Книга
← К списку книгЗагрузка разделов…
активнаАктивные записи участвуют в каталоге и синках. Неактивная книга скрыта, но не удалена из базы.
Книга
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОНКОЛОГИЯ
Заведующий редакцией Р. С. Горяинова. Редактор Д. Б. Голубев. Редактор изда-тельства Л. И. Панова. Художественный редактор Н. Д. Наумова. Оформлениехудожника А. Ю. Колокольцева. Технический редактор Л. А Резникова. КорректорР. И. Гольдина.
ИБ № 3816
Сдано в набор 24.06.86. Подпнсано в печать 18.09.86. М 2 5185. Формат бумаги бОхЭО1/!*- Бумага офсетная № 2. Гарнитура литературная. Печать офсетная. Усл печ л. 22.0. Усл. кр.-отт. 22.5. Уч.-изд. л. 24.94. Тираж 7000 экз. (11-й ззноз 1001 7000 +кз.). 38K. № 392.
Цена I р. 60 к.
Ленннград, Ордена Трудового Красного Знамени издательство «Медицина»Ленннградское отделение 191104, Ленинград, ул. Некрасова, 10
Отпечатано в типографии № 4 ордена Трудового Красного Знамени Ленинградского объединения «Техническая книга» им. Евгении Соколовой Союзполнграфпрома при Государственном комитете СССР по делам издательств, полиграфии и книжной торговти. 191126, Ленинград. Социалистическая ул.» 14 с диапознтивов Ордена Трудового Красного Знамеии Первой типографии издательства «Наука».
199034, Лснннграт. В-34, 9 линия. 12
Сейц И. Ф., Князев П. Г.
С 28 Молекулярная онкология: (Руководство для врачей).— Л.: Медицина, 1986. — 352 с., ил.
Авторы Сейц И. Ф. — профессор, руководитель лаборатории биохимии опухолей НИИ онкологии им. Н Н. Петрова М3 СССР; Князев П. Г. — ст. научный сотрудник той же лаборатории.
В руководстве рассмотрен прогресс теоретической онкологии в изучении химического, вирусного н так называемого спонтанного канцерогенеза с позиций единого нх молекулярного механизма, основанного иа концепции онкогенов. Изложены новейшие данные о сушествованнн в ДНК клеток человека и животных уникальных генов (протооикогеноа). причинно связанных с этиологией злокачественных новообразоваинй, их идентификации, структуре и функции в нормаль ных и опухолевых клетках.
4116000000-064039(01)-864116000000-064039(01)-86176-86176-86Руководство рассчитвио на онкологов, молекулярных биологов, иммунологов, биохимиков, онковирусологов н цитологов
4116000000-064039(01)-86
4116000000-064039(01)-86
176-86
176-86
55.6
© Издательство «Медицина», Москва, 1986 г.
ПРЕДИСЛОВИЕ
В результате прогресса новых научных направлений молекулярной биологии, молекулярной генетики и генной инженерии сделан огромный шаг вперед, что позволяет сейчас задавать природе вопросы, которые ранее ставить было невозможно. Речь идет о понимании самых фундаментальных основ таких явлений, как клеточное деление и дифференцировка, а также причин механизма их нарушений. В конкретном приложении к одной из самых злободневных и волнующих проблем, стоящих перед человечеством, —проблеме злокачественных опухолей — можно говорить о появлении новой науки — молекулярной онкологии. Ее поразительные успехи в сфере изучения молекулярных механизмов онкогенеза и молекулярных основ ракового фенотипа связаны с применением уникальных, присущих ей методов исследования.
Выходящая в свет и предлагаемая читателям книга «Молекулярная онкология» посвящена подведению первых итогов и изложению достижений указанной молодой науки. В ней четко прослеживается преемственность основных принципов и постулатов классической теоретической онкологии прежде всего в главных вопросах: полиэтиологичности возникновения опухолей и многостадийности этого процесса. Однако решения даются уже на другом уровне организации живой материи ——молекулярном. Данная книга ——первая и единственная пока в нашей стране. Она написана авторами, непосредственно и активно работающими в данной области, что предопределило глубину осмысления приводимых конкретных фактов и конструктивность обобщений. Через всю книгу проходит мысль об универсальности молекулярных механизмов онкогенеза. Эта идея естественно вытекает из проводимого авторами анализа новейших исследований основных видов канцерогенеза: химического, физического, биологического, основа которых, как убедительно показывают авторы, едина и может быть выражена в принципиально общих молекулярных терминах. Каждому из этих видов онкогенеза посвящены отдельные главы. 1-я глава обращает читателя к истокам теоретической онкологии, к ее классическим исследованиям начала нынешнего столетия. 2-я и 3-я главы посвящены соответственно молекулярным механизмам химического и вирусного канцерогенеза. Упомянутые первые три главы логически предшествуют заключительным — 4-й и 5-й главам ——подлинной сердцевине книги. Именно в этих главах в концентрированном виде представлены факты и идеи, символизирующие суть и дух современной теоретической онкологии — онкологии молекулярной. Ее достижения вселяют уверенность в конечной победе человеческого разума над тяжелым недугом.
Член-корреспондент АМН СССР профессор Н. /7. Напалков
ВВЕДЕНИЕ
Практическая онкология ждет от теоретической и экспериментальной науки ответов на ряд вопросов, без которых невозможны ни эффективная диагностика злокачественных опухолей, ни рациональная терапия. Первый, фундаментальный, вопрос относится к природе опухолей и их этиологии. Ничто другое не могло бы оказать большую услугу онкологам, чем внесение ясности в эту проблему, чего, однако, до сих пор не произошло. Не меньшую практическую значимость имеет решение и другого вопроса: чем отличаются раковые клетки от нормальных? Установление каких-то различий могло бы стать основой как диагностики, так и терапии злокачественных опухолей. К сожалению, современная биохимия пока не справилась и с этой задачей.
Экспериментально-теоретические исследования злокачественных опухолей принесли обильный фактический материал и значительно расширили наши знания о неоплазмах, однако все еще не дали объяснения их происхождению у человека, как и не указали на какие-либо специфические биологические особенности раковых клеток. Это тем более странно, если учесть, что к решению онкологических проблем привлечены в настоящее время очень большие коллективы и самая передовая техника.
Относительный неуспех биохимического исследования опухолей можно объяснить сложностью изучаемого феномена. Малигни- зация связана с нарушением таких фундаментальных биологических явлений, как рост, пролиферация, наследование признаков в клеточном потомстве. Ни один из этих атрибутов живого не изучен в достаточной мере каждый в отдельности; тем сложнее интерпретация процесса, являющегося результирующей их совокупных изменений. Поскольку рост, дифференциация, наследственность лежат в самой основе жизни, раскрытие феномена рака, включающего в себя все эти элементы, может оказаться не менее сложным, чем уяснение сущности самой жизни.
Если верно, что жизнь отличается от других естественных процессов тем, что она развивается по программе, то это справедливо и в отношении неоплазии, поскольку отдельные нозологические формы опухолей имеют четкие морфологические, биологические, иммунологические и другие характеристики, обусловленные реализацией строгой генетической программы, привнесенной в клетку извне или пробужденной к активности измененной (опять- таки под влиянием окружающей среды) эндогенной информацией.
Систематическое биохимическое изучение злокачественных опухолей проводится уже более 60 лет. В наши дни масштабы этих исследований особенно велики. Однако сегодня особо впечатляют и вселяют надежды, в первую очередь, новейшие открытия в области молекулярной биологии опухолей и процесса канцерогенеза —направления, которые кратко можно было бы охарактеризовать термином «молекулярная онкология».
Использование молекулярно-биологических, молекулярно-генетических, генно-инженерных принципов и методов исследования сделало возможным то, что не было доступным всему комплексу «старых» наук и даже таким, как классические биохимия, иммунология, вирусология, генетика, цитология в отдельности. Только глубокий анализ молекулярных основ трансформации и канцерогенеза способствовал прорыву из незнания в знание и обогатил современную теоретическую онкологию такими открытиями и понятиями, как онкоген, онкобелок, клеточные протоонкогены и др. Создается впечатление, что на базе новых открытий молекулярной онкологии окажется возможным построить универсальную концепцию онкогенеза, объединив в единую теорию развившиеся раздельно и нередко конфликтовавшие направления в изучении химического, вирусного, радиационного, спонтанномутационного канцерогенезов.
В предлагаемой читателю книге главное внимание уделено именно этим новым данным теоретической онкологии и попытке создать интегральное представление о состоянии и уровне наших знаний о раке на сегодня.
Следует также подчеркнуть важную роль в подготовке и становлении указанного современного этапа теоретических знаний о неоплазмах таких наук, как биохимия и вирусология. Без успехов этих дисциплин мы не располагали бы тем, чем не без оснований учение о злокачественных новообразованиях может гордиться сегодня.
Естественно, книга даже такого объема, как эта, не может охватить предмет в необходимой полноте и способна дать лишь общее представление о современных достижениях и тенденциях развития молекулярной онкологии. Содержание ее представляет скорее отдельные штрихи, узловые аспекты сложной многоплановой и загадочной картины; контуры границ достигнутого и возможного; первые систематические знания, лежащие на полпути от созерцания формы к пониманию содержания; примеры драматических успехов и неудач отдельных личностей и целых научных направлений на фоне закономерного и противоречивого исторического процесса познания.
Вместе с тем приведенные в книге многочисленные оригинальные работы отражают теоретический и технико-методический уровень, характер и направленность онкологических исследований.
Выдвигая в центр внимания химические и молекулярные взаимодействия при онкогенезе, авторы не сочтут свою задачу
выполненной, если не создадут у читателя убеждения, что рак представляет собой в высшей степени сложное биологическое явление, включающее много больше, чем только вирус, химический агент или элементарный трансформирующий фактор (онкоген) каждый в отдельности, что рак, при всей кажущейся его противоположности жизни, закономерно вытекает из нее, основан на ее фундаментальных принципах и ключевых явлениях, таких как рост, пролиферация, и без них был бы невозможен; что «орудия», которыми он оперирует, — суть элементы жизни. В этом, по-види- мому, диалектика рака как биологического явления. Другими словами, в условиях постоянного воздействия повреждающих факторов среды, переключающих нередко «плюсы» на «минусы», рак неотделим от жизни, создавая кажущееся впечатление ее тени. Тайна рака переплетена с тайной жизни, поскольку оба феномена покоятся на общих основах — универсальных биологических законах роста, пролиферации. Трудной задачей молекулярной биологии в этих условиях является выявление точек соприкосновения и пересечения двух процессов, установление границы между ними. Задача нелегкая. Тем не менее уже имеющийся опыт и знания молодой науки — молекулярной онкологии ——позволяют смотреть в будущее с оптимизмом.
ГЛАВА /
МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ТЕОРИЯ ВАРБУРГАИ ДРУГИЕ БИОХИМИЧЕСКИЕГИПОТЕЗЫ ВОЗНИКНОВЕНИЯ РАКА
Еще недавно считалось, что ни одна из существующих теорий рака не отжила свой век. Это объяснялось сравнительной молодостью экспериментальной онкологии; как и' всякая молодая наука, она была богата новыми взглядами и теориями, которые не успевали еще ни подтвердиться, ни отмереть. Сегодня утверждение о жизненности и актуальности большинства теорий и гипотез рака представляется сомнительным, особенно в свете новейших данных о существовании специфических онкогенов и он кобел ков В этом смысле справедливым кажется замечание историка науки Уитмена, что идеи, подобно людям, рождаются, переживают приключения и умирают. Тем не менее историческое значение идей н концепций, рожденных теоретической онкологией на первых этапах своего существования, вряд ли может вызывать сомнение, поскольку роль их в развитии этой науки очевидна
Именно это обстоятельство побуждает нас дать хотя бы беглый очерк взглядов на природу и происхождение опухолей, прежде всего в рамках духа этой книги, т. е. с учетом их биохимических, метаболических и молекулярно-биологических предпосылок и аргументов
К числу такого рода теорий и гипотез можно отнести следующие: 1) теория метаболических нарушений как предпосылки возникновения рака; 2) теория индукции опухолей химическими веществами; 3) вирусная теория происхождения опухолей; 4) мутационно-генетическая гипотеза; 5) теория онкогена.
Указанным теориям в этой книге будут посвящены целые самостоятельные разделы. Отдельные аспекты первых четырех не утратили своего значения и на сегодняшний день. Более того, некоторые их элементы, по-видимому, войдут в качестве интегральной части новой универсальной концепции канцерогенеза, представляемой ныне теорией онкогена. Этот вопрос подробнее будет рассмотрен ниже.
Особняком стоит 1-й пункт сделанного ыше перечисления. Идея обменно-химических нарушений как основы возникновения
рака представлялась весьма реальной и перспективной. Она была исключительно популярной несколько десятилетий кряду (30—— 70-е годы). Особенно это относится к теории О. Варбурга (О. Warburg) ,захватившей воображение многих исследователей и завоевавшей ее автору много учеников и последователей. Этот успех не был случайным. Адекватность метаболической теории истинным реакциям и процессам в ходе канцерогенеза, казалось, убедительно подкреплялась новейшими и поразительными открытиями стремительно развивающейся биохимии того времени, а именно: расшифровкой цепи дыхания и гликолиза в конкретных терминах участвующих в них ферментов и коферментов; раскрытием своеобразных взаимоотношений дыхания и гликолиза в нормальной и опухолевой клетке; выяснением энзимохимических реакций, обеспечивающих ж изнедеятельность нормальных и неопластических клеток энергией; установлением связи этих реакций с конкретными субклеточными структурно-морфологическими элементами и др.
Немаловажной причиной успеха, в частности, метаболической концепции Варбурга было и то, что автор ее сам являлся именно тем лицом, которому наука была обязана большинством наиболее значительных и фундаментальных достижений в общей биохимии, объясняющих многие биологические явления. Достаточно сказать, что Варбургу принадлежат следующие выдающиеся открытия: 1) установление связи процесса дыхания с нерастворимыми субклеточными частицами (митохондриями); 2) обнаружение высокой гликолитической активности раковых клеток как главного энергетического источника их существования; 3) идентификация железопорфирина как катализатора утилизации кислорода живыми клетками; 4) открытие флавинмононуклеотида и флавиндинуклеотида в качестве простетических групп катализаторов биологических окислений и выяснение механизма их действия; 5) доказательство роли никотинамида как главного компонента коэнзимов дегидрогеназ (НАД и НАДФ) и установление механизма действия и роли последних в метаболических реакциях; 6) изучение энергетики процесса фотосинтеза; 7) расшифровка молекулярного механизма действия ряда ферментов гликолиза; 8) введение в экспериментальную биохимию техники срезов тканей, спектрофотометрического изучения действия ферментов и коферментов, манометрии как метода исследования дыхания и гликолиза, кристаллизации ферментов и др.
ОТТО ВАРБУРГ И ЕГО БИОХИМИЧЕСКАЯ ТЕОРИЯ РАКА
Первое самостоятельное исследование О. Варбурга, опубликованное в 1908 г., касалось энергетики роста. В нем он изучал изменение в поглощении Ог яйцами морского ежа после оплодотворения. Эти эксперименты привели к важному открытию, что при оплодотворении скорость поглощения О? возрастает в 6 раз.
Связь данной работы с более поздними исследованиями рака очевидна: когда нормальная клетка становится раковой, она растет интенсивно. Поэтому в 1922 г. Варбург стал исследовать поглощение Ог и обмен раковых клеток. В последующей работе он занимался фундаментальными аспектами клеточного дыхания и намеревался объяснить природу катализа в живой материи, делающего молекулярный кислород способным окислять вещества в практически нейтральном растворе и при биологической температуре, которые (вещества) стабильны в этих условиях в отношении кислорода. Варбург нашел, что главные окислительные процессы в биологических объектах всегда связаны с нерастворимыми частицами, которые он назвал «гранулы», «структуры». В 1913 г. им были описаны «гранулы» из печеночных клеток как структуры, ответственные за дыхание. После работ A. Claude, G. Hogeboom и W. Schneider (40—50-е годы нашего столетия) мы знаем, что эти морфологические структуры клетки, описанные гистологами еще в 1890 г., являются митохондриями.
В 1923 г. Варбург обнаружил высокую скорость образования молочной кислоты раковыми клетками и пришел к заключению, что способность получать энергию за счет «молочнокислой ферментации» глюкозы и расти за счет энергии этого процесса является главной биохимической характеристикой раковых клеток. В 1927 г. Нобелевский комитет оценил эту работу как достойную Нобелевской премии и предложил разделить премию между О. Варбургом и J. Fibiger, который сделал якобы открытие, показав возможность развития рака желудка у крыс, инфицированных паразитическим червем Spiroptera. Окончательное решение высшего Нобелевского синклита было в пользу одного J. Fibiger. Ирония судьбы: О. Варбург и J. Fibiger! Последующая оценка работы J. Fibiger бросила тень на мудрость этого решения, так как инфекция Spiroptera является лишь одним из многих возможных раздражающих стимулов, в лучшем случае способствующих развитию рака, но не его этиологической причиной.
Тем не менее Варбург был удостоен Нобелевской премии в 1931 г., однако за другую серию исследований, начатых в 20-е годы. Используя остроумную и совершенно новую технику, он идентифицировал железопорфирин как катализатор, ответственный за утилизацию кислорода живыми клетками. Несколько лет спустя Варбург идентифицировал флавинаденинмононуклео- тид и ф-павинадениндинуклеотид в качестве простетических групп катализаторов биологических окислений и выяснил механизм их действия. Связанным с этой работой оказалось также открытие никотинамида как главного компонента коэнзимов дегидрогеназ (НАД и НАДФ). В 1944 г. Нобелевский комитет вновь признал Варбурга достойным Нобелевской премии, однако он не получил ее по причинам, не имеющим отношения к сути дела.
Варбург впервые показал присутствие железа в биологическом материале и участие его в клеточном дыхании. Сделал это он
с помощью цианида, который, как известно, является мощным ингибитором биологического окисления в результате реакции с тяжелыми металлами. Он продемонстрировал ускорение окисления ряда биологических субстратов: лецитина, линолевой кислоты, цистеина, альдегидов — в присутствии солей железа.
В научной деятельности Варбурга после первой мировой войны можно выделить 3 главных направления исследований: фотосинтез, рак и химическую природу ферментов, ответственных за биологическое окисление и биологическую трансформацию энергии. Во все эти 3 области биохимии (и биологии вообще) Варбург внес неоценимый вклад, значительно продвинув методологию н сделав фундаментальные открытия.
Изучение Варбургом дыхания и гликолиза опухолей. Сначала несколько общих замечаний по этому циклу работ Варбурга.
Проблема рака увлекала Варбурга еще в студенческие годы. Он пытался найти биохимические изменения в тканях, когда нормальная клетка (рост которой контролируется) становится раковой (рост которой неограничен). Варбург интересовался вопросом, отличается ли обмен раковых клеток от нормальных качественно. Он считал необходимым исследовать, в первую очередь, энергетический обмен, так как рост невозможен без поступления энергии.
В 1923 г. Варбург стал измерять дыхание перевивного рака Флекснера—Джоблинга крыс, используя технику срезов ткани. Результат показал, что скорость поглощения кислорода раковыми клетками не отличалась от таковой — нормальными клетками. Однако при исследовании образования молочной кислоты было обнаружено, что раковые клетки легко и с большой скоростью расщепляют глюкозу до молочной кислоты, значительно большей, чем это делают печень, почка, поджелудочная или подчелюстная железы. Скорость образования лактата раковой тканью полностью обеспечивала ее энергией.
Эти данные были вскоре подтверждены на других типах неопластических клеток, включая раковые клетки человека.
Особый интерес представило наблюдение Варбурга, что раковые клетки способны интенсивно гликолизировать не только в анаэробных (что свойственно и нормальным клеткам), но и .：аэробных условиях, т. е. в присутствии кислорода воздуха [Warburg О., 1926].
В попытке выяснить, специфичен ли аэробный гликолиз только для раковых клеток, автор испытывал многие ткани. Он обнаружил, что все живые ткани, являющиеся метаболически активными, способны к анаэробному гликолизу, однако подавляющее большинство их не гликолизирует в аэробных условиях. Последний эффект блокирования гликолиза или брожения со стороны дыхания получил в честь открывшего его автора термин «эффект Пастера», «пастеровский эффект» или, как предпочитал выражаться Варбург, «пастеровская реакция».
Рис. 1. Схема углеводного обмена мышцы.Рис. 1. Схема углеводного обмена мышцы.Главным исключением в отмеченной Варбургом закономерности присутствия аэробного гликолиза в опухолях н отсутствия его в нормальных тканях оказалась сетчатка глаза, показавшая очень высокую гликолитическую активность в аэробных условиях.
Рис. 1. Схема углеводного обмена мышцы.
Рис. 1. Схема углеводного обмена мышцы.
Варбург установил также, что некоторые нормальные ткани, напри
мер гематопоэтические (костный мозг), постепенно развивают аэробный гликолиз, если они экспозируются
in vitro в нефизиологических усло
виях. Он сделал из этого опыта заключение, что аэробный гликолиз, в частности сетчатки, очень своеобразной н ранимой ткани, мог быть артефактом в неадекватных условиях in vitro.
В итоге Варбург пришел к заключению, что раковые клетки отличаются от нераковых, включая растущие эмбриональные клетки, неспособностью подавлять гликолиз в присутствии кислорода (т. е. имеют неполноценный «пастеровский эффект»).
Осуществленные к тому времени исследования Мейергофа (О. Meyerhof), казалось, могли объяснить особенности взаимоотношений дыхания и гликолиза в раковых клетках. Автор устано
вил, что в мышце существует определенная связь между скоростью дыхания и подавлением гликолиза. Как правило, поглощение одной молекулы Ог предотвращало образование двух молекул лактата. Это означало, что эффект кислорода не может быть объяснен (как полагали ранее) полным окислением лактата. Мейергоф высказал предположение, что ферменты, участвующие в образовании лактата, функционируют в аэробных условиях, но что образующийся лактат ресинтезируется обратно в углевод за счет энергии, обеспечиваемой процессом дыхания. Как известно, Мейергоф описал углеводный обмен мышцы (рис. 1).
Мейергоф подсчитал, что энергии поглощения одной молекулы кислорода достаточно для осуществления ресинтеза углевода
из двух молекул лактата.
Открыв высокий аэробный гликолиз раковых клеток, Варбург попытался установить причины неспособности кислорода подавлять гликолиз в раковых клетках. Его измерения анаэробного и аэробного гликолиза (образования лактата) различными тканями и сопоставление этих данных с результатами измерения поглощения О2 показали, что во многих тканях поглощение одной молекулы Ог путем дыхания предотвращает появление двух молекул молочной кислоты. Это ——то же количественное отношение, которое Мейергоф нашел в мышечной ткани. Эффективность дыхания в предотвращении аэробного гликолиза Варбург выразил следующим уравнением:
Аназробннй глнколнз — азроСннй глнколнзДыхание
и назвал его «коэффициентом Мейергофа». Если гликолиз выражен в единицах образованного лактата, а дыхание — в единицах поглощения кислорода, то величина коэффициента Мейергофа обычно равна 2. В раковой ткани Варбург нашел дыхание сниженным и энергетически менее эффективным, что позволило ему сделать заключение о дефектности дыхания раковых клеток в контролировании аэробного гликолиза.
«Эффект Пастера». В тот период времени знания о путях гликолиза и глюконеогенеза были весьма ограниченны, что исключало возможности выяснения вопроса о том, каков механизм действия дыхания в предотвращении продуктов гликолиза и осуществлении ресинтеза углевода. В этой обстановке ограниченности необходимых знаний Варбург внес важный вклад в проблему взаимоотношений дыхания и гликолиза. В 1926 г. он установил, что связь между дыханием и, как говорил тогда Варбург, ферментацией может быть нарушена специфическим ингибитором, этилкарбиламином. В основе действия этого соединения, как показал Варбург, лежит его способность при использовании в низких концентрациях, не угнетая дыхания клеток, индуцировать аэробный гликолиз, т. е. гликолиз в присутствии кислорода. Иными словами, этилкарбиламин оказался агентом, нарушающим «пастеровскую реакцию». Поскольку этилкарбиламин легко хелатирует с ионами тяжелых металлов и тормозит другие реакции, катализируемые тяжелыми металлами, Варбург заключил, что в реализации «пастеровской реакцнн» участвует тяжелый металл.
Природа и механизм «пастеровской реакции» долгие годы оставались необъясненными.
Потребовался длительный отрезок времени для того, чтобы было достигнуто какое-то приближение к пониманию «пастеровского эффекта». Это было сделано в результате серии работ, ыполненных в лабораториях В. А. Энгельгардта, F. Lynen, Т. Bucher и др.
Схематично и кратко механизм осуществления «пастеровского эффекта» может быть представлен на основании современных данных следующим образом, отличным от их толкования Варбургом.
Считается, что суть дела не в индукции кислородом ресинтеза продуктов гликолиза. Дыхание, через синтез АТФ, модифицирует каталитические свойства скоростьограничивающего фермента гликолиза (или брожения), фосфофруктокиназы. Активность этого энзима вариабельна и регулируется концентрацией АТФ, АДФ и неорганического фосфата, равно как и различными другими метаболитами. Фосфофруктокиназа является «аллостерическим» ферментом, и «пастеровский зффект» может быть приписан ал-
л осте ри ческим свойствам этого фермента: АТФ инактивирует фосфофруктокиназу, тогда как АДФ н неорганический фосфат активируют ее. Поскольку дыхание посредством окислительного фосфорилирования вызывает превращение АДФ и неорганического фосфата в АТФ, оно (дыхание) снижает активность фосфофруктокиназы. Далее, так как этилкарбиламин разобщает окислительное фосфорилирование [Warburg О., 1926, 1969], он может устранить влияние дыхания на гликолиз. Многие другие «разобщители» обладают таким же действием [Сейц И. Ф., 1961; Сейц И. Ф., Луганова И. С., 1967]. Таким образом, «пастеровский эффект» («пастеровская реакция») неразрывно связан с окислительным фосфорилированием. Так как тяжелые металлы входят в состав дыхательной цепи клеток, мысль Варбурга об участии их в «пастеровской реакции» представляется в принципе справедливой.
Варбург сохранял интерес к проблеме рака всю свою жизнь. Он продолжал считать, что потеря нормального дыхания является ключевым фактором в канцерогенезе. В 1969 г. (в немецком издании — в 1966 г.) Варбург суммировал свои взгляды, разделив причины болезней на первичные и вторичные. Например, первичной причиной чумы является чумная бацилла, однако вторичными причинами чумы являются грязь, крысы и блохи, которые переносят чумные бациллы от крыс к человеку. Под первичной причиной болезни он понимал такую, которая обнаруживается в каждом случае проявления ее.
Рак, согласно Варбургу, больше, чем се другие болезни, имеет бесчисленные вторичные причины. Почти все они могут вызвать рак. Однако даже для рака имеется только одна первичная причина. Суммируя > немногих словах, первичной причиной рака, по его мнению, является замещение дыхания кислородом в нормальных клетках тела ферментацией сахара. Все нормальные клетки организма удовлетворяют свои энергетические потребности за счет дыхания кислородом, тогда как раковые клетки удовлетворяют свои энергетические потребности в значительной части путем ферментации. Все нормальныые клетки тела являются, таким образом, облигатными аэробами, тогда как все раковые клетки — частичные аэробы. Варбург считал, что с точки зрения физики и химии жизни эта разница между нормальными н раковыми клетками велика. Кислородный газ, донор энергии у растений и животных, развенчан в раковых клетках и заменен энергию- производящей реакцией низших живых форм, а именно ферментацией глюкозы. Ключом к проблеме рака, по Варбургу, является энергетика жизни.
Он утверждал, что замещение кислородного дыхания ферментацией является первичной причиной рака. Поэтому все раковые клетки без исключения должны ферментировать, чего не должно наблюдаться ни у одной нормально растущей клетки.
Поскольку не существует раковых клеток, дыхание которых интактно, Варбург считал, что нет смысла дискутировать по поводу
возможности предотвращения рака при сохранении дыхания раковых клеток интактным.
Исходя из этих своих принципиальных установок в отношении роли дыхания в обеспечении нормального физиологического состояния, Варбург высказал ряд практических предложений для предотвращения развития рака в организме. Так, он рекомендовал: 1) поддерживать скорость кровотока столь высокой, чтобы венозная кровь еще содержала достаточно кислорода; 2) поддерживать высокую концентрацию гемоглобина в крови; 3) всегда добавлять в пищу, даже здоровых людей, активные группы дыхательных ферментов и увеличить дозы этих групп при уже развившемся предраковом состоянии. Если в то же время экзогенные канцерогены строго исключены, тогда, по мнению Варбурга, большинство заболеваний раком может быть предотвращено уже сегодня.
Не все из перечисленных взглядов и положений Варбурга сохраняют силу и разделяются всеми специалистами (особенно в таком крайнем выражении, как приведено выше). Скорее наоборот, по мере накопления новых фактов некоторые из них утрачивают свою доказательную силу. Однако при оценке научного наследия Варбурга следует четко различать две стороны его творчества: 1) фактические данные; 2) интерпретацию и обобщение этих данных. Необходимо четко констатировать, что все сделанное Варбургом экспериментально, абсолютно надежно, достоверно и ценно. Ни один из полученных им конкретных фактов не опровергнут и не подвергнут сомнению. Все его исследования выполнены на высочайшем теоретическом и технико-методическом уровне. Иначе дело обстоит со сделанными им обобщениями и умозаключениями. Нельзя сказать, что они всегда оставались корректны, хотя в момент выдвижения они представлялись адекватными экспериментальным результатам. Но с течением времени при появлении новых данных происходила постепенная их «девальвация>, эрозия надстроек над фактами, что не всегда было безболезненно. Известны упорство и даже некоторый консерватизм Варбурга в отстаи ании собственных взглядов н положений, переходившие в отдельных случаях в нетерпимость к оппонентам.
Варбург был фанатично предан своим идеям и все возражения воспринимал как личную обиду. Однако сегодня совершенно очевидно, что некоторые его теоретические обобщения возникли в результате большого упрощения. В частности, частичное замещение дыхания гликолизом является лишь одной из многих характеристик, которые отличают (да и то не всегда) раковые клетки от нормальных. Варбург игнорировал фундаментальный биохимический аспект раковой проблемы, а именно механизмы, ответственные за контролируемый рост нормальных клеток, которые утрачены в раковых клетках. Несомненно, различия в энергетическом обмене, открытые Варбургом, важны, однако,
будучи таковыми, они находятся на уровне биохимической организации клетки и недостаточно глубоки, чтобы касаться сердцевины проблемы рака, неконтролируемого роста. «Первичная причина рака» Варбурга — замена дыхания гликолизом ——может быть лишь симптомом истинной первичной причины, однако не является таковой сама по себе. Первичную причину следует искать на уровне контроля генной экспрессии, детали которой пока не известны.
Таково, в частности, мнение лауреата Нобелевской премии и в прошлом — коллеги Варбурга по работе Н. Krebs (1972).
Интересно, что Варбург не только провозглашал принципы профилактики рака, считая, что 80 % случаев этого заболевания среди людей могли быть предотвращены, если бы все контакты человека с известными экзогенными канцерогенами были исключены. Он активно сам лично следовал им, создавая некоторыми крайностями в проведении нх в личной жизни впечатление у окружающих немалой эксцентричности и странности. Известно [Krebs Н., 1972], что эксцентричность, например, касалась пищи. Поскольку для Варбурга было совершенно ясно, что рак может возникать при действии большого числа химических соединений, если они апплицируются длительные периоды зременн, он стал исключительно осторожен в приеме пищи, которая обрабатывалась специальными химическими веществами. Он никогда не ел хлеба из магазинов, если мог избежать этого, а использовал хлеб, приготовленный в домашних условиях; опасался удобрений, инсектицидов и пестицидов, в связи с чем выращивал необходимые овощи, ягоды и фрукты в своем хозяйстве без употребления этих химикатов; держал кур, уток, гусей, индюшек и кроликов; приобретал из соседней сельскохозяйственной школы большие партии молока от специального стада, центрифугировал его для получения масла и сметаны.
Экспериментальные факты, послужившие основой метаболической теории Варбурга. Вряд ли будет ошибкой сказать, что исследования Варбурга и сотр. положили начало современной биохимии опухолей. Эти работы овладели умами исследователей, стимулировали новые энергичные поиски особенностей ракового обмена, определили направление исследований во многих лабораториях на много лет вперед.
В серии работ, выполненных с 1923 по 1926 г., Варбург и сотр. провели глубокое изучение энергетического обмена раковых и некоторых нормальных тканей [Warburg О., 1926]. Прежде всего были отмечены чрезвычайно высокая гликолитическая активность срезов раковых тканей и нормальный или несколько сниженный уровень дыхания. Срезы крысиной карциномы Флекснера— Джоблинга, состоящей, главным образом, из эпителиальных клеток, в расчете на 1 мг сухой массы ткани в 1 ч образовывали из добавленной глюкозы в анаэробных условиях 0,124——0,129 мг [Warburg О., 1926] молочной кислоты, что составляет более 12 %
от сухой массы опухоли и соответствует коэффициенту Q：］?= =31—32. Значение этого показателя『становится особенно ясным из его сравнения с показателями гликолитической активности других тканей. Кровь образует за 1 ч молочную кислоту в количестве, соответствующем 0,1 % от ее сухой массы, покоящаяся мышца—0,06 %, а максимально работающая мышца — 1,5 %. Раковая ткань, таким образом, продуцирует молочную кислоту со скоростью, в 124 раза большей, чем кровь, в 20 раз — чем покоящаяся мышца, и в 8 раз большей, чем работающая мышца.
Варбург и сотр. показали, что способность раковых клеток перевиваться тесно связана с их способностью к гликолизу. Утрата раковыми клетками гликолитической активности приводит к потере ими способности перевиваться.
Одним из наиболее интересных и важных результатов лаборатории Варбурга является обнаружение в неопластических клетках аэробного гликолиза. Величина аэробного образования молочной кислоты опухолями оказалась очень высокой: анаэробный гликолиз в срезах крысиной карциномы Флекснера——Джоб- линга колебался в коэффициентах QCOl между 25 н 40, а гликолиз в аэробных условиях — 20―36. Варбург приводит средние цифры соответственно 31 и 25. Поскольку измерения Варбурга показали, что коэффициент Мейергофа 言 раковых и нормальных тканях одинаков, т. е. эффективность дыхания в опухолях сохраняется, но в то же время гликолиз раковых клеток непомерно высок, он решил, что причиной аэробного гликолиза в злокачественных опухолях является количественная недостаточность дыхания по сравнению с гликолизом. Действительно, определение интенсивности дыхания карциномы дало величину QO1 7,2. Хотя эта величина не отличается от таковой у некоторых нормальных тканей, она, конечно, низка. При таком соотношении дыхательной н гликолитической активности клеток возникновение аэробного гликолиза Варбург считал естественным и неизбежным. Таким образом, обмен раковых клеток, по Варбургу, представляет собой сочетание окислительного и гликолитического метаболизма.
Введенный Варбургом коэффициентВведенный Варбургом коэффициентазробнн访 ппикапнзазробнн访 ппикапнздыханиедыханиео пре де-о пре де-
Введенный Варбургом коэффициент
Введенный Варбургом коэффициент
азробнн访 ппикапнз
азробнн访 ппикапнз
дыхание
дыхание
о пре де-
о пре де-
ляющий число молекул молочной кислоты, образующихся на каждую молекулу поглощенного кислорода, характеризовал количественное соотношение двух типов обмена клеток. Для злокачественных опухолей, по данным лаборатории Варбурга, этот коэффициент равен в среднем 3,9. Из указанного соотношения можно подсчитать количество сахара, расщепленного н процессах дыхания и гликолиза в условиях их сосуществования. При этом
Используются международно принятые обозначения:
Qo — поглощение кислорода в мм3 за 1 ч инкубации в расчете на 1 мг сухой массы клеток (ткани);
Qco? — гликолиз в мм3 СО, за 1 ч инкубации на 1 мг сухой массы клеток; Q?& аэробно, qS? — анаэробно.
следует иметь в виду, что 1 молекула молочной кислоты соответствует % молекулы глюкозы, а 1 молекула кислорода способна окислить '/б молекулы этого углевода. Если учесть эти замечания, то упомянутый коэффициент придется умножить на 3. В этом случае получается соотношение ^олизированный сахаро_
окисленный сахар「
вой опухоли оно равно 12. Это значит, что из 13 молекул утилизированного в ходе обменных превращений сахара лишь 1 молекула окисляется, а 12 — гликолизируются. Следовательно, анаэробный обмен абсолютно доминирует в опухолях.
Варбург исследовал и различные человеческие злокачественные опухоли. В 13 различных видах карцином, содержащих 30—80 % эпителиальных клеток, анаэробное образование молочной кислоты составляло в среднем Q,' = 21, т. е. 8,4 % от их сухой массы. В аэробных условиях гликолиз был меньше: Qcl, = 14. Средняя величина Q。？ была равна 5,1. Внеся поправки на «загрязнение» испытывавшихся срезов опухолей соединительнотканными и немалигнизированными эпителиальными элементами, Варбург получил для карцином человека Q = 41. Это соответствует образованию молочной кислоты, равному 16,4 % от сухой массы срезов. Труднее было внести соответствующие поправки для Qo, н Q：o,. Однако независимо от истинных абсолютных величин этих двух коэффициентов соотношение Q玄 и QOa, равное 3,1 и характерное для злокачественного материала, по мнению Вар> бурга, не должно измениться. Для сарком человека были получены следующие метаболические коэффициенты: Q*?=27,9； Q*尸 =15,6; Qo, = 4,9. Испытуемый материал в этом случае содержал лии1Ь 80 % неопластических клеток. Если внести поправки с учетом этого содержания опухолевых клеток, получаются соответственно цифры, характеризующие гликолиз: 34,9 и 18,6. Отношение аэробный гликолиз& °
■равно
дыхание 「
На одну опухолей кислоты.На одну опухолей кислоты.Исследование 冋 лаборатории Варбурга различных доброкачественных опухолей человека показало, что и < них имеется аэробный гликолиз. Так, например, в папилломах мочевого пузыря (почти 100 % эпителиальных клеток) Q”％ = 26; Q?；% = 16; Qo?= =13. Ода ко доброкачественные опухоли существенно отличались от раковых тем, что отношение аэробного гликолиза к дыханию в них никогда не достигало величины 3—4, как в опухолях злокачественных, а колебалось около 1. Этот факт указывает на то, что обмен доброкачественных опухолей сдвинут значительно в сторону окислительного, хотя и занимает промежуточное положение между нормальными и малигнизированными клетками.
На одну опухолей кислоты.
На одну опухолей кислоты.
молекулу поглощаемого клетками доброкачественных кислорода образуется лишь одна молекула молочной
Bap-Bap-аэробный гликолиз
Bap-
Bap-
Именно в величине отношения дыхание
бург усматривал принципиальное отличие нормальных тканей и даже доброкачественных опухолей от неоплазм.
В опытах Варбуга и сотр. 3——5-дневный куриный эмбрион (возраст, когда скорость роста эмбриона сопоставима со скоростью роста крысиной карциномы Флекснера—Джоблинга) показал весьма высокий анаэробный гликолиз ——0,09 мг молочной кислоты на 1 мг сухой массы в час, что соответствует образованию за 1 ч количества, равного 9 % от сухой массы эмбриона. Тем не менее в аэробных условиях нарастания количества молочной кислоты почти не наблюдалось (Q丸=1,1). Таким образом, обмен эмбриона является практически аэробным, несмотря на высокую потенциальную возможность гликолиза, QCo, = 20,6; QOa эмбриона = 10,2.
Следовательно, высокая гликолитическая активность не является исключительной особенностью опухолей, но присуща также другим растущим тканям и, как мы увидим из дальнейшего (раздел, посвященный белым клеткам крови), даже нормальным нерастущим. Существенной разницей является лишь величина
отношения гликолиза к дыханию.
Дыхание нормальных тканей и эмбриона достаточно для исчез
новения молочной кислоты.новения молочной кислоты.для этого.Интересны полученные обмену тканей, из которых соответственно эпителия ндля этого.Интересны полученные обмену тканей, из которых соответственно эпителия на дыхание опухолей — слишком мало
новения молочной кислоты.
новения молочной кислоты.
для этого.
Интересны полученные обмену тканей, из которых соответственно эпителия н
для этого.
Интересны полученные обмену тканей, из которых соответственно эпителия н
в лаборатории Варбурга данные по возникают карциномы и саркомы,—— соединительной ткани. В мышечной
выявлено уловимых (печень, почка, подвыявлено уловимых (печень, почка, подщитовидная железащитовидная железафасции крысы (соединительная ткань) не дыхания н гликолиза. Эпителиальные ткани
выявлено уловимых (печень, почка, под
выявлено уловимых (печень, почка, под
щитовидная железа
щитовидная железа
желудочная железа, подчелюстная железа,
и др.), как правило, имели интенсивное дыхание и заметный анаэробный гликолиз. Последний, однако, был в покоящемся эпителии примерно в 10 раз меньше, чем в эпителиальной опухоли, паэробный гликолиз
Величина отношения —в нормальных эпителиаль-
дыхание「
ных тканях приближалась к 0, что говорит о чисто окислительном обмене. Аэробного гликолиза нормальные эпителиальные ткани не проявляли. Были обнаружены, однако, ткани, в которых гликолиз имел место без одновременного состояния роста, а аэробный гликолиз — без аномального роста. В двух тканях, не достигающих никогда стационарного состояния: зародышевом эпителии и вилочковой железе,——был обнаружен анаэробный гликолиз, значительно более высокий, чем в стационарных тканях. Лимфоидная ткань, как известно, находится в более лабильном состоянии, чем зрелые соединительная ткань или эпителий. Соответственно в ней выше оказался анаэробный гликолиз. Все другие ткани нестационарного состояния обнаружили также заметный аэроб-
ныи гликолиз. Однако отношение в них было
дыхание
меньше 1.
Гиперпластическое разрастание миндаликов сопровождается резким увеличением анаэробного и аэробного гликолиза (QrO1 соответственно 18,0 и 9,2). Но и в этом случае отношение а пробный гликолизс с“
—составляет лишь 0,94.
дыхание
Очень высокий анаэробный н аэробный гликолиз был обнаружен Варбургом в сетчатке: Q工=88; Q* = 45. Эта ткань, находясь в среде, содержащей сахар, образует за 1 ч такое количество молочной кислоты, которое равно 35 % от ее сухой массы. Однако дыхание сетчатки также зесьма высокое, QOj = 30,7. Высокой метаболической активностью характеризуется мозг: Qco, = 19,1; Q о, = 2,5; QOi = 10,7. В то же время ни в сетчатке, аэробный гликолиз
ни в ткани мозга отношение — не достигает зна-
дыхание
чений этого коэффициента в злокачественных опухолях. Таким образом, эта особенность — высокий коэффициент
аэробныйаэробныйгликолизгликолиздыханиедыхание,равный 3—4, — присуща, по данным Варбурга,,равный 3—4, — присуща, по данным Варбурга,
аэробный
аэробный
гликолиз
гликолиз
дыхание
дыхание
,равный 3—4, — присуща, по данным Варбурга,
,равный 3—4, — присуща, по данным Варбурга,
только неопластическим тканям.
На основании полученных данных Варбург развил теорию возникновения опухолей. Согласно его точке зрения, недостаток кислорода, вызванный теми или другими причинами, является фактором, служащим первым толчком в смещении обмена клетки в сторону злокачественности. В результате хронического недостатка кислорода часть клеток гибнет, другая же часть — приспосабливается к новым условиям, развивает высокую гликолитическую активность, которая восполняет возникший дефицит энергии.
Указанную идею Варбург разработал значительно более полно 30 лет спустя, вернувшись вновь к изучению проблемы рака. Этому способствовали новый экспериментальный материал как самого автора, полученный, главным образом, при исследовании асцитических раковых клеток мышиной карциномы Эрлиха, так и данные литературы последних лет, которые были им критически рассмотрены и использованы для подкрепления своих взглядов. Весьма обстоятельно свою модифицированную точку зрения Варбург изложил в обзорах, появившихся в 1954—1956 гг., а также в полемике с S. Weinhouse. Основными материалами, которые дополнительно использовал Варбург, помимо его собственных, явились следующие: обнаружение факта, что быстро регенерирующая печень аэробно не образует молочную кислоту; установление структурных различий в механизме генерации энергии путем дыхания и гликолиза; результаты изучения дыхательных гранул и ыявление их роли в патологии неоплазм; канцерогенез, вызываемый дыхательными ядами и недостатком кислорода, и некоторые другие.
Асцитные раковые клетки оказались особенно удобным объектом биохимических исследований неопластического материала,
так как они практически совершенно не «загрязнены» нераковыми клетками (почти 100 % чистота). Раковый асцит представляет собой взвесь индивидуальных раковых клеток, что особенно выгодно с точки зрения полноценного снабжения кислородом и питательными материалами и имеет преимущества перед срезами. Наконец, очень важно, что асцитные раковые клетки представляют собой целые неповрежденные клетки, хорошо выдерживающие встряхивание в сосудах при инкубации. В опытах с асцитными раковыми клетками, таким образом, исключается влияние фактора повреждения на результаты исследования, чего нельзя сказать о срезах и тем более гомогенатах.
Изучение обмена асцитных раковых клеток мыши (карциномы Эрлиха) в лаборатории Варбурга дало следующие результаты: QOa = 7; Q*% = 30; QCq2 = 60. Следовательно, индивидуальные асцитные раковые клетки обладают еще более высокой гликолитической активностью, чем твердые тканевые опухоли. Асцитные раковые клетки Эрлиха образуют в анаэробных условиях за 1 ч такое количество молочной кислоты, которое составляет до 30 % от их собственной сухой массы. Следовательно, несоответствие между мощной гликолитической активностью неоплазм и их умеренным по интенсивности дыханием в некоторых случаях еще больше, чем оно представлялось ранее на основании изучения твердых опухолей.
В связи с этими данными интересны результаты изучения обмена клеток Эрл я. Как известно, раковые клетки мышей удалось культивировать, причем в двух штаммах ——высокой и низкой злокачественности. О степени злокачественности судили по проценту успешных перевивок. Исследования лаборатории D. Burk показали, что два указанных штамма резко отличаются друг от друга своим обменом веществ. Штамм более злокачественный имел высокий уровень гликолиза и меньшии уровень дыхания: QCOj = =70; Qcos = 30; Qo, = 7, т. е. показатели асцитных раковых клеток; штамм с низкой злокачественностью имел меньший гликолиз, но более интенсивное дыхание: Q*? = 25; Q：% = 10; Qoj= 13.
Опыты с асцитными раковыми клетками и клетками Эрля говорят в пользу концепции Варбурга, ибо в основе изменения обмена нормальных клеток в сторону злокачественного перерождения, согласно Варбургу, лежат повреждение дыхания и возобладание гликолиза. Это повреждение дыхания в условиях организма может вызываться различными причинами, но главная из них —— затруднение в снабжении кислородом в силу механического сдавливания сосудов, хронического раздражения, действия ядовитых веществ, лучистой энергии и др. Действие всех повреждающих факторов, по мнению Варбурга, сводится к одному следствию — повреждению дыхания. Однако не всякое повреждение дыхания может вызвать рак. Варбург указывал, что повреждение дыхания должно иметь следующие особенности для того, чтобы оно могло
стать канцерогенным фактором: 1) повреждение дыхания должно быть необратимым, т. е. оставаться после удаления агента, вызвавшего нарушение. Варбург постулирует, что дыхание, связанное с гранулами, остается поврежденным, если оно однажды повреждено, и никогда не возвращается к норме. Побреждение дыхания может выразиться в уменьшении поглощения кислорода или в «разобщении» окисления и фосфорилирования; 2) повреждение дыхания не должно быть столь большим, чтобы оно привело к гибели клетки, иначе невозможен отбор. В этом плане Варбург указывает, что гораздо менее опасны резкий недостаток кислорода или большие концентрации ядов, чем слабое и длительно продолжающееся воздействие этих факторов; 3) нарушение дыхания должно сохраняться при всех последующих клеточных делениях, т. е. должно передаваться по наследству; 4) повреждение дыхания не должно распространяться на гликолиз, последний должен сохраняться; 5) нарушение дыхания не должно сказываться на клеточном делении. Только при этих условиях нарушение дыхания может быть канцерогенным.
Варбург писал, что возникновение раковых клеток немыслимо без повреждения дыхания:《Keine Krebszelle ohne geschadigte At- mung». Становление раковых клеток из нормальных, по Варбургу, проходит в два этапа. В первой фазе вследствие различных причин происходит необратимое повреждение дыхания, после чего наступает длительный период борьбы пораженных клеток за существование. Лишь некоторые из поврежденных клеток выживают. Это те, которые оказались способными восполнить возникший дефицит в энергии за счет развития мощного ферментного механизма гликолиза. Длительность скрытого периода канцерогенеза объясняется именно долговременностью процесса отбора клеток с высокой способностью к гликолизу. Таинственный латентный период возникновения рака, согласно Варбургу, есть не что иное, как время, в течение которого путем отбора клеток увеличивается глнколнз ткани после повреждения дыхания. Нарушение дыхания, уменьшение доли энергии, которую клетки получают за счет этого процесса, связаны с утратой клетками тех структур, с которыми в норме процесс дыхания связан: уменьшается число митохондрий в клетке. Преобладание процесса гликолиза, таким образом, связано с дедифференцировкой.
Варбург не дал четкого определения, что он понимает под термином «поврежденное дыхание». Однако из всего того, что он говорил по этому поводу, можно понять, что имеется в виду и количественная, и качественная неполноценность дыхания. Что касается количественной недостаточности дыхания, то Варбург придавал значение не столько абсолютным величинам поглощения кислорода, сколько отношению дыхания к гликолизу. Дыхание в раковых клетках не просто мало, оно мало по сравнению с очень высоким гликолизом. С другой стороны, Варбург полагал, что дыхание раковых клеток неполноценно и в качественном отно-
шении. При этом имелась в виду возможность разобщения по типу, который им наблюдался в эмбрионе при переносе его из амниотического мешка в солевой раствор. В амниотическом мешке, по свидетельству Варбурга, метаболические коэффициенты эмбриона таковы: Qo?= 15; QcA* = 0； Qco2 = 25. Следовательно, в пересчете на возможный ресинтез АТФ это означает: Ратф = 105; Qa-гф = 25. В результате разобщения дыхания от фосфорилирования эти показатели обмена меняются: QOa = 15; Q°b2 = 25 (появляется аэробный гликолиз); Q：g, = 25. Соответственно Qa彳е = 0； Q*© = 25. В расчетах принимается, что поглощение 1 молекулы кислорода обеспечивает генерацию 7 молекул АТФ, а образование 1 молекулы молочной кислоты——1 молекулы АТФ (1 мкмоль АТФ равен 22,4 мм3). На основании этой аналогии с эмбрионом Варбург допускал возможность того, что коэффициент Qa%> раковых клеток равен 0. Он даже считал возможным, что первая фаза канцерогенеза — необратимое повреждение дыхания — может выражаться не столько в абсолютном уменьшении дыхания, сколько в разобщении дыхания и фосфорилирования при неизменном общем поглощении кислорода.
В качестве прямого доказательства правильности своих представлений о роли нарушения дыхания в канцерогенезе Варбург приводил данные Н. Goldblatt и G. Cameron (1953). Эти авторы сумели экспериментально вызвать раковое перерождение, создавая условия недостатка кислорода для ткани. Фибробласты сердца выращивались в культуре ткани в течение 2'/г лет. Часть культур в течение этого срока подвергалась прерывистому лишению кислорода на некоторые отрезки времени. В двух таких культурах из фибробластов сердца возникли раковые клетки, из которых при перевивке здоровым крысам развилась трансплантабельная фибросаркома. В контрольной культуре, которая не подвергалась ограничению кислорода, раковые клетки не возникли.
Работа Н. Goldblatt и G. Cameron (1953) весьма эффектна, и естественно, что Варбург придавал ей большое значение. Однако если продолжительное прерывистое лишение ткани кислорода рассматривать просто как длительное неспецифическое хроническое раздражение, вызывающее повреждение, независимо от природы используемого агента, то эти данные предстанут в качестве лишь косвенного, но не прямого доказательства.
Вернемся, однако, к анализу концепции Варбурга. Согласно ей, повреждение дыхания в конце концов приводит к резкому усилению гликолиза. Увеличенный гликолиз, по Варбургу, столь же присущ раку и так же необходим для его возникновения, как и неполноценное дыхание. Варбург говорил, что, в отличие от дыхания, не существует средств, которые могли бы стимулировать гликолиз выше естественно присущего каждой данной ткани анаэробного уровня. Именно поэтому он считал, что увеличение гликолитической активности при превращении нормальных тканей в злокачественные представляет собой медленный
процесс, требующий длительного времени и многих клеточных поколений. Имеются работы, в которых ход этого увеличения прослеживается во времени. Наиболее демонстративны в этом плане исследования D. Burk (1942). Он вырезал часть печени здоровых крыс и исследовал обмен печеночных клеток при регенерации, в ходе которой печень растет стремительнее, чем быстро растущий рак. D. Burk не обнаружил увеличения гликолиза при регенерации печеночной ткани. С другой стороны, этот автор скармливал крысам в течение 200 дней канцерогенный краситель, в результате чего возникала карцинома печени. Было показано, что гликолитическая активность при этом медленно увеличивалась на протяжении 200 дней до уровня, характерного для рака. Варбург считал, что движущей силой увеличения глнколнза являлся в данном случае недостаток энергии, вызванный повреждением дыхания.
На основании опытов D. Burk Варбург сделал вывод о том, что гликолиз клеток не имеет ничего общего с нормальным ростом. В то же время из работ Варбурга известно, что гликолиз клеток тела максимален в наиболее ранних стадиях эмбрионального развития, но постепенно падает по мере дифференциации эмбриона. Гликолитическую активность эмбриональных тканей и способность зрелых высокодифференцированных клеток животных к гликолизу Варбург рассматривал как наследие недифференцированных предков, в свете известной общебиологической закономерности, постулирующей, что онтогенез повторяет филогенез.
Что касается взглядов Варбурга на роль аэробного глнколнза в опухолях, то в поздних своих работах он продолжал придавать этому процессу столь же большое значение, как и раньше. Так, в 1954 г. он констатировал, что со времени его первых работ по раку (1923 г.), когда эта особенность раковых клеток была обнаружена впервые, не найдено ни одной злокачественной опухоли, которая бы не имела аэробного гликолиза, и не было обнаружено ни одной нормально растущей ткани, которая, находясь в теле животного в условиях нормального кровоснабжения при достаточном насыщении кислородом, проявляла бы гликолитическую активность. Аэробный гликолиз, согласно Варбургу, является свойством всех растущих раковых клеток, тогда как аэробный глнколнз без роста есть свойство лишь поврежденных клеток. Если величина анаэробного гликолиза у всех опухолей примерно одинакова, то интенсивность аэробного гликолиза сильно варьирует. Аэробный гликолиз тем выше, чем вирулентнее рак и чем быстрее и деструктивнее он растет. Это говорит, по мнению Варбурга, о том, что управление ростом в организме производится механизмом, который связан с дыханием кислородом. Злокачественные опухоли растут неорганизованно, видимо, потому, что они снабжаются энергетическим источником, который этому управлению не подчиняется. В раковых опухолях дыхание слишком слабо или неактивно, чтобы блокировать гликолиз.
Варбург был крупнейшим знатоком обмена раковых опухолей, и его биохимическая теория происхождения и особенностей неоплазм имеет большую ценность и представляет значительный интерес. Она увлекла и покорила многих исследователей. Тем не менее нельзя не сказать, что некоторые положения его концепции только постулируются, не имея достаточных экспериментальных оснований; другие ——могут толковаться по-разному; третьи — просто противоречат известным фактам. Естественно, что в этих условиях концепция Варбурга, наряду с поддержкой со стороны одних исследователей, вызвала серьезную критику со стороны других. Эта критика будет рассмотрена несколько позже. Сейчас же уместно поставить такой вопрос: если мы откажемся от теории Варбурга, будем ли мы располагать каким- либо цельным и в какой-то мере экспериментально обоснованным воззрением, равноценным в теоретическом отношении отвергаемым идеям Варбурга? К сожалению, в биохимии, как, впрочем, и вообще во всей теоретической онкологии, до самого последнего времени не было другой столь глубоко и всесторонне разработанной теории, которая могла бы с учетом всех имеющихся фактов объяснить не только особенности обмена веществ, но и само происхождение злокачественных опухолей. Другой концепцией такого масштаба и универсальности, как теория Варбурга, биохимия до последнего времени не располагала.
Независимо от событий, которые последуют, теория Варбурга продолжает оставаться наиболее продуманной, смелой и богато экспериментально обоснованной попыткой проникновения в загадку злокачественного роста. До появления концепции онкогенов достаточно солидной альтернативы ей в биохимии и молекулярной онкологии не существовало.
Концепции онкогенов будут посвящены в этой книге специальные главы.
ОБМЕН ВЕЩЕСТВ БЕЛЫХ КЛЕТОК КРОВИВ СВЕТЕ ТЕОРИИ ВАРБУРГА
Рак и лейкозы представляют, пожалуй, самый серьезный вызов, брошенный науке природой. Разочаровывающий опыт практической борьбы с этими заболеваниями убеждает в том, что успех может быть достигнут только на основе глубокого познания фундаментальных особенностей неопластических клеток.
В своей основе проблема злокачественных новообразований является клеточной проблемой. Первичные импульсы, приводящие к инициации, а затем к генерализации процесса и часто к трагическому концу, возникают, по-видимому, на уровне клетки и ее элементов. Поэтому изучение клеток крови и их материнской субстанции — костного мозга — может дать ценный материал в понимании существа и природы лейкозного, т. е. неопластического, перерождения.
Как уже говорилось, проблема аэробного гликолиза и связи его с ростом и функциями относится к числу тех, от решения которых в значительной мере может зависеть понимание существа злокачественного роста. Поскольку считалось (и в этом проявилось большое влияние авторитета Варбурга), что для большинства тканей животного организма характерно отсутствие аэробного гликолиза, а злокачественные опухоли наиболее резко отклоняются от этого правила, все случаи сосуществования дыхания и гликолиза в нераковых тканях заслуживают самого пристального внимания.
Именно с этой точки зрения лейкоциты уже давно привлекали к себе внимание исследователей.
Достоинства лейкоцитов в экспериментальном отношении в значительной мере определяются тем, что они представляют собой отдельные свободно перемещающиеся неповрежденные клетки, что имеет ряд преимуществ перед срезами тканей, снабжение клеток которых в опытах in vitro кислородом и питательными веществами затрудняется.
Кроме того, раневая поверхность срезов ткани может существенно влиять на характер обмена и вносит неопределенность в интерпретацию результатов.
Хотя первые исследования химизма и обмена лейкоцитов были выполнены еще в прошлом столетии и в начале нынешнего, систематическое биохимическое изучение этих клеток началось лишь в 30—40-х годах и особенно в последние десятилетия.
Метаболические характеристики отдельных видов лейкоцитов представляют первостепенный интерес, прежде всего в свете концепции так называемого ракового обмена Варбурга. Один из наиболее принципиальных вопросов, которые ставил Варбург и задавали себе многие другие исследователи, заключался в том, насколько уникален и специфичен обмен злокачественных опухолей с его аэробным гликолизом, низким уровнем дыхания и высоким анаэробным гликолизом.
Уже сам Варбург констатировал, что аэробный гликолиз присущ не только неоплазмам. Он имеется и в некоторых нераковых тканях: доброкачественных опухолях, лимфатических железах, зародышевом эпителии, сетчатке, слизистой оболочке. Варбург объяснял эти факты существования аэробного гликолиза в нераковых тканях двумя причинами. В одних случаях он говорил о том, что ткани находятся в нестационарном состоянии (активный рост, пролиферация); в других — что ткани повреждены. Согласно Варбургу, повреждение представляет собой фактор, необратимо нарушающий «пастеровский эффект». Тем не менее он видел существенные различия между обменом раковых клеток, с одной стороны, и нераковыми тканями, имеющими аэробный гликолиз,—— с другой. Он отметил, что в злокачественных опухолях, как указы- аэробный гликолизо ，
валось выше, отношение ―-— составляет 3——4, тогда
дыхание
как в нормальных тканях, имеющих аэробный гликолиз, это отношение равно примерно 1. До конца своей жизни Варбург продолжал придерживаться взгляда, что несоответствие между чрезвычайно высоким гликолизом и низким, как он считал, «поврежденным», неполноценным дыханием является наиболее характерной чертой, отличающей неоплазмы от нормальных тканей. Эта точка зрения подвергалась серьезной критике рядом авторов.
Проблема аэробного гликолиза и связи его с ростом и функциями имеет первостепенное значение в понимании биологических особенностей опухолей, где соотношение дыхания и глнколнза действительно необычно. Именно с этой точки зрения представляют интерес и лейкоциты, в которых, как указывалось выше, также имеются характерные метаболические черты.
Изучение обмена лейкоцитов началось уже в начале этого века. Была обнаружена способность указанных клеток поглощать кислород и расщеплять глюкозу до молочной кислоты. Многочисленные данные 20——40-х годов, касающиеся абсолютных величин дыхания и гликолиза и соотношения этих энергетических процессов в белых клетках крови, были противоречивы, однако своеобразие метаболизма этих клеток было установлено довольно четко: очень интенсивный гликолиз, причем как анаэробный, так и аэробный, и относительно слабое дыхание. Много исследований было посвящено особенностям обмена лейкоцитов при лейкозах.
Подробно история изучения биохимии клеток крови в норме и при лейкозах рассмотрена в ряде монографий и обзоров, к которым мы и отсылаем читателей [Сейц И. Ф., 1969].
В этой главе нашего руководства мы подведем лишь общие итоги этого направления исследований и обсудим значение полученных данных в свете метаболической теории возникновения рака и биохимических особенностей злокачественных опухолей.
Суммарные результаты изучения дыхания, гликолиза и их соотношения в лейкоцитах приведены в табл. 1.
Метаболические показатели, приведенные в табл. 1, выражены в коэффициентах Варбурга: QO2, Q^yx. Qt；)「 имеется в виду, что Q соответствует 1 мм3 поглощаемого или выделяемого газа: для дыхания — Ог, для гликолиза ——СОг, соответствующих количеству образующейся молочной кислоты на 1 мг сухой массы клеток в 1 ч. Концентрация клеток в среде была оптимальной —— 0,036 мл сырых клеток на 1 мл.
Результаты, приведенные в табл. 1, характеризуют одну из наиболее важных особенностей обмена лейкоцитов ——сравнительно низкое дыхание (особенно в присутствии глюкозы) и весьма высокую гликолитическую активность. Более того, некоторым видам белых клеток крови присущ мощный аэробный глнколнз. В эту категорию попадают, наряду с некоторыми видами лейкозных клеток, также нормальные гранулоциты крови здоровых людей (доноров) и лейкоциты больных полицитемией ——заболевания,
Дыхание, гликолиз и их соотношение в различных видах лейкоцитов человека [Сейц И. Ф., Луганова И. С., 1967|
Источник получения лейкоцитов
Qo, в ОТсутствие глюкозы
Qoa в присутствии глюкозы
Q4产
Q&,
Q縱
Qcba
q + глюкоза
q + глюкоза
Доноры
7,5 ±0.5
5,7 ±0,3
18,8± 1,0
31,1 + 1,1
3.3
5,5
Больные хроническим миелоидным лейкозом
6,4 ±0,4
5,0 ±0,3
13,2±0,7
23,3 ±0,8
2,6
4,7
Больные полицитемией
7,1 ±0,5
5,3 ±0,3
15,4 ±0,7
27,6±1,1
2.9
5»2
Больные хроническим лимфатическим лейкозом
7,9 ±0,5
8,0 ±0,5
0
27,2 ±1,0
0
3,4
Больные острым лейкозом I типа
10,4 ±0,6
8,3 ±0,5
24,0士 1,1
29,0 ±1,2
2,9
3,5
Больные острым лейкозом II типа
9,8±0 9
10,0 ±0,8
0
27.3 ±1.3
0
2.7
Лимфоциты здорового человека
7,1 ±0,4
7.0±0.44
0
25,5 + 2.3
0
3,6
по-видимому, нелейкозной природы. В этом плане все виды лейкоцитов можно разделить на две метаболические группы: 1) клетки, обладающие аэробным гликолизом (1 метаболический тип); 2) клетки, не имеющие аэробного глнколнза. Мы увидим в дальнейшем, что это деление не является формальным, а имеет глубокий смысл, выражая различные биологические, функциональные и, по-видимому, генетические особенности этих двух категорий белых клеток крови.
Как видно из табл. 1, к группе клеток крови с аэробным гликолизом принадлежат: нормальные лейкоциты (гранулоциты), лейкоциты больных полицитемией, лейкоциты больных хроническим миелоидным лейкозом (миелозом), лейкоциты крови части больных острым лейкозом (I метаболический тип).
Общие метаболические черты, которые объединяют все эти клетки в одну группу, следующие: высокий аэробный гликолиз (т. е. несовершенный «пастеровский эффект») и еще более высокий анаэробный гликолиз, низкое или сравнительно низкое дыхание, обратная «пастеровская реакция» (эффект Кребтри) (т. е. все главные признаки так называемого ракового обмена Варбурга) и, как было установлено, равноценный синтез АТФ в аэробных и анаэробных условиях.
Последний признак, кстати говоря, присущ и 2-й группе лейкоцитов, к которой относятся: нормальные лимфоциты крови, лимфоциты больных хроническим лимфатическим лейкозом (лимфа- денозом), молодые недифференцированные белые клетки крови 2~й большой группы больных острым лейкозом. Все эти клетки отличаются тем, что они при инкубации in vitro в присутствии
Дыхание и гликолиз ядерных костномозговых клеток здорового человека и больных лейкозами
[Сейц И. Ф., 1969|
Источник получения миелокариоцитов
Поглощение Ог, мкл/109 клеток за 30 мин
Образование молочной кислоты, аэробно, мг/109 клеток за 30 мин
Здоровые лица
Больные хроническим миелолейкозом
Больные острым лейкозом
I типа
Больные острым лейкозом
II типа
373,0±31,0 (10) 350,0 (2)
427,0±46,0 (10)
336,0±35,0 (8)
3,8±0,3 (10) 5,4 (2)
5,8±0,5 (10)
0 (8)
Примечание. В скобках указано числи наблюдений.
воздуха молочную кислоту не образуют, т. е. не имеют аэробного гликолиза.
Тип обмена и морфология лейкоцитов. Можно думать, что у генетически родственных групп клеток должна существовать энзимологическая и метаболическая преемственность в силу наиболее общих принципов и закономерностей филогенетического и онтогенетического развития. Поэтому сходство энзимохимическое должно указывать на общность происхождения клеток. В случае белых клеток крови можно было бы говорить о развитии двух групп лейкоцитов из двух различных корней — миелоидного и лимфоидного, существенно отличающихся друг от друга в метаболическом и генетическом отношении.
Принципы метаболической классификации белых клеток крови обусловлены генетической преемственностью и родословной разных групп клеток. Эти принципы столь фундаментальны, что перекрывают даже факторы возрастных различий. Независимо от возраста и степени зрелости, белые клетки крови и костного мозга относятся к той или другой метаболической категории в соответствии с их тканевой природой и происхождением.
Приводим таблицу, характеризующую обмен костномозговых клеток здорового человека (доноры) и больных лейкозами (табл. 2).
В терминах Q метаболические показатели клеток нормального костного мозга человека для большого числа случаев были: Qco, = 13,6; Qo? в присутствии глюкозы — 4,7; в отсутствие глюкозы — 5,64. Следовательно, клетки костного мозга здорового человека характеризуются несовершенным «пастеровским эффектом» (высокий аэробный гликолиз) и четко выраженной обратной «пастеровской реакцией» (20 %), т. е. признаками, приписываемыми в качестве специфических для раковых клеток.
Существование так называемого ракового обмена в нормальных гранулоцитах крови и ядерных клетках костного мозга здоро-
во го человека, наряду с парадоксальным фактом отсутствия этих «раковых признаков» в явно неопластических клетках — лимфоцитах больных хроническим лимфатическим лейкозом и лимфобластах больных острым лимфатическим лейкозом, — представляет реально существующий вызов концепции рака Варбурга, остающийся пока без ответа.
СПЕЦИФИЧНОСТЬ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ КРОВЯНЫХ ПЛАСТИНОК(ТРОМБОЦИТОВ)
Тромбоциты имеют дыхание и гликолиз, энергия которых концентрируется в аденозинтрифосфате; они содержат РНК, белки и свободные аминокислоты, что косвенно указывает на их потенциальную активность в； отношении белкового синтеза; они богато оснащены самыми разнообразными ферментными системами, обеспечивающими поддержание ж из недеятел ьности и функциональной активности.
Следует заметить, однако, что обмен веществ в кровяных пластинках направлен не столько на восстановление собственных структур, сколько на осуществление, главным образом всех фаз процесса свертывания крови.
Белки в тромбоцитах составляют около 60 % от сухой массы. В значительном количестве они содержат липиды — 19—24 % от сухой массы; в них много гликогена, различных минеральных веществ и др.
Подробнее об этом можно прочесть в соответствующих изданиях [Сейц И. Ф., Луганова И. С., 1967; Сейц И. Ф., 1969]. Здесь же мы сосредоточимся, главным образом, на энергетическом обмене кровяных пластинок по причинам, которые будут ясны из дальнейшего изложения.
Результаты изучения энергетического обмена тромбоцитов человека представлены в табл. 3.
Данные табл. 3 показывают, что нормальные (донорские) кровяные пластинки характеризуются: 1) низкой дыхательной активностью; 2) весьма невысоким анаэробным гликолизом; 3) высоким аэробным гликолизом. Последний факт говорит о том, что «пастеровский эффект» в тромбоцитах несовершенен — дыхание не блокирует гликолиз полностью. Кроме того, в кровяных пластинках имеет место обратная «пастеровская реакция» (эффект Кребтри), достигающая 20——30 %. Все эти метаболические черты, согласно Варбургу, специфичны для рака. Между тем их демонстрируют тромбоциты здорового человека. Эти данные вновь свидетельствуют о несостоятельности концепции Варбурга о существовании так называемого ракового обмена.
Как видно из табл. 3, энергетический обмен кровяных пластинок больных полицитемией и хроническим миелоидным лейкозом качественно не отличается от обмена нормальных кровяных пластинок, лишь незначительно варьируя количественно.
Дыхание “ гликолиз в тромбоцитах человека [Сейц И. Ф., Луганова И. С., 1967]
Пробы
Qo?
懒
Qco,
Тромб
о ц и т ы д о
норов
Тромбоциты
4』5士 0,36
2,60±0,19
—
Тромбоциты+глюкоза
3 66±0,28
13,05±1,13
20,2±1,76
Тромб
о ц и т ы больных
п о
лицитеми
е й
Тромбоциты
6,23 土 0,56
2,88 土 0,17
—
Тромбоциты+глюкоза
4,46 土 0,36
12,46 土 0,96
21,0±1,6
Тромб
о ц и т ы больных
X р о н и ч
ескнм миелозом
Тромбоциты
6,96 土 0,58
3,29±0,32
—
Тромбоциты+гл юкоза
5,16±0 35
16,50 士 0,92
20,7 士 1,44
О ПОЛНОЦЕННОСТИ ДЫХАНИЯ НЕОПЛАСТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
Смешанному обмену (дыхание и аэробный гликолиз) раковых клеток уже давно придается особое значение в биологии неоплазм. Низкое дыхание, высокий анаэробный гликолиз и наличие азроб- ного гликолиза часто (со времен Варбурга) рассматриваются как характерные черты метаболизма злокачественных новообразований. На этом фундаменте построена одна из наиболее интересных биохимических концепций происхождения и специфики обмена неоплазм — теория Варбурга. В настоящее время, в свете новых фактов, мы можем значительно полнее и объективнее оценить эту точку зрения, чем могли это сделать еще некоторое время назад. Отправной точкой рассуждений Варбурга о происхождении злокачественных опухолей служил тезис о повреждении дыхания. Именно в результате возникающей неполноценности — количественной и качественной (разобщения окисления и фосфорилирования) — развивается, по мнению Варбурга, мощный гликолитический механизм и появляется аэробный гликолиз. Эти явления в их развитии выражают, согласно Варбургу, процесс злокачественного перерождения.
Экспериментальные данные, собранные в этой главе, убеждают, что это основное положение Варбурга не улавливает существа ракового обмена и раковой природы. В этом нетрудно убедиться при рассмотрении табл. 4.
Первыми в табл. 4 стоят карцинома и саркома человека, метаболические коэффициенты которых следует считать классическими для злокачественных опухолей человека (приведены собственные цифры Варбурга без поправок на «загрязнение» нераковым материалом). Как видно из таблицы, действительно, для неопласти-
Дыхание, гликолиз и их соотношение в раковых клетках, лейкоцитах, тромбоцитах и костном мозге человека
[Сейц И. Ф„ 1969]
Клетки
Q&
Q耳
Qco,
Q 爲 JQ。,
Qc6/Qo,
Карцинома
5,1
14,0
21,0
4,1 '
Саркома
4.9
15,6
27.9
5,7
Карцинома эпителия шейки
7,6
7,1
22,2
2,9
матки, «поверхностная*
Карцинома шейки матки (оро-
4,5
3,9
13,1
0,9
2,9
говеваюи1ий пл ос коклеточн ы й эпителий)
HeLa (культура ткани из кар-
6.0
12,0
5,5
2,0
0,9
цииомы шейки матки) Лейкоциты:
донора
5,7
18 8
31,1
3,3
5,5
больного хроническим
5,0
13,2
23,3
2,6
4.7
миелолейкозом
больного острым лейкозом
10,0
0
27,3
0
2.7
1 метаболического типа больного острым лейкозом
8,3
24,0
29,0
2,9
3,5
II мета бол и чес кого типа Тромбоциты донора
3,6
12,6
19,3
3,6
5,4
Костный мозг донора
4,7
13,6
—
2,9
—
В присутствии глюкозы
ческих клеток характерны сравнительно невысокое дыхание, очень высокий анаэробный и аэробный гликолиз. Варбург подчеркивал, что дыхание раковых клеток мало не столько абсолютно, сколько относительно — по сравнению с гликолизом. Поэтому особое значение он придавал количественному соотношению гликолиза й дыхания, что лучше всего выражалось отношением коэффициентов: Q%2 K Qo, и Qco2-
Как упоминалось выше, по Варбургу, для нормальных тканей отношение аэробного гликолиза к дыханию не превышает 1, для злокачественных неоплазм оно равно 3—4. Еще выше в раковых клетках отношение анаэробного гликолиза к дыханию. Из табл. 4 видно, что именно таковы соотношения гликолиза и дыхания в карциномах и саркомах человека. Однако, как следует из табл. 4, так называемая «поверхностная» карцинома эпителия шейки матки и ороговевающий эпителий карциномы шейки матки имеют показатели неракового обмена: Q% = 0,9,
Особый интерес с этой точки зрения представляет обмен лейкоцитов, тромбоцитов и костного мозга. Как идно из табл. 4, показатели обмена веществ этих клеточных элементов у здорового человека почти точно повторяют соответствующие величины, полученные Варбургом для сарком человека, и сопоставимы также с показателями обмена карцином человека. Что касается коэффи-
циентов QcoyQoj н Qco2/Qo,. то они у лейкоцитов оказались даже более «раковыми», чем у карцином.
С этой точки зрения были изучены также тромбоциты и костный мозг, причем получены такие соотношения дыхания и гликолиза, которые типичны, согласно Варбургу, для неопластических тканей (см. табл. 4). Таким образом, руководствуясь теорией Варбурга, мы должны были бы присоединить к числу неопластических клеток, наряду с лейкоцитами больных хроническим миелозом и острым лейкозом I метаболического типа, нормальные лейкоциты, лейкоциты крови больных полицитемией, тромбоциты и клетки костного мозга здорового человека, но исключить из числа злокачественных две карциномы шейки матки, лейкоциты крови и миелокариоциты больных острым лейкозом II метаболического типа, лимфоциты больных хроническим лимфолейкозом. Полное противоречие с действительностью!
Сопоставление обмена карцином и сарком человека с обменом некоторых нормальных и патологических клеток, таким образом, показывает, что полученные Варбургом характеристики дыхания и гликолиза неоплазм, абсолютно надежные сами по себе с экспериментальной точки зрения, не являются специфичными только для них. Такой же в принципе (качественно), а в ряде случаев очень близкий количественно, обмен имеют нормальные гранулоциты крови, тромбоциты, костный мозг и, возможно, другие клетки. Следовательно, можно сделать достаточно обоснованный вывод, что тезис Варбурга о неполноценности дыхания раковых клеток и связанных с этой недостаточноетью дыхания изменениях в гликолитической активности не оправдывается при более широком экспериментальном испытании, прежде всего с количественной стороны. Так, дыхание лейкозных и раковых клеток в ряде случаев ни абсолютно, ни сравнительно с гликолизом (аэробным и анаэробным) не является ущербным и не уступает дыханию многих нормальных клеток.
Не оправдывается тезис о неполноценности неопластических клеток и в качественном отношении. Исследованиями количественного содержания и реосинтеза АТФ в асцитных раковых и лейкозных клетках было показано, что лишено основания и второе положение Варбурга об энергетической, качественной неполноценности дыхания в злокачественных опухолях. «Разобщения» между дыханием и фосфорилированием в неоплазмах не существует. Это доказывается как прямым анализом содержания и реосинтеза АТФ в раковых клетках, так и использованием «разобщающих» ядов, которые вызывают в этих клетках, как и в нормальных, действительное «разобщение», проявляющееся и в нарушении сопряженного с окислением фосфорилирования, и в полном «снятии» «пастеровского эффекта».
АЭРОБНЫЙ ГЛИКОЛИЗ И «ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ НАПРЯЖЕНИЕ»
Что же позитивного можно извлечь из негативных итогов критического рассмотрения метаболической теории рака Варбурга?
Если аэробный гликолиз в тех или иных клетках рассматривать не как проявление патологических изменений, а как результат напряженной функциональной активности (синтез новой клеточной массы в раковых клетках, фагоцитоз и амебоидная подвижность у лейкоцитов и т. д.), приспособленной к возможному ухудшению снабжения кислородом, то общие черты в координации дыхания и гликолиза у раковых и некоторых нормальных клеток найдут объяснение не на патологической, а на нормальной физиологической основе. Можно думать, что истинным регулятором обмена является прежде всего сама физиологическая функция, хотя она, в свою очередь, покоится на химической основе и регулируется влиянием целостного организма. Самым мощным стимулом ресинтеза АТФ является на уровне клетки усиленное ее расходование. Именно физиологическая работа, сопровождаемая значительной затратой богатых энергией фосфорных соединений, является наиболее мощным стимулятором и регулятором метаболизма субстратов. При особенно высокой функциональной нагрузке расходование АТФ будет преобладать над ее ресинтезом и одного механизма энергии может оказаться недостаточно для полной загрузки аденилового акцептора, что открывает возможность включения (в аэробных клетках) или усиления (в клетках со смешанным обменом) процесса гликолиза. Ухудшение снабжения кислородом может лишь способствовать этому процессу перестройки обмена.
На уровне клетки основным фактором, определяющим концентрацию акцепторов эстерифицируемого фосфата и, таким образом, соотношение дыхания и гликолиза при нормальном снабжении питательными материалами, являются условия аэрации и производимая физиологическая работа. Внеклеточные влияния, прежде всего гуморального и нервного происхождения, могут осложнять, но не менять самой природы клеточных механизмов регуляции обмена. Экстрацеллюлярные импульсы, направленные на клетку, в основном усиливают или ослабляют генетически обусловленные элементарные внутриклеточные процессы. Чем сложнее и более высоко развит организм, тем более специализированы и менее автаркичны составляющие его клетки, тем сильнее зависимость внутриклеточных реакций от внеклеточных факторов.
Неопластические клетки отходят от этого принципа контроля и регуляции нормальных тканей прежде всего в аспекте биологическом. Их пролиферация и экспансия не коррелируют с функциями и жизнедеятельностью других систем организма. В метаболическом отношении, однако, эта из ряда вон выходящая особенность неоплазм не находит однозначного и закономерного выраже-
ния. Как мы могли убедиться на основании изложенного выше материала, коренные качественные метаболические характеристики (дыхание, гликолиз, их соотношение и др.) могут варьировать в пределах одного и того же неопластического процесса (лейкозы) в противоположных направлениях. Черты обмена, часто сопровождающие злокачественный рост, могут быть продемонстрированы в нормальных, функционально полноценных клетках, например лейкоцитах, тромбоцитах, миелокариоцитах. Наоборот, присущий большинству животных тканей чисто окислительный обмен обнаруживается в недифференцированных лейкоцитах примерно половины всех больных острым лейкозом и в лимфоцитах больных хроническим лимфолейкозом.
Создается впечатление, что качественные различия неопластических и нормальных клеток в сфере энергетического обмена, может быть, вообще не будут найдены. В лучшем случае, возможно, придется довольствоваться констатацией сдвигов лишь количественного характера. Слишком универсально распространенными, фундаментальными и императивно необходимыми для всего живого являются процессы продукции энергии, чтобы искать в них различия в нормальных и патологических клетках. Вряд ли какой-либо патологический сдвиг в каком-то единичном поколении клеток (если не в индивидуальной клетке) может преодолеть «эволюционное давление» многих миллионов лет и наследственности миллионов поколений предшественников и коренным образом изменить фундаментальные основы энергетического обмена, качественно перестроив сложные энзимохимические системы, выработанные в процессе длительной эволюции, причем изменить :вдруг, в какой-то короткий период существования индивидуальной клетки. Любые коренные изменения в любой системе должны быть генетически закреплены, поскольку сама неопластическая клетка в целом наследственно сохраняет качество злокачественности.
Единственным возможным объяснением подобного скачкообразного изменения могла бы быть мутация. Однако если возможность такого события достоверно показана для процесса превращения протоонкогена в онкоген (см. гл. 4), то никто пока не продемонстрировал наследственных изменений в энзиматической цепи дыхания или гликолиза.
Поскольку основной функцией неопластических клеток является их воспроизведение, а материальным субстратом этого процесса служат нуклеиновые кислоты, именно в этой категории веществ клетки можно было бы в первую очередь ожидать изменений при раковом и лейкозном перерождении в отношении как химизма, так и обменных превращений. Все остальные реакции и процессы, в том числе и энергетические, при всей их значимости для жизнедеятельности клетки являются вторичными, производными и подчинены основной функции наращивания клеточной массы и деления. Поэтому менее вероятно появление качественных
изменении в этих вторичных процессах, которые являются наиболее общими рабочими механизмами всего живого, тем более, что процесс воспроизведения является естественным физиологическим актом и в нормальных клетках, где он, однако, подчинен регулирующим влияниям организма. Ввиду того, что процесс воспроизведения злокачественных клеток не является по своей природе чем-то качественно новым и необычным также для нормальных клеток, но приобретает лишь неконтролируемый характер, все другие подсобные аспекты обмена и биохимические механизмы клетки при малигнизации могут и не меняться, во всяком случае качественно, поскольку они обслуживают процесс, присущий и нормальным клеткам. Можно поэтому ожидать, что решающие открытия в области выяснения природы неоплазм придут именно из сферы изучения состава, структуры и превращения нуклеиновых кислот. Это явилось бы логическим завершением длительного пути и торжеством того направления мысли, которое признает изменения в генетическом материале в качестве первичного импульса ракового или лейкозного перерождения.
Собранные в этой главе данные можно истолковать лишь в том смысле, что ни аэробный гликолиз, ни высокий анаэробный гликолиз, ни обратная «пастеровская реакция», ни способность одинаково эффективно осуществлять ресинтез важнейших внутриклеточных соединений как в аэробных, так и в анаэробных условиях не являются специфичными для злокачественно перерожденных клеток и тканей и между этими чертами обмена веществ и малигнизацией отсутствует причинная связь. Это тем более необходимо подчеркнуть, что до сегодняшнего дня «дух Варбурга» в теоретической онкологии, его концепция «ракового обмена» еще не утратили своей притягательной силы и продолжают оказывать гипнотизирующее влияние на многих исследователей. Мы сказали бы, однако, что популярность метаболической теории рака Варбурга не столько в собственной ее силе, сколько в слабости и по существу отсутствии хорошо обоснованных альтернатив. Других сильных концепций, выдержавших столь длительное испытание временем, как теория Варбурга, биохимия за последние 50 лет не представила.
Такая альтернатива, рожденная совместными успехами молекулярной биологии, молекулярной генетики, генной инженерии, появилась только в 80-е годы.
ДРУГИЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ ГИПОТЕЗЫ РАКА
Тот факт, что по мере накопления новых биохимических данных главные положения концепции Варбурга о специфичности для опухолей поврежденного дыхания и аэробного гликолиза подвергались все большему сомнению, послужил причиной новых усилий и новых поисков объяснения природы и особенностей неоплазм, что привело к появлению новых гипотез и предположений.
Г ипотеза «конвергенции». В сущности, именно идея Варбурга о «конвергенции» всех опухолевых клеток в ущербности дыхания и приобретении всеобщего признака — аэробного гликолиза —послужила основой гипотезы «конвергенции» J. Greenstein (1951). Этот крупный онкобиохимик распространил мысль о приобретении опухолями некоторых существенных общих биохимических свойств также на энзиматические функции опухолевых клеток. Исходной точкой его рассуждений был факт, что в процессе канцерогенеза имеет место прогрессирующая дедифференциация, влекущая за собой специфические последствия. Каждая нормальная клетка характеризуется рядом определенных морфологических и биохимических особенностей, позволяющих выполнять присущие ей и данной ткани физиологические функции. Это требует, наряду с фундаментальными процессами и реакциями обмена веществ (энергетика, рост и др.), необходимыми для обеспечения жизни клетки, ткани и организма, особых специфических только для данной клетки и тканей реакций, связанных со специализированной функцией, участием специфических ферментов, катализирующих отдельные звенья цепей реакций. Развивающиеся в опухолях дедифференцировка и, вместе с нею, потеря функции влекут за собой также утрату указанных специфических ферментов. В результате в неоплазмах сохраняются энзиматические системы, обеспечивающие лишь поддержание минимально необходимого для выживания — функций поставки энергии и размножения. Следствием является то, что все опухоли становятся исключительно похожими, происходит биохимическое уподобление опухолевых клеток друг другу.
J. Greenstein пришел к заключению, что неоплазмы самого различного происхождения более сходны (как морфологически, так и биохимически) друг с другом, чем каждая из них со своей нормальной тканью, из которой она произошла. Во многих случаях указанное единообразие находит проявление лишь в количественном выражении, прежде всего в уменьшении эффективности функциональных реакций при повышении эффективности реакций, необходимых для простой клеточной репликации. Поэтому экспериментальные исследования в плане теории «конвергенции» касались, главным образом, попыток осуществить биохимическое доказательство недостаточности ключевых ферментов функционального метаболизма и, наоборот, стимуляции энзиматических систем, связанных с пролиферацией.
С этой точки зрения привлекли внимание исследования ферментов глюконеогенеза и регуляции содержания сахара в крови в гепатомах. В гликолитическом расщеплении глюкозы важную роль играют две реакции фосфорилирования, ведущие к образованию глюкозо-6-фосфата и фруктозо-1,6-дифосфата за счет богатого энергией фосфора АТФ. В противоположность большинству других реакций этого процесса, они по термодинамическим соображениям являются необратимыми. Дефосфорилиро-
вание указанных веществ оказывается возможным благодаря ферментам глюкозо-6-фосфатазе и фруктозо- 1,6-дифосфатазе, которые в силу этой своей способности занимают ключевое положение в регуляции содержания сахара в крови и в глюконеогенезе. Обе фосфатазы не были обнаружены в гепатоме Новикова, тогда как в медленно растущих гепатомах та и другая фосфатаза присутствовали, хотя и в уменьшенных количествах. Была продемонстрирована связь между активностью фосфатаз и скоростью роста различных гепатом, что подтверждало дедифференциацию в направлении потери специфической печеночной функции глюконеогенеза и регуляции сахара крови.
Многочисленные исследования подкрепляют суть идеи «конвергенции» об увеличенной эффективности анаболических процессов и активации связанных с ними энзиматических систем. Например, в гепатоме Новикова, по сравнению с нормальной печенью, активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы увеличена, а активность фосфоглюкомутазы — уменьшена. Освобождение глюкозы и накопление гликогена резко снижены.
Следует заметить, однако, что, подобно теории Варбурга, гипотеза «конвергенции» J. Greenstein не может объяснить механизма злокачественного перерождения. Тем не менее она основана на многих ценных наблюдениях (с нашей точки зрения, правда, являющихся побочными по отношению к основному феномену — не ре гул и руе мости роста) и содержит некоторые новые аспекты в явлении дедифференцировки тканей при неоплазии.
Во времена J. Greenstein (40—50-е годы настоящего столетия) как представитель гепатом изучалась главным образом гепатома Новикова. Ее энзиматический спектр показал очень хорошее соответствие постулатам гипотезы «конвергенции». Однако первые несоответствия с нею обнаружились при изучении гепатомы W. Dunning. Эта гепатома, как было установлено, еще содержит специфические для печени энзимы (фруктозодифосфатазу, ТПНН- цитохромредуктазу, триптофанпирролазу), которые в гепатоме Новикова более не обнаруживаются. С другой стороны, в гепатоме W. Dunning энзим дезоксицитидилдезаминаза отсутствует, тогда как в гепатоме Новикова он содержится. Рядом работ на перевивных гепатомах крыс продемонстрировано, что часто биохимическое многообразие преобладает над единообразием.
В. С. Шапот (1975), оценивая гипотезу «конвергенции», заключает, что идея J. Greenstein об унификации обмена веществ опухолей различного гистогенеза «. . .верна лишь отчасти. Огромный экспериментальный цате ри ал, накопленный к настоящему времени, свидетельствует о существовании и обратной тенденции ——фенотип отдельно взятой злокачественной опухоли оказывается уникальным, спектр биохимических характеристик неповторимым, включающим в себя каждый раз иные комбинации отклонений от нормы». Можно также согласиться с В. С. Ша потом, что учение о прогрессии L. Foulds (1969) — о независимом, несопря-
женном развитии признаков злокачественности позволяет понять эту вариабельность как закономерную.
В связи с гипотезой «конвергенции», унификацией биохимических признаков опухолей интересны взгляды известного биохимика, работающего в области онкологии, Н. Pitot (1974). Рассматривая дифференциацию как трансляционную функцию, он констатирует, что патологоанатомам морфологические вариации человеческих неоплазм, даже тех, которые возникли из одного и того же типа клеток, представлялись очевидными еще с начала клеточной патологии в середине прошлого века. С момента появления электронной микроскопии гетерогенность, выявляющаяся и со световым микроскопом, стала еще более убедительной. Сейчас ясно, что не существует и не будет найдена какая-то единственная морфологическая характеристика, специфичная для всех неоплазм. Действительно, все биохимические исследования злокачественных опухолей млекопитающих в конечном счете подтвердили эти заключения патологоанатомов об исключительной гетерогенности как человеческих, так и экспериментальных неоплазм. Накопившиеся за последние десятилетия биохимические данные показали, что фенотипическая гетерогенность является правилом, а не исключением. Это относится к данным, полученным с гепатомами, карциномами молочных желез и миеломами. Такая же фенотипическая вариабельность может быть прослежена и на состояниях пренеопластических. Гетерогенность наблюдается не только в активности и регуляции ферментов в неоплазмах, но и в стабильности РНК-матриц и в характеристиках кругооборота мембран эндоплазматического ретикулума.
В ранние 60-е годы были проанализированы фенотипы нескольких высокодифференцированных гепатоцеллюлярных карцином. С того времени в ряде лабораторий было показано, что ни один из изученных биохимических фенотипов гепатоцеллюлярных карцином не является одним и тем же в индивидуальных опухолях. Было исследовано более 40 неоплазм, и во всех случаях чем больше ферментов исследовали, тем очевиднее становилось, что фенотипически каждая неоплазма является уникальной и отличается от печени, ткани-родоначальницы. Среди неоплазм варьировали не только активности четырех исследованных ферментов, но и их регуляция белками диеты. Характеристика каждой гепатомы была уникальной.
В других исследованиях энзиматический профиль или биохимический фенотип как спонтанных, так и перевивных мышиных гепатом были очень разнообразны. При продолжающихся трансплантациях перевивные неоплазмы сохраняли их собственный неповторимый фенотип — феномен, найденный на гепатоцеллюлярных карциномах крыс.
Фенотипическая биохимическая вариабельность была отмечена и в других неоплазмах: в серии первичных и перевивных карцином молочной железы, подобно серии гепатоцеллюлярных карцином,
каждая неоплазма была биохимически уникальна в отношении количественного уровня энзимов и механизма регуляции уровня энзимов со стороны факторов среды.
Хороший пример биохимической гетерогенности в одном классе неоплазм дают также миеломы. Многие годы белок, продуцируемый этой неоплазмой у одного больного, устойчиво отличался от других больных со сходными неоплазмами. В большой серии мышиных миелом белок, образуемый каждой неоплазмой, являлся характерным для данной опухоли. Описаны вариации в поглощении 1311 серией экспериментальных опухолей щитовидной железы. Эти опухоли демонстрируют тот же феномен фенотипической вариабельности, что и в неоплазмах молочной железы и миеломах.
Одной из причин фенотипической изменчивости считают вариабельность времени существования матриц иРНК (информационных РНК). В качестве стабильной матрицы рассматривают структуру, состоящую из комбинации функционирующей пол и со мы и внутриклеточной мембраны. Эта функционирующая, поддающаяся регуляции транслирующая единица была названа «мемб- рон» по аналогии с опероном, функционирующей регулируемой единицей генома. Было показано, что стабильность матриц (иРНК) зависит от связи их с мембраной. Период жизни белков, входящих в структуру мемброна, определяет стабильность иРНК. Срок жизни этих белков в мембронах неоплазм отличается от нормы, он более продолжителен.
Делеционная гипотеза. При изучении канцерогенеза, вызванного азокрасителями, было отмечено связывание диметиламиноазобензола с цитоплазматическими белками печени. В ходе канцерогенеза содержание клеточного белка, реагирующего с красителем, постоянно убывало до полного его исчезновения в сформировавшейся гепатоме. Было высказано предположение, что с канцерогеном связываются белки, контролирующие рост. Потеря, «выпадение» этих регуляторных белков приводит к неограниченному росту. Дальнейшие исследования не внесли ясности в структуру и значение этой группы белков в химическом канцерогенезе.
Несколько позже было показано, что в ходе канцерогенеза кожи мышей полициклическими углеводородами происходит аналогичный процесс связывания и исчезновения белков.
Из этих фактов следовало, что соединение канцерогена с определенным цитоплазматическим белком вызывает необратимое изменение или потерю этого белка, что играет якобы решающую роль в канцерогенезе. Предполагалось, что утрата белка снимала торможение деления ядра и развязывала злокачественный рост.
Сегодня можно подвести итоги исследований этого направления и заключить, что до сих пор не удалось привести достаточных и убедительных доказательств гипотезы «выпадения». Канцерогены связываются не только с белками, но и с другими биохимическими компонентами клетки, в том числе с нуклеиновыми кисло-
тами, и именно на эти реакции должно быть обращено самое пристальное внимание. По-видимому, реакции химических канцерогенов с белками играют в канцерогенезе второстепенную роль.
Вариантом делеционной гипотезы явилась «катаболическая делеционная* концепция, предполагающая, что в ходе канцерогенеза снижаются количественно н «выпадают» ферменты катаболического обмена, в результате чего возникают клеточная гипертрофия и неуправляемое клеточное деление. Однако не известно надежных данных, подтверждающих идею, что делеционные катаболические ферменты играют критическую роль в инициирующих событиях канцерогенеза.
Г и потезы, обосновывающие ведущую роль в неоплазии эпигенетических факторов. Ряд исследователей полагают, что наследуемые и квазинеобратимые изменения могут происходить в ходе клеточной дифференциации в многоклеточных организмах без изменения генетической информации. С этих позиций, канцерогенез может состоять в относительно перманентных изменениях в генной экспрессии. Так, эпигенетические последствия реакций N-гидрокси-эфиров аминов и амидов с аминокислотами (например, метионином, цистеином, тирозином, триптофаном) в белках (репрессорах?) и с гуанином (или другими основаниями) в различных РНК должны также рассматриваться в качестве возможной основы канцерогенеза. Мысль, что такие реакции могли бы результироваться в изменения генной экспрессии (которые могли бы быть ранними и, возможно, обратимыми событиями в канцерогенезе), была высказана еще F. Jacob и J. Monod в 1961 г. Вскоре она получила дальнейшее развитие и экспериментальное подкрепление в виде демонстрации существования быстрого эпигеномного действия метилхолантрена в печени крыс. Были изучены также биохимические реакции транспортных РНК с N-ацетокси-ацетиламинофлюореном. На основании этих и других исследований предположили, что опухоли могут возникать в результате действия потенциально обратимых аберраций в дифференциации, которые появляются благодаря модификации транспортных РНК, индуцированных канцерогенами. Интенсивное изучение химического канцерогенеза позволило рассматривать этот процесс как наследуемую потерю контроля над клеточной мультипликацией. В данном случае возможны два механизма: 1) взаимодействие канцерогенов с ДНК воплощается в изменения генетической информации, содержащейся в макромолекулах; 2) изменения в специфических белках или рибонуклеиновых кислотах, которые приводят к относительно стабильным и наследуемым изменениям в генной экспрессии. Оба механизма пока мало изучены.
В более поздних исследованиях оценивали возможности двух механизмов химического канцерогенеза: генетического и эпигенетического. Под первым подразумеваются соматическая мутация,
наследственные изменения в ДНК генома; под вторым — негеномные изменения, ведущие к квазиперманентным изменениям в транскрипции ДНК и предпочтительной пролиферации пред- существующих пренеопластических или неопластических клеток. Указывают, например, что химическая модификация молекулы ДНК-полимеразы может оказаться достаточной для внесения критических мутаций в клеточную ДНК, способствуя возникновению неопластических клеток.
Реакции химических канцерогенов с белками и рнбонукленно-] вы ми кислотами могут рассматриваться как средства реализации эпигеномных механизмов канцерогенеза. Один из вариантов его основывается на модели клеточной дифференциации. Многообразие экспрессии эмбриональных антигенов и ферментов в химически индуцированных опухолях представляет собой пример действия канцерогенов на считывание генетической информации. Эти изменения в транскрипции могут включать также дерепрессию части или всего интегрированного генома онковирусов.
Гипотезы аномальной 'экспрессии генов. Сдвиги изоэнзимных спектров в опухолях. S. Weinhouse (1972) на примере экспериментальных гепатом изучил отклонения в генетической экспрессии, проявляющиеся в изоэнзимных изменениях. Он усмотрел в результатах исследований своей и других лабораторий свидетельство того, что мис- программирование (ошибочное программирование) генетической информации является общей фенотипической чертой рака, обусловливающей аберрантный синтез белка. Своеобразным феноменом рака является также появление фетальных белков. Он указывает на то, что гены, которые были активны в эмбриональной ткани, но репрессированы в ходе нормального развития, реактивируются при раке. Это — также явление эпигенетического характера.
S. Weinhouse (1972) отмечает существенные изменения в экспериментальных гепатомах различной степени дифференциации и скорости роста изоэнзимного спектра ряда ферментов, в частности углеводного обмена. В его лаборатории было открыто существование среди гексокиназ четырех изоэнзимов, из которых особый интерес представляет глюкокиназа. Активность этого фермента меняется весьма характерно в гепатомах с различной скоростью роста. В медленно растущих, высокодифференцированных гепатомах Морриса у крыс кинетические характеристики как глюкокиназы, так и трех других гексокиназ мало отличаются от таковых нормальной печени: общая гексокиназная активность низкая, а активность глюкокиназы — высокая. С уменьшением степени дифференцировки гепатом активность глюкокиназы практически исчезает, причем она не увеличивается и от введения углеводов или инсулина (что имеет место в норме). Особенно примечательны значительное увеличение гексокиназной и исчезновение глюкокиназной активностей в быстрорастущих
низкодифференцированных гепатомах. Таким образом, в этой группе опухолей имеют место почти полное исчезновение изозима, вы сокоа ктивно го и играющего ключевую физиологическую функцию в нормальной печени, и значительная дерепрессия изозимов, слабоактивных в зрелой ткани. Обращает на себя внимание соответствие этих данных таковым для эмбриональной печени.
Характерны изменения в экспериментальных гепатомах изоферментов альдолазы. Известно, что альдолаза В представляет единственную форму этого фермента в зрелой печени. Этот изозим активен в отношении фруктозо-1 -фосфата, единственного продукта обмена фруктозы в печени, и поэтому играет роль в метаболизме фруктозы — важной функции печени. Альдолаза А — единственная или доминирующая форма фермента в эмбриональной печени. В ходе эмбрионального развития альдолаза А репрессируется, а альдолаза В появляется и становится практически единственной формой фермента после рождения. Как и в случае с глюкокиназой, альдолаза В является фактически единственной формой альдолазы в высокодифференцированных гепатомах. С падением степени дифференциации альдолаза А начинает появляться, и, подобно гексокиназным изоэнзимам, низкодифференцированные гепатомы почти полностью теряют альдолазу В, которая замещается высокоактивным изозимом альдолазы А.
Сходные трансформации происходят в гепатомах с ферментом пируваткиназой. Этот энзим играет весьма важную роль в энергетическом обмене, он является ключевым в осуществлении ряда физиологических функций печени. Фермент существует во множественных формах. Тип II — преобладающая форма в нормальной печени. Этот изоэнзим важен в функции утилизации глюкозы и в глюконеогенезе. В гепатомах происходят также серьезные изменения соотношения различных изоэнзимных форм пируват- киназы, причем того же характера, что и в случаях с изозимами гексокиназы и альдолазы. В медленно растущих высокодифференцированных гепатомах (9618 А) активность пируваткиназы высока, но низка в опухолях средней степени дифференцированности и практически отсутствует — в быстрорастущих, низкодифференцированных. В то же время в последних очень высока активность изозима 1 -формы, которая имеет крайне низкую активность в нормальной зрелой печени. Любопытно, что в эмбриональной печени крыс (20 дней) спектр изозимов пируваткиназы включает 3 формы (как в крайне злокачественной низкодифференцированной гепатоме Новикова): один ——как в нормальной печени, а главный пик, получаемый при хроматографировании, соответствует «раковому». Это еще один пример экспрессии в низкодифференцированных опухолях фетального печеночного белка, который репрессирован в зрелых гепатоцитах. Известно, что изозимы а- и /?-форм гликогенфосфорилазы в низкодифференцированных гепатомах кинетически и иммунологически сходны с таковыми фетальной крысиной печени или мышечной фосфорила-
зой. Аналогичные данные получены при изучении изозимов глутаминазы и аминотрансфераз разветвленных аминокислот.
Эти примеры демонстрируют общий феномен реактивации в опухолях генов, которые были репрессированы в процессе эмбрионального развития.
Рак характеризуется, прежде всего, потерей контроля хозяина над клеточной пролиферацией. Обратной стороной «медали» являются нарушение дифференциации и сопутствующие этому изменения в экспрессии отдельных важных в функциональном отношении генов. Это наглядно демонстрируют экспериментальные гепатомы различной степени дифференцировки. Примечательно, что среди молекулярных изменений в таких неоплазмах наблюдаются потеря ферментов, находящихся под регулирующим влиянием хозяина и сопряженных с печеночной функцией, и замещение их энзимами с измененной молекулярной структурой, которые не контролируются хозяином и сопряжены с эффективной утилизацией метаболических «топливных» материалов.
Делалось много попыток найти связь между пролиферативными процессами опухолей и их энзиматическими активностями, однако безуспешно. Это и понятно, так как простое определение валовых энзиматических активностей часто не выявляет тонких и глубоких сдвигов, определяемых измененной молекулярной структурой отдельных изоэнзимных компонентов. S. Weinhouse (1972) полагал, что обнаружение утраты клетками регуляторных изозимов, занимающих ключевое положение в тех или иных жизненно важных функциях, может внести ясность в механизм неограниченной пролиферации раковых клеток.
Сходство результатов изучения изоэнзимов при раке с измене- иями некоторых иммунологических свойств опухолей обращает на себя внимание. При неоплазии антигены, характеризующие зрелые дифференцированные ткани, исчезают, тогда как новые антигены идентифицируются как эмбриональные белки. Очевидно, это обратная сторона одного процесса: аберрация генной экспрессии характеризуется потерей белков, нормально присутствующих в зрелой, дифференцированной ткани, и приобретением белков, содержащихся в низких концентрациях или вообще отсутствующих в зрелой ткани, но присутствующих в фетальной.
Можно ли это миспрограммирование генетической информации рассматривать как причинное для неопластической трансформации? Исследования дают на этот вопрос отрицательный ответ, поскольку несколько высокодифференцированных экспериментальных гепатом показали изоэнзимные характеристики, практически идентичные таковым нормальной печени.
В целом оценка результатов исследований изоэнзимов в гепатомах разной степени дифференцированности требует осторожности, так как сходные изменения иногда наблюдаются в ненеопластических тканях. Ни антигены, ни изоэнзимы не теряются или приобретаются, но меняются количественно. Печеночные маркер-
ные энзимы, активность которых резко падает в низкодифференцированных гепатомах, также варьируют в норме при пищевых и гормональных влияниях. Эмбриональные антигены (например, а-фетоглобулин) определяются в нормальных тканях и могут количественно нарастать не только при раке, но и в регенерирующей печени [Абелев Г. И., 1971 ], при гепатите и циррозе, а также в кпренеопластической» печени вскоре после начала скармливания канцерогенов.
Интересно, что нормальные крысиные клетки в культуре неизменно проявляют фетальные изозимные характеристики.
Рак, по-видимому, связан с нарушением механизмов, которые контролируют упорядоченную экспрессию генов в дифференцированных тканях. В этом заключается молекулярный дефект неоплазм. Мы должны знать много больше о нормальном процессе дифференциации, чтобы понять механизм ее расстройства при раке.
К сожеланию, эти трюизмы в такой общей форме не очень приближают нас к раскрытию конкретных механизмов канцерогенеза.
ОПУХОЛЬ И ОРГАНИЗМ
Движение экспериментальной и теоретической онкологии от поверхности к сущности, от общего к частному, от целостного организма в глубину — к тканям, клеткам, субклеточным элементам и, наконец, реакциям на молекулярном уровне внесло много нового в познание сущности рака и механизма онкогенеза. Это движение отражало общий прогресс науки, совершенствование методических возможностей проникновения в глубинные процессы, лежащие в основе феномена малигнизации. Однако такое смещение методологических акцентов имело и некоторые негативные последствия. Они стали отчетливо проявляться в определенной дезинтеграции целого, отрыве частных явлений на «нижних этажах» организации живого от состояния, функции и компетенции целостного организма.
Реакцией на указанные отрицательные явления в общем прогрессе теоретической онкологии явилось стремление устранить намечающийся дисбаланс двух противоположных тенденций. Это нашло выражение в активном развитии за последние годы научного направления, формулировавшегося как «взаимоотношения опухоли и организма», или «опухоль и организм*. Плодотворность его очевидна, так как сегодня не требует доказательств положение, что опухоль не местный процесс, а заболевание всего организма.
Очень активно данное направление развивается в нашей стране, и большой вклад в его успех внесли Р. Е. Кавецкий (1977, 1981) и его школа: В. Г. Пинчук (1979), А. И. Быкорез и 3. А. Бутенко (1975), К. П. Балицкий, Н. К. Берлинских (1983), В. М. Дильман (1983). Особенно активно эту проблему разрабатывают В. С. Шапот и соавт. (1975).
Мы изложили наиболее значительные теории и гипотезы происхождения и природы рака, основывающиеся на данных классической биохимии.
Больше всего внимания было уделено теории Варбурга по той причине, что она была, по существу, первой попыткой интерпретации феномена возникновения и особенностей неоплазм с конкретных биохимических позиций. Кроме того, это было сделано потому, что теория Варбурга лучше других подкреплена фактами и логическими обоснованиями. Наконец, эта концепция приобрела и в момент ее появления, и позже, даже до наших дней, необычайную популярность и оказала большое влияние как на мышление онкологов-теоретиков и экспериментаторов, так и на дальнейшие пути исследований многих лабораторий на десятки лет вперед. Однако время шло, накапливались новые данные, заставлявшие взглянуть на те же факты другими глазами. Именно поэтому много места в данной главе было уделено также критической оценке точки зрения Варбурга. Эта критика ни в коей мере не поколебала авторитета этого выдающегося ученого. Все представленные им экспериментальные результаты полностью сохраняют свою силу. Могут быть изменены лишь акценты и логические оценки. В историческом плане теория рака Варбурга была н остается одним из самых оригинальных и впечатляющих усилий, какие предпринимались кем-либо из биохимиков до сих пор.
Другие биохимические гипотезы злокачественного роста представляются нам менее значительными. Однако они ——неотъемлемая часть истории теоретической онкологии, отражают те или иные успехи биохимии своего времени и заслуживают внимательного рассмотрения, тем более, что нам известны примеры «воскрешения» забытых взглядов, получивших новое звучание в свете более поздних открытий.
Наиболее общее заключение, которое может быть сделано в результате взвешенной оценки всего, чем располагает современная биохимия в области онкологии, сводится к следующему. Ни одна из существующих биохимических гипотез, теорий, концепций не может пока объяснить все стороны сложного феномена рака, что исключает возможность разработки на их основе научно обоснованных диагностических тестов и методов лечения злокачественных опухолей.
Надежды в этом плане могут быть связаны, по нашему мнению, только с успехами нового, высшего этапа развития биохимии — молекулярной биологии, а также молекулярной генетики. Опыт последних лет, освещенный в последующих главах этой книги, убеждает в правильности этой мысли.
ГЛАВА 2
БИОХИМИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫХИМИЧЕСКОГО КАНЦЕРОГЕНЕЗА
Канцерогены можно подразделить на химические, физические и биологические агенты, экспозиция к которым увеличивает вероятность возникновения рака. Канцерогены могут действовать в области первичного контакта, в зоне локализации или накопления в избирательном органе (органе-мишени), в местах их экскреции или метаболических превращений.
Все большее признание находит точка зрения, что большинство злокачественных опухолей у человека вызывают химические канцерогены среды и что эти опухоли в конечном счете могут быть предотвращены. По оценкам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), более 75 % заболеваний раком у людей обусловлены факторами окружающей среды. Полагают даже, что примерно 80 % рака у человека происходят в результате воздействия химических веществ [Boyland Е., 1969].
Известный американский онковирусолог, бывший директор Национального института рака США F. Rauschcr (1962), считает, что 60—90 % всех заболеваний раком возникают за счет факторов окружающей среды. Он приводит данные, согласно которым курение обусловливает примерно 40 % смертности от рака, пищевые факторы — 25—30 %, профессиональные факторы— 10 %.
По данным экспертов-эпидемиологов, 80—90 % раковых опухолей могут быть связаны с факторами среды, причем роль некоторых агентов как этиологических факторов рака очевидна. Например, около 30 % смертей от злокачественных опухолей в США связаны с курением и 27 % смертей от рака обусловлены болезнями пищеварительного тракта.
Отдельные исследователи указывают на питание как причину существенных различий в смертности от отдельных видов рака, например, в США и Японии.
Так, в Японии в 7 раз больше смертельных случаев от рака желудка, чем в США. Однако в Японии смертность от рака прямой и толстой кишки встречается в 2 раза реже, чем в США.
В ряде исследований роль специфических канцерогенов окружающей среды была идентифицирована или обоснованно предположена. Наиболее документированные данные по канцерогенезу за счет химических соединений окружающей среды представлены в отношении табака. Уже в течение нескольких десятилетий подозревали, что интенсивное курение прямо и причинно связано с хроническими заболеваниями легких и особенно раком. Более 29 ретроспективных эпидемиологических исследований по раку легких, указавших на причинную роль курения, были опубликованы за период с 1939 по 1964 г. В настоящее время связь рака легкого с курением считается убедительно доказанной.
Имеется также много исследований, показывающих роль загрязнения воздуха городов в возникновении рака легких. В атмосфере городов установлено присутствие ряда химических канцерогенов, причем продемонстрирована более высокая смертность от рака легких в городах с загрязненным воздухом, чем в сельской местности.
Сейчас мало сомнений в том, что многие болезни, рассматривавшиеся ранее как спонтанные, в частности рак, вызываются загрязнением окружающей среды. Они обусловлены экспоненциальным возрастанием экспозиции человека к загрязнениям широко используемых синтетических и других химических соединений (и продуктов их деградации в воздухе, воде и почве), которые пока недостаточно токсикологически и экологически охарактеризованы. Существенную роль играет не поддающаяся контролю профессиональная экспозиция к широкому ряду уже хорошо известных химических канцерогенов, в дополнение к тысячам токсикологически неохарактеризованных синтетических химикалиев.
История обнаружения профессионального канцерогенеза восходит к наблюдению Персиваля Потта [Pott Р., 1875], впервые обнаружившего высокую частоту рака мошонки у молодых британских трубочистов, экспозированных к саже. С тех пор многочисленными авторами описаны и изучены разнообразные профессиональные формы рака. В их число входят рак мочевого пузыря в анилинокрасочной и резиновой промышленности, индуцируемый 2-на- фтиламином, бензидином, 2-аминотиофенилом и 2-нитрофенилом, рак легкого у рабочих урановых рудников в Колорадо, у рабочих коксовых печей, рабочих предприятий по выработке азотистых ипритов в Японии и у рабочих, даже кратковременно соприкасающихся с бис (хлорметил) -эфиром; рак кожи у рабочих промышленности сланцевых масел; рак синуса носа у столяров и плотников; рак легкого и плевральные мезотелиомы у изолировщиков, строительных рабочих, соприкасающихся с асбестом; рак поджелудочной железы, а также лимфомы у химиков-органиков; ангиосаркома печени у рабочих, занимающихся полимеризацион- ными процессами при изготовлении поливинилхлорида.
По оценкам американских авторов, 60 % (а возможно и 90 %) из тех 655 000 случаев рака, которые выявлены в США в 1974 г., вызваны различными факторами окружающей среды, главным образом разнообразными химическими веществами [Maugh Т., 1974]. J. Higginson (1982) указывает, что примерно 80 % всех злокачественных опухолей человека связаны с факторами окружающей среды. Он включает сюда все внешние факторы, имея в виду курение сигарет, диету и потребление лекарств, а также загрязнение воздуха и воды, особенности гео гр а ф и чес ко го местожительства и другие социально-культурные факторы.
КАНЦЕРОГЕНЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
История исследований рака показывает, что открытия в области человеческого канцерогенеза за счет различных химических соединений предшествуют изучению этих веществ на экспериментальных животных. Последующие лабораторные исследования привели к обнаружению большого числа разнообразных химических канцерогенов. Сегодня обычным является следующий путь поисков канцероген^5Tgт зпнде而ологнческнх наблйхае疝й 亡Гёстам на 'животных н~^Ьтем бЗЬатно к человеку. Именно таким путем, особенно в отношении промышленных факторов, был идентифицирован ряд химикатов в качестве канцерогенных для человека веществ. Специфические канцерогенные компоненты различных смол, сажи, масел, сигаретного дыма и бетельных орехов пока не раскрыты. Лучше охарактеризованные канцерогенные для человека химические вещества включают различные ароматические амины и родственные соединения: 2-нафтиламин, бензидин, 4-аминотиофенил, аурамин, NN-биc(2-xлopэтил)-2-нaфтилaмин, бис(2-хлорэтил)сульфид, асбест, некоторые никель- н хромсодержащие канцерогены. Давно в канцерогенном действии на кожу человека подозреваются мышьяковые соединения, и, согласно современным эпидемиологическим данным, им принадлежит также определенная роль в этиологии некоторых форм рака дыхательной системы. Длительное использование фенацетина некоторыми больными, по-видимому, может индуцировать опухоли почек. Однако эти агенты не вызывают опухолей у экспериментальных животных. Афлатоксин и вторичные нитрозамины рассматриваются как весьма вероятные канцерогены для человека, так как они присутствуют в специфической для него окружающей среде и показали себя мощными канцерогенами у многих видов животных.
Сейчас признается, что не менее 1000 химических веществ могут вызывать опухоли у человека н животных, и во много раз больше веществ подозреваются в этом [Maugh Т., 1974]. Важные сведения о химических соединениях вообще и химических канцерогенных веществах в частности приводит известный специалист в этой области U. Saffiotti (1982). Этот автор отмечает, что существуют большие различия: в общем количестве зарегистрированных химических соединений (5- 10ь); числе химических веществ, к которым экспозируется человек (6-104—7 • 104); тех, которые определялись на канцерогенную активность (4-Ю3—7-Ю3); соединений, которые при биологическом испытании были идентифицированы как канцерогенные у животных и экспозиции к которым подвергается человек (3-102—5 -102), и теми, наконец, которые были признаны канцерогенными на основе текущих эпидемиологических наблюдений.
Профессиональные факторы обусловливают примерно 20— 40 % от общего числа случаев рака. В основном эти данные основываются на эпидемиологических наблюдениях. U. Saffiotti (1982)
приводит следующую оценку количества существующих химических веществ и канцерогенов.
Все зарегистрированные химические вещества.50()0000
Все химические вещества, к которым экспозируется человек 60000—70000
Все существующие канцерогены 5000—50000
Все существующие канцерогены, к которым экспо- зируется человек . . 1000—5000
Химические соединения, испытанные на канцерогенность 4000—7000
Испытанные на животных, подозреваемые канцерогены 1400—2800
Испытанные на животных, положительно канцерогенные 800—900
Тест-позитивные канцерогены, к которым экспози- руется человек 300——500
Тест-позитивные канцерогены с профессиональной экс пози цией 200— 300
Канцерогены с позитивными данными для человека 20——40
Из этого следует, что нас окружает бесчисленное количество химических веществ. Все вокруг нас: одежда, которую мы носим, пища, которую едим, газеты, журналы, книги, которые мы читаем, все прочее» питающее современную цивилизацию, — сделано из химических веществ или при их помощи. С течением времени в этом, в высшей степени конструктивном, развитии стали обнаруживаться и негативные стороны, а именно: появились данные о том, что многие из традиционно используемых в быту и промышленности соединений токсичны, а иные канцерогенны.
Естественно, встал вопрос о контроле над этой негативной стороной процесса внедрения изделий химической индустрии и естественных продуктов природы. Сразу же стало ясно, что проверка на канцерогенную активность всех известных или даже только широко используемых химических веществ представляет задачу нереальную ни физически, ни экономически.
Действительно, по имеющимся достоверным компьютеризированным данным [Maugh Т・，1978], на конец 1977 г. в мире зарегистрировано 4 039 907 единиц химических соединений, причем число их возрастает еженедельно на 6000. Компьютерный список содержит все соединения, упомянутые в литературе начиная с 1965 г. Естественно, что в настоящее время общее число известных химических веществ намного больше. Упомянутая машинная регистрация химикалиев основывается на безупречном компьютерном описании их строения и молекулярной структуры, причем каждому регистрируемому уникальному соединению автоматически присваивается постоянный идентификационный номер.
Интересны некоторые общие характеристики зарегистрированных индивидуальных химических веществ. 96 % из них содержат углерод; усредненное соединение имеет 43 атома, 22 из которых являются водородом. Такое усредненное статистическое соединение содержит одну или половину кольцевой системы с восьмью ато-
мами на кольцо. Примерно 3 400 000 химических веществ являются органическими соединениями, структура которых полностью идентифицирована, 3 000 000 из них содержат как минимум одну кольцевую систему. 59 000 органических веществ не до конца идентифицированы. Картотека содержит также 72 000 сплавов, 120 000 полимеров и 10 000 смесей специфических наименований. Из общего числа зарегистрированных химических соединений 33 000 являются веществами широкого использования (по другим оценкам —63 000) и 50 000 — повседневного использования, без включения пестицидов, фармакопрепаратов и добавок к пищевым продуктам.
Естественно, что определение безопасности такого числа веществ, хотя бы только широкого использования, является практически неосуществимой задачей. Во всяком случае, в 1978 г. в 98 институтах 20 стран тестировались на канцерогенность только 990 химических соединений, причем стоимость полного тестирования одного соединения оценивалась в 500 000 фунтов стерлингов. Процедура требует 50 самцов и 50 самок двух видов животных и продолжается 24 мес.
Интересные данные за 1974—1975 гг. приводит В. Toth (1975). По его подсчетам, ежегодно поступает около 200 000 новых химических веществ Если лишь 1 % их представлен в сравнительно больших количествах, то это значит, что человек ежегодно подвергается экспозиции примерно 2000 только новых соединений с неизвестным действием на организм.
К началу 1976 г. во всем мире было исследовано на канцерогенную активность более 6000 химических веществ. Из них более 1000 соединений вызывали опухоли у животных и, по-видимому, способны делать это у человека.
Несмотря на эту статистику и большие усилия, затраченные после того, как более 200 лет назад печная сажа была идентифицирована как причина одного из видов рака, сравнительно мало известно о тонком механизме химического канцерогенеза. Это объясняется главным образом тем, что основные усилия направлялись до недавнего времени на выявление новых канцерогенов, а не на изучение механизма их действия. С другой стороны, концентрация внимания в последние десятилетия на вирусном канцерогенезе также отвлекала от более интенсивной разработки проблемы химического канцерогенеза.
В настоящее время, хотя большие усилия в исследовании химического канцерогенеза все еще продолжают направляться на скрининг, новым элементом работы является значительный сдвиг в сторону молекулярной биологии канцерогенеза. Этому вопросу будут посвящены специальные разделы данной книги. До этого, однако, необходимо рассмотреть тот богатый опыт, который был накоплен экспериментальной онкологией в «домолекулярный» период, и прежде всего именно в скрининге. В этом деле имелись и имеются большие трудности методического и экономического
характера, а также обусловленные видовой специфичностью и различной чувствительностью экспериментальных животных.
Важная информация для проблемы химического канцерогенеза была получена в результате так называемого US mega mouse experiment [Fishbein L., 1980], который ясно показал, что для того, чтобы быть обнаруженным, канцероген должен вводиться непрерывно, число животных должно быть достаточно велико (24 000 в упомянутом эксперименте), и продолжительность опыта должна равняться по крайней мере 24 мес. В противном случае небольшое увеличение в частоте случаев рака, равно как н раков с длительным латентным периодом, останутся нераскрытыми. До сих пор только очень немного опытов по канцерогенезу проводилось в указанных условиях. В связи с этим Международное агентство по изучению рака (IARC, Лион) дало руководящие указания для тестирования канцерогенности [IARC. Report 6, 1980].
ХИМИЧЕСКИЕ КАНЦЕРОГЕНЫ
Число известных канцерогенных веществ велико и продолжает возрастать. Химические канцерогены в настоящее время представляют собой обширную группу широко варьирующих по структуре органических и неорганических соединений с видовой и тканевой избирательностью невирусной и нерадиоактивной природы. Часть этих агентов присутствует в окружающей природе, многие из них являются продуктами человеческой деятельности —— промышленной н лабораторной, а некоторые канцерогены представляют собою метаболиты живых клеток.
Некоторые синтетические (формулы I—VIII) и природные (формулы IX—XII) канцерогены показаны ниже. Главным образом благодаря усилиям эпидемиологов и вследствие неосторожности людей в обращении с различными химическими веществами был выявлен целый ряд химических канцерогенов, причастных к возникновению рака у человека [Miller J., 1970].
АгентМишень
Сажи, смолы, маслаКожа, легкие
Курение сигаретЛегкие
2-НафтиламинМочевойпузырь
4-Аминобифенил» >
Бензидин> »
NэN-биc(2-xлopэтил)-2-нaфтилaмин> >
Бис (2-хлорэтил) сульфидЛегкие
Соединения никеляЛегкие, носовыесинусы
Соединения хромаЛегкие
АсбестЛегкие, плевра
К числу первых экспериментальных обоснований канцерогенного действия ряда химических соединений относятся исследования, установившие: индукцию рака кожи у кроликов (1915 г.) н мышей (1918 г.); индукцию опухолей первым чистым химическим канцерогеном—1,2,5,6-дибензантраценом (1930 г.); изолирова-
с2нв—S—сн2—сн2—сн—соон晶2
этионин
4 - нитрох инолин-1 - оксидСС14VilЧетыреххлористый углерод4 - нитрох инолин-1 - оксидСС14VilЧетыреххлористый углерод2-а цетил ами нофлюорен2-а цетил ами нофлюорендиметилнитрозаминдиметилнитрозаминпирролиэидиновые алкалоидыпирролиэидиновые алкалоидыафлатоксин В〕афлатоксин В〕циказинциказинСН2—СН=СН2СН2—СН=СН2сафролсафрол
4 - нитрох инолин-1 - оксид
СС14Vil
Четыреххлористый углерод
4 - нитрох инолин-1 - оксид
СС14Vil
Четыреххлористый углерод
2-а цетил ами нофлюорен
2-а цетил ами нофлюорен
диметилнитрозамин
диметилнитрозамин
пирролиэидиновые алкалоиды
пирролиэидиновые алкалоиды
афлатоксин В〕
афлатоксин В〕
циказин
циказин
СН2—СН=СН2
СН2—СН=СН2
сафрол
сафрол
7,12-диметил~бенз(ос) антрацен(9,10-диметил ~1,2-бензантрацен)
СОСНЭ II
N-метил-4-ам иноазобензол
C2Hg一О—С一NH?VIII
Оэтил карбамат
Строение некоторых синтетических химических соединений индуцирующих опухали у экслеримнтмьных ^сивотных
ние канцерогена 3,4-бензпирена из каменноугольной смолы (1933 г.); индукцию рака печени у крыс о-аминоазотолуолом и п-диметиламиноазобензолом (1933 и 1936 гг.); индукцию рака мочевого пузыря у собак 2-нафтиламином (1937 г.); стадии инициации и промоции в канцерогенезе кожи смолой (дегтем) и 3,4-бенз- пиреном (1941 г.).
Характерной особенностью соединений (см. формулы I—VIII и IX—XII) является то, что они как таковые неканцерогенны и для такого действия требуют активации. В этом отношении они отличаются от канцерогенных алкилирующих соединений (формулы XIII—XVIII).
Некоторые природные соединения, индуцирующие опухолиу эксперил1ентамных животных
1~этиленокси-3,4 - эпоксициклогексан1~этиленокси-3,4 - эпоксициклогексанVCH2VCH21,4 - димета нсул ьфонок сибутан1,4 - димета нсул ьфонок сибутанXVIIIXVIII
1~этиленокси-3,4 - эпоксициклогексан
1~этиленокси-3,4 - эпоксициклогексан
VCH2
VCH2
1,4 - димета нсул ьфонок сибутан
1,4 - димета нсул ьфонок сибутан
XVIII
XVIII
CH3(CH2)wCO-N<\^ XV
N-стеароилэтиленимин
Некоторые алкилирующие агенты9 показавшие канцерогенность ка экспериленг томных мсиеотных
О разнообразии структуры н действии химических канцерогенов можно судить по следующему перечислению.
Очень сильный канцероген углеводород 9,10-ди метил -1,2 бензантрацен (ДМБА), мультипотентный ароматический амид аце- тиламинофлюорен (ААФ), аминоазокраситель №метн』-4-амнно- азобензол (МАБ) н нитрозамин диметилнитрозамин (ДМНА)— каждый из них является представителем больших групп родственных веществ с различной видо- и тканеспецифичностью. Гетероциклическое соединение 4-нитрохинолин-1 -оксид н родственные ему соединения имеют канцерогенность, сходную с тако ой полициклических ароматических углеводородов. Этионин — аминокислота, гепатоканцерогенная для крыс. Четыреххлористый углерод СС14 является гепатоканцерогеном для мышей, и хомяков. Этил карбамат (уретан) — многосторонний канцероген, существенно отличающимся от перечисленных выше химических веществ по химической структуре.
Варьирование структур канцерогенных веществ кажется бесконечным. В частности, очень своеобразны структуры некоторых метаболитов грибов н зеленых растений. Такие из них, как афлатоксин, пирролизидиновые алкалоиды и циказин, обладают очень сильной гепатоканцерогенной активностью для крыс. Как уже упоминалось, есть мнение, что афлатоксин является одной из причин высокой частоты первичного рака печени среди местного (туземного) населения Центральной и Южной Африки и в других местах.
Наиболее примечательной особенностью канцерогенеза под влиянием перечисленных выше синтетических и естественных канцерогенов является то, что эти вещества как таковые практически все неканцерогенны, о чем будет подробно говориться ниже.
Они, по-видимому, представляют собой преканцерогены, которые в организме хозяина превращаются в активные структуры н канцерогены. В этом отношении они отличаются от канцерогенных алкилирующих агентов (см. формулы XIII—XVIII). Эти агенты находятся в их конечных реактивных формах уже при введении животным и принимают участие в реакциях замещения, нуклеофильных, бимолекулярных (SN2), в которых положительный, или электрофильный, атом в алкилирующем агенте комбинируется с отрицательными, или нуклеофильными, атомами атакуемых молекул в клетках.
Во время введения в ткани эти канцерогенные электрофильные реагенты встречают нуклеофилы, такие как вода и белки, перед их вступлением в клетки. Это может частично объяснять то обстоятельство, что алкилирующие агенты оказываются недостаточно сильными канцерогенами н требуются множественные большие дозы в отдельных местах ткани, чтобы выявить их канцерогенность.
Ряд канцерогенных металлов, например бериллий, кадмий, кобальт, никель и свинец, составляют другую группу агентов, которые в их ионной форме являются электрофилами. Органические электрофильные производные (дериваты) металлов могут также образовываться in vivo.
Классификация химических канцерогенных веществ. К наиболее активным и распространенным канцерогенам можно отнести следующие соединения.
Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ). Типичными их представителями являются: 7,12-ДМБА, 3,4-бензпнрен (3,4-БП), 20-метилхолантрен (20-МХ) и др. Ежегодно в промышленных городах в атмосферу выбрасываются много сотен тонн, например, БП. В то же время несколько микрограммов ПАУ достаточны для индукции опухолей у животных.
Гетероциклические ароматические углеводороды. К ним относятся такие соединения, как 1,2,5,6-дибензакридин, 1,2,5,6- н 3,4,5,6-днбензкарбазол и др.
Ароматические амины н амиды: 2-нафтиламин (2-НА), 4-аминодифенил, бензидин, 2-аминофл юорен, 2-ацетиламино- флюорен (2-ААФ) и др.
Аминоазосоединения: ортоаминоазотолуол, 4-диметилами- ноазобензол (4-ДМАБ) и др.
Нитрозосоединения. Нитрозамины: ДМНА, диэтилнитроз- амин (ДЭНА), К-метил-^-нитро-К нитрозогуанидин (МННГ), нитрозометил мочевина (НММ) и др.
Афлатоксины (В( и др.)
Прочие: уретан (этилкарбамат), этионин, CCL4, хлорэтил- амины, тиоацетамид, эпоксиды, лактоны, винилхлорид, металлы, пластмассы и др.
Одна группа веществ, например ПАУ, обладают, главным образом, местным действием (кожа, подкожная клетчатка), другим
(аминоазосоединения, ароматические амины) свойственно резорбтивное действие, они вызывают опухоли в отдаленных от места введения чувствительных органах.
С другой стороны, все химические канцерогены могут быть разделены на 2 группы по другому принципу: одни являются активными per se, без предварительной активации (ряд простых алкилирующих агентов); другие (их большинство) —нуждаются в предварительной активации (ароматические углеводороды, ароматические амины, афлатоксин В( и др.).
При рассмотрении структуры всех этих веществ прежде всего поражают их разнообразная, иногда совершенно различная природа, размер молекул и другие характеристики. Обращает на себя внимание также химическая инертность многих канцерогенных веществ, например ПАУ, ароматических аминов, нитрозаминов.
Поначалу все эти противоречия представлялись неразрешимыми, вызывали много дискуссий и затрудняли разработку универсальной концепции химического канцерогенеза. Мы увидим ниже, как эти трудности были преодолены.
Метаболическая активация и реактивность химических канцерогенов. Как указывалось выше, практически все химические канцерогены (как естественные, так и синтетические), кроме группы канцерогенных алкилирующих соединений, сами по себе не являются канцерогенными. С этой точки зрения, их следует рассматривать как преканцерогены, которые в организме животного или человека подвергаются метаболическим превращениям, активируются, становятся реактивными структурами.
Поскольку совершенно очевидно, что канцерогенные агенты вызывают неоплазию путем взаимодействия с тканевыми компонентами, основные усилия в расшифровке механизмов химического канцерогенеза были направлены, главным образом, на изучение химической реактивности канцерогенов и их метаболитов. Прежде всего, пытались установить активные формы, т. е. так называемые конечные канцерогены. Вторым этапом являлись выяснение природы взаимодействия этих активных форм канцерогенов с тканевыми компонентами н определение последних. Существенно было установить, с какими молекулярными компонентами клетки взаимодействие конечных канцерогенов является критическим в малигнизации и каковы молекулярный механизм н специфика этого взаимодействия.
В известной мере этапную и основополагающую роль в решении этих вопросов сыграли исследования J. Miller и Е. Miller. Суть их концепции заключается в следующем.
Форма химического вещества, которая в конечном счете реагирует с макромолекулами клетки («конечный» канцероген), должна содержать реактивный электрофильный (т. е. электрондефицит- ный) атом, который может атаковать многие обогащенные электронами (нуклеофильные) центры в полинуклеотидах или белках. К нуклеофильным центрам относятся ионы карбония,
свободные радикалы, эпоксиды, катионы ряда металлов, азот в эфирах гидроксиламинов и гидроксамовых кислот и др. Все канцерогены, которые сами не являются электрофилами, в тканях метаболизируются до таковых. Из этого открытия следовало заключение, что основным принципом химического канцерогенеза является положение о том, что химическое вещество для того, чтобы вызвать трансформацию, должно необратимо реагировать с клеточными макромолекулами. Одним из следствий такой посылки явилась, между прочим, концепция «выпадения», согласно которой в результате необратимого взаимодействия, в частности азокрасителей с белками, регулирующими рост, эти канцерогены инактивируют «регуляторные» белки. Они как бы «выпадают». По иронии судьбы ферменты, чьей первичной функцией в организме являются детоксикация и удаление чужеродных вредных химических веществ, оказались способными активировать химические канцерогены, превращать неактивные формы последних в реактивные. Наиболее важными из них являются группа окислительных ферментов под общим наименованием микросомальных полифункциональных (многоцелевых) оксигеназ. Ими особенно богаты печень и почки, где чужеродные вещества накапливаются. В нормальных тканях оксигеназы путем окисления различных функциональных групп чужеродных веществ делают их более полярными и создают этим точки присоединения к сахарам и другим молекулам, способствуя их растворению и экскреции.
Связывание канцерогеног макромолекулами in vivo. Впервые ковалентное взаимодействие химических канцерогенов с белками тканей-мишеней было отмечено еще более 30 лет тому назад. Наиболее раннее сообщение о реакции нуклеиновых кислот с алкилирующими агентами in vivo появилось в 1957 г.
Ковалентное связывание остатков химических канцерогенов с макромолекулами (ДНК, РНК, белки) in vivo в последующем отмечалось во всех случаях. Аналогичные результаты получены с печенью, кожей и другими тканями животных, обрабатываемых химическими канцерогенами: ароматическими аминами, ароматическими полициклическими углеводородами, алкилирующими агентами и потенциальными алкилирующими агентами. При введении этих н других химических канцерогенов происходит также взаимодействие и с другими макромолекулами, например гликогеном, н с низкомолекулярными соединениями тканей. Однако главное внимание обращается на взаимодействие канцерогенов с нуклеиновыми кислотами и белками в надежде обнаружить изменения, обусловливающие наследственную утрату клеток над контролем роста, что характерно для неоплазм.
Что касается роли белков тканей в связывании с канцерогенами и последующей индукции опухолей, то интересно отметить, что первоначально в изучении механизма действия химических канцерогенных соединений главное внимание обращали не на нуклеиновые кислоты, а именно на белки. Немаловажную роль
в этой области исследования (как н в химиотерапии неоплазм) сыграл С. Heidelberger. Он совместно с сотрудниками синтезировал первый радиоактивномеченный канцерогенный углеводород.
Синтезировав 1,2,5,6-дибензантрацен—|4С3 (ДБА), эти авторы попытались проследить его метаболическую судьбу у мышей и показали образование некоторых до того неизвестных хинонов и других метаболитов. Оказалось, однако, что эта работа была больше связана с детоксикацией, чем с канцерогенезом. Примерно в это время Е. Miller и J. Miller, основываясь на своей предыдущей работе по связыванию гепатоканцерогенных азокрасителей с белками крысиной печени, с помощью флюоресцентной техники показали, что 3,4-бензпирен прочно связан с белком кожи мыши. Поскольку уже со времен Эрлиха стало аксиомой, что вещество должно проявлять свое фармакологическое действие в результате взаимодействия с тканевым рецептором, открытие Е. Miller н J. Miller, казалось, вело к объяснению этого механизма. Имея это в виду, был синтезирован ряд радиоактивномеченных углеводородов и измерена величина их ковалентного связывания с белками кожи мыши после поверхностного нанесения. Когда авторы сравнили связывание серии меченых углеводородов с растворимыми и нерастворимыми белками кожи мыши после введения путем кожной аппликации, они обнаружили корреляцию между количеством связанного углеводорода с растворимыми белками и канцерогенной активностью, за исключением 1,2,3,4-ДБА, который связывался интенсивно, но считался неканцерогенным. С помощью электрофореза в крахмале идентифицировали фракцию, с которой канцерогенные углеводороды связываются, а неканцерогенные — не связываются. К тому же имелось очень хорошее соответствие между связыванием с этой фракцией и канцерогенной активностью серии соединений.
Эта белковая фракция из кожи мыши имела некоторое сходство с h-белком крысиной печени, с которым связываются азокрасители и 2-ААФ. Конъюгаты были детально исследованы и частично очищены. h-Белок кожи мыши легко отделялся от аргиназной активности.
Это противоречило более ранним данным, согласно которым связываемый азокрасителями белок в печени может быть идентичен аргиназе.
С помощью изоэлектрического фокусирования группе С. Heidelberger удалось очистить h-белок в 560 раз, однако он все еще не был полностью гомогенным. Относительная молекулярная масса этого белка была равна 40 000, будучи определенной хроматографией на сефадексе Г-100, и 20 000 — по определению путем электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Это говорит о том, что белок является димером и состоит из двух субъединиц.
Литература, посвященная взаимодействию канцерогенов с белками тканей, велика, и затруднительно ее перечислить полно
даже в таком издании, как эта книга. Важно, однако, другое. Это направление, в общем, не дало ожидаемых результатов, зашло в тупик, и волна подобных исследований резко спала.
Наоборот, все больше внимания стали обращать на реакции канцерогенов с нуклеиновыми кислотами и, особенно, с ДНК. Исследование взаимодействия канцерогенов с ДНК показало, что радиоактивность из 1,2,5,6-ДБА, связанная с сырой фракцией ДНК, изолированной из кожи мыши, освобождалась из диализа- ционного мешка после обработки ДНК ДНКазой. Позже была продемонстрирована хорошая количественная корреляция между связыванием серии 3Н-углеводородов с ДНК и их канцерогенной активностью. Однако другие авторы проделали сходные опыты со связыванием углеводородов in vivo с эпителиальными клетками мышиной кожи и не обнаружили такой корреляции. В частности, неканцерогенный ДВА связывался даже сильнее, чем канцерогенный изомер.
Многие тканевые н видовые различия в активности химических канцерогенов определяются характером и особенностями метабо- лнческнх реакций, ведущих, с одной стороны, к образованию реактивных электрофильных форм химических канцерогенов, с другой стороны ■— к дезактивации последних или их предшественников.
В этом свете понятно значение глубокого изучения и понимания всех молекулярных ступеней превращения преканцерогенов в их активные формы.
Электрофилы, нуклеофилы, свободные радикалы, эпоксиды, диолэпоксиды. В настоящее время можно считать надежно установленным, что, несмотря на различия химической структуры разнообразных канцерогенов, все они метаболизируются in vivo до сильных электрофильных реагентов, имеющих в принципе общую (валовую) электронную структуру.
В общем виде ситуация такова. Родительский нереактивный канцероген, или преканцероген, превращается в другую молекулу, которая сама по себе нереактивна, но стоит уже ближе к конечной реактивной форме, чем преканцероген. Этот промежуточный продукт был назван проксимальным канцерогеном. Он через другие промежуточные проксимальные канцерогены превращается в конечный канцероген, который и взаимодействует с тканевыми нуклеофилами.
Целесообразно рассмотреть подробнее способы образования и свойства этих реактивных форм химических канцерогенов — от промежуточных до конечных.
Nagata и соавт. (1980) подчеркивают значение реакций превращения химических канцерогенов в свободные радикалы. Они указывают, что такие сильные канцерогены, как БП, 2-окси- бенз(а)пирен, 7,12-ДМБА, N,N-димeтил-4~aминoaзoбeнзoл и их дериваты, ААФ и НА, легко превращаются в свободные радикалы после того, как активируются в проксимальные формы. Эти
свободные радикалы были достаточно реактивны, чтобы связываться ковалентно с основаниями нуклеиновых кислот. Было найдено, что антрацен, который не имеет в своей структуре «бэй- области» (область «залива»), и 10 аза-бенз(а)пирен, в котором не ожидается образования диолэпоксидов, активируются до реактивных свободных радикалов.
Эти факторы говорят о том, что метаболически образующиеся свободные радикалы играют важную роль в химическом канцерогенезе.
Упомянутые выше авторы нашли, что все испытанные ими химические канцерогены метаболически превращаются в свободные радикалы, что, по их мнению, указывает на возможное значение гомолитической реакции расщепления связи в образовании электрондефицитных (электрофильных) свободнорадикальных продуктов и в начальных ступенях канцерогенеза. Роль свободных радикалов в канцерогенезе подробно рассмотрена в работах Н. М. Эмануэля (1977). •
Как известно, J. Miller (1978) подчеркивает доминирующее значение гетеролитических реакций (SN2 и SN1——замещения, нуклеофильных, бимолекулярных и замещения, нуклеофильных, мономолекулярных ——соответственно) во взаимодействии с нуклеофилами тканей.
В своей работе С. Nagata и соавт. (1980) рассматривают возможное участие диолэпоксидов, как содержащих в своей структуре «бэй-область», так и не содержащих ее, в реакциях с нуклеиновыми кислотами в клетках и тканях, обработанных БА, 7-МБА и 7,12-ДМБА.
Ранее авторы нашли, что БП превращается в 6-окси-БП- радикал после метаболических превращений в 6-гидрокси-БП в микросомах печени, равно как и в микросомных системах кожи и легкого животных.
Ниже охарактеризованы пути активации, ведущие к образованию свободных радикалов из многих типов сильных химических канцерогенов.
Как видно из формул XIX—XXIV, N-гидроксилирование является одной из обязательных ступеней в метаболических превращениях канцерогенных аминоазокрасителей, равно как и гидроксилирование в случае ПАУ.
В дополнение к канцерогенам XIX—XXIV имеются данные, свидетельствующие о том, что 4-нитрохинолин-1 -оксид, митомицин н другие хиноновые антибиотики дают начало свободным радикалам путем восстановительной активации. Было найдено также, что прямой канцероген (т. е. действующий непосредственно как конечный канцероген) МННГ легко превращается в свободнорадикальную форму без участия ферментов. Все эти наблюдения говорят в пользу того, что свободные радикалы, образуемые из химических канцерогенов, участвуют в инициации образования опухолей.
Энзиматическое образование свободные радикалов из некоторых сильных химических канцерогенов
ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИЕ АРОМАТИЧЕСКИЕ УГЛЕВОДОРОДЫ
Ранние исследования показали, что главными продуктами метаболических превращений полициклических углеводородов под влиянием специфических ферментов, содержащихся в микросомах клеток (подробно об этом см. раздел, посвященный метаболическим превращениям химических канцерогенов в микросомах), являются гидроксилированные производные и эпоксиды (формулы XXV—XXVIII, XXIX, XXX).
В 1950 г. Е. Boyland высказал предположение о том, что эпоксиды образуются в результате окислительных метаболических превращений отдельных двойных связей углеводородов. Эти эпоксиды затем могут или перестраиваться в фенолы, реагировать с водой, давая ди гидродиолы, или, взаимодействуя с глутатионом, образовывать конъюгаты. Последнее предположение представлялось особенно реальным, поскольку эти продукты были известны как главные метаболиты углеводородов. В свою очередь, эпоксиды гипотетически соответствовали возможным кандидатам в конечные канцерогенные формы углеводородов. Таким образом, эпоксиды стали вероятными кандидатами в конечные канцерогены, и многие исследователи стали рассматривать эпоксиды К-области ПАУ в качестве ответственных за реакцию с ДНК. Однако эта точка зрения оспаривалась на том основании, что продукты реакции с ДНК, полученные с этими производными ПАУ, не были идентичны найденным в опытах при связывании канцерогена in vivo. Проблема была решена путем идентификации диолэпоксида БП и демонстрацией того факта, что анти-изомер этого метаболита реагирует с ДНК, давая тот же продукт, что был получен in vivo.
По заданию J. Miller N. Newman синтезировал эпоксидные производные К-области некоторых углеводородов. Предполагалось, что К-области, места высокой плотности электронов, ассоциированные с изолированными фенантреноидными двойными связями (формулы БП, ДМБД и БА) определяют роль углеводородов в канцерогенезе. Однако эта первая попытка связать К-область полициклических углеводородов с канцерогенезом оказалась безуспешной. Эпоксидные продукты синтеза были менее канцерогенны, чем исходные углеводороды.
Успеха добились Р. Sims н соавт. Эти авторы подтвердили положение о том, что эпоксиды действительно образуются из исходных углеводородов под действием микросомальных поли- функциональных оксидаз, присутствующих в человеческих и животных тканях. Более того, в экстрактах из микросом, инкубированных с рядом канцерогенов, в частности БП и 7,12-ДМБА, они обнаружили эпоксиды К-областей этих канцерогенов. Р. Sims и соавт. синтезировали меченные радиоактивными (тритий) изотопами эпоксиды углеводородов и показали, таким образом, причастность этих метаболитов к индукции рака. Эпоксиды К-области полициклических углеводородов оказались электрофильными
Метаболические изменения е месте двойной связи К-области бенз^х) антраценаМетаболические изменения е месте двойной связи К-области бенз^х) антраценаэпопсцц ВПэпопсцц ВПххтхххтхXXXXXX
Метаболические изменения е месте двойной связи К-области бенз^х) антрацена
Метаболические изменения е месте двойной связи К-области бенз^х) антрацена
эпопсцц ВП
эпопсцц ВП
ххтх
ххтх
XXX
XXX
Бенз^а^пирен и 7,12-диметилбенз{д} антрацен 〃 〃*реактивные эпоксидные формы
реагентами, взаимодействующими с нуклеиновыми кислотами как in vitro, так и in vivo. Авторы не установили точное место в нуклеиновых кислотах, которое взаимодействует с эпоксидами, однако предварительные их результаты указывали на участие гуаниновых оснований.
В сотрудничестве с лабораторией С. Heidelberger (Висконсинский университет) группа Р. Sims проверила трансформирующую способность эпоксидов К-области углеводородов в культурах клеток грызунов. Прослеживали возникновение морфологически ненормальных колоний клеток. Колонии трансформированных клеток изолировали и испытывали на туморогенную активность
после введения животным. Результаты этих опытов показали, что эпоксиды К-области углеводородов были более активны как канцерогены, чем исходные соединения, и что гидроксилированные продукты (промежуточные метаболиты ПАУ) были неактивны в использованных системах.
Эти исследования убедительно подтвердили, таким образом, что полициклические углеводороды метаболизируются микросомальными ферментами в активные метаболиты. Однако оставался неясным механизм,, благодаря которому эпоксиды превращают нормальную клетку в неопластическую.
Канцерогенез и мутагенез. Сведения о существовании химического канцерогенеза накапливались параллельно с формированием идей о роли мутации в возникновении опухолей. Связь мутагенеза и канцерогенеза обосновывалась давно [Bauer К., 1928; Boveri Т., 1914, 1929]. Тем не менее до сих пор не все исследователи готовы рассматривать мутационный процесс как основу механизмов химического и физического канцерогенеза. Пока неясно, какие ступени, обусловленные мутациями, вовлечены б трансформацию. Не были бесспорно идентифицированы какие-либо клеточные молекулы в качестве факторов, непосредственно участвующих в индукции клеточной трансформации. Можно рассчитывать, однако, что в будущем будут получены более прямые и ясные данные, если удастся изолировать клеточные мутанты, связанные с трансформацией, и будут идентифицированы клеточные гены и их продукты, контролирующие нормальный и трансформированный фенотипы.
В любом случае нельзя не заметить появления в последние годы многочисленных исследований, направленных на выяснение конкретного молекулярного механизма мутагенеза и его связи с канцерогенезом. Мысль о связи мутагенеза с канцерогенезом на основе действия эпоксидов углеводородов привлекала к себе особое внимание потому, что последние реагируют с ДНК- С. Heidel- berger попытался эту гипотезу проверить. В опытах с культурами клеток китайского хомяка он показал мутагенность эпоксидов (Heidelberger С., 1968. 1973, 1975].
W. Durston и В. Ames (1973) (Калифорнийский университет) в опытах с бактериями показали, что эпоксиды К-области ПАУ являются сильными мутагенами, сдвигающими рамки транскрипции. Этот эффект приводит к включению или, наоборот, делеции одного или двух оснований в цепи ДНК, изменяя, таким образом, последовательность оснований. Было установлено, что эпоксиды К-зоны ПАУ являются сильными мутагенами. Они вызывают внедрение или выпадение одного или двух оснований в цепи ДНК, нарушая триплетный код. Возможно, что планарные молекулы ПАУ вклиниваются между основаниями нуклеиновых кислот (интеркалируют) и ковалентно связываются, реагируя с соседними нуклеофильными центрами оснований.
Ранее существовала довольно умозрительная теория действия полициклических углеводородов, основанная на способности пла-
Рис. 2. Интеркаляция планарных молекул (черные) в ДНК-
нарных молекул углеводородов вклиниваться в ДНК между парами оснований (рис. 2). Полагали, что этот процесс интеркаляции вызывает ошибки в репликации ДНК. Мутации со сдвигом рамки репликации также, по-видимому, возникают в результате интеркаляции планарных молекул между парами оснований ДНК. Вклинивание в дочернюю цепь ДНК или
делеция основания влечет сдвиг в считывании рамки триплетных кодонов в ДНК (схема):
ТРЕ ЛИЗ СЕР ПРО СЕР ЛЕЙ
АЦУ
ААдзГ
АГУ
ЦЦА
УЦА
ЦУУ
АЦУ
ААх
ГАГ
УЦЦ
АУЦ
АЦУ
ТРЕ ? ГЛУ СЕР ЛЕЙ ТРЕ
□ интеркалированный эпоксвд
X экстраоснование
Схема. Механизм, включающий репликацию ДНК, благодаря, которому 9поксиды углеводородов juozym индуцировать мутации со сдвигов рафики считывания.
В опытах В. Ames углеводороды и их гидроксилированные производные были неактивны как мутагены, что соответствует отрицательному результату С. Heidelberger при испытании гидроксилированных дериватов углеводородов в клеточных культурах на образование колоний трансформированных клеток. В. Ames предположил, что мутации, вызываемые эпоксидами, обусловлены интеркаляцией последних, сопровождаемой ковалентной реакцией между эпоксидной группой углеводорода и соседним нуклеофильным центром основания. Результаты работы с некоторыми акридиновыми производными подтвердили этот механизм мутаций. Позже В. Ames вместе с J. Miller и Е. Miller показали, что реактивные производные канцерогенных ароматических аминов также действуют у бактерий как агенты, вызывающие мутации со сдвигом рамки репликации.
Мута инн подобного рода в бнопогнческом плане важнее многих других ТИПОВ "мутаций ПО ТОЙ npHUHHg.
一 Яу>д ннактнвацнк)£на и』н серин сопряженных ген。' Возникновение такого типа мутации могло бы поэтому объяснить, почему некоторые полициклические углеводороды являются столь сильными канцерогенами по сравнению с алифатическими алкилирующими агентами
Уже на основании лишь этих данных можно было построить логическую схему механизма канцерогенеза полициклическими углеводородами. В соответствии с нею углеводород, поглощенный клеткой, подвергается метаболическим превращениям до реактивных эпоксидов, которые образуются быстрее, чем они могут быть инактивированы последующим метаболизмом до гидроксилированных производных. Если эпоксид интеркалирует в ДНК и фиксируется в ней к моменту начала клеточного деления, когда ДНК реплицируется со скоростью, опережающей деятельность клеточных репарирующих энзиматических систем, устраняющих углеводород и восстанавливающих повреждения ДНК, то образуется дочерняя ДНК, несущая мутацию, которая уже не будет «узнаваться» ферментами репарации ДНК-
Р. Grover (1973) высказал мысль о том, что мутации, индуцированные химическими агентами, могут происходить и в интегрированных вирусных геномах. Он рассматривает это как возможный механизм активации «онкогенов», которые, возможно, существуют в, казалось бы, нормальных (во всех других отношениях) клетках. С другой стороны, этот автор не исключает возможности и того, что многие спонтанные мутации в клетках млекопитающих также принадлежат к типу мутаций со сдвигом репликационной рамки, причем они учащаются при старении по причине возрастающего дефекта энзиматических систем, репарирующих ДНК, что и объясняет увеличение частоты рака с возрастом, даже без участия химических канцерогенов или вирусов.
Мутагенность метаболитов потенциально канцерогенных соединений находит подтверждение в многочисленных работах. Более того, на этой основе некоторые авторы пытаются даже объяснить увеличение частоты заболеваемости злокачественными новообразованиями при старении. Так, М. Baird и L. Birnbaum (1979, 1981) изучили вопрос, является ли более высокая смертность среди престарелых результатом увеличенной экспозиции к вездесущим канцерогенам или ее можно рассматривать как следствие продленного лаг-периода тех форм рака, которые присущи взрослым, а именно таких, клинические симптомы которых проявляются в более позднем периоде жизни людей.
В исследовании, выполненном в лаборатории этих авторов несколько ранее, было показано, что обмен в печени ряда фармакологических агентов, включая мышечные релаксанты, барбитураты и седативные средства, изменяется у стареющих крыс и мышей. Поскольку эти соединения метаболизируются, главным образом, системой микросомальных ферментов, которые метаболизируют также сравнительно инертные родительские канцерогены до высокореактивных метаболитов, авторы предположили, что связанные с возрастом изменения в обмене химических канцерогенов могут быть одним из факторов, ответственных за увеличение числа случаев рака с возрастом. Они проверили эту гипотезу экспериментально путем активации химических канцерогенов
до мутагенных форм в биологических испытаниях на модели Salmonella thyphi murium, разработанной В. Ames и соавт. (1973).
Активация проканцерогенных соединений, 3,4-БП и 2-флюорен- амина, печеночными гомогенатами из старых самцов крыс и мышей линий C57BL/6J приводила к увеличенной продукции мутагенных метаболитов у двух различных линий штаммов Salmonella по сравнению с активацией тканевыми препаратами, полученными из более молодых животных. Сходный результат был получен в опытах с микросомами, очищенными из печеночных гомогенатов. Эти наблюдения указывают на то, что связанные с возрастом различия в обмене канцерогенов не являются результатом возрастных изменений в немикросомальных системах детоксикации, которые не способны изменить спектр мутагенных метаболитов, производимых микросомами, ни качественно, ни количественно.
Результаты исследований указанных авторов показали, что метаболиты химических канцерогенов, образуемые старыми животными, качественно и количественно отличаются от тех, которые продуцируются их более молодыми партнерами. По-видимому, полученные данные подкрепляют гипотезу о том, что какая-то доля более частых случаев рака среди старых клеток является результатом связанных с возрастом изменений в обмене химических канцерогенов.
Теория области «залива». Теория «бэй-области» (области «залива») предполагает, что если диолэпоксиды ПАУ располагаются на угловых бензольных кольцах и при этом эпоксидная группа образует часть «бэй-области» канцерогенного ПАУ, то они должны обладать высокой биологической активностью [Jerina D. et al., 1980]. В соответствии с этим предсказанная авторами химическая реактивность позиционных изомеров диолэпоксидов бензольного кольца отдельных углеводородов была параллельна их мутагенности и (или) туморогенности. Тем не менее, хотя относительная реактивность эпоксидов «бэй-области» серий различных углеводородов давала удовлетворительный индекс туморогенности, авторы критически важными детерминантами биологической активности признали также метаболические и стереохимические факторы.
Эта работа D. Jerina и соавт. представляет принципиальный интерес и поэтому заслуживает более подробного рассмотрения.
К концу 1975 г. указанными авторами были представлены достаточно надежные доказательства того, что БП-7,8-диол-9,10- эпоксид является первым конечным канцерогеном, идентифицированным среди класса ПАУ. Основываясь на концепции диолэпоксидов, авторы попытались сформулировать общую концепцию для объяснения и предсказания канцерогенности или отсутствия таковой для данного канцерогена и проверить, в какой мере высокая реактивность БП-7,8-диол-9,10-эпоксидов может быть ответственной за их высокую биологическую активность. Они пришли к заключению, что для каждого данного полициклического углеводорода бензильные позиции на насыщенных бензольных кольцах
Структура фенантрена (XXXI) 〃 бензМ антрацена (ХАЛЛ)Структура фенантрена (XXXI) 〃 бензМ антрацена (ХАЛЛ)должны быть наиболее реактивными, если такие позиции образуют часть «бэй-области» углеводорода. Простейшим примером «бэй-области» может служить зона между 4-й и 5-й позициями фенантрена (формулы XXXI и XXXII), а также область
Структура фенантрена (XXXI) 〃 бензМ антрацена (ХАЛЛ)
Структура фенантрена (XXXI) 〃 бензМ антрацена (ХАЛЛ)
между I -й и 12-й позициями бенз (а) антрацена. Такие стерически стесненные области возникают, если бензольное кольцо вклинивается в ПАУ под углом.
Расчеты, основанные на молекулярно-орбитальной теории, позволили предсказать, что позиционный изомер диолэпоксида, в котором эпоксидная группа образует часть «бэй-области» углеводорода, будет более реактивен, чем другие изомерные диолэпокси ды, возможные для данного углеводорода. Именно на этом
основании авторы высказали предположение о том, что диолэпо- ксиды «бэй-области» могут быть конечными канцерогенами, если они образуются из туморогенных ПАУ.
Используя молекулярно-орбитальные расчеты, удалось на основании учета реактивности «бэй-области» диолэпоксидов различных углеводородов предсказать канцерогенность последних и поставить в закономерный ряд по их канцерогенной активности. Совпадение оказалось достаточно хорошим.
В последние годы было подтверждено, что теория «бэй- области» является очень удобной для предсказания структур конечных канцерогенов различных ПАУ.
Суммируя результаты описанных исследований, можно заключить, что уровень стабилизации бензильного иона карбония «бэй-области» позволяет предсказать химическую реактивность диолэпоксидов (в спонтанных сольволизных реакциях).
Дигидродиолы и диолэпоксиды в активации и детоксикации ПАУ. В настоящее время широко распространено мнение о том, что большинство канцерогенов, в том числе и ПАУ, реагируют ковалентно с клеточными макромолекулами (нуклеиновыми кислотами, белками) и что эти реакции могут участвовать в инициации малигнизации. Однако, поскольку ПАУ химически инертны, было признано, что они должны быть предварительно активированы до электрофильных производных, что является условием их ковалентного взаимодействия с нуклеофильными центрами клеточных макромолекул. Теперь известно, что первичными метаболическими продуктами ПАУ являются простые диоксиды, которые образуются при участии микросомальных НАДФ-зависимых монооксигеназ. Было высказано предположение, что именно эпоксиды, образованные при К-областях (содержащихся в большинстве углеводородов), являются теми электрофилами, которые играют критическую роль при химическом канцерогенезе. Было найдено, однако, что продукты присоединения углеводорода к нуклеозидам нуклеино-
„Бэй-область**■Л 87 вБенз(а) антрацен„Бэй-область**■Л 87 вБенз(а) антрацен
„Бэй-область**
■Л 87 в
Бенз(а) антрацен
„Бэй-область**
■Л 87 в
Бенз(а) антрацен
Реактивные участки /МУ вых кислот, образуемые клетками или тканями при обработке их ПАУ, не возникают путем взаимодействия с эпоксидами К-области углеводородов. Было установлено, что простые эпоксиды метаболизируются далее микросомальным ферментом эпоксидгидразой до трансдигидродиолов, которые могут, в свою очередь, превращаться в диолэпоксиды. Стало очевидным, что диолэпоксиды, образованные из определенных дигидродиолов, локализованных не в К-области (путем метаболизма соседних сопряженных двойных связей), вовлечены в реакции с нуклеиновыми кислотами.
По мнению авторов, соединения такого типа, по-видимому, становятся конечными канцерогенами.
По теоретическим соображениям, более реактивными химически и, таким образом, более активными биологически должны быть эпоксиды, образованные по соседству с «бэй-областью» в ПАУ (формулы ХХХШ—XXXV), чем эпоксиды, образованные в других местах молекулы углеводорода. Р. Sims (1980) рассмотрел этот вопрос, детально исследовав участие диолэпоксидов ПАУ двух типов: образованных при «бэй-области» и образованных в других местах молекул (не в «бэй-области» ПАУ) в реакциях с нуклеиновыми кислотами, имеющих место в клетках и тканях, обработанных бенз (а) антраценом, 7-метилбенз (а) антраценом или 7,12-ДМБА.
Автор показал, что слабый канцероген бенз (а) антрацен метаболизируется в ряд дигидродиолов и диолэпоксидов. Гидролизаты ДНК кожи эмбрионов мыши или хомяка, обработанные этим углеводородом, содержали продукты, возникшие в результате реакций с нуклеиновой кислотой диолэпоксидов как «бэй-области» (анти-3,4-диол-1,2-эпоксид), так и не «бэй-области» (анти-8,9- диол-10,11-эпоксид). Однако лишь последний диолэпоксид участвовал в реакции углеводорода с РНК эмбриональных клеток хомяка. В противоположность этому, активация умеренно активного канцерогена, 7-метилбенз(а) антрацена, и сильного канцерогена, 7,12-диметилбенз (а)антрацена, в коже мыши включает, по-види- мому, главным образом 3,4-диол-1,2-эпоксиды, локализованные при «бэй-области» углеводорода.
Р. Sims (1980) приводит следующие схемы метаболических превращений незамещенного бенз (а) антрацена (см. формулу XXXIII), 7-метилбенз(а)антрацена (см. формулу XXXIV) и 7,12- диметилбензантрацена (см. формулу XXXV).
Неидентифициро- ванный гидроксилированный продукт
3,4-дигидродиол- 1,2-эпокеид (показан анти-изомер)
5, б-дигидродиол-8,9-эпоксид
5,6,8,9-тетра- гидротетрол
10, И-дигидродиол- 8, 9-эпоксид(показан анти-изомер)
8,9-дигид родиол- 10,11- эпоксид (показан анти-изомер)
Метаболическое образование ди^идродио^ов 〃 由/а79〃о附Cw, полученных 〃з бенз(а)антрацена
Продукты метпаболических превращений 7-次?加"«^«4但；0呻做例後
СН3 сн3
7,12-дибенз(а)антранен 3,4-диол-1.2-эпоксид Метаболическая активация % 12 - дш^ти^бенз^антрацеиа
Малоактивный канцероген 7-метилбенз(а)антрацен метаболизируется микросомальными фракциями печени крысы и кожи мыши (органная культура) в пять возможных транс-дигидродиолов [Thakker D. et al., 1978]. причем главными продуктами являются: К-области-5,6-дигидродиол и не-К-области-1,2-, 3,4-, 8,9- и 10,11-дигидродиолы и не К области-3,4- и 8,9-дигидродиолы.
7,12-Диметил бенз (а) антрацен, являющийся сильным канцерогеном, метаболизируется микросомальными фракциями как печени крысы, так и кожи мыши (органная культура) до четырех трансдигидродиолов, а именно: 3,4-, 5,6-, 8,9- и 10,11-производных [Tierney В. et а!., 1977]. 3,4'Диол-1,2-эпоксид «бэй-области» получается при обработке in vitro кожи мыши исходным канцерогеном и в опытах in vivo. Не исключено образование и других продуктов (8,9-диол-10,11 -эпоксид не «бэй-области» и др.).
Была проанализирована реактивность связей С = О в эпоксидных дериватах нескольких циклических углеводородов в свете представлений о роли этих производных как конечных канцерогенов в реакциях с ДНК и РНК тканей. Авторы указывают, что при этом эпоксидное кольцо раскрывается и взаимодействие происходит по атому С-10. Они исследовали, в какой степени влияют на раскрытие эпоксидного кольца следующие 2 фактора: 1) близость в молекуле двойной связи; 2) интрамолекулярное образование двойных связей между соответствующим образом ориентированной гидроксильной группой и эпоксидным кислородом. Было
найдено, что, тогда как присутствие двойной связи может очень значительно усиливать легкость раскрытия эпоксидных связей С = О, таким эффектом не обладает гидроксильная группа, даже если она образует водородную связь с эпоксидом. Результаты этого исследования имеют особое значение в связи с их отношением к диолэпоксидам, которым приписывается роль конечных канцерогенов ряда ПАУ.
Вопросами химической структуры активных метаболитов ПАУ и продуктов их взаимодействия с ДНК активно занимались также A. Jeffrey и соавт. (1980). Эти авторы исходили из широко распространенной сейчас концепции, что модификация ДНК химическими канцерогенами является первым и критически важным событием в индукции опухолей. Они рассмотрели различные методы исследования, химию, конформацию и последствия реакций с ДНК на примере БП и 7,12-ДМБА. Как уже упоминалось, метаболическая активация этих углеводородов происходит через дигидродиолэпоксиды «бэй-области». Главной мишенью атаки в субклеточных системах и в клеточных культурах тканей человека и животных, по их данным, является аминогруппа гуанина. Авторы нашли, что 7-метилбенз(а) пирен метаболизируется до 7,8-дигидродиола и что связывание с ДНК происходит, по-видимому, через 7,8-дигидродиол-9,10-эпоксид. Авторы приводят предварительные данные о структуре ДМБА-ДНК-комплекса (аддукта).
Важность такого рода исследований определяется тем, что, несмотря на интенсивное изучение ПАУ, все еще неясно, как эти или другие канцерогены осуществляют инициацию цепи событий, ведущих к раку. Много факторов могут ограничивать способность соединения экспрессировать этот потенциал. К ним относятся экспозиция и поглощение вещества животным, распределение по тканям, обмен до конечных канцерогенов, стабильность конечных канцерогенов по отношению к метаболическому или химическому разрушению до их реакции с ДНК, способность реагировать с ДНК и возможность реакций с конкурирующими нуклеофилами. Затем могут оказаться критическими такие факторы, как способность клетки-мишени к репарации повреждения ДНК способом, исключающим ошибки, или, наоборот, вероятность того, что модифицированная ДНК пострадает в своей матричной активности или индуцирует репарацию, склонную к ошибкам, или другие формы ответа организма хозяина. В терминах вероятности возникновения опухоли важны также и последующая экспозиция хозяина к опухолевым промотерам или другие кофакторы, и состояние пролиферации или дифференциации данных клеток- мишеней.
Эта сложность и многогранность феномена индукции опухолей химическими канцерогенами побудила авторов рассматриваемой работы заключить, что следует считать маловероятной возможность разработки какого-то единственного биохимического или молекулярного критерия для точного предсказания того, будет или
не будет то или иное соединение канцерогенным, или для определения его относительной активности как канцерогена, без рассмотрения других факторов.
Несмотря на такой умеренный пессимизм, A. Jeffrey и соавт. (1980) активно изучали продукты взаимодействия метаболитов ПАУ с ДНК и внесли существенный вклад в их химическую расшифровку. Эти авторы проследили путь, которым бензпирендигидродиолэпоксид и родственные соединения ковалентно связываются с ДНК, и рассмотрели последствия этого взаимодействия.
Продукты связывания метаболитов ПАУ с компонентами ДНК (аддукты). В работах упомянутых авторов обоснована следующая структура главных продуктов, ДНК-аддуктов, образованных в клеточных системах человека и грызунов, экспозированных к БП (формулы XXXVI, XXXVII).
Методом флюоресцентно-спектрального анализа было показано, что модифицированная бенз (а) пиреном ДНК содержится в количестве 1 • 105—106 оснований. Был осуществлен химический синтез конечных канцерогенов из ряда ПАУ, в частности дигидро- диолэпоксиды «бэй-области» БП и бенз (а) антрацена. Однако попытки приготовить дигидродиолэпоксид «бэй-области» 7,12-ДМБА пока были неудачны. Установлено, что один и тот же главный аддукт — продукт взаимодействия с ДНК, бенз (а) пирендигидро- диолэпоксид-дезоксигуанозин, образуется и бронхолегочными сегментами, и толстой кишкой человека, и образцами ткани пищевода при экспозиции с БП. S. Ashurst и G. Cohen (1981) изучали образование в процессе канцерогенеза продуктов взаимодействия ДНК кожи мышей с метаболитами БП. Авторы использовали мышей штамма Swiss, чувствительных к канцерогенезу углеводородом. Они впервые показали, что аппликация in vivo инициирующей дозы (200 нмоль) БП на кожу мышей вызывает образование нескольких, связанных с ДНК, потенциально канцерогенных продуктов, включая 7,8-дигидрокси-9,10-эпокси-7,8,9,10-тетрагид- робенз (а) пирен-дезоксигуанозин (ДГЭТГ) и 7,8-дигидрокси-9,10- эпокси-7,8,9,10-тетрагидробенз (а) пирен-дезоксиаденозин. Тем не менее специфические аддукты, ответственные за инициацию опухолей, остались неидентифицированными.
Было установлено, что у трех штаммов мышей, имеющих широко различающиеся чувствительности к индуцируемому полициклическими углеводородами канцерогенезу кожи, образуются сходные количества ДГЭТГ-БП-дезоксигуанозиновых и ДГЭТГ- дезоксиаденозиновых продуктов, равно как и таковых, возникающих из дальнейших метаболитов 9-гидроксибенз (а) пирена. Отношение этих ДНК-аддуктов к канцерогенезу не установлено.
Вопрос о том, какие именно продукты взаимодействия канцерогенов с ДНК играют наиболее критическую роль в превращении нормальной клетки в опухолевую, имеет, понятно, первостепенное значение как в теоретическом, так и в практическом плане.
дезоксирибозадезоксирибозаXXXVIIXXXVIIдиолэпоксида с дезоксигуанозиномдиолэпоксида с дезоксигуанозиномаддукт бенз(а)пиренд игидр о - диолэпоксида с де зокси адено -аддукт бенз(а)пиренд игидр о - диолэпоксида с де зокси адено -зиномзином
дезоксирибоза
дезоксирибоза
XXXVII
XXXVII
диолэпоксида с дезоксигуанозином
диолэпоксида с дезоксигуанозином
аддукт бенз(а)пиренд игидр о - диолэпоксида с де зокси адено -
аддукт бенз(а)пиренд игидр о - диолэпоксида с де зокси адено -
зином
зином
Структура продуктов связывания (аддуктов) метаболитов бензд- пирена с компопентали нуклеиновых нисмт
Сравнительно легче полному молекулярному анализу поддаются реакции с ДНК таких классических алкилирующих агентов, как метил метансульфонат и этил мета нсульфонат, которые реагируют с ДНК, давая несколько алкилированных оснований. Однако биологически активными в испытании на бактериофаге были только агенты, способные образовывать О6-алкилдезоксигуа- нозиновые «дефекты». Эти повреждения результировались также в ошибочное считывание генетической информации (мискодинг) матриц ДНК in vitro и ошибочное включение оснований в кополи- меры. Органная специфичность таких монофункциональных алкилирующих агентов, как ди метил нитрозамин и диэтил нитрозамин, довольно хорошо коррелирует с относительной персистенцией О6-алкилдезоксигуанозиновых продуктов по сравнению с М-ал- килдезоксигуанозиновыми продуктами в ДНК тканей-мишеней животных.
Этот механизм не столь хорошо понятен для таких широко распространенных загрязнителей окружающей среды, как полициклические ароматические углеводороды. Р. Brookes и R. Newbold (1980) показали хорошую корреляцию канцерогенной силы серии ПАУ с величиной их реакции с ДНК- Из этой группы химических соединений наиболее изучен сильный канцероген БП, который обильно представлен в выхлопных газах автомашин, сигаретном дыме, копченой рыбе. Как указывалось выше, таким диолэпоксидом «бэй-области», как (±)7р,8а-дигидрокси-9а, 10а-эпокси-7,8,- 9,10-тетрагидробенз(а)пирен, приписывается роль конечных канцерогенных и мутагенных метаболитов полициклических углеводородов.
Причина, почему эти диолэпоксиды инициируют образование опухолей, далеко не ясна, однако много усилий предпринимается для понимания механизма взаимодействия этих реактивных метаболитов с нуклеиновыми кислотами, особенно ДНК тканей животных, чувствительных к канцерогенному действию этих химических агентов.
Введение БП животным in vivo или в культуры клеток приводит к образованию ковалентно связанных продуктов, главный из которых возникает в реакции 7,8-дигидро-9,10-эпокси-7,8,9,10-тетра- гидробенз(а)пирена с экзоциклической аминогруппой дезоксигуанозина. Было показано, что образование этого аддукта коррелирует с мутагенезом в клетках млекопитающих [Newbold R. et al., 1977] и канцерогенезом в коже мыши [Cohen G. et al., 1979].
Phillips и P. Sims (1978) показали, что существует отчетливая корреляция между канцерогенностью различных ПАУ в коже мышей и степенью образования их соответствующих связанных с ДНК аддуктов в этой ткани. Однако они не нашли различий в качественной или количественной природе аддуктов, 7,12-диме- тилбенз(а) антрацен-ДНК или 7,8-дигидрокси-9,10-эпокси-7,8,9,- 10-тетрагидробенз(а)пирен-дезоксигуанозин-ДНК, образованных в коже мышей, чувствительных или относительно резистентных к канцерогенезу кожи, индуцируемому углеводородами. Поэтому образование этих продуктов само по себе не объясняет хорошо известных различий чувствительности этих мышей по отношению к образованию опухолей кожи под воздействием полициклических углеводородов.
Одна из возможностей объяснить эти факты состоит в допущении, что образуются другие, количественно менее представленные бенз (а) пирен-ДНК-аддукты, которые обладают биологическим действием, но не улавливаются традиционными хроматографическими методами.
В соответствующих условиях in vitro многие из производных бенз(а)пирена могут быть метаболически активированы и дать начало связанным с ДНК продуктам. Однако in vivo, вследствие природы аддуктов и канцерогенности и мутагенности диол эпоксидов «бэй-области», главное внимание при изучении канцерогенности бенз (а) пирена фокусировалось на аддуктах, возникших из 7,8-дигидрокси-9,10-эпокси-7,8,9,!0-тетрагидробенз (а) пирена.
Введение жидкостной хроматографии под высоким давлением для анализа углеводород-дезоксирибонуклеозидных аддуктов весьма способствовало разделению различных связанных с ДНК продуктов полициклических углеводородов. Хотя экзоциклическая аминогруппа дезоксигуанозина является главной мишенью 7,8-дигидрокси-9,10-эпокси-7,8,9,10-тетрагидробенз (а) пирена в ДНК, несколько других количественно меньших продуктов наблюдались in vitro, возникающих в результате атаки №-познц,нн дезоксигуанозина, N4-no3HUHH дезоксицитина, фосфатов ДНК и реакции с дезоксигуанозином. Последний продукт был далее охарактеризован как 7,8-дигидрокси-9,10-эпокси-7,8,9,10-тетра- гидробенз(а) пирен, связанный с экзоциклической аминогруппой дезоксиаденозина. J. Di Giovanny и соавт. (1979) показали, что для серии полициклических углеводородов опосредуемое эпидермальными гомогенатами связывание последних с полиаденозином, но не с полигуанозином, коррелирует с канцерогенной силой
углеводородов на коже мышей. Образование in vitro 6енз(а)- пирен-дезоксиаденозиновых продуктов наблюдали в ДНК эмбриональных клеток хомяка и трахеальных трансплантатах крыс, обработанных в культуре бенз(а)пиреном.
Ashurst и G. Cohen (1981) исследовали причины сравнительной резистентности кожи крыс (Wistar) к канцерогенезу, индуцированному БП, прослеживая образование БП-дезоксирибо- нуклеозидных продуктов в ткани кожи после топического нанесения БП (200 нмоль). Авторы предполагают, что относительная резистентность кожи крыс (по сравнению с кожей мышей) к канцерогенезу БП может быть обусловлена частично более низкой степенью связывания БП с ДНК и меньшим процентом растворимых в метаноле углеводород-дезоксирибонуклеозидных аддуктов и аддуктов, образованных из предполагаемого конечного канцерогена БП, 7,8-дигидрокси-9,10-эпокси-7,8,9,10-тетрагидробенз (а)- пирена.
Метаболические превращения бенз(а)пирена. Получены экспериментальные указания на существование организованного комплекса мембраносвязанных белков в микросомах, который способствует образованию конечного канцерогена БП, 7,8-дигид- родиол-9,10-эпоксида БП. Последний определялся по образованию тетрола. Установлено, что метаболическая трансформация БП ведет к образованию разнообразных продуктов, в том числе фенолов, дигидродиолов, эпоксидов, хинонов и более полярных соединений, что можно наблюдать при инкубации микросом печени с БП, НАДФ и кислородом. Отношение образованных продуктов варьирует в зависимости от источника энзиматической системы (различных видов животных, пола, органов), диеты животных, загрязнителей среды, различных биологических агентов, способных стимулировать синтез разнообразных гемопротеидов, цитохрома Р-450.
Катализатором для активации кислорода, требуемого для образования многих продуктов обмена бенз(а)пирена, является семейство мембраносвязанных гемопротеидов, называемых цитохромом Р-450.
Этот гемопротеид функционирует вместе с флавопротеином, названным НАДФН-цитохром P-450-редуктазой, образуя элек- тронтранспортную систему, локализованную обычно в эндоплазматическом ретикулуме.
一[1нтсхрсм Р-450 зе г：)ль к с Liy/HT п ккиегтве монооксигеназы в присутствии кислорода н НАЦФН「но он может такжг 巾ункинс- ffHpO亜ть как пероксидаза в присутствии органических гндропере： Тисе/ или перекиси водорода.
Как полагают, окисление бенз (а) пирена до реактивных диол- эпоксидов происходит в цепи реакций, включающих начальное Окисление канцерогена до 7,8-эпоксида, который затем гидратируется ферментом эпоксидгидразой с образованием 7,8-дигидродиола [Deutsch J. et al., 1980]:
7,8-эпоксид
7,8-дигидродиол может окисляться далее, давая 7,8-дигидродиол- 9,10-эпоксид, который реагирует ковалентно с нуклеиновыми кислотами и белками, начиная таким образом каскад событий, резуль- тирующихся в модификацию ряда клеточных характеристик [Capdevila J. et al., 1980]. Последовательность реакций в процессе образования 7,8-дигидродиол-9,10-эпоксида в энзиматической системе микросом следующая. Молекула БП связывается с активным центром цитохрома Р-450 (или Р-448), где происходит начальная
да
7 в 3
БП(+ + +)
4
7 в
хризен (+)
,S
ЖЖ
1314
6
11| ю1
9
2
в в
7
трифенилен(-)
2
бенз(е)пирен(-)
дибенз( a,九)антрацен R+)
7
дм6енз(а,с)-ннтрацен(+)
it
2
сн3
11 id \
3
4
з
б
876
98
пицен(-)
бенэ(а) антрацен (+)
бенз( с) фенантрен (+)
3-метилхолантрен (+ + + +)
СН3
7,12-диметилбенз- (а) - антрацен ( ++++)
13
.3
9876
бенз(а)нафтацен(-)
Стрелками указана локализация „б«Й - овластм4*(области N эалмваГ). в смобкахтримермая отноемтелькая кжндерогеннак активность
Структура некоторых полициклических ароматических углеводородов и их относительная канцерогенная античность
реакция взаимодействия с кислородом. Образующийся эпоксид может мигрировать из этого центра в поисках молекулы белка, эпоксидгидратазы, для превращения в 7,8-дигидродиол. Молекула последнего должна затем встретиться с незанятой молекулой цитохрома Р-450 (Р-448) для последующего окисления в 7,8-Дигидро- диол-9,10-эпоксид. Все эти сложные реакции координированы во времени и пространстве благодаря организации системы мембраносвязанных ферментов.
Значение «бэй-области» ПАУ в проявлении их канцерогенной активности. ПАУ — наиболее распространенные загрязнители окружающей среды и, в соответствии с имеющимися эпидемиологическими и экспериментальными данными, могут быть ответственны за индукцию рака у человека. Биохимические свойства ПАУ, такие как мутагенность, канцерогенность и ковалентное связывание с клеточными макромолекулами, предполагает их метаболическую активацию содержащими цитохром Р-450 энзиматическими систе-
мамн, метаболизирующими токсические и лекарственные вещества. Обмен ПАУ интенсивно изучался в течение последних трех десятков лет, и прогресс в понимании путей их активации обязан в большой степени обнаружению 7,8-диол-9,10-эпоксидов бенз (а) пирена в качестве главного канцерогенного и мутагенного метаболита. Эти находки и осуществление молекулярно-орбитальных расчетов привели к разработке теории «бэй-области> D. Jerina и соавт. (1976). Диолэпоксиды «бзй-области» некоторых незамещенных ПАУ, таких как хризен, бенз (а) антрацен, дибенз (а) антрацен и бенз (а) фенантрацен, были также расценены как главные канцерогенные и мутагенные метаболиты. Метилзамещенные ПАУ, такие как 5-метилхолантрен, 7-метилбензантрацен, 7,12-диметил- бенз (а)антрацен и 3-метилхолантрен, являются также, по-види- мому, метаболически активированными по «бэй-области>. Однако есть указание на то, что не все ПАУ, содержащие «бэй-области», являются канцерогенными соединениями [Yang S. et al., 1980].
Это объясняется, возможно, тем, что из этих неканцерогенных, но содержащих «бэй-область> ПАУ в условиях in vivo не образуются диолэпоксиды, локализованные в зоне «бэй-области».
Таким образом, вопрос о роли «бэй-области» ПАУ в молекулярных механизмах химического канцерогенеза требует дальнейшей теоретической и экспериментальной разработки.
ДНК и РНК при химическом канцерогенезе. Нуклеофильность ДНК. Общим принципом взаимодействия ДНК и химических канцерогенных веществ является реакция нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеофильные центры, с электрофильными активированными химическими канцерогенами.
Электрофилы для этого должны находиться в виде положительных ионов или незаряженных молекул с реактивными центрами при их электрондефицитных атомах [Miller Е., 1978]. Сказанное
N-гидрокси -1 - НААфлатоксин Bt
Проксимальные оли конечные метаболи ческие электрофиль-ные форумы канцерогенов
справедливо как для канцерогенов, активных per sd (ряд простых алкилирующих агентов), так и тех, которые требуют метаболической активации (ароматические углеводороды, ароматические амины, афлатоксин В| и др.).
Среди известных мишеней зтмх веществ, предположительно важных для их физиологической активности, находятся нуклеиновые кислоты, в которых атакуемыми нуклеофильными центрами являются, прежде всего, богатые электронами атомы пуриновых и пиримидиновых оснований (обычно их неспаренная пара электронов), несущие гетероатомы азотов и кислородов (в некоторых случаях и углеродов) и отрицательно заряженные фосфаты.
Эта ситуация привлекает внимание к проблеме нуклеофильности нуклеиновых кислот и их составляющих, и вследствие очевидной электронной комплементарности взаимодействующих единиц можно предположить важную, хотя, может быть, и не исключительную роль электростатических факторов в этом сродстве [Pullman В., Pullman А., 1980].
/С%/С%Фундаментальное значение электростатического фактора действительно важно, особенно для ранних стадий взаимодействия, где он определяет специфику и характерные черты реакции канцерогенов с нуклеиновыми кислотами и их составными частями, в частности, в обусловленности следующего правежа: сродство электрофильных канцерогенов в отношении субстратов возрастает "как функци^Г слоЖИости последних. Так, МННГ
/С%
/С%
O=N—N
NH
не реагирует с гуанозином, но метилирует гуаниновые остатки при N-7 и N-3 в поли ((Г), поли (ГЦ) и в ДНК. Аналогично N-метил- N-нитрозомочевина (НММ)
/СН3
О—N—№ I? О
и диметилсульфат (СНз)г5О4 метилируют N-3-позицию гуанина в полимерах, но не осуществляют эту реакцию на уровне нуклеозидов.
Арил аминирование и арилирование О6-гуанина канцерогеном N-гидрокси-1 -нафтиламином больше в ДНК, чем в поли(Г) или в денатурированной ДНК, и не происходят с нуклеозидами или нуклеотидами.
Приведем еще пример.
Реакция канцерогена N-гидpoкcи-N-2-aминoфлюopeнa, происходящая, главным образом, гун С-8 гуанинового кольца： лучше протекает с нативной, чем с денатурированной ДНК.
M. Osborne (1976) и другие авторы установили, что главным местом реакции диолэпоксидов БП с ДНК является 2-аминогруппа гуанина, хотя в небольшой степени реакция имеет место также L■—в других местах как гуаниновых, так и адениновых молекул.
Эти сведения, однако, не дают возможности полностью понять молекулярный механизм канцерогенеза полициклическими углеводородами. Так, например, ясно, что не все производные углеводородов, реагирующие с 2-аминогруппой гуанина, в равной степени канцерогенны: 7-бромметилбенз(а) пирен и эпоксиды К-области молекул. Далее, даже с диолэпоксидом БП были отмечены значительные различия в канцерогенной активности для анти- и син- изомеров (формулы XXXVIII и XXXIX соответственно) вопреки факту, что они сходно реагируют с ДНК.
Исследование рибополинуклеотидов, содержащих небольшое число различных модифицированных нуклеотидов, на адекватность в транскрипции при использовании ДНК-зависимой РНК- полимеразы в присутствии Мп2+ показало, что если блокировано нормальное образование водородных связей путем замещения, то возникает полная надежность в транскрипции.
Согласно классической концепции Уотсона ——Крика, недопустимы изменения в определенных позициях, необходимых для образования водородных связей. Так, А (аденин) и У (урацил) или Т (тимин) имеют две водородные связи, причем N-6 аденина отдает протон урацилу (Т) и N-3 урацила (Т) отдает протон N-1 аденина. Любые нарушения этого связывания должны неизбежно вести к менее чем двум требующимся водородным связям. Сходно с этим гуанин (Г) и цитозин (Ц) спариваются предписанным образом. Если позиции модифицируются в местах иных, I чем места образования водородных связей, например пон галоге- ・ ннзнрораннн пятых позсинй пиримидинов, то происходит сбрачп- ▼в2нне .Тар. с_.Н0Рмально К01^дд2мен1^рнь【мн основаниями, ‘"mi имеются уловимые (регистрируемые) изменения в температурной "ста бю1ьно?ПЕ
ЙСГТТедивания В. Singer (1968) по выяснению влияния небольшого числа модифицированных оснований в полинуклеотиде на транскрипцию имеют более общее значение, в частности, в решении вопроса о том, что представляет собой мутагенная модификация.
В результате работы автор заключил, что сбои в транскрипции могут происходить, если не будет образовываться соответствующее число водородных связей между нуклеотидами в полинуклеотидах или в результате стерических препятствий или благодаря
Эффект модифицированных нуклеозидов на транскрипцию; производные, демонстрирующие полную неадеква тность
Модифицированный нуклеозид
Симулируют присутствие *
А
Г
У
ц
3- Мети л нити ди н **
+ +
+ +
+ +
+
3-Метил уридин
+ +
±
+
+
1 -Метиладенозин
+ +
+
+ +
+
О4-Метилуриди н
±
±
+
+
№-Метилгуанозин
+
+
+ +
±
N4-T идроксицитидин
+
+ +
+ +
±
* Частота оижбочного включения варьировала от 50 до 100 %. З-Этил Ц включает А, У и Ц при транскрипции. Данные получены анализом ближайшего соседства.
** З-Этил Ц включает А, У и Ц при транскрипции.
Примечание. Кополимеры содержали 3—16 % модифицированных нуклеозидов
экранированию, равно как и замещению мест образования водородных связей.
Эффект заместителей, блокирующих N-I пуринов и N-3 пиримидинов. Это две позиции водородных связей, которые рассматриваются как существенные для спаривания оснований. В данном случае любой заместитель N-3-уридина, N 3-цитидина или N- 1-цитозина, влияющий на образование водородных связей по Уотсону—Крику, алкилируя позиции N-1 пуринов или N-3 пиримидинов, должны были бы блокировать транскрипцию. Однако этого не происходит.出 действительности полимераза продолжает 丁产“… крипцию С беспорядочным включением uvb ii^MTHд.ш R транскрипт (табл. 5).
Эта тотальная неадекватность напоминает неточность транскрипции, наблюдавшуюся в случае, когда частично денатурированные альтернативные дезокси пол и нуклеотиды транскрибировались при использовании естественных условий для транскрипции ДНК- Анализ частоты ближайшего соседства показал, что включение в транскрипцию ошибочных нуклеотидов действительно имеет место и что это не является артефактом по вине полимеразы.
Эффект метилирования О4- уридина. О4-Ме- тилуридин в полинуклеотидах также действует в транскрипции неадекватно, однако в этом случае возможно образование неустойчивой пары Г -О4-ал кил. Все другие наблюдавшиеся ошибочные включения (см. табл. 5) должны происходить с образованием не более одной водородной связи. Наибольшее искажение ——это образование О'-алкнл У. У.
Эффект алкилирования О6-г уанозина. В последние годы уделялось много внимания образованию и репарации О6-метилгуанозина и О6- эти лгу а нози на in vivo, так как образова-
Эффект модифицированных нуклеозидов на транскрипцию в случае модификации экзоциклических аминогрупп
Модифицированный нуклеозид
Симулируют присутствие
А
Г
У
Ц
N4-Meтилцитидин
±
±
±
+ +
N4-Ацет ил цитидин
—
—
—
+ + + +
N4-Гидроксицитидин
+
+ +
+ +
±
N4-MeTOKCH цитиди н
——
—
+ + + +
—
№-Метил гуанозин
+
+
+ +
±
^-Метиладенозин
+ + + +
—
—
—
^-Гидроксиметиладенозин
+ + + +
—
—
—
№-Изопентиладенозин
+ + + +
—
—
—
ние О6-ал кил гуанозина, по-видимому, коррелирует с канцерогенностью алкилирующих агентов. L. Gerchman и D. Ludlum (1973) показали, что полинуклеотидах О6-метилгуанозин может транскрибироваться, но с ошибками ——с неверным включением (миско- динг) А и У. Данных об искажениях транскрипции с О6-эти л гуанозином пока не получено.
Эффект алкилирования О2-уридина. О2-Ури- дина обычно не требуется для образования водородных связей с аденозином. Однако, если он замещен, N-3 не может быть более донором водородной связи. О8-Этилуридин в полинуклеотидах вызывает ошибочное включение гуанозина. Это отличается от тотальной неадекватности, находимой в случае, если транскрибируются полимеры, содержащие О4-метилуридин. Однако О4-метил- уридин обладает способностью образовывать две водородные связи как с Г, так и с А и направлять последние в транскрипт предпочтительно, тогда как О2-алкилуридин может образовывать лишь единичную водородную связь.
О2-Этилтимидин, подобно О6-этилдезоксигуанозину, является главным продуктом реакции ДНК in vivo с этил нитрозомочевиной (ЭНМ) [Singer В. et al., 1978]. Это производное обладает мутагенным действием в отношении транскрипции, и его неверное спаривание (миспаринг) может быть дополнительным фактором в наблюдавшейся высокой ка нцерогенности этил нитрозомочевины.
Эффект замещения экзоциклических аминогрупп. Была изучена транскрипция полимеров, содержащих заместители при N4 цитидина, N2 гуанозина и N6 аденозина. Было установлено, что замещение при N4 в цитидине группами ОН' или ОСНз ведет к полной неадекватности в транскрипции (табл. 6).
N4-Гидpoкcицитидин характеризовался тем, что он действовал не только как У и Ц, но также, хотя и в меньшей степени, симулировал Г и А. Другой результат был получен с К4-метилцитидином. В этом случае наблюдалось нормальное спаривание модифицированного нуклеозида, однако иногда оно было ошибочным.
Что касается модифицированного цитидина, К4-ацетилцити- дина, то в соответствии с известными данными о неспособности ацетильной группы экранировать спаривание оснований по Уотсону—Крику, поли (Ц, 70 % N4-a цетил цитозина) направлял в транскрипцию только ГМФ.
\2-Метилгуанозин направлял в транскрипцию все 4 нуклеотида с предпочтением к АМФ (см. табл. 5).
№-Замеш_еннь1е аденозины резко контрастировали с №-заме- щенными цитидинами или №-замещенным гуанозином. Метильные, гидроксиэтильные и изопентильные заместители не вызывали какого-либо искаженного спаривания.
Таким образом, действительно, адекватность транскрипции при модификации оснований зависит от образования или невозможности образования соответствующего числа водородных связей —— в силу ли стерических помех, экранирования, или замещения мест водоородных связей.
В более широком плане этот структурный и стереохимический феномен проецируется в мутагенез и, возможно, канцерогенез.
КАНЦЕРОГЕННОСТЬ И МУТАГЕННОСТЬВ СВЯЗИ С МОДИФИКАЦИЕЙ ДНКХИМИЧЕСКИМИ КАНЦЕРОГЕНАМИ
В литературе высказывались интересные мысли о молекулярнохимическом механизме возникновения мутаций, обусловленных структурной модификацией ДНК, в свою очередь, индуцированной химическими канцерогенными агентами. Т. Kakefuda и соавт. (1980) изучали структурную модификацию и ее влияние на генетические функции ДНК, вызванные метаболитом БП, диолэпоксидом этого канцерогена. Ковалентное связывание с ДНК менее чем 0,2 % метаболита заметно не меняло плотности циркулярной ДНК, судя по подвижности модифицированной ДНК в гелевом электрофорезе. Было установлено, что диолэпоксид бенз (а) пирена ковалентно связан со 2-й аминогруппой гуанинового остатка, ориентированного диагонально, примерно на 30° к оси спирали, и не обязательно генерирует сильный эффект скручивания. Увеличенное количество ковалентного связывания, однако, способно вызвать кумулятивное изменение микроокружения в малой борозде спирали ДНК, которое может облегчать другие формы взаимодействия с диолэпоксидом бенз (а) пирена, так же как и связывание с адениновыми остатками. Усечение цепей и спонтанная элиминация продуктов присоединения (аддуктов) происходили только при изменении угла вращения ДНК. Эти находки привели авторов к мысли о многофазном, синергетическом механизме модификации, вызываемой взаимодействием диолэпоксида с различными структурными компонентами ДНК. Было найдено, что метаболит БП с гидроксилированием в позиции 7,8 способен интеркалировать в ДНК. Однако интеркаляция диолэпоксида БП, ковалентно связанного
с гуаниновым остатком, была признана по ряду причин маловероятной. Единственная молекула диолэпоксида, ковалентно связанная с ДНК плазмиды pBR-322, оказалась достаточной для блокирования элонгации полинуклеотидной цепи в ходе репликации in vitro. Новый метод авторов использования опосредуемой плазмидой мутации в Escherichia coli позволил им анализировать эффект небольшого числа диолэпоксидов БП, ковалентно связанных с ДНК, на мутации, без токсического действия на клетки хозяина. Разработанный метод позволяет использовать большие количества мутировавшей ДНК, клонированной из трансформированных клеток, для анализа механизма мутаций, вызванных химическими канцерогенами, на уровне единичных молекул.
БП представляет собой главное загрязнение окружающей среды, образуемое в качестве продукта гидролиза горючих материалов, курения сигарет, побочных отходов промышленности. Он стабильно остается в атмосфере, почве, воде, компонентах пищи на всех этапах от сырья и полуфабрикатов до готовых изделий. Статистические исследования указывают на этот ПАУ как главную причину увеличения заболеваний раком легких.
БП превращается в ряд метаболитов благодаря активности системы микросомальных ферментов, полифункциональных оксидаз, содержащих цитохром Р-450 и эпоксидгидратазу. Среди большого разнообразия продуктов обмена БП, образуемых энзиматически, те из них, которые эпоксидированы в положении 2,3; 4,5; 7,8; 9,10, привлекли особое внимание ввиду их сильной химической реактивности с биологическими макромолекулами.
(± ) г-7Д-8-Дигидрокси4-9,10-окси-7,8,9,10-тетрагндробенз(а)- пирен (ДЭБП) является метаболитом БП, который образуется энзиматически и стереоспецифично путем окисления транс-г-7, {-8-дигидрокси-7,8-дигидробенз (а) пирена в положениях 9,10. Было показано, что 7,8-дигидрокси-9,10-окси-7,8,9,10-тетрагидро- бенз (а) пирен является сильным мутагеном и в то же время, как считают, представляет собой конечную канцерогенную форму БП [Huberman Е. et al., 1976; Nagao М. et al., 1978].
Получение синтетических изомеров диолэпоксидов позволило исследовать взаимодействие изомерного ДЭБП с ДНК как in vitro, так и in vivo. Основное ковалентное связывание происходит между углеродом в 10-м положении ДЭБП и 2-аминогруппой гуанозиновых остатков. Было идентифицировано связывание также с N-7 позицией гуанозина, с аденозином в положении N-6 и с фосфатными группами ДНК. Следующие феномены были ассоциированы с ковалентным связыванием ДЭБП: разрыв нитей, уменьшение плотностей сверхскрученной циркулярной ДНК, локальная денатурация и ковалентное связывание ДЭБП с интеркаляцией или без нее. Пока не совсем ясна взаимосвязь между этими различными типами структурной модификации и их эффектом на генетические функции ДНК. Молекулярные механизмы, участвующие в возникновении мутаций и канцерогенезе, не вполне понятны.
Установление корреляции между степенью ковалентного связывания полициклических углеводородов с ДНК кожи мыши и их канцерогенным потенциалом привело к гипотезе о том, что такие реакции являются важной ступенью в индукции опухолей. В последующие годы эта концепция стала находить признание и распространяться на другие классы химических канцерогенов.
Основываясь на гипотезе о роли ковалентной реакции ДНК в канцерогенезе, Р. Brookes и R. Newbold (1980) исследовали корреляцию между мутациями клеток млекопитающих и канцерогенностью веществ. Экспериментальной системой служила индукция резистентных к 8-азогуанину мутаций в HPRT-локусе V79 клеток китайского хомяка. Была испытана на мутагенность серия эпоксидов—метаболитов углеводородов, которые, как полагают, реагируют ковалентно с ДНК и могли бы быть мутагенными. Действительно, оказалось, что все испытанные эпоксиды являются мутагенными. Однако были обнаружены значительные различия в их мутагенной эффективности, т. е. мутагенности, отнесенной к дозе препарата (частота мутаций в расчете на 105 клеток, мкг, мл) (табл. 7), которые могут быть понятны в терминах стабильности возникших ионов карбония [Newbold R., 1979]. При этом выяснилось, что те соединения, которые имели низкие значения мутагенной эффективности (соединения XLII—XLVII, см. табл. 7), были или неканцерогенны, или слабоканцерогенны. Из этого следует, что сильные канцерогены должны быть эффективными мутагенами. Однако данные таблицы 7 для соединений XXXVIII—XLI показывают, что мутагенная эффективность не может служить достаточным критерием канцерогенности, так как анти-бензпирен-диолэпоксид (± ), имеющий низкую мутагенную активность, является более сильным канцерогеном, чем соединения XXXVIII—XLI, показавшие себя также очень эффективными мутагенами.
「Значительно синая корреляция мутагенности с канцерогенной активностью вняв/яется, если рассчитывается лрутойкоэффи- “ПиенТ"""3巾也'ктнвностн：- мутаг'ииссть, стнегрннаа_к пережнвае- 迎остн「？тот показатель точнее отражает молекулярный механизм мутационного события. Если принять, что как мутация, так и цитотоксичность являются результатом повреждения ДНК (что бывает очень часто, но не всегда), то понятие мутагенной эффективности становится особенно удобным и значимым. Еще более ценным могло бы быть понятие абсолютной мутагенной эффективности, однако для определения ее необходимо вести расчет мутаций на единицу реакционных актов ДНК, что может быть измерено лишь с применением таких методов, как радиоизотопная техника, информация о чем пока далеко не всегда имеется.
Сейчас очевидно, что только анти-БП-эпоксид и его предшественник БП-7,8-дигидродиол (при испытании в клеточной системе) отклоняются по характеру своего ответа от всех других испытанных соединений; соединения XXXIX—XL1 соответствуют соедине-
Мутагенная эффективность серии дериватов углеводородов{Brookes Р., Newbold R., 1980]
Соединения
Доза,мкг/мл
% переживания
Мутаген-ная эф-фектив-ность
XLIII
0.1
96
1050
0,2
92
920
0,3
63
1290
0,1
93
270
0,5
53
180
0,75
20
260
0,1
86
260
0,15
68
270
0,05
28
1500
0.1
30
1730
0,5
88
30
1.0
75
30
2,0
40
40
0,5
83
54
1.0
71
88
2,0
14
72
нию XLII в отношении слабой канцерогенности. Более того, эта разница сохраняется и при определении абсолютной мутагенной эффективности, измеренной с применением производных углеводородов, меченных тритием.
Гипотеза «бэй-области» в объяснении активации углеводородов основана, главным образом, на данных, полученных с БП, хотя весьма вероятно, что сходный механизм активации имеет место и в случае 3-метилхолантрена [King Н. et al., 1977, 1978; Thakker D. et al., 1978], 7-метилбенз(а)антрацена, 7,12-ДМБА [Dippie A., Nebzydoski J., 1978] и бенз (a, h) антрацена [Wood W. et al., 1978].
Поскольку еще несколько лет тому назад меченные тритием диолэпоксиды углеводородов, кроме БП, не производились, С. Wigley и соавт. (1979) испытали абсолютную мутагенную эффективность серии родительских углеводородов в клеточной мутационной системе. Продуктом углеводородов в этой клеточной системе являются диолэпоксидные производные «бэй-области». Это исследование показало, что нет значительных различий в мутагенной эффективности между испытанными углеводородами или БП и его конечным канцерогенным метаболитом — анти-бенз (a)-
Таблица 8
Абсолютная мутагенная эффективность углеводородов и их производных [Brookes Р., Newbold R., 1980]
Характеристика взаимодействий
Антидиол- зпок・ сид
Син- диол- эпоксид
7Вг- метил- БА
БП
7-метил- БА
ЗМХ
ДМБА
БА
Величина реакции углеводород-ДН К. мкмоль/ моль фосфора
13
11
15
15
6,5
10,5
9
0
Индуцированная мутация (8・аза-「『)， частота на 105 выживших клеток
360
90
90
227
73
169
208
1.2
Абсол ютна я м ута ген - ная эффективность, т. е. индуцированные мутации, мкмоль/моль фосфата реакции с ДНК
28
8
6
15
11
16
23
0
Примечание. БА-бенз(а)антрацен; ЗМХ — 3-Метилхолантреи.
пирендиол эпоксидом, хотя значение для син-изомера было значительно ниже (табл. 8).
Вариации в канцерогенной активности различных углеводородов находили отражение, как ранее и предполагалось, в величине индекса связывания для каждого соединения, т. е. величине реакции ДНК, которая выражалась на единицу метаболизированного углеводорода.
Различия в мутагенной эффективности син- и анти-бенз(а)- пирендиолэпоксидов (см. табл. 7 и 8) обусловлены разным выходом образующегося промутагенного О6-метилгуанина. В свете этих данных можно предположить, что анти-бенз(а) пирендиолэпоксид может индуцировать промутагенное повреждение в ДНК, чего не делает син-изомер. Действительно, ранее сообщалось, что только анти-изомер дает \7-гуанин-производное в реакции с ДНК in vitro [King Н. et al., 1973; Osborne M. ct al., 1979]. Однако авторам не удалось идентифицировать этот продукт в реакции бенз (а) пирена или его диолэпоксида in vivo, и остается неясным, почему N'-гуаннн-реакиня, которая ведет к депуринизации, должна вызывать эффективное промутагенное повреждение.
Сопоставление хорошо изученного тотального алкилирования ДНК клеток и, в частности, в позиции Оь-гуанина ДНК при обработке метилнитрозомочевиной с действием на ДНК анти-диол- эпоксида и других углеводородов позволяет предположить, что и в последнем случае повреждения ДНК анти-диолэпоксидом осуществляются сходным механизмом метилирования О6-гуанина ДНК, как и при действии метил нитрозомочевины, что в обоих случаях индуцирует мутации.
Вышеприведенные данные по механизму канцерогенеза подкрепляются исследованием J. Frei и соавт. (1978), которые обнаружили количественную связь между величиной алкилирования
О6-ДНК тимуса и костного мозга и выходом тимусных лимфом у мышей после единичной инъекции метилнитрозомочевины или этилнитрозомочевины.О корреляции между канцерогенностью, мутагенностью у бактерий и использовании тестов на эту корреляцию в качестве прескрининга для химических агентов окружающей среды написано много. В случае углеводородов такие тесты пока мало ценны вследствие их неадекватной метаболической активации в используемых препаратах микросом печени крысы. Поскольку, однако, опосредуемая клетками мутационная система R. Newbold и соавт. (1977) не стра： дает этим недостатком, оказалось возможным тестиро； вать 12 вероятных монометил бенз (а) антраценов [Brookes Р. et al., 1980].Указанная группа соединений особенно удобна тем.О6-ДНК тимуса и костного мозга и выходом тимусных лимфом у мышей после единичной инъекции метилнитрозомочевины или этилнитрозомочевины.О корреляции между канцерогенностью, мутагенностью у бактерий и использовании тестов на эту корреляцию в качестве прескрининга для химических агентов окружающей среды написано много. В случае углеводородов такие тесты пока мало ценны вследствие их неадекватной метаболической активации в используемых препаратах микросом печени крысы. Поскольку, однако, опосредуемая клетками мутационная система R. Newbold и соавт. (1977) не стра： дает этим недостатком, оказалось возможным тестиро； вать 12 вероятных монометил бенз (а) антраценов [Brookes Р. et al., 1980].Указанная группа соединений особенно удобна тем.Корреляция между канц ерогенностьюи мутаген ность юмонометилбенз ( а )антраценов[Brookes Р. et al.t 1980]Корреляция между канц ерогенностьюи мутаген ность юмонометилбенз ( а )антраценов[Brookes Р. et al.t 1980]СоединениеСоединениеКанцероген-ностьКанцероген-ностьМутагенностьМутагенностьНезамещенный 1-Метил 2-Метил 3~Метнл 4-Метил 5-Метил 6-Метил 7-Метил 8-Метил 9-Метил 10-Метил11 -Метил12-МетилНезамещенный 1-Метил 2-Метил 3~Метнл 4-Метил 5-Метил 6-Метил 7-Метил 8-Метил 9-Метил 10-Метил11 -Метил12-Метил000000+ ++ + ++ +000+ + ( + )000000+ ++ + ++ +000+ + ( + )、00 10 о о9407 00 о12、00 10 о о9407 00 о12Примечание Частота индуцированных мутаций на 10s выживающих клеток после обработки I мкг/мл в течение 48 q в опосредуемой клетками мутационной системе.что все 12 углеводородов былиПримечание Частота индуцированных мутаций на 10s выживающих клеток после обработки I мкг/мл в течение 48 q в опосредуемой клетками мутационной системе.что все 12 углеводородов были
О6-ДНК тимуса и костного мозга и выходом тимусных лимфом у мышей после единичной инъекции метилнитрозомочевины или этилнитрозомочевины.
О корреляции между канцерогенностью, мутагенностью у бактерий и использовании тестов на эту корреляцию в качестве прескрининга для химических агентов окружающей среды написано много. В случае углеводородов такие тесты пока мало ценны вследствие их неадекватной метаболической активации в используемых препаратах микросом печени крысы. Поскольку, однако, опосредуемая клетками мутационная система R. Newbold и соавт. (1977) не стра： дает этим недостатком, оказалось возможным тестиро； вать 12 вероятных монометил бенз (а) антраценов [Brookes Р. et al., 1980].
Указанная группа соединений особенно удобна тем.
О6-ДНК тимуса и костного мозга и выходом тимусных лимфом у мышей после единичной инъекции метилнитрозомочевины или этилнитрозомочевины.
О корреляции между канцерогенностью, мутагенностью у бактерий и использовании тестов на эту корреляцию в качестве прескрининга для химических агентов окружающей среды написано много. В случае углеводородов такие тесты пока мало ценны вследствие их неадекватной метаболической активации в используемых препаратах микросом печени крысы. Поскольку, однако, опосредуемая клетками мутационная система R. Newbold и соавт. (1977) не стра： дает этим недостатком, оказалось возможным тестиро； вать 12 вероятных монометил бенз (а) антраценов [Brookes Р. et al., 1980].
Указанная группа соединений особенно удобна тем.
Корреляция между канц ерогенностьюи мутаген ность юмонометилбенз ( а )антраценов[Brookes Р. et al.t 1980]
Корреляция между канц ерогенностьюи мутаген ность юмонометилбенз ( а )антраценов[Brookes Р. et al.t 1980]
Соединение
Соединение
Канцероген-ность
Канцероген-ность
Мутагенность
Мутагенность
Незамещенный 1-Метил 2-Метил 3~Метнл 4-Метил 5-Метил 6-Метил 7-Метил 8-Метил 9-Метил 10-Метил
11 -Метил
12-Метил
Незамещенный 1-Метил 2-Метил 3~Метнл 4-Метил 5-Метил 6-Метил 7-Метил 8-Метил 9-Метил 10-Метил
11 -Метил
12-Метил
0
0
0
0
0
0
+ +
+ + +
+ +
0
0
0
+ + ( + )
0
0
0
0
0
0
+ +
+ + +
+ +
0
0
0
+ + ( + )
、0
0 1
0 о о
9
40
7 0
0 о
12
、0
0 1
0 о о
9
40
7 0
0 о
12
Примечание Частота индуцированных мутаций на 10s выживающих клеток после обработки I мкг/мл в течение 48 q в опосредуемой клетками мутационной системе.
что все 12 углеводородов были
Примечание Частота индуцированных мутаций на 10s выживающих клеток после обработки I мкг/мл в течение 48 q в опосредуемой клетками мутационной системе.
что все 12 углеводородов были
исследованы не одним, а рядом авторов, а также тем, что серия содержит неактивные, слабоактивные и сильные канцерогены. Из табл. 9 видно, что мутагенная активность в клетках V79 с опосредуемой клетками активацией хорошо соответствует канцероген
ному потенциалу.
Дальнейшее доказательство значимости V79-HPRT локуса исследовано в работе A. Wood и соавт. (1977), которые сравнили мутагенность ( + ) и (—) энантиомеров как син-, так и анти-бенз- (а) пирен-диолэпоксидов в этой системе и в Salmonella thyphi murium ТА98 и ТА 100. Все 4 деривата оказались сильными мутагенами в бактериальной системе, однако в V79 клетках только (4-) анти-бенз (а) пирен-диолэпоксид проявил себя эффективным мутагеном в отношении как кожи, так и легкого мышей.
В связи с отмечаемой многими исследователями корреляцией мутаций и трансформации интерес представляет также работа Т. Oesch и соавт. (1980). Эти авторы с помощью 4-нитрохинолин- N-оксида скоординированно вызывали в мышиных фибробластах СЗН 10Т1 /2 мутации и трансформацию, которые идентично моду-
лировались кофеином, что указывало на мутацию как одну из необходимых ступеней ＜： цепи событий, едущих в конечном счете к трансформации. При этом был изучен энзиматический контроль реактивных метаболитов, возникающих из ароматических канцерогенов, с помощью бактериальной системы в качестве аналитического орудия. Показано, что корреляция бактериальной мутагенности с канцерогенностью БП и четырех главных метаболитов становится значительно лучше, если эти соединения активированы интактными гепатоцитами, по сравнению с обычно используемыми препаратами разрушенных клеток. Данный факт говорит о том, что сравнительно слабая корреляция между канцерогенностью метаболитов БП в целых животных н их мутагенностью в стандартном тесте В. Ames являлась результатом скорее различий в метаболизме соединений в двух системах, чем различий в биологических конечных результатах, т. е. мутагенности у бактерий versus и канцерогенности у млекопитающих. Добавление и удаление кофакторов или чистых ферментов показан дифференциальную вовлеченность в контроль мутагенно-активных метаболитов исследованных ароматических канцерогенов монооксигеназы, эпоксидгидролазы, глутатион-S-трансферазы, УДФ-глюкуронозилтрансферазы и сульфотрансферазы.
Сравнение мутаций и трансформации, вызываемых различными агентами в системах, каждая из которых подходит для суждения только об одном из двух конечных явлений, страдает от того недостатка, что любая отмеченная корреляция не может быть однозначно приписана фундаментальным различиям между мутациями и трансформацией, так как фармакокинетические различия между такими феноменами, как мембранная проницаемость, активация и детоксикация тестируемого соединения, или различия в репаративных способностях также могли быть тветственными за такой эффект. Учитывая сказанное, изучение мутаций и трансформации необходимо вести по возможности в одной и той же системе. Упомянутые выше авторы так и поступили. Они исследовали в клеточной системе, будет ли 户ссЬенн”нзве£Тнь1 前 как ингибитор nocTQg- jjjiHKauHOHHofi репарации ДНК, осуществлять сходную модуляцию обоих биологических конечных результатов. Авторы изучили характеристики ответа СЗН 10Т1/2 клеток на экспозицию к 4-нитрохинолин-1 -оксиду (НХО). Кривые частоты возникновения резистентных к оуабину мутантов и трансформантов в этих клетках, индуцированных НХО, были линейны в отношении концентрации агента и не различались по форме или наклону. Трансформация происходила с примерно в 24 раза большей частотой, чем мутации.
Ранее было показано, что-^^^^м имеет различное (ускоряющее, тормозящее или нейтральностей ствие на процессы канцерогенеза и тератогенеза в интактных животных, на выживаемость, мутагенез и злокачественную трансформацию клеток в культуре. Эти эффекты часто приписывали его способности тормозить опре-
деленные пути репарации ДНК, возможно, благодаря вмешательству в снабжение пуриннуклеотидами.
В опытах авторов кофеин слабо влиял или вовсе не влиял ни на мутации, ни на трансформацию при концентрации НХО, равной 0,1 мкг/мл, но при концентрации 0,3 мкг/мл наблюдался очень сильный эффект — торможение примерно на 90 % обоих процессов.
Кофеин проявлял удивительный параллелизм в торможении как мутаций, так и трансформации. Параллельные кривые «доза— ответ» для индукции мутаций и трансформации также говорили против различия механизмов этих двух явлений.
Теории соматических мутаций канцерогенеза получили солидную поддержку от выявленной корреляции между химическими соединениями, являющимися бактериальными мутагенами (в присутствии активирующих систем млекопитающих) и теми соединениями, которые являются канцерогенами для животных [McCann J. et al., 1975; McCann J., Ames В., 1976]. Результаты авторов говорят также о том, что мутация является необходимой ступенью в цепи событий, в конечном счете ведущих к злокачественной трансформации.
Интересными в работе J. McCann и В. Ames (1976), J. McCann и соавт. (1975) являются опыты по энзиматическому контролю реактивных метаболитов ароматических канцерогенов с использованием мутагенности как аналитического средства. БП оказался немутагенным при прямом испытании или после инкубации с гомогенатами без дополнительных кофакторов. Однако он становился、 сильно мутагенном, если к гомогенату до碗Мялась НАДФН-ге- нерирующая система или использовались цельные гепатоциты.
У 3-ОН-БП и 9-ОН-БП обнаружили мутагенную активность в отсутствие метаболизирующей системы млекопитающих. Действие не было сильным, но проявлялось при низких дозах испытуемых соединений. При более высоких дозах оба фенола проявили высокую токсичность. Прямой мутагенный эффект гидро- ксибенз(а) пиренов описан ранее [МсСоПп J., Ames В., 1976; Glatt Н., Oesch F., 1976].
Авторы считают, что наблюдавшиеся ими мутагенный и токсический эффекты у бактерий гидроксибенз(а)пиренов обусловлены образуемыми спонтанно в условиях испытания производными, но не исходными родительскими фенолами.
Высокая мутагенность двух фенолов, метаболитов бенз(а)пирена, выявленная и в ряде других исследований, в которых использовали постмитохондриальный отстой из печени мыши и крысы, контрастирует с исследованиями по инициации опухолей и канцерогенности. Однако при исследс ании на мутагенность в условиях цельных неразрушенных клеток млекопитающих, что необходимо для метаболических превращений, два фенола показали слабую мутагенность, хотя эффект был воспроизводим и статистически достоверен.
9,10-Дигидродиолбенз(а)пирен даже в самых высоких дозах был очень слабомутагенен в отсутствие метаболизирующей системы млекопитающих. Добавление к гомогенатам печеночных клеток НАДФН-генерирующей системы приводило к активации 9,10-дигидродиола бенз (а) пирена в мутаген. Подобную активацию 9,10-дигидродиол бенз (а) пирена наблюдали также С. Malaveille и соавт. (1975), которые использовали НАДФН-постмитохонд- риальную фракцию печени крысы. Однако для экви мутагенного эффекта требовались более высокие дозы БП-9,10-дигидродиола, чем БП,3-ОН-БП или 9-ОН-БП. В присутствии интактных гепатоцитов мутагенность БП-9,10-дигидродиола была ниже, чем в присутствии НАДФН-гомогената, однако он был все же значительно мутагенен.
БП-7,8-дигидродиол в отсутствие метаболизирующей системы не проявлял мутагенной активности.
Соматические мутации как причина рака. Теория соматической мутации как причины рака существует уже более 100 лет, однако е своей современной форме она возникла из модели репликации ДНК благодаря работам J. Watson и F. Crick (1953). В отношении механизма мутаций эти авторы указали, что, если основания ДНК во время их репликации находятся случайно, преходяще, по какой-то причине в «неверных» таутомерных формах, то в этом случае может получиться измененная последовательность оснований в новой ДНК, обусловливающая потенциальную мутацию. Известно, что полимеризирующие ДНК ферменты могут нормально обеспечивать точность (адекватность) репликаций, не «воспринимая» неверные таутомерные формы [Drake J., Baltz R., 1976].
Однако вскоре после формулирования этого положения было высказано мнение о том, что определенные химические модификации матрицы ДНК могут «фиксировать» аномальные таутомерные основания и, таким образом, в значительной мере, если не полностью, предотвращать эту «редакторскую» функцию ферментного комплекса полимеразы ДНК.
Ранние объяснения механизма этого гипотетического явления были связаны с возможной генерацией ионизированных форм оснований путем алкилирования ДНК в положении N-7 гуанина или N-3 аденина. Против первого предположения говорил тот факт, что алкилирующие агенты значительно отличались по их мутагенной силе, которая количественно не коррелировала с их способностью алкилировать N-7 гуанина (доминирующий нуклеофильный центр), и что преходящие (случайные) ионизированные формы оснований не должны были бы акцептироваться ДНК-поли- меразой.
Против идеи о роли алкилирования ДНК в положении N-7 гуанина говорила также сравнительно инертная природа этого алкилирования, т. е. его неспособность вызывать (провоцировать) значительный репарационный ответ.
Пред полол аелюе пролутагенное ошибочное спаривание (^иискодинг} О^-алкилтилина(Т*) с гуанином(Г) (XLV/Я); 0е-алкимуанима (rtc ти- muhoju (r)(XL/X); §-ллетилгуанина {илинная форма maymojuepa}{ Г*) с тимином (T)(L)
3-Алкиладенины казались более важными *в качестве «поражений» в матрице ДНК, так как они стимулировали быстрый репарационный процесс. Исследования Т. Lindahl и A. Andersson (1972) показали, что фермент, который осуществляет эту репарацию, является N-гликозилазой. Было установлено, что образование 3-алкиладенинов вызывает летальное повреждение ДНК.
Кажущийся парадокс в отношении алкилирования гуанина нашел свое объяснение. Оказалось, что более сильные алкилирующие мутагены и канцерогены могут реагировать при атоме 0-6 дезоксигуанозина (формулы XLVIII—L), причем образующееся сильное мискодирующее основание, О6-метилгуанин, является продуктом реакции в ДНК клеток, обработанных метилирующим мутагеном N-мeтил-N,-нитpo-N-нитрозогуанидином.
В последующем была испытана серия алкилирующих канцерогенов в плане соотношения доза—ответ в опытах с мышами, у которых одиночные дозы сильных канцерогенов вызывали тимусные лимфомы. При этом установили количественную позитивную корреляцию между промута генным алкилированием при 0-6 гуанина в ДНК ткани мышей и выходом опухолей [Lawley Р., 1980].
Корреляция между реакциями с ДНК ПАУ и аминов (опосредуемая реактивными метаболитами) и канцерогенной силой не оказалась, однако, на этом этапе исследований такой очевидной, как для алкилирующих агентов, хотя сильный канцероген мочевого пузыря, 2-нафтиламин, как было показано, реагирует при 0-6 гуанина [Kadlubar F., Miller Е., 1978]. Главной реакцией углеводородов (через эпоксиды), однако, оказалось взаимодействие при N-2 гуанина [Phillips D., Sims Р., 1978]. Эта позиция является важной для ароматических аминов (через N-гидроксиметаболиты), поскольку N-2-арилированные дериваты персистируют в ДНК-мишени [Kriek Е., Westra I., 1980].
Наиболее привлекательной для объяснения наблюдавшейся [Newbold R., Brookes F., 1976] способности алкилирующих канцерогенов вызывать мутации прямым мискодированием является гипотеза, выдвинутая F. Kadlubar (1980). Она основывается на схеме альтернативного мискодинга, включающей таутомеры канцерогенных метаболитов. Согласно схеме в ходе репликации ДНК одно из гуаниновых оснований могло бы вращать вокруг гликозильной связи и принимать син-конфигурацию в спирали ДНК, допуская, таким образом, аномальное спаривание (по аналогии с моделью Уотсона—Крика) скорее с другим гуанином, чем с его нормальным партнером—цитозином (формула LI).
Этим путем ароматические канцерогены встают в один ряд с сильными алкилирующими канцерогенами как индукторы мутаций путем прямого мискодирования.
г*-г
Предполагаемое спаривание син-конфигурации гуанина (Г*) с гуанином(Г)
Имеются данные, что эти ошибочные спаривания О4-алкилти- мина с гуанином и О6-ал кил гуанина с тимином обусловливают сильные промутагенные эффекты; однако 3-метилгуанин не является сильным промутагенным основанием (возможно, из-за нормального спаривания с альтернативным иминным таутомером).
Теория соматической мутаций как причины рака увязывает потребности в инициирующем химическом «ударе» с развивающимся во времени последующим явлением неясной пока природы. В этой системе необходимы, по-видимому, множественные про- мутационные инициирующие события. Эта точка зрения поднимает ранее широко обсуждавшийся в радиобиологии вопрос о роли и интерпретации «множественных ударов» н потребности в них. В этом плане выдвигались два варианта.
Согласно первому речь идет о «множественных ударах» (поражениях) как причине повреждения ДНК и гибели клетки [Heidelberger С., 1981].
Второй вариант предусматривает, что единственный «удар» мог бы инактивировать матрицу ДНК (по типу индуцированного алкилирования с поперечной сшивкой или индуцированных радиацией двойных разрывов цепи ДНК или тиминовых димеров), однако интенсивный репарационный процесс удалял бы в ряде случаев летальные количества поврежденных участков ДНК. Более того, в случае недостаточности этогс репарационного механизма
пострепликативная репарация могла бы последующем устранить остаточное повреждение. Эта вторая точка зрения была солидно подкреплена изолированием дефектных по репарации мутантов дрожжей, которые инактивировались дозой УФ-облучения, в 2000 раз меньшей, чем требуемая для дрожжей дикого типа.
Есть и другие примеры мутантов, дефектных по репарации про- мутационного повреждения. Так, описаны штаммы Escherichia coli ada~, которые лишены фермента, способного удалять из ДНК промутагенный О6-метилгуанин, и в несколько тысяч раз более чувствительны к метилирующим мутагенам, чем бактерии дикого типа.
Из этих примеров следует, что дополнительные промутаген- ные «удары», необходимые в канцерогенезе, могут быть интерпретированы как потребность элиминировать репарационные энзимы или путем насыщения, или посредством химического повреждения ферментного комплекса.
Как теперь выясняется, фермент, удаляющий О6-метилгуанин из метилированной канцерогеном ДНК в Е. coli, является демети- лазой [Olsson М., Lindahl Т., 1980].
Такой простой путь репарации возможен и в эукариотических клетках. За исключением экспериментально изолированных дефектных по репарации мутант в, все испытанные до сих пор клетки оказались способными удалять потенциально летальный (и, возможно, промутагенный) 3-метиладенин. Распознана уже способность различных клеток удалять сильный промутагенный О6-ме- тилгуанин. Указанная способность в различных клетках сильно варьирует.
В свете этих данных существенное значение в понимании механизмов канцерогенеза имеет тот факт, что ткани мыши, в общем, (кроме печени) являются сравнительно дефектными в способности удалять это промутагенное основание из ДНК.
При сравнении лимфоидных клеток мыши с человеческими лимфоцитами периферической крови была выявлена более высокая эффективность «нормальных» клеток человека в удалении промута генных повреждений (О6-метилгуанина), чем мышиных, хотя, как было найдено для человеческих фибробластов, количество промутагенного основания, удаляемого в сравнительно короткое время (I ч инкубации), при этом было значительно ограничено.
Данное обстоятельство указывает на необходимость изучения отдельных индивидуумов в отношении их способности репариро- вать ДНК для прямого удаления промутагенных повреждений (или других путей устранения дефекта), так как это может оказаться ключевым фактором в определении индивидуальной чувствительности к канцерогенам.
ХИМИЧЕСКИЙ И РАДИАЦИОННЫЙ КАНЦЕРОГЕНЕЗВ СВЯЗИ С МУТАГЕНЕЗОМ
Различные авторы отмечают определенное качественное и количественное сходство между радиационным и химическим канцерогенезом [Rantonen J., 1982]. Об этом же говорят приведенные Bbiuie литературные данные. Фундаментальные молекулярные механизмы радиационного и химического канцер генезов, по-види- мому, идентичны (повреждение ДНК). Много данных говорят в пользу параллельных эффектов радиационного и химического канцерогенезов. Считается, что как один, так и другой осуществляются в два этапа: индукция и трансформация. Оба процесса предполагают мутагенез, причем речь идет о роли в канцерогенезе соматических мутаций. Однако между химическим и радиационным мутагенезом имеется несколько качественных различий.
Повреждения, вызываемые радиацией,——это, в основном, хромосомные мутации, тогда как химически индуцированные изменения —преимущественно хроматидного типа. В том случае, когда химические мутагены вызывают хромосомные изменения, последние появляются, главным образом, после второго и третьего постэкспозиционного деления. Иными словами, химически индуцированные изменения являются бтсроченными, тогда как индуцированные радиацией хромосомные повреждения оказываются видимыми в первой же метафазе. Сестринские хроматидные обмены редко наблюдаются после экспозиции к радиации, тогда как ряд химических мутагенов вызывает их в дозах, намного ниже тех, которые обусловливают главные аберрации.
Имеется также ряд количественных различий, которые показывают, что химические мутагены индуцируют летальные повреждения менее часто, а менее серьезные пбвреждения — более часто, чем это делает ионизирующая радиация.
Общий ход кривых взаимоотношения доза — ответ как для химических мутагенов, так и для радиационных ——линеен, хотя могут иметь место некоторые индивидуальные изменения. J. Carver и соавт. (1979) описали новый метод для сравнения мутагенной силы химических веществ и радиации. Они показали, что мутагенная сила а- и р- радиации располагается в; «середине» разброса мутагенной активности примерно 20 химических агентов.
Было установлено также, что мутагенный потенциал является реальным «предсказателем» канцерогенности у животных.
Таким образом, данные о сходстве и различии в мутагенности химических веществ и радиации также могли бы быть важными для оценки канцерогенного риска у человека.
После первичного повреждения (инициация) клетки трансформируются до фенотипа, который имеет признаки, характерные для опухолей. Критерии для трансформированных радиацией клеток были описаны С. Вогек (1976) и в случае химически индуцированной трансформации — С. Heidelberger (1980). В общем.
между морфологическими и биохимическими критериями для клеток, трансформированных рентгеновскими лучами или химическими веществами, больших различий не имеется.
Комбинированный эффект радиации и химических промотеров, равно как и химического инициатора и радиации в отношении к трансформации, был изучен С. Heidelberger (1980) и J. Di Paolo (1980).
Они документир( вали увеличение трансформации после экспозиции облученных рентгеновскими лучами клеток к умеренным (2,5 мкг/мл) дозам БП или после экспозиции обработанных БП клеток к облучению рентгеновскими лучами от 1,5 до 2,5 Гр. Уф-облучение не давало такого усиления.
С. Heidelberger (1980) показал как инициацию, так и промоцию путем облучения и обработки химическими веществами в одной н той же системе клеточной культуры (мышиные TI0I/2). Органическое масло 12 О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат вызывало промоцию трансформации как после химических веществ, так и после радиации. Важной в этой работе является также демонстрация как химически индуцированого мутагенеза, так и трансформации в одной и той же клеточной культуре. Автор изучил также последовательные стадии канцерогенеза в TI0I/2 клетках после экспозиции к радиации. Были определены взаимоотношения доза —ответ. Эти находки тесно связывают индуцированные радиацией и химическими веществами мутации и злокачественную трансформацию. Однако, по мнению С. Heidelberger, делать заключение о прямой связи между ними пока преждевременно.—
В то же время из этих данных можно заключить, что как канцерогенные химические вещества, так и радиация могут действовать и как инициаторы, и как промотеры друг друга. Это перекрестное взаимоотношение является центральным для оценки возникновения рака у человека, который всегда экспозируется и к мутагенным химическим агентам, и, по крайней мере^к естественному ф ну радиации.
Оценка возможной канцерогенной активности химических соединений, радиации и биологического риска. Известно, что радиация вызывает рак практически любой ткани, за исключением глазных линз и зрелых нейронов В практике, однако, существует лишь немного мест и органов, имеющих особый риск возникновения рака после облучения всего тела низкими дозами радиации. Известно несколько исследований на животных, которые показали радиационный канцерогенез в различных органах, но лишь немногие использовали такие шкалы доз, которые позволяют ocyuiecT- вить надежную оценку взаимоотношений доза —ответ, адекватную для оценки риска для человека.
Наиболее сопоставимой с облучением ситуацией применительно к человеческому канцерогенезу являются низкодозные, слабо- ионизирующие экспозиции, которым подвержены большие профес-
сиональные или общие популяции. Данные о человеческом раке, индуцированном радиацией, получены из различных источников от случайных или медицинских (терапевтических) экспозиций населения. BEIRIII Комитет (1980) проанализировал примерно 50 больных раком различных локализаций. Хотя индуцированный радиацией рак возможен почти в любой человеческой ткани, статистически нанбрсее важннмн нндуинрованннмн раднаиней опухолями на сегодня являются, согласно данным упомянутого доклада комитета, лейкемия, рак молочной железы, щитовидной . железы, легкого, желудка, кости и кожи.
Из 50 000——60 000 химикатов, существующих в продаже, лишь небольшая часть (около 7000) были изучены на канцерогенную активность. Примерно 1500 из них теперь признаны опухолеродными для животных. Мутагенная и канцерогенная активность этих соединений варьируют в весьма широких пределах с фактором до I07, начиная с физиологических веществ, таких как гормоны, и кончая высокореактивными прямыми алкилирующими соединениями [Fishbein L., 1980; Maugh Т., 1980]. До настоящего времени IARC расценил по крайней мере 30 химических веществ как канцерогенные для человека. Из них 20 являются типичными пр - мышленными химикалиями, большинство остальных широко используются в фармацевтической промышленности в здравоохранении или поступают в продажу.
АРОМАТИЧЕСКИЕ АМИНЫ Н АМИДЫ
Многие из ароматических аминов и амидов широко производятся в промышленности красителей и используются в народном хозяйстве и в быту. Именно поэтому изучение их возможной канцерогенной активности представляется настоятельно необходимым. К данной группе канцерогенов принадлежат следующие соединения: 2-НА, 4-аминодифенил, бензидин, 2-аминофлюорен, 2-ацети- ламинофлюорен (ААФ) и др. Химическая структура некоторых из них изображена ниже.
Ароматические амины принадлежат к той категории канцерогенов, которые обладают резорбтивным действием. Они вызывают опухоли в отдаленных от места введения чувствительных органах. Так, 2-нафтиламин вызывает опухоли мочевого пузыря (у собак, крыс — при введении per os), опухоли печени, саркомы (при введении мышам подкожно); 4-аминодифенил индуцирует опухоли мочевого пузыря (при введении собакам per os), опухоли кишечника, печени, почек (при введении крысам per os)： бензидин вызывает опухоли печени, цымбаловых желез, толстой кишки, саркомы на месте введения (крысам подкожно); 2-аиетиламинофлюорен индуцирует опухоли печени и др.
Впервые синтез ароматических аминов осуществил W. Perkin в 1856 г. С того времени достигнут большой прогресс в их изготовлении, однако о действии ароматических аминов было мало
1-HA1-HAо-толуидино-толуидинр-толуидинр-толуидин2-нитроанилин2-нитроанилинантраниловая кислотаантраниловая кислотаСООНСООНр-аминобен*зойнаякислотар-аминобен*зойнаякислотаH2N^0^O~NH2бензидинH2N^0^O~NH2бензидин4-аминодифени^|4-аминодифени^|4 - аминостил ьбен4 - аминостил ьбен
1-HA
1-HA
о-толуидин
о-толуидин
р-толуидин
р-толуидин
2-нитроанилин
2-нитроанилин
антраниловая кислота
антраниловая кислота
СООН
СООН
р-аминобен*зойная
кислота
р-аминобен*зойная
кислота
H2N^0^O~NH2
бензидин
H2N^0^O~NH2
бензидин
4-аминодифени^|
4-аминодифени^|
4 - аминостил ьбен
4 - аминостил ьбен
известно до 1895 г., когда L. Rehn описал связанное с ними образование опухолей мочевого пузыря. Некоторые вещества этого класса проявляют себя как очевидные канцерогены мочевого пузыря человека и многие другие подозреваются в такой активности [IARC, 1972, 1974, 1975, 1978].
Профессиональная экспозиция, а также лекарственная и косметическая являются наиболее распространенными путями загрязнения ароматическими аминами у человека.
Метаболическая активация ароматических аминов. Склонность ароматических аминов и амидов как канцерогенов индуцировать опухоли в тканях, расположенных далеко от мест введення, но не в самих этих местах у человека и экспериментальных животных породила предположение о том, что данные соединения претерпевают метаболическую активацию [Б. Л. Рубенчик, 1977Г Miller J., 1970], которая приводит к появлению высокореактивных метаболитов и конечных канцерогенов. Метаболическая активация и идентификация конечных канцерогенов других ароматических аминов не так хорошо изучена, как ААФ. Исследование последнего стало классическим примером молекулярного анализа химического канцерогенеза.
Поэтому нами в первую очередь и подробно будет рассмотрен именно этот вопрос.
Согласно J. Miller, первые указания на то, что N-гидроксилирование является начальной ступенью активации ААФ, были получены в его лаборатории.
Первичная активация канцерогена АДФ путем N-гидроксилирования
N - гмдроксм-ААФ / Evie、 производные, связывающиеся с нуклеиновыми кислотами и белкамиN - гмдроксм-ААФ / Evie、 производные, связывающиеся с нуклеиновыми кислотами и белкамиКанцерогенен в печени к (или) других тканях крыс, мышей, хомяков, кроликов, собак, кошек, фазанов
N - гмдроксм-ААФ / Evie、 производные, связывающиеся с нуклеиновыми кислотами и белками
N - гмдроксм-ААФ / Evie、 производные, связывающиеся с нуклеиновыми кислотами и белками
Более канцерогенен, чем ААФ, особенно в месте аппликации у крыс, мышей, хомяков, кроликов и морских свинокБолее канцерогенен, чем ААФ, особенно в месте аппликации у крыс, мышей, хомяков, кроликов и морских свинокНеактивен у морских свинок
Более канцерогенен, чем ААФ, особенно в месте аппликации у крыс, мышей, хомяков, кроликов и морских свинок
Более канцерогенен, чем ААФ, особенно в месте аппликации у крыс, мышей, хомяков, кроликов и морских свинок
Это заключение было затем подтверждено исследованиями с различными канцерогенными ароматическими аминами и амидами. В некоторых случаях неспособность животных N-гидрокси- лировать достаточные количества того или иного амида является решающим фактором, предотвращающим проявление амидом канцерогенной активности. Так, морская свинка имеет слабую активность или вообще лишена активности N-гидроксилировать ААФ, и последний не канцерогенен у этого вида животных, тогда как N-гидрокси-ААФ вызывает опухоли. Синтетическое N-гидроксилирование 7-гидрокси-ААФ, неканцерогенного метаболита ААФ, превращает его в сильный канцероген для крыс. С другой стороны, введение N-гидроксигруппы в ароматический амин или амид не обязательно вызывает превращение его в канцероген. При этом арильная группа является очень важной детерминантой
Однако тот факт, что N-гидрокси-ААФ, подобно А АФ, имеет очень слабую способность реагировать в физиологических условиях с белками или нуклеиновыми кислотами (или их дериватами), указывает на то, что необходимы дальнейшие метаболические ступени для превращения N-гидрокси-ААФ в конечные канцерогенные и реактивные формы.
Метаболическая активация N-метил-4-аминоазобензола in vivo. Моделью для изучения метаболической активации ароматических аминов путем этерификации N-гидроксигруппы с образованием сильных электрофильных реагентов явилось исследование N-ме- тил-4-аминоазобензола (МАБ), гепатоканцерогенного аминоазокрасителя. Исходным веществом в этой работе был N-бензоилокси-МАБ, синтезированный как озможный предшественник N-гидрокси-МАБ. Он оказался сильным электрофильным реагентом, реагировал неэнзиматически с метионином при нейтральном pH и давал водорастворимый дериват, который расщепляется до 3-метилмеркапто-МАБ. Эти наблюдения послужили основа-
нием для предположения, что метаболически активной формой МАБ в печени крыс является эфир N-гидрокси-МАБ.
Дальнейшим подтверждением того, что реактивной формой МАБ in vivo мог бы быть эфир N-гидрокси-МАБ, стало изучение характеристик связанных с белком красителей в печени крыс, получавших с диетой МАБ. Полярные красители, освобождающиеся при гидролизе белков печени, также могли образовываться в реакции N-бензоилокси-МАБ с подходящей аминокислотой:
+ метионин| + цистеин + тирозин
II-t-триптофан I
Полярный “ Полярные красители сульфониевый краситель
Несколько позже было показано, что связанные с нуклеиновыми кислотами производные, образованные из МАБ в печени крысы in vivo, также возникают из эфиров N-гидрокси-МАБ или производных со сходной реактивностью [Miller J., 1970]. Таким образом, деградация РНК и ДНК из печени крыс, получавших инъекции меченного 3Н МАБ, дает производные, которые хроматографически идентичны соединениям, приготовленным в реакции N-бензоилокси-МАБ с гуанозином или дезоксигуанозином. Последние продукты были охарактеризованы как N- (гуанозин-8-ил) - МАБ и N- (дезоксигуанозин-8-ил) -МАБ.
Эти исследования структуры конечных продуктов, образованных е реакции дериватов красителей с белками и нуклеиновыми кислотами in vivo, не установили идентичности реактивных метаболитов. Однако предположение, что эфиры N-гидрокси-МАБ являются метаболическими интермедиатами, подтверждается сходными реактивностями N-бензоилокси-МАБ и реактивностью метаболитов in vivo, а также данными, устанавливающими корреляцию образования сернокислого эфира N-гидрокси-ААФ с гепато- канцерогенностью этой гидроксамовой кислоты (см. ниже).
Метаболическая активация N-гидрокси-ацетиламинофлюорена in vivo. Расшифровка реактивной формы ААФ была ярким этапом блестящей серии работ J. Miller и Е. Miller в области изучения химического канцерогенеза. Подобно N-бензоилокси-МАБ, N-ацетокси-ААФ и N-бензоилокси-ААФ оказались сильными электрофильными агентами. Они реагировали с метионином и метионин-пептидами, и образующиеся сульфониевые производные расщеплялись с образованием смеси 1- и 3-метилмеркапто-ААФ. Печеночные белки крыс, получавших ААФ или N-гидрокси-ААФ, давали при обработке щелочью одни и те же О-метилмеркапто- а цетил а ми нофл юо рен ы. Связанные с белками производные в печени крыс, дававшие начало 1- и 3-метилмеркапто-ААФ, объяс-
няют образование лишь примерно 15 % общих связанных с белками фторидных дериватов. По аналогии со связанными с белками формами МАБ в печени крыс и на основании известных данных о реактивности эфиров N-гидрокси-ААФ естественно предположить, что в печени крыс, получавших N-гидрокси-ААФ, могут появляться также фторидные производные гомоцистеина, цистеина, тирозина и триптофана. Это пока в деталях не изучено.
Синтетические эфиры N-гидрокси-ААФ охотно реагируют с гуаниновыми остатками нуклеозидов, нуклеотидов и нуклеиновых кислот и в меньшей мере — с адениновыми остатками.
В противоположность атаке алкилирующих агентов при N-7-позиции гуанина, исследования Е. Kriek и соавт. (1980) показали, что эфиры N-гидрокси-ААФ реагируют при C-8-положении. Поэтому продукты реакции N-ацетокси-ААФ с гуанозином и дезоксигуанозином были охарактеризованы как №(гуанознн- 8-н』)-АА ① и N- (дезоксигуанозин-8-ил)-ААФ соответственно. Затем энзиматический гидролиз печеночной рибосомальной РНК крыс, получавших ААФ или N-гидрокси-ААФ, до нуклеозидного или нуклеотидного уровня давал производные, хроматографически неотличимые от N- (гуанозин-8-ил) -ААФ или его 5сфосфатного деривата.
Появление производных N- (гуан-8-ил)-2-ацетиламинофлюо- рена наиболее легко объяснимо с точки зрения реакции эфира N-гидрокси-ААФ с гуаниновыми остатками в нуклеиновых кислотах.
Сернокислый эфир N-гидрокси ААФ — конечное реактивное и канцерогенное производное N-гидрокси-ААФ. От 20 до 50 % введенного N-гидрокси-ААФ экскретируется у крысы с мочой и желчью в виде О-глюкуронида. Однако этот метаболит сходным образом экскретируется в больших количествах у других видов, например мыши, хомяка и кролика, которые значительно менее чувствительны к канцерогенному действию этой гидроксамовой кислоты. Данный факт подтвердил положение о том, что О-глюкуронид не является ответственным за канцерогенную активность и реактивность N-гидрокси-ААФ in vivo у крыс, и побуждал искать другие метаболические формы. Прилагались большие усилия, чтобы идентифицировать конечную канцерогенную форму ААФ. Так, пытались оценить возможное значение сернокислых эфиров N-гидрокси-ААФ • канцерогенной активности и реактивности in vivo N-гидрокси-ААФ. С этой целью прослеживали корреляцию между тремя параметрами: 1) активностью печеночной сульфотрансферазы; 2) количествами 1- и 3-метилмеркапто-ААФ, освобождаемыми из печеночных белков животных, получавших N-гидрокси-ААФ; 3) гепатоканцерогенностью N-гидрокси-ААФ в различных условиях. Была отмечена строгая корреляция между указанными тремя параметрами. Поэтому печень самцов крыс значительно более чувствительна к канцерогенной активности N-гидрокси-ААФ, чем печень крыс-самок или печень самцов
Таблица 10
Сравнение активности
печеночной N-гидрокси-ААФ^сульфотрансферазы〃 образования in vivo связанных с белкамипроизводных метионил-А АФ у животных, чувствительныхи резистентных к гепатоканцерогенезу N-гидрокси-ААФ(по J. Miller, 1970)
Вид животного
О-Метнонил мерка пто-ААФ
Гепатоканце- рогенез N-гидрокси- ААФ
образуемый печеночной
сульфотрансферазой in vitro (мкг/0,04 мл отстоя
、за 30 мни)
освобожденный из печеночных белков
(мкг/5 г печени) *
Крыса-самец
23±2
38 ±9
+ + + + +
Крыса-самка
4 ±0,5
4±1
Мышь-самец
<0,5
<1.5
Хомяк-самец
<0,5
<0.3
Кролик-самец
2 ±0,5
<0,5
—
Морская свинка-самец
<0,3
<03
—
После внутрибрюшинного введения животным.
животных ряда других видов. Подобно этому печень крыс-самцов имеет более высокие уровни сульфотрансферазной активности в отношении метионил-ААФ и более высокие уровни связанных с белками производных метионил-ААФ, чем печень других изученных видов животных. Эти данные хорошо демонстрируются в табл. 10.
Печеночный канцерогенез у крыс-самцов, вызываемый ААФ и его производными, чувствителен к модификации различными гормональными манипуляциями. У крыс-самцов тиреоилэктпмия, гипофизэктомия или кастрация гТл沃 в-веденне зстрогена значн- те}й>нсГ&痴S^Tjjiif печеночный кан 11.рр"енез пссрепгтвсм АА^ и ЬГгидрокси ААФ. Каждое из этих эндокринных нарушений также снижало сульфотрансферазную активность в отношении N-гидрокси-ААФ и уменьшало количество связанных с белками метионил-ААФ-производных в печени крыс, получавших N-гидрокси-ААФ.
Соответствие между активностью сульфотрансферазы in vitro и реактивностью in vivo говорит в пользу того, что АА6№сульфат является главной реактивной формой N-гидрокси-ААФ в печени. Вместе с тем это положение окончательно не доказано.
Канцерогенная активность эфиров N-гидрокси-ААФ и родственных гидроксамовых кислот. При изолировании или синтезе конечных канцерогенных метаболитов ожидалось, что они будут проявлять большую канцерогенную активность по отношению к широкому ряду животных и тканей, чем их родительский пре-
канцероген. Однако также было очевидно, что конечные реактивные метаболиты могут не показать ожидаемой канцерогенной активности при экзогенном введении, если реактивность этих веществ тормозит их поступление > клетки. С такой проблемой исследователи уже сталкивались в тестах с канцерогенными алкилирующими агентами, и нечто подобное выявлялось при испытании канцерогенности ААФ^-сульфата и нескольких синтетических нейтральных и жирорастворимых эфиров N-гидрокси- ААФ. Поэтому в то время, как ААФ^-сульфат серьезно подозревался в гепатоканцерогенезе, вызываемом N-гидрокси-ААФ, этот эфир индуцировал очень немного опухолей при нанесении на кожу и в подкожную ткань крысы. По-видимому, высокая реактивность этого эфира, а также его ионная природа препятствовали вхождению достаточных количеств этого соединения в клетку, поскольку до того оно реагирует с внеклеточными и мембранными компонентами клетки. Положение более благоприятно при испытании нейтральных и жирорастворимых синтетических эфиров, таких как N-ацетокси-ААФ и N-бензоилокси-ААФ. Эти соединения, имеющие более длительный полупериод существования, проявили себя более сильными канцерогенами, чем N-гидрокси-ААФ, на месте нанесения, особенно при подкожном введении крысам. N-гидрокси- аминофлюорен и 2-нитрозофлюорен оказались менее канцерогенными, чем N-ацетокси-ААФ и N-бензоилокси-ААФ в этих условиях, и сходные дозы ААФ и аминофлуорена не индуцировали опухоли на месте инъекции. О-Глюкуронид-И-гидрокси-ААФ также был практически неканцерогенен в данных условиях.
Другие эфиры гидроксиламина и гидроксамовых кислот имели также большую канцерогенную активность на месте подкожного введения, чем родительские амины или гидроксамовые кислоты. Так, N-бензоилокси-МАБ оказался активен на месте введения, тогда как МАБ в этих же условиях был неактивен. Подобно этому синтетические N-ацетокси-производные 4-ацетиламинобифенила, 2-ацетил аминофенантрена и 4-ацетил аминостильбена индуцировали больше опухолей на месте подкожного введения у крыс, чем соответствующие N-гидрокси-метаболиты. С другой стороны, более реактивный (менее стабильный) и ионный сернокислый эфир К-гидрокси-4-ацетиламинобифенила проявил и этих условиях слабую (или нулевую) канцерогенную активность.
Мутагенная акти ность Й-гидрокси>эфиров ААФ. Так как наследственные изменения в информации, кодируемой ДНК клеток, нередко экспрессируются фенотипически в виде частичной или полной утраты контроля над их мультипликацией, соматические мутации могут рассматриваться как подходящая теоретическая основа индукции опухолей. В связи с этим проводился анализ мутагенной активности различных метаболических и синтетических производных ААФ и МАБ [Maher V. et al., 1968]. Мутагенность проверяли на очищенной трансформирующей ДНК из дикого типа Bacillus subtilis, которую экспозировали с испыты-
ваемыми соединениями in vitro. Затем ДНК использовали для трансформации штамма Bacillus subtilis, который лишен гена В для триптофансинтетазы. Ген В тесно связан с генами, кодирующими синтез индола из антраниловой кислоты, и мутации е этих последних генах легко выявляются по флюоресценции антраниловой кислоты и по 1 - (О-карбоксифениламино)-1 -дезоксирибу- лезе, которые накапливаются в мутантных клетках. Поэтому частота трансформантов является мерой сохранения гена В, а частота флюоресцирующих колоний — мерой мутагенности соединения, к которому экспозируется трансформирующая ДНК in vitro.
Эфиры N-гидрокси-ААФ инактивировали и вызывали мутации в трансформирующей ДНК, причем эти два биологических эффекта были пропорциональны друг другу и величине реакции эфиров с ДНК, судя по плотности обработанной ДНК или по содержанию в ней "С из N-aцeтoкcи-AAФ-9-l4C. N-БензоилоксиМАБ был также мутагенен в этой системе. А АФ, 2-аминофл юорен и их метаболиты — 2-нитрозофлюорен, N-гидрокси-ААФ, N-гид- рокси-аминофлюорен, глюкуронид N-гидрокси-ААФ и МАБ — показали слабую инактивацию трансформирующей ДНК или индукцию его мутаций. Аналогичное исследование также показало, что эфиры К-гидрокси-4-ацетил аминобифенил а, N-гидрокси- 4-ацетиламиностильбена и Н-гидрокси-2-ацетиламинофлюорена вызывали инактивацию и мутации трансформирующей ДНК, тогда как родительские соединения были неактивны в этом тесте [Miller J., 1970]. Во всех этих случаях химическая реакти ность указанных эфиров была параллельна их инактивирующему и мутагенному действию на трансформирующую ДНК.
Место атаки канцерогенов в структуре ДНК в этих исследованиях лаборатории Miller's не было точно установлено. Вывод, который сделали авторы из этой серии работ, сводится к следующему. Образующиеся метаболические эфиры канцерогенных гидроксиламинов и гидроксамовых кислот могут изменять ДНК таким образом, что вызывают наследственную потерю контроля над ростом. В то же время авторы отмечают, что мутагенные потенции изученных эфиров являются следствием их электрофильной активности и не обязательно связаны с канцерогенной активностью.
Вызывает удивление тот факт, что, располагая таким богатым и оригинальным материалом относительно механизма химического канцерогенеза, в частности индуцируемого ароматическими аминами и амидами, а также данными по связи канцерогенеза и мутагенеза, J. Miller склонился к объяснению химического канцерогенеза как следствия эпигеномных изменений в клетках и тканях. В частности, J. Miller указывает, что наследственные и квазинеобратимые изменения, вызываемые N-гидрокси-эфира ми ААФ, имеют место в клеточной дифференциации в многоклеточном организме без изменений в генетической информации. Он полагает,
что канцерогенез может состоять из относительно перманентных изменений в генной экспрессии. Так, эпигенетические следствия реакций N-гидрокси-эфиров аминов и амидов с аминокислотами (например, метионином, цистеином, тирозином и триптофаном) в белках (репрессорах?) и с гуанином (или другими основаниями) в рабонуклеиновых кислотах также должны рассматриваться как возможная основа канцерогенеза [Miller J., 1970].
Конечные химические канцерогены как сильные электрофильные реактанты. Приведенные выше исследования по реактивности эфиров N-гидрокси-амино и амидов и рассмотрение литературы, касающейся известных или постулируемых реактивных форм других химических канцерогенов, позволили J. Miller (1970) высказать предположение о том, что большинство, а возможно, и все химические канцерогены сами являются сильными электрофильными реагентами при введении или превращаются in vivo в сильные электрофильные агенты. Предполагается, что эти электрофильные реагенты затем инициируют канцерогенный процесс посредством специфических реакций с нуклеофилами в критически важных компонентах ткани, таких как нуклеиновые кислоты и белки. Данные, подтверждающие эту точку зрения на примере различных алифатических канцерогенов, суммированы ниже.
Алкилирующие агенты были распознаны как электрофильные реагенты per se, и многочисленные исследования показали их неэнзиматическую реактивность в физиологических условиях с нуклеофильными центрами в нуклеиновых кислотах и белках; сходные реакции имеют место in vivo. Кроме того, химические канцерогены различных типов превращаются in vivo в алкилирующие агенты энзиматически или неэнзиматически.
Эти потенциальные канцерогенные агенты включают канцерогенные нитроза мины и нитрозамиды, которые акти ируются неэнзиматически в реакции с сульфгидрильными группами. Естественно, встречающийся канцероген циказин гидролизуется до агликона метилазоксиметанола. Это соединение метилирует нуклеиновые кислоты in vivo и in vitro.
Этилирование РНК и белков в печени крысы происходит как следствие ведения этионина. Если высококанцерогенные пирро- лизидиновые алкалоиды имеют слабую активность per se, то эти соединения in vivo превращаются в значительно более сильные алкилирующие агенты в результате энзиматической дегидрогенизации в пирроловые производные. Многосторонний канцероген уретан дает несколько видов реактивных электрофилов, включая свободные радикалы, которые могут реагировать с цистеином и цитозином в РНК in vivo. Свидетельства в пользу образования алкилирующих производных четыреххлористого углерода получены в результате демонстрации связанных с белками, и, возможно, нуклеиновыми кислотами продуктов в печени крысы in vivo, возможными интермедиатами являются свободный радикал или ион карбония.
Канцероген(прёкёГниероген)Канцероген(прёкёГниероген)О с=оО с=оСоединения, дающие а л килиру ющи е агенты：Соединения, дающие а л килиру ющи е агенты：Дмалкн 刀 нитрозаминыДмалкн 刀 нитрозаминыАлк илирующие агенты：Алк илирующие агенты：сн；сн；ЦмказинСН3-^-СН3О-р-глюкоз«л 皿累二怎 CH3-y=N-CH3OH-*CH；0。ЦмказинСН3-^-СН3О-р-глюкоз«л 皿累二怎 CH3-y=N-CH3OH-*CH；0。
Канцероген(прёкёГниероген)
Канцероген(прёкёГниероген)
О с=о
О с=о
Соединения, дающие а л килиру ющи е агенты：
Соединения, дающие а л килиру ющи е агенты：
Дмалкн 刀 нитрозамины
Дмалкн 刀 нитрозамины
Алк илирующие агенты：
Алк илирующие агенты：
сн；
сн；
Цмказин
СН3-^-СН3О-р-глюкоз«л 皿累二怎 CH3-y=N-CH3OH-*CH；
0。
Цмказин
СН3-^-СН3О-р-глюкоз«л 皿累二怎 CH3-y=N-CH3OH-*CH；
0。
Возмогший наннерогеннтя玩 электро中ипьнм備реантаит (конечной канцероген)
3三次计m>1nh2
С2Нб— S—сн2—сн2— СН—СООН^иматин^к^ аденозил—|—C2Hsj ?-^C2Hg
Пиррол изид иновые
алкалоидьГ
УретанУретан
Уретан
Уретан
С2H5О—СО—NH?亏—с2н5о—СО—NH2
夢j3 RS—с2н5
俞k；?55^C2H5O—CO-NHOH^~- эфиры—1 C2HbO-CO-NH
Четырех хлористый углерод
СС14СС14-s,(-c「)-s,(-c「)сс】；,(ссц)сс】；,(ссц)
СС14
СС14
-s,(-c「)
-s,(-c「)
сс】；,(ссц)
сс】；,(ссц)
Конечные канцерогенные мектрофимные реагенты, которые люгут образе вываться in xrlvo из различных алифатических канцерогенов
Известные или предполагаемые электрофильные формы различных ароматических канцерогенов показаны ниже.
Канцероген №ннтрозо-№&енн』мочевнна разрушается в воде в течение немногих минут до иона фенилдиазония, и есть основания полагать, что этот продукт должен также образовываться in vivo. Сильный канцероген 4-нитрохинолин-1 -оксид восстанавливается энзиматически в печени крысы и подкожной ткани до 4-гидрокси- аминохинолин-1 -оксида, который является более сильным канцерогеном, чем родительское соединение. Даже афлатоксин В】，который является очень сильным гепатоканцерогеном у крыс, требует активации для проявления канцерогенной активности.
Канцероген(Ееканцероген)Канцероген(Ееканцероген)Соединения» дающие арилирующие, арил- амидируюхцие и родственные егентыСоединения» дающие арилирующие, арил- амидируюхцие и родственные егентыАроматические амина м производныеАроматические амина м производныеКанцерогенные металлы1Канцерогенные металлы1с 2+с 2++ 4-2 +Be . Ci , Со , Pb , Niс 2+с 2++ 4-2 +Be . Ci , Со , Pb , Ni
Канцероген(Ееканцероген)
Канцероген(Ееканцероген)
Соединения» дающие арилирующие, арил- амидируюхцие и родственные егенты
Соединения» дающие арилирующие, арил- амидируюхцие и родственные егенты
Ароматические амина м производные
Ароматические амина м производные
Канцерогенные металлы1
Канцерогенные металлы1
с 2+с 2++ 4-2 +
Be . Ci , Со , Pb , Ni
с 2+с 2++ 4-2 +
Be . Ci , Со , Pb , Ni
Возмо水нь】й канцерогеннь】" длоктро中ильныйреагент (конечна価 ханнерогвн)
Перечислены электрофильные натионы различных канцерогенных металлов
Возможные реакции катионных радикалов, получающихся, i〃 vivoиз ПАУ, с тканевыми нуклеофилами
Выше показаны также ионные электрофильные формы канцерогенных металлов. Некоторые из этих ионое металлов реагируют с гуанином или образуют сравнительно нерастворимые фосфаты.
Ароматические амины и ДНК. Повреждение ДНК связано с мутагенезом, а экспериментальные данные указывают на то, что физические и химические мутагены часто являются канцерогенами [Ames В. et al., 1973; McCann J. et al., 1975]. Наиболее убедительные доказательства взаимосвязи между повреждением ДНК и развитием опухоли дали работы R. Setlow и соавт. (1980).
Изменения в ДНК, вызываемые физическими и химическими агентами, могут быть доказаны с использованием техники щелочной элюции. Этим методом ДНК элюируется из мембранного фильтра как функция молекулярной массы. Низкомолекулярные фрагменты элюируются более быстро, чем высокомолекулярные. L. Erickson и соавт. (1980) продемонстрировали, что различные типы модификаций ДНК могут быть определены указанной техникой: однонитчатые и двунитчатые разрывы ДНК и др.
Эту методику характеристики ДНК использовали С. Cesarone и соавт. (1982) для определения однонитчатых разрывов, возникающих в ДНК после экспозиции in vivo к ароматическим аминам. Для исследования были отобраны ароматические амины из числа известных в качестве канцерогенов, таких как бензидин и 2-наф- тиламин, а также интермедиаты промышленного производства: 1-нафтиламин, анилин, 2-нитроанилин, о-толуидин, п-толуидин, антраниловая кислота, п-аминобензойная кислота. Ароматические амины вводили внутрибрюшинно мышам-самцам линии SwissCDl за 4 ч до забоя в дозах, эквивалентных 2/з их DL50. Профили элюции ДНК с фильтров показали увеличенную элюцию ДНК из печени и почки мышей, получавших бензидин, 1- и 2-НА, о- и п-тол у и дин. Отмечена хорошая корреляция между повреждением печени, вызванным ароматическими аминами, и данными канцерогенности и мутагенности. Бензидин, 2-НА, 2-о-толуидин, 4-п-толуидин индуцировали наиболее высокие уровни повреждения и з эксперименте с животными были канцерогенны. Анилин, 1-НА, 2-нитроанилин, п-аминобензойная кислота и антраниловая кислота были малоэффективны в отношении повреждения ДНК и не показали канцерогенности на животных.
Индукция повреждений ДНК является одной из ранних ступеней в химическом канцерогенезе. В этом свете оценка модификаций ДНК, индуцированных in vivo и выявленных довольно простым методом щелочной элюции, может быть полезной в определении опасных соединений в окружающей среде.
Метаболизм и активация других ароматических аминов. Активация 4-монометиламиноазобензола уже рассматривалась выше. Что касается других ароматических аминов, об их метаболических превращениях и активации известно меньше.
В общем, эстерификация повышает канцерогенную активность ароматических аминов. Б. Л. Рубенчик (1977) отмечает, например, что нейтральные жирорастворимые эфиры уксусной кислоты, N-гидрокси-ААФ, №гндроксн-4-ацетн』амнностн』ь6ена и 4-гид- рокси-4-ацетил аминодифенил а более канцерогенны, чем исходные соединения. Наоборот, сульфаты некоторых из перечисленных соединений были менее эффективны как канцерогены. Трансацетилирование также рассматривают как путь активации канцерогенной активности некоторых ароматических аминов. Энзиматически, при участии ацетилкоэнзима А, легко ацетилируются in vitro 2-аминофлюорен, 4-аминодифенил, 2~аминонафталин.
Мало известно о метаболическом превращении и активации 2-нафтиламина. Предполагалась, но позже оспаривалась возможность N-гидроксилирования 2-нафтиламина in vivo с образованием N-гидpoкcи-2-нaфтиламина. В качестве конечного канцерогена 2-нафтиламина назывался также бис- (2-аминонафтил)фосфат, имеющий более высокую канцерогенную активность, чем исходное соединение. Возможно, что для усиления биологического действия это вещество нуждается в дальнейшей трансформации. Вряд ли активным интермедиатом метаболических превращений 2-нафтиламина можно рассматривать также 2-амино-1-нафтол.
При всем различии возможных метаболических путей in vivo ароматических аминов 2 этапа обязательны: I) N-гидроксилирование; 2) эстерификация.
Кроме того, и в случае ароматических аминов остается справедливой принципиальная схема взаимодействия химических канцерогенов с макромолекулами клетки: активный электрофил канцерогенного метаболита реагирует с нуклеофилом конституен- тов клеток-мишеней.
НИТРОЗАМИНЫ И НИТРОЗАМИДЫ КАК КАНЦЕРОГЕНЫ
В последние годы все большее внимание стала привлекать группа химических веществ, включающая N-нитрозамины, N- нитрозамиды и другие менее обширные группы родственных соединений, у которых обнаружена канцерогенная активность в опытах с животными. По своей опасности для здоровья человека эта категория химических веществ выдвигается на первый план, наряду с повсеместно распространенными полициклическими ароматическими углеводородами. Сейчас известно более 100 канцерогенных нитрозаминов.
Химическая структура канцерогенных нитрозосоединений Примеры химической структуры отдельных представителей этого класса соединений даны ниже.
Мы видим, что метильная группа в нитрозосоединениях может быть заменена алкилами высшего порядка, арильным заместителем или гетероциклической группой. Двузамещенные N-hht- розамины могут быть симметричными или асимметричными, а циклические нитрозамины представлены соединениями, в которых аминоазот образует часть циклической структуры.
Как видно из приведенных формул, нитрозамины являются N-нитрозосоединениями, которые были хорошо известны химикам- органикам уже много лет. Они легко образуются в реакции вторичных аминов с азотистой кислотой (нитрит в кислой среде). Префикс N используется для отличия их от С-нитрозосоединений, в которых нитрозная группа присоединена к углеродному атому.
Аминные производные отличаются от нитрозамидов по их химической стабильности. Первые обычно химически стабильны в водном растворе в холоде, если содержатся в темноте, тогда
♦сн3)N—N—О* /СНз♦сн3)N—N—О* /СНзснэ—сн2)N—N—О c山一4 2снэ—сн2)N—N—О c山一4 2сн3—сн3—сн2—сна
♦сн3
)N—N—О
* /
СНз
♦сн3
)N—N—О
* /
СНз
снэ—сн2
)N—N—О c山一4 2
снэ—сн2
)N—N—О c山一4 2
〉N—N—О
N, N-диметил- нит розами нN, N-диметил- нит розами нN.N-диэтилни-трозамимN.N-диэтилни-трозамимN-дибутилнитроэаминN-дибутилнитроэаминнм пени ифооо с&ьи 工 INнм пени ифооо с&ьи 工 INсн2—сн2сн2—сн2N—N—ОN—N—Осн2—СН2сн2—СН2N—N—ОN—N—ОCH3CH3♦сн3\3'N—N—О♦сн3\3'N—N—Оh2n—Сh2n—СN-нитрозопирролидинN-нитрозопирролидинN-нитрозометил-анилинN-нитрозометил-анилинсн2-сн2О〈〉N—N—OСН2—СН2N-нитроэоморфолинсн2-сн2О〈〉N—N—OСН2—СН2N-нитроэоморфолинК-метил-К-нитрозо- мочевина*сн3К-метил-К-нитрозо- мочевина*сн3N 1 o2n^ >N 1 o2n^ >N--N=ON--N=ONNНН§ХФХ5^ОО Ф2ХХ^АЬО§^§ХФХ5^ОО Ф2ХХ^АЬО§^*陋*陋*сн3*сн3Ы-метил-К^-нитро-Ы-нитрозогуанидинЫ-метил-К^-нитро-Ы-нитрозогуанидинСН2СН2*сн3NH*сн3NHo-=s—оo-=s—оо—s=oо—s=oNNсн3сн3СН3СН3метилметан-、сульфатметилметан-、сульфатдиметилсульфатдиметилсульфатNH*сн3NH*сн3диаэометан 1,2 -диметилгидразиндиаэометан 1,2 -диметилгидразинСН3— СН2— СН2—СН2
N, N-диметил- нит розами н
N, N-диметил- нит розами н
N.N-диэтилни-трозамим
N.N-диэтилни-трозамим
N-дибутилнитроэамин
N-дибутилнитроэамин
нм пени ифооо с&ьи 工 IN
нм пени ифооо с&ьи 工 IN
сн2—сн2
сн2—сн2
N—N—О
N—N—О
сн2—СН2
сн2—СН2
N—N—О
N—N—О
CH3
CH3
♦сн3
\3
'N—N—О
♦сн3
\3
'N—N—О
h2n—С
h2n—С
N-нитрозопирролидин
N-нитрозопирролидин
N-нитрозометил-анилин
N-нитрозометил-анилин
сн2-сн2
О〈〉N—N—O
СН2—СН2
N-нитроэоморфолин
сн2-сн2
О〈〉N—N—O
СН2—СН2
N-нитроэоморфолин
К-метил-К-нитрозо- мочевина
*сн3
К-метил-К-нитрозо- мочевина
*сн3
N 1 o2n^ >
N 1 o2n^ >
N--N=O
N--N=O
N
N
Н
Н
§ХФХ5^ОО Ф2ХХ^АЬО§^
§ХФХ5^ОО Ф2ХХ^АЬО§^
*陋
*陋
*сн3
*сн3
Ы-метил-К^-нитро-Ы-нитрозогуанидин
Ы-метил-К^-нитро-Ы-нитрозогуанидин
СН2
СН2
*сн3NH
*сн3NH
o-=s—о
o-=s—о
о—s=o
о—s=o
N
N
сн3
сн3
СН3
СН3
метилметан-
、сульфат
метилметан-
、сульфат
диметилсульфат
диметилсульфат
NH
*сн3
NH
*сн3
диаэометан 1,2 -диметилгидразин
диаэометан 1,2 -диметилгидразин
как последние нестабильны в щелочи и могут разрушаться более медленно при нейтральном pH. Нитрозопроизводные алкиламидов легко дают соответствующие диазоалканы при обработке щелочью и интенсивно использовались для реакций алкилирования в синтетической органической химии. Экспозиция N-нитрозосоединений к ультрафиолетовому свету вызывает разрушение с количественным выходом нитрата. Это фотохимическое разрушение является основой одного из методов определения нитрозосоединений.
Интерес к N-нитрозосоединениям обострился с того момента, когда в 50-х годах при исследовании токсического эффекта было обнаружено, что простейший представитель нитрозаминов — ДМНА — обладает канцерогенным действием у крыс.
Последующие исследования показали, что соединения этой группы агентов являются канцерогенными для широкого круга животных видов и для разнообразных тканей. Важное научное и практическое значение имеет способность нитрозосоединений
Алкильная группа может быть перенесена, однако в случае двузамещенных соединений только один из заместителей участвует в ковалентной реакции с молекулами—мишенями. Алкилирование диазометаном включает реакцию
дополнительного водородного атома.
вызывать трансплацентарный канцерогенез, всесторонне и глубоко изученный Н. П. Напалковым и сотр. [Напалков Н. П., 1977; Александров В. А., Напалков Н. П., 1981].
Наряду с токсичностью и канцерогенностью, эти агенты являются также тератогенными [Lawley Р., 1974; Montesano R., Bartsch H.t 1976] и мутагенными и могут выраженно влиять на синтез ДНК, РНК и белка. Попытки дать объяснение этим биологическим и биохимическим эффектам концентрировались на механизмах и продуктах их расщепления и последующей их реакции с клеточными компонентами, особенно с макромолеку； лами. Как и в случае всех других химических канцерогенов, эти эффекты опосредуются электрофильными реакциями с клеточными составляющими [Miller J., 1970], и на этой основе N-нитрозосоединения могут быть разделены на 2 группы: те, которые продуцируют электрофилы в ходе спонтанного распада (например, нитрозамиды) , и те, которые химически более стабильны и требуют метаболической активации для инициации расщепления (как в случае нитрозаминов). Пути превращений, которые были установлены для простых алкилирующих агентов представлены следующими реакциями (см. стр. 113).
Для данного класса химических канцерогенов характерно, что распад и удаление продуктов деградации из организма происходит очень быстро по сравнению со временем появления некоторых поздних биологических эффектов. Далее, количество агента, которое связывается с клеточными компонентами, исключительно мало по сравнению с введенным. Указанный факт подчеркивает значение инициирующих эффектов и иллюстрирует импульсную природу воздействия этих агентов, особенно в случае опытов с единичной дозой.
Катализируемый щелочью распад метил нитрозомочевины и МННГ до алкилирующих интермедиатов происходит in vitro в отсутствие добавляемых тиолов, что указывает на их способность алкилировать нуклеиновые кислоты в этих условиях, однако in vivo алкилирующие интермедиаты образуются, главным образом, опосредуемым тиолом путем, как указано выше. Действия тиолов на расщепление НММ не обнаружено.
Наиболее изучены алкилирующие реакции нитрозосоединений с нуклеофильными центрами в клеточных макромолекулах, главным образом с нуклеиновыми кислотами. Алкилирование белков также имеет место. Известны данные, что могут алкилироваться и жиры. Реакции, иные чем алкилирование, привлекли сравнительно небольшое внимание, однако в некоторых случаях возможны реакции карбомоилирования и др.
До настоящего времени прямо не показана канцерогенность N-нитрозосоединений у человека. Тем не менее способность человеческой печени метаболизировать диметилнитрозамин до метилирующих интермедиатов, которые продуцируют те же продукты реакций с нуклеиновыми кислотами, что найдены в чувствительных
ДМНА
Метнл н и трозомочрвина
Метили итрозоу ретан
CH—
3)N—N—O СН/
(а-с-гидроксилирование)I [О]СНц、*
3 J：N—N=O HOCH/
гидроксиметил мети л- нитрозамин
С®
H2N Jn-n=o
К
О
[ОН]
I нсно формальдегид
HNCOизоцианат
〉N—N=O JHQ-『
О
[RS]
(например, цистеин)
МН НГ
Н
I CHq 二NT—O
N
Н
[RS] (например, цистеин)
СОг (выдыхается)
СН-х
N==Oмонометил нитрозамин
Н
C2HQ、 N=O hq/L'sr
СН3—N=N—ОНметилдиазогидроксид
ОН'+ [снп—N=-N + l , №+'[сн；"，
ионметилдиазония
он метилкарбония
нуклеофильные центры в молекулах-мишенях ч таких как ДНК, РНК.
белки
Распад простых N~numpo3ocoeduнений до предполагаемых алкимрующилг агентов
O2N—< /R (нестабилен)
Н
O2N—N^
NСНСООН тиазолин
к нитрозаминам животных, убедительно указывает, что эти агенты являются потенциально опасными. Их присутствие в окружающей среде и образование из неактивных предшественников, поступающих с пищей, могут быть фактором в индукции по мень山ей мере 80 % человеческих неоплазм, вызванных агентами окружающей среды [Doll R., 1977]. В свете привлекательности гипотезы генетического механизма канцерогенеза (т. е. такого, который включает изменения в последовательности оснований ДНК в качестве инициирующей ступени) многие исследователи пытались установить связь между реакциями N-нитрозосоединений и инициацией образования опухолей. Кроме того, важность алкилированных нуклеозидов в экспрессии нормальной биологической функции таких молекул, как тРНК, иРНК, рРНК, и для действия рестрикционных эндонуклеаз на ДНК ясно указывает на возможности изменения или нарушения функций в результате образования под воздействием нитрозосоединений чуждых алкилированных нуклеозидов в ДНК и РНК [Pegg А., 1977].
В связи с этим первоочередной задачей представляется изучение природы изменений, вызываемых N-нитрозосоединениями, немедленных химических и биологических последствий таких изменений и их связи с поздними биологическими эффектами. В ряде обзоров детально рассмотрены вопросы метаболизма нитрозосоединений [Montesano R., Bartsch Н., 1976], биологического алкилирования, особенно различных видов РНК [Pegg А., 1977], канцерогенеза и мутагенеза [Lawley Р., 1974; Montesano R., Bartsch Н., 1976], в которых можно почерпнуть дополнительную информацию.
Видо- и органоспецифичность действия нитрозаминов. Н. Driick- геу и соавт. (I960) во Фрайнбургском университете в 50— 60-е годы систематически изучали связь между химической структурой и канцерогенным действием ряда N-нитрозосоединений. К концу 60 х годов стало очевидным, что многие нитрозамины индуцируют рак у крыс и других экспериментальных животных. Еще более интересно, что нитрозосоединения с различной структурой вызывали опухоли в различных органах.
Примерами этой «органоселективности», или «органотропизма» (термин Н. Druckrey), являются опухоли мочевого пузыря, вызываемые дибутилнитрозамином, и тенденция несимметричных нитрозаминов, например N-нитрозометилаланина, индуцировать опухоли пищевода. Особенно интересно, что N-нитрозометил- мочевина после повторных внутривенных введений вызывала большое число опухолей мозга и других частей нервной системы. Это был первый эффективный экспериментальный метод индукции, отличающийся от прямого введения химического канцерогена в мозг, и использовался весьма интенсивно в экспериментальной невропатологии.
N- Нитрозоэтил мочевина показала значительную способность индуцировать опухоли нервной системы в потомках матерей крыс,
получавших канцероген в течение последней трети беременности. Демонстрация трансплацентарного канцерогенеза находит аналогию в случаях появления рака влагалища у молодых женщин, чьи матери лечились диэтилстильбэстролом во время беременности.
Индукция опухолей единичными дозами нитрозосоединений интересна по той причине, что она также наблюдалась после обработки этими канцерогенами новорожденных и взрослых животных, а также потому, что нитрозамины (особенно амидные производные) очень быстро элиминируются из организма. Можно думать, что все виды испытанных животных, включая обезьян и других млекопитающих, птиц, амфибий и рыб, являются чувствительными к индукции опухолей нитрозаминами. Указанный факт говорит о том, что и для человека нитрозосоединения являются фактором риска. В этом отношении представляет интерес следующее наблюдение. В начале 60-х годов настоящего столетия в Норвегии была отмечена вспышка жестокой и нередко летальной болезни овец. Некоторые из них заболевали без видимой причины. Позже у них обнаруживали тяжелое поражение печени. Исследования показали, что все пораженные овцы поедали частично разложившуюся рыбную муку, содержащую в качестве консерванта нитрит. Так как рыба может содержать значительные количества аминов, включая ди метил амин и триметиламин, было сделано, а затем и подтверждено предположение о том, что при этом могли бы образовываться нитрозамины. Химический анализ показал присутствие диметилнитрозамина в муке в количествах, достаточных для поражения печени у овец.
Эта демонстрация образования токсических количеств мощного канцерогенного нитрозамина в пище овец привела к мнению, что подобная ситуация могла бы иметь место и у человека, в пище которого содержался нитрит в качестве добавки-консерванта. В Англии такие пищевые продукты включали различное консервированное мясо, как, например, бекон, ветчина и некоторые сорта сыра. Анализы показали, что небольшие количества нитроз- аминов присутствуют в этих продуктах, включая диметилнитроз- амин и N-нитрозопирролидин. Отношение этих фактов к индукции рака у человека пока трудно оценить.
Другой важный аспект проблемы нитрозаминов приоткрылся в результате работ J. Sander и соавт. (1971, 1972), которые показали, что канцерогенные нитрозамины могут образовываться в кислой среде желудка млекопитающих в присутствии соответствующих аминов и нитритов. Значение этой работы увеличивается в результате открытия, что не только вторичные, но и третичные амины могут нитрозироваться с образованием канцерогенных нитрозаминов. Никто не сомневается в потенциально вредном результате такого эндогенного образования нитрозаминов, поскольку имеется много сообщений об индукции опухолей у экспериментальных животных при одновременном введении нитритов и различных вторичных и третичных аминов.
Многие N-нитрозосоединения столь же мутагенны, как и канцерогенны. Химически нестойкие амидные дериваты, особенно N-MeTH』-N'-HHTpo-N-HHrpo3oryaHHnHH, являются очень эффективными мутагенами во всех обычных микробных тест-системах, однако химически более стабильные нитрозамины таковыми не являются. Эти факты могут быть объяснены широко распространенным взглядом, согласно которому нитрозосоединения сами по себе не являются биологически активными, но производят свой эффект через химически реактивные интермедиаты. Последние могут образовываться как с помощью ферментов, так и без них.
Метаболизм N-нитрозосоединений. Химически стабильные нитрозосоединения разрушаются в организме быстро после введения, причем метаболизм осуществляется, главным образом (хотя и не исключительно), в печени. Связанные с обменом N-нитрозосоединений ферменты имеют те же характеристики, что и хорошо известные группы энзимов (микросомные гидроксилазы), которые ответственны за обмен большинства соединений, чужеродных для организма. Эти реакции уменьшают токсичность веществ и, таким образом, полезны. Но иногда, как в случае с нитрозами- намн, имеет место обратное, а именно: продукты расщепления оказываются более токсичными и (или) канцерогенными, чем родительские соединения.
Имеются некоторые данные, свидетельствующие о том, что места индукции опухолей нитрозаминами (органотропия) могут определяться частично присутствием необходимых ферментов в органах-мишенях. Факторы, иные чем энзимная активация, должны также участвовать в этом процессе, поскольку химически неустойчивые нитрозоканцерогены могут также проявлять значительную органоспецифичность. Метаболическая активация их не требуется. Концепция, что химический агент нередко не является молекулярной формой, которая индуцирует опухоль, дала начало новой группе терминов: ^преканцероген^ — для родительского соединения; ^проксиматный канцерогена ——для более канцерогенно активных продуктов распада; «.конечный канцероген» — для продукта, который реагирует с некоторым критическим клеточным компонентом и индуцирует таким образом рак.
Хотя N-нитрозосоединения могут действовать, подобно другим классам химических канцерогенных соединений, как алкилирующие агенты in vivo, образование алкилирующих интермедиатов, как полагают, общих для нитрозаминов и нитрозамидов, происходит совершенно различными путями (см. стр. 113). Сравнительно стабильные нитрозамины, которые не являются алкилирующими агентами per se, обычно подвергаются метаболизму путем гидроксилирования при а-углеродном атоме с образованием нестабильного алкилгидроксиалкилнитрозамина. Последний распадается спонтанно и ступенеобразно до иона алкилдиазония и затем до иона карбония, который является предполагаемой алкилирующей формой. Напротив, нестойкие N-нитрозамиды
являются мощными алкилирующими агентами как in vivo, так и in vitro и генерируют предполагаемые ионы карбония спонтанным, зависимым от pH гидролизом, который в случае алкилнитроз- уретанов и алкил нитрозогуанидинов может быть тиолкатализируе- мым in vivo [Druckrey Н., 1975].
Распространение в тканях и распад N-нитрозосоединений. В многочисленных исследованиях показано, что немедленно после введения N-нитрозосоединения равномерно распределяются по всему организму у крыс и мышей, и, так как нитрозамиды не нуждаются в метаболической активации, они реагируют одинаковой степени с макромолекулами во всех тканях. Для N-метнл- №-ннтро-№ннтрозогуанн_днна и N-метилнитрозомочевины мера реакции зависит от уровня в тканях сульфгидрильных соединений, которые действуют как катализаторы в распаде этих агентов. В случае нитрозаминов, несмотря на их начальное равномерное распределение, реакция с макромолекулами происходит только в тех тканях, которые содержат цитохром P-450-зависимые поли- функциональные оксидазы (называемые также гидроксилазами, или деметилазами). Ответственными за кратко- и долгосрочные токсические эффекты нитрозаминов являются продукты их окислительного обмена, а не сами нитрозамины. Более ранние исследования, в которых диметил нитроза мин вводился гепатэктомирован- ным крысам, показали, что главным органом, способным метаболизировать этот агент, является печень. Путем измерения реакции с тканевыми макромолекулами было показано, что и другие органы, в частности почка, легкое, селезенка и в меньшей степени кишечник и поджелудочная железа, также метаболизируют, по крайней мере, простые нитрозамины.
При сравнительном исследовании полифункциональных оксидаз тканей различных видов лабораторных грызунов печень во всех случаях была наиболее активным органом, а удельные активности почки и легкого были между 15 и 40 % от таковой печени. У _крыс ндйдена сравнительно бедная метаболизирующая ннтроз- ами ны акт ивноет亡二—'
Алкилирование нитрозаминами изучали также in vitro, используя тканевые срезы различных видов лабораторных животных, печени и бронхов человека. Во всех случаях была продемонстрирована способность метаболизировать нитрозамины до алкилирующих интермедиатов.
Нитрозамиды разрушаются в организме очень быстро. После внутривенного введения крысам полупериоды существования метилнитрозомочевины (100 мг/кг) и этилнитрозомочевины (200 мг/кг) были около 2 и 5 мин соответственно. Напротив, распад нитрозаминов происходит намного медленнее, поскольку включает этапы их метаболизма. Так, для полного метаболизма диметилнитрозамина, введенного внутрибрюшинно в дозе 6 мг/кг массы, требуется примерно 3 ч, а введенного парентерально в дозе 30 мг/кг (т. е. меньше, чем DL50)——6 ч с максимумом связанной
радиоактивности через 8 ч. При этих дозах почти 2/з введенной радиоактивности выдыхалось в виде |4СО2 в первые 12 ч.
Рассчитано, что в обшей печеночной ДНК оказывается в виде продуктов алкилирования меньше '/|000 части введенной дозы. Диэтил нитрозамин метаболизируется медленнее. При дозе 204 мг/кг массы скорость составляла 8 мг/ч, меньшая доля общей радиоактивности выдыхалась в виде |4СО2, и значительно большая фракция дозы экскретировалась с мочой в виде исходного соединения или как продукты, сохраняющие нитрозогруппу.
Важным наблюдением является то, что N-нитрозосоединения быстро деградируют в организме до высокореактивных форм и начальное повреждение клеточных компонентов происходит поэтому по импульсному типу.
Возможные механизмы действия нитрозаминов. Многие авторы пытались объяснить механизм действия нитрозаминов, рассматривали роль как неизмененных молекул нитрозосоединений, так и продуктов их распада.
Неизмененные молекулы. Вначале считали, что именно неизмененные молекулы нитрозоканцерогенов (а не какой- либо их метаболит) являются конечными канцерогенами. Известное подкрепление данная точка зрения получила в результате наблюдения, что ди мети л н итроза м и н и некоторые другие канцерогены вызывают денатурацию белка. Этот факт подкреплял гипотезу о роли денатурации протеинов в канцерогенезе.
Указанная концепция, однако, трудно согласовывалась с тем фактом, что при равномерном распределении, например, диметил- нитрозамина в организме опухоли у крыс индуцируются избирательно в печени, почках и легких.
Роль алкилирующих промежуточных метаболитов. Тем временем идея алкилирования при канцерогенезе, индуцируемом нитрозаминами, получила значительную поддержку в исследованиях взаимосвязи химической структуры веществ и их канцерогенных свойств. Была выявлена отчетливая корреляция между способностью превращаться в промежуточные алкилирующие агенты и канцерогенной активностью. Однако, если алифатические нитрозамины удовлетворяли этому правилу, гетероциклические нитрозамины ему не подчинялись. Например, N-нитрозоморфолин был высокоактивен как канцероген, но данных в пользу метаболического расщепления его кольца не было. Без разрыва кольца циклических нитрозосоединений образования диазоалкана и других алкилирующих промежуточных продуктов нс происходит.
Следует заметить, однако, что во время этих дискуссий прямых доказательств невозможности метаболического разрыва кольца циклических нитрозосоединений не существовало. В конце 60-х годов нашего столетия пришли все же к заключению, что если алкилирование и имеет причинную связь с канцерогенезом, индуцируемым нитрозосоединениями, то реакции с клеточным рецеп-
тором должны протекать в критическом месте и в критическое время.
Белки как клеточная мишень в канцерогенном действии N-нитрозосоединений. Факт связывания белков с азокрасителями и полициклическими ароматическими углеводородами послужил основой возникновения так называемой теории выпадения. В этой теории первичное значение придавалось именно реакции канцерогена с белками при участии алкилирования белковых сульфгидрильных групп.
Вскоре, однако, мощная волна исследований нуклеиновых кислот как внутриклеточной мишени действия нитрозоканцерогенов и других канцерогенных соединений отодвинула аналогичную роль белков в этом процессе на второй план.
Канцерогенез и генетический материал клетки. Взаимодействие канцерогенов с нуклеиновыми кислотами приобрело особую значимость особенно в связи с открытием роли этих макромолекул в сохранении и переносе наследственной информации. Естественно, что факт неизбежной передачи качества злокачественности от родительских клеток к дочерним, т. е. генетической обусловленности неопластического состояния, указывал на роль в этом процессе нуклеиновых кислот. С другой стороны, с изменением генетического материала клеток связано и другое важное биологическое явление ——мутагенез.
Таким образом, в едином комплексе, материальным субстратом которого являются нуклеиновые кислоты, оказались тесно сплетенными три феномена: действие канцерогенных веществ, неоплазия и мутагенез.
Предположение о неразрывной связи этих явлений подверглось самой широкой и глубокой экспериментальной и теоретической проверке.
Подробно об этих трех аспектах, как позже выяснилось, единой проблемы уже говорилось и будет еще говориться в соответствующих разделах книги, однако здесь следует сделать некоторые краткие и общие замечания.
Идея о роли соматических мутаций в канцерогенезе возникла около 70 лет назад. Т. Bovery (1914, 1929) предположил, что опухоли обусловлены аномалиями в строении хромосом. Другие авторы большее значение придавали изменению внехромосомных генетических элементов. В отношении гипотезы соматических мутаций как причины онкогенеза высказывались различные взгляды, и она приобретала самые разнообразные варианты. Однако, независимо от признания той или иной причины первичного поражения клеток в процессе канцерогенеза, все сходились в признании того факта, что при трансформации наследуемые изменения связаны с изменением генетического материала, т. е. нуклеиновых кислот.
Действие канцерогена на хромосомную ДНК может быть прямым или опосредованным, косвенным, через ядерные гистоны
или иные экстрахромосомальные цитоплазматические компоненты. Последний вариант соответствует экстрахромосомальной мутационной гипотезе, не предусматривающей для канцерогенеза обязательных первичных изменений в ДНК и отдающей приоритет в развитии канцерогенеза изменениям в репрессорах или других регуляторных молекулах (белках или РНК).
При таких разноречивых и противоречивых мнениях о природе канцерогенеза не может не вызвать удивления и уважения предвидение A. Haddow и С. Darlington, которые еще в 1958 г. высказали мысль о том, что каким бы ни был тонкий химический механизм действия канцерогенов, большое значение должна иметь комбинация канцерогенов с генетическим материалом или его предшественниками путем биологического алкилирования.
Связь канцерогенеза и мутагенеза привлекает пристальное внимание, и характер действия на клетки нитрозаминов дает основание для рассмотрения их в единстве. Основным местом алкилирования является N-7 в гуанине ДНК. В этом ионизированном состоянии алкилированный гуанин может образовать пару с тимином вместо цитозина, с которым он спаривается в нормальных условиях. Этот процесс приводит к замене обычной пары Г-Ц на А-Т при последующей репликации ДНК. Алкилирование гуанина и аденина в ДНК вызывает депуринизацию с выходом из ДНК 7-метилгуанина и 3-алкиладенина. Не исключено, что этот процесс депуринизации может приводить к мутациям, обусловленным делецией пары оснований. Химическая деградация алкилированной ДНК или действие специфической ДНКазы могут привести к еще большей делении генетического материала. Экспериментальные данные соответствуют возможности обоих механизмов соматических мутаций в клетках, где возникает опухоль после введения однократной дозы нитрозоканцерогена.
Перенос алкилирующей группы. В свете сходства продуктов, образуемых в клеточных нуклеиновых кислотах при действии, например, метилнитрозомочевины или ди метил нитрозамина, представляется вероятным, что один и тот же алкилирующий интермедиат вовлечен в реакции как прямых, так и непрямых действующих агентов.
В опытах с меткой дейтерием было показано, что метильная группа, освобождаемая при окислительном обмене диметилнитроз- амина, переносится интактной и что сходная ситуация имеет место и в случае агента прямого действия, N-MeTHJi-N^HHTpo- N-нитрозогуанидина. Дальнейшим подтверждением того, что метильная группа присоединяется путем трансметилирования, явились опыты, в которых ДНК реагировала одновременно с метилнитрозомочевиной, меченной в метильной группе с 3Н, и метил- нитрозомочевиной, меченной в метильной группе с 14С. В каждом из изолированных продуктов поддерживалось исходное соотношение изотопов. Из опытов с дейтерированным диэтилнитрозамином известно, что этильная группа также переносится интактной.
Ситуация более сложна для высших алкильных и циклических нитрозаминов. Показано, что эти нитрозам ины не редуцируются до общих, простых форм. Различия как в их реакции с клеточными макромолекулами, так и в возможной репарации повреждения, кстати еще не изученные, могли бы объяснить отличающееся биологическое действие этих агентов.
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НИТРОЗОСОЕДИНЕНИЙС НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ
Взаимодействие N-нитрозосоединений с клеточными нуклеиновыми кислотами in vivo в количественном отношении обычно очень невелико. В большинстве случаев около 0,1 % или менее оснований подвергаются воздействию, и, чтобы определить такие малые количества, приходится использовать радиоактивномечен- ные соединения.
Спонтанный или энзимозависимый распад N-нитрозосоединений освобождает алкилирующий интермедиат, который реагирует ковалентно с разнообразными нуклеофильными центрами в клеточных компонентах, в том числе нуклеиновых кислотах. Механизмом этой реакции, по крайней мере частично, являются мономолекуляр- ное нуклеофильное замещение или реакция, характеризующаяся высоким сродством алкилирующих форм к атомам кислорода.
По способности реагировать с кислородными атомами алкилирующие реагенты могут быть расположены в следующем порядке: метилметансульфонат, этилметансульфонат, метилнитрозомочевина, этил нитрозомочевина [Lawley Р., 1974]. Эта градация, наблюдавшаяся для атомов кислорода, не выдерживается для других мест в нуклеиновых кислотах, и разнообразные факторы определяют сродство этих других мест (атомов) к алкилирующей частице.
При сравнении реакций перечисленных агентов обращает на себя внимание то обстоятельство, что ряд мест, подвергающихся воздействию в макромолекуле, являются одними и теми же, однако имеются значительные различия в характере продуктов, которые образуются в результате разной степени реакции в индивидуальных местах в нуклеиновой кислоте. Для РНК и ДНК наблюдающийся ряд продуктов в основном один н тот же, различие заключается в выявлении 2-О-алкилирования в углеводном компоненте РНК, а также особенностей в силу присутствия урацила или тимина. Если, однако, рассматривается тот или иной отдельный алкилирующий агент, то характер реакции его с РНК и ДНК может различаться в некоторых аспектах. Например, 3-метиладенин обычно представлен в большем количестве в ДНК, чем в РНК, тогда как реакция в первом положении этого основания имеет тенденцию быть более интенсивной в РНК. При атомах кислорода гуанина и фосфата продукты реакции образуются более интенсивно в ДНК, чем в РНК. То же верно для случая реакций с нуклеи-
новыми кислотами этилирующих N-нитрозосоединений по сравнению с таковыми соответствующих метилирующих агентов. Cyuie- ственной характеристикой реакций этих соединений является количество кислородных атомов в нуклеиновых кислотах, которые служат потенциальной мишенью для атаки алкилирующими агентами. Что касается алкилсульфонатов и сульфатов, то, хотя характер продуктов остается таким же, относительная степень реакции при атомах кислорода значительно уменьшена. В опытах in vitro реакция метилметансульфоната с фосфатом ДНК составляет лишь 1 % от общих продуктов, тогда как эта цифра для метил нитрозомочевины составляет 20 % и для этил нитрозомочевины—70 %. Аналогично при Об-позиции в гуанине реакция с метилметансульфонатом in vitro составляет в молярных пропорциях '/го и '/зо количества, образованного в реакции с метилнитрозомочевиной. Таким образом, хотя алкансульфаты реагируют с нуклеиновыми кислотами, давая продукты того же ряда, что н продукты с N-нитрозосоединениями, ясно, что имеются существенные различия в характере образуемых продуктов. Это дает основание считать, что модификация специфических мест и степень, в которой они подвергаются воздействию, являются важным аспектом реакций с клеточными нуклеиновыми кислотами, что может быть более тесно связано с их мутагенным и канцерогенным действием, чем общий уровень (объем) реакции.
Реакция нитрозаминов с клеточными нуклеиновыми кислотами зависит от дозы. Например, алкилирование in vitro транспортных РНК прямо пропорционально концентрации N-нитрозосоединения н независимо от количества субстрата, безотносительно к тому, сравнивали ли реакции с метил- или этил нитрозомочевиной. Введение in vivo диметил нитроза мина в дозах от 0,25 мг/кг массы также приводит к линейному увеличению метилирования, измеряемого по накоплению 7-метилгуанина, в РНК и ДНК печени крысы [Pegg А., 1977|. Сравнительная степень реакции с различными типами нуклеиновых кислот может, однако, варьировать. Например, транспортная РНК метилируется более интенсивно, чем ДНК в печени, если крысы получали ди метил нитрозамин, или в культивированных клетках млекопитающих, обработанных N-мeтил-N,-нитpo-N-нитpoзoгуанидином, однако в мозговой ткани N-мeтил-N,-нитpo-N-нитpoзoгyaнидин метилировал рРНК и ДНК в равной степени. Сходные небольшие различия были отмечены при метилировании отдельных видов РНК： после обработки метилнитрозомочевиной тРНК из подвздошной кишки и почки крысы метилировалась в одинаковой степени с рРНК в тех же тканях, однако в мозге и печени тРНК метилировалась в большей степени. Алкилирование иРНК и ядерной РНК в печени крысы было небольшим, но достоверным — ниже, чем таковое рРНК, если использовали диметилнитрозамин, однако алкилирование ядерной РНК было больше, чем иРНК и рРНК, если использовали метил- метансульфонат [Pegg А., 1976]. Несколько большие различия
наблюдали при сравнении алкилирования митохондриальной ДНК и ядер ной ДНК крысы и хомяка: ди метил нитрозами н и метилнитрозомочевина метилировали митохондриальную ДНК соответственно в 2—4'/2 раза и в 3—7 раз больше, чем ядерную ДНК.
Еще большие различия в степени алкилирования клеточных нуклеиновых кислот имеют место, если сравнивать результаты для разных органов. Это обусловлено прежде всего варьирующей способностью отдельных тканей генерировать реактивные интермедиаты. Так, агенты типа метил нитрозомочевины, этилнитрозомочевины, метилметансульфоната и этилметансульфоната, которые не требуют метаболической активации, реагируют с тканевыми макромолекулами более или менее однородно (единообразно) по всему организму. С другой стороны, деградация N-метил- N,-HHTpo-N-нитрозогуанидина катализируется тиолами, и это может объяснить, почему нуклеиновые кислоты костного мозга и тимуса не реагируют или мало реагируют с №метнл-№-ннтро- N-нитрозогуанидином, тогда как нуклеиновые кислоты желудка, кишечника и печени легко метилируются. Большие различия между тканями наблюдали и при использовании диметилнитроз- амина: у крыс реакция в семенниках была на грани низших пределов определения, тогда как в тонкой кишке н легком она была соответственно в 300—450 раз и в 15—17 раз меньше, чем таковая с клеточными нуклеиновыми кислотами печени. Реакция в почке была примерно в 8 раз меньше, чем в печени. У хомяка алкилирование ДНК в печени и легком было соответственно в 14 и Р/г раза больше, чем в почке. Этилирующие агенты, требующие метаболической активации, также показали сходное распределение интенсивности реакции с тканевыми нуклеиновыми кислотами; для диэтил нитроза мина реакция в почке и легком крысы была в 4 раза меньше, чем в печени, и в тонкой кишке она была практически неуловимой.
Один важный аспект реакций N-нитрозосоединений касается значительно большего сродства метилирующих агентов, по сравнению с соответствующими этилирующими агентами, к нуклеофильным центрам в нуклеиновых кислотах. В опытах in vitro тРНК алкилируется в 10 раз более интенсивно метилнитрозомочевиной, чем этил нитрозомочевиной, и в опытах in vivo этилирующие реагенты заметно менее реактивны, чем соответствующие метилирующие агенты. Количественное сравнение реакции с печеночной ДНК показывает, что диметилнитрозамин, метил нитрозомочевина и метилметансульфонат образуют соответственно в 170, 50 и 10 раз больше алкилированных продуктов, чем эквимолярные дозы этилирующих агентов.
Продукты реакции нитрозосоединений с РНК. Помимо алкилирования оснований и фосфата, подобная реакция показана также и для 2-О-рибозы. Транспортные, рибосомальные, информационные РНК из различных источников, в том числе бактериофагов, вирусов, бактерий н животных, в опытах in vivo н in vitro не имели
особых различий в характере реакции. Решающая роль принадлежала, как и в случае с ДНК, природе самого алкилирующего агента, что следовало из сравнения реакций N-нитрозосоединений с таковыми алкансульфонатов и сульфатов. Имеется, однако, один необычный пример: реакция №метнм-№-ннтро-М-ннтрозогуанн- дина с РНК в интактном вирусе табачной мозаики дает 3-метил- цитозин и 7-метилгуанин в примерно равных количествах: 35 н 48 % от общих продуктов реакции соответственно, в реакции со свободной РНК соотношение этих оснований соответственно равно 7 и 76 %.
Продукты реакции с ДНК. Несмотря на различия в первичной структуре двух нуклеиновых кислот, места алкилирования в ДНК те же, что и в РНК, однако есть и определенные отличия в относительной степени (мере), в которой индивидуальные места подвергаются воздействию, т. е. в характере реакции. Имеется, например, общая тенденция к алкилированию N3-aTOMa аденина более легко в ДНК, чем в РНК. Сходно с этим в большей степени алкилируются фосфат и Оь-гуанин в ДНК, так что для метилирующих N-нитрозосоединений О-алкилирование занимает примерно 25 и 15 % от общих продуктов в ДНК и РНК соответственно, тогда как с этилирующими соединениями примерно 75 и 60 % продуктов являются О-алкилированными. При использовании диэтилнитроз- амина, однако, доля Об-этилгуанина в ДНК достигает величины, полученной с этил нитрозомочевиной при очень высоких вводимых концентрациях. Как и в случае с РНК, имеет место значительное сходство между реакциями этих агентов в условиях in vitro и in vivo.
Путем сравнения реакций с алкилсульфонатом и сульфатом было установлено, что характер взаимодействия определяется природой используемого агента.
Лимитирующим фактором в реакции нитрозаминов с нуклеиновыми кислотами клеток является образование алкилирующих форм, однако на сравнительные количества продуктов реакции, первично образованных в ДНК, оказывает влияние структура молекулы субстрата. Исследование алкилирования ДНК или гуа- ниннуклеозидов и нуклеотидов диэтил-р-хлорэтиламином показало, что, по сравнению с N7-3tomom в мономере, то же место в нативной ДНК характеризуется 50-кратным увеличением реактивности к алкилированию; в однонитчатой ДНК реактивность была снижена в 5—10 раз. С другой стороны, вторичная структура молекулы, т. е. степень межнитевых водородных связей, может защищать некоторые места от реакции. Это ясно демонстрируется в искусственных полинуклеотидах, в которых водородные связи потенциальных мест реакции частично защищают их от алкилирования. В однонитчатой ДНК после обработки метил мета нсул ьфонатом реакция при №-атоме аденина может достигать 20—30 % от общей реакции, в противоположность 1—5 %, полученным с нативной ДНК, хотя относительное количество образованного
1 -метиладенина может быть искусственно увеличено в некоторой степени благодаря соответствующим потерям 3- и 7-метилпуринов путем депуринизации в ходе продолжительных периодов реакции.
Биологическое действие продуктов алкилирования. Мискодируюшие свойства алкилированных оснований. Одно из главных биологических свойств N -нитрозосоеди нений — их мутагенность [Lawley Р., 1974; Montesano R., Bartsch Н., 1976]. Это предполагает, что индуцированное алкилированием изменение в последовательности оснований ДНК могло бы быть ответственным за инициацию неоплазии. В большинстве случаев места алкилирования оснований ДНК локализуются в пределах областей молекулы, подчиняющихся правилу спаривания оснований по Уотсону——Крику. Данный факт стимулировал исследования по выявлению возможных мискодирующих свойств этих модификаций. Способность модифицированных оснований вмешиваться в спаривание оснований зависит, однако, от разнообразных факторов, особенно от способности к образованию стабильной пары оснований с комплементарными или некомплементарными основаниями. В некоторых случаях природа мутаций, вызванная этими агентами, указывала, какие именно основания ДНК вовлечены.
Поскольку пока еще невозможно изменять мискодирующий эффект in vivo, были разработаны различные in vitro методы для бесклеточного синтеза полипептидов или полинуклеотидов с использованием синтетических матриц, содержащих модифицированные (измененные) основания. Удалось установить, что присутствие 7-метилгуанина ：＞ ДНК не ведет к мискодирующим событиям. Кроме того, данные опытов in vivo показывали, что наличие 7-метилгуанина в ДНК обычно не стимулирует процессы репарации.
Демонстрация алкилирования О' в гуанине и предсказанное свойство продукта вызывать ошибочное спаривание породили гипотезу, что Об-алкилгуанин мог бы иметь отношение к канцерогенному и мутагенному эффектам N-нитрозосоединений [Loveless А., 1969). Это было подкреплено результатами опытов, в которых кополимеры, содержащие цитидиловую н О6-метил- гуаниловую кислоты, были использованы как матрицы для РНК- полимеразы; наблюдавшееся аномальное включение УМФ и в меньшей степени АМФ привело к заключению, что О6-метил- гуанин не образует стабильной пары оснований с цитозином. Однако при использовании индуцированной этилметансульфона- том реверсии бактериофага было найдено, что частота мутаций, индуцированных в специфическом локусе для каждого присутствующего О6-этилгуанина, была примерно 0,35. В соответствии с этой величиной эффективность мискодинга О6-метилгуанина в кополимерах ДНК была определена и достигала примерно 40 %, если концентрации мононуклеотидов не ограничивали скорость полидезоксирибонуклеотидного синтеза. Однако, когда концентра-
ция дезоксицитидинтрифосфата была уменьшена, частота миско- динга увеличивалась.
Хотя наряду с проявлением мискодирующего действия О6- алкилгуанин может вступать в спаривание с нормальным партнером, этому продукту приписывают биологическую роль в свете большого числа экспериментальных данных, отмечающих корреляцию его образования или персистенции в ДНК некоторых органов с чувствительностью к индукции опухолей N-нитрозосоединениями и родственными алкилирующими агентами.
Другой минорный продукт алкилирования гуанина ——3-алкил- гуанин. Хотя предполагалось образование стабильной пары оснований между 3-ал кил гуанином н тимином, это не было подтверждено опытами in vitro по мискодингу. Однако демонстрация факта вырезания этого продукта из ДНК in vivo указывает на то, что его присутствие в ДНК могло бы быть повреждающим.
Главный цитозиновый продукт, 3-алкилцитозин, как в полирибо-, так и в полидезоксирибонуклеотидных матрицах позволяет происходить некомплементарному включению УМФ или АМФ в ходе пол и рибонуклеотидного синтеза. Было подчеркнуто биологическое значение этого фактора, в частности, в мутации вируса табачной мозаики.
С другой стороны, заключили, что 3-метилцитозин не миско- дирует в ДНК-полимеразной системе, так как не обнаруживали ошибочного включения аденина в продукт, если в качестве матрицы использовали метилированную диметилсульфатом или метилнитрозомочевиной поли (дезоксигуаниловую — дезоксицитидиловую кислоту). Возможно, метильная группа в 3-м положении цитозина, в более суровых условиях репликации ДНК, стерически предотвращала образование стабильной пары оснований. Хотя небольшие количества 3-метилцитозина образуются в ДНК in vivo, неизвестно, является ли это основание объектом активного процесса вырезания; предположение, что алкилирование цитидина в О2-позиции может вызывать ошибочное спаривание, также нуждается в подтверждении.
После алкилирования ДНК метил нитрозомочевиной идентифицированы небольшие количества О4-метилтимидина и показано образование О4-алкилтимидин: гуаниновых пар оснований. Можно было думать, что О4-метилтимидин также способен мискодировать в ходе синтеза ДНК. В проведенных опытах степень ошибочного включения дезокси-ТМФ оказалась прямо пропорциональной содержанию полимера О4-метилтимидина. Хотя 3-метилтимидин также присутствовал в этих матрицах, не было указаний на то, что он ответствен за включение некомплементарных оснований в опытную систему.
Что касается опытов in vivo, еще не доказано, что алкилирование ДНК способно вызывать мискодирование, и пока не установлено, в какой мере механизмы, обеспечивающие правильное спаривание, могут элиминировать это нарушение.
Алкилирование и репарация повреждений ДНК в канцерогенном эффекте. В изучении действия N-нитрозосоединений большую роль в последние годы сыграли исследования механизмов образования алкилирующих интермедиатов и их последующего взаимодействия с клеточными компонентами. Это привело к возникновению гипотезы о том, что многие специфические биологические эффекты, вызываемые алкилирующими агентами, обусловлены их реакциями с нуклеиновыми кислотами.
Хотя имеются лишь ограниченные знания о взаимодействии N-нитрозосоединений с клеточными компонентами, такими как белки, углеводы и липиды, многие продукты начальной реакции с нуклеиновыми кислотами теперь хорошо идентифицированы. Эти исследования ясно показали, что из химических агентов, способных метилировать или этилировать нуклеиновые кислоты, те, которые действуют более интенсивно на атомы кислорода, например N-нитрозосоединения, являются сильными канцерогенами. Уже известно, что некоторые продукты алкилирования оснований нуклеиновых кислот являются потенциальными промутагенами, однако реакция в других местах может иметь сходные эффекты и требует в этом отношении специальной оценки.
Начальная скорость реакции в этих местах нуклеиновых кислот может дать лишь частичное объяснение различной тканевой специфичности индивидуальных алкилирующих агентов. Однако обнаружение того факта, что некоторые продукты алкилирования ДНК могут избирательно освобождаться из ДНК энзиматическими механизмами, направили исследования на выяснение возможности существования более определенной взаимосвязи между персистенцией продуктов алкилирования in vivo н тканеспецифической индукцией опухолей. Указанный подход показал, что существуют значительные вариации в способности клеток различных тканей удалять определенные виды алкилирующих продуктов из ДНК и что это могло бы в ряде случаев являться решающим фактором в индукции опухолей алкилирующими агентами.
В настоящее время отмечаются лишь полуколичественные закономерности, заключающиеся в том, что главными тканями- мишенями являются те, в которых специфическое промутагенное повреждение персистирует длительные периоды времени или оно накапливается в большей степени. Эта закономерность проявляется особенно четко при сравнении тканей, являющихся мишенями, н тканей, не являющихся мишенями, у крыс и хомяков. В ситуациях, где не наблюдается очевидной корреляции, другие факторы могут играть значительную роль, однако судьба и функция других потенциально промутагенных поражений требуют изучения в свете варьирующей способности различных видов н линий животных репарировать повреждения ДНК.
Пока нет достаточных экспериментальных оснований предполагать, что деалкилазы или какие-то опосредуемые N-глико-
зидазой или фосфодиэстеразой ступени участвуют в удалении продуктов алкилирования из клеток млекопитающих. Однако, по аналогии с бактериальным энзимом эндонуклеазой II, реакции депуринизации должны рассматриваться как более предпочтительные в качестве начального события процесса репарации.
Ситуация еще более усложнилась после установления возможности того, что различные ферменты или системы могут участвовать на различных уровнях повреждения и общая эффективность системы вырезания может быть изменена целым рядом разнообразных факторов. Обстоятельства (условия), которые позволяют избирательно изменять эффективность процесса репарации, могут предоставить средства более глубокого проникновения в механизм функционирования этих важных ферментных систем.
В итоге может быть сделан общий вывод о том, что необходимы дальнейшие исследования для выяснения пути, каким продукты реакции канцерогенов вызывают проканцерогенные эффекты ДНК и как они сами распределяются в ДНК.
До сих пор изучение продуктов алкилирования in vivo основывалось на определении в целых тканях, однако было бы значительно ценнее выяснить корреляцию между алкилированием и репарацией в тех субпопуляциях клеток, которые дают начало опухолям. Дальнейшие успехи в данной области будут зависеть от разработки чувствительных методов измерения малых количеств продуктов реакции, например иммунотестов или жидкостной хроматографии. Это позволит проследить реакции в срезах, препаратах хромосом или в популяциях избранных клеток, полученных путем фракционирования тканей.
В исследовании канцерогенеза, вызываемого N-нитрозосоединениями и родственными химическими агентами, изучение механизма и продуктов реакций с нуклеиновыми кислотами послужило необходимой основой дальнейшего прогресса. Главным успехом явилось распознание реакций репарации, которые позволили объяснить тканевую специфичность канцерогенных агентов. Дальнейшее изучение указанных энзиматических систем может иметь первостепенное значение в понимании молекулярных процессов, имеющих отношение к инициации канцерогенеза. Хотя эти исследования находятся в начальной стадии, они ясно демонстрируют то, что события на молекулярном уровне могут быть скоррелированы с биологическими эффектами in vivo.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В области изучения канцерогенеза, индуцируемого химическими соединениями, за последние два десятилетия достигнуты впечатляющие результаты.
Химические соединения (промышленного, бытового назначения н естественного происхождения) представляют в современном
человеческом обществе неотъемлемую часть его существования. Число зарегистрированных химических веществ исчисляется на сегодня миллионами и продолжает стремительно увеличиваться ежегодно. Многие химические агенты, с которыми так или иначе соприкасается человек, являются опасными для его здоровья и даже жизни. К таковым относятся вещества, вызывающие злокачественные новообразования, — химические канцерогены.
Компетентные специалисты н авторитетные специализированные международные организации полагают, что 80—90 % всех злокачественных опухолей у человека могут быть обусловлены факторами среды, в первую очередь *химическими веществами. Известно более 1000 химических соединений, вызывающих опухоли у животных, причем есть основания подозревать их аналогичное действие н на человека.
К наиболее распространенным и активным химическим канцерогенам можно отнести следующие: 1) полициклические ароматические углеводороды (7,12-ди мети л бензантрацен, 3,4-бензпирен, 20-метилхолантрен и др.); 2) гетеродйклические ароматические углеводороды (1,2,5,6-дибензакридин,' 1,2,5,6- и 3,4,5,6-дибензкар- базол и др.); 3) ароматические амины (2-нафтиламин, 4-аминодифенил, бензидин н др.); 4) аминоазосоединения (ортоаминоазотолуол, 4-диметиламиноазобензол); 5) нитрозосоединения (диметилнитрозамин, диэтил нитроза мин, №метнл-№-ннтро-№ нитрозогуанидин, нитрозометил мочевина и др.); 6) афлатоксины; 7) прочие (уретан, этионин, СС14, хлорэтиламины, пластмассы, металлы и др.).
Одни группы веществ, например ПАУ, обладают главным образом местным действием (кожа, подкожная клетчатка), другие (аминоазосоедйнения, ароматические амины) оказывают резорбтивное действие, они вызывают опухоли в отдаленных от места введения чувствительных органах.
При рассмотрении структуры упомянутых веществ поражают их разнообразие, иногда совершенно различная природа, размер молекул, химическая инертность многих из них, иногда отсутствие корреляции между канцерогенной н мутагенной активностью. Все эти кажущиеся противоречия и парадоксы сейчас в основном объяснены, в чем немалая заслуга супругов Е. Miller и J. Miller (США), их учеников и последователей. Суть их концепции сводится к следующему.
Форма химического вещества, которая в конечном счете реагирует с макромолекулами клетки (так называемый конечный канцероген), должна содержать реактивный электрофильный (т. е. электрондефицитный) атом, который может взаимодействовать со многими нуклеофильными (т. е. обогащенными электронами) центрами в полинуклеотидах и белках. Важные электрофильные центры включают: ионы карбония, свободные радикалы, эпоксиды, некоторые металлические катионы, азот в эфирах гидроксиламинов и гидроксамовых кислот и др. Все канцерогены,
которые сами не являются электрофилами, в тканях метаболизируются до таковых.
Особое значение в осуществлении канцерогенного эффекта химических соединений в настоящее время придается реакции конечных канцерогенов с нуклеиновыми кислотами. Это объясняется, прежде всего, тем, что нуклеиновые кислоты представляют основу генетического материала клетки и всякие нарушения в структуре последнего должны повлечь за собой те или иные наследственные изменения. Это обстоятельство особенно важно в свете того факта, что на уровне клетки неопластическое состояние генетически наследуется.
Одним из наиболее важных результатов работ в области химического канцерогенеза в последние годы явилось заключение о том, что химические канцерогены требуют активации в теле хозяина, прежде чем они трансформируют клетку. Стал четко вырисовываться и основной принцип химического канцерогенеза. Он сводится к утверждению, что химическое вещество, чтобы вызвать трансформацию, должно необратимо реагировать с клеточными макромолекулами, т. е. ДНК, РНК, белками.
Ряд канцерогенов, например Р-пропиолактон, являются алкилирующими агентами и легко реагируют с нуклеиновыми кислотами. Однако большинство канцерогенов представляют собою сравнительно инертные вещества (ПАУ, ароматические амины, нитрозамины) и нуждаются в активации. По иронии судьбы энзимы, активирующие в организме химические канцерогены,—— это те же, чьей первичной позитивной функцией являются детоксикация и удаление чужеродных химических веществ. Наиболее важной из них является серия окислительных ферментов под общим названием микросомальных многоцелевых (полифункцио- нальных) оксигеназ. Ими особенно богаты печень и почки, где чужеродные вещества накапливаются.
Во многих случаях «конечными» канцерогенами оказались эпоксидные дериваты так называемой К-зоны (области с высокой плотностью электронов, связанные с изолированными фенантре- ноидными двойными связями). Это было показано для ПАУ. Удалось продемонстрировать, что эпоксиды К-зоны являются также и мутагенами. Вообще существенную роль в толковании механизма химического канцерогенеза сыграло доказательство того факта, что все канцерогены являются, как правило, мутагенами, т. е. веществами, вызывающими мутации путем модификации (определенных изменений) структуры ДНК.
Расшифрованы и иные механизмы превращения канцерогенов из неактивных форм в активные (конечные канцерогены).
Мало известно, что происходит после активации канцерогенов, однако накапливаются данные о взаимодействии конечных канцерогенов с нуклеиновыми кислотами. Уже расшифрован ряд продуктов взаимодействия активных канцерогенов с ДНК. Их называют аддуктами. В большинстве, они представляют собой
алкилированные азотистые основания. Естественно рассматривать возникновение и действие этих продуктов реакции электрофилов химических соединений с нуклеофилами нуклеиновых кислот как причину точковых или иных мутаций. Данная констатация приобретает особое значение в свете новейших данных теоретической онкологии о превращении клеточных протоонкогенов в онкогены. Как будет видно из последующих разделов книги, именно точковые мутации в определенных позициях оснований нуклеиновых кислот, в месте локализации клеточных трансформирующих последовательностей, протоонкогенов, индуцируют цепь событий, результирующихся в малигнизацию.
В научно-экспериментальном плане химические канцерогены представляют неоценимое средство изучения механизмов канцерогенеза. Достаточно сказать, что с их помощью у животных можно моделировать все основные типы опухолей. Так, например, с помощью лишь одного класса соединений (нитрозаминов) можно получить: опухоли мочевого пузыря (дибутилнитрозамином), рак пищевода (N-нитрозометилаланином), опухоли желудка (N-ме- тил-К^нитро-К-нитрозогуанидином), опухоли ЦНС (нитрозоме- тилмочевиной), печени (диэтилнитрозамином, диметил нитроза ми- ном) и др. С помощью нитрозаминов можно вызвать опухоли у самых разнообразных типов животных: рыб, амфибий, рептилий, птиц, млекопитающих, включая обезьян.
При всем прогрессе наших знаний в этой области и огромных усилиях исследователей, занимающихся химическим канцерогенезом, нельзя не отметить, однако, что при несомненных конкретных, частных успехах точный молекулярный механизм действия канцерогенных веществ все еще не раскрыт. Если уточнить эту мысль, следует сказать, что много сделано в уяснении отдельных реакций и процессов первых этапов канцерогенеза — до момента структурно-химической модификации ДНК, т. е. в расшифровке метаболической активации канцерогенных агентов и их взаимодействия с клеточными макромолекулами. Однако дальнейшее проникновение в механизм клеточной трансформации и малигниза- ции замедлилось, если не приостановилось. Все последующие события, связанные с воплощением химических реакций в биологические эффекты трансформации и малигнизации, остаются нераскрытыми. Нового «прорыва» в теории химического канцерогенеза, как и онкогенеза вообще, можно, по-видимому, ожидать от соприкосновения и взаимопроникновения всей богатой информации, полученной в ходе изучения действия химических канцерогенных соединений с новейшими достижениями теоретической онкологии в других направлениях, особенно в области онковирусологии, молекулярной биологии и молекулярной генетики опухолей, как и процесса канцерогенеза. Успехи этих направлений теоретической онкологии привели к открытию так называемых онкогенов, существование которых, возможно, станет основой разработки универсальной концепции онкогенеза.
ГЛ AB A 3
ВИРУСНЫЙ ОНКОГЕНЕЗИ ЕГО МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ
Значительный вклад в становление и развитие общей теории канцерогенеза внесло изучение молекулярных механизмов трансформации клеток онкогенными вирусами. Достоинство и преимущество опухолеродных вирусов по сравнению с другими канцерогенными агентами в изучении онкогенеза заключаются, во-первых, в скоротечности индуцируемого ими биологического действия; во-вторых, в способности опухолеродных вирусов поражать широкий круг позвоночных, а также клеточных популяций; в-третьих, в относительной простоте генетической структуры этих вирусов, позволяющей проводить точную молекулярно-биологическую расшифровку механизма индуцируемого вирусами процесса клеточной трансформации и малигнизации.
Во всех случаях вирусиндуцироваиного канцерогенеза онкогенные вирусы внедряют в инфицированную клетку свой геном, в том числе и трансформирующий ген (вирусный онкоген, v-onc), продукт которого инициирует и поддерживает трансформированное состояние клетки-мишени [Альтштейн А. Д., 1973; Vogt Р., 1972; Todaro G., Huebner R., 1972; Hanafusa H. et al., 1972, 1973, 1974; Hayward W. et al., 1981].
Онковирусология в наши дни представляет собой большую самостоятельную науку, которая включает учение о двух типах опухолеродных вирусов, различающихся, в первую очередь, по химическому составу их генома: 1) ДНК； 2) РНК. Каждая из этих групп многочисленна, имеет свою специфику биологического действия, молекулярного механизма индукции опухолей, сложности структурной организации вирионов.
Объем и задачи данной книги не позволяют рассмотреть оба указанных типа онкогенных вирусов. Детальному анализу подвергнется лишь один из них — РНК, РНК-co держащие опухолевые вирусы или ретровирусы. Это объясняется тем, что исследования, прежде всего, этого типа онковирусов привели к поразительным открытиям последних лет в области понимания молекулярного механизма действия не только онкогенных вирусов, но и других канцерогенных агентов. Именно в недрах онковирусологии, в частности при изучении онкогенных ретровирусов, родились современные понятия «онкоген», «онкобелок» и др., которые составляют фундамент современной теоретической (молекулярной) онкологии. Тем не менее мы считали необходимым в этой главе кратко остановиться также на роли вирусов герпеса в возникновении некоторых форм неопластических заболеваний человека.
Содержание ретровирусологии со времени ее зарождения в начале века претерпело серьезные изменения. Поначалу имел место
период открытия новых вирусов, период изучения их биологического действия и морфологии, а также ультраструктуры. За последние годы произошел резкий крен в сторону анализа молекулярной структуры вирусных частиц и изучения молекулярного механизма их биологического действия. Этот второй этап был бы невозможен без первого, равно как первый был бы лишен логического завершения без второго.
Своими успехами онковирусология обязана многим отечественным и иностранным ученым. Исключительное значение имела деятельность выдающегося советского исследователя Л. А. Зильбера и особенно его идея об интеграции вирусного и клеточного генетического материала. Плеяда учеников и последователей продолжает развивать идеи Л. А. Зильбера в современных условиях. Об успехах отечественной и мировой онковирусологии можно полнее узнать в работах А. М. Дядьковой (1966), Д. Б. Голубева и М. А. Шлянкевича (1972), А. И. Агеенко (1978), В. А. Кукайн и соавт. (1981), Н. П. Мазуренко (1962) и, конечно, самого Л. А. Зильбера и соавт. (1975), а также А. Д. Альтштейна (1973), 3. А. Бутенко (1975), И. Ф. Сейца и соавт. (1982), Ф. Л. Киселева и соавт. (1983). Имеется ряд ценных публикаций и в зарубежной литературе [Weiss R. et al., 1982; Gerard G., Grandgenett D., 1980; Besmer P., 1983; Duesberg P., 1983; Rapp F., 1984, и др.].
Это обстоятельство избавляет нас от необходимости подробно излагать отдельные аспекты вирусологии и вирусного онкогенеза и оправдывает авторов данной книги перед читателями за неизбежную порой лаконичность отдельных разделов книги.
КЛАССИФИКАЦИЯ ОНКОГЕННЫХ ВИРУСОВ
Как уже отмечалось, онкогенные (опухолеродные) вирусы подразделяются, согласно их молекулярной структуре генома, на две категории: первая, содержащая в качестве генома ДНК； вторая — РНК [Fenner F., 1975]. Онкогенные вирусы, обладающие ДНК-геномом, распределяются по нескольким группам, некоторые члены которых обладают свойствами, позволяющими рассматривать их как действительно онкогенные. Такие вирусы способны индуцировать опухоли у позвоночных, а также трансформировать культуры клеток. К ДНК-содержащим онкогенным вирусам относятся паповавирусы, аденовирусы, герпесвирусы и вирусы гепатита (гепаднавирусы) [Tooze J., 1980; Galloway D., McDougal J„ 1983].
Напротив, онкогенные РНК-содержащие вирусы являются членами одной общей таксономической группы ——семейства Retro- viridae, или ретровирусов [Fenner 户.，1975]. Это семейство включает все вирусы, имеющие в качестве генома РНК и содержащие фермент РНК-зависимую ДНК-полимеразу (обратную транскриптазу).
Семейство Retroviridae [Fenner F., 1975] подразделяется на три подсемейства: 1) Oncovirinae, включающее все онкогенные и многие неонкогенные, но близкородственные вирусы; 2) Lentivi- rinae, «медленные» вирусы, такие, например, как визна; 3) Spuina- virinae, «пенящие» вирусы, которые вызывают у животных персистирующие инфекции без клинических проявлений [Weiss R. et al., 1982; Brahic M., Haase A., 1981]. «Пенящие» вирусы служат удобной модельной системой для изучения хронических вирусных заболеваний. «Медленные» вирусы вызывают специфические хронические неврологические заболевания [Brahic М., Haase А., 1981].
ОБЩИЕ СВОЙСТВА РЕТРОВИРУСОВ
Все ретровирусы имеют некоторые общие химические, биофизические и морфологические свойства, что позволило отнести их к одному семейству.
Вирионы разных групп ретровирусов имеют сходный химический состав. Они содержат примерно 60—70 % белков: в их числе продукты генов (gag—внутренние структурные белки, ро! — обратная транскриптаза и env — белки вирусной оболочки); 35—40 % липидов (происходящих из клеточной мембраны); 2—4 % углеводов и примерно 1 % РНК [Levin W., Rosenak М., 1976; Eisenman R., Vogt V., 1978]. По физико-химическим свойствам различные ретровирусы также весьма однородны. Их плотность в градиентах сахарозы составляет 1,16—1,18 г/мл, а в хлориде цезия — 1,16—1,21 г/мл. Ретровирусы чувствительны к растворителям липидов, детергентам и тепловой инактивации (56 ℃, 30 мин), однако они высокорезистентны к УФ- и рентгеновскому облучению.
По ультраструктуре (морфологии) ретровирусы подразделяются на 4 типа: А, В, С и D [Быковский А. Ф. и др., 1983; Weiss R. et al., 1982].
Геномная РНК ретровирусов («плюс»-цепь РНК, или положительный геном) представляет собой 60——705-димерный комплекс двух идентичных субъединиц размером 8—10 тысяч оснований (т. о.), которые по своей структуре соответствуют молекуле иРНК [Chien V.-H. et al., 1980; Loevinger G., Schochetman G., 1980]. Кроме геномной РНК, в 60——705-комплекс входят 2 молекулы клеточной тРНК. Так, тРНК пролина обнаружена в вирусах лейкозов мышей, а также в вирусах лейкозов кошек и сарком шерстистых обезьян; тРНК триптофана — в вирусах лейкоза птиц; тРНК лизина — в вирусе рака молочных желез мышей [Gerard G., Grandgenett D., 1980]. Каждая молекула геномной РНК имеет на 5'-конце кэппирующую группу, «шапочку» (m7 Gppp, cap), а на З'-коние ——полиаденилатный тракт (поли А). Две субъединицы 60—705-комплекса соединены водородными связями взаимо- комплементарных 5'-концов, там же располагаются последова-
тельности, родственные тРНК-затравке [Keith J. et al., 1974; Coffin J., 1982].
Геном компетентных по репликации ретровирусов состоит из следующих идентифицированных областей:
R—короткая последовательность (20―80 нуклеотидов), повторяющаяся на обоих концах вирусной РНК. Она используется в процессе репликации, обеспечивая перенос вновь синтезированной цепи (фрагмента) ДНК и ДНК-полимеразы с 5'-конца на З'-конец генома [Coffin J., 1980; Boone L., Skalka A., 1981 ];
U5 — определяемая как область (80—100 нуклеотидов) уникальных последовательностей, отделяющая R от сайта связывания затравки (primer-binding—РВ);
РВ(——)—сайт связывания тРНК-затравки для синтеза негативной цепи ДНК. Он комплементарен 16—19 нуклеотидам участка затравки З'-термннатора [Coffin J., 1980];
L — нетранслируемые последовательности (около 250 нуклеотидов в случае вируса саркомы Рауса — ВСР), предшествующие кодирующей области для вирусных белков. Они содержат последовательности, необходимые для упаковки геномной РНК в вирионы. R, U5, РВ(—), большинство или все L являются частью лидирующих последовательностей, которые лигируются с субгеномными РНК при помощи сплайсинга (например, с иРНК env и src) [Coffin J., 1980; Dhar R. et al., 1980; Weiss S. et al., 1981 ];
gag — область (около 2 т. с.), кодирующая внутренние структурные белки вириона. В результате трансляции этих последовательностей образуется высокомолекулярный полипротеин-предшественник (precursor polypeptide — Рг), который затем подвергается «нарезанию», образуя зрелые белки [Eisenman R., Vogt V., 1978];
pol ——область (около 3 т. о.), кодирующая вирусную РНК- зависимую ДНК-полимеразу с ее различными энзиматическими активностями. Трансляция, по-видимому, осуществляется одновременно с обоих генов — gag и pol, в результате чего синтезируется предшественник с молекулярной массой 180—200 килодальтон (кд), впоследствии подвергающийся процессированию, образуя один или два полипептида [Gerard G., Grandgenett D., 1980; Coffin J., 1982];
env ——область (около 2 т. о.), кодирующая белки, находящиеся на поверхности вирусной оболочки. По крайней мере один из них гликолизирован. Транслируются эти белки на матрице иРНК, прошедшей сплайсинг. Предшественник, синтезированный на этой иРНК, также подвергается процессингу в два зрелых белка [Klementz R., Diggelmann Н., 1978];
src-Последовательность найдена только в ВСР. Эта область (2,2 т. о.) ответственна за быструю трансформацию инфицированных фибробластов in vitro и не требуется ретровирусу для репликации. На субгеномной, подвергнутой сплайсингу иРНК синтезируется фосфопротеин (phosphopolypeptide ——рр) с молеку-
лярной массой 60 кд, имеющий протеинкиназную активность. Мутанты, которые утрачивают src-функцию и большую часть гена, но не весь ген, с высокой частотой возникают в процессе пассирования вируса на клетках. Эти вирусы получили название дефектных по трансформации (td-мутанты);
РВ( + ) —участок идентифицирован на 5'-коние из-областн, содержит сайт начала синтеза позитивной цепи вирусной ДНК, хотя затравка для этой реакции неизвестна. Эта область богата пуринами и содержит высококонсервативные последовательности, гомологичные у неродственных ретровирусов [Coffin J., 1982];
U3 — область располагается между PB(-f-) и R недалеко от З'-конца генома и представлена дважды в интегрированном и неинтегрированном провирусе. Она варьирует в размере от 0,2 до 1,0 т. о. у различных вирусов. Одна копия U3 располагается к 5'-кониу сайта инициации транскрипции и содержит промотер транскрипции [Yamamoto Н. et al., 1980];
U5R — иногда называется как «strong-stop-область»;
LTR ——длинный концевой повтор, представляет собой комбинацию последовательностей U3RU5 геномной РНК в линейной и кольцевой формах ДНК провируса.
Порядок расположения трех репликативных генов у всех ретровирусов идентичен: 5' — gag-pol-env — 3，[Coffin J., 1980]. Геном ряда онкогенных ретровирусов содержит поеледовательности, необходимые для проявления их онкогенных свойств. Эти последовательности получили название onc-гены (онкогены). Поэтому расположение генов одного из представителей остротрансфор- мирующих ретровирусов кур — ВСР может быть представлено в следующем виде: 5' — gag-pol-env-src — 3'. Однако в опухолях наиболее часто встречаются ретровирусы с иной локализацией онкогена в геноме. В этом случае онкогенность ретровируса сопровождается дефектностью по репродукции вируса в клетках, поскольку они обычно при этом утрачивают значительные области генов gag, pol н (или) env, сохраняя неизмененными LTR.
Большинство, если не все онкогены ретровирусов имеют гомологов, т. е. близкородственные последовательности в геноме нормальных клеток. опс-Специфические последовательности клеточного генома топографически не связаны с эндогенными последовательностями ретровирусов, что может указывать на необходимость рекомбинационных событий для трансдукции клеточных онкогенов в вирусный геном. Более подробные сведения о молекулярной структуре онкогенных ретровирусов можно найти в работах Ф. Л. Киселева и соавт. (1983) и J. Coffin (1980, 1982).
В структурном отношении организация генома онкогенных ретровирусов изучена достаточно полно. В ближайшие годы, по-видимому, основные усилия будут направлены на уточнение механизмов транскрипции и трансляции вирусной онкогенной информации, что имеет первостепенное значение для понимания процесса трансформации клеток этими агентами.
РЕПЛИКАЦИЯ РЕТРОВИРУСОВ
Прошло уже около полутора десятков лет, как утвердилось мнение о необходимости в репродуктивном цикле ретровирусов стадии промежуточного синтеза ДНК. Различные аспекты репликационной схемы: РНК-* ДНК-*РНК-*белок были изучены за этот период весьма детально. В первую очередь это относится к механизмам синтеза ДНК-провируса, т. е. к транскрипции вирусной РНК в ДНК с помощью фермента обратной транскриптазы. В настоящее время исследователи могут проследить буквально по часам ход реализации генетических программ при репродукции ретровирусов. Однако многие молекулярно-биологические события этого процесса все еще остаются недостаточно ясными.
Temin (1964) первым высказал предположение о том, что для репродукции и трансформации клеток, инфицированных ретровирусами, необходим синтез ДНК, и обосновал это предположение экспериментально. В последующем указанное положение было многократно подтверждено [Bader J., 1965; Baluda М , 1972]. Решающую роль при этом сыграло открытие в очищенных вирионах ВСР и других ретровирусов ферментной системы обратной транскрипции, непосредственно осуществляющей синтез ДНК- копии генома. Оно явилось прямым доказательством провирусной гипотезы [Temin Н., Baltimore D., 1972]. Методами молекулярной гибридизации и трансфекции были получены свидетельства присутствия в геноме клетки-хозяина интегрированного ДНК-провируса, а также установлена его информационная емкость. Оказалось, что интегрированный ДНК-провирус содержит весь набор генов, необходимый как для репродукции вирусных частиц, так и для трансформации реципиентных клеток [Князев П. Г. и др., 1976; Baluda М., 1972; Hill М., Hillova J., 1972; Hanafusa Н. et al., 1974]. Эксперименты по трансфекции подтвердили также возможность синтеза полноценного ДНК-провируса в бесклеточной системе [Boone L., Skalka А., 1981; Varmus Н., 1982].
Синтез провирусной ДНК. Прежде чем перейти к обсуждению вопросов образования провирусной ДНК, кратко рассмотрим структуру и функцию вирусной ДНК-полимеразы, роль и свойства затравки в этой реакции, а также формы вирусной ДНК, которые обнаруживаются в инфицированных клетках.
Основными энзиматическими активностями продукта гена pol являются: ДНК-полимераза, способная копировать РНК или ДНК-матрицы, и так называемая рибонуклеаза Н (РНКаза Н), гидролизующая РНК в гибридной молекуле РНК：ДНК [Gerard G., Grandgenett D., 1980; Varmus H., 1982].
В структурном отношении и по антигенным свойствам ДНК- полимеразы различных штаммов ретровирусов отличаются друг от друга.
ДНК-полимераза вирусов саркомо-лейкозного комплекса птиц состоит из двух субъединиц: а — 58 кд и Р — 92 кд [Gerard G.,
Grandgenett D., 1980]; анализ пептидных и аминокислотных последовательностей фермента показал, что а- и р-субъединицы гомологичны, однако они в процессе обратной транскрипции вирусного генома выполняют разную роль. Предполагается, что р-субъединица обеспечивает взаимодействие фермента с матрицей, а а — осуществляет транскрипцию. Образование а-субъединицы происходит в результате процессирования р-субъединицы протеазой р15, кодируемой геном gag [Ghysdael J. et al., 1981 ]. В ходе процессирования р-субъединицы образуется также В-фрагмент, функция которого неизвестна. При обработке а-субъединицы химотрипсином образуется A-фрагмент, с которым связана активность РНКазы Н. Процесс обратной транскрипции генома ретровирусов птиц сопровождается фосфорилированием р-субъеди- ницы, однако влияние этой реакции на функцию фермента не известно [Gerard G., Grandgenett D., 1980; Moelling К. et al., 1980].
Уникальность ДНК-полимеразы ретровирусов заключается в том, что ее природными матрицами являются молекулы РНК. Однако для реакции обратной транскрипции присутствия матрицы недостаточно. Образование провируса происходит лишь в том случае, если в реакции участвуют соответствующие молекулы РНК-затравки [Harada F. et al., 1979; Varmus H. et al., 1979; Gerard G., Grandgenett D., 1980]. Как и все известные ДНК- полимеразы, обратная транскриптаза представляет собой функционально «затравказависимый» фермент. Наиболее эффективными затравками для действия фермента оказались синтетические гомополимерные матрицы (олигодезоксирибонуклеотиды), например поли (рЦ), олиго (дГ) и некоторые другие [Gerard G., Grandgenett D., 1980; Varmus H., Swanstrom R., 1982]. Естественными же затравками для работы фермента служат определенные тРНК. In vitro в различных системах обратной транскрипции иРНК вирусов и клеток эукариотов могут использоваться уникальные структурные свойства самих матриц для получения ДНК транскрипта с их определенного участка. Так, наличие полиаденилатного тракта на З'-конце иРНК позволяет в присутствии затравки олиго (дТ) синтезировать гетерополимерные участки, следующие за поли (An) [Gerard G., Grandgenett D., 1980; Boone L., Skalka A., 1981]. Широкоиспользуемой затравкой для синтеза высокопредставительной копии гетерологичных иРНК служат олигонуклеотиды ДНК тимуса теленка (статистические, усредненные, «rendom primers»).
Большое влияние на процесс транскрипции матрицы оказывают очистка ДНК-полимеразы от РНКаз, гидролизующих матрицу, и концентрации каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата в реакции [Varmus Н. et al., 1979; Gerard G., Grandgenett D., 1980].
Функциональная роль РНКазы H в системе ДНК провируса in vitro н in vivo изучена в меньшей степени. В последнее время с функцией РНКазы Н стали связывать деградацию РНК-матрицы
в процессе синтеза (—)-цепи вирионной ДНК [Varmus Н. et al., 1979; Gerard G., Grandgenett D., 1980]. В этих исследованиях было установлено, что олигонуклеотиды, образующиеся в результате действия РНКазы Н на гибридные молекулы РНК：ДНК, могут служить в качестве затравки для синтеза второй, ( + )-цепн вирионной ДНК [Boone L., Skalka А., 1981; Varmus Н., Swan- strom R., 1982]. Вероятно, в условиях in vivo данный фермент выполняет именно такую роль.
С ДНК-полимеразой вируса миелобластоза птиц ассоциирована еще одна ферментативная активность, эндонуклеазная. Этот фермент также располагается в коре вириона, имеет молекулярную массу 32 кд и является продуктом процессинга р-субъединицы ДНК-полимеразы, т. е. В-фрагментом [Gerard G., Grandgenett D., 1980]. Этот важный фермент, связанный с провирусом, вероятнее всего, участвует в процессе интеграции вирусной ДНК в клеточный геном [Gerard G., Grandgenett D., 1980; Varmus H., Swanstrom R., 1982].
Большинство молекул вирусной ДНК, синтезированной in vitro на субъединице РНК, представляют собой короткие фрагменты ограниченной части вирусного генома [Varmus Н. et al., 1979]. Иногда удается получить короткие транскрипты, представляющие в сумме полную копию вирусной или гетерологичной РНК. Это позволило успешно использовать данный метод для получения комплементарной ДНК (кДНК) отдельных вирусных и клеточных генов и успешно осуществить их клонирование [Maniatis Т. et al., 1976; Boone Н., Skalka А., 1981].
Вирусная ДНК составляет небольшую часть (0,0001 % или меньше) от всего препарата ДНК инфицированных клеток. Это существенно затрудняло изучение биосинтетических процессов, приводящих к образованию ДНК-провируса. Тем не менее в ходе репродукции ретровирусов в клетке удалось определить 3 основные формы вирусной ДНК： линейную двухцепочечную, циркулярную двухцепочечную и ковалентно-интегрированную в геном хозяйской клетки [Varmus Н. et а!., 1979; Varmus Н., 1982].
Эти формы ДНК, как было показано в экспериментах по трансфекции, содержат всю генетическую информацию, представленную в субъединице вирионной РНК [Varmus Н., 1982].
Количественно преобладающая линейная форма вирусной ДНК имеет такие же размеры, как и субъединица вирионной РНК, т. е. 5——10 тысяч пар оснований (т. п. о.). В принципе — это полная копия провируса, т. е. ( —)-цепь вирусной ДНК, включающая отдельные фрагменты ( + )-иепн вирионной ДНК, размером от нескольких сот до тысячи пар нуклеотидов. В отдельных случаях эта форма ДНК может быть выявлена в виде полностью двухцепочечной молекулы, т. е. содержащей как (—)- так и ( + )-цепн провируса [Varmus Н. et al., 1979].
В настоящее время известно, что поеледовательности нескольких сот нуклеотидов, расположенных на обоих концах линей-
a
5 R(1「■— Ап 3,Гены вирионной РНК
R 5
5’ Cap —f 三：H
-T
Линейная ДНК
Провирусная ДНК
ip
ip
LTR
Соединение двух LTR в кольцевой ДНК
О
ная ДНК Про моте р
б
«
Вирусная РНК
Рис. 3. Структура (а) субъединицы геномной РНК ретровирусов и схема (б) репродукции через ДНК-провирус [Coffin J.. 1980; Varmus Н., Swanstrom R., 1982]. 5'Сар ——кэппирующая группа; Ап3‘ 一 полиаденилатный тракт; R ——короткие последовательности; U5 — уникальные последовательности 5'-кониа, которые располагаются между РВ(——)и R: U3 •- уинкальиые последовательности З'-кониа, расположенные между РВ( + ) и R； ip — инвертированные повторы, обрамляюшие LTR с двух сторон; dp — прямые повторы клеточной ДНК (4—6 п. о.) представлены единичной копией в <неоккупнроваи- иом> сайте интеграции; детали размеров областей генома ретровирусов и их вариации даиы в тексте.
ной молекулы вирусной ДНК, повторяются в одинаковой ориентации (концы 5' и 3' однонаправлены). Они получили название длинных концевых повторов — LTR [Coffin J., 1982; Temin H., 1982; Varmus H., Swanstrom R., 1982]. LTR содержат последовательности, происходящие из гетерополимерных участков 5'- и З'-кониов вирусной субъединицы РНК (рис. 3). Как видно из рис. 3, в LTR представлены: нуклеотидные последовательности длиной 250——1200 пар оснований (п. о.), комплементарные уникальной области З'-кониа вирионной РНК (из-пос』едователь- ности); короткая единичная копия R-последовательности, обнаруженная на обоих концах вирусной РНК, и участок длиной 80—120 п. о. уникальной области 5'-кониа (и5-последователь- ности).
Размеры областей U3 и U5 значительно варьируют у ретро- вирусов разных видов животных. U5 граничит в З'-направленнн с участком (сайтом), определяющим начало синтеза ( —)-цепи ДНК, а в 5'-направленнн—с R. U3 граничит в 5'-направ〃еннн с участком (сайтом), определяющим начало синтеза (+)-цепи вирусной ДНК, а на З'-направленнн с R (см. рис. 3). Схематическое расположение LTR в линейном провирусе можно представить следующим образом: U3RU5 — вирусные гены — U3RU5 [Kung Н. et al., 1981; Varmus H., Swanstrom R., 1982]. Секвенирование клонированных последовательностей LTR показало, что
они включают также в свой состав несовершенный инвертированный (обратный) повтор длиной 5—22 нуклеотида, который терминирует структуру LTR с двух сторон [Shimotohno К. et al., 1980; Kung Н. et al., 1981; Varmus H., Swanstrom R., 1982].
Механизм образования линейной двухцепочечной формы вирусной ДНК in vitro в общих чертах изучен. Ряд стадий этого процесса подтвержден в случае репродукции ретровирусов в клетке.
Линейная форма ДНК с одинаковой эффективностью синтезируется в цитоплазме как ядерных, так и безъядерных клеток, что свидетельствует о ее цитоплазматическом происхождении [Varmus Н., 1982; Varmus Н. et al., 1982]. В дальнейшем линейная ДНК транспортируется в ядро, где происходит превращение линейной формы провируса в кольцевую.
Формирование кольцевого провируса является последним этапом перед интеграцией вирусного и клеточного геномов. Процесс образования кольцевой молекулы хорошо документирован, и основная роль в нем отводится LTR. Клонирование, а затем последующее секвенирование вирусной ДНК показали, что она может содержать один или два LTR (см. рис. 3). В последнем случае два LTR располагаются в прямом тандемном повторе [Varmus Н. et al., 1979; Kung Н. et al., 1981; Varmus H., Swanstrom R., 1982]. Как правило, циркулярный ДНК-провирус представляет собой мономер, хотя иногда из инфицированных ретровирусами клеток удается изолировать и олигомерные структуры [Varmus Н., Swanstrom R., 1982].
Циркулярная ДНК может быть выделена только из ядерной фракции инфицированных клеток [Varmus Н., Swanstrom R., 1982]. Вероятно, именно в ядре обеспечивается процесс циркуля- ризации молекулы провируса.
Открытие циркулярной формы ДНК-провируса ретровирусов позволило выдвинуть предположение о едином механизме интеграции в геном хозяина генетического материала не только ретровирусов, но и ДНК-содержащих онкогенных вирусов, таких как паповавирусы, или, например, фага X. Для последнего были получены строгие доказательства необходимости процесса образования кольцевой формы молекулы ДНК в период интеграции провируса в геном хозяина. Однако на сегодня прямых доказательств существования подобного способа интеграции ретровирусной ДНК не существует.
В настоящее время широко распространено мнение, что структура ДНК-провируса в общих чертах напоминает структуру транспозонов, т. е. мобильных генетических элементов, обнаруженных у бактерий и у дрозофилы [Георгиев Г. П., 1983; Calos М., Miiller J., 1980; Dunsmuir Р. et al., 1980; Shimotohno К. et al., 1980]. Большинство этих генетических единиц, состоящих из нескольких тысяч неповторяющихся последовательностей, терминируются прямыми и (или) обратными повторами длиной до
нескольких сот оснований. Бактериальный транспозирующий элемент Тп9 по своей генетической структуре напоминает ДНК- провирус. Структурная информация, состоящая более чем из 1000 п. о., фланкируется прямыми повторами размером 800 п. о., которые, в свою очередь, терминируются несовершенным обратным повтором размером 18—25 п. о. [Calos М., МйПег J., 1980]. Наиболее интригующая аналогия между транспозонами и провирусами усматривается в их способе интеграции в ДНК хозяина. Недавно были получены данные, указывающие на то, что интеграция провируса в клеточную ДНК сопровождается дупликацией короткого фрагмента, содержащего последовательности сайта интеграции [Dhar R. et al., 1980; Shimotohno К- et al., 1980; Swanstrom R. et al., 1981]. Такой же феномен был обнаружен ранее для бактериальных транспозонов: прямые фланкирующие повторы, обычно размером 5—9 п. о. приобретаются транспозоном из генома хозяина в процессе транспозиции [Calos М., Muller J., 1980; Shimotohno К. et al., 1980]. Аналогичная короткая дупликация наблюдается в случае транспозиции подвижных элементов генома дрожжей [Gafner V., Phillipsen Р., 1980] и дрозофилы [Dunsmuir Р. et al., 1980].
Несмотря на то, что многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют в пользу предпочтительной интеграции провируса в клеточный геном через его кольцевую форму, до сих пор в этом вопросе остаются сомнения. В частности, в специальных опытах было показано, что присутствие двух LTR в ДНК-провирусе не является обязательным для интеграции последнего в клеточный геном, хотя известно, что именно LTR в концевых положениях ДНК-провируса необходимы для замыкания линейной формы в кольцевую. Иными словами, процесс интеграции провируса может осуществляться без участия LTR.
Главная функция ДНК-провируса как вирусной матрицы в клетке состоит в редупликации и обеспечении синтеза вирусных иРНК, образование которых свидетельствует о начале стадии экспрессии вирусного генома [Varmus Н., 1982]. Однако, прежде чем перейти к детальному рассмотрению вопросов редупликации и синтеза вирусных иРНК, коротко остановимся на некоторых дополнительных функциях провируса, являющихся следствием интеграции двух геномов. К ннм относятся: мутагенез, промоция транскрипции клеточной ДНК, онкогенез (активация протоонкогенов по механизму инсерции), трансдукция, транспозиция, делеции и эксцизии.
Мутагенез. Генетические элементы, способные интегрироваться в различные участки клеточной ДНК, могут влиять на экспрессию хозяйских генов. Подобный эффект может достигаться простым нарушением физической структуры расположения генов или влиянием на их экспрессию регуляторных элементов, расположенных в LTR провируса. Примеры указанного феномена имеются среди фагов-мутаторов или транспозирующих элементов
прокариотов [Calos М., Miiller J., 1980; Shimotohno К. et al., 1980]. H. Varmus и соавт. (1981) показали мутационную способность провирусов в экспериментах по суперинфекции трансформированных вирусом саркомы Рауса клеток крыс нетрансформирующим вариантом вируса лейкоза мышей. Авторы установили, что ревертанты, имеющие морфологические характеристики нормальных клеток, содержали гибридный провирус. При этом провирус вируса лейкоза Молони интегрировался внутрь провируса ВСР в S'-участок src-гена, что приводило к нарушению экспрессии онкогена.
Промоция транскрипции клеточной ДНК- Промоция транскрипции клеточных ДНК и онкогенез имеют, по видимому, единый механизм и будут подробно рассмотрены в гл. 4. Здесь следует лишь указать, что активация транскрипции хозяйской ДНК, расположенной «вниз по течению» от интегрированного провируса, под влиянием вирусных LTR наблюдается как в клетках млекопитающих, трансформированных ВСР, так и в опухолях, индуцированных вирусами лейкоза птиц. В последнем случае происходит активация протоонкогена с-тус, гомологичного онкогену v-myc вируса мнелоинтоматоза кур МС-29, провирусом вируса лейкоза птиц, интегрирующимся «вверх по течению» от указанного протоонкогена [Collins С. et al., 1980; Hayward W. et al., 1981].
Онкогенез. В большинстве случаев функция провируса в онкогенезе заключается в экспрессии его генного продукта (см. раздел «Вирусные онкогены»). Однако вирусные онкогены не всегда могут быть обнаружены в провирусе, который индуцирует онкогенез. Такие данные позволили высказать предположение о том, что позиция провируса в хозяйском геноме может определять малигнизацию клеток-мишеней. Вскоре это положение было подтверждено данными, полученными W. Hayward и соавт. (1981), а также другими [Rechavi G. et al., 1982].
Трансдукция. В ряде экспериментальных работ были получены убедительные данные, свидетельствующие о возможности захвата (трансдукции) клеточных последовательностей в вирусный геном при пассировании вируса в культурах клеток. Прежде всего это относится к трансформирующим генам многих ретровирусов. Механизм трансдукции сложен и до конца не изучен. Исходя из имеющихся представлений о структуре провируса, акт захвата клеточных генов, располагающихся рядом с провирусом, маловероятен. Известные в настоящее время принципы транскрипции провируса и обратной транскрипции вирусной РНК налагают ряд запретов на реализацию подобного явления. Тем не менее получены данные, свидетельствующие о том, что частота акта трансдукции клеточных генов в провирус не столь редкое явление. Она может даже искусственно повышаться, например при пассировании ВСР на клетках уток и крыс [Varmus Н., Swanstrom R., 1982].
Транспозиция. Как уже отмечалось выше, структура провируса и транспозонов прокариот в общих чертах сходна. Однако, в отличие от последних, возможность транспозиции провирусов экспериментально не подтверждена. Анализ структуры провирусов многочисленных субклонов клеток, инфицированных и трансформированных ретровирусами [Shimotohno К. et а0 1980; Varmus Н. et al., 1981 ], а также большого числа эндогенных провирусных последовательностей отдельных особей различных пород кур и мышей [Astrin S., 1978; Shimotohno К. et al., 1980] свидетельствует о стабильности интеграции провируса.
Делении и эксцизии. Полные или частичные делеции транспозирующих элементов бактериального генома представляют собой часто наблюдаемое явление [Varmus Н. et al., 1981]. Подобные делеции, приводящие к удалению LTR из провирусов, обычно левого LTR, часто встречаются среди эндогенных провирусных генов птиц и экзогенных провирусов ALV в опухолях бурсы, а также в процессе спонтанной реверсии трансформированных ВСР клеток млекопитающих в нормальный фенотип (Hayward W. et al., 1981 ].
Эксцизии большей части провируса — также нередкое явление, наблюдаемое в различных клеточных системах, трансформированных ретровирусами. С эксцизиями внутренних репликативных генов исследователи столкнулись при анализе экзогенного провируса ALV в опухолях бурсы у кур.
В процессе пассирования ряда трансформированных ВСР клеточных линий крыс, хомяков и мышей также показана элиминация провирусных генов, включая src [Киселев Ф. Л. и др., 1979, 1981; Varmus Н. et al., 1981; Bishop J., Varmus H., 1982]. В некоторых случаях реверсии клеток в нормальный фенотип эксцизии сопровождались утратой не только внутренних генов провируса, но и обоих LTR. Механизм делений и эксцизий вирусных генов неизвестен. Остается загадкой, экспрессией каких генов поддерживается раковый фенотип клеток млекопитающих, утративших весь экзогенный провирус, включая онкоген [Varmus Н. et al., 1981].
Таким образом, первая фаза жизненного цикла ретровирусов в клетке заканчивается созданием провируса и его интеграцией в клеточный геном. Доминирует в этом процессе вирускодируемая ферментная система обратной транскрипции и, по-видимому, интеграции. Влияние клеточных факторов на процессы формирования провируса в этой фазе биологического цикла несущественно. Напротив, вторая фаза биологического цикла ретровирусов, которая начинается с экспрессии генов провируса и заканчивается в большинстве случаев продукцией вирусных частиц, практически полностью осуществляется ферментными системами клеток. Этот факт подчеркивает первостепенную важность клеточных элементов на решающем уровне экспрессии вирусной информации. Клеточные факторы ответственны за ряд важных этапов репродукции
и биологической активности вирусов: синтез и процессинг ретровирусной иРНК, репликацию самого провируса, синтез и некоторые ступени процессинга вирусных белков.
Экспрессия вирусного генома. Ретровирусы в процессе эволюции развили сложный механизм, позволяющий их генам экспрессироваться в клетке-хозяине. Прежде всего следует отметить различную молекулярную организацию клеточного и вирусного геномов. В эукариотической клетке гены состоят из отдельных цистронов (экзонов), прерывающихся некодирующими областями (интронами). Провирусы, напротив, представляют собою мульти- цистронную генетическую единицу, в которой индивидуальные цистроны не прерываются некодирующими участками. Это утверждение пока не подтверждено данными полного секвенирования вирусной ДНК, но находит поддержку в экспериментах по трансляции вирионных РНК in vitro [Weiss S. et al., 1978] и секвенированию отдельных вирусных генов [Czernilofsky А. et al., 1980]. Ферментные системы клеток эукариотов, по-видимому, не способны осуществлять транскрипцию отдельных генов независимо друг от друга. Результатом экспрессии любого гена является образование про-иРНК, которая затем подвергается процессингу («вырезанию» некодирующих областей) и сплайсингу («сшиванию» отдельных кодирующих областей). В дальнейшем процессированная и сплайсированная иРНК полиаденилируется на 3'-конце, а на 5'-конце присоединяется кэппирующая группа. Подобный механизм экспрессии генетической информации обнаружен у всех ретровирусов животных [Varmus Н., Swanstrom R., 1982].
В этом плане экспрессия генов зависит от двух факторов: структуры иРНК, комплементарных вирусным или клеточным участкам генома, и расщепления первичного продукта трансляции (полипротеина) на несколько зрелых конечных белков. В ретровирусах функционируют оба этих механизма. Субгеномные иРНК, кодируемые внутренней частью вирусного генома, направляют синтез белков, которые образуются после «разрезания» первичного продукта трансляции [Eisenman R., Vogt V., 1978] и созревают в ходе процессинга.
Транскрипция ДНК-провируса после его образования осуществляется клеточной РНК-полимеразой II, ответственной также за синтез клеточных иРНК. Несколько исследовательских групп установили, что в и3-области LTR провируса находятся промотер и сайт инициации синтеза вирусных РНК [Yamamoto Т. et al., 1980; Swanstrom R. et al., 1981]. Последовательности, имеющие отношение к началу транскрипции провируса, ТАТАААА, обнаружены также в клеточных генах [Ziff Е., Evans R., 1978]. Сигнал, терминирующий транскрипцию, находится рядом с правым U3R- концом (З'-концом) провируса. Он определенным образом связан с сигналом полиаденилирования иРНК — AAUAAA [Czernilofsky A. et al., 1980].
В клетках кур, инфицированных ВСР, обнаружены следующие классы вирусспецифических иРНК： 38S, 28S и 21S длиной соответственно 9 т. о., 5,4 т. о. и 3,3 т. о. В клетках, инфицированных вирусом лейкоза мышей, обнаружено только 2 класса иРНК： 35S и сплайсированная 22—24S [Weiss S. et al., 1978; Varmus H., Swanstrom R., 1982]. Продуктом гена gag BCP является полипротеин с молекулярной массой 65——80 кд, транслируемый с иРНК, неотличимой от субъединицы генома. Терминируется продукт гена gag кодоном УАГ. Полипротеин (Pr76Kag) модифицируется путем фосфорилирования и «разрезания» протеазами на мелкие белки сердцевины (кора) вириона: NH2—р|9-р10-р27-р|2-р15 — СООН [Eisenman R., Vogt V., 1978; Shealy D. et al., 1980].
Первичным продуктом гена pol является также большой полипротеин (Prl80gaB ро1), содержащий детерминанты гена gag,— p「76gag. Информационная РНК для Prl80Kagpo1 (ДНК-полимеразы) структурно не отличается от иРНК гена gag. Механизм, при помощи которого РНК-полимераза II беспрепятственно проходит терминирующий кодон УАГ, неизвестен. Предполагается, что кодон УАГ в данном случае подвергается сплайсингу. Существует и другое объяснение подобному феномену, которое допускает сборку вирионов, содержащих 38S РНК (в большинстве случаев для гена gag и для гена pol), без терминатора [Eisenman R., Vogt V., 1978; Klemetz R., Diggelmann H., 1978; Coffin J., 1980].
Ген env экспрессируется при участии субгеномной 28S РНК, формирующейся путем сплайсинга. Предшественник белков оболочки вириона 肝「92'"' содержит два белка, gp85 и gp37, из чего можно заключить, что структура гена env для белков такова: NHrgp85-gp37-COOH [Lewin J., Rosenak M., 1976; Klemetz R., Diggelmann H., 1978; Coffin J., 1982]. Как полагают, в дальнейшем предшественник gPr92eriv встраивается в клеточную мембрану, где он гликолизируется и процессируется до образования гликопротеидов, входящих в оболочку вирионов.
Синтез опс-специфических иРНК и кодируемых ими белков будет подробно рассмотрен в следующем разделе этой главы.
Вируспродуцирующие клетки синтезируют два типа вирусных РНК- иРНК первого типа служат матрицей для трансляции вирусспецифических белков, участвующих в компоновке вириона. Другой тип ——геномная РНК, которая в дальнейшем может упаковываться в вирусное потомство. Выше было отмечено, что структурные различия среди этих вирусспецифических РНК выявить пока не удалось. Тем не менее различия могут быть выявлены функционально. Например, при блокировке синтеза РНК вируса лейкоза мышей актиномицином Д образование вирусного пoтoм^ ства продолжается, однако вирусные частицы содержат не вирусные, а клеточные иРНК [Levin J., Rosenak М., 1976]. Эти результаты говорят о том, что геномная РНК и нРНК возникают из разного пула вирусных РНК.
Таким образом, в общих чертах принципы экспрессии ретровирусных генов известны. В будущем предстоит более детально изучить те области провируса, которые участвуют в регуляции второй из упомянутых ранее двух фаз экспрессии вирусного генома. Выше было отмечено, что этот второй этап репродукции вирусного генома в большей степени зависит от ферментных систем, метаболизма и других факторов клетки. Действительно, влияние клеточных факторов на экспрессию генетической информации ретровирусов велико. Особое внимание исследователей в настоящее время привлечено к изучению экспрессии опс-специ- фических участков (онкогенов) вирусного и клеточного геномов. Это понятно, так как именно с экспрессией онкогенов включаются механизмы, приводящие клетку к трансформации. Поскольку в структурном отношении онкогены существенно отличаются друг от друга, вполне вероятно, что и механизмы их экспрессии имеют индивидуальные черты. В целом экспрессию вирусных онкогенов следует рассматривать как результат активации и функционирования гибридного генома провируса и клетки.
СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ОНКОГЕНОВ РЕТРОВИРУСОВ
Вирусы, обладающие опс-последовательностями (онкогенами), были изолированы как минимум от шести видов животных. Сравнение опс-областей генома этих вирусов при помощи молекулярной гибридизации, фингерпринтного анализа олигонуклеотидов и пептидного картирования соответствующих онкобелков показало, что более 20 неродственных клеточных генов являются донорами (прародителями) вирусных онкогенов [Cooper G., 1982; Bishop J., 1982, 1983; Weinberg R., 1982; Land H. et al., 1983; Swanstrom R. et al., 1983]. Для того чтобы различать определенные трансформирующие элементы вирусного генома, стали использовать трехбуквенные обозначения каждого из онкогенов. Эта номенклатура one-последовательностей получила широкое распространение и принята повсеместно. Обозначение трансформирующих последовательностей происходит от названия вируса, в котором впервые трансформирующие последовательности были обнаружены, и не означает их специфичности для клетки-мишени или функции онкобелка. Поскольку родственные, но неидентичные вирусные онкогены часто обнаруживаются в независимых вирусных изолятах, их название соответствует первоисточнику, к которому добавляется лишь сокращенное наименование вирусного штамма [Coffin J. et al., 1981; Bishop J., Varmus H., 1982]. •
Вирусные и родственные нм клеточные последовательности обозначают следующими сокращениями: «V» — вирусный и «с» — клеточный онкогены. Если название онкогена представлено без префикса, то это свидетельствует о его вирусном характере. В отечественной литературе для обозначения вирусных и клеточных трансформирующих последовательностей наиболее часто упо-
Таблица 11
Трансформирующие гены (онкогены) [Weinberg R., 1983; Bishop J., 1983; Hunter T., 1984]
Онкогены
Источник изолирования
Животное- носитель
Индуцируемая опухоль или злокачественный процесс
Локализация в хромосомах
Онкобелки
человека
мыши
Молекулярная масса (кд) и генетическая структура
Локализация
Свойства
src
Вирус саркомы Рауса
Куры
Саркома
20
2
pp60src
Плазматическая мембрана
Фосфотиро- зинкиназа
yes
Вирус саркомы Яма- гуши
»
»
—
—
P90ga『yes
To же
То же
fps (fes)
Вирус саркомы Фуд- жинами
»
>
15gq 24—25
7
P140gag-(ps
Цитоплазма
»
Вирус саркомы Шнайдера
Кошки
>
—
—
P85gag"es
»
>
abl
Вирус лейкоза мышей Абельсона
Вирус сарком кошек HZ2-FeSV
Мыши
Кошки
В-клеточная лимфома
Саркома
9
2
P120gaR'ab,
P96ga『abl
Плазматическая мембрана То же
> >
ros
Вирус саркомы кур UR II
Куры
—
—
—
P68ga『ro$
>
>
fgr
Вирус саркомы кошек
Гарднера—Рашид
Кошки
Саркома
—
pjQgag-actin-fgr
—
»
erb-A
Вирус эритробластоза птиц, штамм
AEV
Куры
Эритроидный лейкоз.саркома
—
P75gs『e『b A
—
erb-B
То же
»
То же
17
—
gp65ebB
Плазматическая мем-
Фосфопро- теинкиназа
mos
Вирус саркомы мышей Молони
Мыши
Саркома
8
4
p37mos
брана Цитоплазма
(?)
raf (mil) fms
Вирус саркомы мышей 3611
Вирус саркомы кошек
Мыши, куры Кошки
Фибросаркома
Саркома
3
5
6
P78ga^'raf
P|80^ag-fms
Цитоплазма
Фосфопро-
Ha-ras 1
Мак-Доноха
Вирус саркомы мы
Крысы
»
11
7
pl20fms p21Haras 1
Плазмати
теинкиназа
Фосфотрео-
Ha-ras 2 *
шей Харвея
X
ческая мембрана
нинкиназа
N-ras
—
—
—
1
—
p2]№ras
Плазмати
Ki-ras 1 **
ческая мембрана
Ki-ras 2
Вирус саркомы мы
Крысы
Саркома
12
6
p21Kiras
Плазмати
Фосфотрео*
myc
шей Кирстена
Вирус птичьего ми-
Куры
Карцинома»
8q24
15
P9Qgag-myc
ческая мембрана Ядерный
нинкиназа
myc + mil
елоцитоматоза МС 29, ОК 10, МН 2, СМ 11
Вирус лейкоза кошек МН-2, штамм вируса
Кошки Куры
саркома, ми- елоцитома
Миелолейкоз Лейкоз, карци
—
plOOgagmyc p| [Ogaggc P200Kagpo,myc
матрикс
—
c-myc
N-myc
птичьего миелоблас- тоза
Человек
нома
8
2
ррб2c・myc ррббСМ
Ядерный матрикс
Фосфопротеин
myb
Вирус птичьего ми-
Куры
Миелобластная
6
10
p45V-myb
Ядерный
—
елобластоза, штамм AMV
лейкемия
матрикс, перинуклеарное пространство
Онкогены
Источник изолирования
Животное- носитель
Индуцируемая опухоль или злокачественный процесс
Локализация в хромосомах
Онкобелки
человека
мыши
Молекулярная масса (кд) и генетическая структура
Локализация
Свойства
myb + ets
fos
ski
re!
Вирус птичьего ми- елобластоза, штамм Е26
Вирус остеосаркомы, штамм EBJ
Вирус птичьей саркомы SK 770
Вирус эндотелиоза птиц, штамм Т
>
Мыши
Куры
Индюшки
Эритробластоз
Саркома
»
Лимфоидный
лейкоз
2
1
—
p|35gag-myb-ets
р55fos
Ядерный матрикс То же
—
sis
Вирус саркомы шерстистых обезьян
SSV-1 (ASSP)
Вирус саркомы кошек FeSV (PI-FeSV)
Обезьяны
Кошки
Саркомы
»
22
15
р28* …
P76g&g・s 扭
Цитоплазма, межклеточное пространство
Таблица 11 (окончание)
процессирован и содержит ряд
* Псевдоген Ha-ras 2 близкородствен онкогену c-Ha-ras 1. Этот псевдогеи в <опал>-кодонов, блокирующих его транскрипцию.*• Протоонкоген Ki-ras I до конца не изучен, однако он близкородствен онкогену *** Оикобелок p28s,s идентичен В-цепи PDGF — ростового фактора тромбоцитов.* Псевдоген Ha-ras 2 близкородствен онкогену c-Ha-ras 1. Этот псевдогеи в <опал>-кодонов, блокирующих его транскрипцию.*• Протоонкоген Ki-ras I до конца не изучен, однако он близкородствен онкогену *** Оикобелок p28s,s идентичен В-цепи PDGF — ростового фактора тромбоцитов.геноме клеток человекаKi-ras 2.геноме клеток человекаKi-ras 2.Примечание, р ——протеин; Р — полипротеии; префиксом обозначен генетический источник экспрессии.
* Псевдоген Ha-ras 2 близкородствен онкогену c-Ha-ras 1. Этот псевдогеи в <опал>-кодонов, блокирующих его транскрипцию.
*• Протоонкоген Ki-ras I до конца не изучен, однако он близкородствен онкогену *** Оикобелок p28s,s идентичен В-цепи PDGF — ростового фактора тромбоцитов.
* Псевдоген Ha-ras 2 близкородствен онкогену c-Ha-ras 1. Этот псевдогеи в <опал>-кодонов, блокирующих его транскрипцию.
*• Протоонкоген Ki-ras I до конца не изучен, однако он близкородствен онкогену *** Оикобелок p28s,s идентичен В-цепи PDGF — ростового фактора тромбоцитов.
геноме клеток человека
Ki-ras 2.
геноме клеток человека
Ki-ras 2.
требляют сокращения онк-ген или онкоген (т. е. вирусный) или протоонкоген — его клеточный «родственник» [Сейц И. Ф. и др., 1982; Киселев Ф. Л. и др., 1983].
Общие свойства вирусных онкогенов и онкобелков. Для изучения ретровирусных онкогенов используют различные подходы, которые основываются прежде всего на особенностях структуры вирусного генома. К ним относятся генетический анализ различных мутантов, молекулярная гибридизация, рестрикционное и гетеродуплексное картирование, молекулярное клонирование, определение нуклеотидных последовательностей (секвенирование) ,анализ РНК-транскриптов в клетках, трансляции геномных и субгеномных молекул РНК, иммунологическое, пептидное картирование и выявление энзиматических свойств онкобелков.
В табл. 11 суммированы данные, касающиеся свойств ретровирусных онкогенов. Наиболее общим в биологическом плане свойством вирусных онкогенов является то, что они в подавляющем большинстве случаев у различных видов животных индуцируют опухоли. Все индуцируемые вирусными онкогенами неопластические процессы, перечисленные в табл. 11, имеют следующие патоморфологические характеристики: а) саркомы, которые возникают из соединительнотканных (мезенхимальных) элементов; б) лейкозы и другие близкие им заболевания, связанные с трансформацией гемопоэтических клеток; в) карциномы (например, рак молочной железы у мышей), встречающиеся исключительно редко.
Все вирусные онкогены имеют клеточное происхождение, причем их локализация в хромосомах клеток широко варьирует в зависимости от природы онкогена и вида животных. В табл. 11 приведена информация, касающаяся только хромосом человека и мыши, как наиболее изученных в этом отношении объектов.
Еще одним общим свойством онкогенов является необходимость их активации для проявления онкогенной функции. Это происходит с помощью одного из механизмов, подробно рассмотренных в гл. 4. Помимо этих общих свойств, отдельные ретровирусные онкогены имеют определенные индивидуальные особенности. •
Большинство вирусных онкогенов, идентифицированных в настоящее время, транслируется как часть слитного белка — полипротеина (Р), в котором аминотерминальный домен (область гена, определяющая ту или иную независимую функцию белковой молекулы) кодируется вирусными репликативными генами (gag или gag и pol). Это означает, что вирусные и клеточные трансформирующие белки должны обладать разной структурой и функцией, так как протоонкогены не связаны с эндогенными вирусными генами ни в топографическом, ни в функциональном отношении (см. гл. 5). Некоторые вирусные онкогены могут экспрессировать уникальные субгеномные иРНК, представляющие только опс- специфические поеледо в а тельноет и (например, sre, erb В, myb и.
вероятно, mos). В этом случае синтезируются онкобелки, не содержащие антигенные детерминанты, кодируемые репликативными генами.
Обнаружен другой класс онкобелков, который синтезируется на иРНК, равной по размеру геному (например, ras).
Механизмы трансформации клеток при помощи вирусных онкобелков неизвестны, однако ряд онкобелков обладает общими свойствами, например протеинкиназной активностью (или тесным образом с нею связаны), способной фосфорилировать тирозиновые остатки. Протеинкиназы онкогенов: src, fms, yes, ros, abl, fes, erb В и fgr являются фосфопротеинами, содержащими фосфотирозин или другие фосфорилированные аминокислоты.
Для некоторых онкобелков обнаружена одинаковая локализация в клетке. Так, например, онкобелки опс-генов src, abl и семейства ras тесным образом связаны с клеточной мембраной, a myc, ski, fos и myb — с ядерным матриксом (см. табл. 11).
ОНКОГЕНЫ РЕТРОВИРУСОВ ПТИЦ
Вирус саркомы Рауса был одним из первых ретровирусов кур, изолированным еще в 1911 г. Раусом (Р. Rous). В геноме этого вируса классическими методами генетики и молекулярной биологии был обнаружен и выделен первый онкоген src, а позже идентифицирован и трансформирующий белок [Stehelin D. et al., 1976; Linial M., Blair D., 1982]. BCP является единственным недефектным штаммом саркомы птиц, способным вызывать близкие по морфологической характеристике саркомы и трансформировать культуры фибробластов. Из вируса саркомы Рауса изолированы различные условные (по генам gag, pol и src) и делецион- ные (по генам pol и env) мутанты, что позволило в деталях изучить генетику вируса [Bishop J., Varmus Н., 1982]. Это, в свою очередь, способствовало идентификации онкогена и онкобелка.
Первый изолят ВСР имел ограниченный круг хозяев и мог индуцировать саркомы только у некоторых пород цыплят. Постоянное пассирование вируса на животных привело к расширению круга хозяев, варианты вируса приобрели способность индуцировать опухоли у различных видов птиц и даже млекопитающих. Л. А. Зильбер и И. Н. Крюкова (1957), Г. Я- Свет-Молдавский и А. С. Скорикова (1957) первыми установили возможность преодоления естественной резистентности клеток млекопитающих к вирусу саркомы Рауса (штамм Карра — Зильбера), получив у инфицированных взрослых крыс геморрагическое заболевание, заканчивающееся гибелью животного. В последующие годы это направление исследований плодотворно разрабатывалось в нашей стране [Аджигитов Ф. И., 1973; Кузнецов О. К., 1974; Зильбер Л. А. и др.» 1975; Киселев Ф.力.и др., 1983| и за рубежом [Свобода Я., 1965]. В этих работах удалось выяснить
молекулярные механизмы неспособности ВСР репродуцироваться в клетках млекопитающих и установить роль экспрессии гена src в процессе их малигнизации [Киселев Ф. Л. и др., 1983; Collins С. et al., 1980; Varmus Н. et al., 1981].
src-Онкоген вируса саркомы Рауса. src-Гены различных штаммов ВСР (включая некоторые независимые изоляты) очень похожи, но не идентичны друг другу. При помощи гибридизационного анализа с использованием кДНКзгс значительных различий между отдельными штаммами не выявлено [Stehe- lin D. et al., 1976; Wang L. et al., 1979]. Напротив, детальный олигонуклеотидный анализ показал небольшие штаммоспецифические отличия нуклеотидных последовательностей [Bishop J., Varmus Н., 1982], как и иммунологический и структурный анализ продукта src-гена [Collet М. et al., 1979; Neil J. et al., 1981; Bishop J., Varmus H., 1982].
На основании этих данных признается, что все src-гены разных штаммов ВСР происходят от общего гена-предшественника, родственного c-src-последовательностям хозяйских клеток.
Нуклеотидные последовательности фрагмента 3 т. п. о. генома ВСР штаммов Шмидта—Руппина (Ш-Р) и Прага были определены полностью [Czernilofsky A. et al., 1980]. Расшифровка первичной структуры src-гена позволила установить ряд характерных его особенностей: открытая рамка считывания src-гена ВСР Ш-Р равна 1590 нуклеотидам, что достаточно для кодирования 530 аминокислот полипептида с молекулярной массой 58,5 кд. Это соответствует молекулярной массе ррбО'", определенной ранее иммунологическими методами. Кодирующая область src-гена фланкируется (ограничивается) последовательностями, содержащими несущественные рамки считывания. Между терминирующим кодоном УАГ env-гена и инициирующим кодоном АУГ src-гена находятся 400 нуклеотидов нетранслируемых последовательностей. В них присутствуют последовательности, необходимые для регуляции экспрессии src-гена, такие как акцепторный сайт для сплайсинга. Аналогичным образом между терминирующим кодоном src-гена УАГ и из-областью также обнаружена нетран- слируемая зона. Последовательности, фланкирующие src, содержат большой прямой повтор размером в 91 нуклеотид, которые гомологичны на 86 % прямому повтору, расположенному на б^конце этого гена [Bishop J., Varmus Н., 1982].
src-Область ВСР штамма Прага в общих чертах весьма сходна с таковой ВСР штамма Шмидта——Руппина, однако в деталях она имеет и некоторые отличия.
Анализ первичной генетической структуры src-гена показал, что в результате транскрипции этого гена образуется иРНК с коэффициентом седиментации 21S, содержащая две рамки считывания. Теоретически генетическая информация HPHKsrc достаточна, чтобы обеспечить образование двух полипептидов с молекулярными массами 20 и 60 кд. Образование белка с моле-
кулярной массой 20 кд в настоящее время расценивается как маловероятное событие, поскольку его потенциально кодирующие последовательности не начинаются метиониновым кодоном. Следовательно, для образования этого белка uPHKsrc должна содержать дополнительный сигнал сплайсинга, способный сформировать подходящую единицу трансляции. На основе экспериментальных данных, имеющихся на сегодня, оценить реальность существования подобного белка в трансформированных клетках не представляется возможным.
Антисыворотка TBR, полученная от кроликов, несущих опухоли, индуцированные ВСР, может быть использована для иммунопреципитации белка с молекулярной массой 60 кд (pp60sr<?). Этот белок обнаружен в вирустрансформированных клетках и может быть преципитирован только опухолевой антисывороткой, но не антисывороткой к структурным белкам ВСР [Erikson Е., Erikson R., 1980; Sefton В. et al., 1980]. Такой же белок был обнаружен в общем продукте трансляции 3'-о6』астн вирусной РНК в системе бесклеточного синтеза, что окончательно подтвердило непосредственную связь pp60src с трансформацией клеток [Веетоп К., Hunter Т., 1978; Bishop J., Varmus Н., 1982].
Своеобразие и структурный полиморфизм были обнаружены у pp60src различных штаммов ВСР. Во-первых, некоторые образцы опухолевых антисывороток не реагировали с pp60src, экспрессируемыми независимыми изолятами ВСР [Bishop J. et al., 1981 ]. Во-вторых, src-продукты разных штаммов ВСР отличались как по размерам, так и по олигопептидным картам [Neil J. et al., 1981; Bishop J., Varnius H., 1982].
Белок pp60src достаточно хорошо изучен не только в структурно-химическом, но и функциональном плане [Bishop J. et al., 1981]. Этот белок, как и ряд других онкобелков ретровирусов животных, оказался фосфопротеином, фосфорилированным по тирозиновому и сериновому остаткам [Bishop J. et al., 1981; Oppermann H. et al., 1981]. Предполагается, что фосфорилирование pp60src по тирозиновому остатку осуществляется самим этим белком (аутокиназная активность), причем процесс не зависит от клеточного циклоаденозинмонофосфата (цАМФ) [Levinson A. et al., 1981]. Напротив, фосфорилирование pp60src по аминокислоте серину осуществляется цАМФ-зависимой протеин- киназой клетки-хозяина [Levinson A. et al., 1981; Bishop J., Varmus H., 1982]. Фосфорилирование pp60src играет существенную роль в регуляции фосфопротеинкиназной функции трансформирующего белка.
Молекулярная топография pp60src. Физико-химическое изучение трансформирующего белка ВСР показало, что он является скорее линейной, чем глобулярной молекулой [Sefton В. et al., 1980; Levinson A. et al., 1981; Bishop J., Varmus H., 1982]. Использование ряда методических приемов позволило установить локализацию в pp60src участков, важных в функциональном отношении.
В pp60v src имеется два основных сайта фосфорилирования серина: один располагается в 17-й позиции аминокислотных последовательностей, местоположение другого определено менее точно. Единичный фосфотирозиновый остаток занимает позицию 419 у ВСР Шмидта—Руппина и 416 — у ВСР Прага. Не исключая возможной ошибки в определении локализации фосфорилированного тирозина, ряд авторов подчеркивают, что аминокислотные поел ед о вател ьноет и онкобелка, окружающие положение фосфотирозина указанных вирусов, идентичны [Levinson A. et al., 1981; Neil J. et al., 1981; Bishop J., Varmus H., 1982]. Аминокислотные последовательности, окружающие сайт фосфорилирования тирозина в других белках (включая онкобелки ретровирусов, среднего Т-антигена вируса пол ио мы и клеточных белков фосфорилированных pp60v src), также оказались весьма близкими друг другу и содержат только одну замену, а именно аминокислоты аргинина на глутамин [Levinson A. et al., 1981; Neil J. et al., 1981 ]. По-види- мому, этот сайт фосфорилирования тирозина «атакуется» одним и тем же классом протеинкиназ.
Аминотерминальный домен pp60v src с молекулярной массой около 8 кд осуществляет связывание белка с плазматической мембраной [Levinson A. et al., 1981]. Напротив, карбокситерми- нальный домен с молекулярной массой 30 кд осуществляет про- теинкиназную функцию, и активность этого фрагмента белка значительно выше, чем у нативной формы pp60v src. Возможно, что определенные функции аминотерминального домена pp60vsrc (т. е. фосфорилирование серинов) регулируют как кинетическую характеристику белка, так и субстратоспециальность киназной активности, вероятно, при помощи аллостерического эффекта [Bishop J., Varmus Н., 1982].
Локализация pp60 'src в клетке. В клетках, трансформированных ВСР, продукт гена src ассоциирован с рядом субклеточных компонентов. Исключением в этом отношении является лишь ядро. Большинство молекул pp60v srt в инфицированных клетках связано с плазматическими мембранами, что было определено методами иммунофлюоресцентной и иммуноэлектронной микроскопии, а также посредством биохимических характеристик клеточных органелл [Willingham М. et al., 1979; Erikson Е., Erikson R., 1980; Levinson A. et al., 1981; Bishop J., Varmus H., 1982]. Большое количество трансформирующего белка сосредоточено в области контакта плазматических мембран опухолевых клеток друг с другом и их прикрепления к подложке-субстрату [Willingham М. et al„ 1979].
Предполагается, что pp60vsrc в клеточной мембране связан с липидным слоем. Однако этот факт нуждается в уточнении при помощи методов, не требующих прижизненной фиксации клеток.
Синтез pp60v src осуществляется на свободных полирибосомах [Eisenman R., Vogt V., 1978; Bishop J., Varmus H., 1982], и уже
через несколько минут после инфекции клеток вирусом белок можно обнаружить в плазматических мембранах. Процесс транспорта онкобелка ВСР от места его первоначального синтеза до клеточных мембран и других мест в клетке пока не изучен.
Поиск клеточных мишеней pp60vsrc. Получение многократно очищенного pp60v src позволило приступить к более точному изучению специфических белков-субстратов его энзиматической активности в процессе вирусиндуцированной трансформации. Два таких белка, с молекулярной массой 89 и 50 кд, были идентифицированы в иммунопреципитатах pp60vsrc [Erikson Е., Erikson R., 1980; Oppermann H. et al., 1981]. Оба белка формируют физический комплекс с онкобелком, и этот факт можно считать доказанным для клеток, инфицированных ВСР и другими ретровирусами, содержащими онкогены fps и yes [Ghysdael J. et al., 1981; Hanafusa T. et al., 1981; Bishop J., Varmus H., 1982]. Существование такого комплекса указанных белков с pp60csrc в неинфицирован- ных клетках не показано.
Функциональное значение подобного комплекса пока не определено, однако ряд его, возможно, важных для трансформации особенностей удалось выявить. Во-первых, этот комплекс образуется сразу же после завершения синтеза pp60v src, т. е. он первичен и транзиторен. Во-вторых, онкобелок в комплексе фосфорилирован, но только по серину. Предполагается, что белок с молекулярной массой 50 кд является одной из мишеней действия pp60vsrc, поскольку в клетках кур, трансформированных ВСР, этот белок фосфорилирован по сериновым и тирозиновым остаткам [Oppermann Н. et al., 1981 ]. Белок с молекулярной массой 50 кд представляет собой относительно минорный компонент среди всех клеточных белков позвоночных, его структура не консервативна и варьирует у различных видов.
Что касается белка с молекулярной массой 89 кд, то он является основным представителем цитоплазматической белковой фракции каждого типа клеток всех позвоночных. В нем не показано каких-либо различий структуры и сайтов фосфорилирования у разных видов животных. В трансформированных ретровирусами клетках белок с молекулярной массой 89 кд фосфорилирован по серину. Этот же белок образует аналогичные комплексы с онкобелками, кодируемыми onc-генами fps и yes.
Таким образом, на основании имеющихся данных пока трудно оценить, какова истинная роль двух указанных белков и их комплексов с онкобелками в процессе трансформации клеток онкогенными вирусами. Одним из первых белков, выявляющимся в трансформированных ВСР клетках и фосфорилирующимся in vivo по тирозиновому остатку, является белок ррЗб кд [Erikson Е., Erikson R., 1980]. Этот же белок фосфорилируется по тирозину протеинкиназами других ретровирусных онкогенов, fps и аЫ [Ghysdael J. et al., 1981; Sefton В. et al., 1981]. Имеющейся в настоящее время информации, в частности о количестве белка
с молекулярной массой 36 кд в нормальных и опухолевых клетках, его локализации и т. д., недостаточно, чтобы сделать однозначное заключение о роли этого белка в трансформации. Ряд клеточных белков, еще менее охарактеризованных, также подвергаются фосфорилированию по тирозину протеинкиназой ВСР. Эти данные свидетельствуют в пользу плейотропности (множественности) действия протеинкиназ вирусных онкогенов, что практически не оставляет надежды на возможность обнаружения в клетке единственной и высокоспецифичной мишени для «атаки» онкобелками.
Наличие моноспецифических сывороток к индивидуальным белковым компонентам цитоскелета нормальных и опухолевых клеток позволило приступить к изучению процессов фосфорилирования актина, миозина, тубулина, а-актина, филамина, виментина и винкулина. Из перечисленных белков только винкулин можно рассматривать как потенциальную мишень действия pp60v src in vivo. Винкулин — белок с молекулярной массой 130 кд — обнаруживается в участках адгезии клетки к субстрату; вероятно, он выполняет существенную роль в формировании фенотипа нормальных клеток [David-Pfeuty Т., Singer S., 1980]. В трансформированных же клетках винкулин в результате фосфорилирования протеинкиназой ВСР перераспределяется, что приводит к нарушению структуры участков адгезии клеточной мембраны к субстрату. Трансформация клеток, как правило, сопровождается десятикратным увеличением уровня фосфорилирования винкулина по тирозиновым остаткам, однако это составляет только 1 % от общего количества белка в клетке [Sefton В. et al., 1981]. Использование для трансформации температурочувствительных мутантов ВСР (ts-мутантов) подтвердило предположение о причастности ррбО к фосфорилированию винкулин^. Куриные фибробласты, трансформированные температурочувствительным мутантом ВСР ts68 (вирус имеет ts-мутацию в гене src, что сопровождается утратой pp60vsrc способности трансформировать и поддерживать трансформированный фенотип клеток) при непермиссивной температуре (41 ℃), имели нормальный фенотип. Реверсия клеток в нормальный фенотип при сдвиге температуры с 41 ℃ до 37 ℃ сопровождалась упорядочением структур цитоскелета и снижением уровня фосфорилирования винкулина по тирозиновым остаткам до нормального [David-Pfeuty Т., Singer S., 1980* Sefton В. et al., 1981]. Тем не менее фосфорилирование винкулина онкобелком ВСР не может рассматриваться как прямое доказательство участия винкулина в нарушении функции цитоскелета клеток. Надо заметить, что изменение характера и уровня фосфорилирования винкулина не является характерной особенностью трансформации клеток и другими агентами. Так, фосфорилирование винкулина по тирозину не изменяется в процессе трансформации клеток химическими канцерогенами, онкогенными ДНК-содержащими вирусами и даже виру-
сом саркомы кур PRC II, содержащим онкоген fps. Последний факт особенно удивителен, поскольку v-fps кодирует онкобелок, обладающий протеинкиназной активностью [Hanafusa Т. et al., 1981]. Явная неспособность опс-специфической протеинкиназы, кодируемой онкогеном fps, фосфорилировать винкулин пока не имеет удовлетворительного объяснения, однако эти данные все же позволили некоторым авторам сделать заключение о косвенном участии винкулина и белков цитоскелета в трансформации клеток-мишеней. Вероятно, фосфорилирование винкулина может способствовать объяснению лишь некоторых морфологических изменений, сопровождающих трансформацию клеток src-геном. Однако этих фактов все же недостаточно для понимания процессов утраты клетками контролируемого роста как основной характеристики трансформации и малигнизации.
Значительное внимание исследователей привлекли данные, свидетельствующие о том, что процесс трансформации куриных клеток ВСР сопровождается возрастанием уровня фосфорилирования по тирозину ферментов, участвующих в гликолизе. Это касается, в первую очередь, таких ферментов, как энолаза, фосфо- глицератмутаза и лактатдегидрогеназа [Cooper 工 et al., 1983].
В заключение следует упомянуть ряд интригующих данных о возможности вовлечения продукта гена src и других онкобелков в процессы фосфорилирования каскада клеточных протеин киназ, что в конечном итоге влияет на активность мембранноассоциированной Na +/К+ АТФазы. Однако эти сенсационные результаты следует рассматривать осторожно до получения дополнительных, хорошо зоспроизводимых фактов [Racker Е., 1981; Bishop J., Varmus Н., 1982].
Таким образом, все многообразие экспериментальных данных свидетельствует о том, что pp60v src представляет собою фермент- тирозиновую фосфопротеинкиназу. Эта энзиматическая активность играет, по-видимому, ключевую роль в неопластической трансформации, индуцируемой геном src [Bishop J., Varmus Н.» 1982]. Основные мишени действия онкобелка расположены в цитоплазматических мембранах, структурах цитоскелета клеток и пока не выявлены в ядерном матриксе. Немаловажно также, что полученные данные указывают на прямое регуляторное влияние pp60v src на энергетические (гликолиз) процессы опухолевых клеток. Сопоставление данных исследования химической структуры pp60vsrc, его функции и локализации в опухолевой клетке, а также рассмотрение тех биохимических реакций, которые могут существенно изменяться в результате фосфорилирования ферментных систем клеток, позволяют отнести онкобелок ВСР к мультифункциональным ферментам. pp60vsrc влияет на различные уровни структурной и генетической организации вирусинфи- цированной клетки. В результате этого под контроль продукта экспрессии гена src ВСР попадают: клеточные гены нормального «репертуара», регуляция их экспрессии (т. е. транскрипция),
синтез клеточных белков (трансляция), энергетический обмен (глнколнз), функция цитоскелета и, наконец, функция клеточной мембраны, на которую поступают регуляторные экстрацеллюлярные сигналы.
Возможный механизм трансформации клеток src-геном. В научной литературе обсуждаются две альтернативные схемы возможного механизма трансформации клеток в результате «включения» в инфицированной клетке вирусного онкогена src [Bishop J., Varmus H., 1982]. Первая предполагает, что фосфорилирование онкобелком вируса единственной клеточной мишени может привести к запуску каскада биохимических реакций, приводящих в конечном счете к формированию злокачественного фенотипа клетки и росту опухоли. Вторая приписывает непосредственно самому ферменту, продукту гена src, мультифункциональ- ную роль, имея в виду, что протеинкиназа pp60vsrc действует одновременно или по определенной системе на ряд белковых мишеней, например по принципу «важности».
Фосфорилирование многочисленных клеточных мишеней может повлечь за собой развитие целого ряда биохимических «событий», способных, в свою очередь, запускать следующий каскад реакций. Таким образом, большинство имеющихся данных говорит в пользу второй альтернативы. Однако в целом наши знания сегодня не позволяют однозначно оценить те связи, которые существуют между фосфорилированием конкретных клеточных белков pp60v src и фенотипическим проявлением процесса, находящего выражение в малигнизации. Дальнейшее изучение клеточных мишеней действия онкобелков является одним, из магистральных направлений молекулярной онкологии, поскольку именно опосредованно через клеточные мишени можно понять глубину, наиболее полно охарактеризовать развитие событий, в конечном счете приводящих к злокачественному перерождению.
Онкогены дефектных трансформирующих вирусов. Многие штаммы разных ретровирусов способны трансформировать соответствующие культуры клеток и быстро индуцировать злокачественные новообразования у экспериментальных животных. Однако все они, в отличие от ВСР, дефектны по репликации (рис. 4), и поэтому для их репродукции необходима коинфекция клеток вирусами-помощниками [Кузнецов О. К-, 1974; Зильбер Л. А. и др., 1975; Linial М., Blair D., 1982]. Многие из дефектных трансформирующих ретровирусов тесно связаны с широким кругом злокачественных опухолей: саркомами, карциномами, лимфосаркомами и лейкозами. Для проявления трансформирующей функции указанным вирусам гены и белки вирусов-помощников не требуются.
В связи с тем, что трансформирующие гены вирусов этой группы находятся в тесной связи с дефектными (символ A [Dues- berg Р., 1983]) репликативными генами, некоторые из них будут рассмотрены более подробно.
gagpolgagpolСубъединхиа РНК, ALVСубъединхиа РНК, ALVPr76Pr76srcsrcВСР (—), дефектный по репродукции вирус саркомы РаусаВСР (—), дефектный по репродукции вирус саркомы РаусаPlioflae'mycPlioflae'mycgaggag△pol△polMC 29, вирус миелоцитоматоза птицMC 29, вирус миелоцитоматоза птиц0>Е оаьи^фзоо0>Е оаьи^фзооPr76Pr76p2009ag-mycp2009ag-mycmyc Aenv』■—冊~~4myc Aenv』■—冊~~4OK 10, вирус миелоцитоматоза птицOK 10, вирус миелоцитоматоза птиц^^Wss^^\ J^^Wss^^\ Jmilmil△env△envgagpolmybgagpolmybМН 2, вирус миелоцитоматоза птиц, имеющий два онкогена: v-myc и v-mil (raf)AEV, вирус эритробластоза птиц, имеющий два онкогена: v-erb А и v-erb В (гомологичен рецептору EGF)МН 2, вирус миелоцитоматоза птиц, имеющий два онкогена: v-myc и v-mil (raf)AEV, вирус эритробластоза птиц, имеющий два онкогена: v-erb А и v-erb В (гомологичен рецептору EGF)Prl80p45mybPrl80p45mybPr76Pr76AMV, вирус миелобластоза птицAMV, вирус миелобластоза птиц△gag mybetsAenv△gag mybetsAenvP〔35 gag-myb-etsP〔35 gag-myb-etsE26( вирус миелобластоза птиц, несущий два онкогена: v-myb и v-ets
gagpol
gagpol
Субъединхиа РНК, ALV
Субъединхиа РНК, ALV
Pr76
Pr76
src
src
ВСР (—), дефектный по репродукции вирус саркомы Рауса
ВСР (—), дефектный по репродукции вирус саркомы Рауса
Plioflae'myc
Plioflae'myc
gag
gag
△pol
△pol
MC 29, вирус миелоцитоматоза птиц
MC 29, вирус миелоцитоматоза птиц
0>Е оаьи^фзоо
0>Е оаьи^фзоо
Pr76
Pr76
p2009ag-myc
p2009ag-myc
myc Aenv
』■—冊~~4
myc Aenv
』■—冊~~4
OK 10, вирус миелоцитоматоза птиц
OK 10, вирус миелоцитоматоза птиц
^^Wss^^\ J
^^Wss^^\ J
mil
mil
△env
△env
gagpolmyb
gagpolmyb
МН 2, вирус миелоцитоматоза птиц, имеющий два онкогена: v-myc и v-mil (raf)
AEV, вирус эритробластоза птиц, имеющий два онкогена: v-erb А и v-erb В (гомологичен рецептору EGF)
МН 2, вирус миелоцитоматоза птиц, имеющий два онкогена: v-myc и v-mil (raf)
AEV, вирус эритробластоза птиц, имеющий два онкогена: v-erb А и v-erb В (гомологичен рецептору EGF)
Prl80p45myb
Prl80p45myb
Pr76
Pr76
AMV, вирус миелобластоза птиц
AMV, вирус миелобластоза птиц
△gag mybetsAenv
△gag mybetsAenv
P〔35 gag-myb-ets
P〔35 gag-myb-ets
p]40gag・3p]40gag・3Рис. 4. Структура генома дефектных трансформирующих ретровирусов птиц [Coffin J.t 1982].Рис. 4. Структура генома дефектных трансформирующих ретровирусов птиц [Coffin J.t 1982].FuSV, вирус саркомы кур Фуджи на ми
p]40gag・3
p]40gag・3
Рис. 4. Структура генома дефектных трансформирующих ретровирусов птиц [Coffin J.t 1982].
Рис. 4. Структура генома дефектных трансформирующих ретровирусов птиц [Coffin J.t 1982].
Ниже шкалы размеров генов (в т. о ) на первой линии представлена структура генома, компетентного по репродукции вируса лейкоза птиц (ALV) На других линиях схематически представлена структура геномов различных трансформирующих изолятов. Заштрихованными прямоугольниками обозначены специфические последовательности и их локализация в геноме. Незаштрихованные прямоугольники означают размеры делеций. Сплошной черной жнрной линией обозначены предполагаемый размер белкового продукта н локализация его транслируемых последовательностей, кодируемых каждым геном.
Механизмы трансформации клеток под действием сливных («гибридных»), экспрессируемых в этих системах, онкобелков изучены значительно хуже, чем для pp60vsrc. Это обусловлено, в первую очередь, тем, что долгое время не удавалось получить мутанты дефектных трансформирующих вирусов, несущие температурные или делеционные мутации в онкогенах (как было в случае с ВСР). Выделение и изучение ряда подобных мутантов позволили доказать, например, причинную связь трансформирующих последовательностей дефектных вирусов с онкогенезом.
Онкогены дефектных вирусов сарком птиц (fps, yes и г os). До 1980 г. многие исследователи полагали, что все независимые изоляты вирусов птиц, индуцирующие саркомы, являются различными штаммами ВСР. Т. Hanafusa и соавт. (1981) первыми обнаружили трансформирующие последовательности, которые оказались неидентичными src-гену. В следующие годы в вирусах сарком птиц была идентифицирована серия онкогенов, неродственных src и репликативным генам вирусов лейкозов птиц, — ALV [Hanafusa Т. et al., 1981 ].
В нашей стране Л. А. Зильбером (1975) и А. М. Дядьковой (1966) в разные годы был изолирован ряд вирусов, индуцирующих саркомы, которые также были отнесены к группе ВСР. Предварительный анализ трансформирующего гена саркомы кур штамма 6 (индуцированной ДМБА А. М. Дядьковой) показал, что его онкоген в структурном отношении близок src-гену, но при этом имеет и некоторые отличия в рестрикционной карте [Федоров С. Н. и др., 1984]. Возможно, что в числе других изолятов, полученных А. М. Дядьковой и Л. А. Зильбером, есть вирусы, несущие иной, ранее неизвестный онкоген. Это могут показать лишь дальнейшие молекулярно-биологические исследования.
Онкоген fps. Наиболее хорошо изученные изоляты дефектных ретровирусов птиц и кошек, содержащие онкоген fps, можно распределить на 4 группы: 1) вирус Фуджи на ми (FuSV); 2) вирусы группы PRC II; 3) два менее изученных изолята (UR-1 и 16L); 4) вирусы сарком кошек (три изолята: FeSV-ST, FeSV-GA, FeSV-HZl), содержащие онкоген fes, который оказался близкородственным онкогену fps [Hanafusa Т. et al., 1981; Besmer P., 1983].
Структурная организация генома вируса Фуджинами представлена на рис. 4, из которого видно, что трансформирующая область fps 'занимает Agag, Apol и, возможно, Aenv участки -генома. Геном FuSV очень невелик, всего 4,5—5,0 т.；о., причем на долю гена fps приходится 3.2 т. о. [Chien Y.-H., 1980; Besmer Р., 1983]. Первый уникальный саркомогенный полипротеин gag-onc был идентифицирован именно в FuSV. Этот полипротеин P140Kagfps содержит антигенные детерминанты белка гена gag р!9как (рис. 5).
Как видно из рис. 5, все опс-специфические пол и протеины изолятов дефектных вирусов сарком птиц содержат различное
et al., 1981].et al., 1981].P 140"fPs FuSV, вируса саркомы Фуджи намиP 140"fPs FuSV, вируса саркомы Фуджи намир 105 gag.fps PRS II, вирус саркомы курр 105 gag.fps PRS II, вирус саркомы курр〔70gag-fps PRS IV, вирус саркомы курр〔70gag-fps PRS IV, вирус саркомы курр so gag，es вируссаркомы кур Эшар so gag，es вируссаркомы кур Эшаптиц [Ghysdael J.птиц [Ghysdael J.Структура трех продуктов слитных генов Agag-fps н одного gag-yes определена при помоши пептидного анализа ферментов, гндролнзованных белком р15ReR. Наверху представлена организация продукта гена gag Pr76Rag ВСР P-tyr — участок фосфорилирования белка по тирозиновому остатку. Заштрихованная часть прямоугольника означает опс- специфическую область полипротеина» Горизонтальными стрелками обозначены размеры фрагментов онкобелков, образующихся после их протеолиза pl5gag. P-ser — участок фосфорилирования белка по сериновому остатку. NH2 — аминотермннальная группа белка. СООН — карбокситерминальная группа белка. К—молекулярная масса белков в кнло- дальтонах..Структура трех продуктов слитных генов Agag-fps н одного gag-yes определена при помоши пептидного анализа ферментов, гндролнзованных белком р15ReR. Наверху представлена организация продукта гена gag Pr76Rag ВСР P-tyr — участок фосфорилирования белка по тирозиновому остатку. Заштрихованная часть прямоугольника означает опс- специфическую область полипротеина» Горизонтальными стрелками обозначены размеры фрагментов онкобелков, образующихся после их протеолиза pl5gag. P-ser — участок фосфорилирования белка по сериновому остатку. NH2 — аминотермннальная группа белка. СООН — карбокситерминальная группа белка. К—молекулярная масса белков в кнло- дальтонах..Pr 76 880 ALVPr 76 880 ALV
et al., 1981].
et al., 1981].
P 140"fPs FuSV, вируса саркомы Фуджи нами
P 140"fPs FuSV, вируса саркомы Фуджи нами
р 105 gag.fps PRS II, вирус саркомы кур
р 105 gag.fps PRS II, вирус саркомы кур
р〔70gag-fps PRS IV, вирус саркомы кур
р〔70gag-fps PRS IV, вирус саркомы кур
р so gag，es вирус
саркомы кур Эша
р so gag，es вирус
саркомы кур Эша
птиц [Ghysdael J.
птиц [Ghysdael J.
Структура трех продуктов слитных генов Agag-fps н одного gag-yes определена при помоши пептидного анализа ферментов, гндролнзованных белком р15ReR. Наверху представлена организация продукта гена gag Pr76Rag ВСР P-tyr — участок фосфорилирования белка по тирозиновому остатку. Заштрихованная часть прямоугольника означает опс- специфическую область полипротеина» Горизонтальными стрелками обозначены размеры фрагментов онкобелков, образующихся после их протеолиза pl5gag. P-ser — участок фосфорилирования белка по сериновому остатку. NH2 — аминотермннальная группа белка. СООН — карбокситерминальная группа белка. К—молекулярная масса белков в кнло- дальтонах..
Структура трех продуктов слитных генов Agag-fps н одного gag-yes определена при помоши пептидного анализа ферментов, гндролнзованных белком р15ReR. Наверху представлена организация продукта гена gag Pr76Rag ВСР P-tyr — участок фосфорилирования белка по тирозиновому остатку. Заштрихованная часть прямоугольника означает опс- специфическую область полипротеина» Горизонтальными стрелками обозначены размеры фрагментов онкобелков, образующихся после их протеолиза pl5gag. P-ser — участок фосфорилирования белка по сериновому остатку. NH2 — аминотермннальная группа белка. СООН — карбокситерминальная группа белка. К—молекулярная масса белков в кнло- дальтонах..
Pr 76 880 ALV
Pr 76 880 ALV
количество антигенных детерминант белков гена gag. Полипротеин pi40KdK fps фосфорилирован в fps области только по тирозиновому остатку, а в gag—по серину и треонину [Hanafusa Т. et al., 1981; Bishop J., Varmus H., 1982]. С иммунным комплексом FuSV P140RaK fcs ассоциирована протеинкиназа, сходная по своей энзиматической активности с опс-продуктами других изолятов, имеющих онкогены fps, а также yes и ros.
Несколько изолятов, несущих онкоген fps, обладают весьма своеобразным онкогенным эффектом. Вирусы этой группы индуцируют миксоматозные опухоли у животных (например, для сравнения, ВСР индуцирует веретеноклеточные саркомы), а в культуре клеток вызывают трансформацию с преимущественным ростом распластанных, но некруглых опухолевых клеток, продуцирующих большое количество мукоидных продуктов-
Характер трансформации клеток продуктом гена fps косвенным образом свидетельствовал о том, что клеточные мишени, на которые действует этот онкобелок, могут отличаться от таковых при действии pp60“src.
Однако при сравнительном анализе белков, содержащих фосфотирозин в клетках, трансформированных онкогенами src, fps, yes, выявили сходную картину фосфорилирования семи предполагаемых белков-мишеней соответствующих онкобелков [Cooper J., Hunter Т., 1981].
Как уже отмечалось ранее, основным клеточным белком-мишенью фосфорилирования протеинкиназой pp60vsrc является ррЗб кд, он же оказался высокофосфорилированным и в случае действия P140RaB'fes в клетках, трансформированных FuSV [Cooper J., Hunter T., 1981; Bishop J., Varmus H., 1982] С другой стороны, в клетках, трансформированных PRC II, в противоположность ВСР и Y73 (v-yes), уровень фосфорилирования винку- лина по тирозиновым остаткам не изменялся [Bishop J., Varmus Н., 1982].
Онкоген yes. В двух независимых изолятах — вирусе саркомы Ямагуши (Y73) и вирусе саркомы Эша (ESV) — были идентифицированы трансформирующие последовательности, получившие название yes. Ретровирус Y73 индуцирует образование в клетках белка Р90我/в, a ESV — P80RaK yes [Kawai S. et al., 1980; Bishop J., Varmus H., 1982; Coffin J., 1982]. Оба сливных белка содержат антигенные детерминанты p!9gag и не содержат p27gag, однако продукты гидролиза полипротеинов yes оказались у этих двух вирусов различными, что может косвенно свидетельствовать об их неполной гомологии [Kawai S. et al., 1980; Bishop J., Varmus H., 1982J
Характер фосфорилирования белковых мишеней в клетках, трансформированных вирусами Y73 и ESV, также был различным: P8()gagyes в равной степени хорошо фосфорилировал in vivo белки как по сериновым, так и по тирозиновым остаткам, тогда как pgQgag-yes преимущественно фосфорилировал белки по серину [Kawai S. et al., 1980; Ghysdael J. et al., 1981]. В обоих случаях аутофосфорилирование полипротеинов осуществлялось по сходному принципу, однако авторы отмечали наличие фосфорилированных остатков серина не в gag-области, а в самом yes. При этом фосфорилированные сериновые и тирозиновые остатки в опс-спе- цифической области находились в тесной связи. Сайт фосфорилирования тирозина в Agag-yes полипротеине содержал последовательности аминокислот, практически идентичные сайту фосфорилирования в белке pp60src [Neil J. et al., 1981 ].
Таким образом, очевидная идентичность тирозиновых фосфо- акцепторных сайтов у полипротеинов группы yes с src и fps как будто свидетельствовала о наличии общих механизмов трансформации клеток, подробно рассмотренных выше на примере pp60v src. Однако более глубокое изучение этого вопроса позволило устано-
вить, что в числе нескольких клеточных белков, уровень фосфорилирования которых возрастает в процессе трансформации клеток Y73 или ESV, оказался только один винкулин. Это указывало на то, что механизмы трансформации клеток дефектными саркомными вирусами птиц и ВСР не совсем идентичны [Kawai S. et al., 1980; Bishop J., Varmus H., 1982].
Для интерпретации механизмов трансформации клеток указанными онкогенами необходимы дальнейшее изучение локализации fps - и yes-трансформирующих белков в клетке, изолирование вирусных и клеточных мутантов, более четкое определение клеточных мишеней действия онкобелков.
Онкоген г os. Р. Balduzzi и соавт. (1981) идентифицировали в ретровирусе UR-2 полипротеин с молекулярной массой 68 кд, который является продуктом гена gag-onc. Этот онкоген в последующем получил название ros [Balduzzi Р. et al., 1981; Bishop J., Varmus H., 1982]. ros-Последовательности не имели гомологии с известными онкогенами ретровирусов птиц или репликативными генами ALV. Продукт гена ros P68Kagros фосфорилирован in vivo по сериновым и тирозиновым остаткам. Иммунопреципитаты P68gagros ассоциированы с цАМФ-независимой протеинкиназой, которая фосфорилирует преимущественно себя, а также IgG в иммунном комплексе и а-казеин. Предполагается, что продукт гена ros может оказаться совершенно необычным ферментом — протеинкиназой с уникальными энзиматическими свойствами.
Онкоген ski. Е. Stavnezer и соавт. (1981) охарактеризовали три дефектных по репликации ретровируса: SK 770, SK 780 и SK 790. Эти вирусы были изолированы из культур клеток, которые заражали мутантным td ВСР штаммом В77. Все три вируса трансформировали только фибробласты кур, а в трансформированных культурах были обнаружены полипротеины с молекулярной массой 110—125 кд, содержащие Agag и Дро! антигенные детерминанты. Трансформирующие последовательности, получившие название ski, не имели гомологии с репликативными генами и с известными онкогенами ретровирусов птиц [Stavneser Е. et al., 1981; Bishop J., Varmus H., 1982].
Протеинкиназная функция полипротеина Pl юка8 ₽o1 ^^ По предварительным данным, не зарегистрирована.
Таким образом, изучение дефектных саркомных вирусов птиц завершилось идентификацией и выделением ряда онкогенов, отличающихся по структуре и функции от src-гена недефектного ВСР. Как правило, в независимых изолятах этой группы ретровирусов, полученных от больных злокачественными новообразованиями животных или из культуры клеток, удается реидентифицировать один и тот же онкоген. Более того, вирусы саркомы кошек (будут рассмотрены ниже) могут содержать онкогены (например, fes), гомологичные онкогену fps вирусов сарком кур [Besmer Р., 1983]. Следовательно, ретровирусы разных видов животных могут захватывать из генома клетки-хозяина гомологич-
ные протоонкогены. С одной стороны, этот факт указывает на ограниченное число протоонкогенов, которые могут быть превращены в вирусные, а с другой — может косвенно свидетельствовать о сходстве неопластических процессов, возникающих в результате экспрессии гомологичных онкогенов, но у разных видов животных (включая человека).
Можно надеяться, что детальное изучение механизмов трансформации клеток под действием вирусных онкогенов позволит выявить общие закономерности процесса малигнизации инфицированных клеток (например, существование аналогичных и высокоспецифичных мишеней фосфорилирования и т. д.). Это, в свою очередь, позволит ответить на вопросы о видоспецифичности трансформации клеток одинаковым онкогеном и о причастности экспрессии гомологичных им протоонкогенов к спонтанной и индуцированной трансформации тех или иных клеток.
Онкогены дефектных вирусов лейкозов птиц: myc, mil, myb, ets, erb А и erb В и rel. Вирусные лейкозы оказались первыми злокачественными заболеваниями животных, для которых была показана этиологическая связь с переносимыми биологическими агентами (вирусами).
V. Ellerman,O. Bang [Bishop J., Varmus H., 1982] установили, что эритролейкозы у цыплят могут быть индуцированы экстрактами бластных клеток крови больных животных. В последующие десятилетия было выделено большое количество подобных агентов, и именно с их изучением стали связывать надежды на возможность понимания механизмов лейкемогенеза у человека.
Онкогены вирусов миелоцитоматозов птиц: тус “ mil. К этой группе ретровирусов относятся МС 29, МН 2, СМ 11 и ОК 10, которые являются независимыми изолятами; все они индуцируют похожие неопластические процессы in vivo (миелоцитоматоз, карциномы и саркомы), трансформируют одинаковый тип клеток in vitro (гемопоэтические клетки, фибробласты и эпителиальные клетки) и содержат опс-специфические последовательности, имеющие значительное родство друг с другом [Sheiness D. et al., 1980].
Геном МС 29 представлен РНК размером 5,0—5,5 т. о., имеющей 65 % гомологии с вирусами лейкозов птиц (см. рис. 4) [Sheiness D. et al., 1980, 1981; Coffin J., 1982]. Как видно из схемы, представленной на рис. 4, оба вируса миелоцитоматоза птиц (МС 29 и ОК 10) имеют разную (в отношении трансформирующих участков) композицию генома. МС 29 содержит ряд областей, идентичных ALV: на 5'-конце участок гомологии равен 1,5 т. о., а на З'-конце — 2,0 т. о. Установлено, что области генома Agag, Aenv и U3 очень сходны у представителей всей группы ретровирусов МС 29 [Sheiness D. et al., 1980, 1981], однако указанные последовательности не имеют гомологии с опс-специфическим участком. Онкоген этой группы ретровирусов получил название v-myc. v-myc вирусов МС 29, ОК 10, СМ 11, по данным моле-
кулярной гибридизации, практически идентичны друг другу, исключением из этой группы является ретровирус МН 2. Онкоген МН 2 оказался лишь на 70 % идентичен тус-последовательностям МС 29, и эти различия получили объяснение после идентификации в геноме ретровируса МН 2 второго онкогена, mil [Jansen Н. et al., 1984].
Полипротеины, имеющие отношение к трансформации клеток ретровирусами этой группы, достаточно хорошо изучены. Так, например, онкобелок ретровируса МС 29 с молекулярной массой 110 кд (Pl 10Rag-myc)содержит общие детерминанты, кодируемые gag-геном и тус-специфической областью. Как отмечалось выше, значительные отличия генома ретровируса ОК 10 (например, от МС 29), прежде всего, касались размеров неповрежденных репликативных генов. Вирусспецифическая ДНК ОК 10 больше, чем у МС 29, и содержит полный gag и последовательности Apol-гена, совмещенные с тус-специфическим участком (см. рис. 4) [Sheiness D. et. al., 1980; Bishop J., Varmus H., 1982]. В клетках, инфицированных OK 10, выявляются продукт гена gag, предшественник Рг76вае, а также белок с молекулярной массой 200 кд (「200卧％2, содержащий gag-, Дро1- и тус-пептиды [Bishop J., Varmus Н., 1982]). По предварительным данным, эти белки синтезируются на двух независимых иРНК. gag-myc-По- л и протеины группы ретровирусов МС 29 фосфорилированы по серину в обычных сайтах фосфорилирования белков гена gag, а в myc-области фосфорилируются как серин, так и треонин [Ghysdael J. et al., 1981 ]. Существующие методы анализа не позволяют выявить точную локализацию и степень фосфорилирования gag-myc-полипротеинов. Тем не менее установлено, что онкобелки группы онкогенов тус не фосфорилированы по тирозиновым остаткам и сами по себе не обладают протеинкиназной активностью [Ghysdael J. et. al., 1981; Bishop J., Varmus H., 1982].
Механизмы трансформации клеток-мишеней полипротеинами группы онкобелков тус не изучены, и связано это, в первую очередь, с методическими трудностями определения их энзиматической активности и локализации в вирустрансформированной клетке. Стандартное фракционирование клеточных лизатов, а также иммунофлюоресцентные тесты показали, что pilORag-myc располагаются преимущественно в ядрах клеток перепелок, трансформированных МС 29 [Bishop J., Varmus Н., 1982].
erb-Онкоген вируса эритробластоза птиц (AEV). Среди всех онкогенов, дефектных по репликации ретровирусов птиц, наиболее хорошо изучены генетические локусы AEV, ответственные за трансформацию эритроидных клеток и фибробластов. Эти локусы получили символ v-erb. Молекулярно-биологическими и молекулярно-генетическими методами были определены локализация v-erb в геноме вирусов, размер — 3,0 т. о. [Lai М. et al., 1979] и получены данные в пользу существования в нем двух доменов экспрессии (см. рис. 4): v-erb А и v-erb В. Первый кодирует
полипротеин P75«d«егЬ At содержащий антигенные детерминанты генов gag и erb, но лишенный генетической информации по меньшей мере половины v-erb [Lai М. et al., 1980].
В клетках, трансформированных AEV, обнаружены 2 типа иРНК: одна — транскрибированная с полного гена v-erb, другая—лишь части его, З^области, т. е. v-erb В [Lai М. et al., 1979, 1980; Bishop J., Varmus H., 1982].
Пептидное картирование Р75как егЬ показало, что в полипротеин входит белок gag р!9 и, вероятно, часть белка plO [Bishop J., Varmus Н., 1982]. Этот пол и протеин фосфорилирован, но распределение фосфоаминокислот определить пока не удалось. Что касается продукта домена v-erb В, то его идентификация из-за отсутствия соответствующей сыворотки связана с большими трудностями.
Продуктами трансляции геномной РНК AEV в бесклеточной системе белкового синтеза являются два протеина: Р75как егЬ А и белок с молекулярной массой 44 кд, транслирующийся с З'-обла- сти геномной РНК [Lai М. et al., 1980; Beug Н. et al., 1981 ], что указывало на связь экспрессии с v-erb В. Однако антисыворотки цыплят с опухолями, индуцированными AEV, не реагировали с онкобелком p44v erb в [Lai М. et al., 1980].
Таким образом, вопрос о природе р44 кд окончательно пока не решен, и, вместе с тем5 неясна роль v-erb В и кодируемого им белка в онкогенезе, индуцируемом у животных вирусом эритробластоза птиц. Недавно высказано предположение, что v-erb В является не доменом гена erb, а самостоятельным онкогеном. Гетеродуплексное картирование протоонкогена в нормальных клетках кур показало, что c-erb В содержит около 12 экзонов. В последнее время появились данные, свидетельствующие о том, что онкоген v-erb В кодирует гликолизированный белок с молекулярной массой 65 кд, обладающий фосфотирозинкиназной функцией. Этот белок в трансформированных клетках располагается в клеточной мембране. Онкобелок gp65erb Е имеет значительную гомологию с рецептором эпидермального фактора роста (ЭФР) [Heldin С.-H., Westermark В., 1984]. Указанная гомология касается внутриклеточного домена рецептора ЭФР, обладающего также тирозинкиназной активностью [Hunter Т., 1984].
Механизм трансформации клеток-мишеней AEV не изучен. Пока неясно, имеют ли продукты экспрессии двух доменов свои специфические мишени трансформации или они действуют в комбинации. Точно известно лишь то, что для трансформации клеток эритроидного пула необходимы оба домена или оба онкогена v-erb. Делеционный мутант AEV, утративший онкоген v-erb А, т. е. способность кодировать полипротеин P75Kagerb А, не был способен трансформировать клетки эритроидного пула, но этот вирус эффективно, как дикий штамм, трансформировал куриные фибробласты [Lai М. et al., 1980]. По-видимому, Р758ак егЬ А не требуется для трансформации фибробластов. Что касается
механизма трансформирующего действия двух онкогенов erb, то, как полагают ряд авторов, инициирует процесс трансформации клеток эритроидного пула v-erb В (принадлежащий к семейству онкогенов src). Напротив, экспрессия онкогена v-erb А блокирует дифференцировку эритробластов, останавливая этот процесс на ранних стадиях созревания [Debuire В. et al., 1984]. В клетках, трансформированных онкогенами v-erb, наблюдается увеличение приблизительно в 17г раза фосфорилирования некоторых белков по тирозиновым остаткам; в частности, это касается ррЗб кд [Bishop J., Varmus Н., 1982]. Киназная активность у полипротеина P75gaK' гЬ А не обнаружена. Ряд методических трудностей не позволил определить локализацию продуктов экспрессии гена v-erb А в инфицированных клетках.
Онкогены вирусов миелобластоза птиц (AMV и Е26): v-myb, v-ets.
Два независимых изолята ретровирусов птиц, AMV и Е26, содержат онкоген v-myb [Duesberg Р. et al., 1980; Moscovici С. et al., 1981]. AEV вызывает острый миелобластный лейкоз,а Е26 —— эритроидный лейкоз и, реже, смешанные лейкозы, содержащие эритроидные и миелоидные клетки [Moscovici С. et al., 1981; Bishop J”，Varmus H., 1982]. В условиях in vitro оба вируса способны трансформировать макрофаги, однако Е26 в культуре фибробластов перепелки вызывал изменения морфологии, частично напоминающие трансформацию.
Эти данные свидетельствовали о том, что структура геномов AMV и Е26 должна быть различной. На рис. 4 представлена структура генома AMV штамма BAI. Определение топографии гено: Е26 пока не завершено. Как видно из этого рисунка, геном AMV содержит неповрежденный ген gag и, вероятно, Apol и v-myb, который располагается в области env-гена [Duesberg Р. et al., 1980; Moscovici С. et al., 1981 ]. В соответствии со структурой генома AMV в инфицированных этим вирусом клетках выявляются три типа иРНК： для Рг76как, для Рг1808акро1 [Moscovici С. et aL, 1981], а также для онкобелка с молекулярной массой 35 кд (иРНК 21S). Последние, по-видимому, являются продуктами экспрессии онкогена myb. Локализация и функция онкобелка 35 кд в инфицированных AMV клетках неизвестна.
Как указывалось выше, ретровирус Е26 содержит онкоген v-myb, который, так же как и у AMV, располагается в области гена env, т. е. на З'-конце вирусной РНК. Было установлено, что в геноме Е26 онкоген v-myb занимает значительную часть генома, включая и область gag. Об этом свидетельствовал тот факт, что онкобелок ретровируса Е26 содержал антигенные детерминанты продуктов гена gag. В клетках, инфицированных Е26, обнаружен опс-специфический белок с молекулярной массой 130 кд (Р130вакП1уЬ). Предполагается, что продукт гена myb Е26 синтезируется на иРНК геномного размера, однако детали этого процесса не установлены [Bishop J., Varmus Н., 1982].
Ограниченные данные по структуре генома ретровируса Е26 не могли объяснить, почему этот вирус способен не только индуцировать эритробластоз, но и трансформировать куриные фибробласты. Рядом авторов было высказано предположение о том, что подобный гетерогенный биологический эффект не может быть обеспечен только одним геном myb. Они полагали, что в геноме ретровируса Е26 должен присутствовать еще один, дополнительный трансформирующий ген. Дальнейшее изучение структуры генома ретровируса Е26 подтвердило это предсказание и привело к обнаружению так называемых «дополнительных» трансформирующих пос ледовател ьноетей ets [Laprince D. et al., 1983]. В настоящее время ets относится к самостоятельному онкогену (v-ets), который в геноме Е26 в 5'-о6ластн граничит с геном myb, а в З'-направленин занимает область гена env. Лучшим доказательством этому служат факты, полученные после клонирования онкогена v-ets и определения его нуклеотидных последовательностей. При этом оказалось, что он не имел гомологии с известными онкогенами ретровирусов позвоночных. Наконец, в нормальных клетках птиц установлена экспрессия c-ets, которая осуществлялась через иРНК-транскрипт независимо от myb-последовательностей.
Таким образом, структуру ДНК-формы генома Е26 можно представить следующим образом: LTR — gag-myb-ets-env — LTR. Ген ets, как и все другие трансформирующие последовательности ретровирусов, представлен в виде единичной копии в геноме многих позвоночных, включая человека [Laprince D., 1983]. Эти данные могут указывать на клеточное происхождение онкогена ретровируса Е26 кур. Вирус Е26 превосходил все другие ретровирусы по количеству трансформирующих генов. Впервые для объяснения механизма трансформации эритробластов и фибробластов кур стало возможным использовать схему комбинированного взаимодействия двух онкогенов, myb + ets, способных совместно обеспечить трансформацию фибробластов птиц. Подобная ситуация кооперативного взаимодействия двух онкогенов, одновременно присутствующих в генетическом аппарате вируса, обнаружена впервые.
На основании имеющихся данных о предполагаемом механизме трансформации клеток эритроидного пула и фибробластов можно выдвинуть следующие положения: во-первых, ретровирусы животных способны трансдуцировать в свой геном несколько протоонкогенов (как минимум два); во-вторых, присутствие в геноме Е26 двух онкогенов говорит о возможности трансформации клеток в результате экспрессии двух онкогенов, каждый из которых в отдельности неспособен трансформировать фибробласты птиц и NIH ЗТЗ. В-третьих, расшифровка генетической структуры Е26 позволяет определить, какое количество и какие формы функций должны кодировать myb и ets, чтобы трансформировать фибробласты или клетки эритроидного пула.
Онкоген вируса ретикулоэндотелиоза штамма Т (REV-Т) —rel. Методами молекулярной гибридизации, гетеродуплексного и рестрикционного картирования, а также анализа олигонуклеотид- ного состава на З'-коние генома REV-Т был идентифицирован участок длиной 1,5—2,0 т. о. (общий размер генома вируса 5,5 т. о.), ответственный за трансформацию гемопоэтических клеток в культуре и индукцию лимфоретикулярных неоплазм В-клеточной природы у животных. Новый онкоген, получивший название rel, не гомологичен ни репликативным генам вируса-помощника, ни известным онкогенам ретровирусов [Bishop J,, Varmus Н., 1982; Coffin J., 1982]. Онкоген REV-Т представлен единичной копией в геноме нормальных клеток индюшек (наибольшая степень родства) и других видов птиц. Информация о продуктах экспрессии гена rel (РНК, белок) минимальна. Высказано предположение об образовании суб геномной rel иРНК и rei специфического белка размером 55 кд. Данные предварительные.
ОНКОГЕНЫ РЕТРОВИРУСОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Из различных видов млекопитающих были изолированы ретровирусы, способные индуцировать солидные опухоли или лейкозы у чувствительных особей, а также трансформировать культуры клеток [Зильбер Л. А. и др., 1975; Киселев Ф. Л. и др., 1983; Bishop J., Varmus Н., 1982]. Примечательной особенностью ретровирусов млекопитающих является то, что все они без исключения дефектны по репродукции и, подобно дефектным ретровирусам птиц, для своего размножения нуждаются в экспрессии репликативных генов вирусов-помощников. В геноме немногочисленной группы представителей этих ретровирусов были идентифицированы трансформирующие последовательности (онкогены), с которыми стали связывать тот или иной неопластический процесс. Перечень онкогенов ретровирусов млекопитающих невелик, однако некоторые из них, например семейство ras, имеют непосредственное отношение к возникновению неоплазм у человека. С активацией посредством амплификации гена abi связывают ряд злокачественных лимфопролиферативных заболеваний человека. Есть и другие примеры (см. гл. 5). По этой причине изучение структуры онкогенов ретровирусов млекопитающих, экспрессии их генетической информации в виде онкобелков, а также механизмов трансформации клеток вирусами имеет первостепенное значение как в теоретическом, так и практическом плане.
Онкоген вируса лейкоза Абельсона (Ab-MLV)——abl. Вирус лейкоза Абельсона (Abelson) был изолирован из мышей, инфицированных вирусом лейкоза Молони (Mo-MLV) и получавших преднизолон [Baltimore D. et al., 1980]. Для своей репродукции вирус нуждается в вирусе-помощнике, Mo-MLV. Ab-MLV при введении мышам индуцирует пре-В-лимфомы, a in vitro трансформирует некоторые линии фибробластов и лимфоидных клеток [Bai-
△gag
P120K
P100K
P90K
P85K
△pol
gag
RU、1512 30 10
P160K
различные штаммы
mos
Ab-MLV, вирус лейкоза Абельсона
Mo-MSV, штамм 124 (вирус саркомы Молони)
Ha-MSV, вирус саркомы мышей Харвея
fesfesP80®ag-'e$P80®ag-'e$Рис. 6. Структура геномов дефектных трансформирующих вирусов млекопитающих [Coffin J., 1982].Ниже шкалы размеров на первой лннми представлена структура генома, компетентного по репликации вируса лейкоза мышей (MLV); на других линиях даиы схемы геномов различных трансформирующих вирусных изолятов. Маркировка прямоугольника озна* чает опс-специфические последовательности н их локалнзацию в геноме. Прямоугольниками без маркировки обозначены области делеций. Под некоторыми онкогенами сплошной черной линией обозначены размер белкового продукта и область считывания гена.Рис. 6. Структура геномов дефектных трансформирующих вирусов млекопитающих [Coffin J., 1982].Ниже шкалы размеров на первой лннми представлена структура генома, компетентного по репликации вируса лейкоза мышей (MLV); на других линиях даиы схемы геномов различных трансформирующих вирусных изолятов. Маркировка прямоугольника озна* чает опс-специфические последовательности н их локалнзацию в геноме. Прямоугольниками без маркировки обозначены области делеций. Под некоторыми онкогенами сплошной черной линией обозначены размер белкового продукта и область считывания гена.
fes
fes
P80®ag-'e$
P80®ag-'e$
Рис. 6. Структура геномов дефектных трансформирующих вирусов млекопитающих [Coffin J., 1982].
Ниже шкалы размеров на первой лннми представлена структура генома, компетентного по репликации вируса лейкоза мышей (MLV); на других линиях даиы схемы геномов различных трансформирующих вирусных изолятов. Маркировка прямоугольника озна* чает опс-специфические последовательности н их локалнзацию в геноме. Прямоугольниками без маркировки обозначены области делеций. Под некоторыми онкогенами сплошной черной линией обозначены размер белкового продукта и область считывания гена.
Рис. 6. Структура геномов дефектных трансформирующих вирусов млекопитающих [Coffin J., 1982].
Ниже шкалы размеров на первой лннми представлена структура генома, компетентного по репликации вируса лейкоза мышей (MLV); на других линиях даиы схемы геномов различных трансформирующих вирусных изолятов. Маркировка прямоугольника озна* чает опс-специфические последовательности н их локалнзацию в геноме. Прямоугольниками без маркировки обозначены области делеций. Под некоторыми онкогенами сплошной черной линией обозначены размер белкового продукта и область считывания гена.
ST-FeSV, вирус саркомы кошек, штамм Шнейдера-Тил лена
timore D. et al., 1980]. Геномная РНК Ab-MLVj имеет размер 5,6 т. о. и в системе бесклеточного синтеза обеспечивает образование белка P120Kag abl с молекулярной массой 120 кд [Baltimore D. et al., 1980; Bishop J., Varmus H., 1982]. Этот белок по своим размерам идентичен полипротеину, выявляемому в клетках, трансформированных Ab-MLV, и в клетках, не продуцирующих вирусное потомство.
Гетеродуплексное картирование РНК Ab-MLV с помощью комплементарной ДНК Mo-MLV показало, что последовательности 5'-конца (1,25 т. о.) и З'-кониа (0,7 т. о.) Ab-MLV принадлежат вирусу-помощнику, Mo-MLV. В результате рекомбинационных событий внутренняя часть генома Mo-MLV размером 6,5 т. о. в вирусе Ab-MLV заменена на 3,6 т. о. abl-специфические после-
довательности (рис. 6). На рисунке показаны также размеры полипротеинов различных штаммов Ab MLV, которые варьировали от Р160вак'аЬ| до Р85как'аЫ [Bishop J., Varmus Н., 1982]. Авторы предполагают, что ретровирус, кодирующий опс-полипро- теин P160gaK'abl, является исходным штаммом, из которого произошли все остальные. Вирусные варианты, кодирующие полипротеины от 100 до 85 кд, сохраняли трансформирующий потенциал в отношении фибробластов, но утрачивали способность трансформировать лимфоциты и индуцировать лимфомы и не утрачивали протеинкиназную активность [Baltimore D. et al., 1980].
В отличие от других ретровирусов млекопитающих, протеин- киназная активность полипротеинов Ab-MLV и их связь с трансформацией и лейкемогенезом хорошо документированы данными, полученными при изучении различных мутантов.
Последовательности, родственные abl, обнаружены в геноме нормальных клеток различных видов позвоночных [Baltimore D. et al., 1980].
Полипротеин P160gaK'abl, подобно pp60v src и p21v ras, в трансформированных клетках связан с цитоплазматическими мембранами [Bishop J., Varmus Н., 1982]. Удалось установить, что P160gag abl находится на поверхности клеточной мембраны. Поскольку ga g-дете р м и нанты в онкобелке не выявлялись, было высказано предположение о его внутриклеточной локализации. gag-Домен полипротеина в этой необычной конструкции связывается с белками цитоскелета. Указанные данные позволили сделать заключение о трансмембранном расположении онкобелков в трансформированной клетке.
Полипротеин P120gag abl в опухолевых клетках фосфорилирован исключительно по тирозиновым остаткам, однако клеточные мишени протеинкиназной активности онкобелка не определены [Sefton В. et al., 1981]. Информация, которая известна, сводится к следующему. Как гемопоэтические клетки, так и фибробласты NIH ЗТЗ, трансформированные Ab MLV, содержали больше фосфотирозина, чем их нормальные гомологи [Sefton В. et al., 1981]. На этом основании оказалось возможным высказать гипотезу о том, что механизм трансформации клеток-мишеней ВСР (где имеет место аналогичное явление) и Ab-MLV идентичен. Вскоре были получены факты, подтверждающие это предположение. Трансформация клеток с помощью Ab-MLV увеличивала фосфорилирование по тирозину ррЗбК и винкулина, ранее уже идентифицированных в качестве клеточных мишеней для pp60vsrc [Cooper J., Hunter T., 1981; Sefton В. et al., 1981].
В заключение следует отметить важный факт, связанный с реидентификацией онкогена аЫ в вирусе саркомы кошек [Bes- mer Р., 1983]. Биологическое проявление экспрессии онкогена аЫ (морфология опухолей) и круг клеток-мишеней у мышей, инфицированных Ab-MLV, свидетельствовали в пользу того, что этот вирус и его онкоген проявляют лимфотропное действие
(в случае индукции полипротеинов P160Bag abl и P120gae аЬ|). Напротив, мутации abl-специфической области, сопровождающиеся уменьшением экспрессируемых полипротеинов до размера менее 100 кд, приводили к потере способности ряда штаммов Ab-MLV индуцировать пре-В-лимфомы и лимфосаркомы. В свою очередь, утрата лимфотропной функции онкобелка не изменяла способность онкогена abi трансформировать некоторые клеточные линии фибробластов. Подтверждением правильности подобного положения служит факт изоляции вируса саркомы кошек HZ-2 FeSV, который индуцирует исключительно фибросаркомы [Ashurst S., Cohen G., 1981], Ретровирус HZ-2 FeSV содержит онкоген abl, кодирующий пол и протеин с молекулярной массой Р96какаЬ1 и обладающий протеинкиназной активностью. В данном случае наблюдается уменьшение молекулярной массы опс-специфиче- ского полипротеина [Besmer Р., 1983]. Вполне вероятно, что уже в ближайшее время разработка этой интереснейшей модели вирусного канцерогенеза прольет свет на молекулярный механизм «тропности» онкогенов опосредованно через их продукты — онкобелки.
Онкоген вируса саркомы Молони (Mo~MSV) — mos. Mo-MSV был изолирован в 1966 г. из саркомы мышей, которая возникла в ответ на введение вируса лейкоза Молони (Mo-MLV) [Bishop J., Varmus H., 1982]. Этот вирус был дефектным по репродукции (вирусом-помощником служит Mo-MLV), индуцировал фибросаркомы у мышей и трансформировал фибробласты в культуре клеток. Из оригинального ретровируса был изолирован ряд штаммов Mo-MLV, обладавших своеобразными биологическими свойствами. Наиболее хорошо изученным является Mo-MLV, штамм 124, поскольку продуцирующие его клетки содержали избыток трансформирующего компонента над вирусом-помощником в соотношении 30 : 1 [Bishop J., Varmus Н.» 1982).
Организация генома Mo-MLV 124 была изучена при помощи гетеродуплексного картирования [Bishop J., Varmus Н., 1982] и последующего полного секвенирования [Reddy Е. et al., 1980]. mos - Последовате льност и длиной 1,2 т. о. располагаются на 3,-конце генома в области сигнала сплайсинга иРНК (21S) env-гена, который практически замещен полностью онкогеном. Исключение составляют 10 нуклеотидов 5,-конца env-гена, выполняющих функцию инициации транскрипции онкогена mos инициирующим кодоном АУГ. Большинство изученных изолятов вируса саркомы Молони имеют различного характера делеции в pol-гене, происходящем из вируса-помощника (см. рис. 6). Как видно из схемы, представленной на рис. 6, некоторые штаммы Mo-MSV 124 и Gz-MSV) имеют частичные делеции gag-гена Bishop J., Varmus Н., 1982].
Несмотря на то, что mos-область нескольких штаммов была клонирована [Reddy Е. et al., 1980; Van Beveren C. et al., 1981] и секвенирована, белковый продукт этого гена по-прежнему оконча-
тельно не идентифицирован. Трансляция in vitro РНК субгеномного размера, изолированной из вирионов, приводит к образованию серии белковых продуктов [Cremer К. et al., 1981; Papkoff J. et aL, 1982]. Наибольший из них — белок с молекулярной массой 37 кд, что приблизительно соответствует открытой рамке считывания mos, предсказанной анализом нуклеотидных последовательностей. Размер открытой рамки считывания достаточен для кодирования белка с молекулярной массой 40 кд, состоящего из 374—— 408 аминокислот [Reddy Е. et al., 1980; Van Beveren C. et al., 1981; Papkoff J. et al., 1982]. Однако в клетках, трансформированных MSV, указанный белок не найден. В экспериментах по трансфекции клеток NIH ЗТЗ показано, что mos-специфические фрагменты ДНК обладали способностью трансформировать реципиентные клетки [Bishop J., Varmus Н., 1982]. На эффективность трансформирующего действия клонированного mos существенное влияние оказывала З'-область генома MSV, гомологичная LTR [Bishop J., Varmus Н., 1982]. Присутствие LTR оказалось необходимым условием успешной трансформации клеток NIH ЗТЗ препаратом клонированного клеточного гомолога v-mos [Blair D. et al., 1981]. Последующее изучение онкогенного потенциала c-mos позволило установить наличие в области LTR транскрипционного сигнала для онкогена mos [Dhar R. et al., 1980]. Однако принцип регуляции экспрессии mos-специфических последовательностей пока не определен. •
Неожиданные результаты были получены при сравнительном анализе аминокислотных последовательностей теоретически предсказанного р40 К-продукта гена mos с pp60v src. Между продуктом гена mos и карбокситерминальным участком pp60vsrc была обна* ружена значительная область гомологии. Так, 387—468 аминокислотных последовательностей pp60v src (из 530) и 227—309 аминокислот р40К (из 374) оказались практически идентичными [Czernilofsky A. et al., 1980; Reddy Е. et al., 1980; Van Beveren C., 1981]. Эти результаты свидетельствуют о том, что mos и src имеют общее происхождение, хотя, по данным гибридизации, подобная гомология не выявляется. Важно подчеркнуть, что участок гомологии между гипотетическим онкобелком mos и src соответствовал именно той области pp60v src, которая выполняет протеинкиназную функцию. Однако в родственную область продукта гена mos в 419-м положении не входила аминокислота тирозин, являющаяся мишенью фосфорилирования pp60vsrc в трансформированных BCP-клетках [Levinson A. et al., 1981; Bishop J., Varmus H., 1982].
Несмотря на эти данные, продукт гена mos не обладал тирозинспецифической протеинкиназной активностью в трансформированных клетках. Более того, уровень фосфорилирования клеточных белков в процессе экспрессии mos и трансформации не повышался, а ррЗб кд был фосфорилирован как в нормальных клетках. В последнее время установлена строгая зависимость синтеза опухолевого фактора роста от экспрессии онкогена mos [Hel-
din С-H., Westermark В., 1984]. Эти данные свидетельствуют о том, что онкобелок p37v mos прямо или косвенно регулирует синтез опухолевого фактора роста. Подобная регуляция может осуществляться на двух уровнях: транскрипционном и трансляционном.
Таким образом, многочисленные данные, касающиеся структуры mos и его продукта, пока не могут полностью объяснить молекулярный механизм вирусиндуцированной трансформации клеток мишеней.
Семейство онкогенов вирусов мышиных сарком Кирстена, Харвей (KLMSV, На MSV) — ras. Ki-MSV и Ha-MSV представляют собой независимые изоляты родственных, но не идентичных штаммов дефектных саркомных вирусов мышей [Ellis R. et ai., 1980, 1981]. Эти вирусы выделены из сарком крыс, инокулированных вирусом лейкоза Кирстена и вирусом лейкоза Молони соответственно. Оба вируса индуцируют саркомы и эритролейкозы у мышей, a n vitro трансформируют фибробласты в культуре клеток. ДНК-формы геномов этих вирусов существенно отличались от такового вируса саркомы Молони (см. выше ген-mos).
Дефектные трансформирующие вирусы Ki- и Ha-MSV содержат РНК размером соответственно 7,5 т. о. и 5,5 т. о. (см. рис. 6).
По данным олигонуклеотидного и гетеродуплексного картирования, геномы этих ретровирусов сходны друг с другом и имеют родство с вирусом-помощником Mo-MLV [Ellis R. et а!.. 1980; Coffin J., 1982]. Области родственных последовательностей с Mo-MLV занимают 1,0 т. о. на З'-конце генома и короткий участок на 5'-коние [Ellis R. et al., 1980; Coffin J., 1982]. Собственно трансформирующие последовательности Ki- и На MSV, получившие название ras, оказались далеко не идентичными. Клоны ДНК, например pBS-9 и pHiHi-З, содержащие На- и Ki-ras-последовательностн в pBR 322, в жестких условиях гибридизации с образцами ДНК вирусинфицированных клеток проявляли различные свойства. Проба Ha-ras в инфицированных клетках гибридизовалась только с Ha-ras-последовательностями, a Ki-ras — только с Ki-ras [Ellis R. et al., 1981; Pulciani S. et al., 1982]. Наличие специфичных зондов-онкогенов позволило вести более адекватный поиск информационных РНК для ras-онкобелков.
В клетках, зараженных этими вирусами, были обнаружены РНК, равные полному геному; другие, субгеномные РНК пока не выявлены. Эти данные указывали на то, что ras-специфический продукт должен синтезироваться на полной геномной РНК-
Прямое сравнение молекулярных клонированных ДНК-копий генома На- и Ki-MSV с 30S РНК, обнаруженной в нормальных клетках крыс, показало, что указанные клоны содержат участки, не гомологичные 30S РНК (вирусоподобной) и вирусу-помощнику. Эти последовательности находятся между 750-м и 1650-м нуклеотидами в направлении от 5'-кониа генома. На рис. 6 указанные
последовательности отмечены Ha-ras-специфической штриховкой. Следует отметить, что только клоны опс-копий генома Ha-MSV, содержащие указанные последовательности, обладали трансформирующим потенциалом в экспериментах по трансфекции [Chang Е. et al., 1980; Bishop J., Varmus H., 1982].
Таким образом, геном вируса саркомы мышей штамма Харвей, по-видимому, содержит следующие области: 1) короткая последовательность около 2 т. о. на 5'-коние, происходящая из генома вируса-помощника; 2) участок размером около 0,5 т. о., гомологичный 30S РНК, происходящий из нормальных клеток крыс; 3) участок размером 0,9 т. о., представляющий собственно Ha-ras; 4) локус 2,9 т. о., гомологичный 30S РНК; и 5) участок 1,0 т. о., родственный вирусу-помощнику (см. рис. 6).
Исходя из своеобразной «мозаичности» структуры генома Ha-MSV, ряд авторов высказали предположение, что геном этого ретровируса произошел путем как минимум двух рекомбинационных событий. В результате первого рекомбинационного процесса был сформирован гибридный вирус: между вирусами лейкоза мышей MuMLV или Ki-MLV и эндогенным дефектным по репликации вирусом крыс (вирусоподобные частицы VL30). Гибридный вирус, несущий гены двух лейкозных вирусов грызунов, трансду- цировал затем соответствующий c-Ha-ras- нлн c-Ki-ras-онкоген {Ellis R. et al., 1980, 1981 ]. При этом c-ras оказался фланкирован последовательностями 30S РНК нормальных клеток крыс. Очередность рекомбинационных событий могла быть иной, и установить ее пока не представляется возможным.
Анализ и обсуждение фактов, касающихся онкогена ras, затрудняется тем обстоятельством, что эти трансформирующие последовательности в двух независимых изолятах На- и Ki-MSV происходят не от одного уникального клеточного гена, а от небольшого семейства генов. Члены этого семейства существенно дивер- гировали в процессе эволюции, сохранив при этом много общих признаков. Свойства продуктов онкогенов ras подтверждают это [Ellis R. et al., 1981 ]. В клетках, трансформированных На- или Ki-MSV, антисыворотка преципитировала белок с молекулярной массой 21 кд, идентифицированный как продукт экспрессии онкогена ras. Белок p21ras оказался фосфорилированным по треониновым остаткам.
По аналогии с pp60v src, опс-продукт гена ras синтезируется как индивидуальный белок, а не пол и протеин, и местом его синтеза являются свободные пол и рибосомы [Ellis R. et al., 1981]. Следует вновь подчеркнуть, что p21ras синтезируется не на субгеномной, а скорее на геномной иРНК [Bishop J., Varmus Н., 1982].
Методами иммунофлюоресцентной микроскопии в клетках, трансформированных На-MSV, р21ras выявляется в тесной связи с клеточными мембранами [Willingham М , 1980]. Белок не обнаружен на поверхности инфицированных клеток и не концентрируется в области контакта клеток друг с другом, а также в местах
их прикрепления к субстрату. По-видимому, не исключено, что онкобелок ras, подобно продуктам src и аЫ, может действовать и на периферии клеток [Bishop J., Varmus Н., 1982].
Можно отметить два примечательных биохимических свойства p21ras: эффективное связывание гуаниновых нуклеотидов [Scol- nick Е. et al., 1979; Shih T. et al., 1980] и аутофосфорилирование по треониновым остаткам [Shih Т. et al., 1980]. Вероятно, p21ras является своеобразной протеинкиназой. Однако обе указанные энзиматические активности онкобелка ras пока не могут объяснить механизм трансформации клеток при инфекции На- или Ki-MSV, поскольку о взаимодействии р21 с клеточными мишенями ничего неизвестно. Предполагается, что р21ss осуществляет фосфорилирование ряда клеточных рецепторов, например PDGF и опухолевого фактора роста, влияя, таким образом, на взаимодействие рецепторов с факторами. Эта функция несомненно важна как для трансформации, так и для поддержания малигнизированного статуса клеток [Heldin С.-H., Hunter Т., 1984; Wester- mark В., 1984].
Значительный прогресс в изучении структуры и возможной функции белка р2Г ras в процессе трансформации клеток-мишеней был обусловлен идентификацией трансформирующих генов в опухолях человека. Открытие возможной причинной связи онкобелка ras с неоплазмами человека потребовало новых подходов для изучения его природы и функции (см. гл. 5).
Онкогены вирусов сарком кошек (FeS V): fes, fms, sis, abl. Из спонтанных сарком кошек было изолировано более семи дефектных саркомных вирусов [Bishop J., Varmus Н., 1982; Besmer Р., 1983]. РНК вируса саркомы Шнайдера—Тилена (Snyder—Theilen — ST-FeSV) кодирует пол и протеин РЗб*/-” содержащий последовательности аминокислот gag и опс-генов, последний получил название fes {Besmer Р., 1983]. P85gag fes является единственным известным продуктом дефектного вируса ST-FeSV, который включает в свой состав следующие белки гена gag: pl5, pl2 и частично рЗО, слитый с fes-специфическими последовательностями (см. рис. 6). Как видно из рис. 6, геном ST-FeSV размером 4,5 т. о. содержит fes-специфические последовательности размером 1,6 т. о., фланкированные участками размером 1,3 т. о. на 5'-конце и 2,6 т. о. на З'-коние, принадлежащими вирусу-помощнику. •
Препараты РНК двух других изолятов: Гарднера——Арнстейна (Gardner—Arnstein — GA-FeSV) и Харди—Цукерманна (Hardy——Zuckermann ——HZl-FeSV) также кодировали аналогичные полипротеины, содержащие gag- и fes-специфические домены, но молекулярная масса этих продуктов была несколько больше молекулярной массы полипротеина ST-FeSV. P95gagfes и Р96кав fes, согласно иммуноло! ическим данным, пептидному картированию, а также гибридизации соответствующих нуклеиновых кислот, оказались близкородственными белками, принадлежащими к онко-
белкам группы fes. Все три онкобелка in vivo фосфорилированы во многих участках, в том числе по серину, треонину и тирозину [Besmer Р., 1983].
Онкобелки указанных вирусов обладали протеинкиназной активностью, катализирующей перенос фосфатной группы с АТФ к тирозиновым остаткам вирускодируемых белков и тяжелой цепи IgG. Инкубация антисыворотки TBR (полученной от крольчат с опухолями, индуцированными ВСР Ш-Р) с иммунным комплексом (ST-FeSV P85gagfes-I- антитела против p30gag) значительно (в 10—15 раз) усиливала фосфорилирование тяжелой цепи IgG по тирозиновым остаткам [Bishop J., Varmus Т., 1982; Besmer Р., 1983]. Эти данные позволили установить общность функциональных свойств протеинкиназы, кодируемой геном fes, и pp60vsrc. В клетках, трансформированных ST-FeSV, GA-FeSV и HZ 1-FeSV, наблюдается повышение уровня фосфорилирования клеточных белков по тирозину — в 5—10 раз. Фосфопротеинкиназная активность мутантов указанных вирусов была чувствительна к температуре, что подтверждает вирусспецифическую природу онкобелков этой группы ретровирусов. Таким образом, по ряду важных критериев функция онкобелков саркомных вирусов кошек практически идентична pp60vsrc.
Согласно данным молекулярной гибридизации, fes-последовательности ST-FeSV, GA-FeSV и HZI-FeSV оказались гомологичными онкогену fps-дефектных вирусов сарком кур FuSV и PRC II [Bishop J., Varmus Н., 1982; Besmer Р., 1983], что в дальнейшем было подтверждено иммунологическими данными и пептидным картированием белков [Besmer Р.. 1983]. Более того, определение нуклеотидных последовательностей fes/fps, вируса сарком кошек штамма ST-FeSV позволило выявить гомологию некоторых участков полипептидной цепи онкобелков fes с онкобелками (продуктами генов) src и mos [Bishop J., Varmus H., 1982].
В то же время в геноме других изолятов вирусов сарком кошек были обнаружены иные трансформирующие последовательности, не гомологичные онкогену fes. Один из них, fms, обнаружен в геноме ретровируса Мак-Доноха (McDonough — SM- FeSV) {Besmer P., 1983]. PHK SM-FeSV кодирует два полипептида с молекулярными массами 180 и 120 кд. Оба белка содержат гомологичные опс-специфические последовательности аминокислот, причем Р180как fms оказался слитным белком с продуктами гена gag, а р 120 ms, напротив, антигенных детерминант гена gag не содержал. Как P180gag"ms, так и р 120frns обладали протеинкиназной активностью, которая осуществляла специфическое фосфорилирование обоих онкобелков по тирозиновым остаткам [Bishop J., Varmus Н., 1982]. Однако протеинкиназа fms оказалась неспособной фосфорилировать Р180ва8 而^ и pl20*ms in vivo, и, более того, в клетках, трансформированных SM-FeSV, уровень фосфорилирования белков по тирозиновым остаткам не изменялся [Cooper J., Hunter Т., 1981 ]. Результаты опытов по фосфорилированию
клеточных мишеней ставят под сомнение протеинкиназную функцию белка, продукта гена fms, а также свидетельствуют о том, что механизмы трансформации клеток онкогенами fes и fms, вероятно, различны.
Три других изолята вирусов сарком кошек: штамм Пароди— Иргенса (Parodi—Irgens — PI-FeSV), Гарднера—Рашид (Gard- пер — Rasheed — GR-FeSV) и Харди—Цукерманна (HZ2-FeSV), по-видимому, содержат трансформирующие гены, ранее идентифицированные в геноме двух других ретровирусов млекопитающих. РНК вируса PI-FeSV кодирует полипротеин P76gags,s, содержащий домен гена gag и последовательности, гомологичные продукту гена sis (ген sis ранее был выделен из вируса сарком шерстистых обезьян, см. ниже). Полипротеин P76gaffs,s не был фосфорилирован по тирозиновым остаткам и не обладал протеин- киназной активностью [Besmer Р., 1983].
РНК вируса GR-FeSV кодирует полипротеин с молекулярной массой 70 кд (Р708ag"田)，содержащий онкогенные детерминанты гена gag, актина и опс-специфические последовательности, не родственные известным онкогенам. Трансформирующие последовательности вируса GR-FeSV получили название fgr. Пол и протеин P7QKag-«ctin-fKr обладал фосфопротеинкиназной активностью, которая катализировала фосфорилирование клеточных белков по тирозиновым остаткам [Rasheed S. et al., 1983]. '
Наконец, в РНК HZ2-FeSV из второго изолята вирусов сарком кошек обнаружили онкоген abl. Геном этого вируса кодировал полипротеин Р9бкав аЬ\ свойства и функции которого были описаны ранее в разделе, посвященном онкогену abl. P96Kagabl обладал протеинкиназной активностью [Besmer Р., 1983].
Таким образом, дефектные вирусы сарком кошек содержат в своем геноме широкий спектр трансформирующих генов, различных по структуре, а их продукты — по энзиматической активности. Большинство саркомных вирусов кошек содержат онкогены fes, fgr или abl, кодирующие фосфопротеинкиназы, которые близки по своим энзиматическим свойствам pp60vsrc. Дальнейшие исследования могут установить сходство механизмов трансформации фибробластов кошек в результате экспрессии этих онкогенов по сравнению с таковым под действием гена src ВСР. Каков механизм трансформирующего действия двух других онкогенов кошек (fms и sis) — пока неясно.
Онкоген дефектного вируса остеосаркомы мышей (FBJ- MSV) — fos. Вирус остеосаркомы мышей штамм FBJ индуцирует у новорожденных животных остеосаркомы с коротким латентным периодом. В геноме FBJ-MSV были идентифицированы опс-специфические последовательности, получившие название fos, негомологичные онкогенам ретровирусов животных [Curran Т., Teich N., 1982]. Клетки, трансформированные FBJ-MSV, содержат опс-спе- цифический белок P55fos, энзиматические функции которого
пока не изучены. Последовательности fos широко представлены в геноме позвоночных, включая человека [Curran Т., Teich N., 1982]. В клетках, трансформированных FBJ-MSV, продукт онкогена fos выявляется в ядре, однако роль онкобелка в процессе малигнизации и его клеточные мишени не определены. В настоящее время протоонкоген c-fos и продукт его экспрессии привлекают особое внимание, что обусловлено обнаружением непосредственной связи экспрессии этого гена с регулировкой дифференцировки клеток, например макрофагов [Miiller R. et al., 1984]. Вероятнее всего, продукт c-fos вовлечен в процессы начала дифференцировки макрофагов и фибробластов и регулировку клеточного цикла, а именно: под его контролем находится переход клеток из Go в G], т. е. стадию роста и деления.
Онкоген вируса саркомы мышей (MSV-3611) — raf. Онкоген raf является трансформирующим геном вируса мышиной саркомы, который индуцирует фибросаркомы у новорожденных мышей [Rapp U. et al., 1983]. Данных о его гомологии с известными онкогенами ретровирусов позвоночных не было до тех пор, пока не изолировали второй онкоген, mil, в вирусе МН 2, принадлежащем к группе вирусов МС 29. Онкогены mil/mht (его второе название) и raf оказались близкородственными. Родство двух новых онкогенов определяется, по-видимому, их общим клеточным происхождением из клеточного гена c-raf/mil. В одном случае (для MSV-3611) это был клеточный предшественник (c-raf) в мышином геноме, а в другом (для МН 2) —— клеточный предшественник c-mil в курином геноме [Newmark Р., 1983; Rapp U. et al , 1983; Jansen H. et al., 1984]. И в том, и в другом случаях два независимых ретровируса трансдуцировали гомологичный клеточный ген, присутствующий в клетках широкого круга позвоночных.
Онкоген вируса саркомы шерстистых обезьян (SS V)—sis. SSV является единственным трансформирующим ретровирусом, изолированным от приматов. Характеристика генома этого вируса сопряжена с большими трудностями, поскольку все образцы SSV содержат значительное количество вируса-помощника (SSAV).
С помощью генно-инженерной техники и гетеродуплексного картирования было установлено, что геном SSV равен 5,5 т. о. и что он дефектен по всем репликативным генам. Различие между SSV и SSAV заключалось в единственной замене в З'-обла- сти участка генома SSAV на фрагмент длиной 1,0 т. о. [Bishop J., Varmus Н., 1982; Devare S. et al., 1983]. Онкоген sis, вероятнее всего, транскрибируется независимо от репликативных генов, в hPHKs,s, которая обеспечивает синтез белка с молекулярной массой 28 кд (p28s,s). Продукт онкогена sis располагается в цитоплазме инфицированных клеток, и он оказался близкородственным тромбоцитарному фактору роста, PDGF (см. гл. 4) [Doolittle R., 1981; Doolittle R. et al., 1983].
ДНК-провирус SSV был клонирован и полностью секвениро- ван, что позволило более точно определить возможные участки регуляции транскрипции онкогена sis и молекулярную массу гипотетического белка, согласно расположению его рамки считывания. Как показали эти опыты, геном SSV можно схематически представить следующим образом: 5' — gag-pol-Aenv-sis-Aenv — 3'. Длинная рамка считывания для v-sis была найдена в env-гене; этот кодон принадлежит точке инициации транскрипции. В данном случае трансляция онкобелка инициируется третьим кодоном (АТГ), который располагается в области env-5'-KOHua и терминируется кодоном ТГА, расположенным в 3,-области гена env. Такая локализация инициирующего и терминирующего кодонов v-sis позволяет кодировать образование продукта-полипротеина, несущего env- и sis-детерминанты. Аналогичная ситуация, когда несколько env-специфических аминокислот попадают в онкобелок, была показана для mos. Однако в случае sis прямые данные о присутствии гибридной формы онкобелка в трансформированных клетках, как, например, P28env s,s, отсутствуют. С помощью компьютерного анализа, по открытой рамке считывания v-sis определены аминокислотные последовательности p28s,s. Этот белок гидрофо- бен, в трансформированных клетках не фосфорилирован и не является протеинкиназой [Devare S. et. al., 1983].
Вирус эритролейкемии Френд (FEV). FEV индуцирует эритролейкоз у мышей и не трансформирует клетки в культуре [Evans L. et al., 1979; Bishop J., Varmus H., 1982]. Из ретровирусов, вызывающих у животных острые лейкозы, FEV является исключением: в его геноме не найдены опс-специфические последовательности. Сток оригинального образца FEV содержит 3 вируса: FEV-А вирус, индуцирующий анемию; FEV-Р ——вирус, индуцирующий полицитемию; Fe-MLV — вирус-помощник. Первые два ретровируса также содержат стоки дефектных штаммов, которые получили название вирусов, формирующих фокусы селезенки — SFFVA и SFFVp соответственно. Геномы указанных вирусов представлены РНК размером 6 т. о. [Evans L. et al., 1979], содержащими последовательности экотропного вируса-помощника F-MLV, ксенотроп- ного MCF и политропного MLV. Прямое сравнение последовательностей SFFVp с MLV показало ряд отличий, касающихся только частичной делец и и репликативных генов gag-pol. Однако в клетках, инфицированных SFFVp, было выявлено присутствие gP 52 кд вместо gP 70 кд, как у политропного вируса MLV [Evans L. et al., 1979]. Частичная деления env-области в геноме SFFVp приводит к возникновению его онкогенных свойств.
Выше приведены данные относительно структуры генома ретровирусов, способных индуцировать неопластическое заболевание без онкогена и продукта его экспрессии — онкобелка. Нарушение функции репликативных генов, как, например, в случае env-гена SFFVp, приводит к превращению «непатогенного» штамма в вирус эритролейкемии Френд.
Вирус рака молочной железы мышей (MMTV). Принципиальная возможность индукции рака молочных желез у мышей «фактором молока» была показана Дж. Биттнером (J. Bittner) еше в 1936 г. [Зильбер Л. А. и др., 1975; Weis R. el al., 1983]. Позже <фактором молока» оказался ретровирус В-типа MMTV. Дальнейшее изучение этого вируса было сопряжено с большими методическими трудностями из-за отсутствия подходящих клеточных систем, позволяющих накапливать вирус в достаточных количествах для молекулярно-биологических исследований. Лишь использование методов гибридизации и клонирования генов позволило уточнить важные принципы репродукции и структуры генома [Bishop J., Varmus Н., 1982; Nusse R., Varmus H., 1982]. Однако механизмы трансформации клеток эпителия молочной железы при участии MMTV по-прежнему далеки от завершения.
MMTV представляет собой мульти ген ное семейство ретровирусов мышей, существующих как в эндогенной (передача вертикально, через половые клетки потомству в интегрированном состоянии), так и в экзогенной форме («фактор молока» Биттнера). Они ассоциированы с большинством мышиных штаммов. Особое внимание исследователей к этой группе вирусов в последнее время объясняется следующими причинами.
Установлено, что транскрипция генома MMTV находится под контролем глюкокортикоидных гормонов. Участком генома, через который осуществляется гормональный контроль экспрессии провируса, является LTR, точнее его из-область [Heidelberger Ch., 1980]. Дальнейшее изучение влияния глюкокортикоидов на экспрессию провируса MMTV привело к открытию необычного механизма переноса специального рецептора от поверхности клетки в ядро и его непосредственное взаимодействие с LTR [Heidelberger Ch., 1980].
Исключительно большие размеры и3-области LTR MMTV (около 1,2 т. п. о.) позволили высказать предположение о том, что эта область может осуществлять кодирование определенного белка. Как показало клонирование и3-области двух MMTV, она действительно содержит открытую рамку считывания, достаточную для кодирования полипептида с молекулярной массой около 30—36 кд [Dickson С., Peters G., 1981J.
Ранее на суб геномном фрагменте поли (А) РНК MMTV был показан синтез подобного белка [Coffin J., 1982]. Вероятно, синтез полипептида, кодируемого LTR, необходим для экспрессии провируса MMTV и трансформации клеток молочной железы мышей. Однако это положение требует дополнительных доказательств.
Поскольку трансформирующий ген в геноме MMTV не обнаружен, провирусу MMTV в онкогенезе молочной железы отводят второстепенную роль или роль кофактора. Не исключено, что ДНК провирус MMTV активирует локусы протоонкогенов int 1 или int 2, расположенных в хромосомах 15 и 2 соответственно (Ре-
ters G. et al., 1984]. Подобные локусы расположены в геноме клеток человека, однако их отношение к раку молочной железы женщин пока неизвестно. Недавно в карциномах молочной железы мышей, индуцированных метилхолантреном, был идентифицирован трансформирующий ген ras (Sukumar S. et aL, 1983]. Изучение вопросов активации протоонкогенов, например семейства ras, в стадии гормонозависимой экспрессии провируса MMTV позволит определить роль отдельных компонентов этого процесса с малигни- зацией клетки-мишени. Идентификация в клеточной линии SK- BR-3 (клетки рака молочной железы человека) трансформирующего гена ras [Князев П. Г. и др., 1984], c-myc [Kozbor D., Croce С., 1984], а также выявление в опухолевых клетках молочных желез женщин «отпечатков пальцев» MMTV [Weiss S. et al., 1977; Bishop J., Varmus H., 1982] придают этой модели экспериментального и спонтанного канцерогенеза особое значение.
В предыдущих разделах были представлены данные, касающиеся различных вирусных онкогенов, количество которых превышает в настоящее время 20. Большинство из перечисленных онкогенов изучены в структурном отношении достаточно полно, что открывало возможность сравнить их нуклеотидные и аминокислотные последовательности соответственно самих генов и их белков. Такой анализ позволил установить ряд индивидуальных особенностей онкогенов: для некоторых уникальность структуры (отсутствие гомологии с другими), для других — полное или частичное родство с уже известными онкогенами. Будут ли открыты новые онкогены в ретровирусах или их число лимитировано какими-либо биологическими закономерностями? Выше отмечалось, что ретровирусы способны захватывать соответствующие клеточные гены у различного вида животных (fps, abl, sis и др.). Подобная «предпочтительность» к трансдукции ретровирусами определенных клеточных генов свидетельствует об ограниченном числе протоонкогенов, которые служат источником новых вирусных онкогенов.
Проблема взаимной кооперации- вирусных онкогенов в процессе трансформации клеток-мишеней возникла относительно недавно, после открытия двух негомологичных онкогенов в геноме одного ретровируса. Комбинация двух онкогенов в генетическом аппарате вируса существенно изменяла круг клеток-мишеней, подвергающихся трансформации. Так, например, ретровирус Е26, содержащий онкогены myb и ets, способен индуцировать эритробластоз или смешанные лейкозы. Более того, в некоторых случаях вирус Е26 вызывает трансформацию фибробластов кур. Ничего подобного онкоген myb индуцировать самостоятельно не может. Следовательно, либо онкоген ets контролирует онкобелок, способный вызывать трансформацию эритробластов или фибробластов, либо это результат кооперат ивного взаимодействия двух онкогенов—myb и ets. Ответ на этот вопрос будет скоро найден, поскольку другой онкоген, raf, участвующий в образова-
нии фибросарком у мышей, оказался гомологичным онкогену mil, второму онкогену ретровируса птиц МН 2, который содержит два онкогена — myc + mil — и способен индуцировать гепатокарциномы и фибросаркомы. Поэтому способность онкогена raf/mil индуцировать трансформацию фибробластов кур и мышей может отражать специфичность этого онкогена к конкретной клетке и определенному типу неопластического превращения.
МЕХАНИЗМЫ ВИРУСНОГО ЛЕЙКОМОГЕНЕЗАУ МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ЧЕЛОВЕКА
Молекулярные основы неопластических заболеваний у животных (обычно это лейкозы), ассоциированные с ретровирусами, изучены все еще недостаточно. Исключением являются лимфо- саркомы бурсы цыплят, индуцированные ALV, где показана активация протоонкогена тус (см. гл. 4).
Эти заболевания индуцируются недефектными вирусами, которые, по всей видимости, содержат только репликативные гены. В процессе интеграции вируса лейкоза в геном инфицированной клетки могут возникать весьма своеобразные эффекты, которые являются дополнительной функцией ДНКгпровируса. В общих чертах проследить характер взаимодействия ретровируса (не содержащего онкоген) с клеткой практически невозможно, поскольку очень трудно разделить эффекты, возникающие в клетке в процессе репродукции вируса и его интеграции в геном хозяина.
В данной главе проанализировать эти вопросы не представляется возможным, поэтому мы рекомендуем читателям ряд обзоров, рассматривающих вирусиндуцируемый лейкомогенез у животных более подробно [Зильбер-Л. А. и др., 1975; Берлинских Н. К., 1983; Киселев Ф. JI. и др., 1983; Weiss R. et al., 1982].
РОЛЬ ОНКОГЕННЫХ ВИРУСОВВ ВОЗНИКНОВЕНИИ ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА
Открытие вирусных и клеточных трансформирующих генов, индуцирующих злокачественный рост клеток, а также доказательство клеточного происхождения вирусных онкогенов способствовали снижению интереса исследователей к дальнейшему поиску еще неизвестных вирусов. Это тем более оправданно, так как за весь 20-летний период работы, начиная с 60-х годов нашего столетия, из нормальных и опухолевых клеток человека было выделено лишь небольшое число реальных ретровирусов человека, не принадлежащих к эндогенным вирусам животных, как, например, кошек—RD-114 или обезьян — Мейзона — Пфайзера (MPMV). Нередко в опухолевых клетках человека выявлялись следы присутствия отдельных вирусспецифических компонентов, которые, однако, при детальном рассмотрении не имели ничего общего ни с эпидемиологией определенного типа опухолей, ни с па-
то генетическим процессом превращения нормальной клетки в опухолевую.
Важно подчеркнуть, что роль онкогенных вирусов в происхождении опухолей человека в период становления онковирусологии была несколько завышена, что в конечном итоге имело известные негативные последствия, поскольку ориентировало исследователей в более узком, вирусологическом направлении.
Недавние вирусологические и эпидемиологические исследования позволяют рассматривать три группы онкогенных вирусов в качестве реальных кандидатов на роль этиологических факторов неопластических заболеваний человека. Это прежде всего ретровирус Т-лимфолейкоза взрослых людей, а также герпесвирусы и гепадновирусы.
Связь вируса Т-клеточного лимфолейкоза взрослых (HTLV) с малигнизацией гематопоэтических клеток человека. HTLV — С-типа экзогенный ретровирус человека — был изолирован в 1979—1980 гг. из опухолевых клеток взрослых больных Т-кле- точной лимфомой—лейкемией (ATL) fPoiesz В. et al., 1981]. Этот инфекционный агент с момента своего открытия «подозревался» в качестве этиологического фактора указанного заболевания человека. Инфекционный процесс, индуцируемый HTLV и приводящий к развитию Т-клеточной лейкемии, соответствует классической триаде Коха, за исключением модельных экспериментов на животных (по этому поводу нет сообщений в литературе) .
HTLV является новым вирусным агентом, индуцирующим злокачественные заболевания человека. Он найден у всех больных, содержащих антитела к вирусным белкам, индуцирует и трансформирует соответствующие клетки-мишени в культуре. Анализ эпидемиологических данных свидетельствует о том, что эндемическая область распространения заболевания, индуцируемого этим вирусом, ограничивается Японией (южные районы) и Индией. Следует заметить, что единичные случаи заболевания у англичан и американцев клинически и гистологически не отличаются от заболеваний ATL японцев. Увеличение частоты заболеваемости взрослого населения Т-лимфолейкозом в Японии за последние 30 лет (не менее 100 случаев в год) свидетельствует о том, что естественная история и эпидемиология распространения HTLV в достаточной мере еще не изучены.
Использование серологических и молекулярно-биологических тестов для диагностики ATL и лимфом показало, что районы ассоциации этих заболеваний с инфекцией HTLV значительно шире, чем упомянутые, и к ним относятся также Северная и Южная Америка и Ближний Восток [Weiss R. et. al., 1982].
Характер взаимодействия HTLV с чувствительной клеткой- хозяином (Т-лимфоцитом) оказался во многих отношениях неожиданным [Weiss R. et al., 1982; Sarngadhavan M. et al., 1983]. До выделения этого вируса подобные факты среди ретровирусов
животных не наблюдались. Моноклональные антитела, полученные против белка р!9, продукта гена gag HTLV, перекрестно реагируют с эпителиальным антигеном тимуса здорового человека. Поскольку HTLV является экзогенным вирусом, обнаружение продукта гена gag белка р!9 в нормальном тимусе человека могло свидетельствовать о том, что этот антиген кодируется не вирусным, а клеточным геном и попадает белок р!9 в вирион при сборке вирусных частиц. Однако в дальнейшем высказанное предположение не подтвердилось. Моноклональные антитела против белка р!9 реагировали также с предшественником белков р!9 р24. Подобное обстоятельство указывало на то, что белок р!9, несомненно, кодируется вирусным геном.
В связи с тем, что нуклеотидные последовательности генома HTLV определены, можно ожидать, что в ближайшее время вопрос о взаимодействии гена gag HTLV и белка р19 с антигеном (белком) тимуса человека будет решен.
Другой внутренний белок вириона HTLV — р24 — также кодируется геном gag, однако выявляется он только в индуцированных и трансформированных Т-лимфоцитах человека. Наличие антител к р24 в сыворотке крови больных ATL служит диагностическим тестом вирусной инфекции [Sarngadhavan М. et al., 1983].
По данным американских и японских исследователей, в 90—— 98 % случаев типичных острых лимфолейкозов у взрослых в крови последних появляются антитела к HTLV (к белкам р19 и р24). Антитела к белку р24 обнаружены у 30 % родственников больных ATL, а также у 12 % здоровых доноров в эндемичной по ATL области в Японии. 800 проб сывороток крови здоровых доноров, живущих на Европейском континенте, не содержали антител к р24 HTLV [Sarngadhavan М. et al., 1983].
В конце 1983 г. были получены новые и весьма важные данные, касающиеся диагностики, лечения и профилактики ATL. Они свидетельствуют о частичной гомологии генов env и антигенов гистосовместимости (HLA-1). Подобная генетическая гомология позволяет сделать вывод о том, что HLA-1 и глюкопротеид вирусной оболочки являются гомологичными антигенами, кодируемыми вирусным, а не клеточным геномом. Серологический анализ сывороток крови больных ATL показал, что все больные имеют нейтрализующие антитела, специфичные для гликопротеидов оболочки HTLV, а следовательно, и для HLA-1 [Sarngadhavan М. et al., 1983].
Другим клеточным антигеном, ассоциированным с оболочкой HTLV, является белок рецептора фактора роста Т-клеток [Sarngadhavan М. et al . 1983), который может быть распознан tac-1 -моноклональными антителами. В этом случае антиген имеет клеточное происхождение, он кодируется клеточным геном. В процессе почкования вириона HTLV этот белок избирательно захватывается вирионом из клеточной мембраны [Poiesz В. et al., 1981; Sarngadhavan М. et al., 1983).
Механизм трансформации Т-лимфоцитов HTLV неизвестен. Предполагается, что интеграция ДНК-провируса HTLV (по аналогии с ретровирусами птиц — ALV, не имеющими онкогена, но индуцирующими лимфосаркомы бурсы) приводит к активации одного или нескольких — «каскада» — клеточных протоонкогенов. При изучении экспрессии с-опс в клеточной линии взрослого больного острым Т-клеточным лнмфолейкозом HUT-102 выявили присутствие иРНК, комплементарных онкогенам v-myc, v-ras и v-sis, причем экспрессия протоонкогена sis была обнаружена только в этой клеточной линии из всех тестируемых гемопоэтических клеточных линий человека опухолевого и нормального происхождения. Связь интеграции ДНК-провируса с B-lym-трансфор- мирующим геном маловероятна, поскольку этот трансформирующий ген является этапным онкогеном трансформации В-кле- ток птиц и человека.
Роль вирусов герпеса в возникновении некоторых форм неопластических заболеваний человека. Значительный онкологический интерес к вирусам группы герпеса человека обусловлен следующими фактами [Tooze J., 1980; Galloway D., McDougal J., 1983]:
В некоторых опухолях человека электронно-микроскопическими и вирусологическими методами были выявлены частицы, имеющие характерные особенности вирусов группы герпеса； обнаружена экспрессия вирусных антигенов в опухолевых клетках, а также выявлены вирусспецифические РНК и ДНК. К этим опухолям относятся: лимфома Беркитта, назофарингеальный рак у китайцев (ассоциация с вирусом Эпштейна — Барр — EBV) и рак шейки матки у женщин (ассоциация с вирусами герпеса серотипов 1 и 2, HSV-1 и HSV-2).
Зона наибольшего распространения заболеваемости лимфомой Беркитта у африканского населения, проживающего в странах Центральной Африки, указывала на эндемический характер возникновения этой опухоли. Об этом же свидетельствуют данные сероэпидемиологического обследования женщин, больных раком шейки матки. У больных женщин частота положительного выявления гуморальных антител к HSV-2 в 2—4 раза выше, чем в контрольных группах здоровых женщин. Частота инфицированности женщин вирусом группы герпеса простого серотипов 1 и 2 в настоящее время достигает эпидемических масштабов.
Как EBV, так и HSV способны in vitro трансформировать соответствующие культуры клеток; мишенями для EBV являются В-лимфоциты человека. Инфекция В-клеток человека сопровождается незлокачественной трансформацией лимфоцитов, т. е. их иммортализацией. Напротив, инактивированный ультрафиолетовым облучением HSV способен трансформировать культуры фибробластов грызунов, которые сравнительно быстро приобретают раковый фенотип. Отсутствие хорошо охарактеризованных делеционных мутантов HSV затрудняет определение непосред-
ственного участия в трансформации клеток-мишеней в и рус индуцированных белков. Обнаружение подобных белков в инфицированных и трансформированных клетках позволило бы определить конкретный вклад тех или иных вирускодируемых белков в инициацию и поддержание ракового фенотипа клеток.
В настоящее время основное направление молекул я рно-био^ логического изучения как геномов EBV и HSV, так и трансформированных ими клеток направлено на идентификацию трансформирующих генов вирусов и продуктов их экспрессии в процессе трансформации клеток-мии1еней. В этих исследованиях было установлено, что трансфекция реципиентных культур только определенными клонированными фрагментами ДНК геномов HSV приводит к малигнизации клеток грызунов или иммортализации В-лимфоцитов в случае с EBV. В процессе вирусиндуцированной трансформации компетентных клеток наблюдается экспрессия определенных областей вирусного генома, которая может быть определена по присутствию вирусспецифических иРНК и соответствующих вирусных белков-антигенов. Подобные антигены можно выявить не только в экспериментальной системе, но и в опухолевых клетках человека. Механизм трансформации В-лимфоцитов человека EBV изучен наиболее полно, что позволило объединить в единое целое несколько молекулярных процессов, приводящих к формированию лимфомы Беркитта. В малигнизации В-лимфоцитов человека принимает участие «каскад» генетических элементов, в их числе трансформирующие последовательности EBV, транслокация и экспрессия протоонкогена с-тус, а также активация семейства онкогенов ras и, наконец, онкогена B-lym (см. гл. 5).
Молекулярный механизм малигнизируюшего действия вирусов простого герпеса изучен значительно хуже, хотя трансформирующие области геномов HSV-1 и HSV-2 были определены в нескольких лабораториях [Galloway D., McDougal J., 1983]. Для идентификации вирусных генов, ответственных за трансформацию, были использованы следующие подходы.
Традиционными методами молекулярной гибридизации в клетках, трансформированных ирусными частицами, как уже отмечалось выше, были выявлены вирусспецифические иРНК и ДНК. Однако количественно и качественно их содержание менялось в зависимости от числа пассажей трансформированных клеток. В таких клетках удается зарегистрировать лишь незначительное число копий генома HSV или только его часть. Более того, в ДНК ряда длительно культивируемых клеточных линий, по данным молекулярной гибридизации, герпесвирусные гены не определялись [Tooze J., 1980]. Следует заметить, что в указанных экспериментах для определения небольшого фрагмента вирусного генома, интегрированного в ДНК малигнизированных клеток, использовали геномную ДНК HSV тотально, а это значительно снижает чувствительность метода исследования. Что касается определения
вирусиндуцированных антигенов, связанных с трансформацией, то, по предварительным данным, вирусные белки в трансформированных HSV-клетках кодируются последовательностями, расположенными в области 0,30——0,41 и 0,58—0,63 усл. ед. карты вирусного генома. Более совершенным подходом является определение трансформирующей активности клонированных фрагментов генома HSV в отношении различных реципиентных культур клеток. В этих опытах было показано, что трансформирующие гены HSV-1 и HSV-2 расположены в различных участках вирусного генома, хотя локализация остальных репликативных генов этих вирусов была идентична. В геноме HSV-2 обнаружены два фрагмента вирусной ДНК, способных, в зависимости от условий эксперимента по трансфекции, трансформировать клетки грызунов. Вновь, как и в случае с целыми вирусными частицами, малигнизированные клетки в ряде случаев не содержали вирусных последовательностей, первично инициирующих трансформацию [Galloway D., McDougal J., 1983].
Остановимся более подробно на характеристике трансформирующих генов HSV-1 и HSV-2.
Трансформирующий ген HSV-1 располагается между 0,31 — 0,42 усл. ед. карты генома и способен трансформировать эмбриональные культуры клеток хомяков и мышей BALB ЗТЗ. Этот фрагмент кодирует вирусные белки гликопротеин A/В и VP143, которые часто выявляются в вирустрансформированных клетках грызунов. Тем не менее попытки выявить последовательности трансформирующего гена HSV-1 в ДНК малигнизированных клеток оказались безуспешными.
Два трансформирующих гена HSV-2 штамма 333, негомологичные онкогену HSV-1, занимают позиции 0,43—0,58 и 0,58— 0,63 усл. ед. карты генома (фрагменты Bgl II С и Bg II N соответственно) [Galloway D., McDougal J., 1983]. Трансфекция эмбриональных клеток хомяков и крыс фрагментом Bgl II N приводила реципиентные клетки к злокачественной трансформации. Малигни- ация клеток была стабильной, однако, при наличии лишь части последовательностей генома Bgl II N-фрагмента HSV-2, вирусин- дуцируемые белки в указанных линиях клеток не выявлялись. Для Bgl II С-фрагмента генома HSV-2 установлены две трансформирующие функции: левая область этого фрагмента индуцировала иммортализацию реципиентных клеток, тогда как для их злокачественной трансформации требовалась трансфекция клеток целым фрагментом. В дальнейшем при детальном рестрикционном анализе 7,6 т. п. о. Bgl II N-фрагмента генома HSV-2 было установлено, что его трансформирующая область представлена более мелким участком, размером 2,1 т. п. о., который сохранялся в трансформированных клетках. Вопрос о продукте, кодируемом указанным фрагментом и принимающем участие в инициации трансформации, пока не решен однозначно, поскольку в вирустрансформированных клетках иРНК, комплементарные 2,1 т. п. о.
участку фрагмента Bgl II N, обеспечивали синтез не одного, а трех белков с молекулярными массами 140 кд, 61 кд и 35—38 кд. Наиболее вероятным продуктом трансформирующего гена Bgl I N является белок с молекулярной массой 38 кд, который синтезируется в ранний и поздний периоды репродукции вирусного генома в клетках, инфицированных HSV. Парадоксально, но указанный белок не выявлялся а клетках грызунов, трансформированных Bgl II N-фрагментом.
Суммируя данные, полученные на экспериментальных моделях, можно сделать следующее заключение.
Во-первых, два герпесвируса обоих серотипов — 1 и 2 (HSV-1 и HSV-2) содержат в своем геноме трансформирующие гены, способные малигнизировать компетентные клетки. Трансформирующие гены HSV-1 и HSV-2 значительно отличаются друг от друга.
Во-вторых, вирусспецифические белки, по-видимому, не вовлечены в механизм вирусиндуцированной трансформации, а для поддержания малигнизированного состояния клеток присутствие в них онкогенов HSV не требуется.
Эти факты указывают на возможную роль онкогенов HSV-1 и HSV-2 в стадии инициации процесса малигнизации, но не в стадии поддержания неопластического состояния.
Идентификация трансформирующих генов HSV-I и HSV-2 открыла возможности более целенаправленного поиска присутствия и экспрессии вирусспецифических генов в клетках рака шейки матки у женщин. Гибридизацией in situ было установлено, что лишь ограниченные области генома HSV-2 :0,07—0,40; 0,58—0,63 и 0,82—0,85 [Galloway D., McDougal J., 1983] транскрибируются, причем непостоянно и по-разному у различных серопозитивных доноров, в вирусспецифические РНК- Это не позволило идентифицировать трансформирующие гены в опухолевых клетках человека. Правда, имеется сообщение о том, что в 3 из 9 опухолей рака шейки матки были обнаружены последовательности, комплементарные фрагменту Bgl II N. Некоторые из этих опухолей содержали последовательности фрагмента Bgl II J, а в ряде опухолевых клеток зарегистрировано присутствие двух указанных фрагментов генома HSV-2. Эти факты не свидетельствуют о специфичности взаимодействия генома HSV-2 с нормаль- нм эпителием шейки матки в процессе канцерогенеза [Galloway D., McDougal J., 1983].
В культурах опухолевых клеток человека и животных была установлена необходимость для поддержания их малигнизированного статуса персистенции трансформирующих генов ретровирусов и паповавирусов. Подобная связь между малигнизацией и трансформирующими генами HSV-2 пока не определена. Тем не менее многочисленные данные о взаимодействии генома HSV с ДНК инфицированных клеток позволили высказать предположение о причастности герпесвирусных онкогенов к стадии инициации
трансформации, но не к поддержанию малигнизированного состояния клеток (так называемый механизм «hit-and-ran> — «ударил-убежал»). Открытие протоонкогенов и клеточных трансформирующих генов (см. гл. 4 и 5) позволило подвергнуть экспериментальной проверке возможность включения с-опс-генов отдельными фрагментами генома HSV-2 по механизму инсерции или по принципу «hit-and-гап». Следует надеяться, что уже в ближайшем будущем подобные данные будут получены, как это сделано на модели EVB и лимфомы Беркитта.
Другим объяснением необычного характера опухолеродного действия HSV является то, что эти вирусы могут функционировать как мутагены. Все вирусы группы герпеса в инфицированных клетках индуцируют хромосомные аберрации, транслокации участков хромосомы (например, EBV), причем за подобные изменения в клетках ответственны именно ранние функции вирусного генома. Мутагенный эффект HSV не связан с инсерцией вирусного генома в хозяйскую ДНК- В этой связи значительную важность приобретают исследования, направленные на идентификацию вирусных ферментов, способных участвовать в HSV-индуцированном мутагенезе. Действие таких вирускодируемых ферментов может быть направлено на деградацию ДНК (например, щелочная экзонуклеаза — фосфатаза — или экзонуклеазная активность, ассоциированная с ДНК-полимеразой), а также на биохимические реакции, обеспечивающие синтез вирусной и хозяйской ДНК (например, ДНК-полимераза, рибонуклеотидре- дуктаза или тимидинкиназа).
Таким образом, механизм малигнизирующего действия HSV на клетки-мишени еще не установлен. Идентификация трансформирующих областей геномов HSV-1 и HSV-2, а также обнаружение в некоторых случаях рака шейки матки присутствия подобных генов, без продукции, однако, вирусспецифических белков свидетельствуют о канцерогенной опасности герпесвирусной инфекции половых путей женщин. Кроме того, они позволяют высказать ряд рабочих гипотез по поводу природы этого заболевания и возможного способа действия вирусов простого герпеса на клетки-мишени. Тем не менее полученные данные о вирусах герпеса пока не раскрывают окончательного хода молекулярных процессов при малигнизации эпителия шейки матки у женщин и связи герпесвирусов с неоплазиями у людей.
Онковирусология последних лет явилась в известной мере истоком и одной из основ молекулярной онкологии как в методическом, так и в теоретическом плане. В процессе изучения молекулярных событий, происходящих при взаимодействии вирусных генов с клеточным геномом, были открыты важнейшие биологические феномены: интеграция геномов; обратный поток генетической информации (РНК->-ДНК)； трансдукция клеточных генов в вирусный геном. В конечном счете все это привело к идентификации особой категории генов многоклеточных организмов.
имеющих непосредственное отношение к росту (c-sis, c-ras и c-erb В), пролиферации (c-ras и с-тус), дифференцировке (c-fos) и трансформации клеток (все известные вирусные онкогены).
Дальнейшее изучение систем вирус—клетка (или вирусный онкоген—клетка), а также других экспериментальных моделей (например, клеточный трансформирующий ген—клетка) будет направлено, по-видимому, с одной стороны, на углубленное изучение функции онкогенов и их продуктов — онкобелков, а с другой —на исследование внутриклеточных мест приложения действия онкобелков и реакции самой клетки как целого — на вторжение чужеродной генетической информации.
В перспективе это позволяет надеяться на открытие основных биологических принципов феномена малигнизации.
ГЛАВА 4
КЛЕТОЧНЫЕ ОНКОГЕНЫ
ПРОТООНКОГЕНЫ
Разнообразие форм злокачественных опухолей и факторов, вызывающих их, естественно наводило на мысль о множественности путей возникновения этих заболеваний и сложности интерпретации их этиологии. Однако становилось ясным, по крайней мере, одно важное обстоятельство: на уровне клетки неоплазия — явление наследственное, и, следовательно, связано оно с изменениями в генетическом материале клеток, т. е. ДНК. Причин рака, действительно, много, но все они, как вода через горлышко воронки, должны проходить одно критическое русло — ДНК, оставляя в ней какой-то след.
Это стало особенно ясно после открытия онкогенов опухолеродных ретровирусов и, более того, доказательства клеточного происхождения онкогенов. Было установлено, что прародителями как вирусных, так и невирусных онкогенов являются специфические клеточные потенциально трансформирующие последовательности нуклеотидов ДНК клеток, так называемые протоонкогены. В основе современной теории онкогенеза лежит именно модель, рассматривающая клеточный онкоген в качестве критически важного звена в процессе онкогенной трансформации [Альтштейн А. Д., 1973; Huebner R., Todaro G., 1972; Comings D., 1973].
В соответствии с этой моделью онкоген представляет собой нормальные («безобидные») последовательности клеточной ДНК, чья неадекватная (количественная, качественная или временная) экспрессия (или активация) меняет свойства или функцию экспрессируемого продукта. Здесь возможны два аспекта феномена: 1) чисто количественные изменения с переходом количества в иное функциональное качество; 2) качественные изменения: клеточная последовательность (протоонкоген) меняется под воз-
действием различных факторов. Эти два аспекта подробно будут рассмотрены позже в других разделах книги. В данный же момент важно сосредоточиться на центральном звене новой схемы канцерогенеза за счет активности онкогенов ——на клеточных онкогенах. Косвенное подкрепление этой модели пришло из вирусологии опухолей. Среди четырех классов онкогенных вирусов, по-види- мому, три: аденовирусы, паповавирусы и герпесвирусы — приобрели в процессе своей эволюции специфические вирусные генетические последовательности, которые они используют для трансформации инфицированных ими клеток. В противоположность этому, многие члены четвертого класса онкогенных вирусов ——ретровирусов —индуцируют траснформацию путем использования гена, трансдуцированного в виде клеточных генетических последовательностей, чье присутствие в геномах ретровирусов придает последним трансформирующий потенциал. Инкорпорируя клеточный ген в свой геном, вирус высвобождает клеточный ген из-под контроля клеточных механизмов, которые управляют его экспрессией в нормальной клеточной хромосоме, и помещает клеточный ген в систему вирусной регуляторной компетенции. Кроме этого, будучи ассоциирован с вирусным геномом, клеточный ген приобретает генетическую мобильность, характерную для инфекционных вирусов.
Эта интимная связь между ассоциированными с ретровирусом онкогенами и нормальными клеточными генами наиболее полно документирована для птичьего вируса саркомы, ВСР.
Из истории открытия клеточных онкогенов. Вирусный ген ВСР, индуцирующий клеточную трансформацию, был назван src (сарк.).
Эволюционное происхождение ретровирусных онкогенов было неясно до открытия положения о том, что ДНК как птиц [Stehe- lin D. et al., 1976], так и млекопитающих [Spector D. et aL, 1978] содержат нуклеотидные последовательности, близкородственные (гомологичные) онкогену src ВСР. Обнаружение этих фактов вызвало к жизни два предположения: 1) все позвоночные обладают высококонсервативным геном (клеточным src), который родствен вирусному src и является поэтому потенциально онкогеном; 2) вирусный src возник путем трансдукции клеточного src в предшествующий ретровирус.
Когда позже выявлялись новые онкогены, каждый оказывался имеющим клеточного гомолога, из которого вирусный онкоген, по-видимому, возник [Bishop J., 1981; Weiss R. et al., 1982]. Можно думать, что ретровирусные онкогены являются лишь моделью большой группы клеточных генов с онкогенным потенциалом, т. е. «раковыми генами», которые уже фигурируют в медицинской генетике [Knudson А., 1981].
sr с-ген. Онкоген ВСР был первым из идентифицированных онкогенов. Важный шаг в его открытии был сделан J. Martin (Калифорнийский университет), который в 1970 г. идентифицировал
температурочувствительный мутант ВСР. Он показал, что температура способна влиять на способность вируса трансформировать клетки в культуре. С помощью изменения температуры оказалось возможным вызывать обратимую инактивацию гена. Если культуры клеток, инфицированные температурочувствительным мутантом, инкубируются при «пермессивной» температуре (35 ℃), то они трансформируются. Если же температура становится более высокой ——42 ℃ («рестриктивной»), то клетки в течение нескольких часов возвращаются к нормальному фенотипу. Однако при новом понижении температуры они вновь становятся трансформированными. Суть этих феноменов заключается в следующем: при «рестриктивной» температуре продукт мутировавшего гена инактивируется.
Трансформация, таким образом, обусловливается действием гена, который для того, чтобы поддерживать раковое состояние, должен экспрессироваться непрерывно. (В большинстве случаев температура действует не на сам ген, подвергшийся мутации, а на продукт его экспрессии ——белок, который и чувствителен к температуре).
Ген src вскоре приобрел еще большую реальность благодаря исследованиям Р. Duesberg, С. Weissmann, М. Billeter и J. Coffin. Они работали со штаммами ВСР, изолированными Р. Vogt. Эти штаммы являются «делеционными» мутантами, которые потеряли онкоген и поэтому неспособны индуцировать опухоли или трансформировать клетки в культуре. Р. Duesberg и С. Weissmann с сотр. фрагментировали геномы «делеционных» мутантов дикого (онкогенного) типа вирусов ферментом рибонуклеазой. Путем определения, какой именно фрагмент отсутствует в мутантах, они смогли идентифицировать онкоген как сегмент РНК вблизи одного конца генома ВСР.
В настоящее время техника генной инженерии позволяет более точно определять и тестировать онкогены. ДНК теперь может быть рассечена на фрагменты в специфических сайтах с помощью набора ферментов — рестрикционных эндонуклеаз. Отдельные фрагменты могут быть выращены в больших количествах в бактериях (в составе плазмид), затем реизолированы и инсертированы в культивируемые клетки, где гены, несомые ДНК, экспрессируются. Указанным выше путем можно разрезать вирусную ДНК на куски, которые несут искомый единственный ген, способный трансформировать клетки благодаря свойству его кодировать уникальный белковый продукт, трансформирующий клетку. Именно в это время появилась следующая интерпретация описанных опытов: один ген путем программирования синтеза одного белка может осуществить изменения, характеризующие раковую клетку. Считалось, что узнать такой белок, понять, как он действует, — значит раскрыть механизм онкогенеза. Как усложнилась эта ортодоксальная схема в ходе дальнейших исследований, мы укажем позже.
src-Белок. Белок, кодируемый геном src, стал известен благодаря работам R. Erickson и соавт. (1980), которые идентифицировали белок, синтезирующийся в пробирке по «инструкциям» генома дикого типа ВСР, но не образующегося в случае использования генома «делеционного» мутанта, лишенного гена src. Затем они вызвали образование кроличьих антител к предполагаемому src-белку путем индуцирования опухолей у кроликов с помощью ВСР. Антитела соединялись специфически с белком, синтезированным in vitro, а также с идентичным белком в клетках, трансформированных геном src. Это позволило идентифицировать белок, который кодируется src-геном и ответствен за действие гена. Белок был назван pp60v src («рр> указывает на то, что он является фосфопротеином; цифра 60 характеризует его молекулярную массу — 60 кд. v-src указывает на его генетическое происхождение—вирусный ген src).
Происхождение онкогенов. Одно время полагали, что онкогенное действие вирусов могло бы рассматриваться как побочное проявление активности других вирусных генов, чьей главной функцией является участие в продукции новых вирусных частиц. Теперь ясно, что репликация ретровирусов протекает нормально в отсутствие онкогенов. Как в этом случае объяснить широкое распространение онкогенов в ретровирусах и их очевидную «консервацию» в ходе эволюции? Десятилетние исследования дали неожиданный ответ: онкогены ретровирусов являются просто клеточными генами в ином обличье, «пассажирами», подхваченными из животных, в которых вирусы реплицируются. Открытие того факта, что клетки также содержат онкогены, имеет значение, далеко выходящее за пределы онковирусологии.
В 1972 г. D. Stehelin, Н. Varmus и J. Bischop решили проверить «онкогенную гипотезу» R. Huebner и G. Todaro. В поисках единого механизма объяснения индукции рака многими различными агентами R. Huebner и G. Todaro предположили, что онкогены ретровирусов являются частью генетического «багажа* всех клеток, возможно, приобретенного в результате инфекции вирусами клеток на ранних этапах эволюции. Согласно этому представлению, онкогены безобидны до тех пор, пока остаются в покое. Когда же они активируются различными канцерогенными агентами ——индуцируют в клетках раковый рост. D. Stehelin и соавт. предполагали, что если гипотеза R. Huebner и G. Todaro (1972) верна, то src-ген должен присутствовать в ДНК нормальных клеток и, следовательно, его можно там обнаружить. Но как практически сделать это, если учесть, что src-ген единичен, а клеточных генов в геноме позвоночных содержится десятки тысяч? Задача, сравнимая с поиском иголки в стоге сена! D. Stehelin пошел по оригинальному пути： он создал так называемую «пробу» — радиоактивную ДНК, скопированную исключительно с src-гена с помощью обратной транскриптазы. Скопированная с src-гена ДНК служила в качестве зонда в поиске клеточной
ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность, идентичную (или очень сходную) таковой src. Поиск проводился с помощью молекулярной гибридизации, в которой цепи нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) гибридизовались, т. е. образовывали комплексы с родственными участками нуклеиновых кислот.
Поиски увенчались успехом: «проба» — копия гена src — D. Stehelin гибридизовалась с ДНК клеток неинфицированных кур и других птиц. D. Spector и соавт. (1978) показали, что родственные src-участки ДНК содержатся и в геномах млекопитающих, включая человека, и рыб. Было сделано заключение, что все позвоночные обладают геном, родственным src. Эти данные говорили в пользу теории онкогенов Huebner—Todaro.
Мы так подробно рассказываем об этих экспериментах с c-src (《с» ——означает клеточный) по той причине, что они послужили фактической основой ядра теории онкогенов, где клеточные гены — первоисточник двух других главных классов онкогенов: ретровирусных и невирусных опухолевых [Bishop J., 1982].
При более детальном рассмотрении открытого таким образом у позвоночных клеточного онкогена (c-src) подтвердилось, что это явно не ретровирусный, а клеточный ген. Такое заключение следовало из анализа структуры его генома. Было показано, что белоккодирующая информация c-src рассредоточена в нескольких отдаленных друг от друга доменах, называемых экзонами, с вставленными между ними участками, интронами. Такая «расщепленная» структура типична для генов животных, но не генов ретровирусов. Все варианты c-src, найденные у рыб, птиц и млекопитающих, близкородственны гену v-src (исключая интроны).
J. Bishop (1982) приводит такую схему структурной организации клеточного (c-src) и вирусного (v-src) онкогенов src и превращения клеточного src в вирусный (рис. 7). Расщепленный клеточный ген c-src состоит из экзоное (черные) и интронов (заштрихованные). Клеточный ген каким-то образом «подхватывается» ретровирусом. Интроны элиминируются, а экзоны, собранные вместе, инсерцируются в вирусный геном, дополняя геном ВСР. Кроме src, который кодирует src-белок, в ВСР содержатся гены: gag (кодирует белок вирусного капсида), ро! (обратная транскриптаза) , env (кодирует гликопротеиновые шипы вирусной оболочки). Онкогены других ретровирусов имеют сходное строение.
Предполагают, что ген src позвоночных пережил долгие периоды эволюции без большого изменения, что указывает на его важность для существования видов, в которых он персистирует.
Таинственность c-src возросла с открытием факта, что ген не только присутствует в нормальных клетках, но также активен в них, т. е. транскрибируется в иРНК, которая транслируется в src-белок. Последний, правда, синтезируется в большинстве клеток в очень малых количествах и по этой причине ранее не поддавался обнаружению. Однако его удалось обнаружить в опытах
c-src
с антителами, приготовленными первоначально для выявления вирусного трансформирующего протеина, pp60vsrc. Клеточный белок, изолированный с помощью указанных антител, оказался практически неотличимым от соответствующего вирусного белка и был назван поэтому pp60csrc. Два указанных белка сходны по молекулярной массе и химической структуре; оба катализируют фосфорилирование тирозина и тесно связаны с плазматической мембраной клеток. Казалось, что эти два белка предназначены природой для одной и той же функции, хотя один является вирусным продуктом, а другой — клеточным, один — вызывает рак (саркому), другой ——выполняет в нормальной клетке какую-то позитивную функцию.
После всех этих данных сомневаться в клеточном происхождении вирусных онкогенов было невозможно, и дальнейшие исследования развивались с учетом этого факта.
Результаты изучения c-src явились мощным импульсом к сообщению, значение которого трудно переоценить. Все 20 известных на сегодняшний день (1986 г.) ретровирусных онкогенов имеют своих «двойников» в геномах нормальных клеток всех изученных видов позвоночных. Большинство этих клеточных «родственников» вирусных онкогенов подчиняются принципам организации и функции, впервые установленным для src. Они имеют структурную организацию скорее клеточных генов, чем вирусных, «консервативны» (мало отличаются у представителей разного эволюционного уровня развития), активны в нормальных клетках. Все это указывает на правильность заключения о том, что онкогены ретровирусов являются копиями клеточных генов. По-видимому, клеточные онкогены ассоциировались с предсуще- ствовавшими геномами ретровирусов в каком-то не очень отдаленном прошлом. Не исключено, что подобное копирование клеточных генов продолжается и сегодня. Более того, этот процесс можно воспроизвести и в лаборатории. Примером могут служить эксперименты, проведенные Н. Hanafusa и соавт. (1981) (Рокфел-
леровский институт, США). Они нашли штаммы ВСР, потерявшие большую часть гена src (но не весь) и поэтому неспособные индуцировать характерную саркому у животных. Когда Н. Hanafusa и соавт. вводили эти дефектные вирусные штаммы курам и затем изолировали вирусные частицы, образовавшиеся в инфицированных клетках, они обнаружили, что ген v-src вируса был реконструирован, достроен. Генетический материал из гена c-src рекомбинировался с вирусным геномом, когда вирус репродуцировался в клетках птиц. Вирус, содержащий реконструированный указанным образом ген, вновь проявлял полную способность вызывать опухоли, хотя по крайней мере '/《его онкогена были только что приобретены за счет клеточного гена. Н. Hanafusa и соавт. повторили подобные опыты на перепелах. Результаты были те же, что и в опытах на курах.
Эти опыты подтвердили общность функций c-src и v-src. Однако и они не оценивались всеми исследователями однозначно. Некоторые требовали еще более прямых доказательств туморогенного потенциала клеточных генов.
Такие доказательства были представлены группой J. Vande Woude (1980) и Е. Scolnick (1981). Авторы использовали технику генной инженерии для изолирования трех клеточных генов (один из мышей, два других — из крыс) и прямыми опытами показали, что данные гены могут индуцировать раковый рост в культуре клеток. Это удалось сделать путем присоединения к клеточным генам вирусного «промотера», ДНК-кодируемого сигнала, который регулирует экспрессию ближайшего к нему гена. Таким образом, трансформацию осуществлял клеточный ген, получая вирусные «приказы» работать интенсивнее, чем в норме. Клетки, трансформированные двумя крысиными клеточными онкогенами, демонстрировали образование очень больших количеств белков, кодировавшихся этими генами.
Установление способности нормальных генов при их активации (без качественного изменения) вызывать трансформацию благодаря увеличенному образованию нормального клеточного белка говорит в пользу гипотезы «дозы», объясняющей канцерогенный эффект на основе лишь количественных соотношений участвующих компонентов. Об этом подробнее будет говориться ниже.
Что дает открытие клеточных онкогенов. В настоящее время более чем очевидно, что ретровирусы не являются главной причиной человеческих раков. Тем не менее они указывают путь к пониманию главного механизма, лежащего в основе этой болезни. Широко распространено мнение о том, что рак начинается с повреждения ДНК, хотя точная природа повреждения не вполне ясна. Но, независимо от этого, правомерен вопрос: каким образом повреждение ДНК результируется в рак? Ответ многих исследователей сводится к утверждению о существовании 《раковых генов», под которыми подразумевались компоненты нормального
клеточного генома, чья активность развязывается или ускоряется различного рода канцерогенами и затем ответственна за поддержание неорганизованного поведения раковых клеток. В этой схеме раковые гены рассматриваются не как чуждые «незваные гости», а как нормальные, важные для жизнедеятельности клетки гены. Роль канцерогенных агентов сводится к повреждению, превращающему «союзника» в «противника», возможно, путем повреждения какого-то второго гена, регулирующего в норме активность ракового гена. Это — объяснение гипотезы «дозы».
Каково в свете этих данных положение онковирусологов, связавших свой престиж в объяснении онкогенеза с деятельностью ретровирусных онкогенов? Перестройка взглядов в этой области необходима и возможна, тем более, что именно онковирусологи сами были первыми, создавшими принципиальное понятие «онкоген». В своих представлениях они вынуждены подойти к раковым генам как клеточным онкогенам. Поскольку клеточные онкогены и как таковые, и в их вирусной форме туморогенны, резонно рассматривать те и другие как одно и то же.
Таким образом, онкогенная гипотеза была вновь «разыграна» в том же сюжете, но уже другими «актерами*.
В пользу существования клеточных онкогенов и роли их в индукции опухолей говорят также новейшие исследования ряда неоплазий иммунной системы (лимфом кур, человека, плазмацитом мышей) и опухолей другого гистогенеза, где активация «молчащих» клеточных генов в силу ли хромосомных транслокаций и совмещения клеточного гена с вирусным или клеточным промотером, или транспозиций, инсерций и других генетических событий клеточные онкогены начинают активно работать, вызывая образование опухолей. Но об этом подробнее будет сказано в других разделах книги.
Обозревая события, связанные с открытием клеточных онкогенов, известный вирусолог — молекулярный онколог J. Bishop (1982) пишет, что нормальные клетки могут нести семена своего собственного разрушения в форме раковых генов. Активности этих генов могут представлять конечный общий путь, которым многие канцерогены действуют. Раковые гены могут быть не чужеродными гостями, а важными конституентами клеточного генетического аппарата, «предающими» клетку, только если их структура или контроль над ними нарушаются канцерогенами. Наконец, некоторые из этих генов могут появиться в ретровирусах, где они поддаются легкой идентификации, манипуляциям и характеристике. J. Bishop считает, что то, что было познано из исследования онкогенов, представляет первый взгляд за занавес, который так долго скрывал механизм рака. В одном отношении увиденное является огорчающим, потому что химические механизмы, которые, по-видимому, сбивают раковые клетки с пути, не отличаются от механизмов, работающих в нормальных клетках. Это говорит о том, что разработка рациональной терапевтической стратегии
может остаться почти такой же досаждающей, какой она является сегодня. Нет пользы изобретать средства, препятствующие активностям, ответственным за раковый рост, если те же активности в равной мере необходимы для существования нормальных клеток. J. Bishop полагает, что онковирусология пережила свою неудачу найти вирусные агенты рака человека. Вопрос теперь не в том, вызывают ли вирусы человеческие опухоли (как они, возможно, могут иногда это делать), а, скорее, как много можно извлечь из опыта онковирусологии относительно механизма возникновения человеческих опухолей.
Открытие клеточных онкогенов ставит их в центр новых представлений о канцерогенезе, интегрирующих все формы этого процесса в единый универсальный механизм. Ядром служит группа клеточных генов, необходимых для нормального роста и развития. Будучи трансплантированы в ретровирусный геном, такие гены становятся онкогенами. Рак может также возникнуть, если клеточный ген подвергается воздействию любым агентом из широкого круга мутагенов или других канцерогенов (рис. 8).
Практически все, что известно о клеточных онкогенах, пришло из излучения ретровирусных v-опс-генов. Фактически все идентифицированные к настоящему времени ретровирусные v-onc-гены были получены путем молекулярного клонирования. Ни один из v-опс-генов не описан достаточно полно.
Клеточные c-onc-гены распознаются путем установления гомологии с v-onc-генами. Ни в одном случае эта гомология не представляет всю целостность клеточного гена; трансдукция с-опс обычно исключает несколько кардинальных черт последнего, в том числе области, где транскрипция начинается и заканчивается, интроны и, иногда, части кодирующей области. Г рани цы клеточных генов, определяемые путем трансфекции, еще более неопределенны, т. е. гены переносятся во фрагментах ДНК, размер которых вынуждается только потребностью, определяемой тем, чтобы они включали достаточную часть клеточного гена, обеспечивающую экспрессию и функциональную компетенцию. Даже нуклеотидное секвенирование не может разрешить неопределенности относительно транскрипционных границ данного гена и размер кодирующего домена. Между тем адекватно определить c-onc-гены можно только при условии знания, где транскрипция и трансляция генов начинаются и где кончаются.
Топографическая вариабельность клеточных онкогенов соответствует таковой у других клеточных генов. Размер их варьирует от немногих т. п. о. до 40 т. п. о. [Goff S. et al., 1980; Venn- strom В., Bishop J., 1982]. Они могут не иметь интронов, по крайней мере в области, трансдуцируемой в ретровирусы, или содержать их более дюжины. Размер индивидуальных интронов может быть ничтожно малым (несколько десятков пар оснований) или гигантским (тысячи пар оснований). Клеточные онкогены ведут себя генетически как классические менделевские локусы.
Нормальный рост и развитее
Нормальная клеткаНормальная клеткаОнкогенОнкогенНеадекватная экспрессияНеадекватная экспрессияУвеличенная экспрессияУвеличенная экспрессияРаковый ростРаковый ростРис. 8. Схема превращений и функций клеточного онкогена.Рис. 8. Схема превращений и функций клеточного онкогена.
Нормальная клетка
Нормальная клетка
Онкоген
Онкоген
Неадекватная экспрессия
Неадекватная экспрессия
Увеличенная экспрессия
Увеличенная экспрессия
Раковый рост
Раковый рост
Рис. 8. Схема превращений и функций клеточного онкогена.
Рис. 8. Схема превращений и функций клеточного онкогена.
Клеточные онкогены прослежены от примитивных Metazoa до человека; они сохраняют поразительный консерватизм как структуры, так и функции. Большинство этих генов экспрессируется в различных тканях и в различное время в ходе роста и развития. Их функция в нормальных клетках пока недостаточно ясна, хотя преобладает мнение, что они активны в процессе дифференциации [Cooper G., 1982; Lane М. et al., 1982; Bishop J., 1983]. Накапливается все больше данных о том, что клеточные онкогены участвуют в туморогенезе, какой бы ни была его непосредственная причина. Некоторые из этих генов, по-видимому, могут участвовать в инициации генеза опухолей, другие——в поддержании конечного неопластического фенотипа. Однако клеточные гены скорее всего не являются туморогенными в их нативном состоянии, ибо для такой роли они должны быть или активированы до ненормально высокого уровня экспрессии, или мути- рованы таким образом, чтобы изменить некоторые аспекты их функции. В настоящее время, при современном уровне знаний, нельзя с полной определенностью исключить ни один из этих возможных вариантов.
Выявление и изолирование клеточных онкогенов положили начало наступлению на механизмы канцерогенеза. Роль и природа повреждения ДНК теперь могут быть испытаны в прямых опытах (см. ниже о трансфекции). Ныне можно довольно точно определить число генетических функций, необходимых для генеза отдельных типов опухолей. Также могут быть идентифицированы конкретные гены, ответственные за наследственную предиспозицию к раку.
Учитывая клеточное происхождение вирусных онкогенов, а также существование как тех, так и других (т. е. клеточных и вирусных), онковирусологи предположили следующие обозначения: клеточные гены имеют индекс《с», вирусные — «V»: например, c-src, v-src, c-ras, v-ras и т. д. [Coffin J. et al., 1981 ]. Онкогены, идентифицированные путем трансфекции, были названы «опухо-
левыми генами», «клеточными онкогенами», «трансформирующими генами» или просто «онкогенами». Термин «протоонкоген» использовался для обозначения или клеточных прародителей ретровирусных v-опс-генов, или клеточных генов, чье повреждение дает начало активным онкогенам в опухолевой ДНК [Bishop J., 1981; Weinberg R., 1982].
Как указывалось выше, эволюционный «консерватизм» клеточных генов является одной из их характерных черт. Примером этому может быть тот факт, что активности клеточных онкогенов из одного и того же типа опухолей, например грызунов и человека, могут быть инактивированы расщеплением одним и тем же набором рестрикционных эндонуклеаз. Такие результаты подтверждают высокую степень структурной гомологии. Однако степень выраженности ее варьирует от одного онкогена к другому. Причина этих различий пока неясна. По-видимому, все клеточные онкогены возникли не позже, чем появились многоклеточные организмы.
Открытие с-опс-генов у насекомых Drosophila melanogaster и червя Caenorhabditis elegance [Shilo В., Weinberg R., 1981] привлекло особое внимание отчасти потому, что теперь представляется возможным установить момент происхождения этих генов в значительно более отдаленные времена, чем ранее предполагалось. Однако важнее то, что стало возможным произвести сложный генетический анализ на основе функции онкогенов как в нормальных, так и в опухолевых клетках.
Гомологии между ДНК Drosophila, с одной стороны, и v-src, v-abl и v-ras — с другой распространяются на участки вирусных онкогенов, которые являются критическими для функций их белковых продуктов. Уже первые результаты нуклеотидного секвенирования указывают, что c-ras-гены Drosophila melanogaster и грызунов являются заметно родственными. Экспрессия в форме информационных РНК уже показана для нескольких протоонкогенов этого вида плодовой мушки; как эмбриональные клетки, так и ткани ее личинки содержат тирозинспецифическую протеинки- назу, сходную с таковой, кодируемой онкогеном v-src вируса саркомы Рауса [Bishop J., 1983].
Обращают на себя внимание странные колебания числа онкогенов у различных видов позвоночных. Примером может служить следующее.
Имеется сообщение об обнаружении лишь одного локуса с-тус у кур, в то время как их содержится более четырех в ДНК человека. Правда, лишь один локус с-тус человеческой ДНК очень сходен топографически с куриным, тогда как остальные родственны мышиному лишь частично.
Семейство c-ras-генов имеет две ветви: одна — трансдуциро- ванная как v-Ha-ras в мышиный саркомный вирус штамма Харвея (Harvey), другая ——как v-Ki-ras в мышиный саркомный вирус штамма Кирстена (Kirsten) [Ellis R. et al., 1981 ]. c-ras-Гены
Харвея и Кирстена «разошлись», как две ветви семейства, развившиеся раздельно из дупликации древнего гена. Если это так, то родовая дупликация произошла, вероятно, до филогенетического рассеивания, породившего насекомых. c-ras-Гены Харвея и Кирстена распространены среди различных видов по трем характерным типам: в виде уникальных локусов (например, у кур и мышей); в виде дупликации в пределах линий Харвея и Кирстена (у крыс и человека) и в виде в значительной степени амплифи- цированных семейств генов (у грызуна Mus pohari и китайского хомяка). Как результат дупликаций у крыс и человека формы ras Харвея и Кирстена представлены двумя локусами; один — с интронами, другой — без них. Общие топографические характеристики родственных крысиного и человеческого генов сходны. Дупликации c-ras Харвея и Кирстена могли возникнуть, когда сплайсированные варианты исходных генов были транспо- зированы в новые хромосомные положения. Локус Харвея, содержащий интроны, является наиболее консервированным из c-ras- локусов: число, размер и локализация экзонов и интронов аналогичны у мышей, крыс и человека; нуклеотидные последовательности экзонов разошлись очень мало от мыши до человека; интроны также значительно консервированы, хотя намного меньше, чем экзоны, c-ras Харвея амплифицирован примерно до 10 копий у Mus pohari (но не в других видах грызунов), c-ras Кирстена — по крайней мере до 8 копий у китайских (но не сирийских) хомяков. Механизм амплификации пока неясен.
Менее хорошо изученная генная дупликация четко обнаруживается в отношении c-src у кур (два локуса) и человека (два локуса). Две отчетливые формы c-src-белка наблюдали в некоторых человеческих клетках, однако неясно, кодируются лн эти белки различными генами.
Каков биологический смысл многочисленных копий генов? Информация по этому поводу неоднозначна и противоречива. С одной стороны, все (кроме одного) локусы с-тус в человеческой ДНК являются неполными и могли бы быть нефункциональными псевдогенами; одна из двух копий c-src-гена в ДНК кур и человека имеет, по-видимому, ненормальную структуру, и десятикратная амплификация c-ras Харвея у Mus pohari не сопровождается усилением экспрессии гена, как если бы дополнительные копии являлись «молчащими». С другой стороны, обе формы c-ras Харвея у крыс могут трансформировать клетки в культуре, если к ним присоединен ретровирусный промотер транскрипции. Дуплицированные гены должны все же кодировать активные белки.
Тонкие детали эволюционного консерватизма клеточных генов стали проясняться благодаря анализу нуклеотидных последовательностей. Варианты c-mos мыши и человека являются, очевидно, однокопийными генами, первый — без интронов, второй — с интронами [Чумаков И. М. и др., 1980]. Внутри кодирующих областей мышиного и человеческого генов 77 匕；нуклеотидных
последовательностей являются идентичными; дедуцированные последовательности аминокислот кодируемых бел ков также родственны (75 %). Гены c-fps и c-fes являются птичьими и кошачьими вариантами одного и того же генетического локуса. Вирусные формы fps и fes имеют общими 70 % их нуклеотидных последовательностей и дедуцированных последовательностей аминокислот в кодируемых белках. Консервация такой степени говорит о действии мощных сил, направленных на сохранение существенных функций. Интересно и в то же время парадоксально, что нет данных в отношении экспрессии c-mos ни в одном из исследованных видов животных, в то время как c-fps/c-fes экспрессируются в целом ряде нормальных клеток и тканей.
Экспрессия клеточных онкогенов. Поскольку выявление экспрессии клеточных онкогенов по кодируемым белкам встречало трудности, основным методом исследования этого процесса явилось изучение транскрипции онкогенов.
Было установлено, что практически все c-onc-гены транскрибируются в РНК в нормальных и опухолевых клетках. Отмечено лишь одно исключение: не удалось обнаружить транскрипции c-mos. Этот факт вызывает недоумение, учитывая сильную эволюционную консервативность c-mos. Имелись затруднения и с выявлением транскрипции кошачьего гена c-fes, однако аналогичный ген кур c-fps транскрибируется в ряде тканей и, по-видимому, транслируется в клетка ряда млекопитающих.
Механизм транскрипции с-опс-генов сходен с таковым других клеточных генов. Первичный транскрипт содержит интроны, равно как и экзоны, и затем сплайсируется в серию более мелких интермедиатов, обнаруживаемых только в ядре. Интроны элиминируются полностью из цитоплазматических РНК. Ряд этих цитоплазматических РНКсейчас идентифицированы как информационные РНК-транскрипты с c-src, c-erb A, c-erb В (Vennstrom В. et al., 1982]. и РН К была локализована в полирибосомах, а цитоплазматические РНК, представляющие кирстеновский вариант c-ras гена, были транслированы в аутентичные генные продукты in vitro [Ellis R. et al., 1982].
На основании исследований транскрипции клеточных онкогенов были сделаны следующие общие заключения [Bishop J., 1983].
Транскрипция с клеточных генов (с-опс) происходит в различных тканях и у каждого из исследованных видов позвоночных. Транскрипция c-src и с-тус обнаружена также у Drosophila melanogaster.
Количества с-опс-специфической РНК в большинстве клеток исключительно малы (около 1 ——10 копий на клетку).
Функция каждого c-onc-гена требуется только для определенных тканей.
Каждый c-onc-ген дает начало определенным РНК, размеры которых, в общем, однозначны в различных типах клеток и в различных видах животных. Константность этих РНК среди широкого
разнообразия видов позвоночных является дополнительным свидетельством в пользу существования селективного давления, которое сохранило структуру и функцию с-опс-генов.
Многие из иРНК с с-опс-генов по своим размерам явно больше (в 3 и более раз), чем, казалось бы, требовалось для кодирования предполагаемых генных продуктов, как если бы иРНК имели большие нетранслируемые участки. Наиболее драматическим примером в этом роде может служить c-erb В, чьи зрелые иРНК имеют длину 9 и 12 т. о. (хотя образуемые соответствующие этим иРНК белки еще не идентифицированы).
Большинство с-опс-генов, по-видимому, образуют единственную цитоплазматическую РНК в соответствии с ожиданием, что каждый локус представляет один ген. Однако птичьи эмбрионы содержат по крайней мере две иРНК, полученные транскрипцией с c-erb А, и по крайней мере две, полученные с c-erb В. Каждый из этих клеточных локусов, очевидно, порождает один вирусный ген. Есть основания думать поэтому, что каждый локус кодирует один белок. Множественность c-erb иРНК обусловлена, возможно, гетерогенностью в З'-нетранслнруемнх участках РНК, как это имеет место, например, в случае информационных РНК для дигидрофолатредуктазы.
Функции клеточных онкогенов и онкобелков. Для идентификации клеточных онкобелков сейчас успешно используется стратегия, разработанная для соответствующих ретровирусных онкобелков. В частности, антисыворотка, приготовленная против вирусного трансформирующего белка, как правило, реагирует с гомологичным клеточным белком. Именно этим путем была идентифицирована группа белков, кодируемых c-onc-генами (табл. 12).
Хотя идентификация генных продуктов не гарантирует идентификации функции, тем не менее при нынешнем уровне знаний суждение о функции клеточных генов делается по аналогии с функцией, установленной для продуктов гомологичных генов ретровирусов.
Трудность в исследовании клеточных онкобелков заключается в том, что они содержатся в клетках в чрезвычайно малых количествах. Тем не менее многое о них уже известно, отчасти благодаря аналогии с соответствующими вирусными онкобелками. Так, установлено, что как вирусные, так и клеточные онкобелки обладают протеин киназной активностью; и те, и другие локализуются на плазматической мембране и группируются в липкие бляшки — специализированные участки плазматической мембраны, которые обеспечивают прилипание культивируемых клеток к стеклу нлн пластику. Пока установлен лишь один внутриклеточный белок-мишень, с которым взаимодействует онкобелок и который является субстратом энзиматической активности, в частности для рр60сsrc in vivo, это ——содержащийся в значительном количестве клеточный белок с молекулярной массой 36 000 (р36). Функция этого белка точно не установлена, хотя известно, что
Таблица 12
Белки, кодируемые клеточными онкогенами (Bishop J., 1983]
Онкоген
Белок, кд
Предполагаемая функция
клеточного гена
вирусного родственника
c-src
60
Тирозинкиназа
Тирозинкиназа
c-fps
98
»
»
c-abl
150
?
»
c-ras
21
Треонинкиназа
Треонинкиназа
(На/Ki)
c-fes
92
»
Тирозинкиназа
он может быть присоединен к компонентам цитоскелета (Cooper J., Hunter Т., 1981].
Что касается функции рр60с src в физиологии нормальной клетки, то высказываются следующие предположения.
Фосфорилированию тирозина приписывается участие в клеточном ответе на митогенные ростовые факторы (Cooper J., Hunter Т., 1982]. Наиболее ранние события этого ответа происходят в плазматической мембране. Энзиматическая активность и субклеточная локализация pp60r src поэтому указывают на возможное участие его в контроле клеточного роста и деления. Однако лишь косвенные данные свидетельствуют в пользу данного предположения: ростовые факторы вызывают фосфорилирование тирозина в белке р36, но ответственная за этот процесс киназа пока не найдена, и фосфорилирование pp60r src, и усиление его протеинкиназ- ной активности находятся среди немедленных клеточных ответов на фактор роста кровяных пластинок (ростовой фактор тромбоцитов) .
Два семейства генов c-ras кодируют очень сходные белки с молекулярной массой около 21 000 (p21c ras) [Langeheim Н. et al., 1980; Furth M„ et al., 1982]. Эти белки, подобно их вирусным гомологам (p2lvras), активно связывают гуанин нуклеотиды и осуществляют аутофосфорилирование по треонину [Shih Т. et al., 1980; Scolnick Е. et al., 1981 ]. Однако не было обнаружено киназной активности у других белков, и функция ras-белков остается неустановленной. Как вирусный, так и клеточный p21ras локализуются на плазматической мембране.
О продуктах других клеточных онкогенов известно меньше. В отношении продукта с-abl (р!50с аЬ|) было показано, что он отличается по размеру и строению от любого другого, кодируемого несколькими вариантами v-abl, потому, что построен из частей с-abl и вирусного структурного гена (gag); тем не менее имеется сходство между фосфопептидными картами белков с-аЫ и v-abl. Было также найдено, что белковый продукт v-abl присутствует лишь в тимоцитах и других лимфоидных клетках, в то время
как продукт транскрипции с-abl, РНК, содержится в широком круге клеток и тканей. О филогенетическом распределении с-аЫ не сообщалось, так же как ничего не известно о его функции; протеинкиназная активность продукта с-abl (подобно таковому v-abl) не обнаружена.
Продукты c-fps и c-fes должны представлять гомологичные белки, так как два гена, как полагают, являются партнерами у птиц и кошек. Молекулярные массы двух белков отличаются на 6 кд (см. табл. 12). Предполагаемый продукт c-fes (p92ctes) был найден у крыс и родственных млекопитающих, но не у других грызунов. Мало что еще известно об этом белке, а также его функции. Белок, приписываемый c-fps (p98cfps), считается аутентичным продуктом гена, потому что он содержит многочисленные пептиды, идентифицированные ранее в трансформирующих белках, кодируемых вариантами v-fps, и проявляет тирозинспецифическую протеинкиназную активность, подобно вирусным белкам.
Учитывая все имеющиеся данные, было бы преждевременно сделать вывод о том, что фосфорилирование тирозина белков является общей или даже типичной функцией клеточных онкогенов.
Семейства клеточных онкогенов. Структурная организация ретровирусных онкогенов столь разнообразна, что трудно указать какой-то единый биохимический механизм их различного действия и еще труднее представить себе происхождение онкогенов из об щего источника. Тем не менее такая мысль напрашивалась на основании их важнейшей общей биологической способности вызывать туморогенез. Экспериментальные наблюдения подкрепили интуицию, раскрыв две формы родства среди клеточных онкогенов.
Один вид животных может обладать двумя или более клеточными онкогенами, представляющими одно и то же семейство. Примером может служить семейство c-ras. Харвей- и Кирстен-варианты гена ras — родственны лишь отдаленно, если судить по их нуклеотидным последовательностям, однако кодируемые этими генами белки антигенно весьма сходны и имеют общими 85 % их аминокислотных последовательностей. Белки, однако, можно различить серологически, если использовать моноклональные антисыворотки [Furth М. et al., 1982]. Трудности в идентифицировании и объяснении дупликации клеточных онкогенов смягчаются благодаря неожиданному родству между явно различными семействами генов Например, гены c-src и s-yes рассматриваются как различные гены, однако их нуклеотидные последовательности достаточно родственны, чтобы обнаружить уловимые перекрестные реакции при молекулярной гибридизации в не слишком жестких условиях.
Может существовать семейство или даже суперсемейство [Doolittle R., 1981 ] клеточных онкогенов, имеющих единое древнее происхождение. Это стало ясно после установления факта,
что несколько различных онкогенов кодируют тирозинспецифические тирозинкиназы (см. табл. 12) и указанные ферменты могут использовать сходный набор клеточных белков в качестве субстратов [Cooper J., Hunter Т., 1981 ]. В настоящее время анализ последовательностей аминокислот в продуктах клеточных онкогенов показал более близкое родство онкогенов, чем следовало из их нуклеотидных последовательностей. При первичной сравнительной молекулярной гибридизации онкогены src, yes и fps (птичий и кошачий варианты одного и того же гена) казались структурно неродственными, хотя все они кодируют протеинкиназы, специфические по тирозину. Однако дедуцированные аминокислотные последовательности соответствующих белков показали значительное сходство, особенно в карбокснтермннальном домене, который несет энзиматическую активность рр6Осsrc [Levinson A. et al., 1981].
При сравнении с аминокислотной последовательностью pp60csrc получены следующие степени родства с ним продуктов других с-опс-генов: yes — 82 %, fps — 40 %, fes — 45 %.
Фосфотирозин составляет всего 0,01 % от общих фосфоаминокислот в белках нормальных клеток [Hunter Т., Sefton В., 1980]. Однако организмы могут содержать не менее шести тирозинспецифических тирозинкиназ: c-src, c-yes, c-fps/c-fes, c-abl, рецепторов для эпидермального фактора роста [Buhrow S. et al., 1982; Cohen S. et al., 1983] и, возможно, киназы, активируемые другими факторами роста [Ek В. et al., 1982; Kasuga М. et al., 1982; Nishimura J. et al., 1982].
Трудно объяснить биологический смысл большого изобилия ферментов, выполняющих столь редкую модификацию. Возможно лишь одно предположение: фосфорилирование тирозина играет какую-то весьма важную роль в ряде процессов развития, в котором участвует ряд различных киназ, кодируемых отдельными генами [Bishop J., 1983].
Известны 20 различных ретровирусных онкогенов, причем каждый имеет соответствующий с-опс. Опыты с трансфекцией открыли еще около 10 новых онкогенов [Cooper G., 1982; Weinberg R., 1982]. Возможен дальнейший рост числа открываемых онкогенов. Однако количество их не может быть неограниченным. Все чаще повторяются открытия уже известных онкогенов, причем некоторые из них найдены более чем у одного вида животного, и, наоборот, несколько разных онкогенов обнаружены у одного вида. Возможно, что большинство существующих онкогенов уже открыто. J. Bishop (1983), равно как и R. Weinberg (1982), считают, что общее число существующих клеточных онкогенов должно быть не более 50—100, т. е. примерно то количество, которое предполагалось несколько ранее для так называемых раковых генов [Knudson А., 1981].
Локализация клеточных онкогенов в хромосомах. Данный вопрос изучается активно, и некоторая информация в этом отноше-
нии уже получена. Так, установлена локализация в хромосомах человека следующих с-опс-генов [Bishop J., 1983]:
91528, сегмент q24II1286222091528, сегмент q24II12862220c-abl
9
15
2
8, сегмент q24
II
12
8
6
22
20
9
15
2
8, сегмент q24
II
12
8
6
22
20
c-fes
c-fos
c-myc (один локус)
c-ras Harvey (локус с интронами) c-ras Kirsten (локус с интронами) c-mos
c-myb
c-sis
c-src
У мышей локализация клеточных онкогенов по хромосомам следующая: c-abl, c-fps/c-fes и c-src — во 2-й, c-mos — в 4-й.
Свидетельства клеточного происхождения ретровирусных онко-* генов. Клеточное происхождение онкогенов ретровирусов доказывается следующими фактами: 1) постоянством числа и позиции каждого клеточного онкогена у любого данного вида, в отличие от колебаний числа и позиций провирусог для эндогенных ретровирусов; 2) консервативностью клеточных онкогенов на протяжении огромных отрезков времени процесса эволюции, тогда как гомологии среди эндогенных ретровирусов обнаруживаются только у ограниченного числа близкородственных видов; 3) присутствием интронов в большинстве клеточных онкогенов — отличительной чертой эукариотных генов, опять-таки в контрасте с организацией ретровирусных генов; 4) тем, что клеточные гены и не находятся нутри, и не присоединены к провирусам эндогенных ретровирусов. Эти данные подтверждаются рядом работ. Они говорят в пользу того, что ретровирусные онкогены возникли (и, видимо, продолжают возникать) путем трансдукции клеточных онкогенов в ретровирусные геномы.
Трансдуцированный в вирус путем его рекомбинации с вирусным геномом клеточный онкоген после этого генетического акта более не подконтролен регуляторным механизмам. Он теряет интроны, отделяется от своих собственных сигналов к инициации и терминации и включается в геном реплицирующегося ретровируса.
Роль клеточных онкогенов в нормальных клетках. Сам факт сохранения клеточных онкогенов в практически неизмененном состоянии на протяжении значительного периода эволюционного развития говорит в пользу какой-то их важной биологической функции в клетках существ самого различного уровня сложности. Высказывались предположения об их роли в дифференциации. По мнению J. Bishop (1983), в пользу этой идеи говорит следующее.
Наследственное предрасположение к раку у людей тканеспецифично; если существуют «раковые гены», ответственные за это предрасположение, то они действуют в совершенно точных эмбриологических родословных [Knudson А., 1981 ].
Онкогены ретровирусов проявляют тканевую специфичность. Каждый онкоген индуцирует опухоли только в определенных органах и трансформирует только определенные клетки в культуре. Специфичность онкогенов не является просто следствием видовых границ хозяев. Дифференцированные клетки могут содержать и экспрессировать онкоген, но противостоять его трансформирующей силе. По-видимому, уязвимые клетки содержат субстраты для активности онкогена, резистентные клетки — не содержат.
Ретровирусные гены вмешиваются в дифференциацию; v-src индуцирует неадекватную экспрессию одного эмбрионального гена и подавляет экспрессию дифференцированных свойств; v-erb и v-abl блокируют развитие гемопоэтических клеток в их нормальных путях (эритроидном и лимфоидном), и, в некоторой степени, v-myb и v-myc могут обратить дифференциацию моноцитных гемопоэтических клеток.
Клеточные гены, идентифицированные трансфекцией, проявляют определенную тканевую специфичность: например, c-ras Харвея — в карциноме мочевого пузыря; c-ras Кирстена — в карциноме легкого и толстой кишки; малоохарактеризованный c-ras — в нейробластоме; c-ras вариант Кирстена — в фибробластах грызунов, трансформированных метилхолантреном. В других случаях специфичность была оценена путем определения чувствительности и инактивации онкогенов в различных опухолях различными рестрикционными эндонуклеазами. Этим путем было установлено участие отличающихся друг от друга онкогенов в пяти различных формах человеческих лейкозов [Lane М. et al., 1982]. Указанные находки, в свою очередь, подкрепляли предположение, что клеточные онкогены, обнаруженные при лейкозах, являются нормальными стадиеспецифическими детерминантами гемопоэза.
Что касается участия клеточных онкогенов в процессе дифференциации, то ответ на этот вопрос встречает трудности. Экспрессия генов, важных в развитии, варьирует от ткани к ткани, зависит от этапа развития, времени в эмбриогенезе. И действительно, наблюдали значительные вариации в экспрессии. В частности: 1) экспрессия c-myb выражена в гемопоэтических тканях и примитивных гемопоэтических опухолевых клетках [Chen J., 1980; Gonda Т. et al., 1982]; 2) c-myc экспрессируется в самых разнообразных клетках, хотя в гемопоэтических клетках эта экспрессия опять-таки более выражена; 3) экспрессия c-myb и с-тус резко падает в клетках промиелоцитной лейкемии, которые были стимулированы к дифференциации в более зрелые формы химическими агентами; 4) c-erb А и c-erb В транскрибируются дифференциально, первый ——в костномозговых клетках, второй — в эмбриональных фибробластах; 5) у неонатальных мышей c-fos активно экспрессируется в костях ——мишени неопластической трансформации онкогеном v-fos; 6) плюрипотентная гемопоэтическая клетка, полученная из мышиного костного мозга,
содержит исключительно большие количества белка, кодируемого c-ras Кирстена; 7) в ходе эмбриогенеза мыши экспрессия c-ras Харвея поддерживается на высоком уровне, экспрессия с-аЫ, c-fos и некоторых других — варьирует.
Как видно из приведенных данных, в целом картина пестрая. Во многих случаях экспрессия варьирует коррелятивно с дифференциацией. Однако не во всех случаях методики адекватны поставленным вопросам. По-видимому, окончательное заключение о роли клеточных онкогенов в развитии и дифференциации делать еще преждевременно.
Родство вирусных и клеточных онкогенов. Родство вирусных и клеточных онкогенов очень велико. Например, нуклеотидные последовательности v-mos и c-mos (1157 нуклеотидов) различаются только в 25 позициях, а дедуцированная последовательность аминокислотных последовательностей вирусного и клеточного белков — только в 11 аминокислотных остатках [Van Beveren С. et al., 1982]. Вирусный и клеточный варианты myb-генов столь же близки： среди 1197 нуклеотидов различаются лишь 15, что приводит к 11 заменам аминокислот в белковых продуктах этих онкогенов.
Очень сходны белки, кодируемые соответствующими вирусными и клеточными онкогенами. Так: 1) клеточная и вирусная формы рр60”с имеют одну и ту же молекулярную массу, проявляют перекрестную антигенную реактивность, дают сходные пептидные карты, оба ассоциированы с плазматической мембраной, фосфорилированы и имеют одинаково расположенные фосфоаминокислоты, с фосфосерином — вблизи аминотерминального конца и фосфотирозином — в карбокситерминальном домене, оба являются протеинкиназами, специфичными к тирозину; 2) белки, кодируемые семейством v-ras и c-ras, также весьма сходны. Их молекулярная масса равна примерно 21 000. Они имеют, по крайней мере, некоторые общие антигенные детерминанты, дают сходные пептидные карты, обладают пока непонятной способностью связывать гуаниновые нуклеотиды, осуществляют аутофосфорилирование по треониновым остаткам in vitro, однако протеинкиназная активность в отношении других белков не выявлена. Ряд других продукто» клеточных онкогенов (c-abl, c-fps, c-fms и c-fes) имеют сходные иммунологические и биохимические характеристики с их вирусными партнерами. В пользу родства клеточных и вирусных онкогенов говорит также описанный выше факт восстановления дефектного, делецированного на 2/3 вирусного онкогена, v-src, за счет рекомбинации с клеточным онкогеном c-src.
Сходство и различия вирусных и клеточных онкогенов. Исследователи отмечают как сходство, так и определенные различия онкогенов ретровирусов и их клеточных предшественников. Клеточное происхождение вирусных онкогенов было убедительно подтверждено, в частности, молекулярной гибридизацией кДНК-
проб (проб ДНК, комплементарных ретровирусной геномной РНК), приготовленных с помощью обратной транскриптазы, и РНК вирусов сарком Харвея, Кирстена, а также Молони, с клеточной нуклеиновой кислотой. После этого в нормальных клетках были обнаружены гомологи (протоонкогены) более десятка других вирусных генЬв. Любые представители позвоночных содержат в геноме своих клеток прототипы вирусных онкогенов. Например, клетки птиц содержат 8 прототипов онкогенов двух неродственных таксономических групп птичьих ретровирусов, а также ряд онкогенов неродственных между собою вирусов млекопитающих, в частности вирусов лейкемии Абельсона (Abelson), саркомы Молони (Moloney) и саркомы кошек. В то же время клетки млекопитающих содержат прототипы онкогенов ретровирусов млекопитающих, а также ретровирусов птиц МС 29, ВСР, миелобластоза, саркомы Фуджинами (Fujinami). Прототипы онкогенов BCR МС 29, Абельсона и Фуджинами найдены также у дрозофилы. Таким образом, нормальные клетки позвоночных (и ряда беспозвоночных) содержат многие, если не все, известные протоонкогены.
Только с освоением молекулярного клонирования структурное родство клеточных протоонкогенов и вирусных онкогенов стало совершенно очевидным. Начиная с клеточного прототипа вируса саркомы Молони, были клонированы большинство прототипов известных вирусных онкогенов и сравнены с вирусными партнерами в гетеродуплексном анализе, рестрикционно-эндо- нуклеазным картированием, фингерпринтным анализом и путем установления нуклеотидных последовательностей. Эти сопоставления показали, что те части вирусных онкогенов, которые неродственны эссенциальным (репликативным) генам ретровирусов, близкородственны партнерам в нормальных клетках и, что наиболее важно, эти.партнеры в нормальных клетках никак не связаны с каким-либо эссенциальным геном ретровирусов.
Несмотря на отмеченное родство вирусных и клеточных прототипов онкогенов, различия биологических функций тех и других (малигнизация у первых, позитивная роль в развитии ——у вторых) подразумевают определенное несходство в структуре, т. е. изменения качественного, а не просто количественного характера. Это понятно и объяснимо, учитывая сложное интронно-экзонное строение генов эукариот, которое должно существенно упрощаться при превращении клеточных генов в простую безинтрон- ную структуру ретровирусов. Если бы подобного не происходило и обе категории генов были совершенно идентичны, то единственно возможным объяснением механизма действия онкогенов могла быть только «дозная» гипотеза, признающая количественные изменения онкогенов и их продуктов основой осуществляемого или туморогенеза.
Как известно, большинство исследователей не придерживаются этой точки зрения.
Итак, вирусные онкогены и их клеточные прототипы структурно отличаются друг от друга. В чем это различие заключается и каким образом клеточный ген превращается в вирусный?
Современные молекулярно-биологические и молекулярно-генетические данные говорят о том, что многие, если не все, вирусные онкогены отличаются от своих клеточных прототипов в некоторой части генетической информации. Это особенно ясно видно при сравнении гибридных онкогенов и их клеточных прототипов. Такие онкогены состоят из гибрида двух типов кодирующей последовательности, одна из которых возникает за счет эссенциальных вирионных генов, например гена gag (Agag), другая — из клеточного локуса (х). Они имеют общую структуру Agag-x и характеризуются гибридным белковым продуктом. Первый гибридный ген был идентифицирован для птичьего вируса МС 29. Этот ген имеет 5,gag-oблacть размером около 1,5 т. о. и З'-область, называемую тус, размером 1,6 т. о., возникающую за счет клетки. Ген Agag-myc, подобно Agag-x других ретровирусов, как, например, вируса лейкемии Абельсона, вируса саркомы кошек и птичьего вируса саркомы Фуджинами, кодирует Agag-x-белки с возможно трансформирующей функцией (табл. 13). На клонированных вирусных генах и их клеточных прототипах получен ряд данных, говорящих о том, что вирусные онкогены и клеточные протоонкогены не изогенны. Согласно Р. Duesberg (1983), доступная информация свидетельствует в пользу той точки зрения, что для придания протоонкогенам, трансдуцируемым ретровирусами, трансформирующей функции, по-видимому, необходимы какие-то генетические события, возможно делеции, мутации клеточных последовательностей или дополнение их вирусспецифической информацией, например Agag.
Трансформирующая способность клеточных онкогенов. Современная генно-инженерная техника позволяет воспроизвести в эксперименте исторический процесс трансдукции клеточных генов с образованием активных онкогенов. Это достигается путем молекулярного клонирования изолированных клеточных онкогенов, присоединением их к ретровирусным транскрипционным промотерам для придания им способности активно экспрессироваться при возвращении изолированных генов обратно в клетки культуры. Подобный эксперимент позволил создать трансформирующие гены с мышиным c-mos, человеческим и крысиным c-ras-генами. Успешно использовались локусы c-ras как с интронами, так и без них. Клетки, трансформированные геном c-ras, синтезируют большое количество белка р21, который кодирован клеточным онкогеном и является туморогенным у животных.
Имеются, однако, факты, требующие дальнейших исследований и сопоставления генов с-опс и v-onc. Эти факты следующие.
До сих пор не показано, что активированные гены c-mos и c-ras являются непосредственно туморогенными у животных, как это имеет место в опытах с v-mos и v-src.
Таблица 13
Идентифицированные онкогены а их вирусные прототипы [Duesberg Р., 1983]
Онкогенные ретровирусы
Онкогены
Форма рака у животных
Трансформация в клеточной культуре
Саркома
Карцинома
Острый лейкоз
Фнбро* бласты
Клетки крови
Вирусы птиц
Саркома Рауса
src
+
—
—
?
>Фуджинами
gag-fps
+
—
—
—
»Ямагуши
gag-yes
+
—
—
—
»Рочестер-2
gag-ros
+
—
—
—
Миелоцитоматоз МС 29
gag-myc
+
+
+
+
Карцинома МН 2
gag-mht/myc
+
+
+
+
Птичий эритробластоз
gag-erb A/erb В
+
+
+
Миелобластоз и эритробластоз
gag-myb-env
—
—
+
+
Е26
gag-amv-ets
—
—
+
—
+
Ретикулоэндотелиоз
Вирусы млекопитающих
rel
-~
+
—
+
Мышиная саркома Мо-
mos
+
—
—
+
—
ЛОНИ
Крысиная саркома Харвея и Кирстен а
ras
+
—
+
+
?
Лейкемия мышей Абельсона
△gag・abl
—
—
+
+
+
Мышиная остеосаркома FBJ
fos
+
—
—
+
?
Кошачья саркома ST и
GA
Agag-fes
+
+
—
+
—
Кошачья саркома SM
Agag-fms
+
—
—
+
—
Саркома обезьян
Aenv-sis
+
—
—
+
Попытки получить трансформирующие гены путем активации человеческого c-mos, куриного c-src и куриного с-тус были пока безуспешны.
Ряд деталей вызывает сомнение в правильности заключения о том, что белки, кодируемые гомологичными клеточными и вирусными онкогенами, идентичны во всех отношениях. Как следствие мы должны считаться с возможностью, что эффекты активированных генов c-mos и c-ras не представляют прототипы того, как клеточные онкогены могли бы участвовать в туморогенезе. Наоборот, они отражают лишь специальные экспериментальные условия, так же как и установленные клеточные линии, чьи фенотипы особенно уязвимы в отношении неопластической трансформации, или достижение необычного уровня экспрессии онкогенов. Тем не менее способность генов c-mos и c-ras трансформировать клетки в культуре придает значительную силу идее, что клеточные онкогены представляют собой агенты туморогенеза, инициирующие и поддерживающие малигнизацию.
Участие клеточных онкогенов в туморогенезе. В ряде случаев показано участие клеточных онкогенов в образовании опухолей животных и человека несколько необычным путем. Ряд примеров характеризует сложный механизм этого процесса.
Пример опухолеродного действия ретровирусов, не содержащих онкоген [Weiss R. et al., 1982]. Известно, что ретровирусы, лишенные онкогенов, тем не менее, способны индуцировать В-кле- точные лимфомы у кур с высокой частотой [Cooper М. et al., 1978]. Было установлено, что вирусная ДНК в опухолях обычно интегрируется вблизи ранее идентифицированного клеточного онкогена, с-тус; как следствие этой инсерции транскрипция с-тус усиливается в 100 раз [Hayward W. et al., 1981; Payne G. et al., 1982]. Одним из вариантов механизма этого процесса является прямое включение транскрипции с-тус под влиянием вирусного промотера. В других случаях действие вирусной ДНК —— непрямое, путем усиления активности промотера самого вируса. По-видимому, увеличенная экспрессия с-тус провоцирует и, возможно, поддерживает цепь событий, которые вызывают В-кле- точные опухоли, индуцируемые лейкозными вирусами. Аналогично действуют и другие ретровирусы, не содержащие онкогенов, но вызывающие опухоли. Примерами могут служить В-клеточные лимфомы, вызываемые у кур синцитиальным вирусом [Noori- Daloii et al., 1981], почечные карциномы, индуцированные вирусом, ассоциированные с миелобластозом, эритробластоз, вызванный вариантом вируса птичьего лейкоза, и карцинома молочной железы, индуцированная вирусом опухоли молочной железы (MMTV) [Nusse R., Varmus Н., 1982]. Во всех этих случаях туморогенез начинается, когда интеграция вирусной ДНК индуцирует активность специфического клеточного гена или, в других случаях, повреждает определенный домен в геноме хозяина.
Клеточные онкогены, выявленные и изолированные путем трансфекции, вели себя не как нормальные гены. Они индуцировали неопластическую трансформацию без модификации структуры или внутренне присущей им экспрессии, тогда как их партнеры, изолированные из нормальной ткани, такой способностью не отличались [Cooper G., 1982; Weinberg R., 1982, 1982а]. Этот факт указывает на то, что данные гены участвуют в генезе опухолей, из которых они были изолированы. Указанная идея нашла подтверждение, когда активный клеточный онкоген, изолированный из клеток карциномы мочевого пузыря, оказался геном c-ras Харвея (c-Ha-ras) [Der D. et al., 1982; Parada L. et al., 1982; Santos E. et al., 1982, 1983]. Все дальнейшие аналогичные идентификации указывали на представителей того же семейства генов, c-ras. Повторное появление c-ras и удивительно, и пока необъяснимо. Тканеспецифичность не может служить достаточным объяснением, так как большинство известных опухолей имеют эпителиальное происхождение, однако трансформированные мышиные клетки таковыми не являются, c-ras Харвея
экспрессируется на высоких уровнях в ходе мышиного эмбриогенеза, создавая впечатление, что он выполняет какую-то уни- ! ерсальную ростовую функцию. Для подобного утверждения о c-ras Кирстена нет оснований, однако и он причастен к генезу нескольких форм карцином.
Существуют и другие активные онкогены, например при различных лейкозах и карциномах молочной железы, остающиеся пока неидентифицированными и вряд ли являющимися гомологами уже известных ретровирусных онкогенов. Однако нельзя не заметить примечательной унификации в обшей панораме онкогенов: два коренным образом отличающихся экспериментальных подхода ——с одной стороны, прослеживание эволюционного происхождения вирусных онкогенов, с другой ——изолирование активных онкогенов непосредственно из опухолевых клеток — привели к взаимному перекрыванию, совпадению наборов генов, чьи свойства предопределяют роль в канцерогенезе.
Открытие того факта, что некоторые формы вирусного туморогенеза могут начинаться с активации клеточных онкогенов, явилось импульсом к интенсивному поиску экспрессии этих генов в клетках человеческих опухолей. Первые результаты поиска уже имеются; они интригующи, но довольно неопределенны. Следует сказать, что сама стратегия экспериментов, с нашей точки зрения, в принципе порочна. Масса клеток, используемая в качестве контроля, часто недоступна, и в большинстве работ, проводящихся в настоящее время, используются, главным образом, установленные линии клеток, свойства которых, возможно, существенно изменились за время после их эксплантации из опухолей. Кроме того, мы не располагаем пока полным набором онкогенов. Наконец, что весьма важно, непросто идентифицировать экспрессию, играющую этиологическую роль в неопластической трансформации. К тому же есть основания полагать, что значительное увеличение экспрессии активных онкогенов выше нормального уровня не обязательно должно иметь место в человеческих опухолях.
Указанные трудности говорят о том, что в настоящий момент нельзя рассчитывать на полную ясность в проблеме. Есть еще немало противоречий. Так, одни исследователи сообщили об увеличении экспрессии гена с-тус в различных гемопоэтических опухолях В-клеточного происхождения [Rovigatti U. et al., 1982], другие этого не наблюдали [Westin Е. et al., 1982]. Эти исследования предпринимались в попытке установить, связано ли возникновение сех В-клеточных опухолей как птиц, так и человека с одним общим генетическим событием. Такая мысль имела определенное основание, так как увеличенная экспрессия с-тус была обнаружена у широкого круга опухолей, в том числе в саркомах, карциномах, меланомах при лейкемиях [Eva A. et al., 1982; Westin Е. et al., 1982]. Увеличение было, однако, нестабильным, спорадическим для каждой отдельной формы опухоли. По крайней мере в двух случаях ——клеточные линии из промиелоцитной
лейкемии HL-60 и COLO320 из нейроэндокринной опухоли толстой кишки ——увеличенная экспрессия с-тус обусловлена, по-види- мому, его многократной амплификацией [Favera R. et al., 1982; Collins S., Groudine M., 1983]. Значение этих «злоключений» c-myc для этиологии опухолей пока неясно. Во всяком случае, активный онкоген, идентифицированный в клетках промиелоцит- ной лейкемии HL-60, не является геном c-myc [Bishop J., 1983]. Не определен активный онкоген и для COLO320 [Bishop J., 1983 . Экспрессия c-myb была выявлена при лейкозах всех главных гемопоэтических линий, однако лишь в сравнительно примитивных их представителях. Значение этого феномена не вполне ясно, так как экспрессия c-myb выражена и в нормальных гемопоэтических клетках [Chen J., 1980; Gonda Т. et al., 1982]. Экспрессия c-sis, как было установлено, довольно специфична; она имеет место в саркомах и глиобластомах, но не в различных других опухолях [Eva A. et al., 1982]. Экспрессия с-abl и c-ras выявлена в разнообразных опухолевых клетках [Eva A. et al., 1982; Westin Е. et al., 1982], хотя уровень экспрессии не был определен достаточно надежно и мог не отличаться от такового соответствующих нормальных клеток.
Подводя итог этой серии исследований, можно заключить, что полной ясности в вопросе о значении количественных уровней экспрессии клеточных онкогенов в этиологии опухолей пока нет и требуются дальнейшие усилия, прежде всего по установлению в эмбриональных клеточных линиях физиологических функций специфических клеточных онкогенов и более детальному анализу структуры и активности индивидуальных генов, подозреваемых в индукции тех или иных опухолей.
Превращение протоонкогенов в онкогены. В своей нативной форме клеточные онкогены неспособны трансформировать клетки [Cooper G. et al., 1980; Oskarsson M. et al., 1980; De Feo D. et al., 1981; Cooper G., 1982; Weinberg R., 1982]. Этот факт ставит вопрос о том, каким же образом эти гены становятся онкогенными, будучи трансдуцированы в геномы ретровирусов, и какие события приводят к появлению активных онкогенов, обнаруживаемых в ДНК опухолевых клеток.
Для объяснения феномена превращения клеточных протоонкогенов в активные онкогены предложены два возможных механизма:
Количественный («дозный»). Согласно этому принципу превращение клеток в неопластические обусловлено избыточной экспрессией нормальных генов. В результате трансдукции ретровирусами гены попадают под влияние мощных сигналов про- мотеров вирусного генома, которые способствуют избыточной экспрессии трансдуцированных генов. Аналогично канцерогены, повреждающие ДНК, как можно думать, освобождают потенциальные онкогены из-под контроля регуляторных элементов клеточного генома.
Качественный принцип. Этот принцип объяснения превращения клеточных гено в активные трансформирующие факторы подразумевает, что повреждение клеточных генов может изменить их функцию. В частности, протеинкиназы, кодируемые рядом онкогенов, могли бы отличаться измененной субстратной специфичностью, которая и определяет их туморогенность. Мутации в кодирующем домене клеточного онкогена могли бы возникать в ретровирусном геноме в ходе трансдукции или вслед за ней, или как следствие повреждения, наносимого клеточной ДНК канцерогеном.
Ни один из этих двух механизмов не получил безоговорочного признания. Время от времени появляются новые данные в пользу как одного, так и другого механизма.
В пользу первого механизма говорят следующие факты: 1) ретровирусные онкогены, такие как v-src и v-ras, обычно экспрессируются в умеренном избытке, и уменьшение экспрессии может вызывать реверсию трансформированных клеток к явно нормальному фенотипу [Porzig К. et al., 1979; Varmus Н. et al., 1981]; 2) ДНК нормальных клеток содержит онкогены, способные трансформировать клетки в культуре после активации, вызванной удалением cis-регуляторов [Cooper G. et al., 1980], или благодаря инсерции ретровирусных энхенсеров транскрипции; 3) трансформация клеток в культуре изолированными c-mos и c-ras достигалась усилением экспрессии этих генов [Oskarsson М. et al., 1980; De Feo D. et al., 1981; Chang E. et al., 1982]; 4) клетки карциномы мочевого пузыря, из которых была изолирована активная форма c-ras Харвея, и клетки, вторично трансформированные этим изолированным геном, по-видимому, экспрессируют указанный ген в количествах, выше нормальных [Goldfarb М. et al., 1982; Parada L. et al., 1982; Santos E. et al., 1982].
Но имеются данные и противоположного характера не меньшей значимости: 1) господствующее мнение о том, что v-src экспрессируется в клетках, трансформированных ВСР, в избыточных количествах, может оказаться неверным. Экспрессия этого гена в трансформированных клетках сильно варьирует и иногда может снижаться до уровня, лишь в 3—5 раз превышающего экспрессию c-src; 2) такие онкогены, как v-mos и v-abl, являются, по существу, токсичными для некоторых клеток, если они экспрессируются даже в умеренных количествах [Goff S. et al., 1982; Papkoff J. et al., 1982]. Лишь минимальные количества белка, кодируемого v-mos, требуются для неопластической трансформации [Papkoff J. et al., 1982]; 3) попытки трансформировать клетки путем увеличения экспрессии c-src или с-тус окончились неудачей; 4) экспрессия по меньшей мере двух активных онкогенов (c-ras Кирстена в карциномах толстой кишки и легкого и неидентифицированный ген в В-клеточных лимфомах кур) лишь немного увеличена в опухолевых клетках, в которых их активность выявляется путем трансфекции [Cooper G., 1982; Der D. et al., 1982]; 5) с помощью
детального исследования установили небольшие, но потенциально важные различия между белками, кодируемыми несколькими клеточными онкогенами и их вирусными партнерами; клеточный и вирусный варианты pp60src фосфорилированы по разным тирозиновым остаткам и имеют различные аминокислотные последовательности в их карбокситерминальных концах; попытки репарации полных делений v-src рекомбинацией с c-src не удались, хотя неудача может отражать помеху скорее в рекомбинации, чем в свойствах c-src; белки, кодируемые несколькими формами v-src, фосфорилированы, тогда как клеточные партнеры не фосфорилированы, так как они лишены треониновых остатков, по которым происходит фосфорилирование вирусного белка; лишь вирусная форма аЫ-белка фосфорилируется по тирозину in vivo и проявляет фосфотрансферазную активность [Ponticelli A. et al., 1982].
Только дальнейший глубокий анализ клеточных онкогенов, изолированных из опухолевых клеток, устранит эти неясности. Объяснить превращение протоонкогенов в онкогены можно лишь путем установления места и сущности дефектов в клеточных генах, ответственных за этот процесс. В ряде случаев уже есть ответы на эти вопросы. Так, показано, что трансформирующая активность c-ras Харвея в карциноме мочевого пузыря человека обусловлена точковой мутацией в кодирующем домене гена, заменой гуанозина на тимидин. Это влечет за собой замену глицина на валин в аминокислотной последовательности генного продукта [Reddy Е. et al., 1982; Tabin С. et al., 1983]; сходная мутация в той же позиции может быть ответственна за онкоген- ность вирусных форм ras; аргинин заменяет глицин в случае v-Ha-ras и серин в той же позиции в случае v-Ki-ras.
Эти данные существенно подкрепляют гипотезу качественных изменений клеточных генов как причины их превращения в активные онкогены. Подробнее этот вопрос будет рассмотрен в другом разделе книги.
ДНК н канцерогенез. Открытие онкогенов клеточных, вирусных, опухолевых, установление изменений в их структуре при переходе от первых ко вторым и третьим дали прямые доказательства роли изменений ДНК в инициации онкогенеза. Однако установление этого факта еще не проясняло, как именно исходные канцерогены осуществляют свое негативное действие. Онкогены, выявляемые трансфекцией, по-видимому, представляют последнюю ступень в цепи событий, вызывающих злокачественные опухоли, в то время как первые ступени остаются столь же таинственными, как и ранее. Настоятельной задачей следует считать поиск повреждений, вызываемых конечными (проксимальными) канцерогенами.
Современная онкологическая литература полна предположениями о том, как клеточные онкогены могли бы активироваться благодаря повреждению ДНК [Klein G., 1981; Pall М., 1981]. Все эти предположения сводятся к тому, что дозировка объясняет
действие клеточных онкогенов, и поэтому авторы пытаются объяснить, как именно экспрессия онкогенов могла бы быть усилена. Все эти идеи могут оказаться есьма спорными, если «дозная» гипотеза не выдержит натиска потока новых экспериментальных данных.
Точковые мутации могут действовать или в cis-, или trans- позициях. Мутации внутри онкогена или по соседству с ним могут сделать ген резистентным к негативным регуляторам. Это были бы доминантные повреждения такого рода, которые возможно регистрировать с помощью трансфекции, если онкоген способен прямо трансформировать клетки в культуре. Альтернативно мутации в регуляторных генах могли бы нарушить их активность и освободить онкогены из-под контроля. Экспрессия онкогена в этом случае была бы рецессивным повреждением, способным быть обращенным при трансплантации гена в нормальную клетку и поэтому невидимым при трансфекционном испытании [Bishop J., 1983].
Перестройки ДНК, в противоположность точковым мутациям, приобрели значительное признание как потенциальная движущая сила в канцерогенезе [Cairns J., 1981 ]. Возникающие повреждения ДНК могут дуплицировать аномалии в регуляции онкогенов. Альтернативные перестройки ДНК способны перевести ранее «молчавшие» онкогены в сферу влияния позитивных регуляторов путем присоединения этих генов к активным промотерам транскрипции [Klein G., 1981 ] или благодаря приближению этих генов к одному из пока малоизученных регуляторных элементов, так называемых энхенсеров, или усилителей, транскрипции [Ya- niv М., 1982]. Энхенсеры, по-видимому, усиливают или даже пробуждают активность транскрипционных промотеров в обстоятельствах, в которых последние обычно инертны или неактивны [Capecci М., 1980; Banerji J. et al., 1981; Levinson В. et al., 1982]. Длинные концевые повторы (LTR) ретровирусов 'известны одновременно и как транскрипционные промотеры [Temin Н., 1982; Varmus Н., 1982], и как энхенсеры транскрипции [Levinson В. et al., 1982; Varmus Н., 1982]; эти активности ответственны за индукцию экспрессии c-inyc f ходе генеза В-клеточных опухолей при инфекции вирусами птичьих лейкозов. Поэтому делались попытки приписать участие LTR эндогенных ретровирусов в ответе на химические канцерогены [Kirschmeier Р. et aL, 1982]. Пока попытки доказать это не увенчались успехом. Возможно, правильнее было бы рассматривать LTR просто как одну из форм семейства энхенсеров, которые, по-видимому, являются интегральной частью многих, если не всех, транскрипционно-активных зон в хроматине эукариотических клеток. Любой из этих энхенсеров мог бы активировать клеточные онкогены.
Интересной попыткой объяснения активации клеточных онкогенов является идея о роли хромосомных ненормальностей качестве генераторов увеличенной онкогенной дозировки [Klein G., 1981]. Хромосомные дупликации могли бы повышать
дозу онкогена и увеличивать действие trans-регуляторов на ген. Транслокации могли бы пробуждать онкогены путем релокации их「транскрипционно-активные домены хроматина. Например, В-клеточные опухоли лимфом Беркитта обычно демонстрируют транслокации, включающие хромосому 8 и хромосому, несущую иммуноглобулиновый ген, который активен в опухоли: 2, х-цепи; 14, тяжелые цепи; или 22, Л-цеп и. Были высказаны предположения, что хромосомные транслокации при опухолях Беркитта активируют онкоген на хромосоме 8 путем транспозиции его в окрестности транскрибируемых иммуноглобулиновых генов. На сегодня человеческой хромосоме 8 приписывают присутствие двух онкогенов: c-mos и один локус c-myc. c-mos не рассматривается как виновник генеза В-клеточных опухолей. Обнаружение с-тус на хромосоме 8 поставило другую проблему, так как стали предполагать его участие в индукции В-клеточных лимфом птичьими ретровирусами. Действительно, было обнаружено, что с-гпус включается в транслокации между хромосомами 8 и 14 при лимфоме Беркитта [Bishop J., 1983]. Релоцированный с-тус непосредственно приближен к месту разрыва при транслокации и в некоторых случаях вплотную присоединен к гену тяжелой цепи иммуноглобулина. Аналогичным образом транслокации между хромосомами 12 и 15 при мышиных плазмоцитомах, продуцирующих иммуноглобулин А, помещают с-тус (хромосома 15) в область гена для a-тяжелых цепей (хромосома 12).
Другие кариотипические ненормальности в человеческих опухолях также могут быть скоррелированы с локализацией клеточных онкогенов на хромосомах. Примерами могут служить: c-sis на хромосоме 22 (транслокации при хроническом миелоидном лейкозе и некоторых В-клеточных опухолях); c-fes на хромосоме 15 (транслокации при остром промиелоцитном лейкозе); c-myb на хромосоме 6 (делеции при Т-клеточном лейкозе и транслокации при некоторых аденокарциномах яичников); с-тус на хромосоме 8 (транслокации при остром миелобластном лейкозе). При транслокациях, включающих хромосомы 8, 15 и 22, гипотетический активатор переносится к онкогену, а не наоборот, как описано выше для другого вида транслокаций, например при лимфоме Беркитта. •
АКТИВАЦИЯ КЛЕТОЧНЫХ ПРОТООНКОГЕНОВ В ОНКОГЕНЫ
В настоящее время никем не оспаривается тот факт, что какие-то нормальные клеточные гены, жизненно необходимые для существования клеток, породили и продолжают порождать как онкогены остротрансформирующих ретровирусов, так и активные онкогены опухолей невирусного происхождения. Природа этих клеточных генов, названных протоонкогенами, подробно рассмотрена в предыдущем разделе этой книги. В данном контексте уместно н целесообразно систематически проанализировать пути
превращения их в разрушительные трансформирующие гены, инициирующие неопластический процесс.
R. Weinberg (1983) выделяет 4 механизма активации клеточных протоонкогенов, три из которых включают изменения клеточной ДНК и один — вмешательство инфекционного ретровируса: 1) точковая мутация в результате действия радиации или химического канцерогена; при этом изменяется информация кодируемого белка, который становится способным вызывать раковый рост; 2) кодирующая область протоонкогена может стать рекомбинированной, в ходе хромосомной перестройки, с регуляторной областью гена иммуноглобулина, что ведет к неадекватной экспрессии генетической информации протоонкогена; 3) амплификация; протоонкоген каким-то образом реплицируется в множественные копии, и в этом случае результатом является сверхэкспрессия кодируемого протоонкогеном белка; 4) трансдукция; вирус при инфекции клетки «подхватывает» и уносит из клеточного генома клеточную последовательность, содержащую протоонкоген. Последний может затем активироваться путем ассоциации с регуляторной областью зирусного генома или подвергнуться мутации во :время переноса из клеток в ретровирус.
Все это верно, но, с нашей точки зрения, более полным представляется следующее перечисление основных путей активации клеточных протоонкогенов в онкогены: 1) трансдукция ретровирусами; 2) хромосомные транслокации; 3) инсерции, транспозиции генетического материала; 4) амплификация генов; 5) точко- вые мутации.
Рассмотрим их более подробно.
Активация клеточных протоонкогенов путем трансдукции ретровирусами. Отличительной чертой ретровирусных трансформирующих генов (онкогенов) являются специфические нуклеотидные последовательности, которые неродственны их конститутивным репликативным генам, однако близкородственны определенным последовательностям нормальных клеток. Это сходство ретровирусных и клеточных трансформирующих генов оказалось неслучайным, и в результате обстоятельных исследований было истолковано как указание на генетическую с язь тех и других, где пер ичными являются гены клеточные, а вторичными — ретровирусные. В конце концов, исследователи пришли к единодушному заключению, что онкогены ретровирусов произошли за счет клеточных потенциально трансформирующих генов, в результате редких случайных актог захвата неонкогенными инфекционными ретровирусами отдельных блоков генетического материала клеток, в которые вирусы проникают при осуществлении своего естественного жизненного цикла и с геномом которых их геном интегрируется. Явление инкорпорирования клеточных генов в вирусный геном стали называть трансдукцией.
В предыдущих разделах книги уже упоминалось, что переход заблокированных в зрелой, закончившей дифференциацию клетке
генов роста и пролиферации под контроль мощных вирусных промотеров приводит к их реактивации. Возвращение таких «раскрепощенных» генов в клетку при очередном цикле вирусной инфекции в определенных условиях может вести к навязыванию клетке безудержной пролиферации и в конечном счете — к ее трансформации.
Эквивалентность специфической функции стимуляции роста (регулируемого или нерегулируемого) клеточных протоонкогенов и вирусных онкогенов предопределяет тезис о том, что протоонкогены фактически являются латентными раковыми генами. Эта их потенциальная способность реализуется благодаря феномену трансдукции.
Эти, вначале гипотетические, предположения проверялись экспериментально. В частности, исследовалась трансдукция клеточных генов ретровирусами in vivo и in vitro. Принципиальным представлялся вопрос: процесс трансдукции только активирует трансформирующие гены или генерирует их?
Принципиальное структурное сходство позволяет рассматривать протоонкогены клеток в качестве функциональных и транс- дуцируемых эквивалентов вирусных онкогенов. Тем не менее анализ продуктов-предшественников, показал, что во всех случаях протоонкогены были изменены, если они становились частью онкогенных вирусов. Весь процесс, следовательно, должен был сопровождаться специфическими делециями (выпадением участков генетического материала) и мутацией. Поэтому естественная трансдукция не означает полной структурной и функциональной гомологии.
Одними из известных до сих пор экспериментально воспроизводимых трансдукционных систем являются делеционные (>75 %) по гену src мутанты вируса саркомы Рауса, способные восстанавливать трансформирующую функцию в течение 2 мес у 50 % инфицированных кур. Эта естественная трансдукция осуществляется за счет клеточного прото-эгс-онкогена. Аналогичный процесс трансдукции описан для онкогена тус в случае восстановления активности делеционного по этому онкогену ретровируса МС 29 за счет последовательностей прото-тус (с-тус).
Известны также случаи полного восстановления онкогенной функции за счет клеточных протоонкогенных последовательностей в случаях отсутствия "一 ВСР полных 5'- и З'-концов гена src.
Специальные опыты показали, что возможно осуществить трансформацию in vitro с помощью протоонкогенной ДНК, лигированной с ретровирусными промотерами. Было установлено, что ДНК клеточных прототипов вирусов саркомы Молони и Харвея (соответственно прото-mos и прото-ras) трансформирует мышиные клетки NIH ЗТЗ, если она лигирована с промотерами этих вирусов. В последующих опытах было продемонстрировано, что длинные концевые повторы (LTR, ДКП) функционируют как промотеры.
Следует отметить, однако, что специфические трансформирующие активности упомянутых конструкций: промотер сарком- ного вируса прото-mos/ras — были в 10—200 раз ниже, чем у соответствующих клонов ДНК аутентичных вирусных онкогеног Этот факт может отражать определенные различия, но не полное тождество между вирусными онкогенами и их клеточными промотерами, что естественно, учитывая структурные изменения, претерпеваемые протоонкогенами при превращении в активные онкогены в ходе трансдукции ретровирусами. Однако приведенные опыты подтверждают, во-первых, принципиальное родство вирусных онкогенов и их клеточных предшественнико и, во-вторых, факт активации протоонкогенов в результате трансдукции в ретровирусы.
Тем не менее сомнения в том, что активированные клеточные прототипы идентичны вирусным онкогенам, у ряда исследователей остаются. Полагают, что активированные протоонкогены недостаточны для трансформации клеток у животных, и это соответствует наблюдениям о повышенной экспрессии, например, гена прото-ras при ряде нормальных состояний, в частности в развивающихся мышиных эмбриональных клетках и в регенерирующей печени крысы. Конечный тест на функциональную гомологию между зирусными онкогенами и клеточными прототипами может быть осуществлен только в том случае, если удастся реконструировать вирусы Молони и Харвея из соответствующих протоонкогенов и нуклеотидных последовательностей ретровирусного вектора и испытать на способность индуцировать саркомы у мышей.
Нельзя не отметить также, что, за исключением описанных опытов с генами прото-mos и прото ras, лигированными с ретро- яирусными промотерами, се попытки добиться аналогичного результата, т. е. трансформации NIH ЗТЗ клеток с другими прото- онкогенными последовательностями, дали негативные результаты. Это относится к экспериментам с прото-тус, прото-mos из клеток человека, прото-src [Duesberg Р., 1983].
Интересно мнение J. Bishop (1983) о механизмах активации клеточных протоонкогенов путем трансдукции ретровирусы. Автор указывает, что в нати ной форме клеточные онкогены, по-видимому, не способны трансформировать клетки. Эту способность они приобретают при трансдукции в ретровирусы. J. Bishop рассматривает два возможных объяснения превращения протоонкогенов в активные онкогены: 1) количественная избыточная экспрессия обычных условиях нормального гена превращает клетки в неопластический фенотип; трансдукция ретровирусами помещает гены под мощные сигналы в вирусном геноме и способствует их экспрессии в большом избытке («дозная» гипотеза); подобно этому канцерогены, повреждающие ДНК, освобождают потенциал онкогенов от контроля регуляторных элементов; 2) качественные изменения трансдуцируемого ретровирусами гена: повреждение клеточного гена может изменять его функцию; на-
пример, кодируемые рядом онкогенов белки могли бы иметь различные субстратные специфичности, обусловливающие их туморогенность; в ходе трансдукции клеточного онкогена в ретровирус или вслед за нею в онкогене могли бы возникать мутации в кодирующем домене.
Таким образом, одни авторы считают, что трансдуцированный ген качественно идентичен клеточному и вызывает трансформацию лишь благодаря увеличенной экспрессии. Действительно, в ряде случаев при инфекции опухолеродными ретровирусами показано резкое нарастание белка, кодируемого с-онкогенами. Но это явление далеко не всегда имеет место.
Альтернативная, вторая из упомянутых выше, точка зрения ответственной за трансформацию и образование опухолей при инфекции онкогенными ретровирусами считает активность качественно измененных при трансдукции клеточных протоонкогенов.
В настоящее время трудно совершенно категорически отдать предпочтение одной из указанных точек зрения и решительно отвергнуть другую.
Лично нам более убедительной и солиднее обоснованной представляется вторая.
Неза исимо, однако, от вариантов толкования тонкого молекулярного механизма активации клеточных протоонкогенов при их трансдукции < ретровирусы, твердоустановленными можно считать два фундаментальных факта, связанных с этим явлением природы: 1) появление благодаря ему целого класса опухолеродных ретровирусов; 2) активацию широкого спектра уникальных клеточных генов, выполняющих в клетке в норме какие-то жизненно важные физиологические функции, обладающих, шесте с тем, потенциальной трансформирующей способностью. Трансдукция в ретровирусы лишает эти гены их первой позитивной функции и освобождает скрытую в них в норме вторую, негативную. Гены роста и пролиферации предположительно начинают функционировать как гены раковые.
Что касается конкретного молекулярного механизма трансдукции клеточных генов ретровирусами, то в этом отношении высказываются лишь гипотезы. Так, предполагается, что трансдукция осуществляется в две ступени рекомбинации: первая ——между ДНК-формами ретровирусного генома и клеточным геном; вторая —между химерной РНК, транскрибированной с продукта первого этапа рекомбинации, и РНК-геномом ретровируса [Swan- strom R. et al., 1983].
При всей биологической значимости феномена трансдукции в активации клеточных протоонкогенов и появлении грозных раковых генов он, этот процесс, как упоминалось выше, не является единственным путем, ответственным за трансформацию и туморогенез. Природа «позаботилась» о многократном дублировании его другими надежными средствами, молекулярная природа которых описана ниже.
Активация клеточных протоонкогенов в результате хромосомных транслокаций. Под термином «транслокации» имеют в виду взаимный обмен генетическим материалом посредством реципрокного переноса участков хромосом. Этому процессу в настоящее время приписывается важная роль в индукции опухолей и изучению его уделяется все больше нимания. Полагают, что транслокации представляют собою один из важных механизмов активации клеточных протоонкогенов [Cairns J., 1981; Klein G., 1981]. Было отмечено, что точки разрыва многих устойчивых перестроек хромосом, характеризующих отдельные типы рака, включают специфические бэнды, в которых локализованы различные с-опс-гены. Хотя роль последних в индукции злокачественных новообразований у млекопитающих продолжает дискутироваться, озможная связь между хромосомными аберрациями, изменениями активности опс-генов и клеточной трансформацией во многих случаях четко прослеживается. При раке человека наблюдаются следующие 3 главных класса ненормальностей хромосом: реципрокные транслокации, делении и дупликации (последние включают дупликации целых хромосом, их сегментов и отдельных последовательностей генов). Каждая из них теперь связывается с предполагаемой активностью клеточных онкогенов и индукцией опухолей.
F. Gilbert (1983) утверждает, что зо многих, если не во всех раковых опухолях как туморогенез, так и опухолевая прогрессия включают множественные генные изменения. Это, по-видимому, верно и в случае некоторых солидных опухолей детей ■— ретинобластом, нейробластом и опухолей Вильмса. Каждая из них связана с хромосомными перестройками, включающими различные специфические фрагменты и для каждой из которых было постулировано, что требуется изменение, по крайней мере, двух генов.
Большое значение для понимания роли транслокаций в индукции опухолей имели исследования локализации протоонкогенов в отдельных хромосомах. Установлена хромосомная локализация следующих клеточных онкогенов у человека: c-abl в хромосоме 9, с-fes — 15, c-fos — 2, с-myc — 8, с-Нз-гas — 11, c- ki-ras — 12, c-mos — 8, c-myb — 6, c-sis — 22, c-src — 20; у мышей: c-abl в хромосоме 2, с-fos/fes, c-src и c-mos — 4 [Bishop J., 1983].
По данным других авторов [Martinville В. et al., 1983], человеческий онкоген N-ras в клетках промиелоцитной лейкозной линии HL60 локализован в проксимальной части короткого плеча хромосомы 1; гомологи вирусных ras-генов Харвея и Кирстена — на хромосомах человека X, 6, 11, 12, а клеточный гомолог онкогена линии EJ — на хромосоме 11 [Martinville В. et al., 1983а].
К настоящему времени хорошо изучен целый ряд хромосомных транслокаций в связи с различными неопластическими заболеваниями. Хромосомный локус, несущий человеческий и мышиный прото-myc, транслоцируется на одну из нескольких хромосом, которые несут гены иммуноглобулина, в большинстве мышиных плазмоцитом и в человеческих линиях В-клеточных лимфом.
полученных из лимфом Беркитта и иного типа лимфом. У человека прото-myc локализуется, как упоминалось выше, на хромосоме 8, типично транслоцируется на иммуноглобулиновые локусы хромосомы 14 и менее часто — на хромосомы 2 или 22 [Klein G., 1983; Rowley J., 1983]. Предполагается, что транслокация ведет к активации прото-myc, побуждая его функционировать как онкоген в этих опухолях [Dalla-Favera R. et al., 1983; Marcu R. et al., 1983; Rowley J., 1983; Shen-Ong G. et al., 1983]. Точка перекреста зарьирует в различных опухолях, однако при транслокации в большинстве случаев область 5' прото-myc рекомбинирует с областью 5'-гена иммуноглобулина. Во многих, но не всех человеческих и мышиных лимфомах перекрест имеет место внутри коротких фрагментов последовательности прото-myc. В этих случаях локус прото-myc перестраивается, что видно по фрагментам ДНК после обработки рестрикционными эндонуклеазами. Пока нет бесспорных данных об увеличении экспрессии прото-myc после транслокации; сообщаемые по этому поводу данные противоречивы.
Интересно, что транслокации, связанные с человеческими лимфомами, не всегда включают локус прото-myc. В некоторых «неберкиттовских» лимфомах иммуноглобулиновый локус хромосомы 14 рекомбинирует с какими-то неизвестными локусами других хромосомных доноров, в частности хромосомы 18 [Yunis J., 1983].
Другая важная транслокация, затрагивающая вариант хромосомы 22 (филадельфийской хромосомы), встречается в большинстве случаев хронического миелоидного лейкоза. Она возникает из реципрокной транслокации между хромосомами 22 и (часто) 9 [Rowley J., 1983]. Хромосома 22 несет легкую цепь ■ иммуноглобулинового локуса. В нескольких таких случаях прото- аЫ, человеческий клеточный прототип онкогена вируса мышиной лейкемии Абельсона, транслоцируется с хромосомы 9 на 22 [De Klein A. et al., 1982]. Данная транслокация связана с усиленной экспрессией и амплификацией поеледо в а тельност и прото-abl в клеточной линии К-562 миелоидного лейкоза. Важно отметить, что существуют варианты филадельфийской хромосомы, образую шиеся результате транслокаций с 18 различных хромосом [Klein G., 1983]. Указанный факт вызывает сомнения в отношении роли транслокации прото-abl в возникновении лейкемий. Р. Fial- kow и соавт. (1981) указывают, что транслокации могут быть поздним событием, которое встречается также в «нормальных» лимфоцитах, полученных из того же клона, что и лейкемические клетки. Упомянем еще ряд конкретных исследований, указывающих на роль транслокаций в активации клеточных онкогенов и на связь перестроек хромосом с раком.
N. Heisterkamp и соавт. (1982) сообщили, что человеческие клеточные онкогены c-fes и с-abl, локализованные в хромосомах 15 и 9 соответственно, кодируют тирозинспецифические протеинки- назы, связанные с определенными формами рака человека (острый
промиелоцитарный и хронический миелоидный лейкозы и др.). В той же лаборатории показано, что клеточный онкоген c-sis человека локализован на хромосоме 22 и что он транслоцируется при хроническом миелоидном лейкозе на хромосому 9 [Groffen J. et al., 1983].
J. Erikson и соавт. (1983) исследовали места разрыва в хромосомах 14 и 8 в клетках линии P3HR-1 лимфомы Беркитта и уровень транскрипции гена с-тус в этих клетках и других линиях клеток лимфомы Беркитта, используя в качестве контроля человеческие лимфобластоидные клеточные линии, трансформированные вирусом Эпштейна—Барр. Результаты работы показали, что транслокация онкогена с-тус к локусу иммуноглобулинов ведет к его транскрипционной активации, возможно, как существенной ступени на пути к неоплазии. Авторы установили, что точка разрыва хромосомы 14 различна в разных линиях клеток лимфомы Беркитта. То же относится и к хромосоме 8.
Известно, что клетки лимфомы Беркитта несут специфические хромосомные транслокации между хромосомами 8 и 14, 2 и 22. Было показано, что у человека локус тяжелых цепей иммуноглобулинов (Н) расположен на хромосоме 14, локус 入-цепе访一на хромосоме 22 и локус х-цепей — на хромосоме 2. При лимфомах Беркитта область q24-^qter хромосомы 8, по-видимому, трансло- цирована на одну из хромосом, содержащих гены цепей Ig. Установлено также, что человеческий гомолог онкогена миелоцитома- тозного вируса (МС 29) птиц, названный с-тус, локализуется на хромосоме 8 и транслоцирован в клеточных линиях лимфомы Беркитта на хромосому 14.
Исследование перестройки мышиного гомолога с-тус в клетках мышиной плазмоцитомы с хромосомной транслокацией t (12, 15) показало перестройки онкогена с-тус с последовательностями CHIg в ряде образцов [Marcu R. et al., 1983]. В плазмоцитомных клетках наблюдали повышенную транскрипцию транслоцирован- ного с-тус. Таким образом, хромосомная транслокация в мышиных плазмоцитомах, подобно человеческой лимфоме Беркитта, включает хромосомы, содержащие гены Ig и онкоген с-тус.
Транслокация между хромосомами 8 и 14 у человека характерна для лимфомы Беркитта. Эта транслокация ；： какой-то мере является извращением нормальных активностей клеток-прототипов. Клетки, которые дают начало клеткам лимфомы Беркитта, секретирующим антитела, в норме осуществляют также функцию секреции антител. Эта функция в нормальных условиях оказывается возможной в результате перестройки хромосом, содержащих гены антител, в процессе дифференцировки. Подобная перестройка собирает гены антител из сегменто ДНК, рассеянных в различных хромосомах: 14, 2 и 22. В ходе нормальной дифференцировки клеток, продуцирующих антитела, каждая из этих хромосом подвергается серьезным внутренним перестройкам, в результате чего рассредоточенные по разным хромосомам сегменты гена
антител соединяются вместе. В то же время указанные процессы активируют перестройку ДНК так, что на ее основе производятся большие количества белка. При извращении этого процесса, что имеет место в клетках лимфомы Беркитта, любая из трех хромосом, содержащих гены антител, вместо конструктивной реорганизации своей собственной ДНК обменивает некоторую часть ДНК с хромосомой 8. Данное обстоятельство побудило G. Klein (1981) высказать предположение о том, что эти транслокации могли бы не просто активировать гены антител в нормально перестроенной ДНК, но, наряду с этим, активировать протоонкоген на хромосоме 8. Такое предположение получило поддержку ； ряде работ, в которых было продемонстрировано, что действительно, хромосома 8 содержит некий
Рис. 9. Схема превращения здоровой клетки в ра- ,ковую в результате транслокации гена тус в ходе аберрантного обмена фрагментами хромосом 8 и 14.Рис. 9. Схема превращения здоровой клетки в ра- ,ковую в результате транслокации гена тус в ходе аберрантного обмена фрагментами хромосом 8 и 14.протоонкоген, идентифицированный как тус по гомологии с одноименным онкогеном вируса миелоцитоматоза, в котором он былпротоонкоген, идентифицированный как тус по гомологии с одноименным онкогеном вируса миелоцитоматоза, в котором он былпервоначально открыт.
Рис. 9. Схема превращения здоровой клетки в ра- ,ковую в результате транслокации гена тус в ходе аберрантного обмена фрагментами хромосом 8 и 14.
Рис. 9. Схема превращения здоровой клетки в ра- ,ковую в результате транслокации гена тус в ходе аберрантного обмена фрагментами хромосом 8 и 14.
протоонкоген, идентифицированный как тус по гомологии с одноименным онкогеном вируса миелоцитоматоза, в котором он был
протоонкоген, идентифицированный как тус по гомологии с одноименным онкогеном вируса миелоцитоматоза, в котором он был
Все описанные события привлекли к гену тус пристальное внимание и при других лимфомах.
Было показано, что ген тус расположен в хромосоме 8 в ключевой позиции в точке разрыва, где транслоцированный фрагмент этой хромосомы сочленяется с хромосомой 14 в лимфоидных клетках (рис. 9).
Мнения исследователей в отношении характера влияния акта транслокации на протоонкоген тус расходятся. Одни считают, что происходит его активация и соответственно увеличенная экспрессия, другие постулируют перестройку и качественное изменение в процессе транслокации [Croce С., 1982]. В пользу последней точки зрения (качественного изменения протоонкогена) говорит и работа G. Shen-Ong и соавт. (1982). Эти авторы уточнили судьбу транслоцируемого гена с-myc. Они показали, что с-myc и гены тяжелых цепей иммуноглобулинов находятся в противоположной ориентации. Кроме того, в каждой из четырех изученных мышиных плазмоцитом с транслоцированным c-myc G. Shen-Ong и соавт. наи1ли транскрипты иРНК на 400 оснований короче, чем у нормального продукта. Полагают, что один экзон в ходе транслокации был перемещен. Интересно, что увеличения содержания myc-РНК в результате транслокации отмечено не было. Последний факт противоречит предположению, что индукция опухоли является результатом простого увеличения транскрипции с-myc в его новом локусе расположения. С другой стороны, имеются данные,
что в некоторых линиях лимфом Беркитта и плазмоцитом мышей перестройки гена с-тус при транслокации не происходит.
Вопрос требует дальнейшего изучения.
Инсерции, транспозиции генетического материала как механизм активации клеточных протоонкогенов. Онкогенез, лейкемо- генез за счет внесения в клеточный геном лейкозных вирусов, не содержащих онкогены, мог бы служить примером индукции опухолей путем инсерции чужеродного генетического материала. Птичий лейкозный вирус, не содержащий собственного онкогена, намного менее эффективный в индукции рака, чем остротрансфор- мирующие вирусы, содержащие онкоген, тем не менее, действовал он ко ген но путем инсерции его собственных генов, в частности «промотерной» ДНК. Вирусная «промотерная» ДНК, инсерциро- ванная по соседству с клеточным протоонкогеном, активировала ген до неестественного и вызывающего рак уровня экспрессии [Hayward W. et al., 1981 ]. По данным этих авторов, в 6 различных опухолях вирусный промотер инсерцировался рядом с протоонкогеном тус. С. Сгосе и соавт. (1984) в своих исследованиях показали, что инсерция вируса увеличивает экспрессию гена тус, в частности при лимфомах Беркитта.
Temin (1983) отмечает, что более чем в 85 % вирусиндуциро- ванных опухолей ДНК ретровирусов птиц интегрируется вблизи протоонкогена с-тус и иРНК протоонкогенов присутствует в более высокой концентрации, чем в нормальных клетках.
Примером инсерционного канцерогенеза могут служить также наблюдения G. Rechavi и соавт. (1982). Авторы исследовали механизм активации клеточного онкогена c-mos в геноме клеток мышиной миеломы. Данный ген, c-mos, являющийся прародителем трансформирующего гена в вирусе мышиной саркомы Молони, M-MuSV, был ранее охарактеризован в отношении его трансфек- ционной способности и последовательности нуклеотидов [Frenkel A., Fischinger Р., 1976; Canaani Е. et al., 1979]. Было показано, что клеточная информация, содержащаяся в геноме M-MuSV (обозначенная v-mos) и, как предполагается, трансдуцироваиная из мышиного генома в момент генерации указанного вируса, состоит из длинной открытой рамки считывания протяженностью в 369 кодонов. Эта последовательность присоединена в стык к сегменту из 5 кодонов последовательности вирусного помощника. Белок с молекулярной массой 37 кд, идентифицированный в вирус- инфицированных клетках, по-видимому, кодируется именно этой комбинированной последовательностью из 374 кодонов и непосредственно «запускает» клеточную трансформацию. Клеточный гомолог v-mos (c-mos) содержит участок из 21 кодона, присоединенный непосредственно к 5' описанной выше открытой рамки считывания длиной 369 кодонов. До настоящего времени в нормальной клетке не находили белка, кодируемого этим клеточным геном. G. Rechavi и соавт. описали молекулярную перестройку клеточного гена c-mos в мышиной миеломе. Они установили, что
активация гена происходит благодаря перестройке в 5'-конце клеточного гена, включающего делению c-mos и инсерцию (вставку) небольшого фрагмента ДНК, имеющего структурные свойства, характерные для IS-элементов (описанных ранее), транспозабельных элементов бактерий, Mu-фага. Авторы установили, что в миеломе ген c-mos изменяется таким образом, что опухолевая иРНК содержит транскрипты, гибридизующиеся с c-mos-пробой. Перестроенный ген (rc-mos) клонировали в фаге Z и показали, что он (ген) трансформирует мышиные фибробласты в тесте на трансфекцию, чего c-mos не делает. Активированный rc-mos отличается от исходного, c-mos, лишь своим 5'-концом, где он содержит инсерцированный фрагмент клеточной ДНК длиной 159 т. о. (килобаз, тысяч оснований), локализованный непосредственно в 5'-стнк с c-mos.
Это наблюдение является, насколько нам известно, первой демонстрацией активации клеточного онкогена в опухоли невирусного происхождения с помощью механизма, включающего транспозицию (инсерцию) ДНК.
В этом же контексте следует рассматривать и «промотерную гипотезуэ Г. П. Георгиева (1981, 1983), нашедшую более законченную форму в виде транспозонной теории. С нашей точки зрения, «промотерная гипотезаэ вносит важный элемент в концепцию онкогенов, увязывая факт существования клеточных онкогенов с их активацией путем подстановки под промотеры, объясняя таким образом молекулярный механизм превращения так называемых молчащих генов в функционально активные.
Еще дальше в толковании идеи транспозонов пошел В. М. Жданов (1984), рассматривая ДНК-провирусы онкорнавирусов как частный случай и особый класс транспозонов. В. М. Жданов возвращается к высказанной им же ранее идее о биологической роли интегрированных онковирусов в происхождении некоторых клеточных генов, в том числе и принимающих участие в дифференцировке.
Если понимать инсерции и транспозиции генетического материала в широком генетическом плане, как факторы перестройки ДНК и, следовательно, мутагенеза, роль этих процессов в канцерогенезе следует признать весьма существенной.
Амплификация протоонкогенов как механизм индукции рака. Родственные виды эукариот, как правило, содержат одно и то же число копий на клетку гена данной «уникальной последовательности>. В немногих исключениях, например таких, как гены препроинсулина и глобина, в нескольких родственных видах были найдены 1 или 2 дополнительные копии на клетку, что указывает на имевшую место миллионы лет назад амплификацию зародышевой линии в общем прародителе этих генов. Обычно опс-гены представлены одной копией на гаплоидный геном, хотя крыса имеет, по крайней мере, 2 различных гена, гомологичных опс-гену крысиного происхождения вируса мышиной саркомы Харвея
(Ha-MuSV). Как исключение у мыши Mus pohari содержится не менее 10 копий онкогена Ha-MuSV, тогда как большинство других видов Mus содержат традиционно 1 или 2 копии. Аналогично китайские хомячки имеют около 6 копий гена типа Ki-MuSV. Сирийские хомячки содержат по одной копии onc-гена на геном [Chattopadhyay S. et al., 1982].
Как полагают, в клетках эукариот генная амплификация (умножение) обусловлена спонтанными и случайными аномалиями в репликации ДНК. Увеличенная экспрессия является следствием амплификации, так как последняя предоставляет дополнительные матрицы для синтеза РНК.
В ряде работ было установлено, что амплификация и увеличенная экспрессия последовательностей протоонкогенов имеют место в ряде опухолей человека и животных. Это было показано для ряда опухолевых клеточных линий и исходных опухолей. Особенно характерны в этом отношении случаи человеческой промиелоцит- ной лейкемии [Collins S., Groudine М., 1982, 1983; Dalia-Favara R. et al., 1983] и клеточной линии рака толстой кишки [Alitalo К. et al., 1983], о чем подробнее речь будет идти ниже.
Некоторые авторы связывают амплификацию клеточных с-опс- генов и увеличение их экспрессии с возникновением и развитием злокачественных опухолей. Такое толкование индукции неоплазм представляет альтернативу другой точке зрения, рассматривающей возникновение опухолей как результат качественных изменений клеточных генов и, соответственно, продуктов их экспрессии.
Нетрудно понять, что то или иное решение этого вопроса имеет не только чисто академический интерес, но и первостепенное практическое значение. В самом деле, если онкогены опухолевые тождественны протоонкогенам нормальных клеток и тождественны также кодируемые ими белки, то как диагностика, так и терапия опухолей в этом случае значительно усложняются, так как глубочайшие биологические различия раковой и нормальной клетки пришлось бы искать в неуловимо тонких количественных сдвигах. Действительно, количественный уровень экспрессии онкогенов в различных опухолях варьирует от равного экспрессии нормального клеточного партнера до многократно увеличенного, и можно только гадать, наблюдая этот феномен, где находится та критиче； ская граница, которая отделяет порядок и координацию нормальной клетки от хаоса и разрушения, свойственных раковой клетке.
Отсутствие качественных биохимических, молекулярно-биологических и иммунологических особенностей, присущих только раковым клеткам, затруднило бы, если не исключило, использование мощных средств и орудий этих передовых дисциплин в диагностике и лечении опухолей.
При промиелоцитной лейкемии человека амплификация гена с-тус была обнаружена как в культивированных (линия HL-60), так и некультивированных клетках [Dalla-Favera R. et al., 1982]. Установлено, что в клетках HL-60 амплифицированные пос л едо-
вательности прото-myc локализованы в «doubleminits» структурах хромосом [Collins S., Groudine М., 1982]. Из этих клеток была изолирована ДНК, способная трансформировать in vitro клетки NIH ЗТЗ.
По данным лаборатории R. Gallo [Dalla-Favera R. et al., 1982; Westin E. et al., 1982], ген myc выявляется в широком круге человеческих гемопоэтических и иных опухолевых клеток, включая нормальные фибробласты и лимфоциты периферической крови. В большинстве клеток myc-иРНК присутствует в виде 1 —10 копий на клетку. Однако десятикратное увеличение количества РНК было выявлено в немногих случаях, в частности в одной саркоме, двух карциномах и двух гемопоэтических линиях клеток. Наивысшие уровни myc-иРНК присутствовали в клеточной линии человеческой промиелоцитной лейкемии HL-60. Эта клеточная линия имеет способность дифференцироваться в зрелые гранулоциты при индукции некоторыми химическими агентами, например диметилсульфоксидом или ретиноидной кислотой. Интересно, что myc-специфические транскрипты были практически неопределимы в терминально дифференцированных клетках HL-60 [Schwab М. et al., 1983].
Исследование другого клеточного онкогена, c-Ki-ras, показало, что он амплифицирован в 30—60 раз в клетках мышиной адренокортикоидной опухоли Y1, причем амплифицированный онкоген локализуется в «doubleminits» хромосоме (небольшие парные хроматиновые тельца, лишенные центромеров) и в гомогенно окрашивающейся хромосомной области. Эти две кариотипические ненормальности обычно сигнализируют о присутствии амплифици- рованных генов и часто наблюдались в разнообразных опухолевых клетках [Barker Р., 1982] Количества c-Ki-ras-специфической иРНК и белка, кодируемых амплифицированным геном, соответственно увеличены. Авторы полагают, что амплификация и увеличенная экспрессия клеточных онкогенов могут вносить вклад в генез и (или) поддержание трансформированного состояния, по крайней мере естественно встречающихся опухолей.
В клетках человеческой нейробластомы IMR-32 обнаружены амплифицированные участки в коротких плечах хромосомы 1. Амплификация распространялась на фрагмент протяженностью 3000 п. о. В нормальных клетках исходные для амплификации последовательности присутствуют в хромосоме 2 и продолжают оставаться там и в нейробластомных клетках IMR-32. По-види- мому, амплификация этой последовательности как-то связана с ее транспозицией на хромосому 1, которая в нейробластомных клетках демонстрирует высокую степень структурных аберраций [Konda N. et al., 1983]. Амплификация показана также в трех других линиях нейробластомных клеток.
В лаборатории R. Weinberg [McCoy М. et al., 1983] в клеточных линиях карцином толстой кишки и легкого показана амплификация активированного клеточного онкогена c-Ki-ras 2 в 3—5 раз.
Заключая обзор данных по амплификации клеточных протоонкогенов, нельзя не отметить определенные противоречия, выявленные при проведении отдельных исследований по этому вопросу. Так, например, амплификация тус не была обнаружена в 10 свежих случаях миелоидного лейкоза и в других клеточных линиях миелоидного лейкоза, н том числе в клеточной линии К-562 (Collins S., Groudine М., 1982]. Наоборот, в клетках К-562 ампли- фицирован ген прото-аЫ [Duesberg Р., 1983]. В то время как прото-ras амплифицирован в линии клеток мышиной адренокортикоидной опухоли [SchwabМ. et al., 1983], 6 —10-кратная амплификация гена прото-Ha-ras наблюдалась в некоторых штаммах нормальных мышей и хомяков [Chattopadhyay S. et al., 1982].
В НИИ онкологии им. проф. Н. Н. Петрова М3 СССР С. Н. Федоров и О. М. Серова наблюдали парадоксальное явление: резкую амплификацию прото-тус в непораженной слизистой оболочке толстой кишки больного с карциномой этой части кишечника, тогда как в самой опухоли амплификации указанного гена не наблюдалось. Сущность парадокса еще предстоит расшифровать. Создается впечатление, что между амплификацией протоонкогенов и канцерогенезом достаточно устойчивой связи не существует.
Активация клеточных протоонкогенов в трансформирующие онкогены путем точковых мутаций. Рассмотрение в данном разделе точковых мутаций обособленно от других путей активации протоонкогенов не означает, что они являются единственным генетическим механизмом, осуществляющим превращение нормальных клеточных генов в онкогены, в то время как изложенные выше имеют совершенно другую природу. Это не так. Произведенное нами подразделение процессов активации в известной степени носит формальный характер и служит облегчению их классификации.
В действительности практически все без исключения охарактеризованные ранее механизмы активации протоонкогенов затрагивают так или иначе ДНК и, таким образом, в конечном итоге имеют мутационную природу.
В самом деле, что в генетике понимают под мутацией? В монографии С. Г. Инге-Вечтомова (1983) мутация характеризуется следующим образом: «Мутация — это генетическое изменение, приводящее к качественно новому проявлению основных свойств генетического материала: дискретности, непрерывности или линейности. Таким образом, мутации представляют изменения генов (генные мутации), ведущие к появлению новых аллелей». Согласно Ж. Бейссон (1976), «мутация, следовательно, в самом общем смысле представляет собой изменение последовательности нуклеотидов гена». По определению С. М. Гершензона (1979), «мутации — это внезапно возникающие стойкие изменения генетического аппарата, включающие как переход генов из одного аллельного состояния в другое, так и различные изменения числа и строения хромосом». К типам мутаций автор относит: 1) измене-
ния числа наборов хромосом; 2) изменения числа отдельных хромосом; 3) перестройки хромосом (сегментные мутации: делении, дупликации, инверсии, транслокации, транспозиции); 4) генные (или точечные) мутации. Первые 3 типа мутаций обозначают под общим названием <хромосомные аберрации».
Приведенные цитаты из авторитетных источников говорят о том, что практически все рассмотренные нами выше механизмы активации клеточных протоонкогенов представляют собой тот или иной вид мутаций: либо на хромосомном, либо на генном уровне, либо на уровне отдельных нуклеотидов, чем являются точковые (точечные) мутации. Это относится и к трансдукциям, и транслокациям, и инсерциям, и амплификациям, и точковым мутациям.
Точковые мутации в канцерогенезе привлекли особое внимание в связи с серией статей по активации онкогенов, появившихся в конце 1982 г. Проведенные исследования особенно примечательны в том отношении, что впервые в истории онкологии приурочили сложнейшее биологическое явление — трансформацию и туморогенез — к конкретному простому молекулярному акту—— замене одного нуклеотида ДНК другим. Исчерпывается ли указанным элементарным молекулярно-генетическим «ходом природы» вся сложность феномена неоплазии? Вряд ли. Однако в существовании причинно-следственной связи между таинственным биологическим явлением — раком — и молекулярно химическим событием, на уровне ДНК, сомневаться не приходится. Данная простая схема может обрастать дополнительными фактами и деталями, но принцип, по-видимому, сохранится.
Итак, точковая мутация — это мутация, затрагивающая лишь один нуклеотид из тысяч. По данным сразу трех лабораторий (R. Weinberg, М. Barbacid и М. Wigler), она превращает доброкачественный протоонкоген в активный онкоген. Рассмотрим подробнее, как это было установлено.
Обработкой рестрикционными эндонуклеазами ДНК опухоли и гомологичной нормальной ткани расщепили на фрагменты, с помощью техники трансфекции идентифицировали сегменты, содержащие онкоген и протоонкоген, и клонировали те и другие. Таким образом, исследователи располагали клонированными вариантами обоих генов, поэтому определение характера мутации и ее точной локализации при современном уровне развития молекулярной биологии и генной инженерии не представляло непреодолимых трудностей и явилось фактически делом техники.
В принципе было сделано следующее.
Исследователи располагали двумя возможностями: 1) определить полную нуклеотидную последовательность (что теперь и делается во многих случаях) каждого из генов, имеющих протяженность около 5000 п. о.; 2) сравнить две последовательности. Практически более удобным оказался 2 й путь: сначала установили ту область в генах, которая определяла их критическое различие. Это осуществили путем генерирования рекомбинантов
между частями двух генов, при использовании генно-инженернои техники, обеспечивающей подобие классического генетического двойного кроссинговера (рис. 10) [Weinberg R., 1983]. Точковая мутация, превращающая протоонкоген в активный онкоген в клеточной линии EJ карциномы мочевого пузыря человека, была идентифицирована: выявлением биологически активного (трансфекция) сегмента ДНК и секвенированием соответствующих фрагментов ДНК опухолевых и нормальных клеток. Протоонкоген и онкоген (а) расщепляли эндонуклеазами в одном и том же месте (б) и сегменты лигировали (в) перекрестно. Рекомбинанты испытывали на трансфекционную активность. «Вырезали» более мелкие фрагменты (г, д). В наименьших фрагментах (350 нуклеотидов) устанавливали последовательность оснований и выявляли точку мутации.
Специфические сегменты, «вырезанные», как указано выше, из двух генов, соединялись с помощью фермента ДНК-лигазы с образованием двух гибридных генов, одна часть которых происходила из онкогена, а другая — из протоонкогена. Гибридные молекулы испытывали в трансфекционном тесте в культуре мышиных фибробластов линии NIH ЗТЗ, чтобы определить, какая из них утратила онкогенную активность, а какая приобрела.
Именно таким способом удалось значительно сузить искомую критическую для неоплазии область после «скрещиваний» все более мелких сегментов онкогена и его клеточного гомолога — протоонкогена.
Для онкогена рака мочевого пузыря человека конечным фрагментом ДНК, обеспечивающим трансфекционный эффект, оказался блок из 350 нуклеотидов. При введении его в протоонкоген последний приобретал онкогенную активность. Соответственно аналогичный фрагмент протоонкогена, замещающий упомянутый выше нуклеотидный участок онкогена, лишал молекулу онкогена трансформирующей активности.
Это означало, что критический дефект, различающий два близкородственных гена, локализуется в сегменте, состоящем из 350 нуклеотидов. Анализ последовательности нуклеотидов активного и неактивного вариантов сегмента привел к неожиданному результату: активность или неактивность 350-нуклеотидной последовательности зависела от единственного нуклеотида — гуанин во фрагменте протоонкогена был заменен на тимин в онкогене. Следовательно, замена единственного нуклеотида, т. е. точковая мутация, в 5000-нуклеотидном нормальном человеческом гене превращала его в онкоген.
Описанная работа была проделана в лаборатории R. Weinberg на клеточной линии EJ карциномы мочевого пузыря человека [Tabin С. et al., 1982]. Именно таким способом впервые был установлен конкретный генетический дефект, ведущий к бесконтрольному росту человеческой опухоли. Причиной точковой мутации мог быть любой фактор окружающей среды.
онкоген
активный
неактивный
б
становится неактивен
становится активен
становится неактивен
становится активен
становится неактивен
становится активен
д
Рис. 10. Превращение протоонкогена клеток мочевого пузыря человека в онкоген [Weinberg R., 1983J (объяснение в тексте).
Поиск мутагенного повреждающего эффекта, активирующего протоонкогены клетки, не был случайным. Известно много работ по химическому канцерогенезу, указывающих на устойчивую корреляцию канцерогенной активности соединений с их мутагенной способностью [McCann J. et al., 1975; McCann J., Ames B., 1976J. Это свидетельствует о том, что ДНК является конечной мишенью канцерогенной активации. Соответственно стали пытаться идентифицировать и изучить сегменты ДНК в опухолевых клетках, чье изменение критически важно для онкогенного превращения [Shin Т. et al., 1979; Cooper G. et al., 1980; Shin T. et al., 1980; Klein G., 1981]. Учитывалось, что ДНК нормальных клеток не вызывает трансформацию клеток NIH ЗТЗ in vitro, а ДНК опухолевых клеток — часто вызывает. Это явно говорило о существова-
нии в ДНК опухолевых клеток онкогенных факторов и об их отсутствии в клетках нормальных.
Первые указания на присутствие в опухолевых ДНК онкогенноактивных последовательностей были получены в опытах по изучению чувствительности биологической активности ДНК к обработке сайтспецифическими эндонуклеазами [Lane М. et al., 1981; Shilo В., Weinberg R„ 1981].
C. Tabin и соавт. (1982) провели генетическое картирование функционально измененной области онкогена. Для этого они осуществили in vitro гомологичную рекомбинацию между клонами двух генов. Эксперимент предусматривал иссечение рестрикционного фрагмента из онкогена и использование его для замены гомологичного блока протоонкогена. Одновременно реципрокная конструкция была создана путем сплайсинга фрагмента протоонкогена в онкоген. Полученные рекомбинантные модели были затем испытаны на трансфекцию. Онкогенная активность гена EJ была обнаружена во фрагменте, состоящем из 350 нуклеотидов. Указанная область распространялась от первого Xma I эндонуклеазного сайта до сайта Kpn I. 55 % данной области состоит из первого кодирующего экзона, 10 % — из 5'-конца до кодирующей области и 35 % является частью первого интрона.
Разница между 350-нуклеотидными сегментами ДНК нормальных и опухолевых клеток находилась в области первого экзона, кодирующего белок р21, на расстоянии 60 нуклеотидов от сайта расщепления Xma I, в триплете, кодирующем глицин в нормальном крысином и человеческом c-Ha-ras-генах. Гомологичная последовательность в онкогене EJ кодировала не глицин, а валин. Именно эта замена глицина была ответственной за изменение функции продукта онкогена, белка р21.
Другим независимым следствием замены единственного основания в протоонкогене было изменение в сайтах расщепления двух различных эндонуклеаз. Последовательность ГЦЦГГЦ содержится в протоонкогене и представляет сайт распознавания эндонуклеазы Nae I. Она имеет также сайт распознавания ЦЦГГ, специфичный для эндонуклеазы Нра II. Оба этих сайта изменяются в онкогене на последовательность ГЦЦГТЦ, нераспознаваемую указанными ферментами.
Замена глицина на валин в белке р21 имеет явно критическое значение для функции белка, причем, по-видимому, дело не столько в появлении валина, сколько в исчезновении глицина. Действительно, анализ, например, продукта онкогена вируса саркомы Харвея показал его отличие от продукта гомологичного нормального клеточного гена лишь в одной аминокислоте: вместо глицина в нем находится аргинин. В белке, кодируемом онкогеном вируса саркомы Кирстена, в аналогичной позиции находится серин. Следовательно, независимо от характера аминокислоты, заменяющей глицин в белке р21, последний проявляет онкогенные свойства. Все сводится к замене глицина как такового. Чем же отличается
эта аминокислота от других, в чем ее уникальность? Высказываются следующие предположения [Tabin С. et al., 1982].
Глицин является единственной аминокислотой, не содержащей боковой цепи. Поэтому он способен участвовать в изгибах, свертываниях полипептидного скелета белка и дестабилизирует а-спирали [Cantor С., Schimmel Р., 1980]. Поэтому замена глицина валином или аргинином приводит к резкому изменению в локальной стереохимической структуре белка.
Потеря глицина в остатке 12 (среди 37, кодируемых первыми экзонами протоонкогена и онкогена) вызывает значительные изменения в важном домене белка р21. Одно следствие этой замены — конформационный сдвиг в белке, ведущий, в свою очередь, к аберрантной миграции при электрофорезе или процессировании р21. Другое следствие — глубокое влияние на функцию белка р21, выражающееся в характере взаимодействия последнего с клеточными мишенями. В принципе описанный феномен можно было бы сравнить с патологией при серповидно-клеточной анемии, где замена одной из 574 аминокислот в глобине радикально меняет свойства гемоглобина в эритроцитах, делая егод нерастворимым (гемоглобин S) и выпадающим в виде кристаллов. В данном случае а-цеп и двух форм гемоглобина идентичны, а в Р-цепи в положении 6 в нормальном гемоглобине находится остаток глутаминовой кислоты, тогда как в гемоглобине S — остаток валина. Серповидно-клеточная анемия является молекулярной болезнью генетического происхождения. Она — результат мутации в молекуле ДНК, кодирующей синтез P-цепи гемоглобина.
Очень сходное исследование в Национальном раковом институте выполнили Е. Reddy и соавт. (1982). Авторы проанализировали генетические изменения, происходящие в ткани мочевого пузыря человека при ее неопластическом перерождении, исследовали нормальную ткань и клеточную линию Т24 карциномы мочевого пузыря, обнаружили точковую мутацию в протоонкогене при его активации в онкоген. При этом, как и в изложенной выше работе С. Tabin и соавт. (1982), отмечена замена в результате мутации гуанина в протоонкогене на тимин в онкогене и, соответственно, замещение глицина в нормальном протоонкобелке р21 на валин в онкобелке р21, кодируемых соответственно этими генами. Сравнительный анализ онкогена Т24 рака мочевого пузыря человека в сопоставлении с ретровирусными трансформирующими генами (онкогенами) показал, что его внутренний фрагмент близкородствен онкогену мышиных саркомных вирусов Харвея и BALB (v-has/v-bas).
Ранее авторы установили, что плазмида (рТ24-СЗ), содержащая 6,6 т. о. ВатН Гфрагмент ДНК Т24, была способна трансформировать клетки NIH ЗТЗ. Трансформирующая активность этой молекулы была локализована в области 4,6 т. о. Xho I—Sph 1-фрагмента ДНК. Чтобы определить точное место мутации, превращающей пр.отоонкоген в онкоген, Е. Reddy и соавт. сконструировали
серию плазмид, в которых фрагменты Т24-трансформирующего гена были замещены гомологичными нормальными последовательностями гена с-has/bas-l. В реципрокных экспериментах гомологичная область нормального гена с-has/bas-l была замещена соответствую щи м и доменами его трансформирующей аллели. Замена в плазмиде Т24-СЗ-фрагмента ДНК, локализованного между сайтами расщепления Xho I н Kpn I, нормальными последовательностями полностью лишала его трансформирующей активности. Напротив, замена нормальной Xho I-Kpn 1-области ДНК в pbc- N I (плазмида, содержащая фрагменты клеточного протоонкогена) соответствующим доменом плазмиды рТ24-СЗ, генерировала плазмиду (рХКТ-82), которая трансформировала клетки NIH ЗТЗ.
С помощью этой же генно-инженерной техники обмена рестрикционными фрагментами генов Т24 и c-has/bas авторы еще точнее локализовали место, ответственное за активацию Т24. Оно было локализовано в 0,9 т. n>o. Sac I-Kpn I-рестриктазном фрагменте ДНК рТ24-СЗ и pbc-N I.
Найдено лишь одно изменение нуклеотидов, локализованное в позиции 655 от места расщепления эндонуклеазой Sac I. Гуанин нормального гена с-has/bas-l уступил место тимину в онкогене Т24. Е. Reddy и соавт. пришли к такому же заключению, как и С. Tabin и соавт., при изучении EJ-онкогена: активация клеточного с-has/bas-l, нормального протоонкогена, в клетках Т24 человеческой карциномы мочевого пузыря вызвана единственной точке вой мутацией.
Было показано также, что мутировавший гуаниновый остаток является частью гекса нуклеотида ГЦЦГГЦ, который специфически распознается эндонуклеазой Nae I. Установлено, что Nae I расщепляет 6,4 т. о. ВатН I-инсерт плазмиды pbc-N 1 в пяти местах, приводя к образованию 4 внутренних фрагментов ДНК: 0,2; 0,4; 0,6 и 0,9 т. о., тогда как переваривание этой эндонуклеазой плазмиды рТ24-СЗ (содержащей онкоген) дает лишь 3 внутренних фрагмента: 0,2; 0,6 и 1,3 т. о. Утрата Nae 1-сайта расщепления внутри 1,3 т. о.-фрагмента подтверждает местоположение точки мутации.
Согласно проделанному ранее гетеродуплексному и рестрикционному анализам, первый экзон онкогена Т24 содержит кодирующую информацию для 37 аминокислот, находящихся между позициями 621 и 731. Указанные наблюдения локализовали мутировавший гуаниновый остаток во втором основании триплета (655-й нуклеотид), кодирующего глицин— 12-й аминокислотный остаток нормального человеческого белка р21. Замещение гуанина протоонкогена на тимин в онкогене Т24 приводило к замене глицина нормального белка на валин онкобелка. Этого оказывалось достаточно для придания трансформирующих свойств генному продукту онкогена Т24 человека.
Reddy и соавт. (1982) отмечают общее генетическое изменение в человеческом и ретровирусных трансформирующих генах.
По их данным, сравнение первых 37 аминокислот белка р21, кодируемого нормальным геном человека с-has/bas-l, с их ретровирусным партнером показало полную идентичность, кроме позиции 12, т. е. аминокислоты, которая изменена в Т24. В белке р21, кодируемом Ha-MSV, в этом положении присутствует аргинин, в р21, кодируемом BALB-MSV, — лизин, а в р21, кодируемом активированным с-has/bas-l, — валин. Эти данные указывают на то, что точковая мутация касается 12-го кодона нормальных генов и, по-видимому, достаточна для приобретения неопластических свойств.
N. Tsuchida и соавт. (1982) изучили нуклеотидную последовательность гена v-kis — онкогена Ki-MSV. При сравнении первых 37 аминокислот дедуцированного белка Кирстена р21 с таковыми белка, кодируемого с-has/bas-l, авторами отмечены 2 изменения: глицин заменен серином в позиции 12, а глутаминовая кислота — глутамином в положении 37. Таким образом, изменения в глициновом остатке гена c-kis в позиции 12 активируют даннн員 ген.
Логика этих событий могла бы указывать на то, что и другой трансформируют” 員 онкоген человека, идентифицированный в ряде разнообразных человеческих карцином (Kis-2-ген), активировался с помощью того же механизма, каким возник онкоген Т24. Поскольку известные трансформирующие белки р21 имеют в позиции 12 различные аминокислоты, Е. Reddy и соавт.'также считают злокачественные свойства этих белков скорее результатом элиминирования глицина в их нормальном партнере, чем просто заменой одной аминокислоты на другую. Глициновые остатки известны своей способностью изменять а-спиральную структуру белков. Авторы определили, что N-терминальная часть белка р21, кодированного геном c-has/bas-1, содержит 2 а-спиральные области из 10 и 13 аминокислот, соединенные петлей из 7 аминокислот. Петлевидная структура придает гибкость при сгибании и складывании полипептидной молекулы. Если глицин в положении 12 белка р21 заменен валином, то размер петлевой области уменьшается до двух аминокислот, снижая эластичность структуры белка. При этом также увеличивается спиральная часть N-терминального домена трансформирующего белка р21 в сторону от центра сердцевины молекулы.
Таким образом, различие между белками р21, кодируемыми нормальным геном с-has/bas-l, и онкогеном Т24 носит качественный характер.
Как видим, исследования С. Tabin и соавт. (1982) и Е. Reddy и соавт. (1982) очень сходны между собой. Они проведены на одном виде опухолевого материала (рак мочевого пузыря человека) ,хотя и на разных клеточных линиях. Обе работы убедительно демонстрируют роль точковых мутаций в активации клеточных протоонкогенов в онкогены.
Трансформирующие гены, соответствующие клеточному гомологу (c-Ki-ras) вирусного онкогена v-Ki-ras, выявлены в клеточ-
ных линиях, полученных из карцином мочевого пузыря, легкого, толстой кишки и желчного пузыря, равно как и в биопсийной ткани из карцином легкого, поджелудочной железы, толстой кишки и рабдомиосаркомы [Capon D. et al., 1983].
J. Grath и соавт. (1983) показали, что c-Ki-ras 2 потенциально кодирует 2 различных белка р21 (молекулярная масса 21 000) путем дифференциального использования двух из пяти его екоди- руюших экзонов. Оставалось неясным, какой из этих белков (или оба) обладает трансформирующей активностью.
Как видно из изложенного выше, активация гена c-Ha-ras 1 в клетках Т24 карциномы мочевого пузыря человека, вызванная изменением одного нуклеотида, дает начало синтезу белка р21, имеющему одну измененную аминокислоту и отличающемуся иной электрофоретической подвижностью.
Присутствие белков p21ras с различными электрофоретическими подвижностями в двух клеточных линиях карцином легкого и толстой кишки, содержащих активированные гены c-Ki-ras 2, равно как и в клетках NIH ЗТЗ, трансформированных ДНК из этих опухолевых линий, указывало на то, что ген c-Ki-ras 2 мог быть активирован сходным генетическим поражением. Для исследования этой возможности D. Capon и соавт. (1983) клонировали ген c-Ki-ras 2 ДНК из клеточных линий человеческих карцином легкого (Calu-1) и толстой кишки (SW480), несущих активированные гены c-Ki-ras 2.
Анализ нуклеотидных последовательностей показал, что активация гена в онкоген произошла благодаря двум отдельным мутациям одного и того же кодона в указанных двух клеточных линиях. При помещении этих кодирующих элементов клонированного гена c-Ki-ras 2 под транскрипционный контроль гетерологичной экспрессионной системы были получены данные в пользу той точки зрения, что наблюдавшиеся структурные мутации являются необходимыми, а в определенных случаях и достаточными для придания гену трансформирующей активности.
D. Capon и соавт. установили, что: 1) единственный нуклеотид в кодоне 12 отличает области ДНК, кодирующие белок р21; триплет ГГТ, кодирующий глицин в позиции 12 продукта нормального гена c-Ki-ras 2, становится в результате мутации ГТТ, кодирующим валин в клетках SW480 (карцинома толстой кишки), и ТГТ, кодирующим цистеин в клетках Calu-1 (карцинома легкого); 2) второе различие в нуклеотидах найдено вверх от инициирующего кодона АТГ, что указывает на существование двух различных трансформирующих аллелей в клеточной линии SW480.
В описанной работе показано, что транскрипты с активированных трансформирующих генов клеточных линий карцином легкого и толстой кишки человека кодируют белки, отличающиеся друг от друга н от продукта считывания протоонкогена c-Ki-ras 2. Оба различия находятся в позиции 12 кодируемых белков р21, где валин и цистеин замешают глицин, присутствующий в нетран-
сформирующем белке. Единственная замена аминокислоты в этой позиции, таким образом, представляет собой общий механизм активации трансформирующей активности в клеточных онкогенах ras, выявляемой трансфекцией клеток NIH ЗТЗ. Сходно с этим высокогомологичные трансформирующие белки р21, кодируемые мышиными саркомными вирусами Харвея, BALB и Кирстена, имеют соответственно аргинин, лизин и серин в положении 12. Мутация, ответственная за активацию клеточных генов, 'возникла благодаря трансверсии Г->Т, тогда как в трансформирующих ретровирусах гены были активированы, по-видимому, благодаря переходу「f А, возможно, в результате ошибок при обратной транскрипции.
Таким образом, исследование клеточных линий карцином легкого и толстой кишки человека показало, что различные точковые мутации в одном и том же кодоне могут активировать клеточный ген c-Ki-ras 2 и поэтому большинство последовательностей информационных РНК, транскрибированных с этого гена, используют участки 4-го кодирующего экзона, отличающиеся от вирусного партнера.
D. Capon и соавт. (1983) осуществили анализ последовательностей ДНК активированного онкогена из линии клеток Т24 карциномы мочевого пузыря человека и двух аллелей его нормального клеточного прародителя (c-Ha-ras 1). Анализ показал, что гены содержат, по крайней мере, 4 экзона и только единственная точковая мутация, находящаяся в 1-м экзоне, различает кодирующую область обеих аллелей нормального гена от их активированного партнера. Оба варианта гена кодируют белок, который отличается от соответствующего продукта вирусного гена по трем аминокислотным остаткам, один из которых, как было показано ранее, представляет главный сайт фосфорилирования вирусного полипептида.
С момента установления в 1982 г. положения о том, что между трансформирующим геном клеточной линии человеческого рака мочевого пузыря и его нетрансформирующим вариантом в нормальных клетках различие заключается лишь в одном нуклеотиде, началась «охота» за другими примерами подобных изменений. Не все попытки были успешными. Так, A. Feinberg и соавт. (1983) не обнаружили точковой мутации в 12-й аминокислоте в продукте онкогена Ha-ras в 29 различных раковых опухолях человека. Однако представление об участии точковых мутаций в активировании клеточных протоонкогенов не было этим поколеблено. Более того, обнаружили другую мутацию в том же гене клеточной линии рака легкого человека [Yuasa Y. et al., 1983].
Была изучена активация c-Ha-ras (или c-bas/has), клеточного гена, из которого, по-видимому, произошел онкоген вируса мышиной саркомы Харвея (Ha-MSV). Его продуктом является белок р21 (21 кд). В клеточных линиях Т24 и EJ карциномы мочевого пузыря человека точковая мутация изменила 12-ю аминокислоту
белка р21 с глицина на валин. В отличие от этого, в продукте трансформирующего гена c-Ha-ras, изолированного и клонированного У. Yuasa и соавт. из линии клеток Hs-242 человеческой карциномы легкого, в позиции 12, как и в норме, обнаружен глицин. В то же время в 61-м положении вместо присущего нормальному белку р21 глутамина найден лейцин. Таким образом, в 1 -м экзоне онкогена изменений обнаружено не было, но во 2-м экзоне имел место генетический дефект, т. е. точковая мутация. Трансформирующий ген клеточной линии Hs-242 карциномы легкого человека был клонирован в биологически активной форме и идентифицирован как c-bas/has (c-Ha-ras).
S. Rasheed н соавт. (1983) определили нуклеотидную последовательность онкогена штамма Рашид вируса саркомы крыс (RaSV). Онкоген кодирует трансформирующий белок р29 (29 кд), отличающийся от иммунологически родственного ему белка р21 вируса мышиной саркомы Харвея по структуре N-конца и тем, что имеет дополнительные мутации на карбокси-конце. Крысиный саркомный вирус штамма Рашид интересен в том отношении, что возник в клеточных культурах химически индуцированных опухолей крыс с использованием крысиного лейкемического вируса (RaLV). Этот вирус отличается от Ha-MuSV и Ki-MuSV тем, что содержит вирусные и клеточные последовательности только крысиного происхождения. 6,4 т. о.-фрагмент генома RaSV трансформировал культуру клеток NIH ЗТЗ или крысиные клетки, которые начинали экспрессировать р29.
Известно, что онкоген Ha-MuSV кодирует белок, в котором глицин заменен аргинином, а онкоген Ki-MuSV кодирует белок, где вместо глицина расположен серин. Эти перестановки рассматривались как главные различия между нормальными и вирусными онкогенами [Tabin С. et al., 1982; Chang Е. et al., 1982; Parada L. et al., 1982; Pulciani S. et al., 1982; Reddy E. et al., 1982].
Анализ последовательности субгеномного фрагмента RaSV, содержащего около 1400 нуклеотидов, кодирующих белок р29, показал его гомологию с v-Ha-ras, начиная с позиции 724. Однако были выявлены различия в двух триплетах, кодирующих треонин н глицин (остатки 40 н 49), вместо аланина н аргинина в позициях 19 и 11, соответственно, белка р21. За исключением четырех аминокислот и двух измененных аланиновых и аргининовых кодонов (1150 и 1234), все нуклеотиды и дедуцированные аминокислоты. начиная с первого метионина р21 -подобного белка (787), оказались точно совпадающими с последовательностью v-Ha-ras. Это гомология включает критическую мутацию аргинина в 12-м аминокислотном остатке, который в р29 соответствует остатку 71. 4 мутации в последовательности р21-подобного белка вируса RaSV представлены аланином, аланином, гистидином н пролином в остатках 118, 181, 182 н 209 соответственно, по сравнению с треонином, глицином, аргинином и глутамином в остатках 59, 122, 123 и 150 белка р21, кодируемого v-Ha-ras.
К. Shimizu и соавт. (1983) анализировали структуру онкогена Ki-ras в линии клеток Calu-1 карциномы легкого человека. По их данным, гомолог вирусного онкогена Кирстен-ras (v-Ha-ras), найденный в клеточной линии Calu-1 карциномы легкого человека, имеет интрон-экзонную структуру, сходную с таковой человеческого гомолога вирусного гена Харвей-ras (v-Ha-ras). Второй, потенциально 4-й кодирующий экзон присутствует в Ki-ras-гене человека, и сходные последовательности найдены в мышином штамме К и ретен а саркомного вируса. Онкоген Calu-1 кодирует в 12-й аминокислотной позиции цистеин. Это указывает на то, что ген Calu-1 Ki-ras подвергся мутационной активации в том же сайте, что и ген Ha-ras человека в клеточной линии карциномы мочевого пузыря Т24.
Сравнение их предсказанных (рассчитанных по последовательностям нуклеотидов, т. е. дедуцированных) последовательностей аминокислот говорит о том, что ras-белки имеют «константную» и «вариабельную» области.
Авторы отмечают, что Ha-ras клеток Т24, Ki-ras карциномы легкого и толстой кишки, онкоген клеточной линии нейробластомы SK-N-SH, по-видимому, возникли в результате «активации» путем соматической мутации соответствующих клеточных ras-генов [Taparowsky Е., 1973; Reddy Е. et al., 1982; Tabin С. et al., 1982]. Характерно сопоставление родства продукте генов ras.
Наблюдается значительная консервативность всей аминокислотной последовательности между гомологичными ras-генами у отдаленных видов животных. Так, Ha-ras-ген человека отличается от вирусного Ha-ras-гена, имеющего крысиное происхождение, лишь тремя (из 189) остатками аминокислот. Сходно с этим человеческий Ki-ras-ген (состоящий из 4 экзонов: I, II, Ill и IVa) отличается от вирусного Ki-ras-гена, также имеющего крысиное происхождение, лишь 7 из 189 позиций. Авторы считают обнаруженный консерватизм отражением эволюционного давления на поддержание физиологической роли продуктов генов ras.
Индивидуальные члены семейства генов ras демонстрируют высокую степень родства на уровне последовательности аминокислот 1 ——120, 133——163 и 185—189. В этой «константной» области человеческие Ki-ras и Ha-ras различаются лишь в 7 позициях. Человеческий ген N-ras демонстрирует сходную консервативность в той же области. Однако предсказанная поеледовательность аминокислот значительно отклоняется в аминокислотах 164—184 и меньше — в области позиций 121 ——132. Последняя названа «вариабельной» областью. У различных видов данная область проявляет разную степень вариабельности. Так, не отмечено изменений аминокислот между генами Ha-ras человека и вирусов в рассматриваемой области, и имеют место лишь небольшие различия в Ki-ras-генах человека и вирусов. Указанная область может поэтому определять физиологическую роль индивидуальных продуктов генов ras.
Известно по крайней мере 5 членов семейства ras, экспрессия которых, по-видимому, важна в контроле роста, развития и связанной с этими феноменами патологии. Е. Reddy (1983) определил полную нуклеотидную последовательность Т24-онкогена клеточной линии карциномы мочевого пузыря человека, идентифицировал кодирующие и некодирующие последовательности генома. Рассчитана последовательность аминокислот белка р21, продукта трансляции онкогена Т24. Сравнение показало, что приобретение трансформирующих свойств онкогеном Т24 обязано единственной точковой мутации в нормальном клеточном гомологе (аминокислота в позиции 12). Отмечены и другие различия между онкогеном Т24 н его нормальным клеточным партнером, а именно в областях 5'- и З^некодирующих последовательностей. Однако эти различия, по-видимому, объясняются полиморфизмом н не играют значительной роли в процессе трансформации.
Оценивая существующую информацию об активации клеточных протоонкогенов в онкогены, в частности феномен Т24, Е. Reddy отмечает, что гетеродуплексный анализ онкогена Т24 и его нормальной аллели в сравнении с онкогенами v-bas и v-has показал, что предполагаемые кодирующие последовательности этих человеческих генов рассеяны среди четырех экзонов [Goldfarb М. et al., 1982J. Сравнение нуклеотидной последовательности полной кодирующей области онкогена Т24 с таковой нормального гомолога показало, что на протяжении 1683 оснований, которые составляют 4 экзона и 3 интрона, имеются только 2 изменения оснований —— в позициях 1704 и 2720, лишь одно из которых находится в кодирующей области. Эксперименты, в которых использовались рекомбинанты между онкогеном Т24 и его нормальным гомологом, показали, что трансформирующее свойство онкогена Т24 и мутация в 12 кодоне взаимосвязаны.
Интересна следующая информация, приводимая Е. Reddy, о частоте генетических событий в клеточных генах позвоночных. Сравнение последовательности аминокислот белка р21, кодируемого онкогеном Т24, с нх вирусными партнерами показало полную идентичность, за исключением позиций аминокислоты 12 и 143, по сравнению с v-bas и позиций аминокислот 12, 59 и 122 ——по сравнению с v-has.
Из этого сравнения следует 2 важных момента: 1) семейство генов bas/has является высококонсервативным в эволюции с примерно 1 % отклонений в последовательности аминокислот белка от мыши до человека. По контрасту, р-глобине имеется 18 % отклонений между мышиными и человеческими последовательностями аминокислот. Единственная позиция, где все 3 белка р21 отличаются в последовательностях, — это 12-я. Нормальный гомолог крысиного c-has/bas, ген, который, по-видимому, рекомбинирован с мышиным лейкемическим вирусом Молони, генерируя Ha-MSV, также имеет глицин в позиции 12, как и его человеческий гомолог.
Возможно поэтому, что аминокислота в позиции 12 является «горячей точкой» для точковых мутаций. Однако в протоонкогене c-has/bas существуют множественные сайты, мутации в которых могут вести к активации этого гена. Так, как указывалось выше, Y. Yuasa и соавт. (1983) клонировали онкоген семейства c-has/bas с точковой мутацией вне 1-го экзона.
Приведенные примеры убедительно демонстрируют роль точковых мутаций в активации клеточных онкогенов. Наряду с другими формами генетических дефектов н перестроек — трансдукциями, транслокациями, инсерциями, транспозициями, амплификациями, они являются, по-видимому, важным фактором канцерогенеза.
Естествен вопрос о реальной вероятности в природе точковых мутаций в уникальных генах, каковыми являются протоонкогены.
Исследование дивергенции онкогенов позволило определить скорость изменений синонимных кодонов》 Была рассчитана частота порядка (6—7) • 10-9 синонимных замещений на нуклеотидный сайт в год в генах типа препроинсулина и глобина [Myata Т., Yasunada Т., 1981; Perucho Мж, 1981]. В течение 1-го года жизни человека, со средней популяцией 1012 клеток, подвергающихся риску, возможны замещения, воздействующие на кодоны в любых сайтах онкогенов Hs242 (карцинома легкого человека) или Т24 (рак мочевого пузыря человека), в тысячах клеток. Хотя не все такие замещения оснований могут вести к замене аминокислот, способной активировать какой-то определенный ген, тем не менее вероятность подобных событий признается значительной. Соответственно следует считать достаточно высокой и частоту естественных дефектов критических сайтов внутри клеточных генов и, как результат, спонтанных раков [Yuasa Y. et al., 1983].
Интересны в этом отношении также рассуждения R. Weinberg (1982) о связи генетических событий с канцерогенезом.
Он указывает, что непрямые эксперименты свидетельствовали о центральной роли повреждений ДНК в трансформации, главным образом, потому, что агенты, повреждающие ДНК, имеют тенденцию быть канцерогенными [McCann J., Ames В., 1976). Однако было неясно, какие последовательности ДНК должны быть повреждены, чтобы вызвать трансформацию. В этой связи в основе дискуссии оказалась модель, провозгласившая клеточный онкоген в качестве главного звена в процессе онкогенной трансформации [Todaro G., Huebner R., 1972; Comings D., 1973]. Согласно указанной модели, онкоген возникает из нормальной последовательности клеточной ДНК, неадекватная активация которой в ходе онкогенеза придает ей новое качество ——трансформирующую способность. Нарушение регуляции клеточных онкогенов может быть достигнуто путем перестройки или изменения блоков нормальных клеточных поеледовательностей после воздействия канцерогенов на ДНК.
Авторы показали, что внесение ДНК из мышиных фибробластов, трансформированных 3-метилхол антреном, в нетранс-
формированные реципиентные клетки приводило к трансформации последних [Shih С. et al., 1979]. Наоборот, ДНК из нетрансфор- мированных фибробластов этого эффекта не производила. Следовательно, ДНК в первом случае была структурно изменена под влиянием химического канцерогена, причем в тех областях клеточного генома, которые могут вызывать трансформирующий фенотип.
Биологически активные последовательности в трансформирующей ДНК вели себя как дискретные сегменты нуклеотидов. Эти сегменты могли быть в конечном счете определены обычными генетическими критериями как гены. Они оказались способны переноситься из клетки в клетку и, таким образом, соответствовали генам.
Существенно, что в опытах R. Weinberg н соавт. (1982) происходила повторная (в четырех независимых экспериментах) активация одного и того же онкогена в одном н том же сайте ДНК. Это поднимает принципиальный вопрос. Канцероген может взаимодействовать со множеством сайтов в клеточном геноме. Работа с опухолеродными генами человека показала, что несколько (и, возможно, довольно много) латентных клеточных онкогенов существуют в геноме, «ожидая» соответствующей активации. Почему же «немишеневый» агент (канцероген) при взаимодействии с мультимишеневым геномом повторно активирует одну и ту же трансформирующую поеледовательность? По-види- мому, процесс онкогенной трансформации не следует классическим моделям мутагенеза. Скорее, ткане- и клеткаспецифические факторы предрасполагают определенные гены к активации, тогда как другие гены защищены от активации. Одним из таких предрасполагающих факторов могло бы быть состояние экспрессии гена в нормальном геноме до канцерогенного «удара».
Известны и другие факты, которые делают невероятным объяснение активации этих генов классическими моделями мутагенеза [Reznikoff С. et al., 1973; Kennedy A. et al., 1980]. Недавний пример: трансформация СЗН ЮТ г/2 фибробластов с помощью рентгеновских лучей.
Работа с канцерогенезом, индуцируемым радиацией, показала, что не существует пропорциональности между числом клеток, экспозированных изначально к канцерогену, и числом фокусон трансформантов, которые появляются в дочерних культурах. Эта н ранние работы других авторов представляют неортодоксальные гипотезы механизмов канцерогенеза, несовместимые с теорией простой мишени генной активации. Одна из таких гипотез провозглашает, что не обязательно для канцерогена прямо изменять мишеневый онкоген в подвергающейся воздействию клетке для того, чтобы онкоген был активирован в поколениях этой клетки. Канцероген может индуцировать в клетке некое метаболическое состояние, чье наличие необходимо для второго события — последующей активации онкогена.
Не исключено, что новая нуклеотидная последовательность возникает много позже после проявления мутагенной активности канцерогена. Если бы действительно было так, то механизмы, которые действуют между начальным канцерогенным стимулом и конечным созданием новых нуклеотидных последовательностей в клеточных генах, могут остаться невыясненными н после изучения изолированных активированных онкогенов. Можно лишь надеяться на ошибочность данной гипотезы. Во всяком случае, большинство имеющихся данных говорит в пользу того, что мутагенное действие канцерогенов вызывает качественное изменение структуры клеточных протоонкогенов, которые «соло» (если для трансформации достаточен один онкоген) или «каскадом» (если для трансформации необходим ряд онкогенов) вызывают трансформацию и туморогенез. Таким образом, мутация остается, независимо от ее конкретных вариантов, главным механизмом превращения протоонкогенов в онкогены.
ОНКОГЕНЫ, ОНКОБЕЛКИИ ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ ФАКТОРЫ РОСТА
Если сам факт участия онкогенов в туморогенезе уже не вызывает сомнений, то механизм их действия все еще остается загадкой.
Твердо установлено, что онкогены кодируют особые белки, онкобелки, большинство из которых обладает тирозинспецифической протеинкиназной активностью. Каков биологический смысл этого процесса и каково его отношение к онкогенезу? Уникален ли он для онкобелков?
Несколько лет назад появились первые данные о том, что неизвестная ранее модификация белков играет определенную роль в контроле клеточного роста [Kolata G., 1983]. Было обнаружено важное явление: трансформирующий белок ВСР катализирует присоединение фосфата к тирозину определенных белков. При этом выяснилось, что если расположенный на поверхности клеток рецептор эпидермального фактора роста (ЭФР) связывает этот фактор, то рецептор начинает фосфорилировать тирозиновые остатки белков. Затем онковирусологи установили, что 5 различных классов РНК-овых опухолеродных вирусов производят трансформирующие белки, которые фосфорилируют тирозины. Эти трансформирующие белки были важны для превращения нормальных клеток в раковые.
В дальнейшем тезис о связи фосфорилирования с контролем роста еще более укрепился. R. Kahn (США) сообщил, что в случае, если инсулин связывается со своим рецептором, последний начинает фосфорилировать тирозины. Как известно, одной из ключевых функций инсулина является стимуляция клеточного роста. С. Heldin (Швеция) нашла, что ростовой фактор тромбоцитов —— РФТ (PDGF)——связывается со своим рецептором и последний начинает фосфорилировать тирозин.
В результате этих находок был поставлен вопрос о сходстве и различиях действия вирусных онкобелков, которые индуцируют бесконтрольный рост, с одной стороны, н ростовых факторов, вызывающих контролируемый рост, — с другой. В частности, неясно, фосфорилируют ли они одни и те же или разные белки, какие клеточные белки фосфорилируются и какое отношение к контролю роста имеет фосфорилирование тирозина в белках.
Известно, что нормальные клетки содержат ферменты (киназы), которые фосфорилируют аминокислотные остатки белков, однако в этом случае присоединение фосфатных групп происходит, главным образом, по серину или треонину, но не по тирозину. В некоторых случаях это фосфорилирование по серину или треонину включает или выключает ферменты. Т. Hunter и В. Sefton (США) показали, что фосфорилирование по тирозину имеет место и в нормальных клетках, однако в очень малой степени: 1 фосфорилирование тирозина приходится в норме, примерно, на 3000 актов фосфорилирования серина или треонина. В клетках, трансформированных ВСР, фосфорилирование тирозина в белках возрастает в 5—10 раз. Этот факт косвенно указывал на участие тирозинкиназы и самого процесса фосфорилирования тирозина в трансформации.
Последовали новые исследования. Было показано, что гены, кодирующие упомянутые выше тирозинкиназы в пяти опухолеродных ретровирусах, гомологичны между собой более чем на 50 %. Кроме того, оказалось, что эти вирусные киназы обнаруживают большое структурное сходство с белком рецепторов ЭФР. Менее известно о структуре рецепторов инсулина н РФТ.
Интересна и весьма характерна кинетика реакции фосфорилирования в случаях ЭФР и РФТ. Т. Hunter и J. Cooper (1980) показали, что в течение 1 мин после добавления ЭФР к клеткам, содержащим рецепторы к нему, имеет место увеличение фосфорилирования тирозина в клеточных белках. Оно включает фосфорилирование и самого рецептора ЭФР, и в одной человеческой опухолевой клеточной линии ——фосфорилирование некоего белка с молекулярной массой 36 кд, который фосфорилируется также трансформирующим белком ВСР. Природа этого клеточного белка мало изучена, но известно, что он локализуется на внутренней поверхности клеточной мембраны. РФТ также вызывает фосфорилирование тирозина в клеточных белках в течение 1—5 мин. Однако фосфорилированные тирозины оборачиваются очень быстро: пол упер иод жизни их в трансформированных клетках меньше 30 мин.
Факт большой скорости фосфорилирования и дефосфорилирования дал основания для спекуляций. В частности, этому явлению приписывали роль чувствительного сигнала, позволяющего осуществлять тонкую настройку биологических процессов. Важным различием между ростовыми гормонами и трансформирующими вирусами (их онкобелками) является то, что в случае
ростовых гормонов сигнал, заключающийся в фосфорилировании тирозина, преходящ, транзитен: он существует лишь до тех пор, пока в окружении присутствуют гормоны н их рецепторы. При действии трансформирующих вирусов сигнал присутствует все время, и клетки теряют контроль над пролиферацией.
Изучение фосфорилирования тирозина, индуцированного инсулином, находится на начальной стадии и оставляет пока много вопросов без ответа. В частности, долго было неясно, не является ли сам инсулиновый рецептор киназой или киназа тесно ассоциирована с ним.
Этот вопрос имеет принципиальное значение в свете известной связи инсулина с ростовой функцией. Как известно, инсулин связывается со специфическими мембранными рецепторами на поверхности клеток мишеней и затем регулирует различные метаболические процессы. Однако не ясно, как взаимодействие инсулина с его рецептором результируется в изменения клеточных функций. Одной из возможностей является действие инсулина путем стимуляции протеинкиназы или торможения протеинфосфатазы. Известно, что рецептор инсулина в интактных клетках сам фосфорилирован и степень этого фосфорилирования регулируется инсулином [Kasuga M.,Karlsson F. et al., 1982; Kasuga M., Zick Y. et al., 1982]. Фосфорилирование рецептора инсулина наблюдали в солюбилизированных плазматических мембранах печени крысы, причем фосфорилирование происходило по тирозиновым остаткам [Kasuga М., Zick Y. et aL, 1982]. Уже этот результат указывал на возможность того, что рецептор инсулина сам является проте- инкиназой. Исследование R. Roth и D. Cassell (1983) продемонстрировало способность высокоочищенных препаратов рецептора инсулина катализировать фосфорилирование субъединицы (95 кд) инсулинового рецептора. Это говорит о том, что сам рецептор инсулина является протеинкиназой.
Добавление инсулина к целым клеткам или солюбилизированным мембранам, как указывалось выше, увеличивает степень фосфориливания В-субъединицы рецептора [Kasuga М., Zick Y. et al., 1982]. Простейшим объяснением такого результата могло быть предположение о том, что инсулин стимулирует протеинкиназную активность рецептора, который, в свою очередь, фосфорилирует себя, равно как и другие белки. Эти фосфорилирования могли бы затем инициировать «каскад» реакций, результирую- шихся в разнообразные эффекты инсулина. Однако увеличенная киназная активность инсулинового рецептора может быть недостаточной, чтобы индуцировать все известные эффекты инсулина на клетки. По аналогии, рецептор ЭФР также является протеинкиназой [Cohen S. et al., 1980, 1982; Buhrow S. et al., 1982]. Наиболее интересной была находка, что, хотя расщепленный циан-бромидом ЭФР был способен индуцировать фосфорилирование своего рецептора и некоторые краткосрочные эффекты интактного ЭФР, он не стимулировал клеточное деление. Поэтому еще следует
определить, является ли протеинкиназная активность инсулинового рецептора как необходимой, так и достаточной для реализации всех многочисленных эффектов инсулина.
При связывании инсулина с рецептором индуцируется фосфорилирование тирозина. Однако большая часть фосфорилирований и дефосфорилирований при этом приходится на серины. Какова роль этого процесса? Какова связь, если она вообше существует, между действием инсулина и действиями опухолеродных вирусов, ЭФР и РФТ? Нельзя исключить возможность существования еще одного фермента — серинкиназы, активируемого при связывании инсулина с его рецептором. Можно предположить, что тирозин- киназа включает или выключает другие ферменты, которые фосфорилируют или дефосфорилируют серин. Поскольку в большинстве раковых клеток резко изменена гликолитическая активность, представляло бы большой интерес проанализировать связь процессов фосфорилирования н дефосфорилирования киназами под влиянием инсулина и его рецепторов с изменением активности ключевых ферментов этого метаболического процесса. Так или иначе, на сегодня инсулиновый рецептор сходен, по крайней мере in vitro, с вирусной тирозинкиназой и рецепторами киназных активностей ЭФР и РФТ.
Следует отметить, что большинство исследователей допускают существование связей между вирусными тирозинкиназами и рецепторами ростовых гормонов.
Ростовой фактор тромбоцитов (РФТ, PDGF) 1983 год был отмечен в истории теоретической онкологии, помимо серии великолепных работ с онкогенами человека, еще одним знаменательным событием — установлением близкого родства, гомологии, между одним из онкогенов и геном ростового фактора тромбоцитов, РФТ, т. е. нормальным клеточным геном, осуществляющим жизненно важную биологическую функцию в организме человека и животных.
В концепции онкогенов, при всех ее достоинствах и преимуществах перед другими гипотезами канцерогенеза, существует, по крайней мере, одно уязвимое звено. Она до сих пор не может объяснить биологическую роль в организме клеточных генов — предшественников трансформирующих онкогенов, присутствующих в малоизмененном виде на всех ступенях эволюционного развития животного мира. Ученые пытались понять, каким образом необходимые, по всей видимости, в жизнедеятельности нормальных клеток гены при их минимальном изменении (а иногда, возможно, и без него, лишь в результате количественного увеличения) становятся гибельными для клетки и организма, что это за клеточные гены, без которых клетка, с одной стороны, не может существовать, а с другой — не способна противостоять их гибельному воздействию.
Давно высказывалась мысль о том, что клеточные гены, протоонкогены, представляют собой гены роста и дифференциации.
При небольшом повреждении нормальная функция их (стимуляция роста) в принципе сохраняется, однако перестает подчиняться контрольным механизмам клетки. Нормальный управляемый процесс роста н созревания утрачивается н заменяется бесконечным потоком клеточных делений, при котором клетки не успевают дифференцироваться, т. е. созреть до состояния, когда они становятся способными осуществлять присущие им специализированные физиологические функции.
Эта привлекательная идея получила поддержку многих исследователей, однако до последнего времени не обогатилась достаточно солидными фактическими данными в свою пользу.
Именно в этот момент произошло открытие, которое заслуживает более подробного описания не только ввиду его значимости для понимания молекулярного механизма онкогенеза, но н по причине необычности самого его совершения.
Открытие состояло в обнаружении близкого родства онкогена саркомы шерстистой обезьяны (v-sis) с геном РФТ человека и, соответственно, белковых продуктов этих двух, казалось бы, столь функционально различных генетических элементов. Обнаружение негативной, неопластической функции у хорошо изученного физиологически важного РФТ превращает его в глазах исследователей в опасного «двуликого януса», способного вызывать не только полезную для организма регенерацию поврежденных тканей, но и индуцировать неограниченную пролиферацию, ведущую к образованию опухолей. Этот пример демонстрирует, с одной стороны, ограниченность наших иногда однозначных оценок биологической роли отдельных компонентов внутренней среды организма, а с другой — представляет собой поразительный образец непредсказуемой игры природы. Одно вещество, РФТ, может выступать в двух совершенно различных ипостасях и осуществлять диаметрально противоположные по своей биологической сущности процессы — созидания и гибели. Самое удивительное в этом примере заключается в том, что и тот, и другой процессы основаны, в принципе, на одной функции — стимуляции роста. Этот факт весьма поучителен в том отношении, что демонстрирует роль факторов более высокого, чем молекулярный, уровня регуляции, находящихся за пределами молекулярных взаимодействий членов одной и той же цепи реакций. Коренная разница реализации «двух лиц» РФТ заключается в том, что одна и та же функция в одних условиях среды подконтрольна и регулируема, «оперирует» прерывисто, тогда как другая — «работает» непрерывно, вызывая неудержимую пролиферацию. В то же время элементарный молекулярный механизм обоих процессов одинаков.
Открытие онкогенных потенций у РФТ является первым и долгожданным подтверждением упомянутой выше идеи о том, что именно те клеточные гены, которые участвуют в нормальной функции роста и пролиферации, служат предшественниками трансформирующих генов, онкогенов.
Теперь следует сказать несколько слов о том, как было открыто родство одного из онкогенов с геном, кодирующим синтез РФТ, нормального белка здорового организма.
Произошло следующее |Doolittle R. et al., 1983; Marx J., 1983; Waterfield M. et al., 1983].
Несколько групп исследователей работали независимо друг от друга в двух далеко не смежных областях молекулярной биологии. Одни, прежде всего сотрудники лаборатории S. Aaronson (Национальный раковый институт, США), изучали онкогены и онкобелки, в данном случае ген саркомы обезьян, v-sis, и кодируемый им онкобелок; другие — в нескольких лабораториях разных странах — исследовали структуру РФТ, специфического белка, стимулирующего заживление ран путем регенерации ткани после повреждения. Те и другие группы авторов опубликовали результаты своих работ, каждые в отдельности, в 1983 г. и ранее: S. Aaronson и соавт. (1983) — о последовательности нуклеотидов в вышеупомянутом онкогене обезьян, v-sis; Н. Antoniades (Гарвардский университет), М. Hunkapiller (Калифорнийский технологический институт), М. Waterfield (Лаборатория Королевского ракового института, Лондон), Т. Deuel (Вашингтонский университет) ,A. Wasteson (Университет Упсала, Швеция) —описали структуру, функцию н последовательность аминокислот РФТ.
Указанные данные всех этих авторов могли остаться отдельными, не связанными друг с другом публикациями, если бы не неожиданное вмешательство еще одного лица, лично не занимавшегося экспериментальной работой. R. Doolittle (Калифорнийский университет в Сан-Диего) давно интересовался проблемой эволюции белковых молекул и систематически закладывал в компьютер всю информацию, которая появлялась в мире по вопросу строения и аминокислотного состава самых различных белков. После появления в мае 1983 г. в журнале «Science» статьи Н. Antoniades н М. Hunkapiller о последовательности аминокислот РФТ, а также данных лаборатории S. Aaronson о структуре онкобелка онкогена sis R. Doolittle ввел в компьютер и эту информацию. Машина выдала исследователю ошеломивший его результат: саркомный белок обезьян и нормальный РФТ представляют собой практически идентичные белки, тождество составляло более 87%. Небольшую разницу (13 %) специалисты считают незначительной и относят за счет различного эволюционного положения обезьяны н человека.
Получив эти данные, R. Doolittle немедленно связался с упомянутыми коллегами, результатом чего явилась совместная публикация всех упомянутых участников работы.
Другая группа авторов [Waterfield М. et al., 1983] приводит несколько иное, чем в статье R. Doolittle и соавт., описание открытия родства онкогена обезьян и гена РФТ. Однако в принципе излагаются те же основные факты, это открытие комментируют также R. Weiss (1983) и С. Stiles (1983).
Описанные исследования привели к заключению, что гены, кодирующие онкобелок саркомы обезьян (онкоген v-sis), с одной стороны, и нормальный фактор роста кровяных пластинок человека —с другой, гомологичны (родственны). Более того, из этих данных следовало, что саркомный ген обезьян и ген, кодирующий ростовой фактор тромбоцитов, произошли от одного и того же или очень близкородственных клеточных генов.
Благодаря этой работе найдены, наконец, первый нормальный ген и его продукт, выполняющие жизненно важную физиологическую функцию и в то же время имеющие прямое структурное и функциональное родство с одним из известных онкогенов и его онкобелком, причинно связанными с неопластическим ростом. Можно думать, что это всего лишь первый из найденных, но далеко не последний из существующих в природе примеров полипотентных функций близкородственных или даже идентичных веществ, используемых природой в прямо противоположных целях: с одной стороны, обеспечение жизни посредством стимуляции регенерации —РФТ (PDGF) н кодирующий его ген, с другой — уничтожение жизни путем малигнизации — онкобелок и его ген.
Принципиальное значение описанной выше работы заключается в демонстрации факта, что по крайней мере один из онкогенов обусловливает первичную злокачественную трансформацию путем неадекватной продукции вещества, которое в норме стимулирует клеточный рост. Если этот первый, нормальный в обычных условиях, ген стимулирует активную пролиферацию, т. е. создает необходимый биологический фон для развития неоплазии, то один или несколько других онкогенов должны завершать создание полного ракового фенотипа. Эта модель находится в полном соответствии с современным пониманием участия «каскада» онкогенов в канцерогенезе как процессе многоступенчатом. Полагают, что каждый отдельный ген «каскада» участвует в реализации лишь одной из ступеней канцерогенеза.
Интересно, что, по данным S. Aaronson, типы раков, индуцируемые у животных саркомным вирусом обезьян (онкоген sis), очень хорошо соответствуют типам тканей, в которых РФТ стимулирует рост. В общем, это клетки соединительной ткани и в некоторых случаях мышечные клетки.
Только что описанная модель канцерогенеза как процесса многоступенчатого выражает третий (после двух упомянутых выше) кардинальный принцип современной концепции онкогенов и является возрожденной на новой молекулярно-генетической основе идеей о многоступенчатом характере процесса онкогенеза в том смысле, что в становлении неопластического фенотипа участвует не один единственный онкоген, осуществляющий всю цепь молекулярных событий, а «каскад» их, по-видимому, как минимум два, а возможно и больше. Первоначальное впечатление об универсальной роли гена «солиста», единственного онкогена, осуществляющего весь сложный процесс трансформации и тумо-
рогенеза так сказать единолично, сложилось в значительной мере в результате использования в трансфекционном тесте модели мышиных фибробластов NIH ЗТЗ. Эта линия культивируемых клеток, как сейчас установлено, не представляет собой полностью интактные клетки. Она в значительной мере отошла от нормы в сторону трансформированного фенотипа, и достаточно лишь небольших дополнительных импульсов, чтобы индуцировать полностью трансформированный фенотип. Оказалось, что те отдельные онкогены, которые в данной тест-системе легко вызывали трансформацию, на других клетках, более нативных, не являющихся частично трансформированными (как клетки ЗТЗ), трансформацию не индуцировали. Добавление второго, а иногда и третьего онкогена приводило к трансформации. Стало ясно, что клетки ЗТЗ в силу условий длительного культивирования уже прошли полпути, если не больше, в формировании трансформированного фенотипа и не нуждаются в силу этого в ряде онкогенов, требовавшихся для реализации событий указанной первой половины пути.
Здесь нет возможности подробнее останавливаться на данном вопросе. Он требует самостоятельного рассмотрения.
Упомянутое выше исследование, установившее близкое родство РФТ с онкобелком саркомного вируса обезьян, позволяет думать о том, что раковый ген может действовать перманентно, включая тот же ростстимулирующий процесс, который нормально активируется лишь эпизодически о время заживления ран или на ранних этапах эмбриогенеза и развития. Когда вирус саркомы обезьян проникает в клетку, он привносит информацию на продукцию РФТ, клетка синтезирует его и оказывается в состоянии непрерывного деления.
В связи с особо важным значением открытия новой, неопластической, функции нормального физиологического конституента живых клеток—РФТ — рассмотрим данные, которые известны об этом агенте.
Биология РФТ. В нормальных условиях РФТ вырабатывается и сохраняется в тромбоцитах. Сильный стимулятор роста клеток, он содержится в организме в ограниченном количестве. Каждая кровяная пластинка человека располагает примерно 1000 молекулами РФТ, находящимися в изолированных специализированных а-гранулах. Содержимое этих гранул освобождается н процессе свертывания крови. Человеческая сыворотка свернувшейся крови несет 15——20 нг/мл РФТ, тогда как обедненная пластинками плазма, продукт несвернувшейся крови, имеет концентрацию РФТ, равную 1—2 нг/мл. Фибробластоподобные клеточные линии, клетки гладких мышц и глиальные клетки требуют для своего оптимального роста in vitro 1—2 нг/мл РФТ. Эта потребность культивируемых клеток обеспечивается обычно дополнением культуральной среды сывороткой до уровня 10—20 %. Потребность в дополнении стимулирующими рост
веществами характерна для соединительнотканных клеток. Эпителиальные клетки, лимфоциты и эндотелиальные клетки могут одинаково хорошо использовать в качестве дополнительного фактора среды как плазму, так и сыворотку, тогда как клетки соединительной ткани — предпочтительно сыворотку.
Филогенетический анализ указывает, что РФТ появился внезапно (скачком) или изменился скачкообразно с первыми хордовыми и с этого момента функционально законсервировался. Сыворотка свернувшейся крови от обезьян и ниже по эволюционной лестнице содержит соединительнотканный митоген, который эффективно конкурирует с человеческим РФТ за рецепторы. Сыворотка от туникат и ниже по линии развития позвоночных, так же как и сыворотка от всех представителей линии развития членистоногих, не содержит измеримой РФТ-подобной активности. Обнаружение последней в свернувшейся крови у животных совпадает с появлением регулируемой по уровню давления сосудистой системой позвоночных. Этот факт рассматривается специалистами как указание на то, что функцией РФТ in vivo является репарация сосудистой выстилки.
Биохимия РФТ. Человеческий РФТ был очищен до гомогенного состояния и охарактеризован. Он представляет собой белок основного характера, термостабильный (100 ℃), водорастворимый. При электрофорезе выявляют несколько фракций, из которых две главные: РФТ-I (молекулярная масса 31——35 кд) и РФТ-II (молекулярная масса 28—32 кд). Обе эти главные фракции представляют собой гликопротеиды, отличающиеся своим углеводным компонентом. Редуцирующие агенты инактивируют РФТ-I и РФТ-П и диссоциируют их на субъединицы меньшей молекулярной массы.
Ген РФТ. Две независимые друг от друга группы исследователей в середине 1983 г. сообщили о том, что вирус саркомы обезьян, по-видимому, приобрел свой трансформирующий ген (v-sis) за счет гена или генов, кодирующих РФТ. Белковые продукты этих генов гомологичны. Таким образом, клеточный гомолог v-sis (т. е. c-sis) может рассматриваться как структурный ген для РФТ. Человеческий ген c-sis является однокопийным геном, который был изолирован молекулярным клонированием и отнесен по его локализации к хромосоме 22. Ген c-sis состоит из 12 000 нуклеотидных оснований с пятью участками, гомологичными v-sis, прерываемыми четырьмя интронами (некодируюшими участками генома).
Рецепторы РФТ. Рецепторы РФТ обнаружены в диплоидных человеческих фибробластах, клетках ЗТЗ, клетках артериальных гладких мышц и других клетках соединительной ткани у обезьян, мышей, крыс и кур. Эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки и лимфоциты периферической крови не связывали 12ь1-РФТ. Спектр химического связывания РФТ хорошо совпадает с митогенетическим спектром его действия. Содержание реиеп-
торов '- чувствительных клетках колеблется от 40 000 до 400 000 на клетку.
Химически неродственные ростовые факторы (ЭФР, инсулин, MSA) и другие специфические для кровяных пластинок белки ни тормозят, ни способствуют образованию комплексов РФТ-ре- цептор. Курьезно, но обратное неверно. РФТ тормозит связывание 1251-ЭФР и инсулина рецепторами на поверхности фибробластов, однако способствует усиленному присоединению человеческого соматомедина. Рецептором РФТ является мембранный белок с молекулярной массой 164——185 кд. Растительные лектины препятствуют связыванию РФТ, что говорит о содержании в рецепторах РФТ N-ацетил глюкоза мина и галактозы. Вслед за образованием комплекса РФТ-рецептор активируется мембранная тирозинспецифическая протеинкиназа. Это важный факт для понимания родства вирусного саркомного гена обезьян и гена РФТ, учитывая, что продуктом трансляции большинства онкогенов являются онкобелки, обладающие протеинкиназной активностью, причем именно тирозинспецифической. Более того, по-видимому, сам рецептор РФТ является субстратом для этой киназы и способен к аутофосфорилированию, как и в случае с рецептором ЭФР.
Установлено, что период полураспада (Т '/2) РФТ в клетке составляет менее 1 ч, в то время как индуцируемое РФТ компетентное состояние исчезает со скоростью (Т %) 10—20 ч. Следовательно, длительность индуцируемого РФТ компетентного состояния клетки не отражает длительность взаимодействия РФТ с клеткой. Установлено, что между 30 мин и 3 ч после добавления РФТ к культуральной среде чувствительные клетки накапливают сравнительно стабильный внутриклеточный сигнал, который опосредует ответ на РФТ.
Исследование с метаболическими ингибиторами показало, что для генерации этого внутриклеточного си гнала требуется de novo синтез РНК.
Роль РФТ в канцерогенезе. Предполагается, что РФТ синтезируется в мегакариоцитах костного мозга, которые являются родительскими клетками тромбоцитов. Генетические исследования РФТ позволили заключить, что некоторые соединительнотканные неоплазмы возникают результате синтеза и секреции РФТ клетками, которые в норме чувствительны к этому фактору роста. Такая «паракринная» продукция могла бы генерировать само- поддерживающуюся, аутомитогенную клеточную массу, согласно схеме J. De La гео и G. Todaro (1978). Было продемонстрировано, что 6 человеческих саркомных клеточных линий и 3 из 5 человеческих глиобластомных клеточных линий транскрибируют клеточный ген c-sis, тогда как этот ген «молчал» в нормальных фибробластах. Было показано, что человеческая остеосаркомная клеточная линия секретирует белок, который стимулирует рост нормальных фибробластов и глиальных клеток. Продуцируемый остеосаркомными клетками митоген «конкурировал» с 1Й1-РФТ
человека за рецепторы и реагировал с антителами против аутентичного РФТ.
Однако соединительнотканная неоплазия отражает нечто большее, чем аутомитогенный ответ на РФТ. Утрата потребности роста в РФТ является необходимой, но недостаточной ступенью в злокачественной трансформации фибробластов. РФТ не стимулирует рост, например, в метил целлюлозной или мягкоагаровой суспензии, что присуще трансформации соединительной ткани. К тому же не все саркомы экспрессируют гены c-sis или v-sis. Известно также, что онкогены, не идентичные РФТ, также индуцируют саркомы. Тем не менее начиная с этого времени роль РФТ следует оценивать при любом пролиферативном расстройстве, связанном с экспрессией гена c-sis. Последний локализуется в той области хромосомы 22, которая реципрокно транслоцируется с с-abl (хромосома 9) на филадельфийской хромосоме. Человеческая Т-клеточка я линия (HUT102), которая продуцирует ретровирус человеческой Т-клеточной лейкемии, HTLV, экспрессирует c-sis. С этой точки зрения было бы интересно выяснить, участвует ли РФТ в патологии хронической миелоидной лейкемии и грибовидного микоза, которые связаны с филадельфийской хромосомой и HTLV соответственно.
Итоги и перспективы открытия связи РФТ с онкобелком саркомного вируса. РФТ является соединительнотканным митогеном, который был связан с сывороткой свернувшейся крови в процессе эволюции животного мира по крайней мере уже 300 000 000 лет. Он регулирует экспрессию «ранних генов» клеточного цикла в нормальных фибробластах. Индукция указанных «ранних генов» предшествует стимуляции тирозинспецифической киназы. Предполагаемый структурный ген для РФТ был приобретен (захвачен) каким-то остротранс- формируютим ретровирусом и регулярно экспрессируется во многих соединительнотканных опухолях.
Дальнейшая работа должна показать: 1) придает ли образование РФТ опухолевыми клетками пролиферативные преимущества этим клеткам; 2) опосредуют ли тирозинспецифические фосфорилирования индукцию «ранних генов» клеточного цикла ростовым фактором тромбоцитов; 3) играют ли продукты ранних генов клеточного цикла какую-либо функциональную роль в 10—12-часовой цепи событий, которые кульминируются в репликативном синтезе ДНК и клеточном делении.
Пример с РФТ можно рассматривать в качестве образца функционирования других вирусных и невирусных онкогенов, а также их клеточных гомологов. Некоторые из этих генов могли бы действовать в начале митогенного «каскада» путем индукции образования факторов аутомитогенного роста; другие — функционировать внутри «каскада», стимулируя процессы тирозинспецифического фосфорилирования; третьи — быть мутировавшими или перестроенными гомологами «ранних генов» клеточного цикла,
чья экспрессия в нормальных условиях модулируется экстрацеллюлярными факторами роста.
Открытие родства и связи онкобелков с РФТ, равно как и кодирующих их генов, рождает много, с одной стороны, интересных конструктивных мыслей, а с другой — малообоснованных, хотя и смелых спекуляций.
Можно надеяться, что дальнейшие исследования в этой области будут способствовать более глубокому и полному пониманию всей цепи реакций и процессов молекулярного механизма онкогенеза.
Трансформирующие факторы роста (ТФР). В последнее время отдельными авторами делаются попытки ввести в концепцию онкогенов также и трансформирующие факторы роста — ТФР (Голубев А. Г., Дильман В. М., 1982; Днльман В. М., 1983]. В настоящее время известно довольно много ростовых факторов (РФ): эпидермальный (ЭФР), фибробластов (ФРФ), нервов (ФРН), мультипликационный (МФР), соматомедины, тромбоцитарный (РФТ). Все эти факторы по характеру действия напоминают инсулин, стимулируя перенос глюкозы и аминокислот. Полагают, что факторы роста имеют отношение к контролю деления клеток.
Любопытно, что при добавлении ТФР в культуру нормальных фибробластов последние приобретают фенотип трансформированных клеток. Однако это действие ТФР обратимо, и при удалении их из среды клетки возвращаются к исходному нормальному состоянию. Естественно, что описанный феномен индукции трансформированного состояния трансформирующими факторами роста наводил на мысль о подобии последних онкобелкам. Известно, что М. Sporn и G. Todaro (1980) высказали мысль о роли продуцируемых раковой клеткой ТФР в качестве элементов аутокринной гормональной секреции. В. М. Дильман (1983) пошел еще дальше в развитии этой мысли, полагая, что ТФР или внутренний инсули- низируюихий фактор, т. е. сам онкобелок, обеспечивает усиление транспорта глюкозы н аминокислот (а также других вешеств) в клетку, что, в свою очередь, обеспечивает потребности клетки в энергетических и пластических материалах. Этим самым В. М. Дильман как бы заложил метаболическую базу под концепцию онкогенов, объясняя, каким образом изменения метаболизма приводят к делению клеток. Он рассуждал далее следующим образом: усиление поступления в клетку глюкозы вызывает снижение в ней концентрации цАМФ. Последнее сопряжено с усилением синтеза холестерина и через него со стимуляцией синтеза ДНК. В результате этой цепи событий клетка делится. В онкометаболической схеме В. М. Дильмана в центре событий находится поток глюкозы в клетку. В схеме предусматривается, что «каскадный сигнал деления» индуцируется потоком глюкозы [Дильман В. М., 1983]. В данном случае, как нам представляется, можно говорить о новой модели метаболической гипотезы рака.
Однако, как и классическая первая (Варбурга), она в своем построении лишена первичного побуждающего импульса.
Нам кажется, что в оценке роли ТФР в индукции роста и неумеренной пролиферации возможны заблуждения в том смысле, что вторичные процессы могут быть приняты за первичные. Мы имеем в виду следующее. Как правило, действительно все ТФР обладают и нсул и неподобным действием. Это проявляется прежде всего в эффективной стимуляции энергетического и пластического обменов клеток путем усиления потока в клетку питательных материалов, являющихся одними из основных условий обеспечения усиленного роста. Однако совершенно очевидно, что эти эффекты ТФР имеют вторичный, подсобный характер и не имеют отношения к первичной индукции роста. Непервнчная роль ТФР в онкогенезе фактически признается и самим В. М. Дильманом, когда он； говоря о происхождении этих факторов роста, высказывает предположение, что «онкобелок дерепрессирует продукцию ТФР, которая в нормальной клетке заблокирована до минимальных величин» [Дильман В. М., 1983|. Кроме того, В. М. Дильман полагает, что онкоген обеспечивает через ТФР усиление метаболических и пластических процессов в клетке.
Следовательно, сначала все-таки онкоген——онкобелок и лишь затем ТФР.
Таким образом, ТФР находят место в схеме онкогенеза В. М. Дильмана, но на более позднем этапе процесса, чем онкоген—онкобелок. Автор предлагает такую общую схему единого патогенеза рака: онкоген—трансформирующий белок — ТФР — метаболизм трансформированной клетки. К сожалению, пока не известно каких-либо экспериментальных подтверждений такой схемы.
Если первую часть логического построения В. М. Дильмана (онкоген—онкобелок) можно считать теоретически обоснованной и современной наукой экспериментально доказанной, то два последних звена нуждаются пока в доказательстве. То, что ТФР существуют — сомнений не вызывает, но каковы их функции в раковой клетке и какова роль в развитии опухолевого процесса, пока далеко не ясно. Во всяком случае, если они и участвуют в онкогенезе, то не в его начале. Что же касается метаболических особенностей неоплазм, то естественнее всего, как нам кажется, рассматривать их не как следствие направленного действия ТФР, а как результат и проявление мало- или недифференцированного состояния быстропролиферируюших клеток, не успевающих (вследствие непрерывного деления) дифференцироваться и развить специализированные функции и субклеточные структуры, необходимые для нормального окислительного обмена со всеми его функциональными следствиями. Это сближает в метаболическом и функциональном плане раковые клетки с эмбриональными, что и отмечают исследователи, особенно по характеристикам энергетического обмена.
Тем не менее уже сегодня ясно, что ТФР заслуживают пристального внимания и, по-видимому, они как-то связаны с процессом онкогенеза. В пользу этого говорит, в частности, исследование активации эпидермальным фактором роста фосфорилирования среднего Т-антигена вируса полиомы [Sefton В. et al., 1982]. Было установлено, что ЭФР стимулирует фосфорилирование среднего Т-антигена вируса полиомы. Известно, что средний Т-антиген является главным трансформирующим белком этого вируса, ответственным за индукцию фенотипа трансформации клеток. Субфракция среднего Т-антигена ассоциирована с протеинкиназной активностью, которая фосфорилирует средний Т-антиген по тирозину. Существует строгая корреляция между уровнем этой киназной активности и степенью экспрессии трансформированного фенотипа клеток. Факт стимуляции эпидермальным фактором роста фосфорилирования среднего Т-антигена указывает на возможность того, что митогенные факторы регулируют эту фосфорилирующую активность и, следовательно, онкогенный эффект. Здесь следует напомнить исследование, в котором было показано, что рр60с src, клеточный гомолог трансформирующего белка (онкобелка) птичьего саркомного вируса, находится в тесной ассоциации с субфракцией среднего Т-антигена, указывая этим на то, что фосфорилирование тирозина среднего Т-антигена опосредуется белком рр60с s , т. е. тирозинкиназой [Courtneidge S.. Smith А., 1983].
Участие в разработке проблемы ТФР таких крупных исследователей, как G. Todaro, позволяет надеяться, что природа и функция этих интересных и биологически важных элементов живых систем будут установлены в ближайшем будущем, что и позволит определить их точное значение и местоположение в процессе туморогенеза. При нынешнем уровне знаний сделать это трудно.
К исходу 1984 г. положение в области изучения ростовых (РФ), а в известных условиях — трансформирующих факторов сложилось следующим образом [Heldin С.-H., Westermark В., 1984].
Принимается, что РФ, функционирующие в малигнизированной клетке как трансформирующие белки, кодируются онкогенами или, альтернативно, их экспрессия находится под контролем онкогенов. В ряде случаев РФ функционально выступают как онкобелки и являются результатом прямого считывания генетической информации онкогенов. РФ рассматриваются как обязательное звено в цепи событий, обеспечивающих клеточное деление и мультипликацию клеток. В нормальных физиологических условиях РФ поступают в клетку извне, что обусловливает зависимость нормальных клеток от РФ добавляемой сыворотки; трансформированные клетки отличаются независимостью от экзогенных РФ благодаря конститутивной способности клеток производить РФ. Автономный рост неопластических клеток объясняется наличием в них всех элементов биологической системы пролиферации: онкогена, рецепторов РФ, которые служат трансдукторами экстра-
или интрацеллюлярного сигнала к ДНК ядра и, возможно, цепью других членов сигнальной системы. В ряде известных случаев понятие фактора роста непосредственно смыкается и отождествляется с продуктом трансляции онкогенов (РФТ и др.). Таким образом, в свете новых данных РФ предстают как трансформирующие белки.
В настоящее время выделяют 3 основные группы Р'Ф: семейство РФТ, семейство ЭФР и семейство инсулина. Семейство РФТ включает: сам РФТ, остеосаркомный РФ, фибробластный РФ, трансформирующий белок вируса саркомы обезьян. Семейство ЭФР включает: сам ЭФР, трансформирующий РФ (ТРФ-а) Семейство инсулина состоит из: инсулина, инсулиноподобного РФ (ИПРФ I), или соматомедина С, инсулиноподобного РФ 11 (ИПРФ 11), активности, стимулирующей мультипликацию (АСМ).
Как правило, эти вещества уже достаточно хорошо охарактеризованы, определены их молекулярная масса, молекулярная структура, последовательность аминокислот. В некоторых случаях установлено родство между отдельными РФ. Например, показана значительная гомология В-цепи РФТ с онко'белком — продуктом экспрессии вируса саркомы обезьян, ТРФ-а — с ЭФР; ИПРФ 1 — с проинсулином, АСМ — с ИПРФ 11 и т. д.
Можно сказать, что все перечисленные выше факторы функционально аналогичны РФТ. Это, в свою очередь, подразумевает участие в большинстве опухолей человека c-sis, его активацию. Не случайны в свете этих данных частые находки иРНК c：sis в клеточных линиях сарком и глиом человека.
В некоторых случаях было показано, что для трансформации клеток необходимо совместное действие двух РФ. Так, трансформирующая активность клеток, инфицированных MuSV, обусловлена, по-видимому, совместным действием двух факторов:
ЭФР-подобным (ТФР-а).
ТРФ-0, который в комбинации с ЭФР или ТРФ-а индуцирует фенотипическую трансформацию, не обладая, однако, митогенной активностью сам по себе.
Существенным моментом в понимании функции и биологии РФ является то обстоятельство, что существует структурная связь между рецепторами РФ и онкогенами. Так, рецептор ЭФР имеет значительную аналогию в последовательности аминокислот с р65ег в, трансформирующим белком вируса птичьего эритробластоза. Около половины секвенированных пептидов рецептора ЭФР имели 90 % гомологии с предсказанной последовательностью р65ег . По-видимому, родоначальник вируса птичьего эритробластоза приобрел часть гена рецептора ЭФР, который кодирует внутренний домен и трансмембранную часть рецептора, но не внешний домен, содержащий область связывания ЭФР. Иными словами, р65сгЬ в соответствует усеченному рецептору ЭФР. Отсутствие регуляторного связывающего ЭФР домена может сопровождаться конституционной активацией эффекторного домена.
В то же время между РФ и продуктами онкогенов существует не только структурная, но и функциональная связь. Это положение подкрепляется наблюдениями, согласно которым несколько рецепторов РФ (РФТ, ЭРФ, инсулин, ИПРФ) и трансформирующих белков онкогенов (src, yes, fps, fes, ros, abl, fgr) обладают тирозинкиназной активностью. Таким образом, тирозинкиназная активность, слабая в нормальных клетках (менее 0,1 % от общего связываемого белком фосфора приходится на тирозин), в неопластических ассоциирована с клеточной пролиферацией, индуцированной как РФ, так и онкогенными ретровирусами. Киназные активности рецепторов различных РФ являются, по-видимому, интегральными частями рецепторных молекул. Их активация ведет к аутофосфорилированию, а также к фосфорилированию тирозина других клеточных субстратов.
Между индуцированной ростовыми факторами внутриклеточной сигнальной системой и стимуляцией синтеза ДНК существует, по-видимому, непосредственная связь. Митогенетические сигналы, индуцируемые РФ, передаются от рецепторов далее в клетку и доходят до ДНК. Предполагают, что определенные активности клеточных онкогенов участвуют в постреиепторном пути митогенных сигналов. По имеющимся данным, в этой функции участвует и ген с-тус. Добавление РФТ к стационарным клеткам BALB/c ЗТЗ вызывало уже через 2 ч увеличение в несколько раз экспрессии с-тус иРНК, как это имело место, например, при добавлении митогенов к мышиным лимфоцитам. Поскольку продукт гена тус является ядерным белком, функцию его можно усматривать в регуляции экспрессии генетической программы, контролирующей клеточную пролиферацию. Известно, что ген тус, трансдуцированный несколькими ретровирусами, трансформирует широкое разнообразие клеток-мишеней различного гистогенети- ческого происхождения. Амплификация и аберрантная экспрессия гена с-тус наблюдалась в таких злокачественных новообразованиях, как лимфома Беркитта и мелкоклеточная карцинома легкого.
Предполагают, что пострецепторные пути нескольких митогенов конвергируют в регуляции экспрессии гена тус и что это обстоятельство может объяснять большое разнообразие неоплазм с ненормальной экспрессией этого конкретного онкогена.
Если принять, что фосфорилирование тирозина является важным для трансмиссии митогенного сигнала РФ, то фосфорилирование некоторых ключевых цитоплазматических белков можно рассматривать как первую внутриклеточную ступень процесса пролиферации или трансформации. Активные поиски подобных субстратов уже начались. Так, были идентифицированы определенные протеины, которые фосфорилируются после стимуляции интактных клеток РФТ. Правда, функция их пока не выяснена.
Гипотезируя далее, можно принять, что внутриклеточная передающая митогенные сигналы система, состыкованная с рецепторами РФ, представляет собой цепь клеточных событий, вклю-
чаюших посттранскрипционные модификации специфических белков и контролируемую экспрессию специфических генов. Принимая это, можно предполагать, что неконтролируемая экспрессия любого регуляторного компонента в указанной цепи могла бы вести к стимуляции клеточной пролиферации. Поэтому гены для белков, участвующих во внутриклеточной сигнальной системе, передающей митогенные импульсы, могли бы действовать как онкогены в случае, если они неадекватно активируются или экспрессируются в избыточном количестве или с-тус может составлять часть такой индуцируемой ростовыми факторами внутриклеточной сигнальной системы. Не исключено, что клеточные гомологи и других онкогенов входят в качестве пока не идентифицированных членов связанной с ростовыми факторами внутриклеточной сигнальной системы.
Интересным аспектом неопластической трансформации является то, что потребность в нескольких комплементарных онкогенах [Land Н. et al., 1983| имеет аналогию в нормальной репликации, индуцируемой ростовыми факторами. Так, определенные клетки, например BALB/c ЗТЗ, требуют согласованного действия факторов компетенции и прогрессии для инициации синтеза ДНК [Pledger W. et al., 1977; Stiles C. et al., 1979].
Ряд наблюдений связывают различные онкогены, действующие на определенных этапах трансформации, с ростовыми факторами, действующими на различных уровнях инициации и передачи митогенного сигнала. Эти связи включают структурные и функциональные сходства на уровне рецепторов ростовых факторов и возможное участие онкогена в индуцированной ими внутриклеточной сигнальной системе. Было показано, что экспрессия определенных онкогенов вызывает эндогенное образование ростовых факторов, которые затем могут стимулировать продуцирующую клетку по аутокринному типу.
Все сказанное в целом указывает на то, что эти принципы могут иметь универсальное приложение в понимании механизма индукции пролиферации клеток. Любой регуляторный компонент в цепи событий,* связанных с действием нормальных ростовых факторов, может проявить онкогенный потенциал в случае его неадекватной экспрессии или активации.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Практически все испытанные представители многоклеточных, в том числе позвоночные и человек, содержат специфические клеточные потенциальные онкогены (протоонкогены), изменение структуры или усиление экспрессии которых может вести к инициации туморогенеза и поддержанию неопластического роста. Первыми были обнаружены трансдукция и превращение клеточных генов в онкогены ретровирусами. Затем возможность появления активных клеточных онкогенов была показана при
инсерционном мутагенезе ретровирусами и путем генного переноса, опосредуемого ДНК.
Как пишет J. Bishop (1983), логика эволюции не позволила бы сохраниться исключительно только вредоносным генам. Могучие силы отбора должны были действовать, чтобы обеспечить консерватизм протоонкогенов в ходе создания широкого разнообразия многоклеточных форм животного мира. Однако нам неизвестно, почему эти гены закреплялись в эволюции и как это конкретно происходило, ибо пока мы не знаем биологическую функцию клеточных онкогенов. Исследователи знают лишь то, что они экспрессируются в ряде тканей и что они как-то участвуют в росте, дифференциации и развитии. Мало известно и об их биохимических функциях. Возможно, что кодируемые клеточными протоонкогенами белки являются компонентами разветвленной всеохватывающей сети, которая контролирует рост индивидуальных клеток в ходе дифференциации.
Функция клеточных онкогенов в канцерогенезе также не вполне ясна. Трансдукция этих генов ретровирусами дала 20 различных активированных протоонкогенов. Все ли они участвуют в онкогенезе? Принимается, что по крайней мере некоторые из идентифицированных протоонкогенов участвуют в развитии злокачественных опухолей. Однако до сих пор нет единого мнения о механизме этого участия: играет ли роль увеличение количества генного продукта или качественно меняются структура и функция клеточных онкогенов. Располагая современными данными, можно успешно доказывать и то и другое.
В последнее время серьезно встал новый вопрос — достаточен ли для осуществления неопластической трансформации один онкоген или нужен набор их, так называемый «каскад»?
Ведущие теоретики-онкологи все больше склоняются к последнему варианту. Может быть так, что онкогены специализированы, одни осуществляют инициацию туморогенеза, другие — поддержание трансформированного состояния. Или можно себе представить, что «дозный» принцип действия канцерогенов обеспечивает инициацию, а качественные изменения генов — поддержание состояния неоплазии. Вопросов пока больше, чем ответов. И потребуются время и интенсивная работа для того, чтобы на них ответить.
Подведем некоторые итоги этого раздела. Создается впечатление, что в развитии концепции онкогенов складывается ситуация, напоминающая в некоторых отношениях положение, уже давно существующее в теории химического канцерогенеза. Она заключается в том, что в обоих случаях примерно половина общего пути процесса остается нерасшифрованной. Это свидетельствует о большой глубине нашего незнания явления при всей значительности наблюдаемого прогресса. Для химического канцерогенеза — это часть между образующимися аддуктами ДНК и опухолью; для действия онкогенов, наоборот, это первая часть процесса канцеро-
генеза, до включения известных ныне онкогенов. Новейшие данные, полученные уже не на «полутрансформированных» (пре- неопластических) клеточных культурах мыи!иных фибробластов N1H ЗТЗ, а на интактных культивированных фибробластах крыс, продемонстрировали, что большинство известных онкогенов, в первую очередь семейства ras, являются, так сказать, конечными, завершающими процесс трансформации онкогенами, но не инициирующими его. Можно думать, что усилия исследователей сосредоточатся теперь на поисках онкогенов начала пути трансформации, т. е. осуществляющих инициацию и первые этапы процесса. Опыты с полутрансформированными клетками N1H ЗТЗ хотя и облегчили открытие клеточных и опухолевых онкогенов, но в то же время создали иллюзию универсального действия единичных онкогенов, т. е. способности отдельных онкогенов осуществлять весь процесс трансформации от начала до конца. Это, по-видимому, в действительности не так. Процесс малигни- зации ——многостадийный процесс, и он, вероятно, требует для своего осуществления целую цепь последовательно действующих онкогенов, т. е. их «каскад».
ГЛАВА 5
ОНКОГЕНЫ ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ
Как уже указывалось в предыдущих главах, открытие вирусных онкогенов определило главное направление в изучении механизмов трансформации клеток. При этом прежде всего предстояло ответить на вопрос: что происходит с вирусассоциированными клеточными онкогенами (протоонкогенами) в процессе превращения нормальной клетки в опухолевую?
Протоонкогены — определенные локусы клеточной ДНК (с-опс), способные в результате трансдукции (захвата) в ретровирусный геном превращаться в вирусные онкогены или, после активации, в клеточные трансформирующие гены [Bishop J., 1982, 1983; Weinberg R., 1983]. В экспериментах по трансфекции неактивированные протоонкогены оказались неспособными трансформировать N1H ЗТЗ и другие клетки-мишени [Newbold R. et al., 1977, 1979, 1983; Chang E. et al., 1980; Blair D. et al., 1981; Land H. et al., 1983; Newmark P., 1983|.
В исследованиях последних лет была открыта 2-я группа онкогенов, ассоциированных с клеткой, которые не имеют аналогов среди опс-генов известных на сегодняшний день ретровирусов животных [Diamond A. et al., 1983; Eva A. et al., 1983; Goubin G. et al., 1983; Hall A. et al., 1983; Murray M. et al., I983|. Эти гены получили название клеточных трансформирующих генов, или просто онкогенов. Клеточные трансформирующие гены — это локусы ДНК, которые в результате генетических перестроек или
иных активирующих событий приобретают способность трансформировать NIH ЗТЗ и некоторые другие реципиентные клетки. Поскольку нефункционируюшие аналоги (аллели) указанных генов в нормальных клетках по ряду характеристик отличаются от «работающих» в экспериментах по трансфекции, их деятельное состояние стали связывать с активацией, включением [Reddy Е. et al., 1982; Santos Е. et al., 1982; Capon D. et al., 1983a, 1983b; Land H. et al., 1983a],
Первоначальные исследования в этой области были направлены на определение молекулярных детерминант (прежде всего нуклеиновых кислот и ферментов), ответственных за трансформацию клеток, подвергавшихся воздействию канцерогенных веществ [Weinberg R., 1983]. Схема подобных экспериментов была простой. Образны ДНК выделяли из опухолей индуцированных животных химическими канцерогенами, например MX или ДМБА, или, в других случаях, из клеток, трансформированных in vitro этими же веществами. Полученные образцы ДНК вводили в соответствующие нетрансформированные реципиентные культуры и монослои реципиентных культур просматривали на наличие фокусов роста трансформированных клеток. Появление трансформантов свидетельствовало о присутствии действующей доминантной трансформирующей информации в испытуемых образцах клеточной донорской ДНК [Weinberg R., 1982].
Эксперименты по переносу генов (трансфекции) показали, что образцы ДНК определенных типов химически трансформированных клеток несут в своем составе трансформирующие последовательности, онкогены [Shin С. et а!., 1979, 1981; Cooper G., 1980; Weinberg R., 1982; Cairns J.. Logan J., 1983]. Существование подобных трансформирующих последовательностей, выявляемых в экспериментах по трансфекции, в последующем было продемонстрировано в ДНК большого количества различных опухолей, биопсийного материала человека и опухолевых клеточных линий [Князев П. Г. и др., 1980, 1984; Moelling К. et al., 1980; Cooper G., 1982; Colgfarb M. et al., 1982; Lane M. et al., 1982; Parada L. et al., 1982; Pulciani S. et al., 1982; Weinberg R., 1982; Capon D. et al.. 1983; Diamond A., 1983; Eva A. et al., 1983; Hall A. et al., 1983; McCoy M. et al., 1983; Shimizu K. et al., 1983].
Большинство исследователей с целью введения в клетку чужеродных образцов ДНК в настоящее время используют кальцийфосфатную технику, разработанную F. Graham, Е. Van Der Eb (1973). Стерильные кальциевые преципитаты ДНК более эффективно захватываются реципиентными клетками. Дальнейшая судьба чужеродной ДНК, ее транспорт и проникновение в ядро изучены слабо. Известно, что примерно 2 % введенной ДНК определенное время персистирует в трансфецированных клетках; этого, очевидно, оказывается достаточно для процесса интеграции экзогенной ДНК с геномом реципиентных клеток [Hill М., Huppert J., I970J. Использование кальций-фосфатной техники введения пре-
паратов ДНК в клетку существенно повысило эффективность процедуры трансфекции. Было показано, что эффективность трансфекции возрастает с улучшением принципов селекции трансформантов.
Значительное влияние на результаты трансфекции как метода обнаружения трансформирующих генов оказывают сами реци- пиентные клетки. В большинстве экспериментов для определения трансформирующих генов в ДНК опухолей человека в качестве реципиентных клеток использовали линию пренеопластических клеток мышей NIH ЗТЗ. Эти клетки анэуплоидны, постоянно пролиферируют и, в отличие от нормальных диплоидных фибробластов, имеющих ограниченные сроки культивирования и количество пассажей, обладают строго выраженной зависимостью пролиферации от субстрата роста (подложки) и характеризуются контактным торможением роста. Более того, у этих клеток обнаружена исключительно высокая чувствительность к восприятию в собственный геном и фиксации чужеродной ДНК- Появление фокусов трансформированных клеток в монослое, а также субстратнезави- симую пролиферацию клеток N1H ЗТЗ в полужидком агаре стали использовать в качестве критерия успешной трансфекции. Тем не менее по непонятным причинам только 10—20 % испытуемых образцов ДНК из опухолей и опухолевых клеточных линий оказываются способными индуцировать трансформацию клеток N1H ЗТЗ в экспериментах по трансфекции [Pulciani S. et al., 1982; Land H. et al., 1983].
Следует особо отметить, что высокомолекулярные образцы ДНК из нормальных клеток птиц и человека (контроли) не способны вызывать трансформацию клеток NIH ЗТЗ. Однако эти же, но фрагментированные (размер фрагментов > 0,5—5,0 т. п. о.) препараты ДНК лимфоцитов кур и человека индуцируют, правда, с очень низкой частотой (< 0,002 очага трансформации/мкг ДНК/Ю6 клеток) злокачественную трансформацию реципиентной культуры [Cooper G., Lane М.-А., 1984; Schafer R. et al., 1984]. Эти данные свидетельствуют о том, что в принципе в нормальной клетке существуют гены, способные индуцировать неопластическую трансформацию.
Молекулярный анализ трансформантов клеток NIH ЗТЗ, получаемых после трансфекции препаратами ДНК из опухолей человека, значительно упростился после открытия и выделения уникальных клонов умеренно повторяющихся последовательностей генома человека (семейство Alu, Kpn, BamH I). Наличие подобных последовательностей в ДНК трансформантов, определяемых гибридизацией соответствующих плазмид с ДНК реципиентных клеток, оказалось уникальным маркером переноса человеческой генетической информации (например, АIи-последовательностей) в геном мышиных клеток NIH ЗТЗ. Вероятность подобного события достаточно велика, поскольку в геноме человека примерно 5-105 умеренно повторяющихся Alu-последовательностей при-
ходится на единичные копии уникальных генов [Goldfarb М. et al , 1982]. Как правило, проводятся 2—3 последовательных цикла трансфекции клеток NIH ЗТЗ для того, чтобы удалить последовательности донорской ДНК, генетически не связанные с трансформирующими генами. Сохраняющиеся в 2——3 циклах трансфекции клеток NIH ЗТЗ последовательности могут быть использованы в дальнейшем как маркер для молекулярного клонирования уникального фрагмента донорской ДНК, который связан с трансформацией реципиентных клеток, т. е. включает клеточный онкоген [Goldfarb М. et al., 1982; Tabin С. et al., 1982].
Во многих типах неоплазм в процессе превращения нормальных клеток в опухолевые в структуре их ДНК формируются трансформирующие гены (онкогены). К числу подобных опухолей человека относятся карциномы мочевого пузыря, легкого, молочной железы, желудка, кишечника, поджелудочной железы, фибро- и рабдомиосаркомы, глиобластомы, нейробластомы и, наконец, неоплазмы различных гемопоэтических клеток. Предполагается, что онкогены, ассоциированные с указанными опухолями, играют ведущую роль в индукции и поддержании трансформированного фенотипа клеток, однако молекулярный механизм их участия в этих процессах все еще остается недостаточно ясным. Известные экспериментальные данные по трансфекции лишь демонстрируют, что онкогены опухолей человека могут трансформировать чужеродные клетки, в которые они были внесены при помощи техники переноса генов.
Несколько активных трансформирующих генов, гомологичных и негомологичных вирусассоциированным протоонкогенам, изолированы с помощью методики молекулярного клонирования.
КЛЕТОЧНЫЕ ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ ГЕНЫ (ОНКОГЕНЫ)ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА,РОДСТВЕННЫЕ ПРОТООНКОГЕНУ с-Ha-ras 1
Перечень опухолей человека и животных, связанных с активацией протоонкогена c-Ha-ras 1, представлен в табл. 14.
Из данных табл. 14 видно, что трансформирующий ген Ha-ras может быть обнаружен в ДНК широкого круга фенотипически различных неоплазм млекопитающих. Некоторые из перечисленных форм злокачественных новообразований широко распространены у человека и представляют серьезную опасность для жизни. К подобным неоплазмам прежде всего следует отнести рак легкого у мужчин и рак молочной железы у женщин. Частота возникновения указанных опухолей за последние годы не снизилась, а, напротив, оз росла.
В этой связи следует отметить, что и отдаленные результаты лечения данных групп больных (выживаемость) все еще неудовлетворительны [Блохин Н. Н., Напалков 11. П., 1982; Напалков Н. П. и др., 1982].
Клеточные трансформирующие гены человека и животных, родственные протоонкогену с-На-г as /
Гистотип опухоли или фенотип трансформированных клеток
Клеточная линия
Механизм активации
Литературный источник
Какой
кодон поврежден
Изменение нуклеотидов в значимом кодоне
Замена аминокислоты в белке р-21
Человек
Рак: мочевого пузыря
EJ/T24
12-й
1Т
「jiHf вал
D. Der и соавт.
легкого
или J 82
Hs-242
61-й
А—Т
глк)7*лей
(1982);
М. Goldfarb и соавт. (1982);
L. Parada и соавт. (1983); Е. Taparowsky и соавт. (1982).
Y. Yuasa
молочной железы
SK-BR-3
Ис 12-й
?
?
и соавт. (1983) П. Г Князев
Нейробластома
LAN 1
Не 12-й
?
?
и соавт.
(1984);
Ксенограф злокачест-
Ja-1
Не 12-й
?
?
R Schafer
венной меланомы
Спонтанная активация
—
12-й
J А
「лит асп
и соавт. (1984) Е. Santos
c-Ha-ras в процессе трансфекции NIH ЗТЗ-клеток
Животное
Аденокарциномы мо-
12-й
J А
гли-*глю
и соавт. (1983)
S. Sukumar
лочныч желез крыс
Buf/N. индуцированные метилнитрозомочевиной
Рак у кошек и мнию丸
и соавт. (1983)
A Balmain.
индуцированный MX или ДМБА
J. Paragnell (1983)
Первый трансформирующий ген человека был обнаружен и охарактеризован во вторичных трансформантах клеток NIH ЗТЗ, инфицированных и трансформированных препаратами ДНК, изолированными из клеточных линий рака мочевого пузыря EJ [Parada L. et al., 1982], Т24 [Goldfarb M. et al., 1982; Taparowsky E. et al., 1982] и J-82 [Dcr D. et al., 1982]. Позднее было установлено, что EJ, Т24 и некоторые другие опухолевые клеточные линии, например J-82, не представляют собой независимые клеточные линии [O'Toole С.' et al , 1983], а являются перекрестноконтаминированными. Характерной особенностью трансформирующих генов клеток опухолевых линий EJ и Т24 является то, что они в нескольких циклах трансфекции были устойчиво ассоциированы со специфическими для человеческой ДНК Alu-послс-
довательностями, причем каждый последующий цикл трансфекции значительно повышал эффективность трансформации клеток NIH ЗТЗ препаратом ДНК (препараты ДНК брали из фокусов трансформации последовательных циклов трансфекции). С помощью молекулярного клонирования в бактериофаге, где в качестве «зонда» использовались АIu-последовательности, присутствующие в качестве вставки в pBR-322 (проба BLUR-8), и последующего реклонирования BamH I фрагмента размером 6,6 т. п. о. в плазмиде pBR-322 трансформирующий ген был получен в «чистом виде». Последующий сравнительный анализ и сопоставление плазмид, несущих онкоген pEJ-6,6, а также онкоген рТ24, с уже известными вирусными онкогенами, позволили установить, что обнаруженные и изолированные человеческие онкогены принадлежат к типу трансформирующих генов, родственных c-Ha-ras 1 [Goldfarb М. et al., 1982; Parada L. et al., 1982; Ta pa rowsky E. et al., 1982].
Полностью генетический локус протоонкогена c-Ha-ras 1 (вирусспецифическая область, комплементарная v-Ha-ras-онко- гену) в донорских препаратах ДНК, а также первичных и вторичных трансформантах представлен рестрикционным Sac I-фрагментом размером 2,9 т. п. о. [Goldfarb М. et al., 1982; Reddy Е. et al , 1982]. При этом генетический локус c-Ha-ras 2 протоонкогена может быть выявлен в Sac 1-фрагменте размером 21,0 т. п. о. в «мягких» условиях гибридизации [Chang Е. et al., 1982].
Методом А. Махат и W. Gilbert (1977) были определены нуклеотидные последовательности онкогена Т24 [Reddy Е., 1983], в последующем методом гетеродуплексного анализа ——генетическая структура этого гена [Capon D. et al., 1983]. В нем были идентифицированы 4 кодирующие области (экзоны), которые разобщены тремя некодирующими последовательностями нуклеотидов——интронами [Ellis R. et al., 1980]. Каждая кодирующая область гена c-Ha-ras 1 рака мочевого пузыря человека содержит сигналы для сплайсинга иРНК онкогена, а'на З'-коние 4-го экзона имеет терминирующий кодон функционирования ДНК-зависимой РНК-полимеразы и сигнал полиаденирования иРНК [Chang Е. et al., 1982; Reddy Е. et al., 1982, 1984]. Клонированный из ДНК клеточной линии Т24 онкоген c-Ha-ras 1 трансформировал клетки NIH ЗТЗ с высокой эффективностью, в то время как его нормальная аллель из нормальных клеток плаценты человека в параллельных экспериментах по трансфекции была неактивна.
Лигирование протоонкогена c-Ha-ras 1 с сильным промотером также не приводило к его активированию, т. е. способности трансформировать клетки NIH ЗТЗ. По данным молекулярной гибридизации, трансфецированный протоонкоген c-Ha-ras 1 интегрировался в геном реципиентных клеток, при этом уровень экспрессии химерной структуры — протоонкогена с LTR — существенно возрастал. Эти эксперименты косвенно свидетельствовали о том, что активация онкогена ras не связана с повышением уровня
экспрессии его генетической информации и увеличением дозы онкобелка [Chang Е. et al., 1982].
Генетическое повреждение, ведущее к активации протоонкогена c-Ha-ras 1, т. е. проявлению его трансформирующих свойств в системе NIH ЗТЗ-клеток, как было установлено, связано с единичной точковой мутацией в 35-й позиции 1 -го экзона (а именно — заменой гуанозина на тимидин). Эта замена нуклеотидов в протоонкогене сопровождается, в свою очередь, изменением 12-го кодона ГГЦ на ГТЦ с замещением 12-й аминокислоты, глицина, на валин в продукте онкогена — белке p2l [Reddy Е. et al., 1982： Tabin С. et al., 1982; Taparowsky E. et al., 1982; Capon D. et al., 1983; Newmark P., 1983].
Интересно, что вирусные онкогены v-ras (онкоген вируса саркомы мышей штамм Харвея, происходящий из крысиного генома) и v-ras/bas (онкоген вируса саркомы мышей BALB/c) также содержат мутацию в 12-м кодоне для соответствующей аминокислоты белка р21. В этом случае 12-й кодон ГГА (для глицина) в протоонкогене c-Ha-ras крысиных клеток заменен на кодон АГА, кодирующий аргинин [Ellis R. et al., 1980; Sukumar S. et al., 1983].
Поскольку было установлено, что уровень экспрессии онкогена c-Ha-ras 1 в клетках рака мочевого пузыря незначительно отличается от такового в нормальных клетках человека, было выдвинуто предположение о том, что точковая мутация протоонкогена приводит к существенным структурно-конформационным изменениям онкобелка р21 семейства ras [Tabin С. et al., 1982J.
Генетическое повреждение протоонкогена c-Ha-ras 1 приводит при точковой мутации к замене единственного нуклеотида в 12-м кодоне. Это, в свою очередь, существенно изменяет конфигурацию кодируемого белка р21. Точковую мутацию, расположенную в 12-м кодоне, можно обнаружить при рестрикционном энзиматическом анализе структуры самого онкогена (меняются сайты рестрикции для эндонуклеаз Нра II, Msp I и Nae I). В соответствии с этими данными физическое картирование онкогенов, определение изменений их сайтов рестрикции при воздействии ряда эндонуклеаз после генетического повреждения стало важным и эффективным принципом выявления точковых мутаций или иных генетических перестроек при активации клеточных протоонкогенов в онкогены (клеточные трансформирующие гены).
Примером использования этого принципа при анализе человеческих онкогенов могут служить исследования ряда лабораторий, выявивших изменения в структуре клеточных протоонкогенов при малигнизации ткани [Князев П. Г. и др., 1984; Feinberg А. ei al., 1983; Yuasa Y. et al., 1983]. С помощью набора специфических рестриктаз Нра II, Msp I, Nae I, «узнающих» по изменению сайта рестрикции характер и место генетического повреждения [Reddy Е. et al., 1982], удалось определить как природу вовлеченного в процесс неоплазии онкогена, так и область генетического
повреждения. Это было осуществлено на примере трех злокачественных опухолей человека: рака молочной железы, нейробластомы, меланомы. Во всех трех опухолях был идентифицирован активированный клеточный ген c-Ha-ras 1 н установлено, что активация протоонкогена не связана с точковой мутацией в 12-м кодоне трансформирующих генов.
Эти примеры, как и многие другие аналогичные им и известные из литературы последних лет, демонстрируют эффективность комбинации современных молекулярно-биологических и генноинженерных методов в анализе молекулярного механизма неопластической трансформации клеток и тканей.
Наличие ферментов, регистрирующих точковую мутацию в 12-м кодоне трансформирующего гена Ha-ras для белка р21, открыло возможность проводить широкий скрининг подобных мутаций в образцах ДНК опухолей человека. Это попытались сделать, в частности, A. Feinberg и соавт. (1983). Они протестировали рестриктазами Нра II/Msp I и Nae I ДНК 29 опухолей человека, включая 19 первичных опухолевых тканей легких и 10 первичных карцином мочевого пузыря, на наличие точковой мутации, обнаруженной ранее в EJ ДНК. Поскольку ни в одном случае авторы не выявили подобной мутации, было выдвинуто предположение, что 12-й кодон в процессе естественного канцерогенеза у человека повреждается редко [Feinberg A. et al., 1983]. Эта работа, однако, не отрицает значения точковых мутаций в активации клеточных протоонкогенов вообще. Указанные авторы и другие исследователи отмечают, что в протоонкогене Ha-ras могут существовать другие кодоны, в которых точковые мутации приводят к активации и проявлению трансформирующих свойств онкогена Ha-ras в клетках NIH ЗТЗ.
Вскоре это предложение было подтверждено экспериментально. Примерно 10 % случайно отобранных карцином мочеиспускательного тракта человека содержат активный (в NIH ЗТЗ-системе) онкоген Ha-ras. Все образцы ДНК указанных опухолей содержали c-Ha-ras-локус, имеющий точковую мутацию в 61-м кодоне, что определено эндонуклеазой рестрикции BstN I [Fujita J. et al., 19841. Авторы полагают, что активация протоонкогена c-IIa-ras имеет место преимущественно в опухолях мочеиспускательного тракта человека.
К. Shimizu и соавт. (1983) предсказывают возможность существования, например, для c-Ki-ras 2-протоонкогена значительного числа «уязвимых» мест, способных «запускать» канцерогенез при участии этого онкогена.
Трансформирующий ген клеток рака легкого (опухолевая линия Hs-242) также оказался близкородственным протоонкогену c-Ha-ras [Yuasa Y. et al., 1983]. В этом случае генетическим повреждением, ответственным за трансформирующую активность белка р21, является точковая мутация во 2-м экзоне (61-й кодон), что сопровождается изменением Af Т в 61-м кодоне н соответ-
ствующей заменой 61-й аминокислоты, глутамина на лейцин, в белке р21. При этом 12-й кодон оставался неизмененным и был идентичен нормальной аллели протоонкогена c-Ha-ras 1 [Yuasa Y. et al., 1983]. О. Fasano и соавт. (1984) изучили роль точковых мутаций в активации клонированного протоонкогена человека c-Ha-ras 1 при бисульфитном мутагенезе. Авторы показали, что большинство мутаций не превращают протоонкоген в онкоген, однако мутации, приводящие к единичной замене аминокислот в положении 12, 13, 59 —61 кодируемого белка, активируют трансформирующий потенциал Ha-ras в отношении клеток N1H ЗТЗ.
Таким образом, единичная замена аминокислоты в 12-м или 61-м положении в молекуле белка р21, гю-видимому, может быть достаточной для индукции структурных, конформационных и функциональных изменений, приводящих к проявлению у белка р21 трансформирующих свойств [Lane М. et al., 1982; Reddy Е. et al., 1982].
Вскоре в исследованиях D. Stacey и Н. F. Kung (1984) были получены прямые данные, подтверждающие возможность злокачественной трансформации клеток NIH ЗТЗ при помощи микроинъекции в них онкобелка р21. Онкобелок р21 (продукт экспрессии онкогена EJ-c-Ha-ras 1) для этих опытов получен генно-инженерным методом в Escherichia coli. •
Shafer и соавт. (1984) провели скрининг трансформирующей активности препаратов ДНК ряда неоплазм человека в отношении клеток NIH ЗТЗ. Образцы ДНК изолировали из различных опухолей, включая меланомы, карциномы молочной железы, предстательной железы, желудка, нейробластомы и некоторых форм лейкозов. Из 24 препаратов ДНК только три (рак молочной железы — линия SK-BR-3, меланома ——гетеротрансплантат Ja-1 и нейробластома ——линия LA-N-I) с высокой эффективностью трансформировали клетки NIH ЗТЗ (рис. 11 —данные по раку молочной железы). В двух циклах трансфекции трансформирующий ген меланомы и нейробластомы был ассоциирован с Alu- последовательностями. Многократные попытки обнаружить Alu- последовательности в ДНК некоторых клонов первичных и вторичных трансформантов, возникающих от введения ДНК SK-BR-3, оказались безуспешными. Эти данные свидетельствуют о том, что не всегда трансформирующие гены ассоциированы с умеренно повторяющимися последовательностями семейства Alu [Князев П. Г. и др., 1984, Schafer R. et al., 1984].
В первичных и вторичных трансформантах клеток NIH ЗТЗ трех указанных образцов опухолевых ДНК был идентифицирован протоонкоген c-Ha-ras I [Князев П. Г. и др., 1984]. Трансформирующий ген c-Ha-ras 1 рака молочной железы, меланомы и нейробластомы в двух циклах трансфекции был представлен маркерным рестрикционным фрагментом Sac I размером 2,9 т. п. о. (рис. 12), дорожки 2 (контроль положительной трансфекции), 5, 8 и 10.
Рис. 11 Морфологическая характеристика пренеопластических клеток мышей NIH ЗТЗ до (а) и после (б, в) двух циклов трансфекции опухолевыми образцами ДНК.
а — реципиентиые клетки N1H ЗТЗ; б — первичные трансформанты клеток NIH ЗТЗ (клои SRSA I), индуцированные препаратом ДНК клеток рака молочиой железы человека, клеточная линия SK-BR-3; в — вторичные трансформанты клеток NIH ЗТЗ (клон MS-4). иидуцироваииые препаратом ДНК клеток SRSA-I. первичного цикла трансфекции. У в. 200.
Подобный фрагмент не выявлялся в геноме реципиентных NIH ЗТЗ-клеток (дорожка 3).
Как видно из результатов, представленных на рис. 12, протоонкогены c-Ha-ras рака мочевого пузыря, молочной железы, желудка, нейробластомы и меланомы человека существенно отличались друг от друга во фланкирующей (т. е. прилежащей к онкогену) области (см. рис. 12, дорожки 1, 4, 7, 9, 11, 12).
Sac 1-фрагменты донорских образцов ДНК рака мочевого пузыря и меланомы оказались идентичными (см. рис. 12, дорожки 1 и 4). Однако нуклеотидные последовательности генома опухолевых клеток человека в первичных трансформантах, возникающих от введения препаратов ДНК EJ, JA-1 (например, клоны клеток EJ-F5, JASA-3), отличаются друг от друга (см. рис. 12, дорожки 2 и 5).
Второй цикл трансфекции клеток NIH ЗТЗ сопровождался существенными изменениями структуры трансформирующего гена (см. рис. 12, дорожка 6). В препарате ДНК, изолированной из клона MJ-1, отмечено присутствие дополнительных (к 2,9 т. п. о.) вирусспецифических Sac 1-фрагментов размерами 3,4 и 21,0 т. п. о.
Рис. 12. Гибридизация Sac 1-фрагментов ДНК первичных н вторичных трансформантов клеток NIH ЗТЗ с c-Ha-ras 1 онкогеном (плазмида) pEJ 6,6.
1 — Sac 1 локус онкогена c-Ha-ras в EJ-клетках рака мочевого пузыря человека. Фрагмент размером 2.9 т. п. о. содержит последовательности, комплементарные v>Ha-ras- онкогеиу; 2 — ДНК первичных трансформантов EJ-F5, индуцируемых EJ ДНК; 3 — ДНК клеток NIH ЗТЗ, в данной постановке эксперимента проба pEJ 6.6 не выявляет вирусспецифические последовательности, комплементарные эндогенному мышиному с-На- ras-протоонкогену; 4 —— Sac I локус протооикогена c-Ha-ras 1 в ДНК JA-1 клеток злокачественной меланомы человека; 5 — ДНК первичных трансформантов JASA-3. индуцируемых ДНК JA-I; 6 — ДНК вторичных трансформантов MJ-I. возникающих от ДНК JA-I (все три фрагмента: 21 т. п. о., 3, 4 т. п. о. и 2,9 т. п. о. комплементарны v-Ha-ras. что определено пробой pBS-9; 7 — Sac 1-локус протоонкогена c-Ha-ras I в ДНК LA-N-I (клетки нейробластомы человека); 8 — ДНК первичных трансформантов LASA-1. индуцируемых ДНК LAN-1; 9—Sac I-локус протоонкогена c-Ha-ras I в ДНК SK-BR-3 (клетки рака молочной железы человека); 10 — ДНК первичных трансформантов» клон клеток SRSA 1, индуцируемых ДНК SK-BR-3; 11 — Sac I-локус протооикогена c-Ha-ras 1 в ДНК HVM (клетки нормальной слизистой оболочки желудка человека); 12 — Sac I-локус протооикогена c-Ha-ras 1 в ДНК Са VSt (клетка рака желудка человека). Стрелками обозначены Sac 1-фрагменты донорских препаратов ДНК, содержащих вирусспецифи- ческие последовательности, комплементарные онкогену v-Ha-ras 2,9 т п. о., и фланкирую щне последовательности, комплементарные трансформирующему гену EJ-c-Ha-ras 1 5,15 т. п. о. и 6,0 т. п. о. Локус протооикогена c-Ha-ras 2 в данной постановке эксперимента ие выявляется.
комплементарных v-Ha-ras (проба BS-9). Такие изменения, обнаруженные во втором цикле трансфекции клеток NIH ЗТЗ, воз； можно, отражают интеграцию в геном реципиентных клеток дополнительных копий онкогена. Дальнейший рестрикционный анализ показал, что указанные трансформирующие гены человека (c-Ha-ras 1) не содержали точковой мутации в 12-м кодоне.
Спонтанная активация клонированного протооикогена c-Ha- ras 1 была обнаружена в ходе экспериментов по трансфекции клеток NIH ЗТЗ препаратом ДНК плазмиды pBR-322 с вставкой нормальной аллели c-Ha-ras 1 ——оригинальное название протоонкогена c-has/bas (human.). В этом случае спонтанная активация была обусловлена заменой Г —► А все в том же 12-м кодоне c-Ha- ras 1 протооикогена для белка p21 [Santos Е. et al., 1983].
В 13 % случаев всех тестированных клеточных линий меланом человека онкогены семейства ras находились в активированном состоянии [Albino A. et al., 1984]. Авторы полагают, что активация Ha-ras происходит на поздних стадиях прогрессии опухолевых клеток и она не связана инициацией клеточной трансформации. Как показал анализ трансформирующей активности препаратов ДНК (5 образцов) из различных метастазов меланомы -одного и того же больного, лишь один препарат ДНК был способен
вызывать трансформацию клеток NIH ЗТЗ. В трансформантах удалось идентифицировать онкоген типа Ha-ras. На основании этих опытов авторы приходят к заключению о том, что активация онкогена ras не связана причинно с малигнизацией, а является лишь проявлением гетерогенности меланом человека.
Свойства и функции продукта активированного, а также нормального протоонкогена c-Ha-ras, изучены пока недостаточно полно. Однако известно, что белок р21 локализуется на внутренней поверхности цитоплазматических мембран, т. е. его клеточной мишенью, вероятно, являются белки цитоскелета и белки клеточных мембран, а именно рецепторы. По-видимому, р21, обладающий свойствами протеинкиназы, фосфорилирует рецептор для фактора роста — трансферрина, обеспечивая тем самым независимость клетки от внешних регуляторных сигналов и ростовых факторов [Cooper J. et al., 1984].
Помимо фосфорилирования клеточных мишеней, белок р21, в котором произошла замена в 12-м положении аминокислоты глицина на валин, подвергается аутофосфорилированию. Аутофосфорилирование происходит по аминокислоте треонину, располагающейся в 59-м положении. Нормальный р21 в этом положении содержит аминокислоту аланин и, соответственно, не способен к аутофосфорилированию. Значительное увеличение аутофосфорилирования онкобелка р21, по-видимому, определяет его биохимическую активность и трансформирующие свойства [Gibbs J. et al., 1984; McGrath et al., 1984|.
R. Wierenga и W. Hol (1983) сравнили последовательности 37 остатков аминокислот N-терминального конца белка р21 из нормальных клеток человека с последовательностью Ва0-участка структурно-родственных энзимов (например, р-гидроксибензоат гидроксилазы), связывающих, подобно р21 белкам, динуклеотиды. Этот анализ показал, что аминокислотные остатки позиций 5——33 белка р21 формируют гомологичный указанным белкам-ферментам РаР-участок, который выполняет существенную роль в связывании нуклеотидов или динуклеотидов. Авторы разработали трехмерную модель участка Ва0 белка р21, которая объясняет, почему глицин .-：12-м положении не может быть заменен другим остатком без нарушения способности трансформирующего белка связывать нуклеотиды.
Участками связывания дезоксигуанозинтрифосфатов или дезоксигуанозиндифосфатов (дГТФ или дГДФ) являются позиции 12—13 и 59—63 белка p21 [Fasano О. et al., 1984]. Следует отметить, что к белкам, обладающим высоким сродством к дГТФ и дГДФ, относятся также фактор элонгации, тубулин, трансдуцин и рецептор эукариотической аденилатциклазы. Однако наибольшее родство обнаружено между онкобелком р21 и фактором элонгации (50 % гомологии) [Leberman R., Eager U., 1984].
М. Gay и J. Walker (1983) подчеркивают, что аминокислотные последовательности, окружающие 12-ю позицию аминокислоты
в белке р21, имеют частичную гомологию с р-субъединицей митохондриальной АТФазы, и именно в той области полипептидной цепи, которая, вероятно, принимает участие в связывании нуклеотидов.
Дальнейшее уточнение ферментативных свойств онкобелка р21 показало, что активированный онкобелок, в дополнение к связыванию дГТФ и дГДФ, демонстрирует ГТФазную активность.
Вероятно, ГТФазная активность избирательно блокируется точковыми мутациями (например, в 12-м кодоне), приводящими к проявлению онкогенного потенциала онкобелка p21 [McCrath et al., 1984]. Получение генно-инженерными методами онкобелка р21 и его нормального гомолога в Е. coli позволило приступить к детальному изучению их ферментативных активностей и сопоставить влияние других биологически активных молекул, принимающих участие в регуляции роста и дифференцировки клеток, на проявление трансформирующего действия онкобелка. Т. Kakunage и J. Feramisco (1984) установили, что эпидермальный фактор роста существенно стимулирует обе ферментативные функции онкобелка р21, а именно: его связывание с дГТФ и фосфорилирование онкобелком собственной аминокислоты треонина, а также рецепторов клеточной мембраны для трансферрина н PDGF.
Все описанные случаи активации Ha-ras-протоонкогена касаются его первого локуса. Активация другого генетического локуса, c-Ha-ras 2, расположенного в Х-хромосоме клеток человека, пока никем не показана. Не исключено, что этот локус является псевдогеном [O'Brein S. et al., 1983].
Идентификация и изучение механизмОЕ активации протоонкогенов в опухолях человека существенно ограничены практической невозможностью получения опухолевого материала строго определенной стадии малигнизации клетки. Сказанное в особой степени относится к проблеме получения нормальных, не измененных клеток-мишеней в качестве контролен. В этой связи важное значение приобретают хорошо разработанные экспериментальные системы по индукции опухолей определенной локализации и гистотипа канцерогенными веществами. Подобные системы должны отвечать двум основным требованиям:' 1) специфический тип опухоли должен быть индуцирован в контролируемых экспериментальных условиях; 2) конкретный тип протоонкогенов должен быть способен повторно активироваться в каждой опухоли.
Sukumar и соавт. (1983) разработали подобную экспериментальную систему и показали, что в каждой из 9 исследованных карцином молочной железы мышей, индуцированных однократным введением метил нитрозомочевины 50-дневным самкам крыс линии Buf/N, активируется протоонкоген c-Ha-ras 1. Молекулярный анализ одного из этих трансформирующих генов показал, что 12-м кодоном c-Ha-ras 1 вместо ГГА становится ГАА. При этом в кодируемом белке р21 происходила замена 12-го аминокислот-
ного остатка глицина на глутаминовую кислоту. При аминокислотном анализе полипептидной цепи, кодируемой вторым экзоном крысиного c-Ha-ras 1, не выявили повреждения 61 -й аминокислоты. Эти результаты свидетельствуют о том, что опухоли животных, индуцированные химическим канцерогеном, могут являться адекватной моделью изучения роли трансформирующих генов семейства ras в возникновении опухолей человека [Weinberg R., 1982; Sukumar S. et al., 1983], особенно в случае точковых мутаций в 12-м' кодоне гена Ha-ras.
Метил нитрозомочевина является алкилирующим агентом, преимущественно модифицирующим гуанозиновые остатки ДНК клеток-мишеней путем метилирования атомов азота и кислорода соответственно в N7- и О6-положениях. Как следствие этого процесса гуанозиновые остатки могут спариваться с тимидином вместо дезокси цитозина, что приводит, в свою очередь, к замене основания ДНК гуанина на аденин (Г-> А). По-видимому, именно таков механизм злокачественной активации онкогена NMU-Ha-ras в нормальных клетках эпителия молочной железы крыс, ДНК которых подвергалась воздействию химического канцерогена (метилнитрозомочевины NMU) [Sukumar S. et al., 1983].
В экспериментах на животных было показано, что в опухолях кожных покровов, индуцированных у мышей MX и ДМБА, также активируется протоонкоген c-Ha-ras. Механизм генетического повреждения онкогена Ha-ras в этом случае неизвестен [Balmain A., Paragnell J., 1983].
Неожиданные результаты были получены в исследованиях этих же авторов при изучении онкогенов в доброкачественных папилломах кожи, индуцированных у мышей ДМБА [Balmain А. et al., 1984]. В папилломах обнаружена активация онкогена типа Ha-ras. Авторы полагают, что выяснение типа активации онкогена Ha-ras может способствовать пониманию механизмов доброкачественной и злокачественной трансформации. В 5 неродственных злокачественных опухолях мышей в экспериментах по трансфекции клеток N【H ЗТЗ были идентифицированы разные онкогены семейства ras [Vonsden К., Marshall С., 1984]. Т-клеточная лимфома, фибросаркома и гистиоцитарная опухоль (макрофагальная) содержали активный онкоген типа Ki-ras; в клетках миелоидной лейкемии выявлен Ha-ras, а в клетках карциномы легких —— N-ras. Однако в метастазах указанных опухолей удалось обнаружить только онкоген типа Ki-ras.
Протоонкоген c-Ha-ras 1 в нормальных и опухолевых клетках человека расположен в хромосоме 11 [Martinville В. et al., 1983; O'Brein S. et al., 1983; Rowly J., 1983]. Процесс канцерогенеза у человека, обусловленный активацией Ha-ras, не связан с серьезными изменениями первичной генетической структуры, перестройками, транслокациями или амплификацией этого протоонкогена [Yunis J., 1983]. Тем не менее следует отметить, что в опухолевых клетках человека, например при меланомах, некоторых формах
лейкозов, имеются существенные изменения структуры хромосомы 11. Однако специфической связи подобных изменений в этой хромосоме с активацией c-Ha-ras, а также определенным типом малигнизации клеток пока не установлено [Gilbert F., 1983; Rowley J., 1983]. Более того, в препаратах ДНК из клеток белой крови больных раком, а также из злокачественных опухолей и опухолевых клеточных линий часто выявляется аллельный вариант рестрикционных ВатН [-фрагментов локуса онкогена Ha-ras 1. Обнаруженное изменение не наблюдалось в ДНК здоровых доноров, особенно в семействах с низкой частотой раковых заболеваний. Присутствие подобных фрагментов аллельных вариантов онкогена Ha-ras 1, вероятно, может указывать на чувствительность (подверженность) людей к возникновению злокачественных заболеваний [Krontiris Т. et al., 1985].
КЛЕТОЧНЫЕ ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ ГЕНЫОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА,РОДСТВЕННЫЕ ПРОТООНКОГЕНУ c-Ki-ras 2
Der и соавт. (1982) показали, что трансформанты, полученные после трансфекции клеток NIH ЗТЗ препаратами ДНК, изолированными из клеточной линии карциномы легких LX-1, содержат трансформирующий ген, гомологичный онкогену v-Ki- ras. S. Pulciani и соавт. (1982) обнаружили этот же тип трансформирующего гена в препаратах ДНК, изолированных из солидных опухолей толстой кишки, легких, поджелудочной железы и рабдомиосаркомы, а также в клеточных линиях, полученных из опухолей толстой кишки, легких, поджелудочной железы и желчного пузыря человека. Перечень опухолей, связанных с активацией протоонкогена c-Ki-ras 2, представлен в табл. 15.
Эти результаты свидетельствуют в первую очередь о том, что присутствие трансформирующих генов в ДНК не является артефактом культивирования опухолевых клеток in vitro, поскольку этот же трансформирующий ген обнаружен и в первичных опухолях, из которых получены опухолевые клеточные линии. К. Shimizu и соавт. (1983) показали присутствие трансформирующих генов типа Ki-ras в двух карциномах легких (биопсийный материал) и клеточных линиях опухолей легких [Shimizu К. et al., 1983]. Рассмотрение механизмов активации протоонкогена типа Ki-ras в опухолях человека, как и в случае с Ha-ras, показало, что в этом отношении наиболее часто уязвим только один кодон, а именно 1 -й. Активная, трансформирующая форма протоонкогена c-Ki-ras 1 в опухолях человека и животных пока не идентифицирована. В клетках человека этот ген локализован в хромосоме 6, рядом с протоонкогеном c-myb в области основного гена комплекса гистосовместимости [O'Brein S. et al., 1983].
A. Eva и S. Aaronson (1983) обнаружили активацию протоонкогена c-Ki-ras в двух из четырех мышиных фибросарком,
Клеточные трансформирующие гены человека» родственные протоонкогенуc-Ki-ras 2
Гистотип опухолей
Клеточная линия или номер опухоли
Механизм активации
Литературный источник
纟总
X Й
Рак легкого
LX-1 (клетки)
—
D. Der (1982)
Карцинома
1615 (опухоль)
—
C. Pulciani и соавт. (1982)
> поджелудочной железы
1189 (опухоль)
—
—
>
Эмбриональная рабдо* мносаркома
1085 (опухоль)
—
—
»
Карцинома легкого
А427 и A2I82 (клетки)
—
>
желчного пузыря
А1604 (клетки)
толстой кишки
А2233 (клртки) 1665 (опухоль) 2033 (опухоль)
—
—
>
» >
Карцинома: мочевыводящих путей (мочевой пузырь)
AI698 (клетки)
—
С. Pulciani и соавт. (1984)
толстой кишки
SK-CO-1 (клетки)
—*-
—
К Shimizu и соавт. (1983)
легких
SK-Lu-1
(клетки)
—
—
—
К Shimizu и соавт. (1983)
Calu-I
(клетки)
12-й
1Т
гли—► цис
D. С а рол и соавт. (1983), М McCoy и соавт. (1983)：
К Shimizu и соавт. (1983)
толстой кишки
SW-480 (клетки)
12-й
г->т
ГЛИ-* вал
D. Capon и соавт. (1^83)
Примечание. (—) — механизм активации протооикогена не изучен
индуцированных метилхолантреном. Механизм активации этого локуса под действием канцерогена пока неизвестен [Eva А., Aaronson S., 1983].
Недавно две группы исследователей одновременно построили первичную генетическую структуру онкогена c-Ki-ras 2 и определили место генетического повреждения в двух соответствующих трансформирующих генах, изолированных из клеток карциномы толстой кишки человека (линия SW-480) и клеточной линии
карциномы легкого Calu-1 [Shimizu К. et al., 1983; Capon D. et al., 1983]. Клеточная линия карциномы легких Calu-1 содержит трансформирующий ген c-Ki-ras 2, который кодирует в 12-м положении белка р21 аминокислоту цистеин вместо глицина. Для клеточной линии SW-480 D. Capon и соавт. (1983) показали наличие аминокислоты валина в 12-м положении белка р21.
На основе этих данных можно сделать вывод о том, что активация протоонкогена c-Ki-ras 2 также связана с повреждением 12-го кодона, как и в случае активации протоонкогена Ha-ras в клеточных линиях рака мочевого пузыря EJ и Т24. Очевидно, единичная точковая мутация в онкогене ras и замена 12-й аминокислоты в нормальном белке р21 являются «горячей точкой» в процессе мутационной активации семейства онкогенов ras.
Клеточная линия карциномы легких Calu-1 оказалась гетерозиготной, т. е. содержащей активированный тип, имеющий мутацию, и нормальную неповрежденную аллель c-Ki-ras 2. Напротив, клеточная линия SW-480 (карцинома толстой кишки) имеет мутацию в 12-м кодоне обеих аллелей локуса c-Ki-ras 2, которые транскрибируются в опухолевых клетках приблизительно с одинаковой степенью эффективности. Отличия двух аллелей заключаются лишь в единичной замене нуклеотидов в нетранслируемом участке гена [Shimizu К. et al., 1983; Capon D. et al., 1983) K. Shimizu и соавт. высказали предположение о том, что белковый продукт р21 трансформирующих генов семейства ras, вероятно, состоит из константной и вариабельной областей. Вариабельная область может формировать физиологически важный компонент ——комбинированный участок, позволяющий каждому новому продукту гена ras взаимодействовать с различными клеточными и экстрацеллюлярными мишенями [Land Н. et al., 1983; Shimizu К. et al., 1983]. Если предположение авторов правильно, то это в какой-то мере может объяснить неясности, возникающие при изучении онкогенов опухолей человека, а именно: почему близкородственные в структурном отношении гены семейства ras связаны с широким кругом фенотипически различных опухолей.
Изученные физико-химические свойства продукта гена c-Ki- ras 2, белка р21, оказались неотличимыми от продукта гена c-Ha-ras 1 [Ellis R. et al., 1981; Tsuchida N. et al., 1982].
Протоонкоген c-Ki-ras 2, по данным гибридизации in situ и соматической гибридизации, в нормальных и опухолевых клетках человека расположен в хромосоме 12. При активации в большинстве опухолей человека этот локус не претерпевает видимых изменений, лишь в некоторых случаях (линия клеток SW 480) обнаружена амплификация c-Ki-ras 2 [McCoy М. et al., 1983; McGrath J. et al., 1983; O'Brein S. et al., 1983]. Однако следует подчеркнуть, что ряд злокачественных новообразований человека связан с существенными перестройками и транслокациями, обнаруживаемыми в хромосомах 11 и 12 [Gilbert F., 1983; Rowley J., 1983].
КЛЕТОЧНЫЕ ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ ГЕНЫ ЧЕЛОВЕКА,РОДСТВЕННЫЕ ПРОТООНКОГЕНУ N-ras
К. Shimizu и соавт. (1983) первыми описали новый трансформирующий ген, названный ими N-ras, в клетках нейробластомы человека линии SK-N-SH. Ген оказался слабогомологичным (по данным гибридизации) онкогенам v-Ha-ras и Ki-ras. Этот тип трансформирующего гена был изолирован также из клеточной линии НТ-1090 — фибросаркомы человека, клеточной линии RD — рабдомиосаркомы человека, а также из клеток промиелоцитарной лейкемии HL-60 [Hall A. et al., 1983]. Наконец, ряд авторов обнаружили трансформирующие гены типа N-ras в клетках лимфомы Беркитта, линии AW Ramos, в случае острого миелоидного лейкоза и в аденокарциноме толстой кишки (табл. 16). Как видно из табл. 16, онкоген N-ras, как и другие представители семейства N-ras, связан с довольно широким спектром опухолей человека [Myata Т., Yasunaga Т., 1983; Eva A. et al., 1983; Hall A. et al., 1983; Shimizu К. et al., 1983]. Гибридизационный анализ препаратов ДНК донорских опухолевых клеток показал, что их неопластическое состояние не связано с видимыми генными перестройками локуса N-ras. Пока не отмечены транслокации или амплификации этого трансформирующего гена, локализованного в хромосоме I [Martinville В. et al., 1983].
N-ras представляет собой один из первых клеточных протоонкогенов, пока не обнаруженных в ретровирусах животных. Очевидно, по неизвестным причинам этот локус чем-то неудобен для трансдукции в ретровирусный геном.
Taparowsky и соавт. (1983) установили, что ген N-ras в клетках нейробластомы человека имеет единичную точковую мутацию с заменой нуклеотида в клеточном протоонкогене в 61-м кодоне для трансформирующего белка р21. Замена Ц-> А приводит к включению аминокислоты лизина вместо глутамина (глю -► лиз) (см. табл. 16).
Аналогичный тип замены оснований ДНК 61-го кодона N-ras обнаружен также в клетках фибросаркомы человека линии НТ-1080 [Brown R. et al., 1984]. Этот вариант активации онкогенов семейства ras, касающийся 61-го кодона, был установлен ранее в трансформирующем гене c-Ha-ras клеточной линии Hs-242, происходящей из карциномы легкого, где Y. Yuasa и соавт. (1983) впервые определили замену нуклеотида в 61-м кодоне.
Повреждение, ответственное за активацию онкогена N-ras клеток рака легкого (клеточная линия SW-1271), также касается 61-го кодона, однако в этом случае впервые выявлена А -► Г замена оснований ДНК- В результате такой замены оснований 61-го кодона N-ras вместо аминокислоты глутамин в 61-м положении белка р21 присутствует аргинин [Yuasa Y. et al., 1984]. С учетом известных данных относительная частота изолирования трансформирующих генов семейства ras в экспериментах по транс-
Клеточные трансформирующиеся гены человека, родственные протоонкогену N-ras
Гистотип опухолей
Клеточная линия
Механизмы активации
Литературный
ИСТОЧНИК
Поврежденный кодон
Изменения нуклеотидов
Замена амино- кислотного остатка
Нейробластома
SK-N SH
61-й
Uf А
ГЛЮТлнз
К- Shimizu н соавт. (1983)
Фибросаркома
НТ 1080
61-й
Uf А
гл ю-*-л из
A Hall и соавт.
(1983)
Рабдомиосаркома
RD
—
—
R. Brown и соавт. (1984)
Промиелоцитарная лейкемия
HL-60
—
—
—
М. Murray и соавт. (1983)
Лимфома Беркитта
AW Ramos
—
—
—
То же
Острая миелоидная
—
—
—
—
>
лейкемия
Аденокарцинома
—
—
—
—
»
толстой кишки
Острая лимфоидная лейкемия
MOLT-3
—
—
——
A. Eva и соа вт (1983)
Аденокарцинома легких
SW-I27I
61-й
Af「
rviiof ар『
Y. Yuasa и соавт. (1984)
Острый миелоидный лейкоз
Клетки костного мозга
С. Gramble и соавт. (1984)
активации протоонкогеиа не изучен
Примечание. (—) — механизм
фекции клеток NIH ЗТЗ, а следовательно, и их возможного участия в индукции неоплазм человека достигает уже примерно 15 % [Pulciani S. et al., 1982]. Одна из возможных причин большей частоты выявления трансформирующих генов семейства ras в опухолях заключается в том, что эти онкогены в силу каких-то своих естественных особенностей легче, чем другие, обнаруживаются именно в системе клеток NIH ЗТЗ. Причины этого явления уже обсуждены намн выше.
Ряд трансформирующих генов, которые не принадлежат к семейству ras, также могут быть обнаружены в экспериментах по трансфекции клеток NIH ЗТЗ.
ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ ГЕНЫ B-lym И Т-1ут
В опытах по трансфекции клеток NIH ЗТЗ препаратами ДНК из куриной В-клеточной лимфомы, G. Goubin и соавт. (1983) выявили трансформирующий ген, неидентичный ранее известным онкогенам остротрансформирующих ретровирусов животных. Позже A. Diamond и соавт. (1983) показали, что такой же тип трансформирующего гена присутствует в 6 клеточных линиях
лимфомы Беркитта. В связи с тем, что указанные неопластические процессы ассоциированы с трансформацией В-лимфоцитов, этот онкоген получил название B-lym. Геном клеток человека и кур содержит целое семейство протоонкогенов B-lym (около 6—8 локусов), имеющих значительную гомологию друг с другом [Cooper G., 1984]. Анализ нуклеотидных последовательностей клонированного трансформирующего гена и его теоретически построенная модель онкобелка свидетельствуют о частичной гомологии его аминотерминального домена аминокислотных остатков онкобелка с трансферрином —белком, участвующим в регуляции (стимуляции) пролиферации клеток, культивируемых in vitro. Размер трансформирующего гена B-lym 1 человека определен. Он меньше 0,95 т. п. о. Активация этого гена в клетках лимфомы Беркитта не связана с амплификацией или генными перестройками. В контексте трансформации В-лимфоцитов следует рассматривать также амплификацию и транслокацию гена с-тус из хромосомы 8 в хромосому 14 или 22, также часто встречающуюся в лимфомах Беркитта. Вероятно, в неопластический процесс, приводящий к трансформации В-лимфоцитов и формированию лимфомы Беркитта, вовлечены как минимум три трансформирующих гена: N-ras, c-myc и B-lym 1 [Dalla-Favera R. et al., 1982; De Klein A. et al., 1982; Collins S., Groude M., 1982; Klein G., 1983; Murray M. et al., 1983; Neuberger M., Calabi F., 1983; Nushikura K. et al., 1983].
В экспериментах по трансфекции клеток NIH ЗТЗ препаратами ДНК из Т-клеточных лимфом человека был выявлен новый, стадиеспецифический онкоген T-lym 1 [Lane М.-А. et al., 1984]. T-lym I не имеет гомологии с известными вирусными онкогенами и не гомологичен трансформирующему гену B-lym 1. По предварительным данным, размер этого онкогена равняется I—2 т. п. о.
НЕИДЕНТИФИЦИРОВАННЫЕ ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ ГЕНЫ
М. Lane и соавт. (1982) первыми обнаружили трансформирующие свойства препаратов ДНК из Т- и В-клетсчных лимфом мышей и человека в культуре клеток N【H ЗТЗ. В экспериментах по трансфекции авторы установили, что трансформирующий потенциал рестрикционных фрагменте испытуемых препаратов ДНК различен. Использование эндонуклеаз рестрикции и получаемых с их помощью фрагментов ДНК позволило достаточно точно определить родство трансформирующих генов. Авторы на основе полученных данных предположили, что на различных стадиях превращения В-лимфоцитов в опухолевые клетки активируется несколько трансформирующих генов. Один из них, например tx-1, участвует, по-видимому, в злокачественной трансформации лимфоцитов [Cooper G., 1984]. Авторами идентифицировано как минимум 10 типов трансформирующих последовательностей, отличающихся по чувствительности или резистентности к отдель-
ным рестриктазам, в четырех В- и двух Т-клеточных лимфомах. При этом онкоген tx-2 оказался связанным с миелолейкозами, а tx-З — со зрелыми Т-клеточными неоплазмами. Однако, чтобы сделать определенные выводы об истинной роли тех или иных онкогенов, необходима дальнейшая работа, в частности молекулярная характеристика этих потенциальных, специфичных для определенной стадии дифференцировки трансформирующих генов.
В опытах по трансфекции клеток NIH ЗТЗ трансформирующие гены были также обнаружены в препаратах ДНК из опухолей молочной железы человека и молочных желез мышей, индуцированных химическим канцерогеном [Lane М. et al., 1981]. Трансформирующий потенциал рестрикционных фрагментов ДНК опухолей мышей и человека в культуре клеток NIH ЗТЗ был идентичным. Эти данные свидетельствуют о присутствии и активации в указанных опухолях родственных трансформирующих генов типа mam или tx-4. Основываясь на данных по чувствительности трансформирующих последовательностей к эндонуклеазам рестрикции и на их сопоставлении с физической картой протоонкогена c-Ha-ras рака мочевого пузыря, авторы сделали вывод об отличии онкогена рака молочной железы мышей от онкогенов семейства ras. Однако результаты, полученные позже группами М. Barbacid [Sukumar S. et al., 1983] и К. Willecke [Князев П. Г. и др., 1984; Schafer A. et al., 1984], свидетельствуют об обратном: клетки рака молочной железы человека линии SK-BR-3, а также 9 проанализированных опухолей молочной железы крыс, индуцированных метил нитрозомочевиной, содержали в составе ДНК трансформирующие гены, гомологичные онкогену v-Ha-ras.
Не исключено, что в рассмотренных экспериментах по изучению и предварительной идентификации трансформирующих генов рака молочной железы у разных видов животных и некоторых клеточных линий нет противоречия. В предыдущих разделах книги уже были приведены данные о возможности обнаружения нескольких типов онкогенов в клеточных линиях, происходящих из опухолей одинакового гистотипа (см. табл. 14, 15, 16). D. Becker и соавт. (1982) сообщили, что антиген gp86 специфическим образом связан с экспрессией переносимых в трансфекции трансформирующих генов карцином молочной железы человека и мышей, обнаруженных М. Lane и соавт (1981). К сожалению, пока неясно, является ли гликопротеид gp86 белком, кодируемым экзогенным трансформирующим геном, или он производится самими трансформированными клетками NIH ЗТЗ, т. е. является продуктом экспрессии эндогенного протоонкогена [Becker D. et al., 1982].
Опухолевые клетки, из которых выделяются препараты ДНК, содержащие трансформирующие гены, существенно отличаются от клеток, используемых в качестве реципиентных в экспериментах по трансфекции. Так, онкогены, происходящие из перечисленных в табл. 14, 15, 16 опухолей человека и животных, могут трансформировать мышиные клетки NIH ЗТЗ. Это является опре-
деленным доказательством того, что тот или иной конкретный онкоген, например EJ-c—Ha-ras, способен трансформировать клетки генетически неродственных тканей. Последний факт также указывает и на известный недостаток существующих экспериментальных подходов. Не исключено, что иной онкоген, трансформирующий, например, только нормальные клетки эпителия мочевого пузыря человека данным методом, никогда не будет выявлен в системе клеток NIH ЗТЗ. Вероятно, это может служить еще одним из объяснений тому факту, что, по данным опытов с трансфекцией клеток NIH ЗТЗ только около 15—20 % из изученных опухолевых клеточных линий человека содержат активные онкогены, функционирующие в данной клеточной системе [Pulciani S. et al., 1982; Weinberg R., 1982|. Возможно, остальные 80 % опухолей человека содержат онкогены, которые требуют для их выявления других чувствительных реципиентных клеток, компетентных к экспрессии иного уникального онкогена, ответственного за реализацию своего специфического этапа онкогенеза. В большинстве опытов по трансфекции в качестве реципиентных культур используются фибробласты грызунов, которые могут быть нечувствительными к тому или другому специализированному онкогену. С другой стороны, у клеток грызунов (гетерологическая модельная система) есть важное преимущество — в них значительно легче обнаружить методами молекулярной гибридизации перенесенные и функционирующие онкогены. Эти гены, как правило, по сайтам рестрикции отличаются от эндогенных аллелей протоонкогенов. Следует учитывать и тот факт, что некоторые онкогены могут действовать как рецессивные или как слаботрансформируюшие аллели, не- выявляемые в используемой в настоящее время постановке экспериментов по трансфекции. Не случайно остаются пока безуспешными попытки обнаружить трансформирующие гены человека при использовании в качестве реципиентных клеток диплоидных фибробластов человека и животных [Князев П. Г. и др., 1980; Land Н. et al., 1983].
Ограничения в поиске и выделении онкогенов человека и животных, накладываемые современной техникой трансфекции, могут быть частично преодолены. Одним из новых подходов для выявления активных трансформирующих генов является изучение их структуры с помощью гибридизации по Саузерну в различных модификациях. Использование Саузерн-блот-гибридизации позволило обнаружить измененные (активированные) клеточные протоонкогены myc, niyb и аЫ в нескольких типах опухолей человека и мышей невирусной этиологии [Alitalo К. et al., 1983; Schwab М. et al., 1983]. Повреждение указанных онкогенов выражалось в их амплификации и гиперэкспрессии [Collins S.t Groudine М., 1982： Newbold R„ Overell R„ 1983].
Еще одной группой неидентифицированных трансформирующих генов, также не связанных с онкогенами ретровирусов млекопитающих, являются онкогены нейробластом и глиобластом крыс.
индуцированных трансплацентарно этил нитрозомочевиной [Shih С., et al., 1981; Huh N. et al., 1983]. После 2—3 циклов трансфекции клеток NIH ЗТЗ препаратами ДНК, изолированными из нейро- и глиобластом, возникают очаги независимой от субстрата пролиферации, которые уже в 3-м и 4-м циклах трансфекции по своей морфологии существенно отличаются от исходных реципиентных клеток [Shih С. et al., 1979]. Трансформирующие гены, получившие название пен, не имеют пока аналогов среди уже известных клеточных протоонкогенов. Характерной особенностью трансформантов клеток NIH ЗТЗ, индуцированных онкогеном пей, является продукция ими белка с молекулярной массой 185 кд (р!85). Этот белок обнаружен также в донорских клетках и всегда каким-то образом связан с онкогеном [Shih С. et al., 1981].
Суммируя данные по группе трансформирующих генов, обнаруженных в опытах трансфекции, но не имеющих аналогов среди ретровирусных онкогенов, можно сделать следующее заключение.
Онкогены пей и mam (tx-4), по-видимому, структурно и биологически являются несовместимыми с аппаратом и механизмом их трансдукции в ретровирусы. Вероятно, дальнейший поиск трансформирующих генов в химически индуцированных опухолях разных гистотипов и локализаций приведет к идентификации новых, еще неизвестных онкогенов.
Завершая этот раздел, следует отметить, что совершенствование метода трансфекции, его модификации будут способствовать дальнейшему выявлению онкогенов в опухолях человека и животных. Ряд авторов, например, эффективно использовали лигирование донорских клеток ДНК с LTR. В этих опытах впервые в системе клеток NIH ЗТЗ был выделен из опухолей человека онкоген raf [MilIler R. et al., 1984]. К весьма перспективным методам обнаружения и выделения онкогенов следует отнести данные, полученные Y. Tsujincoto и соавт. (1984). Авторы впервые клонировали онкоген Ьс1-1, присутствующий в точке разрыва хромосомы 11 в клетках В-клеточной лимфомы человека. Этот онкоген оказался негомологичным известным на сегодня вирусным и клеточным онкогенам. Вероятно, этот подход позволит идентифицировать серию онкогенов, имеющих обший механизм активации, ассоциированный с транслокациями
ВЛИЯНИЕ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНКНА ЭКСПРЕССИЮ ОНКОГЕНОВ
Различные механизмы активации клеточных протоонкогенов в трансформирующие онкогены рассмотрены в одном из предыдущих разделов этой книги (гл. 4). Поэтому здесь мы опишем лишь один дополнительный биологический феномен, также модифицирующий трансформирующие гены с далекоидущими функциональными последствиями. Мы имеем в виду процесс метилирования ДНК и его роль в экспрессии онкогенов.
Благодаря большому числу новых работ с использованием методов генной инженерии в области изучения механизмов экспрессии генов были получены важные результаты, положенные в основу гипотезы о роли метилирования ДНК, в частности цитозиновых нуклеотидов, в контроле генной активности. Эти результаты указывали на то, что слабое метилирование клеточных генов, как правило, сопровождается более активной экспрессией генетической информации.
Гипотеза постсинтетической (посттранскрипционной) модификации ДНК как основы клеточной дифференцировки была сформулирована R. Holliday и J. Pugh (1975). Эти авторы предположили, что минорное основание б^метилцитозин, которое обнаружено в ДНК всех изученных высших эукариотов, играет важную роль в процессе транскрипции, поскольку именно метилирование является сутью посттранскрипционной модификации ДНК- Еще одним минорным основанием ДНК, подвергающимся метилированию, является аденин (после метилирования — 6 метиламинопурин). Влияние степени метилирования аденина на процесс экспрессии генов практически не изучено, поэтому далее будут рассмотрены вопросы, связанные с метилированием цитозина.
Метилирование цитозина в последовательности 5'-Ц「осуществляется путем переноса метильной группы СНз от аденозил- метионина с помощью метилазы (метилтрансферазы) в процессе репликации ДНК. При этом донор СНз-группы, S-аденозил метионин, превращается в S-аденозил гомоцистеин. Аналогичным образом происходит процесс превращения аденина в 6-метиламинопурин. Метилтрансфераза функционирует на дуплицирующейся цепи ДНК таким образом, что вновь синтезированная нить ДНК в отношении степени метилирования становится идентичной матрице. Именно поэтому метилирование наследуется в процессе транскрипции ДНК. Однако практически лишь 2—7 % цитозинов метилировано в ДНК клеток млекопитающих. С другой стороны, процесс деметилирования сопровождается наследственно закрепленным усилением экспрессии генетической информации.
В 1977 г. J. Christman и соавт. (1977) обнаружили корреляцию между гипометилированным состоянием ДНК ч экспрессией глобиновых генов в клетках мышиной эритролейкемии. Использование рестрикционных нуклеаз н блот-гибридизации по Саузерну позволило более детально изучить влияние метилирования специфических сайтов ДНК на экспрессию генов. Две группы ферментов (изошизомеры) оказались полезными в этом отношении: а) Нра II, способная «разрезать» последовательность 5,-Ц(т)-ЦГГ-3,, если цитозин пары ЦГ не метилирован; Msp 1, способная «разрезать» ту же последовательность, в которой Ц метилирован в динуклеотиде ЦПТ, но не ЦЦ; б) Hha I, неспособная расщеплять последовательность 5,-ЦГЦтГ-3,, если цитозин пары ЦтГ метилирован; Cfo I, способная «разрезать» ту же последовательность, независимо от метилирования цитозинов этого сайта [Bird А., 1978].
Важные результаты, подтверждающие связь метилирования ДНК с экспрессией генетической информации и дифференцировкой, были получены при использовании аналога цитозина, 5'-азаинтнднна (т. е. цитозин, в котором углерод в 5-м положении заменен на атом азота, вследствие чего он не может быть метили
рован) .
Рибоза б^-метил цитозинРибоза б^-метил цитозинРибоза5-азацитидинРибоза5-азацитидин
Рибоза б^-метил цитозин
Рибоза б^-метил цитозин
Рибоза
5-азацитидин
Рибоза
5-азацитидин
Р. Jones и S. Taylor (1980) показали, что 5'-азацнтнднн тормозит метилирование вновь синтезированной ДНК в условиях культуры клеток. Авторы обнаружили, что присутствие этого аналога цитозина в клеточной культуре индуцирует в эмбриональных клетках мышей формирование мыи!ечных клеток. Следовательно, в данном случае снижение уровня метилирования ДНК прямым образом влияло на миогенную дифференцировку. В последующем изучение связи экспрессии различных генов, например генов металлотионина н овальбумина с их метилированием подтвердило это положение.
R. Jaenisch н соавт. (1982) получили результаты, свидетельствующие о существенном влиянии метилирования ДНК на экспрессию эндогенных провирусных генов, интегрированных в различные участки мышиного генома. Провирусные геномы, которые не экспрессировались н поэтому были неинфекционны в экспериментах по трансфекции, оказались высокометилированными [Jaenisch R., 1982]. Напротив, удаление метильных групп путем особого клонирования генов в векторах бактериальных систем способствовало превращению провирусов в экспрессируемые, высокоинфекционные [Simon D. et al., 1983].
На сегодня только незначительное число исследований посвящено изучению связи экспрессии протоонкогенов с метилированием их экзонов н интронов, а также прилежащих н усиливающих последовательностей. Два протоонкогена, c-mos и c-ras, были изучены в этом отношении более детально, поэтому мы рассмотрим эти работы подробнее.
Скрининг экспрессии различных протоонкогенов в многочисленных клеточных линиях нормального н опухолевого происхождения показал, что в них не экспрессируется лишь протоонкоген c-mos. Поэтому ген c-mos можно в принципе отнести к «молчатим> генам [Blair D. et al., 1981; Watson R. et al., 1982; Muller R„ 1983; Murray M. et al., 1983]. Тем не менее, экспрессия протоонкогена c-mos была все же обнаружена в клетках злокачественной мела-
номы мышей, где отмечены существенные перестройки этого гена, и в двух опухолевых крысиных клеточных линиях нейроэктодермального происхождения, сериях TV н GV [Huh N. et al., 1983|. Группа Dino-Dina [Cattoni S. et al., 1982] изучила метилирован- ность «молчащего» гена c-mos в клеточных линиях мышей и крыс, трансформированных вирусом саркомы мышей (несущим онкоген v-mos) или химическими веществами. Оказалось, что в обоих случаях протоонкоген c-mos был гиперметилирован, тогда как v-mos — интегрированный в мышиный геном и экспрессируемый —— был гипометилирован. Для определения степени метилированности протоонкогена c-mos авторы использовали двойную рестрикцию образца ДНК разными эндонуклеазами: Sac 1, «вырезающей» весь c-mos, и Нра II или Msp I, «узнающими» метилирование цитозина в 5'-И「-последовате/ьностн [Gattoni S. et al., 1982].
Feinberg и В. Vogeltein (1983), используя генно-инженерную технику, определили уровень метилирования двух клеточных протоонкогенов — Ha-ras и Ki-ras — в нескольких аденокарциномах кишечника человека н сопоставили их метилированность с таковой Ha-ras и Ki-ras в препаратах ДНК прилежащего к опухоли нормального эпителия. Авторы обнаружили относительное гипометилирование протоонкогена в 6 из 8 аденокарцином. Эти же исследователи показали, что некоторые нормальные гены человека, например гормона роста н сх-глобина, существенно гипометили- рованы в ряде карцином кишечника и легких по сравнению с прилежащими к опухоли здоровыми тканями. Гипометилирование этих генов было еще более значительным в метастазах опухоли в селезенку [Feinberg A., Vogelstein В., 1983]. Эти результаты дают достаточно удовлетворительное объяснение также феномену ненормального синтеза некоторых гормонов и эмбриональных белков опухолевыми клетками, причиной которого может быть гипометилированное состояние соответствующих генов. На основании этих данных можно предполагать, что ненормальная экспрессия некоторых генов при раке, возможно, является результатом нарушения процесса метилирования ДНК [Feinberg A., Vogel- stein В., 1983).
Нам также удалось показать [Huh N. et al., 1983] связь экспрессии генов со степенью их метилирования. Так, было установлено, что экспрессия Ha-ras в опухолях мозга крыс, индуцированных этил нитрозомочевиной (клеточные линии серий ВТ, GV н TV) [Laerum D., Rajewsky M., 1975), коррелировала с его относительным гипометилированием. В эмбриональных клетках мозга крыс (клетки-мишени), где также имеет место экспрессия Ha-ras, было отмечено снижение уровня метилирования указанного протоонкогена, о чем судили по результатам действия рестриктаз Нра II/Msp I, распознающих метилированные и не- метилированные основания.
Таким образом, представленные результаты свидетельствуют в пользу мутационной природы относительного гипометилирования
Ha-ras н связанной с этим состоянием активацией его экспрессии после взаимодействия ДНК клеток-мишеней с эти л нитрозомочевиной [Huh N. et al., 1983].
Сравнение степени метилированности трансформирующих генов c-Ha-ras, идентифицированных в трех неоплазмах человека (злокачественная меланома, рак молочной железы, нейробластома), с таковой у эндогенного мышиного протоонкогена c-Ha- ras клеток NIH ЗТЗ показало четкие различия. Так, в первичных трансформантах клеток NIH ЗТЗ, возникающих в результате трансфекции препаратами ДНК указанных опухолей, обнаружены высокий уровень экспрессии онкогена c-Ha-ras и его гипометили- рованное состояние. Напротив, Ha-ras исходных клеток NIH ЗТЗ не экспрессировался, н было показано его гиперметилированное состояние [Huh N. et al., 1983].
Высокую чувствительность клеток NIH ЗТЗ мышей к трансформирующим генам семейства ras человека н других видов животных можно объяснить низкой степенью метилирования рестрикционных сайтов эндонуклеаз Нра II/Msp I, содержащих б^ЦГ-последовательности, и поэтому высоким уровнем экспрессии соответствующего онкогена. Интеграция в процессе трансфекции гипометилированного онкогена Ha-ras в геном пренеопластических клеток мышей N1H ЗТЗ приводит к его активной экспрессии. В результате, синтез белка р21 и его взаимодействие с клеточной мишенью сопровождаются злокачественной трансформацией реципиентных клеток NIH ЗТЗ, захвативших трансформирующий ген.
В условиях трансформации клеток N1H ЗТЗ переход этих пол утра нсформирова иных клеток в неопластические, возможно, зависит от функции нескольких, как минимум двух, онкогенов: экзогенного гипометилированного, вносимого с экстрацеллюлярной ДНК, и активируемого в процессе неопластической трансформации собственного эндогенного гипотетического гена, обеспечивающего пренеопластический фенотип реципиентных клеток NIH ЗТЗ.
Предложено несколько моделей деметилирования генов (протоонкогенов) ,что, как уже указывалось выше, приводит к экспрессии «молчащих» генов. С этой точки зрения мутации и транслокации можно рассматривать как своеобразный биологический эквивалент деметилирования гена, влекущего за собой активацию экспрессии. В первом случае происходит замена Заметил цитозина на другое неметилированное основание ДНК, а во втором — ген попадает в иное окружение, не контролируемое репрессорами.
Завершая рассмотрение своеобразного механизма активации и регуляции экспрессии протоонкогенов путем изменения степени метилированности оснований ДНК, следует подчеркнуть, что развитие состояния гипометилирования ДНК может сопровождаться также изменением ее конформационных свойств, способствуя переходу ДНК в форму Z [Toth В., 1975). Не исключено, что изменение метилирования ДНК влияет на взаимодействие нуклеи-
новой кислоты с гистонами, определяя тем самым способность отдельных генов к экспрессии.
Можно высказать и другие предположения. Однако на основе имеющихся в настоящий момент лишь немногочисленных данных о влиянии метилирования ДНК на экспрессию генетической информации трудно сделать однозначное заключение об истинной роли этого процесса в превращении протоонкогенов в онкогены. И все же обнаружение связи степени метилирования ДНК с экспрессией генов, в частности в ходе клеточной дифференцировки и онкогенеза, позволяет уже сегодня лучше понять детали молекулярного механизма возникновения некоторых форм злокачественных новообразований человека, а также спонтанных н индуцированных опухолей животных.
ТКАНЕСПЕЦИФИЧНОСТЬ активации онкогенов
Обнаружение в геноме клеток позвоночных сравнительно большого числа онкогенов можно толковать двояко. С одной стороны, этот биологический феномен, казалось бы, соответствует принципу — каждой опухоли свой онкоген. Это подразумевает высокую степень тканеспецифичности отдельных онкогенов. С другой стороны, существование нескольких онкогенов в опухолях может свидетельствовать о многоэтапном характере процесса онкогенеза, каждая ступень которого для реализации требует участия своего специфического агента.
Рассмотрим первый вариант.
Ряд авторов считают, что из всего многообразия протоонкогенов каждый активируется только в определенном типе ткани и, следовательно, специализирован на трансформацию конкретных клеток-мишеней. Эта простая схема активации онкогенов н их взаимоотношения с неопластическими процессами пока не находят солидного экспериментального подтверждения. Так, трансформирующий ген N-ras, который был обнаружен в опытах по трансфекции, связан с саркомами, лимфомами, миелолейкозом, раком толстой кишки н нейробластомами человека [Eva A. et al., 1983; Hall A. et al., 1983; Murray M. et al., 1983; Shimizu K. et al., 1983; Taparowsky A. et al., 1983]. Другой онкоген, c-myc, также вовлечен в трансформацию широкого круга в этом случае гистогенетически неродственных клеток и вероятно, активируется при малигнизации гемопоэтических клеток, клеточных элементов нервной системы, в частности в нейробластомах (в последнем случае с-тус получил название N-myc) и в нейроэндокринных опухолях толстой кишки [Dalla-Favera R. et al., 1982; Collons S., Groudine M., 1983; Schwab M. et al., 19831.
Еще два трансформирующих гена, уже семейства ras, нередко обнаруживаются в экспериментах по трансфекции; они также связаны с широким спектром гистологических типов опухолей человека и животных.
Это может означать, что протоонкогены ras и тус, с одной стороны, малоспецифичны в отношении гистотипов трансформируемых биологических субстратов, с другой — высокочувствительны к активации в разнообразных тканях. Иными словами, оба онкогена способны влиять на поведение широкого круга нормальных клеток.
Таким образом, отсутствие тканеспецифичности в активации протоонкогенов семейства генов ras н тус очевидно. Однако это положение вряд ли может быть распространено на все известные онкогены. Некоторые новые н пока малоохарактеризованные онкогены, как было показано, специфически ассоциированы с конкретным типом опухолей. К ннм относятся онкоген лимфом кур и человека B-lym, стадиеспецифический онкоген T-lym, а также онкогены mam (tx-4) н neu. В отношении онкогена пей появились предварительные данные, свидетельствующие о том, что он принадлежит к онкогенам семейства src, а именно: neu вы со ко- гомологичен v-erb В [Schechter A. L. et aL, 1984]. Наконец, G. Cooper н соавт. (1982) показали, что в процессе трансформации В-лимфоцитов, т. е. на поеледовательных стадиях дифференцировки лимфоидных клеток, активируется несколько онкогенов, имеющих уникальную природу. Поэтому нам представляется, что более адекватной схемой активации серии протоонкогенов н их связи с возникновением и развитием опухолей может быть следующая. В процессе дифференцировки клеток существуют разные уровни специализации. Общий уровень характеризуется низкой степенью дифференцировки клеток, специальный — высокой степенью дифференцировки. Онкогены семейства ras и, возможно, тус можно было бы отнести к онкогенам общего уровня дифференциации. С их включением должен наступать конечный этап прогрессии опухоли, многостадийного превращения нормальной клетки в раковую.
Как видим, это объяснение уже приближается ко второму варианту толкования множественности онкогенов. Кратко оно сводится к следующему: онкогенез — многостадийный процесс, каждая ступень которого осуществляется отдельным специфическим онкогеном. В этом есть известный параллелизм с процессом дифференциации, созревания клеток. Он является также многоступенчатым процессом, состоящим из последовательного включения н выключения «каскада» генов. Возможно, указанная аналогия неслучайна. Не исключено, как думает G. Cooper (1982), что в отношении неоплазм лимфоидной природы неуправляемые гены отдельных этапов дифференцировки суть онкогены, ассоциированные с различными стадиями онкогенеза. Эта интересная мысль привлекла внимание многих исследователей н заслуживает серьезной экспериментальной проверки.
НЕДОСТАТОЧНОСТЬ ЕДИНИЧНОГО ОНКОГЕНАДЛЯ ПОЛНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ КЛЕТОК
Изучение клеточных онкогенов привело к обнаружению и выделению ряда важных генов, участвующих в многостадийном превращении нормальных клеток в опухолевые. Тем не менее данных об активации протоонкогенов, их локализации в хромосомах и продуктах экспрессии все еще недостаточно для понимания всего комплекса молекулярных событий, имеющих место при образовании опухолей в организме. Спонтанный или индуцированный химическими канцерогенами туморогенез является не одноактным, а многостадийным и весьма сложным процессом. Многое говорит в пользу того, что формирование опухолевой клетки в определенном типе ткани требует активации и функционирования более чем одного трансформирующего гена. В то же время активация онкогенов, например относящихся к семейству ras, происходит как единичное, дискретное событие. В этом же плане можно рассматривать и транслокацию протоонкогена с-тус из хромосомы 8 в хромосому 14 при лимфоме Беркитта. Напротив, процесс деметилирования протоонкогенов можно отнести к событиям многостадийного, длительного порядка.
Противоречие между многостадийностью процесса канцерогенеза, с одной стороны, и одностадийностью активации ряда протоонкогенов —с другой наводит на мысль, что активация, например, Ha-ras, вероятно, представляет лишь один из этапов постулируемого многостадийного процесса туморогенеза. Результаты экспериментов по трансфекции клеток N1H ЗТЗ также подтверждают данное предположение. Только эти клетки трансформируются активированным одиночным Ha-ras-геном с такой высокой эффективностью, и причина подобного феномена в пре- неопластическом состоянии указанных клеток. Как полагают, в результате длительного культивирования они уже прошли более половины пути трансформации, в частности стадию иммортализации и некоторые другие, осуществляемые рядом эндогенных онкогенов, подойдя к последнему, возможно, уже одностадийному акту перехода в полностью трансформированное состояние. Такой этап и осуществляет вносимый извне онкоген ras.
Для проверки высказанного положения исследователи ряда лабораторий стали использовать для трансфекции геном Ha-ras другие реципиентиые клетки. В этих исследованиях были получены доказательства ограниченности (дефектности) трансформирующей способности отдельного онкогена, функционирующего в одиночку, н свидетельства необходимости кооперативного взаимодействия различных онкогенов для осуществления неопластической трансформации (Newbold R., Brookes Р., 1976; Land Н. et al., 1983; Ruley E., 1983].
H. Land и соавт. (1983) в качестве реципиентных для Ha-ras- онкогена клеток использовали, как уже указывалось в преды-
душ их разделах книги, вторичные эмбриональные фибробласты крыс (REF), прошедшие лить несколько пассажей и мало отличающиеся от полностью «нормальных» клеток. Трансфекция монослоя REF препаратом онкогена Ha-ras не приводила, как это имело место в опытах с NIH ЗТЗ-фибробластами, к формированию очагов трансформации клеток. Подобные условия трансфекции онкогена в системах NIH ЗТЗ или rat 1 приводили к формированию сотен очагов трансформации монослойных культур. Специальные опыты показали, что результаты трансфекции зависят не столько от трансформирующих свойств онкогена Ha-ras, сколько от «ответа» реципиентных клеток REF на экзогенный онкоген. В трансформированных клетках REF онкоген ras не экспрессировался, т. е. находился в полностью «молчащем» состоянии. Если эти клетки спустя несколько недель культивирования переносили в полужидкий агар, то в этих условиях через 2— 3 нед наблюдался рост колоний трансформантов. Следовательно, лишь один признак, характеризующий трансформацию клеток и проявляющийся в субстратиезависимой пролиферации в агаре, контролировался онкогеном ras (см. гл. 4).
Известно, что в ряде лабораторий изучалась трансформирующая способность препаратов ДНК из опухолей человека и животных для гомологичных нормальных фибробластов. Как в ранних исследованиях, так и в более поздних работах все многочисленные попытки обнаружить в этих условиях трансформирующий эффект опухолевых образцов ДНК были безуспешными [Князев П. Г. и др., 1980].
На сегодня известна лишь одна публикация возможной (положительной) трансформации диплоидных фибробластов человека препаратами ДНК, изолированными из клеточной линии MOLT-4; эта линия имеет лимфобластоидное происхождение [Sutherland В., Bennett Р., 1984]. Реципиентные клетки после трансфекции указанным препаратом ДНК приобретали способность к субстратиезависимой пролиферации, которая сохранялась свыше 30 пассажей клеток. Трансформирующий эффект препарата ДНК MOLT-4 снимался обработкой ДНКазой и некоторыми эндонуклеазами рестрикции, например Bg[ II и BamH I. Следует отметить, что в клеточной линии MOLT-4 ранее в экспериментах по трансфекции клеток NIH ЗТЗ был идентифицирован трансформирующий ген ras [Eva A. et al., 1983). Возможно, что дальнейшие опыты с этой линией клеток позволят установить роль онкогенов семейства ras в трансформации первичных фибробластов человека препаратом ДНК MOLT-4.
В соответствии с идеей недостаточности для полной трансформации клеток одиночного гена, работающего лишь на конкретном отдельном этапе злокачественной трансформации клетки, эти неудачи становятся понятными. Тем не менее использование в качестве реципиентных клеток NIH ЗТЗ, отличающихся гиперчувствительностью к трансформации, можно рассматривать как
несомненную удачу, приведшую к выявлению целого ряда онкогенов и их последующей идентификации.
Таким образом, трансформирующие свойства онкогена Ha-ras оказались существенно ограниченными в случае испытания в клетках REF. Однако если в качестве реципиентных клеток использовались перевивные или иммортализованные («бессмертные») культуры, такие как NIH ЗТЗ или rat 1, то последующее введение в эти культуры онкогена сопровождалось их одностадийной трансформацией в полностью злокачественное состояние. Иными словами, одним из необходимых условий перевиваемости или иммортализации клеток в условиях культуры является активизация клеточной функции, способной кооперировать с геном ras в формировании полностью трансформированного фенотипа.
Следовательно, единичное генетическое событие (точковая мутация), приводящее к образованию трансформирующих генов семейства ras, само по себе еще недостаточно для достижения злокачественного перерождения нормальных фибробластов. Необходимо другое повреждение (точная природа которого еще не установлена), способное к кооперированию с трансформирующим геном. В этом случае наступает кажущаяся «одностадийная» трансформация фибробластов, что в ее истинной сущности не противоречит общей модели многоступенчатой природы канцерогенеза.
Следующий шаг в направлении определения трансформирующей способности активированного онкогена Ha-ras в отношении первичных фибробластов грызунов был сделан D. Spandidos и N. Wilkie (1984). Эти авторы установили, что для злокачественной трансформации первичных фибробластов онкогеном Ha-ras необходимо его лигирование с транскрипционным усилителем (enhancer), который существенно усиливает экспрессию трансформирующего гена. При этом лигирование протоонкогена c-Ha-ras I с enhancer и последующая трансфекция указанных реципиентных клеток приводили лишь к иммортализации, но не трансформации клеток [Spandidos D., Wilkie N., 1984].
КООПЕРИРОВАНИЕ МЕЖДУ ОНКОГЕНАМИ
Как указывалось выше, современная схема канцерогенеза предполагает «кооперативное» действие нескольких онкогенов, так называемого «каскада» онкогенов. Ниже этот вопрос рассматривается более подробно.
Кооперирование между трансформирующими генами и вирусными онкогенами. Взаимодействие ряда онкогенных ДНК-содер- жащих вирусов (вируса полиомы н аденовирусов) с клетками-мишенями сопровождается индукцией пролиферации инфицированных клеток. Стабильные клеточные линии (иммортализованные) были получены также путем трансфекции соответствующих реципиентных клеток вирусными генами [Houweling A. et al.,
1980; Rassoulzadegan M. et al., 1982]. В последующем эти довольно специфические изменения клеток стали связывать с активностью конкретных локусов вирусного генома — онкогенов. Онкогены ДНК-содержащих вирусов, в отличие от ретровирусных онкогенов, являются истинно вирусными (подробнее см. гл. 3). Эти онкогены необходимы для репликации вирусного генома, т. е. они представляют собой конституционные гены и облигатно присутствуют в вирусном геноме на всем протяжении эволюции самих вирусов и эукариотов.
В случае вируса полиомы три различных белка («малый», «средний» и «большой» Т-антигены) кодируются «ранней» репликативной областью генома, которая также активна в процессе вирусной трансформации клеток. Анализ структуры этих генов показал, что они являются «перекрывающимися» генами внутри вирусного генома. R. Kamen и соавт. (1981) сконструировали клоны указанных генов путем получения их ДНК-копий в реакции обратной транскрипции трех ранних вирусных иРНК. Определение биологической активности клонов показало, что они обладают различными свойствами н эффектами, в результате чего удалось связать два клона со средним и большим антигенами.
В экспериментах по трансфекции средний антиген индуцировал морфологические изменения и независимую от субстрата пролиферацию реципиентных клеток, тогда как большой Т-антиген создавал независимость клеток от сыворотки и длительности культивирования [Houweling А., 1980]. Эти и другие результаты имели большое значение для общего понимания механизма трансформации и дальнейших исследований данного явления, так как выявили ряд конкретных критериев трансформации клетки и определили роль в этом процессе экспрессии разных вирусных генов. Вероятно, фенотипы «перевиваемости» и «иммортализации», которые позволяют клеткам «отвечать» на онкоген ras, связаны с одним или несколькими вирусными онкогенами.
Далее Н. Land и соавт. (1983) показали, что при котранс- фекции клеток REF онкогенами средним Т и ras фенотип реципиентных культур не отличался от такового при введении лишь одного гена в отдельности. Однако котрансфекция эмбриональных фибробласте! онкогенами большим Т и ras приводила к критическим изменениям реципиентных клеток: в культуре REF быстро появлялись пролиферирующие фокусы трансформированных клеток. Эти фокусы роста состоял и из трансформированных клеток, формирующих перевиваемые клеточные линии и опухоли у иммунодефицитных мышей.
Таким образом, в этих экспериментах были получены доказательства недостаточности, «дефектности» одиночного трансформирующего гена ras в отношении эмбриональных фибробластов. которые, однако, при действии двух онкогенов (один из них — v-onc) подвергались полной злокачественной трансформации [Land Н. et al., 1983].
Аналогичные результаты кооперативного взаимодействия онкогенов были получены при изучении трансформирующих свойств онкогенов и Ela («ранней области» генома аденовирусов) в экспериментах по трансфекции нормальных клеток. В этом случае ген большого антигена вируса полиомы был заменен на аденовирусный ген Ela, что сопровождалось также злокачественной трансформацией клеток [Ruley Е., 1983].
Следовательно, в обоих случаях превращение нормальной клетки в опухолевую достигалось лишь кооперативным взаимодействием двух различных генов: одного — клеточного, другого вирусного.
Подобная схема кооперативной трансформации в процессе канцерогенеза первичных фибробластов двумя онкогенами нс является, как теперь стало ясно, абсолютной. Если активированный (т. е. содержащий точковую мутацию) Ha-ras лигировать с сильным усилителем, то такая конструкция способна вызывать малигнизацию первичных фибробластов без кооперации с известным клеточным или вносимым извне в процессе трансфекции вторым онкогеном |Spandidos D.. \\ Ikie N., 1984].
Кооперация между геном ras и вторым клеточным онкогеном в процессах трансформации. В предыдущем разделе были рассмотрены экспериментальные данные, свидетельствующие о принципиальной возможности кооперативного взаимодействия трансформирующего гена ras с вирусными онкогенами в процессе злокачественной трансформации нормальных клеток. Однако эти результаты не могут рассматриваться как адекватные в тех случаях канцерогенеза, при которых участие онкогенных вирусов не зарегистрировано. Особенно это относится к ДНК-солержащим вирусам, чьи онкогены в геноме нормальных н опухолевых клеток пока не обнаружены. Неясно также, существуют ли клеточные гены, подобные большому Т или Ela, способные кооперировать с ras в процессе опухолеобразования.
Уже в ранних исследованиях было установлено, что наиболее вероятным кандидатом на роль второго, дополняющего, гена является клеточный онкоген тус. Этот онкоген, находящийся в активированном состоянии (амплификация или транслокация), довольно часто ассоциирован с трансформирующими генами семейства ras или B-lym, которые способны самостоятельно, «соло», трансформировать клетки NIH ЗТЗ. Вероятно, совместное сосуществование этих активных онкогенов в опухолевых клетках нейробластом, лимфом и промиелопитарной лейкемии отражает ту существенную роль, которую они выполняют совместно в ходе процесса туморогенеза.
Н. Land н соавт. (1983) в экспериментах по трансфекции показали, что v-myc при введении в реципиентные клетки NIH ЗТЗ, rat I или REF не вызывает их трансформации. Однако, когда клетки REF были трансфецированы двумя клонами ДНК, несущими вставки v-myc и Ha-ras одновременно, быстро выявлялись
плотные очаги морфологически трансформированных клеток. Следовательно, действуя одновременно, тус и ras способны осуществлять то, что каждый из них в отдельности осуществить не может. Котрансфецированные клетки в последующем довольно быстро превращались в стабильно трансформированные, интенсивно пролиферирующие культуры. В местах введения таких клеток иммунодефицитным мышам через 7—10 дней возникали опухоли fLand Н. et al., 1983].
Эти результаты дают положительный ответ на вопрос о том, являются ли клеточные онкогены, как н онкогены, обнаруженные в геноме ДНК-содержащих вирусов, функционально гетерогенными. По-видимому, различные онкогены осуществляют в клетке качественно отличные эффекты. Подобное утверждение требует переосмысливания понятия «онкоген», которое не может означать просто ген, индуцирующий морфологические изменения н формирование очагов трансформации. Отдельные онкогены вносят конкретный частный вклад в различные пути превращения нормальной клетки в опухолевую. Возникает вопрос: сколько различных онкогенных функций должно кооперироваться для того, чтобы превратить клетку-мишень в принципиально другую клетку, с фенотипом н характеристиками опухолевой? Рассмотренные выше экспериментальные данные указывают на то-, что достаточно как минимум экспрессии онкогенов тус н ras. Однако для возникновения истинно опухолевых клеток в организме, вероятно, требуется экспрессия большего числа онкогенов или просто генов. Не исключено, что поиск третьей, четвертой и других функций может потребовать от исследователей разработки новых подходов и методов.
Тем не менее принципы поиска в этой области молекулярной онкологии уже ясны.
ЭКСПРЕССИЯ ТРАНСФОРМИРУЮЩИХ ГЕНОВВ НОРМАЛЬНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА
Онкогены, изолированные из различных ретровирусов позвоночных, широко используются в настоящее время как пробы для обнаружения в геноме человека родственных последовательностей ДНК и, таким образом, выявления потенциальных опухолеродных генов (с-опс). Однако один лишь факт присутствия вирусных двойников в генетическом материале клеток человека и животных еще не доказывает их причинной роли в возникновении неоплазм, так как указанные гены могут находиться в неактивном, «молчащем» состоянии, что, вероятно, имеет место в случае подавляющей массы генов позвоночных. Для реального функционирования генов, их участия в каком-то биологическом процессе необходима экспрессия этих генов в виде иРНК н белков. С точки зрения большинства исследователей, факт экспрессии онкогенов в геноме человека указывает на их возможную роль
в этиологии неоплазм, а изучение экспрессии приобретает первостепенное значение.
В этом плане само существование и доступность использования стандартных ретровирусных онкогенов, позволяющих методом гибридизации регистрировать присутствие н экспрессию клеточных онкогенов, имеют большую ценность. Гибридизация стандартных проб вирусных онкогенов с РНК-продуктами экспрессии клеточных онкогенов явилась эффективным средством суждения об активности, функционировании онкогенов — как нормальных клеточных, так н опухолевых.
Наличие в руках исследователей вирусных онкогенов (в виде молекулярных зондов) открыло широкие возможности поиска РНК-транскриптов гомологичных генов в нормальных н опухолевых клетках человека и животных, а также позволило установить локализацию ряда трансформирующих генов в отдельных хромосомах.
Принципиальная возможность экспрессии онкогенов в фенотипически «нормальных» клетках впервые была показана в неин- фицированных фибробластах нескольких видов птиц, которые содержали РНК-транскрипты, гомологичные v-arc |Spector D. et al., 1978]. Экспрессия некоторых протоонкогенов в нормальных клетках не зарегистрирована, например c-mos JGattoni S. et al., 1982; Muller R. et al., 1982]. Транскрипция большинства других протоонкогенов в различных нормальных клетках изучена пока недостаточно. Тем не менее некоторые общие закономерности экспрессии с-опс-генов, гомологичных онкогенам ретровирусов птиц, были установлены. Это касается генов c-src, c-myb, c-myc, c-erb и сводится к следующему; 1) каждый c-onc-ген может транскрибироваться в разнообразных клетках и тканях широкого круга позвоночных; 2) транскрипция любого протоонкогена, по-видимому, контролируется клетками одной ткани независимо от другой таким образом, что с-опс-гены экспрессируются в зависимости от «потребности» только определенной ткани; 3) транскрипция протоонкогенов не скоординирована с экспрессией эндогенных генов ретровирусов; 4) размер транскрибируемой с различных протоонкогенов иРНК в клетках различных видов позвоночных сходен; 5) в нормальных клетках животных с-опс- гены —c-src, c-myb, c-myc — транскрибируются в единичные копии [Bishop J., Varmus Н., 1982].
Эти принципы экспрессии клеточных онкогенов хорошо согласуются с представлениями о том, что каждый генетический локус протоонхогенов генерирует транскрипты одного гена. Однако транскрипция гена c-erb в этом отношении является исключением.
Как минимум 4 типа зрелых иРНК были обнаружены в клетках разных типов тканей, что свидетельствует о возможности независимой транскрипции двух доменов этого гена: c-erb А н c-erb В (см. м. 3).
Важные данные по экспрессии с-опс-генов были получены при анализе их транскрипции в процессе эмбрио- и онтогенеза [Miiller R. et al., 1982; Miiller R., 1983]. В процессе эмбриогенеза и раннем периоде онтогенеза мышей была обнаружена постоянная транскрипция протоонкогенов c-Ha-ras н c-Ki-ras, а также тран- зиторная, в зависимости от типа ткани и стадии развития эмбриона, экспрессия протоонкогенов c-fos, c-fms н c-abl. Наи- больи1ий уровень транскрипции c-fos был зарегистрирован в костной ткани новорожденных мышей, тогда как ген c-fos практически не экспрессировался в других тканях. Данные особенно интересны потому, что именно ген v-fos связан с индукцией остеосарком новорожденных мышей. Авторы подчеркивают, что препараты костной ткани новорожденных мышей содержат костный мозг и некоторое количество тканей иного происхождения. При дополнительном анализе не выявили заметного увеличения транскрипции c-fos в клетках костного мозга и клетках гемопоэтического происхождения. Полученные результаты позволили авторам впервые установить связь экспрессии протоонкогена c-fos с пролиферацией и дифференцировкой мезенхимальных клеток.
В последующем R. Miiller и соавт. (1984) установили, что экспрессия c-fos в костном мозге мышей связана именно с макрофагами. Только культуры макрофагов характеризовались повышенным уровнем экспрессии c-fos. Более того, если клетки HL-60 стимулировали к дифференцировке до макрофагов (например, диметилсульфоксидом), то уровень экспрессии этого гена, как правило, возрастал и был максимальным именно в макрофагах. Следует отметить, что экспрессия других протоонкогенов, с-тус н c-myb, в процессе дифференцировки клеток HL-60 снижалась и полностью отсутствовала в макрофагах. Эти данные позволяют предположить, что c-fos как бы «ограничивает» дальнейший процесс дифференцировки на ее поздних стадиях, а с-тус н c-myb каким-то образом ассоциированы с пролиферацией клеток. Протоонкоген c-fos, по-видимому, является первым идентифицированным геном, тесно связанным с процессом дифференцировки.
Сходные данные был и получены в опытах с экспериментальными миелоидными лейкозами мышей [Gonda Th., Metcalf D., 1984]. Авторы предполагают, что активация экспрессии c-fos в макрофагах может отражать также их специфическую функцию на этой стадии дифференцировки.
Транскрипция протоонкогена c-fos значительно усиливается после обработки клеток NIH ЗТЗ, находящихся в стационарной фазе, фактором роста. Экспрессия c-fos является наиболее быстрым ответом генома клеток на ЭФР, РФТ, ТРА, а-аманитин и сыворотку крови [Greenberg М., Ziff Е., 1984]. Уже через 15 мин после стимуляции клеток к росту, например, сывороткой крови регистрируется экспрессия c-fos, затем а-актина, и лишь через 30 мин возрастает экспрессия с-тус. Вероятно, продукт гена c-fos принимает участие также в регулировке клеточного цикла.
Другой протоонкоген, c-abl, как показали R. Muller н соавт. (1983), максимально экспрессируется в среднем периоде эмбриогенеза мышей. Сравнительный аналнз топографии транскрипции с-abl позволил авторам установить природу клеток, содержащих большое количество РНК-транскриптов этого гена. Ими оказались ткани лимфоидных органов (тимуса н селезенки), что также может указывать на возможную физиологическую роль с-аЫ в процессе дифференцировки стволовых клеток лимфоидного ряда. Авторы указывают на возможную связь между повышенной экспрессией с-abl в лимфоидных клетках н пре-В-клеточным лейкозом мышей, который индуцируется интеграцией v-abl онкогена, поступающего в геном В-лимфоцитов в составе ДНК-провируса вируса Абельсона мышей.
Неожиданные результаты были получены при анализе транскрипции с-abl в половых клетках эмбрионов н взрослых мышей. Экспрессия c-abl наблюдалась в половых клетках среднего периода эмбриогенеза мышей, однако очень высокий уровень транскрипции этого гена обнаружен в яичках взрослых особей. При этом выявлялся специфический РНК-транскрипт с молекулярной массой 3,7 т. о. Существование в половых клетках указанного аЫ-транскрипта свидетельствует о том, что инициация, терминация и сплайсинг РНК модулируются исключительно тканеспецифическим механизмом [Miiller R., 1982]. Гиперэкспрессия с-аЫ в половых клетках не сопровождалась реаранжировкой, транслокацией или амплификацией этого гена.
Влияние экспрессии c-Ha-ras, а также семейства протоонкогенов ras в целом на физиологические процессы эмбриогенеза недостаточно ясно, хотя этот ген транскрибируется в эмбрионе на всех стадиях развития, в экстраэмбриональных тканях, во всех клеточных линиях тератокарцином и даже в тканях 10-дневных мышат. Эти результаты позволили авторам высказать предположение о том, что продукт гена ras необходим на всех этапах развития, роста н дифференцировки эмбриона [Miiller R., 1983] Напротив, в тканях взрослого организма подобная корреляция между пролиферацией клеток и транскрипцией c-ras выявляется менее отчетливо. Не исключено, что гетерогенность клеточных популяций в тканях взрослого организма, их разная степень пролиферации как бы маскируют истинную роль в этом процессе c-Ha-ras.
Ряд авторов полагают, что в дифференцированной и не пролиферирующей клетке протоонкогены не экспрессируются [Muller R. et al., 1982]. Однако это положение оспаривается большинством исследователей, и решение вопроса зависит, в первую очередь, от методических приемов и объектов исследования, т. е. выбора адекватной клеточной популяции и определения критериев «завершенности» процесса дифференцировки.
Установление различной транскрипционной активности трансформирующих генов в процессе эмбриогенеза и раннем постна-
тальном развитии мышеи подтверждает широко распространенное мнение о том, что эти гены вовлечены в контроль процессов развития, таких как пролиферация и дифференцировка [Bishop J et al., 1981; Miiller R. et al., 1982]. В дальнейшем для окончательного доказательства этого положения^ необходимо подтвердить корреляцию между уровнем транскрипции и синтезом в клетках соответствующих онкобелков. Выявление н идентификация онкобелков в клетке сопряжены с большими методическими трудностями. Успех зависит, главным образом, от получения антисывороток, реагирующих с продуктами соответствующих вирусных онкогенов. Тем не менее 4 онкобелка, кодируемых протоонкогенами, уже идентифицированы: 1) pp60csrc, 60 кд- фосфопротеин, кодируемый c-src-геном [Sefton В. et al., 1980]; 2) р21с Haras, 21 кд- фосф опротеи н, кодируемый c-Ha-ras-геном [Langeheim Н. et al., 1980]; 3) р 150c ab, 150 кд, кодируемый, вероятно, c-abl-геном [Witte О. et al., 1979], и, наконец, 4) p92c fes, 92 кд, также, вероятно, кодируемый c-fes-геном [Bakker Р., 1982]. Белки ррбО '「с и р2ГHa ras были достаточно хорошо изучены; они оказались практически идентичными их вирусным дво访ннкам по структуре н функции [Sefton В. et al., 1980; Wierenga R., Hol W., 1983]. Оба обнаружены в многочисленных тканях разных видов животных. Остальные клеточные онкобелки пока не изучены.
Несомненная связь транскрипции протоонкогенов с пролиферацией и дифференцировкой клеток, нарушение которых при малигнизации имеет ключевое значение, настоятельно требует выявления подобного участия экспрессируемых с-опс-генов в трансформации клеток и формировании злокачественных опухолей в организме человека.
A. Eva и соавт. (1982) изучили экспрессию c-myc, c-abl. c-sis и c-fos в клеточных линиях, полученных из карцином, сарком, меланом, глиобластом и тератокарцином человека. Все эти клеточные линии, включая нормальные фибробласты человека, содержали лишь единичный транскрипт размером 2,7 т. о., гомологичный онкогену тус. Авторы отмечают, что размер транскрипта с-тус эквивалентен таковому, найденному ранее в клетках птиц и грызунов. Однако в 4 клеточных линиях, происходящих из саркомы, 2 карцином и л им фобл астно го лейкоза, обнаружен исключительно высокий уровень транскрипции протоонкогена с-тус. Из 23 клеточных линий опухолей человека в 8 те же авторы выявили присутствие РНК-транскрипта размером 4,2 т. о., родственного c-sis. В большинстве случаев это были саркомы н глиобластомы, в их числе не оказались лишь карциномы н меланомы человека. РНК-транскрипты, родственные bas- и аЫ-пробам, были обнаружены во всех тестированных опухолевых клеточных линиях, включая и нормальные фибробласты человека. Однако обе указанные пробы гибридизировались с одинаковыми РНК- транскриптами, размерами 7,0, 5,9 и 1,8 т. о. Этот странный результат авторами не обсуждается, однако он может означать.
что идентичные по размеру молекулы РНК в клетке могут выявляться в том случае, когда два онкогена имеют частичную гомологию.
D. Spandidos и I. Kerr (1984) изучили экспрессию онкогенов семейства ras в нормальной слизистой оболочке толстой и прямой кишки, а также в предопухолевых полипах и опухолях. Авторы обнаружили значительное, по сравнению с нормой, повышение экспрессии онкогена ras в предопухолевых и опухолевых тканях. Они полагают, что активация онкогенов семейства ras имеет место в ходе развития опухолей толстой и прямой кишки, однако повышенная экспрессия этих онкогенов еще недостаточна для развития процесса канцерогенеза.
Клонированные вирусные онкогены также использовались для изучения экспрессии трансформирующих генов в опухолевых клетках гемопоэтического происхождения. Е. Westin н соавт. (1982) установили, что экспрессия c-myb наблюдается во всех случаях пролиферации миелобластов. Индукция дифференцировки клеток HL-60 диметилсульфоксидом приводила к прекращению транскрипции c-myb. Транскрипты РНК, гомологичные с-аЫ, c-bas, c-myc и c-sis, выявлялись как в нормальных клетках костного мозга, так и в бластных клетках больных острыми лейкозами. Авторы подчеркивают, однако, что экспрессия указанных с-опс-генов не имеет специфической связи с конкретным неопластическим процессом.
Однако во всех тестированных случаях лимфом, лимфосарком и лимфолейкозов (независимо от В-, Т- или В/Т-формы) была обнаружена экспрессия протоонкогена c-erb В. Этот ген был активен также и в нормальных лимфоцитах периферической крови [Roy-Burman Р. et al., 1984]. Учитывая тот факт, что продукт протоонкогена c-erb В имеет значительную гомологию с рецептором эпидермального фактора роста, эти данные указывают на существенную роль c-erb В в жизнедеятельности лимфоцитов человека.
Этот вывод подтверждается дальнейшим скринингом экспрессии протоонкогена с-тус в опухолевом материале больных лейкозами. Как показали Р. Rothberg и соавт. (1984), повышенная экспрессия с-тус обнаружена у 22 больных (из 106). В 17 наблюдениях это были острые миелолейкозы, а в 5 — лимфомы. Авторы обнаружили реаранжировку этого гена в геноме только больных лимфомами в фазе обострения (лейкемическая стадия). Следовательно, повышенная экспрессия с-тус не обусловлена наблюдаемыми его генетическими нарушениями, поскольку последние обнаружены не во всех изученных случаях.
Dale и В. Ozanne (1983) использовали вирусный онкоген аЫ для скрининга экспрессии протоонкогена c-abl в клетках больным острым лимфолейкозом. Несмотря на то, что многие клеточные линии содержали незначительное количество транскриптов РНК c-abl, их количество резко возрастало в тех
клеточных линиях, которые имели характеристики пре-В-клеточ- ных лейкозов мышей.
А. Г. Татосян н соавт. (1983) провели скрининг экспрессии протоонкогенов в биопсийном материале многих опухолей человека. В этих исследованиях было установлено, что в большинстве тестированных неоплазм экспрессируются множественные онкогены (анализ поли А-РНК).
Изучение экспрессии клеточных трансформирующих генов в опухолевых клетках фактически только началось. Для некоторых опухолей человека повышенная транскрипция с-опс-генов может иметь причинный характер для развития опухоли. В этом плане можно думать об использовании теста на экспрессию онкогенов в диагностических целях. В близком будущем, возможно, этот подход станет неотъемлемой частью общей характеристики того или иного онкогена.
КАНЦЕРОГЕНЕЗ: «ОДНОУДАРНАЯ КИНЕТИКА»ИЛИ «КАСКАД ОНКОГЕНОВ»?
Молекулярная онкология, несмотря на свою «юность», успела занять центральное место в современной теоретической онкологии благодаря поразительным успехам в расшифровке молекулярного механизма онкогенеза. Эта, сегодня фактически самостоятельная, наука представляет естественный сплав, «рекомбинант» молекулярной биологии, молекулярной генетики и генной инженерии с онкологией. Указанное утверждение не следует понимать в том смысле, что первые три играют роль лишь технических приемов, а последняя, и только она, задает идейно-теоретическую канву.
Молекулярная биология давно вышла за рамки методов Ее подходы к pacuiH巾ровке явлений жизни приобрели методологическое значение. Она не только коренным образом изменила возможности получать ответы на вопросы, задаваемые природе биологами, медиками, онкологами, но н позволила ставить принципиально новые, ранее не возникавиже. Доступность анализа на уровне отдельных генов и их составных частей изменила характер ряда естественных наук, причем не только в отношении их методических возможностей, но и в самой научной идеологии, прежде всего биологии и медицины. Поэтому, обогатившись за счет методов н принципов молекулярной биологии, теоретическая онкология изменилась качественно, все больше превращаясь в онкологию молекулярную. Именно молекулярно-биологический подход помог преодолеть тот идейный застой и экспериментальный тупик, которыми характеризовались последние десятилетия в теоретической онкологии. Открытие онкогенов явилось первым сигналом того, что топтание на месте кончилось н начался новый этап движения вперед.
Одним из лидеров современной молекулярной онкологии является стремительно выдвинувшийся в последнее время на
первый план экспериментатор н теоретик из Массачусетского технологического института R. Weinberg. Он с завидной легкостью, без видимых усилий находит логические объяснения любым новым фактам, в том числе н собственным. Эта легкость, однако, не выглядит поверхностной спекуляцией. Примером могут служить его собственные экспериментальные данные и их теоретическое толкование, представленные в одной из недавних публикаций [Land Н. et al., 1983]. R. Weinberg и его сотрудники изучали роль отдельных онкогенов в интегральном процессе канцерогенеза на новой трансфекционной тест-системе — крысиных эмбриональных фибробластах (КЭФ), имеющих перед традиционно используемыми культурами NIH ЗТЗ-клетками (далее ЗТЗ-клетки) то преимущество, что они более нативны, не нмморталнзованн и не npouimH, как последние, половину, если не более, пути в сторону трансформированного состояния в результате длительного культивирования. Эта работа R. Weinberg н его сотрудников имеет принципиальное значение и заслуживает подробного рассмотрения.
Авторы изучали роль одиночных онкогенов и совокупное действие нескольких из них в процессе частичной н полной клеточной трансформации. Были избраны два наиболее распространенных в человеческих опухолях и причастных к их развитию онкогена: ras и тус, а также (в целях выяснения механизма процесса) гены большого н среднего Т-антигенов полиомы.
Исходными моментами исследования являлись два тезиса: 1) система ЗТЗ-клеток не является адекватной для характеристики и выяснения механизма полного процесса клеточной трансформации; 2) канцерогенез является многоступенчатым, а не одностадийным процессом и должен включать участие не одного, а нескольких специфических трансформирующих генов.
Уже и ранее высказывалось мнение, что ЗТЗ-клетки полу- трансформированы и уже прошли ряд этапов по пути трансформации, в которых, возможно, принимали участие несколько онкогенов, осуществлявшие отдельные этапы процесса: установление характеристик культуры клеток, иммортализации и т. д. В результате и единичные онкогены, даже «конечные», т. е. онкогены завершающего этапа трансформации, такие как ras, оказываются эффективными в опытах по трансфекции с ЗТЗ-клетками. Опыты R. Weinberg и его сотрудников показали, что эмбриональные фибробласты крысы при трансфекции человеческим онкогеном ras не превращаются в опухолевые клетки, если до этого клетки не установлены в культуре и не подверглись иммортализации. Наоборот, эмбриональные фибробласты становятся туморогенными, если вводится, по крайней мере, еще один онкоген, например вирусный или клеточный тус, или ген, кодирующий полиомный большой Т-антиген, вместе с геном ras.
Многочисленные исследования указывали, что канцерогенез является процессом, включающим несколько независимых ступе-
ней. В пользу этого говорят эпидемиологические исследования, свидетельствующие, что частота рака пропорциональна множественным импульсам протекшей жизни. Данные патологии, в свою очередь, показывают, что опухоли прогрессивно развивают новые фенотипы в результате прохождения через серию отдельных стадий, таких как анаплазия, метаплазия и неоплазия. Более того, в ряде экспериментальных систем индукция опухоли требует по меньшей мере двух отличающихся друг от друга стимулов, а именно инициации и промотера.
На клеточном уровне положение о многоступенчатом характере трансформации и канцерогенеза менее демонстративно и кажется менее убедительным. Прежде всего это объясняется некоторыми опытами с первичными культурами клеток грызунов, которые могут становиться туморогенными, как это внешне выглядит, в одну ступень после инфекции in vitro опухолеродными вирусами, например вирусом полиомы или аденовирусами. Но это лишь кажущееся отклонение от многоступенчатого принципа канцерогенеза. Недавние исследования показали, что каждый из упомянутых вирусов несет, по крайней мере, два гена, отчетливо кодирующих разные функции, каждая из которых должна быть экспрессирована, чтобы фенотип опухолевой клетки был реализован. На генетическом уровне этот процесс можно представить как цепь последовательной активации и экспрессии генов, обусловливающих и определяющих в совокупности формирование опухолевого фенотипа..
Прецеденты, демонстрирующие существование модели множественных, кооперирующихся и независимо активируемых генов, известны. Так, индукция бурсовой лимфомы птичьим лейкозным вирусом требует активации двух отдельных онкогенов в ходе лимфомогенеза. Ген тус активируется благодаря инсерции по соседству с ним провируса, тогда как недавно открытый ген B-lym становится активным благодаря действию другого механизма, природа которого выясняется. В этом плане в лаборатории R. Weinberg проведена работа с промиелоцитной лейкемией и лимфомой Беркитта. В обоих случаях, как оказалось, опухолевые клетки несли измененные варианты гена тус, равно как и активированные варианты второго клеточного онкогена, названного N-ras.
В противоречии с «многоступенчатой» схемой канцерогенеза находятся опыты с ЗТЗ-клетками, в которых полная трансформация осуществляется по «одноударному» типу кинетики. Введенный в них онкоген (в составе ДНК, трансфекция) приводит к появлению множественных копий онкогена в реципиентных фибробластах, хотя для осуществления полной трансформации достаточно единственной копии онкогена.
Объяснение этого парадокса заключается именно в том, что ЗТЗ-клетки ведут себя в ответ на онкогены как уже частично трансформированные. Эти клетки были «установлены» как куль-
тура (т. е. адаптированы к бесконечному росту в однослойной культуре) и затем интенсивно пассированы in vitro. Это уже предполагало, что они будут отклоняться от нормальных клеток- мишеней в ответ на онкогены in vivo. Как результат культивирования in vitro ЗТЗ-клетки, по-видимому, приобрели ряд изменений, разви аемых клетками в ходе их опухолевой прогрессии. Эти изменения могут предрасполагать ЗТЗ-клетки к туморогенному превращению в результате последующего «одноударного» события. Именно с учетом нежелательной (для оценки сущности действительного механизма процесса трансформации) возможности ложной простоты, одноэтапности трансформации, R. Weinberg и его сотрудники перешли в своей работе на крысиные фибробласты, полагая, что эти клетки более соответствуют нормальным мишеням канцерогенного превращения.
Неполная трансформация онкогеном ras. R. Weinberg и его сотрудники использовали трансформирующий ген, изолированный из линии клеток EJ карциномы мочевого пузыря человека, как молекулярный клон pEJ 6,6. Он является вариантом человеческого клеточного протоонкогена c-Ha-ras 1 и кодирует белок с молекулярной массой 21 кд (р2I).
Этот онкоген близкородствен другим членам семейства ras: Ki (Кирстен)-ras- и N-ras-онкогенам, которые активны в нескольких различных опухолях.
Оказалось, что активность онкогена EJ-ras ограниченна. Он не был способен побуждать трансфецированные КЭФ к фокусной экспансии в плотной монослойной культуре (что мог делать в ЗТЗ-фибробластах). Трансфецированные КЭФ имели лишь ограниченную пролиферативную активность и не были туморогенными при введении в организм животного-хозяина. Однако активности, недостающие у онкогена, могли быть дополнены клеточными функциями, существовавшими в КЭФ до трансфекции. Эти факты побудили авторов сделать заключение, что процесс культивации КЭФ in vitro обеспечивает их функциями, которые сотрудничают (соучаствуют) с онкогеном EJ-ras в создании компетентной опухолевой клетки.
Кооперативные эффекты тус и ras. Следующей задачей исследования R. Weinberg и его сотрудников было установить более тонкий механизм того, как совместно работают онкоген EJ-ras и клеточные функции (точнее говоря, кодирующие их клеточные гены) в создании опухолевой клетки. Возможным таким клеточным геном был клеточный ген тус. Выше указывалось, что измененные варианты этого гена сосуществуют и «сотрудничают» с акивным EJ-ras-онкогеном по меньшей мере в двух человеческих опухолевых клеточных линиях.
R. Weinberg и сотрудники испытали ген тус в форме онкогена, несомого вирусом птичьего миелоцитоматоза МС29. Молекулярный клон его провируса, названный pv-myc, был ранее получен J. Bishop.
2 .TRЛАМ-ГП2 .TRЛАМ-ГПgag mycgag myc
2 .TR
ЛАМ-ГП
2 .TR
ЛАМ-ГП
gag myc
gag myc
Высокая степень консервативности гена myc указывает, что онкоген МС 29, возникнув из птичьего генома, мог бы, тем не менее, быть способен функционировать и в крысиных клетках. Полный провирусный клон был получен путем присоединения кольцевого измененного провирусного клона к дополнительному провирус- ному сегменту на его правом (3‘ 一 провирусном) конце. Это создало тандемно-дуплицированные сегменты LTR на левом (5'-прокснмальном) и правом (З'-проксимальном) концах провируса. Таким образом, представилась возможность испытать биологические свойства этих v-myc -клонов. Каждая ДНК наносилась на ЗТЗ-клетки, КЭФ (первого или второго цикла) или отдельно, или вместе с ДНК Ecogpt-клона. При этом не наблюдали эффекта на трансфецированные клетки.
В последующих опытах тестировали действие онкогенов ras и EJ-ras, введенных вместе в 2° КЭФ. В условиях, в которых EJ-ras или тус раздельно не оказывали эффекта на многослойные культуры, два гена совместно вызывали драматические изменения фенотипа. Быстро растущие фокусы морфологически измененных клеток становились видимыми в течение 8 дней после трансфекции. Это резко контрастировало со слабым ростом клеток, несущих только EJ-ras-ген. Котрансфецированные (ras + myc) клетки были туморогенными при введении голым мышам или 12-дневным крысам, давая опухоли, которые росли до размера 1 см в диаметре за 2 нед после инокуляции. Блот-анализ образцов ДНК из опытных линий по Саузерну показал присутствие множественных копий обоих трансфецированных онкогенов, EJ-ras н v-myc.
На основании этих опытов авторы сделали заключение, что эффекты установления культуры клеток in vitro могут быть воспроизведены («мимипированы»), по крайней мере частично, путем введения активного онкогена тус. Как «культивирование», так и приобретение гена тус делали КЭФ очень чувствительными к трансформирующему действию гена EJ-ras. Однако разница между двумя эффектами, как выяснилось, все же существует, и она была выявлена. EJ-ras-myc-трансфектанты индуцировали опухоль, которая достигала статического размера 2 см после 3 нед быстрого роста в голых мышах. В противоположность этому «установленная» культура КЭФ, несушая ген EJ-ras, индуцировала опухоли, которые росли, пока не убивали животное. Опыт был оценен следующим образом: ген тус резко увеличивает проявления фенотипа, создаваемого онкогеном EJ-ras, однако не способен полностью воспроизводить клеточные признаки, приобретаемые в результате установления культуры и иммортализации in vitro.
Дальнейшие исследования свойств гена тус, позволяющих ему кооперировать с онкогеном EJ-ras, показали, что длинные концевые повторы (LTR), несущие как промотеры, так и энхен- серы, сами по себе не могут быть ответственными за наблюдаемую активность клона в результате лишь делеции Sac I фрагмента величиной 1,6 т. о., располагающегося в белоккодирующих последовательностях онкогена gag-myc в пределах pSVv-myc (см. стр. 311). При котрансфекции с ДНК EY-ras-онкогена этот модифицированный провирус не индуцировал заметного опухолевого фенотипа. Следовательно, активность гена тус зависела от синтеза части или всего gag тус белка.
Аналогичный результат авторы получили при использовании гена тус из мышиной плазмоцитомы.
Комплементационные группы. Способность генов EJ-ras и тус кооперировать побудила R. Weinberg и его сотрудников испытать и другие комбинации генов (myc с N-ras и др.).
Активный клон N-ras был в лаборатории R. Weinberg изолирован из клеток линии HL-60. N-ras и Ha-ras из EJ-линии кодируют сходные белки. Как и ожидалось, N-ras вел себя идентично с Ha-ras-геном в его способности кооперировать с геном тус. Поэтому оба ras-гена были пометены в одну и ту же группу комплементации.
Любопытный результат получен в комплементационных опытах с двумя вирусными генами, кодирующими средний и большой Т-антигены вируса полиомы, изолированными как отдельные молекулярные клоны. Эти гены придают культивированным крысиным клеткам определенные и различающиеся друг от друга фенотипы. Средний Т антиген индуцирует морфологическое изменение и независимость от закрепления на поверхностях, в то время как большой Т-антиген определяет зависимость от сыворотки и клеточную иммортализацию.
Опыты показали, что трансфекция клона гена среднего Т-анти- гена (рРуМТ 1) одного или вместе с EJ-ras-ДНК не индуцирует фокусов в культурах. Наоборот, котрансфекция клона гена среднего Т-антигена и клона гена тус вызывала фокусы трансформации. В опытах на туморогенность эти культуры дали опухоли у 2 из 5 животных. Таким образом, средний Т-антиген вел себя сходно, но не идентично с EJ-ras и мог быть включен в ту же комплементарную группу, что и гены семейства ras.
Трансфекция клона усеченного гена большого Т-антигена (одного) не оказывала какого-либо действия на морфологию монослоя 3° КЭФ. Тот же результат дала котрансфекция с тус- клоном (pSVv-myc). Однако при котрансфекции этого клона измененного гена большого Т-антигена с EJ-ras появлялись многочисленные фокусы уже через 10 дней. При инокуляции фокусов контрансфецированных культур голым мышам появлялись быстрорастущие опухоли. В отличие от опухолей, индуцированных комбинацией myc-EJ-ras, которые останавливались в росте по достижении 2 см, эти опухоли продолжали расти до гибели животных.
Эти данные показывают, что урезанный большой Т-ген ведет себя подобно тус в его способности кооперировать с геном ras. Однако два этих гена функционируют неидентично: тус позволяет расти опухоли до ограниченного размера, тогда как урезанный большой Т-ген — до неограниченного роста опухоли.
О чем говорят описанные опыты? Генам тус и ras приписывается участие в индукции многих разнообразных опухолей. Так, активные ras-онкогены обнаружены в карциномах мочевого пузыря, толстой кишки, легкого, поджелудочной железы, кожи, в нейробластомах, саркомах и, по крайней мере, трех гемопоэтических неоплазмах. Клеточные гены Ki-ras и Ha-ras кодируют почти идентичные белки. Анализ последовательностей третьего члена этого семейства генов, названного N-ras, показал последовательности аминокислот, очень близкие таковым двух других членов семейства генов. Возможно, что все члены семейства ras действуют сходно, если не идентично.
Ген тус также вовлечен в развитие ряда опухолей. Он ассоциирован с такими гемопоэтическими заболеваниями, как миело- цитоматоз, миелоидный лейкоз, бурсовая лимфома, лимфома Беркитта и плазмоцитома. Показано его участие в негемопоэтических заболеваниях. Вирусы, трансдуцировавшие v-myc- онкоген, известны своей способностью инициировать карциномы почек, поджелудочной железы, печени и мезотелиому. Продемонстрировано присутствие этого гена в амплифицированном числе копий в нейроэндокринной опухоли толстой кишки.
Все эти разнообразные и многочисленные данные свидетельствуют о том, что ни один тип гена не является тканеспецифическим онкогеном, имеющим узкий круг тканевого тропизма. Напротив, каждый тип гена компетентен в разнообразной клеточной среде. Более того, возникновение в корне отличных типов опухолей, вероятно, зависит от общих молекулярных механизмов, вовлекающих часто активацию ras- или myc-онкогенов. Многие ткани проявляют сходное поведение по отношению к этим онкогенам.
Различные действия генов ras и тус. Онкоген ras способен изменять морфологию КЭФ в монослоях и может также индуцировать рост колоний в мягком агаре. Он, однако, не способен индуцировать явные фокусы среди плотнорастущих нормальных клеток. КЭФ, трансформированные ras, проявляют очень ограниченную пролиферативную и туморогенную способность. Это отличает их от обладающих высокой туморогенной активностью На- и Ki-мышиных саркомных вирусов, которые трансдуцируют очень близкородственные гены ras и способны индуцировать опухоли в соответствии с «одноударной» кинетикой. R. Weinberg считает, что, возможно, ступени вирусного туморогенеза in vivo нам менее понятны, чем мы предполагаем, и отдельные этапы его могут зависеть, помимо экзогенного онкогена, от изменения каких-то дополнительных клеточных факторов.
В свою очередь, онкоген тус, действуя один, согласно данным лаборатории R. Weinberg, практически не влияет на морфологию
КЭФ. Этот результат не совпадает с данными других авторов о трансформации фибробластов грызунов птичьими тус-онко- генами. Здесь необходимы дополнительные исследования.
Некоторые методические вопросы принципиального характера. Главный вывод рассмотренной выше работы R. Weinberg и его сотрудников заключается в том, что онкогены ras и тус действуют по-разному, так как вместе они способны осуществить образование фенотипов, которые не способны индуцировать порознь. Создается впечатление, что их способ действия различается качественно и действие каждого направлено на разные клеточные мишени. Изучение онкогена тус до последнего времени затруднялось из-за отсутствия какого-либо индуцированного им в клетках млекопитающих специфического фенотипа. Возможно, что система КЭФ R. Weinberg окажется удобной моделью для испытания тус и других онкогенов.
В исследовании R. Weinberg и сотрудников следует обратить особое внимание на обнаруженный феномен процессов установления культуры клеток (establishment) и иммортализации в развитии функций, которые способны кооперировать с онкогеном ras. Пока не известно, как много отдельных клеточных функций требуется для развития полностью туморогенного фенотипа. Однако похоже на то, что культивированные (established) клетки несут все необходимые для этого функции, кроме тех, которые привносят онкоген ras, чье включение производит полную трансформацию по типу «одноударной» кинетики.
Культура ЗТЗ-клеток сыграла свою, причем важную, роль. Она оказалась очень удобной для выявления отдельных онкогенов методом трансфекции, так как, будучи полутрансформированнои, позволяла выявлять онкогены, способные осуществлять лишь отдельные, в большинстве заключительные, этапы формирования неопластического фенотипа. Дальнейшие исследования показали, однако, что система ЗТЗ-клеток позволяет выявлять лишь ограниченный участок общей цепи событий в канцерогенезе. В этом свете новая модель более нативных крысиных эмбриональных фибробластов имеет значительное преим\тество. Оптимальным будет комбинированное использование обеих клеточных систем.
Обязательна ли строгая временная последовательность отдельных этапов в многоступенчатом процессе создания опухолевого фенотипа? Оказалось, что это не так. Тот же R. Weinberg и его сотрудники проделали следующий опыт. Авторы вели онкоген c-Ha-ras (EJ) в 2° КЭФ и лишь позже осуществили установление (культивирование) трансформированных клеток in vitro. Указанные клетки приобрели туморогенный фенотип. Это явно указывало на то, что порядок двух событий — приобретение онкогена ras и установление культурального состояния клеток — не важен для конечного результата.
Опыты с комплементацией онкогенов и схема «многоступенчатого канцерогенеза. Внесение онкогена тус приводит к со-
зданию фенотипа, который частично имитирует эффект установления культивирования клеток in vitro; добавление онкогена ras придает признаки образования фокусов и туморогенеза. Однако внесение тус и установление характеристик клеточной культуры создают идентичные изменения в поведении клеток. Нет прямых доказательств, что тус способен вызывать иммортализацию клеток, так же как неизвестно, зависит ли процесс установления культурального состояния и иммортализации от активации тус- подобных клеточных гено , Тем не менее оба фактора оперируют очень сходно. Это позволяет объединить в одну комплементарную группу тус и функции, связанные с установлением культурального состояния («готовности»). Присоединение к этому классу гена большого Т-антигена не является неожиданным, так как данному гену приписывалось и ранее участие в функциях создания «готовности» и иммортализации. Известны также опыты, указывающие на кооперирование онкогена ras с Ela-онкогеном аденовируса 5 и на то, что Ela действует подобно гену большого Т-антигена полиомы в индукции клеточной иммортализации. Таким образом, в функциональный класс онкогена тус, гена большого Т-антигена и генов создания культивированного состояния («готовности») следует внести также ген Ela.
Другой класс трансформирующих онкогенов включает гены Ha-ras, N-ras и ген среднего Т-антигена полиомы. Этот класс, участвующий в морфологическом изменении клеток и создании свойства независимости от закрепления на поверхностях, кодирует генные продукты, локализующиеся на цитоплазматической мембране. Наоборот, гены вышеупомянутого пёрвого класса (тус, большого Т-антигена и Ela) кодируют белки, связывающиеся с ядерными структурами.
R. Weinberg считает [Land Н. et al., 1983], что выявленные по крайней мере 2 молекулярные ступени в процессе канцерогенеза обусловлены активацией ras-подобного и тус-подобного генов. Пока нет уверенности, что эти две ступени достаточны для превращения нормальной клетки в полностью компетентную опухолевую. Видимо, в этом процессе участвуют и другие системы. О такой возможности говорят следующие факты.
Клетки, несущие онкогены тус и ras, порождают опухоли, которые достигают большого, но статического (стационарного) размера. Это контрастирует с клетками, которые приобрели онкоген ras и подверглись культивации (приобрели состояние «готовности», establishment). Такие клетки порождают опухоли с, по-видимому, неограниченной способностью роста, из чего следует, что процесс «готовности» (культивируемости) клеток, иммортализации ведет к возникновению клеточных функций, помимо тех, которые осуществляет один лишь тус. В этом случае должен существовать как минимум третий, отличающийся ген, который мог бы кооперировать с ras и тус в создании полностью туморогенного фенотипа.
Есть основания думать, что число отдельных ступеней в канцерогенезе ограниченно и каждая из них может быть описана на молекулярном уровне.
Использование методов переноса генов и молекулярного клонирования позволило установить некоторые наиболее важные, центральные детерминанты ракового процесса. Эти детерминанты —онкогены и их продукты — онкобелки, действующие как на структуру, так и на функции клеток, влияющие на регуляторные механизмы биохимических реакций. Многие из этих функций онкогенов и онкобелков пока неизвестны, однако при современном уро не знаний их расшифровка является скорее делом техники, чем принципа. Подлежат выяснению еще такие специфические свойства опухолевых клеток, как независимость от регуляторных сигналов, своеобразие взаимодействия с суб： стратом, независимость от факторов роста, своеобразие энергетического метаболизма и, конечно, неконтролируемость клеточного деления. Вероятнее все го, многие характерные черты процесса канцерогенеза могут быть определены в терминах активации и экспрессии конкретных онкогенов.
Разработка современных методов терапии злокачественных заболеваний настоятельно требует получения и применения лекарственных препаратов, которые распознают и блокируют конкретные мишени, присутствующие только в опухолевых клетках. Эти мишени должны иметь отношение к регуляции клеточного роста и поведения популяции клеток в целом. Онкогены и их онкобелки являются хорошими кандидатами в качестве мишеней для целенаправленной химиотерапии. Поэтому, изучая, как работают онкогены и онкобелки отдельных этапов онкогенеза, представляется возможным понять, какими должны быть их антагонисты.
За время, прошедшее с момента завершения работы над рукописью данной книги (середина 1984 г.) до ее появления в свет (конец 1986 г.), молекулярная онкология продолжала бурно развиваться, что нашло отражение в огромном количестве новых публикаций. Последние не только существенно дополняли и подкрепляли основные положения, изложенные в книге, но нередко побуждали изменить толкование некоторых частных и общих явлений в процессе канцерогенеза.
Указанное обстоятельство заставило нас дать хотя бы очень краткое резюме новых фактов, ставших известными к середине 1986 г. (срок, когда еще было возможно внести в рукопись какие-то изменения).
Ниже приводится лаконичная сводка этих данных.
Как уже подробно рассматривалось в гл. 3—5, включение в «работу» протоонкогенов и превращение их в активные онкогены
имеют место при вирусном, химическом и так называемом спонтанном (неизвестного происхождения) канцерогенезах, что показано на примере разнообразных опухолей человека и животных. В ряде случаев химического канцерогенеза и при анализе опухолей человека продемонстрирована активация протоонкогенов суперсемейства src, например ras, erb В, raf, а также семейства тус [Cooper G., 1984; Bishop J. М., 1984].
Комбинация функционирующих онкогенов и характер механизмов активации протоонкогенов при вирусном, химическом онкогенезе и в злокачественных опухолях человека оказались близкими и в общих чертах сходными.
Длительное время исследователи не имели информации об активации онкогенов при радиационном и спонтанном канцероге- незах у животных. Однако оказалось, что, например, при радиационном канцерогенезе, в частности в случае индукции лимфом у мышей у-лучами, происходит активация протоонкогена c-Ki-ras [Guerrero I. et al., 1984]. Установлено, что активация этого протоонкогена в лимфомах связана с точковой мутацией в 1-м экзоне, где происходит замена гуанина на аденин. Следствием указанной мутации является включение в синтезируемый белок не глицина, а аспарагиновой кислоты, что существенно меняет его стереохимию и биологические свойства.
Онкоген типа Ha-ras был обнаружен в «спонтанны^» гепатоцеллюлярных аденомах и карциномах мышей. Препараты ДНК этих опухолей были активны в тесте на трансфекцию клеток NIH ЗТЗ, и онкоген активировался в результате точковой мутации [Reynolds S. et al., 1985].
Новое подтверждение получила гипотеза об общности (родстве) генов, с одной стороны, нормальных, контролирующих пролиферацию и дифференциацию, а с другой — осуществляющих злокачественный рост. Переход от одной, позитивной, функции к другой, негативной, обусловлен активацией нормальных клеточных генов (протоонкогенов) в онкогены в результате уже известных науке генетических событий на уровне ДНК-
Примерами могут служить протоонкоген c-sis (гомолог онкогена v-sis, индуцирующего саркомы у обезьян), продукт которого идентичен В-цепи ростового фактора тромбоцитов (РФТ) (см. гл. 4); продукт другого гена — c-B-lym (гомолог онкогена B-lym, принимающего участие в малигнизации В-лимфоцитов человека,—лимфома Беркитта и др.) идентичен фактору роста гемопоэтических клеток, трансферрину (см. гл. 5) [Moelling К., 1985]. Возможный механизм действия этих генов заключается в том, что неадекватное включение их экспрессии вызывает аутокринную стимуляцию клеток к пролиферации собственными онкобелками — факторами роста.
Примером другого свойства продуктов протоонкогенов, а именно их рецепторной роли может служить функция генов c-erb В и, по-видимому, c-fms и c-abl, а также некоторых других
генов суперсемейства src [Hunter Т., 1985; Moelling К-, 1985]. Продукт гена c-erb В — gp68erb в гомологичен внутриклеточному домену рецептора эпидермального фактора роста (ЭФР). Гликозилированный белок рецептора ЭФР gp 170 кд состоит из 3 частей: внеклеточного домена, служащего участком связывания рецептора с факторами роста; трансмембранного домена — участка связи рецептора с клеточной мембраной; внутриклеточного, протеинки- назного домена — участка рецептора, осуществляющего фосфорилирование по треониновому остатку клеточной протеинкиназы С [Hunter Т., 1985; Moelling К., 1985]. Вся схема направленного переноса сигнала, регулирующего рост клетки, полностью не изучена, и поэтому неясно, каким образом конкретно онкоген c-erb участвует в малигнизации. Однако экспериментальные данные указывают, что этот ген способен трансформировать клетки NIH ЗТЗ в опытах по трансфекции. Установлено, что он является онкогеном нейробластом крыс, индуцированных этилнитрозомочевиной. Кроме того, оказалось, что экспрессия гена c-erb В во много раз усилена в злокачественных опухолях мозга человека глиального происхождения [Liberman Т. A. et al., 1985]. В образцах ДНК этих опухолей при рестрикционном анализе обнаружены амплификация и реаранжировка протоонкогена c-erb В, что объясняет усиленную продукцию онкобелка, гомологичного ЭФР. В эпидермоидной карциноме человека (клеточная линия А 431) также обнаружены гиперэкспрессия, амплификация и реаранжировка онкогена c-erb В [(Jllrich A. et al., 1984; Hel- din C.-H. et al., 1984; P. Roy-Burman et al., 1984]. Авторы наблюдали повышенную продукцию онкобелка erb В во всех испытанных клеточных линиях, полученных от больных острыми лимфоидными (независимо от их В- или Т-природы) и миелоидными лейкозами. Протоонкоген c-erb В экспрессировался и в лимфоцитах периферической крови здоровых людей. Напротив, увеличенная экспрессия генов с-тус и c-myb была обнаружена лишь в нескольких случаях неоплазм В-клеточной природы.
Следовательно, аномальная гиперэкспрессия протоонкогенов, продукты которых имеют трансмембранное расположение в клетке и обладают протеинкиназной активностью, может приводить к малигнизации. Процесс этот, по-видимому, тесно связан с нарушением регуляторных сигналов, поступающих на клеточную мембрану, и с функцией других активированных онкогенов, в частности продукта онкогена ras (онкобелка р21), ГТФ-связывающая способность которого значительно стимулируется ЭФР [Kamata Т., Feramisco J., 1984]. При этом уровень фосфорилирования онкобелка р21 также возрастает, что активирует все остальные его многочисленные функции (см. ниже).
Обязательными участниками «каскада» «работающих» онкогенов являются протоонкогены семейства тус. Так, продукту гена с-тус — фосфопротеину рр64сп1ус — отводят роль передатчика (трансмиттера) сигнала от клеточной поверхности (рецептора
erb В, способного фосфорилировать этот онкобелок) в ядро [Heldin С.-H., Westermark В., 1984].
Еще одним важным свойством протоонкогенов и кодируемых ими белков, связанным с факторами роста, размножения и дифференцировки клеток, является их «включение» в определенные фазы клеточного цикла и стадии дифференцировки. Было показано, что после воздействия на клетки в фазе Go различных факторов роста не наступают G「 и S-периоды клеточного цикла, если не происходит экспрессии протоонкогена c-ras, т. е. продукции белка p21 [Mulcahy L. S. et at, 1985; Kataoka T. et al., 1985]. Включение экспрессии того или иного протоонкогена определяется природой воздействующего на клетку фактора роста и типом самой клетки. Это положение особенно четко документировано на примере активации протоонкогенов с-myc и c-fos. Стимуляция роста фибробластов NIH ЗТЗ сывороткой крови или очищенными факторами роста, например ЭФР, РФТ и др., уже через несколько минут приводила к резкому усилению экспрессии протоонкогена c-fos и синтезу соответствующего онкобелка. Через 20 мин экспрессия этого гена прекращалась [МйПег R. et al., 1984]. К этому моменту наблюдалось включение протоонкогенов c-ras и с-тус, а также гена а-актина. Полагают, что активация экспрессии гена c-fos является самым ранним генетическим событием в ответ на стимулирующее воздействие на клетку факторов роста [МйПег R. et al., 19841. Воздействие факторов роста на другие клетки, например амниона или макрофаги, также приводит к наиболее раннему включению экспрессии протоонкогена c-fos. Однако в этих клетках данный ген функционирует более или менее постоянно. Результаты позволили предположить, что c-fos в фибробластах контролирует пролиферацию клетки, а в макрофагах — дифференцировку [МйПег R. et al., 1984]. Опыты по трансфекции подтвердили роль c-fos в дифференцировке. Так, введение в культуру стволовых клеток тератокарциномы (линия F9) гена c-fos в комплексе с про моте ром человека или мыши приводило к экспрессии этого протоонкогена, в результате чего клетки изменяли морфологические свойства и продуцировали специфические маркеры, характерные для дифференцированных клеток [МйПег R., Wagner Е. F., 1984].
От первоначального мнения об участии гена с-myc в регуляции клеточного цикла (в частности, его роли в переходе клеток из периода Go в GJ, основанного на результатах опытов с р-интерфе- роном [Einant М. et aL, 1985] и на факте усиления его транскрипции под влиянием факторов роста [Thomson О. В. et al., 1985], позже отказались, сочтя эффекты не обусловленными стадиями клеточного цикла [Thompson О. В. et al., 1985]. Было показано, что уровень транскрипции с-myc и количество кодируемого им белка в клетке не изменяются в течение всего периода клеточного цикла [Haun S. R et al., 1985]. Авторы пришли к заключению, что к осуществлению клеточного цикла причастны две категории
генов: 1) ген тимидинкиназы и ген гистона Н2Ь, которые экспрессируются в строго определенный период клеточного цикла; 2) гены, транскрибирующиеся в пролиферирующих клетках течение всего клеточного цикла [Thompson О. В. et а!.. 1985]. К этой второй группе можно, по-видимому, отнести и протоонкогены семейства ras, экспрессирующиеся на протяжении всего клеточного цикла [Muller R. et al., 1984].
Ассоциация онкогенов семейства ras с возникновением подавляющего большинства опухолей человека и животных свидетельствует о многофункциональной роли онкобелков p21c ras в патогенезе превращения нормальных клеток в злокачественные [Weinberg R., 1984; Kraus Н. et al., 1984; Tanabe T. et al., 1985]. Как минимум 50 % первичных опухолей и опухолевых клеточных линий карцином толстой кишки и легких содержат активный онкоген c-Ki-ras 2. В несколько большем проценте случаев активный онкоген c-N-ras выявляется у больных миелолейкозами I Kraus Н. et al., 1984].
Получение моноклональных антител [MAbs и MAb RAP-1] к онкобелку р21 на-—, содержащему в 12-м кодоне аминокислоту валин, позволило провести анализ активации онкогенof этого семейства радиоиммунологическими методами [Hand Р. Н. et al., 1984]. Моноклональные антитела к онкобелку, содержащему точковую мутацию, не ззаимодействовали с продуктом экспрессии нормального протоонкогена c-Ha-ras 1.
В этих исследованиях было установлено, что все карциномы толстой кишки и молочной железы содержали повышенное количество онкобелка p21Haras. В подавляющем большинстве указанных опухолей человека моноклональные антитела выявляли аномальный, т. е. содержащий мутацию, онкобелок. Напротив, процесс дисфункциональных изменений протоков молочной железы, фиброаденоматоз и кистозный фиброаденоматоз не сопровождались повышением синтеза онкобелка и его мутацией [Hand Р. Н. et al., 1984]. Аналогичные данные были получены для нормальной слизистой оболочки толстой кишки. Авторы разработали весьма перспективный метод для скрининга, а также диагностики присутствия аномального продукта онкогена ras в фиксированных формалином биопсийных препаратах. Парафиновые срезы биопсийного материала онкологических больных окрашивали посредством иммунопероксидазного метода.
Использование высокочувствительной техники позволило установить, что уровень экспрессии онкогена ras коррелирует с прогрессией морфологических признаков злокачественности и глубиной прорастания опухолевых клеток карцином толстой khuikh в стенку кишки.
Наибольшее количество онкобелка р21 выявлялось ■ инвазивных аденокарциномах и клетках опухолей, прорастающих всю стенку толстой кишки до перитонеальной оболочки брюшной полости [Thor A. et al., 1984].
В геноме клеток млекопитающих идентифицированы гены, препятствующие прогрессии опухолевых признаков и метастазированию [Wallich R. et al., 1985]. Ими оказались гены, кодирующие антигены большого комплекса гистосовместимости класса I, а именно Н-2К. Экспрессия de novo генов Н-2К в опухолевых клетках приводит к уменьшению признаков их злокачественности и полному запрещению формирования метастазог у сингенных животных [Wallich R. et al., 1985]. В данном случае присутствие Н-2К-антигена позволяет иммунной системе эффективно распознавать опухолевые клетки и препятствовать их диссеминации в организме. Не исключено, что нарастание концентрации онкобелка р2Г'га!5 в опухолевых клетках или продукта другого онкогена реципрокно влияет на экспрессию генов комплекса гистосовместимости.
В последнее время активно изучается, помимо точковых мутаций, другой механизм активации экспрессии онкогенов типа Haras, а именно путем их амплификации. Это явление наблюдали в ряде опухолей: раке мочевого пузыря [Hayashi К. et al., 1983], меланоме и раке молочной железы [Bishop J. М., 1984]. Отмечено, что онкоген типа Ha-ras не только амплифицируется, но и подвергается реаранжировке. Как правило, этот онкоген амплифици- руется - первичных и вторичных трансформантах клеток NIH ЗТЗ, индуцированных образцами опухолевых ДНК [Князев П. Г. и др., 1985; Pulciani S. et al., 1982].
Большой прогресс отмечается в изучении онкобелков онкогенов семейства ras. Недавно обнаружены протоонкогены ras в геномах дрозофилы [Reymond С. D. et al., 1984] и дрожжей [Galwitz D. et al., 1983]. Встает вопрос об использовании новой информации в этой области для диагностики злокачественных опухолей.
Всего в настоящее время известно 11 членов протоонкогенов н онкогенов семейства ras. В их числе: c-Ha-ras 1, v-Ha-ras, c-Ki-ras 2, v-Ki-ras, c-N-ras, v-Ra-ras, Dras 1 и Dras 2 (Drosophila), c-rassc l, c-rassc 2 и YP2 (Yeast) [Tanabe T. et al., 1985]. Присутствие протоонкогенов ras в геноме клеток относительно просто устроенных организмов, таких, как, например, дрожжи, значительно упрощало изучение биологической функции продуктов их экспрессии и, что особенно важно, позволяло исследовать участие онкобелков в： росте и размножении дрожжевых клеток.
Сложные генетические эксперименты позволили обнаружить у продуктов генов ras дрожжей новую, ранее неизвестную ферментативную активность, ассоциированную с онкобелком р21,— обеспечивающую функцию регуляции GTP-зависимой аденилат- циклазы [Toda Т. et al., 1985]. При этом в экспериментах по трансфекции клеток дрожжей, дефектных по аденилатциклазной активности, онкогеном c-Ha-ras человека, было показано, что этот ген практически полностью компенсировал указанный генетический дефект реципиентных клеток. Функционирование в дрожжевой клетке онкогена рака мочевого пузыря человека типа Ha-ras
значительно повышало уровень GTP-зависимой аденилатци- клазы в клеточных мембранах, а в цитоплазме — сАМР. Однако трансформанты дрожжевых клеток имели существенно удлиненный Gi-период митотического цикла [Kataoka Т. et al., 1985]. Эти данные позволили авторам предположить, что онкобелок р21 может принимать участие в регулировании аденилатциклазной активности, а также контролировать переходы клеток млекопитающих из Gr в S-период митотического цикла [Kataoka Т. et al., 1985].
Семейство клеточных белков, обладающих функцией связывания гуаниновых оснований (G-связывающие белки), осуществляет важную роль в трансдукции сигналов, генерируемых от рецепторов клеточной мембраны. Эти белки, как показал структурный анализ, представляют собой комплекс, состоящий из трех субъединиц: а, 0, Y [Tanabe Т. et al., 1985]. Именно а-субъединица одного из членов семейства G-связывающих белков трансдуцина ответственна за указанную активность. Трансдуцин участвует в передаче изуаль- ного сигнала с поверхности клеток благодаря образованию комплекса с фотолизированным родопсином и активации с GMP фосфодиэстеразы. Одной из энзиматических активностей, обнаруженных у белка р2Г ras, как уже упоминалось, была именно его G-связывающая функция. Следовательно, р2Г ras по этой характеристике может быть отнесен к семейству указанных белков. При сопоставлении первичной структуры онкобелка p2lcras с трансду- цином оказалось, что он имеет значительную гомологию с а- субъединицей трансдуцина, а именно в области сайта, ответственного за связывание dGTP и dGDP [Tanabe Т. et al., 1985]. Следовательно, онкобелок р2Г ras в процессе трансформации клеток может модифицировать передачу регуляторных сигналов от клеточной мембраны.
Все эти данные показывают, что белок p21cras принадлежит к семейству онкобел кое с мультифункциональным действием. В гл. 3 уже отмечалось, что подобное многофункциональное свойство онкобелка впер ые обнаружено у pp60v src, продукта онкогена v-src. Оба гена — v-src и v-ras — принадлежат к одному суперсемейству, поскольку происходят от одного родоначального гена, контролирующего киназную функцию. Онкобелок р2Гras в，процессе трансформации клеток, по-видимому, существенно влияет на биоэнергетику клетки [Kataoka Т. et al., 1985] и передачу регуляторного сигнала от клеточной мембраны в ядро [Tanabe Т. et al., 1985]. Несомненно также и то, что онкобелок р21с ras в своем многофункциональном действии в процессе малигнизации клетки-мишени кооперирует с функциями других активированных протоонкогенов [Weinberg R., 1983; Land Н. et al., 1983, 1984].
В непосредственной связи с аномальной регуляцией транскрипции протоонкогенов, особенно ее усилением, могут находиться так называемые «усиливающие последовательности» — энхен-
серы, которые первоначально были обнаружены в участках вирусных промотеров [Gruss Р. et al., 1983] Усиливающие последовательности обнаружены в геноме нескольких представителей паповавирусов и ретровирусов. Хотя строгой гомологии их первичной нуклеотидной последовательности у различных вирусов не было обнаружено, они имели ряд общих, есьма примечательных функциональных свойств [Mercola М. et al., 1983]. Во-первых, усилители действуют на промотеры только в cis. Во-вторых, они могут влиять как на 5'-, так и на З'-промотерн. В-третьих, усилители работают :в любой ориентации в отношении к промотеру и на значительных расстояниях (10—20 т. п. о.) от промотера. В-четвертых, они могут влиять на гетерологичные промотеры. Активность клеточных промотеров, например гена В-глобина кроликов, усиливается более чем в 100 раз в присутствии вирусных усилителей. В отношении механизма усиливающего действия энхенсеров многое остается загадочным. Однако в ряде исследований установлено, что энхенсер вируса SV40 увеличивает количество ДНК-зависимой РНК-полимеразы, связанной с ДНК [Treisman R., Maniatis Т., 1985; Weber F., Schaffner W., 1985].
В настоящее время надежно показано, что в геноме эукариотических клеток присутствуют подобные элементы, способные тканеспецифично влиять на усиление транскрипции определенных генов. Эффект тканеспецифичен.
У млекопитающих одними из первых изученных в этом отношении генов, имеющих в геноме в области промотеров усилители, оказались гены иммуноглобулинов [Mercola М. et al., 1983].
Можно предполагать, что транслокации участков хромосом и реаранжировки в геноме распространяются не только на области онкогенов, но также на последовательности промотеров и энхенсеров. Это обстоятельство создает дополнительные возможности активации клеточных генов вообще и протоонкогенов в частности.
Существенное влияние на действие усилителей оказывает их метилирование. В этой связи процессы деметилирования усилителей промотеров протоонкогенов, например c-ras и с-тус, что имеет место при малигнизации клеток, могут многократно увеличивать их транскрипцию [Feinberg A., Vogelstein В., 1983; Hayday А. С. et al., 1984].
Для некоторых стероидных гормонов, например глюкокортикоидов, установлен механизм передачи их информации от специфического рецептора в геном клетки. Комплекс «стероидный гормон —рецептор», прямо взаимодействуя со специфическими последовательностями ДНК, прилежащими к промотеру, включает экспрессию строго определенного гена [Beato М. et al., 1983].
Точные данные относительно сайта связывания комплекса «гормон—рецептор» с ДНК получены для области промотера ДНК-провируса MMTV. Эти последовательности ДНК-провируса MMTV оказались усилителем. Аналогичные данные были получены и для представителей стероидных гормонов (прогестерона и
дексаметазона), которые также взаимодействовали с энхенсером. Точная нуклеотидная последовательность участка связывания гормона с ДНК не определена, однако оказалась весьма близкой коровой последовательности, обнаруженной в нескольких энхенсе- рах вирусов — 5,-GTGGttG-3, [Parker М., 1983]. Ряд авторов полагают, что перечисленные 1ыше гормоны должны связываться со строго определенной (специфичной) областью геномной ДНК, стимулируя один и тот же усилитель. Не исключено, что в случае гормонозависимых раков роль активаторов протоонкогенов опосредованно через усилители играют специфические комплексы «гормон—рецептор».
Можно думать, что обнаружению усилителей в геноме клеток млекопитающих, их роли в активации протоонкогенов в процессе канцерогенеза в будущем будет уделяться особое внимание.
Имеются данные об участии「процессах дифференцировки последовательностей так называемых «homoe boxes» [Colberg- Poley A. M. et al., 1985]. Разработка этого направления исследований может пролить дополнительный свет на роль сочетанной экспрессии последовательностей «homoe boxes» и протоонкогенов в канцерогенезе.
Новейшие данные о генах, контролирующих рост и пролиферацию клеток, протоонкогенах и онкогенах, факторах роста (ФР) и онкобелках позволяют, пока общих чертах, рассмотреть рабочую модель малигнизации клеток.
Использование техники культивирования раковых клеток в средах, не содержащих сыворотку крови, а также получение очищенных ФР позволили точно определить, какие специализированные факторы утратили свое стимулирующее действие на конкретную клеточную популяцию. Подобная утрата зависимости роста и пролиферации многих раковых клеток от специализированных ФР, по-видимому, является одной из общих характеристик малигнизации [Goustin A. S. et al., 1986]. Независимость раковых клеток от ФР может обеспечиваться: а) активацией синтеза белков, аутологичных ФР — «аутокринная активация»; б) образованием поврежденных (видоизмененных) рецепторов; в) активацией пострецепторных путей переноса регуляторных сигналов, что позволяет обходиться раковым клеткам без рецепторов ФР вообще [Hunter Т., 1986; Goustin A. S. et al., 1986].
В последнее время были получены данные, свидетельствующие в пользу того, что автономность роста или независимость малигнизированных клеток от внеклеточных специализированных ФР ткани может быть обусловлена перманентной экспрессией некоторых протоонкогенов или онкогенов [Stiles Ch., 1985; Martinet V. et al., 1986]. Продукты экспрессии последних перенимают функцию внеклеточных факторов и сами по себе являются ФР, или рецепторами, передающими экстраклеточные регуляторные сигналы. Они могут повышать порог чувствительности к указанным сигналам, а также выполнять роль внутриклеточных ФР.
Несмотря на то, что между продуктами онкогенов — онкобелками н ФР установлены определенные структурные и функциональные связи, биологическая (в данном случае трансформирующая) функция ни одного из известных онкобелков до конца не изучена. Это утверждение справедливо в отношении даже такого онкобелка, как pp60vsrc, который был получен в чистом виде еще в 1978 г. и изучен лучше других.
Тем не менее, на основе изучения локализации онкобелков в клетке (взаимодействия с предполагаемыми мишенями) и исследования их ферментативной активности достоверно показано, что онкобелки контролируют или принимают участие в важных процессах жизнедеятельности клеток и организма в целом [Muller R. et al., 1984; Hunter T., Cooper J. A., 1985; Zimmerman K- A. et al., 1986]. Функция протоонкогенов настолько важна, что количественные или структурные аномалии в них приводят к серьезным последствиям в росте и дифференцировке стволовых клеток организма [Heldin С.-H., Westermark R.t 1984; Hagag N. et al., 1986; Татосян А. Г. и др., 1986].
В ходе выяснения функций тех или иных онкобелков высказано несколько рабочих гипотез превращения нормальных клеток в неопластические. Наибольшее распространение и признание получила концепция, рассматривающая «аутокринную активацию» пролиферации клеток в качестве центрального элемента трансформации. Первоначально эта концепция была сформулирована М. В. Sporn, G. Todaro (1980). Основу аутокринной модели малигнизации клеток составляет биологически важная эволюционно-реликтовая функция он ко бел ков, во многом аналогичная эндогенным факторам роста.
Первые и обнадеживающие данные, как уже отмечалось в гл. 3 и 4, подтверждающие возможность аутокринной функции онкобелков, были получены при сопоставлении первичной структуры онкобелка p28v s,s и ростового фактора тромбоцитов (РФТ). Частичный аминокислотный анализ В-цепи РФТ показал, что 109 аминокислот аминотерминального остатка этой цепи практически идентичны предсказанным аминокислотным последовательностям онкобелка p28v sis (остатки 67 = 175). Только три замены аминокислот найдены в указанных последовательностях двух поли- пептидных цепей [Doolittle R. F. et al., 1983]. Обнаруженные замены остатков аминокислот в продукте протоонкогена c-sis — белке р24css человека, которые, как указывалось выше, идентичны В-цепи РФТ и p28Vb,s, могут отражать эволюционные различия между человеком и обезьяной. Вполне вероятно, что протоонкоген c-sis и ген РФТ имеют общее происхождение, а именно из одного родоначального гена, некогда выполнявшего роль эндогенного фактора роста [Doolittle R. F. et al., 1983; Ohno S., 1985; Martinet V. et al., 1986].
К этой категории генов относятся также протоонкоген lym 1 человека и средний Т-антиген вируса полиомы, кодирующие
белки, гомологичные трансферрину — фактору ррста гемопоэтических клеток и гастрину — фактору роста некоторых эпителиальных клеток, соответственно [Baldwin G. S., 1985; Roger J. et al., 1986].
Продукт протоонкогена c-mos будет, очевидно, причислен к этой же категории — поскольку он оказался гомологичным высокомолекулярному предшественнику ЭФР [Baldwin G. S., Twardzik К., 1985].
Возможный механизм туморогенного действия указанных онкогенов заключается в том, что неадекватное появление продукта онкогена, при наличии рецептора на клеточной мембране или нутри клетки, при одит к аномальной стимуляции пролиферации популяции клеток собственным фактором роста. Следствием аномальной пролиферации является трансформация клеток, которая, при наличии других комплементнруютнх факторов (функций) с этим онкобелком, приводит к малигнизации. Однако детальный анализ трансформирующей функции аномальных ФР типа РФТ, трансферрина и гастрина еще предстоит провести, прежде чем эта категория онкобелков — факторов роста будет отнесена к истинным трансформирующим факторам и определено их место в цепи последовательного многостадийного превращения нормальной клетки в раковую.
Ранее, в начале этого раздела, уже отмечалась рецепторная роль онкобелков суперсемейства src. Продукты протоонкогенов и онкогенов этого суперсемейства: c-erb В, c-neu, v-fms, v-abl, v-ros, c-trk гомологичны внутриклеточному домену (протеинки- назному) рецепторов различных ФР [Hunter Т., Cooper J. А., 1985; Martin-Zanca D. et al., 1986]. Напомним, что продукт протоонкогена c-erb В-гликолизированный белок gp68L практически идентичен внутриклеточному домену рецептора ЭФР [Yamamoto Т. et al., 1986]. Продукт онкогена c-neu на 50 % также гомологичен рецептору ЭФР, при этом наибольшая гомология наблюдается в тирозинкиназном домене, в котором 80 % аминокислотных остатков идентичны указанному рецептору [Bargmann С. I. et al., 1986]. Полученные данные позволили авторам высказать предположение, что продукт онкогена c-neu кодируется геном рецептора пока неизвестного ФР, но близкого по своей функции ЭФР.
Функция продукта протоонкогена c-fms аналогична. В этом случае протоонкобелок р!70с fms оказался гомологичен внутриклеточному домену рецептора для ФР мононуклеарных макрофагов [Hunter Т., Cooper J. А., 1985].
Недавно была установлена структура рецептора для стероидных гормонов, обе формы которого и содержат последовательности аминокислот, обогащенные по цистеину, лизину и аргинину [Hollenberg S. М. et al., 1986]. Эти последовательности аминокислот представляют участок связывания рецептора стероидного гормона с ДНК. Предсказанные с помощью ЭВМ последова-
тельности продукта онкогена c-erb Аа оказались высокогомологичными обеим формам рецептора глюкокортикоидного гормона в области карбокситерм и нал ьного домена. Эти данные позволили высказать предположение о том, что ген рецепторов стероидных гормонов и протоонкогена c-erb А происходят из одного родоначального гена, который выполнял на ранних этапах эволюции многоклеточных функцию эндогенного ФР [Weinberger С. et al., 1986]. Гомология между рецептором стероидного гормона и протоонкогеном c-erb Аа указывает также на существование нового класса факторов (trans acting factors), взаимодействующих с энхерсерами клеточного генома, иными словами факторами, регулирующими транскрипцию клеточного генома [Weinberger С. et al., 1986]. .
Продукты других протоонкогенов этого суперсемейства, например c-ras, c-src и возможно с-тус, также способны модифицировать рецепторы, то есть фосфорилировать по тирозиновым, сериновым и треониновым остаткам внутриклеточный домен рецепторов ФР. Известно, что фосфорилирование активирует внутриклеточный домен рецептора, делая его компетентным к приему и передаче регуляторного сигнала внутрь клетки. <Атака» онкобелком рецепторов ФР может в принципе извращать смысл сигнала ФР. Так, следствием фосфорилирования (взаимодействия) рецепторов, например, фактора роста нервных клеток и интерлейкина-3 онкобелками p21c ras и рр64с тус, является независимость этих клеток от соответствующих экзогенных факторов роста [Rapp U. R. et al., 1985; Kaczmarek L. et al., 1985; Hagag N. et al., 1986]. Подобная независимость клеток от экзогенных ФР может рассматриваться как автономность или трансформация.
Структура продукта онкогена c-mas, предсказанная ЭВМ на основе первичной последовательности клонированного онкогена эпидермоидной карциномы человека, значительно отличается от ранее обнаруженных онкобелков, имеющих связь с плазматической мембраной [Young D. et al., 1986]. У продукта этого онкогена имеется 7 сильно гидрофобных участков, которые могут быть трансмембранными доменами. Авторы высказали предположение, что продукт онкогена mas пересекает плазматическую мембрану несколько раз. Подобной структурой, по-видимому, обладает продукт трансформирующего гена вируса Эпштейна— Барр [Fennewald S. et al., 1984]. Вероятно, продукт онкогена mas может быть отнесен к классу белков — рецепторов, имеющих структурную гомологию с рецепторами ацетилхолина и визуального родопсина. D. Young et al. (1986) полагают, что онкобелок mas является рецептором, активирующим 1ажнейшие пути регуляции роста посредством трансдукции регуляторного сигнала или мембранного канала. Изучение уникальной структуры и функции онкобелка mas позволит в будущем установить новые связи между процессами, контролирующими рост и малигнизацию клеток.
Следовательно, аномальная экспрессия протоонкогенов, продукты которых имеют трансмембранное, а также подмембранное расположение (c-src) и обладающих протеинкиназной или другой, пока неизвестной активностью (c-abl, c-fms, c-erb A, c-erb В, c-ras, c-trk, c-mas и др.) может приводить к злокачественной трансформации клеток. Процесс этот тесным образом связан с нарушением регуляторных сигналов, поступающих на клеточную мембрану, и с аутокринной стимуляцией, нерегулируемой извне, что ведет к пролиферации клетки-мишени. Возможно, функция других трансформирующих генов, комплементирующих с данной категорией онкогенов, завершает процесс малигнизации.
Непосредственным образом с указанной группой онкогенов, работающих по «аутокринной схеме», связаны гены, продукты которых участвуют переносе сигнала от рецепторов ФР внутрь клетки, в ядро (например, c-ras и с-тус). Продукты этих онкогенов способны, по-видимому, самостоятельно служить регуляторными сигналами или, другими словами, обеспечивать клеткам независимость от экзогенных ФР. В этом случае онкобелки как бы сами выполняют роль эндогенных ФР, обеспечивая клетке необходимый побуждающий импульс и переход из Go периода в G клеточного цикла [Rapp U. R. et al., 1985; Kaczmarek L. et al., 1985]. К этой категории онкогенов могут быть отнесены, по-видимому, c-myb, c-fos, c-ski, c-rel [Bishop J. M., 1985], продукты которых имеют ядерную локализацию [Татосян А. Г. и др., 1986].
Таким образом, превращение нормальных клеток в злокачественные а условиях in vivo и in vitro имеет сложный, кооперативный характер взаимодействия нескольких функций различных по своей природе клеточных онкогенезов. В качестве примера кооперации онкогенов вновь приведем новые данные (см. также гл. 5), полученные при изучении трансформации первичных клеток животных и человека при помощи онкогена c-Ha-ras 1. Злокачественная трансформация первичных фибробластов, трансформированных онкогеном c-Ha-ras 1, наблюдается лишь в тех клонах, которые были супертрансфецированы вторым онкогеном: c-myc, N-myc, р-53, c-int I или обработаны факторами типа ТРА, а также трансформирующим фактором роста [Land Н. et al., 1983; Slamon N. J. et al., 1986; Smith M. R. et al., 1986]. Следует отметить, что в первичных опухолях чаще всего наблюдается активация (например, повышенная экспрессия) нескольких клеточных онкогенов, принадлежащих разным категориям [Киселев Ф. Л., Спитковский Д. Д„ 1986]. В карциномах шейки матки и легких была обнаружена амплификация двух онкогенов — c-myc и c-Ki-ras 2 [Rio G. et al., 1984; Taya Y. et al., 1984]. В наших исследованиях карцином молочной и щитовидной желез была выявлена суперамплификация двух онкогенов — c-Ha-ras и c-myc, которые, как отмечалось, успешно кооперируют в процессе полной неопластической трансформации клеток-мишеней в экспериментах in vitro [Land Н. et al., 1984; Князев П. Г. и др.,
1986; Плужникова Г. Ф. и др., 1986]. Сегодня возможно изучение вклада в малигнизацию клеток лишь немногих из известных (а их около 40) клеточных онкогенов. Основные и второстепенные биохимические события, протекающие в клетке-мишени в результате активации протоонкогенов, еще предстоит установить. Однако, несмотря на всю сложность явления малигнизации, исследователи получили надежные «инструменты» — онкобелки, контролирующие малигнизацию, позволяющие в точных химических терминах уже в ближайшем будущем описать реакции их взаимодействия с внутриклеточными мишенями.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Подведем некоторые итоги.
Критически мыслящему наблюдателю современная теоретическая онкология, возможно, представляется деревом цветущим, но не плодоносящим. Такое впечатление в какой-то мере оправдано и обусловлено явным дисбалансом огромных интеллектуальных усилий и материальных вложений, с одной стороны, и скромных практических выходо — с другой.
Все еще остаются неясными как природа злокачественных новообразований, так и первичный побудительный импульс, инициирующий неотвратимую цепь событий, заканчивающихся во многих случаях трагическим исходом. Как следствие этого — отсутствие достаточно эффективных средств ранней диагностики, предотвращения и лечения указанных заболеваний.
Исторически утвердились и интенсивно разрабатываются несколько направлений в изучении онкогенеза: химический, биологический и радиационный канцерогенезы.
Актуальность первого диктовалась самой жизнью и данными эпидемиологии. Связь раковых заболеваний со все расширяющимся использованием бытовых и промышленных химических соединений была реально осязаемой, и опыты на животных убедительно ее продемонстрировали. Эта область экспериментальной онкологии достигла таких успехов, что теперь оказывается оз- можным предсказывать форму и сроки возникновения опухолей при воздействии тех или иных конкретных химических веществ.
С течением времени выявление канцерогенных свойств химических агентов стало лишь делом техники, и наметилось явное смещение акцентов исследований от рутинного их тестирования на канцерогенность к изучению механизма онкогенного действия. В этом деле, наряду со значительными успехами, выявились и немалые трудности.
Успехи касались чисто химической стороны проблемы: была установлена необходимость активации исходных канцерогенов, изучены метаболизм, взаимодействие канцерогенов с клеточными компонентами, продукты этого взаимодействия.
Трудности, не преодоленные и по сей день, определились при попытке соотнести химические события с биологическими эффектами.
Как описано : гл. 2, самой глубокой распознанной ступенью в процессе метаболических превращений канцерогенов и взаимодействия их с ДНК клеток является образование так называемых ДНК-аддуктов. Это та граница, к которой приблизились наши знания в области химического канцерогенеза и пределы которой до сих пор перейти не удалось, в силу чего главный вопрос остается нерешенным: что происходит дальше? Каким образом вторжение осколков химических канцерогенов в ДНК результи- руется в неконтролируемый рост и трансформацию клеток?
Теор吧 хнмхиеского каниерогент 口刀口 того, что6bl сделать^, новый и решающим шаг перед, нуждается в каком-то научном ■боёытииГ аналогичном по значимости открытию обратной трансКриптазЫ ЁГонковирусологии. В теории химического канцерогенеза подобного события пока не произошло. Тем не менее можно ожидать, что новый импульс дальнейшему плодотворному развитию этого направления теоретической онкологии придаст интеграция его с концепцией онкогенов. На страницах книги упоминались первые сообщения об активации клеточных трансформирующих последовательностей (протоонкогенов) под влиянием химических канцерогенов. Эта новая перспектива обнадеживает и позволяет думать, что изучение химического канцерогенеза в ближайшем будущем станет одним из аспектог исследований онкогенов, а сама идея химического канцерогенеза — одной из составляющих более общей и универсальной теории онкогенеза, концепции онкогенов.
В теории биологических факторов онкогенеза, воплощенной наиболее ярко и убедительно в идее вирусной этиологии опухолей, за последнее десятилетие наблюдался необыкновенный прогресс и крутой поворот. Онковирусология достигла в этот период впечатляющих успехов, хотя в то же время потерпела серьезную неудачу в достижении основной своей цели ——поиска и доказательств существования вирусов, вызывающих рак у человека. Сегодня реально можно говорить, по-видимому, лишь об одном злокачественном заболевании человека, ассоциированном с онкогенным ретровирусом (HTLV), а именно Т-клеточной лейкемии. Других надежных свидетельств связи опухолевых заболеваний человека с вирусами я. настоящее время нет.
Главным успехом онковирусологии наших дней следует считать открытие онкогенов — дискретных материальных генетических элементов в структуре ДНК клеток, ответственных за индукцию злокачественных опухолей у человека и животных. Это направление исследований является наиболее перспективным в современной теоретической онкологии.
Как описано в гл. 3, 4 и 5, онкогены обнаружены в геномной ДНК не только животных, но и человека, а вероятность их участия
в индукции опухолей продемонстрирована молекулярно-биологическими н биологическими экспериментами. /
В целом изучение вирусного канцерогенеза внесло ценный вклад в теоретическую онкологию и в расшифровку молекулярных механизмов канцерогенеза, причем концепция онкогенов, рожденная в недрах онковирусологии, возможно, станет фундаментом универсальной теории онкогенеза.
Говоря о физическом канцерогенезе, обычно имеют в виду канцерогенез радиационный. При всем его своеобразии он имеет много общего с онкогенезом, индуцируемым химическими агентами. Как и в случае химического и вирусного канцерогенеза, первичной мишенью действия проникающей радиации является ДНК, а происходящие в ней изменения носят мутационный характер, что служит основой реализации одного из главных путей активации клеточных протоонкогенов в онкогены. Иными словами, и в случае данного вида канцерогенеза можно усматривать проявление того же универсального молекулярного механизма индукции опухолей — через онкогены, что и при других видах онкогенеза. Таким образом, перефразируя известную поговорку: «все дороги ведут в Рим», можно сказать, что 一. все пути к onvxcrH_ ведут через онкоген».
* Данное положение, естественно, еще нуждается в подкреплении новыми фактами. Тем не менее, как нам кажется, концепция онкогенов представляет собой в настоящее время единственную теоретическую платформу, способную объединить на общей основе главные существующие гипотезы н точки зрения относительно этиологии опухолей. В первую очередь это относится к таким, как казалось ранее, взаимоисключающим друг друга научным направлениям, как теории химического и вирусного канцерогенеза. Естественно, что в эту же категорию событий укладываются также представления о мутационной природе неоплазм.
Еще И. М. Сеченов в 1860 г. в тезисах докторской диссертации писал, что при настоящем состоянии естественных наук единственно возможный принцип патологии есть молекулярный.
Сейчас можно только удивляться этому провидению. Сегодня молекулярная онкология стоит у порога тайны рака. Именно ей принадлежат наиболее выдающиеся успехи в области теоретической онкологии последних лет. К ним можно отнести следующие достижения: 1) открытие молекулярных причинных факторов неоплазм — онкогенов и онкобелков; 2) установление клеточного происхождения онкогенов опухолеродных вирусов и опухолей; 3) доказательство подвижности клеточных, вирусных, опухолевых трансформирующих генов (онкогенов), возможности переноса их между клетками, между клетками и вирусами; 4) демонстрация родства онкогенов с генами пролиферации и дифференциации; 5) клонирование онкогенов и других генетических элементов; 6) разработка концепции онкогенов как универсальной теории канцерогенеза.
Если молекулярная биология в наиболее лаконичной интерпретации может быть охарактеризована как наука, выражающая и объясняющая сложные общебиологические явления в терминах свойств и взаимодействия молекул, то молекулярная онкология, естественно, призвана раскрывать молекулярные механизмы процесса канцерогенеза и особенностей опухолей. В данной книге сделана попытка подытожить успехи этой молодой науки.
Все величие прогресса в познании опухолей в наше время можно продемонстрировать, сопоставляя нынешний уровень знаний об опухолях со следующими высказываниями выдающихся представителей науки прошлого.
Р. Вирхов: «. . .Никто, даже под пыткой, не смог бы сказать, что же такое на самом деле раковая клетка».
Дж. Гринштейн: «По каким-то непонятным причинам исследования в области рака стали кладбищем для многих научных репутаций».
Какой пессимизм, причем в устах передовых людей своего времени!
Примерно 80 и 40 лет, соответственно, отделяют нас от этих безрадостных мыслей исследователей, знавших о раке много больше своих современников. Но какие изменения произошли за это время!
Мы выражаем надежду, что, закрывая эту книгу, читатель, подобно ее авторам, отметит, как далеко наука об опухолях шагнула вперед за указанный небольшой исторический срок.
Авторы приносят глубокую благодарность В. П. Калиновскому, Л. А. Заозерской, Г. Ф. Плужниковой, Л. И. Кожуховой, В. М. Норгела за помощь при оформлении книги.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Агеенко А. И. Механизмы вирусного канцерогенеза.——М.: Медицина, 1978.— 384 с.
(Александров В. А., Напалков Н. П.) Alexandrov V. A., Napalkov М Р. General regularities of transplacental (prenatal) carcinogenesis, — BioL Res. in Pregnancy, 1981, v. 2, N 4. p. 181 —187.
Альтштейн А. Д. Онкогены опухолеродных вирусов. — Журн. Всесоюзн. хим. об-ва им. Менделеева, 1973, т. 18, с. 630—638.
Бердинских Н. К・ Белоксинтезирующий аппарат клеток при опухолевом росте.— Киев: Наукова думка. 1983.— 176 с.
Блохин И. Н., Напалков И. 〃• Развитие онкологии в СССР. — Вопр. онкол.. 1982. № 12. с. 3—9.
Быкорез А. И., Иващенко Ю. Д. Экспериментальные опухоли желудка. — Киев: Наукова думка. 1982. — 315 с.
Бутенко 3. А. Молекулярные механизмы лейкогенеза. — В кн.: Механизмы лейкозогенеза. Киев, 1975, с. 5—29.
Георгиев Г. П. О механизме онкогенеза: «промотерная гипотеза». — Молек. биол., 1981, вып. I» т. 15, с. 264—273.
Георгиев Г. П. Прыгающие гены, эволюция и канцерогенез. — В кн.: Междунар, симпозиум по молекулярной биологии. М., 1983, с. 40.
Гершензон С. М. Основы современной генетики. — Киев: Наукова думка, 1979.— 506 с.
Голубев А. Г., Дильман В. М. Онкофакторы (трансформирующие факторы роста). — Вопр. онкол., 1982, № 5, с. 87—98.
(Greenstein J. Р.) Гринштейн Дж. Биохимия рака. — М.: Иностр, литература, 1951. —394 с.
Дильман В. М. Эндокринологическая онкология. — Л.: Медицина, 1983.——408 с.
Дядькова А. М. Фильтрующиеся и нефильтрующиеся саркомы. — Л.: Медицина» 1966. — 240 с.
Жданов В. М Канцерогенез: вирусы и транспозоны. — Вопр. онкол., 1984. № 2. с. 98—104
Зильбер Л. А., Ирлин И. С., Киселев Ф. Л. Эволюция вирусогенетической теории возникновения опухолей. — М.: Наука, 1975. — 344 с.
Инге-Вечтомов С. Г. Введение в молекулярную генетику. — М.: Высшая школа» 1983. —343 с.
Кавецкий Р. Е. Взаимодействие организма и опухоли. — Киев: Наукова думка. 1977. — 235 с.
Киселев Ф. 刀.，Татосян А Г., Гудков Д. В. и др. Молекулярные механизмы вирусного и невирусного канцерогенеза. — Итоги науки и техники: Вирусология, № 10. М., 1983. — 169 с
Князев /7. Г., Кузнецов О. К., Перевозчиков А /7. и др. Перенос генетической информации онкориавирусов с помощью ДНК опухолевых клеток. — Вопр. оикол., 1976, № 1, с. 47—53.
Князев /7. Г., Шефер Р., Виллике ^. Идентификация трансформирующего гена Ha-ras в злокачественной меланоме, нейробластоме и раке молочной железы человека. — В кн.: 16-я коиф. Федерации европейских биохимических обществ: Тезисы докладов. М., 1984 — с. 300.
КукаПн Р. 4., Муровская М. 0r Ильинская Т. И. Эндогенные вирусы.——Рига: Зинатне, 1981. — 132 с,
Напалков Н П. Трансплацентарный канцерогенез. — Вести. АМН СССР, 1977, № 10, с. 14—19.
Напалков 〃. П., Мерабишвили В. М., Церковный Г.中.Преображенская М. //. Заболеваемость населения СССР злокачественными новообразованиями за период с 1970 по 1980 г. — Вопр. онкол.» 1982, № 10, с. 26 —71.
Пинчук В. Г. Современные проблемы экспериментальной и теоретической онкологии.—Экспер. онкол.. 1979, № 1, с. 5—7.
Рубенчик Б. Л. Биохимия канцерогенеза.— Киев: Здоровья, 1977.— 191 с.
(Сейц И. Ф.) Seitz /. F. The Biochemistry of the Cells of blood and bone marrow / Ed. I. N. Kugelmas. — Springfield: C. Thomas PubL, 1969. — 248 p.
Сейц ". Ф., Князев П. Г., Перевозчиков А. П. и др. Поиск раковых и структурных вирусных генов в ДНК нормальных и опухолевых клеток человека методом трансфекции и молекулярной гибридизации. — В кн.; Вирусы рака и лейкоза. М., 1979. с. 172—175.
Сейц И. Ф., Князев /7. Г., Федоров С. 〃. Онкогены. Происхождение, распространение, структура и функции в канцерогенезе. — Вопр. онкол., 1982, № 10, с. 95—114.
Сейц И. Ф,, Луганова ". С. Биохимия клеток крови и костного мозга в норме и при лейкозах. — Л.: Медицина» 1967. — 331 с.
Татосян А. Г・，Галецкий С. Л., Киселева Н. /7. и др. Анализ экспрессии онкогенов в опухолях человека. — Докл. АН СССР» 1983» т. 272, № 3, с. 726— 728.
Турусов В. С, Парфенов Ю. Д. Проблема порога в химическом канцерогенезе.— Вопр. онкол., 1982, № 12, с. 88—97.
Федоров С. 〃., Татосян А. Г., Князев 〃. Г. и др. Анализ родства генов вируса саркомы кур Д6 и вируса саркомы Рауса штамма Прага С. —Вопр. онкол.. 1984, № 2, с 77—80.
Чумаков И. М, Прасолов 8. С., Киселев Л.刀.Последовательиости ДНК млекопитающих, родственные гену src вируса саркомы Молони, и их картирование.— Докл. АН СССР, 1980, т. 252, № 1, с. 232—234.
Шабад Л. М. Эволюция концепций бластомогеиеза. — М.: Медицина, 1979.— 286 с.
Шапот В. С. Биохимические аспекты опухолевого роста. — М.: Медицина, 1975.— 304 с.
Эмануэль И. М Кинетика экс пер и мента л ьи ы х опухолевых процессов. — М.: Наука, 1977.— 416 с.
А 1Ыпо Д.» Le Strange /?., Oliff A et al. Transforming ras genes from human melanoma: a manifestation of tumor heterogenecity. — Nature, 1984, v. 309, p. 69—72.
Alitalo К.. Schwab AL. Lin С. C. et al. Homogeneously staining chromosomal regions contain amplified copies of an abundantly expressed cellular oncogene (c-onc) in malignant neuroendocrine cells from a human colon carcinoma.— Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983. v. 80, p. 1707—1711.
Ames B.t Durston 呼.E. Yamasaki E. ef al. Carcinogens are mutagenes: a simple test system combining liver homogenates for activation and bacteria for • detection. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1973, v. 10, p. 2281—2285.
Ashurst S. W.t Cohen G. M. In vivo formation of benzo (a) pyrene diol epoxide deoxyadenosine adducts in the skin of mice susceptible to benzo (a) pyrene- induced carcinogenesis. — Int. J. Cancer. 1981, v. 2 7, p. 357—364.
Ashurst S. y.. Cohen G M. The formation and persistence of benzo (a) pyrene metabolite-deoxyribonucleoside adducts in rat skin in vivo. — Int. J Cancer 1981. v. 28, p. 387—392.
Astrin S. M. Endogenous viral genes of the white leghorn chicken: Common site of residence and sites associated with specific phenotypes of viral gene expression. — Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1978, v. 75, p 5941—5945.
Baird M. W.t Birnbaum L. S. Increased production of mutagenic metabolites of carcinogens by tissues from senescent rodents. — In: The Year Book of Cancer/Comp. a. ed by R. L. Clark, R. W. Cumley, R. C. Hickey. Chicago: London, 1981. p. 331—333.
Balmain A., Paragnell /. B. Mouse skin carcinomas induced in vivo by chemical carcinogenesis have a transforming Harvey・「as oncogene. — Nature. 1983 v. 303, p. 72—74.
Balmain A.t Ramsden M., Bowden G. et al. Activation of the mouse cellular Harvey-ras gene in cheminally induced benign skin papillomas. — Nature. 1984, v. 307, p. 658—661.
Baltimore。，Shields G., Otto G. et。厶 Structure and expression of the Abelson murine leukemia virus genome and its relationship to a normal cell gene.— Gold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1980» v. 44. p. 849—854。
Barbacid M, Beemon /С, Devare S. Origin and functional properties of the major gene product of the Snyder-Theilen strain of feline sarcoma virus. — Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1980, v. 77, p. 5158—5162.
Barker R £. Double minutes in human tumor cells. — Cancer Genet. Cytogenet.. 1982, v> 5, p. 81—94.
Bauer K. 〃• Mutationstheorie de「Geschwulst-Entstehung. Uebergang von Korper- zellen in Geschwulst-zellen durch Gen-Anderung. — Berlin, 1928, c. 237.
Becker D., Lane M. A., Cooper C. Identification of an antigen associated with transforming genes of human and mouse mammary carcinomas. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, v. 79, p. 3315—3319.
Beemon /(„ Hunter Г Characterization of Rous sarcoma virus src gene products synthesized in vitro. — J. Virol.. 1978, v. 28, p. 551—566.
Beir Report II. The effects on populations of exposure to low levels of ionizing『adia・ tion. — Natl. Acad. Sci., Natl. Res. Counsil., Washington, 1980.—638 p. (Beisson J.) Бейссон M- Генетика. — M : Атомиздат, 1976. — 128 с.
Besmer P. Acute transforming feline retroviruses.——In: Carrent Topics in Microbiology and Immunology / Ed. by P. K. Vogt, A. Koprowsky. Berlin; N. Y.» 1983, v. 107, p. 1—27.
Beug 〃.，Graf T., Hayman M. J. Production and characterization of antisera specific for erb-portion of p75. the presumptive transforming protein of avian erythroblastosis virus. — Virology, 1981, v. 111. p. 201—210.
Bird A. 2 Use restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation.— J. Molec. Biol., 1978, v. 118, p. 49—60.
Bishop J. M. Enemies within: the genesis of retrovirus oncogenes.— Cell. 1981, v. 23. p. 5—6.
Bishop J. M. Oncogenes. — Sci. Am.. 1982. N 3, p. 80—93.
Bishop J. M. Retroviruses and cancer genes. — Adv. Cancer Res.. 1982, v. 37, p. 1—32.
Bishop J. M. Cellular oncogenes and retroviruses.—Ann. Rev. Biochem.. I983t v. 52, p. 301—354.
Bishop 丄 M., Gonda T., Hughes S. H. ef al. The genesis of avian retrovirus oncogenes.—Maiami Winter Symp., 1981. v. 12, p. 261—273.
Bishop 丄 M., Varmus H. E Functions and origins of retroviral transforming genes. — In: RNA tumor viruses. Molecular Biology of tumor viruses / Ed. by R. Weiss et al. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., 1982, p. 999—1108.
Blair D. С.» Oskarsson M., Wood 7. G. et al. Activation of transforming potential of a normal cell sequence: a molecular model for oncogenesis. — Science, 1981, v. 212. p. 941—943
Borek C. X-ray induced in vitro neoplastic transformation of human diploid cells.— Nature, 1980, v. 283, p. 776—778.
Boveri T. The origin of malignant tumors. — Baltimore, 1929.
Brookes 2. Newbold R. F. Biological effects of specific hydrocarbon — DNA reactions. — In: Carcinogenesis: Fundamental Mechanisms and Environmental Effects / Eds. B. Puleman, P. О. P. Ts'o, H. Gelboin. Dordrecht, Boston, London, 1980. v. 13, p. 81—90.
Brown R., Marshall Ch.t Pennie S. et al. Mechanism of activation of an N-ras gene in the human fibrosarcoma cell line HT 1080. — EMBOJ.. 1984, 3, p. 1321—1326.
Buhrow S 4, Cohen S., Staros 丄 匕 Affinity labeling of the protein kinase associated with the epidermal growth factor receptor in membrane vesicles from A 431 cells. — J. Biol. Chem., 1982, v. 257, p. 4019—4022.
Burnet F. M. Cancer: somatic-genetic considerations.——Adv. Cancer Res., 1978, v. 28, p. 1 —29.
Cairns /. The origin of human cancers. — Nature» 1981, v. 289, p. 353—357.
Cairns J. a. Logan /. Step by step into carcinogenesis. — Nature, 1983, v. 304, p. 582—583.
Calos M P., Muller J. H. Transposable elements. — Cell. 1980, v. 20, p. 579—595.
Canaani £, Robbins C., Aaronson S. A. The transforming gene of Moloney murine sarcoma virus.— Nature, 1979, v. 282. p. 378—383.
Capecchi M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian. - Cell, 19S0, v. 22, p. 479—487.
Capon D. J., Seeburg P. 〃.，McGrath 丄 P. et al. Activation of Ki-ras 2 gene in human and lung carcinomas by two different point mutations. — Nature, 1983. v. 304, p. 507—513.
Capon D.丄，СЛеп E. У., Levinson A D. et q/. Complete nucleotide sequences of the T24 human bladder carcinoma oncogene and its normal homologue.— Nature, 1983, v. 302, p. 33—37.
Chang E.》.，Ellis R 犷.，Scolnick E M. et a/. Transformation by cloned Harvey murine sarcoma virus DNA: efficiency increased by long terminal repeat DNA —Science, v. 210, p. 1249—1251.
Chang E "., Furth M. E, Scolnick E. M. et al. Tumorigenic transformation of mammalian cells induced by a normal human gene homologous to the oncogene of Harvey murine sarcoma virus. — Nature, 1982, v. 297, p. 479—483.
Chang E H.t Gonda M. A., Ellis R. W. et al. Human genome contains four genes homologous to transforming genes of Harvey and Kirsten murine sarcoma virus. — Proc Natl. Acad. Sci. USA. 1982, v. 79, p. 4848—4852.
Chattopadhyay S. /С, Chang £. 〃.，Lander M. R. et al. Amplification and rearrange- met of one genes in mammalian species. — Nature, 1982, v. 296. p. 361—363.
Coffin J. M. Structure of the retroviral genome. — In: RNA tumor viruses.— Molecular Biology of tumor viruses/Ed. by R. Weiss et al. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., 1982, p. 261—368.
Coffin /. M., Varmus H. £., Bishop J. M. et al. Proposal for naming host cell-derived inserts in retrovirus genomes. — J. Virol., 1981, v. 40, p. 953—957.
Cohen S.t Ushino 〃.，Stoscheck C. 〃 al. A native 170.000 epidermal growth factor receptor-kinase complex from shed plasma membrane vesicles. — J. Biol. Chem.. 1982, v. 257, p. 1523—1531
Collet M. S., Brugge J. S・.Erikson R. L. Characterization of normal avian cell protein related to the avian sarcoma virus transforming gene product.— Cell, 1978. v. 15. p. 1363-1369.
Collet M. S.. Erikson £, Erikson R. L. Structural analysis of the avian sarcoma virus transforming protein: sites of phosphorylation. — J. Virol.» 1979. v. 29, p. 770—781
Collins C.丄，Boettiger D.t Green T. L. et al. Arrangement of integrated avian sarcoma virus DNA sequences within the cellular genomes of transformed and revertant mammalian cells. — J. ViroL, 1980, v. 33. p. 760—768
Collins S., Groudine M. Amplification of endogenous myc-related DNA sequences in a human myeloid leukemia cell line. — Nature, 1982, v. 298. p. 679—60L
Collins S.丄，Groudine M. Rearrangement and amplification of c-abl sequences in the human chronic myelogenous leukemia cell line K-562. — Proc. NatL Acad., Sci. USA. 1983, v. 80, p. 4813—4817.
Comings D. E. A general theory of carcinogenesis. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1973. v. 70, p. 3324 -3328.
Cooper G. AL Cellular transforming genes. — Science, 1982, v. 218, p. 801—806.
Cooper G. M., Lane M.-A. Cellular transforming genes and oncogenesis. — BBA, 1984. v. 738, 132, p. 9—20.
Cooper G. M., Neiman P. E. Two distinct candidate transforming genes of limphoid leukosis virus-induced neoplasms. — Nature, 1981, v. 292, p. 857- 858.
Cooper G. M, Okenquist S., Silverman L. Transforming activity of DNA of chemically transformed and normal cells. — Nature. 1980, v. 284, p. 418—421.
Cooper G. M, Bowen-Pope D.凡 Raines Ed al. Similar effects of platelet-derived growth factor and epidermal growth factor on the phosphorylation of tyrosine in cellular proteins. — Cell, 1983, v. 31, p. 263—273.
Cooper /. A., Hunter Г. Four different classes of retroviruses induce phosphorylation of tyrosines present similar cellular proteins. — Molec. Cell. Biol., 1981, v. 1. p. 394 —407.
Cooper /. 4. Hunter T. Discrete primary locations of a tyrosine protein kinase and of three proteins that contain phosphotyrosine in virally transformed chick fibroblasts. — J. Cell. Biol.. 1982, к 94. p 287—296.
Cooper /. A , Reiss N. Д., Schwartz R.丄 et al. Three glycolytic enzymes are phosphorylated at tyrosine in cell transformed by Rous sarcoma virus. Nature, 1983. v. 302, p. 218 -223.
Courtneidge S. A., Smith A. E. Polyoma virus transforming protein associates with the product of the c-src cellular gene. — Nature, 1983, v. 303. p. 435—439.
Cremer X., Reddy E. P., Aaranson S. Translational products of Moloney murine sarcoma virus RNA: identification of proteins endoded by the murine sarcoma virus src gene. — J. Virol.. 1981, v. 38, p. 704—71 L
Curran Teich N. M. Candidate product of the FBJ murine osteosarcoma virus oncogene: characterization of a 55.000 dalton phosphoprotein.—J. Virol., 1982, v. 42, p. 114—122.
Czernilofsky 4 P., Levinson A. D, Varmus A E. et al. Nucleotide sequence of an avian sarcoma virus oncogene (src) and proposed amino acid sequence for gene product. — Nature, 1980t v. 287, p. 198 -203.
Dale 8., Ozanne B. Characterization of mouse cellular deoxyribonucleic acid homologous to Abelson murine leukemia viral-specific sequences.—— Molec. Cell. Biol., 1981. v. 1, p. 731—742.
Dalla-Favera R, Martinotti S., Gallo /?. C. Translocation and rearrangements of the c-myc oncogene locus in human undifferentiated В-cell lymphomas. — Science, 1983, v. 219, p. 963—967.
Dalla-Favera R. D.t Wong-Staal F.. Gallo R. C. One gene amplification in promyelo- cytic leukemia cell line HL-60 and primary leukemia cells of the same patient.—— Nature, 1982b. v. 299. p. 61—63.
David-Pfeuty 7\, Singer S. J. Altered distribution of the cytoskeletal proteins vincu- lin and a-actin in cultured fibroblasts transformed by Rous sarcoma virus.— Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, v. 77, p. 6687—6691.
De Feo 0., Gonda M. 4, Young H. A. et al. Analysis of two divergent rat genomic clones homologous to the transforming gene of Harvey murine sarcoma virus.— Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, v. 78, p. 3328 —3332.
DeKlein A Wessel 4 D., Grossveld G. et al. A cellular oncogene is translocated
to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukemia. — Nature. 1982, v. 300, p. 765—767.
DeLarco J.. Todaro G. /. Growth factors from murine sarcoma virus-transformed.
ceils. — Proc. Nat. Acad. Sci.» 1978, v. 75, p. 4001— 4005.
Der D.丄，Krontiris 7. G, Ceoper G M. Transforming genes of human bladder and lung carcinoma cell lines are homologous to the ras gene of Harvey and Kirsten sarcoma virus. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982. v. 79, p. 3637—3640.
DevareS. G., Reddy E. P., Law /. D. et al. Nucleotide sequence of the simian sarcoma virus genome: demonstration that acquired cellular sequences encode the transforming gene product p 28s,s. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, v. 80, p. 731—735.
Dhar R., McClements IF. L, Enquist £.呪 et al. Nucleotide sequences of integrated Molony sarcoma provirus long terminal repeats and their host and viral junctions. —Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980. v. 77, p. 3937—3941.
Diamond A, Cooper G. M., Ritz J. et al. Identification and molecular cloning of the human Blym transforming gene activated in Burkitt lymphomas. — Nature, 1983, v. 305, p. 112-116.
Dickson C.f Peters G. Protein coding potential of mouse mammary tumor virus genome RNA as examined by in vitro translation. — J. Virol., 1981, v. 37, p. 36—47.
DiPaolo /. A. In vitro transformation: interactions of chemical carcinogens and radiation. —In: Biology of radiation carcinogenesis / Eds. J. M. Yuhas, R. W. Tennant, T. D. Regan. N. Y.. 1980, p. 235—342.
Doll R Strategy for delection of cancer hazards to man — Nature, 1977, v. 265, p. 589—596.
Doolittle R F. Similar amino acid sequences: chance or common ancestry?— Science. 1981, v. 214, p. 149—159.
Doolittle R. F., Hunkapiller M. №., Hood L. E. et q/. Simian sarcoma virus one gene, v-sis, is derived from the gene (or genes) encoding a platelet derived growth factor. — Science, 1983, v. 221, p. 275—277.
Drake 丄 W., Baltz R. H. Biochemistry of mutagenesis. — Ann. Rev. Biochem.. 1976, v. 45, p. 11—37.
Druckrey 〃. Chemical carcinogenesis on N-nitroso-derivatives. — Gann Monogr. Cancer Res., 1975, v. 17, p. 107—131.
Duesberg P. H. Retroviral transforming genes in normal cells? — Nature, 1983, v. 304, p. 219—226.
Duesberg A H., Bister AC, Moscovici C. Genetic structure of avian myoloblastosis virus, released from transformed myeloblasts as defective virus particles.— Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, v. 77, p. 5120—5124.
Eastman 4, Bresnik E Persistent binding of 3-methylcholantrene to mouse lung DNA and its correlation with susceptibility to pulmonary neoplasia.——Cancer Res., 1979, v. 39, p. 2400—2405.
Eisenman R. M, Vogt 匕 M. The biosynthesis of oncovirus proteins. — Biochem. Biophys. Acta, 1978, v. 473, p. 187—239.
Ellis R. IF., De Feo D, Furth M. E. et a厶 Mous cells contain two distinct ras gene mRNA species that can be translated into a p21 one protein. —Molec. Cell. Biol., 1982, v. 2, p. 1339—1345.
Ellis R 励.，De Feo D, Maryak /. M. et q/. Dual evolutionary origin for the rat genetic sequences of Harvey murine sarcoma virus. — J. Virol.» 1980, v. 36, p. 408— 420.
Ellis R. W., De Feo D., Shih 7. У. et al. The p 21 src genes of Harvey and Kirsten sarcoma viruses originate from divergent members of a family of normal verteb* rate genes. — Nature, 1981, v. 292, p. 506—510.
Ek B., Westermark B.t V^asteson A. eZ al. Stimulation of tyrosine-specific phosphorylation by platelet-derived growth factor. — Nature. 1982t v. 295, p. 419—420.
Erikson £.. Erikson R. L. Identification of a cellular protein substrate phosphorylated by the avian sarcoma virus transforming gene product. — Cell, 1980, v. 21, p. 829—836.
Erickson L. C., Osieka R., Sharkey N. 4 et al. Measurement of DNA damage in unlabeled mammalial cells analyzed by alkaline elution and a fiuorometridc DNA assay. — Anal. Biochem., 1980, v. 106, p. 169—174*
Erickson J., Rushdi A., Drwirnga ". L. et al. Transcriptional activation of the translocated c-myc oncogene in Burkitt lymphoma. — Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1983. v. 80, p. 820—824.
Eva A., Aaronson S. A. Frequent activation of c-kis as a transforming gene in fibrosarcomas induced by methylcholantrene. — Science, 1983, v. 20, p. 995—996.
Eva A.t Robbins K. S., Andersen P. R. et al. Cellular genes analogous to retroviral one genes are transcribed in human tumour cells. — Nature, 1982, v. 295, p. 116.
Eva A.t Tronick S. /?., Gol R. A. et al. Transforming genes of human hematopoietic tumors: frequent detection of ras related oncogenes whose activation appears to be independent of tumor phenotype. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, v. 80, p. 4926—4930.
Fasano O., Aldrich T., Tamanoi F. et a/. Analysis of the transforming potential of the human H-ras gene by random mutagenesis. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, v. 81, N 13, p. 4008 -4012.
Faver a R. D, Wong-Staal E, Gallo R. C. One gene amplification in promyelocytic leukaemia cell line HL-60 and primary leukaemic cells of the same patient.—— Nature, 1982, v. 299, p. 61—63.
Feinberg A. 2. Vogelstein B. Hypomethylation distinguishes of ras genes of same human cancer from their normal conterparts. — Nature. 1983, v. 301, p. 89—92.
Feinberg A.尸・，Vogelstein A, Droller M. J. et al. Mutation affecting the 12th amino acid of the c-Ha-ras oncogene product occurs infrequently in human cancer.— Science, 1983, v. 220, p. 1175—1177.
Fialkow P.丄，Martin 尸丄，Najfeld И et al. Evidens for a multistep pathogenesis of chronic myelogenous leukemia. — Blood, 1981, v. 58, p. 158—163.
Fishbein L. Potential carcinogenic and mutagenic industrial chemicals. I. Alkylating agents.—J. Toxic. Environ. Health» 1980, v. 6, p. 5—6.
Fujita /., Yoshida O,, Yuasa К et al. Ha-ras oncogenes are activated by somatic alteration in human urinary tract tumors.— Nature, 1984, 309, p. 265—266.
Furth M. E, Davis 7. /., Fleurdelys B. et al. Monoclonal antibodies of the p21 products of the transforming gene of Harvey murine sarcoma virus and of the cellular ras gene family. —J. Virol., 1982, v. 43. p. 294 —304.
Gafner К, PhilUpsen P. The yeast transposons Ту 1 generates duplications of target DNA on insertion. — Nature, 1980, v. 286, p. 414—418.
Galloway D, A., McDougal /. K・ The oncogenic potential of herpes simplex viruses: evidence for a «hit-and-run> mechanism, — Nature, 1983, v. 302, p. 21—24.
Gambke Ch.9 Singer E., Moroni Ch. et al. Activation N-ras in bone marrow cells from patient with acute myeloblast leukaemia. — Nature, 1984, v. 307. p. 476— 478.
Gattoni S., Kirschmeier P., Weinstein /. et al. Cellular Moloney murine sarcoma (c・ mos) sequences are hypermethylated and transcriptionally silent in normal and transformed rodent cells. — Molec. Cel) Biol., 1982, v. I, p. 42—51, Gay M /., Walker J. E Homology between human bladder carcinoma oncogene product and mitochondrial ATPase. — Nature, 1983, v. 301, p. 262— 264.
Gerard О. £, Grandgenett D. P. Retrovirus reverse transcriptase.— In: Molecular Biology of RNA tumor viruses / Eds. J. Stephenson. N. Y., 1980, p. 345—394.
Ghysdael /., Neil /. C„ Vogt P. K・ Cleaved of four avian sarcoma virus polyproteins with virion protease pl5 removes gag sequences and yields large fragments that function as thyrosine phosphoacceptors in vitro. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, v. 78, p.
Gibbs /., Ellis A., Scolnick f. Autophosphorylation of v-Ha-ras p 21 is modulated by amino acid residue 12. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81, p. 2674—2678.
Gilbert £ Chromosomal aberrations and oncogenes. — Nature, 1983. v. 303. p. 475. Goff S. R, Gilboa E, Witte О. M et al. Structure of the Abelson murine leukemia virus genome and the homologous cellular gene: studies with cloned viral DNA. — Cell, 1980, v. 22. p. 777—785.
Goff S. P., Tabin C. /., Wang J. К et al. Transfection of fibroblasts by cloned Abelson murine leukemia virus DNA and recovery of transmissible virus by recombination with helper virus. — J. Virol., 1982. v. 41, p. 271—285.
Goldfarb M., Shimizu K・，Perucho M. et a/. Isolation and preliminary characterization of a human transforming gene from T24 bladder carcinoma cells.— Nature. 1982, v. 296, p. 404 — 409.
Gonda Th., Metcalf D. Expression of myb, myc and fos protooncogenes during the differentiation of a murine myeloid leukemia. — Nature, 1984, 310, p. 249.
Gonda T. /., Sheiness D. K., Bishop /. M. Transcripts from the cellular homologs of retroviral oncogenes: distribution among chicken tissues. — Molec. Cell. Biol., 1982, v. 2, p. 617—624.
Goubin G., Goldman D., Nice /. et al. Molecular cloning and nucleotide sequence of a transforming gene detected by transfection of chicken В-cell lymphoma DNA. — Nature, 1983, v. 302, p. 314—319.
Greenberg M., Ziff E. Stimulation of 3T3 cell induces transcription of the c-fos proto* oncogene. — Nature, 1984t v. 311, p. 433—438.
Groffen /., Heisterkamp N., Stephenson J. R. et al. c-sis is translocated from chromosome 22 to chromosome 9. —J. Exp. Med., 1983, v. 158, p. 9—15.
Hall A., Marshall C. Spurr M et al. Identification of transforming genes in two human sarcoma cell lines as a new member of the ras gene family located on chromosome 1. — Nature, 1983, v. 303, p. 396—400.
Hanafusa 7\, Mathey-Prevet B., Feldman R. A. et al. Mutant Fujinami sarcoma virus which are temperature-sensitive for cellular transformation and protein kinase activity. — J. Virol., 1981» v. 38, p. 347—355.
Harada F., Peters G. G., Dahlberg 丄 £ The primer tRNA for Moloney murine leukemia virus DNA synthesis. Nucleotide sequence and aminoacylation of tRNAPe. —J. BioL Chem., 1979, v. 254, p. 10979—10985.
Hayward W. S., Neel B. G., Astrin S. M. Activation of a cellular one gene by promoter insertion in ALV-induced lymphoid leukosis. — Nature. 19 81, v. 290, p. 475—480.
Heidelberger C. Chemical oncogenesis in culture, — Ann. Rev. Biochem., 1975, v. 44, p. 79—121.
Heidelberger C. Mammalian cell transformation and mammalian cell mutagenesis in vitro. — J. Environ. Path. Toxicol., 1980, v. 3, 4, p. 69—87.
Heisterkamp M, Groffen 丄，Stephenson J. R, et al. Chromosomal localization of human cellular homologues of two viral oncogenes. — Nature, 1982, v. 299, p. 747— 749.
Heldin С.-H., Westermark В. Growth factors: Mechanism of action and relation to oncogenes. — Cell, 1984, v. 37, p. 9—20.
Higginson 丄 Цит. по C. Mastromatteo, 1982.
Huberman £., Sachs L, Yang S. У. et q/. Identification of mutagenic metabolism of benzo (a) pyrene in mammalian cells. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976, v. 73, p. 607—611.
Huebner R. /., Todaro G 丄 The viral oncogene hypothesis: New evidence. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1972, v. 69, p. 1009—1015.
Huh N., Knyasev P. G., Schafer R. ef al. Expression of the c-ras genes in normal and ethylnitrosourea (EtNU) — transformed rat brain cells. — Febs Letters, 1983, v. 154, p. 407—410.
Hunter Г., Sefton В. M. Transforming gene product of Rous sarcoma virus phosphorylates tyrosine. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980» v. 77, p. 1311 —1315.
I ARC Monographs on the evaluation of the carcinogenic risk of chemicals to humans. —Intern. Agency Cancer Res., Lyon, v. lv 1972; v. 7, 1974; v. 7, 1975; v. 10, 1975; v. 16. 1978.
Jaenisch R Retroviruses and embriogenesis. — Hoppe—Seyler's Z. Physiol. Chem., 1982, Bd. 363, S. 1267—1272.
Jansen 〃. W., Lurz R., Bister /С et al. Homologous cell-derived oncogenes in avian carcinoma virus MH 2 and murine sarcoma virus 3611 — Nature, 1984, v. 207, p. 281—284
Jeffrey A. M.t Kinoshita「，Santella R M. et a/. The chemistry of polycyclic aromatic hydrocarbon — DNA adducts. — In: Carcinogenesis: Fundamental Mechanisms and Environmental Effects / Eds. B. Pullman, P. О. P. Ts*o. H. Gelboin. Dordrecht; Boston; London. 1980, v. 13, p. 565—579.
Jerina D. M., Sayer 丄 M., Thakker D. R. et al. Cardiiogenesity of polycyclic aromatic hydrocarbons: the bay region theory. — Carcinogenesis: Fundamental Mechanisms and Environmental Effects / Eds. B. Pullman. P. О. P. Ts'o, H. Gelboin. Dordrecht; Boston； London, 1980, v. 13, p. 1 —12.
Jones P. A., Taylor S. M. Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methyla* tion. — Cell. 1980. v. 20, p. 85—93.
J unis 丄丄 et al. Distinctive chromosomal abnormalities in histologic subtypes of non-Hodgkin*s lymphoma. — New Engl. J. Med., 1982、v. 307, p. 1231 —1236.
Kadlubar F. E Transversion mutation hypothesis for chemical carcinogenesis by №-substitution of guanine in DNA. — Chem. BioL Interact, 1980. v. 31, p. 255—263.
Kadlubar F. E, Miller E C. Guanine Oe-etylation of DNA by the carcinogen N-hydroxy- 1-naphtylamine. — Cancer Res., 1978, v. 38, p. 3628—3638.
Ka々〃几aga Г Neoplastic transformation of human diploid fibroblast cells by chemical carcinogens. — Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1978, v. 75, p. 1334—1338.
Kasuga Af, Karlsson F. 4.. Kahn C. R. Insulin stimulates the phosphorylation of the 95.000-dalton subunit of its own receptor. — Science, 1982. v. 215, p. 185.
Kasuga M., Zick Y., Blith D. L. et al. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cellfree system. — Nature, 1982t v. 298, p. 667— 669.
Kasuga M., Zick У., Blith D. et al. Insulin stimulation of phosphorylation of the p-subunit of the insulin receptor. J Biol. Chem., 1982, v. 257, p. 9891—9894
Kawai S., Yoshida M., Segawa ^. et a/. Characterization of Y73, an avian sarcoma virus: a unique transforming gene and its product, a phosphoprotein with protein kinase activity. — Proc. Natl. Acad Sci. USA, v. 77t p. 6199—6203.
Kennedy A. R., Fox M.f Murphy G. et al. Relationship between X-ray exposure and malignant transformation in СзН 10T1/2 cells. — Proc. NatL Acad. Sci. USA, 1980, v. 77. p. 7262—7266.
King H. W. S., Osborne M. R、. Brookes P. The metabolism and DNA binding of 3-methyl-cholantrene. — Int. J. Cancer. 1977, v. 20, p. 564 —571.
King H. W. S., Osborne M. &., Brookes P. The identification of 3-methyIcholantrene-9, 10-dihydrodiol as an intermediate in the binding of 3>methylcholantrene to DNA in cells in culture. — Chem.-Biol. Interact.. 1978» v. 20, p. 367—371.
King H. W. S., Osborne M. A.. Brookes P. The in vitro and in vivo reaction at the N7- position of guanine of the ultimate carcinogen derived from benzo (a) pyrene. Chem. Biol. Interact, 1979, v. 24, p. 345—353.
Kirschmeier 2, Gttoni-Celli S., Dona D. et al. Carcinogen- and radiation-transformed C3H10T % cells contain RNAs homologous to the long terminal repeat sequence of a murine leukemia virus. — Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1982, v. 72, p. 2773—2777.
Klein G. The role of gene dosage and genetic transpositions in carcinogenesis.— Nature, 1981, v. 294, p. 313—318
Klein G. Specific chromosomal translocations and the genesis of В-cell derived tumo
urs in mice and men. — Cell, 1983, v. 32, p. 311—315.
Knudson A G. Human cancer genes. — In: Genes,Chromosomes and Neoplasia/Eds.
F. E Arrighi, P. N. Rao, E. Stublefield. N. Y.: Press Raven, 1981, p. 453—462. Kolata G. Is tyrosine the key to growth control? — Science, 1983, v. 219, p. 377—378. Konda N.t Schreck /?., Alt F. et al. Isolation of amplified DNA sequences from
IMR-32 human neuroblastoma cells: Facilitation by fluorescence-activated flow sorting of metaphase chromosomes. — Proc. Natl. Acad. ScL USA, 1983, v. 80, p. 4060—4073.
Krebs H. Otto Heinrich Warburg. — Biol mem. fellows Roy. Soc., 1972, v. 18,
p. 629—699.
Kriek £*., Westra /. G. Metabolic activation of aromatic amines and amides and interactions with nucleic acids. — In: Chemical carcinogens and DNA / Eds. P. L. Grover. New York, 1980, v. 11, p. 1—28.
Krontiris Г G., Cooper G. M. Transforming activity of human tumor DNAs.— Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, v. 78, p. 1181 — 1184.
Krontiris 7. G., DiMartino N. A., Cobb M. et al. Unique allelic restriction fragments of the human Ha-ras locus in leukocyte and tumor DNAs of cancer patients.— Nature, 1985, v. 313, p. 369—374.
Kumata T., Feramisco 丄 Epidermal growth factor stimulates guanine nucleotide binding activity and phosphorylation of ras oncogene proteins. — Nature, 1984. v. 310, p 145-150.
Land 〃.，Parada L, Weinberg R A. Tumorogenic conversion of primary embryo fibroblast requires at least two cooperating oncogenes. — Nature, 1983, v. 304, p. 596—602.
Land 〃.，Parada £., Weinberg R. 4. Cellular oncogenes and multistep carcinogenesis. —Science, 1983, v. 222, p. 771—778
Lai M. M., Hu S. S. E, Vogf P・ K. Avian erythroblastosis virus: transformationspecific sequences from a contiguous segment of 3.25 kb located in the middle of the 6-kb genome. — Virology, 1979. v. 97, p. 366—377.
Lai M, M. C., Neil J. C., Vogt P. ^. Cell-free translation of avian erythroblastosis virus RNA yields two specific and distanct proteins with molecular weights of 75.000. — Virology, 1980, v. 100, p. 475—483.
Lane M.-A.t Sainten A.r Cooper G M. Activation of related transforming genes in mouse and human mammary carcinomas. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. v. 78, p. 5185—5189.
Lane M.-A.t Sainten A., Cooper CM Stage specific transforming genes of human and mouse В and T lymphocyte neoplasms. — Cell, 1982, v. 28, p. 873—880.
Lane M.-A.t Sainten A.. Doherty K. et al. Isolation and characterization of a stagespecific transforming gene Tlym-1, from T-cell lymphomas. — Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1984, v. 81, p. 2227—2231.
Langeheim 〃.，Shih T. Y., Scolnick E. M. Identification of a normal vertebrate cell protein related to the p 21 src of Harvey miirine sarcoma virus. — Virology, 1980, v. 106, p. 292—300
La prince D.t Gegonne A. t Cell 丄 et al. A putative second cell-derived oncogene of the avian leukaemia retrovirus E 26. —Nature, 1983, v. 306, p. 395—397.
Lawley P D. DNA as a target of alkylating carcinogens. — Brit. Med. Bull., 1980, v. 36, p. 19—24
Leberman /?., Eager U. Homologies in the primary structure of GTP-binding proteins: the nucleotide-binding site of EF-Tu and p 21. — EMBO J., 1984, v. 3. p. 339—341
Levin W7., Wood A 皿，Yagi H. et al. (±)-trans-7t8-dihydrobenze (a) pyrene: A potent skin carcinogen when applied topically to mice. — Proc. Natl Acad. Sci USA, 1976, v. 73, p. 3867—3871
Levinson A. D.f Courtneidge S. 4, Bishop 丄 M. Structural and functional domains of the Rous sarcoma virus transforming protein (ррбО") — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, v. 78, p. 1624—1628.
Levinson B., Khoury G., Vande Woude G et al. Activation of SV40 genome by 72-base pair tandem repeats of Moloney sarcoma virus. — Nature, 1982, v. 295, p. 568—572.
Linial AL, Blair D. Genetics of retroviruses. — In: RNA tumor viruses. Molecular Biology of Tumor viruses / Ed. by R. Weiss. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., New York, 1982, v. 649—784.
Maher V. M, Miller E С.» Miller /. A. et al. Mutations and decreases in density of transforming DNA produced by derivatives of the carcinogens 2-acetyl-aminofIuorene and N-methyl-4-aminoazoben zene. — Molec. Pharmacol., 1968, v. 4, p. 411—426.
Maher V. M., Miller E. C., Miller /. A. et a/. Mutations and loss of transforming activity of Bacillus subtilis DNA after reaction with esters of carcinogenic N-hydroxy aromatic amides. — Цит. no Miller J. A., 1970.
Maher V. M., Yang L. L., McCormick /. The role of DNA repair in prevention the cytotoxic and mutagenic effects of carcinogens in human cells. — In: Carcinogenesis: Fundamental Mechanisms and Environmental Effects / Eds. B. Pullman, P. О. P. Ts'o, H. Gelboin. Dordrecht; Boston, London. 1980, v. 13, p. 479 490.
Majors /. £., Varmus 〃. £ Nucleotide sequences at hostproviral junctions for mouse mammary tumour virus. — Nature. 1981, v. 289, p. 253—258.
Malaveille C, Bartsch 〃.，Grover P. L. et al. Mutagenicity of non-K-region diols and diol-epoxides of benz(a)antracene and benzo(a)pyrene.—Biochem. Biophys. Res. Comm., 1975, v. 66, p. 693—700.
Marcu R. B.t Harris 厶.Z, Stanton L. IT. et al. Transcriptionally active c-myc oncogene is contained within NIARD, a DNA sequence associated with chromosome translocations in В-cell neoplasia — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, v. 80, p. 519—523.
Margison G. P., Capps M. /., O'Connor P. J. Nucleic acid modification by Nn it rose compounds. Chapter 5. — In: Chemical carcinogenesis and DNA/Ed. P. L. Grover. N. Y., 1978. v. L p. 111 — 159.
Martinville 8, Cunningham J. M.t Murray M.丄 et aA The N-ras oncogene assigned to the short arm of human chromosome I. — Nucl. Acide Res.. 1983, v. 11, p. 5267—5271.
Martinville B., Giacolone J., Shih C. et al. Oncogene from human EJ bladder carcinoma is located on the short arm of chromosome 11.—Science, 1983, v. 219, p. 498—501.
Marx J. L. Oncogene related to growth factor gene. — Science, 1983, v. 221, p. 248. Mastromatteo C, Current concepts in occupational carcinogenesis. — In: Prevention of occupational cancer: Intern. Symp. Occupational safety and health series. N 46. Intern. Labor. Office. Geneva, 1982, p. 21—46.
Maugh『.H, II. Chemical carcinogenesis: a long neglected field blossoms. — Science, 1974, v. 183, p. 940—944.
Maugh『.". IL Chemicals: How many are there? — Science, 1978, v 199, p. 162. Maugh T. ". Carcinogens in the work place: where to start cleaning up. — Science, 1980, v. 197, p. 1268—1269.
McCann 丄，Ames B. N. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/ microsome test: assay of 300 chemicals: Discussion. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976, v. 73, p. 950—954.
McCann /., Choi £., Yamasaki E. et q/. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsonie test: assay of 300 chemicals. Part I. — Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1975, v. 72, p. 5135—5139.
McCormick J. /., Silinskas К. C., Maher V. M. Transformation of diploid human fibroblasts by chemical carcinogens. — In: Carcinogenesis: Fundamental Mechanisms and Environmental Effects / Eds. Pullman P. О. P., Ts'o, H. Galboin. Dordrecht; Boston; London, 1980, v. 13, p. 491 498.
McCoy M. S., Toole J.『.，Cunningham /. M et al. Characterization of a human colon/lung carcinoma oncogene. 一 Nature, 1983, v. 302, p. 79—81.
McGrath J., Capon D., Goeddel D. of al. Comparative biochemical properties of normal and activated human ras p21 protein. — Nature, 1984, v. 310, p. 644—649.
McGrath /. A, Capon G 丄，Smith D. H. et al. Structure and organization of the human Ki-ras proto-oncogene and a related processed pseudogene. — Nature, 1983, v. 304, p 501—506
Miller E. C. Some current perspectives on chemical carcinogenesis in human and experimental animals: presidential a dress. — Cancer Res., 1978, v. 38, p. 1479— 1496.
Miller /. A. Carcinogenesis by Chemicals: An overview — G. H. Clowes memorial lecture. — Cancer Res., 1970, v. 30» p. 559―576.
Milo G. £., Di Paolo 丄 A Neoplastic transformation of human diploid cells in vitro after chemical carcinogen treatment. — Nature, 1978, v. 275, p. 130—132.
Montesano R , Bartsch H. Mutagenic and carcinogenic N-nitroso compounds: possible environmental hazards. — Mutat. Res., 1976. v. 32, p. 179—228.
Muller R, Milller D., Guilbert L. Differential expression of c-fos in hematopoietic cells: correlation with differentiation of monomyelocytic cells in vitro. — EMBO J” 1984, v. 3, p. 1887—1890.
Muller R_ Salmon D. /., Tremblay J. M. ef a/. Differential expression of cellular oncogenes during pre- and postnatal development of the mouse.——Nature, 1982, v. 299、p. 640—644.
Murray M. /., Cunningham 丄 Л1.. Parada L. E ei al. The HL-60 transforming sequence: a ras oncogene coexisting with altered myc genes in hematopoetic tumors. — Cell, 1983, v. 33, p 749—757.
Nagao M., Sugimura T., Yang S. К- e/ al. Mutagenicity of optically pure (—) trans-7»8-dihydroxy-dihydrobenzo (a) pyrene. — Mutat. Res., 1978, v. 58, p. 361- 365.
Nagata C., Kodama Af., Kimura T. et al. Metabolically generated free radicals from many types of chemical carcinogens and binding of the radicals with nucleic acid bases.——In: Carcinogenesis: Fundamental Mechanisms and Environmental Effects / Eds. В Pullman, P. О P. Ts'o, H. Gelboin. Dordrecht; Boston; London, 1980. v. 13, p. 43—54.
Neil 丄 C, Ghysdael 丄，Vogt P. K. ef a厶 Homologous tyrosine phosphorylation sites in transformation-specific gene products of distinct avian sarcoma viruses. —Nature, 1981, v. 291, p. 675—677.
Neuberger M. S., Calabi F. Reciprocal chromosome translocation between c-myc and immunoglobulin y2b genes. — Nature, 1983, v. 305, p. 240—243.
Newbold R. E, О ver ell 火.呼.Fibroblast immortality is a prerequisite for transformation by EJ c-Ha ras oncogene. — Nature, 1983, v. 304, p. 648—651.
Newmark R The rasmatazz of cancer genes. —Nature, 1983. v. 305, p 470—471.
Newmark P. Viral oncogene permutations. — Nature, 1983, v. 306, p. 426.
Nishimura 丄，〃〃amg 丄 S_ Denel Г F. Platelet-derived growth factor stimulates tyrosine-specific protein kinase activity in swiss mouse 3T3 cell membranes.— Proc Natl Acad. Sci USA. v. 79. p. 4303—4307.
Noori-Daloii M. R., Swift R. 4, Kung H. A et al. Specific integration of REV proviruses in avian bursal lymphomas. — Nature, 1981, v. 294, p. 574—576.
Nushikura A・・ Rushidi A. A, Erickson J. et a/. Differential expression of the normal and of the translocated human c-myc oncogenes in В-cells. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, v. 80, p. 4822—4826.
Nusse /?., Varmus ". £ Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome.— Cell. 1982, v. 31, p. 99-109.
O'Brein S. £., Nash W. G., Goodwin J. L. et al. Dispersion of the ras family of transforming genes to four different chromosomes in man. — Nature, 1983, v. 302, p. 839—842.
Oesch『.，Clegg 丄 C. S., Billings R. et q/. Enzymic control of reactive metabolites from aromatic carcinogens.— In: Carcinogenesis: Fundamental Mechanisms and Environmental Effects / Eds B. Pullman, P. О. P. Ts'o, H Gelboin. Dordrecht; Boston; London, 1980. v. 13, p 167—177.
Oesch F_ Glatt H. R.. Schmassmann H. U. The apparent ubiquity of epoxide hydratase in rat organs. Biochem Pharmacol.. 1977, v. 26, p. 603—607.
Olsson M, Lindahl Г. Repair of alkylated DNA in E. coli; methyl group transfer from O6-methylguanine to a protein cysteine residue. — J. Biol Chem., 1980, v. 255, p. 10569 -10571.
Oppermann 〃.，Levinson A. D., Levintow L. et al. Two cellular proteins that immunoprecipitate with the transforming protein Rous sarcoma virus — Virology, 1981, v. 113, p. 736—751.
Oskarsson M., Clements 昭.L., Blair D. G. et al. Properties of a normal mouse cell DNA sequence (sarc) homologous to the src sequence of Moloney sarcoma virus. — Science, 1980, v. 207, p. 1222—1224.
O'Toole C. AL, Povey S・，Hepburn P. et “/. Identity of some human bladder cancer cell lines. — Nature, 1983T v. 301, p. 429—430.
Pall M. £. Gene-amplification model of carcinogenesis. — Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1981, v. 78, p. 2465—2468.
Papkoff /., Verma 丄 M, Hunter Г. Detection of a transforming gene product in cells transformed by Moloney murine sarcoma virus. — Cell, 1982, v. 29, p. 417—426.
Parada L. F., Tabin C. /., Shih C. et al. Human EJ bladder carcinoma oncogene is homologue of Harvey sarcoma virus ras gene. — Nature, 1982, v. 297, p. 474 -478.
Payne G. S,, Bishop J. M., Varmus H. £ Multiple arrangements of viral DNA and an activated host oncogene in bursal lymphomas. — Nature, 1982, v. 295, p. 209—217.
Pegg A E. Alkylation of rat liver DNA by diniethylnitrosamine: effect of dosage on O6-methylguanine levels. — Proc. Natl. Acad= Sci. USA, 1977, v. 58, p. 681—685.
Pegg 4. £. Formation and metabolism of alkylated nucleosides: Possible role in carcinogenesis by nitroso-compounds and alkylating agents. — Adv. Cancer Res., 1977a, v. 25, p. 195—269.
Pegg A. £., Jeckson A. Alkylation of messenger RNA by dimethylnitrosamine.— Chem. Biol. Interact., 1976, v. 12, p. 279—268.
Perucho M. Human-tumor-derived cell genes contain common and different transforming genes. — Cell. 1981, v. 27, p. 467—4 76.
Phillips D. 〃.，Sims P. Polycyclic aromatic hydrocarbon metabolites: their reactions with nucleic acids. — In: Chemical carcinigens and DNA / Eds. P. L. Grover. N. Y.J978, v. 2, p. 29—57.
Ponticelli A. S., Whitlock C. 4., Rosenberg N. et al. In vivo tyrosine phosphorylations of the Abelson virus transforming protein are absent in its normal cellular homolog. — Cell, 1982, v. 2 9, p. 953—960.
Porzig ^. /., Robbins ^. C., Aaronson S. A. Cellular regulation of mammalian sarcoma virus expression: a gene regulation model for oncogenesis.—— Cell. 1979, v. 16, p. 875—884
Pulciani S., Santos E, Lauver A. V. et al. Oncogenes in solid human tumors.—— Nature, 1982, v. 300, p. 539—542.
Pulciani S., Santos E., Lauver D. R. et al. Oncogenes in human tumor cell lines: Molecular cloning of a transforming gene from human bladder carcinoma cells. — Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1982, v. 79, p. 2845—2849.
Pullman B., Pullman A. Nucleofilicity of DNA Relation to chemical carcinogenesis.— In: Carcinogenesis: Fundamental Mechanisms and Environmental Effects / Eds. B. Pullman, P. О. P. Ts'o, H. Gelboin. Dordrecht; Boston; London, 1980, v. 13, p. 55- 66.
Rantanen /. Chemical and radiation carcinogenesis. Prevention of occupational cancer.——In: Intern, symposium. Occupational safety and health series, N 46. Intern. Labour Office. Geneva, 1982, p. 81- 87.
Rapp U. R・,Coldsborough M. D.t Mack G. E et al. Structure and biological activity of v-raf, a unique oncogene transduced by a retrovirus. — Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1983. v. 80. p. 4218- 4222.
Rasheed S., Norman G L., Heidecker G. Nucleotide sequence of the Rasheed rat sarcoma virus oncogene: new mutations. — Science; 1983, v. 221, p. 155—157.
Rassoulzadegan Af・，Cowie A., Carr A. et q/. The roles of individual polyoma virus early proteins in oncogenic tranformation. Nature, 1982, v. 300, p. 713—718
Rechavi G., Givot D, Canaani E Activation of a cellular oncogene by DNA rearrangement: possible involvement of an IS-like elenient. — Nature, 1982, v. 300, p. 607—611.
Reddy E. P. Nucleotide sequence analysis of the T24 human bladder carcinoma oncogene. — Science, 1983, v. 220, p. 1061—1063.
Reddy £. Р.» Reynolds R. /С, Santos £ et 〃厶 A point mutation is responsible for the acqusition of transforming properties by the T24 human bladder carcinoma oncogene. — Nature, 1982, v. 300, p. 149—152.
Reddy £ Л, Smith M. /., Canaani E. et al. Nucleotide sequence analysis of the transforming region and large terminal redundancies of Moloney murine sar- koma virus. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, v. 77, p. 5234—5237.
Roth R. A.t Cassell D. J. Insulin receptor: Evidence that it is a protein kinase.— Science, 1983, v. 219, p. 299 -301.
Rothberg 尸.，Erisman M.f Diehl /?. et al. Structure and expression of the oncogene c-myc in fresh tumor material from patients with hematopoietic malignancies.— Molec. a Cell. Biol., 1984, v. 4, p 1096 -1103.
Rous P. A A sarcoma of the fowl transmissible by on agent separable from the tumor cells.—J. Exp. Med.. 1911, v. 13, p. 397 - 411.
Rovigatti U. G., Rogier C. £., Neel 8. et al. Expression of endogeneous oncogenes in tumor cells. — In: 4th Ann. Bristol—Meyers Cancer Symp. Tumor Cell Heterogeneity: origin and implications / Eds. A bens J. K., Coffey D S., Baulin S. В N. Y.; London, 1982, p. 319—330.
Rowley /. O. Human oncogene locations and chromosome aberrations.— Nature, 1983. v. 301, p. 29Ю -291.
Roy-Burman P.t Devi 8, Parcer /. Differential expression of c-erb B, c-myc and c myb oncogene loci in human lymphomas and leukemias. — Int. J. Cancer, 1984, 32, p. 185 -191.
Ruley E. H. Adenovirus early region El A enables viral and cellular transforming genes to transform primary cells in culture. — Nature, 1983, v. 304, p. 602- 606.
Saffiotti U. Occupational carcinogenesis in relation to the multifactorial origin of cancer: Experimental pathology approaches. — In： Prevention of occupational cancer: Internet. Symp. Occupational Safety and Health series. N 46, Intern. Labour Office, Geneva, 1982.
Santos £., Reddy E R, Pulciani S. et al. Spontaneous activation of a human proto-oncogene. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, v. 80. p. 4679- 4683.
Santos £., Tronick S. R., Aaronson S. et al. T-24 human bladder carcinoma oncogene is an activated form of the normal human homologue of BALB- and Harvey-MSV transforming genes. — Nature, 1982, v. 298, p. 343 -347.
Sarngadhavan M. G., Schuepbach 丄，Kalyanaraman V. S. et al. Immunological characterization of the natural antibodies to human T-cell leukemia virus in human sera.— In: Modern Trends in Human Leukemia V / Ed. by Neth et al. Berlin et al., 1983, p. 498 —503.
Schafer /?., Griegel S., Knyazev P. et q/. Transforming activity of DNA from human melanoma, neuroblastoma, breast carcinoma and from normal human lymphocytes.—J. Cell. Bioch.t 1984, Suppl. P. A., Abstr. о 168.
Schechter A. L., Stern D. F., Vaidyanathan L. et al. The neu oncogene: an erb-B-rela- ted gene encoding a 185,000 — Mr tiimor antigen. — Nature, 1984, v. 312, p. 513—516.
Schwab M,t Alitalo K., Klempnauer К、H. et al. Amplified DNA with limited homology to myc cellular oncogene is shared by human neuroblastoma cell lines and a neuroblastoma tumor. — Nature, 1983, v. 305, p. 24 5—248
Schwab M.t Alitalo K,, Varmus H. E. et &厶 A second oncogene (c-Ki-ras) is amplified, overexpressed and located within caryotypic abnormalities in mouse adrenocortical tumour cells. — Nature, I983t v. 303, p. 497—501.
Scolnick E. M., Weeks M. O., Shih『.F. et al. Markedly elevated levels of an endogenous sarc protein in a hematopoietic precursor cell line. — Molec. Cell Biol., 1981, v. 1. p. 66—74.
Sefion B. Af, Hunter T., Beemon ^. Relationship of polypeptide products of the transforming gene of Rous sarcoma virus and the homologous gene vertebrates. —Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1980, v. 77, p. 2059—2063.
Sefton В. M., Hunter Т., Ball D. G. et al. Vinculin: a cytoskeletal target of the transforming protein of Rous sarcoma virus. — Cell, 1981, v. 24, p. 165—174.
Sefton 8, Hunter Г.» Raschke W. C. Evidence that the Abelson virus protein functions in vivo as a protein kinase that phosphorylates tyrosine. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, v. 78, p. 1552—1556.
Sefton б. M., Trowbridge /. S.. Cooper J. 4 et al. The transforming proteins of Rous sarcoma virus, Harvey sarcoma virus, and Abelson virus contain tightly bound lipid. — Cell, 1982, v. 31, p. 465—474
Segava K.t Ito У. Enhancement of polyoma virus midle T antigen tyrosin phosphorylation by epidermal growth factor. — Nature, 1983» v. 304, p. 742—744.
Sheiness 力.，Vennstrom 8r Bishop J. M. Virus-specific RNAs in cells infected by avian myelocytomatosis virus and avian erythroblastosis virus: modes of oncogene expression. — Cell, 1981, v. 23, p. 291—300.
Shen-Ong G. L. C., Keath E.丄，Piccoli S.立 et al. Novel myc oncogene RNA from abortive immunoglobulin-gene recombination in mouse plasmocytomas.—— Cell. 1982, v, 31, p. 443—452.
Shih C. et al. Transforming genes of carcinomas and neuroblastomas introduced into mouse fibroblasts. — Nature, 1981, v. 290, p. 261—264.
Shih T. K, Papageorge A. G.. Stokes P. £ et aZ Guanine nucleotide-binding and autophosphorylating activities associated with the p21irc protein of Harvey murine sarcoma virus. — Nature, 1980, v. 287, p. 686—691.
Shih C., Shilo 8, Goldfarb M P. et al. Passage of phenotypes of chemically transformed cells via transfection of DNA and chromatine. — Proc» NatL Acad. Sci. USA. 1979, v. 76, p. 5714—1718
Shilo B. Z., Shih C. 〃.，Merrick M. et al. Progress in cloning the transforming gene from chemically-transformed mouse cells — In: Carcinogenesis: Fundamental Mechanisms and Environmental Effects / Eds. B. Pullman, P. О. P. Ts*o, H. Gelboin. Dordrecht; Boston; London. 1980, v. 13, p. 517—526.
Shilo B.t Simon M. Цит. no J. M. Bishop, 1982.
Shilo B.t Weinberg R. A. Unique transforming gene in carcinogentrasformed mouse cells,— Nature. 1981, v. 289. p. 607—609.
Shilo В Z., Weinberg R. A. DNA sequences homologous to vertebrate oncogenes are conserved in Drosophila melanogaster. — Proc. Natl. Acad Sci.. USA, 1981； v. 78, p. 67—89—6792.
Shimizu K., Birnbaum D. Ruley M. A. et al. Structure of the Ki・ras gene of the human lung carcinoma cell line Calu-I. — Nature, 1983. v. 304, p. 497—500.
Shimizu ^, Goldfarb M.t Perucho M. et al. Isolation and preliminary characterization of the transforming gene of a human neuroblastoma cell line. — Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1983, v. 80, p. 383—387.
Shimizu K., Goldfarb M., Suard Y. et al. Three" human transforming genes are related to the viral ras oncogenes. — Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1983, v. 80, p. 2112—2116.
Shimotohno K., Mizutani S., Temin H. M. Sequence of retrovirus provirus resembles that bacterial transposable elements. — Nature, 1980, v. 285, p. 550—554.
Simon O., Stuhlmann 〃.，Jahner O. ef al. Retrovirus genomes methylated by mammalian but not bacterial methylase are noninfections. — Nature, 1983, v. 304, p. 275—277.
Spandidos D., Kerr /. Elevated expression of the human ras oncogene family in premalignant and malignant tumors of the colorectum. — Brit. J. Cancer, 1984, v. 49, p. 681—688.
Spandidos D. Wilkie N. Malignant transformation of early passage rodent cell by a single mutated human oncogene. — Nature, 1984, v. 310, p. 469—475.
Spector D. H., Baker 8., Varmus H. £ et q/. Characteristics of cellular RNA related to the transforming gene of avian sarcoma viruses. — Cell, 1978, v. 13, p. 381—386.
Spector D. H. et al. Uninfected avian cells contain RNA related to the transforming gene of avian sarcoma viruses. — Cell, 1978, v. 13, p. 3 71—379.
Spector O. 〃.，Varmus H. £., Bishop J. M. Nucleotide sequences related to the transforming gene avian sarcoma virus are present in RNA of uninfected vertebrates. — Proc. NatL Acad. Sci. USA, 1978, v. 75, p. 4102—4106.
Sporn M. В., Todaro G. Autocrine secretion and malignant transforming of cells. — New Engl. J. Med.» 1980, v. 303, p. 878—880.
Stavnezer E. Gerhard D. S., Binary R. C. et al. Generation of transforming viruses in cultures of chiken fibroblasts infected with an avian leukosis virus.—— J. Virol.» 1981, v. 39, p. 920—943.
Stehelin D. Varmus H., Vogt P. ^. DNA related to the transforming gene (s) of avian sarcoma viruses is present in normal avian DNA. — Nature, 1976, v. 260, p. 170—173.
Stiles C D. The molecular biology of platelet derived growth factor. — Cell. 1983, v. 33, p. 653—655.
Sukumar S・，Notario K, Martin-Zanca D. et al. Induction of mammary carcinomas in rats by nitroso rnethylurea involves malignant activation of Ha-ras-l locus by single point mutation. — Nature, 1983, v. 306, p. 658—661
Sutherland 8., Bennett P. Transformation of human cells by DNA transfections.— Cancer Res.. 1984, v. 44, p. 2769—2772.
Swanstrom R., DeLorbe W.丄，Bishop 丄 M. Nucleotide sequence of cloned unintegrated avian sarcoma repeats similar to those in transposible elements.— Proc. Natl. Acad. Sci. US, 1981. v. 78. p. 124—128.
Swanstrom R. et al. Transduction of a cellular oncogene: the genesis of Rous sarcoma virus. — Proc. Natl. Acad. USA, 1983, v. 80, p. 2519—2523.
Tabin C. /., Bradley C. /., Borgmann C. /. et al. Mechanism of activation of a human oncogene. — Nature, 1982, v. 300, p. 143—149.
Taparowsky E., Shimizu K・, Goldfarb M. et al. Structure and activation of the human N-ras gene. — Cell, 1983, v. 34, p. 581—586.
Taparowsky E, Evard У.. Fasano O. et al. Activation of T24 bladder carcinoma transforming gene is linked to a single amino acid change. — Nature. 1982, v. 300, p. 762—765.
Temin H. Function of the retrovirus long terminal repeat — Cell. 1982, v. 28, p. 3—5. Temin H. We still don't understand cancer. — Cancer, 1983, v. 302, p. 656. Temin 〃.，Baliimone D. RNA-directed DNA synthesis and DNA tumor viruses.— Adv. Virus. Res., 1972, v. 17, p. 129—186.
Tooze /. The molecular biology of tumor viruses. Part I. DNA tumor viruses, 2nd ed. Cold Spring Harbor. Laboratory, Cold Spring Harbor; New York, 1980 Toth B. Synthetic and naturally occuring hydrazynes as possible cancer causative agents. —Cancer Res., 1975, v. 35. p. 3693—3697.
Tsuchida M, Ryder T., Ohtsubo E Nucleotide sequence of the oncogene encoding the p21 transforming protein of Kirsten murine sarcoma virus. — Science, 1982, p. 217, p. 937- 939.
Van Beveren C., Gal les haw J. A., Jonas V. et al. Nucleotide sequence and formation of the transforming gene of a mouse sarcoma virus. — Nature, 1981, v. 289, p. 258 -262.
Van Beveren C., Van Straaten E. Galleshow 丄 A. et al. Nucleotide sequence of the
genome of a murine sarcoma virus. — Cell, 1982, v. 27, p 97—108.
Varmus H. E. Form and function of retroviral provirus. — Science, 1982, v. 216, p. 812—827.
Varmus H. E, Quintrell N., Ortiz S. Retroviruses as mutagenes: Insetrion and excision of a nontransforming provirus alter expression of a resident transforming provirus. — Cell, 1981, v. 25, p. 23—36.
Varmus ". £, Quintrell N., Wyke /. Revertants of ASV-transformed rat cell line have los the complete provirus or sustained mutations in src. — Virology, 1981, v. 108, p. 28—46.
Varmus H. E., Shank P. R., Hughes S. £. et al. Synthesis, structure, and integration of the DNA of RNA tumor viruses. — Cold Spring Harbor Symp.
Quant BioL, 1979, v. 4 3, p. 851—864.
Varmus H. E., Swanstrom R. Replication of Retroviruses. — In: RNA tumor viruses / Eds. R. Weiss et al. Molecular Biology of tumor viruses, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, p. 369—512.
Vennstrom B, Bishop /. M. Isolation and characterization of chicken DNA homologous to the two putative oncogenes of avian erythroblastosis virus.— Cell, 1982, v. 28, p. 135—143.、
Vonsden К., Marc hall C. Three different activated ras genes in mouse tumours: evidence for oncogene activation during progression of mouse lymphoma.— EMBO J.. 1984 3, p. 913—917.
U^ang L. 〃.. Moscovici C., Koress R. E et al. Analysis of the src gene of sarcoma virus generated by recombination between transformation defetive mutants and quail cellular sequences. — J. Virol., 1979, v. 32, p. 546—556.
Warburg O. Uber den Stoffwechsel der Tumoren. — Berlin. 1926.
Waterfield 收 D, Sc race G. T., Whittle TV. et 口厶 Platelet-deriver growth factor is structurally related to the putative transforming protein p28s,s of simian sarcoma virus. — Nature, 1983, v. 304, p. 35—39.
Watson /. D., Crick F. H. C. Genetical implications of the structure of DNA.— Nature, 1953, v. 171, p. 964—967.
Watson /?., Oskarsson M.t Vande Woude G. F. Human DNA sequences homologous to the transforming gene (mos) of Moloney murine sarcoma virus. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, v. 79, p. 4078—4082.
Weinberg R. A. Oncogenes of spontaneous and chemically induced tumors.—— Adv. Cancer Res., 1982, v. 36. p. 149—163
Weinberg R. 4 Fewer and fewer oncogenes. — Cell, 1982a, v. 30» p. 3—4.
Weinberg R. A. A molecular basis of cancer. — Scientific American, November, 1983, v. 248, p. 126—142.
Weinberg R А, Цит. no Bishop J. M., 1982.
• Weiss /?. Oncogenes and growth factors. — Nature, 1983, v. 304, p. 12.
Weiss R.t Tech N., Varmus H. et al. Molecular biology of tumor viruses. RNA Tumor viruses. 2nd ed. Cold Spring Harbor; New York, 1982.— 1396 p.
Westin E 〃.，Won Staal F., Gelman E P. “ al. Expression of cellular homologues of retroviral one genes in human hemopoetic cells. — Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1982. v. 79, p. 2490—2493.
* Whitterman A. S. Quantitative theory of oncogenesis. — Adv. Cancer Res., 1978, v. 27. p. 55 —58.
Wierenga R. Д., Hol % G 丄 Predicted nucleotide binding properties of p21 protein and its cancer-associated variant. — Nature, 1983, v. 302, p. 842—844.
Wigley С. B., Newbold R F., Amos 丄 et al. Cell mediated mutagenesis in cultured Chinese hamster cells by polycyclic hydrocarbons: mutagenicity and DNA reaction related to carcinogenicity in a series of compounds. — Int. J. Cancer. 1979, v. 23. p. 691—696.
Willingham M C.t Jay G., Pastan 丄 Localization of the ASV gene product to the plasma membrane of transformed cells by electron microscopic immunocytochemistry.—Cell, 1979, v. 18, p. 125—134.
Willingham M C, Pastan /., Smith T. Y. et al. Localization of the src gene product of the Harvey strain of MSV to the plasma membrane of transformed cells by electron microscopic immunocytochemistry. — Cell, 1980. v. 19. p. 1005.
Wislocki A G.t Wood A.呼.，Chang R 厶.et al. Mutagenicity and cytotoxicity of benzo (a) pyrene arene oxide, phenols» quinones, and dihydrodiols in bacterial and mamalia cells. — Cancer Res., 1976, v. 36, p. 3350—3357.
Witte 0. N., Rosenberg M, Baltimore D. A normal cell protein cross-reactivc to the major Abelson murine leukemia virus gene product. — Nature, 1979, v. 281, p. 39G—398.
U^ood A.吃，Lewin W.. Thomas P. £. et al. Metabolic activation of di benzo (a) anthracene and its dihvdrocliols to bacterial mutagens. — Cancer Res., 1978, v. 38, p. 1967—1973.
Yamamoto『.，deCrombrugghe 8., Pastan /. Identification of a functional promoter in the long terminal repeat of Rous sarcoma virus. — Cell, 1980, v. 22, p. 787—797.
Yang S. K., Chou M. W., Fu P. P, Metabolic and structural requirenments for the carcinogenic potencies of unsubstituted and methyl-substituted polycyclic aromatic hydrocarbons. — In: Carcinogenesis: Fundamental Mechanisms and Environmental Effects / Eds. B. Pullman, P. О. P. Ts'o, H. Gelboin. Dordrecht; Boston; London, 1980, v. 13, p. 143 -156.
Yaniv M. Enhancing elements for activation of eukaryotic promoters. Nature. 1982, v. 297. p. 17—18.
Yuasa Kr Gol R.. Chang A. et al. Mechanism of activation of an N-ras oncogene of SW 1271 human lung carcinoma cells. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81. p. 3670—3674.
Yuasa K, Srivastan S. К.» Dunn С. K. et al. Acqusition of transforming properties by alternative point mitations within c-bas/has human proto-oncogene.—Nature, 1983, v. 303, p. 775—779.
Yunis J. /. The chromosomal basis of human neoplasia. — Science, 1983, v. 221, p. 227—236.
Zi/f £. 8, Evans R. M. Coincidence of the promoter and capped 5*terminus of RNA from the adenovirus 2 major late transcription unit. — Cell, 1978, v. 15, p. 1463—1475.
СПИСОК ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Киселев Ф. Л.» Спитковский Д. Д. Онкогены опухолей человека. — Журн. Всесоюзн. хим. об-ва, 1986, № 3» с. 272—277.
Князев /7. Г., Шефер 尸.，Виллике К., Сейц ". Ф. Идентификация трансформи- руютего гена Ha-ras в клетках меланомы, нейробластомы и рака молочной железы человека. — Вопр. онко』.，1985, № 6, с. 77- 85.
Ar riant is N. Г., Parissi P.t Anagnostakis D et al. Comparative study of Harvey-RAS oncogene expression with conventional clinicopathologic parameters of breast cancer. — Oncology, 1986, vol. 43, p. 36—39.
Colberg-Poley A. M, Voss S. D, Chowdhury /С C aL Structural analysis of murine genes containing homoe box sequences and their expression in embrional carcinoma cells. — Nature, 1985, v. 314, p. 713—718.
Conscience J.•尸・,Verrier B.t Martin G. Interleukin-3-dependent expression of the c-myc and c-fos proto-oncogenes in hemopoietic cell lines. — EMBO J., 1986, v. 5, p. 317—323.
Einant M., Resnitzky D., Kimichi A. Close link between reduction of c-myc expression by interferon and Go/G| arrest. — Nature. 1985, v. 313, p. 597—600.
Guerrero /., Villasante 力.，Corces V. et al. Activation of c-Ki-『as oncogene by somatic mutation in mouse lymphomas induced by gamma radiation. — Science» 1984. v. 225, p. 1159—1162.
Hagag M, Halegona S., Viola M. Inhibition of growth factor induced differentiation of PC12 cells by microinjection of antibody to ras p21. — Nature. 1986, v. 319, p. 680—682.
Hand P. 〃.，Thor 4, Wunderlich D. et aL Monoclonal antibodies of predefined specificity detect activated ras gene expression in human mammary and colon carcinomas. — Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1984, v. 81. p. 5227—5231. Hayday A. C., Gillies S. D., Saito H. et al. Activation of a translocated human c-myc gene by an enhancer in the immunoglobulin heavy-chain locus.— Nature, 1984, v. 307, p. 334 -34 0.
Kamata Г., Feramisco 丄 R. Epidermal growth factor stimulates guanine nucleotide binding activity and phosphorylation of ras oncogene proteins. — Nature, 1984, v. 310, p. 147—150.
Kataoka T.t Powers S.. Cameron S. et q厶 Functional homology of mammalian and Yeast RAS genes. — Cell, 1985. v. 40, p. 19—26.
Kraus M. H., Yuasa Y., Aaranson S. A position 12 activated H-ras oncogene in all HS 578t mammary carcinosarcoma cells and but not normal mammary cells of the same patient. — Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 1984, v. 81, p. 5383 -5388.
Krontiris Th. G., DiMartino M 力.，Colb M. et al. Human restriction fragment lenghth polymorphisms and cancer risk assessment.—J. Cell. Bioch., 1986, v. 30, p. 319 —329.
Liberman T. A., Nursbaum H. R., Razon N. et al. Amplification, enhanced expression and possible rearrangement of EGF receptor gene in primary human brain tumours of glial origin. — Nature, 1985, v. 313, p. 144 —147.
Martinet K, Bitterman P. fl., Mornex J.-F. et al. Activated human monocytes express the c-sis proto-oncogene and release a mediator showing PDGF-like activity. — Nature, 1986, v. 319. p. 158—160.
Martin-Zanca D, Hughes S. 〃.，Barbacid M. A human oncogene formed by fusion of truncated tropomyosin and protein tyrosine kinase sequences. — Nature, 1986, v. 319, p. 743—748.
Mulcahy £. S., Smith M. R, Stacey D. W. Requirenment for ras protooncogene function during serum-stimulated growth oi NIH 3T3 cells.—Nature, 1985, v. 313, p. 341—343.
Miiller /?., Bravo R., Burckhardt /. et a/. Induction of c-fos gene and protein by growth factors precedes activation of c*myc, — Nature, 1984. v. 312, p. 716—720.
Rogers J・，Cooper G.t Goubin G. et M Relationship of Blym genes to repeated sequences. — Nature, 1986, v. 320, p. 579—580.
Sacchi M, Watson D. K., Giertsvan A. 〃. M. el al. Hu-ets-1 and Hu-ets-2 genes are translocated in acute leukemias with (4; 11) and (8; 21) translocation.— Science, 1986. v. 231, p. 379—382.
Slamon M /., Boone Г 乙，Seeger R. C. cZ al. Identification and characterization of the protein encoded by the human H-myc oncogene. — Science, 1986, v. 232. p. 768—772.
Smith M. R.t DeGudicibus S.丄，Stacey D. W. Requirenment for c-ras protein during viral oncogene transformation.— Nature, 1986, v. 320, p. 540— 543.
Tanabe Г.. Nukada Г., Nishikawa У. et q/. Primary structure of the a-subunit of transducin and its relationship to ras proteins.— Nature, 1985, v. 315, p. 242— 245.
Thein S. L.. Oscier D. G., Flint 丄 et qL Ha-ras hypervariable alleles in myelodysplasia.—Nature, 1986, v. 321. p. 84—85.
Thompson О. B. Chailoner P. B., Neiman P. E et al. Levels of c-myc oncogene mRNA are invariant throughout the cell cycle. — Nature, 1985» v. 314, p. 363— 366.
Wallich /?.. Bulbuc M. Hammer ling G. /. et al. Abrogation of metastatic properties of tumour cells by de novo expression of H-2K antigens following H-2 gene transfection. — Nature, 1985, v. 315, p. 301—305.
Yamamoto 7.. Ikawa S., Akiyama Г. et q/. Similarity of protein encoded by the human c-erb B-2 gene to epidermal growth factor receptor. — Nature» 1986, v, 319. p. 230 -234.
Zimmerman K. A, Yancopoulos G. D, Collum9 R. G. et a/. Differential expression of myc family genes during murine development. — Nature, 1986, v. 319, p. 780—783.
Seitz J. F・,Knyazev P. G. Molecular oncology: (manual for doctors) — Leningrad, Medicina, 1986, — p. 352.
Seitz Joseph F., Doctor of Biological Sciences, Professor, Head of Laboratory of Cancer Biochemistry, N. N. Petrov Institute of Oncology. USSR Ministry of Health, Leningrad; Knyazev Peter G-, Candidate of Medical Sciences, Senior Research Worker at the same Laboratory.
Molecular oncology is actually the first monograph of this kind published in the USSR, or abroad. The authors are the first to review volumenous literature and experimental data in the field of a new branch of science — molecular oncology. A universal concept of oncogenesis has been developed, which offers a common theoretical interpretation and basis for chemical, physical and biological (viral) carcenogenesis. The results of the analysis of the data obtained make one feel optimistic when the possibility of a forthcoming solution of the most urgent problem of to-day — the origin of cancer — is concerned. The book deals with new data on identification, intracellular localization, molecular structure and origination of oncogenesis, as well as their action in human and animal tumors. Much attention is also paid to the «working tools» of oncogenesis, viz. oncoproteins. Perspectives on using these data for the development of adequate methods of diagnosis and treatment of neoplasms are also viewed.
There are 14 tables, 12 figures in the book; bibliography includes 391 names.
3 4 78490354 6 8 11 3 6 8 0 18 23477204422 195 7223С634 4 4 5 6 899122 33334578899246 6 11111111111222 23 4 78490354 6 8 11 3 6 8 0 18 23477204422 195 7223С634 4 4 5 6 899122 33334578899246 6 11111111111222 2о 17 82 2о 17 82 2848586899496982 2 2 2 2 2 2848586899496982 2 2 2 2 2 2010729333 3 3 3010729333 3 3 3
3 4 78490354 6 8 11 3 6 8 0 18 23477204422 195 7
223С634 4 4 5 6 899122 33334578899246 6
11111111111222 2
3 4 78490354 6 8 11 3 6 8 0 18 23477204422 195 7
223С634 4 4 5 6 899122 33334578899246 6
11111111111222 2
о 1
7 8
2 2
о 1
7 8
2 2
84858689949698
2 2 2 2 2 2 2
84858689949698
2 2 2 2 2 2 2
01072933
3 3 3 3
01072933
3 3 3 3
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие. 〃. П. Напалков • •
Введение. И. Ф. Сейц Глава 1. Метаболическая теория Варбурга и другие биохимическне гипотезы возникновения рака. И. Ф. Сейц
Отто Варбург и его биохимическая теория рака Обмен веществ белых клеток крови в свете теории Варбурга .... Специфичность обмена веществ кровяных пластинок (тромбоцитов) О полноценности дыхания н еопл а сти ч еских клеток ...... Аэробный гликолиз и «функциональное напряжение> Другие биохимические гипотезы рака
Опухоль и организм
Глава 2. Биохимические и молекулярные основы химического канцерогенеза. И. Ф, Сейц .・,♦
Канцерогены окружающей среды Химические канцерогены
Полициклические ароматические углеводороды
Канцерогенность и мутагенность в связи с модификацией ДНК химиче скнмн канцерогенами Химический и радиационный канцерогенез в связи с мутагенезом Ароматические амины и амиды Нитрозам ины и нитрозамиды как канцерогены °
Взаимодействие нитрозосоединений с нуклеиновыми кислотами Заключение Глава 3. Вирусный онкогенез и его молекулярные основы. П. Г. Князев, И. Ф. Сейц
Классификация онкогенных вирусов .
Общие свойства ретровирусов ..
Репликация ретровирусов Структура и функции онкогенных ретровирусов
Онкогены ретровирусов птиц
Онкогены ретровирусов млекопитающих
Механизмы вирусного лейкомогенеза у млекопитающих и человека Роль онкогенных вирусов в возникновении опухолей человека
Глава 4. Клеточные онкогены. И. Ф. Сейц Протоонкогены Активация клеточных протоонкогенов в онкогены ... Онкогены, онкобелки и трансформирующие факторы роста
Заключение
Глава 5. Онкогены опухолей человека и животных. /7. Г. Князев, И. Ф. Сейц
К-петочные трансформирующие гены (онкогены) опухолей человека, родственные протоонкогену c-Ha-ras 1 Клеточные трансформирующие гены опухолей человека, родственные протоонкогену c-Ki-ras 2
Клеточные трансформирующие гены человека, родственные протоонкогену N-ras
Трансформирующие гены В lym и T-lym
Неидентифицированные трансформирующие гены .
Влияние метилирования ДНК на экспрессию онкогенов Тканеспецифичность активации онкогенов Недостаточность единичного онкогена для полной трансформации клеток Кооперирование между онкогенами Экспрессия трансформирующих генов в нормальных и опухолевых клетках человека Канцерогенез: «одноударная кинетика> или «каскад онкогенов»?.. Заключение. И. Ф Сейц
Список литературы。
И.Ф.СЕЙЦ. П.Г КНЯЗЕВ
".Ф. СЕЙЦ, /7. Г. КНЯЗЕВ
МОЛЕКУЛЯРНАЯ онкология
Руководство для врачей
ЛЕНИНГРАД «МЕДИЦИНА» Ленинградское отделение 1986
ББК 55.6
С 28
УДК 616-006:577.21 (035)
Рецензенты: Бутенко 3. А. — заведующая отделом молекулярных механизмов канцеро- и ленкозогенеза Института проблем онкологии им. Р. Е. Кавецкого АН УССР, чл.-кор. АН УССР доктор мед. наук профессор; Голубев Д. Б.— заведующий отделом молекулярной биологии и генетики вирусов Всесоюзного НИИ гриппа М3 СССР, доктор мед. наук профессор
For summary see page 351.
Иосиф Фридрихович Сейц, Петр Григорьевич Князев