некоторым членам семейства copia, в клетках Drosophila приходится 0,5 -3% суммарной РНК. Соответствующие РНК обнаружены как в ядре, так и в цитоплазме; некоторые из них полиаденилированы. Содержание их зависит от стадии развития организма и типа транскрибируемого элемента. Например, транскрипты В104 не выявляются в культуре клеток, но обнаруживаются в большом количестве во время эмбриогенеза. Транскрипты copia присутствуют в культивируемых клетках и на всех стадиях развития, но у личинок и взрослых особей их больше, чем у зародышей. Транскрипты 412 появляются у зародышей, а у взрослых мух их содержание уменьшается.

Транскрипты copia-элементов, количество которых наиболее велико, сходны с Ту-РНК дрожжей. Обычно по длине они почти равны целому элементу (примерно 5 т. п. н.), начинаясь и заканчиваясь в прямых концевых повторах, и комплементарны лишь одной цепи ДНК. Транскрипция, по-видимо- му, идет в одном направлении. В культуре клеток обнаруживаются также транскрипты меньших размеров (например, copia-PHK длиной 2 т. н.), но вряд ли их роль велика, поскольку в клетках самих мух этих РНК содержится очень мало.

Трансляция элементов copia. Большинство copia- PHK, выделенной из культуры клеток, кэпировано и транслируется in vitro с образованием нескольких полипептидов мол. массой 18-51 кДа. Скорее всего эти полипептиды кодируются мРНК, транскрибированными с левой половины copia, поскольку сегменты, клонированные из левой половины, блокируют трансляцию (разд. 6.4.6).

Почти весь участок между LTR у copia-элемента и у copia-PHK длиной 5 т. н. составляет одну протяженную открытую рамку считывания. У некоторых copia-подобных элементов аналогичный участок включает несколько длинных открытых рамок (такая же картина наблюдается у Ту-элемен- тов). Генные продукты содержат участки, гомологичные генным продуктам Ту-элемента и ретровирусов. Это, в частности, участки, обладающие активностью протеазы, интегразы и обратной транскриптазы (табл. 10.4). По-видимому, copia-подобные элементы кодируют один или более полипептидов, которые расщепляются в результате протеолиза с образованием типичных белков.

В клетках Drosophila присутствуют рибонуклеопротеиновые частицы, содержащие длинные транскрипты copia-подобных элементов. Частицы, содержащие транскрипты copia длиной 5 т. п. н., включают до шести полипептидов и четыре дополнительных РНК длиной менее 300 нуклеотидов, а также обратную транскриптазу. И полипептиды, синтезированные на copia-PHK in vitro, и полипептиды самих частиц осаждаются антителами к этим частицам. Таким образом, copia-PHK кодируют белки, с которыми эти антитела ассоциируют. Кроме того, copia-PHK, присутствующая в частицах, как и Ту-РНК, по-видимому, участвует в репликации и транспозиции copia, происходящей при обрат-

ной транскрипции. Посредниками в этом процессе могут служить гибриды РНК-ДНК copia-подобных ретротранспозонов, которые уже обнаружены.

IАР-последовательности у мышей

У различных позвоночных обнаружены элементы, очень сильно напоминающие ретротранспозоны класса I. Однако охарактеризовано всего одно такое семейство- мышиные 1АР-элементы.

А-частицы, содержащиеся в цистернах. Цитоплазматические рибонуклеопротеиновые комплексы из клеток мыши (А-частицы), содержащиеся в цистернах и обозначаемые ТАР (intracisternal A-parti- cles), весьма необычны. Они появляются на очень ранних стадиях развития зародыша и в различных раковых клетках, кроме клеток тимуса (и только в определенных линиях мышей); в нормальных тканях они почти не встречаются. И по своему составу, и по внешнему виду эти частицы напоминают некоторые ретровирусы, но они не инфекционны. Эти ореховидные частицы диаметром около 80 нм отпочковываются от мембраны эндоплазматического ретикулума и остаются внутри цистерн.

Очищенные IAP-частицы содержат основной структурный белок мол. массой 73 кДа, обратную транскриптазу и несколько специфических РНК, большинство которых гомологичны друг другу и имеют длину 7,2 т.н. (35 S). В некоторых клетках миеломы мышей на долю IAP-PHK приходится примерно 8% суммарной цитоплазматической по- лиаденилированной РНК. В бесклеточной системе эта РНК транслируется с образованием основного структурного белка мол. массой 73 кДа.

РНК IAP негомологична РНК большинства мышиных ретровирусов, за исключением РНК двух видов азиатских мышей, у которых она частично сходна с геномом эндогенных ретровирусов.

Гены, кодирующие А-частицы. Последовательности, гибридизующиеся с РНК IAP, встречаются во всех хромосомах Mus musculus в ~ 1000 диспергированных сайтах; у других видов мышей в хромосомах присутствуют всего 20-25 копий, однако у сирийских хомячков- около 900 копий. Повторяющиеся единицы имеют длину 7,1 т. п. н., хотя встречаются и более короткие члены семейства. Как и все диспергированные повторяющиеся элементы, отдельные члены семейства отличаются друг от друга. У них имеется центральный участок, фланкированный LTR длиной 338 п. н., каждый из которых в свою очередь имеет короткие концевые инвертированные повторы длиной 4 п. н. Таким образом, ДНК IAP это типичный ретротранспозон класса I (рис. 10.27). При его встраивании происходит дупликация сайта-мишени длиной 6 п. н. 5'-кон- цы длинных молекул РНК, обнаруженных в IAP,

соответствуют последовательностям левых LTR (LTR-L), т. е. транскрипция протекает аналогично транскрипции Ту-элемента и copia.

Транспозиция IAP и их мутагенное действие. IAP-элементы, перемещаясь в новые геномные сайты, вызывают мутации как в клетках зародышевой линии, так и в соматических клетках. Например, из клеток-сверхпродуцентов легких цепей иммуноглобулинов были получены мутантные клеточные линии, вообще не продуцирующие этих цепей, и в некоторых из них в интроны гена легкой цепи были встроены IAP-элементы. При этом IAP-элемент мог находиться в любой ориентации относительно направления транскрипции иммуноглобулинового гена. Известен и еще один пример. Встраивание IAP-элемента приводит к повышению уровня экспрессии соседнего с ним гена-явление, типичное для многих транспозирующихся элементов. Так, IAP-элемент, встроенный в 5'-половину кодирующей области мышиного онкогена c-mos, вызывает ускорение транскрипции последовательностей c-mos, расположенных в З'-направлении от вставки, при этом, как и Ту-элемент, ТАР встраивается таким образом, что транскрибируется в противоположном направлении от последовательностей c-mos. Анализ аберрантных транскриптов с использованием нуклеазы S1 наводит на мысль, что LTR-L содержит дополнительный контролирующий элемент, который ускоряет транскрипцию в направлении от IAP-элемента. Наличие двунаправленных промоторов и энхансера в LTR-L было прямо показано в опытах с использованием специально сконструированных векторов.

Сравнение с ретровирусами

Структурное сходство. Структурное сходство ретротранспозонов класса I и интегрированной двухцепочечной формы ретровирусного генома (провируса) не вызывает сомнений (рис. 10.36). Оба они имеют одинаковую структуру: длинные концевые прямые повторы (LTR), окружающие более протяженный центральный участок. Несмотря на то что нуклеотидные последовательности LTR у разных семейств различаются, все они начинаются и заканчиваются короткими инвертированными повторами, так что этими повторами начинаются и заканчиваются и сами единицы. Более того, первые два нуклеотида инвертированных повторов в разных единицах одинаковы: это 5'-ТС (рис. 10.37). В некоторых случаях сходными оказываются и другие пары оснований. Кроме того, отмечается сходство между U3-, R- и U5-областями провирусных LTR и LTR ретротранспозонов. Сигнальные последовательности, участвующие в регуляции транскрипции с помощью РНК-полимеразы II, в том

LTR-RLTR-RТипичный.Типичный.Геномная РНКГеномная РНКLTR-L I U3IU5LTR-L I U3IU5pro RT endo= ORF А — ORF Сpro RT endo= ORF А — ORF СORFBORFB

LTR-R

LTR-R

Типичный.

Типичный.

Геномная РНК

Геномная РНК

LTR-L I U3IU5

LTR-L I U3IU5

pro RT endo= ORF А — ORF С

pro RT endo= ORF А — ORF С

ORFB

ORFB

овирус- геном (провирус)

«~1 ■ ^ ГН- 8^

Днк-с вязы в аю щий участокДнк-с вязы в аю щий участок

Днк-с вязы в аю щий участок

Днк-с вязы в аю щий участок

РИС. 10.36.

Структура ретровирусного генома, встроенного в ДНК хозяйской клетки (провируса), в сравнении со структурой Ту-элемента, copia и IAP. Про- вирусный участок ро! кодирует протеазу (pro), обратную транскриптазу (/?Т) и эндонуклеазу (endo). ORF ретротранспозонов кодируют полипептиды, которые содержат участки, гомологичные соответствующим ретровирусным белкам. Разные ORF перекрываются.

числе промоторная последовательность ТАТААА и сигнал полиаденилирования ААТААА, находятся в указанных LTR в аналогичных положениях. Более того, многие ретротранспозоны имеют последовательность, сходную с ретровирусной (Р-последова- тельность; рис. 2.39), которая гибридизуется с тРНК-праймером (затравкой) во время инициации обратной транскрипции (рис. 10.37). Как и в ретровирусных геномах, эта P-последовательность находится на границе между LTR-L и центральным сегментом ДНК. Далее, область центрального сегмента ретротранспозонов, примыкающая к LTR-R, часто бывает обогащена пуринами, как и соответствующая область ретровирусного генома (рис. 10.37).

Сходство процессов транскрипции и кодирования. Основные транскрипты элементов Ту, copia и IAP также весьма сходны с транскриптами провирусов. Все те РНК, которые были охарактеризованы, начинаются в LTR-L и заканчиваются в LTR-R, так что

транскрипт, во-первых, содержит не менее одной копии полной последовательности элемента и, во- вторых, имеет прямые концевые повторы (рис. 10.31). Как и у ретровирусов, у ретротранспозонов класса I почти вся центральная часть занята открытыми рамками считывания. Ближайший к LTR-L кодирующий участок детерминирует синтез белка, который связывается с нуклеиновой кислотой; этот участок аналогичен гену gag ретровирусов. Следующий кодирующий участок, poi, детерминирует синтез обратной транскриптазы, а также, вероятно, белки, гомологичные протеазе (pro), интегразе (int) и РНКазе Н ретровирусов. Ближе к З'-концу геном ретровируса содержит третий кодирующий участок (сиг), который кодирует белок оболочки вириона. У большинства ретротранспозонов функциональный участок епи, по-видимому, отсутствует; возможно, именно с этим связана их неспособность продуцировать инфекционные частицы. ДНК IAP,

TGTTG - •• ТАТАААА...TGTTG ... ТАТААДТ...TGTTG - •• ТАТАААА...TGTTG ... ТАТААДТ...*СТСА...*ААСА...ААТААА ...ТАСА...А АТААА... ААСА...*СТСА...*ААСА...ААТААА ...ТАСА...А АТААА... ААСА...TGGTAGCG... // ...GGTTATGG... // . . - TGGCGACC... // .. . TGGTGCCG... //..-TGGTAGCG... // ...GGTTATGG... // . . - TGGCGACC... // .. . TGGTGCCG... //..-GGGTGGTA И Ту AGGGGGCG // Copia GAGGGAGA // 412 AGGAGAGA И тарGGGTGGTA И Ту AGGGGGCG // Copia GAGGGAGA // 412 AGGAGAGA И тар

TGTTG - •• ТАТАААА...

TGTTG ... ТАТААДТ...

TGTTG - •• ТАТАААА...

TGTTG ... ТАТААДТ...

*СТСА...

*ААСА...

ААТААА ...ТАСА...

А АТААА... ААСА...

*СТСА...

*ААСА...

ААТААА ...ТАСА...

А АТААА... ААСА...

TGGTAGCG... // ...

GGTTATGG... // . . - TGGCGACC... // .. . TGGTGCCG... //..-

TGGTAGCG... // ...

GGTTATGG... // . . - TGGCGACC... // .. . TGGTGCCG... //..-

GGGTGGTA И Ту AGGGGGCG // Copia GAGGGAGA // 412 AGGAGAGA И тар

GGGTGGTA И Ту AGGGGGCG // Copia GAGGGAGA // 412 AGGAGAGA И тар

TGTA--- ТАТАТТА...

TGT... ТАТААС ...

TGTA... ТАТТТАА... А АТА А А... ТТ С А... TGGTGACC... И ... GAGGGGGA // RSV

TGAAAG ... ААТАААА... А АТ А А А.. .ТТС A... TGGGGGCTC... Ц . .. AAGGGGGG // MoMLV

РИС. 10.37.

Общие структурные особенности Ту-злемента, copia, членов семейства 412, IAP и интегрированных форм ретровирусов (провирусов). Звездочками отмечены

в отличие от других ретротранспозонов, содержит участок, достаточно длинный для того, чтобы оказаться геном его. Однако этот участок не может быть функциональной кодирующей последовательностью, поскольку содержит множество стоп-кодонов.

У всех исследованных ретровирусов и ретротранспозонов класса I дад или gag-подобные рамки считывания (ORF А) транслируются нормально, но затем часто происходит протеолиз с образованием разных продуктов. Copia содержит только одну рамку считывания, и все белки (например, gag-подобный белок и обратная транскриптаза), по-видимому. представляют собой продукты посттрансляционного процессинга. У других ретротранспозонов и многих ретровирусов gag-подобные и ро/-рамки считывания перекрываются (рис. 10.36), но при этом используются разные наборы триплетов, как в случае Ту-элементов. Иногда трансляция, начинаясь с gag-подобного участка, продолжается со сдвигом рамки считывания с образованием слитного белка, содержащего как gag-подобную, так и /^/-последовательности. Из этого белка в результате процессинга образуются отдельные белки.

Локализация транскриптов в рибонуклеопротеиновых частицах. Аналогия между ретровирусами и ретротранспозонами распространяется и на упаковку ретротранспозонных транскриптов в рибонуклеопротеиновые частицы. Частицы с РНК copia- подобных элементов и РНК Ту-элементов обнаружены у Drosophila и дрожжей соответственно. Эти частицы содержат белковые компоненты, кодируемые gag-подобными и ро/-областями РНК.

Транспозиция ретротранспозонов. Имея в виду

участки, где эквивалентных последовательностей не об наружено.

то сходство, которое существует между ретровирусным геномом и ретротранспозонами класса I, можно сделать вывод, что последние перемещаются в геноме с помощью механизма, аналогичного тому, который используют ретровирусы при интеграции в клеточную ДНК. Детали этого процесса для каждого данного семейства ретротранспозонов окончательно не установлены, но можно предложить следующую общую модель: транскрипт ретротранспозона с помощью обратной транскриптазы, кодируемой самим мобильным элементом, превращается в дуплексную ДНК, которая затем встраивается в новый геномный локус. Обратная транскрипция ретровирусной РНК подробно описана в разд. 2.2.а и 5.7.г.

В рамках данной модели оба LTR нового элемента должны образовываться из одной и той же последовательности, поскольку сама РНК содержит лишь один полный набор LTR-последовательностей. Общее происхождение двух LTR дает ответ на вопрос, почему повторы, окружающие один ретротранспозон, практически одинаковы, в то время как LTR у членов разных семейств различаются. Отметим, что многие, а возможно подавляющее большинство членов семейства ретротранспозонов, неспособны к независимой транспозиции. Для них характерны нуклеотидные замены и другие изменения, затрагивающие как регуляторные, так и кодирующие участки генома, которые могут прерывать транскрипцию и трансляцию и блокировать образование функциональных генных продуктов. Некоторые элементы могут приобретать способность к транспозиции при наличии транс-действующих обратной транскриптазы и других активностей.

РИС. 10.38.

Две кольцевые формы copia, различающиеся тем, что первая содержит один LTR, а вторая- два.

В результате обратной транскрипции ретровирусной РНК образуются три разные дуплексные ДНК: одна линейная и две кольцевые, различающиеся тем, что содержат один или два LTR (рис. 2.40). Немногочисленные кольцевые формы Ту, IAP и copia-подобных элементов были выделены и амплифицированы путем клонирования. Например. были обнаружены две кольцевые ДНК copia: длиной 5,0 и 4,7 т. п. н. (рис. 10.38), различающиеся тем, что содержат одну или две копии LTR; этим же различаются и кольцевые ретровирусные ДНК. Однако кольцевые Ту-ДНК содержат лишь один LTR. Возможно, кольцевые формы образуются в результате обратной транскрипции РНК таким же способом, каким образуются ретровирусные кольцевые молекулы. Но они могут возникать и в результате

обычных процессов рекомбинации с участием только ДНК (рис. 10.39). В обоих этих случаях неинтегрированная кольцевая ретротранспозонная ДНК может утрачиваться. Как показывают эксперименты in vitro, линейные дуплексные ДНК и в случае Ту-элемента, и в случае ретровирусов являются промежуточными формами при транспозиции.

Последний этап транспозиции встраивание дуплексной ДНК в геном реципиента, которое у ретротранспозонов и ретровирусов протекает сходным образом. Согласно моделям, представленным на рис. 10.40, в транспозиции действительно участвует линейная дуплексная ДНК, причем этапы этого процесса аналогичны описанным для простого встраивания транспозирующихся элементов прокариот (рис. 10.9). Встраивание начинается с разрыва четырех фосфодиэфирных связей: двух-у донора и двух (несимметричных)-у реципиента. Затем между З'-концами донора и 5'-концами реципиента образуются новые фосфодиэфирные связи.

Общность свойств ретротранспозонов класса 1 и ретровирусов наводит на мысль о наличии у них общего предка. По-видимому, в ходе эволюции ретровирусы развились в жизнеспособные внеклеточные формы, а ретротранспозоны-в исключительно внутриклеточные. Важны оба типа элементов, поскольку оба участвуют в передаче информации от РНК к геному, как это делают ретротранспо-

Copia в геноме

Гомологичная рекомбинация между дуплицированными сайтами-мишенями

Гомологичная рекомбинация между концевыми прямыми повторами

Сайт- мишень г

Сайт- 1 мишень

РИС. 10.39.

Схема образования кольцевых copia- ДНК при вырезании.

Геномная ДНК

5'

Кольцевой или линейный ретротранспозон

Внесение одноцепочечных разрывов специфической эндонуклеазой

5'

^С

5'

Соединение 3-концов разрезанного ретротранспозона с 5-концами геномной ДНК с асимметричными одноцепочечными разрывами

РИС. 10.40.

Встраивание кольцевой или линейной ретровирусной или ретротранспозонной дуплексной ДНК в реципиент- ный геном Прежде всего в реципиентный геном вносятся асимметричные одноцепочечные разрывы (указаны стрелками)-по-видимому, с помощью эндонуклеазы, кодируемой ретровирусом или ретротранспозоном Число пар оснований между этими разрывами специфично для данной эндонуклеазы, поскольку оно определяет характерный для каждого элемента размер дупликации сайта-мишени. Аналогичным образом расщепляется ДНК донора. Как правило, в кольцевых ретровирусных дуплексах содержатся дополнительные 4 пн

между участками U5 и U3 двух соединенных LTR (выделены более темным цветом). По-видимому в линейной ДНК по две из этих пар находятся на концах мопекулы. Одноцепочечные разрывы как в линейной, так и в кольцевой донорной ДНК происходят так, как это изображено на рисунке. Аналогичные дополнительные пары оснований могут содержать и ретротранспозоны. После соединения З'-концов донора с 5'-концами ДНК- мишени эти основания удаляются, а бреши заполняются ДНК-полимеразой и лигируются. [P.O. Brown et al., Cell 49 (1987). p. 347 ]

зоны класса II (разд. IO 3 e) Благодаря этому могут происходить обновление генома и его перестройка - основа эволюционного процесса

Ретротранспозоны класса II

Типичные ретротранспозоны класса II не содержат длинных концевых повторов и имеют длину несколько т. п. н. (рис. 10.41). При их встраивании

происходят дупликации сайта-мишени, но длина дуплицированного участка для разных элементов варьирует. На З'-конце одной из цепей ретротранспозонов имеется A-богатая последовательность, а центральная часть цепи содержит открытые рамки считывания, часть которых кодируют полипептиды, сходные с консервативными pol- и уад-сегментами полипептидов, кодируемых ретровирусной ДНК и ретротранспозонами класса I (табл. 10.4). Итак, не-

(AATAAAli

ААТААА

g П А-богатый

0 Т-богатый

LINE-1, человек

ААТАААААТАААА-богатый Т-богатыйА-богатый Т-богатый

ААТААА

ААТААА

А-богатый Т-богатый

А-богатый Т-богатый

L1NE-1, (;

МЫШЬ

5 III1II|| 3

1234567

Т. П.Н.

РИС. 10.41.

Структура ретротранспозонов класса II. Длинные откры- ностями, кодирующими обратные транскриптазы тые рамки считывания выделены цветом; отмечены (табл. 10.4).

участки, обнаруживающие гомологию с последователь -

смотря на отсутствие прямых данных, можно думать, что ретротранспозоны класса II кодируют собственную обратную транскриптазу и их транспозиция осуществляется в ходе обратной транскрипции РНК-посредника. В отличие от ретровирусов и ретротранспозонов класса I, о ретротранспозонах класса II мы знаем пока очень мало.

F- и G-элементы Drosophila. В эухроматине и хромоцентре генома Drosophila диспергированы примерно 50 членов F-семейства. Самые длинные и наиболее распространенные из них имеют размер 4,7 т. п. н., но есть и более короткие элементы-3,4 т. п. н. На З'-конце всех F-элементов имеется по 12-30 остатков аденина (рис. 10.42). Сразу перед этой A-богатой последовательностью находятся два перекрывающихся сигнала полиаденилирования, ААТААА. Короткие F-элементы «урезаны» с 5'- конца и, таким образом, напоминают последовательности LINE-1 млекопитающих.

В тех F-элементах, которые были секвенирова- ны, обнаружена по крайней мере одна открытая рамка считывания (рис. 10.41). Поскольку неясно, активны или нет эти секвенированные F-элементы, может оказаться, что открытая рамка (или рамки) в функциональных элементах имеет другую организацию. чем в нефункциональных. С этой открытой рамки считывания должен синтезироваться белок, частично сходный с обратной транскриптазой (табл. 10.4). Клеточные транскрипты Е-элемента встречаются очень редко и роль их неясна, а клеточные полипептиды, кодируемые F-элементом, вообще не обнаружены.

Первые предположения о мобильности Е-элемента основывались на данных о его разной локализации в геноме мух и о дупликации сайтов-мишеней. Об этом свидетельствовали результаты опытов по гибридизации in situ клонированных F-зондов с политенными хромосомами D. melanogaster разных

5,-CAGTT6CCGACCA ATGAAGCTTTCGATC6CC—4,7т.п.и.-СААТА|АATAAA|AGTAAAGT( А)1Д G CAGTTGCCGACC А

5' - ATGTTT6AG ATCGCC—4,7т.п.н.-СААта[аатААа]А6СААА6С(А)2б ATGTTTG А -

5‘- AATAATGCGG ТСТСС-4,2т.п.н-С6АтА |AATAAA|AGCAAAGTAAAAT(A):„AATAATGCGG

РИС. 10.42.

Эти три F-элемента гомологичны, но имеют разные 5 -концы. Они фланкированы дуплицированными участками размером 8-13 п. н. с разными нуклеотидными

последовательностями. В рамку заключены сайты полиаденилирования- ААТААА.

линий. Локализация F-элемента оказывается неодинаковой даже у мух в пределах одной линии. Различия между линиями использовали при клонировании и сравнении свободных и занятых сайтов- мишеней точно так же, как в случае Р-элементов (разд 10.2.6). Эти эксперименты позволили установить границы полноразмерного F-элемента и показали, что размер дуплицированного участка для разных копий F-элемента неодинаков и составляет от 8 до 13 п. н. Мобильность F-элемента была прямо продемонстрирована на локусе white Drosophila. White-ivory (глаза цвета слоновой кости) - это мутация, обусловленная дупликацией сегмента длиной 3 т. п. н. в локусе white (рис. 10.43). У одного из ревертантов white-ivory этот дуплицированный участок делегирован, и вместо него встроен Р-элемент.

G-элементы очень напоминают по своей структуре P-элементы (рис. 10.41), но организованы в геноме D. melanogaster совершенно по-другому. G- элементы встречаются в тандемных повторах, встроенных в межгенные спейсеры (IGS) в кластерах рибосомных генов. По-видимому, эти рДНК локализованы в хромоцентрах политенных хромосом, поскольку клонированные G-элементы гибридизу- ются исключительно с этой областью хромосомы.

В тех G-элементах, которые были секвенирова- ны, имеется несколько открытых рамок считывания, на одной из которых синтезируется полипептид, сходный с обратной транскриптазой. Генные транскрипты или белковые продукты G-элемента, равно как и F-элемента, не идентифицированы.

1-элемент Drosophila. Вторая система гибридного дисгенеза, отличная от дисгенеза, обусловленного P-элементами, называется I-R и обнаружена в определенных линиях Drosophila. При скрещивании меж

ду так называемыми самцами-индукторами (I, от inducer) и реактивными самками (R, от reactive) получается дисгенное потомство. Как и в случае с P-элементом, при других типах скрещивания (например, при скрещивании самцов R с самками I) потомство оказывается нормальным (на рис. 10.15 показаны соответствующие скрещивания в Р-М-сис- теме). Фенотипические проявления I-R-дисгенеза сходны с таковыми при Р-М-дисгенезе.

Механизм I-R-дисгенеза аналогичен механизму Р-М-дисгенеза. Когда транспозирующийся 1-элемент попадает в цитоплазму яйца мухи R-линии, происходит его активация. Если 1-элемент попадает в яйцо мухи 1-линии, то активация по каким-то причинам репрессируется. В соответствии с этим некоторые независимые мутации, встречающиеся в локусе white у I-R-дисгенных мух, оказываются обусловленными встраиванием в него сегмента длиной 5,4 т. п. н., т. е. 1-элемента. Каждый элемент фланкирован копией сайта-мишени длиной от 10 до 14 п. н.

РИС. 10.43.Данные, свидетельствующие о транспозиции F-злемен- та. У Drosophila мутация white ivory (w') (глаза цвета слоновой кости) обусловливается дупликацией участка длиной 3 т. п. н. в локусе white дикого типа. У ревертанРИС. 10.43.Данные, свидетельствующие о транспозиции F-злемен- та. У Drosophila мутация white ivory (w') (глаза цвета слоновой кости) обусловливается дупликацией участка длиной 3 т. п. н. в локусе white дикого типа. У ревертантов к дикому типу (w+) эта дупликация утрачивается, и вместо нее встраивается F-злемент, окруженный дуплицированными сайтами-мишенями. [R. Е. Karess, G. М. Rubin, Cell 30 (1982), р. 63.]тов к дикому типу (w+) эта дупликация утрачивается, и вместо нее встраивается F-злемент, окруженный дуплицированными сайтами-мишенями. [R. Е. Karess, G. М. Rubin, Cell 30 (1982), р. 63.]По своей структуре 1-элемент сходен с F- и G-элементами (рис. 10.41); он не содержит ни прямых, ни инвертированных концевых повторов. А- богатый конец представлен четырьмя-семью тандемными повторами последовательности ТАА, но сигнал полиаденилирования отсутствует. Цепь ДНК с A-богатым З'-концом содержит две протяженные открытые рамки считывания (ORF), разделенные участком длиной 471 п. н.; никаких потенциальных сайтов сплайсинга не выявлено. ORF, ближайшая к З'-концу 1-элемента, кодирует полипептид, сходный с обратной транскриптазой (табл. 10.4). Согласно генетическим данным, 1-элементы кодируют активности, необходимые для транспозиции и ее

РИС. 10.43.

Данные, свидетельствующие о транспозиции F-злемен- та. У Drosophila мутация white ivory (w') (глаза цвета слоновой кости) обусловливается дупликацией участка длиной 3 т. п. н. в локусе white дикого типа. У ревертан

РИС. 10.43.

Данные, свидетельствующие о транспозиции F-злемен- та. У Drosophila мутация white ivory (w') (глаза цвета слоновой кости) обусловливается дупликацией участка длиной 3 т. п. н. в локусе white дикого типа. У ревертан

тов к дикому типу (w+) эта дупликация утрачивается, и вместо нее встраивается F-злемент, окруженный дуплицированными сайтами-мишенями. [R. Е. Karess, G. М. Rubin, Cell 30 (1982), р. 63.]

тов к дикому типу (w+) эта дупликация утрачивается, и вместо нее встраивается F-злемент, окруженный дуплицированными сайтами-мишенями. [R. Е. Karess, G. М. Rubin, Cell 30 (1982), р. 63.]

регуляции; возможно, первая из них является обратной транскриптазой. Идентифицированы транскрипты 1-элемента; встречаются они только в яичниках Drosophila.

1-элемент, представленный на рис. 10.41. произошел от элемента, который, согласно результатам генетических экспериментов, способен к транспозиции. Кроме того, 5'-конец этого элемента идентичен 5'-концам некоторых других, уже секвени- рованных [-элементов. Эти данные позволяют предположить, что секвенированный [-элемент-самодостаточная единица, содержащая все необходимое для транспозиции. Из предположения, что транспозиция происходит при участии РНК-посредника, который соответствует полноразмерной единице, следует, что элементы, регулирующие транскрипцию, должны находиться внутри самого I- элемента. По-видимому, это же справедлио и для других ретротранспозонов класса II. Действительно, недавние исследования ретротранспозона класса Il Drosophila, названного Jockey, показали, что его сегмент, расположенный перед первой (5') ORF, обладает премоторной активностью. Если 13 п. н. на 5'-конце делетированы, то транскрипция не происходит. Таким образом, по-видимому, эти элементы используют необычные, внутренние регуляторные последовательности для РНК-полимеразы II.

Семейство L1NE-1 млекопитающих. Наиболее многочисленное семейство длинных диспергированных повторов млекопитающих, LINE-1 (разд. 9.5.в), представляет собой семейство ретротранспозонов класса И, сходных с Jockey и 1-элементами Drosophila (рис. 10.41). О мобильности LINE-1 свидетельствовал тот факт, что их встраивание в геном сопровождалось появлением мутаций. Например, у больных гемофилией мальчиков в гене фактора VIII (белка, участвующего в свертывании крови), локализованном на Х-хромосоме. имелась вставка LINE-1, в то время как у матерей эта вставка отсутствовала.

У многих из 104- 105 копий LINE-1 в геномах млекопитающих укорочен 5'-конец. однако несколько тысяч копий полноразмерные и составляют в длину 6-7 т. п. н. в зависимости от вида. Дупликация сайта-мишени происходит не всегда. Полноразмерные элементы не содержат ни прямых, ни инвертированных концевых повторов. Их А-бога- тые З'-концы могут быть представлены непрерывной ро!у(А)-последовательностью либо тандемными повторами ТААА или сходных единиц, как у 1-элементов. Сравнение LINE-1-элементов млекопитающих, относящихся к разным отрядам, показывает, что все они имеют консервативную центральную область длиной 5 т. п. н. В одной из цепей ДНК эта область перекрывается с протяженными

открытыми рамками считывания. В большинстве клонированных и секвенированных LINE-1 ORF прерываются стоп-кодонами; наблюдается также сдвиг рамок, обусловленный небольшими делениями и вставками. Однако, исходя из структуры консенсусной последовательности, можно сделать вывод, что все LINE-1 произошли в результате дивергенции от одного исходного элемента с двумя ORF. Итак, хотя большинство LINE-1 не содержат функциональных генов, один или более полноразмерных элементов у каждого вида могут кодировать один или несколько полипептидов. Более короткая 5'- ORF (ORF I) менее консервативна, чем длинная З'-ORF (ORFII); последняя кодирует полипептид, сходный с обратной транскриптазой (табл. 10.4 и рис. 10.41). Сегменты, фланкирующие эти две рамки с 5'- и З'-концов, неодинаковы по длине и нуклеотидной последовательности у разных видов млекопитающих.

В разных клетках млекопитающих ядерная РНК представлена большим количеством гетерогенных по длине молекул, которые гибридизуются с LINE-1-зондами, причем с обеими цепями. Вероятно, многие из этих РНК являются первичными транскриптами неродственных генов, содержащих вставки LINE-1 (например, в интронах). В отличие от этого полиаденилированная РНК, содержащая полноразмерный элемент LINI-1, была обнаружена в клетках только тератокарциномы человека. В большинстве клеток Drosophila присутствуют РНК, сходные с Jockey. Все эти РНК в принципе могут быть мРНК или посредниками при транспозиции. Они негомогенны: кДНК, синтезированные на РНК человека длиной 6,5 т. н, различаются примерно по 2% нуклеотидных остатков. Кроме того, многие из них содержат нуклеотидные замены, прерывающие две рамки считывания, так что лишь отдельные РНК могут быть функциональными мРНК. Однако разрыв между двумя ORF, показанный на рис. 10.41, сохраняется в кДНК человека (а следовательно, и в соответствующих РНК), а также в геномных LINE-1 у грызунов и человека.

Общая характеристика ретротранспозонов класса II. Если оставить в стороне вопрос об отсутствии у ретротранспозонов класса II длинных концевых повторов, то можно сделать вывод, что эти ретротранспозоны во многом сходны с ретровирусами и ретротранспозонами класса I. Во-первых, это способность кодировать обратную транскриптазу; во-вторых, наличие во многих случаях двух ORF в одной цепи. Аналогичное сходство наблюдается между дад- (и уог-подобными) генами и ^/-областями ретровирусов и ретротранспозонов класса I. Однако, несмотря на то что ORF И у всех элементов класса II сходны в том отношении, что они кодируют обратную транскриптазу, их ORF I различаются,

за исключением ORF I у близкородственных видов. Как и у элементов, содержащих LTR, участки, разделяющие две ORF в разных семействах класса II, варьируют (рис. 10.41). В Р-, G- и 1-элементах эти рамки разделены несколькими сотнями пар основании а в L1NE-1 мыши они перекрываются-так же как в некоторых ретровирусах и в Ту-элементе. Для трансляции ORFII в ретротранспозонах класса II либо должен произойти сплайсинг РНК, либо каким го образом устраняться или «проскакиваться» разрыв между рамками в процессе трансляции.

Поскольку элементы класса II лишены LTR, их обратная транскрипция и транспозиция должны осуществляться с помощью механизмов, отличных от тех, которые используются ретровирусами и ретротранспозонами класса I. Как это происходит- пока неизвестно. Возможно, посредниками при транспозиции служат недавно обнаруженные кольцевые F- и LINE-1-ДНК.

РЕТРОГЕНЫ

Ретрогенами (используется также термин ретро- позоны) мы называем разнородную группу элементов, которые, по-видимому, транспозируются с помощью РНК-посредника, хотя механизм транспозиции четко не установлен. К ретрогенам относятся самые разнообразные последовательности, которые, однако, обладают тем общим свойством, что сами не кодируют обратную транскриптазу. Их общие структурные особенности состоят в следующем 1) у них отсутствуют концевые повторы - как прямые, так и инвертированные; 2) на З'-конце одной из цепей ДНК имеется A-богатый участок; 3) длина у дуплицированного сайта-мишени варьирует. Нуклеотидной последовательностью ретрогена условились считать последовательность цепи с A-богатым З'-концом. Данные о мобильности ретрогенов носят в основном косвенный характер: это диспергированность членов семейства по различным геномным локусам, дупликация сайтов-мишеней, а также наличие аллелей, различающихся присутствием или отсутствием в них ретрогена.

Транспозиция ретро генов, по-видимому, осуществляется пассивным образом; РНК может подвергаться обратной транскрипции с помощью ферментов, поставляемых ретротранспозонами или ретровирусами. Таким образом, процессированные псевдогены-это и есть ретрогены, которые могут быть копиями мРНК (т.е. процессированными псевдогенами полипептидов) или небольших РНК типа тРНК или 7S-PHK. На долю всех ретрогенов приходится примерно 10% общей длины некоторых геномов, т. е. они вносят существенный вклад в поток информации от РНК к ДНК. Число копий

Таблица 10.5. Примерное число копий некоторых процессированных псевдогенов

Ген

Организм

Примерное число копий

всех

генов

функциональных генов

Ген

актина

Человек

20-30

6

Ген

а-тубулина

Крыса

4

1

Ген

Р-тубулина

Человек

15-20

3

Ген

IFN-a

»

15

10

Ген

U1-PHK

»

1100

100

Ген

глицеральдегид-

Курица

1

1

3-фосфатдегидро-

Человек

10-30

1

геназы

Мышь

> 200

1

отдельных процессированных псевдогенов полипептидов относительно невелико, а число процессированных форм любого специфического гена может значительно варьировать от вида к виду (табл. 10.5). Отметим, однако, что процессированные псевдогены 7SL-PHK, например семейства SINE у приматов и мышей, встречаются с необычайно высокой частотой (так, в ДНК человека присутствует 5-105 копий Alu-SINE-повторов).

Процессированные псевдогеныполипептидов

Структура. Процессированные псевдогены полипептидов образуют отдельный класс псевдогенов (разд. 9.1 .а). Несмотря на имеющиеся различия, все они больше похожи на ДНК-копии мРНК, чем на соответствующие им гены (рис. 10.44). Более того, они располагаются в геномных сайтах, далеко отстоящих от локусов соответствующих функциональных генов, часто даже в других хромосомах. Любопытно, что процессированные псевдогены полипептидов в наибольшем количестве присутствуют в геноме млекопитающих, реже встречаются у других позвоночных и у растений, а у беспозвоночных они вообще не обнаружены.

Типичный процессированный ген а-тубулина крысы начинается там же. где и соответствующая мРНК, не содержит вставочных последовательностей, фланкирован последовательностями, очень сильно отличающимися от последовательностей, окружающих сам ген, и таким образом лишен сигналов регуляции транскрипции, несет несколько мутаций и содержит З'-концевую ро!у(А)-последова- тельность (рис. 9.11 и 10.44). Другие процессированные гены полипептидов обладают лишь некоторыми из этих свойств. Например, в процессированном гене а-глобина мыши, расположенном в хромосоме 15, отсутствуют два интрона, характерных для

ГенГен«-Тубулин крысы«-Тубулин крысыПроцессированный псевдогенПроцессированный псевдоген1-rJ-JМутации1-rJ-JМутации«-Глобин мыши«-Глобин мышиГенГенПооиессиоованный< уaai .А у' ■псевдоген ( гОПооиессиоованный< уaai .А у' ■псевдоген ( гОмРНКмРНКМеталпотионеинчеловека

Ген

Ген

«-Тубулин крысы

«-Тубулин крысы

Процессированный псевдоген

Процессированный псевдоген

1-rJ-J

Мутации

1-rJ-J

Мутации

«-Глобин мыши

«-Глобин мыши

Ген

Ген

Пооиессиоованный< уaai .А у' ■

псевдоген ( гО

Пооиессиоованный< уaai .А у' ■

псевдоген ( гО

мРНК

мРНК

Ге» НЭЩ^8

ПроцессированныйпсевдогенПроцессированныйпсевдоген^-^ен—н^>8^-^ен—н^>8РИС. 10.44.

Процессированныйпсевдоген

Процессированныйпсевдоген

^-^ен—н^>8

^-^ен—н^>8

Сравнение структуры полипептидных генов и их процессированных псевдогенов.

а-глобинового гена, но зато имеются последовательности, расположенные перед сайтом инициации транскрипции функционального гена, локализованного в хромосоме 11; A-богатый З'-конец отсутствует. Еще у одного вида процессированных генов левее участка, отвечающего 5'-концу мРНК, находится последовательность, не гомологичная последовательности, находящейся перед самим геном; по-видимому, она является частью транспозирован- ного участка, поскольку находится внутри сегмента, фланкированного предполагаемыми дупликациями сайта-мишени (к этому типу относится процессированный ген металлотионеина, представленный на рис. 10.44).

Предполагаемые способы образования процессированных псевдогенов полипептидов. Структура процессированных генов полипептидов позволяет предположить, что они являются ДНК-копиями соответствующих мРНК. Согласно одной из моделей, их образование и транспозиция осуществляются путем обратной транскрипции РНК с последующим встраиванием кДНК в геном в месте его асимметричного разрыва (рис. 10.45). При этом происходит

дупликация с образованием дуплицированного участка разного размера. Вариабельность отражает неточность внесения одноцепочечных разрывов; этим псевдогены отличаются от транспозирующих- ся элементов и ретротранспозонов класса I, при встраивании которых размер дуплицированного участка фиксирован. Эта модель сталкивается с двумя серьезными проблемами. Первая связана с тем, что в клетках эмбриона на ранних стадиях развития и в клетках зародышевой линии обратная транскриптаза пока не обнаружена, а для того чтобы в таких клетках происходило наследуемое встраивание, в них должна осуществляться обратная транскрипция. Вторая проблема состоит в отсутствии подходящего праймера. Неясно, что может служить праймером при обратной транскрипции транскриптов, образовавшихся при участии РНК- полимеразы II, если в клетке отсутствует oligo (dT). Впрочем, если оставить в стороне вопрос о праймере, то эта модель оказывается весьма привлекательной для объяснения механизма образования процессированных генов типа гена а-тубулина крысы, представляющих собой почти совершенные копии мРНК. Чтобы эту модель можно было применять к образованию процессированных генов а-глобина мыши или металлотионеина, ее необходимо видоизменить.

В модели, представленной на рис. 10.45, отсутствует ряд важных деталей, так что для разных этапов процесса можно предложить несколько конкретных механизмов. Например, синтез второй цепи кДНК может происходить до встраивания в новый геномный локус или к ДНК в месте разрыва может присоединиться сама РНК и затем синтезироваться кДНК in situ. Все эти модели весьма привлекательны, и в их поддержку появляются все новые данные; правда, можно построить и другие модели, удовлетворяющие большинству этих данных. Итак, распределение каких-то последовательностей по всему геному может проходить по-разному. Высказывалось предположение, что природными рекомбинантными векторами являются ретровирусы. Ретровирусные геномы действительно внедряются в клеточные гены и по прошествии одного или нескольких клеточных циклов могут покидать эти гены, встраиваясь в новые локусы. За время жизненного цикла ретровируса его геном поочередно бывает представлен то ДНК, то РНК. При этом из РНК во время сплайсинга могут удаляться интроны, в результате чего на стадии ДНК образуются процессированные гены. Эта модель объясняет наличие необычных последовательностей в процессированных генах с 5'-стороны от сайта инициации транскрипции, а также отсутствие А-богатого З'-конца. Из нее, в частности, следует, что некоторые процессированные гены должны соседствовать

ДНК-полимераза, лигазаДНК-полимераза, лигазасаита-мишенисаита-мишениРИС. 10.45.

ДНК-полимераза, лигаза

ДНК-полимераза, лигаза

саита-мишени

саита-мишени

Одна из моделей транспозиции ретрогенов при участии РНК-посредника. Для примера рассмотрено образование процессированного полипептидного псевдогена. В результате транскрипции и процессинга, включающего сплайсинг интронов, образуется функциональная мРНК, на которой с помощью обратной транскриптазы синтезируется одна цепь кДНК; РНК-матрица затем расщепляется, например, РНКазой Н. Одноцепочечная ДНК пришивается через З'-гидрОксильный конец к

Б’-концу геномной ДНК в месте несимметричного разреза и с помощью ДНК-полимеразы синтезируется вторая цепь. Альтернативный способ состоит в синтезе двухцепочечной кДНК еще до встраивания или в присоединении цепи РНК в месте разрыва ДНК и синтезе обеих цепей кДНК in situ. В результате этих реакций происходит дупликация сайта-мишени. Отметим, что такая транспозиция консервативна, поскольку исходный ген остается на месте.

в геноме с ретровирусными последовательностями. Согласно другой модели, происходит упаковка клеточных мРНК в ретровирусные или ретротранспо- зонные частицы с последующими обратной транскрипцией и инсерцией. Данные об этом получены при исследовании модельных систем, хотя соответствующие события происходят с весьма низкой частотой. Совершенно иной способ диспергирования геномных последовательностей вообще не предусматривает участия РНК, а предполагает прямую транспозицию последовательностей ДНК. Например, какой-то сегмент, содержащий тот или иной ген, может дуплицироваться в виде тандема с последующей прямой транспозицией одной из копий в отдаленный локус генома. В транспозиции могут участвовать соседние транспозирующиеся элементы или инвертированные повторы. Этот механизм объясняет происхождение диспергированных псев

догенов, в которых в отличие от всех рассмотренных до сих пор примеров сохраняются интроны; такова структура псевдогена мышиного а-глобина из хромосомы 17.

Процессированные псевдогены РНК

Структура. В семейства генов малых ядерных РНК-мяРНК (разд. 9.2.д)-входят различные псевдогены. которые отличаются от функциональных РНК и соответствующих генов одной или несколькими диспергированными парами оснований. Некоторые из них, по-видимому, являются процессированными псевдогенами, поскольку они диспергированы по геному, а фланкирующие их последовательности негомологичны последовательностям, окружающим сами гены. Как и процессированные полипептидные гены, процессированные гены мяРНК

отличаются по структуре от соответствующих истинных генов в разных отношениях (рис. 10.46). Часто они бывают укороченными с конца, соответствующего З'-концу РНК. У всех процессированных генов мяРНК 5'-концы в точности совпадают с началом РНК. В некоторых случаях процессированные гены содержат A-богатые З'-концевые последовательности и короткие прямые повторы, что свидетельствует о дупликации сайта-мишени.

Интересные различия существуют между процессированными псевдогенами мяРНК и мцРНК

Семейство U1 КодируН1ЩИйСемейство U1 КодируН1ЩИйучастокучастокУкорочен IУкорочен IТип а $[ 5QПроцессированные псевдогеиы,.,ТипЬ ^^Тип а $[ 5QПроцессированные псевдогеиы,.,ТипЬ ^^

Семейство U1 КодируН1ЩИй

Семейство U1 КодируН1ЩИй

участок

участок

Укорочен I

Укорочен I

Тип а $[ 5Q

Процессированные псевдогеиы,.,

ТипЬ ^^

Тип а $[ 5Q

Процессированные псевдогеиы,.,

ТипЬ ^^

Семейство U2

Гены U2Гены U2189п.н189п.нПроцессированные псевдогеиыПроцессированные псевдогеиыПроцессированныепсевдогеиыПроцессированныепсевдогеиыУкорочен с 3-конца на разноечисло нуклеотидов

Гены U2

Гены U2

189п.н

189п.н

Процессированные псевдогеиы

Процессированные псевдогеиы

Процессированныепсевдогеиы

Процессированныепсевдогеиы

—н- -ш

Семейство из

Гены U3Гены U3Укорочен с З'-конца на 69 или 70 нуклеотидов f

Гены U3

Гены U3

РИС. 10.46. lTHnd 8

Структура процессированных псевдогенов малых ядер- ных РНК млекопитающих. В процессированных псевдогенах U1 типа а отсутствуют последовательности, находящиеся на З'-конце функциональных генов U1 и самой U1-PHK. С укороченным З'-концом соседствует короткий A-богатый участок, хотя соответствующая U1-PHK не заканчивается таким участком. Процессированные псевдогены U1 типа b не укорочены, заканчиваются A-богатым участком и фланкированы прямыми повторами длиной 20 п. н. или менее. Процессированные псевдогены U2 тоже укорочены с З'-конца и фланкированы прямыми повторами длиной около 20 п. н. Процессированные псевдогены U3 укорочены с З'-конца на 69-70 нуклеотидов; длина РНК составляет 210 нуклеотидов. Некоторые из них фланкированы прямыми повторами длиной 16-20 п.н. (тип с), у других такие повторы отсутствуют (тип d).

(малых цитоплазматических РНК). Во-первых, процессированные псевдо гены мцРНК относятся к числу наиболее высококопийных диспергированных повторов в геномах млекопитающих. Они включают процессированные варианты тРНК-генов, а также Alu-SINE приматов и SINE типа I мыши (оба они являются процессированными вариантами генов 7SL-PHK). Во-вторых, процессированные псевдогены мцРНК сохраняют типичные внутренние промоторы для полимеразы III, имеющиеся в функциональных генах, и нормально транскрибируются-по крайней мере in vitro (большинство генов мяРНК относятся к генам класса II с внешними промоторами). Наконец, структура процессированных псевдогенов мцРНК заметно отличается от структуры функциональных генов и РНК и варьирует от одного отряда млекопитающих к другому (разд. 9.5.в). Например, в случае Alu-SINE деле- тируется центральная часть 7SL-PHK, соединяются два внешних сегмента и полученный сегмент длиной ~ 130 п.н. образует несовершенный тандемный повтор. В случае SINE типа I у грызунов центральная часть 7SL-PHK также отсутствует, но дуплицируется с образованием тандемного повтора лишь малая часть оставшегося сегмента. Несмотря на все эти различия, диспергированность данных сегментов и их связь с дупликациями сайта-мишени указывает на то, что они относятся к процессированным псевдогенам.

Предлагаемые способы образования процессированных псевдогенов РНК. В основе всех моделей образования и транспозиции процессированных псевдогенов РНК лежит схема, представленная на рис. 10.45. Для того чтобы учесть специфические свойства псевдогенов мяРНК-наличие ро1у(А)-кон- цов (в самих РНК они отсутствуют), укороченность З'-концов, иногда наличие прямых фланкирующих повторов (рис. 10.46)-эту схему необходимо модифицировать. Кроме того, как и в случае с процессированными генами полипептидов, для синтеза первой цепи кДНК необходим праймер. В некоторых случаях праймер обеспечивает сама РНК. Подтверждение этому было получено в опытах in vitro с использованием U3-PHK и обратной ретровирусной транскриптазы (рис. 10.47). Термодинамически выгодной является такая вторичная структура U3-PHK, когда между З'-половиной молекулы и внутренней областью, начиная с 70-го остатка, образуется дуплекс, а тем самым и внутримолекулярная матрица-праймер. Заметим, что данная модель объясняет также укороченность З'-конца псевдогена U3.

Поскольку мяРНК синтезируется с помощью РНК-полимеразы III, эта модель оказывается вполне приемлемой в случае таких последовательностей, как Alu и SINE типа I. Начало транскриптов таких SINE-последовательностей совпадает с началом

РИС. 10.47.U3-PHK сама образует праймер, необходимый для функционирования обратной транскриптазы. З'-конец молекулы РНК гибридизуется с комплементарной ему внутренней частью последовательности. Синтез первой цепи кДНК осуществляется путем присоединения dNTPРИС. 10.47.U3-PHK сама образует праймер, необходимый для функционирования обратной транскриптазы. З'-конец молекулы РНК гибридизуется с комплементарной ему внутренней частью последовательности. Синтез первой цепи кДНК осуществляется путем присоединения dNTPк З'-концевой гидроксильной группе (остаток 213). кДНК комплементарна остаткам с 1 по 74-участку, соответствующему процессированным псевдогенам U3 типов end (рис. 10.46). [L. В. Bernstein, S. М. Mount, А. М. Werner, Cell 32 (1983), р. 461.]к З'-концевой гидроксильной группе (остаток 213). кДНК комплементарна остаткам с 1 по 74-участку, соответствующему процессированным псевдогенам U3 типов end (рис. 10.46). [L. В. Bernstein, S. М. Mount, А. М. Werner, Cell 32 (1983), р. 461.]элемента. Заканчиваются они в первом Т-богатом участке, который узнает полимераза, обычно на некотором расстоянии за концом SINE, так что транскрипты содержат дополнительный по сравнению с самим элементом участок, расположенный между A-богатой последовательностью и U-богатым концом транскрипта. Этот U-богатый З'-конец может изгибаться и спариваться с A-богатым участком с образованием праймера, необходимого для обратной транскрипции. Транспозиция завершается гидролизом РНК-матрицы и встраиванием кДНК в геном.

РИС. 10.47.

U3-PHK сама образует праймер, необходимый для функционирования обратной транскриптазы. З'-конец молекулы РНК гибридизуется с комплементарной ему внутренней частью последовательности. Синтез первой цепи кДНК осуществляется путем присоединения dNTP

РИС. 10.47.

U3-PHK сама образует праймер, необходимый для функционирования обратной транскриптазы. З'-конец молекулы РНК гибридизуется с комплементарной ему внутренней частью последовательности. Синтез первой цепи кДНК осуществляется путем присоединения dNTP

к З'-концевой гидроксильной группе (остаток 213). кДНК комплементарна остаткам с 1 по 74-участку, соответствующему процессированным псевдогенам U3 типов end (рис. 10.46). [L. В. Bernstein, S. М. Mount, А. М. Werner, Cell 32 (1983), р. 461.]

к З'-концевой гидроксильной группе (остаток 213). кДНК комплементарна остаткам с 1 по 74-участку, соответствующему процессированным псевдогенам U3 типов end (рис. 10.46). [L. В. Bernstein, S. М. Mount, А. М. Werner, Cell 32 (1983), р. 461.]

Новый элемент содержит последовательность, отвечающую всей РНК, включая часть исходного A-богатого сегмента, и не несет никаких дополнительных последовательностей. Поскольку ново- транспозированный ретроген содержит также внутренние промоторы родительского гена, он может служить родоначальником нового семейства. Этот «автокаталитический» эффект можно объяснить высокой распространенностью Alu-элементов. Заметим, что все эти рассуждения касаются лишь механизма амплификации и транспозиции SINE-последовательностей, но не происхождения самих этих элементов. Возможно, одна или несколько из множества геномных SINE возникли непосредственно из генов 7SL-PHK или тРНК с помощью обратной транскрипции (рис. 10.45). Но в таком случае их структура должна была бы претерпеть существенные изменения, в частности присоединение А-бога- того участка с З'-конца, отсутствующего в РНК, а в случае 7SL-PHK- делецию центральной области, а также тандемные дупликации (рис. 9.40).

ДРУГИЕ НЕОБЫЧНЫЕМОБИЛЬНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ

Большинство мобильных элементов эукариот можно в первом приближении разбить на транспо-

зирующиеся элементы, ретротранспозоны и ретрогены. Однако есть и другие мобильные элементы, обладающие уникальной структурой и необычными свойствами. Большинство таких элементов, описанных к настоящему времени, обнаружены у беспозвоночных, но, по-видимому, в будущем они будут выявлены у всех эукариот. В наши задачи не входит детальное описание каждого из этих элементов. Мы лишь кратко остановимся на некоторых из них, чтобы проиллюстрировать их разнообразие.

Fold-back-элементы дрозофилы

FB-элементы (от fold-back) Drosophila, а также подобные им элементы Xenopus имеют длинные концевые повторы, находящиеся друг относительно друга в противоположной ориентации (рис. 10.48). Для FB-элементов характерны еще две отличительные особенности. Во-первых, центральный участок у разных FB-элементов имеет неодинаковый размер и нуклеотидную последовательность. Во-вторых, длина инвертированных концевых повторов также варьирует, а прямые тандемные повторы имеют сложную структуру. Для последних типичны деле- ции (или вставки), возникающие в результате неравного кроссинговера. Два концевых повтора у данного члена одного семейства более сходны по длине и нуклеотидной последовательности, чем повторы у членов разных семейств, но все же не идентичны. Однако концы инвертированных повторов высококонсервативны даже для разных FB-элементов. Встраивание FB-элементов Drosophila вызывает мутации, а их вырезание может сопровождаться реверсией к дикому типу. FB-элементы перемещаются не только как независимые единицы, но и вместе с длинными сегментами генома Drosophila. Члены одного из классов протяженных транспози- рующихся элементов, называемых ТЕ, представляют собой два FB-элемента, окружающих длинную

РИС. 10.48.

Схематическое представление мобильного FB-злемента Drosophila. Оба концевых инвертированных повтора (IR) и центральная область (С) варьируют подлине: IR составляет 400-3 400 п. н., С-<100-4000 п.н. Различаются и нуклеотидные последовательности С. Диаграмма внизу иллюстрирует сложную структуру тандемных повторов, типичных для IR.

неродственную последовательность. ЕВ-элементы были обнаружены на концах транспозированного сегмента ДНК длиной несколько сотен т. п. н., который переместился с Х-хромосомы в хромосому 2, а оттуда-во множество отдаленных сайтов. Эта транспозиция сопровождалась разнообразными мутациями и перестройками как внутри ТЕ, так и в соседних с ними генах. По всем этим свойствам ТЕ напоминают сложные транспозоны прокариот.

Вставки в рДНК Drosophila

У некоторых видов Drosophila очень большая доля сегментов, кодирующих 28S-pPHK, прерывается последовательностями, отличными от интронов. Эти прерывающиеся рДНК, по-видимому, нефункциональны и транскрибируются с очень низкой эффективностью, а функция самих вставок неизвестна. Один из типов таких инсерционных последовательностей, тип I, встречается в виде тандемных повторов в хромоцентре, а также в нескольких диспергированных эухроматиновых областях и в кодирующей части гена 28S-pPHK. Из нескольких сотен членов семейства инсерционных последовательностей типа I Drosophila почти половина представлена вставками в специфические сайты 288-рДНК в Х-хромосоме. Длина этих вставок составляет в основном 5 т. п. н., однако есть и вставки длиной 0,55-1 т. п. н., а те, которые локализованы в хромоцентре, даже более гетерогенны. Данные о мобильности единиц типа I не носят систематического характера: не обнаружено ни типичных структурных свойств, присущих мобильным элементам, ни экспериментальных доказательств их транспозиции. Нуклеотидные последовательности, непосредственно окружающие элементы типа I, как правило, сходны, даже если эти элементы находятся в разных геномных локусах. Таким образом, их встраивание, по-видимому, происходит в какие-то предпочти

тельные участки и сопровождается сайт-специфи- ческой рекомбинацией. Этим можно объяснить, почему вставки инсерционных последовательностей типа I всегда обнаруживаются в одном специфическом сайте рДНК.

ЗАПРОГРАММИРОВАННЫЕПЕРЕСТРОЙКИ И МОДУЛЯЦИЯ

ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ

Запрограммированные перестройки генов, влияющие на их экспрессию, выявлены у прокариот, дрожжей, тетрахимены, трипаносом и млекопитающих. Такое разнообразие позволяет предположить, что гены, экспрессия которых изменяется в результате аналогичных перестроек, имеются у многих организмов. Здесь мы остановимся на некоторых сайт-специфических перестройках у прокариот, опосредующих регуляцию экспрессии генов при помощи инвертирования сегментов ДНК. Это позволит нам ввести некоторые общие понятия, необходимые для обсуждения соответствующих процессов в эукариотических системах.

Прокариотические модели-транслокация путемфлип-флоп-инверсий

Изменение экспрессии двух генов, кодирующих флагеллин у Salmonella. Флагеллин - основной белок жгутиков Salmonella- представлен двумя иммунологически различающимися формами, Н1 и Н2; они кодируются двумя неаллельными генами, родственными, но не сцепленными друг с другом в хромосоме Salmonella. В любой момент времени экспрессируется только один из этих генов; частота переключений с Н1 на Н2 и обратно у разных штаммов

Salmonella составляет 10”5-10-3 на бактерию в одном поколении. По-видимому, такая пластичность обеспечивает Salmonella некоторую защиту от иммунного ответа хозяина на инфекцию.

В результате сложных генетических экспериментов была построена модель, объясняющая механизм переключения Н1 <->Н2,-так называемой фазовой вариации. Согласно этой модели, ген Н1 представляет собой пассивный элемент, а ген Н2 и тесно сцепленные с ним генетические детерминанты-это регуляторные факторы. При экспрессии Н2 экспрессируется и соседний с ним ген rhl, который кодирует репрессор для Н1; при этом белок Н1 не образуется и флагеллин относится к типу Н2. При переключении прекращается экспрессия как Н2, так и rhl, и синтезируется флагеллин типа Н1. Как мы увидим ниже, эта модель полностью согласуется с результатами проведенных ранее молекулярных исследований.

Гены Н2 и rhl представляют собой часть оперо- на который находится под контролем одного промотора, расположенного на 100 п. н. левее гена Н2 (рис. 10.49). Этот промотор находится внутри сег-

мента длиной 1 т. п. н„ который может быть инвертирован. В одном положении промотор активен и гены Н2 и rhl экспрессируются. При инверсии промотор удаляется от начала гена Н2 и меняет ориентацию, при этом гены Н2 и rh I выключаются и начинается экспрессия Н1. Если инвертированный сегмент длиной 1 т. п. н. принимает исходную ориентацию, то Н2 и rhl вновь экспрессируется, а Н1 выключается.

Исходя из результатов генетического анализа, можно предположить, что этот инвертируемый сегмент содержит кроме промотора три необходимых для инверсии элемента-два czs-сегмента на каждом из концов (AixL и hixR) и некий ген, называемый hin (от H-inversion), продукт которого действует в гиронс-положении. И вновь эти генетические данные получили подтверждение на молекулярном уровне. Показано, что инвертируемый сегмент длиной 1 т. п. н. содержит последовательности, выполняющие определенные генетические функции. Во-первых, это последовательности /нхЕ и hixR длиной 26 п. н., расположенные по концам 1 т. п. н.-сегмента; каждая из них содержит копию сегмента длиной 14 п. н. (эти

Энхансер hixL I

hixR

Н2-оперон включен

Синтезируется флагеллин Н2

Л/п-промотор

Р2-промотор

Инверсия

Н2-оперон выключен

Синтезируется флагеллинж

Белок Hin Фактор II Белок HU

Н1-репрессор (

TTCTTGAAAACC (AAGGTTTTTGATАА AAGAACTTTT GG ( ТТ СС А А А А А СТ АТТTTCTTGAAAACC (AAGGTTTTTGATАА AAGAACTTTT GG ( ТТ СС А А А А А СТ АТТ

TTCTTGAAAACC (AAGGTTTTTGATАА AAGAACTTTT GG ( ТТ СС А А А А А СТ АТТ

TTCTTGAAAACC (AAGGTTTTTGATАА AAGAACTTTT GG ( ТТ СС А А А А А СТ АТТ

Последовательность5'

Ых Lу

VC" 5' ( ТТ АТС A AAAАССТТ ( К: з' Га а fXc fTTf те g ТГГVC" 5' ( ТТ АТС A AAAАССТТ ( К: з' Га а fXc fTTf те g ТГГ

VC" 5' ( ТТ АТС A AAAАССТТ ( К: з' Га а fXc fTTf те g ТГГ

VC" 5' ( ТТ АТС A AAAАССТТ ( К: з' Га а fXc fTTf те g ТГГ

ПоследовательностьhixR

РИС. 10.49.

Инвертируемый участок, контролирующий фазовую вариацию при экспрессии флагеллиновых генов Salmonella. В ситуации, представленной в верхней части рисунка, этот сегмент транскрибируется в том же направлении, что и гены Н2 и rhl. В нижней части рисунка сегмент инвертирован, а гены Н2 и rhl молчат. Внутри инвертируемого сегмента находится ген hin; его продукт необходим для инверсии и должен быть в тронс-попо-

AAAAGGАААА 03'BGTTTT сстттт 05'

жении. Элементы hixL и hixR тоже необходимы для инверсии и должны находиться в цис-положении (их нуклеотидные последовательности представлены внизу); инверсию стимулирует цис-энхансер (в том случае, если он имеется вообще). Последовательности элементов hix представлены для того случая, когда они находятся в прямой ориентации. Участки длиной 14 п. н., присутствующие в hixL и hixR, выделены цветом.

копии находятся во взаимно противоположной ориентации). Сами последовательности длиной 26 п. н. представляют собой несовершенные палиндромы. Во-вторых, это ген hin, кодирующий полипептид из 190 аминокислотных остатков. Эксперименты in vitro с использованием очищенного белка Hin и рекомбинантных плазмид, содержащих два hix- сайта (но не остальную часть 1 т. п. н.-сегмента), показывают, что белок Hin специфически связывается с Л/х-сайтами. И в-третьих, для эффективной инверсии необходимо, чтобы последовательность внутри кодирующего участка гена hin находилась в t/uc-положении. Этот элемент остается активным, даже если его переместить за пределы инвертируемого сегмента ДНК или инвертировать. Таким образом, он обладает свойствами энхансера транскрипции. Как показали эксперименты in vitro, для инверсии необходимы еще два белка. Один из них- небольшой основный белок, названный фактором 11 (или Fis),- связывается с энхансером. Другой представляет собой прокариотический гистоноподобный белок HU. Фактор II, НО и белок Hin стабилизируют ДНК в конфигурации, способствующей перестройкам.

Установлены нуклеотидные последовательности самого инвервертируемого элемента длиной 1 т. п. н. и фланкирующих его последовательностей. При этом последовательности на концах элемента были определены независимо для обеих ориентаций. Положение промотора для гена hin точно не установлено, но скорее всего ген начинается в пределах концевого повтора; стартовый кодон АТС гена hin находится в пределах 100 п. н. от начала повтора. Отметим, что благодаря сходству двух концов элемента промотор hin при инверсии не разрушается. Таким образом, ген hin может экспрессироваться в любой ориентации. С помощью секвенирования установлено положение промотора оперона Н2: внутри сегмента длиной 1 т. п. н., ближе к одному из его концов. Сама кодирующая часть Н2 начинается на расстоянии 16 п. н. от инвертируемого сегмента.

Контроль специфичности по отношению к хозяину с помощью инверсии в геноме фага Ми. Фаг Ми тоже способен изменять экспрессию генов путем инверсии с помощью механизма, сходного с таковым у Salmonella. В геноме фага Ми размером 37 т. п. н. имеется так называемый сегмент G длиной 3 т. п. н„ способный к инверсии (рис. 10.7 и 10.50). Его фланкируют инвертированные повторы длиной 34 п. н., , причем 26 п. н. из этих 34, аналогично повторам, фланкирующим соответствующий сегмент у Salmonella, необходимы для «флип-флопа». Однако нужный для инверсии функциональный ген gin лежит за рамками инвертируемого сегмента, а не внутри его, как ген hin у Salmonella. В пределах кодирующей части gin

находится рекомбинационный энхансер, аналогичный энхансеру у Salmonella, а инверсия in vitro стимулируется дополнительными клеточными белками. Инверсия сегмента G происходит с частотой примерно 1 на 106 фаговых частиц за один литический цикл и сопровождается изменением специфичности фага Ми по отношению к хозяину. При ориентации инвертируемого сегмента G (+) фаг инфицирует E.coli К12. Если G находится в противоположной ориентации, G( —), то Ми инфицирует штамм Е. coli С, а также некоторые другие бактерии. Сам сегмент G кодирует белки, входящие в состав фибрилл хвостового отростка фага, и в зависимости от его ориентации синтезируются разные белки. Таким образом, смена круга хозяев, по-видимому, определяется изменением способности фага прикрепляться к реципиентным клеткам.

Сегмент G содержит кодирующие последовательности для двух альтернативных наборов белков, входящих в состав фибрилл; эти последовательности находятся в противоположных ориентациях- S и S' (рис. 10.50). В положении G(+) экспрессируется S-оперон. а в положении G( — )-оперон S'. Промотор для этих двух оперонов находится за пределами G, в области, называемой Sc; за пределами G находятся и последовательности, кодирующие 5'-концы мРНК и МН2-концевые последовательности первого белка, кодируемого каждым из оперонов. Этот NH2-kohcu одинаков у обоих белков S и S' и кодируется Sc-областью; С-концевые части белков различаются. Поскольку промотор S находится за пределами G, ориентация последнего не влияет на регуляцию экспрессии S, но зато влияет на тип синтезируемого белка.

Сходство Hin и Gin. На удивление сходные инверсионные системы Salmonella и Ми, вероятнее всего, представляют собой две адаптации одной предковой генетической программы, поскольку белки Hin и Gin по своей структуре очень близки и могут замещать друг друга. Клетки Salmonella hin-, лизогенные по фагу Ми, подвергаются фазовой вариации, а функциональный ген hin опосредует инверсию G-сегмента в фаге gin-. Поскольку гены Hin и Gin действуют в тесной связи с инвертированными повторами, фланкирующими инвертируемый сегмент, неудивительно, что соседствующие с G-сегментом фага Ми повторы частично гомологичны инвертированным повторам Salmonella. В данное семейство белков входят и другие члены. Например, в геноме некоторых штаммов Е. coli содержится инвертируемый сегмент, ассоциированный с фланкирующими повторами и с белком, называемым Pin, который восполняет недостающие функции фага Mu gin-. Аминокислотные последовательности белков Hin, Gin и Pin совпадают более чем на 60%. Кроме того, по своей структуре они сходны с резолвазой ТпЗ.

G-сегмент

1R

34п.н.

IR 34п.н.

Транскрипция

ИнверсияИнверсияСинтезируется белок 5'Синтезируется белок 5'

Инверсия

Инверсия

Синтезируется белок 5'

Синтезируется белок 5'

РИС. 10.50.

Карта G-сегмента в геноме фага Ми и фланкирующих его участков в положениях G( + ) и G(-).

Механизм сайт-специфических флип-флоп-инвер- сий. Механизм флип-флоп-инверсий удалось детально исследовать благодаря тому, что 1) с использованием очищенных компонентов можно осуществлять рекомбинацию in vitro; 2) метод рекомбинантных ДНК позволяет получать необходимые субстраты, в частности содержащие сайт-специфиче- ские мутации. Сегменты ДНК, фланкированные двумя инвертированными повторами (/пх-элемен- тами или гомологичными инвертированными повторами G-сегмента фага Ми) и входящие в состав сверхспиральной плазмиды, инвертируются в присутствии очищенных белков Нт и Gin. Расстояние между повторами варьирует от нескольких сотен до тысяч пар оснований. Hin и Gin представляют собой рекомбиназы и одновременно ДНК-связывающие белки, которые узнают инвертированные повторы, фланкирующие инвертируемый сегмент. Повторы как раз и являются теми сайтами, в которых происходят перестройки ДНК, приводящие к инверсии. Этот процесс стимулируется фактором II и белком HU, а также энхансером в t/wc-положении, с которым специфически связывается фактор II.

По-видимому, при инверсии образуется сложный комплекс, состоящий из инвертируемого сегмента ДНК и рекомбиназы (Hin или Gin), расположенных друг относительно друга в нужном положении. Формирование комплекса облегчает фактор II, связывающийся с энхансером, а также белок HU; есть данные о том, что последний обеспечивает изгибание ДНК, необходимое для сближения двух рекомбинационных сайтов. Для инверсии нужно, чтобы в одной молекуле ДНК присутствовали два рекомбинационных сайта, находящихся в противоположной ориентации. В отличие от этого резолваза ТпЗ предпочитает, чтобы эти сайты имели одинаковую ориентацию. Однако в обоих случаях в рекомбинации участвуют четыре цепи ДНК, происходит разрыв четырех фосфодиэфирных связей и четыре новых соединения (рис. 10.51).

Типы спариванияу дрожжей-кассетный механизм

Скрещивание гаплоидных клеток с разным типом спаривания. Почкующиеся клетки S.cerevisiae могут быть как гаплоидными, так и диплоидными. Ди- плоиды гетерозиготны по локусу, называемому локусом, определяющим тип спаривания ^МАТ-от англ mating type locus); два кодоминантных аллеля дикого типа называются МАТа и МАТа. Таким образом, гаплоидные клетки являются либо МА Та, либо МАТа. Для успешной конъюгации двух гаплоидных клеток и образования диплоида необходимо, чтобы эти клетки имели противоположные типы спаривания: одна МАТа, а другая-МА Та. Диплоидные клетки МАТа/МАТа неспособны спариваться путем конъюгации, но конъюгацию можно индуцировать голоданием, в результате чего клетки подвергаются мейозу и споруляции с образованием четырех дочерних гаплоидных клеток, составляющих тетраду (рис. 10 52 и разд. 9.2.а).

Одни штаммы S.cerevisiae, называемые гетеро- талличными, продуцируют гаплоиды со стабильным типом спаривания, другие попадают в группу гомо- таллнчных штаммов, гаплоиды которых нестабильны по локусу МАТ. В гомоталличных гаплоидах аллели МАТ легко переключаются с МАТа на МАТа. Клетки МАТа дают потомство МАТа с частотой более 80% в каждом делении (почковании); переключение с МАТа на МАТа происходит только в тех клетках, которые почковались не менее одного раза. В результате нескольких клеточных делений одна гомоталличная клетка образует популяцию клеток, способных к конъюгации и образованию диплоидов (скрещивающиеся таллотипы гомо- талличные). Однако клон гетероталличных дрожжевых клеток должен вступить в контакт с популяцией клеток противоположного типа спаривания, иначе клетки не смогут конъюгировать.

5'

TTGAA ААС С A AGGTTTTTGAT АА AGCA vTCCTf AACTTTTGG TT CCA AAAA СТАТ T T CGTTAGGAl

Т А ACATTG GT Т АТС А А А А АССТТ СС AAA AGGAj ATTGTAACC AATAGTTTTTGGAAGGTTTT ССЛ

5'

hlxL

hixR

Н2 включен

РИС. 10.51.

Н2 выключен

Сайт-специфическая рекомбинация между hixL и hixR приводит к инверсии расположенного между ними сег

мента. [J. R. Zieg, М. Simon, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), p. 4196.]

Какими будут дрожжевые клетки-гетеротал- личными или гомоталличными,- определяется единственным геном НО, продукт которого необходим для гомоталличного фенотипа. Гаплоидные клетки, несущие мутантный аллель НО (ho~), гетеротал- личны и неспособны к переключению между МАТа и МАТа. Помимо несцепленных между собой МАТ и НО, локализованных на хромосомах 3 и 4 соответственно, для переключения требуются еще два генетических локуса: HMLa и HMRa. Генетические эксперименты показали, что 1) локус HMLa необходим для превращения МАТа в МАТа, а локус HMRa-для обратного процесса; 2) HMLa и HMRa локализованы на левом и правом плечах хромосомы 3 соответственно, а МА Т где-то на правом плече, левее HMRa.

Кассетная модель. На основании этих экспериментов была построена модель, описывающая молекулярный механизм переключения с МАТа на МАТа и обратно. Согласно этой модели локусы HMLa и HMRa содержат молчащие копии генов, ассоциированные с типами спаривания а и а соответственно. Реплики гена а или а транслоцируются из HMLa или HMRa в МАТ, где и экспрессируются. Одновременно происходит замещение исходной последовательности в локусе МАТна альтернативную. Согласно этой модели, переключение с одного типа спаривания на другой аналогично смене кассеты в

кассетном магнитофоне (МАТ), за исключением того, что копии HMLa и HMRa остаются на месте, а их реплики перемещаются в МАТ. Изучение структуры HMLa, HMRa и МАТ, а также молекулярное клонирование полностью подтвердили справедливость кассетной модели и добавили много новых деталей в этот механизм клеточной дифференцировки.

Структура HMLa, HMRa и МАТ. Изучение структуры этих локусов началось с клонирования фрагмента дрожжевой ДНК, который отвечал за спаривание типа а у гаплоидных дрожжевых клеток ho- с дефектным локусом МАТа (рис. 10.53). Клонированный фрагмент использовали в качестве зонда для скрининга различных рестрицированных дрожжевых ДНК с помощью блот-гибридизации (рис. 10.54). Было выявлено четыре разных гибриди- зующихся //»г<Ш 1-фрагмента, которые соответствовали сегментам, содержащим локусы МАТа, МАТа, HMLa и HMRa. Каждый из этих фрагментов был клонирован. Затем все их возможные пары денатурировали и гибридизовали друг с другом, а полученные гетеродуплексы исследовали с помощью электронного микроскопа (рис. 10.55). В соответствии с кассетной моделью при гибридизации МАТа с HMLa или МА Тас HMRa образуются непрерывные гетеродуплексы, причем дуплекс МАТа/НМ La почти на 800 п. н. длиннее дуплекса МАТа,НМ Ra

Гаплоид

J КонъюгацияJ КонъюгацияСпоры, ► не способные к спариваниюСпоры, ► не способные к спариванию

J Конъюгация

J Конъюгация

Споры, ► не способные к спариванию

Споры, ► не способные к спариванию

ho (гетеротапличные) ^^Прорастание ЯО(гомоталличные)

Первое почкование

© © ® ©

©

®

Второе почкование

®©©<@Э®®©©

МАТа

МАТа

РИС. 10.52.

Схема деления дрожжевых клеток, иллюстрирующая типы спаривания.

размером 1,6 т. п. н. Между HMLa и НМ Ra также образуется гибридный дуплекс, но он прерывается негомологичной последовательностью длиной около 800 п. н. Обнаружено также, что последовательности, фланкирующие HML, HMR и МАТ, негомологичны, хотя у МАТ они одинаковы для локусов МАТа и МАТа. Наконец, сегмент длиной 800 п.н., характерный для гетеродуплекса MATa! HMLa, присутствует также и в локусе МАТ а, но не в локусе НМ Ra. Все эти структурные особенности представлены на генетических картах трех локусов на рис. 10.56. Видно, что локус МАТ содержит либо последовательности a-типа, как в локусе HMLa,

либо последовательности а-типа, как в локусе HMRa.

Переключение с одного типа спаривания на другой. Переключение типов спаривания происходит в результате транспозиции копии HMLa или HMRa в локус МАТ. Генетические и структурные исследования выявили некоторые особенности этого процесса. 1. Для переключения необходим продукт локуса НО. 2. Копии последовательностей, «хранящихся» в HMLa или HMRa, перемещаются в клетки МАТа или МАТа соответственно. 3. При встраивании в МАТ эти копии не изменяются. 4. При переключении а- или а-кассета, содержавшаяся в МАТ-локусе, утрачивается, но ни одна из них в норме не встраивается в HML или HMR, т. е. транспозиция происходит асимметрично. Каков механизм этого процесса?

ПлазмидыПлазмиды

Плазмиды

Плазмиды

РИС. 10.53.

Клонирование сегмента дрожжевой ДНК, отвечающего за спаривание ти па а клеток МАТа', ho (МАТа' означает также HMLa Y Челночный вектор дрожжи - Е. соН (разд. 5 8 в), содержащий дрожжевой ген LEU2, разрезали в BamVAT -сайте и проводили лигирование с фрагментами, полученными при расщеплении геномной ДНК из клеток МАТа эндонуклеазой 5адЗА. После трансфекции продуктов лигирования в Е. соН К12 были отобраны и размножены все клоны amp'. tets. Плазмиды, вы деленные из этой популяции, трансфицировали в гаплоидные дрожжевые клетки (/et/2 , МАТа', ho , ILV ), и все колонии LEU2' прове ряли на способность спариваться со штаммом МАТа, Штамм МАТа имел также генотип ilv', поэтому на минимальной среде росли только диплоидные клетки, содержащие функциональный ген ILV от другого родителя. Был выявлен единственный позитивный клон, из которого выделена соответствующая плазмида [К. Nasmyth, К. Tatchell. Cell 19 (1980) р. 753.]

Я/т/Ш-рестрикты ДНК гаплоидных дрожжевых клетокЯ/т/Ш-рестрикты ДНК гаплоидных дрожжевых клеток

Я/т/Ш-рестрикты ДНК гаплоидных дрожжевых клеток

Я/т/Ш-рестрикты ДНК гаплоидных дрожжевых клеток

РИС. 10.54.

Клонированный сегмент дрожжевой ДНК, определяющий тип спаривания а (рис. 10.53), гибридизуется с четырьмя разными сегментами дрожжевой ДНК, содержащими локусы МАТа, МАТа, HMLa и HMRa. Гаплоиды МАТа или МАТа (гетероталличные) дают две общие полосы, соответствующие фрагментам размером 6,1 и 5,0 т. п. н„ а также по одной уникальной полосе 4,3 т.п.н. (МАТа) и 4,1 т.п.н. (МАТа). При спаривании этих двух штаммов в тетрадном анализе обнаружилось, что Hmd\II-фрагмент длиной 4,3 т п. н. ассоциирован с фенотипом МАТа, a Hind\II-фрагмент длиной 4,1 т.п.н,-с фенотипом МАТа. Таким образом эти два фрагмента содержат локусы МАТа и МАТа соответственно. Два других фрагмента размером 6,1 и 5,0 т. п. н. представляют собой молчащие копии HMLa и HMRa. Идентичность этих четырех рестрикционных фрагментов и МАТа, МАТа, HMLa и HMRa подтверждается результатами опытов по клонированию всех трех

HML

HMR МАТа

фрагментов геномных ДНК штаммов МАТа и МАТа с использованием данной плазмиды в качестве зонда [К. Nasmyth, К. Tatchell, Cell 19 (1980), р. 753.]

РИС. 10.55.Схематическое представление структуры гетеродуплексов, образующихся между клонированными локусами HMLa, HMRa, МАТа и МА Та. Указаны цепи гетеродуплексов и их длина в т. п. н. Одноцепочечные петли на самом деле неодинаковы по величине [К. Nasmyth, К. Tatchell, Cell 19 (1980), jp. 753.]РИС. 10.55.Схематическое представление структуры гетеродуплексов, образующихся между клонированными локусами HMLa, HMRa, МАТа и МА Та. Указаны цепи гетеродуплексов и их длина в т. п. н. Одноцепочечные петли на самом деле неодинаковы по величине [К. Nasmyth, К. Tatchell, Cell 19 (1980), jp. 753.]

РИС. 10.55.

Схематическое представление структуры гетеродуплексов, образующихся между клонированными локусами HMLa, HMRa, МАТа и МА Та. Указаны цепи гетеродуплексов и их длина в т. п. н. Одноцепочечные петли на самом деле неодинаковы по величине [К. Nasmyth, К. Tatchell, Cell 19 (1980), jp. 753.]

РИС. 10.55.

Схематическое представление структуры гетеродуплексов, образующихся между клонированными локусами HMLa, HMRa, МАТа и МА Та. Указаны цепи гетеродуплексов и их длина в т. п. н. Одноцепочечные петли на самом деле неодинаковы по величине [К. Nasmyth, К. Tatchell, Cell 19 (1980), jp. 753.]

HMRa-5,0

(О

МАТа-4,1

(О

HMRa-5,0

(О

НМЕа-6,1

(О

НМ Ra-5,0

(О

МАТы-4,3

(О

HMLa-6,1

(О

МАТа-4,1

(О

HMLa-6,1

(О

МАТа-4,3

(О

MATH- 4,3

МАТа-4,1

Ya

IIIII

1234

т.п.н.

РИС. 10.56.

Генетическая карта трех локусов типа спаривания, расположенных в хромосоме III дрожжей. В верхней части рисунка представлена конфигурация активного локуса МАТа (без соблюдения масштаба), а в нижней-конфигурация активного МАТа. Локус МАТ состоит из нескольких сегментов: W (723 п. н.), X (704 п. н.). Ya (747 п. н.) или Ya (642 п.н.), Z1 (239 п. н.) и Z2 (89 п. н.). Такие же сегменты содержит HMLa, а в HMRa отсутствуют W и Z2. В МАТа гены а1 и а2 транскрибируются в противоположных направлениях от центрального промотора в Ya. Экспрессия гена а1 в МАТа регулируется Ya-промотором. Вертикальными стрелками указаны сайты для эндонуклеазы НО.

-*Y 21►Расщепление эндонуклеазой но

S'-GCTTT CCGC AACA|PGT А ТА-

3'- С G A A A G G C Gp)t Т G Т С А Т Ат - МАТа

5*—ACTTCGCGC AACAjpGTATA-

З'-TGAAGC G CGP|TT GT САТАТ- МАТа

РИС. 10.57.

Эндонуклеаза НО разрезает двухцепочечную ДНК в специфическом сайте вблизи соединения Y и Z1.

Локус НО кодирует эндонуклеазу, которая узнает специфический сайт в локусе МАТ (стрелки на рис. 10.56 и 10.57) и делает разрез. В гетероталлич- ных дрожжевых клетках (Ло-) или диплоидных (а/а) гомоталличных клетках эндонуклеаза НО отсутствует и переключения в локусе МАТ не происходит. У значительной части клеток, в которых происходит переключение, НО-сайты расщеплены. Однако соответствующие сайты в локусах HMLa и НМ Ra остаются интактными, т. е. они каким-то образом защищены от расщепления. Учитывая, что расщепление-это один из ранних очень важных этапов переключения, можно предположить, что асимметрия транспозиции по крайней мере отчасти связана с защитой HMLa и HMRa от расщепления.

Сам ген НО был отобран из библиотеки геномной дрожжевой ДНК, полученной с помощью плаз- мидного вектора, благодаря своей способности превращать гетероталличные клетки в гомоталлич- ные. Отсутствие эндонуклеазы НО в гетероталлич- ных клетках, по-видимому, обусловливается какой-то мутацией. Используя этот клонированный ген в качестве зонда, определяли содержание НО-мРНК при разных условиях в клетках, мутантных по специфическим фазам клеточного цикла. В диплоидных клетках a/а НО-мРНК не образуется, и именно поэтому в них не происходит переключения. В гомоталличных гаплоидных клетках как НО-мРНК, так и эндонуклеаза НО синтезируются на поздних стадиях фазы G1, но ко времени начала митоза ни мРНК, ни соответствующий фермент в клетке не обнаруживаются. В дочерних клетках во время Gl-фазы НО-мРНК и эндонуклеаза НО не выявлены, что согласуется с данными о том, что, для того чтобы приобрести способность к переключению, клетки должны пройти хотя бы одно почкование (рис. 10.52). Способность клетки к синтезу НО-мРНК приобретается ею во время прохождения клеточного цикла. Для регуляции транскрипции весьма сложного процесса-необходимы последовательности, диспергированные в 5'-фланкирующем участке гена НО длиной более 1400 п. н., а также некоторые белки.

Чтобы выяснить все детали механизма транспозиции, нам нужны дополнительные данные. В наи

более интересных моделях предполагается, что транспозиция сопряжена с нереципрокным гомологичным кроссинговером (конверсией генов)-процессом, аналогичным представленному на рис. 2.60. Кроссинговер происходит между двумя гомологичными последовательностями в хромосоме 3: HMLa и МАТа или HMRa и МАТа (рис. 10.58). Однако ввиду утраты кассеты, локализованной в локусе МАТ, кроссинговер должен включать какие-то дополнительные этапы. Отметим, что двухцепочечный разрыв, который осуществляет в локусе МАТ эндонуклеаза НО, вполне вписывается в данную модель. Кроме того, для переключения необходимы также продукты других генов, участвующих в репарации и рекомбинации ДНК.

Экспрессия генов типа спаривания. Гены типа спаривания экспрессируются только в том случае, когда они находятся в локусе МАТ, но не в HMLa или HMRa. До сих пор мы касались только одного фенотипического различия между а (МЛ Та)- и а (МА Та)-дрожжевыми клетками, а именно способности клеток типа а спариваться с клетками типа а, но не клеток а с клетками а или клеток а с клетками а. Как контролируется этот процесс и каковы другие фенотипические особенности клеток МЛ Та и МЛ Та? Известно, что а-сегмент содержит только один ген, al, а-сегмент-два гена, al и а2. Продукты этих генов представляют собой регуляторные белки, которые влияют на экспрессию других генов. Данные о действии этих регуляторных элементов суммированы на рис. 10.59. В клетках МАТа продукт гена al действует как позитивный регулятор, запуская транскрипцию группы молчащих генов, также необходимых для проявления a-фенотипа. Эта группа содержит ген MFal, кодирующий a-фактор-секретируемый из клетки олигопептид феромон. Продукт гена а2 представляет собой негативный регулятор, выключающий экспрессию генов в клетках МЛ Та. Как al, так и а2 влияют на транскрипцию соответствующих генов-мишеней, связываясь со специфическими последовательностями вблизи 5'-концов этих генов. Активность а2 зависит также от его кооперативного взаимодействия с другим вездесущим белком дрожжевых клеток. Кроме этого, у диплоидов МАТа/МАТа, в которых экспрессируются оба локуса МАТ, а2, действуя совместно с а1, 1) ингибирует экспрессию al и таким образом всех позитивно регулирующихся им генов; 2) ингибирует экспрессию множества других генов, необходимых для спаривания, например НО и Ту (разд. 10.3.б); 3) индуцируют мейоз и споруляцию клеток при соблюдении других условий. Такая координированная репрессия нескольких генов при совместном действии белков а2 и а 1 определяется специфической последовательностью длиной 20 п. н., находящейся в 5'-фланкирующей области всех генов, на которые

Деградация сегмента Y и встраивание гомологичного участка X

Структура ХолидеяСтруктура ХолидеяI Восстановление линейной хромосомы, 1 содержащей «-последовательность в Т локусе МАТI Восстановление линейной хромосомы, 1 содержащей «-последовательность в Т локусе МАТHMLaHMLa

Структура Холидея

Структура Холидея

I Восстановление линейной хромосомы, 1 содержащей «-последовательность в Т локусе МАТ

I Восстановление линейной хромосомы, 1 содержащей «-последовательность в Т локусе МАТ

HMLa

HMLa

РИС. 10.58.

Модель генной конверсии, объясняющая механизм переключения с одного типа спаривания на другой. [J. D. Watson et al.. Molecular Biology of the Gene (Menlo Park, CA; Benjamin/ Cummings, 1987), p. 580, с изменениями J

оказывается воздействие, включая и ген al. Эта i/wc-последовательность отличается от последовательности, которую узнает сам а2. Взаимодействие с белком al изменяет специфичность связывания белка а2. Эта сложная схема объясняет неспособность //О-диплоидных клеток к переключению и спариванию. Основной регуляторный локус-это МА Т. Он индуцирует переключение, влияя на

НО-ген, и определяет тип спаривания, регулируя экспрессию специфических генов. Отметим также, что МАТа не содержит генов типа спаривания; этот тип определяется просто отсутствием экспрессии гена а. Вся эта система работает таким образом, чтобы обеспечивалось чередование полового и неполового размножения.

Транскрипционные единицы этих трех генов по-

КлеткаГенные продукты

«-специфичных генов «-специфичных генов

а!

Никакой самостоятельной

Функции не выявлено

Ингибирует экспрессию

генов, необходимых для спариваниягенов, необходимых для спаривания

генов, необходимых для спаривания

генов, необходимых для спаривания

РИС. 10.59.

Влияние продуктов генов МАТа и МАТа на экспрессию генов.

казаны на рис. 10.56. Они были идентифицированы с помощью мутагенеза in vitro клонированной МА Т-ДНК и встраивания ее в дрожжевой геном; таким образом была установлена корреляция между мутантным сайтом и мутантным генным продуктом.

Молчащие а- и a-гены в локусах HML и HMR. Несмотря на то что гены а и а в локусах HML и HMR содержат полноразмерные 5'- и З'-фланки- рующие последовательности, включающие промоторы, они не транскрибируются до тех пор. пока не произойдет их транспозиция в МАТ. По крайней мере отчасти этот феномен связан с четырьмя генными продуктами-SIR 1, 2, 3 и 4 (от англ, silent information regulator). На существование SIR-белков указывали мутации у дрожжей, каждая из которых влияла на экспрессию а- или «-генов в локусе HML или HMR. SIR-гены не сцеплены с HML, HMR или МАТ. Таким образом. НМ La и НМ Ra содержат все элементы, необходимые для экспрессии генов а и а, но SIR-белки подавляют ее. Репрессия происходит в результате связывания SIR-белков с участками, фланкирующими HMLa и HMRa (рис. 10.60). Эти участки находятся за пределами транспозирующих- ся единиц и удалены более чем на 1000 п. н. от последовательностей, контролирующих транскрипцию генов al, a2 и al.

Чтобы идентифицировать мишени для SIR-белков, были сконструированы делеционные мутанты по клонированным сегментам HML и дрожжевые клетки, несущие различные SIR-мутации, трансформировали каждым из этих клонов (рис. 10.60). Все делеции, захватывающие сегмент длиной 130 п. н. (Е) слева от HML, приводили к блокированию SIR-репрессии. Сходные результаты были получены и для локуса HMR. Е-сегменты можно рассматривать как сайленсеры (разд. 8.3.д); последние обладают свойствами, характерными для энхансеров транскрипции, но они подавляют транскрипцию, а не стимулируют ее. Если Е-элемент инвертируется или перемещается в другой сайт в пределах 2,5 т. п. н. от генов, определяющих тип спаривания, то SIR-репрессия не снимается. Таким образом, Е-элементы, как и энхансеры транскрипции, функционируют в любой из двух ориентаций и могут находиться на значительном расстоянии от соответствующего гена. С помощью аналогичного делеционного анализа были выявлены и другие сегменты (I)-справа от HMLa HMR, также участвующие в SIR-репрессии.

Конечным результатом транспозиции генов из HML или HMR в МАТ является удаление кодирующих последовательностей из окружающих их участков, подавляющих генную экспрессию. Как

Да~_

Нет-

РИС. 10.60.

Мутагенез in vitro, позволяющий идентифицировать сайт мишень для SIR белков в локусе HML Горизонтальные отрезки указывают размеры делеций, полученных в результате расщепления клонированного сегмента HML в сайте Xho\ и последующего гидролиза с помощью BAL31 (разд. 7.6.6). Каждый из этих деле-

ционных мутантов использовали для трансформации дрожжевых клеток, несущих различные SIR-мутации. Способность различных делеций репрессироваться SIR-белками представлена в виде диаграммы внизу слева (да или нет). К действию SIR-белков чувствителен участок Е, выявленный в этом и других экспериментах.

именно взаимодействие SIR-белков с последовательностями, так далеко отстоящими от промоторов, ингибирует транскрипцию, пока неясно Возможно, это связано с наличием в сайтах взаимодействия с SIR-белками Л/?Х-элементов (разд. 5.6.6), поскольку дерепрессированные клетки должны пройти S-фазу, чтобы в них происходила репрессия. Определенную роль может играть и изменение структуры хроматина. Если эти изменения обусловливают устойчивость HMLa или HMRa к расщеплению с помощью НО, то становится понятным, почему при переключении МАТ служит именно реципиентом, а не донором. В соответствии с этой гипотезой как HML, так и HMR являются реципиентами транспозиции в штаммах sir-.

Гены, кодирующие иммунные белки позвоночных

В иммунном ответе позвоночных участвует множество специфических белков - секретируемых антител и рецепторов, расположенных на плазматической мембране лимфоцитов. Их роль заключается в защите организма от инфекции вирусами, бактериями, паразитами и, возможно, от пролиферации опухолевых клеток. В отличие от генов других клеточных белков гены, кодирующие антитела и рецепторы, в зиготе отсутствуют. Вместо этого в ДНК клеток зародышевой линии содержатся их предшественники в виде отдельных сегментов, а функциональные гены образуются в результате специфических перестроек, которые происходят только во время развития В- и Т-лимфоцитов (называемых также В- и Т-клетками).

По-видимому, в иммунном ответе участвуют соединения с самой разной химической структурой. Антигенными свойствами обладают практически все типы встречающихся в природе веществ - белки, уг

леводы, липиды, нуклеиновые кислоты. Иммунный ответ могут вызывать даже химические вещества, полученные искусственным путем Взаимодействие антигена с различными антителами определяется структурными особенностями его эпитопа. Даже один эпитоп способен стимулировать синтез разных (но сходных по структуре) антител.

Разнообразие и специфичность иммунных систем определяются двумя их замечательными свойствами. Во-первых, иммунная система способна различать свое (химические структуры, свойственные данному организму) и чужое. Именно этим обусловливается отторжение трансплантированных клеток и тканей. Аутоиммунитет (т е. нарушение толерантности к собственным антигенам) встречается редко и обычно бывает связан с определенными патологическими состояниями. Во-вторых, иммунная система обладает памятью, т. е. организм вырабатывает антитела более эффективно и быстро, если встречается с антигенами во второй раз даже спустя много лет

Клеточный и гуморальный иммунитет. Существуют две разные, но связанные между собой иммунные системы, каждая из которых ассоциирована с лимфоцитами определенного типа (рис. 10.61). Клеточный иммунитет обеспечивается Т-клетками, а гуморальный-как В-, так и Т-лимфоцитами. Клеточный иммунитет опосредуется специфическими Т- клетками - цитотоксичными Т-лимфоцитами, или «киллерами» (CTL), и направлен против клеток, несущих на своей поверхности чужеродные антигены (например, против опухолевых клеток, в которых синтезируются новые белки клеточной поверхности, или вирусных частиц на поверхности инфицированных клеток). Для воздействия киллера на клетку-мишень между ними должен возникнуть контакт, во время которого и осуществляется действие одного или нескольких специфических белков,

Клеточный иммунитет

бактерии

модулируемая

Вклетка клеткамитниТ5

Антитела

Секреция

Фагоциты

Антитело

Обломки

Вирусы

Грибы

Цитотоксический Л-лимсроцит (CTL)

РИС. 10.61.

Вирус

Чужеродные молекулы

Вирусный белок

Лизис

Инфицированная клетка

опосредуется Т-клетками, которые сами связываются с клетками, несущими как чужеродный антиген, так и специфические нормальные поверхностные белки.

Две иммунные системы. При гуморальном иммунитете циркулирующие антитела, секретируемые В-клетками, связываются с чужеродными антигенами (бактериями, вирусами, грибами, белками). Клеточный иммунитет

продуцируемых CTL. Гуморальный иммунитет опосредуется циркулирующими в биологических жидкостях антителами, которые продуцируются В-клетками под регуляторным контролем Т-клеток двух видов: Т-хелперов (Тн) и Т-супрессоров (Ts). Антитела циркулируют в сыворотке и в лимфе, однако некоторые из них находятся в лимфатических узлах, селезенке и ассоциированной с кишечником лимфоидной ткани. В любом случае антитела связывают соответствующие антигены, которые находятся в свободном состоянии в растворе или на поверхности инфицирующей клетки. Комплексы антитело-антиген быстро удаляются и разрушаются фагоцитарными клетками, например макрофагами. Соединение некоторых антител с клеточными антигенами (например, бактериями) запускает серию протеолитических реакций - систему комплемента, которая вызывает лизис чужеродных клеток.

Антитела. Антитела в высшей степени специфичны. Они способны различить даже близкородственные эпитопы, например два стерео- (</- и /-энантиомера) или геометрических (уме- и транс-) изомера. Любое антитело способно дифференцировать белки, отличающиеся друг от друга лишь несколькими аминокислотами (например, бычий и человеческий инсулин). Причину столь замечательной специфичности антител и в то же время сходства их функций лучше всего помогает понять изучение их структуры (рис. 1.37, 10.62 и 10.63). Молекула иммуноглобулина представляет собой гетеротетрамер, состоящий из двух идентичных пар полипептидных

цепей. Каждая такая пара в свою очередь состоит из тяжелой цепи (Н-цепи) и легкой цепи (L-цепи). Ни L-цепи в димере связаны бисульфидными мостиками; такие же мостики соединяют и две Н-цепи в каждом тетерамере. Н-цепи одной молекулы антитела имеют одинаковые аминокислотные последовательности, но у каждой из Н-цепей антитела на

Структура антитела. Указаны вариабельная и константная области легкой (VLCL) и тяжелой (VHCH) цепей, а также отдельные домены константных областей тяжелой цепи (Сн1, Сн2 и Сн3) и антигенсвязывающие сайты в вариабельных областях и CDR.

Легкая цепь (23кДа)

CDR1 CDR2 CDR3

NH, осссеосеосхжit odooocodooocxdo

РИС. 10.63.РИС. 10.63.Вариабельный участок ^Константный участок^

РИС. 10.63.

РИС. 10.63.

Схематическое изображение легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина.Схематическое изображение легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина.Тяжелая цепь <55кДа)

Схематическое изображение легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина.

Схематическое изображение легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина.

nh2 оахжхжлохоеомммееемееммимеммем,

I Вариабельный участок ।Константный участок

N-конце имеется вариабельный участок (VH) длиной примерно 115 аминокислотных остатков. Соответственно и у L-цепей есть N-концевой вариабельный участок (VL) длиной примерно ПО аминокислот. С-концевая половина L-цепей (~ 110 аминокислот) называется константной областью (CL), поскольку независимо от последовательности VL она представлена последовательностью одного из двух типов-и или X. Н-цепи также содержат N-концевые константные области, Сн, состоящие из ~ 330 аминокислотных остатков. Они бывают нескольких типов и определяют класс и эффекторные функции соответствующих антител.

Известны лишь два типа легких цепей-каппа (х) и лямбда (X). Тип цепи определяется аминокислотной последовательностью Ск-сегмента и включает L-цепи со множеством разных VL-последовательностей. Тяжелые цепи более разнообразны; известно пять типов Сн: ц, 5, у, е и а. Им соответствуют пять классов иммуноглобулинов-так называемые изотипы IgM, IgD, IgG, IgE и IgA. Каждое из этих антител играет специфическую роль в гуморальном иммунитете. Например, иммуноглобулины G-это обычные циркулирующие антитела, IgE участвуют в аллергических реакциях, a IgA, которые концентрируются в жидкостях, окружающих эпителиальные клетки, по-видимому, защищают организм от микробов. Каждая из тяжелых цепей связывается либо с X-L-, либо с X-L-цепью.

Структура, образующаяся в результате взаимодействия Ун и VL, представляет собой уникальный сайт связывания антигенов и, таким образом, определяет специфичность антитела. Каждое антитело бивалентно, поскольку содержит два идентичных сайта связывания антигена. Специфичность связывания обусловливается комплементарностью антигена и антитела (рис. 10.64) и определяется тремя участками VL и Ун, которые называются гипервариабельными и обозначаются CDR1, CDR2 и CDR3 (от англ, complementary-determining regions). Именно в этих участках наиболее сильно различаются области VL и Ун у разных антител.

Аминокислотные последовательности самых разных иммуноглобулинов были известны задолго до того, как стало возможным прямое изучение эукариотических генов. Было показано существо

вание у этих полипептидов вариабельных и константных областей. Для объяснения поразительного разнообразия V-участков и существования практически неограниченных возможностей для обеспечения разных антигенных специфичностей было выдвинуто много разных гипотез. Основная проблема состоит в том. как объяснить возникновение практически неограниченного числа генов, кодирующих разные V-, но одинаковые С-участки. Как оказалось, ни одна из этих гипотез сама по себе не объясняет данного феномена. Разнообразие V-областей обеспечивается разными механизмами.

Гены легкой цепи. Первые данные о том, что гены полноразмерной L-цепи образуются в результате перестроек ДНК во время дифференцировки В-кле- ток, были получены в результате сравнения рестрикционных карт последовательностей, кодирующих L-цепи в клетках, которые продуцируют антитела (например, в клетках миеломы), и в клетках, которые антител не продуцируют (например, в клетках печени или спермиях) (рис. 10.65). Оказалось, что в ДНК из клеток миеломы V- и С-области экспрессирующегося гена L-цепи находятся в одном рестрикционном фрагменте, в отличие от ДНК из клеток зародышевой линии или нелимфоидных клеток. С тех пор были клонированы и секвенированы кодирующие последовательности многих генов различных и- и Х-цепей. Был не только подтвержден сам факт перестроек, но и в какой-то мере прояснены механизмы, участвующие в этих процессах.

Функциональные гены X- и и-цепей образуются практически одинаковым способом у большинства позвоночных. Рис. 10.66 иллюстрирует образование функционального и-гена. При этом используются три сегмента ДНК: Vx, Jx и Сх. Все они обнаружены на хромосоме 2 человека, при этом присутствуют ~ 300 тандемных копий Ух-сегментов, 5 тандемных копий 1х-сегментов и один Сх-сегмент. В клетках зародышевой линии человека и в большинстве соматических клеток Ух-кластер удален от 1х-кластера на 23 т. п. н., но во время дифференцировки каждой В-клетки один из Ух-сегментов соединяется в результате рекомбинации с каким-либо Лх-сегментом. При этом участок ДНК между Ух- и Лх-сегментами утрачивается или остается в зависимости от взаимной ориентации Ух и Лх в клетках зародышевой линии.

РИС. 10.64.

А. Схематическое изображение связывания антигена со специфическим сайтом иммуноглобулина Кружки обозначают СОЯ. Б. Полученные с помощью компьютера структуры вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антитела лизоцима (слева) и самого лизоцима (справа). В верхней части этого рисунка показана «сты

ковка» двух молекул. Их связывание стабилизируется электростатическими и вандерваальсовыми силами, а также водородными связями. [С любезного разрешения S. Sheriff. См. S. Sheriff et al.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), p. 8075 ]

кДНК-зонд; Полноразмер- 3-конец ная кднккДНК-зонд; Полноразмер- 3-конец ная кднкОбразец Эмбрион Эмбрион ДНК:Миелома МиеломаОбразец Эмбрион Эмбрион ДНК:Миелома МиеломаНаправление электрофорезаНаправление электрофореза

кДНК-зонд; Полноразмер- 3-конец ная кднк

кДНК-зонд; Полноразмер- 3-конец ная кднк

Образец Эмбрион Эмбрион ДНК:Миелома Миелома

Образец Эмбрион Эмбрион ДНК:Миелома Миелома

Направление электрофореза

Направление электрофореза

РИС. 10.65.

Перестройка кодирующих последовательностей гена легкой цепи х в процессе созревания В-клеток. Геномная ДНК была выделена из клеток мышиных эмбрионов и клеток миеломы мыши. Миеломы-это В-клеточные опухоли, представленные одним клеточным клоном и секретирующие единственное гомогенное антитело. ДНК расщепляли эндонуклеазой SamHI и проводили электрофорез и блот-гибридизацию с кДНК-зондами, отвечающими полноразмерной глобулиновой мРНК иэ клеток миеломы или З'-концевой (Ск) части этой мРНК. Оба зонда гибридиэуются с одним рестрикционным фрагментом ДНК из клеток миеломы, но с разными фрагментами ДНК эмбриональных клеток (или ДНК из других, нежели В-клетки, зрелых соматических клеток). [N. Hozumi, S. Tonegawa, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73 (1976), p. 3628.]

Каждый Ух-сегмент содержит три функциональные части: промотор и два экзона, LK и Vx (рис. 10.67). Экзон Lx кодирует сигнальную последовательность, которая направляет образующийся полипептид в эндоплазматический ретикулум, a Vx кодирует участок длиной примерно 80 аминокислот V-области х-цепи. Остальные ~ 30 аминокислот V-области кодируются присоединенным Зх-сегментом. Перестроенный функциональный ген и-цепи содержит промотор, три экзона и два интрона. Один интрон разделяет экзоны Lx и Vx-Jx, а второй находится между экзонами Vx-Jx и Сх. Один из CDR-сегментов L-цепей - CDR3- кодируется последовательностью, образующейся при соединении Vx и JK.

Помимо альтернативного использования X- или х-цепей за разнообразие L-цепей в молекулах антител отвечают три механизма. Во-первых, любой из сотен Ух-сегментов может соединиться с любым

1х-сегментом, ассоциированным с Сх. Таким образом, специфичность L-цепи отчасти определяется тем, какие именно из сегментов Vx и Jx соединяются. Аналогично, из разных V^-, Jv и С^-кодирующих участков образуются легкие цепи X, обладающие разной специфичностью. Во-вторых, соединение VL- и Зк-сегментов происходит неточно, и в результате образуются несколько альтернативных кодирующих последовательностей. В-третьих, после образования функционального гена L-цепи Уь-сегмент подвергается в ходе последующей пролиферации В-клеток необычно частым мутационным изменениям. Такие мутации еще более увеличивают разнообразие анти- генсвязывающих областей L-цепей.

Сайт-специфические рекомбинации, в результате которых Уь-сегмент соединяется с сегментом JL, протекают при участии особой рекомбиназной системы. Рекомбинация зависит от двучленных олиго- нуклеотидных сигналов узнавания, которые находятся на З'-конце VL и на 5'-конце JL (рис. 10.68). Сигнал состоит из двух участков длиной 7 и 9 п. н„ разделенных 11 п.н. (примерно один виток спирали) в У,-области и 23 п. н. (примерно два витка спирали) в Зь-области. Рекомбинация зависит от целостности как гептамерного и нонамерного участков, так и разделяющего их сегмента, но не от нуклеотидной последовательности последнего. Хотя специфичность этих сигналов узнавания весьма высока, на самом деле соединение VL- и 1ь-сегментов происходит не очень точно: небольшое количество оснований при этом либо утрачивается, либо, напротив, добавляется. Вследствие такой неточности иногда рамки считывания соединяемых VL и JL как бы оказываются в фазе, т. е. между ними возникает транслируемый участок, однако такие случаи весьма редки. Более того, сами «совпадающие по фазе» соединения отличаются одно от другого, что приводит к изменчивости кодирующих последовательностей домена CDR3 Уь-области и еще более увеличивает разнообразие последней.

Механизм сборки гена L-цепи эволюционировал в направлении увеличения разнообразия цепей антител даже ценой появления огромного числа дефектных генов. Теоретически соединение любого из почти 300 Ух-сегментов с любым из пяти сегментов Jx приводит к образованию примерно 1500 разных генов Lx-uenefi. Неточность соединения может увеличить это число за счет образования 10 совпадающих по фазе сочленений примерно до 1,5 Ю4. Вместе с аналогичным разнообразием Х-цепей это приводит к огромному увеличению числа возможных легких цепей. У человека имеется несколько разных константных Х-областей, поэтому число разнообразных L-цепей поистине огромно.

При сборке гена легкой цепи не только происходит увеличение разнообразия цепей, но и активи-

1 2 3 4 5

ДНК клеток зароды- шевой линии

Соединение в результате делении /

Соединение врезультате . инверсии

Сплайсинг

мРНК

Трансляция

Белок зе

е—соо*

Первичный транскрипт

H3N+ —

Транскрипция V "

Вариабельный Константный

РИС. 10.66.

Перестройки участков ДНК из клеток зародышееой линии, приводящие к образованию функционального гена х-цепи. Ук-области находятся в разных ориентациях относительно JK- и Ск-сегментов. Во время диф

ференцировки В-клеток один из Ук-сегментов соединяется с одним из сегментов JK. [J. Darnell, Н. Lodish, D. Baltimore, Molecular Cell Biology (New York: Scientific American Books, 1986), p. 1104.]

руется генная экспрессия (разд. 8.3.д); в результате перестроек промотор, расположенный перед каждым Ух-сегментом, оказывается вблизи энхансера, внутри интрона, разделяющего Jx и Сх (рис. 10.67).

Гены тяжелых цепей. Те же самые механизмы,

которые приводят к разнообразию L-цепей, ответственны и за существование огромного числа разных генов Н-цепей, кодирующих VH с разными аминокислотными последовательностями Однако V-области Н-цепей еще более разнообразны, чем

Промотор СВКз

j Энхансер

РИС. 10.67.

Функциональные элементы гена Ех-цепи, образовавшегося в результате перестроек.

соответствующие области L-цепей. поскольку кодирующие их участки строятся не из двух, а из трех сегментов: VH, D„ и J„ (рис. 10 69). У человека все эти сегменты находятся на хромосоме 14, однако VH-, D„- и Лн-кластеры располагаются на большем расстоянии друг от друга. Случайные комбинации одного из нескольких сотен VH с одним из 20 DH и одним из 5 JH дают 104 105 различных цепей. Сигналы узнавания, по которым происходит рекомбинация, состоят из таких же олигонуклеотидов длиной 7 и 9 п. н., которые опосредуют соединение VL- и Зь-обласгей; они находятся на З'-конце V„, на 5'- и З'-концах D„ и на 5-конце J„. Гептамеры и нонамеры каждого рекомбинационного сегмента тоже разделяются последовательностями длиной 11 и 23 п. н. Происходят два последовательных акта соединения. Сначала один из Он-элементов соединяется с одним из 3„-элементов, а затем к уже перестроенному сегменту D„J„ пришивается сегмент V„. Соединения V„DH и D„J„ происходят неточно и часто сопровождаются делециями и ин- серциями новых нуклеотидов. Встроенные, так называемые М-участки, по-видимому, появляются в результате действия терминальной дезоксинуклео-

Кодирует V,.

ССТССIcACAGTG fl —АСАААААСС ( 6 G > GG[ GY 5ТС Ac-11 - Т G T Т T Г ТС G pro

тидилтрансферазы фермента, который был известен за 25 лет до того, как удалось установить его физиологическую роль (разд. 4 8). Эти участки могут кодировать до десяти новых аминокислот Н-цепи В результате делеций и вставок с любой из сторон D„ вариабельность Ун-области увеличивается в несколько сотен раз. Соединение различных VH-, DH- и Лц-сегментов дает ~ 105 комбинаций; вариабельность N-участка увеличивает число различных Н-цепей до 107- 108, а сочетание разных Н- и L-цепей дает 10й 1012 сайтов связывания иммуноглобулинов.

Константные области Н-цепей (С„) также различаются, но эти различия не влияют на CDR. Итак, полученный в результате перестроек V„-сегмент может соединиться с каким-нибудь С„-сегментом ц, б, у, я или а. В зависимости от этого возникают антитела изотипов IgM, IgD, IgG, IgE и IgA соответственно. Прежде чем пытаться понять, как образуются Н-цепи с разными С„-областями, рассмотрим дифференцировку В-клеток. Кроме всего прочего, это поможет нам понять, почему в ответ на один антиген иммунной системой продуцируется огромное количество специфических антител.

Дифференцировка В-клеток Стволовые клетки предшественники В-клеток и всех других клеток, участвующих в гемопоэзе,-появляются вначале в печени и селезенке плода, а после рождения и в красном костном мозге. На этих первых этапах, когда образуются циркулирующие, но непролиферативные пре-В-клетки, антиген отсутствует (рис. 10.70). Тем не менее пре-В-клетки уже содержат перестроенные гены функциональных Н- и L-цепей и образуют антитела, относящиеся к мембраносвязанным IgM и IgD. Некоторые такие клетки

5„Кодирует J*

( Ggtttttgt-23-cactgtg Igtgg Q

( ССАААААСА-23-GTGACAC |САСС 0

Рекомбинация

РИС. 10.68.РИС. 10.68.pro trp;сстс tggq*GGAG ACC 0Рамканарушаетсяpro trp;сстс tggq*GGAG ACC 0Рамканарушается

РИС. 10.68.

РИС. 10.68.

pro trp

;сстс tggq

*GGAG ACC 0

Рамканарушается

pro trp

;сстс tggq

*GGAG ACC 0

Рамканарушается

pro trp

(cct_tgg_q(gGA ACC Q

Рамка сохраняется

Соединение Vx c Jx происходит в результате рекомбинации специфических гомологичных сигналов узнавания Каждый такой сигнал состоит из двух олигонуклеотидов длиной 7 и 9 п. н., которые в Vx и Jx разделены участками размером 11 и 23 п.н. соответственно. Для рекомбинации должен произойти дифференциальный сплайсинг между гептамерной и нонамерной единицами. Соединение происходит неточно.

pro arg

(cctc ggq

(GGAG CCQ

Рамка сохраняется

так что кодирующие части Vx и JK утрачивают несколько пар оснований или приобретают лишние. В результате в некоторых случаях происходит сдвиг рамки считы вания, и пегкая цепь вообще не синтезируется. В других случаях соединение VK и Jx происходит «в фазе», рамка считывания сохраняется, но само место сочленения варьирует, что обусловливает изменчивость СОНЗ-об- ласти.

Первая перестройка

^Сплайсинг РНК

мРНК

h3n+ cxxmpoogooeeeeeeeeeeeie

Вариабельный Константный

РИС. 10.69.

Перестройки ДНК из клеток зародышевой линии, в результате которых образуется функциональный ген тяжелой цепи в В-клетках.

СОО"

продуцируют только IgM, другие-как IgM, так и IgD. Каждая пре-В-клетка несет примерно 104 идентичных молекул IgM, которые, впрочем, отличаются по своей структуре и антигенной специфичности от IgM других клеток, поскольку содержат другие VH- и Уь-области. Таким образом, огромное разнообразие и специфичность антител во многом задаются еще до появления антигена. В пре-В-клет- ках, продуцирующих как IgM, так и IgD, оба им- муноглобина содержат одинаковые VH- и VL-cer- менты и разные сегменты Сн-См или С5.

В результате независимых перестроек х- и Х-ал- лелей в каждой из пар хромосом 2 и 22 соответственно могут образоваться четыре разные L-цепи. Аналогично, в результате независимых перестроек в паре хромосом 14 могут возникнуть две разные Н-цепи. Почему же тогда в пре-В-клетках присутствуют Н- и L-цепи только одного вида? Дело в том,

что перестройки, которые происходят во время развития пре-В-клеток, носят неслучайный характер. Перестройка гена Н-цепи происходит сначала в одной из двух хромосом. Если возникающее при рекомбинации соединение слишком отклоняется от нормы или если в результате DHJH- или последующего VH DHJ „-соединения образуется неэкс- прессирующийся ген, то запускается перестройка второй хромосомы. Удачное завершение перестроек Н-цепи инициирует сборку функционального х-гена. Если рекомбинации оказываются безуспешными, начинаются перестройки в Х-локусе. Клетки, которым не удалось сконструировать функциональные гены Н- и L-цепей, оказываются нежизнеспособными. Механизм, лежащий в основе этого строго упорядоченного уникального процесса, неясен. Можно только предположить, что как только в результате удачных геномных перестроек образо-

Аитигеннезависимые,Антигензависимые,находятся вперифери-

находятся в костном мозгеческих лимфоидных тканях

Клетки,связанные с антигеном

РИС. 10.70.

Образование Т- и В-лимфоцитов из стволовых клеток костного мозга. Для того чтобы стать иммунологически активными, предшественники Т лимфоцитов должны какое то время находиться в тимусе (отсюда название

Т клетки). Название В клеток происходит от названия органа птиц, е котором они были впервые обнаруже ны фабрициевой сумки (bursa)

вались функциональные Н- и L-цепи, перестройки альтернативных аллелей блокируются-феномен, называемый аллельным исключением (allelic exclusion).

Дальнейшая дифференцировка пре-В-клеток с образованием зрелых, короткоживущих и секретирующих антитела плазматических клеток или долгоживущих, не продуцирующих антитела клеток памяти происходит вне костного мозга. Эти превращения зависят от взаимодействия мембраносвязанного IgM В-клеток с родственным антигеном (рис. 10.70). Если связывания антигена не происходит, то пре-В-клетка погибает в течение нескольких дней. Взаимодействие поверхностного IgM с подходящим антигеном запускает серию физиологических реакций, включающих активный рост и пролиферацию клеток, переключение с образования мембраносвязанных антител на образование антител секретируемых и запуск экспрессии генов Н-це- пей. Большинство таких индуцированных клеток живут ограниченное время, но некоторые из них в результате последующей дифференцировки превращаются в клетки памяти, которые в течение многих лет сохраняют способность отвечать на исходный антиген, снова продуцируя соответствующее антитело.

Рост и пролиферация В-клеток в ответ на связывание антигена опосредуются сложными взаимодействиями с макрофагами, хелперными Т-клетка- ми и факторами роста и дифференцировки, называемыми лимфокинами; обсуждение этих процессов выходит за рамки данной главы. Переключения на синтез секретируемых антител и на образование вместо р (или 8-)-цепей цепей одного из изотипов-у, е или а-происходят при участии дифференциального процессинга мРНК и дополнительных геномных перестроек соответственно. Рассмотрим общие принципы этих процессов.

Структура С „-кодирующих участков и их экспрессия. Кодирующие участки константных областей Н-цепей р, 8, у, 8 и а-организованы в указанной последовательности в кластеры длиной 200 т. п. н , одинаковые для геномных ДНК мыши и человека (рис. 10.71). Кластер, состоящий из представленных в единственном числе С^, Cg, СЕ и Са и нескольких Су, находится правее кластера Jн-сег- ментов. Каждый С-сегмент имеет несколько экзонов и интронов.

В пре-В-клетках транскрипция гена мембраносвязанной p-цепи начинается левее лидерной последовательности LH и проходит через первый интрон, перестроенный ¥н-сегмент, второй интрон и Сц-ин-

РИС. 10.71.

Схематическое изображение кластера Сн-сегментов в геноме мыши.

троны и экзоны; полиаденилирование происходит в последнем См-экзоне (рис. 10.72). Последовательности. кодирующие типичные Н-цепи, находятся в первых четырех из шести экзонов См. Последние два экзона кодируют полипептидный сегмент, который заякоривает p-цепи антитела в мембране. Мембраносвязанная форма p-цепи называется рт, а соответствующий иммуноглобулин-IgMm. Анти- генсвязывающий сайт мембраносвязанного IgM находится снаружи В-клетки. Связывание соответствующего антигена с поверхностным IgM запускает несколько процессов. Во-первых, происходит переключение с синтеза IgMm на синтез IgM s- секрети

руемого варианта IgM, который обладает той же антигенсвязывающей специфичностью, но имеет другую аминокислотную последовательность на С-конце p-цепи. Далее, в результате пролиферации В-клеток образуется клон плазматических клеток, секретирующих такой же IgMs. Переключение с синтеза рт на синтез ps происходит при участии альтернативного сигнала полиаденилирования мРНК p-цепи (рис. 10.72). Этот сигнал находится в интроне между экзонами 4 и 5 См и ответствен за удаление из первичного транскрипта последовательности, кодирующей мембранный якорь рт и сохранение в р5-мРНК сегмента на конце экзона 4, кодирующего

Трансляция

Трансляция

Белок

Трансмембранныйучасток

NH2

I — СООН Ifl мт

—соон l9Ms

Пре-В-клетки

РИС. 10.72.

Использование альтернативных сигналов полиаденилирования. расположенных в Ср-сегменте, приводит к синтезу как мембраносвязанных (СРт), так и секретируемых (CMs) легких цепей. Шесть Ср-экзонов обо-

Пролиферирующиеплазматическиеклетки

значены на рисунке цифрами от 3 до 8. [J. Darnel, D. Baltimore, Н. Lodish, Molecular Cell Biology (New York: Scientific American Books, 1986), p. 1113.]

С-конец ps. Эта дополнительная последовательность удаляется из цт-мРНК при сплайсинге.

При синтезе IgD также используются альтернативные сигналы полиаденилирования и сплайсинга. Если первичный транскрипт тяжелой цепи продолжается, захватывая Cg-второй сегмент С„-облас- ти,-и полиаденилирование происходит за Cg. то при дифференциальном сплайсинге из перестроенного VDJ первичного транскрипта может элиминироваться Сц и в некоторых пре-В-клетках синтезируется иммуноглобулин lgDm (рис. 10.71). Переключение с синтеза IgDm на синтез lgDs происходит в результате дифференциального использования сайтов полиаденилирования аналогично тому, как это имеет место в случае IgM.

Индуцированная антигеном дифференцировка пре-В-клеток с образованием плазматических В-кле- ток и В-клеток памяти сопровождается переключением изотипа (например, с IgM на IgG). Вначале, по-видимому, происходит альтернативный сплайсинг очень длинных пре-мРНК, синтез которых начинается в обычном сайте инициации транскрипции на 5'-конце лидерной последовательности V-области и продолжается до сигналов полиаденилирования на конце кодирующих областей Су, СЕ или Са (рис. 10.71). В результате сплайсинга З'-конца сегмента VHDHJH с интроном, непосредственно примыкающим к одному из С-сегментов, образуются мРНК, которые кодируют полипептиды с одинаковыми V„, но разными С„. Однако этот механизм переключения изотипов заменяется основанным на рекомбинационном соединении V„ D„J „-сегмента с одним из Сн-сегментов, расположенных за С^ и Cg, с утратой разделяющего их участка ДНК (рис. 10.73). Например, в результате делеции Сц, Cg, Суз и Су1 синтезируется тяжелая цепь с константной областью Су2Ь, т-е- образуется IgG2b, а делеция См, Cg, Су3, Су1, Су2Ь и СЕ приводит к синтезу IgA. При этом легкие цепи и V„-области, а также антигенная специфичность остаются прежними.

Переключение тяжелых цепей происходит в результате гомологичной рекомбинации между последовательностями ДНК в интронах, расположенными на расстоянии 2-3 т. п. н. перед каждым из С„-сегментов, за исключением Cg. Эти последовательности обозначаются буквой S (от switch-переключение). У мыши несколько копий S-последовательностей образуют перед каждым С„-сегмен- том тандемные повторы длиной обычно 40- 80 нуклеотидов; повторы, расположенные перед S^-cer- ментом, гораздо короче, длиной 4-6 нуклеотидов, при этом у мыши это последовательности GAGCTG и TGGG.

Клональный отбор. Для объяснения огромного многообразия антител и их уникальной специфичности при связывании антигенов было высказано

■200Т.П.Н.

Рекомбинационное переключение

Су2Ь

VDJ Cyl Су2а С£ Се

ЩД JMW

Транскрипция, полиаденилирование, сплайсинг

/\/V^ IgG^MPHK/\/V^ IgG^MPHK

/\/V^ IgG^MPHK

/\/V^ IgG^MPHK

РИС. 10.73.

Перестройки, происходящие при рекомбинационном переключении, в результате которых вместо иммуноглобулинов класса IgM начинают синтезироваться им- муноглобины класса lgGt.

много гипотез. По-видимому, наиболее адекватной является одна из них - гипотеза клонального отбора, в которой разнообразие антител объясняется перестройками ДНК. Вкратце идею клонального отбора можно представить следующим образом. На ранних этапах созревания антиген-независимых В-клеток образуется много самых разных пре-В-клеток (рис. 10.70). Каждая из них несет специфическое антитело в виде поверхностного IgM. Специфичность определяется уникальностью аминокислотных последовательностей VL- и V„-областей, из которых образуется антигенсвязывающий сайт (CDR). При случайном взаимодействии пре-В-клет- ки с родственным антигеном происходит стимуляция клеточной пролиферации и секреции иммуноглобулина. Таким образом, после связывания антигена пре-В-клетка дает начало клону циркулирующих плазматических клеток, которые секретируют иммуноглобулины с той же антигенной специфичностью, что и у исходно стимулированной В-клетки.

При таком поверхностном описании клонального отбора мы опускаем многие интересные детали, в частности не упоминаем о ключевой роли вспомогательных клеток и факторов роста, которые облегчают трансформацию пре-В-клеток. Еще одна очень важная особенность состоит в том, что не все потомки активированной пре-В-клетки представляют собой секретирующие антитела плазматические клетки, некоторые из них - это «бессмертные» В-клетки памяти, которые «помнят» обо всех ветре-

чах организма с антигенами. Эта «запись» хранится в циркулирующих В-клетках, несущих такие мембраносвязанные антитела (IgM), VL- и Ун-области которых были отобраны по признаку наилучшего соответствия чужеродному антигену. При повторной встрече с этим же антигеном В-клетки памяти стимулируются к пролиферации и секреции таких же антител, какие продуцировались пре-В-клетками- предшественниками.

Сама по себе гипотеза клонального отбора не объясняет в полной мере ни природы разнообразия антител, ни того факта, что качество подгонки антитела и антигена изменяется при повторных встречах. В основе этих свойств иммунной системы могут лежать какие-то другие факторы, тоже обеспечивающие разнообразие VH и VL. В покое В-клетки памяти накапливают мутации, возникающие как в самих Ун-областях, так и в ближайшем их окружении, причем частота этих мутаций в миллион раз превышает частоту спонтанных мутаций в других генах. В результате происходит изменение CDR, т.е. изменение антигенной специфичности антитела с уже перестроенной V„-областью. Иногда сайт связывания изменяется настолько, что антитело вообще теряет свою активность. Но мутационные изменения могут и улучшать соответствие между антителом и антигеном. Тогда при повторном контакте с антигеном активируются преимущественно те В-клетки, которые способны продуцировать наиболее прочно связывающиеся антитела. Поскольку эта система создает клетки, «наученные» распознавать угрозу повторной инфекции более эффективно, безопасность организма существенно повышается.

Роль Т-клеток. Как мы уже отмечали, Т-лимфоциты обеспечивают как клеточный, так и гуморальный иммунитет. Эти клетки образуются в костном мозге, но созревают в тимусе (рис. 10.70). Основные «гаранты» клеточного иммунитета-цитотоксичные Т-клетки (CTL) (или Т-киллеры), а гуморального - Т-хелперы и Т-супрессоры. Все физиологические функции, характерные для Т-клеток, реализуются в результате взаимодействия поверхностного Т-кле- точного рецептора (TCR) с соответствующим антигеном. При этом CTL убивают клетки, несущие антиген, а Тн-клетки ускоряют пролиферацию пре-В-клеток. Взаимодействие TCR Тн-клеток и антигена. связанного В-клеткой. приводит к тому, что Т-клетки начинают высвобождать специфические белки роста и дифференцировки В-клеток (лимфо- кины), которые стимулируют пролиферацию В-клеток и секрецию ими антител. Роль Т$-клеток до конца не установлена; возможно, они «приглушают» ответную реакцию В-клеток на собственные антигены организма.

По своей структуре и способности распознавать

антиген TCR напоминают мембраносвязанные антитела (рис. 10.74), однако есть и ряд существенных отличий. TCR остаются связанными с клеточной плазматической мембраной и никогда не секретируются. Кроме того, если поверхностные В-клеточ- ные антитела связывают как растворимые, так и связанные с клеткой антигены, то TCR взаимодействуют только с антителами, ассоциированными с клеткой. Кроме того, TCR обычно узнают и чужеродные антигены, но только в том случае, когда они находятся в комплексе со специфическими белками, локализованными на поверхности клетки, представляющей антиген. Эти белки являются продуктами генов так называемого главного комплекса гистосовместимости (МНС). Каким образом TCR узнают и связывают чужеродные антиген и белки МНС и чем объясняется такой дуализм? Эти интригующие вопросы еще ждут ответа. Здесь мы сконцентрируем свое внимание на структуре TCR и тех геномных перестройках, которые приводят к экспрессии генов, кодирующих составляющие TCR полипептиды.

Все TCR представляют собой мембраносвязанные гетеродимеры (рис. 10.74). Большинство из них состоит из двух цепей, а и 0, но небольшая часть TCR содержит две другие цепи-у и 5. Мол. масса а-. 0- и 5-цепей составляет примерно 45 кДа. а у-цепи-35 кДа. Разные типы Т-клеток несут либо О0-, либо уб-TCR. Цепи удерживаются в паре с помощью дисульфидных связей. Аналогично Ни L-цепям антител, каждая цепь TCR содержит вариабельный N-конец, почти целиком выступающий из мембраны, и константный С-конец, отчасти заякоренный в мембране. Антигенная специфичность TCR определяется трехмерной структурой. которая образуется в результате взаимодействия расположенных соответствующим образом Уа- и Ур- или У7- и Vg-областей.

Сходство между TCR и антителами распространяется и на то. как обеспечивается разнообразие, например, V-областей а- и 0-цепей на генетическом уровне. Информация о V-области 0-цепи распределена между тремя отдельными участками ДНК в хромосоме 6 мыши и хромосоме 7 человека: с каждым из двух Ср-сегментов соединяются примерно 20 Vp-, 2 Dp- и 6 Jp-сегментов. Генные сегменты a-цепи-примерно 50 Уа, 50 Ja и один Са- у мыши и человека локализованы на хромосоме 14. Кодирующие сегменты для у-цепей также разделены, но образуют четыре кластера, каждый из которых содержит несколько V-, J- и С-сегментов; в результате их соединения образуется ген функциональной у-цепи. Механизм перестройки до конца не изучен, но, по-видимому, сходен с таковым для генов антител. Здесь тоже сигналом узнавания служит комплекс из гептамерной и нонамерной единиц,

Легкие цепиЛегкие цепиТяжелые цепиТяжелые цепиКлеточная мембранаКлеточная мембранаАнтигенсвязываю- щий сайтАнтигенсвязываю- щий сайтРИС. 10.74.Схема, иллюстрирующая структуру Т-клеточного рецептора и мембраносвязанного иммуноглобулина. Т-кле- точный рецептор содержит две цепи: а и Р; каждая из них имеет мол. массу примерно 40 кДа и связана своим С-концом с мембраной. Вариабельные области и антигенсвяэывающие сайты находятся на N-конце. [Т. Honjo. S. Kabo, Ann. Rev. Biochem. 54 (1985). p. 820.]РИС. 10.74.Схема, иллюстрирующая структуру Т-клеточного рецептора и мембраносвязанного иммуноглобулина. Т-кле- точный рецептор содержит две цепи: а и Р; каждая из них имеет мол. массу примерно 40 кДа и связана своим С-концом с мембраной. Вариабельные области и антигенсвяэывающие сайты находятся на N-конце. [Т. Honjo. S. Kabo, Ann. Rev. Biochem. 54 (1985). p. 820.]COO" COO"Иммуноглобулин MCOO" COO"Иммуноглобулин MCOO" COO"Т-клеточный рецепторCOO" COO"Т-клеточный рецептора-цепьа-цепьАнтигенсвязываю- щий сайтАнтигенсвязываю- щий сайтNHZNHZNH„ NHNH„ NH6-цепь6-цепьАнтигенсвязываю-щий сайтАнтигенсвязываю-щий сайтNH2NH2разделенных некодирующим спейсерным участком длиной 11-12 и 22-23 п. н.. а перестройки, вероятно, катализируются рекомбиназой. Рекомбинация в Т-клетках тоже происходит неточно, что обеспечивает изменчивость мест соединения рекомбинирующих участков. Сначала происходят перестройки в локусе, отвечающем P-цепи, а затем-в локусе a-цепи, при этом в случае успешной перестройки в одном из аллелей генов Р- или a-цепи перестройка в других аллелях блокируется (аллельное исключение). Насколько это известно, мутации в V-областях TCR не происходят, поэтому разнообразие TCR обусловливается соединением различных генных сегментов и неточностью рекомбинации. Локализация генов a-цепи и генов тяжелой цепи (иммуноглобулина) на одной, 14-й хромосоме у человека имеет одно важное следствие: она создает предпосылки для аберрантного соединения VH- и J „-областей при участии общих сигнальных последовательностей и рекомбиназы. Некоторые происходящие при этом перестройки хромосомы 14 связывают с возникновением Т-клеточных опухолей.

Легкие цепи

Легкие цепи

Тяжелые цепи

Тяжелые цепи

Клеточная мембрана

Клеточная мембрана

Антигенсвязываю- щий сайт

Антигенсвязываю- щий сайт

РИС. 10.74.

Схема, иллюстрирующая структуру Т-клеточного рецептора и мембраносвязанного иммуноглобулина. Т-кле- точный рецептор содержит две цепи: а и Р; каждая из них имеет мол. массу примерно 40 кДа и связана своим С-концом с мембраной. Вариабельные области и антигенсвяэывающие сайты находятся на N-конце. [Т. Honjo. S. Kabo, Ann. Rev. Biochem. 54 (1985). p. 820.]

РИС. 10.74.

Схема, иллюстрирующая структуру Т-клеточного рецептора и мембраносвязанного иммуноглобулина. Т-кле- точный рецептор содержит две цепи: а и Р; каждая из них имеет мол. массу примерно 40 кДа и связана своим С-концом с мембраной. Вариабельные области и антигенсвяэывающие сайты находятся на N-конце. [Т. Honjo. S. Kabo, Ann. Rev. Biochem. 54 (1985). p. 820.]

COO" COO"

Иммуноглобулин M

COO" COO"

Иммуноглобулин M

COO" COO"

Т-клеточный рецептор

COO" COO"

Т-клеточный рецептор

а-цепь

а-цепь

Антигенсвязываю- щий сайт

Антигенсвязываю- щий сайт

NHZ

NHZ

NH„ NH

NH„ NH

6-цепь

6-цепь

Антигенсвязываю-щий сайт

Антигенсвязываю-щий сайт

NH2

NH2

Как и в случае с В-клетками, антигенная специфичность Т-клеток закладывается на ранних стадиях их созревания, происходящего в тимусе в отсутствие антигенов (рис. 10.70). Позже при связывании Т-клетки с клеткой, несущей чужеродный поверхностный антиген, который может связываться с TCR, ускоряется пролиферация клона Т-клеток с данной специфичностью. Например, в ответ на взаимодействие с инфицированными клетками, несущими вирусный антиген, образуется клон цитотоксичных Т-клеток. Вероятно, аналогичным образом появляется клон хелперных Т-клеток в ответ на взаимодействие незрелых Т-клеток с макрофагами, которые расщепляют антиген и несут на своей поверхности продукты этого расщепления.

Для того чтобы клетки, несущие поверхностные антигены, могли связаться с TCR, расположенным на поверхности CTL- или Т „-клетки, необходимо, чтобы на их поверхности присутствовал также белок МНС (рис. 10.75). Эти белки кодируются генными семействами, называемыми Н2 (у мышей) и HLA (у человека). HLA-комплекс занимает не менее 3-106

РИС. 10.75.

Т-клеточный рецептор, связанный как с антигеном, так и с поверхностным белком МНС. (С любезного разрешения Н. McDevitt.)

п. н. на хромосоме 6. Для ответа Т-клетке, по-види- мому, необходим тройной комплекс, состоящий из МНС, антигена и Т-клеточного рецептора. Одна группа белков МНС, называемая МНС класса 1. присутствует на поверхности большинства соматических клеток. Эти белки необходимы для узнавания и связывания цитотоксичной Т-клеткой чужеродных антигенов. Для связывания чужеродного антигена Тн-клетками антиген должен находиться в комплексе с белком МНС класса II, который присутствует на поверхности как макрофага, так и В-клеток. Гены МНС у разных особей одного вида существенно различаются, поэтому полиморфны и соответствующие белки классов I и И. Различия особей по белкам класса I лежат в основе того, что клетки и ткани, взятые от какого-то индивида, оказываются неспособны расти в окружении клеток другого индивида - явление, называемое отторжением тканей. Эти различия влияют и на аутоиммунный ответ антител на собственные антигены: нарушение толерантности. Различия по белкам класса II могут обусловливать некоторую изменчивость антигенной специфичности среди особей одного вида.

Вариабельные поверхностныеантигены трипаносом

Трипаносомии. В некоторых регионах Африки среди людей и домашних животных довольно широко распространена так называемая сонная болезнь. Ее возбудителем является простейшее Trypanosoma brucei, а переносчиком-муха цеце. Паразит размножается путем деления, достигая высокого титра в соединительных тканях и внеклеточных жидкостях, но более 99,9% клеток разрушаются с помощью иммунной системы хозяина. У некоторых организмов, устойчивых к основным антителам, через 7-10 дней наблюдается повторная вспышка численности популяции паразита. Этот процесс повторяется с 7- 10-дневными интервалами в течение месяцев (рис. 10.76), причем каждый раз происходит размножение трипаносом, несущих определенный, отличный от предыдущих случаев вариант антигена (VAT). Дикие животные могут в конце концов побороть инфекцию, но у человека и домашних животных, если их не лечить, исход обычно оказывается летальным. Смерть наступает в результате целого ряда нарушений работы иммунологической системы и инфекций ЦНС.

Уникальная особенность трипаносом, обеспечивающая им успех, состоит в их удивительной способности избегать иммунологического надзора. У нескольких организмов из всей многочисленной популяции (с частотой ~ 10 ”6 за одно клеточное деление) происходит переключение на синтез нового типа антигена, и клетки вновь начинают размножаться.

Варианты типов антигенов (VAT), Единственный антигенный детерминант, представляемый организму-хозяину,- это поверхностный гликопротеин. На плазматической мембране плотно упакованы примерно 107 молекул этого вещества. Каждый VAT имеет уникальный поверхностный антиген (он называется вариантом поверхностного гликопротеина, VSG), и потомки одной клонированной трипаносомы продуцируют 1000 и даже более разных VSG (рис. 10.76). Если особи данного вида инфицированы одним штаммом трипаносом, то в них обнаруживаются VAT одного типа. Трипаносомы, размножающиеся в слюнных железах мух цеце, которые инфицированы данным штаммом, продуцируют набор тех же антигенов. В отличие от млекопитающих, у которых в данный момент продуцируются VAT преимущественно одного вида, у мух цеце трипаносомы образуют гетерогенную в отношении антигенов популяцию. Таким образом, геном трипаносом содержит целый набор генов, кодирующих разные поверхностные антигены. Переход на синтез нового VAT происходит в результате выключения одного гена и включения дру-

РИС. 10.76.Циклический характер инфекций у кроликов, зараженных T.brucei. VAT-вариант антигена, VSG-соответствующий вариант поверхностного гликопротеина. В первом цикле значительная часть паразитов несет на своей поверхности VSG, отличные от VSG, соответствующегоРИС. 10.76.Циклический характер инфекций у кроликов, зараженных T.brucei. VAT-вариант антигена, VSG-соответствующий вариант поверхностного гликопротеина. В первом цикле значительная часть паразитов несет на своей поверхности VSG, отличные от VSG, соответствующегоVAT-N. Каждый VAT может стабильно поддерживаться путем переноса от кроликов к мышам или крысам, в которых эта циклическая инфекция несколько затухает. В 1 мл крови крысы насчитывается 109 трипаносом.VAT-N. Каждый VAT может стабильно поддерживаться путем переноса от кроликов к мышам или крысам, в которых эта циклическая инфекция несколько затухает. В 1 мл крови крысы насчитывается 109 трипаносом.того; при этом у разных клеток мухи обнаруживаются разные поверхностные антигены. Разные штаммы T.brucei имеют свои наборы поверхностных антигенов. Набор, продуцируемый одним клоном трипаносом, называется серодемом.

РИС. 10.76.

Циклический характер инфекций у кроликов, зараженных T.brucei. VAT-вариант антигена, VSG-соответствующий вариант поверхностного гликопротеина. В первом цикле значительная часть паразитов несет на своей поверхности VSG, отличные от VSG, соответствующего

РИС. 10.76.

Циклический характер инфекций у кроликов, зараженных T.brucei. VAT-вариант антигена, VSG-соответствующий вариант поверхностного гликопротеина. В первом цикле значительная часть паразитов несет на своей поверхности VSG, отличные от VSG, соответствующего

VAT-N. Каждый VAT может стабильно поддерживаться путем переноса от кроликов к мышам или крысам, в которых эта циклическая инфекция несколько затухает. В 1 мл крови крысы насчитывается 109 трипаносом.

VAT-N. Каждый VAT может стабильно поддерживаться путем переноса от кроликов к мышам или крысам, в которых эта циклическая инфекция несколько затухает. В 1 мл крови крысы насчитывается 109 трипаносом.

Каждый штамм Т. brucei не только экспрессирует определенный серодем, но и синтезирует разные антигены-члены этого серо дема-в определенном порядке. Одни VAT появляются на ранних стадиях инфекции, другие позже. Кроме того, когда паразиты проникают в уже инфицированный организм, этот порядок сохраняется. Как правило, самая первая многочисленная популяция паразита во вновь инфицированном хозяине продуцирует разнообразные VAT, а последующие популяции становятся более гомогенными (рис. 10.76).

Варианты поверхностных гликопротеинов (VSG). Несмотря на индивидуальные особенности, все VSG имеют общую структурную основу: это гомодимеры гликозилированных полипептидов длиной примерно 500 аминокислот (рис. 10.77). Все VSG гликозилированы по определенным позициям; к некоторым аминокислотам в других позициях присоединены углеводы. У самих полипептидов можно выделить вариабельную и относительно константную области. Вариабельная область находится на N-конце и содержит примерно 400 аминокислот. Константные области содержат 100 аминокислотных остатков; они находятся вблизи С-конца и сходны у всех VSG, но не идентичны. В зависимости от степени гомологии С-концов выделяют два подкласса VSG Т. brucei. Такая гомологичность присуща

мРНК

AUG

Мини-экзон, 35 нуклеотидов

Трансляция

Сигнальный пептидСигнальный пептид"Хвост""Хвост"Созревание полипептидаСозревание полипептида

Сигнальный пептид

Сигнальный пептид

"Хвост"

"Хвост"

Созревание полипептида

Созревание полипептида

Первичный продукт трансляции

Зрелый V5G

сно сно

I I I

I сно сно сно

Вариабельнаяобласть

Константная область

РИС. 10.77.

Типичный поверхностный гликопротеин T.brucei (VSG), соответствующая мРНК (ее структура была определена исходя из данных о структуре клонированной кДНК) и первичный продукт трансляции.

даже VSG, относящимся к разным серодемам. По этой причине и в особенности потому, что сайты гликозилирования находятся на С-конце VSG, наблюдается перекрестная реакция между антителами к разным очищенным VSG, а не к самим трипаносомам. Основным антигенным детерминантом трипаносомы является МН2-конец VSG. поскольку именно он выступает из мембраны.

Зрелые VSG, выделенные из трипаносом, образуются из полипептидных предшественников, которые простираются как за NH2-, так и за СООН- концы. Об этом говорят результаты сравнения структуры VSG с соответствующей мРНК и первичным продуктом трансляции (рис. 10.77). Структура VSG-мРНК была установлена на основании данных о структуре кДНК; на долю VSG приходится примерно 10% суммарных белков трипаносомы, и наличие соответствующих мРНК в больших количествах облегчает клонирование кДНК. Идентичность клонов кДНК была доказана методом HART (см. рис. 6.25) с использованием специфических антител. Типичная кДНК содержит 5'-нетранслируемую лидерную последовательность длиной примерно 100 нуклеотидов, за которой следует участок из 99 нуклеотидов, кодирующий типичный сигнальный пептид; последний состоит из 33 аминокислот и не обнаружен в VSG. Далее идут последовательности, кодирующие зрелый VSG мол. массой 50 кДа, а затем участок из 60-70 нуклеотидов, кодирующий С-концевой сегмент, который, как и сигнальный пептид, в зрелом VSG отсутствует. Этот С-концевой сегмент обладает ярко выраженными гидрофобными свойствами, что облегчает заякоривание VSG в мембране трипаносомы, и при соответствующих условиях может быть удален.

VSG-мультигенное семейство. Каждый из конкретных серодемов, продуцируемых разными клонами трипаносом, кодируется неким набором генов. Независимо от того, какой именно VSG синтезируется, в каждой трипаносоме присутствуют гены всех VSG. Есть данные, что по крайней мере часть этих генов объединена в геноме трипаносомы в кластеры. Примерно 103 VSG-генов могут быть сходны или даже идентичны, но другие гены существенно различаются. Наименее вариабельны З'-концы генов. Об этом свидетельствуют результаты блот-гибридизации субклонов из различных областей кДНК с рестрицированной геномной ДНК. 5'-концевые участки кДНК при гибридизации дают одну или несколько полос, фрагменты, взятые из середины тех же кодирующих последовательностей, обычно несколько большее их число, а З'-кон- цевые зонды-до 50 полос. Лишь небольшая часть этих зондов представляет собой совершенные повторы, поскольку с ужесточением условий гибридизации многие полосы исчезают. Интересно, что

зонды, происходящие из З'-нетранслируемой области мРНК, гибридизуются с самым большим числом геномных фрагментов.

До сих пор мы говорили о мультигенных семействах отдельных клонов T.brucei. Как соотносятся между собой генные семейства, кодирующие разные серодемы? Некоторые VSG-гены и белки присутствуют во многих (но не во всех) серодемах, другие характерны только для какого-то одного серодема. Это означает, что в отличие от большинства генов и генных семейств по крайней мере некоторые VSG-гены эволюционируют очень быстро.

Переключение экспрессии с одного гена PSG на другой. Как только трипаносомный клон переходит с образования одного VAT на синтез другого, выключается один VSG-ген и включается другой. Каждому VAT соответствует только один вид VSG-мРНК. Ранее в этой главе мы обсуждали три механизма переключения для быстрой регуляции транскрипции. При синтезе флагеллина Salmonella оперон Н2 включается и выключается в результате обратимых инверсий промотора. При инверсии G-сегмента в геноме фага Ми промотор остается на месте, но определенные гены перемещаются в положение правее промотора. У дрожжей при переключении типа спаривания сегменты, содержащие соответствующие гены и промоторы, перемещаются в активный участок генома. Именно этот последний механизм используют трипаносомы для переключения генов VSG, но не в чистом виде, а с некоторыми модификациями, еще не до конца установленными. Ясно одно: для трипаносом и других простейших характерны уникальность, с одной стороны, и изменчивость-с другой.

Связь экспрессирующихся генов VSG с теломерными областями хромосом трипаносомы. Экспрессирующиеся гены VSG были идентифицированы с помощью блот-гибридизации в жестких условиях зондов кДНК с геномной ДНК, а также благодаря повышенной чувствительности этих генов в составе хроматина к ДНКазе 1 (разд. 8.7.а). Весьма своеобразны карты этих сегментов, особенно последовательностей, фланкирующих экспрессирующиеся гены VSG (рис. 10.78).

К 5'-концу экспрессирующегося гена часто примыкает участок, не содержащий эндонуклеазных сайтов (рис. 10.78, Б). По мере удаления от 5'-конца карты приобретают более обычный вид. Расстояние между кодирующей частью VSG и эндонуклеазными сайтами перед 5'-концом гена может различаться даже для ДНК из двух разных клонов трипаносом, кодирующих одинаковые VSG (ср. рис. 10.78, Б и 5). Эта ситуация сохраняется, несмотря на то что организация эндонуклеазных сайтов в 5'-дистальном кластере может быть одинаковой, свидетельствуя об

В Bg ESPvhII III IJВ Bg ESPvhII III IJЭкспрессияВыкл.Вкл.ЭкспрессияВыкл.Вкл.

В Bg ESPvh

II III I

J

В Bg ESPvh

II III I

J

Экспрессия

Выкл.

Вкл.

Экспрессия

Выкл.

Вкл.

А. Тан демный повтор ВС в крупных хромосомах BEЕЕ

1 II I 2_ 1—-w- — г^ч—t—s

76п.н.-повторы

Б. Одна из ELC-копий Убб-гена 2

Вкл.

Г. ВС-копия геназ, расположенная в теломерной области ВН Xm Xh В

т Выкл.или вкл.

Д. Ген 3 может переместиться в другой сайт экспрессии

Вкл.

Примерно 25 т.п.н.

РИС. 10.78.

Связь между основной (ВС) и экспрессируемой (ELC) копиями VSG-генов (без соблюдения масштаба). Кодирующие участки выделены цветом. Транспозирован- ные единицы включают последовательности, расположенные к 5'-концу от кодирующего участка. Вертикальные линии - повторы длиной 76 п. н. (их число не соответствует указанному на рисунке). Обычно с ELC связано больше повторов, чем с ВС. А. Тандемный повтор ВС (1 и 2), локализованный во внутренней области крупной хромосомы. Б. Структура одной из

одинаковом расположении VSG-генов в обоих клонах. Вариабельность длины участка, примыкающего к 5'-концу гена, связана с различием в числе тандемных повторов длиной 76 п. н.

Участок, примыкающий к З'-концу экспрессирующихся генов, также содержит очень немного эндо- нуклеазных сайтов (рис. 10.78, Б, В, Д). Более того, карты нельзя продолжить на расстояние более 5- 10 т.п.н. от З'-конца гена VSG. Независимо от того, какая именно эндонуклеаза используется, в результате рестрикции получается фрагмент, один конец которого находится в этой «конечной» позиции. Кроме того, если перед расщеплением рестриктазой препараты ДНК обработать Ва13\ (разд. 4.1.в), то получатся более короткие фрагменты. Все это

ELC-копий гена 2 после транспозиции. В. Структура другой ELC-копии гена 2. Расстояние между геном и кластером сайтов рестрикции на дистальном конце теломеры (Т) различно для случаев Б и В. Находятся ли эти две ELC на разных теломерах или на одной и той же, неясно. Г. Структура теломерной ВС гена 3. Ген в этом сайте может быть как молчащим, так и экспрессируемым. Д. ELC гена 3 после перемещения в другую теломеру.

объясняется тем, что «конец» представляет собой реальный предшествовавший конец дуплексной ДНК. Экспрессирующиеся гены VSG всегда расположены вблизи теломеры, и их З'-конец ориентирован в сторону теломеры.

T.brucei имеет примерно 100 хромосом. Многие из них очень малы: менее 106 п. н. Экспрессирующиеся VSG-гены обнаружены по крайней мере в трех разных теломерных областях, но точное число потенциально активных теломерных локусов неизвестно. Однако ясно, что локализация гена в области теломеры - необходимое, но не достаточное условие экспрессии. Помимо одного, экспрессирующегося в данный момент времени гена, в области теломеры могут находиться и другие, молчащие VSG-гены (рис. 10.78, Г). Они могут включаться без

изменения своей локализации. Существуют и другие молчащие VSG-гены, расположенные не в области теломеры, а во внутренних хромосомных локусах (рис. 10.78, Л). Прежде чем экспрессироваться, копии этих генов перемещаются в теломерные сайты. Сходным образом некоторые теломерные молчащие VSG-гены перед экспрессией подвергаются дуп- ликативной транспозиции в другую теломеру (рис. 10.78, Г, Ду Таким образом, для экспрессии одного из VSG-генов необходимо, чтобы 1) этот ген находился в нужной области теломеры; 2) эта область была активирована; 3) VSG-гены в других потенциально активных областях теломеры были молчащими. Несмотря на то что некоторые способы встраивания VSG-генов в потенциально экспрессируемые области теломер установлены, механизм активации и инактивации экспрессии генов в этих областях остается неизвестным. Результаты некоторых недавно проведенных экспериментов наводят на мысль, что отсутствие генной экспрессии обусловливается какими-то локальными модификациями остатков цитозина. В «молчащих» областях теломеры, в отличие от транскрибируемых областей, Рин11- и Pst 1-сайты не подвергаются расщеплению.

Встраивание VSG-генов в потенциально активные теломерные области. Установлены некоторые способы встраивания VSG-генов в потенциально активные теломерные области. Одна из копий молчащего гена, так называемая основная копия (basic сору, ВС), с помощью дупликативной транспозиции может встроиться в потенциально активную теломерную область. При этом молчащий ген может находиться как во внутренней области хромосомы, так и в неактивной теломере (рис. 10.79, Л или Б). Наиболее вероятный механизм включения VSG- гена-дупликативная транспозиция по типу генной конверсии, которая происходит у дрожжей при переключении типа спаривания. Следовательно, штамм, синтезирующий определенный VSG. часто имеет на

одну копию соответствующего гена больше, чем несинтезирующий штамм. При следующем переключении эта дополнительная копия обычно, но не всегда, утрачивается, и ее место может занять другой VSG-ген. Помимо дупликативной транспозиции за перемещение VSG-гена из молчащей теломеры в потенциально активную может быть ответственна реципрокная рекомбинация (рис. 10.79, В). В этом случае активный ген не утрачивается и может реактивироваться в результате последующего переноса. Все эти типы переключений выявляются с помощью импульсного гель-электрофореза и ДНК-блоттинга (рис. 10.80).

На рис. 10.78 (Л, Б и 5) представлена структура основной копии VSG-гена, расположенной во внутренней области хромосомы, и двух транспозирован- ных экспрессирующихся копий (ELC; от англ, expression-linked copies) гена из двух разных клонов трипаносомы. Структура ВС была получена с использованием фаговых и космидных клонов, отобранных из геномных библиотек с помощью гибридизации с кДНК-зондами. Клонирование ELC из транспозируемых VSG-генов в Е. coli затруднено нестабильностью их последовательностей. Поэтому данные о структуре ELC были получены отчасти путем блот-геномной гибридизации ДНК с субкло- нированными ВС-зондами, а отчасти с помощью секвенирования коротких субклонированных участков EEC. Размер транспозируемых ELC-единиц варьирует от 1 до 40 т. п. н., но чаще всего составляет примерно 3 т. п. н. Они содержат последовательности, присутствующие в зрелой мРНК, а также 5'-фланкирующие участки разной длины, которых нет в мРНК. З'-конец транспозируемой единицы близок к З'-концу гена. Области ELC и ВС за пределами самой транспозируемой единицы не гомологичны между собой. Отметим, что участок вблизи 5'-конца ВС содержит несколько тандемно повторяющихся элементов длиной 76 п. н., которые

Реципрокная транслокация В

Дупликативная транспозиция АБ

РИС. 10.79.

Три способа встраивания генов VSG в экспрессируемые теломерные области. Дупликативные транспозиции из внутреннего хромосомного сайта (А) или из другой теломеры (6), по-видимому, сопровождаются генной

конверсией. При каждом новом встраивании ранее активный ген или утрачивается (дупликативная транспозиция), или перемещается в новый сайт (реципрокная транслокация; BY

в гораздо большем количестве присутствуют вблизи 5'-конца ELC из теломер. Таким образом, транспозиция в сайт экспрессии может сопровождаться спариванием этих повторов, причем в рекомбинационных событиях могут участвовать разные копии. В результате даже при транспозиции в один и тот же сайт экспрессии расстояния между VSG-геном и расположенными левее эндонуклеазными сайтами могут быть разными.

З'-конец транспозируемой единицы обладает не менее интересными особенностями, чем 5'-конец. Напомним, например, о необычайно консервативных З'-концевых кодирующих последовательностях у сильно различающихся в остальном отношении VSG-генов. Еще более консервативен З'-нетрансли- руемый участок различных ВС, EEC и кДНК. Напротив, у множества других мультигенных семейств гомологичные кодирующие участки ассоциированы с высокодивергированными З'-нетранслируемыми последовательностями. В чем смысл необычной консервативности З'-нетранслируемых участков? Частично ответ на этот вопрос дает детальное сравнение З'-нетранслируемого участка мРНК (и ELC) с соответствующими ВС. В основном кДНК и ВС сходны, но все же не идентичны: различия состоят в единичных нуклеотидных заменах и небольших делециях. Впрочем, иногда кДНК оказываются полностью идентичными соответствующим ВС. Эти факты можно объяснить тем, что при дупликативной транспозиции одной из копий ВС происходит не только спаривание тандемных повторов длиной 76 п. н. на 5'-конце, но и гомологичная рекомбинация на З'-конце транспозируемой единицы и З'-конце VSG-гена. Вследствие миграции ветви точка кроссинговера может находиться в любом месте гомологичного участка, который начинается внутри З'-кодирующей области и продолжается до конца нетранслируемого участка (разд. 2.4.6). Таким образом, EEC могут представлять собой мозаику последовательностей, часть которых происходит от старого гена, а часть-от встроенного. Заметим, что в таком случае могли бы существовать два фактора, дающие вклад в давление отбора, направленное на обеспечение консервативности З'-конца: 1) сохранение структуры С-концов VSG- генов и 2) сохранение последовательности, которая обеспечивает гомологичность рекомбинации.

Транскрипция генов VSG. Для экспрессии генов VSG необходимо, чтобы они находились в определенных областях теломеры. Но, как мы уже говорили, это лишь одно из условий экспрессии, поскольку некоторые VSG-гены остаются молчащими даже в этом случае (рис. 10.80). Каков же механизм переключения гена из одного состояния в другое? Ответа на этот вопрос мы не знаем, хотя некоторые данные на этот счет имеются. Например, экспрес-

Перемгоченме

VAT-AVAT-B VAT А'

VSG-AVSG-BVSG-A'

■ Зонд-VSG-A-reH■

И Зонд-VSG-В-генQ

Зонд-"аноннмная" ДНК

РИС. 10.80.

Геномные перестройки, приводящие к переключению синтеза с VSG-А на VSG-В и обратно (VSG-А') в одном из трипаносомных клонов. В каждой колонке суммированы результаты блот-гибридизации нерасщепленных хромосом трипаносомы, разделенных с помощью импульсного гель-злектрофореза (разд. 6.5). Каждая полоса отвечает сегменту ДНК, гибридизующемуся со специфическим зондом (см. разъяснения в нижней части рисунка). Гены VSG изображены в виде прямоугольников, которые выделены цветом, если ген экспрессируется в исследуемых VAT-клетках. В VAT-A- клетках экспрессируется ген VSG-А, который находится в теломерной области хромосомы размером примерно 2000 т. п. н. Вторая, молчащая копия гена VSG-А локализуется в крупной хромосоме, которая остается вверху пластины электрофорезного геля. VAT-A содержит также молчащую копию гена VSG-В, локализованную в теломере. После переключения в фазу VAT-В теломерный ген VSG-А становится молчащим, но остается в ранее активной теломере. Копия теломерного VSG-B встраивается в активную теломеру хромосомы длиной 340 т. п. н.; при этом, по-видимому, происходит дуп- ликативная транспозиция участка размером 90 т. п. н., поскольку длина реципиентной хромосомы увеличивается до 430 т. п. н. (эту хромосому выявляют на радиоавтографе по гибридизации с анонимной пробой, специфичной для данной хромосомы), и вновь начинается экспрессия VSG-A (VAT-A'). Исходно активный ген VSG-В перемещается с помощью рекомбинации из экспрессируемого сайта в крупную хромосому (вверху геля) и становится молчащим, а от ранее активной хромосомы остается сегмент длиной 140 т. п.н. Ген VSG-А реактивируется без изменения своей локализации. [Из работы С. Shea et al., J. Biol. Chem. 261 (1986), p. 6056, с изменениями.]

сирующиеся VSG-гены находятся на большем расстоянии от конца хромосомы, чем не экспрессирующиеся. Есть и другой, более интересный факт: необычные свойства 5'-концов соответствующих мРНК и длина транскрипционных единиц.

5'-фланкирующий участок VSG-мРНК существенно отличается от соответствующего участка ELC, с которого он транскрибируется (рис. 10.81). Во-первых, он начинается с нетранслируемого участка длиной 35 пар оснований, ни в чем не напоминающего область, примыкающую к EEC, и, во-вторых, он содержит делеции. Аналогичные участки длиной 35 п. н. присутствуют перед всеми мРНК VSG, а также перед большинством (а возможно, перед всеми) мРНК трипаносом. Они входят в состав сегмента длиной 1.4 т. п. н., повторяющегося в геноме трипаносомы примерно 200 раз. Большинство таких единиц-это прямые тандемные повторы, но некоторые из них диспергированы. Повторы транскрибируются in vivo с образованием кэпированных РНК длиной 140 нуклеотидов (medPHK, от англ, mini exon derived), несущих на 5'-конце сегмент длиной 35 п. н. Транскрипция, по-видимому, осуществляется с помощью РНК-полимеразы II. Синтез мРНК трипаносом-будь то мРНК VSG или других белков- сопряжен с переносом кэпированного 5'-сегмента длиной 35 п. н. с medPHK на транскрипт кодирующего участка. Поскольку концентрация medPHK у трипаносом обычно бывает высокой, вряд ли они участвуют в транскрипционной регуляции экспрессии генов VSG. По-видимому, регуляция осуществляется на уровне транскрипции в самом сайте экспрессии.

Способные к экспрессии теломерные локусы, где находятся VSG-гены, могут быть как транскрип- ционно активными, так и неактивными и лишь в очень редких случаях (во время самого переключения) в одной клетке одновременно функциониру-

РИС. 10.81.

5-конец VSG-мРНК (и других трипаносомных РНК) является кзпированным 35-нуклеотидным мини-зкзо- ном, который не представлен в ELC (Т-это теломера). Помимо концевого гуанозина (m7G) модифицированы еще четыре остатка. Два из них, А и С, 2'-0-метилиро- ваны, а структура двух других, А и U (они отмечены звездочками), неизвестна. [К. L. Perry, К. Р. Watkins, N. Agabian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), p. 8190.)

ют несколько таких локусов. Транскрипция может начаться на расстоянии до 60 т. п. н. перед VSG-геном. Помимо VSG-области, этот длинный первичный транскрипт содержит несколько неродственных кодирующих участков. Для образования функциональной VSG-мРНК к области первичного транскрипта, содержащей VSG-кодирующую последовательность, должна присоединиться medPHK (рис. 10.82). Эти две РНК соединяются с помощью транс-сплайсинга (разд. 8.5.г), в результате прямого сочленения экзона длиной 35 п. н. с VSG-кодиру- ющим участком (рис. 10.82). З'-конец medPHK длиной 100 нуклеотидов отделяется от полиаденили- рованной части трипаносомной РНК с помощью дебранчинг-фермента из клеток человека. Это предопределяется Y-подобной структурой побочного продукта транс-сплайсинга (разд. 8.5.г). Аналогичным образом могут образоваться функциональные мРНК кодирующих последовательностей, расположенных перед VSG-геном.

Несмотря на то что образование VSG-мРНК изучено во всех деталях, механизм включения и выключения самого сайта экспрессии неясен. Транскрипция VSG-генов не блокируется даже при очень высоких концентрациях п-аманитина, а в области промотора обнаружены последовательности, сходные с промоторами трипаносомной рДНК. Таким образом, возможно, в транскрипции участвует РНК- полимераза I. Высказывалось интересное предположение, состоящее в том, что активная транскрипция осуществляется в ядрышке, где, как известно, находится большая часть (а возможно, и вся) РНК-полимераза I. В таком случае в качестве регулятора транскрипции может выступать процесс перехода сайта экспрессии в ядрышко.

10.7. ЗАПРОГРАММИРОВАННЫЕАМПЛИФИКАЦИЯ И МОДУЛЯЦИЯЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ

В регуляции генной экспрессии в процессе развития иногда участвует запрограммированная амплификация специфических сегментов ДНК. Это четко показано для некоторых простейших, беспозвоночных и позвоночных. В каждом случае в результате амплификации в специфических клетках в определенный момент времени образуется огромное число генных копий, в результате чего синтезируется большое количество важного генного продукта. Однако молекулярные стратегии, используемые для амплификации в конкретных случаях, существенно различаются.

Тандемные повторы тебДНКТандемные повторы тебДНКГен VSGГен VSGРИС. 10.82.

Тандемные повторы тебДНК

Тандемные повторы тебДНК

Ген VSG

Ген VSG

Образование VSG-мРНК. Матрицей для синтеза medPHK служат тандемные повторы е medflHK. Кодирующая область VSG-гена представлена как часть значительно более длинного первичного транскрипта. medPHK и

длинный VSG-транскрипт соединяются друг с другом в результате /прамс-сплайсинга с образованием побочного продукта Y-PHK. [LH.T. Van der Ploeg, Cell 47 (1986), p. 479.]

Непропорциональная репликация:хорионические гены дрозофилы

Высокие требования к белкам оболочки яйца. За непродолжительное время оогенеза у насекомых фолликулярные клетки яичника, окружающие созревающий ооцит, должны секретировать огромное количество различных белков, которые формируют хорион (оболочку яйца). У некоторых насекомых эта краткосрочная проблема решается путем быстрой и эффективной транскрипции высокоповторяющихся хорионических генов, которые составляют часть генома соматических клеток и клеток зародышевой линии. У Drosophila в нормальном гаплоидном геноме имеются лишь единичные копии генов различных белков хориона, но примерно за 18 ч до начала синтеза этих белков в фолликулярных клетках начинается амплификация соответствующих генов, которые затем в течение 5 ч интенсивно экспрессируются.

Некоторые из 20-50 различных хорионических генов Drosophila образуют два кластера; один клас

тер из четырех тандемно расположенных генов находится на хромосоме 3, а другой из шести генов - на Х-хромосоме (рис. 10.83). Амплификация этих геномных областей в фолликулярных клетках была прямо показана путем оценки изменений числа копий определенных рестрикционных фрагментов, полученных из клонированных генов. Было показано, например, что в Х-хромосоме область, содержащая сами гены, амплифицирована почти 15 раз. Фланкирующие эту область последовательности амплифи- цированы в меньшей степени, причем число копий тем меньше, чем дальше они находятся от генного кластера. Участки, удаленные от кластера на 40 т. п. н., амплифицированы только два раза. Другая характерная особенность амплификации состоит в том, что в результате нее не образуется никаких новых рестрикционных фрагментов, которые гиб- ридизовались бы с зондами из амплифицированной области. Таким образом, никаких новых комбинаций из сегментов ДНК не появляется. Наличие градиента амплификации и отсутствие рекомбинации позволяют предложить некий механизм увеличения числа копий хорионических генов.

ЕгоМсайтыЕгоМсайтыПерекрывающиесяУклонированные ЗондыПерекрывающиесяУклонированные Зонды

ЕгоМсайты

ЕгоМсайты

Перекрывающиеся

Уклонированные Зонды

Перекрывающиеся

Уклонированные Зонды

РИС. 10.83.

Амплификация ДНК в области кластера хорионических генов на X-хромосоме в фолликулярных клетках Drosophila. В верхней части рисунка изображен сегмент длиной 100 т.п н., содержащий четыре гена хорионического белка (выделены цветом). Стрелки указывают сайты расщепления эндонуклеазой fcoRI Ниже представлен набор перекрывающихся фрагментов этой области которые служили зондами при блот-гиб- ридизации с рестрицированными £соЯ! геномными ДНК из эмбриональных и фолликулярных клеток. Относительное число копий каждого ЕсоRl-фрагмента определяли из соотношения радиоактив ностей зондов, гибридизующихся с ДНК из фолликулярных и эмбриональных клеток (внизу). Число копий каждого фрагмента в эмбриональных клетках было принято за единицу [А. С. Spradling, Cell 27 (1981), р 193 ]

Амплификация путем непропорциональной репликации. Представим, что сайт начала репликации находится вблизи кластера генов и что синтез ДНК протекает в обе стороны от этого сайта. Через некоторое время в этой же точке начинается второй раунд репликации, затем третий и т. д. ив результате образуется множество копий данной области (рис. 10 84) Более того, поскольку каждая следующая репликативная вилка короче предыдущей, по обе стороны от точки начала репликации возникает градиент числа копий. Вновь образующиеся копии не связаны ковалентно ни друг с другом, ни с исходной дуплексной ДНК, поэтому новых комбинаций ДНК не возникает. Эта модель предполагает, что в данном случае происходит ослабление нормального контроля, запрещающего многократную инициацию репликации в одной точке. Это представляется вероятным, поскольку амплификация хорионических генов продолжается даже после прекращения нормального синтеза ДНК в фолликулярных клетках. Адекватность модели была убедительно показана в результате электронно-микроскопического изучения амплифицированной ДНК из фолликулярных клеток (рис. 10.85). Полученная микрофотография полностью соответствует одной из половинок модели, представленной на рис 10.84.

Способностью к амплификации обладают короткие, менее 5 т. п. н„ сегменты ДНК, расположенные в области хорионических генов в хромосомах

3 и X. Если эти сегменты встраиваются в другие геномные сайты, то последние начинают временно амплифицироваться в фолликулярных клетках. Встраивание таких дополнительных копий элементов, контролирующих амплификацию, осуществляется путем включения их в P-элементы (с помощью рекомбинации in vitro и клонирования) и последующего введения содержащего этот P-элемент вектора в эмбрион Drosophila на ранних стадиях развития (разд. 10.2.6).

рДНК Xenopus: амплификацияпо типу катящегося кольца

Хотя геномы большинства организмов и так содержат многочисленные копии рДНК (разд. 9.2.а), в ооцитах эти гены иногда амплифицированы в еще большей степени, что создает необходимые предпосылки для эмбриогенеза. Наиболее полно изученный пример такого рода Xenopus, у которой 600 (гаплоидных) геномных копий рДНК амплифнци- рованы более чем тысячекратно и содержатся в ядрышках.

Амплификация происходит в две стадии: в примордиальной зародышевой клетке образуется небольшое число копий рДНК, а затем во время мейоза происходит массовая амплификация по механизму катящегося кольца (разд. 2.1.ж). Конечные продукты представляют собой крупные кольцевые

Следующие раунды репликации

Обратите внимание, что связаны между собой только две исходные цепи ДНК. [G. Stark, G. М. Wahl, Ann. Rev. Biochem. 53 (1984), p. 478.]

РИС. 10.84.

Схематическое представление амплификации в результате множественных инициаций двунаправленного синтеза ДНК в одном сайте (модель «кожицы лука»).

молекулы ДНК, каждая из которых содержит до 100 повторяющихся рДНК-единиц. В отличие от обычных повторов геномной рДНК, в которых длина межгенного спейсера (IGS) варьирует, большинство 1GS в кольцевых внехромосомных рДНК имеют одинаковую длину. Создается впечатление, что родоначальником кольцевых ДНК в каждом ооците служит один или несколько хромосомных генов.

Однако в разных ооцитах даже в пределах единственного организма амплифицируются разные повторы геномной рДНК и IGS имеют разную длину. Суммарное число копий рДНК, по-видимому, находится под контролем, и после оплодотворения амплификации не происходит. Как именно одна повторяющаяся рДНК-единица включается в катящееся кольцо-остается загадкой.

РИС. 10.85.Электронная микрофотография ДНК из фолликулярных клеток Drosophila, в которой происходит амплификация хорионических генов. Стрелками указаны реп- ликационные вилки. Точки едоль ДНК-нуклеосомы. Кружком отмечена транскрибирующаяся область (цепь РНК усеяна рибонуклеопротеиноеыми частицами). [С любезного разрешения Y. N. Osheim, О. L. Miller, Jr., Cell 33 (1983), р. 543. Copyright Cell Press.]РИС. 10.85.Электронная микрофотография ДНК из фолликулярных клеток Drosophila, в которой происходит амплификация хорионических генов. Стрелками указаны реп- ликационные вилки. Точки едоль ДНК-нуклеосомы. Кружком отмечена транскрибирующаяся область (цепь РНК усеяна рибонуклеопротеиноеыми частицами). [С любезного разрешения Y. N. Osheim, О. L. Miller, Jr., Cell 33 (1983), р. 543. Copyright Cell Press.]

РИС. 10.85.

Электронная микрофотография ДНК из фолликулярных клеток Drosophila, в которой происходит амплификация хорионических генов. Стрелками указаны реп- ликационные вилки. Точки едоль ДНК-нуклеосомы. Кружком отмечена транскрибирующаяся область (цепь РНК усеяна рибонуклеопротеиноеыми частицами). [С любезного разрешения Y. N. Osheim, О. L. Miller, Jr., Cell 33 (1983), р. 543. Copyright Cell Press.]

РИС. 10.85.

Электронная микрофотография ДНК из фолликулярных клеток Drosophila, в которой происходит амплификация хорионических генов. Стрелками указаны реп- ликационные вилки. Точки едоль ДНК-нуклеосомы. Кружком отмечена транскрибирующаяся область (цепь РНК усеяна рибонуклеопротеиноеыми частицами). [С любезного разрешения Y. N. Osheim, О. L. Miller, Jr., Cell 33 (1983), р. 543. Copyright Cell Press.]

Амплификация рДНК Tetrahymena в макронуклеусах

У жгутиковых простейших при формировании транскрипционно активных макронуклеусов ДНК клеток зародышевой линии разбивается на сотни фрагментов (разд. 9.6.6). Одновременно утрачивается часть ДНК микронуклеуса, к сегментам ДНК макронуклеуса добавляются теломерные последовательности и большинство этих сегментов ампли- фицируются примерно 45 раз. Однако фрагменты, содержащие рДНК. амплифицируются в значительно большей степени: число их копий достигает 104 и они упаковываются во множество ядрышек. Такая структура макронуклеарной ДНК и число ее копий сохраняются во время амитотической вегетативной репликации макронуклеуса. Напротив, ДНК микронуклеуса содержит лишь одну (гаплоидную) копию генов рибосомной РНК. О механизме репликации рДНК, создающем такую предпочтительность, известно мало. Каждый фрагмент рДНК макронуклеуса содержит две полноразмерные транскрипционные единицы рДНК и нетранскрибируемый сегмент длиной примерно 4 т. п. н. (рис. 10.86). Эти две половины молекул представляют собой инвертированные друг относительно друга повторы; весь фрагмент, таким образом, является палиндромом. Его репликация начинается с сайтов, лежащих в центральных IGS-участках, и расходится от них в обоих направлениях к концам фрагмента. Последовательности внутри IGS, необходимые для эффективной репликации рДНК, перекрываются с энхансерами (разд. 8.2), указывая на связь между репликацией рДНК и регуляцией транскрипции.

10.8. ^ЗАПРОГРАММИРОВАННЫЕ

ТАНДЕМНЫЕ АМПЛИФИКАЦИИ

Если в результате мутации или действия специфического ингибитора активность какого-то важного генного продукта становится недостаточной, то часто обнаруживаются мутантные клетки, в которых данный генный продукт синтезируется в большем, чем обычно, количестве. У многих таких клеток имеются многочисленные тандемные повторы соответствующего гена, в результате чего продуцируются избыточные количества мРНК и соответствующих полипептидов. Способностью к такой амплификации генов обладают как бактерии, так и разнообразные эукариотические клетки в культуре. Амплификация происходит и в опухолевых клетках. Как правило, это довольно редкие события, остается посмотреть, как часто наблюдается амплификация в нормальных соматических клетках.

Микронуклеус,! копия (гаплоид)Микронуклеус,! копия (гаплоид)Вырезание, присоединение теломерыВырезание, присоединение теломерыВозможный промежуточный продукт длиной 11Т.П.Н.™г х - - ТеломераВозможный промежуточный продукт длиной 11Т.П.Н.™г х - - Теломера। Образование палиндрома, 1 амплификация। Образование палиндрома, 1 амплификацияМакронуклеус, 104 копийМакронуклеус, 104 копийЦентр палиндрома,точка начала репликацииЦентр палиндрома,точка начала репликацииI1III1050510т. п.н.I1III1050510т. п.н.

Микронуклеус,! копия (гаплоид)

Микронуклеус,! копия (гаплоид)

Вырезание, присоединение теломеры

Вырезание, присоединение теломеры

Возможный промежуточный продукт длиной 11Т.П.Н.

™г х - - Теломера

Возможный промежуточный продукт длиной 11Т.П.Н.

™г х - - Теломера

। Образование палиндрома, 1 амплификация

। Образование палиндрома, 1 амплификация

Макронуклеус, 104 копий

Макронуклеус, 104 копий

Центр палиндрома,точка начала репликации

Центр палиндрома,точка начала репликации

I1III

1050510

т. п.н.

I1III

1050510

т. п.н.

РИС. 10.86.

Единичный генный локус микронуклеарной рРНК Tetrahymena и возможный способ его вырезания и амплификации во фрагментах макронуклеар- ной ДНК. [D.D. Larson et al.. Cell 47 (1986), P. 229 ]

Амплификации, позволяющиекомпенсировать ферментнуюнедостаточность

Устойчивость к лекарственным веществам и амплификация генов. Если обработать клетки ингибиторами (лекарственными веществами), которые действуют специфическим образом на какой-то ключевой фермент, то погибнут все клетки, за исключением резистентных к этому ингибитору мутантов. Две такие системы ингибитор фермент представлены на рис. 10.87. Аналог фолиевой кислоты метотрексат (аметоптерин) ингибирует дигид- рофолатредуктазу (ДГФР), которая катализирует синтез тетрагидрофолата метаболита, необходимого, например, для образования dTMP. М-(фос- фонацетил)-Е-аспартат (ФАЛА) ингибирует аспар- тат-карбамоилтрансферазу- фермент, принимающий участие в биосинтезе пиримидиновых нуклеотидов. Если клетки в культуре обработать этими ингибиторами в низкой концентрации (например, 10"8 М метотрексатом), то можно отобрать несколько (одну из 106-107) резистентных клеток. Если выращивать эти клетки при более высоких концентрациях ингибитора, то вновь образуется несколько колоний. Так постепенно можно получить клетки, устойчивые к очень высоким концентрациям лекарственных веществ (например, к 10"3 М мето

трексату). Многие такие резистентные клетки преодолевают действие ингибитора, продуцируя в большом количестве как ингибируемый фермент, так и соответствующую мРНК. В основе повышения уровня синтеза мРНК и фермента лежит амплификация единственного гена дигидрофолат- редуктазы или аспартат-карбамоилтрансферазы.

Клетки, высокорезистентные к лекарственным веществам, представляют собой богатый источник мРНК, которую можно очистить и клонировать в виде кДНК. В свою очередь, имея клонированную кДНК, можно точно определить концентрацию мРНК и число копий соответствующего гена. В табл. 10.6 представлен пример поэтапного отбора высокоустойчивых к ФАЛА клеток. Клетки, полученные на каждом из этапов, устойчивы к более высоким концентрациям ФАЛА, чем клетки на предыдущем этапе. Повышение устойчивости сопровождается увеличением содержания в клетках аспартат-карбамоилтрансферазы. Кинетический анализ с использованием к ДНК-зондов и РНК или ДНК, выделенных из резистентных клеток, показывает, что увеличивается число копий как мРНК, так и соответствующего гена.

Характерен ли рассматриваемый феномен только для тех двух генов, о которых мы говорим, или амплификация-более универсальное явление? В табл. 10.7 представлено несколько других систем,

АспартатКарбамоилфоссратАспартатКарбамоилфоссратН-(фосфонацетил)-Е-аспартат

Аспартат

Карбамоилфоссрат

Аспартат

Карбамоилфоссрат

I(ФАЛА)

у - / • N-карбамиласпартат

Асп артат-карбамоилтрансфераза

РИС. 10.87.

Ингибирование дигидрофолатредуктазы метотрексатом (А) и аспартат-карбамоилтрансферазы М-(фосфонаце- тил)-1_-аспартатом (ФАЛА) (Б).

в которых были отобраны клетки с амплифици- рованными генами. Заметим, что в одном из случаев отбор клеток с амплифицированными генами не зависел от применяемого лекарственного вещества. Результаты всех этих опытов наводят на мысль, что амплификация многих сегментов генома в культивируемых клетках происходит спонтанно, хотя и с низкой частотой (10-4 10-7 в зависимости от системы). Эта спонтанность означает, что давление отбора-просто механизм, позволяющий выявить эти редкие события.

Реверсия мутантного фенотипа, происходящая в результате генной амплификации. Дополнительные указания на возможность спонтанных ампли

фикаций ДНК в эукариотических клетках дает анализ вторичных мутаций, изменяющих мутантный фенотип. Фермент гипоксантин-гуанин -фосфорибо- зилтрансфераза (ГГФРТаза) ответствен за утилизацию пуринов в животных клетках (рис. 5.32). Клетки, мутантные по гену hprt, синтезируют малоактивную форму ГГФРТазы и не растут на среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда HAT), поскольку аминоптерин - близкий родственник метотрексата-блокирует синтез de novo пуриновых нуклеотидов (рис. 10.87), что препятствует эффективному использованию гипоксантина. В клетках-ревертантах, хорошо растущих на среде HAT, ген hprt часто бывает амплифицирован, в одном случае до 50 раз. Эти клетки синтезируют большое количество мРНК мутантной ГГФРТазы, и содержание данного белка в них почти в 50 раз превышает таковое в клетках дикого типа (табл. 10.7). На то, что этот избыточный белок представляет собой именно мутантную форму, указывают его необычные кинетические свойства и нестабильность. Итак, клонированные клетки, содержащие единственный мутантный ген hprt, кодирующий нестабильный фермент, дают ревертантов с амплифи- цированным мутантным геном, в которых синтезируется огромное количество дефектного фермента. Недостаток качественного фермента компенсируется количеством мутантной формы.

Структура амплифицированныхгенов

ЛинияклетокКонцентрация ФАЛАОтносительное содержаниеОтноситель--1-аспартат-карбамоилтранс-Cot*1ное чиС-поусловия, вусловия, приферазы'копий генакоторых про- которых рост - изводитсяподавляется мРНКферментотборна 50%Дикий типА ВС0 мМ6 мкМ11298010,1 мМ1,6 мМ6,66,42251310 мМ17мМ4225545525 мМ34 мМ687325190ЛинияклетокКонцентрация ФАЛАОтносительное содержаниеОтноситель--1-аспартат-карбамоилтранс-Cot*1ное чиС-поусловия, вусловия, приферазы'копий генакоторых про- которых рост - изводитсяподавляется мРНКферментотборна 50%Дикий типА ВС0 мМ6 мкМ11298010,1 мМ1,6 мМ6,66,42251310 мМ17мМ4225545525 мМ34 мМ687325190Таблица 10.6. Отбор клеток сирийского хомячка, устойчивых к ФАЛАТаблица 10.6. Отбор клеток сирийского хомячка, устойчивых к ФАЛА11 Указаны значения Cot0 5 для ДНК сирийского хомячка, полученные при отжиге с аспартат-карбамоилтрансферазной кДНК (разд. 7.5.6). [G. М. Wahl, R. A. Padgett. G. R. Stark J. Biol. Chem. 2S4 (1978), p. 8679.]11 Указаны значения Cot0 5 для ДНК сирийского хомячка, полученные при отжиге с аспартат-карбамоилтрансферазной кДНК (разд. 7.5.6). [G. М. Wahl, R. A. Padgett. G. R. Stark J. Biol. Chem. 2S4 (1978), p. 8679.]Изменения нуклеотидной последовательности. Амплифицированная единица содержит помимо самого гена еще и другие последовательности. Обычно амплифицированные сегменты содержат регуляторные последовательности, которые фланкируют транскрипционную единицу, кодирующий участок, интроны, а также другие протяженные последовательности. Повторяющиеся единицы образуют тандем, а некоторые из них содержат инвертиро-

Линия

клеток

Концентрация ФАЛАОтносительное содержаниеОтноситель-

-1-аспартат-карбамоилтранс-Cot*1ное чиС-по

условия, вусловия, приферазы'копий гена

которых про- которых рост - изводитсяподавляется мРНКфермент

отборна 50%

Дикий тип

А В

С

0 мМ6 мкМ1129801

0,1 мМ1,6 мМ6,66,422513

10 мМ17мМ42255455

25 мМ34 мМ687325190

Линия

клеток

Концентрация ФАЛАОтносительное содержаниеОтноситель-

-1-аспартат-карбамоилтранс-Cot*1ное чиС-по

условия, вусловия, приферазы'копий гена

которых про- которых рост - изводитсяподавляется мРНКфермент

отборна 50%

Дикий тип

А В

С

0 мМ6 мкМ1129801

0,1 мМ1,6 мМ6,66,422513

10 мМ17мМ42255455

25 мМ34 мМ687325190

Таблица 10.6. Отбор клеток сирийского хомячка, устойчивых к ФАЛА

Таблица 10.6. Отбор клеток сирийского хомячка, устойчивых к ФАЛА

11 Указаны значения Cot0 5 для ДНК сирийского хомячка, полученные при отжиге с аспартат-карбамоилтрансферазной кДНК (разд. 7.5.6). [G. М. Wahl, R. A. Padgett. G. R. Stark J. Biol. Chem. 2S4 (1978), p. 8679.]

11 Указаны значения Cot0 5 для ДНК сирийского хомячка, полученные при отжиге с аспартат-карбамоилтрансферазной кДНК (разд. 7.5.6). [G. М. Wahl, R. A. Padgett. G. R. Stark J. Biol. Chem. 2S4 (1978), p. 8679.]

Таблица 10.7. Амплификация генов, компенсирующая ферментную недостаточность (отдельные примеры)

Фермент, кодируемый данным геном

Организм

Признак, по которому проводился отбор

Дигидрофолатре-

Мышь, китай-

Устойчивость к мето-

дуктаза

ский хомячок

трексату (МТХ)

Аспартат-карба-

Сирийский

Устойчивость к N-

моилтрансфе- раза

хомячок

(фосфонацетил)-Ь- аспартату (ФАЛА)

Металлотионеин

Мышь, обезьяна

Устойчивость к Cd2 +

Аспарагин-

Китайский

Устойчивость к Р-ас-

синтетаза

ХОМЯЧОК

партилгидроксамату

Гипоксантин-гуа-

Мышь, китай-

Реверсия клеток от

нин- фосфорибозилтрансфера за

СКИЙ ХОМЯЧОК

hrpt~ к hrpC

Адениндезаминаза

Крыса

Устойчивость к дезок- сикоформицину

ADH4"

Дрожжи

Устойчивость к анти- мицину А

11 Ген ADH4 дрожжей кодирует либо изоформу алкогольдегидро-

геназы, либо белок, дегидрогеназы.

регулирующим экспрессию гена алкоголь-

ванные дупликации гена. Рассмотрим сначала пример с аспартат-карбамоилтрансферазой. У животных этот фермент является частью единого полипептида, обладающего еще двумя активностями: карбомоил-фосфатсинтазной и дигидрооротазной. Они вступают в действие соответственно перед аспартат-карбамоилтрансферазой и после нее в цепи реакций биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов. Этот «трехглавый» фермент, называемый CAD, кодируется одним геном. У сирийского хомячка этот ген содержит 25 т. п. н., большая часть которых представлена по меньшей мере 37 вставочными последовательностями; мРНК составляет в длину лишь 7,9 т.н. и содержит примерно 6300 кодирующих оснований. Однако соответствующая амп- лифицированная единица может содержать более 500 т. п. н. Аналогично, дигидрофолатредуктазный ген мыши имеет длину 31 т. п. н., содержит не менее пяти интронов и кодирует белок из 186 аминокислот; длина соответствующей мРНК-примерно 1,6 т.н. Длина амплифицированной единицы у разных резистентных клеток различается, но может превышать 100 т. п. н.

Самое простое объяснение столь большого различия в длине повторяющихся единиц и самих генов состоит в том, что эти длинные геномные сегменты содержат амплифицированные гены. Однако структура повторяющихся единиц такова, что возникают предположения о наличии более сложных процессов. В некоторых случаях амплифицированные единицы включают последовательности, происходящие

из несцепленных геномных локусов, которые в норме не соседствуют с данным геном. Кроме того, отдельные повторяющиеся единицы оказываются не всегда идентичными даже в клонированных клеточных линиях. Более того, в период интенсивного роста клеток в условиях, при которых отбор благоприятствует амплификации, перестройки внутри повторяющихся единиц могут происходить непрерывно.

Изменение структуры хромосом. Амплификация генов часто (но не всегда) сопровождается существенными морфологическими изменениями хромосом. Эти изменения могут быть нескольких типов, и какой именно из них реализуется, зависит от вида клеток и самого гена. Иногда накапливаются очень маленькие дополнительные хромосомы, называемые двойными мини-хромосомами (рис. 10.88, Л), которые, по-видимому, содержат амплифицированные последовательности. Двойные мини-хромосомы ацент- ричны и при делении клетки распределяются неравномерно. Этот факт, а также то, что клетки, содержащие много двойных мини-хромосом, растут хуже, чем нормальные клетки, означает, что в неселективной (не содержащей лекарственного вещества) среде резистентность клеток постепенно утрачивается.

Морфологические изменения второго типа обнаруживаются в нормальных во всем остальном хромосомах и проявляются в атипичном характере исчерченности определенных областей при дифференциальном окрашивании (рис. 7.23); эти области называют гомогенно окрашивающимися (HSR). Как правило, они весьма протяженны, и хромосома, содержащая HSR, длиннее своего гомолога (рис. 10.88, Б). В клетках, устойчивых к метотрексату, после гибридизации in situ с радиоактивным зондом, представляющим собой клонированный дигидрофолатредуктазный ген, и обработки фото- чувствительной эмульсией на HSR обнаруживаются зерна серебра. Таким образом, амплифицированные последовательности находятся внутри HSR. В хромосомах клеток сирийского хомячка, содержащих амплифицированные гены аспартат-карбамоил- трансферазы, также обнаруживаются «лишние» протяженные участки. Поскольку эти участки окрашиваются негомогенно, они не являются HSR, но тем не менее содержат амплифицированные сегменты ДНК (рис. 10.88, В). В некоторых случаях амплификация гена CAD происходит и в нормальном локусе CAD сирийского хомячка (в хромосоме В9р), хотя другие хромосомы тоже могут содержать много копий этого гена и иметь разнообразные аномалии (рис. 10.88, Г). Могут встречаться и двойные мини-хромосомы. Во всех исследованных случаях амплификация касается только одной пары гомологичных хромосом. В отличие от нестабильных амплифицированных генов в двойных мини-хромо-

РИС. 10.88.

Хромосомные аберрации, связанные с амплификацией генов и выявляемые на стадии метафазы. А. В устойчивых к ФАЛА клетках сирийского хомячка обнаружены сверхкомплектные двойные мини-хромосомы (DM), дицентрические хромосомы (DC) и амплифицирован- ные хромосомные области (CAD). [G. М. Wahl et al, Mol. Cell Biol. 2 (1982), p. 308.] Б. В устойчивых к метотрексату фибробластах китайского хомячка на хромосоме 2 обнаружена протяженная гомогенно окрашивающаяся область (прямоугольная скобка). Нормальная хромосома отмечена стрелкой. (С любезного разрешения J. L. Biedler). В. Результаты гибридизации in situ зонда CAD с ДНК из устойчивых к ФАЛА клеток сирийского хомячка. Области гибридизации указаны стрелками. Г. Кариотип клеток рис. В. Амплифици- рованную область содержит удлиненная хромосома В9. Аберрантны и некоторые другие пары хромосом. [G.M. Wahl et al.. Mol. Cell Biol. 2 (1982), p. 308.]

сомах, амнлифицированные гены в нормальных хромосомах остаются стабильными даже при интенсивном росте клеток на неселективной среде.

Механизм амплификации

Любая модель амплификации должна учитывать следующие факты: 1) амплификация может происходить в обычном локусе, в удаленных от него локусах и в независимых двойных мини-хромосомах; 2) геномные сегменты, значительно превыша-

ющие по своей длине сам ген, амплифицированы; 3) для амплифицированных участков характерны перестройки исходных геномных последовательностей: 4) амплифицированные участки могут иметь разную структуру. Эти модели должны объяснять нестабильность некоторых амплифицированных сегментов в неселективной среде, хотя не обязательно все должно сводиться к простой реверсии амплификации. Кроме того, необходимо рассмотреть вопрос, действует ли отбор на сам процесс амплификации или его роль состоит в благоприятствовании редким геномным событиям, а значит, возможности их проявления.

Цитологические аспекты. В результате длительного роста устойчивых к метотрексату клеток в присутствии данного лекарственного вещества в популяции с нестабильным фенотипом и двойными мини-хромосомами появляются клетки со стабильным резистентным фенотипом и HSR. Эти наблюдения наводят на мысль, что в некоторых случаях вначале образуются двойные мини-хромосомы, а затем внехромосомная ДНК с помощью рекомбинации вновь встраивается в хромосому. Далее может происходить дополнительная амплификация. В пользу этой гипотезы говорят данные о том, что трансформация клеток чужеродными клонированными генами (например, при трансформации мышиных клеток дигидрофолатредуктазным геном китайского хомячка или клеток китайского хомячка дигидрофолатредуктазным геном мыши) с последующим поэтапным отбором сопровождается амплификацией чужеродного гена. Амплифициро- ванная единица содержит чужеродный ген и соседствующие с ним векторные последовательности (например, pBR322), а также сегменты хозяйской ДНК, которые могут фланкировать встроенные сегменты. Такие эксперименты показывают, что амплификация исходного гена может сопровождаться целой серией событий, в том числе амплификацией in situ в исходном генном локусе, последующим вырезанием, образованием внехромо- сомного промежуточного продукта-двойных минихромосом, повторным встраиванием в геном и дополнительной амплификацией. Это могло бы объяснить тот факт, что амплификация происходит в локусах, отличных от того, где в норме находится данный ген; кроме того, это обусловливает сцепление данного сайта в результате рекомбинации с удаленной областью генома. То или другое из этих событий может чаще происходить в каких-то определенных генах или клетках, приводя к разным эффектам амплификации в различных системах. Все эти сложные процессы, проявляющиеся на цитологическом уровне, свидетельствуют о разнообразии и сложности явлений на молекулярном уровне.

Молекулярные механизмы. При запрограммиро

ванной амплификации могут использоваться разные молекулярные механизмы, и любой из них или все сразу могут участвовать в случайной амплификации генов. Кроме того, на разных стадиях поэтапной амплификации могут действовать разные механизмы. Длинные тандемные повторы образуются как в результате непропорциональной репликации (разд. 10.7.а), так и амплификации по типу катящегося кольца (разд. 10.7.6). Непропорциональная репликация в рамках модели, описанной на рис. 10.84, сама по себе не приводит к появлению сцепленных тандемных повторов. Однако можно представить, что противоположные концы нескольких копий сегментов ДНК в «кожице лука» оказываются в непосредственной близости друг от друга и соединяются в результате рекомбинации с образованием тандемных повторов, в том числе повторов, содержащих инвертированные дуплицированные гены (рис. 10.89). В таком сцеплении могут участвовать, например, члены семейства диспергированных повторов, находящиеся на противоположных концах повторяющейся единицы. Кроме того, противоположные концы новой копии могут соединиться с образованием внехромосомной кольцевой структуры, а затем амплифицироваться с помощью механизма катящегося кольца. Все эти модели предполагают, что амплифицированная единица содержит точку начала репликации. Об адекватности модели этого типа свидетельствует тот факт, что в одном из клонов устойчивых к ФАЛА клеток хомячка были обнаружены внехромосомные замкнутые кольцевые ДНК длиной около 250 т. п. н.. Эти молекулы, слишком мелкие, чтобы их можно было отнести к двойным мини-хромосомам, содержат ген CAD и реплицируются автономно. Возможно, они являются посредниками между исходными хромосомными генами и двойными мини-хромосомами.

Длинные тандемные повторы образуются также в результате последовательных актов неравного кроссинговера между повторяющимися последовательностями в сестринских хроматидах или гомологичных хромосомах (разд. 2.4.а и 9.4.д). При этом должно произойти несколько клеточных делений. Однако эта модель не может объяснить амплификацию в хромосомных локусах, удаленных от исходного гена.

Из всех этих моделей следует, в частности, что в месте соединения тандемно повторяющихся единиц появляется новый сегмент. Это не согласуется с амплификацией хорионического гена Drosophila, о которой шла речь в разд. 10.7.а; в этом случае дополнительные копии ДНК не связаны ковалентно с остальным геномом и никаких новых сегментов не образуется. Новые последовательности в месте соединений обнаружены в С/1 D-системе (рис. 10.90). Отметим, что они амплифицируются вместе с самой

РИС. 10.89.

Использование модели «кожицы лука» для объяснения образования длинных тандемных повторов или «катящихся колец». [G. Stark, G. М. Wahl, Ann. Rev. Biochem. 63 (1984), p 478.]

единицей. В клеточных линиях, выделенных после амплификации гена CAD, в местах соединений обнаруживаются разные последовательности, т. е. начало повторяющейся единицы не фиксировано. Кроме того, некоторые из амплифицированных сегментов содержат инвертированные повторы амплифицированного гена, а структура амплифицированных единиц, как мы уже говорили, различается даже в пределах одной клеточной линии.

Таким образом, схема, представленная на рис. 10.90, весьма упрощена.

Нестабильность амплифицированных генов. Утрата амплифицированных генов после снятия давления отбора предполагает, что тандемные образования динамичны - в них все время происходят делеции и новые амплификации. Такая пластичность была продемонстрирована непосредственным образом с использованием специально сконструированных клеток. Мышиные клетки, несущие мутации как в тимидинкиназном (z/c"), так и в аде- нин-фосфорибозилтрансферазном (aprt ) генах, трансфицировали рекомбинантным вектором, содержащим tk-ген вируса простого герпеса и ген aprt из клеток хомячка. Используя подходящую селек-

А Е1 Е2 ЕЗ

CADCADCADCAD Резистент

ные клетки

Нормальные Резистентные клетки клетки

т.п.н.

8,5

5,6

-Начало

РИС. 10.90.

Возникновение и выявление тандемных повторов в ДНК на примере амплификации гена CAD. А. Схема амплификации и образования нового рестрикционного фрагмента на месте соединения генов (Е1 ЕЗ-ЕсоЯ1-сайты). Б. Блот-гибридизация по Саузерну EcoRI-фрагментов ДНК из нормальных и С-клеток (табл. 10.6). В качестве зонда использовали фрагмент гена CAD левее сайта Е2. В ДНК из нормальных клеток с зондом гибридизуется один сегмент (его длина 8,5 т. п. н.), присутствующий тивную среду, получили клеточные линии, являющиеся одновременно и tk+, и aprt+, которые содержали тандемные амплификации сегмента ДНК, включающего оба гена (рис. 10.91). Если поддерживали давление отбора в отношении амплифи- цированного гена tk, но растили клетки на среде, селективной для фенотипа aprt-, то мутанты aprt- появлялись с той же частотой, с какой они появляются в нормальных клеточных популяциях с геном aprt дикого типа. Этот факт весьма удивителен, поскольку он означает, что одновременно мутировали все 20 содержащихся в данных клетках

в виде единственной копии на гаплоидный геном. В таком же числе копий этот сегмент находится и в ДНК С-клеток. Однако в этой ДНК присутствует еще один сегмент, 5,6 т.п.н.. гибридизующийся с указанным зондом. Он находится в месте соединения CAD-генов, и чиспо его копий, оцениваемое по интенсивности полосы на радиоавтографе, соответствует 190-кратной амплификации CAD.

амплифицированных копий aprt*. Однако именно это и случилось! В некоторых клонированных aprt”, tk + -клетках все гены aprt были делегированы, что дало фенотип aprt-. В других клонах все 20 копий гена aprt* несли одну и ту же мутацию. Конкретный тип мутации варьировал от одной клеточной линии к другой, но общая картина была одинакова: все 20 генов aprt изменялись одним и тем же образом. В тех случаях, когда фенотип aprt обусловливался делециями, последние во всех копиях тандемного повтора также находились в одинаковых позициях. Поскольку вероятность возникновения одинаковых

-► -*- -* -<— -► -*- -► *- -► *- -*- -*- -► -*- fwh&< а 1 ж я 1 $ ж| Отбор aprt"-► -*- -* -<— -► -*- -► *- -► *- -*- -*- -► -*- fwh&< а 1 ж я 1 $ ж| Отбор aprt"♦ Направлениетранскрипции□ Ген aprt (хомячок)■ Ген Нг (герпесвирус)□ Другая последовательность i Мутантный ген aprt♦ Направлениетранскрипции□ Ген aprt (хомячок)■ Ген Нг (герпесвирус)□ Другая последовательность i Мутантный ген aprtРИС. 10.91.

-► -*- -* -<— -► -*- -► *- -► *- -*- -*- -► -*- fwh&< а 1 ж я 1 $ ж

| Отбор aprt"

-► -*- -* -<— -► -*- -► *- -► *- -*- -*- -► -*- fwh&< а 1 ж я 1 $ ж

| Отбор aprt"

♦ Направлениетранскрипции

□ Ген aprt (хомячок)

■ Ген Нг (герпесвирус)

□ Другая последовательность i Мутантный ген aprt

♦ Направлениетранскрипции

□ Ген aprt (хомячок)

■ Ген Нг (герпесвирус)

□ Другая последовательность i Мутантный ген aprt

Изменения в наборе тандемных повторов одинаковы в каждом из его элементов.

случайных мутаций во всех копиях мала, напрашивается вывод, что изменение произошло в одной из копий, а затем все другие копии были заменены ею. Идентичность копий в тандемном повторе должна обеспечиваться с помощью какого-то механизма. Однако точно так же, как мы не можем сейчас предложить какой-то конкретный механизм спонтанной амплификации, мы не можем остановиться и ни на одном из механизмов гомогенизации членов тандемных повторов. Помимо неравного кроссинговера, благодаря которому может уменьшаться и увеличиваться число копий в тандемных повторах, здесь могут играть роль последовательные делеции и амплификации, непропорциональная репликация и генная конверсия.

Химическая стимуляция амплификации. Имеются данные о том, что многие сегменты генома изредка подвергаются спонтанной случайной амплификации. Частота такой амплификации в культуре клеток (в отсутствие давления отбора) составляет не более 10—3—10—4 на каждую амплифици- руемую единицу в одном клеточном поколении. Если учесть, что средняя длина амплифицируемой единицы составляет ~ 105 п. н. и, таким образом, в геноме размером 109 п. н. содержится 104 таких единиц и каждая из них может амплифицироваться, то большинство вновь образующихся клеток будут

содержать одну новую амплификацию. Кроме того, если создать определенные условия, благоприятствующие амплификации (например, постепенно повышать концентрацию метотрексата, в результате чего будут амплифицироваться гены дигидрофолат- редуктазы), то частота амплификаций будет изменяться. Частоту амплификаций случайных геномных сегментов увеличивают некоторые соединения, в частности ингибиторы репликации ДНК и многие канцерогены. В клетках опухолей, либо индуцированных канцерогенами, либо возникших спонтанно, часто обнаруживаются гомогенно окрашенные области хромосом и двойные мини-хромосомы. Эти и другие хромосомные аберрации связаны с амплификацией последовательностей ДНК, в частности кодирующих известные онкогены.

Может оказаться, что разнообразные агенты, нарушающие нормальную репликацию ДНК, способствуют незапрограммированной репликации случайных областей генома. При подходящих селективных условиях клетки с избыточными копиями какого-либо важного гена будут иметь преимущество перед обычными клетками, и после нескольких циклов клеточных делений, особенно в условиях усиливающегося жесткого давления отбора, может произойти массированная амплификация соответствующего гена.

Литература

Введение

Ниже приведены ссылки на статьи, дающие представление об основных затрагиваемых здесь темах. Все работы сгруппированы в соответствии с разделами, выделенными в данном введении, и даны в хронологическом порядке.

Структура эукариотических генов иих экспрессия

Р. Chambon. 1981. Split Genes., Sei. American, 244 (5), 60-71. W Gilbert. 1981. DNA Sequencing and Gene Structure. Nobel Lecture, December 8, 1980. Science, 214, 1305-1312.

A. B. Lassar, P.L. Martin. R.G. Roeder. 1983. Transcription of Class III Genes: Formation of Preinitiation Complexes. Science, 222, 740-748.

E.J. Milner-White. 1984. Isozymes, Isoproteins and Inters. Trends Biochem Sci., 9, 517-519.

E. Setfling, M. Jasin. W. Schaffner. 1985. Enhancers and Eukaryotic Gene Transcription. Trends Genet., 1, 224-230.

W. Gilbert. M. Marchionni, G. Me Knight. 1986. On hhe Antiquity of Introns. Cell. 46, 151-154.

G. Dreyfuss. M.S. Swanson, S. Pinoi-Roma. 1988. Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein Particles and the Pathway of mRNA Formation. Trends Biochem Sci., 13, 86-89.

E. P. Geiduschek, G. P. Tocchini-Vaientini. 1988. Transcription by RNA Polymerase III. Annu. Rev. Biochem., 57, 873-914.

T. W. Traut. 1988. Do Exons Code for Structural or Functional Units in Proteins? Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 2944-2948.

B. Wasylyk. 1988. Transcription Elements and Factors of RNA Polymerase В Promoters of Higher Eukaryotes. Crit. Rev. Biochem., 23, 77-120.

J. A. Witkowski. 1988. The Discovery of Split Genes. Trends Biochem. Sci., 13, 110-113.

M. Belfort. 1989. Bacteriophage Introns: Parasities Within Parasites. Trends Genet., 5, 209-213.

P. N. Benfey, N. Chua. 1989. Regulated Genes in Transgenic Plants. Science, 244, 174-181.

R G. Brennan, B. W. Matthews. 1989. Structural Basis of DNA- Protein Recognition. Trends Biochem Sci., 14, 286-290.

MS. Dynan. 1989. Modularity in Promoters and Enhancers. Cell, 58, 1-4.

R B. Goldberg, S.J. Barker, L. Perez-Grau. 1989. Regulation of Gene Expression During Plant Embryogenesis. Cell, 56, 149-160.

N.D. Hastie, R.C. Allshire. 1989. Human Telomeres: Fusion and Interstitial Sites. Trends Genet., 5, 326-331.

S. Murphy, B. Moorefield, T. Pieler. 1989. Common Mechanisms of Promoter Recognition by RNA Polymerases II and III. Trends Genet., 5, 123-126.

M. Ptashne. 1989. How Gene Activators Work. Sci. American, 260 (1), 40-47.

J.H. Rogers. 1989. How Were Introns Inserted into Nuclear Genes? Trends Genet., 5, 213-216.

Строение генома эукариот

E О. Long. I. В. Dawid. 1980. Repeated Genes in Eukaryotes.

Annu. Rev. Biochem., 49, 727-764.

J.G. Gail. 1981. Chromosome Structure and the C-Value

Paradox. J. Cell Biol, 91, 3s-14s.

A.C. Spradling, G.M. Rubin. 1981. Drosophila Genome Organization: Concerved and Dynamic Aspects. Annu. Rev. Genet., 15, 219-264.

Baltimore. 1985. Retroviruses and Retrotransposons: The Role of Reverse Transcriptase in Shaping the Eukaryotic Genome. Cell, 40, 481-482.

F. Vanin. 1985. Processed Pseudogenes: Characteristics and Evolution. Annu. Rev. Genet., 19, 253-272.

J. H. Nadeau. 1989. Maps of Linkage and Synteny Homologies Between Mouse and Man. Trends Genet., 5. 82-86.

Перестройки последовательностей ДНК

В. McClintock. 1951. Chromosome Organization and Gene Expression. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 16, 13-57.

J. Lederberg, T. Iino. 1956. Phase Variation in Salmonella. Genetics, 41, 743-757.

M.P. Calos, J.H. Miller. 1980. Transposable Elements. Cell, 20, 579-595.

R. T. Schimke. 1980. Gene Amplification and Drug Resistance. Sci. American, 243 (5), 60-69.

P. Leder. 1982. The Genetics of Antibody Diversity. Sci. American, 246 (5), 102- 115.

N. V Federoff. 1984. Transposable Genetic Elements in Maize Sci. American, 250 (6), 84-98.

D. Baltimore. 1985. Retroviruses and Retrotransponosons: The Role of Reverse Transcriptase in Shaping the Eukaryotic Genome. Cell, 40, 481-482.

S. Tonegawa. 1985. The Molecules ot the Immune System. Sci. American, 253 (4), 122-131.

P. Borst, D. R. Greaves. 1987. Programmed Gene Rearrangements Altering Gene Expression. Science, 235, 658-667.

H. Varmus. 1987. Reverse Transcription. Sci. American, 257 (3), 56-64.

D. J. Finnegan. 1989. Eukaryotic Transposable Elements and Genome Evolution. Trends Genet., 5, 103-107.

A. M. Lambowitz. 1989. Infectious Introns. Cell, 56, 323-326. H. E. Varmus. 1989. Reverse Transcription in Bacteria. Cell, 56, 721-724.

Эволюционные аспекты

Avala. 1978. The Mechanisms of Evolution. Sci. American, 239, (3), 56-69.

J. E. Darnell. Jr. 1978. Implications of RNA-RNA Splicing in Evolution of Eukaryotic Cells. Science, 202, 1257-1260.

W. Gilbert. 1978. Why Genet in Pieces? Nature, 271, 501.

M. Kimura. 1979. The Neutral Theory of Molecular Evolution.

Sci. American, 241 (5), 98-126.

D. Reannev. 1984. Genetic Noise in Evolution? Nature, 307, 318-319.

J. E. Darnell, Jr. 1985. RNA. Sci. American, 253 (4), 68-78.

R. F. Doolittle. 1985. The Geneology of Some Recently Evolved Vertebrate Proteins. Trends Biochem. Sci., 10, 233-237.

R. F. Doolittle. 1985. Proteins. Sci. American, 253 (4). 88-99. W. Gilbert. 1985. Genes in Pieces Revisited. Science, 228, 823-824.

A. C. Wilson. 1985. The Molecular Basis of Evolution. Sci. American, 253 (4), 164-173.

T.R.Cech. 1986. Biological Catalysis by RNA. Annu. Rev.

Biochem., 55, 599-629.

J.E. Darnell, W. F. Doolittle. 1986. Speculations on the Early Course of Evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83, 1271-1275.

A. Dover. 1986. Molecular Drive in Multigene Families: How Biological Novelties Arise, Spread, and Are Assimilated. Trends Genet, 2, 159-165.

N.R.Pace, G. J. Olsen, C.R.Woese. 1986. Ribosomal RNA Phylogeny and the Primary Lines of Evolutionary Descent. Cell, 45, 325-326.

W. Gilbert. 1987. The RNA World. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 52, 901-905.

A.M. Weiner, N. Maizels. 1987. tRNA-like Structures Tag the Ends of Genomic RNA Molecules for Replication: Implications for the Origin of Protein Synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 7383-7387.

U. Wintersberger, E. Wintersberger. 1987. RNA Makes DNA: A Speculative View of the Evolution of DNA Replication Mechanisms. Trends Genet., 3, 198-202.

L. L. Cavalli-Sforza, A. Piazza, P. Menozzi, J. Mountain. 1988. Reconstruction of Human Evolution: Bringing Together Genetic, Archeological, and Linguistic Data. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 6002-6006.

C R. Woese. 1987. Bacterial Evolution. Microbiol. Rev., 51, 221-271.

K. G. Field, G. J. Olsen, D. J. Lane, S. J. Gioannoni, M. T. Ghi- selin, E.C. Raff, N. R. Pace R.A. Raff. 1988. Molecular Phylogeny of the Animal Kingdom. Science, 239, 748753.'

R. F. Doolittle. 1989. Similar Amino Acids Revisited. Trends Biochem. Sci., 14, 244-245.

F. Joyce. 1989. RNA Evolution and the Origins of Life. Nature, 338, 217-224.

S. Pddbo, R.G. Higuchi, A.C. Wilson. 1989. Ancient DNA and the Polymerase Chain Reaction. The Emerging Field of Molecular Archaeology. J. Biol. Chern., 264, 9709-9712.

Статьи обзорного характера

J. Darnell. H. Lodish, D. Baltimore. 1986. Molecular Cell Biology. Scientific American Books. New York. The Molecular Biology of Homo sapiens. Cold Spring Harbor Quant. Biol. 51, whole issue.

Freifelder. 1987. Molecular Biology, 2nd, ed. Jones and Bartlett, Boston.

J.D. Watson, N.H. Hopkins. J. W. Roberts, J.A.Steitz, A. M. Weiner. 1987. Molecular Biology of the Gene, 4th ed. Benjamin/Cummings, Menlo Park, Ca.

John, G. Miklos. 1988. The Eukaryote Genome in Development and Evolution. Allen and Unwin, London.

L. Stryer. 1988. Biochemistry, 3rd ed. W. H. Freeman. San Francisco.

Evolution of Catalysis. 1988. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 52, whole issue.

Alberts, D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J.D. Watson. 1989. Molecular Biology of the Cell, 2nd ed. Garland Publishing, New York and London.

E. Berg, M.M. Howe (eds.). 1989. Mobile DNA. American Society for Microbiology, Washington, D. C.

B. Lewin. 1990. Genes, 4th ed. Wiley, New York.

J.D. Rawn. 1988. Biochemistry. Carolina Biological Supply Co., Burlington, North Carolina.

Статьи к соответствующим разделам глав

8.2.а

R. Н. Reeder 1985. Mechanisms of Nucleolar Dominance in Animals and Plants. J. Cell Biol., 101, 2013-2016.

B. Sollner-Webb. J. Tower. 1986. Transcription of Cloned Eukaryotic Ribosomal RNA Genes. Annu. Rev. Biochem., 55, 801-830.

R. G. Worton, J. Sutherland, J. E. Sylvester, H. F. Willard, S. Bodrug, 1. Dube, C. Duff, V. Kean, P. N. Ray, R. D. Schmi- ckel. 1988. Human Ribosomal RNA Genes: Orientation of the Tandem Array and Conservation ot the 5' End. Science, 239. 64-67.

8.2.6

P. Chambon. 1974. Eukaryotic RNA Polymerases. In: P. D. Boyer (ed.). The Enzymes, pp. 261-331. Academic Press, New York.

L. A. Allison, M. Moyle. M. Shales, C.J. Ingles. 1985. Extensive Homology Among the Largest Subunits of Eukaryotic and Prokaryotic RNA Polymerases. Cell, 42, 599-610.

J. Biggs, L.L. Searles, A.L. Greenleat. 1985. Structure of the Eukaryotic Transcription Apparatus: Features of the Gene for the Largest Subunit of Drosophila RNA Polymerase II. Cell, 42, 611-621.

A. Sentence. 1985. Eukaryotic RNA Polymerases. Crit. Rev. Biochem., 18, 31-90.

Bateman, M.R. Paule. 1986. Regulation of Eukaryotic Ribosomal RNA Transcription by RNA Polymerase Modification. Cell, 47, 445-450.

P. Bucher, E.N. Trifonov. 1986. Comrilation and Analysis of Eukaryotic POL II Promoter Sequences. Nucleic Acids Res., 14, 10009-10026.

J. L. Buhler, M. Riva, C. Mann, P. Thuriaux, S. Menet. J. Y. Mi- covin, I. Threich, S. Mariotte, A. Sentenac. 1987. Eukaryotic RNA Polymerases, Subunits and Genes. In: W. S. Rez- nikoff et all. (eds.), RNA Polymerase and the Regulation of Transcription, pp. 25-36. Elsevier, Amsterdam.

D.L. Cadena, M.E. Dahmus. 1987. Messenger RNA Synthesis in Mammalian Cells in Catalyzed by the Phosphorylated Form of RNA Polymerase II. J. Biol Chern., 262, 1246812474.

M. Nonet, D. Sweetser, R.A. Young. 1987. Functional Redundancy and Structural Polymorphism in the Large Subunit of RNA Polymerase II. Cell, 50, 909- 915.

J. Tower, B. Sollner-Webb. 1987. Transcription of Mouse rDNA in Regulated by ano Activated Subform of RNA Polymerase I. Cell, 50, 873-883.

8.2.B

E. A. Elion, J. R. Warner. 1984. The Major Promoter Element of rRNA Transcription in Yeast Lies 2 kb Upstream. Cell, 39, 663-673.

R. Miesfeld, N. Arnheim. 1984. Species-Specific rDNA Transcription Is Due to Promoter-Specific Binding Factors. Mol. Cell. Biol., 4, 221-227.

R. Miesfeld, B. Sollner-Webb, C. Croce, N. Arnheim. 1984. The Absence of a Human-Specific Ribosomal DNA Transcription Factor Leads to Nucleolar Dominance in Mouse > > Human Hybrid Cells. Mol. Cell. Biol, 4, 1306-1312.

R.H. Reeder. 1984. Enhancers and Ribosomal Gene Spacers. Cell, 38, 349-351.

I. Grummt, H. Sorbaz, A. Hofmann, E. Roth. 1985. Spacer Sequences Downstream of the 28S RNA Coding Region Are Part of the Mouse rDNA Transcription Unit. Nucleic Acids Res., 13. 2293-2304.

R. M. Learned, S. Cordes. R. Tjian. 1985. Purification and Characterization of a Transcription Factor That Confers Promoter Specificity to Human RNA Polymerase I. MoL Cell. Biol., 5, 1358-1369.

K. G. Miller. J. Tower, B. Sollner-Webb. 1985. A Complex Control Region of the Mouse rRNA Gene Directs Accurate Initiation by RNA Polymerase 1. Mol. Cell. BioL, 5, 554-562.

V. L. Murtif P. M. M. Rae. 1985. In vivo Transcription of rDNA Spacers in Drosophila. Nucleic Acids Res., 13, 3221-3224.

M.E. Swanson, M. Yip, M.J. Holland. 1985. Characterization of an RNA Polymerase I-Dependent Promoter Within the

Spacer Region of Yeast Ribosomal Cistrons. J. Biol. Chem., 260, 9905-9915.

R.F.J. DeWinter, T. Moss. 1986. Spacer Promoters Are Essential for Efficient Enhancement of X. laevis Ribosomal Transcription. Cell, 44, 313-318.

P. Labhart, R.H. Reeder. 1986. Characterization of Three Sites of RNA 3' End Formation in the Xenopus Ribosomal Gene Spacer. Cell, 45, 431-443.

R. M. Learned, T.K. Learned, M.M. Haltiner, R. T. Tjian. 1986. Human rDNA Transcription is Modulated by the Coordinate Binding of Two Factors to an Upstream Control Element. Cell, 45, 847-857.

J. Windle, B. Sollner-Webb. 1986. Upstream Domains of the Xenopus laevis rDNA Promoter Are Revealed in Microinjected Oocytes. Mol. Cell. Biol., 6, 1228-1234.

P. Kownin, E. Bateman, M.R.Paule. 1987. Eukaryotic RNA Polymerase I Promoter Binding Is Directed by Protein Contacts with Transcription Initiation Factor and Is DNA Sequence-Independent. Cell., 50, 693-699.

E. Bateman. M. R. Paule. 1988. Promoter Occlusi on During Ribosomal RNA Transcription. Cell, 54, 985-992.

S.P. Bell, R.M. Learned, H.M. Jantzen, R. Tjian. 1988. Functional Cooperativity Between Transcription Factors UBF1 and SL1 Mediates Human Ribosomal RNA Synthesis. Science, 241, 1192-1197.

M.H. Jones. R.M. Learned, R. Tjian. 1988. Analysis of Clustered Point Mutations in the Human Ribosomal RNA Gene Promoter by Transient Expression in Vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 669-673.

8.2,r

Grummt. U. Maier, A. Ohrlein, N. Hassouna, J. P. Bachelle- rie. 1985. Transcription of Mouse rDNA Terminates Downstream of the 3' End of 28S RNA and Involves Interaction of Factors with Repeated Sequences in the 3' Spacer. Cell, 43. 801-810.

S. M. Baker, T. Platt. 1986. Pol I Transcription: Which Comes First, the End or the Begining? Cell, 47, 839 840.

Grummt. H. Rosenbauer, I. N iedermeyer, U. Maier, A. Ohrlein. 1986. A Repeated 18 bp Sequence Motif in the Mouse rDNA Spacer Mediates Binding of a Nuclear Factor and Transcription Termination. Cell, 45, 837-846.

P. Labhart, R.H. Reeder. 1986. Characterization of Three Sites of RNA 3' End Formation in the Xenopus Ribosomal Gene Spacer. Cell, 45, 431-443.

Bartsch. C. Schoneberg, I. Grummt. 1987. Evolutionary Changes of Sequences and Factors That Direct Transcription Termination of Human and Mouse Ribosomal Genes. Mol. Cell. Biol., 7, 2521-2529.

S.L.Henderson, K. Ryan. B. Sollner-Webb. 1989. The Promoter- Proximal rDNA Terminator Augments Initiation by Preventing Disruption of the Stable Transcription Complex Caused by Polymerase Readin. Genes and Devel., 3, 212-223

A. Kuhn, I. Grummt. 1989. З'-End Formation of Mouse Pre- rRNA Involves Both Transcription Terminatoin and a Specific Processing Reaction. Genes and Devel., 3, 224-231.

Д

/. Grummt. A. Kuhn, I. Bartsch. H. Rosenbauer. 1986. A Transcription Terminator Located Upstream of the Mouse rDNA Initiation Site Affects rRNA Synthesis. Cell, 47, 901-911.

S. Henderson, B. Sollner-Webb. 1986. A Transcriptional Terminator is a Novel Element of the Promoter of the Mouse Ribosomal RNA Gene. Cell, 47, 891-900.

McStay, R. H. Reeder. 1986. A Termination Site for Xenopus RNA Polymerase 1 Also Acts as an Element of a Adijacent Promoter. Cell, 47, 913-920.

A. Kuhn, A. Normann, I. Bartsch, I. Grummt. 1988. The Mouse Ribosomal Gene Terminator Consists of Three Functionally Separable Sequence Elements. EMBO J., 7, 14971502.

8.3.B

K. S. Zaret, F. Sherman. 1982. DNA Sequence Required for Efficient Transcription Termination in Yeast. Cell, 28. 563-573.

Montell, E.F. Fisher, M. H. Caruthers, A. J. Berk. 1983. Inhibition of RNA Cleavage but Not Polyadenylation by a Point Mutation in mRNA 3' Consensus Sequence AAUAAA. Nature, 305, 600 605.

Gil. N.J. Proudfoot. 1984. A Sequence Downstream of AAUAAA is Required for Rabbiy Р-Globin mRNA 3'-End Formation. Nature, 312, 473-474.

S. Henikojf E. H. Cohen. 1984. Sequences Responsible for Transcription Termination on a Gene Segment in Saccharomy- ces cerevisiea. Mol. Cell. Biol., 4, 1515-1520.

/. Pettersson, M. Hinterberger, T. Mimori. E. Gottlieb, J. A. Steitz. 1984. The Structure of Mammalian Small Nuclear Ribonucleoproteins. J. Biol. Chem., 259, 5907-5914.

M. Bhat. W.S.M. Wold. 1985. AATAAA as Well as Downstream Sequences Are Required for RNA З'-End Formation in the E3 Complex Transcription Unit of Adenovirus. Mol. Cell. Biol., 5, 3183-3193.

M.L.Birnstiel, M. Busslinger, K. Strub. 1985. Transcription Termination and 3' Processing: The End is in Site! Cell, 41, 349-359.

L. Conway, M. Wickens. 1985. A Sequence Downstream of A-A-U-A-A-A is Required for Formation of Simian Virus 40 Late mRNA 3' Termini in Frog Oocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 3949-3953.

R. P. Hart, M.A. McDevitt. H. Ali, J.R. Nevins. 1985. Definition of Essential Sequences and Functional Equivalence of Elements Downstream of the Adenovirus E2A and the Early Simian Virus 40 Polyadenylation Sites. Mol. Cell. Biol, 5, 2975-2983.

J. L. Manley, H. Yu, L. Ryner. 1985. RNA Sequence Containing Hexanucleotide AAUAAA Directs Efficient mRNA Polyadenylation in Vitro. Mol. Cell. Biol., 5, 373-379.

J. McLauchlan. D. Gaffney, J. L. Whitton. J.B. Clements. 1985. The Consensus Sequence YGTGTTYY Located Downstream from the AATAAA Signal Is Required for Efficient Formation of mRNA 3' Termini. Nucleic Acids Res.. 13, 1347-1368.

L. Moore. P.A. Sharp. 1985. Accurate Cleavage and Polyadenylation of Exogenous RNA Substrate. Cell, 41. 845-855.

K.H. Baek. K. Sato. R. Ito, K. Agarwal. 1986. RNA Polymerase Il Transcription Terminates at a Specific DNA Sequence in a HeLa Cell-Free Reaction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83, 7623-7627.

G. Ciliberto, N. Dathan. R. Frank. L. Philipson, I. W. Maitaj. 1986. Formation of the 3' End on U snRNAs Requires at Least Three Sequence Elements. EMBO J., 5, 2931-2937.

C. Hashimoto, J. A. Steitz. 1986. A Small Nuclear Ribonucleoprotein Associates with the AAUAAA Polyadenylation Signal in Vitro. Cell, 45, 581-591.

N. Hernandez, A.M. Weiner. 1986. Formation of the 3' End of UI snRNA Requires Compatible snRNA Promoter Elements. Cell, 47, 249-258.

M.A. McDevitt, R.P.Hart, W. W. Wong, J.R. Nevins. 1986. Sequneces Capable of Restoring Poly(A) Site Function Define Two Distinct Downstream Elements. EMBO J., 5, 2907-2913.

T. Platt. 1986. Transcription Termination and the Regulation of Gene Expression. Annu. Rev. Biochem., 55, 339-372.

K. Sato, R. Ito, K.H. Baek, K. Agarwal. 1986. A Specific DNA Sequence Controls Termination of Transcription in the

Gastrin Gene. Mol. Cell. Biol., 6, 1032-1043.

H.E.N. de Vegvar, E. Lund. J. E. Dahlberg. 1986. 3' End Formation of UI snRNA Precursors in Coupled to Transcription from snRNA Promoters. Cell, 47, 259-266.

Whitelaw, N. Proudfoot. 1986. a-Thalassaemia Caused by a Poly(A) Site Mutation Reveals Thas Transcriptional Termination in Linked to 3' End Processing in the Human a2 Globin Gene. EM BO J., 5, 2915-2922.

R. A. Ach. A.M. Weiner. 1987. The Highly Conserved U Small Nuclear RNA З'-End Formation Signal is Quite Tolerant to Mutation. Mol. Cell. Biol., 7, 2070-2079.

R.L. Dedrick, C.M.Kane, M. J. Chamberlin. 1987. Purified RNA Polymerase II Recognized Specific Termination Sites During Transcription in Vitro. J. Biol. Chern., 262, 9098-9108.

A. Gil, N.J. Proudfoot 1987. Position-Dependent Sequence Elements Downstream of AAUAAA Are Required for Efficient Rabbit Р-Globin m RNA 3' End Formation. Cell, 49, 399-406.

J. Logan. E. Falck-Pedersen, J.E. Darnell. Jr., T. Shenk. 1987. A Poly(A) Addition Site and a Downstream Termination Region Are Required for Efficient Cessation of Transcription by RNA Polymerase II in the Mouse Р-Globin Gene. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 8306-8310.

K.L. Mowry, J.A.Steitz. 1987. Both Conserved Signals on Mammalian Histone Pre-mRNAs Associate with Small Nuclear Ribonucleoproteins During 3' End Formation in Vitro. Mol. Cell. Biol., 7, 1663-1672.

K.L. Mowry, J. A. Steiz. 1987. Identification of the Human U7 snRNP as One of Several Factors Involved in the 3' End Maturation of Histone Premessenger RNA’s. Science, 38, 1682-1687.

D. Reines, D. Wells, M.J. Chamberlin, С. M. Kane. 1987. Identification of Intrinsic Termination Sites in Vitro for RNA Polymerase II Within Eukaryotic Gene Sequences. J. Mol. Biol., 196, 299-312.

J. S. Butler, T. Platt. 1988. RNA Processing Generates the Mature 3' End of Yeast CYC1 Messenger RNA in Vitro. Science, 242, 1270-1274.

G. Chistofori, W. Keller. 1988. 3' Cleavage and Polyadenylation of mRNA Precursors in Vitro Requires a Poly(A) Polymerase, a Cleavage Factor, and a snRNP. Cell, 54, 875-889.

G. M. Gilmartin, F. Schaufele. G. Schaffner, M. L. Birnstiel. 1988. Functional Analysis of the Sea Urchin U7 Small Nuclear RNA. Mol. Cell. Biol., 8, 1076-1084.

K.L. Mowry, J. A. Steitz. 1988. snRNP Mediators of 3' End Processing: Functional Fossils? Trends Biochem. Sci., 13, 447-451.

Y Takagaki, L.C. Ryner. J.L. Manley. 1988. Separation and Characterization of a Poly(A) Polymerase and a Cleavage/ Specificity Factor Required for Pre-mRNA Polyadenylation. Cell, 52, 731-742.

J. Wllusz, D. I. Feig, T. Shenk. 1988. The C Proteins of Heterogeneous Ribonucleoprotein Complexes interact with RNA Sequences Downstream of Polyadenylation Cleavage Sites. Mol. Cell. Biol., 8, 4477-4483.

J. Wllusz T. Shenk. 1988. A 64 kd Nuclear Protein Binds to RNA Segments That Include the AAUAAA Polyadenylation Motif. Cell, 52, 221-228.

N. Levitt. D. Briggs, A. Gil, N.J. Proudfoot. 1989. Definition of an Efficient Synthetic Poly(A) Site. Genes and DeveL, 3, 1019-1025.

N. J. Proudfoot. 1989. How RNA Polymerase II Terminates Transcription in Higher Eukaryotes. Trends Biochem. Sci., 14, 105-110.

M.D. Sheets. M. Wickens. 1989. Two Phases in the Addition of a Poly(A) Tail. Genes and DeveL, 3, 1401-1412.

8.3.r

ITS. Dynan, R. Tjian. 1983. The Promoter-Specific Transcription Factor Sp I Binds to Upstream Sequences in the SV40 Early Promoter. Cell, 35, 79- 87.

M. Fromm, P. Berg. 1983. Simian Virus 40 Early- and Late- Region Promoter Functions Are Enhanced by the 72-Ba- se-Pair Repeat Inserted at Distant Locations and Inverted Orientations. Mol. Cell. Biol., 3, 991-999.

M. Fromm, P. Berg. 1983. Transcription in Vivo from SV40 Early Promoter Deletion Mutants Without Repression by Large T Antigen. J. Mol. Appl. Genet., 2, 127-135.

J. Brady, M. Radonovich, M. Thoren, G. Das. N.P. Salzman. 1984. Simian Virus 40 Major Late Promoter: An Upstream DNA Sequences Required for Efficient in Vitro Transcription. Mol. Cell. Biol., 4, 133-141.

A. R. Buchman, P. Berg. 1984. Unusual Regulation of Simian Virus 40 Early-Region Transcription in Genomes Containing Two Origins of DNA Replication. Mol. Cell. Biol., 4, 1915-1928.

A. R. Buchman, M. Fromm, P. Berg. 1984. Complex Regulation of Simian Virus 40 Early-Region Transcription from Differen: Overlapping Promoters. Mol. Cell. Biol., 4. 1900-1914.

D. Gidoni, IKS. Dynan, R. Tjian. 1984. Multiple Specific Contacts Between a Mammalian Transcription Factor and Its Cognate Promoters. Nature, 312, 409-413.

S.L. McKnight, R.C. Kingsbury, A. Spence, M. Smith. 1984. The Distal Transcription Signals of the Herpesvirus tk Gene Share a Common Hexanucleotide Control Sequence. Cell, 37, 253-262.

Weber, J. de Villiers, W Schaffner. 1984. An SV40 “Enhancer Trap” Incorporates Exogenous Enhancers from its Own Sequences. Cell, 36, 983-992.

IKS. Dynan, R. Tjian. 1985. Control of Eukaryotic Messenger RNA Synthesis by Sequence-Specific DNA-Binding Proteins. Nature, 316, 774-778.

Gidoni, J. T. Kadonaga. H. Barrera-Saldana, K. Takahashi, P. Chambon. R. Tjian. 1985. Bidirectional SV 40 Transcription Mediated by Tandem SP1 Binding Interactions. Science, 230, 511-517.

K. A. Jones, K. R. Yamamoto, R. Tjian. 1985. Two Distinct Transcription Factors Bind to the HSV Thymidine Kinase Promoter in Vitro. Cell, 42, 559-572.

J. M. Keller, J.C. Alwine. 1985. Analysis of an Activatable Promoter: Sequences in the Simian Virus 40 Late Promoter Required for T-Antigen-Mediated trans Activation. Mol. Cell. Biol, 5, 1859-1869.

K. Ryder, E. Vakalopoulou, R. Mertz, I. Mastrangelo, P. Hough, P. Tegtmeyer, E. Fanning. 1985. Seventeen Base Pairs of Region I Encode a Novel Tripartite Binding Signal for SV 40 T Antigen. Cell, 42, 539-548.

Serfling, M. Jasin, W. Schaffner. 1985. Enhancers and Eukaryotic Gene Transcription. Trends Genet., 1, 224-230.

R. Treisman. T. Maniatis. 1985. Simian Virus 40 Enhancer Increases Number of RNA Polymerase II Molecules on Linked DNA. Nature, 315, 72-77.

M.R. Briggs. J.T. Kadonaga, S.P. Bell, R. Tjian. 1986. Purification and Biochemical Characterization of the Promoter-Specific Transcription Factor, Sp 1. Science, 234, 47-52.

W. Herr, J. Clarke. 1986. The SV40 Enhancer Is Composed of Multiple Functional Elements That Can Compensate for One Another. Cell, 45, 461 470.

J.T. Kadonaga, K. A. Jones, R. Tjian. 1986. Promoter-Specific Activation of RNA Polymerase 11 Transcription by Spl. Trends Biochem. Sci., 11, 20-23.

T. Kadonaga, R. Tjian. 1986. Affinity Purification of Sequence-Specific DNA Binding Proteins. Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 83, 5889-5893.

S. McKnight, R. Tjian. 1986. Transcriptional Selectivity of Viral Genes in Mammalian Cell. Cell, 46, 795-805.

S.E. Pion, J. C. Wang. 1986. Transcription of the Human Р-Globin Gene Is Stimulated by an SV40 Enhancer to Which It Is Physically Linked but Topologically Uncoupled. Cell, 45, 575-580.

P. Sassone-Corsi, E. Borrelli. 1986. Transcriptional Regulation by frans-Acting Factors. Trends Genet., 2, 215-219.

Takahashi, M. Vigneron, H. Matthes, A. Wildeman, M. Zenke, P. Chambon. 1986. Requirement of Stereospecific Alignments for Initiation from the Simian Virus 40 Early Promoter. Nature, 319, 121-126.

M. Zenke, T. Grundstrom, H. Matthes, M. Wintzerith, C. Schatz. A. Wildeman, P. Chambon. 1986. Multiple Sequence Motifs Are Involved in SV 40 Enchancer Function. EMBO J., 5, 387-397.

A. Dorn. J. Bollekens, A. Staub, C. Benoist, D. Mathis. 1987. A Multiciplicity of CCAAT Box-Binding Proteins. Cell, 50, 863-872.

R.D. Everett. 1987. The Regulation of Transcription of Viral and Cellular Genes by Herpesvirus Immediate-Early Gene Products. Anticancer Res., 7, 589-604.

L Guarente. 1987. Regulatory Proteins in Yeast. Annu. Rev. Genet., 21, 425-452.

W. Lee, P. Mitchell, R. Tjian. 1987. Purified Transcription Factor AP-1 Interacts with TPA-Inducible Enhancer Elements. Cell, 49, 741-752.

E. May, F. Omilii, M. Ernoult-Lange, M. Zenke, P. Chambon. 1987. The Sequence Motifs That Are Involved in SV 40 Enhancer Function Also Control SV 40 Late Promoter Activity. Nucleic Acids Res., 15, 2445-2462.

P. J. Mitchell, C. Wang, R. Tjian. 1987. Positive and Negative Regulation of Transcription in Vitro: Enhancer-Binding Protein AP-2 Is Inhibited by SV 40 T Antigen. Cell. 50. 847-861.

R. Rosales, M. Vigneron, M. Macchi, I. Davidson, J. H. Xiao, P. Chambon. 1987. In Vitro Binding og Cell-Specific and Ubiquitous Nuclear Protein to the Octamer Motif of the SV 40 Enhancer and Related Motifs Present in Other Promoters and Enhancers. EMBO J., 6, 3015-3025.

S. Schirm, J. Jiricny. W. Schaffner. 1987. The SV 40 Enchancer Can Be Dissected into Multiple Segments, Each with a Different Cell Type Specificity. Genes and Devel., 1, 65-74.

J. H. Xiao, I. Davidson, D. Ferrandon, R. Rosales, M. Vigneron, M. Macchi, F. Ruffenach, P. Chambon. 1987. One CellSpecific and Three Ubiquitous Nuclear Proteins Bind in Vitro to Overlapping Motifs in the Domain Bl of the SV 40 Enhancer. EMBO J., 6, 3005-3013.

S.M. Admayr, J.L. Workman. R.G. Roeder. 1987. The Pseudorabies Immediate Early Protein Stimulates in Vitro Transcription by Facilitating TFIID: Promoter Interactions. Genes and Devel.. 2, 542-553.

T.J. Bos, D. Bohmann, H. Tsuchie, R. Tjian, P.K. Vogt. 1988. v-jun Encodes a Nuclear Protein with Enhancer Binding Properties of AP-1. Cell, 52, 705-712.

S. Buratowski, S. Hahn, P.A. Sharp, L. Guarente. 1988. Function of a Yeast TATA Elemnet-Binding Protein in a Mammalian Transcription System. Nature, 334, 37-42.

Cavallini, J. Huet, J-L. Plassat, A. Sentenac, J-M. Egly, P. Chambon. 1988. A Yeast Activity Can Substitute for the HeLa Cell TATA Box Factor. Nature, 334, 77-80.

L.A. Chodosh, A.S. Baldwin. R. W. Carthew, P.A. Sharp. 1988. Human CCAAT-Binding Proteins Have Heterologous Subunits. Cell, 33, 11- 24.

L.A. Chodosh, J. Olesen, S. Hahn, A.S. Baldwin, L. Guarente, P. A. Sharp. 1988. A Yeast and a Human CCAAT-Binding Protein Have Heterologous Subunits That Are Functionally Interchangeable. Cell, 53, 25-35.

L. Clark, R.M. Pollock, R.T Hay. 1988. Identification and

Purification of EBPI: A HeLa Cell Protein That Binds to a Region Overlapping the “Core” of the SV 40 Enhancer. Genes and Devel., 2, 991-1002.

J Courey, R. Tjian. 1988. Analysis of Sp-1 in Vivo Reveals Multiple Transcriptional Domains, Including a Novel Glutamine-Rich Activation Motif. Cell, 55, 887-898.

C. Fromental, M. Kanno, H. Nomiyama, P. Chambon. 1988. Cooperativity and Hierarchical Levels of Functional Organization in the SV 40 Enhancer. Cell, 54, 943-953.

S. Hahn, L. Guarente. 1988. Yeast HAP2 and HAP3: Transcriptional Activators in a Heteromeric Complex. Science, 240, 317-321.

K.D. Harshman, IES. Moye-Rowley. C.S. Parker. 1988. Transcriptional Activation by the SV 40 AP-1 Recognition Element in Yeast Is Mediated by a Factor Similar to AP-1 That Is Distinct from GCN4. Cell, 53, 321-330.

N.C. Jones. P.W.J. Rigby, E.B. Ziff. 1988. Trans-Acting Proteins Factors and the Regulation of Eukaryotic Transcription: Lessons from Studies on DNA Tumor Viruses. Genes and Devel., 2, 267-281.

J. T. Kadonaga, A. J. Courey, J. Ladika. R. Tjian. 1988. Distinct Regions of SP1 Modulate DNA Binding and Transcriptional Activation. Science, 242, 1566-1569.

S. N. Maity, P.T Golumbek, G. Karsenty, B. de Crombrugghe. 1988. Selective Activation of Transcription by a Novel CCAAT Binding Factor. Science, 241, 582-584.

M. Raymondjean, S. Cereghini, M. Yaniv. 1988. Several Distinct “CCAAT” Box Binding Proteins Coexist in Eukaryotic Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 757 -761.

Wasylyk. 1988. Enhancers and Transcription Factors in the Control of Gene Expression. Biochimica et Biophysica Acta, 951, 17-35.

S. Buratowski, S. Hahn, L. Guarente, P.A. Sharp. 1989. Five Intermediate Complexes in Transcription Initiation by RNA Polymerase II. Cell, 56, 549-561.

P. J. Mitchell, R. Tjian. 1989. Transcriptional Regulation in Mammalian Cells by Sequence-Specific DNA Binding Proteins. Science, 245, 371-378.

WS. Moye-Rowley, K.D. Harshman, C.S. Parker. 1989. Yeast YAP1 Encodes a Novel Form of the Jun Family of Transcriptional Activator Proteins. Genes and Devel., 3, 283-292.

A. G. Saltzman, R. Weinmann. 1989. Promoter Specificity and Modulation of RNA Polymerase II Transcription. FASEB J., 3, 1723-1733.

8.3.Д

M. Mercola, X. Wang, J. Olsen, K. Calame. 1983. Transcriptional Enhancer Activity in the Immunoglobulin Heavy Chain Locus. Science, 221, 663-665.

F. G. Falkner, H.G. Zachau. 1984. Correct Transcription of an Immunoglobulin x Gene Requires an Upstream Fragment Containing Conserved Sequence Elements. Nature, 310, 71-74.

D. Picard, W. Schaffner. 1984. A Lymphocyte-Specific Enhancer in the Mouse Immunoglobulin x Gene. Nature, 307, 80-82.

F. W. Alt. TK. Blackwell, G.D. Yancopoulos. 1985. Immunoglobulin Genes in Transgenic Mice. Trends Genet, 1, 231-236.

K. Calame. 1985. Mechanisms Which Regulate Immunoglobulin Gene Expression. Annu. Rev. Immunol., 3, 159-195.

R. Grosschedl, D. Baltimore. 1985. Cell-Type Specificity of Immunoglobulin Gene Expression is Regulated by at Least Three DNA Sequence Elements. Cell, 41, 885-897.

R. Krumlauf, R. E. Hammer, S. M. Tilghman, R. L. Brinster. 1985. Developmental Regulation of a-Fetoprotein Genes in Transgenic Mice. Mol. Cell. Biol., 5, 1639-1648.

M. Mercola, J. Goverman, C. Mirell, K. Calame. 1985. Immunoglobulin Heavy-Chain Enhancer Requires One or More

Tissue-Specific Factors. Science, 227, 266-270.

О. Picard, W. Schaffner. 1985. Cell-Type Preference of Immunoglobulin and Gene Promoters. EM BO J, 4, 2831-2838.

R. Godbout, R. Ingram, S.M. Tilghman. 1986. Multiple Regulatory Elements in the Intergenic Region Between the a-Fetoprotein and Albumin Genes. Mol. Cell. Biol., 6, 477-487.

C. L. Peterson, K. Orth, K.L. Calame. 1985. Binding in Vitro of Multiple Cellular Proteins to Immunoglobulin HeavyChain Enhancer DNA. Mol. Cell. Biol., 6, 4168-4178.

R. Sen, D. Baltimore. 1986. Inducibility of x Immunoglobulin Enhancer-Binding Protein NF-xB by a Posttranslational Mechanism. Cell, 47, 921-928.

R. Sen, D. Baltimore. 1986. Multiple Nuclear Factors Interact with the Immunoglobulin Enhancer Sequences. Cell, 46, 705-716.

H. Singh. R. Sen, D. Baltimore, P. A. Sharp. 1986. A Nuclear Factor That Binds to a Conserved Sequence Motif in Transcriptional Control Elements of Immunoglobulin Genes. Nature, 319, 154-158.

L.M. Staudt, H. Singh, R. Sen, T. Wirth, P.A. Sharp, D. Baltimore. 1986. A Lymphoid-Specific Protein Binding to the Octamer Motif og Immunoglobulin Genes. Nature, 323, 640-643.

M.L. Atchison, R.P. Perry. 1987. The Role of the x Enhancer and Its Binding Factor NF-xB in the Development Regulation of x Gene Transcription. Cell, 48, 121-128.

L.E. Babiss, R.S. Herbst, A.L. Bennett, J.E. Darnell, Jr. 1987. Factors That Interact with the Rat Albumin Promoter Are Present Both in Hepatocytes and Other Cell Types. Genes and Devel, 1, 256-267.

S. Cereghini, M. Raymondjean, A.G. Carranca, P. Herbomel. M. Yanit). 1987. Factors Involved in Control of TissueSpecific Expression of Albumin Gene. Cell, 50, 627-638.

S. Eaton, K. Calame. 1987. Multiple Elements Are Necessary for the Function of an Immunoglobulin Heavy Chain Promoter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 7634-7638.

J.M. Heard, P. Herbomel, M.O. Oil, A. Mottura-Rollicr, M. Weiss, M. Yaniv. 1987. Determinants of Rat Albumin Promoter Tissue Specificity Analyzed by an Improved Transient Expression System. Mol. Cell. Biol., 7, 24252434.

J. L. Imler, C. Lemaire. C. Wasylyk, B. Wasylyk. 1987. Negative Regulation Contributes to Tissue Specificity of the Immunoglobulin Heavy-Chain Enhancer. Mol. Cell. Biol., 7, 2558-2567.

M. Lenardo. J. W. Pierce, D. Baltimore. 1987. Protein-Binding Sites in 1g Gene Enhancers Determine Transcriptional Activity and Inducibility. Science, 236, 1573- 1577.

S. Lichsteiner, J. Wuarin, U. Schibler. 1987. The Interplay of DNA-Binding Proteins on the Promoter of the Mouse Albumin Gene. Cell. 51, 963-973.

Peterson, K. Calame. 1987. Complex Protein-DNA Interactions on the Mouse Immunoglobulin Heavy Chain Enhancer. Mol. Cell. Biol., 7, 4194-4203.

Scheidereit, A. Heguy, R.G. Roeder. 1987. Identification and Purification of a Human Lymphoid-Specific OctamerBinding Protein (OTF-2) That Activates Transcription of an Immunoglobulin Promoter in Vitro. Cell, 51, 783-793.

K. Araki, H. Maeda, J. Wang. D. Kitamura, T. Watanabe. 1988. Purification of a Nuclear Trans-Acting Factor Involved in the Regulated Transcription of a Human Immunoglobulin Heavy Chain Gene. Cell, 53, 723-730.

A.S. Baldwin, Jr., P. Sharp. 1988. Two Transcription Factors, NF-xB and H2TF1, Interact with a Single Regulatory Sequence in the Class I Major Histocompatibility Complex Promoter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 723-727.

K. Calame, S. Eaton. 1988. Transcriptional Controlling Elements in the Immunoglobulin and T Cell Receptor Loci. Adv. Immunol. 43, 235-275.

S. Cereghini, M. Blumenfeld, M. Yaniv. 1988. A Liver-Specific Factor Essential for Aibumin Transcription Differs Between Differentiated and Dedifferentiated Rat Hepatoma Cells. Genes and Devel., 2, 957-974.

R.H. Costa, E. Lai. D. R. Grayson. J.E. Darnell. Jr. 1988. The Cell-Specific Enhancer of the Mouse Transthyretin (Prealbumin) Gene Binds a Common Factor at One Site and a Liver-Specific Factor(s) at Two Other Sites. Mol. Cell. Biol., 8, 81-90.

G. Courtois. S. Baumhueter. G. R. Crabtree. 1988. Purified Hepatocyte Nuclear Factor 1 Interacts with a Family of Hepatocyte-Specific Promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85. 7937-7941.

R. Godbout, R.S. Ingram, S.M. Tilghman. 1988. Fine-Structure Mapping of the Three Mouse a-Fetoprotein Gene Enhancers. Mol. Cell. Biol., 8, 1169-1178.

R. Godbout, S. M. Tilghman. 1988. Configuration of the a-Fetoprotein Regulatory Domain During Development. Genes and Devel., 2, 949-956.

R. Grayson, R. H. Costa. K. G. Xanthopoulos, J. E. Darnell. Jr. 1988. A Cell-Specific Enhancer of the Mouse al-Anti- trypsin Gene Has Multiple Functional Regions and Corresponding Protein-Binding Sites. Mol. Cell, Biol., 8, 1055-1066.

D. R. Grayson, R. H. Costa, K. G. Xanthopoulos, J. E. Darnell. 1988. One Factor Recognizes the Liver-Specific Enhancers in al-Antitrypsin and Transthyretin Genes. Science, 239, 786-788.

R. Grosschedl. M. Marx. 1988. Stable Propagation of the Active Transcriptional State of an Immunoglobulin Gene Requires Continuous Enhancer Function. Cell, 55, 645-654.

K. Kawakami, C. Scheidereit, R. G. Roeder. 1988. Identification and Purification of a Human Immunoglobulin-Enhancer- Binding Protein (NF-xB) That Activates Transcription from a Human Immunodeficiency Virus Type 1 Promoter in Vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 4700-4704.

H. Ko, P. Fast, W. McBride, L. M. Staudt. 1988. A Human Protein Specific for the Immunoglobulin Octamer DNA Motif Contains a Functional Homeobox Domain. Cell, 55, 135-144.

J. H. LeBowitz, T. Kobayashi, L. Staudt, D. Baltimore, P. A. Sharp. 1988. Octamer-Binding Proteins from В or HeLa Cells Stimulate Transcription of the Immunoglobulin HeavyChain Promoter in Vitro. Genes and Devel, 2, 12271237.

M. M. Muller, S. Ruppert. W. Schaffner. P. Matthias. 1988. A Cloned Octamer Transcription Factor Stimulates Transcription from Lymphoid-Specific Promoters in Non-B Cells. Nature, 336, 544-551.

J. Perez-Mutul, M. Macchi, B. Wasylyk. 1988. Mutational Analysis of the Contribution of Sequence Motifs Within the IgH Enhancer to Tissue Specific Transcriptional Activation. Nucleis Acids Res., 16, 6085-6096.

C. Scheidereit. J. A. Cromlish, T. Gerster, K. Kawakami, C. Bal- maceda, R.A. Currie. R.G. Roeder. 1988. A Human Lymphoid-Specific Transcription Factor That Activates Immunoglobulin Genes Is a Homeobox Protein. Nature, 336, 551-557.

H. Singh. J.H. LeBowitz, A.S. Baldwin, Jr., P.A. Sharp. 1988. Molecular Cloning of an Enhancer Binding Protein: Isolation by Screening of an Expression Library with a Recognition Site DNA. Cell, 52, 415-423.

L. M. Staudt. R. G. Clerc, H. Singh, J. H. LeBowitz, P. A. Sharp, D. Baltimore. 1988. Cloning of a Lymphoid-Specific cDNA Encoding a Protein Binding the Regulatory Octamer DNA Motif. Science, 241, 577-579.

Wasylyk. 1988. Transcription Elements and Factors of RNA Polymerase В Promoters of Higher Eukaryotes. Crit. Rev. Biochem., 23, 77-120.

К. L. Calame. 1989. Immunoglobulin Gene Transcription: Molecular Mechanisms. Trends Genet, 5, 395-399.

S.A. Camper, S.M. Tighman. 1989. Postnatal Repression of the a-Fetoprotein Gene Is Enhancer Independent. Genes and Devel., 3, 537-546.

A. D. Friedman.W.H. Landschulz, S.L. McKnight. 1989.

CCAAT/Enhancer Binding Protein Activates the Promoter of the Serum Albumin Gene in Cultured Hepatoma Cells. Genes and Devel., 3, 1314-1322.

M. A. Garcia-Blanco, R.G. Clerc, P. A. Sharp. 1989. The DNA-Binding Homeo Domain of the Oct-2 Protein. Genes and Devel., 3, 739-745.

P. Herbomeb, A. Mottura, F. Tranche, M.O. Oil. M. Yann M. Weiss. 1989. The Rat Aibumin Promoter Is Composed of Six Distinct Positive Elements Within 130 Nucleotides. Mol. Cell. Biol., 9, 4750-4758.

/. Kemler, E. Schreiber, M.M. Muller, P. Matthias, W. Schaffner. 1989. Octamer Transcription Factors Bind to Two Different Sequence Motifs of the Immunoglobulin Heavy Chain Promoter. EM BO J., 8. 2001-2008.

M. J. Lenardo, D. Baltimore. 1989. NF-xB: A Pleiotropic Medi- tor of Inducible and Tissue Specific Gene Control. Cell, 58, 227-229.

К. B. Meyer, M.S. Neuberger. 1989. The Immunoglobulin x Locus Contains a Second, Stronger B-Cell-Specific Enhancer Which Is Located Downstream of the Constant Region. EM BO J., 8, 1959-1964.

Murre, P.S. McCaw, D. Baltimore. 1989. A New DNA Binding and Dimerization Motif in Immunoglobulin Enhancer Binding, Daughterless, MyoD, and myc Proteins. Cell, 56, 777-783.

R. H. Scheuermann, U. Chen. 1989. A Developmental-Specific Factor Binds to Suppressor Sites Flanking the Immunoglobulin Heavy-Chain Enhancer. Genes and Devel., 3, 1255-1266.

e

R. I. Richards, A. Heguy, M. Karin. 1984. Structural and Functional Analysis of the Human Metalloothionein-1A Gene: Differential Induction by Metal Ions and Glucocorticoids. Cell, 37, 263-272.

Wu. 1984. Activating Protein Factor Binds in Vitro to Upstream Control Sequeces in Heat Shock Gene Chromatin. Nature, 311, 81-84.

M. Bienz. 1985. Transient and Development Activation of Heat-Shock Genes. Trends Biochem. Sci., 10, 157-161.

J. Simpson, M. P. Timko, A. R. Cashmore, J. Schell, M. Van- Montagu, L. Herrera-Estrella. 1985. Light-Inducible and Tissue-Specific Expression of a Chimaeric Gene Under Control of the 5'-Flanking Sequence of a Pea Chlorophyll ab-Binding Protein Gene. EMBO J., 4, 2723-2729.

M.P. Timko, A.P. Kausch. C. Castresana, J. Fussier, L. Herrera-Estrella, G. Van den Broeck, M. Van Montagu, J. Schell, A.R. Cashmore. 1985. Light Regulation of Plant Gene Expression by an Upstream Enhancer-Like Element. Nature, 318, 579-582.

M. Bienz, H.R.B. Pelham. 1986. Heat Shock Regulatory Elements Function as an Inducible Enhancer in the Xenopus hs70 Gene and When Linked to a Heterologous Promoter. Cell, 45 753-760.

S. Grenn, P. Walter, V. Kumar, A. Krust, J. Bornert, P. Argos, P. Chambon. 1986. Human Oestrogen Receptor cDNA: Sequence, Expression and Homology to v-erb-A. Nature, 320, 134-139.

H. Hamer. 1986. Metallothionein. Annu. Rev. Biochem., 55, 913-951.

R. Kiemenz, WJ. Gehring. 1986. Sequence Requirement for Expression of the Drosophila melanogaster Heat Chock Protein hs22 Gene During Heat Shock and Normal Development. Mol. Cell. Biol., 6, 2011-2019.

R.D. Andersen, S.J. Taplitz, S. Worg, G. Bristol, B. Larkin, H.R. Herschman. 1987. Metal-Dependent Binding of a Factor in Viro to the Metal-Responsive Elements of the Metallothionein-1 Gene Promoter. Mol. Cell. Biol., 7, 3574-3581.

Giguere, E.S. Ong, P. Segui, F.M. Evans. 1987. Identification of a Receptor for the Morphogen Retinoic Acid. Nature, 330, 624-629.

Gill, M. Ptashne. 1987. Mutants of GAL4 Protein Altered in an Activation Function. Cell, 51, 121-126.

S. Green. P. Chambon. 1987. Oestradiol Induction of a Glucocorticoid-Responsive Gene by a Chimaeric Receptor. Nature, 325, 75-78.

M. Johnston. 1987. A Model Fungal Gene Regulatory Mechanism: The GAL Genes of Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Rev., 51, 458-476.

M. Karin, A. Haslinger, A. Heguy, T. Dietlin, T. Cooke. 1987. Metal-Responsive Elements Act as Positive Modulators of Human Metallothionein-IIA Enhancer Activity. Mol. Cell. Biol., 7, 606-613.

R. E. Kingston, T. J. Schuetz, Z. Lavin. 1987. Heat-Inducible Human Factor That Binds to a Human hsp"№ Promoter. Mol. Cell. Biol., 7, 1530-1534.

Kuhl, J. de la Fuente, M. Chaturveci, S. Parimoo, J. Ryals, F. Meyer, C. Weissmann. 1987. Reversible Silencing of Enhancers by Sequences Derived from the Human IFN-a Promoter. Cell, 50, 1057- 1069.

Kuhlemeier, P.J. Green. N. Chua. 1987. Regulation of Gene Expression in Higher Plants. Annu. Rev. Plant Physiol., 38, 221-257.

Kumar, S. Green. G. Stack, M. Berry, J. Jin, P. Chambon. 1987. Functional Domains of the Human Estrogen Receptor. Cell, 51, 941-951.

W. Lee, A. Haslinger, M. Karin, R. Tjian. 1987. Activation of Transcription by Two Factors That Bind Promoter and Enhancer Sequences of the Human Metallothionein Gene and SV 40. Nature, 325, 368-372.

N.F. Lue, D.L Chasman, A.R. Buchman, R.D. Kornberg. 1987. Interaction of GAL4 and GAL80 Gene Regulatory Proteins in Vitro. Mol. Cell. Biol., 7, 3446-3451.

J. Ma, M. Ptaschne. 1987. Deletion Analysis of GAL4 Defines Two Transcriptional Activating Segments. Cell, 48, 847853.

M. Petkovich, N.J. Brand, A. Krust, P. Chambon. 1987. A Human Retinoic Acid Receptor Which Belongs to the Family of Nuclear Receptors. Nature, 330, 444-450.

G. Wiederrecht, D. J. Shuey. W.A.Kibbe, C.S. Parker. 1987. The Saccharomyces and Drosophila Heat Shock Transcription Factors Are Identical in Size and DNA Binding Properties. Cell, 48, 507-515.

Zimarino, C. Wu. 1987. Induction of Sequence-Specific Binding of Drosophila Heat Shock Activator Protein Without Protein Synthesis. Nature, 327, 727-730.

LE. Akerblom, E.P. Slater, M. Geato, J.D. Baxter, P.L. Mellon. 1988. Negative Regulation by Glucocorticoids Through Interference with a cAMP Responsive Enhancer. Science, 241, 350-353.

N. Brand, M. Petkovich, A. Krust. P. Chambon, H. de The, A. Marchie, P. Tiollais, A. Dejean. 1988. Identification of a Second Human Retinoic Acid Receptor. Nature, 332, 850 853.

R. M. Evans. 1988. The Steroid and Thyroid Hormone Receptor Superfamily. Science, 240, 889-895.

P. Furst, S. Hu, R. Hackett, D. Hamer. 1988. Copper Activates Metallothionein Gene Transcription by Altering the Conformation of a Specific DNA Binding Protein. Cell, 55, 705-717.

Giguere, N. Yang, P. Segui, R. M. Evans. 1988. Identification of a New Class of Steroid Hormone Receptors. Nature, 331, 91-94.

S. Green, Р. Chambon. 1988. Receptors Enhance Our Understanding of Transcription Regulation. Trends. Genet., 4. 309- 314.

S. Green, И Kumar, 1. Theulaz, W. Wahli, P. Chambon. 1988. The N-Terminal DNA-Binding “Zinc Finger” of the Oestrogen and Glucocorticoid Receptors Determines Target Gene Specifity. EM BO J., 7, 3037- 3044.

S.M. Hollenberg, R.M. Evans. 1988. Multiple and Cooperative Trans-Activation Domains of the Human Glucocorticoid Receptor. Cell, 55, 899-906.

M. Horikoshi, M.F. Carey. H. Kakidani. R.G. Roeder. 1988. Mechanism of Action of a Yeast Activator: Direct Effect of GAL4 Derivatives on Mammalian TFIID-Promoter Interactions. Cell, 54, 665-669.

H. Kakidani, M. Ptaschne. 1988. GAL4 Activates Gene Expression in Mammalian Cells. Cell, 52, 161-167.

Kumar, P. Chambon. 1988. The Estrogen Receptor Binds Tightly to Its Responsive Element as a Ligand-Induced Homodimer. Cell, 55, 145-156.

Lin. M.F. Carey, M. Ptaschne, M.R. Green. 1988. GAL4 Derivatives Function Alone and Synergistically with Mammalian Activators in Vitro. Cell, 54, 659-664.

T. Maniatis. 1988. Mechanisms of Human p-Interferon Gene Regulation. Harvey Lectures, Series 82, 71-104.

Metzger, J. H. White. P. Chambon. 1988. The Human Oestrogen Receptor Functions in Yeast. Nature, 334, 31-36.

A.E. Oro, S.M. Hollenberg. R.M. Evans. 1988. Transcriptional Inhibition by a Glucocorticoid Receptor-p-Galactosidase Fusion Protein. Cell, 55, 1109-1114.

A.E. Oro. E.S Ong, J. S. Margolis, J.W. Posakony, M. McKeown, R.M. Evans. 1988. The Drosophila Gene Knirps- Related Is a Member of the Steroid-Receptor Gene Superfamily. Nature, 336, 493-496.

M. Ponglikimongkol. S. Green, P. Chambon. 1988. Genomic Organization of the Human Oestrogen Receptor Gene. EM BO J., 7, 3385-3388.

D.D. Sakai, S. Helms, J. Carlstedt-Duke, J. Gustafsson, F.M. Rottman.K.R. Yamamoto. 1988. Hormone-Mediated Repression A Negative Glucocorticoid Response Element from the Bovine Prolactin Gene. Genes and Devel., 2, 1144-1154.

M. Schena, K.R. Yamamoto. 1988. Mammalian Glucocorticoid Receptor Derivatives Enhance Transcription in Yeast. Science, 241, 965-967.

R Schuie, M. Muller, C. Kaltschmidt, R. Renkawitz. 1988. Many Transcription Factors Interact Synergistically with Steroid Receptors. Science, 242, 1418-1420.

L. Тога, H. Gronemeyer, B. Turcotte, M. Gaub, P. Chambon. 1988. The N-Terminal Region of the Chicken Progesterone Receptor Specifies Target Gene Activation. Nature, 333, 185-188.

S. Y. Tsai, J. Carlstedt-Duke, N. L. Weigel, K. Dahlman, J. Gustafsson, M. Tsai, B. W. O'Malley. 1988. Molecular Interactions of Steroid Hormone Receptor with its Enhancer Element: Evidence for Receptor Dimer Formation. Cell, 55, 361-369.

K. Umesono. V. Giguere, C.K. Glass, M.G. Rosenfeld, R.M. Evans. 1988. Retinoic Acid and Thyroid Hormone Induce Gene Expression Through a Common Responsive Element. Nature, 336, 262-265.

M. L. Waterman, S. Adler, C. Nelson. G. L. Greene. R. M. Evans, M.G. Rosenfeld. 1988. A Single Domain of the Estrogen Receptor Confers Deoxyribonucleic Acid Binding and Transcriptional Activation of the Rat Prolactin Gene. Mol. Endocrin., 2, 14-21.

N. Webster, J.R. Jin. S. Green, M. Hollis, P. Chambon. 1988. The Yeast UASC Isa Transcriptional Enhancer in Human HeLa Cells in the Presence of the GAL4 Trans-Activator. Cell, 52, 169-178.

G. Wiederrecht, D. Seto, C.S. Parker. 1988. Isolation of the Gene Encoding the S. cerevisiae Heat Shock Transcription Factor. Cell, 54, 841 853.

P.N. Benfey, N. Chua. 1989. Regulated Genes in Transgenic Plants. Science, 244, 174-181.

A. Craig. 1989. Essential Roles of 70kDa Heat Inducible Proteins. BioEssays, 11, 48-52.

K. Damm, С. C. Thompson, R. M. Evans. 1989. Protein Encoded by v-erbA Functions as a Thyroid-Hormone Receptor Antagonist. Nature, 339, 593-596.

R. B. Goldberg, S.J. Barker, L. Perez-Grau 1989. Regulation of Gene Expression During Plant Embryogenesis. Cell, 56, 149-160.

M.J. Lenardo. C. Fan, T. Maniatis, D. Baltimore. 1989. The Involvement of NF-xB in P-lnterferon Gene Regulation Reveals Its Role as a Widely Inducible Second Messenger. Cell, 57, 287-294.

S. Mader, V. Kumar, H. de Verneuil, P. Chambon. 1989. Three Amino Acids of the Oestrogen Receptor Are Essential to Its Ability to Distinguish an Oestrogen from a Glucocorticoid-Responsive Element. Nature, 338, 271-274.

M. Meyer, H. Gronemeyer, B. Turcotte, M. Bocquel, D. Tasset, P. Chambon. 1989. Steroid Hormone Receptors Compete for Factors That Mediate Enhancer Function. Cell, 57, 433-442.

S. Y. Tsai M. Tsai, B. W. O'Malley. 1989. Cooperative Binding of Steroid Hormone Receptors Contributes to Transcriptional Synergism at Target Enhancer Elements. Cell, 57, 443-448.

8.3.Ж

W. J. Gehring. 1985. The Molecular Basis of Development. Sci. American, 253, 153-162.

WJ. Gehring. 1987. Homeo Boxes in the Study of Development. Science, 236, 1245-1252.

M.P. Scott, S.B. Carroll. 1987. The Segmentation and Homeo- tic Gene Network in Early Drosophila Development. Cell, 51, 689-698.

W. Driever. C. Nusslein-Voihard. 1988. The Bicoid Protein Determines Position in the Drosophila Embryo in a Concentration-Dependent Manner. Cell, 54, 95- 104.

W. Driever, C. Nusselein-Volhard. 1988. A Gradient of Bicoid Protein in Drosophila Embryos. Cell, 54, 83-93.

P. W. Ingham. 1988. The Molecular Genetics of Embryonic Pattern Formation in Drosophila. Nature, 335, 25-34.

P. A. Lawrence. 1988. Background to Bicoid. Cell, 54, 1-2.

M.D. Biggin, R. Tjian. 1989. Transcription Factors and the Control of Drosophila Development. Trends Genet., 5, 377-383.

W. Driever, C. Nusslein-Voihard. 1989. The Bicoid Protein Is a Positive Regulator of Hunchback Transcription in the Early Drosophila Embryo. Nature, 337, 138-143.

W. Driever, G. Thoma, C. Nusslein-Voihard. 1989. Determination of Spatial Domains of Zygotic Gene Expression in the Drosophila Embryo by the Affinity of Binding Sites for the Bicoid Morphogen. Nature, 340, 363-367.

M.J. Pankratz, M. Hoch, E. Seifert, H. Jackie. 1989. Kruppel Requirement for Knirps Enhancement Reflects Overlapping Gap Gene Activities in the Drosophila Embrvo. Nature, 341, 337-340.

D. Stanojevic, T. Hoey, M. Levine. 1989. Sequence-Specific DNA-Binding Activities of the Gap Proteins Encoded by Hunchback and Kruppel in Drosophila. Nature, 341, 331-335.

J. Treisman, C. Desplan. 1989. The Products of the Drosophila Gap Genes Hunchback and Kruppel Bind to the Hunchback Promoters. Nature, 341, 335-337.

A.S. Wilkins. 1989. Organizing the Drosophila Posterior Pattern: Why Has the Fruit Fly Made Life So Complicated for Itself? BioEssays, 11, 67.

И Е. Wright. 1989. Vertebrate Homeodomain Proteins: Families of Region-Specific Transcription Factors. Trends Biochem. Sci., 14. 52-56.

8.3.3

M. Ares, Jr., J. Chung, L. Giglio, A.M. Weiner. 1987. Distinct Factors with Spl and NF-A Specificities Bind to Adjancent Functional Elements of the Human U2 snRNA Gene Enhancer. Genes and Devel., 1, 808-817.

P. Carbon, S. Murgo, J. Ebel, A. Krol, G. Tebb, I. W. Mattaj. 1987. A Common Octamer Motif Binding Protein Is Involved in the Transcription of U6 snRNA by RNA Polymerase III and U2 snRNA by RNA Polymerase II. Cell, 51, 71-79.

J. T. Murphy, J. T. Skuzeski, E. Lund, T. H. Steinberg. R. R. Burgess, J. E. Dahlberg. 1987. Functional Elements of the Human UI RNA Promoter. J. Biol. Chern., 262, 17951803.

Das. D. Henning. D. Wright, R. Reddy. 1988. Upstream Regulatory Elements Are Necessary and Sufficient for Transcription of a U6 RNA Gene by RNA Polymerase 111. EMBO J, 7, 503-512.

R. Kunkel, T. Pederson. 1988. Upstream Elements Required for Efficient Transcription of a Human U6 RNA Gene Resemble Those of UI and U2 Genes Even Though a Different Polymerase Is Used. Genes and Devel., 2, 196-204.

W. Mattaj, N.A. Dathan, H.D. Parry, P. Carbon, A. Krol. 1988. Changing the RNA Polymerase Specificity of U snRNA Gene Promoters. Cell, 55, 435-442.

M. Tanaka, U. Grossniklaus. W. Herr, N. Hernandez. 1988. Activation of the U2 snRNA Promoter by the Octamer Motif Defines a New Class of RNA Polymerase II Enhancer Elements. Genes and Devel., 1, 1764-1778.

P. Weller, C. Bark. L. Janson, U. Pettersson. 1988. Transcription Analysis of a Human U4C Gene: Involvement of Transcription Factors Novel to snRNA Gene Expression. Genes and Devel., 2, 1389-1399.

Murphy, B. Moorefield, T. Pieler. 1989. Common Mechanisms of Promoter Recognition by RNA Polymerases II and HI. Trends Genet., 5, 123-126.

H D. Parry, D. Scherly, I. W. Mattaj. 1989. “Snurpogenesis": The Transcriptionand Assembly of U snRNA Components. Trends Biochem. Sci., 14, 15-19.

a

G. Ciliberto, L. Castagnoli, R. Cortese. 1983. Transcription by RNA Polymerase Ill. Genome Function, Cell Interactions, and Differentiation. Current Topics in Dev. Biol., 18, 59-88.

A. L. Bak, A.L. Jorgensen. 1984. RNA Polymerase 111 Control Regions in Retrovirus LTR, Alu-Type Repetitive DNA, and Papovavirus. J. Theor. Biol., 108, 339-348.

E. P. Geiduschek, G. P. Tocchini-Valentini. 1988. Transcription by RNA Polymerase 111. Annu. Rev. Biochem., 57, 873-914.

8.4.6

D.F. Bogenhagen, S. Sakonju, D.D. Brown. 1980. A Control Region in the Center of the 5S RNA Gene Directs Specific Initiation of Transcription: 11. The 3' Border of the Region. Cell, 19, 27-35.

S. Sakonju, D. F. Bogenhagen. D.D. Brown. 1980. A Control Region in the Center of the 5S RNA Gene Directs Specific Initiation of Transcription: I. The 5' Border of the Region. Cell, 19, 13-25.

Galli. H. Hofstetter, M.L. Birnstiel. 1981. Two Conserved Sequence Blocks Within Eukaryotic tRNA Genes Are Major Promoter Elements. Nature, 294, 626 631.

Larson, J. Bradford-Wilcox, L.S. Young, K.U. Sprague.

A Short 5' Flanking Region Containing Conserved Sequences Is Required for Silkworm Alanine tRNA Gene Activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 3416-3420.

D.F. Bogenhagen. 1985. The Intragenic Control Region of the Xenopus 5S RNA Gene Contains Two Factor A Binding Domains That Must Be Aligned Property for Efficient Transcription Initiation. J. Biol. Chern., 260, 6466-6471.

K.C. Raymond. G. J. Raymond, J, D. Johnson. 1985. In Vivo Modulation of Yeast tRNA Gene Expression by 5'-Flank- ing Sequences. EMBO J., 4, 2649-2656.

S. J. Sharp, J. Schaack, I. Cooley, D.J. Burke, D. Soli. 1985. Structure and Transcription of Eukaryotic tRNA Genes. Crit. Rev. Biochem., 19, 107- 144.

Ullu. A. M. Weiner. 1985. Upstream Sequences Modulate the Internal Promoter of the Human 7SL RNA Gene. Nature, 318, 371-375.

G.R. Kunkel, R.L. Maser. J.P. Calvet, T. Pederson. 1986. U6 Small Nuclear RNA Is Transcribed by RNA Polymerase III. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83, 8575-8579.

M.J. Morry, J.D. Harding. 1986. Modulation of Transcriptional Activity and Stable Complex Formation by 5'-Flanking Regions of Mouse tRNA H“ Genes. Mol. Cell. Biol., 6, 105-115.

J. Chung, D.J, Sussman, R. Zeller. P. Leder 1987. The c-mys Gene Encodes Superimposed RNA Polymerase II and HI Promoters. Cell, 51, 1001-1008.

A.D. Garcia, A.M. O'Connell, S.J. Sharp. 1987. Formation of an Active Transcription Complex in the Drosophila mela- nogaster 5S RNA Gene Is Dependent on an Upstream Region. Mol. Cell. Biol., 7, 2046-2051.

S. Murphy, C. diLiegro, M. Meili. 1987. The in Vitro Transcription of the 7SK RNA Gene by RNA Polymerase Hl Is Dependent Only on the Presence of an Upstream Promoter. Cell, 51, 81-87.

T Pieler, J. Hamm, R.G. Roeder. 1987. The 5S Gene Internal Control Region Is Composed of Three Distinct Sequence Elements, Organized at Two Functional Domains with Variable Spacing. Cell, 48, 91 -100.

S.J. Sharp, A.D. Garcia. 1988. Transcription of the Drosophila melanogaster 5S RNA Gene Requires an Upstream Promoter and Four Intragenic Sequence Elements. Mol. Cell. Biol., 8, 1266- 1274.

T. Wilson, D. P. Condliffe, K.U. Sprague. 1988. Transcriptional Properties of BmX, a Moderately Repetitive Silkworm Gene That Is an RNA Polymerase III Template. Mol. Cell. Biol., 8. 624-631.

8.4.B

A.B. Lassar, P.L. Martin, R.G. Roeder. 1983. Transcription of Class III Genes: Formation of Preinitiation Complexes. Science. 222, 740-748.

R.E. Baker, B.D. Hall. 1984. Structural Features of Yeast tRNA Genes Which Affect Transcription Factor Binding. EMBO J., 3, 2793-2800.

D.D. Brown. 1984. The Role of Stable Complexes That Repress and Activate Eukaryotic Genes. Cell, 37. 359-365.

R. Smith, I. J. Jackson, D.D. Brown. 1984. Domains of the Positive Transcription Factor Specific for the Xenopus 5S RNA Gene. Cell, 37, 645-652.

T. Enver. 1985. A Pulling Out of Fingers. Nature, 317, 385-386.

W.K. Hueffler, R.G. Roeder. 1985. Enhancement of RNA Polymerase Ill Transcription by the El A Gene Product of Adenovirus. Cell, 41, 955 963.

J. Miller, A.D. McLachlan. A. Klug. 1985. Repetitive Zins-Bin- ding Domains in the Protein Transcription Factor IHA from Xenopus Oocytes. EMBO J., 4. 1609-1614.

D.R. Setzer, D.D. Brown. 1985. Formation and Stability of the 5S RNA Transcription Complex. J. Biol. Chern., 260, 2483-2492.

M.J. Taylor, J. Segall. 1985. Characterization of Factors and

DNA Sequences Required for Accurate Transcription of the Saccharomyces cerevisiae 5S RNA Gene. J. Biol. Chern., 260, 4531-4540.

L. Fairall. D. Rhodes, A. Klug, 1986. Mapping of the Sites of Protection on a 5S RNA Gene by the Xenopus Transcription Factor III A. J. Mol. Biol., 192, 577-591.

S. C. Harrison. 1986. Fingers and DNA Half-Turns. Nature, 322, 597-598.

Rhodes, A. Klug. 1986. An Underlying Repeat in Some Transcriptional Control Sequences Corresponding to Half a Double Helical Turn of DNA. Cell, 46, 123-132.

A.P. Woljje, D.D. Brown. 1986. DNA Replication in Vitro Erases a Xenopus 5S RNA Gene Transcription Complex. Cell, 47, 217-227.

Klug, D. Rhodes. 1987. “Zinc Fingers”: A Novel Protein Motif for Nucleic Acid Recognition. Trends Biochem. Sei., 12, 464-469.

A. McConkey, D. F. Bogenhagen. 1987. Transition Mutations Within the Xenopus borealis Somatic 5S RNA Gene Can Have Independent Effects on Transcription and DFIIIA Binding. Mol. Cell. Biol., 7, 486-494.

W. R. Folk. 1988. Changing Directions in Pol III Transcription. Genes and Devel., 2, 373-375.

WK. Hoejjler, R. Kovelman, R.G. Roeder. 1988. Activation of Transcription Factor IIIC by the Adenovirus E1A Protein. Cell, 53, 907- 920.

Sollner-Webb. 1988. Surprises in Polymerase III Transcription. Cell, 52, 153-154.

K.E. Vrana, M.E.A. Churchill, ID. Tullius. D.D. Brown. 1988. Mapping Functional Regions of Transcription Factor TFIIIA. Mol. Cell. Biol., 8, 1684-1696.

8.4.r

N. R. Cozzarelli. S. P. Gerrard, M. Schlissel, D. D. Brown, D. F. Bogenhagen. 1983. Purified RNA Polymarase III Accurately and Efficiently Terminates Transcription of 5S RNA Genes. Cell, 34, 829-835.

J. Hess, C. Perez-Stable, G.J. Wu. B. Weir, I. Tinoco, Jr C.K.J. Shen. 1985. End-to-End Transcription of an Alu Family Repeat. J. Mol. Biol., 184, 7-21.

Д

W. M. Wormington, M. Schlissel, D. D. Brown. 1982. Developmental Regulation of Xenopus 5S RNA Genes. Cold Spring. Harbor Symp. Quant. Biol, 47, 879-884.

W. M. Wormington. D.D. Brown. 1983. Onset of 5S RNA Gene Regulation During Xenopus Embryogenesis. Devel. Biol., 99, 248-257.

M.S. Schlissel, D.D. Brown. 1984. The Transcriptional Regulation of Xenopus 5S RNA Genes in Chromatin: The Roles of Active Stable Transcription Complexes and Histone Hl. Cell, 37, 903-913.

D.D. Brown. M.S. Schlissel. 1985. A Positive Transcription Factor Controls the Differential Expression of Two 5S RNA Genes. Cell, 42. 759-767.

M. T. Andrews. D.D. Brown. 1987. Transient Activation of Oocyte 5S RNA Genes in Xenopus Embryos by Raising the Level of the Trans-Acting Factor TFIIIA. Cell, 51, 445-453.

J. Korn, D. R. Guinta, J.Y. Tso. 1987. TFIIIA Mediated Control of 5S RNA Gene Expression in Xenopus. In:

R. A. Firtel and E. H. Davidson (eds.). Molecular Approaches to Developmental Biology. Proceedings of the Duppon- Genetech UCLA Symposium, Keystone, Colorado, March 30-April 6, 1986 (UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, Vol. 51), pp. 25-37. Alan R. Liss, New York.

L.J. Peck, L. MUlstein, P. Eversole-Cire, J.M. Gottesjeld, A. Varshavsky. 1987. Transcriptionally Inactive OocyteType 5S RNA Genes of Xenopus laevis Are Complexed

with TFIIIA in Vitro. Mol. Cell. Biol., 7, 3503-3510.

A.P. Woljje, D.D. Brown. 1987. Differential 5S RNA Gene Expression in Vitro. Cell, 51, 733-740.

A. McConkey, D.F. Bogenhagen. 1988. TFIIIA Binds with Equal Affinity to Somatic and Major Oocyte 5S RNA Genes. Genes and Devel., 2, 205-214.

A.P. Woljje, D.D. Brown. 1988. Developmental Regulation of Two 5S Ribosomal RNA Genes. Science. 241, 1626-1632

8.5.6 и в

T. R. Cech. 1983. RNA Splicing: Three Themes with Variations. Cell, 34. 713-716.

K. Chu, G.F. Maley. F. Maley. M. Beljort. 1984. Intervening Sequence in the Thymidylate Synthase Gene of Bacteriophage T4. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 3049-3053.

Garriga, A.M. Lambowitz. 1984. RNA Splocing in Neuros- pora Mitochondria: Self-Splicing of a Mitochondrial Intron in Vitro. Cell, 38, 631-641.

H.F. Tabak. G. Van der Horst, K.A.Osinga, A.C. Arnberg. 1984. Splicing og Large Ribosomal Precursor RNA and Processing of Intron RNA in Yeast Mitochondria. Cell, 39, 623-629.

M. Beljort, J. Pedersen-Lane. D. West, K. Ehrenman. G. Maley, F. Chu, F. Maley. 1985. Processing of the Intron-Containing Thymidylate Synthase (td) Gene og Phage T4 Is at the RNA Level. Cell, 41, 375-382.

T. R. Cech. 1985. Self-Splicing RNA: Implications for Evolution. Inti. Rev. Cytol., 93, 3-22.

V. Price, T.R. Cech. 1985. Coupling of Tetrehymena Ribosomal RNA Splicing to p-Galactosidase Expression in Escherichia coli. Science, 228, 719-722.

J. Schmidt. 1985. RNA Splicing in Prokaryotes: Bacteriophage T4 Leads the Way. Cell, 41, 339-340.

van der Horst. H.F. Tabak. 1985. Self-Splicing of Yeast Mitochondrial Ribosomal and Messenger RNA Precursors. Cell, 40, 759-766.

A.C. Arnberg, G. Van der Horst. H.F. Tabak. 1986. Formation of Lariats and Cicles in Self-Splicing of the Precursor to the Large Ribosomal RNA of Yeast Mitochondria. Cell, 44, 235-242.

T.R. Cech, 1986. The Generality of Self-Splicing RNA: Relationship to Nuclear mRNA Splicing. Cell, 44, 207-210.

T. R. Cech. 1986. RNA as an Enzyme. Sci American, 255, 64-75.

F.K. Chu, G.F. Maley, D.K. West, M. Beljort. F. Maley. 1986. Characterization of the Intron in the Phage T4 Thymidylate Synthase Gene and Evidence for Its Self-Excision from the Primary Transcript. Cell, 45, 157-166.

Garriga. A. M. Lambowitz. 1986. Protein-Dependent Splicing of a Group I Intron in Ribonucleoprotein Particles and Soluble Fractions. Cell. 46, 669 680.

J.M. Gott, D.A. Shub, M. Beljort. 1986. Multiple Self-Splicing Introns in Bacteriophage T4: Evidence from Autocatalytic GTP Labeling of RNA in Vitro. Cell, 47, 81-87.

C.L. Peebles. P.S. Perlman, K.L. Mecklenburg, M.L. Petrillo, J. H. Tabor, K. A. Jarrell, H.-L. Cheng. 1986. A Self-Splicing RNA Excises an Intron Lariat. Cell, 44, 213-223.

Schmelzer, R.J. Schweyen. 1986. Self-Splicing of Group II Introns in Vitro: Mapping of the Branch Point and Mutational Unhibition of Lariat Formation. Cell, 46, 557-565.

F. Tabak, L.A. Grivell. 1986. RNA Catalysis in the Excision of Yeast Mitochondrial Introns. Trends Genet., 2, 51-55.

van der Veen, A.C. Arnberg, G. van der Horst, L. Bonen, H. F. Tabak. L. A. Grivell. 1986. Excised Group II Intron in Yeast Mitochondria Are Lariats and Can Be Formed by Self-Spricing in Vitro. Cell, 44, 225-234.

B. Waring, P. Towner, S.J. Minter, R. W. Davies. 1986. Splice-Site Selection by a Self-Splicing RNA of Tetrahymena. Nature, 321, 133-139.

R A. Akins. А. М. Lambowitz. 1987. A Protein Required for Splicing Group I Introns in Neurospora Mitochondria Is Mitochondrial Tyrosyl-tRNA Synthetase or a Derivative Thereof. Cell, 50, 331-345.

T.R. Cech. 1987. The Chemistry of Self-Splicing RNA and RNA Enzymes. Science, 236, 1532-1539.

D. H. Hall. С. M. Povinelli, K. Ehrenman, J. Pedersen-Lane, F. Chu, M. Belfort. 1987. Two Domains for Splicing in the Intron of the Phage T4 Thymidylate Synthase (td) Gene Established by Nondirected Mutagenesis. Cell, 48, 63- 71.

J. Kjems, R. A. Garrett. 1988. Novel Splicing Mechanism for the Ribosomal RNA Intron in the Archaebacterium Desulfurococcus mobilis. Cell, 54, 693-703.

J. V. Price. T.R. Cech. 1988. Determinants of the 3' Splice Site for Self-Splicing of the Tetrahymena Pre-rRNA. Genes and Devel, 2, 1439-1447.

S.A. Woodson, T.R. Cech. 1989. Reverse Self-Splicing of the Tetrahymena Group I Intron: Implication for the Directionally of Splicing and for Intron Transposition. Cell, 57, 335-345.

Augustin. M.W Muller, R.J. Schweyen. 1990. Reverse Self- Splising of Group II Intron RNAs in Vitro. Nature, 343, 383-386.

M Morl, C. Schmelzer. 1990. Integration of Group II Intron bll into a Foreign RNA by Reversal of the Self-Splicing Reaction in Vitro. Cell, 60, 629- 636.

Г

H. Busch, R. Reddy, L. Rothblum, Y.C. Choi. 1982. SnRNAs, SnRNPs, and RNA Processing. Annu. Rev. Biochem., 51, 617-654.

H. Domdey, B. Apostol, R.J. Lin, A. Newman, E. Brody, J. Abelson. 1984. Lariat Structures Are in Исо Intermediates in Yeast Pre-mRNA Splicing. Cell, 39, 611-621.

C. Hashimoto, J. A. Steitz. 1984. U4 and U6 RNAs Coexist in a Single Small Nuclear Ribonucleoprotein Particle. Nucleic Acids Res., 12, 3283-3293.

W. Keller. 1984. The RNA Lariat: A New Ring to the Splicing of mRNA Precursors. Cell, 39, 423-425.

J. R. Rodriguez, C. W. Pikieiny, M. Rosbash. 1984. In Vivo Characterization of Yeast mRNA Processing Intermediates. Cell, 39, 603-610.

D.L. Black, B. Chabot, J. A. Steitz. 1985. U2 as Well as UI Small Nuclear Ribonucleoproteins Are Involved in Premessenger RNA Splicing. Cell, 42, 737-750.

If M. Konarska, R.A. Padgett, P.A. Sharp. 1985. Trans Splicing of mRNA Precursors in Vitro, Cell, 42, 165-171.

A.J. Newman, R.J. Lin. S.C. Cheng, J. Abelson. 1985. Molecular Consequences of Specific Intron Mutations on Yeast mRNA Splicing in Vivo and in Vitro. Cell, 42, 335-344.

P A. Sharp. 1985. On the Origin of RNA Splicing and Introns. Cell, 42, 397-400.

D Solnick. 1985. Trans Splicing of mRNA Precursors. Cell, 42, 157-164.

M Ares, Jr. 1986. U2 RNA from Yeast Is Unexpectedly Large and Contains Homology to Vertebrate U4, U5 and U6 Small Nuclear RNAs. Cell, 47, 49-59.

T.R. Cech. 1986. The Generally of Self-Splicing RNA: Relationship to Nuclear mRNA Splicing. Cell, 44, 207-210.

V. Gerke, J. A. Steitz. 1986. A Protein Associated with Small Nuclear Ribonucleoprotein Particles Recognizes the 3' Splice of Premessenger RNA. Cell, 47, 973-984.

M R. Green. 1986. Pre-mRNA Splicing. Annu. Rev. Genet., 20, 671-708.

C Guthrie. 1986. Finding Functions for Small Nuclear RNAs in Yeast. Trends Biochem. Sci., 11, 430-434.

W J Murphy. K.P. Watkins, N. Agabian. 1986. Identification of a Novel Y Branch Structure as an Intermediate in Trypanasome mRNA Processing: Evidence for Trans Splicing. Cell, 47, 517-525.

R. A. Padgett, P. J. Grabowski, M. M. Konarska, S. Seiler, P.A. Sharp. 1986. Splicing of Messenger RNA Precursors. Annu. Rev. Biochem., 55, 1119-1150.

C. W. Pikieiny, M. Robash. 1986. Specific Small Nuclear RNAs Are Associated with Yeast Spliceosomes. Cell, 45, 869877.

R. E. Sutton, J.C. Boothroyd. 1986. Evidence for Trans Splicing in Trypanosomes. Cell, 47, 527-535.

J. Tazi, C. Alibert, J. Temsamani. I. Reveillaund, G. Cathala, C. Brunel, P. Jeanteur. 1986. A Protein That Specifically Recognizes the 3' Splice Site of Mammalian Pre-mRNA Introns Is Associated with a Small Nuclear Ribonucleoprotein. Cell, 47, 755-766.

L. H. T. Van der Ploeg. 1986. Discontinuous Transcription and Splicing in Trypanasomes. Cell, 47, 479-480.

Y Zhuang, A.M. Weiner. 1986. A Compensatory Base Change in UI snRNA Suppresses a 5' Splice Site Mutation. Cell, 46, 827-835.

A. Bindereif, M.R. Green. 1987. An Ordered Pathway of snRNP Binding During Mammalian Pre-mRNA Splicing Complex Assembly. EM BO J., 6, 2415 2424.

S.C. Cheng, J. Abelson. 1987. Spliceosome Assembly in Yeast. Genes and Devel., 1, 1014-1027.

J. R. Couto, J, Tamm, R. Parker, C. Guthrie. 1987. A Transacting Suppressor Restores Splicing of a Yeast Intron with a Branch Point Mutation. Genes and Devel, 1, 445-455.

M.M. Konarska. P.A. Sharp. 1987. Interactions Between Small Nuclear Ribonucleoprotein Particles in Formation of Spliceosomes. Cell, 49, 763-774.

M. Krause, D. Hirsh. 1987. A Trans-Splised Leader Sequence on Actin mRNA in C. elegans. Cell, 49, 753-761.

M. Lossky. G.J. Anderson. S.P. Jackson, J. Beggs. 1987. Identification of a Yeast snRNP Protein and Detection of snRNPRsnRNP Interactions. Cell, 51, 1019-1026.

R. Luhrmann. 1987. snRNP Proteins. In: M. L. Birnstiel (ed.). Structure and Function of Major and Minor Small Nuclear Ribonucleoprotein Particles, pp. 71-99. Springer Verlag, Heidelberg.

T. Maniatis, R. Reed. 1987. The Role of Small Nuclear Ribonucleoprotein Particles in Pre-mRNA Splicing. Nature, 325, 673-678.

R. Parker. P.G. Siliciano, C. Guthrie. 1987. Recognition of the TACTAAC Box During mRNA Splicing in Yeast Involves Base Pairing to the U2-like snRNA. Cell, 49, 229-239.

P.A. Sharp. 1987. Trans Splicing: Variation on a Familiar Theme? Cell, 50, 147-148.

S. Bektesh, K. Van Doren, D. Hirsh. 1988. Presence of the Caenorhabditis elegans Spliced Leader on Different mRNAs and in Different Genera of Nematodes. Genes and Devel., 2, 1277-1283.

C. Guthrie, B. Patterson. 1988. Spliceosomal snRNAs. Annu. Rev. Genet., 22, 387-418.

D.H. Kedes, J. A. Steitz. 1988. Correct in Vivo Splicing of the Mouse Immunuglobulin К Light-Chain Pre-mRNA Is Dependent on 5' Splice-Site Position Even in the Absence of Transcription. Genes and Devel., 2, 1448-1459.

Kramer. 1988. Presplicing Complex Formation Requires Two Proteins and U2 snRNP. Genes and Devel., 2, 1155-1167.

R. Reed, J. Griffith. T. Maniatis. 1988. Purification and Visualization of Native Spliceosomes. Cell, 53, 949-961.

R. Reed, T. Maniatis. 1988. The Role of the Mammalian Branchpoint Sequence in Pre-mRNA Splicing. Genes and Devel., 2, 1268-1276.

Ruskin, P. D. Zamore. M. R. Green. 1988. A Factor, U2AF, Is Required for U2 snRNP Binding and Splicing Complex Assembly. Cell, 52, 207-219.

P. G. Silicano, C. Guthrie. 1988. 5' Splice Site Selection in Yeast: Genetic Alterations in Base-Pairing with U1 Reveal Additional Requirements. Genes and Devel., 2, 1258-1267.

J. A. Steitz. 1988. “Snurps”. Sci. American, 258 (6), 56-63.

Д

C.L. Peebles, R.C. Ogden, G. Knapp, J. Abelson, 1979. Splicing of Yeast tRNA Precursors: A Two-Stage Reaction. Cell, 18, 27-35.

E.M. De Robertis, P. Black, K. Nishikura. 1981. Intranuclear Location of the tRNA Splicing Enzymes. Cell. 23, 89-93.

C.L. Greer, C.L. Peebles, P. Gegenheimer, J. Abelson. 1983. Mechanism of Action of a Yeast RNA Ligase in tRNA Splicing. Cell, 32, 537-546.

C.L. Peebles, D. Gegenheimer, J. Abelson. 1983. Precise Excision of Intervening Sequences from Precursor tRNAs by a Membrane-Associated Yeast Endonuclease. Cell, 32, 525-536.

M.l. Baldi, E. Mattoccia, S. Ciafre, D.G. Attardi, G. P. Toc- chini-Valentini. 1986. Binding and Cleavage of pre-tRNA by the Xenopus Splicing Endonuclease: Two Separatable Steps of the Intron Excision Reaction. Cell, 47, 965-971.

C.L. Greer. 1986. Assembly of a tRNA Splicing Complex: Evidence for Concerted Excision and Joining Steps in Splicing in Vitro. Mol. Cell. Biol., 6, 635-644.

E.M. Phizicky, R.C. Schwartz. J. Abelson. 1986. S. cerevisiae tRNA Ligase: Purification of the Protein and Isolation of the Structural Gene. J. Biol. Chern., 261, 2978-2986.

C.L. Greer, D. Soil, I. Willis. 1987. Substrate Recognition and Identification of Splice Sites by the tRNA-Splicing Endonuclease and Ligase from Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol., 7, 76-84.

V.M. Reyes, J. Abelson. 1988. Substrate Recognition and Splice Site Determination in Yeast tRNA Splicing. Cell, 55, 719-730.

N. Stange, H.J. Gross. H. Beier. 1988. Wheat Germ Splicing Endonuclease Is Highly Specific for Plant Pre-tRNAs. EM BO J., 7, 3823-3828.

M. Winey. I. Edelman, M. R. Culbertson. 1989. A Synthetic Intron in a Naturally Intronless Yeast Pre-tRNA Is Spliced Efficiently in Vivo. Mol. Cell. Biol., 9, 329-331.

e

M. G. Rosenfeld. C. R. Lin, S. G. Amara, L. Stolarsky, B. A. Roos, E.S. Ong, R.M. Evans. 1982. Calcitonin mRNA Polymorphism: Peptide Switching Associated with Alternative RNA Splicing Events. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79, 1717-1721.

M. Kress, D. Claros. G. Khoury, G. Jay. 1983. Alternative RNA Splicing in Expression of the H-2K Gene. Nature, 306, 602-604.

W. Chung, E. W. Davie. 1984. у and Y Chains of Human Fibrinogen Are Produced by Alternative mRNA Processing. Biochemistry, 23, 4232-4236.

de Ferra, H. Engh, L. Hudson, J. Kamholz. C. Puckett, S. Molineaux, R. A. Lazzarini. 1985. Alternative Splicing Accounts for the Four Forms of Myelin Basic Protein. Cell, 43, 721-727.

A.R. Kornblith. K. Umezawa. K. Vibe-Pedersen, F.E. Baralle. 1985. Primary Structure of Human Fibronectin: Differential Splicing May Generate at Least 10 Polypeptides from a Single Gene. EMBO J., 4., 1755-1759.

Solnick. 1985. Alternative Splicing Caused by RNA Secondary Structure. Cell, 43, 667-676.

R. Zamoyska, A. C. Vollmer, К. C. Sizer, C. W. Liaw, J. R. Par- nes. 1985. Two Lyt-2 Polypeptides Arise from a Single Gene by Alternatuve Splicing Patterns of mRNA. Cell, 43, 153-163.

Ben-Neriah, A. Bernards, M. Paskind, G.Q. Daley, D. Baltimore. 1986. Alternative 5' Exons in c-abl mRNA. Cell, 44, 577-586

S.E.Lejf M.G. Rosenfeld. 1986. Complex Transcriptional Units: Diversity in Gene Expression by Alternative RNA

Processing. Annu. Rev. Biochem., 55, 1091-1117.

J.L Paul, J.E. Schwarzbauer, J. W. Tamkun, R.O. Hynes. 1986. Cell-Type-Specific Fibronectin Subunits Generated by Alternative Splicing. J. Biol. Chern., 261, 12258-12265.

R. Reed, T. Maniatis. 1986. A Role for Exon Sequences and Splice-Site Proximity in Splice-Site Selection. Cell, 46, 681-690.

Andreadis, M. E. Gallego, B. Nadal-Ginard. 1987. Generation of Protein Isoform Diversity by Alternative Splicing: Mechanistic and Biological Implications. Annu. Rev. Cell Biol., 3, 207-242.

R. E. Breitbart, A. Andreadis. B. Nadal-Ginard. 1987. Alternative Splicing: A Ubiquitous Mechanism for the Generation of Multiple Protein Isoforms from Single Genes. Annu. Rev. Biochem., 56, 467-495.

R. E. Breitbart, B. Nadal-Ginard. 1987. Developmentally Induced, Muscle-Specific Trans Factors Control the Differential Splicing of Alternative and Constitutive Troponin T Exons. Cell, 49, 793-803.

J.C.S. Noble. C. Prives. J.L. Manley. 1988. Alternative Splicing of SV 40 Early Pre-mRNA Is Determined by Branch Site Selection. Genes and Devel., 2, 1460-1475.

J.C.S. Noble. Z.Q. Pan, C. Prives, J.L. Manley. 1987. Splicing of SV 40 Early Pre-mRNA to Large T and Small t mRNAs Utilizes Different Patterns of Lariat Branch Sites. Cell, 50, 227-236.

S. Baker. 1989. Sex in Flies: The Splice of Life. Nature, 340, 521-524.

a

C.O. Pabo, R. T. Sauer. 1984. Protein-DNA Recognition. Annu. Rev. Biochem.. 53, 293-321.

J.E. Anderson, M. Plashne, S.C. Harrison. 1985. A Phage Repressor-Operator Complex at 7 A Resolution. Nature, 316, 596-605.

W.J. Gehring. 1985. The Homeo Box: A Key to the Understanding of Development? Cell, 40, 3-5.

J.M. Berg. 1986. More Metal-Binding Fingers. Nature, 319, 264-265.

J.M. Berg. 1986. Potential Metal-Binding Domains in Nucleic Acid Binding Proteins. Science, 232, 485-487.

U. B. Rosenberg, C. Schroder, A. Preiss, A. Kienlin, S. Cote, I. Riede. H. Jackie. 1986. Structural Homology of the Product of the Drosophila kruppel Gene with Xenopus Transcription Factor I1IA. Nature, 319, 336-339.

A. Klug, D. Rhodes. 1987. “Zinc Fingers’’: A Novel Protein Motif for Nucleic Acid Recognition. Trends Biochem. Sci., 12, 464-469.•

K. Struhl. 1987. The DNA-Binding Domains of the Jun Oncoprotein and the Yeast CN4 Transcriptional Activator Protein Are Functionally Homologous. Cell, 50, 841846.

J.M. Berg. 1988. Proposed Structure for the Zinc-Binding Domains from Transcription Factor 1IIA and Related Proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 99-103.

M. Bodner, J. Castrillo. L. E. Theill, T. Deerinck. M. Ellisman.

M. Karin. 1988. The Pituitary-Specific Transcription Factor GHF-1 Is a Homeobox-Containing Protein. Cell, 55, 505-518.

R. Chiu, W.J. Boyle, J. Meek, T. Smeal, T. Hunter, M. Karin. 1988. The c-Fos Protein Interacts with c-Jun/AP-1 to Stimulate Transcription of AP-1 Responsive Genes. Cell, 54, 541-552.

R.G. Clerc, L.M. Corcoran. H.H. LeBowitz, D. Baltimore. 1988. The В Cell Specific Oct-2 Protein Contains POU- Box and Homeo Box Type Domains. Genes and Devel., 2, 1570-1582.

T. Curran, B. R. Franza, Jr. 1988. Fos and Jun: The AP-1 Connection. Cell, 55, 395-397.

C. Desplan, J. Theis, P. H. O’Farrell. 1988. The Sequence Sped-

ficity of Homeodomain-DNA Interaction. Cell, 54, 1081 — 1090.

R.M. Evans, S.M. Hollenberg. 1988. Zinc Fingers: Gilt by Association. Cell, 52, 1-3.

T.D. Halazonetis, K. Georgopoulos, M.E. Greenberg, P. Leder. 1988. c-Jun Dimerizes with Itself and with c-Fos. Forming Complexes of Different DNA Binding Affinities. Cell, 55, 917-924.

W. Herr. R. A. Sturm, R. G. Clerc, L. M. Corcoran, D. Baltimore, P. A. Sharp, H. A. Ingraham, M.G. Rosenfeld, M. Finney, G. Ruvkun, H.R. Horvitz. 1988. The POU Domain: A Large Conserved Region in the Mammalian Pit-1, Oct-1, Oct-2, and Caenorhabditis elegans Unc-86 Gene Products. Genes and Devel., 2, 1513-1516.

H. A. Ingraham, R. Chen. H. J. Mangalam, H. P. Elsholtz, S. E. Flynn. C. R. Lin. D. M. Simmons, L. Swanson. M. G. Rosenfeld. 1988. A Tissue-Specific Transcription Factor Containing a Homeodomain Specifies a Pituitary Phenotype. Cell, 55, 519-529.

T. Kouzarides, E. Ziff. 1988. The Role of the Leucine Zipper in the Fos-Jun Interaction. Nature, 336, 646-651.

W. H. Landschulz. P. F. Johnson, S. L. McKnight. 1988. The Leucine Zipper: A Hypothetical Structure Common to a New Class of DNA Binding Proteins. Science, 240, 1759-1764.

M. Levine, T. Hoey. 1988. Homeobox Proteins as SequenceSpecific Transcription Factors. Cell, 55, 537-540.

Y. Nakabeppu, K. Ryder, D. Nathans. 1988. DNA Binding Activities of Three Murine Jun Proteins: Stimulation by Fos. Cell, 55. 907-915.

F.J. Rouscher HI, P.J. Voulalas. B.R. Franza, Jr., T. Curran. 1988. Fos and Jun Bind Cooperatively to the AP-1 Site: Reconstitution in Vitro. Genes and Devel., 2, 1687-1699.

M. Robertson. 1988. Homeo Boxes, POU Proteins and the Limits to Promiscuity. Nature, 336, 522-524.

R. T. Sauer. D.L. Smith, A.D. Johnson. 1988. Flexibility of the Yeast a2 Repressor Enables It to Occupy the Ends of Its Operator, Leaving the Center Free. Genes and Devel., 2, 807-816.

R. A. Sturm. G. Das. W. Herr. 1988. The Ubiquitous OctamerBinding Protein Oct-1 Contains a POU Domain with a Homeo Box Subdomain. Genes and Devel., 2, 1582— 1599.

R.G. Brennan, B. W. Matthews. 1989. Structural Basis of DNA- Protein Recognition. Trends Biochem Sci., 14, 286-290.

W.H. Landschulz. P.F. Johnson, S.L. McKnight. 1989. The DNA Binding Domain of the Rat Liver Nuclear Protein C/EBP is Bipartite. Science, 243, 1681-1687.

M.S. Lee, G.P. Gippert. К. V. Soman, D.A. Case. P.E. Wright. 1989. Three-Dimensional Solution Structure of a Single Zinc Finger DNA-Binding Domain. Science, 245, 635-637.

A. R. Oliphant, C. J. Branch, K. Struhl. 1989. Definning the Sequence Specificity of DNA-Binding Proteins by Selecting Binding Sites from Random-Sequence Oligonucleotides: Analysis of Yeast GCN4 Protein. Mol. Cell. Biol., 9, 2944-2949.

E.K. O'Shea, R. Rutkowski. W.F. Stafford HI. P.S. Kim. 1989. Preferential Heterodimer Formation by Isolated Leucine Zippers from Fos and Jun. Science, 245, 646-648.

T. B. Rajavashisth, A. K. Taylor, A. Andalibi, K. L. Svenson, A. J. Lusis. 1989. Identification of a Zinc Finger Protein That Binds to the Sterol Regulatiry Element. Science, 245, 640-643.

M.P. Scott, J. W. Tamkun, G. W. Hartzell III. 1989. The Structure and Function of the Homeodomain. Biochim. Biophys. Acta. Ser. Rev. Cancer, 989 (1), 25-48.

W. Schaffner. 1989. How Do Different Transcription Factors Binding the Same DNA Sequence Sort Out Their Jobs? Trends Genet., 5, 37-38.

K. Struhl. 1989. Helix-Turn-Helix, Zinc-Finger, and Leucine-

Zipper Motifs for Eukaryotic Transcriptional Regulatory Proteins. Trends Biochem. Sci., 14, 127-140.

С. V. E. Wright, K. W. Y. Cho, G. Oliver, E. M. DeRobertis. 1989. Vertebrate Homeodomain Proteins: Families of RegionSpecific Transcription Factors. Trends Biochem. Sci., 14, 52-56.

8.6.6

A. Hope, K. Struhl. 1986. Functional Dissection of a Eukaryotic Transcriptional Activator Protein, GCN4 of Yeast. Cell, 46, 885-894.

L. Keegan. G. Gill, M. Ptashne. 1986. Separation of DNA Binding from the Transcription-Activating Function of Eukaryotic Regulatory Protein. Science, 231, 699-704.

J. Ma, M. Ptashne. 1987. A New Class of Yeast Transcriptional Activators. Cell, 51, 113-119.

K. Struhl. 1987. Promoters, Activator Proteinns, and the Mechanism of Transcriptional Initiation in Yeast. Cell, 49, 295-297."

L. Guarente. 1988. UASa and Enhancers: Common Mechanism of Transcriptional Activation in Yeast and Mammals. Cell, 52, 303-305.

/. A. Hope, S. Mahadevan, K. Struhl. 1988. Structural and Functional Characterization of the Short Acidic Transcriptional Activation Region of Yeast GCN4 Protein. Nature, 333, 635-640.

S. P. Jackson, R. Tjian. 1988. О-Glycosylation of Eukaryotic Transcription Factors: Implications for Mechanisms of Transcriptional Regulation. Cell, 55, 125-133.

M. Ptashne. 1988. How Eukaryotic Transcriptional Activators Work. Nature, 335, 683-689.

K. Struhl. 1988. JUN Oncoprotein, a Vertebrate Transcription Factor, Activates Transcription in Yeast. Nature, 332, 649-650.

J. C. Wang, G. N. Giaever. 1988. Action at a Distance Along a DNA. Science, 240, 300-304.

J. W. Lillie. M. R. Green. 1989. Transcription Activation by the Adenovirus Ela Protein. Nature, 338, 39-44.

C.V.E. Wright, K.W.YCho, G. Oliver, E.M. De Roberts. 1989. Vertebrate Homeo Domain Proteins: Families of RegionSpecific Transcription Factors. Trends Biochem. Sci., 14, 52-56.

8.7.a

J. R. Paulson, J. K. Laemmli. 1977. Structure of Histone-Dep- leted Metaphase Chromosomes. Cell, 12, 817-826.

M.P. F. Marsden, U.K. Laemmli. 1979. Metaphase Chromosome Structure: Evidence for a Radial Loop Model. Cell, 17, 849-858.

C. Wu. P. M. Bingham, K. J. Livak, R. Holmgren, S. C. R. Elgin. 1979. The Chromatin Structure of Specific Genes: I. Evidence for Higher Order Domains of Defined DNA Sequence. Cell, 16, 797-806.

C. Wu. Y.-C. Wong, S.C.R. Elgin. 1979. The Chromatin Structure of Specific Genes: II. Disruption of Chromatin Structure During Gene Activity. Cell, 16, 807-814.

S. Saragosti, G. Moyne, M. Yaniv. 1980. Absence of Nucleosomes in a Fraction of SV 40 Chromatin Between the Origin of Replication and the Region Coding for the Late leader RNA. Cell, 20, 65-73.

H. Weintraub. 1985. Assembly and Propagation of Repressed and Derepressed Chromosomal States. Cell, 42, 705-711.

M. Yaniv, S. Cereghini. 1986. Structure of Transcriptionally Active Chromatin. Crit. Rev. Biochem., 31, 1-26.

Y. Lorch. J. W. LaPointe, R.D. Kornberg. 1987. Nucleosomes Inhibit the Initiation of Transcription but Allow Chain Elongation with the Displacement of Histones. Cell, 49, 203- 210.

M. A. Goldman. 1988. The Chromatin Domain as a Unit of Gene Regulation. BioEssays, 9, 51-55.

У Lorch, J. W. LaPointe, R. D. Kornberg. 1988. On the Displacement of Histones from DNA by Transcription. Cell, 55. 743-744.

8.7.6

M. Gellert. 1981. DNA Topoisomerases. Annu. Rev. Biochem., 50, 879-910.

A. Rich, A. Mondheim, A. H.-J. Wang. 1984. The Chemistry and Biology of Left-Handed Z-DNA. Annu. Rev. Biochem., 53, 791-846.

J. C. Wang. 1985. DNA Toposiomerases. Annu. Rev. Biochem., 54. 665-697.

Jaworski, W.-T. Hsieh, J. A. Blaho, J.E. Larson. R.D. Wells. 1987. Left-Handed DNA in Vivo. Science, 238, 773-777.

F. Lancillotti, M.C. Lopez, P. Arias, C. Alonso. 1987. Z-DNA in Transcriptionally Active Chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 1560-1564.

R.D. Wells. 1988. Unusual DNA Structures. J. Biol. Chern., 263, 1095-1098.

W. Zacharias. A. Jaworski, J.E. Larson, R.D. Wells. 1988. The В-to Z-DNA Equilibrium in Vivo Is Perturbed by Biological Processes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 70697073.

H. Zhang, J.C. Wang, L.F. Liu. 1988. Involvement of DNA Topoisomerase I in Transcription of Human Ribosomal RNA Genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 1060-1064.

A.R. Rahmouni, R.D. Wells. 1989. Localized Supercoiling Stabilized Short (CG) Sequences in the Z-Structure in Vivo. Science, 246, 358-363.

Wittig, T. Dorbic, A. Rich. 1989. The Level of Z-DNA in Metabolically Active, Permeabilized Mammalian Cell Nuclei Is Regulated by Torsional Strain. J. Cell. Biol., 108, 755-764.

8.7.B

L.H. T. van der Ploeg, R.A. Flavell. 1980. DNA Methylation in the Human ySP-Globin Locus in Erythroid and Noneryth- roid Tissues. Cell, 19, 947-958.

M. Busslinger, J. Hurst, R.A. Flavell. 1983. DNA Methylation and the Regulation of Globin Gene Expression. Cell, 34, 197-206.

W. Doerfler. 1983. DNA Methylation and Gene Activity. Annu. Rev. Biochem., 52, 93-124.

A. Bolden, C. Ward, J. A. Siedlecki, A. Weissbach. 1984. DNA Methylation. Inhibition of de Novo and Maintenance Methylation in Vitro and Synthetic Polynucleotides. J. Biol. Chern., 259, 12437-12443.

A. Bird, M. Taggart, M. Frommer, O.J. Miller, D. Macleod. 1985. A Fraction of the Mouse Genome That Is Derived from Islands of Nonmethylated, CpG-Rich DNA. Cell. 40, 91-99.

G. L. Cantoni, A. Razin (eds.). 1985. Biochemistry and Biology of DNA Methylation, vol. 198, Progress in Clinical and Biological Research. Alan R. Liss, New York.

P. A. Jones. 1985. Altering Gene Expression with 5-Azacytidine. Cell, 40, 485-486.

A. P. Bird. 1986. CpG-Rich Islands and the Function of DNA Methylation. Nature, 321, 209-213.

M. Monk. 1986. Methylation and the X Chromosome. BioEssays, 4, 204-208.

A. Razin, M. Szyf, T. Kafri, M. Roll, H. Giloh, S. Scarpa, D. Carotti, G. L. Cantoni. 1986. Replacement of 3-Methyl- cytosine by Cytosine: A Possible Mechanism for Transient DNA Demethylation During Differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83, 2827-2831.

A. P. Bird. 1987. CpG Islands as Gene Markers in the Vertebrate Nucleus. Trends Genet., 3, 342-347.

R. Holliday. 1987. The Inheritance of Epigenetic Defects. Science, 238, 163-170.

L.F. Lock, N. Takagi, G.R. Martin. 1987. Martin. 1987. Met

hylation of the Hprt Gene on the Inactive X Occurs After Chromosome Inactivation. Cell, 48, 38-46.

M. Monk. 1987. Genomic Imprinting: Memories of Mother and Father. Nature, 328, 203-204.

J. P. Sanford, H.J. Clark, V. M. Chapmen, J. Rossant. 1987. Differences in DNA Methylation During Oogenesis and Spermatogenesis and Their Persistence During Early Embryogenesis in the Mouse. Genes and DeveL, 1, 10391046.

J. L. Swain, T. A. Stewart, P. Leder. 1987. Parental Legacy Determines Methylation and Expression of an Autosomal Transgene: A Molecular Mechanism for Parental Imprinting. Cell, 50, 719-727.

Theiss, R. Schleicher, G. Schimpff-Weiland, H. Foilman. 1987. DNA Methylation in Wheat. Purification and Properties of DNA Methyltransferase. J. Eur. Biochem., 167, 89-96.

Cedar. 1988. DNA Methylation and Gene Activity. Cell, 53, 3-4.

M. Holler, G. Westin, J. Jiricny, W. Schaffner. 1988. Spl Transcription Factor Binds DNA and Activates Transcription Even When the Binding Site Is CpG Methylated. Genes and DeveL, 2, 1127-1135.

R. Khan, X,- Y. Zhang, P. C. Supakar, К. C. Ehrlich, M. Ehrlich. 1988. Human Methylated DNA-Binding Protein. J. Biol. Chern., 263, 14374-14383.

M. Monk. 1988. Genomic Imprinting. Genes and DeveL. 2, 921-925.

W Doeifler. 1989. Complexities in Gene Regulation by Promoter Methylation. Nucleic Acids and Mol. Biol., 3, 92- 119.

R. Holliday. 1989. A Different Kind of Inheritance. Sci. American, 260 (6), 60-70.

S. M. M. Iguchi-Ariga, W. Schaffner. 1989. CpG Methylation of the cAMP-Response Enhancer/Promoter Sequence TGACGTCA Abolishes Specific Factor Binding as Well as Transcriptional Activation. Genes and DeveL, 3, 612-619.

8.7.Г

R. Fink. 1986. Translational Control of Transcription in Eukaryotes. Cell, 45, 155-156.

T. Morris. F. Marashi, L. Weber, E. Hickey, D. Greenspan, J. Bonner, J. Stein, G. Stein. 1986. Involvement of the 5'-Leader Sequence in Coupling the Stability of a Human H3 Histone mRNA with DNA Replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83, 981-985.

P. P. Mueller, A.G. Hinnebusch. 1986. Multiple Upstream AUG Codons Mediate Translational Control of GCN4. Cell, 45, 201-207.

Shaw, R. Kamen. 1986. A Conserved AU Sequence from the 3' Untranslated Region of GM-CSF mRNA Mediates Selective mRNA Degradation. Cell, 46, 659-667.

Brawerman 1987. Determinants of Messenger RNA Stability. Cell, 48, 5-6.

M. W. Hentze, S. W. Caughman, T. A. Roualt, J. G. Barriocanal, A. Dancis, J.B. Harford, R.D. Klausner. 1987. Identification of the Iron-Responsive Element for the Translational Regulation of Human Ferritin mRNA. Science, 238, 15701573.

M. W. Hentze, TA. Rouault, S.W Caughman, A. Dancis. J.B. Harford, R.D. Klausner. 1987. A cis-Acting Element Is Necessary and Sufficient for Translational Regulation of Human Ferritin Expression in Response to Iron. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 6730-6734.

S. Pachter, T. J. Yen, D. W. Cleveland. 1987. Autoregulation of Tubulin Expression Is Achieved Through Specific Degradation of Polysomal Tubulin mRNAs. Cell, 51, 283-292.

T. A. Rouault, M.W Hentze, A. Dancis, W. Caughman, J.B. Harford, R.D. Klausner. 1987. Influence of Altered Transcription on the Translational Control of Human Ferritin Expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 6335-6339.

J.L. Cassey. В. Di Jeso, К. Rao, R.D. Klausner, J.B. Harford. 1988. Two Genetic Loci Participate in the Regulation by Iron of the Gene for the Human Transferrin Receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 1787-1792.

J. L. Casey. M. W. Hentze, D. M. Koeller, S. W. Caughman, T. A. Rouault. R.D. Klausner, J.B. Harford. 1988. IronResponsive Elements: Regulatory RNA Sequences That Control mRNA Levels and Translation. Science. 240, 924-927.

S.W. Caughman, M.W. Hentze, TA. Rouault, J.B. Harford, R.D. Klausner. 1988. The Iron-Responsive Element Is the Single Element Responsible for Iron-Dependent Translational Regulation of Ferritin Biosynthesis. J. Biol. Chern., 263, 19048-19052.

M.W. Hentze, S.W. Caughman, J.L. Casey, D.M. Koeller, T. A. Rouault, J. B. Harford, R. D. Klausner. 1988. A Model for the Structure and Functions of Iron-Responsive Elements. Gene, 72, 201-208.

A.G. Hinnebusch. 1988. Mechanisms of Gene Regulation in the General Control of Amino Acid Biosynthesis in Saccharo- myces cerevisiae. Microbiol. Rev., 52, 248-273.

R.D. Klausner. 1988. From Receptors to Genes- Insights from Molecular Iron Metabolism. Clin. Res., 36, 494-500.

T. A. Rouault, M. W. Hentze, S. W. Caughman. J. B. Harford. R. D. Klausner. 1988. Binding of a Cytosolic Protein to the Iron-Responsive Element of Human Ferritin Messenger RNA. Science, 241, 1207-1210.

T. Wilson, R. Treisman. 1988. Removal of Poly (A) and Consequent Degradation of c-fos mRNA Facilitated by 3' AU-Rich Sequences. Nature, 336, 396-399.

T.J. Yen, D.A. Gay, J.S. Pachter, D. W. Cleveland. 1988. Autoregulated Changes in Stability of Polyribosome-Bound Р-Tubulin mRNAs Are Specified by the First 13 Translated Nucleotides. Mol. Cell. Biol., 8, 1224-1235.

T.J. Yen, P.S. Machlin. D.W. Cleveland. 1988. Autoregulated Instability of Р-Tubulin mRNAs by Recognition of the Nascent Amino Terminus of Р-Tubulin. Nature, 334. 580-585.

M. W Hentze, TA. Rouault, J.B. Harford, R.D. Klausner. 1989. Oxidation-Reduction and the Molecular Molecular Mechanism of a Regulatory RNA-Protein Interaction. Science, 244, 357-359.

J. Paddon, E.M. Hannig, A.G. Hinnebusch. 1989. Amino Acid Sequence Similarity Between GCN3 and GCD2, Positive and Negative Translational Regulators of GCN4: Evidence for Antagonism by Competition. Genetics, 122, 551-559.

Tzamarias, I. Roussou. G. Thireos. 1989. Coupling of GCN4 mRNA Translational Activation with Decreased Rates of Polypeptide Chain Initiation. Cell, 57, 947-954.

R. C. Wek. B.M. Jackson. A.G. Hinnebusch. 1989. Juxtaposition of Domains Homologous to Protein Kinases and Histidyl-tRNA Synhetases in GCN2 Protein Suggests a Mechanism for Coupling GCN4 Expression to Amino Acid Availability. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, 4579-4583.

a

J. Battey. E.E. Max, WO. McBride, D. Swan, P. Leder. 1982. A Processed Human Immunoglobulin e Gene Has Moved to Chromosome 9. Proc. Natl. Acad. Scad. Sci. U.S.A., 79. 5956- 5959.

E.F. Vanin. 1985. Processed Pseudogenes: Characteristics and Evolution. Annu. Rev. Genet, 19, 253-272.

G. Bernardi. 1989. The Isochore Organization of the Human Genome.Annu. Rev. Genet., 23, 637-641.

9.1.6.

E O. Long, L B. Dawid. 1980. Repeated Genes in Eukaryotes. Annu. Rev. Biochem., 49, 727-764.

E. Gilson, J.M. Clement, D. Perrin, M. Hofnung. 1987. Palindromic Units: A Case of Highly Repetitive DNA Sequences in Bacteria. Trends Genet., 3, 226-230.

Y. Yang, G. F.-L. Ames. 1988. DNA Gyrase Binds to the Family of Prokaryotic Repetitive Extragenic Palindromic Sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 8850-8854.

9. Lb

A.C. Wilson, S.S. Carlson, T.J. Write. 1977. Biochemical Evolution. Annu. Rev. Biochem., 46, 573-639.

D. Baltimore, 1981. Gene Conversion: Some Implications for Immunoglobulin Genes. Cell, 24, 592-594.

A. Perler. A. Efstratiadis. P. Lomedico. W. Gilbert, R. Kolod- ner, J. Dodgson. 1981. The Evolution of Genes: The Chicken Preproinsulin Gene. Cell, 20, 555-566.

V. J. Kidd. G. F. Saunders. 1982. Linkage Arrangement of Human Placental Lactogen and Growth Hormone Genes. J. Biol. Chern., 157, 10673-10680.

G.S. Barsch, P.H.Seeburg, R.E. Gelinas. 1983. The Human Growth Hormone Gene Family: Structure and Evolution of the Chromosomal Locus. Nucleic Acids Res., 11, 3939-3858.

A. Dover. R.B. Flavell. 1984. Molecular Coevolution: DNA Divergence and the Maintenance of Function. Cell, 38, 622-623.

G. R. Fink, T. D. Petes. 1984. Gene Conversion in the Absebce of Reciprocal Recombination. Nature, 310, 728-729.

C. C.F. Blake. 1985. Exons and the Evolution of Proteins. Inti. Rev. CytoL, 93, 149-185.

D.LH.Linzer. D. Nathans. 1985. A New Member of the Prolactin-Growth Hormone Gene Family Expressed in Mouse Placenta. EMBO J., 4, 1419-1423.

/. Strauss, W. Gilbert. 1985. Genetic Engineering in the Precambrian. Structure of the Chicken Triosephosphate Isomerase Gene. Mol. Cell. Biol., 5, 3497 3506.

G. A. Dover. 1986. Molecular Drive in Multigene Families: How Biological Novelties Arise, Spread and Are Assimilated. Trends Genet., 2, 159- 165.

N. Maeda. O. Smithies. 1986. The Evolution of Multigene Families: Human Haptoglobulin Genes. Annu. Rev. Genet., 20, 81-108.

M. Marchioni. W. Gilbert. 1986. The Triosephosphate Isomerase Gene from Maize: Introns Antedate the Plant — Animal Divergence. Cell, 46, 133-141.

G. L. McKnight. P.J. O’Hara. M.L. Parker. 1986. Nucleotide Sequence of the Triosephosphate Isomerase Gene from Aspergillus nidulans: Implications for a Differential Loss of Introns. Cell, 46, 143-147.

Molecular Evolutionary Clock. 1987. J. Mol. Evol. 26 (1 and 2) special issue.

S. J. O’Brien, H.N.Seuanez, J.E. Womack. 1988. Mammalian Genome Organization: An Evolutionary View. Annu. Rev. Genet., 22, 323-351.

A.C. Wilson, H. Ochman. E.M. Prager. 1987. Molecular Time Scale for Evolution. Trends Genet., 3, 241-247.

J. Felsenstein. 1988. Phylogenies from Molecular Sequences: Interference and Reliability. Annu. Rev. Genet., 22, 521-565.

M.R. Green. 1988. Mobile RNA Catalysis. Nature, 336, 716-718.

E. Y. Chen, Y.-C. Liao, D.H. Smith, H. A. Barrera-Saldana. R.E. Gelinas, P.H. Seeburg. 1989. The Human Growth Hormone Locus: Nucleotide Sequence, Biology, and Evolution. Genomics, 4, 479-497.

N.J. Dibb, A. J. Newman. 1989. Evidence That Introns Arose at Proto-Splice. EMBO J., 8, 2015-2021.

P.S. Perlman, R.S. Butow. 1989. Mobile Introns and Intron- Encoded Proteins. Science, 246, 1106-1109.

J. Rogers. 1989. How Were Introns Inserted into Nuclear Genes? Trends Genet., 5, 213-216.

а

В. Dawid, D.D. Brown, R.H. Reeder. 1970. Composition and Structure of Chromosomal and Amplified Ribosomal DNAs of Xenopus laevis. J. Mol. Biol., 51, 341-360.

N. V. Federoff. 1979. On Spacers. Cell, 16, 697-710.

R. Bedbrook, W. L. Gerlach. 1980. Cloning of Repeated Sequence DNA from Cereal Plants. In: J.K. Setlow and A. Hollaender (eds.). Genetic Engineering, vol. 2, pp. 1-19. Plenum Press, New York.

E.O. Long, LB. Dawid 1980. Repeated Genes in Eukaryotes. Annu. Rev. Biochem., 49, 727-764.

P. D'Eustachio, O. Meyuhas, F. Ruddle, R. Perry. 1981. Chromosomal Distribution of Ribosomal Protein Genes in the Mouse. Cell, 24, 307-312.

M. Glover. 1981. The rDNA of Drosophila melanogaster. Cell, 26, 297-298.

M. Krystal. P. D’Eustachio, F.H. Ruddle, N. Arnheim. 1981. Human Nucleolus Organizers on Non-Homologous Chromosomes Can Share the Same Ribosomal RNA Gene Variants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78, 5744-5748.

O. L. Miller. Jr. 1981. The Nucleolus, Chromosomes, and Visualization of Genetic Activity. J. Cell Biol., 91, 15s- 27s.

J. Cortadas, M. C. Pavon. 1982. The Organization of Ribosomal Genes in Vertebrates. EMBO J., 1, 1075- 1080.

S.A Gerbi. C. Jeppesen, B. Stebbins-Boaz. M. Ares, Jr. 1987. Evolution of Eukaryotic rRNA: Constraints Imposed by RNA Interactions. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 52, 709-719.

R. S. Hawley, C.H. Marcus. 1989. Recombinational Controls of rDNA Redundancy in Drosophila. Annu. Rev. Genet., 23. 87-120.

9.2.6

D.D. Brown, K. Sugimoto. 1973. 5S DNAs of Xenopus laevis and Xenopus mulleri: Evolution of a Gene Family. J. Mol. Biol, 78, 397-415.

R.C. Peterson, J.L. Doering, D.D. Brown. 1980. Characterization of Two Xenopus Somatic 5S DNAs and One Minor Oocyte-Specific 5S DNA. Cell, 20. 131 141.

J. Mao, B. Appel, J. Schaak, S. Sharp, H. Yamada, D. Soli. 1982. The 5S RNA Genes of Schizosaccharomyces pombe. Nucleic Acids Res., 10, 487-500.

9.2.B

G. I. Bell, L. J. DeGennaro. D. H. Gelfand. R. J. Bishop, P. Valenzuela. W.J. Rutter. 1977. Ribosomal RNA Genes of Saccharomyces cerevisiae. I. Physical Map of the Repeating Unit and Location of the Regions Coding for 5S, 5.8S, 18S, and 25S Ribosomal RNA. J. Biol. Chern., 252, 8118-8125.

T.D. Petes. 1979. Yeast Ribosomal Genes Are Located on Chromosome XII. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76, 410-414.

T.D. Petes. 1980. Unequal Meiotic Recombination Within Tandem Arrays of Yeast Ribosomal DNA Genes. Cell, 19, 765-774.

J.W. Szostak. R. Wu. 1980. Unequal Crossing Over in the Ribosomal DNA of Saccharomyces cerettsiae. Nature, 284, 426-430.

T.J. Zamb, T.D. Petes. 1982. Analysis of the Junction Between Ribosomal RNA Genes and Single-Copy Chromosomal Sequences in the Yeast Saccharomyces cerevisiae. Cell, 28, 355-364.

9.2.r

P.H. Yen, N. Davidson. 1980. The Gross Anatomy of a tRNA Gene Cluster at Region 42A of the D. melanogaster Chromosome. Cell, 22, 137-148.

Kubii. 1982. The Genetics of Transfer RNA in Drosophila. Adv. Genet., 21, 123-172.

S.G. Clarkson. 1983. Transfer RNA Genes. In: N. MacLean,

P. Gregory, and R. A. Flavell (eds.). Eukaryotic Genes: Their Structure. Activity and Regulation, pp. 239-261. Butterworth, London.

9.2.Д

H. Busch, R. Reddv, L. Rothblum. C. Y. Choi. 1982. SnRNAs, SnRNPs, and RNA Processing. Annu. Rev. Biochem., 51, 617-654.

H.P. Saluz, T. Schmidt, R. Dudler. M. Altwegg, E. Stumm-Zol- iinger, E. Kubii, P.S. Chen. 1983. The Genes Coding for 4 snRNAs of Drosophila melanogaster: Localization and Determination of Gene Numbers. Nucleic Acids Res., 11. 77-90.

J. A. Wise, D. Tollervey, D. Maloney. H. Swerdlow, E.J. Dunn. C. Guthrie. 1983. Yeast Contains Small Nuclear RNAs Encoded by Single Copy Genes. Cell, 35, 743-751.

E. Lund, J. E. Dahlberg. 1984. True Genes for Human UI Small Nuclear RNA: Cory Number, Polymorphism, and Methylation. J. Biol. Chern., 259, 2013-2021.

S. W. Van Arsdell, A.M. Weiner. 1984. Human Genes for U2 Small Nuclear RNA Are Tandemly Repeated. Mol. Cell. Biol., 4, 492-499.

R. Zeller, M.-T. Carri, I. W. Mattaj, E. M. DeRobertis. 1984. Xenopus laevis UI snRNA Genes: Characterization of Transcriptionally Active Genes Reveads Major and Minor Repeated Families. EMBO J„ 3, 1075-1081.

L.B. Bernstein, T. Manser, A.M. Weiner. 1985. Human UI Small Nuclear RNA Genes: Extensive Conservation of Flanking Sequences Suggests Cycles of Gene Amplification and Transposition. Mol. Cell. Biol., 5, 2159-2171.

C. Guthrie. 1986. Finding Functions for Small Nuclear RNAs in Yeast. Trends Biochem. Sci., 11, 430-434.

K. A. Montzka, J. A. Steitz. 1988. Additional Low-Abundance Human Small Nuclear Ribonucleopriteins: UH, U12, etc. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 8885-8889.

9.3.6

Efstratiadis, J. W. Posakony, T. Maniatis, R. M. Lawn, C. O'Connell. R. A. Spritz, J.K. DeRiel, B.G. Forget, S. M. Weissman. J. L. Slightom. A. E. Blechl. F. E. Baralle, C.C. Shoulders, N.J. Proudfoot. 1980. The Structure and Evolution of the Human p-Globin Gene Family. Cell, 21, 653-668.

F. Fritsch. C.K. Shen. R.M. Lawn, T. Maniatis. 1980. Molecular Cloning and Characterization of the Human p-like Globin Gene Cluster. Cell, 19, 959-973.

Lemischka. P. A. Sharp. 1982. The Sequences of an Expressed Rat u-Tubulin Gene and a Pseudogene with an Inserted Repetitive Element. Nature, 300, 330-335.

C.D. Wilde. L.T Chow. F.C. Wefalc. N.J. Cowan. 1982. Structure of Two Human ct-Tubulin Genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79, 96 100.

M.B. Buckingham. A. J. Minty. 1983. Contractile Protein Genes. In: N. MacLean, S. P. Gregory, and R. A. Flavell (eds.). Eukaryotic Genes: Their Structure, Activity, and Regulation, vol. 2, pp. 365-395. Butterworth, London.

H. Czosnek, U. Nudel. Y. Mayer, P. E. Barker, D. D. Pravtcheva, F.H. Ruddle, D. Yajfc. 1983. The Genes Coding for the Cardiac Muscle Actin, and Skeletal Muscle Actin, and the Cytoplasmic Р-Actin Are Located on Three Different Mouse Chromosomes. EMBO J., 2, 1977-1979.

S. Pestka. 1983. Interferon Genes. Arch. Biochem. Biophys., 221, 1-37.

S. Collins, S.M. Weissman. 1984. The Molecular Genetics of Human Hemoglobin. Prog. Nucleic Acid Res, and Mol. Biol., 31, 317-462.

Garcia, B. Paz-Aliaga, S. G. Ernst. W. R. Crain, Jr., 1984. Sea Urchin Actin Genes Show Different Patterns of Expression: Muscle Specific, Embryo Specific, and Constitutive. Mol. Cell. Biol., 4, 840-845.

A. D. Sagar Р. В. Sehgal, L. Т. Мау, М. Inouye, D. L. Slate, L. Shulman, F.H. Ruddle. 1984. Interferon-P-Related DNA Is Dispersed in the Human Genome. Science, 223, 13121315.