ЧАСТЬ ПЕРВАЯ

ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ

Бактериологические лаборатории как самостоятельные структурные единицы организуются при санитарно-эпидемиологических станциях (СЭС), в инфекционных больницах, больницах общего типа, некоторых специализированных стационарах (например, в туберкулезных, ревматологических, кожно-венерологических) и в поликлиниках.

Бактериологические лаборатории при СЭС исследуют на общую бактериальную загрязненность, а также на зараженность условно патогенной и патогенной микрофлорой объекты внешней среды： воздух, воду, почву, продукты питания; проводят обследование организованных коллективов и отдельных лиц на носительство патогенных бактерий кишечной группы, коринебактерий дифтерии, коклюша, паракоклюша, менингококка.

Работа бактериологической лаборатории в комплексе с другими отделами СЭС имеет определенную задачу — оздоровление внешней среды и снижение заболеваемости населения.

Бактериологические лаборатории при лечебно-профилактических учреждениях выполняют анализы, необходимые для постановки и уточнения диагноза инфекционного заболевания, способствуя правильному выбору специфического лечения и определению сроков выписки больного из инфекционной больницы.

■Предметом для исследования в бактериологических лабораториях являются: ■

Выделения из организма человека： моча, кал, мокрота, гной, а также кровь, спинномозговая жидкость и трупный материал.

Объекты внешней среды： вода, воздух, почва, продукты питания, смывы с предметов инвентаря, рук и т. п.

ПОМЕЩЕНИЕ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИИ ОБОРУДОВАНИЕ РАБОЧЕГО МЕСТА

Специфика микробиологических работ требует, чтобы помещение, отведенное под лабораторию, было изолировано от больничных палат, жилых комнат, пищевых блоков.

В состав бактериологической лаборатории входят: лабораторные комнаты для бактериологических исследований и подсобные помещения; автоклавная или стерилизационная для обеззараживания отработанного материала и зараженной посуды; моечная, оборудованная для мытья посуды; средоварочная для приготовления, розлива, стерилизации и хранения питательных сред; виварий для содержания подопытных животных; материальная для хранения запасных реактивов, посуды, аппаратуры и хозяйственного инвентаря.

Перечисленные подсобные помещения как самостоятельные структурные единицы входят в состав крупных бактериологических лабораторий. В небольших лабораториях средоварочную и стер ил изационную объединяют в одной комнате; специальное помещение для содержания подопытных животных отсутствует.

Под лабораторные комнаты, в которых производят все бактериологические исследования, отводят наиболее светлые, просторные помещения. Стены в этих комнатах на высоту 170 см от пола окрашивают в светлые тона масляной краской. Пол покрывают релином или линолеумом. Такого рода отделка позволяет пользоваться при уборке помещения дезинфицирующими растворами.

В каждой комнате должна быть раковина с водопроводной подводкой и полкой для бутыли с дезинфицирующим раствором.

В одной из комнат оборудуют застекленный бокс с пред- боксником для выполнения работ в асептических условиях.

В боксе ставят стол для посевов, табурет, над рабочим местом монтируют бактерицидные лампы. В предбоксник помещают шкаф для хранения стерильного материала.

Лабораторное помещение оборудуется столами лабораторного типа, шкафами и полками для хранения необходимой при работе аппаратуры, посуды, красок, реактивов.

Очень большое значение для работы имеет правильная организация рабочего места врача-бактериолога и лаборанта. Лабораторные столы устанавливают около окон. При размещении их нужно стремиться к тому, чтобы свет падал спереди или сбоку от работающего, лучше с левой стороны, но ни в коем случае не сзади. Желательно, чтобы комнаты для проведения анализов, особенно для микроскопирования, имели ориентацию окон на север или северо-запад, так как для работы необходим ровный рассеянный свет. Освещенность поверхности столов для работы должна быть 500 лк. Для удобства дезинфекции поверхность лабораторных столов покрывают пластиком, а каждое рабочее место на нем — зеркальным стеклом.

За каждым сотрудником лаборатории закрепляют отдельное рабочее место площадью 150X60 см. Все рабочие места

Таблица 1

Необходимые предметы для бактериологической работы

№№Нанменоваяие предметаНанменоваяие предметаПримерноеколичествоПримерноеколичество234567890234567890111213ип^п^ ^м2122232425111213ип^п^ ^м2122232425Набор красок и реактивов для окраски препаратовСтекла предметныеСтекла покровныеСтекла с лунками(Ытатнв под пробиркиПетля бактериальнаяШпатели стеклянныеШпатели металлическиеБанка с ватойПипетки градуированные на 1, 2, 5, 10 млПипетки пастеровскиеПинцет, ножницы, скальпельБанка с дезинфицирующим раствором для отработанных предметных стеколМикроскоп с осветителемЛупа X 5Масленка с иммерсионным масломФильтровальная бумагаБанка с дезинфицирующим раствором для пипетокСпиртовая или газовая горелкаУстановка для окраски препаратов:промывалка, лоток с мостикомПесочные часы на 1 и 2 минШприцы с набором нглСтерильные пробиркиБаллоны резиновыеКарандаш по стеклуНабор красок и реактивов для окраски препаратовСтекла предметныеСтекла покровныеСтекла с лунками(Ытатнв под пробиркиПетля бактериальнаяШпатели стеклянныеШпатели металлическиеБанка с ватойПипетки градуированные на 1, 2, 5, 10 млПипетки пастеровскиеПинцет, ножницы, скальпельБанка с дезинфицирующим раствором для отработанных предметных стеколМикроскоп с осветителемЛупа X 5Масленка с иммерсионным масломФильтровальная бумагаБанка с дезинфицирующим раствором для пипетокСпиртовая или газовая горелкаУстановка для окраски препаратов:промывалка, лоток с мостикомПесочные часы на 1 и 2 минШприцы с набором нглСтерильные пробиркиБаллоны резиновыеКарандаш по стеклу25—5025—505—1025—5025—505—10По 25 каждойемкости25—50По 1По 25 каждойемкости25—50По 1113—5 листов3—5 листовПо 1По 151003По 1По 151003

№

№

Нанменоваяие предмета

Нанменоваяие предмета

Примерноеколичество

Примерноеколичество

234567890

234567890

111213ип^п^ ^м2122232425

111213ип^п^ ^м2122232425

Набор красок и реактивов для окраски препаратов

Стекла предметные

Стекла покровные

Стекла с лунками

(Ытатнв под пробирки

Петля бактериальная

Шпатели стеклянные

Шпатели металлические

Банка с ватой

Пипетки градуированные на 1, 2, 5, 10 мл

Пипетки пастеровские

Пинцет, ножницы, скальпель

Банка с дезинфицирующим раствором для отработанных предметных стекол

Микроскоп с осветителем

Лупа X 5

Масленка с иммерсионным маслом

Фильтровальная бумага

Банка с дезинфицирующим раствором для пипеток

Спиртовая или газовая горелка

Установка для окраски препаратов:

промывалка, лоток с мостиком

Песочные часы на 1 и 2 мин

Шприцы с набором нгл

Стерильные пробирки

Баллоны резиновые

Карандаш по стеклу

Набор красок и реактивов для окраски препаратов

Стекла предметные

Стекла покровные

Стекла с лунками

(Ытатнв под пробирки

Петля бактериальная

Шпатели стеклянные

Шпатели металлические

Банка с ватой

Пипетки градуированные на 1, 2, 5, 10 мл

Пипетки пастеровские

Пинцет, ножницы, скальпель

Банка с дезинфицирующим раствором для отработанных предметных стекол

Микроскоп с осветителем

Лупа X 5

Масленка с иммерсионным маслом

Фильтровальная бумага

Банка с дезинфицирующим раствором для пипеток

Спиртовая или газовая горелка

Установка для окраски препаратов:

промывалка, лоток с мостиком

Песочные часы на 1 и 2 мин

Шприцы с набором нгл

Стерильные пробирки

Баллоны резиновые

Карандаш по стеклу

25—50

25—50

5—10

25—50

25—50

5—10

По 25 каждойемкости25—50

По 1

По 25 каждойемкости25—50

По 1

1

1

3—5 листов

3—5 листов

По 1

По 1

5100

3

По 1

По 1

5100

3

оборудуют предметами, необходимыми для повседневной бактериологической работы, перечень которых дан в табл. 1.

ПРАВИЛА РАБОТЫ И ПОВЕДЕНИЯ В ЛАБОРАТОРИИ

Особенностью бактериологических работ является постоянное соприкосновение сотрудников лаборатории с заразным материалом, культурами патогенных микробов, зараженными животными, кровью и выделениями больного. Поэтому все сотрудники бактериологической лаборатории обязаны соблюдать следующие правила работы, которые обеспечивают стерильность в работе и предупреждают возможность возникновения внутрилабораторных заражений.

В помещение бактериологической лаборатории нельзя входить без специальной одежды — халата и белой шапочки или косынки.

Нельзя вносить в лабораторию посторонние вещи.

Запрещается выходить за пределы лаборатории в халатах или надевать верхнее платье на халат.

В помещении бактериологической лаборатории категорически запрещается курить, принимать пищу, хранить продукты питания.

Весь материал, поступающий в бактериологическую лабораторию, должен рассматриваться как инфицированный.

При распаковке присланного заразного материала необходимо соблюдать осторожность： банки, содержащие материал для исследования, при получении обтирают снаружи дезинфицирующим раствором и ставят не прямо на стол, а на подносы или в кюветы,

Переливание жидкостей, содержащих патогенных микробов, производят над сосудом, наполненным дезинфицирующим раствором.

О случаях аварии с посудой, содержащей заразный материал, или проливания жидкого заразного материала надо немедленно сообщать заведующему лабораторией или его заместителю. Мероприятия по обеззараживанию загрязненных патогенным материалом платья, частей тела, предметов рабочего места осуществляются немедленно.

При исследовании зараженного материала и работе с патогенными культурами микробов необходимо строго со- .блюдать общепринятые в бактериологической практике технические приемы, исключающие возможность соприкосновения рук с заразным материалом.

Зараженный материал и ненужные культуры подлежат обязательному уничтожению, по возможности в тот же день. Инструменты, использованные в работе с заразным материалом, тотчас после их употребления дезинфицируют, как и поверхность рабочего места.

При выполнении бактериологических работ нужно строго следить за чистотой рук： по окончании работы с заразным материалом их дезинфицируют. Рабочее место в конце дня приводят в порядок и тщательно дезинфицируют» а заразный материал и культуры микробов, необходимые для дальнейшей работы, ставят на хранение в запирающийся рефрижератор или сейф.

Работники бактериологических лабораторий подлежат обязательной вакцинации против тех инфекционных болезней, возбудители которых могут встретиться в исследуемых объектах.

ПОРЯДОК ХРАНЕНИЯ, ОБРАЩЕНИЯ И ОТПУСККУЛЬТУР ПАТОГЕННЫХ МИКРОБОВ

Возбудители заразных болезней в соответствии со степенью опасности заражения для работающих с ними лиц, учетом клиники вызываемых заболеваний, а также наличием

эффективных приемов охраны труда и техники Оезопасности при работе подразделяются на следующие пять групп:

Группа 1. Возбудитель чумы.

Группа IL Возбудитель холеры, натуральной оспы, бруцеллеза, туляремии, сибирской язвы, сапа, мелиоидоза, эпидемического сыпного тифа, эпидемических энцефалитов, геморрагических лихорадок, желтой лихорадки, лихорадки Ку, лихорадки цуцугамуши, лихорадки 'Скалистых гор, орнито- зов, гистоплазмоза, кокцидиозов, токсин ботулиновый.

Группа III. Возбудители бактерийных (брюшной тиф, дизентерия, дифтерия, туберкулез и др.), вирусных (бешенство, полиомиелит, корь, грипп и др.), риккетсиозных , (болезнь Брилля, клещевые тифы и др.), простейших (малярия, лейшманиоз, возвратный тиф, сифилис и др.), грибковых (актиномикоз, бластомикоз, дерматомикозы и др.), инфекционных заболеваний, выделенных в самостоятельные нозологические формы.

Группа IV, Возбудители токсикоинфекций и острых бактериальных отравлений (сальмонеллы, стафилококки, вибрионы, клостридии и др.), энтеритов (эшерихии, энтеро- и аденовирусы и др.), септицемий и пневмоний (стафилококки, стрептококки, синегнойная палочка и др.).

Группа V. Облигатная непатогенная микрофлора, населяющая слизистые и кожные покровы человека, а также микроорганизмы—показатели санитарного состояния внешней среды (эшерихии, энтерококки, перфрингепс и др.).

Представленная схема распределения возбудителей по группам определяет режим работы, порядок хранения и выдачи микроорганизмов различных групп.

Работу с культурами микробов I и II групп можно проводить только с разрешения Центральной режимпой комиссии Главного управления карантинных инфекций Министерства здравоохранения СССР или Главного санитарно-эпидемиологического управления Министерства здравоохранения союзной республики, в специально оборудованных лабораторных помещениях, работа которых регламентируется действующими инструкциями по режиму работы с материалом, зараженным или подозрительным *па зараженность возбудителями чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии и бруцеллеза.

Работа с возбудителями, отнесенными в III группу, проводится в соответствии с правилами устройства, техники безопасности, производственной санитарии и личной гигиены при работе в лабораториях санитарно-эпидемиологических учреждений.

Работа с возбудителями IV и V групп требует соблюдения обычного режима работы бактериологической лаборатории, обеспечивающего надежную защиту персонала лаборатории от впутрилабораторных заражений в npoixecce исследований

и надлежащее обеззараживание материала, исключающей возможность распространения инфекции за пределы лаборатории.

Порядок хранения культур 1—V групп. Культуры микробов хранят в пробирках на плотных питательных средах и в ампулах в лиофилизированном состоянии. На пробирки и ампулы с культурами наклеивают этикетки с номером штамма по инвентарной книге, названием возбудителя и датой пересева.

Культуры хранят в холодильниках или сейфах. Холодильники и несгораемые шкафы с культурами I, II и III групп по окончании рабочего дня закрывают на ключ, пломбируют или опечатывают. Места хранения культур IV и V групп запирают. Ключи от замков, пломбиры и печати хранятся у заведующего лабораторией или выделенного им лица. В помещениях, где хранят культуры I и II групп, входные двери закрывают на замок и пломбируют или опечатывают сургучной печатью.

Учет культур и материалов, подозрительных на зараженность возбудителями I——V групп. Культуры возбудителей I—— V групп, выделяемые при диагностических исследованиях и находящиеся в работе бактериологической лаборатории, подлежат обязательной регистрации в журналах с пронумерованными страницами, прошнурованных и скрепленных сургучной печатью учреждения.

Министерством здравоохранения СССР для лабораторий> работающих с живыми культурами микробов, утверждены следующие формы журналов 】：

Форма 1. Журнал регистрации материалов (культур), поступивших для исследования.

Форма 2. Журнал учета выделенных культур и их уничтожения.

Форма 3. Журнал, ведение которого предусмотрено для лабораторий, работающих с возбудителями I и II групп, отражает движение микробных культур и материалов, подозрительных на зараженность.

Микробные культуры, отнесенные к I и II группам, и зараженные животные учитываются по каждому виду возбудителя отдельно, микробы III—IV групп — суммарно по каждому роду возбудителя. Микроорганизмы V группы специальному учету не подлежат. Регистрация их ведется в рабочих журналах и дневниках.

Порядок передачи культур микробов внутри учреждения и за его пределы (внутри страны). Из лаборатории в лабора-

1 Положение о порядке хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов и ядов животного происхождения, передаче их в зарубежные страны и получении из зарубежных стран от 30 января 1974 г.

Журнал (форма t) регистрации материалов (культур), поступивших для исследования

№ п/п

Дата

Наименование материала

Откуда поступил

Цель исследования

Результат исследования

Примечание

I

2

3

4

5

6

7

Журнал (форма 2) учета выделенных культур и их уничтожения

Н

艺

Наименование культуры

巴3

載

||

О

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

При культуре — указать этн признаки.

торию в пределах одного учреждения музейные культуры микробов III——V групп передаются по письменному разрешению заведующего музеем культуры микробов, возбудители I—II групп — с разрешения руководителя учреждения. В пределах одной и той же лаборатории штаммы обозначенных групп бактерий могут быть переданы по письменному разрешению заведующего лабораторией.

Для выдачи культур за пределы лаборатории необходимо официальное требование за подписью руководителя учреждения, скрепленное гербовой печатью.

Разрешение на выдачу культур возбудителей I—V групп дает руководитель учреждения. Культуры микробов I и II групп выдаются лишь в те учреждения, которые имеют разрешение Министерства здравоохранения СССР на работу с этими микроорганизмами. Учреждения, запрашивающие культуры возбудителей III группы, одновременно с требованием должны представить заключение местной (районной, городской) СЭС о наличии условий для работы с возбудителями этой группы.

Культуры микробов I——V групп в высушенном виде (в ампулах) или в пробирках на плотных питательных средах при выдаче завертываются в лигнин или гигроскопическую вату и помещаются в металлический (для культур III—V групп

-о

Дата

Вид исследования (наимеиование культуры)

Количество поступивших" объектов " (культур)

КоличествоЗ посевов

Количество Зараженных животных (по видам)

Количество зараженных эктопаразитов (проб)

Количество зараженных органов (проб)

Количество сухих культур (ампул)

КО

! о.| J1

1

2

3

4 5 6 7

8 9 10 11

12 13 14 15

16 17 18 19

20 21 22 23

можно пластмассовый) плот! н。закрнваюЕНВСЯ опеиа— TbIBaeMbпенал・

Культуры бактернйг I ж II групп пересылают со спе， анальной связью。Лрн 9ToM пенал с отправпяемнмм культурами укпаАЕВают в деревннннй проиннйг ЯЕНКУ обшнвают его материалом》 пломбируют млн опеиатнва， ют сургучной печатью，На адресной стороне поснлкн прнкреппяетсн особые я лнк с отметкой -опасно* Не открывать во время пе— ресьшкну

купьтурвозбудителя иумн пересылаются в сопро— всжденнн 2 лн? 0AHнм нз KOTOPbIxkonxeH быть Враи. Мнкробние культуры”, отнесенное в Ш группу》пе， ресЕлаютсн О^ЕЛао» поч— тов©й поснлкой в чм§& 茨е упаковккак культуры I н групп” млн выдаются через нарочного по предъ— явлении нм офгщнапьноз требования》доверенности н паспорта。

УБОРКА ЛА6ОРАТОРНОГО

ПОМЕЕЕННЯПомеЕенме лабораторноежедневно до начала Рабо!Тследует убмрать вл£!ннм способом* Пыль с по—верхностн столов》ПРН60Р0,О6орудованняа также под—оконннков стирают инсто*тряпкой》 увпаясненноА пез,ннфнцнрующнм раствором?попыочнЕают от пнпнпылесосом н после 9To3протирают тряпко尹 CMOqeH—ной в 3—5/ растворе кар-боловой кнслотьь

После окончания работы стены, покрытые метлахскими плитками или окрашенные масляной краской, моют горячей «одой с мылом или стиральным порошком. Потолки, карнизы, верхняя часть стен, окрашенные клеевой краской, не реже одного раза в неделю очищают от пыли пылесосом.

Подготовка бокса к работе. Помещение бокса обрабатывают следующим образом: ежедневно Мред началом работы полы протирают дезинфицирующим веществом (2% раствор хлорамина или 3% раствор фенола); воздух обеззараживают бактерицидными лампами, установленными на высоте 2— 2,5 м от поверхности пола, из расчета одна лампа БУВ-30 (1,5——2,5 Вт) на 1 м3 помещения. При указанных условиях бокс облучают 2——3 ч. Перед началом работы лампы выключают. При отсутствии бактерицидных ламп непосредственно перед работой производят дезинфекцию бокса, протирая помещение 5% раствором хлорамина.

Для того чтобы предотвратить заражение бокса, образцы материалов, подлежащие исследованию, вносят в бокс после предварительного тщательного протирания их 3% раствором фенола. .По этим же соображениям работа в боксе проводится в стерильных халатах, защитных масках и тапочках, специально предназначенных для бокса.

Воздух в боксе следует регулярно, не менее 2 раз в неделю, проверять на бактериальную обсеменепность. Чашки с мясо-пептонным агаром (рец. 38, с. 352) и средой Сабуро (рец. 149, с. 389) оставляют открытыми на 15 мин. Посев на мясо-пептонном агаре выдерживают в термостате 48 ч при 37℃, чашки со средой Сабуро — 96 ч при 22℃. Допустимым ростом считается 5 колоний на чашках. Количество колоний больше 5 при 15-минутной экспозиции является показателем высокой обссменепности воздуха бокса. В этих случаях помещение бокса нуждается в дополнительной, более тщательной обработке. Не менее одного раза в неделю помещение бокса моют горячей водой с мылом, дезинфицирующими средствами и протирают досуха.

Уборка рабочего места. По окончании работы берут пинцетом кусок ваты, смачивают его в 5% растворе хлорамина (см. с. 339) или в 5% растворе карболовой кислоты (см. с. 340) и протирают им поверхность стекла на рабочем месте. Такого рода повседневная дезинфекция носит профилактический характер.

МЫТЬЕ И ОБРАБОТКА ЛАБОРАТОРНОЙ ПОСУДЫ

Посуда для бактериологических работ должна быть чистой, а для многих исследований — и стерилыюй, так как использование загрязненной, плохо вымытой посуды может привести к получению неправильных результатов.

Для мытья лабораторной посуды в микробиологических лабораториях отводится отдельное помещение — моечная или специальное рабочее место, которое обеспечивается большой раковиной с подводкой горячей и холодной воды, нагревательными приборами: газовой или электрической плитой.. В моечной необходимо иметь кастрюли, тазы, ведра, ерши, щетки и доски с колышками для сушки чистой посуды. На дно раковины кладут густую металлическую сетку, чтобы предупредить засорение канализационной сети частицами агара, ватой, бумагой, попадающими в воду при мытье посуды.

В процессе мытья на посуду воздействуют механическими и химическими факторами. К числу первых относится удаление грязи с помощью щеток и ершей. При отсутствии ершей или невозможности их использования, например в случае несоответствия ерша размеру сосуда, посуду моют с помощью мелко нарезанных кусочков бумаги, соломы или сена. При этом загрязнение, имеющееся на внутренних стенках, удаляется механически. Наилучшие результаты мытья посуды отмечаются в том случае, когда воздействие механических факторов сочетается с действием химических веществ. Поэтому ерши, Которыми моют посуду, предварительно погружают в соду, полужидкое мыло, мыльный раствор или стиральный порошок.

Надписи, сделанные на стекле восковым карандашом, легко снимаются щеткой либо кусочком влажной марли с меловым порошком или содой.

Для устранения налета белого цвета, нередко появляющегося на стекле, посуду помещают на 30——40 мин в 5—・ 10% раствор хлористоводородной кислоты.

Сильно загрязненную посуду со следами жира обрабатывают в хромовой смеси (см. с. 340). Хромовая смесь, будучи сильным окислителем, разрушает органические вещества с образованием растворимых или газообразных продуктов. Перед употреблением хромовую смесь подогревают до температуры 45—50℃, а затем заливают ею грязную посуду.

Мытье новой лабораторной посуды. В ведре с теплой водой растворяют хозяйственное мыло, чтобы образовалось небольшое количество пены, погружают в нее посуду н ставят на слабый огонь. После 15-минутного кипячения посуду вынимают, ополаскивают чистой водой, погружают в теплый 1—2% раствор хлористоводородной кислоты, доводят до кипения и вываривают 10—15 мин, чтобы нейтрализовать избыток щелочи, который мог остаться при изготовлении стекла. После кипячения в кислоте посуду прополаскивают водопроводной водой и дважды дистиллированной.

При мытье посуды, служащей для постановки серологических реакций, кислоты и щелочи использовать не рекомендуется, так как даже следы этих веществ, оставшиеся на стен-

ках, могут исказить результат реакции. Такую посуду моют горячей водой, кладут на сетки, чтобы с нее стекла вода, затем несколько раз ополаскивают дистиллированной водой и сушат в сушильном шкафу. /

Мытье лабораторной посуды, бывшей в употреблении. Посуда, в которой содержался зараженный материал, поступает в мойку после предварительной дезинфекции, гарантирующей гибель находящихся в ней патогенных микробов. Перед мытьем из пробирок, чашек и матрацев обеззараженную 'жидкость выливают в канализацию. Не очень загрязненную посуду моют ершом в горячей воде с мылом, содой или в растворе горчицы. Посуду со следами агара, желатина или другой питательной среды за сутки перед мытьем заливают 2——5% раствором едкого натра или едкого кали. Очень загрязненную жирную посуду, не поддающуюся мытью обычным способом, заливают на 30—40 мин хромовой смесью, а затем в течение продолжительного времени промывают проточной водопроводной водой.

Простой и надежный способ мытья и обеззараживания лабораторной посуды предложен Г. П. Кирсановым (1972). Отработанную лабораторную посуду (пробирки, чашки Петри, предметные стекла с мазками после иммерсионной микроскопии и пр.) стерилизуют в автоклаве в течение 2 ч при 2 атм. После стерилизации посуду загружают в бак и заливают раствором, содержащим на 100 мл дистиллированной водн 5 мл нашатырного спирта и 3 г порошка для стирки хлопчатобумажного и льняного белья в механизированных прачечных (изготовитель ——Казанский химкомбинат имени Вахитова, ВТУ 18/37-64). Лабораторная посуда хорошо отмывается и обезжиривается в течение 30 мин кипячения в указанном растворе, затем ее прополаскивают водопроводной водой и дважды дистиллированной. После этого посуду высушивают в сушильном шкафу.

Для обработки посуды, применявшейся для выращивания микобактерий туберкулеза на яичных питательных средах, А. В. Ивановым и соавт. (1974) предложен простой и экономичный способ. Использованные пробирки со средами автоклавируют при 1,5 атм в течение 30 мин, затем по 250— 300 пробирок укладывают в бачки или эмалированные ведра с плотной крышкой, заливают >1 % раствором едкого натра и кипятят 2 ч. Во время кипячения остатки питательной среды растворяются и образуется однородная жидкая мыльно-щелочная смесь, способствующая освобождению пробирок от плотных остатков среды. После 2 ч кипячения мыльно-щелочной раствор переливают в другое ведро для повторного использования (раствор может быть использован 3——4 раза). Прокипяченные отмытые пробирки несколько раз прополаскивают водопроводной водой и высушивают.

Посуду, используемую для приготовления и хранения питательных сред и культивирования микробов, нельзя обрабатывать дезинфицирующими веществами, так как даже следы их делают питательную среду непригодной для размножения микроорганизмов.

Мытье градуированных пипеток. Пипетки и другая градуированная посуда, поступающие для работы, должны быть абсолютно чистыми и хорошо обезжиренными. На стенках плохо обезжиренной посуды при вливании жидкости остается большое количество капель, вследствие чего слитый объем жидкости не будет соответствовать той величине, которая указана на шкале деления.

Новые градуированные пипетки, не бывшие в употреблении, моют следующим образом. -С помощью резинового баллончика, надетого па пипетку, насасывают в нее горячую мыльную воду и погружают затем в сосуд с такой же водой. Чтобы вода из пипеток не вытекала, уровень жидкости в сосуде должен соответствовать высоте пипеток. Выдержав 20— 30 мин в мыльном растворе, пипетки прополаскивают водопроводной водой и переносят в 1——2% раствор хлористоводородной кислоты, который постепенно доводят до кипения. Далее пипетки обрабатывают так же, как и остальную стеклянную посуду.

Пипетки, бывшие в употреблении, тщательно протирают тонкой упругой проволокой, на конец которой плотно накручивают кусочек ваты или марли в виде сливы. Для того чтобы загрязнения снимались быстрее и легче, пользуются горячей мыльной водой, раствором питьевой соды или стирального порошка.

Закупорившийся канал пипетки прочищают мандреном от тонких игл шприцев. Промытые пипетки складывают в таз, заливают теплым раствором горчицы или мыльной водой и ставят на слабый огонь. .После 20——30-минутного кипячения пипетки вынимают и ополаскивают сначала теплой проточной водой, а затем дистиллированной.

Сильно загрязненные пипетки также очищают вначале ершом с мылом или содой, а затем погружают в хромовую смесь, налитую в ванночку или банку, по высоте соответствующую длине обрабатываемых пипеток. В хромовой смеси пипетки выдерживают 20——30 мин, затем в течение нескольких минут промывают проточной и дважды ополаскивают дистиллированной водой.

Мытье предметных и покровных стекол. Предметные и покровные стекла должны иметь абсолютно чистую поверхность и быть хорошо обезжиренными. Капля воды, нанесенная на обезжиренное стекло, растекается равномерно, а на плохо обезжиренном стекле распадается на мелкие капельки. Предметные и покровные стекла рекомендуется мыть и ополаски-

вать в резиновых перчатках, чтобы не загрязнять 咿 жиром, находящимся на поверхности кожи.

Стекла предметные и покровные, не бывшие в употреблении, моют в теплой мыльной воде и после ополаскивания заливают смесью Никифорова (см. с. 29). Если стекла, вынутые через 2—3 дня из смеси Никифорова, сохраняют следы жира, их складывают в фарфоровую чашечку, заливают 2— 5% раствором гидрокарбоната натрия или едкого натра, ставят на слабый огонь и кипятят, считая от момента закипания воды, в течение 20——30 мин. После кипячения в щелочном растворе стекла ополаскивают проточной водопроводной водой, опускают на 10——15 мин в 5——10% раствор хлористоводородной кислоты и затем промывают проточной водой.

Предметные и покровные стекла, бывшие в употреблении, загрязненные краской и иммерсионным маслом, обрабатывают следующим способом： 1) опускают па 2 ч в концентрированную серную кислоту или хромовую смесь, затем тщательно промывают проточной водопроводной водой; 2) заливают 5% раствором гидрокарбоната натрия или щелочи (едкое кали или едкий натр), ставят на слабый огонь и кипятит в течение 30—40 мин.

Силиконирование лабораторной посуды. Тщательно вымытую и обезжиренную посуду высушивают и заливают на несколько минут при комнатной температуре 3% раствором полиметилсилоксановой жидкости (марка ПМС-200 или ПМС-300) в хлороформе. При этом на поверхности стекла образуется тончайшая оргапосиликоновая пленка с хорошими гидрофобными и адгезивными свойствами. Жидкость можно использовать многократно. Обработанную таким образом посуду помещают на '2 ч в сушильный шкаф при температуре 180—210℃. После этого посуда готова к употреблению. Пленка не смывается водой и не разрушается кислотами. Для ее удаления посуду следует в течение 2 ч кипятить в 10% растворе щелочи.

Сушка и хранение чистой лабораторной посуды. Высушенную посуду просматривают на свет. Стекло ее должно быть совершенно прозрачным, без матового налета и пятен.

Вымытую посуду не вытирают, а сушат при комнатной температуре (холодная сушка) или горячим воздухом в сушильном шкафу при температуре 100Т05℃.

Чисто вымытую и высушенную посуду, закрытую пробками с бумажными колпачками или без них, хранят в местах, надежно защищенных от пыли, лучше всего в плотно закрывающемся шкафу.

ДЕЗИНФЕКЦИЯ

Уничтожение патогенных микробов в объектах внешней среды называется дезинфекцией.

В микробиологических лабораториях дезинфекционные мероприятия используются очень широко. Оканчивая работу с заразным материалом, сотрудники бактериологических лабораторий производят профилактическую дезинфекцию рук и рабочего места.

Дезинфекции подвергают отработанный патологический материал (кал, моча, мокрота, спинномозговая жидкость, кровь) перед выбрасыванием его в'канализацию.

Загрязненные патологическим материалом или культурой микробов градуированные и пастеровские пипетки, стеклянные шпатели и металлические инструменты тотчас после их употребления опускают в стеклянные банки с дезинфицирующим раствором, находящиеся на столе у каждого рабочего места.

Обязательной дезинфекции подлежат также использованные в работе предметные и покровные стекла, так как даже в фиксированном и окрашенном мазке иногда сохраняются жизнеспособные микроорганизмы, которые могут явиться источником внутрилабораторного заражения. Не обрабатывается дезинфицирующими средствами только та посуда, в которой выращивались микроорганизмы. Ес складывают в металлические бачки или биксы, пломбируют и сдают в стерилизацию.

Выбор дезинфицирующего вещества, концентрация его раствора, соотношение между количеством дезинфицирующего вещества и обеззараживаемым материалом, а также продолжительность срока дезинфекции устанавливаются в зависимости от конкретных условий, учитывающих в первую очередь устойчивость обеззараживаемых микробов, степень предполагаемого загрязнения, состав и консистенцию материала, в котором они находятся.

Дезинфекция рук после работы с заразным материалом и при попадании его на кожу. По окончании работы с заразным материалом руки профилактически дезинфицируют. Ватный шарик или марлевую салфетку смачивают 1 % раствором хлорамина или 3% раствором лизола, протирают ' сначала левую, затем правую кисть руки в такой последовательности: тыл кисти, ладонная поверхность, межпальцевые пространства, ногтевые ложа. Таким образом, сначала обрабатывают места, наименее загрязненные, затем переходят к участкам кожи, загрязненным наиболее сильно. Протирают руки в течение 2 мин двумя тампонами последовательно. При загрязнении рук культурой патогенного микроба или патологическим материалом в первую очередь дезинфицируют загрязненные участки кожи. С этой целью их покрывают на 3—5 мин ватой, увлажненной 1% раствором хлорамина, затем вату сбрасывают в бачок или ведро с отработанным материалом, а руки обрабатывают вторым тампоном так же,

как и при профилактической дезинфекции. (После обработки хлорамином руки моют теплой водой с мылом. При работе с бактериями, образующими споры, обработка рук производится 1 % активированным хлорамином. При попадании на руки заразного материала экспозицию дезинфицирующего вещества увеличивают до 6 мин.

СТЕРИЛИЗАЦИЯ

Стерилизация в отличие от дезинфекции предусматривает в стерилизуемом объекте уничтожение всех вегетативных и споровых, патогенных и непатогенных микроорганизмов. Стерилизацию производят различными способами： паром, сухим горячим воздухом, кипячением, фильтрацией и т. д. Выбор того или иного способа стерилизации определяется качеством и свойствами микрофлоры стерилизуемого объекта.

Подготовка и стерилизация лабораторной посуды. Перед стерилизацией лабораторную посуду моют и сушат. Пробирки, флаконы, бутыли, матрицы и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх пробок на каждый сосуд (кроме пробирок) надевают бумажные колпачки.

Резиновые, корковые и стеклянные пробки стерилизуют в отдельном пакете, привязанном к горлышку посуды.

Чашки Петри стерилизуют завернутыми в бумагу по 1 — 5 шт. Пастеровские пипетки по 3—15 шт. заворачивают в плотную оберточную бумагу. В верхнюю часть каждой пипетки вкладывают кусочек ваты, предупреждающий попадание материала в рот. При завертывании пипеток нужно соблюдать большую осторожность, чтобы не обломать запаянные концы капилляров. Во время работы пипетки из пакета вынимают за верхний конец.

В верхнюю часть градуированных пипеток, как й в пастеровские пипетки, вставляют предохранительную вату и затем заворачивают в плотную бумагу, нарезанную предварительно полосками шириной 2——2,5 см и длиной 50——70 см. Полоску бумаги кладут на стол, левый конец ее загибают и завертывают им кончик пипетки, затем, вращая пипетку, навертывают на нее ленту бумаги. Для того чтобы бумага не разворачивалась, противоположный конец ее закручивают или приклеивают. На бумаге надписывают объем завернутой пипетки. При наличии пеналов градуированные пипетки стерилизуют в них.

Лабораторную посуду стерилизуют: а) сухим жаром при температуре 150, 160 и 180℃ соответственно 2 ч, 1 ч и 30 мин; б) в автоклаве при давлении 1 атм в течение 20— 30 мин：

Стерилизация шприцев. Шприцы стерилизуют в разобранном виде: отдельно цилиндр и поршень в 2% растворе гидро-

карбоната натрия 30 мин. При работе со спороносной микрофлорой стерилизацию производят в автоклаве при 132±2℃ (давл. 2 атм) в течение 20 мин, при 126±2℃ (давл. 1,5 атм)— 30 мин.

Простерилизованный шприц собирают после того, как он остынет, в цилиндр вставляют поршень, надевают иглу, предварительно вынув из нее мандрен. Иглу, цилиндр и поршень берут пинцетом, который стерилизуют вместе со шприцем.

Стерилизация металлических инструментов. Металлические инструменты (ножницы, скальпели, пинцеты и пр.) стерилизуют в 2% растворе гидрокарбоната натрия, который предупреждает появление ржавчины и потерю остроты. Лезвия скальпелей и ножниц перед погружением в воду рекомендуется обертывать ватой.

Стерилизация бактериальных петель. Бактериальные петли, сделанные из платиновой или нихромовой проволоки, стерилизуют в пламени спиртовой или газовой горелки. Такой способ стерилизации получил название прокаливания или фламбирования.

Петлю в горизонтальном положении вносят в нижнюю,, наиболее холодную, часть пламени горелки, чтобы не произошло разбрызгивания сжигаемого патогенного материала. После того как он сгорит, петлю переводят в вертикальное положение, накаливают докрасна вначале нижнюю, затем верхнюю часть проволоки и прожигают петледержатель. Прокаливание в целом занимает 5—7 с.

Подготовка к стерилизации и стерилизация бумаги, марли и ваты. Вату, марлю, фильтровальную бумагу стерилизуют в сухожаровой печи при температуре 160°С в течение часа от момента показания термометром данной температуры или в автоклаве при давлении 1 атм в течение 30 мин.

Перед стерилизацией бумагу и марлю нарезают кусочками, а вату сворачивают в виде шариков или тампонов нужной величины. После этого каждый вид материала в отдельности по одной или несколько штук заворачивают в плотную бумагу. При разрыве пакета простерилизованный материал следует стерилизовать повторно, так как стерильность его нарушается.

Стерилизация перчаток и других резиновых изделий. Изделия из резины (перчатки, трубки и т. д.), загрязненные вегетативной формой микробов, стерилизуют кипячением в 2% растворе гидрокарбоната натрия или текучим паром в течение 30 мин; при загрязнении спороносной микрофлорой——в автоклаве при давлении 1,5——2 атм в течение 30 или 20 мин.

Резиновые перчатки перед стерилизацией внутри и снаружи пересыпают тальком для предохранения их от склеивания. Между перчатками прокладывают марлю. Каждую пару

перчаток завертывают отдельно в марлю и в таком виде помешают в биксы.

Стерилизация патогенных культур микробов. Пробирки и чашки^ содержащие культуры микробов, не нужные для дальнейшей работы, складывают в металлический бак, пломбируют крышку и сдают на стерилизацию. Культуры патогенных микробов убивают в автоклаве в течение 30 мин при давлении 1 атм. Вегетативные формы микробных культур разрешается уничтожать кипячением. Стерилизуемый материал заливают холодной водой (лучше 2——5% щелочным раствором) и ставят на огонь, предварительно запломбировав крышку бака. Крышка должна иметь несколько маленьких отверстий для выхода пара. Культуры микробов кипятят Р/2—2 ч с момента закипания воды.

Сдача баков для стерилизации в автоклавную производится специально выделенным лицом под расписку. Режим стерилизации регистрируется в специальном журнале.

Вид стерилизацииВид стерилизацииAywHdA其 AKOHHCH二 ♦EdJOHbd AHOHh9& t=du 0= BSHLSHe*AywHdA其 AKOHHCH二 ♦EdJOHbd AHOHh9& t=du 0= BSHLSHe*MMUHSOduMMUHSOduMHnlRhMHnlRh34^08 &MJ"-34^08 &MJ"-BH=9>KaLhHHK KIR uEHdaiEW 0&=вв=BH=9>KaLhHHK KIR uEHdaiEW 0&=вв=—«nss^vb Kwadti—«nss^vb KwadtiORBhBHORBhBHа9нояа9ноя2§ ■WSESa^HO 0JanIH9° .ЯС -«SR EM3ISBd2§ ■WSESa^HO 0JanIH9° .ЯС -«SR EM3ISBd9HHBh9NHdjJ9HHBh9NHdjJ

Вид стерилизации

Вид стерилизации

AywHdA其 AKOHHCH二 ♦EdJOHbd AHOHh9& t=du 0= BSHLSHe*

AywHdA其 AKOHHCH二 ♦EdJOHbd AHOHh9& t=du 0= BSHLSHe*

MMUHSOdu

MMUHSOdu

MHnlRh

MHnlRh

34^08 &MJ"-

34^08 &MJ"-

BH=9>KaLhHHK KIR uEHdaiEW 0&=вв=

BH=9>KaLhHHK KIR uEHdaiEW 0&=вв=

—«nss^vb Kwadti

—«nss^vb Kwadti

ORBhBH

ORBhBH

а9ноя

а9ноя

2§ ■WSESa^HO 0JanIH9° .ЯС -«SR EM3ISBd

2§ ■WSESa^HO 0JanIH9° .ЯС -«SR EM3ISBd

9HHBh9NHdjJ

9HHBh9NHdjJ

При уничтожении культур микробов I и II групп, а также материала, зараженного или подозрительного на зараженность возбудителями, отнесенными к этим группам, баки с отработанным материалом переносят на металлических подносах с высокими бортами в присутствии сопровождающего лица, допущенного к работе с заразным материалом.

ВИДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ

Стерилизация кипячением. Стерилизацию кипячением производят в стерилизаторе. В стерилизатор наливают дистиллированную воду, так как водопроводная образует накипь. Стеклянные предметы погружают в холодную, металлические предметы—в горячую воду с добавлением гидрокарбоната натрия. Стерилизуемые предметы кипятят на слабом огне. Началом стерилизации считается момент закипания воды в стерилизаторе. По окончании кипячения инструменты берут стерильным пинцетом, который кипятят вместе с остальными предметами.

Стерилизация сухим жаром. Стерилизация сухим жаром производится в печи Пастера. Подготовленный к стерилизации материал кладут на полки так, чтобы он не соприкасался со стенками. Шкаф закрывают и после этого включают обогрев. Продолжительность стерилизации при температуре 150℃ 2 ч, при 165℃—1 ч, при 180℃ — 40 мин, при 200℃ —10—15 мин (при 170℃ бумага и вата желтеют, а при более высокой температуре обугливаются).

Началом стерилизации считается тот момент, когда температура в печи достигнет нужной высоты. По окончании срока стерилизации печь выключают, но дверцы шкафа не открывают до полного охлаждения, так как холодный воздух, поступающий внутрь шкафа, может вызвать образование трещин на горячей посуде.

Стерилизация паром под давлением. Стерилизацию паром под давлением производят в автоклаве. Автоклав состоит из двух котлов, вставленных один в другой, кожуха и крышки. Наружный котел называют водопаровой камерой, внутренний——стерилизационной камерой. В водопаровом котле происходит образование пара. Во внутренний котел помещают стерилизуемый материал. В верхней части стерилизационного котла имеются небольшие отверстия, через которые проходит пар из водопаровой камеры. Крышка автоклава гермети

чески привинчивается к кожуху.

Кроме перечисленных основных частей, автоклав имеет ряд деталей, регулирующих его работу: манометр, водомерное стекло, предохранительный клапан, выпускной, воздушный и конденсационный краны. Манометр служит для опре-

ПоказанияТемпература ки-манометра..пения воды поатмЦельсиюПоказанияТемпература ки-манометра..пения воды поатмЦельсиюТаблица 2Таблица 2Соотношения показаний манометра и температуры кипения водыСоотношения показаний манометра и температуры кипения воды2456789 5000000001122456789 500000000112деления давления, создающегося в стерилизованной камере. Нормальное атмосферное давление (760 мм рт. ст.) принимается за нуль, поэтому в неработающем автоклаве стрелка манометра стоит на нуле. Между показаниями манометра и температурой имеется определенная зависимость (табл. 2).

Показания

Температура ки-

манометра.

.пения воды по

атм

Цельсию

Показания

Температура ки-

манометра.

.пения воды по

атм

Цельсию

Таблица 2

Таблица 2

Соотношения показаний манометра и температуры кипения воды

Соотношения показаний манометра и температуры кипения воды

2456789 500000000112

2456789 500000000112

Красная черта на шкале манометра определяет максимальное рабочее давление, которое допускается в автоклаве. Предохранительный клапан служит для предохранения от чрезмерного повышения давления. Его устанавливают на заданное давление, т. е. давление, при котором нужно производить стерилизацию.

при переходе стрелки манометра за черту клапан автоклава автоматически открывается и выпускает лишний пар, замедляя тем самым дальнейший подъем давления.

На боковой стенке автоклава имеется водомерное стекло, показывающее уровень воды в водопаровом котле. На трубке водомерного стекла нанесены две горизонтальные черты —— нижняя и верхняя, обозначающие соответственно допускаемый нижний и верхний уровень воды в водопаровой камере.

Воздушный кран предназначен для удаления воздуха из стерилизационной и водопаровой камер в начале стерилизации, так как воздух, являясь плохим проводником тепла, нарушает режим стерилизации. На дне автоклава находится конденсационный кран для освобождения стерилизационной камеры от конденсата, образующегося в период нагревания стерилизуемого материала.

Пр авил а работы с автокл а в ом. Перед началом работы осматривают автоклав и контрольно-измерительную аппаратуру.

В автоклавах с автоматическим регулированием пара на электровакуумном манометре водопаровой камеры стрелки устанавливают в соответствии с режимом стерилизации: нижнюю стрелку ставят на 0,1 атм ниже, верхнюю — на 0,1 атм выше рабочего давления.

Водопаровую камеру заполняют водой до верхней отметки водомерного стекла. В период заполнения водой вентиль на трубе, по которой пар поступает в камеру, держат открытым для свободного выхода воздуха из котла.

Стерилизационную камеру автоклава загружают стерилизуемым материалом. После этого крышку (или дверь) автоклава закрывают, закрепляя плотно центральным затвором или болтами; чтобы избежать перекоса болты завинчивают крест-накрест (по диаметру). Затем включают источник подогрева (электрический ток, пар), закрывая вентиль на трубе, соединяющей источник пара со стерилизационной камерой. С началом парообразования и создания давления в водопаровой камере производят продувку (удаление воздуха из стерилизационного котла). Способ удаления воздуха определяется конструкцией автоклава. Вначале воздух выходит отдельными порциями, затем появляется ровная непрерывная струя пара, указывающая, что из стерилизационной камеры воздух полностью вытеснен. После удаления воздуха кран закрывают и в стерилизационной камере начинается постепенное повышение давления.

Началом стерилизации считается тот момент, когда стрелка манометра показывает заданное давление. После этого интенсивность подогрева уменьшают, чтобы давление в автоклаве в течение нужного времени оставалось на одном уровне.

По окончании времени стерилизации подогревание прекращают. Закрывают вентиль в трубопроводе, подающем пар в стерилизационную камеру, и открывают вентиль на конденсационной (нисходящей) трубе для снижения давления пара в камере. После падения стрелки манометра до нуля медленно ослабляют прижимные приспособления и открывают крышку (дверь) автоклава.

Температура и продолжительность стерилизации определяются качеством стерилизуемого материала и свойствами тех микроорганизмов, которыми он заражен.

Контроль температуры в стерилизационной камере осуществляется периодически с помощью бактериологических тестов. Биотесты изготовляются бактериологическими лабораториями СЭС или лабораториями дезинфицирующих станций из образцов почвы, содержащей споры сапрофитов, выдерживающей в течение 3——5 мин воздействие пара с температурой 120℃. Не менее трех образцов почвы, завернутых в пергаментную, а затем фильтровальную бумагу, вместе с максимальным термометром закладывают в коробки со стерилизуемым материалом. Вне коробок в верхнюю и нижнюю части стерилизационной камеры кладут еще две биопробы.

По окончании работы автоклава пробы земли вместе с контрольными (непрогретыми)' образцами направляют в бактериологическую лабораторию СЭС па исследование. При соблюдении правил асептики каждую пробу засевают в 20 мл питательных сред (мясо-пептонный сахарный бульон и полужидкий мясо-пептонпый агар). При посеве наружную обертку развертывают, стерильными ножницами срезают угол пакета и содержащуюся в нем землю высыпают над пламенем горелки в пробирки с питательными средами. Посевы инкубируют в термостате 7 сут при 37℃.

При появлении микробного роста из первичного посева производят высев па мясо-пептонный агар для выявления споровой микрофлоры. Рост вегетативных форм (сарцины, кокки) расценивается как загрязнение питательной среды в момент посева вследствие нарушения правил асептики. При наличии в питательных средах роста спорообразующих микроорганизмов бактериологический контроль повторяют и производят проверку технического состояния автоклава.

Стерилизация текучим паром. Стерилизация текучим паром производится в текучепаровом аппарате Коха или в автоклаве при незавинченной крышке и открытом выпускном кране. Аппарат Коха представляет собой металлический полый цилиндр с двойным дном. Пространство между верхней и нижней пластинками дпа заполняют на 2/з водой (для спуска оставшейся после стерилизации воды есть кран). Крышка аппарата имеет в центре отверстие для термометра и несколь- ко небольших отверстий для выхода пара.

Стерилизуемый материал загружают в камеру аппарата неплотно, чтобы обеспечить возможность наибольшего контакта его с паром. Началом стерилизации считается время с момента закипания воды и поступления пара в стерилизационную камеру. В текучепаровом аппарате стерилизуют главным образом питательные среды, свойства которых изменяются при температуре выше 100°С.

Стерилизацию текучим паром следует проводить повторно, так как однократное прогревание при температуре 100℃ не обеспечивает полного обеспложивания. Такой метод получил название дробной стерилизации: обработку стерилизуемого материала текучим паром проводят по 30 мин ежедневно в течение 3 дней. В промежутках между стерилизациями материал выдерживают при комнатной температуре для прорастания спор в вегетативные формы, которые погибают при последующих прогреваниях.

Тиндализация. Тиндализация — дробная стерилизация с применением температуры ниже 100℃, предложенная Тиндалем. Прогревание стерилизуемого материала производят б водяной бане, снабженной терморегулятором, по часу при температуре 60—65℃ в течение 5 дней или при 70— 80℃ в течение 3 дней. В промежутках между прогреваниями обрабатываемый материал выдерживают при температуре 25℃ для прорастания спор в вегетативные формы, которые погибают при последующих прогреваниях. Тиндализацией пользуются для обеспложивания питательных сред, содержащих белок.

Механическая стерилизация с помощью бактериальных ультрафильтров. Бактериальные фильтры применяют для освобождения жидкости от находящихся в ней бактерий^ а также для отделения бактерий от вирусов, фагов и экзотоксинов. Вирусы бактериальными фильтрами не задерживаются, и поэтому ультрафильтрацию нельзя рассматривать как стерилизацию в принятом значении этого слова.

Для изготовления ультрафильтров применяют мелкопористые материалы (каолин, асбест, нитроцеллюлоза и др.), способные задерживать бактерий.

Асбестовые фильтр ы (фильтры Зейтца). Фильтры Зейтца представляют собой асбестовые пластинки толщиной 3——5 мм и диаметром 35 и 140 мм для фильтрации малых и больших объемов жидкости. В СССР асбестовые фильтры изготовляют двух марок:《①》(фильтрующие), задерживающие взвешенные частицы, ио пропускающие бактерий, и《С①》(стерилизующие), более плотные, задерживающие бактерий.

Перед употреблением асбестовые фильтры монтируют в фильтровальные аппараты и вместе с ними стерилизуют в автоклаве. Асбестовые фильтры используются однократно.

Мембранные ультрафильтры. Мембранные ультрафильтры из органического вещества нитроклетчатки

Рис. 1. Прибор Зейтца с воронкой.Рис. 1. Прибор Зейтца с воронкой.воду,воду,огнеогне№ фильтраСредний диаметр пор, мкм0,30,50,70,91,2№ фильтраСредний диаметр пор, мкм0,30,50,70,91,2Таблица 3Бактериальные фильтрыТаблица 3Бактериальные фильтры

Рис. 1. Прибор Зейтца с воронкой.

Рис. 1. Прибор Зейтца с воронкой.

воду,

воду,

огне

огне

№ фильтра

Средний диаметр пор, мкм

0,3

0,5

0,7

0,9

1,2

№ фильтра

Средний диаметр пор, мкм

0,3

0,5

0,7

0,9

1,2

Таблица 3

Бактериальные фильтры

Таблица 3

Бактериальные фильтры

представляют собой диски белого цвета диаметром 35 мм и толщиной 0,1 мм.

Бактериальные фильтры различаются по величине пор и обозначаются порядковыми номерами (табл. 3).

Непосредственно перед употреблением мембранные фильтры стерилизуют кипячением. Фильтры по-

мещают в дистиллированную подогретую до температуры 50—

50℃, чтобы предупредить их скручивание, кипятят на слабом

в течение 30 мин, меняя 2—3 раза

воду. Простерилизованные фильтры во избежание их повреждения вынимают из стерилизатора фламбированным и остуженным пинцетом с гладкими кончиками.

Асбестовые и мембранные фильтры для фильтрации жидкостей монтируют в специальные фильтровальные приборы: Зейтца или Руб-

левской водопроводной станции (рис. 1). Каждый из указанных выше приборов состоит из двух частей: верхней, имеющей форму цилиндра или воронки, и нижней— опорной части аппарата, с так называемым фильтровальным столиком из металлической сетки или пористой керамической пластинки, на которую помещают мембранный или асбестовый фильтр. Опорная часть аппарата имеет форму воронки, суживающаяся часть которой укрепляется в резиновой пробке горлышка колбы Бунзена. В рабочем состоянии верхнюю часть прибора фиксируют на нижней с помощью винтов (в приборе Зейтца) или специального металлического кольца

с двумя пазами, надетого на шейку воронки (в приборе Рублевской водопроводной станции).

Перед началом фильтрации места соединения различных' частей установки для создания герметичности заливают парафином. Отводную трубку колбы присоединяют толстостенной резиновой трубкой к ；водоструйно- му, масляному или велосипедному насосу. После этого в ци-

линдр или воронку аппарата наливают фильтруемую жидкость и включают в действие насос, создающий вакуум в приемном сосуде.

В результате образующейся разности давлений фильтруемая жидкость проходит через поры фильтра в приемник. Микробы остаются на поверхности фильтра.

МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микроскопический метод исследования предусматривает наблюдение за живыми и убитыми микробами в окрашенном и неокрашенном состоянии.

Различают простые и сложные способы окраски. Первые основаны на применении какой-либо одной краски, например метиленового синего или фуксина. Вторые предусматривают воздействие на один и тот же препарат двух красок. Сложные методы окраски позволяют обнаруживать в теле микробной клетки различные структурные элементы (капсулы, споры, включения), помогают дифференцировать сходные по величине и форме бактерии, принадлежащие к различным видам.

МИКРОСКОПИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ в живом состоянии

Для изучения формы и выявления подвижности бактерии изучают в живом состоянии в препаратах раздавленной или висячей капли.

Раздавленная капля. На предметное стекло наносят каплю бульонной культуры. При обильном росте микробов культуру предварительно разводят стерильным изотоническим раствором хлорида натрия (рец. 20, с. 347). Нанесен-. ную на предметное стекло каплю раздавливают. Для этого покровное стекло ставят на ребро у края капли и опускают, постепенно вытесняя воздух, находящийся между предметным и покровным стеклами, чтобы избежать образования в ней пузырьков воздуха. В правильно приготовленном препарате раздавленной капли стекла плотно склеиваются и жидкость тончайшим слоем заполняет пространство между ними, не выступая за края покровного стекла.

Висячая капля (рис. 2). На середину необезжиренного покровного стекла наносят небольшую, с четкими краями каплю бульонной культуры. Каплю материала покрывают предметным стеклом с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином. Предметное стекло с прилипшим к нему покровным стеклом перевертывают. Капля оказывается висячей в герметически закрытой влажной камере, из которой жидкость испаряется очень медленно и поэтому препарат долгое время остается пригодным для наблюдения.

Рис. 2. Препарат висячей капли.

Висячую каплю микроскопируют с плоским зеркалом и суженной диафрагмой. При малом увеличении (8Х) находят край капли, отчетливо видный в затемненном поле зрения. По одну сторону линии (края) видно множество мельчайших капелек конденсата, осевших на внутренней поверхности покровного стекла, по другую сторону линии фон равномерно серого цвета ——искомая капля. Найденный край капли устанавливают в центре поля зрения микроскопа при малом увеличении и, не сдвигая препарата, переходят на более сильную (40 X) или иммерсионную систему, слегка расширив диафрагму микроскопа.

Подвижные бактерии проходят с одинаковой скоростью большие пространства, иногда через все поле зрения микроскопа, вращаясь вокруг своей оси.

Живые микробы, находящиеся в препарате раздавленной капли, можно изучать и в темном поле зрения. При этом методе микроскопирования толщина предметных стекол не должна превышать 1,2 мм, покровных — 0,2 мм. Принцип исследования микробов в темном поле зрения заключается в том, что в объектив и, следовательно, в глаз наблюдателя попадают не прямые лучи света, а отраженные исследуемым объектом. Вследствие этого неосвещенное поле зрения остается совершенно темным, а микробные тела, отражающие лучи света, освещены очень ярко.

Для создания темного поля конденсор Аббе заменяют темнопольным конденсором, имеющим затемнение центральной части. При отсутствии специального берут обычный конденсор Аббе, развинчивают и вкладывают между его линзами кружок черной фотобумаги так, чтобы незначительная периферическая часть линзы оставалась свободной.

При микроскопировании препаратов в темном поле зрения на верхнюю поверхность конденсора наносят каплю кедрового или вазелинового масла, поверх которой очень осторожно, чтобы пе образовалось пузырьков воздуха, наклады-

вают препарат. На покровное стекло наносится вторая капля масла. Наносить масло на обе поверхности препарата необходимо для того, чтобы при микроскопировании с иммерсионной системой проходящие лучи света не преломлялись,

МИКРОСКОПИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ В ОКРАШЕННОМ ВИДЕ

Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют его и после этого окрашивают.

Приготовление мазков. Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности предметного хорошо обезжиренного стекла.

Мазки готовят из культур микробов, патологического материала (мокрота, гиой, моча, кровь и др.) и из органов трупов..

Техника приготовления мазков определяется характером исследуемого материала.

Приготовление мазков из микробных культур с жидкой питательной среды и из ж ид- кого патологического материала (моча, ликвор и др,). Маленькую каплю исследуемой жидкости наносят бактериальной петлей на предметное стекло и круговыми движениями петли распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром в копеечную монету.

Приготовление мазков и з крови. На предметное стекло, ближе к одному из его концов, наносят каплю крови. Второе — шлифованное — стекло, которое должно- быть уже предметного, ставят на первое под углом 45° w подводят к капле крови до соприкосновения с ней. После того как кровь растечется по шлифованному краю, стеклом делают скользящее движение справа налево, равномерно распределяя кровь тонким слоем по всей поверхности стекла (рис. 3). Толщин-a мазка зависит от величины угла между стеклами: чем острее угол, тем тоньше мазок. Правильно1 приготовленный мазок имеет светло-розовую окраску и одинаковую толщину на всем протяжении.

Приготовление толстой капли. На середину предметного стекла пастеровской пипеткой наносят каплю крови или прикладывают стекло непосредственно к капле крови, выступающей из пальца. Нанесенную на стекло кровь размазывают бактериальной петлей так, чтобы диаметр образующегося мазка соответствовал величине копеечной монеты, Стекло оставляют в горизонтальном положении до подсыхания крови. Кровь в 《толстой капле》 распределяется неравномерно, образуя неровный край.

Приготовление мазка из вязкого материала (мокрота, гной). Мокроту или гной, нанесенные

Рис. 3. Приготовление мазков из крови.

на предметное стекло ближе к узкому краю, накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг к другу..

После этого свободные концы стекол захватывают I и II пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны так, чтобы при движении оба стекла плотно прилегали друг к другу. Получаются мазки с равномерно распределенным материалом, занимающим большую часть,

Приготовление мазка из культур с плотных питательных ср ед. На середину чистого, хорошо обезжиренного стекла наносят каплю водопроводной воды, в нее вносят бактериальную петлю с небольшим количеством исследуемой микробной культуры так, чтобы капля жидкости стала слегка мутноватой. После этого излишек микробного материала на петле сжигают в пламени горелки и приступают к приготовлению мазка по описанному выше способу (1).

Приготовление мазков и з органов и тканей. Поверхность органа с целью обеззараживания прижигают накаленными браншами пинцета, делают по этому месту надрез и из глубины остроконечными ножницами вырезают небольшой кусочек ткани, который помещают между двумя предметными стеклами. Далее поступают так же, как при приготовлении мазка из гноя и мокроты. Если ткань органа плотная, то из глубины разреза делают скальпелем со- скоб. Полученный при соскабливании материал распределяют тонким слоем по поверхности стекла скальпелем или бактериальной петлей.

Для изучения взаимного расположения элементов ткани и находящихся в ней микроорганизмов делают мазки-отпечатки. Для этого вырезанный из середины органа небольшой кусочек ткани захватывают пинцетом и прикладывают поверхностью среза к предметному стеклу несколько раз последовательно, получая таким образом ряд мазков-отпечатков.

Высушивание и фиксирование мазков. Приготовленный на предметном стекле мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не

смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

Физический способ фиксации. Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за ребра мазком кверху и плавным движением проводят 2——3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Надежность фиксации йроверяют следующим простым приемом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.

Химический способ фиксации. Для фиксации мазков применяют также химические вещества и соединения (табл. 4). '

Таблица 4

Вещества для химической фиксации

Фиксирующее веществоФиксирующее веществоВремяфиксации,минВремяфиксации,мин

Фиксирующее вещество

Фиксирующее вещество

Времяфиксации,мин

Времяфиксации,мин

5 、 10—15 10—1510—155 、 10—15 10—1510—15Безводный метиловый спирт

5 、 10—15 10—15

10—15

5 、 10—15 10—15

10—15

Этиловый (винный) спирт 96%

Жидкость Никифорова (смесь спирта и наркозного эфира б соотношении 1:1)

Жидкость Ка加уа (спирта 96% 60 мл, хлороформа 30 мл, уксусной кислоты ледяной 10 мл)

Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом и затем высушивают на воздухе.

Техника окраски мазков. Для окраски мазков пользуются растворами красок или красящей бумагой, предложенной А. И. Синевым. Простота приготовления, удобство применения, а также возможность хранения красящих бумаг в течение неограниченно долгого времени явились основанием для широкого их использования при различных способах окраски. Рецепты приготовления красок и реактивов, применяемых при окраске бактериальных препаратов, даны в приложении (с. 341).

Окраска мазков красящей бумагой. На высушенный и фиксированный препарат наносят несколько капель воды, кладут окрашенные бумажки величиной 2X2 см. В течение всего времени прокрашивания бумага должна оставаться влажной и плотно прилегать к поверхности стекла. При подсыхании бумагу дополнительно смачивают водой. Продолжительность окрашивания мазка определяется методом окраски. По окончании окраски бумагу осторожно снимают пинцетом, а мазок промывают водопроводной водой и подсушивают на воздухе или фильтровальной бумагой.

Окраска мазков растворами красителей. На высушенный и фиксированный препарат пипеткой наносят краситель в таком количестве, чтобы он покрывал весь мазок. При окраске мазков концентрированными растворами красителей (карболовый фуксин Циля, карболовый генциа- новый или кристаллический фиолетовый) окрашивание производят через фильтровальную бумагу, задерживающую частицы красителя: на фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают раствор красителя.

Простая окраска

При простых способах окраски применяется какой-нибудь один краситель: метиленовый синий или водно-спиртовой раствор фуксина. Последним красят 1——2 мин, метиленовым синим ——3—5 мин. Окрашенные препараты промывают водопроводной водой, подсушивают и микроскопируют с иммерсионной системой.

Простыми способами окраски пользуются для обнаружо- -ния в микроскопируемом материале микробов, определения их количества, формы и расположения. Препараты, содержащие, кроме бактерий, тканевые и клеточные элементы, красят метиленовым синим, который окрашивает фон препарата значительно слабее, чем тела микробных клеток.

Сложные дифференциальные методы окраски

При сложных способах окраски на мазок воздействую! двумя красящими веществами, из которых один является основным, а другой-—дополнительным. Кроме красящих веществ, при сложных способах окраски применяют различные обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и т. д.

Окраска по методу Грама. Особенностью окраски по Граму является неодинаковое отношение различных микробов к красителям трифенилметановой группы: генциановому, метиловому или кристаллическому фиолетовому. Микробы, входящие в группу грамположительных, например стафилококки, стрептококки, дают прочное соединение с указанными

красителями и йодом. Окрашенные микробы не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином грамположительные микробы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет. Грамотрицательные микроорганизмы (гонококки, менингококки, возбудители кишечных заболеваний и др.) образуют с генциановым кристаллическим или метиловым фиолетовым и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение, в результате чего они обесцвечиваются и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

Отношение микроорганизмов к окрашиванию по Граму имеет большое диагностическое значение.

Методика окраски. 1. Мазок, • фиксированный на огне, окрашивают через фильтровальную бумагу основным красителем — раствором основного карболового кристаллического фиолетового (рец. 3, с. 342). Прокрашивание длится 1—2 мин.

Снимают бумагу, сливают избыток красителя и, не промывая препарата водой, наливают раствор Люголя (рец. 21, с. 347) на 1—2 мин до почернения препарата.

Раствор Люголя сливают. Предметное стекло для обесцвечивания мазка погружают несколько раз в стаканчик се спиртом, процесс обесцвечивания считается завершенным, когда от мазка перестают отделяться окрашенные в фиолетовый цвет струйки жидкости.

Препарат тщательно промывают водопроводной водой.

Докрашивают спирто-водным раствором фуксина (рец, 7, с. 343) 2 мин.

Результаты окраски. Грамположительные бактерии окрашиваются основным красителем в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные бактерии, воспринимая дополнительную окраску, приобретают ярко-малиновый цвет.

В настоящее время более широкое применение в практике бактериологических исследований находит видоизмененный способ окраски Грама по Синеву.

Основной краситель в виде раствора заменяют фильтровальной бумагой, пропитанной 1 % спиртовым раствором кристаллического фиолетового (см. технику приготовления красящей бумаги по Синеву, с. 345). На препарат помещают красящую бумажку и наносят на нее 2——3 капли воды. Окрашивание идет в течение 1—2 мин. Затем бумажки снимают и дальнейшую окраску препарата ведут общепринятым способом.

Окраска кислотоустойчивых бактерий. Кислотоустойчивыми называют тех микробов, которые, будучи окрашены карболовым фуксином, не обесцвечиваются под действием концентрированных минеральных кислот. Особенностью микробов этой группы является то, что они плохо воспринимают окраску.

Для того чтобы окрасить кислотоустойчивые микроорганизмы, приходится применять более концентрированные растворы красителя в подогретом состоянии с протравами и удлиненным сроком окраски.

К кислотоустойчивым патогенным микробам относятся возбудители туберкулеза (см. рис. 29) и проказы.

Методика окраски. 1. Фиксированный на пламени горелки мазок окрашивают в течение 3—5 мин раствором карболового фуксина Циля или окрашенной фуксином бумажкой с подогреванием до появления паров, но не доводя краситель до кипения.

Дают препарату остыть, бумажку снимают, сливают избыток красителя, препарат промывают водой.

Окрашенный препарат обесцвечивают 5% серной кислотой в течение 3——5 с или 95% этиловым спиртом, содержащим 3% по объему хлористоводородной кислоты, несколько раз погружая стекло в стаканчик с раствором.

После обесцвечивания остаток кислоты сливают й препарат тщательно промывают водой.

Докрашивают дополнительно метиленовым синим Леффлера 3—5 мин.

Окрашенный препарат промывают водой, подсушивают и микроскопируют.

При окраске препаратов по методу Циля ——Нильсена кислотоустойчивые бактерии окрашиваются фуксином в рубиново-красный цвет и не обесцвечиваются кислотой.

Некислотоустойчивые бактерии, а также элементы ткани и лейкоциты под действием кислоты становятся бесцветными и приобретают цвет дополнительного красителя.

Окраска по Романовскому — Гимзе, Краситель Романовского —Гимзы состоит из смеси азура, эозина и метиленового синего. Непосредственно перед употреблением к 10 мл дистиллированной воды (pH 7,0—7,2) прибавляют 10 капель имеющегося в продаже красителя Романовского — Гимзы. Приготовленный раствор красителя тотчас наливают на фиксированный мазок или предметное стекло с окрашиваемым препаратом погружают в стаканчик с красителем. Через час краситель сливают, препарат промывают водой и высушивают на воздухе. ^

Краситель Романовского — Гимзы, имеющий в растворе снне・4)но〃етовн立 цвет, окрашивает цитоплазму форменных элементов ткани в голубовато-синий цвет, а ядра клеток, так же как и микробные тела, в фиолетово-красный (см. рис. 30). .

Окраска спор микробов. Споры имеют вид круглых или овальной формы образований, находящихся в теле микробной клетки. Различают три вида расположения спор по отношению к длинной оси палочки: центральное — спора находит-

ся в центре тела микроба, субтерминальное ——спора расположена ближе к одному из ее концов, терминальное — спора располагается на конце палочки. Диаметр споры может не превышать диаметр тела микробной клетки, вследствие чего форма палочки при спорообразовании не изменяется. В других случаях диаметр споры больше поперечного размера микробной клетки и тело ее в месте образования споры утолщается.

Форма, величина и расположение спор постоянны для каждого вида бацилл.

Плотная оболочка спор, непроницаемая для воды, окрашивается с большим трудом, поэтому при обычных методах окраски споры имеют вид неокрашенных пустот внутри клетки. Для окраски спор пользуются специальными методами с применением протрав (кислоты или щелочи). Протравы разрыхляют оболочку споры, облегчая проникновение в нее красителя. Окрасившиеся споры обладают кислотоустойчи- востью в отличие от вегетативного тела микробной клетки, обесцвечивающегося под действием кислоты. Поэтому принцип окраски спор и кислотоустойчивых бактерий одинаков: препарат окрашивают основным красителем, затем обесцвечивают кислотой и докрашивают дополнительно в какой-нибудь контрастный цвет.

Окраска спор методом О ж е ш к о. 1. На высушенный нефиксированный препарат (мазок готовится толстым и на краю стекла) наливают несколько капель 0,5% раствора хлористоводородной кислоты и подогревают 1 — 2 мин над пламенем горелки до закипания, после чего остатки кислоты сливают.

Остывший препарат промывают водой, подсушивают и фиксируют на пламени горелки.

Окрашивают карболовым фуксином Циля (рец. 6, с. 343) с подогреванием до появления паров.

Обесцвечивают 5% раствором серной кислоты в течение нескольких секунд.

Промывают водой.

Докрашивают метиленовым синим (рец. 9, с. 343) или 1 % водным раствором малахитового зеленого (рец. 16) 3—5 мин.

Споры, окрашенные фуксином, имеют рубиново-красный цвет, вегетативные тела микробных клеток при докрашивании синькой Леффлера ——синий цвет, при применении малахитового зеленого ——зеленый цвет.

зазаСпособы выявления и окраски кауул микробов. Некоторые виды бактерий продуцируют слизистое вещество, которое, концентрируясь вокруг тела микробной клетки, образует капсулу. При обычных методах окраски капсулы остаются бесцветными. Это позволяет применять простые методы окра-

за

за

3 Лабинская А. С.

ски для выявления капсульных микроорганизмов в мазках из органов и тканевой жидкости.

Для выявления капсул применяют специальные способы окраски.

Выявление капсул по способу Бурри. На узкий конец предметного стекла наносят каплю туши и петлю исследуемого материала. Смесь тщательно перемешивают петлей, делают мазок, как мазок из крови, высушивают и, не фиксируя, микроскопируют с иммерсионно立 системой. Фон препарата окрашен в темно-дымчатый цвет, микробные тела и их капсулы не окрашиваются тушью и остаются бесцветными, вследствие чего этот способ получил название нега- тивнего.

Окр аска капсул по способу Г ин с а. 1. Приготовляют негативно окрашенный по способу Бурри препарат.

Фиксируют любым химическим способом: метиловым спиртом, смесью Никифорова или другими смесями (с. 29).

Промывают водой.

Окрашивают 3—5 мин карболовым фуксином Циля, разведенным в соотношении 1: 3.

Промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой.

При микроскопировании на темном фоне препарата контрастно выделяются неокрашенные капсулы, внутри которых находятся бактерии ярко-мал ивового цвета. •

Окраска зерен волютина. Среди патогенных микробов включения нуклеопротеидов в виде зерен волютина могут быть обнаружены только у возбудителей дифтерии и сапа.

Окр аска зерен волютин а п о способу Н е й с- с е р а. 1. Фиксированный на пламени горелки мазок окрашивают 1——2 мин синькой Нейссера (рец. 11, с. 344).

Синьку сливают, на препарат наносят несколько капель раствора Люголя (рец. 21) на 1 мин.

Мазок промывают водо立,подсушивают фильтровальной бумагой.

Докрашивают раствором хризоидина или везувина 2—3 мин.

Промывают водой, подсушивают и микроскопируют. Зерна волютина окрашиваются в синий цвет, тела микробных клеток — в светло-коричневый (см. рис. 25).

ОСНОВЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Питательные среды служат для выделения из исследуемого материала чистых культур микробов и изучения их свойств. Питательные среды являются основой бактериологических работ, нередко определяя своим качеством результаты исследования.

В состав сред, применяемых для выращивания бактерий, входят необходимые для построения белков цитоплазмы органогены: азоты, углерод, водород, кислород, неорганические соединения, содержащие фосфор, калий, серу, натрий, магний, железо, микроэлементы: кобальт, йод, марганец, бор, цинк, молибден, медь и др. Все перечисленные элементы должны находиться в питательной среде в удобоусвояемом для данного микроорганизма соединении, причем требования различных микробов в этом отношении неодинаковы. Потребность в кислороде и водороде бактерии удовлетворяют главным образом за счет поступающей в клетку воды.

По характеру усвоения азота патогенные микроорганизмы делятся следующим образом: оДни из них извлекают азот из простых аммонийных соединений, другие нуждаются в аминокислотах, третьи расщепляют высокомолекулярные вещества ——пептоны, представляющие собой продукты неполного ферментативного переваривания белков. Строго паразитические виды бактерий размножаются только в присутствии нативного, т. е. неизмененного, белка.

Источником углерода для патогенных бактерий являются главным образом различные углеводы: сахар, многоатомные спирты, органические кислоты и их соли.

Потребность бактерий в неорганических элементах удовлетворяется прибавляемыми к питательной среде солями: NaCl, КН2Po4, К2НРО4 и т. д. Микроэлементы, выполняющие роль катализаторов химических процессов, необходимы в ничтожно малых количествах и поступают в питательную среду с пептоном, неорганическими солями и водой.

Наряду с перечисленными органическими и неорганическими элементами бактерии нуждаются в ростовых факторах, которые по своей роли соответствуют витаминам для животных. Источником факторов роста являются прибавляемые к питательной среде продукты растительного и животного происхождения, содержащие в своем составе никотиновую, пантотеновую, парабензойную кислоты, витамины А, В, С и др.

Питательные вещества могут усваиваться микробами только при определенной реакции питательной среды, так как проницаемость оболочек микробных клеток изменяется в зависимости от pH среды.

Потребность в питательных веществах и физических усло

виях у различных видов микробов неодинакова и этим исключается возможность создания универсальной питательной

среды.

По консистенции различают плотные и жидкие питательные среды. Плотные питательные среды готовят из жидких посредством прибавления к ним клеевых веществ: агара или желатина. Агар-агар (по-малайски желе)—продукт растительного происхождения, добываемый из морских

водорослей. В воде агар-агар растворяется при температуре 80—86℃» застудневает при 36—40℃. Применение агаровых сред благодаря их способности сохранять плотность при температуре 37* С дало возможность выращивать патогенных микробов при оптимальной для большинства из них температуре на плотных средах. Желатин — вещество белковой природы животного происхождения. В теплой воде при температуре 32—34® С он набухает и растворяется, а при более низкой температуре превращается в студень. Однако при pH ниже 6,3 и выше 7,0 плотность желатина уменьшается и он плохо застывает.

Исходные продукты для приготовления п и- тательных сред. Для приготовления питательных сред используют:

Продукты животного происхождения (мясо, рыба, казеин, молоко, яйца, кровь и т. д.).

, Продукты растительного происхождения (картофель и др.).

Органические и неорганические соединения определенного химического состава.

Питательные среды, приготовленные из продуктов растительного и животного происхождения, несмотря на то что они не могут быть стандартны и не имеют определенного химического состава, находят широкое применение в практике микробиологии. Синтетические питательные среды, составленные из химических соединений, используют преимущественно для изучения обмена веществ микробной клетки.

Требования, предъяв ляемые к питательным средам. Питательные среды должны: 1. Содержать необходимые для питания микроба питательные вещества.

Иметь реакцию pH, оптимальную для выращиваемого вида микроба.

Иметь достаточную влажность, так как микробы питаются по законам диффузии и осмоса.

Обладать изотоничностью.

Быть стерильными, обеспечивая тем самым возможность выращивания чистых культур микробов.

Питательные среды подразделяются на среды общего назначения и специальные. К первой группе относятся мясо-пептонные: агар, бульон, питательный желатин. Среды общего назначения используют для выращивания многих патогенных микробов и применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходимые для размножения того или иного вида микроба.

К специальным питательным средам относятся элективные (избирательные) и дифференциально-диагностические.

Элективные (избирательные) среды. Принцип создания элективных питательных сред основан на удовлетворении основных биохимических и энергетических потребностей того вида микроба, для культивирования которого они предназначаются. Определенный состав и концентрация питательных веществ, микроэлементов, ростовых факторов при строго определенном значении pH обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного или нескольких видов микроорганизмов.

При посеве на них материала, содержащего смесь различных микроорганизмов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого данная среда будет элективной.

Дифференциально-диагностические питательные среды. Дифференциально-диагностические питательные среды используют для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ. По своему назначению дифференциальйо-диагности- ческие питательные среды подразделяются следующим образом:

Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе белковые вещества: кровь, молоко, желатин, свернутую кровяную сыворотку и т. д.

Среды с индифферентными химическими веществами, которые служат источником питания для одних видов микробов и не усваиваются другими видами.

Среды с углеводами и многоатомными спиртами для обнаружения соответствующих ферментов.

Среды для определения редуцирующей способности микробов.

В состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для выявления сахаролитйческих и окислительно-восстановительных ферментов, вводят индикаторы: нейтральную красную, метнленовьл立 синий, лакмусовую настойку, кислый фуксин, бромтимоловый синий, водный голубой краситель и розоловую кислоту (ВР). Изменяя свою окраску при различных значениях pH, индикатор указывает на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления введенного в среду ингредиента. Однако индикатор не является обязательной составной частью сред, предназначенных для выявления ферментов. Так, наличие желатиназы и других протеолитических ферментов в культуре определяют по разжижению желатина, свернутого яичного или сывороточного белка.

Сухие питательные среды. Приготовление питательных сред — один из наиболее ответственных и трудных участков работы бактериологической лаборатории.

В настоящее время медицинской промышленностью Советского Союза организовано производство консервированных сред. Сухие питательные среды представляют собой гигроскопические порошки, растворяющиеся в воде.

Наряду с обычной средой — мясо-пептониым агаром производится много специальных питательных сред сложного рецептурного состава для выращивания микробов кишечной группы (например, среды Эндо (рец. 79, с. 365), Левина (рец. 80), сухой бактоагар Плоскирева (рец. 81), КУА (рец. ПО, с. 377).

Сухие питательные среды поступают в продажу в стеклянных банках с плотно завинчивающимися пластмассовыми крышками, обеспечивающими герметичность. В таком же виде они должны храниться в лаборатории.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ pH ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Реакция среды определяется концентрацией содержащихся в ней водородных и гидроксильных ионов. Преобладание ионов водорода обусловливает кислую реакцию, преобладание гидроксильных — щелочную, равенство их ——нейтральную реакцию среды. Опытным путем было установлено, что нейтральная реакция соответствует концентрации гидроксильных и водородных ионов, равной 0,0000001, или 10~7 ион/л:

(Н+) = (ОН-) = 10-7 г-иоп/л.

Произведение концентрации водородных и гидроксильных ионов равно константе: .

К = (Н-) X (ОН-7) = 10-к.

Таким образом, значения Н+ и ОН~ связаны с постоянной величиной произведения: изменение одной из них влечет за собой соответствующее увеличение или уменьшение другой. Вследствие этого для характеристики реакции среды достаточно определить в растворе содержание каких-либо одних ионов — водородных или гидроксильных. В настоящее время принято определять реакцию среды по содержанию в ней ионов водорода. •

Концентрация водородных ионов, выраженная в г-ионах на 1 л, получила название водородного числа. В воде и биологических жидкостях водородное число представляет собой ничтожно малую величину, неудобную для практического использования. Поэтому для выражения концентрации водородных ионов в жидкости был введен водородный показатель, обозначаемый символом pH; pH представляет собой логарифм величины Н (абсолютной концентрации водородных ионов), взятый с обратным знаком. В принятом обозначении нейтральной реакции соответствует pH 7,0. Показа-

Рис. 4. Компаратор Уольполя — Михаэлиса.

/ — вид спереди; 2 — вид сзади; 3 — схема расположения пробирок в компараторе.

тель ниже 7,0 (6,9—1,0) указывает на кислую реакцию раствора, выше 7,0 (7,1 —14,0) — на щелочную реакцию.

Определение pH раствора производят колориметрическим и электрометрическим способами. В микробиологических лабораториях преимущественное распространение получил первый из упомянутых способов.

Определение pH среды колориметрическим способом. В основу колориметрического определения pH положена способность некоторых веществ, называемых индикаторами, изменять цвет или интенсивность окраски в зависимости от pH раствора. В связи с этим две жидкости с одинаковой толщиной слоя, содержащие один и тот же индикатор, могут иметь полное совпадение цвета только при равных значениях pH. Для колориметрического определения pH в растворе пользуются обычно прибором Уольполя ——Михаэлиса, представляющим собой компаратор и набор индикаторов.

Компаратор Михаэлиса имеет вид деревянного бруска, на верхней поверхности которого высверлено 6 отверстий для пробирок, расположенных по 3 в два ряда. Для удобства работы гнезда имеют условную нумерацию: отверстия ряда, обращенного к глазу наблюдателя, обозначены цифрами 1, 2, 3; отверстия ряда, обращенного к свету,——4, 5, 6. Пробирки на половину своей длины входят в гнезда, как в обыч- нн立 штатив. У основания через стенку просверлены три сквозных канала для прохождения лучей света и наблюдения за пробирками, находящимися в соответствующем ряду. На задней стенке имеются специальные зажимы для придерживания светофильтров (рис. 4).

К компаратору приложены 2 светофильтра ——стеклянные пластинки (матовая и синяя) и 4 стандартные пробирки,, диаметр и форма которых соответствуют пробиркам стандартов-индикаторов.

К прибору Михаэлиса прилагаются 4 индикатора, из которых каждый изменяет окраску от бесцветной до интенсивно желтой в пределах указанного значения pH:

метанитрофеиол — от pH 6,8 до 8,4параинтрофеиол — от pH 5,4 до 7,0гамма-нитрофеиол — от pH 4;0 до 5,4альфа-нитрофенол — от pH 2,8 до 4,4

Соответственно этим индикаторам в приборе имеютс» 4 шкалы стандартов-индикаторов в запаянных пробирках. Стандарты располагаются в следующем порядке.

Первый ряд: стандарты для метанитрофенола —9 пробирок (pH 6,8—8,4).

Второй ряд: стандарты для паранитрофенола — 9 пробирок (pH 5,4—7,0).

Третий ряд: стандарты для гамма-нитрофенола — 8 пробирок (pH 4,0—5,4).

Четвертый ряд: стандарты для альфа-нитрофенола — 9 пробирок (pH 2,8—4,4).

На каждой пробирке стандарта наклеена этикетка, обозначающая величину pH, которой соответствует данный стандарт. Разница pH двух рядом стоящих пробирок соответст* вует 0,2. Набор имеющихся индикаторов и прилагаемые к ним стандарты допускают определение pH раствора в пределах 2,8—8,4.

Наряду с перечисленными индикаторами, предназначенными для точного определения pH, в пробирке имеется так называемый универсальный индикатор для ориентировочного- определения pH исследуемых жидкостей. К нему прилагается фарфоровая палетка и разноцветная шкала на бумажной* карточке. Каждая цветная полоска этой шкалы соответствует определенному значению pH «универсального ипдика* тора》.

Техника определ ения pH р аство р а колориметрическим способом. В фарфоровую палетку наливают 2—3 мл исследуемой жидкости, прибавляют 2—— 3 капли «универсального индикатора» и смешивают стеклянной палочкой; образующуюся при этом окраску сравнивают с цветной бумажной шкалой. pH определяют на основании полного совпадения цвета смеси исследуемого раствора и индикатора с одной из цветных полосок шкалы, под которой имеется соответствующее цифровое обозначение. Определив ориентировочно pH раствора, выбирают соответствующий индикатор Михаэлиса.

В стандартную пробирку наливают 2 мл исследуемой жидкости, 4 мл дистиллированной воды и I мл выбранного индикатора. Пробирку ставят во второе отверстие компаратора. Рядом с ней, справа и слева (отверстия 1 и 3), ставят пробирки, содержащие по 2 мл исследуемого раствора и 5 мл дистиллированной воды.

В отверстие 5 помещают пробирку с 7 мл дистиллированной воды, а с обеих ее сторон, в отверстия 4 и 6, стандарты с тем же индикатором, который добавлен к исследуемой среде. Стандарты подбирают до тех пор, пока интенсивность их окраски и исследуемой жидкости не станет одинаковой.

При исследовании растворов, окрашенных в желтый цвет, в компаратор вставляют светофильтр синего цвета. Жидкость при этом приобретает зеленый цвет, оттенки которого улавливаются значительно легче, чем желтого. При работе с мутной жидкостью вставляют матовый светофильтр, скрывающий мутность исследуемой среды.

pH исследуемого раствора будет соответствовать величине, указанной на этикетке стандарта, с цветом которого он полностью совпадает.

Приготовление растворов с определенным зн ачением pH. Приготовление раствора (среды) с определенной реакцией начинают с ориентировочного определения в нем pH с помощью «универсального индикатора». Если pH ниже заданного, раствор подщелачивают, если выше—подкисляют. В первом и втором случаях точно учитывают количество кислоты или щелочи, истраченной на изменение pH до нужного значения.

Расстановка пробирок в компараторе при приготовлении раствора с определенным значением pH такая же, как описано выше. Однако в гнездах 4 и 6 устанавливают стандарты с заведомо определенным значением pH, которое нужно создать в опытном растворе. Например, для установления в растворе pH 7,3 берут стандарты pH 7,2 и 7,4.

В опытную пробирку 2 градуированной пипеткой прибавляют по каплям децинормальный раствор едкого натра для подщелачивания или децинормальный раствор хлористоводородной кислоты для подкисления до тех пор, пока цвет содержимого в опытной и стандартной пробирках не совпадет полностью. За изменением цвета в опытной пробирке наблюдают все время через отверстие, расположенное на передней стенке у основания штатива.

Для уточнения полученных данных исследование повторяют. К опытному раствору прибавляют заранее то же коли* чество кислоты или щелочи и повторно проверяют величину полученного значения pH.

По окончании исследования приступают к расчету: зная количество щелочи (или кислоты), затраченное для создания

определенного значения pH в 2 мл раствора, легко вычислить, сколько потребуется ее для приготовления 1 л раствора с тем же значением pH.

Пример. Чтобы установить в 2 мл мясо-пептонного бульона pH 7,6, понадобилось 0,2 мл децннормального раствора едкого натра. Следовательно, на 1000 мл того же раствора едкого натра нужно в 500 раз больше.

Количество щелочи или кислоты, необходимое для приготовления любого объема раствора с определенным значением pH, можно рассчитать по следующей формуле:

АХВ

С

где х — искомое количество щелочи (или кислоты), Л — количество децннормального раствора едкого натра, прибавленного к исследуемой пробе, В ——общее количество пита-* тельной среды, С ——количество среды, взятой для опытного определения pH.

При стерилизации питательных сред в автоклаве pH, как правило, снижается, поэтому перед стерилизацией pH среды превышают обычно на 0,2 выше требуемой величины и после автоклавирования реакцию среды проверяют повторно.

Фильтрование питательных сред. Жидкие и желатиновые питательные среды фильтруют через фильтровальную бумагу, среды с агаром ——через ватно-марлевый фидьтр. Перед фильтрованием монтируют вспомогательную установку. В кольце универсального штатива закрепляют воронку, под трубку ее подставляют приемник для фильтрата.

Ватно-марлевые фильтры для агаровых сред готовят следующим образом. Стеклянную воронку покрывают квадратным куском марли, углы которой перегибают через край воронки. На марлю кладут слой гигроскопической ваты. Перед началом фильтрования поверхность ватно-марлевого фильтра, так же как и бумажного, осторожно смачивают дистиллированной водой или фильтруемой средой.

Фильтрование при нагревании. Питательные среды с желатином и агаром фильтруют, предварительно расплавив и подогрев до кипения. Фильтрование с подогреванием удобно проводить в горячем автоклаве, открыв крышку и выключив источник обогрева.

Осветление питательных сред. Осветление питательных сред применяют в том случае, когда в процессе приготовления они мутнеют и приобретают темный цвет. Осветление может быть основано на коагулировании взвешенных частиц, что способствует более быстрому выпадению их в осадок, и на адсорбции, т. е. способности различных веществ осаждать на свою поверхность взвешенные частицы.

Существует несколько способов осветления питательных сред.

К 1 л среды, охлажденной до температуры 50° С, прибавляют один белок свежего куриного яйца, взбитый в пену, с двойным объемом холодной воды. После добавления белка среду хорошо размешивают и кипятят на сильном огне в течение 10 мин или нагревают в автоклаве в течение 30 мин при температуре 105° С. Белок можно заменить нормальной лошадиной сывороткой, прибавляемой на 1 л среды в количестве 30—40 мл. Иногда прибавление белка усиливает мутность питательной среды^ Поэтому приступая к ее осветлению, нужно для пробы взять 10 мл питательной среды, прибавить 0,3 мл белка или сыворотку и вскипятить.

В питательную среду, охлажденную до температуры 40——45° С, вносят па каждый литр среды 20—30 г мяса, пропущенного через мясорубку и растертого в ступке с бульоном до получения однородной массы. Среду с прибавленной к ней мясной кашицей тщательно размешивают и помещают на 1 ч в текучепаровой аппарат.

Фильтрацию и осветление агара можно заменить декантацией, т. е. отделением осадка путем его отстаивания. Для этого расплавленную среду с агаром наливают в широкий сосуд высоким слоем и ставят в горячий автоклав на ночь для осаждения взвешенных частиц, обусловливающих мутность среды. На следующий день посуду с застывшим агаром слегка подогревают в водяной бане, перевертывают вверх дном, вытряхивают агар и срезают придонную часть его, содержащую осадок.

Разливка питательных сред. После осветление и фильтрации питательные среды разливают в колбы, флаконы, пробирки или матрацы.

Среды уже стерильные или стерилизуемые текучим паром, или под давлением 0,5 атм разливают в стерильную посуду, среды, подлежащие стерилизации при давлении 1 атм, — в чистую, но нестерильную посуду.

Для разливки жидких питательных сред пользуются одной из описанных ниже установок.

На конец воронки, закрепленной в кольце штатива, надевают резиновую трубку, оканчивающуюся стеклянным наконечником. На резиновую трубку накладывают зажим Мора. Под воронку подставляют сосуд для приема профильтрованной среды.

Для отмеривания и разливки определенных объемов среды пользуются градуированной бюреткой или собирают специальную установку (рис. 5). Стеклянную воронку и градуированную бюретку соединяют резиновыми трубками с двумя коленами стеклянного тройника, на третье колено его надевают резиновую трубку» заканчивающуюся стеклянным

Рис. 5. Прибор для разливания определенных ■ количеств жидкости.Рис. 5. Прибор для разливания определенных ■ количеств жидкости.наконечником. На резиновые трубкиг соединяющие воронку с тройником, на тройник и наконечник накладывают зажимы Мора. Ослабляя первый зажим, наполняют градуированный цилиндр жидкостью, затем, открыв второй зажим, выпускают отмеренное количество жидкости в сосуд для питательной среды. Первые порции жидкости до вытеснения воздуха из трубок не учитываются.

Рис. 5. Прибор для разливания определенных ■ количеств жидкости.

Рис. 5. Прибор для разливания определенных ■ количеств жидкости.

При разливке сред края посуды нельзя смачивать питательной средой; так как ватно-марлевые пробки, приклеиваясь к стеклу во время стерилизации, вынимаются с трудом и оставляют в просвете отверстия сосуда ворсинки ваты. Попадая в среду, они могут вызвать загрязнение ее посторонней микрофлорой.

Поверх ватно-марлевой пробки на колбы и флаконы с питательными средами надевают бумажные колпачки.

Разливка плотных стерильных питательных сред в чашки Петри. Плотную питательную среду (агар, желатин) во флаконах или пробирках растапливают а водяной бане (сняв предварительно бумажные колпачки). После тога как среда станет жидкой, сосуд берут в правую руку, левой рукой над огнем

вынимают пробку ивынимают пробку идержат между мизинцем и ладонью, а

вынимают пробку и

вынимают пробку и

края флакона или пробирки обжигают. Открытую посуду со средой держат в наклонном положении, чтобы избежать

попадания в среду микробов из воздуха. В то же время левой рукой приподнимают с одной стороны крышку на чашке Петри и выливают в нее питательную среду в количестве 15——20 мл, слегка покачивая чашку, чтобы среда распределялась равномерным слоем по всей ее поверхности (рис. 6).

Во Всесоюзном научно-исследовательском институте антибиотиков Ю. Э. Бартошевич и А. И. Чепурным (1969) сконструирован универсальный прибор-автомат для разливки

Рис. 6. Разливка агара в чашки Петри.

агаризированных сред в чашки Петри, обеспечивающий высокую стерильность и точное дозирование разливаемых сред.

Прибор-автомат представляет собой настольную установку размером 300 X 500X120 мм, работающую от электросети однофазного переменного тока (рис. 7). В конструкции пр% бора различают следующие рабочие узлы: на верхней панели корпуса укреплен магазин для загрузки нескольких чашек Петри. Дно нижней чашки находится на подвижном столике, возвратно-поступательные движения которого совершаются в вертикальном и горизонтальном направлениях.

Диаметр отверстия, расположенного в основе магазина, меньше, чем крышка чашки Петри, но больше, чем диаметр ее донышка. За счет этой разницы при движении столика вниз по вертикали крышка чашки остается над отверстием верхней панели, а дно ее вводится во внутреннюю стерильную камеру, смещается в горизонтальном направлении и устанавливается под дозатором.

Стерильность камеры, в которой происходит разливка питательной среды, обеспечивается бактерицидной лампой БУФ-15, смонтированной таким образом, чтобы среда, наливаемая в чашки, не подвергалась прямому действию ультрафиолетовых лучей.

Рядом с магазином на верхней панели установлен штатив для закрепления матраца с расплавленной питательной средой. Горлышко матраца посредством резиновой прокладки герметически соединено со съемным дозатором, который представляет собой мерный стаканчик с клапаном двустороннего действия, соединенный с электромагнитным приводом.

Рис. 7. Универсальный прибор — автомат для разлива агаризнрованных ии・ тательиых сред в чашки Петри.

Под давлением чашки в момент установки ее под дозатором электромагнит срабатывает, открывая нижнее и прикрывая верхнее отверстие дозатора, вследствие чего агаровая среда в объеме, строго обусловленном камерой дозатора, выливается в чашку.

После определенной экспозиции под дозатором столик с чашкой перемещается с горизонтальной плоскости в сторону отверстия магазина, а затем вертикально вверх до уровня верхней панели так, чтобы донышко чашки вошло под свою крышку. Затем чашка Петри, заполненная питательной средой и закрытая крышкой, с помощью рычажка кривошипного механизма выталкивается на рабочий стол, с которым в одной плоскости расположена верхняя панель аппарата.

При застудневании агара образуется большое количество конденсационной воды, которая оседает на внутренней стороне крышки и увлажняет поверхность среды. Поэтому перед посевом среды подсушивают: чашку в открытом виде помещают в термостат таким образом, чтобы крышка служила опорой для края ее дна, перевернутого средой вниз. Чтобы избежать образования конденсационной влаги, чашки с расплавленным агаром тотчас после разливки накрывают стерильным листом фильтровальной бумаги, которую стерилизуют вместе с чашкой. Бумага не должна касаться поверхности среды. Когда среда совершенно остынет, фильтровальную бумагу снимают, а чашки закрывают крышками.

Стерилизация питательных сред. Стерилизацию питатель^ ных сред осуществляют различными способами в зависимости от тех ингредиентов, которые входят в их состав.

Синтетические среды и все агаровые среды, не содержащие в своем составе нативного белка и углеводов, стерилизуют 15—20 мин в автоклаве при температуре 115—120° С4

Среды с углеводами и молоком (в состав которого входит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100℃ дробно или в автоклаве при 112℃.

Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови, асцитическая жидкость), обеспложивают^ ся тиндализацией или фильтрованием.

Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией через мембранные фильтры Зейтца.

Подготовленные к употреблению питательные среды проверяют на стерильность. Для этого их ставят в термостат при температуре 37℃. Среды, простерилизованные в автоклаве, выдерживают в термостате 1 сут, простерилизованные текучим паром — 3 сут.

ТЕХНИКА ПОСЕВА, КУЛЬТИВИРОВАНИЯИ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ АЭРОБНЬХИ АНАЭРОБНЫХ МИКРОБОВ

Бактериологический метод ——выделение чистых культур микробов и их последующая идентификация ——имеет большое значение в диагностике инфекционных заболеваний, при профилактических обследованиях на носительство патогенных бактерий кишечной группы, бактерий дифтерии, при изучении санитарно-гигиенического состояния объектов внешней среды (вода, воздух, почва, продукты питания) и исследовании их по эпидемиологическим показателям на зараженность патогенными видами микробов.

Материалом для посева могут быть пересеваемые культуры бактерий, различные выделения животных и человека, ткани трупа, вода, почва, продукты питания.

Жидкий материал для посева берут петлей или пипеткой. При взятии петлей жидкость должна образовать в кольце петли тонкую прозрачную пленку — «зеркало». Пипетками пользуются в том случае, когда материал засевают в большом или точно отмеряемом объеме.

Способ взятия плотного материала определяется его консистенцией. При посевах чаще всего пользуются бактериальной петлей.

Все манипуляции, связанные с посевом и выделением микробных культур, производят над пламенем горелки. Бак-

термальную петлю прокаливают над пламенем непосредственно перед взятием материала, затем петлю остужают. Для этого при пересеве микробной культуры с пробирки горячую петлю погружают в конденсационную жидкость, а при пересеве с чашек Петри прикасаются к поверхности питательной среды, свободной от микробного роста. Достаточно остуженная петля не вызывает шипения конденсационной жидкости и не растапливает агар при соприкосновении со средой. После окончания посева петлю прожигают повторно для уничтожения находящейся на ней микробной культуры или инфицированного микроорганизмами материала.

Пипетки и шпатели используемые для посевов, так же как и бактериальные петли, перед посевом прожигают, а после посевов опускают в дезинфицирующий раствор.

После посева на чашках Петри со стороны дна, на пробирках в верхней трети надписывают название засеянного материала или ставят номер анализа и дату посева.

Тасника посевов на плотные и жидкие питательные среды.

При посеве в жидкую питательную среду петлю с находящимся на ней материалом погружают в среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый в пастеровскую или градуированную пипетку, вливают в питательную среду.

При посеве на скошенный мясо-пептонный агар пробирку берут в левую руку между I и II пальцами, чтобы основание пробирки находилось на поверхности кисти руки и посев осуществлялся под контролем глаза. Пробку из пробирки вынимают правой рукой V и IV пальцами, не прикасаясь к той части пробки, которая входит внутрь пробирки. Остальные 3 пальца правой руки остаются свободными для взятия бактериальной петли, посредством которой производится посев. Петлю держат, как писчее перо. После вынимания пробки пробирку с питательной средой держат в наклонном положении во избежание попадания в нее посторонних микроорганизмов из воздуха.

Петлю с находящимся на ней пересеваемым материалом вводят в пробирку до дна, опускают плашмя на поверхность питательной среды и скользящими движениями наносят штрих снизу вверх, от одной стенки пробирки к другой (рис. 8).

При посеве на поверхность плотной питательной среды в чашки Петри чашку держат в левой руке. Дно ее с одной стороны придерживают I и II пальцами, а с другой—IV и V пальцами. Крышку, приоткрытую настолько, чтобы в образовавшуюся щель свободно проходили петля или шпатель, фиксируют I и III или I и II пальцами (рис. 9). Небольшое

Рис. S, Схема пересева культуры микробов из пробирки в пробирку.

количество исследуемого материала втирают бактериальной петлей в поверхность питательной среды у края чашки. Затем петлю прожигают, чтобы уничтожить избыток находящегося на ней материала. Линию посева начинают с того места, в котором находится материал. Бактериальную петлю кладут плашмя на питательную среду» чтобы не поцарапать ее поверхности, и проводят штрихи по всей среде или по секторам, разграфив предварительно дно чашки (при условии, что среда прозрачна) на 4, 8 или 16 равных частей. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые петлей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева и дает возможность получить изолированные колонии микробов.

49494 ЛаСннская А. С.

49

49

Рис. 9. Посев па плотную питательную среду в чашкн Петри.

Для равномерного распределения засеваемого материала по поверхности плотной питательной среды можно пользоваться вместо петли тампоном или шпателем.

При обилии в засеваемом материале микробов они растут в виде пленки, покрывающей всю поверхность питательной среды. Такой характер микробного роста получил название сплошного, или газонного. Посев газоном производят, когда нужно получить большие количества микробной культуры одного вида.

Из материала, подлежащего посеву в толщу плотной питательной среды, готовят взвесь в стерильной водопроводной воде или в изотоническом растворе. Набирают 0,1 — 1 мл взвеси в пипетку (в зависимости от степени пр едпол аг а ем ого микробного загрязнения) и выливают в пустую стерильную чашку Петри. Вслед за этим чашку заливают 15——20 мл мясо-пептонного агара, расплавленного и остуженного до температуры 40—45 °C (при такой температуре пробирка со средой, приложенная к щеке, не должна вызывать ощущения ожога). Для равномерного распределения исследуемого материала в питательной среде закрытую чашку с содержимым слегка вращают по поверхности стола.

Посев уколом в столбик питательной среды производят в пробирку со средой, застывшей в виде столбика. Пробирку берут в левую руку, как обычно, и в центре столбика до дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней материалом.

БАКТЕРИАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ МУТНОСТИ И РАБОТА С НИМ

При некоторых микробиологических исследованиях возникает необходимость посева определенного количества микробных тел в жидкую или плотную питательную среду. В та- 50

ких случаях из микробной культуры, предназначенной для посева, пользуясь бактериальным стандартом, готовят взвесь, содержащую в единице объема (1 мл) заданное количество микробных тел.

Стандарт мутности для определения концентрации микробной взвеси, выпускаемый Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля биологических препаратов имени Л. А. Тарасевича, представляет собой взвешенные в дистиллированной воде частицы стекла «Пирекс» диаметром от 0,5 до 3,5 мкм. Взвесь этого стекла химически устойчива, не коагулирует при седиментации частиц, при взбалтывании осадка образует взвесь исходной дисперсности и мутности.

Стандарт состоит из трех запаянных пробирок-эталонов, эквивалентных по степени мутности 5, 10 и 20 международным единицам мутности. Мутность стандарта на 10 единиц соответствует следующей концентрации микроорганизмов:

850 млн./мл микробов кишечной группы

10 млрд./мл мжробов коклюшной группы

1,5 млрд, бруцеллезных микробов 2 млрд./мл холерных вибрионов 4,5 млрд./мл туляремийных микробов

К комплекту бактериальных эталонов прилагаются шрифтовая таблица, содержащая набор различных шрифтов, и две пустые пробирки, диаметр, толщина стенок и цвет стекла которых точно соответствуют пробиркам-эталонам, так как при сравнении микробной взвеси одной концентрации, содержащейся в пробирках разных диаметров, мутность жидкости будет неодинаковой.

Для приготовления микробной взвеси обычно пользуются 18—24-часовьши микробными культурами, выращенными на скошенном мясо-пептонном агаре или другой плотной среде. Старые культуры микробов непригодны, так как они содержат большое количество погибших микробных клеток. В пробирку с культурой наливают 5 мл изотонического раствора хлорида натрия и осторожно, чтобы не намочить пробку, встряхивают или вращают ее между ладонями обеих рук в одну и затем в другую сторону до тех пор, пока с поверхности агара не смоется весь налет микробного роста. Иногда приготовить смыв описанным способом не удается. Тогда пленку микробного роста предварительно снимают с поверхности среды шпателем, сделанным из пастеровской пипетки.

Небольшое количество (десятые доли миллилитра) полученного смыва набирают в стерильную градуированную пипетку емкостью 1—2 мл и переносят в стандартную пробирку или близкую к ней по диаметру и толщине стенок. Далее к содержимому этой пробирки небольшими, но точно учитываемыми порциями приливают изотонический раствор хло- 4*51

рида натрия, сравнивая при этом мутность опытной пробирки с выбранным эталоном (в качестве его рекомендуется пользоваться эталоном на 10 единиц).

Сравнение степени мутности в опытной и эталонной пробирках производят невооруженным глазом при хорошем дневном освещении в лучах падающего света, подложив под обе пробирки шрифтовую таблицу.

После уравнения мутности в опытной пробирке с эталоном мутности на 10 единиц производят с целью контроля сравнение опытной пробирки с эталоном на 5 и 20 единиц. Приготовленная взвесь должна быть более мутной, чем содержимое первого, и более прозрачной, чем содержимое второго эталона. Зная количество изотонического раствора хлорида натрия, прибавленное к определенному объему исходной микробной взвеси, можно определить число микробных тел, содержащихся в 1 мл исходной бактериальной взвесИ) и приготовить микробную взвесь любой концентрации.

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР

Чистой культурой микробов называют популяцию микроорганизмов одного вида, полученную из изолированной микробной колонии. Под микробной колонией подразумевается потомство бактерий, возникающее в результате размножения одной микробной клетки.

Выделение чистой культуры микробов является обязательным этапом всякого бактериологического исследования. Чистая культура необходима для изучения морфологических, культуральных, биохимических и антигенных свойств, по совокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма.

Для выделения чистых культур микробов из материалов, содержащих обильную смешанную микрофлору, предложено много различных методов. Наибольшее распространение получил метод механического разъединения микроорганизмов, находящихся в исследуемом материале, с целью получения изолированных колоний на поверхности или в глубине питательной среды.

Очень широко применяются элективные питательные среды, стимулирующие развитие тех микроорганизмов, чистую культуру которых предполагается выделить.

Некоторые виды микробов обладают высокой чувствительностью к воздействию определенных факторов внешней среды. Индивидуальная устойчивость микробов к тому или иному фактору -была использована для разработки методов выделения чистых культур путем умерщвления сопутствующей микрофлоры. Этим способом производится выделение споровых форм микробов, устойчивых к действию высокой темпе-

ратуры, микобактерий туберкулеза, безразличных к действию^ концентрированных растворов минеральных кислот, в отличие от остальных микробов, содержащихся в мокроте.

При выделении чистой культуры патогенных микробов из- патологического материала, загрязненного посторонней микрофлорой, прибегают иногда к заражению лабораторных животных, восприимчивых к тому виду микроба, который предполагается выделить из исследуемого материала. Биологический метод выделения чистой культуры применяется при исследовании мокроты на содержание в ней пневмококков, микобактерий туберкулеза.

Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды (по Коху). Три пробирки, содержащие по 15 мл мясопептонного агара, ставят в водяную баню для расплавления агара. Расплавленную среду остужают до температуры 43— 45 ℃. В пробирку вносят одну бактериальную петлю исследуемого материала. Для лучшего перемешивания материала со средой засеянную пробирку вращают несколько раз, зажав, между ладонями. После этого прокаленной и остуженной； петлей содержимое 1-й пробирки переносят во 2-ю и таким же образом из 2-й в З-ю. Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам пробирок.

После застудневания среды с исследуемым материалом чашки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала. '

Выделение чистой культуры по способу Дригальского- Расплавленную питательную среду разливают в три чашки Петри. Застывшую среду обязательно подсушивают, так как влажная поверхность ее способствует образованию сливающегося роста. В первую чашку вносят одну каплю исследуемого материала и стерильным шпателем втирают его в поверхность питательной среды. Далее, не прожигая шпателя- и не набирая нового материала, шпатель переносят во вторую и третью чашки, втирая в поверхность питательных сред, оставшийся на нем материал.

Метод рассева по поверхности, предложенный Дригаль- скнм, является наиболее употребительным для получения чистой культуры микробов. Вместо шпателя можно пользоваться петлей. Материал на питательной среде распределяют параллельными штрихами по всей чашке в одном направлении.. Затем, повернув чашку на 180°, проводят штрихи в направлении, перпендикулярном первым штрихам. При таком способе- посева материал, находящийся на петле, расходуется посте* пенно, и по линиям сетки, нанесенным в конце посева, вырастают изолированные колонии микробов.

Выращивание и выделение чистых культур анаэробов. По характеру дыхания все микробы делятся на аэробы и анаэробы. Аэробы для своего существования нуждаются в кислороде. Процесс дыхания у них протекает по типу окислительной реакции. Анаэробы растут и размножаются в условиях, исключающих доступ кислорода воздуха. Молекулярный кислород оказывает на них токсическое действие. Необходимую для существования энергию анаэробы получают путем расщепления органических и неорганических соединений, входящих в состав питательной среды.

Между крайними группами облигатных, т. е. строгих аэробов и анаэробов, имеются микроорганизмы, способные менять аэробный тип дыхания на анаэробный в зависимости от среды обитания. Такие микроорганизмы получили название факультативных, т. е. условных, анаэробов. К их числу относится преобладающее большинство патогенных микроорганизмов.

Для выращивания анаэробов необходимо создать определенные условия, сущность которых заключается в удалении молекулярного кислорода из питательной среды и пространстве, окружающего эти культуры. Другим обязательным условием, обеспечивающим выделение анаэробов из исследуемого материала, является внесение большого количества посевного материала в питательную среду.

Единственным отличием питательных сред, применяемых для выращивания анаэробов, служит пониженное содержание в них свободного кислорода. Самым простым способом удаления растворенного кислорода является кипячение. Непосредственно перед посевом материала пробирки с питательными средами кипятят в водяной бане в течение 10——20 мин. При кипячении из среды вытесняется воздух и, следовательно, удаляется кислород. Свежепрокипяченную питательную среду быстро охлаждают, погружая в лед или подставляя под струю холодной воды, чтобы не дать ей насытиться кислородом воздуха, и используют для посева. Для уменьшения диффузии кислорода из воздуха питательные среды заливают сверху стерильным вазелиновым или парафиновым маслом (толщина слоя 1——1,5 см). Засев среды производят пипеткой сквозь масло в наклонном положении пробирки.

В качестве редуцирующих веществ используют глюкозу, аскорбиновую кислоту, цистеин, гликокол, глютатиои. Активно связываются с кислородом животные ткани паренхиматозных органов. На этом свойстве животных клеток основано приготовление питательной среды Китта——Тароцци (рец. 113), широко применяемой для выращивания анаэробов. В жидкие питательные Среды помещают иногда пористые вещества: вату, пемзу, которые адсорбируют на своей поверхности пузырьки воздуха.

Для создания бескислородных условий используют ф и- зические, химические и биологические факторы.

Физические способы культивирования анаэробов. 1. Способ В инья л я—В е й о н а. Берут 4—5 пробирок с 0,5% расплавленным и охлажденным до температуры 40—45℃ сахарным агаром (рец. 114). В содержимое одной из них вносят пипеткой небольшое количество исследуемого материала и тщательно размешивают. Для уменьшения концентрации материала с целью получения изолированных колоний засеянную среду в количестве, соответствующем объему внесенного материала, переносят из 1-й пробирки во 2-ю, из 2-й в 3-ю. Затем содержимым каждой пробирки заполняют капилляры трех пастеровских пипеток.

Чтобы предупредить застывание питательной среды в момент насасывания ее в пипетки, кончик их, пока он не обломан, погружают на 3—5 мин в стерильную воду температуры 45——50 ℃. После заполнения вытянутый конец трубки запаивают и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2—3 сут в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов. Выросшие колонии легко изолировать. Для этого капилляр надрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию микроба, находящуюся в агаре, извлекают петлей и пересевают в свежую питательную среду.

Выращивание анаэробов в условиях в а- к у у м а. Вакуумные условия для выращивания анаэробов создают в анаэростате или эксикаторе. Исследуемый материал или культуру микробов засевают в пробирки с жидкой средой или в чашки Петри с плотной питательной средой. Посевы помещают в анаэростат, затем присоединяют его к насосу и выкачивают воздух. Степень разреженности воздуха определяют по показаниям вакуумметра. Колонии анаэробов в вакуумных условиях растут на поверхности плотной питательной среды.

Химические методы выращивания анаэробов (метод Ари- стовского). Материал, исследуемый на наличие анаэробов, засевают на среду в чашки Петри и помещают их в эксикатор, на дно которого кладут химический поглотитель кислорода: гидросульфит натрия или пирогаллол. В расширенную часть сосуда устанавливают на подставке чашки с посевами. Прибор помещают в термостат при температуре 37 ℃ на 24—48 ч.

Биологический метод выращивания анаэробов (по Фортнеру). В чашку Петри наливают толстым слоем 5% кровяной агар с 1—2% глюкозы. Посередине чашки в питательной среде вырезают стерильным скальпелем канавку шириной 1—1,5 см, которая делит питательную среду на две полови-

шы. Одну из них засевают культурой анаэробов или исследуемым на их наличие материалом, другую половину—культурой аэробов: чудесной палочкой (Serratia marcescens) или кишечной палочкой (Е. coli). Перед посевом чашки подсушивают в термостате, чтобы аэробы вместе с капельками влаги •не могли попасть на другую сторону чашки. Засеянные чашки закрывают, а свободное пространство между дном и ■крышкой заклеивают лейкопластырем, чтобы предупредить поступление в чашку кислорода извне. В термостате чашки устанавливают вверх дном. Быстрорастущие аэробы, поглощая находящийся в чашке кислород, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробов.

Анаэростат для культивирования анаэробов. Анаэростат — прибор для выращивания микробов в анаэробных условиях —представляет собой толстостенный металлический щилиндр с герметически привинчивающейся крышкой, на которой имеются вакуумметр и два крана для присоединения к ^вакуум-насосу.

МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ СВОЙСТВ МИКРОБОВ

Культуральные признаки микробов определяются харак* тером роста их на питательных средах. Будучи постоянными .для каждого вида микроба, они являются важным диагностическим признаком.

Рост микробов на плотной питательной среде. Для изучения свойств колоний микробы культивируют на плотных питательных средах в чашках Петри. При посеве материала ^стараются получить изолированный рост колоний. Чашки с посевом просматривают сначала невооруженным глазом или -через лупу, затем помещают их на столик микроскопа вверх 「дном и просматривают колонии в проходящем свете с объективом малого увеличения и с суженной диафрагмой.

Колонии характеризуют по величине, форме, контуру .края, рельефу, поверхности, цвету, структуре и консистенции.

Величина колонии определяется ее диаметром. В зависимости от диаметра различают колонии точечные (диаметр меньше 1 мм), мелкие (диаметр 1—2 мм), средние (диаметр 2—4 мм) и крупные (диаметр 4—6 мм и более).

Форма колонии бывает правильная ——круглая, неправильная ——амебовидная, ризоидная — корневидная, напоминающая переплетающиеся корни деревьев.

Характер контур а края определяют при рассмотрении колонии под лупой или микроскопом с малым увеличе- &инем. Различают ровные края в виде четко выраженной линии и неровные. Последние делят на:

фестончатый край, состоящий из крупных, слегка округлых или уплощенных зубцов правильной формы;

волнистый край, который несколько отличается от фестончатого тем, что крупные зубцы его выражены нечетко;

эрозированный, илн зазубренный, край, состоящий н^ острых зубцов различной величины и формы;

бахромчатый край, имеющий нежные ворсинки.

В некоторых случаях четко выраженная линия, отграничивающая колонию от поверхности среды, отсутствует. Такой край колонии называется расплывчатым.

Рельеф колонии характеризуется приподнятостью ее над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Определяется рельеф колонии невооруженным глазом или с лупой при рассматривании сверху и сбоку. Различают:

каплеобразные и куполообразные колонии правильной круглой формы с различно выраженной степенью выпуклости, которые в вертикальном разрезе представляют собой сегмент шара и отличаются только длиной радиуса. Колонии слабовыпуклые имеют большую длину радиуса; куполообразные —меньшую;

колонии плоско-выпуклые с плоским верхом, пологими или круто обрывающимися краями; имеют в вертикальном разрезе форму трапеции;、

колонии конусообразные, имеющие в вертикальном разрезе форму треугольника;

колонии с приподнятой в виде соска серединой и валиком по периферии;

колонии с вдавленным центром;

колонии плоские, стелющиеся по поверхности среды.

Поверхность колонии изучают с помощью лупы или под микроскопом при малом увеличении. Поверхность колоний бывает матовая или блестящая с глянцем, сухая или влажная, гладкая или шероховатая. Гладкие колонии обозначают буквой S (smooth), шероховатые ——буквой R (rough)r что означает соответственно «гладкий» и «шероховатый». Механизм формирования гладких и шероховатых форм колоний обусловлен различием процессов клеточного деления. Микробные клетки в колониях S-форм располагаются, соприкасаясь своими боковыми поверхностями, клетки R-форм, сохраняя при делении цитоплазматические мостики, образуют цепочки, которые, накладываясь друг на друга, обусловливают шероховатую поверхность и неровный край колонии.

Переход S-форм в R-формы наблюдается при диссоциации. Явление диссоциации у патогенных микробов наблюдается под действием антибиотико- и химиотерапии, факторов специфического иммунитета, формирующихся в течение инфекционного процесса, а также при попадании микроба в» внешнюю среду.

Среди шероховатых форм колоний различают: складчатые, гирозные, по виду напоминающие исчерченную извилинами поверхность мозга; бородавчатые, концентрически или радиально исчерченные; шагреневые, т. е. мелкозернистые.

Цвет колонии определяется пигментом, который продуцирует культура микробов. Преобладающее большинство патогенных бактерий пигмента не образует, вследствие чего колонии их бесцветны или молочно-мутного цвета, похожи на опал. В проходящем свете такие колонии в большей или меньшей степени прозрачны. Пигментообразующие виды микробов дают колонии различных цветов: кремовые, желтые, золотисто-оранжевые, синие, красные, сиреневые, черные и др.

Структур а колоний определяется в проходящем свете при слабом увеличении микроскопа, суженной диафрагме или при несколько опущенном конденсоре. У пигментированных колоний и колоний, не пропускающих света, она не определяется.

По характеру структуры различают следующие виды колоний:

гиалиновые — бесцветные, прозрачные, без видимой определенной структуры;

зернистые, которые в зависимости от величины зерен разделяются на мелко- и грубозернистые;

нитевидные или волокнистые, характеризующиеся наличием длинных, густо переплетающихся нитей в толще колонии.

Колонии бывают однородные и неоднородные. Строение первых одинаково во всех частях, у вторых центральная часть отличается от периферической или отдельные сектора имеют строение, неодинаковое с остальной массой.

Консистенцию колонии, определяющую ее физическое состояние, исследуют посредством прикосновения или взятия из нее части материала бактериальной петлей.

По характеру консистенции колонии бывают:

пастообразные, легко снимающиеся и размывающиеся по поверхности питательной среды наподобие сливочного масла;

вязкие или слизистые, прилипающие и тянущиеся за петлей;

волокнистые или кожистые, плотные, снимающиеся с поверхности питательной среды в виде упругой пленки, соответствующей величине и форме колонии;

хрупкие, сухие, рассыпающиеся при прикосновении петли.

Особенности микробного роста на жидких питательных средах. На жидких питательных средах характер роста микробов менее разнообразен, чем на плотных питательных сре- 58

дах. Однако и здесь выявлены следующие формы роста бак« терий.

Рост бактерий с равномерным помутне^ нием среды, цвет которой остается неизмененным или из, меняется в соответствии с цветом водорастворимого пигмента, образующегося в культуре микроба. Такой рост харак， терен для многих патогенных бактерий, относящихся к груп^ пе факультативных анаэробов.

П р и донный рост бактерий характеризуется образованием осадка на дне пробирки с жидкой питательной средой. Осадок может быть скудным или обильным, крошковидным, гомогенным, волокнистым или в виде крупных рыхлых хлопьев, по консистенции вязким, слизистым, хрупким или пастообразным. Питательная среда над осадком может быть прозрачной или мутной. Цвет осадка и среды, находящейся над ним, определяется наличием пигмента, продуцируемого, культурой микробов. Если культура пигмента не образует, цвет среды не изменяется, а осадок приобретает, как правя- ло, серовато-белый или желтоватый цвет. Придонный рост специфичен для бактерий с анаэробным типом дыхания.

Пристеночный рост бактерий выражается в том,, что питательная среда, находящаяся в пробирке, остается совершенно прозрачной. Бактерии растут, образуя более или менее крупные рыхлые хлопья или, наоборот, компактные зерна, прикрепленные к внутренней поверхности стенок со-, суда, с которых в зависимости от вида бактерий снимаются легко или с трудом.

Поверхностный рост бактерий характеризуется появлением на поверхности жидкой питательной среды пленки, внешний вид и характер которой могут быть раз-, личны:

пленка тонкая, нежная, бесцветная, имеет вид едва заметного налета, исчезающего при встряхивании пробирки, и взбалтывании среды;

пленка влажная, толстая, хорошо видимая простым, глазом, вязкой, слизистой консистенции, прилипает к петле- и тянется за ней;

пленка плотная, сухая, внешним видом напоминает ку-, сочки кожи и при попытке взятия из нес материала сни-. мается целиком в виде круглого диска, соответствующего, диаметру пробирки:

пленка плотная, сухая, со сморщенной, а иногда боро-. давчатой поверхностью, краями прикрепленная к стенкам со-. суда; при взбалтывании жидкости или прикосновении бактериальной петли разбивается на кусочки, погружающиеся вглубь жидкости.

Цвет пленки, как и питательной среды, зависит от пигмент та, вырабатываемого растущей культурой микробов. Рост-

бактерий в виде поверхностной пленки характерен для мик- робов-аэрофилов.

Рост на полужидкой питательной среде. Для выявления особенностей микробного роста на полужидкой питательной среде исследуемую культуру засевают в столбик 0,2—0,5% полужидкого агара. Для того чтобы особенности роста проявлялись наиболее четко, прокол среды делают в непосредственной близости к стенке пробирки. Посев, произведенный таким образом, дает возможность выявить подвижные расы микробов идифференцировать их от неподвижных.

Подвижные микробы в столбике полужидкого агара вызывают выраженное помутнение, распространяющееся более или менее равномерно по всей толщине среды.

Неподвижные формы микробов растут только по ходу прокола среды, напоминая сосульки цилиндрической или конической формы. При этом окружающая среда остается совершенно прозрачной.

БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МИКРОБОВ

И МЕТОДЫ ИХ ИЗУЧЕНИЯ

В жизнедеятельности микробов ферменты играют большую роль. Они являются обязательными участниками разнообразных биохимических реакций, лежащих в основе функций питания, дыхания, размножения. По характеру связи с цитоплазменными структурами и по месту проявления своего действия ферменты делятся на внутри- и внеклеточные. Каждый вид микроорганизмов продуцирует постоянный для него набор ферментов, одни из которых расщепляют в разной степени белки и углеводы, а другие вызывают окисление и восстановление различных субстратов.

Стабильность ферментативных систем бактерий позволяет использовать биохимические свойства бактерий в сочетании с их морфологическими, культуральными и другими постоянными признаками для определения видов и типов бактерий.

Для обнаружения ферментов исследуемую культуру микробов засевают на специальные дифференциально-диагностические питательные среды (с. 37).

Сахаролитические ферменты микробов. Свойство расщеплять углеводы и высокоатомные спирты, которые принято объединять в одну группу, именуемую сахарами, присуще многим патогенным микробам. Под действием сахаролитических ферментов бактерий сахара расщепляются на альдегиды и кислоты. Конечными продуктами их расщепления являются газообразные вещества: СО2 и Нз.

Характерно, что различные виды и даже разновидности микробов относятся по-разному к одним и тем же сахарам.

Так, например, одни бактерии, ферментируя лактозу, остаются нейтральными в отношении глюкозы, другие, наоборот, сбраживают глюкозу, а третьи, наиболее активные, вызывают расщепление и глюкозы, и лактозы.

Для обнаружения сахаролитических ферментов исследуемую культуру бактерий засевают в питательные среды Гис- са, называемые также «пестрым» рядом. «Пестрый» ряд Гисса содержит обычно 5 пробирок: с глюкозой, лактозой, маннитом, мальтозой и сахарозой. При некоторых исследованиях для более углубленного изучения биохимических свойств выделенного микроба ряд Гисса дополняют дульцитом, сорбитом, ксилозой, арабинозой и некоторыми другими сахарами.

Название «пестрый» ряд обусловлено тем, что под действием ферментов микроба одни углеводы остаются неизменными и, следовательно, цвет питательной среды не меняется, в то время как другие сахара расщепляются, образуя кислые продукты распада, которые изменяют цвет индикатора и соответственно цвет питательной среды.

Среды Гисса бывают жидкими и полужидкими (с добавлением 0,2—0,5% агар-агара). В пробирки с жидкими средами Гисса для обнаружения газов, являющихся конечными продуктами распада сахаров, опускают «поплавок» — трубочку диаметром 0,5—0,7 см, запаянную с одного конца. «Поплавок» помещают запаянным концом кверху; при стерилизации он полностью заполняется питательной средой. При образовании в среде газообразных продуктов они вытесняют часть жидкости, находящейся в «поплавке», вследствие чего у запаянного конца его собирается воздушный пузырек.

Для выявления газообразных продуктов, образующихся в жидкой среде при культивировании микроорганизмов, Я. 3. Зимин (1969) вместо «поплавков» предложил пользоваться поролоновой губкой. Ее нарезают кубиками такой величины, чтобы, находясь в пробирке, они не касались ее стенок. Кусочки поролона опускают в питательную среду до ее стерилизации. При автоклавировании пузырьки газа из пор губки вытесняются паром и после остывания заполняются питательной средой, в связи с чем губка опускается на дно пробирки. Если в среде, засеянной микроорганизмами, образуется газ, он задерживается в порах губки и она всплывает на поверхность среды. При этом： сквозь полупрозрачную ткань поролона хорошо видны образующиеся пузырьки газа.

В полужидких средах Гисса газообразование определяют по наличию мелких пузырьков газа в толще среды и стойкой пены на ее поверхности.

Таким образом, при изучении сахаролитических ферментов, выделяемых микробами, учитывают не только явления расщепления тех ил0 ・ннх сахаров по кислотообразованию»

но и глубину ферментативного процесса по наличию в питательной среде конечных газообразных продуктов.

Пробирки с набором сред Гисса ставят в штатив в один ряд. На каждой пробирке надписывают название сахара, содержащегося в среде. На первой пробирке каждого ряда, кроме названия сахара, указывают номер или вид исследуемой микробной культуры. Культуру берут на кончик петли в очень небольшом количестве и засевают по общепринятой методике (с. 48).

Протеолитические ферменты микробов. Некоторые виды микроорганизмов продуцируют и выделяют во внешнюю среду протеолитические ферменты — протеазы, катализирующие расщепление белков. В результате расщепления молекулы белка образуются высокомолекулярные промежуточные продукты распада — пептоны, альбумозы и полипептиды. Под действием других протеолитических ферментов пептоны в свою очередь расщепляются на полипептиды (соединения двух или нескольких аминокислот) и отдельные аминокислоты.

Для выявления протеолитических ферментов исследуемую культуру микроба засевают в питательную среду, содержащую тот или иной белок. Чаще всего для этой цели применяют желатин, реже ——свёрнутую лошадиную сыворотку, коагулированный яичный белок, молоко или кусочки вареного мяса. 、

Протеолитическая активность одного и того же микроба при определении ее на разных питательных средах будет проявляться неодинаково, что обусловлено специфичностью ферментов. Поэтому для разных видов микробов рекомендуют питательные среды различного состава.

Определение протеолитической активности микробов, а) Н а желатине. Мясо-пептонный желатин (рец. 50) разливают в пробирки столбиком по 5— 6 мл. Посев производят уколом, погружая петлю с исследуемой культурой в глубь питательной среды до дна пробирки. Микробы, способные расти при низкой температуре, оставляют стоять в комнате при 20——22 ℃. Остальные посевы инкубируют в термостате при 37 ℃. Вместе с опытными пробирками в термостат ставят одну или две пробирки с незасеянным желатином для контроля. При температуре 37 ℃ желатин плавится, поэтому после инкубации пробирки, вынутые из термостата, опускают в холодную воду или ставят в холодильник. После застудневания желатина в контрольных пробирках приступают к просмотру роста и учету изменений в питательной среде опытных пробирок. Там, где под действием фермента желатиназы произошло расщепление белков желатина, отмечается разжижение питательной среды. Пробирки, в которых после суточного инкубирования сре-

да остается без изменения, оставляют в термостате. Наблюдение за изменением среды ведется в течение 20 сут. В протоколе исследования обязательно отмечают день появления признаков разжижения среды, степень и характер ее разжижения.

Н а м<о л о ч н о м агаре Э й к м а н а. Молочный агар Эйкмана (рец. 51), разлитый и остуженный в чашках Петри, засевают исследуемой культурой микробов. Посев делают петлей или шпателем так, чтобы получить изолированные колонии. Через 24—48 ч инкубации в т^мостате культуры, продуцирующие протеолитический фермент, обусловливают пептонизацию молочного белка — казеина, в результате чего вокруг таких колоний образуются прозрачные зоны, четко выделяющиеся на общем молочно-мутном фоне среды.

На свернутой кровяной сыворотке. Культуру исследуемых аэробных микробов засевают на чашки, анаэробных — уколом в столбик свернутой лошадиной сыворотки (рец. 52), инкубируют в термостате при 37 ℃. Штаммы, продуцирующие протеолитические ферменты, разжижая питательную среду, образуют углубления вокруг колоний или на поверхности столбика среды.

В бульоне с куриным яичным белком. В пробирку с мясо-пептонным бульоном или бульоном Хот- тингера, содержащим кусочек свернутого куриного белка (рец. 53), вносят одну петлю исследуемой культуры микроба. Посевы просматривают ежедневно в течение 5 дней. Протео- литически активные культуры микробов расщепляют коагулированный яичный белок; кусочки белка, содержавшиеся в среде, заметно уменьшаются в размере, превращаясь в крошкообразную массу, или полностью растворяются.

Аналогичным образом проявляются протеолитические свойства микробов в средах с кусочком вареного мяса.

Некоторые виды патогенных микробов с выраженной протеолитической активностью обладают способностью расщеплять белок и пептон до продуктов глубокого распада: и н д ола, сероводорода, мочевины и аммиака.

При определении видов и дифференциации разновидностей патогенных микробов наибольшее значение имеет выявление двух первых продуктов: индола и сероводорода.

Определение индола в культуре микроорганизмов. Индол образуется при расщеплении сложной гетероциклической кислоты — триптофана. Для выявления индолообразования петлю исследуемой культуры засевают в среду Строгова (рец. 54) или другие среды, рекомендуемые для обнаружения индола (рец. 55). Тотчас после посева в пробирку вносят полоску индикаторной бумаги, пропитанную раствором щавелевой кислоты (рец. 31), так, чтобы индикаторная бумага не касалась питательной среды. Для этого

верхнюю треть бумажной полоски прижимают пробкой к стенке пробирки. Посевы инкубируют 24—48 ч при температуре 37 ℃. Образование индола определяют по окрашиванию нижнего конца индикаторной бумаги в бледно-розовый цвет, хорошо заметный в проходящем свете.

Определение сероводорода. Сероводород является конечным продуктом расщепления аминокислот: цистина» цистеина и метионина, содержащих серу. Петлю исследуемой культуры микробов засевают в пробирку с мясопептонным бульоном или бульоном Хоттингера. Тотчас после посева в пробирку вносят пропитанную ацетатом свинца полоску индикаторной бумаги на определение сероводорода (рец. 30, с. 349). В положительных случаях образующийся в культуре сероводород вступает в соединение с бесцветным ацетатом свинца и превращается в сульфат свинца, который придает индикаторной бумаге черно-бурое окрашивание.

Окончательный учет результатов на образование индола и сероводорода проводят на 7—10-й день после посева, так как процесс ферментативного расщепления белка и образования конечных продуктов распада происходит иногда в течение длительного времени.

Окислительно-восстановительные ферменты. В культуре микробов могут быть обнаружены окислительно-восстановительные ферменты, связанные главным образом с дыхательной функцией микроорганизма.

Как известно, процесс окисления субстрата может происходить посредством присоединения к нему кислорода с участием ферментов оксидаз или в результате отщепления от него водорода с участием ферментов дегидраз. Для этого типа реакции характерно то, что окисление какого-либо одного вещества всегда сопровождается восстановлением (редукцией) другого органического вещества. Первое вещество, от которого отщепляется водород, называют донатором, а то вещество, к которому он присоединяется, — акцептором.

Акцептором водорода чаще всего является кислород воздуха, однако им могут быть также многие органические соединения, способные легко окисляться и восстанавливаться.

С целью выявления ферментов дегидраз и определения их активности в практике микробиологических исследований предложен метод, основанный на введении в питательную среду органической краски, выполняющей роль акцептора водорода. В результате присоединения водорода краситель восстанавливается, превращаясь в бесцветное соединение, называемое лейкобазой. При обильном доступе кислорода оно может вновь окислиться и приобрести прежний цвет.

В качестве акцептора водорода используют метиленовый синий, лакмусовую настойку, малахитовый зеленый, индигокармин, нейтральный красный и др.

Для выявления редуцирующих свойств микроба указанные красители добавляют к обычным питательным средам: мясо-пептонному бульону, мясо-пептонному агару, молоку.

Один и тот же вид микроба ведет себя неодинаково по отношению к краскам разного состава. Это свойство микроба использовано в микробиологической практике в качестве дифференциального признака. Бактерии брюшного тифа редуцируют метиленовый синий, но не редуцируют лакмуса и не изменяют нейтрального красного в противоположность кишечной палочке, которая остается нейтральной в отношении метиленового синего, но восстанавливает лакмус и нейтральный красный.

Определение редуцирующей способности.

В 5 мл среды ——молока е метиленовым синим (рец. 48) — засевают петлю исследуемой культуры с плотной питательной среды или 0,1 мл 18-часовой бульонной культуры м после 24 ч инкубации учитывают результаты роста. При положительной реакции на редукцию метиленового синего среда из голубой становится кремового цвета, а при слабоположительной——приобретает зеленоватое окрашивание.

Пробирки с лакмусовым молоком, средой Минкевича (рец. 49) засевают так же, как молоко с метиленовым синим, суточной культурой -с плотной или жидкой питательной среды. Посевы инкубируют в термостате в течение 10 дней, ежедневно наблюдая за изменением цвета среды. Редукция лакмуса проявляется полным обесцвечиванием молока, имеющего розовато-сиреневый цвет до посева. В протоколе исследования редукцию лакмуса обозначают буквой Р.

Среда Минкевича позволяет также выявлять кислото- или щелочеобразование, выражающееся соответственно в покраснении или посинении молочной среды. Образование кислоты обозначается буквой К, щелочи — буквой Щ.

Определение ферм ента каталазы. Некоторые виды микроорганизмов, принадлежащие к группе аэробов, в процессе дыхания образуют переюись водорода, являющуюся клеточным ядом. Количество перекиси водорода в культуре никогда не достигает высоких концентраций, так как по мере образования перекись расщепляется на воду и молекулярный кислород прм участии фермента каталазы. На поверхность микробной культуры, выращенной на плотной питательной среде в чашке Петри, наносят 1—2 мл 1 % раствора перекиси водорода так, чтобы она покрывала поверхность культуры тонким слоем. Появление пузырьков газа в слое нанесенной жидкости свидетельствует об образовании кислорода в результате расщепления перекиси водорода под действием каталазы. Подобный результат в протоколе опыта отмечается знаком + как положительный результат реакции на каталазу.

6565Лабинская А. С

65

65

МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МИКРОБНОГО АНТАГОНИЗМАИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ К АНТИБИОТИКАМ

Явления антагонизма в мире микробов распространены очень широко. Антагонистические взаимоотношения проявляются в невозможности совместного существования некоторых микробных видов вследствие того, что одни из пих препятствуют размножению других, задерживая или вызывая их гибель. Так, например, установлено, что представители нормальной микрофлоры человеческого тела проявляют антагонизм в отношении многих патогенных и гнилостных бактерий.-

Изучение явлений микробного антагонизма привело к открытию специфических антибактериальных веществ, продуцируемых бактериями и грибами в окружающую среду. Они получили наавание антибиотиков (от греч. anti — против и bios — жизнь).

В настоящее время существует много антибиотиков, выделенных из бактерий, грибов и актиномицетов. Однако практическое применение в качестве лечебных препаратов нашли только немногие из них.

Каждый антибиотик действует на определенные чувствительные к нему виды бактерий.

Рациональная антибиотикотерапия инфекционных заболеваний основывается на результатах бактериологической диагностики заболевания с выделением и идентификацией возбудителя. При этом очень важно располагать сведениями о чувствительности возбудителя болезни к антибактериальному препарату, избранному для лечения.

В клинической практике чувствительными к антибиотикам считаются те микроорганизмы, на которые испытуемый антибиотик в концентрации, достигаемой в очаге инфекции, оказывает бактериостатическое или бактерицидное действие. При лабораторном испытании мерой чувствительности микроорганизмов к антибиотикам является минимальная концентрация препарата, подавляющая рост возбудителя заболевания при стандартных условиях постановки опыта.

Деление микроорганизмов на устойчивые и чувствительные осуществляется на основании соотношения минимальной ингибирующей рост микроорганизмов концентрации препарата (определенной в лабораторных условиях) и концентрации этого же препарата, создаваемой в очаге инфекции при введении терапевтических доз. Пр*и соотношении:

МИК (минимальная ингибирующая концентрация антнбнотика) К (концентрация^ препарата в очаге инфекции) ]

можно говорить о чувствительности возбудителя к исследуемому антибиотику.

По степени чувствительности к антибиотикам патогенные микроорганизмы подразделяются на 4 группы:

.1) чувствител ьн ы е ——обычные терапевтические дозы антибиотиков оказываются достаточными для достижения лечебного эффекта при общих заболеваниях;

среднечувствительные ——лечебный эффект препарата при общих заболеваниях достигается только в результате назначения повышенных доз антибиотиков;

умеренно устойчивые ——лечебный эффект достигается только при локализации инфекционного очага в месте, где происходит концентрация антибиотика, или если антибиотик может быть введен непосредственно в очаг инфекции;

устойчив ы е ——лечебный эффект при назначении антибиотика отсутствует.

Определение чувствительности возбудителя имеет особенно большое значение при выборе антибактериальных препаратов для лечения больных с хроническими, затяжными, вялыми формами инфекции, которые сопровождаются угнетением иммунологической реактивности макроорганизма.

Изучение чувствительности возбудителя к антибиотикам играет не менее важную роль в тех 'случаях, когда для лечения больных используются препараты, в отношении которых легко формируются устойчивые формы микроорганизмов (стрептомицин, тетрациклин, рифампицин и др.).

В настоящее время предложены критерии чувствительности микроорганизмов только для некоторых антибиотиков (табл. 5).

Культуры микробов для исследования на чувствительность следует выделять из организма больных до начала лечения, так как под воздействием назначаемых антибактериальных препаратов рост возбудителей заболевания может быть полностью угнетен.

Материал для Посева рекомендуется брать из очага инфекции непосредственно, а в тех случаях, когда это невыполнимо, из соответствующего отделяемого (моча при пиелонефрите, мокрота при воспалительных процессах в легких и т. Д.).

При обнаружении в патологическом материале нескольких видов условно-патогенных микроорганизмов необходимо установить, какой из них является ведущим в происхождении текущего инфекционного процесса. В решении этого вопроса большое вспомогательное значение имеют методы количественного учета микроорганизмов, так как преобладание, в патологическом материале какого-либо одного вида микробов свидетельствует, как правило, о причастности его к этио- лопии данного патологического процесса.

Классификация микроорганизмов по степени чувствительности к антибиотикам (МИК в мкг/мл или ЕД/мл)

Группа микроорганизмов

Днтибиотик

I

II

1П

IV

чувствитель- иые

среднечувствительные

умеренно устойчивые

устойчивые

Пенициллин

0,25

16

128

128

Пенициллин

0,25

4

128

128

Метициллин+

2

X

X

X

Амлицнллин+

0,25

16

128

128

Карбенециллии

X

16

128

128

Цефалоспорины

2

16

128

128

Стрептомиц|ин+

4

X

128

128

Кана-м<ицин+

4

X

128

128

Неомицин4"

4

128

128

Г ентамицин

0,5

64

64

Левомицетин+

1

X

X

Препараты тетрацик-

1

64

64

липового ряда Эритромицин

1

4

64

65

Линкомицин+

Примечание. + означает, что критерии чувствительности относятся ко всем лекарственным формам названного антибиотика, х — группа не установлена.

Если выяснение истинного возбудителя болезни не удается или патологический процесс вызван микробной ассоциацией, чувствительность к антибиотикам необходимо исследовать раздельно у всех видов микроорганизмов (входящих в состав ассоциации), выделенных в чистой культуре.

Чувствительность микробов к антибиотикам определяется методом диффузии в агар с применением стандартных бумажных дисков или методом разведения в жидюих и плотных питательных средах.

Определение чувствительности микробов к антибиотикам методом диффузии в агар с применением дисков. Стандартные диски, выпускаемые отечественной промышленностью (Московский завод медицинских препаратов № 2), представляют собой кружки диаметром 5 мм, приготовленные из определенных сортов фильтровальной бумаги и пропитанные ан- тибиотнкам1и такой 'концентрации, которая обусловливает одинаковый диаметр зон задержки роста (28—32 мм) чувствительных тест-микробов. Для удобства работы диски с различными антибиотиками окрашивают в контрастные цвета (желтый, зеленый, голубой, сиреневый м др.). Метод диффузии в агар для определения чувствительности микробов к антибиотикам вследствие простоты и доступности выполнения в настоящее время используется всеми практическими лабо-

раториями. Соблюдение стандартных условий при постановке опытов способствует получению более точных результатов, обеспечивая тем самым возможность их сопоставления.

Техника постановки опыта. Стерильные чашки Петри диаметром 100 мм устанавливают на строго горизонтальную поверхность, наливают в них 2% мясо-пептонный агар (pH 7,2——7,4) в количестве 20 мл для создания оптимальной толщины слоя, равной 4——5 мм. Для тех видов микробов, которые не растут на мясо-пептонном агаре, как, например, стрептококки, пневмококки и др., применяют 5% кровяной или сывороточный агар. Перед посевом чашки со средой подсушивают в термостате для лучшей диффузии засеваемого материала в питательную среду.

Для засева чашек используют чаще всего 18—20-часовые (при интенсивном росте 4—5-часовые, при замедленном росте 2——3-суточные) бульонные и агаровые культуры микробов. Из агаровых культур готовят микробную взвесь, содержащую 1 млрд, микробных тел в 1 мл.

На поверхность подсушенной среды наносят исследуемую культуру микробов в объеме 1 мл. Посредством покачивания чашки культуру равномерно распределяют по поверхности среды с последующим отсасыванием избытка жидкости пипеткой. Засеянные чашки 30——40 мнн подсушивают при комнатной температуре, затем на поверхность засеянной и подсушенной среды с помощью стерильного остроконечного пинцета кладут диски, прочитанные разными антибиотиками. Каждый диск слегка прижимают браншами пинцета, чтобы ■он плотно прилегал к поверхности агара. Диски должны находиться на равном расстоянии друг от друга % на расстоянии 2—2,5 см от края чашки. Каждая чашка может служить для одновременного испытания штамма к действию 5— 8 антибиотиков. Засеянные чашки с нанесенными на них дисками на 18 ч помещают в термостат при 37 ℃ вверх дном» чтобы избежать попадания конденсационной воды на поверхность посевов.

Антибиотическое вещество, находящееся в диске, диффундирует в агар, формируя вокруг диска зону угнетения роста чувствительных к нему бактерий. Провес диффузии антибиотика в агар заканчивается через 3—4 ч после нанесения диска. Наибольшая концентрация антибиотика отмечается в месте расположения диска; по направлению к периферии содержание его снижается.

Бактерии, чувствительные к антибиотикам, образуют вокруг соответствующих дисков зоны угнетения роста, четко выделяющиеся на фоне сплошного микробного роста. Измерение зоны угнетения производят с помощью циркуля или миллиметровой линейки. Измеряемый диаметр зоны должен проходить через центр диска.

При зоне задержки роста микроба диаметром до 10 мт штамм расценивается как малочувствительный, зона задержки микробного роста более 10 мм свидетельствует о чувствительности штамма к исследуемому антибиотику.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений. Сущность данного метода сводится к выявлению роста исследуемой микробной культуры в ряду пробирок с питательной средой, содержащей разные концентрации антибиотиков.

Метод серийных разведений позволяет определить минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост изучаемого микроорганизма.

Техника постановки опыта относительно проста.

Из порошка антибиотика (желательно стандарта) делают навеску и растворяют стерильной дистиллированной водой из такого расчета, чтобы в 1 мл раствора содержалось 2000 мкг/ЕД. Некоторые антибиотики в указанной концентрации в воде не растворяются, для этого нужно специальные растворители.

Например, антибиотики группы тетрациклина (хлортетра- циклин, террамицин) растворяют в 0,01 N растворе соляной кислоты. Для растворения левомицетина и синтомицина применяют 96% этиловый спирт (0,3 мл спирта на 1 мг антибиотика), а для эритромицина ——химически чистый метиловый спирт (0,1 мл спирта на 1 мг препарата). После полного растворения антиб|иотиков в спирте приливают дистиллированную воду из такого расчета, чтобы общий объем растворителя равнялся 1 мл на 200 мкг препарата.

Из полученного основного раствора готовят все последующие разведения антибиотиков, руководствуясь табл. 6. Диапазон серии разведений определяется установленными критериями чувствительности микроба. Для приготовления основного раствора антибиотика и добавления его в первую* пробирку рекомендуется пользоваться отдельной стерильной пипеткой. В дальнейшем отдельные пипетки используются для каждой группы разведений (пробирки 2, 3, 4; пробирки 5, 6, 7 и т. д.), Полученные растворы антибиотиков разливают в стерильные пробирки по 1 мл. Для этой цели может быть использована одна пипетка при условии, что разливка антибиотиков по пробиркам будет осуществляться от меньших к большим концентрациям раствора.

Для разведения антибиотиков служат стандартные питательные среды (мясо-пептопный бульон, бульон на переваре Хоттингера, pH 7,2——7,4), обеспечивающие оптимальные усло-

,вия роста исследуемого вида и не содержащие веществ, подавляющих действие антибиотиков.

В приготовленные разведения антибиотика вносят бульонные культуры микроорганизмов в логарифмической или ранней стационарной фазе роста. Для большинства патогенных микроорганизмов этот период 'соответствует 16—18 ч; для некоторых видов, рост которых замедлен, — 48 ч культивирования. В соответствии с действующим приказом № 250 от 13 марта 1975 г.《06 унификации методов определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам» вместо бульонных культур допускается использование агаровых культур, которые разводят бульоном и стандартизируют до содержания 105—106 микробных тел в 1 мл. Бульонную культуру или взвесь агаровой культуры исследуемых бактерий в бульоне добавляют в объеме 1 мл к каждому разведению антибиотика. При этом концентрация -антибиотика в пробирке становится в 2 раза ниже. Все ряды пробирок включают по одной контрольной пробирке, содержащей 1 мл бульона без антибиотика и 1 мл культуры каждого испытываемого штамма.

После внесения микробной культуры штатив с пробирками помещают в термостат при 37 ℃ на 16—20 ч. По истечении указанного срока инкубации учитывают полученные результаты, отмечая последнюю пробирку с отчетливо видимой задержкой микробного роста. Количество антибиотика в этой пробирке представляет собой минимальную ингибирующую концентрацию для испытываемого штамма, определяющую степень чувствительности его к данному антибиотику.

Определение содержания антибиотиков в жидкостях и тканях организма методом серийных разведений. Эффективность действия антибиотиков при лечении инфекционных заболеваний определяется не только чувствительностью микробов к применяемому препарату, но и той концентрацией его, которая создается в организме в процеосе проводимой антибио- тикотерапии.

Среди методов определения содержания антибиотиков в жидкостях и тканях организма особого внимания заслуживает метод серийных разведений Флеминга, модифицированный 3. В. Ермольевой и Е. А. Ведьминой.

Техника постановки опыта. Необходимые ингредиенты:

сыворотка крови (или другая жидкость), исследуемая на концентрацию содержащегося в ней антибиотика;

питательная среда Гисса (pH 7,2) с глюкозой и индикатором Андреде (рец. 44);

раствор антибиотиков-стандартов;

стандартная взвесь тест-микроба.

Схема приготовления разведений антибиотиков для метода серийных разведении

№ пробирки

Приготовление разведений антибиотиков

Концентрация антибиотиков в полученном растворе, ЕД/мл или мкг/мл

Окончательная концентрация антибиотика в ыкг/мл или

ЕД/мл в смеси 1 мл раствора антибиотиков и 1 мл инокулята в бульоне

раствор антибиотика, мл

концентрация раствора антибиотика, мкг/мл

объем добавляемого

бульона, мл

1

|2

2000

13,62

256小飞

128

2

2

256

128 ^

3

1

256

64

4

；1

256

32

5

2

32

16

6

1

32

8

7

1

32

4

8

2

4

2

9

1

4

1 '

0,5

1

4

0,5

0,25

2

0,5

0,25

0,125

1

0,5

0,1253

0,063

1

1

0,5 0,063

2 г

0,063j о,оз"

0,031

0,016

Для определения концентрации пенициллина, антибиотиков тетрациклинового ряда -и эритромицина в качестве тест- микроба используют культуру золотистого стафилококка- (штаМ'М Р-209).

В штатив устанавливают два ряда стерильных пробирок (10 в первом и 9 во втором ряду). Первый ряд пробирок предназначен для разведения стандарта-антибиотика, второй—для разредения сыворотки (или другой жидкости), исследуемой на концентрацию содержащегося в ней антибиотика. Неизвестная активность антибиотика (содержащегося в пробирках второго ряда) сопоставляется со стандартом того же антибиотика (пробирки первого ряда), активность которого известна в каждой пробирке ряда.

В пробирки обоих рядов разливают по 0,5 мл среды Гис- са, зараженной культурой золотистого стафилоккока (штамм Р-209), из расчета 1000 микробных тел на 1 мл питательной- среды. В 1-ю пробирку первого ряда прибавляют 0,5 мл раствора соответствующего антибиотика-стандарта с заведомо известным количеством единиц в 1 мл. Содержимое пробирки тщательно перемешивают, после чего 0,5 мл переносят из 1-й пробирки во 2-ю, из 2-й в 3-ю и т. д. до 9-й пробирки включительно. Последняя, 10-я, пробирка, являющаяся контролем роста стафилококка, антибиотика не содержит.

К содержимому 1-й пробирки второго ряда лрибавляюг 0,5 Мл (исследуемой сыворотки. Как и в предыдущем случае,.

содержимое пробирки тщательно перемешивают, после чего 6,5 мл из 1-й пробирки переносят во 2-ю, -из 2-й ——в 3-ю и т. д. до 9-й пробирки включительно. Из последней пробирки лишние 0,5 мл выливают в банку с дезинфицирующим раствором. В результате получается ряд последовательных двукратных разведений исследуемой сыворотки (1:2, 1:4, 1:8, 1:16... 1:512). Штативы с пробирками етавят в термостат при 37 ℃ на 16—18 ч, затем учитывают полученные результаты.

Рост стафилококка сопровождается не только помутнением, но и окрашиванием среды в розовый цвет вследствие сбраживания глюкозы и смещения pH в кислую зону. Концентрация антибиотика в исследуемой жидкости, выраженная в единицах на 1 мл, определяется умножением наибольшего разведения исследуемой сыворотки, задерживающего рост тест-микроба (последняя пробирка с прозрачной средой, не изменившей своей окраски, во втором ряду пробирок), на минимальную концентрацию стандарта-антибиотика, задерживающую рост того же тест-м(икроба в первом ряду пробирок.

МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СВОЙСТВ БАКТЕРИОФАГАИ ЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИОФАГИИ

В 1917 г. французский ученый д'Эрелль отметил, что фильтрат испражнений человека, выздоравливающего после дизентерии, обладает способностью вызывать просветление бульонной культуры одноименных бактерий. Просветление микробной взвеси было обусловлено лизисом, т. е. растворением находящихся в ней микробных клеток.

Агент, вызывающий растворение микробных клеток, д'Эрелль назвал бактериофагом, а явление в целом — феноменом бактериофагии, что в дословном переводе означает ■«пожирание бактерий》. \

При дальнейшем изучении оказалось, что бактериофаг представляет собой разновидность вирусов, вызывающих поражение и гибель бактер-ий. Как и все вирусы, бактериофа- ти ведут паразитический образ жизни, хозяевами их являются ^бактерии. Размножение бактериофага возможно только в живых клетках, находящихся в стадии деления. В процессе размножения фагов были выявлены последовательные этапы: 1) адсорбция 'частиц фага на поверхности микробной клетки; 2) проникновение фага в микробную клетку； 3) образование внутри бактериальной клетки фаговых частиц; 4) лизис клетки ；н освобождение активных частиц фага.

Период от момента инфицирования клетки бактериофагом и началом ее лизиса называется латентным. Продолжительность латентного периода у одних фагов исчисляется минутами, у других — часами. Количество корпускул, образую-

щихся в теле микробной клетки, может колебаться от нескольких десятков до несколько сотен.

При некоторых условиях бактериофаг, проникая в микробную клетку, включается в геном клетки и существует в-* ней, не вызывая лизиса. Такой 'симбиоз микробной клетки с фагом получил название лизогении, а культуры, которые содержат фаг, не лизируясь, были названы лизогенными. Следовательно, лизогенные культурн устойчивы к фагу, который они несут. Соответственно фаги, находящиеся в лизогенных бактериях, получили название умеренных в отличие от фагов в и р у л е н т н ы х, которые вызывают лизис культуры микробных клеток и освобождение размножающегося фага.

Связь, имеющаяся между фагом и лизогенной культурой» стойко передается по наследству.

В настоящее время доказано существование огромного количества фагов, каждый из которых паразитирует в определенном виде бактерий.

Специфичность различных фагов выражена неодинаково: одни из них лизируют культуры микробов определенного вида (моновалентные фаги), другие ——только отдельные штаммы или варианты внутри одного и того же микроба (типовые фаги), третьи, так называемые поливалентные фаги, вы- ,зывают лизис клеток различных родственных видов микробов. В практике микробиологии специфичность моновалентных фагов используют для определения видов микробов, выделяемых из патологического материала и объектов внешней среды. Резко выраженные избирательные свойства типовых фагов позволяют разделить микробов одного и того же вида на различные ф а г о т и п ы. В естественных условиях фаго- тип бактерий характеризуется большой стабильностью. Например, при обследовашш больных было установлено, что на протяжении всего заболевания из организма обследуемых высеваются культуры -микробов одного и того же типа. В результате длительного хранения и частых пассажей на искусственных питательных средах фаготип микроба также не изменялся.

ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИОФАГА ИЗ ПАТОЛОГИЧЕСКОГОМАТЕРИАЛА И ОБЪЕКТОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ

Как отмечено выше, фагу присущи резко выраженные па- разит1ические .свойства, обусловливающие возможность существования и размножения его только в культурах соответствующего вида микроба. На этом основании присутствие- бактериофага можно рассматривать как косвенный показатель загрязненности исследуемого материала соответствующей микрофлорой. Оггределейные фаги можно искать там” где обитают -их хозяева — микробы.

В практике микробиологии обнаружение бактериофага ^производят в том случае, когда выделение культуры мпкр。- “6а не дает положительных результатов, например вследствие чрезмерно малого количества этих микробов в исследуемом -субстрате или сильного загрязнения его посторонней микро- 'флорой.

В настоящее время разработаны различные методы каче- •ственного обнаружения фага в исследуемом материале. В основу всех методов положен феномен бактериофагии л'Зрелля, для проявления которого исследуемый материал засевают совместно с гомологической культурой микробов на плотные и жидкие питательные среды. Культуры >микро- ■бов, чувствительные к выделяемому бактериофагу, принято называть тест-культурами.

Прямой метод выделения бактериофага из исследуемого материала. Исследуемую жидкость фильтруют от микробов. Твердый исследуемый материал (образцы почвы, пищевые продукты, оформленные испражнения) предварительно измельчают в ступке, эмульгируют, ■фильтруют вначале через бумажный, а затем через бактериальный фильтр. Наличие фага в полученном фильтрате определяют в жидких питательных средах или на плотных средах по методу Отто или Грациа (см. с. 76).

Выделение бактериофага методом обогащения «без подсева». Исследуемый материал засевают в жидкую питательную среду, являющуюся наиболее полноценной для развития тех микроорганизмав, против которых ищут бактериофаг. Посевы ставят в термостат и инкубируют .при оптимальной температуре 18——20 ч. По истечении указанного срока сосуды с посевами вынимают из термостата и фильтруют предварительно через бумажный, а затем через бактериальный фильтр. \

Полученные фильтраты испытывают на присутствие в них -бактериофага на плотных и жидких питательных средах.

В основу этого метода положен принцип создания наиболее благоприятных условий для размножения находящихся в исследуемом материале бактерий и соответствующего им ^бактериофага, который предполагается выделить.

Выделение бактериофага м етодо м обогащения 《с подсевом». Жидкий исследуемый материал непосредственно, а плотный после предварительного измельчения -в ступке засевают в <мясо-пептонный бульон или другую жидкую -питательную среду. Одновременно с исследуемым материалом в питательную среду вносят 0,5—1 мл суточной бульонной культуры бактерий, гомологичных выде- .ляемому фагу. Для контроля культуру бактерий, применяемую для обогащения, засевают в стерильную питательную

-среду.

Сосуды с посевами ставят в термостат при 37 ℃ на 18— 24 я. После инкубадии из опытной и контрольной пробирок берут по нескольку миллилитров жидкости и фильтруют отдельно через бактериальные фильтры. Полученный фильтрат исследуют на присутствие бактериофага, гомологичного бактериям, примененным для обогащения.

Сущность данного метода заключается в предварительном обогащении исследуемого материала клетками того микроорганизма, к которому ищут бактериофаг. Бактерии, внесенные в исследуемый материал, начинают размножаться^ и вместе с ними увеличивается количество фага.

КАЧЕСТВЕННЫЕ ПРОБЫ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯБАКТЕРИОФАГА В ЖИДКИХ И НА ПЛОТНЫХПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ

О бнаружение бактериофага в жидкой питательной среде. Два сосуда (пробирки или колбы) с питательными средами засевают одной и той же культурой микроба, гомологичной искомому фагу. Одновременно с посевом или после 3—4-часового >инкубирования в термостате а один из сосудов (опытный) вносят фильтрат исследуемога материала. Второй сосуд, содержащий питательную среду, засеянную культурой микробов, является контролем. Оба сосуда ставят в термостат при 37 ℃ и через 24 ч учитывают результаты.

При учете результатов (по Уварову) возможны следующие варианты.

Содержимое опытного сосуда прозрачно, в контроле — помутнение питательной среды. Полученные данные указывают на содержание в исследуемом фильтрате бактериофага^ высокой активности.•

В опытном сосуде имеется менее выраженное по сравнению с контролем помутнение среды. Эго^свидетельствует о содержании в исследуемом материале бактериофага средней активности.

При одинаковом помутнении в обоих сосудах для окончательного заключения об отсутствии бактериофага необходимо произвести дополнительное исследование: высев на плотную питательную среду содержимого опытной и контрольной пробирок. Высев делают на среду в чашки Петри шпателем, чтобы получить сплошной рост микробов. Чашки ставят в термостат и после 24 ч инкубирования при 37 ℃ учитывают результаты. Посев из контрольного сосуда дает сплошной рост микробов. При наличии фага в исследуемом материале на фоне сплошного роста микробов появляются： стерильные пятна — колонии бактериофага.

Обнаружение бактериофага н а плотных питательных средах по методу Отт а. Мясо-пептон- 76

ный агар 1,5% разливают в чашки Петри (более высокая концентрация агара угнетает развитие негативных колоний бактериофага). После застудневания питательную среду засевают 16—18-часовой бульонной культурой бактерий, гомологичных искомому фагу. Для получения сплошного роста 2—3 капли культуры, нанесенные в центре чашки, растирают шпателем равномерно по всей ее площади. Спустя 5——10 мин после посева на подсушенную поверхность питательной среды наносят каплями исследуемый фильтрат. На одной чашке можно поставить несколько проб. Для этого по дну чашки намечают разделение питательной среды на секторы и в каждый сектор вносят по капле фильтрата. После того как жидкость впитается в среду, чашки перевертывают вверх дном и ставят в термостат при 37 ℃ на 18—24 ч.

Учет результатов: доказательством наличия бактериофага служит полное отсутствие роста культуры в месте попадания капли фильтрата (активный бактериофаг) или появление в этом участке мелких стерильных пятен — колоний бактериофага (бактериофаг слабой активности).

Обнаружение ^бактериофага н а плотных питательных средах двухслойным методом Грация. Мясо-пептонный агар 1,5% разливают в чашки Петри в количестве 25—30 мл (первый слой). После застудневания среды чашки ставят на Р/г——2 ч для подсыхания. В пробирку с 2,5 мл 0,7% расплавленного и остуженного до температуры 45 ℃ агара вносят 1 мл исследуемого фильтрата и 0,1 мл густого смыва суточной агаровой культуры, соответствующей искомому фагу. Содержимое пробирок быстро перемешивают, чтобы не произошло застудневания агара, и выливают в ту же чашку вторым слоем. После застуднева- \ ния агара посев ставят в термостат при 37 ℃. Учет результатов, как правило, возможен через 5—8 ч инкубации в термостате. Присутствие бактериофага определяют по наличию прозрачных пятен, хорошо видимых на матовом фоне глубинного роста бактерий.

ТИТРОВАНИЕ БАКТЕРИОФАГА

После выявления бактериофага в исследуемом материале необходимо определить его количественное содержание или, как 'Принято говорить, найти титр фага.

Для выражения титра бактериофага можно пользоваться двумя показателям'и: количеством активных корпускул бактериофага, содержащихся в 1 мл исследуемой жидкости бактериофага, или величиной наибольшего разведения исследуе-, мой жидкости, при котором бактериофаг проявляет свое литическое действие. Полученную при этом величину выражают отрицательным логарифмом 10, где степень указывает разве： дение фага. Средний титр бактериофага составляет Ю-7.

Для титрования бактериофага предложены различные методы, однако наибольшее распространение получили способ титрования фага в жидкой питательной среде, предложенный Аппельманом, и метод агаровых слоев Грациа.

Титрование бактериофага в жидкой питательной среде по методу Лппельмана. Метод Аппельмана основан на внесении различных количеств титруемого бактериофага в бульон, засеянный одной и той же дозой культуры гомологичных микробов, с целью получения феномена бактериофагии.

Двенадцать пробирок, содержащ1их по 4,5 мл мясо-пептонного бульона, ставят в штатив в один ряд. В 1-ю пробирку стерильной пипеткой вносят 0,5 мл исследуемого фага. Содержимое пробирки перемешивают и 0,5 мл жидкости из 1-й пробирки переносят во 2-ю, из 2-й — в 3-ю и т. д. до 10-й включ1ительно. Из 10-й пробирки лишние 0,5 мл выливают; 11-я и 12-я пробирки контрольные. Переносят жидкость из одной пробирки в другую каждый раз отдельной стерильной пипеткой емкостью 1 мл. Таким образом, в 10 пробирках получают разведения бактериофага от 1 : 10 до 1 : 10-10.

Во все 10 пробирок приготовленного ряда разведений вносят по 0,2 мл 18—24-часовой бульонной культуры бактерий, одноименных титруемому фагу. Прибавляемая культура не должна 'содержать устойчивых к фагу клеток.

Густота микробной взвеои, прибавляемой в пробирки с титруемым бактериофагам, существенного значения не имеет, так как опытным путем (Л. Д. Переметана) было установлено, что изменение микробной концентрации в пределах 100 000—4 500 000 в 1 мл не оказывает заметного влияния на исход титрования бактериофага. Пробирка 11-я ——контроль культуры, содержит 5 мл бульона и 0,2 мл бульонной культуры микробов. Пробирка 12-я — контроль на стерильность, содержит 5 мл бульона без добавления культуры и фага. Штатив с пробирками помещают в термостат\при 37 °C на 18—20 ч.

Учет результатов производят через 18——20 ч после инкубации в термостате при 37℃. Титром считают то максимальное разведение бактериофага, при котором наблюдается полный лизис чувствительной к нему культуры. Практически это соответствует той последней пробирке в ряду, в которой бульон еще остается совершенно прозрачным.

Титрование бактериоф ага н а плотной п и- тательной среде по методу агаровых слоев Грациа. Метод агаровых слоев Грациа основан на внесении различных разведений титруемого бактериофага в со-

ответствующую культуру бактерий и посеве смеси на плотную питательную среду с целью получения негативных колоний бактериофага.

Накануне постановки опыта готовят питательные среды. В чашки Петри разливают 1,5% мясо-пептонный агар в количестве 25——30 мл. Для подавления роста воздушной микрофлоры к расплавленному агару перед разливкой прибавляют 0,004% спиртовой раствор генцианового фиолетового из расчета 0,1 мл краски на каждые 100 мл мясо-иептонного агара. Агар покрывают стерильной фильтровальной бумагой и подсушивают 30 мин в термостате ил<и 2—3 ч при комнатной температуре, после чего закрывают крышкой и оставляют на ночь в комнате.

Подготовленный агар должен быть совершенно сухим, так как даже незначительное увлажнение может изменить количественные показатели содержания корпускул фага в исследуемой жидкости.

Мясо-пептонный агар 0,7%, разлитый в пробирки по 2,5 мл и простерилизованный в них, может быть приготовлен за несколько дней до постановки опыта. Количество чашек Петри, как и пробирок с 0,7% мясо-пептонным агаром, должно соответствовать числу пробирок с разведением фага.

В день постановки опыта из жидкости, содержащей титруемый фаг, готовят в пробирках ряд последовательных десятикратных разведений (так же, как при титровании фага на жидких средах по методу Аппельмана). Для разведений фага можно пользоваться стерильным бульоном или изотоническим раствором хлорида натрия.

Затем в пробирки с 0,7% мясо-пептонным агаром, расплавленным в водяной бане и остуженным до температуры 44—46 ℃, приливают по 1 -мл разведений титруемого фага. Одновременно с фагом в каждую пробирку вносят по 0,1 мл одноименной чувствительной к фагу культуры. Содержимое пробирок перемешивают, быстро вращая пробирки между ладонями, и выливают вторым слоем в чашюи с 1,5% агаром. После остывания среды чашки с посевом переносят в термостат при 37 ℃.

Учет результатов производят после 5—7 ч инкубации посевов в термостате, подсчитывая количество стерильных пятен на 2——3 чашках, засеянных фагом с наиболее высоким раз'веден!нем. Из этих данных выводят среднее арифметическое число колоний и полученную величину умножают на степень максимального разведения. Например:

разведение фага 110~6 92 колонии

》 》10-7 61 КОЛОНИЯ

》 》10-8 27 колоний

Среднее число колоний бактериофага на чашке —60. Титр исследуемого бактериофага равен: 60 X JO-8.

ФАГОТИПАЖ БАКТЕРИЙ И МЕТОДЫ ФАГОТИПИРОВАНИЯ

Специфические бактериофаги являются очень точными индикаторами, определяющими видовую и типовую принадлежность бактерий. Поэтому они нашли широкое применение для идентификации бактерий, выделяемых из организма больного и инфицированных объектов внешней среды.

В настоящее время наиболее полно и тщательно разработаны методы фа го ди агностики стафилококков и бактерий брюшного тифа и паратифов. По отношению к микробам тифо-паратифозной группы найдены фаги, >с помощью которых можно с большой точностью определять виды бактерий и четко разграничивать определенное количество типов в пределах этих видов.

Технмка фаготипирован)ия микробов п о м о- дифилированном у методу Креджн и Йенсена. В основу фаготипирования положен принцип совместного выращивания типируемой культуры с типовым бактериофагом. Наступление лизиса является индикаторным признаком, определяющим типовую принадлежность бактерий.

Для фаготипирования бактерий рекомендуется -применять хорошо подсушенный 1,5% мясо-пептонный агар с 5% глицерина.

Суточную агаровую культуру исследуемого штамма отсевают на бульон и помещают в термостат при 37 ℃. С появлением заметного роста культуру набирают в пастеровскую пипетку с тонко оттянутым капилляром и наносят небольшими каплями на поверхность хорошо подсушенной питательной среды. Расположение капель на поверхности агара можно наметать заранее. С этой целью на поверхности -среды донышком стерильной бактериальной пробирки делают вмятины в виде лунок. Таким образом не только намечают места будущих капель наносимой культуры,悔。и предотвращают растекание их по поверхности среды. Количество капель должно соответствовать числу типовых фагов плюс 1 капля для контроля роста культуры. Каплям культуры дают возможность впитаться, для чего требуется 3——10 мин. Затем на поверхность каждой капли наносят эксцентрично по 1 капле типового фага с таким расчетом, чтобы часть культуры оставалась свободной от воздействия бактериофага. Сектор, оставшийся свободным от воздействия бактериофага, является контролем роста культуры. Пр.и постановке опыта для каждого типа бактериофага берут отдельную пипетку. Типовой бактериофаг применяют в критическом тест-разве- дении, т. е. в наибольшем разведении, при котором исследуемый бактериофаг вызывает на плотной питательной среде.яв- ный лизис культуры гомологичного фаготипа и не лизирует культуры других гетерологических типов. После того как 80

бактериофаг впитается в питательную среду, чашки с посевом помещают в термостат при 37 °C. Через 6—8 ч производят учет результатов фаготипирования. Непрерывное 6-часовое инкубирование чашек в термостате можно заменить^ 2-часовой инкубацией, после которой чашки переносят в хо-' лодильник, а на следующий день их снова на 3—4 ч помещают в термостат и затем учитывают результаты.

Наличие хорошо выраженного лизиса исследуемой культуры с одним из типовых фагов указывает на принадлежность культуры к данному фаготипу. Появление выраженных признаков лизиса одновременно в нескольких каплях указывает на то, что степень разведения типовых фагов, взятых в опыт, недостаточна. В этих случаях опыт следует повторить с большими разведениями бактериофагов.

Учет фаготипирования производят как в проходящем, так и в падающем свете. Интенсивность лизиса отмечают с помощью' четырехкрестной системы.

ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ИНФЕКЦИЯ

Методы исследования, связанные с применением животных, называются биологическими, или экспериментальными, а используемые для этой цели животные ——экспериментальными, или лабораторными. Наиболее широко в микробиологических лабораториях используют кроликов, морских свинок, белых мышей и крыс. 、

Лабораторные животные являются донорами, у которых' систематически берут кровь для получения сыворотки, плазмы, эритроц-итов, лейкоцитов, необходемых при постановке многих серологических реакций и для приготовления кровяных питательных сред. Лабораторные животные служат также для диагностики некоторых инфекционных заболеваний, моделирования экспериментальных острых и хронических инфекционных процессов, установления вирулентности и токси- генности изучаемых штаммов микробов, определения активности приготовленных вакцин и исследован-ия их на безвредность.

СОДЕРЖАНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ И УХОД ЗА НИМИ

Помещение для содержания лабораторных животных, используемых в экспериментальных целях, называется виварием (от лат. vivas ——живой). В структуру вивария входят:

отделение для карантинирования 玄 адаптации вновь поступивших животных;

экспериментально-биологическая клиника для содер^ жания животных, находящихся в опыте; .

6 Лабинская А. С. 、 8*

изоляторы для подозрительных на инфекционные заболевания и заведомо больных животных; уничтожение которых по условиям эксперимента нежелательно;

экспериментальное помещение (или манипуляционная), в котором осуществляются взвешивание, термометрия， заражение, вакцинация животных, взятие у них крови и некоторые другие процедуры.

Оборудование экспериментального ломегцения определяется в каждом конкретном случае задачами и условиями проводимых научных исследований.

Карантинное отделение, отделение для подопытных и изолятор для инфицированных животных размещаются в помещениях, строго изолированных одно от другого и от всех остальных помещений вивария.

Кроме основных перечисленных выше структурных единиц, в составе вивария должны находиться: а) кормокухня——(из двух смежных помещений для переработки и изготовления кормов с самостоятельными выходами в коридор из каждого помещения, кладовая со специально оборудованными ларями (металлическими или обитыми внутри жестью) и хо л од и льни к а м и для хранения запаса кормов, б) дезинфекционно-моечное отделение из 2 комнат, объединенных переходным автоклавом или сухожаровой камерой.

Работа дезинфекционно-моечного отделения определяется состоянием материала, поступающего на обработку. Инфицированный 'матер1иал, налример клетки, подстилки, кормушки, вначале дезинфицируют, а затем подвергают механической чистке и мойке. Материал, не представляющий опасности для заражения, вначале подлежит механической очистке, а затем (при необходимости) стерилизации.

Моечное помещение в правильно организованном виварии имеет мусоропровод для удаления нечистот и грузоподъемник для доставки в виварий материала и оборудования.

Рядом с дезинфекционно-моечным отделением размещаются склад чистого (запасного) инвентаря с клетками, поилками, кормушками и т. тт., бытовые помещения и санитарный блок (душевая к туалет) для обслуживающего персонала.

В соответствии с существующими санитарными правилами виварий размещается в отдельно расположенном здании или на верхнем этаже лабораторного корпуса. При размещении вивария в лабораторном корпусе он должен быть полностью изолирован от всех других помещений.

Помещение для содержания лабораторных животных должно быть теплым, светлым и сухим с центральным отоп-

леннем, естественным и искусственным освещением, принудительной приточно-вытяжной вентиляцией, подводкой горячей и холодной воды.

ла, без плинтусов,ла, без плинтусов,Полы в виварии делают из водонепроницаемого материа-

ла, без плинтусов,

ла, без плинтусов,

■с уклоном к отверстиям или желобам,

присоединенньгм к каналнзацИ1И. Стенки покрывают глазурованной плиткой, потолки и двери окрашивают масляной краской.

Правила пополнения вивария новыми животными. Пополнение вивария новыми лабораторными животными проводят из государственных специализированных питомников в сопровождении ветеринарного свидетельства, удостоверяющего, что животные поступают из хозяйства, благополучного по инфекционным заболеваниям, и клинически здоровы. Животных принимают в чистые, заранее продезинфицированные клетки, размещают в карантинном отделении сроком на 3 дня для адаптации к новым условиям. В период карантина за животными ведется регулярное клиническое наблюдение с ежедневной термометрией и регистрац|ией общего состояния в специальном журнале по приводимой ниже форме.

Журнал регистрации поступления и распределения лабораторных животных в экспериментально-бнологнческой клинике (виварии)

Дата поступления

Вид животных

Пол

Масса тела, возраст

Поставщик

Распределение (№ клетки)

Наблюдение во время карантина

Дата окончания карантнна

Кому выданы животные

Для животных, полученных не из государственных питомников, устанавл-иваются -следующие сроки карантинирования: для мышей и крыс——14 дней, для морских свинок и кроликов—21 день.

В целях предупреждения заноса и распространения инфекции в виварии уход и наблюдение за животными, находящимися в карантине, осуществляются персоналом, закрепленным за данным отделением. По этим же соображениям заггрещается выносить из карантинного отделения в другие помещения вивария корма, спецодежду и инвентарь.

Чистка и мойка 1посуды, клеток и другого инвентаря из карантинного помещения производится в общем дезинфекционно-моечном отделении вивария только после предварительного обеззараживания. Методы дезинфекции в каждом конкретном случае определяются соответственно специфике работы учреждения.

В случае появления в карантинном отделении подозрения на инфекционное заболевание животные подвергаются 6* 83

бактериологическому обследованию. При подтверждении инфекции вся поступившая партия животных уничтожается.

При возникновении массовых заболеваний среди животных, находящихся в карантине, или при обнаружении в период экспериментов отдельных случаев инфекционных заболеваний, особо опасных для лабораторных животных, в виварии проводится необходимый комплекс профилактических мероприятий. В этих случаях опыты на животных временно прекращаются.

Правила содержания экспериментальных животных в виварии. По истечении карантинного срока животных переводят в экспериментальную секцию. Мышей, крыс, морских свинок и кроликов содержат в клетках, установленных на металлических стеллажах. Грызуны .содержатся в клетках со сплошным дном на подстилке или с сетчатым дном-полом. Подстилочным материалом могут служить древесные опилки, стружка, волокнистый торф, мягкая солома. Подстилки заранее автоклавируют или дезинфицируют в сухожаровой печи при температуре 150——180 ℃ в течение 15—20 мин. При размещении животных по клеткам следует исходить из приводимых ниже нормативов (табл. 7).

Таблица 7

Нормы площади для содержания лабораторных животных

Вид животных

Минимальная пло1цадь дна клетки на одно животное, СМ2

Максимально допустимое число животных в клетке

Число животных на 1 м2 площади пола помещения

Мыши

40

15

65 взрослых или 240 молод-

няка

Крысы

150

10

20 взрослых или 400 молод-

/ няка.

Морские свинки

300

5

/5—18

Кролижи

2000

1 /

3—4

Примечание. Для примерного определения производственной площади следует исходить нз расчета, что 1 см2 площади дна клетки должен приходиться на 1 г массы животного. Стеллажи размещаются в основном вдоль стен и должны занимать примерно 0,4 м производственной площади.

В каждом отдельном помещении вивария рекомендуется содержать только один вид животных. Если по условиям эксперимента в одной секции совместно содержатся животные разных видов, размещать их следует на разных стеллажах. На каждой клетке с животными вывешивают паспорта, образец которого приводится ниже.

На клетках подопытных животных, которые могут явиться источником заражения человека, укрепляют паспорта яркого цвета. Животные, наиболее опасные в смысле возмож-

Образец этикетки (паспорта)

Отделение (лаборатория)

Клетка № …

Вид, линия, пол животных

Возраст...

Дата поступления

(фамилия экспериментатора)

Начало эксперимента

Окончание экспери

мента

Особые отметки

ности заражения окружающих, содержатся в изоляторе в металлических клетках или стеклянных банках в металлической оправе.

При уходе за животными, зараженными особо опасными инфекциями, персонал должен надевать два халата, резиновый фартук, нарукавниюн, резиновые перчатки, маску и галоши.

В заразное помещение разрешается входить только рабочим, обслуживающим животных, и научно-техническим сотрудникам, участвующим в опыте.

Трупы животных, погибших в ходе эксперимента, до вскрытия хранятся в специальном холодильнике (не более суток). Вскрытие животных производится экспериментатором. В случае гибели животного вне зависимости от опыта на вскрытии присутствует представитель вивария. Каждый ■случай падежа или вынужденного забоя животных фиксируется в специальном журнале по приводимой ниже 觐рМе.

Журнал регистрации павших или вынужденно забитых животных

Дата

Вцд животных

Секция животных

Предполагаемый диагноз

Результат вскрытия

Кто производил вскрытие

Результат экспертизы

После вскрытия трупы заразных животных сжигают под. контролем ответственного лица, выделенного администрацией, трупы незаряженных животных сдают утильзаводу в во* донепроницаемых металлических ящиках с обязательным оформлением соответствующей документации.

Работа по уходу и содержанию лабораторных животных строится в соответствии с распорядком дня и регламентом работы, утвержденным руководителем учреждения. В распорядке дня предусматривается время на'санитарную обработку помещения и оборудования, раздачу кормов и прове* дение экспериментальных работ и манипуляций.

Уборка и дезинфекция вивария. Уборку вивария производят ежедневно в утренние часы, придерживаясь определенной последовательности. Начинают с осмотра животных, выявляя заболевших и погибших. Из клеток вынимают кормушки и поилки. Пол каждой клетки чистят веннком и металлическим скребком. Находящиеся в клетках кал, остатки пищи соскабливают в совок, сбрасывают в металлический ■бак с плотно закрывающейся крышкой. После чистки каждой клетки скребок обеззараживают, погружая его на несколько минут ъ банку с дезинфицирующим раствором (карболовая кислота или лизол). Вынутые из клеток кормушки и поилки моют горячей водой с зольным щелоком или содой, а затем обдают кипятком. Переставлять кормушки и поилки из одной клетки в другую нельзя.

Очистив клетки, служитель вивария приступает к уборке помещения вивария: протирает пол, стены и подоконники горячей водой с мыльно-карболовым раствором, 1% раствором хлорамина или другим дезинфицирующим веществом.

Для поддержания чистоты и предупреждения заноса инфекции у входа в каждую комнату вивария кладут плотную мешковину, натянутую на лист железа. Один или 2 раза в день -мешковину смачивают 3—5% раствором лизола или карболовой кислоты.

Работу, связанную с уборкой клеток и помещения, служители вивария производят в специальной одежде: халате, фартуке, косынке и резиновых перчатках.

Периодически, примерно один раз в 1%—2 нед, клетки животных моют горячей водой и дезинфицируют 5% раствором карболовой кислоты или горячим зольным щелоком или прожигают пламенем паяльной лампы в целях профилактики инфекционных паразитарных заболеваний и размножения насекомых.

В период текущей дезинфекции животных пересаживают в чистые, заранее продезинфицированные клетки с подготовленными подстилками, кормушками И поилками. Освобождающиеся ：при этом клетки передают для дезинфекции и обработки в дезинфекционно-моечное отделение. Чистка, дезинфекция, мойка клеток, кормушек и поилок производятся рабочими, специально закрепленными за дезинфекционномоечным отделением.

По окончании уборки весь собранный в виварии мусор (кал, остатки пищи, опилки, сено, солома и т. д.) сжигают или утилизируют, согласуй этот вопрос в каждом конкрет- ним случае с местными органами и учреждениями СЭС.

При работе с инфицированным материалом производится обязательное обеззараживание отходов автоклавированием или обработкой дезинфицирующими веществами. По возможности весь собранный в виварии мусор сжигают в печи

с дополнительным бункером, исключающим разбрасывание- близ топки заразного материала.

Правила личной гигиены работников вивария. Каждый работник вивария обеспечивается персональной спецодеждой, спецобувыо, полотенцем и мылом. В его распоряжении находится индивидуальный шкаф с двумя отделениями. Одно из них предназначается для хранения в течение рабочего дня домашней одежды и обуви, которые работник вивария обязан снимать, приходя на работу; в другом отделении во внерабочее время находится спецодежда. Индивидуальные- шкафы периодически, не реже одного раза в месяц, дезинфицируются.

По окончанш! каждого этапа работы, а также перед приемом пищи работники вивария должны обязательно мыть- и дезинфицировать руки. Для этого в каждой секции вивария около раковины умывальника на полках находятся бутыли с дезинфицирующими растворами (2% раствор лизола или хлорамина). После дезинфекции руки протирают вазелином или детским кремом, чтобы предупредить появление трещин на коже.

По окончании работы персонал вмварня обязан пройти обработку в санитарном блоке (принять душ или ванну).

Все лица, 'принимаемые на работу с лабораторными животными, проходят медицинское обследование, включающее исследование на носительство возбудителей туберкулеза и всей группы кишечных инфекций. В дальнейшем обследования производятся периодичеоки, не реже одного раза в год. Больные туберкулезом, кожными и другими заразными заболеваниями к работе в виварии не допускаются. При проведении на животных экспериментов с возбудителями, опасными для людей, обслуживающий персонал вивария подвергается профилактической иммунизации.

Для всех принимаемых в виварий сотрудников проводится инструктаж по вопросам охраны труда, и техники безопасности, правилам внутреннего распорядка в зависимости- от выполняемой работы. Ответственность за проведение инструктажа возлагается на заведующего виварием.

Правила кормления лабораторных животных. В экспериментальных исследованиях правильное содержание и кормление лабораторных животных как до, так и во время опыта- имеет очень большое значение.

Нарушение режима и рациона ：питания, несоблюдение гигиенических мероприятий при кормлении способствуют ослаб* лению организма животных и повышен-ию их восприимчивости к различным инфекционным и соматическим заболеваниям. Возникновение их в течение опыта может привести к искажению результатов исследования и, следовательно, к неправильным заключениям.

Лабораторных животных рекомендуется кормить 2—3 раза в сутки в строго установленные часы, распределяя суточный рацион так, чтобы разные виды кормов чередовались в течение дня.

Основным видом питания лабораторных животных (грызунов) являются зерна злаковых, 'масличных и бобовых культур： овес, пшеница, просо, ячмень, кукуруза, горох, семена подсолнечника, льна, конопли. Семена злаковых и масличных культур дают в натуральном виде, кукурузу и бобовые культуры ——дроблеными. Во избежание заражения животных зерновую смесь перед употреблением подвергают стерилизации в автоклаве при температуре 105 ℃ или в сухожаровой печи в течение 30 мин. Наряду с зернами и семенами используются продукты их переработки: крупа, мука, отруби, жмых. Перед употреблением отруби и ж!мых увлажняют или смешивают с вареным картофелем. В рацион кроликов, особенно молодняка, вводить отруби не рекомендуется, так как они способствуют развитию у ннх кокцидий.

В последнее время для кормления лабораторных грызунов применяют выпускаемые промышленностью неполнорационные брикетированные и гранулированные корма, изготовляемые с учетом оптимальной потребности животных в питательных веществах по трем рецепта^. Брикеты, приготовленные по рецепту № 1, предназначены для кормления крыс и мышей, по рецепту № 2 —для кроликов и морских свинок, по рецепту № 3 ——для кроликов.

При даче лабораторным животным неполнорационных •брикетированных кормов необходимо давать дополнительно: мышам и крысам — молоко, зелень, рыбий жир и подсолнечное масло, кроликам и морским свинкам — сочные и зеленые корма, сало, рыбий жир. Обязательным условием успешного перехода на брикетированные корма служит бесперебойное обеспечение животных чистой водой. '

Необходимым дополнением к концентрированным кормам являются корма животного происхождения, минеральные и витаминные добавки. Корма животного происхождения (мо- -локо, творог, рыбная и мясо-костная мука) служат источни- •кам1и полноценного протеина, улучшают переваривание других кормов и способствуют лучшему росту молодняка.

Сочные корма, сахарная и кормовая свекла, капуста, *брюква представляют -собой источники легко перевариваемых углеводов и витаминов. Корнеплоды и овощи дают только сырые, тщательно очищенные, промытые и нарезанные кусками. Мышам и крысам сочные корма желательно вводить

в рацион в течение всего года, кроликам ——при отсутствии в рационе зеленых кормов. Для морских свинок крайне важно введение в рацион зимой н весной свежей белокочанной капусты, богатой витамином С.

В зеленых кормах содержится большое количество полноценного протеина, углеводов, минеральных солей и витаминов. Для мелких грызунов (мыши, крысы) зеленые корма вводят в рацион в небольшом количестве в течение всего -года. Для морских свинок и кроликов он>и служат одним из основных видов кормов в летнее время. В качестве зеленого корма могут быть использованы почти все дикорастущие, луговые, степные и лесные травы, а для кроликов, кроме того, листья и побеги деревьев и кустарников. При раздаче зеленого корма необходимо следить, чтобы в нем не было вредных и ядовитых растений (дурман, болиголов, чемерица, наперстянка, ландыш, лютик едкий, вех ядовитый).

В зимнее время года для кроликов и морских свинок сено служит одним из основных видов корма, а для других лабораторных животных (грызунов) оно является всего лишь дополнительным источником минеральных веществ и витаминов.

В рацион лабораторных животных должна вводиться минеральная и витаминная подкормка. Источником кальция и фосфора служат костная мука и трикальцийфосфат, натрия и хлора ——хлорид натрия. Для обогащения кормов витаминами А и D вводится свежий витаминизированный рыбий жир. Мышам и крысам рыбий жир дают в течение всего года, морским свинкам и кроликам — если в рационе нет травы. Источником витаминов группы В являются пивные и пекарсюие дрожжи. Перед скармливанием дрожжи кипятят： кипячение предотвращает брожение кормов и обусловливает разрушение убитых дрожжевых грибов, способствуя освобождению содержащихся в них витаминов. Источником витамина С служат капуста, настой свежей хвои, хвойная мука, а также водный раствор аскорбиновой кислоты. В качестве источников витаминов Е и К используются сочные корма и зелень. ,

В клетках лабораторных животных должна постоянно находиться вода. При недостатке ее животные плохо переваривают пищу, утрачивают аппетит, худеют. Для бесперебойного обеспечения животных чистой водой применяют автопоилки. Примером самой простой автопоилки может служить стеклянный флакон емкостью 200——250 мл с резиновой пробкой, в отверстие ее вставлена изогнутая под углом 120——130° стеклянная или металлическая трубка с внутренним диаметром 6 мм. Поилку укрепляют на боковой стороне клетки или на крышке под небольшим наклоном, чтобы конец трубки заходил в клетку на расстояние, удобное для слизыва-

'ния животными капли, висящей на конце трубочки. Если автопоилок нет, в клетках мышей и крыс должны постоянно находиться !мисочки с чистой водой. Кроликов и морских свинок следует поить 2 раза в сутки, а в жаркое время года не менее 3 раз.

При составлении рационов питания нужно исходить из норм кормления подопытных животных, разработанных научно-исследовательскими учреждениями для каждого вида животных и утвержденных Министерством здравоохранения СССР (приказ № 163 от 10 марта 1966 г.).

Подготовка животных к опыту. Перед постановкой опыта отбирают группу животных определенного вида, возраста, массы тела и, если нужно по условиям опыта, какого-либо одного пола.

Животные должны быть совершенно здоровы. Отобран- ：ных животных рассаживают по клеткам и в течение нескольких дней, предшествующих опыту, взвешивают и термомет- рируют. Кроликам и морским свинкам надевают метки. При нормальном питании .и развитии по массе тела животного в период роста можно приблизительно определить его возраст.

Термометрия лабораторных животных. Нормальная температура у разных видов лабораторных животных неодинакова (табл. 8).

Таблица 8

Нормы температуры лабораторных животных

Вид животного

Средняя нормаль* ная температура по Цельсию

Белые <мышн

37—39°

Белые крысы

38,5—39,5。

Морские свинки

\ 37,3-39,5°

Кролики

,7,7—38,8。

Температуру тела животным измеряют в прямой кишке, белым мышам ——специальным маленьким трехгранным термометром, а остальным лабораторным животным — обычным медицинским термометром. Перед употреблением термометр протирают ватой, смоченной в спирте или 3—5% растворе хлорамина, вытирают насухо и смазывают вазелином. Глубина введения термометра должна быть всегда постоянной, так как от нее зависит температура. С этой целью на термометр на определенной высоте от ртутного резервуара надевают резиновое колечко, ограничивающее глубину введения термометра в прямую кишку. Измерение температуры в каж-

Ри-с. 10. Бляыжа с номером для метки лабораторных животных.

дой группе животных в течение всего периода наблюдений производят одним термометром в одно и то же врезн.

Удаление волос и обработка операционного поля у животных. В области операционного поля накануне операции выстригают шерсть. У кроликов, морских свинок и крыс шерсть выстригают ножницами с закругленными концами. Чтобы не- поранить кожу в месте выстригания волос, ее растягивают I и II пальцами левой руки. Для полного удаления шерсти пользуются депилятором. На обрабатываемом участке тела выстригают ножницами шерсть и накладывают на 2——6 мин толстый слой депилятора, предварительно разведенного водой до густоты сметаны. Через указанное время депилятор смывают теплой водой, а кожу вытирают чистой мягкой тряпочкой и смазывают ланолином или детским кремом. При обработке операционного поля депилятором иногда наблюдается раздражение кожи, поэтому пользоваться им нужно за 2——3 дня до постановки опыта.

Нумерация лабораторных животных. Кроликов и морских свинок нумеруют специальными металлическими бляшками^ которые продевают в уши. Бляшка имеет расширенную центральную часть с номером и два отходящих от нее в стороны острых шипа (рис. 10). Перед употреблением бляшки погружают на 3—4 ч в спирт. Ухо животного перед проколом также протирают спиртом, а затем эфиром для обезболивания. После дезинфекции в участке ушной раковины, лишенной кровеносных сосудов, остроконечными ножницами или скальпелем делают два отверстия и через них на внутреннюю поверхность уха выводят шипы бляшки, загибая их внутрь или в стороны.

Крыс и мышей нумеруют непосредственно во время опыта, пользуясь для этой цели красками, дающими стойкое окрашивание, например насыщенным спиртовым раствором фуксина, насыщенным водным или спиртовым раствором пикриновой кислоты или насыщенным водным раствором перманганата калия. У подопытных животных окрашивают разные части тела. Одной краской, как правило, метят первые 9 номеров. Сочетание двух различных красок позволяет пометить до 100 животных.

Ниже в качестве примера приводится одна из схем нумерации. Метки пикриновой кислоты соответствуют единицам, метки фуксином обозначают десятки. Окрашенные та<ким образом животные в зависимости от места расположения пятна н его окраскн будут иметь следующие условные номера: левая передняя лапа — № 1, левый бок — № 2, левая задняя лапа — № 3, голова — № 4, спииа — № 5, область крестца — № 6, правая передняя ла-

па — № 7, правый бок ——№ 8, правая задняя лапа ——№ 9. Нанесение фуксина на те же места (вместо пикриновой кислоты) будет означать ссютвет- ственно: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, §0, 90.

Прн комбинации двух красок может быть иолучен любой |Щвуз<начный номер, например： лапа левая передняя «(фуксин) + лапа левая передняя (пикриновая кислота)—№ 11, лапа правая задняя (фуксин) + лапа левая задняя (ттнкриновая кислота) — № 93.

Фиксация лабораторных животных. Перед опытом животное фиксируют, т. е. придают ему положение, наиболее удобное для проводимой операции, с ограничением подвижности в этом положении.

Существуют различные приемы и приспособления для фиксации лабораторных животных.

Фиксация кроликов в положении, удобном для термометрии. Кролика плотно завертывают полотенцем, прижимая передние лапы к груди, а задние к животу, оставляя свободной голову. У фиксированного таким образом животного легко измерять температуру. Для этого лаборант-кладет его себе на колени так, чтобы голова находилась под локтем левой руки. Той же рукой он приподнимает хвост животного, а правой рукой вводит в прямую кишку термометр.

Указанным способом фиксации можно пользоваться при заражении или взятии крови из краевой вены уха. Туловище кролика плотно зажимают между коленями или прижимают локтем левой руки, оставляя свободной для проведения необходимых манипуляций голову животного, повернутую вправо.

Фикс ация головы кролика. Для этого удобно пользоваться боксом (рис. 11), имеющим вид ящика с верхней выдвижной крышкой. Передняя стенка ящика состоит из двух частей: нижней, укрепленной неподвижно, и верхней выдвигающейся. Посередине передней стенки имеется круглое отверстие диаметром 5 см, состоящее из двух половин: одна половина вырезана на нижней, другая ——на верхней выдвигающейся части передней стенки, "^ерез это отверстие выводят наружу и фиксируют голову кролика. В задней части ящика с внутренней стороны на обеих боковых стенках набито по нескольку вертикальных лланок, между которыми находятся пазы. Вставляя вертикально фанерную дощечку в тот или иной паз, можно увеличивать или уменьшать длину бокса.

Длина бокса 40 см, ширина 15 см, высота 15,5 см (высота нижней передней стенки 9 см, верхней ——6,5 см). Фиксация кролика в боксе описанной конструкции осуществляется следующим образом. Выдвигают верхнюю крышку бокса и вынимают верхнюю половину передней стенки. В ящик сажают кролика так, чтобы шея его проходила через выемку нижней половины передней стенки, после чего голову животного фиксируют, опуская на нее верхнюю половину перед-

Рнс. 11. Бокс для фиксации головы кролика.

ней стенки. В один из пазов вдвигают фанерную дощечку, ограничивая тем самым возможность движений кролика в ящике, а затем закрывают верхнюю крышку, которая фиксирует подвижную часть передней стенки.

Фиксация кролика и других лабораторных животных (морские свинки, крысы) в лежачем положении н а спине или животе. Для фиксации кроликов и других животных (морские свинки, крысы) в лежачем положении на спине или животе пользуются специальными станками. Наиболее просто устроенный станок представляет собой обычную доску на низких ножках, по размерам соответствующую тому или другому виду животного. На ребрах боковых сторон доски имеется по 2 крючка или петли. У одного из узких краев находится приспособление для фиксации головы животного ——головодержатель. Он представляет собой надеваемое на голову животного кольцо, соединенное со штативом. При помощи винтов высоту кольца на стойке штатива можно регулировать.

Животное кладут в удобном для опыта положении, спиной или животом кверху. Все 4 лапы продевают в петли, сделанные из бинта, которые затем плотно затягивают. Свободные концы тесемок из бинта (в первую очередь от передних лап и во вторую — от задних) лривязывают к крючкам или петлям доски. Фиксацию животного к станку производят с помощником.

Фиксация морской свинки руками. Морскую свинку брюшком кверху или наружу (рис. 12) берут левой рукой так, чтобы II палец находился под шеей, а I и III пальцы——под передними конечностями животного. Правой рукой свинку поглаживают по животу до тех пор, пока она не успокоится, и только после этого приступают к намеченной операции, придерживая задние лапы животного правой рукой.

Фиксация крыс. Складку кожи в области затылка захватывают корнцангом, плотно прижимая голову животного к 'поверхности стола. Другой рукой берут хвост крысы

Рис. 13. Фиксация крысы руками при работе без помощника.

Рис. 14. Фиксация (：Г) и заражение (2) мыши при работе без помощника.

и, приподняв ее над поверхностью стола, держат в таком положении, чтобы голова слегка оттягивалась корнцангом (рис. 13).

Фиксация мышей. Мышь пускают по столу, придерживая ее I и II пальцами правой руки за кончик хвоста. Когда, продвигаясь в каком-либо направлении, мышь натянет хвост, быстрым движением левой руки хватают ее за складку кожи в области затылка, ближе к ушам, чтобы она ие могла поворачивать голову. Подняв мышь над столом, помощник держит ее на весу одной рукой за хвост, другой — за складку кожи на затылке, несколько растягивая в положении, удобном для экспериментатора.

Работать с мышами можно и без помощника, фиксируя их левой рукой: I и II пальцами левой руки животное захватывают за складку кожи в области затылка, а остальными 3 пальцами, прижав их к запястью, придерживют хвост н кожу в области крестца. При таком способе фиксирования правой свободной рукой можно производить различные операции (рис. 14).

СПОСОБЫ ЗАРАЖЕНИЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

В зависимости от цели исследования пользуются различными способами заражения: внутрикожным, подкожным, внутримышечным, внутрибрюшинным, внутривенным, пероральным или интраназальным. При перечисленных способах, за исключением перорального и интраназального, заражение осуществляется с помощью шприца.

Взвесь микробной культуры, эмульсию из зараженных органов или кровь больного осторожно набирают в шприц, после чего конец иглы закрывают кусочком ваты, смоченным 5% раствором хлорамина, 5% раствором карболовой кислоты млн спиртом. Повернув шприц иглой кверху, осторожно выпускают из него лузырьки воздуха. Загрязненную вату бросают в банку с дезинфицирующим раствором.

Внутрикожный способ заражения. При этом способе применяют тонкие (№ 18——20) острые иглы с небольшим скосом. Кожу в месте введения материала растягивают I и II пальцами левой руки, правой рукой вводят иглу под очень острым углом, почти касаясь кожи. Конец иглы должен быть виден через эпидермис: при введении материала эпидермис приподнимается в виде четко ограниченного бугорка, кожа над ним становится прозрачной и пористой, вследствие чего ее сравнивают иногда с лимонной корочкой. Материал вводят в объеме до 0,1 мл обычно в кожу спины или живота.

Подкожный способ заражения. Кожу в месте введения материала берут у ее основания, приподнимают I и II пальцами левой руки. Иглу шприца вкалывают снизу образовавшейся складки. Проколов кожу и пройдя вглубь на несколько миллиметров, иглу отклоняют вправо или влево и затем медленно вводят материал, содержащийся в шприце. Изменять направление иглы под кожей рекомендуется для того, чтобы введенное вещество не выступало через прокол кожи наружу. Затем складку кожи опускают, на место укола накладывают ватный тампон, смоченный спиртом или спиртовым раствором, а иглу быстро вынимают. Наиболее удобными местами для подкожного введения материала у кроликов и морских свинок являются область спины и боковые поверхности несколько ниже подмышечных впадин, у крыс и мышей—область спины, крестца и затылка. Количество жидкости, вводимой подкожно, не должно .превышать 30 мл для кроликов, 15 мл—для морских свинок, 10 .мл*——для крыс и 1 мл — для мышей.

Внутримышечный способ заражения. Выбирают участок тела с наиболее развитым мышечным слоем. У кроликов, морских свинок, крыс и мышей таким местом является наружная верхняя треть бедра задней лапы. Захватывают I и II пальцами левой руки толстую мышечную складку я вводят иглу почти под прямым углом в глубь мышц. Объем жидкости, допустимый для внутр и м ыш ечн ого введения, составляет для кроликов 8 мл, для морских свинок ——5 мл, для крыс — 3 мл, для мышей — 0,5 мл.

Внутрибрюшинный способ заражения. Помощник держит животное вниз головой. В этом положении кишечник смещается в сторону Д1иафрагмы, что в значительной мере уменьшает возможность его повреждения в момент прокола. У животных (за исключением мышей) в нижней трети живота, несколько отступя от средней линии, делают скальпелем или остроконечными ножницами надсечку кожи дли-ной 2—^3 мм и через нее вводят притупленную иглу, д^ржа шприц перпендикулярно к брюшной -стейке. Преодолевая сопротивление, очень осторожно, буравящими движениями иглу шр од витают вглубь. Чувство《провала》, исчезновение ощущения сопротив- 96 .

ления на пути говорят о проникновении иглы в брюшную полость. После этого иглу переводят в вертикальное положение и вводят содержащийся в шприце материал в полость брюшины. Внутрибрюшинно можно вводить до 30 мл жидкости кроликам, до 10 мл — морским свинкам, до 5 мл — крысам, до 2 мл — мышам.

Внутривенное заражение кроликов. Кроликов заражают в краевую вену уха. Вдоль наружного края уха выщипывают шерсть, затем это место слегка пощелкивают кончиками пальцев, чтобы вызвать гиперемию сосудов, и протирают ватой, смоченной в 70% спирте. После явного набухания вены под ухо подводят II палец левой руки. Прокол вены следует делать ближе к верхушке уха, так как при частых уколах возможна облитерация сосуда в этом месте, но проксимальный участок вены остается неповрежденным. Чтобы удостовериться, правильно ли введена игла, вводят сначала небольшое количество материала. При нахождении иглы в полости вены материал вводится свободно, в противном же случае жидкость из шприца вытекает с трудом, а на ухе в месте введения образуется вздутие. Если игла не попала в вену, ее вынимают и вводят повторно в другое место, ближе к основанию уха. По окончании введения нижний участок вены слегка придавливают, а к месту укола прикладывают кусочек стерильной ваты, смоченной спиртом или спиртовым раствором йода, после чего из вены извлекают иглу. Внутривенно кроликам можно вводить до 20 мл жидкости. _

Внутривенное заражение крыс и мышей. Крыс и мышей заражают в боковую вену хвоста. Непосредственно перед введением материала хвост животного, чтобы вызвать гиперемию сосудов, погружают в сосуд с водой, подогретой до 50 ℃, смазывают ксилолом или толуолом. После того как сосуды заметно набухают, корень хвоста сдавливают пальцами. Для введения материала лучше всего пользоваться туберкулиновыми иглами, очень тонкими и короткими, с косым срезом. При введении иглы в вену шприц держат под острым углом, почти параллельно оси хвоста. Иглу повертывают отверстием наружу. Корень хвоста освобождают от сдавливания. Как и в предыдущем случае, нахождение иглы в вене определяют по * легкости введения материала и отсутствию заметного уплотнения в месте, где находится игла. Взрослым белым крысам допускается вводить до 6 мл жидкости, мышам—до 0,5 мл.

9797Заражение через пищеварительный тракт. Заразить животное через рот можно двумя способами. Материал, предназначенный для заражения, примешивают к корму или питьк> животного. Такой способ является наиболее простым и естественным, однако в лабораторной практике применение его ограничено, поскольку количество материала, попадающее в

97

97

7 Лабинская А. С.

Рис. 15. Заражение мыши через пищеварительный тракт.

организм заражаемого животного, не подлежит точному учету. Поэтому значительно чаще материал, предназначенный для заражения, вводят животному шприцем, игла которого имеет незначительный изгиб и утолщение на конце в виде оливы. Наличие изгиба допускает введение иглы -в пищевод' животного. Диаметр иглы для мышей должен быть не более 1 мм, для крыс—1—1,5 мм, длина ——соответственно 35——45 и 70—75 мм.

Крыс и мышей фиксируют перед заражением в вертикальном положении: одной рукой помощник держит животное за складку кожи на затылке, около ушей, другой ——за корень хвоста. Животным открывают рот браншами пинцета, вставляя их между нижней и верхней челюстями. Иглу, введенную в рот, продвигают по задней стенке глотки на глубину 1 см у мышей и 2——2,5 см у крыс. На указанной глубине игле придают вертикальное положение. Процесс введения иглы, как правило, затруднений не представляет, конец ее проникает непосредственно в желудок или нижний отдел пищевода. Количество материала, вводимого за один раз в желудок мышей, должно быть не более 1 мл, взрослым крысам ——не более 3,5 мл (рис. 15).

E. Попова (1972) при пероральном введении жидкостей мелким лабораторным животным предложила пользоваться вместо металлического зонда с оливой полихлорвиниловой трубкой, представляющей собой наружную оболочку одного провода многожильного телефонного кабеля, из которого удален проводник. Длина трубки 15——17 см, наружный диаметр 1—1,5 мм, внутренний просвет 0,5—0,7 мм.

В отличие от металлического зонда, часто попадающего в дыхательные пути и вызывающего гибель животных от асфиксии, а при глубоком введении повреждающего стенку желудка и пищевода, эластический зонд при незначительном усилии легко проникает из полости рта в пищевод и желудок животного, не требуя строгого ограничения глубины введения, так как даже при излишне глубоком введении стенки желудка не повреждаются.

Вводимая жидкость дозируется с помощью шприца, на сосок которого надевают эластический зонд.

Морских свинок и кроликов перед заражением per os фиксируют в нормальном для животного положении. Удобнее всего завернуть их в полотенце и посадить к помощнику на колени. '

Заразный материал вводят через эластический зонд. Для этой цели обычно выбирают катетер из наиболее мягкой и эластичной резины длиной 7,5—8 см и толщиной не более 0,3—0,5 см.

Перед введением зонда в рот животному вставляют роторасширитель или, как его называют, «зевпик», который представляет собой дощечку с круглым отверстием в середине. Ширина дощечки для кролика равна 2 см, для морской свинки — 1 см. Через отверстие вставленного в рот «зев- ника》осторожно вводят в пищевод зонд, смазанный вазелином или глицерином. Для того чтобы облегчить введение зонда, животному вливают пипеткой в рот несколько капель воды, вызывая глотательные движения, во время которых зонд легко, без внешнего воздействия продвигается в глубь пищевода. Наружный конец введенного зонда присоединяют к шприцу, наполненному материалом, который вводят в желудок медленно в количестве 2,5—3,5 мл морским свинкам и 3,5—5 мл кроликам.

Заражение через дыхательные пути (интраназальное заражение). Животному, фиксированному на доске, прикладывают к носу кусочек ваты, смоченной эфиром или хлороформом, К заражению приступают после того, как у животного появится состояние легкого наркоза. Зараженный материал с помощью шприца вводят в нос небольшими каплями на глу- шину 1—1,5 мм мышам, 2—3 мм крысам, 4 мм кроликам и морским свинкам. Чтобы не поранить слизистые оболочки, для введения материала берут абсолютно тупую иглу.

ТЕХНИКА ВЗЯТИЯ У ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ КРОВИ ! И ПОЛУЧЕНИЯ ИЗ НЕЕ ОТДЕЛЬНЫХ ИНГРЕДИЕНТОВ

Небольшое количество крови получают у кроликов и морских свинок из вен уха, у мышей и крыс — из вен хвоста, а большие количества — из сердца. В особых случаях прибегают к полному, или тотальному, обескровливанию, после которого животное погибает.

В табл. 9 приведены данные о максимальных количествах крови и интервалах времени, через которые можно брать кровь у животных.

Та блица 9

Схема взятия крови от животных-доноров

Вид животного

Масса тела донора, г

Максимальное количество крови, допускаемое для взятия однсжомеит- НО. мл

Интервалы времени между взятием крови

Максимальное количество крови, получаемое л財 тотальном обескровливании, мл

Кролики

Морские свин-

3000—3500 400—500

25—30

10—12

10—15 дней

10—15 >

120—15

30—40

КН Крысы

180—200

6—8

10—15 >

20—25

Для пункции сердца животных фиксируют к доске брюшком кверху. Шерсть в области груди тщательно выстригают, кожу обрабатывают спиртовым раствором йода и после этого приступают к проколу, который в зависимости от вида животного имеет некоторые различия.

Пункция сердца кроликов. Определяют II пальцем, обработанным спиртом и смазанным спиртовым раствором йода, сердечный толчок, т. е. точку наиболее сильно выраженной- пульсации сердца. Обычно она прощупывается в третьем межреберье. Прокол грудной клетки делают в области сердечного толчка на расстоянии 2—4 мм от левого края грудины; иглу ведут в направлении к средней линии на глубину 2—2,5 см. При попадании иглы в полость сердца рука, в которой находится шприц, начинает ощущать ритмичные толчки, связанные с пульсацией сердца и приподнимающие иглу. Поршень шприца легко выдвигается наружу и в цилиндре ■его тотчас появляется кровь. Взятие крови должно производиться по возможности быстрее во избежание ее свертывания. По этой же'причине шприц и иглу рекомендуется промывать перед опытом стерильным раствором цитрата или оксалата натрия. Взяв необходимое количество крови, быстрым движением, без рывка, вынимают иглу и на месте укола накладывают ватный тампон, пропитанный спиртовым раствором йода. Животному подкожно вводят подогретый до температуры тела стерильный изотонический раствор хлорида

«атрия или глюкозу в количестве, равном двойному объему взятой крови. Пункцией сердца можно получить у кролика 25—30 мл крови.

Пункция сердца у морских свинок. Кончиками III—IV пальцев левой руки нащупывают сердечный толчок, в направлении которого вертикально на глубину 1,5—2 см вкалывают иглу, отступя на 1—2 мм от левого края грудииы. У морских свинок можно получить таким образом 10—12 мл крови.

Пункция сердца у крыс. Как и в предыдущих случаях, пальпаторно определяют место сердечного толчка. На 1 см выше от установленной точки и на 1——2 мм левее от края грудины делают прокол на глубину 1,5—2 см, держа иглу вертикально. Одномоментно у крыс можно получить 6—8 мл крови.

Тотальное обескровливание кролика. Вскрывают одну из сонных артерий, расположенных по обеим сторонам трахеи. Для получения стерильной крови руки оперируемого должны -быть тщательно вымыты и обработаны спиртом или спиртовым раствором йода, все инструменты предварительно необходимо простерилизовать.

Подготовленного для кровопускания кролика привязывают 做 станку брюшком кверху, фиксируя голову кольцом к штативу. Шерсть на шее тщательно выстригают, кожу дезинфицируют. К носу животного прикладывают кусочек ваты, смоченной эфиром. После того как наступит состояние наркоза, скальпелем делают разрез по средней линии шеи и разводят- края раны пинцетом. Сонные артерии проходят по бокам трахеи в яремном желобке между веной и нервом. Сверху артерия прикрыта грудино-подъязычной и грудино-щитовидной мышцами. Поэтому для обнаружения нервно-сосудистого пучка эти мышцы разделяют тупым концом скальпеля или бран- шами пинцета. Артерию освобождают от окружающей соединительной ткани и подводят под нее две лигатуры. Ближайшую к головке лигатуру завязывают двойным узлом, позади второй лигатуры на расстоянии 0,3—0,5 см накладывают пеан. Между лигатурой и пеаном маленькими остроконечными ножницами делают продольный разрез сосуда длиной не более 1,5—2 мм, вставляя в него канюлю (стеклянную трубочку с оттянутым капилляром, кончик которой скошен и хорошо оплавлен). Кончик вставленной канюли укрепляют второй лигатурой. После этого под резиновую трубку, надетую на расширенную часть канюли, подставляют пробирку или флакон и снимают пеан с артерии, чтобы кровь могла вытекать свободно (рис. 16). Обескровливание морских свинок производят так же, как и кроликов.

Взятие крови из вены уха кролика. Для получения крови 蛆з краевой вены нужно прежде всего вызвать гиперемию уха.

Рис. 16. Введение канюли в артерию лри обескровливании животных.

потирая его ладонями рук и слегка ударяя кончиками пальцев. Затем вдоль наружного края уха удаляют пушок и протирают ватой, увлажненной 70% спиртом. Если в результате всех перечисленных процедур сосуды не инъецируются, ухо смазывают ксилолом Млн толуолом. После того как сосуды набухнут и четко обозначатся на поверхности ушной раковины, наружную поверхность ее покрывают тонким слоем жидкого парафина (во избежание быстрого свертывания крови) и делают прокол вены.

Для получения небольшого количества крови (менее 1 мл)・ прокалывают одну из небольших периферических ветвей, а для получения больших объемов крови (5——10 мл) вскрывают краевую вену уха. С этой целью иглу шприца вводят в вену почти параллельно поверхности уха, чтобы не повредить противоположную стенку вены. При проколе вены иглой шприца кровь, как правило, выходит отдельными каплями с большими интервалами и кровотечение прекращается быстро. Для того чтобы вызвать обильное кровотечение, нужно сделать ранку с рваными краями. С этой целью пользуются обломком тонкого капилляра пастеровской пипетки. При таком способе прокола из уха кролика получают до 30 мл крови. После взятия крови к проколу вены прикладывают на 2—— 3 мин кусочек сухой стерильной ваты, не нажимая сильно на стенку сосуда, так как при этом кровотечение может усилить^ ся. Если кровотечение долго не прекращается, хорошие результаты дает нанесение на ранку нескольких капель перекиси водорода. °

Йзятие крови из вен у морских свинок, крыс и мышей. У морских свинок кровь в количестве 0,3—0,5 мл получают после нанесения насечек на край уха или прокола мягких подушек лапы.

У белых крыс и мышей для получения 1—3 капель крови приходится прибегать к ампутации кончика хвоста после продолжительного прогревания его в воде температуры 45—50 ℃ или протирания ксилолом. Взяв кровь, рану прижигают перекисью водорода.

М, Концова (1968) предложила способ, позволяющий получить у крыс 0,5—1 мл крови из венозного сплетения, лежащего в орбите, позади глазного яблока. Взятие крови про- -изводят стеклянной пипеткой с оттянутым капилляром (наружный диаметр 0,6 мл), острие которого сточено под углом 45°.

Животное берут I и II пальцами левой руки со стороны спины за шею и слегка сдавливают с боков, вызывая легкое ^выпячивание глаз. Вращательным движением пипетки делают прокол конъюнктивального мешка в медиальном углу глаза между глазным яблоком и орбитой. После прокола пипетку ведут в направлении гортани на глубину 4——5 мм. Попадание в венозное сплетение сопровождается заполнением капилляра пипетки кровью.

Получение дефибринированной крови. Кровь животного сливают в стерильную колбу со стеклянными бусами и непрерывно в течение 10—15 мин встряхивают. В результате встряхивания находящийся в крови фибрин выпада- wt в осадок, обволакивая бусы, а дефибринированная кровь, слитая в другую колбу или пробирку, утрачивает способность свертываться.

Приготовление взвеси эритроцитов. Для освобождения от пленок фибрина дефибринированную кровь фильтруют через трехслойный марлевый фильтр. Фильтрат наливают в центрифужные пробирки и центрифугируют при 2000—3000 об/мин в течение 10—15 мин. Эритроциты оседают да дно пробирки, а прозрачная, слегка желтоватого цвета плазма образует надосадочный слой. После центрифугирования уровень жидкости в пробирке отмечают карандашом, отсасывают плазму пастеровской пипеткой, эритроциты промывают, доливая до метки стерильный изотонический раствор хлорида натрия, и вновь центрифугируют. Промывание эрит- .роцитов с добавлением свежего раствора производят 2—3 раза, чтобы последняя порция промывной жидкости была бесцветна.

Из промытых эритроцитов готовят 3% или 5% взвесь, прибавляя к 3—5 мл эритроцитов соответственно 97—95 мл изотонического раствора хлорида натрия (для получения меньших количеств взвеси объемы обоих ингредиентов уменьшает в одинаковое число раз).

Взвесь эритроцитов можно хранить в холодильнике при температуре 3—4 °C в течение 5—6 дней.

Приготовление сыворотки крови. Кровь, со・ бранную в стерильную пробирку, закрывают ватно-марлевой пробкой, ставят на 20—30 мин в термостат или водяную баню, отрегулированную на 37 ℃, так как в тепле кровь свертывается быстрее и лучше. Во время свертывания сгусток «рови обычно прилипает к стенкам пробирки. Поэтому после

взятия пробирок из термостата сгусток отделяют от стенок пробирки круговым движением капилляра стерильной пастеровской пипетки или стеклянной стерильной палочкой.

После отделения сгустка сыворотку ставят в холодильник при температуре 3—4℃. В течение 3—4 ч сыворотка обычно отделяется полностью, и ее можно отсосать стерильной пастеровской пипеткой. Для того чтобы во время отсасывания содержимое пробирки было хорошо видно, пастеровскую пипетку соединяют со стеклянной трубкой — «мундштуком» (ре* зиновая трубка длиной 20—25 см). При отсасывании кончик пипетки не должен соприкасаться со сгустком крови, чтобы в сыворотку не попали эритроциты.

Окрашенную в розовый цвет сыворотку центрифугируют при 2000——3000 об/мин в течение 10——15 мин для осаждения форменных элементов крови.

При взятии крови вскоре после кормления животных, а также при повторных кровопусканиях с короткими ннтерва- лами возникает иногда липемия, т. е. появление избытка ж и- ровых веществ в крови. Сыворотки, получаемые во время ли- пемии, бывают мутные (хилезные), иногда опалесцирующие,, и это очень затрудняет чтение диагностических реакций, особенно реакции преципитации. Во избежание получения мутных сывороток кровь у животных берут натощак. Просветление липемической плазмы наступает также при введении в< кровеносное русло животного гепарина, способствующего по* вышению концентрации в крови фермента, называемого фак^ тором просветления. С этой целью кроликам весом 2——2,5 ki в краевую вену уха вводят за 1——Р/2 ч до обескровливания- 60 мг гепарина.

Форменные элементы из крови удаляют центрифугированием. В слитой с осадка плазме через короткое время после центрифугирования образуется сгусток фибрина, который уплотняется при перемешивании крови стеклянной палочкой. Затем этот сгусток удаляют. В некоторых случаях фибрин из плазмы выпадает не полностью. Для удаления остатков фибрина и выявления полноты его удаления к сыворотке прибавляют несколько капель тромбина. Освобожденную от фибрина сыворотку фильтруют через асбестовые фильтры. Полученная таким способом сыворотка совершенно прозрачна и не имеет признаков опалесценции.

Приготовление цитратной крови. Подученную^ из сердца или вены кровь сливают в пробирку с 5% раствором цитрата натрия (10 мл крови, 1 мл цитрата натрия). Цитратная кровь не свертывается.

Приготовление пл аз м ы крови. Цитратную кровь ставят на 18—20 ч в холодильник или подвергают центрифугированию. В результате над осадком эритроцитов образуется прозрачный слой жидкости желтоватого цвета — плазмы.

УМЕРЩВЛЕНИЕ И ВСКРЫТИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

В лабораторной практике приняты способы умерщвления, которые характеризуются простотой приемов и вызывают быструю смерть животного. Мышей, крыс, морских свинок помещают в стеклянную, плотно закрывающуюся банку с кусочком ваты, пропитанным хлороформом или эфиром. Животные засыпают и гибнут в течение 3—5 мин. Кроликов умерщвляют посредством воздушной эмболии. Для этого в краевую вену уха по направлению к его основанию вводят иг- 』у шприца. Появление капельки крови свидетельствует о том, что игла находится в вене. После этого иглу соединяют с пустым 10-граммовым шприцем, поршень которого вытянут до конца. При надавливании на поршень в кровеносную систему животного поступает находящийся в цилиндре шприца воздух, вызывая эмболию и быструю смерть.

Вскрытие животных. Трупы лабораторных животных вскрывают с целью выяснения причин гибели, выделения введенного возбудителя, выявления механизма распространения микробов в организме и места их локализации, изучения патологоанатомических изменений, наступающих в результате перенесенной инфекции. Вскрытие трупов животных производят стерильными инструментами, соблюдая правила асептики.

На столе должны находиться стакай, наполненный до по- .ловины спиртом, стерильные ножницы, скальпель, анатомиче- бкне и хирургические пинцеты, бактериальная петля, стериль- ，ные чашки Петри, пробирки и чашки с питательными средами, стерильные пастеровские пипетки, предметные стекла, стерильный изотонический раствор хлорида натрия, банка с дезинфицирующим раствором, ватные тампоны, спички и горелки (спиртовая и газовая). Вскрытие трупов следует производить таким образом, чтобы предупредить внесение микроорганизмов с поверхности в глубину тканей, а также перенос микробов из одного органа в другой. С этой целью рекомендуется вскрывать животных в агональном состоянии, усыпив >их эфиром, или тотчас после наступления смерти, так как в ближайшие часы после нее проницаемость тканей нарушается и бактерии из одного органа могут проникнуть в другой. Особую опасность в этом отношении представляет кишечник, содержимое которого изобилует микробами.

Труп животного брюшком кверху кладут на деревянную доску или лоток с пластинкой застывшего парафина, растягивают пинцетом все 4 лапы и в таком положении фиксируют их булавками или небольшими острыми гвоздиками к поверхности дерева или парафина. Грудь и брюшко протирают ватой, смоченной 5% раствором карболовой кислоты или 5% раствором хлорамина, или, лучше, смачивают спиртом и под-

жигают шерсть, чтобы содержащиеся на ней микробы, в том числе спороносные палочки, не разлетались и не загрязнял» стерильные инструменты и органы вскрытия трупа. В процессе вскрытия придерживаются общепринятого порядка. Сначала исследуют наружные покровы н подкожную клетчатку, затем проводят вскрытие, исследование и взятие материала из органов грудной полости, а в последнюю очередь вскрытие» исследование и взятие материала из органов брюшной полости.

Обработанную кожу разрезают по средней линии живота протяженностью от симфиза до грудино-ключичного сочленения. На уровне передних и задних лап делают боковые надрезы. Кожные лоскуты отсепаровывают от подкожной клетчатки и отворачивают в стороны, прикалывая булавками к доске.

В протоколе вскрытия отмечают состояние подкожной- клетчатки и лимфатических узлов в паху и подмышечных впадинах. Подкожная клетчатка может быть развита сильно» слабо или умеренно. Подмышечные и паховые узлы обнаруживаются легко. При осмотре узлов обращают внимание на их величину, форму и цвет. Для бактериологического исследования лимфатические узлы раздавливают стерильным пинцетом и погружают в жидкую питательную среду или втирают в поверхность плотной питательной среды.

Сменив или простерилизовав использованные для вскрытия кожных покровов инструменты, приступают к вскрытию грудной клетки. Грудину, захваченную пинцетом, слегка приподнимают, делают под ней небольшой надрез, вводят в него браншу ножниц и перерезают ребра вначале с одной, а затем с другой стороны. Если в грудной полости есть экссудат, из него делают мазки и посев. Вновь сменив ножницы или протерев их ватой, смоченной спиртом, разрезают перикард» обнажая поверхность сердца. Накаливают на пламени горелки бранши пинцета или скальпель, прижигают поверхность сердца, затем стерильным пинцетом оттягивают кверху ушко правого предсердия и после этого через прижженное- место вводят в полость желудочка или предсердия капилляр пастеровской пипетки. Кровь, поднявшуюся по капилляру пипетки, засевают в питательную среду.

Далее приступают к осмотру органов, расположенных в грудной полости, регистрируя в протоколе имеющиеся в них изменения, например наличие экссудата в полости плевры, абсцессы, гиперемию (багрово-красное окрашивание) или, наоборот, ишемию (малокровие) в легких. Кусочки легкого е выявленными в нем изменениями вырезают для бактериологического исследования.

После этого, сменив инструменты, переходят к исследованию органов брюшной полости. Передний листок брюшины 106

«скрывают ножницами. При наличии экссудата в брюшной полости делают из него мазок и производят посев в питательную среду. Затем осматривают печень, селезенку, почки, отмечая цвет, величину органов, характеризуя их консистен- адю (нормальная, дряблая, уплотненная, хрупкая) и имеющиеся очаги поражения, например абсцессы.

При локализации инфекционного процесса в желудочнокишечном тракте делают посев содержимого желудка и кишечника, набирая его в пастеровскую пипетку через прижженную желудочную и кишечную стенки. Таким же образом Для посева берут экссудат, содержимое абсцессов, желчного 惠 мочевого пузыря.

Из паренхиматозных органов (печень, почки, селезенка) взятие материала и засев его производят одним из следующих способов.

У стерильной пастеровской пипетки обламывают кончик и проводят ее через пламя горелки. Затем капилляром випетки прокалывают прижженный участок исследуемого органа и насасывают в нее тканевую жидкость, которую засевают в питательную среду. Пипетки после использования опускают в банку с дезинфицирующим раствором.

Прижженную поверхность органа надрезают стерильным скальпелем и из глубины надреза соскабливают бактериальной петлей небольшое количество материала, которое затем вносят в питательную среду.

На прижженной поверхности органа делают надрез, остроконечными ножницами из глубины его вырезают маленький кусочек, раздавливают между браншами пинцета и опускают в жидкую питательную среду или срезом кусочка делают отпечатки на поверхности плотной питательной среды.

Изменения, обнаруженные при вскрытии трупа, а также результаты бактериологического исследования вносят в протокол вскрытия и бактериологического исследования трупного материала, составленный примерно по такому образцу:

Вид лабораторного животного, взятого в опыт.

Время заражения (месяц, число, час).

Материал, примененный для заражения (взвесь микробов с плотной питательной среды, бульонная культура, взвесь патологического материала и т. д.)・

Время гибели животного (месяц, число, час).

Изменения, обнаруженные при вскрытии животного в месте введения заразного материала, состояние подкожной клетчатки, лимфатических узлов; изменения, найденные во внутренних органах.

Вид микроба, выделенного из трупного материала, его основные морфологические, культуральные, биохимические и серологические свойства.

После вскрытия трупы животных складывают в металлические бачки с плотно закрывающимися крышками и засыпают сухой хлорной известью. Трупы мелких лабораторных жц* вотных можно заливать раствором различных дезинфицирующих веществ: 5% раствором карболовой кислоты, 3—5% мыльно-карболовым раствором,. 3—5% раствором хлорамина. Трупы животных, погибших от заражения споровыми формами микробов, заливают хлорноизвестковым молоком или 5— 10% осветленным раствором хлорной извести. В дезинфицирующем веществе трупы животных хранят до момента их сжигания.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИРУЛЕНТНОСТИ МИКРОБОВ

Вирулентность — биологическое свойство микроба, харак*. теризующее степень его патогенности в момент исследования. В отличие от патогенности вирулентность является не видовым, а индивидуальным признаком микроба, который может усиливаться или ослабляться вплоть до полного исчезновения под влиянием различных факторов внешней среды.

Для характеристики вирулентности пользуются количественными показателями, определяющими способность исследуемой микробной культуры вызывать гибель искусственно зараженных ею подопытных животных. Изучение вирулентности бывает сопряжено с рядом трудностей, так как она определяется не только комплексом культурно-морфологических, токсигенных и биологических свойств микроба, но и резистентностью микроорганизма, подверженной большим колебаниям в связи с видом, возрастом животных, режимом их питания, температурой внешней среды, а также способом заражения, принятым в опыте. Поэтому при установлении вирулентности микроба очень важно вести исследование, точно соблюдая стандартность всех условий опыта.

Для определения вирулентности микробных культур чаще всего используют белых мышей. В том случае, когда белые мыши невосприимчивы к исследуемому возбудителю заболевания, пользуются другими видами животных: крысами, морскими свинками или кроликами.

Для определения вирулентности применяют молодук> культуру микроба, так как старые культуры содержат большое количество мертвых клеток.

Культуру микроба для заражения выращивают на мясопептонном агаре или другой плотной питательной среде, так как бульон, представляя собой сложный белковый субстрат^ небезразличен для животного организма и может извращать результаты опыта. Исследуемую культуру микроба, выращенную на скошенном мясо-пептонном агаре, смывают изотоническим раствором хлорида натрия и стандартизуют по от

тическому стандарту так, чтобы в 1 мл этого раствора содержалось определенное количество микробных тел. В зависимости от вида культуры, патогенности ее для животных, взятых в опыт, а также от цели и задач исследования , количество микробных тел, содержащееся в 1 мл взвеси, может колебаться от единиц до миллиардов. В тех случаях, когда по каким-либо причинам получить агаровую культуру невозможно, пользуются суточной бульонной культурой. Для определения Dim из бульонной культуры готовят ряд последовательных десятикратных разведений: 1:10, 1:100, 1 ： 1000, 1:10 000^ 1 :100 000 и т. д.

Исследуемую взвесь бактерий вводят различными способами: внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожно, интраназально — в зависимости от целей и задач исследования.

Отстандартизованную взвесь микробов в изотоническом растворе хлорида натрия, а также разведения бульонной культуры готовят с таким расчетом, чтобы различные дозы микроба, используемые в опыте, содержались в одинаковых объемах жидкости.

Каждую дозу культуры вводят одновременно нескольккм животным. При определении минимальной смертельной дозы учитывают и отмечают в протоколе опыта следующие данные:

количество микробов, введенных в организм животного;

способ их введения;

масса тела зараженного животного；

сроки гибели после заражения.

Степень вирулентности чаще всего характеризуют тремя следующими показателями:

Минимальная смертельная доза Dim (Dosis letalis minima), т. e. наименьшая доза микробов, которая при определенном способе заражения, в определенных условиях опыта вызывает гибель около 95% подопытных животных.

Наименьшая безусловно смертельная доза Del (Dosis certe letalis)—— наименьшая доза микробов, являющаяся смертельной для всех 100% животных, взятых в опыт.

Средняя смертельная доза микробов LD50 (Dosis letalis 50%)—доза микробов, вызывающая гибель 50% зараженных животных.

Показатель LD50 позволяет получить более достоверные результаты, и потому он чаще других используется в практике экспериментальных исследований.

В ютличие от Dim и Del, определявшихся непосредственно по результатам опыта, LD50 вычисляется путем довольно сложных математических расчетов. Более прост метод Кербера, в котором простота расчета удачно сочетается с достаточно высокой точностью получаемых результатов.

Метод Кербера предусматривает: а) введение в опыт одинакового количества животных на каждую испытуемую дозу микробов; б) постоянство величины отношений каждой последующей дозы микробов к предыдущей.

При этом расчет DLi50 ведется по следующей формуле:

lg DLi^q = 1g Dn — 6 (SZz = 0,5);

L Dbg = anti 1g DLi^o,

м反e Dn — максимальная доза микробов, взятая в опыт； 6 — •логарифм отношения каждой последующей дозы к предыдущей, т. е. логарифм кратности испытанных разведений; Li一 отношение числа погибших к общему числу животных, которым введена данная доза； 2Li — сумма значений Li, найденных для всех испытанных доз.

Пример. В табл. 10 приведены данные по установлению вирулентности культуры риккетсий цуцугамуши. В опыте использовано пять различных доз культуры, взятых в разведении IO-3, 10-4 ... 10-7. Каждая испытуемая доза вводилась 6 подопытным мышам.

Таким образом, наибольшая из испытуемых доз в этом опыте составляет 10~3, следовательно lg Dn=——3,

Кратность разведений равна 10, отсюда 6=lg 10=1,0. Наконец, сумма значений Li, найденных для всех испытанных доз, W Li=4,00. Тогда по формуле:

lgLD50=lgDN—d(2Li—0,5) =—3—1,0Х (4,0—0,5) =—6,5

LD50 anti lg(—6,5) = 1/3160000 мл.

Таким образом, в 1 мл исходной микробной взвеси содержится 3 160 000 LD50.

Таблица 10

Определение вирулентности риккетсийцуцугамуши

Доза (разве* дение) исходной взвеси

Число погибших животных

Отношение числа погибших к общему числу животных, которым введена данная доза (Li)

6

1

g

6

g

6

1

10-6

4

0,67

10-7

2

0,33

2Li—4

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИГЕННОСТИ МИКРОБОВ

В патологии человека большую роль играют токсигенные микроорганизмы, к которым относятся палочки ботулизма, столбняка, газовой анаэробной инфекции, дифтерии, а также некоторые штаммы бактерий дизентерии Григорьева — Шига, стафилококка и стрептококка.

Экзотоксины, вырабатываемые различными представителями этой группы микробов, обладают резко выраженной токсичностью, высокой избирательностью действия с поражением отдельных органов и тканей и способностью при парентеральном введении в организм вызывать образование антител—антитоксинов, способных нейтрализовать соответствующие им экзотоксины.

Продуцируемые в процессе жизнедеятельности микроба экзотоксины легко диффундируют из клетки в окружающую их питательную среду. Бульонную культуру микроба выдерживают в термостате в течение 2—3 нед для накопления в ней токсина, затем фильтруют через бактериальный фильтр. Получаемый при этом прозрачный фильтрат содержит нераз- веденный токсин.

Токсигенность микробов определяют по тому же принципу, что и вирулентность. Единицами измерения токсигенности, как и вирулентности, являются минимальная смертельная доза (Dim) и средняя смертельная доза (LD50).

Для определения Dim и LD50 фильтрат бульонной культуры разводят стерильным изотоническим раствором хлорида натрия в сотни, тысячи и миллионы раз. Каждую дозу токсина испытывают одновременно на 6—10 животных. Для постановки проб подбирают животных, наиболее чувствительных к исследуемому токсину. Например, дифтерийный токсин титруют на морских свинках, столбнячный токсин ——на мышах.

При учете полученных результатов в протоколе опыта отмечают дозу введенного токсина, способ его введения, массу тела животного и время наступления его гибели после введения токсина.

ИММУНИТЕТ И МЕТОДЫ ЕГО ИЗУЧЕНИЯ

Под термином «иммунитет» (от лат. immunitas — избавление от дани) подразумевают систему наследственно полученных и индивидуально приобретенных защитных анатомо-. физиологических признаков, которые обеспечивают постоянство внутренней среды макроорганизма, определяют невосприимчивость его к действию патогенных микробов и их токсинов.

Иммунитет может быть врожденным и приобретенным. Врожденный иммунитет, являясь преимущественно видовым признаком, развивался в процессе длительной эволюции взаимоотношений макроорганизма и патогенного микроба. В результате в организме животного и человека формировались тканевые и гуморальные защитные приспособления, обусловливающие состояние невосприимчивости к неко-

Торым инфекционным заболеваниям, передающимся по наследству.

Примером видового иммунитета может служить невосприимчивость человека к куриной холере, животных — к дизентерии, птиц— к сибирской язве, лягушек — к столбняку. Напряженность видового иммунитета настолько высока, что заражение естественно резистентных экспериментальных животных заведомо смертельными дозами вирулентных микробов не нарушает присущего им иммунитета и не вызывает заболевания.

Приобретенный иммунитет по характеру происхождения делится на естественный и искусственный, а по механизму своего действия — на активный и пассивный.

При активных формах естественно и искусственно лриобретенного иммунитета организм сам вырабатывает антитела —— защитные вещества белковой природы, действие которых направлено против микробов и продуктов их жизнедеятельности. Современной наукой установлено, что антитела вырабатываются лимфоидной системой, клетки которой сконцентрированы в лимфоидных органах (селезенка, лимфатические узлы, вилочковая железа) и рассеяны в подкожной клетчатке и подслизистых слоях пищеварительного, дыхательного тракта и мочеполовой системы.

Естественно приобретенный активный иммунитет возникает в результате перенесенного инфекционного заболевания или повторных инфицирований организма, не сопровождающихся клинически выраженными симптомами болезни.

Искусственно приобретенный активный иммунитет создается в результате вакцинации, когда в ответ на введение живых ослабленных или убитых микробов, а также продуктов их жизнедеятельности в организме животных или человека образуются антитела, аналогичные тем, которые возникают при естественно приобретенном активном иммунитете.

Приобретенный активный (естественный или искусственный) иммунитет не передается по наследству и для многих инфекционных заболеваний, не будучи пожизненным, утрачивается с годами.

При пассивном иммунитете в организм вводятся готовые антитела. Естественно приобретенный пассивный иммунитет к некоторым инфекционным заболеваниям имеют новорожденные, приобретая антитела в период внутриутробного развития через плаценту и после рождения — через молоко матери.

Искусственный пассивный иммунитет воспроизводится посредством введения в организм животных и человека иммунных сывороток, содержащих антитела. Защитное действие ив-

кусственно приобретенного пассивного иммунитета начинается в ближайшие часы после введения иммунной сыворотки и прекращается через 2—3 нед вследствие разрушения введенных в организм антител.

Для активных и пассивных форм естественного и искусственного иммунитета характерна высокая специфичность, обусловленная тем, что защитные антитела, формирующиеся в процессе иммуногенеза или введенные в организм с иммунной сывороткой, реагируют только с теми бактериями и продуктами жизнедеятельности тех микробов, против которых они вырабатывались.

Наряду со специфическими механизмами иммунитета в комплексе защитных реакций организма большая роль принадлежит факторам естественной невосприимчивости, которые, не обладая какой-либо иммунологической специфичностью, обеспечивают защиту организма при встрече его с различными видами патогенных и непатогенных микробов. Неспецифическая защита организма осуществляется с участием клеточных систем в виде фагоцитоза и местной воспалительной реакции, препятствующих распространению микробов в организме, а также гуморальных факторов, в частности лизоцима и комплемента, которые в совокупности обусловливают бактериостатическое и бактериолитическое действие сыворотки.

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯФАКТОРОВ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА

Во всех иммунологических реакциях основным компонентом является антиген — вещество белковой природы, обладающее двумя свойствами: способностью вызывать иммунологический процесс в организме и соединяться с антителами в серологических реакциях.

Микробная клетка представляет собой сложный антигенный комплекс. С телом ее связан соматический (от лат. soma — тело) антиген, обозначаемый буквой《0》.У подвижных микробов обнаружен жгутиковый антиген 《Н》・ Микроорганизмы, находящиеся в капсульной форме, имеют капсульный антиген.

Разные виды микробов имеют различные видовые антигены, специфические для каждого вида, и типовые антигены, обусловливающие существование различных серологических типов внутри вида.

Родственные между собой виды микробов могут иметь общие, или групповые, антигены. Они обнаружены у представителей бактерий кишечной группы: бактерий брюшного тифа, паратифа А, В и др.

При введении в организм животного каждый антиген стимулирует образование особых белковых веществ — антител,

1131136 Лабинская А. С.

113

113

относящихся к у-глобулнново立 фракции сыворотки. Отличительной особенностью антител является их способность образовывать специфические соединения с соответствующими антигенами. Антитело можно обнаружить in vitro. Для этого к сыворотке крови, содержаще立 антитела, прибавляют бактерии, вызвавшие их образование, или белок микробов, полученный посредством разрушения бактериальных тел. Внешним проявлением реакции взаимодействия антигена с антителом в пробирке может быть агглютинация, т. е. образование видимых хлопьев вследствие скучивания и склеивания целых микробных клеток; преципитация — осаждение видимого осадка, состоящего из вступивших друг с другом в соединение белков — антигена и антител; бактериолиз —растворение микробных тел и др.

Реакции взаимодействия антитела с антигеном получили название серологических от лат. serum — сыворотка.

Серологические реакции отличаются высокой специфичностью. Это позволяет использовать их при решении двоякого рода задач: 1) для обнаружения в сыворотке крови антител к тому или иному микробу с помощью известного специфического антигена (при серодиагностике заболевания); 2) для установления вида или типа выделенного микроба по его антигенной структуре с помощью диагностической сыворотки, содержащей известные специфические антитела.

Посуда и аппаратура для постановки серологических реакций. Посуда. Пробирки бактериологические или химические, агглютинационные, преципитационные и центрифужные. Колбы Эрленмейера и плоскодонные. Пипетки пастеровские и пипетки (без вредного пространства) объемом 10 и 5 мл с делениями по 0,1 мл; пипетки объемом 1——2 мл с делениями по 0,01 мл. Градуированные цилиндры различной емкости. Посуда для серологических реакций должна быть чистой и сухой. Для обработки ее не должны применяться дезинфицирующие средства, кислоты и щелочи. Посуду кипятят в простой воде. Вымытые пипетки просушивают этиловым спиртом. Стерилизовать серологическую посуду не обязательно.

Аппаратура. Штативы с гнездами, соответствующим и диаметру пробирок. Термостат и водяная баня с терморегуляторами. Центрифуга на 2000—3000 об/мин. Агглютиноскоп. Микротитратор «Такачи». В последнее время при. постановке серологических реакций стеклянные пробирки стали заменяться полистероловыми панелями с лунками объемом от 0,5 до 1,2 мл, а при работе с малыми количествами сыворотки оказались незаменимыми микротитраторы системы «Такачи» (Венгрия).

Микротитратор «Такачи» имеет три основные части:

полистероловые прозрачные пластинки (129X93 мм) с лунками, заменяющие пробирки;

приспособления для взятия и разбавления исследуемых сывороток — разбавители. По размеру различают 2 типа разбавителей: меньший, рассчитанный на взятие жидкости в количестве 0,025 мл, и больший — на 0,05 мл. Размер разбавителей стандартен и при пользовании не требует дополнительной калибровки;

стеклянные пипетки с капельницами для разливки стандартных (предусмотренных условиями опыта) объемов растворителя.

Каждая пластинка имеет на своей поверхности 8 рядов по 12 лунок. Различают пластинки типа U с полусферическим профилем сечения лунок, предназначенные для реакции связывания комплемента, и пластинки типа V — с коническим профилем сечения для постановки реакции гемагглютинации.

Разбавители — приспособления для взятия и разбавления исследуемой сыворотки, представляют собой тонкие стержни из термостойкого металла. На одном конце стержня находится легкая металлическая рукоятка, на другом — наконечник, представляющий собой головку полусферической формы, состоящую из платиновых пластин с вертикальными прорезями. Верхние концы пластин спаяны с осью стержня, нижние образуют по его окружности капиллярную щель. Конец оси, выступающий на каркас разбавителя, служит опорой, предохраняющей головку от деформации во время работы, облегчает возможность ее вращения и предотвращает образование царапин на дне лунок полистероловых пластин.

Принцип действия разбавителя основан на свойстве капиллярности и поверхностного натяжения жидкости. Капиллярность обеспечивает проникновение и заполнение полости головки исследуемой жидкостью в момент соприкосновения с ее поверхностью, поэтому погружать головку в глубину жидкости нет никакой необходимости. При отделении разбавителя от поверхностного слоя жидкости она удерживается в полости головки силой поверхностного натяжения. Поскольку при постановке серологических реакций чаще всего готовят несколько параллельных рядов разведений, брать исследуемую сыворотку целесообразно несколькими разбавителями одновременно, держа их в руке, как веер (рис. 17).

Стеклянные пипетки с капельницами для приготовления серийных разведений снабжены конусом Луе- ра, посредством которого капельная насадка надевается на пипетку, как игла на шприц. Капельные насадки представляют собой пластмассовый конус с вделанной в него стальной трубочкой, конец которой оформлен таким образом, что при заполнении пипетки изотоническим раствором хлорида натрия, буферным раствором, а также белковым раствором с я* 115

Рис. 17. Прибор Такачи~ аппарат для серологиче- скоро 'микротитроваиия. Приготовление серий* иых разведений.

/ — общий вид; 2 —схемаработы с аппаратом Такач№(объясяеяие в тексте}.

концентрацией белка до 10% образуется капля стандартной* величины, равная 0,025 мл.

При стекании жидкости через пипетку формирование капли происходит на конце трубочки. В исключительно редких случаях, когда пипетка долгое время находится в растворителе, капля может образоваться на наружной боковой поверхности трубки. В этих случаях пипетку следует протереть ватой или лигнином.

Пользуясь капельной насадкой пипетки, разливают растворитель (буферный или изотонический раствор хлорида натрия) в лунки пластин по одной (0,025 мл) или две (0,05 мл) капли в соответствии с условиями реакции. При разливке жидкости пипетку для правильного образования капель держат вертикально, на высоте 1 см от пластин, регулируя темп образования капель указательным пальцем одной руки и направляя трубочку пипетки в середину лунок пальцами другой руки так, чтобы образующиеся капли падали на дно лунок, а не стекали по ее стенке.

После заполнения лунок растворителем головки разбавителей, содержащие исследуемую сыворотку, помещают & первый ряд лунок так, чтобы ось, выступающая за каркас головки, упиралась в дно лунок, а концы рукояток, расположенные в один ряд, было удобно вращать вокруг оси рукой. Вращение головки разбавителя обусловливает интенсивное перемешивание жидкости, основанное на засасывании растворителя через капиллярную щель снизу и удалении его под действием центробежных сил через вертикальные боковые прорези платиновых пластинок. После 4—5-кратного вращения головки разбавителя, обеспечивающего надежное перемешивание и разведение сыворотки в 2 раза, его переносят из первого ряда лунок во второй, повторяя в нем предыдущую^ операцию.

По окончании приготовления последних разведений, определяемых в каждом конкретном случае условиями реакции, разбавители на несколько секунд оставляют в горизонтальном положении на смоченном лигнине для освобождения полости головки от находящейся в ней жидкости. После этого их промывают дистиллированной водой, повторяют операцию с лигнином и затем обжигают на пламени горелки до появления желтого окрашивания платиновых пластин.

В приготовленные таким образом серийные разведения сывороток с помощью капельной пипетки вносят необходимые реактивы. При этом перемешивание веществ в лунках обеспечивается завихрением жидкости, вызываемым падением капли.

В принципе с помощью микротитратора можно воспроизвести любую серологическую реакцию, основанную на серий-

ном разведении сыворотки, составив предварительно схему ее постановки и рассчитав оптимальные концентрации ее ингредиентов.

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ

Агглютинацией называется обнаруживаемое невооруженным глазом склеивание и выпадение в осадок микробных тел ври взаимодействии их со специфическими антителами — агглютининами. Видимая фаза агглютинации наступает в присутствии раствора электролита. Агглютинины содержатся в сыворотке крови человека и животных, перенесших инфекцию или искусственно иммунизированных соответствующим видом микроба.

Благодаря специфичности и простоте постановки реакция агглютинации получила широкое распространение в микробиологической практике для диагностики многих инфекционных заболеваний.

Существуют различные модификации постановки реакции агглютинации. Из них наибольшее значение имеют:

Макроскопическая объемная агглютинация в пробирках (классический метод).

Ускоренная ориентировочная реакция агглютинации на предметном стекле.

Постановка развернутой реакции агглютинации объемным способом. Для постановки реакции агглютинации требуется: 1) сыворотка крови, подлежащая исследованию, в количестве ОД——0,2 мл; 2) изотонический раствор хлорида натрия; 3) корпускулярный антиген: взвесь живых или убитых бак-' •терий (диагностикум).

Приготовление разведений сыворотки ^больного. Из сыворотки, с которой предполагается ставить реакцию агглютинации, готовят ряд последовательных двухкратных разведений, чаще всего от 1 :50—1 : 100 до 1 : 1600— i:3200. В отдельной пробирке готовят первое, основное, раз- ъедение сыворотки, обычно 1 :50 или 1 : 100. Для этого градуированной пипеткой емкостью 1 мл набирают 0,1 мл сыворотки, другой пипеткой емкостью 10 мл прибавляют к ней ■4,9 мл (1:50) или 9,9 мл (1 : 100) изотонического раствора хлорида натрия. Жидкость в пробирке тщательно перемеши- ъают, набирая ее в пипетку и выдувая в пробирку. Основной раствор сыворотки используют для приготовления ряда последовательных разведений.

В штатив устанавливают ряд агглютинационных пробирок. На первой пробирке ряда пишут наименование антигена, который будет введен в реакцию, и указывают номер исследуемой сыворотки. На каждой пробирке ряда обозначают степень разведения находящейся в ней сыворотки. Две по- 118

следние пробирки ряда предназначены для контроля антигена и сыворотки. На них ставят условные обозначения: КА — контроль антигена и КС — контроль сыворотки.

Во все пробирки, за исключением первой и последней (КС), наливают по 1 мл изотонического раствора хлорида натрия, пользуясь для этой цели градуированной пипеткой емкостью 5—10 мл. Затем из сосуда с основным разведением сыворотки (например, 1: 100) берут 3 мл и наливают по 1 мл в 1-ю, 2-ю и в последнюю пробирку (КС). Далее 1 мл содержимого 2-й пробирки переносят в 3-ю, из 3-й пробирки такое же количество — в 4-ю, из 4-й — в 5-ю. Из 5-й пробирки (последняя опытная) 1 мл содержимого выливают в банку с дезинфицирующим раствором для сохранения одинакового объема (1 мл) во всех пробирках.

Таким образом, разведение сыворотки в первой пробирке соответствует основному ее разведению (1 : 100); в последующих пробирках получается ряд последовательных двукратных разведений: 1 :200, 1 : 400, 1 :800, 1 : 1600.

Вместо 1 мл можно разливать в пробирки по 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия и соответственно прибавлять по 0,5 мл основного разведения сыворотки, в результате чего объем окончательных разведений сыворотки во- всех пробирках будет составлять 0,5 мл.

По окончании разведений во все пробирки ряда, за исключением КС, прибавляют по 1—3 капли антигена, содержащего 2 млрд, живых или убитых микробных тел в 1 мл. После этого жидкость в пробирках становится слегка мутноватой.

После добавления антигена к разведенной сыворотке штатив с пробирками встряхивают для лучшего перемешивания сыворотки с изотоническим раствором хлорида натрия, ставят на 2 ч в термостат при 37℃, а затем учитывают предварительный результат реакции. Окончательный результат регистрируют через 18——20 ч стояния пробирок при комнатной температуре (табл. 11).

Таблица 11

Схема постановки реакции агглютинации объемным методом

Ингредиент

№ пробирки

КА

КС

1-я

2-я

З-я

4-я

5-я

6-я

7-я

Изотонический раствор

—

1

1

1

1

1

хлорида натрия, мл Сыворотка, мл

1

1

1

1

—

1

Полученное разведение

1 ： 100

1 ：200

1 ：400

1 ：800

1:1600

—

—

Антиген, капли

3

3

3

3

3

Положительный результат реакции агглютинации характеризуется образованием на дне пробирки осадка с выраженным просветлением надосадочной жидкости. Остаток на дне пробирки, образовавшийся в результате склеивания микробных тел, называется агглютинатом. По характеру аг- тлютината различают мелкозернистую (О) и круп- -нохлопчатую ;(：Н) агглютинацию. О-агглютинины, возникшие в организме под действием соматического О-антигена, -обусловливают склеивание микробных тел с образованием компактного мелкозернистого осадка, оседающего на дно пробирки в виде кучки. Мелкозернистая агглютинация протекает медленно, учитывается после 2-часового пребывания в термостате и 18—20-часового выдерживания пробирок при комнатной температуре. Н-агглютинины, появляющиеся-в организме в ответ на введение жгутикового антигена, вызывают склеивание бактериальных клеток посредством их жгутиков с образованием крупных хлопьев, похожих на снежинки. Выпадая на дно пробирки, крупнохлопчатый агглютинат лриобретает форму опрокинутого вниз зонтика. Крупнохлоп- ••чатая агглютинация наступает и заканчивается в течение 2 ч пребывания пробирок в термостате. Жгутиковые агглютинины, как правило, достигают более высокого титра, чем соматические. Крупнохлопчатый Н-агглютинат легко обнаруживается простым глазом.

Для выявления мелкозернистого О-агглютината приходится пользоваться агглютиноскопом или вогнутым зеркалом.

Учет результатов реакции агглютинации начинают с просмотра контрольных пробирок. Реакция может считаться положительной лишь в том случае, если в пробирках с контро- лями жидкость остается совершенно однородной： в КА —— слегка мутной, в КС ——прозрачной.

Для регистрации результатов реакции агглютинации пользуются четырехкрестной системой обозначения:

+ + полная агглютинация, при которой большой осадок на дне располагается кучкой или в форме открытого перевернутого зонтика； надосадочная жидкость в пробирке совершенно прозрачна;

4- почти полная агглютинация; осадок такой же, как в предыдущем случае; жидкость почти прозрачная;

лабая агглютинация; небольшой осадок, жидкость непрозрачная;

4- отмечают следы агглютинации: осадок едва заметен; жидкость непрозрачная;

— отрицательная реакция: содержимое пробирок равномерно мутное, без осадка, ло виду неотличимо от содержимого пробирки КА.

Последнее разведение сыворотки, в котором наблюдается •агглютинация, считают ее титром.

Определение серологического типа выделенного микроба. Серологическая идентификация микроба посредством агглютинации соответствующей специфической сывороткой явля-

ется завершающим этапом в изучении многих микробных культур. '

Неизвестный штамм микроба испытывают в реакции агглютинации с разведенной до титра иммунной диагностической сывороткой. За титр принимают конечное разведение сыворотки, при котором происходит еще отчетливая агглютинация соответствующего ей вида микроба.

Предположим, что иммунная сыворотка агглютинирует соответствующий ей микроб до разведения 1:12 800. Следовательно, титр данной сыворотки равен 1:12 800.

Подготовка антигена (неизвестный ингредиент реакции). Из микробной культуры, выращенной на скошенном мясо-пептонном агаре, готовят взвесь в изотоническом растворе хлорида натрия, содержащую в 1 мл 2 млрд, микробных тел по оптическому стандарту.

Приготовление разведений диагностической иммунной сыворотки. При определении вида- микроба пользуются набором диагностических агглютинирую-* щих сывороток. Их готовят в лаборатории, иммунизируя кроликов соответствующим антигеном, или получают в готовое виде из производственных институтов, изготовляющих бактерийные препараты. Сыворотки выпускают в высушенном виде. На этикетках ампул указаны срок годности и титр сыворотки.

Перед употреблением ампулу вскрывают, содержащуюся- в ней сыворотку растворяют в 1 мл изотонического раствора хлорида натрия и готовят из нее 3——4, в зависимости от тнтра、 сыворотки, основных разведения: 1:100, 1:1000, 1:10 000^ 1:100 000. Приготовление нескольких основных разведений сыворотки обусловлено необходимостью составления длинного ряда сыворотки в каждой последующей пробирке ряда по сравнению с предыдущей увеличивается примерно- в 1,2——1,4 раза. Разведения сыворотки готовят следующим ■ образом:

0,1 мл неразведенной сыворотки (из ампул)，+ 9,9 мл изотонического раствора хлорида натрия = 1:100.

Б. 1 мл (разведения А) + 9 мл изотонического раствора хлорида натрия =. 1:1000.

1 мл (разведения Б) + 9 мл изотонического раствора хлорида натрия =. 1 :10000.

Г. 1 мл (разведения В) + 9 мл изотонического раствора* хлорида натрия = 1 :100 000.

Из основных разведений сыворотки, условно обозначен- мых А, Б, В и Г, готовят необходимые для постановки реак- жии разведения, придерживаясь при этом схемы расчета, дан-* кой в табл. 12.

В состав каждого агглютинационного ряда вводят разве- аения диагностической сыворотки, начиная от 1:100 и кончая титром сыворотки, указанной на ее этикетке.

При проведении основного опыта в штатив устанавливают ряд агглютинационных пробирок, количество которых определяется титром иммунной сыворотки. Количество рядов соответствует числу диагностических сывороток, участвующих в опыте.

На 1-й пробирке каждого ряда указывают название агглютинирующей сыворотки. На каждой пробирке надписывав ют степень разведения находящейся в ней сыворотки. После этого из приготовленного ряда разведений берут по 1 мл сыворотки и переносят последовательно в ряд агглютинационных пробирок так, чтобы степень разведения сыворотки соответствовала надписи на пробирке. В предпоследнюю пробирку ряда (контроль антигена) сыворотку не наливают. В последнюю пробирку (контроль сыворотки) наливают 1 мл .наименьшего разведения сыворотки, содержащегося в 1-й пробирке данного ряда. Перенос сыворотки из пробирок основного ряда в пробирки агглютинационные, начиная от 'больших р азведений и переходя к меньшим, можно производить одной и той же пипеткой. В пробирки с разведениями сыворотки прибавляют по 0,5 мл антигена — взвеси изучаемого микроба, содержащей 2 млрд, микробных тел в 1 мл. Затем штатив с пробирками встряхивают и ставят в термостат на 2 ч, после чего производят предварительный учет результатов. Окончательный результат регистрируется после 18—20 ч стояния пробирок при комнатной температуре. Учитывают получаемые результаты так же, как при выявлении агглютининов в исследуемой сыворотке больного (см. с. 120).

Соответствие между видом или типом микроба и диагностической агглютинирующей сывороткой считается достоверным при условии четко выраженной реакции агглютинации в пробирках с разведением сыворотки в пределах з/$ ее титра и выше (табл. 12).

Ориентировочная (пластинчатая) реакция агглютинации. Пластинчатой реакцией агглютинации на предметном стекле часто пользуются для определения вида микроба. На поверхность хорошо обезжиренного предметного стекла наносят с помощью пастеровской пипетки 2 капли агглютинирующей сыворотки и 1 каплю изотонического раствора хлорида натрия. Капли располагают на некотором расстоянии друг от друга, чтобы исключить возможность их слияния.

Затем в каплю изотонического раствора хлорида натрия (КА) и в одну из капель агглютинирующей сыворотки вносят исследуемую бактериальную культуру, снятую с поверхности плотной питательной среды. Ко второй капле (КС) культуру 122

не добавляют. Внесенную культуру тщательно перемешивают, чтобы капля жидкости сделалась равномерно мутной. Реакция протекает при комнатной температуре. Результат учитывают с помощью лупы через 5—10 мин. Учет реакции можно, производить и через больший промежуток времени (30— 40 мин), но для этого предметные стекла, на которых постав* лена реакция, кладут в чашку Петри с влажным комочком ваты и закрывают крышкой (влажная камера), исключая таким образом испарение и высыхание капель. При положительной реакции в капле с сывороткой отмечается скучивание бактерий в виде зернышек или хлопьев, хорошо видимых через лупу (Х'5) при покачивании стекла. Жидкость в КА остается равномерно мутной, а в КС ——прозрачной.

Групповая реакция агглютинации и способ ее устранения, по Кастеллани. Некоторые микроорганизмы, кроме специфических видовых антигенов, содержат групповые антигены, общие для родственных видов бактерий. При парентеральном введении таких бактерий в организме животного и человека появляются двоякого рода антитела-агглютинины: специфические, соответствующие видовым антигенам, и неспецифические, возникающие под действием групповых антигенов.

Сыворотка, содержащая групповые агглютинины, агглютинирует различные родственные между собой микробные виды, имеющие общий групповой антиген.

Реакция агглютинации, при которой один и тот ж е микроб агглютинируется различными сыворотками или одна сыворотка агглютинирует различные микробы, получила пазва- н и е групповой.

Для ес устранения итальянским ученым Кастеллани предложен метод специфической адсорбции антител. Сущность его заключается в том, что при насыщении иммунной сыворотки гомологической культурой бактерий на них адсорбируются как специфические, так и групповые агглютинины, тогда как- насыщение сыворотки гетерологическим штаммом делает возможным удаление из нее групповых и сохранение специфических антител.

Метод адсорбции антител находит широкое применение- при изучении антигенной структуры микроорганизмов, при иммунологическом анализе антисывороток, а также при изготовлении диагностических сывороток.

Адсорбированные сыворотки. В настоящее время для устранения групповой реакции агглютинации пользуются строго специфическими сыворотками, которые содержат в своем составе только видовые или типовые антитела и соответствуют определенному виду или типу микроба.

Эти сыворотки получили название адсорбированных м монорежепторных. Адсорбированные сыворотки мо-

гут быть монорецепторными, т. е. содержать только один вид агглютининов, или поливалентными — содержать два рецептора или больше.

В Советском Союзе адсорбированные сыворотки готовят для идентификации дизентерийных бактерий, сальмонелл, холерных и нехолерных вибрионов, бруцелл. Для производства адсорбированных и монорецепторных с&вороток подбирают « селекционируют штаммы микробов, предназначенные специально для иммунизации животных.

Для устранения групповых антител сыворотки насыщают последовательно культурами родственных микробов, которые адсорбируют содержащиеся в сыворотке групповые агглютинины.

Адсорбированные агглютинирующие сыворотки применяют в реакции агглютинации на стекле с целью идентификации и изучения антигенной структуры микробов.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации

Сущность непрямой, или пассивной, реакции гемагглютинации (РИГА) заключается в том, что эритроциты, обладая способностью адсорбировать на себе антигены, становятся «чувствительными» (сенсибилизированными) к соответствующей иммунной сыворотке. Под воздействием специфических антител сенсибилизированные эритроциты склеиваются и выпадают в осадок, образуя на дне пробирки гемагглютинат.

Отличаясь высокой чувствительностью и специфичностью, РИГА позволяет обнаруживать минимальные количества - антител и неполноценные антигены полисахаридной природы.

Для постановки РИГА требуются:

Сыворотка, подлежащая исследованию.

Растворимый антиген для сенсибилизации эритроцитов.

Эритроциты.

Изотонический раствор хлорида натрия.

Реакцию непрямой гемагглютинации ставят в пластинках из органического стекла с лунками.

Подготовка эритроцитов для постановки РГА. Для постановки этой реакции пользуются свежими или консервированными эритроцитами барана, быка или человека, полученными из дефибринированной крови. Для консервации эритроцитов используют раствор Олсвера (рец. 22, с. 347) или Мигулиной (рец. 23).

Из крови берут осадок эритроцитов в объеме 0,1——1 мл и 2—3 раза отмывают его от остатка сыворотки в десятикратном объеме стерильного изотонического раствора хлорида натрия. После каждого центрифугирования (при 2000— 3000 об/мин) надосадочную жидкость сливают, заменяя свежим изотоническим раствором хлорида натрия.

Отмытые эритроциты могут быть использованы в течение 48 ч в случае хранения их в холодильнике при температуре 3—4℃.

После промывания эритроцитов приступают к сенсибилизации их антигеном. Отмытые эритроциты в объеме от 0,1 до 1 мл смешивают с антигеном, количество которого определяется его качеством и способностью адсорбироваться на эритроцитах. Смесь антигена с эритроцитами помещают в термостат на 1——2 ч, а иногда, по условиям опыта, на более продолжительное время. После инкубации взвесь сенсибилизированных эритроцитов центрифугируют, отмывают 2—3 раза изотоническим раствором хлорида натрия и из промытого осадка готовят 0,5—1 % взвесь эритроцитов для постановки реакции гемагглютинации. Приготовленная взвесь может храниться в холодильнике при температуре 3—4℃ до появления признаков гемолиза.

Однако описанный способ сенсибилизации эритроцитов пригоден только для тех случаев, когда антиген относится к группе полисахаридов. Антигены белковой природы адсорбируются эритроцитами очень слабо и поэтому при добавлении соответствующей иммунной сыворотки реакция гемагглютинации не наступает.

Для адсорбции крупномолекулярных антигенов белковой природы эритроциты предварительно обрабатывают танином, который уплотняет и изменяет физико-химические свойства их поверхности и повышает адсорбционную способность. Взвесь эритроцитов (2,5%) в изотоническом растворе хлорида натрия pH 7,2 смешивают с равным объемом раствора танина 1:20 000, приготовленного на обычном изотоническом растворе хлорида натрия, и ставят на 10——15 мин в термостат или водяную баню при 37℃. По истечении указанного времени смесь центрифугируют, надосадочную жидкость сливают, а осадок эритроцитов промывают фосфатно-буферным раствором при pH 7,2. Надосадочная жидкость может быть окрашена в желтый или желтовато-розовый цвет, что обусловлено токсическим влиянием танина на эритроциты.

После обработки танином устойчивость эритроцитов, взвешенных в изотоническом растворе хлорида натрия, снижается. Поэтому для приготовления стойкой взвеси пользуются стабилизатором —— раствором нормальной сыворотки кролика. Сыворотку, полученную от кроликов-доноров, инактивируют при температуре 56°С в течение 30 мин, истощают от неспецифических гемагглютининов, прибавляя к 1 мл инактивированной сыворотки 0,5 мл осадка отмытых нормальных эритроцитов. Смесь выдерживают 30 мин при комнатной температуре, центрифугируют, отсасывают сыворотку и непосредственно перед использованием разводят ее в 100 «ли 250 раз.

Подготовка исследуемых сывороток для постановки РГА. Сыворотку, подлежащую исследованию, разводят в 2——10 раз изотоническим раствором хлорида натрия и удаляют из нее неспецифические антитела. Для этого к 1 мл разведенной сыворотки прибавляют по 2 капли нормальных отмытых эритроцитов барана. Смесь выдерживают 15—20 мин при комнатной температуре, после чего центрифугируют. Операцию адсорбции неспецифических антител повторяют 3 раза на одних и тех же эритроцитах. После последнего центрифугирования надосадочный слой, представляющий собой разведенную сыворотку, освобожденную от неспецифических гем агглютининов, отсасывают пастеровской пипеткой и инактивируют 30 мин при температуре 5б℃.

Для устранения неспецифических гемагглютининов вместо адсорбции можно пользоваться прогреванием исследуемых сывороток при температуре 65℃ в течение 20 мин.

Техника постановки реакции. Из исследуемой сыворотки готовят ряд последовательных разведений (с учетом того разведения, которое было сделано до прибавления эритроцитов). При серодиагностике разных видов инфекций пределы разведений сыворотки различны. Приготовленные разведения сыворотки разливают в лунки по 0,5 мл.. К каждому разведению исследуемой сыворотки прибавляют от 0,1 до 0,5 мл (в зависимости от частного случая) 0,5—1 % взвеси сенсибилизированных эритроцитов. Каждый опыт сопровождается постановкой контролен на отсутствие спонтанной агглютинации (1 и 2) и контролем на специфичность реакции (3 и4): -

0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия + рабочая доза сенсибилизированных эритроцитов.

0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия + рабочая доза несенсибилизированных эритроцитов.

Иммунная сыворотка, взятая в разведении, соответствующем ее титру (последнее разведение, дающее положительную реакцию в РИГА), + рабочая доза сенсибилизированных эритроцитов.

Нормальная сыворотка, нс содержащая специфических антител, + рабочая доза сенсибилизированных эритроцитов.

Результат реакции агглютинации учитывают после осаждения эритроцитов в контрольных пробирках непосредственно после инкубации в термостате при температуре 37℃ или после дополнительного выдерживания при комнатной температуре в течение 18—24 ч.

Результаты оценивают по внешнему виду осадка эритроцитов в лунках. В положительном случае, обозначаемом знаком + , эритроциты равномерно в виде《зонтика》покрывают почти все дно пробирки или лунки. При наклоне из осадка образуются хлопья. При отрицательном результате (—) эрмт-

роциты оседают в зависимости от дна пробирки в форме компактного комочка, «пуговки» или маленького колечка в самом низком месте дна. При наклоне образуется равномерная муть. Сомнительные случаи, обозначаемые знаком +, требуют повторения постановки реакции в целях ее уточнения.

Реакция торможения непрямой гемагглютинации

Реакция торможения непрямой агглютинации (РТНГА), предложенная для обнаружения и титрования в исследуемых субстратах микробных антигенов и антител, основана на участии трех компонентов: антигенов, антител и эритроцитов с адсорбированными на них антигенами (если задачей реакции является выявление и титрование антител) или антителами (если реакция ставится в целях обнаружения соответствующих специфических антигенов). РТНГА ставят в пластинках из органического стекла с лунками в объеме 1,5——2 мл или в микротитраторе «Такачи». Перед постановкой реакции из исследуемых сывороток, разведенных в 2—10 раз изотониче- •ским или буферным раствором хлорида натрия, удаляют неспецифические гемагглютинины.

Определяют рабочую дозу антигена в РИГА. Для этого готовят двукратные разведения антигена в объеме 0,5 мл (при работе с микротитратором — в объеме 0,05 мл). Во все лунки приготовленных разведений антигена вносят по 0,25 мл (или соответственно по 0,025 мл) .1% взвеси эритроцитов, ■сенсибилизированных антителами, гомологичными титруемому антигену. Содержимое лунок тщательно перемешивают путем легкого постукивания по углам панели и оставляют на 1—Р/г 叮 при комнатной температуре до полного оседания эритроцитов. За 1 антигенную единицу (АЕ) связывания принимают наибольшее разведение антигена, образующего осадок эритроцитов в виде перевернутого зонтика. В качестве рабочей дозы для РТНГА используют 4 АЕ.

После удаления неспецифических гемагглютининов из исследуемой сыворотки и определения рабочей дозы антигена приступают к постановке РТНГА. Из исследуемой сыворотки готовят ряд последовательных разведений с учетом того разведения, которое было сделано при удалении из нее не- <пецифических гемагглютининов. При постановке реакции обычным способом сыворотку разводят в объеме 0,5 мл, при постановке в микротитраторе — в объеме 0,025 мл.

Постановке реакции сопутствуют два контроля: КС и КА.

КС: 0,5 мл (или 0,025 мл) взятого в опыт наименьшего разведения исследуемой сыворотки с добавлением вместо антигена равного объема буферного или изотонического раствора хлорида натрия.

KA: 0,5 мл (или 0,025 мл) антигена в рабочей дозе с добавлением вместо сыворотки равного объема буферного или изотонического раствора хлорида натрия.

К каждому разведению сыворотки (кроме КС) добавляют рабочую дозу антигена в объеме 0,5 мл (или 0,025 мл). Содержимое лунок тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре или температуре термостата (в соответствии с условиями реакции) на время, необходимое для нейтрализации системы антиген ——антитело.

По истечении времени, необходимого для осуществления реакции, во все лунки ряда, в том числе в лунки с КС и КА, добавляют в объеме 0,1—0,5 мл (при микрореакции—в объеме 0,025 м) 1% взвесь сенсибилизированных эритроцитов с предварительно оттитрованной рабочей дозой антигена.

Для лучшего перемешивания смеси панель постукивают по углам и оставляют при комнатной температуре или температуре термостата на время, которое по условиям реакции необходимо для агглютинации сенсибилизированных эритроцитов гомологичным антигеном.

Результат реакции оценивают по внешнему виду осадка эритроцитов. При положительной реакции на дне лунки образуется диск или кольцо из осевших эритроцитов. Это свидетельствует о наличии в исследуемой сыворотке антител, гомологичных добавленному антигену, вследствие чего агглютинации эритроцитов не происходит. При отрицательной реакции сенсибилизированные эритроциты, агглютинированные свободными антителами, располагаются в виде перевернутого на дне лунки зонтика.

Реакция преципитации

Реакция преципитации относится к числу наиболее простых и ускоренных методов серологического анализа. В основе реакции лежит образование видимого осадка, состоящего из вступивших друг с другом в соединение антител и молекулярных антигенов (например, бактериальных белков или полисахаридов, образовавшихся при разрушении микробных тел). По своей сущности реакция преципитации аналогична реакции агглютинации. Основным различием между ними является то, что в первом случае применяется корпускулярный антиген, а во втором — антиген представляет собой коллоидное вещество белковой или полисахаридной природы.

Другим существенным различием является то, что агглютинация представляет собой количественный метод исследования, с помощью которого устанавливают титр агглютининов, содержащихся в исследуемой сыворотке крови. Реакция преципитации — качественный метод исследования, при котором диагностическое значение имеет появление есад* ка в реагирующих жидкостях.

Для обозначения антигенов, участвующих в реакции преципитации, принят термин «преципитиноген», для антител —«преципитин», для специфического осадка, образующего в результате реакции — «преципитат». Преципитат, возникающий вследствие укрупнения коллоидных частиц антигена, может иметь вид кольца, формирующегося на границе антигена с иммунной сывороткой, или аморфного осадка, выпадающего на дно пробирки.

Реакцию преципитации используют для: 1) выявления специфических антител в исследуемой сыворотке на основе применения определенных антигенов; 2) обнаружения антигенов белковой или полисахаридной природы с использованием известной специфической преципитирующей сыворотки.

Для постановки реакции преципитации необходимы:

L Сыворотки (в зависимости от задач опыта — исследуемые или иммунные — преципитирующие).

Антигены (также в зависимости от задач анализа — исследуемые или диагностические).

Изотонический раствор хлорида натрия pH 7,0——7,2.

Пастеровские пипетки с тонко оттянутым капилляром,

Преципитационные пробирки (диаметром 2—3 мм и высотой 2——3 см для реакции кольцепреципитации, диаметром 4 мм и высотой 4——6 см для реакции преципитации по типу флокуляции). В узких пробирках реакция преципитации наступает значительно скорее и проявляется более четко, чем в пробирках большого диаметра.

Антигены, применяемые для постановки реакции преципитации, представляя собой, как указано выше, коллоидные вещества в состоянии тонкой дисперсности, обязательно должны быть в растворимом состоянии. В качестве антигенов для реакции преципитации используют фильтраты бульонных культур, экстракты микробных тел, полученные различными способами, «полный» антиген Буавена, экстракты пораженных органов, спинномозговую жидкость, гной, мокроту и другие материалы, содержащие продукты распада возбудителей болезни. Способы приготовления антигена для постановки реакции преципитации даны в разделе частной микробиологии конкретно для каждого случая.

Преципитирующие сыворотки, приготовленные против различных видов микробов, реагируют с антигенами, полученными только от этих видов микробов. Однако наличие общих антигенов у родственных видов бактерий может обусловли-. вать возникновение групповой реакции преципитации.

Участвующие в реакции ингредиенты должны быть совершенно прозрачны. Для этого их центрифугируют или фильтруют через бактериальный фильтр.

129：129：Реакцию преципитации можно ставить в виде смеси различных разведений антигена с антителом или в виде реакции

129：

129：

9 Лабинская А. С.

кольцепреципитации с наслоением одного компонента на другой.

□ри постановке реакции преципитации в отличие от реакции агглютинации титр преципитирующих сывороток определяют по наибольшему р азведению антигена, при котором еще наблюдает- с я образование преципитата. Это объясняется тем, что в реакции преципитации участвуют мицеллы (частицы) коллоидного раствора, величина которых во много раз меньше корпускулярных антигенов и которые для образования видимого преципитата требуют в 10 000 раз большего количества антител, чем бактериальные клетки, образующие аг- глютинат.

Избыток антигена препятствует образованию и выпадению преципитата, вызывает задержку реакции преципитации, а иногда даже обусловливает ее отсутствие. Это явление получило название «зоны задержки».

Техника постановки реакции преципитации. I. В штатив устанавливают два ряда преципитационных пробирок. В пробирках первого ряда готовят несколько последовательных разведений антигена (степень начального и конечного разведений определяется способом приготовления и активностью антигена). Экстракты микробных культур разводят обычно от 2 до 64 раз. '

《Полный» антиген Буавена, представляющий собой комплекс полисахаридов и липоидов, извлеченных из тела микробной клетки, разводят в десятки и сотни тысяч раз.

В каждую пробирку второго параллельного ряда вносят 0,5 мл цельной или разведенной 1 :2 преципитирующей сыворотки. Затем разведенный антиген, находящийся в пробирках первого ряда, переносят в объеме 0,5 мл в соответствующие пробирки второго ряда.

Для предупреждения возможных ошибок при оценке результатов реакции рекомендуется ставить следующие конт- роли:

нормальная сыворотка от животного того же вида, которого иммунизировали для получения преципитирующей сыворотки, + исследуемый антиген;

специфическая преципитирующая сыворотка + изотонический раствор хлорида натрия;

специфическая преципитирующая сыворотка + заведомо соответствующий ей антиген.

Смесь антигена с сывороткой после тщательного перемешивания ставят на 2 ч в термостат, а затем на 18—20 ч оставляют при комнатной температуре. Реакцию учитывают простым глазом или при помощи лупы. В случае положительного результата в прозрачной жидкости образуют хлрпья преципитата, оседающие в виде рыхлого осадка на дно пробирки.

Предельное разведение антигена, с которым сыворотка образует преципитат, считается титром сыворотки.

. При постановке р еакции кольцепреципита- ц и и в ряд маленьких узких пробирок вносят с помощью пастеровской пипетки с длинным и тонко оттянутым капилляром по 0,1—0,2 мл сыворотки так, чтобы не смочить ею внутреннюю поверхность стенок пробирки. Затем на-поверхность сыворотки наслаивают различные разведения антигена в количестве, равном объему сыворотки, содержащейся в пробирке I

Чтобы не произошло смешивания жидкостей, пробирку в момент наслаивания антигена держат в наклонном положении, а антиген отдельными каплями наливают по внутренней поверхности стенки, пользуясь для этой цели пастеровской пипеткой с длинным, очень тонким капилляром. В результате правильного наслоения антигена в пробирке образуются два четко отграниченных, не смешивающихся при стоянии слоя. Реакция кольцепреципитации сопровождается постановкой трех обязательных контролей (см. с. 130). После добавления антигена пробирки помещают в штатив и оставляют при комнатной температуре.

При положительной реакции преципитации, отмечаемой знаком +, в течение 5—30 мин на границе соприкосновения двух жидкостей появляется хорошо видимое на темном фоне кольцо молочно-белого цвета, четко отграниченное сверху и снизу. При стоянии пробирок толщина кольца увеличивается» а четкость линий исчезает.

В контрольных пробирках, за исключением 3-й (специфическая прсципитирующая сыворотка + соответствующий ей антиген), кольца помутнения не появляются.

Реакция преципитации в агаре. В последнее время в практике иммуномикробиологических исследований широкое распространение получила реакция специфической преципитации в агаре, предложенная Уденом и разработанная Аухтерлони.

Реакция преципитации в агаре используется для изучения состава сложных антигенных смесей, обнаружения состава сложных общих антигенов у микроорганизмов, принадлежащих к различным токсономическим единицам, и для контроля степени очистки биологических препаратов.

Метод основан на том, что в силу различной дисперсности частиц антиген и антитела за определенный промежуток времени проходят в агаре различные расстояния, создавал при этом постепенно убывающие концентрации. При встрече соответствующих антигенов и антител в зоне оптимальных кон-

При постановке реакции преципитации антиген наслаивается ^обычно на сыворотку, которая ло своей относительной плотности тяжелее*антигена. Одиако если антиген имеет большую относительную плотность, чёй снв°・ ротка, порядок распределения ннгреднентов в пробирке меняется.

центраций образуются видимые простым глазом белые линии преципитата. Антиген, вступая во взаимодействие с гомологичным антителом, образует только одну линию преципитата; при участии в реакции нескольких антигенов и антител каждая система ведет себя независимо друг от друга; число образующихся зон преципитации р авно или меньше количества присутствующих в растворе систем антиген — антитело. Несоответствие между числом полос преципитации и количеством участвующих в реакции комплексов антиген —— антитело может быть обусловлено:

А. Совмещением линий преципитации, образуемых двумя различными системами антиген ——антитело.

Б. Отсутствием видимой линии преципитата из-за очень высокой или, наоборот, низкой концентрации антигенного компонента.

Таким образом, реакция приципитации, представляя собой метод качественного анализа, позволяет изучать антигенный состав бактериальных препаратов.

По технике постановки реакции преципитации различают:

метод простой диффузии, при котором одно реагирующее вещество (обычно антиген) диффундирует в агар, содержащий постоянную концентрацию другого реагирующего вещества,——иммунную сыворотку;

метод двойной диффузии, когда оба реагента, антиген и антитело, движутся навстречу друг другу через нейтральный слой агара, не содержащий ни одного реагента.

В настоящее время предложено большое количество различных вариантов и модификаций как первого, так и второго метода преципитации в агаре.

Метод простой диффузии. Агар, приготовленный специально для постановки реакции преципитации (рец. 24), растапливают в водяной бане. К расплавленной и охлажденной до температуры 45——50℃ среде приливают равное количество преципитирующей сыворотки, смесь осторожно перемешивают, чтобы не произошло вспенивания, и разливают в чашки Петри, расположенные на строго горизонтальной поверхности.

Чашки для постановки опыта подбирают одинакового размера (диаметр 90—95 мм), с ровным дном, без царапин и других изъянов, затрудняющих чтение реакции и учет результатов.

В каждую чашку наливают 6——8 мл среды, чтобы все дно чашки было равномерно покрыто агаром, слой которого должен равняться примерно 3 мм. После застудневания агара осторожно, чтобы не повредить поверхность среды, устанавливают матриксы (металлические цилиндры диаметром 0,5— 0,7 см) в количестве, соответствующем числу исследуемых антигенов.

Недопустимо, чтобы дном лунки являлась стеклянная поверхность дна чашек Петри, так как добавляемый антиген растечется между стеклом и пластинкой агара.

Располагают матриксы на расстоянии не менее 1 см друг от друга по схеме, заранее вычерченной и подложенной под дно чашки. После установки матриксов в чашку наливают еще один слой агара высотой 3——4 мм, для чего требуется 12—16 мл среды.

После застудневания второго слоя агара матриксы вынимают с помощью пинцета. Для того чтобы при этом не появлялись трещины в агаре, матрикс вначале слегка поворачивают вокруг своей оси. Образующиеся после вынимания матрикса лунки в среде заполняют исследуемыми антигенами» после чего чашки на 3—5 ч оставляют при комнатной температуре, а затем сохраняют в холодильнике при 3℃ в течение 10——14 дней. Чтобы избежать высыхания среды и испарения антигенов из лунок, чашки со стороны дна заклеивают лейкопластырем или помещают во влажную камеру.

При положительном результате реакции обычно на 7— 10-й день после постановки опыта появляются зоны преципитации мутно-белого цвета в форме концентрических окружностей, расположенных вокруг лунок. Возникновение преципитационных линий следует учитывать ежедневно. Чем тоньше слой агара в чашке, тем быстрее происходит в нем диффузия антигена и тем скорее образуется преципитат.

Метод двойной диффузии. В стерильные чашки Петри наливают 2% агар без добавления сыворотки. Так нее как в предыдущем случае, при постановке реакции методом простой диффузии устанавливают матриксы и наливают еще один слой среды.

Взаимное расположение и расстояние матриксов друг от друга (1—3 см) может варьировать в зависимости от условий опыта. Одну лунку заполняют преципитирующей сывороткой, а в другую лунку, находящуюся на некотором расстоянии от нее, наливают антиген. Чашки хранят при комнатной температуре или в холодильнике в течение 2 нед. Растворимые антигены и сыворотка диффундируют в окружающий агар во всех направлениях. При положительном результате реакции по линии контакта между двумя диффундирующими веществами происходит реакция преципитации, внешним проявлением которой служит возникновение между лунками, заполненными сывороткой и антигеном, поперечной полоски молочно-белого цвета, хорошо видимой на фоне прозрачной среды.

При использовании в опыте сложных антигенных смесей 、 в агаре, разделяющем лунки, образуется спектр линий. Число линий соответствует числу пар антиген ——антитело, однак^：.^

линий может быть меньше количества пар; это бывает в тех случаях, когда реагенты содержатся в слишком малых концентрациях, чтобы дать видимый комплекс.

Реакция гемолиза

Парентеральное введение животным эритроцитов другого вида животных сопровождается появлением в крови специфических защитных антител — гемолизинов, способных нарушать связь гемоглобина со стромой эритроцитов и обусловливать гемолиз, т. е. выхождение его в окружающую среду.

Реакцией гемолиза в иммунобактериологической практике пользуются главным образом для определения титра гемолитических сывороток. Гемолитическая сыворотка представляет собой сыворотки кролика, иммунизированного эритроцитами барана. Гемолитическую сыворотку выпускают институты бактерийных препаратов. На этикетке каждой ампулы указан титр сыворотки и обозначен срок ее годности. Перед употреблением, особенно если ампулы хранились длительное время, проверяют титр гемолитической сыворотки (табл. 12).

Титром гемолитической сыворотки называется максимальное разведение ее в объеме 0,5 мл, при котором наблюдается полный гемолиз 0,5 мл 3% взвеси бараньих эритроцитов в присутствии 0s5 мл комплемента, разведенного 1:10, после выдерживания пробирок в течение часа в термостате при 37℃.

Реакция гемолиза протекает при обязательном участии трех компонентов: .

гемолитической сыворотки, содержащей специфические антитела — гемолизины;

3% взвеси эритроцитов барана (антиген, которым иммунизировались кролики);

неспецифического фактора — комплемента (см. с. 149).

Техника постановки реакции гемолиза при определении титра гемолитической сыворотки сводится к следующему. К 0,1 мл инактивированной сыворотки прибавляют 9,9 мл изотонического раствора хлорида натрия, получая таким образом основное разведение сыворотки 1 : 100. Из основного разведения, пользуясь схемой (табл. 13), готовят ряд разведений —от 1 : 1000 до 1 :4500.

Из каждой пробирки приготовленного ряда разведений берут по 0,5 мл, переносят в свободные пробирки с надписями, соответствующими степени разведения внесенной в них сыворотки. Для переноса сыворотки из одной пробирки в другую можно пользоваться одной пипеткой, начиная работу с наибольших разведений сыворотки.

В приготовленный ряд разведений гемолитической сыворотки, разлитой в равных объемах по 0,5 мл, прибавляют 134

Схема приготовления последовательных разведений сыворотки1

Разведения ： 100 (А)=0,1 мл сы-

Разведения 1: 1000 (Б)

=1 мл разве*

Разведения 1: 10 000 (В) = 1 мл раз-

Разведения 1 : 100 000 (Г) — 1 мл

воротки 4- 9,9 мл изотонического

дения

А + 9 мл изотонического рас-

ведения Б + 9 мл изотонического рас-

разведения В + 9 мл изотоиичес-

раствора хлорида натрия

твора хлсфида натрия

твора хлорида натрия

ского

раствора хлорида натрия

разве.

изотонический

разве-

изотонический

разве-

изотонический

разве-

изотонический

денне^А

раствор хлорн-

получаемые

Пенне Б

раствор хлори-

получаемые

деиие В

раствор хлори-

получаемые

денне Г

раствор хлори-

получаемые

да натрия

разведения

да натрия

разведения

да натрия

разведения

да натрия

разведения

в мл

в мл

в мл

в мл

0,5

0,5

1 ：200

0,5

0,5

1 ：2000

0,5

0,5

1 ：20000

0,5

0,5

1 ： 200 000

0,5

1,5

1 400

0,5

1,0

1 ：3000

0,5

0,75

1! 25 000

0,5

0,75

1 ： 250 000

0,5

2,5

1 ：600

0,5

1,5

1:4000

0,5

1,0

1 ：30000

0,5

1,0

1 ： 300 000

0,5

3,5

1:800

0,5

2,5

1:6000

0,5

1,5

1 ： 40 000

0,5

1,25

1 ： 350 000

0,5

5,5

1:1200

0.5

4,5

1 ： 10 000

0,5

3,0

Ь 70 000

0,5

2,0

1 ： 500 000

0,5

6,5

1 ：1400

0,5

5,5

1 ： 12 000

0,5

3,5

1 ：80000

0,5

9,5

1:2000

0,5

8,0

1 ： 17 000

0,5

4,5

1:100000

0,5

12,0

1:25000

0,5

7,0

1:150 000

0,5

9,5

1 ： 200 000

< См. «Микробиологические методы исследования при инфекционных заболеваниях». Под ред. Г. Я. Синай и О. Г. Биргера, М., 1949.

Схема разведения гемолизина1

№ про- биркн

Геиолвзнв, мл

Изотова, ческяй раствор, мл

Полученные разведения гемолизина

1

0,1

9,9

1 ： 100 (основное

разведение)

2

0,5 основного разведения

4,5

1 ： 1000

3

5,5

1:1200

4

0,5»»

7,0

1： 1500

5

0,5>>

8,5

1 ：1800

6

0,5>»

10,0

1:2100

7

0,5»»

11,5

1:2400

8

0,5»»

13,0

1 ：2700

9

0,5>»

14,0

1 ：3000

10

0,5>>

22,0

1:4500

1 См. Б. Е. Предтеченский. Руководство по клиническим лабораторный исследоваиияи. М.. 1960.

равные количества (по 0,5 мл) 3% взвеси эритроцитов и 10%. раствора комплемента, после чего общий объем жидкости в каждой пробирке доводят изотоническим раствором хлорида натрия до 2,5 мл (табл. 14).

При постановке реакции гемолиза и титрования гемолитической сыворотки ставят три обязательных контроля:

Контроль на инактивацию комплемента (KJ・

Контроль комплемента на отсутствие в нормальной сыворотке морских свинок специфических антител (Кг).

Контроль на устойчивость эритроцитов при выдержив-а- нии их в термостате при 37 ℃ (Кз).

После того как смешают все перечисленные ингредиенты,, участвующие в реакции, штатив с пробирками энергично встряхивают и ставят в термостат на 1 ч и затем учитывают результат реакции (рис. 18).

Интенсивность гемолиза характеризуется различной степенью разрушения эритроцитов.

Реакция связывания комплемента

Реакция связывания комплемента (РСК) основана на том, что взаимодействие антигена с соответствующим специфическим антителом происходит только при участии комплемента. Реакция протекает в две фазы с участием двух систем: бактериальной и гемолитической.

В первой реакции (специфическая) участвуют антиген Ч- + антитело + комплемент.

Схема реакции титрования гемолитической сыворотки

^^Номер пробирки и разведение гемо- литической сыворотки

Ингредиент

蠹1

2

3

4

5

庙6

值7

8

'э

10

кя

К,

1:1000

1:1200

1:1500

1:1800*

1:2100

1:2400

1:2700

1:3000

1:4500

1:1000

Гемолитическая сыворотка

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

—

—

3% взвесь бараньих эритроцитов

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Комилемент ЫО

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

—

0,5

Изотонический раствор хлорида натрия

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1.0

1,0

1,0

1,0

1,5

1,5

0

Штатиф с

пробирками помещают на 1

q в термостат при температуре 37°С

Результаты реакции

Гемолиз

Гемолиз

Гемо- ЛИЗ

Гемолиз

Задержка гемолиза

Положительный результат реакции, наступающий при соответствии антител антигену, характеризуется образованием специфического бактериального комплекса антиген — антитело с адсорбированным, или, как говорят,《связанным》, комплементом. Оставаясь невидимым, комплекс не вызывает никаких внешних изменений той среды, в которой он образовался.

Отрицательный результат РСК имеет место при отсутствии специфического сродства между антигеном и антителом сыворотки и характеризуется сохранением "свободного активного комплемента.

Первая фаза РСК может проводиться в термостате при 37 ℃ (1—2 ч) или в холодильнике при 3—4℃ (18—20 ч).

При длительном образовании иммунного комплекса антиген—антитело на холоду происходит более полное связывание комплемента и вследствие этого чувствительность реакции увеличивается.

При постановке сравнительных опытов советским иммунологом акад. В. И. Иоффе и его учениками было показано, что в условиях длительного связывания комплемента на холоду можно уловить в 100—500 раз меньшие количества антигена и получить положительные результаты при больших разведениях иммунной сыворотки, чем в опыте связывания комплемента при температуре 37 ℃ в течение 1—2 ч.

Вторая фаза реакции (индикаторная) происходит между реагентами гемолитической системы (смесь 3% взвеси эритроцитов и гемолитической сыворотки в равных объемах) при температуре 37 ℃ только при наличии комплемента, остав-ше- гося свободным от первой фазы реакции (реакция отрицательная) .

При отсутствии свободного активного комплемента гемолиза эритроцитов под действием специфических гемолизинов не наступает (реакция положительная).

Реакцию связывания комплемента можно применять для:

выявления специфических антител в неизвестной сыворотке на основании взаимодействия их с антигеном известной природы;

изучения свойств антигена в реакции с известной специфической сывороткой.

Подготовка ингредиентов для постановки РСК. 1. Сыворотку крови, полученную для исследования, накануне постановки реакции прогревают в водяной бане при 56 ℃ в течение 30 мин для инактивации ее собственного комплемента. Инактивированная сыворотка может храниться при температуре 3—4℃ в течение 5—6 дней. В день постановки1 опыта сыворотку разводят изотоническим раствором хлорида натрия в соотношении 1: 5 (0,1 мл исследуемой сыворотки + 0,4 мл изотонического раствора хлорида натрия).

Антигеном для постановки РСК могут быть культуры разнообразных микробов, бактериальные белки и экстракты, полученные из микробных культур, патологически измененных и нормальных органов и тканей. Особенности приготовления антигена определяются характером инфекционного процесса и особенностями его возбудителя.

Комплементом является смесь сывороток, полученная от 3——5 здоровых морских свинок, или сухой комплемент в ампулах. Непосредственно перед употреблением сыворотку морской свинки разводят изотоническим раствором хлорида натрия в отношении 1 : 10, получая основной раствор,

Гемолитическую сыворотку перед постановкой опыта инактивируют прогреванием при температуре 56 ℃ в течение 30 мин. Для постановки основного опыта РСК, а также для титрования комплемента и антигена применяют гемолитическую сыворотку в тройном титре. Например, если титр гемолитической сыворотки 1: 1800, в реакции применяют разведение сыворотки 1 : 600.

Эритроциты получают из дефибринированной крови барана. Кровь для удаления пленок фибрина фильтруют через трехслойный марлевый фильтр. Полученный фильтрат центрифугируют, сыворотку отсасывают и сливают, а эритроциты промывают 3—4-кратным центрифугированием с изотоническим раствором хлорида натрия. При последнем промывании эритроцитов надосадочный слой жидкости должен быть совершенно прозрачным. Из отмытых эритроцитов готовят 3% взвесь в изотоническом растворе хлорида натрия (см. с. 103).

Подготовив указанным выше способом ингредиенты, участвующие в РСК, приступают к титрованию гемолитической сыворотки, комплемента и антигена.

Титрование комплемента. Перед постановкой опыта натив- мый или консервированный комплемент подвергают обязательному титрованию, т. е. определяют то наименьшее количество комплемента, которое, будучи смешанным с 0,5 мл гемолитической сыворотки (в тройном титре), гемолизирует Ю,5 мл 3% взвеси эритроцитов в течение 30 мин.

Для титрования пользуются основным разведением комплемента (1:10). Основное разведение комплемента разливают в ряд пробирок от 0,05 до 0,5 мл. Затем в каждую пробирку прибавляют изотонический раствор хлорида натрия, доводя общий объем жидкости во всех пробирках до 1,5 мл. Штатив с пробирками помещают в термостат и через 45 мин во все пробирки добавляют гемолитическую систему в объеме 1 мл (табл. 15).

Титрование комплемента сопровождается двумя обязательными контролями: контроль гемолитической системы (1 мл гемолитической системы 4-1,5 мл изотонического раствора хлорида натрия) и контроль комплемента (0,5 мл основ-

ног。разведения компл? мента+0》5 мл взвесн эритроцитов L5 мл изото* HHqecKor。 раствора хло— рада натрия)。После до— бавленин гемол0THqecKO системы: пробирки ТЕа— телвно встряхивают н снова помещают в термостат на 30 мин・Титром компле— мента называется то минимальное количество ее в присутствии кото— рого5 мл гемолити 帛 ской сывороткв Тро ном тнтре》лизирует 0》5 мп 3 ^ взвеси эритроцитов барана в течение 30 мнн при температуре 37 ОС， При постановке РСК пользуются не титрома рабочей дозой §^а^? ментпредставлтюЕе собой тнтр комплемент увелииенннй на 20—30 практически это соответствует тому колнчест— ву комплемента》которое имеется в предпоследнее пробирке с гемолизом* Необходимость увелше— ннн дозы комплемента вызвана тем обстоятель— ством》 £то активность комплемента при поста， новке основного опыта иногда подавляется дру— гими ингредиентами ре— акции - антнгеном н ОЕ* вороткой・Разведение 一 компле— мента для постановка ре， акни производят такт ито6bl одна рабоиан доза его (рассчитанная на со— держнмое одной опытноног。разведения компл? мента+0》5 мл взвесн эритроцитов L5 мл изото* HHqecKor。 раствора хло— рада натрия)。После до— бавленин гемол0THqecKO системы: пробирки ТЕа— телвно встряхивают н снова помещают в термостат на 30 мин・Титром компле— мента называется то минимальное количество ее в присутствии кото— рого5 мл гемолити 帛 ской сывороткв Тро ном тнтре》лизирует 0》5 мп 3 ^ взвеси эритроцитов барана в течение 30 мнн при температуре 37 ОС， При постановке РСК пользуются не титрома рабочей дозой §^а^? ментпредставлтюЕе собой тнтр комплемент увелииенннй на 20—30 практически это соответствует тому колнчест— ву комплемента》которое имеется в предпоследнее пробирке с гемолизом* Необходимость увелше— ннн дозы комплемента вызвана тем обстоятель— ством》 £то активность комплемента при поста， новке основного опыта иногда подавляется дру— гими ингредиентами ре— акции - антнгеном н ОЕ* вороткой・Разведение 一 компле— мента для постановка ре， акни производят такт ито6bl одна рабоиан доза его (рассчитанная на со— держнмое одной опытноСхема реакции титрования комплемента

ног。разведения компл? мента+0》5 мл взвесн эритроцитов L5 мл изото* HHqecKor。 раствора хло— рада натрия)。После до— бавленин гемол0THqecKO системы: пробирки ТЕа— телвно встряхивают н снова помещают в термостат на 30 мин・

Титром компле— мента называется то минимальное количество ее в присутствии кото— рого5 мл гемолити 帛 ской сывороткв Тро ном тнтре》лизирует 0》5 мп 3 ^ взвеси эритроцитов барана в течение 30 мнн при температуре 37 ОС， При постановке РСК пользуются не титрома рабочей дозой §^а^? ментпредставлтюЕе собой тнтр комплемент увелииенннй на 20—30 практически это соответствует тому колнчест— ву комплемента》которое имеется в предпоследнее пробирке с гемолизом* Необходимость увелше— ннн дозы комплемента вызвана тем обстоятель— ством》 £то активность комплемента при поста， новке основного опыта иногда подавляется дру— гими ингредиентами ре— акции - антнгеном н ОЕ* вороткой・

Разведение 一 компле— мента для постановка ре， акни производят такт ито6bl одна рабоиан доза его (рассчитанная на со— держнмое одной опытно

ног。разведения компл? мента+0》5 мл взвесн эритроцитов L5 мл изото* HHqecKor。 раствора хло— рада натрия)。После до— бавленин гемол0THqecKO системы: пробирки ТЕа— телвно встряхивают н снова помещают в термостат на 30 мин・

Титром компле— мента называется то минимальное количество ее в присутствии кото— рого5 мл гемолити 帛 ской сывороткв Тро ном тнтре》лизирует 0》5 мп 3 ^ взвеси эритроцитов барана в течение 30 мнн при температуре 37 ОС， При постановке РСК пользуются не титрома рабочей дозой §^а^? ментпредставлтюЕе собой тнтр комплемент увелииенннй на 20—30 практически это соответствует тому колнчест— ву комплемента》которое имеется в предпоследнее пробирке с гемолизом* Необходимость увелше— ннн дозы комплемента вызвана тем обстоятель— ством》 £то активность комплемента при поста， новке основного опыта иногда подавляется дру— гими ингредиентами ре— акции - антнгеном н ОЕ* вороткой・

Разведение 一 компле— мента для постановка ре， акни производят такт ито6bl одна рабоиан доза его (рассчитанная на со— держнмое одной опытно

―一 Номер пробирки

Ингредиент~ j~一 ■.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Комплемент (основное разведение), мл

0,05

0,1

0,15

0,0

0,25

0,3

0*35

0,4

0,45

0,5

0,5

—

Изотонический раствор хлорида натрия, мл

1,45

1,4

1,35

1,3

1,25

1,2

1/5

1,1

1,05

1,5

1,5

1,5

Штатив с пробирками помещают иа 45 мин в термостат при 37 ℃

Гемолитическая система, мл

1,0

1.0

1,0

1,0

1,0

1,0

1.0

1,0

1,0

1,0

0,5

1,0

Штатив с пробирками помещают на 30 мин в термостат при 37 ℃

или контрольной пробирки) содержалась в объеме 0,5 мл.

Для приготовления рабочего раствора комплемента пользуются приведенной ниже схемой расчета.

Пример. Рабочая доза комплемента равна 0,25 мл. Это значит, что в 0,25 мл основного разведения (1:10) содержится 0,025 мл нативной сыворотки. Для постановки реакции, рассчитанной иа 60 пробирок, требуется нативной сыворотки:

0,025 млХбО=：1,5 мл .

Полученную путем такого расчета дозу сыворотки (1,5 мл) разводят в 30 мл изотонического раствора хлорида натрия, так как в каждую опытную пробирку наливают только по 0,5 -мл рабочего раствора камплемента.

Титрование антигена. Ввиду того что антиген может оказывать антикомплементарное действие, его подвергают предварительному титрованию. Для этого из основного разведения антигена готовят ряд последовательных разведений. Основным разведением антигена может быть взвесь микробов, содержащая 500 млн. или 1 млрд, микробных тел в 1 мл изотонического раствора хлорида натрия.

В ряд пробирок, установленных в штатив, вносят несколько последовательно уменьшающихся доз основного разведения антигена от 0,5 до 0,05 мл, доливают до 1 мл изотоническим раствором хлорида натрия, прибавляют по 0,5 мл рабочей дозы комплемента и по 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия. Штатив с приготовленной смесью хорошо встряхивают и помещают в термостат при 37 ℃ на 1 ч. По истечении указанного времени во все пробирки прибавляют по 1 мл гемолитической системы, после чего штатив с пробирками снова помещают в термостат на 1 ч (табл. 16).

Таблица 16

Схема реакции титрования антигена

№ 口робнрки

Ингредиент

1

2

3

4

5

6

Антиген основного разведения, мл

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0,5 -

Изотонический раствор хлорида

0,5

0,6

0,7

0.8

0,9

0,95

натрия, мл

Рабочая доза комллемеита, мл

0.5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Штатив с пробирками помещают на

1 ч в термостат при 37 ℃

Гемолитическая система, мл

к。

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

Штатив с пробирками помещают на 1 ч в термостат при 37 ℃

Титром антигена считается его наименьшая доза, при которой прекращается задержка гемолиза и, следовательно, отсутствует его комплементарное действие. Для постановки РКС берут рабочую дозу антигена, составляющую примерно 1/2——2/з ее титра (во избежание антикомплементарного действия антигена при постановке реакции).

Техника постановки основного опыта. Оттитрованные ингредиенты (антиген, комплемент и гемолитическая сыворотка) разводят изотоническим раствором хлорида натрия таким образом, чтобы рабочая доза каждого из них содержалась в объеме 0,5 мл. Реакцию ставят в общем объеме 2,5 мл. В случае недостаточного количества исследуемого материала допускается снижение общего объема до 1,25 мл и соответственно каждого ингредиента до 0,25 мл. При наличии микротитратора «Такачи» РСК можно ставить с сывороткой в объеме 0,025—0,05 мл.

При постановке реакции сначала смешивают исследуемую сыворотку, антиген и комплемент, смесь выдерживают в термостате при температуре 37 ℃ в течение часа или комнатной температуре в течение 18—20 ч. По истечении указанного срока в пробирки добавляют гемолитическую систему (после предварительного выдерживания ее в термостате). Смесь всех ингредиентов после энергичного встряхивания помещают в термостат при 37℃ на 1 ч (табл. 17). '

Таблица 17

Схема поставовки РСК

Фаза реакции

№ ингредиента

Ингредиенты, участвующие в реакции

№ пробирки

1 (опытная)

2 (контроль I)

3 (контроль II)

1

Исследуемаясыворотка,

разведеннаяизотониче

ским раствором 1:5 мл

0,5

0,5

—

Первая

Антиген в рабочей дозе

0,5

0,5

Комплемент в рабочей дозе

0,5

0,5

0,5

Изотонический раствор хлорида натрия, мл

—

0,5

0,5

В термостат при 37 ℃ на 1 ч

Вторая 1 1

1

Гемолитическая система

1,0

1,0

1,0

В термостат при 37 ℃ на 1 ч

В данном примере 1-я пробирка является опытной, 2-я и 3-я — служат контролем. В контрольных пробирках должно наступить явление гемолиза, так как в них не могло произойти связывание комплемента первой фазой. В 1-й, опытной, пробирке при наличии соответствия антитела с антигеном происходит связывание комплемента и, следовательно, задержка гемолиза.

Степень интенсивной реакции оценивают по схеме:

+ + -)-+ полная задержка гемолиза, жидкость бесцветна, значительный осадок эритроцитов

+ + + ясная задержка гемолиза, жидкость бледно-розового цвета, значительный осадок эритроцитов

+ + частичная задержка гемолиза, жидкость интенсивно окрашена, ,довольно компактный осадок эритр(щитов

+ слабая задержка, жидкость интенсивно окрашена, осадок эритроцитов небольшой

土 следы задержки, почти полный гемолиз, осадок в виде облачка — полный гемолиз,《лаковая» кровь, отсутствие осадка

ФАКТОРЫ ЕСТЕСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА,МЕТОДЫ ИХ ИЗУЧЕНИЯ

Фагоцитоз

Явление фагоцитоза было открыто и изучено русским ученым И. И. Мечниковым. Он установил, что фагоцитоз (от грея, phagos ——пожирающий, cytos — клетки)——это врожденная реакция организма, проявляющаяся в способности клеток—фагоцитов — захватывать проникающие в тело животного инородные частицы с последующим их перевариванием.

Отождествляя собой функцию внутриклеточного пищеварения, свойственную простейшим организмам, фагоцитоз филогенетически является наиболее древним защитным механизмом, общим для всех видов беспозвоночных и позвоночных животных. У человека и высших животных фагоцитарной способностью обладают клетки ретикулоэндотелиальной системы: лейкоциты крови и лимфы, фиксированные купферовские клетки печени, ретикулярные клетки селезенки, костного мозга, лимфатических узлов, эндотелий кровеносных и лимфатических сосудов, гистиоциты рыхлой соединительной ткани.

В борьбе с патогенными микробами большую роль играют лейкоциты. Судьба микроорганизмов, захваченных лейкоцитами, может иметь три исхода:

полное внутриклеточное переваривание микробов, приводящее к их исчезновению в лейкоците,——завер шенный фагоцитоз;

выталкивание микробов из лейкоцитов в окружающую среду; *

активное размножение микробов внутри лейкоцитов— незавершенный фагоцитоз.

В последнем случае фагоцитоз приобретает отрицательное значение для организма, так как микробы, находящиеся внутри клеток, становятся менее доступными действию антител.

Находясь в цитоплазме лейкоцитов, микробы не только остаются живыми, но и сохраняют способность к размножению. Явление незавершенного фагоцитоза имеет место при заболевании туберкулезом, бруцеллезом, туляремией, гонореей.

При изучении процесса фагоцитоза было обнаружено, что разные виды микробов имеют различные защитные приспособления, которые повышают устойчивость их в отношении фагоцитов. К числу таких приспособлений относится образование капсул, препятствующих фагоцитозу бактерий чумы, пневмококков и некоторых типов стрептококка; продуцирование микробными клетками токсических веществ, поступающих в окружающую среду и вызывающих повреждение лейкоцитов (например, лейкоцидин, вырабатываемый некоторыми штаммами стафилококков).

Установлено, что приобретение специфического активного иммунитета после перенесения инфекционного заболевания или вакцинации сопровождается повышением фагоцитарной активности лейкоцитов в отношении соответствующего возбудителя инфекции. Связано это с наличием в иммунной сыворотке специфических антител — опсонинов, которые, воздействуя на объект фагоцитоза, изменяют его, делая легкодоступным для поглощения и переваривания фагоцитами.

Для оценки фагоцитарной функции лейкоцитов служат три основных показателя: а) активность фагоцитоза (АФ) '— процент активно фагоцитирующих клеток;

интенсивность фагоцитоза (ИФ) — среднее число микроорганизмов, приходящихся на одну фагоцитировавшую клетку;

завершенность фагоцитоза (ЗФ) — процент фагоцитов, полностью переваривших фагоцитированные микроорганизмы.

Определение фагоцитарной активности лейкоцитов. Фагоцитарная активность лейкоцитов выражается процентом активных лейкоцитов (фагоцитов) к общему числу подсчитанных нейтрофильных лейкоцитов. Определение фагоцитарной активности лейкоцитов осуществляется следующим образом. В стерильную центрифужную пробирку наливают 0,2 мл 2% раствора цитрата натрия, прибавляют 0,1 мл исследуемой крови, взятой из мякоти пальца, и 0,05 мл микробной взвеси, содержащей по оптическому стандарту мутности 25 млн. микробных тел (500 млн. микробных тел в 1 мл).

В зависимости от задач и цели исследования для постановки опыта может быть использован любой вид живых или убитых микроорганизмов: кишечная палочка, стафилококк, стрептококк и т. д.

Пробирку с приготовленной смесью осторожно встряхивают и помещают на 30 мин в термостат. По истечении указанного срока смесь центрифугируют при 2000—3000 об/мин до расслоения жидкости на верхний соломенно-желтый прозрач-

ный слой плазмы, нижний — слой эритроцитов и среднюю серебристую пленку между ними — слой лейкоцитов. Пастеровской пипеткой с тонко оттянутым капилляром отсасывают вначале верхний слой, затем очень осторожно снимают средний слой, делают из него 3—5 мазков (по способу приготовления мазков крови) и окрашивают методом Романовского — Гимза (см. с. 32).

При микроскопии мазка подсчитывают число фагоцитировавших нейтрофильных лейкоцитов из общего числа подсчитанных лейкоцитов. Для получения достоверных результатов количество должно быть не менее 100. Полученный результат выражают в процентах.

Определение фагоцитарного индекса. Фагоцитарный индекс, характеризуя интенсивность фагоцитоза, определяется средним числом фагоцитированных микробов, приходящихся на один лейкоцит. Для определения фагоцитарного индекса служат те же мазки, по которым определялась фагоцитарная активность лейкоцитов. В препаратах, приготовленных описанным выше способом, подсчитывают не менее 100 нейтрофильных лейкоцитов и количество поглощенных ими микробных тел. Вычисляется фагоцитарный индекс путем деления числа фагоцитированных бактерий на общее число подсчитанных нейтрофилов.

Пример. При просмотре мазка установлено, что 100 лейкоцитов фагоцитировали 650 микробных тел. Следовательно, фагоцитарный индекс 650 一 равен 而=6,5・

Техника определения опс оно-ф агоцитарно- го индекса. Опсоно-фагоцитарным индексом называется отношение фагоцитарного индекса иммунной сыворотки к фагоцитарному индексу нормальной сыворотки.

Для постановки опыта необходимы:

Исследуемая сыворотка, полученная у больного или иммунизированного.

Сыворотка, полученная от практически здорового организма.

Взвесь лейкоцитов, полученная из крови здорового организма.

Микробная взвесь, содержащая по оптическому стандарту мутности 500 мл микробных тел в 1 мл.

На двух пастеровских пипетках стеклографом делают отметки на высоте 1,5—2 см от конца капилляра. По сделанной метке набирают последовательно лейкоциты, затем бактериальную взвесь и сыворотки (в одну пипетку берут иммунную сыворотку, в другую — сыворотку нормальную). Повторным втягиванием и выдуванием на двух предметных или часовых стеклах сыворотку хорошо перемешивают с взвесью лейкоцитов и микробных тел. Затем смесь втягивают в капилляр той

10 Лабинская А. С.14В

же пастеровской пипетки, запаивают его конец и помещают в термостат. Спустя 15—30 мин кончик капилляра отламывают, содержимое пипетки выдувают на предметное стекло и готовят препарат по способу приготовления мазка крови, окрашивая его водно-спиртовым раствором метиленового синего (рец. 9). .

При микроскопии препаратов для определения фагоцитарных индексов в исследуемой иммунной и нормальной сыворотках подсчитывают по 100 нейтрофильных лейкоцитов и количество поглощенных ими микробов.

Опсоно-фагоцитарный нндез+аг叫тар.吧й индекс нмм理ой снвороткн . фагоцитарный индекс нормальной сыворотки Пример. В 100 лейкоцитах нормальной сыворотки обнаружено 150 фагоцитированных -бактерий. Следовательно, фагоцитарный индекс нормаль- 150“

нои сыворотки равен = 1,5.

В 100 лейкоцитах иммунной сыворотки обнаружено 300 фагоцитированных бактерий. Следовательно, фагоцитарный индекс иммунной сыворотки 300 равен—= 3.

На основании (Полученных данных вычисляется опсоно-фагоцитарный 3 с индекс: —= 2.

Опсоно-фагоцитарная реакция. Опсопо-фагоцитарная реакция, так же как и фагоцитарный индекс, характеризует состояние макроорганизма и его взаимодействие с микробом- возбудителем. Указанная реакция нашла применение при диагностике некоторых инфекций, например бруцеллеза, дифтерии, сыпного тифа.

Опсоно-фагоцитарную реакцию ставят следующим образом. В центрифужную пробирку наливают и тщательно перемешивают 0,25 мл 2% раствора цитрата натрия и 0,25 мл исследуемой крови больного. Затем туда же добавляют 0,25 мл двухмиллиардной взвеси микробов, т. е. 500 млн. микробных тел, соответствующих возбудителю предполагаемого заболевания (при подозрении на бруцеллез прибавляют взвесь бруцелл, содержащую 4 млрд, микробных тел в 1 мл). Пробирку с приготовленной смесью помещают на 30 мин в водяную баню, отрегулированную на 37 ℃. После прогревания смесь центрифугируют и пастеровской пипеткой отсасывают верхний слой образовавшегося осадка, состоящий из лейкоцитов. Каплю его наносят на поверхность хорошо обезжиренного предметного стекла, приготовляют мазок по типу мазка крови, высушивают, фиксируют смесью Никифорова (см. с. 29) и окрашивают по способу Романовского—Гимзы (см. с. 32).

Окрашенный мазок микроскопируют, подсчитывая при этом количество микробов, фагоцитированных 25 лейкоцита- 146

мн, находящимися в различных полях зрения. Каждый фагоцит в зависимости от количества фагоцитированных им микробов относят к определенной группе (табл. 18).

Таблица 18

Схема учета опсоно-фагоцитарной реакции

Количество фагоци-тированных микробовв одном лейкоцитеКоличество фагоци-тированных микробовв одном лейкоцитеОценкафагоци-тозаОценкафагоци-тозаКоличестве лейноцитовКоличестве лейноцитовВычисление пифро-квого показателяфагоцитозаВычисление пифро-квого показателяфагоцитоза

Количество фагоци-тированных микробовв одном лейкоците

Количество фагоци-тированных микробовв одном лейкоците

Оценкафагоци-тоза

Оценкафагоци-тоза

Количестве лейноцитов

Количестве лейноцитов

Вычисление пифро-квого показателяфагоцитоза

Вычисление пифро-квого показателяфагоцитоза

О1—2021—4041 и болееО1—2021—4041 и более+ +++ ++++++++25414254142X0=05X1=54X2=814X3=42 0+5+8+42=552X0=05X1=54X2=814X3=42 0+5+8+42=55

О

1—2021—4041 и более

О

1—2021—4041 и более

+ ++

+ ++

+++

+++

2

5

4

14

2

5

4

14

2X0=0

5X1=5

4X2=8

14X3=42 0+5+8+42=55

2X0=0

5X1=5

4X2=8

14X3=42 0+5+8+42=55

Для оценки опсоно-фагоцитарной реакции В. А. Штритер предложил числовой показатель, представляющий собой сумму произведений, полученных в результате перемножения количества лейкоцитов на число соответствующих им плюсов, характеризующих интенсивность фагоцитоза. Таким образом, максимальный показатель опсоно-фагоцитарной реакции может быть равен 75 (25x3=75).

Принято считать, что цифровой показатель в пределах 10—24 характеризует слабоположительную реакцию, 25—49— ясно выраженную и 50—75 — резко положительную опсоно- фагоцитарную реакцию.

У здоровых людей цифровой показатель опсоно-фагоцитарной реакции в большинстве случаев равен 1——3.

Завершенный фагоцитоз. Со времени работ И. И. Мечникова известно, что процесс фагоцитоза складывается из ряда последовательных фаз, финалом которых является разрушение микробов в фагоцитах. Последнее явление определяет фагоцитоз как защитную реакцию организма. Однако установить завершенность фагоцитарного процесса трудно в связи с отсутствием достоверных методов оценки физиологического состояния микробов, поглощенных лейкоцитами.

В. М. Берман и Е. М. Славская, разрабатывая метод, пригодный для систематического изучения процесса отмирания фагоцитированных микробов, предложили в качестве критерия жизни и гибели использовать наличие или отсутствие у микробов способности к росту, т. е. способности давать в первые часы своего развития гигантские формы.

Завершенность фагоцитоза определяется по отсутствию роста микробов внутри лейкоцитов и наличию признаков их разрушения.

Техника определения показателя завершенного фагоцитоза относительно проста. В мерную центрифужную пробирку

Рнс. 19. Препарат-отпечаток с завершенным (А) н незавершенным (Б) фагоцитозом кишечной палочки.

с 5—10 мг оксалата натрия вносят 0,5—1 мл крови, подлежащей исследованию. После тщательного перемешивания в эту же пробирку прибавляют равное количество 2 млрд, взвеси микробов (стафилококк, кишечная палочка или Вас. sub- tilis). После перемешивания смесь помещают в термостат при 37 ℃ на 30 мин. Затем несколько капель исследуемой лейкоцитарно-микробной взвеси вносят в чашку Петри с застыв* шим хорошо подсушенным 2% мясо-пептонным агаром и распределяют их по поверхности среды скользящим движением предметного стекла с отшлифованными краями так же, как при обычном изготовлении мазков крови. Засеянные чашки помещают в термостат при 37 ℃ для подращивания микробов и наступления третьей фазы фагоцитарной реакции, т. е, захватывания микробов фагоцитами. Время экспозиции чашек в термостате может варьировать в зависимости от задач опыта и видов микробов, взятых в опыт. Для получения постоянных и демонстративных результатов время инкубации в термостате должно быть установлено в предварительных опытах.

После окончания установленного срока инкубации приступают к изготовлению мазков-отпечатков. Для этого хорошо очищенные и обезжиренные предметные стекла подогревают на пламени горелки и, положив на поверхность агара, слегка прижимают их к мазку крови, находящемуся на поверхности агаровой среды. Приготовленные таким образом мазки- отпечатки высушивают, фиксируют 3 мин метиловым спиртом и окрашивают по способу Романовского—Гимзы (см. с. 32).

При микроскопировании препаратов, приготовленных из лейкоцитарно-микробной взвеси, инкубированной в термостате, отчетливо видны различия между жизнеспособными и нежизнеспособными клетками микроорганизмов. Первые характеризуются своими гигантскими размерами, вторые в силу отсутствия роста сохраняют исходную величину.

В случаях, когда процесс фагоцитоза носит завершенный характер, внутри лейкоцитов отмечаются фрагменты разрушенных клеток, имеющих разнообразную форму, и отдельные микробные тела значительно меньших размеров, чем в лейкоцитах с незавершенным фагоцитозом (рис. 19).

Для оценки степени завершенного фагоцитоза применяется так называемый показатель завершенного фагоцитоза, определяемый количеством клеток с завершенным фагоцитозом на 100 фагоцитировавших сегментоядерных нейтрофилов.

ГУМОРАЛЬНЫЕ ФАКТОРЫ ЕСТЕСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИОРГАНИЗМА И МЕТОДЫ ИХ ИЗУЧЕНИЯ

Комплемент, техника его определения

Комплемент (от лат. complementum ——дополнение) представляет собой сложный комплекс белков сыворотки крови глобулиновой природы, обозначаемый символом С. В состав его входят 9 компонентов: С'1, Сх2, С'З, Сх4, Сх5, С'6, С'7, Сх8 и С'9・ Все компоненты различны по своему химическому составу, физическим и биологическим свойствам. Активным является весь комплемент в целом, но не отдельные его компоненты. Комплемент находится в крови человека, всех теплокровных и многих холоднокровных животных. Наиболее постоянное и высокое содержание комплемента выявлено в сыворотке крови морских свинок. Поэтому при постановке серологических реакций, основанных на участии комплемента, в качестве его используют смесь сывороток, полученных от 3—4 морских свинок.

Основные функции комплемента сводятся к тому, что он способствует: 1) лизису сенсибилизированных бактерий в присутствии бактериолизинов; 2) лизису сенсибилизированных эритроцитов; 3) опсонизации (подготовке) бактерий к фагоцитозу.

Сам по себе комплемент оказывает слабое антимикробное- действие, но, вступая в контакт и адсорбируясь на поверхности специфических антител, усиливает их действие. В отсутствие комплемента активность некоторых антител полностыа утрачивается. Поэтому содержание и уровень комплемента в крови можно использовать как тест, характеризующий со-

стояние естественной резистентности макроорганизма: высокое содержание комплемента в крови считается благоприятным признаком; снижение уровня комплемента, наблюдаемое при некоторых патологических состояниях, является отрицательным прогностическим показателем.

При определении комплемента в сыворотке крови и постановке серологических реакций с участием комплемента необходимо учитывать большую лабильность комплемента в отношении многих физических и химических воздействий. Разрушение его происходит при механическом встряхивании, под действием тепла, ультрафиолетовых лучей, кислот, щелочей, эфира, алкоголя. Для инактивации комплемента пользуются прогреванием сыворотки при температуре 56 ℃ в течение 30 мин. 《

Консервирование комплемента. Для продолжительного сохранения биологических свойств комплемента рекомендуются химические ■и физические способы его консервирования. Лучший метод химического жонсервирования предложили С. И. Гинзбург и В. С. Калинин. Метод за- 'ключается в добавлении 0,5 г кр ист а л лического сульфата натрия и 0,4гх.чя ^борной кислоты к 10 мл свежей консервируемой сыворотки. Добавляемые химические вещества предохраняют комплемент от микробного загрязнения 咧 стабилизируют свойства комплемента, благодаря чему активность его сохраняется на протяжении нескольких месяцев.

Физический способ консервирования сводится к замораживанию сывороток и хранению нх при температуре от 一20° до —40 °C. При таком способе хранения сывороток активность комплемента не утрачивается в течение Р/а—2 мес. Однако после оттаивания сыворотки пеобходи-мо немедленно использовать, так как при повторном замораживании активность комплемента резко снижается.

В настоящее время наибольшее практическое применение для консервирования камллемента нашел метод лиофильного высушивания. Сущность его заключается в быстром замораживании консервируемой £ыворотки или другого биологического препарата с последующим высуши^ ван нем его в условиях глубокого вакуума. При этом вода из высушиваемого материала удаляется путем превращения льда непосредственно в пар, минуя жидкую фазУ и не нарушая тем самым молекулярной структуры -комплемента. Высушенное вещество имеет вид губчатой массы, которая может сохраняться без изменения в течение многих месяцев и при необходимости быстро и полностью растворяться, восстанавливая присущие исходному состоянию физические, химические и биологические свойства.

Сухой комплемент, расфасованный в ампулы, является коммерческим препаратом, выпускаемым советской медицинской промышленностью. Перед употреблением амлулу надламывают и содержимое ее растворяют в 1 мл изотонического раствора хлорида натрия, что соответствует нативной сыворотке.

Определение титра комплемента гемолитическим методом. Гемолитический метод в силу своей доступности и возможности точного определения уровня комплемента получил широкое применение при его титровании. Степень гемолиза при постановке опыта может быть определена с помощью фотоколориметра, спектрофотометра или визуально посредством сопоставления гемолиза в опытных пробирках со стандартной шкалой лизированных эритроцитов. Последний способ наиболее прост, не требует для постановки реакции дефицит-

ной, дорогостоящей аппаратуры и дает достаточно точные результаты.

Для постановки реакции определения титра комплемента* гемолитическим методом с визуальным определением степени1 гемолиза требуются; 1) сыворотка крови, подлежащая ис* следованию, взятая в день постановки опыта или полученная заранее и законсервированная; 2) изотонический раствор; 3) эритроциты барана; 4) гемолитическая сыворотка.

Постановка опыта начинается с приготовления стандартной шкалы лизированных эритроцитов по способу, предложенному А. П, Кониковым. Для этого к 5 мл гемолитической* системы добавляют 5 мл дистиллированной воды. Гемолизированную жидкость разливают в ряд пробирок, как указано в схеме разведений, приведенной в табл. 19.

Таблица 1»

Схема определения степени гемолиза

Ингредиент

№ пробирки

1

2

3

4

5

6

7

8

Гемолитическая

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9・

система, разведенная вдвое, мл

Дистиллирован-

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

ная вода, мл

Гемолиз, %

20

30

40

50

60

70

80

90

При просмотре пробирок шкалы видно, что различия между смежными степенями гемолиза в двух рядом расположенных пробирках наиболее отчетливо проявляются в зоне 50% гемолиза.

Сыворотку, в которой определяют титр комплемента, разводят 1 : 10, разливают в 10 пробирок от 0^05 до 0,5 мл с разницей в объеме между отдельными дозами 0,05 мл (табл. 20)

Таблица 20

Схема определения титра комплемента сыворотки

№ пробирки

Ингредиент

2

3

4

5

6

7

8

9

10 1 и

Исследуемая сыворотка,разведенная

1:10, мл

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

1,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

—

Изотонический раствор, мл

1,45

1,4

1,35

1,3

1,2

1,15

1,1

1,05

1,0

1,5

Гемолитическая система

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

1,5

и в каждую пробирку приливают изотонический раствор хлорида натрия с таким расчетом, чтобы общий объем жидкости во всех пробирках ряда был одинаковым (1,5 мл).

После этого к разведениям сыворотки добавляют 1,5 мл гемолитической системы (смесь равных объемов 3% взвеси эритроцитов барана и гемолитической сыворотки в утроенном титре; см. с. 139). Приготовленную смесь помещают на 45 мин в термостат, затем охлаждают 10 мин в холодильнике при 3— 5 °C, центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин и приступают к учету результатов. '

Титр комплемента выражают в 50% гемолитических единицах, обозначаемых С'%。.

За одну 50% гемолитическую единицу принимают количество комплемента, способствующее 50% лизису 0,5 мл сенсибилизированных эритроцитов в течение 45 мин при температуре 37 ℃. Эта единица является условной, поскольку ее величина зависит от концентрации эритроцитов, их стойкости, количества сенсибилизирующих антител, времени и температуры реакции.

Учет результатов реакции осуществляется следующим образом: пробирку № 4 из шкалы гемолиза с одной 50% единицей комплемента сравнивают с пробирками ряда сыворотки, исследуемой на титр комплемента. Если содержимое пробирки № 4 по цвету и прозрачности соответствует, например, содержимому пробирки № 5 из ряда титрования комплемента исследуемой сыворотки, расчет ведется следующим образом:

0,025 мл сыворотки ± 1 C'Hso

мл сыворотки — X единиц СЛНМ

1X1 1000 тгX=^F=40CH5。

Оценка получаемых результатов по учету 50% гемолиза обусловлена новейшими данными исследований, которые показали, что процесс лизиса сенсибилизированных эритроцитов при графическом изображении имеет не линейный, а S-образный характер. Форма этой кривой указывает на то, что в центральной части 30—50% гемолиза кривая идет круто и степень лизиса изменяется при небольших колебаниях в количествах комплемента. В зоне 30—100% интенсивность гемолиза изменяется постепенно. Для осуществления лизиса последних 10% клеток необходимо относительно большое увеличение количества комплемента. Поэтому зависимость процента гемолиза от количества комплемента наиболее точно может быть определена в зоне частичного гемолиза, соответствующего 50%, которая находится в центральной части S-образной кривой.

Лизоцим и методы его титрования

Лизоцим——фермент, широко распространенный в природе, обладающий свойством лизировать живые и мертвые клетки Micrococcus lysodeikticus и целый ряд других, в основном грамположительных, микроорганизмов. Присутствие лизоцима установлено у всех представителей животного мира и у значительной части растений. В организме человека лизоцим находится в слезной жидкости, слюне, секрете слизистых оболочек носа, желудочном и дуоденальном соке, грудном молоке, сыворотке крови, экстрактах, полученных из различных тканей и органов.

Лизоцимы, выделенные из различных источников, различаются по своей ферментативной активности, химическому составу и физическим свойствам.

Биологическое назначение лизоцима в животных и растительных организмах окончательно не установлено. Основываясь на антибактериальных свойствах лизоцима, большинство исследователей склонны рассматривать его как фактор неспецифического иммунитета. Эту точку зрения подтверждает высокое содержание лизоцима в слезной жидкости, секрете слизистых оболочек полости рта и верхних дыхательных путей, т. е. в тех органах, которые являются первым барьером на пути проникновения микроба в организм. По материалам экспериментальных исследований, кроме основного антибактериального действия, лизоцим стимулирует естественную резистентность живого организма, что играет большую роль в исходе инфекционного процесса.

Наиболее точными способами определения лизоцима в сыворотке крови и других субстратах организма следует счи* тать: '

Метод турбидиметрического определения лизоцима, основанный на определении уменьшения степени мутности тест- микроба под действием лизоцима в определенный интервал времени. Постановка этого метода связана с использованием спектрофотометра, ФЭК или нефелометра.

Метод диффузии в агар, основанный на том, что раствор лизоцима, диффундируя из лунок, лизирует взвешенный в агаре тест-микроб, вследствие чего вокруг лунок с лизоцимом образуются прозрачные зоны, диаметр которых соответствует концентрации находящегося в них лизоцима.

Определение активности лизоцима методом диффузии в агар, отличаясь относительно простой техникой постановки опыта, в то же время, при соблюдении стандартных условий, дает точные, хорошо воспроизводимые результаты, позволяющие рекомендовать его в практику.

Прежде чем приступить к постановке опытов по определению активности лизоцима в исследуемых субстратах, не-

юбходимо изготовить в количестве, достаточном для проведения всей серии предполагаемых экспериментов, ацетоновый -порошок убитой культуры М. lysodeikticus. Применение убитой культуры тест-микроба стандартизирует условия проводимых опытов, исключает необходимость многократных пересе- <вов культуры, позволяет вести исследование без соблюдения условий стерильности.

Техника приготовления ацетонового порошка убитой культуры М. lysodeikticus сводится к следующему. Суточную, а лри слабом микробном росте двухсуточную культуру микро* ба, выращенную в пробирках на 2% мясо-пептонном агаре (рец. 38, с. 352), смывают 5 мл изотонического раствора хлорида натрия. Полученной микробной взвесью засевают поверхность мясо-пептонного агара, разлитого в матрацы. На каждый матрац расходуется 2 мл микробной культуры. Затем матрацы помещают в термостат с температурой 37 ℃ в горизонтальном положении засеянной поверхностью кверху.

По истечении срока инкубации выросшую культуру микроба смывают с поверхности среды каждого матраца 75— 100 мл изотонического раствора хлорида натрия. Газон микробного роста смывается легко. Образующуюся гомогенную взвесь сливают в центрифужные пробирки через два слоя марли для задержания комочков агара, центр и фугируют на холоде при 3000 об/мин в течение 20 мин, затем отмывают 2 раза изотоническим раствором хлорида натрия и один раз дистиллированной водой. Промытую таким образом микробную массу переносят небольшими порциями при постоянном помешивании стеклянной палочкой в десятикратный объем -безводного ацетона, в результате чего образуется хлопьевидная взвесь. Ее помещают в холодильник при 3—4℃ на 1— 2 ч. По истечении указанного времени взвесь микробов в ацетоне после тщательного перемешивания вливают в воронку Бюхнера, на дно которой кладут два обеззоленных фильтра, смоченных дистиллированной водой. Микробный осадок, остающийся на поверхности фильтра, промывают 4 раза холодным ацетоном и 2 раза эфиром. После этого микробную массу, остающуюся на фильтре, высушивают на воздухе при комнатной температуре и измельчают в фарфоровой ступке до полной гомогенности. Приготовленная таким образом сухая культура в виде мелкого желтовато-серого порошка может длительное время храниться в пузырьках из-под пенициллина, плотно закрытых резиновыми пробками.

Тест-культуру М. lysodeikticus, приготовленную таким способом, перед использованием в опыте испытывают на лизи- руемость лизоцимом. Для этого, пользуясь микробным стандартом мутности (см. с. 50), готовят микробную взвесь, содержащую 1 млрд, микробных тел в 1 мл, и разливают ее в две пробирки. В одну из них — опытную — добавляют 8 мкг

лизоцима, растворенного в 1 мл изотонического раствора хло* рида натрия. Таким образом, конечная концентрация лизоци* ма в растворе составляет 4 мкг/мл. Во вторую — контрольную —пробирку прибавляют равное количество изотонического раствора хлорида натрия. Пробирки выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин. Культура считается пригодной для работы, если за указанный период в опытной пробирке произойдет полный лизис находящихся в ней клеток.

Турбидиметрический метод количественного определения лизоцима в сыворотке. Для определения лизоцима в сыворотке крови и других жидкостях организма методом Перри в модификации X. Я. Грант и со авт. (1970) необходимо иметь:

Ацетоновый порошок М. lysodcikticus.

Кристаллический лизоцим L

Спектрофотометр.'

Определение лизоцима в исследуемой жидкости начинается с изготовления стандартной взвеси тест-микроба и основного раствора лизоцима. Для этого:

50 мг ацетонового порошка М. lysodeikticus взвешивают в 100 мл 0,007 М фосфатного буфера pH 6,2.

Б. 10 мг кристаллического лизоцима растворяют в 100 мл того же 0,006 М фосфатного буфера pH 6,2.

Из основного раствора, содержащего 100 мкг лизоцима в 1 мл, путем дальнейших разведений готовят рабочие растворы, содержащие 12,5; 6,25; 3,13; 1,56 мкг/мл, необходимые- для получения калибровочной кривой.

Подготавливают для испытания сыворотку или другой субстрат, подлежащий исследованию. В кварцевую кювету (рабочая толщина 1 см) вносят:

1,5 мл свежеприготовленной взвеси М. lysodeikticus, 0,5 мл 0,3 М раствора хлорида натрия,

мл исследуемой сыворотки, разведенной в 10 раз.

Все ингредиенты вносят в указанной последовательности быстро размешивают стеклянной палочкой и спектрофотомет- рируют при длине волны 540 нм. Одновременно с помещением кювет в спектрофотометр включают секундомер и определяют экстинкцию через 15 с (£о) и 180 с (瓦)• Эти сроки выбраны как оптимальные на основании многократных проверочных исследований. В качестве контроля служит предварительно подготовленная и помещенная в спектрофотометр вторая кювета, содержащая 3 мл буферного раствора.

По результатам определения активности лизоцима в стандартных растворах, содержащих 12,5; 6,25; 3,13 и 1,56 мкг лизоцима в 1 мл, строят калибровочную (стандартную) кри-

'Кристаллический лизоцим из яичного порошка в настоящее время производится Олайискнм заводом химических реактивов Латвийской ССР.

вую. Активность лизоцима в стандартных растворах определяется так же, как в образцах исследуемых сывороток. Результаты измерения экстинкции наносят на сетку графика, где по оси абсцисс отложена концентрация лизоцима в микрограммах на 1 мл, по оси ординат — разница величин экстинкции (Ео——Е$). В пределах концентрации 1,56—— 12,5 мкг/мл нанесенные на сетку точки соединяют прямой, устанавливая таким образом линейное соответствие количества лизоцима степени его мутности. '

После получения калибровочной кривой рассчитывают содержание лизоцима в исследуемых сыворотках. При этом на оси ординат находят число экстинкции (рассчитанное по разнице &—Е$) и определяют соответствующую ему концентрацию лизоцима (мкг/мл) на оси абсцисс.

Количественное определение лизоцима методом диффузии в агаре. При отсутствии спектрофотометра, ФЭК, нефелометра содержание лизоцима в сыворотке крови и других жидкостях может быть определено методом диффузии в агаре, предложенным Чариоти (модификации Л. А. Каграмановой).

Для проведения исследований этим методом необходимо иметь:

Фталатовый агар (рец. 25, с. 348).

Ацетоновый порошок М. lysodeikticus.

Раствор бифталата калия pH 6,2. .

Стандартный раствор лизоцима.

Растапливают в водяной бане фталатный агар из расчета 15 мл на каждую опытную чашку. Из ацетонового порошка убитой культуры тест-микроба готовят взвесь. На каждые 10 мл среды берут 150 мг высушенной микробной массы, вносят в маленькую фарфоровую ступку и, непрерывно растирая пестиком, приливают небольшими порциями 10 мл раствора бифталата калия pH 6,2. Микробную взвесь, приготовленную таким' образом, приливают к расплавленному и остуженному до температуры 45 ℃ агару. Смесь хорошо перемешивают и разливают мерной пипеткой по 15 мл в чашки, предварительно установленные на строго горизонтальной поверхности стола для равномерного распределения в них слоя среды.

Б. Рабочий стандарт лизоцима готовят следующим образом: 10 мг кристаллического лизоцима растворяют в 50 мл дистиллированной воды. Полученный раствор, содержащий 200 мкг лизоцима в 1 мл, разливают по 3—4 мл в химически чистые флаконы из-под пенициллина, закрывают их резиновыми пробками, парафинируют и хранят в замороженном состоянии при температуре —20 ℃.

Непосредственно перед постановкой опыта лизоцим размораживают, берут 2 мл и разводят 48 мл дистиллированной воды. Полученный исходный раствор, содержащий 8 мкг ли-

зоцима в 1 мл, служит для приготовления рабочих стандартов, содержащих 4, 2 и 1 мкг лизоцима в 1 мл:

1 мл исходного раствора4-1 мл дистиллированной воды=4 мкг/мл. 0,4 мл исходного раствора +1,5 мл дистиллированной воды == 2 мкг/мл. 0,25 мл исходного раствора + i,75 мл дистиллированной воды = 1 мкг/мл.

В застывшем агаре пробочным сверлом из нержавеющей стали вырезают на равном расстоянии друг от друга 5 лунок диаметром по 6—8 мм каждая. Расположение лунок должно быть во всех опытах стандартным, что достигается применением рисунка-трафарета, который подкладывают под дно чашки перед вырезыванием лунок. В 3 лунки вносят по 2 капли рабочих стандартов лизоцима, содержащих 1, 2 и 4 мкг в 1 мл раствора; две другие лунки заполняют материалом, подлежащим исследованию на лизоцим. Материал вносят в неразведенном состоянии и в разведении 1 : 2 (сыворотка крови) или 1 : 10 (слезная жидкость, белок куриного яйца или другой субстрат, богатый лизоцимом). После заполнения лунок стандартными количествами лизоцима и исследуемым веществом чашки помещают в термостат при 37 ℃ на 24 ч.

Учет полученных результатов. На всех опытных чашках измеряют в двух направлениях диаметр зон лизиса, образующихся вокруг лунок с рабочими стандартами лизоцима. Диаметр зон лизиса, пропорциональный концентрациям лизоцима в соответствующих луиках составляет в среднем 17 мм для 1 мкг лизоцима, 23 мм для 2 мкг и 26 мм для 4 мкг лизоцима. Полученные величины складывают и выводят средние арифметические отдельно для каждой дозы лизоцима. Затем, пользуясь полулогарифмической сеткой, строят калиброванную кривую, откладывая на оси абсцесс диаметр зон лизиса, а на оси ординат количество микрограммов лизоцима. По вычерченной калиброванной кривой определяют содержание лизоцима в исследуемых субстратах.

ЧАСТЬ ВТОРАЯ

СПЕЦИАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ТЕХНИКА СОБИРАНИЯ У БОЛЬНОГО МАТЕРИАЛАДЛЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

В постановке диагноза заболевания решающее значение имеет клиническое обследование больного, позволяющее нередко уже в первые дни и даже часы болезни выявить характерные для того или иного заболевания симптомы.

Лабораторные методы исследования, в том числе и им- мунобактериологические, облегчают раннюю диагностику инфекционного заболевания, позволяют дифференцировать нозологические формы, имеющие общность в клиническом проявлении и течении болезни, дают лечащему врачу объективные фактические доказательства полной достоверности поставленного диагноза.

В диагностике инфекционных болезней пользуются бак- териоскопическими, бактериологическими, биологическими^ серологическими методами исследования и методом аллергических проб.

Микроскопический метод, предусматривающий обнаружение в патологическом материале бактерий, морфологически сходных с возбудителем предполагаемого заболевания, дает основание для постановки ориентировочного диагноза*

Бактериологический метод, основанный на получении чистой культуры возбудителя болезни с последующим ее изучением, имеет большое значение в диагностике большинства инфекционных болезней.

Биологический метод — заражение лабораторных животных——используется при диагностике зоонозных инфекций.

Серологический метод исследования применяют только в поздние сроки болезни (с конца 1-й— начала 2-й недели заболевания), когда в крови больного накапливаются специфические антитела к возбудителю заболевания.

Метод аллергических проб позволяет обнаружить повышенную чувствительность макроорганизма при некоторых инфекционных заболеваниях. Выбор материала для лабораторного исследования определяется локализацией патологического процесса, особенностями патогенеза болезни и биологическими свойствами возбудителя.

Успех бактериологического исследования в значительной степени зависит от правильности взятия патологическоге ма

териала. Очень часто неправильность взятия и несвоевременность доставки материала в лабораторию обусловливают низкую высеваемость из него возбудителя болезни. Патологический материал для б актериологического исследования рекомендуется брать у больного до начала специфического лечения, так как под влиянием сульфаниламидов, антибиотиков, иммунной сыворотки и других лечебных средств бактерии изменяются и утрачивают способность к росту на искусственных питательных средах.

Взятие крови венепункцией. Кровь в количестве 5——10 мл получают из вены локтевого сгиба. Больного (если позволяет его состояние) сажают на стул. Руку его, разогнутую в локтевом суставе, кладут на стол. Плечо несколько выше локтевого сустава стягивают резиновым жгутом, чтобы приостановить венозный отток крови, не нарушая при этом артериального кровообращения (проверяется по наличию пульса в лучевой артерии). После наложения жгута кожу в месте взятия крови дезинфицируют спиртом. Больному предлагают несколько раз медленно, но с силой сжать кисть в кулак. При этом вены на предплечье сильно набухают. Одну из наиболее сильно набухших вен локтевого сгиба фиксируют I пальцем левой руки, а правой рукой вкалывают иглу шприца в вену по направлению тока крови. Попадание иглы в вену сопровождается поступлением крови в цилиндр шприца при оттягивании поршня. Кровь, взятую в нужном количестве, сливают в стерильную пробирку. После этого ослабляют жгут, извлекают иглу из вены, а место прокола плотно прижимают кусочком стерильной ваты, смоченной йодом, и перевязывают.

Взятие крови из мякоти пальца. Кровь в небольшом количестве (до 1 мл) можно получить из мякоти пальца. Кончик IV пальца левой руки, кожа которого обычно более тонкая, обтирают ватой со спиртом и эфиром и подсушивают (на влажной коже не образуется концентрированной, хорошо стекающей капли).

После обработки места укола лаборант фиксирует палец больного, взяв его за ногтевую фалангу I и II пальцами левой руки. В это же время правой рукой устанавливают иглу шприца или оспопрививательный ланцет перпендикулярно кончику пальца, плотно прижимают к коже и делают прокол на глубину 2—3 мм в зависимости от толщины кожи у больного и количества крови, которое предполагается взять. После прокола конец пальца слегка сжимают» чтобы вызвать кровотечение из ранки. Кровь, стекающую отдельными каплями, собирают в стерильную агглютинационную пробирку.

После взятия необходимого количества крови к месту прокола прикладывают кусочек ваты, смоченной йодом.

Получение сыворотки крови и способ ее транспортировки. Способ получения сыворотки крови описан подробно на

с. 103. Сыворотки, предназначенные для продолжительного хранения или пересылки в отдаленные места, консервируют, прибавляя 2% раствор х. ч. бориой кислоты (0,1 г борной кислоты на 5 мл сыворотки).

Если взято несколько капель крови, из которых получить нужное количество сыворотки не представляется возможным, поступают следующим образом. Кровь смешивают с изотоническим раствором хлорида натрия приблизительно из расчета 1 :10, центрифугируют и затем пастеровской пипеткой отсасывают прозрачный слой жидкости, содержащий сыворотку. Степень разведения полученной таким образом сыворотки равна примерно 1 : 20, если исходить из положения, что объем сыворотки составляет примерно 50% от общего объема крови.

Для пересылки небольшого количества сыворотки иа большие расстояния 2 капли крови, нанесенные на прямоугольный кусочек бумаги размером 5X8 см, подсушивают при комнатной температуре или в термостате. После подсыхания крови бумагу свертывают в форме пакетика аптечного порошка каплями внутрь и отправляют по назначению. В лаборатории высохшие пластинки крови, снятые с бумаги скальпелем, ссыпают в пробирку, заливают 1 мл изотонического раствора хлорида натрия и помещают для растворения на 1—2 q в термостат. Полученная прозрачная жидкость соответствует разведению сыворотки 1:20, так как объем 2 капель крови составляет приблизительно ОД мл, а объем сыворотки в ней — 0,05 мл. Разведение 1:20 является основой для приготовления рабочих разведений сыворотки.

Сыворотка крови, направляемая в лабораторию для серологического анализа, должна иметь сопроводительный документ со следующими данными:

фамилия, имя и отчество;

возраст больного;

предполагаемый клинический диагноз;

день заболевания;

отметка о прививке в прошлом вакциной, антиген которой соответствует возбудителю предполагаемого заболевания;

отметка о заболевании в прошлом болезнью, предполагаемой в данный момент.

Взятие слизистого отделяемого верхних дыхательных путей тампоном и методом кашлевых пластинок. Слизистое отделяемое верхних дыхательных путей для бактериологического исследования следует брать натощак или 2 ч спустя после приема пищи и полоскания иоса и горла дезинфицирующим раствором.

Взятие слизистого отд ел я е м о го полости носа. При взятии материала со слизистых оболочек носа кожу в окружности наружных отверстий носа протирают ватой, смоченной 60% спиртом. После этого тампон вводят в глубь полости носа и снимают слизь со стенки носовой перегородки. Забирать материал из разных ноздрей можно одним тампоном.

Взятие слизи тампоном со слизистых оболочек зева. Больного усаживают на стул против света и предлагают широко раскрыть рот. Корень языка придавливают шпателем, который вводят в рот обследуемого левой рукой так, чтобы введенный конец был несколько ниже того, за который его держат. Язык стараются придавить книзу и придвинуть кпереди, чтобы лучше осмотреть зев. Тампон в полость рта вводят правой рукой осторожно, не касаясь поверхности языка, содержащего обильную микрофлору. Снимая налет и слизь с миндалин, дужек мягкого неба и задней стенки глотки, обращают внимание на видимые измененные участки слизистой оболочки.

Взятие материала из области хоан и задней стенки глотки. Материал из области хоан и задней стенки глотки берут тампоном, укрепленным на легко гнущейся алюминиевой проволоке. Перед употреблением конец проволоки на 2——3 см от края сгибают о край пробирки под тупым (примерно 150°) углом. В широко раскрытый рот больного вводят сначала шпатель, прижимая язык книзу, а затем тампон. Загнутый кверху конец тампона заводят за язычок неба, протирают им заднюю стенку носоглотки и снимают слизь из хоан.

Получение слизистого отделяемого трахеи и бронхов. Метод кашлевых пластинок. При взятии материала с помощью кашлевых пластинок чаш* ку Петри с питательной средой, элективной для того вида микроба, который предполагается выделить, устанавливают вертикально на расстоянии 10—15 см от рта больного. Во время приступа кашля крышку с чашки снимают и выделяющиеся капельки, содержащие в основном микроорганизмы, обитающие в бронхах и бронхиолах, попадают на плотную питательную среду, на которой затем и растут. При получе

нии материала методом кашлевых пластинок приходится ожидать наступления приступа кашля, что усложняет работу, особенно если она связана с обследованием детских коллективов и лиц со слабо выраженными и редкими приступами кашля.

Метод гортанных тампонов. Обследуемому предлагают открыть рот, после чего шпателем нажимают на корень языка, а тампон, введенный в полость рта, продвигают вглубь так, чтобы опущенный конец его навис над входом в гортань. У большинства людей при этом появляется кашлевой рефлекс, сопровождающийся выделением слизи, значительная часть которой попадает на тампон.

Взятие мокроты для микробиологического исследования. Утреннюю порцию мокроты, выделяющуюся во время приступа кашля, собирают в стерильную склянку с хорошо подобранной пробкой. У детей, которые не умеют откашливать

мокроту, искусственно вызывают кашель, раздражая корень языка тампоном.

Взятие рвотных масс для бактериологического исследования. Рвотные массы собирают в широкогорлую банку, желательно стерильную. Отверстие ее закрывают вощаной бумагой, обвязывают ниткой и отправляют в лабораторию. Рвотные массы должны быть собраны и при необходимости отправлены в лабораторию для исследования в любое время суток, так как рвота может не повториться.

Взятие испражнений для бактериологического исследования. Испражнения собирают в стерильные картонные тарелки или в подкладные судна и эмалированные лотки, предварительно обеззараженные раствором хлорной извести (но не лизола и не карболовой кислоты) и затем многократно промытые горячей водой для уничтожения следов дезинфицирующих веществ. Стерильным деревянным шпателем из разных мест полученной порции кала отбирают 1—2 г испражнений, помещают их в пробирки или склянки с хорошо закрывающимися пробками. При наличии патологических включений (слизь, гной) их обязательно вносят в посевной материал.

Исследуемый материал, который пе может быть своевременно доставлен в лабораторию, консервируют. В качестве консервантов могут быть использованы глицериновая смесь (рец. 69), 1,5——3% раствор хлорида натрия, среды обогащения: желчный бульон (рец. 76), среда Мюллера (рец. 72), среда Кауфмана (рец. 73). Нативные испражнения могут сохраняться в течение 1—2 сут (если невозможно произвести посев) на холоду при температуре 3—4℃.

Получить испражнения для исследования можно, не ожидая акта дефекации, пользуясь для этой цели ректальными трубками. Последние представляют собой трубки, сделанные из стекла, диаметром от 5 мм (для детей) до 10 мм (для взрослых) и длиной около 20 см. Нижний конец трубки запаян, а на расстоянии 20—25 мм от запаянного конца имеются два опаяннйх отверстия, расположенных друг против друга одно несколько ниже другого. Открытый конец трубки закрывают кусочком ваты, трубку опускают в пробирку через ватно-марлевую пробку и в таком виде стерилизуют. Для взятия материала ректальные трубки вводят в прямую кишку на глубину 8—10 см у детей и 12—15 см у взрослых. Для доставки взятого материала ректальные трубки помещают в пробирки с консервантом.

Взятие мочи для бактериологического исследования. Мочу берет медицинская сестра через катетер в стерильную склянку в количестве 25—30 мл.

Отделяемое из влагалища и шейки матки. Берут его на гинекологическом кресле под контролем зеркала с помощью ватного тампона или бактериальной петли.

Взятие гноя из абсцесса и отделяемого раны. Поверхность невскрывшихся абсцессов, пустул и везикул обрабатывают ва-- той, смоченной спиртом, затем эфиром. После дезинфекции кожи делают прокол, набирая содержимое в шприц. К шприцу подбирают иглы с каналом широкого диаметра. Гной из вскрывшихся абсцессов, гнойников, фурункулов и отделяемое ран берут из глубины стерильным тампоном.

Взятие материала для бактериологического исследования от трупа. При проведении посмертного бактериологического исследования вскрытие трупа должно быть произведено в первые часы после смерти, так как при трупном разложении вульгарная микрофлора кишечника наводняет все ткани и органы. От трупа берут кровь и кусочки внутренних органов. Кровь удобнее всего брать из правого желудочка сердца. Для этого его поверхность площадью примерно 2 см2 прижигают накаленным скальпелем или шпателем и через прижженный участок вводят стерильную пастеровскую пипетку, набирая в нее необходимое количество крови. Полученную кровь сливают в стерильную пробирку или засевают непосредственно в питательные среды.

Из паренхиматозных органов — селезенки, печени, почек, а также из мозга, лимфатических сосудов, легких после предварительного прижигания их поверхности вырезают стерильными ножницами из глубины кусочки величиной с горошину. Вырезанные кусочки помещают в стерильные пробирки или стеклянные баночки с притертыми пробками.

Для взятия желудка накладывают две лигатуры на пищевод, выше желудочка на 1—2 см, и две другие лигатуры на двенадцатиперстную кишку, на таком же расстоянии от желудка. Линии разреза делают между двумя лигатурами так, чтобы оба конца желудка были перерезаны. Точно так же берут для исследования отрезок кишечника. Вырезанный желудок и участок кишки помещают в стерильную банку с притертой пробкой. Содержимое кишечника и желудка в количестве, необходимом для бактериологического исследования, можно получить также с помощью прокола желудочной или кишечной стенки шприцем. Желчный пузырь после перевязки протока вырезают вместе с кусочком печени.

Патологический материал, направляемый в лабораторию для бактериологического исследования, должен иметь сопроводительное отношение, содержащее следующие сведения:

Фамилия, имя, отчество и возраст больного.

День заболевания. Температура тела.

Предполагаемый на основании клинических данных диагноз или повод для исследования (например, по эпидемическим показаниям, предполагаемое бактерионосительство и т. д.).

Наименование объекта, направляемого на бактериологическое исследование (кал, мокрота, кровь и т. д.). При консервировании материала указать, какой консервант применен.

Цель исследования.

Наименование учреждения и фамилия врача, направляющего материал на исследование.

При направлении на бактериологическое исследование но пражнений, спинномозговой жидкости необходимо указать время взятия пробы. При направлении трупного материала важно отметить время наступления смерти, вскрытия трупа и взятия материала.

ПАТОГЕННЫЕ КОККИ

К группе патогенных (гноеродных) кокков относятся стафилококки, стрептококки, пневмококки, менингококки и гонококки.

По тинкториальному признаку они делятся на две группы: грамположительные (стафилококки, стрептококки и пневмококки) и грамотрицательные (менингококки и гонококки).

СТАФИЛОКОККИ

Стафилококки представляют собой широко распространенную в природе группу микроорганизмов, объединяющую в себе наряду с сапрофитическими болезнетворные формы микробов с различно выраженной степенью их патогенности и вирулентности.

Стафилококки являются возбудителями гнойничковых заболеваний кожи, фурункулов, абсцессов, флегмон. В ослабленном организме проникновение стафилококка в кровь сопровождается развитием сепсиса с образованием вторичных абсцессов во внутренних органах: печени, легких, почках. Наиболее часто стафилококковые заболевания наблюдаются у рожениц и новорожденных (послеродовой сепсис, маститы, пиодермиты и пневмонии новорожденных).

Некоторые штаммы стафилококка, попадая в пищевые продукты и размножаясь в них, становятся причиной пищевых отравлений.

Однако выделение стафилококков из материала, содержащего смешанную микрофлору, не является доказательством его этиологического значения, принимая во внимание широкую распространенность стафилококков в природе и большую вариабельность их биологических свойств.

Выделение монокультуры стафилококка из закрытых гнойных очагов, независимо от свойств штамма является бесспорным доказательством его патогенности.

1в4

Обнаружение в очагах инфекции стафилококков в ассоциации с другими видами микроорганизмов требует специальных доказательств того, что выделенные штаммы стафилококков причастны к этиологии текущего воспалительного процесса.

Для дифференциации патогенных стафилококков рекомендован комплекс тестов, среди которых плазмокоагулирующей и лецитовителлазной активности принадлежит видное место.

В настоящее время для решения вопроса о стафилококковой природе того или иного заболевания пользуются бактериологическими и серологическими методами исследования, применяя их порознь иди во взаимном сопоставлении.

Материал для исследования. В зависимости от характера заболевания и локализации патологического очага ■материалом для исследования служат:

Гной из очагов поражения при гнойничковых заболеваниях кожи, фурункулах, флегмонах и т. д.

Кровь при подозрении на сепсис.

Слизистое отделяемое зева и носоглотки при заболеваниях верхних дыхательных путей и выявлении стафилококкового носительства. .

Мокрота при пнемонии.

Рвотные массы и промывные воды желудка, а также остатки пищи, подозреваемые в качестве причины интоксикации при пищевых отравлениях.

Микробиологический диагноз заболеваний, вызванных стафилококками. В лаборатории для диагностики стафилококковых заболеваний используют бактериологический метод исследования — посев патологического материала на питательные среды с последующим выделением чистой культуры и изучением свойств, характеризующих ее патогенность.

Первый день. Для посева материала, исследуемого на зараженность стафилококками, очень важно подобрать питательную среду.

При исследовании гноя открытых ран, отделяемого ран или свищей, мокроты, рвотных масс, промывных вод желудка, пищевых продуктов, изъятых при пищевых отравлениях, и другого подобного материала, в котором можно предполагать содержание обильной, посторонней микрофлоры, лучше всего пользоваться желточно-солевым агаром Чистовича (рец. 61) или молочно-солевым агаром Петрович (рец. 62). Эти среды обладают элективными свойствами, обусловленными высоким содержанием хлорида натрия, а желточно-солевой агар, кроме того, позволяет 6piiee четко, чем кровяной агар, дифференцировать патогенные и непатогенные штаммы стафилококка. Для засева солевых сред берется большое количество материала, который втирают в поверхность пита-

тельной среды шпателем. Срок инкубации при температуре 37Х увеличивают до 2 сут.

При посеве гноя из невскрывшихся абсцессов, флегмон, экссудата, полученного из закрытых полостей, можно пользоваться обычным мясо-пептонным или 5% кровяным агаром. Исследуемый материал наносят на питательную среду в количестве 1——2 капель и затем распределяют по всей поверхности чашки. '■>

Инкубация посевов при температуре 37℃ длится 18—: 24 ч. •

Кровь в количестве 10—15 мл засевают в 100—150 мл 0,25% сахарного бульона (рец. 42) или по методу Френкеля в 80—100 мл среды Китта — Тароцци «(рец. 113) с добавлением 0,15% агар-агара. Перед посевом крови среду Китта — Тароцци регенерируют 20——30 мин в кипящей водяной бане (см. с. 54) и быстро охлаждают. Предложенный метод основан на том, что патогенные бактерии при выделении их из организма больного значительно лучше развиваются в анаэробных условиях, чем в аэробных.

■Среды, засеянные кровью, выдерживают в термостате в- течение 10 сут, производя каждые 2 сут высевы на 5% кровяной агар и желточную среду Чистовича (рец. 63).

Второй день. 1. Просматривают посевы исследуемого материала на мясо-пептонном, молочно-солевом, желточно-солевом и кровяном агаре. Колонии стафилококка на плотных питательных средах круглые, слегка выпуклые, с ровными краями, влажной глянцевой поверхностью. По цвету колонии, в зависимости от продуцируемого пигмента, стафилококки подразделяются на эмалево-белые (Staphylococcus albus), лимонно-желтые (Staphylococcus citreus) и золотистые (Staphylococcus. aureus).

Для лучшего выявления пигмента посевы на молочно-солевом агаре выдерживают 2—3 дня при комнатной температуре. На кровяном агаре вокруг колоний стафилококка может обнаруживаться гемолиз. На желточно-солевом агаре большая часть патогенных стафилококков, образующих лецитиназу, дает лецитовителлазную (желточную) реакцию, проявляющуюся в образовании вокруг колонии зоны помутнения с радужным венчиком по периферии.

Из колонии с типичными для стафилококка признаками делают мазок для окраски по Граму. При наличии стафилококков видны характерные гроздевидные скопления кокков, окрашенных по Граму положительно.

Две — три колонии с положительной лецитовителлазной реакцией отсевают для дальнейшего изучения в пробирки со скошенным мясо-пептонным агаром.

Третий день. С культурами микроорганизмов, выращенными на скошенном агаре, ставят реакцию плазмокоагу-- 1@6

ляции. Штаммы, продуцирующие фермент плазмокоагу- лазу, вызывают свертывание плазмы, вследствие чего она превращается в желеобразную массу, не выливающуюся при перевертывании пробирок.

Для постановки реакции пользуются асептично взятой кроличьей или человеческой плазмой, стабилизированной при помощи 1—4% цитрата или 0,1% оксалата L Нестерильно взятая плазма, а также плазма, полученная от людей или животных, перенесших стафилококковое заболевание, для постановки реакции плазмокоагуляции непригодна, так как в ней может находиться антикоагулаза, препятствующая свертыванию плазмы. Реакцию плазмокоагуляции ставят ускоренным способом на стекле «Слид тест》и в преципитационных пробирках. Ускоренным способом постановки реакции пользуются при массовых обследованиях, связанных с изучением большого количества микробных культур.

При изучении штаммов ускоренным методом на предметное стекло наносят каплю воды и в ней тщательно, до образования равномерной мутности, суспендируют исследуемую бактериальную культуру. После этого к капле микробной взвеси добавляют каплю разведенной 1 : 5 плазмы крови кролика. При положительной реакции плазма коагулирует в ближайшие 15——60 с, при сомнительной ——после 1 мин, при отрицательной реакции образование сгустка не происходит в течение 3 мин.

При постановке реакции пробирочным способом в две стерильные преципитационные пробирки наливают по 0,5 мл плазмы, разбавленной ex tempore 1 : 5 изотоническим раствором хлорида натрия (1 мл плазмы +4 мл изотонического раствора хлорида натрия), после чего в каждую пробирку вносят по 1 петле 18——20-часовой культуры стафилококка. Одну пробирку (опытную) засевают исследуемой культурой, вторую (контроль) —заведомо патогенным, плазмокоагулирующим штаммом стафилококка. Засеянные пробирки выдерживают в течение 3 ч. Если за указанное время коагуляции плазмы не происходит, пробирки оставляют при комнатной температуре еще па 18 ч. Если и через это время свертывания плазмы не произойдет, испытуемая культура является коагулазоотрицательной. Одновременно в термостат ставят несколько пробирок с незасеянной плазмой (второй контроль). В тех случаях, когда хотя бы в одной пробирке второго контроля наступает коагуляция плазмы, обусловленная микробным загрязнением^ результат опыта не учитывается.

1 В настоящее время предприятие по производству бактерийных лрепа- ратов Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения БССР выпускает сухую цитратную <ллазму кролика специально для л остановки реакции плазмокоагуляции.

Тесты дифференциации патогенных и непатогеиных стафилококков. Для установления патогенности стафилококков рекомендуется с выделенными штаммами возбудителя ставить реакцию плазмокоагуляции и лецитовителлазную пробу. Культуры микроорганизмов, коагулирующие плазму и обладающие лецитовителлазной активностью, независимо от характера продуцируемого ими пигмента и гемолитической активности должны рассматриваться как потенциально патогенные.

Между тем при исследовании посевов крови и другого патологического материала нередко высеваются культуры коагулазоотрицательных стафилококков. При получении такого рода результатов возникает необходимость в решении вопро-? са, является ли выделенный микроб этиологическим фактором болезни или следствием загрязнения посевов вульгарной, микрофлорой.

По результатам однократного посева патологического материала делать какие-либо выводы очень трудно. Поэтому исследование необходимо повторить. При повторном выделения из патологического материала коагулазоотрицательных стафилококков необходимо установить тождество выделенных культур по морфологическим, культурально-биохимическим признакам и антибиотикограммам. Возбудители заболеваний,, повторно выделяемые из организма, обычно обладают тождественной характеристикой.

В тех случаях, когда у больных выделяют вначале типичные патогенные стафилококки, а затем начинают высеваться коагулазоотрицательные штаммы, необходимо все микробные культуры, полученные в динамике заболевания, подвергнуть сравнительному фаготипированию, так как известно, что дегенерирующие под влиянием антибиотиков стафилококки изменяют морфологические, культуральные и биохимические свойства, но стойко сохраняют присущий им фаготип.

Фаготипирование стафилококков. При возникновении массовых заболеваний стафилококковой этиологии (в родильных домах, детских и больничных учреждениях) большое значение приобретает выявление источников инфекции и установление эпидемических связей. Решение этой задачи возможно только методом фаготипирования стафилококков, подтверждающим идентичность микроорганизмов, выделяемых у больных, носителей и объектов внешней среды. В настоящее время для фаготипирования плазмокоагулирующих стафилококков Международным подкомитетом по фаготипированию стафилококков рекомендован набор из 20 типовых фагов \ разделенных по литическому сродству на 4 группы (табл. 21).

Наборы стафилококковых бактериофагов выпускаются производственным отделом Института эпидемиологии и микробиологии АМН СССР имени Н. Ф. Гамалеи.

Ш

Рис. 20. Приспособление для иаиесеиия капель фагов на поверхность плотной питательной сре-Рис. 20. Приспособление для иаиесеиия капель фагов на поверхность плотной питательной сре-/ — стеклянная трубка； 2 —резиновая трубка; 3 — инъ-екционная игла./ — стеклянная трубка； 2 —резиновая трубка; 3 — инъ-екционная игла.

Рис. 20. Приспособление для иаиесеиия капель фагов на поверхность плотной питательной сре-

Рис. 20. Приспособление для иаиесеиия капель фагов на поверхность плотной питательной сре-

/ — стеклянная трубка； 2 —резиновая трубка; 3 — инъ-екционная игла.

/ — стеклянная трубка； 2 —резиновая трубка; 3 — инъ-екционная игла.

Отобранные для фаготипирования плазмокоагулирующие штаммы стафилококка засевают на скошенный мясопептонный агар и инкубируют 18—24 ч при 37℃. На следующий день агаровую культуру пересевают в пробирки с 2,5 мл бульона Хоттингера (рец. 37) или бульона Мартена (рец. 40) и ставят в термостат при 37℃. Бульонную 3—4-часовую культуру стафилококка пересевают на чашки со свежеприготовленным и подсушенным 1,25% агаром (pH 7,2—7,4), содержащим 0,4% глюкозы и 0,02% хлорида кальция (стерильный 10% раствор хлорида кальция в объеме 0,2 мл добавляют к 100 мл расплавленного агара непосредственно перед разливом среды). Культуру в количестве нескольких капель наносят на по- •верхность среды, распределяют шпателем по всей площади чашки, а избыток ее отсасывают пастеровской пипеткой. Засеянные чашки в течение 30—40 &нн подсушивают в термостате. После подсушивания дно чашки расчер

чивают карандашом по числу фагов на 20 квадратов и в каждый квадрат засеянной среды, всегда в одном и том же порядке, стандартной петлей (диаметр 2 мм) или пастеровской пипеткой с тонко оттянутым капилляром наносят по капле соответствующего фага. После нанесения на чашку одного из фагов петлю прожигают. При пользовании пипеткой фаг наносят накнм образом, чтобы кончик пипетки не касался поверхности засеянной среды, исключая тем самым возможность переноса культуры с одной чашки на другую или внесения культуры в пробирки с типовым фагом.

Таблица 21

Группа

Фаг

I

29

52

52А

79

80

II

ЗА

ЗС

55

71

III

IV

6,75 42Д

42Е.77

47,83А

53,84

54,85

Н. И. Леонене и В. А. Вайчювенас (1971) упростили и значительно ускорили технику нанесения капель фага на засеянные чашки Петри, предложив для этой цели пользоваться трубкой диаметром 5 мм, на конце которой с помощью резинового кольца закрепляют инъекционную иглу (рис. 20). Иглу подбирают с таким расчетом, чтобы при открытом верхнем конце трубки жидкость через иглу стекала самопроизвольно с промежутком времени между отделением 2 капель, достаточным для того, чтобы, не закрывая конца стеклянной трубки, успеть перенести ее от одной чашки Петри к другой, затем к третьей и т. д. При соблюдении указанных условий капли получаются одинаковыми по размеру и форме. При подсыхании капель фагов чашку переворачивают крышкой вниз и инкубируют 18—20 ч при 30℃ или 5—6 ч при 37℃.

Для типирования применяют два рабочих разведения фагов: одно из них соответствует 1 ТР (тест-разведение), которое должно быть не ниже 10-3, другое——100 ТР, соответст* венно не ниже 10-1. Фаготипирование штаммов начинают рабочим разведением фагов, соответствующим 1 ТР. Штаммы, с которыми получают отрицательный результат (отсутствие учитываемого лизиса хотя бы одним фагом), на следующий день типируют повторно разведением фагов, соответствующим 100 ТР.

Результаты фаготипирования регистрируют с учетом степени лизиса по четырехкрестной системе:

+ + + + сливной (полный) лизис

+++ полусливной (незначительный) лизис, рост культуры в зоне лизиса + + наличие в месте нанесения капли фага свыше 50 колоний фага (пятен лизиса)

от 20 до 50 колоний фага

± менее 20 колонии фага

—полное отсутствие лизиса

Для упрощения схемы учета степеней лизиса обозначения + + + +, + + + и ++ относят к «сильным реакциям》и выражают + +. Штаммы стафилококка считаются типирован- ными, если хотя бы один фаг вызвал явления лизиса на ++『 Более слабые степени лизиса не учитывают. 'Следовательно, если при первичном типировании штамма (1 ТР) один или несколько фагов дали лизис на +, такие штаммы следует типировать повторно 100 ТР. Если при повторном типировании штамма имеет место лизис на +, такие штаммы считают нетипируемыми.

При регистрации результатов типирования против каждого исследованного штамма записывают: номер фага, давшего лизис на + +, а также степень разведения фага (1 ТР и 100 ТР). В скобках можно отметить номер фагов, давших лизис на + или ±. Учет такого лизиса, не являясь достаточно показательным для характеристики штамма, может, однако, 170

помочь установлению идентичности нескольких штаммов, что имеет значение при эпидемиологическом обследовании.

Штаммы стафилококков лизируются чаще всего не одним> а несколькими фагами, что дает для каждого штамма характерную фагомозаику. В зависимости от фагов штаммы стафилококков могут относиться к какой-либо одной (I, II, III или IV) группе или к смешанным группам (например, I и III).

Определение энтеротоксина стафилококков. Штаммы стафилококков, выделенные при пищевых отравлениях, испытывают на наличие энтеротоксина следующим образом. Одну петлю суточной агаровой культуры стафилококка вносят в колбу, содержащую 50 мл питательной среды, предназначен- .ной специально для накопления стафилококкового энтеротоксина (рец. 64). Колбу помещают в эксикатор, в котором воздух замещен 20% углекислотой. Для этого на дно сосуда емкостью 2 л насыпают 2 г двууглекислой соды. Крышку эксикатора смещают по ранту, смазанному смесью вазелина с ла- -нолином в отношении 1 : 1 так, чтобы осталась небольшая щель, через которую можно ввести пипетку и влить в соду 17 мл 10% серной кислоты. После этого крышку плотно притирают к эксикатору. Посевы инкубируют в термостате при 37℃, ежедневно насыщая среду эксикатора новой порцией углекислоты. На 4-й день колбу с засеянной средой вынимают из термостата и содержимое ее фильтруют через мембранные фильтры № 3 или 4 (см. с. 24). Полученный фильтрат в количестве 10——15 мл смешивают с равным количеством теплого молока и скармливают котятам 4——8-недельного возраста с массой тела 350—600 г.

При наличии энтеротоксина в исследуемом фильтрате •спустя несколько минут после приема его котята начинают проявлять беспокойство, а через 1——3 ч возникают симптомы гастроэнтерита: многократный понос с выделением испражнений слизистого характера, в редких случаях с примесью крови, рвота. Понос, являясь обязательным симптомом стафилококковой интоксикации, продолжается иногда в течение 2——3 дней; в тяжелых случаях котята погибают.

Определение стафилококкового антитоксина в сыворотке крови. Многие заболевания стафилококковой этиологии, осо- •бенно с глубокой локализацией патологического очага (остеомиелиты, септикопиемические процессы), сопровождаются постоянным поступлением больших количеств стафилококкового антигена в русло крови, стимулируя тем самым формирование специфических антител, одним из которых является стафилококковый антитоксин, нейтрализующий гемолитические свойства стафилококкового токсина. У здоровых людей, так же как у лиц, перенесших стафилококковую инфекцию кожных покровов или гнойное хирургическое заболевание, титр стафилококкового антитоксина не превышает 2 АЕ.

Определение стафилококкового антитоксина в сыворотке крови приобретает большое значение при диагностике септи- копиемических процессов, когда жизнь больного находится в опасности, а бактериологические исследования, проводимые на фоне массивной антибиотикотерапии, как правило, остаются безрезультатными.

Определение антистафилолизина в сыворотках, содержащих менее 1 АЕ в 1 мл. Для титрования сывороток, содержащих в 1 мл крови менее 1 АЕ, используют метод нейтрализации гемолитических свойств стафилококкового токсина — Lh (Limes haemolyticus).

Лимитом гемолитического действия Lh считается количе^ ство его, которое, будучи связано с 1 АЕ стафилококкового антитоксина, вызывает почти полный гемолиз кроличьих эритроцитов. •

Для определения Lh в ряд пробирок разливают стафилококковый токсин в дозах: 0,08; 0,1; 0,12; 0,15; 0,18; 0,2; 0,22; 0,24; 0,26; 0,28; 0,3; 0,32; 0,35; доводят общий объем до 1 мл изотоническим раствором, затем в каждую пробирку добавляют стандартную антистафилококковую сыворотку по 1 АЕ в 1 мл и после тщательного перемешивания смеси вносят по капле (0,05 мл) кроличьих эритроцитов, разведенных из расчета 1 мл отмытых эритроцитов+ 2 мл изотонического раствора хлорида натрия.

Для контроля в одну пробирку наливают 2 мл изотонического раствора хлорида натрия, к которым добавляют 1 каплю тех же эритроцитов. Пробирки в течение часа выдерживают в термостате при 37℃ и затем 1 ч — при комнатной температуре, после чего учитывают результаты реакции.

Наименьшую дозу токсина, которая в смеси с 1 АЕ сыворотки дает гемолиз эритроцитов, принимают за Lh токсина.

При определении титра антистафилолизина сыворотки больных или иммунизированных, подлежащие исследованию, предварительно инактивируют 20 мин при температуре 56°С» а затем разводят в 5 раз (1 мл испытуемой сыворотки + 4 мл изотонического раствора хлорида натрия).

Одновременно готовят 4 разведения стафилококкового токсина: Lh/5, Lh/10, Lh/20, Lh/40. Например, если по паспортным данным, указанным на этикетке, Lh токсина равен 0,2, то：

Lh/ 5Ko,2: 5=0,04Lh/10=0,2:10=0,02Lh/20—0,2:20 = 0,01Lh/40=0,2:40 ==0,005

На каждую исследуемую сыворотку берут 6 пробирок. В 4 из них наливают по 1 мл исследуемой разведенной сыворотки, прибавляют к ней по 1 мл приготовленных разведений токсина и после тщательного перемешивания в каж-

дую Пробирку вносят по 0,05 мл (одна капля) трижды отмытых, Ьазведенных в пропорции 1 : 3 кроличьих эритроцитов.

Опытный ряд пробирок сопровождают два контроля: контроль Эритроцитов (5-я пробирка), в котором находится 2 мл изотопического раствора хлорида натрия и 0,05 мл взвеси эритроцитов; контроль токсина (6-я пробирка), содержащий 1 мл наибольшей дозы стафилококкового токсина (Lh/5), 1 мл изотонического раствора и 0,05 мл взвеси эритроцитов. Смесь всех ингредиентов после тщательного перемешивания выдерживают 1 ч в термостате при 37℃ и 1 ч при комнатной температуре, после чего приступают х учету результатов. Чтение реакции начинают с контролен. В 6-й пробирке с контролем токсина эритроциты должны быть полностью лизированы, в 5-й пробирке — контроль эритроцитов — отмечается полная задержка гемолиза.

Количество сыворотки, в смеси с которой минимальная доза токсина, взятая в опыт, вызывает полную задержку гемолиза или дает слабый гемолиз, оцениваемый + или ++, принимают за титр разведенной сыворотки. Для определения титра неразведенной сыворотки полученную величину умножают на степень разведения сыворотки.

Пример. Если 1 мл сыворотки, разведенной в 5 раз, нейтрализовал 1X5

Lh/40 токсина, титр ее равен —— = 0,125 АЕ.

40

При отсутствии нейтрализации гемолиза во всех пробирках дают заключение, что испытуемая сыворотка содержит меньше 0,125 АЕ в 1 мл.

Методика титрования сывороток, содержащих более 1 АЕ в 1 мл. Из исследуемой сыворотки готовят ряд разведений по табл. 22. Применяемый для титрования сывороток стафилококковый токсин берется в одном разведении — Lh/5. К 1 мл каждого разведения исследуемой сыворотки прибавляют по 1 мл разведенного Lh/5 стафилококкового токсина. После тщательного перемешивания к полученной смеси добавляют 0,05 мл отмытых и разведенных изотоническим раствором хлорида натрия в пропорции 1: 3 эритроцитов кролика. К опыту ставят два контроля: контроль эритроцитов (2 мл изотонического раствора хлорида натрия и 1 капля взвеси эритроцитов) и контроль токсина (1 мл токсина в опытном разведении, 1 мл изотонического раствора хлорида натрия и 0,05 мл эритроцитов).

Штатив с опытными и контрольными пробирками выдерживают 1 ч в термостате и 1 ч при комнатной температуре, после чего учитывают результаты реакции.

Максимальное разведение сыворотки, в смеси с которым Lh/5 токсина дает гемолиз, содержит Vs АЕ. В 1 мл неразведенной сыворотки содержится в *5 раз больше антитоксических единиц. Для определения их количеств в различных разведе-

Табл и；ц а 22

Схема разведения и учета полученных результатов при титровании ‘сывороток, содержащих ciафилококкового антитоксина от 1 до 也 АЕ

в 1 мл

№ пробирки

Сыворотка, мл

Изотонический раствор хлорида натрия, мл

Разведение

Количество, АЕ

1

Неразведенная 0,6

2,4

1:5

2

Из 1-й пробирки 2,0

2,0

1:10

3

》2-й》1,0

0,5

1:15

4

》2-й»1,0

1:20

4 (вылить 0,5 мл)

：5

А 3-й А0,5

1:30

6

6

》4-й》0,5

0,5

1:40

8

7

》2-й»0,2

0,8

1:50

10

В

》2-й》0,2

1,0

1:60

12 (вылить 0,2 мл)

9

》2-й》0,2

1,2

1:70

14 (вылить 0,4 мл)

10

》2-й》0,2

1:80

16 (вылить 0,6 мл)

И

》2-й》0,2

1

1:90

18 (вылить 0,8 мл)

ниях исследуемой сыворотки удобно пользоваться готовым расчетом, приведенным в табл. 22.

СТРЕПТОКОККИ

Стрептококки (Streptococcus pyogenes) представляют собой обширную группу, объединяющую патогенные и непатогенные разновидности.

По характеру роста на кровяном агаре стрептококки делятся па три группы: ^-гемолитические стрептококки (Str. haemolyticus) вызывают гемолиз эритроцитов, а-зеленящие стрептококки (Str. viridans) образуют вокруг колоний зеленую зону гемометаморфоза, негемолитические у-стрептококки (Str. anhaemolyticus) не изменяют эритроцитов и не вызывают гемолиза кровяного агара. Раньше гемолитическую способность стрептококков расценивали как критерий патогенности микроба. В настоящее время установлено, что р-гемо- литические стрептококки в патологическом процессе участвуют значительно чаще, чем пегемолитические. Однако гемолитические штаммы обнаруживают иногда в группе стрептококков, непатогенных для человека, а патогенные виды стрептококков под действием антибиотиков и других факторов внешней среды утрачивают гемолитическую активность.

Таким образом, гемолитические свойства, не являясь дифференцирующим тестом, облегчают выявление патогенных штаммов стрептококка.

Единственным методом дифференциации патогенных и непатогенных стрептококков является серологический метод 174

ЛенсЛилд. Ленсфилд обнаружила в клеточной стенке стретт- токойка поверхностно расположенный группоспецифи- чес к\и й полисахаридный антиген, который позволил разделить в основом гемолитические и отчасти зеленящие стрептококки на 17 групп, обозначенных условно заглавными буквами латинского алфавита от А до S. Наиболее изученной является группа А, объединяющая большинство штаммов, патогенных для человека.

Кроме группоспецифического полисахаридного антигена^ на поверхности клеточной стенки стрептококков группы А расположены протеиновые типовые антигены Т и М, которые могут быть выявлены с помощью реакции агглютинации и преципитации.

В настоящее время культуры стрептококков, выделяемые у больных скарлатиной, ангиной, фарингитом, другими стрептококковыми инфекциями и здоровых носителей, могут быть подразделены на 53 типа. Из них 49 входят в состав группы А, 3 типа (7, 20 и 21) —в группу С и один тип (16) —в группу G. Определение серологических типов стрептококка очень важно при проведении исследований, имеющих эпидемиологическое значение. Распространение и участие в* патологии человека остальных групп стрептококка изучено недостаточно.

Стрептококки серологической группы А вызывают у человека заболевания верхних дыхательных путей: ангину, фарингит, ларинготрахеит, синусит, хронический тонзиллит и др.

Острые стрептококковые инфекции осложняются и могут привести к тяжелым хроническим заболеваниям (нефрит, эндокардит, ревматизм). Стрептококки всегда обнаруживаются в зеве больного скарлатиной и в настоящее время признаются этиологическим фактором этого заболевания. Они являются причиной послеродовых сепсисов, иногда осложняют течение послеоперационных ран и ран военного времени, вызывая их нагноение.

В патогенезе стрептококковых инфекций большое значение принадлежит эритрогенному токсину, стрепто- лизину=0 и ферментам — гиалуронидазе, стрептокиназе и протеиназе, являющимися факторами агрессии стрептококка.

Патологическим материалом для исследования на стрептококки являются:

Налет и слизь с миндалин и слизистых оболочек зева при ангине и скарлатине.

2・ Гной из очагов поражения.

Кровь при явлениях септического характера и подозрении на эндокардит.

Для выделения стрептококков применяют специальные среды, содержащие глюкозу или нативный белок (сыворотка крови или кровь). ■

Схема микробиологического исследования на стрептококки. В основу лабораторной диагностики стрептококковых заболеваний положен бактериологический метод исследования —посев патологического материала на питательны^ сре- :д& с последующим выделением чистой культуры стрептококка, определением ее серологической группы по Ленсфилд, а при эпидемиологических исследованиях — типиров/анием штаммов, относящихся к группе А. ：

Первый день. Чаще всего для обнаружения стрептококков приходится производить посев крови и слизистого отделяемого носоглотки.

Для выделения гемокультуры стрептококка целесообразно кровь, поступившую на исследование, засевать параллельно в 3 флакона, содержащих 50 мл полужидкого агара (0,15——0,2%) с 10% кровяной сыворотки, бульон Левинталя (рец. 57, с. 359) с 5% дефибринированной крови и печеночный бульон Китта —Тароцци (рец. ИЗ, с. 378). В каждую среду вносят по 3——4 мл исследуемой крови. Посевы выдерживают в термостате в течение 1%—2 мес, так как при лечении антибиотиками и сульфаниламидами рост микробов очень замедлен. Для обнаружения роста стрептококка каждые 2——3 дня из всех 3 флаконов с соблюдением правил асептики производят контрольные высевы на 3% кровяной агар.

Материал слизистых оболочек носоглотки, находящийся на тампонах, засевают в чашки Петри с 3% кровяным агаром. Для получения изолированного роста колоний отпечаток тампона, сделанный на поверхности среды, легкими движениями стеклянного шпателя растирают равномерно по всей площади чашки. Посевы на кровяном агаре выдерживают в термостате при 37℃ не более 18—20 ч.

Второй день. 1. Просматривают первичные посевы на чашках с кровяным агаром. Штаммы стрептококков серологической группы А, наиболее патогенные для человека, могут образовывать колонии трех видов:

мукоидные — крупные, до 2—2,5 мм в диаметре, блестящие, гомогенные, прозрачные в проходящем свете, вязкой консистенции. Такой вид колоний характерен для свежевыделенных вирулентных штаммов стрептококка;

шероховатые (matt) —мелкие, диаметром 0,5—0,8 мм, плоские, с шероховатой поверхностью, зернистой структурой, изрезанным краем;

гладкие (glossy) — глянцевые, мелкие колонии серовато-зеленого цвета в проходящем свете; характерны для слабовирулентных и невирулентных штаммов стрептококка.

Гемолитические стрептококки образуют вокруг колонии четко выраженную прозрачную зону гемолиза, ширина которой может изменяться от десятых долей миллиметра до нескольких миллиметров. Зеленящие стрептококки образуют 176

вокруг колонии ореол зеленоватого цвета с несколько повы* шейной прозрачностью агара. Негемолитические стрептококки не вызывают никаких изменений при росте их на кровяном агаре.

Из колоний с признаками, характерными для стрептококка, бактериальной петлей берут небольшое количество материала и готовят мазок для окраски по Граму. При микроскопировании в препарате, приготовленном из культуры с плотной питательной среды, стрептококки располагаются парами, короткими цепочками, образуют иногда скопления, напоминающие грозди стафилококка. Морфологические свойства стрептококков непостоянны: наряду с мелкцми, шарообразными, слегка уплощенными кокками в материале обнаруживаются иногда крупные, грубые кокки, вытянутые в длину. В одной и той же цепочке кокки могут различаться по величине и форме.

Колонии, окруженные зоной гемолиза, отвивают для определения групповой принадлежности. Отобранные колонии снимают петлей и пересевают в пробирки с комбинированным мясным бульоном (рец. 60, с. 360), бульоном Мартена (рец. 40, с. 353) или кровяным бульоном. Полученную на одной из указанных выше сред шестичасовую культуру стрептококка высевают в 25 мл бульона Мартена с 0,25% глюкозы для приготовления группового антигена по Ленсфилд.

Третий день. 1. Просматривают рост стрептококка во флаконах с бульоном Мартена. В жидких питательных средах при характерном росте стрептококка бульон остается совершенно прозрачным и только на дне и стенках пробирки образуется крошковидный осадок беловато-кремового цвета. Характер роста обусловлен длиной цепочек: чем длиннее цепочки, тем лучше выражена зернистость.

Однако многие штаммы стрептококка, выделенные у больных хроническими стрептококковыми инфекциями, длительное время леченных антибиотиками, при росте на жидких питательных средах вызывают их равномерное помутнение.

С солянокислыми экстрактами, полученными из бульонной культуры стрептококка, ставят реакцию преципитации для определения серологической группы по Ленсфилд.

■ Методика определения серологической группы стрептококка по Ленсфилд. Для приготовления полисахаридного С-ан- тигена суточную культуру стрептококка, выращенную на ■бульоне Мартена, центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают в банку с дезинфицирующим раствором. Полученный осадок заливают изотоническим раствором хлорида натрия, снова центрифугируют и надосадочную жидкость сливают. Микробный осадок из всех центрифужных пробирок сливают в одну пробирку и прибавля-

177177■2 Лабинская А. С.

177

177

ют 0,4 мл 0,2 N раствора хлористоводородной кислоты, при* готовленного на изотоническом растворе хлорида натрия.；

Приготовленную смесь помещают в водяную баню и кипятят 15 мин. Во время прогревания пробирку, содержащую смесь культуры с хлористоводородной кислотой, неоднократно встряхивают для равномерного прогревания осадка. После кипячения охлаждают и вновь центрифугируют.

Полученную после центрифугирования прозрачную жидкость ——экстракт, содержащий полисахарид С,——сливают в чистую пробирку и нейтрализуют 0,2 N раствором едкого натра до pH 7,0—7,4, прибавляя в качестве индикатора 0,01 мл 0,04% раствора бромтимолового синего (рец. 27, с. 349). Во время нейтрализации экстракт из соломенно-желтого становится зеленоватым, а затем лазурно-голубым (при pH 7,0 оливково-зеленый, при 7,4 лазурно-голубой). При добавлении щелочи экстракт иногда мутнеет; в таких случаях его центрифугируют повторно до полной прозрачности.

Техника постановки реакции преципитации. В две преципитационные пробирки диаметром 2 мм наливают примерно по 0,1 мл групповой сыворотки и нормальной кроличьей сыворотки (для контроля). Затем в обе пробирки осторожно, чтобы не произошло смешивания жидкостей, наслаивают по стенке примерно такое же количество^ исследуемого солянокислого экстракта. Для этого удобнее всего пользоваться пастеровской пипеткой с длинным и тонко оттянутым капилляром. При положительном результате реакции преципитации через 10—15 мин в опытной пробирке на границе экстракта и сыворотки появляется тонкое, четко выраженное кольцо молочно-белого цвета, отсутствующее в контроле. Практически важно дифференцировать стрептококки группы А, патогенные для человека, от остальных серологических групп. Поэтому в реакции преципитации чаще всего ограничиваются использованием только одной групповой сыворотки А. При изучении культур, выделенных из крови больных септическим эндокардитом, имеет значение выявление устойчивых к пенициллину культур стрептококка, принадле-. жащих к группе D. При изучении микробного пейзажа носоглотки выделяемые штаммы стрептококка проверяют параллельно с антистрептококковыми групповыми сыворотками А, С, G, Н, соответствующими наиболее распространенным группам стрептококка, обитающим на слизистых оболочках верхних дыхательных путей.

Определение серологических типов стрептококка методом Гриффитса. Определение серологических типов стрептококка имеет значение только при решении вопросов эпидемиологического значения.

Культуры гемолитического стрептококка группы А, которые предполагается типировать, засевают для получения го- 178

могенной микробной взвеси в пробирки с 5 мл бессолевого комбинированного мясного бульона (рец. 60) и выращивают в течение 48 ч при температуре 22—27℃. Через 2 сут выращенную бульонную культуру сливают в центрифужные пробирки, центрифугируют, полученный осадок разводят 0,5— 1 мл изотонического раствора хлорида натрия и используют для постановки реакции агглютинации.

В целях экономии дефицитных типоспецифических сывороток каждый исследуемый штамм стрептококка типируют сначала с несколькими смесями, состоящими из различных типовых сывороток, разведенных изотоническим раствором хлорида натрия в отношении 1 : 10.

Пример. Смесь А состоит из сывороток типа 1, 2, 3, 5, 12, 27; смесь Б содержит типы 6, 8, 9, 10, 15; смесь В — типы 11, 13, 14; смесь Г — типы 17, 18, 22, 23; смесь Д — типы 4, 24, 26, 28, 29 и 30 сывороток. Состав смесей подбирается произвольно, однако в первую очередь берут сыворотки тех типов, которые встречаются на территории проводимого исследования.

Техника постановки реакции проста. На одно или два предметных стекла наносят по капле разных смесей типовых сывороток, разведенных 1 : 10. Затем в каждую каплю сыворотки бактериальной петлей вносят небольшое количество микробной массы исследуемого штамма стрептококка. Смесь тщательно перемешивают. Учет результатов реакции производят общепринятым способом (см. с. 120) спустя 3——5 мин. При наступлении агглютинации стрептококка с одной из примененных сывороточных смесей исследуемую культуру типируют со всеми входящими в ее состав сыворотками, разведенными 1 : 5—1 : 10.

Приготовление групповых стрептококковых сывороток. Групповые и типовые антистрептококковые сыворотки медицинская промышленность Советского Союза не производит. Их получают в отдельных лабораториях, занимающихся изучением стрептококковых инфекций.

Для иммунизации кроликов применяют вакцины, приготовленные следующим образом; суточные культуры эталонных штаммов стрептококка, принадлежащие к определенным серологическим группам, отмывают троекратно изотоническим раствором хлорида натрия от примеси питательной среды. Из осадка культуры, полученного после центрифугирования при отмывании, готовят 2 млрд, взвесь в изотоническом растворе хлорида натрия и прогревают ее в водяной бане при температуре 56 ℃ в течение 1，2 ч. Кроликов с массой тела 2,5—3 кг вакцинируют внутривенно по 4 дня подряд с трехдневными перерывами в течение месяца, что составляет полный цикл иммунизации. Дозу вводимой вакцины изменяют в зависимости от срока вакцинации, В течение 1-й недели вводят 0,25 мл (500 млн. микробных тел), 2—3-й недели — по 0,5 мл (1 млрд, микробных тел), в течение 4—5-й недели一по 1 мл (2 млрд, микробных тел).

Сыворотки достаточно высокого титра получают обычно после двух циклов вакцинации с полуторамесячным перерывом между ними. '

Техника приготовления типовых стрептококковых сывороток. Для приготовления типовых стрептококковых сывороток пользуются эталонными типовыми штаммами стрептококка серологической грузипы А. В течение 2 нед кроликов иммунизируют внутривенно вакциной.

убитой нагреванием, так же как при изготовлении групповых стрептококковых сывороток. Затем в течение 2 нед (по 4 дня в неделю) вводят внутри- венио живую культуру стрептококка в дозе 500 млн. микробных тел в Течение 1 •力 недели и 1 млрд, микробных тел в течение 2-й недели. 1

Для изготовления типовых стрептококковых сывороток проводят не менее 4 циклов вакцинации с интервалом между ними 1%—2 мес.

Полученные типовые стрептококковые сыворотки адсорбируют культурой стрептококка группы А I типа, автоклавированной в течение Р/г ч пр» температуре 130 ℃. При автоклавировании в клетках стрептококка сохраняется групповой полисахаридный антиген и разрушаются типовые антигены М и Т.

К 1 мл адсорбируемой сыворотки добавляют 360 млрд, микробных тел, помещают в термостат на 2 ч <при 37℃ и затем на 18—20 ч в холодильник. После этого смесь центрифугируют для удаления из сыворотки микробных тел. Полностью адсорбированные типовые сыворотки не содержат антител к групповому полисахариду С и потрму не должны давать реакцию агглютинации с автоклавированной культурой стрептококка и реакцию преципитации с солянокислым экстрактом из культур стрептококка группы А гетерологических типов.

Адсорбированная таким образом сыворотка содержит антитела Т и поэтому реагирует в реакции агглютинации с живыми культурами стрептококка гомологичного типа.

Серологическая диагностика острых и хронических стрептококковых инфекций. При некоторых острых, но главным образом при хронических стрептококковых заболеваниях (хронический тонзиллит, ревматизм, нефрит) больные, как правило, длительное время получают большие дозы антимикробных препаратов: сульфаниламидов, антибиотиков. Выделение же возбудителя из слизистого отделяемого носоглотки, мокроты, гноя ран, абсцессов и крови представляет большие трудности. Поэтому проведение трудоемких бактериологических исследований на стрептококки в таких случаях оказывается безрезультатным. В то же время проведение полного серологического анализа с обнаружением в крови стрептококкового антигена и определение титра стрептококковых антител может оказать большую помощь в установлении этиологического фактора болезни.

Серологическое обследование больных в целях выявления стрептококковой инфекции предусматривает определение в крови стрептококкового антигена и титра стрептококковых антител к токсинам: стрептолизину-0 (СЛО) и стрептогиа- луронидазе (СГ), которым придают большое значение в патогенезе стрептококковых инфекций.

Обязательным условием серологической диагностики является повторность проведения исследований для наблюдения за динамикой изучаемых показателей.

Определение стрептококкового антигена в сыворотке крови. Появление стрептококкового антигена в крови является следствием декомпенсации инфекционного очага и, следовательно, одним из убедительных доказательств активно текущего инфекционного процесса. Для обнаружения антигенов стрептококка применяют РСК на холоду.

Для постановки реакции необходимы следующие ингредиенты:

Сыворотка больного, подлежащая исследованию.

Антистрептококковая иммунная сыворотка.

Сыворотка кроличья нормальная (для контроля). Сыворотки, подлежащие исследованию, и кроличьи (иммунная и нормальная) перед постановкой опыта прогревают 30 мин при 56℃ для инактивации собственного комплемента.

Комплемент.

Гемолитическая сыворотка.

Эритроциты барана (3% взвесь).

Изотонический раствор хлорида натрия pH 7,0—7,2.

В предварительном опыте в РСК оттитровывают рабочую дозу иммунной сыворотки с солянокислым антигеном, приготовленным из штамма стрептококка типа I, которым вакцинировали животных. Иммунную сыворотку разводят по схеме, приведенной в табл. 23.

Таблица 23

Схема разведения иммунной сыворотки

№ пробирки

Объем иммунной сыворотки, мл

Изотонический ■ раствор хлорида натрия, мл

Полученные разведения

1

0,1

2,9

Г: 30

2

0,1

3,9

1:40

3

1 (1)

1:60

4

2 (2)

1:80

5

0,1

9,9

1:100

6

1 (4)

1:160

7

1 (5)

1:300

Примечание. Цифры в скобках означают номера пробирок, из которых берется указанный в таблице объем разведенной сыворотки для получения каждого последующего разведения.

Из солянокислого антигена готовят ряд последовательных разведений (табл. 24).

Титрование рабочей дозы иммунной сыворотки осущест* вляется следующим способом. В 14 параллельных рядов пробирок разливают по 0,1 мл солянокислого антигена в последовательных разведениях (от 1 :40 до 1 : 2560). Затем в пробирки каждого нечетного ряда добавляют по 0,1 мл иммунной сыворотки. В пробирки 1-го ряда добавляют иммунную сыворотку в разведении 1 : 30, в пробирки 3-го ряда прибавляют тот же объем иммунной сыворотки, разведенной 1 : 60» и т. д. В четные (контрольные) ряды пробирок с последовательными разведениями солянокислого антигена вносят по 0,1 мл нормальной кроличьей сыворотки в разведениях, со-

Схема разведения антигена

№ пробирки

Солянокислый антиген, мл

Изотонический раствор хлорида натрвя, мл

Полученные разведеиия

I

0,2

7,8

1:40

2

3 (I)

3

1：80

3

3 (2)

3 •

1 ： 160

4

3 (3)

3

1：320

5

3 (4)

3

1 ：640

6

3 (5)

3

1 ： 1280

7

3 (6)

3

1 ： 2580

Примечание. Цифры в скобках означают номера пребирок, из которых берется указанный в таблице объем разведенного антигена для получения каждого последующего разведения.

стветствующих разведениям иммунной сыворотки. Далее в пробирки всех рядов доливают по 0,1 мл изотонического раствора хлорида натрия и по 0,1 мл комплемента в рабочей дозе.

Штатив с пробирками встряхивают для лучшего перемешивания всех ингредиентов и помещают в холодильник при температуре 3—4℃ на 18—20 ч. По истечении указанного срока во все пробирки опытных и контрольных рядов добавляют по 0,2 мл гемолитической системы и через 10——45 мин выдерживания в термостате при 37℃ после прохождения реакции в контроле производят учет результатов общепринятым способом (см. с. 143). За рабочую дозу иммунной сыворотки принимают то наименьшее разведение, при котором юна, не проявляя антикомплементарного действия, реагирует с наибольшим разведением солянокислого антигена. Чаще всего рабочая доза соответствует разведению сыворотки 1 : 60—1 : 100. Однако при постановке опыта иммунную сыворотку используют в разведении, предшествующем рабочей дозе. Так, в приведенном нами примере рабочая доза иммунной сыворотки — 1/80, следовательно, опытная доза ее— 1/160.

Постановка основного опыта, предусматривающего определение стрептококкового антигена в сыворотке крови, осуществляется по схеме, приведенной в табл. 25. Учет реакции производят общепринятым способом по четырехкрестной системе (см. с. 143) в момент появления гемолиза в контрольных пробирках.

За титр антигена принимается наибольшее разведение исследуемой сыворотки, вызывающее задержку гемолиза не менее чем на ++.

Определение титра аитистрептолизина-0 по способу Ренца и Рендела, модифицированному Институтом эпидемиоло- 182

Схема постановки основного опыта

Ингредиент реакции, мл

Опытный ряд пробирок

Контроль на специфичность реакции

Контроль исследуемой сыворотки на антиком плементарность

Контроль иммунной сыворотки на антн- компле- ментар- ность

Контроль нормальной сывороткн на анти- компле- ментар- ность

разведение исследуемой сыворотки

1 : 20

1 ：40

1 : 80

1 ： 160

1:2。

1 : 40

1 : 80

1 : 160

1 ：20

1 :40

1 :80

1 : 160

Исследуемая сыворотка

0,1

0,1

0,1

0」

0,1

0,1

0」

0」

0,1

0」

0」

0,1

二

Иммунная сыворотка соответственно ее титру

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

Нормальная сыворотка кролика, разведенная соответственно титру иммунной сыворотки

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

Изотонический раствор хлорида натрия

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

Комплемент (рабочая доза)

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

0」

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

0J

0,1

Выдерживание в холодильнике лри 3—4℃ в течение 18—20 ч

Гемолитическая системаГемолитическая система0,20,20,20,20,20,20,20,20,20,20,2 0?0,20,2

Гемолитическая система

Гемолитическая система

Выдерживание в термостате при 37 ℃ в течение 20—30 мин

гии и микробиологии АМН СССР имени Н. Ф. Гамалеи. Способность стрептолизпна-0 вызывать гемолиз эритроцитов in vitro утрачивается частично или полностью при добавлении к нему антистрептолизина-О, содержащегося в крови больных и выздоравливающих от стрептококковой инфекции. Этот феномен положен в основу методики определения антистрептолизина-0 в сыворотке крови, которую предложили Ренц и Рендель.

Для постановки реакции необходимы следующие ингредиенты: 1. Сыворотка крови, подлежащая исследованию, прогретая при температуре 56℃ 30 мин (хилезные, гемолизированные и проросшие сыворотки для титрования антистрептолизина-0 непригодны).

Препарат стрептолизина-О, полученный из фильтрата продуцирующей его культуры стрептококка.

Фосфатный, буфер pH 6,5—6,7. Пропись: NaCI 7,4 г, КН2РО4 3,17 г, Na2HPO4 1,81 г. Доливают до 1 л дистиллированной водой. Добавляют 0,1 N раствора NaOH до получения указанного значения pH. Готовый буфер должен храниться в холодильнике при температуре 4—10°С.

Взвесь эритроцитов кролика (5%) готовят общепринятым способом (см. с. 103) на фосфатном буфере в день постановки опыта.

При определении титра антистрептолизина-О, кроме эритроцитов кролика, можно пользоваться эритроцитами барана и человека, так как результат реакции не зависит от видовой принадлежности эритроцитов.

Постановку реакции титрования антистрептолизина-0 начинают с приготовления рабочих разведений исследуемых сывороток и растворения высушенного препарата стрептолизи- на-О.

Сыворотки, подлежащие исследованию на антистрептолизин-0, разводят фосфатным буфером соответственно приве^ денному ниже расчету:

А. 1 : 50—0,1 мл сыворотки+4,9 мл буфера.

Б. 1 : 250—0,5 мл (разведения А) +2 мл буфера.

Стрептолизин-О растворяют фосфатным буфером непосредственно перед добавлением его в пробирки, как указано на этикетке ампулы. Разведенный таким образом препарат стрептолизина-0 содержит ® объеме 0,3 мл одну рабочую дозу, т. е. то количество стрептолизина-О, которое почти полностью (+ + ) нейтрализует половину AEStO (StO — международная единица стандарта стрептолизина-О).

Разведенные сыворотки и другие ингредиенты реакции разливают в ряд пробирок в последовательности, указанной в схеме опыта (табл. 26).■

Результаты реакции учитывают после наступления полного гемолиза эритроцитов в 13-й пробирке с контролем стрептолизина-О. Для обозначения полученных результатов пользуются знаками + и —:

+ + + положительная реакция, отсутствие гемолиза, в осадке иерастворен- иые эритроциты

+ + положительная реакция, слабый гемолиз

+ , ± сомнительная реакция, в пробирке почти полный гемолиз.

— отрицательная реакция, в пробирке полный гемолиз.

Титр исследуемой сыворотки выражают числом AEStO в 1 мл. В табл. 26 приведено число AEStO в 1 мл при нейтрализации стрептолизина-0 разными разведениями исследуемой сыворотки.

Определение антистрептогиалуронидазы методом Мак Клина, модифицированным Н・ М. Лямперт и Э. А. Гальпериным. Определение антистрептогиалуронидазы основано на способности сывороток, содержащих антитела, нейтрализовать активность стрептогиалуронидазы, предотвращая тем самым деполимеризацию молекул гиалуроновой кислоты и снижение ее вязкости.

При добавлении сыворотки, содержащей антистрептогиа- луронидазу, гиалуроновая кислота, находящаяся в смеси с гиалуронидазой, сохраняет присущую ей способность образовывать нерастворимый комплекс с белками, который при подкислении среды выпадает в виде компактного осадка.

В контрольной пробирке, содержащей гиалуронидазу и гиалуроновую кислоту без сыворотки, сгусток муцина не образуется.

Для определения титра антистрептогиалуронидазы необходимы следующие ингредиенты:

Сыворотка, подлежащая исследованию на титр антистрептогиалуронидазы, прогретая при температуре 5б℃ 30 мин (хилезные, гемолизированные и проросшие сыворотки для титрования непригодны).

■ 2. Препарат стрептококковой гиалуронидазы L полученный из гиалуронидазоактивной культуры стрептококка группы А.

Гиалуроновая кислота.

Уксусная кислота 15% (15 мл х. ч. ледяной уксусной кислоты + 85 мл дистиллированной воды).

Изотонический раствор хлорида натрия.

Коммерческие препараты стрептококковой гиалуронидазы, высушенные лиофильным способом и расфасаванные в ампулы, выпускает произвол* ствеиный отдел Института эпидемиологии и микробиологии АМН СССР имени Н・ Ф. Гамалеи.

Схема титрования аитистрептолизина-0 в сыворотках

Разведевие сыворотки

1 :50

1 :250

1 : 1000

Контроль

*

SS 鐘

№ яробиркн

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

U

12

13

Доза сыворотки, мл

0,4

0,2

0,15

0,1

0,3

0,25

0,2

0,1

0,25

0,15

-

Фосфатный буфер pH 6,5—6,7

0」

0,3

0,35

0,4

0,2

0,25

0,3

0,4

0,25

0,35

0,8

0,5

Стрептолизин-0

0,3

0,3

0,3

0,3

0,3

0,3

0,3

0,3

0,3

0,3

0,3

Выдерживание в термостате лри 37 ℃ 15 мин

5% взвесь эритроцитов, мл

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

Выдерживание в термостате при 37 °C 1 час

Число AEStO в 1 мл, ИЕ

63

125

165

250

313

413

500

625

1250

2000

3000

Примечание. Тнтр антистрептолизина-0 до 250 АЕ в 1 мл, обнаруживаемый у практически здоровых лиц, считается в пределах нормы.

А. Приготовление гиалуроновой кислоты. В день перед постановкой опыта из пупочных канатиков новорожденных готовят гиалуроновую кислоту. Для этого мелко нарезанные кусочки свежей пуповины освобождают, пользуясь пинцетом, от сосудов, отмывают дистиллированной водой от остатков крови и измельчают ножницами до получения кашицеобразной массы. Подготовленную таким образом массу заливают двойным объемом дистиллированной воды и помещают на 3 ч или более в холодильник при 3℃.

После настаивания в холодильнике смесь нагревают, доводя ее до кипения (но не кипятят!), фильтруют через 2— 3 слоя стерильной марли и определяют рабочую дозу гиалуроновой кислоты по относительной вязкости (а) или по способности ее образовывать муциновый сгусток в кислой среде 「(6). Определение рабочей дозы гиалуроновой кислоты необходимо проводить перед каждым опытом титрования анти- стрептогиалуронидазы.

При титровании антистрептогиалуронидазы в сыворотке крови рекомендуется использовать раствор гиалуроновой кислоты с относительной вязкостью, равной 3. С этой целью сопоставляют время истечения дистиллированной воды и раствора гиалуроновой кислоты при температуре 36—37℃ в вискозиметре Освальда. Расчет относительной вязкости раствора гиалуроновой кислоты производят следующим образом. Например, время истечения гиалуроновой кислоты 27 с, а время истечения воды 9 с; следовательно, относительная вязкость раствора гиалуроновой кислоты равна 3 (27:9). В том случае, если эта величина больше 3, раствор разводят дистиллированной водой до получения нужной вязкости и в качестве рабочей дозы берут 0,3 мл.

Рабочую дозу гиалуроновой кислоты по образованию муцинового сгустка определяют по табл. 27.

После добавления в пробирки всех ингредиентов штатив с пробирками несколько раз встряхивают и приступают к учету результатов. За рабочую дозу гиалуроновой кислоты принимают минимальное количество ее, которое при добавлении раствора уксусной кислоты образует плотный сгусток муцина величиной с горошину при полном просветлении среды. Чаще всего рабочая доза гиалуроновой кислоты составляет 0,2—0,3 мл.

Б. Р азведение исследуемых сывороток. Сыворотки, подлежащие исследованию, разводят изотоническим раствором хлорида натрия соответственно приведенному ниже расчету:

1 :50—0,1 мл сыворотки + 4,9 мл изотонического раствора хлорида натрия

-I : 250——0,5 мл разведения 1 + 2 мл изотонического раствора хлорида натрия

Таблица 27

Определение рабочей дозы гиалуроновой кислоты

№ пробирки

Ингредиент

1

2

3

4

5

6

7

Изотонический раствор хлорида натрия, мл

0,85

0,8

0,75

0,7

0,65

0,55

0,5

Гиалуроновая кислота, ■мл

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,45

0,5

Уксусная кислота 15%, мл

0,1

0,1

0,1

0,1

0」

0,1

0,1

1: 1000—0,5 мл (разведения 2) + 1,5 мл изотонического раствора хлорида натрия.

В. Разведение гиалуронидазы. Содержимое ампулы с коммерческим препаратом стрептококковой гиалуронидазы растворяют изотоническим раствором хлорида натрия, как указано на этикетке. Разведенная гиалуронидаза должна содержать в 0,2 мл одну опытную дозу, т. е. то количество гиалуронидазы, которое нейтрализуется одной единицей рабочего стандарта антистрептогиалуронидазы.

При определении титра антистрептогиалуронидазы разведенные сыворотки и другие ингредиенты реакции разливают по пробиркам, как указано в табл. 28.

После прибавления раствора уксусной кислоты в пробирки опытного и контрольного рядов приступают к учету результатов. В контроле гиалуроновой кислоты (пробирка № 13) должен находиться плотный сгусток муцина, величиной с горошину, при полном просветлении среды. В контроле гиалуронидазы (пробирка № 12) молекулы гиалуроновой кислоты под действием гиалуронидазы деполимеризуются и сгустка не образуется.

Результаты титрования обозначают знаками + и —:

+ положительная реакция, сгусток и просветление среды

—отрицательная реакция, мутная среда без сгустка

土 сомнительная реакция, в содержимом пробирки хлопья и нити

Титр сыворотки выражают числом единиц антигиалуронидазы в 1 мл сыворотки. За 1 АЕ HyS принимают то минимальное количество сыворотки, которое нейтрализует одну опытную дозу гиалуронидазы. В табл. 28 приведено число единиц HyS в 1 мл при нейтрализации стрептококковой гиалуронидазы различными разведениями сыворотки.

ПНЕВМОКОККИ

Пневмококки (Streptococcus pneumoniae) являются специфическими возбудителями крупозной пневмонии и могут вызывать различные заболевания верхних дыхательных путей:

Схема титрования антистрептогиалуронидазы а сыворотках

Разведенне сыворотки

1 ：Б0

1:250

1 :2000

Контроль гиалуронидазы

Контроль гиалуроновой кислоты

№ лробирки

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

Количество сыворотки, мл

0,4

0,2

0,15

0」

0,4

0,3

0,25

0,2

0,1

0,25

0,15

—

Изотонический раствор хлорида натрия

До общего объема 1 мл 1

Одна опытная доза гиалуронидазы

В объеме 0,2 мл на каждую пробирку

Гиалуроновая кислота

Выдержнвание в термостате при 37 ℃ 30 мии

По одной рабочей дозе в каждую пробирку

Выдерживание в термостате при 37 ℃ 10 мин

Выдерживание в холодильнике при 3℃ 10 мин

Уксусная кислота

По 3 капли в каждую пробирку

Число АЕ HyS в 1 мл

/25

2502

330

550

625

825

1000

1250

2500

4000

6000

1 Общий объем всех ингредиентов, участвующих в реакции, должен быть равен 1 мл. Оя складывается нз количества разведенной сы- =* воротки больного, гиалуронидазы, рабочей дозы гиалуроновой кислоты н изотонического раствора хлорида натрия.

沼 2 Титр антистрептогиалуронидазы до 300 АЕ HyS, обнаруживаемый у практически здоровых лнц. считается s пределах нормы.

ангину, бронхопневмонии, бронхит, абсцесс легкого. Тяжелое течение пневмонии осложняется иногда сепсисом и менингитом.

Для бактериологического исследования на пневмококки могут быть использованы:

мокрота при крупозной пневмонии и бронхопневмонии;

слизистое отделяемое зева и носоглотки при ангине и катаре верхних дыхательных путей;

кровь при подозрении на сепсис;

спинномозговая жидкость при менингите;

гной при абсцессах.

Патологический материал тотчас после его получения направляют в лабораторию на исследование. Если по каким- либо причинам транспортировка задерживается, материал должен находиться в леднике, однако не свыше 2 ч, так как при более продолжительном хранении пневмококки погибают.

В лаборатории материал подвергают бактериоскопическо- му исследованию (кроме крови). Выявление в материале капсульных диплококков характерной формы дает основание предположить наличие пневмококка.

Идентификация выделенной культуры с пневмококком основывается на изучении морфологии микроба, капсулообра- зования в организме зараженного животного и больного человека, растворимости микробов в желчи, реакции агглютинации со специфическими противопневмококковыми сыворотками.

По антигенной структуре пневмококки разделяются более чем на 70 типов, обозначаемых римскими цифрами I, II, III, и группу X, объединяющую все остальные типы. В патологии человека основная роль принадлежит пневмококкам I, II, III типов. Типирование пневмококков производят с помощью типовых антипневмококковых сывороток.

Схема микробиологического исследования мокроты на пневмококки. Первый день. 1. Из мокроты, поступившей на исследование, готовят в соответствии с существующими правилами (см. с. 27) два тонких мазка для микроскопического исследования. Один Мазок окрашивают по Граму, другой ——для обнаружения капсул ——по методу Бурри (см. с. 34).

При микроскопировании мокроты в мазках, окрашенных по Граму, пневмококк обнаруживается в виде грамположи- тельных парно расположенных кокков. Та сторона, которой они соприкасаются друг с другом, уплощена, противоположная сторона вытянута и несколько заострена. Форму клеток пневмококка иногда сравнивают с формой ланцета, называя его ланцетовидным диплококком (Diplococcus lanceolatus). В мазке, обработанном специально для выявления капсул, в

окружности клеток пневмококка обнаруживается хорошо выраженная капсула, которая образуется только в организме животного или человека.

Для выделения культуры пневмококка из мокроты рекомендуется биологический способ. При обычном посеве на питательные среды рост пневмококков угнетается размножением посторонних микробов, которыми изобилует мокрота. В организме мышей, несмотря на сопутствующую микрофлору, пневмококки размножаются очень быстро, вызывая сепсис, приводящий к гибели животных. Мокротой, поступившей на исследование, заражают внутрибрюшинно двух белых мышей по методике, описанной выше (см. с. 96).

Признаки заболевания появляются обычно через 4—6 ч после заражения. В конце того же дня животных с явными признаками заболевания вскрывают под эфирным наркозом. Кровь, полученную из сердца, и кусочки внутренних органов (печени, селезенки) засевают в сывороточный бульон и на кровяной агар, которые помещают в термостат при 37℃ на 18—20 q.

Второй день. 1. Просматривают пробирки с сывороточным бульоном и чашки с кровяным агаром, засеянные материалом, взятым у животного, зараженного исследуемой мокротой.

На кровяном агаре пневмококки образуют мелкие (диаметром 0,5—1,2 мм) колонии, прозрачные в проходящем свете. В падающем свете колонии пневмококков имеют зеленовато-серый цвет, темный в центре и более светлый по периферии. Вокруг колоний очень часто отмечается зеленоватый отсвечивающий ореол, возникающий вследствие превращения гемоглобина в метгемоглобин. По внешнему виду колонии пневмококка трудно отличить от колоний зеленящего стрептококка.

В пробирках с сывороточным бульоном пневмококки вызывают равномерное помутнение среды с пылевидным осадком на дне, поднимающимся в виде легкого облачка при взбалтывании среды.

Из бульонной культуры выделенного микроба и из колоний с признаками, характерными для пневмококка, делают мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. При наличии пневмококка в мазках обнаруживаются грамполо- жительные кокки, расположенные парами или в виде цепочек наподобие стрептококка. Расположение в виде цепочек особенно характерно для сывороточно-бульонной культуры.

На основании морфологических свойств и культуральных признаков трудно дифференцировать пневмококки от зеленящих стрептококков. Поэтому для определения принадлежности выделенной культуры к пневмококкам и отличия ее от

зеленящих стрептококков определяют способность разлагать инулин и ставят реакцию на растворение в желчи.

Для проверки на желчеустойчивость 2—3 мл исследуемой культуры, выращенной на сывороточном бульоне, засевают в 5 мл 10% желчного бульона, после чего он становится мутным. Пробирку с посевом ставят в термостат на сутки. Если после суточного содержания в термостате происходит полное просветление среды, наступающее вследствие лизиса микробных тел, исследуемую культуру следует отнести к пневмококкам, так как зеленящие стрептококки, устойчивые к бычьей желчи и желчнокислым солям, в указанной среде не лизируются.

МЕНИНГОКОККИ '

Менингококк (Neisseria meningitidis) является возбудителем у человека менингококковой инфекции — не только цереброспинального эпидемического менингита, но и других клинических форм болезни: менингококцемии (сепсис без поражения мозговых оболочек), менингококкового эндокардита, менингококкового назофарингита. Менингококки могут быть также обнаружены на слизистых оболочках носоглотки практически здоровых людей. Бессимптомное менингококковое носительство встречается обычно среди людей, имевших контакт с больными менингитом или перенесших незадолго до обследования менингококковую инфекцию.

Патологический материал для исследования на менингококки. Объектом лабораторного исследования на менингококковую инфекцию могут служить спинномозговая жидкость (ликвор), носоглоточная слизь, кровь, трупный материал.

Взятие спинномозговой жидкости (ликвора) проводят с соблюдением правил асептики в день поступления больного в стационар. Первую порцию жидкости, около 1 мл, берут в отдельную пробирку для общего ликворологического исследования. Вторую порцию, предназначенную для бактериологического исследования, наливают в стерильную пробирку. Полученный материал (если невозможно немедленно доставить его в лабораторию) может сохраняться в течение нескольких часов в термостате при 37°С.

Анализ носоглоточной слизи на менингококк проводится при обследовании больных с подозрением на менингококковый назофарингит и при выявлении носителей менингококка. Исследуют отделяемое задней стенки носоглотки и слизь, полученную тампоном на уровне хоан (см. с. 161).

Трупный материал (кровь, гной с мозговых оболочек, нз кожных поражений и т. д.) в связи со слабой жизнеспособностью менингококка имеет смысл брать на исследование только в первые часы после смерти, пока не произошло остывание трупа.

Материал, подлежащий исследованию на менингококки, тотчас после взятия направляют в лабораторию. При пересылке в холодное время года материал необходимо оберегать от охлаждения, утепляя его ватой и резиновыми грелками с водой, подогретой до температуры 40 ℃.

Схема исследования спинномозговой жидкости. Первый день. 1. Спинномозговую жидкость центрифугируют и затем 2—3 капли осадка жидкости засевают на поверхность сывороточного агара (рец. 59) в чашке Петри. Поскольку менингококки растут только в условиях повышенной влажности, отличаясь при этом большой чувствительностью к малейшим отклонениям температуры от оптимума (37 ℃), посевы первичного материала и пассирование микробных культур производятся только иа свежеприготовленные питательные среды, предварительно прогретые в термостате.

Из этого же осадка делают мазок, окрашивают его водным раствором метиленового синего (рец. 9) или водным раствором основного фуксина (рец. 7) и микроскопируют. В мазке спинномозговой жидкости характерно наличие диплококков, расположенных внутри и вне лейкоцитов, напоминающих своей формой кофейные зерна, обращенные плоскими сторонами друг к другу. Вокруг клеток нередко выявляется нежная капсула, исчезающая при пассировании возбудителя на искусственных питательных средах (рис. 21).

Обнаружение в мазках морфологически типичных менингококков является основанием для выдачи лечащему врачу предварительного ответа в следующей формулировке: «В спинномозговой жидкости при прямой бактериоскопии предварительно идентифицирован менингококк».

Оставшийся от посева и микроскопирования осадок спинномозговой жидкости для «обогащения» менингококками заливают 5 мл полужидкого (0,1 %) агара и оставляют на сутки в термостате при 37 ℃.

Второй день. 1. Просматривают сделанные накануне посевы спинномозговой жидкости. На сывороточном агаре менингококк образует бесцветные мелкие (от 0,5 до 1,5 мм в диаметре) колонии с ровными краями, слегка уплощенные. Под микроскопом при боковом освещении они слабо опалесцируют, в проходящем свете имеют матовый центр и прозрачную периферию. Консистенция колоний вязкая.

Так как гнойные менингиты могут иметь различную этиологию, то на сывороточном агаре, кроме менингококков, могут размножаться культуры других микроорганизмов (стафилококки, стрептококки и пневмбкокки). Культуры, не соответствующие по морфологическим и культуральным признакам роду нейссерий, отсеваются и изучаются.

Из выросших на поверхности сывороточного агара колоний делают мазки, окрашивают их методом Грама в мо-

13 Лабинская А. С. 193

.Дификации Калины. Техника окраскй сводится к следукь щему.

В каплю исследуемой микробной взвеси вносят петлю 0,5% спиртового раствора бриллиантового зеленого, после чего общепринятым способом (см. с. 27) готовят мазок, подсушивают его на воздухе и фиксируют однократным проведением над пламенем горелки. Фиксированный мазок окрашивают 1%—2 мин основным красителем Калины (рец. 19). Затем промывают водой, обесцвечивают спиртом до отхождения облачков краски, промывают водой повторно и докрашивают в течение 2 мин водным раствором фуксина. При микроскопии препарата грамотрицательные бактерии имеют ярко-розовый, грамположительные ——зелено-черный или темно-фиолетовый цвет.

Обнаружение в мазке беспорядочно расположенных полиморфных кокков, неравномерно окрашенных по Граму, дает основание отнести выделенные микроорганизмы к роду нейс- серий.

На основании результатов проведенного исследования на 2-е сутки возможна выдача предварительного ответа, констатирующего, что при прямом посеве спинномозговой жидкости на сывороточном агаре получен рост нейссерий.

Колонии с культуральными и морфологическими признаками, типичными для менингококка, отвивают в две пробирки со скошенным сывороточным агаром и в одну пробирку со скошенным мясо-пептонным агаром (рец. 38).

При пересеве исследуемого материала засевают пробирку с сывороточным агаром, а остаток его, содержащийся на петле, наносят частым штрихом на поверхность мясо-пептонного агара. После этого петлю прожигают и новую порцию исследуемого материала засевают на вторую пробирку с сывороточным агаром. Посевы на сывороточном агаре выращивают параллельно при температуре 37° и 22 ℃, на мясо-пептонном агаре — при 37 ℃. Одновременное культивирование выделенного возбудителя на простых и сывороточных питательных средах при температуре 22° и 37 ℃ является простым и надежным тестом, позволяющим дифференцировать менингококки, неспособные расти на сывороточной среде при 22 ℃ и на беесывороточной среде при 37 ℃, от сходных с ними по морфологическим и культуральным признакам N. са- tarrhalis.

При скудном росте (1—2) колоний в посевах первичного материала отсев производят только на сывороточный агар с последующим подращиванием при температуре 37 ℃, вследствие чего дифференциация выделеняых микроорганизмов с N, catarrhalis передвигается на сутки. -

Третий день. 1. Просматривают посевы, сделанные накануне. На поверхности сывороточного агара менингококки 194

образуют нежный влажный налет сероватого цвета, прозрачный в проходящем свете.

Из пленки микробного роста берут небольшое количество материала, готовят мазок, окрашивают его по Граму в модификации Калины, микроскопируют для определения чистоты выделенной культуры и подтверждения тинкториальной и морфологической идентичности выделенных бактерий с бактериями рода Neisseria.

Учитывают результаты посевов, сделанных с целью дифференциации менингококка от N. catarrhalis на сывороточном агаре, инкубированном при 22 ℃, на мясо-пептонном агаре ирн 37 ℃ (табл. 29). Следует иметь в виду, что обильное нанесение материала на бессывороточную среду в некоторых случаях сопровождается скудным микробным ростом в начале штриха. В этих случаях культура идентифицируется по характеру роста на сывороточной среде, инкубированной при 22 ℃. На этом этапе исследования возможна выдача окончательного положительного ответа.

Таблица 29

Морфологические, культуральные и биохимические свойства неиссерий,встречающихся наиболее часто в носоглотке

ВиднейссерийВиднейссерий。一mege8"d9o。一mege8"d9o^SWSUMO BH Ks^unv^^SWSUMO BH Ks^unv^Отношение к условиямкультивированияОтношение к условиямкультивированияуглеводамуглеводам°。ZC Hdc 百JB VtCHhOI баойло BH HQ&°。ZC Hdc 百JB VtCHhOI баойло BH HQ&Do zm Hdu &BJB SOX^OHROn .30«® ns 50aDo zm Hdu &BJB SOX^OHROn .30«® ns 50a°。8sac•odosm вн HQ&°。8sac•odosm вн HQ&«Oss«OssBeodBXB。BeodBXB。N, meningitidis Я. catarrhalis .siccaN. qerflavaN. flavaN. subflavaN. flavescensN. lactamicusN, meningitidis Я. catarrhalis .siccaN. qerflavaN. flavaN. subflavaN. flavescensN. lactamicus一 --++++-一 --++++-+++++++++++++++++++++++++++++++++4-или—4-ИЛИ— 4-ИЛИ—+4-или—4-ИЛИ— 4-ИЛИ——редко -| редко+ +рсдко——Ьредко— +редко——+или————редко+—редко -| редко+ +рсдко——Ьредко— +редко——+или————редко+- 一++ 一 一二二 ++-TГ 一一+ 一 +++一 ++- ++- +- 一++ 一 一二二 ++-TГ 一一+ 一 +++一 ++- ++- +

Виднейссерий

Виднейссерий

。一mege8"d9o

。一mege8"d9o

^SWSUMO BH Ks^unv^

^SWSUMO BH Ks^unv^

Отношение к условиямкультивирования

Отношение к условиямкультивирования

углеводам

углеводам

°。ZC Hdc 百JB VtCHhOI баойло BH HQ&

°。ZC Hdc 百JB VtCHhOI баойло BH HQ&

Do zm Hdu &BJB SOX^OHROn .30«® ns 50a

Do zm Hdu &BJB SOX^OHROn .30«® ns 50a

°。8sac

•odosm вн HQ&

°。8sac

•odosm вн HQ&

«Oss

«Oss

BeodBXB。

BeodBXB。

N, meningitidis Я. catarrhalis .sicca

N. qerflava

N. flava

N. subflava

N. flavescens

N. lactamicus

N, meningitidis Я. catarrhalis .sicca

N. qerflava

N. flava

N. subflava

N. flavescens

N. lactamicus

一 --++++-

一 --++++-

++++++++

++++++++

++++++++

++++++++

+4-или—

4-ИЛИ— 4-ИЛИ—

+4-или—

4-ИЛИ— 4-ИЛИ—

—редко -| редко+ +рсдко——Ьредко— +редко——+или——

——редко+

—редко -| редко+ +рсдко——Ьредко— +редко——+или——

——редко+

- 一++ 一 一二二 ++-TГ 一一+ 一 +++一 ++- ++- +

- 一++ 一 一二二 ++-TГ 一一+ 一 +++一 ++- ++- +

Примечание. Среди биохимических признаков важным является наличие 巾5“ента оксидазы, имеющегося у всех представителей рода нейссерий. Сахаро力нтн- веские свойства выражены нечетко.

Если прямой посев спинномозговой жидкости на сывороточном агаре не дал роста колоний, прибегают к повторному высеву из смеси ликвора с полужидким агаром, инкубированным в термостате. При отрицательных результатах высев иэ обогащенного ликвора повторяют ежедневно в течение 2— 7 дней инкубации его в термостате. Если получен рост коло-

1в* 阀

«ий, их исследование проводится тем же путем, что и при прямом посеве спинномозговой жидкости.

Схема исследования носоглоточной слизи. Первый день. Полученную для исследования слизь из носоглотки

засевают у постели больного на питательные среды: сывороточный агар (рец. 59) и ристомициновую среду (рец. 67), Ристомициновая среда содержит антибиотик — ристомицин, подавляющий рост грамлоложительных кокков, которыми изобилует слизистая оболочка носоглотки. Нейссерии малочувствительны к ристомицину, и при его концентрации в среде порядка 100—150 ЕД/мл их рост почти не подавляется. Исследуемый материал втирают в поверхность небольшого участка питательной среды всеми сторонами тампона. Затем этим же тампоном внесенный материал растирают штрихом (с отрывом) по всей площади чашки. При использовании обеих сред сначала делают посев на сектор (%—%> чашки с ристомициновой средой, затем засевают Vs чашки с сывороточным агаром. В случае ристомициновой среды материал от одного лица засевают на 2 чашки с сывороточным агаром.

При транспортировке в холодное время года материал, засеянный на чашки, оберегают от охлаждения. Транспортировка незасеянных тампонов в лабораторию не допускается.

Второй день. 1. Просматривают посевы. При этом рекомендуется пользоваться бинокулярной стереоскопической лупой (МБС-1 или МБС-3). На поверхности сывороточного агара, кроме бактерий рода нейссерии, наблюдается обильный рост многочисленных грамположительных кокков, вегетирующих на слизистой оболочке зева.

На среде с ристомицином вырастают только грамотрица- тельные бактерии, преимущественно представители рода нейссерий.

При просмотре отбирают колонии, характерные для менингококка и N. catarrhalis. Колонии пигментообразующих нейссерий дифференцируются по желтому пигменту, интенсивность которого усиливается при выдерживании чашек на свету в течение 2—3 сут.

С колониями, подозрительными в отношении рода, нейссерий, ставят оксидазную реакцию. Для этого в месте их скопления на поверхность питательной среды наносят каплю свежеприготовленного биметилпарафенилендиамина (рец. 32). Если колонии принадлежат к представителям рода нейссерий, для которого характерно наличие фермента оксидазы (см. табл. 29), то под действием реактива они приобретают розовую окраску.

Колонии, по результатам оксидазного теста относящиеся к роду нейссерий, в течение ближайших 2 мин (во избе* жание гибели бактерий под влиянием реактива) пересевают «а сектор чашки с сывороточным агаром.

Дальнейшее изучение выделенных культур в плане дифференциации менингококка от N. catarrhalis ведется так же, как при исследовании спинномозговой жидкости.

гонококки

Гонококки (Neisseria gonorrhoeae) являются возбудителем гонореи ——гнойного воспаления слизистых оболочек мочеполового тракта и бленнореи — специфического поражения конъюнктивы глаз. Гонококки поражают только человека, животные обладают врожденной невосприимчивостью к гонококковой инфекции.

Материал для бактериологического исследования. При острой форме гонореи материалов для бактериологического исследования у мужчин служит отделяемое уретры, у женщин——отделяемое уретры, влагалища, шейки матки, которое берут тампоном непосредственно из пораженного органа.

При хронической форме гонореи, а также к концу лечения острой гонореи, когда количество выделений резко уменьшается или они прекращаются, у мужчин исследуют слизисто-гнойные нити или хлопья, содержащиеся в моче. Для исследования берут 10—15 мл утренней мочи.

Материалом для исследования при поражении глаз служат гнойные выделения конъюнктивы глаза.

За 2——3 дня до взятия материала для бактериологического исследования больному гонореей не вводят антибиотики, антисептические средства и не делают спринцеваний. Материал тотчас после взятия засевают на питательные среды, так как гонококки очень чувствительны к температурным колебаниям, высыханию и даже в гнойном содержимом гибнут в течение нескольких часов.

Бактериоскопическое исследование патологического материала——основной метод лабораторной диагностики гонореи. Простота и доступность этого метода способствуют широкому применению его в лабораториях дермато-венерологических учреждений. Однако в связи с изменившимся течением инфекции однократное обследование больных для обнаружения возбудителя часто бывает недостаточным. Поэтому в целях улучшения диагностики гонореи М. В. Януха и В. Г. Шрай- 石ерг (1974) рекомендуют больным, у которых в отделяемом из очагов при первичном обследовании гонококки не обнаруживаются, назначать провокацию (инъекция гоновакцины в дозе 50 млн. микробных тел и местное смазывание очагов 1 % люголевским раствором на глицерине) с дальнейшим ежедневным, в течение 3—7 дней, бактериоскопическим исследованием отделяемого из всех возможных очагов заболевания.

При хронической форме гонореи, а также в случаях острой гонореи, леченной антибиотиками и сульфаниламидами,

количество гонококков в патологическом материале резко уменьшается, а оставшиеся микроорганизмы изменяют присущую им форму и расположение. В таких случаях приходится прибегать к бактериологическому методу — посеву исследуемого материала на искусственные питательные среды. К питательным средам гонококк чрезвычайно требователен. Для выращивания его применяют среды, содержащие нативный белок: человеческую кровь или сыворотку крови. Другим обязательным условием является достаточная влажность среды. Для выделения гонококков рекомендуется сывороточный агар (рец. 59) и среда Бейли с асцитической жидкостью (рец. 66). При отрицательных результатах бактериологического исследования и при хронической гонорее ставят реакцию связывания комплемента (реакция Борде—Жангу). Положительный результат реакции отмечается в 85—100% случаев с 3-й недели от начала заболевания и держится на всем его протяжении независимо от формы течения.

Бактериоскопический метод исследования при гонорее^ Гной, выделяющийся из уретры, наносят непосредственно на предметное стекло. Мазок из гноя делают так же,_ как из мокроты (см. с. 27), и направляют в лабораторию для окраски и микроскопирования. Из исследуемой мочи вылавливают и наносят на предметное стекло гнойные комочки и нити ил* используют для этой цели осадок, образующийся в результате центрифугирования мочи.

Из каждого образца материала готовят не менее двух мазков, высушивают их и фиксируют. Затем один мазок окрашивают слабым раствором водного метиленового синего (метиленовый синий разводят дистиллированной водой до такой степени, чтобы он окрашивал в светло-голубой цвет ядра лейкоцитов), а другой ——по Граму. Окраска по Граму имеет основное дифференциально-диагностическое значение для распознавания гонококков.

В положительных случаях в мазках, приготовленных из гнойного секрета, обнаруживаются парно расположенные кокки бобовидной формы, обращенные друг к другу вогнутыми, несоприкасающимися сторонами. Преобладающее большинство гонококков находится в цитоллазмс лейкоцитов. Явление и е з а в е р ше иного ф агоцито з а свойственно гонококковой инфекции (рис. 22). Для гонококков, находящихся в эпителиальных клетках, нередко характерно расположение правильными рядами.

В препаратах, окрашенных синькой Леффлера, гонококки имеют темно-синий цвет, в то время как клетки тканей и слизь окрашиваются в бледно-голубой цвет. В мазках, окрашенных по Граму, гонококки грамотрицательны, однако в выделениях больного хронической гонореей, а также у леченных сульфаниламидами и антибиотиками наряду с грамотри-

дательными встречаются гр а м положительные гонококки, получившие название форм Аша, и дегенеративные формы в виде гигантских или карликовых клеток неправильной формы.

Бактериологическое исследование патологического материала на гонококки. Первый день. При подозрении на гонорею материал немедленно после взятия засевают на свежеприготовленные прогретые в термостате питательные среды, сывороточный агар или среду -Бейли (рец. 59, 66). Материал, нанесенный на плотную питательную среду, втирают шпателем для получения изолированных колоний гонококка. Чашки с посевами помещают на 24 ч в термостат при 36— 370c.

При невозможности проведения посева на месте пересылать материал в лабораторию рекомендуется в среде обогащения (рец. 68). В этих случаях материал берут тампоном, который предварительно обрабатывают фосфатно-буферным раствором и импрегнируют тонко измельченным древесным углем. После взятия материала тампон возможно глубже погружают в столбик со средой обогащения. Сверху пробирку закрывают резиновым колпачком. В лаборатории материал пересевают с тампоном на чашки с сывороточным агаром или средой Бейли. Для подавления роста сопутствующей флоры к питательной среде рекомендуется добавлять полимиксин в концентрации 25 ЕД или ристомицин — 20 ЕД на 1 мл среды. Эти антибиотики, не оказывая пагубного действия на гонококки, угнетают рост сопутствующей банальной микрофлоры, способствуя, таким образом, выделению возбудителя из исследуемого материала.

Второй день. 1. Просматривают чашки с посевами для выявления колоний гонококка. При скудном росте микробов на поверхности питательной среды чашки с посевами оставляют в термостате на 2 сут.

Колонии гонококка на поверхности питательных сред напоминают капельки росы диаметром 1—2 мм, прозрачные, голубоватого цвета, с гладкой блестящей поверхностью, ровными краями. При взятии петлей они имеют консистенцию масла. При старении колонии гонококка становятся матовыми и приобретают сероватый цвет.

Из колоний, характерных для гонококка, делают мазки и окрашивают их по Граму. В чистой культуре гонококки имеют вид грамотрицательных кокков круглой, реже бобовидной формы, в большинстве своем неодинаковых по вели* чине и расположенных беспорядочно.

Дифференциальная диагностика гонококков. Гонококки приходится дифференцировать с менингококком, а также с другими грамотрицательными диплококками, обитающими на слизистых оболочках верхних дыхательных путей. При диффе-

ренциации гонококка прежде всего следует уточнить место, откуда выделен диплококк: как отмечено выше, гонококки обнаруживаются преимущественно на слизистых оболочках мочеполового тракта, при поражении глаз — на слизистой оболочке конъюнктивы. В редких случаях гонококковой септицемии и пиемии гонококки находят в крови.

Менингококки и катаральные диплококки располагаются на слизистых оболочках верхних дыхательных путей, их почти никогда не находят в мочеполовых органах.

СЕМЕЙСТВО КИШЕЧНЫХ БАКТЕРИЙ(ENTEROBACTERIACEAE)

Семейство кишечных бактерий, естественным местом локализации которых является кишечный тракт, представляет обширную группу микроорганизмов, включающую сапрофитные, условно патогенные и патогенные сиды. Родоначальником их является, очевидно, кишечная палочка Е. coli, ведущая образ жизни комменсалов кишечника.

Единство источника происхождения и генетическая связь патогенных и непатогенных кишечных бактерий подтверждаются структурой их антигенного аппарата. В нем наряду с видовыми специфическими антигенами определяются и общие родовые антигены, свидетельствующие о родственной связи между отдаленными на первый взгляд видами кишечных микроорганизмов.

С позиций медицинской микробиологии в семействе кишечных бактерий основное значение имеют три рода микроорганизмов: Escherichia, Salmonella и Shigella.

Обширная группа условно патогенных микроорганизмов Enterobacteriaceae представлена родом Escherichia. В нормальных условиях постоянного места обитания, т. е. в кишечнике человека и животных, эшерихии не только не вызывают заболеваний, но даже играют положительную роль, проявляя антагонистическое действие по отношению к патогенным видам кишечных бактерий и синтезируя в процессе своей жизнедеятельности витамины комплекса В. Однако среди условно патогенных эшерихий имеются мутанты, так называемые энтеропатогенные эшерихии, обладающие свойствами истинных патогенных бактерий. Энтеропатогенные формы Е. coli вызывают тяжелые колиэнтериты у новорожденных и детей грудного возраста, а также дизентерие- и холероподобные заболевания у детей старшего возраста и взрослых.

Патогенные виды кишечных микроорганизмов подразделяются на тифопаратифозную группу бактерий, относящуюся К роду сальмонелл (Salmonellae), и дизентерийные бактерии, принадлежащие к роду шигелл (Shigellae).

Ж

Все микроорганизмы семейства кишечных бактерий представляют собой мелкие (1,5——4 мкм в длину), грамотрица- тельные, не образующие спор палочки. Одни из них (большая часть представителей рода Escherichia и рода Salmonella) имеют перитрихиально расположенные жгутики и способны к активному движению, другие (бактерии рода Shigella) ——лишены жгутиков и неподвижны.

При культивировании в лабораторных условиях микроорганизмы хорошо растут на обычных питательных средах. Семейство кишечных бактерий отличается большой стабильностью биохимических признаков, характеризующих особенности питания и обмена веществ каждого отдельного представителя этой группы. Наиболее выраженной ферментативной активностью обладают эшерихии, что обеспечивает им большие возможности приспособления к существованию в кишечнике различных видов животных и длительному сохранению в условиях внешней среды. С повышением патогенности снижается биохимическая активность кишечных микроорганизмов, так как, приобретая паразитические свойства, они утрачивают способность к воспроизведению многих ненужных ферментов.

В соответствии со сказанным показатели ферментации углеводов и некоторых других химических соединений имеют большое значение при бактериологической диагностике кишечных инфекций.

ЭШЕРИХИИ .

Кишечная палочка — Escherichia coli — названа так в честь немецкого ученого Эшериха, выделившего ее из испражнений. .

Эшерихии, относящиеся к категории условно патогенных микроорганизмов, при попадании в желчные и мочеполовые пути способны вызывать тяжело протекающие -воспалительные процессы: цистит, пиелит, холецистит, оканчивающиеся иногда колисепсисом.

Энтеропатогенные кишечные палочки отличаются от условно патогенных только по антигенной структуре, постоянной и характерной для каждого штамма. Морфологические и культуральные свойства у них одинаковы.

Изучение антигенного строения патогенных эшерихиЗ показало, что они имеют три антигена:

О-антиген (соматический)—термостабильный, не разрушается при длительном кипячении и автоклавировании при температуре 120℃. '

К-антиген ~ комплекс поверхностно расположенных антигенов, среди которых различают термолабильные (L, В, Vi) и термостабильные (А, М) антигены.

Н-антиген ——жгутиковый термолабильныЗ антиген*

Современная дифференциально-диагностическая схема энтеропатогенных кишечных палочек строится на основе их антигенной структуры. Диагностическое значение имеют все три комплекса антигенов. К настоящему времени патогенные формы кишечных палочек подразделяются на 149 разновидностей по О антигену, на 94 серологическую разновидность по К-антигену и на 56 серологических разновидностей по Н-антигену.

Для обозначения энтеропатогенных кишечных палочек пользуются антигенными формулами. Для разделения антигенов в формуле ставится двоеточие. Например, 020: К84 (В) : Н34. В сокращенных антигенных формулах опускают символы О, К, Н, так как порядок их расположения постоянен. При этом приведенная выше формула приобретает следующий вид: 20 : 84 (В) : 34.

Для дифференциации энтеропатогенных кишечных палочек пользуются реакцией агглютинации со специфическими О- и OK-сыворотками. При постановке реакции агглютинации для определения О-антигена нужно помнить, что К-анти- ген тормозит агглютинацию живых кишечных палочек в гомологичной О-сыворотке. Это явление получило название феномена О-инагглютинабельности. Устранить его можно инактивацией оболочечно-комплексных антигенов посредством длительного прогревания культуры.

На основании серологического различия возбудителей, а также патогенетической, клинической и эпидемиологической неоднородности вызываемых ими заболеваний энтеропато- генные кишечные палочки з настоящее время подразделяются на две категории.

Энтеропатогенные кишечные палочки первой категории вызывают у грудных детей тяжелые формы энтерита (воспаление тонкого кишечника), у новорожденных — токсико-септические заболевания с явлениями интоксикации, заканчивающиеся иногда летально. К возбудителям кишечной коли-инфекции у детей рапнего возраста относятся преимущественно следующие серологические типы патогенных эше* рихий: 0111 :В4; 055: В5; 026 : Вб; 028: В8; О20:В(145).

Энтеропатогенные кишечные палочки второй категории являются возбудителями острых кишечных заболеваний у взрослых и детей старше года. Эшерихии, входящие в состав второй категории, делятся в свою очередь по биохимическим, антигенным и патогенетическим признакам на 3 группы.

Группа первая ——дизентериеподобные эшерихиозы —— объединяет 10 серологических групп рода Escherichia, вызывающих у человека заболевания, сходные по клинической； картине с легкими формами дизентерии. В числе их серологическая группа 0124: В17, имеющая три серологических ти- 202

囂а. Особенностью культур энтеропатогенных кишечных палочек этой серологической группы является идентичность их термостабильного соматического антигена с антигеном дизентерийных бактерий Ларджа—Сакса 3, а также способность свежевыделенных культур в отличие от других энтеропатогенных палочек, подобно шигеллам, вызывать кератоконъюнктивит у морских свинок. Таким образом, названные признаки характеризуют близость энтеропатогенных кишечных палочек 0124: В17 к представителям рода шигелл.

Группа вторая, представитель —《Крым》, является возбудителем дизентериеподобного заболевания с очень легким течением. Почти в половине случаев выделения этого возбудителя наблюдаются бессимптомные формы инфекции.

Группа третья, представленная четырьмя серологическими группами эшерихиозов, изучена недостаточно. При попадании в организм человека они вызывают заболевания, клиническое течение которых сходно с легкой формой холеры.

Основные антигенные и биохимические признаки эшери- хий, обусловливающих заболевания у взрослых и детей, даны в табл. 30.

Общность клинической картины колиэнтеритов с дизентерией, гастроэнтеритами сальмонеллезпой этиологии, а в некоторых случаях с легкими формами холеры определяет решающее значение бактериологического исследования в диагностике заболевания и, следовательно, в проведении рациональных терапевтических, противоэпидемических и профилактических мероприятий.

Схема бактериологической диагностики колиэнтеритов. Бактериологическая диагностика эшерихиозов, предусматривающая выделение и установление серологического типа воз- буд-ителя, является основой дифференциации сходных по характеру клинического течения коли-инфекций. Бактериологическому исследованию на содержание энтеропатогенных кишечных палочек подвергают испражнения, а при наличии рвоты ——рвотные массы. Взятие материала, учитывая быстротечность клинической картины эшерихиозов, следует проводить без промедления, при первом обращении больных за медицинской помощью, до приема антибиотиков. У новорожденных и грудных детей с токсико-септической формой заболевания производится также посев слизистого отделяемого носа и зева. При летальном исходе материалом для бактериологического исследования служит содержимое тонких и толстых кишок, кровь из сердца, кусочки легкого, печени, селезенки и почек. Если материал не может быть доставлен в лабораторию в первые 2 ч с момента взятия, его сохраняют в леднике при температуре 1—4℃, но не дольше суток.

Первый день. Посев материала осуществляется с учетом создания оптимальных условий для выделения энтеро-

Таблица 30

Антигенное строение и ферментативные свойства энтеропатогенных эшерихий

§1

II

Антиген

IS

Н

3

8 H S

5

V w

"в 3 я д d Н I

Характер вызываемого ваболевания

°|

к

0111

055

58(В4)

59(В5)

±

+ +

+ +

+ +

十

X

—

(+) (+)

:(+)

+ +

(+) +

+ +

(+)

一

一

±

一

Колиэнтерит детей грудного возраста

Первая

026

020

«145»

60(В6)

К84(В)

+

十

+ +

+ +

+

(士)

+ +

±

(+)

挥

+

+ +

+ +

± +

X

(+)

—

十

Токсико-септические заболевания новорожденных

，О25'

(+)

(+)

—

(干)

(+)

(+)

Заболевания,

028а, с

В18

(+)

(+)

—

(干)

(+)

(+)

—

протекающие

0112а, с

Аз

Вп

(+)

(±)

(+)

—

(+)

+

(+)

(+)

—

по типу легкой

0115

(±)

—

(+)

(+)

(+)

土

—

формы дизенте-

0124

Аз

Bi?

рии

I

ш

—

(+)

—

—

(+)

—

—

—

II

—

—

(+)

—

—

Вто-

III

—

—

(+)

+

—

——

рая

0129

В$

♦ . ♦

—

—

(+)

(+)

(+)

—

—

—

0135

&

—

—

(+)

—

—

0136

В?2

(+)

—

(+)

—

—

(+)

—

—

0143

С8

Вх1

(+)

(+)

(+)

——

(+)

—

—

—

0144

Вх2

(干)

(+)

(+)

±

Продолжение

II

Антиген

I

1 I

I

1

s

Характер вызываемого ваболеваикя

О

К

2

Крым II

01

06

0112а, в 0148

С15

В1з

(+)

+

+

+ + +

+ +

+

(+)

+

+

(+)

+

+

+

+

+

(+)

(+)

(+) 甯 +

its

(+) +

+

(+) +

+

(士) (+)

+

(+) +

(+)

+

(千)

+ (+)

(+)

(+)

+

Очень легкие дизентериеподобные формы заболевания и бессимптомное носительство Заболевания, протекающие по типу легких форм холеры

Условные обозначения: + ферментация; — ферментация не происходит;±позднее ферментирование； х-*воможны варианты; 土 признак непостоянный.-

патогенных кишечных палочек, дизентерийных бактерий и сальмонелл. С этой целью посев производят параллельно на среды Плоскирева (рец. 81), Вильсона——Блер (рец. 82)； а также на среды обогащения: Мюллера (рец. 72) и Лейфсона с селенитом (рец. 74). Для выделения энтеропатогенных кишечных палочек исследуемый материал высевают на среды Эндо (рец. 79), Левина (рец. 80) и Аселя—Либерманна (рец. 83). При посеве испражнений небольшое количество материала эмульгируют в изотоническом растворе хлорида натрия (примерно в соотношении 1 : 10) и оставляют на несколько минут. После оседания крупных частиц с поверхности жидкости берут 1—2 капли, вносят в чашку Петри и на небольшом участке питательной среды растирают досуха стерильным стеклянным шпателем. Затем шпатель отрывают от поверхности агара и, не прожигая его, распределяют остаток материала по остальной поверхности чашки. Для посева во 2-ю и 3-ю чашки материал берут заново.

Второй день. 1. Просматривают посевы, сделанные накануне. Колонии энтеропатогенных кишечных палочек не отличаются от колоний условно патогенных кишечных палочек. На чашках со средой Эндо они имеют круглую форму, ровный, четко очерченный край, матовую поверхность, малиново-красный цвет, который зависит от способности бактерий расщеплять лактозу с образованием кислоты, но без металлического блеска. На среде Левина колонии кишечной палочки темно-синего цвета, в остальном они пе отличаются от колоний кишечной палочки на среде Эндо. На среде Аселя—Либерманна колонии энтеропатогенных кишечных палочек имеют розовый цвет, на среде Плоскирева они подобны колониям дизентерийных бактерий.

Анализ на патогенные эшерихии начинают с серологического типирования, так как ни культуральные признаки, ни ферментативные свойства не дают достаточных оснований для дифференциации патогенных эшерихий. Из нескольких колоний берут материал для постановки пробной агглютинации на стекле. При наличии нескольких типов колоний в агглютинации испытывают по 3—4 колонии каждого типа. С материалом каждой колонии отдельно ставят реакцию агглютинации на стекле с поливалентной OK-сывороткой \ представляющей собой смесь типовых OK-сывороток к наиболее распространенным типам энтеропатогенных палочек. При положительном результате реакции агглютинации исследуемая культура в первую же минуту наблюдения образует хорошо видимые простым глазом крупные хлопья агглю- тината.

1 Агглютинирующие поливалентные и типовые ОК-жоли-сыворотки выпускаются производственными лабораториями институтов вакцин и сывороток.

Каждую агглютинировавшуюся колонию отмечают с противоположной стороны чашки карандашом или чернилами по стеклу.

В тех случаях, когда все колонии не агглютинируются смесью сывороток, дается отрицательный ответ.

Характерные для кишечной палочки колонии отсеивают: а) на скошенный мясо-пептонный агар; б) на трехсахарный агар с мочевиной по Олькеницкому (рец. 87), на среду Ресселя (рец. 84, 85) или короткий «пестрый ряд» Гисса (рец. 44) (глюкоза, лактоза, маннит, мальтоза, сахароза, пептонная вода) для установления сахаролитических свойств и выявления индола и сероводорода; в) в полужидкий (0,2—— 0,5%) питательный агар для определения активной подвижности бактерий.

Третий день. 1. Просматривают посевы. Учитывают результаты ферментации углеводов, отмечают образование индола, сероводорода и подвижность бактерий по характеру роста в полужидком агаре. Руководствуясь данными, приведенными в табл. 30, отбирают культуры, которые по ферментативным признакам могут относиться к энтеропатогенным кишечным палочкам.

Для установления серологической группы выделенн-ых культур: а) ставят реакцию агглютинации на стекле с поливалентными OK-сыворотками; б) отбирают штаммы бактерий, давшие с поливалентной ОК-сывороткой в течение ближайших 2 мин отчетливо выраженную крупнохлопчатную агглютинацию, для постаноаки реакции на стекле с каждой типовой OK-сывороткой, входившей в состав поливалентной смеси. Контролем реакции служит взвесь микробов в капле изотопического раствора хлорида натрия. Реакция агглютинации на стекле с живой культурой имеет только ориентировочное значение, указывая на наличие в ней соответствук> щего К-антигепа, и не может служить основанием для отнесения выделенного штамма к той или иной О-группе.

Для окончательной идентификации культур по О- и К- антигену ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с той OK-сывороткой, которая агглютинировала культуру на предметном стекле. Если положительная агглютинация на стекле имела место с несколькими типовыми сыворотками, развернутую агглютинацию ставят со всеми этими сыворотками. Принадлежность культуры к серологическому типу в таком случае определяют по наивысшему титру с той или иной сывороткой. При постановке развернутой реакции агглютинации готовят два ряда разведений типовой агглютинирующей OK-сыворотки от 1:50 до титра, указанного на этикетке ампулы. Разведенную сыворотку разливают по 0,5— 1 мл. Для определения К-антигенов в каждую пробирку добавляют трехмиллиардную взвесь живой исследуемой куль-

туры кишечной палочки. При определении О-антигена пользуются этой же микробной взвесью, но после предварительного кипячения ее в водяной бане в течение часа для инактивации поверхностнооболочечных антигенов и устранения таким образом феномена О-инагглютинабельности. Последние две пробирки ряда ——контрольные: контроль антигена (КА) — исследуемая культура в изотоническом растворе хлорида натрия и контроль сыворотки (КС)——сыворотка в разведении 1 :50. Штатив с пробирками встряхивают для лучшего перемешивания сыворотки с антигеном и ставят в термостат на 20 ч.

Положительный ответ дают в том случае, если выделенная культура по антигенному строению соответствует той или иной серологической группе энтеропатогенных эшерихий. При этом живая культура образует крупнохлопчатый агглю- тинат с полным просветлением жидкости над осадком не менее чем в 2—3 разведениях сыворотки; прогретая культура выпадает в виде мелкозернистого агглютината до предельного разведения той же сыворотки или до 3Д титра, указанного на этикетке L Такого рода результат указывает на принадлежность выделенной культуры к соответствующей серологической группе энтеропатогенных кишечных палочек.

Образование мелкозернистого агглютината в ряду пробирок с живой и прогретой культурой, в разведениях сыворотки до "Ai ее титра по О-антигену свидетельствует о принадлежности культуры к соответствующей О-группе и отсутствии или низком содержании в ней поверхностных соматических К-антигенов (В или L). Реакция считается положительной.

Отсутствие агглютинации в пробирках с гретой культурой указывает па принадлежность выделенной культуры к другой О-группе. Если прогретая культура агглютинируется только в начальных разведениях сыворотки, это свидетельствует о ее принадлежности к другой группе, имеющей антигенное родство с соответствующей О-группой. Реакция считается отрицательной. .

САЛЬМОНЕЛЛЫ

Бактерии рода Salmonella представляют обширную группу микроорганизмов, включающую более 1600 серологических типов. Значение серологических типов сальмонелл в патологии человека различно. В числе их находятся возбудите-

Сказанное относится к энтеропатогенным кишечным палочкам второй категории, обладающим 'поверхностным соматическим К-антигеном В или L, препятствующим О-агглютинации и инактивирующимся прогреванием в течение 1 ч. Энтеропатогенные кишечные палочки《Крим» не имеют К-анти- гена и поэтому агглютинируются в живом и убитом состоянии гомологичной сывороткой до ее предельного титра.

ли брюшного тифа (S. typhi), паратифа A (S. paratyphi А) и паратифа В (S. schottmuHeri), которые, адаптировавшись к паразитированию в организме человека, стали причиной самостоятельных нозологических форм заболеваний, подлежащих отдельной регистрации.

Хозяевами подавляющего большинства других типов сальмонелл являются различные представители домашних и диких животных, птицы, рыбы, рептилии. Однако, будучи по- липатогенными микроорганизмами, многие из этих бактерий опасны пе только для животных, но и для людей.

Морфологически все бактерии, относящиеся к роду сальмонелл, представляют грамотрицательные палочки (длиной 2——4 мкм), не образующие спор. Подавляющее большинство из них подвижно благодаря наличию перитрихиально расположенных жгутиков.

Видовая идентификация тифопаратифозной группы бактерий основана на изучении ферментативных свойств и обнаружении видо- и типоспецифических антигенов. Все представители рода сальмонелл различаются между собой двумя основными антигенами: термостабильным соматическим О-ан- тигеном и термолабильным жгутиковым Н-антигеном. Жгутиковый Н-антиген у подавляющего большинства сальмонелл имеет две фазы: I ——специфическую и II ——неспецифическую.

Структура антигенного аппарата, детально изученная Кауфманом и Уайтом, легла в основу современной серологической классификации сальмонелл. По общности строения соматических антигенов бактерии этого рода были разделены на серологические группы (А, В, С, D, Е и т. д.). Бактерии, входящие в состав каждой серологической группы, по совокупности I и II фаз Н-антигенов в свою очередь подразделяются на серологические типы. Установление серологической группы и серологического типа сальмонелл основано на определении формулы их антигенного строения по идентификации рецепторов соматических О-антигенов и жгутиковых Н-антигенов I и II фаз в реакции агглютинации с моноре- цепторными сыворотками.

В настоящее время род сальмонелл по рекомендации Международного номенклатурного комитета подразделен на 4 вида (табл. 31). Вид I, обозначенный S. kauffmani, объединяет большую часть патогенных для человека сальмонелл серологических групп А, В, С, D, Е.

Ко II виду, S. salamal, отнесены представители, отличающиеся от I вида некоторыми биохимическими признаками, в частности способностью разжижать желатин и расщеплять малонат натрия.

Вид III, S. arisona, отличается от двух предыдущих видов способностью ферментировать (большей частью замедленно)

Род сальмонелл по Кауфману

Виды (подроды)

Признаки

Н

1П

IV

Серологи ческие

О н

А, В, С, D, Е 60%

Чаще 013-60

Часце сложные двухфазные комплексы

Чаще 017-65

Чаше Z,—Z57

0-7, 16, 40, 45, 53 и др.

Только монофазные (I фаза)

Q—之&—Z*b

Ферментативные

Лактоза Дульцит Салицин Желатин Малонат натрия d-Тартрат (сегпетова соль)

+

+

+

+ +

--ИЛИ X

+или X

+ +

—ИЛИ X

+ +

--или X

Условные обозначения: + наличие ферментации; — отсутствие; х—возможны варианты.

лактозу и относиться индифферентно к дульциту. Бактеряи этого вида выделяются у птиц, рептилий, млекопитающих. У человека S. arisona обнаруживаются при лихорадочных состояниях с явлениями диареи и гастроэнтерита. В последние годы описания заболеваний людей, причиной возникновения которых авторы считают бактерии Arisona, значительно участились.

К IV виду, S. houtenae,. отнесены изъятые из II вида «атипичные» в биохимическом отношении сальмонеллы, ферментирующие салицин и растущие в присутствии цианида калия. Чувствительность к цианиду калия отражает, по-видимому, определенную общебиологическую закономерность: все патогенные для человека кишечные бактерии чувствительны к цианиду калия и не растут в его присутствии (шигеллы, сальмонеллы); все непатогенные виды кишечных бактерий способны расти на средах с цианидом калия. Бактерии рода Escherichia и Arisona, включающие патогенных для человека представителей, подобно шигеллам и сальмонеллам чувствительны к этому яду.

Клинические проявления сальмоиеллезных инфекций чрезвычайно разнообразны. Наряду с типичной клинической картиной брюшного тифа и острых токсикоинфекций с гастроинтестинальными симптомами могут наблюдаться симпто- мокомплексы, подобные дизентерии, холере, а иногда и септическая форма течения.

В последние годы отмечается учащение случаев стертого и атипичного течения сальмонеллезов, обусловленное, оче- видно> широким, но не всегда правильным применением антибиотиков при кишечных заболеваниях инфекционной природы.

Многообразие клинических форм сальмонеллезной инфекции определяет ведущую роль бактериологического метода исследования в их выявлении и дифференциальной диагностике, указывая на необходимость поиска всех возможных представителей патогенных микроорганизмов кишечной группы.

Схема бактериологического обследования больных на тифопаратифозную инфекцию. Материалом для бактериологического исследования при подозрении на инфекцию сальмонеллезной этиологии служат кровь, испражнения, рвотные массы или промывные воды желудка, дуоденальное содержимое, моча, а в тех случаях, когда заболевание заканчивается летально,— секционный материал (кусочки паренхиматозных органов, кровь из сердца, желчь, мезентериальные лимфатические узлы, содержимое и отрезок тонкой кишки). Выбор материала для лабораторного исследования определяется характером развития инфекционного процесса.

Наиболее ранним и достоверным методом диагностики сальмонеллезов является выделение гемокультуры, поскольку бактериемия у больных возникает в конце инкубационного периода и сохраняется в течение всего периода лихорадочного состояния. Кровь для посева берут из вены локтевого сгиба в количестве 5——10 мл.

Исследование испражнений при острых кишечных заболеваниях повторяют многократно; со дня поступления больного и до дня выписки его из стационара. Поскольку при сальмопеллезных инфекциях патологический процесс развивается в тонком кишечнике, пробы для бактериологического исследования следует брать из последней, более жидкой порции испражнений. В соответствии с этим для взятия материала не следует пользоваться ректальными трубками. При брюшном тифе интенсивное выделение бактерий начинается на 3-й неделе заболевания, так как в этот период патологический процесс и соответственно возбудитель заболевания сосредоточиваются в лимфатическом аппарате кишечника. Однако следует иметь в виду, что в дуоденальном содержимом тифопаратифозные бактерии обнаруживаются в 1%—2 раза чаще, чем в испражнениях, поэтому естественно, что бактериологическое исследование желчи дает лучшие результаты, чем бактериологическое исследование кала.

Зондирование производят в лечебных учреждениях по назначению лечащего врача. Пробы содержимого двенадцатиперстной кишки берут натощак. Примерно через 15 мин по-

еле введения дуоденального зонда начинает выделяться светлый дуоденальный сок ——порция А. После этого в двенадцатиперстную кишку через зонд вводят 30——50 мл стерильного, слегка подогретого раствора сульфата магния, который вызывает сокращение и опорожнение желчного пузыря (порция В темно-зеленого или коричневого цвета) и выход желчи из желчных протоков (порция С светло-желтого цвета). Для бактериологического исследования используют порции В и С; они могут быть засеяны отдельно или же делают общий посев из смеси обоих порций.

Исследование рвотных масс и промывных вод желудка производят при всех кишечных заболеваниях, сопровождающихся рвотой, и в случаях промывания желудка.

Первичный посев и выделение сальмонелл из крови. Первый день. Кровь больного засевают немедленно после взятия во флакон с 10——20% желчным бульоном (рец. 76) или в среду Рапопорт (рец. 77). Желчь, содержащаяся в питательных средах, способствует росту тифопаратифозных бактерий, подавляет действие антител и предотвращает свертывание крови. Высокий процент высеваемости тифопаратифозных бактерий отмечается также при посеве крови на голодную среду Клодницкого (рец. 78).

Объем питательной среды для подавления бактерицидных свойств сыворотки должен в 10 раз превышать количество засеваемой крови.

Второй день. 1. Просматривают колбы с посевами. Размножение бактерий тифопаратифозной группы в среде Рапопорт проявляется уже через 24——48 ч; питательная среда, совершенно прозрачная до посева, становится мутной. На дне сосуда обнаруживается желто-серый гомогенный осадок белков крови. Изменяется и цвет питательной среды: из желтой она становится розоватой вследствие восстановления индикатора Андреде, что свидетельствует о расщеплении с образованием кислоты входящих в ее состав глюкозы или маннита. Размножение паратифозных бактерий сопровождается появлением газа в поплавке.

Размножение бактерий в желчном бульоне или стерильной воде (при посеве крови по Клодницкому) в первые 2——3 дня после произведенного посева ие всегда сопровождается помутнением среды.

. Из среды с первичным посевом крови независимо от того, имеются ли в ней внешне выраженные признаки микробного ■ роста, делают высев на чашки с внсмут-сульфитным агаром (рец. 82), средой Плоскирева (рец. 81), Эндо (рец. 79) и Левина (рец. 80).

Засеянные среды помещают в термостат вместе с первичным посевом крови; его сохраняют для повторных высевов на тот случай, если на плотных питательных средах не обна-

ружатся колонии, характерные для тифопаратифозных бактерий. Повторные высёвы со сред обогащения производят на 2-е, 3-и, 5-е, 7-е и 10-е сутки. В случае отсутствия характерных колоний после высева, произведенного на 10-е сутки, лаборатория дает отрицательный ответ и прекращает исследование.

Первичный посев и выделение сальмонелл из дуоденального содержимого. Желчь, полученную для бактериологического исследования, засевают: а) на плотные питательные среды Плоскирева (рец. 81), висмут-сульфитный агар (рец. 82), среду Левина (рец. 80) и Эндо (рец. 79); б) во флаконы с бульоном так, чтобы соотношение между исследуемым материалом и питательной средой составляло 1:10.

Оставшийся от посева материал, являющийся питательной средой, благоприятной для бактерий, ставят в термостат вместе с посевами. В течение 10 дней из него производят высевы на плотные дифференциально-диагностические среды.

При обнаружении колоний, подозрительных на патогенные бактерии кишечной группы, дальнейшее изучение посевов крови и дуоденального содержимого ведется по общей схеме, приводимой ниже.

Первичный посев и выделение сальмонелл из кишечного содержимого. Бактериологическое исследование испражнений ведут по методике, обеспечивающей возможность выделения любого представителя патогенных кишечных бактерий, которые могут содержаться в исследуемом материале: патогенные эшерихии, сальмонеллы, шигеллы. Из этих соображений посев материала производят параллельно на несколько сред, каждая из которых способствует преимущественному выделению того или иного возбудителя. Для выделения сальмонелл, в том числе бактерий брюшного тифа, паратифов, исследуемый материал высевают на дифференциально-диагностические среды: висмут-сульфитный агар, среду Плоскирева и на среды обогащения—селенитовую среду накопления Лейерсона (рец. 74) или па магниевую среду 《М» (рец. 75). Наряду с перечисленными выше средами обогащения можно применять также жидкую среду Мюллера (рец. 72) и Кауфмана (рец. 73). При посеве в среды обогащения соотношение между засеваемым материалом и питательной средой должно оставаться постоянным, равным 1: 5.

Поступившие в лабораторию испражнения в консерванте или в среде обогащения эмульгируют в соответствующей жидкости. Испражнения, доставленные без консерванта, эмульгируют в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия в соотношении 1 : 10. Приготовленную взвесь ставят для оседания крупных частиц, после чего приступают к посеву. Каплю взвеси пастеровской пипеткой или бактериальной петлей наносят на поверхность одной из названных вы-

ш.е питательных сред близ бортика чашки. Нанесенный материал стеклянным стерильным шпателем втирают на ограниченном, в виде небольшого круга или овала участке питательной среды. Затем, отняв шпатель от этого участка и не прожигая его на пламени горелки, производят засев остальной поверхности среды.

Схема идентификации выделенных бактерий с бактериями рода сальмонелл. Идентификация культур, выделенных из испражнений, крови и других материалов, подвергшихся исследованию, является самым ответственным и самым трудным этапом бактериологической диагностики кишечных заболеваний. Идентификация микробных культур, выделенных у больных и бактерионосителей, начинается с отграничения колоний сальмонелл от сходных с ними колоний патогенных и непатогенных представителей семейства кишечных бактерий.

Второй день исследования. 1. Просматривают посевы, сделанные на дифференциально-диагностических средах, простым глазом и через лупу (Х5 или X10), чтобы не пропустить мелкие колонии. Если через 24 ч после произведенного посева на висмут-сульфитной среде роста колоний, характерных для сальмонелл, не видно, чашки оставляют в термостате еще на сутки.

Различные представители бактерий рода сальмонелл на плотных дифференциально-диагностических средах образуют колонии с признаками, описанными в табл. 32.

Из колоний, подозрительных на сальмонеллы, делают мазок, окрашивают его nq Граму и микроскопируют.

Три——пять колоний с признаками, характерными для тифо-паратифозных бактерий, отсевают на среду Ресселя (рец. 84, 85) или на скошенный столбик агара с мочевиной (рец. 86) для накопления чистой культуры и определения ферментативных свойств в отношении глюкозы и лактозы. На комбинированной среде посев делают сначала на скошенную поверхность, а затем уколом в глубину столбика.

В этот же день производят высевы со сред обогащения по аналогии первичного посева на две чашки со средой Пло- скирева и висмут-сульфитной средой. Дальнейшее исследование этих посевов ведут по общепринятой схеме с задержкой на 1 день (рис. 23 и 24).

Третий день. 1. Для определения чистоты выделенных культур со среды Ресселя или скошенного столбика агара с мочевиной делают мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют.

Учитывают ферментативные свойства микробов, выросших на среде Ресселя и агаре с мочевиной. Тифопаратифозные бактерии, не расщепляющие лактозы, не изменяют окраски скошенной поверхности, но окрашивают в соответствии с изменением цвета индикатора столбик среды вследствие фер-

Характер роста бактеряб тифопаратифозиой группы иа дифференциально-диагностнческмх средах

Среда

Тип сальмонелл

Особенности роста колоний

Мясо-пептон- ный агар

Эндо

Левина

Плоскирева и бактоагар Ж Внсмут-суль- фит-агар Виль- cxiw — Блер

Подавляющее большинство типов сальмонелл

S. schottmulleri

S. abortus equi, S. cho- lerae suis

S. schottmulleri, S. typhi- murium

S. paratyphi, A. S. sendai,

S. abortus ovis, S. chole- rae suis, S. gallinarum Все серотипы

Все серотипы

Все серотилы

S. typhi

S. paratyphi A

S. schottmulleri

Все серотипы

Круглые, слегка выпуклые, с ровным краем, приподнятым центром, 2—4 мм в диаметре. Глянцевые, прозрачные или полупрозрачные

Формирование по наружному краю колоний слизистого, круто поднимающегося валика («феномен валообразова- ния»)

Склонность к образованию дочерних колоний

Скудный рост с образованием ■мелких колоний

Прозрачные или полупрозрачные, бесцветные или бледно- розового цвета

Прозрачные, бесцветные, иногда с нежно-розовым или розовато-фиолетовым оттенком

Прозрачные, бесцветные или бледно-розового цвета

Мелкие, серовато-зеленые с черным центром

Мелкие, очень нежные, зеленоватого цвета в 1-е сутки, зе- леновато-черного цвета в центре, со светлым, блестящим ободком ло периферии на 2-е сутки

Крупные, коричневые с металлическим блеском

В местах роста колоний на питательной среде образуются точки темно-коричневого или черного цвета

меытации глюкозы с образованием кислоты (при наличии индикатора Аыдреде столбик среды окрашивается в розовый цвет). Паратифозные бактерии, расщепляющие глюкозу с кислото- и газообразованием, не только изменяют окраску столбика среды, по и вызывают в нем появление пузырьков газа.

Культуры, сбраживающие на среде Ресселя лактозу и глюкозу с образованием кислоты а газа (разновидности ки-

шечной палочки) или расщепляющие в скошенном столбике мочевину (протей), больше не исследуют. Дается ответ «Патогенных бактерий семейства кишечных в исследуемом материале не обнаружено». .

Культуры, индифферентные в отношении лактозы, но сбраживающие глюкозу с образованием кислоты или кислоты и газа (изменение цвета в столбике среды, вспенивание конденсационной жидкости, иногда разрыв агара), как подозрительные на сальмонеллы засевают для определения подвижности уколом в полужидкий (0,2——0,5%) мясо-пептонный агар (рец. 38) или в 1 мл подогретого до температуры 37° С мясо-пептонного бульона (рец. 35).

В тот же день из 4——5-часовой бульонной культуры готовят для микроскопирования препарат «раздавленной» или «висячей» капли. Бактерии рода сальмонелл обладают активной подвижностью.

Для более полной биохимической характеристики культуры выделенного микроба пересевают на среды Гисса с маннитом, мальтозой, сахарозой, сорбитом, адонитом, салицином, дульцитом, в бульон Хеттингера для определения сероводорода, в среду Строгова (рец. 54) или другие среды (рец. 55) для определения индола, в столбик питательного желатина и в пробирку с лакмусовым молоком (см. табл. 34).

В тот же день приступают к изучению антигенной структуры выделенных бактерий с применением адсорбированных сальмопеллезных поливалентных и монорецепторных сывороток. Принцип серологической идентификации бактерий группы сальмонелл заключается в том, что в первую очередь определяется групповая принадлежность по О-соматиче- ским сывороткам, затем в пределах установленной группы определяют типовую принадлежность бактерий с помощью Н- сывороток к специфическим фазам Н-антигена (табл. 33).

Идентификация выделенных культур ведется по следующей схеме.

Исследуемую культуру прежде всего испытывают в реакций агглютинации на стекле с поливалентной сальмонел- лезпой О-сывороткой, содержащей агглютинины к специфиче- ■ским антигенам групп А, В, С, D и Е. Представители перечисленных выше групп составляют более 98% культур сальмонелл, выделяемых у больных и носителей в Советском Союзе и за рубежом. При положительном результате реакции агглютинации, подтверждающем принадлежность исследуемой микробной культуры к роду сальмонелл, приступают к определению ее серологической группы. Для решения этой задачи вначале ставят реакцию агглютинации отдельно с каждой О-сывороткой, входящей в состав смеси. Используемые для этой цели сыворотки содержат только «обязательные» для соответствующей серологической группы антигены:

Схема антигенного строения наиболее распространенных сальмонелл

СерА

Н-антиген

логическая группа

Серелогическнй тип

О-антнген

фаза 1

фаза 2

А

S. paratyphi А

S. schottmulleri

S. Stanley

S. saint-paul

S. Chester

⑴，2, 12

⑴,4,(5), 12 4,5,12 1,4,5,12 4,12

e,h e,h

1,2

1,2

1,2

1.2

e, n, x

В

S. reading

S. derby

S. typhimurium

S. brandenburg

S. heidelberg

S. Stanleyville

1,4,12 ⑴,4,⑸12

4,12

4,5,12 4,5,12 1,4,12

e,h f,Q i

r

z4» z23

U

,i?2

1，n，Z15

1,2

С-1

S. paratyphi C

S. cholerae suis

S. typhi suis

S. mission

S. montevideo

S. oranienburg

S. thompson

S. concord

S. potsdam

S. bareibly

S. infantis

Vi, 6,7

6：7

6"

6,7

6,7

6J 6,7 6,7

C c c d g, m, s t, m k 1, v 1, v У z29

1,5 1,5 L5 1.6 二 1,5

1,2

±5

С-2

S. muendien

S. newport

S. kottbus

S. bovis morbificans

6；8

d

1, h e, h

z

1,2

1,2

1,5

1

D

S. typhi

S. enteritidis

S. dublin

S. gallinarum-pullorum

Vi, 9,12 9,12 1,9,12?

1,9,12 支

d

g, m

g, P

Е

S. muenster

S. anatum

S. meleagridis

S. london

S. give

S. lexington

S. Senftenberg

3,10

3,10

3,10

3,10

3,10

3,10

1,3,19

e, h e, h e, h

1, v

1, v

Z, 0

d, s, t

1,6

1

1,6

1,7

1,5

Дру- гие группы

От 11 до 64

02 — серологической группы А

04 — серологической группы В

07 ——серологической грутгпы С, подгруппы С-1

08 — серологической группы С, подгруппы С-2

09 — серологической группы D

Определив принадлежность выделенных бактерий к той или иной серологической группе, приступают к выявлению остальных О-антигенов, характеризующих сальмонеллы данной серологической группы. Изучение полного комплекса О-анти- генов дает возможность, во-первых, установить серологическую подгруппу (в серологических группах С и Е) и выявить серологические варианты, что имеет значение для эпидемиологического анализа (в серологических группах А, В и D).

В настоящее время для диагностики бактерий группы сальмонелл медицинская промышленность Советского Союза выпускает следующий набор сывороток.

Агглютинирующая адсорбированная поливалентная салымонеллезная О-сыворотка (группы А, В, С, D, Е).

Агглютинирующая адсорбированная поливалеттная сальмонеллезная .О-сыворотка редких групп (по рецепторам).

Агглютинирующие адсорбированные сальмонеллезные О-сывороткн, рецепторы (с 1-го по 53-й).

Агглютинирующие адсорбированные сальмонеллезные Н-сывороткн, рецепторы (a, b, с, d, е — до z 36; 1,5; 1,6; 1,7).

Агглютинирующая неадсорбированная брюшнотифозная сыворотка.

Агглютинирующая неадсорбированная паратифозная А-сыворотка.

Агглютинирующая неадсорбированная паратифозная В-сыворотка.

Агглютинирующая неадсорбированная сыворотка S. typhimurium.

Агглютинирующая неадсорбированная сыворотка S. cholerae suis.

Агглютинирующая неадсорбированная сыворотка S. newport

. Агглютинирующая неадсорбированная сыворотка S. enteritidis.

Сухие адсорбированные поливалентные и монорецептор- ные сыворотки разводят 1——2 мл (как указано на этикетке ампулы) стерильного изотонического раствора хлорида натрия, что соответствует первоначальному объему сыворотки до высушивания. Растворенные сыворотки используют в реакции агглютинации на стекле без дополнительного разведения.

Культуры бактерий, не реагировавшие со смесью сывороток; А, В, С, D и Е, испытывают со смесью О-сывороток редко встречающихся групп сальмонелл: F, Q, Н, I и т. д. и затем п-ри положительном результате реакции агглютинации испытывают раздельно с каждой монорецепторной О-сыво- роткой, входившей в состав смеси.

После установления серологической группы определяют серологический тип выделенного возбудителя с адсорбированными монорецепториыми Н-сыворотками сальмонелл, входящих в данную группу. При этом Н-сыворотки применяют в порядке, соответствующем распространению типов сальмонелл в данной местности. После определения первой

специфической фазы Н-антигена культуру испытывают с сыворотками против 2-й неспецифической фазы Н-антигена. Таким образом устанавливается антигенная формула выделенной культуры.

Для реакции агглютинации с О-сыворотками культуру берут с верхней части скошенного агара, для агглютинации с Н-сыворотками ——из конденсационной воды (наиболее подвижные особи).

Ч етверты й день. 1. Учитывают характер роста исследуемых культур на средах Гисса, в пробирках с бульоном Хеттингера, пептонной водой, питательным желатином и лакмусовым молоком.

Данные о ферментативных свойствах различных типов сальмонелл приведены в табл. 34.

Повторяют реакцию агглютинации на стекло е О- и Н- монорецепторными сыворотками, агглютинировавшими накануне исследуемую культуру.

Четвертый день исследования является днем выдачи окончательного ответа.

В тех случаях, когда культура по морфологическим и ферментативным свойствам, а также по результатам серологического анализа, выполненного с применением монорецеп- торных сывороток, соответствует определенному типу сальмонелл, дается заключение об обнаружении бактерий этой группы с указанием серологического типа.

Фаготипирование бактерий брюшного тифа. В последние годы в практике эпидемиологического обследования широкое распространение получил метод фаготипирования брюшнотифозных бактерий. Исходя из представлений, что фаготип является одним из постоянных признаков патогенных микробов, следует прийти к заключению, что совпадение фаготипов культур, выделенных в очаге инфекции у разных лиц или из разных объектов, указывает на их эпидемиологическую связь.

Таким образом, при проведении эпидемиологического обследования метод фаготипирования бактерий дает возможность: 1) устанавливать или исключать предполагаемые источники инфекции; 2) прослеживать эпидемические связи, 3) отличать местные случаи от «привозных» и спорадические заболевания от эпидемических.

В настоящее время существует всемирно признанная схема типироваиия S. typhi, разработанная Крелжи и Феликсом. Имеющимся набором типовых брюшнотифозных Vi-бак- териофагов удается типировать 90—100% штаммов S. typhi, находящихся в Vi-форме (т. е. содержащих Vi-антигеп). Для типирования бактерий применяется 78 специфических Vi-бак- териофагов. Бактериофаги и соответствующие им штаммы бактерий обозначаются прописными буквами латинского алфавита (от А до Т)_, для части фагов приняты обозначения

Основные биохимический свойства сальмонелл

Биохимические свойства, общие для всех сальмонелл

8

0

8 S'

I

1

5 3

1

i

II

+ +

++

—

—

—

+

+ (+)

—

—

—

——

+

++

++

—

—

—

+

+

—

—

—

—

+

++

++

—

—

—

+

+ (+)

一

——

——

——

+

+ +

++

•—

—

—

+

+

—

—

—

——

+

+ +

4—

++ +—

—

一

—

+ (+)

+

一

—

—

——

+

++

++

—

+ .

+

+

SKSFKUOSavo

1 2 а b а & D E

1 鏡

+

+ (+)

—

+

+

——

—

+

—

+

+ (+)

+

+

+ (+)

+ (+)

+

+

(+)

+

+

+

+

+

+

+

一

—

(+)

+

(+)

(+)

一

一

(+)

+

+

+

+

+

+

+

+

—

+

+

+

+

+

+

+

+

(+)

+

+

+

+

+

+

+

Биохимические свойства представителей отдельных серологических групп

hedkdel

+ 一 + 一 + + 一 +

Условные обозначения： + наличие ферментации； — отсутствие ее. В скобках указана замедленная ферментация.

арабскими цифрами (от 25 до 46) . Культуры бактерий, не содержащие Vi-антигена, Vi-бактериофагами не типируются.

Техника типирования. Суточную агаровую культуру исследуемого штамма S. typhi проверяют на содержание Vi-антигена в реакции агглютинации с монорецепторной Vi- сывороткой. При наличии указанного антигена культуру засевают в пробирку с 4 мл мартеновского бульона pH 6,8— 7,2 (рец. 40) или бульона Хоттингера (рец. 37) и помещают в термостат на 3—4 ч. По истечении указанного срока бульонную культуру высевают на чашку со слабощелочным питательным агаром. Посев производят петлей диаметром 5 мм в виде отдельных капель, число которых должно соответствовать количеству используемых типовых бактериофагов. После того как нанесенная культура впитается в агар и засеянные участки подсохнут, на них наносят петлей несколько меньшего диаметра капли типовых бактериофагов в тест-раз- ведениях (см. с. 80). После подсыхания капель бактериофага чашки помещают в термостат при 37—37,5℃.

Фаготипирование брюшнотифозных бактерий сопровождается постановкой двух контролен: посева исследуемого штамма без добавления бактериофага (контроль роста культуры) и посева культуры с нанесением неразведенного Vi-бактериофага для определения Vi-антигена в исследуемом штамме.

Результаты поставленного опыта учитывают дважды: через 5—6 и 18——20 ч инкубирования в термостате. Учет результатов производят невооруженным глазом и с помощью лупы (Х5) через дно чашки, пользуясь прямым или косым Освещением. Для оценки полученных результатов приняты условные обозначения. Определение фаготипа культуры производят в соответствии со схемой, прилагаемой к наборам выпускаемых бактериофагов.

При фаготипировании S. typhi могут быть получены результаты, не соответствующие данным схемы. К таким отклонениям относятся: .

культура исследуемых бактерий не лизируется ни одним из типовых фагов, но лизируется Vi-фагом, нанесенным в качестве индикатора на содержание Vi-антигена. Такие культуры обозначаются как нетипирующиеся Vi-штаммы.

культура богата Vi-антигеном, но проявляет чувствительность к нескольким типовым фагам. Это так называемые полилизабельные, или деградированные, штаммы. Для определения их фаготипа рекомендуется рассеять культуру на чашки и затем несколько изолированных колоний подвергнуть повторному типированию, так как некоторые из них сохраняют признаки определенного фаготипа;

культуры, лишенные Vi-антигена, не могут быть типи- рованы Vi-бактериофагами. Такие культуры получили название W-форм.

Атипичные свойства бактерий рода сальмонелл и методы* их идентификации. Трудность идентификации сальмонелл возникает тогда, когда при обследовании больных и носителей выделяются микроорганизмы с атипичными культурально-морфологическими, ферментативными и антигенными признаками. Поэтому при исследовании выделенных возбудителей следует знать не только типичные признаки сальмонелл, но и те отклонения от типичных свойств, которые не препятствуют отнесению их к роду сальмонелл.

Данные о наиболее частых отклонениях от характерных свойств сальмонелл приведены в табл. 35. Большие трудности возникают при определении видовой принадлежности бактерий, сходных с сальмонеллами биохимически, но не агглютинирующихся сальмонеллезпыми сыворотками, илн, наоборот, бактерий, дающих агглютинацию, но атипичных по ферментативным свойствам. В этих случаях необходимо прежде всего убедиться в чистоте выделенных культур. Для этоге исследуемую культуру рассеивают на чашки со средой Эндо, отбирают наиболее типичные колонии и подвергают их дополнительному исследованию.

Для уточнения ферментативной характеристики определяют способность бактерий расщеплять салицин. Возможность ферментации салицина даже в поздние сроки, как правило, исключает принадлежность бактерий к роду сальмонелл. Однако следует учесть, что сальмонеллы IV вида (см, табл. 30) салицин расщепляют.

Сели выделенная культура обладает суммой характерных для сальмонелл биохимических признаков, но не агглютинируется сальмонеллезными О- и Н-сыворотками, следует испытать ее способность лизироваться сальмонеллезным О-фагом. Чувствительность сальмонелл к О-фагу, по данным различных авторов, колеблется от 97 до 99%. Прочие кишечные бактерии (кроме бактерий дизентерии, которые в небольшом проценте случаев чувствительны к этому фагу) лизируются не более чем в 0,6—0,7% случаев.

Для определения чувствительности культур к О-фагу пользуются методикой В. А. Килессо (1963). Исследуемую 4—— 18-часовую культуру пастеровской пипеткой с топко оттянутым капилляром в количестве двух изолированных капель высевают па поверхность слабощелочного агара (рМ 7,2— 7,4) в чашки Петри. После подсыхания микробной взвеси на поверхность одной капли наносят сальмонеллезный бактериофаг в тест-разведении, на другую — контрольную каплю (стерильный бульон). На одной чашке можно испытать 8—— 10 микробных культур одновременно. Результаты лизиса учитывают через 6—18 ч инкубации чашек при 37℃. Положительную реакцию (наличие лизиса) определяют по появлению на месте нанесения фага четко очерченной зоны сливного

Т а б л и ц a 35

Отклонения, не препятствующие отнесению микробных культур к роду сальмонелл

Свойства

•Отклонения

их характер

1серологические типы

частота

Морфологические

Подвижность

Отсутствие подвижности

Многие

Часто

Культуральные

Характер роста на мясо-цеп-

Скудный рост, мелкие колонии

S, paratyhi, A, S. abortus ovls,

S. typhi suis, S. sendai, S. gallinarum

Как травило

тонном агаре

Шероховатые формы

Bee

Редко

Фермеитатив-

Характер роста на элективных средах

На висмут-сульфит-агаре отсутствие почернения среды (или отсутствие роста)

На бактоагаре * — слизистый рост

S. typhi cholerae suis, S. typhimurium

S. hyphimurium

S. dublin

Постоянно Очень редко

Редко

Маннит

Замедленная ферментация

S. saintpaul, S. enteritidis и др.

Очень часта

ные

Мальтоза

Отсутствие ферментации

S. gallinarum—pullorum

S. typhi suis

Часто

Отсутствие фер.ментации

S. paratyphi A, S. paratyphi B, S. typhimurium, S. cholerae suis, S. enteritidis

Очень редко

HzS

Отсутствие способности образовывать Н2s

S. paratyphi A. S. Senftenberg, S, typhi, S. barelly

Часто

Редко

Антигенные

О-антиген

Н-антиген

Частичная или полная потеря антигена (переход в шероховатую форму, неспецифичеокое выпадение культуры в сыворотке)

Временная (или полная) утрата: Н-антигена

одной из фаз Н-антигена

Bee

Bee Bee

У свежевыделенных культур редко

Редко

Довольно часто

ОН-антиген

Временная или постоянная утрата способности агглютинироваться в го-

Bee

Часто

2

2

3

мологичных ОН-сыворотках

лизиса или отдельных негативных колоний. Отрицательная реакция (отсутствие лизиса) проявляется сплошным ростом микробной культуры в месте нанесения фага, не отличающимся от контроля. Чувствительность к О-фагу свидетельствует о принадлежности выделенной культуры к роду сальмонелл.

В тех случаях, когда выделенная культура обладает биохимическими свойствами сальмонелл, но не агглютинируется ни О-, ни Н-сыворотками и не лизируется О-фагом, необходимо уточнить, не является ли она разновидностью бактерий рода Escherichia с замедленной ферментативной активностью. Для решения этого вопроса выделенные штаммы засевают в среду Гисса с 4% лактозы и пониженным количеством пептона (0,3—0,5%). Среда с повышенным содержанием лактозы угнетает рост сальмонелл (I и II вида), не препятствуя размножению и ферментации лактозы бактериями рода Arisona и Escherichia.

Следует иметь в виду, что свежевыделенные из организма больного культуры сальмонелл довольно часто не агглютинируются ни О-, ни Н-сальмонеллезными сыворотками. Для восстановления агглютинабельности такие культуры рекомендуется пассировать на слабощелочном агаре или в желчном бульоне. Этим же способом пользуются в тех случаях, когда свежевыделенная культура агглютинируется одновременно несколькими гетерогенными сыворотками.

Свежевыделенную микробную культуру, биохимически сходную с бактериями брюшного тифа, но не агглютинирующуюся брюшнотифозной сывороткой, испытывают с моноре- цепторной Vi-сывороткой, а затем ставят реакцию агглютинации прогретой культуры с О-сывороткой.

Бактерии брюшного тифа, обладающие хорошо выраженным Vi-антигеном, расположенным более поверхностно, чем О-антиген, очень часто не агглютинируются О-сыворотками. Для инактивации Vi-антигена исследуемую культуру перед постановкой реакции агглютинации подвергают кипячению в водяной бане в течение 30 мин.

При серологической идентификации сальмонелл основные трудности возникают обычно при исследовании жгутиковых Н-аптигепов, имеющих сложную структуру. Чаще всего это связано с утратой подвижности либо с преобладанием у популяции той или иной фазы Н-антигена. Для восстановления подвижности используют феномен «роения». Сущность его заключается в следующем: 1 каплю 3-часовой бульонной культуры исследуемого штамма наносят на середину чашки с 0,5% питательным агаром. При размножении бактерий на полужидкой среде наиболее подвижные особи перемещаются и располагаются по периферической части колонии.

Для восстановления отсутствующей фазы жгутикового Н- антигена пользуются способом Свена Гарда. Принцип его заключается в том, что добавление к питательной среде моно- рецепторной Н-сыворотки, гомологичной выявленной фазе Н- антигена, угнетает или полностью подавляет развитие ее, способствуя формированию противоположной фазы, не подвергающейся влиянию сыворотки. Для воспроизведения этого феномена заготовляют 2% мясо-пептонный агар, расфасованный по 15 мл, и мясо-пептонный быльон, разлитый по 16—— 17 мл. Перед постановкой опыта к расплавленному агару добавляют бульон, получая 0,8——1,0% агар (консистенция агара должна быть такой, чтобы он не «сползал》с чашек). К слегка охлажденному агару прибавляют 4—5 капель не- разведенной монорецепторной сыворотки, гомологичной установленной фазе Н-антигена. Сразу после добавления сыворотки и тщательного перемешивания агара среду выливают в чашки Петри. После застудневания и подсушивания агара в термостате (не более 5——10 мин) в центр агаровой пластинки осторожным прикосновением петли наносят культуру с нижнего участка скошенного агара. После 18—24 ч инкубации посевов в термостате при 37℃ с микробной культурой, взятой с периферии выросшей макроколонии, ставят реакцию агглютинации с монорецепторной Н-сывороткой искомой фазы.

Серологическая диагностика тифопаратифозных заболеваний. В связи с тем что высеять возбудителя болезни не всегда удается, значительную помощь в лабораторной диагностике кишечных заболеваний оказывают серологические исследования.

В крови больных брюшным тифом и паратифами с 8— 10-го дня болезни появляются антитела к О-и Н-антигенам соответствующего возбудителя. Образующиеся антитела легко обнаружить с помощью реакции агглютинации Видаля или реакции пассивной Vi-гемагглютинации.

Реакция агглютинации Видаля. Реакция Видаля для диагностики тифопаратифозных заболеваний применяется очень широко, однако ее нельзя считать основным диагностическим методом, так как имеются формы заболевания, при которых иммунологические сдвиги в организме выражены очень слабо или совершенно не проявляются. В то же время положительная реакция Видаля появляется после ранее перенесенного заболевания («анамнестический Видаль») или вакцинации соответствующим антигеном («прививочный Видаль》).

Для постановки реакции Видаля необходимы:

Исследуемая сыворотка больного.

Набор 4 диагностикумов:

брюшнотифозный диагностикум ОН, в котором преобладает Н-антиген;

22522515 Лабинская А. С,

225

225

брюшнотифозный диагностикум О;

паратифозный В-диагностикум (ОН) с преобладанием Н-антигена;

паратифозный А-диагностикум (ОН) с преобладанием Н-антигена.

Изотонический раствор хлорида натрия.

Реакцию Видаля ставят, как обычную реакцию агглютинации (см. с. 118). Из исследуемой сыворотки больного готовят 4 ряда последовательных двукратных разведений от 1: 100 до 1:1600—1: 3200. Разведенную сыворотку разливают в пробирки по 0,5——1 мл. Затем в количестве 0,5 мл добавляют диагностикум: в первый ряд пробирок ——брюшнотифозный (ОН), во второй ряд ——брюшнотифозный (О), в третий ряд ——паратифозный В (ОН) и в четвертый ряд ——паратифозный А (ОН). Последняя пробирка каждого ряда служит контролем антигена. Контроль сыворотки (один на все 4 ряда) представляет собой исследуемую сыворотку больного, взятую в минимальном разведении (1:100). Штатив с пробирками, содержащими смесь сыворотки с антигеном, встряхивают, ставят на 2 ч в термостат и затем на 12—18 ч оставляют при комнатной температуре. Результат реакции Видаля учитывают общепринятым для реакции агглютинации способом (см. с. 120). Положительным результатом реакции Видаля у непривитых людей считают титр агглютинации в разведении 1 : 100 при соответствующих клинических показателях.

У ранее привитых больных титр О-антител в разведении 1:200 не является надежным диагностическим признаком. Диагностический титр Н-антител у таких больных должен быть не менее 1 :400.

При заболевании брюшным тифом наблюдается характерная реакция агглютинации в ряду пробирок с брюшнотифозным О-антигеном, так как в крови больного брюшным тифом прежде всего накапливаются антитела к О-антигену возбудителя. Подтверждением активно текущего инфекционного процесса является нарастание титра О-агглютининов в период болезни. В то же время накапливаются Н-агглютинины, обусловливающие положительную агглютинацию с брюшнотифозным Н-диагностикумом.

При иммунизации брюшнотифозной вакциной О-антитела к брюшному тифу обнаруживаются в крови вакцинированных недолго. Н-агглютинины сохраняются продолжительное время.

Реакция пассивной Vi-гемагглютинации. Для выявления хронического носительства бактерий брюшного тифа широкое практическое применение в настоящее время нашла реакция непрямой гемагглютинации с эритроцитарным Vi-диагности-

кумом для обнаружения Vi-антител в сыворотке больных и переболевших брюшным тифом.

Для постановки реакции гемагглютинации необходимы следующие ингредиенты:

Стандартный формалинизированный эритроцитарный Vi-диагностикум L

Подлежащая исследованию сыворотка, прогретая перед постановкой реакции в течение 30 мин при 56°С для разрушения групповых агглютининов.

Контрольная Vi-сыворотка.

Контрольная О-сыворотка.

Из исследуемой сыворотки готовят ряд последователь- пых двукратных разведений от 1:10 до 1: 1280 в объеме 0,5 мл.

К ряду приготовленных разведений сыворотки, разлитых в лунки полистероловых пластин, добавляют эритроцитарный Vi-диагностикум в объеме 0,25 мл. Опытный ряд пробирок сопровождается контролями диагностикума:

постановка реакции с адсорбированной монорецептор- ной Vi-сывороткой. Реакция должна быть положительной до предельного титра сыворотки, указанного на этикетке ампулы;

постановка реакции с О-сывороткой. Результат реакции должен быть отрицательным.

Учет реакции производят общепринятым способом (см. с. 126) через 2 ч после осаждения эритроцитов в контроле (предварительно) и через 24 ч стояния пластин при комнатной температуре (окончательно).

Диагностическое значение имеет реакция агглютинации эритроцитов на + + + в разведении сыворотки 1:40 и выше. Всех здоровых людей, сыворотки которых дают положительную реакцию с эритроцитарным Vi-диагностикумом в разведении 1 :80 и выше, относят к подозрительным на носительство бактерий брюшного тифа. Они подлежат тщательному многократному обследованию. Однако окончательный диагноз носительства может быть поставлен только после выделения культуры палочек брюшного тифа из желчи, испражнений или мочи.

Реакция пассивной гемагглютинации применяется в настоящее время для диагностики не только брюшного тифа, но и других сальмонеллезных заболеваний. С этой целью применяют групповые сальмонеллезные В, С, D и Е эритроцитарные диагностикумы.

1 Эритроцитарный Vi-диагностикум производит Московский научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения РСФСР.

ШИГЕЛЛЫ

Возбудителями дизентерии являются бактерии, объединенные общим родовым названием Shigella в честь японского ученого Шига, доказавшего роль этих бактерий в этиологии заболевания.

В 1962 г. Комитетом по номенклатуре патогенных бактерий была утверждена советская классификация шигелл, основанная на совокупности антигенных и биохимических признаков, присущих основным представителям указанной группы микроорганизмов.

Согласно принятой классификации, шигеллы разделяются на две группы: маннитотрицательные и маннитположитель- ные (см. табл. 38).

К первой группе относятся три вида: бактерии Григорьева—Шига (Sh. grigoriew-shigae), бактерии Штуцера—Шмитца (Sh. stutzeri-schmitz) и бактерии Ларджа——Сакса (Sh. 1аг- ge-sachsii), объединяющие 8 типов, различающихся по антигенной структуре-

Группа маннитположительных шигелл включает два вида: бактерии Флекснера (Sh. flexneri) и бактерии Зонне (Sh. sonnei).

Вид Флекснера по своим ферментативным и серологическим свойствам делится на три подвида: собственно Флекснера (Sh. flexneri), Ньюкасл (Sh- neucastle) и Бойда (Sh. boy- dii).

Подвид Флекснера серологически неоднороден: он состоит из 5 серологических типов (1, 2, 3, 4, 5), которые в свою очередь подразделяются на подтипы: la, lb; 2а, 2Ь; За, ЗЬ, Зс; 4а, 4в, 5(х+), 5(х—) и два варианта — х и у.

Бактерии Ньюкасл серологических вариантов не имеют, но. по биохимическим свойствам они неоднородны, что послужило основанием для деления их на три биохимические разновидности: Бойд 88, Дантон и Манчестер, Ньюкасл (табл. 36).

Таблица 36

Биохимические варианты подвида Ньюкастл

Биохимические тип

^Вариант

iФерментация

глюкоза

маниит

дульцит

Бойд 88

1

К

к

2

к

к

К1

Дантои

1

кг

кг

кг

•Манчестер

2

кг

кг

—

Ньюкасл

1

кг

—

кг

2

к

3

к

—

к

1 Обозначения в скобках означают замедленную реакцию, наблюдение которой ведется в течение 15 сут при 37 ℃.

В подгруппе Бойда в настоящее время насчитывается 15 типов. Биохимически они сходны с бактериями Флекснера, но имеют четкую антигенную специфичность со слабовыражен- ными групповыми реакциями.

Бактерии вида Зонне в классификационной схеме на типы не подразделяются. Однако, по данным Новгородской, в нем выделяют четыре ферментативных типа, различающихся по способности расщеплять рамнозу и ксилозу. К I типу относятся культуры, сбраживающие рамнозу в первые сутки и не ферментирующие ксилозу; ко II типу ——поздно сбраживающие рамнозу и не ферментирующие ксилозу; к III типу — ферментирующие рамнозу и ксилозу в первые сутки; к IV типу—расщепляющие рамнозу в первые сутки и замедленно ферментирующие ксилозу (табл. 37).

Таблица 37

Ферментативные типы шигелл Зонне

Биохимический тип

Срок ферментации углеводов, сут

рамноза

ксилоза

мальтоза

1а

+⑴

+(1-2)

1b

+(1)

+(〉2)

ng

+(>2)

+(1-2)

Не

+(>1)

+(>2)

Hid

+⑴

+⑴

+(1-2)

Шс IVf

+(1) +(1)

+(1)

+(2 и позже)

+(>2)

+(1 и позже)

Условные обозначения： + ферментация; —отсутствие ее.

Типирование шигелл Зонне имеет большое значение при эпидемиологическом обследовании очагов инфекции (табл. 37).

Серологических подвидов и типов бактерии Зонне не имеют, х ар а ктеризуются склонностью к диссоциации на плотных питательных средах. В процессе диссоциации образуется два варианта колоний: небольшие (до 2 м в диаметре), прозрачные, бесцветные с ровными краями (S-форма) и более крупные (3—4 в диаметре), плоские, шероховатые, с изрезанными краями, менее прозрачные, чем колонии I типа (R-фор- мы). Обе формы нестойки и при рассеве на плотных питательных средах легко расщепляются.

Материал для лабораторной диагностики. Бактериологическому исследованию при подозрении на дизентерию подвергают испражнения больного, способ взятия которых изложен на с. 162.

Время с момента получения кала до его посева на искусственные питательные среды не должно превышать 2 ч. При

невозможности осуществления посева в течение первых 2 ч после взятия материала для сохранения жизнеспособности дизентерийных бактерий пользуются консервантами: глицериновой смесью (рец. 69), консервантом Изралимского и Теп- лицкой (рец. 70), 1,5——3% гипертоническим раствором хлорида натрия. В консервант, налитый в пробирки или склянки по 10 мл, вносят 2——3 г испражнений и ставят их в холодильник при температуре 4℃. При соблюдении указанных условий испражнения могут сохраняться 12—24 ч.

Для выделения бактерий дизентерии применяется селенитовая среда накопления Лейфсона (рец. 74). Селенит натрия стимулирует размножение дизентерийных бактерий и подавляет развитие сопутствующих микробов-сапрофитов. Испражнения вносят в пробирку с селенитовой средой в таком количестве, чтобы по отношению к среде они составляли примерно % ч. Смесь тщательно перемешивают и помещают в термостат на 18—20 ч.

Схема бактериологического исследования. Первый день. Из испражнений, поступивших на исследование без консерванта, бактериальной петлей извлекают слизисто-гнойные комочки, промывают их в небольшом количестве изотонического раствора хлорида натрия (для удаления посторонней микрофлоры, находящейся на поверхности), наносят у края чашки на поверхность плотных питательных сред, растирают на небольшой площади (1X2 см2) и затем шпателем втирают досуха по всей поверхности чашки.

Слизисто-гнойные комочки, полученные из испражнений, залитых консервантом, засевают на питательные среды без предварительного промывания их в изотоническом растворе хлорида натрия.

При исследовании испражнений с целью обнаружения бактерий дизентерии пользуются элективными питательными средами: Плоскирева (рец. 81), Левина (рец. 80) и Эндо (рец. 79). Исследуемый материал рекомендуется засевать одновременно на 2—3 среды.

Поскольку вероятность выделения возбудителя возрастает с увеличением количества исследуемых испражнений, рекомендуется при засеве каждой чашки брать новую порцию материала.

Среда Плоскирева имеет перед средами Левина и Эндо два преимущества. Во-первых, она в значительно большей степени, чем другие среды, подавляет размножение сапрофитов, обусловливая тем самым возможность увеличивать количество высеваемого на нее материала; во-вторых, обладает антифаговым свойством, что обеспечивает более высокую частоту высеваемости возбудителей дизентерии. Однако наряду с отмеченными положительными качествами среда Плоскирева в отдельных случаях угнетает рост дизентерийных мик-

робов, главным образом бактерий Григорьева — Шига и Штуцера —Шмитца.

Появление в последние десятилетия большого количества штаммов, устойчивых к синтомицину и левомицетину, послужило основанием при выделении возбудителя из исследуемого материала пользоваться наряду с обычными питательными средами средами с добавлением антибиотиков. Применение сред с антибиотиками привело к повышению высеваемости антибиотикоустойчивых и зависимых форм бактерий дизентерии. При этом лучшей из многих испытанных модификаций оказалась среда Плоскирева, содержащая на 1 мл среды 50 мкг синтомицина или 25 мкг левомицетина.

Второй день. 1. Посевы, сделанные накануне, просматривают с лупой Х5, чтобы не пропустить мелкие колонии, подозрительные на бактерии дизентерии.

На- средах Левина, Плоскирева бактерии дизентерии образуют бесцветные прозрачные колонии круглой формы, слегка приподнятые над поверхностью питательной среды, с глянцевой поверхностью и ровным краем. Бактерии дизентерии Зонне часто растут в R-форме, образуя плоские, распластанные по поверхности питательной среды колонии с зазубренными краями. При отсутствии на плотных питательных средах характерного для дизентерийных бактерий роста производят высев на эти же питательные среды с селенитовой среды обогащения.

Из колоний, характерных для бактерий дизентерии, делают мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют.

Колонии с признаками, перечисленными выше, в количестве 3——5 шт. отсевают на среду Ресселя с мочевиной (рец. 84 и 85), среду Олькеницкого (рец. 87) или «пестрый» ряд Гисса (рец. 44) с лактозой и глюкозой. При использовании в работе жидких сред Гисса исследуемые штаммы для испытания на подвижность засевают параллельно в столбик полужидкого (0,2——0,5%) мясо-пептонного агара.

етий день. 1. Просматривают и учитывают результаты посевов, сделанных накануне (табл. 38).

Штаммы, ферментирующие лактозу, а также расщепляющие мочевину, регистрируют как непатогенные и дают заключение, что в исследуемом материале бактерий дизентерии не обнаружено.

Штаммы, расщепляющие глюкозу без образования газа, подвергают дальнейшему изучению как подозрительные на шигеллы.

По характеру роста в полужидких средах Гисса или в «раздавленной капле» с мясо-пептонного бульона определяют подвижность выделенных микроорганизмов. Шигеллы一 неподвижные формы семейства кишечных бактерий, растут только по ходу прокола среды петлей.

Из отобранных штаммов, под оз р ител ьных в отношении шигелл, готовят мазки, окрашивают их по Граму и мик- роскопируют для установления чистоты выделенных культур.

С чистыми культурами грамотрицательных неподвижных бактерий ставят ориентировочную реакцию агглютинации на стекле.

Сначала исследуемую культуру испытывают в реакции агглютинации со смесью дизентерийных сывороток Флекснера, Зонне, Ньюкасл (смесь № 1), соответствующих наиболее распространенным в Советском Союзе штаммам дизентерии. 232

При отрицательном результате реакцию повторяют, применяя смесь № 2, состоящую из агглютинирующих сывороток Бойда, Григорьева — Шига и Штуцера — Шмитца.

При положительном результате реакции агглютинации бактерий со смесью сывороток № 1 исследуемую культуру испытывают в реакции агглютинации отдельно с адсорбированной поливалентной сывороткой Флекснера, сывороткой Зонне и сывороткой Ньюкасл. При положительном результате реакции агглютинации со смесью сывороток № 2 исследуемую культуру испытывают отдельно с адсорбированными сыворотками Бойда, Григорьева ——Шига и Штуцера — Шмитца.

При положительном результате реакции с поливалентной сывороткой Флекснера необходимо определить тип и подтип выделенного микроба (в соответствии с принятой номенклатурой).

При положительном результате реакции агглютинации с сывороткой Бойда культуру испытывают с типовыми адсорбированными сыворотками (№ 1——15) для определения серологического типа. Сыворотки для агглютинации берут в порядке, соответствующем распределению в данной местности типов и подтипов возбудителей дизентерии.

При положительном результате реакции со смесью № 1 и отрицательной реакции с поливалентной сывороткой Флекснера выделенную культуру испытывают последовательно с адсорбированными сыворотками Зонне и Ньюкасл.

При положительном результате реакции со смесью № 2 и отрицательной реакции агглютинации с поливалентной сывороткой Бойда ставят реакцию агглютинации с сывороткой Штуцера—Шмитца и Григорьева — Шига.

Если же выделенная культура не агглютинировалась на стекле в смеси сывороток № 1 и 2, ее испытывают в реакции агглютинации с поливалентной сывороткой Ларджу — Сакса. При положительной реакции с ней продолжают идентификацию типовыми сыворотками этого вида.

При типичных культурально-морфологических и биохимических свойствах с хорошо выраженной реакцией агглютинации на стекле с соответствующей видовой, типовой и групповой агглютинирующей сыворотками уже на 3-й день можно дать предварительный ответ: «Выделена палочка, подозрительная на шигеллу». 。

Для окончательной идентификации выделенной культуры с бактериями дизентерии производят посев:

в среды Гисса с маннитом, мальтозой, сахарозой для определения ферментации углеводов (пробирка со средой Ресселя, определяющая отношение микроба к лактозе и глюкозе, остается от предыдущего исследования);

в пробирку с бульоном Хоттингера для определения сероводорода;

в среду Строгова (рец. 54) или другие среды (рец. 55), пригодные для определения индолообразования;

на среду Симмонса (рец. 148), в которой единственным источником азота и углерода является цитрат аммония.

Основанием для положительного ответа о выделении ши- гелл служат следующие признаки: грамотрицательная неподвижная палочка, не сбраживающая лактозу и салицин. Некоторое исключение представляют в этом отношении бактерии Зонне, расщепляющие лактозу и салицин в поздние сроки. В отношении маннита, сахарозы, глицерина, ксилозы, рамнозы, мальтозы биохимическая активность шигелл различна и зависит от вида и типа бактерий. Но если они ферментируют тот или иной углевод, то только с образованием кислоты. Исключение составляют бактерии подвида Ньюкасл, отдельные варианты которого расщепляют углевод до кислоты и газа.

При изучении аминокислотного обмена установлено, что шигеллы не образуют индол и сероводород, не растут на средах, в которых единственным источником углерода и азота является цитрат аммония.

Основные биохимические и антигенные признаки, положенные в основу дифференциации шигелл от других представителей семейства энтеробактерий, приведены в табл. 36 и 38.

Типирование шигелл по феномену колициногении. Многие микроорганизмы, в том числе представители семейства энтеробактерий, обладают способностью синтезировать антибиотические вещества особого рода, способные вызывать гибель родственных видов бактерий. Эти вещества получили название колицинов, а процесс их образования ——кoлицинo- г е н и и. Способность бактерий продуцировать колицины является стойким наследственным свойством и определяется наличием- в цитоплазме микроба специфических генетических структур, названных ф а ктором колициноген- н о с т и.

Наличие колициногенных факторов обусловливает потенциальную летальность для микробной клетки, в которой они содержатся. При обычных условиях культивирования синтез колицинов осуществляется небольшой частью клеток (примерно одной на 1000). При этом образующийся колицин диффундирует в среду, а продуцирующие его клетки погибают.

Таким образом, биологическое действие колицинов сводится к тому, чтобы своим угнетающим действием задерживать развитие бактерий, родственных штамму, продуцирующему колицин. При этом ценой гибели части клеток, синтезирующих колицин, популяция микробных клеток в целом получает селективное преимущество в сложном микробном ценозе по сравнению с неколициногенпыми культурами.

нам осуществляется с помощью эталонныхколициногенныхштаммов Фредерика:Е. coliCA-18продуцируетКОЛИЦИНЕ. coliCA-23Е. coliCA-38■ 》E + lЕ. coliCA-42》»Е. coliCA-53》Е. coliCA-235》Е. coliCA-62»》I + IЕ. coliCA-7》Sh. boydiiP-1Sh. sonneiP-9s§ +1Sh. disparP-14нам осуществляется с помощью эталонныхколициногенныхштаммов Фредерика:Е. coliCA-18продуцируетКОЛИЦИНЕ. coliCA-23Е. coliCA-38■ 》E + lЕ. coliCA-42》»Е. coliCA-53》Е. coliCA-235》Е. coliCA-62»》I + IЕ. coliCA-7》Sh. boydiiP-1Sh. sonneiP-9s§ +1Sh. disparP-14Определение спектра чувствительности шигелл к колициОпределение спектра чувствительности шигелл к колици

нам осуществляется с помощью эталонных

колициногенных

штаммов Фредерика:

Е. coli

CA-18

продуцирует

КОЛИЦИН

Е. coli

CA-23

Е. coli

CA-38

■ 》

E + l

Е. coli

CA-42

》

»

Е. coli

CA-53

》

Е. coli

CA-235

》

Е. coli

CA-62

»

》

I + I

Е. coli

CA-7

》

Sh. boydii

P-1

Sh. sonnei

P-9

s§ +1

Sh. dispar

P-14

нам осуществляется с помощью эталонных

колициногенных

штаммов Фредерика:

Е. coli

CA-18

продуцирует

КОЛИЦИН

Е. coli

CA-23

Е. coli

CA-38

■ 》

E + l

Е. coli

CA-42

》

»

Е. coli

CA-53

》

Е. coli

CA-235

》

Е. coli

CA-62

»

》

I + I

Е. coli

CA-7

》

Sh. boydii

P-1

Sh. sonnei

P-9

s§ +1

Sh. dispar

P-14

Определение спектра чувствительности шигелл к колици

Определение спектра чувствительности шигелл к колици

В настоящее время известно 25 типов колицинов, различающихся по спектру действия на бактерии, чувствительности к протеолитическим ферментам и антигенным свойствам. Колицины принято обозначать прописными буквами латинского алфавита.

Особенностью колицинов является их специфичность. Она определяется биологическими свойствами колицина и наличием на поверхности бактериальных клеток, чувствительных к каждому колицину, рецепторов, на которых происходит адсорбция только одного типа колицина, вызывающего гибель клетки. Установлено, что штаммы, чувствительные к одному колицину, имеют один вид рецепторов, тогда как штаммы, чувствительные к двум или нескольким колицинам, несут на своей поверхности соответственно два или несколько рецепторов, соответствующих тем колицинам, действию которых они подвержены.

Действие колицинов сводится к тому, что, адсорбируясь на поверхности микробной клетки, они нарушают клеточный метаболизм с прекращением синтеза белка. Убивая микробную клетку, колицины в противоположность фагам в ней не размножаются. Это основной признак, отличающий колицины от бактериофагов.

Феномен колициногении не только представляет теоретический интерес, но и имеет большое практическое значение. Определением колициногенности и установлением спектра чувствительности к колицинам в настоящее время пользуются в качестве дополнительного метода дифференциации шигелл, ферментирующих маннит, от эшерихий, сбраживающих углеводы до кислоты без газообразования.

Особенно большое значение методы типирования шигелл на основе колициногении приобретают при проведении исследований в целях эпидемиологического анализа.

Метод колицинотипирования шигелл с помощью колици- ногенных штаммов. Метод колицинотипирования шигелл основан на чувствительности изучаемых штаммов к определенным колицинам.

Наименование оригинального штаммаИSh. sonnei2100031Sh. sonnei56100032Sh. sonnei17、100033Sh. sonnei2M100034Sh. sonnei38100035Sh. sonnei56/56100036Sh. sonnei56/98100037Sh. sonneiRt100038Sh. sonnei&100039Sh. dysenteriae2M19 СТС8218Sh. sonnei2/7100040Sh. sonnei2/64100041Sh. sonnei2/15100042100043E. coliК-12100044Наименование оригинального штаммаИSh. sonnei2100031Sh. sonnei56100032Sh. sonnei17、100033Sh. sonnei2M100034Sh. sonnei38100035Sh. sonnei56/56100036Sh. sonnei56/98100037Sh. sonneiRt100038Sh. sonnei&100039Sh. dysenteriae2M19 СТС8218Sh. sonnei2/7100040Sh. sonnei2/64100041Sh. sonnei2/15100042100043E. coliК-12100044Таблица 39Таблица 39Индикаторные штаммыИндикаторные штаммыРегистрационные номера индикаторных штаммов указаны в соответствии с перечнем Международного справочного центра (Лондон). В повседнев* ной работе удобно обозначать индикаторные штаммы последними цифрами соответствующих номеров (31, 32, 33 и т. д.).Регистрационные номера индикаторных штаммов указаны в соответствии с перечнем Международного справочного центра (Лондон). В повседнев* ной работе удобно обозначать индикаторные штаммы последними цифрами соответствующих номеров (31, 32, 33 и т. д.).реформа. Для этого нареформа. Для этого на

Наименование оригинального штамма

И

Sh. sonnei

2

100031

Sh. sonnei

56

100032

Sh. sonnei

17、

100033

Sh. sonnei

2M

100034

Sh. sonnei

38

100035

Sh. sonnei

56/56

100036

Sh. sonnei

56/98

100037

Sh. sonnei

Rt

100038

Sh. sonnei

&

100039

Sh. dysenteriae

2M19 СТС

8218

Sh. sonnei

2/7

100040

Sh. sonnei

2/64

100041

Sh. sonnei

2/15

100042

100043

E. coli

К-12

100044

Наименование оригинального штамма

И

Sh. sonnei

2

100031

Sh. sonnei

56

100032

Sh. sonnei

17、

100033

Sh. sonnei

2M

100034

Sh. sonnei

38

100035

Sh. sonnei

56/56

100036

Sh. sonnei

56/98

100037

Sh. sonnei

Rt

100038

Sh. sonnei

&

100039

Sh. dysenteriae

2M19 СТС

8218

Sh. sonnei

2/7

100040

Sh. sonnei

2/64

100041

Sh. sonnei

2/15

100042

100043

E. coli

К-12

100044

Таблица 39

Таблица 39

Индикаторные штаммы

Индикаторные штаммы

Регистрационные номера индикаторных штаммов указаны в соответствии с перечнем Международного справочного центра (Лондон). В повседнев* ной работе удобно обозначать индикаторные штаммы последними цифрами соответствующих номеров (31, 32, 33 и т. д.).

Регистрационные номера индикаторных штаммов указаны в соответствии с перечнем Международного справочного центра (Лондон). В повседнев* ной работе удобно обозначать индикаторные штаммы последними цифрами соответствующих номеров (31, 32, 33 и т. д.).

реформа. Для этого на

реформа. Для этого на

Колицины дают четкие зо-

ны угнетения роста шигелл, позволяя подразделить их на колицинотипы.

Техника постановки опыта заключается в следующем. В чашки Петри разливают по 20 мл 1,5% мясо-пептонного агара с генцианом фиолетовым (2—4 капли 0,1% водно-' го генциана фиолетового на 100 мл среды). Перед постановкой опыта среды подсушивают в термостате. Затем дно чашек по числу эталонных колициногенных культур расчерчивают на 12 квадратов. В каждый квадрат чашки уколом петли засевают эталонную суточную культуру КОЛИ- циногенного штамма, выращенную на среде Ресселя (рец. 84 и 85). Перед посевом каждого следующего штамма петлю прожигают. Среды, засеянные колициногенными культурами, инкубируют 22—24 ч при 37℃, после чего выросшие колонии убивают парами хло- 50 мин чашки размещают па

столе вверх дном, а на внутреннюю поверхность крышек наносят по 8—12 капель хлороформа. После этого 0,1 мл исследуемой бульонной 24-часовой культуры шигелл вносят в 2,5 мл расплавленного и охлажденного до 45℃ полужидкого (0,7%) агара. Смесь тщательно перемешивают и наслаивают равным слоем в чашки поверх убитых колоний колицииоген- ных культур. Каждый штамм испытывают параллельно на

двух чашках.

После 16—20-часовой инкубации в термостате вокруг колоний, к колицинам которых исследуемый штамм шигелл чувствителен, образуются зоны задержки роста. Величину зон оценивают в крестах. Ширина зоны в 2 мм обозначается + , от 2 до 5 мм ++, от 5 до 10 мм + + +, более 10 мм + 4- + +. Культура считается чувствительной к колицину, если ширина зоны задержки роста больше 2 мм.

Результаты типирования культур записываются в виде спектра их чувствительности к колицинам. Если у испытуемого штамма спектр чувствительности к колицинам одноти-

Таблица 40

Схема типирования шигелл Зоине (по Аббо и Шеннону)

Индикаториая культура.

Колицино-—'

генный.,

тип 3132 33 34 35 3637 38 39 8218 4041424344

+ + + +++ + + + +++ + + + + + 二 一++一 一一二 + 一 一 一 一 一 + 一 一 一 + + + + - - + - + - + - ++ 二 一 ++++ 一二 土二 一 ++ 二一 ++ + + 一 二二二 一 + + + + 一 + 二 + 二二 + 二一二 -+++++++ 一 一 一 + 一 +++Т 二 一++++一 一+++一+ 一+ + + 一 ++ 一 ++ 一 -++-+++ 一 ++-++ 一 ++ 二 ++ 一 +++ - 一 一 一 一+++ 一 一 +V+ 一 + 一 ++ 二一 一 一vvj 一二二一一力 +++++++-++++--+++ ++++++ +十二 ++ - +++ 一 ++-++++--+++-+-+++ + + +++ + + + +++ + + + + + 二 一++一 一一二 + 一 一 一 一 一 + 一 一 一 + + + + - - + - + - + - ++ 二 一 ++++ 一二 土二 一 ++ 二一 ++ + + 一 二二二 一 + + + + 一 + 二 + 二二 + 二一二 -+++++++ 一 一 一 + 一 +++Т 二 一++++一 一+++一+ 一+ + + 一 ++ 一 ++ 一 -++-+++ 一 ++-++ 一 ++ 二 ++ 一 +++ - 一 一 一 一+++ 一 一 +V+ 一 + 一 ++ 二一 一 一vvj 一二二一一力 +++++++-++++--+++ ++++++ +十二 ++ - +++ 一 ++-++++--+++-+-++^^23^456789012345«1 n H 11 и И^^23^456789012345«1 n H 11 и И

+ + + +++ + + + +++ + + + + + 二 一++一 一一二 + 一 一 一 一 一 + 一 一 一 + + + + - - + - + - + - ++ 二 一 ++++ 一二 土二 一 ++ 二一 ++ + + 一 二二二 一 + + + + 一 + 二 + 二二 + 二一二 -+++++++ 一 一 一 + 一 +++Т 二 一++++一 一+++一+ 一+ + + 一 ++ 一 ++ 一 -++-+++ 一 ++-++ 一 ++ 二 ++ 一 +++ - 一 一 一 一+++ 一 一 +V+ 一 + 一 ++ 二一 一 一vvj 一二二一一力 +++++++-++++--+++ ++++++ +十二 ++ - +++ 一 ++-++++--+++-+-++

+ + + +++ + + + +++ + + + + + 二 一++一 一一二 + 一 一 一 一 一 + 一 一 一 + + + + - - + - + - + - ++ 二 一 ++++ 一二 土二 一 ++ 二一 ++ + + 一 二二二 一 + + + + 一 + 二 + 二二 + 二一二 -+++++++ 一 一 一 + 一 +++Т 二 一++++一 一+++一+ 一+ + + 一 ++ 一 ++ 一 -++-+++ 一 ++-++ 一 ++ 二 ++ 一 +++ - 一 一 一 一+++ 一 一 +V+ 一 + 一 ++ 二一 一 一vvj 一二二一一力 +++++++-++++--+++ ++++++ +十二 ++ - +++ 一 ++-++++--+++-+-++

^^23^456789012345

«1 n H 11 и И

^^23^456789012345

«1 n H 11 и И

Условные обозначения: + наличие зоны торможения индикаторного штамма; — отсутствие ее； V — вариабельные результаты.

пен на обеих чашках, опыт проведен правильно. При расхождении результатов чувствительность штамма к колицинам определяют повторно.

Методика колициногенотипирования шигелл Зонне по Аббо и Шеннону. Установлено, что большая часть культур шигелл Зонне обладает способностью продуцировать коли- цины. Поскольку колициногенность и тип продуцируемого ко- лицина являются стойкими наследственными признаками, бактерии вида Зонне оказалось возможным подразделить на 15 типов, различающихся по своему действию на специально подобранные индикаторные штаммы (табл. 39).

Типы колициногенных бактерий Зонне обозначают цифрами: см. от 1а до 15. Штаммы, не синтезирующие коли- цинов, относятся к типу 0. Техника постановки опыта относительно проста. В чашки Петри разливают по 20 мл 1,5% мясопептонного агара, к которому для усиления колициногении прибавляют генциан фиолетовый (2—4 капли 0,1% раствора красителя на 100 мл среды).

Культуры шигелл, подлежащие исследованию и выращенные в бульоне в течение суток, засевают на чашки бактериальной петлей двумя штрихами, параллельно диаметру чашки, на расстоянии 3—4 см друг от друга. Каждый штамм засевают одновременно на две чашки. Засеянные чашки в течение суток инкубируют в термостате, после чего выращен-

ную микробную культуру убивают хлороформом (см. с. 236). Убитую культуру снимают с поверхности среды узким краем стерильного шлифованного предметного стекла, после чего среду вновь стерилизуют парами хлороформа в течение 30— 40 мин.

Затем чашки открывают и производят посев 4-часовой бульонной культуры индикаторных штаммов в виде параллельных штрихов, перпендикулярных направлению линий посевов исследуемых культур и пересекающих их на равном расстоянии друг от друга. Учет результатов производится по наличию или отсутствию зон торможения роста индикаторных культур. Культуру считают чувствительной, если зона торможения ее роста в месте пересечения с линией посева исследуемой (удаленной) культуры более 4 мм.

Тип штамма определяют по табл. 40.

ВОЗБУДИТЕЛИ ХОЛЕРЫ

Холерный вибрион (Vibrio cholerae) —возбудитель острого инфекционного заболевания, протекающего с явлениями гастроэнтерита на фоне общей интоксикации. Тяжелое клиническое течение, высокая летальность и возможность, в относительно короткий срок поражения больших контингентов населения на обширных территориях явились основанием для отнесения холерного вибриона к группе возбудителей карантинных инфекций.

Возбудитель холеры цо ферментативным и ряду других биологических признаков подразделяется на два биотипа: классический холерный вибрион (V. cholerae biotype cholerae) и вибрион Эль Top (Vibrio cholerae biotype eltor). Кроме холерных вибрионов, к роду Vibrio относятся и другие патогенные и непатогенные для человека вибрионы, выделяемые из открытых водоемов и кишечного содержимого животных и человека, отличающиеся от холерных вибрионов отсутствием агглютинабельности холерными О- и OR-сыворотками, но имеющими общий с холерными вибрионами жгутиковый антиген.

Материал для бактериологического исследования. Испражнения больного и рвотные массы берут в индивидуальное, отмытое от дезинфицирующего раствора судно, на дно которого помещают меньший по размеру сосуд, удобный для обеззараживания кипячением, или листы пергамента. Выделения в объеме 10——20 мл стерильной металлической, деревянной или картонной ложкой переносят в стеклянные стерильные банки с плотно закрывающимися стеклянными или корковыми пробками.

Взятие материала можно производить ректальными трубками (см. с. 162). Больным с выраженным гастроэнтеритом 238

для взятия испражнений вводят в прямую кишку резиновый катетер, другой конец которого опускают в банку или пробирку. При этом жидкие испражнения набираются в сосуд свободно при легком надавливании на брюшную стенку.

При обследовании реконвалесцентов, а также здоровых лиц, соприкасавшихся с источником инфекции или заразным материалом, взятие материала производят после приема слабительного (25——30 г сульфата магния), чтобы получить ис* пражнения из верхней части кишечника.

Если материал, подлежащий бактериологическому иссле-' дованию, в ближайшие 2—3 ч после его взятия невозможно доставить в лабораторию, необходимо использовать консервант Венкантрамана — Рамакришнана (рец. 89), щелочную пептонную воду (рец. 90) или щелочную пептонную воду с теллуритом калия (рец. 91). Последние две среды обладают свойствами обогащения, что позволяет выделить холерный вибрион даже при содержании единичных клеток его в исследуемом материале.

При постановке посмертного диагноза берут содержимое из трех отрезков тонкого кишечника (верхней, средней и нижней части длиной около 10 см каждая), а желчный пузырь после перевязки протока извлекают целиком. Взятые образцы органов трупа укладывают отдельно в стерильные банки с притертыми стеклянными или корковыми, хорошо подогнанными пробками, которые закрывают сверху двойным слоем пергаментной бумаги и завязывают.

Каждый образец материала подробно этикетируют. На этикетке указывают имя и фамилию больного (реконвалесцента), название образца материала, место и время его взя) тая, предполагаемый диагноз и фамилию бравшего материал.

При пересылке исследуемого материала в отдаленные лаборатории банки с ним плотно укладывают в металлическую тару (биксы, ведра, кастрюли), перекладывают бумагой, стружкой, помещают в ящик с надписью: «Верх, Осторожно!» и в таком виде пересылают с нарочным.

€хема бактериологического исследования. Бактериологический анализ материала, поступившего в лабораторию для исследования на холеру, ведется в соответствии с инструктивно-методическими указаниями по профилактике, лабораторной диагностике, лечению и борьбе с холерой, утвержденными Министерством здравоохранения СССР 20 января 1975 г.

Первый этап. 1. Из поступившего материала готовят несколько мазков для микроскопического исследования. Мазки высушивают на воздухе, фиксируют 20 мин этиловым спиртом или смесью Никифорова (см. с. 29), окрашивают фуксином Пфейферера (рец. 7) и по Граму. При микроскопии окрашенные грамотрицательные холерные вибрионы имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек. Наряду с типичными

клетками в мазке можно обнаружить кокковидные, спиралевидные формы и палочки, сходные с микробами тифопаратифозной группы.

Исследуемый материал (испражнения, рвотные массы, содержимое желчного пузыря, а также суспензия, приготовленная из комочков слизистой оболочки кишечника трупа) высевают на жидкие и твердые питательные среды. В качестве жидких питательных сред обогащения рекомендуются ще-. лочная 1% пептонная вода (рец. 90) или 1% пептонная вода с теллуритом калия 1 : 100000 (рец. 91).

На плотные питательные среды (щелочной мясо-пептонный агар (рец. 92) или агар TCBS (рец. 93) исследуемый материал засевают петлей так, чтобы получить изолированные колонии. Поэтому перед использованием среды должны быть . хорошо подсушены.

Посевы инкубируют в термостате при 37°С на 1% щелочной пептонной воде 6—8 ч, на пептонной воде с теллуритом калия 16—18 ч, на щелочном агаре 12——14 ч и на среде TCBS 18—24 ч.

Второй этап. 1. Просматривают посевы на 1-й среде накопления, изучают характер роста на ней. При росте холерного вибриона на жидких питательных средах вначале отмечается легкая опалесценция, затем на поверхности среды появляется тонкая нежная пленка, хорошо заметная на стенке колбы при небольшом ее наклоне. В более поздние сроки (8—18 ч) образуется отчетливо видимая голубоватая пленка (при выделении холерных вибрионов классического биотипа) или пленка беловатого цвета (при выделении вибрионов : биотипа Эль Тор).

Производят пересев с 1-й на 2-ю среду накопления. Для этого с поверхностного слоя 1-й среды берут 2——3 петли материала и вносят его в 5——8 мл 1 % пептонной воды (2-я среда накопления). Параллельно петлей берут материал с поверхности пленки жидкой среды и высевают его на чашки с плотными питательными средами (щелочной мясо-пеп- ； тонный агар и среда TCBS).

Третий этап. 1. Делают высев из 2-й пептонной воды ; на твердые питательные среды.<

Изучают характер микробного роста на чашках с посе- + вами нативного материала, отбирая колонии, подозритель- : ные на холерный вибрион. Они имеют достаточно характер、 ； НЫЙ ВИД：:

На щелочном агаре колонии холерного вибриона круп- ? ные, диаметром 1——2 мм, плоские, круглые, гладкие, голубо-： ватого цвета в падающем, прозрачные — в проходящем све- j те, серовато-зеленые в косопроходящих лучах при просмотре : через стереоскопический микроскоп. Консистенция колоний j маслянистая, они легко снимаются петлей и эмульгируются j 240J

в изотоническом растворе хлорида натрия. В более поздние сроки (после 18 ч) колонии мутнеют.

'Наряду с колониями описанного типа в посевах патологического материала, полученного преимущественно у выздоравливающих, а также у лиц, леченных антибиотиками, встречаются мутные колонии с беловатым или кремовым оттенком. При микроскопии в проходящем свете у таких колоний заметны желтоватая или коричневатая окраска, зернистость и даже складчатость в центре (шероховатые, плохо эмульгирую|[циеся OR-, реже R-варианты).

На среде TCBS колонии холерного вибриона крупные, плотные, желтые на фоне голубовато-зеленого цвета среды. При стоянии из желтых становятся зелеными. Сопутствующая микрофлора на средах TCBS, как правило, не растет, за исключением некоторых видов протея, образующих колонии темно-желтого цвета.

Из материала колоний с признаками, типичными для холерного вибриона:

ставят ориентировочную реакцию агглютинации с холерной О-сывороткой;

готовят препарат висячей или раздавленной капли для установления подвижности;

при положительной реакции агглютинации и достаточном количестве подозрительных колоний ставят ориентировочную реакцию агглютинации с типовыми сыворотками Ога- ва и Инаба.

Положительный результат реакции агглютинации с холерной О-сывороткой, сочетающийся с типичными для холерного вибриона морфологическими и культур а льны м и свойствами, является на данном этапе исследования основанием -для предварительного положительного ответа.

Агглютинирующиеся колонии для окончательной идентификации отсевают на полиуглеводную лактозо-сахарозную среду (рец. 94), среду Клигера (рец. 95) или Ресселя (рец. 84, 85) и в пробирку со скошенным щелочным агаром.

Четвертый этап. 1. Изучают результаты роста на по- лиуглеводных средах. Отбирают для окончательной идентификации культуры, расщепляющие сахарозу без газа и не ферментирующие лактозу (на сахарозо-лактозной среде и среде Ресселя — изменение цвета столбика без изменения цвета скошенной части и полное пожелтение среды Клигера).

В препаратах, окрашенных по Граму, проверяют чистоту микробных культур, выделенных с полиуглеводных сред.

С полученными чистыми культурами ставят реакцию агглютинации с видо- и типоспецифическими сыворотками и проводят окончательную идентификацию выделенных культур.

Просматривают чашки со щелочным агаром с высевами из 1-й пептонной воды и посевами нативного материала на элективных питательных средах. '

Пятый этап. 1. Учет окончательной идентификации культур, выделенных с посевом нативного материала. При положительном результате анализ считается законченным, при отрицательном или сомнительном исследовании продолжают.

Дальнейшее изучение культур, отобранных при высеве из 1-й среды накопления (см. четвертый этап).

Просмотр чашек с высевом со 2-й среды накопления, отбор и изучение колоний, подозрительных в отношении колоний холерного вибриона (см. третий этап, п. 2).

Шестой этап. 1. Учитывают результаты идентификации культур, выделенных с первой пептонной воды. При положительном результате анализ считается законченным, при отрицательном ——продолжается.

Ведется дальнейшее изучение культур, выделенных при высеве со 2-й среды накопления (см. четвертый этап, п. 1).

Седьмой этап. 1. Окончательная идентификация колоний, выделенных со 2-й пептонной воды. При положительных результатах дают ответ о выделении холерного вибриона. При отсутствии в посеве подозрительных колоний исследования, предусмотренные данной схемой, не проводят.

Положительный ответ при бактериологическом исследовании может быть выдан в пределах 18—48 ч; при использовании элективных и полиуглеводных питательных сред продолжительность анализа увеличивается на 12—24 ч. Отрицательный результат анализа может быть выдан в течение 24—48 ч.

Идентификация выделенных культур с холерными вибрионами. Культуры, подозрительные на холерный вибрион, выделенные на различных этапах исследования, изучают с целью определения принадлежности их к роду Vibrio и виду V. cholerae.

Предварительная идентификация выделенных культур проводится на основании характерных культуральных признаков, морфологии, подвижности и результатов ориентировочной реакции агглютинации на стекле с видоспецифической холерной О-сывороткой, разведенной 1 : 100, и типоспецифическими сыворотками Огава и Инаба, разведенными 1 :50.

Окончательная идентификация выделенных культур, предусматривающая определение биотипа холерного вибриона, осуществляется по ряду основных и дополнительных признаков. К основным дифференциально-диагностическим признакам биотипов холерных вибрионов относятся серологические свойства, определяемые в развернутой реакции агглютинации с видоспецифической холерной О-сывороткой и типоспецифическими сыворотками Огава и Инаба; чувствительность к ди-

агностическим фагам ——классическому IV типа фагу Мукерджи и фагу Эль Тор; чувствительность к полимиксину； агглютинация куриных эритроцитов. Дополнительными признаками считают гемолитическую активность и реакцию на ацетилме- тилкарбинол (табл. 41).

Таблица 41

Дифференциальные признаки биотипов холерных вибрионов

Признак

V. cholerae

V. eltor

Агглютинация холерной О-сывороткой

+

+

》》сывороткой Огава

十（一）

+㈠

》》》Инаба

一(+)

一（+）

Чувствительность к холерным фагам: классический (IV Мукерджи) С

+

Эль Top II

+

Агглютинация куриных эритроцитов

—

+

Чувствительность к 50 ЕД полимиксина

+

（口

Гемолитическая активность

Образование ацетилметилкарбинола

—

+

Условные обозначения： + положительный признак; + (—) признак чаще положительный； — отрицательный признак; — (+) признак чаще отрицательный; (±) признак варьирует.

Исследование антигенной структуры вибрионов. Холерный вибрион содержит два антигена: соматический О-антиген, специфический для холерных вибрионов, и жгутиковый Н-ан- тиген, общий с нехолерными вибрионами. Для определения видовой принадлежности вибрионов применяют агглютинирующую холерную O-cuBopofKy. Цельную агглютинирующую О-сыворотку разводят изотоническим раствором хлорида натрия, начиная с 1:50. К 0,5 мл каждого полученного разведения сыворотки прибавляют по 0,5 мл взвеси исследуемой микробной культуры, содержащей 1 млрд, микробных тел в 1 мл по стандарту мутности ГИСК. Таким образом, величина разведений сыворотки удваивается. Последнее разведение должно соответствовать титру сыворотки, указанному на этикетке. Реакция агглютинации, как обычно, сопровождается контролем антигена (0,5 мл взвеси культуры +0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия) и контролем сыворотки (0,5 мл сыворотки в разведении 1 : 50+0,5 мл изотонического раствора). После перемешивания содержимого пробирок путем встряхивания штативов их помещают на 2 ч в термостат при температуре 37 ℃. По истечении указанного срока предварительно учитывают результаты. Окончательный учет проводят через 20 ч выдерживания пробирок при комнатной^температуре. Оценка результатов ведется по общепринятой методике. .

Культуру следует считать специфической при условии положительной реакции агглютинации в разведении сыворотки от % титра до титра, указанного на этикетке.

Слабоагглютинирующиеся штаммы с признаками холерного вибриона испытывают в реакции агглютинации с RO-сыворотками. Техника постановки реакции аналогична описанной выше с применением О-сыворотки. Однако взвесь исследуемой микробной культуры (антиген) готовят на дистиллированной воде.

С эпидемиологической точки зрения очень важно установить тип выделенного вибриона (Инаба, Огава, Гикошима). Для определения серотипа холерного вибриона ставят реакцию агглютинации на стекле с типовыми сыворотками Инаба и Огава. При положительной ориентировочной реакции агглютинации ставят развернутую реакцию с той же сывороткой, разведенной до титра.

Положительная реакция с одной из типовых сывороток указывает, к какому серологическому типу принадлежит изучаемая культура холерного вибриона.

Тесты с холерными бактериофагами. Для дифференциации классического типа холерного вибриона и вибриона Эль Тор применяют холерные бактериофаги: классический холерный бактериофаг С (IV Мукерджи) и бактериофаг Эль Тор. Для постановки реакции используют чашки Петри, залитые 1,5—2% питательным агаром pH 7,4—8,0. После предварительного подсушивания питательной среды дно чашки делят на сектора по количеству 10-кратных разведений фага (начиная от цельного до рабочего), указанному на этикетке ампулы. В пробирку с 3 мл 0,7% агара Хоттингера, расплавленного и охлажденного до температуры 46℃, добавляют 0,1 мл 3—4-часовой бульонной культуры изучаемого штамма вибриона. Культуру тщательно перемешивают и выливают на поверхность агара в чашку Петри. После застывания слоя агара чашки подсушивают 30 мин при комнатной температуре и затем в центр секторов наносят петлей (диаметр 2— 3 мм) по капле фагов в соответствующих разведениях. На одну чашку наносят разведение фага С, на другую — фага Эль Top II. Для подсыхания капель фага чашки выдерживают при комнатной температуре 15—20 мин, затем перевертывают кверху дном и помещают в термостат при 37 ℃. Просмотр чашек начинают после 2—4 ч выдерживания в термостате. Окончательный учет результатов фаголизиса осуществляется через 12—14 ч инкубации.

Бактериофаг С активен только в отношении классического варианта холерного вибриона, бактериофаг Эль Top II действует только на вариант Эль Тор. Наличие лизиса в виде одного «стерильного» пятна или группы мелких пятен на месте нанесения бактериофага в рабочем разведении оцени- 244

вается как положительный результат реакции с холерным бактериофагом.

Реакция агглютинации с куриными эритроцитами. На предметное стекло помещают каплю изотонического раствора хлорида натрия и растирают в ней петлю 18-часовой агаровой культуры исследуемых вибрионов до получения густой взвеси, затем добавляют каплю 2,5% взвеси куриных эритроцитов, отмытых дважды изотоническим раствором. Взвесь эритроцитов и вибрионов смешивают легким покачиванием стекла.

Реакция сопровождается двумя контролями — 2,5% взвесью эритроцитов, размешанной в капле изотонического раствора хлорида натрия (контроль эритроцитов), и взвесью испытуемых вибрионов в капле этого же раствора (контроль антигена).

При положительном результате реакции (при отрицательных контролях) склеивание эритроцитов происходит в течение минуты.

Холерные вибрионы биотипа Эль Тор агглютинируют куриные эритроциты \ классические холерные вибрионы не вызывают их агглютинации.

Чувствительность к полимиксину. Чувствительность микробных культур к полимиксину определяется путем посева исследуемой микробной культуры на чашки питательного агара pH 7,6, содержащего полимиксин М или В из расчета 50 ЕД на 1 мл среды. На застывшие пластинки агаровой сре： ды с полимиксином засевают петлю культуры исследуемого вибриона.

Результаты роста учитывают после инкубации посевов при температуре 37℃ в течение 18 ч. Вибрионы Эль Тор растут на полимиксиновой среде; классические холерные вибрионы на ней не растут. ,

Определение гемолитической активности (проба Грейга). К 1 мл 'суточной культуры испытуемых вибрионов, выращенных на бульоне с 1 % глицерина, добавляют 1 мл 1 % взвеси эритроцитов барана, трижды отмытых изотоническим раствором хлорида натрия. Смесь культуры и эритроцитов осторожно перемешивают и помещают на 2 ч в термостат при 37 ℃г а затем до следующего дня в холодильник. Учет результатов производят через 2 ч пр едв а р ительно и через 18——30 ч окончательно. При положительном результате реакции в опытной пробирке происходит лизис эритроцитов (лаковая кровь); в контрольной пробирке, содержащей бульон (1 мл) и взвесь эритроцитов (1 мл), лизис эритроцитов не наступает.

1 При отсутствии куриных эритроцитов можно пользоваться эритроцитами барана или морской свинки.

Реакция Фогеса— Проскауэра. Эта реакция заключается в способности микробной культуры образовывать ацетилметил- карбинол. Для ее выявления исследуемую культуру засевают в глюкозофосфатный бульон Кларка (рец. 96). После 1— 3 сут инкубирования посевов в термостате при 37℃ к 1 мл исследуемой культуры добавляют 0,6 мл 6% спиртового раствора альфа-нафтола и 0,2 мл 40% раствора едкого кали. Пробирки встряхивают и помещают на 1 ч в термостат. При положительном результате реакции, свойственной вибрионам Эль Тор, наступает розовое или рубиново-красное окрашивание среды вследствие образования ацетилметилкарбинола.

Определение принадлежности микроорганизмов к роду Vibrio,

При обследовании и выделении у больных с желудочно-кишечными заболеваниями штаммов» сходных с холерными вибрионами, во не агглютинирующихся холерными диагностическими сыворотками, возникает необходимость установления принадлежности их к роду Vibrio. С этой целью культуры микробов, подлежащие идентификации, исследуют по ряду тестов, позволяющих дифференцировать представителей рода Vibrio от сходных с ними бактерий Aeromonas, Plesiomonas и Pseudomonas. В качестве основных дифференциально-диагностических тестов рекомендуются определение оксидазы, типа расщепления глюкозы, выявление декарбоксилазы лизина и орнитина и дигидролазы аргинина, установление протеолитических сиойств и уреазной активности (табл. 42).

Таблица 42

Дифференциальные признаки микроорганизмов рода Vibrio и сходных с ними бактерий

Основные признаки

Vibrio

Aeromonas

Plesiomonas

Pseudomonas

Наличие оксидазы

十

十

十

±

Расщепление глюкозы:

К

аэробное (окисление)

К

器圉

К

анаэробное (ферментация)

к

к

Образование декарбоксилазы:

лизииа

+

—

+

—

орнитина

Образование дигидрола-

+

—

+

зы:

аргинина

—,

十

+(-)

+(-)

Разложение мочевины

—

+(-)

—

+㈠

Разложение «желатина

+

+

—

Образование индола

+

+

-+

—

Условные обозначения: К — кислота, КГ — газ； + реакция положительная —отрицательная.

Тест и а оксидазу. На поверхность 18-часовой агаровой культуры наносят:

каплю 1% водного раствора парааминодиметиланилииа (гидрохлорида или оксалата), добавляют каплю 1% спиртового раствора альфа-

нафтола. Положительная реакция на оксидазу характеризуется ярко-снней окраской, появляющейся через 1—3 мии.

несколько капель -1 % водного раствора тетр а метилпар афениленди - амина -(гидрохлорида) или диметилпарафеи иленди амина (дигидрохлорнда), после чего чашку быстро наклоняют на бок. Положительная реакция, возникающая через 20—30 с, проявляется окрашиванием колоний в темно-красный цвет.

Определение типа расщепления глюкозы (тест Хью— Лей-фсона). Среду Хью—Лейфсона (рец. 97), разлитую столбиком в две пробирки, засевают уколом исследуемой культуры. После засева в одной из пробирок поверхность среды заливают 1 мл стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при 37℃ в течение 1—~4 дней. Окисление определяют в аэробных, ферментацию — в анаэробных условиях по изменению цвета среды из болотно-зеленого в желтый.

Олределение декарбоксилазной активное ти. Пробирки с питательной средой Меллера (рец, 98) или Фалькоу (рец. 99), в состав которых входят глюкоза и одна из аминокислот (лизин, орнитин, аргинин) засевают одной петлей 18-часовой исследуемой культуры. Поверхность засеянных питательных сред заливают 1 мл стерильного вазелинового масла. Учет результатов производится на 1—4-е сутки инкубации в термостате при 37 ℃. Вследствие ферментации глюкозы вначале происходит сдвиг pH в кислую зону, в дальнейшем декарбоксилирование аминокислот ведет к защелачиианию сред.

Определение протеолитической активности. Для выявления протеолитической активности 18-часовую исследуемую культуру засевают уколом в столбик желатина. Посевы инкубируют в течение 2— 3 сут лри 22—23 ℃ или 18 ч при 37 ℃. Учет результатов цроизводят после 20-минутпого выдерживания пробирок в холодильнике. При положительном результате реакции желатин остается жидким, при отрицательном—затвердевает, как в контрольной пробирке.

Олределение уреазной активности. Испытуемую культуру засевают петлей на агар Кристенсена (рец. 100). Засеянную среду выдерживают 24—48 ч лри 37 °C. Расщепление мочевины определяют по переходу цвета среды от желтого к красно-фиолетовому.

Таким образом, бактерии, относящиеся 虱 роду Vibrio, дифференцируются главным образом по типу расщепления глюкозы в аэробных и анаэробных условиях от сходных с ними бактерий рода Pseudomonas, расщепляющих глюкозу только в аэробных условиях, и от Aeromonas, ферментирующих глюкозу в аэробных и анаэробных условиях с образованием кислоты и газа. Основным признаком, отличающим вибрионов от негазообразующих аэромонад, служит их отношение к аминокислотам. Вибрионы ферментируют лизин и орнитин и не расщепляют аргинин. Представители рода Аего- monas ферментируют аргинин и остаются инертными к лизину и орнитину. Вибрионы не расщепляют мочевину, обладают лротеолитической активностью и образуют индол.

Метод иммобилизации вибрионов под влиянием специфической холерной О-сыворотки. Метод иммобилизации и микроагглютинации вибрионов под влиянием специфической холерной О-сыворотки дает возможность поставить диагноз в течение нескольких минут при концентрации возбудителя не менее 4,3* 10 клеток в 1 мл исследуемого материала.

На предметное стекло наносят две капли испражнений, смыва с ректального тампона или каплю поверхностного слоя 1-й (2-й) пептонной воды. Первую каплю накрывают покровным стеклом (контроль), ко второй — добавляют каплю О-сыворотки в разведении 1 :100, смесь перемешивают и накрыва-

ют покровным стеклом. Раздавленную каплю рассматривают под микроскопом при увеличении в 400—600 раз, используя конденсор темного поля.

При наличии в исследуемом материале холерных вибрионов в первой капле отмечается характерная подвижность, во второй — подвижность вибрионов прекращается через 2— 3 мин. Реакция иммобилизации специфична и позволяет дать первый сигнальный ответ через 15—20 мин после начала исследования.

Методика быстрого обнаружения холерного вибриона в питьевой воде при использовании реакции агглютинации. При заболевании холерой наряду с выявлением источников инфекции —больных и вибриононосителей — большое значение приобретает бактериологическое исследование объектов внешней среды. Особенно важно своевременно определить зараженность холерными вибрионами источников водоснабжения, которые способствуют быстрому распространению возбудителя среди населения' и возникновению больших эпидемий холеры.

Для обнаружения холерного вибриона в воде предложен очень простой по выполнению ускоренный метод исследования, в основу которого положена способность холерного вибриона быстро размножаться и давать хорошо видимую реакцию агглютинации в присутствии специфической холерной О-сыворотки. Предел чувствительности данного метода равен приблизительно 100 вибрионов в 1 мл исследуемой воды.

Техника постановки опыта. 1. К чистой воде непосредственно, а к загрязненной — после предварительного фильтрования ее через стерильный фильтр из обычной фильтровальной бумаги добавляют слабощелочной концентрированный раствор пептона (сухого пептона 100 г, хлорида натрия 50 г, воды 1000 мл, pH 7,2—7,4) из расчета 1 ч питательной среды на 9 ч исследуемой воды. Смесь перемешивают взбалтыванием.

С полученной смесью ставят развернутую реакцию агглютинации со специфической холерной агглютинирующей О-сывороткой. Для этого в штатив устанавливают ряд пробирок. В 1-ю пробирку наливают 9 мл исследуемой воды, смешанной с раствором пептона, во все остальные пробирки вносят эту же смесь по 1 мл. Затем в 1-ю пробирку прибавляют ОД мл агглютинирующей холерной О-сыворотки, получая разведение 1 :100. Жидкость в пробирке тщательно перемешивают, после чего 8 мл выливают в банку с дезинфицирующим раствором, а 1 мл переносят во 2-ю пробирку ряда, в которой получается разведение сыворотки 1:200. После перемешивания 1 мл жидкости переносят из 2-й в 3-ю пробирку, где разведение становится равным 1:400. Таким образом, готовят ряд последовательных разведений до титра сы-

воротки. Последняя пробирка ряда (контроль) содержит 1 мл испытуемой смеси без добавления сыворотки. Штатив с пробирками помещают в термостат при температуре 37 ℃.

Через 6 ч инкубации в термостате производят учет результатов. При положительном результате агглютинации в пробирках, содержащих агглютинирующую сыворотку, появляются хлопья, легкоразличимые простым глазом. В контрольной пробирке жидкость прозрачна. При отрицательной реакции хлопья отсутствуют во всех пробирках.

При положительном результате реакции из контрольной пробирки делают мазок, фиксируют его и окрашивают фуксином Пфейффера. В мазках обнаруживаются вибрионы.

При положительном результате агглютинации в ответе указывают не только факт обнаружения в исследуемой воде холерного вибриона, но и титр, в котором вибрионы агглютинируются специфической холерной агглютинирующей О-сы- вороткой. Убедительной является положительная реакция агглютинации в титре 1 :800—1 : 1600 при использовании сыворотки среднего титра (1 : 2000—1 ： 3200).

Так как данный метод не обнаруживает холерных вибрионов при малом содержании их в воде, он может считаться только ориентировочным. Положительный результат должен быть в дальнейшем подтвержден выделением чистой культуры вибриона с последующей идентификацией ее по общепринятой методике.

ПАТОГЕННЫЕ АНАЭРОБЫ

К группе патогенных анаэробов принадлежат возбудители столбняка, газовой гангрены, ботулизма. Особенностью этих микробов является повышенная чувствительность к кислороду, вследствие чего культивирование их на искусственных питательных средах возможно только в условиях анаэробиоза.

ВОЗБУДИТЕЛЬ СТОЛБНЯКА

Столбняк ——острая раневая инфекция, развивающаяся в результате проникновения возбудителя столбняка (Clostridium tetani) в организм через поврежденную ткань кожи или слизистых оболочек.

Наибольшая распространенность столбняка, связанная с массовым травматизмом, наблюдается во время войн. В рану бациллы столбняка переносятся обычно с почвой, куда попадают с испражнениями животных и человека. В организме споры столбняка прорастают в вегетативные формы, размножаются и выделяют экзотоксин, который, распространяясь ло нервным стволам, поражает центральную нервную систе-

Рис. 25. Бациллы столбняка в чистой культуре.

му. Бациллы столбняка остаются при этом в месте их внедрения.

Материал для лабораторной диагностики. К микробиологической диагностике столбняка прибегают в редких случаях, когда болезнь протекает в атипичной форме и правильность клинического диагноза вызывает сомнения. Для постановки лабораторного диагноза столбняка берут кусочки пораженных мышц и кожи, иссекаемые при обработке раны, раневое отделяемое или обнаруженные в ране инородные тела (осколки снаряда, занозы и т. д.). При посмертном диагнозе на исследование берут материал из раны (если она имеется), воспалительных очагов, старых рубцов. В связи с возможностью в некоторых случаях генерализации процесса лабораторному исследованию (на содержание столбнячного токсина и самого возбудителя) подвергают кровь, кусочки печени и селезенки.

Схема исследования. Первый день. 1. Из патологического или секционного материала, поступившего на исследование, готовят несколько мазков-отпечатков. Мазки окрашивают по способу Ожешко для обнаружения спор. Наличие в патологическом или секционном материале крупных грампо- ложительных палочек с терминально расположенной спорой, придающей микробу вид барабанной палочки, вызывает подозрение на присутствие Cl. tetani (рис. 25).

Материал разрезают на мелкие кусочки стерильными ножницами, растирают в стерильной ступке с двойным объемом изотонического раствора хлорида натрия и добавляют стерильное кварцевое стекло до образования однородной массы. Гомогенат, приготовленный из исследуемого материала, оставляют в течение часа при комнатной температуре для

Рис. 26. Воспроизведение экспериментального столбняка на мышах.

экстрагирования токсина. Образующийся при отстаивании полупрозрачный надосадочный слой жидкости фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр. Приготовленный таким образом фильтрат делят на две порции и к одной из них добавляют противостолбнячную сыворотку: на 1 мл исследуемого экстракта ——0,5 мл сыворотки, содержащей 200 АЕ антитоксина. Смесь в течение 40 мин выдерживают при комнатной температуре для нейтрализации токсина антитоксином.

Реакцию нейтрализации ставят на 4 белых мышах. Первой паре мышей вводят внутримышечно в верхнюю треть бедра исследуемый экстракт в объеме 0,5—1 мл, второй паре—смесь экстракта и антитоксином по 0,75—1,5 мл. Наблюдение за подопытными животными ведется в течение 4— 5 дней.

Второй ——четвертый день. При наличии в исследуемом материале бацилл столбняка или столбнячного токсина признаки заболевания у мышей возникают обычно на 1—3-и сутки. Клиническая картина экспериментального столбняка очень характерна: у мышей появляются взъерошивание шерсти, напряженность хвоста и мышц, ближайших к месту инъекции заразного материала, в результате чего хвост поднимается вверх трубой. Задняя лапа со стороны, соответствующей введению материала, содержащего столбнячный токсин, вследствие паралича отечна, вытянута, при движении животного волочится, не касаясь поверхности пола. Несколько позже развивается ригидность (напряженность) мышц спины, вызывающая искривление позвоночника. Животные погибают в характерной позе: поджав передние и вытянув задние лапы (рис. 26). У мышей, получивших токсин с противостолбнячной сывороткой, симптомы столбняка отсутствуют.

ВОЗБУДИТЕЛИ ГАЗОВОЙ ГАНГРЕНЫ

Газовая гангрена — тяжелое инфекционное заболевание, осложняющее заживление огнестрельных ран, тяжелых сельскохозяйственных, уличных и бытовых травм, сопровождающихся повреждением и загрязнением обширных участков мягких тканей. Это ——полимикробное заболевание, вызываемое группой анаэробных микробов (Cl. perfringens, CL oede- matiens, Cl. histolyticum, Cl. septicum, Cl. sordelli, Cl. falax) обычно в сочетании с кокками — стафилококками и стрептококками.

Из ран, осложненных анаэробной инфекцией, чаще всего высевают Cl. perfringens, затем Cl. oedematiens, реже находят CL septicum и CL histolyticum. Кроме перечисленных возбудителей газовой гангрены, в очаге поражения очень часто обнаруживаются непатогенные анаэробы Cl. putrificus. Cl. tertium и др.

Роль микробных ассоциаций в развитии газовой гангрены изучена недостаточно.-

Материал для лабораторной диагностики. При подозрении на газовую гангрену бактериологическому исследованию подвергают некротизированную ткань из различных участков, расположенных вблизи здоровой ткани, кусочки пораженных мышц весом не менее 2—3 г, иссекаемые при хирургической обработке ран, отечную жидкость, набираемую шприцем на границе со здоровой тканью, кровь из вены (5—10 мл).

Трупный материал (участки травмированной кожи и патологически измененные мышцы, иссеченные в окружности раны, кусочки печени, селезенки, кровь из сердца) берут в ближайшие часы после смерти, до проникновения в ткани трупа анаэробной микрофлоры из желудочно-кишечного тракта.

Банки или пробирки с материалом обертывают ватой или легнином, помещают в металлический футляр вместе с со- “ проводительным бланком и немедленно пересылают в лабораторию для микробиологического исследования.

Схема бактериологического исследования. Первый день, 1. Из материала, поступившего на исследование, готовят мазки-отпечатки для микроскопического исследования. Один мазок окрашивают по Граму, другой для обнаружения капсул — по Гинсу (стр. 34). При регистрации результатов микроскопирования в протоколе отмечают все формы микробов, обнаруженных в мазке. Основанием для подозрения на . газовую гангрену является содержание в мазке патологиче-. ского материала большого количества грамположительных грубых или полиморфных палочек, большей частью в соче-; тании с кокками. В препаратах, окрашенных по Гинсу, могут , быть обнаружены капсулы, образованные CL perfringens (табл. 43).

После предварительного микроскопирования патологический материал подгота вл ив ают к посеву: а) некротизированные участки кожи, патологически измененную ткань мышц, кусочки печени и селезенки, соблюдая правила стерильности, измельчают ножницами, а затем, добавив небольшое количество кварцевого песка и изотонического раствора хлорида натрия, растирают в ступке до образования гомогената； б) поступившие на исследование отечную жидкость и кровь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин.

Приготовленный гомогенат ткани и осадок крови или отечной жидкости засевают петлей на плотные питательные среды: кровяной агар (рец. 116 или 118), агар Вильсона — Блер (рец. 115), бензидиновый агар (рец. 120), среду Виллиса и Хоббса (рец. 119).

Параллельно с посевом на плотные питательные среды взвесь исследуемого материала в объеме 1 мл засевают под слой вазелинового масла в 5 пробирок со средой Китта—Та- роцци (рец. 113).

Непосредственно перед посевом эту среду регенерируют кипячением в течение 10—20 мин с последующим быстрым охлаждением. После посева 1 пробирку оставляют без прогревания, остальные 4 прогревают в водяной бане (при 80 ℃ в течение 15 мин 1 пробирку, при 100℃ в течение 5, 10 и 20 мин 3 пробирки) для уничтожения посторонней вегетативной микрофлоры, которая может подавить развитие анаэробов —возбудителей газовой гангрены.

Второй ——пятнадцатый день. 1. Посевы на плотных питательных средах инкубируют 1 сут в анаэростате, просматривая чашки каждые 2 дня; посевы в жидких питательных средах выращивают в обычных условиях в термостате в течение 15 сут, просматривая их ежедневно.

Колонии, подозрительные в отношении возбудителей газовой гангрены (см. табл. 43), исследуют бактериоскопи- чески. При обнаружении грамположительных грубых или полиморфных палочек материал из нескольких колоний отсевают для накопления чистой культуры в среду Китта——Тароцци (рец. 113).

Из пробирок с посевами первичного материала, в которых отмечается помутнение среды с образованием пузырьков газа, свидетельствующих о развитии и накоплении в ней микробов-анаэробов, готовят мазки для бактериоскопии. При выявлении в них грубых или полиморфных грамположительных палочек производят высев на плотные питательные среды (кровяной агар, среда Вильсона ——Блер или Виллиса и Хоббса) для получения роста изолированных колоний и выделения чистых культур.

Чистую культуру микробов-анаэробов, выращенную в жидких питательных средах, исследуют бактериоскопически,

22Таблица 43

2

2

Культурально-морфологические свойства патогенных и непатогениых клостридий

Название клостридий

Морфология

ПОДВИЖ" КОСТЬ

Споры

Особенности роста микробных колоний

в глубине агара

на поверхности кровяного агара

иа среде Вильсоиа—Блер

иа среде Виллиса и Хоббса

1

2

3

4

5

6

7

8

CL perfrin- gens

Толстая, грубая, иногда короткая палочка. В организме животных и человека образует капсулы

Овальной формы, расположены субтерми- иально, реже центрально.

Споры бацилл типа А переносят кипячение от 1 до 6 ч, типов В, С, D, Е— в течение 15— 30 мин

Дискообразные, реже мохнатые, в виде плотных комочков ваты

Круглые, влажные, сероватооливкового или зеленого цвета с зоной гемолиза

Интенсивно черные с почернением среды под колонией и вокруг нее. Обнаруживают через 4—6 ч после посева

Покраснение среды с ореолам опалесценции

Cl. oedema- tiens

Толстая, длинная палочка с закругленными концами, часто располагается цепочками

+

Овальной формы, расположены центрально или субтерминально. Выдерживают кипячение до 1 ч

Пушистые колонии с уплотненным центром и тонкими пушинками по периферии

Сочные, выпуклые со слегка зернистой поверхностью, окруженные зоной гемолиза

Крупные, с зернистой или шероховатой ло- верхпостью серовато-зелено

го цвета

Полупрозрачные, опалесцирующие, с перламутровым ореолом по периферии

Cl. septicum

Тонкая палочка с закругленными концами, образует длинные нити

+

Овальной формы, расположены субтермн- нально. Выдерживают кипячение до 40 мнн

В виде чечевицы с древовидно разветвляющимися отростками

Нежный рост в виде извитых нитей и завитков с узкой воной гемолиза

Блестящие, крупные, интенсивно черные, вызывающие почернение среды вокруг колонии

Блестящие, полупрозрачные, с ЗОНОЙ поро- эовения среды вокруг колоний

Cl. histolyti- ciim

Мелкие, с закругленными концами палочки

Овальиой формы, расположены субтерминально. Выдерживают кипячение от 30 до 9 ч

Плотные, ветвистые, темио- желтого цвета

Мелкие, глянцевые, напоминающие капли росы, без гемолиза или с узкой зоной гемолиза

Мелкие, полусферические, блестящие, зеленовато-черного цвета

Светлые, полупрозрачные, с зоной просветления вокруг колоний

CL sordellii

Мелкие, грубые полиморфные палочки

Овальной формы, расположены центрально илн субтерми- иально

Чечевицеобраз- иые, иногда с выростами

Слегка выпуклые, сероватобелого цвета, с зоной узкого гемолиза

Мелкие, полупрозрачные, с зоной опалесценции м просветления

富

Таблица 45

Схема постановки реакции нейтрализации на мышах1

Пробирки

Центрифу- гат культуры, мл

Антитоксическая сыворотка,

Изотонический раствор хлорида натрия

Cl. perfringens типа А

Cl. oedematiens типов АиВ

Cl. septl- cum

Cl. histolyticum

Cl. sordellii

1

2

3

4

5

6 (контроль)

0,9

0,9

0,9

0,9

0,9

0,9

0,6 МЛ

(50 ME)

0,6 мл (50МЕ)

0,6 мл (100 ME)

0,6 МЛ

(100 ME)

0,6 мл (100 ME)

0,6

】В кн.: Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней. Под ред. К. И. Матвеева. М” «Медицина>, 1973, с. 377.

приготовляя： а) мазок для окраски по Граму для обнаружения грамположительных грубых или полиморфных палочек, среди которых возможно наличие споровых форм; б) препа-. рат «висячей капли》для выявления активной подвижности изучаемых микроорганизмов.

Биохимические свойства выделенных возбудителей оценивают по способности их при посеве и культивировании в анаэробных условиях сбраживать углеводы в средах «пестрого ряда》Гисса (рец. 44), изменять цвет лакмусового молока (рец. 49), разжижать питательный желатин (рец. 50) и свернутую сыворотку (рец. 52) или яичный белок (рец. 53) (табл. 44).

Видовую принадлежность выделенного микроба-анаэроба определяют с помощью биологической пробы на мышах методом нейтрализации токсинов специфическими противо- гангренозными сыворотками. Для постановки опыта используют центрифугат 24-часовой культуры, выращенной на среде Китта——Тароцци и смешанной с антитоксическими сыворотками Cl. perfringens типа A, Cl. oedematiens типа А и В, С1. septicum, Cl. histolyticum и Cl. sordellii. Из названных выше сывороток в соответствии с указанными на этикетке данными готовят разведения из такого расчета, чтобы в объеме 0,6 мл содержалось по 50 ME антитоксина Cl. perfringens типа A. CL oedematiens типов А и В и по 100 ME антитоксинов Cl. septicum, Cl. histolyticum и Cl. sordellii. Разведенные сыворотки в объеме 0,6 мл. смешивают с 0,9 мл центрифугата

Таблица 44

Основные ферментативные свойства клостридий

Название Клостридий

Протеолитические свойства

Сахаролитические свойства

Патогенность для животных

лакмусовое молоко

Cl. perfringens

±

土

—

—

+

+

+

+

+

十

—

土

十

Свертывание с образованием сгустка

Газовая гангрена

Cl. oedematiens

+

—

—

—

+

士

—

—

—

Медленное (несколько дней) свертывание

+

То же

Cl. septicum

+

—

—

—

十

—

+

——

—

+

—

—-

—

+

—

—

То же

-г

Cl. histolyticum

+

+

+

Пептоиизация

+

Газовая гангрена с расплавлением мышц

S. sordellii

+

+

+

+

—

—

—

+

—

—

—

То же

Газовая гангрена

7 Условные обозначения； + наличие ферментации; — отсутствие ферментации.

культуры микробов-анаэробов (исследуемый токсин). Приготовленную таким образом смесь выдерживают 40 мин при температуре 20 ℃ в темном месте и затем вводят 2 мышам по 0,5 мл внутривенно (табл. 45).

Результаты биологической пробы учитывают в ближайшие 3 сут, чаще всего в первые 5—6 ч, по действию гомологичной антитоксической сыворотки, нейтрализующей токсин. Действие ее определяется по выживанию одной пары подопытных животных при гибели контрольных мышей, получивших токсин без антитоксической противогангренозной сыворотки, а также по заболеванию и гибели всех остальных подопытных животных вследствие несоответствия исследуемого токсина противогангренозной антитоксической сыворотке.

ВОЗБУДИТЕЛЬ БОТУЛИЗМА

Ботулизм — тяжелая пищевая токсикоинфекция, возникающая в результате употребления в пищу продуктов, зараженных клостридиями ботулизма или загрязненных ботулиническим токсином. Cl. botulinum вырабатывает экзотоксин различных типов. В патологии человека имеют значение клостридии ботулинуса, вырабатывающие экзотоксины типов А, В, С и Е. Отличаясь специфичностью, каждый тип токсина нейтрализуется антитоксинами соответствующего типа.

Лабораторный диагноз заболевания, подозрительного на ботулизм, ограничивают обычно постановкой биологической пробы для обнаружения в исследуемом материале ботулинического токсина.

Биологическая проба и реакция нейтрализации токсина. Для постановки биологической пробы используют материал, полученный у больного, рвотные массы, промывные воды желудка, кровь, материал от трупа и пищевые продукты, подозреваемые как причина отравления.

Из глубины продуктов, поступивших на исследование, вырезают несколько кусочков. Содержимое консервных банок извлекают из участков, расположенных ближе к центру. Вырезанные кусочки тщательно растирают в ступке с двойным объемом изотонического раствора хлорида натрия (соленые продукты растирают в дистиллированной воде). Приготовленную взвесь оставляют при комнатной температуре на 2 ч для экстрагирования токсина. Экстракт центрифугируют, образующийся прозрачный слой надосадочной жидкости используют для постановки биологической пробы. Аналогичным образом подготавливают секционный материал. Промывные воды желудка больного при подозрении на ботулизм сливают в стерильную посуду, а содержащиеся в них частицы пищи помещают в стерильную ступку; тщательно растирают, прибав-

ляя небольшие количества промывных вод. Подготовленную взвесь оставляют на 2 ч при комнатной температуре для экстрагирования токсина, затем центрифугируют, используя надосадочный слой для постановки биологической пробы. Кровь вводят без предварительной подготовки.

Техника постановки биологической пробы. Экстракт исследуемого материала делят на две порции. Одну из них подвергают 30-минутному прогреванию в водяной бане при 100 °C и затем каждую порцию отдельно вводят подкожно или внутрибрюшинно лабораторным животным (мыши или морские свинки). Мышам массой тела 16——18 г вводят 1 мл исследуемого экстракта, морским свинкам массой тела 300—350 г — 3 мл.

Животных выдерживают под наблюдением в течение 10 дней. При наличии токсина ботулинуса в исследуемом материале животные, получившие негретый экстракт, погибают на 3——4-е сутки при характерной клинической картине. У мышей развивается парез конечностей, бока вследствие паралича диафрагмы втягиваются, образуя так называемую осиную талию. У морских свинок даже при легкой степени отравления наблюдается расслабление всей мускулатуры: животные неподвижно лежат на животе. Дыхание, вначале учащенное, впоследствии становится замедленным. Отмечается задержка мочеиспускания. При вскрытии погибших животных наблюдаются гиперемия внутренних органов, очаги пневмонии в легких, переполнение желудка, мочевого и желчного пузырей.

При наличии в исследуемом материале токсина ботулинуса погибают только те животные, которым вводят негретый материал. Животные, получившие прогретый экстра^ не погибают, так как под действием высокой температуры токсин инактивируется.

Нейтрализация токсина антитоксином позволяет определить наличие в исследуемом материале токсина и его типовую принадлежность, что очень важно для назначения специфического лечения. Для постановки реакции нейтрализации необходимы：

Антиботулиничсские сыворотки типов А, В, С, Е (исходя из титра, обозначенного на этикетке, содержимое ампулы разводят изотоническим раствором хлорида натрия так, чтобы в 1 мл приготовленного разведения содержалось 100—■ 200 ME).

Экстракт, приготовленный из исследуемого материала^ или испытуемая кровь. Разливают их в 5 пробирок по 1 мл. Затем в первые 4 пробирки прибавляют по 1 мл противобо- тулинических сывороток типов А, В, С, Е. В 5-ю (контрольную) пробирку прибавляют 1 мл нормальной сыворотки. После добавления сыворотки пробирки ставят в термостат на 17* 259

30 мин для нейтрализации токсина антитоксином. Затем смесь из каждой пробирки вводят 2 мышам по 1 мл подкожно. Каждую пару мышей метят соответственно номеру пробирки, из которой была взята жидкость. Результаты реакции учитывают на 4—5-е сутки после введения материала. При наличии в исследуемом материале ботулинического токсина выживает только одна пара мышей вследствие нейтрализации токсина антитоксической сывороткой соответствующего типа. Таким образом, тип ботулинического токсина определяется типом сыворотки, которая нейтрализовала его действие.

ЗООНОЗЫ

Группу зоонозных инфекций составляют чума, туляремия, бруцеллез, сибирская язва.

К бактериологической диагностике этих заболеваний допускаются только врачи и лаборанты, прошедшие специальную подготовку для работы с особо опасными инфекциями.

При проведении б а ктер ио логически х исследований, связанных с диагностикой перечисленных выше зоонозов, соблюдаются меры предосторожности, регламентированные действующей инструкцией о режиме работы с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность чумой, туляремией, бруцеллезом и сибирской язвой.

ВОЗБУДИТЕЛЬ ЧУМЫ

Чума (возбудитель Jersinia pestis) относится к карантинным особо опасным инфекциям, поэтому бактериологическая диагностика ее допускается только в специальных противочумных учреждениях, где режим гарантирует персонал лаборатории от заражения. К числу мероприятий, обеспечивающих полную безопасность работы с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность возбудителями чумы, относятся надежная текущая и заключительная дезинфекция, правильное хранение заразного материала, допуск к нему только лиц, овладевших техникой работы с чумным материалом, обязательное ношение противочумного костюма при взятии патологического материала и его исследовании. Противочумный костюм состоит из комбинезона, сапог, резиновых перчаток и полотенца, смоченного дезинфицирующим раствором (находится за поясом с правой стороны). На голове капюшон с завязками, на глазах ——очки-консервы шоферские или авиационные, на лице — ватно-марлевая маска, скрывающая нос, рот и подбородок. Поверх костюма надевается медицинский халат.

Взятие материала у больного с подозрением на чуму. Выбор материала для бактериологического исследования на чу-

му определяется клинической формой заболевания. При бубонной и кожно-бубонной форме чумы берут пунктах из бубона, при наличии выраженного отека вокруг бубона — пунктах из отечной жидкости, содержимое везикул, пустул, карбункулов. Тканевую жидкость насасывают "в иглу шприца в количестве не более 1——2 капель. При легочной форме чумы исследуют мокроту. В случае подозрения на септическую форму чумы берут кровь. Из взятой крови непосредственно у постели больного делают 2——3 мазка и производят посев 1—2 капли крови на чашки с агаром и 3—5 мл в 200 мл бульона. При вскрытии трупов людей, умерших от заболевания, подозрительного на чуму, для бактериологического исследования берут легкие, печень, селезенку, лимфатические узлы, кровь, участки кожи с какими-либо изменениями (кровоизлияния, пустулы, карбункулы, язвы и т. д.). При развившемся гниении трупа выпиливают кусочек трубчатой кости и 1——2 кусочка костей с миелоидной тканью (грудина, ребра). Весь собранный материал укладывают в широкогорлые банки с притертыми пробками и очень тщательно упаковывают.

Шприц с тканевой жидкостью опускают в пробирку и закрывают ее ватно-марлевой пробкой. Чашки, флаконы с посевами, склянки с патологическим и трупным материалом заворачивают в марлевую салфетку, смоченную 5% раствором карболовой кислоты, помещают в бюкс и опечатывают. При пересылке материала на дальние расстояния, особенно в жаркое время года, материал для консервации рекомендуется помещать в смесь Берлина и Башевой (рец. 121) или в жидкость Брока (рец. 122). Исследуемый материал пересылают на ближайший противочумный пункт с врачом или 〃а・ борантом на специально выделенном транспорте. Материал сдают под расписку. К каждой отсылаемой пробе прилагают направление с указанием всех необходимых сведений о ней.

Микробиологический диагноз чумы. Материал, подозрительный на чуму, подвергают бактсриоскопическому, бактериологическому и биологическому исследованию. Диагноз первых случаев заболевания чумой должен быть обязательно подтвержден выделением и идентификацией выделенного возбудителя болезни.

Первый день. 1. Из патологического материала, поступившего для исследования на чуму, готовят несколько препаратов-мазков и фиксируют их 20 мин смесью Никифорова с последующим обязательным сжиганием спирта на стекле. Один мазок окрашивают метиленовым синим, другой — по Граму. Обнаружение в мазке беспорядочно расположенных грамотрицательных палочек овоидной формы, концы которых окрашены более интенсивно, чем центральная часть (бипо-

лярная окраска), при соответствующих клинических и эпидемиологических данных позволяет поставить предварительный диагноз чумы.

Жидкий патологический материал — кровь, тканевую жидкость из бубона, мокроту засевают без предварительной подготовки в мясо-пептонный бульон и на мясо-пептонный агар. Материал, полученный в небольшом количестве, например жидкость из бубона, предварительно разводят в 0,3——0,5 мл мясо-пептонного бульона, насасывая его в шприц.

На простых питательных средах бактерии чумы размножаются только при высокой посевной дозе (не менее 10 000 микробных тел) в исходном материале. .

Значительно лучшие результаты были достигнуты при использовании агара Мартина (рец. 41) или агара, приготовленного на бульоне Хоттингера (рец. 37) с добавлением стимуляторов роста: сульфита натрия, лнзированно立 крови, приготовленной ex tempore, перевара Филдса (рец. 123), стимулятора Карпзиди (фильтрат сарцин) илн манифестатора Покровской (фильтрат культур В. mesentericum siscus). Для подавления роста посторонней микрофлоры к среде добавляют генциан фиолетовый. Лучшей средой для выделения чумного микроба из любого материала является агар Хоттингера с сульфитом натрия и генцианом фиолетовым- (pH 7,2).

Из трупного материала готовят суспензию в изотоническом растворе хлорида натрия и засевают ее на среду с ген- цианом фиолетовым Туманского (рец. 124), которая стимулирует рост чумной палочки и подавляет развитие гнилостных бактерий.

Выращивание бактерий чумы производят при температуре- 28—30 ℃ в течение 12—24 ч.

Второй день. 1. Просматривают посева. На поверхности плотной питательной среды бактерии чумы образуют колонии круглой формы, слегка выпуклые. Центральная часть колонии, возвышающаяся над поверхностью питательной среды, более плотная, серовато-белого цвета. Вокруг нее имеется хорошо заметная, очень нежная, почти прозрачная фестон、 чатая кайма беловатого цвета.

В пробирках с мясо-пептонным бульоном отмечается рост в виде хлопьев, взвешенных в совершенно прозрачной среде с рыхлым осадком на дне пробирки. При длительном стоянии посевов на поверхности среды образуется нежная пленка, от которой в глубь среды отходят отростки, получившие название «чумных» сталактитов.

Из бульонной культуры выделенного микроба готовят мазок и окрашивают его по Граму. Биполярно окрашенные палочки чумы при росте в бульоне образуют цепочки.

. Из колоний, типичных для бактерий чумы, берут пет- 』ей небольшое количество материала, пересевают его на скошенный мясо-пептонный агар для накопления чистой культуры.

Выделенные бактерии чумы важно дифференцировать от палочки псевдотуберкулеза (табл. 46), так как по своим морфологическим и культуральным признакам они очень похожи.

В целях дифференциации ставят пробу с бактериофагом. Исследуемой культурой микроба засевают поверхность мясопептонного агара для получения газонного роста. После подсыхания на засеянную среду наносят 1 каплю чумного бактериофага и наклоняют чашку для ее стекания. Посевы ставят в термостат при 28 ℃ на сутки.

Третий день. 1. Просматривают посевы, сделанные накануне. На поверхности скошенного мясо-пептонного агара бактерии чумы образуют нежный налет серовато-белого цвета, плохо смачивающийся изотоническим раствором хлорида натрия.

При положительной реакции с бактериофагом на фоне сплошного микробного роста остается стерильная дорожка в месте нанесения и стекания бактериофага.

Чистую культуру микроба, выращенную на скошенном мясо-пептонном агаре, пересевают: а) на среду Бессоновой с рамнозой (рец. 126); б) на голоднокислый агар по Бессоновой (рец. 125); в) на скошенный мясо-пептонный агар для определения подвижности бактерий, выращенных при 18— 20℃; г) в лакмусовое молоко для наблюдения за изменением реакции среды в процессе роста.

Четвертый день. 1. Просматривают посевы, сделанные на среду с рамнозой и лакмусовым молоком. Бактерии чумы в отличие от бактерий псевдотуберкулеза не сбраживают рамнозу и вызывают медленное подщелачивание лакмусового молока.

На голоднокислом агаре Бессоновой бактерии чумы не растут. .

В «висячей капле》，приготовленной с агаровой культурой» выращенной при 18——20 ℃, бактерии неподвижны (см. табл. 46).

Биологическую пробу на морских свинках ставят в первый день исследования, используя для заражения животных часть патологического материала, оставшуюся от микроскопирования и посева. Заражают морских свинок различными способами в зависимости от характера патологического материала. Материал, содержащий постороннюю микрофлору, например мокроту, загнивший материал, полученный от трупа, втирают в скарифицированную кожу живот- яого. Для этого на участке кожи размером 5——6 см2, пред-

Таблица 45

Дифференциально-диагностические признаки возбудителей чумыи псевдотуберкулеза

Признак

Чума

Псевдотуберкулез

Форма колонии

Выпуклые, шероховатые, большей частью с резко отграниченной от центра каемкой

Мутноватые, хромогенные (типичные штаммы)

Выпу1клые, шероховатые с нерезко отграниченной от центра каемкой, полупрозрачные, ахро- могенные

Подвижность

Неподвижные

Подвижность выявляется при выращивании культуры при .20 ℃

Посевная доза

(минимальная)

Несколько тысяч клеток

Несколько десятков клеток

Рост на голоднокис-

Отсутствует

Наблюдается

лом агаре Бессоновой

Патогенность для ла-

Убивает морских свинок

Убивает морских свшюк.

бораторных живот-

и крыс с характерными

реже крыс. У свинок

ных

изменениями

при подкожном заражении в типичных случаях узелки в печени к селезенке, при внутрибрюшинном заражении утолщение сальника, палет на кишках

Отношение к чумному

Лизируется до титра

Как правило, не ллзи-

бактериофагу

(кроме измененных вариантов)

руется

Отношение к псевдо-

Не лизируется

Лизируется

туберкулезному фагу

Изменение • ла-кмусо-

Медленное ощелачивание

Быстрое ощелачивание

вого мосока (исходный pH 5,7)

Рост на среде Бессоновой с рамнозой

Редко с образованием кислоты

С кислотообразованнем

назначенном для заражения, выбривают или выщипывают шерсть. Место заражения протирают стерильным изотоническим раствором хлорида натрия, снимают скальпелем поверхностный слой эпидермиса, наносят па него исследуемый патологический или секционный материал и втирают шпателем в течение 2—3 мин под прикрытием крышки от чашки Петри. Материал, не содержащий посторонней микрофлоры (кровь, тканевая жидкость), вводят под кожу внутренней поверхности бедра, нижней части живота или внутрибрюшинно. Свинки, зараженные внутрибрюшинно, погибают обычно

^ерсз 2——3 дня, зараженные подкожно ——спустя 3——7 дней, через кожу посредством втирания ——через 7—9 дней.

У свинок, погибших в первые 2——4 дня при внутрибрюшинном заражении, отмечают геморрагический или серозно- геморрагический выпот в брюшную полость, гиперемию легких, печени и селезенки.

При заражении подкожном и посредством втирания в месте введения материала обнаруживают резко выраженную инъекцию подкожных сосудов, геморрагический инфильтрат, увеличение регионарных, т. е. ближайших, лимфатических узлов, инфильтрацию окружающей ткани. Лимфатические узлы на разрезе геморрагичны, красного цвета. Если животное не погибает до 5——7-го дня, его забивают. В месте введения материала обнаруживают гнойно-некротический инфильтрат, регионарные лимфатические узлы сильно увеличены и спаяны с окружающей тканью. Селезенка и печень увеличиваются я содержат большое количество некротических узелков. В мазках из экссудата и крови, в отпечатках из внутренних органов в типичных случаях, если гибель свинок наступает в первые 5 сут после заражения, находят большое колйчест- во грамотрицательных биполярно окрашенных палочек. '

ВОЗБУДИТЕЛЬ ТУЛЯРЕМИИ

Бактерии туляремии (Francisella tularensis) возбудители острого заразного заболевания, которое в зависимости от пути заражения и места внедрения возбудителя может давать различные клинические проявления.

Работа с подозрительным на заражение Fr. tularensis материалом и культурами Fr. tularensis требует такой же осто- / рожиости, как и работа с возбудителем чумы. Поэтому ее выполнение разрешается только в специальных лабораториях, где режим обеспечивает безопасность работы с возбудителями особо опасных инфекций.

Лабораторный диагноз заболевания, подозрительного на туляремию, ставят на основании реакции агглютинации, реакции пассивной гемагглютинации и результатов постановки биологической пробы.，。

Бактериологический метод, предусматривающий посев исследуемого материала на искусственные питательные среды с целью выделения и идентификации чистой культуры возбудителя, в диагностике туляремии не находит применения.

Серологический диагноз туляремии. Вполне надежным методом диагностики туляремии является двукратное исследование сыворотки больного в реакции агглютинации с туляремийным диагностикумом. Развернутую реакцию агглютинации ставят общепринятым методом (с. 118) с разведениями сыворотки от 1 :50 до 1 : 1600 и выше, исполь-

зуя в качестве антигена готовый туляремийный диагностикум.. Реакция сопровождается постановкой контролей: 0,5 мл антигена и 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия (контроль антигена) и исходное разведение сыворотки без добавления антигена (контроль сыворотки).

Результаты учитываются по четырехкратной системе после 2 ч выдерживания пробирок в термостате и 18——20 ч при комнатной температуре. Для определения титра агглютининов в динамике кровь больного рекомендуется исследовать в конце 2-й недели заболевания, затем спустя 7——10 дней. Диагностическим титром является титр сыворотки 1:100 при условии, что в течение болезни он увеличивается в 2 раза или больше.

Более чувствительным методом диагностики туляремии служит реакция пассивной гсмагглютнна ц и и, дающая положительный результат с конца 1-й недели заболевания. Реакцию ставят объемным способом в полистероловых пластинах с лунками. Перед постановкой реакции исследуемые сыворотки инактивируют прогреванием при 56 ℃ в течение 30 мин и истощают бараньими эритроцитами (см. с. 103). Из инактивированной сыворотки готовят ряд последовательных двукратных разведений (от 1 : 10 до 1 :2560) на изотоническом растворе хлорида натрия с 1% нормальной кроличьей сыворотки. Приготовленные таким образом разведения разливают в лунки пластин по 0,5 мл. В качестве антигена используют туляремийный эритроцитарный диагно- стикум, представляющий собой взвесь консервированных формалином бараньих эритроцитов, сенсибилизированных туляремийным антигеном. К каждому разведению сыворотки прибавляют по 1 капле 2,5% взвеси диагностикума.

Постановка реакции сопровождается 4 контролями:

испытуемая сыворотка, взятая в наименьшем разведении, с добавлением несенсибилизированных эритроцитов;

контрольная туляремийная сыворотка с добавлением сенсибилизированных эритроцитов;

контрольная туляремийная сыворотка с добавлением несенсибилизированных эритроцитов;

растворитель сыворотки (изотонический раствор хлорида натрия с 1 % нормальной кроличьей сыворотки и сенсибилизированными эритроцитами).

Пластинки выдерживают 2 ч при комнатной темиературе и 18 ч в рефрижераторе, после чего приступают к учету результатов реакции (см. с. 126). Гемагглютинационный титр сыворотки больных туляремне立 достигает разведения 1:2800 и выше.

Экспериментальное заражение животных. Отделяемое язв» пунктат из пораженного лимфатического узла, слизь, снятую с миндалин и слизистых оболочек зева, вносят в пробирку 266

迎 1—1,5 мл изотонического раствора и тщательно размешивают (кровь больного разводят вдвое изотоническим раствором хлорида натрия, из секционного материала готовят эмульсию в изотоническом растворе хлорида натрия). Подготовленный таким образом материал вводят подкожно в количестве 0,5 мл 3—5 белым мышам.

Четвертый (5—10-й) день. 1. Гибель мышей при массивной зараженности введенного материала наступает на 4—5-е сутки, при небольшом количестве введенных микробов—на 6——10-е сутки. Выживших мышей умерщвляют на 15-й день после заражения. У белых мышей, погибших от туляремии, имеются характерные патологоанатомические изменения: в месте введения материала плотный инфильтрат, увеличение и уплотнение регионарных (расположенных наибр- лее близко к месту заражения) лимфатических узлов. Внутренние органы (селезенка, печень) уплотнены и гипереми- рованы.

Из органов вскрытого животного делают два мазка-отпечатка. Один из них окрашивают по Граму, другой — по Романовскому——Гимзе для обнаружения возбудителя туляремии. Бактерии туляремии имеют грамотрицательную окраску. При окрашивании по Романовскому — Гимзе приобретают красно-фиолетовый цвет. В мазках из органов животных наряду с мелкими овоидными палочками обнаруживается большое количество кокков.

Материал из печени и селезенки высевают на скошенную поверхность свернутой желточной среды Мак-Коя (рец. 127), прикладывая свежесрезанную поверхность кусочка органа к среде последовательно, начиная с нижней части пробирки. Посевы ставят в термостат при 37 ℃.

Пятый (6—10-й) день. Признаки роста бактерий туляремии при обилии их в исследуемом материале появляются через 18—24 ч. При незначительном количестве засеянных микробов рост бактерий становится заметным на 3—5-е сутки. Колонии этих бактерий на свернутой желточной среде мелкие (1—1,5 мм в диаметре), блестящие, выпуклые, с ровным краем. При обилии туляремийных бактерий на поверхности среды появляется бесцветный блестящий налет.

Для идентификации выделенного микроба с бактериями туляремии из микробной культуры, выращенной на желточ* ной среде Мак-Коя, производят высев: а) в 3 пробирки для накопления чистой культуры; б) в 1 пробирку на скошенный мясо-пептонный агар. Посевы помещают в термостат и инкубируют при 37 ℃ в течение 1—2 сут.

Седьмой (8—9-й) день. 1чИз культуры микроба, вы^ ращенной на свернутой желточной среде, делают мазки, ок・ рашивают их по Граму или по Романовскому — Гимзе для оп* ределения чистоты культуры.

Просматривают посевы, сделанные на мясо-пептонном агаре и мясо-пептонном бульоне.

Для определения видовой принадлежности культуру выделенного микроба (5-миллиардиая микробная взвесь) испытывают в реакции агглютинации с туляремийной диагностической сывороткой титром не менее 1 :20 000. Микробную массу для постановки реакции снимают с поверхности желточной среды бактериальной петлей и суспендируют в изотоническом растворе хлорида натрия. Смывать налет микробного роста не рекомендуется, так как при этом в суспеизик> попадают частицы желточной среды, затрудняющие в дальнейшем учет результатов реакции агглютинации. Положительным результатом считается агглютинация микробов до 2/з титра агглютинирующей сыворотки.

Идентификация бактерий туляремии основывается на совокупности следующих признаков: характерной морфологии и окраске микробных клеток в мазках, специфичности микробного роста на свернутой желточной среде Мак-Кон, отсутствии роста на мясо-псптоином агаре, агглютинации микроба специфической туляремийной сывороткой, патогенности бактерий в отношении белых мышей с воспроизведением типичной иатологоанатомичсской картины.

ВОЗБУДИТЕЛЬ БРУЦЕЛЛЕЗА

Бруцсллы вызывают у человека инфекционное заболевание——бруцеллез, или мальтийскую лнхорапку, с чрезвычайно полиморфной клинической картиной, затрудняющей диагноз болезни. Б ру цел л ы подразделяются на три типа: возбудитель инфекционного аборта коз и овец — Brucella melitensis, возбудитель бруцеллеза крупного рогатого скота — Br. abortus bovis и возбудитель бруцеллеза свиней ——Вг. suis.

Материал для бактериологического исследования. Исследуют мочу, кровь, костный мозг, получаемый в условиях стационара посредством пункции костного мозга. Для установления посмертного диагноза берут кровь, материал из селезенки, лимфатических узлов, в которых бруцеллы локализуются наиболее постоянно. По эпидемическим показаниям бактериологическому исследованию на содержание бруцелл подвергаются молоко и молочные продукты.

Лабораторный диагноз заболевания ставят на основании серологических методов исследования ——реакции агглютинации Райта и Хсддлсона. Проведение бактериологического исследования с выделением чистой культуры высококонтагиозных бруцелл допускается в лабораториях, где предусмотрена возможность работы с возбудителями особо опасных инфекций.

Серологическая диагностика бруцеллеза. Реакция Хедд л с о н а. Реакция Хеддлсона представляет собой ускорен- 268

нь!Й метод диагностики бруцеллеза, отличающийся высокой специфичностью. Ингредиенты реакции: совершенно прозрачная сыворотка больного, исследуемая на бруцеллез, антиген Хеддлсона — убитые нагреванием окрашенные кристаллическим фиолетовым или бриллиантовым зеленым бруцеллы, взвешенные в 12% карболизированном растворе хлорида натрия, в концентрации 10 млрд, микробных тел в 1 мл.

Техника постановки реакции Хеддлсона. На чистую, хорошо обезжиренную стеклянную пластинку размером 20х 12 см наносят микропипеткой 4 дозы исследуемой сыворотки： 0,04； 0,02； 0,01; 0,02 мл. В первые 3 капли прибавляют антиген Хеддлсона в количестве 0,03 мл. Четвертая капля является контролем, обязательным для каждой исследуемой сыворотки. К ней прибавляют 0,03 мл 12% раствора хлорида натрия. Различные дозы сыворотки берут нс для определения ее агглютинационного титра, а для создания и выявления наиболее оптимальных соотношений антител с антигеном, позволяющих с достоверностью определить результат реакции. В отдельной капле ставят контроль антигена: 0,03 мл антигена, смешанного с 0,03 мл изотонического раствора хлорида натрия. Капилляром запаянной пипетки смешивают сыворотку с антигеном, переходя от малой к большой дозе сыворотки. Через Р/а—2 мин просматривают контроль и учитывают результаты. Контроль сыворотки и контроль антигена должны быть гомогенны, без. каких-либо признаков образования хлопьев.

При положительной реакции Хеддлсона, отмечаемой + 4- или + + +, в дозах сыворотки 0,02—0,01 мл в течение первых минут происходит полное просветление жидкости с образованием хорошо различимых хлопьев, располагающихся по периферии капли. При сомнительных результатах реакции (±) агглютинация появляется только в дозе 0,04 мл. В эти^ случаях реакцию следует повторить через 7—10 дней.

Реакция Хеддлсона оказывается положительной с 1-й недели заболевания, однако, будучи качественным методом, не позволяет определить агглютинационный татр сывороток, исследуемых на бруцеллез.

Реакция агглютинации Райта. Обладая высокой специфичностью, реакция Райта, как правило, дает положительный результат со 2-й недели заболевания и сохраняется на протяжении первого года болезни, а затем титр ее начинает снижаться. Реакцию Райта рекомендуется ставить с сыворотками, положительно реагирующими в реакции Хеддлсона. Для постановки реакции необходимы:

прозрачная сыворотка больного, подлежащая исследованию; " в

диагностикум ——формализированный антиген, который перед употреблением разводят изотоническим раствором

хлорида натрия так, чтобы В' 1 мл его содержался 1 млрд, бруцелл (институт вакцин и сывороток имени И. И. Мечникова в Одессе выпускает единый цветной бруцеллезный диа- гностикум, применяемый для реакций Райта и Хеддлсона).

Реакцию Райта ставят по принципу реакции агглютинации (см. с. 118). Результаты реакции учитывают по общепринятой четырехкрестной системе после выдерживания пробирок в термостате в течение 18—20 ч.

При просмотре пробирок иногда обнаруживается такое же явление, как и в реакции Хеддлсона: положительному результату реакции в разведении сыворотки 1 :200 или выше предшествует отрицательный или слабоположительный результат. Результат реакции оценивают следующим образом: положительная реакция агглютинации при титре 1 :50——1: 100 признается сомнительной, при титре 1 : 200——1 : 400 ——положительной, 1 : 1000 и выше ——резко положительной.

Бактериологический диагноз бруцеллеза. При бактериологической диагностике бруцеллеза необходимо иметь в виду, что Вг. melitensis и Br. suis хорошо размножаются в аэробных условиях, тогда как для выращивания Вг. abortus bovis требуется повышенное содержание углекислого газа. Поэтому каждый образец материала, поступающего в лабораторию для исследования на бруцеллез, выращивают параллельно в обычных аэробных условиях и при повышенном содержании углекислоты. Для этого на дно эксикатора (на каждый литр объема сосуда) насыпают 0,4 г бикарбоната натрия и наливают 0,35 мл концентрированной хлористоводородной кислоты. После внесения чашек Петри и пробирок с посевами эксикатор закрывают крышкой и слегка наклоняют, соединяя бикарбонат натрия с кислотой. В пробирках или колбах повышенное содержание углекислоты создается поджиганием внутреннего конца ватной пробки с последующим проталкиванием ее в глубь сосуда и заливкой наружно конца пробки воском или парафином.

Посев крови и костного мозга для выделения • бруцелл рекомендуется проводить по методу Кастенеды. Для посева крови пользуются прямоугольными флаконами емкостью 100 мл , в которые разливают по 20 мл питательного агара. После стерилизации флаконы кладут так, чтобы среда распределилась и застыла равномерным слоем на поверхности одной из граней флакона. После этого во флаконы вносят стерильный печеночный бульон или бульон Мартена (рец. 40) в количестве 15—20 мл. В каждый флакон засевают по 5—10 мл крови. Для того чтобы она не свернулась в жидкую питательную среду, прибавляют 0,5% цитрата натрия.

Посев костного мозга производят в пробирки со скошенным агаром и тем же печеночным или мартеновским бульоном. Для выделения миелокультур в пробирки с 5—7 мл

жидкой среды вносят несколько капель исследуемого костного мозга. Посевы инкубируют в термостате при 37℃ параллельно в аэробных условиях и в условиях повышенного содержания углекислого газа.

Пятый (5—15-й) день. Каждые 5 дней из колб с посевами делают высевы на агар Мартена (рец. 41), печеночный агар (рец. 128) или глюкозо-глицериновый агар (рец. 129), разлитый толстым слоем в чашки Петри.

Рост бруцелл на искусственных питательных средах при посеве патологического материала появляется в редких случаях на 7-й, значительно чаще на 15-й день, а в некоторых случаях на 30-е сутки.

Идентификация бруцелл. Первн立 день. 1. Посевы, сделанные на плотные питательные среды, просматривают ежедневно, начиная с 5-го дня инкубации в термостате. Культуральные признаки для всех типов бруцелл совершенно одинаковы: а) на плотной питательной среде колонии правильной круглой формы, выпуклые, диаметром от 1 до 3 мм, прозрачные в проходящем и матово-белые в падающем свете; структура колоний гомогенная или нежно-зернистая; б) в жидкой питательной среде бруцеллы вызывают равномерное помутнение.

Из культур с жидких и плотных питательных сред готовят мазок для окраски по Граму и препарат «висячей капли» для определения подвижности. В препарате, окрашенном по Граму, бруцеллы имеют вид грамотрицательных, беспорядочно расположенных бактерий палочковидной, овоидной или шаровидной формы. В препарате «висячей капли》 активного движения бактерий не наблюдается.

Несколько колоний с признаками, характерными для бруцелл, высевают в 3—5 пробирок с печеночным или глю- козо-глицериновым агаром для получения чистой культуры.

Третий день. 1. Просматривают 2-суточный рост культуры на скошенном печеночном или глюкозо-глицериновом агаре (при повторных высевах культуры бруцелл на искусственных питательных средах растут более быстро, чем при выделении их из патологического материала). На поверхности скошенного агара бруцеллы растут в виде густо расположенных мелких колоний или сплошного налета с оттенком сероватого цвета.

Для определения видовой принадлежности выделенную культуру, испытывают в развернутой реакции агглютинации со специфическими противобруцеллезными сыворотками. Учет и регистрацию результатов производят после 18—20-ча- сового выдерживания пробирок в термостате. Выделенные культуры можно отнести к бруцеллам, если они агглютинируются специфической противобруцеллезной сывороткой, разведенной не менее чем на % ее титра.

Вторым тестом, рекомендуемым для идентификации выделенных культур с бруцеллами, является проба на лизируе- мость культуры поливалентным бруцеллезным фагом. Глю- козо-глицериновый или мартеновский агар (1,2—1,5%, pH 7,2) разливают в две чашки Петри толстым слоем. После подсыхания поверхность среды каждой чашки засевают 0,1 мл исследуемой микробной взвеси, содержащей от 500 млн. до 1 млрд, микробных тел в 1 мл. Исследуемую культуру распределяют шпателем для получения газонного роста. На середину чашки наносят 1 каплю бактериофага. В контрольную чашку бактериофаг не вносят. Посевы инкубируют в термостате при 37 ℃ в течение 24—48 ч.

Четвертый день. 1. Учитывают результаты реакции агглютинации. Культуры бруцелл независимо от типовой при- надлежнстн дают обычно положительную реакцию агглютинации до 2/з или до полного титра противобруцеллсзной сыворотки.

Учитывают лизис бактерий в чашках с бактериофагом. Если выделенная культура принадлежит к бруцеллам, в месте нанесения бактериофага на фоне газонного роста микробов обнаруживается более или менее четко выраженная зона отсутствия микробного роста.

Таким образом, для определения принадлежности выделенной культуры к бруцеллам достаточно изучения морфологических и культуральных свойств, постановки реакции агглютинации со специфической агглютинирующей сывороткой и лизиса культуры специфическим, поливалентным бруцеллезным бактериофагом.

Определение типа бруцелл основано на неодинаковом действии на бактерии некоторых анилиновых красок. Как видно из табл. 47, Вг. mclitensls растут на средах Мейера и Цобеля (рец. 130), содержащих основной фуксин и тионип, Вг. abortus bovis — только в присутствии основного фуксина, Вг. suis — в присутствии тиопина.

Таблица 47

Основные особенности различных типов бруцелл

Тип бруцелл

Условия культивирования

р Бактериостатическое ' действие красок

Образование сероводорода

фуксин

1 ： 50 000

тионин

1 : 25 000

Вг. melitensis

Вг. suis

Вг. abortus bovis

Аэробные

При 5—10% СО2

+

-Г

+ +

Условные обозначения： + наличие роста микробов или образование сероводорода; — отсутствие микробного роста или сероводорода.

ВОЗБУДИТЕЛЬ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ

Бациллы сибирской язвы (Вас. anthracis) вызывают у человека острое инфекционное заболевание — сибирскую язву, протекающую в кожной, легочной или кишечной форме.

Материал для исследования иа сибирскую язву. При подозрении на легочную форму сибирской язвы исследуют мокроту, на кишечную форму ——кал, при кожной форме — серозно-кровянистое содержимое сибиреязвенного карбункула. При вскрытии трупа человека, умершего от заболевания, подозрительного на сибирскую язву, для бактериологического исследования берут кровь и селезенку. Пересылка патологического и секционного материала, подозрительного на зараженность сибиреязвенными бациллами, производится по правилам работы с особо опасными инфекциями.

Схема микробиологического исследования. Первый день. 1. Из мокроты и содержимого сибиреязвенного карбункула делают несколько мазков. Один из них окрашивают по Граму (см. с. 30), другие, для выявления капсул, — по способу Гинса (см. с. 34). В материале, полученном у больного сибирской язвой, обнаруживают крупные грубые грамполо- жительные палочки с обрубленными или втянутыми внутрь клетки концами. Основанием для постановки диагноза сибирской язвы является содержание в патологическом материале грамположительных, окруженных капсулой^ палочек, расположенных в виде коротких цепочек. Однако капсульная форма возбудителя встречается, как правило, только в крови больных в септической фазе заболевания.

Материал, поступивший на исследование, засевают на чашки с мясо-пептонным агаром и в пробирки с мясо-пептонным бульоном (pH срд. 7,2). Посевы инкубируют в термостате при 37℃ 18—24 ч.

Для выявления способности возбудителя образовывать капсулы исследуемый материал засевается на сывороточнокровяные среды/Государственного института((рец. 131), или Томова，(рен. 1132), или Буза (рец. 133). Инкубация посевов производится 18—24 ч при 37qC в микроанаэростате в атмосфере 20—40% углекислого газа.

С суспензией патологического материала ставят биологическую пробу (см. с. '275).

Второй день. 1. Просматривают посевы, сделанные накануне. Бациллы сибирской язвы образуют:

на чашках с мясо-пептонным агаром крупные сухие колонии серовато-белого цвета с неровно очерченным краем, напоминающим под малым увеличением микроскопа переплетающиеся, опутанные волосы；

в бульоне ——осадок в виде комочка ваты на дне прозрачной среды;

на средах Томова и ГКИ — гладкие глянцевые колонии- слизистой консистенции (S- и SM-форма);

на среде Буза — гладкие слизистой консистенции колонии, окруженные желто-зеленым ореолом, в отличие от сапрофита Вас. cereus, образующего на этой среде зону отчетливо выраженного гемолиза.

Выращенные культуры микроскопируют:

в «висячей капле» из бульонной культуры палочки неподвижны;

в мазке, окрашенном по Граму, грамположительны, располагаются парами и цепочками;

в мазках приготовленных со сред ГКИ, Томова или Буза, встречаются капсульные формы.

Колонии, подозрительные на возбудителя сибирской язвы, отсевают на мясо-пептонный агар для получения чистой культуры.

Третий день. 1. Определяют вирулентность выделенной культуры. С этой целью 2——3 белым мышам с массой тела 18—20 г вводят внутрибрюшинно или подкожно взвесь бацилл в объеме 0,2 мл. Наблюдение за зараженными животными ведут до их гибели, но не более 10 сут. Мыши от сибирской язвы погибают в конце 1-х или в начале 2-х суток. Из крови, селезенки и печени погибших животных делают высев на мясо-пептонный бульон и мясо-пептонный агар и мазки на предметные стекла, окрашивают их указанным выше способом и микроскопируют. Нахождение в мазках палочек, окруженных капсулой, дает основание сделать заключение о специфической патогенности исследуемого микроорганизма.

С культурой выделенного возбудителя для идентификации его с бациллой сибирской язвы ставят тест «жемчужного ожерелья» (метод Йенсена и Клеемейера в модификации Груз). Для этого в сывороточный бульон с пенициллином (0,5 ЕД/мл), разлитый в пробирки по 2——3 мл, вносят по 2 капли бульонной или 1 петлю агаровой культуры исслсдуе- мого микроорганизма. Посев инкубируют в течение 3 ч при 37℃. После указанного срока из бульонной культуры готовят мазки, фиксируют их жидкостью Корнуа .(см. с. 29) г окрашивают метиленовым синим в течение 20—30 с и микроскопируют. Бациллы при выращивании в среде с пенициллином образуют цепочки, состоящие из клеток, шарообразной формы, напоминающие ожерелье. Вас. cereus и другие сапрофитные бациллы сохраняют присущую им форму палочек.

Исследуемую культуру проверяют на лизабельность сибиреязвенным фагом. Для этой цели в чашки Петри разливают расплавленный и остуженный до 5℃ 1,5% мясо-пептонный агар. После застудневания и подсушивания агара в 274

термостате дно чашек расчерчивают на квадраты (2x2 см). В каждый квадрат петлей диаметром 5 мм наносят каплю 6-часовой бульонной культуры исследуемого микроорганизма. После этого чашки подсушивают в течение 30 мин в термостате и затем в середину каждой подсохшей капли наносят петлей диаметром 2 мм каплю сибиреязвенного фага. Учет результатов производится через 5—6 ч инкубации посевов при 37ЦС. При положительном результате на месте нанесения фага отмечается лизис колоний.

Постановка биологической пробы при сибирской язве. Биологическую пробу ставят с суспензией патологического материала или гомогенатом трупного материала, растертыми в изотоническом растворе хлорида натрия, в первый день исследования. Исследуемый материал вводят подкожно белым мышам по 0,1—0,2 мл или морским свинкам по 0,2—0,5 мл. Зараженные животные находятся под наблюдением в течение 10 дней. Мыши, заболевшие сибирской язвой, погибают обычно на 2-й день, а морские свинки — через 2——4 сут. При вскрытии погибших животных под кожей в месте введения материала обнаруживают студенистый отек, во внутренних органах (главным образом в селезенке) наблюдается гиперемия. Из внутренних органов готовят препараты для микроскопирования и при исследовании отмечают наличие в них ■типичных для сибирской язвы коротких цепочек из палочек, окруженных капсулой.

Окончательный бактериологический диагноз сибирской язвы ставится на основании выделения чистой культуры возбудителя, способного образовывать капсулы па сывороточнокровяных средах (ГКИ, Сомова, Буза) в атмосфере углекислого газа, лизироваться специфическим сибиреязвенным фагом, давать феномен «жемчужного ожерелья» при выращивании на среде с пенициллином и обладать специфической патогенностью.

Постановка реакции преципитации по Асколи. <В тех случаях, когда выделить возбудителя сибирской язвы не удается, прибегают к реакции преципитации по Асколи с целью обнаружения антигена сибиреязвенных бацилл. Для постановки реакции необходимы: преципитирующая сибиреязвенная сыворотка, сибиреязвенный стандартный антиген для контроля (готовят централизованным порядком в институтах вакцин и сывороток) и антиген из материала, подлежащего исследованию, подготовленный следующим образом. Исследуемый материал (кожа, шкура, шерсть, кусочки органов и т. д.) заливают изотоническим раствором хлорида натрия из расчета 10 мл раствора на 1 г материала. Пробирку ставят в водяную баню и экстрагируют кипячением на слабом огне в течение 10—20 мин. Полученный экстракт фильтруют через бумажный фильтр до полной прозрачности.

В три преципитационные пробирки пастеровской пипеткой наливают по 0,2——0,3 мл преципитирующей сыворотки. В 4-к> пробирку вливают такое же количество нормальной сыворотки животного, от которого получена преципитирующая сыворотка. Затем в первую пробирку (опытную) по стенке наслаивают 0,2—0,3 мл испытуемого экстракта. Во 2-ю пробирку (контроль преципитирующей сыворотки) добавляют стандартный сибиреязвенный антиген. В 3-ю пробирку /(второй контроль преципитирующей сыворотки) прибавляют экстракт, приготовленный из материала, аналогичного тому, из которого приготовлен опытный антиген, но от заведомо здорового животного. В 4-ю пробирку .(контроль антигена) к нормальной сыворотке прибавляют стандартный сибиреязвенный антиген.

В случае положительной реакции Асколи па границе двух жидкостей образуется тонкое кольцо молочно-белого цвета. Такое же кольцо должно быть во 2-й контрольной пробирке.

ВОЗБУДИТЕЛИ КОКЛЮША И ПАРАКОКЛЮША

Бактерии коклюша (Bordetella pertusiss, Борде—Жангу) вызывают острое заболевание верхних дыхательных путей с поражением интерстициальной ткани легких и локализацией в них возбудителя. Коклюш поражает детей преимущественно дошкольного младшего школьного возраста.

Очень сходную с коклюшем клиническую картину заболевания вызывает другой возбудитель, также относящийся к роду Bordetella,— паракоклюшная палочка В parapertussis. Коклюш и паракоклюш ——два самостоятельных заболевания. Дети, переболевшие коклюшем, могут заразиться и заболеть паракоклюшем и наоборот. Дифференциальная диагностика этих заболеваний возможна только на основании бактериологического исследования, роль которого в последние годы стала особенно велика в связи с частым появлением атипичных и стертых форм заболевания, обусловленных массовой профилактической иммунизацией детей против коклюша и широким использованием антибиотиков для лечения этого заболевания.

Материал для лабораторной диагностики коклюша. В период болезни возбудители коклюша и паракоклюша находятся на слизистых оболочках дыхательного тракта. Соответственно этому материал для посева и выделения возбудителя берут с задней стенки глотки и глубоких отделов дыхательных путей с помощью тампонов — маленьких кусочков ваты, плотно накрученной на конец тонкой эластичной проволоки.

Брать материал можно через рот и пос. При взятии материала через рот тампон, слегка согнутый под тупым углом, 276

вводят за мягкое небо и снимают слизь с задней стенки глотки, стараясь при этом не коснуться корня языка и миндалин. У маленьких детей тампон в носоглотку удобнее вводить через ноздрю. Эта процедура в большинстве случаев сопровождается приступом кашля, который не препятствует взятию материала и до прекращения которого удалять тампон из носоглотки не следует.

Метод кашлевых пластинок при обследовании на каклюш не находит широкого применения, так как в последние годы в результате вакцинации стали преобладать легкие и стертые формы болезни без характерного спастического кашля.

Схема бактериологического исследования. Первый день. Для постановки микробиологического диагноза коклюша и паракоклюша пользуются посевом исследуемого материала на казеиново-угольный агар (рец. ПО). Для подавления роста сопутствующих сапрофитических микробов, препятствующих размножению палочки коклюша, рекомендуется из расчета на 1 мл питательной среды добавлять по 0,25— 0,5 ЕД пенициллина или в поверхность питательной среды за 1%―2 ч до посева втирать шпателем ОД мл раствора пенициллина, содержащего 10 ЕД. /Взятый материал круговыми движениями тампона засевают по краю чашки так, чтобы все стороны тампона коснулись поверхности питательной среды. В центре чашки тампоном наносят штрихи. Этим же тампоном делают точно такой же посев на вторую чашку с питательной средой. Нанесенные в центре чашки штрихи растирают для получения изолированных колоний шпателем, отдельным для каждой чашки. Чашки с посевами помещают в термостат вверх дном. Обязательным условием культивирования коклюшных палочек является достаточная влажность в термостате, достигаемая путем помещения в пего открытого сосуда с водой. Оптимальная температура роста для коклюшных палочек 364c ,(±1°).

Третий и четвертый дни. 1. После 2——3-суточного инкубирования чашки с посевами вынимают и просматривают с лупой X 10, выявляя колонии, характерные для коклюша и паракоклюша.

Рост В. pertusiss на казеиново-угольном агаре появляется обычно через 70—80 ч инкубации. Колонии бактерий коклюша мелкие (0,5—1 мм в диаметре), выпуклые, блестящие, четко контурированные, с блестящей поверхностью, сероватокремового цвета, по консистенции напоминающие густую сметану. С поверхности питательной среды легко снимаются петлей и легко эмульгируются в изотопичском растворе хлорида натрия.

Колонии В parapertussis по внешнему виду очень похожи на колонии /В. pertussis, но более крупные и появляются уже через 24 ч после инкубации в термостате.

Если на чашках с питательной средой подозрительные колонии очень малы или единичны и материала для постановки реакции агглютинации недостаточно, делают пересев с казеиново-угольной среды на среду Борде—Жангу (рец. 1‘11).

Из колоний с признаками, характерными для бактерий коклюша и паракоклюша, берут небольшое количество материала, готовят на предметном стекле мазки и окрашивают их по Граму. Бактерии коклюша и паракоклюша представляют собой короткие овоидной формы палочки, окрашивающиеся по Граму отрицательно. Располагаются палочки поодиночке, парами и в редких случаях цепочками.

На предметном стекле ставят реакцию агглютинации выделенной микробной культуры с иммунной противококлюшной сывороткой, разведенной 4 : 10 (при титре сыворотки 1 : 10000). При положительном результате агглютинация бактерий наступает почти немедленно, в очень редких случаях — в течение 5—10 мин； в контрольной капле (изотонический раствор хлорида натрия) агглютинации не происходит, жидкость сохраняет равномерное помутнение.

Вследствие наличия у коклюшных и паракоклюшных бактерий общих антигенов паракоклюшная палочка агглютинируется коклюшной сывороткой в обычно применяемых для реакции на стекле разведениях сыворотки.

Для исключения перекрестных реакций в настоящее время применяют адсорбированные видоспецифические сыворотки, содержащие антитела к агглютинину 1 (видоспецифический для В. pertussis) и к агглютинину 14 (видоспецифический для В. parapetrussis).

Несколько колоний с признаками, характерными для бактерий коклюша, пересевают в чашки или на скошенный агар той же питательной среды, которая использовалась для выделения возбудителя из патологического материала. Посевы помещают в термостат при 37^С на сутки. При посеве материала на чашку среду делят па несколько секторов и каждую колонию отсевают в отдельный сектор, тщательно втирая материал в поверхность питательной среды.

Для дифференциации коклюшной и паракоклюшной палочек производят высев выделенной культуры на скошенный мясо-пептонный агар с добавлением 0,il % тирозина.

Пятый день. 1. Просматривают рост микробов на питательных средах, засеянных в предшествующий день. Паракоклюшная палочка дает рост на мясо-пептопном агаре и вырастает уже через 24 ч. Рост коклюшной палочки появляется не ранее чем через 48 ч только на специальных средах. При просмотре посевов обращают внимание на изменение окраски среды. Лри обильном росте паракоклюшной палочки происходит изменение цвета питательной среды. Казеиновоугольный агар окрашивается диффузно в буровато-коричпе- 278

вый цвет, хорошо заметный в проходящем свете; глицериново-картофельный агар Борде заметно темнеет. При росте коклюшной палочки цвет питательных сред не изменяется.

Для определения чистоты выделенной культуры готовят из нее 2—3 препарата, окрашивают их по Граму и микроско- пируют.

Просматривают посевы на мясо-пептонном агаре с тирозином. Коклюшная палочка на агаре не растет; рост пара- коклюшной палочки, сопровождающийся диффузным окрашиванием среды в коричневый цвет, появляется в первые 18—20 ч после произведенного посева.

Для окончательной идентификации выделенного микроба ставят пробу на уреазу. В агглютинационную пробирку наливают 0,3 мл среды Закса (рец. 112), прибавляют 1―2 петли исследуемой культуры, затем пробирки встряхивают и помещают на 30 мип в термостат. Паракооюшные бактерии, продуцирующие уреазу, расщепляют мочевину с образованием аммиака. Положительная реакция на уреазу проявляется изменением цвета индикатора (фенолфталеина) в малиновокрасный цвет. Окончательный учет реакции на уреазу производят через 2 ч.

Таким образом, бактерии коклюша и паракоклюша сходны по морфологии, отношению к окраске по Граму, по культуральным признакам; вступают в перекрестную реакцию агглютинации с агглютинирующими коклюшными и паракок- люшными сыворотками в низких разведениях. В основу дифференциации их положена способность паракоклюшных палочек расти на простых питательных средах, изменять окраску питательных сред и расщеплять мочевину с образованием аммиака (табл. 48).

Т а б л и -ц а 48

Основные свойства бактерий коклюша и паракоклюша

Бактерии

管X

list О Ч S о

=к

Q О.

h

У xg d н н

Коклюш Паракоклюш

48—72

24-48

1—2

2-4

Грамотрица- тельиые, овоидиые палочки

+

+

+

+

Ответ выдается на 3——5-е сутки. Предварительный положительный ответ: «Обнаружены микробы, подозрительные на

279

возбудителя коклюша или паракоклюша, исследование продолжается»——может быть выдан на 3-и сутки. Окончательный положительный ответ получают на 5-е сутки. Отрицательный ответ: «Коклюшные и паракоклюшные микробы пе обнаружены» — выдают через 5 сут.

ВОЗБУДИТЕЛЬ ДИФТЕРИИ

Дифтерийные палочки ('Corynebacterium diphtheriae) вызывают тяжелое заболевание, поражающее преимущественно детей. По культуральным и биохимическим свойствам бактерии дифтерии подр аз дел я юте я на три типа: gravis, mitis, intermedins.

Материал для лабораторной диагностики дифтерии определяется локализацией патологического процесса. Чаще всего дифтерия поражает слизистые оболочки верхних дыхательных путей, поэтому для исследования берут одновременно слизь из зева и носа. При дифтерии носа материал берут из глубины носовых ходов одним тампоном сначала из здоровой, а затем из пораженной половины носа. Для взятия материала из зева и носа пользуются разными тампонами. Пленки и слизь снимают сухим тампоном на границе налета и непораженной ткани. Для получения большого количества материала тампон поворачивают вокруг оси, стараясь захватить кусочек пленки, плотно спаянной с подлежащей тканью.

При транспортировке материала на далекие расстояния, занимающей более 3 ч, тампон перед употреблением смачивают 5% раствором глицерина, приготовленным на изотоническом растворе хлорида натрия (pH глицерина доводят до 7,6 с помощью 2% раствора Na2Hpe)4, или используют среды обогащения: полужидкий сывороточный агар (рец. 102), среду Лер гол а (рец. 101), в которые погружают тампон тотчас после взятия материала.

На каждый анализ дается сопроводительный бланк, в котором указывают фамилию и адрес лица, от которого взят материал для исследования, происхождение взятого материала, название учреждения, направляющего на анализ, и цель обследования (диагноз заболевания, по эпидемическим показаниям, профилактическое обследование).

Схема лабораторного диагноза дифтерии. В настоящее время инструкция и методические указания предусматривают проведение полного бактериологического анализа с выделением чистой культуры возбудителя и его последующей идентификацией, так как на слизистых оболочках верхних дыхательных путей и на коже иногда встречаются морфологически сходные с возбудителем дифтерии, но не патогенные для человека сапрофиты: ложнодифтерийные бактерии и диф- тероиды, а также дифтерийные палочки с нехарактерными 280

морфологическими признаками, возникшие под влиянием широкого и не всегда правильного применения антибиотиков.

Первый день. 1. ^Патологический материал, поступивший для исследования на дифтерию, засевают на среды, избирательные для коринебактерий： свернутую сыворотку (рец. 103), теллурит-кровяную среду Клауберга『(рец. 104), хинозольную среду Бунина (рец. 105) или среду Тиндаля (рец. 106). Для лучшего и более быстрого роста микробов питательную среду перед посевом прогревают в термостате. Засев материала, взятого из зева и носа одного и того же больного, производят раздельно.

Для получения изолированных колоний материал, находящийся на тампоне, втирают вначале на небольшую площадь (2X1 см2) питательной среды. При засеве тампон поворачивают всеми сторонами поверхности. Затем нанесенный па среду материал этим же тампоном распределяют штрихами по всей площади чашки. Посевы помещают в термостат при 37℃ на сутки.

Тампоны, доставленные в лабораторию в средах обогащения, помещают в термостат. Исследуемый материал, находящийся в полужидкой сывороточной среде, инкубируют 5——6 ч, а в среде Пергола — 20—24 ч. После указанных сроков инкубации высев материала производят отжатым о стенки пробирки тампоном на четверть или половину чашки Петри с плотной питательной средой.

Бактериоскопию патологического материала («мазок с тампона》) производят только по требованию врача. Для приготовления мазка исследуемый материал берут отдельным тампоном и, прикасаясь разными сторонами его к поверхности предметного стекла, делают ряд отпечатков. Высохшие на воздухе мазки фиксируют над пламенем горелки и окрашивают одним из следующих красителей： щелочным метиленовым синим Леффлера (рец. 10), ацетатом толуидинового синего (рец. 12), ацетатом кристаллического или метилового фиолетового (рец. 4).

Особенностью возбудителя дифтерии является сильно выраженный полиморфизм: в мазке наряду с длинными, тонкими, прямыми или слегка изогнутыми палочками можно обнаружить короткие, толстые. Характерна также неравномерность окраски тела палочки, что иногда придает ей вид цепочки. Концы палочек очень часто имеют колбовидные вздутия, вследствие чего они приобретают форму булавы (согу- пе). Характерным признаком бактерий дифтерии являются включения зерен волютина, находящиеся на концах палочки (рис. 27). В патологическом материале бактерии дифтерии лежат обычно под углом друг к другу, напоминая римскую цифру V, в отличие от ложиодифтерийных бактерий, располагающихся параллельно друг другу в виде частокола. Лож-

нодифтерийные палочки (С. pseudodiphtheriae) значительно короче, грубее бактерий дифтерии и, как правило, не содержат зерен волютина.

При обнаружении в исследуемом материале подозрительных на дифтерию форм микробов дается ответ: «Дифтерийные палочки, обнаружены, исследование продолжается».

Второй день. 1. С помощью лупы X б просматривают микробный рост на поверхности засеянных питательных сред. При отсутствии подозрительных колоний просмотр чашек повторяют через 48 ч.

В пробирках на свернутой сыворотке колонии бактерий дифтерии имеют кремовый цвет, круглую, хорошо очерченную форму, ровный край. Растут колонии, не сливаясь, вследствие чего поверхность питательной среды приобретает бугристый характер.

На теллурит-кровяной среде Клауберга бактерии дифтерии, восстанавливая теллурит калия в металлический теллур, образуют колонии серовато-черного цвета. Бактерии типа gravis образуют серо-черные или черные колонии с шероховатой поверхностью, напоминающие цветок маргаритки. Колонии бактерий типа mitis — выпуклые, черные, блестящие, с ровным краем и гладкой поверхностью. Бактерии типа intermedins растут скудно, образуют мелкие колонии черного цвета с прозрачной каймой по краю.

Кроме бактерий дифтерии, на теллурит-кровяном агаре растут стафилококки, стрептококки, ложнодифтерийная палочка. Микробы кокковой группы растут медленно. Колонии стафилококка к концу 2-х суток становятся крупными, серого или черного цвета с коричневыми оттенками. Колонии ложнодифтерийных палочек в 1-е сутки роста гладкие, слизистые, с черным центром; на 2-е сутки вся поверхность колонии приобретает черную окраску.

При росте на среде Бучина бактерии дифтерии восстанавливают индикатор, вследствие чего в местах их образования среда приобретает фиолетовый цвет. Колонии палочек дифтерии окрашиваются в синий цвет, дифтероиды образуют бесцветные колонии, ложнодифтерийные палочки —— колонии голубоватого цвета.

Из культуры микробов со свернутой сыворотки готовят препараты для микроскопирования. Материал берут прерывистыми движениями петли из нескольких колоний, приготовляют мазок и окрашивают его 2—3 мин щелочным метиленовым синим Леффлера. При обнаружении в мазке единичных полиморфных палочек с утолщением и более интенсивной окраской на концах, характерной для зерен волютина, готовят второй мазок для окраски по способу Нейссера.

Из материала 1——2 колоний, подозрительных на дифтерию, производится высев параллельно на три среды：

одну половину колонии засевают в виде хорошо растертой «бляшки» на поверхность среды для определения ток- сигенности (рец. 109);

после засева 《бляшки» той же петлей без прожигания, производят посев в столбик среды (рец. 107) для определения цистиназы (проба Пизу);

вторую половину колонии снимают после предварительного прокаливания петли и пересевают в пробирку на скошенную поверхность свернутой сыворотки или сывороточного агара.

Из нескольких других колоний, подозрительных на дифтерию, производят посев на среду для определения токсиген- пости еще в виде двух «бляшек》. Для высева одной «бляшки» берут материал 5—6 колоний, учитывая, что среди них могут находиться одновременно токсигенные и нетоксиген- ные разновидности дифтерийных палочек.

Третий день. Просматривают сделанные накануне посевы. 1. Из микробной культуры со свернутой лошадиной сыворотки или сывороточного агара делают мазки для микро^ скопического исследования.

Обнаружение в мазке чистых культур кокков, дрожжей или спороносных палочек позволяет прекратить дальнейшее изучение выделенных бактерий.

Учитывают результаты постановки пробы Пизу. При наличии фермента цистиназы в результате образования сульфида свинца среда приобретает черно-бурый цвет по ходу укола и вокруг него в виде коричневого «облачка» особенно характерного в глубине среды, на расстоянии 1 см от поверхности. Такое изменение среды характерно только для бактерий дифтерии. В случае отрицательного результата цвет среды не изменяется или появляется слабое помутнение по ходу укола.

Производят просмотр чашек и учитывают результаты реакции на токсигенность бактерий дифтерии.

При обнаружении в мазке коринебактерий с положительной реакцией на цистиназу (пробу Пизу), но не образующих токсина, чашки с культурой оставляют в термостате еще на 24 ч для окончательного решения вопроса о токсигенности выделенной культуры.

Культуры коринебактерий с отрицательной реакцией на цистиназу и нетоксигенные после 48 ч инкубации в термостате подвергают дальнейшей идентификации. ：С этой целью производят:

посев на среды Гисса с сахарозой, глюкозой (рец. 46) и крахмалом (рец. 47);

посев в пробирки со средой Закса (рец. 108) для определения уреазы. Пробирки с засеянными средами закрывают пробками и ставят в термостат на 30 мин. Бактерии,

образующие фермент уреазу, за указанный период расщепляют мочевину с образованием аммиака, который, смещая pH среды в щелочную зону, изменяет цвет индикатора фенолового красного в красный.

Четвертый день. 1. Регистрируют результаты роста на средах Гисса. Бактерии дифтерии, подразделяемые на три типа (см. выше), к различным углеводам относятся по-разному. Глюкозу представители всех трех типов ферментируют с образованием кислоты без газа; крахмал расщепляют только бактерии типа gravis. В отношении сахарозы бактерии дифтерии всех типов остаются, как правило, инертными.

Основные дифференциально-диагностические биохимические свойства дифтерийных, ложнодифтерийных бактерий и дифтероидов приведены в табл. 49.

Таблица 49

Основные свойства возбудителей дифтерии и близких к ним дифтероидов

У глеводыУ глеводыВидВидТокси-Цисти-ген- Уреаза наза ностьТокси-Цисти-ген- Уреаза наза ностьглюкозаглюкозакрахмалкрахмалC. diiphtheriae—gravis——mitis—intermedinsCl. ipseudodiphtheriaeC. xerosisC. enzymicusC. pyogenesC. diiphtheriae—gravis——mitis—intermedinsCl. ipseudodiphtheriaeC. xerosisC. enzymicusC. pyogenes一 一 一 +±)一 一一 一 一 +±)一 一+++- - + -+++- - + -+++ - ++++++ - +++----+++----++++ + +-++++ + +-+++

У глеводы

У глеводы

Вид

Вид

Токси-Цисти-

ген- Уреаза наза ность

Токси-Цисти-

ген- Уреаза наза ность

глюкоза

глюкоза

крахмал

крахмал

C. diiphtheriae

—gravis

——mitis

—intermedins

Cl. ipseudodiphtheriae

C. xerosis

C. enzymicus

C. pyogenes

C. diiphtheriae

—gravis

——mitis

—intermedins

Cl. ipseudodiphtheriae

C. xerosis

C. enzymicus

C. pyogenes

一 一 一 +±)一 一

一 一 一 +±)一 一

+++- - + -

+++- - + -

+++ - +++

+++ - +++

----+++

----+++

+ + +-+++

+ + +-+++

Определение токсигенности дифтерииных бактерии. Определение токсигепности имеет особенно большое значение при изучении культур, выделенных от носителей, так как патогенность возбудителей дифтерии обусловлена их токсигепностью.

：В основу метода определения токсигенности положен принцип взаимодействия дифтерийного токсина и антитоксической противодифтерийной сыворотки, диффундирующих в толщу агара и образующих в нем зоны преципитации (рис. 28). Однако при испытании дифтерийных культур на токе и- генность нужно иметь в виду, что появление преципитатов в агаровом геле у дифтерийных культур возможно за счет взаимодействия не только токсина с антитоксином (специфические преципитаты), но и антибактериальных антител с соответствующим антигеном микробной клетки (неспецифические преципитаты). Неспецифические преципитаты могут образовываться у токсигенных и нетоксигенных дифтерийных культур. От специфических эти преципитаты отличаются слабой выраженностью, нечеткостью контуров и более поздним обра-

Рис. 28. Линии преципитации в агаре при определении токсигенности дифтерийных бактерий.

зованием ^(48—72 ч). При образовании контрольным штаммом нескольких линий преципитации специфическими являются наиболее четкие и наиболее рано появляющиеся линии преципитата.

Техника определения токсигенности дифтерийных бактерий. В стерильные чашки Петри, имеющие равное, дно и диаметр 10 см, наливают 12 мл расплавленной и охлажденной до 50℃ готовой питательной среды. После застывания агара на середину чашки помещают стерильную фильтровальную бумагу размером 1,5x8 см, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой, содержащей 500 ME в 1 мл. Затем 15——20 мин чашки подсушивают в термостате.

Культуры бактерий, подлежащие исследованию на токси- гепность, засевают в виде 《бляшек》диаметром 1 см вдоль обеих сторон фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксином, на расстоянии 0,5 см друг от друга и от краев бумажной палочки. Для посева пользуются материалом из двух отдельных колоний и из 5——6 колоний одновременно, засевая его одной «бляшкой». На одной чашке испытывается одновременно 10《бляшек», в том числе 4 культуры исследуемые и 6 контрольных. Контролем служит заведомо токсигенный штамм, который засевается между исследуемыми культурами. Чашки с посевами помещают в термостат при 37匕 просматривая их через 24 и 48 ч инкубации. Просмотр чашек производят с лупой, на темном фоне в проходящем свете.

При учете полученных результатов могут быть следующие варианты в образовании преципитата:

исследуемая дифтерийная культура токсигенпа: образуемые ею линии преципитата сливаются или идут на соединение с соответствующими специфическими линиями заведомо токсигепного штамма;

исследуемая культура нетоксигенна: линии преципитации располагаются так, что концы их не могут слиться с концами специфических линий контрольного штамма. Линии испытуемого штамма перекрещиваются со специфическими линиями и сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма. Линии преципитации испытуемого штамма сливаются с песпецифическими линиями контрольного штамма.

ВОЗБУДИТЕЛЬ ТУБЕРКУЛЕЗА

Микобактерии туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis) являются возбудителем тяжелого инфекционного заболевания— туберкулеза. Местом локализации туберкулезного процесса у человека могут быть любая ткань и орган: кишечник,, почки, твердые мозговые оболочки, кости, кожа, лимфатические узлы, но чаще всего ——легкие.

Кроме человека, туберкулезом болеют домашние животные. Различают следующие типы бактерий туберкулеза: Ту- pus humanus ——человеческий тип, Typus bovinus ——бычий тип и Typus avium ——птичий тип. Заболевания у человека вызывают в основном два первых типа.

Чаще всего для бактериологического исследования берут мокроту и промывные воды желудка и бронхов.

Микроскопическое исследование патологического материала. Микроскопическое исследование мокрот ы. Мокроту, поступившую на исследование, выливают в чашку Петри, поставленную на стекло, под которое положена черная бумага. Деревянной остроконечной палочкой выбирают из мокроты несколько желто-зеленых гнойных комочков, хорошо заметных на темном фоне, переносят на предметное стекло, готовят тонкий мазок 《см. с. 27) и окрашивают его по Цилю — Нильсену. При окраске по этому способу (см. с. 31) фон препарата, представленный клеточными элементами и слизис. ым веществом мокроты, имеет голубоватосиний цвет. Кисло гоустойчивые микобактерии туберкулеза в отличие от некислотоустойчивых микроорганизмов, находящихся в мокроте, окрашены фуксином в рубиново-красный цвет. В большинстве случаев микобактерии туберкулеза очень мелкие (2——4 мкм), тонкие, прямые или слегка изогнутые (рис. 29). В теле микобактерий обнаруживаются иногда более темно окрашенные зерна.

Микобактерии туберкулеза склонны к полиморфизму, который наиболее отчетливо проявляется под влиянием анти- 286

бнотмков и химиотерапевтических препаратов. В мокроте вольных, леченных антибиотиками, часто встречаются формы туберкулезных микобактерий в виде длинных и тонких или толстых и грубых палочек с колбообразными расширениями на концах, палочки, похожие на кокков. В мокроте больных туберкулезом микобактерии располагаются поодиночке, иногда группами по 2—3, и в редких случаях образуют массивные скопления беспорядочно расположенных микробов. Количество микобактерий туберкулеза, обнаруживаемых в мазке, может быть различно.

При отрицательном результате микроскопического исследования прибегают к методу флотации, позволяющему в небольшом объеме исследуемого материала концентрировать микобактерии туберкулеза, содержащиеся в мокроте, собранной в течение суток.

Метод флотации предложен в 1931 г. Петенжером и основан на том, что прибавленный к гомогенизированной мокроте бензол или ксилол разбивается при взбалтывании ее на мельчайшие капельки, которые, поднимаясь кверху, адсорбируют на своей поверхности микобактерии туберкулеза. К 10—15 мл исследуемой мокроты, налитой в склянку емкостью '250 мл прибавляют равное количество 0,5% раствора едкого натра или едкого кали. Склянки плотно закрывают резиновой или хорошо притертой стеклянной пробкой и после этого встряхивают в течение 15—20 мин в электровстряхивателе до полной гомогенизации мокроты. Затем склянку с гомогенизированной мокротой помещают в водяную баню, нагревают при температуре 55℃ в течение 30 мин и после этого приливают 2 мл ксилола (бензола или толуола) и 100 мл дистиллированной воды. Смесь снова в течение 15—20 мин встряхивают, а затем отстаивают в течение часа при комнатной температуре. При стоянии на поверхности жидкости появляется сливкообразный слой — флотационное кольцо, состоящее из всплывших кверху капелек ксилола с находящимися на их поверхности микобактериями туберкулеза. Образовавшееся кольцо отсасывают пастеровской пипеткой с резиновым баллончиком и переносят на два предметных стекла, нагретых заранее до температуры 60℃. На предметные стекла сливкообразную массу наносят по 5——6 раз, каждый раз после подсыхания предыдущей порции. Подсохшие мазки фиксируют и окрашивают фуксином Циля с подогреванием в течение 10 мин. Дальнейшая окраска производится по Цилю——Нильсену.

Микр оскопия промывных вод желудка. Больному натощак дают стакан дистиллированной воды. Через стерильный желудочный зонд извлекают около 250 мл желудочного содержимого. К полученной жидкости прибавляют 2 мл 0,5% водного раствора едкого кали, тщательно в

течение нескольких минут перемешивают, затем туда же добавляют 2 мл ксилола или бензола, после чего склянку со смесью помещают на 10 мин в электровстряхиватель, а затем оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Приготовление мазков для микроскопирования ведется по описанному выше методу исследования мокроты.

Техника обработки материала перед посевом. Для экспериментального заражения и посева на питательные среды мокроту и промывные воды желудка или бронхов обрабатывают минеральными кислотами с целью освобождения от посторонней микрофлоры. Для этого к исследуемому материалу, предста вл я ющему собой осадок гемо- генизированной мокроты, центрифугат промывных вод желудка или мочи в объеме 3—5 мл, прибавляют равный объем 2——4% водного раствора стерильной серной кислоты. Смесь в течение 10 мин энергично встряхивают, затем переливают в стерильные центрифужные пробирки (с ватно-марлевыми пробками) и центрифугируют в течение 15—20 мин. После центрифугирования надосадочпый слой жидкости сливают в банки с дезинфицирующим раствором, осадок нейтрализуют 1——2 каплями 3% раствора едкого натра и используют для постановки биологической пробы или посева на питательные среды.

Спинномозговую жидкость, гной из невскрывшихся абсцессов, не содержащие посторонней микрофлоры, используют для посева и заражения без предварительной обработки.

Бактериологический метод. Посев патологического материала на искусственные питательные среды является обязательным в тех случаях, когда микроскопическое исследование с применением методов обогащения дает отрицательный результат. Патологический материал, обработанный кислотой, набирают пастеровской пипеткой и засевают по 1 капле на поверхность скошенной в пробирках среды Левенштейна —— Йенсена (рец. 135), -Петраньяни (рец.力36) или Гельберга (рец. 137).

Явные признаки роста микобактерий туберкулеза на плотных питательных средах появляются обычно на 3——4-й неделе после посева. Поэтому очень важно, чтобы в течение всего периода среда сохраняла достаточную влажность. С этой целью посев производят на свежеприготовленные питательные среды с конденсационной водой на дне пробирки. При отсутствии конденсационной воды в пробирки до посева наливают по 0,5—0,7 мл стерильного изотопического раствора хлорида натрия. После посева пробирки закрывают как обычно ватно-марлевыми пробками, надевая сверху резиновые колпачки или заливая их расплавленным парафином. Пробирки с посевами выдерживают в термостате при 37℃ в течение 1——3 мес.

Посевы просматривают каждую неделю, отмечая время появления микробного роста. Наиболее часто признаки роста микобактерий туберкулеза появляются на 20——40-й день в виде сухого бугристого налета белого или слегка желтоватого цвета, напоминающего цветную капусту. При отсутствии выраженного роста после 6—8 нед выдерживания в термостате с поверхности питательной среды делают соскоб, готовят из него мазок и с помощью окраски по Цилю — Нильсену выявляют содержание в нем кислотоустойчивых бактерий.

Выделение микрокультур бактерий туберкулеза способом Прайса. На стеклянных пластинках размером 70*12 мм, простерилизованных в сухожаровой печи, готовят из исследуемого материала несколько препаратов-мазков, как для микроскопии. После подсыхания предметные стекла с мазками захватывают стерильным пинцетом и погружают па 5 мин в стерильный 6% раствор серной кислоты. Препараты, обработанные кислотой, промывают стерильным изотоническим раствором хлорида натрия, а затем погружают целиком в склянку с питательной средой Прайса (рец. 134). Для предотвращения роста посторонней микрофлоры в питательную среду добавляют раствор пенициллина из расчета 10 ЕД антибиотика на 1 мл среды. Посевы инкубируют в термостате при 37℃. Через 7—10 дней на препаратах-мазках появляется рост микобактерий туберкулеза. Для обнаружения выросших микроорганизмов мазки отмывают от крови, погружая осторожно пластинки стекла в стаканчик с водопроводной водой. После этого стекла высушивают, мазок-микроколонию фиксируют над огнем и окрашивают по Цилю — Нильсену. Под микроскопом микрокультуры микобактерий туберкулеза имеют вид 《жгутов》 или массивных беспорядочных скоплений палочек.

Заражение морских свинок. Морские свинки очень чувствительны к туберкулезной инфекции. Для воспроизведения прогрессирующего генерализованного туберкулеза в организм морской свинки достаточно ввести одну или несколько микобактерий туберкулеза. Установлено, что морские свинки могут болеть, заражаясь туберкулезом от окружающих их людей. Использование для постановки биологической пробы животных, зараженных туберкулезом, может послужить источником ошибочного диагноза. Поэтому морской свивке за 2 дня перед постановкой опыта вводят внутрикожно 0,1 мл туберкулина, разведенного 1 : 10. У здорового животного в месте введения туберкулина не отмечается каких-либо выраженных изменений. У животных, зараженных туберкулезом, на месте введения туберкулина через 24—48 ч появляются гиперемия и инфильтрат. Такие животные для опыта непригодны.

Заражение морских свинок для постановки диагноза туберкулеза производят следующим образом. Исследуемый патологический материал (мокрота, гной, моча после предварительной обработки серной кислотой) вводят- в объеме 1— 1,5 мл двум морским свинкам в область паха. При наличии в патологическом материале вирулентных бактерий туберкулеза в месте введения материала уже на 6——10-й день появляется уплотнение, увеличивающееся со временем. На поверхности его образуется незаживающая язва, из которой постоянно выделяется густой гной. Увеличиваются регионарные лимфатические узлы, достигая иногда величины грецкого ореха. При появлении местных изменений, характерных для туберкулеза, животных умерщвляют. Из гноя язвы и лимфатических узлов делают мазки, окрашивают их по Цилю— Нильсену. При рассматривании под микроскопом в мазках обнаруживают в большом количестве микобактерии туберкулеза. Животных, у которых в месте введения патологического материала и в регионарных лимфатических узлах изменений не обнаруживается, забивают через 6——8 нед после заражения. При вскрытии животных, заболевших туберкулезом, в лимфатических узлах брюшины и бронхов, в селезенке и почках отмечается большое количество хорошо заметных обычным глазом бугорков величиной с просяное зерно; некоторые из них некротизированы.

ПАТОГЕННЫЕ СПИРОХЕТЫ

Патогенные спирохеты представляют собой группу микробов, занимающую промежуточное положение между бактериями и простейшими. Под микроскопом спирохеты имеют вид тонких нитей со штопорообразными завитками. Спирохеты подвижны, могут совершать поступательные и сгибательные движения.

Спирохеты широко распространены в природе. Среди них есть несколько видов, патогенных для человека. К их числу относятся спирохеты, вызывающие возвратный тиф, сифилис, а также возбудители лептоспирозов: инфекционной желтухи и водной лихорадки.

ВОЗБУДИТЕЛИ ВОЗВРАТНЫХ ТИФОВ

■ В СССР встречаются две формы возвратного тифа: среднеазиатский возвратный тиф (возбудитель Borrelia sogdia- num и кавказский (возбудитель Borrelia caucasica), передающиеся через клещей. Европейский возвратный тиф, вызываемый спирохетой Обермейера (Spirochaeta obermeyeri или Borrelia recur rent is), передающийся через платяную вошь, в настоящее время в Советском Союзе не встречается.

Возбудители возвратных тифов вызывают у человека острое заболевание, при котором приступы лихорадки чередуются с периодами удовлетворительного состояния и нормальной температуры.

При европейском возвратном тифе во время приступа спи-, рохеты обнаруживаются в крови в большом количестве. При нормализации температуры, в период между приступами, найти спирохеты в крови не удается.

Возбудители среднеазиатского и кавказского возвратного тифа могут быть обнаружены в крови больного в единичных случаях как в лихорадочном, так и в межприступном периодах болезни.

Материалом для исследования при подозрении на возвратный тиф является кровь, взятая во время приступа. Прокалывают мякоть пальца и из выступившей в месте укола крови готовят три препарата: два тонких мазка и препарат толстой капли (см. с. 27). Тонкий мазок готовят обычным способом с помощью шлифованного стекла. После высыхания мазок фиксируют 5 мин в метиловом спирте или смеси Никифорова (см. с. 29) и окрашивают карболовым фуксином Циля, разведенным дистиллированной водой в 2—3 раза, или краской Романовского—Гимзы в течение 30——40 мин. При микроскопировании мазка в препарате среди эритроцитов обнаруживаются тонкие, длинные, превышающие в 3—6 раз диаметр эритроцитов спиралевидные нити — спирохеты возвратного тифа (имеющие от 4 до 12 завитков) с заостренными концами. 、

При европейском возвратном тифе спирохет в препарате очень много (если кровь исследуют во время приступа). Располагаются они поодиночке и в виде клубков. При клещевом возвратном тифе встречаются единичные спирохеты, которые чаще всего можно обнаружить только в толстой капле. На препарат толстой капли, высохший, но не фиксированный, наносят несколько капель краски Романовского—Гимзы, приготовленной на дистиллированной воде, чтобы вызвать лизис эритроцитов. Окрашивание препарата длится 35—40 мин. При микроскопировании препарата толстой капли спирохеты возвратного тифа, окрашенные в фиолетовый цвет, находятся среди «теней» эритроцитов. При клещевом возвратном тифе обнаруживаются единичные спирохеты. При европейском возвратном тифе спирохеты содержатся в большом количестве» образуя клубки разной величины.

ВОЗБУДИТЕЛИ ЛЕПТОСПИРОЗОВ

Род лептоспир (Leptospira) широко распространен в природе и объединяет большое количество сапрофитических и патогенных видов спирохет. Патогенные лептоспиры относят*

ся к группе зоонозов. Они поражают различные виды животных: крупный и мелкий рогатый скот, свиней, лошадей, собак, диких животных, грызунов. У человека лептоспиры вызывают острое лихорадочное заболевание, при котором возбудитель локализуется в крови и тканях различных органов. По характеру клинических проявлений различают желтушную и безжелтушную формы лептоспироза.

В Советском Союзе от больных людей с разными клиническими формами лептоспироза выделено 16 серотипов лептоспир, различных по биологическим свойствам и структуре антигенного аппарата.

Материал для исследования. При подозрении на лептоспироз берут кровь из вены локтевого сгиба в количестве 6 мл. Для микроскопического исследования 2 мл крови, тотчас после ее взятия, наливают в пробирку с 4 мл 1,5% цитрата натрия. |Предназначенные для посева 4 мл крови выливают в пробирку с питательной средой.

Для серологического исследования кровь берут в более поздние сроки заболевания в сухую пробирку в количестве 2——2,5 мл. Образующуюся сыворотку разливают в стерильные ампулы или агглютинационные пробирки и запечатывают.

'Спинномозговую жидкость в количестве 4—6 мл берут исключительно по клиническим показаниям при наличии менингеальных явлений. Мочу для исследования собирают в стерильные склянки.

Схема лабораторного исследования при диагностике лептоспирозов. 1. Бактериоскопическое исследование. Морфологию лептоспир изучают в живом состоянии в темном поле. Бактериальными красителями они почти не окрашиваются. Для микроскопического исследования цитратную кровь оставляют в пробирках при комнатной температуре на 1—d，2 ч. Верхний прозрачный слой отстоявшейся плазмы используют для приготовления микроскопических препаратов. Значительно лучшие результаты дает микроскопия осадка сыворотки, полученного в результате центрифугирования при 10 000—12 000 об/мин в течение часа.

В редких случаях возбудителя болезни обнаруживают в мазках из осадка спинномозговой жидкости, которую центрифугируют так же, как сыворотку.

Мочу в целях обнаружения лептоспир исследуют с конца 1-й недели заболевания и в течение последующих 3 мес болезни. -Осадок получают из 30——50 мл мочи. Для обнаружения лептоспир микроскопируют 10——15 препаратов «раздавленной» капли, приготовленных из осадка патологического материала на абсолютно чистых стеклах толщиной не более 1,2 мм.

Микроскопическое исследование препаратов производят в темном поле с сухой системой (объектив Х40); серебристобелые лептоспиры четко выделяются на темном фоне препарата. Так как'просмотр материала ведется при сравнительно небольшом увеличении, первичные завитки спирохеты не обнаруживаются.

Лептоспиры имеют вид тонких, длинных палочек с двумя крючками на концах. Они обладают способностью совершать активные поступательные движения и подвижностью вокруг своей продольной оси. При движении лептоспиры образуют фигуры, напоминающие гимнастические гири или букву S.

Бактериологическое исследование. Патологический материал тотчас после получения засевают в пробирки со средой Уленгута (рец. 138) или средой Терских (рец. 139). Посев крови производят в 3 пробирки: в 1-ю засевают 0,5 мл, во 2-ю 1 мл, в 3-ю — 2 мл крови. Асептично собранную мочу засевают по 0,5—1 мл в 4—5 пробирок. В таком же объеме делают посев спинномозговой жидкости. Размножение лептоспир значительно лучше происходит в условиях анаэробиоза. Поэтому среду в пробирках заливают 0,5—4 мл стерильного вазелинового масла. Вазелиновое масло до разливки по пробиркам стерилизуют в автоклаве 30 мин при температуре 120久 (после стерилизации масло мутнеет).

Рост лептоспир начинается с 7——10-го дня после посева. Однако размножение их не сопровождается помутнением среды в пробирках. Рост лептоспир выявляется в препарате раздавленной капли. Материал для приготовления препарата берут из-под слоя вазелинового масла следующим образом: пробирку с посевом осторожно наклоняют почти до горизонтального положения так, чтобы все масло перешло на нижнюю стенку пробирки. После этого пастеровскую пипетку вводят в питательную среду по верхней стенке пробирки над слоем вазелинового масла. Препарат раздавленной капли, приготовленный из засеянной питательной среды, просматривают в темном поле. Наблюдение за ростом лептоспир в питательной среде производится каждые 5 дней в течение 3 мес. При отсутствии роста в течение указанного срока результат посева считается отрицательным.

. Серологический метод исследования. Антитела против лептоспир в крови человека в достаточном для обнаружения титре появляются обычно в конце 1-й ——начале 2-й недели заболевания. После перенесения болезни они сохраняются в течение многих лет.

Серологическая диагностика лептоспирозов состоит в постановке реакции агглютинации — лизиса. Методика постановки реакции агглютинации при лептоспирозе не

СерегруппаОтечественные штаммыIcterohaemorr-СудьинhagiaeJavanicaSorexCanicolaКаширский *AutumnalisEfinaceus 6701AustralisЕж 1PomonaШалиGrippotyphosaMoskvaHebdcmadisГамзулин1BatavideMycromis minu-tus 167TarassoviPerepelicinSemarangaБ. Ш.1СерегруппаОтечественные штаммыIcterohaemorr-СудьинhagiaeJavanicaSorexCanicolaКаширский *AutumnalisEfinaceus 6701AustralisЕж 1PomonaШалиGrippotyphosaMoskvaHebdcmadisГамзулин1BatavideMycromis minu-tus 167TarassoviPerepelicinSemarangaБ. Ш.1Таблица 50Таблица 50Диагностические штаммы лептоспирДиагностические штаммы лептоспир1 Штаммы не соответствуют зарубежному эталону по серотипу.1 Штаммы не соответствуют зарубежному эталону по серотипу.

Серегруппа

Отечественные штаммы

Icterohaemorr-

Судьин

hagiae

Javanica

Sorex

Canicola

Каширский *

Autumnalis

Efinaceus 6701

Australis

Еж 1

Pomona

Шали

Grippotyphosa

Moskva

Hebdcmadis

Гамзулин1

Batavide

Mycromis minu-

tus 167

Tarassovi

Perepelicin

Semaranga

Б. Ш.1

Серегруппа

Отечественные штаммы

Icterohaemorr-

Судьин

hagiae

Javanica

Sorex

Canicola

Каширский *

Autumnalis

Efinaceus 6701

Australis

Еж 1

Pomona

Шали

Grippotyphosa

Moskva

Hebdcmadis

Гамзулин1

Batavide

Mycromis minu-

tus 167

Tarassovi

Perepelicin

Semaranga

Б. Ш.1

Таблица 50

Таблица 50

Диагностические штаммы лептоспир

Диагностические штаммы лептоспир

1 Штаммы не соответствуют зарубежному эталону по серотипу.

1 Штаммы не соответствуют зарубежному эталону по серотипу.

отличается от таковой при других инфекциях, кроме учета результатов, который производят под микроскопом в темном поле зрения. Сложность постановки этой реакции заключается в том, что патогенные лептоспиры объединяют 124 серологических типа, входящих в состав Г8 серологических групп. На территории Советского Союза обнаружены представители 8 серологических групп. Естественно, что постановка реакции со всеми 124 серотипами лептоспир невозможна, а реакция с произвольно выбранными, например «местными», штаммами не обеспечивает полного выявления больных. Учитывая это, научная группа по лептоспирозным заболеваниям при ВОЗ (1965) рекомендует пользоваться для постановки реакции агглютинации — лизиса на- бором штаммов, представляющим серологические группы, которые обладают наиболее полным набором внутригрупповых антигенных связей следовательно, могут обеспечить наиболее достоверный серологический диагноз. Перечень эталонных культур для диагностики лептоспирозов на территории Советского Союза приведен в табл. 50.

Применение единого для всей страны диагностического набора штаммов обеспечивает

серогрупповой диагноз и позволяет получить сравнимые данные о краевой распространенности лептоспирозов разных серологических групп.

Для постановки реакции агглютинации необходимы следующие ингредиенты: 1) сыворотка больного, подлежащая исследованию; 2) изотонический раствор хлорида натрия; 3) живые культуры лептоспир. Перечисленные штаммы выписывают из Московского научно-исследовательского института вакцин и сывороток имени И. И. Мечникова. Для постановки реакции агглютинации — лизиса применяют 7——10-дневные культуры, содержащие в поле зрения 50—100 лептоспир и более с активной подвижностью, без признаков спонтанной агглютинации (клубочки, узелки из лептоспир).

Из сыворотки больного, подлежащей исследованию, готовят ряд последовательных разведенн立——от 1 : 50 до 1 : 6400. Приготовленные разведения разливают по 0,2 мл в агглютина- ционные пробирки или лунки полистероловых пластин, в 1J

параллельных рядов с 9 пробирками или лунками в каждом ряду. В последнюю, контрольную, лунку (пробирку) каждого ряда наливают по 0,2 мл изотонического раствора хлорида натрия. Затем во все пробирки одного ряда, включая и кон・ трольную, прибавляют равные количества (0,2 мл) культу、 ры лептоспир одного или того же серологического типа. После добавления антигена к сыворотке штатив с пробирками встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 2 ч, по истечении которых учитывают результаты реакции- под микроскопом в темном поле зрения.

При регистрации результатов отмечают феномены агглютинации и лизиса, которые наступают одновременно. Феномен лизиса проявляется зернистым набуханием лептоспир, утратой подвижности с последующим распадом на отдельные фрагменты. Иногда лизис протекает настолько энергично, что в первых пробирках с малыми разведениями сыворотки все лептоспиры оказываются растворенными. Феномен агглютинации характеризуется склеиванием отдельных лептоспир в виде так называемых паучков, отсутствующих в контрольной пробирке. Реакция агглютинации, не сопровождающаяся лизисом, не может считаться специфической. Титром реакции агглютинации считают то максимальное разведение исследуемой сыворотки, при котором обнаруживаются склеивающиеся лептоспиры .(«паучки»), отсутствующие в содержимом контрольной пробирки. Агглютинационный титр при лептоспирозе достигает больших величин (1 : 6400—1 : 12 800).

Литическим титром считают максимальное разведение сыворотки, при котором имеются резко выраженная зернистость и набухание лептоспир, отсутствующие в контрольной пробирке. Литический титр, как правило, ниже агглютинацион- ного. За диагностический титр при лептоспирозе принимают титр, равный 1 : 400.

С целью упрощения развернутой реакции агглютинации В. С. Киктенко рекомендует исследовать участвующие в ней штаммы лептоспир предварительно в ориентировочной реакции на стекле. На предметное стекло наносят три капли： каплю исследуемой сыворотки больного в разведении 1 : 50, каплю той же сыворотки в разведении 1 :500 и каплю изотонического раствора хлорида натрия (контроль). К каждой капле прибавляют равные количества соответствующей культуры лептоспир, вследствие чего фактическое разведение сыворотки удваивается, достигая в первой капле 1 ： 100, во второй—1 : 1000. Смесь сыворотки с культурой лептоспир тщательно перемешивают углом другого предметного стекла и слегка подогревают.

Результат реакции учитывают спустя 3——5 мин посредством приготовления препарата раздавленной капли и микро- скопирования его в темном поле зрения. Штаммы лептоспир^ положительно реагирующие с сывороткой больного в опыте на предметном стекле, используются для постановки развернутой реакции агглютинации. Таким образом, число рядов в ней значительно уменьшается.

ВОЗБУДИТЕЛЬ СИФИЛИСА

Бледная спирохета '(Treponema pallidum), получившая название в связи с плохой окрашиваемостью анилиновыми красителями, является возбудителем сифилиса ——заболевания, свойственного только человеку.

По характеру клинических проявлений в течении сифилиса различают четыре периода. Лабораторная диагностика заболевания определяется периодом болезни. В первом периоде, при развитии местных явлений, лабораторный диагноз заболевания основывается на микроскопическом исследовании отделяемого твердого шанкра. Во втором и третьем периодах микроскопическому исследованию подвергают отделяемое кожных поражений (розеолы, пустулы).

Начиная с третьего периода, в лабораторной диагностике сифилиса ведущее значение приобретают серологические методы исследования, к числу которых относятся реакция Вассермана и осадочные реакции Капа и Закса — Витебского.

Культивирование бледных спирохет в лабораторных условиях сопряжено с большими трудностями, поэтому в диагностике сифилиса бактериологический метод исследования не используется.

Материал для лабораторной диагностики сифилиса. Материалом для исследования с 3——4-й недели заболевания служит тканевая жидкость, взятая из первичной язвы. Тканевую жидкость получают следующим образом. Язву очищают кусочками стерильной ваты, смоченной очищенным бензином или изотоническим раствором хлорида натрия. После этого* края язвы слегка сдавливают I и II пальцами левой руки. Сдавливание производят с перерывами в течение нескольких секунд. В результате такой манипуляции на поверхности язвы появляется капля прозрачной жидкости желтоватого цвета, которую набирают в пастеровскую пипетку и наносят на> предметное стекло. Брать материал из твердого шанкра следует обязательно в резиновых перчатках. >С 4——5-й педели после заражения материалом для микроскопирования служит тканевая жидкость, полученная посредством пункции регионарных лимфатических узлов.

Для постановки реакции Вассермана берут кровь натощак из вены локтевого сгиба в количестве. 5—7 мл и получают им нее сыворотку.

Микроскопическое исследование при диагностике сифилиса. Из капли тканевой жидкости, нанесенной на предметное стекло, готовят препарат раздавленной капли и микроскопируют его в темном поле зрения микроскопа (см. с. 26). При микроскопировании препарата обнаруживают спирохеты, обладающие характерными для возбудителя сифилиса плавными, медленными движениями. Поступательные движения часто сопровождаются вращением вокруг продольной оси и отступлением назад. При движении вперед спирохета как бы перегибается пополам, совершая при этом маятникообразные колебания. При микроскопировании препарата, приготовленного по способу Бурри, на темно-дымчатом фоне обнаруживают светлые спирохеты в виде тонких, нежных нитей с мелкими завитками (10——12) одинаковой величины и правильной формы.

Окрашивание по Романовскому — Гимзе производят горячей краской в течение 1—2 ч, после чего препарат промывают водой и высушивают между двумя листками фильтровальной бумаги. При таком способе окраски спирохета приобретает бледно-розовый цвет (рис. 30).

Серологическая диагностика сифилиса. Серологические методы исследования находят широкое применение для диагностики скрытых форм сифилиса, при обследовании доноров, беременных для профилактики врожденного сифилиса у детей; результаты серологических реакций служат также критерием эффективности лечения, которыми руководствуются перед снятием с учета больных сифилисом и при выдаче им разрешения на брак.

Реакция Вассермана. Реакция Вассермана, основанная на принципе РСК, заключается в том, что глобулины сыворотки больных сифилисом в отличие от здоровых людей способны вступать в соединение с липоидными вытяжками, полученными из печени сифилитического плода или мышцы бычьего сердца здоройых Животных (кардиолипиновый антиген) .

Образующийся комплекс ：(глобулин сыворотки крови—липоидный антиген) адсорбирует комплемент. Адсорбция комплемента комплексом определяется только при добавлении индикаторной системы, состоящей из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки ——гемолизина (см. с. 139).

В настоящее время реакцию Вассермана ставят с тремя антигенами: № 1 ——неспецифический антиген, состоящий из двух очищенных компонентов (фосфолипид и лецитин), полученных из мышц бычьего сердца; № 2 и № 3 ——специфические, высокочувствительные антигены, приготовленные из культур бледных трепонем.

Антиген для реакции Вассермана должен удовлетворять следующим требованиям： 1) не вызывать гемолиза эритроци-

тов; 2) не инактивировать и не адсорбировать комплемента; 3) не образовывать с сывороткой здоровых лиц специфический комплекс, способный адсорбировать комплемент.

Для разведения антигенов, так же как и всех других ингредиентов реакции Вассермана, пользуются свежепрокипя- ченным для удаления углекислоты изотоническим раствором хлорида натрия (рец. 20).

Техника постановки реа кции Вассермана. Сыворотку, подлежащую исследованию, прогревают в водяной бане 30 мин при 56℃ для инактивации содержащегося в ней комплемента, разливают в 4 пробирки по 0,1 мл, добавляют изотонический раствор хлорида натрия: в первые 3 пробирки (опытные) по 0,4 мл, в 4-ю (контрольную)—> 0,9 мл.

После этого в пробирки с опытным разведением сыворотки вносят по 0,5 мл антигенов (№ 1, № 2 и № 3), разведенных изотоническим раствором хлорида натрия до титров, указанных на этикетке ампулы, и затем по 0,5 мл комплемента в рабочей дозе. ，

Четвертая пробирка каждого ряда (0,5 мл исследуемой сыворотки, разведенной в отношении 1 : 5+0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия+ 0,5 мл комплемента) является контролем на содержание в сыворотке веществ, которые сами по себе, без добавления антигена, могут задерживать гемолиз.

После прибавления антигена и комплемента к исследуемым и контрольным сывороткам штатив с пробирками встряхивают и помещают в термостат на 45 мин. Пока штатив с пробирками находится в термостате, его примерно каждые 10——15 мин встряхивают. По истечении указанного периода во все опытные и контрольные пробирки добавляют 1 мл гемолитической системы, после чего штатив с пробирками снова помещают в термостат на 40—60 мин в зависимости от наступления гемолиза в контролях.

Результат реакции Вассермана при исследовании на сифилис оформляют в виде следующего ответа:

RW положительная — в том случае, когда результат реакции соответ* ствует + + + + или + + +

,RW слабо положительная — результат реакции отмечается + +

RW сомнительная — результат реакции отмечен + или 土

RW отрицательная — результат реакции отмечается —.

Осадочные реакции (реакции преципитации) в диагностике сифилиса. В комплекс серологического метода диагностики сифилиса в настоящее время вошли осадочные реакции Кана и Закса — Витебского, в основу которых положено образование видимого простым глазом хлопьевидного осадка при добавлении к сыворотке больного сифилисом липоидных антигенов.

Для постановки реакции необходимо иметь: <1) сыворотку больного, Инактивированную в день постановки реакции; 2) антиген, представляющий собой экстракт липоидов из мышечной ткани бычьих сердец, к которому для повышения чувствительности прибавляют 0,6% холестерина.

При постановке реакции антиген разводят согласно титру, указанному на этикетке ампулы, соблюдая следующие правила: в одну пробирку наливают необходимое количество изотонического раствора хлорида натрия, в другую ——экстракт антигена. Содержимое 1-й пробирки быстро вливают во 2-ю (не наоборот!); для лучшего перемешивания смесь переливают из пробирки в пробирку 6—7 раз и после этого оставляют на 10 мин при комнатной температуре для созревания.

Схем а постановки реакции. Разведенный антиген после .10-минутного выдерживания наливают микропипеткой в 3 опытные и 3 контрольные пробирки, не касаясь их стенок. В 1-ю пробирку наливают 0,6 мл, во 2-ю — 0,026 мл и в 3-ю пробирку ——0,0125 мл антигена; такие же количества антигена разливают соответственно в три контрольные пробирки. Во все опытные пробирки наливают по 0,15 мл исследуемой сыворотки, в контрольные ——такое же количество изотонического раствора. Штатив с пробирками в течение 3 мин энергично встряхивают, чтобы произошло перемешивание сыворотки с антигеном, и после этого ставят в термостат при зКс на 10 мин.

.После выдерживания в термостате в 1-ю опытную и 1-ю контрольную пробирки прибавляют до 1 мл изотонического раствора хлорида натрия, во 2-ю и 3-ю опытную и контрольную пробирки — по 0,5 мл этого раствора.

Появление ясно выраженного преципитата отмечается как положительный результат реакции, слабо выраженный преципитат —как слабо положительный, отсутствие преципитата ——как отрицательный.

Осадочная реакция Кана модифицирована Заксом и Витебским. Авторы использовали концентрированный антиген и это привело к более быстрому выпадению грубодисперсных частиц, что позволило учитывать результат реакции тотчас.

РИККЕТСИИ

Под названием 《риккетсий》объединяется своеобразйая группа микроорганизмов, которые по своим свойствам занимают промежуточное положение между бактериями и вирусами.

Риккетсии имеют морфологическое сходство с бактериями. Они неподвижны, имеют вид грамотрицательных кокков, кок- кобактерий или палочек величиной 0,3―0,5 мкм.

Подобно вирусам, риккетсий неспособны размножаться на искусственных питательных средах. При попадании в организм восприимчивого животного риккетсии поселяются и размножаются внутри клеток, являясь, таким образом, внутри* клеточными паразитами.

Некоторые представители этой группы патогенны для че* ловёка, вызывая различные заболевания. Например, риккетсии Провачека вызывают эпидемический сыпной тиф, риккетсии Музера ——крысиный тиф, риккетсии Конора ―■ марсельскую лихорадку, риккетсии Бернета ——лихорадку Ку.

РИККЕТСИИ ПРОВАЧЕКА

Риккетсии Провачека '(Rickettsia prowazekii) являются возбудителем острого заразного заболевания ——эпидемического сыпного тифа, при котором риккетсии в течение всего периода болезни циркулируют в крови. Сыпной тиф от больного человека здоровому передается через платяную вошь/ Для лабораторной диагностики сыпного тифа рекомендуется использование трех серологических реакций: РСК, реакции непрямой гема ггл ют ин аци и и реакции агглютинации риккетсий.

Реакция связывания комплемента с риккетсиозным антигеном. Постановка РСК применяется для дифференциальной диагностики эпидемического и эндемического сыпного тифа. Для этой цели исследуемые сыворотки испытывают параллельно с двумя антигенами — из риккетсий Провачека и Музера.

Диагностическим титром РСК при сыппом тифе и крысином риккетсиозе считают разведение от 1 : 80 на 6——8-й день- болезни и 1 : 1280—1 : 5.120 на 2—4-й педеле заболевания.

Реакция непрямой гемагглютинации. Для постановки РИГА при диагностике сыпного тифа необходимы: 1) сыворотка больного, подлежащая исследованию, инактивированная общепринятым способом и истощенная бараньими эритроцитами для удаления неспецифических агглютининов; 2) эритроциты барана, 2—3 раза отмытые изотоническим раствором хлорида натрия и сенсибилизированные антигеном из риккетсий Провачека (к 4 мл осадка отмытых эритроцитов добавляют 0,1 мл антигена в рабочей дозе). Диагностическим титром реакции гемагглютинации при сыпном тифе считают разведение сыворотки 1 : 250.

Реакция агглютинации риккетсий. Реакция агглютинации с риккетсиями Провачека ставится по общепринятой методике. Ввиду того что реакция агглютинации риккетсий высокоспецифична, диагностическим титром считается разведение сыворотки 1 : 100 не менее чем на + + + +.

\ЧАСТЬ ТРЕТЬЯ

САНИТАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Санитарная микробиология занимается изучением микрофлоры и микробиологических процессов, происходящих в объектах внешней среды, осуществляет контроль за сапитар- но-бактериологическим состоянием воды, воздуха и пищевых продуктов.

Перечисленные исследования выполняются бактериологическими лабораториями С1Э1С в плановом порядке и по эпидемическим показаниям.

Непосредственное обнаружение патогенных микробов в объектах внешней среды, как правило, сопряжено с большими трудностями, так как встречаются они непостоянно, главным образом в период эпидемических вспышек и в окружении бактерионосителей, представляя ничтожно малую величину по сравнению с постоянной, непатогенной микрофлорой исследуемого объекта. Поэтому возможное загрязнение внешней среды патогенными микробами определяют на основании косвенного показателя — обнаружения так называемых санитарно-показательных микробов: кишечных палочек, а-зеленя- щих и р-гемолитических стрептококков и стафилококков. Присутствие санитарно-показательных микробов в объектах внешней среды указывает на зараженность их выделениями человеческого организма.

Кишечная палочка, будучи постоянным представителем нормальной микрофлоры кишечника человека, является показателем фекального загрязнения. На загрязненность кишечными палочками исследуют воду, почву, пищевые продукты. Санитарно-показательными бактериями, указывающими на фекальное загрязнение объектов внешней среды, принято считать все цитратотрицательные грамнегативные бактерии, ферментирующие с образованием кислоты и газа лактозу, глюкозу, маннит, мальтозу и в некоторых случаях сахарозу. Обязательному учету подлежат также штаммы Е. coli, не сбраживающие лактозу, выделяемые у лиц преимущественно с заболеваниями кишечного тракта.

Цитратположительные разновидности кишечной палочки, растущие на цитратных питательных средах Козера и Симмонса, к микробам ——показателям фекального загрязнения не относятся. Возможность ассимиляции углерода из солей лимонной кислоты указывает на длительное пребывание этих

бактерий вне организма животных и на приспособление их к существованию в объектах внешней среды. /

Идентификация выделенных микробов с бактериями кишечной палочки осуществляется следующим образо^я.

На среде Эндо отмечают колонии с признаками, характерными для кишечной палочки. К их числу относятся красные колонии с металлическим блеском и без него, розовые колонии, бесцветные с розовым центром, бесцветные колонии.

Из отмеченных колоний, характерных для группы бактерий кишечной палочки, готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют.

Из колоний, состоящих из грамотрицательных неспороносных бактерий, производят высев в пробирку со средой Гисса, содержащей глюкозу, и в пробирки с цитратной средой Симмонса или Козера.

При учете результатов отмечают цитратотрицательные штаммы кишечной палочки, сбраживающие глюкозу с образованием кислоты и газа. Образование газа позволяет отнести выделенные культуры бактерий к санитарно-показательным разновидностям кишечной палочки, являюпХимся индикаторами фекального загрязнения.

Интенсивность фекального загрязнения объектов внешней среды характеризуется двумя показателями: коли-титром и коли-индексом.

Под титром подразумевается наименьшее количество исследуемого материала (выраженное в миллилитрах или граммах), в котором обнаруживается кишечная палочка.

Коли-индекс ——количество особей кишечной палочки, найденное в 1 л жидкости или 1 г плотного вещества.

Установив коли-титр исследуемого вещества, можно произвести пересчет на коли-индекс и наоборот. Для перевода коЛи-титра в коли-индекс необходимо 1000 разделить на число, выражающее коли-титр.

Пример. Коли-титр равен 25 мл; следовательно, коли-индекс будет: 1000

=40, т. е. в 1 л исследуемой жидкости содержится 40 кишечных палочек.

Для перевода коли-индекса в коли-титр необходимо 1000 разделить иа число, выражающее коли-индекс.

П р и <м е р. Коли-нндекс равен 250; коли-титр в таком случае будет 1000

Рав^н：~=4 мл. .

Стрептококки и стафилококки, постоянно обитающие на слизистых оболочках полости рта и верхних дыхательных путей, являются индикаторами обсеменения воздушной среды микрофлорой дыхательных путей.

Чем выше концентрация санитарно-показательных микробов в исследуемом материале, тем больше он загрязнен вы- 302

делениями человеческого организма и тем вероятнее в нём содержаний патогенных микробов — возбудителей инфекционных заболеваний. Санитарно-бактериологические исследования многвд объектов внешней среды регл а ментир уются ГОСТами Н инструкциями, утвержденными Министерством здравоохрауеиия СССР.

САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ

ИССЛЕДОВАНИЕ ВОДЫ

Санитарно^бактериологическое исследование воды заключается в следующем:

Определяют общее количество микробов в 1 мл.

Определяют титр кишечной палочки.

Взятие проб воды для санитарно-бактериологического исследования. Воду для санитарно-бактериологического исследования отбирают в количестве 600 мл в бутылки, предварительно простерилизованные в бумажных пакетах, с ватномарлевой пробкой, покрытой сверху бумажным колпачком. К горлышку бутылки привязывают пакетик с завернутой в него запасной пробкой.•

Пробы воды из открытых водоемов ——колодцев, бассейнов, рек и т. д. отбирают с помощью батометров, представляющих собой металлический каркас с массивным свинцовым дном-грузилом (рис. 31). В металлический каркас вставляют бутылку. Батометр погружают на заданную глубину и открывают бутылку, потягивая за веревку, привязанную к пробке. После наполнения ее батометр извлекают и закрывают бутылку стерильной пробкой.

Пробы воды из открытых водоемов рекомендуется брать на глубине 10—15 см от поверхности воды и на таком же расстоянии от дна при малой глубине водоема.

Из кранов водопроводных сооружений пробы берут в период наибольшего расхода воды после предварительной стерилизации кранов обжиганием пламенем горящего тампона, смоченного спиртом, и последующего спуска воды в течение 10—15 мин при полностью открытом кране.

Пробы хлорированной воды берут во флаконы с дехлоратором, так как под действием хлора микробы в воде погибают. В качестве дехлоратора на 500 мл исследуемой воды добавляют 10 мг серноватистокислого натрия.

*К отобранным пробам воды прилагают сопроводительный документ с указанием следующих данных:

место расположения крана;

дата отбора пробы с указанием года, месяца, числа и часа;,'

особые обстоятельства при отборе пробы (время спуска воды из крана, условия тра нспортировки и т. д.)« . '

Рис. 31. Батометр — прибор для взятия проб воды.Рис. 31. Батометр — прибор для взятия проб воды.цель исследования: сделан ли отбор пробы в порядке / текущего санитарного надзора или 轮 особым показаниям./

Рис. 31. Батометр — прибор для взятия проб воды.

Рис. 31. Батометр — прибор для взятия проб воды.

Бактериологический анализ воды должен быть произведен / не позднее 2 ч с момента ее взятия. / Указанный срок может быть увеличу!! до 6 ч при условии сохранения или,- транспортировки пробы воды при температуре от 1 до 5℃, что достигается с помощью резиновых мешков, наполненных зимой теплой водой, а 'летом ——льдом. ГОСТ 2874-73 нормирует следующие бактериологические показатели питьевой водопроводной воды:

а) общее число бактерий при посеве 1 мл неразведенной воды, определяемое числом колоний на мясо-пептонном агаре после 24-часового выращивания при температуре 37℃ (не более 100); б) количество кишечных палочек в 1 л воды, определяемое числом колоний на среде Эндо с применением концентрации бактерий на мембранных фильтрах (не более 3).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО ЧИСЛА МИКРОБОВ В ВОДЕ

Общее микробное загрязнение определяется количеством микроорганизмов в 1 мл воды, которые при посеве на мясопептонный агар и инкубации при 37±0,5℃ в течение 24 ч образуют колонии, видимые простым глазом или при увеличении в 2—5 раз.

В зависимости от степени предполагаемого загрязнения производят посев не менее двух различных объемов воды, выбранных с таким расчетом, чтобы на чашках вырастало от 30 до 300 колоний. Водопроводную воду и воду артезианских колодцев засевают в неразведенном виде по 1 мл.

При бактериологическом исследовании загрязненных вод (воды шахтных колодцев, речные воды и т. д.) делают посевы разведенной воды. Разведения готовят следующим образом. Берут несколько пробирок, содержащих по 9 мл стерильной водопроводной воды. Исследуемую воду в количестве 1 мл набирают стерильной пипеткой и вносят в 1-ю пробирку. При этом пипетка должна быть опущена ниже воды не более чем на 3 мм, чтобы избежать смывания бактерий с ее наружной поверхности. Другой стерильной пипеткой проду-

ванием воздуха тщательно перемешивают содержимое пробирки. Таким образом, получают первое разведение 1 : 10. Затем из 1-ц пробирки набирают 1 мл и переносят его во 2-к> пробирку -у получают второе разведение >1 :100. Из 2-й пробирки так* же количество переносят в 3-ю и т. д. Для приготовления раждого разведения следует применять новую стерильную ^ипетку. ,

Из исследуемого образца неразведенной воды и из пробирок с ее разведениями в соответствии со степенью предполагаемого загрязнения берут по 1 мл, вносят в стерильные чашки Петри я заливают <10—12 мл растопленного и остуженного до 45℃ мясо-пептонного агара. Круговыми движениями руки, вращая чашки по горизонтальной поверхности стола, распределяют их содержимое равномерным слоем по всей площади дна. После застудневания агара чашки с посевами вверх дном помещают в термостат при 37±0,5℃ на сутки.

После указанного срока выращивания приступают к подсчету колоний, выросших как на поверхности, так и в глубине агара. Подсчет колоний ведется с помощью лупы (Х5) или прибора для счета колоний (см. с. 308). Для этого кладут чашку вверх дном па темный лист бумаги (обеспечивая тем самым лучшую видимость колоний). Для удобства каждую подсчитанную Колонию отмечают со стороны дна чашки карандашом или чернилами для стекла. Оценивают только те разведения, при посеве которых на чашках вырастает от 30 до 300 колоний.

Если в чашке с наиболее высоким разведением выросло свыше 300 колоний и анализ нельзя повторить, колонии подсчитывают при помощи пластинки с сеткой и лупы при сильном боковом освещении. Подсчитывают в разных местах чашки не менее 20 квадратов площадью 1 см2 каждый. Затем выводят среднее арифметическое число колоний, приходящееся на 1 см2, и умножают его на площадь чашки в квадратных сантиметрах.

Результаты анализа выражают количеством бактерий на 1 мл исследуемой воды, для чего число выросших на чашке колоний умножаемся на степень разведения воды.

За окончательное количество бактерий принимается среднее арифметическое результата подсчета на двух параллельных чашках. При оформлении протокола количество микроорганизмов, определенное в 1 мл исследуемой воды, округляют (табл. 61). 、

305305Прибор для счета микробных колоний. Прибор состоит из металлического корпуса, на верхней панели которого вмонтирована круглая пластинка из матового термостойкого стекла с сеткой, на которую вверх дном устанавливают чашки Петри.

305

305

20 Лабинская А. С.

При включении прибора в электросеть, включается источник освещения, в результате чего растровая сетка / вместе с находящейся на ней чашкой приобретает равномерную осве* щенность./

Подсчет колоний, выросших в глубине и на поверхности питательных сред, производят через лупу х2, укрепленную на подставке. С помрщью специальных винтов-зажимов лупе придают такое пс^ожение, при котором колонну/ микробов в

При количестве ■ОЛОННЙ В 1 BUIЗапись результата анализаОт 1 до 100Конкретная цифра подсчета101—1000Округленная до 101001—10 000Округленная до 10010 001—100 000Округленная до 1000100 001—1 000 000Округленная до10 000При количестве ■ОЛОННЙ В 1 BUIЗапись результата анализаОт 1 до 100Конкретная цифра подсчета101—1000Округленная до 101001—10 000Округленная до 10010 001—100 000Округленная до 1000100 001—1 000 000Округленная до10 000Т а б л и ц а 51Т а б л и ц а 51Запись результатов определения микробного числа водыЗапись результатов определения микробного числа водычашке видны наиболее отчетливо (рис. 32). / Подсчет колоний осуществляется посред* ством специального электропера, соединенного через авторучку с автоматическим счетчиком. Техника подсчета проста. Авторучку наполняют чернилами и в местах нахождения колоний наносят чернильные тоткн. При этом в "момент надавливания иа перо электроконтакт, находящийся в корпусе ручки, замнкается.

При количестве ■ОЛОННЙ В 1 BUI

Запись результата анализа

От 1 до 100

Конкретная цифра подсчета

101—1000

Округленная до 10

1001—10 000

Округленная до 100

10 001—100 000

Округленная до 1000

100 001—1 000 000

Округленная до

10 000

При количестве ■ОЛОННЙ В 1 BUI

Запись результата анализа

От 1 до 100

Конкретная цифра подсчета

101—1000

Округленная до 10

1001—10 000

Округленная до 100

10 001—100 000

Округленная до 1000

100 001—1 000 000

Округленная до

10 000

Т а б л и ц а 51

Т а б л и ц а 51

Запись результатов определения микробного числа воды

Запись результатов определения микробного числа воды

в результате чего к автоматическому счетчику поступает электроимпульс, сопровождающийся появлением цифры иа таблице импульсного счетчика. При каждом нажиме на перо показатель счетчика увеличивается на единицу. Отсчет количества колоний бактерий производится путем вычисления разности показаний импульсного счетчика до начала отсчета

Рис. 32. Прибор для счета колоний в чашках Петри.Рис. 32. Прибор для счета колоний в чашках Петри.и после его окончания.

Рис. 32. Прибор для счета колоний в чашках Петри.

Рис. 32. Прибор для счета колоний в чашках Петри.

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИТРА КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ В ВОДЕ

Коли-ти^р в питьевой воде, согласно действующему ГОСТу 18963-73, определяют методом мембранных фильтров и бродильным методом. Выбор метода зависит от качества исследуемой воды. При исследовании чистой, хорошо фильтрующейся воды удобнее пользоваться методом мембранных фильтров. При исследовании воды, содержащей коллоидные вещества и посторонние примеси, затрудняющие процесс фильтрования, пользуются бродильным методом.

Определение титра кишечной палочки методом мембранных фильтров. Сущность метода заключается в концентрировании бактерий из определенного объема воды на мембранных фильтрах с подращиванием их на среде Эндо при 37元, дифференцированием выросших колоний и последующим Подсчетом количества бактерий группы кишечных палочек в 4 л воды.

Первый день. 1. Подготовка мембранных фильтров. Для фильтрования воды отбирают мембранные фильтры № 3 (без изъянов), помещают их в подогретую до температуры 80℃ дистиллированную воду и ставят на слабый огонь до закипания. Кипячение фильтров производят трижды по 10 мин. После первого и второго кипячения воду сливают. После последнего кипячения воду не сливают и фильтры оставляют в ней до употребления.

Подготовка фильтровального аппарата. Перед посевом воды фильтровальный аппарат протирают ватным тампоном, смоченным спиртом, и обжигают в целях стерилизации. На охлажденный после прожигания столик фильтровального аппарата помещают с помощью стерильного пинцета с гладкими кончиками мембранный фильтр. Во избежание повреждения фильтра под него подкладывают кружок стерильной фильтровальной бумаги. Если вода содержит большое количество взвешенных веществ или клеток фитопланктона, ее сначала фильтруют через предварительный фильтр № 6, помещая его поверх фильтра № 3.

На фильтровальный столик с положенными на него фильтрами устанавливают и закрепляют верхнюю часть прибора— воронку.

Фильтрование воды. В воронку фильтровального аппарата стерильно наливают исследуемый объем воды и с помощью водоструйного насоса создают вакуум в приемном сосуде.

При анализе воды, поступающей в водопроводную сеть, необходимо брать объем не менее 333 мл. На этапах очистки исследуют не менее двух десятикратных объемов воды, выбранных так, чтобы на фильтре вырастало не более 30 колоний бактерий группы кишечных палочек. Для этого следует

ориентироваться на результаты предыдущих анализов воды в этих же пунктах. Так, например, для воды поел, первичного хлорирования рекомендуется брать объемы 1(У и 100 мл; для необеззараженной воды — 0,1; 1; 10 мл. При анализе воды неизвестного качества следует засевать 3—4 десятикратных объема. Например, из водопроводной сети можно фильтровать 3; 30; 100; 200 мл воды, на этапах очистки — 0,1; 1; 10; 100 мл.

Воду открытых источников хозяйственно-питьевого водоснабжения фильтруют в объемах, соответствующих предполагаемой степени ее загрязнения. При анализе воды незагрязненных шахтных колодцев фильтруют количества, равные 100; 10; 1 и ОД мл. '

Фильтруют сначала меньшие, а затем большие объемы воды через один фильтровальный аппарат, меняя каждый раз фильтры. При фильтровании небольших объемов воды (1 мл и меньше) в воронку сначала наливают 10 мл стерильной воды, а затем вносят анализируемую воду. По окончании фильтрования снимают воронку прибора, фильтр захватывают обожженным пинцетом и накладывают на поверхность среды Эпдо в чашки Петри.

При пользовании предварительным фильтром на среду Эндо кладут оба фильтра (№ 6 и № 3). На одну чашку можно поместить 4—5 фильтров. Под каждым фильтром делают надпись с указанием даты, номера анализа и объема профильтрованной воды. Посевы инкубируют в термостате 18— 24 ч при 3701c.

Второй д е н ь. 1. По окончании сроков инкубации производят просмотр посевов:

отсутствие микробного роста на фильтрах или обнаружение на них колоний, не характерных для бактерий кишечной группы (губчатые, пленчатые с неровной поверхностью и краем), позволяет на этом этапе анализа закончить исследования <18——24 ч) с выдачей отрицательного результата на присутствие кишечных палочек в анализируемом объеме воды;

при обнаружении на фильтре колоний, характерных для кишечных палочек (темно-красных с металлическим блеском или без него, розовых и прозрачных), исследование продолжают. Из нескольких колоний каждого типа готовят мазки, окрашивают их по Граму, микроскопируют. Отсутствие в мазках грамотрицательных, неспороносных палочек является основанием для прекращения анализа с регистрацией отрицательного результата.

При обнаружении в мазке грамотрицательных палочек, морфологически сходных с кишечной .(возможны удлиненные, нитевидные формы или крупные полярно окрашенные палочки), ставится оксидазная проба.

Оксидазный тест предложен для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от гр амотрицател fa- ных бактерий семейства Pseudomonadaceae и других водных сапрофитов, которые в отличие от кишечных бактерий вырабатывают фермент оксидазу, окисляющую фенилендиаминовые соединения до индофенола, имеющего ярко-синий цвет.

Для постановки оксидазного теста мембранные фильтры с выросшими на них колониями переносят (не переворачивая) на лист фильтровальной бумаги, предварительно смоченный реактивом для выявления оксидазы (рец. 32). Результат реакции учитывают через 2—4 мин.

Колонии микроорганизмов, продуцирующие оксидазу (не относящиеся к семейству кишечных бактерий), при взаимодействии с добавленным реактивом, приобретают синий ободок 口財 периферии или окрашиваются в синий цвет полностью (положительная реакция).

Колонии семейства Enterobacteriaceae, не продуцирующие фермент оксидазу, не изменяют своего первоначального цвета •(отрицательная реакция).

При обнаружении на мембранных фильтрах однотипных лактозоположительных колоний (темно-красных с металлическим блеском или без него), не вырабатывающих оксидазы, анализ воды заканчивается на данном этапе подсчетом выросших колоний. '

При обнаружении на мембранных фильтрах розовых и бесцветных колоний с отрицательной оксидазной активностью； их подсчитывают и подтверждают принадлежность к бактериям группы кишечных палочек посевом 2——3 изолированных колоний каждого типа в полужидкую среду с глюкозой (рец. 44). Результаты роста учитывают через 4—5 ч инкубации в термостате при 37°iC. При образовании кислоты и газа результат считается положительным, при отсутствии кислото- и газообразования ——отрицательным. При наличии только кислоты пробирки оставляют в термостате для окончательного учета результатов роста через 24 ч. При отсутствии газообразования через сутки получают окончательный отрицательный результат, при наличии газообразования — положительный результат.

Вычисление коли-индекса. Результат выражают в виде коли-индекса, определяемого посредством суммирования колоний кишечных палочек, выросших на поверхности мембранных фильтров в одной пробе воды, и пересчитывают это количество на 1 л воды.

Пример. При исследовании пробы воды профильтровано 3 объема по 100 мл. На первом и втором фильтрах выросло по 3 колонии, на третьем—9 колоний. Всего выросло 15 колоний. Таким образом, коли-индекс исследуемого образца воды равен: 1000X15:300=50.

Питьевая вода удовлетворяет требованиям ГОСТа 2874-73 в том случае, когда коли-индекс не превышает 3.

При установлении бактериальной загрязненности воды свыше допустимых норм прибегают к повторному исследованию воды на наличие бактерий свежего фекального загрязнения (преимущественно Escherichia coli), способных ферментировать лактозу до кислоты и газа при 43±0,5℃, в присутствии ингибиторов посторонней микрофлоры. Исследуемый образец воды фильтруют через мембранный фильтр с последующим подращиванием его на среде Эндо в течение 24 ч при 37℃.

При повторном обнаружении на фильтрах лактозоположительных темно-красных колоний с металлическим блеском и без него параллельно определению коли-индекса эти колонии в количестве не более 15 засевают в лактозную среду с борной кислотой (рец. 143), предварительно нагретую в водяной бане до 43℃, и 24 ч инкубируют в термостате при 43Х. Вместо указанной среды можно пользоваться желчнолактозной средой с .бриллиантовым зеленым (рец. 142), с инкубацией посевов при 44,5℃.

Помутнение с образованием кислоты и газа в посевах является показателем свежего фекального загрязнения; появление микробного роста (помутнение среды) без газообразования не учитывается.

Определение титра кишечной палочки бродильным методом. Сущность бродильного метода заключается в посеве определенных объемов исследуемой воды, инкубации ее при 37Х в средах накопления с последующим высевом на среду Эндо, дифференциацией выросших колоний и определением наиболее вероятного числа бактерий группы кишечных палочек в 1 л воды по таблицам.

Первый день. Для установления титра кишечной палочки бродильным методом воду в зависимости от характера водоисточника засевают во флаконы и пробирки с глюкозопептонной <(рец. 140) или лактозо-пептонной средой (рец. 141) с поплавками или комочками ваты для выявления газообразования:

при исследовании воды на этапах очистки и обеззараживания засевают: 100; 10; 1; 0,1 мл;

на выходе в водопроводную сеть — три объема по 100 мл; три объема по 16 мл; три объема по 1 мл.

Посев воды в объеме 100 и 10 мл производится во флаконы и пробирки, соответственно с 10 и 1 мл концентрированной питательной среды. Посев воды в объеме 1 и 0,1 мл засевается в пробирки с 10 мл среды нормальной концентрации. Флаконы и пробирки с засеянными средами инкубируют в термостате 24 ч при 37℃.

Второй день. 1. Учитывают результаты посевов:

отсутствие помутнения и образования кислоты и газа во флаконах и пробирках является показателем отрицательного результата на наличие бактерий группы кишечной палочки в исследуемом объеме воды, дающим право закончить исследование через 24 ч;

при помутнении питательной среды с образованием кислоты и газа или помутнении и кислотообразовании (на глюкозо-пептонной среде) или только помутнении (на лактозо-пептонной среде) производится высев на среду Эндо. Высев делается бактериальной петлей, густым штрихом, для получения изолированных колоний. Чашки с посевами инкубируют 16—18 ч при 37℃.

етий день. 1. Просматривают посевы на среде Эндо:

отсутствие микробного роста или наличие пленчатых, губчатых колоний с неровной поверхностью и краями, а также плесневых и других не характерных для кишечной палочки колоний является основанием для отрицательного ответа;

при обнаружении лактозоположительных темно-красных колоний с металлическим блеском или без него необходимо установить пр ин адлежность выросших микроорганизмов к семейству кишечных бактерий. С этой целью производится микроскопирование материала колоний и постановка оксидазного теста.

Оксидазный тест при исследовании воды бродильным методом ставится следующим образом. Со среды Эндо бактериальной петлей или стеклянной палочкой снимают по 2—3 колонии каждого типа. Снятую таким образом микробную массу наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную реактивом (рец. 32). При отрицательном результате оксидазного теста бумага в месте нанесения бактериальной культуры цвета не изменяет. При положительном результате — в течение минуты — приобретает ярко-синюю окраску. При постановке данного теста одним из обязательных условий является исследование изолированных колоний, так как примесь оксидазоположительных бактерий может привести к ложному посинению материала и необоснованному исключению при подсчете колоний кишечных палочек.

Наличие в мазках грамотрицательных неспороносных палочек с отрицательной реакцией оксидазного теста позволяет немедленно дать положительный ответ о наличии бактерий группы кишечной палочки в исследуемой воде.

При исследовании питьевой воды учитывают розовые и бесцветные колонии. В этих случаях из 2—3 колоний разного типа делают мазки, окрашивают по Граму, макроскопи- руют. При обнаружении грамотрицательных неспороносных

Определение индекса бактерий группы кишечных палочек при исследовании 300 мл воды

Количество положительных результатов анализа воды из

Коли-нидекс

Пределы индекса (доверительные границы)

Коли-титр

3 флаконов по 100 мл

3 пробирок по 10 мл

3 Пробирок по 1 мл

нижний

верхний

0

Менее 3

■—

Более 333

0

0,5

9

333

1

0,5

13

333

0

0,5

20

250

0

1

21

143

1

1

23

143

1

1

36

91

2

3

36

91

0

1

36

Ш

0

3

37

72

1

3

44

67

1

7

89

50

2

4

47

48

2

10

149

86

0

4

120

43

0

7

130

26

0

15

379

16

1

7

210

23

1

14

230

13

1

120

30

380

8

2

15

380

И

2

150

30

440

2

210

35

470

3

240

36

1300

3

1

460

71

2400

3

2

1100

150

4800

0,9

3

3

Более 1100

—

Менее 0,9

палочек с колониями каждого типа ставится оксидазный тест.

При наличии грамположительных или спорообразующих бактерий и положительном результате оксидазного теста на 40——42-м часу ведения анализа дается отрицательный результат на наличие бактерий кишечной группы в исследуемом объеме воды.

При выявлении в воде грамотрицательных, бесспоро- вых, оксидазоотрицательных бактерий из 2—3 колоний различного типа берут микробную культуру для высева в полужидкую среду с глюкозой. Результат роста учитывают после 4—5 ч инкубации в термостате при 37℃:

при обнаружении кислоты и газа в посеве дается положительный ответ;

при отсутствии кислоты и газа дается отрицательный ответ;

Таблица 53

Определение коли-индекса при исследовании 500 мл воды

Количество положчтель- иых результатов из 5 флаконов по 100 мл

Коли-индекс

Пределы индекса (доверительные границы)

Колн-тнтр

нижиий

верхний

Ченее 2

0

6,0

Более 455

2

0,1

12,6

455

5

0,5

19,2

196

9

1,8

29,4

109

16

3,3

52,9

62

Более 16

8,0

—

Менее 62

Примечание. Данные таблицы могут быть применены в тех случаях, когда воду на выходе в водопроводную сеть или из нее исследуют в объеме 500 мл.

при наличии в посевах только кислоты пробирки оставляют еще па 24 ч для окончательного учета. При отсутствии газообразования на 2-е сутки дается окончательный отрицательный результат, при появлении газа ——окончательный положительный результат.

4. Вычисление коли-ипдекса. Результат анализа выражают в виде коли-индекса: наиболее вероятного числа бактерий группы кишечных палочек в 1 л воды. Величину коли-индекса определяют по таблицам. При анализе питьевой воды на выходе в водопроводную сеть и из нее коли-индекс определяют по табл. 52 и 53, на этапах очистки и обеззараживания —по табл. 54.

Табл. 59—61 для вычисления результатов анализа водопроводной воды бродильным методом заимствованы из Международного стандарта качества питьевой воды (1964). В рекомендуемые таблицы введены индексы при всех положи-

Таблнца54

Определение колн-индекса при исследовании воды по этапам очистки

Объем исследуемой воды, мл

Колн-индекс

Коли-тнтр

100

10

1

0,1

Менее 9

Более 111

—

9

+

10

23

+

94

230

+

960

+

2380

+

+

'Более 2380

Менее 0,4

тельных и всех отрицательных результатах и даны титры (т. е. наименьшее количество воды, в котором содержится хотя бы одна микробная клетка), рассчитанные по формуле:

,1000

coli-титр =

индекс

По таблицам определяют наиболее вероятную величину индекса бактерий группы кишечных палочек, соответствующую полученным комбинациям положительных и отрицательных результатов.

Доверительные интервалы определяют верхний и нижний пределы, в диапазоне которых может колебаться истинное количество бактерий с 95% вероятностью. При регистрации результатов анализа доверительные границы не указывают.

Для определения индекса кишечных палочек на этапах очистки и обеззараживания пользуются табл. 64 в соответствии со схемой посева четырех десятикратных объемов воды. При таком ограниченном количестве объемов доверительные границы не могут быть рассчитаны и результаты следует считать ориентировочными.

При анализе воды большей степени загрязнения уменьшают объем воды в 10 или 100 раз для того, чтобы в последнем объеме получить отрицательные результаты При этом соответственно увеличивают в 10 или 100 раз индекс и уменьшают в 10 или 100 раз титр.

САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ

ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЧВЫ НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ

Санитарно-бактериологический анализ почвы включает: 1) определение общего микробного числа в 1 г почвы; 2) установление титра кишечной палочки; 3) обнаружение в почве Cl. perfringens.

При наличии эпидемических показаний производят исследование почвы на зараженность бактериями тифо-паратифозной группы, клостридиями столбняка и ботулизма.

Санитарное состояние почвы оценивают по количеству содержащихся в ней микробов, титру кишечной палочки и титру Cl. perfringens (табл. 55).

Техника взятия проб почвы. На обследуемой территории до 1000 м2 выделяют два участка по 25 м2. Один должен быть расположен близ источников загрязнения (выгребные ямы, мусорные ящики и т. д.), другой — в отдалении от них.

На каждом участке намечают 5 точек: четыре — по углам участка и одну — в центре его, чтобы составить точное представление о санитарном состоянии исследуемой территсфнн.

Схема санитарной оценки почвы по бактериологическим показателям

Оценка печга

Общее чиело бактерий в 1 г почвы

Титр в г

Титр в мл

Чистая

Слабо загрязненная

Умеренно загрязненная

Сильно зат^язненная

10 000

Не более 10 000 100D00—900 000

1 000 000 и выше

Выше 1 1—0,01 0,01—0,001

До 0,001

Выше б, 1 0,1—0,001 0,001—0,0001

До 0,001

Для исследования поверхностного слоя почвы выкапывают лопатой цельный кусок почвы. Затем с одной из боковых поверхностей его прокаленным на огне ножом срезают пласт толщиной 1—1,5 см и из середины куска на заданной глубине от верха набирают стерильной ложкой 200—300 г почвы.

Взятие образцов из глубинных слоев почвы производят буром Некрасова (рис. 33), который представляет собой штангу, снабженную на верхнем конце рукояткой для вращения. В нижней части бура имеется полость, остающаяся закрытой во время бурения. При достижении заданной глубины бур поворачивают в обратную сторону, вследствие чего полость его открывается, наполняясь почвой, подлежащей исследованию.

Приготовление почвенной взвеси (б о л тушка). Навеску почвы в количестве 30 г или больше высыпают в стерильную колбу емкостью 500 мл и доливают стерильной водопроводной водой из расчета 1 : 10. Полученную таким образом почвенную болтушку взбалтывают в течение 10— 15 мин, а затем в течение 2—5 мин отстаивают. Из первого разведения (1 : 10) готовят несколько последовательных разведений (см. с. 306). При исследовании чистых почв ограничиваются 3——4 разведениями (до 1 : 1000, 1 : 10 000); при исследовании сильно загрязненных почв готовят 6——7 разведений, исследуя разведения 1 : 100 000—1 : 1 000 000.

Определение общего микробного числа в почве. Общую микробную обсемененность почвы определяют так же, как микробную загрязненность воды. Из каждой пробы используют для посева не менее двух различных разведений (в зависимости от степени предполагаемого загрязнения почвы). Посевы помещают в термостат при 3743 на 24 ч. Подсчет выросших колоний и пересчет на количество микробов, содержащихся на 1 мл исследуемой почвы, производят, как описано выше.

Определение титра кишечной палочки почвы. Для определения загрязнения почвы бактериями кишечной палочки различные количества почвы засевают в среду Кесслера (рец. 144).

Рис. 33. Почвенный бур Некрасова.

/ — головка с рукояткой; 2 — основная штанга; 3 — шпонка; 4—муфта： 5 — крышка; 6 — дополнительная 1птаига； 7 — коробка; 8 — нож; 9 — бур в собранном виде.

Чистую почву засевают от 1 до 0,001 г, загрязненную — от 0,001 до 0,000001 г, для посевов пользуются различными разведениями почвенной взвеси. Для посева 1 г почвы набирают стерильной пипеткой 10 мл первого разведения (1 : 10) и вносят его в колбу с 50 мл среды Кесслера. Меньшие количества почвы берут из соответствующих разведений по 1 мл и засевают пробирки с поплавками, содержащими по 5 мл среды. Для посева 0,1 г набирают 1 мл первого разведения, для посева 0,001 г ——0,1 мл из разведения 1 : 1000 и т. д. Колбы и пробирки с засеянной средой Кесслера помещают в термостат при 430c. Дальнейший ход анализа и учет полученных результатов ведутся так же, как при исследовании воды. •

Определение титра Cl. perfringens в почве. Для определения титра -Cl. perfringens пользуются разведениями почвенной взвеси. Чистую почву засевают в разведении 1 : 10— 1: 1000, загрязненную — 1: 10 000——1 : 100 000; 1 мл из каждого разведения почвенной взвеси вносят в пробирки с 5 мл молочной среды Тукаева (рец. 117). Для освобождения от посторонней неспороносной микрофлоры посевы прогревают

в водяной бапе при 80^С в течение 15 мин и затем выращивают в термостате при 43℃ (можно при 37°) в течение 12——20 ч. Размножение Cl. perfringens сопровождается характерным свертыванием молока. Предельное разведение почвенной взвеси, которое дает на молочной среде размножение Cl. perfringens, означает титр этого микроба в почве.

САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗДУХА -

(В атмосферном воздухе содержится большое количество микробов — почвенных сапрофитов, попадающих в воздух с мельчайшими частицами почвы. Среди них находятся спорообразующие палочки, пигментные бактерии, грибы и дрожжи.

В воздухе закрытых помещений обнаруживаются микроорганизмы, выделяемые постоянно со слизистых оболочек верхних дыхательных путей человека. От больных с локализацией патологического процесса в полости рта и верхних дыхательных путях наряду с условно патогенными микроорганизмами—стафилококками и зеленящими стрептококками ——выделяются в окружающую среду патогенные микробы —гемолитические стрептококки группы А, бактерии дифтерии, коклюша, микобактерии туберкулеза и др., в зависимости от этиологии заболевания. Микробиологический анализ воздуха на патогенную флору производят только по эпидемическим показаниям.

В плановом порядке пробы воздуха для бактериологического исследования берутся в операционных блоках, послеоперационных палатах, отделениях реанимации, интенсивной терапии и других помещениях, требующих асептических условий. По эпидемическим показаниям бактериологическому исследованию подвергают воздух ясель, детских садов, школ, заводов, кинотеатров и т. д.

Для санитарно-гигиенической оценки воздуха определяют:

общее количество микробов, находящихся в 1 м3 воздуха;

количество в том же объеме воздуха санитарно-показательных микробов (-р-гемолитические, а-зеленящие стрептококки и гемолитические стафилококки). По концентрации этих микробов определяют степень загрязнения воздушной среды аналогично тому, как по титру кишечной палочки оценивают качество питьевой воды.

Обнаружение в воздухе закрытых помещений р-гемолити- ческого стрептококка группы А и стафилококка, обладающего признаками патогенности, является показателем эпидемического неблагополучия данного объекта.

Нормативов по оценке бактериальной загрязненности воздуха в настоящее время нет. Критерием для оценки чистого

Рис. 34. Аппарат Кротова (схема конструкции)/ — цилиндрический корпус; 2 — основание корпуса； 3 — электромотор； 4 — центробежный вентилятор; 6 — восьмилопастная крыльчат* ка; 6 —rrck; 7 — пружнны; 8 — чашка Петрн; 9 — крышка прибора; 10 — накидные замки; Н — диски из плексигласа; /2 — клиновидная щель; 13 — разрезное кольцо; 14 — штуцер с диафрагмой; /5 — выводная трубка.

и загрязненного воздуха помещений могут служить показатели, приведенные в табл. 56.

При исследовании воздуха закрытых помещений большое значение имеет способ выделения микроорганизмов из воздуха. В зависимости от принципа улавливания бактерий микробиологические методы исследования воздуха разделяют на седиментациойные, фильтрационные и аспирационные. В настоящее время наиболее широкое распространение находит аспирационный метод с применением аппарата Кротова.

Отбор воздуха аспирационным методом с применением аппарата Кротова. Конструкция аппарата Кротова основана на принципе ударного действия струи воздуха (к аппарату Кротова прилагаются подробное описание прибора и правила его эксплуатации).

Аппарат состоит из трех частей: узла для отбора проб воздуха, микроманометра и электромотора (рис. 34). Узел для отбора проб воздуха, вмонтированный в металлический корпус, имеющий форму цилиндра, представляет собой электромотор, на оси которого укреплен центробежный вентилятор, а в ротор вделана малая крыльчатка. Одновременно с вращением центробежного вентилятора начинает вращаться малая крыльчатка, на диске которой с помощью трех пружин укрепляется чашка Петри, заполненная плотной питательной средой.

Для определения общей микробной обсемененности взятие проб воздуха производят на 2% мясо-пептонный агар, для выделения стафилококков ——на молочио-солевой (рец. 62}

Та#лж«а М

Бактериологические показатели, рекомендуемые для санитарно-гигиенической оценки воздуха лечебно-профилактических учреждений

Нгаменованве объекта

Условия

Допустимые показателя

Источввя

микробное число в 1 м3

содержание

патогенных стафилококков

патогенвых стрептококков

Операционные

До операции

До 500

Не должно

Не должно

Временные методические рекоменда-

После операции

» 1000

быть

То же

быть

То же

цни по организации и проведению комплексных санитарно-гигиениче-

Послеоперационные яа-

> 750

» »

> »

ских мероприятий в отделениях* больницах, клиниках, клиниках и

латы, отделение реанимации

Родильный дом, родилъ-

При поступлении

> 1500

» »

» >

институтах хирургического профиля № 1142—73 от 29 декабря 1973 г.

Временные методические “указания .по

ные залы

Послеродовые палаты

рожениц н приеме родов

> 2000

До 16 сумм

арно

санитарной бактериологии для родильных домов № 679—67 от 19 июля 1967 г.

Палаты новорожденных

Перевязочные, предопе-

До начала работы

> 1500

> .750

До 12»

Не должно

Не должно

рационные палаты

Летом

» 3500

быть

До 24

быть

До 16

Зимой

» 5000

» 52

》36

или желточно-солевой агар (рец. 61), для выделения стрептококков —— на среду Гарро (рец. 65). Для выделения других патогенных микроорганизмов подбирают соответствующие им элективные питательные среды.

Корпус прибора герметически закрывают крышкой, центральная часть которой представляет собой прозрачный диск, из плексигласа с радиально расположенной клиновидной целью. Ширина щели у края диска 1,2 мм, а у центра — 0,1 мм.

При вращении вентилятора воздух засасывается через щель крышки, ударяется о поверхность питательной среды и оставляет на ней большую часть микроорганизмов, содержащихся в порции поступающего воздуха. Вращение чашки с примерной скоростью 60 об/мин гарантирует равномерное распределение микробов по всей поверхности питательной среды, находящейся в чашке. Воздух, поступивший в прибор, выделяется наружу через воздухопроводную трубу, соединенную с микроманометром, с помощью которого регистрируется скорость просасывания воздуха через прибор. Аппарат позволяет пропускать от 25 до 50 л воздуха в минуту.

Порядок работы с аппаратом Кротова. Прибор включают в электросеть. Снимают крышку, укрепляют на диске открытую чашку Петри с питательной средой, сообщая ей некоторые движения от руки по часовой стрелке. Крышку прибора закрывают и отмечают начальное время поступления воздуха в прибор. Устанавливают скорость просасывания воздуха, равную 25 л/мин. Для определения общей обсемененности ограничиваются просасыванием 100 л, для выявления кокковой и другой патогенной микрофлоры объем исследуемого воздуха увеличивают до 250 л.

Чашки с «посевом воздуха» инкубируют 24—48 ч при температуре 37 ℃. При просмотре микробного роста через указанный промежуток времени из колоний, подозрительных на тот или иной вид микроба, готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют, а затем выделяют чистую культуру для изучения ее свойств и определения видовой принадлежности, пользуясь для этой цели общепринятыми методами, изложенными в соответствующих разделах частной микробиологии. Результаты анализа выражают средним числом микроорганизмов, обнаруженных в 1 м3 воздуха.

САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛОКА И МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ

Санитарно-бактериологический анализ молока и молочных продуктов предусматривает определение общей микробной обсемененности продукта и количественного содержания в нем бактерий группы кишечной палочки.

При наличии эп1идвмических показаний молочные продукты исследуют на содержание naTOireHiHbix микробов.

В табл. 57 лр1И1ведены нормы содержания микробов в молоке и некоторых и&иболее уиготребителыных молочных продуктах. •

Отбор проб молока <и молочных продуктов производится в соответствии с ГОСТ 3^2-67. Молоко, сливки, кефир, про1стаквашу 必 другие жидаие продукты после тщательного перемешивания стерильным черпаком, щупом или шпателем отби-рают в количестве 50 г/(мл. Пробы мороженого в том же кол1ичест!ве берут 必з середины массы, для чего с поверхности ее снимают стер1ильной ложоюой верхний слой толщиной 2,5 ом. Пробы тв'орога и сливочного масла по 20 г забирают щупом из глубины в 2—3 различных точках после тщательного зач-ищения верхнего -слоя. Из раюфаюоваи- ных тьродуктов берут по два образца в орипи1нально直 ynaiKOB・ ке. При взятии проб сьпра поверхность его протирают ватой, смоченной этиловым сли(ртом, а затем прож'Игают ее. Стерильный щуп вводят наклонно в середину сыра на 3Д его глубины и отбкрают около 10 г. Молоко сухое, сливки сухие с сахарам и без сахара берут из разных мест в количестве 50 г стфилыюй ложкой. Молочные консер-вы (сгущенное молоко и сливки с сахаром, кофе и какао с сахаром и сгущен- ihelm молоком) отбирают для б актер иологического исследом- 1ния по две банки от каждой варки.

Подг от о в к а мо л о чн ы х продуктов для бакте- )риолопиче1ского исследования. Из образца продуктов жадкой и полуж1вдкой конои1стенци.и готовят ряд последовательных десятикратных разделен-ий в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия. Для этого образцы масла и мороженого помещают в стерильную посуду и растапливают в воджной бане при температуре 40—45 °C до образова- Н1ия однородной массы.

Банки с молочными консе|рвам<и нрамьввают чгистой теплой водой со щеткой и вытирают. Перед вскрытием банку фламбируют смоченным в спирте и зажженным факелом из ваты. Вскрытие банок производят стерильным консервным ножом.

Образцы творога, изделий из него и сьъра, полученные из разл1ич!ных yqacTKOB продукта, перемешивают стерильным шпателем. Из каждого подготовленного таким образом продукта в стерилыную посуду берут на1веаки по 10 г, добавляют к ним 90 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия, 'подогретого до 40——45 ℃, и затем тщательно в те- чен'ие 3——5 мин взбалтывают до получения^ од<нород|ной эмуль- ети.

ПриготовлeHiHoе оюно®1ное разведение (1:10) используют для получения всех дальнейшнгх разведений. Вы160tp разведе- iHiHii для посева на общую микробную обсемененность лроив-

Таблица 57

Допустимые нормы содержания микробов в молоке и молочных продуктах

Наименование и сорт продукта

Общее количество бактерий, допустимое в 1 мл (г) молочного продукта

Кишечиая палочка в 1 мл молочного продукта

Молоко пастеризованное

-в бутылках и пакетах: сорт А

75 000

3

сорт Б

150 000

0,3

П а стер изов энное во флягах 眩 цистернах

300 000

0,3

Сливки сухие и сливки сухие с сахаром:

■СОрТ ВЫСШ'ИЙ

50 000

Не допускается

сорт I

100 000

Мороженое (все сорта)

100 000

0,3

Молоко коровье цельное сухое: сорт высший

50 000

Не допускается

сорт I

70 000

Молоко сухое для детей грудного воз-

25000

Молоко консервированное, сгущенное с

50 000

0,3

сахаром

&ОД1ИТСЯ с учетом наиболее вероятного микробного обсеменения для каждого вида продукции в соответств-ии с дан1ным1и, приведеныЫ1ММ в табл. 57.

Определение рбщей (микробной юбсемененности молока и молочных продуктов. Общее количество бактерий определяют в 1 мл/г исследуемого молока или молочного продукта. Выбранные для посева разведения продукта вносят по 1 мл (-ка'ждого развадеиия) в。以ну чашку Петри и заливают 12—— 15 мл рааплаюлвнного и остуженного до температуры 45 ℃ мя1с04пептон<ного агара. Посевы помещают в термостат при 37 ℃ на 48 ч.

Подсчет колоний и определение общего мигкробного чжла sir исследуемого продукта производят в соответстзии с общепринятой методикой (см. с. 306). У молочнокислых продуктов (кефир, nipacTOiKB'ama, ац/идофилыное молоко и др.) общую микробную абсеменен1Н1О1СТь не определяют, так как он阴 содержат Л1роизводствен1Hlyю 'молоч1НО»И'сл1ую (м.июрофлору: Str. lactis, Str. cremoris, Str. diacetillactis, Str. thermophilus, Lactobact. bulgaricum в виде диплококков, цепочек и палочек.

Определение титра кишечной палочки в молоке и молочных продуктах. Обсеменены ость молока и молочных про дукатов бактериями группы кишечяой палочки определяется бродильным методом, сущность которого заключается в следующем.

■Первый день. Из разведений иоследуемых образцов продуктов (табл. 58) берут по 1 мл и засевают в пробирки со средой Кесслера (ipeu,. 144). Засеянные пробирки помещают н，а 1824 ч в термостат при 43 ℃.

Таблица 58

Продукт

Засеваемое разведшие

Количество пробирок со средой, засеваемое из каждого рвзведеиия

Молоко и сливки пастеризованные, сгущенное молоко с сахаром, кефир, кумыс, ацидофильное молоко, простокваша, ряжеика, кисломолочный иапиток «Южный», йогурт

1; 1:10

-3

Молоко и сливки сырые

От 1:10 до 1:10 000

Мороженое, коктейли из мороженого

1:10

Масло

1; 1:10; 1:100;

1:1000

2

Сыр

От 1:10 до 1:100 000

2

Творог, сметана

От 1:10 до 1:100 000

1

Второй день. Учитывают результаты первой бродильной пробы. Из п@о：6мрк>к с нал'Ичие'М газа в поплавках делают вьисевы на среду Эндо. Посевы инкубируют при 37 ℃ в течение 20—24 ч.

Третей д еяь. Проем а грив а ют результаты микробного роста на среде Эндо. Отбирают колодаи, характерные для бактерий группы кишечной пало^^ки, готовят из них мазки, oKipamiHBaioT по Граму и м<икрocKOinnipyют. При нал1ичи1и в вмазке прамотрицательных палочек, подозрительных в огно- шеняи группы кишечных бактерий, иромзвопят Высев: а) в (Среду Гисса с глюкозой (2-я бродильная проба); б) в среду Коз ер а (рец. 147) для выявления Ц|итр.атпол!ожителыных раз- (ноВ1ИД1Ностей Е. coli, которые, согласно указаниям ГОСТ 9225-68, при определении коли-титра молока и молочных про- дуктов не учитьиваются.

Ч етв ерт ы й день. Просматривают посевы, сделанные накануне.

Пр едет ав'ит ели кишечных баиггерий — показатели фекального загрязнения объектов внешней среды, не усваиваю- щ.ие углерод из солей ли-моиной кислоты, на среде Коз ер а распи неспособны. Рост не подлежащих учету цитратполо* жительных разновидностей бактерий группы кишечной палочки со£П1ровождается нзманенмем цвета среды из оля1&ко1во* зеленого в василыкойвый.

На среде Гисса с лактозой отмечают результат второй бродилыной пробы и устанавливают коли-титр исследуем ого продукта, руководствуясь указаньижми ГОСТ 9225-68.

Для па1сте'ри.зова1нного молока, сливак, кефира, кумыса, ацидофильного молока, молочнокислого напитка «Южный», колм-титр вычисляется в cooTBerciWH с да.Н|Ны-ми,. приведен- .ны1м；и в табл. 59.

《более 3 мл》.

■б) Если в одном из трех за!сея<нных объемов по 1 мл продукта обнаруживаются кислота и газ, коли-титр считается равным《3 мл》.

в) Если кишечная пал10чка обнаруживается в посевах 5 объемов илн во всех 6 объемах продукта, колк-титр считается 《:менее 0,3 мл».

Во всех остальных случаях коли-титр принимается за 《0,3 мл».

Для мороженого и молочных коктейлей коли-ггитр устанавливают, руководствуясь AaiH*HbiiMH табл. .60.

Если кислота и газ не обнаруживаются ни в одном из ①рех засеянных объемов по 0,1 мл, коли-титр считается «более 0r3 мл».

Таблица 60

лВарнант

Кишечная палочка обнаружена в следующих объемах, мл

Вычисление колн-титра, мл

0,1

0,1

0.1

а

>0,3

6

—

二

0,3

.в

+

<0,3

+

十

Если кислота и газ о бн ару жив а ются в одном из трех за-сея»ных объемов по 0,1 мл, колм-титр считается ра-вным 《0,3 мл》.

Если кислота и газ обнару»?зваются в двух или трех засежН|НЫх объемах по 0,1 мл, коли-ттшр《менее 0,3 мл».

Для остальных продуктов коли-титр устанавл1Ивают, .руководствуясь данны,м;и табл. 61.

Таблица 61

Вариант

Кишечная палочка обнаружена в следующих объемах, мл

Вычисление колн-тнтра, мл

1

0,1

0,01

0,001

0,0001

а б в г Д

+

+ +

+

+

+

+

^0^0001

1,1 0,1 0,01

Если ни в одном из засеянных объемов продукта не обнаружено кислоты и газа, коли-титр считается больше суммы засеянных объемов.

Если кислота и газ обнаружены во всех засеяиных объемах продукта, коли-титр считается менее наимвнылего засеянного объема или массы продукта.

Если кислота и газ обнaipуживаются только в одном ш засеяйных объемов, кол>и-титр равен общему засеянному объему (массе) продукта.

Е1СЛ1И кислота и газ абна1руживаются в первых двух еасея-н'ных объемах, коли-ггитр считается 《раиньш ОД мл》.

Есл'И кислота и газ абн аружя в а ются в нескольких за- сеян1ных объемах, за коли-титр принимают количество продукта в наибольшем разведевии, давшем рост кишечной па- лоч(ки. Если кишечная палочка обнаруживается в меньшем засеянном объеме и не обнаруживается в большем исследр- ваиие необходимо повторить.

САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕИССЛЕДОВАНИЕ ИЗДЕЛИЙ ИЗ КРЕМА

Саниггарно-бактериологическое иоследовате кондитерско- кремовых изделий в соответствии с методически'ми указаниями, утверж|денны1ми Министерством здравоохранетия СССР (1351-75), предусматривает: 1) установление титра кишечной шлочки и 2) определение плазмокоагулярующ：их стаф|ИЛ01ККЖ- ков в 1 г изделий из крема.

■Возиикнавение ста фи л ок-окк ов ых HnTOKcHKaixiifl после упо требления изделий из крема становится возмож<ным при нарушении сан-итар'ных условий изготовления, хранения и реализации этих издел!ий. Заг.ряз1не(Н1ие изделий из крема стафи- лококкамн происходит при несоблюдение правил личиой шигиены и при плохом санитарном состоянии конД|Итерских цехов.

Отбор проб крема м подготовка мх для бактериологического исследования. Крем из различных участков продукта снимают стерильной ложкой в ко.л1ичестве около 50 г, помещают в стерильную колбу и ставят в термостат или водяную 6aiHio при 43—45 ℃. Для посева используют нпиемий слой растопленного крема.

Определение титра кишечной лалочки в изделии из крема. Первый день. Для апределеимя титра кишечной палочки из нижнего слоя растопленного крема берут 1 мл и вносят в пробирку с 9 мл стерильной пептонной воды или изотонического раствора хлорида натрия. Из полученного такнм образом основного (1 :10) разведения готовят ряд последо* вателыных десятикратных разведений.

Исследуемый продукт засевают в объеме 1; 0,1; 0,01 и- 0,001 мл. Вььсев 1 мл осуществляется посредством засева 10 мл исх'одаого разведения (1 : 10) крема в колбу с 50 мл среды Кесслера (рец. 144). Все остальные объемы засевают в количестве 1 мл соответствующего ражадения в пробирки со средой Кесслера, разкнто访 по 5 мл. Посевы исследуемото материала инкубируют 18——24 ч пр(и 43 ℃.

Второй дещь; Из всех пробирок со средой Кесслера иезависимо от наличия в ней признаков роста производят высев на сектора чашек со средой Эндо. Засеянные чашки помещают в термостат с температурой 37 ℃ на 18—24 ч.

Третий день. Проем атр ив а ют результаты мнкробного роста на среде Эндо. При отсутствии колоний, характерных для бактерий группы кишеч-ной палочки, на всех секторах чашек дают отрицательный отает. Из колоний, подозрительных в отношении Е. coli, готовят мазки для окрашивания по rpaiMy. Наличие в препаратах гра!мяегативных палоивк указывает на присутствие бактерий группы кишечных палочек.

Вычисление коли-титр а кондитерских изделий из крема производится в соответствии с табл. 58 (ГОСТ 9225-68).

Выявление в креме коагулазоположительных стафилококков. 1. Из нижнего слоя крема, растопленного при 45℃, набирают в пипетку 0,1 мл и засевают его на поверхность мо-

лочно-1соле®ого атара (рец. 62)； Засеваемый материал тщательно втирают в поверхность питательной среды. Засеянные чашки выдерживают 18—24 ч в термотате при 37 °C или 48 ч пр»и комнатной температуре.

Параллельно посеву на плотную питательную 1Среду исследуемый крем в объеме 0,5 мл высевают в тгробирки с 5 мл среды накопления — солевым (6,5—10%) бульоном. Посевы ин/кубируют при 37 ℃ в течение суток.

Второй д евдь. 1. Просматривают посевы, сделанные на молочно-солевом агаре. Из колоний с признаками, характерными для стафилококка (см. с. 165), делают мазки, окрашивают их по PpaiMy и микроскоп ируют.

Три ——пять отмеченных колоний отсевают в чашки с 5% кровяным апаром для оп；ределен1ия гемолитической активности.

Первичные посевы на молочно-солевом агаре сохраняют в течение нескольких дней при комнатной температуре лля выжвлен(ия пипм&нта стафилококков. При отсутствии характерных колоний через 48 ч п(ро1из>водят высев со сред на- жмтления на кровяной агар и в чашки с молочаюнсолевым агаром.

Тр ети й день. 1. Отмечают характер роста на кровяном агаре (см. с. 166).

Ставят реакцию плазмокоагуляции (см. с. 166).

Определяют характер пигмента на молочно-юоле®о.м агаре (см. с. 166). При наличии соответствующих показаний выделенные штаадмы стафилококка иопытьивают в биологиче- •ской пробе на энтеротоксин (см. с. 171).

Для количественного учета стафилококков в 1 г/мл исследуемого материала все выросшие на плотной среде колонии, характерные для стафилококков, подлежат подсчету и пересчету на 1 г/мл исследуемой пробы по общепринятой методике (см. с. 306).

САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕИССЛЕДОВАНИЕ МЯСО-КОЛБАСНЫХ ИЗДЕЛИЙ

Б актер ио логическое исследование колбасных изделий и продуктов из мяса (ГОСТ 9958-74) предусматривает определение: 1) общего числа бактерий; 2) присутствия бактерий группы ки-шетной палочки; 3) наличия бактерий рода сальмонелл. з

Из каждого образца колбасных !издел(ий, подлежащих ба1Ктер!ИОлогиче|С|Ком(у исследованию, берут навески массой по 20 г, помещают их в стерильные стаканы гомогенизатора мли фарфоровые ступки л растирают с 2—3 г стерильного кварцевого песка, добавляя небольшими порциями стерильный изотонииеюкий раствор хлорида натрия. Приготовлешую

таким образом гомогенную массу оставляют на 15 ми(н при камнатнюй температуре.

Посев на общую микробную обсемененность. Для определения общей ми1К|ро1б|Ной обсемененности из каждого исследуемого О|браз(ца продукта делают 2 посева по 0,1 и 0,01 г, чтобы получить на чашках от 30 до 300 колоний. Для высева 0,1 г стерильной пипеткой с широким концом отбирают 0,5 мл исходной взвеси и переносят ее в старильную чашку Петри. Для посева 0,01 г бер,ут ту же вз1весь в объеме 0,5 мл и вносят в пробирку с 4,5 мл изотонического раствора хлорида натрия. После тщательного пербмешива1Н'ия(из содержи моих) пробирки набирают 0,5 мл .и переносят во вторую чашку Петри. Обе чашки заливают 12——15 мл раюплавленного и остуженного до 40—45℃ мяюо-пептонного агара. После застуди ев апгия на поверхность агара нал'ивают 4—5 мл голодного агара для' абразоваиия слоя толщ'инюй 3~-4 мм, предоп&ра- щающего ползущий рост протея.

Подсчет выросших колоний промзвопят по общепр1и1нятой методике через 48 ч инкубации посевов при 37℃.

Исследование колбасных изделий на содержание кишечной палочки. Определение обсемененн-ости колбасных изделий ба1ктерия1ми группы кишечной палочки основааю на способности бактерий ферментировать маинит с образовании ем ккслых продуктов, из1меняюш|и>х цвет индикатора в средах 《ХЕ》 (рец. 146) и Хейфеца (рец. 145), и расщеплять глюкозу с образова1нием кислоты и газа пр(и росте на среде Кесслера (рец. 144). В пробирки, содержащие по 10 мл среды Кесслера, «ХВ》или Хейфеца двойной концентрации, вносят по 5 мл первого и второго разведения исследуемой колбасной взвеси. Ин|Куба；щию посевов осуществляют при 43 ℃ в течение 18—20 ч.

При налмии роста кишешных палочек среды《Х6» и Хейфеца приобретают желтый цвет, а на среде Кеослера образуется пузырек газа в попла1В1ке. Идентификация выросших бактерий с баоктеризвми группы кишечной палочки осуществляется по способу, описанному выше (см. с. 303).

Исследование колбасных изделий на содержание сальмонелл. Для обнаружения в колбасных изделиях бактерий рода сальмонелл п;р1иготовленную исходную взвесь в объеме 25 мл засевают во флаконы со 100 мл среды Мюллера (рец. 72)» Кауфмана (рец. 73) или магниевой среды 《М》(рец. 75). Посевы исследуемого материала инкубируют при 37 ℃ в течение 18——24 ч. На 2-е сутки со сред обогащения производят высев в чашки со средами Эндо (рец. 79) и средой Вильсо на―Блер (рец. 82). Дальнейшее исследован1ие, натравленное на ；В|сесторон1нее изучение и определение вида выделен1ных культур, ведется по методике, принятой для 'изучения указанной группы микробов (см. с. 208).

Санита|рно-/бактериологи1ческий анализ куЛ1И1нарны1х изде- л'ий из рубленого мяса (котлеты, б1иточки, шнищрлл жареные) производится так же, как и>сследова1Н<ие колб ясных изделий.

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕБАНОЧНЫХ КОНСЕРВОВ

Мясные, овощные и рыбные кон(серв1ированные продукты (в металлических и стеклянных банках), находящ?ие1ся в то- ва(ро1проводящей сеги, подвергают бактериологическому 'исследованию при нал'ичи1и факторов, вызывающих сомнение в качестве продукта.

Образцы консервов, доста1вл0нные в лабораторию, репи* сфируют в спедиалыном журнале, отмечая асе данные, обо- вкаченные на этикетке банки и в сопроводитель1НО1м документе. Затем баики освобождают от этикеток и делают в журнале запись обо всех обнаруженных при внешнем осмотре дефектах (бомбаж, деформация коробок, ржавчина, следы потеков и цр.). Баи|Ки с нарушенной герметичностью баасгермо- лопичеюкому 'июследованию не подлежат.

Герметические банки с консервами, предназначенные для выявления аэробных и анаэробных мезофильные бактерий, помещают в термостат на 5 сут при 37 ℃.

Подготовка банок с коне е р в а ми для бакте- р«ио логического ясс ледо(в а н>и я. Бакте»риолопичекжое 発©следование KaHcepiBOiB П|ро®од1ится в баксах со строим соблюдением правил асептики. При этом в боксе должны находиться:

Стерильные стеклянные трубки диаметром 7—9 мм, закрытые с одного конца ватой.

|Пр|Обойник ((металлический стержень, один конец которого имеет форму копья).

Питательные среды: 1% саха(р(ныЗ бульон и среда Та- роцти без масла, но с добавлением 0,15% агара, регенери- рован'ная перед посевом Зб-адинутным прогреванием в водяной бане с последующим быстрым охлаждением до 40 ℃.

В ic к р ы т >и е б а и о к. Исследуемую банку, предварительно обмытую горячей водой с мылам, насухо вытертую полотенцем, обтирают спиртом; верхнюю крышку обжигают. Затем на середину крышки на тот участок, в котором предполагается пробить отверстие для взятия пробы, кладут кусочек ваты, смоченный спиртом, и зажигают. Под горящую вату подводят остр1ие про而ламбярованного пробойника под углом 30—40° к поверхности крьшпки и нажимом на ручку прокалывают ее. Получающееся при этом отверстие вполие достаточно для нвадения стекля|Н1НОЙ трубки. После изелече- 向ия про1бойника из банки отверстие тотчас закрывают стерильной половинкой чашк<и Петри.

Посев содержимого консервных банок на питательные среды. Материал для посева набирают из банки через отверстие, сделанное в крышке, слепка шриоткрыв прикрывающую его половтаку от чаш^и Петри. В стеклянную трубку насасы1вают иаидкую массу с плотным-и частицами и засевают ее в питательные среды для выделения аэробной и анаэробной микрофлоры.

Посев н а обм аружени е аэробных, бактерий. Исследуемый материал в количестве 1—1,5 мл засевают в две пробирки с мHico-пепtohihы，м бульоном, посевы помещают в термостат прн 37 ℃ ；на 5 сут. За шстоянием посевов ведут повседневное наблюдение.

Из npo6HipoiK с приз(на1ка)ми микробного роста в период инкубации в термостате делают мазок и производят высев на окошенный мя：со-<пennoiHiHый агар.

Выросдгие на мяюо-пепго1н<нюм агаре колонии микро-ско- тируют. При О|6наруженогн гр а)м о тр1иц а тел ьн ы х неспоронооиых палочек П1р.0'И31вюдят пе,ресе® на диффереициально-диаппости- ческие среды (Левина или Эндо). Выделенную чистую культуру идентифицируют с ба1ктер!ия1ми группы киш1еч1ной палочки (см. с. 303) или бактериями группы сальмонелл (см. с. 208).

При обнаружении в кон-сервах микробов с культураль- но^морф'Ологически1Ми npiHSHaiKaiMH, характераьимм для стафилококка, исследова1ние проводят, руководствуясь методикой,» описанной на с, 166.

При об|на1ружен1и>и в посевах /Вaic. subtilis м Вас. mesen- teriicus исследовамие ®а данном этапе закаяччивают к (результат опмечают (в протоколе июслепо1ван1ия・

При отсутствии явно выраженных признаков микробного роста на 5—6-е сутки инкуби1ро1ва1ния посевов ib термостате из содержимого пробирок делают мазки, акраш™ают их по Граму и микроскопируют.

Одновременно производят высев на скошенный мясо-пептонный агар. Дальнейшее исследование проводят по описанной выше схеме.

,По1С ев н а обн ар у ж ен и е а« а эро бih ы х i6 а к т ер я й. .Июследуемый материал азо 3—4 г засевают ib две пробирки, содержащие по 15—20 мл среды Тароцци, предварительно р еген ерир ов ан нп й ки1ПЯ'Ч'ен1ием.

После засева одну 磔з пробирок прогревают ：в воджной бане три температуре в0℃ ib течение 20 iwh для уничтоженаяе сопутствующей вегетатив(ной микрофлоры. Обе засеянные npo^HpiKH -помещают в термостат три 37 ℃ иа 5 сут. Затем «еза(ви1симо от наличия или отсутстаия лрижаков 1М1И1кробного ■роста готовят маж必,окрашивают их по Граму *и (М'икрюско- пируют. При обнару.Ж1ени1и в ‘мазках(из анаэробных посевов； грамположителыных палочек со спорами овальной формыг

расположенными 'субтер1М1ин<аль,но, далынейшее исследование п(раводят в ллане адентификаци'и (выделенного ,м№Кфо6а с возбудителем ботулизма (см. с. 258).

ИССЛЕДОВАНИЕ ПЕРЕВЯЗОЧНОГО ИХИРУРГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА НА СТЕРИЛЬНОСТЬ

В М|И1кро1биоло1Гичеоку1о лабораторию для 'исследоваиия на стерильность поступает перевязочный материал (бинты, марлевые 'салфетии, ватные шарик и 'и тампоны), шовный хирургический материал (шелк, кетгут), прocrepiHл'изовhihihый в лечебно-профилактических уч1реж1дениях. Материал для 1Иссле- дования направляют в ла/бо：раторию в день его стерилиза-ц'ии. Перевязочный материал Д|оста1вляют в лабораторию в закрытых 'и опечатанных биксах. Пробы кетгута и шелка берет хирургическая сестра в условиях чистой операционной по одному мотку из «каждой баики © лодготовленным для операции 1ПОВ1НЫ1М материалам.

Для провадения посевов в боксе необходимы:

Набор стерильных инструментов1—нож1Н1И.цы, корнцанги, анатомжес1К1ие пиндеты.

.Стерильный гипосульфит, 10% раствор.

Дистил лир о в анн а я стерильная вода.

Набор питательных сред.

'Посев И|С：следу&м)ого материала производят: а) для выде- лен'ия аэробной мжрофлоры в зиясо-лептонный бульон с 0^5% глюкозы; б) для выделения анаэробных)мжрооргащизмооз в <ре)ду，К1итта——Таровди с 0,15% агара.

Исследуемый хи1рурпический материал (бинты, тампоны, марля, ватные шарики) достают 必з разных мест бикса стерильным пинцетом .над пламенем пор елки 假 опускают в 2 про- Зяркн с сахарным (бульоном ：и в 2 пробирки со средой 瘫т・ та—Таротщн.

Кетгут абычно сохраняют в спиртовом растворе йода, ло- этому перед посевом на стерильность необходимо йод нейтрализовать. Для этого:

моток кетгута помещают на 24 <ч в колбу с 30 мл стерильного 10% раств'Ора Г|ИП0'сулыфита;

по <истечбН1ии yiKaaaiHHono времени кетгут из растеора гипосульфита переносят в колбу с 30 мл стерильной дистил- Л'ированной воды на 24 ч；

и ел ос р еде тв qhiho перед посевам моток кетгута 1извлека- ют стерильным пинцетом из колбы с джтилл1ировайной водой, «ладут в чашку Петри, простерилизованную аместе с кружком ф-ильтровалыной бумаги, разрезают стерильными ножн1Ица1М'И на куски длиной 2—4 см.

В 2 пробир|Ки с сахариым бульоном и в 2 пробирки со «редой Кнтта——Тароцци вносят по нескольку кусочи«>в исследуемого кетгута.

Посев шел-ка производят так же, как м посев кетгута. Ввиду того что шелк сохраняют :в сиирту, перед посевом моток шелка выдерживают 24 ч в стерильной дистиллировапиой воде.

П(ро1бир<ки и колбы с nocGBidMM ставят в термостат при 37℃. Посевы, сделанные в icaxaipiHMfi бульон для выделения аэробной м：И1Крофлоры, инкубируют 6—7 дней; посевы, сделанные <на среду Китта——Тароцди для выделения ащаэробной микрофлоры, — 10—<12 дней. Просмотр посевов производят каждые 1—2 дня. Если в течение указанного времени среда, в которую по1сеян исследуемый материал, остается прозрачной, М'атериал пр|изнается стерильным.

Из шробирак с пр'И31на<кам1И !микр0'бного роста делают мазки, окрашивают их по Граму и м икроскопиру ют. Дальнейший ход 1Hlecледо©а1нм:я апределяе'гся характерам обнаруженной при микроскопическом исследовапж! -ми1крофлоры. Материал признается нестерильным, если признаки микробного роста обнар.ужив а ются в двух или в (большем количестве засеянных П1робир.01к.

САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ

ИССЛЕДОВАНИЕ СМЫВОВ С РУК И ПРЕДМЕТОВОКРУЖАЮЩЕЙ ОБСТАНОВКИ

Изучение бактериальной загрязненности рук -и разлмзннх предметов инвентаря лроизвод1ится в целях:

■а) оценки caiHirrapiHO-riHOieH'HMecKoro состояйия исследуемого объекта;

устанавления путей распространения инфекции при эпидем1И!0Л0|ГИ(ческих обследованиях;

ла；борато'р1нопо контроля эффек™&но1сти обработки кожи рук (гла1В1НЫ1М образом хирургов).

В за1ни(оимасти от дели пров-одимого последова1Н：ия и характера контфолируемьгх объектов в полученных смывах определяют:

общую микробную обсемененность обычно с пересчетом на 1 см2 1исследуемой поверхности;

) наличие бактерий группы кишечной палочки как показателей фекального загрязнения, свидетельствующих о нарушении caiH'HT^piHono режима;

наличие патагеиных бакте(р'ий кишечной группы, обна- рвение которых является безу)слав!ны1м показателем эпидемического неблагололуч1ия;

наличие стафилококков и других микроорганизмов.

Для получен1ия омьбвов пользуются .стерильными ©атными тампонами мл-и 1ма(рлевыми «салфетками. В день взятия смыва (в каждую пробирку с тампоном наливают по 2 мл стер иль-

ной водопр«01вод1ной воды или и：зотон1Ичеоко1РО раствора Флорида натрия так, чтобы ватный TaiMinoH наход1ился над ураннем жидкости. Марлевые салфетки размером 5X5 ом заве|рты(ва- ют по одной -в бумажные «пакеты. К каждой салфетке готовят заранее П|ро.бирку ю 2 мл стерильной воды для омачи©ания. Непооредственно перед (взятием смыва щроби：р|Ку наклоняют, увлажняя находящийся в ией тампон. В случае применен1ия салфеток их захватывают конником стерилыного пинцета, прокаленного над пламенем го-релюи,弘 увлажняют стерильной водой из прсбпркп.

У|влаж!ненный водой тампон <или салфетку дают в руки обследуемому, 'предлагая протереть им сначала <кожу левой,, а затем п；равой руки в такой nocJiemoiBaTejibHocTiH (от участков ic меныпей к учасгкнм с 'большей за(гряз!не1н*но1стью): тыл кисти, ладонную поверхность, межпальц&вые простр анства, ногтевые ложа. По окончании процедуры салфетки или тампоны помещают в пробирку, в которой они находились.

При взятии омбрвов с предметов, имеющих большую поверхность, исследуемый участок огранич1ивают рамкой—трафаретом ллощадью 25, 50 1ил(и 100 юм2. Трафарет, изготовленный из проволоки, шосле 'каждого смыва и п師ед употреблением прожигают <над пламенем горелкп.

При И10следова1Н1ИИ мелких предметов смыва делают со вс^й их поверхногти.

Бактериологическое исследование смывов. Для определен ния общего числа 1микроб'ов в иссладуемом смыве к 2 мл воды, которая(была иополь：зова1на для увлажншия тампона, 1П|рибавляют еще 8 мл воды. Тампон тщательно в течение 2—3 мин отмывают, получая июходное <разведение. Из него готовят ряд последавательных десятикрапных ：р.аэведений (см. с. 306). Затем из различных разведений смыва берут по 1 «мл, вносят в стерильные qauiKiH Петри, заливают мясо-лео!- тонным агарам. Лосевы выдерживают 24 ч при 37 ℃ -и 24 q отря fKOMiHarnOH температуре, после чего П|роиз®одят подсчет выростш колоний.

Уст а н а'В л и в а ют количество микробов в 1 мл ihicjcoahoto разведения смыва. Для этого лодсчитьввают Ч1исло колоний иа агаре в 4auiiKe и полученную величжу умножают на степень разведения смыва.

Определяют количествю 1М1Икробов в 10 мл смыва, соответствующее общему числу микробов, находящихся на той площади, «с кото|рой производился смыв. Для этопо величину, соответствующую количеству ми1кробав в 1 мл смыва, умио- жают на 10.

Определяют количество М1И/кробов в 1 ом2 исследуемой поверхности. Для этого величину, характеризующую количество микробов в 1 мл смыва, делят на число квадратных сантиметров, с которых сделан смыв.

Исследование смывов на содержание бактерий кишечной группы. Для выявления бактерий группы кишечной палочки можно пользоваться прямым посевом исследуемого материала на чашки со средой Эадо. Для этого матфиал, находящийся на тампоне, втирают в поверхность питательной среды. Однако значительно лучшие результаты получены при йспользова1нии сред обогащения (желчный 10% бульон, среда Кессл-ера и среда Мюллера). Посевы на плотных питательных средах инкубируют в термостате 0：рп 37 ℃, посевы на жидких средах обогащения ——пр必 43 ℃ в течение 18— 24 ч. На 2-й день мз флаконов с признакам-и микробного роста производят высев на чашк>и со ^средой Эндо. Дальнейший ход 1И'ОСледава1Ния полностью соответствует методике изучения штаммов кишечной палочки (см. с. 303).

Для выявления патогенных бактерий кишечной группы содержащийся на тампоне материал тщательно втирают в по- ®e)pxHOiCTb плотных питательных сред Левина, Вильсона—— Блер, Плоскирева. После произведенного посева тампон, снятый с палочки, и оставшуюся в пробирке жидкость ——смыв засевают в ср аду обогащен1ия (10% желтаый |бульан).

Через 24—48 ч инкубации в термостате при 37℃ просматривают посевы, сделанные на плотные питательные среды, выявляя прозрачные и полупрозрачные бесцветные колонии, характерные для ' патогенных бактерий кишечной группы. Идентификация выделенных микробов с бактериями группы сальмонелл и бактерий дизентерии производится по методам, изложенным в соответствующих разделах руководства (см. с. 208).

Исследование смывов на содержание стафилококков. Для выявления в исследуемом смыве стафилококка производят посев 0,5——1 мл амыва на 'моло'4но-1соле(вой агар Петрович и в среду накопления (7,5——10% солевой бульон). Колонии микробов с признаками, характерными для стафилококка, изучают описанным выше способом (см. с. 166).

ПРИЛОЛ№НИЕ

НАИБОЛЕЕ УПОТРЕБИТЕЛЬНЫЕДЕЗИНФИЦИРУЮЩИЕ СРЕДСТВА и ПРОПИСИПРИГОТОВЛЕНИЯ ИЗ НИХ РАБОЧИХ РАСТВОРОВ

ХЛОРСОДЕРЖАЩИЕ СРЕДСТВА

Дез ин фвдир ующее действие хлорсодержащих средств основано /на расщепл0НИ|И молекул их вещества с выделением хлора .и кислорода, действующих бактерицидно.

Хлорная известь. Обладает высокой бактерицидной способностью и даже в слабых коицентрациях вызывает пи- бель микробов в воде и на поверхности различных предметов. В орга1Н*ичвеком материале, содержащем белки, ；бактери- цид!иость хлорной извести уменьшается, однако и в этих условиях прп п：авышени1И ее концентрации отмечается хороший бактер1ицидный эффект.

При употреблении хлорной извести нужно иметь в виду, что она нарушает эластичБОсть текстильных тканей и обес* цвечивает их, а на металлических изделиях вызывает коррозию.

Бактерицидный эффект хлоркой извести заниемт от со- даржа1Н|Ия в ней активного хлора, т. е. хлора, который может быть(вытесне1н при воздействии на известь кислотой. Количество активного хлора выражают в Т1|роцентном отношении к aidcce изозести. При хране«н1ии содержание акти1В1НОго хлора в хлорной извести уменьшается, вследствие чего пои'ижается ее бактерицидаость.

Техника определения количестаеииого содержания актив л с，г с хлора в хлорной извести. В конической колбе растворяют 0,5 г хлорной извести в 24—30 制л дистиллированной веды, раствор- тщательно размещают стеклянной палочкой и добавляют последовательна 10 мл 10% раствора йодида калия, 10 мл 20% раствора- хлористо водородной кислоты и 1 мл 1% раствора крахмала (индикатор). Жидкость при этом окрашивается в синий цвет. Содержимое колбы титруют 0」 N раствором тиосульфита до полного обесцвечивания. Химический процесс, происходящий при этом в колбе, можно выразить следующим уравнением:

С12 + 2Kl *■ 2КС1 十 Ig

Ia+2Na2SO3 —н ZNa + NaFd

Количество активного хлора во взятой навеске хлорной извести определяется по количеству тиосульфита натрия, израсходованного на связы-

ванне свободного йода, вытесненного из йодида калия активным хлором* Расчет активного хлора в П1роцентах производят по формуле:

а-0,00355-100

0^•

где а—коЛ'Ичестязо миллилитров 0,1 N раствора таосульфита натрия, использованного для титрования； 0,00355 — количество активного хлора, требующееся для вытеснения иода, содержащегося в 1; мл 0,1 N раствора гипосульфита натрия. 一

Пример, а = 30 мл. Активного хлора в исследуемом образце находится:

30.0,00355-100踊 =21,3%.

Хлорную -известь используют в микробиологической практш'ке в виде порацика, 10—20% хларноизвеюткового молока и 0,2——10% осветленного раствора.

Хлор1но1известко(вое молоко. В табл. 62, составленной на основаннм соответствующих расчетов, покааана взаимосвязь между содержали ем активного хлора в хлорной извести и ее количеством, необходимым для приготовления 10 л хлорноизвестковопо молока 10—20% кон'цент(рац|И1И.

Отлвешеноюе соответствевно да!нным табл. 62 количество хлорной извести высыпают в глиняную или эмалированную посуду. Часть воды, отмеренную для пр<игото1влен1ия хлорно- иэвестковаго молока, вливают в хлорную известь и тщательно размешивают деревянной лопаткой для получения одно； родной массы. Затем при постоянном помешива'нии вливают остальную часть воды. Для растворения хлорной н箈€ТН применяют холодную водопроводную воду.

Таблица 62

Схема приготовления хлорноизвесткового молока

Концентрация

Хлориоизвесткового молока, %

Количество хлориой извести (в г) на 10 л воды при содержании в ней активного хлора. %

16

18

20

22

24

25

26

28

30

32

10

1560

1380

1250

1140

1040

1000

960

890

830

780

20

3120

2760

2500

2280

2080

2000

1920

1780

1660

1560

Осв е т л е н н ы е «р аст,в oip ы х л о р <н о й извести: Сливают 10% хлapiHои31ве1стко®ое молоко в бутыли темлого стекла, закрывают деревЯ1Н1ньим；и пробками и оставляют на сутки. Над О|бразовавшим1ся осадкам отстаивается слой прозрачной жидкости-—основной 10% раствор. Основной раствор осторожно, чтобы нс взмутить осадка, -сл1ивают с помощью сифо-

на в другую посуду через несколько слоев марли. Количество ochobihotq (ра(СБвора, необходимое для приготовления 0,2— 10% ооветлешных растворов хлорной иавеюти, приведено в табл. 63.

Таблица 63

Схема приготовления растворов хлориой извести

Концентрация хлорной извести в рабочих (осветленных) растворах, %

Количество основного раствора (10%) для приготовления 10 л осветленного рабочего раствора, мл

Примечание

0,2

200

Процент рабочего раствара опреде-

0,5

500

ляется по весовому количеству

1,0

I 000

хлорной извести, взятой для приго-

3 000

товления хлорноиэвесткового мо-

5000

лока

Основной раствор

Оюновной осветленный раствор хлорной извести, находящийся в темном сосуде, закрытом деревянной пробаюй, может храниться в прохладном помещении до 10 дней. Рабочие растворы необходимой концентрации готовят из основного раствора непосредственно перед их употреблением.

%

Количество хлорамина (в г) ва

1л

10 л

0,2

2

20

0,5

5

50

10

100

20

200

50

500

100

1000

Таблица 64Таблица 64Схема приготовлении различных растворов хлораминаСхема приготовлении различных растворов хлораминаХлорамин. Кристалличе-

Таблица 64

Таблица 64

Схема приготовлении различных растворов хлорамина

Схема приготовлении различных растворов хлорамина

кое вещество белого или слегка желтоватого цвета, содержащее 25—26,5 % активного хлора.

В микробиологических лабораториях пользуются 0,2— 10% растворами хлорамина. В воде хлорамин растворяется хорошо, поэтому растворы его можно готовить непосредственно перед употреблением. В посуде из темного стекла с притертой пробкой раствор сохраняется в течение 15 сут

от момента изготовления, не утрачивая бактерицидности. 。

Для растворения препарата пользуются водой комнатной температуры или подогретой до 50—60℃. При растворении в горячей воде обеззараживающая способность хлорамина увеличивается. Растворяют хлорамин в стеклянной или эмалированной посуде. “ “

Соотношение межту процентной концентрацией раствора я 1кюл.ичеством хлорамина в граммах на 1 >и 10 л раствора пр|И|Ведано в табл. 64.

22 Лабинская А. С.

ДЕЗИНФИЦИРУЮЩИЕ СРЕДСТВА ГРУППЫ ФЕНОЛА

К групле фенола оттосится ряд веществ, обладающих сильно выраженным бактерицидным свойством. Из них в мн・ •кробиологической практике применяют фенол (карболовая кислота).

Обладая способностью хорошо растворяться в липоидах» фенол нака1ПЛ1йвается ib бактериальной клетке, вступает в со- единен1ие с белками ее цитоплаз1мы, денатурирует их, нарушая ж,из1ненно важные функции микроба.

Карболовая кислота. Карболовая кислота — крис- сталлическое вещество с peaK印м своеобразным запахо-м. Кристаллы его игольчатой формы, беедветные, под дейст&ием света, воздуха -и влаги О1краш>иваются в .малиново-розовый цвет. Обладая большой DHTip о скоп ичн ость ю, карболовая кислота поглощает из окружающей среды влагу и !Стано1В'Итея жидкой. Жидкая карболовая кислота содержит 90% кристал- лн叮емкого фенола и 10% воды.

В микробиологи|Ч|е1С1К'ИХ лабораториях приме1няют холодные и горячие 3—6% растворы карболовой кислоты. Горячие растворы обладают более выраженным бактерид1ид[ны|м свойством. Готовят их из кристаллического фенола или жидкой карболовой кислоты ио схеме, приведенной в табл. 65.

Та 6』н н а 65

Схема приготовления различных растворов карболовой кислоты

Концентрация рабочего раствора карболовой кислоты, %

Количество кристаллической кислоты (в г) для приготовления

Количество жидкой карболовой кислоты (в мл) для приготовления、

1 л

10 л

1 л

10 л

3

30

300

33

330

5

50

300

55—60

550—600

При изготовлении кржталлы отвеШ1йвают в нужном количестве, (помещают в металлическую или стекля1Н1ную посуду, прибавляют отмеренный объем воды, подогретой до температуры 45—50 ℃.

Карболовая кислота действует тоюсически на клежи различных тканей, особенно нервной системы. Поэтому при работе с ней надевают резиновые перчатки или в крайнем случае смазывают руки вазелином.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ХРОМОВОЙ СМЕСИ

Пропись первая. В колбу емкостью 200 мл наливают 150 мл кон-центрировайной серной кислоты, туда же осыпают 25 г измельченного бихромата калия. Полученную смесь

взбалтывают и оставляют стоять до растворения. Через сут- 5ки раствор темню-оранжевого цвета может быть применен для мытья посуды. Перед употреблением смесь следует подогреть до температуры 45—50 ℃. -Изменение темно-оранже- ©ого цвета хромовой смеси на темно-зеленый свадетельству- ет об ее неоър必годностл.”

Пропись вторая. В 1000 мл дис тилли ров aiHiH о й воды растворяют 10 г неочищенного измельченного бихромата калия и затем, перемешивая жидкость, тонкой струей вливают в нее 1000 мл концентрирован ной серной 'кислоты.

При приготовлен困r хромовой смеси ж мытье ею посуды нуж(но надевать резиновые перчажи, так как попадание на кожу хромовой смеси вызывает болезненные ожоги; нельзя |Насасы1Вать хромовую смесь в пипетки ртом; в хромовую смесь, содержащую кислоту, нельзя вливать воду.

РЕЦЕПТЫ КРАСИТЕЛЕЙ И РЕАКТИВОВ,НЕОБХОДИМЫХ ДЛЯ ОКРАШИВАНИЯБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Принцип приготовления насыщенных спиртовых растворов красителей. В основе приготовления многих красящих рас? творов лежит применение насыщенных спиртовых растворов красителей» -иэротовление которых очень просто и в принципе одинаково для всех.

ПорО|Ш1КИ в кол1ичествах, указанных ниже KOHiKpenH。для каждого красителя, высыпают во флаконы, заливают сп-ир- том и ставят(н.а 18—24 iq в термостат npin 37℃, периодически взбалтывая. В течение указанного времени значительная часть красителя растворяется и на дне флажона остается лишь небольптой осадок, 1сввдетельствующий о насыщении раствора.

Насыщенные растворы могут храниться долгое время во флаконах из темного стекла.

Принцип приготовления спирто-водных растворов красителей. Спирто-водные растворы красителей готовят из насыщенных спиртовых растваро®. Для этого насыщенный спирто- вюй раствор >кр ааителя смешивают в разлтных соотношениях (в за!ВИ1симости от красителя) ic дистил л иров а н/н ой водой.

КРИСТАЛЛИЧЕСКИЙ ФИОЛЕТОВЫЙ

Кристаллический фиолетовый — насыщенный спиртовой раствор

Кристаллический фиолетовый . . . .10 г

Спирт этиловый100мл

22*22*339

22*

22*

В|меюто кр ист а л л ич еоко.го фиолетового можно пользоваться генцианом фиолетовым или метиловым фиолетовым.'

Кристаллический фиолетовый — спирто-водный раствор

1 мл насыщенного спиртового раствора разбавляют 10 мл дистиллированной воды

Кристаллический фиолетовый ——карболовый раствор

КрН'сталлдческий фиолетовый ....1 г

Карболовая кислота кристаллическая .2 >

Спирт 96% 10 мл

Вода дистиллированная100 »

Карболовый раствор кр иста л лического гендианового или ■метилавого- фиолетового готовят аналогично первой п-рописи карболового (растеора фуксина Циля (см. ниже) или смешивают 10. млг1 насыщенного спи|ртового раствора краокн со 100- мл карболовой кислоты; полученную смесь тщательно взбалтывают и фильтруют через бумажный фильтр. Растворы кр ирт а л л ич еакого метилового, геиицианового ф|Иолетового нестойки, поэтому их приготовление в большом кол(ичестве с ^расчетам на длительное хранение не рекомендуется.

Кристаллический фиолетовый Ацетат

Кристаллический фиолетовый (насыщенный раствор) 0,25мл

Уксусная кислота 5% 100»

Приготовлен1ную смесь тщательно взбалтывают и фильтруют через бумажный фильтр. Вместо крйсталл1ического фиолетового можно использовать насыщенный раствор метилового фиолетового. К|ра1ситель нестойкий, хранится не более месяца во флаконе темного стекла.

ФУКСИН

Фуксин — насыщенный спиртовой раствор

Основной фуксин8—9 г

Спирт этиловый100 мл

Фуксии — спирто-водный раствор

1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина разбавляют 10 мл дисти л лиров анно й вощы.

340

Фуксин Циля карболовый

Основной фуксин в порошке 1г

Карболовая кислота кристаллическая . . .5 »

Глицерин0,5мл

Спирт 96%Ю >

Вода дистилл up oib а hih а я100»

П роп и сь п е рв а я. 1 г основного кр ист а л л ич еского фуксина Циля растирают в фарфоровой ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты и несколькими {кашля'ми глицерина. Во время растирания небольшими порциями прибавляют- спирт. После того как краситель хорошо разотрется, приливают при постоянном помешм1ва1н.ии 100 мл дистиллИ|рава1Н- ной воды. Раствор красителя фильтруют через влажный бумажный фяльтр. Функсин Циля очень стойкий и мажет храниться долгое зремя во фла!ко(не темного стекла с притертой пробкой. *

Пропись вторая. К Ю мл насыщенног-о 53nHpтового раствора основного фуксина приливают 90 мл 5%. карболовой кислоты (карболовую кислоту вливают)в краситель, *а не. наоборот). Смесь в течение .нескольких минут энергич1но встряхивают, фильтруют через бумажный фильтр, а затем сл1И(вают во флакон для хранен-ия.

Фуксин спирто-водный (раствор Пфейффера)

К 1 ч. карболового фуксина Циля приливают 9 ч. дистиллированной воды. Раствор очень ：нестойК|ИЙ, лоэтому его готовят в небольших количествах непосред-ственно перед использованием.

МЕТИЛЕНОВЫЙ СИНИЙ

Метиленовый синий ——насыщенный спиртовой раствор

Метиленовый ситй8―9 г

Спирт этиловый 96%t00 мл

Метиленовый синий ——спирто-водный раствор

1 мл иасыщенного спиртового раствора метиленового синего разбавляют 30 мл дист.илл1Ирава1Н1Ной воды.

Метиленовый ЕннМ (Леффлера)

иового синего 30млДистиллированная вода 99>Едкое кали 1% 1：»иового синего 30млДистиллированная вода 99>Едкое кали 1% 1：»Насыщен1ны/ спиртовой раствор метэдле-

иового синего 30мл

Дистиллированная вода 99>

Едкое кали 1% 1：»

иового синего 30мл

Дистиллированная вода 99>

Едкое кали 1% 1：»

Насыщен1ный растшор метиленового ои-него фильтруют через бумажный фильтр, прибавляют едкое кали и разбавляют дистиллированной водой. Приготовленный таким образом раствор красителя может храниться во флаконе в течение длительного времени, не изменяя свойств.

Синька Нейссера

Готовят отд елын о два основных раствора Первый р а створ:

Метиленовый .синий

Этиловый спирт 96%

Ледяная уксусная кислота

Дистиллиров энная вода

Второй раствор:

Кристаллический фиолетовый1 г

Этиловый спирт 96% 10мл

Дистиллировавшая вода 300>

Для окраски зерен волютина 1непосредственно перед окраской смешивают 2 ч. первого раствора с 1 ч. второго раствора.

Толуидиновый Юиний —>ацетат

Толуидиновый синий

Ледяная уксусная кислота ..

Этиловый спирт 96% ....

Дистиллированная вода ...

Хризоидин — водный раствор

Хризоидин в порошке 1г

Дистиллированная вода150мл

В воронку на бумажный фильтр насыпают отвешенное количество краски, птеле чего вливают указанное количество кипящей воды.

Везувин, или коричневый краситель

Везувмн в порошке 2г

二пнрт этиловый 96% 60мл

Дистиллированная вода 40»

Пе1речи1слен(ные ингредиенты смешивают, нагревают до <кипения на слабом опне й после осты)ва1ння фильтруют через бумажный фильтр.

Нейтральный (Красный ——водный раствор

Нейтральный красный (0,5% раствор)...0,5г

Нейтральный красный (1 % раствор)..・1,0>

Нейтральный красный (1,5% раствор)...1,5»

Дистиллирова1гН'ая вода (кипящая) , . .100 мл

Малахитовый зеленый — водный раствор

Малахитовый зеленый в порошке ...5 г

Дистиллированная вода 100мл

Указанное количество >малах1итового зеленого ссыпают во флакон и заливают горячей дистиллираванной водой, ставят на сутки в термостат, периодически взбалтывая. На дне флакона остается небольшой осадок, свидетельствующий о на- сыщен1Н01СВД pacTBOipa.

Краситель Романовского—Гимзы

Краситель Ром а1нав!ского—Гимзы представляет собой смесь азура (органвдескн" краситель, получаемый .из метиленового синего), эозина и метиленавого синего. В растворенном виде К'рас1ителн имеет ф(иолетово-син1ий цвет. Продается в готовом виде.

Тушь 泣ля окраски препаратов по Бурри

Тушь черная 5мл

Дистиллированная вода 15 »

К 1 г объему черной туши прибавляют 3 объема досциллированной воды. Разведенную тушь наливают в центрифужную пробирку и центр И1фугируют 15——20 мин лри 2000— 3000 oiG/mihh для осаждения крупных qacTinu туши. После центри'фупирсива1ния пробирку ^быстро перевертывают, сливая надосадочный слой туши, и стерилизуют в автоклаве прн> 0,5 атм в течение 30 мин.

Реактив Калины

Раствор йодида калия 0,5%96 мл

Спиртовой раствор основного фуксина 5% ..2 >

Спиртовой pacTBoip йода 5% 2 »

ПРИГОТОВЛЕНИЕ КРАСЯЩИХ БУМАЖЕК ПО СИНЕВУ

Для приготовления красящих бумажек пользуются стандартной фильтровальной бумагой, которую п,ред1ва'ритель,нгг 1июпытывают та пригодность. Для этого отрезают полоску бумаги и погружают в cniHpTOBofi раствор красителя； затем вы-

34^

суШ'Ивают на воздухе. Хорошая бумага окрашивается равно- мерио, без пятеи. Затем от нее отрезают небольшой кусок и кладут 1на стекло с несколькими каплями воды. Пригодная для окраски бумага сразу пропитывается водой <и через несколько секунд 《отдает》 краситель, вследствие чего вода ескруг становится интенсивно окрашенной R соотвепствую- щий цвет. Если этого не происходит, бумага для приготовления красящих бумажек непригодна.

Техника приготовл е.н>ия красящих б ум а ж е к. Краситель, П|редназиачеиный для проп1иты1ва1ния бумаги, на・ лмвают в лоток ил>и глубокую тарелку. Бумагу нарезают в ваде полосок шириной 2—2,5 см 必 длиной 30——50 см. Полоску попружают на негаколько секунд в краситель так, чтобы ома1ЧИ1вались обе ее поверхности. Окрашенные полосы вынимают пинцетом, дают краюителю стечь н подвешивают на ве- ре®йе для .вы1сушиван1ия. Бумагу сушат на воздухе при комнатной температуре или в термостате при 37—50 ℃. Высушенные положи бумага разрезают на кусоч-ки размером 2x2 или 2X4,5 см.

Пропи с и paiCTBOpOB красителей дляприготовления бумаги.

Кристаллический генциановый или метиловый фиолетовый для окраски ло Граму

Кр-исталлический фиолетовый1 г

Спирт этиловыб 96%100мл

Глицерин 5»

Фуксин (основной)

Фуксин 2г

Старт этиловый 96%100мл

Глицерин 1>

Фуксин карболовый Циля

Пропись обычная: на 100 мл приготовленного красителя добавляют 1—Й мл глицерина.

.Метиленовый синий

Метиленовый синий 1г

Спирт этиловый 96% 400мл

Глицерин 1>

Малахитовый зеленый

Малахитовый зеленый 5г

Дистиллированная сода горячая ...100 мл

Глицерни 5»

РАСТВОРЫ

Изотонический раствор хлорида натрия

8,5 г хлорида натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды. Раствор доводят до кипения, остужают, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы или пробирки 妳 стерилизуют в автоклаве при 1—1,5 атм в течение 20 мин.

Раствор Люголя

Кристаллический йод 1г

Иодид калия 2»

Дистиллированная вода 300мл

йодит калия растворяют в 5—10 -мл дистиллированной воды, затем прибавляют кристаллический йод» оставляют на 1несколько часов до полного его раствор1ения и после этого приливают остальное количество воды.

Раствор Олсвера для хранения эритроцитов

1008005541886610080055418866Дистиллированная вода

10080055418866

10080055418866

Трехзамещенный цитрат натрия ..

Лимонная кислота

Хлорид натрия

Глюкоэа (х.ч.)

Реакция приготовленного раствора должна соответствовать pH 6,4.

Раствор Мигуновой для хранения эритроцитов

Дистиллированная вода100мл

Глюкоза 6г

Хлорид натрия 850мг

АГАРОВЫЕ СРЕДЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ПРИПОСТАНОВКЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

Агар для постановки реакции преципитации

2 % агар, npinroTOB л ен ны й на днети л лиров а нной воде^ разливают в горячем состоянии в ванночки слоем толщинойг- 1—1,5 см. После застывания агаровую пластинку разрезают «а кубики величиной 0,5——1 см3, которые промывают в течение 2 сут upoTOTiHOH водопроводной водой, а затем сутки—— дистиллиро(ва1нной водой, меняя ее за это время 3—4 раза. После промы1вания агар по возмож1ности освобождают от свободной воды, разогревают м разводят в горячем состоя-

яти в 2 раза 1,7% раствором хлорида натрия, чтобы конечная концентратия агара была 1%, а 'Концентрация NaCl——. 右,85%.

Горячий агар трижды фильтруют через бумажный фильтр и консервируют 1мертиолатом из расчета 1 О'бъем 1% мертио- лата на 100 объемов агара. Готовый агар разливают в кол.бы приблиз1ительно по 25—30 мл, что：бы не происходило изменения его кон1ОИ1Стен|Ции при многократных разогреваниях. Агар хранят на холоду или при 1ко1мнатной температуре. Перед употреблением его разогревают на водяной бане, затем охлаждают примерно до темшературы 50——60 ℃ и разливают 、в чашки. Агар должен быть предельно О'Оветлен1ным и прозрачным.

Бифталатный агар (pH 6,2) для определения лизоцима

20,42 г бифталата калия растворяют в 1 л дистиллированной воды (ОДЫ раствор бифталата калия). Заданное значение pH получают добавлением 8—10 мл 10 N или 2—3 мл 1N раствор а едкого натра.

К 100 мл приготовленного раствора бифталата калия с pH 6,2 добавляют 1 г агара Дифко, смесь нагревают на слабом огне до полного .растворения агара, доводят до кипения, стерилизуют 15 мин при, температуре 115℃ в авто- .клаве. .

РЕЦЕПТЫ ИНДИКАТОРОВ

Инд(икаторам1и называют различные химические ветест- за, которые с мзмененкем pH юреды изменяют свою окраску. ■Различают 0Д|Н0|Цветные и двухцветные индикаторы. У одноцветных индикаторов в за1висимо(сти от pH среды изменяется тон окрааки, у двухцветных — цвет. Каждый индикатор спо- «со|бен изменять авою окраску только в о：пределен1ньих пределах значения【pH.

Лакмусовая настойка

Продажный лакмус в кусках помещают в фарфоровую ■стулку, 1иэмельчают в порошок и экстрагируют 3 сут при температуре 37 ℃ IB десятикратном количестве 96% спирта, ежедневно меняя его. Затем спирт сливают, осадок высушивают ив термостате. Сухой осадок заливают 10-кратньш количеством дистиллированной воды и после трехдневного настаива- чния при комнатной температуре фильтруют. В кислой среде лакмусавая настойка имеет красноватую окраску, в щелочной среде ——синюю.

Настойка лакмуса в темном месте в хорошо закрытом флаконе может сохраняться долгое время.

Индикатор бромтимоловый синий

Бромтимоловый синий позволяет определить изменение .реакции среды в пределах pH 6,0—7,6. В щелоч1ной зоне pH 7,6 индикатор имеет синий цвет, в кислой зоне pH 6,0 — желтый. При изменении pH в указанном диапазоне бро^тимоло- вый синий изменяет окраску через различные оттенки зеле- ihoto цвета. В нейтральной точке pH 7,0 индикатор имеет ха- рактер1ный, легко запоминающийся травя1нистый оттенок.

В работе применяют раствор бромтимоловый синий, приготовленный по следующей прописи.

Бро»мтимоловый синий 0,4 г растворяют в 40 <м〃 дистил- лмрованной)воды, нагревая ее до кнпенмя. После этого к раствору прибавляют 6,4 мл децш н ор.м а льного раствора едкого натра, в результате чего жидкость приобретает зеленоватый цвет, и доливают дистиллировап1ной водой до 100 мл. При- гото1влен!ный таким образом индикатор может сохраняться в теммом месте в склянке, закрытой притертой пробкой в течение длительного времени.

Индикатор розоловая кислота

Розоловую кислоту (1 г) растворяют в 500 мл эгилового спирта. Если раствор окрашен в желтый цвет, прибавляют едкий натр до "появления жраановатого оттенка. В киюлой среде индикатор имеет ли!М>о.нно-ж«елтый цвет, в щелочлой——ро- зово-<крясный. Переходная зона pH 6,8—7,0.

Индикатор Андреде

Фуксина кислого 0,5 г растворяют в 16,4 г N раствора гидрата окиси -натрия, прибавляют 100 мл дистиллированной воды, |Настаивают 24 ч при 37 ℃, стерилизуют при температуре 100℃ в течение 5 мин. Сохраняют во флаконах темного' стекла с притертой пробкой. Приготовленный так-им образом индикатор имеет соломенно-желтый цвет. При смещении pH в кислую зону (Индикатор Ап др еде приобретает ярконмали!но- вую окраску.

Индикаторная бумага на сероводород

Для выявления сероводорода полоски фильтровалыной бумаги смаивают в растворе следующего состава:

дистиллироваиная вода1°°мл

ацетат свинца 20г

бикарбонат натрия 1>

Бумагу высушивают, .нарезают полосками шириной 0,2—— 0,4 мм и длиной 5—6 ом. Перед употреблением бумага бес- нветна, а при образовании микробной культурой сероводорода приобретает черно-бурый цвет.

Индикаторная бумага на индол

Полоски фгильтровальной бумаги пропитывают следующим уеакти®ом: парадиметила1мвдобе1нзальдегид ——5 г, спирт этиловый 96% —50 мл, фосфарная кислота (очищенная концентрированная) —10 мл. После растворения порошка полученной тепловатой жидкостью смачивают полоски фильтровальной бумаги, высушивают и хранят их в банке темного стекла. Цвет бумажек желтый, при наличии индола — сероваторозовый до интен.сИ|ВНо малинового.

Индикатор для обнаружения оксидазы

Нафтола 30—40 мг растворяют в 2,5 мл этилавого опирта- тректафиката, добавляют 7,5 мл дистиллированной воды и растворяют 40—60 мг диметил-П-фенилендиамина.

РЕЦЕПТЫ ОСНОВНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Мясная вода

Парную говядину или конмну освобождают от костей, жира, сухожилий, пропускают через мясорубку. 1 кг полученного мясного фарша заливают 2 л водопроводной воды .и кипятят в течение часа, накипь снимают. После кишения мясную воду остужают для застывания жира, который легко при этом удаляется, фильтруют через ватно-марлевый ф-ильтр до полной лрозра^чностн, затем доливают водопроводной водой до первО|Началь1Ного объема, разливают в бутыли и стерилизуют 20 мин при температуре 130 ℃.

Вместо мясной воды можно применять 'плацентарную во ду, приготовляемую следующим образом. Свежую, промытую <(и оавобожденную от оболочки человеческую плаценту пропускают через мя1сорубку. Фа(рш зал.и=вают двойньим объемом ■воды, кипятят в течение 30 мин, фильтруют, разнлвают в бу- тыл-и и стерил1изуют 30 мин в автоклаве при температуре 120 ℃.

Получен1ную таким образом мясную воду стерилизуют в бутылях, закрытых ватно-；марлввыми пробками, 20 mmih при температуре 120 ℃ или дробно текучим паром. Стерильная мя-сная вода, являющаяся основой для приготовления многих -питательных сред, может сохраняться длительное время.

Пептонная вода

К диет ил Л'Ир ав анн ой воде прибавляют 1——2% пептона и 0,5% хлорида натрия, устанавливают необходимое значение 348

pH, кипятят 30 мин, проверяют pH, фильтруют через бумажный фильтр до полной прозрачности .и стерилизуют при температуре 120 ℃ в течение 30 мин.

Мясо-^пептонный бульон

К 1 л мясной воды добавляют 1 % сухого лептона 必 0,5% хлорида натрия, устанавливают необходимую реакдаю, кипятят в течение 30 мин, после чего доводят уровень воды до и epiBOH ач а л иного объема. Затем фильтруют через бумажный фильтр, окончательно устанавливают насыщен1ньш раствором пвдрокар|боната натрия .или 10% раствором едкого натра требуемую реакцию, стерилизуют 15—<20 мнн при температуре 120 °C. Если после стерилизации в мяоо-пептонном бульоне выпадает осадок, его фильтруют вториадо и снова стерилизуют. Вторичная стерилизация производится при более низкой температуре, чем пр едш ествующа я, для предотвр ащени я выпадения осадка.

Триптический перевар Хоттингера

Говяжье мясо освобождают от костей, жира, сухожилий, нарезают мелки ми кусочками, взвешивают и опускают в кипящую воду из расчета 1 кг мяса на 1 л воды. Мясо кипятят в течение 15——20 miwh, затем вынимают и пропускают через мясорубку. Бульон смешивают с фаршем и сливают в бутыль с таким расчетом, чтобы 7з бутыли оставалась свободной. К горлыш-ку бутыли подбирают хорошо пригнанную резиновую пробку. Смесь подщелачивают 20% раствором игитьввой соды до pH 7,8——8,0, прмбавл^ют очищенную от жира, соединительной ткаии и дважды пропущенную через мясорубку поджелудовдую железу -в количестве 10% к имеющемуся объему (на 1 л жидкости 100 г железы). Вместо ота«креатичеокой железы можно прибавить па!йкреати'Н в количестве 0,5% и выше в зависимости от его активности. Че- <рез 1—2 ч после доба1влен.ия фермента проверяют реакцию перевара и подщела<ч!И1вают его повторно до pH 7,4—7^5. От- сутствие сдвига реакции смеси в сторону окисления после прибавления фе,р(мента указывает на его недоб-рокачествен- ' ность..

Содержимое бутыли тщательно перемешивают, добавляют хлороформ из расчета 10—30 мл на каждый литр перевара. Бутыль плотно закрывают резиновой пробкой и ставят в термостат при 37 ℃ на 7—10 сут. В течение первого дня содержимое бытыли лереметивают вначале каждые 15—30 мин, затем через 2—В % а в последующие дай — по неокольку раз в день, открывая при этом пробку для выхода избытка паров хлороформа.

При стоя|Н1Ии в термостате мясо ферментируется, превращаясь в од'нородиый осадок с еров ато-!Ж ел того цвета, а жидкость из мутно-серой становится совершенно прозрачной,, соломенно-желтого цвета. Об окончании переваривания судят по образованию триптофана, обнаруживаемого следующим образом: в пробирку наливают 3—4 мл фильтрованного перевара, добавляют 3—4 капли бромной воды. При наличие триптофана жидкость принимает розово-фиолетовый цвет.

Приготовление бромной воды. На 100 мл дистиллированной- воды берут 33,5 мл чистого брома для получения насыщенного раствора. Хранят в склянке темного стекла (не на свету!).

По О1канчании гидролиза перевар фильтруют через бумажный фильтр, разливают в бутыли и стерилизуют 30 мян пр%， температуре 120 ℃.

Бульон на переваре Хоттиигера

Для приготовления бульона основной перевар Хоттингера разводят в несколько раз дистиллированной или водопровод- «ой водой, добавляя 0,5% хлорида натрия, 0,1% дауза=меще1н- >ного фосфата калия, устанавл1И1вают pH 7,4——7,6 и кипятят 15—20 мин.

Пригото!влен|ный таким образом бульон фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр, разливают во флаконы или пробирки .и стерилизуют при температуре 120 °C в течение 20—30 мин.

Мясо-пептонный агар

К мясной воде прибавляют 1 % пептона и 0,5% хлорида натрия, кипятят на слабом оше при постоянном помешивании до полного растворения добавлеаных ингредиенто1В. Прм- готовлен1ный таким образом бульон фильтруют, устанавливают слабощелочную реакцию (pH 7,2—7,4) и добавляют 0,2—2% измельченного агар-агара (в зависимости от качества агар-агара и нажачения среды). После добавлеашя агар-агара жидкость кипятят на слабом огне при постоянном пометИ1ва(нии до пол|ного растворения агара. При помутиeiHM среды ее просветляют одним из указанных способов (см. с. 42). Приготовленный агар фильтруют или декантируют^ разливают в пробирки или во флаконы и стер!илизуют в - автоклаве при температуре 120 ℃ в течение 20 ми：н.

Основной пептон Мартена

Свиные желудки тщательно очищают от пленок, жира <и грубого содержимого, н е промьшая внутр емней ч а с- т и, разрезают на куаки и пропускают через мясорубку. Полученный фарш помещают в бутыли, доливают водолроводнюй 350

водой, подогретой до температуры 50℃ (на 200 г фарша прибавляют 1 л воды), а затем добавляют 10 мл концентрированной соляной кислоты.

Содержимое бутыли хорошо перемешивают и ставят на сутки в термостат при 45—48 ℃. Первые 6—7 ч бутыль периодически встряхивают, а затем дают жидкости отстояться. К концу 2-х суток жидкость окрашивается в интенюив'но желтый цвет и вместо круптиого фарша на дне бутыли образуется ж ©большое коЛ'Ичеютво го1моген!ного, похожего на желтый песок осадка. Надоюадочный слой полученного таким образом основного пептона Мартена осторожно сливают, прогревают при температуре 80℃ в течение 10 就ин для прекращения действия ферментов.

Пептон Мартена стерилизуют текучим паром 30 мин, хранят в сухом и прохладном месте. Употреблять его можно не ранее чем через 5 сут после при1гото,влен1ия.

Бульон Мартена

Накануне приготоозления бульона готовят мясную воду. Для этого 500 г мясного фарша заливают 1 л воды, добавляют 4 г хлебных прессованных дрожжей, раз5зеден1ных в небольшом количестве воды, помещают в термостат при 37 ℃ на 12—14 ч, фильтруют через ватно-^марлевый фильтр, кипятят и вновь фильтруют.

Затем смешивают равные количества мясной воды и пептона Мартена (рец. 39). Смесь кипятят 10 мин, подщелачивают 10% раствором едкого натра до pH 8,0—8,2, добавляют 0,5% ацетата натрия, кипятят 5 мин, фильтруют и разливают в матращы. Бульосн Мартена стерилизуют дробно текучим паром 2 для подряд по 40 мин.

Агар Мартена

В бульон Мартена, подогретый до температуры 50——60 ℃, опускают мелко нарезанный промытый агар-агар <из расчета 25 г на 1 л, периоди1чеаки помешивая, жидкость доводят до кипения для полного растворения агар-агара. В горячем состоянии агар фильтруют через ватно-1марлевый фильтр, разливают в посуду и стерилизуют в автоклаве 30 мин при температуре 120 °C.

Сахарный бульон (бульон с глюкозой)

К мясо-пептонному бульону нейтральной реакции прибавляют глюкозу в количестве 0,25—12%. Перед добавлением к бульону глюкозу растворяют в я ©большом количест1ве дистиллированной воды. Приготовленную среду стерилизуют теку-

чим паром 3 дня подряд по 30 'мянн или однократно в автоклаве при температуре 115℃ 30 мин.

Сахарный агар (агар с глюкозой)

К расплавленнаму мжсо-пеаггонному агару прибавляют от 0,5 до 2% глюкозы, предварительно растворенной в небольг шам количестве нистилли1Poважной -воды. Приготовленную среду стерилизуют дробно, 3 да я по 20 мим или 15 мин при температуре 115℃ в автоклаве.

РЕЦЕПТЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТАЦИИ УГЛЕВОДОВ

Цветные среды Гисса с углеводами

К 100 мл ди1стиллиро!ванной воды прибавляют 1 г лептона, 0,5 г хлорида натрия. Пептон к соль растворяют при нагревании воды в течение нескольких минут, фильтруют через бумажный фильтр так, чтобы раствор был совершенно прозрачным, устанавливают pH 7,0—7,4, прибавляют 0,5—1 г одного из необходимых углеводов (лактоза, глюкоза, сахароза, маннит и т. д.), а затем индикатор Андреде в количестве 1 мл на 100 мл среды или 0,1 мл 1,6% раствора индикатора бромтимолового синего.

Готовую среду разливают по 3 мл в пробирки, простери- лизованные вместе с поплавками, р асп о ложенными запаянным концом кверху. Среду стер1или.зуют текуч!им паром 3 дня подряд по 30 или 20 мин при температуре 112℃. Во время стерилмзации поплавки залолляют^я доверху питательной средой. Основой сред, применяемых для определения ферментации углеводов, является пептонная вода. Мясной бульон для этой цели непригоден, так как он содержит различные углеводы, что может привести к получению неправильных результатов. Среды Гисса с индикатором Андраде имеют соломенно-желтый цвет, с индикатором бромтимоловым синим—болотно-зеленый (pH 7,0——7,2). В результате роста бактерий, сопровождающегося расщеплением углевода с образованием кислых продуктов pa.cn ад а, цвет среды изменяется: в первом случае она приобретает ярко-розовый цвет; во втором ——желтый.'

Образование газа в среде определяют по наличию пузырьков газа, собирающихся в паплавке.

Среды Гисса с сывороткой крови

К готовым средам Гисса добавляют 10—30% стерильной лошадиной сыворотки. Для контроля сыворотки выдерживают в течение 3 дней в термостате.

Среды Гисса на сыворотке

Стерильную лошадиную сыворотку разводят стерильной дистиллированной водой (1:5), прогревают в текучепаровом аппарате при температуре 100℃ в течение 30 мин. Прибавляют 0,5% углеводов (глюкоза, мальтоза или сахароза), устанавливают pH 7,6 и прибавляют 1 мл 1% водного раствора кислого фуксина на 100 мл среды, разливают по пробиркам и стерилизуют при температуре 1(Ю℃ 3 дня подряд в течение 10 мин.

Приготовленная среда почти бесцветна. Перед употреблением ее выдерживают для проверки на стерильность в термостате в течение 2 сут. При расщеплении углеводов с образованием кислоты среда краснеет и сыворотка свертывается. Срок наблюдения над изменением среды 2——3 сут.

Среды Гисса с крахмалом

Обычный картофельный крахмал в количестве 25 г несколько раз промывают теплой дистиллированной водой для удаления растворимых частиц. Затем заваривают 500 мл горячей дистиллированной воды и отстаивают. Надосадочный слой крахмальной воды сливают для дальнейшего использования. Отдельно готовят пептонно-сывороточную воду: растворяют 5 г пептона и 1 г двузамещенного фосфата натрия в 1250 мл .дистиллированной воды, добавляют 250 мл лошадиной сыворотки, устанавливают pH 7,6. Крахмальную воду (325 мл) смешивают с 1250 мл пептонно-сывороточной воды, к смеси прибавляют 40 мл 0,02% спиртового раствора фенолового красного и все кипятят в водяной бане в течение часа, затем фильтруют через бумажный фильтр, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин. Приготовленная среда имеет насыщенно розовый цвет. Результат ферментации крахмала учитывают через 3 сут после произведенного засева культуры. При расщеплении крахмала цвет среды изменяется в желтый и она свертывается.

РЕЦЕПТЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯРЕДУЦИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ БАКТЕРИЙ

Молоко с метиленовым синим

Свежее молоко доводят на огне до кипения, оставляют в прохладном месте на сутки, освобождают от сливок, вторично кипятят, оставляют снова на сутки и вторично снимают верхний слой. Обезжиренное таким образом молоко фильтруют через толстый слой ваты, подщелачивают 10% раствором карбоната натрия до pH 7,2.

35335323 Лабинская А. С.

353

353

К 100 мл молока добавляют 2 мл 1% водного раствора метиленового синего. Приготовленную среду разливают по 5 мл в стерильные пробирки и стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин. Среда после остывания имеет насыщенно голубой цвет, при редукции метиленовым синим обесцвечивается и приобретает кремовый цвет.

Лакмусовое молоко (в прописи Минкевича)

100 мл свежего молока подщелачивают 10% раствором питьевой соды до слабощелочной реакции (по лакмусу), кипятят и прибавляют 100 мл дистиллированной воды и 5 мл лакмусовой настойки. Приготовленную таким образом среду сливают в бутыли, прибавляют на 1 л 10 мл хлороформа, закрывают плотно резиновой или корковой пробкой, хорошо встряхивают н ставят на 2——3 дня в темное место. Будучи тяжелее воды, хлороформ оседает на дно, увлекая за собой растворившиеся в нем сливки. Обезжиренную таким образом среду осторожно сливают, разливая по пробиркам по 5 мл, и стерилизуют 20 мин при температуре 115 ℃.

Вынутая из автоклава среда вследствие редукции лакмуса имеет желтый цвет, и только через несколько часов приобретает характерный для нее бледно-фиолетовый оттенок.

В результате роста различных видов бактерий лакмусовое молоко изменяется неодинаково. Изменение среды отмечают в протоколе исследования, пользуясь условными обозначениями:

N — рост бактерий, не сопровождающийся изменением реакции среды и, следовательно, изменением ее цвета.

К — кислотообразование в среде с четко выраженным по- розовением ее.

NK — слабовыраженное кислотообразование, вызывающее изменение оттенка среды, улавливаемое только при сопоставлении опытной пробирки с контрольной (незасеянная среда).

Щ — щелочеобразование, сопровождающееся явно выраженным посинением среды.

МЩ — слабовыраженное щелочеобразование, сопровождающееся изменением оттенка среды, улавливаемое только при сопоставлении ее с цветом контрольной пробирки.

Р ——редукция лакмуса, проявляющаяся полным обесцвечиванием лакмуса.*

РЕЦЕПТЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ СПОСОБНОСТИ БАКТЕРИЙ

Питательный желатин

К мясо-пептонному бульону прибавляют мелко нарезанный желатин из расчета 10—15 г на 100 мл. Желатину дают набухнуть и затем раствориться при медленном нагрева-

нии в водяной бане, доведенной до температура*^)—450(3. Устанавливают pH 7,0, прибавляя к расплавленном^ желатину 10% раствор бикарбоната натрия.

При более щелочной реакции желатин застывает плохо, а иногда совсем не застывает. После установления pH среды фильтруют через складчатый бумажный фильтр. Процесс фильтрации протекает очень медленно. Чтобы желатин не застывал, процесс фильтрации производят в горячем автоклаве. Полученный фильтрат, как правило, бывает совершенно прозрачным. Профильтрованную среду разливают в пробирки по 5——8 мл так, чтобы не намочить края и верхнюю часть пробирки, соприкасающуюся с пробкой. Стерилизацию среды производят дробно 3 дня по часу при температуре 100℃ или однократно при 110еС в течение 20 мин. После стерилизации среду охлаждают в строго вертикальном положении, чтобы верхняя часть столбика при застудневании оставалась совершенно равной.

Молочный агар Эйкмана

К 10 мл стерильного расплавленного на водяной бане мясо-пептонного агара добавляют, соблюдая правила асептики, 2,5——3 мл снятого стерильного молока. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и выливают в чашку Петри. Среду используют без дополнительной стерилизации, так как совместная стерилизация молока с агаром неприменима вследствие свертывания казеина с образованием хлопьев.

Свернутая сыворотка

Стерильную лошадиную сыворотку (не содержащую консерванта) разливают в стерильные пробирки в количестве 4——5 мл для приготовления среды со скошенной поверхностью и по 7——10 мл для 'приготовления столбиков. Пробирки помещают в водяную баню, подогревая воду до температуры 65℃ (по 45 мин в течение 3 дней подряд). При указанной температуре сыворотка свертывается. Для приготовления свернутой сыворотки со скошенной поверхностью пробирки прогревают в наклонном положении. Для получения свернутой сыворотки столбиком пробирки прогревают в вертикальном положении.

Бульон с кусочками вареного куриного белка

К пробирке со стерильным мясо*пептонным бульоном нейтральной реакции прибавляют кусочки вареного куриного белка, нарезанные в форме кубиков с гранями 5—^8 мм. Бе-

лок куриного яйца нарезают в стерильной посуде и затем стерилизуют в течение 20 мин при температуре 120℃. Про- • стерилизованные кубики коагулированного белка прибавляют к стерильному бульону, соблюдая асептические условия.

Среда Строгова для определения индола

Хлорид натрия0,5 г

Двузамещенный фосфат калия0,25 »

Триптофан0,25 »

Дистиллированная вода 100 мл

После полного растворения всех ингредиентов среды (можно при подогревании) среду разливают по 2—3 мл в пробирки и стерилизуют 40 мин при 100℃.

Среды для определения индолообразования

В качестве основной питательной среды применяют бульон Хоттингера, мяспой или казеиновый бульон или пептонную воду. Среда должна обязательно содержать триптофан, который катализируется триптофапазой бактерий и расщепляется с образованием индола.

Поэтому для большей достоверности в указанные среды рекомендуется добавлять Z-триптофан (50 мг на 1 л среды). Среда, применяемая для выявления индолообразования, не должна содержать углеводов, так как они препятствуют образованию индола. ,

Для выявления образовавшегося индола пользуются индикаторными бумажками (способ приготовления см. Приготовление индикаторов, рец. 31).

РЕЦЕПТ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

Кровяной агар

Расплавляют определенное количество 2% мясо-пептонного стерильного агара, охлаждают его до температуры 45℃ (не выше!) и прибавляют 5—10% дефибринированной стерильно взятой крови лошади, кролика или барана. Добавление крови производят, соблюдая правила стерильности. Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри (предварительно нагретые в термостате), дают ей застыть и подсушивают в термостате. Слой агара должен быть равномерно окрашен в красный цвет.

РЕЦЕПТЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ

кокков

Бульон и агар из мяса по Левинталю

Двуосновный фосфат натрия в количестве 8 г растворяют в 1 л дистиллированной воды, подкисляют хлористоводородной кислотой до pH 5,6——6,0 (буферный раствор).

100 г мясного фарша, 300 мл стерильной; дистиллированной воды, 10 мл гидрокарбоната натрия хорошо перемешивают и оставляют при температуре 37℃ на 2 ч. Добавляют 0,5 г панкреатина, растворенного в 20 мл воды, 2 мл N раствора соды и 10 мл хлороформа； герметически закрывают и оставляют на 24 ч при температуре 37℃, периодически встряхивая. Через сутки производят предварительную пробу, для чего смешивают 20 мл буферного раствора и 20 мл равномерно взболтанной мясной кашицы и кипятят 1 мин, фильтруют через бумажный фильтр, охлаждают, определяют pH, который должен быть равен 6,9——7,2. В случае несоответствия pH среду подщелачивают или подкисляют. Для приготовления бульона смешивают равные количества мясной кашицы и буферного раствора, кипятят, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, исправляют реакцию до pH 7,2——7,4, снова кипятят, разливают в пробирки и стерилизуют.3 дня подряд в текучепаровом аппарате (пептон и соль не добавляют).

Для приготовления агара по Левинталю:

К 1 л двуосновного фосфата натрия добавляют 3% агара (после 2 ч разбухания), расплавляют в текучепаровом аппарате, декантируют, не осветляя, устанавливают pH 5,5— 6,0. J

Расплавленный и охлажденный до температуры 70— 80 ℃ буферный агар смешивают с равным объемом мясной кашицы, кипятят 1 мин, декантированный, нарезанный комочками агар переносят в колбу и еще раз дают вскипеть, фильтруют через бумажный фильтр горячим, подщелачивают 10% раствором бикарбоната натрия до pH 7,6—7,8, разливают в пробирки и стерилизуют 3 дня подряд при температуре 100 ℃ в течение 10—15 мин. Среда должна быть прозрачной.

Сывороточный бульон

Смешивают 1 ч. свежеприготовленного мясо-пептонного бульона pH 7,6 и 2 ч. свежей кровяной сыворотки (бычьей или лошадиной). Мартеновский бульон и сыворотку смешивают в соотношении 1 : 1. Сыворотку перед прибавлением ее к питательной среде инактивируют прогреванием в течение 30 мин в водяной бане при температуре 56℃.

Сывороточный агар

В качестве основы используют 3% мясо-пептонный агар, pH 7,4—7,6, расплавленный и остуженный до 45——50℃, к которому, соблюдая правила асептики, добавляют 10——25% стерильной лошадиной или бычьей сыворотки, без консерванта или консервированной хлороформом.

Смесь тщательно перемешивают, следя за тем, чтобы не образовалась пена, и разливают в чашки или пробирки для застудневания.

Комбинированный мясной бульон (для производстваскарлатинозного токсина)

Смешивают 900 мл триптического мясного гидролизата, 900 мл мартеновского пептона и 5 г хлорида натрия, постепенно нагревают, подщелачивают до pH 7,8. Кипятят в течение 15 мин. Добавляют 0,5% мальтозы или глюкозы, после чего бульон фильтруют, разливают по 100—200 мл во флаконы, стерилизуют дробно текучим паром по 30 мин в течение 3 дней.

Желточно-солевой агар (Чистовича)

Для приготовления желточно-солевого агара готовят впрок мясо-пептонный агар (pH 7,2—7,4) с содержанием 10% хлорида натрия. После разливки во флаконы по 100—— 200 мл агар стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин при температуре 120 ℃. Перед употреблением растапливают, охлаждают до 45—50 ℃ и добавляют 20% (по объему) стерильной желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 150—— 200 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия). Среду быстро перемешивают, разливают в стерильные чашки, которые продолжительное время могут сохраняться в холодильнике.

Молочно-солевой агар Петрович

К расплавленному мясо-пептонному агару pH 7,2——7,4, со держащему 5—7,5% хлорида натрия, добавляют 10% стерильного теплого хорошо обезжиренного молока, тщательна перемешивают и разливают в чашки.

Желточная среда Чистовича

Мясо-пептонный питательный агар готовят по общеприня1- той прописи и добавляют к нему 20% желточной взвеси (1 желток на 150—200 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия). Желточную взвесь готовят, соблюдая правила асептики.

64・ Среда для получения стафилококковогоэнтеротоксина

На 1000 мл дистиллированной воды прибавляют пептона 20 г, однозамещенного фосфата калия 1 г, хлорида натрия 5 г, хлорида кальция D,1 г» хлорида магния 0,2 г, агар-агара, мелко нарезанного и промытого, 0,8 г. Устанавливают' pH 7,0——7,2. Приготовленную смесь ставят на слабый огонь, доводят до кипения. Разливают во флаконы по 500 мл, стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин при температуре 115 °C.

Среда Гарро

К 100 мл расплавленного и остуженного до 45 ℃ мясопептонного агара (pH 7,4) добавляют 3—5% крови кролика или барана и 0,2% водного 0,1 % раствора генцианового фиолетового.

Среда Бейли

Агар (30 г) промывают в водопроводной воде и погружают в 1 л дистиллированной воды на 8——10 ч, затем ставят в автоклав на 20 мин при давлении 1 атм, фильтруют через марлю, охлаждают до температуры 58℃, добавляют 250 г мелко нарезанного мяса и 250 г бычьего сердца. Смесь нагревают при температуре 80 ℃ в течение 30 мин, процеживают через марлю, прибавляют 1% пептона и 0,5% хлорида натрия, подщелачивают едкнм натром до установления pH 7,3— 7,5. Приготовленную таким образом среду переливают в стаканы и оставляют до следующего дня. На следующий день с застывшего агара срезают прозрачную верхнюю часть, стерилизуют ее текучим паром 3 дня подряд по 15 мин при температуре 100 ℃. Перед посевом к среде стерильно добавляют 25% асцитической жидкости.

Ристомициновая среда

Готовят 20% сывороточный агар (рец. 59), добавляя одновременно с сывороткой 0,75 мл (или другое количество в зависимости от результатов предварительного титрования) водного раствора ристомицина, содержащего 20 000 ЕД в 1 мл. Раствор антибиотика готовят в стерильной воде и со храняют в холодильнике. После добавления сыворотки и ан- тибиртика среда готова для использования в течение 48 ч при хранении ее в холодильнике. Перед употреблением обязательно подсушивание.

Среда обогащения для гонококков

Дистиллированная вода, свободная от хлора 1000 мл Агар-агар 30 г

м > А А А 002000020 9 11м > А А А 002000020 9 11Дистиллированная вода, свободная от хлора Тиогликолевая кислота . . * Едкий натр, раствор Однозамещенный фосфат натрия, 20% раствор Хлорид кальция, 10% раствор

м > А А А 002000020 9 11

м > А А А 002000020 9 11

Вторую смесь прибавляют к свежеприготовленному агару (1-я смесь), устанавливают pH 7,3——7,4. Приготовленную таким образом среду разливают в стерильные пробирки по 10 мл, стерилизуют текучим паром в течение часа.

РЕЦЕПТЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙСЕМЕЙСТВА КИШЕЧНЫХ

БАКТЕРИЙ

СРЕДЫ ДЛЯ КОНСЕРВИРОВАНИЯ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА

69. Глицериновая смесь

Пропись первая. 330 мл нейтрального глицерина смешивают с 670 мл 0,6% раствора хлорида натрия. Для создания щелочной реакции (pH 7,0——7,2) к смеси прибавляют 20% раствор фосфата натрия.

Пропись вторая. 1 л 0,75% раствора хлорида натрия смешивают с 500 мл х. ч. нейтрального глицерина и прибавляют 20% раствор фосфата натрия в таком количестве, чтобы получить pH 8,0. Приготовленный консервант стерилизуют дробно или в течение 10 мин при температуре 112℃. После стерилизации pH снижается до 7,6—7,8.

Боратная смесь Изралимского и Теплицкой

В 1 л дистиллированной воды растворяют 10,4 г буры, 16,8 г борной кислоты и 19,8 г хлорида натрия. Устанавливают pH 8,3 и разливают по 5 мл в стерильные пробирки.

Консервант Шустовой

К 100 мл 2% мясо-пептонного агара, растопленного и охлажденного до 45—50℃, добавляют 10 мл 50% раствора серноватистокислого натрия и 2 мл раствора йода в йодиде калия (см. среду Мюллера, рец. 72).

360

СРЕДЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИБАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА КИШЕЧНЫХ

Среда Мюллера \ ■

Колбу, содержащую 4,5 г мела, стерилизуют сухим жаром, после чего в нее наливают 90 мл мясо-пептонного бульона, стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин при температуре 120 ℃. В асептических условиях в колбу прибавляют 2 мл раствора Люголя и 10 мл раствора серноватистокислого натрия. Раствор Люголя: 20 мл йода, 25 г йодида калия и 100 мл дистиллированной воды. Раствор серноватистокислога натрия: к 50 г серноватисто кислого натрия добавляют 100 мл, дистиллированной воды, стерилизуют в аппарате Коха 30 мин.

После добавления каждого ингредиента смесь тщательно взбалтывают. Среду разливают по 8—10 мл в стерильные пробирки или во флаконы по 90 мл.

Тетратионатовая соль натрия, образующаяся в результате взаимодействия серноватистокислого натрия и йода, подавляет рост кишечной палочки и способствует росту тифонара- тифозных бактерий.

Среда Кауфмана

К 100 мл среды Мюллера добавляют 1 мл водного раствора бриллиантового зеленого (1 :1000) и 5 мл стерильной бычьей желчи. Приготовленную смесь стерилизуют текучим паром в течение 30 мин. Среда сохраняется длительное время. До стерилизации среда зеленого цвета, после стерилизации она приобретает зеленовато-коричневый тон.

Селенитовая среда накопления Лейфсона

Селенит натрия кислый (без примеси теллура) 4 г

Пептон импортный чешской фирмы «Спофа»

или венгерской фирмы «Рихтер»5A

Фосфат натрия двузамещенный безводный (7а

Фосфат натрия однозамещенныйЗа

Лактоза 4A

Дистиллированная вода 1000мл

,Среду готовят из двух основных растворов. Прежде всего экспериментально определяют точную пропорцию двузаме- щенно(,о и однозамещенного фосфата натрия, которая с используемым образцом пептона и кислого селенистокислого натрия дает pH не выше 6,9—7,1, что регулируется изменением соотношения фосфатов. Такая предварительная подтит- ровка производится всякий раз, когда меняется серия любого из входящих в среду основных ингредиентов (пептон, кислый селенистокислый натрий, фосфаты).

После установления указанных соотношений к приготовленному раствору фосфатов добавляют пептон и лактозу, разливают во флаконы по 50 мл и стерилизуют текучим паром 2 дня по 30 мин или при температуре 112℃ однократно в течение 30 мин.

Отдельно на стерильной воде готовят 10% раствор кислого селенита натрия. Перед началом работы на каждый флакон с 50 мл основного раствора добавляют 2 мл раствора ：кислого селенита натрия. Приготовленную среду разливают ■в стерильные пробирки по 5—7 мл и закрывают плотно пригнанными пробками.

Раствор А. Пептон отечественный (семипаРаствор А. Пептон отечественный (семипаСреда обогащения «М» (магниевая среда с малахитовым зеленым в прописи Г. П. Калины и В. Л. Шигановой)

Раствор А. Пептон отечественный (семипа

Раствор А. Пептон отечественный (семипа

латинский)*0,42 г

Хлорид натрия0,7 »

Дрожжевой диализат *0,9 мл

Фосфат калия0,15 г

Дистиллированная вода .. г ..89мл

Раствор Б. Хлорид магния0,36г

Дистиллированная вода 9мл

Раствор В. Бриллиантовый зеленый (водный раствор 0,5%)0,09»

Все три раствора смешать, простерилизовать при 100℃ в течение 30 мин.

Желчный бульан

К мясо-пептонному бульону, приготовленному на переваре Хоттингера, добавляют нативную желчь, устанавливают pH 7,6.

900 мл бульона+100 мл желчи=10% желчный бульон800 мл бульона4-200 мл жел-чи=20% желчный бульон.

Приготовленный желчный бульон стерилизуют в автоклаве 20—30 мин при температуре 120℃.

Среда Рапопорт

К 1 мл мясо-пептонного бульона добавляют 100 мл желчи, 20 г глюкозы или 10 г маннита и 10 мл индикатора Андреде (рец. 29). Индикатор Андреде может быть заменен 0,1— 1,6%. спиртовым раствором индикатора бромкрезола пурпурного. При этом индикаторе первоначально фиолетовый цвет средн при сбраживании сахаров и смещении pH среды в кис-

Производства Института эпидемиологии и микробиологии АМН СССР имени Н. Ф. Гамалеи.

362

лую зону переходит в желтый. Чувствительность этого индикатора выше, чем фуксинового, и изменение цвета гораздо резче.

Приготовленную среду разливают во флаконы по 50 мл с опущенными в них трубочками-поплавками, которые на 3— 3,5 см должны возвышаться над уровнем налитой жидкости. Среду стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин. Во время стерилизации среда заполняет поплавки доверху.

Голодная среда Клодиицкого

К дистиллированной воде добавляют 0,1% агара, доводят до кипения, разливают по 75—100 мл во флаконы, стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин при температуре 120 ℃.

Среда Эндо

Мясо-пептонный (100 мл) агар pH 7,4 растапливают и охлаждают до температуры 70℃, прибавляют 1 г х. ч. лактозы, предварительно растворенной в стерильной пробирке в небольшом количестве дистиллированной воды и прокипяченной. 、

В отдельных пробирках приготовляют:

2—3 мл спиртового насыщенного основного фуксина.

10 мл 10% водного раствора сульфида натрия.

В стерильную пробирку отмеривают 1 мл фуксина и прибавляют раствор сульфида натрия до обесцвечивания фуксина (бледно-розовый цвет). Приготовленную смесь вливают в растопленный агар, хорошо перемешивают и разливают по чашкам. Горячий агар имеет бледно-розовый цвет, а при застывании становится бесцветным. Среду готовят в день ее использования.

Среда Левина (агар с эозином и метиленовым синим)

К 100 мл расплавленного мясо-пептонного 沔ара (pH 7,2— 7,4) добавляют в указанной последовательности 2 мл 0,5% водного раствора метиленового синего, предварительно подогретого в водяной бане, 1,5 мл 2% раствора эозина желтого, 2,г лактозы и 0,2 г двуосновного фосфата калия. Растворы красок готовят на дистиллированной воде, стерилизуют текучим паром в течение часа и сохраняют впрок. Лактозу и двуосновный фосфат калия перед добавлением к агару разводят в небольшом количестве стерильной дистиллированной воды и кипятят в пробирке.

После добавления всех ингредиентов среду хорошо перемешивают и стерильно разливают в чашки. Среда имеет дсрасно-фиолетовый цвет.

Среда Плоскирева и бактоагар Плоскирева

Среда Плоскирева и бактоагар Ж, предназначенные для выделения бактерий тифопаратифозной и дизентерийной групп микробов, выпускаются медицинской промышленностью в виде сухих порошков, представляющих собой готовые питательные среды. Согласно указанию, имеющемуся на этикетке банки со средой, отвешивают необходимое количество сухой среды, растворяют ее в соответствующем количестве воды при подогревании, кипятят и разливают в стерильные чашки Петри.

Висмут-сульфитная среда Вильсона—Блер (по прописиМинкевича)

Расплавляют в водяной бане 100 мл 3% мясо-пептонного агара (pH 7,0—7,1). Одновременно нагревают в той же водяной бане 50 млл стерильной дистиллированной воды.

Приготовляют «предварительную смесь》.В стерильную колбу емкостью 50 мл отвешивают 1 г глюкозы, 1,5 г сульфата натрия в порошке и 1 г кристаллического фосфата натрия. Смесь перечисленных ингредиентов растворяют в 20 мл горячей (70—80 ℃) стерильной дистиллированной воды, которую вносят в колбу стерильной пипеткой.

Параллельно готовят висмутовый раствор из цитрата висмут-аммония. В стерильную пробирку вносят навеску 0,45 г висмут-аммония-цитрата, добавляют 5 мл горячей (70——80 ℃) стерильной дистиллированной воды и растворяют при энергичном встряхивании. После растворения прибавляют 0,1 мл 10% раствора едкого натра, отчего раствор становится молочно-мутным.

«Окончательная смесь》получается путем внесения висмутового раствора из пробирки в колбу с «предварительной смесью» («окончательная смесь» слегка мутновата).

Приготовляют 8% раствор закисного сульфата железа (железный купорос): отвешивают 0,2—0,4 г закисного сульфата железа и прибавляют к нему 2,5——5 мл горячей стерильной дистиллированной воды.

Приготовляют 1% раствор бриллиантового зеленого на дистиллированной воде (раствор можно приготовить впрок и хранить месяцами).

В расплавленный и охлажденный до 60℃ агар добавляют подготовленные ингредиенты в следующем порядке:

1 мл раствора сульфата железа, хорошо перемешивая его с агаром;

«окончательную смесь» в приготовленном объеме; после добавления содержимое колбы хорошо перемешивают;

0,4 мл 1% водного раствора бриллиантового зеленого* хорошо перемешивая с агаром.

Приготовленная среда бесцветная, молочно-мутная, pH 8,0—8,1. Разлитую в чашки Петри среду подсушивают в термостате.

Рост колоний на среде Вильсона——Блер:

Бактерии брюшного тифа образуют плоские колонии? темно-дымчатого цвета. К концу 2-х суток роста они увеличиваются в размере и принимают темно-зеленоватую окраску», иногда более светлую на периферии.

Паратифозные бактерии дают влажно-слизистые, слегка выпуклые колонии черного цвета, с темными ореолами. Кишечная палочка обычно не вырастает или дает единичные колонии, коричневого оттенка.

Примечание. В настоящее время среды Эндо, Левина, Вильсона — Блер изготовляются медицинской промышленностью Советского Союза и- выпускаются централизованным порядком в виде сухих порошков.

83・ Среда Аселя—Либерманна

На 1 л мясо-пептонного агара добавляют 10 г лактозы 坤 0,6 г конго красного. Агар, содержащий 1 % лактозы, стерилизуют 2 раза текучим паром. Среду можно приготовить впрок и длительно хранить в лаборатории. Краситель предварительно растворяют в пробирке с 3—4 мл дистиллированной воды при подогревании на пламени горелки (не кипятят!).

84・ Среда Ресселя

К 100 мл 1,5% мясо-пептонного агара (pH 7,2) прибавляют 1 % лактозы, 0,1% глюкозы и 1 мл индикатора Андреде (рец. 29). Среду разливают в пробирки в количестве 5—6 мл^ стерилизуют в автоклаве при 112℃ в течение 20 мин и скашивают так, чтобы на 2—3 см от дна пробирки агар оставался в виде столбика.

В работе пользуются также модификациями среды Ресселя, в которых сочетание лактозы и глюкозы заменяют сочетанием сахаров: маннита и лактозы, лактозы и сахарозы,, маннита и сахарозы.

Одна пробирка среды Ресселя заменяет скошенный мясопептонный агар и среды Гисса с двумя сахарами; глюкозой и лактозой. Микробную культуру со скошенной поверхности среды, так же как культуру с мясо-пептонного агара, используют для приготовления мазков, пересева на другие питательные среды и постановки ориентировочной реакции агглютинации.

Ферментацию лактозы определяют по появлению малиновой окраски соответственно добавленному индикатору Андре-

.де в скошенной части среды, сбраживание глюкозы ——по окраске столбика среды. При сбраживании лактозы и глюкозы происходит резкое покраснение всей среды: столбика и скошенной его части.

Характер изменения цвета среды Ресселя определяется неодинаковой интенсивностью расщепления микроорганизмами азотистых веществ и образованием щелочных продуктов в аэробных и анаэробных условиях. Более интенсивное ще- лочеобразование, происходящее на поверхности агара, приводит к быстрой нейтрализации кислоты, образующейся при расщеплении глюкозы (присутствующей в среде в небольшом количестве), поэтому в «косяке》 кислота обнаруживается только при ферментации лактозы. В столбике, где щелочные продукты образуются в ничтожном количестве, выявляется процесс ферментации глюкозы.

Г азообразование в среде определяют по вспениванию конденсационной жидкости на дне пробирки, а также по образованию трещин и разрывов в агаре.

. Среда Ресселя из сухих питательных сред

На 950 мл дистиллированной воды берут 40 г сухого питательного агара с индикатором ВР и лактозой и 5 г сухого питательного агара. Смесь растворяют при нагревании до кипения. В 50 мл дистиллированной воды растворяют 1 г глюкозы и добавляют к указанной выше смеси.

Приготовленную среду разливают в стерильные пробирки по 5—6- мл, стерилизуют текучим паром 2 раза по 30 мин. Среду скашивают так, чтобы на дне пробирки оставался небольшой столбик.

Свежеприготовленная среда имеет фиолетовый или розовато-серый цвет. При кислотообразовании цвет среды изменяется на синий.

.《Скошенный столбик» с мочевиной '

Среду рекомендуется готовить в два этапа: 1. К 1000 мл бульона или пептонной воды добавляют 0,75——1% агар-агара 阻 20 мл комплексного индикатора: 100 мл индикатора Андре- 』е и 0,4 г тимолового синего. Эту часть среды стерилизуют в автоклаве 30 мин при 120 ℃.

2. В стерильной посуде со 100 мл стерильной дистиллированной воды растворяют 1 г глюкозы, 10 г лактозы' и 10 г .мочевины. Полученный раствор добавляют к основной среде 田 разливают в стерильные пробирки по 5—6 мл. Стернлнзу- ；ют текучим паром в течение 30 мин. Среду скашивают так, ^чтобы оставался еюлбик. Цвет среды чуть желтоватый, при кислой реакции — красный, при щелочной ——синий или сине-фиолетовый.

Трехсахарный агар с мочевиной по Олькеницкому

К 100 мл стерильного питательного агара добавляют 1 г лактозы, 0,02 г соли Мора, 0,03 г гипосульфита, 1 г сахарозы, 0,1 г глюкозы, 1 г мочевины и 0,4 г 0,4% раствора фенолового красного.

Предварительно растворяют соль Мора с гипосульфитом в одной пробирке с небольшим количеством воды, а в другой —— мочевину с углеводами. После растворения все смешивают с агаром и профильтровывают через стерильную марлю. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 20 мин. Горячую среду скашивают, как среду Ресселя. Незасеянная среда имеет бледно-розовый цвет. Механизм действия среды Олькениц- кого тот же, что и среды Ресселя.

Покраснение скошенной части столбика указывает на образование кислоты в результате расщепления лактозы, сахарозы или обоих сахаров, добавляемых к среде в равных количествах (по 1%). Покраснение столбика среды свидетельствует о расщеплении глюкозы.

Эта среда позволяет выявлять расщепление мочевины. Под * действием фермента уреазы происходит расщепление мочевины с образованием NH3 и СО2. При этом аммиак нейтрализует кислоту, образующуюся в результате расщепления глюкозы, и восстанавливает цвет столбика среды до исходного цвета.

Добавление к трехсахарному агару вместе с мочевиной соли Мора (сульфата железа) и гипосульфита позволяет также обнаруживать способность изучаемой культуры к образованию сероводорода на основании почернения среды разной интенсивности (от темной линии по месту прокола среды до разлитого почернения всего столбика среды) в результате превращения сульфата железа в сульфид, имеющий черный цвет.

Бульон глицериновый по Штерну 、

К 100 мл мясо-пептонного бульона прибавляют 5 капель насыщенного спиртового раствора основного фуксина, 1 мл глицерина и 2 мл свежеприготовленного 10% раствора сульфата натрия. Разливают в пробирки по 5——6 мл, стерилизуют при 110—112℃ в течение 10—15 мин. Среда золотисто-желтого цвета. При расщеплении глицерина розовеет.

РЕЦЕПТЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ

СРЕДЫ ДЛЯ КОНСЕРВАЦИИ И ОБОГАЩЕНИЯИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА

Консервант Венкатрамена—Рамакришнана

Приготовление основного раствора: а) 12,405 г борной кислоты и 14,912 г хлорида калия растворяют в 800 мл горячей дистиллированной воды. По охлаждении объем жидкости доводят до 1 л;

250 мл основного раствора смешивают со 133,5 мл 0,8% раствора едкого натра. После перемешивания составных частей объем жидкости доводят дистиллированной водой до 1 л (буферная смесь)；

20 г морской соли или хлорида натрия растворяют в 1 л буферной смеси. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр, разливают по 10 мл в стеклянные широ- когорлые склянки и стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин при 1*20 ℃.

Приготовленный таким образом консервант имеет pH 9,2 и сохраняется в течение нескольких месяцев.

Щелочная пептонная вода

Основной раствор пептона готовят по следующей прописи:

Пептон 100 г

Хлорид натрия 50A

Нитрат калия !》

Карбонат натрия 25 »

Дистиллированная вода ....1000 мл

pH,.8,2-8,4

Смесь пептона с хлоридом натрия и карбонатом натрия растирают в ступке и после этого растворяют в дистиллированной воде при нагревании; затем прибавляют нитрат калия. Раствор автоклавируют при 120 ℃ в течение 20 мин.

Основной раствор пептона (10% пептонная вода) сохраняется длительное время (до 6 мес). Для получения 1 % пептонной воды основной раствор пептона разводят в 10 раз. Полученную пептонную воду разливают в соответствующую посуду и стерилизуют, доводя предварительно pH до 8,2—8,4- Срок хранения среды 2 мес.

Щелочная пептонная вода с теллуритом калия

В 1% пептонную воду после автоклавирования добавляют теллурит калия в конечном разведении 1:100000 или 1:200 000 (концентрация теллурита должна быть предварительно оттитрована на культуре холерного вибриона).

Среду готовят непосредственно перед употреблением или не ранее чем за 24—48 ч до ее использования.

СРЕДЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ

Щелочной мясо-пептонный агар

Мясная вода .. 1000 мл

Пелтон ..10 г

Хлорид натрия 5A

Агар-агар■ 20 »

pH . ....... а . « 7,8—8,8

В мясную воду вносят пептон и хлорид натрия. Смесь перемешивают и подщелачивают 20% раствором едкого натра до pH 8,3—8,4. Затем добавляют агар-агар и содержимое помещают в автоклав для варки среды вначале текучим паром в течение 30 мин, а затем при 1 атм 20 мин. Если мясо-пептонный агар варят на плите, среду кипятят до полного расплавления агар-агара1 при постоянном помешивании. Приготовленную среду осветляют одним из общепринятых способов (см. с. 42), устанавливают щелочную реакцию среды, после чего разливают ее в посуду и стерилизуют при 0,7 атм 20 мин. Срок хранения среды в прохладном месте 3 мес.

Бактоагар TCBS

Бактоагар TCBS ——сухая среда для диагностики холеры (pH 8,6). Выпускается фирмой Дифко (Детройт, штат Мичиган, США).

На 1 л дистиллированной воды берут 89 г сухой среды, нагревают до кипения (до полного растворения). Среду, не •стерилизуя, разливают в чашки Петри.

Лактозо-сахарозная полиуглеводная среда*

г » » » » л 55111 м > л^-о- n^- 4Мг » » » » л 55111 м > л^-о- n^- 4МПептони

г » » » » л 55111 м > л^-о- n^- 4М

г » » » » л 55111 м > л^-о- n^- 4М

Хлорид натрия ..

Лактоза

Сахароза

Агар-агар ....

Индикатор Андреде .

Вода дистиллированная pH

Готовую среду после стерилизации скашивают, как среду Ресселя, и посев на нее производят по общепринятой методике.

Холерные и холероподобные вибрионы, расщепляя саха-

розу, дают покраснение среды в столбике без образования газа. Дизентерийные и тифопаратифозные бактерии не изменяют цвета среды. Эшерихии образуют кислоту с газом как в столбике, так и в скошенных участках среды.

Среда Клигера

К мясо-пептонному агару (1,5—1,7%) добавляют 10 г лактозы, 10 г сахарозы и 1 г глюкозы. После растворения уг・ леводов добавляют по 10 мл 2% раствора сульфата железа, 0,8% раствора тиосульфита натрия (Na2s2О3—7Н2О) и 0,4% раствора сульфата натрия (Na2SO3). Эта смесь солей служит реактивом на сероводород. В нее же добавляют 24 мл 1 % водно-спиртового раствора фенолового красного (pH 7,2— 7,4). Среду разливают в пробирки по 3—5 мл, скашивают столбиком, засевают по скошенной поверхности штрихом и в столбик — уколом. Культуры вибрионов и других сахарозо- и глюкозопозитивных микроорганизмов в этой среде дают пожелтение столбика; цвет скошенной поверхности не изменяется. При образовании культурами сероводорода агар чернеет.

Среда Кларка

(для реакции Фогеса—Проскауэра и реакции сметиловым красным)

В 1 л дистиллированной воды растворяют 5 г калия двузамещенного (К2НРО4), 5 г пептона, 5 г глюкозы.

Среду нагревают до кипения, фильтруют, разливают в пробирки по 2—3 мл и стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин. Каждую культуру засевают в 2 пробирки.

Среда Хью——Лейфсона

Пелтон 2г

Хлорид натрия 5》

Фосфат калия двузамещенный ..0,3г

Глюкоза ■Ю »

Бромтимоловыйсиний0,03》

Агар-агар 3》

Дистиллированнаявода . ...1000 мл

pH 7,1-7,2

К воде добавляют пептон, хлорид натрия и агар-агар. Смесь подогревают до расплавления агара, вносят фосфат калия и глюкозу, продолжают кипятить 2——3 мин. Смесь подщелачивают 20% раствором едкого натра до pH 7,4—7,5, доводят объем среды до первоначального и добавляют 3 мл 1% водного раствора бромтимолового синего. Приготовленную таким образом среду фильтруют через ватно-марлевый 370

фильтр, разливают по 3—4 мл в стерильные пробирки и с» рилизуют при 0,5 атм 20 мин. Цвет среды до стерилизации5 синий, после стерилизации — травянистый (pH 7,1——7,2). При； кислой реакции среда желтеет.

СРЕДЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕКАРБОКСИЛАЗ АМИНОКИСЛОТ

Среда Меллера

Экстракт молодого мяса (1 кг мяса 4-1 л ди

стиллированной воды) • 5 г

Пептон . 5》

Бромкрезоловый красный《1,6%) . . . .0,6 мл

Крезоловый красный (0,2%)2,5»

D-глюкоза . 0,5 г

Пиродоксаль (можно витамин В6).5 мг

Дистиллированная вода 1000мл

pH 6,0

Среда Фалькоу

Гидролизат казеина 5г

Дрожжевой экстракт. 3》

D-глюкоза 1»

Бромтимоловый синий (0,1% раствор в 20% спирте)45 мл

Дистиллированная вода 1000》

pH 6,0

При отсутствии гидролизата казеина в состав среды вво* дят 1 л мясной воды, разведенной 1 : 1 дистиллированной во& дой, и 0,5% пептона.

Все компоненты по прописи сред (рец. 98 и 99) растворяй ют при нагревании, устанавливают pH среды 6,0, затем добавляют соответствующий индикатор и делят среду на 4 равные части. В одну часть аминокислоты не добавляют, эта порция ' служит контролем. В остальные порции вносят соответственно: в первую — 1% лизина, во вторую —‘1% орнитина, в третью — 1% аргинина. Аминокислоты должны быть в L-формё. Если имеются DL-аминокислоты, то добав-. ляют 2%, так как микроорганизмы активны только в отно-. шении L-форм. После добавления аминокислоты перед стер и-, лизацисй исправляют реакцию среды до 6,0. Аргинин и орни^. тин pH не изменяют, а лизин защелачивает среду до pH 8,8. Среду разливают по 1—2 мл в стерильные пробирки и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин.

Среда Меллера фиолетового цвета, при кислой реакции желтеет, при щелочной ——изменяется до красно-фиолетовога цвета. Среда Фалькоу травянисто-зеленого цвета, при кислой реакции желтеет, при щелочной — приобретает синий цвет.

Среда с мочевиной (Кристенсена)

Пелтон 1г

Хлорид натрия 5>

Фосфат калия однозамещенный ....2》

Глюкоза . . . 1》

Феноловый красный0,012»

Агар-агар 20»

Мочевина 20》

Дистиллированная вода 1000мл

pH 6,8

Предварительно промытый агар вносят в воду и нагревают до расплавления, затем добавляют пептон, соли и глюкозу. Дают агару закипеть, после чего вносят феноловый красный, предварительно растворенный в 0,1 N растворе едкого натра. Учитывая количество щелочи, пошедшей на растворение индикатора, приливают к смеси остальное количество ее до общего объема 25 мл. Смеси дают снова закипеть. Среду разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин. После охлаждения среды до 50 ℃ в каждую пробирку добавляют по 0,5 мл 20% раствора мочевины (20 г мочевины растворяют в стерильной дистиллированной воде и кипятят в водяной бане в течение 30 мин). Полученную среду охлаждают в наклонном положении для получения скошенного агара. Цвет готовой среды желтоватозеленый. При щелочеобразовании цвет среды становится красно-фиолетовым.

РЕЦЕПТЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯДИФТЕРИЙНЫХ БАКТЕРИЙ

СРЕДЫ ДЛЯ КОНСЕРВАЦИИ И ОБОГАЩЕНИЯИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА

Среда Пергола

{жидкая сывороточно-желточная среда с теллуритом калия)

Куриное яйцо предварительно моют щеткой, мылом и опускают в спирт на 15 мин, затем смазывают спиртовой на-' стойкой йода и надбивают стерильным скальпелем. Белок удаляют, желток переносят в банку с бусами и добавляют к 100 мл нормальной лошадиной сыворотки. Туда же добавляют 1 мл 2% раствора теллурита калия. Полученную смесь взбалтывают и разливают по 2—3 мл в стерильные пробирки. Пробирки со ср?дой помещают в водяную баню и инактивируют сыворотку при 56 ℃ в течение часа. После инактивации среду выдерживают 2 сут в термостате для контроля на стерильность.

Полужидкая сывороточная среда

Полужидкий 0,1% мясо-пептонный агар или 0,1% агар на переваре Хоттингера (pH 7,6) разливают в пробирки по 5 мл. Среду стерилизуют в автоклаве 30 мин при 120 ℃. Перед использованием в каждую пробирку с питательной средой, соблюдая правила асептики, прибавляют 0,5 мл нормальной лошадиной сыворотки или сыворотки крупного рогатого скота, инактивированной при 56℃, 1 каплю (0,5 мл) 2% раствора теллурита калия. .

СРЕДЫ ДЛЯ ВЬЩЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИБАКТЕРИЙ ДИФТЕРИИ

Свернутая сыворотка

Для приготовления свернутой сыворотки используют нормальную лошадиную сыворотку или сыворотку крупного рогатого скота. Для свертывания сыворотку стерильно разливают в стерильные пробирки по 3 мл. Пробирки укладывают в ряд (скос должен начинаться от дна пробирки) в аппарате для свертывания, подогретом до 50 ℃. Температуру доводят постепенно до 80 ℃ и держат в нем пробирки 1 ч. Затем пробирки со свернутой сывороткой вынимают (так как дальнейшее нахождение их в свертывателе ведет к высыханию сыворотки) и охлаждают при комнатной температуре. Свернутая сыворотка должна обязательно содержать конденсационную воду. Приготовленные среды контролируют выборочно на стерильность в термостате. Если при контрольном прогревании они прорастают кокковой микрофлорой, их повторно прогревают при 80 ℃ в течение 2 ч. .

Теллуровая среда Клауберга

Первая смесь. Предварительно, за Р/г мес, готовят глицериново-кровяную смесь, смешивая 20 мл бараньей или лошадиной крови и 10 мл х. ч. глицерина. В день приготовления среды готовят две другие смеси.

Вторая смесь. Растапливают 50 мл мясо-пептонного агара и охлаждают до 50 ℃, после чего к нему прибавляют 2,5 мл глицериново-кровяной смеси.

Третья смесь. Смешивают 17 мл бараньей крови с 33 мл дистиллированной воды (смесь готовят стерильно), подогревают в водяной бане до 50 ℃. Соединяют вторую и третью смеси, добавляют 4 мл 1% раствора теллурита калия, быстро все перемешивают и разливают в чашки. Среда прозрачная, цвета красного вина.

Сухая хинозольная индикаторная среда Бучина

К 100 мл холодной воды (pH 7,6——7,8) добавляют согласно прописи на этикетке порошок сухой хинозольной среды, тщательно размешивают его и нагревают на слабом огне до полного расплавления агара. Среду кипятят 2—3 мин до образования крупнопузырчатой, быстро оседающей пены. К приготовленной и охлажденной до 50 ℃ среде прибавляют 5 мл (лучше 10—15 мл) дефибринированной крови (кролика, барана или донорскую кровь). Среду тщательно перемешивают, разливают в чашки Петри слоем 3——4 см. Готовая среда темно-синего цвета, может сохраняться 3——4 сут при 4—10℃.

Цистин-теллурит-сывороточная среда Тиндаля(модифицированная)

К 100 мл 2% питательного агара, расплавленного и охлажденного до 50℃, добавляют следующие ингредиенты:

1 % раствор цистина на 0,1 N растворе серной 12 мл или хлористоводородной кислоты “ ..

0,1 N раствор едкого натра12»

2% раствор теллурита калия1,8»

2,5% раствор гипосульфита натрия . ...1,8 »

Нормальная лошадиная или бычья сыворотка 20 »

Цистин нерастворим в воде, поэтому его вводят в среду в виде 1 % раствора на ОД N растворе серной или хлористоводородной кислоты. Раствор едкого натра добавляют к среде для нейтрализации соответствующего количества кислоты. Раствор гипосульфита натрия (2,5%) готовят на стерильной дистиллированной воде.

После добавления каждого ингредиента среду тщательно перемешивают. Чашки с готовой питательной средой могут сохраняться в холодильнике при 10 ℃ не более 3——4 сут.

Среда для определения цистиназы(для пробы Пизу)

К 90 мл расплавленного 2% мясо-пептонного агара (pH 7,6) добавляют 2 мл раствора цистина (1% раствор цистина в 0,1 N растворе едкого натра), тщательно перемешивают и добавляют такой же объем 4,1 N раствора серной, кислоты. Среду стерилизуют 30 мин при 112℃. К расплавленной и остуженной до 50℃ среде добавляют 1 мл 10% раствора ацетата свинца (стерилизованного двукратно текучим паром), перемешивают и добавляют 9 мл нормальной лошадиной сыворотки. Среду стерильно разливают по маленьким пробиркам по 2 мл. Посев производят уколом.

Среда Закса для определения фермента уреазы

А. К 4 мл дистиллированной воды добавляют 4 мл 96% этилового спирта и 2 г мочевины. Раствор не стерилизуют, хранят при 4—10℃.

Б. К ЮО мл дистиллированной воды добавляют 1 мл фенолового красного (0,2% раствор), 0,1 г фосфата калия однозамещенного, 0,1 г двузамещенного фосфата калия, 0,5 г хлорида натрия.

Перед употреблением смешивают 1 ч раствора А и 19 ч раствора Б. Полученную смесь разливают в узкие пробирки по 0,1 мл. Посевы помещают на 30 мин в термостат. При наличии уреазы среда краснеет.

Сухой питательный агар для определениятоксигенности дифтерийных культур

Сухой порошок, согласно прописи, растворяют в воде из расчета 3 г на 100 мл, тщательно перемешивают и на слабом огне при постоянном помешивании нагревают до полного расплавления агара. Среду кипятят 5—7 мин. После кипячения среду фильтруют через ватно-марлевый или полотняный фильтр, разливают в стерильные флаконы (по 70—80 мл) или в пробирки (по 12 мл), стерилизуют однократно текучим паром 30 мин. Перед разливкой в чашки Петри к растопленному и охлажденному до 50℃ агару добавляют 20% нормальной лошадиной сыворотки. -

РЕЦЕПТЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ БАКТЕРИЙ КОКЛЮША И ПАРАКОКЛЮША

ПО. Казеиново-угольный агар (КУА)

К 1000 мл дистиллированной воды добавляют гидролиза^ та казеина 20 мл, хлорида натрия 5 г, хлорида калия 0,2 г, хлорида кальция 0,002 г, карбоната натрия 0,4 г, хлорида магния 0,025 г, фосфорно-двукалиевой соли 0,24 г, крахмала растворимого 1 г, цистина 0,01 г, агара 20 г.

Среду варят, как обычную агаровую среду, устанавливают pH 7,2, разливают по бутылям, стерилизуют в автоклаве под давлением 0,5 атм в течение 30 мин.

Перед употреблением в растопленный и остуженный до 50℃ агар добавляют 3% дрожжевого экстракта и 0,2% сухого активированного угля (стерилизованного в автоклаве).

Пр иготовление дрожжевого экстр акта. 1000 г прессованных дрожжей размельчают и смешивают с 825 мл дистиллированной воды. Взвесь нагревают до 9092 ℃ и сразу же фильтруют через складчатый бумажный фильтр, а

затем через фильтр Зейтца. Для проверки на стерильность 2—3 мл дрожжевого экстракта засевают в 10 мл сахарного мясо-пептонного бульона и выдерживают 3 сут при 28—30 ℃. Дрожжевой экстракт готовят впрок и хранят в холодном месте.

Картофельно-глицериновый агар по Борде—Жангу

Очищенный и нарезанный тонкими ломтиками картофель (200 г) промывают дистиллированной водой, заливают 400 мл 4% раствора х. ч. глицерина и варят на медленном огне при постоянном помешивании, пока картофель не разварится. Жидкость сцеживают и фильтруют через марлю. К фильтрату прибавляют дистиллированную воду до первоначального объема. К 500 мл картофельно-глицеринового бульона добавляют 1,5 л дистиллированной воды, 17 г хлорида натрия и 50—60 г агар-агара. Варят в автоклаве 30 мин, устанавливают pH 7,4, кипятят на огне, фильтруют, разливают, стерилизуют. На 100 мл растопленного и охлажденного до 45 ℃ агара Борде прибавляют 25% нагретой до 45℃ дефибриниро- вапной крови (бараньей или человеческой). Среду разливают по пробиркам и чашкам и ставят на сутки в термостат для контроля.

Среда Закса для определения уреазы

А. К 4 мл дистиллированной воды добавляют 4 мл 96% этилового спирта и 2 г мочевины. Раствор без стерилизации хранят при 4—10℃.

Б. К ЮО мл дистиллированной воды добавляют 1 мл фенолового красного (0,2% раствор), 0,1 г фосфата калия однозамещенного, 0,1 г фосфата калия двузамещенного, 0,5 г хлорида натрия.

Перед употреблением смешивают 1 часть раствора А и 19 частей раствора Б. Полученную смесь разливают в пробирки по 0,1 мл.

РЕЦЕПТЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ПАТОГЕННЫХ АНАЭРОБОВ

Среда Китта — Тароцци

Печень животного, обычно говяжью, нарезают кусочками по 1—1,5 г, прибавляют по весу тройное количество мясопептонного бульона или бульона Хоттингера нейтральной реакции, кипятят 30 мин. Бульон отфильтровывают, печень промывают под краном на сите. Отфильтрованный бульон разливают по 7—10 мл в пробирки. В каждую пробирку кла-

дут по 4—5 кусочков отмытой печени. Бульон сверху заливают слоем вазелинового масла и стерилизуют в автоклаве при давлении 0,5 атм 30 мин.

Полужидкий агар для трубок Вейона

К 0,5% глюкозному мяср-пептонному бульону или бульону Хоттингера прибавляют 0,5% агара, стерилизуют дробно при 100° 30 мин 3 дня подряд. •

Среда Вильсона—Блер

Растапливают 100 мл 3% мясо-пептонного агара с 1% глюкозы‘в водяной бане, добавляют 10 мл 20% раствора сульфита натрия и 1 мл 8% раствора хлорида железа. Оба раствора готовят на стерильной дистиллированной воде и кипятят. Среду разливают в пробирки по 7 мл.

Кровяной агар Цейсслера

К 3% мясо-пептонному агару прибавляют 1% глюкозы, устанавливают pH 7,2, разливают во флаконы по 100 мл, стерилизуют при давлении 0,5 атм 30 мин. Перед употреблением к расплавленной и охлажденной до 45 °C среде прибавляют 20% свежевзятой дефибринированной крови. Среду разливают в чашки Петри.

Молоко по Тукаеву

К 1 % пептонной воде прибавляют 5—6% обезжиренного молока, среду стерилизуют дробно при 100 ℃ 3 дня подряд по 30 мин.

Кровяной сахарный агар

Агар 2% на бульоне Хоттингера в объеме 100 мл расплавляют и охлаждают до 45 ℃, после чего добавляют к нему 10——15 мл свежевзятой стерильной дефибринированной крови кролика, барана или крупного рогатого скота и 10 мл 20% стерильного раствора глюкозы. Смесь взбалтывают так, чтобы не образовалось пузырей и пены, и разливают по чашкам. Среда служит для выделения чистых культур анаэробов.

Среда Виллиса и Хоббса

377377Бульона Хоттингера 400 мл, агара 4,8 г, лактозы 4,8 г и 1% раствора нейтрального красного 1,3 мл смешивают, автоклавируют, охлаждают до 50—55 ℃. Затем добавляют 15 мл

377

377

суспензии желтка куриного, смешанного с равным объемом изотонического раствора хлорида натрия и 60 мл стерильного обезжиренного молока.

Бензидиновый агар

Бензидин0,26г

Хлористоводородная кислота, 1 N раствор 0,3 мл

Вода50»

Приготовленный раствор стерилизуют кипячением и добавляют к стерильному агару из расчета 10 мл раствора на 100 мл агара.

РЕЦЕПТЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫЗЫВАЮЩИХ ЗООНОЗЫ

一 121. Консервант Берлина и Башевой

Консервант представляет собой смесь нейтральных жиров следующего состава:

вазелиновое масло 3 весовые части

парафин1 весовая часть

Смесь подогревают при 45 ℃, тщательно перемешивают и разливают в широкогорлые банки с хорошо притертыми пробками.

Кусочки органов величиной 2—3 см3 вносят в подогретый до 45 ℃ расплавленный состав и тщательно размельчают в нем с помощью пинцета. Затем банки закрывают пробками и смесь взбалтывают. В этом консерванте материал сохраняется в течение нескольких недель.

Жидкость Брокэ

Нейтральный глицерин20мл

Дистиллированная вода . ....80》

Карбонат кальция 2г

В банки с 5—10 мл жидкости помещают подлежащие исследованию кусочки органов величиной 1——2 см3. В этом консерванте материал может сохраняться несколько дней.

Перевар Филдса

Во флаконе емкостью 250 мл (с притертой пробкой) смешивают:

Изотонический раствор хлорида натрия ..150 мл

X. ч. хлор истоводороди а я кислота...6 »

Дефибрииированиая кровь барана...50 >

Пелсии 1г

Смесь энергично встряхивают (до растворения), ставят в водяную баню при 55 ℃ на срок до 24 ч, изредка взбалтывают. Затем к смеси прибавляют 12 мл 20% раствора едкого натра, после чего испытывают реакцию среды с раствором крезолового красного (ОД % спиртовой или водный раствор). Если не получится окраски, напоминающей цвет перманганата, прибавляют тот же раствор едкого натра до получения такой окраски. После этого наливают по каплям концентрированную хлористоводородную кислоту до получения пробы с крезоловым красным цвета перманганата, а е феноловым красным — красного цвета. Затем прибавляют 0,25% хлороформа, смазывают пробку стерильным оливковым маслом, взбалтывают содержимое до растворения хлороформа и закрывают пробку бумажным колпачком.

Приготовляя среду для выращивания чумного микроба,, берут 1 мл этого перевара на 100 мл агара.

Среда Туманского

К 100 мл расплавленного и остывшего до 50 ℃ агара прибавляют водно-спиртовой раствор генцианового фиолетового в разведении от 1: 50 000 до 1 : 200 000 и 1—2 мл гемолизированной крови.

Приготовление раствора генцианового фиолетового: 0,1 г генцианового фиолетового растворяют в 1 мл этилового спирта и прибавляют к 100 мл дистиллированной воды.

Гемолизированную кровь готовят по следующей прописи: к 9 мл стерильной дистиллированной воды прибавляют 1 мл крови барана, кролика, морской свинки или коровы. Гемолизированную кровь разливают в стерильные ампулы и сохраняют в прохладном месте. Срок хранения ее до 5 лет. Растворы генцианового фиолетового и гемолизированной крови предварительно испытывают и подтитровывают.

Среда считается пригодной, если на ней полностью подавляется рост стафилококков и спороносных микробов и в то же время не угнетается рост чумных бактерий, засеянных на среду в количестве 100 микробных тел.

Голоднокислый агар Бессоновой

Готовят 3% агар на изотоническом растворе хлорида натрия, устанавливают pH 5,9—6,1, стерилизуют среду в автоклаве при температуре 120 ℃ в течение 20 мин. Чумной микроб в отличие от бактерий псевдотуберкулеза на этой среде не растет.'

Среда с рамнозой Бессоновой

К пептонной воде, содержащей 0,5% пептона, прибавляют 0,5% хлорида натрия и 1% рамнозы.

25* 37*

Желточная среда Мак-Коя

Свежие куриные яйца моют щеткой и мылом в теплой во* «де, обтирают спиртом и быстро проводят через пламя горел- кн，Желтки,^ отделенные от белков, сливают отдельно в градуированный стерильный сосуд и доливают стерильным изотоническим раствором хлорида натрия в следующей пропорции: 60 ч желтков и 40 ч раствора pH 7,0—7,2. После перемешивания желточную смесь набирают стерильной пипеткой, разливают в стерильные пробирки по 4——5 мд и помещают в аппарат для свертывания сыворотки в наклонном положении Для получения скошенной поверхности.

Свертывание желтка производят в течение 2 дней: 1-й день при температуре 74—75 ℃ в течение часа, на 2-й день при температуре 82—85℃ в течение 30 мин. Приготовленную среду ставят на 48 ч в термостат при 37 ℃, проверяя на стерильность, и сохраняют в холодильнике для предотвращения высыхания. Правильно свернутая среда должна иметь на дне пробирки конденсационную жидкость.

Печеночный агар

Свежую печень ^крупного рогатого скота освобождают от пленок и жира, пропускают через мясорубку. Фарш заливают двойным объемом водопроводной или дистиллированной воды и оставляют на холоде в течение 2 ч, затем кипятят 1 ч, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и доливают водой до исходного объема. Полученную таким образом печеночную воду стерилизуют в автоклаве 30 мин при 120 ℃.

Для приготовления печеночного бульона к печеночной воде прибавляют равное количество водопроводной воды, затем 1 % пептона и 0,5% хлорида натрия. Приготовленный таким образом бульон подщелачивают до pH 6,87,0 и стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин при 110℃.

К приготовленному печеночному бульону прибавляют 2— 3% хорошо промытого измельченного агар-агара. Смесь прогревают, доводя до кипения, устанавливают pH 6,8—7,0, фильтруют, разливают во флаконы и стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин при 110℃.

Мясо-пептонный глюкозо-глицериновый агар

К расплавленному и профильтрованному мясо-пептонному агару прибавляют 1%. глюкозы и 2% х. ч. глицерина, устанавливают pH 6,8—7,0, разливают в необходимую посуду и стерилизуют в автоклаве 20 мии при 115℃.

Полужидкий агар Me京ера и Цобеля

Смешивают 500 мл мясной воды с 500 мл дистиллирован» ной воды, прибавляют 5 г хлорида натрия, 2 г пептона и 2 г хорошо промытого агар-агара. После стерилизации в автоклаве устанавливают pH 6,8——7,0. Среду стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин при 115 ℃. После стерилизации pH снижается до 6,8. Перед употреблением к расплавленной и остуженной до 45—60 ℃ среде прибавляют стерильно основной 0,1% раствор красителя： фуксина 2 мл (концентрация красителя 1 :25000), тионина 4 мл (концентрация красителя 1 : 50 000) на 10 0 мл среды.

Приготовление р а створ а красителей — фук* сина и тионина. 0,1 мл красителей — фуксина или тао нина — растирают в ступке, прибавляя постепенно 20 мл этилового спирта. После полного растворения к красителю прибавляют 80 мл бидистиллированной воды. Приготовленный ОД % раствор красителя хранят в плотно укупоренном флаконе в темном месте.

Среда Государственного контрольного институтаимени Л. А. Тарасевича (ГКИ)

Среда ГКИ состоит из раствора Хенкса с добавлением 40% стерильной бычьей сыворотки, предварительно инактивированной при температуре 56 ℃ в течение 30 мин. Среду доводят с помощью бикарбоната натрия до pH 7,2—7,4 и разливают в пробирки по 2 мл. Посевы инкубируют при 37℃ в течение 16—18 ч, после чего из выросшей культуры готовят мазки для выявления капсульных палочек.

Среда Томова

Агар 10%

Пептон

Хлорид натрия .

Белок куриного яйца

Гемии 0,4% в N/100 растворе едкого натра

Уксусная кислота N/100

В стерильной склянке смешивают говяжью сыворотку и яичный белок, нагревают до 50 ℃ и добавляют к расплавленному и охлажденному до 50 ℃ пептонному агару. Содержимое колбы тщательно перемешивают, после чего в нее добавляют раздельно стерильный подогретый раствор гемина и уксусной кислоты в указанных выше количествах. Готовую среду (pH 7,4—7,6) разливают в чашки Петри.

Среда Буза

Готовится из 30% голодного агара (без пептона) pH 7,4, к :которому добавляют 15% дефибринированной крови барана.

РЕЦЕПТЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗНЫХ МИКОБАКТЕРИЙ

Среда Прайса

Кровь кролика или барана смешивают с цитратом натрия в соотношении 10 мл крови на 2 мл 5% цитрата. Цитратную кровь разводят дистиллированной водой: на 1 ч крови берут 2——4 ч дистиллированной стерильной воды. Среду разливают в стерильные пробирки по 5 мл.

Среда Левенштейна——Иенсеиа

В 600 мл дистиллированной воды, содержащей 12 мл глицерина, растворяют аспарагина 3,6 г, фосфата калия (однозамещенного) 2,4 г, сульфата магния 0,24 г, цитрата магния 0,6 г, картофельной муки 5 г, малахитового зеленого 0,4 г. Полученную смесь стерилизуют в автоклаве 15 мин при 120 ℃.

Приготовляют 1000 мл однородной взвеси из свежих яиц. Для этого предварительно вымытые мылом со щеткой в проточной воде яйца (примерно 20——25 шт.) помещают в 70% спирт на 1V2—2 ч, затем разбивают их в стерильную круглодонную колбу с бусами (из каждого десятка яиц отбрасывают 2 белка). Добавляют стерильно в яичную взвесь основной солевой раствор, подогретый до 45——60 °C, тщательно перемешивают, избегая появления пузырьков воздуха, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по пробиркам и скашивают при 85 ℃ в течение 45 мин.

Среда Петраньяни

В стерильную литровую колбу с бусами помещают 150 мл -молока, 6 г картофельной муки, 1 г пептона и нарезанную мелкими кусочками небольшую картофелину (величиной с куриное яйцо). Колбу ставят в водяную баню (кипящую) на 10 мин и помешивают, пока не образуется клейстер. Затем понижают температуру воды до 56 ℃ и оставляют в ней колбу со средой на 1 час, выливают в смесь 4 цельных яйца и желток пятого.

Массу фильтруют через стерильную марлю, вливают 12 мл глицерина и 10 мл 2% водного раствора малахитовой зелени. 'Среду асептично разливают по стерильным пробиркам и про- 382

гревают при температуре 85 ℃ 2% q в наклонном положении для образования скоса среды. В последующие 2 дия среду стерилизуют нагреванием при 75℃ в течение 30 мин. Поверх пробок (для предупреждения высыхания среды) надевают резиновые колпачки или заливают их парафином.

Среда Гельберга

Приготовление молока. Сырое молоко в стерильной посуде ставят на сутки в холодильник. Затем с него снимают сливки, разливают по ПО мл в колбы, стерилизуют 2 дня текучим паром: 1-й день — 15 мин, 2-й день—10 мин.

Приготовление картофельного агара. Картофель моют мылом со щеткой в проточной воде, очищают и заливают двойным количеством водопроводной воды. После кипячения в течение 15 мин отвар отстаивают, фильтруют через фильтр, сделанный из марли и ваты, и разливают по НО мл. Стерилизуют отвар в автоклаве, доводя температуру до 120 ℃, после чего автоклав выключают.

Пр иготовление солевого раствора. На 1 л дистиллированной воды берут следующее количество:

Фосфат калиядвуосаовной1г

Цитрат натрия 1>

Сульфат магния . »

Пептон 5>

Глицерин 30>

Стерилизуют раствор в автоклаве, доводя температуру до 120 ℃, затем автоклав выключают.

Приготовление красителя малахитового зеленого. 2 г красителя растовряют в 100 мл дистиллированной воды. Стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин при 115℃.

Пр иготовление среды Гельберга. 10 яиц тщательно моют, затем кладут на 3 мин в 5% раствор карболовой кислоты, протирают спиртом, обжигают на легком огне. Подготовленные таким образом яйца разбивают и стерильно йы- ливают в колбу из расчета 6 яиц цельных и 4 желтка. В колбу добавляют 100 мл молока, 100 мл картофельного отвара, 100 мл солевого раствора, 7,5 мл 2% раствора малахитового зеленого, 5 мл 10% стерильного раствора лимонной кислоты. Все ингредиенты хорошо встряхивают. Среду разливают и стерилизуют при температуре 85 ℃ 2 дня по 30 мин.

РЕЦЕПТЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯСПИРОХЕТ

Среда Уленгута

Смешивают 1 ч стерильной кроличьей или лошадиной сыворотки с 10 ч водопроводной воды, стерилизованной 3 дня

подряд по 1 ч при температуре 100 ℃, разливают но 3 мл в пробирки, заливают 1 мл стерильного жидкого парафина.

Среда Терских

Среда Терских состоит из фосфатной смеси Зеренсена н кроличьей сыворотки.

Фосфатная смесь:、

Фосфат натрия двузамещенный . ..11,876 г

Вода дистиллированная 1000мл

Фосфат кални однозамещенныи . ..9,078 г

Вода дистиллированная 1000мл

Первый и второй растворы могут храниться в темном месте месяцами. Приготовляют смесь с pH 7,2—7,3. Для этого берут первого раствора 90 мл и второго раствора 10 мл. К ним прибавляют 900 мл свежей дистиллированной воды. Полученный раствор разливают по 5 мл в пробирки из невыще- лачивающегося стекла, стерилизуют при 1,5 атм в течение 20 мин. В каждую пробирку прибавляют асептично 6——8 капель инактивированной при температуре 56 ℃ сыворотки кролика.

РЕЦЕПТЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД, ПРИМЕНЯЕМЫХПРИ САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХИССЛЕДОВАНИЯХ

Глюкозо-пептонная среда

А. Концентрированная среда Э й км а н а. В 1 л воды растворяют 100 г пептона, 50 г хлорида натрия, нагревают смесь до кипения, фильтруют, прибавляют 100 г глюкозы, устанавливают pH 7,4—7,6, разливают по 10 мл в колбы или склянки емкостью 250—500 мл с поплавками и по 1 мл в пробирки с поплавками. Стерилизуют при 112℃.

Б. Разведенная среда. Готовят так же> как концентрированную, но количество всех ингредиентов, кроме воды, уменьшают в 10 раз.

Лактозо-пептонная среда

Готовят так же, как глюкозо-пептонную среду, заменив глюкозу лактозой.

Желчно-лактозный бульон с бриллиантовым зеленым

Пептона 10 г, лактозы 10 г, свежей фильтрованной желчи крупного рогатого скота 200 мл (или сухой обезвоженной желчи, растворенной в 200 мл дистиллированной воды) раст- 384

воряют при нагревании в 700 мл дистиллированвЬй ^бды^ устанавливают pH 7,2—7,4, прибавляют 13,3 мл 1%： водного раствора бриллиантового зеленого, доливают дистиллированной водой до общего объема 1 л, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по 5 мл в пробирки с поплавками,, стерилизуют при 112℃ в течение 12 мин или 3 дня при 100 ℃. Срок хранения среды 2 нед.

Борнокислая буферная среда с лактозой

Пептона 10 г, фосфата калия двузамещенного (безводно го) 12,2 г, фосфата калия однозамещенного (безводного) 4,1 г, борной кислоты 3,2 г, лактозы 5 г растворяют в 1 л дистиллированной воды, разливают по 5 мл в пробирки с поплавками, стерилизуют при 112℃ в течение 12 мин. Срок хранения среды 2 нед.

Среда Кесслера

Пептона 10 г, желчи 50 мл, воды дистиллированной 1000 мл кипятят 20—30 мин, фильтруют через вату, добавляют 10 г лактозы и доводят объем до 1 л, устанавливают pH 7,4—7,6, добавляют 4 мл 1% водного раствора генциана фиолетового. Среду разливают в пробирки с поплавками по 50 мл и стерилизуют при давлении 0,5 атм в течение 15 мин. Среда имеет фиолетовый цвет.

Среда Хейфеца

В 1 л водопроводной воды (для среды двойной концентрации——в 500 мл) растворяют 10 г пептона, 5 г хлорида натрия, 5 г маннита. После установления pH 7,4—7,6 среду нагревают до кипения, фильтруют, прибавляя 1 мл 5% спиртового раствора розоловой кислоты и 2,5 мл 0,1 % раствора метилового голубого. Среду стерилизуют однократно 20 миа в текучепаровом аппарате или кипячением в течениеч5 мин. Простерилизованную среду, разлитую в пробирки по 8——10 мл^ скашивают со столбиком. Цвет среды красно-фиолетовый.

Среда «ХБ>(хииозол-бромкрезолпурпурная среда)

В 1 л водопроводной воды (для среды двойной концентрации в 500 мл) растворяют 10 г пептона, 5 г хлорида натрия, 5 г м-аннита. Приготовленную смесь кипятят 15—20 мнн^ устанавливают pH 7,4—7,6, фильтруют через бумажный фильтр, вновь кипятят 10 мин и охлаждают до 60 ℃, после- чего стерильно добавляют 30 мл дрожжевого автолизата.

38&

15 мл желчи крупного рогатого скота, 10 мл раствора хино- зола (1 : 1000) и 10 мл 1,6% спиртового раствора бромкрезо- ла пурпурного. Среду разливают в стерильные пробирки по 7—8 мл. ,

Растворы красок готовят следующим образом: 0,8 г порошка бромкрезола пурпурного заливают 50 мл этилового спирта-ректификата. Через день раствор готов к употреблению.

Порошка хинозола 0,7 г растворяют в 100 мл стерильной дистиллированной воды.

Приготовление дрожжевого автолизата: 100 г прессованных хлебных дрожжей суспендируют в 600 мл стерильной воды, в которой разведено 1 г фосфата калия однозамещенного и 0,1 г сульфата магния.

В колбу с суспензией дрожжей наливают 8——10 мл хлороформа. Колбу закрывают ватной пробкой, которую сверху покрывают колпачком из вощаной бумаги (для предотвращения испарения). Суспензию дрожжей помещают в термостат при 45——47 ℃ на 10 сут, затем ставят в водяную баню и кипятят 20 мин, фильтруют и стерилизуют 15 мин при 112,5℃.

Среда Козера (модифицированная)

К 1 л дистиллированной воды добавляют 1,5 г фосфата натрий-аммония, 1 г фосфата калия однозамещенного, 0,2 г сульфата магния, 2,5——3 г цитрата натрия. Раствор стерилизуют в автоклаве при 1 атм 15 мин, прибавляют к нему 10 мл 0,5% спиртового раствора бромтимолового синего и разливают в стерильные пробирки.

Цитратный агар Симмонса

Растворяют в 1 л дистиллированной воды сульфата магния 0,2 г, фосфата натрия-аммония 1,5 г, одноосновного фосфата калия 1 г, цитрата натрия кристаллического 3 г. Смесь стерилизуют в автоклаве. Прибавляют 20 г агар-агара, нагревают до его расплавления, устанавливают pH 7,2 и затем прибавляют 1 мл 1,5% спиртового раствора бромтимолового синего.

Среда Сабуро

Помещают 18 г агара в 1 л дистиллированной воды и дают ему набухать 30 мин, нагревают, помешивая, пока не растворится агар, добавляют 10 г пептона и 40 г глюкозы или мальтозы. Пробирки со средой стерилизуют 15 мин при 115℃.

СОДЕРЖАНИЕЧАСТЬ ПЕРВАЯ. ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Бактериологическая лаборатория

Помещение -бактериологической лаборатории и оборудование рабо： чего места

Правила работы и поведения в лаборатории:

Порядок хранения, обращения и отпуск культур патогенных микробов

Уборка лабораторного помещения

Мытье и обработка лабораторной посуды

Дезинфекция

Стерилизация ,

Виды стерилизации

Мижроскопические методы исследования

Кроскопия микроорганизмов в живом состоянии

роскопня микроорганизмов в окрашенном виде ....

Простая окраска

Сложные дифференциальные методы окраски

Основы приготовления питательных сред .. *

Определение pH литательных сред

Техника посева, культивирования и выделения чистой культуры аэробных и анаэробных микробов

Бактериальный стандарт мутности и работа с ним

Методы выделения чистых культур

Методы изучения культуральных свойств микробов

Биохимические свойства микробов и методы их изучения ...

Методы изучения микробного антагонизма и определения чувствительности патогенных бактерий к антибиотикам

Методы изучения свойств бактериофага и явления бактериофагии .

Выдёлеиие бактериофага из патологического материала и объектов внешней среды

Качественные пробы для обнаружения бактериофага в жидких н на плотных питательных средах

Титрование бактериофага

Фаготипаж бактерий и методы фаготипирования

Лабораторные животные и экспериментальная инфекция .....

Содержание лабораторных животных и уход за ними

Способы заражения лабораторных животных

Техника взятия у лабораторных животных крови и получения из нее отдельных ингредиентов

Умерщвление и вскрытие лабораторных животных

Определение вирулентности микробов

Определение токсигениости микробов

Иммунитет и методы его изучения

Серологические методы, применяемые для изучения .факторов гуморального иммунитета

Реакция агглютинации

3 3561011151719252527303034384750525660667374767780818195от^отюи ^^^111L1 1113 3561011151719252527303034384750525660667374767780818195от^отюи ^^^111L1 111Реакция непрямой (лассивлой) гемагглютинации ..••

3 3561011151719252527303034384750525660667374767780818195от^отюи ^^^

111L1 111

3 3561011151719252527303034384750525660667374767780818195от^отюи ^^^

111L1 111

Возбудитель чумыВозбудитель чумыВозбудитель туляремииВозбудитель бруцеллезаВозбудитель сибирской язвыВозбудитель туляремииВозбудитель бруцеллезаВозбудитель сибирской язвыРиккетсии ПровачекаРиккетсии Провачека272834364343««и1* ^д 1* If 11 1* 1* и «1272834364343««и1* ^д 1* If 11 1* 1* и «1158164164174188侬牆201208228舞翁258260260265-舞窈286舞291296嶽158164164174188侬牆201208228舞翁258260260265-舞窈286舞291296嶽⑬04071417^%^^ ^ 33333 33350 &⑬04071417^%^^ ^ 33333 33350 &

Возбудитель чумы

Возбудитель чумы

Возбудитель туляремии

Возбудитель бруцеллеза

Возбудитель сибирской язвы

Возбудитель туляремии

Возбудитель бруцеллеза

Возбудитель сибирской язвы

Риккетсии Провачека

Риккетсии Провачека

272834364343««и

1* ^д 1* If 11 1* 1* и «1

272834364343««и

1* ^д 1* If 11 1* 1* и «1

158164164174188侬牆201208228舞翁258260260265-舞窈286舞291296嶽

158164164174188侬牆201208228舞翁258260260265-舞窈286舞291296嶽

⑬04071417^%^^ ^ 33333 33350 &

⑬04071417^%^^ ^ 33333 33350 &

Реакция торможения непрямой гемагглютинации . ..

Реакция преципитации .

Реакция гемолиза

Реакция связывания комплемента

Факторы естествеииой резистентности организма, методы их изучения Фагоцитоз

Гуморальные факторы естественной <резистентности организма и ме тоды их изучения

Комплемент, техника его определения

Лнзоцим и методы его титрования

ЧАСТЬ ВТОРАЯ. СПЕЦИАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Техника собирания у больного материала для бактериологического исследования Патогенные кокки Стафилококки ・... .

Стрептококки Пневмококки Мениигококкн Гонококки

Семейство кишечных бактерий (Enterobacteriaceae) Эшер их ии

Сальмонеллы Шигеллы ..

Возбудители холеры Патогенные анаэробы Возбудитель столбняка Возбудители газовой гангрены Возбудитель ботулизма Зоонозы

Возбудители коклюша и паракоклюша

Возбудитель дифтерии

Возбудитель туберкулеза

Патогенные спирохеты

Возбудители возвратных тифов

Возбудители лептоспирозов

Возбудитель сифилиса

Риккетсии

ЧАСТЬ ТРЕТЬЯ. САНИТАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Санитарио-бактериологическое исследование воды

Определение общего числа микробов в воде .

Методы определения титра кншечиой палочки в воде .

Санитарно-бактериологическое исследование почвы населенных мест Санитарно-бактериологическое исследование воздуха Санитарно-бактериологическое исследование молока и молочных продуктов Саиитарио-бактериологиЧеское йсследоваиие изделий из крема .

Санитарно-бактериологическое исследование мясо-колбасных изделий Бактериологическое исследование баночных консервов .

Исследование перевязочного и хирургической материала иа стерильность.

335335338338339339339340340340341341341341341342342鴉翁34334332345345345345348345345346346346347347347347348348348348348349349350335335338338339339339340340340341341341341341342342鴉翁34334332345345345345348345345346346346347347347347348348348348348349349350

335335338338339339339340340340341341341341341342342鴉翁34334332345345345345348345345346346346347347347347348348348348348349349350

335335338338339339339340340340341341341341341342342鴉翁34334332345345345345348345345346346346347347347347348348348348348349349350

Саимтарио-бактернологическое исследование смывов с рук ■ предметов окружающей обстановки .

приложение

Наиболее употребительные дезинфицирующие средства и прописи приготовления из иих рабочих растворов

ЭОюрсодержащие средства-

Дезинфицирующие средства -группы фенола

Приготовление хромовой смеси

Рецепты красителей и реактивов, необходимых для окрашивания бактериальных* препаратов

Кристаллический фиолетовый ...■..7

Кристаллический фиолетовый — насыщенный спиртовой раствор

Кристаллический фиолетовый — спирто-водиый раствор .

Кристаллический фиолетовый — карболовый раствор ...

Кристаллический фиолетовый ацетат

Фуксин

Фуксин — насыщенный спиртовой раствор

Фуксин Циля карболовый

Фуксии спирто-водный (раствор Пфейффера)

Метиленовый синий

Метиленовый синий — насыщенный спиртовой раствор . .

Метиленоиый синий ——опирто-водный раствор .

Метиленовый синий (Леффлера)

Синька Нейссера

Толуидиноиый синий — ацетат

Хризоидни—водный раствор

Везувии, или коричневый краситель

Нейтральный красный — водный раствор

Малахитовый зеленый — водный раствор

Краситель Романовского — Гимзы

Тушь для окраски препаратов по Бурри

Реактив Калины

Приготовление красящих бумажек по Синеву

Растворы ..

Изотонический раствор хлорида натрия

Раствор Люголя

PajCTBOp Олсвера для хранения эритроцитов

Раствор Мигуновой для хранения эритроцитов .

Агаровые среды, применяемые при постановке иммунологических реакций . • ・ *•

Агар для постановки реакции преципитации

Бифталатный агар (pH 6,2) для определения лизоцима .

Рецепты индикаторов

Лакмусовая настойка

Индикатор бромтимоловый синий

Индикатор розоловая кислота

Индикатор Андреде

Индикаторная бумага иа сероводород .

Индикаторная 'бумага на индол

Индикатор для обнаружения оксидазы

Реценты основных питательных сред

Мясная вода ..

Пептонная вода

Мясо-пептониый бульон

Триптический перевар Хоттингера

Бульон на переваре Хоттингера

О&И12Д2233 353535353535%3535汲35О&И12Д2233 353535353535%3535汲3553535543 з53535543 ззззззззззззззззззззз888899999 353535353535353535888899999 353535353535353535333333333333&3®&w 爭 3333333333333&3®&w 爭 3

О&И12Д2233 353535353535%3535汲35

О&И12Д2233 353535353535%3535汲35

5353554

3 з

5353554

3 з

зззззззззз

зззззззззз

888899999 353535353535353535

888899999 353535353535353535

333333333333&3®&w 爭 3

333333333333&3®&w 爭 3

Мясо-пептониый агар ..,.

Основной пептон Мартена

Бульон Мартена

Агар Мартена

Сахарный бульон .-(-бульон с глюкозой)

Сахарный агар (агар с глюкозой)

Рецепты питательных сред для определения ферментации углеводов

Цветные среды Гисса с углеводами

Среды Гисса с сывороткой крови

Среды Гисса на сыворотке

Среды Гисса с крахмалом

Рецепты питательных сред для определения редуцирующей способности бактерий

Молоко с метиленовым синим

Лакмусовое молоко (в прописи Минкевича)

Рецепты питательных сред для определения протеолитической способности бактерий

Питательный желатин：

Молочный агар Эйкмаиа

Свернутая сыворотка

Бульон с кусачками вареного куриного белка ....

Среда Строгова для определения индола

Среды для определения инодолообразования

Рецепт питательной среды для определения гемолитической активности

Кровяной агар

Рецепты питательных сред для выращивания кокков

Бульон и агар из мяса по Левинталю

Сывороточный бульон

Сывороточный агар

Комбинированный мясной бульон (для производства скарлатинозного токсина)

Желточно-солевой агар Чистовича

Молочно-солевой агар Петрович

Желточная среда Чистовича

Среда для получения стафилококкового энтеротоксина ..

Среда Гарро

Среда Бейли-. . .

Ристомицииовая среда

Среда обогащения для гонококков

Рецепты приготовлении питательных сред для выращивания представителей семейства кишечных бактерий

Среды для коисервироваиия исследуемого материала ....

Глицериновая смесь

Боратная смесь Изралимского и Твплицкой

Консервант Шустовой

Срды для выделения и идентификации бактерий семейства кишечных

Среда Мюллера

Среда Кауфмана

Селенитовая среда накопления Лейфсона

Среда обогащения《М》 ..

Желчный бульон

Среда Рапопорт

Голодная среда Клодницкого

Среда Эндо

Среда Левина

Среда Плоскирева и бактоагар Плоскирева

Внсмут-сульфитная среда Вильсона — Блер

Среда Аселя — Либерманна

Среда Ресселя

Среда Ресселя нз сухих питательных сред

366367367368368368368368369369369369370370370371371371372372372372373373373373374374374375375発遂蔡部^第摊378373379疆380381366367367368368368368368369369369369370370370371371371372372372372373373373373374374374375375発遂蔡部^第摊378373379疆380381

366367367368368368368368369369369369370370370371371371372372372372373373373373374374374375375発遂蔡部^第摊378373379疆380381

366367367368368368368368369369369369370370370371371371372372372372373373373373374374374375375発遂蔡部^第摊378373379疆380381

«Скошенный столбик» с мочевиной .・.・・•.

Трехсахарный агар с мочевиной по Олькеницкому . . .

Бульон 11лицериновый по Штерну .

Рецепты питательных сред для выращивания холерных вибрионов

Средн для консервации н обогащения исследуемого материала

Консервант Венкатрамена и Рамакришнана * ・* .

Щелочная пептонная вода

Щелочная пептонная вода с теллуритом калия .. .

Среды для выделения и идентификации холерных вибрионов .

Щелочной мясо*пептонный агар

Бактоагар TCBS ..

Лактозо-сахарозиая полиуглеводная среда

Среда Клигера

Среда Кларка ..

Среда Хью—Лейфсона

Среды для определения декарбоксилаз аминокислот ・ . ..

Среда Меллера*

Среда Фалькоу

Среда с мочевиной (Кристенсена)•

Реценты питательных сред для выращивания дифтерийных бактерн

Среды для консервации и обогащения исследуемого материала

Среда Пергола

Полужидкая сывороточная среда

Среды для выделения и идентификации бактерий дифтерии .

Свернутая сыворотка

Теллуровая среда Клауберга

Сухая хинозольиая индикаторная среда Бучина ...

> Цистин-теллурит-сывороточная среда Тиндаля (модифициро ванная) <

Среда для определения цистнназы (для пробы Пизу).

Среда Закса для определения фермента уреазы . ..

Сухой питательный агар для определения токсигенности ди^ терийных культур

Рецепты питательных сред для выращивания бактерий коклюша н п ракоклюша

Казениово-угольный агар (КУА) .

Картофельно-глицериновый агар на Борде — Жангу *.

Среда Закса для определения уреазы

Рецепты питательных сред для выращивания патогенных аиаэробо

Среда Китта—Тароцци

Полужидкий агар для трубок Вейона

Среда Вильсона — Блер ..

Кровяной агар Цейсслераi

Молоко по Тукаеву

Кровяной сахарный агар .

Среда Виллиса и Хоббса

Бензидиновый агар

Рецепты питательных сред для выращивания микроорганизмов, выз вающих зоонозы

. Консервант Берлина н Башевой

Жидкость Брокэ

Перевар Филдса

Среда Туманского •••

Голоднокислый агар Бессоновой

Среда с рамнозой Бессоновой-

Желточная среда Мак-Коя

Печеночный агар

Мясо-пептониый глюкозо-глнцернновый агар .

Полужидкий агар Мейера и Цобеля

Среда

Среда Томова

Среда Буза

Рецепты питательных сред для выращивания туберкулезных микобактерий

Среда Прайса ■

Среда Левеиштейна—Йенсена

Среда Петраньяин

Среда Гельберга

Рецепты питательных сред для выращивания спирохет .

Среда Уленгута 、

Среда Терских

Рецепты питательных сред, применяемых при саинтарио-бактериоло- тнческих. исследованиях . .*

Глюкозо-пептонная среда .

I⑷.Лактозо-пептоииая среда

Желчно-лактозный бульон с 'бриллиантовым зеленым ..

Борнокислая буферная среда с лактозой

Среда Кесслера .

Среда Хейфеца

Среда «ХБ» (хииозол-^бромкрезол1пу|рпурная среда) ...

Среда Козера (модифицированная)

Цитратный агар Симмонса . . . .

Среда Сабуро

J82«28282838358384啾«43843(85侬Й585Й68686^^лзззз^зх5б出&3833J82«28282838358384啾«43843(85侬Й585Й68686^^лзззз^зх5б出&3833ИБ № 1390

J82«28282838358384啾«43843(85侬Й585Й68686

^^лзззз^зх5б出&3833

J82«28282838358384啾«43843(85侬Й585Й68686

^^лзззз^зх5б出&3833

Лабинская Ариадна Семеновнамикробиология с техникойМИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИИ

Редактор С. 4 ЕфремоваХудожественный редактор Я. И. С^някоеаКорректор М. X. ЯшинаТехн, редактор В. И. ТабенскаяПереплет художника В. С. Сергеевой

Сдано в набор 24/VII 1977 г. Подписано к печати 15/Х 1977 г. Формат бумаги 60x90】/i6, 24,5 печ. л, + 0,25 печ. л. вкл. (условных 23,83 л.) 24,48 уч.- нзд. л. Бум. тип. № 2 Тираж 50 000 экз. Т 17233 МУ-42. Цена 84 коп.

Издательство «Медицина». Москва, Петроверигский пер., 6/8

Заказ 2002. (Московская типография № 11 Союзполиграфпрома при Государственном комитете Совета Министров СССР по делам издательств, полиграфии и книжной тррго.вли. Мрсква, 113105,. Нагатинская, 1.

Реакция гемолиза

(окраска метиленовым синим).

Рис. 22. Гонококк в гное (окраска метиленовым синим).

стр. 214стр. 214Рис. 23. Колонии бактерий тифопаратифозной группы на среде Плоскирева.Рис. 23. Колонии бактерий тифопаратифозной группы на среде Плоскирева.

стр. 214

стр. 214

Рис. 23. Колонии бактерий тифопаратифозной группы на среде Плоскирева.

Рис. 23. Колонии бактерий тифопаратифозной группы на среде Плоскирева.

Рис. 24. Колонии бактерий тифопаратифозной группы на среде Вильсона — Блер.

Рис. 27. Бактерии дифтерии. Окраска по Нейссеру.

Рис. 29. Бактерии туберкулеза (окраска по Цилю — Нильсену).

Рис. 30. Бледные спирохеты в отделяемом из твердого шанкра (окраска по методу Романовского — Гимзы).

К стр. 297

УДК 576.8(024) : 61] (075.8)

ЛАБИНСКАЯ А. С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. Изд. 4-е, перераб. и доп. М., «Медицина», 1978, 394 с.» нл.

В учебнике три части: общая микробиология, специальная часть и санитарная микробиология. В первой части дается описание бактериологической лаборатории, излагаются микроскопические методы исследования и основы приготовления питательных сред. Во второй части дается характеристика различных патогенных микроорганизмов и методика бактериологических исследований. В третьей части изложены методы санитарно-бактериологического исследования воды, лочвы населенных мест, воздуха и продуктов питания.

В приложении приведены наиболее употребительные дезинфицирующие средства н прописи приготовления из них рабочих растворов, рецепты приготовления красок и реактивов, индикаторов, питательных сред и консервантов.

Учебник написан в соответствии с программой, утвержденной Министерством здравоохранения СССР, и предназначен для фельдшерско-лаборантских отделений медицинских училищ.

В учебнике 34 рис., 65 табл.

Рецензенты:

Преподаватели микробиологии Харьковского медицинского училища № 1 кандидат медицинских наук, доцент Н. Ф. Головина и Ф. М. вагановская

51000—008

Л33—78

039(01)-78